CN116479016A - 牛副流感病毒3型全长感染性克隆及其构建方法、用途 - Google Patents

牛副流感病毒3型全长感染性克隆及其构建方法、用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及病毒构建技术领域，具体涉及一种牛副流感病毒3型全长感染性克隆及其构建方法、用途。该牛副流感病毒3型全长感染性克隆的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。本发明用分离自中国牛群的BPIV3毒株，构建出包含病毒全基因组的感染性克隆质粒，并成功拯救病毒，为开展BPIV3的基础及应用研究提供了技术平台，具有重要的科学价值和应用价值。

Description

牛副流感病毒3型全长感染性克隆及其构建方法、用途
技术领域
本发明涉及病毒构建技术领域，具体涉及一种牛副流感病毒3型全长感染性克隆及其构建方法、用途。
背景技术
牛呼吸道综合征(Bovine respiratory disease complex,BRDC)是引起世界范围内牛呼吸道疾病的主要原因，每年给养牛业造成巨大的经济损失。随着集约化养殖的发展，牛呼吸道疾病已广泛存在于舍饲牛群中。牛副流感病毒(Bovine parainfluenza type3,BPIV3)属副粘病毒科，呼吸道病毒属成员，是牛病毒性呼吸道疾病的主要病原之一。BPIV3感染常发生于秋冬两季，且常与其他急性的呼吸道病毒并发，另外还可引起细菌性疾病的继发感染。流行病学调查显示，目前该病原广泛流行于肉牛及奶牛群中，具有较高的血清阳性率。然而，截至目前在我国尚未有商品化的疫苗和靶向药物用于BPIV3的预防和治疗。因此，基于BPIV3的全长感染性克隆，开展BPIV3致病机制研究以及相关生物制品的研发，将有利于相关研究人员更加深入的了解该病原，从而有利于制定该病的防控政策。
BPIV3的基因组为单股负链RNA，长度约15Kb。基因组包含6个开放型阅读框(ORF)，分别编码NP、P、M、F、HN、L 6个结构蛋白，其中P基因由2个mRNA剪辑编辑位点，编码V、C、D 3个非结构蛋白。病毒的3’端和5’端分别由Leader和Trailer序列构成。根据BPIV3全基因组序列分析显示，BPIV3毒株共分为3个基因型(A、B、C)。目前，我国主要流行的基因型为C型，国内外学者已针对该病毒的生物学特性、致病机理以及相关生物制品的研究等方面做出了一些工作，但是仍然缺乏该病的有效防控手段。病毒的全长感染性克隆是以病毒的遗传物质为基础，体外构建感染性克隆质粒，在细胞或易感宿主体内拯救出活病毒，该技术对病毒生物学特性的研究及疫苗的开发具有重要意义。因此，建立BPIV3的全长感染性克隆，可为研究BPIV3生物学特性以及进行相关生物制品的研发提供重要的技术支撑。
发明内容
基于以上技术问题，本发明提供一种BPIV3全长感染性克隆。本发明用一株分离自中国牛群的BPIV3毒株，构建出包含病毒全基因组的感染性克隆质粒，并成功拯救病毒。本发明为开展BPIV3的基础及应用研究提供了技术平台，具有重要的科学价值。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
本发明第一个目的，提供一种牛副流感病毒3型全长感染性克隆，其核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
本发明第二个目的，提供一种牛副流感病毒3型全长感染性克隆的构建方法，是将BPIV3-SX-2021株病毒全基因组341bp位置处将C突变为A。
优选地，所述牛副流感病毒3型全长感染性克隆的构建方法包括以下步骤：
S1、将BPIV3-SX-2021株病毒全基因组序列分为6段进行扩增，将扩增的片段克隆至pCMV-add载体中，获得包含BPIV3全长基因组的质粒pBPIV3-SX；
所述pCMV-add载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；
S2、以质粒pBPIV3-SX为模板，分别扩增BPIV3-SX-2021株病毒的核蛋白、磷蛋白、大聚合酶蛋白基因序列，并将扩增片段分别克隆至pCI-neo真核表达质粒中，获得三种辅助质粒；
S3、将所述质粒pBPIV3-SX及三种所述辅助质粒共同转染细胞，病毒拯救后获得牛副流感病毒3型全长感染性克隆；
S1中，扩增用的6对引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
优选地，所述质粒pBPIV3-SX的具体构建过程为：
S11、提取BPIV3-SX-2021的RNA，经反转录获得cDNA，以cDNA为模板，分别用扩增引物进行PCR扩增，分别得到A片段、B片段、C片段、D片段、E片段、F片段；
S12、将A片段克隆至pCMV-add载体的BsshII和KpnI限制性酶切位点处，获得重组质粒pCMV-A；将B片段与重组质粒pCMV-A分别用KpnI和PacI进行双酶切，连接获得重组质粒pCMV-AB；将C片段和重组质粒pCMV-AB分别用PacI和RsrII进行双酶切，连接获得含BPIV3部分基因组的克隆质粒pCMV-ABC；
将F片段克隆至pCMV的SacII和RsrII限制性酶切位点处，获得重组质粒pCMV-F；将E片段与重组质粒pCMV-F分别用Nhel及Sacll进行双酶切，连接获得重组质粒pCMV-EF；将D片段和重组质粒pCMV-EF分别用Sacll及Pstl进行双酶切，连接获得含BPIV3部分基因组的克隆质粒pCMV-DEF；
S13、将pCMV-DEF用NcoI和RsrII进行双酶切，回收含有D片段、E片段及F片段的目的片段；将pCMV-ABC用NcoI和RsrII进行双酶切，回收含有A片段、B片段及C片段的目的片段，将两个目的片段进行连接，获得包含BPIV3全基因组的重组质粒pBPIV3-SX。
优选地，S11中，获得A片段、B片段、C片段、D片段、E片段、F片段后，在A片段N端引入BsshII限制性酶切位点和T7 RNA聚合酶的启动子序列，在F片段C端引入RsrII限制性酶切位点和HDV核酶的部分序列，再用S1-NcoI-F/R将A片段中的NcoI酶切位点通过融合PCR进行同义突变，用S2-NcoI-F/R引物将B片段中的NcoI酶切位点通过融合PCR进行同义突变；
其中，S1-NcoI-F/R引物和S2-NcoI-F/R引物分别如SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。
优选地，S2中，所述核蛋白的扩增引物为SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示，所述磷蛋白的扩增引物为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示，所述大聚合酶蛋白的扩增引物为SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示。
优选地，S1与S2中，PCR扩增程序均为：98℃预变性10s，55℃变性15s，72℃复性延伸30s，共35个循环；
PCR反应体系均为：Prime-F/R各1.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL，cDNA2μL，H2O 20μL。
本发明第三个目的，提供一种所述牛副流感病毒3型全长感染性克隆在制备牛副流感病毒疫苗中的用途。
本发明第四个目的，提供一种所述牛副流感病毒3型全长感染性克隆在构建荧光病毒中的用途。
本发明第五个目的，提供一种所述牛副流感病毒3型全长感染性克隆在抗病毒药物筛选中的用途。
对比现有技术，本发明的有益效果为：
本发明用分离自中国牛群的BPIV3毒株，构建出包含病毒全基因组的感染性克隆质粒，并成功拯救病毒，为开展BPIV3的基础及应用研究提供了技术平台，具有重要的科学价值和应用价值。
附图说明
图1为BPIV3全长感染性克隆基因组及辅助质粒构建示意图；A、BPIV3全长感染性克隆基因组构建；B、辅助质粒构建；
图2为病毒感染MDBK细胞：rBPIV3-SX重组病毒感染MDBK细胞(10X)；BPIV3-SX-2021病毒感染MDBK细胞(10X)；正常MDBK细胞(10X)；
图3为分子遗传标记的酶切鉴定：NcoI单酶切鉴定；
图4为分子遗传标记测序鉴定；
图5为病毒感染MDBK细胞使用NP蛋白多克隆抗体IFA检测：rBPIV3-SX感染MDBK细胞；BPIV3-SX-2021感染MDBK细胞；正常MDBK细胞；
图6为rBPIV3-SX与BPIV3-SX-2021感染MDBK细胞，Western-blot检测分析结果；
图7为rBPIV3-SX和BPIV3-SX-2021在MDBK细胞上的生长动力学曲线；
图8为pBPIV3-SX-EGFP构建示意图；
图9为rBPIV3-SX-EGFP重组病毒的IFA鉴定；
图10为利巴韦林对MDBK细胞安全药物浓度测定；
图11为不同浓度利巴韦林处理下BPIV3复制荧光图；
图12为不同浓度利巴韦林处理BPIV3病毒滴度检测图。
具体实施方式
以下具体实施方式是对本发明提供的方法与计划方案的进一步说明，但不应理解成对本发明的限制。
实施例1
牛副流感病毒全长感染性克隆构建
1、材料与方法
1.1、病毒、细胞、质粒及抗体
BHK-21细胞和MDBK细胞及BPIV3-SX-2021(Genebank：ON804787)均由本实验室保存。用于构建全长基因组cDNA的克隆质粒pCMV-add、用于构建辅助质粒pCI-neo载体以及包含T7RNA聚合酶序列的pCAGGS-T7质粒均由本实验室保存。BPIV3 NP蛋白多克隆抗体由本实验室制备并保存。
1.2、主要试剂
各种限制性内切酶及T4连接酶购自美国NEB公司；转染试剂TurboFectTMTransfection Reagent购自Thermo Fisher Scientific公司；Opti-MEM、胎牛血清、DMEM购自Gibco公司；PrimerSTAR MAX高保真聚合酶、Trizol RNAiso Plus购自TaKaRa宝日医生物公司；StarPrep快速DNA胶回收试剂盒购自北京康润生物(Genestar)；质粒小量提取试剂盒购自天根公司；
1.3、主要仪器
超净工作台(济南鑫贝西BIOBASE BBS-DDC)；紫外凝胶成像仪(英国Syngene)；蛋白电泳仪(北京君意东方)；倒置荧光显微镜(OLYMPUS DP80)；高压蒸汽灭菌锅(上海博讯)；普通PCR仪(博日TC-XP)。
1.4、引物设计
通过SnapGene软件对BPIV3-SX-2021株病毒(其核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示)全基因组序列进行分析，根据其酶切位点将全基因组序列分为6个基因片段，并设计6对特异性引物对病毒的全基因组序列进行分段扩增。其中片段A上游引物引入BsshII限制性酶切位点和T7 RNA聚合酶的启动子序列，片段F下游引入RsrII限制性酶切位点和HDV核酶的部分序列。分段构建全长质粒需使用NcoI限制性酶切位点进行连接，因此将片段A和片段B中的NcoI酶切位点通过融合PCR进行同义突变，引物送至西安擎科生物有限公司合成(表1)。
表1全长感染性克隆构建以及鉴定所需引物
1.5、pBPIV3-SX重组质粒的构建
首先，按照Trizol RNAiso Plus试剂说明书提取BPIV3-SX-2021的RNA，然后按照StarScript II First-strand cDNA Synthesis Mix反转试剂盒说明书操作，得到cDNA。以cDNA为模板，分别用引物S1、S2、S3、S4、S5、S6进行PCR扩增(PCR扩增程序为：98℃预变性10s，55℃变性15s，72℃复性延伸30s，共35个循环；PCR反应体系为：Prime-F/R各1.5μL，PrimerSTARMix 25μL，cDNA 2μL，H2O 20μL)，得到A、B、C、D、E、F片段，同时在A片段N端引入BsshII限制性酶切位点和T7 RNA聚合酶的启动子序列(其中，T7 RNA聚合酶的启动子序列靠近片段A的N端)，在F片段C端引入RsrII限制性酶切位点和HDV核酶的部分序列(HDV核酶的部分序列如SEQ ID No.26所示，HDV核酶的部分序列更靠近片段B的C端)。然后用S1-NcoI-F/R引物通过点突变的方法将A片段中的NcoI酶切位点进行定点消除，用S2-NcoI-F/R引物通过点突变的方法将B片段中的NcoI酶切位点进行定点消除，对A片段及B片段中NcoI酶切位点进行定点消除是用于全长的连接。凝胶纯化回收A、B、C、D、E、F片段保存备用。，
将回收纯化后的A片段克隆至pCMV-add载体的BsshII和KpnI限制性酶切位点处(该pCMV-add载体是以pBluescript SK质粒为骨架，将T7启动子替换为CMV启动子，并引入HDV ribozyme序列后得到，pCMV-add载体的核苷酸序列如SEQ ID No.27所示)，获得重组质粒pCMV-A。其次，将纯化后的B片段和pCMV-A用KpnI和PacI进行双酶切，连接获得重组质粒pCMV-AB。最后，将C片段与pCMV-AB用PacI和RsrII进行双酶切，连接获得含BPIV3部分基因组的克隆质粒pCMV-ABC。将回收纯化后的F片段克隆至pCMV的SacII和RsrII限制性酶切位点处，获得重组质粒pCMV-F。其次，将纯化后的E片段和pCMV-F用Nhel限制性酶及Sacll限制性酶双酶切，连接获得重组质粒pCMV-EF。最后，将D片段与pCMV-EF用Sacll限制性酶及Pstl限制性酶进行双酶切，连接获得含BPIV3部分基因组的克隆质粒pCMV-DEF。最后，将pCMV-DEF和pCMV-ABC用NcoI和RsrII进行双酶切，回收包含DEF基因组的片段和与线性化的pCMV-ABC进行连接，从而获得包含BPIV3全基因组的重组质粒pBPIV3-SX(图1A)。将其送至西安擎科生物有限公司进行全长测序。
实施例2
重组病毒拯救
1、辅助质粒的构建
以质粒pBPIV3-SX为模板，分别扩增BPIV3-SX-2021株病毒的核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、大聚合酶蛋白(L)基因序列，并将扩增片段分别克隆至pCI-neo真核表达质粒中，获得辅助质粒：
以实施例1中包含BPIV3全基因组质粒pBPIV3-SX为模板，分别用NP、P、L三对特异性引物(引物序列见表1)进行扩增(PCR扩增程序为：98℃预变性10s，55℃变性15s，72℃复性延伸30s，共35个循环；PCR反应体系为：Prime-F/R各1.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL，cDNA2μL，H2O 20μL)，分别获得NP片段、P片段、L片段，使用Nhel限制性酶及Notl限制性酶通过酶切连接的方法将NP片段克隆至pCI-neo真核表达质粒，获得辅助质粒pCI-NP；使用Nhel限制性酶及Notl限制性酶通过酶切连接的方法将P片段克隆至pCI-neo真核表达质粒，获得辅助质粒pCI-P；使用Xhol限制性酶及Notl限制性酶通过酶切连接的方法将L片段克隆至pCI-neo真核表达质粒，获得辅助质粒pCI-L(图1B)。
2、重组病毒的拯救
将所述质粒pBPIV3-SX及所述辅助质粒共同转染细胞，病毒拯救后获得牛副流感病毒3型全长感染性克隆(即重组病毒/拯救病毒)：
参照Turbofect转染试剂盒说明书进行转染操作，具体步骤如下：转染前一天将BHK-21细胞铺至12孔细胞培养板，使细胞汇合度在12h后达到70％～80％。用200μLOpti-MEM与3μLTurbofect转染试剂在1.5mL离心管中充分混匀，然后加入0.5μg pBPIV3-SX、0.5μgpCGSSS-T7(其是将T7RANA聚合酶序列克隆至pCAGGS真核载体中获得)、0.1μg pCI-NP、0.05μg pCI-P、0.35μg pCI-L重组质粒充分混匀，室温孵育15min。弃掉12孔板中10％FBS培养基，用无菌PBS冲洗细胞3次，加500μL Opti-MEM。将DNA-脂质体复合物转染至BHK-21细胞。同时设置正常细胞作为阴性对照。转染6h后弃液，并加入含2％胎牛血清的DMEM置于37℃、5％CO2培养箱继续培养，72h后收取转染细胞记为F0代，置于-70℃反复冻融3次。取F0代细胞液离心收取细胞上清，将200μL细胞上清接种至MDBK细胞，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养，每天观察细胞，并在72h后收获细胞液计为F1代。按照此方法进行逐代盲传，直至产生明显致细胞病变(Cytopathic Effect,CPE)。
结果显示，随着代次升高，出现CPE的时间逐渐变短，病变程度愈加明显。盲传至F1代时，出现明显CPE，细胞出现圆缩，脱落，得到重组病毒(图2)，即牛副流感病毒3型全长感染性克隆，其核苷酸序列如SEQ ID No.25所示。
在构建牛副流感病毒3型全长感染性克隆时在BPIV3-SX-2021株病毒基因组341bp位置处将C突变为A，使CCATGG(NcoI)变为CAATGG(NcoI)从而消除NcoI酶切位点，同时可用于区别亲本病毒的分子遗传标记。
3、拯救病毒的鉴定
按照1.5步骤提取亲本病毒(BPIV3-SX-2021株病毒)RNA，选用NCO-F和NCO-R引物(引物序列见表1)对亲本病毒进行PCR扩增；
按照1.5步骤提取拯救病毒RNA，选用NCO-F和NCO-R引物(引物序列见表1)对拯救病毒进行PCR扩增；
PCR反应体系：PrimeScript 1Step Enzyme Mix 2μL、2×1Step Buffer 25μL、上游Primer(20μM)1μL、下游Primer(20μM)1μL、RNA 1μL、ddH2O 20μL。
PCR反应程序：42℃反转录30min，95℃预变性5min，循环参数为95℃变性5s，52.5℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环，72℃终延伸10min。反应结束后，取5μL产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书回收目的基因的PCR产物，送至上海生工生物公司进行测序鉴定，同时用NcoI酶切PCR产物，酶切体系：NEB Buffer 2.15μL、纯化的PCR产物3μL、限制性内切酶NcoI 1μL、ddH2O 41μL。37℃酶切2h后，进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1％琼脂糖凝胶电泳结果显示，拯救病毒的核酸不能被切开，而亲本病毒的PCR产物被切成预期大小为402bp和230bp的两个条带，结果见图(3)。同时将PCR产物胶回收后测序，结果显示拯救病毒不包含NcoI酶切位点，而亲本病毒存在该酶切位点(图4)。因此，拯救病毒不是来自亲本病毒污染。
4、间接免疫荧光检测
以NP蛋白多克隆抗体为一抗与拯救病毒进行间接免疫荧光试验，操作步骤如下：将拯救病毒与亲本病毒(MOI＝0.1)分别接种MDBK细胞，同时设置正常细胞作为阴性对照。培养24h后，弃掉培养基，并用PBS漂洗细胞。每孔加入1mL 4％的多聚甲醛固定液并置于室温固定15min。弃掉固定液，并用PBST漂洗细胞3次。加入0.1％TX-100室温下作用5min使细胞膜通透。加入含1％BSA的PBST封闭液置于37℃封闭1h。以BPIV3 NP蛋白鼠源多克隆阳性血(1∶200)作为一抗，37℃孵育1h，用PBST漂洗3次，加入Alexa Fluor488标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶500)，37℃孵育1h，PBS漂洗3次，加DAPI染核，PBS洗涤后加50％甘油封片，置于倒置荧光显微镜观察并拍照。
基于NP蛋白抗体的间接免疫荧光结果显示，拯救病毒rBPIV3-SX和亲本病毒感染MDBK细胞后检测到特异性荧光，而细胞对照未观察到荧光，表示拯救病毒是BPIV3病毒(图5)。
5、拯救病毒蛋白免疫印迹试(Western-blot)试验
以NP蛋白多克隆阳性血清为一抗与拯救病毒进行蛋白免疫印迹试验，操作步骤如下：将拯救病毒和亲本病毒按MOI＝0.1接种至MDBK细胞，24h后收获细胞样品后加入5×Loading buffer充分混匀，置于100℃金属浴加热，使蛋白质变性。取10μL蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，随后采用湿转法将目的蛋白转移至PVDF膜上，用5％的脱脂乳37℃封闭1h，之后用TBST洗涤3次，每次5min。用BPIV3 NP鼠源多克隆阳性血清(1:1000)作为一抗，4℃过夜孵育，TBST洗涤3次。随后加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶5000)，室温孵育1h，TBST洗涤3次。最后用ECL显色试剂盒进行显色拍照。
结果显示，在69KDa处呈现特异性反应条带，与NP蛋白在病毒中表达的大小一致(图6)。
6、生长曲线测定
将拯救病毒与亲本病毒按照MOI＝0.01接种MDBK细胞，病毒吸附1h后弃上清，用无菌PBS漂洗3次，加入含有2％FBS的DMEM培养。分别在12h，24h，36h，18h，60h和72h收获细胞上清，并测定每个收获时间段的TCID50。以病毒不同的收获时间点为横坐标，对应时间点病毒的TCID50为纵坐标，绘制病毒生长曲线。
结果显示拯救病毒和亲本病毒具有相似的复制能力和增值特性，均在60h达到最高的滴度(图7)。
实施例3
构建携带EGFP基因的牛副流感病毒全长感染性克隆
将EGFP基因插入到BPIV3的P基因和M基因之间，具体是按照以下步骤进行操作：
以实施例1中pIRES2-EGFP质粒为模板，扩增EGFP片段(扩增引物序列为EGFP-1-F/R)。同时以pBPIV3-SX质粒为模板，扩增包含S1、S2片段N端部分序列(扩增引物序列为S1-F/EGFP-2R)和S2片段C(扩增引物序列为EGFP-2F/S2-R)端部分序列。将3个片段通过融合PCR的方法进行拼接，然后使用BssHII和PacI分别对该片段和pBPIV3-SX质粒均进行双酶切，将含有EGFP的S1和S2片段替换至pBPIV3-SX中，从而获得pBPIV3-SX-EGFP(图8)。EGFP-1-F/R、EGFP-2-F/R的序列如下所示：
EGFP-1F：GCCAATCAGTCCCTCGACAAAccgccaccATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG，如SEQ IDNO.所示；
EGFP-1R：CTCCTCGCCCTTGCTCACCATggtggcggTTTGTCGAGGGACTGATTGGC，如SEQ IDNO.所示；
EGFP-2F：ATGGACGAGCTGTACAAGTAGACAGCCAAATGACAATCACC，如SEQ ID NO.所示；
EGFP-2R：GGTGATTGTCATTTGGCTGTCTACTTGTACAGCTCGTCCAT，如SEQ ID NO.所示。
将pBPIV3-SX-EGFP和辅助质粒共转染至BHK-21细胞中，经MDBK细胞盲传，获得携带EGFP基因的重组病毒，命名为rBPIV3-SX-EGFP(图9)。
实施例4
rBPIV3-SX-EGFP在抗病毒药物筛选中的应用
1、利巴韦林对MDBK细胞的毒性分析
在96孔板中接种MDBK细胞，待细胞密度达到80％～90％，弃掉孔中的细胞培养基，换做含不同浓度利巴韦林(2、4、8、16μM)的细胞维持液，培养24h后，参照CCK8说明书测定吸光值，计算利巴韦林对MDBK细胞的药物安全浓度(图10)。
2、利巴韦林对rBPIV3-SX-EGFP的抑制作用
在24孔板中接种MDBK细胞过夜培养，待细胞密度达到80％～90％，弃掉细胞培养基，接种实施例2得到的rBPIV3-SX-EGFP(MOI＝1)病毒，37℃吸附1h后弃掉病毒液，更换含不同浓度利巴韦林的维持液。24h后，置于倒置荧光显微镜下观察(图11)，并收集不同药物浓度的细胞培养液进行病毒滴度测定(图12)。
结果显示，随着利巴韦林浓度的逐渐增加，其抑制BPIV3复制能力逐渐增强，表明利巴韦林与BPIV3抑制关系呈剂量依赖性。表明本发明所构建的rBPIV3-SX-EGFP可用于抗BPIV3药物筛选研究。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种牛副流感病毒3型全长感染性克隆，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
2.一种权利要求1所述的牛副流感病毒3型全长感染性克隆的构建方法，其特征在于，是将BPIV3-SX-2021株病毒全基因组在341bp位置处将C突变为A。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将BPIV3-SX-2021株病毒全基因组序列分为6段进行扩增，将扩增的片段克隆至pCMV-add载体中，获得包含BPIV3全长基因组的质粒pBPIV3-SX；
所述pCMV-add载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；
S2、以质粒pBPIV3-SX为模板，分别扩增BPIV3-SX-2021株病毒的核蛋白、磷蛋白、大聚合酶蛋白基因序列，并将扩增片段分别克隆至pCI-neo真核表达质粒中，获得三种辅助质粒；
S3、将所述质粒pBPIV3-SX及三种所述辅助质粒共同转染细胞，病毒拯救后获得牛副流感病毒3型全长感染性克隆；
S1中，扩增用的6对引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述质粒pBPIV3-SX的具体构建过程为：
S11、提取BPIV3-SX-2021的RNA，经反转录获得cDNA，以cDNA为模板，分别用扩增引物进行PCR扩增，分别得到A片段、B片段、C片段、D片段、E片段、F片段；
S12、将A片段克隆至pCMV-add载体的BsshII和KpnI限制性酶切位点处，获得重组质粒pCMV-A；将B片段与重组质粒pCMV-A分别用KpnI和PacI进行双酶切，连接获得重组质粒pCMV-AB；将C片段和重组质粒pCMV-AB分别用PacI和RsrII进行双酶切，连接获得含BPIV3部分基因组的克隆质粒pCMV-ABC；
将F片段克隆至pCMV的SacII和RsrII限制性酶切位点处，获得重组质粒pCMV-F；将E片段与重组质粒pCMV-F分别用Nhel及Sacll进行双酶切，连接获得重组质粒pCMV-EF；将D片段和重组质粒pCMV-EF分别用Sacll及Pstl进行双酶切，连接获得含BPIV3部分基因组的克隆质粒pCMV-DEF；
S13、将pCMV-DEF用NcoI和RsrII进行双酶切，回收含有D片段、E片段及F片段的目的片段；将pCMV-ABC用NcoI和RsrII进行双酶切，回收含有A片段、B片段及C片段的目的片段，将两个目的片段进行连接，获得包含BPIV3全基因组的重组质粒pBPIV3-SX。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，S11中，获得A片段、B片段、C片段、D片段、E片段、F片段后，在A片段N端引入BsshII限制性酶切位点和T7 RNA聚合酶的启动子序列，在F片段C端引入RsrII限制性酶切位点和HDV核酶的部分序列，再用S1-NcoI-F/R将A片段中的NcoI酶切位点通过融合PCR进行同义突变，用S2-NcoI-F/R引物将B片段中的NcoI酶切位点通过融合PCR进行同义突变；
其中，S1-NcoI-F/R引物分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，S2-NcoI-F/R引物分别如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。
6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，S2中，所述核蛋白的扩增引物为SEQID NO.19和SEQ ID NO.20所示，所述磷蛋白的扩增引物为SEQ IDNO.21和SEQ ID NO.22所示，所述大聚合酶蛋白的扩增引物为SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示。
7.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，S1与S2中，PCR扩增程序均为：98℃预变性10s，55℃变性15s，72℃复性延伸30s，共35个循环；
PCR反应体系均为：Prime-F/R各1.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL，cDNA2μL，H2O 20μL。
8.一种权利要求1所述的牛副流感病毒3型全长感染性克隆在制备牛副流感病毒疫苗中的用途。
9.一种权利要求1所述的牛副流感病毒3型全长感染性克隆在构建荧光病毒中的用途。
10.一种权利要求1所述的牛副流感病毒3型全长感染性克隆在抗病毒药物筛选中的用途。
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