WO2021066612A2 - 종양 표적화 단백질 또는 이의 단편 및 그것에 결합하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents

종양 표적화 단백질 또는 이의 단편 및 그것에 결합하는 항체 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2021066612A2
WO2021066612A2 PCT/KR2020/013485 KR2020013485W WO2021066612A2 WO 2021066612 A2 WO2021066612 A2 WO 2021066612A2 KR 2020013485 W KR2020013485 W KR 2020013485W WO 2021066612 A2 WO2021066612 A2 WO 2021066612A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
seq
virus
protein
fragment
Prior art date
Application number
PCT/KR2020/013485
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2021066612A3 (ko
Inventor
황태호
조몽
조은아
Original Assignee
주식회사 바이오녹스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 바이오녹스 filed Critical 주식회사 바이오녹스
Priority to US17/642,868 priority Critical patent/US20220389085A1/en
Priority to CN202080069818.2A priority patent/CN114867738A/zh
Priority to AU2020361337A priority patent/AU2020361337A1/en
Priority to JP2022511267A priority patent/JP7456584B2/ja
Priority to CA3156346A priority patent/CA3156346A1/en
Priority to EP20871186.1A priority patent/EP4043482A4/en
Publication of WO2021066612A2 publication Critical patent/WO2021066612A2/ko
Publication of WO2021066612A3 publication Critical patent/WO2021066612A3/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/768—Oncolytic viruses not provided for in groups A61K35/761 - A61K35/766
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent

Definitions

  • the present invention relates to tumor targeting proteins or fragments thereof and antibodies that bind thereto and uses thereof. More specifically, the present invention relates to a vector comprising a nucleic acid encoding a fragment of the A56 protein and uses thereof. It also relates to an antibody that specifically binds to the A56 protein or a fragment thereof and uses thereof.
  • Cancer also called a tumor, refers to cells that have grown abnormally due to the autonomic overgrowth of body tissues.
  • the incidence of cancer continues to increase due to the aging population in the modern society, the increase in the smoking population, the increase in alcohol consumption, the westernization of dietary habits, and environmental pollution.
  • Cancer treatment methods include surgery, radiation therapy, and chemotherapy.
  • surgical therapy is a treatment method for removing cancerous tissue from the body, and is very effective for early cancer or cancer in which the lesion is limited to a part.
  • radiation therapy or chemotherapy is used in combination.
  • Radiotherapy or chemotherapy is mainly used for the treatment of advanced or terminal cancer, but it also affects normal cells and causes serious side effects.
  • Immune cell therapy differs from existing treatment methods in that it uses the patient's immune cells to kill cancer cells.
  • immune cell therapy is a method of obtaining the patient's immune cells, activating them to proliferate or specifically attack cancer cells, and then putting them back into the patient's body. This is the maximized method.
  • immune checkpoint inhibitor has been actively studied as an immunotherapy to treat cancer for the past five years.
  • inhibitors against immune checkpoints such as cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4), programmed cell death protein 1 (PD-1), and PD-L1 have been studied.
  • Immune checkpoint inhibitors such as ipilimumab (anti-CTLA-4), nivolumab (anti-PD-1) and pembrolizumab (anti-PD-1) have been used to treat many types of cancer.
  • immune checkpoint inhibitors are limited to the treatment of patients with certain types of cancer, such as melanoma, lung cancer, head and neck cancer, kidney cancer, and bladder cancer.
  • the present inventors studied to develop a method for safely and effectively targeting cancer cells.
  • A56 protein is expressed on the surface of cancer cells.
  • the present invention was completed by confirming that an antibody that binds to the A56 protein or a fragment thereof binds to the A56 protein expressed on the cell surface of cancer cells.
  • One aspect of the present invention provides an anticancer agent comprising an antibody that specifically binds to the A56 protein or a fragment thereof or a fragment thereof as an active ingredient.
  • Another aspect of the present invention provides an anti-cancer virus comprising a nucleic acid encoding the A56 protein or a fragment thereof.
  • Another aspect of the present invention provides an antibody or fragment thereof that binds to the A56 protein or fragment thereof.
  • Another aspect of the present invention comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1038, 1040, 1042, 1044, 1046, 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060, 1073, 1075, 1077, or 1079.
  • a cancer targeting polypeptide or fragment thereof is provided.
  • Another aspect of the present invention provides an isolated nucleic acid encoding the cancer targeting polypeptide or fragment thereof.
  • Another aspect of the present invention provides a kit for treating cancer comprising the anticancer virus and the antibody or fragment thereof.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for targeting cancer comprising the anticancer virus.
  • an anticancer virus containing a nucleic acid encoding the A56 protein, a fragment thereof, or a variant thereof of the present invention When used as a vector and administered to an individual, only cancer cells are primarily specifically killed. In addition, cancer cells that survive even after being infected with an anticancer virus express A56 protein on the cell surface, and thus can be targeted for secondary anticancer treatment. Accordingly, when using a vector containing a nucleic acid encoding the A56 protein, a fragment thereof, or a variant thereof, which is an embodiment of the present invention, and an antibody that binds to A56 or a fragment thereof, cancer can be effectively treated.
  • FIG. 1 is a diagram showing a targeting process of tumor cells using an anticancer virus containing a nucleic acid encoding an A56 protein or a fragment thereof.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating the presence or absence of A56 protein expression on the surface of the infected A549 cell line after infection with an anticancer virus containing a nucleic acid encoding the A56 protein through immunofluorescence staining to a human lung cancer cell line (A549).
  • FIG. 3 is a diagram showing the presence or absence of A56 protein expression on the surface of the infected HCT-116 cell line after infection with an anticancer virus containing a nucleic acid encoding the A56 protein through immunofluorescence staining in a human colorectal cancer cell line (HCT-116). .
  • FIG. 4 is a diagram showing the expression of the A56 protein on the surface of each tissue after intraperitoneal administration of an anticancer virus containing a nucleic acid encoding the A56 protein to a mouse implanted with a human colorectal cancer cell line (HT-29).
  • FIG. 5 is a diagram showing the expression of the A56 protein on the surface of each tissue after intraperitoneal administration of an anticancer virus containing a nucleic acid encoding the A56 protein to a normal rabbit.
  • Figure 6 shows the A56 protein on the surface of the tumor tissue on the 7th, 10th and 14th days after intratumoral administration of an anticancer virus containing a nucleic acid encoding the A56 protein to a mouse implanted with a mouse kidney cancer cell line (Renca). It is a figure confirming the expression.
  • FIG. 7 shows the surface of tumor tissue on days 7, 10 and 14 after intratumoral administration of an anticancer virus containing a nucleic acid encoding A56 protein and hydroxyurea to a mouse implanted with a mouse kidney cancer cell line (Renca). Is a diagram confirming the expression of the A56 protein.
  • Figure 8 shows the A56 protein on the surface of tumor tissues on the 21st, 24th and 28th days after the second administration of an anticancer virus containing a nucleic acid encoding the A56 protein to a mouse implanted with a mouse kidney cancer cell line (Renca).
  • Figure 9 is a diagram showing the expression.
  • Figure 9 is a second administration of an anti-cancer virus containing a nucleic acid encoding hydroxyurea and A56 protein to a mouse implanted with a mouse kidney cancer cell line (Renca), then 21, 24 and 28 It is a diagram confirming the expression of the A56 protein on the surface of the tumor tissue on the first day.
  • FIG. 10 is a diagram showing the volume of a tumor of a mouse after administration of an anticancer virus containing a nucleic acid encoding A56 protein and hydroxyurea to a mouse implanted with a mouse kidney cancer cell line (Renca).
  • Fig. 11 is a diagram showing the body weight of a mouse after administration of an anticancer virus containing a nucleic acid encoding A56 protein and hydroxyurea to a mouse implanted with a mouse kidney cancer cell line (Renca).
  • FIG. 12 is a diagram showing a specific example of the A56 protein and a fragment thereof.
  • FIG. 13 is a diagram confirming that the A56 protein and a fragment thereof are expressed on the cell surface.
  • Figure 20a is a diagram showing the amount of antibody production of A56-01A02 to A56-02B06.
  • 20B is a graph showing the amount of antibody production of A56-01A02 to A56-02B06.
  • Figure 20c is a diagram confirming the antibody production amount of A56-02D04 to A56-59E12.
  • 21 to 37 are views confirmed through SDS-PAGE after purification of the produced anti-A56 antibody.
  • 38 is a diagram showing the results of measurement by flow cytometry after treatment with five anti-A56 antibodies to Hela or HT-29 cell lines treated with or without anti-cancer virus.
  • 39 is a diagram showing the results of measurement by flow cytometry after treatment with three anti-A56 antibodies to A549, MCF-7, or PC-3 cell lines treated with or without anti-cancer virus.
  • FIG. 40 is a diagram showing the results of FACS analysis measured after treatment with an anti-A56 antibody (Antibodies-Online) in Hela cell lines treated with or without anti-cancer virus.
  • 41 is a view showing the results of FACS analysis measured after treatment with an anti-A56 antibody (LakePharma variant3) in Hela cell lines treated with or without anti-cancer virus.
  • Figure 42 shows the results of FACS analysis measured after treatment with an anti-A56 antibody (LakePharma variant4) in Hela cell line treated with or without anticancer virus
  • FIG. 43 is a view showing the FACS analysis results measured after treatment with anti-A56 antibodies (Antibodies-Online, LakePharma variant3 and LakePharma variant4) to Hela cell lines treated with or without anticancer virus.
  • FIG 44 is a diagram showing the results of measurement by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (Ab18) in an A549 cancer cell line treated with or without anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 45 is a diagram showing the results of measurement with a flow cytometer after treatment with an anti-A56 antibody (Ab19) in an A549 cancer cell line treated with or without an anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 46 is a diagram showing the results of measurement by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (Ab01) in an A549 cancer cell line treated with or without anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 47 is a diagram showing the results of measurement by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (Ab13) in an A549 cancer cell line treated with or without anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 48 is a diagram showing the results of measurement by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (Ab14) in an A549 cancer cell line treated with or without anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 49 is a diagram showing the results of measurement by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (Ab08) in an A549 cancer cell line treated with or without anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 50 is a diagram showing the results of measurement with a flow cytometer after treatment with an anti-A56 antibody (Ab03) in an A549 cancer cell line with or without an anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 51 is a diagram showing the results of measurement by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (Ab51) in an A549 cancer cell line treated with or without anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 52 is a diagram showing the results of measurement by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (Ab55) to an A549 cancer cell line treated with or without anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 53 is a diagram showing the results of measurement by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (Ab16) in an A549 cancer cell line treated with or without anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 54 is a diagram showing the results of measurement by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (LP Variant3) in an A549 cancer cell line treated with or without anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • LP Variant3 anti-A56 antibody
  • OTS-412, WOTS-418 anti-cancer virus
  • FIG. 55 is a diagram showing the results of measurement by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (LP Variant4) in an A549 cancer cell line treated with or without anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • LP Variant4 an anti-A56 antibody
  • OTS-412, WOTS-418 an anti-cancer virus
  • FIG. 57 shows an anti-A56 antibody (Ab18, Ab19, Ab01, Ab13, Ab14, Ab08, Ab03, Ab51, Ab55, Ab16) to an A549 cancer cell line treated with or without anticancer virus (WOTS-418), It is a diagram comparing the results measured by flow cytometry.
  • FIG. 58 is a diagram showing the results of measurement by flow cytometry after treatment with anti-A56 antibodies (Ab18, Ab16) to A549 cancer cell lines treated with or without anticancer virus (OTS-412).
  • FIG. 59 is a diagram showing the results of measurement by flow cytometry after treatment with anti-A56 antibodies (Ab18, Ab16) in A549 cancer cell lines treated with or without anticancer virus (WOTS-418).
  • Figure 60 is a view showing the results measured by flow cytometry after treatment with LakePharma variant3 and LakePharma variant4 in the A549 cancer cell line treated or not treated with anticancer virus (OTS-412).
  • Figure 61 is a view showing the results measured by flow cytometry after treatment with LakePharma variant3 and LakePharma variant4 in the A549 cancer cell line treated or not treated with anticancer virus (WOTS-418).
  • FIG. 62 is a diagram showing the results measured by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (Ab18) in a PC3 cancer cell line treated with or without anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • 63 is a view showing the results of measurement by flow cytometry after treatment with anti-A56 antibody (Ab19) in PC3 cancer cell lines treated with or without anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 64 is a diagram showing the results of measurement by flow cytometry after treatment with anti-A56 antibody (Ab01) in PC3 cancer cell lines treated with or without anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 65 is a diagram showing the results measured by flow cytometry after treatment with anti-A56 antibody (Ab13) in PC3 cancer cell lines treated with or without anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • 66 is a diagram showing the results of measurement by flow cytometry after treatment with anti-A56 antibody (Ab14) in PC3 cancer cell lines treated with or without anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 67 is a diagram showing the results measured by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (Ab08) in a PC3 cancer cell line treated with or without anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 68 is a diagram showing the results of measurement by flow cytometry after treatment with anti-A56 antibody (Ab03) in PC3 cancer cell lines treated with or without anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • 69 is a diagram showing the results of measurement by flow cytometry after treatment with anti-A56 antibody (Ab51) in PC3 cancer cell lines treated with or without anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 70 is a diagram showing the results measured by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (Ab55) in a PC3 cancer cell line treated with or without anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 71 is a diagram showing the results measured by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (Ab16) in a PC3 cancer cell line treated with or without anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 72 is a diagram showing the results measured by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (LP Variant3) in a PC3 cancer cell line treated with or without anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • LP Variant3 anti-A56 antibody
  • OTS-412, WOTS-418 anti-cancer virus
  • 73 is a diagram showing the results of measurement by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (LP Variant4) in a PC3 cancer cell line treated with or without anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • LP Variant4 an anti-A56 antibody
  • OTS-412, WOTS-418 an anti-cancer virus
  • 74 shows anti-A56 antibodies (Ab18, Ab19, Ab01, Ab13, Ab14, Ab08, Ab03, Ab51, Ab55, Ab16) to a PC3 cancer cell line treated with or without anticancer virus (OTS-412), It is a diagram comparing the results measured by flow cytometry.
  • 76 is a diagram showing the results of measurement by flow cytometry after treatment with anti-A56 antibodies (Ab18, Ab16) in PC3 cancer cell lines treated with or without anticancer virus (OTS-412).
  • FIG. 77 is a diagram showing the results measured by flow cytometry after treatment with anti-A56 antibodies (Ab18, Ab16) in PC3 cancer cell lines treated with or without anti-cancer virus (WOTS-418).
  • FIG. 78 is a diagram showing the results measured by flow cytometry after treatment with LakePharma variant3 and LakePharma variant4 in PC3 cancer cell lines treated with or without anticancer virus (OTS-412).
  • FIG. 79 is a diagram showing the results measured by flow cytometry after treatment with LakePharma variant3 and LakePharma variant4 in PC3 cancer cell lines treated with or without anticancer virus (WOTS-418).
  • FIG. 80 is a diagram showing the results measured by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (Ab18) in an MCF7 cancer cell line treated with or without anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 81 is a diagram showing the results measured by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (Ab19) in an MCF7 cancer cell line treated with or without an anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 82 is a diagram showing the results measured by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (Ab01) in an MCF7 cancer cell line treated with or without an anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 83 is a diagram showing the results measured by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (Ab13) in an MCF7 cancer cell line treated with or without an anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 84 is a diagram showing the results measured by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (Ab14) in an MCF7 cancer cell line treated with or without an anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 85 is a diagram showing the results measured by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (Ab08) in an MCF7 cancer cell line treated with or without an anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 86 is a diagram showing the results measured by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (Ab03) in an MCF7 cancer cell line treated with or without an anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • 87 is a diagram showing the results measured by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (Ab51) in an MCF7 cancer cell line treated with or without anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 88 is a diagram showing the results measured by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (Ab55) in an MCF7 cancer cell line treated with or without an anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 89 is a diagram showing the results measured by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (Ab16) in an MCF7 cancer cell line treated with or without an anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • FIG. 90 is a diagram showing the results measured by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (LP Variant3) in an MCF7 cancer cell line treated with or without an anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • LP Variant3 an anti-A56 antibody
  • OTS-412, WOTS-418 an anti-cancer virus
  • FIG. 91 is a diagram showing the results measured by flow cytometry after treatment with an anti-A56 antibody (LP Variant4) in an MCF7 cancer cell line treated with or without an anti-cancer virus (OTS-412, WOTS-418).
  • LP Variant4 an anti-A56 antibody
  • OTS-412, WOTS-418 an anti-cancer virus
  • FIG. 92 shows an anti-A56 antibody (Ab18, Ab19, Ab01, Ab13, Ab14, Ab08, Ab03, Ab51, Ab55, Ab16) treated with an anti-cancer virus (OTS-412) treated or untreated MCF7 cancer cell line, It is a diagram comparing the results measured by flow cytometry.
  • 93 shows an anti-A56 antibody (Ab18, Ab19, Ab01, Ab13, Ab14, Ab08, Ab03, Ab51, Ab55, Ab16) treated with an anticancer virus (WOTS-418) or not treated with an MCF7 cancer cell line, It is a diagram comparing the results measured by flow cytometry.
  • FIG. 94 is a diagram showing the results measured by flow cytometry after treatment with LakePharma variant3 and LakePharma variant4 in MCF7 cancer cell lines treated with or without anticancer virus (OTS-412).
  • FIG. 95 is a diagram showing results measured by flow cytometry after treatment with LakePharma variant3 and LakePharma variant4 in MCF7 cancer cell lines treated with or without anticancer virus (WOTS-418).
  • 96 is a diagram showing the result of performing an ELISA test using the prepared antibody.
  • 97 is a diagram confirming the expression level of the A56 fusion protein to which Fc is fused.
  • 98 is a view confirming the expression level of the prepared A56 fragment.
  • FIG. 99 is a diagram illustrating sequence homology to A56 protein of anticancer viruses (OTS-412 and WOTS-418).
  • One aspect of the present invention provides an anticancer agent comprising an antibody that specifically binds to the A56 protein or a fragment thereof or a fragment thereof as an active ingredient.
  • A56 protein refers to a gene expressed by A56 , A56R or HA encoded in the viral gene after a poxviridae virus infects a host cell (eg GeneID: 3707652)
  • Detoxification ( ⁇ ) refers to the protein.
  • the A56 protein or fragment thereof comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1038, 1040, 1042, 1044, 1046, 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060, 1073, 1075, 1077, or 1079. I can.
  • the nucleic acid encoding the A56 protein or fragment thereof is SEQ ID NO: 1039, 1041, 1043, 1045, 1047, 1049, 1051, 1053, 1055, 1057, 1059, 1061, 1072, 107, 1076, 1078 It may be to include.
  • the A56 protein may be a wild-type A56 protein or a variant thereof.
  • the wild-type A56 protein may have an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1038 or 1073.
  • the nucleic acid encoding the wild-type A56 protein may be a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1039 or 1072.
  • the nucleotide sequence encoding the A56 protein variant is a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having at least 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more sequence homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1038 or 1073. It may be, and most preferably, may be a base sequence encoding an amino acid sequence having 95% or more sequence homology.
  • the variant of the A56 protein may include an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1075 or 1079.
  • the nucleic acid encoding the variant of the A56 protein may include a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1074 or 1078.
  • the fragment of the A56 protein may be a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1040, 1042, 1044, 1046, 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060 or 1077.
  • the nucleic acid encoding the fragment may be a nucleotide sequence encoding a polypeptide represented by SEQ ID NOs: 1040, 1042, 1044, 1046, 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060 or 1076.
  • nucleotide sequence encoding the fragment of the A56 protein is at least 60% or more, 70% or more with the amino acid sequence represented by 1040, 1042, 1044, 1046, 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060 or 1077. , It may be a base sequence encoding an amino acid sequence having sequence homology of 80% or more, 90% or more, and most preferably a base sequence encoding an amino acid sequence having sequence homology of 95% or more.
  • antibody refers to an immunoprotein that binds to an antigen and interferes with the function of the antigen or removes the antigen.
  • IgM immunoglobulin
  • IgD immunoglobulin D
  • IgG immunoglobulin G
  • IgA immunoglobulin A
  • IgE immunoglobulin A
  • IgG immunoglobulin G
  • IgG1 IgG2, IgG3, and IgG4
  • the IgG forms a very stable Y-shaped structure (molecular weight, about 150 kDa) made of two heavy chain (about 50 kDa) proteins and two light chain (about 25 kDa) proteins.
  • the light and heavy chains of an antibody are divided into variable regions whose amino acid sequences are different for each antibody and constant regions having the same amino acid sequence.
  • the heavy chain constant region has CH1, H (hinge), CH2, and CH3 domains. Each domain consists of two ⁇ -sheets and is linked by an intramolecular disulfide bond.
  • the two variable regions of the heavy and light chains are combined to form an antigen binding site.
  • Fab antibody binding fragment
  • Fc crystalizable fragment
  • CDR refers to a hypervariable region, which is a site having an amino acid sequence different for each antibody in the heavy and light chain variable regions of an antibody, and refers to a site that binds to an antigen. Looking at the conformational structure of the antibody, CDRs have a loop shape on the surface of the antibody, and under the ring there is a framework region (FR) that structurally supports it. There are three ring structures in each of the heavy and light chains, and these six ring region structures merge with each other to directly contact the antigen. Each of the antigen binding sites of the six ring region structures is referred to as CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 and CDR6 for convenience.
  • the antibody fragment may be any one selected from the group consisting of Fab, scFv, F(ab) 2 and Fv.
  • Antibody fragments refer to antigen-binding domains excluding the Fc region, which has an effector function that transmits antigen-binding stimulation to cells or complement, etc., and refers to a single domain antibody or a small antibody. ) And the like.
  • the antibody fragment is smaller in size than the fully-structured IgG, the penetration rate into tissues or tumors is good, and since it can be produced by bacteria, the production cost is low.
  • the antibody fragment has no Fc, it is used when the function of transmitting antigen-binding stimulation to cells or complement is not desired.
  • Antibody fragments have a short half-life in the human body and are suitable for biodiagnosis, but if some basic, acidic, or neutral amino acids of the amino acids that make up the antibody are interchanged, the unique isoelectric point (pi) of the antibody may change. have. Since such changes in the isoelectric point of the antibody can induce changes such as reducing toxic side effects in vivo or increasing water solubility of the antibody, in the case of a therapeutic antibody, a complete IgG can be used in consideration of affinity or structural form.
  • the antibody can be easily prepared by known monoclonal antibody production techniques.
  • the method of preparing a monoclonal antibody may be performed by preparing a hybridoma using B lymphocytes obtained from an immunized animal, or may be performed by using a phage display technology, but is not limited thereto.
  • the antibody or fragment thereof is SEQ ID NO: 1, 18, 35, 52, 69, 86, 103, 120, 137, 154, 171, 188, 205, 222, 239, 256, 273, 290, 307, 324, 341, 358, 375, 392, 409, 426, 443, 460, 477, 494, 511, 528, 545, 562, 579, 596, 613, 630, 647, 664, 681, 698, 715, 732, 749, 766, A heavy chain CDR1 selected from the group consisting of 783, 800, 817, 834, 851, 868, 885, 902, 919, 936, 953, 970, 987, 1004, 1021, 1062 and 1063;
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • the antibody or fragment thereof comprises a heavy chain CDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 35, 120, 222, 239, 290, 324, 341, 851, 919, 1062 or 1063;
  • Heavy chain CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 36, 121, 223, 240, 291, 325, 342, 852, 920 or 1064;
  • a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 37, 122, 224, 241, 292, 326, 343, 853, 921 or 1065;
  • Light chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, 38, 123, 225, 242, 293, 327, 344, 854, 922 or 1066;
  • a light chain CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, 39, 124, 226, 243, 294, 328, 345, 855, 923 or 1067;
  • VL light chain variable region
  • the antibody or fragment thereof is a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; Heavy chain CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; And a heavy chain variable region (VH) comprising a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; And a light chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; Light chain CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5; And it may include a light chain variable region (VL) comprising a light chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the antibody or fragment thereof is a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35; Heavy chain CDR2 having amino acid sequence SEQ ID NO: 36; And a heavy chain variable region (VH) comprising a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37; And a light chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38; Light chain CDR2 having amino acid sequence SEQ ID NO: 39; And a light chain variable region (VL) comprising a light chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40.
  • the antibody or fragment thereof is a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 120; Heavy chain CDR2 having amino acid sequence SEQ ID NO: 121; And a heavy chain variable region (VH) comprising a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 122; And a light chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 123; Light chain CDR2 having amino acid sequence SEQ ID NO: 124; And a light chain variable region (VL) comprising a light chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 125.
  • the antibody or fragment thereof is a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 222; Heavy chain CDR2 having amino acid sequence SEQ ID NO: 223; And a heavy chain variable region (VH) comprising a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 224; And a light chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 225; Light chain CDR2 having amino acid sequence SEQ ID NO: 226; And a light chain variable region (VL) comprising a light chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 227.
  • the antibody or fragment thereof is a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 239; Heavy chain CDR2 having amino acid sequence SEQ ID NO: 240; And a heavy chain variable region (VH) comprising a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 241; And a light chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 242; Light chain CDR2 having amino acid sequence SEQ ID NO: 243; And a light chain variable region (VL) comprising a light chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 244.
  • the antibody or fragment thereof is a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 290; Heavy chain CDR2 having amino acid sequence SEQ ID NO: 291; And a heavy chain variable region (VH) comprising a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 292; And a light chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 293; Light chain CDR2 having amino acid sequence SEQ ID NO: 294; And it may include a light chain variable region (VL) comprising a light chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 295.
  • the antibody or fragment thereof comprises a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 324; Heavy chain CDR2 having amino acid sequence SEQ ID NO: 325; And a heavy chain variable region (VH) comprising a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 326; And a light chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 327; Light chain CDR2 having amino acid sequence SEQ ID NO: 328; And a light chain variable region (VL) comprising a light chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 329.
  • the antibody or fragment thereof is a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 341; Heavy chain CDR2 having amino acid sequence SEQ ID NO: 342; And a heavy chain variable region (VH) comprising a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 343; And a light chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 344; Light chain CDR2 having amino acid sequence SEQ ID NO: 345; And a light chain variable region (VL) comprising a light chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 346.
  • the antibody or fragment thereof comprises a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 851; Heavy chain CDR2 having amino acid sequence SEQ ID NO: 852; And a heavy chain variable region (VH) comprising a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 853; And a light chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 854; Light chain CDR2 having amino acid sequence SEQ ID NO: 855; And a light chain variable region (VL) comprising a light chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 856.
  • the antibody or fragment thereof comprises a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 919; Heavy chain CDR2 having amino acid sequence SEQ ID NO: 920; And a heavy chain variable region (VH) comprising a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 921; And a light chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 922; Light chain CDR2 having amino acid sequence SEQ ID NO: 923; And a light chain variable region (VL) comprising a light chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 924.
  • the antibody or fragment thereof is a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1062 or 1063; Heavy chain CDR2 having amino acid sequence SEQ ID NO: 1064; And a heavy chain variable region (VH) comprising a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1065; And a light chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1066; Light chain CDR2 having amino acid sequence SEQ ID NO: 1067; And a light chain variable region (VL) comprising a light chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1068.
  • the antibody or fragment thereof may include a combination of the following CDRs:
  • the antibody or fragment thereof is SEQ ID NO: 8, 25, 42, 59, 76, 93, 110, 127, 144, 161, 178, 195, 212, 229, 246, 263, 280, 297, 314, 331, 348, 365, 382, 399, 416, 433, 450, 467, 484, 501, 518, 535, 552, 569, 586, 603, 620, 637, 654, 671, 688, 705, 722, 739, 756, Heavy chain variable having any one amino acid sequence selected from the group consisting of 773, 790, 807, 824, 841, 858, 875, 892, 909, 926, 943, 960, 977, 994, 1011, 1028, 1069 and 1070 It can include areas.
  • the antibody or fragment thereof is a heavy chain variable having any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8, 42, 127, 229, 246, 297, 331, 348, 858, 926, 1069 and 1070 It can include areas.
  • the antibody or fragment thereof is SEQ ID NO: 9, 26, 43, 60, 77, 94, 111, 128, 145, 162, 179, 196, 213, 230, 247, 264, 281, 298, 315, 332, 349, 366, 383, 400, 417, 434, 451, 468, 485, 502, 519, 536, 553, 570, 587, 604, 621, 638, 655, 672, 689, 706, 723, 740, 757,
  • a light chain variable region having any one amino acid sequence selected from the group consisting of 774, 791, 808, 825, 842, 859, 876, 893, 910, 927, 944, 961, 978, 995, 1012, 1029 and 1071 Can include.
  • the antibody or fragment thereof is a light chain variable region having any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9, 43, 128, 230, 247, 298, 332, 349, 859, 927, and 1071.
  • the antibody or fragment thereof is SEQ ID NO: 8, 25, 42, 59, 76, 93, 110, 127, 144, 161, 178, 195, 212, 229, 246, 263, 280, 297, 314, 331, 348, 365, 382, 399, 416, 433, 450, 467, 484, 501, 518, 535, 552, 569, 586, 603, 620, 637, 654, 671, 688, 705, 722, 739, 756, 773, A heavy chain variable region having any one amino acid sequence selected from the group consisting of 790, 807, 824, 841, 858, 875, 892, 909, 926, 943, 960, 977, 994, 1011, 1028, 1069 and 1070, and SEQ ID NOs: 9, 26, 43, 60, 77, 94, 111, 128, 145, 162, 179, 196, 213, 230, 247, 264, 281, 298, 315, 332, 349
  • the antibody or fragment thereof is a heavy chain variable region having any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8, 42, 127, 229, 246, 297, 331, 348, 858, 926, 1069 and 1070
  • SEQ ID NOs: 9, 43, 128, 230, 247, 298, 332, 349, 859, 927 and 1071 may include a light chain variable region having an amino acid sequence selected from the group consisting of.
  • the anticancer agent may target cancer cells infected with an anticancer virus.
  • the anticancer virus may be an anticancer virus vaccinia virus.
  • the anticancer virus may include a nucleic acid encoding the A56 protein or a fragment thereof.
  • the A56 protein or fragment thereof is the same as described above.
  • the A56 protein may be a wild-type A56 protein or a variant of the A56 protein.
  • the nucleic acid encoding the A56 protein or a fragment thereof may be a nucleic acid encoding a wild-type A56 protein or a variant of the A56 protein.
  • the nucleic acid encoding the A56 protein or fragment thereof is SEQ ID NO: 1039, 1041, 1043, 1045, 1047, 1049, 1051, 1053, 1055, 1057, 1059 or 1061, 1072, 1074, 1076, 1078 It may be to include.
  • the vaccinia virus is Western Reserve (WR), NYVAC (New York Vaccinia Virus), Wyeth (The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, Lister, Copenhagen, Tiantan ( Tian Tan), USSR, TashKent, Evans, International Health Division-J (IHD-J) or International Health Division-White (IHD-W) vaccinia virus strain, but limited thereto. It does not become.
  • the anticancer virus may be a thymidine kinase (TK) gene deletion.
  • the anticancer virus may be a recombinant vaccinia virus in which the thymidine kinase gene is deleted.
  • TK thymidine kinase
  • the term "TK (thymidine kinase)" used in the present invention is called thymidine kinase, and refers to an enzyme involved in the biosynthesis of nucleotides.
  • the TK is an enzyme used for both cell and viral nucleotide biosynthesis.
  • normal cells no longer divide, so TK does not exist, and even cells that divide rapidly like hair follicle cells do not have enough TK to be used by the virus. Taking advantage of this, by deleting the TK gene in the virus, the virus can proliferate only when the TK of the cancer cell is present, so that only cancer cells can be selectively killed.
  • the anticancer agent may further include a physiologically acceptable carrier.
  • the anticancer agent may further include suitable excipients and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • it may be formulated and used in the form of an oral formulation such as a powder, granule, tablet, capsule, suspension, emulsion, syrup, aerosol, etc., external preparation, suppository, or injection according to a conventional method.
  • the anticancer agent may be in the form of an injection. Suitable formulations known in the art may be those disclosed in Remington's Pharmaceutical Science, 1985.
  • the anticancer agent is lung cancer, colon cancer, prostate cancer, thyroid cancer, breast cancer, brain cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, skin cancer, thymus cancer, stomach cancer, colon cancer, liver cancer, ovarian cancer, uterine cancer, bladder cancer, rectal cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, lymphoma , Acute leukemia, multiple myeloma, and may be for the prevention or treatment of cancer selected from the group consisting of a combination thereof.
  • the anticancer agent as a carrier, excipient and diluent salt (sodium chloride), lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxy benzoate, propylhydroxy benzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants that are usually used.
  • Formulations for parenteral administration may include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized formulations, suppositories, and the like.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate may be used.
  • injectable ester such as ethyl oleate
  • a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerogelatin, and the like can be used.
  • the cancer may be solid cancer or blood cancer.
  • the solid cancer is lung cancer, colon cancer, prostate cancer, thyroid cancer, breast cancer, brain cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, skin cancer, thymus cancer, stomach cancer, colon cancer, liver cancer, ovarian cancer, uterine cancer, bladder cancer, rectal cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, It may be any one selected from the group consisting of pancreatic cancer and combinations thereof.
  • the blood cancer may be any one selected from the group consisting of lymphoma, acute leukemia, multiple myeloma, and combinations thereof.
  • the dosage of the anticancer agent is recommended to be determined in consideration of the patient's age, sex, condition, absorption of the active ingredient in the body, the inactivation rate, and the drug to be used in combination, and when based on the antibody or fragment thereof, 0.0001 mg/kg ( Body weight) to 100 mg / kg (body weight) can be administered.
  • Another aspect of the present invention provides an anti-cancer virus comprising a nucleic acid encoding the A56 protein or a fragment thereof.
  • compositions for targeting cancer cells comprising an anti-cancer virus comprising a nucleic acid encoding the A56 protein or a fragment thereof as an active ingredient.
  • the anticancer virus is the same as described above for the anticancer agent.
  • the cancer cells may be solid cancer or blood cancer.
  • the solid cancer is lung cancer, colon cancer, prostate cancer, thyroid cancer, breast cancer, brain cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, skin cancer, thymus cancer, stomach cancer, colon cancer, liver cancer, ovarian cancer, uterine cancer, bladder cancer, rectal cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, It may be any one selected from the group consisting of pancreatic cancer, kidney cancer, fibroblastoma, testicular cancer, brain metastasis cancer, liver metastasis cancer, and combinations thereof. It is not limited thereto.
  • the blood cancer may be any one selected from the group consisting of lymphoma, acute leukemia, multiple myeloma, and combinations thereof. It is not limited thereto.
  • Another aspect of the present invention provides a method of targeting cancer cells comprising administering the anticancer virus to an individual.
  • the individual may be a mammal, including a human, and may be a non-human animal.
  • non-human animal refers to all vertebrates, and may include non-human primates, sheep, dogs, cats, horses, cows, chickens, amphibians, reptiles, and other mammals and non-mammals. have.
  • the individual refers to an individual suffering from a cancer disease or a state in which the disease can be alleviated, suppressed, or treated by administering the anti-cancer virus.
  • the dosage of the anticancer virus varies depending on the condition and weight of the individual, the degree of the disease, the drug type, the route and duration of administration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • Patients can be administered with 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 18 virus particles, infectious viral units (TCID50), or plaque-forming units (pfu) of anti-cancer viruses.
  • TCID50 infectious viral units
  • pfu plaque-forming units
  • the anticancer virus may be administered at a dose of 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 10 pfu. More preferably, the anticancer virus may be administered at a dose of 1 ⁇ 10 5 or more and less than 1 ⁇ 10 9 pfu.
  • the anticancer virus may be administered parenterally, intratumoral, intraperitoneal, sub-cutaneous, intra-dermal, intra-nodal, and intravenous -venous) can be administered by a suitable method. Preferably, it may be intratumoral, intraperitoneal or intravenous administration.
  • the administration route, dosage, and frequency of administration of the anticancer virus can be administered to the subject in various ways and amounts depending on the condition of the patient and the presence or absence of side effects. You can choose from a range.
  • the anticancer virus may be administered in combination with other drugs or physiologically active substances known to have therapeutic effects on the disease to be treated, or may be formulated in the form of a combination formulation with other drugs.
  • the anticancer virus may be provided in the form of an injection.
  • Another aspect of the present invention provides an antibody or fragment thereof that binds to the A56 protein or fragment thereof.
  • the antibody or fragment thereof is the same as described above for the anticancer agent.
  • the antibody comprises the steps of: i) administering the A56 protein or fragment thereof to the subject; ii) obtaining B cells from the subject; And iii) culturing the B cells to obtain an anti-recombinant A56 protein antibody.
  • the A56 protein or a fragment thereof is prepared by i) transfecting the vector of the present invention into a host cell; ii) culturing the transfected host cells; And iii) obtaining a recombinant A56 protein from the culture can be produced through a protein production method.
  • the host cell may be a prokaryotic cell or a eukaryotic cell. More specifically, the prokaryotic cell may be Escherichia coli (E. coli) or yeast (Yeast).
  • the eukaryotic cells may be NS/0 myeloma cells, 293 cells, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), HeLa cells, CapT cells (human amniotic fluid derived cells), or COS cells.
  • the transfection is transient transfection, microinjection, transduction, cell fusion, calcium phosphate precipitation, liposome-mediated transfection, DEAE dextran-mediated transfection ( DEAE Dextran-mediated transfection), polybrene-mediated transfection, or electroporation, or a gene gun.
  • Another aspect of the present invention comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1038, 1040, 1042, 1044, 1046, 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060, 1073, 1075, 1077, or 1079.
  • a cancer targeting polypeptide or fragment thereof is provided.
  • the polypeptide or fragment thereof comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1038, 1040, 1042, 1044, 1046, 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060, 1073, 1075, 1077, or 1079 is an anticancer agent As described above in.
  • nucleic acid encoding the cancer targeting polypeptide or fragment thereof.
  • the nucleic acid may include a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 1039, 1041, 1043, 1045, 1047, 1049, 1051, 1053, 1055, 1057, 1059, 1061, 1072, 107, 1076, 1078.
  • Another aspect of the present invention provides a kit for treating cancer comprising the anti-cancer virus and the antibody or fragment thereof.
  • the anticancer virus and antibody or fragments thereof are as described above in the anticancer agent.
  • the individual refers to an individual suffering from a disease or a state in which a disease can be alleviated, suppressed, or treated by administering the anti-cancer virus and the antibody or a fragment thereof.
  • the individual may be a mammal, including a human, and may be a non-human animal.
  • non-human animal refers to all vertebrates, and may include non-human primates, sheep, dogs, cats, horses, cows, chickens, amphibians, reptiles, and other mammals and non-mammals. have.
  • the anti-cancer virus is a first composition for killing and targeting cancer cells.When the anti-cancer virus is administered to an individual, it first specifically kills only cancer cells, and the cancer cells surviving the anti-cancer virus express A56 protein on the cell surface. Therefore, targeting for secondary chemotherapy is possible.
  • the antibody or fragment thereof is a second composition for secondary anticancer treatment, and when the antibody or fragment thereof is administered to an individual, only cancer cells expressing the A56 protein on the cell surface can be secondaryly killed.
  • the first composition and the second composition may be administered in a pharmaceutically effective amount to treat cancer cells or their metastasis, or to inhibit the growth of cancer. It may vary according to various factors such as cancer type, patient's age, weight, characteristics and degree of symptoms, type of current treatment, number of treatments, dosage form and route, and can be easily determined by experts in the field.
  • the first composition and the second composition may be administered parenterally.
  • intravenous (intra-venous) can be administered by a suitable method.
  • it may be intratumoral, intraperitoneal or intravenous administration.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may be determined according to an administration schedule, dosage, and health status of a patient.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for targeting cancer comprising the anticancer virus.
  • the anticancer virus is the same as described above for the anticancer agent.
  • Another aspect of the present invention provides the use of the anticancer virus for targeting cancer.
  • Another aspect of the present invention provides a method for targeting cancer comprising administering the anticancer virus to an individual.
  • the anticancer virus is the same as described above for the anticancer agent.
  • Another aspect of the present invention provides the use of the anticancer virus and the antibody or fragment thereof for treating cancer.
  • the anticancer virus and antibody or fragments thereof are the same as described above for the anticancer agent.
  • Another aspect of the present invention is the steps of i) administering the anticancer virus to a subject; And ii) administering the antibody or fragment thereof to a subject.
  • the anticancer virus and antibody or fragments thereof are the same as described above for the anticancer agent.
  • Wild-type vaccinia virus (NYC Department of Health strain, VR-1536) was purchased from the American Type Culture Collection (ATCC).
  • ATCC American Type Culture Collection
  • pUC57amp+ (genewiz, USA) with HSV1-TK gene (pSE/L promoter) and firefly luciferase reporter (p7.5 promoter) gene was used as a shuttle plasmid vector.
  • Hela cells (ATCC) were prepared in a 6-well plate in the condition of 4 ⁇ 10 5 cells/well and in EMEM medium containing 10% fetal calf serum. Wild-type vaccinia virus was treated with 0.05 MOI, and after 2 hours, replaced with EMEM medium containing 2% fetal calf serum, and linearized the shuttle plasmid vector, and then 4 ⁇ g of the linearized shuttle plasmid vector was added to XfectTM polymer (Clonetech 631317). , USA). After culturing for 4 hours, the cells were replaced with EMEM medium containing 2% fetal calf serum, and then cultured for an additional 72 hours. Recombinant vaccinia virus containing the HSV1-TK gene was obtained by confirming luciferase activity in HeLa cells.
  • HSV1-TK with genetic stability A mutated vaccinia virus (OTS-412) expressing the fragment was obtained.
  • the most reported mutations in HSV-TK are insertion or deletion of bases occurring in the 430th to 436th nucleotide sequences (7G) and 548th to 583th nucleotide sequences (6C). This is a frame shift mutation, and after inserting the native HSV-TK into the vaccinia virus, more than 98% mutation occurred there. Accordingly, in order to make the nucleotide sequence silent mutation, GGGGGGG, which is the 430th to 436th nucleotide sequence, was changed to GGTGGTG, and the CCCCCC, which is the 548th to 583th nucleotide sequence, was changed to CCCCTC.
  • HSV-TK variant gene was used as a shuttle vector by encoding alanine at position 167 of the amino acid sequence of HSV-TK as tyrosine. Thereafter, a recombinant vaccinia virus was prepared in the same manner as OTS-412 using the above shuttle vector using the Western Reserve species (WOTS-418) vaccinia virus.
  • the A56 proteins of OTS-412 and WOTS-418 were sequenced by requesting gene sequencing from Macrogen. As a result of alignment of each sequence for the A56 protein of OTS-412 and WOTS-418 through NCBI Blast and Uniprot, a 100% matching sequence was not found, and in particular, the 245th to 250th amino acids were deleted. Confirmed. It was compared with 4 species with high sequence homology (FIG. 96).
  • Wild-type pox virus (New York City Department of Health Laboratories) was purchased from ATCC (American Type Culture Collection, VR-1536) to knock out thymidine kinase gene by homologous recombination, and reporter and A56 protein or fragment thereof (SEQ ID NOs: 1039, 1041, 1043, 1045, 1047, 1049, 1051, 1053, 1055, 1057, 1059 or 1061, 1072, 1074 (OTS-412-A56), 1076, 1078 (WOTS-418- A56)).
  • Anti-cancer virus production comprising nucleic acid encoding A56 protein or fragment thereof
  • HelaS3 (ATCC) cell lines were prepared in a 6-well plate in the condition of 4 ⁇ 10 5 cells/well and in EMEM medium containing 10% fetal calf serum. Wild-type vaccinia virus was treated with an MOI of 0.05, and after 2 hours, it was replaced with an EMEM medium containing 2% fetal calf serum, and then 4 ⁇ g of the anticancer virus vector prepared in Preparation Example 1.1 was transfected using Xfect reagent buffer. After culturing for 4 hours, the cells were replaced with EMEM medium containing 2% fetal calf serum, and then cultured for an additional 72 hours.
  • the cells are lysed by repeating freezing and thawing three times and ultrasonic pulverization, and anticancer containing nucleic acids encoding A56 protein or fragments thereof isolated by sucrose cushion method. The virus was secured.
  • the anticancer virus containing the nucleic acid encoding the A56 protein or fragment thereof prepared in Preparation Example 1.3 was infected with a human lung cancer cell line (A549) or a human colorectal cancer cell line (HCT-116) to confirm whether the A56 protein was expressed on the surface of cancer cells. I did.
  • A549 lung carcinoma, ATCC, USA
  • HCT-116 colonal carcinoma, Korea Cell Line Bank
  • A549 lung carcinoma, ATCC, USA
  • HCT-116 colonal carcinoma, Korea Cell Line Bank
  • An anti-cancer virus containing a nucleic acid encoding the A56 protein or fragment thereof prepared in Preparation Example 1.3 was administered intraperitoneally to a mouse model inducing cancer to confirm whether the A56 protein was expressed on the tissue surface.
  • cancer was induced by subcutaneous transplantation of an HT-29 colorectal cancer cell line (Korea Cell Line Bank, KCLB) with a number of 6.3 ⁇ 10 6 cells to BALB/c nude mice.
  • an anticancer virus at a dose of 2 ⁇ 10 7 pfu prepared in Preparation Example 1.3 was administered intraperitoneally. Thereafter, on the fourth day, the mice were sacrificed to collect tumor tissues, brain, heart, lung, muscle, kidney, liver, and spleen tissue.
  • Immunofluorescence staining for A56 protein was performed in the same manner as in Experimental Example 1. After DAPI staining, each tissue sample was placed on a slide glass and observed using a fluorescence microscope.
  • the expression of the A56 protein was confirmed on the surface of the tumor tissue of the mouse to which the anticancer virus was administered.
  • A56 protein was not expressed in brain, heart, lung, muscle, kidney, liver, and spleen tissues (FIG. 4).
  • an antibody targeting the A56 protein expressed on the surface of a tumor tissue after administration of an anticancer virus could be produced and used as an anticancer immunotherapy.
  • An anti-cancer virus containing a nucleic acid encoding the A56 protein or fragment thereof prepared in Preparation Example 1.3 was intravenously administered to a normal rabbit to confirm whether the A56 protein was expressed on the tissue surface.
  • a dose of 1 ⁇ 10 8 pfu or 1 ⁇ 10 9 pfu of anticancer virus prepared in Preparation Example 1.2 was administered intravenously to New Zealand rabbits. Then, at the 3rd or 8th week, the rabbit was sacrificed to collect brain, heart, lung, muscle, kidney, liver, and spleen tissues.
  • Immunofluorescence staining for A56 protein was performed in the same manner as in Experimental Example 1. After DAPI staining, each tissue sample was placed on a slide glass and observed using a fluorescence microscope.
  • the A56 protein was not expressed in the heart, lung, muscle, kidney, liver, and spleen tissues of rabbits administered with the anticancer virus.
  • a fluorescence reaction was detected in the brain tissues of rabbits to which the anticancer virus was administered.
  • the brain tissue of a normal rabbit without an anticancer virus was immunofluorescent stained in the same manner as above, and then the fluorescence response was confirmed using a fluorescence microscope. I did.
  • cancer was induced by subcutaneous transplantation of Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) with a number of 6.3 ⁇ 10 6 cells to BALB/c nude mice.
  • Renca cancer cell line Kerat Cell Line Bank
  • a dose of 2 ⁇ 10 7 pfu of anticancer virus prepared in Preparation Example 1.2 was administered intratumorally, and hydroxyurea was administered at a dose of 30 mg/kg.
  • a saline set the administration subject group tumors in the control group, anti-cancer virus (1 ⁇ 10 7 pfu) only administered receiving group, and anti-cancer viruses (1 ⁇ 10 7 pfu) and hydroxy-urea (30 mg / kg) coadministration receiving
  • the group was set as the experimental group.
  • the anticancer virus was administered intratumorally twice on days 0 and 14, and hydroxyurea was administered intraperitoneally 6 times/week, excluding the day of administration of the anticancer virus from 1 day before the anticancer virus administration to the 21st day after administration.
  • mice were sacrificed on the 7th, 10th, and 14th days to collect tumor tissue, and the mice were sacrificed on the 21st, 24th and 28th days after the second anticancer virus administration to collect tumor tissues.
  • Immunofluorescence staining for A56 protein was performed in the same manner as in Experimental Example 1. After DAPI staining, each tissue sample was placed on a slide glass and observed using a fluorescence microscope.
  • A56 protein was clearly expressed on the surface of mouse tumors in the group administered with only the anticancer virus until the 7th, 10th, and 14th days after administration of the first anticancer virus and the group receiving the combination of anticancer virus and hydroxyurea. It was confirmed (Figs. 6 and 7).
  • An anti-cancer virus containing a nucleic acid encoding the A56 protein or fragment thereof prepared in Preparation Example 1.3 was treated with the A549 cell line to confirm whether the A56 protein was expressed on the cell surface.
  • the A549 (lung carcinoma, ATCC, USA) cell line was inoculated on a cover glass in a 12-well plate so as to have a number of 3.5 x 10 4 cells per well. Then, after infection with an anticancer virus of 0.1 MOI, it was incubated for 30 hours at 37°C CO 2 condition. After harvesting each cell line after cultivation, 4% (v/v) PFA (paraformaldehyde), 1% (v/v) BSA, anti-A56 antibody diluted in a ratio of 1:500 (Cat no. ABIN1606294, Antibodies) -Online) and a secondary antibody diluted in a 1:200 ratio (Alexa 594, Cat no. A21205, Invitrogen) were treated.
  • the nuclei were stained with DAPI, and the Golgi apparatus was stained with a fluorescent dye. Thereafter, a sample of the cell line was placed on a slide glass and observed using a confocal microscope (Olympus, FV1000). The results are shown in Figs. 12, 13, and Table 2.
  • a primer for removing a specific region from the wild-type A56 protein was prepared and a region overlapping with GFP was formed to perform overlapping PCR.
  • vector DNA (N293F-A56-C-HIS) was amplified, introduced into HEK293F cells, overexpressed, and then purified first by affinity chromatography (Ni-NTA), followed by cation exchange chromatography (CEX). Primary purification was performed, and finally A56-C-HIS protein was produced (FIGS. 97 and 98 ).
  • An anti-A56 antibody specifically binding to the A56 protein, its mutant or fragment thereof was requested from Ybiologics, and 61 antibodies were prepared and CDR analyzed through the phage library technique. Biopanning was performed to find a hit to bind by putting a phage library into a tube coated with the A56 antigen. The phage having specific binding was selected by washing an average of 3 times. After passing through the panning process three times, affinity was tested, and a small amount of colonies showing high affinity were picked to confirm whether affinity for the actual antigen appeared. A set with relatively many hits was selected, picked using an automated system, and selected hits.
  • FIGS. 14 to 19 The results of measuring the affinity between the anti-A56 antibody and the A56 protein thus produced are shown in FIGS. 14 to 19.
  • the production amount of the anti-A56 antibody is shown in FIGS. 20A to 20C.
  • FIGS. 21 to 37 show the results of confirming the produced anti-A56 antibody through SDS-PAGE.
  • a blocking process was performed. After the blocking process, the antibody subjected to three-fold serial dilution from 100 nM in each well was reacted at room temperature for a predetermined time. Thereafter, after washing three times with PBS, the secondary antibody was also treated at room temperature for a predetermined time, and the affinity between the A56 protein and the anti-A56 antibody was measured for each concentration.
  • the anti-cancer virus prepared in Preparation Example 1.3 was infected with HeLa, HT-29, A549, MCF-7, and PC-3 cell lines at 1 MOI, respectively. After 24 hours, each cell line infected with an anticancer virus was treated with five anti-A56 antibodies (ab01, ab02, ab03, ab04, ab05) prepared in Preparation Example 3, respectively, and then reacted at a temperature of 4°C for 1 hour. Made it. Then, after washing three times with PBS, anti-hIgG antibody (FITC, Abcam) was treated.
  • FITC anti-hIgG antibody
  • an anti-A56 antibody (Cat no. ABIN1606294, Antibodies-Online) was requested by LakePharma to prepare an antibody through reverse coding engineering.
  • the two antibodies were named “LakePharma variant3" and “LakePharma variant4".
  • the anti-cancer virus prepared in Preparation Example 1.2 was infected with each HeLa cell line at 1 MOI. After 24 days, an anti-A56 antibody (Cat no.ABIN1606294, Antibodies-Online) and two anti-A56 antibodies prepared in Preparation Example 4 (LakePharma variant3, 4) were treated with the HeLa cell line infected with the anticancer virus, respectively. It was reacted at a temperature of 4° C. for 1 hour. Then, after washing three times with PBS, anti-hIgG antibody (FITC, Abcam) was treated.
  • FITC anti-hIgG antibody
  • Anti-cancer viruses (OTS-412 and WOTS-418) encoding the A56 proteins of SEQ ID NOs: 1074 and 1078 prepared in Preparation Example 1.3 were treated with the A549 cancer cell line to express the A56 protein, and then the anti-A56 antibody (human It was confirmed whether 10 anti-A56 antibodies and 2 mouse anti-A56 antibodies) bound to the A56 protein.
  • Anti-cancer viruses were treated with 1 MOI in each A549 cancer cell line, 24 hours later, 10 antibodies (binding affinity top 10) Ab18, Ab19, Ab01, Ab13, Ab14, using the human scFv prepared in Preparation Example 3 as a binding domain.
  • Ab08, Ab03, Ab51, Ab55, Ab16 and two antibodies produced in Preparation Example 4 LPvariant03, variant04 were treated.
  • secondary antibodies Goat anti-human IgG FC, Goat anti-mouse IgG H&L
  • PI Propidium iodide
  • the anti-cancer viruses (OTS-412 and WOTS-418) encoding the A56 proteins of SEQ ID NOs: 1074 and 1078 prepared in Preparation Example 1.3 were treated with the A549 cancer cell line to express the A56 protein, and then Preparation Example 3 And it was confirmed whether the anti-A56 antibody prepared in 4 (Ybiologics: Ab18 and Ab16, LakePharma: LakePharma variant3, 4) binds to the A56 protein.
  • Anti-cancer virus and anti-A56 antibody were treated on the A549 cancer cell line in the same manner as in Experimental Example 9.
  • the A549 cancer cell line was stained with PI (Propidium iodide) and analyzed by flow cytometry (Moflo Astrios EQ, Backman Coulter).
  • Anti-cancer viruses (OTS-412 and WOTS-418) encoding A56 proteins of SEQ ID NOs: 1074 and 1078 prepared in Preparation Example 1.3 were PC3 After treatment with a cancer cell line to express the A56 protein, it was confirmed whether the anti-A56 antibody (10 types of human anti-A56 antibodies, 2 types of mouse anti-A56 antibodies) binds to the A56 protein.
  • Anti-cancer viruses (OTS-412 and WOTS-418) encoding A56 proteins of SEQ ID NOs: 1074 and 1078 prepared in Preparation Example 1 were PC3 After treating the cancer cell line to express the A56 protein, it was confirmed whether the anti-A56 antibodies (Ybiologics: Ab18 and Ab16, LakePharma: LakePharma variant3, 4) prepared in Preparation Examples 3 and 4 bind to the A56 protein.
  • PC3 anticancer virus and anti-A56 antibody in the same manner as in Experimental Example 9 It was treated on a cancer cell line.
  • PC3 above Cancer cell lines were stained with PI and analyzed by flow cytometry (Moflo Astrios EQ, Backman Coulter).
  • the anticancer viruses (OTS-412 and WOTS-418) encoding the A56 proteins of SEQ ID NOs: 1074 and 1078 prepared in Preparation Example 1 were MCF7. After treatment with a cancer cell line to express the A56 protein, it was confirmed whether the anti-A56 antibody (10 types of human anti-A56 antibodies, 2 types of mouse anti-A56 antibodies) binds to the A56 protein.
  • the PC3 cancer cell line was stained with PI and analyzed by flow cytometry (Moflo Astrios EQ, Backman Coulter).
  • the anticancer viruses (OTS-412 and WOTS-418) encoding the A56 proteins of SEQ ID NOs: 1074 and 1078 prepared in Preparation Example 1 were MCF7 After treating the cancer cell line to express the A56 protein, it was confirmed whether the anti-A56 antibody (LakePharma: LakePharma variant 3, 4) prepared in Preparation Example 4 binds to the A56 protein.
  • MCF7 anticancer virus and anti-A56 antibody in the same manner as in Experimental Example 9 It was treated on a cancer cell line.
  • MCF7 above Cancer cell lines were stained with PI and analyzed by flow cytometry (Moflo Astrios EQ, Backman Coulter).
  • the anticancer virus prepared in Preparation Example 1.3 was administered to a mouse inducing cancer prepared in the same manner as in Experimental Example 2. After a predetermined time elapsed, physiological saline was administered to the control group, and the antibody prepared in Preparation Example 3 was administered to the cancer-causing mice to the experimental group. As a result, cancer cells that were not killed by the anticancer virus remained in the tumor tissues of the control group, whereas the cancer cells were completely killed in the tumor tissues of the experimental group.
  • the anticancer virus prepared in Preparation Example 1.2 was administered to a mouse inducing cancer prepared in the same manner as in Experimental Example 2. After a predetermined time elapsed, physiological saline was administered to the control group, and the prepared immune cells were administered to the cancer-causing mice to the experimental group. As a result, cancer cells that were not killed by the anticancer virus remained in the tumor tissues of the control group, whereas the cancer cells were completely killed in the tumor tissues of the experimental group.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 종양 표적화 단백질 또는 이의 단편 및 그것에 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 및 이의 용도에 관한 것이다. 또한, A56 단백질 또는 이의 단편에 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 A56 단백질, 이의 단편 또는 이의 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 항암바이러스를 벡터로서 사용하여 개체에 투여할 경우 1차적으로 암세포만을 특이적으로 사멸시킨다. 또한, 항암바이러스에 감염되었음에도 살아남은 암세포는 세포 표면에 A56 단백질을 발현하고 있어 2차 항암치료를 위한 표적화가 가능하다. 따라서, 본 발명의 일 구체예인 A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 및 A56에 결합하는 항체를 이용할 경우, 암을 효과적으로 치료할 수 있다.

Description

종양 표적화 단백질 또는 이의 단편 및 그것에 결합하는 항체 및 이의 용도
본 발명은 종양 표적화 단백질 또는 이의 단편 및 그것에 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 A56 단백질의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 및 이의 용도에 관한 것이다. 또한, A56 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
암은 종양이라고도 불리며, 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자라난 세포를 의미한다. 현대사회의 인구 고령화, 흡연 인구의 증가, 음주량의 증가, 식습관의 서구화 및 환경오염으로 인해 암 발병률이 지속적으로 증가하고 있다.
암의 치료방법으로는 외과요법, 방사선요법, 화학요법 등이 있다. 구체적으로, 외과요법은 암 조직을 체내에서 제거하는 치료방법으로, 조기암 또는 병소가 일부에 국한되어 있는 암에 대해서는 매우 효과적이다. 하지만, 병소 주위의 조직 속에 침윤하거나 림프선으로 전이된 암은 제거하기 힘들며, 이러한 암은 재발병할 확률이 높다. 이런 경우 방사선 요법 또는 화학요법을 병용하여 치료한다. 방사선요법이나 화학요법은 진행암 또는 말기암의 치료에 주로 쓰이지만, 정상 세포들에도 영향을 미쳐 심각한 부작용을 초래한다.
최근 암의 치료방법으로서 면역세포 치료제가 활발히 연구되고 있다. 면역세포치료제는 암세포를 죽이는데 환자의 면역세포를 이용한다는 점에서 기존의 치료방법과 차이가 있다. 구체적으로, 면역세포 치료제는 환자의 면역세포를 수득하고, 이를 증식 또는 암세포에 특이적으로 공격하게 작용하도록 활성화시킨 후 다시 환자의 체내에 넣어주는 방식으로, 약물로 인한 부작용을 최소화하면서 항암 효과를 극대화한 방법이다.
또한, 지난 5년간 암을 치료하는 면역 요법으로써 면역 체크포인트 억제제(Immune checkpoint inhibitor)가 활발히 연구되었다. 특히, CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4), PD-1(Programmed cell death protein 1) 및 PD-L1과 같은 면역 체크포인트에 대한 억제제가 연구되어 왔다. 이필리무맙(ipilimumab, anti-CTLA-4), 니볼루맙(nivolumab, anti-PD-1) 및 펨브롤리주맙(pembrolizumab, anti-PD-1)과 같은 면역 체크포인트 억제제는 여러 종류의 암 치료에 대한 규제 기관의 승인을 받았다. 하지만, 면역 체크포인트 억제제는 흑색종, 폐암, 두경부암, 신장암, 방광암과 같은 특정 유형의 암을 가진 환자의 치료에 제한된다.
따라서, 안전하고 고형암에도 효과적으로 표적화시킬 수 있는 암세포 표적화 방법에 대한 지속적인 연구개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 안전하고 효과적으로 암세포를 표적화하는 방법을 개발하기 위해 연구한 결과, A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 주입하여 암세포에 처리하는 경우, 암세포 표면에 A56 단백질이 발현되는 것을 확인하였다. 또한, A56 단백질 또는 이의 단편에 결합하는 항체가 암세포의 세포 표면에 발현된 A56 단백질에 결합하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 측면은, A56 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 절편을 유효성분으로 포함하는 항암제를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, A56 단백질 또는 이의 단편과 결합하는 항체 또는 이의 절편을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 서열번호 1038, 1040, 1042, 1044, 1046, 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060, 1073, 1075, 1077, 또는 1079로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 암 표적화 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 암 표적화 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 항암바이러스 및 상기 항체 또는 이의 절편을 포함하는 암 치료용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 항암바이러스를 포함하는 암을 표적화시키기 위한 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 A56 단백질, 이의 단편 또는 이의 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스를 벡터로서 사용하여 개체에 투여할 경우 1차적으로 암세포만을 특이적으로 사멸시킨다. 또한, 항암바이러스에 감염되었음에도 살아남은 암세포는 세포 표면에 A56 단백질을 발현하고 있어 2차 항암치료를 위한 표적화가 가능하다. 따라서, 본 발명의 일 구체예인 A56 단백질, 이의 단편, 또는 이의 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 및 A56 또는 이의 단편에 결합하는 항체를 이용할 경우, 암을 효과적으로 치료할 수 있다.
도 1은 A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스를 이용한 종양 세포의 표적화 과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 인간 폐암 세포주(A549)에 A56 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스로 감염시킨 후, 감염된 A549 세포주 표면에서 A56 단백질의 발현 유무를 면역형광염색을 통해 확인한 도면이다.
도 3은 인간 대장암 세포주(HCT-116)에 A56 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스로 감염시킨 후, 감염된 HCT-116 세포주 표면에서 A56 단백질의 발현 유무를 면역형광염색을 통해 확인한 도면이다.
도 4는 인간 대장암 세포주(HT-29)를 식립한 마우스에 A56 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스를 복강내 투여한 후, 각 조직 표면에서 A56 단백질의 발현을 확인한 도면이다.
도 5는 정상 토끼에 A56 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스를 복강내 투여한 후, 각 조직 표면에서의 A56 단백질의 발현을 확인한 도면이다.
도 6은 마우스 신장암 세포주(Renca)를 식립한 마우스에 A56 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스를 종양내 투여한 후, 7일, 10일 및 14일째에 종양 조직의 표면에서 A56 단백질의 발현을 확인한 도면이다.
도 7은 마우스 신장암 세포주(Renca)를 식립한 마우스에 A56 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스 및 히드록시유레아를 종양내 투여한 후, 7일, 10일 및 14일째에 종양 조직의 표면에서 A56 단백질의 발현을 확인한 도면이다.
도 8은 마우스 신장암 세포주(Renca)를 식립한 마우스에 A56 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스를 2차 투여한 후, 21일, 24일 및 28일째에 종양 조직의 표면에서 A56 단백질의 발현을 확인한 도면이다.도 9는 마우스 신장암 세포주(Renca)를 식립한 마우스에 히드록시유레아와 A56 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스를 2차 투여한 후, 21일, 24일 및 28일째에 종양 조직의 표면에서 A56 단백질의 발현을 확인한 도면이다.
도 10은 마우스 신장암 세포주(Renca)를 식립한 마우스에 A56 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스 및 히드록시유레아를 투여한 후, 마우스의 종양의 부피를 측정한 도면이다.
도 11은 마우스 신장암 세포주(Renca)를 식립한 마우스에 A56 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스 및 히드록시유레아를 투여한 후, 마우스의 체중을 측정한 도면이다.
도 12는 A56 단백질 및 이의 단편의 일 구체예를 표기한 도면이다.
도 13은 A56 단백질 및 이의 단편이 세포 표면에 발현되는 것을 확인한 도면이다.
도 14 내지 도 19는 제조한 항-A56 항체들과 A56 간의 친화도를 측정한 도면이다.
도 20a는 A56-01A02 내지 A56-02B06의 항체 생산량을 확인한 도면이다.
도 20b는 A56-01A02 내지 A56-02B06의 항체 생산량을 나타낸 그래프이다.
도 20c는 A56-02D04 내지 A56-59E12의 항체 생산량을 확인한 도면이다.
도 21 내지 도 37은 생산된 항-A56 항체를 정제한 후, SDS-PAGE를 통해 확인한 도면이다.
도 38은 항암바이러스를 처리 또는 처리하지 않은 Hela 또는 HT-29 세포주에 항-A56 항체 5종을 각각 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 39는 항암바이러스를 처리 또는 처리하지 않은 A549, MCF-7 또는 PC-3 세포주에 항-A56 항체 3종을 각각 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 40은 항암바이러스를 처리 또는 처리하지 않은 Hela 세포주에 항-A56 항체(Antibodies-Online)를 처리한 후, 측정한 FACS 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 41은 항암바이러스를 처리 또는 처리하지 않은 Hela 세포주에 항-A56 항체(LakePharma variant3)를 처리한 후, 측정한 FACS 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 42는 항암바이러스를 처리 또는 처리하지 않은 Hela 세포주에 항-A56 항체(LakePharma variant4)를 처리한 후, 측정한 FACS 분석 결과를 나타낸
도 43은 항암바이러스를 처리 또는 처리하지 않은 Hela 세포주에 항-A56 항체(Antibodies-Online, LakePharma variant3 및 LakePharma variant4)를 처리한 후, 측정한 FACS 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 44는 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 A549 암세포주에 항-A56 항체(Ab18)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 45는 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 A549 암세포주에 항-A56 항체(Ab19)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 46은 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 A549 암세포주에 항-A56 항체(Ab01)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 47은 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 A549 암세포주에 항-A56 항체(Ab13)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 48은 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 A549 암세포주에 항-A56 항체(Ab14)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 49는 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 A549 암세포주에 항-A56 항체(Ab08)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 50은 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 A549 암세포주에 항-A56 항체(Ab03)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 51은 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 A549 암세포주에 항-A56 항체(Ab51)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 52는 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 A549 암세포주에 항-A56 항체(Ab55)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 53은 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 A549 암세포주에 항-A56 항체(Ab16)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 54는 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 A549 암세포주에 항-A56 항체(LP Variant3)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 55는 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 A549 암세포주에 항-A56 항체(LP Variant4)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 56은 항암바이러스(OTS-412)를 처리 또는 처리하지 않은 A549 암세포주에 항-A56 항체(Ab18, Ab19, Ab01, Ab13, Ab14, Ab08, Ab03, Ab51, Ab55, Ab16)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 비교한 도면이다.
도 57은 항암바이러스(WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 A549 암세포주에 항-A56 항체(Ab18, Ab19, Ab01, Ab13, Ab14, Ab08, Ab03, Ab51, Ab55, Ab16)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 비교한 도면이다.
도 58은 항암바이러스(OTS-412)를 처리 또는 처리하지 않은 A549 암세포주에 항-A56 항체(Ab18, Ab16)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 59는 항암바이러스(WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 A549 암세포주에 항-A56 항체(Ab18, Ab16)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 60은 항암바이러스(OTS-412)를 처리 또는 처리하지 않은 A549 암세포주에 LakePharma variant3 및 LakePharma variant4를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 61은 항암바이러스(WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 A549 암세포주에 LakePharma variant3 및 LakePharma variant4를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 62는 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 PC3 암세포주에 항-A56 항체(Ab18)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 63은 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 PC3 암세포주에 항-A56 항체(Ab19)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 64는 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 PC3 암세포주에 항-A56 항체(Ab01)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 65는 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 PC3 암세포주에 항-A56 항체(Ab13)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 66은 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 PC3 암세포주에 항-A56 항체(Ab14)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 67은 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 PC3 암세포주에 항-A56 항체(Ab08)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 68은 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 PC3 암세포주에 항-A56 항체(Ab03)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 69는 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 PC3 암세포주에 항-A56 항체(Ab51)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 70은 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 PC3 암세포주에 항-A56 항체(Ab55)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 71은 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 PC3 암세포주에 항-A56 항체(Ab16)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 72는 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 PC3 암세포주에 항-A56 항체(LP Variant3)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 73은 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 PC3 암세포주에 항-A56 항체(LP Variant4)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 74는 항암바이러스(OTS-412)를 처리 또는 처리하지 않은 PC3 암세포주에 항-A56 항체(Ab18, Ab19, Ab01, Ab13, Ab14, Ab08, Ab03, Ab51, Ab55, Ab16)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 비교한 도면이다.
도 75는 항암바이러스(WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 PC3 암세포주에 항-A56 항체(Ab18, Ab19, Ab01, Ab13, Ab14, Ab08, Ab03, Ab51, Ab55, Ab16)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 비교한 도면이다.
도 76은 항암바이러스(OTS-412)를 처리 또는 처리하지 않은 PC3 암세포주에 항-A56 항체(Ab18, Ab16)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 77은 항암바이러스(WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 PC3 암세포주에 항-A56 항체(Ab18, Ab16)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 78은 항암바이러스(OTS-412)를 처리 또는 처리하지 않은 PC3 암세포주에 LakePharma variant3 및 LakePharma variant4를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 79는 항암바이러스(WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 PC3 암세포주에 LakePharma variant3 및 LakePharma variant4를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 80은 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 MCF7 암세포주에 항-A56 항체(Ab18)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 81은 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 MCF7 암세포주에 항-A56 항체(Ab19)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 82는 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 MCF7 암세포주에 항-A56 항체(Ab01)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 83은 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 MCF7 암세포주에 항-A56 항체(Ab13)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 84는 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 MCF7 암세포주에 항-A56 항체(Ab14)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 85는 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 MCF7 암세포주에 항-A56 항체(Ab08)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 86은 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 MCF7 암세포주에 항-A56 항체(Ab03)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 87은 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 MCF7 암세포주에 항-A56 항체(Ab51)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 88은 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 MCF7 암세포주에 항-A56 항체(Ab55)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 89는 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 MCF7 암세포주에 항-A56 항체(Ab16)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 90은 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 MCF7 암세포주에 항-A56 항체(LP Variant3)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 91은 항암바이러스(OTS-412, WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 MCF7 암세포주에 항-A56 항체(LP Variant4)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 92는 항암바이러스(OTS-412)를 처리 또는 처리하지 않은 MCF7 암세포주에 항-A56 항체(Ab18, Ab19, Ab01, Ab13, Ab14, Ab08, Ab03, Ab51, Ab55, Ab16)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 비교한 도면이다.
도 93은 항암바이러스(WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 MCF7 암세포주에 항-A56 항체(Ab18, Ab19, Ab01, Ab13, Ab14, Ab08, Ab03, Ab51, Ab55, Ab16)를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 비교한 도면이다.
도 94는 항암바이러스(OTS-412)를 처리 또는 처리하지 않은 MCF7 암세포주에 LakePharma variant3 및 LakePharma variant4를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 95는 항암바이러스(WOTS-418)를 처리 또는 처리하지 않은 MCF7 암세포주에 LakePharma variant3 및 LakePharma variant4를 처리한 후, 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 96은 제조한 항체를 이용하여 ELISA 테스트를 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 97은 Fc가 융합된 A56 융합 단백질의 발현량을 확인한 도면이다.
도 98은 제조한 A56의 단편의 발현량을 확인한 도면이다.
도 99는 항암바이러스(OTS-412 및 WOTS-418)의 A56 단백질에 대한 서열 상동성을 분석한 도면이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 측면은, A56 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 절편을 유효성분으로 포함하는 항암제를 제공한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "A56 단백질"이란, 폭스비리데 계열(poxviridae)의 바이러스가 숙주세포를 감염시킨 후 바이러스 유전자에 코딩되어 있는 A56, A56R 또는 HA로 표현되는 유전자(예: GeneID: 3707652)의 해독(解讀) 단백질을 말한다. 상기 A56 단백질 또는 이의 단편이 서열번호 1038, 1040, 1042, 1044, 1046, 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060, 1073, 1075, 1077, 또는 1079로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산이 서열번호 1039, 1041, 1043, 1045, 1047, 1049, 1051, 1053, 1055, 1057, 1059, 1061, 1072, 107, 1076, 1078로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 A56 단백질은 야생형 A56 단백질 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 야생형 A56 단백질은 서열번호 1038 또는 1073으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 야생형 A56 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 1039 또는 1072로 표시되는 염기서열일 수 있다.
또한, 상기 A56 단백질의 변이체는 A56 단백질과 같이 암세포 표면에 위치할 수 있는 한, 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가될 수 있다. 상기 A56 단백질 변이체를 코딩하는 염기서열은 서열번호 1038 또는 1073으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열일 수 있으며, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열일 수 있다. 구체적으로, 상기 A56 단백질의 변이체는 서열번호 1075 또는 1079로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 A56 단백질의 변이체를 코딩하는 핵산은 서열번호 1074 또는 1078로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 A56 단백질의 단편은 서열번호 1040, 1042, 1044, 1046, 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060 또는 1077로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 상기 단편을 코딩하는 핵산은 서열번호 1040, 1042, 1044, 1046, 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060 또는 1076으로 표시되는 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열일 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1040, 1042, 1044, 1046, 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060 또는 1077로 표시되는 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열은 각각 순서대로 서열번호 1041, 1043, 1045, 1047, 1049, 1051, 1053, 1055, 1057, 1059, 1061 또는 1076으로 표시될 수 있다.
또한, 상기 A56 단백질의 단편을 코딩하는 염기서열은 1040, 1042, 1044, 1046, 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060 또는 1077로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열일 수 있으며, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "항체"란, 항원과 결합하여 항원의 작용을 방해하거나, 항원을 제거하는 면역단백질을 의미한다. 항체에는 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE의 5종류가 있으며, 각각 중쇄 불변영역 유전자 μ, δ, γ, α, ε로부터 만들어진 중쇄를 포함한다. 항체기술에서는 주로 IgG가 사용되는데 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 4종류의 동종(isotype)이 있으며, 각각의 구조 및 기능적 특성은 상이할 수 있다.
상기 IgG는 중쇄(heavy chain, 약 50 kDa) 단백질 2개와 경쇄(light chain, 약 25 kDa) 단백질 2개로 만들어진 Y자 모양의 매우 안정된 구조(분자량, 약 150 kDa)를 형성하고 있다. 항체의 경쇄와 중쇄는 아미노산 서열이 항체들마다 서로 다른 가변영역(variable region)과 아미노산 서열이 같은 불변영역(constant region)으로 나뉘어져 있다. 중쇄 불변영역에는 CH1, H(hinge), CH2, CH3 도메인이 존재한다. 각 도메인은 두 개의 β-시트(sheet)로 구성되어 있고 분자 내 이화항결합(disulfide bond)으로 연결되어 있다. 중쇄와 경쇄의 가변영역 두 개가 합쳐져 항원 결합 부위(antigen binding site)가 형성된다. 상기 부위는 Y자 모양의 두 개의 팔에 각각 한 개씩 존재하는데 이러한 항원과 결합할 수 있는 부분을 Fab(antibody binding fragment)이라 하고, 항원과 결합하지 못하는 부분을 Fc(crystalizable fragment)라고 한다. Fab과 Fc은 유연한 경첩 부위(hinge region)로 연결되어 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "CDR"이란, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역 안에 항체마다 다른 아미노산 서열을 가지는 부위인 초가변영역(hypervariable region)으로서, 항원과 결합하는 부위를 의미한다. 항체의 입체구조를 살펴보면, CDR은 항체의 표면에서 고리(loop) 모양을 하고 있고 고리 아래에는 이를 구조적으로 지지해주는 FR(framework region)이 존재한다. 중쇄와 경쇄에는 각각 세 개씩의 고리구조가 존재하며, 이들 여섯 개의 고리 지역 구조는 서로 합쳐져서 항원과 직접적으로 접촉한다. 상기 여섯 개의 고리 지역 구조의 항원 결합 부위 각각을 편의상 CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 및 CDR6라고 지칭한다.
또한, 상기 항체 절편은 Fab, scFv, F(ab)2 및 Fv로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 항체 절편은 항원과의 결합 자극을 세포나 보체 등에 전달하는 기능(effector function)을 하는 결정가능 영역(Fc region)을 제외한 항원결합 도메인들을 말하며, 단일 도메인 항체(single domain antibody)나 소형 항체(minibody) 등과 같은 3세대 항체 절편을 포함할 수 있다.
또한, 상기 항체 절편은 완전한 구조의 IgG에 비하여 크기가 작기 때문에 조직이나 종양으로의 침투율이 좋고, 박테리아에서 생산할 수 있으므로 생산 비용이 적게 드는 장점이 있다. 또한, 상기 항체 절편은 Fc가 없기 때문에 항원과의 결합 자극을 세포나 보체 등에 전달하는 기능을 원하지 않는 경우에 사용한다. 항체 절편은 인체 내에서의 반감기가 짧아 생체 진단용으로 적합하지만, 항체를 이루고 있는 아미노산 중 일부 염기성, 산성 혹은 중성 아미노산을 상호 교체할 경우 그 항체만의 고유한 등전점(isoelectric point, pI)이 바뀔 수 있다. 이러한 항체의 등전점 변화가 항체의 생체 내 독성 부작용을 경감한다거나 수용성을 증가시키는 등의 변화를 유도할 수 있으므로 치료용 항체의 경우 친화도나 구조적 형태를 고려하여 완전한 구조의 IgG를 사용할 수 있다.
상기 항체는 공지의 단일클론 항체 제조기술로 용이하게 제조될 수 있다. 단일클론항체를 제조하는 방법은 면역된 동물로부터 얻은 B 림프구를 사용하여 하이브리도마를 제조함으로써 수행되거나, 파지 디스플레이(phage display) 기술을 이용함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항체 또는 이의 절편은 서열번호 1, 18, 35, 52, 69, 86, 103, 120, 137, 154, 171, 188, 205, 222, 239, 256, 273, 290, 307, 324, 341, 358, 375, 392, 409, 426, 443, 460, 477, 494, 511, 528, 545, 562, 579, 596, 613, 630, 647, 664, 681, 698, 715, 732, 749, 766, 783, 800, 817, 834, 851, 868, 885, 902, 919, 936, 953, 970, 987, 1004, 1021, 1062 및 1063으로 이루어진 군에서 선택된 중쇄 CDR1;
서열번호 2, 19, 36, 53, 70, 87, 104, 121, 138, 155, 172, 189, 206, 223, 240, 257, 274, 291, 308, 325, 342, 359, 376, 393, 410, 427, 444, 461, 478, 495, 512, 529, 546, 563, 580, 597, 614, 631, 648, 665, 682, 699, 716, 733, 750, 767, 784, 801, 818, 835, 852, 869, 886, 903, 920, 937, 954, 971, 988, 1005, 1022 및 1064로 이루어진 군에서 선택된 중쇄 CDR2; 및
서열번호 3, 20, 37, 54, 71, 88, 105, 122, 139, 156, 173, 190, 207, 224, 241, 258, 275, 292, 309, 326, 343, 360, 377, 394, 411, 428, 445, 462, 479, 496, 513, 530, 547, 564, 581, 598, 615, 632, 649, 666, 683, 700, 717, 734, 751, 768, 785, 802, 819, 836, 853, 870, 887, 904, 921, 938, 955, 972, 989, 1006, 1023 및 1065로 이루어진 군에서 선택된 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및
서열번호 4, 21, 38, 55, 72, 89, 106, 123, 140, 157, 174, 191, 208, 225, 242, 259, 276, 293, 310, 327, 344, 361, 378, 395, 412, 429, 446, 463, 480, 497, 514, 531, 548, 565, 582, 599, 616, 633, 650, 667, 684, 701, 718, 735, 752, 769, 786, 803, 820, 837, 854, 871, 888, 905, 922, 939, 956, 973, 990, 1007, 1024 및 1066으로 이루어진 군에서 선택된 경쇄 CDR1;
서열번호 5, 22, 39, 56, 73, 90, 107, 124, 141, 158, 175, 192, 209, 226, 243, 260, 277, 294, 311, 328, 345, 362, 379, 396, 413, 430, 447, 464, 481, 498, 515, 532, 549, 566, 583, 600, 617, 634, 651, 668, 685, 702, 719, 736, 753, 770, 787, 804, 821, 838, 855, 872, 889, 906, 923, 940, 957, 974, 991, 1008, 1025 및 1067로 이루어진 군에서 선택된 경쇄 CDR2; 및
서열번호 6, 23, 40, 57, 74, 91, 108, 125, 142, 159, 176, 193, 210, 227, 244, 261, 278, 295, 312, 329, 346, 363, 380, 397, 414, 431, 448, 465, 482, 499, 516, 533, 550, 567, 584, 601, 618, 635, 652, 669, 686, 703, 720, 737, 754, 771, 788, 805, 822, 839, 856, 873, 890, 907, 924, 941, 958, 975, 992, 1009, 1026 및 1068로 이루어진 군에서 선택된 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
상기 항체 또는 이의 절편은 서열번호 1, 35, 120, 222, 239, 290, 324, 341, 851, 919, 1062 또는 1063의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
서열번호 2, 36, 121, 223, 240, 291, 325, 342, 852, 920 또는 1064의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
서열번호 3, 37, 122, 224, 241, 292, 326, 343, 853, 921 또는 1065의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및
서열번호 4, 38, 123, 225, 242, 293, 327, 344, 854, 922 또는 1066의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
서열번호 5, 39, 124, 226, 243, 294, 328, 345, 855, 923 또는 1067의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및
서열번호 6, 40, 125, 227, 244, 295, 329, 346, 856, 924 또는 1068의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
상기 항체 또는 이의 절편은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
상기 항체 또는 이의 절편은 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1; 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1; 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
상기 항체 또는 이의 절편은 서열번호 120의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1; 서열번호 121의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 122의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 123의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1; 서열번호 124의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 125의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
상기 항체 또는 이의 절편은 서열번호 222의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1; 서열번호 223의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 224의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 225의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1; 서열번호 226의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 227의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
상기 항체 또는 이의 절편은 서열번호 239의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1; 서열번호 240의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 241의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 242의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1; 서열번호 243의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 244의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
상기 항체 또는 이의 절편은 서열번호 290의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1; 서열번호 291의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 292의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 293의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1; 서열번호 294의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 295의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
상기 항체 또는 이의 절편은 서열번호 324의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1; 서열번호 325의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 326의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 327의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1; 서열번호 328의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 329의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
상기 항체 또는 이의 절편은 서열번호 341의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1; 서열번호 342의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 343의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 344의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1; 서열번호 345의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 346의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
상기 항체 또는 이의 절편은 서열번호 851의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1; 서열번호 852의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 853의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 854의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1; 서열번호 855의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 856의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
상기 항체 또는 이의 절편은 서열번호 919의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1; 서열번호 920의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 921의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 922의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1; 서열번호 923의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 924의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
상기 항체 또는 이의 절편은 서열번호 1062 또는 1063의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1; 서열번호 1064의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 1065의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 1066의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1; 서열번호 1067의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 1068의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
일 실시예로 상기 항체 또는 이의 절편은 하기의 CDR의 조합을 포함하는 것 일 수 있다:
Figure PCTKR2020013485-appb-T000001
Figure PCTKR2020013485-appb-I000001
Figure PCTKR2020013485-appb-I000002
특히, 상기 항체 또는 이의 절편은 서열번호 8, 25, 42, 59, 76, 93, 110, 127, 144, 161, 178, 195, 212, 229, 246, 263, 280, 297, 314, 331, 348, 365, 382, 399, 416, 433, 450, 467, 484, 501, 518, 535, 552, 569, 586, 603, 620, 637, 654, 671, 688, 705, 722, 739, 756, 773, 790, 807, 824, 841, 858, 875, 892, 909, 926, 943, 960, 977, 994, 1011, 1028, 1069 및 1070으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 항체 또는 이의 절편은, 서열번호 8, 42, 127, 229, 246, 297, 331, 348, 858, 926, 1069 및 1070으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
또한, 상기 항체 또는 이의 절편은 서열번호 9, 26, 43, 60, 77, 94, 111, 128, 145, 162, 179, 196, 213, 230, 247, 264, 281, 298, 315, 332, 349, 366, 383, 400, 417, 434, 451, 468, 485, 502, 519, 536, 553, 570, 587, 604, 621, 638, 655, 672, 689, 706, 723, 740, 757, 774, 791, 808, 825, 842, 859, 876, 893, 910, 927, 944, 961, 978, 995, 1012, 1029 및 1071로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 항체 또는 이의 절편은, 서열번호 9, 43, 128, 230, 247, 298, 332, 349, 859, 927 및 1071로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
상기 항체 또는 이의 절편은 서열번호 8, 25, 42, 59, 76, 93, 110, 127, 144, 161, 178, 195, 212, 229, 246, 263, 280, 297, 314, 331, 348, 365, 382, 399, 416, 433, 450, 467, 484, 501, 518, 535, 552, 569, 586, 603, 620, 637, 654, 671, 688, 705, 722, 739, 756, 773, 790, 807, 824, 841, 858, 875, 892, 909, 926, 943, 960, 977, 994, 1011, 1028, 1069 및 1070으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호 9, 26, 43, 60, 77, 94, 111, 128, 145, 162, 179, 196, 213, 230, 247, 264, 281, 298, 315, 332, 349, 366, 383, 400, 417, 434, 451, 468, 485, 502, 519, 536, 553, 570, 587, 604, 621, 638, 655, 672, 689, 706, 723, 740, 757, 774, 791, 808, 825, 842, 859, 876, 893, 910, 927, 944, 961, 978, 995, 1012, 1029 및 1071로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 항체 또는 이의 절편은 서열번호 8, 42, 127, 229, 246, 297, 331, 348, 858, 926, 1069 및 1070으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호 9, 43, 128, 230, 247, 298, 332, 349, 859, 927 및 1071로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
상기 항암제는 항암바이러스에 감염된 암세포를 타겟으로 할 수 있다. 구체적으로, 상기 항암바이러스는 항암바이러스 백시니아 바이러스(vaccinia virus)일 수 있다. 상기 항암바이러스는 A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 것일 수 있다.
A56 단백질 또는 이의 단편은 상술한 바와 동일하다. 상기 A56 단백질은 야생형 A56 단백질 또는 A56 단백질의 변이체일 수 있다. 상기 A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산은 야생형 A56 단백질 또는 A56 단백질의 변이체를 코딩하는 핵산일 수 있다.
상기 A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산이 서열번호 1039, 1041, 1043, 1045, 1047, 1049, 1051, 1053, 1055, 1057, 1059 또는 1061, 1072, 1074, 1076, 1078로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), Wyeth(The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), IHD-J(International Health Division-J) 또는 IHD-W(International Health Division-White) 백시니아 바이러스 주(strain)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항암바이러스는 티미딘 키나아제(Thymidine kinase, TK) 유전자를 결손시킨 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 항암바이러스는 티미딘 키나아제 유전자를 결손시킨 재조합 백시니아 바이러스일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "TK(thymidine kinase)"란, 티미딘 키나아제로 불리며, 뉴클레오티드의 생합성에 관여하는 효소를 의미한다. 상기 TK는 세포 및 바이러스의 뉴클레오티드의 생합성에 모두 쓰이는 효소이다. 이때, 세포의 경우 정상세포는 더 이상 분열하지 않아 TK가 존재하지 않으며, 모근세포처럼 빠르게 분열하는 세포라 하더라도 TK의 양이 바이러스가 이용할 만큼 충분하지 않다. 이러한 점을 이용해 바이러스에서 TK 유전자를 결손 시킴으로써 바이러스가 암세포의 TK가 존재하는 경우에만 증식할 수 있게 함으로써, 암세포만을 선택적으로 사멸시킬 수 있다.
상기 항암제는 생리적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 항암제는 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제, 또는 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 항암제는 주사제의 형태일 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 1985)에 게시되어 있는 것을 사용할 수 있다.
상기 항암제는 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 림프종, 급성 백혈병, 다발성 골수종 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있다. 또한, 상기 항암제는 담체, 부형제 및 희석제로 소금 (sodium chloride), 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함할 수 있다. 상기 항암보조제를 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 구체적으로, 상기 고형암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, 상기 혈액암은 림프종, 급성 백혈병, 다발성 골수종 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 항암제의 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성률 및 병용되는 약물을 고려하여 결정하는 것이 좋으며, 항체 또는 이의 절편을 기준으로 하였을 때 0.0001 mg/kg(체중) 내지 100 mg/kg(체중)으로 투여할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스를 유효성분으로 포함하는 암세포 표적화 조성물을 제공한다. 상기 항암바이러스는 항암제에서 상술한 바와 동일하다.
상기 암세포는 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 구체적으로, 상기 고형암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 신장암, 섬유욕종, 고환암, 뇌전이암, 간전이암 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 혈액암은 림프종, 급성 백혈병, 다발성 골수종 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 항암바이러스를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암세포를 표적화하는 방법을 제공한다.
상기 개체는 인간을 포함하는 포유류일 수 있으며, 인간이 아닌 동물일 수 있다. 상기 "인간이 아닌 동물"이라는 용어는 모든 척추동물로서, 인간이 아닌 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등과 같은 포유동물 및 비(非) 포유동물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 개체는 상기 항암바이러스를 투여하여 질환이 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태이거나 암 질환을 앓고 있는 개체를 의미한다.
상기 항암바이러스의 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 환자에게 1×105 내지 1×1018의 바이러스 입자(virus particle), 감염능을 가지는 바이러스 단위(TCID50) 또는 플라크 형성 단위(pfu)의 항암바이러스를 투여할 수 있다. 구체적으로는, 1×105, 2×105, 5×105, 1×106, 2×106, 5×106, 1×107, 2×107, 5×107, 1×108, 2×108, 5×108, 1×109, 2×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011, 5×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017 또는 그 이상의 바이러스 입자, 감염능을 가지는 바이러스 단위 또는 플라크 형성 단위의 항암바이러스를 투여하는 것으로써, 상기 사이에 다양한 수 및 범위를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항암바이러스는 1×105 내지 1×1010 pfu 용량으로 투여될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 항암바이러스는 1×105 이상, 1×109 pfu 미만의 용량으로 투여될 수 있다.
상기 항암바이러스는 비경구적으로 투여될 수 있는데, 종양 내(intratumoral), 복강내(intraperitoneal), 피하(sub-cutaneous), 피내(intra-dermal), 림프절내(intra-nodal) 및 정맥 내(intra-venous) 등에 적당한 방법에 의해서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 종양 내 투여, 복강 투여 또는 정맥 투여 일 수 있다.
상기 항암바이러스의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 항암바이러스는 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다. 구체적으로, 상기 항암바이러스는 주사제 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, A56 단백질 또는 이의 단편과 결합하는 항체 또는 이의 절편을 제공한다. 상기 항체 또는 이의 절편은 항암제에서 상술한 바와 동일하다.
상기 항체는 i) A56 단백질 또는 이의 단편을 개체에 투여하는 단계; ii) 개체로부터 B세포를 수득하는 단계; 및 iii) 상기 B세포를 배양하여 항-재조합 A56 단백질 항체를 수득하는 단계를 포함하는 항체 생산 방법을 통해 생산될 수 있다.
또한, 상기 A56 단백질 또는 이의 단편은 i) 본 발명의 벡터를 숙주세포로 형질주입시키는 단계; ii) 형질주입시킨 숙주세포를 배양하는 단계; 및 iii) 상기 배양물로부터 재조합 A56 단백질을 수득하는 단계를 단백질 생산 방법을 통해 생산될 수 있다.
상기 숙주세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 구체적으로, 상기 원핵세포는 대장균(E. coli) 또는 효모(Yeast)일 수 있다. 상기 진핵세포는 NS/0 골수종 세포(NS/0 myeloma cell), 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell), HeLa 세포, CapT 세포(인간 양수 유래 세포) 또는 COS 세포일 수 있다.
상기 형질주입은 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection) 또는 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun)을 통해 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 서열번호 1038, 1040, 1042, 1044, 1046, 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060, 1073, 1075, 1077, 또는 1079로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 암 표적화 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 제공한다. 상기 서열번호 1038, 1040, 1042, 1044, 1046, 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060, 1073, 1075, 1077, 또는 1079로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 단편은 항암제에서 상술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 암 표적화 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 상기 핵산은 서열번호 1039, 1041, 1043, 1045, 1047, 1049, 1051, 1053, 1055, 1057, 1059, 1061, 1072, 107, 1076, 1078로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 항암바이러스 및 상기 항체 또는 이의 절편을 포함하는 암 치료용 키트를 제공한다.
상기 항암바이러스 및 항체 또는 이의 절편은 항암제에서 상술한 바와 같다.
상기 개체는 상기 항암바이러스와 상기 항체 또는 이의 절편을 투여하여 질환이 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태이거나 질환을 앓고 있는 개체를 의미한다. 상기 개체는 인간을 포함하는 포유류일 수 있으며, 인간이 아닌 동물일 수 있다. 상기 "인간이 아닌 동물"이라는 용어는 모든 척추동물로서, 인간이 아닌 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등과 같은 포유동물 및 비(非) 포유동물을 포함할 수 있다. 상기 항암바이러스는 암세포의 사멸 및 표적화를 위한 제1조성물로서, 상기 항암바이러스를 개체에 투여할 경우 1차적으로 암세포만을 특이적으로 사멸시키고, 항암바이러스로부터 살아남은 암세포는 세포 표면에 A56 단백질을 발현하게 되므로 2차 항암치료를 위한 표적화가 가능하다.
상기 항체 또는 이의 절편은 2차 항암치료를 위한 제2조성물로서, 상기 항체 또는 이의 절편을 개체에 투여할 경우 2차적으로 세포 표면에 A56 단백질을 발현하는 암세포만을 사멸시킬 수 있다.
상기 제1조성물 및 제2조성물은 암세포 또는 그들의 전이를 치료하기 위하여, 또는 암의 성장을 억제하기 위하여 약학적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 암 종류, 환자의 연령, 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 치료 회수, 투여 형태 및 경로 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 해당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 상기 제1조성물 및 제2조성물은 비경구적으로 투여될 수 있는데, 종양 내(intratumoral), 복강내(intraperitoneal), 피하(sub-cutaneous), 피내(intra-dermal), 림프절내(intra-nodal) 및 정맥 내(intra-venous) 등에 적당한 방법에 의해서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 종양 내 투여, 복강 투여 또는 정맥 투여 일 수 있다. 한편, 상기 약학 조성물의 투여량은 투여 스케줄, 투여량 및 환자의 건강 상태 등에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 항암바이러스를 포함하는 암을 표적화시키기 위한 약학 조성물을 제공한다. 상기 항암바이러스는 항암제에서 상술한 바와 동일하다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암을 표적화시키기 위한 상기 항암바이러스의 용도를 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면은, 상기 항암바이러스를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 표적화시키는 방법을 제공한다. 상기 항암바이러스는 항암제에서 상술한 바와 동일하다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암을 치료하기 위한 상기 항암바이러스 및 상기 항체 또는 이의 절편의 용도를 제공한다. 상기 항암바이러스 및 항체 또는 이의 절편은 항암제에서 상술한 바와 동일하다.
본 발명의 또 다른 측면은 i) 상기 항암바이러스를 개체에 투여하는 단계; 및 ii) 상기 항체 또는 이의 절편을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 항암바이러스 및 항체 또는 이의 절편은 항암제에서 상술한 바와 동일하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.
I. A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스 제조 및 종양 세포 표면에서의 발현 확인
제조예 1.1. A56 단백질의 변이체 제작 및 확인
ATCC(American Type Culture Collection)에서 야생형 백시니아 바이러스(NYC Department of Health strain, VR-1536)를 구입하였다. 재조합을 위해 HSV1-TK 유전자(pSE/L promoter)와 firefly luciferase reporter(p7.5 promoter) 유전자를 가진 pUC57amp+ (genewiz, USA)를 셔틀 플라스미드 벡터로 사용하였다.
재조합 바이러스를 확보하기 위하여, Hela 세포(ATCC)를 6-웰 플레이트에 4x105 세포/웰 조건 및 10% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지 상태로 준비하였다. 야생형 백시니아 바이러스 0.05 MOI를 처리하고, 2시간 후, 2% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지로 교체하고, 상기 셔틀 플라스미드 벡터를 선형화 시킨 후, 선형화된 셔틀 플라스미드 벡터 4 ㎍을 XfectTM polymer(Clonetech 631317, USA)로 세포 내에 전달하였다. 4시간 배양 후, 세포를 2% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지로 교체한 후 72시간 추가 배양하였다. HeLa 세포에서 루시퍼라제(luciferase) 활성을 확인하여 HSV1-TK 유전자를 포함하는 재조합 백시니아 바이러스를 확보하였다.
그 후, TK- 골육종(osteosarcoma 143 TK-) 세포주에서 BrdU(Thymidine analogue, 15 ㎍/㎖) 존재 하, TK 기능이 없는 세포를 선택할 수 있는 생화학적 환경(TK- selection pressure)이 가해진 상태에서 10회의 연속 계대 배양을 통해 HSV1-TK의 돌연변이를 유도하였다. 변이된 백시니아 바이러스의 아미노산 서열 분석(amino acid sequencing)을 마크로젠에 의뢰하였다. 그 결과, 변이된 백시나아 바이러스의 HSV1-TK의 C-말단의 46번째 아미노산인 글루타민(Gln)을 코딩하는 코돈(caa)이 스탑 코돈(stop codon)으로 점 돌연변이(point mutation)된 것을 확인하였다. 또한, 변이된 백시나아 바이러스의 HSV1-TK의 46번째 이후의 C-말단의 아미노산 잔기들이 결실된 것을 확인하였다. 최종적으로, 유전적 안정성이 확보된 HSV1-TK 단편을 발현하는 변이된 백시니아 바이러스(OTS-412)를 획득하였다.
또한, HSV-TK의 가장 많이 보고된 변이 부분은 430번째 내지 436번째 염기서열(7G) 및 548번째 내지 583번째 염기서열(6C) 구간에서 발생하는 염기의 삽입(insertion) 또는 삭제(deletion)로 인한 프레임 시프트(frame shift) 변이이고, 자연형 HSV-TK를 백시니아 바이러스에 삽입한 후, 98% 이상의 변이가 이곳에서 발생하였다. 이에, 상기 염기서열 부분을 침묵 돌연변이(scient mutation) 시키기 위해 430번째 내지 436번째 염기서열인 GGGGGGG를 GGTGGTG로 변경하였으며, 548번째 내지 583번째 염기서열인 CCCCCC를 CCCCTC로 변경하였다. 또한, HSV-TK의 아미노산 서열 중 167번째 알라닌(alanine)을 티로신(tyrosine)으로 코딩하여 HSV-TK 변이체 유전자를 셔틀벡터로 사용하였다. 그 후, 위 셔틀벡터를 웨스턴 리저브종(WOTS-418)의 백시니아 바이러스를 이용하여 OTS-412와 동일한 방법으로 재조합 백시니아 바이러스를 제조하였다.
상기 OTS-412 및 WOTS-418의 A56 단백질을 마크로젠사에 유전자 시퀀싱을 의뢰하여 서열을 분석하였다. OTS-412 및 WOTS-418의 A56 단백질에 대한 각각의 서열을 NCBI Blast 및 Uniprot를 통해 정렬(alignment)한 결과, 100% 일치하는 서열은 찾지 못하였으며, 특히 245번째 내지 250번째 아미노산이 결실되어 있는 것을 확인하였다. 서열 상동성이 높은 4종과 비교하였다(도 96).
제조예 1.2. A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스 벡터 제조
ATCC(American Type Culture Collection, VR-1536)에서 야생형 폭스 바이러스(New York City Department of Health Laboratories)를 구입하여 티미딘 키나아제 유전자를 상동성 재조합에 의해 녹아웃(knock out)시키고 리포터 및 A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 유전자(서열번호 1039, 1041, 1043, 1045, 1047, 1049, 1051, 1053, 1055, 1057, 1059 또는 1061, 1072, 1074(OTS-412-A56), 1076, 1078(WOTS-418-A56))로 대체하였다.
제조예 1.3. A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스 생산
A56 단백질을 포함하는 항암바이러스를 생산하기 위하여, HelaS3(ATCC) 세포주를 6-웰 플레이트에 4×105 세포/웰 조건 및 10% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지 상태로 준비하였다. 야생형 백시니아 바이러스 0.05 MOI를 처리하고, 2시간 후, 2% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지로 교체한 후 제조예 1.1에서 제작한 항암바이러스 벡터 4 ㎍을 Xfect reagent buffer를 이용하여 형질주입하였다. 4시간 배양 후, 세포를 2% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지로 교체한 후 72시간 추가 배양하였다. 최종적으로, 감염된 세포를 회수한 다음 동결 및 해동을 3회 반복과 초음파분쇄로 세포를 용해시키고, 수크로스 쿠션법(sucrose cushion method)으로 분리된 A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스를 확보하였다.
실험예 1. 암세포 표면에서의 A56 단백질 발현
제조예 1.3에서 제조한 A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스를 인간 폐암 세포주(A549) 또는 인간 대장암 세포주(HCT-116)에 감염시켜 암세포 표면에 A56 단백질이 발현되었는지를 확인하였다.
구체적으로, A549(lung carcinoma, ATCC, 미국), HCT-116(colorectal carcinoma, 한국세포주은행) 세포주를 12-웰-플레이트 내의 커버글라스 상에 각 웰당 3.5Х104 세포수가 되도록 접종하였다. 그 후, 0.1 MOI의 항암바이러스로 감염시킨 후, 37℃ CO2 조건에서 30시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 각각의 세포주들을 수확한 후, 4%(v/v) PFA(paraformaldehyde), 1%(v/v) BSA, 1:500 비율로 희석시킨 항-A56 1차 항체(Cat no. ABIN1606294, Antibodies-Online) 및 1:200 비율로 희석시킨 2차 항체(Alexa 594, Cat no. A21205, Invitrogen)를 처리하였다. DAPI 염색을 한 후, 슬라이드 글라스에 각각의 세포주 샘플을 올려놓고 공초점현미경(Olympus, FV1000)을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 항암바이러스로 감염시킨 A549 및 HCT-116 세포주의 세포 표면에서 A56 단백질의 발현을 확인하였다(도 2 및 도 3).
실험예 2. 마우스의 종양 조직 표면에서의 A56 단백질 발현 확인 I
제조예 1.3에서 제조한 A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스를 암을 유발시킨 마우스 모델에 복강내 투여하여 조직 표면에 A56 단백질이 발현되었는지를 확인하였다.
구체적으로, BALB/c 누드 마우스에 6.3×106 세포수의 HT-29 대장암 세포주(한국세포주은행, KCLB)를 피하 이식하여 암을 유발하였다. 종양의 평균 부피가 150 ㎜3 내지 200 ㎜3이 되었을 때, 제조예 1.3에서 제조한 2×107 pfu 용량의 항암바이러스를 복강 내 투여하였다. 그 후, 4일째에 마우스를 희생하여 종양 조직과 뇌, 심장, 폐, 근육, 신장, 간 및 비장 조직을 수집하였다.
상기 실험예 1과 동일한 방법으로 A56 단백질에 대한 면역형광염색을 수행하였다. DAPI 염색을 한 후, 슬라이드 글라스에 각 조직 샘플을 올려 놓고 형광현미경을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 항암바이러스를 투여한 마우스의 종양 조직의 표면에서 A56 단백질의 발현을 확인하였다. 반면, 뇌, 심장, 폐, 근육, 신장, 간 및 비장 조직에서는 A56 단백질이 발현되지 않는 것을 확인하였다(도 4). 이를 통해, 항암바이러스를 투여한 후 종양조직 표면에 발현된 A56 단백질을 타겟으로 하는 항체를 제작하여 항암면역치료제로 활용할 수 있음을 확인하였다.
실험예 3. 토끼의 조직 표면에서의 A56 단백질 발현 확인
제조예 1.3에서 제조한 A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스를 정상 토끼에 정맥 내로 투여하여 조직 표면에 A56 단백질이 발현되었는지를 확인하였다.
구체적으로, 뉴질랜드 토끼에 제조예 1.2에서 제조한 1×108 pfu 또는 1×109 pfu 용량의 항암바이러스를 정맥 내로 투여하였다. 그 후, 3주차 또는 8주차에 토끼를 희생하여 뇌, 심장, 폐, 근육, 신장, 간 및 비장 조직을 수집하였다.
상기 실험예 1과 동일한 방법으로 A56 단백질에 대한 면역형광염색을 수행하였다. DAPI 염색을 한 후, 슬라이드 글라스에 각 조직 샘플을 올려 놓고 형광현미경을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 항암바이러스를 투여한 토끼의 심장, 폐, 근육, 신장, 간 및 비장 조직에서는 A56 단백질이 발현되지 않는 것을 확인하였다.
한편, 항암바이러스를 투여한 토끼의 뇌 조직에서 형광 반응이 검출되었다. 검출된 형광 반응이 항-A56 항체의 비특이적인 반응인지를 확인하기 위해, 항암바이러스를 투여하지 않은 정상 토끼의 뇌 조직을 상기와 동일한 방법으로 면역형광염색한 후 형광현미경을 이용하여 형광 반응을 확인하였다.
그 결과, 항암바이러스를 투여하지 않은 토끼의 뇌 조직에서도 형광 반응이 검출되었으며, 이를 통해 비특이적인 반응인 것을 확인하였다(도 5).
또한, 항암바이러스를 투여하지 않은 정상 인간의 뇌 조직(양산부산대학교병원)을 상기와 동일한 방법으로 면역형광염색한 후 형광현미경을 이용하여 형광 반응이 미약하게 검출되었으나, 항체의 경우 혈액 뇌 장벽(blood brain barrier)을 통과하지 않으므로, 뇌실 내 직접 투여하지 않는 이상, 항-A56 항체의 비특이적인 반응이 일어나지 않을 것으로 판단된다.
실험예 4. 마우스의 종양 조직 표면에서의 A56 단백질 발현 확인 II
제조예 1.3에서 제조한 A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스와 히드록시유레아를 암을 유발시킨 마우스 모델에 병용 투여하여 조직 표면에 A56 단백질이 발현되었는지를 확인하였다.
구체적으로, BALB/c 누드 마우스에 6.3×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)를 피하 이식하여 암을 유발하였다. 종양의 평균 부피가 150 ㎜3 내지 200 ㎜3이 되었을 때, 제조예 1.2에서 제조한 2×107 pfu 용량의 항암바이러스를 종양 내 투여하였으며, 히드록시유레아는 30 ㎎/㎏ 용량으로 투여하였다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹(n=4)으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 대조군으로 설정하였으며, 항암바이러스(1×107 pfu)만 투여받는 그룹 및 항암바이러스(1×107 pfu)와 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 병용투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 항암바이러스는 0일째 및 14일째에 종양 내 2회 투여하였고, 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 21일까지 항암바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
1차 항암바이러스 투여 후, 7일, 10일 및 14일째에 마우스를 희생시켜 종양 조직을 수집하였으며, 2차 항암바이러스 투여 후 21일, 24일 및 28일째에 마우스를 희생시켜 종양 조직을 수집하였다. 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 A56 단백질에 대한 면역형광염색을 수행하였다. DAPI 염색을 한 후, 슬라이드 글라스에 각 조직 샘플을 올려 놓고 형광현미경을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 1차 항암바이러스를 투여한 후 7일, 10일, 14일째까지 항암바이러스만을 투여한 그룹 및 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용투여 받은 그룹의 마우스 종양 표면에 A56 단백질이 뚜렷하게 발현되고 있는 것을 확인하였다(도 6 및 도 7).
또한, 1차 항암바이러스 투여하고 14일째 되는 날에 2차 항암바이러스를 투여한 후, 그로부터 7일, 10일, 14일째까지 A56 단백질이 종양 표면에 발현되는 것을 확인하였다(도 8 및 도 9). 특히, 24일(D10)째 죽어있는 세포와 살아있는 세포 모두 A56 단백질이 발현되어 있는 것이 확인되었다.
나아가, 상기 항암바이러스를 단독투여 받은 그룹의 마우스와 항암바이러스 및 히드록시유레아를 병용투여 받은 그룹의 마우스에서 모두 식염수만을 투여받은 그룹의 마우스보다 종양의 부피가 유의미하게 감소한 것을 확인하였다(도 10). 또한, 상기 3개 그룹의 마우스의 체중을 3일, 7일, 14일, 18일 및 21일째에 측정한 결과, 모든 그룹에서 유의미한 체중 감소가 나타나지 않았다(도 11).
실험예 5. 세포 표면에서의 A56 단백질 또는 이의 단편 발현
제조예 1.3에서 제조한 A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스를 A549 세포주에 처리하여 세포 표면에 A56 단백질이 발현되었는지를 확인하였다.
구체적으로, A549(lung carcinoma, ATCC, 미국) 세포주를 12-웰-플레이트 내의 커버글라스 상에 각 웰당 3.5Х104 세포수가 되도록 접종하였다. 그 후, 0.1 MOI의 항암바이러스로 감염시킨 후, 37℃ CO2 조건에서 30시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 각각의 세포주들을 수확한 후, 4%(v/v) PFA(paraformaldehyde), 1%(v/v) BSA, 1:500 비율로 희석시킨 항-A56 항체(Cat no. ABIN1606294, Antibodies-Online) 및 1:200 비율로 희석시킨 2차 항체(Alexa 594, Cat no. A21205, Invitrogen)를 처리하였다. DAPI로 핵을 염색을 하였으며, 형광염료를 사용하여 골지체를 염색하였다. 그 후, 슬라이드 글라스에 세포주 샘플을 올려놓고 공초점현미경(Olympus, FV1000)을 이용하여 관찰하였다. 그 결과를 도 12, 도 13 및 표 2에 나타내었다.
Figure PCTKR2020013485-appb-T000002
야생형 A56 (A56-G)과 A56의 6개의 영역이 일부 절단된 단편을 세포 표면에 발현시킨 결과, 야생형 A56 (A56-G)과 IgV 유사 도메인(IgV-like domain)이 절단된 A56-121만이 세포 표면에 도달하여 발현되는 것을 확인하였다. IgV 유사 도메인을 제외한 A56 변이체에서 시그널 펩타이드(signal peptides), 막통과 도메인(transmembrane domain), 스토크 영역(Stalk region), 텐덤 반복(Tandem repeats) 영역이 각각 또는 함께 절단된 변이체의 경우 세포막(plasma membrane)에 발현되지 않음을 확인하였다. 또한, IgV 유사 도메인이 포함된 상태에서 막통과 도메인만 포함된 변이체의 경우도 세포막에 발현되지 않는 것을 확인하였다. 즉, IgV 유사 도메인을 제외한 5개의 영역이 포함하는 변이체가 세포막에서 발현되는 것을 확인하였다.
II. A56 단백질 또는 이의 단편에 결합하는 항체 제조
제조예 2. A56 단백질 및 이의 단편 제조
야생형 A56 단백질에서 특정영역을 제거하기 위한 프라이머를 제작하고 GFP와 겹쳐주는 영역을 형성시켜 중복 PCR을 진행하였다.
구체적으로, 벡터 DNA(N293F-A56-C-HIS)를 증폭하고 HEK293F 세포에 도입하여 과발현시킨 후, 친화크로마토그래피(Ni-NTA)로 1차 정제한 후, 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)로 2차 정제를 수행하고, 최종적으로 A56-C-HIS 단백질을 생산하였다(도 97 및 도 98).
제조예 3. A56 단백질 또는 이의 단편에 결합하는 항체 제조 I
A56 단백질, 이의 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항-A56 항체를 Ybiologics사에 의뢰하여 파지 라이브러리 기법을 통해 61종의 항체를 제조 및 CDR 분석하였다. A56 항원을 코팅한 튜브에 파지 라이브러리를 넣어주어 결합하는 힛(hit)을 찾는 바이오패닝을 실시하였다. 평균 3번에 걸쳐 세척을 하여 특이적 결합을 이루어지는 파지를 선별하였다. 3번의 패닝 과정을 거친 후, 친화력(affinity)을 테스트하고 높은 친화력을 보이는 콜로니를 소량 피킹하여 실제 항원에 대한 친화력이 나타나는지 확인하였다. 상대적으로 힛이 많이 나오는 세트를 골라 자동화 시스템을 이용해 피킹을 하고 힛을 선별하였다.
이와 같이 생산한 항-A56 항체와 A56 단백질 간의 친화도를 측정한 결과를 도 14 내지 도 19에 나타내었다. 또한, 도 20a 내지 도 20c에 항-A56 항체의 생산량을 나타내었다. 또한, 도 21 내지 도 37에는 생산된 항-A56 항체를 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과를 나타내었다.
실험예 6. 항-A56 항체의 친화도 측정
Immuno-tube의 각 웰마다 A56 단백질을 코팅시켜준 후, 블로킹(blocking) 과정을 수행하였다.　블로킹 과정 후에 각 웰마다 100 nM부터 three-fold serial dilution을 거친 항체를 상온에서 소정의 시간 동안 반응을 시켜주었다. 그 후, PBS로 3회 세척한 후, 2차 항체도 상온에서 소정의 시간 동안 처리한 후에 농도 별로 A56 단백질과 항-A56 항체의 친화도를 측정하였다.
실험예 7. 종양 세포 표면에 발현된 A56 단백질과 항-A56 항체(I)의 결합 확인
제조예 1.3에서 제조한 항암바이러스를 HeLa, HT-29, A549, MCF-7 및 PC-3 세포주에 각각 1 MOI로 감염시켰다. 24시간 후, 항암바이러스로 감염시킨 각각의 세포주에 제조예 3에서 제조한 항-A56 항체 5종(ab01, ab02, ab03, ab04, ab05)을 각각 처리한 후, 4℃ 온도에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, PBS로 3회 세척한 후, 항-hIgG 항체(FITC, Abcam)를 처리하였다. 그 후, 4℃ 온도에서 1시간 동안 반응시켰으며, 1시간 후 PI 염색 키트(BD Annexin V Kit)을 이용하여 제조사에 매뉴얼에 따라 염색한 후, 유세포 분석기(Moflo Astrios EQ, Backman Coulter)를 이용하여 분석하였다.
도 38 및 도 39에 나타난 바와 같이, 항암바이러스를 처리하지 않은 암세포주(Cell Only)의 분석결과(파란색 영역)와 비교한 결과, 항암바이러스를 처리한 암세포주(Cell+VV)의 경우, 항-A56 항체와 결합하여 붉은색 영역으로 시프팅(shifting)되었다. 이를 통해, 항-A56 항체가 종양 세포 표면에 발현된 A56 단백질과 결합하는 것을 확인하였다.
제조예 4. A56 단백질 또는 이의 단편에 결합하는 항체 제조 II
아울러, 항-A56 항체(Cat no. ABIN1606294, Antibodies-Online)를 LakePharma 업체에 의뢰하여, 역코딩 기법(reverse coding engineering)을 통해 항체를 제조하였다. 상기 항체 2종을 "LakePharma variant3" 및 "LakePharma variant4"로 명명하였다.
실험예 8. 종양 세포 표면에 발현된 A56 단백질과 항-A56 항체(II)의 결합 확인
제조예 1.2에서 제조한 항암바이러스를 HeLa 세포주에 각각 1 MOI로 감염시켰다. 24일 후, 항암바이러스로 감염시킨 HeLa 세포주에 항-A56 항체(Cat no. ABIN1606294, Antibodies-Online) 및 제조예 4에서 제조한 항-A56 항체 2종(LakePharma variant3, 4)을 각각 처리한 후, 4℃ 온도에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, PBS로 3회 세척한 후, 항-hIgG 항체(FITC, Abcam)를 처리하였다. 그 후, 4℃ 온도에서 1시간 동안 반응시켰으며, 1시간 후 PI 염색 키트(BD Annexin V Kit)을 이용하여 제조사에 매뉴얼에 따라 염색한 후, 유세포 분석기 (Moflo Astrios EQ, Backman Coulter)를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 양성 대조군으로서, 항-A56 항체(Cat no. ABIN1606294, Antibodies-Online)를 처리한 경우, Hela 세포주만을 처리한 경우(Cell Only)와 비교하였을 때, 항암바이러스를 처리하여 Hela 세포주의 세표 표면에 발현된 A56(Cell+OV)과 항-A56 항체가 결합하여 오른쪽으로 시프팅 되는 것을 확인하였다(도 40).
또한, 실험군으로서, 항-A56 항체 2종(LakePharma variant3, 4)을 각각 처리한 경우, Hela 세포주만을 처리한 경우(Cell Only)와 비교하였을 때, 항암바이러스를 처리하여 Hela 세포주의 세표 표면에 발현된 A56(Cell+OV)과 항-A56 항체가 결합하여 오른쪽으로 시프팅 되었다(도 41 및 도 42). 이를 통해, 제조예 4에서 제조한 항-A56 항체 2종(LakePharma variant3, 4)이 세포 표면에 발현된 A56에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다(도 43).
실험예 9. 종양 세포 표면에 발현된 A56 단백질과 항-A56 항체의 결합 확인: A549 암세포주 I
상기 제조예 1.3에서 제조한 서열번호 1074 및 1078의 A56 단백질을 코딩하고 있는 항암바이러스(OTS-412 및 WOTS-418)를 A549 암세포주에 처리하여 A56 단백질을 발현시킨 뒤, 항-A56 항체(인간 항-A56 항체 10종, 마우스 항-A56 항체 2종)가 A56 단백질에 결합하는지를 확인하였다.
항암바이러스를 각각 A549 암세포주에 1 MOI로 처리한 후 24시간 뒤, 제조예 3에서 제작한 인간 scFv를 결합 도메인으로 하는 항체 10종(binding affinity top 10) Ab18, Ab19, Ab01, Ab13, Ab14, Ab08, Ab03, Ab51, Ab55, Ab16과 제조예 4에서 제작한 항체 2종 LPvariant03, variant04를 처리하였다. 1시간 뒤, 2차 항체(Goat anti-human IgG FC, Goat anti-mouse IgG H&L)을 넣어준 뒤, 1시간 후에 세척하고 A549 암세포주를 PI(Propidium iodide)로 염색하여 유세포분석기(flow cytometry)로 분석하였다.
그 결과, 항암바이러스를 처리한 A549 암세포주와 10종의 인간 항체 및 2종의 마우스 항체의 결합 시그널이 90% 이상 유사하게 나타나는 것을 확인하였다(도 44 내지 도 55). 또한, 항암바이러스를 처리한 A549 암세포주에서 10종의 인간 항체 간 피크의 차이는 약간 있었으나, 그 차이는 크지 않은 것을 확인하였다(도 56 및 도 57).
실험예 10. 종양 세포 표면에 발현된 A56 단백질과 항-A56 항체의 결합 확인: A549 암세포주 II
상기 제조예 1.3에서 제조한 서열번호 서열번호 1074 및 1078의 A56 단백질을 코딩하고 있는 항암바이러스(OTS-412 및 WOTS-418)를 A549 암세포주에 처리하여 A56 단백질을 발현시킨 뒤, 상기 제조예 3 및 4에서 제조한 항-A56 항체(Ybiologics: Ab18 및 Ab16, LakePharma: LakePharma variant3, 4)가 A56 단백질에 결합하는지를 확인하였다.
상기 실험예 9와 동일한 방법으로 항암바이러스 및 항-A56 항체를 A549 암세포주에 처리하였다. 상기 A549 암세포주를 PI(Propidium iodide)로 염색하여 유세포분석기(Moflo Astrios EQ, Backman Coulter)로 분석하였다.
그 결과, 항암바이러스를 처리한 A549 암세포주와 Ybiologics 및 LakePharma를 통해 제조한 각각의 항-A56 항체간의 결합 시그널이 93% 이상 유사하게 나타나는 것을 확인하였다(도 58 내지 도 61).
실험예 11. 종양 세포 표면에 발현된 A56 단백질과 항-A56 항체의 결합 확인: PC3 암세포주 I
상기 제조예 1.3에서 제조한 서열번호 서열번호 1074 및 1078의 A56 단백질을 코딩하고 있는 항암바이러스(OTS-412 및 WOTS-418)를 PC3 암세포주에 처리하여 A56 단백질을 발현시킨 뒤, 항-A56 항체(인간 항-A56 항체 10종, 마우스 항-A56 항체 2종)가 A56 단백질에 결합하는지를 확인하였다.
상기 실험예 9와 동일한 방법으로 항암바이러스 및 제조예 3에서 제작한 인간 scFv를 결합 도메인으로 하는 항체 10종(binding affinity top 10) Ab18, Ab19, Ab01, Ab13, Ab14, Ab08, Ab03, Ab51, Ab55, Ab16과 제조예 4에서 제작한 항체 2종 LPvariant03, variant04를 PC3 암세포주에 처리하였다. 상기 PC3 암세포주를 PI로 염색하여 유세포분석기(Moflo Astrios EQ, Backman Coulter)로 분석하였다.
그 결과, 항암바이러스를 처리한 PC3 암세포주와 10종의 인간 항체 및 2종의 마우스 항체의 결합 시그널이 90% 이상 유사하게 나타나는 것을 확인하였다(도 62 내지 도 73). 또한, 항암바이러스를 처리한 PC3 세포주에서 10종의 인간 항체 간 피크의 차이는 약간 있었으나, 시그널이 60% 이상이었으며, Ab51 항-A56 항체의 결합 시그널이 각각 70.71% 및 78.61%로 가장 높은 것을 확인하였다(도 74 및 도 75).
실험예 12. 종양 세포 표면에 발현된 A56 단백질과 항-A56 항체의 결합 확인: PC 암세포주 II
상기 제조예 1에서 제조한 서열번호 서열번호 1074 및 1078의 A56 단백질을 코딩하고 있는 항암바이러스(OTS-412 및 WOTS-418)를 PC3 암세포주에 처리하여 A56 단백질을 발현시킨 뒤, 상기 제조예 3 및 4에서 제조한 항-A56 항체(Ybiologics: Ab18 및 Ab16, LakePharma: LakePharma variant3, 4)가 A56 단백질에 결합하는지를 확인하였다.
상기 실험예 9와 동일한 방법으로 항암바이러스 및 항-A56 항체를 PC3 암세포주에 처리하였다. 상기 PC3 암세포주를 PI로 염색하여 유세포분석기(Moflo Astrios EQ, Backman Coulter)로 분석하였다.
그 결과, 항암바이러스를 처리한 PC3 암세포주와 Ybiologics를 통해 제조한 각각의 Ab18 및 Ab16의 항-A56 항체간의 결합 시그널이 각각 60% 및 70% 이상 나타나는 것을 확인하였다(도 76 및 도 77). 또한, LakePharma를 통해 제조한 각각의 LakePharma variant3, 4의 항-A56 항체간의 결합 시그널이 모두 90% 이상 나타나는 것을 확인하였다(도 78 및 도 79).
실험예 13. 종양 세포 표면에 발현된 A56 단백질과 항-A56 항체의 결합 확인: MCF7 암세포주 I
상기 제조예 1에서 제조한 서열번호 1074 및 1078의 A56 단백질을 코딩하고 있는 항암바이러스(OTS-412 및 WOTS-418)를 MCF7 암세포주에 처리하여 A56 단백질을 발현시킨 뒤, 항-A56 항체(인간 항-A56 항체 10종, 마우스 항-A56 항체 2종)가 A56 단백질에 결합하는지를 확인하였다.
상기 실험예 9와 동일한 방법으로 항암바이러스 및 제조예 3에서 제작한 인간 scFv를 결합 도메인으로 하는 항체 10종(binding affinity top 10) Ab18, Ab19, Ab01, Ab13, Ab14, Ab08, Ab03, Ab51, Ab55, Ab16과 제조예 4에서 제작한 항체 2종 LPvariant03, variant04를 MCF7 암세포주에 처리하였다. 상기 PC3 암세포주를 PI로 염색하여 유세포분석기(Moflo Astrios EQ, Backman Coulter)로 분석하였다.
그 결과, 항암바이러스를 처리한 MCF7 암세포주와 10종의 인간 항체 및 2종의 마우스 항체의 결합 시그널이 80% 이상 유사하게 나타나는 것을 확인하였다(도 80 내지 도 91). 또한, 항암바이러스를 처리한 PC3 세포주에서 10종의 인간 항체 간 피크의 차이는 약간 있었으나, 시그널이 80% 이상인 것을 확인하였다(도 92 및 도 93).
실험예 14. 종양 세포 표면에 발현된 A56 단백질과 항-A56 항체의 결합 확인: MCF7 암세포주 II
상기 제조예 1에서 제조한 서열번호 서열번호 1074 및 1078의 A56 단백질을 코딩하고 있는 항암바이러스(OTS-412 및 WOTS-418)를 MCF7 암세포주에 처리하여 A56 단백질을 발현시킨 뒤, 상기 제조예 4에서 제조한 항-A56 항체(LakePharma: LakePharma variant3, 4)가 A56 단백질에 결합하는지를 확인하였다.
상기 실험예 9와 동일한 방법으로 항암바이러스 및 항-A56 항체를 MCF7 암세포주에 처리하였다. 상기 MCF7 암세포주를 PI로 염색하여 유세포분석기(Moflo Astrios EQ, Backman Coulter)로 분석하였다.
그 결과, 항암바이러스를 처리한 MCF7 암세포주와 LakePharma를 통해 제조한 각각의 LakePharma variant3, 4의 항-A56 항체간의 결합 시그널이 모두 97% 이상 나타나는 것을 확인하였다(도 94 및 도 95).
III. 항암바이러스 및 항체를 이용한 항암효과 확인
실험예 15. 항암바이러스 및 항체를 이용한 항암 효과 확인
제조예 1.3에서 제조한 항암바이러스를 실험예 2와 동일한 방법으로 제작한 암을 유발시킨 마우스에 투여하였다. 소정의 시간이 경과한 후, 대조군에는 생리식염수를 투여하고, 실험군에는 제조예 3에서 제조한 항체를 상기 암 유발 마우스에 투여하였다. 그 결과, 대조군의 종양조직에서는 항암바이러스에 의해 사멸되지 않은 암세포가 남아있는 반면, 실험군의 종양조직에서는 완전히 암세포가 사멸하였다.
실험예 16. 항암바이러스 및 면역세포를 이용한 항암 효과 확인
제조예 1.2에서 제조한 항암바이러스를 실험예 2와 동일한 방법으로 제작한 암을 유발시킨 마우스에 투여하였다. 소정의 시간이 경과한 후, 대조군에는 생리식염수를 투여하고, 실험군에는 제조한 면역세포를 상기 암 유발 마우스에 투여하였다. 그 결과, 대조군의 종양조직에서는 항암바이러스에 의해 사멸되지 않은 암세포가 남아있는 반면, 실험군의 종양조직에서는 완전히 암세포가 사멸하였다.

Claims (24)

  1. A56 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 절편을 유효성분으로 포함하는 항암제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 절편은 서열번호 1, 18, 35, 52, 69, 86, 103, 120, 137, 154, 171, 188, 205, 222, 239, 256, 273, 290, 307, 324, 341, 358, 375, 392, 409, 426, 443, 460, 477, 494, 511, 528, 545, 562, 579, 596, 613, 630, 647, 664, 681, 698, 715, 732, 749, 766, 783, 800, 817, 834, 851, 868, 885, 902, 919, 936, 953, 970, 987, 1004, 1021, 1062 및 1063으로 이루어진 군에서 선택된 중쇄 CDR1;
    서열번호 2, 19, 36, 53, 70, 87, 104, 121, 138, 155, 172, 189, 206, 223, 240, 257, 274, 291, 308, 325, 342, 359, 376, 393, 410, 427, 444, 461, 478, 495, 512, 529, 546, 563, 580, 597, 614, 631, 648, 665, 682, 699, 716, 733, 750, 767, 784, 801, 818, 835, 852, 869, 886, 903, 920, 937, 954, 971, 988, 1005, 1022 및 1064로 이루어진 군에서 선택된 중쇄 CDR2; 및
    서열번호 3, 20, 37, 54, 71, 88, 105, 122, 139, 156, 173, 190, 207, 224, 241, 258, 275, 292, 309, 326, 343, 360, 377, 394, 411, 428, 445, 462, 479, 496, 513, 530, 547, 564, 581, 598, 615, 632, 649, 666, 683, 700, 717, 734, 751, 768, 785, 802, 819, 836, 853, 870, 887, 904, 921, 938, 955, 972, 989, 1006, 1023 및 1065로 이루어진 군에서 선택된 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및
    서열번호 4, 21, 38, 55, 72, 89, 106, 123, 140, 157, 174, 191, 208, 225, 242, 259, 276, 293, 310, 327, 344, 361, 378, 395, 412, 429, 446, 463, 480, 497, 514, 531, 548, 565, 582, 599, 616, 633, 650, 667, 684, 701, 718, 735, 752, 769, 786, 803, 820, 837, 854, 871, 888, 905, 922, 939, 956, 973, 990, 1007, 1024 및 1066으로 이루어진 군에서 선택된 경쇄 CDR1;
    서열번호 5, 22, 39, 56, 73, 90, 107, 124, 141, 158, 175, 192, 209, 226, 243, 260, 277, 294, 311, 328, 345, 362, 379, 396, 413, 430, 447, 464, 481, 498, 515, 532, 549, 566, 583, 600, 617, 634, 651, 668, 685, 702, 719, 736, 753, 770, 787, 804, 821, 838, 855, 872, 889, 906, 923, 940, 957, 974, 991, 1008, 1025 및 1067로 이루어진 군에서 선택된 경쇄 CDR2; 및
    서열번호 6, 23, 40, 57, 74, 91, 108, 125, 142, 159, 176, 193, 210, 227, 244, 261, 278, 295, 312, 329, 346, 363, 380, 397, 414, 431, 448, 465, 482, 499, 516, 533, 550, 567, 584, 601, 618, 635, 652, 669, 686, 703, 720, 737, 754, 771, 788, 805, 822, 839, 856, 873, 890, 907, 924, 941, 958, 975, 992, 1009, 1026 및 1068로 이루어진 군에서 선택된 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 것인, 항암제.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 절편은 서열번호 1, 35, 120, 222, 239, 290, 324, 341, 851, 919, 1062 또는 1063의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
    서열번호 2, 36, 121, 223, 240, 291, 325, 342, 852, 920 또는 1064의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
    서열번호 3, 37, 122, 224, 241, 292, 326, 343, 853, 921 또는 1065의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및
    서열번호 4, 38, 123, 225, 242, 293, 327, 344, 854, 922 또는 1066의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
    서열번호 5, 39, 124, 226, 243, 294, 328, 345, 855, 923 또는 1067의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및
    서열번호 6, 40, 125, 227, 244, 295, 329, 346, 856, 924 또는 1068의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 것인, 항암제.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 항암제는 항암바이러스에 감염된 암세포를 타겟으로 하는 것인, 항암제.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 항암바이러스는 백시니아 바이러스(vaccinia virus)인 것인, 항암제.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 항암바이러스는 A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 것인, 항암제.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 A56 단백질이 야생형 A56 단백질 또는 A56 단백질의 변이체인 것인, 항암제.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 A56 단백질 또는 이의 단편이 서열번호 1038, 1040, 1042, 1044, 1046, 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060, 1073, 1075, 1077, 또는 1079로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항암제.
  9. 제 6 항에 있어서,
    상기 A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산이 서열번호 1039, 1041, 1043, 1045, 1047, 1049, 1051, 1053, 1055, 1057, 1059, 1061, 1072, 1074, 1076, 1078로 표시되는 염기서열을 포함하는 것인, 항암제.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 항암제가 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 림프종, 급성 백혈병, 다발성 골수종 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 예방 또는 치료를 위한 것인, 항암제.
  11. A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 항암바이러스.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 항암바이러스는 백시니아 바이러스(vaccinia virus)인 것인, 항암바이러스.
  13. 제 11 항에 있어서,
    상기 A56 단백질이 야생형 A56 단백질 또는 A56 단백질의 변이체인 것인, 항암바이러스.
  14. 제 11 항에 있어서,
    상기 A56 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산이 서열번호 1039, 1041, 1043, 1045, 1047, 1049, 1051, 1053, 1055, 1057, 1059 또는 1061, 1072, 1074, 1076, 1078로 표시되는 염기서열을 포함하는 것인, 항암바이러스.
  15. A56 단백질 또는 이의 단편과 결합하는 항체 또는 이의 절편.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 절편은 서열번호 1, 35, 120, 222, 239, 290, 324, 341, 851, 919, 1062 또는 1063의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
    서열번호 2, 36, 121, 223, 240, 291, 325, 342, 852, 920 또는 1064의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
    서열번호 3, 37, 122, 224, 241, 292, 326, 343, 853, 921 또는 1065의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및
    서열번호 4, 38, 123, 225, 242, 293, 327, 344, 854, 922 또는 1066의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
    서열번호 5, 39, 124, 226, 243, 294, 328, 345, 855, 923 또는 1067의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및
    서열번호 6, 40, 125, 227, 244, 295, 329, 346, 856, 924 또는 1068의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 절편.
  17. 서열번호 1038, 1040, 1042, 1044, 1046, 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060, 1073, 1075, 1077, 또는 1079로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 암 표적화 폴리펩타이드 또는 이의 단편.
  18. 제 17 항의 암 표적화 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 코딩하는 단리된 핵산.
  19. 제 11 항의 항암바이러스; 및 제 15 항의 항체 또는 이의 절편을 포함하는 암 치료용 키트.
  20. 제 11 항의 항암바이러스를 포함하는 암을 표적화시키기 위한 약학 조성물.
  21. 암을 표적화시키기 위한 제11항의 항암바이러스의 용도.
  22. 제 11 항의 항암바이러스를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 표적화 방법.
  23. 암을 치료하기 위한 제 11 항의 항암바이러스 및 제 15 항의 항체 또는 이의 절편의 용도.
  24. i) 제 11 항의 항암바이러스를 개체에 투여하는 단계 및 ii) 제 15 항의 항체 또는 이의 절편을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법.
PCT/KR2020/013485 2019-10-02 2020-10-05 종양 표적화 단백질 또는 이의 단편 및 그것에 결합하는 항체 및 이의 용도 WO2021066612A2 (ko)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17/642,868 US20220389085A1 (en) 2019-10-02 2020-10-05 Tumor-targeting protein or fragment thereof, antibody binding thereto and use thereof
CN202080069818.2A CN114867738A (zh) 2019-10-02 2020-10-05 肿瘤靶向蛋白或其片段、与其结合的抗体及其用途
AU2020361337A AU2020361337A1 (en) 2019-10-02 2020-10-05 Tumor-targeting protein or fragment thereof, antibody binding thereto and use thereof
JP2022511267A JP7456584B2 (ja) 2019-10-02 2020-10-05 腫瘍標的化タンパク質又はその断片、それに結合する抗体及びその使用
CA3156346A CA3156346A1 (en) 2019-10-02 2020-10-05 PROTEIN TARGETING A TUMOR OR ASSOCIATED FRAGMENT, ANTIBODY BINDING THEREOF AND USE THEREOF
EP20871186.1A EP4043482A4 (en) 2019-10-02 2020-10-05 TUMOR TARGETING PROTEIN OR ASSOCIATED FRAGMENT, ANTIBODIES BINDING THEREWITH AND ITS USE

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2019-0122076 2019-10-02
KR20190122076 2019-10-02

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2021066612A2 true WO2021066612A2 (ko) 2021-04-08
WO2021066612A3 WO2021066612A3 (ko) 2021-05-27

Family

ID=75338429

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2020/013485 WO2021066612A2 (ko) 2019-10-02 2020-10-05 종양 표적화 단백질 또는 이의 단편 및 그것에 결합하는 항체 및 이의 용도

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20220389085A1 (ko)
EP (1) EP4043482A4 (ko)
JP (1) JP7456584B2 (ko)
KR (1) KR102550094B1 (ko)
CN (1) CN114867738A (ko)
AU (1) AU2020361337A1 (ko)
CA (1) CA3156346A1 (ko)
WO (1) WO2021066612A2 (ko)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7645456B2 (en) 2001-04-23 2010-01-12 Sanofi Pasteur Biologics Co. Vaccinia virus strains
EP2426142A3 (en) * 2006-10-16 2012-06-13 Genelux Corporation Modified vaccinia virus strains for use in a diagnostic and therapeutic method
EP2488649B1 (en) * 2009-10-16 2019-04-03 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Recombinant modified vaccinia ankara (mva) vaccinia virus containing restructured insertion sites
EP4059516A1 (en) * 2016-04-22 2022-09-21 Vaccinex, Inc. Integral membrane protein display on poxvirus extracellular enveloped virions
EP3717000A1 (en) * 2017-12-01 2020-10-07 Gerd Sutter Immuno-modulated replication-efficient vaccinia virus strain
KR20220054631A (ko) * 2019-08-26 2022-05-03 주식회사 바이오녹스 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물
CA3154214A1 (en) 2019-09-13 2021-03-18 adMare Therapeutics Society Anti-oncolytic virus antigen antibodies and methods of using same

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 1985

Also Published As

Publication number Publication date
US20220389085A1 (en) 2022-12-08
EP4043482A4 (en) 2024-03-13
CN114867738A (zh) 2022-08-05
EP4043482A2 (en) 2022-08-17
AU2020361337A1 (en) 2022-03-31
KR102550094B1 (ko) 2023-07-04
CA3156346A1 (en) 2021-04-08
WO2021066612A3 (ko) 2021-05-27
JP7456584B2 (ja) 2024-03-27
KR20210039973A (ko) 2021-04-12
JP2022550667A (ja) 2022-12-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2015005632A1 (ko) Dll4와 vegf에 특이적으로 결합하는 신규 이중표적 단백질 및 이의 용도
WO2012165925A2 (ko) Hgf 활성을 가지는 c-met에 대한 인간항체 및 이의 용도
WO2017023138A1 (ko) 키메라 항원 수용체 및 키메라 항원 수용체가 발현된 t 세포
WO2016153276A1 (ko) 뉴로필린1 특이적 결합 펩타이드 및 이 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 및 이의 용도
WO2019004799A1 (ko) Vegf-grab 단백질과 약물의 결합체 및 이의 용도
WO2019112347A2 (ko) 악성 b 세포를 특이적으로 인지하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
WO2019050362A2 (ko) 인간 dlk1에 대한 항체 및 이의 용도
WO2021235696A1 (ko) Cd22에 특이적인 항체 및 이의 용도
WO2019078699A2 (ko) 항-vista 항체 및 이의 용도
WO2019125070A1 (ko) 악성 b 세포를 특이적으로 인지하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
WO2019143201A1 (ko) 재조합 백시니아 바이러스 및 이를 포함하는 약학 조성물
WO2016199964A1 (ko) 분리된 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편
WO2021066612A2 (ko) 종양 표적화 단백질 또는 이의 단편 및 그것에 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2019045182A1 (ko) 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 피부질환 예방 및 치료용 조성물
WO2019132579A2 (ko) 세포질 침투 항체에 융합된 rna 분해효소를 포함하는 면역독소
WO2020004937A1 (ko) 항-bcma 항체-약물 접합체 및 그 용도
WO2023277361A1 (ko) 메소텔린 특이적 항체 및 이의 용도
WO2010126279A2 (ko) 사이토케라틴１７-특이적인 인간항체
WO2022035200A1 (ko) Il-12 및 항-cd20 항체를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
WO2018026249A1 (ko) 프로그램화된 세포 사멸 단백질 리간드-1 (pd-l1)에 대한 항체 및 이의 용도
WO2020204305A1 (ko) 항-메소텔린 항체, 항-cd3 항체 또는 항-egfr 항체를 포함하는 융합 단백질 및 이를 포함하는 이중 특이적 또는 삼중 특이적 항체 및 이의 용도
WO2020130711A1 (ko) 신규사이토카인 및 이의 용도
WO2019093807A2 (ko) Il-17a 에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2022215762A1 (ko) 바이러스 벡터 유래 항암요법 표적 단백질 및 이에 특이적으로 결합하는 결합 분자 또는 이의 단편
WO2019088658A1 (ko) Scf 및 갈렉틴-1을 표적으로 하는 이중표적항체 및 그 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20871186

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022511267

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3156346

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020361337

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20201005

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020871186

Country of ref document: EP

Effective date: 20220502