CN104520421B - 用于生产腺伴随病毒的细胞系 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在无动物组分的悬浮条件下生长的HEK293细胞系。该细胞系对于腺伴随病毒（AAV）的快速和可扩大生产是理想的，并且支持所有AAV的血清型和嵌合体的生产。

Description

用于生产腺伴随病毒的细胞系
相关申请
本申请要求于2011年10月28日提交的美国临时申请号61/552,492的权益。本申请的完整内容全部通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及在无动物组分的悬浮条件下生长的HEK293细胞系。该细胞系对于腺伴随病毒（AAV）的快速和可扩大生产是理想的，并且支持所有AAV血清型和嵌合体的生产。
发明背景
重组腺伴随病毒（rAAV）载体已证实在体内具有很少毒性和炎症至无毒性和炎症的转导和长期基因表达。AAV的这些独特特征已导致其公认为用于基因治疗应用的主导载体候选物。许多利用AAV的I期和II期临床试验已在全世界执行（Aucoin等人，Biotechnol.Adv. 26:73（2008）；Mueller等人，Gene Ther. 15:858（2008））。然而，许多临床前研究和成功的临床试验已证实仍需要解决以支持rAAV的人基因治疗使用的许多挑战（Mueller等人，Gene Ther. 15:858（2008））。一个主要挑战是依照现代优良生产实践（cGMP）建立大规模制造技术，以获得扩展的临床需要所需的纯化载体数量。生成可扩大生产技术的成功在很大程度上依赖理解AAV关于生成试剂的基础生物学，例如细胞系、质粒或重组病毒载体等，当一起使用时，其将密切模拟野生型AAV生产。
AAV已分类为细小病毒科中的依赖病毒属，因为它需要与辅助病毒例如腺病毒（Ad）或单纯疱疹病毒（HSV）一起共感染用于细胞培养中的生产性感染(productiveinfection)（Atchison等人，Science 149:754（1965）；Buller等人，J. Virol. 40:241（1981））。细小病毒在最小的DNA动物病毒中，具有完全由蛋白质和DNA构成的直径大约25nm的病毒粒子。AAV基因组是含有4679个碱基的线性、直链DNA分子（Srivastava等人，J.Virol. 45:555（1983））。野生型（wt）AAV基因组由两个基因构成，所述两个基因分别编码四种复制蛋白质和三种衣壳蛋白质，并且在任一端上侧翼为反向末端重复（ITR）（Lusby等人，J. Virol. 4:402（1980）；Srivastava等人，J. Virol. 45:555（1983））。ITR是基因组复制和包装到衣壳内所需的唯一顺式作用元件。四种复制蛋白质（Rep 78、68、52和40）是多功能的，并且在受感染细胞的核内的转录、病毒DNA复制和DNA包装到预形成的病毒衣壳内起作用（Chejanovsky等人，Virology 173:120（1989）；King等人，EMBO J. 20:3282（2001））。病毒衣壳由分别以1:1:8比的三种蛋白质Vp1、Vp2和Vp3构成。衣壳蛋白质由相同可读框（ORF）产生，但利用不同的翻译起始位点。
因为ITR是基因组复制和包装所需的唯一顺式作用元件，所以rep和cap基因可被移出且克隆到单独的质粒内，而无功能中的丧失。启动子和由启动子驱动的目的基因随后可克隆在ITR之间。因此，侧翼为ITR的任何基因可有效包装到AAV衣壳内，只要基因组大小小于5.0 kb（Dong等人，Mol. Ther. 18:87（2010）；Grieger等人，J. Virol. 79:9933（2005）；Wu等人，Mol. Ther. 18:80（2010））。然而，AAV仍缺乏复制的能力。AAV的鲜明特点之一是需要与辅助病毒例如Ad或HSV一起共感染。rAAV的生成习惯于需要载体和包装构建体转染到受Ad感染的细胞内（Muzyczka，Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:97（1992））。在与Ad或HSV一起共感染后，AAV利用几种辅助病毒早期基因以促进其自身复制。Ad感染到生产细胞内以生成rAAV在生产rAAV中是有效的，但后果是它还产生过于充足的Ad颗粒。Ad的完全去除已依赖物理技术例如CsCl梯度、柱层析和热变性步骤，以灭活可能仍存在的任何残留Ad颗粒。虽然这些操作中的大多数已在不同程度上成功，但Ad污染的可能性是不必要的风险，并且Ad变性蛋白质的存在对于临床使用是不能接受的。rAAV生产发展中的显著改进是三重质粒转染(triple plasmid transfection)的引入（Xiao等人，J.Virol.72:2224（1998））。该方法使用rep和cap质粒以及ITR质粒的变化，但消除Ad感染的使用。将E1A、E1B、E4和E2A的Ad蛋白质以及VA RNA克隆到称为XX680的单个质粒内。在XX680质粒上供应Ad辅助基因消除在受转染细胞中的Ad生产，仅获得rAAV载体。三重转染方法仍是使用rAAV的大多数实验室实验中的标准生产方法。然而，该方法已受限于贴壁细胞的使用。
rAAV生产中的进展已在过去10年中取得，所述进展已允许大量实验室抛弃使用贴壁HEK293细胞的生产，并且转向可扩大技术例如通过使用下述的基于感染的技术：重组腺病毒（Gao等人，Mol. Ther. 5:644（2002）；Gao等人，Hum. Gene Ther. 9:2353（1998）；Liu等人，Mol. Ther. 2:394（2000）；Liu等人，Gene Ther. 6:293（1999）；Tessier等人，J.Virol. 75:375（2001））、单纯疱疹病毒（Booth等人，Gene Ther. 11:829（2004）；Conway等人，Gene Ther. 6:986（1999）；Hwang等人，Mol. Ther. 7:S14（2003）；Kang等人，GeneTher. 16:229（2009）；Thomas等人，Hum. Gene Ther. 20:861（2009））、杆状病毒表达载体系统（BEVS）（Aslanidi等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:5059（2009）；Cecchini等人，Gene Ther. 15:823（2008）；Kohlbrenner等人，Mol. Ther. 12:1217（2005）；Negrete等人，Meth. Mol. Biol. 433:79（2008）；Negrete等人，J. Gene Med. 9:938（2007）；Urabe等人，Hum. Gene Ther. 13:1935（2002）；Urabe等人，J. Virol. 80:1874（2006））、和悬浮HEK293细胞的瞬时转染（Durocher等人，J. Virol. Meth. 144:32（2007）；Hildinger等人，Biotechnol. Lett. 29:1713（2007）；Park等人，Biotechnol. Bioeng.94:416（2006））。Park等人和Durocher等人证实使用其优化的无血清悬浮HEK293细胞生产系统分别生成大约1.4x104和3x104 vg/细胞。这些研究共同的是下述事实：载体产率继续成为障碍，并且显著低于经由贴壁HEK293细胞转染和rHSV生产系统生成的vg/细胞。
氯化铯纯化（CsCl）仍是最广泛使用的AAV纯化形式（Grieger等人，Nat.Protoc.1:1412（2006）；Grieger等人，Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 99:119（2005））。使用CsCl纯化的利益是其相对低的成本、对于任何AAV血清型的相容性以及空颗粒和含基因组颗粒的分离。然而，几个缺点有损该方法用于临床应用，包括：（1）在多重CsCl梯度纯化运行内鉴定含病毒级分所需的时间和努力；（2）所得到的病毒含有除铯之外的许多杂质；（3）阻碍按比例放大；和（4）在纯化过程中的众多开放步骤（Brument等人，Mol. Ther. 6:678（2002）；Chahal等人，J. Virol. Meth. 139:61（2007）；Hermens等人，Hum. GeneTher.10:1885（1999）；Kaludov等人，Hum. Gene Ther. 13:1235（2002）；Smith等人，J.Virol. Meth.114:115（2003）；Zolotukhin，Hum. Gene Ther. 16:551（2005））。由Hermens等人和Zolotukin等人进行的实验显示在使用肝素亲和层析进一步纯化后，称为碘克沙醇的密度梯度介质在分离AAV2中是非常有效的（Hermens等人，Hum. Gene Ther. 10:1885（1999）；Zolotukhin等人，Gene Ther. 6:973（1999）；Zolotukhin等人，Methods 28:158（2002））。该系统需要注意的（The caveat of this system）是不能纯化其他AAV血清型和嵌合衣壳缺乏对于硫酸肝素的亲和力，因此恢复rAAV对CsCl的纯化。已存在不使用CsCl的纯化的几种其他尝试，包括具有表位的病毒衣壳的操作（Koerber等人，Hum. Gene Ther. 18:367（2007））和多种形式的层析（Brument等人，Mol. Ther. 6:678（2002）；Chahal等人，J. Virol. Meth. 139:61（2007）；Davidoff等人，J. Virol. Meth. 121:209（2004）；Gao等人，Hum. Gene Ther. 11:2079（2000）；Hermens等人，Hum. Gene Ther. 10:1885（1999）；Kaludov等人，Hum. GeneTher. 13:1235（2002）；Smith等人，J. Virol. Meth. 114:115（2003）；Zolotukhin等人，Gene Ther. 6:973（1999）；Zolotukhin等人，Methods 28:158（2002））。离子交换层析的使用已显示成功纯化几种AAV血清型。Brument等人和Davidoff等人使用二柱系统纯化AAV血清型2、5和8（Brument等人，Mol. Ther. 6:678（2002）；Davidoff等人，J. Virol. Meth.121:209（2004））。Zolotukhin等人显示使用碘克沙醇加上利用Q-Sepharose柱的离子交换能够纯化血清型1、2和5（Zolotukhin等人，Methods 28:158（2002））。这些方法显示在AAV纯化中的极大希望，但仅对指定血清型有效。可纯化所有AAV血清型的通用方法仍有待鉴定。
本发明提供了在无动物组分的悬浮条件下生长且可以用于AAV生产系统中的HEK293细胞系，所述AAV生产系统是快速的、可放大的、产生高滴度、并且对于所有AAV血清型和嵌合体均起作用。
发明概述
本发明涉及用于AAV载体的可扩大制造方法的开发，所述制造方法有效生成高滴度、高度纯和有效数量的AAV载体。该方法的开发包括HEK293细胞系的生成，所述HEK293细胞系在无动物组分的悬浮条件下生长。
本发明的一个方面涉及保藏为ATCC编号PTA-13274的分离的HEK293细胞。
本发明的另一个方面涉及生产AAV颗粒的方法，其包括：（a）向本发明的HEK293细胞提供AAV表达系统；（b）在其中产生AAV颗粒的条件下培养细胞；和（c）任选分离AAV颗粒。
本发明的这些及其他方面在下文本发明说明书中更详细地阐述。
附图简述
图1A-1B显示三重转染质粒比和转染混合物（cocktail）体积的优化。（A）利用XX680、AAV rep/cap辅助和TR质粒的不同质粒比，以测定rAAV载体生产的优化质粒比。（B）测试不同转染混合物体积，以测定用2:1的转染试剂（化学品或脂质）与DNA比和温育时间的优化转染条件。转染混合物的体积百分比与最终细胞培养体积百分比有关。
图2A-2B显示细胞密度转染优化实验，和细胞培养年龄(cell culture age)对载体生产的影响。（A）1 x 106和2 x 106活细胞/mL用1-2 µg质粒DNA（2:1.5:1 XX680:AAVrep/cap辅助:TR质粒）转染。（B）使用优化参数转染低、中和高传代细胞，以测定细胞培养年龄是否影响转染效率和rAAV生产。
图3A-3B举例说明在柱层析后经由银染色和负染色透射电子显微镜检查（TEM）的AAV洗脱峰级分的纯度。
图4A-4B证实使用优化生产和纯化条件，单链和自互补(self-complementary)rAAV血清型1-6、8和9的生产和纯化。对于每个血清型转染在摇瓶中的一升细胞培养物。使用HeLaRC32细胞，对于每个血清型计算细胞裂解产物和纯化后滴度加上vg:TU比（参见方法）。（A）单链血清型1-6、8和9纯化后的银染色图像。（B）自互补的rAAV1-6、8和9的DNA印迹。从每个血清型衣壳中分离载体基因组且在碱性琼脂糖凝胶上运行。
图5显示单链和自互补rAAV血清型1-6、8和9的负染色TEM图像。基于负染色TEM图像测定每个血清型的实心与空心衣壳比。
图6显示用1x1011 vg的AAV6、8和9 CBA-Luc载体注射的小鼠的体内图像。CBA-萤光素酶载体经由尾静脉注射施用到每只小鼠内。由悬浮HEK293细胞生成的CBA-Luc载体经由不连续密度梯度/柱层析进行纯化，并且由贴壁HEK293细胞生成的那些经由CsCl密度梯度进行纯化。小鼠在（A）一周和（B）一个月时进行成像。对照小鼠用PBS进行注射。AAV8和9的光子范围设为5x106至1x108。AAV6设为5x104至1x106。曝光时间对于AAV8和9为1分钟，并且对于AAV 6为5分钟。
图7A-7B显示单链和自互补rAAV载体纯化后的浓度。（A）浓缩前的rAAV载体和（B）浓缩后的rAAV载体的负染色TEM图像。
图8显示使用在摇瓶和波浪（wave）生物反应器中生长且转染的悬浮HEK293细胞的rAAV载体生产的时间线。
图9显示来自悬浮HEK293培养基的rAAV8和rAAV9的连续生产和收获。总产率代表所有培养基时间点和加在一起的120小时细胞沉淀产率。48小时细胞沉淀对照代表如本文描述的来自在转染后48小时的标准收获的产率。
发明详述
本发明现在将参考附图进行描述，在所述附图中显示了本发明的优选实施方案。然而，本发明可以以不同形式体现，并且不应解释为限制于本文所述的实施方案。相反，这些实施方案这样提供，使得本公开内容将是彻底和完整的，并且将本发明的范围完全传达给本领域技术人员。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。在本文本发明说明书中使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不旨在是本发明的限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利及其他参考文献通过引用整体并入。
除非另有具体说明，否则核苷酸序列在本文中仅通过单链、以5'至3'方向、从左到右呈现。核苷酸和氨基酸在本文中以由IUPAC-IUB生物化学命名委员会（BiochemicalNomenclature Commission）推荐的方式，或（对于氨基酸）通过依照37 CFR §1.822和确定用法的单字母代码或三字母代码表示。参见例如PatentIn User Manual，99-102（1990年11月）（美国专利和商标局）。
除另有指示外，本领域技术人员已知的标准方法可以用于构建rAAV构建体，表达AAV Rep和/或Cap序列的包装载体，以及瞬时转染和稳定转染的包装细胞。此类技术是本领域技术人员已知的。参见例如SAMBROOK等人MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL第2版（Cold Spring Harbor，NY，1989）；AUSUBEL等人CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY（Green Publishing Associates，Inc.和John Wiley & Sons，Inc.，New York）。
此外，本发明还考虑在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文阐述的任何特点或特点组合。
定义
下述术语用于本文说明书和所附的权利要求中。
除非上下文另有明确说明，否则单数形式的“一个(a)”和“一个(an)”旨在还包括复数形式。
此外，如本文使用的术语“约”当提及可测量值例如多核苷酸或多肽序列的长度、剂量、时间、温度等等的量时，意欲包含指定量的20%、10%、5%、1%、0.5%或甚至0.1%的变化。
还如本文使用的，“和/或”指的是且包含相关列出项中的一个或多个的任何和所有可能组合，以及在替代方案中解释时组合的缺乏（“或”）。
如本文使用的，过渡短语“基本上由……组成”应解释为包含所述材料或步骤“以及实质上不影响本发明的一个或多个基本和新型特征的材料或步骤”（例如rAAV复制）。参见In re Herz，537 F.2d 549，551-52，190 U.S.P.Q. 461，463（CCPA 1976）（原文中的重点）；还参见MPEP § 2111.03。因此，如本文使用的术语“基本上由……组成”不应解释为等价于“包含”。
如本文使用的术语“细小病毒(parvovirus)”包含细小病毒科(Parvoviridae)，包括自主复制细小病毒和依赖病毒。自主性细小病毒包括属细小病毒属（Parvovirus）、红病毒属（Erythrovirus）、浓核病毒属（Densovirus）、重复病毒属（Iteravirus）和康特拉病毒属（Contravirus）的成员。示例性自主性细小病毒包括但不限于小鼠细小病毒、牛细小病毒、犬细小病毒、鸡细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫细小病毒、鹅细小病毒、H1细小病毒、番鸭细小病毒、蛇细小病毒和B19病毒。其他自主性细小病毒是本领域技术人员已知的。参见例如FIELDS等人VIROLOGY，第2卷，第69章（第4版，Lippincott-Raven出版商）。
属依赖病毒属（Dependovirus）含有腺伴随病毒（AAV），包括但不限于AAV 1型、AAV2型、AAV 3型（包括3A和3B型）、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV10型、AAV 11型、AAV 12型、AAV 13型、禽AAV、牛AAV、犬AAV、山羊AAV、蛇AAV、马AAV和绵羊AAV。参见例如FIELDS等人VIROLOGY，第2卷，第69章（第4版，Lippincott-Raven出版商）；和表1。
如本文使用的，术语“腺伴随病毒”（AAV）包括但不限于AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型（包括3A和3B型）、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV11型、AAV 12型、AAV 13型、蛇AAV、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、山羊AAV、虾AAV及任何其他目前已知或以后发现的AAV。参见例如FIELDS等人VIROLOGY，第2卷，第69章（第4版，Lippincott-Raven出版商）。许多相对新的AAV血清型和进化枝已得到鉴定（参见例如Gao等人，J. Virol. 78:6381（2004）；Moris等人，Virol. 33:375（2004）；和表1）。
多种AAV血清型的基因组序列，以及天然ITR、Rep蛋白质和衣壳亚基(capsid subunit)的序列是本领域已知的。此类序列可以在文献或公共数据库例如GenBank中找到。参见例如，GenBank检索号 和其公开内容通过引用并入本文用于教导AAV核酸和氨基酸序列。还参见例如Bantel-Schaal等人，J.Virol. 73:939（1999）；Chiorini等人，J.Virol. 71:6823（1997）；Chiorini等人，J.Virol. 73:1309（1999）；Gao等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854（2002）；Moris等人，Virology，33:375（2004）；Mori等人，Virology，330:375（2004）；Muramatsu等人，Virology，221:208（1996）；Ruffing等人，J.Gen. Virol. 75:3385（1994）；Rutledge等人，J.Virol. 72:309（1998）；Schmidt等人，J. Virol. 82:8911（2008）；Shade等人，J. Virol.58:921（1986）；Srivastava等人，J. Virol. 45:555（1983）；Xiao等人，J.Virol. 73:3994（1999）；国际专利公开WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；和美国专利号6,156,303；其公开内容通过引用并入本文用于教导AAV核酸和氨基酸序列。还参见表1。AAV1、AAV2和AAV3 ITR序列的早期描述由Xiao，X.，（1996），“Characterization of Adeno-associatedvirus（AAV）DNA replication and integration,” Ph.D. Dissertation，University ofPittsburgh，Pittsburgh，PA（以其整体并入本文）提供。
如本文使用的术语“向性(tropism)”指病毒进入细胞内，任选且优选随后为由病毒基因组携带的序列在细胞中的表达（例如转录和任选的翻译），例如对于重组病毒，一种或多种异源核苷酸序列的表达。本领域技术人员应当理解来自病毒基因组的异源核酸序列的转录在不存在反式作用因子的情况下可能不起始，例如对于诱导型启动子或另外调节的核酸序列。在AAV的情况下，来自病毒基因组的基因表达可以来自稳定整合的原病毒，来自未整合的附加体，以及其中病毒可以在细胞内采取的任何其他形式。
如本文使用的，通过AAV的细胞“转导”或“感染”意指AAV进入细胞以建立活动性（即裂解性）感染。如本文使用的，通过AAV的细胞“转导”意指AAV进入细胞以建立潜伏性感染。参见例如FIELDS等人VIROLOGY，第2卷，第69章（第4版，Lippincott-Raven出版商）。
术语“5'位置”和“3'位置”是限定两种或更多种元件之间的空间关系的相对术语。因此，例如，多核苷酸的“3'部分”指示其为另一个区段下游的多核苷酸区段。术语“3'部分”不预期指示该区段一定在多核苷酸的3'端处，或甚至它一定在多核苷酸的3'一半中，尽管它可能是这样。同样地，多核苷酸的“5'部分”指示其为另一个区段上游的多核苷酸区段。术语“5'部分”不预期指示该区段一定在多核苷酸的5'端处，或甚至它一定在多核苷酸的5'一半中，尽管它可能是这样。
如本文使用的，除非另有说明，否则术语“多核苷酸”包含肽和蛋白质。
“多核苷酸”是核苷酸碱基的序列，并且可以是RNA、DNA或DNA-RNA杂交序列（包括天然存在和非天然存在的核苷酸），并且可以是单链或双链DNA序列。
如本文使用的，“分离的”多核苷酸（例如“分离的DNA”或“分离的RNA”）意指这样的多核苷酸，其与天然存在的生物或病毒的其他组分中的至少一些分离，或基本上不含天然存在的生物或病毒的其他组分中的至少一些，例如细胞或病毒结构组分（例如细胞壁或细胞膜）或通常发现与多核苷酸结合的其他多肽或核酸。在一些实施方案中，分离的多核苷酸是至少约20%纯，例如至少约30、40、50、60、70、80、90或95%纯的多核苷酸。
同样地，“分离的”多肽意指这样的多肽，其与天然存在的生物或病毒的其他组分中的至少一些分离，或基本上不含天然存在的生物或病毒的其他组分中的至少一些，例如细胞或病毒结构组分（例如细胞壁或细胞膜）或通常发现与多肽结合的其他多肽或核酸。在一些实施方案中，分离的多肽是至少约20%纯，例如至少约30、40、50、60、70、80、90或95%纯的多肽。
“治疗多肽”是可以减轻或减少产生于蛋白质在细胞或个体中的不存在或缺损的症状的多肽。或者，“治疗多肽”是在其他方面对个体赋予利益例如抗癌作用或移植物存活性中的改进的多肽。
如本文使用的，当应用于多核苷酸或多肽序列时，术语“经修饰的”意指由于一种或多种缺失、添加、取代或其任何组合而不同于野生型序列的序列。
如本文使用的，“分离”或“纯化”（或语法等价物）病毒载体意指病毒载体至少部分与起始材料中的其他组分中的至少一些分离。
术语“治疗（treat）”、“治疗（treating）”或“治疗（treatment of）”（及其语法变化）意指个体状况的严重性降低，至少部分改进或稳定和/或实现至少一种临床症状中的一些减轻、缓和、减少或稳定和/或存在疾病或病症进展中的延迟。
术语“预防（prevent）”、“预防（preventing）”和“预防（prevention）”（及其语法变化）意指相对于在不存在本发明的方法的情况下将发生的情况，个体中的疾病、病症和/或一种或多种临床症状的发作的预防和/或延迟，和/或疾病、病症和/或一种或多种临床症状的发作严重性中的降低。预防可以是完全的，例如疾病、病症和/或一种或多种临床症状的完全不存在。预防还可以是部分的，使得个体中的疾病、病症和/或一种或多种临床症状的出现和/或发作的严重性小于在不存在本发明的情况下将发生的情况。
如本文使用的“治疗有效”量是足以对个体提供一些改善或利益的量。或者说，“治疗有效”量是将在个体中的至少一种临床症状中提供一些减轻、缓和、减少或稳定的量。本领域技术人员应当理解疗效无需是完全的或治愈的，只要对个体提供一些利益。
如本文使用的“预防有效”量是相对于在不存在本发明的方法的情况下将发生的情况，足以预防和/或延迟个体中的疾病、病症和/或多种临床症状的发作，和/或降低和/或延迟疾病、病症和/或多种临床症状的发作严重性的量。本领域技术人员应当理解预防水平无需是完全的，只要对个体提供一些利益。
术语“异源核苷酸序列”和“异源核酸”在本文中可互换使用，并且指在病毒中并非天然存在的序列。一般地，异源核酸包含编码目的多肽或非翻译RNA（例如用于递送至细胞或个体）的可读框。
如本文使用的，术语“病毒载体”、“载体”或“基因递送载体”指这样的病毒（例如AAV）颗粒，其充当核酸递送媒介物，并且其包含包装在病毒粒子内的载体基因组（例如病毒DNA [vDNA]）。或者，在一些背景下，术语“载体”可以用于指单独的载体基因组/vDNA。
本发明的病毒载体可以进一步是如国际专利公开WO 01/92551（其公开内容通过引用整体并入本文）中所述的双链体AAV颗粒。因此，在一些实施方案中，双链（双链体）基因组可以包装到病毒衣壳内。
“rAAV载体基因组”或“rAAV基因组”是包含一种或多种异源核酸序列的AAV基因组（即vDNA）。rAAV载体一般仅需要以顺式（in cis）的145碱基ITR，以生成病毒。所有其他病毒序列是可有可无的，并且可以以反式（in trans）供应（Muzyczka，Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97（1992））。通常，rAAV载体基因组将仅保留一种或多种ITR序列，以便使可以由载体有效包装的转基因大小达到最大。结构和非结构蛋白质编码序列可以以反式提供（例如由载体例如质粒，或通过将序列稳定整合到包装细胞内）。在本发明的实施方案中，rAAV载体基因组包含至少一种ITR序列（例如AAV ITR序列），任选两个ITR（例如两个AAV ITR），其通常将在载体基因组的5'和3'端处，并且侧接异源核酸，但无需与之邻接。ITR可以彼此相同或不同。
“AAV表达系统”是一种或多种多核苷酸的系统，当引入合适的宿主细胞内时，所述系统足以支持rAAV的生产。AAV表达系统通常将包括编码AAV rep和cap、辅助基因和rAAV基因组的多核苷酸。AAV表达系统的一个实例是三重转染方法。
术语“末端重复”或“TR”包括任何病毒末端重复或合成序列，其形成发夹结构且充当反向末端重复（即，介导所需功能例如复制、病毒包装、整合和/或原病毒拯救等等）。ITR可以是AAV ITR或非AAV ITR。例如，非AAV ITR序列例如其他细小病毒（例如犬细小病毒、牛细小病毒、小鼠细小病毒、猪细小病毒、人细小病毒B-19）的那些，或充当SV40复制起点的SV40发夹可以用作ITR，其可以进一步通过截短、取代、缺失、插入和/或添加进行修饰。进一步地，ITR可以部分或完全是合成的，例如如给予Samulski等人的美国专利号5,478,745中所述的“双重D序列”。
AAV基因组具有在其5'和3'端处的回文序列。序列的回文性质导致发夹结构的形成，所述发夹结构通过互补碱基对之间的氢键形成加以稳定。该发夹结构被认为采用“Y”或“T”形状。参见例如FIELDS等人VIROLOGY，第2卷，第69和70章（第4版，Lippincott-Raven出版商）。
“AAV反向末端重复”或“AAV ITR”可以来自任何AAV，包括但不限于血清型1、2、3a、3b、4、5、6、7、8、9、10、11或13，蛇AAV，禽AAV，牛AAV，犬AAV，马AAV，绵羊AAV，山羊AAV，虾AAV及任何其他目前已知或以后发现的AAV（参见例如表1）。AAV ITR无需具有天然末端重复序列（例如天然AAV ITR序列可以通过插入、缺失、截短和/或错义突变加以改变），只要末端重复介导所需功能，例如复制、病毒包装、整合和/或原病毒拯救等等。
本发明的病毒载体可以进一步是“靶向”病毒载体（例如具有定向的向性）和/或“杂交”AAV（即，其中病毒ITR和病毒衣壳来自不同AAV或其他细小病毒），如国际专利公开WO00/28004和Chao等人，Mol. Therapy 2:619（2000）中所述。在其他实施方案中，病毒载体是“嵌合”AAV（即，其中衣壳蛋白质来自超过一种血清型和/或衣壳蛋白质进行修饰以含有来自超过一种血清型的序列）。
进一步地，病毒衣壳或基因组元件可以含有其他修饰，包括插入、缺失和/或取代。
术语“模板”或“底物”在本文中用于指可以复制以产生AAV病毒DNA的多核苷酸序列。为了病毒生产的目的，模板通常将嵌入更大的核苷酸序列或构建体内，包括但不限于质粒、裸露DNA载体、细菌人工染色体（BAC）、酵母人工染色体（YAC）或病毒载体（例如腺病毒、疱疹病毒、EB病毒、AAV、杆状病毒、逆转录病毒载体等等）。或者，模板可以稳定掺入包装细胞的染色体内。
如本文使用的，AAV“Rep编码序列”指示编码AAV非结构蛋白质的核酸序列，所述AAV非结构蛋白质介导病毒复制和新病毒颗粒的产生。AAV复制基因和蛋白质已在例如Fields等人Virology，第2卷，第69和70章（第4版，Lippincott-Raven出版商）中描述。
“Rep编码序列”无需编码所有AAV Rep蛋白质。例如，就AAV而言，Rep编码序列无需编码所有四种AAV Rep蛋白质（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40），事实上，认为AAV5仅表达剪接的Rep68和Rep40蛋白质。在代表性实施方案中，Rep编码序列编码至少那些其是病毒基因组复制和包装到新病毒粒子内所需的复制蛋白质。Rep编码序列一般将编码至少一种大Rep蛋白质（即Rep78/68）和一种小Rep蛋白质（即Rep52/40）。在特定实施方案中，Rep编码序列编码AAV Rep78蛋白质和AAV Rep52和/或Rep40蛋白质。在其他实施方案中，Rep编码序列编码Rep68和Rep52和/或Rep40蛋白质。在再进一步的实施方案中，Rep编码序列编码Rep68和Rep52蛋白质、Rep68和Rep40蛋白质、Rep78和Rep52蛋白质或Rep78和Rep40蛋白质。
如本文使用的，术语“大Rep蛋白质”指Rep68和/或Rep78。大Rep蛋白质可以是野生型或合成的。野生型大Rep蛋白质可以来自任何AAV，包括但不限于血清型1、2、3a、3b、4、5、6、7、8、9、10、11或13及任何其他目前已知或以后发现的AAV（参见例如表1）。合成的大Rep蛋白质可以通过插入、缺失、截短和/或错义突变加以改变。
本领域技术人员将进一步理解不一定复制蛋白质由同一多核苷酸编码。例如，AAVp19启动子可以是失活的，并且一种或多种大Rep蛋白质由一条多核苷酸表达，而一种或多种小Rep蛋白质由不同的多核苷酸表达。通常，然而，由单一构建体表达复制蛋白质将是更方便的。在一些系统中，病毒启动子（例如AAV p19启动子）可能不由细胞识别，并且因此需要由分开的表达盒表达大和小Rep蛋白质。在其他情况下，可能希望分开地即在分开的转录和/或翻译控制元件的控制下表达大Rep蛋白质和小Rep蛋白质。例如，可能希望控制大Rep蛋白质的表达，以便减少大与小Rep蛋白质的比。在昆虫细胞的情况下，下调大Rep蛋白质（例如Rep78/68）的表达可能是有利的，以避免对细胞的毒性（参见例如Urabe等人，Hum.Gene Ther. 13:1935（2002））。
如本文使用的，AAV“cap编码序列”编码形成功能AAV衣壳（即，可以包装DNA且感染靶细胞）的结构蛋白质。通常，cap编码序列将编码所有AAV衣壳亚基，但可以编码少于所有的衣壳亚基，只要能产生功能衣壳。通常但不一定，cap编码序列将存在于单一核酸分子上。AAV的衣壳结构在BERNARD N. FIELDS等人，VIROLOGY，第2卷，第69和70章（第4版，Lippincott-Raven出版商）中更详细地描述。
如本文使用的，术语“无动物组分”指不含从动物或动物细胞提取或纯化的任何产物的培养基或其他组合物，所述产物包括血清、酶、碳水化合物、核酸、蛋白质、抗体、细胞外基质等。
悬浮HEK293细胞系
在生成可扩大制造技术以生产高滴度和高度纯的rAAV的努力中，开发了在无动物组分的悬浮条件下生长的HEK293细胞系。该细胞系由合格的原始细胞库(master cellbank)开发。在适应于在无动物组分的悬浮条件下生长后，悬浮HEK293细胞系维持其有效转染和rAAV生产的能力。
因此，本发明的一个方面涉及分离的HEK293细胞，其于2012年10月23日根据布达佩斯条约保藏于ATCC，P.O. Box 1549，Manassas，Virginia，20108（ATCC保藏号PTA-13274）。
在一个实施方案中，该细胞系适合于在从10 ml（例如在摇瓶中）到10 L、50 L、100L或更多（例如在生物反应器中）的任何体积的培养基中培养。该细胞系适合于生产所有AAV的血清型、嵌合体和杂交物(hybrid)，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13，及其任何嵌合体和/或杂交物，例如AAV1-13 2.5、2i8、9.45及其他嵌合或杂交衣壳。
在某些实施方案中，该细胞系可以用于AAV生产方法中，其提供纯化前每细胞至少约4 x 104含载体基因组的颗粒，例如纯化前每细胞至少约1 x 105含载体基因组的颗粒。在其他实施方案中，该细胞系可以用于AAV生产方法中，其提供每升细胞培养物至少约1 x1012纯化的含载体基因组的颗粒，例如每升细胞培养物至少约1 x 1013或1 x 1014纯化的含载体基因组的颗粒。
生产病毒载体的方法
本发明进一步提供了生产病毒载体的方法。在一个方面，本发明涉及生产AAV颗粒的方法，其包括：（a）向本发明的HEK293细胞提供AAV表达系统；（b）在其中产生AAV颗粒的条件下培养细胞；和（c）任选分离AAV颗粒。在一个实施方案中，细胞是悬浮培养的。在另一个实施方案中，细胞在无动物组分的条件下培养。无动物组分的培养基可以是与HEK293细胞相容的任何无动物组分的培养基（例如无血清培养基）。实例包括但不限于SFM4Transfx-293（Hyclone）、Ex-Cell 293（JRH Biosciences）、LC-SFM（Invitrogen）和Pro293-S（Lonza）。
对于AAV颗粒复制和包装足够的条件可以是例如对于AAV模板复制和壳体化入AAV衣壳内足够的AAV序列（例如AAV rep序列和AAV cap序列）和来自腺病毒和/或疱疹病毒的辅助序列的存在。在特定实施方案中，AAV模板包含两个AAV ITR序列，其位于异源核酸序列的5'和3'，尽管它们无需与之直接邻接。
在一些实施方案中，AAV模板包含未由Rep解决的ITR，以制备双链体AAV载体，如国际专利公开WO 01/92551中所述。
AAV模板以及AAV rep和cap序列在这样的条件下提供，使得在细胞中产生包含在AAV衣壳内包装的AAV模板的病毒载体。该方法可以进一步包括从培养物中收集病毒载体的步骤。在一个实施方案中，病毒载体可以通过裂解细胞进行收集，例如在从培养基中移出细胞后，例如通过使细胞形成沉淀。在另一个实施方案中，病毒载体可以从细胞在其中培养的培养基中进行收集，例如以分离由细胞分泌的载体。一些或所有培养基可以一次或超过一次从培养物中去除，例如在培养步骤过程中的定期间隔，用于收集rAAV（例如每12、18、24或36小时或与细胞活力或载体生产相容的更长的延长时间），例如在转染后约48小时开始。在培养基去除后，含或不含另外的营养补充物的新鲜培养基可以加入培养物中。在一个实施方案中，细胞可以在灌注系统中培养，使得培养基在细胞上恒定流动，并且被收集用于分离分泌的rAAV。从培养基中收集rAAV可以持续（只要转染的细胞保持活力）例如转染后48、72、96或120小时或更久。在某些实施方案中，分泌的rAAV的收集对于AAV血清型（例如AAV8和AAV9）进行，所述AAV血清型不结合生产细胞或仅与生产细胞松散结合。在其他实施方案中，分泌的rAAV的收集对于AAV的肝素结合血清型（例如AAV2）进行，所述AAV的肝素结合血清型已进行修饰，以便不结合它们在其中产生的细胞。合适修饰以及rAAV收集技术的实例公开于美国公开号2009/0275107，其通过引用整体并入本文。
AAV复制和衣壳序列可以通过本领域已知的任何方法提供。目前方案通常在单一质粒上表达AAV rep/cap基因。AAV复制和包装序列无需一起提供，尽管这样做可以是更方便的。AAV rep和/或cap序列可以通过任何病毒或非病毒载体提供。例如，rep/cap序列可以通过杂交腺病毒或疱疹病毒载体提供（例如插入缺失的腺病毒载体的E1a或E3区内）。EBV载体也可以用于表达AAV cap和rep基因。该方法的一个优点是EBV载体是附加型的，在相继细胞分裂中自始至终仍维持高拷贝数（即，作为染色体外元件稳定整合到细胞内，指定为“基于EBV的核附加体”，参见Margolski，Curr. Top. Microbiol. Immun. 158:67（1992））。
作为进一步的替代方案，rep/cap序列可以稳定掺入细胞内。
通常，AAV rep/cap序列将不由TR侧接，以防止这些序列的拯救和/或包装。
AAV模板可以使用本领域已知的任何方法提供给细胞。例如，模板可以由非病毒（例如质粒）或病毒载体供应。在特定实施方案中，AAV模板由疱疹病毒或腺病毒载体供应（例如插入缺失的腺病毒的E1a或E3区内）。作为另一个举例说明，Palombo等人，J. Virol.72:5025（1998），描述了携带侧翼为AAV TR的报道基因的杆状病毒载体。EBV载体也可以用于递送模板，如上文就rep/cap基因而言描述的。
在另一个代表性实施方案中，AAV模板由复制rAAV病毒提供。在还其他实施方案中，包含AAV模板的AAV原病毒稳定整合到细胞的染色体内。
为了增强病毒滴度，促进生产性AAV感染的辅助病毒功能（例如腺病毒或疱疹病毒）可以提供给细胞。AAV复制所需的辅助病毒序列是本领域已知的。通常，这些序列将由辅助腺病毒或疱疹病毒载体提供。或者，腺病毒或疱疹病毒序列可以由另一种非病毒或病毒载体提供，例如作为非感染性腺病毒小质粒，其携带促进有效AAV生产的所有辅助基因，如由Ferrari等人，Nature Med. 3:1295（1997）以及美国专利号6,040,183和6,093,570描述的。
进一步地，辅助病毒功能可以由包装细胞提供，所述包装细胞具有嵌入染色体中或作为稳定染色体外元件维持的辅助序列。一般地，辅助病毒序列不能包装到AAV病毒粒子内，例如不由TR侧接。
本领域技术人员应当理解，在单一辅助构建体上提供AAV复制和衣壳序列以及辅助病毒序列（例如腺病毒序列）可以是有利的。该辅助构建体可以是非病毒或病毒构建体。作为一个非限制性举例说明，辅助构建体可以是包含AAV rep/cap基因的杂交腺病毒或杂交疱疹病毒。
在一个特定实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单一腺病毒辅助载体供应。该载体可以进一步包含AAV模板。AAV rep/cap序列和/或AAV模板可以插入腺病毒的缺失区（例如E1a或E3区）内。
在进一步的实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单一腺病毒辅助载体供应。根据该实施方案，AAV模板可以作为质粒模板提供。
在另一个举例说明性实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单一腺病毒辅助载体提供，并且AAV模板作为原病毒整合到细胞内。或者，AAV模板由EBV载体提供，所述EBV载体作为染色体外元件（例如作为基于EBV的核附加体）维持在细胞内。
在进一步的示例性实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单一腺病毒辅助物(helper)提供。AAV模板可以作为分开的复制病毒载体提供。例如，AAV模板可以由AAV颗粒或第二重组腺病毒颗粒提供。
根据前述方法，杂交腺病毒载体通常包含对于腺病毒复制和包装足够的腺病毒5’和3’顺式序列（即，腺病毒末端重复和PAC序列）。AAV rep/cap序列和AAV模板（如果存在的话）嵌入腺病毒骨架中，并且侧翼为5’和3’顺式序列，使得这些序列可以包装到腺病毒衣壳内。如上所述，腺病毒辅助序列和AAV rep/cap序列一般不由TR侧接，使得这些序列不包装到AAV病毒粒子内。
Zhang等人，Gene Ther. 18:704（（2001））描述了包含腺病毒以及AAV rep和cap基因的嵌合辅助物。
疱疹病毒还可以用作AAV包装方法中的辅助病毒。编码一种或多种AAV Rep蛋白质的杂交疱疹病毒可以有利地促进可扩大的AAV载体生产方案。表达AAV-2 rep和cap基因的杂交单纯疱疹病毒I型（HSV-1）载体已得到描述（Conway等人，Gene Ther. 6:986（1999）和WO 00/17377）。
不含污染性辅助病毒的AAV载体原种(AAV vector stocks)可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，AAV和辅助病毒可以基于大小容易地区分。AAV还可以基于对于肝素底物的亲和力与辅助病毒分离开（Zolotukhin等人Gene Ther. 6:973（1999））。缺失的复制缺陷型辅助病毒可以这样使用，使得任何污染性辅助病毒均无复制能力。作为进一步的替代方案，可以采用缺乏晚期基因表达的腺病毒辅助物，因为仅腺病毒早期基因表达是介导AAV包装所需的。对于晚期基因表达缺陷的腺病毒突变体是本领域已知的（例如ts100K和ts149腺病毒突变体）。
在代表性实施方案中，本发明的方法是完全可扩大的，因此它可以在例如从10 ml（例如在摇瓶中）到10 L、50 L、100 L或更多（例如在生物反应器中，例如波浪生物反应器系统和搅拌槽）的任何所需体积的培养基中进行。
该方法适合于生产所有AAV血清型和嵌合体，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13，及其任何嵌合体。
在某些实施方案中，该方法提供纯化前每细胞至少约1 x 104含载体基因组的颗粒，例如纯化前每细胞至少约2 x 104、3 x 104、4 x 104、5 x 104、6 x 104、7 x 104、8 x104、9 x 104或1 x 105或更多含载体基因组的颗粒。在其他实施方案中，该方法提供每升细胞培养物至少约1 x 1012纯化的含载体基因组的颗粒，例如每升细胞培养物至少约5 x1012、1 x 1013、5 x 1013或1 x 1014或更多纯化的含载体基因组的颗粒。
重组病毒载体
通过本发明产生的病毒载体可用于在体外、先体外后体内(ex vivo)和在体内将核酸递送至细胞。特别地，病毒载体可以有利地用于将核酸递送或转移至动物（包括哺乳动物）细胞。
任何一种或多种目的异源核酸序列均可在由本发明产生的病毒载体中递送。目的核酸包括编码多肽或RNA的核酸，所述多肽或RNA包括报道分子、治疗（例如用于医学或兽医学用途）、免疫原性（例如用于疫苗）、或诊断多肽或RNA。
作为进一步的替代方案，异源核酸可以编码希望在体外、先体外后体内或体内细胞中产生的任何多肽或RNA。例如，病毒载体可以引入培养的细胞内，并且由其分离表达的基因产物。
本领域技术人员应当理解，一种或多种目的异源核酸可以与适当的控制序列可操作地结合。例如，异源核酸可以与表达控制元件可操作地结合，所述表达控制元件例如转录/翻译控制信号、复制起点、多腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点（IRES）、启动子和/或增强子等等。
本领域技术人员应当理解，取决于所需水平和组织特异性表达，可以使用多种启动子/增强子元件。取决于所需表达模式，启动子/增强子可以是组成型或诱导型的。启动子/增强子可以是天然或外来的，并且可以是天然或合成序列。外来的意指转录起始区在转录起始区引入其内的野生型宿主内未发现。
在特定实施方案中，启动子/增强子元件可以对于待处理的靶细胞或个体是天然的。在代表性实施方案中，启动子/增强子元件可以对于异源核酸序列是天然的。启动子/增强子元件一般这样选择，使得它在一种或多种目的靶细胞中起作用。进一步地，在特定实施方案中，启动子/增强子元件是哺乳动物启动子/增强子元件。启动子/增强子元件可以是组成型或诱导型的。
诱导型表达控制元件通常在这样的应用中是有利的，在所述应用中希望提供对一种或多种异源核酸序列表达的调节。用于基因递送的诱导型启动子/增强子元件可以是组织特异性或优选(preferred)的启动子/增强子元件，并且包括肌肉特异性或优选的（包括心肌、骨骼肌和/或平滑肌特异性或优选的）、神经组织特异性或优选的（包括脑特异性或优选的）、眼特异性或优选的（包括视网膜特异性和角膜特异性）、肝特异性或优选的、骨髓特异性或优选的、胰腺特异性或优选的、脾特异性或优选的和肺特异性或优选的启动子/增强子元件。其他诱导型启动子/增强子元件包括激素诱导型和金属诱导型元件。示例性诱导型启动子/增强子元件包括但不限于Tet开/关元件、RU486诱导型启动子、蜕皮激素诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。
在其中一种或多种异源核酸序列在靶细胞中转录且随后翻译的实施方案中，一般包括特异性起始信号用于插入的蛋白质编码序列的有效翻译。可以包括ATG起始密码子和相邻序列的这些外源翻译控制序列，可以具有多种天然和合成的起源。
根据本发明产生的病毒载体提供用于将异源核酸递送到广泛范围的细胞包括分裂和非分裂细胞内的方法。病毒载体可以用于将目的核酸递送至体外细胞，例如以体外产生多肽或用于先体外后体内基因治疗。病毒载体另外可用于将核酸递送至有此需要的个体的方法中，例如以表达免疫原性或治疗多肽或功能RNA。以这种方式，多肽或功能RNA可以在个体体内产生。个体可以是需要多肽的，因为个体具有多肽的缺乏。进一步地，该方法可以实践是因为多肽或功能RNA在个体中的产生可能赋予一些有利效应。
病毒载体还可以用于在培养细胞或个体中产生目的多肽或功能RNA（例如使用个体作为生物反应器，以产生多肽或观察功能RNA对个体的作用，例如与筛选方法结合）。
本发明已得到描述，本发明将在下述实施例中更详细地说明，所述实施例在本文中包括仅用于举例说明性目的，并且不旨在是本发明的限制。
实施例1
材料与方法
由贴壁HEK293合格原始细胞库衍生悬浮HEK293细胞。由亲本HEK293合格原始细胞库（MCB）衍生悬浮细胞系在10,000级洁净室设施中执行。悬浮细胞系的衍生在两相方法中进行，所述两相方法涉及首先使细胞断掉(weaning)含有牛血清的培养基，并且随后使细胞适应与HEK293细胞相容的无血清悬浮培养基。悬浮细胞系如下制备。首先，将合格原始细胞库（MCB）小瓶解冻且置于含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养，并且培养几天以允许细胞从冻/融循环恢复。经过4周时期将MCB细胞培养且传代，同时使组织培养基中的FBS量从10%逐步降低到2.5%。随后将细胞从DMEM 2.5% FBS转移到无血清悬浮培养基中，并且在摇瓶中生长。随后将细胞在无血清培养基中培养另外3周，同时监控其生长率和活力。随后将适应的细胞平展且冷冻下来。随后使来自该细胞库的多个小瓶解冻且用于方法开发研究过程中，以制备使用摇瓶和波浪生物反应器系统的可扩大制造方法，以生成rAAV载体。使悬浮HEK293细胞在无血清悬浮培养基中生长，所述无血清悬浮培养基支持在摇瓶和波浪生物反应器袋中的生长和高转染效率。Multitron Shaker Incubators（ATR）用于以特定rpm振荡速度（基于细胞培养体积）、80%湿度和5% CO2维持细胞和生成rAAV载体。
悬浮HEK293细胞的转染。在转染当天，使用ViCell XR Viability Analyzer（Beckman Coulter）计数细胞且稀释用于转染。为了混合转染混合物，将下述试剂以该次序加入圆锥管中：质粒DNA、OPTIMEM® I（Gibco）或OptiPro SFM（Gibco）或其他无血清相容转染培养基、和随后以与质粒DNA的特定比的转染试剂。pXR系列的辅助质粒用于这些研究中，以生成多重rAAV血清型载体（Rabinowitz等人，J. Virol. 76:791（2002））。在RT下温育前，将混合物倒置混合。随后将转染混合物吸取到烧瓶内并且随后放回振荡器/温箱中。所有优化研究以30 mL培养体积进行，随后为在更大培养体积下的验证。细胞在转染后48小时收获。
使用波浪生物反应器系统的rAAV生产。在转染前2天接种波浪袋。波浪袋接种后两天，获得细胞培养物计数，并且随后在转染前扩增/稀释细胞培养物。随后转染波浪生物反应器细胞培养物。在转染后至少48小时，从波浪生物反应器袋收获细胞培养物。
使用流式细胞术分析转染效率/GFP表达。转染后大约24小时，从每个烧瓶或波浪生物反应器袋中取出1 mL细胞培养物以及未转染的对照。使用Dako Cyan流式细胞仪分析样品。
从摇瓶和波浪生物反应器袋中收获悬浮细胞。转染后48小时，通过从摇瓶中倾出或从波浪生物反应器袋中泵出，将细胞培养物收集到500 mL聚丙烯锥形管（Corning）内。随后使用Sorvall RC3C加离心机和H6000A转子，将细胞培养物以655 x g离心10分钟。弃去上清液，并且将细胞重悬浮于1X PBS中，转移至50 mL锥形管，并且以655 x g离心10分钟。在该点上，沉淀可以贮存于NLT-60℃中或继续通过纯化。
使用qPCR由细胞裂解产物滴定rAAV。取出10 mL细胞培养物，并且使用SorvallRC3C加离心机和H6000A转子，以655 x g离心10分钟。从细胞沉淀倾析上清液。随后将细胞沉淀重悬浮于5 mL DNA酶缓冲液（5 mM CaCl2、5 mM MgCl2、50 mM Tris-HCl pH 8.0）中，随后超声处理，以有效裂解细胞。随后取出300 µL且置于1.5 mL微量离心管内。随后将140单位的DNA酶I加入每个样品中，并且在37℃下温育1小时。为了测定DNA酶消化的有效性，将4-5 µg TReGFP质粒掺入到未转染的细胞裂解产物内，伴随和不伴随DNA酶的添加。随后将50µL EDTA/Sarkosyl溶液（6.3% sarkosyl、62.5 mM EDTA pH 8.0）加入每个管中，并且在70℃下温育20分钟。随后加入50 µL蛋白酶K（10 mg/mL），并且在55℃下温育至少2小时。随后将样品煮沸15分钟，以使蛋白酶K失活。从每个样品中取出一份等分试样以通过qPCR分析。进行两个qPCR反应，以便有效测定每个细胞生成多少rAAV载体。使用设计为与质粒XX680、pXR2和TReGFP的骨架上的同源序列结合的一组引物，建立一个qPCR反应。使用与eGFP基因内的区域结合且扩增该区域的一组引物，建立第二qPCR反应。使用Sybr绿试剂和来自Roche的Light循环仪480进行qPCR。样品在95℃下变性10分钟，随后为45个循环（90℃10秒、62℃10秒和72℃10秒）和解链曲线（1个循环99℃30秒、65℃连续1分钟）。
由粗制裂解产物纯化rAAV。将每份细胞沉淀调整至10 mL的最终体积。将沉淀轻轻涡旋，并且在开一秒、关一秒连发（bursts）中以30%产率超声处理4分钟。在超声处理后，加入550 U DNA酶，并且在37℃下温育45分钟。随后使用Sorvall RC5B离心机和HS-4转子，将沉淀以9400 x g离心，以使细胞碎片形成沉淀，并且将澄清裂解产物转移至Type70Ti离心管（Beckman 361625）。关于收获和裂解悬浮HEK293细胞用于分离rAAV，本领域技术人员可以使用机械方法例如微流化或化学方法例如去污剂等，随后为使用深层过滤或切向流过滤（TFF）的澄清步骤。
AAV载体纯化。如本领域技术人员将知道的和下述手稿（Allay等人，Davidoff等人，Kaludov等人，Zolotukhin等人，Zolotukin等人等）中描述的，通过柱层析法纯化澄清的AAV裂解产物。
使用斑点印迹滴定rAAV。将100 µL DNA酶缓冲液（140单位DNA酶、5 mM CaCl2、5mM MgCl2、50 mM Tris-HCl pH 8.0）加入96孔微量滴定板的每个孔中。将1-3 µL或系列稀释的病毒加入每个孔中，并且在37℃下温育30分钟。随后用15 µL Sarkosyl/EDTA溶液（6.3% sarkosyl、62.5 mM EDTA pH 8.0）补充样品且在70℃下放置20分钟。接下来，加入15µL蛋白酶K（10 mg/mL），并且在50℃下温育至少2小时。将125 µL NaOH缓冲液（80 mM NaOH、4 mM EDTA pH 8.0）加入每个孔中。通过稀释系列制备一系列转基因特异性标准品。随后加入NaOH缓冲液并温育。使尼龙膜在RT下在0.4 M Tris-HCl，pH 7.5中温育，并且随后设置在斑点印迹仪器上。在NaOH缓冲液中的10-15温育后，将样品和标准品装载到斑点印迹仪器内的GeneScreen PlusR杂交转移膜（PerkinElmer）上。随后使用真空将样品应用于膜。将尼龙膜浸泡在0.4 M Tris-HCl、pH 7.5中，并且随后使用UV strata交联仪 1800（Stratagene）在600 ujoulsx100下交联。随后使膜在CHURCH缓冲液（1% BSA、7% SDS、1 mM EDTA、0.5 MNa3PO4、pH 7.5）中预杂交。在预杂交后，使膜与32P-CTP标记的转基因探针（Roche RandomPrime DNA标记试剂盒）杂交过夜。第二天，用低严格性SSC缓冲液（1xSSC、0.1% SDS）和高严格性（0.1xSSC、0.1% SDS）洗涤膜。它随后在磷屏成像（phosphorimager）屏幕上曝光，并且使用STORM840扫描仪（GE）就光密度法进行分析。
使用银染色法分析rAAV载体纯度。将来自纯化载体的样品装载到NuPage 10%Bis-Tris凝胶（Invitrogen）上，并且使用1x NuPage运行缓冲液运行。通常，每个孔装载1 x1010颗粒。用SilverXpress银染色试剂盒#LC6100（Invitrogen）处理凝胶。
使用碱性凝胶电泳和DNA印迹分析自互补的基因组。简言之，将纯化的自互补的rAAV加入200 µL DNA酶I缓冲液（140单位DNA酶、5 mM CaCl2、5 mM MgCl2、50 mM Tris-HClpH 8.0）中，并且在37℃下温育60分钟，随后通过添加30 µL EDTA Sarkosyl/EDTA溶液（6.3% sarkosyl、62.5 mM EDTA pH 8.0）使DNA酶失活，并且在70℃下放置20分钟。随后将20 µL蛋白酶K（10 mg/mL）加入样品中，并且在50℃下温育最少2小时。苯酚/氯仿以1:1比加入，随后为病毒载体DNA的乙醇沉淀。随后将形成沉淀的DNA重悬浮于碱性缓冲液（50 mMNaOH、1 mM EDTA）中用于变性，装载到1%碱性琼脂糖凝胶上，并且在25V下运行过夜。凝胶随后在碱性转移缓冲液（0.4 M NaOH、1 M NaCl）中平衡，并且经由载体DNA至GeneScreenPlusR杂交转移膜（PerkinElmer）的过夜转移执行DNA印迹。膜随后使用含1 M NaCl的0.5 MTris pH 7.5中和，并且与32P-CTP标记的转基因探针杂交过夜。在如先前描述的洗涤膜后，使膜对磷屏成像屏幕曝光，并且使用STORM840扫描仪进行分析。
转导测定。将HeLaRC-32细胞（Chadeuf等人，J. Gene Med. 2:260（2000））以2x105细胞/孔铺平板24孔板，并且在37℃下温育过夜。就90-100%汇合观察细胞。使50 mL具有2%FBS、1% Pen/Strep的DMEM预加温，并且以MOI 10加入腺病毒（dl309）。将含dl309培养基以900 µL级分等分，并且在一系列十倍稀释中用于稀释rAAV。随后将rAAV以400 µL铺平板，并且允许在37℃下温育48小时。对于含有eGFP转基因的rAAV，使用荧光显微镜检查计数GFP阳性细胞。对于含有萤光素酶转基因的rAAV，从细胞中抽吸培养基，并且加入100 µL被动性裂解缓冲液(passive lysis buffer)。将细胞在-80℃下冷冻，并且随后在37℃下解冻，以帮助细胞裂解。随后将50 µL细胞裂解产物连同50 µL萤光素一起吸取到不透明的96孔板内。随后在Wallac板阅读器上就相对光单位阅读细胞。
浓度测定。将起始载体原种取样且装载到vivaspin柱上，并且以10分钟间隔以470x g（Sorvall H1000B）离心。一旦已实现所需体积/浓度，就用渗余物(retentate)冲洗膜两侧，随后收集所述渗余物。获得浓缩前和浓缩的rAAV样品，以测定物理滴度和转导单位。
负染色的rAAV颗粒的透射电子显微镜检查（TEM）。电子显微镜检查允许病毒颗粒的直接显现。通过将网格倒置在20 µL病毒小滴上，将纯化的透析的rAAV载体置于400目辉光放电碳网格上。随后通过倒置在20 µL ddH2O小滴上随后将网格倒置在20 µL 2%乙酸铀小滴上30秒，将网格洗涤2次。网格通过使Whatman纸与网格边缘轻轻接触而印干。使用Zeiss EM 910电子显微镜显现每个载体。
实施例2
悬浮HEK293细胞系的开发
该工作的目的是使用瞬时转染技术和哺乳动物HEK293细胞，生成可扩大的制造技术，以产生高滴度和高度纯的rAAV。为了开始，如实施例1中所述，使来自我们的合格原始细胞库的贴壁HEK293细胞系适应于在无动物组分和无抗生素的悬浮条件下生长。在适应于无动物组分的悬浮条件和选择相容的无动物组分悬浮培养基后，悬浮HEK293细胞系维持其有效转染和rAAV生产的能力。
实施例3
转染条件的优化
使用瞬时转染生产rAAV的主要需求中的两个是测定三种质粒的优化质粒比以及转染试剂与总DNA的比。转染试剂可以是基于化学品的（例如磷酸钙或聚乙烯亚胺）或基于生物制品/脂质的（例如293fectin、脂质转染胺 (lipofectamine)等）。悬浮HEK293细胞最初在无血清培养基-1中在125 mL摇瓶中以30 mL体积在转染当天生长。使用2:1和4:1的转染试剂与DNA比与1 µg DNA/mL的细胞，测试XX680:Rep/Cap:TReGFP的多个比，并且在室温下温育。如图1A中所示，2:1.5:1的质粒比伴随2:1的转染试剂与DNA比生成最多的载体基因组（vg）/细胞。使用如实施例1中所述的qPCR方法测定来自细胞裂解产物的Vg/细胞。显而易见的是4:1的转染试剂与DNA比在测试的所有质粒比下生成最少量的vg/细胞。这最可能是由于通过Beckman ViCell XR Viability分析仪检测到的较低的转染后细胞活力，提示用转染试剂达到毒性水平。另外，4:1的转染试剂与DNA比导致在转染后更大的细胞聚集物。
许多商购可得的转染方案描述转染混合物体积的重要性以及它可以如何影响转染效率。为了测定转染混合物体积如何影响这些细胞，选择2、5和10%的转染混合物体积。%体积基于摇瓶中的最终细胞培养物体积。例如，30 mL培养物用于测定优化转染混合物体积，因此对于10%转染混合物，将27 mL细胞培养物置于摇瓶中，并且转染混合物为3 mL。如图1B中举例说明的，5%转染混合物体积显示具有更佳的转染效率（基于GFP流式细胞术）且生成最多的vg/细胞。
实施例4
细胞密度和质粒DNA浓度的优化
在起始这些研究之前，我们开始使用另一种无血清培养基（无血清培养基-2），其支持更佳的生长，增加转染效率且增加载体生产/细胞（参见表2）。将悬浮HEK293细胞在无血清培养基-2中稀释至1x106和2x106活细胞/mL，以实现30 mL的最终细胞培养体积。1、1.5和2 µg/mL质粒DNA用于这组实验中。基于图2A中所示的数据，显而易见的是当细胞密度在使用1.5 µg/mL的质粒DNA转染时是1x106活细胞/mL时，rAAV载体生产是最佳的。
使悬浮HEK293细胞传代多次，并且当低、中和高传代细胞可获得时，将它们转染以测定细胞培养年龄是否影响转染效率和rAAV生产。如图2B中所示，转染效率不受细胞培养年龄影响，但rAAV生产/细胞随着时间过去减少，提示开发的悬浮HEK293细胞克隆应使用30-40次传代的最大值。
实施例5
使用柱层析的rAAV血清型纯化
与悬浮HEK293细胞中的rAAV生产优化结合，决定另一个焦点应是AAV生产。希望开发用于所有AAV血清型的通用纯化策略。先前研究报道几种不同血清型的纯化可以通过使用柱层析来完成。柱层析因此可以通过调节在结合和洗脱步骤过程中的具体参数用于纯化所有血清型是合理的。如图3中举例说明的，利用柱层析法收集高度纯的洗脱级分。该通用方案用于纯化所有AAV血清型和嵌合衣壳。
实施例6
单链和自互补的rAAV血清型1-6、8和9的生产和纯化
如实施例1中所述，使用优化转染参数转染1升培养物体积，以生成包装CMV-GFP转基因盒的单链和自互补的rAAV血清型1-6、8和9。如表3中所示，转染效率（基于GFP流式细胞术）在所有转染是几乎相等的。所有包装单链基因组的血清型生成大约和超过1x105 vg/细胞。排除rAAV4，所有测试的单链rAAV血清型均由纯化后的1升细胞培养物生成8.2x1012至3.3x1013总rAAV，并且相对不含除VP1、VP2和VP3外的任何蛋白质，如图4A中的银染色中所示。众所周知自互补的载体制剂获得比其单链对应物更少的含有全部载体的颗粒，并且通常包含不同浓度的自互补（二聚体）和单链（单体）基因组（McCarty等人，Gene Ther. 8:1248（2001））。再次排除rAAV4，所有测试的自互补rAAV血清型均由纯化后的1升细胞培养物生成4.0x1012至1.3x1013总rAAV。如图4B中所示，rAAV颗粒有效包装高百分比的自互补基因组。当生成具有多种转基因盒的另外的自互补rAAV载体时，包装的大多数基因组是自互补的，指示这些结果对于自互补的GFP盒不是唯一的。
对于大多数AAV血清型允许的通用细胞系仍未发现。然而，称为（coined）HeLaRC-32的经修饰的HeLa细胞系（Chadeuf等人，J. Gene Med. 2:260（2000））可以通过所有测试的血清型在不同程度上转导。该细胞系含有整合的AAV2 rep和cap基因，并且在用腺病毒（dl309）感染后，将复制侧翼为AAV2 ITR的任何载体基因。增加的基因组拷贝数将引发目的基因的更强表达，在这种情况下，所述目的基因是GFP，其随后可以使用荧光显微镜检查进行显现和计数。随后基于稀释度并且将每个视野的平均计数数目乘以在特定放大率下每个孔的总视野数目，来计算转导单位（TU）。在表3中显而易见一系列vg:TU比存在于血清型之间，这最可能是由于HeLaRC-32细胞对于每个血清型的允许范围。这可以是结合和进入和/或在细胞内的运输的水平。将这些转导实验重复数次，并且转导与颗粒比保持一致。因此，转导测定例如这个或类似于这个可以仅用作指导或测量工具，以定性测定特定rAAV血清型制剂是否落入由研究者设置的特定接受标准内。如预期的，自互补的rAAV载体比单链rAAV载体更具感染性。如Aucoin等人中所述，由于用于定量感染性的测定的多样性，在出版物之间的转导或感染性数据的比较应小心完成（Aucoin等人，Biotechnol. Adv. 26:73（2008））。
为了证实单链和自互补的rAAV的总体纯度，使用负染色透射电子显微镜检查（TEM）使每个血清型成像（图5）。众所周知当在任何目前生产技术中生产rAAV时，生成大量空颗粒(empty particle)。需要有效地从实心颗粒(full particle)中去除空颗粒的发现操作。负染色TEM是测定空颗粒与实心颗粒比的几种方法之一。空颗粒与实心颗粒不同地吸收负染色（2%乙酸铀），使得能够定量载体制剂中的实心颗粒和空颗粒数目。另一种是基于ELISA的方法，其利用识别实心颗粒和空颗粒的衣壳特异性抗体。qPCR或斑点印迹滴度随后从由ELISA生成的总颗粒滴度中扣除，以测定空衣壳与实心衣壳比。大多数AAV血清型的衣壳抗体仍有待确定且表征用于在ELISA。如图5中包括的表中所示，总体实心颗粒与空颗粒比不小于10，提示纯化处理有效去除空颗粒。负染色TEM图像也用于测定最终贮存溶液防止rAAV颗粒聚集的有效性。明确的是最终贮存缓冲液能够防止rAAV颗粒的聚集，当在体内递送时，所述聚集将最可能影响载体的感染性和传播。
实施例7
由贴壁和悬浮HEK293细胞生成的rAAV的体内比较
使用贴壁HEK293细胞和悬浮HEK293细胞生成AAV6、8和9 CBA-Luc载体。使用CsCl梯度（Grieger等人，Nat. Protoc. 1:1412（2006））纯化贴壁细胞中产生的载体，并且使用本文描述的优化方法纯化悬浮细胞中产生的载体。在体内研究之前，将载体在相同斑点印迹上滴定。用每个载体的系列稀释感染HeLaRC32细胞，并且使用萤光素酶测定定量基因表达。基于体外转导测定，在血清型中的转导在纯化策略之间是几乎相等的。经由尾静脉注射将每个血清型总共1x1011 vg的CBA-Luc载体注射到每只小鼠内。小鼠在注射后一周和一个月成像（图6）。明确的是测试的每个血清型载体的向性和转导概况是相似的，并且不受纯化方法影响。
实施例8
使用波浪生物反应器的rAAV生产
优化使用无动物组分的悬浮培养基在摇瓶中生成rAAV的生产参数。下一个步骤是将优化参数转换至以多种细胞培养体积的波浪生物反应器，以测定可扩大性。表4举例说明生成不同血清型载体的在大小范围从4.3到10升细胞培养的多个波浪生物反应器运行。可能时，转染摇瓶中的1升培养物以充当对照，以比较GFP载体是否产生的转染效率，以及比较纯化后每升培养物的载体生产。转染效率在烧瓶和波浪生物反应器袋之间是几乎相等的。有趣的是，CMV驱动的GFP质粒一致地显示比CBA和小CBA启动子（CBh）驱动的GFP质粒更高百分比的表达GFP的细胞，但每升培养物生成几乎相等的载体产率。这提示CMV和CBA GFP质粒之间的转染效率是相似的，但转染在HEK293细胞中的启动子之间不同。如摇瓶中所示，大多数波浪生物反应器运行生成1x1013纯化的rAAV载体/升培养物，确定在摇瓶中对于转染和rAAV生产优化的参数转换至波浪生物反应器。在大多数10升波浪生物反应器生产运行中，生成大于1x1014纯化的scrAAV载体。当在规模差异中运算因子（factoring）时，大于1x1014纯化的scrAAV将是在波浪生物反应器中以10升培养物体积时生成的（基于表4中的AAV2和AAV9）。
实施例9
rAAV的浓缩
某些临床前和临床应用例如rAAV直接注射到脑或眼内要求低体积/高度浓缩剂量的rAAV。通过使用Sartorius vivaspin柱，优化导致浓缩rAAV的具体条件，伴随很少的颗粒和感染性丧失或无颗粒和感染性丧失，如表5（萤光素酶载体的浓度；浓缩前和浓缩后的载体滴度和感染性（萤光素酶测定）的比较）和表6（GFP载体的浓度；浓缩前和浓缩后的载体滴度和转导单位（HeLaRC32转导测定）的比较）中举例说明的。该柱利用具有100K的分子量截断的PES膜，允许过量液体经过滤器，同时保留rAAV颗粒。测试多种分子量截断大小，但在保留且浓缩rAAV中不是有效的。如表5和6中所示，直接测量相等滴度的浓缩前rAAV与相等滴度的浓缩rAAV。因此，如果观察到转导中的丧失，则浓缩rAAV的相对光单位或转导单位将小于浓缩前的rAAV。在测试几种AAV血清型后，不存在滴度和活性中的显著丧失。因此，浓缩的rAAV具有与浓缩前rAAV几乎相等的活性，指示病毒被有效浓缩。为了证实病毒滴度未改变，通过斑点印迹评价总vg和vg/ml。当总vg保持相同时，vg/ml是相对于体积。因此能够通过经由低速离心去除体积浓缩rAAV载体，利用足够小以保留rAAV的分子量截断过滤系统。与浓缩前和浓缩后滴度相关，图7A和7B中的TEM图像举例说明载体浓度中的增加。最终贮存溶液也能够在1x1013 vg/mL的浓度时防止rAAV颗粒聚集。
实施例10
从悬浮培养基的连续rAAV收获
如在测定从贴壁HEK293细胞中收获AAV的最佳时间点的先前AAV生产出版物中描述的，近来证实何时是从细胞培养基中收获AAV的优化时间点（Lock等人Hum Gene Ther 21:1259（2010）；Vandenberghe等人Hum Gene Ther 21:1251（2010））。为了测定AAV是否可以随着时间过去（累加地）从培养基中收集，我们使用本文描述的优化参数转染30 mL悬浮HEK293细胞培养物，以产生rAAV8和rAAV9 CMV-eGFP载体。转染后四十八小时，通过低速离心使细胞培养物形成沉淀，并且去除培养基用于通过斑点印迹和qPCR滴定DNA酶抗性颗粒。随后将细胞沉淀重悬浮于新鲜的无血清培养基中，并且放回到振荡温箱内用于继续生长和rAAV生产。随后每24小时获得培养基样品，并且每48小时替换培养基。在120小时时间点，由培养基和细胞沉淀测定rAAV8和rAAV9滴度。如图9中所示，rAAV8和rAAV9可以从转染后48小时的培养基中检测且收获，随着时间进展和培养基替换在培养基中发现渐增量的载体。当比较图9中的总产率与48小时细胞沉淀对照时，连续收获法获得分别多6.5和4.8倍的rAAV8和rAAV9载体。这是使用可扩大的无动物组分系统，在转染后的众多时间点从悬浮培养基中收获连续rAAV的首篇报道。该方法随后适应于使用2L灌注波浪生物反应器袋的生物反应器规模。转染1L细胞培养物以生成rAAV8载体。在每个时间点（48、72、96、120和144小时），使用蠕动泵通过在波浪生物反应器袋内的灌注滤器，取出800 mL细胞培养物。随后将800 mL新鲜的无动物组分悬浮细胞培养基加回到波浪袋内。随后使用TFF随后为澄清和柱层析纯化来浓缩收获的培养基。表7显示在特定时间点（48、72、96、120和144小时）来自培养基以及来自144小时细胞沉淀的灌注波浪生物反应器rAAV8载体产率。总体纯化的rAAV8指定48、72、96、120、144小时培养基和144小时细胞沉淀rAAV8产率的总和。通常的rAAV 48小时产率代表在48小时从细胞沉淀收获时，通常对于rAAV8实现的产率范围。如表7中所示，rAAV8可以使用灌注波浪生物反应器袋在所有时间点收获。使用灌注波浪生物反应器袋收获的总rAAV8导致比通常的48小时细胞沉淀产率大5-10倍的产率。这是使用可扩大的无动物组分生产技术和悬浮细胞，在转染后的众多时间点从使用生物反应器的悬浮培养基收获的连续rAAV的首篇报道。这将允许制造商在所有规模上经由单次转染，利用无动物组分的悬浮培养从培养基连续生产、收获且纯化rAAV。这依次又由等量输入质粒生成比标准生产方案更多的rAAV，在所述标准生产方案中，当细胞在转染后48-96小时收获时，生产过程停止。本领域技术人员应当理解为了优于144小时，将需要增加细胞活力且保持在时间点中一致的载体生产。取决于AAV辅助功能和细胞活力，本领域技术人员可以将这扩展至利用可调节系统用于生成rAAV的稳定细胞系的生成，以基于细胞活力和载体产率等打开和关闭生产。
利用AAV的大量I期和II期临床试验已在全世界对于遗传性和获得性疾病进行（Aucoin等人，Biotechnol. Adv. 26:73（2008）；Mueller等人，Gene Ther. 15:858（2008））。临床试验数目中的增加强调建立可扩大的制造技术的需要，所述可扩大的制造技术可以有效生成高滴度、高度纯的和有效数量的AAV，以满足扩大的临床需要。已追求rAAV载体生产的许多方法，其包括含有AAV的rep和cap基因的包装细胞系、稳定原病毒细胞系和多重质粒瞬时转染到贴壁HEK293细胞内。贴壁HEK293细胞的瞬时转染仍是最广泛使用的rAAV生产方法，并且负责在临床前和临床应用中施用的大多数rAAV。下一个步骤是通过转染能够在无动物组分的悬浮条件下生长的HEK293细胞，使瞬时转染技术适应于可扩大技术。少数研究已报道使用悬浮HEK293细胞的rAAV生产（Durocher等人，J. Virol. Meth. 144:32（2007）；Hildinger等人，Biotechnol. Lett. 29:1713（2007）；Park等人，Biotechnol. Bioeng. 94:416（2006）），但载体产率（大约1.4x104和3x104 vg/细胞）仍是悬浮HEK293细胞瞬时转染技术的阻碍。
本公开内容详述了使用HEK293细胞系的强大的可扩大瞬时转染制造技术，所述HEK293细胞系可以在无动物组分的悬浮条件下生长，并且生成比杆状病毒表达载体系统更高的rAAV产率/细胞，和与近期rHSV感染技术可比较的产率/细胞。因高转染效率（>70%）和rAAV载体生产而选择的贴壁HEK293细胞克隆适应于在无动物组分的悬浮条件下生长。筛选许多商购可得的无血清悬浮培养基，以选择支持生长和高转染效率的培养基。发现无动物组分的悬浮培养基支持最佳生长、高转染效率和高rAAV载体产率（表2以及图2和4）。除鉴定优化培养基之外，还优化许多变量。利用优化的参数，能够生成每细胞大于1x105含载体基因组rAAV和从1升细胞培养基的大于1x103纯化的含载体基因组rAAV。这从摇瓶中的30 mL到1 L细胞培养物以及波浪生物反应器袋中直到10 L体积加以验证（参见表3），举例说明该技术是可扩大的。另外，显示rAAV可以在转染后的多个时间点由无动物组分的悬浮培养基连续收获，其使用摇瓶和灌注波浪生物反应器袋显著增加来自相等细胞培养体积和输入质粒的总体rAAV产率。
rAAV通过使用不连续密度梯度随后为柱层析从细胞裂解产物中纯化。优化不连续梯度的装载能力，以测定可以在柱层析前有效澄清（有效去除蛋白质污染物）的裂解产物的最大量。优化柱层析缓冲剂，以开发有效结合且洗脱所有AAV血清型和嵌合衣壳（迄今为止测试的）的通用纯化系统。通过广泛的方法开发工作，能够经由层析缓冲剂的简单操作去除主要和次要蛋白质污染物，而不影响所有AAV血清型和嵌合衣壳的结合和洗脱概况（图3和4中的参考银染色）。通过最可能涉及使用不连续密度梯度和柱层析的方法，去除显著量的空颗粒，在最终产物中留下高百分比的含基因组rAAV（图5）。总之，生成的rAAV是高度纯的，具有高实心衣壳与空衣壳比，并且具有与使用以前的生产（贴壁HEK293细胞）和纯化方法生成的载体（Aucoin等人，Biotechnol. Adv. 26:73（2008））相似的基因组与感染性比（基于GFP荧光计数测定）。
许多可扩大的系统已开发用于生产rAAV，其包括基于腺病毒、基于rHSV、基于BEVS和基于瞬时转染的方法。相比之下，本文的使用悬浮HEK293细胞的可扩大的瞬时转染技术生成比基于腺病毒和BEVS的rAAV技术更多的rAAV和每细胞更多的感染性rAAV，和与基于rHSV的生产技术可比较的产率。此外，使用该系统生成rAAV花费的总体时间是很少的（图8）。
前述是本发明的举例说明，并且不应解释为其限制。本发明通过下述权利要求限定，权利要求的等价物包括在其中。

Claims (16)

1.分离的HEK293细胞，其保藏为ATCC编号PTA-13274。
2.生产AAV颗粒的方法，其包括：
（a）向权利要求1的HEK293细胞提供AAV表达系统；
（b）在其中产生AAV颗粒的条件下培养所述细胞；和
（c）任选分离所述AAV颗粒。
3.权利要求2的方法，其中所述细胞是悬浮培养的。
4.权利要求2或3的方法，其中所述细胞在无动物组分的条件下培养。
5.权利要求2或3的方法，其中步骤（c）包括从所述细胞中分离所述AAV颗粒。
6.权利要求2或3的方法，其中步骤（c）包括从所述细胞在其中培养的培养基中分离所述AAV颗粒。
7.权利要求2或3的方法，其中所述细胞在摇瓶中培养。
8.权利要求2或3的方法，其中所述细胞在生物反应器中培养。
9.权利要求2或3的方法，其中所述方法能够生产所有AAV的血清型、嵌合体和杂交物。
10.权利要求2或3的方法，其中所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12和AAV13或由2.5、2i8、9.45及其他嵌合或杂交衣壳构成的嵌合AAV。
11.权利要求2或3的方法，其中所述AAV表达系统包括包含异源核酸的重组AAV质粒、含rep-cap的包装质粒和腺病毒辅助质粒。
12.权利要求11的方法，其中所述异源核酸是报道分子、治疗、免疫原性或诊断基因。
13.权利要求2或3的方法，其中所述方法提供纯化前每细胞至少4 x 104含载体基因组的颗粒。
14.权利要求2或3的方法，其中所述方法提供纯化前每细胞至少1 x 105含载体基因组的颗粒。
15.权利要求2或3的方法，其中所述方法提供每升细胞培养物至少1 x 1012纯化的含载体基因组的颗粒。
16.权利要求2或3的方法，其中所述方法提供每升细胞培养物至少1 x 1013纯化的含载体基因组的颗粒。
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