NO20120234L - Fusjonsproteiner fra mycobacterium tuberkulose og deres anvedelser - Google Patents
Fusjonsproteiner fra mycobacterium tuberkulose og deres anvedelserInfo
- Publication number
- NO20120234L NO20120234L NO20120234A NO20120234A NO20120234L NO 20120234 L NO20120234 L NO 20120234L NO 20120234 A NO20120234 A NO 20120234A NO 20120234 A NO20120234 A NO 20120234A NO 20120234 L NO20120234 L NO 20120234L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- amino acid
- seq
- acid sequence
- nucleotide sequence
- polynucleotide
- Prior art date
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title abstract description 87
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title abstract description 85
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 title abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 85
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 50
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 146
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 139
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 137
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 54
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 48
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 48
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 48
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 46
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 38
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 37
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 37
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 28
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 28
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 22
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 19
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 15
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 14
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 claims description 13
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 13
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 12
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 10
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 9
- 230000014828 interferon-gamma production Effects 0.000 claims description 7
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 107
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 107
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 107
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 abstract description 82
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 70
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 24
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 65
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 30
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 25
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 24
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 20
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 19
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 19
- 230000004044 response Effects 0.000 description 19
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 17
- 239000000463 material Substances 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 14
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 12
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 11
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 11
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 10
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 8
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 8
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 7
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 7
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 7
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 7
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 7
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- -1 fluorine amino acid Chemical class 0.000 description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 6
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 6
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 5
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 5
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 5
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 230000019734 interleukin-12 production Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 3
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 3
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 3
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 3
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N alpha-aminobutyric acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 3
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 3
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GMRQFYUYWCNGIN-UHFFFAOYSA-N 1,25-Dihydroxy-vitamin D3' Natural products C1CCC2(C)C(C(CCCC(C)(C)O)C)CCC2C1=CC=C1CC(O)CC(O)C1=C GMRQFYUYWCNGIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 101001044384 Mus musculus Interferon gamma Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 101100224410 Solanum tuberosum DPEP gene Proteins 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 2
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- GMRQFYUYWCNGIN-NKMMMXOESA-N calcitriol Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(C)(C)O)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)C[C@H](O)C1=C GMRQFYUYWCNGIN-NKMMMXOESA-N 0.000 description 2
- 229960005084 calcitriol Drugs 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N cysteic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CS(O)(=O)=O XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 230000017307 interleukin-4 production Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 2
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 210000001533 respiratory mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-(cyclohexylazaniumyl)propanoate Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC1CCCCC1 BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-(tert-butylamino)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(C)(C)C MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N (2s)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N (2s)-2-amino-3,3-dimethylbutanoic acid Chemical compound CC(C)(C)[C@H](N)C(O)=O NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- DDMOUSALMHHKOS-UHFFFAOYSA-N 1,2-dichloro-1,1,2,2-tetrafluoroethane Chemical compound FC(F)(Cl)C(F)(F)Cl DDMOUSALMHHKOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HZLCGUXUOFWCCN-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxynonadecane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCC(C(O)=O)C(O)(C(O)=O)CC(O)=O HZLCGUXUOFWCCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229910018626 Al(OH) Inorganic materials 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000581364 Clinitrachus argentatus Species 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000004338 Dichlorodifluoromethane Substances 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- CEXINUGNTZFNRY-BYPYZUCNSA-N Gly-Cys-Gly Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC([O-])=O CEXINUGNTZFNRY-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101100321817 Human parvovirus B19 (strain HV) 7.5K gene Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 125000000773 L-serino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])*)C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 235000006679 Mentha X verticillata Nutrition 0.000 description 1
- 235000002899 Mentha suaveolens Nutrition 0.000 description 1
- 235000001636 Mentha x rotundifolia Nutrition 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 1
- UTGQNNCQYDRXCH-UHFFFAOYSA-N N,N'-diphenyl-1,4-phenylenediamine Chemical compound C=1C=C(NC=2C=CC=CC=2)C=CC=1NC1=CC=CC=C1 UTGQNNCQYDRXCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000702208 Shigella phage SfX Species 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N [2-[3-[6-[3-[(5R,6aS,6bR,12aR)-10-[6-[2-[2-[4,5-dihydroxy-3-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]ethoxy]ethyl]-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]oxy-5-hydroxy-2,2,6a,6b,9,9,12a-heptamethyl-1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-tetradecahydropicene-4a-carbonyl]peroxypropyl]-5-[[5-[8-[3,5-dihydroxy-4-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]octoxy]-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxyoxan-2-yl]propoxymethyl]-5-hydroxy-3-[(6S)-6-hydroxy-2,6-dimethylocta-2,7-dienoyl]oxy-6-methyloxan-4-yl] (2E,6S)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-methylocta-2,7-dienoate Chemical compound C=C[C@@](C)(O)CCC=C(C)C(=O)OC1C(OC(=O)C(\CO)=C\CC[C@](C)(O)C=C)C(O)C(C)OC1COCCCC1C(O)C(O)C(OCC2C(C(O)C(OCCCCCCCCC3C(C(OC4C(C(O)C(O)CO4)O)C(O)CO3)O)C(C)O2)O)C(CCCOOC(=O)C23C(CC(C)(C)CC2)C=2[C@@]([C@]4(C)CCC5C(C)(C)C(OC6C(C(O)C(O)C(CCOCCC7C(C(O)C(O)CO7)OC7C(C(O)C(O)CO7)O)O6)O)CC[C@]5(C)C4CC=2)(C)C[C@H]3O)O1 FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 229940040563 agaric acid Drugs 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000001355 anti-mycobacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960004424 carbon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229930002868 chlorophyll a Natural products 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 229940099112 cornstarch Drugs 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 1
- 229940124447 delivery agent Drugs 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N dichlorodifluoromethane Chemical compound FC(F)(Cl)Cl PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019404 dichlorodifluoromethane Nutrition 0.000 description 1
- 229940042935 dichlorodifluoromethane Drugs 0.000 description 1
- 229940087091 dichlorotetrafluoroethane Drugs 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940079360 enema for constipation Drugs 0.000 description 1
- UVCJGUGAGLDPAA-UHFFFAOYSA-N ensulizole Chemical compound N1C2=CC(S(=O)(=O)O)=CC=C2N=C1C1=CC=CC=C1 UVCJGUGAGLDPAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003979 granulating agent Substances 0.000 description 1
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 1
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 230000006674 lysosomal degradation Effects 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 235000010603 pastilles Nutrition 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920009537 polybutylene succinate adipate Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000016412 positive regulation of cytokine production Effects 0.000 description 1
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 1
- 229940116317 potato starch Drugs 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000029983 protein stabilization Effects 0.000 description 1
- 230000003161 proteinsynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000601 reactogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 229940100486 rice starch Drugs 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000032922 susceptibility to mycobacterium tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 1
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N trichlorofluoromethane Chemical compound FC(Cl)(Cl)Cl CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940029284 trichlorofluoromethane Drugs 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 229940100445 wheat starch Drugs 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
- A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Den foreliggende oppfinnelse vedrører fusjonsproteiner som inneholder to Mycobacterium tuberkulose antigener. Spesielt, vedrører den bi-fusjonsproteiner som inneholder to individuelle M tuberkulose antigener, tri-fusjonsproteiner som inneholder tre M tuberkulose antigener, tetra-fusjonsproteiner som inneholder fire M tuberkulose antigener, og penta-fusjonsproteiner som inneholder fem M tuberkulose antigener, og metoder for deres anvendelse i diagnose, behandling og forebygging av tuberkuloseinfeksjon.
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører immunogent polypeptid som inneholder minst mykobacterium tuberkuloseantigener, polynukleotid som koder for polypeptidene, farmasøytisk sammensetning som omfatter polypeptidene eller polynukleotidene. Videre omfatter oppfinnelsen ekspresjonsvektor som omfatter nevnte polynukleotider, isolert vertcelle, samt en vaksinesammensetning og en fremgangsmåte for å fremstille polypeptidene
Spesielt, vedrører den bi-fusjonsproteiner som inneholder to individuelle M. tuberkuloseantigener, tri-fusjonsproteiner som inneholder tre M.tuberkuloseantigener, tetrafusjonsproteiner som inneholder fire M. tuberkulose-antigener og pentafusjonsproteiner som inneholder fem M. tuberkuloseantigener og fremgangsmåter for deres anvendelse i diagnose, behandling og forebygging av tuberkuloseinfeksjon.
Tuberkulose er en kronisk infeksiøs sykdom forårsaket av infeksjon med M. tuberkulose. Den er en utbredt sykdom i utviklingsland, så vel som et økene problem i utviklede områder i verden, med omtrent 8 millioner nye tilfeller og 3 millioner dødsfall hver år. Skjønt infeksjonen kan være asymptomatisk i en lengre tidsperiode, blir sykdommen vanligvis manifestert som en akutt inflammasjon i lungene, som resulterer i feber og ikke produktiv hoste. Hvis ubehandlet, er resultatet alvorlig komplikasjoner og dør typisk.
Skjønt tuberkulose kan generelt kontrolleres ved å bruke utstrakt antibiotikaterapi, er slik behandling ikke tilstrekkelig for å lindre spredning av sykdommen. Infiserte individer kan være asymptomatisk, men smittsomme i en tidsperiode. I tillegg, skjønt overholdelse av behandlingsregimet er kritisk, er pasient oppførsel vanskelig å måle. Noen pasienter fullfører ikke behandlingen, som kan føre til ineffektiv behandling og utvikling av medikamentresistens.
For å kontrollere spredning av tuberkulose, er effektiv vaksinering og nøyaktig tidlig diagnose av sykdommen svært viktig. For tiden, er vaksinering med levende vaksine den mest effektive metoden for å indusere beskyttende immunitet. Den mest vanlige mycobakterien som anvendes for dette formålet er Bacillus Calmette-Guerin (BCG), og avirulent stamme av M. bovis. Imidlertid, er sikkerheten og effektiviteten til BCG en kilde for kontroversialitet og i noen land, slik som USA vaksineres ikke befolkningen med dette midlet.
Diagnose for tuberkulose oppnås vanligvis ved å bruke en hudtest, som involverer intradermal eksponering til tuberkulin PPD (proteinrenset derivat). Antigen-spesifikk T-celleresponer resulterer i målbar hevelse på injeksjonstedet ved 48-72 timer etter injeksjon, som indikerer eksponering til myobakterielle antigener. Sensitivitet og spesifisitet har, imidlertid, vært et problem med denne testen, og individer vaksinert med BCG kan ikke skjelnes fra infiserte individer.
Mens makrofager har blitt vist å virke som den prinsipielle effektoren til M. tuberkulose immunitet, er T-cellene er de dominerende induserende av slik immunitet. Den essensielle rollen til T-celler i beskyttelse mot M. tuberkulose infeksjon er vist av den hyppige forekomsten av M. tuberkulose i "Acquired Immunodeficiency Syndrome" pasienter som skyldes nedgang av CD4<+>T-celler assosiert med human immunosvikt-virus (HIV) infeksjon. Mycobakterium-reaktive CD4<+>T-celler har blitt vist å være potente produsenter av gamma-interferon (IFN-y) som igjen, har blitt vist å trigge anti-mycobakterielle effekter av makrofager i mus. Mens rollen til IFN-y i mennesker er mindre klar, har studier vist at 1,25-dihydroksy-vitamin D3, enten alene eller i kombinasjon med IFN-y eller tumornekrosefaktor-alfa, aktivere human makrofager for å inhibere M. tuberkulose infeksjon. Dessuten, er det kjent at IFN-y stimulerer humane makrofager til å fremstille 1,25-dihydroksy-vitamen D3. På samme måte, har interleukin-12 (IL-12) blitt vist å spille en rolle i å stimulere resistens mot M tuberkuloseinfeksjon. For en oversikt over immunologien til M. tuberkuloseinfeksjon, se Chan and Kaufrnann, 1994, Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control, Blomm (utg.), ASM Press, Washington, DC.
Følgelig, er det et behov for forbedrede vaksiner, og forbedrede metoder for å diagnostisere, forebygge og behandle tuberkulose.
Foreliggende oppfinnelse vedrører fusjonsproteiner fra M. tuberkuloseantigener. Spesielt, vedrører den fusjonspolypeptider som inneholder to eller flere M. tuberkulose-antigener, polynukleotider som koder for slike polypeptider, fremgangsmåter for å anvende polypeptider og polynukleotider i diagnosen, behandling og forebygging av M. tuberkuloseinfeksj on.
Foreliggende oppfinnelse er basert, delvis, på oppfinnernes oppdagelse at polynukleotider som inneholder to til fem M. tuberkulose kodene sekvenser produserer rekombinante fusjonsproteiner som bibeholder immunogeniteten og antigeniteten fra deres individuelle komponenter. Fusjonsproteinene beskrevet heri induserte både T celler og B celleresponser, målt ved T celleproliferering, cytokinproduksjon og antistoff-produksjon. Dessuten, ble fusjonsprotein brukt som et immunogen med adjuvanter in vivo for å reise både celle-formidlet og humoral immunitet mot M. tuberkulose. I tillegg, ble et fusjonsprotein fremstilt av en fusjonskonstruksjon og brukt i en vaksineformulering med en adjuvant for å oppnå en langtidsbeskyttelse i dyrene mot utvikling av tuberkulose. Fusjonsproteinet var et mer effektivt immunogen enn en blanding av dets individuelle proteinkomponenter.
I en spesifikk utførelsesform av oppfinnelsen, kan det isolerte eller isolerte M. tuberkulosepolypeptidene fra oppfinnelsen bli formulert som farmasøytiske sammensetninger for administrering til et individ for å hindre og/eller behandle M. tuberkulose\ nf& s] on. Immunogeniteten av fusjonsproteinet kan økes ved inklusjon av en adjuvant.
I et annet aspekt av oppfinnelsen, blir isolerte eller rensede polynukloetider brukt for å produsere rekombinant fusjonspolypeptidantigener in vitro. Alternativt, kan polynukleotidene bli administrert direkte inn i et individ som DNA vaksiner for å forårsake antigenekspresjon i individer, og deretter induksjon av en anti-M. tuberkulose-immunrespons.
Det er også et formål med oppfinnelsen at polypeptidene kan bli brukt in vitro analyse for å detektere humorale antistoffer eller cellemediert immunitet mot M. tuberkulose for diagnose av infeksjon eller å måle sykdomsprogresjon. I tillegg, kan polypeptidene blir brukt som et in vivo diagnostisk middel i form av en intradermal hudtest. Alternativt, kan polypeptidene bli brukt som immunogener for å danne anti-M tuberkuloseanti-stoffer i et ikke humant dyr. Antistoffene kan bli brukt for å detektere målantigenene in vivo og in vitro. Figur IA og IB: Nukleotidsekvensen (SEQ ID NR: 1) og aminosyresekvensen (SEQ ID NR: 2) av tri-fusjonsproteinet Ral2-TbH9-Ra35 (kalt Mtb32A). Figur 2: Nukleotidseksensen (SEQ ID NR: 3) og aminosyresekvensen (SEQ ED NR: 4) av tri-fusjonsproteinet Erdl4-DPV-MTl (kalt Mtb39A). Figur 3 A - 3D: Nukleotidsekvensen (SEQ ED NR: 5) og aminosyresekvensen (SEQ ID NR: 6) av tri-fusjonsprotenet TbRa3-38kD-Tb38-l. Figur 4A - 4D: Nukleotidsekvensen (SEQ ID NR: 7) og aminosyresekvensen
(SEQ ID NR: 8) av bi-fusjonsproteinet TbH9-Tb38-l.
Figur 5A - 5J: Nukleotidsekvensen (SEQ ID NR: 9) og aminosyresekvensen (SEQ ID NR: 10) av tetra-fusjonsproteinet TbRa3-38kD-Tb38-l-DPEP (kalt TbF-2). Figur 6A og 6B: Nukleotidsekvensen (SEQ ID NR: 11) og aminosyresekvensen (SEQ ID NR: 12) av penta-fusjonsproteinet Erdl4-DPV-MTl-MSL-MTCC2 (kalt Mtb88f). Figur 7A og 7B: Nukleotidsekvensen (SEQ ID NR: 13) og aminosyresekvensen (SEQ ID NR: 14) av tetra-fusjonsproteinet Erdl4-DPV-MTl-MSL (kalt Mtb46f). Figur 8A og 8B: Nukleotidsekvensen (SEQ ID NR: 15) og aminosyresekvensen (SEQ ID NR: 16) av tetra-fusjonsproteinet DPV-MT1-MSL-MTCC2(kaltMtb71f). Figur 9A og 9B: Nukleotidsekvensen (SEQ ID NR: 17) og aminosyresekvensen (SEQ ID NR: 18) av tri-fusjonsproteinet DPV-MT1-MSL (kalt Mtb31f). Figur 10A og 10B: Nukleotidsekvensen (SEQ ID NR: 19) og aminosyresekvensen (SEQ ID NR: 20) av tri-fusjonsproteinet TbH9-DPV-MT1 (kalt Mtb61f). Figur 1 IA og 1 IB: Nukleotidsekvensen (SEQ ID NR: 21) og aminosyresekvensen (SEQ ID NR: 22) av tri-fusjonsproteinet Erdl4-DPV-MTl (kalt Mtb36f). Figur 12A og 12B: Nukleotidsekvensen (SEQ ID NR: 23) og aminosyresekvensen (SEQ ID NR: 24) av bi-fusjonsproteinet TbH9-Ra35 (kalt Mtb59f). Figur 13A og 13B: Nukleotidsekvensen (SEQ ID NR: 25) og aminosyresekvensen (SEQ ID NR: 26) av bi-fusjonsproteinet Ral2-DPPD (kalt Mtb24). Figur 14A-14F: T celleprolifereringsresponser av seks PPD+ individer når de ble stimulert med to fusjonsproteiner og deres individuelle komponenter. Figur 15A-I5F: IFN-y produksjon av seks PPD+ individer når de ble stimulert
med to fusjonsproteiner og deres individuelle komponenter.
Figur 16A-16F: T celleproliferering av mus immunisert med et fusjonsprotein
eller dets individuelle komponenter og en adjuvant.
Figur 17: IFN-y produksjon av mus immunisert med et fusjonsprotein eller
dets individuelle komponenter og en adjuvant.
Figur 18: IL-4 produksjon av mus immunisert med et fusjonsprotein eller
dets individuelle komponenter og en adjuvant.
Figur 19A-19F: Serumantistoffkonsentrasjoner av mus immunisert med et
fusjonsprotein eller dets individuelle komponenter og en adjuvant.
Figur 20A-20C: Overlevelse av marsvin etter aerosolprovosering med M.
tuberkulose. Fusjonsproteinene Mtb32A og Mtb39A, ble formulert i adjuvant SBASlc (20A), SBAS2 (20B) eller SBAS7 (20C), og brukt som et immunogen i masvin forutfor for provosering med bakterie. BCG er den positive kontrollen. Figur 21A og 21B: Stimulering av proliferering og IFN-y produksjon i TbH9-spesifikke T celler ved fusjonsproteinet TbH9-Tb38-l. Figur 22A og 22B: Stimulering av proliferering og IFN-y produksjon i Tb3 8-1 -
spesifikke T celler ved fusjonsproteinet TbH9-Tb38-l.
Figur 23A og 23B: Stimulering av proliferering og IFN-y produksjon i T celler tidligere vist å respondere på både TbH-9 og Tb38-1 antigener ved fusjonsproteinet TbH9-Tb38-l.
Foreliggende oppfinnelse vedrører antigener som er nyttig for behandling og forebygging av polynukleotider som koder slike antigener og metoder for deres anvendelse. Antigener fra den foreliggende oppfinnelse er fusjonspolypeptider fra M. tuberkuloseantigener og varianter derav. Mer spesifikt, omfatter antigenene fra den foreliggende oppfinnelse minst to polypeptider av M. tuberkulose som settes sammen til et større fusjonspolypeptidmolekyl. Antigenene fra den foreliggende oppfinnelse kan ytterligere omfatte andre komponenter fremstilt for å øke immuniteten til antigenene eller forbedre disse antigenene i andre aspekter, f.eks., isoleringen av disse antigenene gjennom tilsetning av et strekk av histidinresidier i en ende av antigenet.
Antigenene fra den foreliggende oppfinnelse er eksemplifisert i figurene IA til 13B, inklusiv homologer og varianter av disse antigenene. Disse antigenene kan modifiseres f.eks., ved å tilsette linkerpeptidsekvenser som beskrevet under. Disse linkerpeptidene kan settes mellom en eller flere polypeptider som utgjør hver av fusjonsproteinene presentert i figurene IA til 13B. Andre antigener fra den foreliggende oppfinnelse er antigener beskrevet i figurene IA til 13B som har blitt koblet til et kjent antigen hos M. tuberkulose, slik som tidligere beskrevet 38kD (SEQ ID NR: 27) antigen (Andersen and Hansen, 1989, Infect. Immun. 57:2481-2488; Genbank Aksesjonsnummer M30046).
Antigener beskrevet heri og immunogene deler derav, har evnen til å indusere immunogenrespons. Mer spesifikt, har antigene evnen til å indusere proliferering og/eller cytokinproduksjon (dvs. interferon-y og/eller interleukin-12 produksjon) i T celler, NK celler, B celeler og/eller makrofager avledet fra en M. tuberkulose- immunt individ. Seleksjonen av celletype for anvendelse i evaluering av immunogen respons til et antigen vil avhenge av den ønskede responsen. F.eks., blir interleukin-12 produksjonen lettes evaluert ved å bruke fremstillinger som inneholder B celler og/eller makrofager. Et M. tuberkulose- immunt individ er en som man betrakter å være resistent for utvikling av tuberkulose i kraft av å ha en effektiv T cellerespons mot M. tuberkulose (dvs. i det vesentlig fri for sykdomssymptomer). Slike individer kan være identifisert basert på en sterk positiv (dvs. større enn 10 mm diameter hevelse) intradermal hudtestrespons for tuberkuloseproteiner (PPD) og et fravær av et hvilket som helst tegn eller symptomer av tuberkulosesykdom. T celler, NK celler, B celler og makrofager avledet fra M. tuberkulose- immune individer kan fremstilles ved å bruke metoder kjent innen fagfeltet. F.eks., en fremstilling av PBMC (dvs. perifere blod-mononukleærceller) kan anvendes uten ytterligere separasjon av komponentcellene. PBMC kan generelt fremstilles, f.eks., ved å bruke tetthetssentrifugering gjennom "FICOLL" (Winthrop Laboratories, NY). T celler for anvendelse i analysene beskrevet heri kan også renses direkte fra PBMC. Alternativt, kan en anriket T cellelinje som er reaktiv mot mykobakterielle proteiner, eller T cellekloner reaktive for individuelle mykobakterielle proteiner, anvendes. Slike T cellekloner kan fremstilles fra, f.eks., dyrkning av PBMC fra M. tuberkulose- immune individer med mykobakterielle proteiner i en periode på 2-4 uker. Dette tillater ekspansjon av kun de mykobakterielle protein-spesifikke T celler, som resulterte i en linje sammensatt kun av slike celler. Disse cellen kan deretter bli klonet og testet med individuelle proteiner, ved å bruke metoder kjent for en fagperson, for mer å nøyaktig definere individuell T cellespesifisitet. Generelt, antigener som tester positivt i analyse for proliferering og/eller cytokinproduksjon (dvs. interferon-y og/eller interleukin-12 produksjon) utført ved å bruke T celler, NK celler, B celler og/eller makrofager avledet fra en M. tuberkulose- immunt individ blir betraktet som immunogen. Slike analyser kan utføres, f.eks., ved å bruke representative prosedyrer som beskrevet under. Immunogene deler av slike antigener kan identifiseres ved å bruke lignende analyser, og kan være tilstede innenfor polypeptidene beskrevet heri.
Evnen til et polypeptid (f.eks. et immunogent antigen, eller en del eller annen variant derav) for å indusere celleproliferering blir evaluert ved å bringe cellene i kontakt (f.eks., T celler og/eller NK celler) med polypeptidet og måle prolifereringen av cellene. Generelt, er mengden av polypeptid som er tilstrekkelig for evaluering av omtrent 10<5>celler varierer fra omtrent 10 ng/ml til omtrent 100 ug/ml og fortrinnsvis er omtrent 10 ug/ml. Inkuberingen av polypeptidet med celler blir typisk utført ved 37°C i omtrent seks dager. Etter inkubering med polypeptidet, blir cellene analysert for proliferativ respons, som kan evalueres ved kjente metoder innen fagfeltet, slik som å eksponere cellene til en puls av radioaktivt merket tymidin og måle inkorporeringen av innmerking i cellulært DNA. Generelt, blir et polypeptid som resulterer i minst tre gangers økning i prolifereringen over bakgrunnen (dvs. prolifereringer observert for celler dyrket uten polypeptider) betraktet å være i stand til å indusere proliferering.
Evnen til et polypeptid å stimulere produksjonen av interferon-y og/eller interleukin-12 i celler kan evalueres ved å bringe cellene i kontakt med polypeptidet å måle nivået av interferon-y eller interleukin-12 produsert av cellene. Generelt, er mengden av polypeptid som er tilstrekkelig for evaluering av IO<5>celler varierende fra omtrent 10 ng/ml til omtrent 100 u.g/ml og fortrinnsvis omtrent 10 ug/ml. Polypeptidet kan være, men behøver ikke å være, immobilisert på et fast støtteunderlag, slik som en kule eller biodegraderbar mikrosfære, slik som de som er beskrevet i U.S. patent nr. 4,897,268 og 5,075,109. Inkubering av polypeptidet med cellene blir utført ved 37°C i omtrent seks dager. Etter inkubering med polypeptidet, blir cellene analysert for interferon-y og/eller interleukin-12 (eller en eller flere subenheter derav), som kan evalueres ved fremgangsmåter kjent innen fagfeltet, slik som et enzymkoblet immunosorbentanalyse (ELISA) eller, i tilfellet av IL-12 P70 subenheten, en bianalyse slik som en analyse som måler proliferering av T celler. Generelt, blir et polypeptid som resulterer i produksjon av minst 50 pg av interferon-y per ml av dyrket supernatant (som inneholder IO<4->10<5>T celler per ml) blir betraktet å være i stand til å stimulere produksjon av interferon-y. Et polypeptid som stimulerer produksjonen av minst 10 pg/ml av IL-12 P70 subenhet, og/eller minst 100 pg/ml av IL-12 P40 subenhet, per 10<5>makrofager eller B celler (eller per 3 x IO<5>PBMC) blir betraktet å være i stand til å stimulere produksjon av IL-12.
Generelt, er immunogene antigener de antigenene som stimulerer proliferering og/eller cytokinproduksjon (dvs. interferon-y og/eller interleukin-12 produksjon) i T celler, NK celler, B celler og/eller makrofager avledet fra mint 25% av M. tuberkulos- immune individer. Blant disse immunogene antigenene, kan polypeptidene som har overlegne terapeutiske egenskaper blir holdt fra hverandre basert på størrelsen på responsen i de ovenfor nevnte analyser og basert på prosentandelen av individer for hvilke en respons blir observert. I tillegg, vil antigener som har overlegne terapeutiske egenskaper ikke stimulere proliferering og/eller cytokinproduksjon in vitro i celler avledet fra mer enn omtrent 25% av individene som ikke er M. tuberkulose- immune, for derved å eliminere responsene som ikke er spesifikke på grunn av M. tuberkulose- responsive celler. Disse antigenene som induserer en respons i en høy prosentandel av T cellen, NK cellen, B cellen og/eller makrofagprepareringene fra M. tuberkulose- immune individer (med en lav insidens av respons i celleprepareringene fra andre individer) har overlegne terapeutiske egenskaper.
Antigener med overlegne terapeutiske egenskaper kan også bli identifisert og basert på deres evne til å minske alvorligheten av M. tuberkulose infeksjon i forsøksdyr, når det blir administrert som en vaksine. Egnede vaksinefremstillinger for anvendelse på forsøksdyr er beskrevet i detalj under. Effektiviteten kan bestemmes ved å se på evnen til antigen og tilveiebringe minst omtrent 50% reduksjon i bakterieantall og/eller minst omtrent en 40% nedgang i mortalitet etter eksperimentell infeksjon. Egnede forsøksdyr inkluderer mus, marsvin og primater.
Den foreliggende oppfinnelse vedrører også nukleinsyremolekyler som koder for fusjonspolypeptidene til M. tuberkulose. I en spesifikk utførelsesform ved eksemplet i eksempeldelen, ble tretten M. tuberkulose fusjonskodene sekvenser konstruert. I overenstemmelse med oppfinnelsen, kan en hvilken som helst nukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensen til fusjonsproteinet bli brukt for å danne rekombinante molekyler som dirigerer ekspresjonen av den kodene sekvensen.
For å klone fullengde kodene sekvenser eller homologe varianter for å fremstille fusjonspolynukleotider, kan merkede DNA prober designet fra en hvilken som helst del av nukleotidsekvensene eller deres komplementer beskrevet heri bli brukt for å screene et genomisk eller cDNA bibliotek fremstilt fra forskjellige stammer av M. tuberkulose for å identifisere den kodene sekvensen til hver individuell komponent. Isolering av kodene sekvenser kan også bli utført ved polymerasekjedereaksjoner (PCR) ved å bruke to degenererte oligonukleotidprimersamlinger designet på basis de kodene sekvensene beskrevet heri.
Oppfinnelsen vedrører også isolater eller rensede polynukleotider komplementære til nukleotidsekvensene fra SEQ ID NR: 1, 3, 5,7, 9,11,13,15,17,19,21,23 og 25, og polynukleotider som selektivt hybridiserer til slike komplementære sekvenser. I en foretrukket utførelsesform, blir et polynukleotid som hybridiserer til sekvensen fra SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 9,11,13,15,17,19, 21,23 og 25 eller det komplementære sekvens under betingelser med lav stringens og koder for et protein som bibeholder immunogeniteten til fusjonsproteinene fra SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8,10,12,14,16,18,20,22,24 og 26 tilveiebrakt. Ved eksemplet og ingen begrensning, er eksempelbetingelsene for lav stringens som følger (se også Shilo and Weinberg, 1981, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78:6789-6792): filtrene som inneholder DNA blir forbehandlet i 6 timer ved 40°C til en løsning som inneholder 35% formamid, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,1% PVP, 0,1%) Ficoll, 1% BSA og 500 ug/ml denaturert laksesperm DNA. Hybridiseringene ble utført i samme løsning med følgende modifiseringer; 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,2% BSA, 100 ug/ml laksesperm DNA, 10% (vekt/volum) dekstransulfat, og 5-20 X IO<6>cpm<32>P-merked probe blir brukt. Filtrene blir inkubert i hybridiseringsblanding i 18-20 timer ved 40°C og deretter vasket i 1,5 timer ved 55°C i en løsning som inneholder 2 X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA og 0,1% SDS. Vaskeløsningen ble erstattet med fersk løsning og inkubert i ytterligere 1,5 time ved 60°C. Filtrene blir blottet tørrer og eksponert for autoradiografi. Hvis nødvendig, blir filtrene vasket en tredje gang ved 65-68°C og reeksponert for filmen. Andre betingelser med lav stringens som kan anvendes er velkjent innen fagfeltet (f.eks. som anvendt for kryss-artshybirdiseringer).
I en annen foretrukket utførelsesform, blir et polynukleotid som hybridiserer til den kodene sekvensen til SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 9,11,13,15,17,19,21,23 og 25 eller det komplementære sekvens under betingelser med høy stringens og som koder for et protein som bibeholder immunogeniteten til fusjonsproteinene fra SEQ ID NR: 2,4, 6, 8,10, 12, 14,16, 18,20,22,24 og 26 tilveiebrakt. Via eksmpler og ikke begrensning, er eksempelbetingelsene for høy stringens som følger: prehybridisering av filtrene som inneholder DNA blir utført i 8 timer til over natten ved 65°C i buffer sammensatt av 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA, og 500 jig/ml denaturert laksesperm DNA. Filtrene ble hybridisert i 48 timer ved 65°C i prehybridiseringsblanding som inneholder 100 ug/ml denaturert laksesperm DNA og 5-20 X IO<6>cpm av<32>P-merket probe. Vasking av filtrene blir utført ved 37°C i 1 time i en løsning som inneholder 2X SSC, 0,01% PVP, 0,01% Ficoll og 0,01 BSA. Dette etterfølges av en vask i 0,1X SSC ved 50°C for 45 minutter før autoradiografi. Andre betingelser for høy stringens som kan bli brukt er velkjent innen fagfeltet.
I enda en annen utførelsesform, blir et polypeptid som hybridiserer til den kodene sekvensen fra SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 9,11,13,15,17,19,21,23 og 25 eller deres komplementære sekvens under betingelser for moderat stringens og som koder et protein som bibeholder immunogeniteten av fusjonsproteinene fra SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8,10,12,14,16,18, 20,22,24 og 26 tilveiebrakt. Eksempelbetingelser for moderat stringens er som følger: filtrene som inneholder DNA blir forbehandlet i 6 timer ved 55°C i en løsning som inneholder 6 X SSC, 5X Denharfs løsning, 0,5% SDS og 100 ug/ml denaturert laksesperm DNA. Hybridiseringene blir utført i samme løsning og 5-20 X IO<6>cpm<32>P-merket probe blir brukt. Filtrene blir inkubert i hybridiserings-blandingen ved 18-20 timer ved 55°C, og deretter vasket to ganger i 30 minutter ved 60°C i en løsning som inneholder IX SSC og 0,1% SDS. Filtrene blir blottet tørre og eksponert for autoradiografi. Andre betingelser for moderat stringens som kan anvendes er velkjent innen fagfeltet. Vasking av filtrene blir utført ved 37°C i 1 time i en løsning som inneholder 2X SSC, 0,1% SDS.
I overensstemmelse med oppfinnelsen, kan et polynukleotid fra oppfinnelsen som koder for et fusjonsprotein, fragmenter derav, eller funksjonelle ekvivalenter derav blir brukt for å fremstille rekombinante nukleinsyremolekyler som dirigerer ekspresjon av fusjonsproteinet, fragmenter derav, eller funksjonelle ekvivalenter derav, i egnede vertsceller. Fusjonspolypeptidproduktene som kodes for av slike polynukleotider kan endres ved molekylær manipulering av den kodene sekvensen.
På grunn av innebygget degenerering av den genetiske kode, kan andre DNA sekvenser som koder for i det vesentlige samme eller funksjonelt ekvivalent aminosyresekvens, bli brukt i utførelse av oppfinnelsen for ekspresjon av fusjonspolypeptidene. Slike DNA sekvenser inkluderer de som er i stand til å hybridisere til de kodene sekvensene eller deres komplementer beskrevet heri under lav, moderat eller stringente betingelser beskrevet i avsnittet over.
Endrede nukleotidsekvenser som kan bli brukt i samsvar med overensstemmelse med oppfinnelsen inkluderer delesjoner, addisjoner og substitusjoner av forskjellige nukleotidresidier som resulterer i en sekvens som koder for det samme eller et funksjonelt ekvivalent genprodukt. Genproduktet i seg selv kan inneholde delesjoner, addisjoner eller substitusjoner av aminosyreresidier, som resulterer i en stille endring som allikevel produserer funksjonelt ekvivalent antigenepitop.
Slike konservative aminosyresubstitusjoner kan gjøres på basis av likhet i polaritet, ladning, løselighet, hydrofobisitet, hydrofilisitet, og/eller amfifatisk egenskap til residiene som er involvert. F.eks., inkluderer negativt ladede aminosyrer asparaginsyre og glutaminsyre; positivt ladede aminosyrer inkuderer lysin, histidin og arginin; aminosyrer med uladede polare hodegrupper som har lik hydrofilisitetsverdier inkluderer følgende: glycin, asparagin, glutamin, serin, treoning og tyrosin; og aminosyrer med nonpolare hodegrupper inkluderer alanin, valin, isoleucin, leucin, fenylalanin, prolin, metionin og tryptofan.
Nukleotidsekvensene fra oppfinnelsen kan fremstilles for å endre fusjonsproteinkodene sekvens for forskjellige ender, inklusiv men ikke begrenset til, endringer som modifiserer prosessering og ekspresjon av genproduktet. F.eks., kan mutasjonene introduseres ved å bruke teknikker som er velkjent innen fagfeltet, f.eks. setedirigert mutagenese, for å sette inn nye restriksjonsseter, for å endre glykosyleringsmønstrene, fosforylering, etc.
I en alternativ utførelsesform av oppfinnelsen, kan den kodene sekvensen til et fusjonsprotein bli syntetisert i et hele eller en del, ved å bruke kjemiske metoder velkjent innen fagfeltet. Se f.eks. Caruthers et al, 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7:215-233; Crea and Horn, 180, Nuc, AcidsRes. 9( 10) :233l; Matteucci and Caruthers, 1980, Tetrahedron Letter 27:719; og Chow and Kempe, 1981, Nuc. Acids Res. 9(12):2807-2817. Alternativt, kan polypeptidet i seg selv bli produsert ved å bruke kjemiske metoder for å syntetisere en aminosyresekvens i et hele eller en del. F.eks., kan peptidene syntetiseres ved fast faseteknikker, kuttet fra resin, og renset ved preparativ høyutførelsesflytene kromatografi. (Se Creighton, 1983, Proteins Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman og Co., N.Y. sidene 50-60). Sammensetningen av de syntetiske polypeptidene kan bli bekreftet ved aminosyreanalyse eller sekvensering (f.eks., Edman degraderingsprosedyre; se Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y., sidene 34,49).
I tillegg, kan den kodene sekvensen til et fusjonsprotein bli mutert in vitro eller in vivo, for å danne og/eller ødelegge translasjon, initiering og/eller termineringssekvenser, eller å danne variasjoner i de kodene regionene og/eller danne nye restriksjonendonuklease-seter eller ødelegge allerede eksisterende, for å lette ytterligere in vitro modifisering. I hvilken som helst teknikk for mutagenese kjent innen fagfeltet kan brukes, inklusiv, men ikke begrenset til kjemisk mutagenese, in vitro setedirigert mutagenese (Hutchinson, C, et al, 1978, J. Biol. Chem 253-6551), anvendelse av TAB linkere (Pharmacia) og dets like. Det er viktig av manipuleringene ikke ødelegger immunogeniteten til fusjonspolypeptidene.
I tillegg, kan ikke klassiske aminosyrer eller kjemiske aminosyreanaloger bli introdusert som en substitusjon eller addisjon til sekvensen. Ikke klassiske aminosyrer inkluderer, men er ikke begrenset til, D-isomerer av vanlige aminosyrer, a-aminoisobutyrinsyre, 4-aminobutyrinsyre, Abu, 2-aminobutyrinsyre, y-Abu, e-Ahx, 6-aminohekanoinsyre, Aib, 2-aminoisobutyrinsyre, 3-aminopropionsyre, ornitin, norleucin, norvalin, hydroksy-prolin, sarcosin, sitrulin, cysteinsyre, t-butylglycin, t-butylalanin, fenylglycin, cykloheksylalanin, J3-alanin, fluor-aminosyre, designeraminosyre slik som fi-metylaminosyres, Ca-metylaminosyrer, Na-metylaminosyre, og aminosyreanaloger i generell. Dessuten, kan aminosyren være D (dekstrorotering) eller L (levorotering).
I en spesifikk utførelsesform, blir de kodene sekvensene til hvert anitgen i fusjonsproteinene satt sammen i deres amino- eller karboksy-terminale ende via en
peptidbinding i en hvilken som helst rekkefølge. Alternativt, kan peptidlinkersekvensen anvendes for å separerer individuelle polypeptider som utgjør et fusjonspolypeptid med en distanse som er tilstrekkelig for å sikre at hvert polypeptid foldes til et sekundært og tertiærstruktur som maksimaliserer dets antigene effektivitet for å forebygge og
behandle tuberkulose. En slik peptidlinkersekvens blir inkorporert i fusjonsproteinet ved å bruke standarteknikker velkjent innen fagfeltet. Egnede peptidlinkersekvenser kan bli valgt basert på følgende faktorer: (1) deres evne til å adoptere en fleksibel utstrakt konformasjon; (2) deres evne til å adoptere sekundærstruktur som kan reagere med funksjonelle epitoper på den første og andre polypeptidet; og (3) mangel på hydrofobe eller ladede residier som kan reagere med polypeptidfunksjonelle epitoper. Foretrukket peptidlinkersekvenser inneholder Gly, Asn og Ser residier. Andre nær nøytrale aminosyrer, slik som Thr og Ala, kan også bli brukt i linkersekvensen. Aminosyresekvensene som kan være nyttige å anvende som linkere inkluderer de som er beskrevet i Maratea et al, Gene 40:39-46,1985; Murphy et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:8258-8262, 1986; U.S. patent nr. 4,935,233 og U.S. patent nr. 4,751,180. Linkersekvensen kan være fra 1 til omtrent 50 aminosyrer i lengde. Peptidsekvensene kreves ikke når de første og andre polypeptidene har ikke essensiell N-terminal aminosyreregioner som kan bli brukt for å separere funksjonelle domener og hindre sterisk interferens. F.eks., kan antigenene i et fusjonsprotein bli bundet sammen av en fleksibel polylinker som som Gly-Cys-Gly eller Gly-Gly-Gly-Gly-Ser repertert 1 til 3 ganger (Bird et al, 1988, Science 242:423-426; Chaudhary et al, 1990, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:1066-1070).
I en utførelseform, blir et slik protein produsert ved rekombinant ekspresjon av en nukleinsyre som koder for proteinet. Et slikt fusjonsprodukt kan fremstilles ved ligering av egnet nukleinsyresekvenser som koder for ønskede aminosyresekvenser til hverandre ved metoder kjent innen fagfeltet, i riktig leseramme, og som uttrykker produktet ved fremgangsmåter kjent innen fagfeltet. Alternativt, kan et slikt produkt bli fremstilt ved proteinsyntetiske teknikker, f.eks., ved anvendelse av peptidsyntetiseringsmaskin. Kodene sekvenser for andre molekyler slik som et cytokin eller en adjuvant kan tilsettes til fusjonspolynukleotidet også.
For å produsere et M.fø&erÆw/osefusjonsprotein fra oppfinnelsen, blir nukleotidsekvensen som koder for proteinet eller funksjonelt ekvivalent, satt inn i en egnet ekspresjonsvektor, dvs. en vektor som inneholder de nødvendige elementene for transkripsjon og translasjon av den innsatte kodene sekvens. Vertscellene eller cellelinjene transfektert eller transformert med rekombinante ekspresjonsvektorer kan bli brukt for forskjellige formål. Dette inkluderer, men er ikke begrenset til, storskala-produksjon av fusjonsproteinet.
Fremgangsmåter som er velkjent innen fagfeltet kan bli brukt for å konstruere ekspresjonsvektorer som inneholder en fusjon kodene sekvens og egnet transkripsjon/ translasjonskontrollsignalet. Disse fremgangsmåtene inkluderer in vitro rekombinante DNA teknikker, syntetiske teknikker og in vivo rekombinasjon/genetisk rekombinasjon.
(Se f.eks. teknikkene beskrevet i Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. og Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y.). RNA som er i stand til å kode for et polypeptid kan også bli kjemisk syntetisert. (Gait, utg. 1984, Oligonucleoide Synthesis, IRL Press, Oxford). Forskjellige vertscelleekspresjonsvektorsystemer kan utnyttes for å uttrykke en fusjonsproteinkodene sekvens. Disse inkluderer men er ikke begrenset til, mikroorganismer slik som bakterier (f.eks. E. coli, B. subtilis) transformert med rekombinant bakteriofag DNA, plasmid DNA eller cosmid DNA ekspresjonsvektorer som inneholder en kodene sekvens; gjær (f.eks. Saccaromycdes, Pichia) transformert med rekombinant gjærekspresjonsvektorer som inneholder en kodene sekvens; insektscellesystemer infisert med rekombinante virusekspresjonsvektorer (f.eks. baculovirus) som inneholder en kodene sekvens; plantecellesystemer infisert med rekombinant virusekspresjonsvektorer (f.eks. blomkål mosaikkvirus, CaMV; tobakk mosaikkvirus, TMV) eller transformert med rekombinante plasmid ekspresjonsvektorer (f.eks. Ti plasmid) som inneholder en kodene sekvens; eller mammaliske cellesystemer (f.eks. COS, CHO, BHK, 293, 3T3 celler). Ekspresjonselementene til disse systemene varierer i deres styrke og spesifisiteter.
Avhengig av vert/vektorsystemet som benyttes, kan et hvilket som helst antall av egnede transkripsjon og translasjonselementer, inklusiv konstitutive og induserbare promoterer, bli brukt i ekspresjonsvektoren. F.eks., når man kloner i bakterielle systemer, kan enduserbare promoterer slik som pL og bakteriofag X, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac hybridpromoter; cytomegaloviruspromoter) og dets like bli brukt; når en kloner i insekts cellesystemer, kan promotere slik som baculoviruspolyhedronpromoter bli brukt; når man kloner i plantecellesystemer, kan promotere avledet fra genomet til plantecellene (f.eks. varmesjokkpromotere; promoteren for lille subenheten til REBISCO; promoteren for klorofyll a/ R bindingsprotein) eller fra plantevirus (f.eks. 35S RNA promoter fra CaMV; kappeproteinpromoteren til TMV) anvendes; når en kloner i mammalske cellesystemer, kan promotere avledes fra genomet til mammalske celler (f.eks. metallotioneinpromoter) eller fra mammalske virus (f.eks. adenovirussen-promoter; vaksiniavirus 7,5K promoter) anvendes; når det dannes cellelinjer som inneholder mange kopier av en antigenkodende sekvens, kan SV40-, BPV- og EBV-baserte vektorer anvendes med en egnet selekterbar markør.
Bakterielle systemer blir foretrukket for ekspresjon av M. tuberkuloseantigener. For in vivo avlevering, kan en bakterie slik som Bacillus- Calmette- Guerrin bli fremstilt for å uttrykke et fusjonspolypeptid fra oppfinnelsen på dets celleoverflate. Et antall av andre bakterielle ekspresjonsvektorer kan med fordel bli selektert avhengig av anvendelsen for de uttrykte produktene. F.eks., når store kvanta av fusjonsprotein blir produsert for formulering for farmasøytiske samemnsetninger, blir vektorene som dirigerer ekspresjonen av høynivå av fusjonsproteinproduktene som lett kan renses kan være ønskelig. Slike vektorer, inkluderer men er ikke begrenset til E. coli ekspresjonsvektoren pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), hvor i en kodende sekvens kan ligeres inn i vektoren i leseramme med lacZ kodene region slik at et hybridprotein blir produsert; pIN vektorer (Inouye and Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; VanHeeke and Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509); og dets like. pGEX vektorene kan også bli brukt for å uttrykke fremmede polypeptider som fusjonsproteiner med glutation S-transferase (GST). Generelt, er slike fusjonsproteiner løselig og kan renses lett fra lyserte celler ved adsorpsjon ved glutation-agarosekuler etterfulgt av eluering ved tilstedeværelse av fritt glutation. pGEX vektorene er designet for å inkludere trombin eller faktor Xa proteasekuttingseter slik at de klonede fusjons-polypeptidet av interesse kan frigis fra GST delen.
Når et rekombinant protein blir uttrykt, kan det identifiseres ved analyser basert på fysiske eller funksjonelle egenskaper til produktet, inklusiv radioaktiv merking av produktet etterfulgt av analyse ved gelelektroforese, radioimmunoanalyse, ELISA, bianalyser, etc.
Når det kodede proteinet blir identifisert, kan det bli isolert og renset ved standardmetoder inklusiv kromatografi (f.eks. "high performance" flytene kromatografi, ionebytte, affinitet og størrelseskolonnekromatografi), sentrifugering, differensiell løselighet, eller ved en hvilken som helst annen standardteknikk for rensing av proteiner. De aktuelle betingelsene som blir brukt vil avhenge, i delvis, av faktorer slik som nettoladning, hydrofobisitet, hydrofilisitet, etc, og vil være tydelig for den som kjenner fagfeltet. Funksjonelle egenskaper kan evalueres ved å bruke en hvilken som helst egnet analyse, slik som antistoffbinding, induksjon av T celleproliferering, stimulering av cytokinproduksjon slik som IL2, IL-4 og IFN-y. For utførelse av den foreliggende oppfinnelse, er det foretrukket at hvert fusjonsprotein er minst 80% renset fra andre proteiner. Det er mer foretrukket at det er minst 90% renset. For in vivo administrering, er det foretrukket at proteinene er mer enn 95% renset.
Fusjonsproteinkodene sekvens fra oppfinnelsen kan brukes for å kode et proteinprodukt for anvendelse som et immunogen for å indusere og/eller forsterke immunresponsen for M. tuberkulose. I tillegg, kan en slik kodene sekvens ligeres med en kodene sekvens fra et annet molekyl slik som cytokin eller adjuvant. Slike polynukleotider kan bli brukt in vivo som en DNA vaksine (U.S. patent nr. 5,589,466; 5,679,647; 5,703,055). I denne utførelsesform av oppfinnelsen, uttrykker polynukleotidet dets kodede protein i en resipient for direkte å indusere en immunrespons. Polynukleotidet kan injiseres inn i et individ for å prime en immunrespons til dets kodede produkt, eller administreres til en infisert eller immunisert individ for å forsterke de sekundære immunresponsene.
I en foretrukket utførelsesform, omfatter den terapeutiske sammensetning en fusjonsprotein kodene sekvens eller fragmenter derav som er en del av ekspresjonsvektoren. Spesielt, inneholder et slikt polynukleotid en promoter som er operativt koblet til den kodene regionene, hvor nevnte promoter er induserbar eller konstitutiv, og, eventuelt vevsspesifikk. En annen utførelsesform, inneholder et polynukleotid en kodene sekvens flankert av regioner som fremmer homolog rekombinasjon ved et ønsket sete i genomet, for derved å tilveiebringe intrakromosomal ekspresjon av den kodene sekvensen (Koller and Smithies, 1989, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438).
Avlevering av nukleinsyren i et subjekt kan enten være direkte, i hvilke tilfellet individet blir direkte eksponert til nukleinsyren eller nukleinsyrebærervektoren, eller indirekte, som er tilfellet, blir cellene først transformert med nukleinsyren in vitro deretter transplantert inn i individet. Disse to tilnærmingsmåtene er kjent, respektivt, som in vivo eller ex vivo genoverføring.
I en spesifikk utførelsesform, blir nukleinsyren direkte administrert in vivo, hvor den blir uttrykt for å produsere det kodede fusjonsproteinproduktet. Dette kan utføres ved hvilken som helst av fremgangsmåtene kjent innen fagfeltet, f.eks., ved å konstruere den som en del av en egnet nukleinsyreekspresjonsvektor og administrere den slik at den blir intracellulær, f.eks. ved infeksjon ved å bruke et defekt eller attenuert retroviralt eller andre virale vektorer (se U.S. patent nr. 4,980,286) eller ved direkte injeksjon av nakent DNA, eller ved anvendelse av mikropartikkelbombardering (f.eks. en genpistol; Biolistic, Dupont), eller overtrekkes med lipider eller celleoverflatereseptorer eller transfekterende midler, innkapslet i liposomer, mikropartikler eller mikrokapsler (USA patent nr. 5,407,609; 5,853,763; 5,814,344 og 5,820,883), eller ved å administrere den i kobling med et peptid som er kjent å inn i kjernen, ved å administrere den sammen med en ligand som utsettes for reseptormediert endocytose (se f.eks. Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432) som kan bli brukt for å målsøke celletyper som spesifikt uttrykker reseptorer, etc. En annen utførelsesform, kan en nukleinsyreligandkompleks bli dannet hvor i liganden omfatter et fusogenisk viralt peptid som ødelegger endosomene, som tillater nukleinsyrene å unngå lysosomal degradering. I enda en annen utførelsesform, kan nukleinsyren bli målrettet in vivo for cellespesifikt opptak og ekspresjon, ved å målsøke en spesifikk reseptor (se f.eks. PCT publikasjon WO 92/06180 datert 16 april 1992; WO 92/22635 datert 3 desember 1992; WO 92/20316 datert 26 november 1992; WO 93/14188 datert 22 juli 1993; WO 93/20221 datert 4 oktober 1993). Alternativt, kan nukleinsyren introduseres intracellulært og inkorporeres i vertscelle DNA for ekspresjon, ved homolog rekombinasjon (Koller and Smithies, 1989, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:8932-8935; Zijilstra et al., 1989, Nature 342:435-438).
I en spesifikk utførelsesform, kan en viral vektor slik som en retroviralvektor bli brukt (se Miller et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599). Retrovirale vektorer har blitt modifisert til å deletere retrovirale sekvenser som ikke er nødvendig for pakking av det virale genomet og integrering inn i vertscelle DNA. En fusjonskodene sekvens blir klonet inn i vektoren, som letter avlevering av nukleinsyren til en resipient. Mer detaljer om retrovirale vektorer kan finnes i Boesen et al., 1994, Biotherapy 6:291-302, som beskriver anvendelsen av retroviral vektor for avlevering av mdrl genet til hematopoetiske stamceller for å fremstille stamceller som er resistente mot kjemoterapi. Andre referanser som illustrerer anvendelse av retrovirale vektorer i genterapi er: Clowes et al, 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651; Kiem et al, 1994, Blood 83:1467-1473; Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141; og Grossman and Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114.
Adenovirus er andre virale vektorer som kan bli brukt i genterapi. Adenovirus er spesielt attraktive bærere for å avlevere gener til respiratorisk epitel. Adenovirus infiserer naturlig respiratorisk epitel hvor de kan forårsake en mild sykdom. Andre mål for adenovirusbasert avleveringssystemer er lever, sentralnervesystemet, endotelceller, og muskler. Adenovirus har den fordel å være i stand til å infisere ikke-delene celler. Adenoassosierte virus (AAV) har også blitt fremstilt for anvendelse i in vivo genoverføring (Walsh et al, 1993, Proe. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300).
En annen tilnærming involverer overføring av en konstruksjon til celler i vevskultur ved slike metoder som elektroporatin, lipofektin, kalsiumfosfatformidlet transfeksjon, eller viral infeksjon. Vanligvis, inkluderer fremgangsmåten for overføring av en selekterbar markør til cellene. Cellene blir deretter plassert under seleksjon for å isolere de cellene som har tatt opp og som uttrykker det overførte genet. Disse cellene blir deretter avlevert til et individ.
I denne utførelsesformen, blir nukleinsyren introdusert i en celle forut for administreringen in vivo av den resulterende rekombinante cellen. Slik introduksjon kan utføres ved en hvilken som helst kjent metode innen fagfeltet, inklusiv men ikke begrenset til transfeksjon, elektroporering, mikroinjeksjon, infeksjon med en viral eller bakteriofag vektor som inneholder nukleinsyresekvenser, cellefusjon, kromosom-formidlet genoverføring, mikrocelleformidlet genoverføring, sferoplastfusjon, etc. Mange teknikker er kjent innen fagfeltet for introduksjon av fremmede gener inn i celler (se f.eks. Loeffler and Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618; Cohen et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644; Cline, 1985, Pharmac, Ther. 29:69-92) og kan bli brukt i samsvar med foreliggende oppfinnelse.
Polynukleotidene fira oppfinnelsen kan også bli brukt i diagnose av tuberkulose for deteksjon av polynukleotidsekvenser sepsifikke for M. tuberkulose i en pasient. Slik deteksjon kan fullføres, f.eks., ved å isolere polynukleotider fra biologisk prøve, ervervet fra en pasient som er følsom for å bli infisert med en bakterie. Ved isolering av polynukleotidene fra den biologiske prøven, vil et merket polynukleotid fra oppfinnelsen som er komplementære til en eller flere av polynukleotidene, tillates å hybridisere til polynukleotidene i den biologiske prøve ved å bruke teknikker for nukleinsyrehybridisering som er kjent for en fagperson innen fagfeltet. F.eks., kan en slik hybridisering bli utført i løsning eller med en hybridiseirngspartner på et fast støtteunderlag.
Renset eller delvis renset fusjonsproteiner eller fragmenter derav kan formuleres som en vaksine eller terapeutisk sammensetning. Slik sammensetning kan inkludere adjuvanter for å forsterke immunresponsene. I tillegg, kan slike proteiner ytterligere bli suspendert i en oljeemulsjon for å forårsake en langsommere frigivelse av proteinene in vivo ved injeksjon. De optimale reatio av hver komponent i formuleringen kan bestemmes ved teknikker velkjent for de som kjenner fagfeltet.
En hvilken som helst av adj uvanter kan anvendes i vaksinene fra denne oppfinnelsen for å forsterke immunresponsen. De fleste adj uvanter inneholder en substans som er designet for å beskytte antigen fra rask katabolisme, slik som aluminiumhydroksid eller mineralolje, og en ikke spesifikk stimulator for immunresponser, slik som lipid A, Bortadalle pertussis eller Mycobacterium tuberkulosis. Egnede adjuvanter er kommersielt tilgjengelig og inkluderer f.eks., fra ufullstendig adjuvant og Freunds fullstendige adjuvant (Difco Laboratories) og Merck adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ). Andre egnede adjuvanter inkluderer alum, biodegraderbare mikrosfærer, monofosforyl lipid A, quil A, SMASlc, SBAS2 (Ling et al., 1997, Vaccine 15:1562-1567), SM AS 7 og Al(OH)3.
I vaksinene fra den foreliggende oppfinnelse er det foretrukket at adjuvanten induserer en immunrespons som omfatter Thl aspektene. Egnede adjuvantssystemer inkluderer, f.eks., en kombinasjon av monofosforyllipid A, fortrinnsvis 3-di-O-acylert monofosforyl lipid A (3D-MLP) sammen med et aluminiumsalt. Et forsterket system involverer kombinasjonen av et monofosforyl lipid A og et saponinderivat, spesielt kombinasjonen av 3D-MPL og saponinen QS21 som beskrevet i WO 94/00153, eller en mindre reaktogen sammensetning hvor QS21 blir stoppet med kolesterol som beskrevet i WO 96/33739. Tidligere eksperimenter har vist en klar synergistisk effekt på kombinasjonene av 3D-MLP og QS21 i induksjonen av både humoral og Thl type cellulære immunresponser. En spesiell potent adjuvantdannelse involverer QS21, 3D-MLP og tokoferol i en olj e-i-vann emulsjon som beskrevet i WO 95/17210 og er en foretrukket formulering.
Formuleringer som inneholder et antigen fra den foreliggende oppfinnelsen kan administrerer til et individ per se eller i form av et farmasøytisk eller terapeutisk sammensetning. Farmasøytiske sammensetninger som omfatter proteinene kan bli fremstilt ved metoder for konvensjonell blanding, oppløsning, granulering, dragee-fremstilling, pulverisering, emulgering, innkapslin, innfanging, eller lyofiliserings-prosesser. Farmasøytiske sammensetninger kan formuleres på konvensjonell måte ved å bruke en eller flere fysiologiske akseptable bærere, diluenter, eksipientet eller hjelpe-midler som letter prosesseringen av polypeptidene inn i fremstillingene som kan bli brukt farmasøytisk. Egnet formulering er avhengig av måten for administrering som velges.
For topisk administrering, kan proteinene bli formulert som løsninger, geler, salver, kremer, suspensjoner, etc, som er vel kjent innen fagfeltet.
Systemiske formulering inkluderer de som er designet for administrering ved injeksjon, f.eks. subkutant, intravenøs, intramuskulær, intratekal eller intraperitonal injeksjon, så vel som de som er designet for transdermal, transmukosal, oral eller pulmonær administrering.
For injeksjon, kan proteinene formuleres i vandige løsninger, fortrinnsvis i fysiologisk kompatible buffere slik som Hanks løsning, Ringers løsning eller fysiologisk saltvanns-buffer. Løsningen kan inneholde formulatoriske midler slik som suspendering, stabilisering og/eller dispergerende midler. Alternativt, kan proteinene være i pulverform for konstituering med et egnet bindemiddel, f.eks. sterilt pyrogen-fritt vann, før anvendelse.
For transmukosal administrering, blir penetranser egnet for barrieren som skal permeeres brukt i formuleringen. Slike penetranser er generelt kjent innen fagfeltet.
For oral administrering kan en sammensetning lett formuleres ved å kombinere proteinene med farmasøytisk akseptable bærere velkjent innen fagfeltet. Slike bærere muliggjør at proteinene kan formuleres som tabletter, piller, drageer, kapsler, flytene midler, geler, sirup, oppslamminger, suspensjoner av det like, for oral inntak hos individet som behandles. For orale faste formuleringer, slik som, f.eks., pulvere, kapsler og tabletter, inkluderer egnede eksipienter fyllere, slik som sukker, slik som laktose, fruktose, mannitol og sorbitol; cellulosefremstillinger slik som maisstivelse, hvetestivelse, risstivelse, potetstivelse, gelatin, gummitragakant, metylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose, natriumkarboksymetylcellulose, og/eller polyvinylpyrrolidon (PVP); granulerende midler; og bindingsmidler. Hvis ønskelig, kan disintegreirngsmidler tilsettes, slik som kryssbundet polyvinylpyrrolidon, agar, eller algininsyre eller et salt derav, slik som et natriumalginat.
Hvis ønskelig, kan faste doseformer være sukkerbetrukket eller enterisk betrukket ved å bruke standard teknikker.
For orale flytene fremstillinger slik som, f.eks., suspensjoner, eleksirer og løsninger, egnede bærere, eksipienter eller diluenter inkluderer vann, glykoler, oljer, alkoholer, etc. Ytterligere, kan smaksmidler, konserveringsmidler, fargemidler og dets like tilsettes. For bukal administrering, kan proteinene ta form som tabletter, pastiller, etc. formulert på konvensjonell måte.
For administrering ved inhalering, blir proteinene for anvendelse i følge foreliggende oppfinnelsen enkelt avlevert i form av en aerosolspray fra trykkpakninger eller en forstøver, med anvendelse av en egnet propellant, f.eks. diklorodifluorometan, trikloro-fluorometan, diklorotetrafluoroetan, karbondioksid, eller annen egnet gass. I tilfelle av aerosol under trykk, kan doseenheten bli bestemt ved å tilveiebringe en ventil for å avlevere en avmålt mengde. Kapsler og "cartrdiges" av f.eks. gelain for bruk som en inhalator eller insufflator kan bli formulert til å inneholde en pulverblanding av proteinet og en egnet pulverbase slik som laktose eller stivelse.
Proteinene kan også bli formulert i rektale eller vaginale sammensetninger slik som suppositorier eller retensjonsklyster, f.eks. å inneholde konvensjonelle suppositorier basert på kakaosmør eller andre glycerider.
I tillegg til formuleringer som tidligere beskrevet, kan proteinene også bli formulert som en depotfremstilling. Slike langtidsvirkende formuleringer kan administreres ved implantasjon (f.eks. subkutant eller intramuskulært) eller ved intramuskulær injeksjon. Derfor, f.eks., kan proteinene bli formulert ved egnet polymer eller hydrofobe materialer (f.eks. som en emulsjon i en aksepterbar olje) eller ionebytterresiner, eller som sparsomme løselige derivater, f.eks. som sparsomt løselig salt.
Alternativt, kan andre farmasøytiske avleveringssystemer anvendes. Lipisomene og emulsjonene er velkjente eksempler for avleveringsmidler som kan bli brukt for å avlevere et antigen. Visse organiske løsningsmidler slik som dimetylsulfoksid kan også anvendes, skjønt vanligvis vil dette medføre høyere toksisitet. Fusjonsproteinene kan også innkapsles i mikrosfærer (U.S. patent nr. 5,407,609; 5,853,763; 5,814,344 og 5,820,833). I tillegg, kan proteinene bli avlevert ved å bruke et vedvarende frigivelses-system, slik som semipermeable matrikser av faste polymerer som inneholder det terapeutiske eller vaksineringsmidlet. Forskjellige vedvarende frigivningsmaterialer har blitt etablert og er velkjent for de som kjenner fagfeltet. Vedvarende frigivelseskapsler kan, avhengig av deres kjemiske natur, frigi proteiner i noen få uker opptil 100 dager. Avhengig av den kjemiske egenskapen og den biologiske stabiliteten til reagenser, ytterligere strategier for proteinstabilisering kan anvendes.
Bestemmelse av en effektiv mengde av fusjonsproteinet for induserende immunrespons i et individ er vel innenfor evnen til en fagperson, spesielt i lysest av den detaljerte beskrivelsen tilveiebrakt heri.
En effektiv dose kan esimeres initielt fra in vitro analyse. F.eks., kan en dose formuleres i dyremodeller for å oppnå en induksjon av en immunrespons for å bruke teknikker som er velkjent innen fagfeltet. En som har en ordinær utdannelse innen faget vil lett optimalisere administrering til mennesker basert på dyredata. Dosemengde og intervall kan justeres individuelt. F.eks., når den blir brukt som en vaksine, kan polypeptidene og/eller polynukleotidene fra oppfinnelsen bli administrert til omtrent 1 til 3 doser for en 1-36 uker periode. Fortrinnsvis, blir 3 doser administrert, i intervaller på omtrent 3-4 måneder, og boostervaksinasjonene kan gis periodisk deretter. Alternative protokoller kan være egnet for individuelle pasienter. En egnet dose er en mengde av polypeptid eller DNA som den blir administrert som beskrevet over, er i stand til å reise en immunrespons i en immunisert pasient tilstrekkelig til å beskytte pasienten fra M. tuberkulose\ nf& s,] on for minst 1-2 år. Generelt, varierer mengden av polypeptid tilstede i en dose (eller produsert in situ ved DNA i en dose) fra omtrent 1 pg til omtrent 100 mg per kilo av verten, typisk fra omtrent 10 pg til omtrent 1 mg, og fortrinnsvis fra omtrent 100 pg til omtrent 1 ug. Egnet doseområde vil variere med størrelsen til pasienten, men vil typisk variere fra omtrent 0,1 ml til omtrent 5 ml.
Fusjonspolypeptidene fra oppfinnelsen er nyttige i diagnose av tuberkuloseinfeksjon in vitro og in vivo. Evnen til et polypeptid fra oppfinnelsen er å indusere celleproliferering eller cytokinproduksjon kan analysere ved fremgangsmåtene beskrevet over.
I et annet aspekt, tilveiebringer denne oppfinnelsen fremgangsmåter for å anvende en eller flere av fusjonspolypeptidene for å diagnostisere tuberkulose ved å bruke en hudtest in vivo. Som brukt heri, kan en hudtest en hvilken som helst analyse utført direkte på en pasient hvor i en forsinket type hypersensitivitet (DTH) reaksjon (slik som hevelse, rødme eller dermatitt) blir målt etter intradermal injeksjon av en eller flere polypeptider som bekrevet over. Slik injeksjon kan oppnås ved å bruke en hvilken som helst egnet innretning tilstrekkelig for å bringe polypeptidet i kontakt med dermalcellene til pasienten, slik som, f.eks, en tuberkulinsprøyte eller en 1 ml sprøyte. Fortrinnsvis, blir reaksjonen målt minst omtrent 48 timer etter injeksjonen, mer foretrekkbart omtrent 48 til omtrent 72 timer etter injeksjon.
DTH reaksjonen er en celleformidlet immunrespons, som er større i pasientene som har blitt eksponert tidligere til testantigenet (dvs. den immunogene delen av polypeptidet som anvendes, eller en variant derav). Responsen kan bli målt visuelt, ved å bruke en linjal. Generelt, er en respons som er større enn omtrent 0,5 cm i diameter, fortrinnsvis større enn omtrent 1,0 cm i diameter, en positiv respons, indikativ på tuberkuloseinfeksjon, som kan eller ikke kan manifistere seg som en aktiv sykdom.
Fusjonspolypeptidene fra denne oppfinnelsen blir fortrinnsvis formulert, for anvendelse i en hudtest, som farmasøytiske sammensetninger som inneholder et polypeptid og en fysiologisk akseptabel brer. Slike sammensetninger inneholder typisk en eller flere av de ovenfornevnte polypeptidene i en mengde varierende fra omtrent 1 ug til 100 ug, fortrinnsvis fra omtrent 10 ug til omtrent 50 ug til et volum på 0,1 ml. Fortrinnsvis, er en bærer som anvendes i slike farmasøytiske sammensetninger en saltvannsløsning med egnede konserveringsmidler, slik som fenol og/eller Tween 80™.
I et annet aspekt, tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for anvendelse av polypeptider for diagnose av tuberkulose. I dette aspektet blir fremgangsmåtene tilveiebrakt for å detektere M. tuberkulose infeksjon i en biologisk prøve ved å bruke fusjonspolypeptidene alene eller i kombinasjon. Som brukt heri, er en "biologisk prøve" en hvilket som helst antistoffinneholdene prøve ervervet fra en pasient. Fortrinnsvis, er prøven helblod, sputum, serum, plasma, spytt, cerebrospinalvæske eller urin. Mer foretrekkbart, er prøven blod, serum eller plasmaprøve ervervet fra en pasient eller en blodtilførsel. Polypeptidet eller polypeptidene blir brukt i en analyse, som beskrevet under, for å bestemme tilstedeværelse eller fravær av antistoffene til polypeptidet eller polypeptidene i prøven relativ til en på forhånd bestemt "cut-off verdi. Tilstedeværelse av slike antistoff indikerer tidligere sensibilisering til mykobakterielle antigener som kan være indikative på tuberkulose.
I utførelsesformer hvor mer enn et fusjonspolypeptid anvendes, er polypeptidene som brukes fortrinnsvis komplementære (dvs. en komponent polypeptid vil tendere og detektere infeksjon i prøvene hvor infeksjonen ikke ville bli detektert av en annen komponent polypeptid). Komplementære polypeptider kan generelt identifiseres ved å bruke hvert polypeptid individuelt for å evaluere serumprøvene ervervet fra en serie av pasienter kjent å være infisert med M. tuberkulose. Etter bestemmelse av hvilke prøver som tester positivt (som beskrevet under) med hver polypeptid, kombinasjoner av to eller flere fusjonspolypeptider kan formuleres som i stand til å detektere infeksjon i de fleste eller alle av prøvene som teste. Slike polypeptider er komplementære. Omtrent 25-30% av sera fra tuberkuloseinfiserte individer er negative for antistoffer til et hvilket som helst enkelt protein. Komplementære polypeptider kan, derfor, bli brukt i kombinasjon for å forbedre sensitiviteten til en diagnostisk test.
Det er forskjellige analyseformater kjent for en fagperson innen feltet for anvendelse av en eller flere polypeptider for å detekter antistoffer i en prøve. Se f.eks. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, som er inkorporert heri ved referanse. I en foretrukket utførelsesform, involverer analysen anvendelsen av polypeptid immobilisert på et fast støttemateriale for å binde til å fjerne antistoffer fra prøven. Den bundede antistoffet kan deretter detekteres ved å bruke et deteksjonsreagens som inneholder en reportergruppe. Egnede deteksjonsreagenser inkluderer antistoffer som bindes til antistoff/polypeptidkomplekset og fritt polypeptid merket med en reportergruppe (f.eks. i en semikonkurrerende analyser). Alternativt, kan en konkurrerende analyse benyttes, hvor i et antistoff som bindes til polypeptidet er merket med en reportergruppe å tillater å binde til det immobiliserte antigenet etter inkubering av antigenet med prøven. Graden hvor ved komponentene fra prøven inhiberer binding av det merkede antistoffet til polypeptidet er indikativ på reaktiviteten til prøven med det immobiliserte polypeptidet.
Det faste støttematerialet kan være et hvilket som helst fast materiale kjent for en fagperson innen feltet i hvilket antigenet kan være festet. F.eks., kan støttematerialet være en testbrønn i en mikrotiterplate eller mikrocellulose eller annen egnet membran. Alternativt, kan støttemateriale være en kule eller plate (dise) slik som glass, fiberglass, lateks eller et plastisk materiale slik som polystyren eller polyvinylklorid. Støttematerialet kan også være en magnetisk partikkel eller en fiberoptisk sensor, slik som de som er beskrevet, f.eks., i U.S. patent nr. 5,359,681.
Polypeptidene kan bindes til et fast materiale ved å bruke forskjellige teknikker kjent innen fagfeltet. I sammenheng med den foreliggende oppfinnelse, referer "binding" seg til både ikke kovalent assosiering, slik som absorpsjon, og kovalent binding (som kan være en direkte kobling mellom antigenet og funksjonelle grupper på støttemateriale eller kan være en binding via et krossbindende middel). Binding ved adsorpsjon til en brønn i en mikrotiterplate eller til en membran er foretrukket. I slike tilfeller, kan absorpsjon oppnås ved å bringe i kontakt polypeptidet, i en egnet buffer, med et fast støttemateriale for en egnet tidsperiode. Kontakttiden varierer med temperaturen, men er typisk mellom 1 time og 1 dag. Generelt, i kontakt en brønn fra en plastisk mikrotiterplate (slik som polystyren eller polyvinylklorid) med en mengde av polypeptid varierende fra omtrent 10 ng til omtrent 1 u,g, og fortrinnsvis omtrent 100 ng er tilstrekkelig for å binde en adekvat mengde av antigen.
Kovalent binding av polypeptidet til et fast støttemateriale kan generelt oppnås ved først å reagere støttematerialet med et bifunksjonelt reagens som vil reagere med både støttematerialet og en funskjonell gruppe, slik som hydroksyl eller aminogruppe, på polypeptidet. F.eks., kan polypeptidet bindes til støttemateriale som har en egnet polymerovertrekk ved å bruke benzoquinon eller ved kondensering av en aldehydgruppe på støttematerialet med en amin og et aktivt hydrogen på polypeptidet (se f.eks., Pierce Immunotechonoly Catalog and Handbook, 1991, ved A12-A13).
I visse utførelsesformer, er analysen en enzymkoblet immunosorbentanalyse (ELISA). Denne analysen kan utføres ved først å bringe i kontakt et fusjonspolypeptidantigen som har blitt immobilisert på et fast støttemateriale, vanligvis brønn i en mikrotiterplate, med prøven, slik at antistoffene til polypeptidet i prøven får lov til å binde seg til det immobiliserte polypeptidet. Ubunden prøve blir deretter fjernet fra immobilisert polypeptid og et deteksjonsreagens som er i stand til å binde det immobiliserte antistoffpolypeptidkomplekset blir tilsatt. Mengden av deteksjonsreagens som forblir bundet til det faste støttematerialet blir deretter bestemt ved å bruke en fremgangsmåte som er egnet for det spesifikke deteksjonsreagenset.
Mer spesifikt, når polypeptidet er immobilisert på støttematerialet som er beskrevet over, blir de gjenværende proteinbindingssetene på støttematerialet blokkert. Et hvilket som helst egnet blokkeringsmaterialet kjent for de som kjenner fagfeltet, slik som bovin serum albumin eller Tween 20™ (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) kan anvendes. Det immobiliserte polypeptidet blir deretter inkubert med prøven og antistoffet får lov til å bindes til antigenet. Prøven blir fortynnet med et egnet fortynningsmiddel, slik som fosfatbufferet saltvann (PBS) forutfor inkubering. Generelt, er den egnede kontakttiden en periode som er tilstrekkelig for å detektere tilstedeværelse av antistoff i en M. tuberkulosemfisert prøve. Fortrinnsvis, er kontakttiden tilstrekkelig for å oppnå et nivå av binding som er minst 95% av den oppnådde ved likevekt mellom bundet og ubundet antistoff. De som kjenner fagfeltet vil gjenkjenne at tiden som er nødvendig for å oppnå likevekt kan lette bestemmes ved å analysere nivået av binding som forekommer over en tidsperiode. Ved romtemperatur, er en inkuberingstid på omtrent 30 minutter tilstrekkelig.
Ubundet prøve kan deretter blir fjernet ved å vaske det faste støttemateriale med en egnet buffer, slik som PBS som inneholder 0,1% Tween 20. Deteksjonsreagenser kan deretter bli tilsatt til det faste støttematerialet. Et egnet deteksjonsreagens i en hvilken som helst forbindelse som bindes til immobilisert antistoff-polypeptidkompleks og som kan detekteres ved en hvilken som helst metode kjent for fagpersoner. Fortrinnsvis, inneholder deteksjonsreagenset et bindingsmiddel (f.eks. protein A, protein G, lektin eller fritt antigen) konjugert til en reportergruppe. Foretrukne reportergrupper inkluderer enzymer (slik som pepperrotperoksidase), substrater, kofaktorer, inhibitorer, farger, radionukleotider, luminisensgrupper, fluoresensgrupper, biotin og kolloidalpartikler, slik som kolloidalt gull og selenium. Konjugasjon av bindingsmidlet til reportergruppen kan oppnås ved å bruke standardmetoder kjent for de som kjenner fagfeltet. Vanlige bindingsmidler kan også kjøpes konjugert til forskjellige reportergrupper fra mange kommersielle kilder (f.eks. Zymed Laboratories, San Francisco, CA, og Pierce, Rockford. IL).
Deteksjonsreagensene ble deretter inkubert med immobilisert antistoff-polypeptidkompleks for en tidsperiode som er tilstrekkelig for å detektere bundet antistoff. En egnet tidsperiode kan generelt bestemmes fra forhandlerens instruksjoner eller ved å analyser nivået av binding som forekommer over en tidsperiode. Ubundet deteksjonsreagens blir deretter fjernet og bundet deteksjonsreagens blir detektert ved å bruke reportergruppen. Metoden som anvendes ved å detektere reportergruppen avhenger av egenskapen til reportergruppen. For radioaktive grupper, er sintillasjonstelling eller autoradiografiske metoder egnet. Spektroskopiske fremgangsmåter kan bli brukt for å detektere farger, luminisensgrupper og fluoresensgrupper. Biotin kan detekteres ved å bruke avidin, koblet til forskjellige reportergrupper (vanligvis en radioaktiv eller fluoresensgruppe eller et enzym). Enzymreportergrupper kan generelt detekteres ved tilsetning av substrat (generelt for en spesifikk tidsperiode), etterfulgt av spektroskopiske eller andre analyser av reaksjonsproduktene.
For å bestemme tilstedeværelse eller fravær av anti - M. tuberkulose antistoffer i prøven, forblir signalet detektert fra reportergruppen bundet til det faste støttemateriale generelt sammenlignet med et signal som korresponderer til en på forhånd bestemt "cut-off' verdi. I en foretrukket utførelsesform, er "cut-off verdien gjennomsnittssignalet ervervet når det immobiliserte antigenet blir inkubert med prøvene fra en uinfisert pasient. Generelt, er en prøve som danner et signal som er tre standardavvik over den på forhånd bestemt "cut-off verdien betraktet positivt for tuberkulose. En alternativ foretrukket utførelsesform, blir "cut-off verdien bestemt ved å bruke en Receiver Operator Curve i samsvar med fremgangsmåten til Sackett et al, 1985, Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., sidene 106-107.1 korthet, i denne utførelsesformen, kan "cut-off verdien bli bestemt fra et plott av par av positive rater (sensitivitet) og falske positive rater (100% spesifisitet) som korresponderer til hver mulig "cut-off verdi for det diagnostiske testresultatet. "Cut-off verdien til plottet som er nærmest venstre øverste hjørne (dvs. verdien som inneholder det største arealet) er den mest nøyaktige "cut-off verdien, og prøven danner et signal som er høyere enn "cut-off verdien bestemt ved denne metoden kan betraktes som positive. Alternativt, kan "cut-off verdien flyttes til venstre langs plottet, for å minimalisere den falske positive raten, eller til høyre, for å minimalisere den falske negative raten. Generelt, en prøve som danner et signal som er høyere enn "cut-off verdien bestemt ved denne metoden betraktes som positiv for tuberkulose.
I en beslektet utførelsesform, blir analysen utført i en rask gennomstrømning eller remsetestformat, hvor i antigenet blir immobilisert på membran, slik som nitrocellulose. I gjennomstrømningstesten, passerer antistoffene i prøven bundet til det immobiliserte polypeptidet i mens prøven passerer gjennom membranen. Et deteksjonsreagens (f.eks. protein A-kolloidal gull) bindes deretter til antistoff-polypeptidkomplekset siden løsningen inneholder deteksjonsreagenset strømmer gjennom membranen. Deteksjonen av bundet deteksjonsreagens kan deretter utføres som beskrevet over. I remsetestformatet, blir en ende av membranen hvor polypeptidet er bundet nedsunket i en løsning som inneholder prøven. Prøven beveger seg langs membranen gjennom en region som inneholder deteksjonsreagenset og til området for det immobiliserte polypeptidet. Konsentrasjonen av deteksjonsreagenset ved polypeptidet indikerer tilstedeværelse av anti - M. tuberkulose antistoffer i prøven. Typisk, danner konsentrasjonen av deteksjonsregens på det stedet et mønster, slik som en linje, som kan leses visuelt. Fravær av slik mønster indikerer at prøven er negativ. Generelt, blir mengden av polypeptidet immobilisert på membranen selektert for å danne et visuelt mønster som kan skjelnes når den biologiske prøven inneholder et nivå av antistoffer som ville være tilstrekkelig for å danne et positivt signal i en ELISA, som diskutert over. Fortrinnsvis, varierer mengde av polypeptid immobilisert på membranen fra omtrent 5 ng til omtrent 1 ug, og mer foretrekkbart fra omtrent 50 ng til omtrent 500 ng. Slike tester kan typisk utføres med en veldig liten mengde (f.eks. en dråpe) av pasient-serum eller blod.
Oppfinnelsen har blitt beskrevet, de følgende eksemplene fremsettes for illustrering og ikke begrensende.
EKSEMPEL:FUSJONSPROTEINENE TILM. TUBERKULOSEANTIGENER
BIBEHOLDER IMMUNIGENITET TIL DE INDIVIDUELLE KOMPONENTENE
MATERIALER OG METODER
KONSTRUKSJON AV FUSJONSPROTEINER
De kodene sekvensene til M. tuberkuloseaxitigonor når de blir modifisert ved PCR for å lette deres fusjon og deretter ekspresjon av fusjonsproteinet. DNA amplifiseringen ble utført ved å bruke 10 ul 10X Pfu buffer, 2 ul 10 mM dNTP, 2 ul av hver PCR primer ved 10 uM konsentrasjon, 81,5 ul vann, 1,5 ul Pfu DNA polymerase (Stratagene, La Jolla, CA) og 1 ul DNA ved enten 70 ng/ml (for TbRa3 antigen) eller 50 ng/ml (for 38 kD og Tb38-1 antigener). For TbRa3 antigen, ble denaturering ved 94°C utført i 2 minutter, etterfulgt av 40 cykler med 96°C i 15 sekunder og 72°C i 1 minutt og til slutt 72°C i 4 minutter. For 38 kD antigen, ble denaturering ved 96°C utført i 2 minutter, etterfulgt av 40 cykler med 96°C i 30 sekunder, 68°C i 15 sekunder og 72°C i 3 minutter, og til slutt ved 72°C i 4 minutter. For Tb38-1 antigen, ble denaturering ved 94°C i 2 minutter etterfulgt av 10 cykler med 96°C i 15 sekunder, 68°C i 15 sekunder og 72°C i 1,5 minutt, 30 cykler ved 96°C i 15 sekunder, 64°C i 15 sekunder og 72°C i 1,5 minutt, og til slutt 72°C i 4 minutter.
Etter kutting med et restriksjonsendonuklease for å gi ønskede kohesive eller butte ender, ble polynukleotid spesifikke for hver fusjonspolypeptid ligert inn i et ekspresjonsplasmid. Hver resulterende plasmid inneholdt de kodene sekvensene for individuelle antigener fra hver fusjonspolypeptid. Ekspresjonsvektoren som ble brukt var pET-12b og pT7<A>L2 ILI 1.
Tre kodene sekvenser for antigenet Ral2, TbH9 og Ra35 ble ligert for å kode for et fusjonsprotein (SEQ ID NR: 1 og 2) (figur IA og 2B). Tre andre kodene sekvenser for antigenene Erdl4 DPV og MTI ble ligert for å kode for et andre fusjonsprotein (SEQ ID NR: 3 og 4) (figur 2). Tre kodene sekvenser for antigenene TbRa3,38kD og Tb38-1 ble ligert for å kode et fusjonsprotein (SEQ ID NR: 5 og 6) (figur 3A - 3D). To kodene sekvenser for antigene TbH9 og Tb38-1 ble ligert for å kode for et fusjonsprotein (SEQ ID NR: 7 og 8) (figur 4A - 4D). Fire kodene sekvenser for antigenene TbRa3, 38kD, Tb38-1 og DPEP ble ligert for kode for et fusjonsprotein (SEQ ID NR: 9 og 10) (figur 5A - 5J). Fire kodene sekvenser for å antigenene Erdl4, DPC, MTI, MSL og MTCC2 ble ligert for å kode for et fusjonsprotein (SEQ ID NR: 11 og 12) (figur 6A og 6B). Fire kodene sekvenser for antigenene Erdl4, DPV, MTI og MSI ble ligert for å kode for et fusjonsprotein (SEQ ID NR: 13 og 14) (figur 7A og 7B). Fire kodene sekvenser for å antigenene DPV;, MTI, MSL og MTCC2 ble ligert for å kode for et fusjonsprotein (SEQ ID NR: 15 og 16) (figur 8A og 8B). Tre kodene sekvenser for antivenene DPV, MTI og MSL ble ligert for å kode for et fusjonsprotein (SEQ ID NR: 17 og 18) (figur 9A og 9B). Tre kodene sekvenser for antigene TbH9, DPV og MTI ble ligert for å kode for et fusjonsprotein (SEQ ID NR: 19 og 20) (figur 10A og 10B). Tre kodene sekvenser for å angtigenene Erdl4, DPV og MTI ble ligert for å kode for et fusjonsprotein (SEQ ID NR: 21 og 22) (figur 1 IA og 1 IB). To kodene sekvenser for antigenene TbH9 og Ra35 ble ligert for å kode for et fusjonsprotein (SEQ ID NR: 23 og 24) (figur 12A og 12B). To kodene sekvenser for antigenene Ral 2 og DPPD ble ligert for å kode for et fusjonsprotein (SEQ ID NR: 25 og 26) (figur 13A og 13B).
Tre rekombinante proteiner ble uttrykt i E. coli med seks histidinresidier ved den amino-terminale delen ved å bruke pET plasmidvektoren (pET-17b) og et T7 RNA polymeraseekspresjonssystem (Novagen, Madison Wi). E. coli stamme BL21 (DE3) pLysE (Novagen) ble brukt før høynivåekspresjon. Den rekombinante (His-Tag) fusjonsprotenene ble renset fra den løselige supernatanten eller uløseligen inklusjons-mengden av 500 ml av IPTG induserte batchkulturer ved affinitetskromatografi ved å bruke et trinns QIA ekspress Ni-NTA agarosematrisk (QIAGEN, Chatsworth, CA) med tilstedeværelse av 8M urea. I korthet, ble en 20 ml over natt mettet kultur med BL21 som inneholdt pET konstruksjon tilsatt itl 500 ml 2 x YT medium som inneholdt 50Hg/ml ampicillin og 34 ug/ml kloramfenikol, dyrket ved 37°C ved risting. De bakterielle kulturene ble indusert med 2mM D?TG ved en OD 560 på 0,3 og dyrket i ytterligere 3 timer (OD = 1,3 til 1,9). Cellene ble høstet fra 500 ml kulturer ved sentrifugering og resuspendert i 20 ml bindingsbuffer (0,1 M natriumfosfat, pH 8,0; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) som inneholdt 2 mM PMSF og 20 ug/ml leupeptin pluss en fullstendig protease-inhibitortablett (Boehringer Mannheim) per 25 ml. E. coli ble lysert ved frysetining etterfult av en kort sonikering, deretter spunnet ned ved 12 k rpm i 30 minutter for å pelletere inklusjonssamlingene.
Inklusjonssamlingene ble vasket tre ganger i 1% CHAPS i 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Dette trinnet reduserte heftig nivået av kontaminering av LPS. Inklusjonssamlingen ble til slutt løst i 20 ml bindingsbuffer som inneholdt 8 M urea eller 8 M urea ble tilsatt direkte til den løselige supernatanten. Rekombinante fusjonsproteiner med His-Tag residier ble "batch" bundet til Ni-NTA agarose resin (5 ml resin per 500 ml induksjoner) ved vipping ved romtemperatur i 1 time og deretter ble komplekset satt på en kolonne. Gjennomstrømningen fikk passere to ganger over samme kolonne og kolonnen ble vasket tre ganger med 30 ml hver av vaskebufferen (0,1 M natriumsulfat og 10 mM Tris-HCl, pH 6,3) som også inneholdt 8 M urea. Bundet protein ble eluert med 30 ml 150 mM immidazol i vaskebuffer og 5 ml fraksjoneringer ble samlet sammen. Fraksjonene som inneholdt hvert rekombinant fusjonsprotein ble samlet, dialysert mot 10 mM Tris HC1 (pH 8,0) bundet en eller flere ganger til Ni-NTA matriks, eluert og dialysert i 10 mM Tris-HCl (pH 7,8). Utbytte av det rekombinante proteinet varierte fira 25 til 150 mg per liter av indusert bakteriekultur med mer enn 98% renhet. Rekombinante proteiner ble analysert for endotoksinkontaminering ved å bruke Limulus analyse (BioWhittaker) og var kjent å inneholde < 10 E.U.Img.
T CELLEPROLIFIREINGSANALYSE
Renset fusjonspolypeptider ble testet for evnen til å indusere T celleproliferering i perifere blodmononukleære celle (PBMC) prepareringer. PBMC fra donorene var kjent å være PPD hudtestpositive og hvis T celler ble vist å proliferere som en respons til PPD og råoppløselige proteiner fra M. tuberkulose ble dyrket i RPMI1640 supplert med 10% oppsamlet humant serum og 50 ug/ml gentamicin. Rensede polypeptider ble tilsatt i duplikat ved konsentrasjoner på 0,5 til 10 ug/ml. Etter seks dager med dyrking i 96 brønners rundbundede plater i et volum på 200 ul, ble 50 ul av mediumet fjernet fra hver brønn for å bestemme IFN-y nivåene, som beskrevet under. Platene ble deretter pulset med 1 uCi/per brønn av tritiert tymidin for ytterligere 18 timer, høstet og tritium-opptak ble bestemt ved å bruke en gassscintillasjonsteller. Fraksjoner som resulterte i proliferering i begge replikatene tre ganger større enn prolifereringen observert i celler dyrket i medium alene ble betraktet som positive.
INTERFERON- Y ANALYSE
Milt fra mus ble fjernet aseptisk og enkelcellesuspensjon fremstilt i fullstendig RPMI etter lysis av røde blodceller. 100 ul av celler (2 x IO"<5>celler) ble platet ut per brønn i en 96-brønners flatbunnet mikrotiterplate. Kulturene ble stimulert med et indikerte rekombinante proteinet i 24 timer og supernatanten analysert for IFN-y.
Nivåene av supernatant IFN-y ble analysert ved sandwich ELISA, ved å bruke antistoff-par og prosedyrer tilgjengelig fra PharMingen. Standardkurve ble fremstilt ved å bruke rekombinante muscytokiner. ELISA platene (Corning) ble trukket med 50 ul/brønn (1 jig/ml, i 0,1 M bikarbonat overtrekksbuffer, pH 9,6) av et cytokinoppfangings mAb (rotteantimus IFN-y (PharMingen; Cat. # 1818ID)), og inkubert i 4 timer ved romtemperatur. Rist ut plateinnholdene og blokker med PBS-0,05% Tween, 1,0% BSA (200 ul/brønn) over natten ved 4°C og vask 6 ganger i PBS-0,1% Tween. Standarder (muse IFN-y) og supernatantprøvene fortynnet i PBS-0,05% Tween, 0,1% PBSA ble deretter tilsatt i 2 timer ved romtemperatur. Platene ble vasket som over og deretter inkubert i 2 timer ved romtempertur med 100 ul/brønn av et annet Ab (biotonrotte a muse IFN-y (Cat. # 18112D; PharMingen)) ved 0,5 ug/ml fortynnet i PBS-0,05 Tween, 0,1% BSA. Etter vasking, ble platene inkubert med 100 ug/brønn av streptavidin-HRP (Zymed) ved en 1:2500 fortynning i PBS-0,05%) Tween, 0,1 % BSA ved romtemperatur i 1 time. Platene ble vasket en siste gang og fremkalt med 100 (il/brønn TMB substrat (3,3', 5,5' — tetrametylbenzidin, Kirkegaard og Perry, Gaithersburg, MD) og reaksjonen ble stoppet etter fargefremkalling, med H2SO4, 50 ul/brønn. Absorbansen (OD) ble bestemt ved 450 nm ved å bruke 570 nm som en referansebølgelengde og cytokinkonsentrasjonen evaluert ved å bruke standardkurven.
RESULTATER
TRI- FUSJONSPROTEINER INDUSERTE IMMUNRESPONSER
Tre kodene sekvenser for M. tuberkuloseantigener ble innsatt i en ekspresjonsvektor for produksjon av fusjonsprotein. Antigenene som ble kalt Ral2, TbH9 og Ra35 ble produsert som et rekombinant fusjonsprotein (figur IA og IB). Antigenene Erdl4, DPV og MTI ble produsert som et andre fusjonsprotein (figur 2). De to fusjonsproteinene ble affinitetsrenset for anvendelse i in vitro og i in vivo analyse.
De to fusjonsproteinene ble testet for deres evne til å stimulere T celleresponser fra seks PPD<+>individer. Når T celleproliferering ble målt, viste begge fusjonsproteinene et likt reaktivitetsmønster som deres individuelle komponenter (figur 14A-14F). Et lignende resultat ble ervervet når IFN-y produksjonen ble målt (figur 15A-15F). F.eks., responderte individ Dl60 til antigenene TbH9 og MTI individuelt. Individ Dl60 responderte også til fusjonsproteinene som inneholdt disse antigenene (figur 14B og 15B). I motsetning til, ble det ikke observert noen T cellerespons fra D160 til andre antigener individuelt. Et annet individ, D201, som ikke reagerte med antigenene Erdl4, DPV og MTI individuelt, var også ikke responsive til fusjonsproteinet som inneholdt disse antigenene. Det skal bemerkes at når T celleresponsene til individuelle komponenter av de to fusjonsproteinene ikke var spesielt sterk, stimulerte fusjonsproteiner responser som var lik til eller høyere enn den som ble indusert av individuelle antigener i de fleste tilfeller.
Ral2-TbH9-Ra35 tri-fusjonsprotein ble også testet som et immunogen in vivo. I disse eksperimentene, ble fusjonsproteinet injisert inn i fotsålen til mus for immunisering. Hver gruppe på tre mus mottok proteinet i forskjellige adjuvansformuleringer: SBASlc, SBAS2 (Ling et al., 1997, Vaccine 15:1562-1567), SMAS7 og AL(OH)3. Etter to subkutane immuniseringer med tre ukers intervaller, ble dyrene avlivet en uke senere, og deres tappene lymfeknuter ble høstet for anvendelse som responsceller i T celleproliferering og cytokinproduksjonsanalyser.
Uansett hvilket adjuvans som ble brukt i immunisering, ble det indusert sterk T celleprolifereringsresponser mot TbH9 når den ble brukt som et individuelt antigen (figur 16A). Svakere responser ble indusert mot Ra35 og Ral2 (figur 16B og 16C). Når Ral2-TbH9-Ra35 fusjonsproteinet ble brukt som et immunogen, ble en respons lik den mot de individuelle komponentene observert.
Når cytokinproduksjonen ble målt, produserte adjuvansene SBASlc og SBAS2 likt IFN-y (figur 17) og IL-4 responser (figur 18). Imidlertid, produserte kombinasjonen av SBAS7 og aluminiumshydroksid det sterkeste IFN-y responsene og det laveste nivået av IL-4 produksjonen for alle tre antigenene. Med hensyn til humoral antistoffrespons in vivo, viste figur 19A-19F at fusjonsproteinet reiste både IgGiog IgG2aantigen-spesifikke responser når den ble brukt med en hvilken som helst av de tre adjuvantene.
I tillegg, ble C57BL/6 mus immunisert med en kombinasjon av to ekspresjons-konstruksjoner som hver inneholdt Ral2-TbH9-Ra35 (Mtb32A) eller Erdl4-DPV-MTI (Mtb39A) kodene sekvens som DNA vaksine. De immuniserte dyrene utviste signifikant beskyttelse mot tuberkulose ved en etterfølgende aerosolprovosering med levende bakterier. Basert på disse resultatene, ble en fusjonskonstruksjon av Mtb32A og Mtb39A kodene sekvens fremstilt, og dets kodene produkt testet i marsvin langtids-beskyttende modell. I disse studiene, ble marvin immunisert med et enkelt rekombinant fusjonsprotein eller en blanding av Mtb32A og Mtb39A proteiner i formuleringer som inneholder et adjuvant. Figur 20A-20C viste at marsvin immunisert med fusjonsproteinet i SBASlc eller SBAS2 var bedre beskyttet mot utvikling av tuberkulose ved etterfølgende provosering, sammenlignet med dyr immunisert med to antigener i en blanding i samme adjuvantformulering. Fusjonsproteinene i SBAS2 formuleringen av den største beskyttelsen i dyrene. Derfor, kan fusjonsproteinene fra forskjellig M. tuberkulosemtigeneT bli brukt som mer effektive immunogener i vaksineformuleringer enn en blanding av de individuelle komponentene.
BI- FUSJONSPROTEIN INDUSERT IMMUNRESPONSER
Et bi-fusjonsprotein som inneholder TbH-9 og Tb38-1 antigener uten en hengselsekvens ble produsert ved rekombinante metoder. Evnen til TbH9-Tb38-l fusjonsprotein til å indusere T celleproliferering og IFN-y produksjon ble undersøkt. PBMC fra tre donorer ble anvendt: en donor hadde tidligere vist å respondere til TbH9 men ikke til Tb38-1 (donor 131); en hadde vist å respondere til Tb38-1 men ikke til TbH9 (donor 184); og en hadde vist å respondere til begge antigenene (donor 201). Resultatene av disse studiene viste den funksjonelle aktiviteten til begge antigenene i fusjonsproteinet (figurene 21A og 21B, 22A og 22B og 23A og 23B).
ET TETRA- FUSJONSPROTEIN SOM REAGERTE MED TUBERKULOSEPASIENT SERA
Et fusjonsprotein som inneholdt TbRa3, 38KD antigen, Tb38-1 og DPEP ble produsert ved rekombinante metoder. Reaktiviteten til dette tetra-fusjonsproteinet ble referert til som TbF-2 med sera fra M. tuberkuloseinfiserte pasienter ble undersøkt med ELISA. Resultatene til disse studiene (tabell 1) viste at alle fire antigenene fungerte uavhengig i fusjonsproteinet.
En som kjenner fagfeltet vil forstå at rekkefølgen av de individuelle antigenene innenfor hvert fusjonsprotein kan endres og at sammenlignbar aktivitet kan forventes forutsatt at hver av epitopene fortsatt er funksjonelt tilgjengelig. I tillegg, kan forkortede former av proteinet som inneholder aktive epitoper bli brukt i konstruksjonen av fusj onsproteinene.
Den foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset i omfang av det eksemplifierte utførelsesformene som har til hensikt å illustrere enkelte aspekter fra oppfinnelsen, og hvilke som helst kloner, nukleotid eller aminosyresekvenser som funksjonelle ekvivalenter er innenfor omfanget av oppfinnelsen. Forskjellige modifiseringer av oppfinnelsen i tillegg til de som er beskrevet heri vil være tydelig for de som kjenner fagfeltet fra foregående beskrivelse og de vedlagte tegningene. Slike modifiseringer har til hensikt å falle innenfor området av de vedlagte kravene. Det skal også forstås at alle baseparstørrelser gitt for nukleotider er omtrentlige og er brukt for beskrivelsesformål.
Alle publikasjonene sitert heri er inkorporert ved referanse i deres helhet.
Claims (32)
1.
Immunogent polypeptid, karakterisert ved at det omfatter aminosyresekvens SEQ DD NO: 16, hvor nevnte aminosyresekvens valgfritt inneholder en eller flere konservative aminosyre delesjoner, addisjoner, og/eller substitusjoner og valgfritt uten strekket av histidin rester i den N-terminale enden.
2.
Immunogent polypeptid ifølge krav 1, karakterisert v e d at det består av aminosyresekvens SEQ ID NO: 16, hvor nevnte aminosyresekvens valgfritt inneholder én eller flere konservative aminosyredelesjoner, addisjoner og/eller substitusjoner og valgfritt uten strekket av histidinresidier i den N-terminale enden.
3.
Immunogent polypeptid ifølge krav 1, karakterisert v e d at det omfatter aminosyresekvens SEQ ID NO: 16, hvor nevnte aminosyresekvens valgfritt inneholder én konservativ aminosyredelesjon, addisjon og/eller substitusjon og valgfritt uten strekket av histidinrester i den N-terminale enden.
4.
Immunogent polypeptid ifølge krav 2, karakterisert v e d at det består av aminosyresekvens SEQ ID NO: 16, hvor nevnte aminosyresekvens valgfritt inneholder én konservativ aminosyredelesjon, addisjon og/eller substitusjon og valgfritt uten strekket av histidinrester i den N-terminale enden.
5.
Immunogent polypeptid ifølge krav 3, karakterisert ved at det omfatter aminosyresekvens SEQ ID NO: 16, valgfritt uten strekket av histidinrester i den N-terminale enden.
6.
Immunogent polypeptid ifølge krav 4, karakterisert ved at det består av aminosyresekvens SEQ ID NO: 16, valgfritt uten strekket av histidinrester i den N-terminale enden.
7
Immunogent polypeptid ifølge krav 5, karakterisert ved at det omfatter aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 16.
8.
Immunogent polypeptid ifølge krav 6, karakterisert ved at det består av aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 16.
9.
Immunogent polypeptid, karakterisert ved at det omfatter en aminosyresekvens i henhold til restene 9 til 710 fra SEQ DD NO: 16, hvor nevnte aminosyresekvens valgfritt inneholder én eller flere konservative aminosyredelesjoner, addisjoner og/eller substitusjoner.
10.
Immunogent polypeptid i følge krav 9, karakterisert ved at det består av en aminosyresekvens i henhold til restene 9 til 710 fra SEQ DD NO: 16, hvor nevnte aminosyresekvens valgfritt inneholder én eller flere konservative aminosyredelesjoner, addisjoner og/eller substitusjoner.
11.
Immunogent polypeptid i følge krav 9, karakterisert ved at det omfatter en aminosyresekvens i henhold til restene 9 til 710 fra SEQ DD NO: 16, hvor nevnte aminosyresekvens valgfritt inneholder én konservative aminosyredelesjon, addisjon og/eller substitusjon.
12.
Immunogent polypeptid i følge krav 10, karakterisert ved at det inneholder en aminosyresekvens i henhold til restene 9 til 710 fra SEQ DD NO: 16, hvor nevnte aminosyresekvens valgfritt inneholder én konservative aminosyredelesjon, addisjon og/eller substitusjon.
13.
Immunogent polypeptid i følge krav 11, karakterisert ved at det omfatter en aminosyresekvens i henhold til restene 9 til 710 fra SEQ DD NO: 16.
14.
Immunogent polypeptid i følge krav 12, karakterisert ved at det inneholder en aminosyresekvens i henhold til restene 9 til 710 fra SEQ ID NO: 16.
15.
Polynukleotid, karakterisert ved at det omfatter en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid i følge et hvilket som helst av kravene 1-14.
16.
Polynukleotid, karakterisert ved at det omfatter nukleotidsekvensen til SEQ ID NO: 15 eller en sekvens som koder for det samme eller en funksjonelt ekvivalent genprodukt.
17.
Polynukleotid, karakterisert ved at det består av nukleotidsekvensen til SEQ ID NO: 15 eller en sekvens som koder for det samme eller en funksjonelt ekvivalent genprodukt.
18.
Polynukleotid, karakterisert ved at det består av nukleotidsekvensen til SEQ ID NO: 15.
19.
Polynukleotid, karakterisert ved at det omfatter en første nukleotidsekvens som hybridiserer under moderate stringente betingelser med en andre nukleotidsekvens som er komplementær med en nukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensen SEQ ID NO: 16, valgfritt uten strekket av histidinrester i den N-terminale enden, der nevnte polynukleotid omfatter en første nukleotidsekvens som koder for et polypeptid som er funksjonelt ekvivalent til aminosyresekvens SEQ DD NO: 16, valgfritt uten strekket av histidinrester i den N-terminale enden, i en T-celle proliferering eller interferon gamma produksjonsanalyse.
20.
Polynukleotid i følge krav 19, karakterisert ved at det omfatter en første nukleotidsekvens som hybridiserer under høye stringente betingelser med en andre nukleotidsekvens som er komplementær med en nukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensen SEQ DD NO: 16, valgfritt uten strekket av histidinrester i den N-terminale enden, der nevnte polynukleotid omfatter en første nukleotidsekvens som koder for et polypeptid som er funksjonelt ekvivalent til aminosyresekvens SEQ ED NO: 16, valgfritt uten strekket av histidinrester i den N-terminale enden, i en T-celle proliferering eller interferon gamma produksjonsanalyse.
21.
Polynukleotid, karakterisert ved at det omfatter en første nukleotidsekvens som hybridiserer under moderate stringente betingelser med en andre nukleotidsekvens som er komplementær med en nukleotidsekvens som koder for restene 9-710 ifølge SEQ ID NO: 16, der nevnte polynukleotid omfatter en første nukleotidsekvens som koder for et polypeptid som er funksjonelt ekvivalent til restene 9-710 fra SEQ DD NO: 16, i en T-celle proliferering eller interferon gamma produksjonsanalyse.
22.
Polynukleotid i følge krav 21, karakterisert ved at det omfatter en første nukleotidsekvens som hybridiserer under høye stringente betingelser med en andre nukleotidsekvens som er komplementær med en nukleotidsekvens som koder for restene 9-710 til SEQ DD NO: 16, der nevnte polynukleotid omfatter en første nukleotidsekvens som koder for et polypeptid som er funksjonelt ekvivalent til restene 9-710 fra SEQ DD NO: 16, i en T-celle proliferering eller interferon gamma produksj onsanalyse.
23.
Polypeptid, karakterisert ved at det er koder for av et polynukleotid i følge et hvilket som helst av kravene 16 til 22.
24.
Polypeptid i følge krav 23, karakterisert ved at det er fusjonert med et andre heterologt polypeptid.
25.
Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter et polypeptid i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 14,23 eller 24.
26.
Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter et polynukleotid følge et hvilket som helst av kravene 15 til 22.
27.
Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter et polynukleotid i følge et hvilket som helst av kravene 15-22.
28.
Ekspresjonsvektor i følge krav 27, karakterisert ved at nevnte vektor er en viral vektor.
29.
Vaksinesammensetning, karakterisert ved at den omfatter et polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 14,23 eller 24 og en adjuvant.
30.
Vaksinesammensetning, karakterisert ved at den omfatter et polynukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 15 til 22.
31.
Isolert vertscelle, karakterisert ved at den rekombinant uttrykker rekombinant et polypeptid i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 14,23 eller 24.
32.
Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 14, 23 eller 24, karakterisert ved at den omfatter rekombinant ekspresjon av et polynukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 15 til 22.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US09/056,556 US6350456B1 (en) | 1997-03-13 | 1998-04-07 | Compositions and methods for the prevention and treatment of M. tuberculosis infection |
US09/223,040 US6544522B1 (en) | 1998-12-30 | 1998-12-30 | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses |
PCT/US1999/007717 WO1999051748A2 (en) | 1998-04-07 | 1999-04-07 | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20120234L true NO20120234L (no) | 2000-11-30 |
Family
ID=22834762
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20120234A NO20120234L (no) | 1998-04-07 | 2012-03-01 | Fusjonsproteiner fra mycobacterium tuberkulose og deres anvedelser |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6544522B1 (no) |
EP (2) | EP2383342A1 (no) |
JP (1) | JP4516616B2 (no) |
AR (2) | AR020066A1 (no) |
CO (1) | CO5070585A1 (no) |
CZ (1) | CZ302852B6 (no) |
NO (1) | NO20120234L (no) |
PL (1) | PL209260B1 (no) |
TW (1) | TWI223001B (no) |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6290969B1 (en) * | 1995-09-01 | 2001-09-18 | Corixa Corporation | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
US6592877B1 (en) | 1995-09-01 | 2003-07-15 | Corixa Corporation | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
US6458366B1 (en) | 1995-09-01 | 2002-10-01 | Corixa Corporation | Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis |
US7087713B2 (en) * | 2000-02-25 | 2006-08-08 | Corixa Corporation | Compounds and methods for diagnosis and immunotherapy of tuberculosis |
PL202844B1 (pl) * | 1998-04-07 | 2009-07-31 | Corixa Corp | Immunogeniczny polipeptyd, polinukleotyd, polipeptyd, kompozycja farmaceutyczna, wektor ekspresji, kompozycja szczepionki, polipeptyd do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu infekcjom Mycobacterium tuberculosis, polinukleotyd do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu infekcjom Mycobacterium tuberculosis i sposób wytwarzania polipeptydu |
US8143386B2 (en) * | 1999-04-07 | 2012-03-27 | Corixa Corporation | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses |
AU779846B2 (en) * | 1999-10-07 | 2005-02-17 | Corixa Corporation | Methods of using a mycobacterium tuberculosis coding sequence to facilitate stable and high yield expression of heterologous proteins |
US7009042B1 (en) * | 1999-10-07 | 2006-03-07 | Corixa Corporation | Methods of using a Mycobacterium tuberculosis coding sequence to facilitate stable and high yield expression of the heterologous proteins |
US7311922B1 (en) | 1999-10-07 | 2007-12-25 | Corixa Corporation | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis |
SI1542732T1 (sl) * | 2000-06-20 | 2010-01-29 | Corixa Corp Csc The United Sta | Fuzijski proteini Mycobacterium tuberculosis |
US7026465B2 (en) * | 2002-02-15 | 2006-04-11 | Corixa Corporation | Fusion proteins of Mycobacterium tuberculosis |
US8475735B2 (en) * | 2004-11-01 | 2013-07-02 | Uma Mahesh Babu | Disposable immunodiagnostic test system |
KR101255870B1 (ko) * | 2004-11-16 | 2013-04-17 | 아에라스 글로벌 티비 백신 파운데이션 | 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 다가 백신 |
WO2006060484A2 (en) * | 2004-12-01 | 2006-06-08 | Gene Therapy Systems, Inc. | Tuberculosis nucleic acids, polypeptides and immunogenic compositions |
ATE530569T1 (de) | 2005-07-01 | 2011-11-15 | Forsyth Dental In Ry For Children Fa | Assays zum nachweis von tuberkulose- antigenen, und impfstoffe |
WO2007041539A1 (en) * | 2005-09-30 | 2007-04-12 | Transcutaneous Technologies, Inc. | Iontophoresis apparatus and method for the diagnosis of tuberculosis |
US8708320B2 (en) | 2006-12-15 | 2014-04-29 | Air Products And Chemicals, Inc. | Splashguard and inlet diffuser for high vacuum, high flow bubbler vessel |
MX2012008790A (es) | 2010-01-27 | 2012-08-17 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Antigenos de tuberculosis modificados. |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5330754A (en) | 1992-06-29 | 1994-07-19 | Archana Kapoor | Membrane-associated immunogens of mycobacteria |
DK79793D0 (da) | 1993-07-02 | 1993-07-02 | Statens Seruminstitut | Diagnostic test |
DK79893D0 (da) * | 1993-07-02 | 1993-07-02 | Statens Seruminstitut | New vaccine |
ES2313719T3 (es) | 1993-11-23 | 2009-03-01 | The Regents Of The University Of California | Productos extracelulares abundantes y procedimiento de produccion y uso de los mismos. |
ES2185762T3 (es) * | 1995-03-13 | 2003-05-01 | Secr Defence | Vacunas contra la peste. |
ES2262595T3 (es) | 1995-09-01 | 2006-12-01 | Corixa Corporation | Compuestos y metodos para la inmunoterapia y diagnostico de la tuberculosis. |
MX9801687A (es) | 1995-09-01 | 1998-11-29 | Corixa Corp | Compuestos y metodos para el diagnostico de tuberculosis. |
US6555653B2 (en) * | 1997-05-20 | 2003-04-29 | Corixa Corporation | Compounds for diagnosis of tuberculosis and methods for their use |
-
1998
- 1998-12-30 US US09/223,040 patent/US6544522B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-04-07 CZ CZ20100086A patent/CZ302852B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-04-07 EP EP10182762A patent/EP2383342A1/en not_active Withdrawn
- 1999-04-07 EP EP10182700A patent/EP2397555A1/en not_active Withdrawn
- 1999-04-07 PL PL386292A patent/PL209260B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-04-07 AR ARP990101583A patent/AR020066A1/es unknown
- 1999-04-07 CO CO99020328A patent/CO5070585A1/es unknown
- 1999-04-26 TW TW088105532A patent/TWI223001B/zh active
-
2003
- 2003-02-05 US US10/359,459 patent/US7064195B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2008
- 2008-06-06 JP JP2008149834A patent/JP4516616B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2008-07-22 AR ARP080103186A patent/AR067658A2/es unknown
-
2012
- 2012-03-01 NO NO20120234A patent/NO20120234L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
TWI223001B (en) | 2004-11-01 |
AR020066A1 (es) | 2002-04-10 |
US6544522B1 (en) | 2003-04-08 |
EP2383342A1 (en) | 2011-11-02 |
PL209260B1 (pl) | 2011-08-31 |
CO5070585A1 (es) | 2001-08-28 |
EP2397555A1 (en) | 2011-12-21 |
AR067658A2 (es) | 2009-10-21 |
JP4516616B2 (ja) | 2010-08-04 |
US20040013677A1 (en) | 2004-01-22 |
US7064195B2 (en) | 2006-06-20 |
JP2009000107A (ja) | 2009-01-08 |
CZ302852B6 (cs) | 2011-12-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA2326598C (en) | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses | |
US7335369B2 (en) | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses | |
NO20120234L (no) | Fusjonsproteiner fra mycobacterium tuberkulose og deres anvedelser | |
EP1347055B1 (en) | Compounds for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis | |
JP4764445B2 (ja) | 結核の免疫治療および診断のための化合物およびそれらの使用方法 | |
US8143386B2 (en) | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses | |
JP2002503683A (ja) | 結核の免疫療法および診断のための化合物および方法 | |
MXPA00009803A (en) | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis | |
ZA200005505B (en) | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis and their uses. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
FC2A | Withdrawal, rejection or dismissal of laid open patent application |