WO2013077618A1 - 항 ｋｉａａ１１１４ 항체를 유효성분으로 함유하는 ｋｉａａ１１１４ 과발현에 의해 야기되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

항 ｋｉａａ１１１４ 항체를 유효성분으로 함유하는 ｋｉａａ１１１４ 과발현에 의해 야기되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2013077618A1
WO2013077618A1 PCT/KR2012/009843 KR2012009843W WO2013077618A1 WO 2013077618 A1 WO2013077618 A1 WO 2013077618A1 KR 2012009843 W KR2012009843 W KR 2012009843W WO 2013077618 A1 WO2013077618 A1 WO 2013077618A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
kiaa1114
antibody
ser
gly
Prior art date
Application number
PCT/KR2012/009843
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
성영철
김세원
양세환
Original Assignee
주식회사 제넥신
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 제넥신 filed Critical 주식회사 제넥신
Publication of WO2013077618A1 publication Critical patent/WO2013077618A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer caused by KIAA1114 overexpression containing an anti-KIAA1114 antibody as an active ingredient.
  • the KIAA1114 gene was first known in the cDNA library of human brain tissue [Kikuno et al, 1999, DNA Res. 6: 197-205], since it was discovered that the genes of the Malanoma-associated antigen encoding gene (MAGE) family have a common MAGE homology domain (MHD), it is also called the MAGE-D3 gene.
  • MAGE Malanoma-associated antigen encoding gene
  • MAGE-D3 gene MAGE homology domain
  • Early members of the MAGE family classified by the Type I MAGE gene (MAGE A, B, C), are composed of a single exon of transcriptional detox (ORF), and are specific for most cancer tissues, including melanoma. It is expressed in normal cells but not expressed in test cells and placenta, and has been used as a diagnostic marker for tumors and as an antigen for targeted therapeutics.
  • ORF transcriptional detox
  • MAGE D, E, F, G, H, I, J, K, L2, NECDIN MAGE D, E, F, G, H, I, J, K, L2, NECDIN
  • type II MAGE genes in particular the MAGE-D subfamily genes, are ORF
  • the Type II MAGE gene human KIAA1114 or MAGE-D3, has a 4.7 kb transcription frame encoding 1431 amino acids with a molecular weight of about 138 kDa, which consists of 12 exons.
  • the KIAA1114 gene consists of an unknown name N-terminal domain, a middle MAGE homology domain (MHD), a C-terminal Trophinin domain, and a replacement splice using several translation initiation sites in the in-frame region.
  • MHD middle MAGE homology domain
  • Alternative splicing is known to produce a number of proteins with a variety of biological roles, see Saburi et al, 2001, J Biol Chem. 276 (52): 49378-89; Nadano et al, 2002, Biol Reprod. 66 (2): 313-21], the known proteins include KIAA1114, MAGPHININ- ⁇ , ⁇ , ⁇ , and TROPHININ proteins.
  • the proteins MAGPHININ- ⁇ , ⁇ , and ⁇ which are encoded by the upper region containing the MAGE homology domain (MHD) of the KIAA1114 gene, are known to be involved in cell cycle regulation [Aoyama et al, 2008, J Cell Biochem. 103: 765-777.
  • the TROPHININ protein encoded by the C-terminal TROPHININ domain, is a membrane protein involved in the process of embryo transplantation. Apical cell adhesion between trophoblastic cells and luminal epithelial cells in the endometrium. It is known as a homophilic cell adhesion molecule that mediates apical cell adhesion [Fukuda, et al 1995, Genes Dev.
  • KIAA1114 at the gene level was similar to that of the TROPHININ gene, and the expression level was similar in human endometrial tissue, mouse brain, eye, and embryonic tissues. KIAA1114 and TROPHININ exons were expressed in one transcriptional unit. It was found that this is because [Chomez et al, 2001, Cancer Res. 61: 5544-5551. This means that KIAA1114 protein is also more likely to be expressed in tissues in which TROPHININ protein is expressed, and its role and function may be similar to TROPHININ protein.
  • TROPHININ-mediated cell adhesion during human embryo transplantation promotes the activation of ErbB4, one of the epidermal growth factor receptor (EGFR) expressed by trophoblast cells, inducing proliferation and invasion of trophoblast cells. Induces apoptosis of endometrial cells through PKC- ⁇ signaling [Sugihara et al, 2007, Proc Natl Acad Sci US A. 104 (10): 3799-804; Tamura et al, 2011, Cell Cycle. 10 (1): 135-143].
  • the rapid proliferation and endothelial invasion of trophoblast cells seen during embryonic transplantation is similar to the aggressive nature of metastatic cancer cells [Denker, 1990, Plenum Medical Book Company, p. 3-20].
  • the immunohistochemical staining method using anti-TROPHININ antibody showed high expression of TROPHININ in the tissues of patients with lung metastasis of testicular germ cell tumors [Hatakeyama et al, 2004, Cancer Res. 64 (12): 4257-62], suggesting that increased expression of TROPHININ is a predictor of low survival rates through the same experimental method in early lung and colorectal cancer models [Kuan-Yu Chen et al, 2007, Eur J Cancer. 43 (4): 782-90; Oi Harada et al, 2007, Int J Cancer. 121 (5): 1072-8].
  • the anti-TROPHININ antibody used in the clinical studies can recognize the KIAA1114 protein (first presented experimental evidence in the present invention; see FIG. 3), the KIAA1114 protein, like the TROPHININ protein, may be used in metastatic cancer or malignant tumors. It can be seen that it is overexpressed.
  • KIAA1114 or TROPHININ activity by targeting tumor cells overexpressing KIAA1114 or TROPHININ using an anti-KIAA1114 or anti-TROPHININ antibody, it may inhibit the growth of cancer cells or prevent the invasion and metastasis of the cancer cells.
  • the anti-TROPHININ antibody Clone 3-11 a conventional monoclonal antibody that recognizes TROPHININ, has been used for diagnostic purposes, including immunohistochemical staining.
  • the present inventors prepared an anti-KIAA1114 antibody using a KIAA1114 antigen-expressing gene vaccine while studying an antibody capable of inhibiting the growth of cancer cells caused by overexpression of KIAA1114 or preventing the invasion and metastasis of cancer cells. It was confirmed that the anti-KIAA1114 antibody specifically binds to the extracellular domain of KIAA1114 protein, specifically reacts with various cancer cell lines, and has excellent ability to inhibit cancer cell metastasis in vivo in an animal model using KIAA1114 overexpressing cancer cell line. Was completed.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer caused by overexpression of K I A A 1 1 1 4 protein containing an anti K I A A 1 1 4 antibody as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer caused by overexpression of KIAA1114 protein containing an anti-KIAA1114 antibody as an active ingredient.
  • the antibody is characterized in that the antigen of the full-length human KIAA1114 protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the antibody is characterized in that the antibody specifically binding to the extracellular domain of the KIAA1114 protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the antibody is characterized in that the antibody binds to an epitope included in amino acids 200-214 (SEQ ID NO: 5) of a full length human KIAA1114 protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the antibody is characterized in that the antibody comprising a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the antibody is characterized in that the polyclonal antibody or monoclonal antibody.
  • the cancer caused by overexpression of the KIAA1114 protein is lung cancer, stomach cancer, liver cancer, bone cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, cholangiocarcinoma, skin cancer, head and neck cancer, skin melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, Colorectal cancer, colon cancer, breast cancer, uterine sarcoma, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, esophageal cancer, laryngeal cancer, small bowel cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penis cancer, prostate Cancer, childhood solid tumors, bladder cancer, kidney cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, spinal contraction tumor, glioma and pituitary adenoma.
  • the cancer caused by overexpression of the KIAA1114 protein is characterized in that it is a metastatic cancer.
  • the composition is characterized in that it is formulated as pills, capsules, granules, tablets, aqueous solutions, suspensions or emulsions.
  • the anti-KIAA1114 antibody of the present invention specifically binds to the extracellular domain of KIAA1114 protein, specifically reacts with various cancer cell lines, and has excellent ability to inhibit cancer cell metastasis in vivo in animal models of metastatic cancer using KIAA1114 overexpressing cancer cell lines. . Therefore, the anti-KIAA1114 antibody of the present invention can be usefully used for the prevention or treatment of cancer caused by KIAA1114 overexpression, especially metastatic cancer.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a KIAA1114 antigen-expressing gene vaccine used in the present invention.
  • Figure 2 shows the results of observing the antigen specificity of the anti-KIAA1114 polyclonal antibody of the present invention in the serum of mice administered the KIAA1114 antigen expression gene vaccine using an enzyme immunoassay (ELISA).
  • ELISA enzyme immunoassay
  • Figure 3 is a diagram showing the results observed by Western blotting mouse and human KIAA1114 protein recognition ability of the anti-KIAA1114 monoclonal antibody (Kiatomab) according to the present invention.
  • Figure 4a is a diagram showing the amino acid sequence of the human KIAA1114 extracellular domain encoded by the KIAA1114 antigen expression gene vaccine of the present invention and the amino acid sequence analysis of the corresponding mouse KIAA1114 and the sequence position of the synthesized peptide antigens
  • Figure 4b is an anti KIAA1114 monoclonal antibody (Kiatomab) is a diagram showing the results observed by the ELISA analysis of various peptide antigens.
  • Figure 5a is a result of observing the reactivity of the anti-KIAA1114 monoclonal antibody (Kiatomab) and human ovarian cancer cell line and blood cancer-derived cell line of the present invention by FACS analysis
  • Figure 5b is the anti-KIAA1114 monoclonal antibody (Kiatomab) and human colon Reactivity with cancer cell line, cholangiocarcinoma cell line, liver cancer cell line is a diagram showing the results observed by FACS analysis.
  • FIG. 6 shows the results of observing the reactivity of anti-KIAA1114 monoclonal antibody (Kiatomab) of the present invention and commercialized anti-TROPHININ monoclonal antibody (clone 3-11) with liver cancer cell lines of human and mouse origin by FACS analysis.
  • FIG. 7 is a diagram showing the in vivo cancer cell metastasis suppression ability in the lung metastasis model using the mouse colon cancer (CT26-Her2 / neu and CT26) cell line of the anti-KIAA1114 monoclonal antibody (Kiatomab) according to the present invention.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer caused by overexpression of KIAA1114 protein containing an anti-KIAA1114 antibody as an active ingredient.
  • Anti-KIAA1114 antibody as an active ingredient in the composition of the present invention is characterized in that it specifically binds to the extracellular domain of the KIAA1114 protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • KIAA1114 may include all of KIAA1114 present in mammals such as human (Homo sapiens), mouse (Mus musculus), rat (Rattus norvegicus), and in the present invention, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (NCBI database approval) Preference is given to human KIAA1114 with the number NP_001034794).
  • the mRNA of KIAA1114 may include all mRNAs of KIAA1114 present in mammals such as humans, mice, and rats, and in the present invention, the sequence of human KIAA1114 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 (accession number NM_001039705 on NCBI database) mRNA is preferred.
  • the antibody may be a whole form of an antibody (hereinafter referred to as "antibody") or a functional fragment thereof.
  • the whole antibody may be in the form of a monomer or a multimer in which two or more whole antibodies are bound.
  • the functional fragment of the antibody is an antibody having the heavy and light chain variable regions of the whole antibody, which means to recognize the same antigen binding site (epitope) that the whole antibody recognizes.
  • Functional fragments of the antibody include, but are not limited to, single chain variable region fragments (scFv), (scFv) 2 , Fab, Fab 'and F (ab') 2 , and the like.
  • the single chain variable region (scFv) refers to an antibody fragment in which a heavy chain variable region and a light chain variable region are linked through a linker peptide to take the form of a single chain polypeptide.
  • the antibody can be modified by binding to various molecules such as enzymes, fluorescent materials, radioactive materials and proteins. Modified antibodies can be obtained by chemically modifying the antibody. Such modification methods are commonly used in the art.
  • the antibody is obtained as a chimeric antibody in which a variable region derived from a non-human antibody and a constant region derived from a human antibody are combined, or complementarity derived from a non-human antibody. It may be obtained as a humanized antibody in which a constant region is combined with a frame work region (FR) derived from a human antibody including a crystal site.
  • FR frame work region
  • the antibody may be a method known in the art, such as a protein or peptide vaccine, or a gene vaccine to immunize a mammal such as a mouse, sheep, rat, rabbit; Phage display method; Or it can be produced using a yeast display method, of which the method using a gene vaccine has a number of advantages over other methods. Genetic vaccines can reduce the effort and time required to purify antigenic proteins from bacteria, and can also overcome technical limitations in the purification process since the purification of antigenic proteins is omitted. In addition, in the case of immunization with a gene vaccine, since the antigenic protein is expressed in vivo, it has the same structure as the original three-dimensional structure of the protein, and the antibody produced thereby is more suitable for the purpose of cell separation. In particular, when KIAA1114, a transmembrane protein that is difficult to separate and purify proteins, is an antigen, a method of producing an antibody using a gene vaccine is more useful.
  • the anti-KIAA1114 antibody of the present invention is produced as a polyclonal antibody and a monoclonal antibody using a gene vaccine method, and the produced anti-KIAA1114 monoclonal antibody was named "Kiatomab (IgG2b, ⁇ )".
  • mice vaccinated with the KIAA1114 antigen expressing gene vaccine of the present invention show high absorbance values on ELISA for cell lysates containing KIAA1114 antigen, unlike the sera of mice not vaccinated with the KIAA1114 antigen expressing gene vaccine. This means that there is a polyclonal antibody specific for KIAA1114 antigen in mouse serum.
  • the anti-KIAA1114 monoclonal antibody (Kiatomab) of the present invention recognizes mouse KIAA1114 protein ( ⁇ 196 kD) and human KIAA1114 protein ( ⁇ 138 kD) in the same manner as the existing anti-TROPHININ antibody (clone 3-11), but C- of KIAA1114 protein Unlike clone 3-11, which binds to the terminal region (amino acids 1319-1327), it binds to the extracellular domain of the N-terminal region (amino acids 200-214).
  • the anti-KIAA1114 antibody of the present invention reacts specifically with various cancer cell lines, and in particular, responds relatively higher to cancer cell lines with high malignancy or high tumorigenicity, or metastatic.
  • Anti-KIAA1114 antibodies (IgG2b, ⁇ ) of the present invention not only have a higher affinity than commercially available anti-TROPHININ antibodies (clone 3-11, IgM), but also have IgG subtypes, and their industrial applicability is higher than that of IgM subtype antibodies.
  • Outstanding Antibodies of the IgM subtype have a narrow range of dissolution compared to antibodies of the IgG subtype, and have a disadvantage in that they are easily denatured. This property renders the harsh elution conditions used in antibody purification of conventional IgG subtypes unusable for IgM purification.
  • IgM subtype antibodies are associated with slow diffusion constants, which slow the use of traditional porous-partical-based chromatography media.
  • purification of IgG antibodies can be performed quickly and conveniently using a column filled with Protein G-agarose gel, which is conventionally used in the art, and is advantageous for the development of therapeutic antibodies requiring large amounts of demand.
  • there are various advantages such as longer half-life in vivo than IgM subtype antibody and easy penetration of tissue due to its small size. This means that the anti-KIAA1114 antibody of the present invention is not only easier to produce than the commercially available anti-KIAA1114 antibody, but also excellent in efficacy.
  • the anti-KIAA1114 monoclonal antibody (Kiatomab) of the present invention is excellent in inhibiting cancer cell metastasis in vivo through a lung metastasis model using mouse colorectal cancer (CT26-Her2 / neu and CT26) cell lines.
  • the anti-KIAA1114 antibody of the present invention specifically binds to the extracellular domain of KIAA1114 protein, specifically reacts with various cancer cell lines, and in vivo in a lung metastatic animal model injected with KIAA1114 and expression cancer cell lines. Excellent transfer inhibitory ability. Therefore, the anti-KIAA1114 antibody of the present invention can be usefully used for the prevention or treatment of cancer caused by KIAA1114 overexpression, especially metastatic cancer.
  • Cancer caused by KIAA1114 overexpression is lung cancer, stomach cancer, liver cancer, bone cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, cholangiocarcinoma, skin cancer, head and neck cancer, skin melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, colon cancer, colon cancer, breast cancer, uterine sarcoma, fallopian tubes
  • composition of the present invention may contain one or more known active ingredients having an anticancer effect together with the anti-KIAA1114 antibody.
  • composition of the present invention may be prepared by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above-described active ingredients for administration.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may be used in combination with saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components, if necessary, as an antioxidant, buffer And other conventional additives such as bacteriostatic agents can be added.
  • Diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may also be added in addition to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • it may be preferably formulated according to each disease or component by a suitable method in the art or using a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, Easton PA.
  • compositions of the present invention can be administered orally or parenterally (eg, applied intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) according to the desired method.
  • the dosage of the composition of the present invention varies depending on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, administration method, excretion rate and severity of the disease of the patient.
  • the daily dosage of the composition is about 1 ⁇ g / kg to 100 mg / kg, preferably about 0.1 mg / kg to 20 mg / kg, and more preferably, administered once to several times a day.
  • composition of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, hormone therapy, drug therapy and biological response modifiers for the prevention and treatment of cancer caused by KIAA1114 overexpression.
  • the pGX10 vector (Korean Patent Publication No. 10-2003-47667) was cut with restriction enzymes Kpn I and Xba I, and then the synthesized tpa-MCS-GS linker-ILZ-mCD40Lecd co nucleotide (SEQ ID NO: 4) was used as a ligase.
  • the recombinant vector pGX10-tpa-MCS-GS linker-ILZ-mCD40Lecd co was prepared by ligation.
  • tpa tissue plasminogen activator
  • GS linker is a base sequence of a linker consisting of glycine and serine
  • ILZ Isoleucine Zipper
  • a nucleotide corresponding to the extracellular domain of the KIAA1114 gene at the MCS (multicloning site) of the recombinant vector (SEQ ID NO: 3, obtained by requesting synthesis from GenScript, Piscataway, NJ, USA) was obtained from Not I and Asc.
  • KIAA1114 antigen expressing gene vaccines were obtained by ligation followed by restriction.
  • the amino acid sequence of human KIAA1114 (accession number NP_001034794) on the NCBI database is shown by SEQ ID NO: 1
  • the nucleotide sequence of human KIAA1114 mRNA accession number NM_001039705
  • FIG. 1 A schematic diagram of the KIAA1114 antigen expressing gene vaccine used in the present invention is shown in FIG. 1.
  • mice 100 ⁇ g of the KIAA1114 antigen-expressing gene vaccine prepared in Example 1 was subjected to hydrodynamic injection (Zhang et al., Hum. Gene Ther. 10: 1735-1737, 1999) at intervals of 1 to 2 weeks.
  • Balb / c mice were inoculated five times.
  • blood was collected using microcapillary tubes in the ocular blood vessels of mice, and only serum after coagulation of blood was recovered to produce polyclonal antibodies that specifically bind to KIAA1114.
  • the cells obtained by separating the spleen from the mice and lysing red blood cells were counted, and then, SP2 / O and 5: 1, which are myeloma cells. I mixed it. Three washes with Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM) containing 10 mM HEPES [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid] buffer, followed by pre-warmed PEG 1 ml of (polyethylene glycol) was dropped within 1 minute to proceed cell fusion.
  • DMEM Dulbecco's Modified Essential Medium
  • HAT medium Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine media
  • DMEM conditioned medium
  • Example 2 serum obtained from the mouse vaccinated with the KIAA1114 antigen expression gene vaccine
  • serum obtained from the mouse vaccinated with the KIAA1114 antigen expression gene vaccine was used.
  • Those with higher optical density (O.D) values than the positive control were selected and transferred to 24 wells.
  • Initial hybridoma clones were divided into 200 cells per 96 wells and incubated for 10 days to select and screen only those that formed a single colony. The positive ones were grown again to divide 50 cells and screen one more time. Hybridoma cells were selected.
  • Example 2 20 ⁇ g of the KIAA1114 antigen expression gene vaccine prepared in Example 1 was put into 5 ⁇ 10 6 Cos7 cells (Korea Cell Line Bank) by electric stimulation to express the fusion protein for 36 to 48 hours. Cell lysates were obtained through three freezing and thawing cycles.
  • the serum the serum obtained in Example 2 was used.
  • 50 ⁇ l of an anti-CD40L antibody (anti-CD40L Ab, where CD40L is the same as CD154 as CD40 ligand) is coated in a well of a plate by 50 ⁇ l, and the cell lysate is added thereto. After 50 ⁇ l of 50: 1 was added, the serum obtained in Example 2 was diluted 1: 100 as a test antibody.
  • anti-mouse immunoglobulin G (anti-mouse IgG Ab) bound to horseradish peroxidase (HRP), anti-mouse IgA Ab, anti-mouse immunity Dilute globulin M (anti-mouse IgM Ab) at 1: 3000, and add 50 ⁇ l of TMB (substrate, cat #: 50-76-00, KPL, USA) solution as a substrate for horseradish peroxidase.
  • TMB substrate, cat #: 50-76-00, KPL, USA
  • stop solution 2N H 2 SO 4
  • mice vaccinated with KIAA1114 antigen-expressing gene vaccine were tested on ELISA for cell lysates containing KIAA1114 antigen, unlike the negative control group (serum of mice not vaccinated with KIAA1114 antigen-expressing gene vaccine). High absorbance values are shown. This means that there is a polyclonal antibody specific for KIAA1114 antigen in mouse serum.
  • Example 3 In order to confirm that the monoclonal antibody prepared in Example 3 binds to mouse and human KIAA1114 protein, a lysate of 293T cells transfected with human KIAA1114 gene and a protein extracted from brain tissue of mouse expressing KIAA1114 Western blotting was performed using (cat #: sc-113881, Santa Cruz, USA).
  • a mouse brain tissue extract protein 300 ⁇ l of protein lysis solution [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.2 M NaCl, 5 mM CaCl 2 , 1% Triton X-100] was added and ground using a tissue mill (MagNa Lyser, Roche, USA). 300 ⁇ l of protein lysis solution was added to the digested brain tissue, incubated with brain tissue for 30 minutes on ice, and then centrifuged at 4 ° C. for 5 minutes at 15,000 rpm to store the supernatant in a new tube. Cooled for 1 hour or more. This was sufficiently dissolved at room temperature, centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C, and the EDTA-free protease inhibitor was added to the separated supernatant and stored at -70 ° C.
  • protein lysis solution 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.2 M NaCl, 5 mM CaCl 2 , 1%
  • the membrane with the protein completely electrophoresed was placed in a blocking solution (5% skim milk powder in TBS-T (1% Tween 20)] and shaken for 1 hour. After washing the blocking solution with TBS-T (0.1% Tween 20) for 30 minutes, the anti-KIAA1114 monoclonal antibody (Kiatomab), a primary antibody, or an anti-TROPHININ antibody (clone 3-11; cat # 80002, Santa Cruz) from Santa Cruz Biotechnology, USA) was diluted 1 / 1,000 in TBS-T (0.1% Tween 20) and incubated for 16 hours at 4 °C.
  • a blocking solution 5% skim milk powder in TBS-T (1% Tween 20)
  • the secondary antibody Anti-mouse Ig (H + L), horseradish peroxidase linked conjugate; cat # 170-6516, Biorad, USA
  • the Western detection solution was applied to the membrane and then developed by photosensitive in the dark room (see FIG. 3).
  • the anti-KIAA1114 monoclonal antibody (Kiatomab) according to the present invention recognizes the mouse KIAA1114 protein ( ⁇ 196 kD) and human KIAA1114 protein ( ⁇ 138 kD) in the same manner as the anti-TROPHININ antibody (clone 3-11). It was confirmed.
  • the extracellular domain of the human KIAA1114 protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 used as the antigen gene of the monoclonal antibody prepared in Example 3 and the amino acid sequence of the corresponding mouse KIAA1114 protein were compared and analyzed. Identifying highly homologous regions and predicting linear epitopes exposed to the cell surface with the Emini surface accessibility prediction program and the Bepipred Linear epitope prediction program (http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell) Peptron (Korea) was commissioned to synthesize a peptide.
  • Peptides were synthesized based on the nucleotide sequence sites commonly applied to the bottoms of the red and blue solid lines among the nucleotide sequences indicated by the yellow background, and the synthesized portions are indicated by dotted boxes (see FIG. 4A).
  • ELISA enzyme immunoassay
  • Blocking solution [5% skim milk powder in PBS-T (1% Tween 20)] was applied and maintained at room temperature for 1 hour, followed by 1 ⁇ g of isotype control antibody or anti-KIAA1114 monoclonal antibody (Kiatomab). , 3 ⁇ g, or 10 ⁇ g was diluted in 100 ⁇ l blocking solution and reacted at room temperature for 5 hours. After washing 5 times with PBS-T (0.1% Tween 20), blocking the secondary antibody (Goat anti-mouse IgG2b-HRP; cat # 1090-05, Southern Biotechnology Inc., USA) to 1 / 3,000 diluted in solution) and reacted at room temperature for 1 hour.
  • PBS-T 0.1% Tween 20
  • the anti-KIAA1114 monoclonal antibody (Kiatomab) of the present invention increases the concentration-dependent absorbance value of the antibody on ELISA for epitopes included in amino acids 200-214 (SEQ ID NO: 5) of human KIAA1114 protein.
  • epitope of anti-KIAA1114 monoclonal antibody (Kiatomab) is included in amino acids 200-214 (SEQ ID NO: 5) of human KIAA1114 protein.
  • the anti-KIAA1114 monoclonal antibody (Kiatomab) obtained in Example 3 was purified from a plurality of supernatants, and the purification of the antibody was requested by Youngin Frontier Co., Ltd. (Korea) using a column packed with Protein G-Agarose gel. Purification was carried out.
  • the cell lines used in the experiments include HepG2 and Hep3B, which are human liver cancer (Hepatocellular Carcinoma) cell lines; Cholangiocarcinoma cell lines JCK and SCK; Ovarian Cancer cell lines A2780, SKOV3, C13, and KF; Leukemia cell lines Jurkat, Ramos, and MC / Car; Colorectal Carcinoma cell lines SW480 and SW620 were used.
  • HepG2 and Hep3B which are human liver cancer (Hepatocellular Carcinoma) cell lines
  • Cholangiocarcinoma cell lines JCK and SCK Cholangiocarcinoma cell lines JCK and SCK
  • Ovarian Cancer cell lines A2780, SKOV3, C13, and KF Ovarian Cancer cell lines A2780, SKOV3, C13, and KF
  • Leukemia cell lines Jurkat, Ramos, and MC / Car Colorectal Carcinoma cell lines SW480 and SW620 were used.
  • the anti-KIAA1114 monoclonal antibody (Kiatomab) of the present invention compared to the isotype control antibody, A2780, an undifferentiated carcinoma-derived cell line, SKOV3, a cell line derived from endometrial adenocarcinoma, C13 and intestinal cell lines derived from endometrial adenocarcinoma
  • the ovarian cancer cell line of KF a humoral carcinoma cell line, was actively responded, whereas the leukemia cell line, Jurkat, lymphoma, Ramos, and myeloma-derived MC / Car were low.
  • anti-KIAA1114 monoclonal antibody is lymph node metastasis-derived cell line of the same patient compared to SW480 (tumor stage: Dukes' type B), a primary cancer-derived colorectal cancer cell line compared to isotype control antibody It showed higher responsiveness to SW620 (Tumor stage: Dukes' type C).
  • the cholangiocarcinoma cell line showed no reactivity with the general cholangiocarcinoma cell line JCK while strong reactivity with the sarcoma cholangiocarcinoma cell line SCK having a large metastatic tendency.
  • the HuH7 cell line which has high tumorigenic capacity in vivo in immunodeficient mice, has a weaker tumorigenicity [Yang et al, 2008, Cancer Cell. 13 (2): 153-66] expressed higher KIAA1114 protein.
  • KIAA1114 is specifically overexpressed in metastatic or malignant tumors, indicating similarities to previous results that TROPHININ expression is markedly increased as the clinical stage progresses.
  • the cell lines used in the experiments were HeptoB, HuH7, PLC / PRF / 5, and SNU475, which are human liver carcinoma (Hepatocellular Carcinoma) cell lines; Mouse liver cancer cell lines MIH2 and Hepa-1c1c7 were used.
  • anti-KIAA1114 monoclonal antibody obtained in Example 3, commercialized anti-TROPHININ antibody (clone 3-11; IgM; cat # 80002, Santa Cruz Biotechnology, USA), isotype control antibody (Normal Mouse IgG , cat # NI03, Oncogene, USA) were diluted in 100 [mu] l FACS buffer and reacted with the hepatocellular carcinoma cell lines (2.5 ⁇ 10 5 cells) in ice.
  • the APC conjugate of the antibody against the CD133 marker whose expression level in the human liver cancer cell line is known from previous reports as a positive control group
  • 5 ⁇ l of antibody was diluted in 100 ⁇ l of FACS buffer and reacted with the cell lines as specified in the product's date sheet.
  • Unbound antibody was washed twice with FACS buffer, and then 0.5 ⁇ l of anti-mouse Ig-APC (cat #: 550826, BD pharmingen, USA) secondary antibody for the anti-KIAA1114 monoclonal antibody (Kiatomab) treated group; 0.5 ⁇ l of anti-mouse IgM-APC (clone II / 41, cat # 17-5790-82, eBioscience, USA) secondary antibody for the commercialized anti-TROPHININ antibody (clone 3-11; IgM) treatment group After diluting in buffer and reacting on ice, washing with FACS buffer twice. Finally, the suspension was suspended in 250 ⁇ l FACS buffer and analyzed using a flow cytometer (see FIG. 6).
  • the anti-KIAA1114 monoclonal antibody (Kiatomab) of the present invention reacts highly with human liver cancer cell lines Hep3B, HuH7, and PLC / PRF / 5 or mouse liver cancer cell lines MIH2 and Hepa-1c1c7, while it is a commercialized anti TROPHININ antibody (clone 3-11) showed low reactivity in all of these cancer cell lines.
  • the anti-CD133 antibody responded strongly to the human liver cancer cell lines Hep3B, HuH7, and PLC / PRF / 5, indicating that the state of the cells is normal.
  • the commercialized anti-TROPHININ antibody (clone 3-11) is a monoclonal antibody made using a synthetic peptide corresponding to amino acids 1319-1327 of human KIAA1114 protein as an antigenic vaccine, anti-KIAA1114 single induced by genetic vaccine It is shown that Kiatomab has a higher affinity than commercialized anti-TROPHININ antibodies (clone 3-11) induced by peptide vaccines. This is consistent with previous reports that antibodies derived by DNA vaccination have a 1,000-fold higher avidity than antibodies obtained by administering an amount of protein vaccine that produces the same overall IgG response [Boyle et al. , 1997, PNAS. 94: 14626-31.
  • mice Intravenous injection of mouse colorectal cancer cell line CT26-Her2 / neu (human Her2 / neu receptor overexpression) or CT26 (2 ⁇ 10 5 cells) into mice followed by isotype control antibody or anti-KIAA1114 monoclonal antibody (Kiatomab) ) was injected intraperitoneally at 1 ⁇ g, 3 ⁇ g, or 10 ⁇ g and the number of colon cancer cells in the lungs of mice was measured 2 weeks after cancer cell administration (see FIG. 7).
  • the anti-KIAA1114 antibody according to the present invention is excellent in inhibiting cancer cell metastasis in KIAA1114 overexpressing cancer cell lines.
  • Total RNA was obtained from hybridomas producing anti-KIAA1114 monoclonal antibody (Kiatomab) using the easy-spin TM Total RNA Extraction (cat # 17221) kit from Invitrogen Biotechnology. After 5 x 10 6 hybridoma cells were pelleted, 1 mL Lysis buffer was added, vortexed for 30 seconds, and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. Next, 200 ⁇ L of chloroform was added, vortexed for 15 seconds, left at room temperature for 3 minutes, centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and 400 ⁇ L of the supernatant was transferred to a new tube.
  • Binding buffer After adding the same amount of Binding buffer and mixed well and left for 1 minute at room temperature, the solution was transferred to a spin column, placed in a 2-mL collection tube and centrifuged for 30 seconds at 13,000 rpm. The column was washed with 700 ⁇ L Washing Buffer A, centrifuged at 13,000 rpm for 30 seconds, and then washed once with 700 ⁇ L Washing Buffer B. Place the empty column again in a 2-mL collection tube, centrifuge at 13,000 rpm for 1 minute to dry, transfer to a new tube, add 50 ⁇ L of Elution buffer and leave at room temperature for 1 minute, then 13,000 rpm Elution was performed by centrifuging for 1 min at.
  • CDNA was synthesized from the RNA obtained above using QuantiTect Reverse Transcription (cat # 205311) kit from Qiagen. Briefly, 2 ⁇ L reverse transcriptase (containing RNase inhibitor), 2 ⁇ L RT primer mix (oligo-dT and random primer mixture), and 8 ⁇ L RT buffer (containing Mg2 + and dNTP) were added to 2 ⁇ g of extracted RNA. After the reaction, cDNA was synthesized by reacting 15 minutes at 42 ° C. and 3 minutes at 95 ° C., respectively.
  • Synthesized cDNA was amplified by PCR using a light and heavy chain primer mixture provided in the Mouse ScFv module provided by Amersham Biosciences, respectively. Briefly, 2 ⁇ L of a light or heavy chain primer mixture, 4 ⁇ L of distilled water, and 1 ⁇ L of i-MAX TM DNA polymerase (cat # 25261, Invitrogen Biotechnology) were added to 33 ⁇ L of the synthesized cDNA, and 40 ⁇ L of the reaction solution was prepared. Denatured at 5 ° C. for amplification. PCR cycle conditions were performed 30 cycles at 94 °C 1 minute, 56 °C 2 minutes, and 72 °C 2 minutes, and reacted for 10 minutes at 72 °C. PCR products were confirmed by electrophoresis on 1.5% agarose, ethidium bromide mixed gel, and purified using Invitrogen Biotechnology's MEGA-spinTM Agarose gel extraction (cat # 17183) kit.
  • the PCR product was ligation using pGEM-T easy vector (Promega) and T4 DNA ligase, transformed into XL-1 Blue competent cell (cat # 200249, Stratagene), 40 ⁇ L of 1M IPTG and 200 mg / mL
  • the plate was plated on an LB plate containing 4 ⁇ L of X-gal and incubated at 37 ° C. for 12 hours.
  • White colonies were selected and grown in LB liquid medium containing ampicillin, and recombinant plasmids were isolated and purified using Invitrogen Biotechnology's DNA-spinTM Plasmid DNA Purification (cat # 17093) kit. Base sequence determination of the obtained plasmid was requested from Cosmojin Tech Co., Ltd. (South Korea).
  • the heavy chain variable region amino acid sequence of the anti-KIAA1114 antibody (Kiatomab) is shown by SEQ ID NO: 6, and the light chain variable region amino acid sequence is shown by SEQ ID NO: 7.
  • a tablet was prepared by a direct tableting method.
  • the powder was prepared by mixing the above components, the powder was filled in a hard capsule according to the conventional method for preparing a capsule to prepare a capsule.
  • the amount of the above-mentioned ingredient was prepared per ampoule (2 ml).
  • Each component was added to and dissolved in purified water according to the conventional method for preparing a liquid, and lemon flavor was added appropriately, followed by mixing the above components. Then, purified water was added thereto to adjust the total volume to 100 ml, and then filled into a brown bottle and sterilized to prepare a liquid.
  • the anti-KIAA1114 antibody of the present invention specifically binds to the extracellular domain of KIAA1114 protein, specifically reacts with various cancer cell lines, and has excellent ability to inhibit cancer cell metastasis in vivo in a metastatic cancer animal model using KIAA1114 overexpressing cancer cell line. Therefore, it can be usefully used as a prophylactic or therapeutic agent for cancer caused by KIAA1114 overexpression, especially metastatic cancer.
  • composition for preventing or treating cancer ⁇ 120> Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer
  • acacagcagt caaggcagtt atggccaatc agctgagggt gtcatgtgat ggaaaaatct 4560

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명은 항 KIAA1114 항체를 유효성분으로 함유하는 KIAA1114 과발현에 의해 야기되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항 KIAA1114 항체는 KIAA1114 단백질의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하며, 다양한 암세포주와 특이적으로 반응하고, KIAA1114 과발현 암세포주를 이용한 폐 전이 동물 모델에서의 생체 내 암세포 전이 억제능이 우수하다. 따라서, 본 발명의 항 KIAA1114 항체는 KIAA1114 과발현에 의해 야기되는 암, 특히 전이성 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항 ＫＩＡＡ１１１４ 항체를 유효성분으로 함유하는 ＫＩＡＡ１１１４ 과발현에 의해 야기되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 항 KIAA1114 항체를 유효성분으로 함유하는 KIAA1114 과발현에 의해 야기되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
KIAA1114 유전자는 인간의 뇌 조직에서 만들어진 cDNA library에서 최초로 그 염기서열이 알려졌고 [Kikuno et al, 1999, DNA Res. 6:197-205], Malanoma-associated antigen encoding gene (MAGE) family에 속한 유전자들이 공통적으로 가지고 있는 MAGE homology domain (MHD) 를 지니고 있는 것이 발견된 이래, MAGE-D3 유전자라고도 불리워지고 있다. Type I MAGE 유전자 (MAGE A, B, C) 로 분류되는 MAGE family 의 초기 멤버들은 전사해독틀 (ORF)이 하나의 엑손(exon)으로 구성되어 있고, 흑색종을 포함한 대부분의 암 조직에서는 특이적으로 발현되지만 정상세포에서는 고환 및 태반 이외에는 발현되지 않는 특징을 가지고 있어, 종양의 진단마커 및 표적 치료제의 항원으로 이용되고 있다. 반면에, type II MAGE 유전자로 분류되는 10개의 MAGE 유전자 (MAGE D, E, F, G, H, I, J, K, L2, NECDIN) 중 일부, 특히 MAGE-D subfamily 유전자들은 전사해독틀 (ORF)이 다수의 엑손으로 이루어져있고, 대부분의 정상세포에서도 발현이 된다 [Barker et al, 2002, J Neurosci Res. 67:705-712]. Type II MAGE 유전자인 인간 KIAA1114 또는 MAGE-D3 은 약 138 kDa 의 분자량을 갖는 1431개의 아미노산을 암호화하는 4.7 kb 크기의 전사해독틀을 가지고 있으며, 이는 12개의 엑손으로 구성되어 있다. KIAA1114 유전자는 이름이 알려지지 않은 N-말단 도메인, 중간 부분의 MAGE homology 도메인 (MHD), C-말단의 Trophinin 도메인으로 구성되어 있고, in-frame 부분에 존재하는 여러 개의 번역 개시부위를 이용한 대체 스플라이싱 (alternative splicing) 을 통해 다양한 생물학적 역할을 하는 다수의 단백질을 생산한다고 알려져 있으며 [Saburi et al, 2001, J Biol Chem. 276(52):49378-89; Nadano et al, 2002, Biol Reprod. 66(2):313-21], 현재까지 알려진 단백질로는 KIAA1114, MAGPHININ-α, β, γ, 그리고 TROPHININ 단백질이 있다.
KIAA1114 유전자의 MAGE homology 도메인 (MHD)을 포함하는 상부 부위에 의해 암호화되는 단백질들인 MAGPHININ-α, β, 및 γ 는 세포 주기 조절에 관여한다고 알려져 있다 [Aoyama et al, 2008, J Cell Biochem. 103:765-777]. C-말단 TROPHININ 도메인에 의해 암호화되는 TROPHININ 단백질은 배아 이식(embryo transplantation) 과정에 관여하는 막 단백질로, 영양막 세포(trophoblastic cells)와 자궁 내막의 내강 상피세포 (luminal epithelial cells) 사이의 정단 세포 부착(apical cell adhesion)을 매개하는 동종친화성 세포부착분자(homophilic cell adhesion molecule)로 알려져 있다 [Fukuda, et al 1995, Genes Dev. 9(10):1199-210; Suzuki et al, 1998, Proc Natl Acad Sci U S A. 95(9):5027-32]. 반면에, KIAA1114 전장유전자에 의해 암호화되는 full-length 단백질 KIAA1114 는 in vitro 또는 in vivo 에서의 실제적인 단백질 레벨에서의 발현이 보고된 바가 없으며, 역할 및 기능 또한 알려져 있지 않다.
유전자 레벨에서 KIAA1114 의 발현은 TROPHININ 유전자의 발현 양상과 유사하고 그 발현 정도 또한 비슷하다는 것이 인간 자궁내막 조직 및 마우스 뇌와 눈, 배아 조직에서 발견되었고, 이는 KIAA1114 와 TROPHININ 엑손들이 하나의 transcriptional unit에서 발현되기 때문임이 밝혀졌다 [Chomez et al, 2001, Cancer Res. 61:5544-5551]. 이는 KIAA1114 단백질 또한 TROPHININ 단백질이 발현되는 조직에서 발현될 확률이 높고, 그 역할 및 기능 또한 TROPHININ 단백질과 유사할 수 있음을 의미한다.
인간 배아 이식 과정에서 TROPHININ을 매개로 하는 세포 부착은 영양막 세포가 발현하는 표피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR)의 하나인 ErbB4의 활성화를 촉진하여, 영양막 세포의 증식 및 침입을 유도함과 동시에 PKC-δ 신호전달과정을 통해 자궁내막세포의 사멸을 유도한다 [Sugihara et al, 2007, Proc Natl Acad Sci U S A. 104(10):3799-804; Tamura et al, 2011, Cell Cycle. 10(1):135-143]. 배아 이식과정에서 보이는 영양막 세포의 빠른 증식과 자궁 내막 침입은, 전이성 암세포의 공격적인 특성과도 유사성을 보이고[Denker, 1990, Plenum Medical Book Company, p.3-20], 실제로 TROPHININ 단백질은 암의 전이 촉진자로 작용하여 암의 전이 형성에서 중요한 역할을 한다는 것이 보고되었다. 환 정상피종, 대장 샘암종(colon adenocarcinoma), 담낭암 세포주에서 TROPHININ의 형질감염은 암 세포주의 침입 및 전이 잠재력을 증가시키는 반면 [Hatakeyama et al, 2004, Cancer Res. 64(12):4257-62; Oi Harada et al, 2007, Int J Cancer. 121(5):1072-8; Chang et al, 2009, J Cancer Res Clin Oncol. 135(4):581-90], TROPHININ 유전자의 녹다운(KNOCKDOWN)은 정반대의 효과를 나타낸다. 이러한 결과는 다양한 임상 연구와 일치되는데, 항-TROPHININ 항체를 이용한 면역조직화학염색법을 통해 고환 생식세포종양의 폐전이가 있는 환자들의 조직에서 TROPHININ이 높게 발현되고 [Hatakeyama et al, 2004, Cancer Res. 64(12):4257-62], 이러한 TROPHININ의 발현 증가는 낮은 생존율의 예측자임을 초기 폐암 및 대장암 모델에서 동일한 실험 방법을 통해 보여주었다 [Kuan-Yu Chen et al, 2007, Eur J Cancer. 43(4):782-90; Oi Harada et al, 2007, Int J Cancer. 121(5):1072-8]. 상기 임상 연구에서 사용된 항-TROPHININ 항체는 KIAA1114 단백질을 인식할 수 있음을 고려할 때 (본 발명에서 최초로 실험적 증거를 제시함; 도 3 참조), KIAA1114 단백질은 TROPHININ 단백질과 마찬가지로 전이성 암 또는 악성 종양에서 과발현 됨을 알 수 있다.
이는 항 KIAA1114 또는 항 TROPHININ 항체를 사용하여 KIAA1114 또는 TROPHININ을 과발현하는 종양세포를 표적하여 KIAA1114 또는 TROPHININ의 활성을 저해하면 암세포의 성장을 억제하거나 또는 암세포의 침입 및 전이를 방지할 수 있음을 의미한다. TROPHININ 을 인식하는 기존의 단클론항체인 항-TROPHININ 항체 Clone 3-11 은 면역조직화학염색을 포함한 진단 용도로 적용된 사례들은 있으나, 치료용 목적으로 적용된 사례는 보고된 바가 없다.
본 발명자들은 KIAA1114 의 과발현에 의해 야기되는 암세포의 성장을 억제하거나 또는 암세포의 침입 및 전이를 방지할 수 있는 항체에 대해 연구하던 중, KIAA1114 항원 발현 유전자 백신을 이용하여 항 KIAA1114 항체를 제조하였으며, 상기 항 KIAA1114 항체가 KIAA1114 단백질의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하며, 다양한 암세포주와 특이적으로 반응하고, KIAA1114 과발현 암세포주를 이용한 동물 모델에서의 생체 내 암세포 전이 억제능이 우수함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 항 K I A A 1 1 1 4 항체를 유효성분으로 함유하는 K I A A 1 1 1 4 단백질의 과발현에 의해 야기되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 항 KIAA1114 항체를 유효성분으로 함유하는 KIAA1114 단백질의 과발현에 의해 야기되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 완전한 길이의 인간 KIAA1114 단백질을 항원으로 하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 3의 염기서열에 의해 암호화되는 KIAA1114 단백질의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 완전한 길이의 인간 KIAA1114 단백질의 아미노산 200-214 (서열번호 5) 에 포함되는 에피토프와 결합하는 항체인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 항체는 다클론항체 또는 단일클론항체인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 KIAA1114 단백질의 과발현에 의해 야기되는 암은 폐암, 위암, 간암, 골암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 피부암, 두경부암, 피부 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 대장암, 결장암, 유방암, 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 후두암, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 유년기의 고상 종양, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신장 골반 암종, 척수축 종양, 신경교종 및 뇌하수체 아데노마로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 KIAA1114 단백질의 과발현에 의해 야기되는 암은 전이성 암인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 환약, 캡슐, 과립, 정제, 수용액, 현탁액 또는 유탁액으로 제형화되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 항 KIAA1114 항체는 KIAA1114 단백질의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하며, 다양한 암세포주와 특이적으로 반응하고, KIAA1114 과발현 암세포주를 이용한 전이암 동물 모델에서의 생체 내 암세포 전이 억제능이 우수하다. 따라서, 본 발명의 항 KIAA1114 항체는 KIAA1114 과발현에 의해 야기되는 암, 특히 전이성 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 사용되는 KIAA1114 항원 발현 유전자 백신의 모식도이다.
도 2는 KIAA1114 항원 발현 유전자 백신이 투여된 마우스의 혈청 내에서 본 발명의 항 KIAA1114 다클론항체의 항원 특이성을 효소면역측정법(ELISA)을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 항 KIAA1114 단일클론항체(Kiatomab)의 마우스 및 인간 KIAA1114 단백질 인식능을 웨스턴 블롯팅을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 4a는 본 발명의 KIAA1114 항원 발현 유전자 백신이 암호화하는 인간 KIAA1114 세포외 도메인의 아미노산 서열 및 그에 상응하는 마우스 KIAA1114 의 아미노산 서열 분석 결과 및 합성된 펩타이드 항원들의 서열 위치를 나타낸 도이고, 도 4b는 항 KIAA1114 단일클론항체(Kiatomab)와 다양한 펩타이드 항원들과의 반응성을 ELISA 분석법으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 5a는 본 발명의 항 KIAA1114 단일클론항체(Kiatomab)와 인간 난소암 세포주 및 혈액암 유래 세포주와의 반응성을 FACS 분석법으로 관찰한 결과이고, 도 5b 는 항 KIAA1114 단일클론항체(Kiatomab)와 인간 대장암 세포주, 담관암 세포주, 간암세포주와의 반응성을 FACS 분석법으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 항 KIAA1114 단일클론항체(Kiatomab) 및 상용화된 항 TROPHININ 단일클론항체(클론 3-11)와 인간 및 마우스 기원 간암세포주와의 반응성을 FACS 분석법으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 항 KIAA1114 단일클론항체(Kiatomab)의 마우스 대장암(CT26-Her2/neu 및 CT26) 세포주를 이용한 폐 전이 모델에서의 생체 내 암세포 전이 억제능을 나타낸 도이다.
본 발명은 항 KIAA1114 항체를 유효성분으로 함유하는 KIAA1114 단백질의 과발현에 의해 야기되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 조성물에서 유효성분인 항 KIAA1114 항체는 서열번호 3의 염기서열에 의해 암호화되는 KIAA1114 단백질의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 KIAA1114은 인간(Homo sapiens), 마우스(Mus musculus), 랫트 (Rattus norvegicus) 등의 포유류에 존재하는 KIAA1114을 모두 포함할 수 있으며, 본 발명에서는 서열번호 1의 아미노산 서열(NCBI 데이터베이스상의 승인번호 NP_001034794)을 갖는 인간 KIAA1114이 바람직하다.
본 발명에서 KIAA1114의 mRNA는 인간, 마우스, 랫트 등의 포유류에 존재하는 KIAA1114의 mRNA를 모두 포함할 수 있으며, 본 발명에서는 서열번호 2의 염기서열(NCBI 데이터베이스상의 승인번호 NM_001039705)을 갖는 인간 KIAA1114의 mRNA가 바람직하다.
본 발명에서 항체는 전체 형태의 항체(이하 "전항체"라고 함) 또는 그의 기능적인 단편일 수 있다. 상기 전항체는 단량체 또는 2 이상의 전항체가 결합되어 있는 다량체의 형태일 수 있다. 상기 항체의 기능적인 단편은 전항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 갖는 항체로서, 실질적으로 전항체가 인식하는 것과 동일한 항원결합부위(epitope)를 인식하는 것을 의미한다. 상기 항체의 기능적인 단편에는 단일쇄 가변영역 단편 (scFv), (scFv)2, Fab, Fab' 및 F(ab')2 등이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 상기 단일쇄 가변영역(scFv)은 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 링커 펩타이드를 통해 연결되어 단일쇄 폴리펩티드 형태를 취하는 항체 단편을 의미한다.
상기 항체는 효소, 형광 물질, 방사선 물질 및 단백질 등과 같은 다양한 분자와 결합하여 변형될 수 있다. 변형된 항체는 화학적으로 항체를 변형하여 수득할 수 있다. 이러한 변형 방법은 당업계에서 통상적으로 사용된다. 또한, 상기 항체는 비인간 항체로부터 유래한 변형 부위(variable region)와 인간 항체로부터 유래한 불변 부위(constant region)가 결합된 키메라 항체(chimeric antibody)로 수득되거나, 또는 인간이 아닌 항체로부터 유도된 상보성 결정 부위를 포함하여 인간 항체로부터 유도된 구조 부위(frame work region, FR)와 불변부위가 결합된 인간화 항체(humanized antibody)로 수득될 수 있다. 이러한 항체는 당업계에 알려져 있는 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
상기 항체는 당업계에 알려져 있는 방법, 예를 들어, 단백질 또는 펩티드 백신, 또는 유전자 백신으로 마우스, 양, 랫트, 토끼와 같은 포유동물을 면역화하는 방법; 파지 디스플레이 방법; 또는 효모 디스플레이 방법을 이용하여 생성될 수 있는데, 이 중 유전자 백신을 사용하는 방법이 다른 방법에 비해 여러 가지 이점이 있다. 유전자 백신을 이용하는 경우 박테리아에서 항원 단백질을 정제하는데 소요되는 많은 노력과 시간을 줄일 수 있고, 항원 단백질의 정제과정이 생략되므로 정제과정에서의 기술적인 제약도 극복할 수 있다. 또한, 유전자 백신에 의한 면역 접종의 경우 항원 단백질이 생체 내에서 발현되므로 단백질의 본래의 3차원적인 구조와 동일한 구조를 가지고, 이에 의해 생성된 항체는 세포분리와 같은 목적에 더 적합하다. 특히, 단백질 분리 및 정제가 어려운 세포막 표면 단백질(transmembrane protein)인 KIAA1114이 항원인 경우 유전자 백신을 이용하여 항체를 생산하는 방법이 보다 유용하다.
본 발명의 항 KIAA1114 항체는 유전자 백신 방법을 이용하여 다클론항체와 단일클론항체로 생산되며, 상기 생산된 항 KIAA1114 단일클론항체를 "Kiatomab (IgG2b, κ)"으로 명명하였다.
본 발명의 KIAA1114 항원 발현 유전자 백신을 접종한 마우스의 혈청은 KIAA1114 항원 발현 유전자 백신을 접종하지 않은 마우스의 혈청과는 달리 KIAA1114 항원을 포함하는 세포용해물에 대해서 ELISA 상에서 높은 흡광도 값을 나타낸다. 이는 마우스 혈청 내에 KIAA1114 항원에 특이적인 다클론항체가 있음을 의미한다.
본 발명의 항 KIAA1114 단일클론항체(Kiatomab)는 기존의 항 TROPHININ 항체(클론 3-11)와 동일하게 마우스 KIAA1114 단백질(~196kD) 및 인간 KIAA1114 단백질(~138kD)을 인식하나, KIAA1114 단백질의 C-말단 부위 (아미노산 1319-1327) 에 결합하는 클론 3-11과는 차별적으로 N-말단 부위 (아미노산 200-214) 의 세포외 도메인에 결합한다. 또한, 본 발명의 항 KIAA1114 항체는 다양한 암세포주와 특이적으로 반응하며, 특히 악성도가 높거나 높은 종양형성능(tumorigenicity)을 가진, 또는 전이성을 띈 암세포주에 상대적으로 더 높게 반응한다.
본 발명의 항 KIAA1114 항체(IgG2b, κ)는 상용화된 항 TROPHININ 항체(클론 3-11, IgM)에 비해 높은 친화력을 갖을 뿐 아니라, IgG 아형을 가지고 있어 그 산업상 이용가능성이 IgM 아형의 항체보다 월등히 뛰어나다. IgM 아형의 항체는 IgG 아형의 항체에 비해 용해되는 범위가 좁고, 쉽게 변성된다는 단점이 있다. 이러한 성질은 기존의 IgG 아형의 항체 정제에서 사용되는 가혹한 용출 조건을 IgM 정제에 사용할 수 없게 만든다. 또한 IgM 아형 항체의 큰 크기는, 느린 확산 계수 (diffusion constants)와 연관되어 있고, 느린 확산 계수는 전통적인 다공성 입자 기반 크로마토그래피 배지(porous-partical-based chromatography media)에서의 사용을 제한한다. 반면, IgG 항체의 정제는 당업계에서 전통적으로 쓰이는 Protein G-아가로오스겔이 충전된 컬럼을 사용하여 정제 공정이 빠르고 간편하게 이루어질 수 있어, 대량의 수요를 요구하는 치료용 항체의 개발에 유리하고, 그 외에도 IgM 아형 항체보다 생체 내 반감기가 길고, 작은 크기로 인해 조직의 침투가 용이하다는 등의 다양한 장점이 있다. 이는 본 발명의 항 KIAA1114 항체가 상용화된 항 KIAA1114 항체에 비해 그 생산 공정이 용이할 뿐 아니라, 효능 또한 더 뛰어나다는 것을 의미한다.
또한, 본 발명의 항 KIAA1114 단일클론항체 (Kiatomab)는 마우스 대장암(CT26-Her2/neu 및 CT26) 세포주를 이용한 폐 전이 모델을 통해 생체 내에서 암세포 전이 억제능이 우수함을 알 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 항 KIAA1114 항체는 KIAA1114 단백질의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하며, 다양한 암세포주와 특이적으로 반응하고, KIAA1114과발현 암세포주를 주입한 폐 전이 동물 모델에서의 생체 내 전이 억제능이 우수하다. 따라서, 본 발명의 항 KIAA1114 항체는 KIAA1114 과발현에 의해 야기되는 암, 특히 전이성 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 KIAA1114 과발현에 의해 야기되는 암은 폐암, 위암, 간암, 골암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 피부암, 두경부암, 피부 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 대장암, 결장암, 유방암, 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 후두암, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 유년기의 고상 종양, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신장 골반 암종, 척수축 종양, 신경교종 또는 뇌하수체 아데노마 등을 포함하나 이에 한정되지 않으며, KIAA1114 과발현에 의해 야기되는 암을 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 항 KIAA1114 항체와 함께 항암효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 조성물의 일일 투여량은 약 1㎍/㎏ 내지 100㎎/㎏, 바람직하게는 약 0.1㎎/㎏ 내지 20㎎/㎏이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물은 KIAA1114 과발현에 의해 야기되는 암의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. KIAA1114 항원 발현 유전자 백신의 제작
pGX10 벡터(대한민국 공개특허공보 제 10-2003-47667호)를 제한효소 KpnI과 XbaI로 자른 후, 합성된 tpa-MCS-GS linker-ILZ-mCD40Lecdco 뉴클레오티드(서열번호 4)를 리가아제로 연결하여 재조합 벡터 pGX10-tpa-MCS-GS linker-ILZ-mCD40Lecdco를 제작하였다.
구체적으로, tpa(tissue plasminogen activator)는 인간 조직 플라스미노겐 활성화 인자의 신호서열로서 단백질 분비를 촉진하기 위해서 사용하였고, GS linker는 글리신, 세린으로 이루어진 링커의 염기 서열이며, ILZ(Isoleucine Zipper)는 강제적 삼량화 집행 영역(trimerizaion-enforcing domain)으로 융합 단백질을 삼량화하여 항체 반응을 증가시키고자 하였다. 또한, mCD40Lecdco(murine CD40 Ligand extracellular domain)는 뮤린 CD40 리간드의 세포외 도메인으로 마우스에서의 체액성 항체반응을 증가시키는 역할을 수행할 수 있으며, 발현 증진을 위해서 코돈 최적화된 유전자를 이용하였다. 상기 재조합 벡터의 MCS(multicloning site; 다중클로닝 부위)에 KIAA1114 유전자의 세포외 도메인에 해당하는 뉴클레오티드[서열번호 3, GenScript사 (Piscataway, NJ, USA)에 합성을 의뢰하여 얻음]를 NotI과 AscI으로 제한한 후 연결함으로써 KIAA1114 항원 발현 유전자 백신을 수득하였다. 인간 KIAA1114의 아미노산 서열(NCBI 데이터베이스상의 승인번호 NP_001034794)은 서열번호 1로 나타내었고, 인간 KIAA1114 mRNA의 염기서열(NCBI 데이터베이스상의 승인번호 NM_001039705)은 서열번호 2로 나타내었다.
본 발명에 사용되는 KIAA1114 항원 발현 유전자 백신의 모식도는 도 1에 나타내었다.
실시예 2 : 항 KIAA1114 다클론항체의 생산
상기 실시예 1에서 제조한 KIAA1114 항원 발현 유전자 백신 100㎍을 액체역학 주사법(hydrodynamic injection; Zhang et al., Hum. Gene Ther. 10: 1735-1737, 1999)을 이용하여 1주 내지 2주 간격으로 Balb/c 마우스에게 5회 접종하였다. 마지막 접종 전 3일 이내에 마우스의 안구혈관에서 미세모세관 튜브(microcapillary tube)를 이용하여 혈액을 채취하고, 혈액의 응고 후 혈청만을 회수하여 KIAA1114에 특이적으로 결합하는 다클론항체를 생산하였다.
실시예 3 : 항 KIAA1114 단일클론항체의 생산
3-1. 하이브리도마 세포의 제작
상기 실시예 2에서 KIAA1114 항원 발현 유전자 백신을 마지막으로 접종한 후 마우스로부터 비장을 분리하고 적혈구를 용해시켜 얻은 세포를 카운트 (counting) 한 후 골수종 세포(myeloma cell)인 SP2/O와 5 : 1로 섞어주었다. 10mM HEPES[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid] 완충액을 함유한 DMEM(Dulbecco's Modified Essential Medium)으로 3번 세척한 후, 세포가 잘 퍼지도록 한 상태에서 미리 데운(pre-warmed) PEG(polyethylene glycol) 1㎖를 1분 이내에 떨어뜨려 세포융합을 진행하였다. 미리 데운 10mM HEPES 완충액을 함유한 DMEM 완충액 1㎖를 1분 이내에 떨어뜨린 후 10mM HEPES를 함유한 DMEM 10㎖를 동일한 방법으로 2번 떨어뜨렸다. 세포를 상층액과 분리한 후 HAT 배지(Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine media)와 조건배지(conditioned media, SP2를 16시간 정도 배양했었던 DMEM)를 1:1로 섞어서 200㎕씩 96웰 플레이트에 분주하였다. 2 내지 3일 간격으로 HAT 배지로 교체해 준 후 융합한 지 11일째부터 하이브리도마 클론 (hybridoma clone)의 융합상태(confluence)가 50% 이상일 때 스크리닝을 수행하였다. 양성대조군으로는 상기 실시예 2에서 얻은 혈청(KIAA1114 항원 발현 유전자 백신을 접종한 마우스에서 얻은 혈청)을 사용하였다. 양성대조군보다 높은 흡광도 (Optical Density, O.D) 값을 보이는 것을 선택하여 24웰로 옮겨주었다. 초기 하이브리도마 클론은 96웰 당 200개의 세포를 분주하고 10일간 배양하여 단일 콜로니 (colony)가 형성된 것만 선택하여 스크리닝 하고, 양성으로 나온 것은 다시 키워서 50개의 세포를 분주하여 한 번 더 스크리닝하여 최종 하이브리도마 세포를 선택하였다.
3-2. 하이브리도마 세포로부터 항 KIAA1114 단일클론항체의 생산
상기 3-1에서 선택된 최종 하이브리도마 세포로부터 항 KIAA1114 단일클론항체를 생산하기 위하여, 마우스 복강(abdominal cavity) 내에 프리스탄(pristane) 0.5㎖를 주사하였다.
구체적으로, 프리스탄 투여 7일 후 마우스 복강 내에 무혈청(serum-free) DMEM으로 2번 세척한 하이브리도마 세포 5×106 내지 1×107 을 주사하였다. 3일 내지 5일 간격으로 확인하여 복강에 복수(ascites)가 가득찼을 때 18G 주사 바늘을 이용하여 복수를 뽑았다. 복수를 실온에서 1 내지 2시간 방치한 후, 4℃에서 3,500rpm으로 30분 동안 원심분리하여 노란 지방층을 포함한 덩어리 물질을 제거하고 상층액만을 분리하였다. 분리한 상층액은 분주하여 -20℃에 보관하였다. 복수 상층액에 포함되어 있는 항 KIAA1114 단일클론항체를 "Kiatomab (IgG2b, κ)"으로 명명하였다.
실시예 4. KIAA1114 항원 발현 유전자 백신이 투여된 마우스 혈청 내에서 항 KIAA1114 다클론항체의 항원 특이성 확인
KIAA1114 항원 발현 유전자 백신이 투여된 마우스의 혈청 내에서 본 발명의 항 KIAA1114 다클론항체의 항원 특이성을 확인하기 위하여, 샌드위치 효소면역측정법(Sandwich ELISA)을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조된 KIAA1114 항원 발현 유전자 백신 20㎍을 5×106의 Cos7 세포(한국 세포주 은행)에 전기 자극의 방법으로 넣어서 융합 단백질을 36시간 내지 48시간 동안 발현시킨 다음, 3번의 동결융해(freezing & thawing)를 거쳐서 세포용해물(cell lysates)을 얻었다. 혈청은 상기 실시예 2에서 얻은 혈청을 사용하였다. 구체적으로는, 0.5㎍/㎖의 항-CD40L 항체(anti-CD40L Ab, 여기서 CD40L은 CD40 리간드를 의미하는 것으로서 CD154와 동일함)를 플레이트의 웰에 50㎕씩 코팅하고, 여기에 세포용해물을 50:1로 50㎕ 넣어준 후에, 시험용 항체로서 상기 실시예 2에서 얻은 혈청을 1:100으로 희석하여 넣어주었다. 그 다음, 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase; HRP)가 결합된 항-마우스 면역글로불린 G(anti-mouse IgG Ab), 항-마우스 면역글로불린 A(anti-mouse IgA Ab), 항-마우스 면역글로불린 M(anti-mouse IgM Ab)을 1:3000으로 희석하여 넣어주고, 호스래디쉬 퍼옥시다제의 기질로서 TMB(substrate, cat #:50-76-00, KPL, USA) 용액 50㎕를 넣어준 후 10분간 빛을 차단한 조건에서 반응시킨 다음 정지액(2N H2SO4) 50㎕를 넣어 반응을 정지시킨 후, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 450 nm에서 흡광도(optical density, O.D)를 측정하였다. 음성대조군으로는 KIAA1114 항원 발현 유전자 백신을 접종하지 않은 마우스의 혈청을 사용하였다 (도 2 참조).
도 2에 나타난 바와 같이, KIAA1114 항원 발현 유전자 백신을 접종한 마우스의 혈청은 음성대조군(KIAA1114 항원 발현 유전자 백신을 접종하지 않은 마우스의 혈청)과는 달리 KIAA1114 항원을 포함하는 세포용해물에 대해서 ELISA 상에서 높은 흡광도 값을 나타내었다. 이는 마우스 혈청 내에 KIAA1114 항원에 특이적인 다클론항체가 있음을 의미한다.
실시예 5. 항 KIAA1114 단일클론항체의 KIAA1114 단백질 인식능 확인
본 발명의 항 KIAA1114 단일클론항체의 KIAA1114 단백질 인식능을 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯팅을 통해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
상기 실시예 3에서 제조한 단일클론항체가 마우스와 인간 KIAA1114 단백질에 결합하는지 확인하기 위하여, KIAA1114이 발현되는 마우스의 뇌 조직에서 추출된 단백질과 인간 KIAA1114 유전자가 형질감염된 293T 세포의 용해물(lysate) (cat#: sc-113881, Santa Cruz, USA)을 사용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
구체적으로, 마우스 뇌조직 추출 단백질을 얻기 위하여, 희생된 마우스로부터 약 50㎍의 뇌조직에 300㎕의 단백질 용해 용액[50mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.2M NaCl, 5mM CaCl2, 1% Triton X-100]을 첨가하고 조직분쇄기(MagNa Lyser, Roche, USA)를 사용하여 마쇄하였다. 분해된 뇌조직에 300㎕의 단백질 용해 용액을 첨가하여 뇌조직과 함께 얼음에서 30분 동안 배양한 후, 15,000rpm으로 4℃에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 새로운 튜브에 담고 -70℃에서 1시간 이상 냉각시켰다. 이를 실온에서 충분히 녹인 후, 4℃에서 15,000rpm으로 15분 동안 원심분리하고, 분리된 상층액에 EDTA-free 프로테아제 저해제를 첨가한 후 -70℃에 보관하였다.
마우스의 뇌조직 추출 단백질과 인간 KIAA1114 유전자가 형질감염된 293T 세포의 용해물로부터 정량한 단백질 5㎍을 전기영동을 통해 8% 아크릴아미드겔을 이용하여 분리하였다. 전기영동한 겔을 미리 적셔둔 다공성 패드(porous pad)와 3MM 페이퍼(Whatman laboratory Products, Maidstone, UK) 위에 올려놓고 그 위에 PVDF 막(PVDF Western Blottng Membrane, Roche)과 3MM 페이퍼(Whatman), 다공성 패드를 공기 방울이 생기지 않게 잘 덮고 전이 카세트(transfer cassette)로 압착하였다. 이것을 전극 전이 키트(electrode transfer kit)에 넣고 전이완충액(2.5mM Tris, 6.9mM 글리신, 20% 메탄올)에 완전히 잠기게 한 후 전기이동하였다. 단백질이 완전하게 전기이동된 막을 차단용액(blocking solution) [TBS-T(1% Tween 20) 내 5% 탈지분유]에 넣고 1시간 동안 진탕 배양하였다. TBS-T(0.1% Tween 20)로 차단용액을 30분 동안 세척한 후, 일차 항체인 항 KIAA1114 단일클론항체 (Kiatomab) 또는 Santa Cruz 사의 항 TROPHININ 항체(클론 3-11; cat# 80002, Santa Cruz Biotechnology, USA)를 TBS-T(0.1% Tween 20)에 1/1,000로 희석하여 넣고 4℃에서 16시간 동안 진탕 배양하였다. TBS-T(0.1% Tween 20)로 막을 10분 동안 3회에 걸쳐 헹구어준 후, 이차 항체(Anti-mouse Ig(H+L), horseradish peroxidase linked conjugate; cat# 170-6516, Biorad, USA)를 1/3,000으로 희석하여 넣고 실온에서 2시간 동안 진탕 배양하였다. TBS-T(0.1% Tween 20)로 막을 20분 동안 3회 헹구어 준 후, 막에 웨스턴 검출용액(western detection solution)을 도포한 후 암실에서 필름에 감광시켜 현상하였다 (도 3 참조).
도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 항 KIAA1114 단일클론항체 (Kiatomab)는 항 TROPHININ 항체(클론 3-11)와 동일하게 마우스 KIAA1114 단백질 (~196kD) 및 인간 KIAA1114 단백질(~138kD)을 인식함을 확인하였다.
실시예 6. 항 KIAA1114 단일클론항체의 에피토프 동정 실험
본 발명의 항 KIAA1114 단일클론항체가 인식하는 에피토프를 확인하기 위하여, 효소면역측정법(ELISA)을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
상기 실시예 3에서 제조한 단일클론항체의 항원 유전자로 사용된 서열번호 3의 염기서열에 의해 암호화되는 인간 KIAA1114 단백질의 세포외 도메인과 이에 상응하는 마우스 KIAA1114 단백질의 아미노산 염기서열을 비교분석하여, 상동성이 높은 부위를 확인하고, Emini surface accessibility prediction 프로그램과 Bepipred Linear epitope prediction 프로그램 (http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell) 으로 세포 표면에 노출된 선형 에피토프를 예측하여, 공통된 염기서열 부위를 펩트론사 (대한민국)에 의뢰하여 펩타이드를 합성하였다.
구체적으로, 인간 KIAA1114 (상단 서열) 및 마우스 KIAA1114 (하단 서열)의 세포외 도메인 아미노산 염기서열을 the software BioEdit version 7.0.9.9. (BioEdit Sequence Alignment Editor)를 이용하여 정렬시키고, 일치된 부분의 서열들을 붉은색 및 노란 배경으로 나타내었다. Bepipred Linear epitope prediction 프로그램를 이용하여 항체의 선형 에피토프로 예측되는 염기서열의 상단에는 붉은 실선을, Emini surface accessibility prediction 프로그램을 이용하여 항체에 대한 항원의 접근성이 높은 부분으로 예측되는 염기서열의 상단에는 푸른 실선을 적용하였다. 노란 배경으로 표기된 염기서열 중 붉은 실선 및 푸른 실선의 하단에 공통적으로 적용된 염기서열 부위를 중심으로 펩타이드를 합성하였고, 합성된 부분은 점선 상자로 나타내었다 (도 4a 참조).
또한, 합성된 펩타이드들과 본 발명의 항 KIAA1114 단일클론항체(Kiatomab)의 반응성을 확인하기 위하여, 효소면역측정법(ELISA)을 수행하였다. 각 epitope들을 coating buffer (0.05 M carbonate-bicarbonate, pH 9.6)에 10 ㎍/㎖의 농도로 희석한 후 플레이트에 4℃, 16시간동안 부착시킨 후 PBS-T (0.1% Tween 20)으로 3번 세척하였다. 차단용액(blocking solution) [PBS-T(1% Tween 20) 내 5% 탈지분유]을 도포하고 상온에서 1시간 동안 유지한 뒤, 이소타입 대조군 항체 또는 항 KIAA1114 단일클론항체(Kiatomab)를 1㎍, 3㎍, 또는 10㎍을 100㎕ 차단용액(blocking solution)에 희석하여 상온에서 5시간 동안 반응시켰다. 이를 PBS-T (0.1% Tween 20)으로 5회 세척한 뒤, 이차 항체(Goat anti-mouse IgG2b-HRP; cat# 1090-05, Southern Biotechnology Inc., USA)를 1/3,000으로 차단용액(blocking solution)에 희석하여 넣고 실온에서 1시간 동안 반응하였다. 이를 다시 PBS-T (0.1% Tween 20)으로 5회 세척한 뒤, TMB(substrate, cat #:50-76-00, KPL, USA) 용액 50㎕를 넣어준 후 10분간 빛을 차단한 조건에서 반응시킨 다음 정지액(2N H2SO4) 50㎕를 넣어 반응을 정지시킨 후, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 450 nm에서 흡광도(optical density, O.D)를 측정하였다. 합성된 펩타이드의 서열 및 본 발명의 항 KIAA1114 항체(Kiatomab)와 펩타이드와의 반응성 결과는 도 4b에 나타내었다.
도 4b에 나타난 바와 같이, 본 발명의 항 KIAA1114 단일클론항체 (Kiatomab)는 인간 KIAA1114 단백질의 아미노산 200-214 (서열번호 5) 에 포함되는 에피토프에 대해서 ELISA 상에서 항체의 농도 의존적으로 흡광도 값이 높아지는 것을 확인하였으나, 다른 에피토프들에 대해서는 항체 농도 변화에 따른 흡광도 값의 변화가 보이지 않았다. 이는 항 KIAA1114 단일클론항체 (Kiatomab)의 에피토프가 인간 KIAA1114 단백질의 아미노산 200-214 (서열번호 5) 에 포함됨을 의미한다.
실시예 7. 항 KIAA1114 단일클론항체와 다양한 암세포주와의 반응성 실험
본 발명의 항 KIAA1114 단일클론항체의 다양한 암세포주와의 반응성을 확인하기 위하여, FACS 분석 방법을 통해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
상기 실시예 3에서 얻은 항 KIAA1114 단일클론항체(Kiatomab)는 복수 상층액으로부터 정제하여 사용하였으며, 항체의 정제는 영인프론티어사(대한민국)에 의뢰하여 Protein G-아가로오스겔이 충전된 컬럼을 사용하여 정제하였다.
구체적으로, 실험에 사용된 세포주로는 인간 간암(Hepatocellular Carcinoma) 세포주인 HepG2 및 Hep3B; 담관암 (Cholangiocarcinoma) 세포주인 JCK 및 SCK; 난소암(Ovarian Cancer) 세포주인 A2780, SKOV3, C13, 및 KF; 혈액암 (Leukemia) 세포주인 Jurkat, Ramos, 및 MC/Car ; 대장암(Colorectal Carcinoma) 세포주인 SW480 및 SW620을 사용하였다.
상기 정제된 항 KIAA1114 단일클론항체(Kiatomab) 또는 이소타입 대조군 항체(Mouse IgG2b κ Isotype Control Purified, cat# 14-4732, eBioscience, USA) 1㎍을 100㎕의 FACS 완충액 (0.5% FBS, 0.09% Sodium azide 의 PBS) 에 희석한 후, 상기 암세포주들(2.5×105 cell 사용)과 얼음 속에서 반응시켰다. 결합하지 않은 항체를 FACS 완충액으로 2회 씻어낸 후, 100㎕의 FACS 완충액에 FACS 분석용 염료가 연결된 항-마우스 Ig-APC(cat#: 550826, BD pharmingen, USA) 이차 항체 0.5 ㎕를 넣어 얼음에서 반응시키고, FACS 완충액으로 2회 씻어내었다. 마지막으로 250㎕의 FACS 완충액으로 현탁한 다음 유세포분석기로 분석을 수행하고, 항 KIAA1114 단일클론항체(Kiatomab)와 인간 유래 다양한 조직 기원의 대표 암세포주와의 반응성을 FACS 분석법으로 관찰한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5a에 나타난 바와 같이, 본 발명의 항 KIAA1114 단일클론항체 (Kiatomab)는 이소타입 대조군 항체에 비하여 미분화 암종 유래 세포주인 A2780, 투명세포암종 유래 세포주인 SKOV3, 자궁내막양 선암종 유래 세포주인 C13 과 장액성 암종 유래 세포주인 KF 의 모든 난소암 세포주에 활발하게 반응한 반면, 혈액암 (Leukemia) 세포주인 백혈병 유래 Jurkat, 림프종 유래 Ramos, 골수종 유래 MC/Car 에는 모두 낮은 반응성을 보였다.
또한, 도 5b에 나타난 바와 같이, 항 KIAA1114 단일클론항체 (Kiatomab)는 이소타입 대조군 항체에 비하여 원발암 유래 대장암 세포주인 SW480 (종양 병기: Dukes' type B) 에 비하여 동일 환자의 임파절 전이 유래 세포주인 SW620 (종양 병기: Dukes' type C) 에 더 높은 반응성을 보였다. 담관암 세포주의 경우, 일반적 담관암 세포주 JCK 에는 반응성을 보이지 않은 반면, 전이성 성향이 큰 육종성 담관암 세포주 SCK에는 강한 반응성을 보였다. 간암 세포주의 경우, 면역결핍쥐에서의 생체 내 종양 형성능이 강한 HuH7 세포주가 종양 형성능이 약한 HepG2 [Yang et al, 2008, Cancer Cell. 13(2):153-66] 에 비하여 KIAA1114 단백질을 더 높게 발현하였다.
따라서, KIAA1114 는 전이성 암 또는 악성 종양에서 특이적으로 과발현되며, 이는 TROPHININ 발현이 임상적 병기가 진행함에 따라 현저히 증가한다는 기존의 결과와 유사성을 나타낸다.
실시예 8. 항 KIAA1114 단일클론항체 및 상용화된 항 TROPHININ 단일클론항체의 암세포주와의 반응성 비교
본 발명의 항 KIAA1114 단일클론항체 및 상용화된 항 TROPHININ 단일클론항체의 암세포주와의 반응성을 비교하기 위하여, FACS 분석 방법을 통해 하기와 같은 실험을 수행하였다. 실험에 사용된 세포주로는 인간 간암(Hepatocellular Carcinoma) 세포주인 Hep3B, HuH7, PLC/PRF/5, 및 SNU475; 마우스 간암 세포주인 MIH2 와 Hepa-1c1c7 가 사용되었다.
구체적으로, 상기 실시예 3에서 얻은 항 KIAA1114 단일클론항체(Kiatomab), 상용화된 항 TROPHININ 항체(클론 3-11; IgM; cat# 80002, Santa Cruz Biotechnology, USA), 이소타입 대조군 항체(Normal Mouse IgG, cat# NI03, Oncogene, USA) 1㎍을 100㎕의 FACS 완충액에 희석한 후, 상기 간암세포주들(2.5×105 cell 사용)과 얼음 속에서 반응시켰다. 또한, 세포의 상태에 이상이 없음을 검증하고자, 기존의 보고들로부터 인간 간암 세포주에서의 발현정도가 알려진 CD133 마커에 대한 항체의 APC 접합체를 (cat#: 130-090-854) 양성대조군으로 사용하였고, 항-CD133 항체와 APC 접합체의 경우 제품의 날짜 시트에 명시된 대로 5㎕의 항체를 100㎕의 FACS 완충액에 희석하여 세포주들과 반응시켰다. 결합하지 않은 항체를 FACS 완충액으로 2회 씻어낸 후, 항 KIAA1114 단일클론항체(Kiatomab) 처리군의 경우 항-마우스 Ig-APC(cat#: 550826, BD pharmingen, USA) 이차 항체 0.5 ㎕; 상용화된 항 TROPHININ 항체(클론 3-11; IgM) 처리군의 경우 항-마우스 IgM-APC(클론 Ⅱ/41, cat# 17-5790-82, eBioscience, USA) 이차 항체 0.5 ㎕을 100㎕의 FACS 완충액에 희석하여 얼음 속에서 반응시키고, FACS 완충액으로 2회 씻어낸 후. 마지막으로 250㎕의 FACS 완충액으로 현탁한 다음 유세포분석기로 분석을 수행하였다 (도 6 참조).
도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 항 KIAA1114 단일클론항체 (Kiatomab)는 인간 간암 세포주 Hep3B, HuH7, 및 PLC/PRF/5 또는 마우스 간암 세포주 MIH2 및 Hepa-1c1c7 과 높게 반응하는 반면, 상용화된 항 TROPHININ 항체(클론 3-11)는 상기 모든 암세포주에서 낮은 반응성을 나타내었다. 항-CD133 항체는 인간 간암 세포주 Hep3B, HuH7, 및 PLC/PRF/5에 강하게 반응하여, 세포의 상태가 정상임을 나타내었다.
즉, 상용화된 항 TROPHININ 항체(클론 3-11)는 인간 KIAA1114 단백질의 아미노산 1319-1327에 해당하는 합성 펩티드를 항원 백신으로 사용하여 만든 단일클론항체임을 고려할 때, 유전자 백신에 의해 유도된 항 KIAA1114 단일클론항체(Kiatomab)가 펩티드 백신에 의해 유도된 상용화된 항 TROPHININ 항체(클론 3-11)보다 더 높은 친화력을 가지고 있다는 것을 나타내는 것이다. 이는 DNA 백신법에 의해 유도된 항체가 동일한 전체 IgG 반응을 생산하는 양의 단백질 백신을 투여하여 얻어진 항체에 비하여 1,000배 정도 높은 친화력(avidity)을 갖는다는 기존의 보고와도 일치하였다 [Boyle et al, 1997, PNAS. 94:14626-31].
실시예 9. 항 KIAA1114 단일클론항체의 생체 내 암 전이 억제능 평가
본 발명의 항 KIAA1114 단일클론항체가 생체 내에서 암의 전이에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
마우스 대장암 세포주 CT26-Her2/neu (인간 Her2/neu 수용체 과발현) 또는 CT26 (2×105 cells)를 마우스에 정맥 주사한 후, 암세포 투여 직후에 이소타입 대조군 항체 또는 항 KIAA1114 단일클론항체(Kiatomab)를 1㎍, 3㎍, 또는 10㎍으로 복강에 주사하고, 암세포 투여 후 2주째에 마우스의 폐에서 대장암 세포의 수를 측정하였다 (도 7 참조).
도 7에 나타난 바와 같이, KIAA1114을 과발현하는 CT26-Her2/neu (95% 발현) 을 주입한 폐 전이 모델의 경우, 본 발명의 항 KIAA1114 단일클론항체(Kiatomab) 10㎍ 를 주사한 마우스의 폐 조직에서 관찰된 암세포의 콜로니수는 이소타입 대조군 항체 10㎍ 를 주사한 마우스의 폐 조직에 비해 10배 이상 감소된 것을 확인하였다. 또한, KIAA1114을 상기 세포주와 비교해 낮은 정도로 발현하는 CT26 세포주 (56% 발현)를 주입한 동물 모델의 경우, 그 억제 정도가 상대적으로 약해짐을 보였다. 이는 본 발명의 항 KIAA1114 단일클론항체(Kiatomab)의 전이 억제 효과는 암세포의 KIAA1114 발현 정도와 비례한다는 것을 나타내었다.
따라서, 본 발명에 따른 항 KIAA1114 항체는 KIAA1114 과발현 암세포주에서 암세포 전이 억제능이 우수함을 알 수 있다.
실시예 10. 전이 억제능이 확인된 항 KIAA1114 단일클론항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열분석
실시예 9에서 생체 내 전이 억제능이 확인된 항 KIAA1114 단일클론항체의 경쇄 및 중쇄 가변 서열분석을 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
10-1. RNA의 분리
Invitrogen Biotechnology 사의 easy-spinTM Total RNA Extraction (cat# 17221) 키트를 사용하여 전체 RNA를 항 KIAA1114 단일클론항체(Kiatomab)를 생산하는 하이브리도마로부터 수득하였다. 하이브리도마 세포 5 X 106 개를 펠렛화한 후, 1 mL Lysis buffer 를 넣고 30초간 vortex 한 후, 5분간 실온에서 방치하였다. 다음으로, 클로로포름 200 μL 를 넣고 15초 동안 vortex 한 후, 실온에서 3분간 방치한 다음, 4℃에서 10분 동안 13,000 rpm 으로 원심분리 한 뒤, 상층액 400 μL 를 새 튜브에 옮겼다. 동량의 Binding buffer 를 넣어준 뒤 잘 혼합하여 실온에서 1 분 동안 방치한 뒤, 용액을 스핀 컬럼으로 옮기고, 2-mL 수집관 내에 놓고, 13,000 rpm에서 30초 동안 원심분리(speening)하였다. 컬럼을 700 μL Washing buffer A를 넣고 13,000 rpm에서 30초 동안 원심분리(speening)하여 세정한 후, 700 μL Washing buffer B를 넣고 세정을 1회 반복하였다. 빈 컬럼을 다시 2-mL 수집관 내에 넣고, 13,000 rpm에서 1분 동안 원심분리(speening)하여 건조한 후, 새로운 튜브로 옮기고, 50 μL 의 Elution buffer를 넣고 실온에서 1분 동안 방치한 뒤, 13,000 rpm에서 1분 동안 원심분리(speening)하여 용출시켰다.
10-2. 역전사효소 반응으로의 cDNA 합성 및 증폭
Qiagen 사의 QuantiTect Reverse Transcription (cat# 205311) 키트를 사용하여 상기에서 얻어진 RNA 로부터 cDNA를 합성하였다. 간략하게, 추출한 RNA 2㎍ 에 2 μL reverse transcriptase (RNase 억제제 함유), 2 μL RT primer mix (oligo-dT 및 랜덤 primer 혼합물), 8 μL RT buffer (Mg2+ 및 dNTP 함유) 를 첨가하여 전체가 40 μL 가 되도록 한 후, 42℃에서 15분, 95℃에서 3분간을 각각 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
합성한 cDNA 는 Amersham Biosciences 사에서 제공되는 Mouse ScFv module 에서 제공되는 경쇄 및 중쇄 프라이머 혼합물을 사용하여 각각 PCR 로 증폭시켰다. 간략하게, 합성한 cDNA 33 μL 에 경쇄 또는 중쇄 프라이머 혼합물 2μL, 증류수 4 μL, 및 i-MAXTM DNA polymerase (cat# 25261, Invitrogen Biotechnology 사) 1 μL 를 넣어, 40 μL 반응액을 조제한 후, 95℃에서 5분간 변성시킨 후 증폭하였다. PCR cycle 조건은 94℃ 1분, 56℃ 2분, 및 72℃ 2분으로 30 cycles 을 수행하고, 72℃에서 10분간 반응시켰다. PCR 산물은 1.5% agarose, ethidium bromide 혼합젤에서 전기영동을 하여 확인하였고, Invitrogen Biotechnology 사의 MEGA-spinTM Agarose gel extraction (cat# 17183) 키트를 사용하여 분리 정제하였다.
10-3. 재조합 벡터 제조
상기 PCR 산물을 pGEM-T easy vector (Promega 사) 및 T4 DNA ligase를 사용하여 ligation 하고, XL-1 Blue competent cell (cat# 200249, Stratagene) 에 transformation 한 후, 1M IPTG 40 μL 및 200 mg/mL X-gal 4 μL 가 포함된 LB 플레이트에 도말하여 37℃에서 12시간 배양하였다. 하얀색 콜로니를 선별하여 ampicillin 이 함유되어 있는 LB 액체배지에서 증식시킨 뒤, Invitrogen Biotechnology 사의 DNA-spinTM Plasmid DNA Purification (cat# 17093) 키트를 사용하여 재조합 플라스미드를 분리 정제하였다. 얻어진 플라스미드의 염기 서열 결정은 코스모진텍사(대한민국)에 의뢰하였다.
항-KIAA1114 항체 (Kiatomab)의 중쇄 가변영역 아미노산 서열은 서열번호 6 으로 나타내었고, 경쇄 가변영역 아미노산 서열은 서열번호 7 로 나타내었다.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.
제제예 1 : 산제의 제조
항 KIAA1114 항체 0.1 g
유당 1.5 g
탈크 0.5 g
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
제제예 2 : 정제의 제조
항 KIAA1114 항체 0.1 g
락토오스 7.9 g
결정성 셀룰로오스 1.5 g
마그네슘 스테아레이트 0.5 g
상기의 성분들을 혼합한 후 직타법(direct tableting method)으로 정제를 제조하였다.
제제예 3 : 캡슐제의 제조
항 KIAA1114 항체 0.1 g
옥수수전분 5 g
카복시 셀룰로오스 4.9 g
상기의 성분들을 혼합하여 분말을 제조한 후, 상기 분말을 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라 경질 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
제제예 4 : 주사제의 제조
항 KIAA1114 항체 0.02~0.2 g
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
안정화제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.
제제예 5 : 액제의 제조
항 KIAA1114 항체 0.1 g
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고, 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합하였다. 그 다음 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 항 KIAA1114 항체는 KIAA1114 단백질의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하며, 다양한 암세포주와 특이적으로 반응하고, KIAA1114 과발현 암세포주를 이용한 전이암 동물 모델에서의 생체 내 암세포 전이 억제능이 우수한 특징이 있으므로 KIAA1114 과발현에 의해 야기되는 암, 특히 전이성 암의 예방 또는 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.
<110> GENEXINE CO., LTD.
<120> Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer
caused by overexpressing K I A A 1 1 1 4 comprising anti K I A A
1 1 1 4 antibody
<130> PCT01585
<150> KR 10-2011-0124375
<151> 2011-11-25
<160> 7
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1431
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Asp Arg Arg Asn Asp Tyr Gly Tyr Arg Val Pro Leu Phe Gln Gly
1 5 10 15
Pro Leu Pro Pro Pro Gly Ser Leu Gly Leu Pro Phe Pro Pro Asp Ile
20 25 30
Gln Thr Glu Thr Thr Glu Glu Asp Ser Val Leu Leu Met His Thr Leu
35 40 45
Leu Ala Ala Thr Lys Asp Ser Leu Ala Met Asp Pro Pro Val Val Asn
50 55 60
Arg Pro Lys Lys Ser Lys Thr Lys Lys Ala Pro Ile Lys Thr Ile Thr
65 70 75 80
Lys Ala Ala Pro Ala Ala Pro Pro Val Pro Ala Ala Asn Glu Ile Ala
85 90 95
Thr Asn Lys Pro Lys Ile Thr Trp Gln Ala Leu Asn Leu Pro Val Ile
100 105 110
Thr Gln Ile Ser Gln Ala Leu Pro Thr Thr Glu Val Thr Asn Thr Gln
115 120 125
Ala Ser Ser Val Thr Ala Gln Pro Lys Lys Ala Asn Lys Met Lys Arg
130 135 140
Val Thr Ala Lys Ala Ala Gln Gly Ser Gln Ser Pro Thr Gly His Glu
145 150 155 160
Gly Gly Thr Ile Gln Leu Lys Ser Pro Leu Gln Val Leu Lys Leu Pro
165 170 175
Val Ile Ser Gln Asn Ile His Ala Pro Ile Ala Asn Glu Ser Ala Ser
180 185 190
Ser Gln Ala Leu Ile Thr Ser Ile Lys Pro Lys Lys Ala Ser Lys Ala
195 200 205
Lys Lys Ala Ala Asn Lys Ala Ile Ala Ser Ala Thr Glu Val Ser Leu
210 215 220
Ala Ala Thr Ala Thr His Thr Ala Thr Thr Gln Gly Gln Ile Thr Asn
225 230 235 240
Glu Thr Ala Ser Ile His Thr Thr Ala Ala Ser Ile Arg Thr Lys Lys
245 250 255
Ala Ser Lys Ala Arg Lys Thr Ile Ala Lys Val Ile Asn Thr Asp Thr
260 265 270
Glu His Ile Glu Ala Leu Asn Val Thr Asp Ala Ala Thr Arg Gln Ile
275 280 285
Glu Ala Ser Val Val Ala Ile Arg Pro Lys Lys Ser Lys Gly Lys Lys
290 295 300
Ala Ala Ser Arg Gly Pro Asn Ser Val Ser Glu Ile Ser Glu Ala Pro
305 310 315 320
Leu Ala Thr Gln Ile Val Thr Asn Gln Ala Leu Ala Ala Thr Leu Arg
325 330 335
Val Lys Arg Gly Ser Arg Ala Arg Lys Ala Ala Thr Lys Ala Arg Ala
340 345 350
Thr Glu Ser Gln Thr Pro Asn Ala Asp Gln Gly Ala Gln Ala Lys Ile
355 360 365
Ala Ser Ala Gln Thr Asn Val Ser Ala Leu Glu Thr Gln Val Ala Ala
370 375 380
Ala Val Gln Ala Leu Ala Asp Asp Tyr Leu Ala Gln Leu Ser Leu Glu
385 390 395 400
Pro Thr Thr Arg Thr Arg Gly Lys Arg Asn Arg Lys Ser Lys His Leu
405 410 415
Asn Gly Asp Glu Arg Ser Gly Ser Asn Tyr Arg Arg Ile Pro Trp Gly
420 425 430
Arg Arg Pro Ala Pro Pro Arg Asp Val Ala Ile Leu Gln Glu Arg Ala
435 440 445
Asn Lys Leu Val Lys Tyr Leu Leu Val Lys Asp Gln Thr Lys Ile Pro
450 455 460
Ile Lys Arg Ser Asp Met Leu Arg Asp Val Ile Gln Glu Tyr Asp Glu
465 470 475 480
Tyr Phe Pro Glu Ile Ile Glu Arg Ala Ser Tyr Thr Leu Glu Lys Met
485 490 495
Phe Arg Val Asn Leu Lys Glu Ile Asp Lys Gln Ser Ser Leu Tyr Ile
500 505 510
Leu Ile Ser Thr Gln Glu Ser Ser Ala Gly Ile Leu Gly Thr Thr Lys
515 520 525
Asp Thr Pro Lys Leu Gly Leu Leu Met Val Ile Leu Ser Val Ile Phe
530 535 540
Met Asn Gly Asn Lys Ala Ser Glu Ala Val Ile Trp Glu Val Leu Arg
545 550 555 560
Lys Leu Gly Leu Arg Pro Gly Val Arg His Ser Leu Phe Gly Glu Val
565 570 575
Arg Lys Leu Ile Thr Asp Glu Phe Val Lys Gln Lys Tyr Leu Glu Tyr
580 585 590
Lys Arg Val Pro Asn Ser Arg Pro Pro Glu Tyr Glu Phe Phe Trp Gly
595 600 605
Leu Arg Ser Tyr His Glu Thr Ser Lys Met Lys Val Leu Lys Phe Ala
610 615 620
Cys Arg Val Gln Lys Lys Asp Pro Lys Asp Trp Ala Val Gln Tyr Arg
625 630 635 640
Glu Ala Val Glu Met Glu Val Gln Ala Ala Ala Val Ala Val Ala Glu
645 650 655
Ala Glu Ala Arg Ala Glu Ala Arg Ala Gln Met Gly Ile Gly Glu Glu
660 665 670
Ala Val Ala Gly Pro Trp Asn Trp Asp Asp Met Asp Ile Asp Cys Leu
675 680 685
Thr Arg Glu Glu Leu Gly Asp Asp Ala Gln Ala Trp Ser Arg Phe Ser
690 695 700
Phe Glu Ile Glu Ala Arg Ala Gln Glu Asn Ala Asp Ala Ser Thr Asn
705 710 715 720
Val Asn Phe Ser Arg Gly Ala Ser Thr Arg Ala Gly Phe Ser Asp Gly
725 730 735
Ala Ser Ile Ser Phe Asn Gly Ala Pro Ser Ser Ser Gly Gly Phe Ser
740 745 750
Gly Gly Pro Gly Ile Thr Phe Gly Val Ala Pro Ser Thr Ser Ala Ser
755 760 765
Phe Ser Asn Thr Ala Ser Ile Ser Phe Gly Gly Thr Leu Ser Thr Ser
770 775 780
Ser Ser Phe Ser Ser Ala Ala Ser Ile Ser Phe Gly Cys Ala His Ser
785 790 795 800
Thr Ser Thr Ser Phe Ser Ser Glu Ala Ser Ile Ser Phe Gly Gly Met
805 810 815
Pro Cys Thr Ser Ala Ser Phe Ser Gly Gly Val Ser Ser Ser Phe Ser
820 825 830
Gly Pro Leu Ser Thr Ser Ala Thr Phe Ser Gly Gly Ala Ser Ser Gly
835 840 845
Phe Gly Gly Thr Leu Ser Thr Thr Ala Gly Phe Ser Gly Val Leu Ser
850 855 860
Thr Ser Thr Ser Phe Gly Ser Ala Pro Thr Thr Ser Thr Val Phe Ser
865 870 875 880
Ser Ala Leu Ser Thr Ser Thr Gly Phe Gly Gly Ile Leu Ser Thr Ser
885 890 895
Val Cys Phe Gly Gly Ser Pro Ser Ser Ser Gly Ser Phe Gly Gly Thr
900 905 910
Leu Ser Thr Ser Ile Cys Phe Gly Gly Ser Pro Cys Thr Ser Thr Gly
915 920 925
Phe Gly Gly Thr Leu Ser Thr Ser Val Ser Phe Gly Gly Ser Ser Ser
930 935 940
Thr Ser Ala Asn Phe Gly Gly Thr Leu Ser Thr Ser Ile Cys Phe Asp
945 950 955 960
Gly Ser Pro Ser Thr Gly Ala Gly Phe Gly Gly Ala Leu Asn Thr Ser
965 970 975
Ala Ser Phe Gly Ser Val Leu Asn Thr Ser Thr Gly Phe Gly Gly Ala
980 985 990
Met Ser Thr Ser Ala Asp Phe Gly Gly Thr Leu Ser Thr Ser Val Cys
995 1000 1005
Phe Gly Gly Ser Pro Gly Thr Ser Val Ser Phe Gly Ser Ala Leu Asn
1010 1015 1020
Thr Asn Ala Gly Tyr Gly Gly Ala Val Ser Thr Asn Thr Asp Phe Gly
1025 1030 1035 1040
Gly Thr Leu Ser Thr Ser Val Cys Phe Gly Gly Ser Pro Ser Thr Ser
1045 1050 1055
Ala Gly Phe Gly Gly Ala Leu Asn Thr Asn Ala Ser Phe Gly Cys Ala
1060 1065 1070
Val Ser Thr Ser Ala Ser Phe Ser Gly Ala Val Ser Thr Ser Ala Cys
1075 1080 1085
Phe Ser Gly Ala Pro Ile Thr Asn Pro Gly Phe Gly Gly Ala Phe Ser
1090 1095 1100
Thr Ser Ala Gly Phe Gly Gly Ala Leu Ser Thr Ala Ala Asp Phe Gly
1105 1110 1115 1120
Gly Thr Pro Ser Asn Ser Ile Gly Phe Gly Ala Ala Pro Ser Thr Ser
1125 1130 1135
Val Ser Phe Gly Gly Ala His Gly Thr Ser Leu Cys Phe Gly Gly Ala
1140 1145 1150
Pro Ser Thr Ser Leu Cys Phe Gly Ser Ala Ser Asn Thr Asn Leu Cys
1155 1160 1165
Phe Gly Gly Pro Pro Ser Thr Ser Ala Cys Phe Ser Gly Ala Thr Ser
1170 1175 1180
Pro Ser Phe Cys Asp Gly Pro Ser Thr Ser Thr Gly Phe Ser Phe Gly
1185 1190 1195 1200
Asn Gly Leu Ser Thr Asn Ala Gly Phe Gly Gly Gly Leu Asn Thr Ser
1205 1210 1215
Ala Gly Phe Gly Gly Gly Leu Gly Thr Ser Ala Gly Phe Ser Gly Gly
1220 1225 1230
Leu Ser Thr Ser Ser Gly Phe Asp Gly Gly Leu Gly Thr Ser Ala Gly
1235 1240 1245
Phe Gly Gly Gly Pro Gly Thr Ser Thr Gly Phe Gly Gly Gly Leu Gly
1250 1255 1260
Thr Ser Ala Gly Phe Ser Gly Gly Leu Gly Thr Ser Ala Gly Phe Gly
1265 1270 1275 1280
Gly Gly Leu Val Thr Ser Asp Gly Phe Gly Gly Gly Leu Gly Thr Asn
1285 1290 1295
Ala Ser Phe Gly Ser Thr Leu Gly Thr Ser Ala Gly Phe Ser Gly Gly
1300 1305 1310
Leu Ser Thr Ser Asp Gly Phe Gly Ser Arg Pro Asn Ala Ser Phe Asp
1315 1320 1325
Arg Gly Leu Ser Thr Ile Ile Gly Phe Gly Ser Gly Ser Asn Thr Ser
1330 1335 1340
Thr Gly Phe Thr Gly Glu Pro Ser Thr Ser Thr Gly Phe Ser Ser Gly
1345 1350 1355 1360
Pro Ser Ser Ile Val Gly Phe Ser Gly Gly Pro Ser Thr Gly Val Gly
1365 1370 1375
Phe Cys Ser Gly Pro Ser Thr Ser Gly Phe Ser Gly Gly Pro Ser Thr
1380 1385 1390
Gly Ala Gly Phe Gly Gly Gly Pro Asn Thr Gly Ala Gly Phe Gly Gly
1395 1400 1405
Gly Pro Ser Thr Ser Ala Gly Phe Gly Ser Gly Ala Ala Ser Leu Gly
1410 1415 1420
Ala Cys Gly Phe Ser Tyr Gly
1425 1430
<210> 2
<211> 4665
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
ataggctcag acacaaggag aggcttggag agagcagacg ccttctggat tcaagaagac 60
gaggcccatt cccctcaggc tcacctgtta ctcggcctcc cagaaagatg gataggagaa 120
atgactacgg atatagggtg cctctatttc agggccctct gcctcccccg gggagcctgg 180
ggcttccctt ccctccagat atacagactg agaccacaga agaggacagt gtcctgctga 240
tgcataccct gttggcggca accaaggact ccctggccat ggacccacca gttgtcaacc 300
ggcctaagaa aagcaagacc aagaaggccc ctataaagac tattactaag gctgcacctg 360
ctgcccctcc agtcccagct gccaatgaga ttgccaccaa caagcccaaa ataacttggc 420
aggctttaaa cctgccagtc attacccaga tcagccaggc tttacctacc actgaggtaa 480
ccaatactca ggcttcttca gtcactgctc agcctaagaa agccaacaag atgaagagag 540
ttactgccaa ggcagcccaa ggctcccaat ccccaactgg ccatgagggt ggcactatac 600
agctgaagtc acccttgcag gtcctaaagc taccagtcat ctcacagaat attcacgctc 660
caattgccaa tgagtcagcc agttcccaag ccttgataac ctctatcaag cctaagaaag 720
cttccaaggc taagaaggct gcaaataagg ccatagctag tgccaccgag gtctcgctgg 780
ctgcaactgc cacccataca gctaccaccc aaggccaaat taccaatgag acagccagta 840
tccacaccac agcagcctcc atccgaacca agaaagcctc caaagccagg aagacaattg 900
ctaaggtcat aaatactgac actgagcata tagaggctct aaatgtcact gacgcagcta 960
ccaggcagat tgaggcctca gtagtggcta tcaggcccaa aaaatccaag ggcaagaagg 1020
ctgccagcag gggcccaaat tctgtctctg agatctctga ggccccactt gccactcaga 1080
tagtcacaaa ccaagccctg gcagccaccc tgcgggtcaa gagagggtct agggctcgga 1140
aggctgccac taaggctcgg gcaactgaaa gccagactcc aaatgctgac caaggggccc 1200
aggccaagat agcctctgct cagaccaacg taagtgccct tgagactcag gttgctgctg 1260
ctgtccaggc cctggcagat gactatctgg ctcagttgag cctggagccc acaaccagga 1320
cccggggcaa aagaaaccga aagtccaagc atctgaatgg ggatgagaga agtggcagta 1380
attacaggcg gatcccatgg ggccggaggc ctgcaccacc gcgagatgtg gccattttac 1440
aagaaagggc taataagttg gtgaaatacc tgttggttaa ggaccagaca aagatcccca 1500
tcaaacgctc agacatgctg agggatgtca tccaagaata tgatgaatat ttcccagaaa 1560
tcattgaacg agcaagctac actctggaga agatgtttcg agtcaatctg aaagaaattg 1620
ataagcaaag tagcttgtat attctcatca gcactcagga atcctctgca ggcatactgg 1680
gaacgaccaa ggacacaccc aagctgggtc tcctcatggt gattctgagt gtcattttta 1740
tgaatggcaa caaggccagt gaggctgtca tctgggaggt gctgcgcaag ttggggctgc 1800
gccctggggt gaggcattca ctctttgggg aagtgaggaa gctcatcaca gacgagtttg 1860
tgaagcagaa gtacctggag tacaagaggg tccctaacag cagaccacct gaatatgagt 1920
tcttctgggg cttgcgctcc taccacgaga ctagcaagat gaaagtcctc aagtttgcat 1980
gcagggtgca gaagaaagac cccaaggact gggctgtgca gtaccgcgag gcagtggaga 2040
tggaagtcca agctgcagct gtggctgtgg ctgaggctga agccagggct gaggcaagag 2100
cccaaatggg gattggagag gaagctgtgg ctgggccctg gaattgggat gacatggata 2160
tcgactgcct aacaagggaa gagttaggcg atgatgctca ggcctggagc agattttcat 2220
ttgaaattga ggccagagcc caagaaaatg cagatgccag caccaacgtc aacttcagca 2280
gaggagctag taccagggct ggcttcagcg atggtgctag tattagcttc aatggtgcac 2340
ccagctccag tggtggcttc agtggtggac ctggcattac ctttggtgtt gcacccagca 2400
ccagtgccag cttcagcaat acagccagca ttagctttgg tggtacactg agcactagct 2460
ccagcttcag cagcgcagcc agcattagct ttggttgtgc acacagcacc agcactagtt 2520
tcagcagtga agccagcatt agctttggtg gcatgccttg taccagtgcc agctttagtg 2580
gtggagtcag ctctagtttt agtggcccac tcagcaccag tgccactttc agtggtggag 2640
ccagctctgg ctttggaggc acactcagca ccacggctgg ctttagtggt gtactcagca 2700
ctagcaccag ctttggcagt gcacccacaa cgagcacagt cttcagtagt gcgcttagca 2760
ccagcactgg ctttggaggc atactcagca ccagtgtctg ttttggtggc tctcccagct 2820
ccagtggtag ctttggtggt acactcagta ccagtatctg cttcggtggc tctccctgca 2880
ccagcactgg ctttggaggc acacttagca ccagtgtctc ctttggtggc tcttccagca 2940
ccagtgccaa ttttggtggt acactaagta ccagcatctg ctttgatggc tctcccagca 3000
ctggtgctgg ctttggtggt gctctcaaca ccagtgccag ctttggcagt gtgctcaaca 3060
ccagtactgg ttttggtggt gctatgagca ccagtgctga ctttggcggt acactaagca 3120
ccagtgtctg ctttggtggc tctcctggca ccagtgtcag ctttggcagt gcactcaaca 3180
ccaatgctgg ttatggtggt gctgtcagca ccaacactga ctttggtggt acactaagca 3240
ccagcgtctg ttttggtggc tctcccagca ccagtgctgg ctttggtggt gcactcaaca 3300
ccaatgccag ctttggctgt gccgtcagca ccagtgccag cttcagtggt gctgtcagca 3360
ccagtgcttg cttcagtggt gcaccaatca ccaaccctgg ctttggcggt gcatttagca 3420
ccagtgctgg cttcggtggg gcacttagta ccgctgctga cttcggtggt actcccagca 3480
acagcattgg ctttggtgct gctcccagca ccagtgtcag ctttggtggt gctcatggca 3540
ccagcctctg ttttggtgga gctcccagca ccagcctctg ctttggcagt gcatctaata 3600
ctaacctatg ctttggtggc cctcctagca ccagtgcctg ctttagtggt gctaccagcc 3660
ctagtttttg tgatggaccc agcaccagta ccggtttcag ctttggcaat gggttaagca 3720
ccaatgctgg atttggtggt ggactgaaca ccagtgctgg ctttggtggt ggcctaggca 3780
ccagtgctgg cttcagtggt ggcctaagca caagttctgg ctttgatggt gggctaggta 3840
ccagcgctgg cttcggtgga ggaccaggca ccagcactgg ttttggtggt ggactgggca 3900
ccagtgctgg cttcagtggc ggactgggca ccagtgctgg ctttggtggt ggactggtca 3960
ctagtgatgg ctttggtggt ggactgggca ccaatgctag tttcggcagc acacttggca 4020
ccagtgctgg ctttagtggt ggcctcagca ccagcgatgg ctttggcagt aggcctaatg 4080
ccagcttcga cagaggactg agtaccatca ttggctttgg cagtggttcc aacaccagca 4140
ctggctttac tggcgaaccc agcaccagca cgggcttcag tagtggaccc agttctattg 4200
ttggcttcag cggtggacca agcactggtg ttggcttctg cagtggacca agcaccagtg 4260
gcttcagcgg tggaccgagc acaggagctg gcttcggcgg tggaccaaac actggtgctg 4320
gctttggtgg tggaccgagc accagtgctg gctttggcag tggagccgcc agtcttggtg 4380
cctgtggctt ctcgtatggc tagtgaggtt tcagatttat tccccatgtt tacagatacc 4440
gctaataaat tgcagtagtc cttcccatgg agccaaagta catccttgga atctttgtcc 4500
acacagcagt caaggcagtt atggccaatc agctgagggt gtcatgtgat ggaaaaatct 4560
gtttgctgtt cctgctttat tgtttgcttt ctgtgtgctg tcatattttg gtatcagagt 4620
tacattaaat ttgcaaaatg aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 4665
<210> 3
<211> 1116
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Extracellular domain gene of KIAA1114
<400> 3
gcggccgcaa tggatagaag gaatgattac ggatacagag tgcctctgtt tcagggacct 60
ctgcctcctc ccggcagcct gggactgccc tttcctcccg atattcagac agaaacaacc 120
gaggaagaca gcgtgctgct gatgcacacc ctgctcgctg ccaccaaaga cagcctggcc 180
atggatcctc ccgtggtgaa cagacccaag aaaagcaaaa ccaagaaagc tcccattaag 240
accattacca aggctgctcc tgccgctcct cccgtgcccg ctgccaatga aattgccacc 300
aacaagccca agatcacctg gcaggctctg aatctgcctg tgatcacaca gatcagccag 360
gccctgccta caaccgaagt gaccaacacc caggccagca gcgtgaccgc tcagcccaag 420
aaagccaaca agatgaagag agtgacagcc aaagctgctc agggcagcca gagccccaca 480
ggccacgaag gaggcaccat tcagctgaaa agccctctgc aggtgctgaa actgcctgtg 540
attagccaga atatccacgc tcccattgcc aatgagagcg cctctagcca ggccctgatc 600
accagcatca aacccaagaa agccagcaaa gccaagaaag ctgccaacaa agccattgcc 660
agcgccaccg aagtgagcct ggctgccaca gccacacaca cagccaccac acagggacag 720
atcaccaacg agaccgctag catccacacc acagctgcca gcatcagaac caagaaagcc 780
agcaaagcca ggaagaccat tgccaaggtg attaataccg ataccgaaca cattgaagct 840
ctgaatgtga ccgatgctgc caccagacag attgaagcca gcgtggtggc catcagaccc 900
aagaaaagca aaggcaagaa agctgctagc agaggaccca acagcgtgag cgagatcagc 960
gaagctcctc tggctaccca gattgtgacc aatcaggctc tggctgccac actgagagtg 1020
aagagaggaa gcagagccag aaaggctgcc accaaagcca gagccacaga gagccagaca 1080
cctaatgctg accagggagc tcaggccagg cgcgcc 1116
<210> 4
<211> 901
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tpa-MCS-GS linker-ILZ-mCD40Lecd nucleotide
<400> 4
ggtaccgcca ccatggatgc tatgaaacgg ggcctgtgct gcgtgctgct cctgtgcggc 60
gctgtgtttg tgagccctag cgctgcggcc gcacgatcga tgatatcgct agctaggcgc 120
gccggcagcg gcagcggcag cggcagcggc agccgatcga gaatgaagca gatcgaggac 180
aaaattgagg aaatcctgtc caagatttac cacatcgaga acgagatcgc ccggattaag 240
aaactcattg gcgagaggag acgcgccaag gtggaggagg aggtgaacct gcatgaggac 300
ttcgtgttca tcaagaagct gaagaggtgc aacaagggcg agggcagcct gagcctgctg 360
aactgcgagg agatgaggag gcagttcgag gacctggtga aggacatcac cctgaacaag 420
gaggagaaga aggagaacag cttcgagatg cagaggggcg acgaggaccc ccagatcgcc 480
gcccatgtgg tgagcgaggc caacagcaac gccgccagcg tgctgcagtg ggccaagaag 540
ggctactaca ccatgaagag caacctggtg atgctggaga acggcaagca gctgaccgtg 600
aagagggagg gcctgtacta cgtgtacacc caggtgacct tctgcagcaa cagggagccc 660
agcagccaga ggcccttcat cgtgggcctg tggctgaagc ccagcagcgg cagcgagagg 720
atcctgctga aggccgccaa cacccatagc agcagccagc tgtgcgagca gcagagcgtg 780
catctgggcg gcgtgttcga gctgcaggcc ggcgccagcg tgttcgtgaa cgtgaccgag 840
gccagccagg tgatccatag ggtgggcttc agcagcttcg gcctgctgaa gctgctctag 900
a 901
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Epitope sequence of anti-KIAA1114 monoclonal antibody
<400> 5
Ile Lys Pro Lys Lys Ala Ser Lys Ala Lys Lys Ala Ala Asn Lys
1 5 10 15
<210> 6
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy chain variable region sequence of anti-KIAA1114 monoclonal
antibody
<400> 6
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Lys Arg Gln Leu Gly Leu Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Light chain variable region sequence of anti-KIAA1114 monoclonal
antibody
<400> 7
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Ile Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala
115

Claims (9)

  1. 항 KIAA1114 항체를 유효성분으로 함유하는, KIAA1114 과발현에 의해 야기되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 인간 KIAA1114 단백질을 항원으로 하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 3의 염기서열에 의해 암호화되는 KIAA1114 단백질의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 인간 KIAA1114 단백질의 200 내지 214번째 아미노산 서열(서열번호 5)에 포함되는 에피토프와 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 다클론항체 또는 단일클론항체인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 KIAA1114 과발현에 의해 야기되는 암은 폐암, 위암, 간암, 골암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 피부암, 두경부암, 피부 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 대장암, 결장암, 유방암, 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 후두암, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 유년기의 고상 종양, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신장 골반 암종, 척수축 종양, 신경교종 및 뇌하수체 아데노마로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 KIAA1114 과발현에 의해 야기되는 암은 전이성 암인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 환약, 캡슐, 과립, 정제, 수용액, 현탁액 또는 유탁액으로 제형화되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
PCT/KR2012/009843 2011-11-25 2012-11-20 항 ｋｉａａ１１１４ 항체를 유효성분으로 함유하는 ｋｉａａ１１１４ 과발현에 의해 야기되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 WO2013077618A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2011-0124375 2011-11-25
KR1020110124375A KR20130058390A (ko) 2011-11-25 2011-11-25 항 ｋｉａａ１１１４ 항체를 유효성분으로 함유하는 ｋｉａａ１１１４ 과발현에 의해 야기되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013077618A1 true WO2013077618A1 (ko) 2013-05-30

Family

ID=48470008

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2012/009843 WO2013077618A1 (ko) 2011-11-25 2012-11-20 항 ｋｉａａ１１１４ 항체를 유효성분으로 함유하는 ｋｉａａ１１１４ 과발현에 의해 야기되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20130058390A (ko)
WO (1) WO2013077618A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109306010A (zh) * 2017-07-26 2019-02-05 石家庄以岭药业股份有限公司 表皮生长因子受体抗体及其用途
CN113480646A (zh) * 2021-07-01 2021-10-08 中国科学院生物物理研究所 特异性结合h1.4移码突变蛋白的单克隆抗体制备及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRAD STONE ET AL., GENE, vol. 267, 2001, pages 173 - 182 *
DAITA NADANO ET AL., BIOLOGY OF REPRODUCTION, vol. 66, 2002, pages 313 - 321 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109306010A (zh) * 2017-07-26 2019-02-05 石家庄以岭药业股份有限公司 表皮生长因子受体抗体及其用途
CN109306010B (zh) * 2017-07-26 2022-07-19 石家庄以岭药业股份有限公司 表皮生长因子受体抗体及其用途
CN113480646A (zh) * 2021-07-01 2021-10-08 中国科学院生物物理研究所 特异性结合h1.4移码突变蛋白的单克隆抗体制备及其应用
CN113480646B (zh) * 2021-07-01 2022-03-15 中国科学院生物物理研究所 特异性结合h1.4移码突变蛋白的单克隆抗体制备及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20130058390A (ko) 2013-06-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018194381A1 (ko) Lrig-1 단백질에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도
WO2015005632A1 (ko) Dll4와 vegf에 특이적으로 결합하는 신규 이중표적 단백질 및 이의 용도
WO2019107812A1 (ko) 세포의 세포질에 침투하여 세포내 활성화된 ras를 억제하는 항체 및 이의 용도
WO2016137108A1 (en) Novel antibody binding to tfpi and composition comprising the same
WO2014090053A1 (zh) 拮抗抑制血管内皮细胞生长因子与其受体结合的单克隆抗体及其编码序列与用途
WO2017023138A1 (ko) 키메라 항원 수용체 및 키메라 항원 수용체가 발현된 t 세포
WO2021162521A1 (ko) 외부에서 도입된 세포 신호 조절 인자를 과발현하는 면역 세포 및 이들의 용도
WO2014077648A1 (ko) 인간 및 마우스 ｌ１ｃａｍ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2016013870A1 (ko) 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체를 세포막을 투과하여 세포질에 위치시키는 방법 및 그의 이용
WO2022039490A1 (en) Anti-b7-h4/anti-4-1bb bispecific antibodies and use thereof
WO2021071319A1 (ko) 다중 특이적 융합 단백질 및 이의 용도
WO2017204606A1 (ko) 세포질 침투 항체 및 이의 용도
WO2018026248A1 (ko) 프로그램화된 세포 사멸 단백질(pd-1)에 대한 신규 항체 및 이의 용도
WO2023277361A1 (ko) 메소텔린 특이적 항체 및 이의 용도
WO2020080853A1 (ko) Lrig-1 단백질에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도
WO2010047509A9 (ko) 친화도와 안정성이 향상된 항 ｄｒ5 항체, 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물
AU2020320233A1 (en) Anti-HER2/anti-4-1BB bispecific antibody and use thereof
WO2013077618A1 (ko) 항 ｋｉａａ１１１４ 항체를 유효성분으로 함유하는 ｋｉａａ１１１４ 과발현에 의해 야기되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2021101346A1 (en) Anti-ror1/anti-4-1bb bispecific antibodies and uses thereof
WO2019045477A1 (ko) 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 피부질환 예방 및 치료용 조성물
WO2019132579A2 (ko) 세포질 침투 항체에 융합된 rna 분해효소를 포함하는 면역독소
WO2022035201A1 (ko) Il-12 및 항-fap 항체를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
WO2018026249A1 (ko) 프로그램화된 세포 사멸 단백질 리간드-1 (pd-l1)에 대한 항체 및 이의 용도
WO2021015419A1 (ko) 인산화된 베타-카테닌에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2021006714A1 (ko) 면역체크포인트 억제제 저항성 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12852332

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 12852332

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1