CN113456798B - 新型冠状病毒SARS-CoV-2 NSP13基因的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新型冠状病毒SARS‑CoV‑2NSP13基因的用途，将SARS‑CoV‑2NSP13蛋白制备成用于抑制乙肝病毒(HBV)复制的产品，或将SARS‑CoV‑2NSP13基因制备成允许表达SARS‑CoV‑2NSP13蛋白的产品，譬如重组质粒、重组蛋白和mRNA，通过不同方式向真核细胞中引入SARS‑CoV‑2NSP13蛋白都可以显著性地抑制HBV复制，具体表现在抑制HBV的转录和翻译。本发明寻找到了新的抑制HBV复制的蛋白，其能够应用于制备治疗乙肝患者疾病的产品，丰富了抗乙肝病毒药物的类型，为开发新的抗乙肝病毒药物提出了新的思路，具有较好的开发及应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术研究领域，具体涉及到新型冠状病毒 SARS-CoV-2NSP13基因的用途。
背景技术
乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)是一种嗜肝性DNA病毒，HBV 感染可导致慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)、肝硬化(liver cirrhosis,LC)以及肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)。2015年，世界卫生组织报道全球约有20亿人曾感染过HBV，其中约2.5亿患者最终转变为以病毒表面抗原阳性为标志的慢性感染者，有约88万人死于HBV感染引发的肝硬化、肝细胞癌及各种并发症(WHO,2018)。尽管疫苗能有效预防HBV感染，但是对全球约2.5亿慢性乙肝患者没有帮助。HBV慢性感染能导致逐渐恶化的肝疾病如肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌，仍然是严重的公共健康问题。
HBV基因组为松弛环状的不完全双链DNA(RC-DNA)，全长 3.2kb。HBV成熟病毒颗粒在感染细胞后首先释放出基因组RC-DNA，然后在宿主的一些相关因子的修复下形成共价闭合环状DNA (covalently closed circular DNA,cccDNA)，cccDNA再作为转录模板转录出不同长度的HBV RNAs，3.5kb的RNA可以分为两种：3.5kb的前基因组RNA(pregenomic RNA,pgRNA)，pgRNA作为逆转录合成病毒负链DNA基因组的模板并翻译产生HBc蛋白和HBp蛋白；3.5kb 的pre-Core RNA，翻译表达HBeAg蛋白；2.4kb和2.1kb的pre-S和S mRNA，翻译成病毒的三种表面抗原L-HBsAg、M-HBsAg和S-HBsAg 蛋白；0.7kb的HBx mRNA，翻译表达HBx蛋白，这些都是HBV生活周期过程中重要的检测指标。
目前，关于HBV的治疗药物靶点有限，这些靶点包括靶向病毒自身组分的直接抗病毒药物，针对相关宿主因子的靶向宿主药物以及参与免疫调节的相关药物。
针对HBV生活周期的不同时期的不同靶标开发的相应的药物。比如常见的有：针对乙肝病毒进入细胞的抑制剂Myrcludex B，它是一种来源于HBV L蛋白preS1结构域的合成脂肽，可以与HBV preS1竞争性结合肝细胞表面的NTCP从而阻断HBV进入肝细胞，作为一种不可逆的NTCP受体阻断剂，它对于HBV和HDV共感染患者的治疗效果评估已经完成Ⅱ期临床试验。有影响cccDNA形成和转录的抑制剂，比如GS-5801作为赖氨酸脱甲基酶-5的抑制剂，调节cccDNA表观遗传修饰的药物，正在进行Ⅰ期临床试验。还有利用基因编辑技术 CRISPR/Cas9系统靶向HBV DNA，切割使其失活甚至消除cccDNA，但是不可避免的一个问题就是CRISPR/Cas9系统对患者的脱靶效应。除此之外，还有正在处于试验阶段的针对HBV的siRNA，有生物公司开发了相应含HBV特异性siRNA的药物，比如ALN-HBV02 (Vir-2218)，目前处于Ⅰ/Ⅱ期临床试验阶段。另外，还有一些针对HBV 核衣壳组装的调节剂，如苯丙烯酰胺类化合物可以干扰pgRNA的包装，并加速未成熟空核衣壳样颗粒的形成，或者杂芳基二氢嘧啶类化合物诱导异常的核衣壳组装和破坏完整的核衣壳等；HBV聚合酶相关抑制剂恩替卡韦、替诺福韦等以及正处于Ⅱ期临床试验阶段的HBV分泌抑制剂REP9AC，它能有效抑制HBV感染患者肝细胞释放HBsAg。
因为免疫细胞和细胞因子可以介导HBV感染的细胞裂解和非细胞裂解清除，所以促进细胞因子介导的先天免疫和重塑适应性免疫对病毒感染的治疗是非常重要的。目前美国食品和药品管理局(FDA)批准用于治疗乙型肝炎的药物干扰素α(IFNα)可以诱导细胞内抗病毒活性的干扰素刺激基因(IFN-stimμLated genes,ISGs)的表达，从而抑制病毒复制。但IFNα导致的副作用也限制了其应用。Toll样受体(TLR7， TLR8)和RNA解旋酶DExD/H-box解旋酶58(DDX58/RIG-I)的一系列激动剂正在研发当中，有一些药物已经进入Ⅰ/Ⅱ期临床试验阶段。适应性免疫应答的激活主要包括靶向受感染细胞表面分子的抗体、重新激活抗原特异性T细胞的检查点抑制剂以及使用基因修饰T细胞的细胞疗法和治疗性疫苗。
除此之外，由于高通量技术的快速发展和小分子化学库的不断扩大，一些研究人员也筛选出了多种HBV抑制剂。并且通过这种高通量筛选技术，实现“老药新用”策略，既缩短了药物开发时间，还能够节约药物研发成本。
尽管现在有很多针对乙肝病毒的药物，但目前慢性乙肝仍很难完全治愈，其中包括一些难以解决的科学问题：HBV cccDNA难以彻底清除，T细胞失调、B细胞反应不足等，所以需要加大针对非传统病毒靶标的新型治疗方法相关药物研发的投入。基于以上背景技术，寻找新的抑制HBV复制的药物，使得其能够应用于治愈乙型肝炎，仍然是一个有待深入研究的重大科学问题。
NSP13蛋白是严重急性呼吸综合征冠状病毒2(又称新型冠状病毒，简称SARS-CoV-2)的一个高度保守的非结构蛋白，具有DNA/RNA解旋酶、NTP酶以及RNA 5’三磷酸酶的活性。NSP13 蛋白由ZBD、stalk、1B、Rec1A和Rec2A五个结构域组成。其中ZBD 结构域具有结合DNA和RNA的功能，Rec1A和Rec2A是NSP13蛋白的DNA/RNA解旋酶和NTP酶活性的核心结构域。在病毒的生活周期中，NSP13蛋白发挥其解旋酶活性将双链RNA解开进行下一轮RNA 复制。目前对NSP13蛋白在宿主细胞的功能还不太清楚，所以对NSP13 蛋白功能的研究是非常重要的。
发明内容
申请人发现新型冠状病毒SARS-CoV-2基因组编码的一种高度保守的非结构蛋白NSP13蛋白可以抑制乙肝病毒的复制，并且这种抑制作用在不同HBV复制系统中都得到了验证。
基于以上发现，本发明提供如下技术方案：
第一方面，提供一种SARS-CoV-2 NSP13基因的用途，用于制备用于抑制HBV复制的产品，该产品包含SARS-CoV-2 NSP13基因的表达载体，以用来抑制乙肝病毒的复制，尤其是，该产品允许在真核细胞中表达NSP13蛋白，以用来抑制真核细胞中乙肝病毒的复制。SARS-CoV-2 NSP13基因序列如SEQ ID NO.1所示。进一步地，表达载体适合在细菌中复制扩增，以便于在生产SARS-CoV-2 NSP13蛋白。
第二方面，提供一种SARS-CoV-2 NSP13蛋白的用途，用于制备抑制HBV复制的产品，该产品允许进入真核细胞中，SARS-CoV-2 NSP13蛋白进入携带乙肝病毒的真核细胞后可以抑制乙肝病毒的复制。
第三方面，提供一种用于抑制HBV复制的产品，其包括：包含 NSP13基因且能正常表达SARS-CoV-2 NSP13蛋白的重组质粒或 mRNA，或包含上述重组质粒或mRNA的细胞。
优选地，重组质粒以pXJ40-HA为骨架载体，可以良好地表达 SARS-CoV-2 NSP13蛋白。
进一步地，包含重组质粒的细胞允许重组质粒在其子代细胞中保持恒定数量，且重组质粒在子代细胞中能正常表达SARS-CoV-2 NSP13 蛋白。
本发明具有如下优点及有益效果：
本发明寻找到了新的抑制HBV复制的蛋白，使得其能够应用于治疗乙肝患者疾病，丰富了抗乙肝病毒药物的类型。本发明为开发新的抗乙肝病毒药物方面提出了新的思路，具有较好的进一步开发及应用前景。
附图说明
图1展示了本发明实施例1中重组质粒的构建策略。
图2展示了实施例2的SDS-PAGE跑胶结果。
图3展示了实施例3肝细胞Huh7中转染HBV rcccDNA后 SARS-CoV-2 NSP13蛋白对HBV复制和转录水平的影响；其中，图3 (A)展示了SARS-CoV-2 NSP13蛋白对上清中HBeAg表达量的影响；图3(B)展示了SARS-CoV-2 NSP13蛋白对上清中HBsAg表达量的影响；图3(C)展示了SARS-CoV-2 NSP13蛋白对细胞中HBV total RNA 的影响；图3(D)展示了SARS-CoV-2NSP13蛋白对细胞中HBV pgRNA 的影响；图3(E)展示了SARS-CoV-2 NSP13蛋白对细胞培养上清中 HBV DNA拷贝数的影响；图3(F)展示了SARS-CoV-2 NSP13蛋白对细胞中HBV core蛋白表达的影响。
图4展示了实施例4中Huh7细胞中转染pEPI-EGFP-1.3HBV后 SARS-CoV-2 NSP13蛋白对HBV复制和转录水平的影响；其中，图4 (A)展示了SARS-CoV-2 NSP13蛋白对HBeAg表达量的影响；图4 (B)展示了NSP13对HBsAg表达量的影响；图4(C)展示了 SARS-CoV-2 NSP13蛋白对细胞中total RNA的影响；图4(D)展示了SARS-CoV-2 NSP13蛋白对细胞中HBV pgRNA的影响；图4(E) 展示了SARS-CoV-2 NSP13蛋白对细胞培养上清中HBV DNA的影响；图4(F)展示了SARS-CoV-2 NSP13蛋白对细胞中HBV core蛋白表达的影响。
图5展示了HBV持续感染的Huh7-NTCP细胞中SARS-CoV-2 NSP13蛋白对HBV复制和转录水平的影响；其中，图5(A)展示了 SARS-CoV-2 NSP13蛋白对HBeAg表达量的影响；图5(B)展示了 SARS-CoV-2 NSP13蛋白对HBsAg表达量的影响；图5(C)展示了 SARS-CoV-2NSP13蛋白对细胞中HBV total RNA的影响；图5(D) 展示了SARS-CoV-2 NSP13蛋白对细胞中HBV pgRNA的影响；图5 (E)展示了SARS-CoV-2 NSP13蛋白对上清中HBV DNA的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明的技术方案进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
如无特殊说明，本发明下述各实施例在常温条件下进行，常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
本发明通过SARS-CoV-2的基因组数据，获得编码SARS-CoV-2 NSP13蛋白的基因序列信息，简称SARS-CoV-2 NSP13基因，然后通过基因合成的方法获得SARS-CoV-2 NSP13基因，进而通过分子克隆的方法获得可以在真核细胞中表达SARS-CoV-2 NSP13蛋白的真核表达质粒pXJ40-HA-NSP13。本发明通过在不同HBV复制系统中引入 SARS-CoV-2 NSP13蛋白，检测HBV生活周期相关复制转录翻译指标，来评估SARS-CoV-2 NSP13蛋白的抗病毒功效。本发明中使用的HBV 重组cccDNA(rcccDNA)模型是HBV病毒学研究的一类重要工具， rcccDNA与野生病毒cccDNA具有较大相似性，能够在细胞内或体外系统大量诱导产生。我们发现SARS-CoV-2 NSP13蛋白在HBV重组 cccDNA(rcccDNA)模型中的抑制了HBV的转录和翻译；本发明中使用的HBV复制性质粒能够随着细胞有丝分裂而持续存在，可以利用其建立HBV持续感染模型。我们发现，SARS-CoV-2 NSP13蛋白抑制了 HBV复制性质粒pEPI-EGFP-1.3HBV的转录和翻译；在HBV感染细胞的过程中，SARS-CoV-2 NSP13蛋白抑制了HBV的转录和翻译。综上所述，SARS-CoV-2 NSP13蛋白可以抑制乙肝病毒的转录和翻译，可作为新的抗HBV药物应用于治疗乙肝患者疾病。
本发明具体实施方式主要分为如下几个部分：
第一部分，通过分子克隆的方法获得包含SARS-CoV-2 NSP13基因的真核表达质粒pXJ40-HA-NSP13。
第二部分，验证真核表达质粒pXJ40-HA-NSP13能否正确表达 SARS-CoV-2 NSP13蛋白。
第三部分，在不同HBV复制系统中引入pXJ40-HA-NSP13，过表达SARS-CoV-2 NSP13蛋白，检测HBV生活周期相关复制转录翻译指标，来评估SARS-CoV-2 NSP13蛋白的抗病毒功效，发现SARS-CoV-2 NSP13蛋白可以在不同模型中有效抑制HBV的复制：
1、HBV重组cccDNA(rcccDNA)模型，该模型是HBV病毒学研究的一类重要工具，rcccDNA与野生病毒cccDNA具有较大相似性，能够在细胞内或体外系统大量诱导产生。我们发现SARS-CoV-2 NSP13 蛋白在HBV重组cccDNA(rcccDNA)模型中的抑制了HBV的转录和翻译。
2、HBV非感染细胞模型，该模型通过在肝癌细胞系Huh7细胞中转染HBV复制型质粒pEPI-EGFP-1.3HBV来探究SARS-CoV-2 NSP13 蛋白对HBV复制和转录水平的影响。我们发现，SARS-CoV-2 NSP13 蛋白抑制了HBV复制性质粒pEPI-EGFP-1.3HBV的转录和翻译。
3、HBV持续感染的Huh7-NTCP细胞模型，在该模型中， SARS-CoV-2 NSP13蛋白抑制了HBV的转录和翻译。
本发明的具体实施方式如下实施例所示。
实施例1：构建重组质粒
酶切连接构建pXJ40-HA-NSP13质粒，构建策略如图1所示意。编码SARS-CoV-2NSP13蛋白的基因序列，即SARS-CoV-2 NSP13基因，如SEQ ID NO.1所示，选取Xho1和Not1作为插入位点。
(1)PCR扩增SARS-CoV-2 NSP13基因目的片段以及酶切骨架载体。
聚合酶链反应(PCR)采用50μL反应体系，反应体系见表1，反应程序见表2，采用的50μL双酶切体系见表3。
表1 PCR反应体系
| 总体系 | 50μL |
| 模板 | 2μL |
| 上游引物 | 2μL |
| 下游引物 | 2μL |
| MIX | 25μL |
| 灭菌ddH<sub>2</sub>O | 19μL |
表2 PCR反应程序
∞表示保存时间不确定。
表3 50μL双酶切体系
X代表载体质粒的体积。
配好体系后，37°酶切5-15min，之后凝胶提取目的条带。
(2)用胶回收试剂盒纯化目的基因片段以及酶切骨架。
(2.1)DNA电泳结束后，在紫外灯下快速切下含目的DNA片段的凝胶，建议用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，并尽量去除多余的凝胶。称取凝胶重量(去除空管重量)，100mg凝胶等同于100μL体积，作为一个凝胶体积。
(2.2)加入等倍体积缓冲液GDP。50-55℃水浴7-10min，根据凝胶大小适当调整时间，确保凝胶完全溶解。水浴期间颠倒混匀2次加速溶胶。
(2.3)短暂离心收集管壁上的液滴。将Fsatpure DNA Mini Columns-G吸附柱置于2mL收集管中，把≤700μL溶胶液转移至吸附柱中，12000×g离心30-60s。若溶胶体积大于700μL，把吸附柱置回收集管中，剩余的溶胶液转移至吸附柱中，12000×g离心30-60s。
(2.4)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入300μL缓冲液GDP 至吸附柱中。静置1min。12000×g离心30-60s。
(2.5)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入600μL缓冲液GW (已加入无水乙醇)至吸附柱中。12000×g离心30-60s。
(2.6)重复步骤(2.5)。
(2.7)弃滤液，把吸附柱置回收集管中。12000×g离心2min。
(2.8)将吸附柱置于1.5mL灭菌的离心管中，加入10-30μL洗脱缓冲液至吸附柱中央，放置2min。12000×g离心1min。弃去吸附柱，把DNA保存于-20℃。
(3)将酶切骨架与SARS-CoV-2 NSP13基因目的片段在22℃的连接体系中连接1h，并将连接产物转化。连接体系如表4所示。
表4连接体系
| 总体系 | 10μL |
| T4连接酶 | 1μL |
| 10×T4连接酶缓冲液 | 1μL |
| 质粒载体酶切产物 | 3μL |
| PCR产物酶切回收片段 | 5μL |
转化步骤如下：
(3.1)取冻存在-80℃的100μL感受态JM109放冰上融化。
(3.2)将连接产物加入感受态JM109中，轻弹离心管，使感受态 JM109与连接产物混匀，置于冰上30min。
(3.3)然后在42℃的水浴锅中热激90s，放冰上冷却5min，加入 1mL新鲜LB培养基，放在37℃摇床，220rpm振荡培养1h将其活化。
(3.4)将步骤(3.3)活化后的培养物5000rpm离心5min，用移液枪丢弃900μL上清，将剩下的液体吹打混匀，用玻璃棒均匀地涂抹在氨苄抗性的LB固体平板上。37℃培养箱正置15min后倒置，第二天观察细菌生长情况，分别挑取一定数量不同位置单菌落在氨苄抗性的 LB培养基中培养。
(4)菌落PCR以及琼脂糖凝胶电泳鉴定
在氨苄抗性的LB培养基中挑取4-5个菌落，进行菌落PCR鉴定，并通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定条带是否或者有无。菌落PCR体系如表 5所示：
表5菌落PCR体系
| 总体系 | 20μL |
| 2×MIX | 10μL |
| 模板 | 1μL |
| 上游引物 | 1μL |
| 下游引物 | 1μL |
| 灭菌双蒸水 | 7μL |
(5)将鉴定正确的菌落进行扩大培养，提取pXJ40-HA-NSP13质粒
将菌液和LB培养基按1:100(即100μL菌液加到10mL培养基中) 扩大培养于37°恒温摇床12-16h，接着按照质粒提取试剂盒进行 pXJ40-HA-NSP13质粒的提取。步骤如下：
(5.1)取5-15mL过夜培养的菌液，13000rpm离心1min收集细菌，吸弃上清。
(5.2)向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL缓冲液P1(已经加入核糖核酸酶A，即RNaseA)，充分混匀菌液，悬浮细菌沉淀，充分裂解。
(5.3)向离心管中加入500μL缓冲液P2，温和混匀8-10次(不要剧烈震荡)，使菌体充分溶解，室温下放置3-5μL，此时溶液变得清亮黏稠。
(5.4)向离心管中加入500μL缓冲液E3，立即上下颠倒混匀8-10 次，避免产生局部沉淀，室温下放置5min，之后13000rpm离心5min，吸取上清加入过滤柱中，13000rpm离心1min，收集滤液于新的离心管中。
(5.5)向滤液中加入450μL异丙醇，上下颠倒充分混匀。
(5.6)吸取200μL缓冲液PS于吸附柱中，13000rpm离心2min，弃去废液。
(5.7)将步骤(5.5)中的混合液加入吸附柱中，1300rpm离心1min，弃去收集管中的废液。
(5.8)向吸附柱中加入700μL缓冲液PW(已加入乙醇)，1300rpm 离心1min，弃去收集管中的废液。
(5.9)重复步骤(5.8)。
(5.10)空转吸附柱，1300rpm离心1min，除去残存的乙醇。
(5.11)将吸附柱放到新灭菌过的1.5mL离心管中，加入100μL Elution缓冲液，室温放置2-5min，1300rpm离心2min，得到 pXJ40-HA-NSP13质粒，-20℃保存。
实施例2：检测转染构建好的pXJ40-HA-NSP13质粒能否正确表达 SARS-CoV-2NSP13蛋白：
在24孔板中培养HEK293T细胞，转染构建好的pXJ40-HA-NSP13 质粒，使用的转染试剂是PEI，pXJ40-HA-NSP13质粒与PEI用量比为1g:3mL，转染溶剂为opti-MEM。转染6h后换液，加入新鲜培养基， 24h后收细胞样提取蛋白进行蛋白质印迹法(Western Blot)验证。具体步骤如下：
(1)弃去培养基，向培养基中加入1mL PBS清洗一遍，之后再加入1mL PBS，用细胞刮将细胞刮下来，将细胞转移到1.5mL离心管中，4500rpm离心5min。
(2)将上清PBS弃掉，加入适量细胞裂解液，吹打细胞悬浮，4℃翻转摇床裂解细胞30min。
(3)裂解之后，4℃、1200rpm离心10min，收集上清细胞蛋白于 1.5mL离心管。
(4)在蛋白样品中加入适量5×上样缓冲液，涡旋震荡，瞬时离心后100℃煮样10min，然后瞬时离心，将蛋白样收集于管内，进行 SDS-PAGE跑胶。图2展示了SDS-PAGE跑胶结果，结果表明， pXJ40-HA-NSP13质粒能够在HEK293T细胞中正确表达SARS-CoV-2 NSP13蛋白。
实施例3：检测SARS-CoV-2 NSP13蛋白在HBV重组 cccDNA(rcccDNA)模型中的抗病毒效应：
HBV重组rcccDNA与野生病毒cccDNA具有较大相似性，能够在细胞内或体外系统大量诱导产生，是HBV病毒学研究的一类重要工具。我们通过在肝细胞Huh7中转染HBVrcccDNA来模拟HBV感染细胞系统，通过引入重组质粒pXJ40-HA-NSP13，来探究SARS-CoV-2NSP13蛋白的抗HBV病毒效应。具体实验步骤如下：
(1)在24孔板中培养肝癌细胞系Huh7细胞，等细胞密度长到 70％-80％时，将pXJ40-HA或pXJ40-HA-NSP13与HBV重组cccDNA(rcccDNA)共同转染，使用的转染试剂是lipofectamine 2000，质粒与lipofectamine 2000的用量比为1g:2.5mL，转染溶剂为Opti-MEM Medium。6h后换液(培养基换成含2.5％DMSO的DMEM)。
(2)分别收集换液后第2天、第4天、第6天的细胞上清，ELISA 检测细胞上清中的HBsAg(s抗原)和HBeAg(e抗原)以及用HBV 定量试剂盒检测上清中HBV的分泌情况；收集第6天的细胞RNA样， Trizol法提取RNA，qPCR检测细胞中的HBV total RNA(HBV总RNA) 和HBVpgRNA；收集第6天的细胞样，提取蛋白，Western Blot检测 HBV core蛋白的表达变化情况。
结果如图3所示，与pXJ40-HA一组相比，pXJ40-HA-NSP13一组显著下调了上清中的HBsAg(s抗原)和HBeAg(s抗原)的表达量以及抑制了HBV core蛋白的表达，说明SARS-CoV-2NSP13蛋白抑制了HBV的翻译过程；通过qPCR定量细胞中的HBV total RNA和HBV pgRNA，解释了SARS-CoV-2 NSP13蛋白抑制了HBV转录层面的total RNA和pgRNA的水平，在转录水平发挥抗病毒作用；同时，上清中的HBV病毒颗粒也因为SARS-CoV-2 NSP13蛋白的过表达而显著降低。
实施例4：检测SARS-CoV-2 NSP13蛋白对HBV复制性质粒pEPI的影响：
在肝癌细胞系Huh7细胞中通过转染HBV复制型质粒pEPI来探究SARS-CoV-2 NSP13蛋白对HBV复制和转录水平的影响。质粒pEPI 是一种非病毒的、附加型的自主性复制质粒，它能够在Hela细胞、 HEK293细胞甚至是原代细胞中随着细胞的有丝分裂而持续存在，所以当把HBV1.3倍体构建到pEPI质粒上之后，可以在细胞水平建立HBV 非感染型的复制周期。具体实验步骤如下：
(1)在24孔板中培养肝癌细胞系Huh7细胞，等细胞密度长到 70％-80％时，将pXJ40-HA和pXJ40-HA-NSP13分别与HBV复制性质粒pEPI-EGFP-1.3HBV共同转染，使用的转染试剂是lipofectamine 2000，质粒与lipofectamine 2000用量比为1g:2.5mL，转染溶剂为 Opti-MEM Medium。6h后换液(培养基换成含2.5％DMSO的DMEM)，分别收集换液后第3天、第5天、第7天的细胞上清，ELISA检测细胞上清中的HBsAg(s抗原)和HBeAg(e抗原)；收集第7天的细胞RNA样，Trizol法提取RNA，qPCR检测细胞中的HBV total RNA(HBV总RNA)和HBVpgRNA；收集第7天的细胞样，提取蛋白， Western Blot检测HBV core蛋白的表达变化情况。由于HBV复制性质粒pEPI-EGFP-1.3HBV带有EGFP标签，我们还分别在第3天、第5 天、第7天用荧光显微镜观察Huh7细胞内绿色荧光的表达情况。
结果如图4所示，与pXJ40-HA一组相比，pXJ40-HA-NSP13一组显著下调了上清中的HBsAg和HBeAg的表达量，并抑制了HBV core 蛋白的表达，说明SARS-CoV-2 NSP13蛋白抑制了HBV的翻译过程；通过qPCR定量细胞中的HBV total RNA和HBV pgRNA，解释了 SARS-CoV-2 NSP13蛋白在转录水平发挥抗病毒作用；同时，上清中的HBV病毒颗粒也因为SARS-CoV-2NSP13蛋白的过表达而显著降低。
实施例5：检测SARS-CoV-2 NSP13蛋白在HBV感染模型中的影响：
由于HBV感染细胞实验的限制性，上述对于探究SARS-CoV-2 NSP13蛋白对HBV的转录复制有影响的实验都是通过模拟HBV感染系统来实现的。接下来，我们通过肝癌细胞系Huh7-NTCP细胞建立了 HBV的持续感染，通过引入重组质粒pXJ40-HA-NSP13，来探究 SARS-CoV-2 NSP13蛋白是如何在HBV持续感染过程中发挥抑制作用的。具体实验步骤如下：
在24孔板中培养肝癌细胞系Huh7-NTCP细胞，等细胞密度长到 70％左右时，分别转染pXJ40-HA和pXJ40-HA-NSP13，6h后换液(培养基换成含2.5％DMSO的DMEM)，大约24h后加HBV建立感染， 24h后换液，分别收集换液后第3天、第5天、第7天的细胞上清，ELISA 检测细胞上清中的HBsAg(s抗原)和HBeAg(e抗原)；收集第7 天的细胞RNA样，Trizol法提取RNA，检测细胞中的HBV total RNA(HBV总RNA)和HBV pgRNA；收集第7天的细胞样，提取蛋白，检测HBV core蛋白的表达变化情况。
结果如图5所示，SARS-CoV-2 NSP13蛋白显著下调了上清中的 HBsAg和HBeAg的表达量以及HBV颗粒的分泌量，同时也抑制了 HBV total RNA和HBV pgRNA水平。
综上所述，本发明披露了SARS-CoV-2 NSP13蛋白可以在HBV感染模型以及在转染HBV重组质粒的模型中抑制HBV的转录和翻译，即SARS-CoV-2 NSP13蛋白可以应用于抗HBV治疗中。
应用时，(1)可以将SARS-CoV-2 NSP13蛋白制备成用于抑制 HBV复制的产品，该产品中的SARS-CoV-2 NSP13蛋白进入携带乙肝病毒的真核细胞后可以抑制乙肝病毒的复制；(2)也可以将 SARS-CoV-2 NSP13基因制备成用于抑制HBV复制的产品，譬如包含 SARS-CoV-2 NSP13基因的重组质粒pXJ40-HA-NSP13或者 SARS-CoV-2 NSP13 mRNA，该产品表达的SARS-CoV-2 NSP13蛋白可以用来抑制乙肝病毒的复制，尤其是，该产品直接在真核细胞中表达SARS-CoV-2 NSP13蛋白，抑制真核细胞中乙肝病毒的复制。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 新型冠状病毒SARS-CoV-2 NSP13基因的用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1806
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcggtgg gtgcgtgcgt tctgtgcaac agccaaacca gcctgcgttg cggtgcgtgc 60
atccgtcgtc cgttcctgtg ctgcaagtgc tgctacgatc acgttattag caccagccac 120
aaactggtgc tgagcgttaa cccgtatgtg tgcaacgcgc cgggttgcga cgtgaccgat 180
gttacccagc tgtacctggg tggcatgagc tactattgca agagccacaa accgccgatc 240
agcttcccgc tgtgcgcgaa cggtcaagtt tttggcctgt ataagaacac ctgcgtgggt 300
agcgacaacg ttaccgattt taacgcgatt gcgacctgcg actggaccaa cgcgggtgat 360
tacattctgg cgaacacctg caccgaacgt ctgaaactgt ttgcggcgga gaccctgaag 420
gcgaccgagg aaacctttaa actgagctac ggtatcgcga ccgtgcgtga ggttctgagc 480
gaccgtgaac tgcacctgag ctgggaagtg ggcaagccgc gtccgccgct gaaccgtaac 540
tacgtgttca ccggttatcg tgttaccaag aacagcaaag tgcaaattgg cgagtatacc 600
tttgaaaagg gtgactacgg cgatgcggtg gtttatcgtg gtaccaccac ctacaaactg 660
aacgtgggcg attacttcgt tctgaccagc cacaccgtga tgccgctgag cgcgccgacc 720
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gacgagttca gcagcaacgt tgcgaactat cagaaagtgg gtatgcaaaa atatagcacc 840
ctgcaaggtc cgccgggtac cggcaagagc cactttgcga tcggtctggc gctgtactat 900
ccgagcgcgc gtattgttta taccgcgtgc agccatgcgg cggtggatgc gctgtgcgaa 960
aaggcgctga aatacctgcc gatcgacaaa tgcagccgta tcattccggc gcgtgcgcgt 1020
gttgaatgct tcgacaagtt taaagtgaac agcaccctgg agcagtatgt gttctgcacc 1080
gttaacgcgc tgccggaaac caccgcggac atcgtggttt ttgatgagat tagcatggcg 1140
accaactacg atctgagcgt ggttaacgcg cgtctgcgtg cgaagcacta cgtttatatt 1200
ggtgacccgg cgcaactgcc ggcgccgcgt accctgctga ccaagggtac cctggagccg 1260
gaatacttca acagcgtgtg ccgtctgatg aaaaccatcg gtccggatat gtttctgggt 1320
acctgccgtc gttgcccggc ggaaattgtg gacaccgtta gcgcgctggt gtatgataac 1380
aagctgaaag cgcacaagga caaaagcgcg cagtgcttca agatgtttta caaaggtgtg 1440
atcacccacg acgttagcag cgcgatcaac cgtccgcaaa ttggcgtggt tcgtgagttc 1500
ctgacccgta acccggcgtg gcgtaaggcg gtttttatca gcccgtataa cagccagaac 1560
gcggtggcga gcaaaattct gggtctgccg acccagaccg ttgatagcag ccaaggcagc 1620
gaatacgact atgtgatctt cacccaaacc accgagaccg cgcacagctg caacgtgaac 1680
cgttttaacg ttgcgattac ccgtgcgaag gttggtatcc tgtgcattat gagcgaccgt 1740
gatctgtacg ataaactgca gttcaccagc ctggaaattc cgcgtcgtaa cgttgcgacc 1800
ctgcag 1806
Claims (6)
1.SARS-CoV-2 NSP13基因的用途，其特征在于：用于制备用于抑制HBV复制的产品，所述产品允许表达SARS-CoV-2 NSP13蛋白。
2.根据权利要求1所述的SARS-CoV-2 NSP13基因的用途，其特征在于：所述产品允许在真核细胞中表达SARS-CoV-2 NSP13蛋白。
3.根据权利要求1所述的SARS-CoV-2 NSP13基因的用途，其特征在于：所述产品包含允许表达SARS-CoV-2 NSP13蛋白的表达载体。
4.根据权利要求3所述的SARS-CoV-2 NSP13基因的用途，其特征在于：所述表达载体适合在真核细胞中自主复制，并表达SARS-CoV-2 NSP13蛋白。
5.根据权利要求3所述的SARS-CoV-2 NSP13基因的用途，其特征在于：所述表达载体适合在细菌中扩增，并表达SARS-CoV-2 NSP13蛋白。
6.根据权利要求1~5任一项所述的SARS-CoV-2 NSP13基因的用途，其特征在于：所述SARS-CoV-2 NSP13基因序列为SEQ ID NO：1。
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