JP2013512256A - 腸内細菌関連ペプチドの発現に関する組成物、方法、および使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、PCT出願であり、2009年11月24日に出願された米国仮特許出願第61/264,144号の利益を主張する。米国特許法119条(e)に従って、この先行出願は、すべての目的のために、その全体が本明細書中で参考として援用される。
本発明の実施形態は、腸内細菌関連ペプチドを有する構築物を生成および発現するための方法、組成物および使用を報告する。いくつかの実施形態において、腸内細菌関連ペプチドとしては、ペスト関連ペプチドが挙げられるが、これに限定されない。特定の実施形態において、本発明は、限定されずに、腸内細菌関連ペプチドを発現する弱毒化または改変されたワクシニアウイルスベクターを含む構築物を作製および使用するための方法を開示する。
ウイルス感染症に対して保護するためのワクチンは、ヒト疾患の発生を低減するために有効に使用されてきた。ウイルスワクチンについての最も成功した技術の1つは、弱められた、または弱毒化されたウイルスの株(「生の弱毒化されたウイルス」)で動物またはヒトを免疫することである。免疫処置後の限定された複製に起因して、上記弱毒化された株は、疾患を引き起こさない。しかし、上記限定されたウイルス複製は、ウイルス抗原の完全なレパートリー(repertoire)を発現するのに十分であり、そのウイルスに対して効力があって長期にわたる免疫応答を生成する。従って、上記ウイルスの病原性株に対する引き続きの曝露の際に、免疫された個体は、疾患から保護される。これらの生の弱毒化されたウイルスワクチンは、公衆衛生において使用される最も成功したワクチンの中の1つである。
本明細書中で使用されるとき、「a」または「an」は、項目の1つまたは1つよりも多くを意味し得る。
以下のセクションにおいて、種々の例示的な組成物および方法が、種々の実施形態を詳述するために記載される。種々の実施形態を実施することは、本明細書中で概説される詳細の全てまたはいくつかさえを用いることを必要としないが、むしろ濃度、回数、および他の詳細が、ごく普通の実験法を通して改変され得るということは、当業者に明らかである。いくつかの場合において、周知の方法または構成要素は、本説明において含まれていない。
ペストは、元来、ノミによって伝播される野生のげっ歯類の疾患であるが、それは、ヒト、家庭用ペット、および野生動物も苦しめ得る。上記疾患は、歴史を通してヒトおよび動物集団を打ちのめした。近年、それは、世界の多くの地方において、深刻な大流行を引き起こし、その結果、ヒトの死亡および深刻な経済損失をもたらしている。Yersinia pestisisは、米国南西部、東南アジア、東欧、中央および南アフリカ、ならびに南アメリカにおいて、野生のげっ歯類集団中にはびこり、これらの地域におけるヒト集団は、高度に感受性がある。米国において、ペストは、西部の州に広がり、リス、野生のマウス、およびプレーリードッグにおいて重大な死亡率が生じている。家庭用ネコもY.pestis感染に対して感受性があり、それらは、ヒトにおけるペストの多くの近年の症例において、感染源として同定されている。
ポックスウイルス(Poxviridae科のメンバー)は、科として、脊椎動物および無脊椎動物の両方に感染し得るウイルスである。ヒトに感染し得るポックスウイルスの4つの公知の属が存在する:オルトポックス、パラポックス、ヤタポックス、モルシポックス。オルトポックスとしては、痘瘡(variola)ウイルス、ワクシニアウイルス、ウシポックスウイルス、サルポックスウイルス、および痘瘡(smallpox)が挙げられるが、これらに限定されない。パラポックスとしては、オルフウイルス、偽ウシポックス(pseudocowpox)、ウシ丘疹性口内炎ウイルス;ヤタポックス:タナポックスウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。モルシポックスとしては、伝染性軟属腫ウイルス(MCV)が挙げられるが、これに限定されない。より一般的なポックスウイルス(oixvirus)は、ワクシニアおよび伝染性軟属腫であるが、サルポックス感染が上昇中のようである。
本発明の特定の実施形態は、ワクチン組成物において、改変または弱毒化された、オルトポックスウイルスを使用することを含み得る。オルトポックスウイルスは、哺乳動物から単離された多くの病原体(agent)を含むポックスウイルス科の属であり、ワクシニア、サルポックス、ウシポックス、ラクダポックス、アザラシポックスウイルス、スイギュウポックスウイルス、アライグマポックスウイルス、スカンクポックスウイルス、ハタネズミポックスウイルス、およびエクトロメリアウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ポックスウイルス科のメンバーは、大きな線状二本鎖DNAを有し、ゲノムサイズは、130kbp〜300kbpに範囲が及ぶ。上記属のメンバーのうちの1つは、痘瘡(smallpox)を引き起こす痘瘡(variola)ウイルスである。痘瘡(smallpox)は、ワクチンとして、別のオルトポックスウイルスである上記ワクシニアウイルスを用いて以前に根絶された。
本発明におけるいくつかの実施形態は、予め決定された遺伝子または遺伝子セグメントを発現することが可能である弱毒化ポックスウイルス(例えば、改変されたワクシニアウイルスアンカラ(MVA)、NYVAC、LC16m8、またはCVI−78)に由来する組換えのワクシニアウイルスを使用する組成物および方法を報告する。当業者は、他の弱毒化ポックスウイルスは、例えば、細胞培養における連続継代によって、またはポックスウイルス遺伝子の故意の欠失もしくは当該分野において公知である他の方法によって生成され得ることを認識する。特定の実施形態において、予め決定された遺伝子は、MVAゲノムにおける天然に存在する欠失部位に挿入され得る。他の実施形態において、組換えのMVAウイルスは、例えば、ワクチン組成物を投与された被験体において免疫応答を誘導することが可能である、上記ワクチン組成物に使用する、ポリペプチド(例えば、抗原)の生産のため、または抗原をコードするために使用され得る。
いくつかの実施形態は、必要に応じて、エンハンサー、例えば、翻訳調節配列を含み得る。特定の実施形態において、翻訳調節配列としては、内部リボソーム進入部位(IRES)(例えば、EMCV−IRES)が挙げられ得る。ウイルスのIRESは、4つの群に分類され得る:群1(コオロギ麻痺ウイルス(CrPV)、チャバネアオカメムシ腸管ウイルス(PSIV)、およびタウラ症候群ウイルス(TSV));群2(C型肝炎ウイルス、(HCV)、古典的ブタコレラウイルス(CSFV)、およびブタテッショウウイルス1(PTV−1));群3(脳心筋炎ウイルス(EMCV)、口蹄疫ウイルス(FMDV)、およびタイラーマウス脳脊髄炎ウイルス(TMEV));ならびに群4(ポリオウイルス(PV)およびライノウイルス(RV))。他の実施形態において、ウイルスのコード配列に対して5’側に見出されるウイルスの非翻訳領域(UTR)は、翻訳を指揮するために使用され得る。当該分野において公知のウイルス構築物での使用のあらゆる翻訳調節配列が企図される。特定の実施形態において、ウイルスの内部リボソーム進入部位(IRES)は、本明細書中に企図されるペスト抗原の発現を増加させるために使用され得る。IRES配列は、メッセンジャーRNA分子において、終止コドン後に置くことができ、リボソームは、そのmRNAに再結合し(re−attach)得、2つ目のタンパク質がその同じRNAから翻訳され得る。従って、上記IRES配列は、複数の抗原、例えば、複数の腸内細菌抗原またはある腸内細菌抗原、および別の病原性ウイルスもしくは細菌由来の抗原を発現するために使用され得る。例えば、2つ目のタンパク質が選択可能なマーカーである場合、このマーカーの使用は、上記選択可能なマーカーの検出によって、目的の遺伝子(上記プロモーターと上記IRESの間に配置された)が、発現される確率(probability)を増加させる。多数のバイシストロニックベクターは、これらの概念に基づいて生成されている。当該分野において公知であるバイシストロニックベクターのうちのいずれかの使用が、本明細書中で企図される。
あるいは、本発明の実施形態は、1つまたはそれより多くの分泌シグナル配列を有する構築物を含み得る。使用する分泌シグナルとしては、哺乳動物の分泌シグナル配列が挙げられ得るが、これに限定されない。翻訳調節配列および/または分泌シグナルにより、いくつかのワクチンの効力を増加させることが実証された。いくつかの実施形態において、1つまたはそれより多くの分泌シグナル配列は、プロリーダー配列を含み得る。特定の例において、tPAプレプロリーダー配列が使用され得、ここでリーダー配列としては、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)リーダー配列、補因子リーダー配列、プレプロインスリンリーダー配列、インベルターゼリーダー配列、免疫グロブリンAリーダー配列、オボアルブミンリーダー配列、およびP−グロビンリーダー配列、または当該分野において公知である他のプロリーダー配列、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、追加の選択マーカーが使用され得、例えば、多様な手法(例えば、目的の分子の精製)でのベクターの使用を容易にするために、例えば、設計され得る任意の数の選択マーカーを挿入し得る。例えば、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)遺伝子融合システムは、目的の構築物、タンパク質、またはペプチドを収集する都合のよい手段を提供する。任意の1つの理論または作用様式に限定することなく、GST−融合タンパク質は、グルタチオンアガロースビーズを用いて、GSTタグによって精製され得る。本発明の実施形態は、分泌可能なGST−分子融合物をコードする構築物にまで広がることが理解されるべきである。これは、例えば、切断可能なGSTに融合する切断可能なシグナル配列をコードし、次に上記GSTが目的の分子に融合するような最初の核酸領域の配列を設計することによって達成され得る。別の例において、それ自体が、プロテインA(分泌された産物の精製を可能にする)の360bpとβ−ラクタマーゼ(単色反応(simple colour reaction)によって上清の試験を可能にする細菌の酵素)との間の融合である融合タグが使用され得る。β−ラクタマーゼは、目的の分子についてのアッセイの非存在下で、目的の分子についてのアッセイの選択を容易にする。プロテインA/β−ラクタマーゼ融合物は、切断を容易にするために、切断部位によって目的の分子から分離され得、その結果、分子が精製された後、上記タグは、容易に除去され得る。当該分野において公知である任意の他の選択マーカーが使用され得る。
電気泳動は、分子のサイズおよび電荷に基づいて、分子(例えば、タンパク質または核酸のような大分子)を分離するために使用され得る。当該分野において公知である電気泳動の多くのバリエーションが存在する。溶液であって、それを通って上記分子が移動する、溶液は、自由(free)であり得、通常毛管内にあり、または、それはマトリックスに包埋され得る。一般的なマトリックスとしては、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル、および濾紙が挙げられる。
特定の実施形態において、タンパク質またはペプチドを有する構築物は、基質と接触する際に蛍光産物、発光産物、または着色した産物を生成する、二次結合リガンドに、または酵素(酵素タグ)に連結され得る。適切な酵素の例としては、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、(ホースラディシュ)水素(hydrogen)ペルオキシダーゼ、およびグルコースオキシダーゼが挙げられる。このような標識の使用および同定は、当業者に周知である。
増幅のための鋳型として使用される核酸配列は、標準方法に従って、生物学的サンプルに含まれるウイルス、細菌、細胞、または細胞構成要素から単離され得る。核酸配列は、ゲノムDNA、または分画されたもしくは全細胞RNAであり得る。RNAが使用される場合、上記RNAを相補cDNAに変換することが所望され得る。1つの実施形態において、上記RNAは、全細胞RNAであり、増幅のための鋳型として直接的に使用される。核酸分子を増幅するための当該分野において公知である任意の方法が企図される(例えば、PCR、LCR、Qbetaレプリカーゼ)。
遺伝子または遺伝子セグメントは、大量のポリペプチド産物を生成するために任意の数の異なる組換えのDNA発現システムにおいて発現され得、これは、次に、精製され得、本明細書中に報告される方法および組成物において使用され得る。構築物を生成および使用するための当該分野において公知である任意の方法が企図される。特定の実施形態において、1つまたはそれより多くのポリペプチドをコードする遺伝子または遺伝子フラグメントは、当該分野において公知である標準クローニング技術またはサブクローニング技術によって発現ベクターへ挿入され得る。
本明細書中のいくつかの実施形態の水性の組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒体に溶解または分散した、有効量の治療のタンパク質、ペプチド、構築物、エピトープコア領域、刺激薬、インヒビターなどを含み得る。先行するもののいずれかを発現するベクターの水性の組成物はまた、企図される。句「薬学的または薬理学的に受容可能」は、動物またはヒトに適宜投与されるとき、有害な、アレルギー性の、または他の不適当な反応を生成しない分子実体および組成物を指す。
さらなる実施形態は、本明細書中に記載される方法および組成物を用いて使用するキットに関する。いくつかの実施形態は、腸内細菌を有するかまたはこれに曝された被験体を、防ぐ、または処置するために使用するワクチン組成物を有するキットに関する。キットは、携帯型(例えば、遠隔地において、運搬および使用できる)であり得る。他のキットは、腸内細菌に曝されている、または腸内細菌(例えば、Yersinia spp)への曝露のリスクがあることが疑われる被験体を処置するための健康施設(health facility)において使用することができる。
当業者に公知である任意の方法は、組換えMVAの大規模な生産のために使用され得る。例えば、マスターシードストックおよびワーキングシードストックは、GMP条件下で適格な(qualified)初代CEFにおいて、または他の方法によって、調製され得る。細胞は、大きい表面積のフラスコに蒔かれ、コンフルエンス(confluence)近くまで増殖され、選択されたMOIで感染させられ、ワクチンウイルスが精製され得る。細胞は収集され、機械的破壊によって細胞内ウイルスが放出され、細胞の破片が大きな孔の深層濾過によって除去され、宿主細胞DNAがエンドヌクレアーゼで消化され得る。ウイルス粒子は、引き続いて精製され、タンジェンシャルフロー(tangential−flow)濾過後、ダイアフィルトレーション(diafiltration)によって濃縮され得る。結果として生じる濃縮された大量のワクチンは、安定剤を含むバッファーでの希釈によって処方され、バイアルに充填され、凍結乾燥され得る。組成物および処方物は、後の使用のために保管され得る。使用のために、凍結乾燥されたワクチンは、希釈剤の添加によって再構成され得る。
タンパク質発現
いくつかの例示的な方法において、Y.pestisのF1、V、およびV307抗原の発現を、MVA/Y.pestis組換えウイルスを感染させた細胞からのタンパク質の免疫ブロット分析によって評価した。発現レベルを、MVA許容のCEF細胞および非許容の哺乳動物のVero細胞の感染後に細胞全体の抽出物および細胞培養上清において評価した(図2A〜2E)。MVA/F1組換え体によるF1タンパク質の発現を、細胞ペレットおよび細胞培養上清の両方において検出した。MVA/F1感染CEF細胞において、F1莢膜抗原を、予測されるタンパク質(約18キロダルトン、kd;予測されるタンパク質)および約23kdにある高い分子量の形態と合致する2つのより低い分子量の形態として観測した(図2A)。その23kdの形態は、細胞上清において、より優勢であり、このことは、それが優先して分泌されていることを示唆した。莢膜F1タンパク質は、脊椎動物細胞の場合、1つの予測されるN−グリコシレーション部位および6つの予測されるo−グリコシレーション部位を有する。従って、上記23kdの形態がグリコシル化タンパク質を表し得ると仮定した。CEFによって発現されるF1の脱グリコシル化は、上記23kdの形態を排除し、18kdの形態のみが残った(図2E)。約34kdおよびそれを超えるより高い分子量の形態をまた、上記細胞ペレットにおいて観測した。これらの形態は、ダイマーおよび他のマルチマーと合致し;上記F1莢膜タンパク質は、分泌の際にマルチマー構造を強固に(avidly)形成する。広範囲にわたる変性の際にはこれらの形態を観測しなかった(例えば、図2Eを参照のこと)。MVA/IRES/tPA/F1ウイルスを感染させたCEF細胞において、唯一より低い分子量の形態が低レベルで発現することを、上記細胞ペレットにおいて観測した。
1つの実施例において、脳心筋炎ウイルス(EMVC)内部リボソーム進入部位(IRES)の翻訳調節下で、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)分泌シグナルを有する、Yersinia pestis由来の低カルシウム応答V(V307)抗原の短縮型バージョンを含む構築物組成物を、マウスに投与した。上記構築物組成物は、マウスにおいて、Y.pestisのCO92(莢膜に被われている)株またはJava 9(莢膜に被われていない)株を用いる、それぞれ鼻内または腹腔内へのチャレンジに対して、高められた免疫原性を与え、一貫して有意な保護を与えた(87.5%〜100%)。V抗原の完全バージョンを発現するMVA構築物は、高度に免疫原性であったが、この実験において、CO92株またはJava 9株それぞれに対して有意に低い保護(37.5%)を提供した。莢膜タンパク質(F1)を発現するMVA構築物は、検出可能な抗体を顕在化させ損ねたが、CO92またはJava 9のチャレンジに対して、それぞれ50%および25%の保護を与えた。この研究において試験された全てのMVAベクター化(vectored)ペストワクチンは、重症複合免疫不全(SCID)マウスにおいて全く安全であることが示された。MVAは、もともとの生の弱毒化されたワクシニア株よりも優れた安全性を有する第二世代の痘瘡(smallpox)ワクチンとして使用するために備蓄されている。従って、組換えのMVA/IRES/tPA/V307ワクチンは、痘瘡(smallpox)およびペストに対する保護を同時に提供する潜在力を有する。
MVA構築物の免疫原性
別の例示的な方法において、BALB/cマウスの群を、F1、V、またはV307抗原をコードするMVA/Y.pestis構築物を用いて筋肉内に免疫した。単一の免疫(ブースト前)後および2回の免疫(チャレンジ前)後の、抗体のタイターをELISA分析によって評価した。MVA/V構築物によって顕在化したチャレンジ前の抗体のタイターは、MVA/V307構築物よりも有意に高かった(P<0.05)が、これらの構築物によって誘導されたブースト前のタイター間で有意差はなかった(図3B)。IRESおよびtPA配列の、免疫原性に及ぼす作用を調べた。図3Bに示されるように、IRESおよび分泌シグナル(MVA/IRES/tPA/V307)の制御下でのV307の発現は、その免疫原性を著しく高めた。ブースト前およびチャレンジ前の、抗体のタイターの両方は、MVA/V307よりもMVA/IRES/tPA/V307で免疫されたマウスにおいて有意に高かった(P<0.05)。MVA/IRES/tPA/V307およびMVA/V307構築物によって顕在化したIgGサブクラスの分析は、IgG1サブクラスとIgG2aサブクラスとの間でバランスのとれた応答を示した(データ示さず)。V抗原を発現するMVA構築物は、一次免疫と比較して、抗体応答に及ぼす有意なブースター作用(P<0.05)を、全ての免疫されたマウスにおいて誘導した(図3B)。MVA/F1またはMVA/IRES/tPA/F1構築物で免疫されたマウスにおいて、ブースター作用は検出されなかった。さらに、MVA/F1またはMVA/IRES/tPA/F1構築物によって顕在化したチャレンジ前の抗体のタイターは、V抗原を発現する構築物によって誘導されたタイターよりも有意に低かった(P>0.05)(図3Aおよび3B)。
ペストチャレンジに対する保護
他の例において、本明細書中に開示されるいくつかの構築物の導入後、動物モデルをペストに対する保護を評価するために使用した。MVA/IRES/tPA/V307でワクチン接種された全てのマウスは、Y.pestisのCO92(35 LD50)株またはJava 9(100 LD50)株のいずれかでの致命的なペストチャレンジから生き残った(図4Aおよび4B)。さらに、MVA/IRES/tPA/V307で免疫したマウス由来のプールされた免疫血清の、ナイーブBALB/cマウスへの受身移入は、対照のマウスと比較して、Y.pestisのJava 9株に対して有意な保護を与えた(P<0.05)(データ示さず)。対照的に、MVA/V307、MVA/V、またはMVA/IRES/tPA/Vで免疫されたマウスの25%のみ、37.5%〜50%が、それぞれY.pestisのCO92株でのチャレンジから生き残った(図4A)。MVA/F1またはMVA/IRES/tPA/F1で免疫したマウスは、それぞれY.pestisのCO92株またはJava 9株でのチャレンジに対して50%または25%の生存率を有した(図4Aおよび4B)。
MVA/IRES/tPA/V307ワクチンの最小保護用量
リード(lead)候補ワクチンの最小保護用量を確立するために、8匹のBALB/cマウスの群を、漸増する用量(5×105pfu、5×106pfu、または5×107pfu)のMVA/IRES/tPA/V307を用いて免疫し(予備刺激およびブースト)、次にCO92 Y.pestis株の35LD50または350LD50のいずれかでチャレンジした。漸増する用量のMVA/IRES/tPA/V307で免疫したマウスでは、それぞれ3.38、3.75、または4.25(log10)という、チャレンジ前の抗体のタイターを有する、対応する免疫応答の増加が顕在化した。最も高い免疫用量(5×107)は、より低い用量と比較して、有意により高い抗体のタイター(P<0.05)を顕在化させ、それは、CO92 Y.pestis株の35LD50または350LD50のいずれかでのチャレンジのそれぞれに対して、有意な保護(87.5%)を与えた(下の表2)。MVA/IRES/tPA/V307ワクチンのうちの2つのより低い用量で免疫され、その後、Y.pestisの35LD50でチャレンジされたマウスの生存率間に有意差はなかった(P>0.05)(表2)。チャレンジ用量における10倍の増加(350LD50)により、MVA/IRES/tPA/V307ワクチンの最低用量(5×105pfu)によって与えられる生存率が減少し、MVA/GFP対照群の生存率との有意差がなかった(P>0.05)(表2)。しかし、対照群と比較しての有意な保護(P=0.01)を、Y.pestisの350LD50でのチャレンジに対して5×106pfuのワクチンで免疫したマウスに与えた。
ワクシニア−Wyethが接種された群における全てのマウスは、その尾および足におけるポックス病変、ならびに持続する体重減少によって特徴付けられる臨床疾患症状を発達させ、感染後5〜7週間以内に死亡した。MVAwtまたはMVA/Y.pestisワクチン構築物からの動物のうち、どれも、全くポックス病変を発達させなかった。ワクシニア−Wyeth群における体重減少は、MVAwtまたはMVA/ペストワクチン構築物で感染させた群においてよりも有意に大きかった(P<0.0001)(図5)。
抗体のタイター
図6は、筋肉内経路または皮内経路を介して、種々の分泌シグナルを発現する、5×107PFUのMVA/ペストワクチンで免疫されたマウスの群(n=10)を表す。MVA/ペストワクチンを用いた、予備刺激およびブースト免疫後の抗体のタイター(平均値±SD)をElisaによって分析した。MVA/tPA/V307(IM)またはMVA/IRES/tPA/V307(ID)で免疫されたマウスからのブースト後のタイター(post−boost titer)は、MVA/C13L/V307またはMVA/IRES/tPA/V307(IM)群よりも有意に高かった(P値**<0.01、*<0.05)。
MVA組換えワクチンの構築
トランスファープラスミドpdIIIGFP(提供された)を、Y.pestis抗原を発現する組換えMVAを生成するために使用した。このプラスミドは、1)MVAのHindIII Aフラグメント内の欠失IIIに隣接するDNAセグメント(flank 1およびflank 2)、2)複数のクローニング部位(MCS)の上流に、強い合成の初期/後期(SEL)ワクシニアウイルスプロモーター、および3)多様なSELプロモーターの制御下にある緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を含んだ(図1)。ECMV IRES配列、その後のtPA分泌シグナルを含む第二のトランスファープラスミドpdIIIGFP/IRES/tPAを、pdIIIGFPにIRES/tPAカセットを挿入することによって生成した。Y.pestis抗原、F1、全長V、およびaa307で短縮されたV(V307)のそれぞれのための発現カセットを、pdIIIGFPまたはpdIIIGFP/IRES/tPAに挿入した。発現カセットを、pdIIIGFPまたはpdIIIGFP/IRES/tPAへの挿入に適切な制限酵素部位を含むようにPCRによって生成した(表1)。そのPCR産物を、pdIIIGFPまたはpdIIIGFP/IRES/tPAのMCSにクローン化し、得られたプラスミドをpdIIIGFP/F1、pdIIIGFP/IRES/tPA/F1、pdIIIGFP/V、pdIIIGFP/IRES/tPA/V、pdIIIGFP/V307、およびpdIIIGFP/IRES/tPA/V307と呼んだ。
F1、V、V307、またはIRES/tPA/F1、IRES/tPA/V、IRES/tPA/V307抗原を含む、組換えMVAウイルスのインビトロでの発現を、免疫ブロット分析によって決定した。CEF細胞またはVero細胞を、6ウェルプレートに蒔き、血清を含まない条件で、0.5または5のMOIにて、それぞれ組換えMVA/F1、MVA/IRES/tPA/F1、MVA/V、MVA/IRES/tPA/V、MVA/V307、またはMVA/IRES/tPA/V307ウイルスを用いて感染させた。感染後48時間に、感染させた細胞を、プロテアーゼインヒビターカクテル(Mini Protease tabs,Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)の存在下で収集し、洗浄し、1×ローディングバッファーに再懸濁して、95℃まで5分間加熱した。感染させた細胞からの上清を遠心分離し、3kDaのカットオフ膜(Nanosep 3K Omega,Pall,Inc.,East Hills,NY)を用いた限外濾過によって濃縮した。その上清を次に、等しい体積の2×ローディングバッファーと合わせ、95℃まで5分間加熱した。上清および細胞サンプルをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって分割し、組織内で(in−house)生産されたポリクローナルウサギ抗F1または抗V血清を用いる免疫ブロット分析のためにニトロセルロース膜に移した。特定病原体未感染(SPF:specific pathogen free)ウサギに、精製されたF1(caf1オペロン発現システム由来)またはV(ATCC,BEI Resources,Manassas,VA,カタログ番号NR−3832)タンパク質を接種することによって、そのポリクローナル抗体を生成した。これらの抗体は、免疫ブロット分析に用いられるとき、CEFまたはVeroから発現されるMVA野生型に対してわずかなバックグラウンド(minor background)を示した。
Y.pestis培養物の調製およびその後の動物チャレンジ実験を、以前に記載されるように行った。手短に言えば、作業用ストック(working stock)を調製するために、75μLの凍結Y.pestis分離菌を融解し、ボルテックスし、血液寒天プレート(Remel,Lenexa,KS)上に広げ、28℃で48時間インキュベートした。細菌叢(bacterial lawn)を、上記寒天プレートから削り、0.2%のキシロースを有する、200mlのHeart Infusion Broth(Difco Laboratories,Detroit,MI)に入れ、28℃で48時間インキュベートした。最終ストックを、その肉汁培養物(v/v)に20%のグリセロールを加えることによって調製し、−80℃にてアリコートで保管した。Y.pestisの細菌株CO92およびJava 9を提供した。この研究のためのえり抜きのF−株は、C12株であった(これは当時、入手可能ではなかった);それゆえ、容易に入手可能であったF1−Java 9を使用した。
8匹の4〜6週齢のメスのBALB/cマウス(Harlan Sprague Dawley,Indianapolis,IN)の群は、後肢への筋肉内注射によって、各ワクチン候補での一次免疫および追加免疫(28日離して)を受けた。50μl中5×107プラーク形成単位(pfu)の用量を、両方の注射のために使用した。対照群を、組換えF1タンパク質(rF1−40μg)、空のMVAベクター(MVA/GFP−5×107pfu)、またはリン酸緩衝食塩水(PBS−50μL)のいずれかで免疫した。追加免疫の2週間後に、全ての動物を、野生型Y.pestis CO92株を用いて、その細菌の1×105コロニー形成単位(cfu)(35LD50)を含む接種材料10μL(各鼻孔に5μL)の鼻内点滴注入によって、チャレンジした。Y.pestisのJava 9株でチャレンジされた動物は、100cfu(100LD50)を含む100μlの接種材料を腹腔内に受けた。この研究に使用されたJava 9の分離菌は、鼻内経路を介しては、より低い毒性であったが、腹腔内に使用されるとき、毒性が高かった。チャレンジされた動物を2週間モニターした。
血清サンプルを、一次ワクチン接種後28日目およびブースト後(チャレンジ前)14日目に収集し、Y.pestisのF1またはV抗原に対する抗体のタイターを評価した。血清の総IgGならびにIgG1およびIgG2aサブクラスのタイターを、以前に記載されるように、酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)によって測定した。手短に言えば、96ウェルのELISAプレートを、精製された組換えF1またはV抗原(1ウェルにつき、100μLの炭酸バッファー中0.1μg、pH9.6)で、4℃にて一晩、コーティングした。コーティングされたプレートを、PBS中0.05%のTween20(洗浄バッファー)で2回洗浄して、ブロッキングバッファー(PBS中1%のBSA)で、室温(RT)にて1時間すすいだ。血清サンプルを次に、ELISA希釈剤(洗浄バッファー中0.1%のBSA)中1:100〜1:100,000まで段階的に希釈し、調製したELISAプレートに3つ組で加えた。以前の研究からの、組換えF1またはV抗原で接種されたマウスに由来する、公知の陰性および陽性血清サンプルを、対照として使用し、プレートを室温で1時間インキュベートした。洗浄後、1ウェルにつき100μLの、ホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP)結合体化ウサギ抗マウスIgG(Abcam Inc,Cambridge,MA)の1:10,000希釈物を各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、1ウェルにつき100μLのテトラメチルベンジジン(TMB)クロモゲン(Invitrogen,Calsbad,CA)を、各ウェルに加え、暗所にて5分間インキュベートした。その反応を次に、1ウェルにつき100μLの2mM H2SO4(Sigma,St Louis,MO)を加えることによって止めた。比色定量を、マイクロプレートリーダー(ELx800−BioTek,Winooski,VT)を用いて、450nmの試験波長および630nmの参照波長で評価した。陽性(公知の陰性血清サンプルの平均値+3標準偏差を超えた)であった最も高い希釈度を終点と考え、その逆数値(reciprocal value)をタイターとして記録した。
6匹の5週齢のBALB/cSCIDマウス(Harlan Sprague Dawley,Indianapolis,IN)の群に対して、1×108pfuのMVA/F1、MVA/V、MVA/V307、MVA/IRES/tPA/V307または野生型MVA(MVAwt)を腹腔内に接種した。さらなる群は、1×106pfuのワクシニアWyeth株を、同じ経路によって受けた。マウスを3ヶ月間毎日モニターし、それらの体重を毎週記録した。マウスは、自然に死亡するか、または以前に記載されるように、2未満(BCS<2)のボディコンディションスコアを示したときに安楽死させた。
ブースト前の抗体およびチャレンジ前の抗体のタイターに及ぼすワクチン群の作用を評価するために、一元ANOVAを使用した。ワクチン群の作用が統計的に有意であった場合(Kruskal−Wallis検定によってP<0.05)、0.05の調整していないP値を用いて、群中での全てのペアをなす比較を行った。生存率の分析を行って、CO92またはJava 9でのチャレンジに対するワクチンの有効性を評価した;報告されたP値は、フィッシャーの正確検定からのものである。全ての統計解析について、GraphPad Prism 5ソフトウェア(La Jolla, CA)を用いて、0.05未満の確率値を有意であると考えた。
Claims (26)
- 被験体に投与するための組成物であって、
該組成物は、1つまたはそれより多くの構築物を含み、
該構築物は、1つまたはそれより多くの腸内細菌由来の1つまたはそれより多くのペプチドをコードする1つまたはそれより多くの弱毒化または改変されたポックスウイルス;および
少なくとも1つの哺乳動物の分泌シグナル配列、または少なくとも1つの翻訳調節領域を含み、
ここで、1つまたはそれより多くの該構築物は、該被験体において、1つまたはそれより多くの該腸内細菌に対する免疫応答を生み出すことが可能である、
組成物。 - ワクチン組成物が、莢膜に被われていない腸内細菌および莢膜に被われている腸内細菌に対して前記被験体を保護することが可能である、請求項1に記載の組成物。
- 1つまたはそれより多くの腸内細菌に関連する1つまたはそれより多くの前記ペプチドが、Yersinia spp由来の1つまたはそれより多くのペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。
- 1つまたはそれより多くの前記弱毒化されたポックスウイルスが、改変されたワクシニアウイルスアンカラ(MVA)、改変されたワクシニアコペンハーゲン株、NYVAC、LC16m8、CVI−78、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 前記弱毒化されたポックスウイルスのうちの1つが、改変されたワクシニアウイルスアンカラ(MVA)である、請求項1に記載の組成物。
- 1つまたはそれより多くの腸内細菌に関連する1つまたはそれより多くの前記ペプチドが、Yersinia sppに関連する1つまたはそれより多くのペプチドを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記Yersinia sppがYersinia pestisである、請求項6に記載の組成物。
- 1つまたはそれより多くの翻訳調節配列が、1つまたはそれより多くの内部リボソーム進入部位(IRES)をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 1つまたはそれより多くの前記翻訳調節配列が、1つまたはそれより多くの非翻訳領域(UTR)をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- Yersinia pestis由来の1つまたはそれより多くの前記ペプチドが、莢膜タンパク質(F1)、低カルシウム応答(V)抗原、該低カルシウム応答V抗原の短縮型バージョン、F1およびVのうちの1つもしくはそれより多くからの変異した形態、またはそれらの組み合わせの、全てもしくは一部を含む、請求項7に記載の組成物。
- Yersinia pestis由来の1つまたはそれより多くの前記ペプチドが、C末端の短縮を有する1つまたはそれより多くの低カルシウム応答(V)抗原(LcrV)を含む、請求項7に記載の組成物。
- 前記C末端の短縮により、免疫抑制性配列が除かれる、請求項11に記載の組成物。
- Yersinia pestis由来の1つまたはそれより多くの前記ペプチドが、1つまたはそれより多くの低カルシウム応答(V)抗原(LcrV)を含み、該低カルシウム応答(V)抗原(LcrV)が、LcrVの163個までの連続した残基の欠失、内部欠失、90個までの連続した残基の内部欠失、LcrVタンパク質のアミノ酸240〜325に広がる内部欠失、LcrVの50個までの連続した残基のC末端の欠失、長さが少なくとも275残基のLcrVタンパク質、およびLcrVの残基271〜300の欠失を含む、請求項7に記載の組成物。
- Yersinia pestis由来の1つまたはそれより多くの前記ペプチドが、1つまたはそれより多くのV307ペプチドを含む、請求項7に記載の組成物。
- 被験体に投与するためのワクチン組成物であって、
該組成物は、1つまたはそれより多くの弱毒化または改変されたワクシニアウイルスのうちの1つまたはそれより多くの構築物を含み、
該構築物は、Yersinia pestis由来のV307;ならびに
哺乳動物の分泌シグナル配列および翻訳調節領域のうちの1つまたはそれより多くを含み、
ここで、1つまたはそれより多くの該構築物は、被験体において、Yersinia pestisに対する免疫応答を誘導することが可能である、
ワクチン組成物。 - 被験体において腸内細菌に対する免疫応答を誘導するための方法であって、
該方法は、該被験体に組成物を投与する工程であって、
該組成物が、1つまたはそれより多くの構築物を含み、
該構築物が、1つまたはそれより多くのYersinia pestis由来の1つまたはそれより多くのペプチド;少なくとも1つのシグナル配列;および1つまたはそれより多くの弱毒化ワクシニアウイルスを含む、工程を含み、
ここで、該組成物は、該被験体において該腸内細菌に対する免疫応答を誘導することが可能である、
方法。 - 1つまたはそれより多くの前記ワクシニアウイルスが、改変されたワクシニアウイルスアンカラ(MVA)、改変されたワクシニアコペンハーゲン株、NYVAC、LC16m8、CVI−78、またはそれらの組み合わせを含む、請求項16に記載の方法。
- 1つまたはそれより多くの前記Yersinia spp.がYersinia pestisを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記組成物の投与が、前記被験体への該組成物の皮内投与を含む、請求項16に記載の方法。
- 改変されたワクシニアウイルスアンカラ(MVA)核酸構築物であって、
該構築物は、以下:
(i)1つまたはそれより多くの検出可能な配列(複数可)またはマーカー(複数可)をコードする核酸配列に、作動可能に連結されるウイルスの翻訳調節配列、あるいは
(ii)発現構築物に作動可能に連結される哺乳動物またはウイルスの分泌シグナル配列(ここで、該発現構築物の発現は、1つまたはそれより多くの腸内細菌由来の1つまたはそれより多くのペプチドおよび1つまたはそれより多くの該マーカーの翻訳を引き起こすことが可能である)、ならびに
(iii)1つまたはそれより多くの腸内細菌関連ペプチド由来の1つまたはそれより多くの核酸配列、あるいは1つまたはそれより多くの腸内細菌関連ペプチドをコードする1つまたはそれより多くの核酸配列が組み込まれ得る核酸配列
のうちの1つまたはそれより多くに作動可能に連結される改変されたワクシニアアンカラ(MVA)核酸構築物のプロモーターを含む、
構築物。 - Yersinia pestis由来の1つまたはそれより多くの前記ペプチドが、莢膜タンパク質(F1)、低カルシウム応答(V)抗原、該低カルシウム応答V抗原の短縮型バージョン、またはそれらの組み合わせの、全てまたはフラグメントを含む、請求項20に記載の構築物。
- 前記哺乳動物の分泌シグナル配列が、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)リーダー配列、補因子リーダー配列、プレプロインスリンリーダー配列、インベルターゼリーダー配列、免疫グロブリンAリーダー配列、オボアルブミンリーダー配列、およびP−グロビンリーダー配列、または他のプロリーダー配列、またはそれらの組み合わせを含む、請求項20に記載の構築物。
- ワクチンキットであって、該ワクチンキットは、
少なくとも1つの構築物組成物であって、該構築物組成物は、少なくとも1つのペプチド(複数可)をコードすることが可能である構築物を含み、ここで該ペプチドは、タンパク質、腸内細菌のタンパク質フラグメントまたは遺伝子セグメントおよび哺乳動物の分泌シグナル配列である、構築物組成物;ならびに
少なくとも1つの容器を含む、
ワクチンキット。 - 前記ペプチドのうちの少なくとも1つがV307である、請求項23に記載のキット。
- 被験体に送達するための送達デバイスをさらに含む、請求項23に記載のキット。
- 分子構築物を生成するためのキットであって、該キットは、
少なくとも1つの改変されたワクシニアウイルスエレメント、腸内細菌由来の少なくとも1つのV307エレメント、および哺乳動物の分泌シグナル配列;ならびに
少なくとも1つの容器を含む、
キット。
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