MXPA02009437A - Una construccion de acido nucleico que codifica para un componente de procesamiento derivado de la region n-terminal del virus orf2 de hepatits y un polipeptido antigenico. - Google Patents

Abstract

Un metodo para aumentar una respuesta inmune a vacuna de acido nucleico que comprende administrar a un animal, una construccion de acido nucleico que codifica para una proteina de fusion que comprende un componente de procesamiento y un polipeptido antigenico de interes, en donde el componente de procesamiento proporciona procesamiento heterogeneo del polipeptido antigenico cuando la construccion de acido nucleico se expresa en una celula huesped y un aumento resultante de la respuesta inmune. El componente de procesamiento es derivado de una porcion N-terminal de PORF2 del virus de la Hepatitis E.

Description

Una construcción de ácido nucleico que codifica para un componente de procesamiento derivado de la región n- terminal del virus ORF2 de hepatitis y un polipeptido antigénico CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general a una estrategia para mejorar la respuesta inmune a vacunas de ácido nucleico. En particular, la presente invención se refiere a una construcción de ácido nucleico que expresa una proteina de fusión que comprende un polipéptido antigénico de interés y un péptido de procesamiento, que mejora la respuesta inmune del anticuerpo y/o la celular al polipéptido antigénico de interés. La presente invención es útil, entre otros, en el diseño y desarrollo de un amplio campo de métodos, construcciones y vectores para la modulación de la respuesta inmune a un antigeno y en el diagnóstico, tratamiento y/o profilaxis de condiciones, infecciones o enfermedades tales como pero no limitadas a cánceres, enfermedades autoinmunes o bacterianas, infecciones virales o por parásitos en animales, incluyendo humanos y otros mamíferos, peces y aves.

GENERAL Aquellos expertos en la técnica se percatarán de que la invención descrita en la presente está sujeta a variaciones y modi icaciones diferentes de aquellas específicamente descritas. Se debe entender que la invención descrita en la presente incluye todas las variaciones y modificaciones tales. La invención también incluye todos los pasos, características, composiciones y compuestos tales, denominados o indicados en esta especificación, individualmente o colectivamente, y todas las combinaciones de cualesquiera dos ¦ o más de dichas etapas o características . En toda esta especificación, a no ser que el contexto lo requiera de otro modo, la palabra "comprenden'7, y las variaciones tales como "comprende" y "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de una totalidad establecida o etapa o grupo de totalidades o etapas, pero no la exclusión de ninguna otra totalidad o etapa o grupo de totalidades o etapas. La presente invención no está limitada en alcance por las modalidades específicas descritas en la presente, las cuales se enfocan para fines de ej emplificación únicamente. Los productos, composiciones y métodos funcionalmente equivalentes están claramente dentro del alcance de la invención, como se describe en la presente. Los detalles bibliográficos de las publicaciones denominadas por autor en esta especificación están indicados al final de la descripción. La referencia en la presente a la técnica anterior, incluyendo cualquiera de uno o más documentos de la técnica anterior, no se debe tomar como un conocimiento, o sugerencia, de que la técnica anterior es de conocimiento general común o forma parte del conocimiento general común. Como se utiliza en la presente, el término "derivado de" se debe tomar como que indica una totalidad particular o grupo de totalidades que se ha originado de la especie especificada, pero que no necesariamente ha sido obtenida directamente a partir de la fuente especificada. Esta especificación contiene información de secuencias de nucleótidos y aminoácidos, preparadas utilizando el programa Patentln Versión 3.0, presentadas posteriormente en la presente, en las reivindicaciones. Cada secuencia es identificada en el listado de secuencias por el indicador numérico <210> seguido por el identificador de secuencia [por ejemplo <210>1, <210>2, etc.] . La longitud, tipo de secuencia [ADN, proteína, (PRT), etc.] y organismo fuente para cada secuencia, se indican por la información proporcionada en los campos de indicador numérico <211>, <212> y <213>, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos o aminoácidos referidas en la especificación son definidas por el término "SEQ ID NO:", seguido por el identificador de secuencia [por ejemplo SEQ ID NO: 1 se refiere a la secuencia designada en el listado de secuencias como <400>1] . La designación de residuos de nucleótidos referidos en la' presente son aquellas recomendadas por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB, en donde A representa Adenina, C representa Citosina, G representa Guanina, T representa Timidina, Y representa un residuo de pirimidina, R representa un residuo de purina, M representa Adenina o Citosina, K representa Guanina o Timidina, S representa Guanina o Citosina, W representa Adenina o Timidina, H representa un nucleótido diferente de Guanina, B representa un nucleótido diferente de Adenina, V representa un nucleótido diferente de Timidina, D representa un nucleótido diferente de Citosina y N representa cualquier residuo nucleot ídico .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN "Vacuna de ácido nucleico" es un término general que refleja tecnologías que son utilizadas para dirigir la síntesis de proteínas objetivo (vacuna) en células del recipiente, vía la administración de cualquier ADN (plásmidos) o ácidos nucleicos de auto-replicación, subgenómicos virales (replicones virales). Las vacunas de ácido nucleico, y vacunas de ADN en particular, en las cuales los ADNs plásmidos que codifican para antígenos de proteína, son administradas en vez de las proteínas mismas, que han llegado a ser el foco de investigación extensa mundialmente , debido a que la observación de que el ADN desnudo podría inducir a la síntesis de antígenos in vivo que conducen a la inducción de respuestas inmunes (Wolf et al, 1990). Dos ventajas potenciales principales en el uso de las vacunas de ácido nucleico son (a) la presentación de epítopes nativos del sistema inmune después de la expresión de la proteína en células del recipiente, y (b) la homogeneidad química, facilidad de preparación, y estabilidad de ácidos nucleicos, los cuales serán de utilidad particular para vacunas combinadas y para el uso en ausencia de la cadena fría requerida para las vacunas convencionales. s La gran mayoría de las vacunas efectivas "tradicionales" están dirigidas a las infecciones autolimitantes, agudas y promueven una respuesta inmune que imita aquella asociada con la recuperación de, y la inmunidad a, la infección correspondiente. Es decir, éstas confian en la respuesta inmune normal a los antígenos del agente infeccioso, presentado en su forma o formas nativas. Las vacunas de ácido nucleico tienen una ventaja estratégica en tales sistemas. En el pasado esto ha sido generalmente logrado mediante el uso ya sea de (i) organismos vivos, atenuados en vacuna (por ejemplo vacunas de polio Sabin) ; (ii) organismos de tipo silvestre (o toxinas bacterianas) que son subsecuentemente inactivados (por ejemplo vacunas de polio Salk) , o (iii) fabricación de antígenos nativos utilizando tecnología de ADN recombinante (por ejemplo vacunas subunitarias de hepatitis B). En este contexto, las vacunas de ADN tienen la ventaja mayor de que los antígenos objetivo se sintetizan en una forma nativa dentro de las células del recipiente. Esto es también cierto para los sistemas de distribución basados en replicón viral (por ejemplo, el sistema de replicón Kunjin ( hromykh, et al. 1997; Varnavski, et al. 1999; Varnavski, et al. 2000). Sin embargó, las respuestas de anticuerpo a las · vacunas de ADN que codifican para antigenos son frecuentemente poco o no detectables . Han sido realizados muchos menos progresos en el desarrollo de vacunas preventivas y terapéuticas contra infecciones donde la respuesta inmune normal falla para eliminar la infección. Para agentes tales como HCV y el virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) donde la falla para eliminar la infección es la norma, las vacunas que son capaces de inducir la respuesta inmune normal a antigenos relevantes pueden tener poca utilidad. Esto es también verdad para los antigenos específicos de tumor que son usualmente observados como "propios" y de este modo la respuesta inmune normal es una de tolerancia. A pesar de sus diversas ventajas potenciales, las vacunas estándares de ADN o replicón pueden ser ineficientes en tales casos, precisamente debido a que éstas codifican antígenos en sus formas nativas. Han sido utilizados una variedad de métodos para modular respuestas inmunes a vacunas de ADN, que incluyen (i) codistribución de citocinas o plásmidos que codifican para citocina; (ii) el papel inmunoestimulador de dinucleótídos CpG comúnmente encontrados en ADNs bacterianos (y plásmidos) (Hemmi et al, 2000); y (iii) protocolos de refuerzo principal, que utilizan vacunas de ADN junto con vectores de poxvirus . Existen estrategias para dirección al objetivo de antigeno que incluyen el uso de (a) fusiones de ubiquitina (ubiquitina-A76 o -G76-K) para proteínas objetivo para la poliubiquit inación, degradación intracelular rápida en proteasomas y presentación eficiente de MHC-I: (b) fusión a proteína 1 de membrana asociada a lisosoma (LAMP-1) para dirigir al objetivo de la vía MHC-II; (c) fusión a la secuencia guia E3 de adenovirus para dirigir el epítope al retículo endoplásmico (ER) y (d) fusión a CTLA4 para dirigir el epítope para la secreción y captación por antígeno profesional que presenta células (APCs) . Sin embargo, la eficacia de muchas vacunas de ADN ha sido pobre (Gurunathan S et al, 2000) y existe una necesidad para el desarrollo de tecnologías y moléculas mejoradas, para modular la respuesta inmune a proteínas expresadas por vacunas de ADN que conducen a la recuperación o a la protección.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En el trabajo que conduce a la presente invención, los inventores han encontrado que cuando la proteína de cápside de longitud completa, P0RF2, del virus de la hepatitis E (HEV) es expresada en células de mamífero, aproximadamente 80% de la proteína nuevamente sintetizada es transpuesta al retículo endoplásmico y rápidamente degradado mientras que 20% de la proteína se acumula en una forma intacta dentro del citosol ( 4 ) . De acuerdo con la presente invención, los inventores han identificado secuencias peptídicas N-terminales de la PORF2 de HEV que permiten el procesamiento del polipéptido heterogéneo ("péptido de procesamiento" o "componente de procesamiento") y también han desarrollado una estrategia para aumentar la respuesta inmune al polipéptido antigénico de interés, utilizando tales secuencias peptídicas de procesamiento . Los inventores expresaron el fragmento polipeptídico antigénico P0RF2.1 de HEV en células animales utilizando una serie de vectores de expresión, que codifican para el fragmento ORF2.1 sin una proteína de fusión (ORF2.1) o como proteínas de fusión con secuencias provenientes del extremo N de PORF2 de HEV; Sigl-ORF2.1 que tiene los aminoácidos 1 al 22 de P0RF2, Sig2-ORF2 que tiene los aminoácidos 1 al 36 de P0RF2 o Sig3-ORF2.1 que tiene los aminoácidos 1 al 50 de PORF2.

Los inventores establecieron que mientras la proteína ORF2.1 fue encontrada casi exclusivamente en la fracción soluble de citosol, el péptido Sigl está dirigido casi exclusivamente a la fracción membranal mientras que los péptidos Sig2 y Sig3 confieren una localización heterogénea. Además, en el caso de los polipéptidos Sig2-ORF2.1 y Sig3-ORF2.1, se encontró que la proteína asociada a citosol es estable mientras la proteína asociada a la membrana se degradó consistente con la generación de una respuesta inmune mixta (respuestas de anticuerpo CTL respectivamente) . La generalidad amplia de este hallazgo se confirmó cuando las secuencias N-terminales de 0RF2 (Sigl, Sig2 y Sig3) se fusionaron a Glutatión-S-transferasa y mostraron ser procesadas (por ejemplo, localizadas y procesadas) heterogéneamente de la misma manera . La habilidad de los péptidos de procesamiento para aumentar una respuesta inmune a un polipéptido antigénico en comparación a la proteína no modificada, se probó en un modelo de rata, en el cual una respuesta de anticuerpo a P0RF2.1 fue medible. Sigl-0RF2.1 y Sig3-ORF2.1 indujeron una respuesta de anticuerpo aumentada y en el caso de Sig3-0RF2.1 la mayoría de la fracción transpuesta se degradó rápidamente, lo que favorece a la presentación de la vía MHC-I y a la inducción de las respuestas inmunes celulares. En consecuencia, un aspecto de la presente invención proporciona un método para aumentar, en un animal, una respuesta inmune a un polipéptido antigénico de interés, el método comprende administrar al animal un cantidad efectiva de una composición que comprende una construcción de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión que contiene un componente de procesamiento y el polipéptido antigénico mencionado, en donde el componente de procesamiento proporciona procesamiento heterogéneo del polipéptido antigénico cuando la construcción de ácido nucleico es expresada en una célula huésped y un aumento resultante de la respuesta inmune al polipéptido antigénico. Otro aspecto de la presente invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican para un péptido de procesamiento capaz de modular la respuesta inmune a un polipéptido antigénico en un huésped, cuando la molécula de ácido nucleico es expresada en una célula huésped como una proteína de fusión que comprende el péptido de procesamiento y el polipéptido antigénico. En otro aspecto, la presente invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican para un péptido de procesamiento que proporciona procesamiento heterogéneo de un polipéptido antigénico de interés, cuando la molécula de ácido nucleico es expresada en una célula huésped como una proteina de fusión que comprende el péptido de procesamiento y el polipéptido antigénico. Otro aspecto de la presente invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que codifica para un péptido de procesamiento capaz de aumentar la respuesta inmune a un polipéptido antigénico en un huésped, cuando la molécula de ácido nucleico es expresada en una célula huésped como una proteina de fusión que contiene el péptido de procesamiento y el polipéptido antigénico, en donde el péptido de procesamiento es codificado por una secuencia de nucleótidos contiguos de .la región N-terminal de la secuencia nucleotidica 0RF2 del virus de la hepatitis E o un derivado funcional, variante, parte u homólogo del mismo. Otro aspecto adicional de la presente invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que codifica para un péptido de procesamiento capaz de modular la respuesta inmune a un polipéptido antigénico en un huésped, cuando la molécula de ácido nucleico es expresada en una célula huésped como una proteina de fusión que contiene el péptido de procesamiento y el polipéptido antigénico, en donde el péptido de procesamiento comprende una secuencia de aproximadamente 5-100 aminoácidos contiguos seleccionados de la región N-terminal de la proteina P0RF2 del virus de la hepatitis E o un derivado funcional, variante, parte u homólogo del mismo. En una modalidad de la presente invención, la molécula aislada de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente como se describe el la SEQ ID NO: 4 o SED ID NO: 5 o SED ID NO: 6 o un derivado funcional, variante, parte u homólogo de la misma. Otro aspecto adicional de la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 5-100 aminoácidos contiguos seleccionados de la región N-terminal de la proteina P0RF2 del virus de la hepatitis E o un derivado funcional, variante, parte u homólogo del mismo. Preferentemente, el polipéptido aislado como se describe anteriormente en la presente, tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se establece en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 o un derivado funcional, variante, parte u homólogo del mismo. Un aspecto adicional de la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican para una proteina de fusión, en donde la proteina de fusión comprende un componente de procesamiento y al menos un componente antigénico, en donde el componente de procesamiento proporciona procesamiento heterólogo del componente antigénico y un aumento resultante de la respuesta inmune al componente antigénico en un huésped, cuando la construcción de ácido nucleico es expresada en una célula huésped. Otro aspecto relacionado de la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican para una proteina de fusión, la proteina de fusión comprende un componente de procesamiento y al menos un componente antigénico en un huésped, el componente de procesamiento es capaz de aumentar la respuesta inmune al componente antigénico, y comprende una secuencia de señal y opcionalmente un péptido intermediario que contiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente que corresponden a la región N-terminal de una proteína que es capaz del procesamiento intracelular heterogéneo. Preferentemente, el componente de procesamiento como se describe anteriormente en la presente comprende tanto una secuencia de señal como un péptido intermediario que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente correspondiente a la región N-terminal de una proteína que es capaz del procesamiento intracelular heterogéneo. Otro aspecto adicional de la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican para una proteína de fusión, la proteína de fusión comprende un componente de procesamiento y al menos un componente antigénico, el componente de procesamiento es capaz de aumentar la respuesta inmune al componente antigénico, el componente de procesamiento comprende una secuencia de señal y opcionalmente un péptido intermediario que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponden substancialmente a la región N-terminal de la proteína estructural principal del virus de la hepatitis E (PORF2) o un derivado funcional, variante, parte u homólogo del mismo. Preferentemente, el componente de procesamiento como se describe anteriormente en la presente comprende tanto una secuencia de señal como una secuencia de péptido intermediario proveniente de la región N-terminal de la proteina estructural principal del virus de la hepatitis E (P0RF2) o un derivado funcional, variante, parte u homólogo del mismo . Otro aspecto más de la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican para una proteina de fusión, en donde la proteina de fusión comprende un componente de procesamiento y al menos un componente antigénico, el componente de procesamiento es capaz de modular la respuesta inmune al componente antigénico en un huésped, y comprende una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 5 a 100 aminoácidos contiguos seleccionados de la región N-terminal de la proteína estructural principal del virus de la hepatitis E (P0RF2) o un derivado funcional, variante, parte u homólogo del mismo. En un aspecto particularmente preferido de la presente invención, el componente de procesamiento de la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos como se describe sustancialmente en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 correspondiente a los aminoácidos 1-22, 1-36 ó 1-50 respectivamente de la región N-terminal de PORF2 o un derivado funcional, variante, parte u homólogo del mismo. Un aspecto adicional de la presente invención proporciona una construcción aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican para una proteina de fusión, en donde la proteina de fusión comprende un componente de procesamiento codificado por una región 5' del gen ORF2 del virus de la hepatitis E y un componente antigénico, en donde el componente de procesamiento modula la respuesta inmune al componente antigénico en un huésped, cuando la onstrucción de ácido nucleico es expresada en una célula huésped. Un aspecto adicional de la presente invención proporciona una vacuna que comprende una construcción de ácido nucleico como se describe anteriormente en la presente, tal como, por ejemplo, un replicón viral o molécula de ADN. Un aspecto relacionado de la invención proporciona una célula, tal como, por ejemplo, un antigeno que presenta células, transfectado con una construcción de ácido nucleico como se describe anteriormente en la presente. Otro aspecto adicional de la presente invención proporciona una composición para el uso y el aumento de la respuesta inmune en un animal, que comprende una construcción de ácido nucleico como se describe anteriormente en la presente y uno o más portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Otro aspecto más de la presente invención proporciona un método para modular, en un animal, una respuesta inmune a un antigeno de interés, el método comprende administrar al animal una cantidad efectiva de una construcción de ácido nucleico como se describe anteriormente en la presente, o vacuna o célula que codifica o que comprende una construcción de ácido nucleico como se describe anteriormente en la presente, por un tiempo y bajo condiciones suficientes para modular la respuesta inmune al antigeno. La presente invención también se extiende al uso de una molécula o construcción de ácido nucleico como se describe anteriormente en la presente, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de condiciones o infecciones que incluyen pero no están limitadas a condiciones de cáncer o precancerosas , enfermedades autoinmunes, infecciones virales, bacterianas o por parásitos en animales, incluyendo humanos y otros mamíferos, peces o aves. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 proporciona un mapa de los péptidos sigl, sig2 y sig3 relativos a la proteina P0RF2 de longitud completa del virus de la hepatitis E, y las secuencias de aminoácidos de las proteínas respectivas. Es aparente que podría esperarse que las proteínas de tamaño intermedio entre estos ejemplos tengan utilidad similar. La figura 2 es una representación de inmunoprecipitación y análisis de PAGE de ORF2.1 y sigl-2.1, sig2-2.1 y sig3-2.1 radiactivamente marcados que muestran la localización diferencial de las proteínas codificadas en las fracciones citosólicas (c) o asociadas a la membrana (m) de las células. Nótese que ORF2.1 y sigl-2.1 tienen localización homogénea, mientras que sig2-2.1 y sig3-2.1 tienen localización heterogénea. Nótese también que las bandas múltiples de velocidades de migración diferentes se deben a la glucosilación parcial de aquellas proteínas que son transpuestas a la sección membranal. La figura 3 es una representación de la inmunoprecipitación y análisis de PAGE de 0RF2.1 y sigl.2.1, si2-2.1 y sig3-2.1 radiactivamente marcados, que muestra la localización diferencial de las proteínas codificadas en las fracciones citosólicas (cyto) o asociadas a la membrana (memb) de las células (como para la figura 2), y la estabilidad diferencial de cada especie de proteina a las 0, 1 ó 4 horas después de la marcación. Nótese que ORF2.1 y sigl-2.1 tienen procesamiento homogéneo (degradado o estable después de 4 horas, respectivamente), mientras que sig2-2.1 y sig3-2.1 tienen procesamiento heterogéneo (estable y degradado) consistente con su localización heterogénea (cyto y memb, respectivamente) . La figura 4 es una representación de inmunoprecipitación y análisis de PAGE de sigl-GST, sig2-GST y sig3-GST radiactivamente marcados, que muestra la localización diferencial de proteínas codificadas en las fracciones citosólicas (cyto) o asociada a la membrana (memb) de las células y la estabilidad diferencial de cada especie de proteína a las 0 ó 3 horas después de la marcación. Nótese que sigl-GST tiene localización heterogénea (cyto más memb), pero procesamiento homogéneo (estable), mientras que sig2-GST y sig3-GST tienen localización heterogénea (cyto más memb) y procesamiento heterogéneo (estable y degradado) . La figura 5 es una representación diagramática de las respuestas inmunes a las vacunas basadas en vector o virales de ácido nucleico en animales o en el ser humano. (A) . El patrón general de las respuestas inmunes a las proteínas antigénicas depende de su procesamiento y localización intracelular . Nótese que la mayoría de las especies proteicas individuales son propensas a seguir únicamente una de las 4 vías mostradas. (B) Modulación del patrón de respuestas inmunes, predicho a partir del uso de los péptidos sig fusionados a antígenos de interés. En el ejemplo utilizado, el antígeno 0RF2.1 de HEV es el antígeno objetivo y contiene ambos epitopes de células B lineales y conformacionales así como los que son similares por contener epitopes de células T, y las vacunas son vacunas de ADN basadas en plásmido que codifican para ORF2.1 , sigl-2.1 o sig3-2.1, o ubiquitin-2.1 para producir un producto rápidamente degradado (referencias 8 y 9) . Las vías de respuesta inmune predichas se muestran para los animales que reciben diferentes vacunas. Nótese que la localización y procesamiento heterogéneos del sig3-2.1 es única en la activación de las respuestas inmune humoral (anticuerpos) y celular, con el potencial agregado para la retroalimentación positiva entre los dos brazos de la respuesta inmune. Abreviaturas: Ab, linear: anticuerpo para epitopes peptidicos lineales. Ab, conform. : anticuerpo para epítopes peptídicos conformacionales . CTL: respuestas inmunes celulares. La figura 6 es una representación gráfica que muestra el desarrollo del anticuerpo a 0RF2.1 de HEV en ratas inmunizadas con diversas construcciones de vacuna de ADN (vec; vector solo; 0RF2.1 solo, Ub.2.1; ubiquitin-A76-ORF2.1, sigl.2.1 Sigl-0RF2.1, sig3.2.1; Sig3-ORF2.1 ) . Dos ratas por grupo se inmunizaron via inyección IM de 100 µg de ADN en solución salina a las 0, 4 y 8 semanas, y las respuestas de anticuerpo en los tiempos indicados se midieron utilizando el ensayo de ELISA de ORF2.1 (Anderson et al, 1999). La figura 7 es una representación que es un manchado de Western que muestra el desarrollo del anticuerpo a ORF2.1 de HEV en ratas inmunizadas con construcciones de vacuna de ADN. El anticuerpo proveniente de las ratas inmunizadas con sigl-ORF2.1 o sig3-ORF2.1 se probaron mediante inmunomanchado de Western contra diversos fragmentos de la proteina ORF2 de longitud completa como se describe en Riddell et al (2000). Nótese que la vacuna de ADN de Sigl-ORF2.1 induce anticuerpos al epítope ORF2.1 conformacional , mientras que la vacuna de ADN de sig3-ORF2.1 induce a un alto nivel de anticuerpo contra el epítope de ORF2.1 conformacional así como los epítopes lineales, consistente con la presentación del antigeno intacto y el degradado a través de la vía MHC-II.

TABLA 1 RESUMEN DE LAS SEQ ID NOS .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La presente invención está basada en parte en la identificación de los péptidos N-terminales de la proteína de la cápside de P0RF2 del virus de la hepatitis E, que confiere patrones únicos de procesamiento de proteína intracelular a las proteínas de fusión que comprenden uno de los péptidos fusionados a las proteínas heterólogas. Los métodos para generar vectores de expresión adecuados y estrategias de clonación son bien conocidos en la técnica. De esta manera, el antígeno codificado por la vacuna de ADN puede ser simultáneamente procesado para la estimulación óptima de ambas respuestas inmunes celulares y humorales. Se considera que las construcciones de ácido nucleico que codifican para las secuencias peptidicas de procesamiento de la presente invención, fusionadas a cualquier péptido o polipéptido antigénico de interés, modularán la respuesta inmune al polipéptido antigénico de interés cuando la construcción de ácido nucleico se exprese en una célula huésped. Investigación reciente sobre vacunas de ácido nucleico ha mostrado que las respuestas inmunes celulares son aumentadas mediante la degradación rápida de proteina a través de la via de proteasoma, lograda por la fusión a ubiquitina, mientras que tal degradación ampliamente cancela las respuestas inmunes de anticuerpo (humoral) a las mismas proteínas (8 y 9) . Similarmente, las respuestas inmunes diferentes son promovidas mediante la expresión de la misma proteína antigénica dirigida para que permanezca la célula asociada o excretada de la célula (3) . Las respuestas inmunes celulares y humorales a las vacunas de ácido nucleico son por lo tanto sensibles para el patrón de procesamiento de proteína intracelular del antígeno.

En muchos casos, ambos brazos de la vía inmune pueden ser requeridos para la eficacia protectora de vacunas, y una respuesta balanceada puede requerir procesamiento diferencial de una proteína antigénica particular. Cuando los antígenos proteicos son expresados en la célula, su procesamiento intracelular es generalmente homogéneo. Es decir, cada copia de la proteína será procesada esencialmente de la misma manera, por ejemplo mediante transposición al retículo endoplásmico y la expresión o excreción subsecuente de la superficie celular, o alternativamente mediante retención en el citosol o dirección al objetivo para la degradación en el proteasoma u otras vías degradativas . Como resultado, la expresión de una proteína después de la administración de una vacuna de ácido nucleico dará como resultado un patrón homogéneo de procesamiento para la proteína codificada, desviando la respuesta inmune hacia las vías celular o humoral, dependiendo de la vía de procesamiento para esa proteína particular. Para diversas enfermedades, no se sabe si la inmunidad humoral o celular es más similar para proporcionar protección de la enfermedad o los efectos terapéuticos, y es probable que ambos brazos de la respuesta inmune frecuentemente serán requeridos para la protección óptima o los efectos terapéuticos.

Además, existen diversas enfermedades que están caracterizadas por la falta de una respuesta inmune protectora o terapéutica en individuos afectados, tales como cánceres o infecciones con virus crónicas tales como hepatitis C, hepatitis B y los virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1 y VIH-2) . Para estas enfermedades, es claro que el patrón normal del procesamiento de proteína para los antígenos proteicos asociados con la enfermedad, no promueve una respuesta inmune que pueda conducir a la recuperación o a la protección. En consecuencia, un aspecto de la presente invención proporciona un método para aumentar, en un animal, una respuesta inmune a un polipéptido antigénico de interés, el método comprende administrar al animal una cantidad efectiva de una composición que comprende una construcción de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión que contiene un componente de procesamiento y el polipéptido antigénico, en donde el componente de procesamiento proporciona procesamiento heterogéneo del polipéptido antigénico cuando la construcción de ácido nucleico es expresada en una célula huésped y un aumento resultante de la respuesta inmune al polipéptido antigénico. En una modalidad, la construcción de ácido nucleico que codifica para un componente de procesamiento, codifica para un componente de procesamiento que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 o un derivado funcional, variante, parte u homólogo de la misma. La referencia en la presente a "aumento de la respuesta inmune" o "modulación de la respuesta inmune", debe entenderse que incluye la referencia a supra-regulación y sub-regulación de uno o más brazos de la respuesta inmune e incluye estimulación óptima de la respuesta inmune celular y/o humoral (anticuerpos) y puede también incluir mecanismos ventajosos de ret roalimentación entre estos dos brazos de la respuesta inmune- La activación de las respuestas inmunes humorales además de las respuestas inmunes celulares puede tener también una ventaja agregada de modular las respuestas inflamatorias y en particular las células inmunes tipo TH1 · De acuerdo a una modalidad preferida, el procesamiento heterogéneo de polipéptidos antigénicos permite aumentar las respuestas inmunes mixtas por ejemplo, ambas respuestas de anticuerpo y celulares. La referencia en la presente a "componente de procesamiento" o "péptido de procesamiento" de una proteina de fusión, debe entenderse que incluye la referencia a un péptido o polipéptido que afecta entre otros a la localización intracelular y/o el procesamiento proteolitico de la proteina de fusión. Preferentemente, el componente de procesamiento hace posible la localización intracelular del componente antigénico. El componente de procesamiento puede ser proveniente de HEV o puede ser proveniente de cualquier otra fuente. El péptido de procesamiento puede estar colocado 5' al polipéptido antigénico.

Alternativamente, el polipéptido de procesamiento puede funcionar a partir de una posición 3' con relación al polipéptido antigénico. Como alternativa adicional, el componente de procesamiento puede funcionar a partir de una posición anidada dentro de la proteina de fusión. Claramente, las proteínas de fusión contempladas por los presentes inventores no se extienden a moléculas de origen natural. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que los métodos descritos en la presente pueden ser utilizados para identificar péptidos adicionales de procesamiento que permitan el procesamiento heterogéneo de las proteínas de fusión que los contienen. Otro aspecto de la presente invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican para un péptido de procesamiento capaz de modular la respuesta inmune a un polipéptido antigénico en un huésped, cuando la molécula de ácido nucleico es expresada en una célula huésped como una proteina de fusión que comprende el péptido de procesamiento y el polipéptido antigénico. Otro aspecto más de la presente invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico como se describe anteriormente en la presente, que comprende una secuencia de nucleótidos que corresponden sustancialmente a la región N-terminal del gen ORF2 del virus de la hepatitis E o un derivado funcional, variante, parte u homólogo de la misma. Otro aspecto adicional de la presente invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico como se describe anteriormente en la presente, que codifica para un péptido de procesamiento que comprende una secuencia de aproximadamente 5-100 aminoácidos contiguos seleccionados de la región N-terminal de la proteina P0RF2 del virus de la hepatitis E o derivado funcional, variante, parte u homólogo de la misma. -De acuerdo a este aspecto particular de la invención, el aminoácido 1 es el aminoácido más N-terminal. La región N-terminal puede comprender hasta aproximadamente 100 aminoácidos. Preferentemente, el péptido objetivo comprende los aminoácidos 1-22 ó 1-36 de la región N-terminal de P0RF2, incluso más preferentemente el péptido en cuestión comprende los aminoácidos 1-50 de la región N-terminal de P0RF2 o un derivado funcional, variante, parte u homólogo del mismo. La referencia a "funcional" de acuerdo a este aspecto de la invención, incluye la referencia a los polipéptidos y a sus polinucleotidos que lo codifican, que son capaces de modular la respuesta inmune cuando el polinucleótido es expresado en una célula huésped. Un aspecto de la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican para una proteina de fusión, en donde la proteina de fusión comprende un componente de procesamiento y al menos un componente antigénico, el componente de procesamiento está localizado 5' al componente antigénico y es capaz de aumentar la respuesta inmune al componente antigénico en un huésped, cuando la construcción de ácido nucleico es expresada en una célula huésped. La molécula de ácido nucleico adecuada para el uso en la presente invención puede ser cualquier forma de molécula de ácido nucleico tal como ADN o ARN. En una modalidad particular de este aspecto de la invención, el componente .de procesamiento comprende una secuencia de señal que dirige la proteina de fusión a una membrana y a la localización de citosol en una célula huésped, en donde la proteina de fusión es estable en un periodo de horas y es efectiva en el aumento de una respuesta de anticuerpo al componente antigénico. En un aspecto preferido de la invención, el componente de procesamiento contiene las propiedades de localización intracelular heterogénea (por ejemplo al citosol y a los compartimentos de la membrana) y/o procesamiento proteolitico intracelular mixto (estable y degradado) . Sin limitar la presente invención a ningún modo o teoría de acción, se entiende que el componente de procesamiento de la presente invención simultáneamente dirige al objetivo la proteína de fusión para la estimulación óptima de ambas respuestas inmunes, celular y humoral. En consecuencia, otro aspecto de la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican " para una proteína de fusión, en donde la proteína de fusión comprende un componente de procesamiento y al menos un componente antigénico, el componente de procesamiento está localizado 5' al componente antigénico y es capaz de modular la respuesta inmune al componente antigénico en un huésped, el componente de procesamiento comprende una secuencia de señal y opcionalmente un péptido intermediario que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponden sustancialmente a la región N-terminal de una proteina que es capaz del procesamiento post-traduccional intracelular heterogéneo . Preferentemente, el componente de procesamiento como se describe anteriormente en la presente comprende tanto una secuencia de señal como un péptido intermediario que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde sustancialmente a la región N-terminal de una proteína que es capaz del procesamiento post-traduccional intracelular heterogéneo . La referencia en la presente a una "secuencia de señal"' debe entenderse que incluye la referencia un péptido usualmente, pero no necesariamente, localizado en el extremo N de un polipéptido recientemente sintetizado. La secuencia de señal puede dirigir la captación post-traduccional por organelos y puede ser escindida como las proteínas maduras. Ésta incluye cualquier secuencia de señal eucariótica o procariótica que puede estar asociada, en su forma de origen natural, con la proteína antigénica de interés o proveniente de cualquier otra fuente útil. De acuerdo con la presente invención, la secuencia de señal puede ser totalmente funcional y totalmente escindida o alternativamente escindida y/o la función de secuencia de señal puede ser ineficiente. Como se sabe por aquellos expertos en la técnica, la secuencia de señal de un polipéptido puede ser predicha utilizando diversos algoritmos conocidos (G. Von Heijne et al, 1989) . Otro aspecto más de la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican para una proteína de fusión, en donde la proteína de fusión comprende un componente de procesamiento y al menos un componente antigénico en un huésped, el componente de procesamiento está localizado 5' al componente antigénico y es capaz de modular la respuesta inmune al componente antigénico, el componente de procesamiento comprende una secuencia de señal y opcionalmente un péptido intermediario que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde sustancialmente a la región N-terminal de la proteina estructural principal del virus de la hepatitis E (P0RF2) o un derivado funcional, variante, parte u homólogo del mismo. Preferentemente, el componente de procesamiento como se describe anteriormente en la presente comprende tanto una secuencia de señal como un péptido intermediario que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponden sustancialmente a la región N-terminal de la proteina estructural principal del virus de la hepatitis E ( PORF2 ) o un derivado funcional, variante, · parte u homólogo del mismo. La referencia en la presente a una "secuencia peptidica intermediaria" debe entenderse que incluye la referencia a secuencias colocadas 3' de la secuencia de señal, cuyas secuencias 3' alteran las propiedades de procesamiento conferidas por el componente de procesamiento de la proteina de fusión. Como con la secuencia de señal, la secuencia peptidica intermediaria puede originarse de cualquier fuente, incluyendo la región terminal N de PORF2 del virus de la hepatitis E. Otro aspecto más de la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican para una proteina de fusión, en donde la proteina de fusión comprende un componente de procesamiento y al menos un componente antigénico, el componente de procesamiento está localizado 5' al componente antigénico y es capaz de modular la respuesta inmune al componente antigénico, el componente de procesamiento comprende una secuencia de señal y un péptido intermediario, en donde el componente de procesamiento comprende una secuencia de aminoácidos que corresponden sustancialmente de 5 hasta 100 aminoácidos contiguos seleccionados de la región N-terminal de la proteina estructural principal del virus de la hepatitis E (PORF2) o un derivado funcional, variante, parte u homólogo del mismo. En una modalidad, el componente de procesamiento comprende aproximadamente 5-100 aminoácidos, más preferentemente 30-90 y aún más preferentemente 20-60 aminoácidos seleccionados de la región N-terminal de PORF2 o un derivado funcional, variante, parte u homólogo del mismo. Preferentemente, el componente de procesamiento comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se describe en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3 correspondiente a los aminoácidos 1-22, 1-36 o 1-50 respectivamente de la región N-terminal de la proteina P0RF2 o un derivado funcional, variante, parte u homólogo de la misma. Con referencia a "derivados" de acuerdo a este aspecto de la presente invención, incluye fragmentos, partes, porciones, equivalentes, análogos, imitantes, imitaciones u homólogos. Los derivados polipeptidicos pueden ser derivados por inserción, supresión o sustitución de los aminoácidos. Los derivados polinucleotidicos pueden ser derivados de sustituciones, supresiones, y/o adiciones de ácido nucleico, simples o múltiples, incluyendo fusión .con otras moléculas de ácido nucleico. Se entiende que los equivalentes incluyen referencia a moléculas que pueden actuar como análogos o agonistas funcionales. Los equivalentes pueden ser detectados siguiendo, por ejemplo, selección de producto natural. La referencia a "variantes" incluye referencia a moléculas que tienen al menos 50% o preferentemente 60% o entre 65 y 80% de similitud, y más preferentemente al menos 90% de similitud a la secuencia polipeptidica o polinucleotidica . Las variantes funcionales pueden ser establecidas por estudios de mutagénesis o a través de diseño racional. Además, las variantes polinucleotidicas pueden incluir polinucleótidos capaces de hibridarse a los polinucleótidos de la presente invención bajo condiciones de exigencia del medio . En un aspecto relacionado de la presente invención, el componente de procesamiento de la proteina de fusión comprende un péptido codificado por una secuencia de 1-300 nucleótidos que corresponden sustancialmente a los nucleótidos contiguos de la región N-terminal del gen ORF2 de HEV. Preferentemente, el componente de procesamiento comprende un péptido codificado por una secuencia de nucleótidos como se describe sustancialmente en la SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6 un derivado funcional, variante, parte u homólogo del mismo. Un aspecto adicional de la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican para una proteina de fusión, en donde la proteina de fusión comprende un componente de procesamiento codificado por una región 5' de ORF2 del virus de la hepatitis E y un componente antigénico, en donde el componente de procesamiento modula la respuesta inmune al componente antigénico en un huésped, cuando la construcción de ácido nucleico es expresada en una célula huésped. Un aspecto adicional de la presente invención proporciona una vacuna que comprende una construcción de ácido nucleico como se describe anteriormente en la presente. Un aspecto relacionado, adicional de la invención proporciona una célula transfectada con una construcción de ácido nucleico como se describe anteriormente en la presente. Una célula adecuada para el uso en la presente invención puede ser una célula inmune y/o una célula de presentación capaz de presentar o dirigir al objetivo o dirigir la proteina de fusión dentro de un organismo huésped, para optimizar la respuesta inmune al componente antigénico. De acuerdo a este aspecto, la célula puede ser transfectada in vitro o in vivo. Un tipo celular particularmente preferido es una célula dendritica. Otro aspecto más de la presente invención proporciona una composición para el uso en la modulación de la respuesta inmune en un animal, que comprende una construcción de ácido nucleico como se describe anteriormente en la presente y uno o más portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. La referencia en la presente a "animal" se utiliza en un sentido amplio para incluir mamíferos, aves, peces y reptiles, y se extiende a animales tales como pero no limitados a humanos, primates, ganado (ovejas, cerdos, vacas, caballos), animales de compañía (perros, gatos), animales de prueba en laboratorios (por ejemplo ratón, rata, conejo, cobayo, hámster), animales silvestres cautivos (por ejemplo zorro, venado), aves enjauladas (por ejemplo loro) y aves de corral (por ejemplo pollo, pato). Preferentemente, el animal objetivo es un humano o primate. Más preferentemente, el sujeto es un humano. Las formas farmacéuticas apropiadas para el uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (solubles en agua) y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles por dispersión. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida a un grado que exista capacidad de fluir en la jeringa fácilmente. Ésta debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe ser preservada contra la acción de contaminación por microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un medio solvente o de dispersión que contenga por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) , mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez adecuada puede ser mantenida, por ejemplo mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes . Las prevenciones de la acción de microorganismos pueden ser originadas por diversos agentes antibacterianos y fúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, tirmerosal y similares. En muchos casos será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción 'prolongada de las composiciones inyectables puede ser originada por el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Cuando los ingredientes activos son adecuadamente protegidos, éstos pueden ser administrados oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un portador comestible asimilable, o éstos pueden estar encerrados en cápsulas de gelatina dura o de recubrimiento suave, o pueden ser comprimidos en tabletas, o pueden ser incorporados con el alimento de la dieta. Para la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede ser incorporado con excipientes y utilizado en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Tales composiciones y preparaciones deben contener al menos 1% en peso del compuesto activo. El porcentaje de la composición y las preparaciones puede, por supuesto, ser variado y puede convenientemente estar entre aproximadamente 5 hasta aproximadamente 80% en peso de la unidad. La cantidad de compuesto activo en tales composiciones terapéuticamente útiles es tal que será obtenida una dosificación adecuada. Las composiciones o preparaciones preferidas de acuerdo a la presente invención se preparan de modo que una forma unitaria de dosis oral contiene entre aproximadamente 0.1 y 2000 mg del compuesto activo. Las tabletas, trociscos, pildoras, cápsulas y similares, pueden también contener lo siguiente: un aglutinante tal como goma de tragacanto, acacia, almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicálcico, un agente de desintegración tal como almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; y un agente edulcorante tal como sucrosa, lactosa o sacarina, pueden ser agregados o un agente saborizante tal como menta, aceite de gaulteria, o saborizante de cereza. Cuando la forma unitaria de dosificación es una cápsula, ésta puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un portador liquido. Otros diversos materiales pueden estar presentes como recubrimientos o para modificar de otro modo la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, las tabletas, pildoras, o cápsulas pueden ser recubiertas con goma laca, azúcar o ambas. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sucrosa como un agente edulcorante, metil- y propilparabeno como conservadores, un colorante y saborizantes tal como sabor de cereza o de naranja. Por supuesto, cualquier material utilizado en la preparación de cualquier forma unitaria de dosificación debe ser farmacéuticamente puro y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, el compuesto activo puede ser incorporado en las formulaciones y preparaciones de liberación controlada. Los portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardadores o promotores isotónicos y de absorción y similares. El uso de tales medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en cuanto a que cualquier medio o agente convencional sea compatible con el ingrediente activo o célula, se contempla el uso del mismo en las composiciones terapéuticas. Los ingredientes activos suplementarios pueden también ser incorporados en las composiciones. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma unitaria de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma unitaria de dosificación como se utiliza en la presente, se refiere a. unidades físicamente discretas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos a ser tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo, calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación, nuevas, de la invención, son dictadas por y directamente dependientes de (a) las características únicas de material activo y el efecto terapéutico particular a ser logrado, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de los compuestos tales como un material activo para el tratamiento de la enfermedad en sujetos vivos que tienen una condición de enfermedad en la cual la salud corporal es deteriorada como se describe en la presente con detalle. El ingrediente activo principal está compuesto para la administración conveniente y efectiva, en cantidades efectivas con un portador farmacéuticamente aceptable, adecuado en forma unitaria de dosificación como se describe anteriormente en la presente. Una forma de dosificación unitaria puede, por ejemplo, contener el compuesto activo principal en cantidades que varían desde 0.5 hasta aproximadamente 2000 mg. Expresado en proporciones, el compuesto activo está generalmente presente en el intervalo de aproximadamente 0.5 µg hasta aproximadamente 2000 mg/ml de portador. En el caso de las composiciones que contienen ingredientes activos suplementarios, las dosificaciones son determinadas por referencia a la dosis y a la manera usual de administración de los ingredientes . La administración de la construcción de ácido nucleico o vacuna en la forma de una composición, puede ser cualquier modo conveniente tal como, pero no limitado a, administración directa por pistola de genes, distribución de microesferas liposomales o poliméricas o distribución vía vectores basados en virus. El agente de la composición farmacéutica es contemplado para mostrar actividad terapéutica o profiláctica en una cantidad que depende del caso particular. La variación depende por ejemplo del animal, del modo de administración y del tratamiento requerido. Un intervalo amplio de dosis puede ser aplicable. Considerando a un paciente, por ejemplo, de aproximadamente 0.1 µg hasta aproximadamente 1 mg de construcción de ácido nucleico, puede ser administrado por kilogramo de peso corporal. Los regímenes de dosificación pueden ser ajustados para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. El agente puede ser administrado en cualquier manera conveniente tal como las rutas oral, intravenosa (soluble en agua), intranasal, intraperitonal, intramuscular, subcutánea, intradér ica o por supositorio o implante (por ejemplo utilizando moléculas de liberación lenta) . Otro aspecto adicional de la presente invención proporciona un método para modular, en un animal, una respuesta inmune a un antígeno de interés, el método comprende administrar al animal una cantidad efectiva de una construcción de ácido nucleico como se describe anteriormente en la presente, o vacuna o célula que codifica o que comprende una construcción de ácido nucleico como se describe anteriormente en la presente, por un tiempo y bajo condiciones suficientes para modular la respuesta inmune al antigeno.

El método anterior puede proporcionar un método particularmente útil para la producción de anticuerpos, incluyendo producción de anticuerpos monoclonales en un animal de laboratorio o in vitro o in vivo . La presente invención también se extiende al uso de una construcción de ácido nucleico como se describe anteriormente en la presente, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de condiciones o infecciones que incluyen pero no están limitadas a, condiciones de cáncer o precancerosas , enfermedades autoinmunes, infecciones virales, bacterianas o por parásitos. Las caracteristicas adicionales de la presente invención son más completamente descritas en los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1 Localización diferencial de proteínas de fusión de HEV a fracciones de células citosólicas o asociadas a membranas La proteina antigénica 0RF2.1 codificada por HEV, se expresó en células de mamífero utilizando una serie de vectores de expresión que codifican para 0RF2.1 sin una proteina de fusión (0RF2.1) o con proteínas de fusión N-terminal de sigl (sigl-2.1), sig2 (sig2-2.1) o sig3 (sig3-2.1) (figura 1) . Las células fueron incubadas en presencia de metionina y cisteína radiactivas para marcar las proteínas recientemente sintetizadas, las células fueron fraccionadas en las fracciones citosólica soluble (c) y membranal (m) , y las proteínas que contenían la secuencia 0RF2.1 fueron seleccionadas mediante inmunoprecipitación con anticuerpos policlonales específicos de ORF2.1 y fueron detectadas mediante SDS-PAGE y autorradiografí a . Se puede observar que mientras 0RF2.1 está casi exclusivamente encontrado en la fracción de citosol soluble, sigl-2.1 es encontrado casi exclusivamente en la fracción membranal mientras que sig2-2.1 y sig3-2.1 se encuentran en proporciones similares en ambas fracciones. Nótese que las bandas múltiples de diferentes velocidades de migración se deben a la glucosilación parcial de aquellas proteínas que están transpuestas a la fracción membranal, ya que éstas son suprimidas cuando las células son tratadas con tunicamicina para prevenir la N-glucosilación (no mostrada) . Esta figura demuestra los efectos únicos que cada proteína sig confiere a la localización de proteína dentro de la célula, especialmente con respecto a sig2 y sig3 que confieren una localización heterogénea .

EJEMPLO 2 Estabilidad diferencial de proteínas de fusión de HEV Las células que expresan cada proteína fueron incubadas en presencia de aminoácidos radiactivos como en la figura 2, pero fueron luego posteriormente incubados en presencia de un exceso de aminoácidos no radiactivos por diversos tiempos, antes del fraccionamiento y el análisis como se mencionó anteriormente. Esto nos permitió definir el patrón de procesamiento para cada una de las proteínas, mediante la comparación de la cantidad de cada proteína radiactiva al final de la marcación radiactiva (tiempo 0 horas) versus 1 ó 4 horas de incubación adicional en la célula. Se puede observar (figura 3) que la proteína ORF2.1 es encontrada predominantemente en el citosol (cyto) y es estable una hora después de la síntesis, mientras que la proteína sigl-2.1 se encuentra predominantemente en la fracción membranal (memb) y es estable a 4 horas después de la síntesis. En contraste, sig2-2.1 y sig3-2.1 cada una se encuentran en ambas fracciones cyto y memb, con la proteina citoasociada que es estable después de 4 horas, mientras que la proteína memb-asociada es casi completamente degradada después de 4 horas. Por lo tanto se espera que sig2-2.1 y sig3-2.1 en estos ejemplos pudieran dar origen a respuestas inmunes mixtas a la proteína 0RF2.1 debido a su procesamiento y localización heterogéneos, mientras que 0RF2.1 y sigl-2.1 cada uno podría dar un patrón simple de respuesta inmune debido a su procesamiento y localización homogéneos .

EJEMPLO 3 Localización diferencial y estabilidad de proteínas de fusión SIG.GST Sigl, sig2 o sig3 fueron fusionados a glutación-S-transferasa (GST) para la expresión en células de mamífero como en el ejemplo 2. En este ejemplo, se puede observar que sigl-GST tiene una localización heterogénea con iguales proporciones en 1 a fracción cyto y memb, pero procesamiento homogéneo con ambas fracciones que son estables después de 4 horas. En contraste, sig2-GST y sig3-GST tienen localización heterogénea con iguales proporciones en las fracciones cyto y memb, a las 0 horas, y también procesamiento heterogéneo con la fracción cyto que es estable después de 3 horas, mientras que la fracción memb es casi completamente degradada después de 3 horas. Se espera por lo tanto que el uso de estas proteínas de fusión sigl, sig2 o sig3 podría modular respuestas inmunes a antígenos objetivo con GST como el ejemplo .

EJEMPLO 4 Secuencia de ácido nucleico de Sigl, Sig2 y Sig3 Las siguientes secuencias se derivaron mediante amplificación de PCR de fragmentos apropiados a partir de la secuencia 0RF2 de longitud completa con la adición de sitios de restricción en los cebadores.

El vector de expresión de mamífero utilizado para la expresión fue pCl-neo (Promega) que tiene el promotor inmediatamente temprano CMV, la señal de empalme de poliadenilacion SV40 y quimérico.

EJEMPLO 5 Inmunización de ratones Balb/C con construcciones de plásmido La actividad de los péptidos sigl, sig2 y sig3 se demostrará mediante la inoculación de ratones Balb/C con cada una de las construcciones de plásmido 0RF2.1, Osigl-2.1, sig2-2.1 y sig3-2.1 y GST-, sigl-GST, sig2-GST y sig3-GST por métodos estándares tales como pistola de genes o inyección intramuscular, y la respuesta inmune en animales que reciben cada vacuna será comparada por métodos tales como perfil isotópico de anticuerpo especifico, respuestas proliferativas de células T, y respuestas de células G citoliticas. Se anticipa que los patrones diferentes del procesamiento intracelular, observados en cultivo celular en los ejemplos, mostrados en la presente también ocurrirán en las células de ratones inoculados con las vacunas de ADN, y darán origen a respuestas inmunes moduladas, dependiendo del procesamiento de proteina de las construcciones individuales. Esto puede ser además probado mediante la fusión de cada péptido sig a otros antigenos de interés, incluyendo pero no limitados a la nucleoproteina (NP) y hemaglutinina (HA) de virus de influenza, la envoltura y proteínas de núcleo del virus de la hepatitis C y del virus de la hepatitis B, la envoltura y las proteínas gag del virus de inmunodeficiencia humana y antígenos de interés derivados de otros patógenos virales, bacterianos, fúngicos y parasíticos de humanos y animales así como antígenos asociados al cáncer. Las diferentes respuestas inmunes esperadas de cada una de las construcciones de vacuna se muestran diagramáticamente en la figura 5. En conclusión, cuando se codifica por vacunas de ácido nucleico, los péptidos sigl, sig2 y sig3 y relacionados derivados de P0RF2 de HEV tendrán utilidad en la modulación y el aumento de la respuesta inmune a antígenos de proteínas de fusión en virtud de patrones heterogéneos de procesamiento y localización intracelular, en comparación a antígenos solos o con proteínas de fusión péptido-antígeno (tales como proteínas de fusión de ubiquitin-antígeno) con patrones homogéneos de procesamiento y localización intracelular .

EJEMPLO 6 Respuestas inmunes a péptidos de señal HEV fusionados a proteínas heterólogas Fueron administradas series 0RF2.1 de construcciones plasmidicas a ratas vía inyección IM de 100 µg de ADN en solución salina a las 0, 4 y 8 semanas y las respuestas de anticuerpo se midieron utilizando el ensayo de ELISA para ORF2.1 (Anderson et al, 1999) (tabla 1, figura 6, figura 7). Los plásmidos que codifican para ORF2.1 solos o fusionados con ubiquitin-A76 fallaron para promover cualesquiera anticuerpos detectables, mientras que sigl-ORF2.1 indujeron una fuerte respuesta de anticuerpo en 2/2 ratas. De mayor interés sig3-ORF2.1 indujo una fuerte respuesta de anticuerpo en 1/2 ratas. Además, la mayoría de la proteína (la fracción transpuesta) se degradó dentro de 4 horas, lo cual es similar a la presentación favorable por la vía MHC-I y la inducción de la respuesta- CTL. La respuesta de anticuerpo en ratas fue también examinada mediante inmunomanchado de Western contra fragmentos diferentes de proteína ORF2 (Lie et al, 1995; Riddell et al, 2000), que puede revelar reactividad a los epítopes conformacionales y lineales (figura 7). Notablemente, ambos sigl- y sig3-ORF2.1 indujeron a los anticuerpos contra el epitope conformacional 0RF2.1 de HEV (Riddell et al, 2000), una propiedad que podemos considerar es importante para la eficacia amplia de las vacunas de ADN. Se debe notar que SIG3-ORF2.1 indujo altos niveles de reactividad de anticuerpos en inmunomanchado de Western que lo que hizo SIG1-2.1, probablemente debido a la mezcla del antigeno intacto (conformacional) y degradado (lineal) que se presentó a las células B. Estos experimentos por lo tanto demuestran que las fusiones sigl y sig3 promueven respuestas de anticuerpo aumentadas en comparación a las proteínas no modificadas codificadas por las vacunas de ADN, y acopladas con la degradación rápida de una proporción de las proteínas de fusión con sig3, esto podría conducir a un balance de ambas respuestas de CTL y respuestas de anticuerpo, lo que pudiera a su vez mejorar la efectividad de las vacunas de ¦ ADN que codifican para antígenos tales como por ejemplo, aquellos de agentes infecciosos o tumores.

EJEMPLO 7 Aplicación amplia del péptido de señal de HEV dirigido al objetivo del sistema Las construcciones de vacuna de ADN se prepararán en pCI-neo para codificar fusiones de sigl y sig3 con los siguientes antigenos: (i) núcleo HCV/E1/E2 (ii) núcleo HCV; (iii) HCV E1/E2; (iv) antigeno superficial de hepatitis B (HBsAg); (v). nucleoproteína de influenza (NP) ; (vi) hemaglutinina de influenza (HA) . También serán construidas las secuencias de codificación para cada proteina se amplificarán a partir de los plásmidos existentes por PCR, y en cada caso los plásmidos que expresan la proteina de longitud completa (nativa) correspondiente y la proteina de longitud completa fusionada en el extremo C de ubiquitin-A76 (control, dirección al objetivo MHC-I) . Las células Cos serán transfectadas con cada plásmido, y el destino de las proteínas objetivo analizado mediante radiomarcación de pulso-seguimiento, fraccionamiento celular, inmunomanchado de Western e inmunoprecipitación para demostrar si los efectos de dirección al objetivo de sigl y sig3 de HEV pueden ser conferidos en un intervalo muy diverso de antí genos objetivos.

Los grupos de 6 ratones se inmunizarán cada uno en las semanas 0 y 4 vía inyección IM de 100 µg de vector (plásmido pCI-neo, control negativo), o vector que codifica para uno de los antigenos objetivos GST, 0RF2.1, HBsAg, NP y HA en la forma de (a) proteina de longitud completa (control) ; (b) proteina Ub-A.76 (control); (c) proteína Sigl; (d) proteína Sig3. Las vacunas proteicas correspondientes servirán como controles adicionales. Se recolectará sangre en las semanas 0, 4r 8 y 12 y los tejidos (nodulos linfáticos, bazo), cosechados a las 12 semanas. Las respuestas totales e IgG específicas de isotipo se determinarán mediante ELISA, dando una indicación de la magnitud de la respuesta inmune humoral y un marcador sustituto para desviación de Thl/Th2 de la respuesta, respectivamente. Para HA y NP, el análisis incluirá (a) actividad de CTL y (b) tinción con ELISPOT y/o citocina intracelular, para determinar la frecuencia y la desviación de Thl/Th2 de células T específicas. Para proporcionar una prueba más exigente de la eficacia proporcionada por Sigl o Sig3 de HEV, las construcciones de vacuna de ADN de HA y NP serán examinadas utilizando el modelo de infección de influenza subletal en ratones. Los animales serán inmunizados como se mencionó anteriormente, y en la semana 12 todos los animales serán retados vía inoculación intranasal con una dosis subletal de una cepa atenuada de virus de influenza. Cinco días después, los ratones se sacrificaron y el tejido pulmonar se cosecha para la medición de la carga de virus por ensayo de placa. Estos estudios confirmarán que la dirección al objetivo mixta por secuencias Sig de HEV conducirá a respuestas inmunes aumentadas.

BIBLIOGRAFÍA 1. Anderson, D., et al. (1999) J. Virological Methods 81:131-142 2. Gurunathan, S . et al . (2000) Anr¡ Rev Immunol. 18:927-74 3. Forns, X., S. U. et al. (1999). Vaccine. 17:1992-2002 4. von Heijne G. et al (1989) Protein Eng. r 2.-531 5. Khromykh, A. A. , et al. (1997). J. Virol. 72 1497-505. 6. Li, F., et al . (1997 ) J. Virological Methods 52:289-300 7. Riddell, M. , et al. (2000) J. Virol. 74:8011-8017 8. Rodriguez F. , et al. (1997). J. Virol. 71:8491-503 9. Rodríguez F., et al. (1997). J. Virol. 72:5174-81 10. Torresi, J., F. et al. (1999). J. Gen Virol . #0:1185-8 11. Varnavski, A. N. et al. (1999) Virology. 255:366-75 12. Varnavski, A. N. et al. (2000) J. Virol. 74:4394-403 13. Wolff, J. A. et al . (1999) Science. 247:1465-8 Tabla 2 Resumen de procesamiento intracelular e inmunogenicidad de proteínas de fusión peptldicas de señal HEV codificadas sobre plásmidos de ADN Degradación Inducción de Construcción Transposición de ER Secreción rápida" anticuerpob 0RF2.1 - + - - Sigl-0RF2.1 ++ - - ++++ Sig2-ORF2.1 + + - nt Sig3-ORF2.1 + + - ++ UbA76-ORF2.1 - + - - GST - - - nt Sigl-GST + - + nt Sig2-GST + + + nt Sig3-GST + + + nt UbA76-GST - + nt nt a Degradación de más del 75% de proteína objetivo después de 4 horas (por ejemplo t±/2 < 2 horas) . Para las proteínas Sig2 y Sig3, únicamente se degradó la fracción transpuesta. b 100 µg de ADN IM en las semanas 0, 4 y 8, 2 ratas por grupo, Ab específico de 0RF2.1 medido en la semana 12.

LISTADO DE SECUENCIAS <212> PRT <213> Virus de Hepatitis S <<00> 1 Met Arg Pro Arg Pro lie Leu Leu Leu Leu Leu Met Phe Leu Pro Met 1 5 10 15 Leu ¦ co Ala Pro Pro Pro 20 <210> 2 <211¾ 36 <212> PRT <213> Virua de Hepatitis E <400> 2 Met Arg Pro Arg Pro II· Leu Leu Leu Leu Leu Met Phe Leu Pro Met 1 5 10 15 Leu Pro Ala Pro Pro Pro Gly Gln Pro Ser Gly Axg Axg Arg Gly Arg 20 25 30 Arg Ser Gly Gly 35 <210> 3 <211> 50 <212> PRT <213> Virus de Hepatitis B <400> 3 Met Ara Pro Arg Pro lie Leu -eu Leu Leu Leu Met Phe Leu Pro Met 1 5 10 15 Leu Pro Ala Pro Pro Pro Gly Gln Pro Ser Gly Arg Arg Arg Gly Arg 20 25 30 Arg Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Phe Trp Gly Asp Arg Val Asp Ser 35 40 45 Gln Pro 50 <210> 4 <211> .66 <212> ADN <213> virus de Hepatitis S <400> 4 atgcgccctc ggcctatttt gctgttgctc ctcatgtttc tgectatget gcccgcgcca 60 <21 > 5 <2?? 108 <212> ADN <213 Virus de Hepatitis E <400> 5 atgcgccctc ggcctatttt gctgttgctc ctcatgtttc tgcctatgct gcccgcgcca 60 ccgcccggtc agccgtctgg ccgccgtcgt gggcggcgca gcggcggt 108 <210> 6 <211> 150 <212> *DN <213> Virus de Hepatitis E . <400> 6 atgcgccctc ggcctatttt gctgttgctc ctcatgtttc tgcctatgct gcccgcgcca 60 ccgcccggtc agccgtctgg ccgccgtcgt gggcggcgca gcggcggttc cggcggtggt 120 ttctggggtg accgggttga ttc cagccc 150

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Un método para aumentar, en un animal, una respuesta inmune a un polipéptido antigénico de interés, el método comprende administrar al animal una cantidad efectiva de una composición que comprende una construcción de ácido nucleico que codifica para una proteina de fusión que comprende un componente de procesamiento y el polipéptido antigénico de interés, en donde el componente de procesamiento proporciona procesamiento heterogéneo del polipéptido antigénico cuando la construcción de ácido nucleico es expresada en una célula huésped y un aumento resultante de la respuesta inmune al polipéptido antigénico.

2. Un método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el componente de procesamiento es derivado de una región N-terminal de la proteina P0RF2 del virus de la hepatitis E.

3. Un método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la construcción de ácido nucleico que codifica para un componente de procesamiento, codifica para · un componente de procesamiento que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 o un derivado funcional, variante, parte u homólogo de la misma.

4. Un método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el componente de procesamiento comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se describe en la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 o un derivado funcional, variante, parte u homólogo de la misma.

5. Un método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el componente de procesamiento comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos sustancialmente como se describe en la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6 o un derivado funcional, variante, parte u homólogo de la misma.

6. Un método para aumentar, en un animal, una respuesta inmune a un polipéptido de cápside viral, el método comprende administrar al animal una cantidad efectiva de una composición que comprende una construcción de ácido nucleico que codifica para una proteina de fusión que comprende un componente de procesamiento y el polipéptido de cápside, en donde el componente de procesamiento es codificado por una secuencia de nucleótidos, sustancialmente como se describe en la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6 o un derivado funcional, variante, parte u homólogo de la misma y proporciona procesamiento heterogéneo de la proteína de cápside y un aumento resultante de la respuesta inmune a éste.

7. Un método de conformidad con la reivindicación 5, en donde el componente de procesamiento es codificado por la secuencia de nucleótidos como se describe en la SEQ ID NO: 6.

8. Jna molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido de procesamiento que aumenta una respuesta inmune a un polipéptido antigénico de interés en un huésped, cuando la molécula de ácido nucleico es expresada en una célula huésped como una proteína de fusión que comprende el péptido de procesamiento y el polipéptido antigénico.

9. Una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido de procesamiento que proporciona procesamiento heterogéneo de un polipéptido antigénico de interés, cuando la molécula de ácido nucleico es expresada en una célula huésped como una proteina de fusión que comprende el péptido de procesamiento y el polipéptido antigénico.

10. Una molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 8 ó 9, en donde el componente de procesamiento es derivado de una región N-terminal de la proteina PORF2 del virus de la hepatitis E.

11. Una molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 8 ó 9, en donde el componente de procesamiento es codificado por una secuencia de nucleótidos sustancialmente como se describe en la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6 o un derivado funcional, variante, parte u homólogo de la misma.

12. Una molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 8 ó 9, en donde el componente de procesamiento comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se describe en la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 o un derivado funcional, variante, parte u homólogo de la misma.

13. Una construcción aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de fusión que comprende un componente de procesamiento y al menos un componente antigénico, el componente de procesamiento comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se describe en la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, en donde el componente de procesamiento proporciona procesamiento heterogéneo del componente polipept ídico antigénico cuando la construcción de ácido nucleico es expresada en una célula huésped y dando como resultado el aumento de la respuesta inmune al polipéptido antigénico.

14. Una célula aislada, transfectada con una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 o una construcción de conformidad con la reivindicación 13.

15. Una célula de conformidad con la reivindicación 14, en donde la célula es un antígeno que presenta la célula.

16. Una vacuna de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico o construcción de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13.

17. Una vacuna de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 16, en donde la vacuna de ácido nucleico comprende un replicón viral.