JP2003528614A

JP2003528614A - 肝炎ウイルスのｏｒｆ２のｎ末端領域に由来するプロセシング成分および抗原性ポリペプチドをコードする核酸構築物

Info

Publication number: JP2003528614A
Application number: JP2001570795A
Authority: JP
Inventors: ファンリー; デビッドアンドリューアンダーソン; ダミアンフランシスジョンパーシル
Original assignee: Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health Ltd
Current assignee: Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health Ltd
Priority date: 2000-03-31
Filing date: 2001-03-30
Publication date: 2003-09-30
Also published as: AUPQ661600A0; MXPA02009437A; EP1274851B1; KR20030015223A; ATE430804T1; CN1426472A; ZA200207769B; CA2407036A1; DE60138612D1; WO2001073078A1; EP1274851A4; US7341723B2; EP1274851A1; NZ521758A; KR100768051B1; HK1052368A1; US20030158138A1

Abstract

(57)【要約】プロセシング成分と対象となる抗原性ポリペプチドとを含む融合タンパク質をコードする核酸構築物を動物に投与する段階を含む核酸ワクチンに対する免疫応答を高める方法であって、核酸構築物が宿主細胞で発現される場合に、プロセシング成分は抗原性ポリペプチドの異種プロセシングをもたらし、その結果、その免疫応答が高まる。このプロセシング成分は、E型肝炎ウイルスのPORF2のN末端部分に由来する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、一般的に、核酸ワクチンに対する免疫応答を高めるための方法に関
する。特に本発明は、対象となる抗原性ポリペプチドと、その対象となる抗原性
ポリペプチドに対する抗体及び/または細胞の免疫応答を高めるプロセシングペ
プチドとを含む融合タンパク質を発現する核酸構築物に関する。とりわけ本発明
は、抗原に対する免疫応答を調節するための広範な方法、構築物、及びベクター
を設計しかつ開発する際、また、特に限定するつもりはないが、ヒトおよび他の
哺乳動物、魚類、並びに鳥類を含む動物における癌、自己免疫疾患、または細菌
性、ウイルス性もしくは寄生体の感染症などの状態、感染症、もしくは疾患の診
断、治療及び/または予防を行う際に有用である。

【０００２】概説当業者は、本明細書に記載された発明が、特定して記載された以外に変形及び
修飾されることを認識すると思われる。本明細書に記載された発明はすべてのそ
のような変形及び修飾を含むと理解すべきである。本発明にはまた、本明細書に
おいて個々に、または集合的に述べられているか指示されているすべてのそのよ
うな工程、特徴、組成物及び化合物、並びに前記工程または特徴のうちのいずれ
か二つもしくはそれ以上の組み合わせのいくつか及びすべてが含まれる。

【０００３】本明細書を通じて文脈で別記しない限り、「含む(comprise)」という用語、並
びに「含む(comprises)」及び「含む(comprising)」のような変形語は、述べた
全体もしくは工程、または全体もしくは工程の群を含むが、他のいずれかの全体
もしくは工程、または全体もしくは工程の群を排除しないことを意味すると理解
されたい。本発明は、例示のみの目的が意図される本明細書に記載された特定の
態様により、特許請求の範囲が制限されることはない。機能的に等価な生成物、
組成物、及び方法は、本明細書に記載されたように本発明の範囲内に明らかに含
まれる。

【０００４】本明細書において著者によって述べられている刊行物についての参考文献一覧
の詳細は、この記載の最後にまとめて記載される。一報またはそれ以上の従来技
術の報告を含む従来技術についての、本明細書の参考文献は、前記従来技術が共
通の一般的な知識であること、または共通の一般的な知識の一部を形成している
ことを承認しているととらえるべきでも、または示唆しているととらえるべきで
もない。

【０００５】本明細書において用いられているように「に由来する」という用語は、特定の
全体または全体の群が特定した種から生じたのであって、特定の起源から直接的
に、必然的に得られたのではないことを示すものとしてととらえるべきである。

【０００６】本明細書は、特許請求の範囲の後の本明細書に示され、パテントインバージョ
ン3.0(PatentIn Version 3)のプログラムを用いて作成したヌクレオチド配列及
びアミノ酸配列情報を含む。それぞれの配列は、配列表内で多くの指標<210>に
よって識別され、その後、配列識別子[例えば、<210>1、<210>2等]によって識別
される。それぞれの配列について、配列の長さ、配列の型[DNA、タンパク質(PRF
)等]、及び生物起源が、多くの指標分野<211>、<212>、及び<213>において、そ
れぞれ提供された情報により指示される。本明細書で述べられたヌクレオチド配
列またはアミノ酸配列は、「配列番号：」という用語によって特徴付けられ、続
いて、配列識別子[例えば、配列番号：1は、配列表中に<400>1として示された配
列のことを言う]によって明らかにされる。

【０００７】本明細書に記載されたヌクレオチド残基の名称はIUPAC-IUB生化学用語委員会(
Biochemical Nomenclature Commission)によって推奨されているものであって、
この場合、Aはアデニンを示し、Cはシトシンを示し、Gはグアニンを示し、Tはチ
ミジンを示し、Yはピリミジン残基を示し、Rはプリン残基を示し、Mはアデニン
またはシトシンを示し、Kはグアニンまたはチミジンを示し、Sはグアニンまたは
シトシンを示し、Wはアデニンまたはチミジンを示し、Hはグアニン以外のヌクレ
オチドを示し、Bはアデニン以外のヌクレオチドを示し、Vはチミジン以外のヌク
レオチドを示し、Dはシトシン以外にヌクレオチドを示し、およびNは任意のヌク
レオチド残基を示す。

【０００８】発明の背景「核酸ワクチン」は、DNA(プラスミド)または自己複製型-サブゲノムウイルス
核酸(ウイルスレプリコン）のいずれかを投与することによって、受容者の細胞
において標的(ワクチン)タンパク質の合成を誘導するために使用される技術を反
映する一般用語である。

【０００９】核酸ワクチン、および、特定するとタンパク質自体ではなくタンパク質抗原を
コードするプラスミドDNAが投与されるDNAワクチンは、裸のDNA(naked DNA)によ
って免疫応答の誘導に至るインビボでの抗原合成が誘導されうるという観察結果
(Wolffら、1990)から、世界中で研究に焦点があてられている。核酸ワクチンを
利用する場合の二つの主要な潜在的な利点は、(a)受容者の細胞においてタンパ
ク質が発現された後で免疫系に天然のエピトープが提示されること、及び(b)化
学的均質性、調製の容易性、及び核酸の安定性であり、それは組み合わせワクチ
ンの場合、および従来のワクチンで必須であったコールド・チェーン(cold chai
n)のない場合に特に有用であると考えられる。

【００１０】大部分の有効な「伝統的な」ワクチンは、急性で自己限定性の感染症に用いら
れており、対応する感染症からの回復、またその感染症に対する免疫性の関連を
擬態する免疫応答を刺激する。すなわちそれらは、その天然の形態で存在してい
る感染物質由来の抗原に対する通常の免疫応答によるものである。核酸ワクチン
はそのような系で戦略的な利点を有している。従来これは一般に、(i)弱毒した
生ワクチン生物(例えば、セービン(Sabin)ポリオワクチン)；(ii)後に不活化し
た野生型生物(または細菌毒)(例えば、ソーク(Salk)ポリオワクチン)；または(i
ii)組換えDNA技術を用いた天然の抗原の製造(例えば、B型肝炎ワクチン）のいず
れかを用いることによって達成されている。この状況ではDNAワクチンは、標的
抗原が受容者の細胞内で天然の形態で合成されるという大きな利点を有している
。このことは、ウイルスレプリコンを基にした送達系(例えば、Kunjinレプリコ
ン系(Khromykhら、1997；Varnavskiら、1999；Varnavskiら、2000))にもあては
まる。しかし、抗原をコードするDNAワクチンに応答する抗体は、低レベルであ
るか、または検出不可能であることも多い。

【００１１】正常な免疫応答が感染症を一掃できない場合、感染症に対して抑制的かつ治療
的であるワクチンの開発はあまり進歩していない。感染症を一掃できないことが
標準的であるHCV及びヒト免疫不全ウイルス(HIV)のような病原体では、関連する
抗原に対して通常の免疫応答を誘導可能なワクチンはほとんど役にたたない。こ
のことはまた、「自己」として通常認識される腫瘍特異性抗原にもあてはまり、
したがって正常の免疫応答は寛容の一つである。多くの潜在的な利点があるにも
かかわらず、標準的なDNAまたはレプリコンワクチンは、正確にそれらが天然の
形態で抗原をコードするために、このような場合では効果がないと思われる。

【００１２】さまざまな方法がDNAワクチンに対する免疫応答を調節するために用いられる
が、それには(i)サイトカインまたはサイトカインをコードするプラスミドの同
時送達、(ii)細菌(及びプラスミド)のDNAにおいて一般的に見出されるCpGジヌク
レオチドの免疫刺激性の役割(Hemmiら、2000)、及び(iii)DNAワクチンをポック
スウイルスベクターとともに用いる初回抗原刺激プロトコールが含まれる。

【００１３】抗原標的化のための現存する方法には、(a)ポリユビキチン化、プロテアソー
ムにおける急速細胞内分解及び効率的なMHC-I提示のための標的タンパク質に対
するユビキチン融合法(ユビキチン−A76または-G76-K)、(b)MHC-II経路を標的と
するリソソーム−関連膜タンパク質1(LAMP-1)への融合、(c)エピトープを小胞体
(ER)に向けるためのアデノウイルスE3リーダー配列への融合、及び(d)専門的抗
原提示細胞(APC)によって分泌され取り込まれるためにエピトープを標的とするC
TLA4への融合の使用が含まれる。

【００１４】しかしながら多くのDNAワクチンの効力は小さく(Gurunathan Sら、2000)、回
復または保護に至らせるDNAワクチンによって発現されたタンパク質に対する免
疫応答を調節する改良された技術及び分子を開発する必要性がある。

【００１５】発明の概要本発明に至るまでの研究において、発明者らは、E型肝炎ウイルス(HEV)の完全
長のキャプシドタンパク質であるPORF2が哺乳動物細胞で発現すると、新しく合
成されたタンパク質の約80％が小胞体に転位して急速に分解するが、タンパク質
の20％はサイトゾル内で無傷の形態で蓄積される(4)。

【００１６】本発明に従って、本発明者らは、異種ポリペプチドプロセシング(「プロセシ
ングペプチド」または「プロセシング成分」)を許容するHEVのPORF2にあるN末端
ペプチド配列を同定するとともに、そのようなプロセシングペプチド配列を用い
て対象となる抗原性ポリペプチドに対する免疫応答を高めるための方法も開発し
た。

【００１７】本発明者らは、融合タンパク質(ORF2.1)を含まないORF2.1断片をコードする一
連の発現ベクターを用いて動物細胞におけるHEVのPORF2.1抗原性ポリペプチド断
片を、すなわちHEVのPORF2のN末端由来の配列を持つ融合タンパク質である、POR
F2の1〜22位のアミノ酸を有するSig1-ORF2.1、PORF2の1〜36位のアミノ酸を有す
るSig2-ORF2.1、またはPORF2の1〜50位のアミノ酸を有するSig3-ORF2.1由来の配
列を持つ融合タンパク質として発現させた。本発明者らは、ORF2.1タンパク質は
可溶性サイトゾル画分でほとんど独占的に見出されるが、これに対してSig1ペプ
チドは膜の断片にほとんど独占して誘導されており、一方Sig2及びSig3ペプチド
は異種局在性を示すことを確立した。さらにSig2-ORF2.1とSig3-ORF2.1ポリペプ
チドの場合では、サイトゾル関連タンパク質は安定であるが、これに対して膜−
関連タンパク質は混合免疫応答(抗体とCTLのそれぞれの応答)の発生と一致して
分解した。

【００１８】この知見についての広範な一般性は、ORF2のN末端配列(Sig1、Sig2及びSig3)
をグルタチオン-S-トランスフェラーゼと融合させた場合には確認され、同方法
で異種プロセシングされる(すなわち、局在化しプロセシングされる)ことがわか
った。

【００１９】修飾されていないタンパク質に比べて抗原性ポリペプチドに対する免疫応答性
を高めるプロセシングペプチドの能力を、PORF2.1に対する抗体反応が測定可能
であるラットモデルで試験した。Sig1-ORF2.1及びSig3-ORF2.1は高い抗体応答性
を誘導し、Sig3-ORF2.1の場合では転位した画分のほとんどが迅速に分解するが
、それがMHC-I経路の提示と細胞免疫性応答の誘導には好都合であった。

【００２０】したがって本発明の一局面は、動物において対象となる抗原性ポリペプチドに
対する免疫応答を高める方法であって、その方法は、プロセシング成分と前記抗
原性ポリペプチドとを含む融合タンパク質をコードする核酸構築物を含有する組
成物の有効量を前記動物に投与する段階を含み、核酸構築物が宿主細胞で発現さ
れる場合に、前記プロセシング成分が抗原性ポリペプチドの異種プロセシングを
もたらし、その結果、抗原性ポリペプチドに対する免疫応答を高める方法を提供
する。

【００２１】本発明の別の局面は、核酸分子がプロセシングペプチドと対象となる抗原性ポ
リペプチドとを含む融合タンパク質として宿主細胞で発現される場合に、その宿
主において抗原性ポリペプチドに対する免疫応答を調節することができるプロセ
シングペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を提供する。

【００２２】別の局面において、本発明は、核酸分子がプロセシングペプチドと対象となる
抗原性ポリペプチドとを含む融合タンパク質として宿主細胞で発現される場合に
、その対象となる抗原性ポリペプチドの異種プロセシングをもたらす前記プロセ
シングペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を提供する。

【００２３】本発明の別の局面は、核酸分子がプロセシングペプチドと抗原性ポリペプチド
とを含む融合タンパク質として宿主細胞で発現される場合に、その宿主において
抗原性ポリペプチドに対する免疫応答を高めることができるプロセシングペプチ
ドをコードする単離核酸分子であって、前記プロセシングペプチドが、E型肝炎
ウイルスのPORF2ヌクレオチド配列にあるN末端領域の連続するヌクレオチド配列
、またはその機能性誘導体、変異体、部分、もしくは相同体によってコードされ
る単離核酸分子を提供する。

【００２４】本発明のさらに別の局面は、核酸分子がプロセシングペプチドと抗原性ポリペ
プチドとを含む融合タンパク質として宿主細胞で発現される場合に、その宿主に
おいて抗原性ポリペプチドに対する免疫応答を調節することができるプロセシン
グペプチドをコードする単離核酸分子であって、この場合の前記プロセシングペ
プチドが、E型肝炎ウイルスのPORF2タンパク質のN末端領域から選択された約5〜
100個の連続するアミノ酸配列、またはその機能性誘導体、変異体、部分、もし
くは相同体を含む単離核酸分子を提供する。

【００２５】本発明の一態様においては、単離核酸分子が、実質的に配列番号：4、配列番
号：5、もしくは配列番号：6に記載のヌクレオチド配列、またはその機能性誘導
体、変異体、部分、もしくは相同体を含む。

【００２６】本発明のさらに別の局面は、E型肝炎ウイルスのPORF2タンパク質のN末端領域
から選択された約5〜100個の連続するアミノ酸のアミノ酸配列、またはその機能
性誘導体、変異体、部分、もしくは相同体を含む単離ポリペプチドを提供する。

【００２７】好ましくは、前述した単離ポリペプチドは、実質的に配列番号：1、配列番号
：2、もしくは配列番号：3に記載のアミノ酸配列、またはその機能性誘導体、変
異体、部分、もしくは相同体を有している。

【００２８】本発明の更なる局面は、プロセシング成分と少なくとも一個の抗原性成分とを
含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物であって、
その核酸構築物が宿主細胞で発現する場合、プロセシング成分が抗原性成分を異
種プロセシングさせるために提供され、その結果、宿主における前記抗原性成分
に対する免疫応答を高める核酸構築物を提供する。

【００２９】本発明の別の関連する局面は、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含む核酸構築物を提供し、その融合タンパク質は宿主においてプロセシング成
分と少なくとも一個の抗原性成分とを含み、そのプロセシング成分は前記の抗原
性成分に対する免疫応答を高めることができ、シグナル配列と、任意で異種細胞
内プロセシング可能なタンパク質のN末端領域に実質的に対応するアミノ酸配列
を含む中間ペプチドとを含む。

【００３０】好ましくは、前述したプロセシング成分は、シグナル配列と、異種性の細胞内
プロセシング可能なタンパク質のN末端領域に実質的に対応するアミノ酸配列を
含む中間ペプチドとの両方をを含む。

【００３１】本発明のさらに別の局面は、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を
含む核酸構築物を提供し、その融合タンパク質はプロセシング成分と少なくとも
一個の抗原性成分とを含み、そのプロセシング成分は前記の抗原性成分に対する
免疫応答を高めることができ、そのプロセシング成分は、シグナル配列と、任意
でE型肝炎ウイルスの主要な構造的タンパク質(PORF2)のN末端領域に実質的に対
応するアミノ酸配列を含む中間ペプチド、またはその機能的誘導体、変異体、部
分、もしくは相同体とを含む。

【００３２】好ましくは、前述したプロセシング成分は、シグナル配列と、E型肝炎ウイル
スの主要な構造的タンパク質(PORF2)のN末端領域由来の中間ペプチド配列、また
はその機能的誘導体、変異体、部分、もしくは相同体の両方とを含む。

【００３３】本発明のさらに別の局面は、プロセシング成分と少なくとも一つの抗原性成分
とを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物であっ
て、そのプロセシング成分は宿主において前記の抗原性成分に対する免疫応答を
調節することができ、かつE型肝炎ウイルスの主要な構造的タンパク質(PORF2)の
N末端領域、またはその機能的誘導体、変異体、部分、もしくは相同体から選択
される5から100個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む核酸構築物を提
供する。

【００３４】本発明の特に好ましい局面において、融合タンパク質のプロセシング成分は、
PORF2のN末端領域の1〜22位のアミノ酸、1〜36位のアミノ酸、または1〜50位の
アミノ酸にそれぞれ対応する、実質的に配列番号：1、配列番号：2、または配列
番号：3に記載のアミノ酸配列、またはその機能的誘導体、変異体、部分、もし
くは相同体を含む。

【００３５】本発明のさらに別の局面は、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を
含む単離核酸構築物であって、その融合タンパク質がE型肝炎ウイルスのORF2遺
伝子の5'末端領域によってコードされたプロセシング成分と抗原性成分とを含み
、核酸構築物が宿主細胞で発現される場合に、前記プロセシング成分が前記宿主
における抗原性成分に対する免疫応答を調節する単離核酸構築物を提供する。

【００３６】また本発明の更なる局面は、例えばウイルスレプリコンまたはDNA分子のよう
な上述した核酸構築物を含むワクチンを提供する。

【００３７】本発明の関連する局面は、上述したように核酸構築物をトランスフェクトした
例えば抗原提示細胞のような細胞を提供する。

【００３８】また本発明のさらに別の局面は、上述したような核酸構築物、並びに一種また
は複数の薬学的に許容される担体及び/または希釈剤を含み、動物における免疫
応答を高める際に使用するための組成物を提供する。

【００３９】本発明のさらに別の局面は、動物において対象となる抗原に対する免疫応答を
調節する方法であって、その方法は、前記抗原に対する免疫応答を十分に調節で
きる時間と条件で上述したような核酸構築物の有効量、または上述したような核
酸構築物をコードするかもしくは含んでいるワクチンもしくは細胞の有効量を前
記動物に投与する段階を含む方法を提供する。

【００４０】本発明はまた、特に限定するつもりはないが、ヒト及び他の哺乳動物、魚類、
または鳥類を含む動物における癌もしくは前癌状態、自己免疫疾患、ウイルス、
細菌もしくは寄生体の感染症といった状態または感染症の治療や予防を行うため
の医薬品を製造する際に、上述したような核酸分子または構築物を利用すること
にも関する。

【００４１】

【表１】配列番号の概略

【００４２】好ましい態様の詳細な説明本発明では一部は、細胞内タンパク質プロセシングの独特なパターンを、異種
タンパク質に融合したこれらのペプチドの1つを含む融合タンパク質に付与する
、E型肝炎ウイルスのPORF2カプシドタンパク質のN末端ペプチドの同定について
述べている。適切な発現ベクターの作成方法およびクローニング戦略は当技術分
野で周知である。このようにしてDNAワクチンコード化抗原は、細胞および体液
性免疫応答の両方の最適刺激について同時にプロセシングすることができる。

【００４３】対象となるあらゆる抗原ペプチドまたはポリペプチドに融合した本発明のプロ
セシングペプチド配列をコードする核酸構築物は、核酸構築物が宿主細胞で発現
されるときに、対象となるポリペプチドに対する免疫応答を調節することが予想
される。

【００４４】核酸ワクチンに関する最近の研究により、プロテアソーム経路によるタンパク
質の急速な分解は、ユビキチンへの融合により達成され、細胞性免疫応答を高め
るが、これに対してそのような分解は同一タンパク質（8および9）に対する抗体
（体液性）免疫応答を大いに排除することが示されている。同様に、細胞との結
合または細胞（3）からの分泌を維持するために標的化された同一の抗原タンパ
ク質の発現により、各種の免疫応答が誘発される。したがって、核酸ワクチンに
対する細胞性および体液性免疫応答は、抗原の細胞内タンパク質プロセシングの
パターンに感受性である。多くの場合、ワクチンの防御有効性には免疫経路のど
ちらの分野も必要とされ、バランスの取れた反応には、特定の抗原タンパク質の
特異なプロセシングが必要となりうる。

【００４５】タンパク質抗原が細胞内で発現される場合、その細胞内プロセシングは一般に
同種である。すなわち、タンパク質の各コピーは本質的に同じ方法で、たとえば
小胞体への転位とその後の細胞表面発現もしくは分泌によって、またはサイトゾ
ル内での保持、またはプロテアソームもしくは他の分解経路で分解するための標
的化によってプロセシングされる。結果として、核酸ワクチン投与後のタンパク
質の発現は、コードされたタンパク質に対する同種パターンのプロセシングを発
生させ、その特定のタンパク質のプロセシング経路によって、免疫応答を細胞性
経路または体液性経路に偏らせる。

【００４６】多くの疾患では、体液性または細胞性免疫のどちらが疾患または治療効果から
の防御を提供する可能性が高いかは不明であり、最適な防御および治療効果には
、免疫応答のどちらの部門も必要とされることが多いように思われる。加えて、
癌、およびC型肝炎、B型肝炎ならびにヒト免疫不全ウイルス（HIV-1およびHIV-2
）などの慢性ウイルスによる感染などの、罹患した患者に防御または治療的な免
疫応答が欠如していることを特徴とする多くの疾患がある。これらの疾患では、
疾患に関係するタンパク質抗原に対するタンパク質プロセシングの正常なパター
ンによって、回復または防御につながる免疫応答が誘発されないことが明らかで
ある。

【００４７】したがって、本発明の1つの局面は、動物における対象となる抗原ポリペプチ
ドに対する免疫応答を高める方法を提供し、該方法は、プロセシング成分および
該抗原ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸構築物を含む、有効
量の組成物を該動物に投与する段階を含み、該プロセシング成分は、核酸構築物
が宿主細胞中で発現される場合に、抗原ポリペプチドの同種プロセシングを提供
し、その結果、抗原ポリペプチドに対する免疫応答を高める方法を提供する。

【００４８】 1つの態様において、プロセシング成分をコードする該核酸構築物は、配列番
号：2または配列番号：3として示されるアミノ酸配列、またはその機能性誘導体
、変異体もしくは相同体を含む、プロセシング成分をコードする。

【００４９】本明細書において、「免疫応答を高める」または「免疫応答の調節」という言
及は、免疫応答の1つまたは複数の部門をアップレギュレートおよびダウンレギ
ュレートすることへの言及を含むものと理解すべきであり、細胞性および／また
は体液性（抗体）免疫応答の最適刺激を含み、これら2つの免疫応答の部門間の
好都合なフィードバック機構も含みうる。細胞性免疫応答に加えて、体液性免疫
応答の活性化も、特にT_H1型免疫細胞における炎症反応を調節する、さらなる利
点を持つことがある。好ましい態様によって、抗原ペプチドの異種プロセシング
によって、混合免疫応答、すなわち抗体および細胞反応の両方が高まる。

【００５０】本明細書において、融合タンパク質の「プロセシング成分」または「プロセシ
ングペプチド」という言及は、特に融合タンパク質の細胞内局在化および／また
はタンパク質分解プロセシングに影響を及ぼすペプチドまたはポリペプチドへの
言及を含むものと理解すべきである。好ましくは、プロセシング成分によって、
抗原成分の異種細胞内局在化が可能となる。プロセシング成分はHEVによるか、
または別の任意の供給源によることがある。プロセシングペプチドは抗原ポリペ
プチドの5'側に位置しうる。または、プロセシングペプチドは、抗原ポリペプチ
ドに対して3'位置から機能しうる。さらなる代替として、プロセシング成分は融
合タンパク質内の入れ子位置から機能しうる。明らかに、本発明者らが考えた融
合タンパク質は、天然型分子にまで伸長しない。当業者は、それらを含む融合タ
ンパク質の異種プロセシングを可能にする、さらなるプロセシングペプチドを同
定するために、本明細書で述べた方法が使用できることを認識すると思われる。

【００５１】本発明の別の局面は単離核酸分子であって、該核酸分子が宿主細胞内で、プロ
セシングペプチドおよび抗原ポリペプチドを含む融合タンパク質として発現され
た場合に、宿主内で抗原ポリペプチドに対する免疫応答を調節できるプロセシン
グペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子を提供する。

【００５２】本発明のまた別の局面は、E型肝炎ウイルスのPORF2遺伝子、またはその機能性
誘導体、変異体、部分、もしくは相同体のN末端領域に実質的に対応するヌクレ
オチド配列を含む、上述した単離核酸分子を提供する。

【００５３】本発明のさらに別の局面は、E型肝炎ウイルスのPORF2タンパク質、またはその
機能性誘導体、変異体、部分、もしくは相同体のN末端領域から選択された約5〜
100個の連続するアミノ酸配列を含むプロセシングペプチドをコードする、上述
した単離核酸分子を提供する。

【００５４】本発明のこの特定の局面により、アミノ酸1は最もN末端のアミノ酸である。N
末端領域は、最大約100個のアミノ酸を含みうる。

【００５５】好ましくは、本ペプチドはPORF2のN末端領域の1〜22位のアミノ酸または1〜36
位のアミノ酸を含み、さらになお好ましくは、本ペプチドはPORF2、またはその
機能性誘導体、変異体、部分もしくは相同体のN末端領域の1〜50位のアミノ酸を
含む。

【００５６】本発明のこの局面による「機能性」という言及は、ポリヌクレオチドが宿主細
胞で発現されたときに免疫応答を調節できるポリペプチドおよびそのコードする
ポリヌクレオチドへの言及を含む。

【００５７】本発明の1つの局面は、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む
核酸構築物を提供し、ここで該融合タンパク質はプロセシング成分および少なく
とも1つの抗原成分を含み、該プロセシング成分は抗原成分の5'側に位置し、該
核酸構築物が宿主細胞内で発現されると、宿主内にて該抗原成分に対する免疫応
答を高めることができる。

【００５８】本発明で使用するのに適した核酸分子は、DNAまたはRNAなどの核酸分子の任意
の形態をとりうる。

【００５９】本発明の局面の1つの特定の態様において、プロセシング成分は、宿主細胞に
おいて融合タンパク質を膜およびサイトゾル局在化に方向づけるシグナル配列を
含み、宿主細胞では、融合タンパク質は数時間にわたって安定であり、抗原成分
に対する抗体反応を効果的に高める。

【００６０】本発明の好ましい局面において、プロセシング成分は異種細胞内局在化（すな
わちサイトゾルおよび膜画分に対する）および／または混合細胞内タンパク質分
解プロセシング（安定および分解した）の特性を付与する。本発明を作用の1つ
の様式または理論に制限することなく、本発明のプロセシング成分は、細胞性お
よび体液性免疫応答の両方の最適刺激のために、同時に融合タンパク質を標的と
する。

【００６１】したがって、本発明の別の局面は、融合タンパク質をコードするヌクレオチド
配列を含む核酸構築物を提供し、ここで該融合タンパク質はプロセシング成分お
よび少なくとも1つの抗原成分を含み、該プロセシング成分は該抗原成分の5'側
に位置し、宿主内で該抗原成分への免疫応答を調節可能であり、該プロセシング
成分はシグナル配列、および選択的に、異種細胞内翻訳後プロセシングを行える
タンパク質のN末端領域と実質的に対応するアミノ酸配列を含む中間ペプチドを
含む。

【００６２】好ましくは、プロセシング成分は上述のように、シグナル配列、および異種細
胞内翻訳後プロセシングを行えるタンパク質のN末端領域と実質的に対応するア
ミノ酸配列を含む、中間ペプチドの両方を含む。

【００６３】本明細書において、「シグナル配列」への言及は通常、新たに合成されたポリ
ペプチドのN末端に位置するペプチドへの言及を含むものとして理解するべきで
あるが、必ずしもそうであるとはいえない。シグナル配列は、細胞小器官による
翻訳後の取り込みを指示し、タンパク質の成熟につれて開裂しうる。シグナル配
列は、すべての真核または原核シグナル配列を含み、その天然に生じる形で対象
となる、または他の有用な供給源による抗原タンパク質と結合しうる。本発明に
より、シグナル配列は完全に機能性で、かつ完全に開裂しているか、または開裂
および／もしくはシグナル配列機能は不十分でありうる。当業者には公知である
ように、ポリペプチドのシグナル配列は、各種の既知のアルゴリズムを使用して
予測されうる（G.von Heijneら、1989）。

【００６４】本発明のさらにまた別の局面は、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配
列を含む核酸構築物を提供し、ここでは該融合タンパク質は、プロセシング成分
および宿主中の少なくとも1つの抗原成分を含み、該プロセシング成分は抗原成
分の5'側に位置し、該抗原成分に対する免疫応答を調節することが可能であって
、該プロセシング成分はシグナル配列、および場合によっては、E型肝炎ウイル
スの主要構造タンパク質（PORF2）、またはその機能性誘導体、変異体、部分、
もしくは相同体のN末端領域に実質的に対応するアミノ酸配列を含む、中間ペプ
チドを含む。

【００６５】好ましくは、プロセシング成分は上述のように、シグナル配列と、E型肝炎ウ
イルスの主要構造タンパク質（PORF2）またはその機能性誘導体、変異体、部分
、もしくは相同体のN末端領域と実質的に対応するアミノ酸配列を含む中間ペプ
チドの両方を含む。

【００６６】本明細書において、「中間ペプチド配列」への言及は、シグナル配列の3'側に
位置する配列への言及を含むものとして理解する必要があり、3'配列は融合タン
パク質のプロセシング成分によって付与されたプロセシング特性を変化させる。
中間ペプチド配列はシグナル配列と同様に、E型肝炎ウイルスのPORF2のN末端領
域を含む、任意の供給源からも発生しうる。

【００６７】本発明のさらに別の局面は、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を
含む核酸構築物を提供し、ここでは該融合タンパク質は、プロセシング成分およ
び少なくとも1つの抗原成分を含み、該プロセシング成分は抗原成分の5'側に位
置し、該抗原成分に対する免疫応答を調節することが可能であって、該プロセシ
ング成分はシグナル配列および中間ペプチドを含み、ここで該プロセシング成分
は、E型肝炎ウイルスの主要構造タンパク質（PORF2）、またはその機能性誘導体
、変異体、部分、もしくは相同体のN末端領域から選択される、5〜100個の連続
するアミノ酸に実質的に対応するアミノ酸配列を含む。

【００６８】 1つの態様において、プロセシング成分は、PORF2、またはその機能性誘導体、
変異体、部分、もしくは相同体のN末端領域から選択される、約5〜100個のアミ
ノ酸、より好ましくは30〜90個のアミノ酸、およびさらに好ましくは20〜60個の
アミノ酸を含む。

【００６９】好ましくは、プロセシング成分は、PORF2タンパク質、またはその機能性誘導
体、変異体、部分、もしくは相同体のN末端領域の1〜22位のアミノ酸、1〜36位
のアミノ酸、または1〜50位のアミノ酸にそれぞれ該当する、実質的に配列番号
：1または配列番号：2または配列番号：3のように示されるアミノ酸配列を含む
。

【００７０】本発明のこの局面による「誘導体」への言及は、断片、一部、部分、等価物、
類似体、変異体、模倣体、または相同体を含む。ポリペプチド誘導体は、アミノ
酸の挿入、欠失または置換に由来しうる。ポリヌクレオチド誘導体は、単一また
は複数の核酸の置換、欠失および／または他の核酸分子との融合を含む付加に由
来しうる。等価物は、機能性類似体または作用物質として作用可能な分子への言
及を含むものと理解される。等価物は、たとえば天然物スクリーニングの結果、
検出されうる。「変異体」への言及は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配
列に対して、少なくとも50％、または好ましくは60％、または65〜80％の類似性
、および最も好ましくは少なくとも90％の類似性を有する分子への言及を含む。
機能性変異体は、突然変異研究によって、または合理的設計を通じて確立されう
る。さらにポリヌクレオチド変異体も、中程度のストリンジェンシーの条件下で
本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを含みうる
。

【００７１】本発明の関連する局面において、融合タンパク質のプロセシング成分は、HEV
のORF2遺伝子のN末端領域の連続するヌクレオチドに実質的に相当する、1〜300
のヌクレオチドの配列によってコードされるペプチドを含む。

【００７２】好ましくは、プロセシング成分は、実質的に配列番号：4または配列番号：5ま
たは配列番号：6、またはその機能性誘導体、変異体、部分、もしくは相同体と
して示されるヌクレオチド配列によってコードされるペプチドを含む。

【００７３】本発明のさらなる局面は、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含
む核酸構築物を提供し、該融合タンパク質はE型肝炎ウイルスのORF2の5'領域に
よってコードされるプロセシング成分および抗原成分を含み、該プロセシング成
分は、核酸構築物が宿主細胞内で発現される場合、宿主内の抗原成分に対する免
疫応答を調節する。

【００７４】本発明のなおさらなる局面は、上述の核酸構築物を含むワクチンを提供する。

【００７５】本発明のさらなる関連する局面は、上述の核酸構築物をトランスフェクトした
細胞を提供する。本発明で使用するのに適した細胞は、抗原成分に対する免疫応
答を最適化するために、宿主生物内の融合タンパク質を提示、標的化または方向
付けできる免疫細胞および／または提示細胞である。この局面により、細胞はイ
ンビトロまたはインビボでトランスフェクトできる。特に好ましい細胞種は樹状
細胞である。

【００７６】本発明のさらに別の局面は、上述の核酸構築物および1つまたは複数の薬学的
に許容される担体および／または希釈剤を含む、動物における免疫応答を調節す
る組成物を提供する。

【００７７】本明細書において、「動物」への言及は、哺乳類、鳥類、魚類および爬虫類を
含む広範な意味で使用され、これに限定されるわけではないがヒト、霊長類、家
畜（たとえばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ）、愛玩動物（たとえばイヌ、ネコ）、
研究所の実験用動物（たとえばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスタ
ー）、捕獲された野生動物（たとえばキツネ、シカ）、籠のトリ（たとえばオウ
ム）、家禽（たとえばニワトリ、アヒル）などの動物にも及ぶ。好ましくは被験
動物はヒトまたは霊長類である。より好ましくは、被験者はヒトである。

【００７８】注射用に適した薬学的形態は、滅菌水溶液（水溶性の場合）および注射可能な
滅菌溶液または懸濁液を即座に調製するための滅菌粉末を含む。すべての場合に
おいて、この形態は滅菌されており、容易に注射できる程度に流動性でなければ
ならない。製造および保管条件下で安定であり、細菌および菌類などの微生物の
汚染作用を防ぐよう、保存する必要がある。担体は、たとえば水、エタノール、
ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチ
レングリコールなど）、その適切な混合物および植物油などを含む、溶媒または
分散媒でもよい。適正な流動度はたとえば、レシチンなどのコーティングの使用
によって、分散の場合には必要な粒径の維持によって、そして界面活性剤の使用
によって維持できる。微生物の作用の防止はたとえば、パラベン、クロロブタノ
ール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの各種の抗菌剤および抗真菌
剤によって行える。多くの場合、糖類または塩化ナトリウムなどの等張剤を含む
ことが好ましい。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、たとえばモノステア
リン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの、吸収を遅延させる薬剤を組成物中で
使用することによってもたらされる。

【００７９】活性成分が適切に保護されている場合、これらはたとえば不活性希釈剤または
同化性食用担体とともに経口投与するか、硬質または軟質ゼラチンカプセル内に
封入するか、または錠剤に圧縮するか、または治療食の食物中に直接含ませるこ
とができる。経口治療投与の場合、活性化合物は賦形剤に含ませて、摂取可能な
錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、オブ
ラート剤などの形で使用されうる。そのような組成物および調製物は、少なくと
も1重量％の活性化合物を含むべきである。組成物および調製物の割合はもちろ
ん変化してもよく、好都合には単位当たり約5重量％〜約80重量％の間になりう
る。そのような適切な用量中の、そのような治療上有用な組成物中の活性化合物
の量が得られるであろう。本発明による好ましい組成物または調製物は、経口投
与単位の形態が約0.1μg〜2000mgの活性化合物を含むように調製される。

【００８０】錠剤、トローチ、丸薬、カプセルなども以下を含みうる：トラガカントガム、
アラビアゴム、コーンスターチもしくはゼラチンなどのバインダー；リン酸二カ
ルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸など
の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；およびスクロース、ラクト
ースもしくは添加できるサッカリンなどの甘味料、またはペパーミント、冬緑油
もしくはチェリー香料などの香味料。投薬単位の形態がカプセルである場合、上
記の種類の物質に加えて液体担体を含みうる。その他さまざまな物質がコーティ
ングとして、そうでなければ投薬単位の物理的形態を変更するために存在しうる
。たとえば錠剤、丸薬またはカプセルはシェラック、糖またはその両方によって
コーティングされうる。シロップまたはエリキシルは活性化合物、甘味料として
のスクロース、保存料としてのメチルおよびプロピルパラベン、チェリーまたは
オレンジフレーバーなどの着色香味料を含みうる。もちろん投薬単位形態の調製
に使用するあらゆる物質は、薬学的に純粋であり、使用する量において実質的に
非毒性でなければならない。さらに、活性化合物は持続放出調製物および製剤に
含ませることもできる。

【００８１】薬学的に許容される担体および／または希釈剤には、あらゆる溶媒、分散媒、
コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延もしくは促進剤などが
含まれる。薬学的活性物質にそのような溶媒および薬剤を使用することは、当技
術分野で周知である。従来の媒質または薬剤が活性成分または細胞と不適合であ
る場合を除き、治療用組成物におけるその使用も検討される。追加の活性成分も
組成物に含有させることができる。

【００８２】投与を容易にし、用量を均一にするためには、投薬単位形態の非経口組成物を
調合することが特に好都合である。本明細書で使用する投薬単位形態は、治療を
受ける被験哺乳類の単位用量として適した、物理的に分離された単位を示す；各
単位は、必要な薬学的担体と結合して望ましい治療効果を生じるために算出され
た、所定量の活性物質を含む。本発明の新規投薬単位形態の仕様は、本明細書に
おいて詳細に開示されているように、（a）活性物質および達成される特定の治
療効果の独特な特徴、および（b）身体上の健康が損なわれた疾患状態を有する
生存被験者における、疾患治療用のそのような活性物質の調合技術に固有の制限
によって決定され、それらに直接依存する。

【００８３】好都合かつ有効な投与のために、主要な活性成分は上記で開示した投薬単位形
態で、有効量を適切な薬学的に許容される担体と調合される。投薬単位形態はた
とえば、主要な活性化合物を0.5μg〜約2000mgの範囲の量で含む。比率で示すと
、活性化合物は一般に、担体に対して約0.5μg〜約2000mg／mlで存在する。追加
の活性成分を含む組成物の場合、用量は該成分の通常の用量および投与方法を参
照して決定される。

【００８４】組成物の形態の核酸構築物またはワクチンの投与は、これに限定されるわけで
はないが、遺伝子銃、リポソームまたは高分子微小球送達あるいはウイルスベー
スのベクターによる送達などの任意の便利な様式であってもよい。薬学組成物の
薬剤は、特定の症例に依存する量で治療および予防活性を示すと考えられる。た
とえば動物、投与様式および必要な治療によって変化する。広範囲の用量が適用
されうる。ある患者を考慮すると、たとえば体重1キログラム当たり約0.1μg〜
約1mgの核酸構築物が投与される。投薬方式は、最適な治療反応を与えるよう調
整されうる。薬剤は、経口、静脈（水溶性の場合）、鼻腔内、腹腔内、筋肉内、
皮下、皮内または坐薬経路またはインプラント（たとえば放出の遅い分子）など
の任意の好都合な方法で投与されうる。

【００８５】本発明のさらに別の局面は、動物における、対象となる抗原に対する免疫応答
を調節する方法を提供し、この方法は、該動物に有効量の上記の核酸構築物、ま
たはワクチンまたは上記の核酸構築物をコードするもしくは含有する細胞を、該
抗原に対する免疫応答を調節するのに十分な時間および条件で投与する段階を含
む。

【００８６】上記の方法は、実験用動物中、またはインビトロもしくはインビボでのモノク
ローナル抗体製造を含む、抗体製造に特に有用な方法を提供しうる。

【００８７】本発明は上記の、これに限定されるわけではないが、癌または前癌症状、自己
免疫疾患、ウイルス、細菌または寄生虫感染を含む症状または感染を治療または
予防するための医薬品の製造において、上記された核酸構築物の使用にも広がる
。

【００８８】本発明のさらなる特徴は、以下の非制限的な実施例でさらに詳しく述べる。

【００８９】実施例1 細胞のサイトゾルまたは膜結合画分へのHEV融合タンパク質の示唆的局在化 HEVコード化抗原タンパク質ORF2.1は、ORF2.1をコードする一連の発現ベクタ
ーを用いて、融合タンパク質（ORF2.1）を用いずに、またはsig1（sig1-2.1）、
sig2（sig2-2.1）もしくはsig3（sig3-2.1）のN末端融合タンパク質を用いて、
哺乳類細胞中で発現させた（図1）。細胞は新たに合成されたタンパク質を標識
するために放射性メチオニンおよびシステインの存在下でインキュベートされ、
細胞は溶解性サイトゾル画分（c）および膜画分（m）に分画され、特異的なORF2
.1ポリクローナル抗体による免疫沈降によって、ORF2.1配列を含むタンパク質を
選択し、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーによって検出された。ORF2.1が
可溶性サイトゾル画分中でほぼ排他的に見出されるのに対して、sig1-2.1は膜画
分中でほぼ排他的に見出され、これに対してsig2-2.1およびsig3-2.1はどちらの
画分にも同様の割合で見出されることがわかる。各種の遊走速度の複数のバンド
は、N-グリコシル化を防止するために細胞をツニカマイシンによって処理する場
合にそれらが消滅するため、膜画分に転位されたこれらのタンパク質の部分グリ
コシル化によるものであることに留意のこと（図示せず）。この図は、特に異種
局在化を付与するsig2およびsig3に関して、細胞内で各sigタンパク質がタンパ
ク質局在化に付与する独特な効果を証明している。

【００９０】実施例2 HEV融合タンパク質の示唆的安定性各タンパク質を発現する細胞を図2と同様に放射性アミノ酸の存在下でインキ
ュベートしたが、次に過剰の非放射性アミノ酸の存在下で種々の回数インキュベ
ートしてから、前と同様に分画と分析を行った。本発明者らはこのことにより、
放射線標識終了時（時間0時間）と、さらなる1時間または4時間の細胞中のイン
キュベーション後における各放射性タンパク質を比較して、各タンパク質のプロ
セシングパターンを定義することができた。タンパク質ORF2.1は大部分がサイト
ゾル（cyto）にみられ、合成の1時間後には安定であるが、これに対してタンパ
ク質sig1-2.1は大部分が膜画分（memb）中に見られ、合成の4時間後には安定で
あることがわかる（図3）。これに対してsig2-2.1およびsig3-2.1はそれぞれ、c
ytoおよびmemb画分の両方に見られ、cyto結合タンパク質は4時間後に安定である
が、memb結合タンパク質は4時間後にはほぼ完全に分解している。したがって、
これらの例のsig2-2.1およびsig3-2.1は、その異種プロセシングおよび局在化に
よって、ORF2.1タンパク質に対する混合免疫応答を誘発するが、ORF2.1およびsi
g1-2.1はその同種プロセシングおよび局在化によって、それぞれ単一パターンの
免疫応答を与えることが予想される。

【００９１】実施例3 SIG.GST融合タンパク質の示差的局在化および安定性実施例2と同様に哺乳類細胞中で発現させるために、sig1、sig2またはsig3を
グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）に融合させた。この実施例では、sig
1-GSTが、cytoおよびmemb画分にて同じ割合で異種局在化を有するが、両方の画
分の同種プロセシングは4時間後に安定であることがわかる。これに対して、sig
2-GSTおよびsig3-GSTは、0時間ではcytoおよびmembにて同じ割合で異種局在化を
有し、3時間後もcyto画分の異種プロセシングは安定であるが、memb画分は3時間
後にはほぼ完全に分解している。したがって、これらのsig1、sig2またはsig3融
合タンパク質の使用は、例としてGSTを有する抗原を標的とする免疫応答を調節
することが予想される。

【００９２】実施例4 Sig1、Sig2およびSig3の核酸配列以下の配列は、全長ORF2配列からの適切な断片のPCR増幅によって、プライマ
ーに制限酵素部位を加えることによって誘導された。

【００９３】発現に使用した哺乳類発現ベクターは、CMV前初期プロモーター、SV40ポリア
デニル化およびキメラスプライスシグナルを有するpCl-neo（Promega）であった
。

【００９４】実施例5 プラスミド構築物によるBalb／Cマウスの免疫化 sig1、sig2およびsig3ペプチドの活性は、遺伝子銃または筋肉内注射などの標
準方法による、各プラスミド構築物ORF2.1、sig1-2.1、sig2-2.1、およびsig3-2
.1、ならびにGST、sig1-GST、sig2-GSTおよびsig3-GSTのBalb／Cマウスへの接種
によって証明され、各ワクチンを接種される動物における免疫応答を、特異的な
抗体アイソタイププロフィール、T細胞増殖反応、および細胞溶解性T細胞反応な
どの方法によって比較する。本明細書において示される実施例の細胞培養で観察
された細胞内プロセシングの各種パターンは、DNAワクチンを接種したマウスの
細胞でも発生し、個々の構築物のタンパク質プロセシングに依存する調節された
免疫応答が誘発されることが予想される。このことはさらに各sigペプチドを、
これに限定されるわけではないが、インフルエンザウイルスの核タンパク質（NP
）および赤血球凝集素（HA）、C型肝炎ウイルスおよびB型肝炎ウイルスのエンベ
ロープおよびコアタンパク質、ヒト免疫不全症ウイルスのエンベロープおよびga
gタンパク質、ヒトおよび動物の他のウイルス性、細菌性、真菌性および寄生虫
性病原体から誘導された対象となる抗体、ならびに癌関連抗原を含む、目的の他
の抗原に融合することによって試験できる。ワクチン構築物それぞれから予想さ
れる異なる免疫応答を図式的に図5に示す。

【００９５】結論として、核酸ワクチンによってコードされる場合、sig1、sig2およびsig3
およびHEV PORF2に由来する関連ペプチドは、異種パターンの細胞内プロセシン
グおよび局在化によって、抗原のみと、または同種パターンの細胞内プロセシン
グおよび局在化を持つペプチド-抗原融合タンパク質（ユビキチン-抗原融合タン
パク質など）を用いた場合と比較して、融合タンパク質抗原に対する免疫応答を
調節および高めるのに有用である。

【００９６】実施例6 異種タンパク質に融合されたHEVシグナルペプチドに対する免疫応答プラスミド構築物のORF2.1系は、第0週、第4週および第8週に生理的食塩水中1
00μgのDNAを筋肉内注射することによってラットに投与し、ORF2.1 ELISA（Ande
rsonら、1999）を用いて抗体反応を測定した（表1、図6、図7）。単独の、また
はユビキチン-A76に融合したORF2.1をコードするプラスミドは、検出可能ないか
なる抗体も誘発できなかったが、それに対してsig1-ORF2.1は2／2ラットに強力
な抗体反応を誘発した。最も興味深いのは、sig3-ORF2.1が1／2ラットに強力な
抗体反応を誘発したことである。さらに、大半のタンパク質（転位画分）は4時
間以内に分解し、MHC-I経路による提示およびCTL反応による誘発に好都合である
ように思われる。

【００９７】ラットにおける抗体反応は、ORF2タンパク質の各種の断片に対するウェスタン
免疫ブロッティングによっても検査され（Liら、1997；Riddellら、2000）、こ
れによって直鎖状のエピトープ(linear epitope)および高次構造のエピトープ(c
onformational epitope)に対する反応性が明らかになる（図7）。注目すべきは
、sig1-およびsig3-ORF2.1の両方が、HEVの高次構造のORF2.1エピトープに対す
る抗体を誘発し（Riddelら、2000）、その特性はDNAワクチンの幅広い有効性に
とって重要であると本発明者らは考えている。

【００９８】ウェスタン免疫ブロッティングにおいては、おそらくB細胞に提示された無傷
の（高次構造）および分解された（直鎖状）抗原の混合物によって、SIG3-ORF2.
1がSIG1-ORF2.1よりも高レベルの抗体反応性を誘発したことにも注目する必要が
ある。

【００９９】したがって、これらの実験は、Sig1およびSig3の融合が、DNAワクチンによっ
てコードされる未修飾タンパク質と比較して抗体反応を高め、これはSig3による
融合タンパク質の一部の急速な分解と相まって、CTL反応と抗体反応の両方のバ
ランスをとり、次に、たとえば感染または腫瘍の抗原などの抗原をコードするDN
Aワクチンの有効性を高める。

【０１００】実施例7 HEVシグナルペプチド標的化系における広範な応用以下の抗原を用いてSig1およびSig3の融合物をコードするために、DNAワクチ
ン構築物をpCI-neo中で調製する：（i）HCVコア／E1／E2；（ii）HCVコア；（ii
i）HCV E1／E2；（iv）B型肝炎表面抗原（HBsAg）；（v）インフルエンザ核タ
ンパク質（NP）；（vi）インフルエンザ赤血球凝集素（HA）。各タンパク質のコ
ード化配列は、既存のプラスミドからPCRによって増幅し、それぞれの場合、プ
ラスミドは対応する全長（未変性）タンパク質を発現し、ユビキチン-A76のC末
端に融合させた全長タンパク質（対照、MHC-I標的化）も構築される。Cos細胞は
各プラスミドによってトランスフェクトされ、標的タンパク質の運命をパルス追
跡放射線標識、細胞分画、ウェスタン免疫ブロッティングおよび免疫沈降によっ
て分析して、HEV Sig1およびSig3の標的化効果が標的抗原のきわめて多種多様な
範囲で付与されるかどうかを証明する。

【０１０１】マウス6匹の群はそれぞれ、第0週および第4週に100μgのベクター（pCI-neo、
プラスミド、陰性対照）または、標的抗原GST、ORF2.1、HBsAg、NPおよびHAの1
つをコードするベクターを、（a）全長タンパク質（対照）；（b）Ub-A76-タン
パク質（対照）；（c）Sig1-タンパク質；（d）Sig3-タンパク質の形態で、筋肉
内注射して免疫化する。対応するタンパク質ワクチンは、追加の対照として作用
する。

【０１０２】血液は第0週、第4週、第8週および第12週に回収し、組織（リンパ節、脾臓）
は第12週に採取した。全体およびアイソタイプ特異的なIgG反応は、ELISAによっ
て決定され、体液性免疫応答の大きさの指標、および反応のTh1／Th2傾向に関す
る代理マーカーがそれぞれ与えられる。HAおよびNPでは、分析は特異的T細胞の
頻度およびTh1／Th2傾向を判定するために、（a）CTL活性ならびに（b）ELISPOT
および／または細胞内サイトカイン染色を含む。

【０１０３】 HEV Sig1またはSig3によって与えられる有効性の、さらにストリンジェント
な試験を行うために、マウスの亜致死インフルエンザ感染モデルを使用して、HA
およびNP DNAワクチン構築物を検査する。動物は前と同様に免疫化して、第12
週にすべての動物に対して、インフルエンザウイルスの穏和な菌株の亜致死量を
鼻腔内接種して病原菌投与する。5日後、マウスを安楽死させ、プラークアッセ
イ法によりウイルス負荷を測定するために肺組織を採取する。これらの研究によ
って、HEV Sig配列による混合標的化が免疫応答を高めることが確認される。

【０１０４】参考文献一覧

【０１０５】

【表２】 DNAプラスミドにコードされるHEVシグナルペプチド融合タンパク質の
細胞内プロセシングおよび免疫原性の概要 ^a4時間後の標的タンパク質の75％を超える分解（すなわちt_1／2＜2時間）。Sig2
タンパク質およびSig3タンパク質の場合、転位画分のみが分解される。^b 0週目、4週目、および8週目において100μgのDNAを筋肉内投与、1群当たりラッ
ト2匹、ORF2.1特異性Abは12週目に測定。

【図面の簡単な説明】

【図１】 E型肝炎ウイルスの完全長のPORF2タンパク質に比較したsig1、si
g2、及びsig3ペプチド、並びにそれぞれのタンパク質のアミノ酸配列のマップを
提供する。三つの例の間の中間サイズのタンパク質は、類似の利用性を有すると
予測される。

【図２】放射性標識したORF2.1並びにsig1-2.1、sig2-2.1及びsig3-2.1の
免疫沈降法及びPAGEを示し、細胞のサイトゾル(c)または膜に関連する(m)画分中
でコードタンパク質が示差的に局在化することを示す。ORF2.1とsig1-2.1は同種
局在性を有するが、これに対してsig2-2.1とsig3-2.1とは異種局在性を有するこ
とに注目するとよい。また、異なる移動速度の多数のバンドは、膜画分に転位し
たタンパク質が部分的にグリコシル化されることによることにも注目するとよい
。

【図３】放射性標識したORF2.1並びにsig1-2.1、sig2-2.1、及びsig3-2.1
の免疫沈降法及びPAGEを示す。細胞のサイトゾル(サイトゾル)または膜に関連す
る(膜)画分中でコードタンパク質が示差的に局在化することを示し(図2に対と同
様)、及び標識した0.1または4時間後にはそれぞれのタンパク質種の安定性が異
なることを示す。ORF2.1とsig1-2.1は同種プロセシング(4時間後にはそれぞれ分
解または安定)を有するが、これに対してsig2-2.1とsig3-2.1とは異種局在化(そ
れぞれ、サイトゾル及び膜)と一致するプロセシング(安定及び局在性)を有する
ことに注目するとよい。

【図４】放射性標識したsig1-GST、sig2-GST及びsig3-GSTの免疫沈降法及
びPAGEの表示であって、細胞のサイトゾル(サイトゾル)または膜に関連する(膜)
画分中でコードタンパク質が示差的に局在化することを示し、及び標識した0ま
たは3時間後にはそれぞれのタンパク質種の安定性が異なることを示す。sig1-GS
Tは異種局在化(サイトゾル及び膜)するものの、同種プロセシングし(安定)、こ
れに対してsig2-GST及びsig3−GSTは異種局在化(サイトゾル及び膜)し、かつ異
種プロセシング(安定及び分解)する。

【図５】動物もしくはヒトにおける核酸またはウイルスベクターを基にし
たワクチンに対する免疫応答の概略図である。(A)細胞内プロセシング及び局在
化に応じた抗原タンパク質に対する免疫応答性の一般的パターン。ほとんどの個
々のタンパク質種は、示した4つの経路のうちの1つのみを通る可能性を有するこ
とに注目するとよい。(B)免疫応答のパターンの調節は、対象となる抗原に融合
させるsigペプチドを使用して予測した。用いた例ではHEVのORF2.1抗原は標的抗
原であって直鎖状および高次構造のB細胞エピトープの両方を含み、同様にT細胞
エピトープも含む可能性を有し、ワクチンは、迅速に分解された生成物を生じう
るORF2.1、sig1-2.1もしくはsig3-2.1、またはユビキチン-2.1をコードするプラ
スミドを基にしたDNAワクチンである(参照文献8及び9)。予測される免疫応答経
路が異なるワクチンを受容する動物に対して示される。sig3-2.1の異種局在化と
プロセシングは、免疫応答の二つのアームの間で正のフィードバックを行う付加
的な能力を用いて体液性(抗体)と細胞性免疫応答の両方を活性化する点で特有で
ある。省略形：Ab,直鎖状：直鎖状のペプチドエピトープに対する抗体。Ab,conf
orm.：高次構造のペプチドエピトープに対する抗体。CTL：細胞性免疫応答。

【図６】種々のDNAワクチン構築物を用いて免疫感作したラットにおけるH
EV ORF2.1に対する抗体の生成を示すグラフ図である(vec；ベクター単独；ORF2.
1単独、Ub2.1；ユビキチン-A76-ORF2.1、sig1.2.1；Sig1-ORF2.1、sig3.2.1；Si
g3-ORF2.1)。一群につき二匹のラットが0週目、4週目、及び8週目に塩水に溶解
した100μgのDNAを筋肉内注入することで免疫感作され、指示した時間での抗体
反応をORF2.1 ELISAを用いて測定した(Andersonら、1999)。

【図７】 DNAワクチン構築物で免疫感作したラットにおけるHEV ORF2.1に
対する抗体の生成を示すウエスタンブロット法の図である。Sig1-ORF2.1またはS
ig3-ORF2.1を用いて免疫感作したラットから得られる抗体を、Riddelら(2000)に
記載されたように、完全長のORF2.1タンパク質の種々の断片に対するウエスタン
免疫ブロット法によって試験した。Sig1-ORF2.1のDNAワクチンが高次構造のORF2
.1エピトープに対する抗体を誘導し、これに対してSig3-ORF2.1のDNAワクチンは
直鎖状エピトープと同様に高次構造のORF2.1エピトープの両方に対する高レベル
の抗体を誘導するが、それはMHC-II経路を経て無傷の抗原及び崩壊した抗原の両
方が提示されることと一致している。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 35/00 35/00 37/06 37/06 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者アンダーソンデビッドアンドリューオーストラリア国ブランズウィックエドワードストリート 64 (72)発明者パーシルダミアンフランシスジョンオーストラリア国バルウィンノースミュスカストリート６Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA02 CA07 DA02 EA04 GA11 HA17 4B065 AA90X AA96Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA45 4C085 AA03 BA87 BB23 EE01 GG02 GG04 GG05 GG06 GG08 4C086 AA01 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB05 ZB26 ZB33 ZB35

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】動物において対象となる抗原性ポリペプチドに対する免疫応
答を高める方法であって、該方法がプロセシング成分と該対象となる抗原性ポリ
ペプチドとを含む融合タンパク質をコードする核酸構築物を含有する組成物の有
効量を該動物に投与する段階を含み、該核酸構築物が宿主細胞で発現される場合
に、該プロセシング成分が該抗原性ポリペプチドの異種プロセシングをもたらし
、その結果、抗原性ポリペプチドに対する免疫応答を高める方法。
【請求項２】プロセシング成分が、E型肝炎ウイルスのPORF2タンパク質の
N末端領域に由来する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】プロセシング成分をコードする核酸構築物が、配列番号：2
もしくは配列番号：3に記載のアミノ酸配列、またはその機能性誘導体、変異体
、部分、もしくは相同体を含むプロセシング成分をコードする、請求項1に記載
の方法。
【請求項４】プロセシング成分が、実質的に配列番号：2もしくは配列番
号：3に記載のアミノ酸配列、またはその機能性誘導体、変異体、部分、もしく
は相同体を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】プロセシング成分が、実質的に配列番号：5もしくは配列番
号：6に記載のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、またはそ
の機能性誘導体、変異体、部分、もしくは相同体を含む、請求項1に記載の方法
。
【請求項６】動物においてウイルスキャプシドポリペプチドに対する免疫
応答を高める方法であって、該方法がプロセシング成分と該キャプシドポリペプ
チドとを含む融合タンパク質をコードする核酸構築物を含む組成物の有効量を該
動物に投与する段階を含み、該プロセシング成分が、実質的に配列番号：5もし
くは配列番号：6に記載のヌクレオチド配列、またはその機能的誘導体、変異体
、部分、もしくは相同体によってコードされ、該キャプシドタンパク質の異種プ
ロセシングをもたらし、その結果、それに対する免疫応答を高める方法。
【請求項７】プロセシング成分が、配列番号：6に記載のヌクレオチド配
列によってコードされる、請求項5に記載の方法。
【請求項８】核酸分子がプロセシングペプチドと対象となる抗原性ポリペ
プチドとを含む融合タンパク質として宿主細胞で発現される場合に、宿主におい
て該対象となる抗原性ポリペプチドに対する免疫応答を高める該プロセシングペ
プチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
【請求項９】核酸分子がプロセシングペプチドと対象となる抗原性ポリペ
プチドとを含む融合タンパク質として宿主細胞で発現される場合に、該対象とな
る抗原性ポリペプチドの異種プロセシングをもたらす該プロセシングペプチドを
コードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
【請求項１０】プロセシング成分が、E型肝炎ウイルスのPORF2タンパク質
のN末端領域に由来する、請求項8または9に記載の単離核酸分子。
【請求項１１】プロセシング成分が、実質的に配列番号：5もしくは配列
番号：6に記載のヌクレオチド配列、またはその機能的誘導体、変異体、部分、
もしくは相同体によってコードされる、請求項8または9に記載の単離核酸分子。
【請求項１２】プロセシング成分が、実質的に配列番号：2もしくは配列
番号：3に記載のアミノ酸配列、またはその機能的誘導体、変異体、部分、もし
くは相同体を含む、請求項8または9に記載の単離核酸分子。
【請求項１３】プロセシング成分と少なくとも一個の抗原性成分とを含む
融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸構築物であって、
該プロセシング成分が、実質的に配列番号：2または配列番号：3に記載のアミノ
酸配列を含み、該核酸構築物が宿主細胞で発現される場合に、該プロセシング成
分が抗原性ポリペプチド成分の異種プロセシングをもたらし、その結果、抗原性
ポリペプチドに対する免疫応答を高める、単離核酸構築物。
【請求項１４】請求項8から12のいずれか一項に記載の核酸分子、または
請求項13に記載の構築物をトランスフェクトした単離細胞。
【請求項１５】抗原提示細胞である請求項14に記載の細胞。
【請求項１６】請求項8から13のいずれか一項に記載の核酸分子、または
構築物を含む、核酸ワクチン。
【請求項１７】ウイルスレプリコンを含む、請求項16に記載の核酸ワクチ
ン。