BRPI0114510B1 - multímero de polipeptídeo monomérico purificado, composição de vacina para profilaxia ou tratamento da infecção por vírus da hepatite e em mamíferos, kit de diagnóstico para infecção por vírus da hepatite e em amostras biológicas, método de diagnóstico in vitro da infecção por vírus da hepatite e em mamíferos, método para detecção in vitro de anticorpos totais contra o vírus da hepatite e em amostras biológicas, método para detecção in vitro do anticorpo igg contra o vírus da hepatite e em amostras biológicas e método para detectar in vitro o anticorpo igm contra o vírus da hepatite e em amostras biológicas - Google Patents
multímero de polipeptídeo monomérico purificado, composição de vacina para profilaxia ou tratamento da infecção por vírus da hepatite e em mamíferos, kit de diagnóstico para infecção por vírus da hepatite e em amostras biológicas, método de diagnóstico in vitro da infecção por vírus da hepatite e em mamíferos, método para detecção in vitro de anticorpos totais contra o vírus da hepatite e em amostras biológicas, método para detecção in vitro do anticorpo igg contra o vírus da hepatite e em amostras biológicas e método para detectar in vitro o anticorpo igm contra o vírus da hepatite e em amostras biológicas Download PDFInfo
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Abstract
"fragmentos de polipeptídeos do vírus da hepatite e, composição de vacina e kits de diagnóstico compreendendo o mesmo e uso destes". a presente invenção refere-se ao(s) polipeptídeo(s) compreendendo a seqüência de aminoácido apresentada na seq.id.no:1 da orf 2 do vírus da hepatite e ou seus fragmentos, o qual está na forma de polipeptídeo n-polimérico, onde n é um número inteiro de 1-180; uma proteína quimérica consistindo de um polipeptídeo da presente invenção e um fragmento conservado do antígeno hemaglutina do vírus influenza; um polipeptídeo da presente invenção ligado a um polipeptídeo contendo o epítopo da orf3 do vírus da hepatite e, ou um fragmento imunogênico do mesmo; um vetor de expressão recombinante compreendendo a molécula de dna codificando os polipeptídeos acima e a célula hospedeira transformada com o dito vetor de expressão recombinante que é capaz de expressar o polipeptídeo da presente invenção. a presente invenção refere-se adicionalmente a uma composição de vacina contra o vírus da hepatite e que compreende o polipeptídeo acima mencionado, ou kit de diagnóstico para infecção do vírus da hepatite e compreendendo o polipeptídeo acima mencionado, que inclui igg, igm, ou o kit de diagnóstico dos anticorpos totais para o vírus da hepatite e, e para o uso da composição da vacina e o kit de diagnóstico para profilaxia, diagnose e/ou tratamento da infecção por vírus da hepatite e.
Description
Campo da invenção [001] A presente invenção refere-se a um polipeptídio compreendendo a sequência de aminoácidos como apresentado na
SEQ.ID.NO:1 da
ORF2 do vírus da hepatite
E ou seus fragmentos, os quais estão na forma de polipeptídio Npolimérico, onde
N é um inteiro de 1-180;
para uma proteína quimérica consistindo de um polipeptídio da presente invenção e um fragmento conservado do antígeno da hemaglutina do vírus influenza; para um polipeptídio da presente invenção ligado a um peptídeo contendo o epítopo da ORF3 do vírus da hepatite E ou um fragmento imunogênico do mesmo; para um vetor da expressão recombinante compreendendo a molécula de DNA codificando o polipeptídio acima e a célula hospedeira transformada com dito vetor da expressão recombinante que é capaz de expressar o polipeptídio da presente invenção.
[002] A presente invenção refere-se adicionalmente a uma composição da vacina contra o vírus da hepatite E que compreende o polipeptídio acima-mencionado, ou kit de diagnóstico para infecção por vírus da hepatite E
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2/93 compreendendo o polipeptídio acima-mencionado, o qual inclui IgG, IgM, ou o kit de diagnóstico dos anticorpos totais para o vírus da hepatite E, e para uso da composição de vacina e kit de diagnóstico para profilaxia, diagnose e/ou tratamento da infecção por vírus da hepatite E.
Histórico da invenção [003] O vírus da Hepatite E (HEV) foi primeiramente reconhecido como um patógeno de transmissão entérica da hepatite não-A, não-B em 1983 (Balayan et al., 1983, Intervirology 20:23). A Hepatite E é principalmente endêmica nos países em desenvolvimento na Ásia, África e América Central. Em países em desenvolvimento, os casos de hepatite E foram na maioria das vezes, encontrados em imigrantes ou em viajantes estrangeiros. Ambos os casos tem sido documentados, tanto os casos esporádicos e quanto as grandes epidemias. Durante o período de 1950 a 1990, houve muitas aparições sequencialmente repentinas da hepatite E devido a ingestão de água poluída (visvanathan, 1957, Indian J. Med. Res. (Suppl.), 45:1-30; Wong et al., 1980 lancet, 2:882-885; Myint et al., 1985, Am. J. Trop. Med. Hyg., 34:1183-1189; Bclabbes et al., 1985, J. Med. Virol., 16:257-263; Hau et al., 1999, am. J. Trop. Med. Hyg., 60:277-280). Muitas infecções por hepatite E foram auto-limitadas e mal desenvolvidas dentro das crônicas; mas para a grávida, a sequela foi grave com uma
faixa | de mortalidade acima | de 17% | (Tsega et | al., 1992, Clin | |
Infec | Dis., 14:961- 965; | Dilawari | et | al., | 1994, Indian J |
Gastroenterol., 13:44-48; | Hussaini | et | al., | 1997, J. Viral | |
Hepat. | , 4:51-54). |
[004] Em 1991, pesquisadores identificaram a primeira sequência completa do genoma de HEV, um vírus RNA nãoPetição 870190054122, de 12/06/2019, pág. 8/117
3/93 envelopado de fita simples positiva (Tam et al., 1991, virology 185:120-131) . A análise da sequência mostrou o genoma de 7.2 kb com três regiões de início de leitura. ORF1 que se localiza na extremidade 5' codificando a proteína nãoestrutural do vírus, ORF2 que se localiza na extremidade
3' codificando maior proteína estrutural do vírus.
Na extremidade
5' da ORF3, há um bp sobrepondo-se com extremidade
3' da ORF1.
Na extremidade
3' da ORF3, existem
339 bp sobrepondo-se com extremidade da ORF2. É conhecido que a
ORF3 codifica uma outra proteína estrutural com uma função desconhecida (Tam et al., 1991, Virology, 185:120-131;
Aye et al.,
1992,
Nucleic Acids Res.,
20:3512; aye et al.,
1993, Virus
Genes,
7:95-1098; Huang et al.,
1992, Viroly,
191:550-558;
Reyes et al.,
1993, Arch.
Virol.
Suppl., 7:15[005] detecção da infecção por
HEV depende principalmente da Microscopia Eletrônica
Imunológica (IEM) ou
Técnica de Fluorescência Imunológica para um longo período, mas estas técnicas são muito complicadas, onerosas e difíceis de serem completadas em muitos laboratórios. Após a clonagem e o sequenciamento do genoma de HEV, muitas técnicas sensíveis tipo ELISA, desenvolvidas para serem
Westhern Blot, PCR, etc, foram usadas na detecção da infecção por
HEV.
[006] É bem reconhecido que o desenvolvimento de kits de anticorpos do soro HEV é absolutamente necessário, mas devido à concentração muito baixa do vírus HEV secretado por um humano infectado ou animais, é impossível desse modo usar o soro como fonte do antígeno. Até agora, a eficiência da cultura de células HEV é ainda muito baixa, o que limita a
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4/93 viabilidade de antígenos suficientes para a detecção de HEV. Assim, a detecção dos anticorpos HEV é ainda dependente dos peptídeos sintetizados ou antígenos recombinantes. Infelizmente, muitos estudos sorológicos mostram grandes variedades consistentes baseados nos polipeptídios sintetizados ou antígenos recombinantes de diferentes regiões do genoma HEV. Por exemplo, Goldsmith et al., (1992, Lancet, 399:328-331) usando o antígeno da ORF2, 3-2 (M) (a.a 613-660, cepa Mexicana) para detectar nos casos hospitalares a infecção do vírus da hepatite E. A detecção da faixa de IgG foi de 91%, e diminuiu para 27 ~ 50% após 6 ~ 12 meses. Quando ele usou 3-2(B) (Os mesmos fragmentos da ORF2 da cepa Burma) na detecção, a faixa foi exatamente 64% e nenhum resultado positivo foi encontrado após 6 ~12 meses. Ao contrário, 3-2(M) poderia não reagir com o soro convalescente em um indivíduo do Parkistão, mas 3-2(B) poderia reagir com o soro do mesmo caso 4,5 anos mais tarde. Para estas proteínas, quando o anticorpo em alguns casos se tornou negativo, em outros ainda permaneceu em uma titulação alta. Os resultados foram similares quando a proteína do mosaico com vários epítopos lineares foi expressa quando se usou E. coli. A necessidade de bons kits de anticorpos HEV limitou profundamente as pesquisas na dinâmica dos anticorpos durante a infecção HEV. Geralmente, durante a infecção HEV, o anticorpo IgG específico é detectável no estágio inicial, com o ponto máximo após 2~4 semanas e um rápido declínio. A maioria tornou-se negativo após 9 meses, mas alguns pacientes mantiveram-se positivos muitos anos mais tarde. Recentemente, muitos antígenos recombinantes foram expressos tanto em baculovírus e quanto em E. coli, os quais reagem fortemente
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5/93 com o soro de ambas as fases, aguda e convalescente. Em princípio, estes antígenos são mais adequados para a sobrevivência epidemiológica do soro: o título da IgG no soro HEV diminuiu rapidamente após o estágio agudo, mas ainda se manteve em um nível detectável. Foi convenientemente notificado que o anticorpo está relacionado com a proteção da infecção durante a doença epidêmica.
[007] De outro modo, devido ao fato de que apenas métodos indiretos dos métodos de detecção estão disponíveis até o presente, não foi ainda estabelecido qualquer kit IgM HEV em todo o mundo. Com relação aos métodos indiretos, entretanto, o resultado detectado foi afetado por vários fatores e a reprodução foi pobre; por outro lado, a segurança do resultado é muito baixo em relação à alta possibilidade de falso-positivo, valores altamente negativos, ou menores sensibilidades. De acordo com relatórios recentes, durante a detecção das amostras clínicas, quando o resultado para IgM é positivo, a IgG é geralmente positiva também, assim seus valores em diagnósticos primários é limitado, mas pode ser útil na elevação da especificidade da diagnose da infecção aguda.
[008] É relatado que o anticorpo para muitos peptídeos sintetizados e alguns antígenos recombinantes irão desaparecer rapidamente em muitos indivíduos infectados, assim o diagnóstico clínico em infecções agudas por vírus da hepatite E é geralmente baseado no anticorpo IgG com uma alta concordância clínica, mas a falha mais significante deste método é que não pode distinguir uma infecção passada de uma infecção recente, o que irá conduzir ao mesmo tempo a falsos diagnósticos em grandes áreas endêmicas da infecção pelo
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6/93 vírus da hepatite E, e sob avaliação da prevalência da infecção por vírus da hepatite E durante os estudos epidemiológicos. Portanto, há urgência na questão do desenvolvimento de um kit de diagnóstico IgM cadeia anti-μ seguro e sensível e um kit de diagnóstico IgG que é caracterizado pela alta sensibilidade para o soro convalescente.
[009] Nos anos atuais, foram feitos alguns progressos no desenvolvimento de um kit de diagnóstico IgG altamente sensível. Mast et al., (1998, Hepatology, 27 : 857-861) proveram uma avaliação abrangendo os 10 maiores anticorpos IgG EIAs em todo o mundo. A concordância de muitos kits foi razoavelmente boa na detecção de soros positivos conhecidos, mas uma grande diferença existiu entre kits diferentes para a detecção de doadores de sangue Americanos. Isto implica que a segurança dos resultados é pior em estudos de prevalência de HEV em áreas não-endêmicas. Dentre estes kits, muitos antígenos estão baseados nos epítopos lineares de HEV, mas dois kits usaram epítopo conformacionais como antígenos. O primeiro é ORF2.1 (aa, 394-660), o outro é o baculovírus expressando VLP (aa, 112-607). Ambos os antígenos podem detectar anticorpos convalescentes, mas dados diretos na comparação da concordância entre estes dois antígenos não estão disponíveis até agora. É possível que aqueles dois antígenos identifiquem anticorpos diferentes. Adicionalmente, aproximadamente 20% da prevalência foi relatada na América não-endêmica usando kit VLP, o que estimulou as suspeitas de sua especificidade. Mas com a infecção HEV positiva relatada em suínos, cabras, vacas, galinhas, ratos, macacos selvagens e macacos presos, junto com aproximadamente 77% e 44% de
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7/93 prevalência dos anticorpos entre ratos selvagens em Maryland e Louisanna, é possível que a prevalência do anticorpo seja subestimada na população americana, embora a HEV animal não possa causar doenças clínicas devido a sua virulência. (Kabrane-Lazizi et al., 1999, Am. J. Tropic Medicine, 61:331335). E o kit ORF2.1 pode detectar a alta faixa de positividade entre a infecção CMV e as doenças autoimunológicas. Adicionalmente, o polipeptídio ORF2.1 relatado, que é uma proteína conquimérica GST ou proteína conquimérica poliarginina, pretende obter resultados falso positivos na prática.
[010] Ambas as culturas, celular e de tecido para HEV tem sido bem sucedidas, e métodos práticos para resultar em uma grande quantidade de vírus não está disponível, assim a única via de pesquisa para mudança da tradicional vacina, do vírus morto ou atenuado, para vacina da sub-unidade ou de DNA através da engenharia genética.
[011] A ORF2 de HEV, começa na base posicionada no 5147, tem 1980 nucleotídeos, que codificam um polipeptídio com 660 aminoácidos presumidos como sendo a maior proteína estrutural e constituem o capsídeo do vírus. Na extremidade N-terminal da proteína ORF2, há uma sequência sinal clássica seguida por uma região rica em arginina, a qual é uma região carregada altamente positiva e acredita-se estar envolvida na encapsidação do RNA genômico durante a construção viral. Durante o processo de translação, a ORF2 penetrou no retículo endoplasmático (ER) por um mecanismo da proteína de reconhecimento do peptídeo sinal (SRP), e é adicionalmente glicosilado e acumulado no ER, formando então, provavelmente, o capsômero do capsídeo em seguida. Três sítios N
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8/93 glicosilados, Asn-137, Asn-310 e Asn-562, estão localizados na ORF2. Eles são altamente conservativos entre as diferentes cepas do vírus, e Asn-310 é o maior sítio glicosilado. A ORF2 transfectada em células COS de mamíferos, Huh-7 carcinoma hepatocelular humano HepG2, podem desse modo expressar uma glicoproteína de 88 kD que pode ser encontrada tanto no citoplasma quanto na membrana. A mutação nestes sítios glicosilados não afeta a localização da PORF2 na membrana celular. Entretanto, após a sequência do peptídeo sinal ser removida da mesma, a PORF2 pode apenas ser encontrada no citoplasma. Isto implica no fato de que a substituição de PORF2 ao invés da glicosilação é necessária para a localização da proteína na membrana celular. Proteína do tipo MS em HBV, PORF2 é possivelmente secretada para a membrana celular diretamente através da ER ao invés do complexo de Golgi. Na superfície da célula transfectada, a gpORF2 não é aleatoriamente distribuída, mas concentrada em algumas zonas, o que implica em um processo de combinação ativa de uma subunidade da proteína e pode ser agregada dentro de mais algumas formas avançadas ordenadas. A construção final/maturação do vírus necessita da encapsidação do RNA genômico, assim isto deve ocorrer fora do citoplasma de ER ou na parede interna da membrana celular. O acúmulo da gpORF2 na membrana pode implicar na construção do vírus. Ao mesmo tempo, a localização da proteína do capsídeo na membrana também implica na possibilidade de secreção do vírus maturado fora da célula através da construção. Deve ser descrita com mais atenção que, o transcrito in vitro e a translação da PORF2 usando o sistema de translação in vitro com translação e função de modificação pode produzir 88kD da gpORF2 em ambas
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9/93 as formas, tanto em monômeros quanto em dímeros. É ilustrado que a gpORF2 foi disposta de modo a formar dímeros homólogos, e o capsômero do capsídeo pode ser constituída pelos referidos dímeros homólogos da gpORF2 (Jameel et al., 1996,
J. Virol., 70:207-216). Através da microscopia em um microscópio de seleção a frio (Frost etching election microscope) Li et al., demonstraram que a VLPs do HEV recombinante, a qual é expressa pelo baculovírus tem simetria viral icosahédrica (T=1), o qual foi ajustado com sessenta subunidades p50 com 22-23 nm de diâmetro. Uma vez que o espaço interno de partícula deste tamanho pode conter aproximadamente 1kb do RNA, e o genoma HEV tem 7.5 kb de extensão, e é especulado que o HEV natural poderia ser uma estrutura cristalina gradeada com T > 3, mas a estrutura topológica do capsômero é similar. O número total das subunidades de T = 3 é de 90 capsômeros (Li et al., 1999, Virology, 265:35-45).
[012] De acordo com o acima, HIV é um vírus nãoenvelopado. O capsídeo do vírus é feito da ORF2 codificando a proteína. A proteína incorpora os maiores epítopos imunológicos e alguns epítopos neutralizantes, assim torna-se o fragmento mais favorável durante a pesquisa da subunidade da vacina.
[013] Na patente U.S. 5,885,768, Reyes et al., primeiramente relatou que 4 macacos cinomolgos foram injetados i.m. com a proteína recombinante trpE-C2 expressa em E. coli compreendendo o C-terminal da ORF2 da cepa Burma de HEV 2/3 (aa225~660), onde dita proteína é formulada com um adjuvante alume, através da administração em 0, 30 dias com mg/dose. Outros dois macacos foram usados como controles
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10/93 apenas com o adjuvante. Quatro resultado positivo relacionado sangue coletado foi encontrado terceiro período de imunização semanas mais tarde, nenhum ao anticorpo produzido no por Westhern Blotting. Um foi feito em dois macacos dentre eles através da administração de 80 mg da proteína recombinante insolúvel sem adjuvante. Quatro semanas mais tarde, todos os macacos foram positivos (WB). Então, os seis macacos foram agrupados dentro do primeiro e do segundo grupos, cada grupo incluindo três macacos, dois deles foram também imunizados durante três períodos ou dois períodos de inoculação, e um foi controle. O primeiro grupo foi atacado com Burma de HEV, e o segundo grupo HEV Mexicana. Os resultados foram: (1) ALT manteve-se normal o tempo todo no grupo imunizado, mas aumentou de 6~10 vezes mais do que antes da imunização no controle; (2) nas amostras da biopsia de fígado foram detectadas através do método de fluorescência imunológica. O antígeno pode ser encontrado em todos os outros macacos exceto naqueles imunizados com três doses e atacados pela cepa Burma. (3) a excreção do vírus nas fezes pode ser encontrada sequencialmente em todos os outros macacos exceto naqueles imunizados com três doses e infectados pela cepa Burma. Esta amostra de pesquisa é pequena, mas implica em que a proteína recombinante de ORF2 pode bloquear a ocorrência de índices bioquímicos do vírus da hepatite E proteger completamente da infecção quando os macacos forem atacados pelo HEV selvagem.
[014] Tsarev et al. (1994, Proc. Nat. Acad. Sci., USA,
91:10198-10202; Tsarev et al., 1993, J. Infect. Dis.,
168:369-378; Tsarev et al., 1997, Vaccine 15:1834-1838) usou baculovírus em insetos (célula SF) para expressar a ORF2 de
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HEV e precisar as partículas de proteínas com vários tamanhos de 20 nm~30nm em solução na célula. A porcentagem de partículas menores é substancialmente aumentada durante a anáfase das células infectadas. O método WB foi usado para detectar o baculovirus expressando ORF2 com muitas bandas específicas de diferentes tamanhos como: 25kD, 29kD, 35kD,
40~45kD, 55~70kD, 72kD. A troca de íons e o método de varredura molecular foram usados para purificar a proteína HEV específica. Um dia após o vírus recombinante infectar as células, toda a ORF2 do peptídeo de 72 kD apareceu primeiramente e então desapareceu gradualmente. No segundo dia, os peptídeos de 63 kD e 55kD apareceram. No primeiro dia, o peptídeo de 53kD apareceu na solução celular em grande quantidade e culminou no terceiro dia. Isto implica que a proteína de 72kD primária foi aleatoriamente cortada dentro da proteína HEV com 55 kD (na solução de lise celular) e/ou 53kD (solução celular). O sequenciamento daquelas duas proteínas mostrou 55 kD localizado na ORF2 a.a.112~607, mas
53kD localizado no
a.a.112~578 e
63kD no a.a.112~660.
Os resultados do ELISA mostraram que a atividade de 55 kD foi aparentemente mais forte do que 53kD.
Se o fragmento
a.a.112~660 foi expresso no baculovírus em inseto, uma proteína HEV recombinante de
63kD e 55kD pode também ser encontrada.
[015]
As células SF9 foram colhidas no sétimo dia após as células terem sido infectadas. A proteína foi primeiramente purificada e absorvida com adjuvante alume. Então os macacos cinomolgos foram imunizados i.m. com 50 mg da proteína por dose. Quatro receberam 1 dose, os outros quadro duas doses (0d, 28d). Após o final das doses, todos os macacos foram
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12/93 atacados com doses 100~10000CID50 i.v. da mesma cepa HEV (SAR-55, de um paciente do Paquistão). Dentro de 15 semanas, a amostras de fígado, soro e fezes foram colhidas todas as semanas. Antes do ataque do vírus, os títulos de anticorpos dos macacos que receberam uma dose foram 1:100~1:10000, mas no grupo de duas doses elas foram todas 1:10000 (revestido com 55kD purificado). No grupo de uma dose, um macaco morreu devido ao acidente com a anestesia 9 semanas após o ataque com o vírus (ainda calculado no resultado). No grupo que recebeu duas doses, dois macacos morreram logo após o ataque do vírus (não calculado no resultado) devido à razão desconhecida.
Em seis macacos após imunização não apresentaram elevação do nível de
ALT ou uma mudança patológica na amostra de fígado, não viremia.
Entre os quatro macacos do grupo de uma dose, três tiveram excreção viral, mas dois macacos no grupo que recebeu duas doses não apresentaram excreção viral.
[016] A purificação adicional foi feita na proteína com 55kD expressa no sistema baculovirus através da troca de íon e dos métodos de peneiramento molecular para fazer sua purificação atingindo acima de 99%. Após absorver com o adjuvante alume, a proteína com dose de 50 mg, 10 mg, 2 mg,
0.4 mg, 0 mg (controle) foi cada uma injetada dentro de 4 macacos rhesus administrados em 0 e 28 dias. Quatro semanas após a última dose, os macacos foram atacados com o mesmo vírus (SAR-55). Dezesseis macacos no grupo imunizado se apresentaram todos normais, e apenas um macaco com uma dose de 2 mg e o outro com uma dose de 0.4 mg apresentou uma mudança patológica muito sutil. Contudo, o imunizado pode prevenir a hepatite, mas não a infecção. Todos os dezesseis
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13/93 macacos imunizados apresentaram excreção viral, também viremia exceto um macaco com uma dose de 50mg e o outro com uma dose de 10 mg. E a quantidade do vírus foi limitada em muitos macacos, mas a duração não foi diminuída. Outros quatro macacos foram imunizados com 2 x 50 mg, e atacados com 100, 000 MID50 e o outro HEV 4 semanas após a dose final. Os resultados foram similares. Todos os quatro macacos não demonstraram elevação de ALT e alteração patológica, mas apenas um macaco não mostrou excreção viral e viremia. A quantidade do vírus diminuiu aparentemente, mas a duração não foi reduzida. De acordo com a opinião do autor, o efeito da proteção completa nestes macacos foi pior do que o tempo previsto. É possível atribuir este fato à quantidade do vírus usada no ataque. A quantidade do vírus neste experimento atingiu 300,000, mas foi de 1000~10000MID50 no último período. Em um outro experimento, o título dos anticorpos entre os grupos de 0.4 mg a 50 mg não demonstrou diferença antes do ataque.
[017] Os assistentes da companhia Genelabs expressaram a ORF2 aa112-660 usando o mesmo baculovírus em insetos que necessita de uma grande quantidade da proteína recombinante de 62kD solúvel. Após a purificação, os macacos cinomolgos foram imunizados e protegidos contra o ataque do vírus (cepa Mexicana) com dose 1000CID50 (três macacos imunizados com 20 mg não adoeceram). A excreção do vírus não foi encontrada em dois dos macacos e a quantidade da excreção do vírus diminuiu em um macaco. (Zhang et al., 1997, Clin. Diagn. Lab. Immunol.; 4:423-8).
[018] McAtee et al., (1996, Protein Expr. Purif., 8:262270) preparou a ORF2 de Burma de 62kD, o dímero expresso no
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14/93 baculvírus recombinante. O dímero foi dissociado dentro de dois peptídeos separadamente com 56.5kD e 58.1kD através de HPLC-MS. A análise da impressão da massa de peptídeo mostrou que o N-terminal detes dois peptídeos foi a mesma do aa112, e o C-terminal é separadamente aa637 e aa652. E a proteína de 56.5kD foi um imunogênico muito bom.
[019] O grupo Anderson na Austrália (Anderson et al., 1999, J. Virol. Methods, 81:131-142; Li et al., 1994, J. Clin. Microbio), 32:2060-2066; Li et al., 1997, J. Med. Virol., 52:289-300; Li et al., 2000, J. Med. Virol., 60:379386) usou a ORF2 aa394-660 (ORF2.1) expressa em E. coli. O produto é uma conquimérica GST ou uma proteína poli arginina que pode formar um epítopo convalescente altamente conformacional. Este epítopo pode detectar uma faixa muito alta do soro convalescente, mas irá desaparecer quando o fragmento for estendido ou truncado para a N-terminal. O soro na 30 a semana após os ratos terem sido imunizados com a proteína ORF2.1 recombinante foi usado para bloquear o soro dos pacientes convalescentes com VLP expressa em baculovírus com o antígeno revestido. A faixa de bloqueio irá atingir 81%~86%. O anticorpo monoclonal foi preparado com a ORF2.1 da proteína e dois anticorpos monoclonais 2E2 e 4B2 que podem identificar a ORF2.1 dos epítopo conformacionais, e cinco possíveis anticorpos monoclonais identificáveis foram obtidos. A faixa de bloqueio pode atingir 60% se 2E2 ou 4B2 for usada para bloquear o soro convalescente com VLPs como antígeno. Isto significa que aqueles dois anticorpos monoclonais podem identificar os epítopos que são os maiores componentes do anticorpo identificando epítopos no soro convalescente. Dados diferentes mostraram que a ORF2.1 tem
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15/93 estrutura epítopo maior do que os similares para VLP. O anticorpo para os epítopos pode existir para um longo período em soro infectado por HEV. É provavelmente um importante epítopo protetor, mas um experimento de proteção animal aproximadamente ORF2.1 não foi relatado até agora.
Sumário da invenção [020] Em um aspecto da presente invenção, é provido um polipeptídio compreendendo a sequência de aminoácido da região de abertura de leitura (ORF) do vírus da hepatite E (como apresentado na SEQ.ID.NO:1) ou seus fragmentos, que está na forma de um polipeptídio n-polimérico, onde n é um inteiro de 1-180, dito polipeptídio compreendendo o aminoácido como apresentado na SEQ.ID.NO:1 da ORF2 do vírus da hepatite E ou seus fragmentos selecionados do grupo consistindo de:
1) um polipeptídio tendo um terminal amino inicial entre os resíduos de aminoácidos 113 e 469, e o terminal carboxila final entre os resíduos de aminoácidos 596 e 660;
2) um polipeptídio tendo um terminal amino inicial entre os resíduos de aminoácidos 370 e 469, e o terminal carboxila final entre os resíduos de aminoácidos 601 e 628;
3) um polipeptídio tendo um terminal amino inicial entre os resíduos de aminoácidos 390 e 459, e o terminal carboxila final entre os resíduos de aminoácidos 601 e 610;
4) um polipeptídio tendo a sequência de aminoácidos dos resíduos de aminoácidos de 414 a 660 da SEQ.ID.NO:1, ou seja, o polipeptídio 247;
5) um polipeptídio tendo a sequência de aminoácidos dos resíduos de aminoácidos de 429 a 660 da SEQ.ID.NO:1, ou seja, o polipeptídio 232;
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6) um polipeptídio tendo a resíduos de aminoácidos de 439 o polipeptídio 222;
7) um polipeptídio tendo a resíduos de aminoácidos de 459 o polipeptídio 201;
8) um polipeptídio tendo a resíduos de aminoácidos de 394 o polipeptídio 235N;
9) um polipeptídio tendo a resíduos de aminoácidos de 394 o polipeptídio 225N;
10) um polipeptídio tendo a resíduos de aminoácidos de 394 o polipeptídio 209N;
11) um polipeptídio tendo a resíduos de aminoácidos de 394 o polipeptídio 208N;
12) um polipeptídio tendo a resíduos de aminoácidos de 394 o polipeptídio NE2I;
13) um polipeptídio tendo a resíduos de aminoácidos de 390 o polipeptídio 217D;
14) um polipeptídio tendo a resíduos de aminoácidos de 374 o polipeptídio 205;
15) um polipeptídio tendo a resíduos de aminoácidos de 414 o polipeptídio 189;
sequência de aminoácidos dos a 660 da SEQ.ID.NO:1, ou seja, sequência de aminoácidos dos a 660 da SEQ.ID.NO:1, ou seja, sequência de aminoácidos dos a 628 da SEQ.ID.NO:1, ou seja, sequência de aminoácidos dos a 618 da SEQ.ID.NO:1, ou seja, sequência de aminoácidos dos a 602 da SEQ.ID.NO:1, ou seja, sequência de aminoácidos dos a 601 da SEQ.ID.NO:1, ou seja, sequência de aminoácidos dos a 606 da SEQ.ID.NO:1, ou seja, sequência de aminoácidos dos a 603 da SEQ.ID.NO:1, ou seja, sequência de aminoácidos dos a 618 da SEQ.ID.NO:1, ou seja, sequência de aminoácidos dos a 602 da SEQ.ID.NO:1, ou seja,
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16) um | polipeptídio tendo a | sequência | de | aminoácidos | dos |
resíduos | de aminoácidos de 414 | a 601 da SEQ. | ID.NO:1, ou seja, | ||
o polipeptídio 188; | |||||
17) um | polipeptídio tendo a | sequência | de | aminoácidos | dos |
resíduos | de aminoácidos de 459 | a 628 da SEQ. | ID.NO:1; e | ||
18) um | polipeptídio tendo a | sequência | de | aminoácidos | dos |
resíduos | de aminoácido de X | a 603 da | SEQ | .ID.NO:1 com | Met |
adicionada a N-terminal e a uma C-terminal modificada, onde a referida C-terminal modificada refere-se a adição, na direção de 5'-3', da sequência de aminoácido -Pro-Pro-Arg no resíduo de aminoácido 603, Pro, em sua extremidade 3'-; incluindo:
a) quando | X | é o | resíduo | de | aminoácido | 394, | dito |
polipeptídio | é | como apresentado na SEQ.ID.NO:2, ou | seja, | NE2; | |||
b) quando | X | é o | resíduo | de | aminoácido | 414, | dito |
polipeptídio | é | como | apresentado | na | SEQ.ID.NO:3, | ou | seja, |
193C; | |||||||
c) quando | X | é o | resíduo | de | aminoácido | 429, | dito |
polipeptídio | é | como | apresentado | na | SEQ.ID.NO:4, | ou | seja, |
178C; | |||||||
d) quando | X | é o | resíduo | de | aminoácido | 439, | dito |
polipeptídio | é | como | apresentado | na | SEQ.ID.NO:7, | ou | seja, |
168C; | |||||||
e) quando | X | é o | resíduo | de | aminoácido | 449, | dito |
polipeptídio | é | como | apresentado | na | SEQ.ID.NO:8, | ou | seja, |
158C; | |||||||
f) quando | X | é o | resíduo | de | aminoácido | 459, | dito |
polipeptídio | é | como | apresentado | na | SEQ.ID.NO:9, | ou | seja, |
148C; | |||||||
g) quando | X | é o | resíduo | de | aminoácido | 469, | dito |
polipeptídio | é | como | apresentado | na | SEQ.ID.NO:10, | ou | seja, |
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138C;
[021] Um outro aspecto da presente invenção, provê adicionalmente um polipeptídio tendo pelo menos 80% de homologia com qualquer um dos polipeptídios como apresentado nos itens (1 -18) acima e tendo propriedade biológica substancialmente idêntica, tais como antigenicidade ou imunogenicidade, etc..
[022] Em um outro aspecto da presente invenção, é provido adicionalmente um vetor de expressão recombinante compreendendo a sequência de nucleotídeo codificando os polipeptídios acima mencionados da presente invenção. Em um outro aspecto da presente invenção, é previsto adicionalmente, uma célula hospedeira transformada com qualquer um dos vetores de expressão recombinantes acima que são capazes de expressar o(s) polipeptídio(s) da presente invenção.
[023] Em um outro aspecto da presente invenção, é provido adicionalmente, uma composição de vacina para profilaxia e/ou tratamento da infecção por vírus da hepatite E em mamíferos, que compreende pelo menos um dos polipeptídios da presente invenção ou qualquer combinação do mesmo, e opcionalmente, veículos farmacêuticos apropriados e/ou adjuvante.
[024] Em um outro aspecto da presente invenção, é provido adicionalmente uma proteína quimérica compreendendo um polipeptídio da presente invenção e um fragmento conservado do antígeno hemaglutina do vírus influenza.
[025] Em um outro aspecto da presente invenção, é provido adicionalmente, uma composição de vacina para profilaxia e/ou tratamento da infecção do vírus da hepatite E em mamíferos, que compreende a proteína quimérica consistindo de um dos
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19/93 polipeptídios da presente invenção e um fragmento conservado do antígeno da hemaglutina do vírus influenza, e opcionalmente, veículos farmacêuticos aceitáveis e/ou adjuvante.
[026] Em um outro aspecto da presente invenção é provido adicionalmente o uso das composições de vacina acima mencionada para vacinação de mamíferos para prevenir a infecção por vírus da hepatite E.
[027] Em um outro aspecto da presente invenção, é provido adicionalmente um método para profilaxia e/ou tratamento da infecção por vírus da hepatite E em mamíferos, que compreende a administração ao indivíduo com uma quantidade efetiva para profilaxia e/ou tratamento de pelo menos um dos polipeptídio(s) ou proteína(s) acima mencionados, consistindo de pelo menos um polipeptídio acima mencionado e um fragmento conservado do antígeno da hemaglutina do vírus influenza.
[028] Em um outro aspecto da presente invenção, é provido adicionalmente um kit de diagnóstico para a diagnose da infecção por vírus da hepatite E em amostra biológica, o qual compreende uma quantidade efetiva para diagnose de pelo menos um dos polipeptídios da presente invenção ou qualquer combinação dos mesmos.
[029] Em um outro aspecto da presente invenção, é provido um kit de diagnóstico para a diagnose da infecção por vírus da hepatite E em amostra biológica, que compreende uma quantidade efetiva para diagnose de pelo menos um dos polipeptídios da presente invenção ou qualquer combinação do mesmo, e compreende adicionalmente o polipeptídio contendo epítopo imunogênico da ORF3 do vírus da hepatite E ou um fragmento imunogênico do mesmo, onde dito polipeptídio
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20/93 contendo epítopo imunogênico da ORF3 do vírus da hepatite E ou um fragmento imunogênico dos mesmos é, opcionalmente, covalentemente ligado ao dito polipeptídio.
[030] Em um outro aspecto da presente invenção, é provido adicionalmente um método para diagnose da infecção por vírus da hepatite E em amostras biológicas, compreendendo contatar o kit de diagnóstico acima mencionado com a amostra a ser detectada sob condições apropriadas para a interação do antígeno e do anticorpo.
[031] Em um outro aspecto da presente invenção, é provido adicionalmente um método para detectar os anticorpos totais contra o vírus da hepatite E, um método para detecção do anticorpo IgG contra o vírus da hepatite E, e um método para detectar o anticorpo IgM contra o vírus da hepatite E em amostras biológicas.
Breve descrição dos desenhos [032] A figura 1 apresenta um diagrama esquemático da construção do plasmídeo pTO-T7-ORF2-201 para expressão do polipeptídio 201;
[033] A figura 2 mostra os resultados da análise em um gel de poliacrilamida sulfato de sódio dodecila 12% (SDSPAGE) (corante R250 azul brilhante de Coomassie) com relação ao lisado da cultura da indução da E.coli transformada com o vetor de expressão pTO-T7-ORF2-201 (com etapas de: centrifugação do meio de cultura, colheita do precipitado celular, então re-suspensão dos grânulos com tampão carregado incluindo 0.1% SDS, tratamento adicional em água fervente por 10 minutos, então centrifugado sob 12,000 rpm por 10 minutos, colhendo o sobrenadante para determinação). As colunas 1 e 2 contêm, respectivamente, dois lisados diferentes da cultura
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21/93 de bactéria. Os produtos expressos foram absorvidos em aproximadamente 35% da proteína total como analisado pelo sistema de imagem em gel Uvi (UVItec, ltd., modelo DBT-08);
[034] A figura 3 mostra os resultados da análise do corante R250 azul brilante de Coomassie em gel de poliacrilamida sulfato de sódio dodecila 12% (SDS-PAGE) relacionado à solução de uréia 2M e 4M do corpo de inclusão do polipeptídio 201 purificado a partir dos quatro grupos de polipeptídios 201, onde ditas amostras são obtidas do vetor de expressão configurado na E. coli recombinante pTO-T7-ORF2201. Os resultados mostram que alguns dos peptídeos 201 passaram por renaturação em 1 X PBS (20 X PBS (1L) :Na2HPO412H2O, 73.344g; KH2PO4, 4g; NaCl, 163.632 g; KCl, 4.024g; pH 7.45). Como mostrado na figura 4, porcentagem do dímero é 299%.
[035] A figura 4 mostra os resultados da análise por Westhern blotting do polipeptídio 201 com o soro do paciente infectado com HEV. As colunas 1-3 são o controle SDS-PAGE, onde, a coluna 1 refere-se ao marcador do peso molecular da proteína; a coluna 2, refere-se a mostra renaturada do polipeptídio 201 em 1 X PBS; a coluna 3, refere-se ao polipeptídio 201 restaurado tratado em banho de água fervente por 10 minutos; as colunas 4 e 5, referem-se aos respectivos resultados de Westhern blotting correspondentes às amostras das colunas 2 e 3.
[036] A figura 5 mostra os resultados da análise do semidiâmetro da dinâmica hidratada por um instrumento de dispersão do polipeptídio 201 acima mencionado, onde o polipeptídio 201 é purificado vantajosamente por filtragem HPLC em gel, e centrifugado durante 10 minutos sob 20000g,
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22/93 filtrado com um filtro de membrana de 0.1 gm.
[037] A figura 6 mostra os resultados do Westhern blot da reação dos polipeptídios 208N, 209N e 225N com camundongo Mab
1F6, 2C9 e 3F5. As correspondem à amostra colunas 1, 2, 3, respectivamente, renaturada sendo tratada em banho de água fervente por 10 minutos, a mostra renaturada e as amostras renaturadas precipitadas do polipeptídio 208N;
colunas 4,
6, respectivamente, correspondem a amostra renaturada sendo tratada em banho de água fervente por 20 minutos, a amostra renaturada as amostras renaturadas precipitadas do polipeptídio
209N;
Colunas 7, 8, 9, respectivamente, correspondente a amostra renaturada sendo tratada em banho de água fervente por 10 minutos; a amostra renaturada e as amostras renaturadas precipitadas do polipeptídio 225N; e a coluna 10 é o monômero do polipeptídio 201 como controle.
[038] A figura 7 ilustra o perfil dos anticorpos de HEV destacado no soro dos camundongos subsequente a imunização com a vacina do polipeptídio 201 (contendo o adjuvante de Feund) em várias dosagens. A coordenada horizontal é definida como os dias após a primeira imunização. A coordenada vertical é definida como a OD450nm/620nm medida por ELISA.
[039] A figura 8 ilustra o perfil dos anticorpos de HEV destacado no soro dos camundongos subsequente a imunização com a vacina do polipeptídio 201 (não contendo o adjuvante) em várias dosagens. A coordenada vertical é definida como a
OD450nm/620nm medida por ELISA.
[040] A figura 9 ilustra o perfil dos anticorpos de HEV destacado no soro dos camundongos subsequente a imunização com a vacina do polipeptídio 201 (não contendo hidróxido de
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23/93 alumínio como adjuvante) em várias dosagens. A coordenada horizontal é definida como o dia após a primeira imunização. A coordenada vertical é definida como a OD450nm/620nm medida por ELISA.
[041] As figuras 10A, 10B, 10C e 10D mostram o perfil dos anticorpos de HEV destacados no soro de macacos Rhesus agrupados como No.1, No.2, No.3 e No.13, respectivamente. Todos estes animais foram submetidos a contaminação com HEV através de injeção intravenosa. A coordenada horizontal é definida como os dias após a primeira imunização. A coordenada vertical é definida como o valor de OD450nm/620nm do ELISA. Os resultados ilustram que o anti-NE2I-IgG é mais presente nos dias 5-10 do que o GENLABS-IgG, e anti-HEV-IgG WANTAI no soro dos macacos em grupo No.1, No.2, e No.3; o anti-NE2I-IgG se detectou no soro dos macacos e do grupo de No.13, e não no anti-HEV-IgG Genelabs e no anti-HEV-IgG WANTAI detectado no soro dos macacos do grupo de No.13.
[042] A menos que de outro modo indicado, todos os termos ou nomenclaturas aqui são os mesmos que aqueles convencionalmente usados na técnica. A produção convencional da cultura de célula, genética molecular, química do ácido nucléico, e procedimento imunológico são realizados como técnica de rotina na arte. Na presente invenção, a menos que de outro modo indicado, estes termos aqui usados têm os significados a seguir:
[043] Vírus da hepatite E ou HEV refere-se ao vírus, tipo de vírus ou classe de vírus, que: i) causa a liquefação, na hepatite infecciosa; ii) distinção do vírus da hepatite A (HAV), vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C (HCV), ou vírus da hepatite D (HDV) em termos de características
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24/93 sorológicas; iii) contendo uma região genômica que é homológo a um cDNA de 1.33 kb inserido no pTZKF1(ET1.1), dito plasmídeo é configurado em uma cepa E. coli depositada na American type Culture Collection (ATCC)” com número de acesso 67717.
O polipeptídio da presente invenção [044] Em um aspecto, a presente invenção provê surpreendentemente uma série de fragmentos de polipeptídio de HEV com reatividade dos anticorpos satisfatório e/ou imunogenicidade, onde dito fragmento está incluído na sequência de aminoácido da ORF2 de HEV, como apresentado na
SEQ.ID.NO:1. A denominação do fragmento individual pode ser encontrada na tabela 1 do exemplo 6.
[045] Na presente invenção, o número de resíduos de aminoácidos por posição na sequência de aminoácido está de acordo com a forma de numeração da International Union of Pure and applied chemistry and International Union of Biochemistry”, a liga da comissão de Nomenclatura Bioquímica,
Nomenclature and symbolism for Amino Acids and Peptides”, Pure Appl. Chem., 56, 595-624(1984). Especificamente, o sítio de início da codificação Met na SEQ.ID.NO:1 é designado como a posição 1, aumentando na direção de 5' para 3'.
[046] Em um outro aspecto da presente invenção, é provido um polipeptídio, que compreende a sequência de aminoácido como representado na SEQ.ID.NO:1 da ORF2 do vírus da hepatite E ou seus fragmentos na forma de polipeptídio n-polimérico, onde n é um inteiro de 1-180. Quando n é 2, o referido polipeptídio é um polipeptídio dimérico; quando n é 3, dito polipeptídio é um polipeptídio trimérico; quando n é 4, dito polipeptídio é um polipeptídio tetramérico, e assim por
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25/93 diante .
[047] Na presente invenção, o terminal amino (extremidade
5') do referido fragmento do polipeptídio compreendendo a sequência de aminoácido como representado na SEQ.ID.NO:1 inicial entre os resíduos de aminoácidos 113 e 469, preferivelmente, entre os resíduos de aminoácidos 370 e 469, mais preferivelmente, entre os resíduos 390 e 459; e o terminal carboxila (extremidade 3') da dita extremidade do polipeptídio entre os resíduos de aminoácido 596 e 660, preferivelmente, entre os resíduos de aminoácidos 601 e 628, mais preferivelmente, entre o resíduo de aminoácido 601 e 610. Especificamente, os polipeptídios preferidos da presente
invenção são: | polipeptídio | 247, | polipeptídio | 232, | |
polipeptídio | 222, | polipeptídio | 201, | polipeptídio | 235N, |
polipeptídio | 225N | , polipeptídio | 209N, | polipeptídio | 208N, |
polipeptídio | NE21 | , polipeptídio | 217D, | polipeptídio | 205, |
polipeptídio 189, polipeptídio 188, e o polipeptídio tendo a sequência de aminoácido do resíduo de aminoácido 459 a 628 da SEQ.ID.NO:1.
[048] Na presente invenção, é descrito adicionalmente o polipeptídio tendo uma sequência de aminoácido dos resíduos de aminoácidos X a 603 da SEQ.ID.NO:1 com Met adicionado a Nterminal e a um C-terminal modificado, onde dito C-terminal modificado refere-se a adição, na direção de 5'-3', da sequência de aminoácido -Pro-Pro-Arg no resíduo de aminoácido
603; e | Pro, em | sua extremidade | 3'; incluindo: a | NE2; | b) | |
193c; c) | 178C; d) | 168C; | e) 158C; | f) 148C; g) 138C. | ||
[049] | Em um | outro | aspecto | da presente invenção, | é | |
descrito | adicionalmente | um polipeptídio tendo pelo | menos | 80% |
de homologia com qualquer um dos polipeptídios precedentes e
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26/93 tendo propriedade biológica substancialmente idêntica, tal como antigenicidade ou imunogenicidade, ou seja, os derivados do polipeptídio da presente invenção. Especificamente, o polipeptídio é considerado como derivado do polipeptídio da presente invenção sob a condição de que o aminoácido do dito polipeptídio compreende a sequência do aminoácido do polipeptídio acima mencionado com outros aminoácidos além dos da sequência natural adjacente ao referido polipeptídio na extremidade N-terminal e/ou C-terminal dos mesmos, mas ainda substantivamente remanescente a propriedade biológica similar, tal como, antigenicidade e/ou imunogenicidade etc., do polipeptídio da presente invenção. Consequentemente, o fragmento de DNA correspondente ao mesmo é chamado de DNA derivado da presente invenção. Por exemplo, para o propósito de expressão e/ou purificação, a purificação seria facilitada através da adição do aminoácido inicial (Metionina) ou outro peptídeo de direção e/ou peptídeo sinal na N-terminal do mesmo, ou por muitas adições de Histidinas na C-terminal do mesmo.
[050] A presente invenção contempla adicionalmente o polipeptídio tendo propriedade biológica idêntica, tal como antigenicidade e/ou imunogenicidade, etc. para qualquer um dos polipeptídios acima mencionados; ou polipeptídio tendo pelo menos 80% de identidade da sequência com qualquer um dos polipeptídios acima mencionados. O termo porcentagem de identidade predentede abranger uma porcentagem de nucleotídeos ou de resíduos de aminoácidos que são idênticos entre as duas sequências a serem comparadas, obtida após o melhor alinhamento, esta porcentagem sendo puramente estatística e as diferenças entre as duas sequências sendo
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27/93 distribuídos aleatoriamente e sobre sua extensão inteira. A comparação das sequências entre os dois nucleotídeos ou sequências de aminoácidos é convencionalmente realizada por comparação destas sequências após terem se alinhado otimamente, dita comparação sendo realizada por segmento ou por janela de comparação de modo a identificar e comparar as regiões locais da similaridade da sequência. O alinhamento ótimo das sequências para comparação pode ser produzido, também manualmente, por meio de homologia local algorítmica de Smith e Waterman (1981) Ad. App. Math., 2:482, por meio de homologia local algorítmica da Neddleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol., 48:443, por meios de método de pesquisa de similaridade de Pearson e Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 2444, por meio de programas de computadores que usam estes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N e TFASTA em Pacotes de Software da Genetics Wisconsin, Genetics Computer Group, 57 Science Drive, Madison, WI).
[051] A porcentagem de identidade entre dois ácidos nucléicos ou sequências de aminoácidos é determinada por comparação destas duas sequências alinhadas da melhor forma, onde o ácido nucléico ou a sequência de aminoácido a ser comparado podem compreender adições ou deleções comparadas à sequência referência através de um ótimo alinhamento entre estas duas sequências. A porcentagem de identidade é calculada por determinação do número de posições idênticas onde o nucleotídeo ou o resíduo de aminoácido é idêntico entre as duas sequências, dividindo este número de posições comparadas e multiplicando o resultado obtido por 100 de modo a obter a porcentagem de identidade entre estas duas
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28/93 sequências .
[052] Por exemplo, o programa BLAST sequências BLAST 2 pode ser usado, o qual pode ser obtido do site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b!2.html, também pode ser usado, mas o parâmetro apresenta falhas (particularmente quanto, a capacidade minima de abertura é 5, a capacidade minima de extensão é 2; a matriz é provida por programas tais como Blosum 62), a porcentagem de identidade entre as duas sequências a serem alinhadsa é diretamente calculada pelo programa.
Preparação do polipeptídio da presente invenção [053] O polipeptídio da presente invenção pode ser preparado por métodos conhecidos na técnica, tal como, métodos sintéticos químicos e tecnologia de DNA recombinante. Preferivelmente, o método de preparação para o polipeptídio da presente invenção pode ser através da expressão do DNA recombinante. Os métodos para preparação da proteína recombinante são bem conhecidos da técnica, os quais não são descritos em detalhes aqui; em adição, a referência podería ser feita aos métodos nos exemplos. Quanto às células úteis para produção da proteína recombinante, dever ser feita menção a célula bacteriana (P.O. Olins and S.C. Lee, 1993, Curr. Opi. Biotechnology, 4:520-525), célula animal, especialmente a cultura de célula de mamíferos (C.P. Edwards and A. Aruffo, 1993, Curr. Opi. Biotechnology, 4:558-563), e célula de inseto. Com relação ao método para célula de inseto, referência deve ser feita a, por exemplo, baculovírus (V.A. Luckow, 1993, Curr. Opi. Biotechnology, 4:564-572). Neste sentido, a presente invenção provê adicionalmente um vetor de expressão recombinante, o qual compreende uma
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29/93 sequência de nucleotídeo codificando o polipeptídio acima mencionado. A presente invenção provê adicionalmente uma célula hospedeira transformada com o vetor de expressão recombinante acima mencionado, o qual está apto para expressar os referidos polipeptídios codificados pela sequência nucleotídeo contida nos mesmos.
de
[054] Em | uma configuração da presente | invenção, E. | coli é | |
usada para | expressar individualmente | o polipeptídio da | ||
presente invenção | como a seguir: | polipeptídio | 247, | |
polipeptídio | 232, | polipeptídio 222, | polipeptídio | 201, |
polipeptídio | 235N, | polipeptídio 225N, | polipeptídio | 209N, |
polipeptídio | 208N, | polipeptídio NE2I, | polipeptídio | 217D, |
polipeptídio | 205, | polipeptídio 189, polipeptídio 188, (e | ||
polipeptídio | a) NE2 | ; b)193C. |
[055] referido
A razão entre o monômero e o dímero do polipeptídio, a formação do polipeptídio polimérico e o raio individual dos mesmos são determinados (ver, exemplo 6 para detalhes). Como o resultado mostra, o produto expresso está inclinado a redobra. A capacidade para auto-formação de polímeros estáveis na solução após fazer redobra o polipeptídio da presente invenção particularmente apropriado para ser usado como vacina, para a profilaxia e/ou tratamento da HEV. Em uma configuração da presente invenção, o polímero incluindo dímero, trímero, e tetrâmero foi detectado em um teste. Limitado pela metodologia até o presente, há a possibilidade de que o trímero deduzido é de fato composto pela mistura do dímero e tetrâmero em uma proporção adequada. É também contemplado que o polipeptídio da presente invenção é capaz de formar também o maior polipeptídio devido a um melhoramento na metodologia. Deduzido a partir das
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30/93 referências publicadas (Jameel, et al., 1996, J. Virology, 70:207-216; Li, et al., 1999, Virology 265:35-45), existe uma alta possibilidade de que o HEV natural é composto de 90 subpartículas, onde cada sub-partícula é o dímero da ORF2 do polipeptídio. Portanto, é razoável contemplar que o polipeptídio da presente invenção é capaz de formar um polímero de até 180 polipeptídios -mericos, ou ainda grandes polímeros, com o desenvolvimento do entendimento da estrutura do vírus.
[056] Em uma outra configuração preferida da presente invenção, embora o polipeptídio 201 é expresso por E. coli na forma de corpos de inclusão com alto rendimento, a presente invenção encontrou surpreendentemente que dito corpo de inclusão é capaz de se auto-renaturar espontaneamente no tampão PBS em um pH de 7.45, o qual impede os problemas com tempo-custo e o desgaste normal envolvidos no processo de denaturação/renaturação que reduz substancialmente a proporção de cobertura, incluindo a etapa de adição do hidrocloreto de guanidina e então se submeter às múltiplas etapas de diálise. Em adição, uma vez que, outras proteínas não desejadas do corpo de inclusão, expressas simultaneamente por E. coli são incapazes de se auto-renaturar espontaneamente, a proteína de interesse da presente invenção pode ser substancialmente purificada, simplesmente por centrifugação e recuperação do sobrenadante.
[057] A proteína quimérica consistindo do polipeptídio da presente invenção e o fragmento conservado do antígeno hemaglutina do vírus influenza.
[058] Em um outro aspecto da presente invenção, é também provida a proteína quimérica consistindo de qualquer um dos
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31/93 polipeptídios acima mencionado e do fragmento conservado do antígeno hemaglutina do vírus influenza. O antígeno hemaglutina (doravante denominado como HA) é uma das duas superfícies dos antígenos do vírus influenza, e é o mais importante antígeno usado na detecção específica para o anticorpo contra o vírus influenza no soro do indivíduo. É conhecido que o anticorpo identificado através da vacinação animal com HA pode prevenir efetivamente o receptor da reinfecção do vírus influenza. Portanto, é razoável acreditar que o anticorpo contra HA está presente em muitos da população. De acordo com o relatório prévio (McEwen J. et al., Vaccine, 1992; 10 (6):405-11), epítopo 91-108 aa é a sequência de aminoácido conservada no gene HA entre todas as cepas H3 do vírus influenza tipo A. Em uma configuração preferida da presente invenção, primeiramente, a expressão quimérica em um sistema de expressão procarionte, especialmente em E. coli é estabelecido pela flexibilidade de ligação do gene HA (91-108aa) ao fragmento do polipeptídio do gene ORF2 de HEV da presente invenção que é altamente imunogênico, tal como Gly-Gly-Ser construído por engenharia genética. Assim, o impulso com o anticorpo HA destacou-se previamente pela infecção do vírus influenza, de modo a produzir um alto título de proteção do anticorpo anti-HEV. Deste modo, uma vacina HEV é obtida de forma a ser a melhor a vacina contendo o fragmento ORF2 do polipeptídio da presente invenção sozinho.
[059] Na luz dos ensinamentos da presente invenção, os epítopos úteis para a composição de vacina da presente invenção podem ser selecionados de outro fragmento conservado no gene HA por um técnico no assunto. Como um ligante
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32/93 flexível específico de ligação a epítopo específico do HA e do polipeptídio da presente invenção, pode consistir em um fragmento do peptídeo apropriado ou análogo do mesmo, provido de modo a facilitar a ligação entre o polipeptídio da presente invenção e o fragmento selecionado de HA e de modo que não afete substancialmente o uso do polipeptídio da presente invenção para profilaxia/tratamento da infecção por HEV em mamíferos. Deve ser entendido que, a seleção do ligante para ligação com o polipeptídio da presente invenção e o HA depende principalmente da propriedade específica do polipeptídio definido na presente invenção. Por exemplo, diferentes ligantes podem ser selecionados de acordo com o polipeptídio selecionado da presente invenção a ser ligado com HA. Preferivelmente, o fragmento conservado de HA usado na presente invenção é um fragmento do resíduo de aminoácido 91-108.
[060] O ligante para ligação do polipeptídio da presente invenção como imunógeno e o fragmento de HA selecionado pode ser sintetizado preferivelmente por técnicas de sínteses convencionais, tais como, a técnica de síntese química. Adicionalmente, qualquer peptídeo pode ser sintetizado por um técnico no assunto de acordo com o método químico padrão, tais como método t-BOC através de um sintetizador automático de peptídeo (ver, por exemplo, L.A. Carpino, J. Am. Chem. Soc., 79:4427, 1957), o peptídeo pode ser também produzido por hidrólise química da proteína ou outros métodos conhecidos.
[061] Alternativamente, a proteína quimérica, do polipeptídio da presente invenção, com HA pode ser produzida por uma célula hospedeira transformada com a sequência de
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33/93 ácido nucléico de uma molécula de DNA onde a referida molécula de DNA compreende uma sequência codificando o fragmento de HA e o polipeptídio da presente invenção que é obtido por clonagem em um microorganismo hospedeiro ou célula através de métodos de engenharia genética convencionais, tais como a técnica do DNA recombinante. Quando é produzido através da técnica recombinante em uma célula transformada, a proteína quimérica resultante pode ser purificada e recuperada através de métodos de rotina do meio de cultura, célula hospedeira ou em ambos. Dita proteína quimérica produzida por método de recombinação é isolada de forma que o peptídeo resultante pode ser substancialmente separado da substância celular ou meio de cultura durante a produção recombinante por técnicas de DNA recombinante. Adicionalmente, a sequência codificante para o peptídeo resultante pode também ser preparada através de síntese, ou através do uso do RNA viral de acordo com métodos conhecidos ou do plasmídeo disponível contendo o cDNA do mesmo.
[062] Para uso no método da presente invenção, a proteína quimérica acima-mencionada pode ser designada para contructos geralmente conhecidos ou outros constructos de modo a aumentar a produção dos mesmos ou facilitar a purificação do mesmo. O sistema apropriado e os vetores são conhecidos e estão disponíveis ao público ou comercialmente disponível para clonagem e expressão do peptídeo quimérico em vários microorganismos e células, incluindo, por exemplo, E. coli, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, mamíferos, leveduras, célula de inseto e célula de planta.
[063] A proteína quimérica produzida também através de recombinação ou síntese pode ser purificada pelo método de
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34/93 purificação de rotina. Um técnico no assunto pode facilmente determinar a pureza desejada para o polipeptídio de acordo com o uso de interesse.
Composição de Vacina [064] Em um outro aspecto da presente invenção, é provido adicionalmente uma composição de vacina para profilaxia e/ou tratamento da infecção por vírus da hepatite E em mamíferos, que compreende pelo menos um dos polipeptídios da presente invenção ou qualquer combinação dos mesmos, e opcionalmente, veículos farmaceuticamente aceitáveis e/ou adjuvante.
[065] Em ainda um outro aspecto da presente invenção, é provida adicionalmente uma composição de vacina para profilaxia e/ou tratamento da infecção por vírus da hepatite E em mamíferos, o qual compreende a proteína quimérica contendo um polipeptídio da presente invenção e um fragmento conservado do antígeno hemaglutina do vírus influenza, e opcionalmente, veículos farmaceuticamente apropriados e/ou veículos.
[066] Em ainda um outro aspecto da presente invenção, é provido o uso das composições de vacina para vacinação de mamíferos para prevenir a infecção por vírus da hepatite E.
[067] Na presente invenção, os mamíferos a serem inoculados ou tratados incluindo, mas não se limitando aos seres humanos e outros primatas, tais como babuíno, macacos, gorilas, etc.; animais econômicos, tais como, bovinos, caprinos, suínos, coelhos, murino, bem como, animais de estimação, tais como, felinos, caninos, etc.. Dita composição de vacina contendo uma quantidade efetiva para tratamento e/ou profilaxia de pelo menos um dos polipeptídios da presente invenção, onde dita quantidade efetiva é uma
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35/93 quantidade que é suficiente para efetivamente tratar o indivíduo infectado por HEV ou prevenir o indivíduo da infecção por HEV após administração durante um determinado período.
[068] A composição de vacina da presente invenção pode ser usada também sozinha ou como parte de uma formulação para medicamente ou profilaxia, o qual contém opcionalmente veículos farmaceuticamente aceitáveis, incluindo agentes controladores de liberação.
Ditos veículos podem adicionalmente incluir vetores farmaceuticamente aceitáveis ou diluentes apropriados para serem administrados para tratamento e/ou profilaxia da infecção por HEV. Vetores farmaceuticamente aceitáveis apropriados referem-se àqueles biologicamente inertes e/ou não-tóxicos. Vários vetores conhecidos da técnica podem ser selecionados de acordo com o uso desejado. Tipicamente, dito vetor pode ser selecionado de, mas não se limita ao grupo consistindo de: salina estéril, lactose, sacarose, ortofosfato de cálcio, gelatina, dextrina, ágar, alume, óxido de alumínio, hidróxido de alumínio, óleo de amendoim, óleo de oliva, óleo de gergelim, e água. Adicionalmente, vetor ou diluentes podem conter adicionalmente substâncias de liberação controlada, tais como mono-estearato de glicerila/di-estearato de glicerila, também sozinho ou em combinação com parafina. Adicionalmente, podem também ser usadas formulações de polímeros de liberação controlada convencional, incluindo cristal solúvel.
[069] Ainda adicionalmente, quando desejado, a composição de vacina da presente invenção compreendendo pelo menos um polipeptídio da presente invenção ou qualquer combinação do mesmo pode compreender adicionalmente outros agentes de
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36/93 tratamento e/ou profilaxia. Por exemplo, dita composição pode compreender um coquetel mistura de vários agentes, o qual é útil no tratamento ou profilaxia para infecção por HEV. Dita mistura coquetel pode incluir adicionalmente outros agentes, tais como intérferon, nucleotídeos análogos e/ou N-acetilcisteína.
[070] Opcionalmente, a composição de vacina da presente invenção compreendendo pelo menos um polipeptídio da presente invenção pode compreender adicionalmente modificadores do sistema imune, tais como, adjuvantes ou citosinas úteis para indução adicional de anticorpos e resposta da célula T no indivíduo. Dito modificador inclui convencionalmente adjuvantes baseados em alume, dipeptídeos muramila, preservativos, estabilizantes químicos ou outra proteína antigênica. Geralmente, estabilizantes, adjuvantes ou conservantes e do gênero são otimizadas para determinar a melhor formulação para eficácia na aplicação desejada. Os conservantes apropriados podem incluir clorobutinol, sorbato de potássio, ácido sórbico, dióxido de enxofre, galato de propila, parabenos, glicerina, e fenol.
Método para profilaxia e/ou tratamento da infecção por HEV em mamíferos usando a composição de vacina da presente invenção.
[071] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um método para profilaxia e/ou tratamento da infecção por vírus da hepatite E em mamíferos, o qual compreende a administração a um indivíduo de uma quantidade efetiva do polipeptídio(s) da presente invenção para profilaxia e/ou tratamento ou proteína(s) quimérica(s) consistindo de pelo menos um dos polipeptídios da presente invenção e o fragmento conservado
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37/93 da hemaglutina do vírus influenza. Particularmente, dito método compreende a etapa de administração do indivíduo com a composição de vacina da presente invenção. Preferivelmente, o fragmento conservado selecionado pelo presente invenção é um fragmento de aminoácido dos resíduos de aminoácidos de 91108.
[072] Quantidades apropriadas destas composições podem ser determinadas baseadas no nível de resposta desejada. Geralmente, as composições compreendendo o polipeptídio da presente invenção pode conter entre aproximadamente 5 mg e aproximadamente 200 mg das partículas. Ditas composições podem ser administradas em uma ou uma série de inoculações, por exemplo, três inoculações em intervalos de dois a seis meses. Dosagens adequadas podem ser também determinadas através do julgamento do tratamento físico, levando em consideração fatores tais como o estado de saúde do paciente, peso ou idade, bem como a dosagem convencional de um imunógeno componente, quando administrado como uma monoterapia. Uma melhora na condição do paciente ou na probabilidade de aumento de exposição ao referido patógeno, uma dose de manutenção de uma composição compreendendo o polipeptídio da presente invenção pode ser administrada, se necessária. Subsequentemente, a dosagem ou a frequência de administração, ou ambas, pode ser reduzida ao nível em que o efeito desejado é mantido. Neste ponto, o tratamento deve ser interrompido. Indivíduos podem, entretanto, requerer tratamento intermitente por um longo período, baseado na recorrência de uma determinada condição não desejada.
[073] As composições compreendendo o polipeptídio da presente invenção podem ser administradas através de qualquer
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38/93 rota apropriada, tal como, por exemplo, administração parenteral, particularmente, intramuscular ou subcutânea, bem como administração oral. Outras rotas podem também ser usadas, tais como, pulmonar, nasal, aural, anal, dérmica, ocular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, mucosa, sublingual, subcutânea e intracranial.
[074]
A preparação da composição de vacina da presente invenção pode ser realizada para formular composições injetáveis ou também vacinas em soluções líquidas ou suspensões
As formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da injeção podem também ser preparadas
As preparações também podem, em determinadas configurações, lipossomo, ou controlada e/ou ser emulsificantes ou encapsuladas no em garrafas solúveis, para distribuição distribuição prolongada. Alternativamente, as preparações podem ser na forma de aerossol ou de spray. Elas podem também ser incluídas como em adesivos transdérmicos. O ingrediente ativo pode ser misturado com qualquer número de excipientes que sejam farmaceuticamente apropriados e compatíveis com o ingrediente ativo ou ingredientes. O excipiente inclui, por exemplo, adjuvante incompleto de Freund, lipopolissacarídeo bacteriano, trocador de íon, óxido de alumínio, estearato de alumínio, dipeptídeo de muramila, lecitina, substância tampão, substâncias baseada em celulose e polietileno glicol.
Kit de diagnóstico e método para detectar anticorpos IgG, IgM ou anticorpos totais contra HEV em amostra biológica.
[075] O polipeptídio da presente invenção pode ser usado para detecção da presença de anticorpos IgG, IgM ou anticorpos totais contra HEV em amostra biológica, o qual é
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39/93 caracterizado pela alta sensibilidade e alta especificidade, comparado ao kit de detecção inicial ou o método de detecção. Portanto, a presente invenção provê um método para determinar a presença da infecção HEV em uma amostra biológica, que compreende a etapa de contatar a amostra a ser detectada com a quantidade efetiva de detecção do polipeptídio da presente invenção sob uma condição que é adequada para interação anticorpo/antígeno.
[076] A amostra biológica a ser detectada na presente invenção deriva do, mas não se limita aos, seres humanos e outros primatas, tais como, babuíno, babuíno, macacos, gorilas, etc.; animais econômicos, tais como, bovinos, caprinos, suínos, coelhos, murino, bem como, animais de estimação, tais como, felinos, caninos, etc..
[077] Em um outro aspecto da presente invenção, é provido um kit de diagnóstico para determinação do anticorpo IgG contra o vírus da hepatite E em amostra biológica, o qual compreende pelo menos um dos polipeptídios da presente invenção, se desejado, dito polipeptídio é pré-revestido na superfície de um suporte apropriado; e compreende adicionalmente anticorpos marcadores detectáveis anti-IgG comercialmente disponíveis ou produzidos rotineiramente, os quais são dirigidos contra a IgG da amostra biológica a ser detectada, e o agente de detecção correspondente ao dito marcador detectável; e se desejado, compreende adicionalmente um sistema tampão adequado.
[078] Em uma outra configuração da presente invenção, dita amostra biológica a ser detectada é dirigida a seres humanos, onde o anticorpo é o anticorpo IgG anti-humano. Mais especificamente, o kit de diagnóstico para anticorpo IgG da
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40/93 presente invenção inclui adicionalmente um polipeptídio tendo o epítopo imunogênico na ORF3 do HEV ou um fragmento imunogênico do mesmo, onde o referido epítopo imunogênico na ORF3 do HEV ou um fragmento imunogênico do mesmo é opcionalmente covalentemente ligado ao polipeptídio da presente invenção.
[079] Para a situação em que o referido epítopo imunogênico na ORF3 do HEV ou um fragmento imunogênico do mesmo é opcionalmente covalentemente ligado ao polipeptídio da presente invenção, o polipeptídio quimérico é preferivelmente produzido através do método de recombinação genética. O método químico pode também ser usado para ligar covalentemente dito epítopo imunogênico na ORF3 do HEV ou em um fragmento do mesmo para o polipeptídio acima-mencionado.
[080] Em um outro aspecto da presente invenção, é provido um kit de diagnóstico para determinação do anticorpo IgM contra o vírus da hepatite E na amostra biológica, o qual compreende anticorpo anti-IgM marcador detectável, comercialmente disponível ou produzido rotineiramente, como anticorpo de captura, o qual está direcionado contra a IgM da amostra biológica a ser detectada, se desejado, dito anticorpo de captura é pré-revestido na superfície de um suporte adequado; e compreende adicionalmente, marcadores detectáveis em pelo menos um dos polipeptídios da presente invenção, e o agente de detecção correspondente ao dito marcador detectável; se desejado, compreende adicionalmente, um sistema de tampão adequado.
[081] Em uma configuração da presente invenção, dita amostra biológica a ser detectada é derivado do ser humano, onde o anticorpo é o anticorpo IgM anti-humano. Mais
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41/93 especificamente, o kit de diagnóstico para o anticorpo IgM da presente invenção inclui adicionalmente um polipeptídio tendo o epítopo imunogênico na ORF3 do HEV ou um fragmento imunogênico do mesmo, onde dito epítopo imunogênico na ORF3 do HEV ou um fragmento imunogênico do mesmo é opcionalmente covalentemente ligada ao polipeptídio da presente invenção. [082] Para a situação em que dito epítopo imunogênico na
ORF3 do HEV ou um fragmento imunogênico do mesmo é opcionalmente covalentemente ligado ao polipeptídio da presente invenção, o polipeptídio quimérico é preferivelmente produzido pelo método de recombinação genética. O método químico pode também ser usado para ligar covalentemente dito epítopo imunogênico na ORF3 do HEV ou em um fragmento do mesmo para o polipeptídio acima-mencionado.
[083] Em um outro aspecto da presente invenção, é provido um kit de diagnóstico para determinação do anticorpo IgM contra o vírus da hepatite E na amostra biológica, o qual compreende anticorpo anti-IgM marcador detectável, comercialmente disponível ou produzido rotineiramente, como o anticorpo de captura que está direcionado contra a IgM da amostra biológica a ser detectada, se desejado, dito anticorpo de captura é pré-revestido na superfície de um suporte adequado; e compreende adicionalmente, marcadores detectáveis em pelo menos um dos polipeptídios da presente invenção, e o agente de detecção correspondente ao dito marcador detectável; se desejado, compreende adicionalmente, um sistema de tampão adequado.
[084] Em uma configuração da presente invenção, dita amostra biológica a ser detectado é derivado do ser humano, onde o anticorpo é o anticorpo IgM anti-humano. Mais
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42/93 especificamente, o kit de diagnóstico para o anticorpo IgM da presente invenção inclui adicionalmente um polipeptídio tendo o epítopo imunogênico na ORF3 do HEV ou um fragmento imunogênico do mesmo, onde dito epítopo imunogênico na ORF3 do HEV ou um fragmento imunogênico do mesmo é opcionalmente covalentemente ligada ao polipeptídio da presente invenção. [085] Para a situação em que o epítopo imunogênico na
ORF3 do HEV ou um fragmento imunogênico do mesmo é opcionalmente covalentemente ligado ao polipeptídio da presente invenção, o polipeptídio quimérico é preferivelmente produzido pelo método de recombinação genética. O método químico pode ser também usado para ligar covalentemente dito epítopo imunogênico na ORF3 de HEV ou um fragmento imunogênico do mesmo ao polipeptídio acima mencionado.
[086] Em ainda um outro aspecto da presente invenção, é também provido um kit de diagnóstico para determinação dos anticorpos totais contra o vírus da hepatite E na amostra biológica, o qual compreende pelo menos um dos polipeptídios da presente invenção, se desejado, dito polipeptídio é prérevestido na superfície de um suporte adequado; e compreende adicionalmente marcadores detectáveis em pelo menos um dos polipeptídios de acordo com a reivindicação 1, e o agente de detecção correspondente ao dito marcador detectável; onde dito polipeptídio selecionado dos polipeptídios de acordo com a reivindicação 1 para pré-revestir a superfície de um suporte e o polipeptídio marcador detectável selecionado dos polipeptídios de acordo com a reivindicação 1 poderia ser o mesmo polipeptídio, ou um diferente.
[087] Mais especificamente, o kit de diagnóstico para os anticorpos totais da presente invenção inclui adicionalmente
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43/93 um polipeptídio tendo um epítopo imunogênico na ORF3 do HEV ou um fragmento imunogênico do mesmo, onde dito epítopo na ORF3 do HEV ou um fragmento imunogênico do mesmo é opcionalmente covalentemente ligado ao polipeptídio da presente invenção.
[088] Para a situação em que dito epítopo imunogênico na ORF3 do HEV ou um fragmento imunogênico do mesmo é opcionalmente covalentemente ligado ao polipeptídio da presente invenção, o polipeptídio quimérico é preferivelmente produzido pelo método de recombinação genética. O método quimérico pode também ser usado para ligar covalentemente dito epítopo imunogênico na ORF3 do HEV ou um fragmento imunogênico do mesmo para o polipeptídio acima-mencionado.
[089] É bem conhecido da técnica que no kit de diagnóstico acima-mencionado, a IgG anti-humana ou a IgM anti-humana as quais podem ser produzidas por vários métodos comercialmente disponíveis ou rotineiramente produzidas têm a vantagem de poder serem usadas em vários animais. Alternativamente, a anti-IgG ou a anti-IgM de animais específicos dos quais a amostra biológica a ser detectada é derivada são usadas as quais podem ser produzidas por ter a vantagem de se relacionar com o animal. Para o propósito de preparação do anticorpo, os animais selecionados incluem, mas não se limitam a: cabras, carneiros, ratos, camundongos, coelhos, porquinho-da-índia, suínos, etc.. Dito marcador detectável para detecção pode ser usado sozinho ou em combinação com outra composição ou composto para prover um sinal detectável para visualizar a presença da substância de interesse na amostra. Dito marcador detectável pode ser aqueles materiais conhecidos e de fácil disponibilidade na
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44/93 técnica do campo de detecção, incluindo, mas não se limitando a marcadores enzimáticos, marcadores fluorescentes, marcadores radioativos, etc.. Assim, a presente invenção não está limitada a seleção específica de marcadores de detecção, e contemplam todos aqueles incluídos nos métodos de detecção conhecidos da técnica. Para o propósito de conveniência, dito agente de detecção pode ser provido na forma de um kit.
[090] Opcionalmente, o referido kit inclui adicionalmente placas de micro-titulação pré-revestidas com o polipeptídio da presente invenção, vários diluentes formulados adequadamente e/ou tampão, sustância marcadora ou outros agentes produtores de sinais para detecção da ligação específica do complexo antígeno/anticorpo, tal como, substrato enzimático, co-fator e cromoforo. Outros componentes podem ser aqui facilmente selecionados por um técnico no assunto.
[091] Adicionalmente, é provido um método para detecção do anticorpo IgG contra o vírus da hepatite E nas amostras biológicas, o qual compreende a etapa de: imobilizar pelo menos um dos polipeptídios da presente invenção na superfície de um suporte; então lavar com um tampão adequado; contatá-lo com a amostra a ser detectada sob as condições adequadas para a interação do antígeno e anticorpo; lavar novamente com um tampão adequado; e então incubar com o anticorpo anti-IgG marcador detectável, comercialmente disponível ou rotineiramente produzido, com um período de tempo suficiente para interação antígeno/anticorpo, onde a referida anti-IgG é usada no animal a partir do qual a amostra biológica a ser detectada foi obtida; após esta etapa, detectar o complexo antígeno/anticorpo na superfície de um suporte através do uso
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45/93 de um agente detector correspondente ao dito marcador detectável, calculando a quantidade de anticorpo IgG na amostra.
[092] Em uma configuração da presente invenção, a referida amostra biológica a ser detectada é derivada de um ser humano, e o referido anticorpo usado é a IgG anti-humana. [093] Em uma outra configuração da presente invenção, o polipeptídio NE2I usado como antígeno é pré-revestido na superfície de um suporte predeterminado. Em uma outra configuração da presente invenção, o polipeptídio
247 emparelhado com o epítopo na ORF3 do HEV é usado como antígeno a ser pré-revestido na superfície específica do suporte.
[094]
Em um outro aspecto da presente invenção, é provido um método para detectar o anticorpo IgM contra o vírus da hepatite E nas amostras biológicas, que compreende a etapa de: imobilizar o anticorpo anti-IgM na superfície de um suporte comercialmente disponível ou rotineiramente produzido, onde dito anticorpo anti-IgM é usado no animal a partir do qual a amostra biológica a ser detectada foi obtida; lavar adequadamente; contatá-lo com a amostra a ser detectada, preferivelmente soro, sob as condições apropriadas para a interação do antígeno e anticorpo; lavar novamente com um tampão adequado; e então incubar com o marcador adequado em pelo menos um dos polipeptídios da presente invenção durante um período suficiente para a interação entre o antígeno e o anticorpo, após o que, detectar o complexo antígeno/anticorpo na superfície de um suporte através do uso do agente detector correspondente ao referido marcador detectável, calcular a quantidade de anticorpo IgM na
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46/93 amostra.
[095] Em uma configuração da presente invenção, dita amostra biológica a ser detectada é derivada de um ser humano, dito anticorpo usado é a IgM anti-humana.
[096] Em uma configuração da presente invenção, dito anticorpo IgM na amostra é detectado através do polipeptídio 225N emparelhado com a peroxidase do rábano silvestre. Em ainda uma outra configuração da presente invenção, o polipeptídio 247 emparelhado com o epítopo da ORF3 de HEV é emparelhado adicionalmente com a peroxidase do rábano silvestre para detectar a IgM contida na amostra.
[097] Adicionalmente, é também provido um método para detectar os anticorpos totais contra o vírus da hepatite E nas amostras biológicas, o qual compreende a etapa de: imobilizar pelo menos um dos polipeptídios da presente invenção na superfície de um suporte; lavar com um tampão adequado; contatá-lo com a amostra biológica a ser detectada sob as condições adequadas para a interação do antígeno e do anticorpo;
opcionalmente, lavar novamente com um tampão adequado;
incubar com o marcador detectável em um dos presentes polipeptídios em um tempo suficiente para a interação entre o antígeno o anticorpo; e detectar o complexo antígeno/anticorpo na superfície de um suporte através do uso do antígeno do vírus da hepatite E com um marcador detectável e um agente detector correspondente, calcular a quantidade dos anticorpos totais na amostra.
[098]
Em uma configuração da presente invenção, NE2I é pré-revestida na superfície do suporte, e os anticorpos totais na amostra são detectados pelo polipeptídio 225 previamente emparelhado com a peroxidase do rábano silvestre.
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Em uma outra configuração da presente invenção, a NE2I emparelhada com o epítopo da ORF3 de HEV é pré-revestido na superfície do suporte, e os anticorpos totais na amostra são detectados pela peroxidase de ligação do polipeptídio 225 do rábano silvestre o qual é previamente emparelhado com o epítopo da ORF3 de HEV.
[099] A presente invenção é adicionalmente ilustrada em detalhes fazendo referência as descrições a seguir, feita nos desenhos e nos exemplos, as quais não devem, de forma alguma, ser interpretadas como limitação do escopo de proteção da presente invenção.
EXEMPLOS [100] A menos que especificamente indicado, métodos experimentais de biologia molecular e imunoensaios da presente invenção são todos aqueles basicamente descritos na Clonagem Molecular: a Laboratory Manual, 2nd Edition, Joseph Sambrook, David W. Russell, por Cold Spring Harbor Laboratory Press e Short Protocols in Molecular biology, 3 Edition, Joh Wiley & Sons, Inc., 1995. O uso das endonucleases de restrição segue os protocolos providos pelo fabricante.
Exemplo 1
Preparação dos genes codificantes dos polipeptídios da presente invenção e construção do vetor de expressão contendo os mesmos.
[101] Para preparar o gene de interesse, a reação em cadeia por polimerase (PCR) é usada com um gene HEV de extensão completa clonado de paciente infectado com HEV na província de Xin Jiang, China como molde (Aye, T.T., Uchida etc., Nucleic Acids Research, 20(13), 3512(1992); GeneBank número de acesso D11092), junto com dois primers, ORF2 FP:
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5'-atgcgccctcggcca-3' como primer superior e ORF2 RP: 5'aaataaactataactcccga-3' como primer inferior. A reação do PCR é conduzida em um ciclador termal PCR (BIOMETRA t3) sob a seguinte condição: 94°C, 5 minutos; então 25 ciclos a: 94°C, 50 segundos, 57°C, 50 segundos e 72°C, 2,5 minutos; finalizando por 72°C, 10 minutos. Um fragmento de DNA de aproximadamente 2 kb é obtido, o qual está na ORF2 do HEV usado como molde para a preparação do polipeptídio da presente invenção. O produto de PCR acima-mencionado é adicionalmente ligado dentro do vetor comercialmente disponível pMD18-T (TAKARA CO.) e então digerido com BamH I/Hind III, de modo a identificar o clone positivo inserido com o gene da ORF2. Usando M13(+)/(-) como primer, o resultante é sequenciado e desse modo identifica os dois fragmentos de DNA da ORF2 de HEV que é usada como molde para preparação do polipeptídio da presente invenção, um deles é uma sequência conservativa (Molde 1, SEQ.ID.NO.:5), a outra é uma sequência mutante (Molde 2, SEQ.ID.NO:6).
[102] Através do alinhamento de sequência e análise de ORF, é encontrado que a sequência de ORF2 de HEV (SEQ.ID.NO:6) usada como molde para preparar o polipeptídio da presente invenção tendo uma base A deletada, comparado à sequência conservativa (SEQ.ID.NO:5), resultou na troca de mutação dos resíduos de aminoácidos 604-605 da ORF2 alterados de His-Ser-Val para Pro-Pro-Arg, e a translação para dito polipeptídio é desse modo interrompida pelo código tag de parada formado pela dita mutação.
[103] Através dos exemplos, o polipeptídio 201 da presente invenção é usado doravante para ilustrar a preparação do nucleotídeo codificando o polipeptídio 201 e o
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49/93 vetor de expressão compreendendo o mesmo.
Preparação do polinucleotídeo codificando o polipeptídio 201 da presente invenção e o vetor de expressão contendo o mesmo.
[104] O gene é sintetizado usado a reação em cadeia de polimerase (PCR), onde a sequência acima obtida SEQ.ID.NO:5 é usado com molde, junto com os seguintes primers, 201FP:5'ggatcccatatggttattcaggattatgac-3' (ver, tabela 1), na qual os sítios BamHI, sítios NdeI (CAT ATG), e ATG como códon inicial de translação no sistema E. coli são introduzidos; e 201 RP: 5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3' (ver tabela 1) como primer reverso, na qual o códon de parada e o sítio EcoRI são introduzidos. O PCR é realizado no ciclador térmico como a seguir: aquecido para denaturação por 5 minutos a 94°C, então amplificado durante 30 ciclos: 50 segundos a 94°c, 40 segundos a 57°C e 40 segundos a 72°C, para finalizar, 10 minutos a 72°C. O produto de PCR resultante ~ 600 bp é identificado como a sequência de nucleotídeo codificante do polipeptídio 201 da presente invenção.
[105] A construção do vetor de expressão pTO-17 para expressão do polipeptídio da presente invenção segue o método em referência no documento de LUO Wen-Xin, et al., Chinese Journal of Biotechnology, 2000, 16:53-57. O referido método inclui as etapas de: clonar o produto de PCR acima-mencionado dentro do vetor pMD18-T disponível comercialmente (companhia TAKARA), e digerido com BamHI/HindIII para identificar e obter o subclone positivo inserido com o nucleotídeo codificando o polipeptídio 201; digerir adicionalmente o referido subclone positivo com NdeI e EcoRI para obter a sequência de nucleotídeo compreendendo o gene do polipeptídio 201, e então clonado dentro de pTO-T7 digerido com NdI/EcoRI.
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O clone positivo pTO-T7-ORF2-201 que incorpora a sequência codificante do polipeptídio 201 é identificado pela digestão com Ndel/EcoRI. A estratégia para construção do vetor de expressão para o polipeptídio da ORF 201 está ilustrada na figura 1.
[106] Similarmente, outros polipeptídios da presente invenção dos quais o terminal carboxila é outro que a ProPro-Arg podem ser adquiridos de acordo com o método acima através do uso da sequência SEQ.ID.NO:6 como molde, e usando os primers listados na tabela, que são especificamente designados contra os polipeptídios individuais de interesse. O nucleotídeo codificando os polipeptídios da presente invenção nos quais o terminal carboxila é Pro-Pro-Arg é expresso pela transformação de E. coli ERR 2566 com o vetor de expressão obtido de acordo com o método acima mencionado para o vetor de expressão da ORF2-201. Especificamente, tomando a sequência mutante da ORF2 de HEV acima mencionada SEQ.ID.NO:6 como molde, usando os primers anteriores/primers reversos individuais, especificamente designados contra o polipeptídio individual da presente invenção (ver, tabela 1), o vetor de expressão correspondente é obtido por PCR sob condições similares para produção do vetor de expressão do polipeptídio 201. Deste modo, uma série de polipeptídio da presente invenção com boa imunogenicidade e imunoreatividade é obtido, onde o polipeptídio resultante têm Met adicionado em sua N-terminal, e têm a sequência de aminoácido -Pro-ProArg adicionada na direção de 5'-3' na extremidade 3' do aminoácido 603, Pro, em seu terminal carboxila.
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Tabela 1: Amplificação por PCR do molde para a preparação do nucleotídeo codificando o polipeptídio da presente invenção e dos correspondentes primers anterior/reverso.
Polipeptídeo | Posição da ORF2 de HEV | No molde de número | Primer anterior (FP e primer reverso (RP) |
HEFP:5'-ggatccatatgcagctgttctactctcgtc-3' | |||
NE2 | 394-603ppr* | 2 | HERP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3' |
217FP:5'-ggatcccatatgtcggctggtggccag-3' | |||
217C | 390-603ppr | 2 | HERP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3' |
E220F:5'-ggatcccatatgacatctgtagagaatgctca-3' | |||
193C | 414-603ppr | 2 | HERP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3' |
E235F:5'-ggatcccatatgcatgacatcgacctcg-3' | |||
178C | 429-603ppr | 2 | HERP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3' |
E46F:5'-ggatcccatatggttattcaggattatgac-3' | |||
168C | 439-603ppr | 2 | HERP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3' |
E56F:5'-ggatcccatatgcaggaccgaccgac-3' | |||
158C | 449-603ppr | 2 | HERP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3' |
E66F:5'-ggatcccatatgtcgcgcccttttt-3' | |||
148C | 459-603ppr | 2 | HERP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3' |
138CF:5'-ggatcccatatggacgtgctttggctttctc-3' | |||
138C | 469-603ppr | 2 | HERP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3' |
HEFP:5'-ggatccatatgcagctgttctactctcgtc-3' | |||
NE2D | 394-603 | 2 | E2RD:5'-gaattcttagggggctaaaacagc-3' |
217FP:5'-ggatcccatatgtcggctggtggccag-3' | |||
217D | 390-603 | 2 | E2RD:5'-gaattcttagggggctaaaacagc-3' |
E220F:5'-ggatcccatatgacatctgtagagaatgctca-3' | |||
193D | 414-603 | 2 | E2RD:5'-gaattcttagggggctaaaacagc-3' |
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E235F:5'-ggatcccatatgcatgacatcgacctcg-3' | |||
178D | 429-603 | 2 | E2RD:5'-gaattcttagggggctaaaacagc-3' |
HEFP:5'-ggatccatatgcagctgttctactctcgtc-3' | |||
NE2I | 394-606 | 2 | E2RI:5'-gaattcttatgcggaatggggggctaaaacag-3' |
217FP:5'-ggatcccatatgtcggctggtggccag-3' | |||
217I | 390-606 | 2 | E2RI:5'-gaattcttatgcggaatggggggctaaaacag-3' |
E220F:5'-ggatcccatatgacatctgtagagaatgctca-3' | |||
193I | 414-606 | 2 | E2RI:5'-gaattcttatgcggaatggggggctaaaacag-3' |
E235F:5'-ggatcccatatgcatgacatcgacctcg-3' | |||
178I | 429-606 | 2 | E2RI:5'-gaattcttatgcggaatggggggctaaaacag-3' |
HEFP:5'-ggatccatatgcagctgttctactctcgtc-3' | |||
2 6 6N | 394-660 | 1 | HERP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3' |
HEFP:5'-ggatccatatgcagctgttctactctcgtc-3' | |||
235N | 394-628 | 2 | 235NR:5'-gaattcttacgggcagaagtcatcg-3' |
HEFP:5'-ggatccatatgcagctgttctactctcgtc-3' | |||
225N | 394-618 | 2 | 225RP:5'-gaattcttaggcagggtagtccatgg-3' |
HEFP:5'-ggatccatatgcagctgttctactctcgtc-3' | |||
2 0 9N | 394-602 | 2 | 209RP:5'-gaattcttaggctaaaacagcaacc-3' |
HEFP:5'-ggatccatatgcagctgttctactctcgtc-3' | |||
208N | 394-601 | 2 | 208RP:5'-ggattcttataaaacagcaaccgc-3' |
HEFP:5'-ggatccatatgcagctgttctactctcgtc-3' | |||
207N | 394-600 | 2 | 207RP:5'-gaattcttaaacagcaaccgcg-3' |
HEFP:5'-ggatccatatgcagctgttctactctcgtc-3' | |||
203N | 394-596 | 2 | E203R:5'-gaattcttaggaaatagagacgggac-3' |
HEFP:5'-ggatccatatgcagctgttctactctcgtc-3' | |||
193N | 394-586 | 2 | E220R:5'-ctcgagttaagtggtgtaagtggaaatag-3' |
HEFP:5'-ggatccatatgcagctgttctactctcgtc-3' | |||
176N | 394-569 | 2 | E237R:5'-ctcgagttacagttggtcactagcagt-3' |
227FP:5'-ggatcccatatgctaggcggtctaccca-3' |
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280 | 380-660 | 1 | HERP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3' |
217FP:5'-ggatcccatatgtcggctggtggccag-3' | |||
270 | 390-660 | 1 | HEFP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3' |
207FP:5'-ggatcccatatgcccgtcgtctcagc-3' | |||
260 | 400-660 | 1 | HERP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3' |
E220F:5'-ggatcccatatgacatctgtagagaatgctca-3' | |||
247 | 414-660 | 1 | HERP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3' |
E235F:5'-ggatcccatatgcatgacatcgacctcg-3' | |||
232 | 429-660 | 1 | HERP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3' |
E46F:5'-ggatcccatatggttattcaggattatgac-3' | |||
222 | 439-660 | 1 | HERP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3' |
E220F:5'-ggatcccatatgacatctgtagagaatgctca-3' | |||
205 | 414-618 | 2 | 225RP:5'-gaattcttaggcagggtagtccatgg-3' |
E46F:5'-ggatcccatatggttattcaggattatgac-3' | |||
201 | 459-606 | 1 | HERP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3' |
138CF:5'-ggatcccatatggacgtgctttggctttctc-3' | |||
191 | 4 69-660 | 1 | HERP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3' |
E220F:5'-ggatcccatatgacatctgtagagaatgctca-3' | |||
189 | 414-602 | 2 | 209RP:5'-gaattcttaggctaaaacagcaacc-3' |
E220F:5'-ggatcccatatgacatctgtagagaatgctca-3' | |||
188 | 414-601 | 2 | 208RP:5'-gaattcttataaaacagcaaccgc-3' |
E220F:5'-ggatcccatatgacatctgtagagaatgctca-3' | |||
183 | 414-596 | 2 | E203R:5'-gaattcttaggaaatagagacgggac-3' |
E220F:5'-ggatcccatatgacatctgtagagaatgctca-3' | |||
173 | 414-586 | 2 | E220R:5'-ctcgagttaagtggtgtaagtggaaatag-3' |
E46F:5'-ggatcccatatggttattcaggattatgac-3' | |||
170 | 459-628 | 2 | 235NR:5'-gaattcttacgggcagaagtcatcg-3' |
138CF:5'-ggatcccatatggacgtgctttggctttctc-3' |
53/93
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54/93
C160 | 469-628 | 2 | 235NR:5'-gaattcttacgggcagaagtcatcg-3' |
E46F:5'-ggatcccatatggttattcaggattatgac-3' | |||
N160 | 459-618 | 2 | 225RP:5'-gaattcttaggcagggtagtccatgg-3' |
138CF:5'-ggatcccatatggacgtgctttggctttctc-3' | |||
150 | 469-618 | 2 | 225RP:5'-gaattcttaggcagggtagtccatgg-3' |
E46F:5'-ggatcccatatggttattcaggattatgac-3' | |||
144 | 459-602 | 2 | 209RP:5'-gaattcttaggctaaaacagcaacc-3' |
E46F:5'-ggatcccatatggttattcaggattatgac-3' | |||
142 | 459-600 | 2 | 207RP:5'-gaattcttaaacagcaaccgcg-3' |
138CF:5'-ggatcccatatggacgtgctttggctttctc-3' | |||
134 | 469-602 | 2 | 209RP:5'-gaattcttaggctaaaacagcaacc-3' |
*ppr representa um polipeptídio tendo a sequência de aminoácido -Pro-Pro-Arg adicionada na direção de 5'-3' terminando na posição 603 do aminoácido, Pro, no C-terminal.
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Exemplo 2: Expressão do polipeptídio 201 [107] 1 ml do plasmídeo pTO-T7-ORF2-201 (0.15 mg/mL) foi adicionado dentro de 40 mL de células competentes de E. coli
ERR2566 (produzido sob o método de cloreto de cálcio) para transformação. Então a mistura foi riscada sobre uma placa com kanamicina-LB, e a placa foi incubada a 37° por 10-12 horas até a presença de clones individuais. Os clones individuais foram escolhidos e adicionalmente inoculados em 4 mL de meio de cultura LB em tubos, agitados a 220rpm a 37°C por 10 horas, até o valor de OD550nm da cultura é de aproximadamente 1.5. Então, 1 mL do meio de cultura foi armazenado a 4°C para ser usado mais tarde, e 2 ml de 0.5 m IPTG foi adicionado dentro do 3 ml restantes do meio de cultura (conteúdo final é de 0.2 mM). O meio de cultura contendo IPTG foi mantido em incubação a 37°C por 4 horas com agitação de 220 rpm para indução da expressão do polipeptídio de interesse. 1.5mL do meio de cultura indutor foi centrifugado a 12000g por 30 segundos. As células precipitadas foram re-suspendidas em 100 mL do tampão carregado com a proteína (50 mM de Tris Cl, pH6.8, 100mM de DTT, 2% de SDS, 0.1% de Bromofenol Blue, 10% de Glicerol), e adicionalmente fervidos durante 10 minutos, então centrifugados a 12000g por 10 minutos. 10 ml do sobrenadante foi carregado com 12% de SDS-PAGE para análise da expressão do polipeptídio 201. O clone que expressa um alto rendimento foi usado para fermentação futura.
[108] 200ml do meio de cultura pesquisado foi adicionado dentro de 500 mL do meio de cultura LB contido em um frasco de Erlenmyer de 1L. Após incubação a 37°C com agitação de 190rpm por aproximadamente 11 horas até o valor de OD550nm da
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56/93 cultura pesquisada de 2.0, 300 μΐ de 0.5M IPTG foi adicionado ao conteúdo final que é de 0.3 mM. A mistura foi adicionalmente incubada por 4 horas sob as condições acima mencionadas. 1.5mL da cultura indutora foram centrifugadas a 12000g por 30 segundos. As células foram re-suspendidas em 100mL do tampão carregado com a proteína, e fervido por 10 minutos, então centrifugada a 12000g por 10 minutos. 10ml do sobrenadante foram carregados com 12% de SDS-PAGE para análise da expressão do polipeptídio 201. O resultado da análise do SDS-PAGE (corado com Coomassie Brilliant blue R250) mostrou que a expressão do polipeptídio 201 é de aproximadamente 35% do total das células expressando as proteínas como mostrou o aparelho de imagem em gel UVI (UVItech, modelo DBT-08).
Exemplo 3: Purificação do polipeptídio 201 nos corpos de
inclusão expressos | em E.coli. | ||||
[109] O | meio | de cultura | de E. | coli contendo | o |
polipeptídio | 201 | recombinante | obtido | no exemplo 2 | foi |
centrifugado | a 400 | rpm por 15 | minutos, | e cada 500 mL | do |
precipitado da cultura foi re-suspendido em 15mL de tampão de lise (50mM de Tris Cl, 10mM de EDTA e 300mM de NaCl em dH2O, pH7.2). As células foram sonicadas em um instrumento ultrasônico. (Uilbra-Cell VCX500, SONICS& MATERIALS Company, força 70%; ligado durante 40 segundos; 60 segundos desligado; sonicado por 20 minutos totalmente). A mistura sonicada foi centrifugada a 12000rpm por 10 minutos a 4°C, e a massa foi re-suspendida em uma solução tampão I (200mM de Tris de Cl, pH8.5; 5mM de EDTA; 100mM de NaCl) contendo 2% de TritonX100, e o volume final é o mesmo que o da lise original. A mistura foi agitada a 200rpm por 30 minutos a 37°C, então
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57/93 centrifugada a 10000rpm por 10 minutos a 4°C. A massa foi resuspendida em volume igual do tampão I, e a mistura foi sonicada (40 segundos ligado; 60 segundos desligado; força 70%; sonicado por 3 minutos totalmente). Após o que a mistura foi centrifugada (10000rpm) por 10 minutos a 4°C. A massa foi re-suspendida no tampão I contendo 2% de Triton-X100 para o volume final que é o mesmo que antes. Após a mistura ter sido agitada (200rpm) por 30 minutos a 37°C, foi centrifugada (10000rpm) por 10 minutos a 4°C. A massa foi re-suspendida em volume igual ao do tampão I, agitada (200rpm) por 30 minutos a 37°C. A mistura foi então centrifugada a 10000rpm por 10 minutos a 4°C. A massa foi re-suspendida em tampão I o qual contêm Uréia 2M em um volume final que é o mesmo que o da mistura original. Após agitação a 200rpm por 30 minutos a 72°C, a mistura foi centrifugada a 10000rpm por 10 minutos a 4°c. Este sobrenadante é marcado com 201-2M. A massa foi resuspendida em tampão I contendo Uréia 4M para o volume final que é o mesmo que o anterior. Após agitação (200rpm) por 1 hora a 37°C, a mistura foi armazenada a 4°C overnight, e foi então centrifugada a 12000rpm por 10 minutos a 4°C. Este sobrenadante foi marcado com 201-4M. A pureza de todas as amostras foi analisada por 12% de SDS-PAGE. Os resultados são mostrados na figura 3.
Exemplo 4: Renaturação do polipeptídio 201 recombinante.
[110] 100ml da amostra 201-4M preparada de acordo com o Exemplo 3 foi carregado dentro de 2 bolsas de diálise (36 DM, retentivo MW: 8000~10000, United Carbon Compound, U.S.A.) e dialisado sob agitação em uma caneca de 1L, com 900ml de 1 xPBS (20xPBS (lL) contendo 73.344g de Na2HPO4.12H20, 4g de KH2PO4, 163,632g de NaCl, 4.024g de KCl e pH 7.45) a 25°C
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58/93 overnight (10 horas), e então o precipitado branco foi observado nas bolsas de diálise. A restauração do dialisado e o retorno a diálise, e em seguida o dialisado foi restaurado a cada 3 horas por 4 vezes. Em princípio, o conteúdo da uréia na amostra seria 4x10-6M quando a diálise é superior. A amostra dialisada foi centrifugada a 25°C, 12000rpm por 10 minutos; o sobrenadante foi filtrado em uma membrana de filtro de 0.22pm para purificação adicional; a massa resuspendida em 4M uréia/tampão I pode ser usada em uma nova diálise durante a qual os precipitados também são parecidos, mas a concentração da amostra da proteína obtida seria menor do que a da primeira amostra obtida.
Exemplo 5: Purificação do polipeptídio 201 recombinante com gel de filtragem HPLC.
[111] A amostra renaturada 201 preparada de acordo com os métodos do Exemplo 4 foi adicionalmente purificada por HPLC como a seguir:
Instrumento: Beckman System Gold Nouveau 125NMP/160NMP HPLC; Coluna: TSK GEL SW3000 21.5mmx60 cm;
Eluição: 1 x PBS, pH 7.45;
Vazão do fluxo: 4ml/minuto;
Detecção: UV a 280 nm;
Amostra: 2 ml de 4M NE2(8mg/ml);
Exame: coletor de vértice automático do modelo de janela, Tempo de exame: 1 tubo/20 segundos;
Tempo de atraso: 6 segundos.
[112] O resultado mostra que a molécula filtrada é muito efetiva no cromatograma, mas que o vértice do componente contendo monômeros e dímeros bem como as proteínas são distribuídas igualmente entre elas. Depois de tratada em água
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59/93 fervente por 10 minutos, a amostra da proteína foi analisada por SDS-PAGE com 12% de acrilamida para a purificação do monômero do pico da proteína objeto, que está acima de 95%. Isto demonstra que em adição ao auto-agregado, o monômero ORF2-201 também agrega com outras pequenas proteínas e as interações ocorrem também entre os multímeros que foram eluídos juntos, durante o cromatograma.
Exemplo 6: Caracterização dos produtos do polipeptídio recombinante da invenção.
[113] O polipeptídio recombinante da invenção foi construído e expresso de acordo aos métodos dos Exemplos de 1-5. Além disso, cada peptídeo recombinante foi lavado e dialisado de acordo com os métodos dos Exemplos 3-4. Na tabela 2 a correspondente posição do aminoácido de cada peptídeo recombinante no vírus da hepatite E, a propriedade de renaturação dos produtos recombinantes expressos e as proporções dos monômeros e dímeros em seus SDS-PAGE bem como é provida a formação dos multímeros.
[114] Tabela 2. Posições correspondentes dos aminoácidos de cada peptídeo recombinante no vírus da hepatite E, a propriedade de renaturação dos produtos recombinantes expressos e as proporções dos monômeros e dímeros em seus SDS-PAGE bem como a formação dos multímeros.
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Nome do polipeptídeo | Sequência | % do Monomero | % do dímero | Multimerização | Renaturável por diálise |
NE2 | SEQ.ID.NO :2 | 10% | 90% | Sim | Sim |
193C | SEQ.ID.NO :3 | 5% | 95% | Sim | Sim |
178C | SEQ.ID.NO : 4 | 100% | 0% | Não | Sim |
168C | SEQ.ID.NO : 7 | 100% | 0% | Não | Sim |
158C | SEQ.ID.NO :8 | 60% | 40% | Não | Sim |
148C | SEQ.ID.NO : 9 | 100% | 0% | Não | Sim |
138C | SEQ.ID.NO : 10 | 100% | 0% | Não | Sim |
NE2I | SEQ.ID.NO :1 aa394~aa6 06 | 5% | 95% | Não | Sim |
217I | SEQ.ID.NO :1 aa390~aa6 06 | 85% | 15% | Não | Sim |
193I | SEQ.ID.NO :1 aa414~606 | 100% | 0% | Não | Sim |
178I | SEQ.ID.NO :1 aa429~aa6 06 | 60% | 40% | Não | Sim |
NE2D | SEQ.ID.NO :1 aa394~aa6 03 | 80% | 20% | Não | Sim |
217D | SEQ.ID.NO :1 aa390~aa6 03 | 20% | 80% | Não | Sim |
193D | SEQ.ID.NO :1 aa414~aa6 03 | 100% | 0% | Não | Sim |
178D | SEQ.ID.NO |
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: 1 aa429~aa6 03 | 100% | 0% | Não | Sim | |
235N | SEQ.ID.NO :1 aa394~aa6 28 | 10% | 90% | Não | Sim |
225N | SEQ.ID.NO :1 aa394~aa6 28 | 4% | 96% | Não | Sim |
2 0 9N | SEQ.ID.NO :1 aa394~aa6 02 | 25% | 75% | Não | Sim |
208N | SEQ.ID.NO :1 aa394~aa6 01 | 100% | 0% | Não | Sim |
207N | SEQ.ID.NO :1 aa394~aa6 00 | 100% | 0% | Não | Não |
203N | SEQ.ID.NO :1 aa394~aa5 96 | 100% | 0% | Não | Não |
193N | SEQ.ID.NO :1 aa394~aa5 86 | 100% | 0% | Não | Não |
17 6N | SEQ.ID.NO :1 aa394~aa5 69 | 100% | 0% | Não | Não |
247 | SEQ.ID.NO :1 aa414~aa6 60 | 10% | 90% | Não | Sim |
232 | SEQ.ID.NO :1 aa429~aa6 60 | 10% | 90% | Não | Sim |
222 | SEQ.ID.NO :1 aa439~aa6 | 10% | 90% | Não | Sim |
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62/93
60 | |||||
205 | SEQ.ID.NO :1 aa374~aa6 18 | 10% | 90% | Não | Sim |
201 | SEQ.ID.NO :1 aa459~aa6 60 | 1% | 99% | Não | Sim |
189 | SEQ.ID.NO :1 aa414~aa6 02 | 2% | 98% | Não | Sim |
188 | SEQ.ID.NO :1 aa414~aa6 01 | 4% | 94% | Não | Sim |
183 | SEQ.ID.NO :1 aa414~aa5 96 | 100% | 0% | Não | Não |
173 | SEQ.ID.NO :1 aa414~aa5 86 | 100% | 0% | Não | Não |
[115] Como mostrado na tabela 2, os polipeptídios da invenção os quais estão incluídos na sequência de aminoácido da SEQ.ID.NO:1 da ORF2 de HEV têm a capacidade de ser bem renaturado, o qual pretende apresentar uma estrutura dimensional próxima a proteína de HEV original, quando seus terminais carboxila se localizam entre o aa601 (Leu) e o aa660 da SEQ.ID.NO:1. Especificamente, os peptídeos 247, 232, 222, 201, 235N, 225N, 209N, NE2I, 217D, 205, 189, 188, NE2 (SEQ.ID.NO:2) e 193C (SEQ.ID.NO:3) foram encontrados como tendo expressão ligada na posição correspondente ao peso da molécula do monômero e 2 vezes o peso da molécula do monômero enquanto as quantidades dos dímeros são aparentemente maiores do que os monômeros. NE2 e 193C verificaram-se como tendo ligações óbvias nas posições de maiores pesos das moléculas,
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63/93 os quais sugerem que ditos peptídeos servem para multimerização espontânea.
[116] Após os peptídeos recombinantes renaturáveis na tabela 2, 193C, 201, 208N, 209N, NE2, 222, 225N, 232 e 247, foram adicionalmente purificados por filtração em gel no HPLC e cada um foi centrifugado por 10 minutos a 20000g e filtrado com 0.1 gm A12O3 em membrana de filtro, os raios dinâmicos destes peptídeos foi medido através o instrumento de varredura de luz dinâmico (DYNAPRO99-D-50 instrumento de varredura de luz dinâmico, produzido por PROTEÍN SOLUTIONS) e sua condição de montagem foi especulada na tabela 3. O raio de molécula obtida a partir de cada peptídeo recombinante é aparentemente maior do que o raio previsto para o monômero. De acordo com o peso da molécula putativa, pode-se concluir que aqueles peptídeos dão forma ao menos aos dímeros da solução, e a maioria destes formam multímeros de ordem maiores, os quais estão em conformidade com sua conduta em SDS-PAGE. De fato, os polipeptídios da invenção preparados com os métodos acima podem formar multímeros de até 180 ou mais monômeros. Foi demonstrado adicionalmente que os polipeptídios da invenção têm propriedades não-esperadas, ou seja, os referidos peptídeos recombinantes acima expressos pelo sistema E. coli contribuem para multimerização espontânea em solução de PBS livre de reagentes denaturantes e isto é vantajoso para aumentar sua imunogenicidade como vacina.
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Tabela 3: Detecção do Status agregado dos peptídeos recombinantes renaturáveis da invenção pelo instrumento de disseminação dinâmica leve.
Polipeptídeo | Monômero de peso molecular teórico (KD) | Medida do raio (nm) | Peso da molécula putativa (KD) | Classe do agregado putativo |
193C | 21, 2 | 3, 44 | 47 | Dímero(21,2x2-42,4) |
201 | 22, 1 | 3, 08 | 62,7 | Trímero(22, 1x3-66, 3) |
208N | 22, 9 | 3, 57 | 66, 1 | Trímero(22, 9x3-68, 7) |
2 0 9N | 23 | 4, 10 | 91 | Tetrâmero(23x4=92) |
NE2 | 24,4 | 4,04 | 90 | Tetrâmero(24,4x4 = 97, 6) |
222 | 24,4 | 3, 72 | 73 | Trímero (24,4x3=73,2) |
225N | 24,8 | 3, 91 | 82 | Trímero(74,4)tetrâmero (99,2) co-existindo |
232 | 25, 5 | 3, 97 | 85 | Trímero(25, 5x3=76, 5) |
247 | 27,2 | 4,28 | 101 | Dímero(27,2x4=108,8) |
2 6 6N | 29, 3 | 4,41 | 108 | Tetrâmero(29, 3x4 = 117,2) |
Exemplo 7: Propriedades físico-químicas do polipeptídio
Renaturação do corpo de inclusão [117]
O corpo de inclusão do polipeptídio recombinante preparado como descrito nos exemplos de
1-3 foi denaturalizado por
4M uréia, então dialisado com mais de
100 no exemplo 4.
O dialisado foi como descrito volumes de PBS,
centrifugado a | 12, | 000rpm | por |
contém alguns | ou | todos | os |
demonstrando desse | modo | que |
polipeptídios recombinantes são capazes minutos.
os referidos
O sobrenadante recombinantes, polipeptídios de renaturação.
Polimerização dos peptídeos recombinantes [118]
Na análise dos sobrenadantes usando SDS-PAGE convencional, as bandas que correspondem, respectivamente, ao monômero, dímero polímero foi identificados.
especificidade das referidas bandas foi adicionalmente confirmada por Westhern blotting convencional, demonstrando
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65/93 desse modo que o polipeptídio recombinante 201 forma um polímero após a renaturação (ver Figura 4).
Determinação do tamanho molecular do polipeptídio 201 através da técnica de varredura de luz.
[119] De acordo com o Exemplo 6, o polipeptídio 201 foi centrifugado a 20,000rpm por 10 minutos após purificação com HPLC, então filtrado com uma membrana Milipore de alumínio de 0.1gm. O filtrado foi medido por instrumento de varredura de luz (DYNAPOR99-D-50, PROTEIN SOLUTION Com. Ltd. U.S.A.) a 824.0nm. O algoritmo de regulação foi usado para calcular, e sua aplicabilidade foi confirmada por muitas amostras padrão. O raio da molécula é calculado a partir do raio dinâmico correspondente a % do pico de intensidade. O solvente foi disposto como amostra de tampão PBS. Os resultados medidos mostrados na figura 5 indicam que o raio principal do polipeptídio 201 na solução livre de denaturação foi de 3.08 nm, com o MW calculado em 62.7KD (correspondente ao trímero). É conhecido dos técnicos no assunto que o referido polipeptídio da invenção poderia formar normalmente polímeros de 180 monômeros ou mais.
Exemplo 8: Preparação dos anticorpos monoclonais anti-NE2 de camundongo.
[120] Para a imunização primária, cada camundongo fêmea
Balb/C (6-8 semanas de idade) foi inoculada com 5 mg do antígeno NE2 recombinante emulsificado com o adjuvante de Freund incompleto (o volume total é 50 mL) · 15 dias mais tarde, o camundongo foi imunizado intramuscularmente para o segundo tempo com a mesma quantidade de NE2 emulsificado no adjuvante de Freund incompleto. 30 dias mais tarde, o camundongo foi então impulsionado intravenosamente (via cauda
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66/93 da veia) com 5 mg dos antígenos sem o adjuvante. Os camundongos foram sacrificados entre 72-96 horas após a indução da imunização. O sangue foi então coletado e o baço foi ressecado para preparar a suspensão do esplenócito (suspensa em meio RPMI 1640). Os esplenócitos foram contados com um contador celular. Então os esplenócitos foram misturados em um razão de 6:1 com as células SP2/0 do mieloma de camundongos e centrifugadas. As células foram fundidas com PEG (PEG 1500), então misturadas com o volume igual ao das células alimentadoras, e transferidas as placas com 96 poços (200pL/poço). Na atmosfera de 5% de CO2, a placa de 96 poços foi incubada em um incubador (ESPEC BNA 31) a 37°C. 3 dias mais tarde, metade do meio de cultura foi recolocada por meio de nutrição HT (1,361mg de hipoxantina e 0,388mg de timidina, com a adição de meio RPMI 1640 (GIBCO Int.)), para 100mL, dissolvido em aproximadamente 45-50°C e filtrado para esterilização). 7 dias mais tarde, a placa de 96 poços foi coberta com NE2, e o ensaio ELISA foi realizado na cultura de célula do hibridoma como descrito abaixo. As células positivas para o ensaio ELISA foram clonadas através de meios de diluição limitante.
Ensaio ELISA [121] 100pL de NE2 foram purificados por HPLC descrito no Exemplo 5 a 37°c, e então dissolvido em 0.05 mol/L de CB(20,02g de Na2CO3 e 2,52g de NaHCO3, com a adição de ddH2O para 1L, pH9,5) para uma concentração final de 0,3mg/mL. A placa de microtitulação em polivinila com 96 poços foi tratada com a solução resultante por 2 horas a 37°C e então overnight a 4°C. A placa de microtitulação foi lavada com PBST (8,0g de NaCl, 0,2g de KH2PO4, 2,9g de Na2NPO4 de 12H20,
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0,2g de KCl e 0,5 mL de Tween-20, com a adição de ddH2O para 1L, pH 7,4) para remover os antígenos não-absorvidos. Então 200mL de solução bloqueadora (2% de glutina, 0,2% de caseína e 2% de sacarose em 1XPBS) foram adicionadas por poço e incubadas por 2 horas. Então a solução foi dispensada, os poços foram secos e as placas armazenadas a vácuo a 4°C.
[122] Para o ensaio, 100mL da cultura celular foram adicionadas em cada poço, e apresentou um controle positivo (adicionada 100mL 1:100 de soro anti-NE2 policlonal diluído) e um controle negativo (adicionada 100mL de meio HT) para cada placa. Após incubação a 37°C por 30 minutos. A placa foi lavada com PBST por 5 vezes e seca. 50 mL da solução do substrato A (13,42g de Na2HPO4, 12H2O, 4,2g de ácido cítrico, H2O e 0,3g de H2O2, com a adição de ddH2O para 700mL) e 50 mL de solução substrato B(0,2g de TMD e 20mL de dimetilformamida, com a adição de ddH2O para 700mL) foram adicionados a placa e esta foi incubada por 10 minutos a 37°C. 50 mL de solução de parada foi usada para terminar a reação. O valor de OD450 de cada poço foi lido por um leitor ELISA. Em geral, o valor OD450 pode ser pelo menos duas vezes maior do que o controle negativo pode ser considerado positivo.
Preparação da ascite e a purificação dos anticorpos monoclonais.
[123] Cada camundongo Balb/C com 10 semanas de idade foi inoculado intraperitonealmente com 0,5mL do adjuvante de Freund incompleto. 2-7 dias mais tarde, as células do hibridoma foram coletadas e centrifugadas. Então, o sobrenadante foi descartado e adicionado ao meio livre de soro as células com uma concentração final de 2X105-2X106
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68/93 célula/mL. 0,5mL da suspensão resultante das células foram usadas para inocular cada camundongo. Os ascites foram colhidos entre 7-10 dias mais tarde quando o abdome do camundongo intumescido, e então centrifugado por 15 minutos a 3,000rpm. O líquido claro na parte intermediária do tubo foi pipetado para fora e filtrado com uma membrana Millipore de 0,45gm para esterilização. O filtrado foi armazenado a -20°C.
[124] Diluído o ascite tratado com o volume igual de PBS (81mL de 0,2mol/L de Na2HPO4 e 19mL, 0,2 mol/L de NaH2PO4, com a adição de salina normal para 100mL) . (NH4)2SO4 foi então adicionado gota a gota com agitação leve até 50% de saturação, e mantido a 4°C overnight. A solução foi centrifugada (12,000rpm) a 4°C por 15 minutos, e o sobrenadante foi descartado. A partícula foi dissolvida em PBS (2 volumes dos ascites usados). (NH4)2SO4 foi adicionado gota a gota novamente para a solução resultante com agitação até 33% de saturação, e mantido overnight a 4°C. A solução foi centrifugada (12,00rpm) a 4°C para 15 minutos, e o sobrenadante foi descartado. A partícula foi dissolvida em PBS (2 volumes dos ascites usados). (NH4)2SO4 foi adicionado gota a gota com agitação gentil até 50% de saturação, e mantido overnight a 4°C. A solução foi centrifugada (12,00rpm) a 4°C para 15 minutos, e o sobrenadante foi descartado. A partícula foi então dissolvida em quantidades apropriadas de PBS em uma bolsa de diálise e o dialisado em 50-100 volumes de 120 mmol/L do tampão Tris-HCl (contendo 20mmol/L de NaCl, pH7,8) por aproximadamente 12 horas a 4°C com agitação. Recolocado o tampão por mais do que três vezes. O dialisado foi armazenado a -20°C.
[125] De acordo com o método descrito acima, os
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69/93 anticorpos monoclonais foram preparados por imunização de camundongos Balb/C com o polipeptídio NE2 da invenção, e 8 anticorpos monoclonais anti-NE2 foram identificados (1F6,
2C9, 3F5,
8C11, 13D8,
15B2 e 16D7) . Cobertos os tubos de eppendorf com os referidos 8 anticorpos, respectivamente, o teste de capacidade de ditos anticorpos ligados com o HEV nativo por captura de RT-PCR(ver o
Exemplo 9). Como resultado, 8C11, 8H3
13D8 mostram significante atividade de ligação de HEV, a qual indicou que seus sítios de reconhecimento foram os epítopos na superfície do revestimento viral. Ditos três anticorpos foram usados no
Exemplo 10.
Exemplo 9: Teste da potencialidade do mAb que liga HEV pelo anticorpo que captura o RT-PCR [126] Os eppendorfs de 1,5mL foram irradiados por ultravioleta durante 30 minutos, e então foi adicionado 500mL de mAb diluído 1:1000 em CB (20,02g de NaCO3 e 2,52 de NaHCO3, com a adição de ddH2O para 1L, pH9,5). Depois da incubação overnight a 37°C, o tampão foi decantado e adicionado 1,5mL de tampão bloqueador (1X PBS com 2% de albumina, pH7,4) para bloquear 2 horas a 37°c. Então o tampão de bloqueio foi decantado e adicionado 500mL a 10% abatido em salina normal esterilizada a qual é positiva para HEV. Após reação a 37°C por 2 horas, o eppendorf foi lavado com PBST por 6 vezes e então adicionado 250 mL de ddH2O em cada eppendorf. O ensaio RT-PCR foi então realizado de acordo com o Exemplo 14. Como resultado, os anticorpos monoclonais de 8C11, 8H3 e 13D8 foram capazes de se ligar ao HEV, enquanto 1F6, 2C9, 3F5, 15B2 e 16D7 não foram capazes de se ligar ao
HEV.
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Exemplo 10: ELISA dos polipeptídios da presente invenção com
o soro positivo do macaco Rhesus, soro humano e murino | ||
derivado de anticorpos monoclonais e o | ponto de | blotting |
dos polipeptídios da presente invenção | com os | anticorpos |
monoclonais derivados de murino. |
[127] Ensaio por ELISA do polipeptídio recombinante com soro do macaco Rhesus positivo, soro humano e de murino derivado dos anticorpos monoclonais.
[128] O polipeptídio da presente invenção mostrado na tabela 2 é produzido e purificado de acordo com os métodos mencionados nos exemplos de 1-6. As amostras da proteína recombinante purificadas resultantes com concentração de 1 mg/ml são diluídas em 1:500 com tampão PBS (20Mm, ph7,4), e revestida com 100ml/poço na placa de microtitulação com 96 poços sob as seguintes condições: incubar a 37°C por 2 horas e então incubada overnight por aproximadamente 12 horas a 4°C. Após uma lavagem com a solução de lavagem de PBS-Tween20 (8,0 g de NaCl, 0,2g de KH2PO4, 2,9g de Na2HPO4, 12H2O, 0,2g de KCl e 0,5 ml de Tween-20, adicionado a H2O não-iônica para um volume final de 1L, pH7,4) no lavador automático (TECAN, M12/45 Columbus plus), e seco, a solução bloqueadora (2% de glutina, 0,2% de caseína e 2% de sacarose em PBS) foi adicionada, 200pl/poço, incubação a 37°c por 30 minutos. Então a diluição conveniente anti-soro ou anticorpo monoclonal foi adicionada, a 37°C por 30 minutos. Após lavagem por 5 vezes com a solução de lavagem PBS-Tween-20 no lavador automático com 20 segundos de intervalo e lavagem, a diluição conveniente do segundo anticorpo marcado com HRP (anti-humano de cabra, anticorpo IgG de camundongo) foi adicionada, a 37°C por 30 minutos. Após 5 períodos de lavagem
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71/93 com a solução de lavagem PBS-Tween-20 no lavador automático com intervalos de 20 segundos e secos, uma gota de cada um dos agentes cromogênicos A e B (A: 13,4g Na2HPO4,12H2O, 4,2g de ácido cítrico, H2O e 0,3g de H2O2, ajustando o volume para 700ml com água não-iônica; B: 0,2g de TMB, 20ml de dimetilformamida, ajustando o volume para 700ml com água não iônica) foi adicionado para desenvolver coloração a 37°C por minutos.
Uma gota da solução de parada (2M
H2SO4) foi adicionada.
O valor OD450nm foi medido em um leitor de microplaca (TECAN,
Sunrise
Remote/Touch
Screen) (com referência ao comprimento de onda de 620nm).
Três vezes do principal valor do controle negativo foi apresentado como o valor limite positivo, e o resultado é positivo quando o valor de OD deste é maior do que o valor limite.
Ponto de blotting dos polipeptídios da presente invenção com vários anticorpos monoclonais derivados de murino.
[129] 10pl (1mg/ml) de cada um dos polipeptídios listados na tabela 2 os quais foram produzidos de acordo com os métodos dos exemplos de 1-5 e purificados por filtração em gel de HPLC foi pontuado respectivamente e vagarosamente na membrana e seco ao ar. Após bloqueamento com 5% de leite desnatado por 1,5 hora a temperatura ambiente, vários anticorpos monoclonais derivados de murino produzidos como mencionado no exemplo 8 (o sobrenadante celular secretado pelo linfócito B monoclonal em uma diluição de 1:100 com 5% de leite desnatado) foram adicionados, reagindo a temperatura ambiente por 1 hora. Então, a membrana foi lavada 3 vezes usando TNT(10mM de Tris, Cl, pH8,0, 150mM de NaCL, 0,05% de
Tween-20) em intervalos de 5 minutos. A IgG anti-camundongo obtida da cabra foi marcada com HRP (produzida por JINGMEI
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Biological Company, diluído em 1:1000 com 5% de leite desnatado) foi adicionada, e reagida a temperatura ambiente por 1 hora. Após três períodos de lavagem com TNT em intervalos de 5 minutos, NBT/BCIP (C40H30N10O6Cl2/C8H6BrClNO4PC7H9N) foi adicionada para desenvolver coloração. Os pontos foram verificados com o sistema de imagem em gel e desviados dentro dos valores da grade cinza e divididos em cinco grades positivas como ++++, +++, ++, + +- e a grade negativa como -. Comparado com a técnica de Westhern blotting clássica, este método pode refletir mais apropriadamente a imunoreatividade na ausência do agente de denaturação devido ao objeto não ser denaturado com o SDS.
Tabela 4: A reatividade do polipeptídio da presente invenção contra o anticorpo monoclonal derivado do murino, soro de paciente HEV em fase de recorrência, e soro do macaco Rhesus infectado com HEV na fase aguda.
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ELISA | Ponto de blotting | |||||||
Polipeptídeo | Soro do macaco | Soro humano | 8C11 | 8H3 | 13D8 | 8C11 | 8H3 | 13D8 |
NE2 | ++ | ++ | +++ | ++ | +++ | ++++ | ++ | +++ |
193C | ++ | ++ | +++ | + | ++ | ++ | ++ | ++ |
178C | + | ++ | +++ | +- | +++ | ++ | ++ | ++ |
168C | - | +- | ++ | - | +++ | + /- | + /- | + /- |
158C | +- | + | + | - | +++ | + | + /- | + /- |
148C | + | ++ | - | - | - | + /- | + /- | + /- |
138C | - | - | - | - | - | + /- | + /- | + /- |
NE2I | +++ | ++ | + | +++ | +++ | +++ | ++ | +++ |
217I | + | + | ++ | - | ++ | + | + | + |
193I | ++ | ++ | ++ | - | ++ | +++ | ++ | +++ |
178I | +++ | ++ | ++ | - | ++ | ++ | ++ | ++ |
NE2D | ++ | ++ | ++ | - | ++ | + | + | + |
217D | ++ | ++ | ++ | - | ++ | + | + | + |
193C | ++ | ++ | ++ | - | ++ | + | + | + |
178C | ++ | ++ | +++ | - | +++ | + | + | + |
235N | ++ | +- | +++ | +- | +++ | +++ | + | +++ |
225N | +++ | +++ | +++ | +- | +++ | ++++ | + | +++ |
2 0 9N | ++ | ++ | +++ | + | +++ | ++++ | + | +++ |
208N | + | +++ | +++ | - | +++ | ++ | + | ++ |
207N | - | - | - | - | - | ++ | + | + |
203N | - | - | - | - | - | ++ | + | + |
193N | - | - | - | - | - | ++ | + | + |
176N | - | + | - | - | - | + | + /- | + |
247 | +++ | + | +++ | ++++ | +++ | ++++ | ||
232 | +++ | + | +++ | ++++ | ++++ | ++++ | ||
222 | +++ | +- | +++ | ++++ | ++ | ++++ | ||
205 | ++ | + | +++ | - | +++ | +++ | ++ | ++ |
201 | +++ | + | ++ | ++++ | ++ | ++++ | ||
189 | - | +- | +++ | - | +++ | ++ | ++ | ++ |
188 | - | +- | ++ | - | +++ | ++ | ++ | ++ |
183 | - | + | +- | - | +- | ++ | ++ | ++ |
173 | - | - | - | - | - | ++ | + | ++ |
170 | +++ | - | +++ | ++++ | +++ | ++++ | ||
C160 | - | - | - | - | - | - | ||
N160 | ++ | - | ++ | ++ | - | ++ | ||
150 | - | - | - | - | - | - | ||
144 | ++ | - | ++ | ++ | - | ++ | ||
142 | - | - | - | - | - | - | ||
134 | - | - | - | - | - | - |
Resultado
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74/93 [130] Respectivamente, os polipeptídios recombinantes purificados listados na tabela 4 foram revestidos na placa de microtitulação, e a reatividade destes para os anticorpos monoclonais derivado dos murinos 8C11, 8H3 e 13D8 mencionado no exemplo 8, soro do paciente com HEV na fase de recorrência e o soro do macaco Rhesus infectado com HEV na fase aguda foram examinados por ELISA. A reatividade dos mesmos para o uso dos três anticorpos monoclonais foi examinada através do ensaio de ponto de blotting. Os resultados mostraram que os polipeptídios NE2, 193C, 178C, NE2I, 235N, 225N, 209N, 247, 232, 222 e 201 tiveram melhor reatividade para em cada um do soro/anticorpo monoclonal. Isto sugere que os polipeptídios foram melhores do que o epítopo HEV original e podem ser usados para o kit de diagnóstico e/ou para vacina para HEV.
[131] Os polipeptídios 138C, C160, 150, 142 e 134 tiveram pouca reatividade para vários anticorpos. Isto mostrou que a formação dos maiores epítopos originais da ORF2 envolveram pelo menos o fragmento de aa469 a aa600.
[132] As sequências dos polipeptídios 170, C160, N160, 150, 144, 142 e 134 foram aquelas aa459-aa628, aa469-aa628, aa459-aa618, aa469-aa618, aa459-aa602, aa459-aa600, da ORF2 que estavam ligadas respectivamente ao aminoácido inicial(Met).
Exemplo 11: Westhern blotting dos polipeptídios da presente invenção com anticorpos monoclonais derivados de murino.
[133] Foi realizado Westhern blotting dos polipeptídios 208N, 209n e 225N produzidos na presente invenção, como mencionado nos exemplos de 1-5, com os anticorpos monoclonais derivados de murino 1F6, 2C9, 3F5 produzidos no exemplo 8. Os referidos polipeptídios foram separados por SDS-PAGE, então
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75/93 transferidos a uma membrana de nitrocelulose de acordo com os métodos convencionais e 5% de leite desnatado foi adicionado para bloqueamento por 1,5 hora; vários anticorpos monoclonais derivados de murino (o sobrenadante celular secretado pelos linfócitos monoclonal B a uma diluição de 1:100 com 5% de leite desnatado) foram adicionados, reagindo em temperatura ambiente por 1 hora; após lavagem em 3 períodos com intervalos de 5 minutos, a IgG anti-camundongo marcada com HRP (em uma diluição de 1:1000 com 5% de leite desnatado) foi adicionada, temperatura ambiente por 1 hora; após 3 períodos de lavagem com TNT em intervalos de 5 minutos, NBT/BCIP foram adicionados para desenvolvimento de coloração. Os resultados do Westhern blotting são apresentados na figura 6. Os resultados mostraram que as bandas do polímero, em particular na coluna 8, a qual não pode ser observada pela coloração azul brilhante de Coomassie R250, devido ao efeito de amplificação ligado a enzima do ensaio de Westhern blotting. Foi adicionalmente confirmado que o polipeptídio recombinante 208N da presente invenção não forma dentro de polímeros durante 12% de SDS-PAGE, e que o anticorpo monoclonal 1F6 têm forte atividade para 209N e 225N comparada com os anticorpos monoclonais 2C9 e 2F5.
Exemplo 12: Preparação da vacina contendo o polipeptídio 201 e o ensaio da imunização de camundongos com esta vacina.
[134] Preparação da vacina contendo o polipeptídio 201 com o adjuvante de Freund:
[135] O polipeptídio 201 da presente invenção produzido como acima-mencionado e purificado por HPLC (pureza > 95% e a concentração da proteína de 1,02mg/ml) foi diluído com PBS, e o volume equivalente do adjuvante completo de Freund
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76/93 (contendo BCG) foi adicionado para atingir uma concentração final desejada do polipeptídio 201 (por exemplo, se cada camundongo for imunizado com a quantidade desejada de 100pl, 5pg, a concentração do polipeptídio 201 seria preparada dentro de 0,05mg/ml). A solução foi misturada e emulsificada por 30 minutos até nenhuma fase líquida separada aparecer após ter sido mantida por mais 30 minutos.
[136] Usando o adjuvante de Freund como adjuvante de vacina, quatro grupos de camundongos (cada grupo de 3 camundongos brancos Kunning), cada um foi injetado intramuscularmente com 0,5, 1, 2, 5pg em 100ml/camundongo de acordo com a listagem de imunização de 0, 7, 28 dias. Os resultados estão mostrados na figura 7. Os resultados indicaram que a ORF2-201 da vacina preparada com o adjuvante de Freund com as
2mg acima apresentaram uma imunogenicidade muito forte, a produção do anticorpo foi iniciada na segunda semana após a imunização e atingiu uma grande titulação em 40 semanas.
considerado que o anticorpo com uma alta titulação pode ser produzido apenas em camundongos imunizados com antígeno da proteína com doses de 307 0pg/camundongo de acordo com os livros comuns e literatura em imunologia.
Desse modo, os resultados mostraram que a vacina e o polipeptídio 201 com o adjuvante de Freund, da presente invenção, combinados têm notavelmente um alto efeito imunogênico comparado com a vacina disponível.
Preparação da vacina contendo o polipeptídio 201 com adjuvante de alumínio:
[137] Uma quantidade desejada do adjuvante de alumínio original (A13+ 13,68%, Na+3,36%, pH5,55), os qual foi obtido da Lanzhou Biological Product Institute of China, foi
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77/93 ajustado com 1N NaOH até produzir o precipitado. Após completamente misturado, 1xPBS foi adicionado para atingir o dobro do volume. Então a centrifugação foi realizada a 10,000 por 1 minuto, e o sobrenadante foi descartado. O precipitado foi re-suspendido com 1xPBS para o dobro do volume novamente, e centrifugado a 10,000 por 1 minuto e o sobrenadante foi descartado. O referido processo foi repetido muitas vezes até o pH atingir 7-7,4. Finalmente, o precipitado foi resuspendido com volume igual de 1xPBS, e a solução foi esterilizada e armazenada a 4°C, e usada com 9x a solução estoque.
[138] Similarmente, o polipeptídio 201 produzido como acima mencionado e purificado por HPLC (pureza > 95% e a concentração da proteína 1,02 mg/ml) foi diluído com PBS, e o volume de 1/9 do adjuvante de alumínio foi adicionado para atingir uma concentração final desejada do polipeptídio 201, e misturá-lo overnight a 4°C. O imunizado é de 100ml/camundongo. Usando o adjuvante de alumínio como adjuvante de vacina, cada um do grupo de 3 camundongo Balb/c, foi injetado intramuscularmente com 2, 5, 10mg/camundongo de acordo com a tabela de imunização de 0, 7, 28 dias. Os resultados foram mostrados na Figura 9. Os resultados indicaram que as doses de 5, 10 mg/camundongo tiveram melhor efeito imunogênico, os quais são comparáveis àqueles das vacinas dos antígenos de superfície de HBV disponíveis atualmente, o qual é um antígeno particulado e pretende-se que tenha melhor imunogenicidade comparado ao antígeno do monômero. Portanto, os resultados mostram que os polímeros da presente invenção são úteis para a vacina.
Ensaio da imunidade do polipeptídio 201 sem adjuvante.
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78/93 [139] O polipeptídio 201 obtido como acima-mencionado foi dissolvido em uréia 4M, e o sobrenadante foi dialisado com PBS (pH 7,45) para renaturar, com a pureza de aproximadamente 95%. Usando o adjuvante de Freund como adjuvante de vacina, cada um do grupo de 3 camundongos brancos Kunming, foi injetado intramuscularmente com 5, 25, 50 mg/camundongo (o grupo controle com 5 mg/camundongo) de acordo com a tabela de imunização de 0, 7 28 dias. Os resultados foram mostrados na figura 8. Os resultados indicaram que os anticorpos consideráveis foram produzidos nos camundongos imunizados com a vacina de ORF2-201 não-adjuvante, e a dosagem usada dos mesmos foi comparável àquela do antígeno convencional com o adjuvante de Freund. Foi mostrado adicionalmente que o polipeptídio de polímero da presente invenção têm maior imunogenicidade comparada com o antígeno convencional.
[140] Pode ser concluído a partir dos resultados acima que o camundongo Balb/c pode ser induzido a produzir anticorpos específicos quando imunizado tanto com o polipeptídio 201 recombinante quanto com a NE2 (5mg/camundongo) sem consideração da formulação do adjuvante de Freund ou adjuvante de alumínio. E outros polipeptídios renaturáveis formulados com o adjuvante de Freund também podem ser usados para induzir os camundongos a produzir anticorpos específicos. Portanto, os polipeptídios da presente invenção têm uma boa propriedade para uso como vacina.
Exemplo 13: Imunização dos macacos rhesus com a vacina compreendendo um polipeptídio recombinante da presente invenção.
[141] Seis macacos rhesus com ALT normal e HEV negativo
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79/93 foram selecionados e divididos dentro de dois grupos, um grupo designado HF1, HF2 e HF3 e o outro grupo designado HF4, HF5 e HF6. Os dois grupos de indivíduos de macacos rhesus foram vacinados por injeção intradeltoidal com o adjuvante de alumínio contendo a vacina do polipeptídio NE2I e a vacina do polipeptídio 201 preparadas como descrito nos exemplos de 1-5 e 12 nas dosagens de 20 mg, respectivamente. Ditas vacinações foram realizadas nos dias 0, 10 e 30 respectivamente. Três semanas após a última vacinação, as titulações do anticorpo IgG anti- NE2I dos animais foram testadas por ELISA indireto com os resultados a seguir:
HF1(1:16000), HF2(1:4000), HF3(1:8000), HF4(1:2000), HF5(1:3000) e HF6(1:5000).
[142] Os resultados acima ilustrados pelos polipeptídios NE2I e 201 indicaram que os polipeptídios recombinantes da invenção tiveram melhor imunogenicidade comparada com a ORF2 do polipeptídio de HEV trpE-C2(aminoácidos 225-660 da SEQ.ID.NO:1) usado como imunógeno na patente US 5,885,768. Na patente US No. 5,885,768, Reyes, et al., foram vacinados 4 macacos cinomolgos através de injeção intravenosa com 50ug da ORF2 do polipeptídio de HEV trpE-C2 expresso por E. coli em combinação com um adjuvante de alumínio melhorado nos dias 0 e 30 respectivamente. Dois macacos cinomolgos injetados com o
adjuvante | sozinho | foram | usados | como | controle. | Nenhum | |
anticorpo | para HEV | foi | detectado | no | grupo | dos | macacos |
vacinados | 4 semanas | após | a segundo | vacinação. | Dois | destes | |
macacos | vacinados | foram | selecionados | para | receber uma |
terceira vacinação com 80ug do polipeptídio insolúvel trpE-C2 sem adjuvante no 58° dia, e o anticorpo anti-HEV foi detectado apenas 4 semanas mais tarde.
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Exemplo 14: Infecção com HEV dos macacos rhesus imunizados com a vacina compreendendo o polipeptídio recombinante da presente invenção.
[143] Preparação e quantificação do vírus da hepatite E (HEV).
[144] Uma amostra fecal de um paciente de HEV do Hinjiang, China, foi formulada para 10% da suspensão em solução salina fisiológica estéril. A suspensão foi centrifugada a 12000g por 20 minutos a 4°C, e o sobrenadante foi filtrado-esterilizado em um filtro estéril de 0,2 gm (NALGENE® Cat. No. 190-2520). O HEV em uma quantidade detectável no PCR foi usado como uma dosagem para infecção.
[145] A extração, transcrição reversa e PCR do RNA de HEV da amostra fecal: Os RNAs foram extraídos de 10% da suspensão fecal usando o reagente de Trizol (GIBCOL) de acordo com suas instruções de manipulação, e foram submetidos a transcrição reversa em um volume de 20 gl da reação a 42°C por 40 minutos com o primer específico A3 (4566-4586, 5'ggctcaccggagtgtttcttc-3')como primer RT usando a transcriptase reversa AMV. Então, a primeira corrida do RTPCR foi realizada em um volume final de 20ul usando 2ul do produto de RT como padrão e usando primer A3 e primer A5 (4341-4362, 5'-ctttgatgacaccgtcttctcg-3') sob as seguintes condições de reação: pré-denaturação a 94°C por 5 minutos; 35 ciclos de denaturação a 94°C por 40 segundos e estendidos a 68°C por 40 segundos; estendido a 75°C por 5 minutos. Uma segunda corrida de PCR foi realizada em um volume final de 20ul usando 2ul da primeira corrida do produto de reação como molde e usando primers B5 (4372-7392, 5'gccgcagcaaaggcatccatg-3') e B3 (4554-4575, 5'
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81/93 gtgtttcttccaaaaccctcgc-3') sob as seguintes condições de reação: pré-renaturação a 94°C por 5 minutos; 35 ciclos de denaturação a 94°c por 40 segundos; anelamento a 56°c por 40 segundos e estendidos a 72°C por 1 minuto e 20 segundos; estendidos a 75°c por 5 minutos.
[146] Grupos dos macacos rhesus usados neste experimento: grupo 1 imunizado incluindo os macacos rhesus V10, V11 e V12 correspondendo aos animais HF1, HF2 e HF3 no Exemplo 2, respectivamente; Grupo 2 imunizado incluindo os macacos rhesus V13, V14 e V15 correspondente aos animais HF4, HF5 e HF6 no Exemplo 2, respectivamente; foi designado um grupo controle incluindo três macacos rhesus não imunizados: V16, V17 e V18.
Infecção com HEV.
[147] O HEV em uma quantidade detectável pelo PCR foi usado como uma dose de infecção. Três semanas após a última vacinação do macaco rhesus HF1-6 com a vacina compreendendo os peptídeos recombinantes da presente invenção como descritos no Exemplo 13, os macacos acima foram infectados com 1.000 doses de infecção do HEV. Após infecção, o ALT de todos os macacos não aumentou. A Anti-NE2I-IgG nos animais V16 e V17 foi detectada na quarta semana, e Anti-NE2-IgG foi detectada no animal V18 no animal V18 na quinta semana. Dos dias 1 a 37, nenhuma excreção HEV foi detectada nos animais V10-15; a excreção de HEV no animal V16 iniciou no dia 5 e terminou no dia 30; e a excreção do HEV nos animais V17 e V18 começou no dia 5 também, mas não parou no dia 37. Estes resultados indicaram que o polipeptídio da presente invenção como vacina possuía melhor imunogenicidade e produzia melhor proteção comparada com o polipeptídio trpE-C2 da ORF2 de HEV
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82/93 na Patente US No. 5,885,768.
[148] A partir destes resultados, pode ser observado que quando uma baixa dose da vacina desta invenção foi usada para vacinação de macacos, os macacos vacinados podiam produzir excelentes anticorpos de resposta ao HEV e ALT anormal e excreção viral nas fezes não foi observada após o início da infecção com HEV. Assim, a melhor imunoproteção foi produzida comparada com os resultados da vacinação relatados nas vacinas preparadas usando o polipeptídio trpE-C2 da ORF2 de HEV (Patente U.S. No. 5,885768) e as vacinas compreendendo os polipeptídios preparados por Tsarev et al.. Adicionalmente, o sistema de expressão do baculovírus aplicado por Tsarev e Genelabs Co., apresenta danos potenciais ao corpo humano, de modo que não foi relatado até aqui qualquer proteína recombinante expressa por este sistema que tinha sido aprovada como uma droga comercializada ou uma vacina comercializada para uso em seres humanos. Ao contrário, várias das proteínas recombinantes expressas pelo sistema de expressão em E. coli de acordo com a presente invenção foram aprovados como drogas in vivo para humanos comercializadas, e tem muito mais segurança.
Exemplo 15: Preparação de um polipeptídio quimérico compreendendo polipeptídio 247 da invenção ligado ao epítopo na ORF3 de HEV.
[149] | A reação do | PCR | foi | realizada com | a extensão |
completa do genoma do | vírus | da | hepatite E (HEV) | isolado a | |
partir | de um paciente com HEV | da | HinJiang, China. | (Aye, t.T., | |
Uchida | et al., Nucleic | Acids | Research, 20(13), | 3512(1992); | |
número | de acesso no | GenBank:GI221701) usando | como molde |
usando o primer anterior,
372FP (5'Petição 870190054122, de 12/06/2019, pág. 88/117
83/93 ggatcccatatgaataacatgtcttttgct-3'), introduzindo sítios de endonuclease de restrição BamHI e Ndel em sua 5'-terminal, e o primer reverso, 372BRP (5'-ggatcctcggcgcggcc-3'), introduzindo sítios endonucleases de restrição BamHI em sua 5'-terminal, sob as seguintes condições de reação: 94°C por 5 minutos, 30 ciclos a 94°C a 50 segundos, 56°C a 50 segundos e 72°C a 30 segundos, e 70°C a 10 minutos. Um fragmento de DNA específico com um tamanho de aproximadamente 370bp codificando o epítopo na ORF3 de HEV foi obtido. O produto do PCR obtido acima foi ligado dentro do plasmídeo 18-T pMD comercial (TAKARA Co.). Um sub-clone positivo no qual o gene do epítopo na ORF3 de HEV foi inserido e foi identificado por digestão com BamHI. O sequenciamento do DNA não indicou
qualquer mutação no clone, | e desse modo | a | sequência de | |
aminoácidos | do gene epítopo | na ORF3 da HEV | foi | obtido, como |
apresentado | na SEQ.ID.NO:11. | |||
[150] O | fragmento do | gene HEV-ORF3 | foi | obtido por |
digestão com BamHI, e ligado dentro do plasmídeo vetor de expressão pTO-T7-ORF2-247 (preparado de acordo com o método descrito no exemplo), o qual foi digerido com BamHI. Um clone de expressão positivo, pTO-T7-ORF3-247, no qual o fragmento do gene de HEV-ORF3 foi inserido, foi identificado por digestão com BamHI. O clone foi transformado dentro da cepa de E. coli ERR2566, a qual foi usada para expressar o polipeptídio quimérico ORF3-247.
Exemplo 16: Preparação de um polipeptídio quimérico de NE2D ligado ao antígeno hemaglutina do vírus influenza.
[151] A sequência do nucleotídeo do peptídeo quimérico foi obtida através da amplificação por PCR com uma sequência mutante HEV-ORF2 (SEQ.ID.NO:6) preparado no exemplo 1 como
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84/93 molde para uso dos pares de primer HAFP/E2RD. A reação do PCR é conduzida como a seguir: pré-aquecimento a 97 °C por 5 minutos; 30 ciclos de denaturação a 94°C por 50 segundos, anelamento a 56°C por 50 segundos, extensão a 72°c por 70 segundos; e extensão a 72°C por 10 minutos pelo menos. O produto do PCR resultante é um fragmento de DNA de aproximadamente 800 bp, codificando o polipeptídio quimérico compreendendo HA do vírus influenza e o polipeptídio NE2D da presente invenção. O primer anterior HAFP contêm os sítios de restrição BamHI e NdeI. O primer reverso E2R2 contém o sítio de restrição EcoRI e um códon de parada de translação TAA. A sequência para o sítio NdeI é CAT ATG, onde ATG é um códon de translação inicial. Além disso, de modo a manter as conformações exatas dos dois peptídeos HA e NE2D, respectivamente, um ligador flexível Gly-Gly-Ser codificado por CAG CTG TTC foi introduzido entre os peptídeos HA e NE2D. Portanto, o polipeptídio quimérico HA-NE2D pode ser adequadamente empregado na vacina HEV. As sequências dos pares de primer são as seguintes:
HAFP:5'- AGA TCT CAT ATG TCT AAA GCT TTC TCT AAC
1) | BglII | Ndel91 | Ser | Lys AlaPhe Ser | Asn | Cys | |||
a) | TGC | TAC | CCT | ||||||
b) | TyrPro | ||||||||
TAC | GAC | GTT | CCG | GAC | TAC | GCT TCT TTA | GGT | GGA | TCC |
Tyr | Asp | Val | Pro | Asp | Tyr | Ala Ser Leu108 | Gly | Gly | Ser |
CAG | CTG | TTC | TAC | TCT | CGT | CC-3' |
E2RD:5'-gaattcttagggggctaaaacagc-3'
Preparação do vetor de expressão compreendendo uma construção do ácido nucléico codificando o polipeptídio quimérico resultante.
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85/93 [152]
O produto de
PCR acima mencionado foi clonado dentro de um plasmídeo comercialmente disponível pMD 18-t (TAKARA com. Ltd.).
A sequência de interesse foi então adquirida através da digestão com BamHi/EcoRI do plamídeo pMD
18-T-HA-ORF2- NE2D, e integrado dentro do vetor de expressão com digestão com BamHI/EcoRI e ligação. Um peptídeo quimérico HA-ORF2-NE2D foi isolado das células hospedeiras E. coli ERR2566 com o plasmídeo de expressão pTO-T7-HA-ORF2-NE2D. A sequência de aminoácido foi designada como SEQ.ID.NO:12.
[153] O kit de detecção da IgG para HEV com polipeptídio NE2I desta invenção compreende: placas de microtitulação revestidas com o polipeptídio recombinante NE2I e bloqueada com uma solução bloqueadora (20mM, pH 7,2 PB, 0,5% de caseína, 2% de Gelatina); amostra do diluente (20mM pH 7,2 PB, 1% de Caseína); conjugado de trabalho (IgG anti-humana de cabra (DAKO)) marcada com HRP diluído com diluente de enzima (10mM pH7,2 PB, 0,5% de Caseína, 10% de NBS)); material nãobioreativo tal como 20x PBST, cromatógeno A, cromatógeno B e solução de parada (Beijing wantai).
[154] Séries de soro de macacos foram detectadas com o kit IgG anti-HEV baseado no NE2I comparado com os dois kits comerciais da IgG anti-HEV de Beijing Wantai e Singapura Genelabs. Os soros dos macacos foram os soros dos macacos No1, No2, No3 e No13 imitando o macaco infectado naturalmente por HEV de 0 a 18 semanas após infecção intravenosa.
[155] O procedimento de manipulação é como a seguir: adicionar 100ul da amostra de solvente para cada microtitulação; adicionar 10ul do espécime para a microtitulação; misturar totalmente por batidas leves em todos os lados da microplaca; incubar por 30 minutos a 37°C;
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86/93 lavar a microplaca com 1 tempo de PBST cinco vezes; secar por inversão da microplaca e batidas firmes sobre papel absorvente; adicionar 100ul de conjugado de trabalho para todos os poços e incubação da microplaca por 30 minutos a 37°c; lavar a microplaca cinco vezes novamente e secagem; adicionados 50ul do cromatógeno A e 50ul do cromatógeno B e misturados totalmente por batidas leves; incubar a microplaca por 10 minutos a 37°C no escuro; adicionar 50ul de solução de parada para cada poço e misturar gentilmente através de batidas leves na placa; determinar a absorbância para cada poço em 450nm/620nm. Os dois kits comerciais IgG anti-HEV foram ensaiados normalmente de acordo com cada procedimento de ensaio.
[156] O resultado é como a seguir: o kit baseado na conversão do soro NE2I detectado mais facilmente do que os dois kits comerciais de Beijing Wantai e Singapore Genelabs por 7-14 dias; a duração do anti-NE2I-IgG foi mais longo do que o anti-HEV-IgG da Genelabs e o anti-HEV-IgG da Wantai; A razão detectável do anti-NE2I-IgG foi maior do que a dos dois kits comerciais anti-HEV-IgG (ver figura 10, dados puros mostrado na tabela 5). Quando 34 soros aleatórios de pessoas normais foram detectados, a faixa positiva do anti-NE2I-IgG e os anti-HEV-IgG da Genelabs foram 35% e 11% respectivamente, e o último foi absolutamente incluído no molde. Quando o soro de 263 pacientes de hepatite da clínica, a faixa positiva do anti-NE2I-IgG e o anti-HEV-IgG Wantai foram 27,2% e 10,6% respectivamente. Quando 91 soros de pacientes de hepatite não-A, não-B, não-C, a faixa positiva do anti-NE2IIgG e do anti-HEV-IgG da Genelabs foram 69.2% e 24,2% respectivamente. Em uma palavra, o anti-HEV-IgG baseado no
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NE2I desta invenção é mais sensível do que os kits comerciais anti-HEV-IgG.
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Tabela 5: comparação da sensibilidade para detecção do soro de macacos infectados com HEV pelo Kit de detecção do anticorpo IgG anti-HEV da presente invenção (NE2I-IgG) e por dois kits de detecção disponíveis comercialmente (Genelabs; WANTAI).
Soro N°1 | 0 p | 1 p | 2 p | 3 p | 4 p | 5 p | 6 p | 7 p | 8 p | 9 p | 10 p | 11 p | 12 p | 13 p | 14 p | 15 p | 16 p | 17 p | 18 p |
Anti-HEVIgG Genelabs | 0,01 | 0,01 | 0,01 | 0,01 | 0,21 | 2,61 | 3 | 3 | 3 | 2,61 | 1, 78 | 1, 36 | 0,92 | 0,92 | 0, 92 | 0, 96 | 0,72 | ||
AntiHEV-IgG WANTAI | 0,01 | 0,02 | 0,01 | 0,02 | 0,01 | 1,82 | 2, 45 | 2, 48 | 2,42 | 1,7 | 1, 37 | 0, 54 | 0,36 | 0,25 | 0, 18 | 0,1 | 0,05 | 0,05 | 0, 03 |
NE2I-IgG inventivo | 0,01 | 0,02 | 0,01 | 1,87 | 2,56 | 2, 5 | 2, 52 | 2, 49 | 2,72 | 2,52 | 2, 52 | 2, 47 | 2,53 | 2,58 | 2, 64 | 2, 65 | 2,40 | 2,36 | 2,35 |
Soro N°2 | 0 p | 1 p | 2 p | 3 p | 4 p | 5 p | 6 p | 7 p | 8 p | 9 p | 10 p | 11 p | 12 p | 13 p | 14 p | 15 p | 16 p | 17 p | 18 p |
Anti-HEV- IgG Genelabs | 0,05 | 0,07 | 0,05 | 0,04 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | ||
AntiHEV-IgG WANTAI | 0,02 | 0,02 | 0,02 | 0,02 | 2,05 | 2,58 | 2, 42 | 2, 46 | 2,65 | 2, 5 | 2,33 | 2,23 | 2,3 | 2,21 | 2,2 | 2,26 | 2,26 | 2,38 | 2, 46 |
NE2I-IgG inventivo | 0,06 | 0,06 | 0,06 | 0,77 | 2,26 | 2,36 | 2,5 | 2, 56 | 2,62 | 2,65 | 2, 49 | 2, 47 | 2m4 | 2,54 | 2, 51 | 2,38 | 2,29 | 2,34 | 2,33 |
Soro N°3 | 0 p | 1 p | 2 p | 3 p | 4 p | 5 p | 6 p | 7 p | 8 p | 9 p | 10 p | 11 p | 12 p | 13 p | 14 p | 15 p | 16 p | 17 p | 18 p |
Anti-HEVIgG Genelabs | 0,05 | 0,02 | 0,02 | 0,02 | 0,78 | 3 | 3 | 2, 91 | 2,83 | 2,77 | 2,22 | 1, 95 | 1,79 | 1,54 | 1, 42 | 1, 42 | 1,38 | ||
AntiHEV-IgG WANTAI | 0 | 0 | 0 | 0,02 | 0,02 | 1,87 | 1, 62 | 1, 67 | 1,82 | 1,48 | 1, 05 | 0, 67 | 0,75 | 0,76 | 0, 58 | 0,38 | 0,46 | 0,34 | 0,23 |
NE2I-IgG inventivo | 0,01 | 0,05 | 0,04 | 0,83 | 2,2 | 2,63 | 2, 59 | 2, 62 | 2,75 | 3 | 2,7 | 2,6 | 2,55 | 2, 6 | 2, 54 | 2, 51 | 2,51 | 2,36 | 2, 51 |
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Soro N°13 | 0 p | 1 p | 2 p | 3 p | 4 p | 5 p | 6 p | 7 p | 8 p | 9 p | 10 p | 11 p | 12 p | 13 p | 14 p | 15 p | 16 p | 17 p | 18 p |
Anti-HEV- IgG Genelabs | 0, 04 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,04 | 0,05 | 0, 15 | 0,1 | 0,08 | 0,06 | 0, 06 | 0, 07 | 0,08 | 0,07 | 0,1 | 0, 15 | 0,07 | 0,04 | 0, 02 |
AntiHEV-IgG WANTAI | 0, 02 | 0 | 0,01 | 0,01 | 0,01 | 0 | 0, 01 | 0, 02 | 0,04 | 0,03 | 0, 03 | 0, 03 | 0,02 | 0,02 | 0, 02 | 0, 02 | 0,02 | 0,02 | |
NE2I-IgG inventivo | 0,1 | 0,11 | 0,09 | 0,09 | 2,3 | 2,45 | 2, 51 | 2,5 | 2,34 | 2,21 | 2, 13 | 2, 14 | 2,05 | 2,01 | 1, 82 | 1, 87 | 1,79 | 1,7 | 1,6 |
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Exemplo 18: Método para marcar as proteínas recombinantes da presente invenção com HRP.
[157] Dissolver 1 mg de HRP (Biozyme R/Z>3) e NaIO4, respectivamente, em água ultra-pura (UPW); adicionando gota a gota a solução de NaIO4 com agitação; a solução da mistura é colocada por 30 minutos no escuro a temperatura ambiente;
adicionando cuidadosamente 100ul da solução de etileno glicol a 1% , misturar; deixá-la para descansar por 30 minutos no escuro a 4°C.
A proteína recombinante foi dialisada com o tampão carbonado (10mM, pH9,6) durante 3 horas;
adicionar a proteína recombinante dializada apropriada para o HRP oxigenado, diálise por horas a temperatura ambiente (ou
4°C) no tampão carbonado (10mM, pH9,5) com agitação gentil; adicionar 20 ul da solução de NaBH4 0,1M preparada normalmente para a mistura acima mencionada; deixar descansar por 2 horas a 4°C no escuro, agitar em vórtex gentilmente uma vez a cada 30 minutos; diálise em PBS (10mM, pH7,2) overnight a 4°c.
Exemplo 19: Kit de diagnóstico para detecção do anticorpo IgM contra HEV em amostras biológicas e ensaio de captura para detecção do anticorpo IgM contra HEV em amostras biológicas.
[158] O polipeptídio 225N foi marcado com HRP de acordo com o método descrito no exemplo 18.
[159] O kit de diagnóstico para detecção do anticorpo IgG contra HEV contendo o polipeptídio NE2I marcado com HRP da presente invenção compreende: uma placa de microtitulação que é pré-revestida com o anticorpo policlonal de cadeia μ da IgM anti-humana de camundongo (Dako company, Dinamarca) e bloqueada com a solução bloqueadora; amostra do diluente (20mM, pH7,2 de PB, 1% de caseína); conjugado de trabalho
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91/93 (polipeptídio marcado com HPR que é diluído adequadamente com enzima diluente (20mM, pH7,2 PB, 0,5% de Caseína, 10% de
NB) ) ; material não-bioreativo, tal com o 20xPBST, agente cromatógeno A, agente cromatógeno B e solução de parada (WANTAI Company, Beijing).
[160] O ensaio de captura usando o kit de diagnóstico da presente invenção é realizado como a seguir: adicionar 100ul do tampão diluente em cada poço que é pré-revestido com o anticorpo policlonal da cadeia μ da IgM anti-humana de camundongo; adicionar 01ul da amostra a ser detectada dentro do tampão diluente; misturar totalmente através de batidas leves; incubar durante 30 minutos a 37°C; lavar com PBST por 5 vezes; secar por inversão da microplaca de cabeça para baixo e batidas firmes sobre o tecido; adicionar 100ul do conjugado de trabalho (polipeptídio 225N marcado com HRP que é diluído adequadamente) em cada poço e incubar a microplaca por 30 minutos a 37°c; lavar por cinco vezes novamente e secar; adicionar a seguir 50ul do cromatógeno A e 50ul do cromatógeno B e misturar totalmente através de batidas leves; incubar durante 10 minutos a 37°C no escuro; adicionar 50ul da solução de parada em cada poço e misturar gentilmente através de batidas leves na placa; determinar a absorbância para cada poço em OD450nm/620nm.
[161] Usando o kit de diagnóstico anti-HEV-IgM preparado de acordo com a presente invenção, o soro de 263 pacientes da clínica com hepatite foi detectado pelo ensaio de captura acima mencionado com uma porcentagem positiva de 11%; e 91 soro de pacientes de hepatite não-A, não-B, não-C, foram também detectados pelo referido ensaio de captura com uma porcentagem positiva de 48,4%. Provisoriamente, uma
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92/93 porcentagem positiva para estes 91 amostras de soro detectadas pelo kit de diagnóstico anti-HEV-IgG da Genelabs foi meramente de 24,2%. Como indicado pelos resultados acima, a amostra positiva detectada pelo kit de diagnóstico antiHEV-IgM da presente invenção usando o ensaio de captura está bem de acordo com os diagnósticos clínicos. Além disso, muitas amostras positivas detectadas pelo kit anti-HEV-IgG da Genelabs são também positivos no presente invenção de captura. Isto quer dizer que, o kit anti-HEV-IgM da presente invenção bem como o referido ensaio de capture possui maior sensibilidade e especificidade no diagnóstico clínico de HEV do que os kits comerciais disponíveis existentes.
Exemplo 20: Kit de diagnóstico para detecção dos anticorpos
totais contra | HEV em amostras biológicas e | método para |
detecção dos | anticorpos totais contra HEV | em amostras |
biológicas.
[162] O polipeptídio 225N foi marcado com peroxidase do rábano silvestre (HRP) de acordo com o método descrito nos exemplos 18.
[163] O kit de detecção dos anticorpos totais para HEV contendo os polipeptídios NE2I e 225N da presente invenção compreende: faixas de microtitulação pré-revestidas com o polipeptídio NE2I recombinante e bloqueado com a solução de bloqueamento (20mM, pH7,2 PB, 0,5% de caseína, 2% de gelatina); conjugado de trabalho (polipeptídio 225N marcado cm HRP diluído com enzima diluente (20mM, pH 7,2 PB, 0,5% de caseína, 10% de NBS)); material não-bioreativo, tal como 20x PBST, agente cromatógeno A, agente cromatógeno B e a solução de parada (WANTAI company, Beijing).
[164] O protocolo de detecção do kit da presente invenção
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93/93 é como a seguir descrito: adicionar 50ul do soro e 50ul do polipeptídio 225N recombinante diluído adequadamente que é marcado com HRP dentro da placa de microtitulação na referida faixa que está previamente revestida com o polipeptídio NE2I; misturar através de batidas leves em todos os lados da microplaca; incubar por 60 minutos a 37°C; lavar a microplaca com PBST por 5 vezes; secar através da inversão da microplaca; adicionar 50ul do cromatógeno A e 50ul do cromatógeno B; e então incubar a microplaca durante 15 minutos a 37°C; finalmente, adicionar 50ml de solução de parada em cada poço e misturar gentilmente através de batidas na placa; determinar a absorbância para em poço por OD4 50nm/620nm · [165] Os resultados da detecção são providos como a seguir: detectar com o sanduíche do kit de anticorpos antiHEV total baseado nos polipeptídios NE2I e 225N da presente invenção· 263 soros de pacientes da clínica com hepatite foram detectados com a porcentagem positiva de 52%, enquanto apenas 10,6% foi determinado através da detecção com o kit anti-HEV-IgG da WANTAI· E adicionalmente 91 soros de pacientes com hepatite não-A, não-B, não-C foram detectados usando o mesmo kit sanduíche, com uma porcentagem positiva de 54,9%· Portanto, nestes 91 soros, a porcentagem positiva detectada pelo anti-HEV-IgG da Genelabs foi meramente de 24,2%· Como indicado pelos dados acima, a detecção com o kit de diagnóstico da presente invenção é superior àqueles kits de diagnósticos comercialmente disponíveis existentes para diagnósticos clínicos·
Claims (3)
1) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos dos resíduos de aminoácidos de 414 a 660 da SEQ.ID.NO:1, ou seja, o polipeptídeo 247;
1. Multímero de polipeptídeo monomérico purificado, caracterizado pelo fato de o multímero ser formado pro 2-180 polipeptídios monomérico purificados via auto-agregação, e cada referido polipeptídio monomérico purificado sendo um polipeptído consistindo de um fragmento de aminoácidos como apresentados na SEQ.ID.NO.:1 da ORF 2 do vírus da hepatite E, dito fragmento sendo selecionado do grupo consistindo de:
2/5 definido na reivindicação 1, uma ORF3 do epítopo imunogênico do vírus da hepatite E, tal como representado na SEQ ID NO:11.
4. Composição de vacina para profilaxia e tratamento da infecção por vírus da hepatite E em mamíferos, caracterizada pelo fato de compreender o multímero, conforme definido na reivindicação 3, e veículos farmaceuticamente aceitáveis e/ou adjuvante.
5. Kit de diagnóstico para infecção por vírus da hepatite E em amostras biológicas, caracterizado pelo fato de compreender uma quantidade efetiva para diagnose do multímero conforme definido em qualqur uma das reivindicações 1 ou 3.
6. Kit de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de compreender, adicionalmente, um polipeptídeo contendo epítopo imunogênico da ORF3 do vírus da hepatite E ou um fragmento imunogênico do mesmo, sendo o dito polipeptídeo contendo epítopo imunogênico da ORF3 do vírus da hepatite E ou um fragmento imunogênico do mesmo opcionalmente ligado covalentemente ao polipeptídeo selecionado, como definido na reivindicação 1.
7. Kit de diagnóstico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 ou 6, para determinação do anticorpo IgG contra o vírus da hepatite E em amostras biológicas, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos um dos multímeros conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 3, se desejado, dito polipeptídeo sendo pre-revestido na superfície de um suporte apropriado; e compreende detectável adicionalmente um anticorpo anti-IgG marcador que está direcionado contra a IgG da amostra biológica a ser detectada, e um agente de detecção
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3/5 correspondente ao dito marcador detectável; e, se desejado, compreender adicionalmente, um sistema tampão apropriado.
8. Kit de diagnóstico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 ou 6, para determinação do anticorpo IgM contra o vírus da hepatite E em amostras biológicas, caracterizado pelo fato de compreender um anticorpo anti-IgM marcador detectável como anticorpo de captura que está direcionado contra a IgM da amostra biológica a ser detectada, se desejado, dito anticorpo de captura sendo prerevestido na superfície de um suporte adequado; e compreender, adicionalmente, pelo menos um dos multímeros de marcadores detectáveis, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 3, e um agente de detecção correspondente ao dito marcador detectável; e, se desejado, compreender ainda um sistema de tampão apropriado.
9. Kit de diagnóstico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 ou 6, para determinação dos anticorpos totais contra os vírus da hepatite E em amostras biológicas, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos um dos multímeros conforme definido em qualquer uma as reivindicações 1 ou 3, se desejado, dito polipeptídeo sendo pre-revestido na superfície de um suporte apropriado; e compreender adicionalmente pelo menos um dos multímeros de marcadores detectáveis, e um agente de detecção correspondente ao dito marcador detectável; sendo dito multímero para pre-revestir a superfície de um suporte e o multímero de marcador detectável podendo ser o mesmo ou um diferente.
10. Método de diagnóstico in vitro da infecção por vírus da hepatite E em mamíferos, caracterizado pelo fato de
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4/5 compreender o contato do kit de diagnóstico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 5 ou 6, com a amostra do mamífero para ser detectado sob condições apropriadas para a interação do antígeno ou anticorpo.
11. Método para detecção ín vítro de anticorpos totais contra o vírus da hepatite E em amostras biológicas, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de: imobilizar pelo menos um dos multímeros de polipeptídeos monoméricos, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 3, na superfície de um suporte; contatar este com uma amostra a ser detectada sob condições apropriadas para a interação do antígeno e do anticorpo; lavar com um tampão apropriado; e detectar o complexo antígeno/anticorpo na superfície de um suporte através do uso de um antígeno do vírus da hepatite E com um marcador adequado e um agente detector correspondente.
12. Método para detecção ín vítro do anticorpo IgG contra o vírus da hepatite E em amostras biológicas, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de: imobilizar pelo menos um dos multímeros, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 3, na superfície de um suporte; contatar este com uma amostra a ser detectada sob as condições apropriadas para a interação do antígeno e do anticorpo; lavar com um tampão apropriado; e detectar o complexo antígeno/anticorpo na superfície de um suporte através do uso de anticorpos anti-IgG marcadores detectáveis contra o vírus da hepatite E, e um agente detector correspondente.
13. Método para detectar ín vítro o anticorpo IgM contra o vírus da hepatite E em amostras biológicas, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de: imobilizar o anticorpo anti-IgM na superfície de um suporte; contatar com a amostra
Petição 870190054122, de 12/06/2019, pág. 103/117
5/5 a ser detectada sob as condições apropriadas para a interação do antígeno e do anticorpo; lavar com um tampão adequado; e detectar o complexo anti-IgM/IgM na superfície de um suporte através do uso de marcadores detectáveis de pelo menos um dos multímeros conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 3, e de um agente detector correspondente.
14. Método para detectar in vitro o anticorpo IgM contra o vírus da hepatite E em amostras biológicas, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de: imobilizar o anticorpo anti-IgM na superfície de um suporte; contatá-lo com uma amostra a ser detectada sob condições apropriadas para a interação do antígeno e do anticorpo;
lavar com um tampão apropriado;
e então contatá-lo com pelo menos um dos multímeros conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou
2. Composição de vacina para profilaxia e tratamento da infecção por vírus da hepatite E em mamíferos, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um dos multímeros conforme definido na reivindicação 1 e, opcionalmente, veículos farmaceuticamente aceitáveis e/ou adjuvante.
3. Multímero de polipeptídeos monoméricos purificados, caracterizado pelo fato de dito multímero ser formado por 2180 polipeptídeos monoméricos purificados via auto-agregação, e cada referido polipeptídeo monomérico purificado ser uma proteína quimérica compreendendo um polipeptídeo como
Petição 870190054122, de 12/06/2019, pág. 100/117
2) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos dos resíduos de aminoácidos de 429 a 660 da SEQ.ID.NO:1, ou seja, o polipeptídeo 232;
3) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos dos resíduos de aminoácidos de 439 a 660 da SEQ.ID.NO:1, ou seja, o polipeptídeo 222; e
4) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos dos resíduos de aminoácidos de 459 a 660 da SEQ.ID.NO:1, ou seja, o polipeptídeo 201.
3 sob condições apropriadas para a interação do antígeno e do anticorpo;
lavar com um tampão apropriado;
e então detectar o complexo antígeno/anticorpo na superfície de um suporte através do uso de um marcador detectável anticorpo anti-HEV policlonal ou monoclonal e do agente detector correspondente.
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