CN1650013A - 抗汉坦病毒属病毒感染的dna疫苗 - Google Patents

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Abstract

本申请介绍的是抗HFRS－和HPS－相关汉坦病毒的保护性DNA疫苗。疫苗的构建是将表示中间(M)序列(编码G1和G2糖蛋白)的cDNA亚克隆到DNA表达载体pWRG7077中。接种有M构建体的动物产生中和抗体反应。被动转移试验显示，攻击后4或5天注射接种动物的血清可以保护动物免受致命疾病的伤害。

Description

抗汉坦病毒属病毒感染的DNA疫苗
本申请是2000年1月27日提交的美国申请09/941974的部分继续申请，其要求1999年1月29日提交的美国临时申请60/117680的优先权。本申请也对更早提交的临时申请系列享有优先权，分别是2002年3月22日提交的60/367128和2002年7月26日提交的60/398985。前言
目前，有四种已知的肾综合征出血热(HFRS)相关的汉坦病毒属病毒：汉坦病毒(HTNV)，多布拉伐-贝尔格莱德病毒(DOBV)，普马拉病毒(PUUV)，和汉城病毒(SEOV)。因为通常不同的汉坦病毒属病毒仅是由一个主要的啮齿类宿主携带，因此，汉坦病毒属病毒的分布一般就局限在那个宿主的范围(Schmaljohn和Hjelle1997年的综述，Emerg.Infect.Dis.3，95-104)。黑线姬鼠(Apodemus agrarius)携带的HTNV在亚洲发现；黄颈鼠(Apodemus flavicollis)携带的DOBV和欧鼠(Clethrionomys glareolus)携带的PUUV在欧洲发现。SEOV比其它任何已经识别的汉坦病毒属病毒散布得更广泛，因为它的宿主，普通的都市大鼠(褐家鼠(Rattus norvegicus))可以在全世界范围发现。
在美洲，新的世界范围的汉坦病毒属病毒都和高致命疾病汉坦病毒肺症候群(HPS)的爆发相关。(Schmaljohn和Hjelle1997年的综述，Emerg.Infect.Dis.3，95-104)。这种疾病的特征是发热，血管渗漏，从而导致非心源性肺水肿，接着出现休克。由绝大部分流行于北美和南美的汉坦病毒属病毒，辛诺柏病毒(SNV)，安地斯病毒(ANDV)所引起的HPS致死病例分别是30-50％。
汉坦病毒属(布尼亚病毒科)中的病毒都是包膜病毒，所含的基因组由三个单链RNA区段组成，根据大小分别命名为大(L)，中(M)，小(S)区段(参考Schmaljohn 1996年的综述：《 布尼亚病毒科(The Bunyaviridae)》，R.M.Elliott编辑，纽约，Plenum出版社，63-90页)。汉坦病毒属病毒的L区段编码依赖RNA的RNA聚合酶，M区段编码两个包膜糖蛋白(G1和G2)，而S区段编码核壳蛋白质(N)。
从细胞培养物或啮齿类动物大脑中，开发了许多灭活的HFRS疫苗，并在亚洲进行了测试(Lee等人，1990，Arch.Virol.，增刊1，35-47；Song等人，1992，Vaccine 10，214-216；Lu等人，1996，J.Med.Virol.49，333-335)。传统病毒灭活疫苗的缺点包括在病毒的生长和操作中要求适当的防护。为了克服这些缺点，开发了涉及重组DNA技术的疫苗方法，包括痘苗载体疫苗(Schmaljohn等人，1990，J.Virol.64，3162-3170；Schmaljohn等人，1992，Vaccine 10，10-13；Xu等人，1992，Am.J.Trop.Med.Hyg.47，397-404)，在细菌或昆虫细胞中表达的蛋白亚基疫苗(Schmaljohn等人，1990，同上，Yoshimatsu等人，1993，Arch.Virol.130，365-376；Lundkvist等人，1996，Virology 216，397-406)，和基于乙肝核心抗原的重组疫苗(Ulrich等人，1998，Vaccine16，272-280)。
用表达HTNV或SEOV的M区段的重组痘苗接种，能诱导中和抗体的产生，保护啮齿类动物不受HTNV和SEOV的感染，这表明仅仅对G1-G2的免疫反应就能对动物起保护作用(Schmaljohn等人，1990，同上，Xu等人，1992，同上，Chu等人，1995，J.Virol.69，6417-6423)。相似地，用在昆虫细胞中表达的G1-G2蛋白接种(杆状病毒重组系统)，能诱导中和抗体的产生，保护仓鼠不受HTNV的感染(Schmaljohn等人，1990，同上)。在痘苗和杆状病毒系统这两种情况下，G1-G2接种比单独用G1或G2接种提供的保护更完全(Schmaljohn等人，1990，同上)。在前述疫苗研究中，中和抗体对G1-G2的应答与保护相关联，表明中和抗体在预防汉坦病毒属病毒感染中发挥了重要的作用。被动转移特异于G1或G2的中和单克隆抗体(MAbs)能保护仓鼠免受HTNV感染(Schmaljohn等人，1990，同上，Arikawa等人，1992，J.Gen.Virol.70，615-624)，支持了这样的观点，即中和抗体单独也能发挥保护作用。
N蛋白在防止汉坦病毒属病毒感染中也发挥了重要作用。用在细菌，昆虫细胞表达的N蛋白接种，或用作为嵌合的乙型肝炎病毒(HBV)核心粒子的N蛋白接种能保护啮齿类动物免受汉坦病毒属病毒感染(Schmaljohn等人，1990，同上，Yoshimatsu等人，1993，同上，Lundkvist等人，1996，同上，Ulrich等人，1998，同上)。用表达S区段的重组痘苗病毒接种得到的结论比较少。表达HTNV S区段的构建体并不能保护仓鼠免受HTNV的感染，可能是因为N的表达水平低(Schmaljohn等人，1990)  而表达SEOV S区段的构建体能保护四种沙鼠中的三种免受SEOV感染(Xu等人，1992，同上)。
相似的，自从20世纪90年代中叶分离第一株HPS相关汉坦病毒属病毒以来，抵御HPS、基于基因疫苗的基础研究就一直在进行。有报道认为候选DNA疫苗包括SNV M基因的大约500核苷酸序列，或全长的S基因，是小鼠的免疫原(Bharadwaj等人，1999，Vaccine 17，2836-43)，而且在鹿鼠感染模型中能起到一些保护作用，免受SNV的感染(Bharadwaj等人，2002，J.Gen，Virol.83，1745-1751)。这种保护被推测是细胞介导的，因为没有令人信服的证据表明这些构建体能诱导中和，或其他保护性抗体反应。
因此，现在不是很清楚单独G1，单独G2，或者糖蛋白的片段是否诱导出中和抗体，并且防止感染。用只含有G1或G2的重组杆状病毒感染的细胞裂解产物以及只表达G1或G2的重组痘苗病毒接种，都不能诱导中和抗体，并且在仓鼠感染模型中不能表示出完全的保护作用(Schmaljohn等人，1990)。尽管这些痘苗疫苗表示出了一些潜能，但重组的痘苗病毒疫苗和基于痘苗的疫苗表示出了一些不足，包括散布感染的能力，尤其是在无免疫应答的个体中，因为该疫苗由活病毒组成。同样，用这些病毒接种会导致病灶(痘疤)，这种病灶中含有感染的病毒。这些病灶的病毒会无意地向其他部位(如眼睛)或别的个体扩散。此外，痘苗载体疫苗在以前接种过天花疫苗的人中具有很弱的免疫原性(McClain等人，2000，J.Med.Virol.60，77-85)。基于痘苗的疫苗的其他缺点包括由于淋巴结肿胀而导致的不适以及在接种部位留下疤痕。
发明概述
在本报告中，我们介绍了一种新的重组DNA疫苗方法，它涉及用表达单个汉坦病毒属病毒基因组区段cDNA的裸露DNA接种。裸露DNA接种涉及到将带有目的基因的质粒DNA构建体转移到受接种者的组织中(参考Robinson和Torres，1997，Semin.Immunol.9，271-283；和Gregoriadis，1998，Pharm，Res.15，661-670)。
这种疫苗方法比亚单位疫苗有优点，亚单位疫苗不能诱导对防止已经出现的感染或疾病所必需的细胞毒性反应。DNA疫苗接种模仿从头合成抗原，并且用活的疫苗获得I型MHC限制的抗原呈递，而没有病原菌感染的危险。此外，这种DNA疫苗方法允许疫苗进入粘膜组织，粘膜组织能帮助抵抗病毒导入，因为病毒的进入可能通过粘膜组织。
在我们的申请中，目的基因就是汉坦病毒属病毒基因组区段，它被哺乳动物或病毒启动子控制(例如巨细胞病毒立即早期启动子)，这些启动子有助于裸露DNA基因产物在受接种者细胞中的表达。这种胞内表达能诱导体液和细胞介导的免疫反应(Robinson和Torres，1997，同上，以及Gregoriadis，1998，同上)。DNA转移的方法包括接种针接种，口腔或肺部给药，以及通过粒子轰击法接种(即基因枪)。用这些方法中的每一种进行DNA疫苗接种都能诱导出针对许多不同的病原菌，包括众多病毒的保护性免疫反应(Robinson和Torres，1997，同上，以及Gregoriadis，1998，同上)。然而，迄今为止，还没有证明DNA疫苗能诱导抗汉坦病毒属病毒的免疫反应，以及防止汉坦病毒属病毒感染。
在本报告中，我们证明了用裸露的SEOV M或S基因组区段接种能诱导啮齿类动物SEOV特异的抗体反应。更重要的是，我们还证明了用SEOV M区段接种能诱导中和抗体，并保护仓鼠免受SEOV感染。
也是在本申请中，我们报道了HTNV M DNA疫苗的开发。这种疫苗表达HTNV的G1和G2蛋白，诱导仓鼠产生中和抗体，防止仓鼠感染HTNV，SEOV和DOBV。此外，我们还证明了SEOV M，和HTNV M DNA疫苗在非人的灵长类动物中能诱导高效价的中和抗体反应。
此外，我们介绍了第一个基于ANDV M基因的DNA疫苗的开发和检测，这种疫苗能诱导中和，或者其他保护性抗体反应。这是意料之外的结果，因为该疫苗在仓鼠中既没有免疫原性，也不是保护性的，而在猕猴中是免疫原性和保护性的。此外，对另外两种HPS相关的汉坦病毒属病毒：辛诺柏病毒和黑渠港病毒的交叉保护作用是明显的。
本申请也介绍了一种汉他/安地斯病毒双M基因的汉坦病毒属病毒DNA疫苗，含有HTNV和ANDV的M基因。这种疫苗在非人的灵长类动物中表示出免疫原性和保护作用。这是第一个设计用来防止所有汉坦病毒属病毒的DNA疫苗，包括HPRS相关和HPS相关的，这些病毒能引起严重的疾病。检测这种汉他/安地斯病毒双M基因汉坦病毒属病毒DNA疫苗，pWRG/HA-M在猕猴中的免疫原性。这种疫苗能诱导抗体反应，该反应能中和汉坦病毒和安地斯病毒(参看表8)。在单一的仓鼠实验中，我们发现这种质粒和安地斯病毒质粒相似，因为它在仓鼠中不能诱导抗体反应。然而，它在猴子中能诱导中和抗体的事实表明它在人体中能诱导中和抗体。
此外，本申请也介绍了一种汉坦病毒属病毒免疫球蛋白组合物，这种组合物有预防或治疗作用，与汉坦病毒属病毒接触后，能防止汉坦病毒属病毒感染，和/或能治疗汉坦病毒属病毒疾病。目前，没有特异的药物或免疫治疗手段来治疗HPS或HFRS疾病，或施用给可能暴露在汉坦病毒属病毒中或患汉坦病毒属病毒疾病的人。本发明的汉坦病毒属病毒免疫球蛋白组合物由多克隆抗血清组成，这种血清来自接种了DNA疫苗的动物/人群，DNA疫苗包括一种能表达安地斯病毒和/或汉坦病毒M基因的质粒。这种多克隆血清含有中和抗体，能预防安地斯病毒和/或汉坦病毒。不像常规的多克隆免疫血清产品，用在本发明的方法(产生灵长类动物抗体的受接种者的DNA疫苗接种)并不涉及活病毒，而且不要求识别从汉坦病毒属病毒疾病中幸存下来的患者。
因此，本发明的一个目的是提供一种汉坦病毒属病毒DNA疫苗，这种疫苗含有汉坦病毒属病毒基因组区段。更具体地说，本发明涉及一种SEOV汉坦病毒属病毒DNA疫苗，这种疫苗含有如SEQ ID NO：1所示的SEOV M基因组区段或如SEQ ID NO：2所示的SEOV S区段。本发明也涉及HTNV汉坦病毒属病毒DNA疫苗，这种疫苗包括HTNVM基因组区段，如Genebank登录号M14627的2-3565这一段延伸序列所示。本发明还进一步涉及到ANDV DNA疫苗，它包括ANDV M基因组区段，如Genebank登录号AF291703的2-3671这一段延伸序列所示。本发明也涉及到HTNV/ANDV疫苗，这种疫苗含有SEQ IDNO：3的HTNV M基因组区段和SEQ ID NO：4的ANDV M基因组区段。上面介绍的汉坦病毒属病毒DNA片段可以单独作为DNA疫苗的一部分呈递给供试者，或者和其他汉坦病毒属病毒DNA片段一起呈递给供试者，而不管它们是组合在相同还是不同的构建体上。
本发明的另一个目的是提供一种能在供试者中诱导免疫反应防止汉坦病毒属病毒的方法，该方法包括给供试者施用一种含有汉坦病毒属病毒基因组区段的DNA片段。更具体地说，本发明涉及通过提供SEOV M或S基因组区段来诱导免疫反应防止SEOV病毒的方法，通过提供HTNV M基因组区段来诱导免疫反应防止HTNV病毒的方法，通过提供ANDV M基因组区段来诱导免疫反应防止ANDV病毒的方法。交叉保护防止别的汉坦病毒属病毒如汉坦病毒和多布拉伐病毒或辛诺柏病毒和黑渠港病毒也是本发明的一个目的。
提供一种DNA疫苗也是本发明的一个目的，该疫苗是汉坦病毒M基因DNA疫苗与安地斯病毒M基因DNA疫苗的结合，通过给供试者提供这种DNA疫苗，使每个M基因在供试者中表达，从而诱导抗HFRS和HFS汉坦病毒属病毒的免疫反应，并能防止所有能引起严重疾病的汉坦病毒属病毒。汉坦病毒M基因或安地斯病毒M基因可以单独给药，即通过单独的载体给药，或者如本发明的一个方面所介绍的那样可以结合在同一个载体上。此外，为了制造一种多价的疫苗，可以将别的汉坦病毒属病毒，如普马拉病毒的M基因区段同汉坦病毒DNA疫苗以及安地斯DNA疫苗结合，这种多价病毒能提供额外的保护，防止汉坦病毒属病毒感染。
在本发明的一个方面，DNA疫苗的转移方法是在一个小的载体粒子上涂上DNA疫苗，通过粒子轰击法将涂有DNA疫苗的粒子转移到动物的表皮组织。这个方法适用于将DNA疫苗转移到表皮或粘膜组织，或转移到外周血细胞，而且可以在接种个体中用于诱导体液，细胞介导的，以及是分泌的免疫反应。
本发明的DNA疫苗本质上是安全的，给药时不痛苦，而且不会给接种的个体带来不利的副作用。此外，本发明不要求生长或使用汉坦病毒属病毒，这会通过空气悬浮粒子传输进行扩散。
本发明进一步的目的是提供一种灵长类动物多克隆血清组合物，这种组合物含有中和抗体，针对至少一种，优选的是两种或多种汉坦病毒属如安地斯病毒和/或汉坦病毒的M区段。
本发明的另一个目的是提供在功能上和上述抗体等效的抗体。这些功能上等效的抗体和上下文介绍的抗体基本上共享至少一种主要功能特性，包括体外免疫反应活性，预防性给药或治疗用给药时能防止汉坦病毒属病毒攻击，竞争G1和/或G2上同一个结合位点。抗体可以是诸如IgG，IgM，或IgA中的任何一类或诸如IgG1，IgG2a以及别的本领域已知的亚类中的任何一亚类。此外，可以通过任何方法来制造抗体，如噬菌体展示，或在任何生物或细胞系中制造抗体，包括细菌，昆虫，哺乳动物或别的能产生具所需特征的抗体，如人源化抗体的细胞类型或细胞系。将来自不同物种的Fab部分和Fc部分结合在一起也能形成抗体。
本发明的另一个目的是通过施用治疗或预防有效量的本发明血清或抗体混合物给需要这种治疗的供试者来治疗或预防汉坦病毒属病毒感染。
本发明的另一个目的是提供被动疫苗用于治疗或预防汉坦病毒属病毒感染，这种疫苗包括治疗或预防有效量的能防止汉坦病毒属病毒疾病的本发明抗体以及可药用的载体或赋型剂。
本发明的另一个目是提供一种用于诊断汉坦病毒属病毒感染的方法，即通过使用本发明的抗体测试样品中汉坦病毒属病毒的存在。
本发明的另一个目的是提供新的含有本发明抗体的用于检测汉坦病毒属病毒感染的免疫探针和检测试剂盒。对于免疫探针，抗体直接或间接地连接到合适的报告分子如酶或放射性核素上。检测试剂盒包括一个容器，容器中容纳了一或多种本发明的抗体，还包括抗体使用说明书，目的是使抗体结合到汉坦病毒属病毒形成免疫复合物，并检测免疫复合物的形成，这样就将免疫复合物的存在与否和汉坦病毒属病毒的存在与否联系起来了。
附图简述
参考下列说明书，随附的权利要求书及附图，可以更好的理解本发明的特征，方面以及优点，这些附图是：
图1：裸露SEOV DNA表达构建体。通过RT-PCR扩增SEOV M或S基因组区段，并将其克隆到pWRG7077的NotI和BamHI位点(PowderJect Vaccines公司，Madison，Wisconsin，在Schmaljohn等人1997年的文章中介绍了，同上)。pWRG7077的特征和以前介绍的pWRG1602的特征相似(Dimmock，N.J.，1995，Med.Virol.5：165)，并且包括一个人巨细胞病毒早期启动子(CMV IE启动子)和内含子A，牛生长激素转录终止子，多腺苷酸化信号序列(BGH pA)，以及卡那霉素抗性基因。CMV IE启动子：巨细胞病毒立即早期启动子和内含子A，BGHpA：牛生长激素多腺苷酸化信号，KAN：卡那霉素抗性基因。
图2A和2B：pWRG/SEO-M(SEQ ID NO：3)和pWRG/SEO-S(SEQ IDNO：4)的瞬时表达。A)在转染了SEOV M或S构建体的单层COS细胞中进行IFAT。转染了pWRG/7077的单层细胞用作阴性对照。抗SEOV多克隆兔抗血清用作一级抗体。B)用所示质粒转染COS细胞，放射性标记的表达产物用抗SEOV多克隆兔血清进行免疫沉淀。kDa大小的分子标准(MW)表示在左边，而SEOV G1，G2和N蛋白的位置表示在右边。
图3A和3B：通过基因枪或接种针肌内接种了裸露SEOV DNA的小鼠的抗体反应(ELISA)。用ELISA评估通过基因枪或接种针肌内接种了pWRG/SEO-M(图A)或pWRG-SEO-S(图B)的抗体反应。接种了阴性对照质粒pWRG7707的小鼠通过两次ELISA进行评估。预放血前的血清，第一次接种(1 vacc)后4周收集的血清，第二次接种(2 vacc)后4周收集的血清，最后一次接种(3 vacc)后3周收集的血清在一次试验中进行检测。符号表示的是单个小鼠血清样品双重检测的平均值。
图4：接种了裸露SEOV DNA的小鼠的中和抗体反应。在用基因枪或接种针肌内注射(接种针)进行第三次接种后3周收集的小鼠血清样品进行PRNT。柱形表示的是接种了所示免疫原的单个小鼠血清。加热灭活血清(56℃，30分钟)，并且在5％豚鼠补体存在的情况下进行试验。PRNT50％效价表示成导致噬菌斑减少50％时最高血清稀释度的倒数。
图5：接种pWRG/SEO-M能交叉保护防止汉坦病毒感染。根据下面介绍的方法用pWRG/SEO-M或阴性对照质粒(pWRG7707)对分组仓鼠接种，每组仓鼠4-5只。最后一次接种后3周，获得攻击前的血清样品，然后用1000PFU的汉坦病毒攻击仓鼠。攻击后28天，获得攻击后血清样品。对攻击前和攻击后的血清样品进行评估，方法是通过抗N ELISA检测核壳的抗体，以及通过汉坦病毒噬菌斑降低中和测验(PRNT)检测汉坦病毒中和抗体。ELISA效价表示的是使得OD值比背景OD值+标准差3大的最低稀释度倒数。PRNT50％效价表示的是在血清缺乏的情况下导致噬菌斑数目减少50％的最低稀释度倒数。
图6：用pWRG/SEO-M接种能交叉保护防止多布拉伐病毒感染。根据介绍的方法，用pWRG/SEO-M或阴性对照质粒(pWRG7077)对分组仓鼠进行接种，每组5只仓鼠。最后一次接种后3周，获得攻击前的血清样品，然后用1000PFU的多布拉伐病毒攻击仓鼠。攻击后28天，获得攻击后血清样品。对攻击前和攻击后的血清样品进行评估，方法是通过抗N ELISA检测核壳的抗体，以及通过多布拉伐病毒噬菌斑降低中和测验(PRNT)检测多布拉伐病毒的中和抗体。ELISA效价表示的是使得OD值比背景OD值+标准差3大的最低稀释度倒数。PRNT50％效价表示的是在血清缺乏的情况下导致噬菌斑数目减少50％的最低稀释度倒数。汉城病毒攻击前的中和抗体效价(由疫苗诱导)也被检测。汉城病毒的PRNT80％值表示成空环。
图7：用pWRG/SEO-M接种不能交叉保护防止普马拉病毒感染。根据介绍的方法，用pWRG/SEO-M或阴性对照质粒(pWRG7077)对分组仓鼠进行接种，每组5只仓鼠。最后一次接种后3周，获得攻击前的血清样品，然后用1000PFU的普马拉病毒攻击仓鼠。攻击后28天，获得攻击后血清样品。对攻击前和攻击后的血清样品进行评估，方法是通过抗N ELISA检测核壳的抗体，以及通过普马拉病毒噬菌斑降低中和测验(PRNT)检测普马拉病毒的中和抗体。ELISA效价表示的是使得OD值比背景OD值+标准差3大的最低稀释度倒数。PRNT50％效价表示的是在血清缺乏的情况下导致噬菌斑数目减少50％的最低稀释度倒数。汉城病毒攻击前的中和抗体效价(由疫苗诱导)也被检测。汉城病毒的PRNT80％值表示成空环。
图8：HTNV G1和G2的瞬时表达。用pWRG/HTN-M或阴性对照质粒(pWRG7077)转染Cos细胞，并在24小时后，用RIPA制备用于分析的放射性标记的细胞裂解液。用抗HTNV的多克隆小鼠超免疫腹水(HTNV HMAF)，即G1特异的MAb(Mab 6D4)，或G2特异的MAb(Mab-23G10)免疫沉淀表达产物。分子标准(M)在左边表示成kDa大小，而G1和G2的位置表示在右边。
图9A，9B，9C，9D：有效表达G1要求上游外源序列。(A)含有SEOV M基因的DNA疫苗质粒pWRG/SEO-M的示意图，表示的是载体NotI位点和SEOV G1起始密码子之间的核苷酸序列[SEQ IDNO：5]。NotI位点后是来自以前的克隆方法的24个外源的核苷酸[SEQID NO：6]，这些核苷酸后接的是SEOV M反基因组5’非编码区，从位置2开始。汉坦病毒属病毒M基因被克隆进pWRG7077的NotI-BamHI位点，或NotI-BglII位点。G1/G2，编码G1和G2糖蛋白的开放阅读框，CMV IE内含子A，巨细胞病毒立即早期启动子，后面接着内含子A序列，KANr：卡那霉素抗性基因，BGH polyA：牛生长激素多腺苷酸化信号。(B)外源序列的改变能影响SEOV G1的表达。用pWRG/SEO-M(SEO-M)(在这栏中的序列对应SEQ ID NO：6)，或有如下变化的质粒转染COS细胞：去掉外源序列(0)；恢复外源序列(1-24)(在这栏中的序列对应SEQ ID NO：6)；反向放置外源序列(24-1)(在这栏中的序列对应SEQ ID NO：7)；去掉外源序列的3’部分(1-12)(在这栏中的序列对应SEQ ID NO：6的核苷酸1-12)；去掉外源序列的5’部分(13-24)(在这栏中的序列对应SEQ ID NO：6的核苷酸13-24)；在外源序列的9，10位用CC取代AG(1-24)(在这栏中的序列对应SEQ ID NO：6，这个序列的9，10位用CC取代了AG)。用多克隆兔抗SEOV抗体进行免疫沉淀，抗SEOV抗体含有G1特异的和G2特异的抗体(1)，或G2特异多克隆抗体池(3)。在载体的NotI位点和SEOV M基因非翻译区的位置2之间的序列如图所示。Δ表示外源序列被去掉了。有下划线的GGATCTGC(SEQ ID NO：6的核苷酸1-8)是和G1有效表达相关的最小未改变序列。(C)如果外源基因的1-8位核苷酸，GGATCTGC(SEQ ID NO：6的1-8位核苷酸)包括在NotI位点和SEOV M非编码区之间，G1就能恢复有效表达。用pWRG/SEO-M(SEO-M)或质粒转染COS细胞，所述质粒去掉了外源基因(0)；恢复了外源序列(1-24)(SEQ ID NO：6)；或外源序列截短了(1-8)(SEQ ID NO：6的1-8位核苷酸)。用多克隆兔抗SEOV抗体进行免疫沉淀，抗SEOV抗体含有G1特异的和G2特异的抗体(1)，G1特异的MAb池(2)，或G2特异的MAb-11E10(3)。(D)去掉外源序列能影响HTNV G1表达。用含HTNV M基因的DNA疫苗质粒，pWRG/HTN-M(x)(HTN-M)(在这栏中的序列对应SEQ IDNO：6)，或有下列变化的质粒转染COS细胞：去掉外源序列(0)；恢复外源序列(1-24)(在这栏中的序列对应SEQ ID NO：6)。用抗HTNV的小鼠超免疫腹水进行免疫沉淀，超免疫腹水含有G1特异的和G2特异的抗体(1)，G1特异的MAb池(2)，或G2特异的MAb-11E10(3)。分子标准(M)在左边表示成kDa大小，而G1和G2的位置表示在右边。
图10：表达G1和G2的质粒pWRG/HTNV-M(x)的示意图。pWRG/HTNV-M(x)采用了hCMV立即早期启动子和外显子1和2的5’非编码区，在它们之间有一个天然插入的内含子A。汉坦病毒M基因5′开放阅读框(ORF)之前有汉坦病毒M基因的非翻译区(UTR)，而后面是汉坦病毒M基因的3’-UTR。我们发现的外源序列对G1有效表达是必要的，它介于内含子A和汉坦病毒5’UTR之间。牛生长激素多腺苷酸化信号(BGH polyA)有助于转录终止。质粒骨架是pUC19，而卡那霉素抗性基因(KanR)提供了抗生素抗性。
图11：用表达HTNV G1和G2的质粒DNA接种能防止HTNV感染。这张图结合了两个独立的实验结果。在第一个实验中，一组仓鼠(659-666)用pWRG/HTN-M接种，而第二组阴性对照(667-674)用载体质粒pWRG7077接种。在第二个实验中，一组仓鼠(2101-2108)用pWRG/HTN-M(x)接种，而第二组阴性对照(2109-2116)没有接种。最后接种后3周，收集攻击前的血清，并用HTNV攻击仓鼠。攻击后28天收集攻击后血清。用抗N ELISA检测攻击前和攻击后血清中N特异的抗体，而用PRNT检测中和抗体。每个仓鼠攻击前和攻击后，终点抗体效价如图所示。对于每个试验，攻击前的同型PRNT80％效价按从最高到最低，从左到右进行分类。
图12：12A，12B，12C，12D和12E：交叉保护。仓鼠用图示质粒(含有外源序列的pWRG/SEO-M，pWRG/HTN-M(x)或阴性对照质粒)接种，然后用图示的病毒攻击。图A，图B和图C中的阴性对照仓鼠用基于pWRG7077的质粒接种，而图D和图E中的阴性对照仓鼠不接种。用抗N ELISA检测攻击前和攻击后血清样品中的抗N抗体，并用PRNT检测中和抗体。同型病毒的PRNT80％效价和异型病毒的PRNT50％也检测了。攻击前和攻击后，每个仓鼠的终点抗体效价如图所示。攻击前的同型PRNT80％效价(从最高到最低，从左到右进行分类)表示成带符号的线。每只仓鼠的识别代码表示在X轴上。仓鼠943，944，945和948的HTNV PRNT和抗N ELISA数据以前发表了(Kamrud等人，1999，Virology，263，209-219)。
图13：用表达SEOV或HTNV G1和G2的质粒DNA接种，在猕猴中能诱导高效价的中和抗体反应。根据所述方法中所示的路线，用pWRG/SEO-M(x)，pWRG/HTN-M(x)或rVV/HTN-M+S接种猕猴。接种前收集血清样品(P)，然后在第一次(1)，第二次(2)，和第三次(3)接种后3周收集血清样品。在最后一次接种后2个月(a)，4个月(b)，和6个月(c)后也收集血清。PRNT效价表示的是中和病毒噬菌斑数80％或50％血清稀释度的倒数，每只猴子的识别代码表示在各自的图下面。
图14：猴子中中和抗体反应的持续时间。由DNA疫苗接种所诱发的中和抗体反应仍在最后接种后8个月的猕猴中检测到了。用所示疫苗接种的猕猴在每次接种后3周放血，然后在最后接种后2，4，6和8个月(分别是14，22，30和38周)放血。用PRNT对第一次接种后所示的周(0周)的同源中和抗体反应进行评估。每一条线代表一只猴子。第9周的数据在图13也表示了。
图15：在仓鼠/ANDV致死病模型中评估HFRS DNA疫苗。用pWRG/HTN-M(x)或阴性对照质粒pWRG7077接种仓鼠，然后用ANDV攻击。对于死亡的动物，死亡日期用圆括号表示。从第一次攻击后幸存下来的动物继续用ANDV进行第二次攻击。用PRNT对攻击当天(攻击前)，攻击后4-6周(攻击后)，以及第二次攻击后28-48周(重新攻击后)收集的血清样品检测HTNV和ANDV特异的MAbs。柱子表示PRNT效价。仓鼠识别代码(ID#)68-91以及501-523表示的是两个独立的实验；N表示没有做。
图16：质粒pWRG/AND-M的示意图。pWRG/AND-M采用了hCMV立即早期启动子和外显子1和2的5′非编码区，在它们之间有一个天然插入的内含子A。安地斯病毒M基因开放阅读框(ORF)之前有安地斯病毒M非翻译区(UTR)，而后面是安地斯病毒M基因的3’-UTR序列。我们发现的外源序列对G1有效表达是必要的，它介于内含子A和安地斯病毒5’UTR之间。牛生长激素多腺苷酸化信号(BGHpolyA)有助于转录终止。质粒骨架是pUC19，而卡那霉素抗性基因(KanR)提供了抗生素抗性。
图17A，17B和17C：pWRG/AND-M的表达。A)用pWRG/AND-M(+)或空的质粒pWRG7077(-)转染COS细胞，然后用阿根廷或美国的HPS康复期血清对来自COS细胞的放射标记的蛋白进行免疫沉淀。B)用pWRG/AND-M，pWRG7077转染COS细胞，或用ANDV转染Vero E6细胞，然后用阿根廷(抗ANDV的人)的HPS康复期血清对来自COS细胞或Vero E6细胞的蛋白进行免疫沉淀。C)用pWRG/AND-M(x)(H)或pWRG/AND(A)转染COS细胞，用指定的HTNV特异的MAbs，HTNV特异的小鼠超免疫腹水(HTN-poly)或阿根廷(AND-poly)的HPS康复期血清对来自COS细胞的蛋白进行免疫沉淀。+表示G1或G2被免疫沉淀了，-表示没有蛋白被免疫沉淀了，而*表示G1和G2都被免疫沉淀了。分子标准(M)在左边表示成kDa大小，而G1，G2和N的位置表示在右边。
图18A，18B和18C：汉坦病毒属病毒DNA疫苗在非人的灵长类动物中的免疫原性。A)用pWRG/HTN-M(x)，pWRG/AND-M，或阴性对照质粒接种猕猴。在第一次接种之前(P)，以及在第一次，第二次，第三次和第四次接种后3周分别收集血清。进行HTNV-，ANDV-，BCCV-，以及SNV特异的PRNT，并确定终点50％和80％的效价。B)对用pWRG/AND-M接种四次之前(放血前)和之后(接种后)收集的猴子CH69的血清，利用转染了pWRG/AND-M的细胞放射标记的裂解物，通过RIPA检测其中的G1和G2特异的抗体。人HPS-患者康复期血清(抗-ANDV人)被用作抗-ANDV抗体的阳性对照。分子标准(M)在左边表示成kDa大小，而G1，G2和约70kDa(同一性未知)大小的蛋白的位置表示在右边。C)每次接种后和第一次接种(0周)后的指定星期时，确定接种了pWRG/HTN-M(x)或pWRG/AND-M的猴子的NAb反应。CH64，CH85和CH69在第0，3，6和12周时接种，而猴子90BD25在第0，3，6和9周接种。HTNV的NAb效价(实线)或ANDV(虚线)通过PRNT进行确定。
图19：pWRG/HA-M质粒的示意图。通过PCR从pWRG/AND-M中扩增一个区域，并将其插入pWRG/HTN-M(x)的XbaI位点，构建成pWRG/HA-M。扩增的区域(利用了能创造XbaI位点的引物)包括CMV启动子，内含子A，外显子2，外源序列，安地斯病毒M5′-UTR，安地斯病毒M ORF，安地斯病毒3’-UTR以及BGH PolyA。对于别的缩写请参考前面的图。
详细介绍
在本申请中，介绍了用于个体接种防止汉坦病毒属病毒的组合物和方法。该方法包括将编码汉坦病毒属病毒抗原的DNA转移到个体的细胞中，使得抗原在细胞中表达，从而在个体中诱导免疫反应。
DNA疫苗接种涉及在体施用编码抗原的多核苷酸，从而在靶细胞中诱导生成正确折叠的抗原。将DNA疫苗导入细胞，将会促使和一种或多种病原菌蛋白相关的结构蛋白决定簇在细胞中表达。加工的结构蛋白将会和正常细胞的主要组织相容性复合物(MHC)抗原共同展示在转染细胞的表面。即便细胞介导的免疫不是防止感染的主要手段，它仍可能对解决已经发生的感染是重要的。此外，转染细胞表达的结构蛋白也可以被抗原呈递细胞获得，从而引发全身性的体液抗体反应。
为了获得要寻求的免疫反应，能引起接种个体的转染细胞表达一或多个主要的病毒抗原决定簇的DNA疫苗构建体是必需的。这可以通过如下方式来进行：确定病毒基因组中编码病毒糖蛋白或衣壳成分的区域，并将这种编码序列和能在受接种者细胞中表达其的启动子连接起来。此外，病毒基因组本身，或部分基因组也可以使用。
在一个实施方案中，本发明涉及到能编码汉坦病毒属病毒抗原的DNA或cDNA。汉坦病毒属病毒的意思是指任何能引起肾综合征出血热(HFRS)的汉坦病毒属病毒，如汉坦病毒(HTNV)，多布拉伐-贝尔格莱德病毒(DOBV)，普马拉病毒(PUUV)和汉城病毒(SEOV)以及能引起汉坦病毒属病毒肺症候群(HPS)的汉坦病毒属病毒，如辛诺柏病毒(SNV)，黑渠港病毒(BCCV)，长沼病毒(BAYV)，纽约病毒(NYV)，安地斯病毒(ANDV)，Laguna Negra病毒(LNV)，以及任何别的已知能在人类中引起疾病的汉坦病毒属病毒。
更具体一点，编码两种包膜糖蛋白(G1和G2)的汉坦病毒属病毒基因组M区段(SEQ ID NO：1)，以及编码核壳蛋白的S区段(SEQIDNO：2)从SEOV菌株SR-11(Kitamura，T等人，1983，Jpn.J.Med.Sci.Biol.36，17-25)病毒基因组(Arikawa，J等人，1990，Virology176，114-125)中推导出来。M区段(如SEQ ID NO：1中所示)，Genebank登录号是M34882，对应于汉城病毒(SR-11)M基因2-3602位核苷酸。S区段(在SEQ ID NO：2)，Genebank登录号是M34881，对应于汉城病毒(SR-11)M基因2-1699位核苷酸。
汉坦病毒(HTNV)编码G1/G2的M区段对应于汉坦病毒(菌株76-118)的2-3565位核苷酸，汉坦病毒M序列已经发表，登录号是M14627。安地斯病毒编码G1/G2的M区段对应于安地斯病毒菌株Chile-9717869的2-3671位核苷酸，这个序列的Genebank登录号是AF291703。
本发明也涉及到DNA或多核苷酸序列，它们包括别的汉坦病毒属病毒的M或S基因区段，含有保护性的表位或抗原决定簇。这种表位是具有构象的，包括G1和/或G2的序列，因为G1和G2的单克隆抗体表现出能中和病毒，并且在被动保护实验中能保护啮齿类动物。此外，N蛋白的氨基端具有高度的免疫原性，而且已经有人表示，别的用氨基端区域接种的方法能起保护作用(Lundvist，1996，同上，Ulrich，1998，同上)。
衍生的序列在物理形态上并不必衍生自核苷酸序列本身，而是通过任何方式产生，包括例如化学合成或DNA复制，或逆转录或转录，这些方法都是基于多核苷酸序列衍生区域的碱基序列提供的信息。此外，用本领域已知的方法对对应于标明序列的区域结合进行修饰，从而达到使用的意图。本发明的序列能用在诸如杂交实验和聚合酶链式反应(PCR)这样的诊断分析中，用来检测汉坦病毒属病毒。
通过RT-PCR来克隆SEOV菌株SR-11的M和S基因组区段，这种方法已经在前面介绍了(Arikawa等人，1990，Virology 176，114-125)。用BglII和BamHI将含有汉城病毒(SR-11)M基因2-3602位核苷酸序列的DNA片段从YMIS/SR11-M中剪切下来(Arikawa，1990，同上)。这个片段被连接到pWRG7077的BamHI位点，得到pWRG/SEO-M(SEQ ID NO：3)。pWRG/SEO-M含有额外的核苷酸，它衍生自克隆载体杆状病毒转移载体YMIS。
利用EcoRI从pBSK+/SR11-S(Arikawa，1990，同上)中剪切DNA片段，该DNA片段含有汉城病毒(SR-11)S基因2-1699位核苷酸。用Klenow酶将该区段的限制性酶切位点钝化，然后连接到用Klenow钝化的pWRG7077的NotI位点(由Wisconsin，Madison的Powderject公司提供)，获得pWRG/SEO-S(SEQ ID NO：4)。pWRG/SEO-S中含有衍生自克隆载体pBSKS+的额外的核苷酸。
HTNV M DNA疫苗质粒，pWRG/HTN-M(x)(SEQ ID NO：7)基本上是按下列方法构建的。首先，用BglII将编码HTNV G1/G2的DNA从pTZ19RHTNMm(Schmaljohn等人，1989，在：负链病毒的遗传学和病原性(Genetics and pathogenicity of negative strand virus)，D.Kolokofsky和B.Mahy编辑，58-66页，Elsevier出版社，Amsterdam)中剪切下来，并和用BamHI剪切的pWRG7077载体连接。这个质粒表达G2，但不表达G1。我们发现，如果介于载体NotI克隆位点和SEOVM非编码区(图9A)之间的一段长24碱基对(bp)的外源DNA序列(SEQ ID NO：6)被去掉的话，SEOV M质粒pWRG/SEO-M就不能有效地表达G1，于是我们解决了上面的问题。这段外源DNA是在更早的SEOV基因克隆和亚克隆程序中获得的。去掉了24bp序列的SEOVM构建体不能表达G1，但能表达G2(图9B)。如果将这段24bp的序列通过基因工程以正向，而不是反向重新连接到构建体体中，G2的表达能恢复(图9B)。这个结果表明核苷酸序列，而不是核苷酸数目能影响G1表达。为了绘制能有效表达G1的序列，我们构建了包括1-12位或13-24位核苷酸外源序列的载体。当1-12位核苷酸，而不是13-24位核苷酸出现在质粒中时，G1被表达(图9B)。我们注意到DNA 4-10位核苷酸(TCTGCAG)和内含子A的最后7个核苷酸(即剪切受体位点)完全一样(Stenberg等人，1984，J.Virol.49，190-199)。将推定的剪切受体二核苷酸AG突变成CC，并不能影响G1的表达，表明如果该区域参与了剪切，则并不依赖于保持内含子A剪切位点序列的确切性(图9B)。我们构建了含有外源DNA 1-8位核苷酸的载体，并且发现这能有效地恢复G1的表达(图9C)。因此，我们确定位于介于载体NotI位点和SEOV M基因的5′非编码区之间的序列GGATCTGC对于基于pWRG7077的DNA疫苗有效表达G1是必需的。
根据SEOV M中的发现，我们推定，DNA疫苗质粒中包括外源HTNV M基因上游序列使得我们能解决DNA疫苗质粒不能同时表达HTNV G1和G2的问题。我们构建了一个质粒，它包括外源HTNV M基因上游序列，而且如果我们这样做的话，我们获得了能表达G1和G2的克隆，pWRG/HTN-M(x)(图9D和图10)。当去掉外源序列，不能表达G1，而当恢复这段序列时，G1又能有效地表达(图9D)。这些数据证实了外源序列不仅对成功表达SEOV G1是必需的，而且对成功表达HTNV G1也是必需的。这个序列并不影响来自SEOV或HTNV的G2的表达(图9)。外源序列影响G1表达，但不能影响G2表达的机制现在并不明了。
为了构建基于ANDV M基因的DNA疫苗质粒pWRG/AND-M(SEQ ID NO：8)，从ANDV感染的Vero E6中分离病毒RNA，进行反转录。在反转录反应中，包括根据已发表的SNV和PUUV序列分别设计的正向和反向引物。正向引物包括一个NotI限制性位点(下划线)和M基因非编码区上游的24个核苷酸，这24个核苷酸就是我们以前发现的在pWRG/HTN-M表达G1时很重要的序列，这在上面已有介绍。纯化cDNA，并在PCR反应中作为模板。用NotI和BamHI酶切PCR产物，并把酶切产物和用NotI和BamHI酶切的pWRG7077载体连接，得到pWRG/AND-M。ANDV M基因的序列未知，因此，我们对M基因以及载体/插入连接处进行了测序。菌株Chile-9717869的ANDV全长M基因通过RT-PCR克隆到pWRG7077中，得到pWRG/AND-M。我们对整个M基因开放阅读框进行了测序。我们克隆的M基因的序列和已经发表的，Genebank登录号为AF291703的ANDV M基因序列几乎完全一样，这种情况并不奇怪，因为病毒分离株来自同一种啮齿类动物(Meisner等人，2002，Virus Res.89，131-143)。在序列中有两个腺嘌呤取代鸟嘌呤的变化。在位置1504的变化是沉默的，而在位置1840的改变却导致了苏氨酸取代597位的丙氨酸。
制备了同时含有汉坦病毒M基因和安地斯病毒M基因的构建体。将汉坦病毒M基因和安地斯病毒M基因克隆到pWRG7077中，得到pWRG/HA-M(SEQ ID NO：9，图19)。每个M基因的侧翼是巨细胞病毒启动子和内含子A(CMV内含子A)以及牛生长激素多腺苷酸化位点。整个汉坦病毒和安地斯病毒M基因开放阅读框以及绝大部分5’和3’非编码序列都包括在这个构建体中。此外，24bp序列位于每个汉坦病毒属病毒M序列和它们各自CMV内含子A序列之间。如上面所讨论的那样，我们发现，由于一些不明了的原因，这个24bp的序列(或者它的一部分)对于G1糖蛋白的表达是必需的。当pWRG/HA-M被导入哺乳动物细胞时，汉坦病毒和安地斯病毒M基因被表达。表达产物由汉坦病毒G1和G2糖蛋白以及安地斯病毒G1和G2糖蛋白组成。
在本领域可以理解，基因构建体中所用核苷酸序列上的某些变化对由该构建体编码的蛋白影响很小，或没影响，原因例如是遗传密码具有简并性。这种变化可能是由于沉默的点突变，也可能是点突变编码的不同氨基酸并不能显著改变编码蛋白的行为。也可以理解，去掉一部分编码区域，却不影响构建体体达到所需效果的能力，即诱导抗汉坦病毒属病毒的保护性免疫反应。在本领域可以进一步理解，可以采用一些有利的步骤，如修饰氨基酸组成来增加编码蛋白的抗原性。通过修饰编码这种蛋白的遗传序列，可以将这种变化导入氨基酸组成。值得思考的是汉坦病毒属病毒M和S区段的所有这些修饰和变异在本发明的范围之内都是等同的。
编码所需抗原的DNA可以任何合适的形式导入细胞，这些形式包括线性质粒，环形质粒，能复制的质粒，附加体，RNA等。把基因包含在质粒中是优选的。在一个特别优选的实施方案中，质粒是表达载体。能表达遗传物质的单个表达载体可以通过标准的重组技术获得。例如对于一般的克隆方法，请参看：Maniatis等人，1985，分子克隆：实验室手册或DNA克隆，第I和第II卷(D.N.Glover，编辑，1985)。
因此，在另一实施方案中，本发明涉及重组DNA分子，它包括载体以及上述的DNA序列。载体可以质粒的形式存在，如pCRII(Invitrogen)，或pJW4303(Konishi，E.等人，1992，Virology 188：714)或任何诸如病毒载体这样的表达载体，如腺病毒或委内瑞拉马脑炎病毒或别的本领域已知的病毒。在靶细胞中优选的是将可操作的启动子序列连接在DNA序列上。对于哺乳动物系统，已知若干这种启动子，为了使编码蛋白表达，启动子可以连接在编码序列的5’端，或上游。合适的启动子是人巨细胞病毒立即早期启动子。下游转录终止子，或多腺苷酸化序列，如牛生长激素基因的PolyA附加序列也可以加在蛋白编码序列的3’端。
用在本发明方法中的合适构建体是图1中的pWRG7077(4326bp)(PowderJect Vaccines公司，Madison，WT)。pWRG7077包括人巨细胞病毒(hCMV)立即早期启动子(IE)以及牛生长激素polyA附加位点。启动子和polyA附加位点之间是内含子A，它在天然情况下和hCMV IE启动子一起出现，当hCMV IE启动子出现在表达质粒中时，能增强转录。内含子A下游，介于内含子A和polyA附加序列之间的是唯一的克隆位点，汉坦病毒属病毒M或SDNA可克隆到其中。pWRG7077也包括能使细菌宿主细胞对卡那霉素具有抗性的基因。编码汉坦病毒属病毒G1和/或G2或核壳蛋白的任何区段都可以通过本领域已知的方法克隆到pWRG7077的一个克隆位点。
在进一步的实施方案中，本发明涉及稳定转化或转染了上述重组DNA构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞如杆状细菌或大肠杆菌，或真核细胞如糖酵母或毕赤酵母，或哺乳动物细胞或昆虫细胞。含有汉坦病毒属病毒序列的载体在细菌中表达，而表达产物用于诊断或作为疫苗。例如对于通用的克隆方法，请参看：Maniatis等人，1985，分子克隆：实验室手册或DNA克隆，第I和第II卷(D.N.Glover编辑，1985)。DNA序列可以出现在载体中，可操作地连接到高度纯化的IgG分子，佐剂，载体，或有助于汉坦病毒属病毒蛋白或肽纯化的试剂上。转化或转染的宿主细胞可以作为上述DNA序列的来源。当重组分子是表达系统时，转化或转染细胞可以作为DNA编码蛋白或肽的来源。DNA使用时可以是线形或环形的，或线性化的质粒，只要汉坦病毒属病毒序列可操作地连接在启动子上，而启动子可以在转染细胞中表达。
在本申请中，我们介绍了DNA疫苗针对汉坦病毒属病毒引发保护性免疫。DNA的转移方式可以是通过注射进入受体组织，口服或肺部给药，或者通过粒子轰击(即基因枪)接种。任何一种方法都可以转移DNA，只要DNA能被表达而且细胞能制造所需的抗原。本申请例举了两种方法，这两种方法都能在受接种者中成功地诱导保护性免疫反应。
为了通过粒子轰击转移DNA疫苗，我们选用了在1995年7月27日公开的WO95/19799中介绍的PowdererJect-XRTM基因枪装置。别的仪器都可以得到，而且本领域的人所熟知。这些仪器利用高速粒子轰击将包被了DNA的金珠直接转移到表皮细胞，和别的接种同样DNA的非肠道途径相比，它用更少量的DNA，能更有效地诱导体液和细胞介导的免疫反应(Eisenbraun，M等人，1993，DNA Cell.Biol.，12：791；Fynan，E.F.等人，1993，美国科学院院刊，90：11478；Haynes，J.R.等人，1994，AIDS Res.Hum.Retroviruses 10：Suppl.2：S43；Pertmer，T.M等人，1995，Vaccine 13：1427)。DNA候选疫苗进行表皮接种对于在免疫活性组织中的基因表达也有好处，免疫活性组织一般在15-30天脱落，而且它是蜱螫伤后病毒繁殖的重要天然聚集点(Bos，J.D.，1997，Clin.Exp.Immuno.107，Suppl.1：3；Labuda，M等人，1996，Virology219：357；Rambukkana，A等人，1995，Lab.Invest.73：521；Stingl，G.，1993，Recent Results Cancer Res.128：45)。
候选疫苗包括含有M基因组区段的粒子，M基因组区段含有G1和/或G2，来自一或多个不同的HFRS相关的病毒，如汉城病毒，汉坦病毒，普马拉型病毒和多布拉伐病毒，也来自一或多个HPS相关的病毒，如辛诺柏病毒，黑渠港病毒，长沼病毒，纽约病毒，安地斯病毒和Laguna Negra病毒或这些病毒的组合。来自不同病毒的DNA片段可以在不同的粒子上，也可以在同一粒子上，无论哪种都会导致所需的免疫反应。此外，本发明涉及的疫苗包括一或多个来自不同汉坦病毒属病毒的DNA。这种疫苗被称作多价疫苗。设计这种疫苗来防止由于暴露在一或多个汉坦病毒属病毒中而引起的病变。疫苗也可以和试剂结合，这种试剂能提高疫苗的抗原性，或降低它的副作用。
加速粒子基因转移或粒子轰击的技术的基础是将要转移到细胞中的DNA涂在很小的载体粒子上，该粒子比通过这个方法寻求转化的细胞要小。含有所需基因的DNA序列能在一种小的惰性粒子上简单地干燥。粒子可以由任何惰性材料组成，如惰性金属(金，银，铂，钨等)或惰性塑料(聚苯乙烯，聚丙烯，聚碳酸酯纤维等)。优选的粒子是由金，铂或钨组成。最优选的粒子是由金组成。合适的粒子是球形的，直径是0.5-5微米，优选的是1-3微米。
含有所需基因的DNA序列可以制备成适合基因导入的形式，能简单地在裸露的金或钨粒子上干燥。然而，这种形式的DNA分子具有相对短的稳定期，而且由于和粒子本身的金属或氧化底物的化学反应，DNA分子往往降解得十分迅速。因此，如果载体粒子首先用封装试剂包被，DNA链的稳定性会显著改善，而且即便是在几周的时间内，也不会显著降解。合适的封装试剂是聚赖氨酸(分子量200000)，它在DNA分子使用前用在载体粒子中。包括亚精胺在内的其他封装试剂，聚合的还是非聚合的，可以作为相似的封装试剂使用。聚赖氨酸在粒子中的应用方式是：用含0.02％聚赖氨酸的溶液冲洗金粒子，然后空气干燥或加热干燥，从而将粒子包被。一旦包被了聚赖氨酸的金属离子被合适地干燥，就可以将DNA链负载到粒子中。
DNA负载到粒子中的比率是每毫克金珠0.5-30微克DNA。DNA和金珠的优选比率是每毫克金珠0.5-5.0μgDNA。样品开始用γ射线照射(优选的是30kGy)乙烯-四氟乙烯共聚物小管。金粒子在微离心管中称重，加入大约0.5M亚精氨(游离碱)并混合，然后加入DNA。10％的CaCl2溶液和DNA一起培养大约10分钟，提供细的钙沉淀。沉淀物携带DNA到金珠上。将微离心管离心，沉淀重悬并用100％乙醇冲洗，终产物重悬在含有0.0025mg/ml PVP的100％乙醇中。然后把带有DNA的金粒子放在小管中干燥。
加速粒子基因转染的通用方法在授权给Sanford的美国专利No4945050中已有介绍。根据这种方法改进版本设计的仪器可以通过商业途径从Wisconsin，Madison的PowderJect Vaccines公司购买到，这在WO95/19799中介绍了。本申请上下文所引用的所有文件都以其全文被引作本发明的参考。简而言之，包被了DNA的粒子沉积在塑料小管的内表面，塑料小管被切成合适的长度，形成样品夹。将样品夹放在压缩气体的通道上(例如氦气，压力足以将粒子从弹药夹中驱逐出来，如350-400psi)。粒子被气流带走，然后朝着靶组织用足够的力量转移到组织的细胞中。进一步的详细说明可以从已经出版的仪器应用指南上获得。
包被的载体粒子通过物理方法加速飞向将要被转化的细胞，致使载体粒子射入靶细胞的里面。这种技术可以在体外细胞中使用，也可以在体内细胞中使用。以前已包被在载体粒子上的DNA以某种频率在靶细胞中表达。基因表达技术已经证明在原核和真核细胞，从细菌和酵母到高等植物和动物中都能发挥作用。因此，加速粒子的方法提供了一种方便的方法学，它可以将基因转移到范围更广的不同类型的组织细胞中，并提供了一种原位或体内转移基因到细胞中的能力，而不会对处理的个体有不利的影响或副作用。因此，加速粒子的方法也是优选的，因为它使得DNA疫苗能够针对特定的组织和某种组织的特定细胞层诱导免疫反应，只要分别改变转移位点和粒子加速的力量。这种技术因此特别适合将抗原蛋白的基因转移到表皮上。
为了在个体中获得所需的抗原反应，利用一种非入侵的方式将DNA疫苗转移到不同类型的易感组织中。最有利的是，基因疫苗可以导入表皮。已经发现，这种转移能产生一种全身性的体液免疫反应。
为了从这种技术中获得额外的效果和保证在接种个体中产生粘膜，体液和细胞免疫反应，将基因转移到粘膜组织表面也是需要的。有许多不同的可用的适合转移的位点，包括表皮，外周血细胞以及不同的口腔，上呼吸道，和生殖粘膜表面上任意数目的位点，外周血细胞即淋巴细胞，它们可以在体外处理，然后放回体内。
通过基因枪进行DNA免疫能使DNA直接转移到胞内，诱发更高水平的保护性免疫反应，而且比标准接种方法使用的DNA要少大约3个量级。
此外，基因枪转移使得在某个给定的表皮位点能精确地控制抗原产物的水平和形式，因为胞内DNA转移能通过系统性地改变转移的粒子数目和每个粒子中DNA的量来控制。对抗原产物水平和形式的精确控制使得控制产生的免疫反应的属性成为可能。
本发明使用的术语“转染”指的是整合了转移的外源DNA疫苗的细胞，而不管使用的转移技术。
本发明公开的是在DNA疫苗接种后，在诱导细胞，体液，和保护性免疫反应时，优选的靶细胞是表皮细胞，而不是更深层皮肤，如真皮的细胞。表皮细胞是优选的DNA疫苗的受体，因为这些细胞是身体中最容易进入的细胞，因此，可以非入侵的方式免疫。第二，除了能诱导体液免疫反应，DNA免疫的表皮细胞也能诱导细胞毒性反应，这种反应比表皮下细胞中产生的反应更强烈。向真皮转移也具有侵入少以及转移的细胞最终被身体脱落的优点。
尽管通过将遗传物质转移到靶动物中来诱导免疫反应是所需的，但仅仅证明免疫反应并不足以给动物提供保护性好处。重要的是获得一种保护性的免疫反应，这种反应显然和临床的形式有差异。换句话说，一种方法只要在它能降低疾病症状的严重性时才是有效的。在汉坦病毒属病毒攻击免疫种群后，抑制死亡的有效性至少能达到20％的免疫方法是优选的。对免疫种群死亡的抑制能达到50％或更大的有效性的免疫接种方法是更优选的，而最优选70-100％的有效性。本发明显示的免疫接种方法对汉坦病毒属病毒感染的仓鼠模型具有100％的有效性。仓鼠被广泛地用作实验室模型，选用来评估针对汉坦病毒属病毒的保护性免疫反应。相反，由于汉坦病毒属病毒的攻击，没有免疫的动物一律被感染。我们的结果表明用SEOV M基因组区段接种能防止汉城病毒，汉坦病毒(HTNV)和多布拉伐病毒(DBOV)感染。用HTNV M基因组区段接种能防止汉坦病毒，汉城病毒和多布拉伐病毒感染。用ANDV M基因组区段接种能防止ANDV，辛诺柏病毒和黑渠港病毒感染。用ANDV-M/HTNV-M区段接种能防止SEOV，HTNV，DBOV，ANDV，辛诺柏病毒以及黑渠港病毒等其他汉坦病毒属病毒的感染。
总之，施用的DNA疫苗数量是每剂大约1-8μgDNA，而且取决于将要处理的供试者，供试者免疫系统产生所需免疫反应的能力，以及所需保护的程度。将要施用疫苗的精确数量取决于从业者的判断，而对每个供试者和抗原是特殊的。
诱导免疫反应的疫苗能防止一或多种病毒，可以单剂量施用，或优选地以多剂量施用，在多剂量规程中，疫苗接种开始进程是1-8次单独剂量，在随后的时间间隔中使用的是其他剂量，时间间隔是保持或增强免疫反应所必需的，例如，在1-4个月是第2剂，而如果需要的话，若干月后，再施用随后的剂量。合适免疫规程的实施例包括：(i)0，1和6个月；(ii)0，7天和1个月；(iii)0和1个月；(iv)0和6个月，或别的足以诱导所需免疫反应，按预期那样提供保护性免疫反应，或减少疾病症状，或降低疾病严重性的免疫规程。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于实施本发明方法的试剂。这种试剂包括含有来自一或多个汉坦病毒属病毒的M或S或两个基因片段的DNA片段，以及小的惰性的密集的粒子。DNA片段和密集的粒子在上面已经介绍了。
DNA优选的是冷冻的或冻干的，而小的惰性的密集的粒子是干粉形式。如果使用了包被溶液，包被溶液的干燥成分可以预混合和提前测量，而且可以放在诸如小瓶或密封的包膜这样的容器中。
本发明也提供用来实施本发明的试剂盒。本试剂盒含有第一个容器，该容器中含有上述冷冻或冻干的DNA。该试剂盒也包括第二个容器，该容器中含有包被溶液或包被溶液中预混合和提前检测的干燥成分。该试剂盒也包括第三个容器，该容器中包括小的，惰性的，密集的粒子，这些粒子是干粉形式或悬浮在100％的乙醇中。这些容器可以由玻璃，塑料或金属薄片构成，可以是小瓶，瓶子，袋子，管子，包等。该试剂盒也包括书写的信息，如实施本发明的程序，或分析信息，如第一个容器中包含的试剂数量(例如DNA的摩尔数或质量数)。手写的信息可以在第一，第二和/或第三个容器中的任一个中，和/或与第一，第二，和第三个容器一起，单独放在第四个容器中。例如，第四个容器可以是盒子或包，而且包括第一，第二和第三个容器。
在另一个实施方案中，本发明涉及多克隆抗体，它来自接受了上述DNA疫苗的受接种者。术语“抗体”是本领域公知的术语，意思包括能结合已知抗原的分子或分子的活性片段。这些活性片段是通过许多技术从本发明的抗体中衍生而来的。为了进一步介绍分离抗体活性片段的通用技术，请参看Khaw，B.A等人，J.Nucl.Med.23：1011-1019(1982)。术语“抗体”也包括双特异和嵌合抗体。
下面实施例介绍的多克隆抗体的特征是用诸如ELISA，免疫沉淀，或免疫荧光试验时，能和合适免疫原，即G1和G2结合的抗体。此外，用噬菌斑降低中和试验(PRNT)检测抗体必须能中和汉坦病毒属病毒。任何保留了这些特征的抗体都和本发明有关。多克隆抗体可以浓缩，照射以及测验中和安地斯病毒和汉坦病毒等其他目的汉坦病毒属病毒的能力。具有足够高中和抗体效价的血清，即高到转移后足以在受体中检测到反应，可以被汇集。然后将产物冻干用于贮存和复溶。
如实施例中所更详细介绍的那样，本发明人发现，用含有诸如汉坦病毒或安地斯病毒这类汉坦病毒属病毒M区段的DNA疫苗免疫的受接种者的血清含有能中和汉坦病毒属病毒的抗体，并能在体外和体内展示中和汉坦病毒属病毒的性质。有意义的是，抗体的反应性适用于范围更广的不同的汉坦病毒属病毒，无论是HFRS汉坦病毒属病毒还是HPS汉坦病毒属病毒。
鉴于这些结果，本发明的多克隆抗体适合作为治疗用和预防用试剂，这些试剂用来治疗或预防易受汉坦病毒属病毒接触影响的供试者中汉坦病毒属病毒感染或疾病。供试者包括诸如小鼠或豚鼠这样的啮齿类动物，鸟或禽类，以及包括人在类的哺乳类动物。
总之，这种方法包括给可能在汉坦病毒属病毒中暴露的供试者或表示出汉坦病毒属病毒症状的供试者施用治疗或预防有效量的本发明多克隆抗体。抗体的任何活性形式都可以施用。本发明的抗体可以在任何系统中产生，包括昆虫细胞，杆状病毒表达系统，小鸡，兔，山羊，母牛，或植物，如番茄，马铃薯，香蕉或草莓。在这些系统中生产抗体的方法是本领域普通的技术人员所熟知的。优选的是，使用的抗体和受体物种是相容的，致使针对抗体的免疫反应不会在病毒得到控制之前将抗体清除掉，而且供试者中针对抗体诱导的免疫反应不会在供试者中诱导“血清病”。
患有汉坦病毒属病毒感染的个体的治疗可包括施用治疗有效量的本发明抗汉坦病毒属病毒的抗体。抗体可以在下面介绍的试剂盒中提供。在给患者提供能结合汉坦病毒属病毒的抗体，或抗体区段，或能防止患者受体感染汉坦病毒属病毒的抗体时，施用试剂的剂量根据患者的因素如年龄，体重，高度，性别，总的医疗情况，以前病史等来变化。
总之，给受体提供一剂抗体是所需的，尽管可以施用更低或更高的剂量，但抗体剂量的范围是1pg/kg-100pg/kg，100pg/kg-500pg/kg，500pg/kg-1ng/kg，1ng/kg-100ng/kg，100ng/kg-500ng/kg，500ng/kg-1μg/kg，1μg/kg-100μg/kg，100μg/kg-500μg/kg，500μg/kg-1mg/kg，1mg/kg-50mg/kg，50mg/kg-100mg/kg，100mg/kg-500mg/kg，500mg/kg-1g/kg，1g/kg-5g/kg，5g/kg-10g/kg(受体的体重)。
把防止汉坦病毒属病毒感染的抗体提供给受体供试者，数量足以减轻汉坦病毒属病毒感染症状。如果试剂的剂量，给药途径等足以影响这种反应，数量被说成足以“影响”感染症状的减轻。对施用抗体的反应可以通过分析供试者的生命征象来检测。
如果组合物的施用能被受体患者耐受，则说它是“可药用的”。如果这种试剂施用的数量具有生理意义，则说它是以“治疗有效量”施用的。如果一种试剂的存在能在受体患者中检测到生理变化，则说它具有生理意义。
根据已知的方法，可以将本发明的化合物配制成药用组合物，将这些材料，或它们的功能衍生物，和可药用的载体介质结合成混合物。合适的介质，以及它们的制剂，包括其他人蛋白，如人血清白蛋白，都在诸如Remington的《药物科学》(16版)(Osol，A编辑，Mack EastonPa.(1980))这样的出版物中被介绍了。为了形成药用可接受的组合物，适合有效地施用，这种组合物将包含有效量的上述化合物，以及合适数量的载体介质。
可以应用别的药用方法去控制作用的持久。通过使用多聚体来复合或吸收化合物来获得控释制剂。为了控制释放，通过选择合适的大分子(例如聚酯，聚氨基酸，聚乙烯，吡咯酮，乙烯-醋酸乙烯共聚物，甲基纤维素，羧甲基纤维素或硫酸鱼精蛋白)和大分子浓度以及掺入的方法可实施受控的转移。另一种由控释制剂控制作用持续时间的可能方法是将本发明的化合物整合到诸如聚酯，聚氨基酸，水凝胶，聚乳酸或乙烯-醋酸乙烯共聚物这样的多聚体材料粒子中。此外，也可以不把这些试剂整合到多聚体粒子中，而把这些试剂包埋在通过诸如界面聚合法制备的微胶囊，如羟甲基纤维素或明胶微胶囊以及聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊中，或者胶体药物释放系统如脂质体，白蛋白微球体，微乳剂，纳米微粒，以及纳米囊或巨大乳剂中也是可能的。这些技术在Remington′s Pharmaceutical Sciences一书中(1980)中公开了。
可以采用任何合适的方法包括肠道外注射(如腹膜内的，皮下的或肌肉注射)，蛋内(in ovo)注射鸟，口服或局部给药将抗体(典型的是包含在药用制剂中)施用在导气管表面这样的方法施用本发明公开的抗体。将抗体局部施用到导气管表面的实施方法是鼻内给药(例如利用点滴器，药签或吸入器，这些仪器都能在鼻内放置药用制剂)。将抗体局部施用到导气管表面的实施方法也可是吸入给药，如通过制造一种药用制剂的可呼吸粒子(包括固体和液体粒子)，该药用制剂含有以气溶胶悬浮液形式存在的抗体，然后使得供试者吸入可吸入粒子。药用制剂呼吸粒子给药的方法和仪器是众所周知的，而且任何常规的技术都可以使用。口腔给药的方式可以是可消化的液体或固体形式。
治疗可以是单剂量规程，或者优选的是多剂量规程，在多剂量规程中，初始疗程是单独的1-10剂，在随后的时间间隔中使用的是其他剂量，时间间隔是保持或增强免疫反应所必需的，例如，在1-4个月是第2剂，而如果需要的话，若干月后，可以施用随后的剂量。合适的治疗方案实施例包括：(i)0，1和6个月；(ii)0，7天和1个月；(iii)0和1个月；(iv)0和6个月，或别的足以诱导所需免疫反应，按预期那样减少疾病症状，或降低疾病严重性的方案。
本发明进一步涉及一种在疑似汉坦病毒属病毒感染样品中检测汉坦病毒属病毒的方法。方法包括，用本发明能结合汉坦病毒属病毒抗原的多克隆抗体接触样品，让抗体结合到汉坦病毒属病毒抗原上形成免疫复合物，检测形成的免疫复合物，并且使免疫复合物存在与否与样品中汉坦病毒属病毒存在与否相联系。样品可以是生物样品，环境样品或食物样品。
“检测形成的免疫复合物”这句话的意思包括发现样品中汉坦病毒属病毒抗原存在与否。利用免疫试验可以检测汉坦病毒属病毒抗原存在与否。许多用来检测和/或定量抗原的免疫试验都是本领域普通技术人员所熟知的。参看Harlow和Lane，抗体：实验室手册(冷泉港实验室，纽约1988，555-612)。这些免疫试验包括抗体捕捉试验，抗原捕捉试验和双抗体夹心试验。这些试验都是本领域普通技术人员通用的方法。在抗体捕捉试验中，将抗原吸附到固体支持物上，允许标记的抗体结合。冲洗后，通过检测固体支持物上保留的抗体数量来定量该实验。这个实验的一个变化是竞争性ELISA，在ELISA实验中，抗原结合在固体支持物上，而两种含有能结合抗原的抗体溶液，例如汉坦病毒属病毒受接种者的血清以及本发明的多克隆抗体，都被允许和抗原竞争性地结合。然后检测结合的多克隆抗体的量，然后可以确定血清中是否含有抗汉坦病毒属病毒抗原的抗体。这个竞争性ELISA实验结果可用来表示接种后，受接种者中已知的保护性表位的免疫性。
在抗原捕捉实验中，将抗体吸附到固体支持物上，允许标记的抗原结合。通过冲洗去掉未结合的蛋白，通过检测结合抗原的数量来定量该实验。在双抗体夹心试验中，一种抗体吸附到固体支持物上，允许抗原结合该第一种抗体。通过检测可结合抗原的标记第二个抗体的数量来定量该实验。
这些免疫试验典型的依赖于检测用的标记的抗原，抗体或第二种试剂。这些蛋白可以用放射活性化合物，酶，生物素或荧光染料标记。其中，放射活性标记几乎可以用在所有类型的实验中，而且有最多的变化。当放射活性必须避免或需要快速的结果时，酶联标记是特别有用的。生物素偶联的试剂通常用标记的链霉亲和素来检测。链霉亲和素能紧密和迅速地结合生物素，并且标记上放射性同位素或酶。荧光染料，尽管在使用时要求昂贵的设备，但它提供了非常灵敏的检测方法。用在这些实验中的抗体包括单克隆抗体，多克隆抗体，以及亲和纯化的多克隆抗体。本领域普通技术人员都知道别的合适的标记，它们可根据本发明来使用。利用本领域普通技术人员共同知道的标准技术可以将这些标记和抗体或抗体区段结合在一起。典型的技术在Kennedy，J.H.等人1976年的Clin.Chim.Acta 70：1-31)和Schurs，A.H.W.M.等人1977年的Clin.Chim Acta 81：1-40中介绍了。在后文中提到的偶联技术是戊二醛方法，高碘酸盐方法，二马来酰亚胺方法以及其他，所有这些方法都被引作本申请的参考。
“生物样品”这句话的意思包括生物材料，如细胞，组织，或生物流体。“环境样品”意思是指诸如土和水这样的样品。食物样品包括罐装品，肉等。
本发明另一方面是检测生物样品中汉坦病毒属病毒的试剂盒。试剂盒包括含有一或多个本发明多克隆抗体的容器，本发明多克隆抗体能结合汉坦病毒属病毒抗原，还包括抗体使用说明书，目的是将抗体结合到汉坦病毒属病毒抗原上形成免疫复合物，并且检测免疫复合物的形成，以致将免疫复合物的存在与否和样品中汉坦病毒属病毒的存在与否联系起来。容器的实施例包括多孔培养板，它使得能同时检测多个样品中的汉坦病毒属病毒。
所有在整个本申请中引用的参考文献的内容(包括文献参考，发表的专利，出版的专利申请和在审申请)专门在此引作本申请的参考。
本发明的其他特征将在下面示范性实施方案的介绍过程中变得更清晰，给出的这些实施方案是为了证明本发明，而不是有意限制本发明。
下列材料和方法都在下面实施例中使用了。
材料和方法
病毒，细胞和培养基
HTNV病毒株76-118(Lee等人，1978，J.Infect.Dis.137，298-308)，ANDV病毒株Chile-9717869(Hooper等人，2001，Virology 289，6-14)，BCCV(Rollin等人，1995，J.Med.Virol.46，35-39)，和SNV病毒株CC107(Schmaljohn等人，1995，Virology 206，963-972)都在Vero E6细胞中繁殖(Vero C1008，ATCC CRL 1586)。在COS细胞(COS-7；ATTC CRL1651)中进行瞬时表达实验。两种类型细胞都在37℃，5％CO2培养箱中培养，培养基是含有Earle氏盐的Eagle氏基础培养基(EMEM)，其中含有10％的胎牛血清，10mM，pH7.4的HEPES，以及抗生素(青霉素[100U/ml]，链霉素[100μg/ml]和硫酸庆大霉素[50μg/ml])(cEMEM)。
HTNV G2特异的单克隆抗体(MAbs)：MAb-23G10，MAb-11E10，MAb-3D7，MAb-16E6和MAb-HC02；HTNV G1特异的MAbs：MAb-2D5，MAb-6D4，MAb-8B6，MAb-3D5，以及MAb-10F11都在以前介绍了(Arikawa等人，1989，J.Gen.Virol.70，615-24，24)。MAb-HC02和MAbE606由J.McCormick博士提供(亚特兰大，疾病控制中心，Georgia，Ruo等人，1991，Arch.Virol.119，1-11)。
SEOV M和S裸露DNA质粒的构建：通过RT-PCR克隆SEOV病毒株SR-11的M和S基因组区段这种方法已经在前面介绍了(Arikawa等人，1990，Virology 176，114-125)。将代表每个基因组区段的cDNA亚克隆到以前介绍的裸露DNA载体pWRG7077的NotI或BamHI位点(Schmaljohn等人，1997，J.Virol.64，3162-3170)。根据制造商的说明书，用Qiagen maxiprep DNA纯化试剂盒(目录号12163，Qiagen)纯化质粒DNA。我们用于接种针肌内接种和表皮基因枪接种的DNA并不是通过无内毒素(endo-free)qiagen DNA试剂盒制备的，因此，该DNA并不是无内毒素的(Qiagen质粒试剂盒，每μgDNA产生～9.3内毒素单位[QIAGEN质粒纯化手册01.971])。为了控制内毒素可能的免疫刺激效果，我们用制备候选疫苗相同的方法精确地制备了阴性对照质粒DNA。
含汉坦病毒属病毒M基因的DNA疫苗质粒的构建。
用如下方式构建pWRG/SEO-M的修饰版本。
用聚合酶链式反应(PCR)从pWRG/SEO-M扩增SEOV M DNA，使用的正向引物是[引物0，5’-GCGCGCGGCCGCAGTAGTAGACTCCGCAAGAAAC(SEQ ID NO：10)]和反向引物[反向，5′-GCGCGGATCCCGGGTACCGGGCCCCCCCTCG(SEQ ID NO：11)]。用NotI和BamHI切割PCR产物，然后连接到用NotI-BamHI切割的pWRG7077中，得到pWRG/SEO-M(0)。
通过PCR从pWRG/SEO-M(0)中扩增SEOV M DNA，使用的正向引物是[引物1-24，5’GGCCGCGGCCGCGGATCTGCAGGAATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCA(SEQ ID NO：12)]，或[引物24-1，5’-GGCCGCGGCCGCGAGCACGGCTTAAGGACGTCTAGGAGTAGTAGTCTCCGCAAGAAACAGCA(SEQ ID NO：13)]，或[引物1-12，5’-GGCCGCGGCCGCATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCA(SEQ ID NO：14)]，或[引物13-24，5’-GGCCGCGGCCGCGGATCTGCAGGAAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCA(SEQ ID NO：15)]，或[引物1-24*，5’GGCCGCGGCCGCGGATCTGCCCGAATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCA(SEQ ID NO：16)]，或[引物1-8，5’GGCCGCGGCCGCGGATCTGCAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCA(SEQ ID NO：17)]以及反向引物BACK。用NotI和BamHI切割PCR产物，然后连接到用NotI-BamHI切割的pWRG7077中，分别得到pWRG/SEO-M(1-24)，pWRG/SEO-M(24-1)，pWRG/SEO-M(1-12)，pWRG/SEO-M(13-24)，pWRG/SEO-M(1-24*)，以及pWRG/SEO-M(1-8)。
为了构建pWRG/SEO-M(x)，通过PCR从pWRG/SEO-M中扩增编码SEOV G1/G2蛋白的DNA，使用引物1-24和反向引物[SEOMX，5′-GCGCGGATCCAGATTGGGAGATAGAAGAGAG(SEQ IDNO：18)]。用NotI和BamHI切割PCR产物，然后连接到用NotI-BamHI切割的pWRG7077中。通过去掉pWRG7077 BamHI和BglII位点之间不需要的克隆人造DNA(猿免疫缺陷病毒nef基因大约100个核苷酸)，构建该克隆。去掉该序列对克隆基因的表达没影响(数据没有表示出来)。
HTNV M DNA疫苗质粒pWRG/HTN-M的构建基本按如下方法进行。首先，用BglII将编码HTNV G1/G2的DNA从pTZ19RHTNMm中剪切下来(Schmaljohn等人，1989，同上)，并连接到用BamHI剪切的pWRG7077载体中。该质粒表达G2，但不表达G1(数据没有表示出来)。第二步，该质粒含有M基因5’末端的NotI-PshAI区段被剪切下来，并用PCR扩增的DNA(来自质粒pUC18，pUC18中含有全长HTNV M基因，该基因是通过反转录酶PCR从病毒RNA中克隆来的)取代，PCR使用的引物是1-24(参考上文)和反向引物[M5B，5’-TCAGGACTCCTGTCATGCAATAAGATCTC(SEQ ID NO：19)]。反向引物包括HTNV M基因中沉默的核苷酸变化，这种变化创造了一个用于诊断的BglII位点。用NotI和PshAI切割PCR产物，然后连接到用NotI-PshAI切割的pWRG7077中，得到pWRG/HTN-M。
利用引物1-24和反向引物[HTNMX，5’-GCGCGGATCCGTTTGTGGTTAGAAAGCTAC(SEQ ID NO：20)]从pWRG/HTN-M中扩增HTNV M基因，构建pWRG/HTN-M(x)。用NotI和BamHI切割PCR产物，然后连接到用NotI-BamHI切割的载体pWRG7077中。这个克隆和pWRG/HTN-M完全一样。然而，该基因3，非翻译区的一部分，以及NotI和BglII之间的载体序列被去掉了。
利用引物0和反向引物HTNMX，从pWRG/HTN-M(x)中PCR扩增HTNV M基因，构建pWRG/HTN-M(0)。用NotI和BamHI切割PCR产物，然后连接到用NotI-BamHI切割的pWRG7077中。
利用引物1-24和反向引物HTNMX，从pWRG/HTN-M(0)中PCR扩增HTNV M基因，构建pWRG/HTN-M(1-24)。用NotI和BamHI切割PCR产物，然后连接到用NotI-BamHI切割的pWRG7077中。
根据制造商的说明书，用Qiagen maxiprep DNA纯化试剂盒纯化质粒DNA。
为了构建含有ANDV M基因的DNA疫苗质粒pWRG/AND-M，根据标准方法，利用TRIzol(Invitrogen，Carlsbad，Calif)从ANDV感染的Vero E6细胞中分离病毒RNA。利用SuperscriptII反转录酶(Invitrogen)在50℃将该RNA反转录50分钟，然后在70℃培养15分钟使反转录酶失活。用RNaseH在37℃消化20分钟，去掉RNA。分别根据已经发表的SNV和PUUV序列设计的正向和反向引物包括在反转录反应中：正向引物[SN-Fj，5’-GGCC GCGGCCGCGGATCTGCAGGAATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCACGAAGAAGC(SEQ ID NO：21)]和反向引物[PUUM-R，5’-GCGC GGATCCTAGTAGTATGCTCCGCAGGAAC(SEQ IDNO：22)]。正向引物包括一个NotI限制性位点(下划线)和M基因非编码区上游的24个核苷酸，这24个核苷酸就是我们以前发现的在pWRG/HTN-M(x)中表达G1时很重要的序列。反向引物包括一个BamHI限制性位点(下划线)。用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化cDNA，并在PCR反应中作为模板。PCR反应包括SN-Fj和PUUM-R引物，以及Platinum Taq高保真DNA聚合酶(Invitrogen)：94℃，3分钟，一个循环，紧接着是30个循环，每个循化是94℃30秒，68℃8分钟。用NotI和BamHI切割PCR产物，然后连接到用NotI-BamHI切割的pWRG7077中，得到pWRG/AND-M(1.1)，迄今称作pWRG/AND-M(SEQID NO：8)。根据制造商的说明书，用Qiagen maxiprep DNA纯化试剂盒纯化质粒DNA。在构建这个质粒的时候，ANDV M基因的序列是未知的，因此我们利用引物步移技术和ABI 3100基因分析仪对M基因和载体/插入位点连接处进行了测序。
间接荧光抗体实验(IFAT)
IFAT是以前介绍的方法的修改(Kamrud等人，1995，Exp.Parasitol.81，394-403)。根据制造商的说明，利用Fugene6(BoehringerMannheim)，将1μg质粒DNA转染生长在12孔细胞培养板的15mm玻璃盖玻片上的COS细胞。转染后24小时，用PBS(pH7.4)冲洗盖玻片一次，用丙酮在室温下固定10分钟，然后和抗SEOV的多克隆抗血清(兔)或接种动物的血清反应。在含有3％胎牛血清(FBS)的PBS中稀释抗体，然后和转染细胞在37℃培养30分钟。用PBS冲洗盖玻片三次，并和生物素酰化的猴抗兔抗体在37℃培养30分钟，紧接着和稀释在含3％FBS的PBS中的链霉亲和素交联的荧光素(Amersham)，或荧光素标记的山羊抗仓鼠抗体反应(Kirkegaard &Perry实验室)。伊文氏蓝(Fisher)包含在二级抗体溶液中，作为复染剂。用PBS冲洗盖玻片三次，并且用去离子水冲洗一遍，然后放在玻片上荧光装片基质(DAKO)液滴中。用Zeiss Axioplan荧光显微镜观察细胞。
对于HTNV，仓鼠血清用含有3％FBS的PBS按1∶200稀释，然后和转染细胞在37℃培养1小时。用PBS冲洗盖玻片三次，并和荧光素标记的山羊抗仓鼠IgG抗体在37℃培养30分钟(Kirkegaard &Perry实验室)。赫斯特染色剂(1μg/ml)包含在二级抗体溶液中，作为复染剂。用PBS冲洗盖玻片三次，并且用去离子水冲洗一遍，然后放在玻片上荧光装片基质(DAKO)液滴中。用Nikon E600荧光显微镜观察细胞。
免疫沉淀
培养在T-25细胞培养瓶中的COS细胞经Fugene6(BoehringerMannhein)介导，用5-8μg质粒DNA转染。24小时后，表达产物用Promix([35S]-甲硫氨酸和[35S]-半胱氨酸，Amersham)进行放射性标记，然后根据前面介绍的方法进行免疫沉淀(Schmaljohn等人，1997，Emerg.Infect.Dis.3，95-104)。还原的样品在200V常压下，4-12％Bis-Tris SDSPAGE梯度胶上电泳，3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)做电泳缓冲液(NuPage)。
用基因枪接种
根据前面介绍的方法制备基因枪的弹夹(Eisenbraun等人，1993，DNA Cell Biol.12，791-797；Schmaljohn等人，1997，同上)。简而言之，将～1.5μgDNA沉淀到0.5mg的约2μm直径的金珠上(Degussa)。DNA包被的金珠被用来包被Tefzel小管的内表面(McMaster-Carr)。弹夹的制作方法是将DNA-金-包被的Tefzel小管切成约0.5英寸的小块，每一块含有～0.5mg的金，包被着～0.75μg的DNA(根据洗脱和荧光分析确定的结合在金珠上的沉淀DNA的～50％)。为了接种动物，用大剪刀去掉腹部的毛，根据以前介绍的方法(Pertmer等人，1995，Vaccine 13，1427-1430)，利用基因枪(Powderject-XR转移装置，Powderject Vaccine公司)将DNA包被的金珠施用到腹部表皮的不相重叠的部位。BALB/c小鼠(National Cancer Institute(国家癌症研究所))和远交的叙利亚仓鼠(Charles River)分别用2或4个弹夹在400p.s.i的氦气压下接种。这些研究根据Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals(实验室动物管理及使用指南)上介绍的方法进行(国家卫生研究院，1996)。这些设施已经被American Association for Accreditationof Laboratory Animal Care(美国实验室动物管理授权协会)充分授权了。
对于HTNV，制备基因枪弹夹(～0.5μg质粒DNA包被0.5mg金珠)，并且如上所述用基因枪接种远交的金黄色叙利亚仓鼠。仓鼠每隔3周接种3次。猕猴用接种仓鼠同样的弹夹和基因枪条件接种，然而，猴子每接种一次得给药8次，而不是4次。
根据第II期临床试验接种人的方法(McClain等人，2000，同上)，猕猴用重组的痘苗病毒rVV/HTN-M+S接种。用26G3/8英寸的针将疫苗(0.5ml PBS中有3.4×107PFU)皮下注射到右侧上臂。42天后，猴子左臂接受了完全一样的加强接种。
对于ANDV，质粒DNA沉淀在金珠上(每毫克金珠是3μg DNA)，然后将DNA包被的金珠包被在小管上。制备由包被在0.5mg金珠上的～0.75μg质粒DNA的基因枪弹夹，并将其贮存在4℃，使变干，直到使用时。在400p.s.i氦气压的情况下在刮剃的腹部表皮的非重叠部位叙利亚仓鼠用Powderject XR1粒子介导的表皮转移装置(基因枪)(Powerject Vaccines公司，Madison，Wis.)接种，每次接种要给药四次。猕猴用接种仓鼠同样的弹夹和基因枪条件接种，然而，猴子每接种一次得给药8次(4次在腹部，而4次在腹股沟淋巴结)。在不痛苦的基因枪接种过程中，仓鼠和猴子都得麻醉。唯一可见到的效果是在接种部位有轻微的红斑。
接种针肌内接种
用28.5号针头将悬浮在50μl PBS(pH7.4)中的质粒DNA(25μg)注射到麻醉了的小鼠腓肠肌中。
ELISA。为了检测SEOV G1和G2，将SEOV感染的Vero E6细胞裂解液(-Co照射(3000000拉德)失活的病毒)用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释，4℃过夜，然后涂在酶标板(Costar)上。用PBS，3％脱脂奶，0.05％Tween-20(封闭溶液)在37℃封闭酶标板1小时，然后用PBS，0.05％Tween-20(冲洗溶液)冲洗一遍。小鼠或仓鼠血清在封闭溶液中稀释，加到孔中，然后用前面的方法培养酶标板。用冲洗溶液冲洗酶标板4次，然后和在封闭溶液中稀释了1000倍的辣根过氧化物酶(HRP)交联的山羊抗小鼠抗体(目录号A-4416，Sigma)或稀释了2000倍的辣根过氧化物酶标记的山羊抗仓鼠抗体(目录号14-22-06，Kirkegaard & Perry实验室)培养1小时。同前面一样冲洗酶标板，然后和四甲基联苯胺底物(TMB，目录号50-76-04，Kirkegaard & Perry实验室)在室温共培养10分钟。加入终止溶液(目录号50-85-04，Kirkegaard & Perry实验室)终止呈色反应，并且确定450nm处的光密度(OD)。检测SEOV N特异抗体的方法是从以前介绍的技术中改编而来的(Elgh等人，1997，J.Clin.Microbiol.35，1122-1130)。利用pRSET质粒(Invitrogen)将SEOV(病毒株SR-11)核壳蛋白的1-117位氨基酸在大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)中表达成组氨酸标签的融合蛋白，并在Ni-NTA柱(Qiagen)上通过亲和层析进行纯化。用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释抗原，并将其加入96孔的微升板上(Maxisorp；NUNC)(每个孔中100μl缓冲液，含有0.2μg抗原)，然后在4℃培养过夜。用去离子水冲洗酶标板，并在室温下和封闭溶液培养30分钟。用去离子水冲洗酶标板后，将100μl血清(在封闭缓冲液中稀释，封闭缓冲液含有大肠杆菌抗原提取物[0.6mg/ml])加入完全相同的孔。酶标板在37℃培养1小时，然后又用以前的方法冲洗。加入HRP二级抗体，用上面介绍的方法，对SEOV G1-G2 ELISA进行呈色检测。终点效价被确定为最高的稀释度，这时的OD比阴性对照质粒(pWRG7077)接种的动物血清的平均OD加上3个标准差要大。用SEOV N抗原检测HTNV N特异的抗体，而用PUUV N来检测ANDV N特异的抗体。
噬菌斑减少中和试验(PRNT)。中和试验基本上是按以前介绍的方法进行(Chu等人，1995，J.Virol.69，6417-6423)。血清样品在cEMEM中稀释，然后和等量的含有～75PFU SEOV的cEMEM(111μl)结合。这种血清病毒混合物在4℃培养过夜，然后以200μl/孔的量加入6孔酶标板中，酶标板中含有3-7天大的Vero E6单层细胞。在37℃吸收1小时后，在每个孔中加入3ml含10％FBS的覆盖培养基(Earl氏基础培养基(EBME)，10mM HEPEs，0.6％琼脂糖[Sea Kem ME琼脂糖]，8mM L-谷氨酰胺，抗生素)和1×非必需氨基酸(GIBCOBRL)。酶标板在37℃培养7天，然后通过添加2ml/孔的含5％FBS和5％中性红溶液(GIBCO BRL)的覆盖培养基进行染色。酶标板在37℃培养2天后计数噬菌斑。实验前将血清样品加热灭活(56℃，30分钟)。在使用补体的实验中，血清和病毒在存在5％豚鼠补体(目录号ACL-4051，Accurate Chemical and Scientific Corporation)的情况下培养过夜。HTNV，SEOV，ANDV，以及BCCV PRNT在1周后用中性红染色，而PUUV，DOBV，以及SNV PRNT在9天后染色。染色后2-3天(37℃)计数噬菌斑。
用SEOV攻击。将稀释在0.2ml灭菌PBS(pH7.4)中的103PFU的SEOV用25号针通过肌内(近尾股)注射到仓鼠。103PFU剂量是根据以前发表的文章来定的，该文章报道用这样的剂量和途径攻击后，仓鼠会100％感染(Schmaljohn等人，1990，同上，Chu等人，1995，同上)。攻击后28天，将仓鼠麻醉，通过心脏穿刺进行抽血。通过IFAT，ELISA和PRNT评估攻击后血清中抗SEOV抗体的存在与否。攻击后病毒蛋白，而不是免疫原的抗体效价显著上升说明仓鼠被SEOV感染了。
对于HTNV和ANDV，通过ELISA评估攻击前和攻击后血清中N特异抗体的存在，并且通过PRNT评估中和抗体的存在。检测攻击后N特异抗体表明仓鼠被攻击的病毒感染。
HTNV的攻击剂量是2000PFU，这时大约1000LD50(未发表的数据)。ANDV的攻击剂量是2000PFU，这时大约250LD50。在生物安全4级(BSL-4)实验室做了一些涉及感染了ANDV的仓鼠的实验。在生物安全3级(BSL-3)实验室做了涉及感染了HTNV的仓鼠的实验，这时要戴着3M-RACAL兜帽，穿着TYVEK衣服。利用一种逻辑回归模型评估疫苗对残存结果的作用。利用SAS8.2版本(SAS Insitute Inc.SAS OnlineDoc，Version 8，Cary，NC2000)进行分析。
所有的动物研究都是根据实验室动物管理与使用指南中介绍的方法进行的(国家卫生研究所，Bethesda，MD，1996)。这种设施是由美国实验室动物管理授权委员会充分授权的。
交叉保护实验。用pWRG/SEO-M或阴性对照质粒(pWRG7707)接种仓鼠，每组仓鼠4-5只。在3周的间隔中，用基因枪给药(每次给药约1.5μg DNA)接种了4次。最后一次接种后3周，获得攻击前的血清样品，然后用1000PFU的汉坦病毒，1000PFU的多布拉伐病毒或1000-2000PFU的普马拉病毒攻击仓鼠。攻击后28天，获得攻击后血清样品。对攻击前和攻击后的血清样品进行评估，方法是通过抗NELISA检测核壳的抗体，通过汉坦病毒，多布拉伐病毒或普马拉病毒噬菌斑降低中和测验(PRNT)检测攻击病毒依赖的切除的中和抗体。
抗体注射。把人类HPS患者的恢复期的血浆冻干，重悬在水中，在使用前加入CaCl2至0.1M，在37℃培养4小时，然后在4℃过夜，最后在-20℃放置1小时进行重新钙化。将处理过的血浆解冻，在10000×G下离心20分钟，收集上清夜。将接种了DNA疫苗的猴血清和人血清(PEL-FREEZ，Biologics，Rogers，Ariz)加热灭活(56℃，30分钟)。用带25号，5/8英寸针头的1ml注射器将1ml血清或血浆以腹膜内(i.p.)给药的方式注射到仓鼠中。
实施例1
汉坦病毒属病毒基因的瞬时表达
表示SEOV病毒株SR-11M(SEQ ID NO：1)或S(SEQ ID NO：2)基因区段的cDNA被亚克隆到裸露的DNA表达载体pWRG7077巨细胞病毒立即早期启动子的下游，分别得到pWRG/SEO-M(SEQ ID NO：3)和pWRG/SEO-S(SEQ ID NO：4)(图1)。为了检测M和S构建体的表达，将这些质粒转染到COS细胞中，并对表达蛋白进行免疫染色或免疫沉淀。在和抗SEOV的多克隆血清一起培养的转染单层细胞中，出现了染色的细胞，表明pWRG/SEO-M和pWRG/SEO-S都表达了SEOV反应蛋白(图2A)。放射性标记的表达产物用抗SEOV的多克隆抗血清进行免疫沉淀，并用SDS-PAGE分析(图2B)。免疫沉淀的蛋白具有G1，G2和N所预计的表观分子量(80kDa，56kDa，以及48kDa)(Elliot等人，1984，J.Gen.Virol.65，1285-1293；Schmaljohn等人，1986，Virology 155，633-643)。其他表观分子量是约37kDa和约28kDa的蛋白条带和N蛋白共沉淀。这些多肽被N蛋白氨基端特异的单克隆抗体免疫沉淀，并且用Western印迹能检测出来，表明它们是截短形式的N蛋白(数据未表示)。
实施例2
用pWRG/SEO-M或pWRG/SEO-S免疫接种小鼠。为了确定是M构建体还是S构建体在小鼠中诱导抗体反应，用pWRG/SEO-M，pWRG/SEO-S或阴性对照质粒(pWRG7077)对10组6-8周大小的BALB/c小鼠免疫接种，采用了两种不同的接种方式：用基因枪接种表皮或用针注射腓肠肌。对小鼠进行初次接种，然后在4周的间隔中加强2次。每次接种前收集血样品，并且在最后一次加强后3周，用ELISA筛选SEOV特异的抗体反应。M构建体和S构建体用两种DNA给药途径都能诱导SEOV特异的抗体反应(图3)。用基因枪接种了SEOV S基因的大多数小鼠仅在一次接种后表示出特异的抗体，而在随后的免疫接种后抗体反应增加(图3B)。为了比较相对抗体反应，对终了血样品确定终点ELISA效价(表1)。与肌内接种任一构建体比较，基因枪接种导致较高的血清转化频率和几何平均效价(GMT)。
表1：在接种有SEOV裸露的DNA疫苗的小鼠中的ELISA效价
  接种的DNA   疫苗途径a   阳性/总数 终点效价范围     GMTb
  pWRG/SEO-M     g.g.     9/10     200-1600     303
  pWRG/SEO-M     i.m.     7/10     100-400     132
  pWRG/SEO-S     g.g.     10/10     6400-12800     7352
  pWRG/SEO-S     i.m.     9/10     800-6400     1213
备注：小鼠在4周间隔中接种3次。
在最后加强免疫后3周对采集的血清确定效价。
ag.g.表述基因枪；i.m.表示肌内接种针接种。
b组中所有动物的几何平均效价。
为了确定裸露的DNA接种是否引发中和抗体，本发明人对最后加强接种后3周采集的血清进行了噬菌斑减少中和测试(PRNT)。所有以基因枪接种有pWRG/SEO-M的小鼠(10/10)所显示的PRNT50％效价范围为40-1280(图4)。而仅有1/10的通过接种针注射接种有pWRG/SEO-M的小鼠显示出可检测的中和抗体反应(PRNT50％＝40)。通过基因枪或接种针注射接种有pWRG/SEO-S或pWRG7077的小鼠未发展中和抗体(图4)。
实施例3
对仓鼠进行接种和攻击。为了研究裸露的DNA汉坦病毒属病毒疫苗的保护性作用，用基因枪将pWRG/SEO-M，pWRG/SEO-S或阴性对照质粒pWRG7077接种到仓鼠中，每组5只仓鼠(对小鼠进行初次接种，接着在4周的间隔中加强2次)，然后在最后一次加强后6周用SEOV攻击。对接种前，攻击当天以及攻击后4周收集的血清样品进行IFAT，ELISA和PRNT。由于在成年啮齿类动物中没有汉坦病毒属病毒的疾病模型，我们评估了本发明的DNA疫苗是否能保护免受感染，而不是预防疾病。
IFAT和ELISA结果表明，接种前，没有仓鼠对SEOV G1-G2或N蛋白是阳性的(数据没有表示)。接种后(在攻击当天收集的攻击前血清)，根据IFAT结果(表2)，接种了pWRG/SEO-M的5只仓鼠都产生了抗G1-G2抗体，而5只接种了pWRG/SEO-S的仓鼠中有4只产生了抗N的抗体。除了5只接种了pWRG/SEO-M的仓鼠中仅有4只是抗SEOV ELISA的阳性之外，攻击前ELISA结果检测到了相似的抗体反应。根据IFAT和ELISA结果，攻击前，pWRG7077接种的仓鼠不能产生G1-G2和N蛋白特异抗体。
根据IFAT结果，攻击后，以前接种了pWRG/SEO-M的仓鼠血清样品对抗核壳抗体仍是阴性的，表明动物没被SEOV感染。相反，接种了pWRG/SEO-S和pWRG7077的仓鼠在攻击后，血清样品对G1-G2和N抗体都是阳性的，表明动物用SEOV攻击时受到了感染。攻击后的ELISA结果和IFAT结果相似，然而，5只接种了pWRG/SEO-M的仓鼠中有3只攻击后表示出弱的抗N反应，表明尽管IFAT结果是阴性的，仓鼠还是产生了针对攻击病毒的抗体。
接种前，没有仓鼠有SEOV中和抗体效价(数据没有表示)。接种后，所有接种了pWRG/SEO-M的仓鼠产生了中和抗体，PRNT80％效价范围是160-640(表2)。中和抗体在接种了pWRG/SEO-S和pWRG7077的仓鼠的攻击前血清中没有检测到。SEOV攻击后，pWRG/SEO-M免疫动物的中和抗体效价仍然基本上和攻击前一样(+/-2倍)。相反，pWRG7077和pWRG/SEO-S免疫动物的攻击后中和抗体效价显著上升，从小于20到介于1280和大于81920之间。
表2.接种了裸露的DNA疫苗的仓鼠的血清学反应和保护
     IFAT b PRNT 50％前                          后             保护
疫苗a     抗 -N     抗 -G1-G2
  仓鼠     前   后     前 后
pWRG/SEO-M     12345     -----   -----     +++++   +++++     320(20)320(40)320(20)80(＜20)640(20)   64064012801601280     是是是是是
PWRG/SEO-S     12345     ++++-   +++++     -----   +++++     ＜20(＜20)＜20(＜20)＜20(＜20)＜20(＜20)＜20(＜20)   ＞640＞640＞640＞640＞640     否否否否否
PWRG7077     12345     -----   +++++     -----   +++++     ＜20(＜20)＜20(＜20)＜20(＜20)＜20(＜20)＜20(＜20)   ＞640＞640＞640＞640＞640     否否否否否
a三次接种，每次接种都是在4周的间隔中施加4个基因枪弹夹(大约1.5μg/弹夹)。
b在IFAT中，利用转染了pWRG/SEO-S或pWRG/SEO-M的细胞作为靶抗原，按1∶200分别筛选血清中的抗N和
抗G1-G2。-表示没有反应性，+表示有反应性。
cPRNT值是能降低噬菌斑数50％时血清稀释度的倒数。在5％豚鼠补体存在的情况下进行试验。括弧中的
数字表示在补体缺乏的情况下，加热血清中的PRNT值。前：攻击前血清样品，是在攻击当天收集的；
后：攻击后血清样品，是在攻击后血清样品，是在攻击后4周收集的。
在本研究过程中，我们观察到如果血清被加热灭活(56℃，30分钟)，PRNT效价就会显著下降。为了测试中和活性是补体增强的可能性，我们在5％豚鼠补体存在下做了PRNT试验，并且发现添加补体能使加热血清的PRNT效价上升4-32倍(表2)。单独补体对SEOV噬菌斑数没有影响(数据没有表示)。
实施例4
用pWRG/SEO-M接种能交叉保护防止汉坦病毒感染
接种了pWRG/SEO-M的仓鼠在攻击前检测不到抗N抗体，而攻击后的抗N反应也检测不到或水平非常低(＜＝1∶200)(图6)。相反，接种了阴性对照质粒的仓鼠的抗N抗体显著增长(相对于背景有约2的指数倍增长)。PRNT结果表明，在4只接种了pWRG/SEO-M的仓鼠中有3只能检测到交叉中和抗体。这些仓鼠的PRNT效价攻击后不会上升。在一只检测不到(＜1∶20)汉坦病毒中和抗体的仓鼠中，PRNT效价确实上升了，然而，这种增长至少比接种了阴性对照质粒的仓鼠中观察到的至少低32倍。
用汉坦病毒攻击后，针对汉坦病毒结构蛋白的抗体效价增长较低或不增长(用ELISA和PRNT检测)，表明用汉城病毒M基因(pWRG/SEO-M)接种能防止汉坦病毒感染。
实施例5
用pWRG/SEO-M接种能交叉保护防止多布拉伐病毒感染。
接种了pWRG/SEO-M的仓鼠在攻击前检测不到抗N抗体，而攻击后的抗N反应也检测不到。相反，除了一只，所有接种了阴性对照质粒的仓鼠的抗N抗体显著增长(攻击后抗N效价在1∶200-1∶204800之间)。PRNT结果表明，在5只接种了pWRG/SEO-M的仓鼠中全部能诱发低水平的交叉中和抗体。这些仓鼠的PRNT效价攻击后不会上升超过1∶80。相反，所有接种了阴性对照质粒的仓鼠，除了一只外都表示出高的攻击后PRNT(1∶5120)，表明仓鼠被多布拉伐病毒所感染。现在还不清楚为什么#182号动物没被感染。
用多布拉伐病毒攻击后，多布拉伐病毒结构蛋白的抗体效价增长小或不增长(根据ELISA和PRNT检测结果)，表明用汉城病毒M基因(pWRG/SEO-M)接种具有保护作用，能防止多布拉伐病毒感染。
实施例6
用pWRG/SEO-M接种不能交叉保护防止普马拉病毒感染
用pWRG/SEO-M接种的仓鼠在攻击前检测不到抗N抗体。攻击后，除了一只外，所有仓鼠攻击后的抗N反应都要大于或等于1∶200，表明仓鼠被普马拉病毒感染。阴性对照质粒接种的仓鼠具有相似的攻击前和攻击后抗N效价。PRNT结果表明，尽管用pWRG/SEO-M接种能诱导抗汉城病毒的中和抗体(空的环)，但这些抗体并不能交叉中和普马拉病毒，并且不能防止感染。除了一只接种了阴性对照质粒的仓鼠没被感染外，pWRG/SEO-M接种和阴性对照质粒接种的仓鼠的攻击后普马拉病毒PRNT效价都是相似的(大于或等于1∶160)。现在还不清楚为什么#220号动物没被感染。
用普马拉病毒攻击后，多布拉伐病毒结构蛋白的抗体效价增长(根据ELISA和PRN检测结果)，表明用汉城病毒M基因(pWRG/SEO-M)接种没有保护作用，不能防止普马拉病毒感染。应该注意到仓鼠的最高攻击前抗汉城病毒PRNT效价是1∶640(#209动物)。动物攻击前中和抗体效价越高，它就越有可能起交叉保护作用，防止普马拉病毒感染。
讨论
我们报道了作为一种防止汉坦病毒属病毒的接种手段，裸露DNA具有美好的前景。本发明结果证明了用SEOV M或S基因组区段的cDNA接种能在BALB/c小鼠和叙利亚仓鼠中诱导抗体反应。用M区段，而不是S区段的DNA接种仓鼠，产生中和抗体，能防止SEOV感染。
在我们最初的免疫原性试验中，在BALB/c小鼠中，无论是pWRG/SEO-M还是pWRG/SEO-S，基因枪接种都会比接种针肌内接种导致更高的血清转化率，正如ELISA和PRNT所检测。这些预备试验数据促使我们将注意力集中到基因枪上，而不是通过肌内转移DNA。然而，因为只测试了一次肌内注射DNA剂量(每只动物25μg)，通过调整参数如注射DNA的量，注射位点，或疫苗接种规程是有可能增加血清转变率和/或效价的。也有可能针注射接种主要诱导的是针对DNA疫苗的细胞介导的，而不是体液介导的反应，这和通过别的方式所看到的一样(Feltquate等人，1997，J.Immunol.158，2278-2284，Robinson和Torres，1997，Semin.Immunol，9，271-283；Gregoriadis，1998，Pharm.Res.15，661-670)。
用pWRG/SEO-M通过基因枪接种能保护所有仓鼠免受SEOV感染，正如根据1)检测不到，或很少检测到攻击后抗N抗体反应和2)在SEOV攻击后基本不变的PRNT效价所测量的。尽管IFAT结果表明没有pWRG/SEO-M接种的仓鼠在攻击后产生了抗N抗体，但更灵敏的抗N ELISA结果表示3只仓鼠有弱的抗N抗体反应。因为这些仓鼠的攻击后抗N ELISA GMT(GMT＝50)比阴性对照pWRG7077接种的仓鼠(GMT＞3195)要低50多倍，因此可能抗N抗体的反应表示的是针对输入型SEOV抗原(没有复制)，或针对有限的感染(例如一轮复制)。PRNT数据提供了额外的证据，即用pWRG/SEO-M，而不是pWRG/SEO-S接种保护仓鼠免受SEOV感染。然而阴性对照pWRG7077接种的仓鼠PRNT效价在攻击后从＜20增加到10280和81920之间，pWRG/SEO-M接种的仓鼠PRNT效价保持在攻击前水平的2倍上。此外，pWRG/SEO-M接种的仓鼠的攻击后PRNT效价(GMT＝368)仍远低于接种了pWRG7077的仓鼠的攻击后PRNT效价(GMT＞27024)。接种了pWRG/SEO-S的仓鼠攻击后感染有SEOV。pWRG/SEO-S接种的仓鼠攻击后PRNT效价从＜20增加到2560和20480之间。尽管接种了pWRG/SEO-S的仓鼠攻击后PRNT效价高(GMT＝5885)，但值得注意的是这些效价要比接种阴性对照(pWRG7077)仓鼠攻击后效价(GMT＞27024)低约5倍。
不管有没有补体存在，接种了pWRG/SEO-S的小鼠和仓鼠中都不存在中和抗体反应，这和已经发表的数据即G1和G2蛋白，但不是N蛋白的单克隆抗体具有中和活性(Dantas等人，1986，Virology 151，379-384；Arikawa等人，1989，J.Gen.Virol.70，615-624；Schmaljohn等人，1990，J.Virol.64，3162-3170；Arikawa等人，1992，Arch.Virol.70，615-624)相一致，而且用表达G1和/或G2蛋白，而不是N蛋白的重组痘苗接种诱导中和反应(Pensiero等人，1988，J.Virol.62，696-702；Schmaljohn等人，1992，Vaccine 10，10-13；Xu等人，1992，Am.J.Trop.Med.Hyg.47，397-404，Chu等人，1995，同上)。
抗N免疫反应不能防止感染出乎意料，因为别人发现用在昆虫细胞，细菌细胞中表达的重组N蛋白或以嵌合的HBV核心粒子形式接种能防止感染(Schmaljohn等人，1990，同上；Yoshimatsu等人，1993，Arch.Virol.130，365-376；Lundkvist等人，1996，Virology 216，397-406；Ulrich等人，1998，Vaccine 16，272-280)。此外，用表达SEOV S区段的重组痘苗病毒接种能部分保护沙鼠免受SEOV感染(Xu等人，1992，同上)。在我们实验中用S区段的裸露的DNA接种不能保护仓鼠，这可能和定量，而不是定性缺陷有关。尽管5只接种了pWRG/SEO-S的仓鼠中有4只能产生可用IFAT和ELISA检测到的抗体反应，但效价相对较低(ELISA效价小于或等于1∶1600)。仓鼠，而不是小鼠中抗N抗体效价低的原因还不明了。这种过错不能归结于基因枪弹夹，因为在同一天用同一批样品接种了仓鼠和小鼠，而小鼠的血清转化率是90％，ELISA GMT超过7000。抗体效价低反映了用pWRG/SEO-S接种的仓鼠中并不全面的免疫反应，或者，有可能是用基因枪表皮施用S DNA，导致主要是细胞介导的，而不是体液介导的针对N的反应。不过，我们的发现证明了5只用基因枪接种了裸露的pWRG/SEO-S的仓鼠中有4只能检测到抗N的免疫反应，而这种反应，不管是体液介导的，还是细胞介导的都不足以防止SEOV感染。pWRG/SEO-S和pWRG7077接种的仓鼠攻击后PRNT效价有约5倍差异表明pWRG/SEO-S接种可限制SEOV感染。
我们发现如果血清被加热灭活(56℃，30分钟)，小鼠和仓鼠中诱导的SEOV中和活性降低4-32倍。如果豚鼠补体包括在PRNT，那么中和活性中的这种损失可以完全逆转。这些数据和下列别人报道的数据一致：人，小鼠尤其是大鼠血清中的汉坦病毒属病毒中和活性可以被补体增强(Takenaka等人，1985，Arch.Virol.84，197-206；Asada等人，1989，J.Gen.Virol.70，819-825)。补体在汉坦病毒属病毒中和中发挥了重要的作用，这种发现的意义重大，因为PRNT效价通常被用来评估免疫原性和预测汉坦病毒属病毒疫苗的效力。去掉或添加补体的条件，如加热灭活，或添加外源补体(例如作为纯化蛋白的级分或新鲜的动物血清)能改变PRNT效价，并且能改变候选疫苗的评估。
实施例7
HTNV M DNA疫苗G1和G2的表达
将表示HTNV M基因组区段的cDNA克隆到含巨细胞病毒(CMV)启动子的表达质粒pWRG7077中，获得pWRG/HTN-M。利用多克隆和单克隆抗体(MAbs)的放射性免疫沉淀实验(RIPA)表明无论G1还是G2都能在转染了pWRG/HTN-M的细胞中瞬时表达G1和G2蛋白(图8)。
早期开发功能性HTNV M DNA疫苗的努力没有成功(即表达G2，而不是G1)(数据没有发表)。我们解决了这个问题，我们发现如果位于载体NotI克隆位点和SEOV M非编码区的24bp大小的外源DNA序列(图9A)被去掉，我们的SEOV M质粒(pWRG/SEO-M)就不能有效地表达G1(图9A)。这段外源DNA是在更早对SEOVM基因进行克隆与亚克隆过程中产生的。去掉了24bp序列的SEOV M构建体不能表达G1，但能表达G2(图9B)。如果将24bp的序列以正向，而不是反向改造回构建体中，那G1的表达就会恢复(图9B)。这个结果表明核苷酸序列，而不是核苷酸数目，能影响G1表达。为了绘制能有效表达G1的序列图谱，我们构建了不同的载体，包括外源序列的1-12或13-24。当核苷酸1-12，而不是13-24出现在质粒中时，G1能被表达(图9B)。我们注意到4-10位核苷酸的DNA(TCTGCAG)和内含子A(即剪切受体位点)(Stenberg等人，1984，同上)的最后7个核苷酸完全一样。把推导的剪切受体二核苷酸AG突变成CC，并不影响G1的表达，表明如果该区域参与了剪切，则并不需要保持内含子A剪切位点序列的确切性(图9B)。我们构建了含有外源DNA 1-8位核苷酸的载体，并且发现这足以恢复G1的表达(图9C)。因此，我们确定位于介于载体NotI位点和SEOV M基因非编码区之间的序列GGATCTGC对基于pWRG7077的DNA疫苗有效表达G1是必需的。
根据SEOV M中的发现，我们推导DNA疫苗质粒中包括HTNV M基因上游外源序列使得我们能解决DNA疫苗质粒不能同时表达HTNVG1和G2的问题。我们构建了一种质粒，它包括HTNV M基因上游外源序列，而且如果这样做的话，就获得了能表达G1和G2的克隆，pWRG/HTN-M(图9D)。当去掉外源序列，不能表达G1，而当恢复这段序列时，G1又能有效地表达(图9D)。这些数据证实了外源序列不仅对成功表达SEOV G1也是必需的，而且对成功表达HTNV G1是必需的。这个序列并不影响来自SEOV或HTNV的G2的表达(图9)。外源序列影响G1表达，但不能影响G2表达的机制现在尚不明了。
实施例8
用pWRG/HTN-M接种能诱导中和抗体，并能保护仓鼠免受HTNV感染
为了确定HTNV M DNA疫苗质粒是否是免疫原性的，我们使用基因枪用pWRG/HTN-M(pWRG/HTN-M或pWRG/HTN-M(x)，参看方法)或阴性对照接种仓鼠。最后一次接种后3周，对仓鼠进行放血，通过溶菌斑减少中和试验(PRNT)检测中和抗体。在两个单独实验中，所有接种了pWRG/SEO-M疫苗的仓鼠产生了HTNV中和抗体反应(图11)。第一次实验中效价(PRNT80％)范围是20-1280，几何平均效价(GMT)＝104，而第二次试验分别是20-10240，GMT＝493。阴性对照组是血清反应阴性。因此，基因枪接种pWRG/SEO-M在仓鼠中是免疫原性的。
为了确定pWRG/HTN-M的保护性效力，我们使用了以前介绍的感染模型(Hooper等人，1999，同上)。该模型涉及用病毒攻击接种的仓鼠，而且4周后，利用血清学实验来检测感染。具体而言，如果一个攻击的仓鼠产生了针对汉坦病毒属病毒N蛋白(它不是疫苗的成分)的抗体，那这种仓鼠就被认为感染了病毒。另一方面，如果受到攻击的仓鼠不能产生N蛋白特异的抗体反应，那么这种仓鼠就没感染病毒(即防止了感染)。攻击后中和抗体反应增长超过4倍也用作感染的标记。
用2000噬菌斑形成单位(ID50大约是2个噬菌斑形成单位[PFU]，数据没有发表)的HTNV对接种仓鼠进行肌内(i.m)攻击。攻击后4周，收集血清样品，通过ELISA检测N蛋白特异抗体，而通过PRNT检测中和抗体。攻击前和攻击后抗N蛋白效价和PRNT效价表示在(图11)。所有接种了pWRG/HTN-M的仓鼠能防止感染，这是根据攻击后没有N蛋白特异的抗体反应所定义的。此外，攻击前和攻击后PRNT效价差异≤4倍。相反，所有接种了阴性对照质粒的仓鼠，无论它们是接种了阴性对照质粒pWRG7077，还是没有接种，都被感染，这是因为它们攻击后产生了N蛋白特异抗体和中和抗体。因此，基因枪接种pWRG/HTN-M(或pWRG/HTN-M(x))能防止HTNV的生产感染，甚至当攻击前效价PRNT80％低于20。
实施例9
接种了pWRG/SEO-M或pWRG/HTN-M能交叉保护，防止异型汉坦病毒属病毒的攻击
因为已确定了含有SEOV M和HTNV M基因的DNA疫苗能保护仓鼠免受同型病毒的感染，我们想确定这两种疫苗中的每一种是否能交叉保护防止HFRS-相关汉坦病毒属病毒的感染。我们首先测量了HFRS汉坦病毒属病毒感染仓鼠以及接种了SEOV M或HTNV M疫苗仓鼠血清的交叉中和活性(表3)。我们发现SEOV感染的仓鼠血清HTNV中和活性水平低，没有检测到DOBV或PUUV中和活性。HTNV或DOBV感染仓鼠血清表示了低水平的抗SEOV，DOBV和PUUV的中和抗体。PUUV感染的仓鼠不能中和HTNV或SEOV，而且很少能检测到DOBV中和活性。接种仓鼠血清比感染仓鼠血清的交叉中和活性要高。用pWRG/SEO-M或pWRG/HTN-M接种能诱导抗体反应，这种反应能中和SEOV，HTNV和DOBV，但不是PUUV。
表3.感染或DNA接种仓鼠血清的交叉中和活性
血清源a                                             PRNT
        SEOV            HTNV          DOBV        PUUV
    80％     50％     80％     50％     80％     50％     80％     50％
用SEOV感染b用HTNV感染用DOBV感染用PUUV感染用pWRG/SEO-M接种c用pWRG/HTN-M接种     640*20*512040     5120160320*1024080     *128020*3205120     805120160*3205120     *402560*160160     *3201024020320640     ***5120**     *204020480**
a同型效价至少160的4只仓鼠中有3只血清的总和。感染后4周或最后一次接种基因疫苗后3周收集血清。
b肌内注射了2000PFU所示病毒的仓鼠。
c用基因枪将所示DNA疫苗接种到仓鼠中，一共3次，间隔三周。
d PRNT值是能将所示病毒噬菌斑数中和80％或50％时血清稀释度的倒数。同型效价用黑体表示。
*，少于20的效价。
我们以前证明SEOV M DNA疫苗不仅能保护大多数仓鼠免受SEOV攻击，还能受HTNV攻击(Kamrud等人，1999，Virology 263，209-219)。为了证实这些发现，而且进一步评价SEOV M疫苗交叉保护防止别的汉坦病毒属病毒的能力，我们测试了pWRG/SEO-M对HTNV，DOBV，和PUUV的保护性效力。本研究的结果表明接种了pWRG/SEO-M的仓鼠能防止HTNV和DOBV，但不能防止PUUV，这是根据攻击后没有抗N蛋白抗体反应来确定的(图12)。大于160的同型PRNT80％效价能防止DOBV，小于80的效价能防止DOBV，但高达1280的效价不能防止PUUV(图12A，12B，12C)。一只接种了疫苗和一只对照仓鼠不能对PUUV攻击产生反应，可能是因为PUUV攻击剂量是10ID50，而其他病毒的攻击剂量是1000ID50(数据未发表)。
我们测试了pWRG/HTN-M交叉保护防止SEOV或DOBV的能力。结果表明用pWRG/HTN-M接种能诱导抗SEOV和DOBV的交叉保护免疫(图12D和12E)。小于640的同型PRNT80％效价和仓鼠防止SEOV感染相关，而小于320的效价能防止DOBV。我们没有测量接种pWRG/HTN-M防止PUUV感染的能力，因为我们发现SEOV基因疫苗并不能保护(图12C)，而且因为痘苗载体化的HTNV疫苗不能保护仓鼠免受PUUV感染(Schmaljohn等人，1995，Virology 206，963-972)。总之，这些数据表明用pWRG/SEO-M或pWRG/HTN-M接种能交叉保护防止四种HFRS相关汉坦病毒属病毒中的三种：SEOV，HTNV和DOBV。
实施例10
用pWRG/SEO-M或pWRG/HTN-M接种能诱导非人灵长类动物中高效价的中和抗体反应
用能表达SEOV M基因(Hooper等人，1999，同上)或HTNV M基因的质粒接种的数据表明这些疫苗可能在人中有效。作为临床开发这些疫苗的进一步，我们测试了它们在非人灵长类动物中诱导抗体反应的能力。用SEOV M基因疫苗接种两只猕猴，而用HTNV M基因疫苗接种三只猕猴。三只接种了表达不相关基因的pWRG7077的猕猴作为阴性对照，而三只接种了表达HTNV M和S基因的重组痘苗病毒rVV/HTN-M+S的猴子作为阳性对照(Schmaljohn等人，1992，Vaccine 10，10-13)。rVV/HTN-M+S以前表示能诱导HTNV特异的免疫性，包括仓鼠中的中和抗体(Chu等人，1995，J.Virol.69，6417-6423)以及诱导人中的中和抗体(Mcclain等人，2000，J.Med.Virol.60，77-85)。基因疫苗在3周间隔中给药3次。rVV/HTN-M+S给药的剂量和规程与人II期实验中使用的一样(即初次皮下接种，接着在第42天加强)。
第一次接种后3周，3只接种了pWRG/HTN-M(x)中的2只表现出了中和抗体(图13)。第二次基因枪接种后3周，所有接种了pWRG/SEO-M(x)或pWRG/HTN-M(x)的猴子都能检测到中和抗体。第三次接种后3周，所有接种了pWRG/SEO-M(x)或pWRG/HTN-M(x)的猴子的中和抗体效价惊人地高。阴性对照接种的猴子从不产生中和抗体(数据未示出)。接种rVV/HTN-M+S的猴子在一次接种后，不能产生中和抗体反应，但在第42天加强后都产生中和抗体。最后一次接种后3周，接种了pWRG/SEO-M(x)，pWRG/HTN-M(x)或rVV/HTN-M+S的猴子的PRNT80％GMT分别是905，2032和160。这些数据第一次表明了表达汉坦病毒属病毒M基因产物的疫苗在非人灵长类动物中是免疫原性的，并且能诱导相对高水平的中和抗体。
为了评估由基因疫苗和重组痘苗病毒疫苗诱导的免疫性的持续时间，分别在最后一次接种后2，4和6个月收集接种猴子血清，并且测试它的中和活性。最后一次接种后2个月，接种了基因疫苗的仓鼠血清的中和抗体效价下降了2-4倍(图14，表9和10)。在接种后4个月，接种了pWRG/SEO-M(x)或pWRG/HTN-M(x)的猴子的PRNT80％GMT分别等于160和80。接种后6个月，所有接种了pWRG/SEO-M(x)或pWRG/HTN-M(x)的猴子仍然可检测到中和抗体，PRNT80％GMT分别等于113和63。接种后8个月，接种了HTNV M基因疫苗的猴子(CH27)之一的PRNT80％效价小于20，然而，仍然可以检测到中和抗体反应，PRNT50％＝20。相反，接种了阳性对照疫苗rVV/HTN-M+S的猴子在最后一次接种后4个月，中和抗体水平很低或检测不到。
实施例11
用pWRG/SEO-M或pWRG/HTN-M疫苗接种非人灵长类动物能诱导交叉中和DOBV的抗体。
我们用PRNT测试了接种猴子血清的交叉中和活性(表4)。所有接种了pWRG/SEO-M(x)或pWRG/HTN-M(x)的猴子都具有交叉中和DOBV的抗体。接种了rVV/HTN-M+S的猴子也有DOBV交叉中和抗体，虽然效价更低。令人惊奇的是，接种了pWRG/SEO-M(x)的猴子HTNV中和抗体水平很低或检测不到，而接种了pWRG/HTN-M(x)的猴子SEOV中和抗体水平很低或检测不到。只有一只猴子(CH32号猴子)，它是用pWRG/SEO-M(x)接种，能检测到PUUV中和抗体。
表4.接种猴子血清的交叉中和活性
血清源a 猴子e                                     PRNTd
        SEOV          HTNV         DOBV        PUUV
    80％     50％     80％     50％     80％   50％     80％     50％
用pWRG/SEO-M(x)接种b用pWRG/HTN-M(x)接种b用rVV/HTN-M+S接种c     CH03CH32CH28CH02CH2762FCH21AA016     6401280******     12801280**20***     **2560512064040320320     *802560102401280160640320     40320*16080***   1606403203203208016020     ********     *40******
a最后一次接种后3周收集的猴血清。
b用基因枪在3周间隔中给猴子接种所示基因疫苗质粒3次。
c用重组痘苗病毒疫苗在42天间隔中2次皮下注射猴子。
d PRNT值是能将所示病毒噬菌斑数中和80％或50％时血清稀释度的倒数。
同型效价用黑体表示。
*，少于20的效价。
讨论
利用重组痘苗病毒和杆状病毒系统第一次完成了克隆HTNV V基因的瞬时表达(Pensiero等人，1988，J.Virol.62，696-702；Schmaljohn等人，1989，同上)。G1和G2蛋白都能表达，而且看起来和真的病毒蛋白具有完全相同的生化和抗原活性。利用痘苗病毒/T7RNA聚合酶表达系统，HTNVG1和G2也能在含有HTNV基因的质粒中表达，HTNV基因受T7启动子控制(Kamrud和Schmaljohn，1994，Virus Res.31，109-121)。然而当HTNV M基因被克隆到利用CMV启动子的质粒时，糖蛋白表达中出现了一些问题。在绝大部分情况下，用RIPA检测发现G2表达，G1不表达(数据没有表示)。例如，最近用在假病毒研究中的质粒pcHTN-M(Ma等人，1999，Virus Res.64，23-34)被认为能表达G1和G2，然而，我们实验室随后做的RIPA实验结果表明，只有G2被正确表达了(数据未发表)。可能是G1被表达了，但加工不正确(例如不正确折叠，从细胞分泌，靶向到细胞核，或导向降解)，或部分表达(例如被截短)。
我们发现在SEOV或HTNV M基因上游包括一段短的外源DNA序列，能使DNA疫苗载体pWRG7077表达G1。在pWRG7077中，CMV启动子后接的是内含子A。内含子A包括能增加克隆基因表达水平的元件(chapman等人，1991，Nucl.Acids.Res.19，3979-3986)。转录后，内含子A序列从RNA中被剪切掉，而剪切的转录本从细胞核转运到细胞质，在细胞质中，它被表达。我们假设，如果内含子A剪切异常，那么不知什么原因就会导致G1序列的破坏，于是在G1表达中就会观察到缺失，而G2表达正常。我们推测，位于内含子A和汉坦病毒属病毒M基因之间的异源序列，可能会抑制这种假设的异常剪切，使G1和G2表达正常。我们注意到外源序列中的7个核苷酸序列和内含子A剪切受体位点TCTGCAG完全一样，这种发现支持了这个假设(Stenberg等人，1984，同上)。然而，外源序列中推导的拼接受主的突变对G1表达没有影响(图9B)。这不能排除这种可能性，即别的剪切事件影响了质粒pWRG7077中G1的表达。阐明位于克隆的SEOV和HTNV M基因上游的一段短核苷酸序列，GGATCTG如何能够影响G1，但不是G2的表达，还有必要进一步的实验。不管机制如何，这种发现使得我们能开发一种抗HTNV的候选DNA疫苗。
以前对SEOV M基因疫苗研究的结果以及本发明报道的结果证明了HTNV M基因疫苗的免疫原性和保护性效力，强有力的情形是全长M基因可以用在抗别的汉坦病毒属病毒DNA疫苗中。现在还不清楚单独G1，单独G2，或糖蛋白的片段是否能诱导中和抗体以及防止感染。用只含G1或G2的重组杆状病毒感染细胞裂解物以及只表达G1或G2的重组痘苗病毒接种不能诱导中和抗体，并且在仓鼠感染模型中，表现出不完全的保护作用(Schmaljohn等人，1990，J.Virol.64，3162-3170)。这些数据表明能表达G1和G2的全长M基因对保护性免疫是必需的。相反，Bharadwai等人报道用含HPS相关汉坦病毒属病毒，辛诺柏病毒(SNV)M基因短区段(～166个氨基酸)的基因疫苗质粒通过针肌内注射小鼠，产生低水平的中和抗体(Bharadwai等人，1999，Vaccine 17，2836-2843)。这个发现表明，为了诱导中和抗体反应，不必全长的M基因，只要G1或G2的亚基被表达就可以诱导中和抗体。目前，我们正在做一些实验，设计来测试DNA疫苗诱导中和抗体以及保护仓鼠免受感染的能力，所述DNA疫苗只能表达HTNV G1，或G2或G1和G2的组合(在不同质粒中表达)。
现在已知至少有10种汉坦病毒属病毒能引起HFRS或HPS，因此关于汉坦病毒属病毒之间的交叉中和与交叉保护的信息对交叉保护疫苗的合理设计是重要的。调查者评估了用汉坦病毒属病毒感染的不同物种(包括人)血清交叉中和别的汉坦病毒属病毒的能力(Chu等人，1995，同上，Niklasson等人，1991，Am.J.Trop.Med.Hyg.45，660-665；Lee等人，1985，J.Clin.Microbiol.22，940-944；Lundkvist等人，1997，J.Med.Virol.53，51-59)。不同的物种，以及一个物种中的不同个体显示出不同水平的交叉中和抗体。总之，这些试验的数据表明HTNV，SEOV或DOBV感染的个体血清具有共同的交叉中和抗体，虽然血清型中效价有4倍的差异。然而，PUUV感染的个体血清表示出很低水平的SEOV，HTNV或DOBV交叉中和抗体，或没有抗体。我们从感染病毒或接种了DNA疫苗的仓鼠血清中获得的数据和更早的发现一致。我们观察到接种了DNA疫苗的仓鼠中收集的血清的交叉中和抗体比感染的仓鼠要高。这可能反映了接种DNA疫苗后诱发的抗体和感染诱导的抗体之间性质的差异，或者它只是简单地反映了抗体水平的数量差异。值得注意的是接种仓鼠中高水平的同型中和抗体并没必要和交叉中和活性相关(图12)。
对仓鼠血清池的交叉中和测试表明，如果中和抗体能预知保护性免疫反应的话，那用pWRG/SEO-M或pWRG/HTN-M接种可以防止SEOV，HTNV，但不会防止PUUV，并且我们发现这基本上都是真的。图12的数据表明交叉中和抗体的存在和保护性效果相关联，除了一个例外。仓鼠2119表示了交叉中和抗体，但并不受到保护，因为能检测到抗N蛋白的反应。然而，检测不到交叉中和抗体没必要预测缺乏保护。后一种情况的实施例可以在图12的仓鼠1437，1434，2122和2133中发现。有可能存在交叉中和抗体，但由于试验限制检测不到，或者非中和反应也是保护性的。
在本研究中，我们证明了用pWRG/SEO-M或pWRG/HTN-M接种能交叉防止SEOV，HTNV和DOBV。在别的试验中，汉坦病毒属病毒疫苗有交叉保护的能力。例如，表达HTNV G1，G2和N(rVV/HTN-M+S)的重组痘苗能交叉防止SEOV感染，但不能防止PUUV感染(Chu等人，1995，J.Virol.69，6417-6423)，而且表达SEOVG1和G2或N的重组痘苗能交叉防止HTNV(Xu等人，1992，Am.J.Trop.Med.Hyg.47，397-404)。本发明是第一次证明能防止DOBV的报道。
含有汉坦病毒属病毒M基因的DNA疫苗在猕猴中不仅能诱导阳性反应，而且能诱导相对高水平的中和抗体。当我们将三次接种SEOV和HTNV M基因疫苗的猕猴的血清学数据结合时，PRNT80％GMT是1470。这种中和抗体反应几乎比重组痘苗病毒疫苗诱导的大10倍，重组痘苗病毒疫苗诱导的中和抗体反应PRNT80％GMT＝160，PRNT50％GMT＝320。rVV/HTN-M+S中和抗体反应和以前报道的人的中和抗体反应PRNT80％＝160相似(McClain等人，2000，同上)。施用给人的灭活的汉坦病毒属病毒疫苗也能按常规方式诱导效价为～100的中和抗体(Yu等人，1999，在：Factors in the Emergence and Control ofRodent-borne Viral Diseases(Hantavirus and Arenal Diseases)(啮齿类病毒疾病(汉坦病毒属病毒和肾上腺疾病)出现和控制因子)，J.F.Saluzzo和B.Dodet编辑，157-161页。Elsevier出版社，巴黎；Zhu等人，1994，Chinese Med.J.107，167-170)。
我们发现接种猴子的中和抗体水平在最后一次基因枪接种后的数月中下降。然而，即便是在6个月后，中和抗体仍然可以在接种了pWRG/SEO-M(x)或pWRG/HTN-M(x)的所有猴子中检测到。比较而言，接种了rVV/HTN-M+S的猴子在4个月后检测不到中和抗体(图14)。
在中国，已开发了若干抗汉坦病毒属病毒的灭活病毒疫苗，并已在人体中进行了测试，PRNT实验被用来评估疫苗的潜能(Zhu等人，1994，同上，Yu等人综述，1999，同上)。绝大部分从细胞培养物中制备的灭活病毒疫苗在三次剂量后，在90-100％的受接种者中能诱导中和抗体，GMT≤100。血清反应阳性的速率在最后一次加强后6个月降低到～50％，但通过施用加强接种可以得到恢复。尽管在亚洲开发的汉坦病毒属病毒疫苗根据效力而言表示出了很好的前景，但我们还要努力开发重组的汉坦病毒属病毒疫苗，这种疫苗要避免已根植于灭活病毒疫苗中的安全担忧。此外，我们相信利用受接种者细胞内必须表达G1和G2(例如DNA疫苗)，而不是外源蛋白(如和佐剂结合的β-丙内酯处理的病毒粒子)这样一个疫苗平台，可能诱导更猛烈的中和抗体反应。在接种了DNA疫苗的猴子中诱导高水平的中和抗体反应表明高水平的中和抗体可以通过疫苗方法达到。
实施例12
pWRG/HTN-M(x)能部分防止致命的ANDV攻击。我们以前证明了本发明的基于HTNV M基因的DNA疫苗，pWRG/HTN-M(x)能交叉防止四种导致HFRS的汉坦病毒属病毒中的三种。为了确定这种疫苗能否防止引起HPS的汉坦病毒属病毒，我们用pWRG/HTN-M(x)或阴性对照质粒在3周的间隔中接种了仓鼠3次，然后在最后一次接种后3周用ANDV攻击(250LD50，肌内注射)。做了两个独立的试验，组合的结果如图15所示。除了一只仓鼠外，该疫苗能在其余所有仓鼠中诱导HTNV NAb(50％中和几何平均效价[GMT]＝226；范围＜20-5120)。除了一个例外(#514，效价＝20)，检测不到ANDV交叉NAb。攻击后，24只接种了pWRG/HTN-M(x)的仓鼠中死了15只，而15只接种了阴性对照质粒的仓鼠中死了14只。两组的平均死亡天数都是13。因此，由pWRG/HTN-M(x)接种对致命ANDV攻击的防止没有统计学意义，但有启发性(P＝0.0569)。从攻击中幸存下来的仓鼠用ANDV重新攻击，保证它们暴露在病毒中。至少一只动物(ID#504)在两次连续的攻击后没有抗体反应，但明显能防止致命疾病。
实施例13
表达G1和G2的基于ANDV M基因的DNA疫苗。因为我们实验中pWRG/HTN-M(x)提供的保护水平仅有38％，我们努力构建一种含ANDV M基因的DNA疫苗。ANDV病毒株Chile-9717869的全长M基因通过RT-PCR克隆进pWRG7077中，得到pWRG/AND-M(SEQ IDNO：8)。我们将整个M基因开放阅读框进行了测序。我们克隆的M基因的序列几乎和已经发表的Genebank登录号是AF291703的ANDV的M基因序列一样，这并不令人惊奇，因为不同的病毒分离株是来自同一种啮齿类动物标本(Meissner等人，2002，Virus Res.89，131-143)。有两个腺嘌呤变成了鸟嘌呤。在位置1504上的变化是沉默的，而在1840上的变化却导致在597位氨基酸以丙氨酸取代了苏氨酸。
通过RIPA来评估转染COS细胞中G1和G2的表达。从康复HPS患者中收集的血清免疫沉淀多肽，该多肽和pWRG/AND-M转染细胞或ANDV感染细胞中的G1和G2的预测大小一样(图17A-B)。表达产物的大小和别的汉坦病毒属病毒G1和G2的大小一样，G1的范围是68-76kDa，而G2的范围是52-58kDa(Schmaljohn和Hooper，2001，在：Fields Virology(病毒学领域)，第4版，Lippincott，Williams，和Wilkins，Philadelphia，PA，1581-1602页)。我们假设在ANDV感染细胞，而不是pWRG/AND-M转染细胞中，～46kDa蛋白是ANDV核壳蛋白。为了证实这个多肽是G1和G2，我们筛选了一系列的HTNV G1和G2特异的MAbs免疫沉淀ANDV糖蛋白的能力，糖蛋白来自转染了pWRG/AND-M或pWRG/HTN-M(x)细胞。我们不能确定和ANDV G1蛋白交叉反应的HTNV G1特异的MAbs，MAb-2D5，MAb-6D4，MAb-8B6(图17C)，MAb-10F11，或MAb-3D5(数据未表示)。HTNV G2特异的MAb-23G10，MAb-16E6和MAb-HCO2不能免疫沉淀ANDVG2，然而，HTNV G2特异的MAb-3D7却能免疫沉淀pWRG/AND-M转染细胞的ANDV G2蛋白(图17C)。根据推断，我们得出结论：迁移在69kDa分子标准之下的蛋白是被HPS患者血清，而不是被G2特异的MAb-3D7免疫沉淀的，该蛋白就是ANDV G1蛋白。～70kDa蛋白的身份仍然未知。
实施例14
pWRG/AND-M基因疫苗在仓鼠中既不能产生免疫原性，也不能起保护作用。为了测试pWRG/AND-M的免疫原性，我们在3周的间隔中用基因枪将24只仓鼠接种了3次，收集血清样品，通过PRNT测试NAb。检测不到ANDV特异的NAb(没有表示数据)。在同一天接种了pWRG/HTN-M(x)的仓鼠确实产生了效价高达10240的HTNV特异的NAb(没有表示数据)。为了确定用pWRG/AND-M接种是否能诱导ANDV G1或G2特异的非中和抗体，我们用转染了pWRG/AND-M的细胞进行了IFAT。从有代表性的接种了pWRG/AND-M的仓鼠血清中检测不到抗G1或G2的抗体，但在以前感染了ANDV的仓鼠血清的阳性对照样品中能检测到抗体(数据没有表示)。我们在第二组7只仓鼠中重复了整个接种试验，又没检测到NAb反应(数据没表示)。因为存在一种可能性，即用pWRG/AND-M接种能诱导非体液的，但仍然是保护性的免疫反应，我们用250 LD50的ANDV在第一次实验中攻击了8只仓鼠，而第二次试验攻击了7只仓鼠。14只接种了pWRG/AND-M的仓鼠中有12只患了HPS，并死亡。8只未接种的仓鼠中有6只患了HPS，并死亡。接种和未接种组的平均死亡天数介于12和13之间。从这些否定数据中，我们得出结论pWRG/AND-M在叙利亚仓鼠中没有免疫原性。
实施例15
pWRG/AND-M在猕猴中能诱导高效价的NAb反应。为了确定pWRG/AND-M在仓鼠中缺乏免疫原性是否是种属特异的现象，我们在猕猴中测试了这个质粒。在3周的间隔中，用基因枪对编号为ID#CH69的猴子进行4次pWRG/AND-M接种。两只接种了pWRG/HTN-M(x)的猕猴作为阳性对照，我们以前显示pWRG/HTN-M(x)在非人灵长类动物中具有免疫原性。在每次接种前收集血清，然后在第四次接种后3周测试HTNV和ANDV NAb的存在(图18A，C)。接种了pWRG/AND-M的CH69猴子以及接种了pWRG/HTN-M(x)的阳性对照猴子在第二次接种后产生NAb反应，而第四次接种后NAb效价异常地高(图18A，C)。
我们测试了接种猴子血清和别的HPS相关汉坦病毒属病毒交叉中和的能力。接种了pWRG/AND-M，但没有接种pWRG/HTN-M(x)的猴子血清能中和SNV和BCCV(图18A)。接种了pWRG/AND-M或pWRG/HTN-M(x)的猴子血清不能分别交叉中和HTNV或ANDV。
接种前和接种后(最后一次接种后6周)，收集CH69猴子的血清，并且通过RIPA测试免疫沉淀ANDV糖蛋白的能力。接种后，但不是接种前血清免疫沉淀蛋白和人康复期血清免疫沉淀的蛋白相似：一条强烈的G2带，一条弱的G1带，以及一条未知身份的～70kDa带(图18B)。
为了证实pWRG/AND-M接种在猕猴中是免疫原性的，我们在3周的间隔中对第二只动物接种了四次。这只猴子(ID#90BD25)在第二次接种后能产生5120的PRNT50效价，而在第四次接种后3周能产生10240的效价(图18C)。因此，pWRG/AND-M在非人灵长类动物中诱导高效价Nab的能力是可重复的。
为了看看接种了HPS或HFRS DNA疫苗的猴子的NAb反应的持续时间，定期性地收集血清样品约6个月。接种了pWRG/AND-M的猴子在接种最后一次疫苗后20和25周仍然分别具有320(ID#90BD25猴子)和2560(ID#CH69猴子)的PRNT50效价(图18C)。两只接种了pWRG/HTN-M(x)的阳性对照猴子在最后一次接种后25周仍然具有同源的PRNT50效价(640)。
实施例16
双构建体能防止HTNV和ANDV感染。制备含汉坦病毒M基因和安地斯病毒M基因的载体。将汉坦病毒M基因和安地斯病毒M基因克隆到pWRG7077中，获得pWRG/HA-M(SEQ ID NO：9)。每个M基因的侧翼是巨细胞病毒启动子和内含子A(CMV内含子A)以及牛生长激素多腺苷酸化位点。整个汉坦病毒和安地斯病毒M基因开放阅读框以及绝大部分5’和3’非编码序列都包括在这个构建体中。此外，24bp序列位于每个汉坦病毒属病毒M序列和它们各自CMV内含子A序列之间。如上面所讨论的那样，我们发现，由于一些不明了的原因，这个24bp的序列(或者他的一部分)对于G1糖蛋白的表达是必需的。
当pWRG/HA-M被导入哺乳动物细胞时，汉坦病毒和安地斯病毒M基因被表达。表达产物由汉坦病毒G1和G2糖蛋白以及安地斯病毒G1和G2糖蛋白组成。
测试了汉坦病毒/安地斯病毒双M基因疫苗pWRG/HA-M在猕猴中的免疫原性。疫苗能诱导中和汉坦病毒和安地斯病毒的抗体反应(参看表8)。在一个单独的仓鼠实验中，我们发现这个质粒和安地斯病毒质粒相似，因为它在仓鼠中不能诱导抗体反应。然而，它能在猴子中诱导中和抗体的事实说明它能在人中诱导中和抗体。这是第一个被设计来防止所有能引起严重疾病的汉坦病毒属病毒，包括HRPS相关的和HPS相关的病毒的DNA疫苗。
实施例17
在攻击前一天从接种了pWRG/AND-M猴子中被动转移它的血清能延迟或预防仓鼠中的HPS。因为已经成功地用HPS基因疫苗接种了猕猴，我们现在感兴趣的是确定由这种疫苗所诱导的NAb反应是否能保护仓鼠免受致命ANDV感染。为此，接种了pWRG/AND-M的猴子血清，或接种了阴性对照质粒的猴子的血清被注射到了4个一组的仓鼠中。第二天用ANDV(250 LD50，肌内注射)攻击仓鼠，并且每天观察，持续4周。所有接受了含ANDV NAb的血清的仓鼠都幸存下来了，而所有接受阴性对照血清的仓鼠在攻击后10-13天都死亡(表5)。对攻击当天(0天)以及28天时幸存的仓鼠中收集的血清样品进行PRNT。注射了ANDV PRNT50效价为20480的保护性猴血清后，仓鼠在攻击时的PRNT50效价是320-1280。四周后，和ELISA检测的结果一样，这些仓鼠检测不到NAb和核壳特异的抗体。因此，这些仓鼠不仅幸存下来，而且这些数据表明它们对来自攻击的感染具有无菌免疫。
在第二个实验中，接种了pWRG/AND-M(ANDV PRNT50效价＝640)的猴子的不同血清池被注射到四只仓鼠中。用接种了阴性对照质粒的猴子血清注射仓鼠作为阴性对照。用ANDV(250 LD50，肌内注射)攻击仓鼠，并每天观察，持续14周。如预料的那样，注射了阴性对照猴子血清的仓鼠都会产生HPS，并在10-14之间死亡(表5)。然而，在第一个实验中，所有注射了来自接种pWRG/AND-M猴子的血清的仓鼠都被无菌保护，在第二个实验中，这些仓鼠中的两只在第23天死亡，而剩余的两只在第40天死亡。总之，前面提到的实验表明，在攻击前一天对接种pWRG/AND-M的猴子的血清进行被动转移能无菌保护仓鼠免受致命的ANDV攻击，或显著迟缓疾病的开始和死亡。
表5：把接种了pWRG/AND-M的猕猴的血清在攻击前和攻击后被动转移到仓鼠
                    抗体                                                          终了放血f                      保护率％
 仓鼠ID#     来源a  注射日b    第0天的PRNT效价c   攻击病毒d 死亡日e   PRNT效价g   ELISA效价h   死亡率   感染率i
 905     AND-M   -1     320   ANDV     -   ＜20   ＜100     50     50
 906   -1     640   ANDV     -   ＜20   ＜100
 907   -1     320   ANDV     -   ＜20   ＜100
 908   -1     1280   ANDV     -   ＜20   ＜100
 105   -1     20   ANDV     23   na   na
 106   -1     40   ANDV     23   na   na
 107   -1     20   ANDV     40   na   na
 108   -1     20   ANDV     40   na   na
 901     (-)   -1     ＜20   ANDV     12   na   na     0     0
 902   -1     ＜20   ANDV     13   na   na
 903   -1     ＜20   ANDV     10   na   na
 904   -1     ＜20   ANDV     13   na   na
 101   -1     ＜20   ANDV     10   na   na
 102   -1     ＜20   ANDV     14   na   na
 103   -1     ＜20   ANDV     10   na   na
 104   -1     ＜20   ANDV     11   na   na
 909     AND-M    3     ＜20   ANDV     -   ＜20   ＜100     88     14
 910    3     ＜20   ANDV     -   ＜20   400
 911    3     ＜20   ANDV     -   2560   12800
表5续：把接种了pWRG/AND-M的猕猴的血清在攻击前和攻击后被动转移到仓鼠
                   抗体                                                         终了放血f        保护率％
仓鼠ID#     来源a   注射日b  第0天的PRNT效价c  攻击病毒d 死亡日e  PRNT效价g  ELISA效价b     死亡率   感染率i
912     3     ＜20   ANDV     -   160   800
109     3     ＜20   ANDV     -   ＞640   1600
110     3     ＜20   ANDV     -   640   6400
111     3     ＜20   ANDV     12   na   na
112     3     ＜20   ANDV     -   ＞640   3200
113     AND-M     4     ＜20   ANDV     -   160   400     100      0
114     4     ＜20   ANDV     -   640   400
115     4     ＜20   ANDV     -   ＞640   12800
116     4     ＜20   ANDV     -   320   1600
117     AND-M     5     ＜20   ANDV     -   320   1600     100      0
118     5     ＜20   ANDV     -   ＞640   1600
119     5     ＜20   ANDV     -   640   800
120     5     ＜20   ANDV     -   160   400
121     AND-M     6     ＜20   ANDV     11   na   na     38       0
122     6     ＜20   ANDV     -   40   800
123     6     ＜20   ANDV     13   na   na
124     6     ＜20   ANDV     12   na   na
表5续：把接种了pWRG/AND-M的猕猴的血清在攻击前和攻击后被动转移到仓鼠
                      抗体                                                        终了放血f                        保护率％
仓鼠ID#    来源a   注射日b   第0天的PRNT效价c 攻击病毒d 死亡日e   PRNT效价g    ELISA效价h   死亡率   感染率i
913     6     ＜20  ANDV     11   na    na
914     6     ＜20  ANDV     -   1280    12800
915     6     ＜20  ANDV     10   na    na
916     6     ＜20  ANDV     -   1280    6400
917   AND-M     9     ＜20  ANDV     11   na    na     25      0
918     9     ＜20  ANDV     13   na    na
919     9     ＜20  ANDV     -   10240    12800
920     9     ＜20  ANDV     11   na    na
921   AND-M    -1     160  PBS     -   ＜20    ＜100     100     100
922    -1     640  PBS     -   ＜20    ＜100
923    -1     ＜20  PBS     -   ＜20    ＜100
924    -1     160  PBS     -   ＜20    ＜100
a 接种了pWRG/AND-M(AND-M)猴子的血清或阴性对照血清(-)。
b 相对于攻击注射抗体的日子(0天)。
c 攻击时仓鼠血清中的NAb效价。
d 2000PFU ANDV(250LD50)，或PBS在0天时通过肌肉注射。
e -，幸存的动物
f 在第一个实验中(ID#909-924)，在第28天进行终了放血。在第2个实验中(ID#109-124)，在第98天终了放血。
g 中和50％噬菌斑的最高稀释度的倒数，na，没有应用。
h 终点ELISA效价。
i 无菌免疫表示没有检测到针对核壳的抗体。
表6.接种pWRG/HTN-M(x)的NHP血清在非致命感染模型中的被动转移
  仓鼠ID#    抗体源a    第0天的PRNT效价b     攻击病毒c          终了放血f     无菌免疫性％g
  PRNT效价d   ELISA效价e
  492493494495496497498499     HTN-M     640128064012806401280＜20640     HTNVHTNVHTNVHTNVHTNVHTNVHTNVHTNV   20802020＜2012805120ND   ＜100＜100＜100200＜100＜10012800＜100     YYYNYYNY
  484485486488489490491     (-)     ＜2020＜20＜20＜20＜20＜20     HTNVHTNVHTNVHTNVHTNVHTNVHTNV   ＞640＞640＞640＞640＞640＞640＞640   ＞12800＞12800＞12800＞12800＞128003200＞12800     NNNNNNN
表6续：接种pWRG/HTN-M(x)的NHP血清在非致命感染模型中的被动转移
 仓鼠ID#   抗体源a   第0天的PRNT效价b     攻击病毒c          终了放血f     无菌免疫性％g
  PRNT效价d   ELISA效价e
 476477478479480481482483   无   ＜20＜20＜20＜20＜20＜20＜20＜20     HTNVHTNVHTNVHTNVHTNVHTNVHTNVHTNV   ＞640＞640＞640＞640＞640＞640＞640＞640 ＞12800＞12800＞12800＞12800＞12800＞12800＞12800＞12800     NNNNNNNN
a HTN-M表示接种了pWRG/HTN-M(x)的猴子的血清；(-)表示接种了不相关质粒的阴性对照猴子血清，无″表示没有被动转移。
b 攻击时仓鼠血清中的NAb效价(50％)。
c 2000PFU ANDV(1000 LD50)在0天时通过肌肉注射。
d 中和50％噬菌斑的最高稀释度的倒数；ND，未做。
e 终点ELISA效价。
f 攻击后35天时终了放血。
g 无菌免疫表示没有检测到针对核壳的抗体。Y和N分别表示有或没有无菌免疫。
表7.在攻击前和攻击后把智利HPS患者的血浆被动转移到仓鼠
                抗体                                                               终了放血f                      保护率％
 仓鼠ID#   来源a     注射日b   第0天的PRNT效价c   攻击病毒d 死亡日e    PRNT效价g    ELISA效价h   死亡率   感染率i
 125   正常     -1     ＜20   ANDV     12     na     na     0     0
 126     ＜20   ANDV     10     na     na
 127     ＜20   ANDV     11     na     na
 128     ＜20   ANDV     12     na     na
 129   HPS     -1     640   ANDV     -     ＜20     ＜100     50     50
 130     1280   ANDV     57     na     na
 131     640   ANDV     68     na     na
 132     1280   ANDV     -     ＜20     ＜100
 133   HPS     3     ＜20   ANDV     -     ＞640     3200     75     0
 134     ＜20   ANDV     -     160     800
 135     ＜20   ANDV     -     80     800
 136     ＜20   ANDV     12     na     na
 137   HPS     4     ＜20   ANDV     12     na     na     50     0
 138     ＜20   ANDV     15     na     na
 139     ＜20   ANDV     -     320     1600
 140     ＜20   ANDV     -     320     3200
表7续：在攻击前和攻击后把Chilean HPS感染患者的血浆被动转移到仓鼠
                  抗体       终了放血f                   保护率％
仓鼠ID#   来源a     注射日b  第0天的PRNT效价c   攻击病毒d 死亡日e     PRNT   ELISA效价g  效价h     死亡率   感染率i
141   HPS     5   ＜20   ANDV     -     ＞640  6400     50     0
142   ＜20   ANDV     -     40    ＜100
143   ＜20   ANDV     11     na    na
144   ＜20   ANDV     11     na    na
145   HPS     -1   40   无     -     ＜20  ＜100     100     100
146   640   无     -     ＜20  ＜100
147   320   无     -     ＜20  ＜100
a HPS表示来自HPS患者的血浆，″正常″表示正常的人血清。
b 相对于攻击注射抗体的日子(0天)。
c 攻击时仓鼠血清中的NAb效价。
d 通过肌肉注射2000PFU ANDV(250 LD50)(ANDV)，或没处理(无)。
e -，活着的动物。
f 在第98天时终了放血。
g 中和50％噬菌斑的最高稀释度的倒数，na，没有应用。
h 终点ELISA效价。
i 防止感染(无菌免疫)表示没有检测到针对核壳的抗体。
实施例18
将接种了pWRG/AND-M的猴子血清在ANDV攻击后4-5天被动转移到仓鼠，能完全防止致命的HPS。当接种pWRG/AND-M的猴子血清在攻击后3，4，5，6或9天时施用给仓鼠时，我们测试了它的保护效力(表5)。攻击后3，4，5天接受了抗体的16只仓鼠中有15只幸存下来了。然而，如果抗体在攻击后6天施用，那8只仓鼠中只有3只能幸存下来，而如果抗体是在攻击后9天施用，那四只仓鼠中只有1只能幸存。除了一只外(ID#909，第3天)，所有暴露后实验中幸存下来的仓鼠被ANDV感染，这可以通过PRNT和核壳特异的ELISA检测。不像上文介绍的攻击前被动转移试验，在攻击后被动转移实验中，我们后来没有观察到死亡。因此，用接种了pWRG/AND-M猴子血清进行的免疫预防，最多在用ANDV进行致命攻击后5天才能保护88-100％的受ANDV攻击的仓鼠。
实施例19
HTN-M DNA接种猴子血清被动转移能保护仓鼠免受HTNV感染。在更早的研究中，我们证明了用pWRG/HTN-M(x)接种的仓鼠能诱导NAbs，并能防止感染；然而，我们从没测试诱导的抗体本身能否足以起保护作用。为了解决这个问题，不同组的仓鼠或者不注射，或者用来自接种了pWRG/HTN-M(x)四次的猴子血清池注射(PRNT50效价＝20480)，或用来自接种了阴性对照质粒的猴子血清池接种。被动转移后一天，仓鼠被放血，并用HTNV攻击。攻击后5周，仓鼠被终了放血，并通过PRNT从0天到第35天测试血清中的HTNV NAbs，以及通过ELISA测试核壳特异的抗体(表6)。所有注射了阴性对照血清或无血清的仓鼠显然被感染了，这可通过高的PRNT和核壳特异的ELISA效价表示出来。相反，注射了来自接种了pWRG/HTN-M(x)的仓鼠血清的8只仓鼠中有6只用ELISA检测不到抗核壳抗体。仓鼠#495的ELISA效价低，表明感染水平低。尽管仓鼠#498在注射了免疫血清的一组，但在攻击的时候没检测到NAb反应，表明抗体没有成功地转移，这就解释了为什么这个动物没有防止HTNV感染。因此，来自接种了pWRG/HTN-M(x)的非人灵长类动物的血清，在攻击前一天施用，足以有效地保护仓鼠免受HTNV感染。
实施例20
从HPS人类患者中被动转移血浆。由于已经证明来自接种了基于ANDV M基因DNA疫苗的猴子血清在暴露前或暴露后施用时，能防止致命ANDV攻击，我们调查了Chilean HPS患者康复期血浆(人HPS血浆)在ANDV/仓鼠致命疾病模型的保护能力。人HPS血浆，最初的ANDV NAb PRNT50效价是10240，在第1，3，4或5天的时候注射到不同组的仓鼠中。对照组在第一天注射了正常的人血清。在0天，从仓鼠中收集血清，然后用ANDV攻击仓鼠(250 LD50，肌内注射)。作为毒性对照，三只在第一天注射了人HPS血浆的仓鼠没有被攻击。监控仓鼠98天，幸存的仓鼠被终了放血，并在第0天和98天，对血清样品进行PRNT和ELISA(表7)。所有接受了正常人血清的仓鼠在攻击后10-12天死亡。四只在第一天接受了人HPS血浆的仓鼠中有两只幸存下来。在第一天组的另外两只仓鼠产生了HPS，并在攻击后的第57和68天死亡。在攻击后的第3，4，或5天接受抗体的12只仓鼠中有7只幸存下来了。在这些组中死亡的仓鼠在攻击后11-15天也接受了抗体。在毒性对照组中的3只仓鼠都保持健康。
攻击后血清的血清学结果表明在第1天注射了人HPS血浆，并幸存下来的两只仓鼠可以防止感染(即他们不会产生抗核壳抗体)(表7)。除了一只外，所有攻击后接受了人HPS血浆，并幸存下来的仓鼠仍然被感染了，这是因为他们产生了抗核壳抗体。因此，当人HPS血浆在第1，3，4或5天施用时，保护至少一半受到攻击的仓鼠。在第一天接受血浆的仓鼠或者能防止感染，或者比对照存活时间长4倍。
讨论
目前，没有疫苗，有效的抗病毒药物，或免疫促进剂(immunologics)能防止或治疗HPS。这令人不安，因为HPS能折磨在所有年龄组中的以前健康的个体，疾病进程很快，而且致死率在已知的任何急性病毒疾病中是最高的之一。在阿根廷南部和智利，关于人对人传播AND V相关HPS的报道使得发展抗这种高致命疾病的对策显得尤为迫切(Padula等人，1998，Virology 241，323-330；Toro等人，1997，Emerg.Infect.Dis.4，687-694；Wells等人，1997，Emerg.Infect.Dis.3，171-174)。在本申请中，我们报道了一种候选HPS基因疫苗的开发，该疫苗在非人灵长类动物中能诱导高效价NAb。此外，我们报道了被这种疫苗诱导的抗体能保护仓鼠免受致命HPS的感染，甚至在攻击后5天施用都可以。
这是第一个研究，在这个研究中，成年实验动物汉坦病毒属病毒疾病模型一直被用来评估候选疫苗，药物或免疫促进剂的保护性效力。以前的研究使用包括小鼠，仓鼠，或田鼠在内的汉坦病毒属病毒感染模型来评估疫苗或免疫促进剂，或利用哺乳的小鼠神经性疾病模型来评估药物(Hooper和Li，2001，在：汉坦病毒属病毒，171-191页，Springer-Verlag，柏林，德国，Schmaljohn和Hooper，2001，同上)。在本申请中，我们利用了最近介绍的ANDV/仓鼠致命疾病模型(Hooper等人，2001，Virology 289，6-14)。我们证实ANDV在成年的叙利亚仓鼠中能引起致命的HPS，并确定这种攻击有相对一致的结果。在主动接种或被动转移实验中，作为阴性对照的35只仓鼠中，ANDV攻击的仓鼠100％被感染，并且91％患上了致命的HPS(平均死亡天数＝12，范围是10-15天)。症状(如呼吸困难)开始很快，并且通常在开始后24小时内死亡。
在更早的研究中，我们证明了以前用HTNV，SEOV，DOBV，PUUV或SNV感染能保护仓鼠免受致命的ANDV的攻击(Hooper等人，2001，同上)。从这点出发，我们推断利用我们的基于HTNV M基因的DNA疫苗pWRG/HTN-M(x)保护仓鼠免受ANDV攻击是可能的。我们测试了这种可能性，并且发现pWRG/HTN-M(x)能保护24只仓鼠中的9只免受致命的ANDV的攻击。这种保护水平没有统计学上的意义(P＝0.0569)，但却表明该疫苗能诱导一些抗ANDV的免疫反应。很可能pWRG/HTN-M(x)疫苗能提供更高水平的抗少于250 LD50的攻击剂量的保护，或抗不同攻击途径的保护(如气溶胶或口服途径)。在pWRG/HTN-M(x)接种的仓鼠(图14)或HTNV感染的仓鼠血清中基本没有ANDV交叉中和抗体，HTNV感染的仓鼠在我们更早的工作中被保护了(Hooper等人，2001，同上)。这表明我们在以前感染的仓鼠中观察到的交叉保护是因为细胞介导的免疫反应靶向核壳和糖蛋白，然而我们在pWRG/HTN-M(x)接种的仓鼠中观察到的部分交叉保护可能是因为细胞介导的免疫反应仅靶向糖蛋白。在理论上可能是L基因组区段产物在以前感染的仓鼠中观察到的保护中发挥了重要的作用，然而，目前没有关于病毒聚合酶诱导体液或细胞介导的免疫反应的证据。用HTNV感染后的交叉保护，而不是用HTNV糖蛋白接种后的交叉保护表明用表达HTNV核壳和唐蛋白的质粒接种能模仿HTNV感染和抗ANDV的交叉保护。
在另一个开发HPS疫苗的方法中，我们构建了一种质粒，这种质粒被设计来特异性防止引起HPS的病毒感染。该质粒pWRG/AND-M含有完全的ANDV M基因开放阅读框，并且在细胞培养物中表达G1和G2糖蛋白。据我们所知，BCCV M基因是其他HPS汉坦病毒属病毒中唯一的已经被成功克隆和表达的完全M基因(Ravkov等人，1998，J.Virol.72，2865-2870)。在那个研究中，将BCCV M基因克隆到辛德毕斯病毒复制系统SIN-rep5中，并通过免疫沉淀检测在BHK21细胞中的表达。
用pWRG/AND-M接种能诱导猕猴中潜在的NAb反应。这是第一个候选的HPS疫苗，它能在任何实验室动物中明确地诱导NAb反应。不仅猴子中产生的NAb，而且1)仅在两次接种后就能检测到NAbs；2)NAbs效价非常高(即效价和在HPS患者康复血清中发现的一样高)；3)NAbs至少能和两种别的HPS相关汉坦病毒属病毒SNV和BCCV交叉中和；以及4)在最后一次接种后6个月，仍然能检测到NAbs。SNV的中和表明pWRG/AND-M疫苗将能防止南美和北美主要的HPS汉坦病毒属病毒，分别是ANDV和SNV。BCCV的中和表明用pWRG/AND-M接种可能防止大范围的汉坦病毒属病毒(参看表8)。这些数据加上我们HFRS DNA疫苗数据表明包括pWRG/HTN-M(x)和pWRG/AND-M的疫苗能令人信服地防止若干已知对人高度致命的主要汉坦病毒属病毒。
表8.基于汉坦病毒属病毒M基因的DNA疫苗在非人灵长类动物中的免疫原性：在1-4次接种后的反应。
  实验a  DNA疫苗质粒 猴子ID#                 接种后3周的效价b
  Vacc1    Vacc2     Vacc3     Vacc4
    I  pWRG/SEO-M(x)   CH03   ＜20     160     1280     na
    I   CH32   ＜20     160     1280     na
    I  pWRG/HTN-M(x)   CH28   40     1280     2560     na
    I   CH02   40     1280     10240     na
    I   CH27   ＜20     320     1280     na
    II   CH64   ＜20     160     1280     20480
    II   CH85   ＜20     160     320     20480
    II  pWRG/AND-M   CH69   ＜20     2560     2560     20480
    III   90BD25   ＜20     5120     5120     10240
    III  pWRG/HA-Mc   CAA   HTN＜20     160     80     320
  AND＜20     ＜20     ＜20     320
  HJV   HTN＜20     320     160     ＞640
  AND＜20     40     80     640
a作了三个独立的实验。每次接种猴子接受8g.g的给药。
b抗同型病毒的PRNT50效价。对于pWRG/HA-M，给出了汉坦病毒(HTN)和安地斯病毒(AND)的效价。
cpWRG/HA-M是一种质粒，它含有安地斯病毒和汉坦病毒的M基因。
所有接种了本发明基于汉坦病毒，汉城病毒，安地斯病毒或汉坦病毒/安地斯病毒M基因的DNA疫苗的猴子都能诱导中和抗体，水平在6个月后仍然能检测到。接种了pWRG/HTN-M(x)的3只猴子中有2只在最后一次接种后2年仍然能检测到中和抗体(表9)。免疫持续时间数据在表10中总结了。
表9.基于汉坦病毒属病毒M基因的DNA疫苗在非人灵长类动物中的免疫原性：免疫持续时间
实验a DNA疫苗质粒   猴子ID#                        PRNT50效价
                  最后一次接种后的月数
～1 ～6 ～12 ～18 ～24
    I  pWRG/SEO-M(x)   CH03   1280     160     320     nd
    I   CH32   1280     320     40     nd
    IIIIIII  pWRG/HTN-M(x)   CH28   2560     320     80     160     80
  CH02   10240     320     80     640     80
  CH27   1280     40     ＜20     ＜20     ＜20
  CH64   20480     640     nd
  CH85   20480     1280     nd
    IIIII  pWRG/AND-M   CH69   20480     2560     nd
  90BD25   10240     320     nd
a作了三个独立的实验。每次接种猴子接受了8g.g给药。
b抗同型病毒的PRNT50效价。
表10.基于汉坦病毒属病毒M基因的DNA疫苗在非人灵长类动物中的免疫原性：免疫持续时间
    DNA疫苗                            几何平均效价a
                     最后一次接种后的月数
    ～1     ～6     ～12     ～18     ～24
  PWRG/SEO-M(x)PWRG/HTN-M(x)PWRG/AND-M全部     12806756144825530     226320269373     11340ndnd     nd101ndnd     nd40ndnd
a抗同型病毒的PRNT50效价。
我们在研究过程中获得的令人更困惑的结果之一是pWRG/AND-M在仓鼠中不能诱导可检测的免疫反应。在两个独立的实验中，三次接种了pWRG/AND-M的仓鼠不能产生通过PRNT或IFAT可检测到的抗体，而且不能防止致命的ANDV的攻击。相反，只接种了少至2次pWRG/AND-M的猕猴产生了可检测的NAb反应。尽管不相似，但可能是DNA疫苗由于技术的原因在仓鼠中没有免疫原性。在探究为什么pWRG/AND-M在仓鼠中不能产生免疫反应，以及这种现象是否涉及叙利亚仓鼠中高致命的ANDV性质的机制之前，我们应该谨慎地评估在一起做的实验中，仓鼠和非人类灵长类动物中的pWRG/AND-M疫苗，在这些实验中，两种动物中都使用了同一批疫苗和接种规程。在目前的研究中，关键点是pWRG/AND-M在非人灵长类动物中是高度免疫原性的。
在以前的研究中，我们证明了表达SEOV或HTNV糖蛋白的基因疫苗能在小鼠，仓鼠和非人灵长类动物中诱导NAb，而且我们证明了接种仓鼠中存在的NAb和防止感染相关联(Hooper等人，1999，Virology 255，269-78；Kamrud等人，1999，Virology 263，209-219)。在本申请中，我们第一次证明了由pWRG/HTN-M(x)DNA接种所诱导的体液反应足以防止HTNV感染。具体而言，我们证明了在攻击前一天接种了pWRG/HTN-M(x)的猴子血清的被动转移给用HTNV攻击的8只仓鼠中的6只提供了无菌保护。没有被保护的两只仓鼠或者保护有限(#495仓鼠)，这可通过攻击后非常低的抗核壳效价来确定，或没有接受正确的血清注射(仓鼠#498)，这可通过检测攻击当天可检测的NAb存在与否来确定。相似的被动转移试验可以用作临床研究的一部分，评估接种了pWRG/HTN-M(x)的人的血清以及预测疫苗的效力，这是有可能的。
目前，对暴露或潜在暴露在HPS汉坦病毒属病毒中的个体没有治疗手段。医院接纳的患者中NAb高效价和有利的临床治疗相关的报道表明NAb可能能改善疾病，因此免疫治疗可能对暴露在HPS病毒中的人是一种可行的治疗选择(Bharadwaj等人，2000，J.Infect.Dis.182，43-48)。对于HFRS相关的汉坦病毒属病毒，感染大鼠免疫血清或小鼠MAbs的被动转移能防止仓鼠感染或防止新生大鼠或哺乳小鼠患神经性疾病(Arikawa等人，1989，J.Gen.Virol.70，615-24；Liang等人，1996，Virology 217，262-271；Schmaljohn等人，1997，J.Virol.71，9563-9569，Zhang等人，1989，Arch Virol.105，235-246)。对于HPS汉坦病毒属病毒，没有关于保护性免疫被动转移的报道。AND/仓鼠致命疾病模型的发现使得我们第一次能评估抗体防止和人疾病相似的汉坦病毒属病毒疾病的能力。利用这个模型，我们证明了接种了pWRG/AND-M的猴子血清，如果在暴露后第4或5天施用被动转移能100％保护受到攻击的仓鼠免受致命的ANDV的感染。这个发现表明有可能开发一种产品(例如包括人的灵长类动物多克隆免疫球蛋白，用pWRG/AND-M和/或pWRG/HTN-M(x)接种，或中和ANDV和/或HTNV的MAbs)，它能用于治疗暴露在汉坦病毒属病毒中的实验室工作人员，和HFRS或HPS患者亲密接触的家庭成员或其他人，或治疗HPS病例的医疗机构工作人员，尤其在南美，在这里有人对人传播HPS的证据(Padula等人，1998，Virology 241，323-330；Toro等人，1997，同上，Wells等人，1997，Emerg.Infect.Dis.3，171-174)。
在暴露后第3天施用时，HPS患者康复血清基本上和猴子血清效果一样(保护作用是75％对88％)，但是当在暴露后第4或5天施用时，仓鼠只有50％的保护作用了。因为低的样品数，这种差异可以是人为现象。此外，有可能是人的NAbs比猕猴的NAbs清除得更快，从而导致在攻击时低效的NAb效价。我们没有评估猴子或人汉坦病毒属病毒特异的NAbs从仓鼠中被清除的动力学。
将接种pWRG/AND-M的猴子血清或HPS患者血浆在攻击前1天施用被动转移能通过无菌免疫保护仓鼠免受致命的ANDV攻击，或者延缓疾病开始和降低死亡率2倍至几乎4倍。在涉及将含有ANDVNAb的血清被动转移的实验中(表5和表7)，后来死掉的唯一的一批仓鼠是在攻击前1天注射了血清的仓鼠。这六只仓鼠分别在第23，23，40，40，57和68天死亡，平均死亡天数是42天。这种死亡时间的延缓是很有意义的，因为注射了阴性对照血清(猴子或人)的12只仓鼠在10-14天全都死亡，平均死亡天数是12天。我们推测在第1天注射了抗体的仓鼠后来死亡可能是异型猴子或人ANDV特异NAb的清除，以及随后从“来自外部”(例如从同一个房间不同笼子中的仓鼠散布出来的ANDV)或“来自内部”(例如，从用被动转移抗体而产生的中和中逃逸出来并感染细胞的病毒)导入的病毒扩增的结果。我们假设以后死亡没有在暴露后接受血清的仓鼠中观察到，因为受攻击的仓鼠设置了一道针对攻击病毒的活性免疫反应。这道主动的免疫反应在正常情况下是不足以保护仓鼠免受ANDV感染，然而，在第3-5天施用的被动转移免疫(即来自接种了pWRG/AND-M的猴子血清的NAb)使平衡朝有利于仓鼠方向倾斜，并且使其幸存下来(28只仓鼠中有22只幸存，参看表6和表7)。当仓鼠在被动免疫被清除后重新暴露在ANDV中时，主动的免疫反应将会保持并保护仓鼠。为了支持这个结论，在第3，4，5，6或9天时接受了被动转移抗体的26只幸存仓鼠中，除了一只外(仓鼠#902，表5)仍然被感染了，这可以通过攻击后若干星期检测到抗核壳和/或NAb反应表现出来。不管后来的死亡是否是因为重新暴露在来自“内部”或“外面”的病毒，这些数据都表明汉坦病毒属病毒暴露后的预防性治疗方案可能要求重复施用，或者是抗体的被动转移和主动接种免疫。暴露后预防用的被动/主动免疫方法按常规是用来防止别的病毒疾病，包括甲型肝炎，乙型肝炎和狂犬病(疾病控制中心，Atlanta，Georgia，1991，MMWR40，1-19，MMWR 48，1-21，MMWR 48，1-37)。
绝大部分在第6或9天接受了ANDV特异的NAb的仓鼠都死亡了，表明当疾病发展后，免疫预防可能没什么效果。别人报道小的分子药物利巴伟林(Ribavirin)可能对治疗HPS无效，因为对于绝大部分患者，药物治疗都是在临床症状出现后开始的(Chapman等人，1999，Antivir，Ther.4，211-219)。关键的致病结合点还没有确定，在这个结合点中，由感染所引起的损伤不能逆转，而且预防也不可能。将来在安地斯病毒/仓鼠致命疾病模型中以HPS时控为特点的研究，将会对HPS的发病机理提供见解，并且允许我们阐明暴露前和暴露后预防和治疗的策略。
                   序列表
Seq ID NO：1 SEOV M基因组区段
tagtagtaga ctccgcaaga aacagcagtt aaagaacaat        40
aggatcatgt ggagtttgct attactggcc gctttagttg        80
gccaaggctt tgcattaaaa aatgtatttg acatgagaat       120
tcagttgccc cactcagtca actttgggga aacaagtgtg       160
tcaggctata cagaatttcc cccactctca ttacaggagg       200
cagaacagct agtgccagag agctcatgca acatggacaa       240
ccaccagtca ctctcaacaa taaataaatt aaccaaggtc       280
atatggcgga aaaaagcaaa tcaggaatca gcaaaccaga       320
attcatttga agttgtggaa agtgaagtca gctttaaagg       360
gttgtgtatg ttaaagcata gaatggttga agaatcatat       400
agaaatagga gatcagtaat ctgttatgat ctagcctgta       440
atagtacatt ctgtaaacca actgtttata tgattgttcc       480
tatacatgct tgcaacatga tgaaaagctg tttgattggc       520
cttggcccct acagaatcca ggttgtctat gaaaggacat       560
actgcactac gggtatattg acagaaggaa aatgctttgt       600
ccctgacaag gctgttgtca gtgcattgaa aagaggcatg       640
tatgctatag caagcataga gacaatctgc ttttttattc       680
atcagaaagg gaatacatat aagatagtga ctgccattac       720
atcagcaatg ggctccaaat gtaataatac agatactaaa       760
gttcaaggat attatatctg tattattggt ggaaactccg       800
cccctgtata tgcccctgct ggtgaagact tcagagcaat       840
ggaggttttt tctgggatta ttacatcacc acatggagaa       880
gaccatgacc tacccggcga agaaatcgca acgtaccaga       920
tttcagggca gatagaggca aaaatccctc atacagtgag       960
ctccaaaaac ttaaaattga ctgcttttgc aggtattcca      1000
tcatactcat caactagtat attggctgct tcagaagatg      1040
gtcgtttcat atttagtcct ggtttatttc ctaacctaaa      1080
tcagtcagtc tgtgacaaca atgcactccc tttaatctgg      1120
aggggcctaa ttgatttaac gggatactat gaggcagtcc      1160
acccttgcaa tgtgttctgt gtcttatcag gaccaggtgc      1200
ttcatgtgag gccttttcag aaggaggtag gggcaatatt      1240
acttctccaa tgtgtctggt gtctaagcaa aatagattta      1280
gagcagctga gcagcagatt agctttgtct gccaaagagt      1320
tgatatggat attatagtgt actgtaatgg tcagaaaaaa      1360
acaatcctaa caaaaacatt agttataggc caatgtattt      1400
atactattac aagtctcttt tcactgttac caggggttgc      1440
ccattctatt gctattgagt tgtgtgttcc agggtttcat      1480
ggctgggcca cagctgcact tttgattaca ttctgcttcg      1520
gctgggtatt gattcctgca tgtacattag ctattctttt      1560
agtccttaag ttctttgcaa atatccttca tacaagcaat      1600
caagagaacc gattcaaagc cattctacgg aaaataaagg      1640
aggagtttga aaaaacaaag ggttccatgg tttgtgagat      1680
ctgtaagtat gagtgtgaaa cattaaagga attgaaggca      1720
cataacctat catgtgttca aggagagtgc ccatattgct      1760
ttacccactg tgaaccgaca gaaactgcaa ttcaggcaca      1800
ttacaaagtt tgtcaagcca cccaccgatt cagagaagat      1840
ttaaaaaaga ctgtaactcc tcaaaatatt gggccaggct      1880
gttaccgaac actaaatctt tttaggtata aaagtaggtg      1920
ttatattctg acaatgtgga ctcttcttct cattattgaa  1960
tccatcctct gggcagcaag tgcagcagaa atcccccttg  2000
tccctctctg gacagataat gctcatggcg ttgggagtgt  2040
tcctatgcat acggatcttg aattagactt ctctttgcca  2080
tccagttcta agtacacata caaaagacat ctcacaaacc  2120
cagttaatga ccaacagagt gtctcattgc atatagaaat  2160
tgaaagtcaa ggcattggtg ctgctgttca tcatcttgga  2200
cattggtatg atgcaagatt gaatctaaaa acctcatttc  2240
attgttatgg tgcctgcaca aaatatcaat acccatggca  2280
cactgcaaaa tgccattttg agaaagatta tgagtatgaa  2320
aatagctggg cttgcaaccc cccagattgc ccaggggttg  2360
gtacaggttg tactgcttgt ggattatatc tagatcaatt  2400
gaagccggta ggaacagcct ttaaaattat aagtgtaaga  2440
tacagtagaa aagtgtgcgt gcagtttggt gaagaacacc  2480
tttgtaaaac aattgatatg aatgattgct ttgtgactag  2520
gcatgccaaa atatgtataa ttgggactgt atctaagttt  2560
tctcaaggtg acactctact atttctgggg cccatggaag  2600
gaggtggtat aatctttaaa cactggtgta catctacctg  2640
tcactttgga gaccctggtg atgtcatggg tccaaaagat  2680
aaaccattta tttgccctga atttccaggg caatttagga  2720
aaaaatgtaa ctttgccaca actccagttt gtgaatatga  2760
tggaaacatt atatcaggct ataagaaagt acttgcaaca  2800
attgattctt tccaatcatt taacacaagc aatatacact  2840
tcactgatga gagaattgaa tggagagacc ctgatggcat  2880
gcttcgggat catattaata ttgttatttc taaagatatt  2920
gattttgaaa atttggctga gaatccttgt aaagtagggc  2960
tccaggcagc aaacatagaa ggtgcctggg gttcaggtgt  3000
cgggtttaca ctcacatgca aggtgtctct cacagaatgc  3040
ccaacatttc ttacatcaat aaaggcctgt gacatggcaa  3080
tttgttatgg tgcagaaagt gtgacactct cacgaggaca  3120
aaatactgtc aaaattaccg ggaaaggtgg ccatagtggt  3160
tcttcattca aatgctgtca tgggaaagaa tgttcatcaa  3200
ctggcctcca agccagtgca ccacatctgg ataaggtaaa  3240
tggtatctct gagttagaaa acgagaaagt ttatgatgac  3280
ggtgcacctg aatgtggcat tacttgttgg tttaaaaaat  3320
caggtgaatg ggttatgggt ataatcaatg ggaactgggt  3360
tgtcctaatt gtcttgtgtg tactgctgct cttttctctt  3400
atcctgttga gcatcttgtg tcctgttaga aagcataaaa  3440
aatcataaat cccacctaac aatcttcaca tcatgtatcg  3480
attttcaaac actttatcat ttagaactta acttggcact  3520
actatctgat aactgacttt catttttatt tttatatgga  3560
ttaattacta aaaaaaatac tctcttctat ctcccaatct  3600
tttattgatt caccggggtg ctgtcttgac atctggcggc  3640
gtctactact a                                 3651
SEQ ID NO：2 SEOV S基因组区段
tagtagtaga ctccctaaag agctactaca ctaacaagaa    40
aaatggcaac tatggaagaa atccagagag aaatcactgc    80
tcacgagggg cagcttgtga tagcacgcca gaaggtcaag   120
gatgcagaaa agcagtatga gaaggatcct gatgacttaa   160
acaagagggc actgcatgat cgggagagtg tcgcagcttc   200
aatacaatca aaaattgatg aattgaagcg ccaacttgcc   240
gacagattgc agcagggaag aacatccggg caggaccggg   280
atcctacagg ggtagagcca ggtgatcatc ttaaggaaag   320
atcagcacta agctacggga atacactgga cctgaatagt   360
cttgacattg atgaacctac aggacagaca gctgattggc   400
tgaccataat tgtctatctg acatcattcg tggtcccgat   440
catcttgaag gcactgtaca tgttaacaac acgaggtagg   480
cagacttcaa aggacaacaa ggggatgagg atcagattca   520
aggatgacag ctcatatgag gatgtcaatg gaatcagaaa   560
gcccaaacat ctgtatgtgt caatgccaaa cgcccaatcc   600
agcatgaagg ctgaagagat aacaccagga agattccgca   640
ctgcagtatg tggactatat cctgcacaga taaaggcaag   680
gaatatggta agccctgtca tgagtgtagt tgggttcttg   720
gcactggcaa aagactggac atcgagaatt gaagaatggc   760
tcggtgcacc ctgcaaattc atggcggagt ctcttattgc   800
cgggagttta tctgggaatc ctgtgaatcg tgactatatc   840
agacagagac aaggtgcact tgcagggatg gagccaaagg   880
aatttcaagc cctcaggcaa cattcaaagg atgctggatg   920
tacactagtt gaacatattg agtcaccatc atcaatatgg   960
gtgtttgctg gggcccctga taggtgtcca ccaacatgct  1000
tgtttgtcgg agggatggct gaattaggtg ccttcttttc  1040
tatacttcag gatatgagga acacaatcat ggcttcaaaa  1080
actgtgggca cagctgatga aaagcttcga aagaaatcat  1120
cattctatca atcatacctc agacgcacac aatcaatggg  1160
aatacaactg gaccagagga taattgttat gtttatggtt  1200
gcctggggaa aggaggcagt ggacaacttt catctcggtg  1240
atgacatgga tccagagctt cgtagcctgg ctcagatctt  1280
gattgaccag aaagtgaagg aaatctcaaa ccaggaacct  1320
atgaaattat aagtacataa atatataatc aatactaact  1360
ataggttaag aaatactaat cattagttaa taagaatata  1400
gatttattga ataatcatat taaataatta ggtaagttaa  1440
ctagtattta gttaagttag ctaattgatt tatatgattg  1480
tcacaattaa atgtaatcat aagcacaatc actgccatgt  1520
ataatcacgg gtatacgggt ggttttcata tggggaacag  1560
ggtgggctta gggccaggtc accttaagtg accttttttt  1600
gtatatatgg atgtagattt caattgatcg aatactaatc  1640
ctactgtcct cttttctttt cctttctcct tctttactaa  1680
caacaacaaa ctacctcaca ccttaatata tactacttta  1720
ttaagttgtt aagttgtgtc tttttgggga gtaagggagt  1760
ctactacta                                    1769
SEQ ID NO：3
备注＝″亚克隆到DNA载体pWGR7077中SEOV病毒株
SR-11的M基因组区段″
gggggggggg ggcgctgagg tctgcctcgt gaagaaggtg    40
ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc catcatccag    80
ccagaaagtg agggagccac ggttgatgag agctttgttg   120
taggtggacc agttggtgat tttgaacttt tgctttgcca   160
cggaacggtc tgcgttgtcg ggaagatgcg tgatctgatc   200
cttcaactca gcaaaagttc gatttattca acaaagccga   240
cgtcccgtca agtcagcgta atgctctgcc agtgttacaa   280
ccaattaacc aattctgatt agaaaaactc atcgagcatc   320
aaatgaaact gcaatttatt catatcagga ttatcaatac   360
catatttttg aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa   400
ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag atcctggtat   440
cggtctgcga ttccgactcg tccaacatca atacaaccta   480
ttaatttccc ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa   520
atcaccatga gtgacgactg aatccggtga gaatggcaaa   560
agcttatgca tttctttcca gacttgttca acaggccagc   600
cattacgctc gtcatcaaaa tcactcgcat caaccaaacc   640
gttattcatt cgtgattgcg cctgagcgag acgaaatacg   680
cgatcgctgt taaaaggaca attacaaaca ggaatcgaat   720
gcaaccggcg caggaacact gccagcgcat caacaatatt   760
ttcacctgaa tcaggatatt cttctaatac ctggaatgct   800
gttttcccgg ggatcgcagt ggtgagtaac catgcatcat   840
caggagtacg gataaaatgc ttgatggtcg gaagaggcat   880
aaattccgtc agccagttta gtctgaccat ctcatctgta   920
acatcattgg caacgctacc tttgccatgt ttcagaaaca   960
actctggcgc atcgggcttc ccatacaatc gatagattgt  1000
cgcacctgat tgccccacat tatcgcgagc ccatttatac  1040
ccatataaat cagcatccat gttggaattt aatcgcggcc  1080
tcgagcaaga cgtttcccgt tgaatatggc tcataacacc  1120
ccttgtatta ctgtttatgt aagcagacag ttttattgtt  1160
catgatgata tatttttatc ttgtgcaatg taacatcaga  1200
gattttgaga cacaacgtgg ctttcccccc ccccccggca  1240
tgcctgcagg tcgacataaa tcaatattgg ctattggcca  1280
ttgcatacgt tgtatctata tcataatatg tacatttata  1320
ttggctcatg tccaatatga ccgccatgtt gacattgatt  1360
attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta  1400
gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta  1440
cggtaaatgg cccgcctcgt gaccgcccaa cgacccccgc  1480
ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc  1520
caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt  1560
acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat  1600
atgccaagtc cggcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa  1640
tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg  1680
actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc  1720
tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta caccaatggg  1760
cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc  1800
accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa  1840
tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaataa ccccgccccg  1880
ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct  1920
atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg  1960
gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac  2000
cgggaccgat ccagcctccg cggccgggaa cggtgcattg  2040
gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgacg taagtaccgc  2080
ctatagactc tataggcaca cccctttggc tcttatgcat  2120
gctatactgt ttttggcttg gggcctatac acccccgctc  2160
cttatgctat aggtgatggt atagcttagc ctataggtgt  2200
gggttattga ccattattga ccactcccct attggtgacg  2240
atactttcca ttactaatcc ataacatggc tctttgccac  2280
aactatctct attggctata tgccaatact ctgtccttca  2320
gagactgaca cggactctgt atttttacag gatggggtcc  2360
catttattat ttacaaattc acatatacaa caacgccgtc  2400
ccccgtgccc gcagttttta ttaaacatag cgtgggatct  2440
ccacgcgaat ctcgggtacg tgttccggac atgggctctt  2480
ctccggtagc ggcggagctt ccacatccga gccctggtcc  2520
catgcctcca gcggctcatg gtcgctcggc agctccttgc  2560
tcctaacagt ggaggccaga cttaggcaca gcacaatgcc  2600
caccaccacc agtgtgccgc acaaggccgt ggcggtaggg  2640
tatgtgtctg aaaatgagct cggagattgg gctcgcaccg  2680
tgacgcagat ggaagactta aggcagcggc agaagaagat  2720
gcaggcagct gagttgttgt attctgataa gagtcagagg  2760
taactcccgt tgcggtgctg ttaacggtgg agggcagtgt  2800
agtctgagca gtactcgttg ctgccgcgcg cgccaccaga  2840
cataatagct gacagactaa cagactgttc ctttccatgg  2880
gtcttttctg cagtcaccgt ccaagcttgc ggccgcggat  2920
ctgcaggaat tcggcacgag agtagtagac tccgcaagaa  2960
acagcagtta aagaacaata ggatcatgtg gagtttgcta  3000
ttactggccg ctttagttgg ccaaggcttt gcattaaaaa  3040
atgtatttga catgagaatt cagttgcccc actcagtcaa  3080
ctttggggaa acaagtgtgt caggctatac agaatttccc  3120
ccactctcat tacaggaggc agaacagcta gtgccagaga  3160
gctcatgcaa catggacaac caccagtcac tctcaacaat  3200
aaataaatta accaaggtca tatggcggaa aaaagcaaat  3240
caggaatcag caaaccagaa ttcatttgaa gttgtggaaa  3280
gtgaagtcag ctttaaaggg ttgtgtatgt taaagcatag  3320
aatggttgaa gaatcatata gaaataggag atcagtaatc  3360
tgttatgatc tagcctgtaa tagtacattc tgtaaaccaa  3400
ctgtttatat gattgttcct atacatgctt gcaacatgat  3440
gaaaagctgt ttgattggcc ttggccccta cagaatccag  3480
gttgtctatg aaaggacata ctgcactacg ggtatattga  3520
cagaaggaaa atgctttgtc cctgacaagg ctgttgtcag  3560
tgcattgaaa agaggcatgt atgctatagc aagcatagag  3600
acaatctgct tttttattca tcagaaaggg aatacatata  3640
agatagtgac tgccattaca tcagcaatgg gctccaaatg  3680
taataataca gatactaaag ttcaaggata ttatatctgt  3720
attattggtg gaaactccgc ccctgtatat gcccctgctg  3760
gtgaagactt cagagcaatg gaggtttttt ctgggattat  3800
tacatcacca catggagaag accatgacct acccggcgaa  3840
gaaatcgcaa cgtaccagat ttcagggcag atagaggcaa  3880
aaatccctca tacagtgagc tccaaaaact taaaattgac  3920
tgcttttgca ggtattccat catactcatc aactagtata  3960
ttggctgctt cagaagatgg tcgtttcata tttagtcctg  4000
gtttatttcc taacctaaat cagtcagtct gtgacaacaa  4040
tgcactccct ttaatctgga ggggcctaat tgatttaacg  4080
ggatactatg aggcagtcca cccttgcaat gtgttctgtg  4120
tcttatcagg accaggtgct tcatgtgagg ccttttcaga  4160
aggaggtatt ttcaatatta cttctccaat gtgtctggtg  4200
tctaagcaaa atagatttag agcagctgag cagcagatta  4240
gctttgtctg ccaaagagtt gatatggata ttatagtgta  4280
ctgtaatggt cagaaaaaaa caatcctaac aaaaacatta  4320
gttataggcc aatgtattta tactattaca agtctctttt  4360
cactgttacc aggggttgcc cattctattg ctattgagtt  4400
gtgtgttcca gggtttcatg gctgggccac agctgcactt  4440
ttgattacat tctgcttcgg ctgggtattg attcctgcat  4480
gtacattagc tattctttta gtccttaagt tctttgcaaa  4520
tatccttcat acaagcaatc aagagaaccg attcaaagcc  4560
attctacgga aaataaagga ggagtttgaa aaaacaaagg  4600
gttccatggt ttgtgagatc tgtaagtatg agtgtgaaac  4640
attaaaggaa ttgaaggcac ataacctatc atgtgttcaa  4680
ggagagtgcc catattgctt tacccactgt gaaccgacag  4720
aaactgcaat tcaggcacat tacaaagttt gtcaagccac  4760
ccaccgattc agagaagatt taaaaaagac tgtaactcct  4800
caaaatattg ggccaggctg ttaccgaaca ctaaatcttt  4840
ttaggtataa aagtaggtgt tatattctga caatgtggac  4880
tcttcttctc attattgaat ccatcctctg ggcagcaagt  4920
gcagcagaaa tcccccttgt ccctctctgg acagataatg  4960
ctcatggcgt tgggagtgtt cctatgcata cggatcttga  5000
attagacttc tctttgccat ccagttctaa gtacacatac  5040
aaaagacatc tcacaaaccc agttaatgac caacagagtg  5080
tctcattgca tatagaaatt gaaagtcaag gcattggtgc  5120
tgctgttcat catcttggac attggtatga tgcaagattg  5160
aatctaaaaa cctcatttca ttgttatggt gcctgcacaa  5200
aatatcaata cccatggcac actgcaaaat gccattttga  5240
gaaagattat gagtatgaaa atagctgggc ttgcaacccc  5280
ccagattgcc caggggttgg tacaggttgt actgcttgtg  5320
gattatatct agatcaattg aagccggtag gaacagcctt  5360
taaaattata agtgtaagat acagtagaaa agtgtgcgtg  5400
cagtttggtg aagaacacct ttgtaaaaca attgatatga  5440
atgattgctt tgtgactagg catgccaaaa tatgtataat  5480
tgggactgta tctaagtttt ctcaaggtga cactctacta  5520
tttctggggc ccatggaagg aggtggtata atctttaaac  5560
actggtgtac atctacctgt cactttggag accctggtga  5600
tgtcatgggt ccaaaagata aaccatttat ttgccctgaa  5640
ttcccagggc aatttaggaa aaaatgtaac tttgccacaa  5680
ctccagtttg tgaatatgat ggaaacatta tatcaggcta  5720
taagaaagta cttgcaacaa ttgattcttt ccaatcattt  5760
aacacaagca atatacactt cactgatgag agaattgaat  5800
ggagagaccc tgatggcatg cttcgggatc atattaatat  5840
tgttatttct aaagatattg attttgaaaa tttggctgag  5880
aatccttgta aagtagggct ccaggcagca aacatagaag  5920
gtgcctgggg ttcaggtgtc gggtttacac tcacatgcaa  5960
ggtgtctctc acagaatgcc caacatttct tacatcaata  6000
aaggcctgtg acatggcaat ttgttatggt gcagaaagtg  6040
tgacactctc acgaggacaa aatactgtca aaattaccgg  6080
gaaaggtggc catagtggtt cttcattcaa atgctgtcat  6120
gggaaagaat gttcatcaac tggcctccaa gccagtgcac  6160
cacatctgga taaggtaaat ggtatctctg agttagaaaa  6200
cgagaaagtt tatgatgacg gtgcacctga atgtggcatt  6240
acttgttggt ttaaaaaatc aggtgaatgg gttatgggta  6280
taatcaatgg gaactgggtt gtcctaattg tcttgtgtgt  6320
actgctgctc ttttctctta tcctgttgag catcttgtgt  6360
cctgttagaa agcataaaaa atcataaatc ccacctaaca  6400
atcttcacat catgtatcga ttttcaaaca ctttatcatt  6440
tagaacttaa cttggcacta ctatctgata actgactttc  6480
atttttattt ttatatggat taattactaa aaaaaatact  6520
ctctcgtgcc gaattcgata tcaagcttat cgataccgtc  6560
gacctcgagg gggggcccgg tacccgggat cctcgcaatc  6600
cctaggagga ttaggcaagg gcttgagctc acgctcttgt  6640
gagggacaga aatacaatca ggggcagtat atgaatactc  6680
catggagaaa cccagatcta cgtatgatca gcctcgactg  6720
tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc  6760
cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc  6800
ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga  6840
gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga  6880
cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct  6920
ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa  6960
ccagctgggg ctcgacagct cgactctaga attgcttcct  7000
cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg  7040
agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc  7080
acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa  7120
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt  7160
gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat  7200
cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga  7240
caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc  7280
cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga  7320
tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt  7360
ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt  7400
cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt  7440
cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg  7480
agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc  7520
agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc  7560
ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct  7600
acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa  7640
gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc  7680
ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt  7720
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga  7760
agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg  7800
aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atcagattat  7840
caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg  7880
aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg  7920
tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct  7960
cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact  8000
c                                            8001
SEQ ID NO：4
亚克隆到DNA载体pWRG7077中的SEOV病毒株
SR-11的S基因组区段
gggggggggg ggcgctgagg tctgcctcgt gaagaaggtg    40
ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc catcatccag    80
ccagaaagtg agggagccac ggttgatgag agctttgttg   120
taggtggacc agttggtgat tttgaacttt tgctttgcca   160
cggaacggtc tgcgttgtcg ggaagatgcg tgatctgatc   200
cttcaactca gcaaaagttc gatttattca acaaagccgc   240
cgtcccgtca agtcagcgta atgctctgcc agtgttacaa   280
ccaattaacc aattctgatt agaaaaactc atcgagcatc   320
aaatgaaact gcaatttatt catatcagga ttatcaatac   360
catatttttg aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa   400
ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag atcctggtat   440
cggtctgcga ttccgactcg tccaacatca atacaaccta   480
ttaatttccc ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa   520
atcaccatga gtgacgactg aatccggtga gaatggcaaa   560
agcttatgca tttctttcca gacttgttca acaggccagc   600
cattacgctc gtcatcaaaa tcactcgcat caaccaaacc   640
gttattcatt cgtgattgcg cctgagcgag acgaaatacg   680
cgatcgctgt taaaaggaca attacaaaca ggaatcgaat   720
gcaaccggcg caggaacact gccagcgcat caacaatatt   760
ttcacctgaa tcaggatatt cttctaatac ctggaatgct   800
gttttcccgg ggatcgcagt ggtgagtaac catgcatcat   840
caggagtacg gataaaatgc ttgatggtcg gaagaggcat   880
aaatcccgtc agccagttta gtctgaccat ctcatctgta   920
acatcattgg caacgctacc tttgccatgt ttcagaaaca   960
actctggcgc atcgggcttc ccatacaatc gatagattgt  1000
cgcacctgat tgcccgacat tatcgcgagc ccatttatac  1040
ccatataaat cagcatccat gttggaattt aatcgcggcc  1080
tcgagcaaga cgtttcccgt tgaatatggc tcataacacc  1120
ccttgtatta ctgtttatgt aagcagacag ttttattgtt  1160
catgatgata tatttttatc ttgtgcaatg taacatcaga  1200
gattttgaga cacaacgtgg ctttcccccc ccccccggca  1240
tgcctgcagg tcgacataaa tcaatattgg ctattggcca  1280
ttgcatacgt tgtatctata tcataatatg tacatttata  1320
ttggctcatg tccaatatga ccgccatgtt gacattgatt  1360
attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta  1400
gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta  1440
cggtaaatgg cccgcctcgt gaccgcccaa cgacccccgc  1480
ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc  1520
caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt  1560
acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat  1600
atgccaagtc cggcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa  1640
tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg  1680
actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc  1720
tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta caccaatggg  1760
cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc  1800
accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa  1840
tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaataa ccccgccccg  1880
ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtctacgg tgggaggtct  1920
atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg  1960
gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac  2000
cgggaccgat ccagcctccg cggccgggaa cggtgcattg  2040
gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgacgt aagtaccgc  2080
ctatagactc tataggcaca cccctttggc tcttatgcat  2120
gctatactgt ttttggcttg gggcctatac acccccgctc  2160
cttatgctat aggtgatggt atagcttagc ctataggtgt  2200
gggttattga ccattattga ccactcccct attggtgacg  2240
atactttcca ttactaatcc ataacatggc tctttgccac  2280
aactatctct attggctata tgccaatact ctgtccttca  2320
gagactgaca cggactctgt atttttacag gatggggtcc  2360
catttattat ttacaaattc acatatacaa caacgccgtc  2400
ccccgtgccc gcagttttta ttaaacatag cgtgggatct  2440
ccacgcgaat ctcgggtacg tgttccggac atgggctctt  2480
ctccggtagc ggcggagctt ccacatccga gccctggtcc  2520
catgcctcca gcggctcatg gtcgctcggc agctccttgc  2560
tcctaacagt ggaggccaga cttaggcaca gcacaatgcc  2600
caccaccacc agtgtgccgc acaaggccgt ggcggtaggg  2640
tatgtgtctg aaaatgagct cggagattgg gctcgcaccg  2680
tgacgcagat ggaagactta aggcagcggc agaagaagat  2720
gcaggcagct gagttgttgt attctgataa gagtcagagg  2760
taactcccgt tgcggtgctg ttaacggtgg agggcagtgt  2800
agtctgagca gtactcgttg ctgccgcgcg cgccaccaga  2840
cataatagct gacagactaa cagactgttc ctttccatgg  2880
gtcttttctg cagtcaccgt ccaagcttgc ggccaattcg  2920
gcacgagaga gtagtagact ccctaaagag ctactacact  2960
aacaagaaaa atggcaacta tggaagaaat ccagagagaa  3000
atcagtgctc acgaggggca gcttgtgata gcacgccaga  3040
aggtcaagga tgcagaaaag cagtatgaga aggatcctga  3080
tgacttaaac aagagggcac tgcatgatcg ggagagtgtc  3120
gcagcttcaa tacaatcaaa aattgatgaa ttgaagcgcc  3160
aacttgccga cagattgcag cagggaagaa catccgggca  3200
ggaccgggat cctacagggg tagagccagg tgatcatctt  3240
aaggaaagat cagcactaag ctacgggaat acactggacc  3280
tgaatagtct tgacattgat gaacctacag gacagacagc  3320
tgattggctg accataattg tctatctgac atcattcgtg  3360
gtcccgatca tcttgaaggc actgtacatg ttaacaacac  3400
gaggtaggca gacttcaaag gacaacaagg ggatgaggat  3440
cagattcaag gatgacagct catatgagga tgtcaatgga  3480
atcagaaagc ccaaacatct gtatgtgtca atgccaaacg  3520
cccaatccag catgaaggct gaagagataa caccaggaag  3560
attccgcact gcagtatgtg gactatatcc tgcacagata  3600
aaggcaagga atatggtaag ccctgtcatg agtgtagttg  3640
ggttcttggc actggcaaaa gactggacat cgagaattga  3680
agaatggctc ggtgcaccct gcaaattcat ggcggagtct  3720
cttattgccg ggagtttatc tgggaatcct gtgaatcgtg  3760
actatatcag acagagacaa ggtgcacttg cagggatgga  3800
gccaaaggaa tttcaagccc tcaggcaaca ttcaaaggat  3840
gctggatgta cactagttga acatattgag tcaccatcat  3880
caatatgggt gtttgctggg gcccctgata ggtgtccacc  3920
aacatgcttg tttgtcggag ggatggctga attaggtgcc  3960
ttcttttcta tacttcagga tatgaggaac acaatcatgg  4000
cttcaaaaac tgtgggcaca gctgatgaaa agcttcgaaa  4040
gaaatcatca ttctatcaat catacctcag acgcacacaa  4080
tcaatgggaa tacaactgga ccagaggata attgttatgt  4120
ttatggttgc ctggggaaag gaggcagtgg acaactttca  4160
tctcggtgat gacatggatc cagagcttcg tagcctggct  4200
cagatcttga ttgaccagaa agtgaaggaa atctcaaacc  4240
aggaacctat gaaattataa gtacataaat atataatcaa  4280
tactaactat aggttaagaa atactaatca ttagttaata  4320
agaatataga tttattgaat aatcatatta aataattagg  4360
taagttaact agtatttagt taagttagct aattgattta  4400
tatgattgtc acaattaaat gtaatcataa gcacaatcac  4440
tgccatgtat aatcacgggt atacgggtgg ttttcatatg  4480
gggaacaggg tgggcttagg gccaggtcac cttaagtgac  4520
ctttttttgt atatatggat gtagatttca attgatcgaa  4560
tactaatcct actgtcctct tttcttttcc tttctccttc  4600
tttactaaca aactacctcg tgccgaattg gccgcggatc  4640
ctcgcaatcc ctaggaggat taggcaaggg cttgagctca  4680
cgctcttgtg agggacagaa atacaatcag gggcagtata  4720
tgaatactcc atggagaaac ccagatctac gtatgatcag  4760
cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg  4800
cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact  4840
cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc  4880
attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt  4920
ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc  4960
aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg gcttctgagg  5000
cggaaagaac cagctggggc tcgacagctc gactctagaa 5040
ttgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 5080
gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 5120
cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca 5160
tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 5200
ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 5240
gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 5280
gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 5320
tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 5360
cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg 5400
tggcgctttc tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc 5440
ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 5480
ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 5520
atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 5560
actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 5600
tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 5640
actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 5680
tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 5720
tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt 5760
tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 5800
atctcaagaa gatcctttga tattttctac ggggtctgac 5840
gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca 5880
tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 5920
ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 5960
taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg 6000
cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 6040
tgcctgactc                                  6050
SEQ ID NO:5
图9A中的质粒pWRG/SEO-M的序列
gcggccgc ggatctgcaggaattcggcacgag
agtagtagactccgcaagaaacagcagttaaagaacaataggatcatg
SEQ ID NO:6
24bp外源序列
ggatctgcaggaattcggcacgag
SEQ ID NO:7
pWRG/HTN-M(x)序列
GGGGGGGGGGGGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAATCGCCCCATCATCCAG
CCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCA
CGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGC
CGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATC
AAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAA
CTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTA
TTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAA
AGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACC
GTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAAT
GCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCT
GTTTTCCCGGGGATCGVAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCAT
AAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACA
ACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATAC
CCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACC
CCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGA
GATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCGGCGTGCCTGCAGGTCGACAATATTGGCTATTGGCCATTGCATA
CGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACT
AGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAA
TGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAG
GGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCA
AGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCC
TACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCATTACACCAATGGGCGTGGAT
AGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGG
GACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAG
CAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACC
GATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGA
CTCTATAGGCACACCCCTTTGGCTCTTATGCATGCTATACTGTTTTTGGCTTGGGGCCTATACACCCCCGCTTCCTTATG
CTATAGGTGATGGTATAGCTTAGCCTATAGGTGTGGGTTATTGACCATTATTGACCACTCCCCTATTGGTGACGATACTT
TCCATTACTAATCCATAACATGGCTCTTTGCCACAACTATCTCTATTGGCTATATGCCAATACTCTGTCCTTCAGAGACT
GACACGGACTCTGTATTTTTACAGGATGGGGTCCCATTTATTATTTACAAATTCACATATACAACAACGCCGTCCCCCGT
GCCCGCAGTTTTTATTAAACATAGCGTGGGATCTCCACGCGAATCTCGGGTACGTGTTCCGGACATGGGCTCTTCTCCGG
TAGCGGCGGAGCTTCCACATCCGAGCCCTGGTCCCATGCCTCCAGCGGCTCATGGTCGCTCGGCAGCTCCTTGCTCCTAA
CAGTGGAGGCCAGACTTAGGCACAGCACAATGCCCACCACCACCAGTGTGCCGCACAAGGCCGTGGCGGTAGGGTATGTG
TCTGAAAATGAGCTCGGAGATTGGGCTCGCACCGCTGACGCAGATGGAAGACTTAAGGCAGCGGCAGAAGAAGATGCAGG
CAGCTGAGTTGTTGTATTCTGATAAGAGTCAGAGGTAACTCCCGTTGCGGTGCTGTTAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCT
GAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCGCCACCAGACATAATAGCTGACAGACTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTT
TTCTGCAGTCACCGTCCAAGCTTGCGGCCGCGGATCTGCAGGAATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGC
AGTCAATCAGCAACATGGGGATATGGAAGTGGCTAGTGATGGCCAGTTTAGTATGGCCTGTTTTGACACTGAGAAATGTC
TATGACATGAAAATTGAGTGCCCCCATACAGTAAGTTTTGGGGAAAACAGTGTGATAGGTTATGTAGAATACCCCCCCGT
GCCATTGGCCGACACAGCACAGATGGTGCCTGAGAGTTCTTGTAGCATGGATAATCACCAATCGTTGAATACAATAACAA
AATATACCCAAGTAAGTTGGAGAGGAAAGGCTGATCAGTCACAGTCTAGTCAAAATTCATTTGAGACAGTGTCCACTGAA
GTTGACTTGAAAGGAACATGTGCTCTAAAACACAAAATGGTGGAAGAATCATACCGTAGTAGGAAATCAGTAACCTGTTA
CGACCTGTCTTGCAATAGCACTTACTGCAAGCCAACACTATACATGATTGTACCAATTCATGCATGCAATATGATGAAAA
GCTGTTTGATTGCATTGGGACCATACAGAGTACAGGTGGTTTATGAGAGATCTTATTGCATGACAGGAGTCCTGATTGAA
GGGAAATGCTTTGTCCCAGATCAAAGTGTGGTCAGTATTATCAAGCATGGGATCTTTGATATTGCAAGTGTTCATATTGT
ATGTTTCTTTGTTGCAGTTAAAGGGAATACTTATAAAATTTTTGAACAGGTTAAGAAATCCTTTGAATCAACATGCAATG
ATACAGAGAATAAAGTGCAAGGATATTATATTTGTATTGTAGGGGGAAACTCTGCACCAATATATGTTCCAACACTTGAT
GATTTCAGATCCATGGAAGCATTTACAGGAATCTTCAGATCACCACATGGGGAAGATCATGATCTGGCTGGAGAAGAAAT
TGCATCTTATTCTATAGTCGGACCTGCCAATGCAAAAGTTCCTCATAGTGCTAGCTCAGATACATTGAGCTTGATTGCCT
ATTCAGGTATACCATCTTATTCTTCCCTTAGCATCCTAACAAGTTCAACAGAAGCTAAGCATGTATTCAGCCCTGGGTTG
TTCCCAAAACTTAATCACACAAATTGTGATAAAAGTGCCATACCACTCATATGGACTGGGATGATTGATTTACCTGGATA
CTACGAAGCTGTCCACCCTTGTACAGTTTTTTGCGTATTATCAGGTCCTGGGGCATCATGTGAAGCCTTTTCTGAAGGCG
GGATTTTCAACATAACCTCTCCCATGTGCTTAGTGTCAAAACAAAATCGATTCCGGTTAACAGAACAGCAAGTGAATTTT
GTGTGTCAGCGAGTGGACATGGACATTGTTGTGTACTGCAACGGGCAGAGGAAAGTAATATTAACAAAAACTCTAGTTAT
TGGACAGTGTATATATACTATAACAAGCTTATTCTCATTACTACCTGGAGTAGCACATTCTATTGCTGTTGAATTGTGTG
TACCTGGGTTCCATGGTTGGGCCACAGCTGCTCTGCTTGTTACATTCTGTTTCGGATGGGTTCTTATACCAGCAATTACA
TTTATCATACTAACAGTCCTAAAGTTCATTGCTAATATTTTTCACACAAGTAATCAAGAGAATAGGCTAAAATCAGTACT
TAGAAAGATAAAGGAAGAGTTTGAAAAAACAAAAGGCTCAATGGTATGTGATGTCTGCAAGTATGAGTGTGAAACCTATA
AAGAATTAAAGGCACACGGGGTATCATGCCCCCAATCTCAATGTCCTTACTGTTTTACTCATTGTGAACCCACAGAAGCA
GCATTCCAAGCTCATTACAAGGTATGCCAAGTTACTCACAGATTCAGGGATGATCTAAAGAAAACTGTTACTCCTCAAAA
TTTTACACCAGGATGTTACCGGACACTAAATTTATTTAGATACAAAAGCAGGTGCTACATCTTTACAATGTGGATATTTC
TTCTTGTCTTAGAATCCATACTGTGGGCTGCAAGTGCATCAGAGACACCATTAACTCCTGTCTGGAATGACAATGCCCAT
GGGGTAGGTTCTGTTCCTATGCATACAGATTTAGAGCTTGATTTCTCTTTAACATCCAGTTCCAAGTATACATACCGTAG
GAAGTTAACAAACCCACTTGAGGAAGCACAATCCATTGACCTACATATTGAAATAGAAGAACAGACAATTGGTGTTGATG
TGCATGCTCTAGGACACTGGTTTGATGGTCGTCTTAACCTTAAAACATCCTTTCACTGTTATGGTGCTTGTACAAAGTAT
GAATACCCTTGGCATACTGCAAAGTGCCACTATGAAAGAGATTACCAATATGAGACGAGCTGGGGTTGTAATCCATCAGA
TTGTCCTGGGGTGGGCACAGGCTGTACAGCATGTGGTTTATACCTAGATCAACTGAAACCAGTTGGTAGTGCTTATAAAA
TTATCACAATAAGGTACAGCAGGAGAGTCTGTGTTCAGTTTGGGGAGGAAAACCTTTGTAAGATAATAGACATGAATGAT
TGTTTTGTATCTAGGCATGTTAAGGTCTGCATAATTGGTACAGTATCTAAATTCTCTCAGGGTGATACCTTATTGTTTTT
TGGACCGCTTGAAGGTGGTGGTCTAATATTTAAACACTGGTGTACATCCACATGTCAATTTGGTGACCCAGGAGATATCA
TGAGTCCAAAGACAAAGGTTTTTTATGCCCTGTAGTTTCCAGGTAGTTTCAGGAAGAAATGCAACTTTGCTACTACCCCT
ATTTGTGAGTATGATGGAAATATGGTCTCAGGTTACAAGAAAGTGATGGCGACAATTGATTCCTTCCAATCTTTTAATAC
AAGCACTATGCACTTCACTGATGAAAGGATAGAGTGGAAAGACCCTGATGGAATGCTAAGGGACCATATAAACATTTTAG
TAACGAAGGACATTGACTTTGATAACCTTGGTGAAAATCCTTGCAAAATTGGCCTACAAACATCTTCTATTGAGGGGGCC
TGGGGTTCTGGTGTGGGGTTCACATTAACATGTCTGGTATCACTAACAGAATGTCCTACCTTTTTGACCTCAATAAAGGC
TTGTGATAAGGCTATCTGTTATGGTGCAGAGAGTGTAACATTGACAAGAGGACAAAATACAGTCAAGGTATCAGGGAAAG
GTGGCCATAGTGGTTCAACATTTAGGTGTTGCCATGGGGAGGACTGTTCACAAATTGGACTCCATGCTGCTGCACCTCAC
CTTGACAAGGTAAATGGGATTTCTGAGATAGAAAATAGTAAAGTATATGATGATGGGGCACCCCAATGTGGGATAAAATG
TTGGTTTGTTAAATCAGGGGAATGGATTTCAGGGATATTACGTGGTAATTGGATTGTACTCATTGTCCTCTGTGTATTTC
TATTGTTCTCCTTGGTTTTACTAAGCATTCTCTGYCCCGTAAGGAAGCATAAAAAATCATAGCTAAATTCTGTGACTATC
CTGTTCTTATGTATAGCTTTAACATATATACTAATTTTTATATTCCAGTATACTCTATCTAACACACTAAAAAAAATAGT
AGCTTTCTAACCACAAAACGGATCTACGYATGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCC
CTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATT
GTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGG
CATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGACAGCTCGACTCTAGAATTG
CTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGG
TTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGC
CGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAA
ACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCTGFCCGCTT
ACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGT
GTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATC
GTCTTGAGTCCAACCCCGGAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTAT
GTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCT
GCTGAAGCCAGTTACCTTGGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTATGCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTT
TTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCT
CAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTA
AAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCAC
CTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTC
SEQIDNO:8
PWRG/AND-M(X)序列
GGGGGGGGGGGGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAATCGCCCCATCATCCAG
CCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCA
CGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGC
CGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATC
AAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAA
CTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTCGATTCCGACTCVGTCCAACATCAATACAACCTA
TTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAA
AGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACC
GTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAAT
GCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCT
GTTTTCCCGGGGATCGCAGTGTGAGTAACCATGCATCATCAAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCAT
AAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTACCATCTCATCTGTAACATCCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACA
ACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATGATTGTCGCACCTGATTGCCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATAC
CCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACC
CCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGA
GATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCGGCATGCCTGCAGGTCGACAATATTGGCTATTGGCCATTGCATA
CGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACT
AGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAA
TGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAG
GGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCA
AGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCCCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCC
TACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGAT
AGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGG
GACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAG
CAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACC
GATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGA
CTCTATAGGCACACCCCTTTGGCTCTTATGCATGCTATACTGTTTTTGGCTTGGGGCCTATACACCCCCGCTTCCTTATG
CTATAGGTGATGGTATAGCTTAGCCTATAGGTGTGGGTTATTGACCATTATTGACCACTCCCCTATTGGTGACGATACTT
TCCATTACTAATCCATAACATGGCTCTTTGCCACAACTATCTCTATTGGCTATATGCCAATACTCTGTCCTTCAGAGACT
GACACGGACTCTGTATTTTTACAGGATGGGGTCCCATTTATTATTTACAAATTCACATATACAACAACGCCGTCCCCCGT
GCCCGCAGTTTTTATTAAACATAGCGTGGGATCTCCACGCGAATCTCGGGTACGTGTTCCGGACATGGGCTCTTCTCCGG
TAGCGGCGGAGCTTCCACATCCGAGCCCTGGTCCCATGCCTCCAGCGGCTCATGGTCGCTCGGCAGCTCCTTGCTCCTAA
CAGTGGAGGCCAGACTTAGGCACAGCACAATGCCCACCACCACCAGTGTGCCGCACAAGGCCGTGGCGGTAGGGTATGTG
TCTGAAAATGAGCTCGGAGATTGGGCTCGCACCGCTGACGCAGATGGAAGACTTAAGGCAGCGGCAGAAGAAGATGCAGG
CAGCTGAGTTGTTGTATTCTGATAAGAGTCAGAGGTAACTCCCGTTGCGGTGCTGTTAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCT
GAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCGCCACCAGACATAATAGCTGACAGACTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTT
TTCTGCAGTCACCGTCCAAGCTTGCGGCCGCGGATCTGCAGGAATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCACGAAGAAGC
AAAAAATTAAAGAAGTGAGTTTAAAATGGAAGGGTGGTATCTGGTTGTTCTTGGAGTCTGCTATACGCTGACACTGGCAA
TGCCCAAGACCATTTATGAGCTTAAAATGGAATGCCCGCACACTGTGGGTCTCGGTCAAGGTTACATCATTGGCTCAACA
GAACTAGGTTTGATCTCAATTGAGGCTGCATCTGATATAAAGCTCGAGAGCTCTTGCAATTTTGATCTTCATACAACATC
TATGGCCCAGAAGAGTTTCACCCAAGTTGAATGGAGAAAGAAAAGTGACACAACTGATACCACAAATGCTGCGTCCACTA
CCTTTGAAGCACAAACTAAAACTGTTAACCTTAGAGGGACTTGTATACTGGCACCTGAACTCTATGATACATTGAAGAAA
GTAAAAAAGACAGTCCTGTGCTATGATCTAACATGTAATCAAACACATTGTCAGCCAACTGTCTATCTGATTGCACCTGT
ATTGACATGCATGTCAATAAGAAGTTGTATGGCTAGTGTGTTTACAAGCAGGATTCAGGTGATTTATGAAAAGACACATT
GTGTAACAGGTCAGCTGATTGAGGGTCAGTGTTTCAACCCAGCACACACATTGACATTATCTCAGCCTGCTCACACTTAT
GATACTGTCACCCTTCCTATCTCTTGTTTTTTCACACCAAAGAAGTCGGAGCAACTAAAAGTTATAAAAACATTTGAAGG
AATTCTGACGAAGACAGGTTGCACGGAGAATGCATTGCAGGGTTATTATGTGTGTTTTTTAGGGAGTCATTCAGAACCTT
TAATTGTTCCGAGTTTGGAGGACATACGGTCTGCTGAAGTTGTTAGTAGGATGCTTGTACACCCTAGGGGAGAAGACCAT
GATGCCATACAGAATTCACAAAGTCACTTAAGAATAGTGGGACCTATCACAGCAAAAGTGCCATCAACTAGTTCCACAGA
TACCCTAAAGGGGACAGCCTTTGCAGGCGTCCCAATGTATAGCTCTTTATCTACACTAGTCAGAAATGCAGACCCAGAAT
TTGTATTTTCTCCAGGTATAGTACCTGAATCTAATCACAGTACATGTGATAAGAAGACAGTACCTATCACATGGACAGGC
TACCTACCAATATCAGGTGAGATGGAAAAAGTGACTGGATGTACAGTTTTTTGTACACTAGCAGGACCTGGTGCTAGTTG
TGAGGCCTATTCTGAAAATGGTATATTTAACATCAGTTCTCCAACATGTCTTGTAAACAAAGTCCAAAGATTTCGTGGAT
CTGAACAGAAAATAAATTTTATCTGTCAGCGGGTAGATCAGGATGTTGTTGTATACTGCAATGGGCAAAAGAAAGTCATA
TTAACCAAAACTTTGGTTATTGGGCAGTGTATTTATACATTCACAAGCCTATTTTCATTGATGCCTGATGTAGCCCACTC
ATTGGCTGTAGAATTATGTGTCCCGGGATTACATGGGTGGCCCACTGTCATGCTTCTATCAACATTCTGCTTTGGGTGGG
TCTTGATTCCTGCGGTCACATTAATAATATTAAAGTGTCTAAGGGTTTTGACGTTTTCTTGTTCCCATTACACTAATGAG
TCAAAATTTAAATTCATCCTGGAAAAAGTTAAAATTGAATACCAAAAGACTATGGGATCAATGGTGTGCGATGTATGTCA
TCATGAGTGTGAAACAGCAAAAGAACTTGAATCACATAGACAGAGTTGTATCAATGGACAATGTCCTTATTGCATGACAA
TAACTGAAGCAACTGAAAGTGCCTTGCAAGCCCATTATTCCATTTGTAAATTGGCAGGAAGATTTCAGGAGGCACTGAAA
AAGTCACTTAAAAAGCCAGAGGTAAAAAAAGGTTGTTACAGAACACTCGGGGTATTTAGATATAAAAGTAGATGTTATGT
GGGTTTGGTATGGTGCCTATTGTTGACATGTGAAATTGTTATTTGGGCCGCAAGTGCAGAGACTCCACTAATGGAGTCAG
GCTGGTCAGATACGGCTCATGGTGTTGGTGAGATTCCAATGAAGACAGACCTCAGGCTGGACTTTTCACTGCCTTCTTCA
TCCTCTTACAGTTATAGGAGAAAGCTCACAAACCCAGCCAATAAAGAAGAGTCTATTCCCTTCCACTTCCAGATGGAAAA
ACAAGTAATTCATGCTGAAATCCAACCCCTGGGTCATTGGATGGATGCGACATTTAATATTAAGACTGCATTTCATTGTT
ATGGTGCATGCCAGAAATACTCTTATCCATGGCAGACATCTAAGTGCTTCTTTGAAAAGGACTACCAGTATGAAACAGGC
TGGGGCTGTTATCCTGGTGACTGCCCAGGGGTTGGGACTGGATGCACTGCTTGTGGTGTTTATCTCGATAAACTAAAATC
TGTTGGGAAGGCCTATAAGATAATTTCTTTAAAATATACCAGAAAGGTTTGTATTCAGTTAGGAACAGAACAAACTTGCA
AGCATATTGATGCAAATGATTGTTTAGTGACACCATCTGTGAAAGTTTGCATAGTGGGCACAGTTTCAAAACTTCAACCA
TCTGATACTCTTTTGTTCTTAGGTCCACTAGAACAAGGGGGAATCATTCTTAAGCAATGGTGCACAACATCATGTGCATT
TGGGGACCCTGGTGATATCATGTCCACTCCCAGTGGTATGAGGTGTCCAGAGCACACTGGATCATTTAGGAAAATTTGCG
GTTTTGCTACTACACCAGTTTGTGAATATCAAGGAAATACCATTTCTGGATATAAAAGAATGATGGCAACAAAAGATTCA
TTCCAATCATTTAACTTAACAGAACCTCACATCACAACAAACAAGCTTGAATGGATCGACCCAGATGGGAATACAAGAGA
CCACGTAAACCTTGTCTTAAATAGAGATGTCTCATTTCAGGATTTAAGTGATAACCCCTGTAAAGTAGACCTACACACAC
AAGCAATAGAAGGGGCATGGGGTTCTGGTGTAGGGTTTACACTCACATGTACTGTCGGATTAACAGAGTGCCCAAGTTTT
ATGACATCAATTAAGGCATGTGACCTAGCTATGTGTTATGGATCAACAGTAACAAACCTTGCCAGGGGCTCTAATACAGT
GAAAGTAGTTGGTAAAGGAGGCCATTCAGGGTCCTCATTTAAATGCTGTCATGATACAGATTGCTCCTCTGAAGGTTTAC
TTGCATCAGCCCCTCATCTTGAGAGGGTAACAGGATTCAATCAAATTGATTCAGATAAGGTTTATGATGATGGTGCACCA
CCTTGCACATTCAAATGCTGGTTCACTAAGTCAGGTGAGTGGCTTCTTGGGATCTTAAACGGGAATTGGATTGTTGTTGT
AGTGCTTGTTCTGATACTCATTCTCTCTATCATAATGTTCAGTGTTTTGTGTCCCAGGAGAGGGCACAAGAAAACTGTCT
AAGCATTGACCTCAACTCCTACATTAGATCATATACATTTATGCACTTCCTCATATTTAGCTGCACTAAGATATTAATAA
ACTCTAGTTATTGACTTTATAAGATTATTATGGAACTAACCTCACTTAAAAAAAACAAATACTTTACTCATATATAACTC
CATATTCTCTTACCGAGGATTTTGTTCCTGCGGAGCATACTACTAGGATCTACGTATGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCT
AGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTA
ATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGG
GGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGG
GGCTCGACAGCTCGACTCTAGAATTGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTAT
CAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAG
CAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAA
TCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGC
GCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGC
TCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGA
CCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTG
GTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGA
AGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACA
AACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTT
TGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGG
ATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAG
TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTC
SEQ ID NO：9
pWRG/HA-M 序列
GGGGGGGGGGGGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAATCGCCCCATCATCCAG
CCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCA
CGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGC
CGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATC
AAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAA
CTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTA
TTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAA
AGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACC
GTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAAT
GCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCT
GTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCAT
AAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACA
ACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATAC
CCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACC
CCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGA
GATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCGGCATGCCTGCAGGTCGACAATATTGGCTATTGGCCATTGCATA
CGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACT
AGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAA
TGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAG
GGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCA
AGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCC
TACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGAT
AGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGG
GACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAG
CAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACC
GATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGA
CTCTATAGGCACACCCCTTTGGCTCTTATGCATGCTATACTGTTTTTGGCTTGGGGCCTATACACCCCCGCTTCCTTATG
CTATAGGTGATGGTATAGCTTAGCCTATAGGTGTGGGTTATTGACCATTATTGACCACTCCCCTATTGGTGACGATACTT
TCCATTACTAATCCATAACATGGCTCTTTGCCACAACTATCTCTATTGGCTATATGCCAATACTCTGTCCTTCAGAGACT
GACACGGACTCTGTATTTTTACAGGATGGGGTCCCATTTATTATTTACAAATTCACATATACAACAACGCCGTCCCCCGT
GCCCGCAGTTTTTATTAAACATAGCGTGGGATCTCCACGCGAATCTCGGGTACGTGTTCCGGACATGGGCTCTTCTCCGG
TAGCGGCGGAGCTTCCACATCCCAGCCCTGGTCCCATGCCTCCAGCGGCTCATGGTCGCTCGGCAGCTCCTTGCTCCTAA
CAGTGGAGGCCAGACTTAGGCACAGCACAATGCCCACCACCACCAGTGTGCCGCACAAGGCCGTGGCGGTAGGGTATGTG
TCTGAAAATGAGCTCGGAGATTGGGCTCGCACCGCTGACGCAGATGGAAGACTTAAGGCAGCGGCAGAAGAAGATGCAGG
CAGCTGAGTTGTTGTATTCTGATAAGAGTCAGAGGTAACTCCCGTTGCGGTGCTGTTAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCT
GAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCGCCACCAGACATAATAGCTGACAGACTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTT
TTCTGCAGTCACCGTCCAAGCTTGCGGCCGCGGATCTGCAGGAATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGC
AGTCAATCAGCAACATGGGGATATGGAAGTGGCTAGTGATGGCCAGTTTAGTATGGCCTGTTTTGACACTGAGAAATGTC
TATGACATGAAAATTGAGTGCCCCCATACAGTAAGTTTTGGGGAAAACAGTGTGATAGGTTATGTAGAATTACCCCCCCT
GCCATTGGCCGACACAGCACAGATGGTGCCTGAGAGTTCTTGTAGCATGGATAATCACCAATCGTTGAATACAATAACAA
AATATACCCAAGTAAGTTGGAGAGGAAAGGCTGATCAGYCACAGTCTAGTCAAAATTCATTTGAGACAGTGTCCACTGAA
GTTGACTTGAAAGGAACATGTGCTCTAAAACACAAAATGGTGGAAGAATCATACCGTAGTAGGAAATCAGTAACCTGTTA
CGACCTGTCTTGCAATAGCACTTACTGCAAGCCAACACTATACATGATTGTACCAATTCATGCATGCAATATGATGAAAA
GCTGTTTGATTGCATTGGGACCATACAGAGTACAGGTGGTTTATGAGAGATCTTATTGCATGACAGGAGTCCTGATTGAA
GGGAAATGCTTTGTCCCAGATCAAAGTGTGGTCAGTATTATCAAGCATGGGATCTTTGATATTGCAAGTGTTCATATTGT
ATGTTTCTTTGTTGCAGTTAAAGGGAATACTTATAAAATTTTTGAACAGGTTAAGAAATCCTTTGAATCAACATGCAATG
ATACAGAGAATAAAGTGCAAGGATATTATATTTGTATTGTAGGGGGAAACTCTGCACCAATATATGTTCCAACACTTGAT
GATTTCAGATCCATGGAAGCATTTACAGGAATCTTCAGATCACCACATGGGGAAGATCATGATCTGGCTGGAGAAGAAAT
TGCATCTTATTCTATAGTCGGACCTGCCAATGCAAAAGTTCCTCATAGTGCTAGCTCAGATACATTGAGCTTGATTGCCT
ATTCAGGTATACCATCTTATTCTTCCCTTAGCATCCTAACAAGTTCAACAGAAGCTAAGCATGTATTCAGCCCTGGGTTG
TTCCCAAAACTTAATCACACAAATTGTGATAAAAGTGCCATACCACTCATATGGACTGGGATGATTGATTTACCTGGATA
CTACGAAGCTGTCCACCCTTGTACAGTTTTTTGCGTATTATCAGGTCCTGGGGCATCATGTGAAGCCTTTTCTGAAGGCG
GGATTTTCAACATAACCTCTCCCATGTGCTTAGTGTCAAAACAAAATCGATTCCGGTTAACAGAACAGCAAGCGAATTTT
GTGTGTCAGCGAGTGGACATGGACATTGTTGTGTACTGCAACGGGCAGAGGAAAGTAATATTAACAAAAACTCTAGTTAT
TGGACAGTGTATATATACTATAACAAGCTTATTCTCATTACTACCTGGAGTAGCACATTCTATTGCTGTTGAATTGTGTG
TACCTGGGTTCCATGGTTGGGCCACAGCTGCTCTGCTTGTTACATTCTGTTTCGGATGGGTTCTTATACCAGCAATTACA
TTTATCATACTAACAGTCCTAAAGTTCATTGCTAATATTTTTCACACAATTAATCAAGAGAATAGGCTAAAATCAGTACT
TAGAAAGATAAAGGAAGAGTTTGAAAAAACAAAAGGCTCAATGGTATGTGATGTCTGCAAGTATGAGTGTGAAACCTATA
AAGAATTAAAGGCACACGGGGTATCATGCCCCCAATCTCAATGTCCTTACTGTTTTACTCATTGTGAACCCACAGAAGCA
GCATTCCAAGCTCATTACAAGGTATGCCAAGTTACTCACAGATTCAGGGATGATCTAAAGAAAACTGTTACTCCTCAAAA
TTTTACACCAGGATGTTACCGGACACTAAATTTATTTAGATACAAAAGCAGGTGCTACATCTTTACAATGTGGATATTTC
TTCTTGTCTTAGAATCCATACTGTGGGCTGCAAGTGCATCAGAGACACCATTAACTCCTGTCTGGAATGACAATGCCCAT
GGGGTAGGTTCTGTTCCTATGCATACAGATTTAGAGCTTGATTTCTCTTTAACATCCAGTTCCAAGTATACATACCGTAG
GAAGTTAACAAACCCACTTGAGGAAGCACAATCCATTGACCTACATATTGAAATAGAAGAACAGACAATTGGTGTTGATG
TGCATGCTCTAGGACACTGGTTTGATGGTCGTCTTAACCTTAAAACATCCTTTCACTGTTATGGTGCTTGTACAAACTAT
GAATACCCTTGGCATACTGCAAAGTGCCACTATGAAAGAGATTACCAATATGAGACGAGCTGGGGTTGTAATCCATCAGA
TTGTCCTGGGGTGGGCACAGGCTGTACAGCATGTGGTTTATACCTAGATCAACTGAAACCAGTTGGTAGTGCTTATAAAA
TTATCACAATAAGGTACAGCAGGAGAGTCTGTGTTCAGTTTGGGGAGGAAAACCTTTGTAAGATAATAGACATGAATGAT
TGTTTTGTATCTAGGCATGTTAAGGTCTGCATAATTGGTACAGTATCTAAATTCTCTCAGGGTGATACCTTATTGTTTTT
TGGACCGCTTGAAGGTGGTGGTCTAATATTTAAACACTGGTGTACATCCACATGTCAATTTGGTGACCCAGGAGATATCA
TGAGTCCAAGAGACAAAGGTTTTTTATGCCCTGAGTTTCCAGGTAGTTTCAGGAAGAAATGCAACTTTGCTACTACCCCT
ATTTGTGAGTATGATGGAAATATGGTCTCAGGTTACAAGAAAGTGATGGCGACAATTGATTCCTTCCAATCTTTTAATAC
AAGCACTATGCACTTCACTGATGAAAGGATAGAGTGGAAAGACCCTGATGGAATGCTAAGGGACCATATAAACATTTTAG
TAACGAAGGACATTGACTTTGATAACCTTGGTGAAAATCCTTGCAAAATTGGCCTACAAACATCTTCTATTGAGGGGGCC
TGGGGTTCTGGTGTGGGGTTCACATTAACATGTCTGGTATCACTAACAGAATGTCCTACCTTTTTGACCTCAATAAAGGC
TTGTGATAAGGCTATCTGTTATGGTGCAGAGAGTGTAACATTGACAAGAGGACAAAATACAGTCAAGGTATCAGGGAAAG
GTGGCCATAGTGGTTCAACATTTAGGTGTTGCCATGGGGAGGACTGTTCACAAATTGGACTCCATGCTGCTGCACCTCAC
CTTGACAAGGTAAATGGGATTTCTGAGATAGAAAATAGTAAAGTATATGATGATGGGGCACCGCAATGTGGGATAAAATG
TTGGTTTGTTAAATCAGGGGAATGGATTTCAGGGATATTCAGTGGTAATTGGATTGTACTCATTGTCCTCTGTGTATTTC
TATTGTTCTCCTTGGTTTTACTAAGCATTCTCTGTCCCGTAAGGAAGCATAAAAAATCATAGCTAAATTCTGTGACTATC
CTGTTCTTATGTATAGCTTTAACATATATACTAATTTTTATATTCCAGTATACTCTATCTAACACACTAAAAAAAATACT
AGCTTTCTAACCACAAAACGGATCTACGTATGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCC
CTCCCCCCTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATT
GTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGG
CATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGACAGCTCGACTCTAGAGCAG
GTCGACAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAAT
ATGACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATA
TGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATA
ATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCA
CTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATT
ATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATG
CGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAA
TGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCG
GTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGC
TGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCC
TGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGACTCTATAGGCACACCCCTTTGGCTCTTATGCATGCTATACTGTTTTTGG
CTTGGGGCCTATACACCCCCGCTTCCTTATGCTATAGGTGATGGTATAGCTTAGCCTATAGGTGTGGGTTATTGACCATT
ATTGACCACTCCCCTATTGGTGACGATACTTTCCATTACTAATCCATAACATGGCTCTTTGCCACAACTATCTCTATTGG
CTATATGCCAATACTCTGTCCTTCAGAGACTGACACGGACTCTGTATTTTTACAGGATGGGGTCCCATTTATTATTTACA
AATTCACATATACAACAACGCCGTCCCCCGTGCCCGCAGTTTTTATTAAACATAGCGTGGGATCTCCACGCGAATCTCGG
GTACGTGTTCCGGACATGGGCTCTTCTCCGGTAGCGGCGGAGCTTCCACATCCGAGCCCTGGTCCCATGCCTCCAGCGGC
TCATGGTCGCTCGGCAGCTCCTTGCTCCTAACAGTGGAGGCCAGACTTAGGCACAGCACAATGCCCACCACCACCAGTGT
GCCGCACAAGGCCGTGGCGGTAGGGTATGTGTCTGAAAATGAGCTGCGGAGCTGGGCTCGCACCGCTGACGCAGATGGAA
GACTTAAGGCAGCGGCAGAAGAAGATGCAGGCAGCTGAGTTGTTGTATTCTGATAAGAGTCAGAGGTAACTCCCGTTGCG
GTGCTGTTAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCGCCACCAGACAGAATAGCTGACA
GACTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTTTTCTGCAGTCACCGTCCAAGCTTGCGGCCGCGGATCTGCAGGAATTCGG
CACGAGAGTAGTAGACTCCGCACGAAGAAGCAAAAAAATTAAAGAAGTGAGTTTAAAATGGAAGGGTGGTATCTGGTGTT
CTTGGAGTCTGCTATACGCTGACACTGGCAATGCCCAAGACCATTTATGAGCTTAAAATGGAATGCCCGCACACTGTGGG
TCTCGGTCAAGGTTACATCATTGGCTCAACAGAACTAGGTTTGATCTCAATTGAGGCTGCATCTGATATAAAGCTCGAGA
GCTCTTGCAATTTTGATCTTCATACAACATCTATGGCCCAGAAGAGTTTCACCCAAGTTGAATGGAGAAAGAAAACTGAC
ACAACTGATACCACAAATGCTGCGTCCACTACCTTTGAAGCACAAACTAAAACTGTTAACCTTAGAGGGACTTGTATACT
GGCACCTGAACTCTATGATACATTGAAGAAAGTAAAAAACACAGTCCTGTGCTATGATCTAACATGTAATCAAACACATT
GTCAGCCAACTGTCTATCTGATTGCACCTGTATTGACATGCATGTCAATAAGAAGTTGTATGGCTAGTGTGTTTACAAGC
AGGATTCAGGTGATTTATGAAAAGACACATTGTGTAACAGGTCAGCTGATTGAGGGTCAGTGTTTCAACCCAGCACACAC
ATTGACATTATCTCAGCCTGCTCACACTTATGATACTGTCACCCTTCCTATCTCTTGTTTTTTCACACCAAAGAAGTCGG
AGCAACTAAAAGTTATAAAAACATTTGAAGGAATTCTGACGAAGACAGGTTGCACGGAGAATGCATTGCAGGGTTATTAT
GTGTGTTTTTTAGGAAGTCATTCAGAACCTTTAATTGTTCCGAGTTTGGAGGACATACGGTCTGCTGAAGTTGTTAGTAG
GATGCTTGTACACCCTAGGGGAGAAGACCATGATGCCATACAGAATTCACAAACTCACTTAAGAATAGTGGGACCTATCA
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AAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTT
CGTTCATCCATAGTTGCCTGACTC
SEQ ID NO:10
引物0，
5’-GCGCGCGGCCGCAGTAGTAGACTCCGCAAGAAAC
SEQ ID NO:11
反向引物，
5’-GCGCGGATCCCGGGTACCGGGCCCCCCCTCG
SEQ ID NO:12
引物1-24，
5’GGCCGCGGCCGCGGATCTGCAGGAATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCC
GCAAGAAACAGCA
SEQ ID NO:13
引物24-1，
5’-GGCCGCGGCCGCGAGCACGGCTTAAGGACGTCTAGGAGTAGTAGTC
TCCGCAAGAAACAGCA
SEQ ID NO:14
引物1-12
5’-GGCCGCGGCCGCATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCAAGAA
ACAGCA
SEQ ID NO：15
引物13-24，
5′GGCCGCGGCCGCGGATCTGCAGTAGTAGACT
CCGCAAGAAACAGCA
SEQ ID NO：16
引物1-24*，
5′GGCCGCGGCCGCGGATCTGCCCGAATTCGGCACGGAGAGTAGTAGACTC
CGCAAGAAACAGCA
SEQ ID NO：17
引物1-8，
5 ′GGCCGCGGCCGCGGATCTGCAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCA
SEQ ID NO：18
SEOMX，
5′-GCGCGGATCCAGATTGGGAGATAGAAGAGAG
SEQ ID NO：19
M5B，
5′-TCAGGACTCCTGTCATGCAATAAGATCTC
SEQ ID NO：20
HTNMX，
5′-GCGCGGATCCGTTTGTGGTTAGAAAGCTAC
SEQ ID NO：21
SN-Fj，
5′-GGCC GCGGCCGCGGATCTGCAGGAATTCGGCACGAGAGTAG
TAGACTCCGCACGAAGAAGC
SEQ ID NO：22
PUUM-R，
5′-GCGC GGATCCTAGTAGTATGCTCCGCAGGAAC

Claims (61)

1.如SEQ ID NO：6中所示的核酸。
2.DNA片段，编码汉坦病毒M基因区段以及权利要求1所述的序列。
3.DNA片段，编码汉城病毒M基因区段以及权利要求1所述的序列。
4.DNA片段，编码安地斯病毒M基因区段以及权利要求1所述的序列。
5.一种重组DNA构建体，包括：
i)载体，
ii)至少一种汉坦病毒属病毒M基因核酸片段，以及
iii)权利要求1所述的核酸片段。
6.根据权利要求5所述的重组DNA构建体，其中所述的构建体是如SEQ ID NO：1中所示的pWRG/SEO-M。
7.根据权利要求5所述的重组DNA构建体，其中所述的构建体是如SEQ ID NO：7中所示的pWRG/HTN-M(x)。
8.根据权利要求5所述的重组DNA构建体，其中所述的构建体是如SEQ ID NO：8中所示的pWRG/AND-M(x)。
9.根据权利要求5所述的重组DNA构建体，其中所述的构建体包括两种所述的汉坦病毒属病毒M基因核酸片段。
10.根据权利要求9所述的重组DNA构建体，其中所述的构建体是如SEQ ID NO：9中所示的pWRG/HA-M。
11.一种组合物，包括惰性粒子，以及包被在惰性粒子上形成核酸包被的粒子的核酸，所述核酸包括能在哺乳动物细胞中操作的启动子和汉坦病毒属病毒多核苷酸M区段，该区段编码一或多种汉坦病毒属病毒的G1和G2蛋白。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述的汉坦病毒属病毒选自汉城病毒，多布拉伐病毒，普马拉病毒，汉坦病毒，辛诺柏病毒，黑渠港病毒，长沼病毒，纽约病毒，安地斯病毒和Laguna Negra病毒。
13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述核酸进一步包括如SEQ ID NO：6中所示的序列。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述汉坦病毒属病毒是SEOV。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述核酸是如SEQ IDNO：1中所示的pWRG/SEO-M。
16.根据权利要求13所述的组合物，其中所述汉坦病毒属病毒是HTNV。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述核酸是如SEQ IDNO：7中所示的pWRG/HTN-M(x)。
18.根据权利要求13所述的组合物，其中所述汉坦病毒属病毒是ANDV。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述核酸是如SEQ IDNO：8中所示的pWRG/AND-M。
20.根据权利要求11所述的组合物，其中所述核酸包括两种汉坦病毒属病毒的M区段。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述两种汉坦病毒属病毒是HTNV和ANDV。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述核酸是如SEQ IDNO：9中所示的pWRG/HA-M。
23.一种在哺乳动物中诱导抗汉坦病毒属病毒感染的保护性免疫反应的方法，包括：
在体内促进权利要求11所述的组合物进入哺乳动物表皮细胞，以便所述核酸能表达。
24.一种在哺乳动物中诱导抗SEOV，HTNV，DOBV感染的保护性免疫反应的方法，包括：
在体内促进权利要求15所述的组合物进入哺乳动物表皮细胞，以便所述核酸能表达。
25.一种在哺乳动物中诱导抗HTNV，SEOV，以及DOBV感染的保护性免疫反应的方法，包括：
在体内促进权利要求17所述的组合物进入哺乳动物表皮细胞，以便所述核酸能表达。
26.一种在哺乳动物中诱导抗ANDV，SNV，以及BCCV感染的保护性免疫反应的方法，包括：
在体内促进权利要求19所述的组合物进入哺乳动物表皮细胞，以便所述核酸能表达。
27.一种在哺乳动物中诱导抗HTNV，SEOV，DOBV，ANDV，SNV，以及BCCV感染的保护性免疫反应的方法，包括：
在体内促进权利要求22所述的组合物进入哺乳动物表皮细胞，以便所述核酸能表达。
28.一种抗SEOV，DOBV，以及HTNV感染的疫苗，所述疫苗包括权利要求15所述的组合物。
29.一种抗SEOV，DOBV，以及HTNV感染的疫苗，所述疫苗包括权利要求17所述的组合物。
30.一种抗ANDV，SNV，以及BCCV感染的疫苗，所述疫苗包括权利要求19所述的组合物。
31.一种抗SEOV，HTNV，DOBV，ANDV，SNV，以及BCCV感染的疫苗，所述疫苗包括权利要求22所述的组合物。
32.一种防止多于一种HFRS汉坦病毒属病毒感染的多价疫苗，包括组合物，所述组合物含有惰性粒子，在所述惰性粒子上包被了核酸，所述核酸含有两种或多种不同汉坦病毒属病毒的M区段，每个M区段编码来自各自汉坦病毒属病毒的G1和G2，并且可操作地连接在启动子上，这些启动子在哺乳动物细胞中有活性。
33.根据权利要求32所述的多价疫苗，其中所述汉坦病毒属病毒选自SEOV，PUUV，HTNV和DOBV。
34.一种防止多于一种HFRS汉坦病毒属病毒感染的多价疫苗，包括组合物，所述组合物含有两种或多种惰性粒子，每种惰性粒子上包被了核酸，所述核酸含有HFRS相关汉坦病毒属病毒的M区段，所述M区段编码G1和G2蛋白，并且可操作地连接在启动子上，这些启动子在哺乳动物细胞中有活性，其中所述M区段选自不同的汉坦病毒属病毒。
35.根据权利要求34所述的多价疫苗，其中所述汉坦病毒属病毒选自HTNV，DOBV，PUUV和SEOV。
36.一种防止多于一种HPS汉坦病毒属病毒感染的多价疫苗，包括组合物，所述组合物含有惰性粒子，在所述惰性粒子上包被了核酸，所述核酸含有两种或多种不同HPS相关汉坦病毒属病毒的M区段，每个M区段编码来自各自汉坦病毒属病毒的G1和G2，并且可操作地连接在启动子上，这些启动子在哺乳动物细胞中有活性。
37.根据权利要求36所述的多价疫苗，其中所述汉坦病毒属病毒选自ANDV，SNV，以及BCCV。
38.一种防止多于一种HPS汉坦病毒属病毒感染的多价疫苗，包括组合物，所述组合物含有两种或多种惰性粒子，在每种惰性粒子包被了核酸，所述核酸含有HPS相关汉坦病毒属病毒的M区段，所述M区段编码G1和G2蛋白，并且可操作地连接在启动子上，这些启动子在哺乳动物细胞中有活性，其中所述M区段选自不同汉坦病毒属病毒。
39.根据权利要求38所述的多价疫苗，其中所述汉坦病毒属病毒选自ANDV，SNV，以及BCCV。
40.一种防止多于一种HFRS和HPS汉坦病毒属病毒感染的多价疫苗，包括组合物，所述组合物含有两种或多种惰性粒子，在每种惰性粒子上包被了核酸，所述核酸含有汉坦病毒属病毒的M区段，所述M区段编码G1和G2蛋白，并且可操作地连接在启动子上，这些启动子在哺乳动物细胞中有活性，其中所述M区段选自不同汉坦病毒属病毒，这些汉坦病毒属病毒包括至少一种HPS相关汉坦病毒属病毒和至少一种HFRS相关汉坦病毒属病毒。
41.根据权利要求40所述的多价疫苗，其中所述汉坦病毒属病毒选自ANDV，HTNV，以及SEOV。
42.一种防止多于一种HFRS和HPS汉坦病毒属病毒感染的多价疫苗，包括组合物，所述组合物含有惰性粒子，所述惰性粒子上包被了两种或多种核酸，每个核酸含有汉坦病毒属病毒的M区段，所述M区段编码G1和G2蛋白，并且可操作地连接在启动子上，这些启动子在哺乳动物细胞中有活性，其中所述M区段选自不同汉坦病毒属病毒，这些汉坦病毒属病毒包括至少一种HPS相关汉坦病毒属病毒和至少一种HFRS相关汉坦病毒属病毒。
43.根据权利要求42所述的多价疫苗，其中所述汉坦病毒属病毒选自ANDV，HTNV，以及SEOV。
44.一种组合物，含有一群受接种者的多克隆抗体，受接种者接种了DNA疫苗，该疫苗含有能表达汉坦病毒属病毒M基因区段的质粒。
45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述的汉坦病毒属病毒选自汉城病毒，多布拉伐病毒，普马拉病毒，汉坦病毒，辛诺柏病毒，黑渠港病毒，长沼病毒，纽约病毒，安地斯病毒和Laguna Negra病毒。
46.根据权利要求44所述的组合物，其中所述疫苗含有pWRG/SEO-M。
47.根据权利要求44所述的组合物，其中所述疫苗含有pWRG/HTN-M(x)。
48.根据权利要求44所述的组合物，其中所述疫苗含有pWRG/AND-M。
49.根据权利要求44所述的组合物，其中所述疫苗含有pWRG/HA-M。
50.根据权利要求44所述的组合物，其中所述组合物能在供试者体内抑制汉坦病毒属病毒感染。
51.根据权利要求50所述的组合物，其中所述供试者是哺乳动物。
51.根据权利要求44所述的组合物，其中当所述组合物在感染汉坦病毒属病毒后施用给供试者时，能改善汉坦病毒属病毒感染症状。
52.根据权利要求51所述的组合物，其中所述供试者是哺乳动物。
53.根据权利要求44所述的组合物，其中所述多克隆抗体在体外能中和汉坦病毒属病毒。
54.一种改善汉坦病毒属病毒感染症状的治疗用组合物，包括权利要求44所述的组合物，以及可药用的赋形剂。
55.一种抗汉坦病毒属病毒感染的被动疫苗，包括权利要求44所述的组合物。
56.一种抗汉坦病毒属病毒的组合物，包括来自接种了DNA疫苗的受接种者的多克隆抗体和可药用的载体，所述DNA疫苗包括汉坦病毒属病毒M区段，所述多克隆抗体的数量足以抑制汉坦病毒属病毒感染。
57.一种治疗汉坦病毒属病毒感染的方法，包括给需要这种治疗的患者使用有效量的权利要求54所述的组合物。
58.一种检测汉坦病毒属病毒感染的方法，包括将疑似感染汉坦病毒属病毒的供试者样品和权利要求44所述的抗体接触，以及通过检测汉坦病毒属病毒抗原及其特异抗体之间形成的复合物的存在与否来确定是否存在汉坦病毒属病毒感染。
59.一种诊断汉坦病毒属病毒感染的方法，包括下列步骤：
(i)将疑似感染汉坦病毒属病毒的个体的样品和权利要求44所述的组合物接触，并且
(ii)通过检测汉坦病毒属病毒抗原及其特异抗体之间形成的复合物的存在与否来确定是否存在汉坦病毒属病毒感染。
60.一种汉坦病毒属病毒感染诊断试剂盒，包括权利要求44所述的组合物和助剂，所述助剂适合用于检测样品中是否存在汉坦病毒属病毒抗原。
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