CN116479016A - 牛副流感病毒3型全长感染性克隆及其构建方法、用途 - Google Patents

牛副流感病毒3型全长感染性克隆及其构建方法、用途 Download PDF

Info

Publication number
CN116479016A
CN116479016A CN202310366854.0A CN202310366854A CN116479016A CN 116479016 A CN116479016 A CN 116479016A CN 202310366854 A CN202310366854 A CN 202310366854A CN 116479016 A CN116479016 A CN 116479016A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fragment
seq
virus
pcmv
bpiv3
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202310366854.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116479016B (zh
Inventor
杨增岐
韩宇
刘海金
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northwest A&F University
Original Assignee
Northwest A&F University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northwest A&F University filed Critical Northwest A&F University
Priority to CN202310366854.0A priority Critical patent/CN116479016B/zh
Publication of CN116479016A publication Critical patent/CN116479016A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116479016B publication Critical patent/CN116479016B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18611—Respirovirus, e.g. Bovine, human parainfluenza 1,3
    • C12N2760/18622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18611—Respirovirus, e.g. Bovine, human parainfluenza 1,3
    • C12N2760/18634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及病毒构建技术领域，具体涉及一种牛副流感病毒3型全长感染性克隆及其构建方法、用途。该牛副流感病毒3型全长感染性克隆的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。本发明用分离自中国牛群的BPIV3毒株，构建出包含病毒全基因组的感染性克隆质粒，并成功拯救病毒，为开展BPIV3的基础及应用研究提供了技术平台，具有重要的科学价值和应用价值。

Description

牛副流感病毒3型全长感染性克隆及其构建方法、用途
技术领域
本发明涉及病毒构建技术领域，具体涉及一种牛副流感病毒3型全长感染性克隆及其构建方法、用途。
背景技术
牛呼吸道综合征(Bovine respiratory disease complex,BRDC)是引起世界范围内牛呼吸道疾病的主要原因，每年给养牛业造成巨大的经济损失。随着集约化养殖的发展，牛呼吸道疾病已广泛存在于舍饲牛群中。牛副流感病毒(Bovine parainfluenza type3,BPIV3)属副粘病毒科，呼吸道病毒属成员，是牛病毒性呼吸道疾病的主要病原之一。BPIV3感染常发生于秋冬两季，且常与其他急性的呼吸道病毒并发，另外还可引起细菌性疾病的继发感染。流行病学调查显示，目前该病原广泛流行于肉牛及奶牛群中，具有较高的血清阳性率。然而，截至目前在我国尚未有商品化的疫苗和靶向药物用于BPIV3的预防和治疗。因此，基于BPIV3的全长感染性克隆，开展BPIV3致病机制研究以及相关生物制品的研发，将有利于相关研究人员更加深入的了解该病原，从而有利于制定该病的防控政策。
BPIV3的基因组为单股负链RNA，长度约15Kb。基因组包含6个开放型阅读框(ORF)，分别编码NP、P、M、F、HN、L 6个结构蛋白，其中P基因由2个mRNA剪辑编辑位点，编码V、C、D 3个非结构蛋白。病毒的3’端和5’端分别由Leader和Trailer序列构成。根据BPIV3全基因组序列分析显示，BPIV3毒株共分为3个基因型(A、B、C)。目前，我国主要流行的基因型为C型，国内外学者已针对该病毒的生物学特性、致病机理以及相关生物制品的研究等方面做出了一些工作，但是仍然缺乏该病的有效防控手段。病毒的全长感染性克隆是以病毒的遗传物质为基础，体外构建感染性克隆质粒，在细胞或易感宿主体内拯救出活病毒，该技术对病毒生物学特性的研究及疫苗的开发具有重要意义。因此，建立BPIV3的全长感染性克隆，可为研究BPIV3生物学特性以及进行相关生物制品的研发提供重要的技术支撑。
发明内容
基于以上技术问题，本发明提供一种BPIV3全长感染性克隆。本发明用一株分离自中国牛群的BPIV3毒株，构建出包含病毒全基因组的感染性克隆质粒，并成功拯救病毒。本发明为开展BPIV3的基础及应用研究提供了技术平台，具有重要的科学价值。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
本发明第一个目的，提供一种牛副流感病毒3型全长感染性克隆，其核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
本发明第二个目的，提供一种牛副流感病毒3型全长感染性克隆的构建方法，是将BPIV3-SX-2021株病毒全基因组341bp位置处将C突变为A。
优选地，所述牛副流感病毒3型全长感染性克隆的构建方法包括以下步骤：
S1、将BPIV3-SX-2021株病毒全基因组序列分为6段进行扩增，将扩增的片段克隆至pCMV-add载体中，获得包含BPIV3全长基因组的质粒pBPIV3-SX；
所述pCMV-add载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；
S2、以质粒pBPIV3-SX为模板，分别扩增BPIV3-SX-2021株病毒的核蛋白、磷蛋白、大聚合酶蛋白基因序列，并将扩增片段分别克隆至pCI-neo真核表达质粒中，获得三种辅助质粒；
S3、将所述质粒pBPIV3-SX及三种所述辅助质粒共同转染细胞，病毒拯救后获得牛副流感病毒3型全长感染性克隆；
S1中，扩增用的6对引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
优选地，所述质粒pBPIV3-SX的具体构建过程为：
S11、提取BPIV3-SX-2021的RNA，经反转录获得cDNA，以cDNA为模板，分别用扩增引物进行PCR扩增，分别得到A片段、B片段、C片段、D片段、E片段、F片段；
S12、将A片段克隆至pCMV-add载体的BsshII和KpnI限制性酶切位点处，获得重组质粒pCMV-A；将B片段与重组质粒pCMV-A分别用KpnI和PacI进行双酶切，连接获得重组质粒pCMV-AB；将C片段和重组质粒pCMV-AB分别用PacI和RsrII进行双酶切，连接获得含BPIV3部分基因组的克隆质粒pCMV-ABC；
将F片段克隆至pCMV的SacII和RsrII限制性酶切位点处，获得重组质粒pCMV-F；将E片段与重组质粒pCMV-F分别用Nhel及Sacll进行双酶切，连接获得重组质粒pCMV-EF；将D片段和重组质粒pCMV-EF分别用Sacll及Pstl进行双酶切，连接获得含BPIV3部分基因组的克隆质粒pCMV-DEF；
S13、将pCMV-DEF用NcoI和RsrII进行双酶切，回收含有D片段、E片段及F片段的目的片段；将pCMV-ABC用NcoI和RsrII进行双酶切，回收含有A片段、B片段及C片段的目的片段，将两个目的片段进行连接，获得包含BPIV3全基因组的重组质粒pBPIV3-SX。
优选地，S11中，获得A片段、B片段、C片段、D片段、E片段、F片段后，在A片段N端引入BsshII限制性酶切位点和T7 RNA聚合酶的启动子序列，在F片段C端引入RsrII限制性酶切位点和HDV核酶的部分序列，再用S1-NcoI-F/R将A片段中的NcoI酶切位点通过融合PCR进行同义突变，用S2-NcoI-F/R引物将B片段中的NcoI酶切位点通过融合PCR进行同义突变；
其中，S1-NcoI-F/R引物和S2-NcoI-F/R引物分别如SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。
优选地，S2中，所述核蛋白的扩增引物为SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示，所述磷蛋白的扩增引物为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示，所述大聚合酶蛋白的扩增引物为SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示。
优选地，S1与S2中，PCR扩增程序均为：98℃预变性10s，55℃变性15s，72℃复性延伸30s，共35个循环；
PCR反应体系均为：Prime-F/R各1.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL，cDNA2μL，H2O 20μL。
本发明第三个目的，提供一种所述牛副流感病毒3型全长感染性克隆在制备牛副流感病毒疫苗中的用途。
本发明第四个目的，提供一种所述牛副流感病毒3型全长感染性克隆在构建荧光病毒中的用途。
本发明第五个目的，提供一种所述牛副流感病毒3型全长感染性克隆在抗病毒药物筛选中的用途。
对比现有技术，本发明的有益效果为：
本发明用分离自中国牛群的BPIV3毒株，构建出包含病毒全基因组的感染性克隆质粒，并成功拯救病毒，为开展BPIV3的基础及应用研究提供了技术平台，具有重要的科学价值和应用价值。
附图说明
图1为BPIV3全长感染性克隆基因组及辅助质粒构建示意图；A、BPIV3全长感染性克隆基因组构建；B、辅助质粒构建；
图2为病毒感染MDBK细胞：rBPIV3-SX重组病毒感染MDBK细胞(10X)；BPIV3-SX-2021病毒感染MDBK细胞(10X)；正常MDBK细胞(10X)；
图3为分子遗传标记的酶切鉴定：NcoI单酶切鉴定；
图4为分子遗传标记测序鉴定；
图5为病毒感染MDBK细胞使用NP蛋白多克隆抗体IFA检测：rBPIV3-SX感染MDBK细胞；BPIV3-SX-2021感染MDBK细胞；正常MDBK细胞；
图6为rBPIV3-SX与BPIV3-SX-2021感染MDBK细胞，Western-blot检测分析结果；
图7为rBPIV3-SX和BPIV3-SX-2021在MDBK细胞上的生长动力学曲线；
图8为pBPIV3-SX-EGFP构建示意图；
图9为rBPIV3-SX-EGFP重组病毒的IFA鉴定；
图10为利巴韦林对MDBK细胞安全药物浓度测定；
图11为不同浓度利巴韦林处理下BPIV3复制荧光图；
图12为不同浓度利巴韦林处理BPIV3病毒滴度检测图。
具体实施方式
以下具体实施方式是对本发明提供的方法与计划方案的进一步说明，但不应理解成对本发明的限制。
实施例1
牛副流感病毒全长感染性克隆构建
1、材料与方法
1.1、病毒、细胞、质粒及抗体
BHK-21细胞和MDBK细胞及BPIV3-SX-2021(Genebank：ON804787)均由本实验室保存。用于构建全长基因组cDNA的克隆质粒pCMV-add、用于构建辅助质粒pCI-neo载体以及包含T7RNA聚合酶序列的pCAGGS-T7质粒均由本实验室保存。BPIV3 NP蛋白多克隆抗体由本实验室制备并保存。
1.2、主要试剂
各种限制性内切酶及T4连接酶购自美国NEB公司；转染试剂TurboFectTMTransfection Reagent购自Thermo Fisher Scientific公司；Opti-MEM、胎牛血清、DMEM购自Gibco公司；PrimerSTAR MAX高保真聚合酶、Trizol RNAiso Plus购自TaKaRa宝日医生物公司；StarPrep快速DNA胶回收试剂盒购自北京康润生物(Genestar)；质粒小量提取试剂盒购自天根公司；
1.3、主要仪器
超净工作台(济南鑫贝西BIOBASE BBS-DDC)；紫外凝胶成像仪(英国Syngene)；蛋白电泳仪(北京君意东方)；倒置荧光显微镜(OLYMPUS DP80)；高压蒸汽灭菌锅(上海博讯)；普通PCR仪(博日TC-XP)。
1.4、引物设计
通过SnapGene软件对BPIV3-SX-2021株病毒(其核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示)全基因组序列进行分析，根据其酶切位点将全基因组序列分为6个基因片段，并设计6对特异性引物对病毒的全基因组序列进行分段扩增。其中片段A上游引物引入BsshII限制性酶切位点和T7 RNA聚合酶的启动子序列，片段F下游引入RsrII限制性酶切位点和HDV核酶的部分序列。分段构建全长质粒需使用NcoI限制性酶切位点进行连接，因此将片段A和片段B中的NcoI酶切位点通过融合PCR进行同义突变，引物送至西安擎科生物有限公司合成(表1)。
表1全长感染性克隆构建以及鉴定所需引物
1.5、pBPIV3-SX重组质粒的构建
首先，按照Trizol RNAiso Plus试剂说明书提取BPIV3-SX-2021的RNA，然后按照StarScript II First-strand cDNA Synthesis Mix反转试剂盒说明书操作，得到cDNA。以cDNA为模板，分别用引物S1、S2、S3、S4、S5、S6进行PCR扩增(PCR扩增程序为：98℃预变性10s，55℃变性15s，72℃复性延伸30s，共35个循环；PCR反应体系为：Prime-F/R各1.5μL，PrimerSTARMix 25μL，cDNA 2μL，H2O 20μL)，得到A、B、C、D、E、F片段，同时在A片段N端引入BsshII限制性酶切位点和T7 RNA聚合酶的启动子序列(其中，T7 RNA聚合酶的启动子序列靠近片段A的N端)，在F片段C端引入RsrII限制性酶切位点和HDV核酶的部分序列(HDV核酶的部分序列如SEQ ID No.26所示，HDV核酶的部分序列更靠近片段B的C端)。然后用S1-NcoI-F/R引物通过点突变的方法将A片段中的NcoI酶切位点进行定点消除，用S2-NcoI-F/R引物通过点突变的方法将B片段中的NcoI酶切位点进行定点消除，对A片段及B片段中NcoI酶切位点进行定点消除是用于全长的连接。凝胶纯化回收A、B、C、D、E、F片段保存备用。，
将回收纯化后的A片段克隆至pCMV-add载体的BsshII和KpnI限制性酶切位点处(该pCMV-add载体是以pBluescript SK质粒为骨架，将T7启动子替换为CMV启动子，并引入HDV ribozyme序列后得到，pCMV-add载体的核苷酸序列如SEQ ID No.27所示)，获得重组质粒pCMV-A。其次，将纯化后的B片段和pCMV-A用KpnI和PacI进行双酶切，连接获得重组质粒pCMV-AB。最后，将C片段与pCMV-AB用PacI和RsrII进行双酶切，连接获得含BPIV3部分基因组的克隆质粒pCMV-ABC。将回收纯化后的F片段克隆至pCMV的SacII和RsrII限制性酶切位点处，获得重组质粒pCMV-F。其次，将纯化后的E片段和pCMV-F用Nhel限制性酶及Sacll限制性酶双酶切，连接获得重组质粒pCMV-EF。最后，将D片段与pCMV-EF用Sacll限制性酶及Pstl限制性酶进行双酶切，连接获得含BPIV3部分基因组的克隆质粒pCMV-DEF。最后，将pCMV-DEF和pCMV-ABC用NcoI和RsrII进行双酶切，回收包含DEF基因组的片段和与线性化的pCMV-ABC进行连接，从而获得包含BPIV3全基因组的重组质粒pBPIV3-SX(图1A)。将其送至西安擎科生物有限公司进行全长测序。
实施例2
重组病毒拯救
1、辅助质粒的构建
以质粒pBPIV3-SX为模板，分别扩增BPIV3-SX-2021株病毒的核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、大聚合酶蛋白(L)基因序列，并将扩增片段分别克隆至pCI-neo真核表达质粒中，获得辅助质粒：
以实施例1中包含BPIV3全基因组质粒pBPIV3-SX为模板，分别用NP、P、L三对特异性引物(引物序列见表1)进行扩增(PCR扩增程序为：98℃预变性10s，55℃变性15s，72℃复性延伸30s，共35个循环；PCR反应体系为：Prime-F/R各1.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL，cDNA2μL，H2O 20μL)，分别获得NP片段、P片段、L片段，使用Nhel限制性酶及Notl限制性酶通过酶切连接的方法将NP片段克隆至pCI-neo真核表达质粒，获得辅助质粒pCI-NP；使用Nhel限制性酶及Notl限制性酶通过酶切连接的方法将P片段克隆至pCI-neo真核表达质粒，获得辅助质粒pCI-P；使用Xhol限制性酶及Notl限制性酶通过酶切连接的方法将L片段克隆至pCI-neo真核表达质粒，获得辅助质粒pCI-L(图1B)。
2、重组病毒的拯救
将所述质粒pBPIV3-SX及所述辅助质粒共同转染细胞，病毒拯救后获得牛副流感病毒3型全长感染性克隆(即重组病毒/拯救病毒)：
参照Turbofect转染试剂盒说明书进行转染操作，具体步骤如下：转染前一天将BHK-21细胞铺至12孔细胞培养板，使细胞汇合度在12h后达到70％～80％。用200μLOpti-MEM与3μLTurbofect转染试剂在1.5mL离心管中充分混匀，然后加入0.5μg pBPIV3-SX、0.5μgpCGSSS-T7(其是将T7RANA聚合酶序列克隆至pCAGGS真核载体中获得)、0.1μg pCI-NP、0.05μg pCI-P、0.35μg pCI-L重组质粒充分混匀，室温孵育15min。弃掉12孔板中10％FBS培养基，用无菌PBS冲洗细胞3次，加500μL Opti-MEM。将DNA-脂质体复合物转染至BHK-21细胞。同时设置正常细胞作为阴性对照。转染6h后弃液，并加入含2％胎牛血清的DMEM置于37℃、5％CO2培养箱继续培养，72h后收取转染细胞记为F0代，置于-70℃反复冻融3次。取F0代细胞液离心收取细胞上清，将200μL细胞上清接种至MDBK细胞，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养，每天观察细胞，并在72h后收获细胞液计为F1代。按照此方法进行逐代盲传，直至产生明显致细胞病变(Cytopathic Effect,CPE)。
结果显示，随着代次升高，出现CPE的时间逐渐变短，病变程度愈加明显。盲传至F1代时，出现明显CPE，细胞出现圆缩，脱落，得到重组病毒(图2)，即牛副流感病毒3型全长感染性克隆，其核苷酸序列如SEQ ID No.25所示。
在构建牛副流感病毒3型全长感染性克隆时在BPIV3-SX-2021株病毒基因组341bp位置处将C突变为A，使CCATGG(NcoI)变为CAATGG(NcoI)从而消除NcoI酶切位点，同时可用于区别亲本病毒的分子遗传标记。
3、拯救病毒的鉴定
按照1.5步骤提取亲本病毒(BPIV3-SX-2021株病毒)RNA，选用NCO-F和NCO-R引物(引物序列见表1)对亲本病毒进行PCR扩增；
按照1.5步骤提取拯救病毒RNA，选用NCO-F和NCO-R引物(引物序列见表1)对拯救病毒进行PCR扩增；
PCR反应体系：PrimeScript 1Step Enzyme Mix 2μL、2×1Step Buffer 25μL、上游Primer(20μM)1μL、下游Primer(20μM)1μL、RNA 1μL、ddH2O 20μL。
PCR反应程序：42℃反转录30min，95℃预变性5min，循环参数为95℃变性5s，52.5℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环，72℃终延伸10min。反应结束后，取5μL产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书回收目的基因的PCR产物，送至上海生工生物公司进行测序鉴定，同时用NcoI酶切PCR产物，酶切体系：NEB Buffer 2.15μL、纯化的PCR产物3μL、限制性内切酶NcoI 1μL、ddH2O 41μL。37℃酶切2h后，进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1％琼脂糖凝胶电泳结果显示，拯救病毒的核酸不能被切开，而亲本病毒的PCR产物被切成预期大小为402bp和230bp的两个条带，结果见图(3)。同时将PCR产物胶回收后测序，结果显示拯救病毒不包含NcoI酶切位点，而亲本病毒存在该酶切位点(图4)。因此，拯救病毒不是来自亲本病毒污染。
4、间接免疫荧光检测
以NP蛋白多克隆抗体为一抗与拯救病毒进行间接免疫荧光试验，操作步骤如下：将拯救病毒与亲本病毒(MOI＝0.1)分别接种MDBK细胞，同时设置正常细胞作为阴性对照。培养24h后，弃掉培养基，并用PBS漂洗细胞。每孔加入1mL 4％的多聚甲醛固定液并置于室温固定15min。弃掉固定液，并用PBST漂洗细胞3次。加入0.1％TX-100室温下作用5min使细胞膜通透。加入含1％BSA的PBST封闭液置于37℃封闭1h。以BPIV3 NP蛋白鼠源多克隆阳性血(1∶200)作为一抗，37℃孵育1h，用PBST漂洗3次，加入Alexa Fluor488标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶500)，37℃孵育1h，PBS漂洗3次，加DAPI染核，PBS洗涤后加50％甘油封片，置于倒置荧光显微镜观察并拍照。
基于NP蛋白抗体的间接免疫荧光结果显示，拯救病毒rBPIV3-SX和亲本病毒感染MDBK细胞后检测到特异性荧光，而细胞对照未观察到荧光，表示拯救病毒是BPIV3病毒(图5)。
5、拯救病毒蛋白免疫印迹试(Western-blot)试验
以NP蛋白多克隆阳性血清为一抗与拯救病毒进行蛋白免疫印迹试验，操作步骤如下：将拯救病毒和亲本病毒按MOI＝0.1接种至MDBK细胞，24h后收获细胞样品后加入5×Loading buffer充分混匀，置于100℃金属浴加热，使蛋白质变性。取10μL蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，随后采用湿转法将目的蛋白转移至PVDF膜上，用5％的脱脂乳37℃封闭1h，之后用TBST洗涤3次，每次5min。用BPIV3 NP鼠源多克隆阳性血清(1:1000)作为一抗，4℃过夜孵育，TBST洗涤3次。随后加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶5000)，室温孵育1h，TBST洗涤3次。最后用ECL显色试剂盒进行显色拍照。
结果显示，在69KDa处呈现特异性反应条带，与NP蛋白在病毒中表达的大小一致(图6)。
6、生长曲线测定
将拯救病毒与亲本病毒按照MOI＝0.01接种MDBK细胞，病毒吸附1h后弃上清，用无菌PBS漂洗3次，加入含有2％FBS的DMEM培养。分别在12h，24h，36h，18h，60h和72h收获细胞上清，并测定每个收获时间段的TCID50。以病毒不同的收获时间点为横坐标，对应时间点病毒的TCID50为纵坐标，绘制病毒生长曲线。
结果显示拯救病毒和亲本病毒具有相似的复制能力和增值特性，均在60h达到最高的滴度(图7)。
实施例3
构建携带EGFP基因的牛副流感病毒全长感染性克隆
将EGFP基因插入到BPIV3的P基因和M基因之间，具体是按照以下步骤进行操作：
以实施例1中pIRES2-EGFP质粒为模板，扩增EGFP片段(扩增引物序列为EGFP-1-F/R)。同时以pBPIV3-SX质粒为模板，扩增包含S1、S2片段N端部分序列(扩增引物序列为S1-F/EGFP-2R)和S2片段C(扩增引物序列为EGFP-2F/S2-R)端部分序列。将3个片段通过融合PCR的方法进行拼接，然后使用BssHII和PacI分别对该片段和pBPIV3-SX质粒均进行双酶切，将含有EGFP的S1和S2片段替换至pBPIV3-SX中，从而获得pBPIV3-SX-EGFP(图8)。EGFP-1-F/R、EGFP-2-F/R的序列如下所示：
EGFP-1F：GCCAATCAGTCCCTCGACAAAccgccaccATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG，如SEQ IDNO.所示；
EGFP-1R：CTCCTCGCCCTTGCTCACCATggtggcggTTTGTCGAGGGACTGATTGGC，如SEQ IDNO.所示；
EGFP-2F：ATGGACGAGCTGTACAAGTAGACAGCCAAATGACAATCACC，如SEQ ID NO.所示；
EGFP-2R：GGTGATTGTCATTTGGCTGTCTACTTGTACAGCTCGTCCAT，如SEQ ID NO.所示。
将pBPIV3-SX-EGFP和辅助质粒共转染至BHK-21细胞中，经MDBK细胞盲传，获得携带EGFP基因的重组病毒，命名为rBPIV3-SX-EGFP(图9)。
实施例4
rBPIV3-SX-EGFP在抗病毒药物筛选中的应用
1、利巴韦林对MDBK细胞的毒性分析
在96孔板中接种MDBK细胞，待细胞密度达到80％～90％，弃掉孔中的细胞培养基，换做含不同浓度利巴韦林(2、4、8、16μM)的细胞维持液，培养24h后，参照CCK8说明书测定吸光值，计算利巴韦林对MDBK细胞的药物安全浓度(图10)。
2、利巴韦林对rBPIV3-SX-EGFP的抑制作用
在24孔板中接种MDBK细胞过夜培养，待细胞密度达到80％～90％，弃掉细胞培养基，接种实施例2得到的rBPIV3-SX-EGFP(MOI＝1)病毒，37℃吸附1h后弃掉病毒液，更换含不同浓度利巴韦林的维持液。24h后，置于倒置荧光显微镜下观察(图11)，并收集不同药物浓度的细胞培养液进行病毒滴度测定(图12)。
结果显示，随着利巴韦林浓度的逐渐增加，其抑制BPIV3复制能力逐渐增强，表明利巴韦林与BPIV3抑制关系呈剂量依赖性。表明本发明所构建的rBPIV3-SX-EGFP可用于抗BPIV3药物筛选研究。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种牛副流感病毒3型全长感染性克隆，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
2.一种权利要求1所述的牛副流感病毒3型全长感染性克隆的构建方法，其特征在于，是将BPIV3-SX-2021株病毒全基因组在341bp位置处将C突变为A。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将BPIV3-SX-2021株病毒全基因组序列分为6段进行扩增，将扩增的片段克隆至pCMV-add载体中，获得包含BPIV3全长基因组的质粒pBPIV3-SX；
所述pCMV-add载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；
S2、以质粒pBPIV3-SX为模板，分别扩增BPIV3-SX-2021株病毒的核蛋白、磷蛋白、大聚合酶蛋白基因序列，并将扩增片段分别克隆至pCI-neo真核表达质粒中，获得三种辅助质粒；
S3、将所述质粒pBPIV3-SX及三种所述辅助质粒共同转染细胞，病毒拯救后获得牛副流感病毒3型全长感染性克隆；
S1中，扩增用的6对引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述质粒pBPIV3-SX的具体构建过程为：
S11、提取BPIV3-SX-2021的RNA，经反转录获得cDNA，以cDNA为模板，分别用扩增引物进行PCR扩增，分别得到A片段、B片段、C片段、D片段、E片段、F片段；
S12、将A片段克隆至pCMV-add载体的BsshII和KpnI限制性酶切位点处，获得重组质粒pCMV-A；将B片段与重组质粒pCMV-A分别用KpnI和PacI进行双酶切，连接获得重组质粒pCMV-AB；将C片段和重组质粒pCMV-AB分别用PacI和RsrII进行双酶切，连接获得含BPIV3部分基因组的克隆质粒pCMV-ABC；
将F片段克隆至pCMV的SacII和RsrII限制性酶切位点处，获得重组质粒pCMV-F；将E片段与重组质粒pCMV-F分别用Nhel及Sacll进行双酶切，连接获得重组质粒pCMV-EF；将D片段和重组质粒pCMV-EF分别用Sacll及Pstl进行双酶切，连接获得含BPIV3部分基因组的克隆质粒pCMV-DEF；
S13、将pCMV-DEF用NcoI和RsrII进行双酶切，回收含有D片段、E片段及F片段的目的片段；将pCMV-ABC用NcoI和RsrII进行双酶切，回收含有A片段、B片段及C片段的目的片段，将两个目的片段进行连接，获得包含BPIV3全基因组的重组质粒pBPIV3-SX。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，S11中，获得A片段、B片段、C片段、D片段、E片段、F片段后，在A片段N端引入BsshII限制性酶切位点和T7 RNA聚合酶的启动子序列，在F片段C端引入RsrII限制性酶切位点和HDV核酶的部分序列，再用S1-NcoI-F/R将A片段中的NcoI酶切位点通过融合PCR进行同义突变，用S2-NcoI-F/R引物将B片段中的NcoI酶切位点通过融合PCR进行同义突变；
其中，S1-NcoI-F/R引物分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，S2-NcoI-F/R引物分别如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。
6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，S2中，所述核蛋白的扩增引物为SEQID NO.19和SEQ ID NO.20所示，所述磷蛋白的扩增引物为SEQ IDNO.21和SEQ ID NO.22所示，所述大聚合酶蛋白的扩增引物为SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示。
7.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，S1与S2中，PCR扩增程序均为：98℃预变性10s，55℃变性15s，72℃复性延伸30s，共35个循环；
PCR反应体系均为：Prime-F/R各1.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL，cDNA2μL，H2O 20μL。
8.一种权利要求1所述的牛副流感病毒3型全长感染性克隆在制备牛副流感病毒疫苗中的用途。
9.一种权利要求1所述的牛副流感病毒3型全长感染性克隆在构建荧光病毒中的用途。
10.一种权利要求1所述的牛副流感病毒3型全长感染性克隆在抗病毒药物筛选中的用途。
CN202310366854.0A 2023-04-07 2023-04-07 牛副流感病毒3型全长感染性克隆及其构建方法、用途 Active CN116479016B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310366854.0A CN116479016B (zh) 2023-04-07 2023-04-07 牛副流感病毒3型全长感染性克隆及其构建方法、用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310366854.0A CN116479016B (zh) 2023-04-07 2023-04-07 牛副流感病毒3型全长感染性克隆及其构建方法、用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116479016A true CN116479016A (zh) 2023-07-25
CN116479016B CN116479016B (zh) 2024-05-17

Family

ID=87224292

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310366854.0A Active CN116479016B (zh) 2023-04-07 2023-04-07 牛副流感病毒3型全长感染性克隆及其构建方法、用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116479016B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7201907B1 (en) * 1997-05-23 2007-04-10 The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus(PIV) vaccines
CN113736799A (zh) * 2021-09-17 2021-12-03 江苏省农业科学院 山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆构建方法及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7201907B1 (en) * 1997-05-23 2007-04-10 The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus(PIV) vaccines
CN113736799A (zh) * 2021-09-17 2021-12-03 江苏省农业科学院 山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆构建方法及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAN, Y.: "Bovine respirovirus 3 strain SX2021, complete genome", GENBANK: ON804787.1, 5 February 2023 (2023-02-05) *
XU WANG等: "A Isolation, Identification, and Genetic Phylogenetic Analysis of Two Different Genotypes of Bovine Parainfluenza 3 Virus in China", VIRUSES, vol. 14, no. 10, 9 October 2022 (2022-10-09), pages 2 - 10 *
蒋磊: "牛副流感病毒3型研究进展", 湖南畜牧兽医, no. 6, 30 June 2022 (2022-06-30), pages 40 - 43 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116479016B (zh) 2024-05-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106755089B (zh) 表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系及其构建方法与应用
CN107164409B (zh) 犬瘟热病毒敏感细胞系slam-mdck及其构建方法和应用
CN110951699B (zh) 表达犬瘟热病毒结构蛋白的重组狂犬病病毒及其应用
CN111733187B (zh) 一种wpre突变体病毒载体及其应用
CN110951778B (zh) 犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆及其构建方法和应用
CN112458064A (zh) 盖他病毒全长感染性克隆、复制子系统及其制备和应用
CN111471709A (zh) 一种基于dna质粒转染的拯救pedv zju/g2/2013株的反向遗传系统
CN110468155B (zh) 一种用于拯救猪肠道甲型冠状病毒的系统、方法及应用
CN109136200B (zh) 一种重组传染性造血器官坏死病毒及其构建方法与应用
WO2022262206A1 (zh) Gmp级逆转录病毒载体的纯化方法与应用
CN116479016B (zh) 牛副流感病毒3型全长感染性克隆及其构建方法、用途
CN116790508A (zh) 一种稳定表达赤羽病病毒核衣壳蛋白的重组bhk-21细胞系及其构建方法和应用
CN117286111A (zh) 牛冠状病毒分离株、稳定表达牛冠状病毒n蛋白细胞系及在构建反向遗传操作系统中的应用
CN113736799B (zh) 山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆构建方法及其应用
CN107201371B (zh) 一种携带去优化m基因和两个g基因的重组狂犬病病毒
CN115948343A (zh) 表达狂犬病病毒糖蛋白的稳转细胞株及其构建方法与应用
CN112301042B (zh) A型塞内卡病毒全长感染性cDNA克隆及其构建方法及应用
CN104694561B (zh) 表达海肾或萤火虫荧光素酶基因的prrsv重组质粒的构建方法以及应用
Moroz et al. A Method for the Production of Recombinant VSVs with Confirmation of Biological Activity
CN114381437A (zh) 一种利用可诱导表达狂犬病病毒蛋白的稳定细胞系生产狂犬病病毒假病毒系统的方法
US20100143889A1 (en) Rhabdoviridae virus preparations
CN112522204A (zh) 一种重组marc-145细胞及其构建方法和应用
CN107034232B (zh) Atg16l1基因在增强新城疫病毒的复制能力中的用途
CN110904056A (zh) 一种传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a及其构建方法和应用
CN105749272B (zh) 表达大熊猫犬瘟热病毒h、f基因重组山羊痘病毒的疫苗、其制备方法及免疫应用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant