KR20220049568A - 엔젤만 증후군의 치료를 위한 ube3a - Google Patents

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KR20220049568A KR1020227009111A KR20227009111A KR20220049568A KR 20220049568 A KR20220049568 A KR 20220049568A KR 1020227009111 A KR1020227009111 A KR 1020227009111A KR 20227009111 A KR20227009111 A KR 20227009111A KR 20220049568 A KR20220049568 A KR 20220049568A
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조셉 앤더슨
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더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

엔젤만 증후군은 발달 지연, 지적 장애, 심각한 언어 장애, 및 운동과 균형 문제를 포함하는 특징을 가진 유전적 신경 장애이다. 본원에는 엔젤만 증후군을 치료하기 위한 폴리뉴클레오티드, 벡터, 폴리펩티드, 세포, 조성물, 키트 및 방법이 제공된다.

Description

엔젤만 증후군의 치료를 위한 UBE3A
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 각각 2019년 8월 22일 및 2020년 12월 6일에 출원된 미국 가출원 제62/890,364호 및 제62/945,062호의 35 U.S.C. § 119(e) 하에서의 우선권을 주장하며, 이들 각각의 내용은 전문이 본 출원에 참고로 포함된다.
엔젤만 증후군(angelman syndrome; AS)은 발달 지연, 지적 장애, 심각한 언어 장애, 운동 및 균형 문제를 포함하는 특징을 가진 유전적 신경 장애이다. 대부분의 환자는 재발성 발작 및 더 작은 머리 크기를 갖는다. 대부분의 환자는 발달 지연을 보이며 다른 일반적인 증상은 유아기에 나타난다. AS가 있는 어린이는 전형적으로 행복하고 흥분을 잘하는 태도를 갖는다. 또 다른 증상은 과잉행동, 짧은 주의 지속 시간, 및 물에 대한 강한 흥미를 포함한다. 환자가 나이가 들어감에 따라, 엔젤만 증후군을 가진 사람들은 덜 흥분하게 되고 수면 문제가 개선된다. 그러나, 이 환자들은 남은 평생 동안 지적 장애, 언어 장애 및 발작을 계속한다.
AS는 UBE3A라는 유전자의 기능 상실에 의해 발생한다. 사람들은 각 부모로부터 UBE3A 유전자("Ube3a")의 하나의 카피를 물려받는다. Ube3a의 두 카피는 모두 신체의 많은 조직에서 활성이다. 그러나, 뇌에서는 모체 카피만 활성이다. 유전자의 이러한 부모-특이적 활성화는 게놈 각인(genomic imprinting)이라는 과정에 의해 발생한다. UBE3A의 모체 카피가 결실 또는 돌연변이로 인해 손실되면 뇌의 일부 부분에서 Ube3a의 발현이 부족하게 될 것이다. AS를 치료하는데 효과적인 치료법은 이용 가능하지 않다. 본 개시내용은 AS의 증상 및 원인을 대체하거나 약화시키는 유전자 요법을 제공한다.
따라서, 하나의 측면에서, 예를 들면, 유전자 요법 및 연구에 사용하기 위한, 하나 이상의 자연 발생 또는 비발생 글리코실화 부위를 갖는 유비퀴틴 단백질 리가제(ubiquitin protein ligase) E3A(Ube3a) 단백질을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다. 하나의 측면에서, Ube3a 단백질은 하나 이상의 자연 발생 또는 비-자연 발생 글리코실화 부위, 또는 2개 이상의 자연 발생 또는 비-자연 발생 글리코실화 부위, 또는 3개 이상의 자연 발생 또는 비-자연 발생 글리코실화 부위를 갖는다. 또 다른 측면에서, Ube3a 단백질은 4개 이상의 자연 발생 또는 비-자연 발생 글리코실화 부위를 갖는다. 또 다른 측면에서, Ube3a 단백질은 5개 이상의 자연 발생 또는 비-자연 발생 글리코실화 부위를 갖는다. 또 다른 측면에서, Ube3a 단백질은 6개 이상의 자연 발생 또는 비-자연 발생 글리코실화 부위를 갖는다. 하나의 측면에서, Ube3a 단백질은 7개 이상 또는 8개 이상의 자연 발생 또는 비-자연 발생 글리코실화 부위를 갖는다. 하나의 측면에서, Ube3a 단백질은 자연 발생 또는 비-자연 발생 글리코실화 부위를 갖는다. 하나의 측면에서, Ube3a 단백질은 본원에 개시된 바와 같이 비-자연 발생, 또는 이의 등가물 또는 보체이다. 하나의 측면에서, Ube3a 단백질은 자연 발생적이지만 하나 이상의 자연 발생 또는 비자연 발생 글리코실화 부위를 포함한다. 또 다른 측면에서, 단백질은 자연 발생적이지만 각 측면에서, 단백질은 하나 이상의 비-자연 발생 글리코실화 부위를 갖는다. 하나의 측면에서, 단백질은 하나 이상의 비-자연 발생 글리코실화 부위를 갖는 비-자연 발생 Ube3a 단백질 또는 폴리펩티드이다. 추가로 또는 대안적으로, 하나 이상의 글리코실화 부위는 비-자연 발생적이다.
또한 1개 이상의 글리코실화 부위, 2개 이상의 글리코실화 부위, 또는 3개 이상의 글리코실화 부위를 갖는 Ube3a 단백질이 제공된다. 또 다른 측면에서, Ube3a 단백질은 4개 이상의 글리코실화 부위를 갖는다. 또 다른 측면에서, Ube3a 단백질은 5개 이상의 글리코실화 부위를 갖는다. 또 다른 측면에서, Ube3a 단백질은 6개 이상의 글리코실화 부위를 갖는다. 하나의 측면에서, Ube3a 단백질은 7개 이상 또는 8개 이상의 글리코실화 부위를 갖는다. 하나의 측면에서, 단백질은 비-자연 발생적이며 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함한다. 또 다른 측면에서, 단백질은 자연 발생적이지만 각 측면에서, 단백질은 하나 이상의 글리코실화 부위를 갖는다. 하나의 측면에서, 단백질은 하나 이상의 비-자연 발생적 글리코실화 부위를 갖는 비-자연 발생 Ube3a 단백질 또는 폴리펩티드이다. 추가로 또는 대안적으로, 하나 이상의 글리코실화 부위는 비-자연 발생적이다. 추가의 측면에서, 단백질은 세포 투과 도메인을 추가로 포함한다. 또 다른 측면에서, 단백질은 분비(secretion) 신호를 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 단백질은 검출가능한 또는 정제 마커를 추가로 포함한다.
하나의 측면에서, 단백질은 예를 들면 이 문서의 서열 목록 섹션 뿐만 아니라 이들 각각의 등가물에서 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체 또는 등가물에 의해 암호화된다. 하나의 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 또한 비-자연 발생적이며 임의로 세포 투과 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
추가의 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 이러한 비제한적인 예는 MNDU3 프로모터, CMV 프로모터, PGK 프로모터, 및 EF1알파 프로모터의 그룹으로부터 선택된 pol II 프로모터를 포함한다. 프로모터는 코딩 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결되어 적합한 숙주 시스템에서 발현을 유도할 수 있다. 추가의 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 변형된 Ube3a 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 5'에 위치한 분비 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 분비 신호의 비제한적인 예는 단일 사슬 단편 가변 분비 신호, 쌍-아르기닌 수송 단백질(twin-arginine transport protein) 분비 신호, IL-4 분비 신호, IL-2 분비 신호 및 IL-10 분비 신호를 포함한다. 예시적인 분비 신호 폴리뉴클레오티드는 이의 등가물과 함께 아래에 제공된다. 폴리뉴클레오티드는 검출 가능한 마커 또는 정제 마커이거나 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본원에 기술된 바와 같은 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(vector)가 제공된다. 벡터는 원핵 및 진핵 숙주 세포 시스템에서 발현을 위한 벡터, 예를 들어 플라스미드, 또는 바이러스 벡터, 예를 들어 배큘로바이러스, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, AAV 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 예시적인 벡터 맵이 도 3a 내지 도 3d에 도시되어 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터, 예를 들어, 아데노바이러스 또는 렌티바이러스 벡터의 역 말단 반복부(ITR)가 측면에 있다.
비-바이러스 벡터는 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 표적 세포에 전달될 수 있는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드를 포함할 수 있다. 이종 폴리뉴클레오티드는 돌연변이된 Ube3a 유전자(예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 재조합 폴리뉴클레오티드)를 포함할 수 있고 하나 이상의 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있으며 돌연변이된 Ube3a 유전자의 전사를 제어할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 벡터는 궁극적인 표적 세포 또는 대상체(subject)에서 복제할 수 있을 필요는 없다. 벡터라는 용어는 발현 벡터 및 클로닝 벡터를 포함할 수 있다. 하나의 측면에서, 벡터는 pCCLc 플라스미드 벡터이다.
폴리뉴클레오티드 및 벡터는 폴리뉴클레오티드의 전달 또는 발현을 위해 숙주 세포 시스템에 포함될 수 있다. 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 하나의 측면에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 개, 고양이, 소, 말, 뮤린, 래트 또는 인간이다. 포유동물 세포는 줄기 세포, 예를 들어 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 배아 줄기 세포, 성체 또는 체세포 줄기 세포로부터 선택될 수 있다. 하나의 측면에서, 줄기 세포는 예를 들면 조혈 줄기 세포 또는 신경 줄기 세포와 같은 중간엽 줄기 세포이다. 또 다른 측면에서, 줄기 세포는 CD34+ 마커를 발현함으로써 임의로 동정된 중간엽 줄기 세포이다.
또한 이종성(상이한 종이거나 상이한 벡터 및 폴리뉴클레오티드를 가짐)이거나 실질적으로 동종일 뿐만 아니라 클론성일 수 있는 세포의 집단이 제공된다.
추가로, 본원에 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드, 단백질 또는 폴리펩티드, 벡터, 숙주 세포 또는 집단 중 하나 이상, 및 담체를 포함하는 조성물이 제공된다. 하나의 측면에서, 담체는 약제학적으로 허용되는 담체이다.
또한 다음을 포함하는 바이러스 패키징 시스템이 제공된다: (a) 본원에 기술된 바와 같은 바이러스 벡터; (b) 패키징 플라스미드(packaging plasmid); 및 (c) 외피 플라스미드(envelope plasmid). 추가의 측면에서, 상기 시스템은 (d) 예를 들면 HEK-293 세포주와 같은 패키징 세포주를 추가로 포함한다. 패키징 시스템은 바이러스 벡터를 패키징하기에 적합한 조건하에서 패키징 세포주를 형질도입하는데 사용될 수 있다.
또한 Ube3a 단백질의 발현을 허용하는 조건하에서 본원에 기술된 바와 같은 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하거나, 대안적으로 이러한 단계로 본질적으로 구성되거나, 이러한 단계로 추가로 구성되는, 분비된 변형된 Ube3a 단백질을 발현시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 실행될 수 있다. 추가로, 본원에 기술된 바와 같은 벡터 또는 숙주 세포의 유효량을 대상체에 투여하여 대상체에서 변형된 Ube3a를 발현시키는 단계를 포함하거나, 대안적으로 이러한 단계로 본질적으로 구성되거나, 이러한 단계로 추가로 구성되는, 대상체에서 변형된 Ube3a을 발현시키는 방법이 제공된다. 하나의 측면에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 인간 환자이다. 추가의 측면에서, 대상체는 결함이 있는 Ube3a 유전자가 결핍되어 있거나 결함이 있는 Ube3a 유전자를 보유한다. 또 다른 측면에서, 포유동물은 엔젤만 증후군에 대해 무증상이다. 또 다른 측면에서, 대상체는 엔젤만 증후군(본원에서 AS로도 지칭됨)에 대해 증상이 있거나 그렇지 않은 태아, 유아 또는 사춘기-전 대상체이다. 추가의 측면에서, 대상체는 성인, 임의로 성인 인간, 추가로 임의로, 18세 이상의 성인 인간이다.
추가로, 결함이 있는 Ube3a 유전자 또는 대립유전자를 보유하는 대상에서 엔젤만 증후군을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 예를 들면 본원에 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포, 또는 Ube3a 단백질 또는 폴리펩티드 중의 하나 이상의 유효량을 대상체에게 제공함으로써 엔젤만 증후군을 치료하는 단계를 포함하거나, 대안적으로 이러한 단계로 본질적으로 구성되거나, 이러한 단계로 추가로 구성된다. 추가의 측면에서, 대상체는 결함이 있는 Ube3A 유전자가 결핍되어 있거나 Ube3A 유전자를 보유한다. 하나의 측면에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 인간 환자이다. 하나의 측면에서, 포유동물은 엔젤만 증후군에 대해 증상이 있다. 또 다른 측면에서, 포유동물은 엔젤만 증후군에 대해 무증상이다. 또 다른 측면에서, 대상체는 AS에 대해 증상이 있거나 그렇지 않은 태아, 유아 또는 사춘기-전 대상체이다. 추가의 측면에서, 대상체는 성인, 임의로 성인 인간, 추가로 임의로, 18세 이상의 성인 인간이다.
추가로, 본원에 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드, 단백질 또는 폴리펩티드, 벡터, 숙주 세포, 또는 집단 중 하나 이상, 및 임의로, 사용 설명서를 포함하는 키트(kit)가 제공된다.
전술한 일반적인 설명 및 다음의 상세한 설명은 예시적이고 설명적이며 청구된 바와 같은 개시내용의 추가 설명을 제공하기 위한 것이다. 다른 목적, 이점, 및 신규 특징은 하기 도면의 간단한 설명 및 본 개시내용의 상세한 설명으로부터 당업계의 숙련가들에게 용이하게 명백할 것이다.
도 1a - 1f는 렌티바이러스 벡터를 발현하는 Ube3a의 개략도를 보여준다. 도 1a는 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터를 도시하며, CCLc-X 백본이 사용되었다. 이것은 Ube3a 폴리뉴클레오티드를 발현하는 이식유전자가 없는 부모 벡터이다. CCLc-MNDU3-X 벡터의 예시된 서열은 서열 번호 35로서 제공된다. 도 1b는 빈 벡터 대조군으로 사용된 EGFP 벡터를 도시한다. 도 1c는 변형된 마우스 Ube3a 이소형 3이 MNDU3 프로모터의 제어하에 클로닝되었음을 보여준다. EGFP는 PGK 프로모터의 제어하에 다운스트림으로 클로닝되었다. 도 1d는 변형된 인간 이소형 1이 MNDU3 프로모터의 제어하에 클로닝되었음을 보여준다. EGFP는 PGK 프로모터의 제어하에 다운스트림으로 클로닝되었다. 도 1e는 변형된 인간 이소형 1이 EGFP 리포터 유전자가 없는 MNDU3 프로모터의 제어하에 클로닝되었음을 보여준다. 도 1f는 도 1e의 예시적인 벡터를 도시하고 그 안의 분비 신호(ss)를 주지한다.
도 2는 Ube3a 벡터 형질도입된 인간 CD34+ HPC의 CFU 분석을 보여준다. 인간 CD34+ HPC는 형질도입되지 않은 상태로 남아있거나(NT, 각 막대 그룹의 왼쪽 열) EGFP-단독 대조군 벡터(EGFP, 각 막대 그룹의 중간 열) 또는 Ube3a 벡터(Ube3a, 각 막대 그룹의 오른쪽 열)로 형질도입되었다. 그후 특정 콜로니(BFU-E, GM 및 GEMM)를 계수할 때 세포를 12일 동안 메틸셀룰로오스 배지에서 배양하였다.
도 3a - 3b는 Ube3a 렌티벡터의 과발현 및 유비퀴틴화 활성을 제공한다. 인간 CD34+ HPC를 Ube3a 렌티벡터(Ube3a)로 형질도입하고 성숙한 대식세포로 유도하였다. 그후, 세포 추출물을 생성하고 (도 3a) 웨스턴 블롯에 의한 Ube3a의 과발현 및 (도 3b) Ube3a S5a 표적 단백질의 유비퀴틴화 활성에 대해 평가하였다. 대조군 비형질도입된(NT) 및 EGFP 벡터 단독(EGFP) 형질도입된 세포를 대조군으로 사용하였다. 도 3b는 Ube3a의 다른 돌연변이 형태가 이들의 S5A 표적을 유비퀴틴화한다는 것을 추가로 보여준다. "AS Native"는 세포에서 자연적으로 발견되는 Ube3a의 비분비된 야생형 형태를 시험 샘플로 사용하는 것을 나타낸다. "AS WT"는 IL-2 분비 신호를 추가한 Ube3a의 야생형 형태를 시험 샘플로 사용하는 것을 나타낸다. "AS4"는 IL-2 분비 신호 외에 4x 잠재적 글리코실화 부위를 생성하기 위한 4x 돌연변이 부위를 갖는 Ube3a의 돌연변이된 형태를 시험 샘플로 사용하는 것을 나타낸다. "AS8"은 IL-2 분비 신호 외에 8x 잠재적 글리코실화 부위를 생성하기 위한 8x 돌연변이 부위를 갖는 Ube3a의 돌연변이된 형태를 시험 샘플로 사용하는 것을 나타낸다. "유비퀴틴화된 S5A"는 증가된 유비퀴틴화로 분자량이 증가하는 S5A의 유비퀴틴화된 형태의 밴드를 나타낸다.
도 4는 신생아 마우스에서 표현형 교정을 위한 예시적인 연구 설계를 예시한다.
도 5a - 5h는 보행 능력, 균형, 운동 협응 및 걸음걸이가 맞춤형 운동 행동 배터리에 의해 측정됨을 보여준다. 방사선 조사되고 형질도입되지 않거나(NT Het, 도 5b의 열린 점 및 다른 패널의 왼쪽 절반이 채워진 점) Ube3a 렌티벡터 형질도입된(Ube3a Het, 도 5b의 점선 또는 다른 패널의 열린 점) 인간 CD34+ HSC를 갖는 새끼로 이식된 처리된 및 비처리된 Ube3a 마우스에서 4가지 표준 운동 행동 검사를 사용한 운동 번역 표현형의 정밀한 평가. 야생형 마우스(WT, 검은색 실선)를 대조군으로 사용하였다. 이식후 8주에, 마우스를 개방 영역 이동(도 5a, 수평; 도 5b, 수직 및 도 5c, 총 활동량), 평균대(도 5d 및 도 5e), 로타로드(도 5f), 및 트레드밀 걷기 및 DigiGait 분석(도 5g 및 도 5h)에 적용하였다. 모든 검사에서, Ube3a 벡터 형질도입된 인간 CD34+ HSC가 이식된 Ube3a-결핍 마우스(Ube3a Het)는 야생형 값의 수행능력을 나타냈다. 개방 영역 활동량은 총 거리와 수평 활동량 지표 둘 다에 의해 증가하였다. 평균대는 폭이 줄어들고 막대 #1에서 막대 #2, 막대 #3으로 갈수록 건너가기가 더 어렵다. 로타로드에서 떨어지기까지의 잠복기는 비이식된(NT Het) 세포 대조군과 비교하여 Ube3a 벡터 형질도입된 인간 CD34+ HSC가 이식된 Ube3a-결핍 마우스(Ube3a Het)에서 유의하게 개선되었다. AS 환자에서, 표준 AS 마우스와 신규 Ube3a 마우스도 비정상적으로 넓은 자세를 나타낸다. DigiGait 분석은 치료된 그룹에서 이러한 넓은 자세의 축소를 보여주었다. * = p<0.05.
도 6a - 6b는 새로운 물체 인식 분석으로부터 수득된 결과를 제공한다. 이식후 11주에, 마우스를 새로운 물체 인식 검사를 사용하여 학습 및 기억 능력에 대해 평가하였다. 도 6a는 새로운 물체 및 친숙한 물체를 스니핑하는 시간의 평가를 제공한다. 도 6b는 두 개의 동일한 (친숙한) 물체를 사용한 친숙화 검사의 결과를 제공한다. 신생아 BGU 마우스에 비-형질도입된(NT-HET) 또는 Ube3a 벡터 형질도입된(Ube3a-HET) 인간 CD34+ HSC를 이식하였다. 야생형 마우스(WT) 및 비이식된 BGU 마우스(HET)를 대조군으로 사용하였다. Ube3a-HET는 WT와 유사한 온전한 물체 인식을 나타낸 반면, NT-HETS는 새로운 물체에 더 많은 시간을 보내지 않아 인식 기억의 부족을 나타내었다. * p<0.05, 새로운 대 친숙한.
도 7a - 7b는 Ube3a-HET 마우스에서(도 7a) 및 인간의 EEG와 비교하여(도 7b, Anderson, BCM, 2017에서 재생산) 검출된 상승된 델타 힘(delta power)의 구제를 보여준다. 표면 EEG를 무선 원격 계측 장치를 통해 마우스에서 수집하고 스펙트럼 힘 차이에 대해 분석하였다. 델타 힘 피크는 HET 및 NT-HET 동물에서 나타나며 WT 또는 Ube3a-HET 처리된 동물에서는 존재하지 않는다. HET 동물에서 관찰된 상승된 델타 표현형은 임상적으로 보여진 상승된 델타를 개괄하며 UBE3A의 재발현은 WT 수준으로의 구제를 초래하였다. *p< 0.0001.
도 8은 Ube3a 벡터 형질도입된 세포가 이식된 마우스의 뇌에서 Ube3a의 발현을 보여준다. WT, Ube3a-/+ BGU (HET), 및 Ube3a 벡터 형질도입된 세포가 이식된 Ube3a-/+ (Ube3a-HET) 마우스를 안락사시키고 DAB 퍼옥시다제 기질 및 항-Ube3a 항체를 사용하여 Ube3a 발현에 대해 분석하였다. 명시야 면역조직화학 염색된 슬라이드를 스캔하고 상대적 Ube3a 발현을 측정하였다. *p=0.0126.
도 9a - 9c는 NRG 마우스에서 인간 T 세포의 생착 및 발달을 보여준다. 인간 CD34+ HSC는 형질도입되지 않은 상태로 남아있거나 EGFP 대조군(EGFP) 또는 Ube3a 발현(hAS8-EGFP) 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다. 세포를 2-5일령 NRG 마우스에 이식하였다. 이식 후 16주에, 마우스를 안락사시키고 인간 T 세포를 (도 9a) 말초 혈액, (도 9b) 비장 및 (도 9c) 흉선에서 CD3, CD4 및 CD8 발현에 대해 분석하였다.
도 10a - 10b는 NRG 마우스에서 인간 B 세포의 생착 및 발달을 보여준다: 인간 CD34+ HSC는 형질도입되지 않은 상태로 남아있거나 EGFP 대조군(EGFP) 또는 Ube3a 발현(hAS8-EGFP) 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다. 세포를 2-5일령 NRG 마우스에 이식하였다. 이식 후 16주에, 마우스를 안락사시키고 인간 B 세포를 (도 10a) 비장 및 (도 10b) 골수에서 CD45 및 CD19에 대해 분석하였다.
도 11은 NRG 마우스의 골수에서 인간 대식세포 및 CD34+ 세포의 생착 및 발달을 보여준다. 인간 CD34+ HSC는 형질도입되지 않은 상태로 남아있거나 EGFP 대조군(EGFP) 또는 Ube3a 발현(hAS8-EGFP) 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다. 세포를 2-5일령 NRG 마우스에 이식하였다. 이식 후 16주에, 마우스를 안락사시키고 인간 대식세포 및 CD34+ 세포를 골수에서의 생착에 대해 분석하였다.
도 12는 성체 마우스에서 표현형의 교정을 위한 예시적인 연구 설계를 예시한다.
도 13a - 13g는 Ube3a 렌티바이러스 벡터 형질도입된 인간 CD34+ HSC가 이식된 성체 BGU 마우스를 대상으로 보행 능력, 균형, 운동 협응 및 걸음걸이가 맞춤형 운동 행동 배터리에 의해 측정됨을 보여준다. 방사선 조사되고 형질도입되지 않거나(NT-HET) Ube3a 렌티벡터(Ube3a-HET) 형질도입된 인간 CD34+ HSC를 갖는 성체로 이식된 처리된 및 비처리된 Ube3a 마우스에서 4가지 표준 운동 행동 검사를 사용한 운동 번역 표현형의 정밀한 평가. 4주령 내지 6주령 마우스를 부설판으로 컨디셔닝하고 정맥내 이식하였다. 6주 후 마우스를 개방 영역 이동(도 13a, 수평; 도 13b, 수직 및 도 13c, 총 활동량), 평균대(도 13d 및 도 13e), 로타로드(도 13f), 및 트레드밀 걷기(도 13g)에 적용하였다. 모든 검사에서, Ube3a 벡터 형질도입된 인간 CD34+ HSC가 이식된 Ube3a-결핍 마우스(Ube3a Het)는 야생형 값의 수행능력을 나타내었다. 개방 영역 활동량은 총 거리와 수평 활동량 지표 둘 다에 의해 증가하였다. 평균대는 폭이 줄어들고 말대 #1에서 막대 #2를 거쳐 막대 #3으로 갈수록 건너가기가 더 어렵다. 야생형 마우스(WT)를 대조군으로 사용하였다. 로타로드에서 떨어지기까지의 잠복기는 비-이식된(NT-HET) 세포 및 비-이식된(HET) 대조군과 비교하여 Ube3a 벡터 형질도입된 인간 CD34+ HSC가 이식된 Ube3a-결핍 마우스(Ube3a-Het)에서 유의하게 개선되었다. AS 환자에서, 표준 AS 마우스와 신규 Ube3a 마우스도 비정상적으로 넓은 자세를 나타낸다. DigiGait 분석은 치료된 그룹에서 이러한 넓은 자세의 축소를 보여주었다. * = p<0.05.
도 14a - 14b는 Ube3a 렌티바이러스 벡터 형질도입된 인간 CD34+ HSC가 이식된 BGU 마우스를 대상으로 하는 새로운 물체 인식 분석을 보여준다. 이식후 6주에 성체 마우스에서, 대상체를 새로운 물체 인식 검사를 사용하여 학습 및 기억 능력에 대해 평가하였다. 도 14a는 새로운 물체 및 친숙한 물체를 스니핑하는 시간의 평가를 보여준다. 도 14b는 두 개의 동일한 (친숙한) 물체를 사용한 친숙화 검사의 결과를 제공한다. Ube3a HET 마우스에 비-형질도입된(NT Het) 또는 Ube3a 벡터 형질도입된(Ube3a Het) 인간 CD34+ HSC를 이식하거나 이식하지 않은 채로 두었다(HET). 야생형 마우스(WT)를 대조군으로 사용하였다. 이식된 HET(Ube3a-HET)는 WT와 유사한 온전한 물체 인식을 나타낸 반면, NT-HET 및 HET는 새로운 물체에 더 많은 시간을 보내지 않아 인식 기억의 부족을 나타내었다. * p<0.05, 새로운 대 친숙한.
도 15는 Ube3a-/+ 성체 마우스의 뇌에서 Ube3a의 발현을 보여준다. 비형질도입된(NT-HET) 또는 Ube3a 벡터 형질도입된(Ube3a-HET) 세포가 이식된 WT, Ube3a-/+ BGU(HET) 및 Ube3a-/+ 마우스를 안락사시키고 DAB 퍼옥시다제 기질 및 항-Ube3a 항체를 사용하여 Ube3a 발현에 대해 분석하였다. 명시야 면역조직화학 염색된 슬라이드를 스캔하고 Ube3a 양성 세포를 계수하였다. *p=0.0058.
도 16a-16b는 NM_001354506의 NCBI 참조 번호를 갖는 호모 사피엔스 유비퀴틴 단백질 리가제 E3A(UBE3A), 전사체 변이체 5의 뉴클레오티드 단편(서열 번호 31에 재현됨), 및 이의 번역된 아미노산 서열(서열 번호 32 및 33)을 기반으로 하는 여러 글리코실화 부위의 예를 제공한다. 아미노산 서열 넘버링은 서열 번호 32의 단편인 서열 번호 8을 기반으로 한다. 대문자가 아닌 아미노산 잔기는 NetNGlyC라는 온라인 도구에 의해 예측되는 N-글리코실화 부위를 제공한다. 볼드체, 이탤릭체 음영 처리된 아미노산 잔기는 S 또는 T를 포함하는 부위의 예를 제공하며 여기서 N 말단의 두 번째 아미노산이 N으로 돌연변이되면 잠재적인 글리코실화 부위가 야기된다. 밑줄 친 아미노산 잔기는 N을 포함하는 부위의 예를 제공하며 여기서 C 말단의 두 번째 아미노산이 S/T로 돌연변이되면 잠재적인 글리코실화 부위가 야기된다. 박스 안의 아미노산 잔기는 본원에 확인된 바와 같은 돌연변이에 의해 생성될 수 있는 일부 예시된 글리코실화 부위를 나타낸다. 뉴클레오티드 단편의 코딩 서열(coding sequence; CDS)은 시작 코돈(음영 ATG로 표시)으로 시작하여 정지 코돈(음영 TAA로 표시)으로 끝난다. 나머지 음영 뉴클레오티드 잔기는 글리코실화 부위를 생성하는 잠재적인 돌연변이 부위를 제공한다. 도 16b는 도 16a에 나타낸 아미노산 서열의 2개의 단편에서 글리코실화 부위를 형성하기 위해 돌연변이가 어떻게 수행될 수 있는지를 추가로 예시한다. 상단의 단편은 서열번호 32의 아미노산 (aa) 201 내지 aa 220, 즉, 서열번호 8의 aa 183 내지 aa 202인 반면 하단의 단편은 서열 번호 32의 aa 341 내지 aa 360, 즉, 서열 번호 8의 aa 323 내지 aa342이다.
정의
이해되는 바와 같이, 본원에 사용된 섹션 또는 하위섹션 표제는 조직 목적만을 위한 것이며 설명된 주제를 제한 및/또는 분리하는 것으로 해석되어서는 안된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 통상의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 개시내용의 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 재료가 이하에서 기술된다. 본원에 인용된 모든 기술 간행물 및 특허 간행물은 전문이 본원에 참고로 포함된다. 본원의 어떤 것도 공개가 사전 공개에 의해 이러한 공개보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 개시내용의 실행은, 달리 지시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 조직 배양, 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 예를 들어, 문헌[Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; U.S. Patent No. 4,683,195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology; Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002)); Sohail (ed.) (2004) Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application (CRC Press)]을 참조한다.
범위를 포함하여 모든 수 명칭, 예를 들어 pH, 온도, 시간, 농도, 및 분자량은 적절한 경우 0.1 또는 1.0의 증분으로 ( + ) 또는 ( - ) 변화하는 근사치이다. 항상 명시적으로 언급된 것은 아니지만, 모든 수 명칭에는 앞에 "약"이라는 용어가 온다는 것을 이해해야 한다. 또한, 항상 명시적으로 언급된 것은 아니지만, 본원에 기술된 시약은 단지 예시적이며 이의 등가물이 당업계에 공지되어 있음을 이해해야 한다.
명세서 및 청구범위에 사용된 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 예를 들면, "세포"라는 용어는 이들의 혼합물을 포함하는 복수의 세포를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "포함하는(comprising)" 또는 "포함하다(comprises)"은 조성물 및 방법이 인용된 요소를 포함하지만 다른 것을 배제하지 않는다는 것을 의미하도록 의도된다. "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"은 조성물 및 방법을 정의하는데 사용되는 경우 명시된 목적을 위한 조합에 대해 본질적으로 중요한 다른 요소를 배제하는 것을 의미한다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같은 요소로 본질적으로 구성된 조성물은 단리 및 정제 방법으로부터의 미량의 오염 물질 및 인산염 완충 염수, 보존제 등과 같은 약제학적으로 허용되는 담체를 배제하지 않을 것이다. "구성된(consisting of)"은 다른 성분의 미량 원소 및 본 개시내용의 조성물을 투여하기 위한 실질적인 방법 단계 또는 조성물을 생성하거나 의도된 결과를 달성하기 위한 공정 단계 이상을 배제하는 것을 의미한다. 이러한 전환 용어 각각에 의해 정의된 실시양태는 본 개시내용의 범위 내에 있다.
"임의의" 또는 "임의로"는 이후에 설명되는 상황이 발생하거나 발생하지 않을 수 있음을 의미하므로 설명에는 상황이 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, "및/또는"은 연관된 나열된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합 뿐만 아니라 대안("또는")으로 해석될 때의 조합의 결여를 지칭하고 포함한다.
"실질적으로(substantially)" 또는 "본질적으로(essentially)"는 거의 전체 또는 완전히, 예를 들어 일부 주어진 양의 95% 이상을 의미한다. 일부 실시양태에서, "실질적으로" 또는 "본질적으로"는 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9%를 의미한다.
DNA 또는 RNA와 같은 핵산과 관련하여 본원에 사용된 용어 "단리된"은 거대분자의 천연 공급원에 존재하는 각각 다른 DNA 또는 RNA로부터 분리된 분자를 지칭한다. 용어 "단리된 핵산"은 단편으로서 자연적으로 발생하지 않고 자연 상태에서는 발견되지 않는 핵산 단편을 포함하는 것을 의미한다. 용어 "단리된"은 또한 본원에서 다른 세포 단백질로부터 단리된 폴리펩티드, 단백질 및/또는 숙주 세포를 지칭하는데 사용되며 정제된 폴리펩티드 및 재조합 폴리펩티드 둘 다를 포함하는 것을 의미한다. 또 다른 실시양태에서, 용어 "단리된"은 자연에서 정상적으로 회합되는 세포성 및 기타 성분, 여기서는 세포, 조직, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 이의 단편(들)으로부터 분리됨을 의미한다. 예를 들면, 단리된 세포는 표현형 또는 유전자형이 다른 조직 또는 세포로부터 분리된 세포이다. 당업계의 숙련가들에게 명백한 바와 같이, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 이의 단편(들)은 이의 자연 발생 대응물과 구별하기 위해 "단리"를 필요로 하지 않는다.
일부 실시양태에서, 용어 "조작된" 또는 "재조합"은 자연 발생 단백질, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 균주, 야생형 균주 또는 언급된 종의 모 숙주 균주에서 정상적으로 발견되지 않는 적어도 하나의 변형을 갖는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 용어 "조작된" 또는 "재조합"은 인간 개입에 의해 합성되는 것을 지칭한다.
당업계의 숙련가들에게 공지된 바와 같이, 6가지 부류의 바이러스가 있다. DNA 바이러스는 클래스 I 및 II를 구성한다. RNA 바이러스 및 레트로바이러스가 나머지 부류를 구성한다. 클래스 III 바이러스는 이중 가닥 RNA 게놈을 갖는다. 클래스 IV 바이러스는 양성 단일 가닥 RNA 게놈을 갖고, 게놈 자체가 mRNA로 작용하는 클래스 V 바이러스는 mRNA 합성을 위한 주형으로 사용되는 음성 단일 가닥 RNA 게놈을 갖는다. 클래스 VI 바이러스는 양성 단일 가닥 RNA 게놈을 갖지만 복제에서 뿐만 아니라 mRNA 합성에서도 DNA 중간체를 갖는다. 레트로바이러스는 RNA의 형태로 유전 정보를 전달한다: 그러나, 일단 바이러스가 세포를 감염시키면, RNA는 감염된 세포의 게놈 DNA에 통합되는 DNA 형태로 역전사된다. 통합된 DNA 형태를 프로바이러스라고 한다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용되며 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 이들의 유사체와 같은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 3차원 구조를 가질 수 있으며 알려지거나 알려지지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편(예를 들면, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 폴리뉴클레오티드의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 표지 성분과의 접합에 의해 중합 후에 추가로 변형될 수 있다. 이 용어는 또한 이중 가닥 및 단일 가닥 분자 둘 다를 지칭한다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오티드인 본 개시내용의 임의의 실시양태는 이중 가닥 형태 및 이중 가닥 형태를 구성하는 것으로 알려지거나 예측되는 2개의 상보적 단일 가닥 형태 각각을 모두 포함한다.
폴리뉴클레오티드는 4개의 뉴클레오티드 염기의 특정 서열로 구성된다: 아데닌(A); 시토신(C); 구아닌(G); 티민(T); 및 폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우 티민에 대해 우라실(U). 따라서, 용어 "폴리뉴클레오티드 서열"은 폴리뉴클레오티드 분자의 알파벳 표현이다. 이러한 알파벳 표현은 중앙 처리 장치가 있는 컴퓨터의 데이터베이스에 입력할 수 있으며 기능 유전체학 및 상동성 검색과 같은 생물 정보학 응용에 사용할 수 있다.
"상동성" 또는 "동일성(identity)" 또는 "유사성"은 2개의 펩티드 사이 또는 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 상동성은 비교 목적으로 정렬될 수 있는 각 서열의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유될 때, 분자는 그 위치에서 상동성이다. 서열 간의 상동성 정도는 서열에 의해 공유된 일치하거나 상동적인 위치의 수의 함수이다. "비관련된" 또는 "비-상동성" 서열은 본 개시내용의 서열 중 하나와 40% 미만의 동일성, 또는 대안적으로 25% 미만의 동일성을 공유한다.
본원에 사용된 바와 같이, 참조 서열에서 확인된 위치에 "상응하는" 관심 서열의 아미노산(aa) 또는 뉴클레오티드(nt) 잔기 위치는 잔기 위치가 관심 서열과 참조 서열 사이의 서열 정렬에서 확인된 위치에 정렬된다는 것을 지칭한다. Clustal Omega 및 BLAST와 같은 다양한 프로그램이 이러한 서열 정렬을 수행하는데 이용 가능하다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 영역(또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역)이 또 다른 서열에 대해 특정 백분율(예를 들면, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%)의 "서열 동일성"을 갖는다는 것은, 정렬될 때, 염기(또는 아미노산)의 백분율이 두 서열을 비교할 때 동일함을 의미한다. 이러한 정렬 및 상동성 퍼센트 또는 서열 동일성은 당업계에 알려진 소프트웨어 프로그램, 예를 들면 문헌[Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology]에 기술된 것을 사용하여 결정할 수 있다. 바람직하게는, 기본 매개변수가 정렬에 사용된다. 하나의 정렬 프로그램은 기본 매개변수를 사용하는 BLAST이다. 특히, 프로그램은 다음 기본 매개변수를 사용하는 BLASTN 및 BLASTP이다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 둘 다; 컷오프 = 60; 기대 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50개 서열; 정렬 기준 = 높은 점수; 데이터베이스 = 비중복, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + SwissProtein + SPupdate + PIR. 이러한 프로그램에 대한 세부사항은 다음 인터넷 주소에서 찾을 수 있다: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 RNA이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 DNA 및 RNA의 하이브리드이다.
일부 실시양태에서, 참조 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 대한 등가물은 참조에 의해 암호화되는 동일한 서열을 암호화한다. 일부 실시양태에서, 참조 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 대한 등가물은 임의로 높은 엄격성의 조건하에 참조, 보체 참조, 역 참조 및/또는 역-보체 참조와 혼성화된다.
추가적으로 또는 대안적으로, 등가 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 참조 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 대해 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 85% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 90% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 92% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 95% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 97% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 것이거나, 대안적으로 등가 핵산은 높은 엄격성의 조건하에서 참조 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체와 혼성화된다. 하나의 측면에서, 등가물은 임의로 본원에 기술된 하나 이상의 분석을 통해 확인될 수 있는 기능성 단백질을 암호화해야 한다. 또 다른 측면에서, 등가물은 참조 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 대해 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 85% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 90% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 92% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 95% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 97% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 98% 서열 동일성을 갖거나, 대안적으로 하나 이상의 비-자연 발생 글리코실화 부위를 갖는 본원에서 확인된 하나 이상의 돌연변이된 폴리뉴클레오티드가 개시된 서열의 상응하는 돌연변이된 폴리뉴클레오티드로부터 돌연변이되지 않는 한 등가 핵산은 높은 엄격성의 조건하에서 참조 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체와 혼성화된다. 예를 들면, 변형된 인간 이소형 #1의 등가 폴리뉴클레오티드는 아래 서열 목록에 나타낸 바와 같은 190, 293, 310, 661, 662, 1066, 1067, 1771, 1773, 1870, 1871, 2413, 2414, 2417, 2418로부터 선택된 위치에 있는 하나 이상의 뉴클레오티드를 제외한 뉴클레오티드 위치의 변형을 가질 것이다. 추가로 또는 대안적으로, 폴리뉴클레오티드의 등가물은 참조 또는 모 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 유사한 기능의 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화할 것이다.
용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 2개 이상의 서브유닛 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩티드모방체의 화합물을 지칭하기 위해 상호교환적으로 가장 넓은 의미로 사용된다. 서브유닛은 펩티드 결합에 의해 연결될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 서브유닛은 다른 결합, 예를 들어 에스테르, 에테르 등에 의해 연결될 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 포함해야 하며 단백질 또는 펩티드의 서열을 구성할 수 있는 아미노산의 최대 수에는 제한이 없다. 본원에 사용된 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 및 L 광학 이성체, 아미노산 유사체 및 펩티드모방체를 포함하는 자연 및/또는 비자연 또는 합성 아미노산을 지칭한다.
등가물 및 생물학적 등가물이라는 용어는 예를 들면 참조로서 단백질 또는 폴리펩티드를 언급할 때 상호교환적으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 등가 단백질 또는 폴리펩티드는 참조 단배질 또는 폴리펩티드에 대해 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 것이다. 일부 실시양태에서, 등가 단백질 또는 폴리펩티드는 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 또는 단백질에 대해 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 등가 단백질 또는 폴리펩티드는 본원에 주지된 바와 같은 등가 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드 또는 단백질에 대해 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는다. 추가로 또는 대안적으로, 폴리뉴클레오티드의 등가물은 참조 또는 모 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 유사한 기능의 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화할 것이다.
일부 실시양태에서, 등가물은 본원에 기술된 하나 이상의 분석을 통해 임의로 확인될 수 있는 기능성 단백질이다. 또 다른 측면에서, 등가물은 참조 단백질 또는 폴리펩티드에 대해 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태는 가능한 글리코실화 부위로 돌연변이된 것으로 본원에서 확인된 하나 이상의 아미노산이 개시된 서열의 폴리펩티드 또는 단백질로부터 돌연변이된다는 것을 전제로 한다. 일부 실시양태는 가능한 글리코실화 부위로 돌연변이된 것으로 본원에서 확인된 하나 이상의 아미노산이 개시된 서열의 폴리펩티드 또는 단백질로부터 돌연변이되지 않는다는 것을 전제로 한다. 예를 들면, 변형된 인간 이소형 #1의 등가 폴리펩티드는 본원에 개시된 바와 같이 나타낸 서열로서 64, 98, 104, 221, 356, 591, 624, 805 및 806으로부터 선택된 위치에 있는 하나 이상의 아미노산을 제외한 아미노산 위치의 변형을 가질 것이다.
일부 실시양태에서, 등가 단백질 또는 폴리펩티드는 야생형과 유사한 기능 및/또는 야생형과 비교하여 유사한 수준으로 기능을 수행한다. 예를 들면, Ube3a 단백질 또는 폴리펩티드의 생물학적 등가물은 야생형 Ube3a 단백질과 비교하여 유사한 기능 및/또는 야생형 Ube3a 단백질 또는 폴리펩티드와 비교하여 유사한 수준(예를 들어 유사한 활성을 가짐)에서 Ube3a 단백질 또는 폴리펩티드의 생물학적 등가물의 기능 중 하나 이상을 가질 수 있다. 추가의 실시양태에서, 예를 들면, 등가물의 기능은 이들 야생형의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 100%, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배의 수준이다. 이러한 기능의 비제한적인 예는 Ube3a 표적 단백질 S5a를 유비퀴틴화하는 것과 같은 유비퀴틴화 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 등가물은 야생형의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 100%, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배인 유비퀴틴화 활성을 갖는다. 이러한 활성을 평가하는 예시적인 방법은 당업계에 공지되어 있으며 몇 가지가 실험 방법에 예시되어 있다.
일부 실시양태에서, 야생형 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 단백질(본원에서 야생형으로도 지칭됨)은 자연 발생 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 의미한다. 추가의 실시양태에서, 야생형 Ube3a 단백질 또는 폴리펩티드는 서열 번호 8, 10, 12, 20, 22 및/또는 24 중 하나 이상으로부터 선택된 서열, 또는 이의 자연 변이체를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성된다. 이러한 가변적인 자연 변이체는 www.uniprot.org/uniprot/Q05086 및 www.uniprot.org/uniprot/O08759에 열거되어 있으며, 이들 각각은 전문이 본원에 포함된다. 일부 실시양태에서, 야생형 Ube3a 단백질 또는 폴리펩티드는 서열 번호 8, 10, 12, 20, 22 및/또는 24 중 하나 이상으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성되는 이소형이다. 추가의 실시양태에서, 야생형 Ube3a 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 7, 9, 11, 19, 21 및/또는 23 중 하나 이상으로부터 선택된 서열, 또는 이의 자연 변이체를 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성된다. 이러한 가변적인 자연 변이체는 전사체 또는 변이체로서 www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=UBE3A에 열거되어 있으며, 이들은 전문이 본원에 포함된다. 일부 실시양태에서, 야생형 Ube3a 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 7, 9, 11, 19, 21 및/또는 23 중 하나 이상으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성되는 이소형이다.
본원에 사용된 바와 같이, 자연 변이체는 인공적인 수단에 의해 생성되는 대신 자연적으로 생성되는(예를 들면, 우발적으로 생성되는) 돌연변이체를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 자연 변이체는 기능적이며, 예를 들면, 야생형과 유사한 기능 및/또는 야생형과 비교하여 유사한 수준으로 기능을 수행한다. 예를 들면, Ube3a 단백질 또는 폴리펩티드의 자연 변이체는 야생형 Ube3a 단백질과 비교하여 유사한 기능 및/또는 야생형 Ube3a 단백질 또는 폴리펩티드와 비교하여 유사한 수준(예를 들어 유사한 활성을 가짐)으로 Ube3a 단백질 또는 폴리펩티드의 자연 변이체의 기능 중 하나 이상을 가질 수 있다. 추가의 실시양태에서, 예를 들면, 자연 변이체의 기능은 이들 야생형의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 100%, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배 수준이다. 이러한 기능의 비제한적인 예는 Ube3a 표적 단백질 S5a를 유비퀴틴화하는 것과 같은 유비퀴틴화 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 자연 변이체는 야생형의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 100%, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배인 유비퀴틴화 활성을 갖는다. 이러한 활성을 평가하는 예시적인 방법은 실험 방법에서 찾을 수 있다.
일부 실시양태에서, 자연 변이체는 기능적이지 않으며, 따라서 본원에서는 결함 변이체, 유전자 또는 대립유전자로 지칭된다. 예를 들면, 이러한 결함 유전자 또는 대립유전자는 야생형의 특정 기능을 수행하지 않는 결함 단백질 변이체를 및/또는 야생형과 비교하여 실질적으로 감소된 수준으로 암호화한다. 일부 실시양태에서, 결함 단백질 변이체의 기능은 야생형의 약 50% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만의 수준이다. 이러한 기능의 비제한적인 예는 Ube3a 표적 단백질 S5a를 유비퀴틴화하는 것과 같은 유비퀴틴화 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결함 변이체는 야생형의 약 50% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만인 유비퀴틴화 활성을 갖는다. 이러한 활성을 평가하는 예시적인 방법은 실험 방법에서 찾을 수 있다.
"폴리뉴클레오티드의 증폭"이라는 표현은 PCR, 연결 증폭(또는 리가제 연쇄 반응, LCR) 및 증폭 방법과 같은 방법을 포함한다. 이들 방법은 공지되어 있으며 당업계에서 널리 실시된다. 예를 들면, 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호 및 문헌[Innis et al., 1990 (PCR의 경우); and Wu et al. (1989) Genomics 4:560-569 (LCR의 경우)]을 참조한다. 일반적으로, PCR 절차는 (i) DNA 샘플(또는 라이브러리) 내의 특정 유전자에 대한 프라이머의 서열-특이적 혼성화, (ii) DNA 폴리머라제를 사용한 어닐링, 연장 및 변성의 여러 라운드를 포함하는 후속 증폭 및 (iii) 정확한 크기의 밴드에 대한 PCR 산물 스크리닝으로 구성된 유전자 증폭 방법을 설명한다. 사용된 프라이머는 중합 개시를 제공하기에 충분한 길이와 적절한 서열의 올리고뉴클레오티드이며, 즉, 각 프라이머는 증폭될 게놈 유전자좌의 각 가닥에 상보적이도록 특별히 설계된다.
PCR을 수행하기 위한 시약 및 하드웨어는 상업적으로 이용 가능하다. 특정 유전자 영역으로부터의 서열을 증폭시키는데 유용한 프라이머는 바람직하게는 표적 영역 또는 이의 측면 영역에 있는 서열에 상보적이며 특이적으로 혼성화한다. 증폭에 의해 생성된 핵산 서열은 직접 시퀀싱될 수 있다. 대안적으로, 증폭된 서열(들)은 서열 분석 전에 클로닝될 수 있다. 효소적으로 증폭된 게놈 절편의 직접적인 클로닝 및 서열 분석을 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다.
"유전자"는 전사 및 번역 후 특정 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화할 수 있는 적어도 하나의 개방 판독 프레임(ORF)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
용어 "발현"은 유전자 산물의 생산을 지칭한다.
본원에 사용된 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 후속적으로 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래된 경우, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
"유전자 산물" 또는 대안적으로 "유전자 발현 산물"은 유전자가 전사 및 번역될 때 생성되는 아미노산(예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드)을 지칭한다.
"전사 제어하에"는 당업계에서 잘 이해되는 용어이며 폴리뉴클레오티드 서열, 통상적으로 DNA 서열의 전사가 전사의 개시에 기여하거나 전사를 촉진하는 요소에 작동적으로 연결되는 것에 의존함을 나타낸다. "작동적으로 연결된"은 폴리뉴클레오티드가 이들이 세포에서 기능할 수 있도록 하는 방식으로 정열되는 것을 의도한다.
폴리뉴클레오티드에 적용될 때 용어 "암호화한다"는 폴리뉴클레오티드가 천연 상태에서 또는 당업계의 숙련가들에게 잘 알려진 방법에 의해 조작될 때 전사되고/되거나 번역되어 폴리펩티드 및/또는 이의 단편에 대한 mRNA를 생성될 수 있는 경우 폴리펩티드를 "암호화"한다고 하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 안티센스 가닥은 이러한 핵산의 보체이며, 이로부터 암호화 서열을 추론할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 조작의 맥락에서 사용될 때 "프로브"는 표적과 혼성화함으로써 관심 샘플에 잠재적으로 존재하는 표적을 검출하기 위한 시약으로서 제공되는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 통상적으로, 프로브는 검출 가능한 표지 또는 마커 또는 혼성화 반응 전 또는 후에 표지 또는 마커가 부착될 수 있는 수단을 포함할 것이다. 대안적으로, "프로브"는 관심 샘플에 잠재적으로 존재하는 표적에 결합할 수 있는 폴리펩티드, 항체 또는 이의 단편과 같은 생물학적 화합물일 수 있다.
"검출 가능한 표지", "표지", "검출 가능한 마커" 또는 "마커"는 상호교환적으로 사용되며, 방사성 동위원소, 형광색소, 화학발광 화합물, 염료 및 효소를 포함한 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 검출 가능한 표지는 또한 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 항체 또는 조성물에 부착될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "표지" 또는 검출 가능한 표지는 "표지된" 조성물을 생성하도록, 검출될 조성물에 직접 또는 간접적으로 접합된 직접 또는 간접적으로 검출 가능한 화합물 또는 조성물, 예를 들어, N-말단 히스티딘 태그(N-His), 자기 활성 동위원소, 예를 들어, 115Sn,　117Sn 및 119Sn, 비방사성 동위원소, 예를 들어 13C 및 15N, 폴리뉴클레오티드 또는 단백질, 예를 들어 항체를 의도한다. 이 용어는 또한 녹색 형광 단백질(GFP) 등과 같은 삽입된 서열의 발현시 신호를 제공하는 폴리뉴클레오티드에 접합된 서열을 포함한다. 표지는 그 자체로 검출할 수 있거나(예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우, 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다. 표지는 소규모 검출에 적합하거나 고속 대량 스크리닝에 더 적합할 수 있다. 이와 같이, 적합한 표지는 자기 활성 동위원소, 비방사성 동위원소, 방사성 동위원소, 형광색소, 화학발광 화합물, 염료, 및 효소를 포함한 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 표지는 단순히 검출될 수 있거나 정량화될 수 있다. 단순히 검출되는 반응은 일반적으로 존재가 단순히 확인되는 반응을 포함하는 반면, 정량화된 반응은 일반적으로 강도, 편광 및/또는 기타 속성과 같은 정량화 가능한(예를 들어, 수치 보고 가능한) 값을 갖는 반응을 포함한다. 발광 또는 형광 분석에서, 검출 가능한 반응은 실제로 결합에 관련된 분석 성분과 관련된 발광단 또는 형광단을 사용하여 직접적으로, 다른(예를 들어, 리포터 또는 표시기) 성분과 관련된 발광단 또는 형광단을 사용하여 간접적으로 생성될 수 있다. 신호를 생성하는 발광 표지의 예는 생물발광 및 화학발광을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 검출가능한 발광 반응은 일반적으로 발광 신호의 변화 또는 발생을 포함한다. 분석 성분을 발광적으로 표지하기 위한 적절한 방법 및 발광단은 당업계에 공지되어 있으며 예를 들면 문헌[Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th　ed)]에 기술되어 있다. 발광 프로브의 예는 에쿼린 및 루시페라제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "면역접합체"는 세포독성제, 검출가능한 제제, 방사성 제제, 표적화제, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 합성 항체, 반합성 항체 또는 다중특이성 항체와 같은 제2 제제와 회합되거나 연결된 항체 또는 항체 유도체를 포함한다.
적합한 형광 표지의 예는 플루오레세인, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리트로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 피렌, 말라사이트 그린, 스틸벤, 루시퍼 옐로우, Cascade Blue™, 및 텍사스 레드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 적합한 광학 염료는 문헌[Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th　ed.)]에 기술되어 있다.
또 다른 측면에서, 형광 표지는 세포 표면 마커와 같은 세포 또는 조직의 표면 내에 또는 상에 존재하는 세포 성분에 대한 공유 부착을 용이하게 하도록 기능화된다. 적합한 기능성 그룹은 이소티오시아네이트 그룹, 아미노 그룹, 할로아세틸 그룹, 말레이미드, 숙신이미딜 에스테르 및 술포닐 할라이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 이들 모두는 형광 표지를 제2 분자에 부착하는데 사용될 수 있다. 형광 표지의 기능성 그룹의 선택은 링커, 제제, 마커 또는 제2 표지화제에 대한 부착 부위에 따라 좌우될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 정제 표지 또는 마커는 에피토프 태그(Myc 태그, 인간 인플루엔자 혈구응집소(HA) 태그, FLAG 태그를 포함하지만, 이에 제한되지 않음), 친화성 태그(글루타티온-S 트랜스퍼라제(GST), 폴리-히스티딘(His) 태그, 칼모듈린 결합 단백질(CBP) 또는 말토스 결합 단백질(MBP)을 포함하지만, 이에 제한되지 않음), 또는 형광 태그와 같이 표지가 접합된 분자 또는 성분을 정제하는데 사용될 수 있는 표지를 지칭한다.
"프라이머"는 일반적으로 표적과 혼성화한 후 표적에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 중합을 촉진함으로써 관심 샘플에 잠재적으로 존재하는 표적 또는 "주형"에 결합하는 유리 3'-OH 그룹을 갖는 짧은 폴리뉴클레오티드이다. "폴리머라제 연쇄 반응"("PCR")은 복제 카피가 "업스트림" 및 "다운스트림" 프라이머로 구성된 "프라이머 세트" 또는 "한 쌍의 프라이머" 및 DNA 폴리머라제와 같은 중합 촉매, 및 전형적으로 열 안정한 폴리머라제 효소를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드로 만들어지는 반응이다. PCR을 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 문헌[MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press)]에 교시되어 있다. PCR 또는 유전자 클로닝과 같은 폴리뉴클레오티드의 복제 카피를 생성하는 모든 과정을 본원에서는 집합적으로 "복제"라고 한다. 프라이머는 또한 서던 또는 노던 블롯 분석과 같은 혼성화 반응에서 프로브로 사용될 수 있다. Sambrook and Russell (2001), infra.
"혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여 뉴클레오티드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화되는 복합체를 형성하는 반응을 지칭한다. 수소 결합은 왓슨 크릭 염기 쌍형성, 후그스테인(Hoogstein) 결합, 또는 임의의 다른 서열-특이적 방식으로 일어날 수 있다. 복합체는 이중 구조를 형성하는 2개의 가닥, 다중 가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일 자가-혼성화 가닥, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 PCR 반응의 개시 또는 리보자임에 의한 폴리뉴클레오티드의 효소적 절단과 같은 보다 광범위한 과정의 단계를 구성할 수 있다.
혼성화 반응은 상이한 "엄격성" 조건하에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 낮은 엄격성 혼성화 반응은 10 x SSC 또는 등가 이온 강도/온도의 용액에서 약 40℃에서 수행된다. 중간 엄격성 혼성화는 전형적으로 6 x SSC에서 약 50℃에서 수행되고, 높은 엄격성 혼성화 반응은 일반적으로 1 x SSC에서 약 60℃에서 수행된다. 혼성화 반응은 또한 당업계의 숙련가에게 잘 알려진 "생리학적 조건"하에서 수행될 수 있다. 생리학적 조건의 비제한적인 예는 세포에서 정상적으로 발견되는 온도, 이온 강도, pH 및 Mg2+ 농도이다.
혼성화가 두 개의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 사이의 역평행 배열에서 발생하는 경우, 반응을 "어닐링"이라고 하며 이러한 폴리뉴클레오티드는 "상보적"으로 설명된다. 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 혼성화가 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드의 가닥 중 하나 사이에서 일어날 수 있다면, 다른 폴리뉴클레오티드에 "상보적"이거나 "상동성"일 수 있다. "상보성" 또는 "상동성"(하나의 폴리뉴클레오티드가 다른 폴리뉴클레오티드와 상보적인 정도)는 일반적으로 허용되는 염기쌍 규칙에 따라 서로 수소 결합을 형성할 것으로 예상되는 반대 가닥의 염기 비율 측면에서 정량화할 수 있다.
용어 "번식하다"는 세포 또는 세포 집단을 성장시키는 것을 의미한다. 용어 "성장"은 또한 지지 배지, 영양소, 성장 인자, 지지 세포, 또는 원하는 수의 세포 또는 세포 유형을 수득하는데 필요한 임의의 화학적 또는 생물학적 화합물의 존재하에서의 세포의 증식을 지칭한다.
용어 "배양"은 다양한 종류의 배지 상에서 또는 내에서 세포 또는 유기체의 시험관내 증식을 지칭한다. 배양에서 성장한 세포의 후손은 모세포와 완전히 (즉, 형태학적으로, 유전적으로 또는 표현형적으로) 동일하지 않을 수 있는 것으로 이해된다.
변형되지 않은 세포를 때때로 "소스 세포" 또는 "소스 줄기 세포"라고 한다. 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있으며, 박테리아 세포, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 동물 세포 및 포유동물 세포, 예를 들어 고양이, 개, 말, 뮤린, 랫트, 유인원, 소, 돼지 및 인간을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 실시양태에서, "미성숙 세포"는 원하는 (성인) 표현형 또는 유전자형을 갖지 않는 세포를 지칭한다. 예를 들면, 하나의 실시양태에서, 성숙한 세포는 대체되는 세포이다. 미성숙 세포는 "성숙 세포"로 세포의 표현형 또는 유전자형을 변화시키거나, 변화를 개시하거나, 변경하는 물리적, 생물학적 또는 화학적 과정을 포함하는 기술을 거칠 수 있다. "성숙 세포"는 원하는 표현형 또는 유전자형을 보유하는 세포를 지칭한다.
"바이러스 벡터"는 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 숙주 세포 내로 전달될 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합적으로 생성된 바이러스 또는 바이러스 입자로 정의된다. 바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터 등을 포함한다. 셈리키 삼림열 바이러스-기반 벡터 및 신드비스 바이러스-기반 벡터와 같은 알파바이러스 벡터도 유전자 요법 및 면역요법에 사용하기 위해 개발되었다. 문헌[Schlesinger and Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439 and Ying, et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827]을 참조한다.
유전자 전달이 렌티바이러스 벡터에 의해 매개되는 측면에서, 벡터 작제물은 렌티바이러스 게놈 또는 이의 일부, 및 치료 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 본원에 사용된 "렌티바이러스 매개된 유전자 전달" 또는 "렌티바이러스 형질도입"은 동일한 의미를 지니며, 바이러스가 세포에 들어가서 이의 게놈을 숙주 세포 게놈으로 통합함으로써 유전자 또는 핵산 서열이 숙주 세포 내로 안정적으로 전달되는 과정을 지칭한다. 바이러스는 정상적인 감염 메카니즘을 통해 숙주 세포에 들어가거나 다른 숙주 세포 표면 수용체 또는 리간드에 결합하여 세포에 들어가도록 변형될 수 있다. 레트로바이러스는 RNA의 형태로 이들의 유전 정보를 전달한다; 그러나, 일단 바이러스가 세포를 감염시키면, RNA는 감염된 세포의 게놈 DNA에 통합되는 DNA 형태로 역전사된다. 통합된 DNA 형태를 프로바이러스라고 한다. 본원에 사용된 바와 같이, 렌티바이러스 벡터는 바이러스 또는 바이러스-유사 진입 메카니즘을 통해 외인성 핵산을 세포 내로 도입할 수 있는 바이러스 입자를 지칭한다. "렌티바이러스 벡터"는 다른 레트로바이러스 벡터와 비교하여 비분열 세포를 형질도입하는데 있어 특정 이점을 갖는 당업계에 잘 알려진 레트로바이러스 벡터의 한 유형이다. 문헌[Trono D. (2002) Lentiviral vectors, New York: Spring-Verlag Berlin Heidelberg]을 참조한다.
본 개시내용의 렌티바이러스 벡터는 온코레트로바이러스(MLV를 함유하는 레트로바이러스의 하위그룹) 및 렌티바이러스(HIV를 함유하는 레트로바이러스의 하위그룹)를 기반으로 하거나 이로부터 유래된다. 예는 ASLV, SNV 및 RSV를 포함하며 이들 모두는 렌티바이러스 벡터 입자 생산 시스템을 위한 패키징 및 벡터 성분으로 분할되었다. 본 개시내용에 따른 렌티바이러스 벡터 입자는 유전적으로 또는 달리 (예를 들어, 패키징 세포 시스템의 특정 선택에 의해) 변경된 버전의 특정 레트로바이러스를 기반으로 할 수 있다.
본 개시내용에 따른 벡터 입자가 특정 레트로바이러스"를 기반으로 한다"는 것은 벡터가 그 특정 레트로바이러스로부터 유래된다는 것을 의미한다. 벡터 입자의 게놈은 그 레트로바이러스의 성분을 백본으로서 포함한다. 벡터 입자는 역전사 및 통합 시스템을 포함하여 RNA 게놈과 상용성인 필수 벡터 성분을 포함한다. 통상적으로 이들은 특정 레트로바이러스로부터 유래된 gag 및 pol 단백질을 포함할 것이다. 따라서, 벡터 입자의 구조 성분의 대부분은 통상적으로 그 레트로바이러스로부터 유래되지만 이들은 원하는 유용한 특성을 제공하도록 유전적으로 또는 달리 변경되었을 수 있다. 그러나, 특정 구조 성분 및 특히 env 단백질은 상이한 바이러스로부터 기원할 수 있다. 감염되거나 형질도입된 벡터 숙주 범위 및 세포 유형은 벡터 입자에 상이한 특이성을 제공하기 위해 벡터 입자 생산 시스템에서 상이한 env 유전자를 사용함으로써 변경될 수 있다.
양 또는 농도 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 본원에 사용된 용어 "약"은 명시된 양의 20%, 10%, 5%, 1%, 0.5%, 또는 심지어 0.1%의 변동을 포함하는 것을 의미한다.
본원에 개시된 임의의 성분, 범위, 투여 형태 등의 선택을 설명하기 위해 사용될 때 용어 "허용되는", "효과적인" 또는 "충분한"은 상기 성분, 범위, 투여 형태 등이 개시된 목적에 적합하다는 것을 의도한다.
본원에 사용된 용어 "아데노-관련 바이러스" 또는 "AAV"는 이 이름과 관련되고 파보바이러스과(family Parvoviridae) 데펜도파보바이러스 속(genus dependoparvovirus)에 속하는 바이러스 부류의 구성원을 지칭한다. 이 바이러스의 여러 혈청형은 유전자 전달에 적합한 것으로 알려져 있다; 알려진 모든 혈청형은 다양한 조직 유형으로부터의 세포를 감염시킬 수 있다. 적어도 11개의 순차적으로 번호가 매겨진 AAV 혈청형이 당업계에 알려져 있다. 본원에 개시된 방법에 유용한 비제한적인 예시적 혈청형은 11가지 혈청형 중 어느 것, 예를 들어 AAV2, AAV8, AAV9, 또는 변이체 또는 합성 혈청형, 예를 들어 AAV-DJ 및 AAV PHP.B를 포함한다. AAV 입자는 VP1, VP2 및 VP3의 3가지 주요 바이러스 단백질을 포함하거나, 대안적으로 본질적으로 이들로 구성되거나, 이들로 추가로 구성된다. 하나의 실시양태에서, AAV는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV PHP.B, 또는 AAV rh74를 지칭한다. 이러한 벡터는 상업적으로 이용 가능하거나 특허 또는 기술 문헌에 설명되어 있다.
본원에 사용된 "항체"는 전체 항체 및 이의 임의의 항원-결합 단편 또는 단일 쇄를 포함한다. 따라서, 용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 이의 예는 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 리간드 결합 부분의 상보성 결정 영역(CDR), 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크(FR) 영역, 또는 이의 임의의 부분, 또는 결합 단백질의 적어도 일부를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이들 중 임의의 것은 본 개시내용의 항체에 포함될 수 있다. 용어 "항체"는 항체 모방체를 포함하거나 항체의 구조 및/또는 기능을 모방하는 항체의 부분을 포함하는 소화 단편, 이의 특정 부분, 유도체 및 변이체 또는 단일 사슬 항체 및 이의 단편을 포함하는 이의 특정 단편 또는 이의 일부를 포함하는 것으로 추가로 의도된다. 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예는 VL, VH, CL 및 CH, 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; VH 및 CH, 도메인으로 구성된 Fd 단편; 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward et al. (1989) Nature 341:544-546); 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 두 도메인인 VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단쇄 Fv(scFv)로 알려짐)를 형성하는 단일 단백질 사슬로 만들어질 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 결합될 수 있다(참조; Bird et al. (1988) Science 242:423-426 and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883). 단일 사슬 항체는 또한 "항체의 단편"이라는 용어 내에 포함되는 것으로 의도된다. 상기 언급된 항체 단편 중 어느 것은 당업계의 숙련가들에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되며, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 결합 특이성 및 중화 활성에 대해 스크리닝된다.
용어 "항체 변이체"는 마우스 이외의 종에서 생산된 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 이것은 또한 항체 또는 단편의 선형 폴리펩티드 서열에 대한 번역후 변형을 함유하는 항체를 포함한다. 이는 완전 인간 항체를 추가로 포함한다.
용어 "항체 유도체"는 상기 정의된 바와 같은 에피토프에 결합하고 본 개시내용의 천연 단클론 항체의 변형 또는 유도체인 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 유도체는, 예를 들면, 이중특이성, 다중특이성, 이종특이성, 삼중특이성, 사중특이성, 다중특이성 항체, 디아바디, 키메라, 재조합 및 인간화 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "Ube3a"는 유비퀴틴 단백질 리가제 E3A라고 하는 단백질을 암호화하는 유전자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, Ube3a의 약어는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, Ube3a의 약어는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 유비퀴틴 단백질 리가제는 세포 내에서 붕괴(분해)될 다른 단백질을 표적으로 하는 효소이다. 이 효소는 유비퀴틴이라는 작은 분자를 분해되어야 하는 단백질에 부착한다. 프로테아좀이라고 하는 세포 구조가 이러한 유비퀴틴-태그된 단백질을 인식하고 소화한다. 단백질 분해는 손상되거나 불필요한 단백질을 제거하고 세포의 정상적인 기능을 유지하는데 도움이 되는 정상적인 과정이다. 2019년 5월 23일에 마지막으로 액세스한 ghr.nlm.nih.gov/gene/UBE3A를 참조한다.
연구에서는 유비퀴틴 단백질 리가제 E3A가 신경계의 정상적인 발달과 기능에 중요한 역할을 한다고 시사한다. 연구에서는 이것이 세포간 통신이 일어나는 신경 세포(시냅스) 사이의 접합부에서 단백질 합성과 분해(단백질 항상성)의 균형을 제어(조절)하는데 도움이 된다고 시사한다. 단백질 항상성의 조절은 시냅스가 시냅스 가소성(synaptic plasticity)이라는 특성을 경험하는데 대한 반응으로 시간이 지남에 따라 변화하고 적응하는데 중요하다. 시냅스 가소성은 학습 및 기억에 중요하다. 5' 말단에서 서로 다른 유전자의 3가지 이소형이 있다(NCBI NM_0013545606; NM_000462.5; 및 NM001354505 참조). 문헌0Yamamoto et al. (1997) Genomics Apr. 15;41(2):263-266]은 E6-AP의 코딩 영역의 게놈 구조, 및 극단의 아미노-말단에서 서로 다른 E6-AP 단백질의 3가지 단백질 이소형(이소형 I, II, III)을 암호화할 가능성이 있는 5개의 E6-AP mRNA 세트 분석에 대해 기술한다.
본원에 사용된 바와 같이, N-연결된 글리코실화는 여러 당 분자로 구성된 탄수화물인 올리고당 또는 글리칸이 단백질 또는 폴리펩티드의 아스파라긴(Asn, N) 잔기의 아미드 질소와 같은 질소 원자에 부착되는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "조절 서열" "발현 조절 요소" 또는 "프로모터"는 전사 및/또는 복제될 표적 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결되어 폴리뉴클레오티드의 발현 및/또는 복제를 촉진하는 폴리뉴클레오티드를 의도한다. 프로모터는 발현 조절 요소 또는 조절 서열의 예이다. 프로모터는 유전자 또는 다른 폴리뉴클레오티드의 5' 또는 상류에 위치하여 조절된 유전자 전사를 위한 조절점을 제공할 수 있다. 폴리머라제 II 및 III은 프로모터의 예이다. MNDU3 프로모터의 서열 및 예시적인 CMV 프로모터의 서열은 아래에 제공되어 있다.
폴리머라제 II 또는 "pol II" 프로모터는 DNA의 전사를 촉매하여 mRNA의 전구체, 및 대부분의 shRNA 및 microRNA를 합성한다. pol II 프로모터의 예는 당업계에 알려져 있으며 제한 없이 포스포글리세레이트 키나제("PGK") 프로모터; EF1-알파; CMV(최소 사이토메갈로바이러스 프로모터); 및 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터로부터의 LTR을 포함한다. 다른 pol II 프로모터는 예를 들어 세포 특이 프로모터(CD14 프로모터, CD3 프로모터, CD19 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않음), 임의의 혈액 세포 계통 촉진제(CD2, CD11b, CD11c, CD16, CD24, CD56, CD66b 및 CD235 중의 어느 하나의 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않음), 및/또는 인간 세포에서 단백질 발현을 지시할 수 있는 임의의 다른 프로모터로부터 선택될 수 있다.
인핸서(enhancer)는 표적 서열의 발현을 증가시키는 조절 요소이다. "프로모터/인핸서"는 프로모터 및 인핸서 기능 둘 다를 제공할 수 있는 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드이다. 예를 들면, 레트로바이러스의 긴 말단 반복체는 프로모터와 인핸서 기능을 둘 다 함유한다. 인핸서/프로모터는 "내인성" 또는 "외인성" 또는 "이종성"일 수 있다. "내인성" 인핸서/프로모터는 게놈에서 주어진 유전자와 자연적으로 연결된 것이다. "외인성" 또는 "이종성" 인핸서/프로모터는 유전자 조작(즉, 분자 생물학적 기술)에 의해 유전자에 병치되어 배치되어 그 유전자의 전사가 연결된 인핸서/프로모터에 의해 지시되도록 하는 것이다.
본원에 사용된 신호 펩티드는 (때때로 신호 서열, 표적화 신호, 국소화 신호, 국소화 서열, 전이 펩티드, 리더 서열 또는 리더 펩티드로 지칭됨) 분비 경로로 향하는 대부분의 새로 합성된 단백질의 N-말단에 존재하는 짧은 펩티드(통상적으로 16-30개 아미노산 길이)를 지칭한다. 하나의 실시양태에서, 신호 펩티드는 분비 신호이다.
분비 신호는 세포질에서 분비 경로로의 단백질의 수출을 가능하게 하는 분비 신호 펩티드를 의도한다. 단백질은 차등 수준의 성공적인 분비를 나타낼 수 있으며 종종 특정 신호 펩티드는 특정 단백질과 짝을 이룰 때 더 낮거나 더 높은 수준을 유발할 수 있다. 진핵생물에서, 신호 펩티드는 진핵 세포의 세포질에서 신호 인식 입자(SRP)에 의해 인식되는 아미노산의 소수성 스트링이다. mRNA-리보솜 복합체로부터 신호 펩티드가 생성된 후, SRP가 펩티드에 결합하고 단백질 번역을 중단한다. 그후 SRP는 mRNA/리보솜 복합체를 조면 소포체로 셔틀링하여 여기서 단백질이 소포체의 내강으로 번역된다. 그후 신호 펩티드는 단백질에서 절단되어 소포체에서 가용성 또는 막 태그된(막관통 영역이 또한 존재하는 경우) 단백질을 생성한다. 이들은 당업계에 알려져 있으며, 판매사, 예를 들어, Oxford Genetics로부터 상업적으로 이용 가능하다.
세포 투과 펩티드 또는 세포 투과 도메인(CPP) 또는 본원에 사용된 바와 같은 세포 투과 도메인은 다양한 분자 카고(molecular cargo)(작은 화학 분자에서 나노크기 입자 및 DNA의 큰 단편까지)의 세포 흡수를 촉진하는 짧은 펩티드를 지칭한다. 본원에 개시된 바와 같은 변형된 단백질과 같은 "카고"는 공유 결합을 통한 화학적 연결을 통해 또는 비공유 상호작용을 통해 펩티드와 결합된다. CPP의 기능은 카고를 표적 세포로 전달하는 것이며, 이것은 일반적으로 살아있는 포유동물 세포의 엔도솜으로 카고가 전달되는 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 발생하는 과정이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 뉴런이다. CPP는 전형적으로 리신 또는 아르기닌과 같은 양으로 하전된 아미노산의 높은 상대 존재비를 함유한 아미노산 조성을 갖거나 극성/하전된 아미노산과 비극성의 소수성 아미노산의 교대 패턴을 함유한 서열을 갖는다. 인간 면역결핍 바이러스 전사 활성제(HIV-TAT) 단백질이 CPP를 사용하여 세포에 전달될 수 있다는 것이 이전에 보고되었다.
CPP는 또한 CPP의 C-말단 근처에서 프레닐화되는 것과 같이 화학적으로 변형될 수 있다. 프레닐화는 펩티드에 15개(파르네이실) 또는 20개(제라닐제라닐) 탄소 이소프레노이드 사슬을 추가하는 번역후 변형이다. 화학적으로 변형된 CPP는 심지어 더 짧을 수 있으며 여전히 세포 투과 특성을 보유한다. 따라서, 본 개시내용의 또 다른 측면에 따르면, CPP는 2 내지 35개의 아미노산, 바람직하게는 5 내지 25개의 아미노산, 보다 바람직하게는 10 내지 25개의 아미노산, 또는 훨씬 더 바람직하게는 15 내지 25개의 아미노산을 갖는 화학적으로 변형된 CPP이다.
CPP는 재조합적으로, 공유적으로 또는 비공유적으로 단백질에 연결될 수 있다. CPP 펩티드를 갖는 재조합 단백질은 대장균과 같은 박테리아, 인간 HEK293 세포와 같은 포유동물 세포, 또는 단백질 발현에 적합한 임의의 세포에서 제조될 수 있다. 공유 및 비공유 방법이 또한 CPP/단백질 복합체를 형성하기 위해 개발되었다. CPP인 Pep-1은 단백질 복합체를 형성하는 것으로 나타났으며 전달에 효과적인 것으로 판명되었다(Kameyama et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:597-602).
CPP는 또한 관심 세포 또는 조직으로의 단백질의 전달을 촉진하는데 사용될 수 있는 양이온성 접합체를 포함한다. 양이온성 접합체는 아민, 구아니딘, 아미딘, N-함유 헤테로사이클, 또는 이들의 조합을 포함하는 복수의 잔기를 포함할 수 있다. 관련 실시양태에서, 양이온성 접합체는 알파-아미노산, 베타-아미노산, 감마-아미노산, 양이온으로 작용화된 단당류, 양이온으로 작용화된 에틸렌 글리콜, 에틸렌 이민, 치환된 에틸렌 이민, N-치환된 스페르민, N-치환된 스페르미딘, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 복수의 반응성 단위를 포함할 수 있다. 양이온성 접합체는 또한 올리고펩티드, 올리고아미드, 양이온으로 작용화된 올리고에테르, 양이온으로 작용화된 올리고당, 올리고아민, 올리고에틸렌이민 등 뿐만 아니라 이들의 조합을 포함하는 올리고머일 수 있다. 올리고머는 올리고펩티드의 아미노산 잔기가 양전하를 형성할 수 있는 올리고펩티드일 수 있다. 올리고펩티드는 5 내지 25개의 아미노산; 바람직하게는 5 내지 15개의 아미노산; 보다 바람직하게는 5 내지 10개의 양이온성 아미노산 또는 다른 양이온성 서브유닛을 함유할 수 있다.
CPP를 단백질에 고정시키는 재조합 단백질을 생성하여 세포 또는 조직으로 전달하는데 사용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 절단 가능한 링커로도 지칭되는 절단 가능한 펩티드는, 예를 들면, 효소에 의해 절단될 수 있는 펩티드를 의미한다. 이러한 절단 가능한 펩티드를 포함하는 하나의 번역된 폴리펩티드는 2개의 최종 산물을 생성할 수 있으므로, 하나의 개방 판독 프레임으로부터 하나 이상의 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 절단 가능한 펩티드의 한 가지 예는 2A 자가-절단 펩티드와 같은 자가-절단 펩티드이다. 2A 자가-절단 펩티드는 18-22개의 aa-길이 펩티드의 부류이며, 이것은 세포에서 재조합 단백질의 절단을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2A 자가-절단 펩티드는 P2A, T2A, E2A, F2A 및 BmCPV2A로부터 선택된다. 예를 들면, 문헌[Wang Y, et al. 2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori.　Sci Rep. 2015;5:16273. Published 2015 Nov 5]을 참조한다.
용어 "줄기 세포"는 미분화 또는 부분 분화 상태에 있고 자가-재생 및/또는 분화된 자손을 생성하는 능력을 갖는 세포를 지칭한다. 자가-재생은 발달 가능성(즉, 전분화능, 다능성, 다분화능 등)을 유지하면서 줄기 세포가 증식하고 이러한 줄기 세포를 더 많이 생성하는 능력으로 정의된다. 용어 "체세포 줄기 세포"는 태아, 청소년 및 성인 조직을 포함하는 비배아 조직으로부터 유래된 임의의 줄기 세포를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 자연 체세포 줄기 세포는 혈액, 골수, 뇌, 후각 상피, 피부, 췌장, 골격근 및 심장 근육을 포함한 다양한 성인 조직으로부터 단리하였다. 예시적인 자연 발생 체세포 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포(MSC) 및 신경 또는 뉴런 줄기 세포(NSC)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 줄기 또는 전구 세포(progenitor cell)는 배아 줄기 세포일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "배아 줄기 세포"는 배아-전 조직(예를 들면, 배반포), 배아 조직, 또는 임신 동안, 필수적인 것은 아니지만 전형적으로 대략 임신 10-12주 이전의 임의의 시간에 채취된 태아 조직을 포함하여, 수정 후 임신 말기 이전에 형성된 조직으로부터 유래된 줄기 세포를 지칭한다. 가장 흔히, 배아 줄기 세포는 초기 배아 또는 배반포로부터 유래된 다능성 세포이다. 배아 줄기 세포는 인간 조직을 포함하지만 이에 제한되지 않는 적합한 조직으로부터 또는 확립된 배아 세포주로부터 직접 수득될 수 있다. "배아-유사 줄기 세포"는 배아 줄기 세포의 모든 특성이 아닌 하나 이상의 특성을 공유하는 세포를 지칭한다.
"분화"는 특수화되지 않은 세포가 심장, 간 또는 근육 세포와 같은 특수화된 세포의 특징을 획득하는 과정을 기술한다. "지정 분화"는 특정 세포 유형으로의 분화를 유도하기 위해 줄기 세포 배양 조건을 조작하는 것을 지칭한다. "탈분화"는 세포 계통 내에서 덜 위탁된(committed ) 위치로 되돌아가는 세포를 정의한다. 본원에 사용된 용어 "분화하다 또는 분화된"은 세포의 계통 내에서 더욱 위탁된("분화된") 위치를 취하는 세포를 정의한다. 본원에 사용된 바와 같이 "중배엽(또는 외배엽 또는 내배엽) 계통으로 분화하는 세포"는 각각 특정 중배엽, 외배엽 또는 내배엽 계통으로 위탁되는 세포를 정의한다. 중배엽 계통으로 분화하거나 특정 중배엽 세포를 발생시키는 세포의 예는 지방형성, 평활근형성, 연골형성, 심장형성, 피부형성, 조혈, 혈관형성, 근육형성, 신장형성, 비뇨생식형성, 골형성, 심막형성 또는 기질성인 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "분화하다 또는 분화된"은 세포의 계통 내에서 더욱 위탁된("분화된") 위치를 취하는 세포를 정의한다. "탈분화된"는 세포 계통 내에서 덜 위탁된 위치로 되돌아가는 세포를 정의한다. 유도 만능 줄기 세포는 탈분화된 세포의 예이다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포의 "계통"은 세포의 유전, 즉 이의 선조 및 자손을 정의한다. 세포의 계통은 세포를 발달과 분화의 유전 계획 내에 둔다.
"다계통 줄기 세포" 또는 "다능성 줄기 세포"는 자체를 재생하는 줄기 세포 및 별개의 발달 계통으로부터 적어도 2개의 추가로 분화된 자손 세포를 지칭한다. 계통은 동일한 배엽(즉, 중배엽, 외배엽 또는 내배엽) 또는 다른 배엽으로부터 유래할 수 있다. 다계통 줄기 세포의 분화에서 구별되는 발달 계통을 가진 두 개의 자손 세포의 예는 근육형성 세포 및 지방형성 세포이다(둘 다 중배엽 기원이지만 다른 조직을 발생시킨다). 또 다른 예는 (외배엽 기원의) 신경형성 세포 및 (중배엽 기원의) 지방형성 세포이다.
"전구체" 또는 "전구 세포"는 특정 유형의 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미하도록 의도된다. 전구 세포는 줄기 세포일 수 있다. 전구 세포는 또한 줄기 세포보다 더 특이적일 수 있다. 전구 세포는 단분화능 또는 다분화능일 수 있다. 성인 줄기 세포와 비교하여, 전구 세포는 세포 분화의 후기 단계에 있을 수 있다. 전구 세포의 예는 제한 없이 전구 신경 세포를 포함한다.
본원에 사용된 "다능성 세포"는 적어도 2개의 별개의(유전자형으로 및/또는 표현형으로) 추가 분화된 자손 세포를 생성할 수 있는 덜 분화된 세포를 정의한다. 또 다른 측면에서, "다능성 세포"는 하나 이상의 줄기 세포 특이 유전자의 발현을 유도함으로써 조직학적으로 생산된 비-다능성 세포, 전형적으로 성인 체세포로부터 인공적으로 유래된 줄기 세포인 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)를 포함한다. 이러한 줄기 세포 특이 유전자는 옥타머 전사 인자 계열, 즉 Oct-3/4; Sox 유전자 계열, 즉, Sox1, Sox2, Sox3, Sox 15 및 Sox 18; Klf 유전자 계열, 즉 Klf1, Klf2, Klf4 및 Klf5; Myc 유전자 계열, 즉 c-myc 및 L-myc; Nanog 유전자 계열, 즉, OCT4, NANOG 및 REX1; 또는 LIN28을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. iPSC의 예는 문헌[Takahashi et al. (2007) Cell advance online publication 20 November 2007; Takahashi & Yamanaka (2006) Cell 126:663-76; Okita et al. (2007) Nature 448:260-262; Yu et al. (2007) Science advance online publication 20 November 2007; and Nakagawa et al. (2007) Nat. Biotechnol. Advance online publication 30 November 2007]에 기술되어 있다.
"배양체 또는 EB"는 후속 분화를 촉진하는 배양 중에 형성된 배아 줄기 세포의 3차원(3D) 응집체이다. 현탁 배양에서 성장하는 경우, EB 세포는 내장 내배엽의 외부 층으로 둘러싸인 세포의 작은 응집체를 형성한다. 성장 및 분화시, EB는 유체로 채워진 공동과 외배엽-유사 세포의 내부층이 있는 낭포성 배양체로 발달한다.
"유도 다능성 세포"는 성인 세포로부터 미성숙 표현형으로 재프로그래밍된 배아-유사 세포를 의도한다. 다양한 방법이 당업계, 예를 들어 문헌["A simple new way to induce pluripotency: Acid." Nature, 29 January 2014] available at sciencedaily.com/releases/2014/01/140129184445, last accessed on February 5, 2014] 및 미국 특허 출원 공개 제2010/0041054호에 알려져 있다. 인간 iPSC는 또한 줄기 세포 마커를 발현하고 모든 세 개의 배엽층을 특징지우는 세포를 생성할 수 있다.
"단위생식 줄기 세포"는 난자의 단위생식적 활성화로부터 발생하는 줄기 세포를 지칭한다. 단위생식 줄기 세포를 생성하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들면, 문헌[Cibelli et al. (2002) Science 295(5556):819 and Vrana et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(Suppl. 1)11911-6]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "다능성 유전자 또는 마커"는 미성숙 또는 미분화 표현형, 예를 들어 Oct ¾, Sox2, Nanog, c-Myc 및 LIN-28과 상관관계가 있는 발현된 유전자 또는 단백질을 의도한다. 이를 식별하는 방법은 당업계에 알려져 있으며 이를 식별하는 시스템은, 예를 들면, EMD Millipore(MILLIPLEX® Map Kit)로부터 상업적으로 이용 가능하다.
용어 "표현형"은 측정할 수 있고 집단 내의 개체의 하위집합에서만 발현되는 개체의 특성 또는 특징에 대한 설명을 지칭한다. 본 개시내용의 하나의 측면에서, 개체의 표현형은 단일 세포, 실질적으로 균질한 세포 집단, 분화된 세포 집단, 또는 세포 집단으로 구성된 조직의 표현형을 포함한다.
생물학적으로 상용성인 담체 또는 배지라는 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체(또는 배지)라는 용어는 치료적으로 투여되는 세포 및 기타 제제와 상용성일 뿐만 아니라 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 시약, 세포, 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다. 본 개시내용에 사용하기에 적합한 약제학적으로 허용되는 담체는 액체, 반고체(예를 들어, 겔) 및 고체 물질(예를 들어, 세포 스캐폴드 및 매트릭스, 튜브 시트 및 당업계에 공지되고 본원에 더욱 상세히 기술된 바와 같은 이러한 기타 물질)을 포함한다. 이러한 반고체 및 고체 물질은 체내 분해에 저항하도록 설계될 수 있거나(비-생분해성) 체내 분해하도록 설계될 수 있다(생분해성, 생부식성). 생분해성 물질은 추가로 생체 흡수성(bioresorbable) 또는 생흡수성(bioabsorbable)일 수 있으며, 즉, 이것은 용해되어 체액에 흡수되거나(수용성 임플란트가 한 예임), 분해되어 궁극적으로 다른 물질로 전환되거나 자연 경로를 통해 분해 및 제거되어 신체로부터 제거될 수 있다.
세포 집단은 표현형 및/또는 유전자형이 동일하거나(클론성) 동일하지 않은 하나 이상의 세포 집합을 의도한다. 집단은 본원에 기술된 바와 같이 정제되거나, 고도로 정제되거나, 실질적으로 균질하거나 이종성일 수 있다.
유효 기간(또는 시간) 및 유효 조건이라는 용어는 제제 또는 조성물이 의도한 결과, 예를 들어, 미리 결정된 세포 유형으로의 세포의 분화 또는 탈분화를 달성하기 위해 필요하거나 바람직한 기간 또는 기타 제어 가능한 조건(예를 들어, 시험관내 방법의 경우 온도, 습도)을 지칭한다.
"실질적으로 균질한"은 세포의 약 50% 이상, 또는 대안적으로 약 60% 이상, 또는 대안적으로 70% 이상, 또는 대안적으로 75% 이상, 또는 대안적으로 80% 이상, 또는 대안적으로 85% 이상, 또는 대안적으로 90% 이상, 또는 대안적으로, 95% 이상이 동일하거나 유사한 표현형인 세포 집단을 설명한다. 표현형은 미리 선택된 세포 표면 마커 또는 다른 마커에 의해 결정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료하는", "치료" 등은 본원에서 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 의미하는 것으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 효과는 장애 또는 이의 징후 또는 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 측면에서 예방적일 수 있고/있거나 장애 및/또는 장애에 기인할 수 있는 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 측면에서 치료적일 수 있다. "치료"의 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 장애에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 장애가 있는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 장애가 발생하는 것을 방지하는 것; 장애를 억제하는 것, 즉 장애의 발달을 저지하는 것; 및/또는 장애의 증상을 완화 또는 개선하는 것. 하나의 측면에서, 치료는 질환 또는 장애, 예를 들어 엔젤만 증후군의 증상의 발달을 저지하는 것이다. 일부 실시양태에서, 이들은 (1) 질환의 소인이 있거나 아직 질환의 증상을 나타내지 않는 대상체에서 증상 또는 질환이 발생하는 것을 예방하는 것; (2) 질환을 억제하거나 질환의 발달을 저지하는 것; 또는 (3) 질환 또는 질환의 증상을 개선하거나 퇴행시키는 것을 지칭한다. 당업계에서 이해되는 바와 같이, "치료"는 임상 결과를 포함하여 유익하거나 원하는 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 기술의 목적을 위해, 유익한 또는 원하는 결과는 하나 이상의 증상의 완화 또는 개선, 병태(질환 포함)의 정도 감소, 병태(질환 포함)의 안정화된(즉, 악화되지 않은) 상태, 병태(질환 포함)의 지연 또는 감속, 병태(질환 포함)의 진행, 개선 또는 완화, 검출 가능하든 검출 가능하지 않든 상태 및 관해(부분적 또는 전체적) 중 하나 이상을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 하나의 측면에서, 치료는 예방 또는 방지를 배제한다.
하나의 실시양태에서, 본원에 사용된 용어 "질환" 또는 "장애"는 엔젤만 증후군(Angelman syndrome) 및/또는 프라더 윌리 증후군(Prader-Willi syndrome)과 같은 결함이 있는 Ube3a 변이체 또는 유전자와 관련된 질환, 이러한 질환으로 진단된 상태, 이러한 질환이 의심되는 상태 또는 이러한 질환에 걸릴 위험이 높은 상태를 지칭한다.
세포 또는 벡터 또는 다른 제제 및 이를 함유하는 조성물의 "투여" 또는 "전달"은 치료 과정 전반에 걸쳐 연속적으로 또는 간헐적으로 1회 용량으로 수행될 수 있다. 가장 효과적인 투여 수단 및 투여량을 결정하는 방법은 당업계의 숙련가들에게 알려져 있으며 치료법에 사용되는 조성물, 치료법의 목적, 치료되는 표적 세포, 및 치료되는 대상체에 따라 달라질 것이다. 단일 또는 다중 투여는 치료 의사에 의해 또는 동물의 경우 치료 수의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다. 적절한 투여 제형 및 제제를 투여하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 투여 경로가 또한 결정될 수 있고 가장 효과적인 투여 경로를 결정하는 방법은 당업계의 숙련가들에게 알려져 있으며 치료에 사용되는 조성물, 치료의 목적, 치료되는 대상체의 건강 상태 또는 병기, 및 표적 세포 또는 조직에 따라 달라질 것이다. 투여 경로의 비제한적인 예는 경구 투여, 복강내, 주입, 비강 투여, 흡입, 주사 및 국소 적용을 포함한다.
"약제학적 조성물"은 활성 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체와 불활성 또는 활성 담체, 예를 들어 고체 지지체의 조합물을 포함하여 조성물을 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 진단 또는 치료 용도에 적합하게 만드는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 임의의 표준 약제학적 담체, 예를 들어 인산염 완충 염수 용액, 물, 및 에멀젼, 예를 들어 오일/물 또는 물/오일 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제를 포함한다. 조성물은 또한 안정화제 및 방부제를 포함할 수 있다. 담체, 안정화제 및 보조제의 예에 대해, 문헌[Martin (1975) Remington's Pharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton)]을 참조한다.
"대상체", "개체" 또는 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간을 지칭한다. 포유동물은 뮤린, 래트, 토끼, 유인원, 소, 양, 돼지, 개, 고양이, 농장 동물, 스포츠 동물, 애완 동물, 말 및 영장류, 특히 인간을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 인간 치료에 유용한 것 외에도, 본 개시내용은 반려 포유동물, 외래 동물, 및 포유동물, 설치류를 비롯한 가축의 수의학적 치료에도 유용하다. 하나의 실시양태에서, 포유동물은 말, 개 및 고양이를 포함한다. 본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 인간은 태아, 유아, 사춘기-전 대상체, 청소년, 소아 환자, 또는 성인이다. 하나의 측면에서, 대상체는 증상-잔 포유동물 또는 인간이다. 또 다른 측면에서, 대상체는 질환의 최소한의 임상 증상을 갖는다. 대상체는 남성 또는 여성, 성인, 유아 또는 소아 대상체일 수 있다. 추가의 측면에서, 대상체는 성인이다. 일부 경우에, 성인은 성인 인간, 예를 들어 18세 초과의 성인 인간이다.
"숙주 세포"는 특정 대상체 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 모세포와 동일하지 않을 수 있지만 여전히 본원에 사용된 바와 같은 용어의 범위 내에 포함된다.
세포의 "풍부한 집단"은 특정 정의된 특성을 갖는 실질적으로 균일한 세포 집단을 의도한다. 세포는 정의된 특성이 70% 이상, 또는 대안적으로 75% 이상, 또는 대안적으로 80% 이상, 또는 대안적으로 85% 이상, 또는 대안적으로 90% 이상, 또는 대안적으로 95% 이상, 또는 대안적으로 98% 이상 동일하다.
"치료"라는 용어와 관련된 "고통"이라는 용어는 엔젤만 증후군(Angelman syndrome)으로 진단받았거나 엔젤만 증후군에 걸리기 쉬운 환자 또는 개체를 지칭한다. 환자는 또한 하나 이상의 유전적 돌연변이를 가지고 있기 때문에 질병으로 "고통받을 위험"이 있는 것으로 언급될 수 있다. 이 환자는 아직 특징적인 질환 병리를 발병하지 않았다.
"유효량"은 유익하거나 원하는 결과를 달성하기에 충분한 양이다. 유효량은 하나 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있다. 이러한 전달은 개별 투여 단위가 사용되는 기간, 치료제의 생체이용률, 투여 경로 등을 포함한 다수의 변수에 따라 좌우된다. 그러나, 임의의 특정 대상체에 대한 본 개시내용의 치료제의 특정 용량 수준은 사용된 특정 화합물의 활성, 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이, 투여 시간, 배설 속도, 약물 조합, 및 치료되는 특정 장애의 중증도 및 투여 형태를 포함한 다양한 인자에 의존하는 것으로 이해된다. 치료 투여량은 일반적으로 안전성과 효능을 최적화하도록 적정될 수 있다. 전형적으로, 시험관내 및/또는 생체내 시험으로부터의 용량-효과 관계는 초기에 환자 투여에 적절한 용량에 대한 유용한 지침을 제공할 수 있다. 일반적으로, 시험관내에서 효과적인 것으로 밝혀진 농도에 상응하는 혈청 수준을 달성하는데 효과적인 화합물의 양을 투여하기를 원할 것이다. 이러한 매개변수의 결정은 당업계의 기술 내에 있다. 이러한 고려 사항 뿐만 아니라 효과적인 제형 및 투여 절차는 당업계에 잘 알려져 있으며 표준 교과서에 기술되어 있다.
투여라는 용어는 제한 없이 경구, 비경구(예를 들어, 근육내, 복강내, 정맥내, 뇌실내(ICV), 척추강내, 수조내 주사 또는 주입, 피하 주사, 또는 이식), 흡입 스프레이 비강, 질, 직장, 설하, 요도(예를 들어, 요도 좌약) 또는 국소 투여 경로(예를 들어, 젤, 연고, 크림, 에어로졸 등)에 의한 투여를 포함하며 각각의 투여 경로에 적합한 통상적인 약제학적으로 허용되는 비독성 담체, 보조제, 부형제 및 비히클을 함유하는 적합한 투여 단위 제형으로, 단독으로 또는 함께, 제형화될 수 있다. 본 개시내용은 투여 경로, 제형 또는 투여 일정에 의해 제한되지 않는다.
설명적인 실시양태
폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드
본 개시내용은 유비퀴틴 단백질 리가제 E3A(Ube3a) 단백질, 폴리펩티드, 또는 이의 생물학적 등가물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 재조합 및/또는 단리된다. 일부 실시양태에서, Ube3a 단백질, 폴리펩티드, 또는 이의 생물학적 등가물은 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함한다.
또한 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함하는 Ube3a 단백질, 폴리펩티드, 또는 이의 생물학적 등가물이 제공된다. 일부 실시양태에서, Ube3a 단백질, 폴리펩티드, 또는 이의 생물학적 등가물은 단리, 조작 및/또는 재조합된다.
일부 실시양태에서, Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물은 서열 번호 8, 10, 12, 20, 22 또는 24로부터 선택된 서열을 포함하는 것과 같은 야생형 Ube3a 단백질, 또는 이의 임의의 자연 변이체가 아니다. 이러한 Ube3a 단백질, 폴리펩티드, 또는 이의 생물학적 등가물은 또한 본원에서 변형된 Ube3a 단백질로 지칭된다.
일부 실시양태에서, Ube3a 단백질, 폴리펩티드, 또는 이의 생물학적 등가물은 2개 이상의 글리코실화 부위, 또는 3개 이상의 글리코실화 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, Ube3a 단백질, 폴리펩티드, 또는 이의 생물학적 등가물은 4개 이상의 글리코실화 부위, 또는 5개 이상의 글리코실화 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물은 적어도 4개 또는 적어도 5개의 글리코실화 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, Ube3a 단백질, 폴리펩티드, 또는 이의 생물학적 등가물은 6개 이상, 또는 7개 이상의 글리코실화 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, Ube3a 단백질, 폴리펩티드, 또는 이의 생물학적 등가물은 8개 이상의 글리코실화 부위를 포함한다.
일부 실시양태에서, 임의의 하나 이상의 글리코실화 부위는 자연 발생적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 임의의 하나 이상의 글리코실화 부위는 비-자연 발생적일 수 있다. 추가 실시양태에서, 글리코실화 부위 중 적어도 하나는 비-자연 발생적이다. 추가로 또는 대안적으로, 글리코실화 부위 중 적어도 하나의 아미노산 잔기(들) 중 임의의 하나 또는 임의의 2개 또는 3개 모두가 야생형 Ube3a 폴리펩티드 또는 단백질과 비교하여 돌연변이되어 글리코실화 부위를 구성한다.
재조합 및/또는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 Ube3a 단백질, 폴리펩티드, 또는 이의 생물학적 등가물은 자연 발생적일 수 있거나, 예를 들어 하나 또는 다수의 글리코실화 부위(들) 및/또는 비-자연 발생 서열에 대한 자연 발생 글리코실화 부위의 변형(들)을 포함하도록 야생형 폴리뉴클레오티드의 개방 판독 프레임의 돌연변이에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, Ube3a 단백질, 폴리펩티드, 또는 이의 생물학적 등가물은 하나 이상의 비-자연 발생 글리코실화 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 Ube3a 단백질, 폴리펩티드, 또는 이의 생물학적 등가물은 또한 본원에서 변형된 Ube3a 단백질 또는 변형된 단백질로 지칭된다.
본원의 임의의 개시내용의 일부 실시양태에서, Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물은 적어도 하나의 비-자연 발생 글리코실화 부위를 포함한다. 이러한 비-자연 발생 글리코실화 부위는 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물을 비기능적으로 만들지 않는다. 예를 들면, 실험 번호 1에 나타난 바와 같이, 이들은 여전히 S5a를 유비퀴틴화할 수 있다. 또한, 실험 방법에 나타난 바와 같이, 이들은 AS를 효과적으로 치료할 수 있다.
이러한 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물의 예는 아래에 제공되어 있으며, 여기서 모티프 "NXT/S"는 글리코실화 부위를 식별하고, 여기서 X는 임의의 아미노산 잔기이다. 일부 실시양태에서, 글리코실화 부위는 NXaaT/S의 컨센서스 서열(consensus sequence)(즉, NXaaT 및/또는 NXaaS)을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성되며, 여기서 Xaa는 임의의 아미노산 잔기이다. 일부 실시양태에서, 글리코실화 부위는 NXaaT/S의 컨센서스 서열(즉, NXaaT 및/또는 NXaaS)을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성되며, 여기서 Xaa는 프롤린(P)을 제외한 임의의 아미노산 잔기이다. 일부 실시양태에서, 글리코실화는 N-연결된다.
일부 실시양태에서, 출발 또는 참조 Ube3a 단백질 또는 폴리펩티드, 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 야생형, 이의 이소형, 이의 자연 변이체, 또는 이의 비-자연 변이체는 적어도 하나의 비-자연 발생 글리코실화 부위 및 글리코실화 부위를 구성하지 않아 조작된 및/또는 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물을 생성하지 않는 하나 이상의 임의의 추가 돌연변이된 잔기를 갖도록 돌연변이될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 출발 또는 참조 Ube3a 단백질 또는 폴리펩티드는 이의 C 말단 측의 두 번째 아미노산 잔기가 T 또는 S인 한 임의로 N으로 돌연변이된 임의의 위치에 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 출발 또는 참조 Ube3a 단백질 또는 폴리펩티드는 이의 N 말단 측의 두 번째 아미노산 잔기가 N인 한 임의로 S에서 T로 돌연변이된 임의의 위치에 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, Xaa1Xaa2Xaa3의 서열을 갖는 출발 또는 참조 Ube3a 단백질 또는 폴리펩티드의 임의의 부분은 NXaaT/S(즉, NXaaT 및/또는 NXaaS)가 되도록 조작될 수 있으며, 이에 따라 본원에 개시된 바와 같은 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물이 생성될 수 있으며, 여기서 Xaa1, Xaa2, Xaa3 또는 Xaa는 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. 추가의 실시양태에서, Xaa2 및 Xaa 중의 어느 하나 또는 둘 다는 P가 아니다. 하나의 실시양태에서, Xaa3은 S 또는 T이고 임의로 Xaa1은 N이 아니다. 또 다른 실시양태에서, Xaa1은 N이고 임의로 Xaa3은 S도 T도 아니다. 일부 실시양태에서, Xaa1은 N이 아니며 Xaa3은 S도 T도 아니다. 예시적인 글리코실화 부위 및/또는 이들의 위치는 도 16a, 도 16b 및 서열 번호 32에서 찾을 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물은 출발 또는 참조 Ube3a 단백질 또는 폴리펩티드의 코딩 서열의 뉴클레오티드 잔기 중 하나 이상을 돌연변이시킴으로써 조작 및/또는 생산될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 이러한 돌연변이된 뉴클레오티드 잔기는 글리코실화 부위를 암호화한다. 일부 예시된 뉴클레오티드 돌연변이는 도 16a, 도 16b, 및 서열 번호 13, 15, 17, 25, 27, 29 및 31에서 찾을 수 있다.
일부 실시양태에서, 글리코실화 부위는 다음으로부터 선택된 것들 중 하나 이상에 상응하는 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 등가물의 아미노산(aa) 위치에 있다:
서열 번호 14의 aa62 내지 aa64, 서열 번호 14의 aa96 내지 aa98, 서열 번호 14의 aa102 내지 aa104, 서열 번호 14의 aa219 내지 aa221, 서열 번호 14의 aa354 내지 aa356, 서열 번호 14의 aa591 내지 aa 593, 서열 번호 14의 aa622 내지 aa624, 서열 번호 14의 aa 805 내지 aa 807, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치;
서열 번호 16의 aa85 내지 aa87, 서열 번호 16의 aa119 내지 aa121, 서열 번호 16의 aa125 내지 aa127, 서열 번호 16의 aa242 내지 aa244, 서열 번호 16의 aa377 내지 aa379, 서열 번호 16의 aa614 내지 aa616, 서열 번호 16의 aa645 내지 aa647, 서열 번호 16의 aa828 내지 aa830, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치;
서열 번호 18의 aa82 내지 aa84, 서열 번호 18의 aa116 내지 aa118, 서열 번호 18의 aa122 내지 aa124, 서열 번호 18의 aa239 내지 aa241, 서열 번호 18의 aa374 내지 aa376, 서열 번호 18의 aa611 내지 aa613, 서열 번호 18의 aa642 내지 aa644, 서열 번호 18의 aa825 내지 aa827, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치;
서열 번호 26 또는 28의 aa83 내지 aa85, 서열 번호 26 또는 28의 aa117 내지 aa119, 서열 번호 26 또는 28의 aa123 내지 aa125, 서열 번호 26 또는 28의 aa 237 내지 aa239, 서열 번호 26 또는 28의 aa372 내지 aa374, 서열 번호 26 또는 28의 aa609 내지 aa 611, 서열 번호 26 또는 28의 aa640 내지 aa642, 서열 번호 26 또는 28의 aa823 내지 aa825, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치;
서열 번호 30의 aa62 내지 aa64, 서열 번호 30의 aa96 내지 aa98, 서열 번호 30의 aa102 내지 aa104, 서열 번호 30의 aa216 내지 aa218, 서열 번호 30의 aa351 내지 aa353, 서열 번호 30의 aa588 내지 aa590, 서열 번호 30의 aa619 내지 aa621, 또는 서열 번호 30의 aa802 내지 aa804, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치.
본원의 임의의 개시내용의 일부 실시양태에서, 이동된 위치는 또한 본원에서 참조 위치 부근의 위치로 지칭된다. 추가의 실시양태에서, 참조 위치는 본원에 확인된 것들 중의 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 이동된 위치는 여전히 3개 또는 2개 또는 1개의 아미노산 잔기(들)로 구성된다. 예를 들면, 서열 번호 14의 aa62 내지 aa64의 참조 위치를 1개 아미노산만큼 C 말단으로 이동시킨 위치는 서열 번호 14의 aa63 내지 aa65에 상응하는 위치가 될 것이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함하는 Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물(예를 들면, 본원에 사용된 바와 같은 변형된 Ube3a 단백질)은 서열 번호 14, 16, 18, 26, 28, 30 중의 어느 하나의 서열 또는 이의 단편을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성된다. 일부 실시양태에서, Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물은 확인된 바와 같은 글리코실화 부위 중의 하나 이상을 포함하지만, 서열 번호 14, 16, 18, 26, 28, 30 중의 어느 하나 이상의 서열의 변이체 또는 이의 단편이다. 일부 실시양태에서, Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물은 서열 번호 14, 16, 18, 26, 28, 30 중의 어느 하나 이상에 상응하는 위치에 하나 이상의 상이한 아미노산 잔기(들)를 추가로 포함하며, 여기서 위치는 본원에 개시된 바와 같은 글리코실화 부위에 있지 않다. 한 가지 예는 Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물이 본원에 개시된 글리코실화 부위를 형성하기 위해 변이체의 하나 이상의 아미노산 잔기(들)를 돌연변이시킴으로써 Ube3a 자연 변이체에 기초하여 생성될 수 있는 것이다.
일부 실시양태에서, Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물은 하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에서 확인된 바와 같은 8개의 aa 위치에 상응하는 아미노산(aa) 위치에 8개의 글리코실화 부위를 포함한다:
(a) 서열 번호 14의 aa62 내지 aa64, 서열 번호 14의 aa96 내지 aa98, 서열 번호 14의 aa102 내지 aa104, 서열 번호 14의 aa219 내지 aa221, 서열 번호 14의 aa354 내지 aa356, 서열 번호 14의 aa591 내지 aa 593, 서열 번호 14의 aa622 내지 aa624, 서열 번호 14의 aa805 내지 aa 807, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치;
(b) 서열 번호 16의 aa85 내지 aa87, 서열 번호 16의 aa119 내지 aa121, 서열 번호 16의 aa125 내지 aa127, 서열 번호 16의 aa242 내지 aa244, 서열 번호 16의 aa377 내지 aa379, 서열 번호 16의 aa614 내지 aa616, 서열 번호 16의 aa645 내지 aa647, 서열 번호 16의 aa828 내지 aa830, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치;
(c) 서열 번호 18의 aa82 내지 aa84, 서열 번호 18의 aa116 내지 aa118, 서열 번호 18의 aa122 내지 aa124, 서열 번호 18의 aa239 내지 aa241, 서열 번호 18의 aa374 내지 aa376, 서열 번호 18의 aa611 내지 aa613, 서열 번호 18의 aa642 내지 aa644, 서열 번호 18의 aa825 내지 aa827, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치;
(d) 서열 번호 26 또는 28의 aa83 내지 aa85, 서열 번호 26 또는 28의 aa117 내지 aa119, 서열 번호 26 또는 28의 aa123 내지 aa125, 서열 번호 26 또는 28의 aa237 내지 aa239, 서열 번호 26 또는 28의 aa372 내지 aa374, 서열 번호 26 또는 28의 aa609 내지 aa611, 서열 번호 26 또는 28의 aa640 내지 aa642, 서열 번호 26 또는 28의 aa823 내지 aa825, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치; 및
(e) 서열 번호 30의 aa62 내지 aa64, 서열 번호 30의 aa96 내지 aa98, 서열 번호 30의 aa102 내지 aa104, 서열 번호 30의 aa216 내지 aa218, 서열 번호 30의 aa351 내지 aa353, 서열 번호 30의 aa588 내지 aa590, 서열 번호 30의 aa619 내지 aa621, 또는 서열 번호 30의 aa802 내지 aa804, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치.
일부 실시양태에서, Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물은 다음으로부터 선택된 것들 중 하나 이상에 상응하는 aa 위치(들)에 돌연변이된 아미노산 잔기(들) 중 하나 이상을 포함함으로써 글리코실화 부위(들) 중 하나 이상을 형성한다:
서열 번호 14의 aa64, 서열 번호 14의 aa98, 서열 번호 14의 aa104, 서열 번호 14의 aa221, 서열 번호 14의 aa356, 서열 번호 14의 aa591, 서열 번호 14의 aa624, 서열 번호 14의 aa805, 서열 번호 14의 aa806, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치;
서열 번호 16의 aa87, 서열 번호 16의 aa121, 서열 번호 16의 aa127, 서열 번호 16의 aa244, 서열 번호 16의 aa379, 서열 번호 16의 aa614, 서열 번호 16의 aa647, 서열 번호 16의 aa828, 서열 번호 16의 aa829, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치;
서열 번호 18의 aa84, 서열 번호 18의 aa118, 서열 번호 18의 aa124, 서열 번호 18의 aa241, 서열 번호 18의 aa376, 서열 번호 18의 aa611, 서열 번호 18의 aa644, 서열 번호 18의 aa825, 서열 번호 18의 aa826, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치;
서열 번호 26 또는 28의 aa85, 서열 번호 26 또는 28의 aa119, 서열 번호 26 또는 28의 aa125, 서열 번호 26 또는 28의 aa239, 서열 번호 26 또는 28의 aa374, 서열 번호 26 또는 28의 aa609, 서열 번호 26 또는 28의 aa610, 서열 번호 26 또는 28의 aa642, 서열 번호 26 또는 28의 aa823, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치;
서열 번호 30의 aa64, 서열 번호 30의 aa98, 서열 번호 30의 aa104, 서열 번호 30의 aa218, 서열 번호 30의 aa353, 서열 번호 30의 aa588, 서열 번호 30의 aa589, 서열 번호 30의 aa621, 또는 서열 번호 30의 aa802, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치.
일부 실시양태에서, Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물은 하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에서 확인된 것들에 상응하는 aa 위치에 9개의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함함으로써 8개의 글리코실화 부위를 형성한다:
(a) 서열 번호 14의 aa64, 서열 번호 14의 aa98, 서열 번호 14의 aa104, 서열 번호 14의 aa221, 서열 번호 14의 aa356, 서열 번호 14의 aa591, 서열 번호 14의 aa624, 서열 번호 14의 aa 805, 및 서열 번호 14의 aa 806, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치;
(b) 서열 번호 16의 aa87, 서열 번호 16의 aa121, 서열 번호 16의 aa127, 서열 번호 16의 aa244, 서열 번호 16의 aa379, 서열 번호 16의 aa614, 서열 번호 16의 aa647, 서열 번호 16의 aa828, 및 서열 번호 16의 aa829, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치;
(c) 서열 번호 18의 aa84, 서열 번호 18의 aa118, 서열 번호 18의 aa124, 서열 번호 18의 aa241, 서열 번호 18의 aa376, 서열 번호 18의 aa611, 서열 번호 18의 aa644, 서열 번호 18의 aa825, 및 서열 번호 18의 aa826, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치;
(d) 서열 번호 26 또는 28의 aa85, 서열 번호 26 또는 28의 aa119, 서열 번호 26 또는 28의 aa125, 서열 번호 26 또는 28의 aa239, 서열 번호 26 또는 28의 aa374, 서열 번호 26 또는 28의 aa609, 서열 번호 26 또는 28의 aa610, 서열 번호 26 또는 28의 aa642, 및 서열 번호 26 또는 28의 aa823, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치; 또는
(e) 서열 번호 30의 aa64, 서열 번호 30의 aa98, 서열 번호 30의 aa104, 서열 번호 30의 aa218, 서열 번호 30의 aa353, 서열 번호 30의 aa588, 서열 번호 30의 aa589, 서열 번호 30의 aa621, 및 서열 번호 30의 aa802, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치.
도 16a에 예시된 바와 같이, 온라인 도구 NetNGlyC를 사용하여 잠재적인 글리코실화 부위를 예측하였다. 4개의 N-글리코실화 부위가 확인되었으며, 그 중 서열 번호 8의 아미노산 82에서 시작하는 부위만이 (a) 내지 (c)에 논의된 바와 같은 돌연변이에 의해 생성된 글리코실화 부위에 해당하는 위치에 있다. 추가로, NetNGlyC는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 돌연변이를 나타내지 않는다.
일부 실시양태에서, Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물은 하기 (a') 내지 (e') 중 어느 하나에서 확인된 것에 상응하는 aa 위치에 8개의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함함으로써 7개의 글리코실화 부위를 형성한다:
(a') 서열 번호 14의 aa64, 서열 번호 14의 aa98, 서열 번호 14의 aa221, 서열 번호 14의 aa356, 서열 번호 14의 aa591, 서열 번호 14의 aa624, 서열 번호 14의 aa 805, 및 서열 번호 14의 aa 806, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치;
(b') 서열 번호 16의 aa87, 서열 번호 16의 aa121, 서열 번호 16의 aa244, 서열 번호 16의 aa379, 서열 번호 16의 aa614, 서열 번호 16의 aa647, 서열 번호 16의 aa828, 및 서열 번호 16의 aa829, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치;
(c') 서열 번호 18의 aa84, 서열 번호 18의 aa118, 서열 번호 18의 aa241, 서열 번호 18의 aa376, 서열 번호 18의 aa611, 서열 번호 18의 aa644, 서열 번호 18의 aa825, 및 서열 번호 18의 aa826, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치;
(d') 서열 번호 26 또는 28의 aa85, 서열 번호 26 또는 28의 aa119, 서열 번호 26 또는 28의 aa239, 서열 번호 26 또는 28의 aa374, 서열 번호 26 또는 28의 aa609, 서열 번호 26 또는 28의 aa610, 서열 번호 26 또는 28의 aa642, 및 서열 번호 26 또는 28의 aa823, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치; 및
(e') 서열 번호 30의 aa64, 서열 번호 30의 aa98, 서열 번호 30의 aa218, 서열 번호 30의 aa353, 서열 번호 30의 aa588, 서열 번호 30의 aa589, 서열 번호 30의 aa621, 및 서열 번호 30의 aa802, 또는 본원에 확인된 위치 중 어느 하나를 약 1개의 아미노산, 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 또는 약 10개의 아미노산만큼 폴리펩티드, 단백질 또는 등가물 상의 C 말단 또는 N 말단으로 이동시키는 위치.
일부 실시양태에서, 형성된 글리코실화 부위는 NXaaT 또는 NXaaS의 컨센서스 서열을 포함하며, 여기서 Xaa는 임의로 프롤린(P)을 제외한 임의의 아미노산 잔기이다.
일부 실시양태에서, 돌연변이된 아미노산 잔기(들)는 다음 중의 하나 이상으로부터 선택된다:
서열 번호 14의 aa64에 상응하는 aa 위치에 트레오닌(Thr 또는 T) 또는 세린(Ser 또는 S), 서열 번호 14의 aa98에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 14의 aa104에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 14의 aa221에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 14의 aa356에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 14의 aa591에 상응하는 aa 위치에 아스파라긴(Asn 또는 N), 서열 번호 14의 aa624에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 14의 aa 805에 상응하는 aa 위치에 N, 및 서열 번호 14의 aa 806에 상응하는 aa 위치에 N;
서열 번호 16의 aa87에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 16의 aa121에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 16의 aa127에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 16의 aa244에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 16의 aa379에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 16의 aa614에 상응하는 aa 위치에 N, 서열 번호 16의 aa647에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 16의 aa828에 상응하는 aa 위치에 N, 및 서열 번호 16의 aa829에 상응하는 aa 위치에 N;
서열 번호 18의 aa84에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 18의 aa118에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 18의 aa124에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 18의 aa241에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 18의 aa376에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 18의 aa611에 상응하는 aa 위치에 N, 서열 번호 18의 aa644에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 18의 aa825에 상응하는 aa 위치에 N, 및 서열 번호 18의 aa826에 상응하는 aa 위치에 N;
서열 번호 26 또는 28의 aa85에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 26 또는 28의 aa119에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 26 또는 28의 aa125에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 26 또는 28의 aa239에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 26 또는 28의 aa374에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 26 또는 28의 aa609에 상응하는 aa 위치에 N, 서열 번호 26 또는 28의 aa610에 상응하는 aa 위치에 N, 서열 번호 26 또는 28의 aa642에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 및 서열 번호 26 또는 28의 aa823에 상응하는 aa 위치에 N; 또는
서열 번호 30의 aa64에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 30의 aa98에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 30의 aa104에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 30의 aa218에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 30의 aa353에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 30의 aa588에 상응하는 aa 위치에 N, 서열 번호 30의 aa589에 상응하는 aa 위치에 N, 서열 번호 30의 aa621에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 및 서열 번호 30의 aa802에 상응하는 aa 위치에 N.
일부 실시양태에서, Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물은 다음으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다: 서열 번호 14의 aa21 내지 aa 872, 서열 번호 16의 aa21 내지 aa 895, 서열 번호 18의 aa21 내지 aa 892, 서열 번호 26의 aa21 내지 aa 890, 서열 번호 28의 aa21 내지 aa 890, 서열 번호 30의 aa21 내지 aa 869, 또는 이의 각각에 대해 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열. 추가의 실시양태에서, Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물은 본원에 개시된 바와 같은 글리코실화 부위 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물은 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 신호 펩티드는 분비 신호 펩티드(본원에서 분비 신호로도 지칭됨)이다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드 또는 분비 신호는 항체 중쇄/경쇄 분비 신호, 쌍-아르기닌 수송 단백질 분비 신호, 인터루킨-2(IL2) 분비 신호, 인터루킨-4(IL4) 분비 신호, 인터루킨-10(IL10) 분비 신호, 인터루킨-3(IL3) 분비 신호, 인터루킨-7(IL7) 분비 신호, 인간 IL2 분비 신호, 인간 OSM 분비 신호, VSV-G 분비 신호, 마우스 Ig 카파 분비 신호, 인간 IgG2 H 분비 신호, BM40 분비 신호, 세크레콘(secrecon) 분비 신호, 인간 IgKVIII 분비 신호, CD33 분비 신호, tPA 분비 신호, 인간 키모트립시노겐 분비 신호, 인간 트립시노겐-2 분비 신호, 가우스 luc 분비 신호, 알부민(HSA) 분비 신호, 인플루엔자 혈구응집소 분비 신호, 인간 인슐린 분비 신호 또는 누에 피브로인 LC로부터 선택된다. 하나의 실시양태에서, 신호 펩티드 또는 분비 신호는 서열 번호 14의 aa1 내지 aa20의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드 또는 분비 신호는 Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물의 N 말단에 위치한다. 일부 실시양태에서, Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물은 N 말단의 신호 펩티드 또는 분비 신호로 시작한다.
일부 실시양태에서, Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물은 서열 번호 14, 16, 18, 26, 28 및 30 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이들 각각에 대해 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물은 본원에 개시된 바와 같은 글리코실화 부위 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물은 본원에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 이의 등가물에 의해 암호화된다. 하나의 측면에서, 폴리뉴클레오티드 등가물은 암호화된 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물에 적어도 1개, 또는 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개의 글리코실화 부위를 유지한다. 일부 실시양태에서, 암호화된 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물은 8개 이상의 글리코실화 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 비-자연 발생 글리코실화 부위를 갖는 Ube3a 단백질 또는 폴리펩티드의 생물학적 등가물을 암호화한다.
일부 실시양태에서, Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물은 다음 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다: 서열 번호 13의 nt 61 내지 nt 2619, 서열 번호 15의 nt 61 내지 nt 2688, 서열 번호 17의 nt 61 내지 nt 2679, 서열 번호 25의 nt 61 내지 nt 2673, 서열 번호 27의 nt 61 내지 nt 2673, 서열 번호 29의 nt 61 내지 nt 2610; 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 또는 이들 각각에 대해 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열. 추가의 실시양태에서, Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물은 본원에 개시된 바와 같은 글리코실화 부위 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 및/또는 단리된 폴리뉴클레오티드는 다음 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성된다: 서열 번호 13의 nt 61 내지 nt 2619, 서열 번호 15의 nt 61 내지 nt 2688, 서열 번호 17의 nt 61 내지 nt 2679, 서열 번호 25의 nt 61 내지 nt 2673, 서열 번호 27의 nt 61 내지 nt 2673, 서열 번호 29의 nt 61 내지 nt 2610; 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 또는 이들 각각에 대해 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열. 추가의 실시양태에서, Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물은 본원에 개시된 바와 같은 글리코실화 부위 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 돌연변이된 아미노산(aa) 또는 뉴클레오티드(nt) 잔기는 aa 잔기 또는 nt 잔기가 참조 서열의 상응하는 위치에 있는 잔기와 상이하다는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 단백질, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드는 돌연변이된 aa 또는 nt 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 참조 서열은 자연 발생 및/또는 야생형 서열이다. 하나의 실시양태에서, 참조 서열은 아미노산 서열이며 서열 번호 8, 10, 12, 20, 22, 24 또는 이들 각각의 자연 변이체 중 하나 이상으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성된다. 하나의 실시양태에서, 참조 서열은 뉴클레오티드 서열이며 서열 번호 7, 9, 11, 19, 21, 23 또는 이들 각각의 자연 변이체 중 하나 이상으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성된다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물의 발현을 지시하는 조절 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조절 서열은 다음 중 하나 이상을 포함한다: 프로모터, 인트론, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 종결인자(terminator), 침묵인자(silencer), TATA 상자, 또는 우드척(Woodchuck) 간염 바이러스(WHP) 전사후 조절 요소(WPRE). 추가의 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 이의 비제한적 예는 pol II 프로모터, 예를 들어, MNDU3 프로모터, CMV 프로모터, PGK 프로모터, 및 EF1알파 프로모터로부터 선택된 프로모터를 포함한다. 이들 및 다른 pol II 프로모터의 서열은 당업계에 공지되어 있다. MNDU3 프로모터의 서열 및 예시적인 CMV 프로모터의 서열이 본원에 제공된다. 하나의 실시양태에서, MNDU3 프로모터는 서열 번호 3의 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성된다. 하나의 실시양태에서, CMV 프로모터는 서열 번호 1, 2, 또는 34로부터 선택될 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성된다. 하나의 실시양태에서, PKG 프로모터는 서열 번호 4의 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성된다. 하나의 실시양태에서, MNDU 프로모터는 서열 번호 5의 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성된다. 하나의 실시양태에서, EF1알파 프로모터는 서열 번호 6의 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성된다. 폴리뉴클레오티드는 돌연변이된 Ube3a 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 인핸서 요소를 추가로 포함하여 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가 또는 향상시킬 수 있다.
추가의 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 변형된 Ube3a 단백질을 암호화는 폴리뉴클레오티드의 5'에 위치한 신호 펩티드 및/또는 분비 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 이러한 신호 펩티드 및/또는 분비 신호의 비제한적인 예는 단일 사슬 단편 가변 신호 펩티드, 쌍-아르기닌 수송 단백질 신호 펩티드, IL-4 분비 신호, IL-2 분비 신호 및 IL-10 분비 신호를 포함한다. 예시적인 분비 IL-2 분비 신호 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 다음 중 하나 이상을 추가로 포함한다: 폴리퓨린관(polypurine tract) 서열(PPT), 중심 PPT(cPPT), R 영역, U5, 캡시드화 신호(Psi), Rev-반응 요소(RRE), 전장 U3 또는 이의 단편, 검출 가능한 마커 또는 선택 마커, 검출 가능한 폴리펩티드 또는 선택 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 검출 가능한 폴리펩티드 또는 선택 폴리펩티드의 발현을 지시하는 조절 서열, 또는 검출 가능한 폴리펩티드 또는 선택 폴리펩티드에 대한 코딩 서열과 Ube3a 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이의 생물학적 등가물을 암호화하는 서열 사이에 위치한 절단 가능한 펩티드에 대한 코딩 서열. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 펩티드는 자가-절단 펩티드, 임의로 2A 자가-절단 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 2A 자가-절단 펩티드는 P2A, T2A, E2A, F2A 및 BmCPV2A로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터 입자(본원에서 벡터 게놈 또는 바이러스 게놈으로도 지칭됨)의 유전 정보는, 5' 및 3' 말단 상에 벡터의 통합에 필요한 최소 LTR 영역, 및 2개의 LTR 영역 사이의 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성된 RNA이다. 일부 실시양태에서, 2개의 LTR 영역 사이는 벡터 RNA를 입자로 패키징하는데 필요한 캡시드화 신호(psi 영역)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, psi 영역 다음에는 벡터 입자로의 효율적인 패키징을 위해 전장 벡터 전사체를 핵으로부터 수송함으로써 벡터 생성을 향상시키는 Rev-반응 요소(RRE) 및 중심 폴리퓨린관 서열(cPPT)이 뒤따른다.
변형된 Ube3a 코딩 폴리뉴클레오티드에 대한 등가물, 보체, 역 서열, 또는 역 보체인 폴리뉴클레오티드가 추가로 제공된다. 일부 실시양태에서, 등가 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 참조 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 75% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 80% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 85% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 90% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 91% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 92% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 93% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 94% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 95% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 96% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 97% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 98% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 것이다. 추가로 또는 대안적으로, 등가 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 참조 폴리뉴클레오티드, 이의 보체 또는 이의 역 보체 중 어느 하나에 높은 엄격도의 조건하에서 혼성화된다.
추가로 또는 대안적으로, 등가 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 본원에 기술된 하나 이상의 분석을 통해 임의로 확인될 수 있는 기능적 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물을 암호화해야 한다. 일부 실시양태에서, 등가 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 참조 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 75% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 80% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 85% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 90% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 91% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 92% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 93% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 94% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 95% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 96% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 97% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 98% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 추가로 또는 대안적으로, 등가 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 참조 폴리뉴클레오티드, 이의 보체 또는 이의 역 보체 중 어느 하나에 높은 엄격도의 조건하에서 혼성화된다.
일부 실시양태는 하나 이상의 글리코실화 부위를 갖는 본원에 확인된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 서열 번호 7, 9, 11, 19, 21, 또는 23 중의 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드로부터 돌연변이된다는 것을 전제로 한다. 일부 실시양태는 하나 이상의 글리코실화 부위를 갖는 본원에 확인된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 서열 번호 7, 9, 11, 19, 21, 또는 23 중의 어느 하나 및 이들 각각의 자연 변이체로부터 선택된 폴리뉴클레오티드로부터 돌연변이된다는 것을 전제로 한다. 일부 실시양태는 하나 이상의 글리코실화 부위를 갖는 본원에 확인된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 글리코실화 부위를 형성하지 않는 하나 이상의 돌연변이(들)를 추가로 포함한다는 것을 전제로 한다.
폴리뉴클레오티드는 검출 가능한 마커 또는 정제 마커이거나 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 및 이들 각각의 등가물에 의해 암호화된 재조합 및/또는 단리된 폴리펩티드가 추가로 제공된다. 일부 실시양태에서, 등가 또는 생생물학적 등가 단백질 또는 폴리펩티드는 참조 단백질 또는 폴리펩티드 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 또는 단백질(예를 들어 서열 번호 8, 10, 12, 20, 22, 또는 24 중 어느 하나, 또는 본원에 언급된 등가 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드 또는 단백질)에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 75% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 80% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 85% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 90% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 91% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 92% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 93% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 94% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 95% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 96% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 97% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 98% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 것이다.
일부 실시양태에서, 등가 또는 생물학적 등가 단백질 또는 폴리펩티드는 본원에 기술된 하나 이상의 분석을 통해 임의로 확인될 수 있는 기능적 단백질이다. 일부 실시양태에서, 등가 또는 생물학적 등가 단백질 또는 폴리펩티드는 참조 단백질 또는 폴리펩티드 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 또는 단백질(예를 들어 서열 번호 8, 10, 12, 20, 22, 또는 24 중의 어느 하나, 또는 본원에 언급된 등가 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드 또는 단백질)에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 75% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 80% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 85% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 90% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 91% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 92% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 93% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 94% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 95% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 96% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 97% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 98% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시양태는 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물에서 가능한 글리코실화 부위를 형성하도록 돌연변이된 것으로 본원에서 확인된 하나 이상의 아미노산 잔기가 서열 번호 8, 10, 12, 20, 22, 또는 24 중 어느 하나로부터 선택된 폴리펩티드로부터 돌연변이된다는 것을 전제로 한다. 일부 실시양태는 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물에서 가능한 글리코실화 부위를 형성하도록 돌연변이된 것으로 본원에서 확인된 하나 이상의 아미노산 잔기가 서열 번호 8, 10, 12, 20, 22, 또는 24 중 어느 하나로부터 선택된 폴리펩티드 및 이들 각각의 자연 변이체로부터 돌연변이된다는 것을 전제로 한다. 일부 실시양태는 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물에서 가능한 글리코실화 부위를 형성하도록 돌연변이된 것으로 본원에서 확인된 하나 이상의 아미노산 잔기가 글리코실화 부위를 형성하지 않는 하나 이상의 돌연변이(들)를 추가로 포함한다는 것을 전제로 한다. 일부 실시양태는 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물에서 가능한 글리코실화 부위를 형성하도록 돌연변이된 것으로 본원에서 확인된 하나 이상의 아미노산 잔기가 서열 번호 8, 10, 12, 20, 22, 또는 24 중의 어느 하나의 비-자연 변이체로부터 선택된 폴리펩티드로부터 돌연변이되지 않는다는 것을 전제로 한다. 추가의 실시양태에서, 이러한 비-자연 변이체는 상응하는 서열 번호 8, 10, 12, 20, 22, 또는 24의 Ube3a 생물학적 등가물이다.
폴리펩티드는 검출 가능한 마커 또는 정제 마커를 추가로 포함할 수 있다. 폴리펩티드 및 단백질은 임의의 적절한 시스템, 예를 들어, 포유동물 또는 인간 세포와 같은 원핵 또는 진핵 시스템에서 발현될 수 있다.
벡터
본 개시내용은 또한 바이러스 백본 내로 임의로 삽입된, 본원에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성되는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 원핵 또는 진핵 세포에서 발현을 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 변형된 단백질을 암호화하는, 본원에 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 폴리뉴클레오티드(본원에서 변형된 유전자라고도 함)의 복제를 허용하는, 본원에 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성된다. 추가의 실시양태에서, 벡터는 변형된 유전자에 작동가능하게 연결되고 변형된 유전자의 복제를 지시하는 조절 서열을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 조절 서열은 다음 중 하나 이상을 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성된다: 프로모터, 인트론, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 종결인자, 침묵인자, TATA 상자, 또는 우드척 간염 바이러스(WHP) 전사후 조절 요소(WPRE).
일부 실시양태에서, 벡터는 비-바이러스 벡터, 임의로 플라스미드이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터(예를 들어 렌티바이러스 벡터), 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 또는 헤르페스 바이러스 벡터로부터 임의로 선택되는 바이러스 벡터이다. 추가의 실시양태에서, 바이러스 백본은 변형된 유전자를 표적 세포의 게놈으로 통합하기 위한 필수 핵산 또는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 세포의 게놈으로의 통합에 필요한 필수 핵산은 5' 및 3' 말단에 벡터의 통합에 필요한 최소 LTR 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, "벡터"라는 용어는 비분열 세포 및/또는 천천히 분열하는 세포를 감염 및 형질도입하고 표적 세포의 게놈에 통합하는 능력을 보유하는 재조합 벡터를 의도한다. 몇몇 실시양태에서, 벡터는 야생형 바이러스로부터 유래되거나 이를 기반으로 한다. 추가의 실시양태에서, 벡터는 야생형 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 또는 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래되거나 기반으로 한다. 레트로바이러스의 예는 제한 없이 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV), 유인원 면역결핍 바이러스(SIV) 및 고양이 면역결핍 바이러스(FIV)를 포함한다. 대안적으로, 다른 레트로바이러스가 뮤린 백혈병 바이러스(MLV)와 같은 벡터 백본에 대한 기초로서 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 본 개시내용에 따른 바이러스 벡터가 특정 바이러스의 성분에 국한될 필요는 없다는 것이 명백할 것이다. 바이러스 벡터는 2개 이상의 상이한 바이러스로부터 유래된 성분을 포함할 수 있고, 또한 합성 성분을 포함할 수 있다. 벡터 성분은 표적 세포 특이성과 같은 원하는 특성을 수득하기 위해 조작될 수 있다.
본 개시내용의 재조합 벡터는 영장류 및 비-영장류로부터 유래된다. 영장류 렌티바이러스의 예는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인간 후천성 면역결핍 증후군(AIDS)의 원인 인자 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함한다. 비-영장류 렌티바이러스 그룹은 프로토타입 "지연성 바이러스" 비스나/매디 바이러스(VMV) 뿐만 아니라 관련 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV), 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV) 및 보다 최근에 기술된 고양이 면역결핍 바이러스(FIV) 및 소 면역결핍 바이러스(BIV)를 포함한다. 선행 기술의 재조합 렌티바이러스 벡터는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제6,924,123호; 제7,056,699호; 제7,419,829호 및 제7,442,551호(본원에 참고로 포함됨)를 참조한다. 일부 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터는 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터이다. 추가의 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터는 TATA 상자가 결여된 U3 영역을 갖는다. 추가로 또는 대안적으로, 렌티바이러스 벡터는 전사 인자 결합 부위(들) 중 하나 이상이 결여된 U3 영역을 갖는다.
미국 특허 제6,924,123호는 특정 레트로바이러스 서열이 표적 세포 게놈으로의 통합을 촉진한다는 것을 개시한다. 이 특허는 각각의 레트로바이러스 게놈이 비리온 단백질 및 효소를 암호화하는 gag, pol 및 env라는 유전자를 포함한다고 교시한다. 이들 유전자는 양쪽 말단에 긴 말단 반복부(LTR)라고 불리는 영역이 측면에 있다. LTR은 프로바이러스 통합 및 전사를 담당한다. 이들은 또한 인핸서-프로모터 서열로서 역할을 한다. 즉, LTR은 바이러스 유전자의 발현을 제어할 수 있다. 레트로바이러스 RNA의 캡시드화는 바이러스 게놈의 5' 말단에 위치한 psi 서열에 의해 발생한다. LTR 자체는 U3, R 및 U5라고 하는 세 가지 요소로 나눌 수 있는 동일한 서열이다. U3는 RNA의 3' 말단에 고유한 서열로부터 유래된다. R은 RNA의 양 말단에 반복되는 서열로부터 유래되며, U5는 RNA의 5' 말단에 고유한 서열로부터 유래된다. 세 가지 요소의 크기는 상이한 레트로바이러스에 따라 상당하게 달라질 수 있다. 바이러스 게놈의 경우, 폴리(A) 추가(종결) 부위는 오른쪽 LTR에서 R과 U5 사이의 경계에 있다. U3는 세포 및 일부 경우에 바이러스 전사 활성화 단백질에 반응하는 프로모터 및 다중 인핸서 서열을 포함하는 프로바이러스의 전사 제어 요소의 대부분을 포함한다.
구조 유전자 gag, pol 및 env 자체와 관련하여, gag는 바이러스의 내부 구조 단백질을 암호화한다. gag 단백질은 성숙 단백질 MA(매트릭스), CA(캡시드) 및 NC(뉴클레오캡시드)로 단백분해 처리된다. pol 유전자는 게놈 복제를 매개하는, DNA 폴리머라제, 관련 RNase H 및 인테그라제(IN)를 포함하는 역전사효소(RT)를 암호화한다.
바이러스 벡터 입자의 생산을 위해, 벡터 RNA 게놈은 숙주 세포에서 이를 암호화하는 DNA 작제물로부터 발현된다. 벡터 게놈에 의해 암호화되지 않은 입자의 성분은 숙주 세포에서 발현되는 추가 핵산 서열(통상적으로 gag/pol 및 env 유전자 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 "패키징 시스템")에 의해 트랜스로 제공된다. 바이러스 벡터 입자의 생산에 필요한 서열의 세트는 일시적인 형질감염에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있거나, 숙주 세포 게놈에 통합될 수 있거나, 혼합 방식으로 제공될 수 있다. 관련된 기술은 당업계의 숙련가들에게 알려져 있다.
본 개시내용에 사용하기 위한 레트로바이러스 벡터는 Lentigen Corp.에서 제조된 Invitrogen의 pLenti 시리즈 버전 4, 6 및 6.2 "ViraPower" 시스템; City of Hope Research Institute에 의해 실험실 생성되고 사용되는 pHIV-7-GFP; Clontech에 의해 제조된 "Lenti-X" 렌티바이러스 벡터, pLVX; Sigma-Aldrich에 의해 제조된 pLKO.1-puro; Open Biosystems에 의해 제조된 pLemiR; 및 독일 베를린에 소재하는 Charite Medical School, Institute of Virology(CBF)에 의해 실험실 생성되고 사용되는 pLV를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
따라서, 하나의 측면에서, 유전자 요법 및 연구에 사용하기 위한 하나 이상의 글리코실화 부위를 갖는 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 단편을 암호화하는 본원에 개시된 바와 같은 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공된다. 일부 실시양태에서, Ube3a 단백질은 자연 발생적이다. 일부 실시양태에서, 이것은 아미노산을 변형시키는 하나 이상의 뉴클레오티드의 변형에 의해 재조합적으로 생산된다. 일부 실시양태에서, Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 단편은 3개 이상의 글리코실화 부위를 갖는다. 일부 실시양태에서, Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 단편은 4개 이상의 글리코실화 부위를 갖는다. 일부 실시양태에서, 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 단편은 서열 목록에 나타낸 폴리뉴클레오티드 및 이들 각각의 등가물에 의해 암호화된다. 일부 실시양태에서, 등가물은 적어도 하나 이상의 확인된 글리코실화 부위를 유지한다. 일부 실시양태에서, Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 단편은 8개 이상의 글리코실화 부위를 갖는다. 추가의 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 신호 서열의 하류에 위치한 세포 투과 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 벡터는 폴리뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터의 비제한적인 예는 MNDU3 프로모터, 최소 사이토메갈로바이러스 프로모터(CMV) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 프로모터(PKG) 프로모터, 및 EF1알파 프로모터의 그룹으로부터 이므이로 선택된 pol II 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 변형된 Ube3a 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 5'에 위치한 분비 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 이러한 분비 신호의 비제한적인 예는 단일 사슬 단편 가변 분비 신호, 쌍-아르기닌 수송 단백질 분비 신호, IL-4 분비 신호, IL-2 분비 신호 및 IL-10 분비 신호를 포함한다. 예시적인 분비 신호 폴리뉴클레오티드는 하기 제공된 서열 목록에 제시된 것들 및 이의 등가물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 벡터는 검출 가능한 마커 또는 정제 마커이거나 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 대안적인 폴리머라제 II 프로모터는 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터로부터의 LTR을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터는 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 녹색 형광 단백질(GFP) 및 황색 형광 단백질(YFP) 등을 암호화하는 유전자와 같은 마커 또는 검출 가능한 표지를 추가로 포함한다. 이들은 상업적으로 이용 가능하며 기술 분야에 기술되어 있다. 이들은 변형된 Ube3a 단백질의 발현을 유도하는 프로모터와 같은 동일하거나 별도의 조절 서열로부터 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 PGK 프로모터이다.
일부 실시양태에서, 벡터는 예를 들면, 인간 면역결핍 바이러스 전사 활성제(HIV-TAT) 펩티드를 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나이들로 추가로 구성될 수 있는 세포 침투 도메인을 암호화하는 서열을 포함한다.
본 개시내용의 한 측면에 따라 사용되는 바와 같은 CPP는 3 내지 35개의 아미노산, 바람직하게는 5 내지 25개의 아미노산, 보다 바람직하게는 10 내지 25개의 아미노산, 또는 훨씬 더 바람직하게는 15 내지 25개의 아미노산을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 한 측면을 수행하기에 적합한 CPP는 아르기닌, 리신 및 히스티딘과 같은 적어도 하나의 염기성 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CPP는 더 많은, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상의 이러한 염기성 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 대안적으로 아미노산의 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%가 염기성 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, CPP는 적어도 2개의 연속적인 염기성 아미노산, 또는 대안적으로 적어도 3개, 또는 적어도 5개의 연속적인 염기성 아미노산을 함유한다. 특정 실시양태에서, CPP는 적어도 2개, 3개, 4개 또는 5개의 연속 아르기닌을 포함한다. 추가의 실시양태에서, CPP는 리신 또는 히스티딘보다 더 많은 아르기닌을 포함하거나, 바람직하게는 리신과 히스티딘을 합한 것보다 더 많은 아르기닌을 포함한다.
CPP는 산성 아미노산을 포함할 수 있지만 산성 아미노산의 수는 염기성 아미노산의 수보다 작아야 한다. 하나의 실시양태에서, CPP는 최대 하나의 산성 아미노산을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, CPP는 산성 아미노산을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 적합한 CPP는 HIV-TAT 펩티드이다.
일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지 또는 정제 마커를 갖거나 갖지 않는 도 1a 내지 도 1f 중 어느 하나에 예시된 바와 같은 벡터가 제공된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열 번호 35의 서열을 포함하고, 서열 번호 35의 서열에서 MNDU3 프로모터 뒤에 삽입된 본원에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 도 1a 내지 도 1f 중 어느 하나에 예시된 것들에 의해 생산된 벡터(예를 들어, 레트로바이러스 벡터 및/또는 렌티바이러스 벡터)가 제공된다. 추가의 실시양태에서, 레트로바이러스 및/또는 렌티바이러스 벡터는 도 1a 내지 도 1f 중 어느 하나에 예시된 바와 같은 벡터에 의해 암호화된 폴리뉴클레오티드(예를 들어 RNA)를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 레트로바이러스 및/또는 렌티바이러스 벡터는, 서열 번호 35의 서열을 포함하고 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어 RNA) 또는 서열 번호 35의 서열에서 MNDU3 프로모터 뒤에 삽입된 Ube3a 암호화 폴리뉴클레오티드의 역보체를 추가로 포함하는 벡터에 의해 암호화된 폴리뉴클레오티드(예를 들어 RNA)를 포함한다.
일부 실시양태에서, Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, RNA), 또는 폴리뉴클레오티드의 역보체를 포함하는 벡터(예를 들어 레트로바이러스 벡터 및/또는 렌티바이러스 벡터)가 제공된다. 일부 실시양태에서, 벡터(예를 들어 레트로바이러스 벡터 및/또는 렌티바이러스 벡터)의 폴리뉴클레오티드는 다음 중의 하나 이상을 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성된다: (1) R 영역, (2) U5, (3) Psi, (4) RRE, (5) 프로모터(예를 들어 MNDU3 프로모터), (6) Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어 RNA), 또는 폴리뉴클레오티드의 역보체, (7) U3, (8) R 영역, 및 (9) U5, 임의로 5'에서 3'로.
이들 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 숙주 세포 시스템에 의해 암호화된 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
패키징 시스템
본 개시내용은 또한 다음을 포함하는 바이러스 패키징 시스템을 제공한다: 임의로 백본이 바이러스로부터 유래되는 본원에 기술된 바와 같은 벡터; 패키징 플라스미드; 및 외피 플라스미드. 패키징 플라스미드는 뉴클레오시드, 기질 단백질, 캡시드, 및 벡터 게놈을 바이러스 입자로 패키징하는데 필요한 기타 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 패키징 플라스미드는 특허 문헌, 예를 들어 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제7,262,049호; 제6,995,258호; 제7,252,991호 및 제5,710,037호에 기술되어 있다.
시스템은 또한 외피 플라스미드에 의해 제공되는 위형 외피 단백질(pseudotyped envelope protein)을 암호화하는 플라스미드를 포함할 수 있다. 위형 바이러스 벡터는 다른 외피 바이러스로부터 유래되거나 또는 대안적으로 기능적 부분을 포함하는 당단백질을 지닌 벡터 입자로 구성된다. 예를 들면, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제7,262,049호를 참조한다. 일부 실시양태에서, 외피 플라스미드는 임의로 바이러스 입자가 세포 또는 세포 집단에 비특이적으로 결합하지 않도록 하는 외피 단백질을 암호화한다. 바이러스 입자의 특이성은 입자 외피에 삽입되는 항체 결합 도메인과 같은 단백질 또는 폴리펩티드에 의해 부여될 수 있다. 적합한 외피 단백질의 예는 VSVG 또는 RD114 도메인을 함유하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 개시내용은 또한 적합한 패키징 세포주를 제공한다. 하나의 측면에서, 패키징 세포주는 HEK-293 세포주이다. 다른 적합한 세포주는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면, 각각 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제7,070,994호; 제6,995,919호; 제6,475,786호; 제6,372,502호; 제6,365,150호 및 제5,591,624호에 기술되어 있다.
바이러스 입자 및 바이러스 입자를 생산하는 방법
본 개시내용은 바이러스 벡터를 패키징하기에 적합한 조건하에서, 패키징 세포주를 상기한 바와 같은 바이러스 시스템으로 형질도입함을 포함하거나, 대안적으로 이것으로 본질적으로 구성되거나, 이것으로 추가로 구성되는, Ube3a 단백질, 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 생물학적 등가물을 포함하는 바이러스 입자를 생산하는 방법을 추가로 제공한다. 이러한 조건은 당업계에 공지되어 있으며 본원에 간략하게 기술되어 있다. 바이러스 입자는 당업계의 숙련가들에게 공지된 방법, 예를 들어 원심분리를 사용하여 세포 상청액으로부터 단리될 수 있다. 이러한 단리된 입자는 본 개시내용에 의해 추가로 제공된다.
본 개시내용은 이 방법에 의해 생산되는 단리된 바이러스 입자를 추가로 제공한다. 바이러스 입자는 본원에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성된다.
본 개시내용은 또한 외피 입자로의 벡터의 패키징을 용이하게 하는 조건하에서 본원에 기술된 바와 같은 패키징 세포주를 벡터, 외피 플라스미드 및 패키징 플라스미드로 형질도입함으로써 본원에 개시된 바와 같은 변형된 Ube3a 유전자와 같은 본원에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 입자를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 입자는 위형 바이러스 입자이다. 추가의 실시양태에서, 입자는 세포 상청액으로부터 분리되고 세포-특이 표적화를 위한 항체에 접합된다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터 입자(본원에서 벡터 게놈 또는 바이러스 게놈으로도 지칭됨)의 유전 정보는, 5' 및 3' 말단에, 벡터의 통합에 필요한 최소 LTR 영역, 및 2개의 LTR 영역 사이의 본원에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성된 RNA이다. 일부 실시양태에서, 2개의 LTR 영역 사이는 벡터 RNA를 입자로 패키징하는데 필요한 캡시드화 신호(psi 영역)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, psi 영역 다음에는 벡터 입자로의 효율적인 패키징을 위해 전장 벡터 전사체를 핵으로부터 수송함으로써 벡터 생성을 향상시키는 Rev-반응 요소(RRE) 및 중심 폴리퓨린관 서열(cPPT)이 뒤따른다.
일부 실시양태에서, 벡터는 변형된 Ube3a 유전자의 발현을 유도하는 MNDU3과 같은 폴리머라제-II 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 임의로 PGK 프로모터와 같은 폴리머라제 II 프로모터에 의해 유도되는 마커, 예를 들어 EGFP 유전자(향상된 녹색 형광 단백질)를 포함한다. EGFP 유전자는 형질도입된 세포를 검출하기 위한 리포터 유전자로서 사용된다.
일부 실시양태에서, 열거된 유전 요소는 전장 RNA 분자로 전사되며, 이것은 벡터 입자로 패키징되고, 형질도입된 세포에 통합될 모든 유전 정보를 포함한다.
일부 실시양태에서, 전장 RNA 전사체는 델타-8.91과 같은 패키징 플라스미드로부터 생성되는 뉴클레오캡시드, 캡시드 및 매트릭스 단백질을 포함하는 벡터 입자의 캡시드 내부에 패키징된다. 일부 실시양태에서, 패키징 플라스미드 델타-8.91로부터 생성되는 역전사효소 폴리머라제는 또한 RNA 전사체가 있는 캡시드 내에 위치한다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 전장 RNA 전사체를 감싸고 보호한다.
일부 실시양태에서, HEK-293T 세포와 같은 패키징 세포주의 세포는 형질감염 24시간 전에 완전 DMEM 배지에서 75% 융합도로 플레이팅된다. 세포를 플레이팅한지 적어도 24시간 후, 형질감염 혼합물이 제조된다. 3밀리리터의 무혈청 배지를 실온에서 20분 동안 150ul의 리포펙션 시약과 함께 배양한다. 그후 플라스미드를 5:5:2(패키징 플라스미드: 바이러스 벡터 플라스미드: 외피 플라스미드)의 비율로 배지/리포펙션 시약 혼합물에 첨가하고 30분 동안 배양한다. 그후, 이러한 최종 배양 기간 후, 배지/리포펙션 시약/DNA 혼합물을 HEK-293T 세포에 첨가하고 형질감염이 일어나도록 밤새 방치한다. 다음날, 형질감염 배지를 제거하고 새로 완전 DMEM을 첨가한다. 72시간 후, 세포 배양 상청액을 수집하고 1.5시간 동안 20,000rpm에서 초원심분리하여 농축할 수 있다.
일단 벡터 입자가 패키징 세포로부터 발아되어 상청액으로 방출되면, 이 벡터 입자는 항체가 입자를 특이적으로 인식하거나 결합함으로써 및/또는 본원에 정의된 바와 같이 입자의 외피에 접합된 항체를 가짐으로써 단리 및/또는 정제될 수 있다.
세포 및 세포 집단
본원에서 다음 중 하나 이상을 포함하여 폴리뉴클레오티드, 벡터, 또는 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물을 생성하는 세포가 제공된다: 본원에 개시된 바와 같은 재조합 폴리뉴클레오티드, 본원에 개시된 바와 같은 벡터, 본원에 개시된 바와 같은 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물. 일부 실시양태에서, 세포는 단리된 세포 및/또는 조작된 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 시험관내 및/또는 생체외 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체의 생체내 세포이다.
또한 본원에 개시된 바와 같은 세포의 클론 집단(clonal population)이 제공된다.
재조합 Ube3a 단백질 또는 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물의 발현을 허용하는 조건하에서 본원에 개시된 바와 같은 세포를 성장시킴을 포함하여, 분비된 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물을 발현시키는 방법이 추가로 제공된다.
다음 중의 하나 이상을 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성되는 세포 또는 세포의 집단이 추가로 제공된다: 본원에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드, 본원에 개시된 바와 같은 벡터, 및 본원에 개시된 바와 같은 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 입자이다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 세포의 집단은 검출 가능한 마커를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포는 단리된 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 자연 발생 세포가 아니다. 일부 실시양태에서, 세포는 또한 본원에서 숙주 세포로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 단리된 숙주 세포는 패키징 세포주이다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포와 같은 진핵 세포이다. 추가의 실시양태에서, 세포는 뮤린 세포 또는 인간 세포이다.
추가로 또는 대안적으로, 세포는 전구 세포 또는 이의 자손이다. 일부 실시양태에서, 세포는 줄기 세포, 예를 들어, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 성체 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 조혈 줄기 세포(HSC) 또는 이들 각각의 자손이다. 일부 실시양태에서, 벡터 및/또는 숙주 세포는 검출 가능한 표지 또는 정제 표지를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포는 줄기 세포, 예를 들어 조혈 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포, 예를 들어 CD34+ 세포이다. 대안적으로, 줄기 세포는 신경 줄기 세포 또는 iPSC이다.
일부 실시양태에서, 세포는 B 세포, T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 수지상 세포, 골수 계통의 세포, 호중구, 단핵구, 대식세포, 및/또는 미세아교세포로부터 임의로 선택되는 면역 세포이다. 추가의 실시양태에서, 면역 세포는 전구 세포(예를 들어 조혈 전구 세포), 줄기 세포(예를 들어 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 성체 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 조혈 줄기 세포(HSC)), 또는 이들 각각의 자손으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4를 발현하며, 즉 CD4+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD8을 발현하며, 즉 CD8+ T 세포이다.
치료적으로 사용될 때, 세포는 치료될 대상체에 대해 동종이계 또는 자가조직일 수 있다. 대상체는 포유동물, 예를 들어 뮤린, 개, 소, 말, 양, 고양이 또는 인간 대상체 또는 환자일 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포는 본원에 개시된 바와 같은 재조합 Ube3a 단백질 또는 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물을 발현 및/또는 분비한다.
또한, 본원에 개시된 바와 같은 세포의 집단 및/또는 이의 자손이 제공된다.
본 개시내용은 임의로 상기한 줄기 세포로부터 유래되거나 분화된 단리된 세포 또는 농축된 세포 집단을 추가로 제공한다. 일부 경우에서, 유래되거나 분화된 세포 또는 농축된 세포 집단은 면역 세포를 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성된다. 일부 경우에서, 면역 세포는 B-세포, T-세포, 자연 살해(NK) 세포, 수지상 세포, 골수 계통의 세포, 및/또는 호중구로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4를 발현하며, 즉 CD4+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD8을 발현하며, 즉 CD8+ T 세포이다. 일부 경우에, 단리된 세포 또는 면역 세포의 농축된 집단은 단핵구, 대식세포 및/또는 미세아교세포를 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성된다. 일부 경우에, 본원에 기술된 면역 세포의 하나 이상의 유형은 Ube3a 발현 면역 세포를 생성하기 위해 본원에 기술된 Ube3a 단백질을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드로 변형된다. 일부 경우에, B-세포, T-세포, NK 세포, 수지상 세포, 호중구, 또는 골수 계통의 세포는 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물을 발현하는 변형된 세포를 생성하기 위해 본원에 기술된 Ube3a 단백질을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드로 변형(예를 들어, 형질도입 또는 형질감염)된다. 일부 경우에, 대식세포는 생체내 및/또는 시험관내에서 Ube3a 발현 대식세포를 생성하기 위해 본원에 기술된 변형된 Ube3a 단백질을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드로 변형(예를 들어, 형질도입 또는 형질감염)된다. 일부 경우에, CD34+ HSC는 생체내 및/또는 시험관내에서 Ube3a 발현 HSC 및/또는 대식세포를 생성하기 위해 본원에 기술된 변형된 Ube3a 단백질을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드로 변형(예를 들어, 형질도입 또는 형질감염)된다.
일부 실시양태에서, 세포 집단은 CD4, CD14 및 HLADR을 발현한다. 일부 실시양태에서, 집단 중의 세포의 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 91%, 또는 적어도 약 92%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%는 CD4+이고, 즉 임의로 세포 표면 상에 CD4를 발현한다. 추가로 또는 대안적으로, 집단 중의 세포의 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 91%, 또는 적어도 약 92%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%는 CD14+이고, 즉 임의로 세포 표면 상에 CD14를 발현한다. 추가로 또는 대안적으로, 집단 중의 세포의 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 91%, 또는 적어도 약 92%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%는 HL-ADR+이고, 즉 임의로 세포 표면 상에 HLA-DR을 발현한다.
일부 실시양태에서, 세포 집단은 적절한 조건하에서 대식세포를 유도하며, 예에 대해서는 실험 방법을 참조한다.
일부 실시양태에서, 세포 집단은 HSC와 같은 줄기 세포로부터 임의로 유래된 대식세포를 실질적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 집단은 임의로 대식세포로 유도되는 HSC와 같은 줄기 세포를 실질적으로 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포 집단은 실질적으로 균일하며, 예를 들면, 집단 중의 세포의 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 91%, 또는 적어도 약 92%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%는 동일하다.
이들 세포는 이를 필요로 하는 대상체에서 엔젤만 증후군을 치료 및/또는 예방하거나 신규 요법을 시험하는데 유용하다. 대상체는 태아, 유아, 청소년 또는 성인일 수 있다.
조성물, 스크린 및 치료 용도
다음 중의 어느 하나 이상 및 담체를 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성된 조성물이 본 개시내용에 의해 제공된다: 본원에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드, 본원에 개시된 바와 같은 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물, 본원에 개시된 바와 같은 벡터, 본원에 개시된 바와 같은 세포, 본원에 개시된 바와 같은 세포 집단, 본원에 개시된 바와 같은 클론 집단 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 패키징 시스템. 일부 실시양태에서, 담체는 약제학적으로 허용되는 담체이다.
사용에 대한 임의의 설명서 및 다음 중의 어느 하나 이상을 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성된 키트가 본 개시내용에 의해 제공된다: 결함이 있는 Ube3a 유전자를 검출하기 위한 프로브, 본원에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드, 본원에 개시된 바와 같은 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물, 본원에 개시된 바와 같은 벡터, 본원에 개시된 바와 같은 세포, 본원에 개시된 바와 같은 세포 집단, 본원에 개시된 바와 같은 클론 집단, 본원에 개시된 바와 같은 패키징 시스템, 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 조성물. 일부 실시양태에서, 설명서는 본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 것이다.
이러한 조성물 및/또는 키트는 본원에 기술된 바와 같이 진단적으로 또는 치료적으로 사용될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 이들 조성물은 다른 알려진 요법과 조합하여 사용될 수 있다.
조성물은 시험할 제제의 다양한 양을 조성물에 첨가하고 이를 제제를 갖지 않지만 다음 중의 하나 이상에 의해 임의로 달성되는 원하는 치료 효과를 나타내는 동반 시스템과 비교함으로써 단독으로 또는 다른 요법과 조합하여 요법의 효과를 변형시킬 수 있는 소분자 및 기타 제제를 스크리닝하기 위해 시험관내에서 사용될 수 있다: 본원에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드, 본원에 개시된 바와 같은 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물, 본원에 개시된 바와 같은 벡터, 본원에 개시된 바와 같은 세포, 본원에 개시된 바와 같은 세포 집단, 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 조성물.
폴리뉴클레오티드, 벡터, 폴리펩티드, 세포 및/또는 조성물이 적절한 동물 대상체에게 투여될 때, 동물 대상체는 시험관내 스크리닝과 동일한 방식으로 대체 요법을 시험하기 위한 동물 모델로서 사용될 수 있다.
또한, Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물의 발현을 허용하는 조건하에서 본원에 기술된 바와 같은 숙주 세포를 성장시킴을 포함하거나, 대안적으로 이것으로 본질적으로 구성되거나, 이것으로 추가로 구성되는, Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물을 발현하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 실행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현된 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물은 임의로 이러한 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물을 발현하는 세포로부터 분비된다.
예를 들면, 본원에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드, 본원에 개시된 바와 같은 벡터 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 세포 중 하나 이상의 유효량을 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 Ube3a를 발현시킴을 포함하거나, 대안적으로 이것으로 본질적으로 구성되거나, 이것으로 추가로 구성되는, 대상체에서 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물을 발현하는 방법이 추가로 제공된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물을 암호화하며, 여기서 상기 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물은 하나 이상의 글리코실화 부위를 갖는다. 추가의 실시양태에서, 하나 이상의 글리코실화 부위는 비-자연 발생적이다.
일부 실시양태에서, 발현된 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물은 이러한 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물을 생산하는 세포로부터 분비된다. 일부 실시양태에서, 발현된 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물은 대상체의 혈액으로 분비된다. 추가의 실시양태에서, 발현된 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물은 대상체의 말초혈액으로 분비된다. 추가로 또는 대안적으로, 발현된 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물은 혈뇌 장벽 내에서 대상체 뇌로 분비된다. 일부 실시양태에서, 발현된 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물은 신경 세포에 결합하고, 임의로 신경 세포에 들어간다.
일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 인간 환자이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 결함이 있는 Ube3a 유전자가 결핍되거나 이를 보유한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 엔젤만 증후군(Angelman syndrome) 또는 프라더-윌리 증후군(Prader-Willi syndrome)에 무증상이거나, 이러한 증후군에 대해 증상이 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 태아, 유아 또는 사춘기전 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 성인이다.
예를 들면, 본원에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드, 본원에 개시된 바와 같은 벡터, 본원에 개시된 바와 같은 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물, 본원에 개시된 바와 같은 세포, 본원에 개시된 바와 같은 세포 집단, 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 조성물 중 하나 이상의 유효량을 대상체에게 투여함으로써 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물을 발현시키고/시키거나 뇌에서 및/또는 대상체의 뉴런에 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물을 전달하고/하거나 엔젤만 증후군(Angelman syndrome) 및/또는 프라더-윌리 증후군(Prader-Willi syndrome)을 치료함을 포함하거나, 대안적으로 이것으로 본질적으로 구성되거나, 이것으로 추가로 구성되는, 결함이 있는 Ube3a 유전자 또는 대립유전자를 보유하는 대상체에서 엔젤만 증후군(Angelman syndrome)을 치료, 예방, 중지 또는 역전(reversing)시키는 방법이 추가로 제공된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 결함이 있는 Ube3A 유전자가 결핍되거나 이를 보유한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 인간 환자이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 엔젤만 증후군(Angelman syndrome)에 무증상이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 태아, 유아 또는 사춘기전 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 성인이다.
예를 들면, 본원에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드, 본원에 개시된 바와 같은 벡터, 본원에 개시된 바와 같은 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물, 본원에 개시된 바와 같은 세포, 본원에 개시된 바와 같은 세포 집단, 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 조성물 중 하나 이상의 유효량을 대상체에게 투여함으로써 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물을 발현시키고/시키거나 뇌에서 및/또는 대상체의 뉴런에 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물을 전달하고/하거나 엔젤만 증후군(Angelman syndrome)을 치료함을 포함하거나, 대안적으로 이것으로 본질적으로 구성되거나, 이것으로 추가로 구성되는, 뇌에서 및/또는 뉴런으로의 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물의 전달을 향상시키는 방법이 또한 제공된다.
본원에 개시된 임의의 방법, 조성물 및 기타와 관련된 일부 실시양태에서, 대상체는 결함이 있는 Ube3A 유전자가 결핍되거나 이를 보유한다. 추가의 실시양태에서, 대상체는 결함이 있는 Ube3A 단백질을 포함하고/하거나 발현한다. 하나의 실시양태에서, 결함이 있는 Ube3A 단백질은 Ube3A 단백질의 생물학적 등가물이 아니다. 하나의 실시양태에서, 결함이 있는 Ube3A 단백질은 야생형의 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만, 또는 약 0.1% 미만의 수준으로 S5a 또는 다른 단백질을 유비퀴틴화하는 것과 같은 Ube3A 기능을 수행한다. 추가의 실시양태에서, 대상체는 건강한 대조군과 비교하여 감소된 수준으로 Ube3A 단백질 또는 이의 생물학적 등가물을 포함하고/하거나 발현한다. 하나의 실시양태에서, 건강한 대조군은 어떠한 질환도 없는 대상체이다. 또 다른 실시양태에서, 건강한 대조군은 본원에 개시된 바와 같은 질환이 없는 대상체이다. 또 다른 실시양태에서, 건강한 대조군은 AS가 없는 대상체이다. 하나의 실시양태에서, 대상체는 건강한 대조군의 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만, 또는 약 0.1% 미만의 수준으로 Ube3A 단백질 또는 이의 생물학적 등가물을 포함하고/하거나 발현한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 인간 환자이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 엔젤만 증후군(Angelman syndrome)에 무증상이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 엔젤만 증후군(Angelman syndrome)에 대해 증상이 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 태아, 유아 또는 사춘기전 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 성인이다.
추가의 효과적인 요법이 본 개시내용과 조합되고/되거나 필요에 따라 추가될 수 있다.
일부 실시양태에서, "유효량"이 전달되며, 이것은 유익하거나 원하는 결과를 수행하기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있다. 이러한 전달은 개별 투여 단위가 사용되는 기간, 치료제의 생체이용률, 투여 경로 등을 포함한 여러 변수에 따라 달라진다. 그러나, 임의의 특정 대상체에 대한 본 개시내용의 치료제의 구체적인 용량 수준은 사용된 특정 화합물의 활성, 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이, 투여 시간, 배설 속도, 약물 조합, 및 치료되는 특정 장애의 중증도 및 투여 형태를 포함한 다양한 인자에 따라 좌우되는 것으로 이해된다. 치료 투여량은 일반적으로 안전성과 효능을 최적화하도록 적정될 수 있다. 전형적으로, 시험관내 및/또는 생체내 시험으로부터의 투여량-효과 관계는 초기에 환자 투여를 위한 적절한 용량에 대한 유용한 지침을 제공할 수 있다. 일반적으로, 시험관내에서 효과적인 것으로 밝혀진 농도에 상응하는 혈청 수준을 달성하는데 효과적인 유전자 또는 단백질의 양을 투여하기를 원할 것이다. 이러한 매개변수의 결정은 당업계의 기술 내에 있다. 이러한 고려사항 뿐만 아니라 효과적인 제형 및 투여 절차는 당업계에 잘 알려져 있으며 표준 교과서에 설명되어 있다. 이 정의와 일치하게, 본원에 사용된 용어 "치료적 유효량"은 치료적 이점을 제공하기에 충분한 양이다.
투여라는 용어는 제한 없이 경구, 비경구(예를 들어, 근육내, 복강내, 정맥내, 뇌실내(ICV), 척추강내, 수조내 주사 또는 주입, 피하 주사, 또는 이식), 흡입 스프레이 비강, 질, 직장, 설하, 요도(예를 들어, 요도 좌약), 두개내 또는 국부 투여 경로(예를 들어, 젤, 연고, 크림, 에어로졸 등)에 의한 국소 또는 전신 투여를 포함하며, 각각의 투여 경로에 적합한 통상적인 비독성 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 부형제 및 비히클을 함유하는 적합한 투여 단위 제형으로, 단독으로 또는 함께, 제형화될 수 있다. 본 개시내용은 투여 경로, 제형 또는 투여 일정에 의해 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 투여는 골수로 또는 뇌에서와 같이 국소적으로 수행된다. 일부 실시양태에서, 투여는 전신으로 수행된다. 일부 실시양태에서, 투여는 예를 들면 약 1시간, 약 1.5시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 12시간, 또는 약 1일에 걸친 주입이다.
일부 실시양태에서, 세포 또는 세포 집단은 약 1.0 x 104 내지 약 1 x 1015개 세포/대상체 체중 kg의 용량으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 용량은 적어도 약 1 x 104개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 2 x 104개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 3 x 104개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 4 x 104개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 5 x 104개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 6 x 104개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 7 x 104개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 8 x 104개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 9 x 104개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 1 x 105개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 2 x 105개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 3 x 105개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 4 x 105개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 5 x 105개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 6 x 105개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 7 x 105개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 8 x 105개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 9 x 105개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 1 x 106개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 2 x 106개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 3 x 106개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 4 x 106개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 5 x 106개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 6 x 106개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 7 x 106개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 8 x 106개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 9 x 106개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 1 x 107개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 2 x 107개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 3 x 107개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 4 x 107개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 5 x 107개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 6 x 107개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 7 x 107개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 8 x 107개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 9 x 107개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 1 x 108개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 2 x 108개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 3 x 108개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 4 x 108개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 5 x 108개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 6 x 108개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 7 x 108개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 8 x 108개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 9 x 108개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 1 x 109개 CD34+ 세포/kg 대상체 체중이다.
추가로 또는 대안적으로, 용량은 1 x 109개 미만, 또는 9 x 108개 미만, 또는 8 x 108개 미만, 또는 7 x 108개 미만, 또는 6 x 108개 미만, 또는 5 x 108개 미만, 또는 4 x 108개 미만, 또는 3 x 108개 미만, 또는 2 x 108개 미만, 또는 1 x 108개 미만, 또는 9 x 107개 미만, 또는 8 x 107개 미만, 또는 7 x 107개 미만, 또는 6 x 107개 미만, 또는 5 x 107개 미만, 또는 4 x 107개 미만, 또는 3 x 107개 미만, 또는 2 x 107개 미만, 또는 1 x 107개 미만, 또는 9 x 106개 미만, 또는 8 x 106개 미만, 또는 7 x 106개 미만, 또는 6 x 106개 미만, 또는 5 x 106개 미만, 또는 4 x 106개 미만, 또는 3 x 106개 미만, 또는 2 x 106개 미만, 또는 1 x 106개 미만, 또는 9 x 105개 미만, 또는 8 x 105개 미만, 또는 7 x 105개 미만, 또는 6 x 105개 미만, 또는 5 x 105개 미만, 또는 4 x 105개 미만, 또는 3 x 105개 미만, 또는 2 x 105개 미만, 또는 1 x 105개 미만의 세포, 예를 들어 CD34+ HSC/대상체 체중 kg이다.
추가로 또는 대안적으로, 용량은 1 x 109개 미만, 또는 9 x 108개 미만, 또는 8 x 108개 미만, 또는 7 x 108개 미만, 또는 6 x 108개 미만, 또는 5 x 108개 미만, 또는 4 x 108개 미만, 또는 3 x 108개 미만, 또는 2 x 108개 미만, 또는 1 x 108개 미만, 또는 9 x 107개 미만, 또는 8 x 107개 미만, 또는 7 x 107개 미만, 또는 6 x 107개 미만, 또는 5 x 107개 미만, 또는 4 x 107개 미만, 또는 3 x 107개 미만, 또는 2 x 107개 미만, 또는 1 x 107개 미만, 또는 9 x 106개 미만, 또는 8 x 106개 미만, 또는 7 x 106개 미만, 또는 6 x 106개 미만, 또는 5 x 106개 미만, 또는 4 x 106개 미만, 또는 3 x 106개 미만, 또는 2 x 106개 미만, 또는 1 x 106개 미만, 또는 9 x 105개 미만, 또는 8 x 105개 미만, 또는 7 x 105개 미만, 또는 6 x 105개 미만, 또는 5 x 105개 미만, 또는 4 x 105개 미만, 또는 3 x 105개 미만, 또는 2 x 105개 미만, 또는 1 x 105개 미만의 변형된 세포, 예를 들어 변형된 CD34+ 세포/대상체의 체중 kg이다.
하기 실시예는 본원에 개시된 실시양태를 예시하기 위한 것이며 제한하지 않는다.
실험 방법
실험 번호 1 - 벡터 작제
렌티바이러스 벡터 설계 및 생산
이 실험에서 다음 연구의 목적을 위해, 모든 렌티바이러스 벡터는 자가-불활성화 3세대 렌티바이러스 벡터 백본 CCLc-x를 사용하여 생성하였다(도 1a). 생체내 효능 연구를 위해, 이러한 실험이 B6-IL2-/-Ube3a-/+ 마우스 모델에서 수행되었기 때문에 마우스 Ube3a 이소형 3의 변형된 형태를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 사용하였다. 마우스 Ube3a 발현 렌티바이러스 벡터를 생성하기 위해, 마우스 이소형 3의 변형된 형태(변형은 단백질 전체에 걸쳐 N-말단 분비 신호 및 8개의 N-글리코실화 부위를 추가하는 것을 포함함)를 합성하고 MNDU3 프로모터의 제어하에 CCLc-x 벡터 백본에 클로닝하였다(도 1c). PGK 프로모터의 제어하에 EGFP 유전자를 형질도입 및 형질도입된 세포의 생착을 추적하기 위해 다운스트림에 클로닝하였다. 야생형 Ube3a는 세포내 단백질이며 세포로부터 분비되지 않는다. 따라서, 형질도입된 세포로부터 분비될 수 있도록 분비 신호를 추가하였다. N-글리코실화 부위는 뉴런에서 발견되는 만노스-6-포스페이트 수용체에 결합하는데 사용된다. 이들 부위는 형질도입된 세포로부터 분비된 후 뉴런으로의 효율적인 부착 및 흡수를 허용하기 위해 마우스 Ube3a 단백질에 추가되었다. 생체내 실험을 위해, 인간 Ube3a 이소형 1의 변형된 형태를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 사용하였다. 인간 이소형 1은 마우스 이소형 3과 동등종(species-equivalent)이다. 인간 Ube3a 이소형 1 유전자는 생체내 효능 연구에 사용된 마우스 Ube3a 이소형 3 유전자와 동일한 N-말단 분비 신호 및 동일한 8개의 N-글리코실화 부위 변형을 포함한다. 변형된 인간 Ube3a 이소형 1 유전자를 합성하고 MNDU3 프로모터의 제어하에 CCLc-x 벡터에 클로닝하였다(도 1e 및 도 1f). PGK 프로모터의 제어하에 EGFP 유전자를 안전성/독성 실험(도 1d) 동안 추적을 위해 사용될 인간 Ube3a 유전자로부터 다운스트림에 클로닝하였지만 임상 사용을 위해서는 생략한다. PGK 프로모터의 제어하에 EGFP 유전자를 클로닝함으로써 EGFP 리포터 유전자만을 포함하는 대조군 빈 벡터를 생성하였다(도 1b). 재조합 DNA를 수반한 실험은 NIH 지침에 따라 수행하였다.
렌티바이러스 벡터는 세포를 1:5:5 비율의 외피 수포성 구내염 바이러스 당단백질(VSVG), 벡터 캡시드 및 역전사효소 유전자를 포함하는 패키징 플라스미드(△8.9), 및 Ube3a 벡터 또는 대조군 EGFP 벡터 중 어느 하나인 상기 언급된 전이 플라스미드 중 하나로 형질감염시킴으로써 인간 배아 신장(HEK)-293 세포에서 GMP-등가 시약을 사용하여 생성하였다. 형질감염 48시간 후, 벡터 상청액을 수집하고 한외여과에 의해 농축하였다. 각 벡터의 형질도입 단위 역가는 HEK-293 세포를 형질도입하고 EGFP 발현 카세트를 함유하는 벡터에 대한 형질도입 48시간 후 유세포 분석에 의해 EGFP 발현을 분석함으로써 계산하였다. EGFP를 함유하지 않는 Ube3a 벡터의 경우, 형질도입된 세포로부터 전체 게놈 DNA를 추출하고 벡터 특이적 psi 프라이머 및 프로브 세트와 함께 Taqman 실시간 PCR 마스터 믹스를 사용하여 정량적 PCR로 분석하였다.
Ube3a 벡터 기능-인간 CD34+ HPC 유래 대식세포에서 렌티벡터 발현된 Ube3a의 과발현 및 유비퀴틴화 활성
인간 Ube3a 렌티벡터의 발현 및 기능을 평가하기 위해, 인간 CD34+ HPSC를 hAS8 벡터로 형질도입하고 시험관내에서 성숙한 대식세포로 유도하였다. 인간 CD34+ HSPC를 Ficoll-Paque 밀도 구배에 의해 UC Davis 제대혈 수집 프로그램으로부터 수득된 제대혈로부터 단리하고 CD34 자기 비드 컬럼 분리에 의해 추가로 정제하였다. 총 CD34+ 세포를 50ng/ml 줄기 세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO) 및 Flt-3 리간드가 보충된 XVIVO-10 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 단리한지 48시간 후, CD34+ 세포를 8mg/ml 프로타민 설페이트로 MOI 20에서 EGFP 대조군 벡터 또는 hAS8 벡터로 형질도입하지 않거나(NT) 섭씨 37도에서 최소 3시간 동안 형질도입하였다. 그후 EGFP 대조군 및 hAS8 벡터 형질도입된 CD34+ 세포를 후속 실험을 위해 EGFP 발현에 기초하여 분류하였다.
콜로니 형성 단위 분석 ( CFU )
렌티바이러스 형질도입에 의한 CD34+ HSPC에서의 HexA 및 HexB의 과발현으로 인해, 세포의 유해한 성장 및 분화가 발생할 수 있다. 이를 평가하기 위해, HSPC CFU 분석을 수행하였다. NT, 형광 활성화된 세포 분류(FACS) EGFP 대조군 벡터 형질도입된 세포 또는 FACS 분류 hAS8 벡터 형질도입된 세포(총 세포 500개) 중의 어느 하나인 CD34+ 세포를 사이토카인이 보충된 메틸셀룰로오스 배지에서 12일 동안 배양하였다. 배양 기간 후, 총 대집락 형성 단위-적아구 콜로니(BFU-E), 과립구/대식세포(GM) 콜로니 및 과립구/적혈구/거핵구/대식세포(GEMM) 콜로니를 현미경으로 관찰하고 계수하였다. 실험은 삼중으로 수행하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 대조군 세포와 비교하여 Ube3a 렌티벡터 형질도입된 세포에서 세 가지 콜로니 유형의 유사한 수준이 관찰되었다.
표현형적으로 정상인 대식세포의 유도
CFU 분석으로부터의 세포를 시험관내에서 성숙한 대식세포로 더욱 분화하였다. NT 및 벡터 형질도입된 CD34+ 세포로부터 유래된 CFU는 10% FBS, 10ng/ml 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 및 10ng/ml 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)가 보충된 DMEM으로 2일마다 배지를 교체하면서 4일 동안 6웰 플레이트에 세포를 플레이팅함으로써 성숙한 대식세포로 추가로 유도하였다. 세포를 현미경으로 관찰하여 대식세포 형태를 확인하고 정상 대식세포 세포 표면 마커의 발현에 대해 유세포 분석으로 분석하였다. 대식세포를 피코에리트린(PE)-접합된 CD14, PE-접합된 HLA-DR 또는 PE-접합된 CD4로 염색하였다. Beckman Coulter Cytomics FC500 및 CXP 소프트웨어를 사용하여 유세포 분석을 수행하였다. 실험은 삼중으로 수행하였다.
대식세포를 정상 대식세포 마커인 CD4, CD14 및 HLA-DR에 특이적인 항체를 사용하여 유세포 분석법으로 분석하였다. Ube3a 렌티벡터로 형질도입된 CD34+ HPC로부터 유래된 대식세포는 평균적으로 96.1%의 CD4%, 99.6%의 CD14%, 및 99.1%의 HLA-DR%를 나타내는 표현형적으로 정상이었다. 이러한 수준은 각각 95.7% 및 96.4%의 CD4% 수준, 99.3% 및 97.6%의 CD14% 수준, 및 98.0% 및 97.5%의 HLADR% 수준을 나타내는 대조군 NT 및 EGFP-단독 대식세포의 수준과 유사하였다.
웨스턴 블롯
그후 Halt 프로테아제 억제제가 보충된 Pierce RIPA 완충액을 사용하여 대식세포로부터 총 세포 추출물을 수집하고 급속 동결하였다. 총 단백질 농도를 제조업체의 프로토콜에 따라 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 결정하였다. 단백질을 폴리아크릴아미드 겔에 부하하고 폴리비닐리덴 플루오라이드 막으로 옮겼다. 그후 막을 각각의 1차 항체인 마우스 항-인간 Ube3a와 함께 배양하였다. 그후 염소 항-마우스 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 접합된 이차 항체를 첨가하였다. 그후 SuperSignal West Pico 화학발광 기질을 사용하여 블롯을 현상하였다.
도 3a에 나타낸 바와 같이, Ube3a의 과발현은 강한 Ube3a 밴드와 이의 스플라이스 변이체의 존재로부터 검출되었다. 이것을 대조군 비형질도입된 세포(NT) 및 대조군 EGFP-단독(EGFP) 벡터 형질도입된 세포와 비교하였다. 렌티벡터에 의해 발현된 인간 Ube3a 단백질이 이의 표적 단백질 S5a를 유비퀴틴화하는 기능이 있는지 여부를 추가로 평가하기 위해, 유비퀴틴화 분석(예를 들면, (R&D Systems, 인간 E6AP/S5a 유비퀴틴화 키트, cat# K-230))을, 예를 들면, 문헌[Yi et al. (2017) J. Biol. Chem. 28;292(30):12503-12515]에 기술된 방법을 사용하여 인간 CD34+ HPC 유래된 대식세포 세포 추출물에서 수행하였다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, S5a 단백질의 유비퀴틴화는 Ube3a 벡터 형질도입된 세포에서 검출되었다. 이것은 "AS8" 레인에서 사다리꼴 밴딩 패턴으로 표시된다.
종합하면, 이러한 결과는 Ube3a의 과발현 및 표적 단백질의 후속 유비퀴틴화에서 인간 Ube3a 렌티바이러스 벡터의 기능을 입증하였다. 이 데이터는 또한 인간 Ube3a 렌티바이러스 벡터를 사용한 형질도입시 시험관내에서 정상적인 인간 CD34+ HSPC 콜로니 형성 및 표현형적으로 정상인 말기 대식세포의 분화를 입증하였다.
실험 번호 2 - 마우스 모델에서의 신생아 치료
Ube3a-/+ 마우스와 B6-IL2rg-/- 녹아웃 마우스를 교배하여 생착을 위해 인간 CD34+ 세포를 수용할 수 있는 신규한 면역결핍 Ube3a-/+ 마우스 모델(BGU)을 생성하였다. BGU 마우스는 결핍된 운동, 행동 및 인지 표현형의 징후와 발작 유도의 더 낮은 역치를 나타내는 정상 면역적격 Ube3a-/+ 마우스의 표현형을 보유한다. 이 마우스 모델은 렌티바이러스 벡터를 발현하는 Ube3a로 형질도입된 인간 CD34+ 세포의 전임상 평가로 만들어졌다.
본 출원인은 인간화 AS 및 NRG 마우스 모델에서 인간 CD34+ HSC에 Ube3a 유전자를 발현하는 렌티바이러스 벡터의 성공적인 기능, 효능 및 안전성을 입증하였다. 기능적 효소 활성의 회복은 질환-특이 세포 및 HSC-유래 면역 세포에서 관찰되었다. Ube3a 벡터가 형질도입된 인간 HSC가 이식된 AS 마우스에서 운동 및 행동 표현형의 상당한 개선이 관찰되었다. Ube3a 렌티바이러스 벡터가 형질도입된 인간 CD34+ HSC의 장기 안전성이 또한 인간화 NRG 마우스 모델에서 생착 및 다계통 조혈시에 관찰되었다.
Ube3a 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 HSC로 신생아 치료 후 HSC의 기능적 효능
본 출원인은 Ube3a-결핍 마우스와 면역결핍 B6-IL2rg-/- 녹아웃 마우스를 교배하여 인간화 면역결핍 Ube3a-결핍 마우스 모델(BGUbe3a)을 생성하였다. 따라서, 이식된 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포(HSC)는 인간 면역 시스템을 가진 마우스를 성공적으로 재구성할 수 있고 임상적으로 사용하고자 하는 치료 후보물질: Ube3a 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 인간 CD34+ HSC의 평가를 가능하게 한다. BGUbe3a-결핍 마우스는 운동, 행동 및 신경학적 결손을 포함한 AS-관련 표현형을 나타낸다. 이들은 또한 WT 마우스에 비해 폭이 넓은 걸음걸이와 느린 움직임을 나타낸다. 아래의 모든 실험에 대해, 임상적으로 등가인 Ube3a 벡터(도 1b에 표시됨)를 사용하여 세포 이식에 사용된 인간 CD34+ HSC를 형질도입하였다. 아래에 제시된 모든 생체내 효능 데이터는 2-5일령에 간내 이식된 마우스에서 얻은 것이다. 이 연령에서, 마우스는 AS의 증상을 나타내지 않는다. 이 실험의 가설은 마우스에게 이식하여 AS-관련 표현형이 발생하는 것을 방지하는 것이었다.
신생아 이식된 BGU 마우스에서 AS 표현형의 기능적 구제
AS 표현형을 개선하는 Ube3a 렌티바이러스 벡터의 능력을 평가하기 위해, mAS8 벡터 형질도입된 인간 CD34+ HSC를 신생아 면역결핍 BGU 신생 마우스에 이식하였다. 비형질도입된 또는 mAS8(Ube3a) 벡터 형질도입된 인간 CD34+ HSC(500,000개 세포)를 100rad로 준치사적으로 조사된 2-5일령 BGU 새끼에게 간내 이식하였다. 이식한지 8주 후, 마우스를 꼬리 정맥을 통해 채혈하고 마우스 항-인간 CD45 항체를 사용하여 유세포 분석에 의해 생착에 대해 분석하였다. 그후 성공적으로 생착된 마우스를 AS 표현형에 대해 평가하였다. 시험 순서 및 연령은 다음과 같았다: (1) 9주령에 개방 영역, (2) 9주령에 평균대 걷기, (3) 10주령에 로타로드, (4) 10주령에 DigiGait 및 (5) 11주령에 새로운 물체 인식.
시험 코호트
4개의 유전자형/치료 그룹을 AS와 관련된 행동 분석에서 기능적 구제에 대해 분석하였다. 그룹은 대조군 야생형(WT; 면역 시스템 효과의 적절한 제어를 위한 IL2 삭제 돌연변이를 가짐), HET(IL2 삭제 돌연변이로 생성된 Ube3a의 모계 결실이 있는 새로운 AS 모델), NT-HET(IL2 삭제 돌연변이로 생성되고 HSC 단독의 효과를 제어하기 위해 비형질도입된 인간 CD34+ 세포가 이식된 Ube3a의 모체 결실이 있는 새로운 AS 모델), 및 Ube3a-HET(IL2 삭제 돌연변이로 생성되고 Ube3a 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 인간 CD34+ HSC가 이식된 Ube3a의 모체 결실이 있는 새로운 AS 모델)였다. 엔젤만 증후군(Angelman Syndrome) 전임상 또는 임상 결과에서 성별 차이가 없었기 때문에 성별을 조합하였다.
Ube3a 벡터 형질도입 세포가 이식된 BGUbe3a 마우스의 개방 영역 활동량
Ube3a-결핍 마우스는 개방 영역 분석에서 운동 및 행동 결함을 나타내며 움직임 및 총 활동량이 감소된다. 따라서, Ube3a 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 인간 CD34+ HSC가 이러한 결함이 발생하는 것을 방지하는지를 평가하기 위해, 마우스를 수평, 수직 및 총 활동량에 대해 평가하였다. 간단히 말해서, 도 5a 내지 5c에 도시된 바와 같이, Ube3a 벡터 형질도입된 세포가 이식된 Ube3a-결핍 마우스(Ube3a Het)는 (도 5a) 수평, (도 5b) 수직 및 (도 5c) 총 활동량에 있어서 비형질도입된 인간 C34+ 세포가 이식된 Ube3a-결핍 마우스(NT Het)보다 유의하게(p<0.0001) 더 나은 수행능력을 나타내었다. Ube3a Het 마우스는 야생형(WT) 마우스와 유사한 수행능력을 나타내었다. 자세한 내용은 아래에 논의되어 있다.
새로운 개방 영역 경기장에서 일반적인 탐험적 이동을 이전에 기술된 바와 같이 평가하였다(1-8). 간단히 말해서, 각 대상체를 VersaMax 동물 활동 모니터링 시스템에서 ~30lux 테스트 룸에서 30분 동안 시험하였다. 총 이동 거리, 수평 활동량, 수직 활동량, 및 중앙에서 보낸 시간을 자동으로 측정하여 마우스의 총 운동 능력을 평가하였다.
Ube3a 벡터 형질도입된(Ube3a-Het) 인간 CD34+ HSC가 이식된 신생 BGU 마우스를 이식 후 8주에 행동적으로 검사하였으며 운동 행동 결함의 다중 분석에서 WT와 구별할 수 없었다. 새로운 개방 영역에서의 보행을 수집하여, 새로운 경기장에서 빔 브레이크를 사용하여 총 횡단 거리 및 수평 움직임을 평가하였다.
총 거리의 그룹 차이는 다중-요인 반복 측정 ANOVA를 사용하여 관찰되었다(도 5c; F (3, 67) = 8.194, p < 0.0001). 다중 비교를 위한 Holm-Sidak 보정된 사후 분석은 NT-HET(p < 0.0001) 및 HET(p < 0.0028) 둘 다는 WT와 상이한 반면 치료 그룹 Ube3a-HET는 WT와 상이하지 않았음(p > 0.05)을 강조하였다. 다중 비교를 위한 Holm-Sidak 보정된 사후 분석은 NT-HET(p < 0.0001) 및 HET(p < 0.0002) 둘 다는 WT와 상이한 반면 치료 그룹 Ube3a-HET는 WT와 다르지 않았음(p = 0.191)을 강조하였다. 이러한 사후 분석의 엄격도는 현저하다. Ube3a-처리된 HET는 30분 분석에 걸쳐 어떤 시점에서도 WT와 상이하지 않은 반면(0-5min, p = 0.389, 6-10 min, p = 0.5027, 11-15min, p = 0.132, 16-20min, p = 0.5418, 21-25min p = 0.995, 26-30min p = 0.8991), Holm Sidak으로부터 조정된 p가 제공된 HET 및 WT(0-5min, p < 0.0052, 6-10 min, p < 0.0076, 11-15min, p < 0.004, 16-20min, p < 0.024, 21-25min, 26-30min)는 6개의 5분 시간 간격(time bin) 중 4개에서 상이하며 NT-HET 및 WT는 30분 과제의 5분 간격마다 상이하다(0-5min, p < 0.0002, 6-10 min, p < 0.000, 11-15min, p < 0.0004, 16-20min, p < 0.003, 21-25min, p < 0.0287, 26-30min, p < 0.0003).
확증(corroboration)을 위해, 수평 활동 수가 또한 다중-요인 반복 측정 ANOVA를 사용하여 그룹 차이를 예시하였다(도 5a; F (3, 67) = 9.487, p < 0.0001). 다중 비교를 위한 Holm-Sidak 보정된 사후 분석은 NT-HET(p < 0.0001) 및 HET(p < 0.0002) 둘 다가 WT와 상이한 반면 치료 그룹 Ube3a-HET는 WT와 상이하지 않았음을 강조하였다(p = 0.191). 이러한 사후 분석의 엄격도는 현저하다. Ube3a-처리된 HET는 30분 분석에 걸쳐 어떤 시점에서도 WT와 상이하지 않은 반면(0-5min, p = 0.4383, 6-10 min, p = 0.3297, 11-15min, p = 0.0439, 16-20min, p = 0.2038, 21-25min p = 0.7833, 26-30min p = 2903), Holm Sidak으로부터 조정된 p가 제공된 HET 및 WT(0-5min, p < 0.0001, 6-10 min, p < 0.0001, 11-15min, p < 0.0023, 16-20min, p < 0.0002, 21-25min, p < 0.0231, 26-30min, p < 0.0214)는 6개의 5분 시간 간격 중 5개에서 상이하며 NT-HET 및 WT는 30분 과제의 5분 간격마다 상이하다(0-5min, p < 0.0002, 6-10 min, p < 0.0001, 11-15min, p < 0.0001, 16-20min, p < 0.0003, 21-25min, p < 0.0103, 26-30min, p < 0.0001).
Ube3a 벡터 형질도입 세포가 이식된 Ube3a 마우스의 평균대 걷기 활동
AS-관련 표현형을 방지하는 Ube3a 벡터 형질도입 세포의 능력을 추가로 평가하기 위해, 이식된 마우스를 다양한 폭의 3개의 평균대를 건너가기까지의 대기 시간으로 측정한 평균대 걷기 분석에 적용하였다. 간단히 말해서, 도 5d 및 도 5e에 도시된 바와 같이 Ube3a 벡터 형질도입된 인간 CD34+ HSC(Ube3a Het)가 이식된 Ube3a-결핍 마우스는 비형질도입된(NT Het) 세포가 이식된 Ube3a-결핍 마우스와 비교하여 평균대 걷기 활동에 있어 유의하게(p<0.05) 더 나은 수행능력을 나타내었다. Ube3a Het 마우스는 WT 마우스와 유사한 수행능력을 나타내었다. 자세한 내용은 아래에 논의되어 있다.
평균대 걷기 운동 과제는 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다(1-8). 59센티미터 길이의 둥근 막대가 쿠션이 있는 착지 패드 위로 68센티미터에 매달려 있었다. 평균대 끝에 있는 골 박스는 평균대를 건너갈 동기를 제공하기 위해 12센티미터 직경의 실린더로 구성되었다. 각 마우스를 평균대의 한쪽 끝에 놓고 다른 쪽 끝에 있는 골 박스로 건너가기까지의 시간을 측정하였다. 시험 순서는 난이도가 높은 순서대로 가장 큰 직경에서 가장 작은 직경의 막대로 이동하였다. 시험 전날, 모든 동물은 절차에 익숙해지기 위해 가장 큰 직경의 원형 평균대에서 두 번의 연습 시행을 받았다. 시험 당일, 각 동물을 3개의 둥근 막대(35, 18, 13mm)에서 순차적으로 시험하였다. 시험 순서는 증가하는 난이도 수준을 나타내기 위해 감소하는 직경의 표시에 기반하였다. 각 마우스를 각 평균대에서 대략 30분 간격으로 두 번의 시험을 받았다. 평균대를 가로지르는 시간을 기록하고 각 평균대에 대해 두 번의 시험에 걸쳐 평균을 내었다. 그 기간 동안 평균대를 건너지 못한 개체에는 최대 60초의 시간이 할당되었다. 마우스가 빔에서 떨어지는 소수의 경우에는 60초의 점수가 할당되었다.
평균대 걷기 운동 과제를 수행하였다. 예상대로 모든 그룹은 막대 모양의 평균대가 더 얇아지고 횡단하기 더 어려워짐에 따라 평균대를 건너는데 더 긴 대기 시간을 보였다. 다중-요인 반복 측정 ANOVA를 사용한 그룹 차이(도 5d; F (3, 67) = 17.02, p < 0.0001). 흥미롭게도, Ube3a 렌티바이러스 형질도입된 인간 CD34+ HSC가 이식된 Ube3a-결핍 마우스(Ube3a-Het)는 Holm-Sidak 사후 분석을 통해 예시된 바와 같이 평균대에서 야생형 값의 수행능력을 나타내었다. Ube3a-처리된 HET는 막대 #3(rod#3, p > 0.999)에서는 WT와 상이하지 않은 반면 HET(p < 0.0001) 및 NT-HET(p < 0.227)는 막대 #3를 건너기까지의 대기 시간이 훨씬 더 느리며, 이것은 처리된 그룹의 개선된 운동 협응을 강조한다. 도 5e는 막대를 가로지르는 시간으로는 서로 구별할 수 없기 때문에 WT와 Ube3a-HET를 강조하는 막대를 건너는 가장 빠른 그룹을 예시하며, 이것은 운동 협응의 상당한 개선을 강조한다.
Ube3a 벡터 형질도입된 세포가 이식된 Ube3a 마우스의 로타로드 및 Digigait 활동량
AS-관련 표현형을 방지하는 Ube3a 벡터 형질도입 세포의 능력을 평가하기 위한 또 다른 시험으로서, 이식된 마우스를 로타로드 및 DigiGait 분석에 적용하였다. 로타로드 분석은 회전하는 막대의 가속을 천천히 증가시키는 막대에서 떨어지기까지의 대기 시간을 결정한다. 도 5f에 도시된 바와 같이, Ube3a 벡터 형질도입된 인간 CD34+ HSC(Ube3a Het)가 이식된 Ube3a-결핍 마우스는 비형질도입된 (NT Het) 세포가 이식된 Ube3a-결핍 마우스와 비교하여 로타로드 분석에서 유의하게(p<0.05) 더 나은 수행능력을 나타내었다. Ube3a Het 마우스는 WT 마우스와 유사한 수행능력을 나타내었다. DigiGait 분석은 시험된 마우스의 걸음걸이 폭을 측정한다. 도 5g에 도시된 바와 같이, Ube3a 벡터 형질도입된 인간 CD34+ HSC(Ube3a Het)가 이식된 Ube3a-결핍 마우스는 비형질도입된(NT Het) 세포가 이식된 Ube3a-결핍 마우스와 비교하여 앞발과 뒷발 모두에서 유의하게(p<0.05) 개선된 걸음걸이를 나타내었다. Ube3a Het 마우스의 걸음걸이는 WT 마우스의 걸음걸이와 유사해 보였다. 자세한 내용은 아래에 논의되어 있다.
로타로드: 운동 협응, 균형 및 운동 학습은 이전에 기술된 바와 같이 Ugo Basile로부터의 가속 로타로드로 시험하였다(1-8). 5분에 걸쳐 분당 5 내지 40회전수로 천천히 가속되는 회전 실린더에 마우스를 넣았다. 마우스는 60분의 시험간 휴식 간격으로 하루에 3번의 시험을 받았고 총 9번의 시험에 대해 연속 3일 동안 시험하였다. 수행능력은 최대 대기 시간을 5분으로 하여 실린더에서 떨어지기까지의 대기 시간으로 점수를 매겼다.
DigiGait: Mouse Specifics Inc로부터의 DigiGait 분석기를 사용하여 걸음걸이를 분석하였다. DigiGait는 전동 투명 벨트 아래에 위치한 배면 카메라가 있는 트레드밀이다. 이미지 캡처를 위해 벨트를 출발시키기 전에 마우스를 1분 동안 보행 복도에 적응시켰다. 벨트 속도를 20cm/s로 설정하고 각 대상체의 발을 5초 동안 기록하였다. 5초 비디오에서 900개의 비디오 프레임이 초당 180프레임으로 수집되었다. 캡처된 프레임을 디지털화하고, 관련 걸음걸이 매개변수를 DigiGait 분석 소프트웨어로 분석하였다. 왼쪽 및 오른쪽 앞다리와 뒷다리를 대상체당 함께 평균을 내었다. 5초 동안 목표 속도로 걸을 수 없는 동물을 쉬게 하고 재시험하였다. 3회 후에도 이 기준을 완료할 수 없는 경우, 대상체를 연구에서 제외시켰다.
마우스가 이 과제에서 극적인 결함을 갖고 있기 때문에 운동 협응의 이차 확증 분석은 로타로드 분석이다. 예상대로, HET는 2일(p < 0.0098) 및 3일(p < 0.0133)에 가속 막대(도 5f; F(3, 67) = 8.395, p < 0.0001)에서 떨어지기까지의 대기 시간이 WT와 상이하며, 이것은 좋지 못한 운동 협응 및 운동 학습의 부족을 예시한다. 두드러지게도, Ube3a 렌티벡터 형질도입된 인간 CD34+ HSC가 이식된 Ube3a-결핍 마우스는 Holm-Sidak 사후 분석을 사용한 모든 3일간의 시험(1일차, p = 0.8356), (2일차, p = 0.9572) 및 (3일차, p = 9979)에 걸쳐 야생형과 유사하였다. 그룹 차이는 다중-요인 ANOVA를 사용하여 검출하였다(도 4f; F(3, 65) = 5.782, p < 0.002).
여러 보고서에서, AS 환자는 Zenowalk Way에 대해 넓은 자세를 나타낸다. (1-8) Digigait 분석은 HET(p < 0.0026) 및 NT-HET(p < 0.002)는 야생형과 상이한 반면 Ube3a-처리된 HET 그룹은 이러한 넓은 자세의 협소화를 나타낸다(p = 0.3486)는 것을 보여주었다.
Ube3a 벡터 형질도입된 세포가 이식된 Ube3a 마우스의 새로운 물체 인식(NOR)
Ube3a-결핍 마우스는 신경학적 결함으로 인해 새로운 물체 인식의 부족을 나타낸다. 따라서, Ube3a 벡터 형질도입된 인간 CD34+ HSC의 이식이 신경학적 결함을 개선하는지 평가하기 위해, NOR 검정을 수행하였다. 이 버전의 NOR는 30분 동안 동물을 시험장에 적응시키는 것으로 시작되었다. 24시간 후, 대상체는 10분의 친숙화 세션을 제공받았으며 각 물체를 스니핑하는데 보낸 시간을 기록하였다. 그후 물체를 청소하고 1시간 간격 후, 마우스를 친숙한 물체와 새로운 물체가 있는 경기장에 다시 배치하였다. 도 6a 내지 6b에 도시된 바와 같이, Ube3a 벡터 형질도입된 인간 CD34+ HSC(Ube3a Het)가 이식된 Ube3a-결핍 마우스는 비형질도입(NT Het) 세포가 이식된 Ube3a-결핍 마우스와 비교하여 유의하게(p<0.05) 더 나은 수행능력을 나타냈다. Ube3a Het 마우스는 WT 마우스와 유사한 수행능력을 나타냈다. 자세한 내용은 아래에 논의되어 있다.
새로운 물체 인식 검사는 불투명한 무광택 흰색(P95 White, Tap Plastics, Sacramento, CA, USA) 경기장(41cm l x 41cm w x 30cm h)에서 이전에 기술된 바와 같이(1-8) 수행하였다. 분석은 4개 세션으로 구성되었다: 30분 습관화 세션, 두 번째 10분 습관화 단계, 10분 친숙화 세션, 및 5분 인식 검사. 1일차에, 각 대상체를 30분 동안 깨끗하고 비어 있는 경기장에 길들였다. 24시간 후, 각 대상체를 추가 10분 습관화 세션을 위해 빈 경기장으로 돌려 보냈다. 그후 마우스를 시험 경기장에서 꺼내 깨끗한 임시 수용 케이지에 넣었고 두 개의 동일한 물체를 경기장에 배치하였다. 대상체를 시험장으로 돌려 보내고 10분의 친숙화 시간을 주어 이들이 두 개의 동일한 물체를 살펴볼 시간을 가졌다. 친숙화 단계 후, 대상체를 1시간 간격으로 수용 케이지로 돌려 보냈다. 친숙화 단계 동안 두 개의 동일한 물체가 위치한 경기장에 한 개의 친숙한 물체와 한 개의 새로운 물체를 배치하였다. 1시간 간격 후, 각 대상체를 5분 인식 검사를 위해 경기장으로 돌려 보냈다. 친숙화 세션 및 인식 검사는 Ethovision XT 비디오 추적 소프트웨어(버전 9.0, Noldus Information Technologies, Leesburg, VA, USA)를 사용하여 기록하였다. 스니핑은 머리를 물체를 향하게 하여 코끝을 물체로부터 2cm 이내에 두는 것으로 정의하였다. 각 대상체가 스니핑하는데 보낸 시간을 유전자형 및 치료 모두에 대해 블라인딩된 조사자가 점수를 매겼다. 인식 기억은 친숙한 물체에 비해 새로운 물건을 스니핑하는데 유의하게 더 많은 시간을 소모하는 것으로 정의하였다. 두 물체 모두를 스니핑하는데 보낸 총 시간을 일반적인 탐색의 척도로 사용하였다. 친숙화 단계 동안 두 개의 동일한 물체를 스니핑하는데 보낸 시간은 타고난 편향(innate side bias)이 없음을 확인시켜 주었다. 유전자형 내에서 반복 측정 ANOVA를 사용하여 비교로 새로운 물체 대 친숙한 물체를 사용한 새로운 물체 인식을 분석하였다. F, 자유도 및 p-값이 보고된다.
AS Ube3a-결핍 마우스는 새로운 물체 인식 분석에서 학습 및 기억 결함을 나타낸다(1-8). 도 6a 내지 도 6b에 도시된 바와 같이, Ube3a 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 인간 CD34+ HSC가 이식된 BGU 마우스에서 인지 행동 장애의 기능적 역전이 관찰되었다. 모든 채점은 초기에 자동화된 Ethovision 소프트웨어에 의해 수행하였으며 유전자형 및 치료 그룹에 대해 블라인딩된 고도로 훈련된 관찰자의 수동 채점에 의해 확인하였다. 예상대로, WT는 친숙한 물체와 비교하여 새로운 물체를 조사하는데 더 많은 시간을 보냈다. 대조적으로, HET 및 NT-HET 그룹은 전형적인 새로운 물체 선호도를 나타내지 않았다(도 6a: WT; t (15) = 8.714, p < 0.0001; HET; t (14) = 44 .10, p < 0.0002; NT-HET; t (19) = 4.544, p < 0.0060). HET 및 NT-HET 그룹과 대조적으로, 본 출원인은 Ube3a-HET 처리 그룹에서 인지 구제를 관찰하였다(도 6a: Ube3a-HET; t (16) = 3.271, p < 0.003 모든 그룹은 친숙화 단계 동안 두 개의 동일한 물체를 유사하게 탐색하였다(도 6b: WT; HET; NT-HET; Ube3a-HET).
뇌파(EEG) 분석
상승된 델타 힘을 포함하여 AS에서 여러 EEG 이상이 기술된 바 있다. 이러한 관찰은 Ube3a-/+ BGU 마우스 모델에도 존재한다. 따라서, Ube3a 벡터 형질도입된 세포의 이식이 EEG 표현형을 개선시키고 델타파 스펙트럼을 감소시키는지 여부를 평가하기 위해, EEG 분석을 수행하였다.
EEG 이식: 무선 EEG 전송기를 연속 이소플루란을 사용하여 마취된 시험 동물에 이식하였다. 이식물을 동물의 불편함과 움직임으로 인한 변위를 피하기 위해 척추 측면의 피하낭에 배치하였다. 각 이식물은 의료-등급 실리콘으로 절연된 니켈-코발트 기반 합금으로 만들어진 신호 및 기준 리드를 포함하는 두 개의 채널을 갖는다. EEG, EMG, 온도, 활동 및 신호 강도 데이터를 각 이식물로 수집하였다. EEG 데이터를 수집하기 위해, 브레그마에 대해 2개의 1.0mm 절삭 구멍(1.0mm 전방 및 1.0mm 측면; -3.0mm 후방 및 1.0mm 측면)을 뚫고 스테인리스 강 두개골 나사를 사용하여 생체전위 리드를 고정하였다. 제자리에 고정되면, 두개골 나사와 리드 연결부를 치과용 시멘트를 사용하여 고정하였다. EMG 데이터를 수집하기 위해, 동물의 승모근에 리드를 배치하였다. 마우스에게 수술 직후 및 수술 후 24시간에 진통제로서 카르포펜(5mg/kg; i.p.)을 제공하였다. 대상체를 EEG 획득 전 1주일 동안 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 개별적으로 가두고 적절한 절개 치유 및 회복을 보장하기 위해 매일 모니터링하였다.
EEG 데이터 획득, 처리 및 분석: 외과적 이식으로부터 1주일 회복 후, Ponemah 소프트웨어(Data Sciences International)를 사용하여 데이터 교환 매트릭스를 통해 EEG 이식물의 데이터를 컴퓨터로 전송하는 PhysioTel RPC 수신기 플레이트에 개별적으로 수용된 마우스를 할당하였다. EEG 및 EMG 데이터를 0.1Hz 고역 통과 및 100Hz 저역 통과 대역 필터를 사용하여 500Hz의 샘플링 속도로 수집하였다. 활동, 온도 및 신호 강도는 200Hz의 샘플링 속도로 수집하였다. Ponemah에서 획득한 데이터를 Python으로 읽고 관심 주파수에 초점을 맞추기 위해 0-50Hz의 대역 필터로 추가 처리하였다. 스펙트럼 분석을 위해, 주파수 대역은 델타 0.5-4Hz, 세타 5-9Hz, 알파 9-12Hz, 베타 13-30Hz 및 감마 30-50Hz로 정의하였다. 스펙트럼 힘을 신호에 대해 윈도우를 설정하고 스펙트럼 샘플에 대해 평균을 내는 Welch의 방법을 사용하여 분석하였다. 상대적 델타 주파수는 평균 델타 밀도를 동물당 총 밀도로 나누고 유전자형에 대해 평균화함으로써 계산하였다. 양방향 반복 측정 ANOVA를 사용하여 유전자형 간의 힘 스펙트럼 밀도를 분석하고 Sidak의 다중 비교 검정을 사용하여 각 주파수 지점에서 유의도를 검사하였다. F, 자유도 및 p-값이 보고된다.
도 7a에 도시된 바와 같이, 본 출원인은 WT 마우스의 값과 유사한 Ube3a-HET 코호트에서의 델타 힘의 감소를 관찰하였다(F(25, 300) = 0.223, p > 0.999). Ube3a-HET 마우스는 또한 HET(이식되지 않은 Ube3a-/+) 마우스보다 유의하게 더 낮은 델타 힘을 나타내었다(F(25, 475) = 3.249, p < 0.0001). 본 출원인은 WT 한배 새끼 대조군과 비교할 때 HET 그룹에서 상승된 델타 힘을 관찰하였으며, 이것은 Ube3a-/+ 유전자형을 가진 마우스에서 일치한다(F(25, 362) = 4.312, p < 0.0001). 본 출원인은 NT-HET 동물의 델타 힘의 유의한 변화를 검출하지 못했지만(F(25, 150) = 0.651, p = 0.896), 이것은 평균 선이 Ube3a-/+ HET 마우스의 것과 상관 관계가 있으므로 그 그룹에서 검출된 높은 오류율 때문일 가능성이 높다.
이식된 Ube3a -/+ 마우스의 CNS에서의 Ube3a의 발현
Ube3a 벡터 형질도입된 세포가 이식된 Ube3a-/+ BGU 마우스의 CNS에서 Ube3a가 검출될 수 있는지 평가하기 위해, 마우스로부터 수득된 뇌 절편을 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 방법을 사용하여 염색하였다.
면역조직화학 표지화 및 분석: AS 표현형의 기능적 개선에 대해 마우스를 평가한 후, 마우스를 안락사시키고 양측 정중선에서 시상 뇌 절편(40um)을 수득하였다. 조직을 프로토콜을 포함하는 제조업체의 권장 사항에 따라 Vectastain ABC 키트를 사용하여 Vector Labs로부터의 ImmPACT DAB 퍼옥시다제 기질로 표지하였다. 조직은 물 중의 0.3% 과산화수소 용액을 사용하여 30분 동안 퍼옥시다제 켄칭을 거친 후 PBS(SEA BLOCK Blocking Buffer) 중의 10% 차단 용액에 1시간 동안 침지시켰으며, 그후 4℃에서 밤새 배양하면서 1:500의 농도 비율로 1차 항체 UBE3a(마우스에서 생산된 단클론 항-UBE3A 항체, SAB1404508)에 침지시켰다. 둘째 날 조직을 1시간 동안 배양하면서 1:200 농도로 비오틴화된 이차 항체 용액(염소 항-마우스 IgG 항체, Vector Labs)에 침지시킨 다음 Vectastain ABC 시약을 30분 동안 배양하였으며(Vector Labs), 제조업체 권장 농도로 8분 동안 ImmPACT DAB ㅍ퍼옥시다제 기질(Vector Labs)에 침지시키는 것으로 끝냈다. 각 단계 사이에 모든 조직을 PBST(0.1% Triton)를 사용하여 대략 15분 동안 세척하였다. 일련의 절편을 충전되지 않은 슬라이드에 장착하고 Permount Mounting Meduim를 사용하여 커버 슬립을 덮었다. 명시야 면역조직화학 염색된 슬라이드를 Axio Scan(Zeiss)에서 명시야 조명과 함께 20X 대물렌즈(0.8, M27)를 사용하여 스캔하였다.
도 8에 도시된 바와 같이, 이식되지 않은 Ube3a-/+ 마우스(HET)와 비교하여 Ube3a 벡터 형질도입된 세포가 이식된 Ube3a-/+ BGU 마우스의 뇌에서 Ube3a 발현의 유의한(p=0.0126) 증가가 관찰되었다. Ube3a 벡터 형질도입된 세포가 이식된 마우스의 뇌에서 Ube3a 발현의 수준은 WT 마우스의 발현 수준과 유사하였고 유의한 차이가 없었다(p=0.1923). Tukey의 다중 비교 검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다.
종합하면, 상기 데이터는 Ube3a 발현 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 인간 CD34+ HSC를 신생 Ube3a-+/BGU 마우스에 이식한 후 운동, 행동 및 인지 기능의 개선이 관찰되었고 WT 마우스와 유사하다는 것을 강력하게 입증한다. Ube3a 벡터 형질도입된 세포가 이식된 Ube3a-/+ 마우스에서도 정상적인 EEG 델타파가 관찰되었다. WT 마우스에서 관찰된 수준과 유사한 Ube3a의 발현이 Ube3a 벡터 형질도입된 세포가 이식된 Ube3a-/+ 마우스에서 검출되었다. 이러한 결과는 임상 AS 증상이 발병하기 전에 마우스의 삶의 초기에 치료 세포를 이식함으로써 AS 표현형이 Ube3a 발현의 회복으로 인해 예방될 수 있음을 입증한다. 이러한 결과는 또한 Ube3a 발현 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 인간 CD34+ HSC의 성공적인 생착 및 기능을 입증하는데, 이는 이들이 말초 혈액에서 검출될 수 있고 이식된 마우스의 뇌에서 Ube3a의 발현을 입증하기 때문이다.
실험 번호 3 - Ube3a 벡터 형질도입된 인간 CD34+ HSC의 생체내 안전성 및 다계통 조혈 및 시험관내 불멸화 분석
Ube3a 발현 렌티바이러스로의 인간 CD34+ HSC의 형질도입 및 후속적인 Ube3a의 과발현시, 이들 세포의 생체내 생착 및 다계통 조혈 가능성이 손상될 수 있다. 따라서, 인간 CD34+ HSC 생착 및 다계통 조혈을 모방할 수 있는 생체내 모델 시스템을 사용해야 한다. NOD-RAG1-/-IL2rg-/-(NRG) 면역결핍 마우스 모델이 인간 CD34+ HSC의 이러한 특성을 평가하는데 이상적이다. RAG1 및 IL2 감마 수용체 유전자의 결실로 인해, 이 모델은 비장, 흉선 및 골수를 포함한 림프 기관 및 말초 혈액에서 인간 CD34+ HSC의 생착 및 T 세포, B 세포 및 대식세포를 포함한 성숙한 인간 세포의 장기 발달을 허용한다. NRG 마우스의 이러한 특성으로 인해, 이 모델은 인간 CD34+ HSC에서 렌티바이러스 벡터 형질도입 및 Ube3a의 과발현의 안전성을 평가하는데 사용되었다.
NOD-RAG1-/-IL2rg-/-(NRG) 마우스(스톡 번호 007799)는 잭슨 연구소에서 입수하였다. (9) 2 내지 5일령 NRG 마우스에 100 rads를 준치사적으로 조사하고 비형질도입된(N=8), EGFP 대조군 벡터(도 1b) 형질도입된(N=8), 또는 hAS8 Ube3a 렌티바이러스 벡터 형질도입된(N=8)(N=8)(도 1d) (8ug/ml 프로타민 설페이트를 갖는 MOI 20) 인간 CD34+ HSC(총 세포 300,000개)를 이식하였다. 상기한 바와 같이, hAS8 벡터는 단백질 전체에 걸쳐 N-말단의 분비 신호 및 8개의 N-글리코실화 부위를 포함하도록 변형된 인간 Ube3a 이소형 1을 발현한다. 인간 Ube3a 이소형 1은 BGU 마우스 모델에서 전임상 연구에 사용된 마우스 Ube3a 이소형 3과 동등종이다. EGFP 리포터 유전자를 포함하는 벡터를 사용하여 Ube3a 벡터 형질도입된 세포를 비형질도입된 세포와 구별하고 유세포 분석이 수행될 때 이들 세포에 특이적으로 게이팅하였다. 이 게이팅 전략을 통해 본 출원인은 벡터 형질도입된 세포를 선별하고 분석된 다양한 면역 세포로의 발달 및 분화를 구체적으로 살펴볼 수 있었다. 생착 수준을 결정하기 위해, 이식 후 3개월에, 마우스를 꼬리 정맥을 통해 채혈하고 PE-CY7-접합된 항-인간 CD45 항체를 사용하여 유세포 분석에 의해 분석하였다. Beckman Coulter FC-500을 사용하여 유세포 분석을 수행하였다. 마우스는 기관 및 IACUC 지침에 따라 사용하였다. 성공적인 생착이 관찰되면, 다계통 조혈 및 림프 기관 생착을 평가하기 위해 안락사 전에 마우스를 또 다른 3개월(이식 후 총 6개월) 동안 방치하였다. 인간 T 세포 분석(CD3, CD4 및 CD8 세포 마커)은 혈액, 비장 및 흉선에서 수행하였다. 인간 B 세포 분석(CD19)은 비장 및 골수에서 수행하였다. 인간 대식세포(CD14) 분석은 골수에서 수행하였다. 인간 CD34+ 분석(CD34)은 골수에서 수행하였다. 비장, 흉선, 말초 혈액 및 골수로부터의 세포를 인간 면역 세포 마커에 특이적인 항체로 표지하고 유세포 분석으로 분석하였다. Beckman Coulter FC500을 사용하여 유세포 분석을 수행하였다. 세포를 초기에 벡터 형질도입된 세포를 식별하기 위해 EGFP에 게이팅한 다음 특정 세포 유형의 발달을 식별하기 위해 인간 세포 특이 마커에 대해 분석하였다.
분석 결과 hAS8 Ube3a 렌티바이러스 벡터 형질도입된 CD34+ 세포의 정상적인 생착 및 인간 T 세포의 발달이 생착된 NRG 마우스의 말초 혈액에서 입증되었음을 확인하였다. 도 9a에 도시된 바와 같이, EGFP-대조군 벡터 형질도입된 또는 비형질도입된 인간 CD34+ 세포와 비교하여 hAS8 벡터 형질도입된 인간 CD34+ 세포로부터의 CD3+/CD4+ T 세포, CD3+/CD8+ T 세포 또는 CD4+/CD8+ 이중 양성 T 세포의 발달에 있어서 유의한 차이(p>0.05)는 관찰되지 않았다. 분석된 모든 T 세포 집단의 유사한 수준이 모든 마우스 코호트의 말초 혈액에서 관찰되었다. 평균적으로, Ube3a 벡터 형질도입된 세포가 이식된 마우스는 비형질도입된 세포(CD3+/CD4+(72.1%), CD3+/CD8+(47.5%), 및 CD3+/CD4+/CD8+(19.6%)) 및 EGFP 단독 벡터 형질도입된 세포(CD3+/CD4+(68.2%), CD3+/CD8+(37.9%), 및 CD3+/CD4+/CD8+(13.1%))가 이식된 마우스와 비교하여 말초 혈액에서 CD3+/CD4+(76.1%), CD3+/CD8+(38.2%) 및 CD3+/CD4+/CD8+(24.4%) 수준을 나타내었다. 도 9b에 나타난 바와 같이, 말초혈액과 유사하게, EGFP-대조군 벡터 형질도입된 또는 비형질도입된 인간 CD34+ 세포와 비교하여 hAS8 벡터 형질도입된 인간 CD34+ 세포로부터 생착된 마우스의 비장에서 CD3+/CD4+ T 세포, CD3+/CD8+ T 세포, 또는 CD4+/CD8+ 이중 양성 T 세포의 발달에 있어 유의한 차이(p>0.05)는 관찰되지 않았다. 평균적으로, 비형질도입된 세포(CD3+/CD4+(67.8%), CD3+/CD8+(58.5%), 및 CD3+/CD4+/CD8+(26.4%)) 및 EGFP 단독 벡터 형질도입된 세포(CD3+/CD4+(57.9%), CD3+/CD8+(52.0%), 및 CD3+/CD4+/CD8+(19.1%))가 이식된 마우스와 비교하여 Ube3a 벡터 형질도입된 세포가 이식된 마우스는 비장에서 CD3+/CD4+(70.9%), CD3+/CD8+(46.3%) 및 CD3+/CD4+/CD8+(15.3%) 수준을 나타내었다. 다음으로 본 출원인은 생착된 마우스의 흉선에서 T 세포의 수준을 분석하였다. 도 9c에 도시된 바와 같이, EGFP-대조군 벡터 형질도입된 또는 비형질도입된 인간 CD34+ 세포와 비교하여 hAS8 벡터 형질도입된 인간 CD34+ 세포로부터 생착된 마우스의 흉선에서 CD3+/CD4+ T 세포, CD3+/CD8+ T 세포, 또는 CD4+/CD8+ 이중 양성 T 세포의 발달에 있어 유의한 차이(p>0.05)는 관찰되지 않았다. 평균적으로, 비형질도입된 세포(CD3+/CD4+(74.3%), CD3+/CD8+(53.6%), 및 CD3+/CD4+/CD8+(28.0%)) 및 EGFP 단독 벡터 형질도입된 세포(CD3+/CD4+(65.2%), CD3+/CD8+(57.1%), 및 CD3+/CD4+/CD8+(22.3%))가 이식된 마우스와 비교하여 Ube3a 벡터 형질도입된 세포가 이식된 마우스는 흉선에서 CD3+/CD4+(66.1%), CD3+/CD8+(54.4%) 및 CD3+/CD4+/CD8+(27.7%) 수준을 나타내었다. 이러한 결과는 hAS8 Ube3a 발현 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 인간 CD34+ HSC가 NRG 마우스에서 생착할 수 있었고 생착된 마우스의 말초 혈액, 비장 및 흉선에서 정상 T 세포로 분화할 수 있었음을 입증한다.
Ube3a 벡터 형질도입된 세포의 안전성을 평가하는 다음 단계로서, 생착된 NRG 마우스의 비장 및 골수에서 인간 B 세포 분석을 수행하였다. 도 10a에 도시된 바와 같이, EGFP-대조군 벡터 형질도입된 또는 비형질도입된 인간 CD34+ 세포와 비교하여 hAS8 벡터 형질도입된 인간 CD34+ 세포로부터 생착된 마우스의 비장에서 CD45+/CD19+ B 세포의 발달에 있어 유의한 차이(p>0.05)는 관찰되지 않았다. 평균적으로, 비형질도입된 세포(CD45+/CD19+(51.6%) 및 EGFP 단독 벡터 형질도입된 세포(CD45+/CD19+ (45.8%)가 이식된 마우스와 비교하여 Ube3a 벡터 형질도입된 세포가 이식된 마우스는 비장에서 CD45+/CD19+(38.5%) 수준을 나타내었다. 유사하게, 도 10b에 도시된 바와 같이, EGFP-대조군 벡터 형질도입된 또는 비형질도입된 인간 CD34+ 세포와 비교하여 hAS8 벡터 형질도입된 인간 CD34+ 세포로부터 생착된 마우스의 골수에서 CD45+/CD19+ B 세포의 발달에 있어 유의한 차이(p>0.05)는 관찰되지 않았다. 평균적으로, Ube3a 벡터 형질도입된 세포가 이식된 마우스는 비형질도입된 세포(CD45+/CD19+(47.9%) 및 EGFP 단독 벡터 형질도입된 세포(CD45+/CD19+, (39.8%)가 이식된 마우스와 비교하여 골수에서 CD45+/CD19+(32.6%) 수준을 나타내어TEk. 이러한 결과는 hAS8 Ube3a 발현 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 인간 CD34+ HSC가 NRG 마우스에서 생착할 수 있었고 생착된 마우스의 비장 및 골수에서 정상 B 세포로 분화할 수 있었음을 입증한다.
다음으로 본 출원인은 hAS8 Ube3a 벡터 형질도입된 세포가 이식된 NRG 마우스의 골수에 생착된 인간 대식세포 및 인간 CD34+ 세포의 수준을 평가하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, EGFP-대조군 벡터 형질도입된 또는 비형질도입된 인간 CD34+ 세포와 비교하여 hAS8 벡터 형질도입된 인간 CD34+ 세포로부터 생착된 마우스의 골수에서 CD45+/CD14+ 대식세포 또는 CD45+/CD34+ 세포의 발달에 있어 유의한 차이(p>0.05)는 관찰되지 않았다. 평균적으로, Ube3a 벡터 형질도입된 세포가 이식한 마우스는 비형질도입된 세포(CD45+/CD14+(24.5%) 및 CD45+/CD34+(13.0)) 및 EGFP 단독 벡터 형질도입된 세포(CD45+/CD14+ (14.6%) 및 CD45+/CD34+ (9.5))가 이식된 마우스에 비해 골수에서 CD45+/CD14+(19.2%) 수준 및 CD45+/CD34+(18.5%) 수준을 나타내었다. 이러한 결과는 hAS8 Ube3a 발현 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 인간 CD34+ HSC가 NRG 마우스에서 생착할 수 있었고 생착된 마우스의 골수에서 정상적인 대식세포로 분화할 수 있었음을 입증한다. 이러한 결과는 또한 Ube3a 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 인간 CD34+ 세포가 이식한지 6개월 후에도 생착된 마우스의 골수에 여전히 존재하였음을 입증한다.
시험관내 불멸화 분석
hAS8 Ube3a 발현 렌티바이러스 벡터로의 인간 CD34+ 세포의 형질도입 이 세포의 불멸화를 유발하는지 평가하기 위해, 시험관내 불멸화 분석을 수행하였다. 간단히 말해서, 인간 CD34+ 세포를 EGFP 단독 대조군 벡터, hAS8-GFP 벡터 또는 hAS8 렌티바이러스 벡터로 형질도입되지 않거나 형질도입된 상태로 두었다(도 1). 이들 세포를 10% FBS를 함유하고 50ng/ml SCF, Flt-3 리간드 및 TPO가 보충된 IMDM 배지에서 14일 동안 배양하였다. 세포 밀도를 3일마다 5x105개 세포/ml로 조정하였다. 이러한 확장 후, 세포를 100개 세포/ml의 밀도로 세포 그룹당 3x 96웰 플레이트에 플레이팅하고 14일 동안 방치하였다. 이어서 불멸화 빈도에 대해 웰을 계수하였다. 세포 그룹당 총 288개의 웰을 플레이팅하고 불멸화 빈도에 대해 계수하였다.
[표 1]
Ube3a 렌티바이러스 벡터 형질도입된 세포를 사용한 시험관내 불멸화 분석
Figure pct00001
실험 번호 4 - Ube3a 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 HSC로 성인 치료 후 HSC의 기능적 효능
Ube3a 렌티바이러스 벡터 형질도입된 인간 CD34+ HSC의 효능을 평가하는 다음 단계로, AS 표현형이 발달한 후 성체 BGU 마우스에 세포를 이식하였다. 성체 마우스를 평가하기 위해, AS 표현형이 이미 발달한 후 BGU의 연령인 4-5주령에 세포를 정맥내 이식하였다.
Ube3a 벡터 형질도입된 세포가 이식된 성체 BGU 마우스에서 AS 표현형의 기능적 구조
Ube3a 렌티바이러스 벡터의 출현 후 이들이 AS 표현형을 개선하는 능력을 평가하기 위해, mAS8 벡터 형질도입된 인간 CD34+ HSC를 성체 면역결핍 BGU 마우스에 이식하였다. 성체 마우스의 경우, 4-5주령에, 비형질도입된(NT) 또는 Ube3a(Ube3a-HET) 렌티바이러스 벡터 형질도입된 인간 CD34+ HSC 중 하나를 500,000개 총 세포/마우스로 정맥내 이식하기 48시간 및 24시간 전에 마우스를 20mg/kg 부설판으로 복강내 처리하였다. 이식 후 6주에, 마우스를 꼬리 정맥을 통해 채혈하고 마우스 항-인간 CD45 항체를 사용하여 유세포 분석에 의해 생착에 대해 분석하였다. 그후 성공적으로 생착된 마우스를 행동 표현형에 대해 평가하였다. 시험 순서 및 연령은 다음과 같았다: (1) 11-12주령에 개방 영역, (2) 11-12주령에 평균대 걷기, (3) 12-13주령에 로타로드, (4) 12-13주령에 digigait, (5) 14-15주령에 새로운 물체 인식.
개방 영역, 평균대 걷기, 로타로드, DigiGait, 및 새로운 물체 인식 분석을 위한 방법은 상기한 바와 같이 수행하였다.
시험 코호트
동일한 4개의 시험 코호트가 성인 효능 실험에 사용되었다: WT(Ube3a의 야생형 발현), HET(Ube3a 결핍 BGU 마우스), NT-HET(비형질도입된 인간 CD34+ HSC가 이식된 Ube3a 결핍 BGU 마우스), 및 Ube3a-HET(Ube3a 렌티바이러스 벡터 형질도입된 인간 CD34+ HSC가 이식된 Ube3a 결핍 BGU 마우스). 엔젤만 증후군 전임상 또는 임상 결과에서 성별 차이가 없었기 때문에 성별을 조합하였다.
비형질도입된 HSC(NT-Het) 또는 Ube3a 벡터 형질도입된(Ube3a-HET) 인간 CD34+ HSC로 처리된 성체 HET 마우스는 이식 후 6주에 행동 검사를 받았다. 본원에 개시된 바와 같은 신생아 연구와 유사하게, 본 출원인은 맞춤형 운동 행동 배터리의 다중 분석을 수행하였다.
새로운 개방 영역에서의 보행을 수집하여, 새로운 경기장에서 빔 브레이크를 사용하여 총 횡단 거리 및 수평 움직임을 평가하였다. 총 거리의 그룹 차이는 다중-요인 반복 측정 ANOVA(도 13c; F(3, 63) = 9.650, p < 0.0001)에 이어 Holm Sidak 사후 검정(p = 0.3465)을 사용하여 관찰하였다. 처리된 새끼에서와 같이, 성체 처리된 그룹에서, 다중 비교를 위해 Holm-Sidak을 보정하였으며 여전히 NT-HET(p < 0.0397) 및 HET(p < 0.0001) 둘 다는 WT와 상이한 반면 처리 그룹 Ube3a-HET은 WT와 상이하지 않다(p =0.3465)는 것을 분명히 강조하였다. 다중 비교를 위한 Holm-Sidak 보정된 사후 분석은 NT-HET(p < 0.0001) 및 HET(p < 0.0002) 둘 다는 WT와 상이한 반면 처리 그룹 Ube3a-HET는 WT와 상이하지 않다(p = 0.191)는 것을 강조하였다. Ube3a-처리된 HET는 30분 분석에 걸쳐 어떤 시점에서도 WT와 상이하지 않은 반면(0-5min, p = 0.0122, 6-10 min, p = 0.4324, 11-15min, p = 0.6395, 16-20min, p = >0.9999, 21-25min p = 0.5583, 26-30min p = 0.7356), Holm Sidak으로부터 조정된 p가 제공된 HET(0-5min, p < 0.0001, 6-10 min, p < 0.0001, 11-15min, p < 0.0001, 16-20min, p < 0.0067, 21-25min, p < 0.0002, 26-30min, p < 0.0059)는 6개의 5분 시간 간격(time bin) 중 4개에서 상이하였다. NT-HET는 6개의 5분 시간 간격 중 3개에서 상이하였다(0-5min, p < 0.0013, 6-10 min, p < 0.0316, 11-15min, p < 0.017, 16-20min, p = 0.7957, 21-25min, p = 0.1765, 26-30min, p = 0.7682).
확증을 위해, 수평 활동 수가 또한 다중-요인 반복 측정 ANOVA를 사용하여 그룹 차이를 예시하였다(도 13a; F (3, 61) = 11.78, p < 0.0001). 다중 비교를 위한 Holm-Sidak 보정된 사후 분석은 NT-HET(p < 0.0001) 및 HET(p < 0.0002) 둘 다가 WT와 상이한 반면 처리 그룹 Ube3a-HET는 WT와 상이하지 않음(p = 0.191)을 강조하였다. Ube3a-처리된 HET는 30분 분석에 걸쳐 어떤 시점에서도 WT와 상이하지 않은 반면(0-5min, p = 0.4383, 6-10 min, p = 0.3297, 11-15min, p = 0.0439, 16-20min, p = 0.2038, 21-25min p = 0.7833, 26-30min p = 2903), Holm Sidak으로부터 조정된 p가 제공된 HET(0-5min, p < 0.0001, 6-10 min, p < 0.0001, 11-15min, p < 0.0023, 16-20min, p < 0.0002, 21-25min, p < 0.0231, 26-30min, p < 0.0214)는 6개의 5분 시간 간격 중 5개에서 상이하며 NT-HET는 30분 과제의 5분 간격마다 상이하였다(0-5min, p < 0.0002, 6-10 min, p < 0.0001, 11-15min, p < 0.0001, 16-20min, p < 0.0003, 21-25min, p < 0.0103, 26-30min, p < 0.0001).
평균대 걷기 운동 과제는 새끼 코호트에서와 같이 수행하였으며, 모든 그룹은 예상한 바와 같이 막대 모양의 빔이 얇아지고 횡단하기가 더 어려워짐에 따라 막대 모양 평균대를 건너가는데 더 긴 대기 시간을 보여주었다(F(2, 124) = 11.73, p < 0.0001). 다중-요인 반복 측정 ANOVA를 사용한 그룹 차이(도 13d - 13e; F (3, 62) = 11.24, p < 0.0001). 놀랍게도, Ube3a 렌티벡터 형질도입된 인간 CD34+ HSC(Ube3a-HET)가 이식된 Ube3a-결핍 마우스는 Holm-Sidak 사후 분석을 통해 예시된 바와 같이 평균대에서 야생형 값의 수행능력을 나타내었다. Ube3a-처리된 HET는 막대 #3(rod#3, p = 0.9931)에서 WT와 상이하지 않은 반면 HET(p < 0.0164) 및 NT-HET(p < 0.0002)는 막대 #3를 건너기까지의 대기 시간이 훨씬 더 느리며, 이것은 처리된 그룹의 개선된 운동 협응을 강조한다. 도 13e는 막대를 가로지르는 시간으로는 서로 구별할 수 없기 때문에 WT와 Ube3a-HET를 강조하는 막대를 건너는 가장 빠른 그룹을 예시하며, 이것은 운동 협응의 상당한 개선을 강조한다.
로타로드, 확증 조정 분석에서, HET 마우스는 3일차(p < 0.05)에 가속 막대에서 떨어지기까지의 대기 시간이 WT와 상이하였으며(도 13f; F(3, 59) = 3.30, p < 0.05), 이것은 Ube3a-/+ HET 마우스의 좋지 못한 운동 협응 및 운동 학습의 부족을 예시한다. 두드러지게도, Ube3a 렌티벡터 형질도입된 인간 CD34+ HSC가 이식된 Ube3a-결핍 마우스는 Holm-Sidak 사후 분석을 사용한 모든 3일간의 시험(1일차 ; p = 0.9321), (2일차; p = 0.9691), 및 (3일차; p = 0.9514)에 걸쳐 야생형과 유사하였다. 그룹 사이는 다중-요인 ANOVA를 사용하여 검출하였다(도 20f; F (3, 65) = 5.782, p < 0.002). 도 13g에 도시된 바와 같이, DigiGait 분석은 HET(p < 0.0026) 및 NT-HET(p < 0.002)는 야생형과 상이한 반면 Ube3a-처리 HET 그룹은 이러한 넓은 자세의 축소를 보여주었음(p = 0.3486)을 입증하였다.
데이터는 Ube3a를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 인간 CD34+ HSC를 이식한지 6주 후의 도 14a 내지 14b에서 인지 행동 장애의 기능적 역전을 예시하였다. NOR 과제에 의해 측정된 바와 같은 인지 능력은 원하는 샘플 크기에 도달하기 위해 여러 독립적인 코호트에서 시험하였지만 표준 실험 설계를 최대화하기 위해 각 하위 코호트는 각 처리 그룹을 포함하였다. 모든 채점은 초기에 자동화된 Ethovision 소프트웨어에 의해 수행하였으며 유전자형 및 치료 그룹에 대해 블라인딩된 고도로 훈련된 관찰자의 수동 채점에 의해 확인하였다. 예상대로, WT는 친숙한 물체와 비교하여 새로운 물체를 조사하는데 더 많은 시간을 보냈다. 대조적으로, HET 및 NT-HET 그룹은 전형적인 새로운 물체 선호도를 나타내지 않았다(도 14a: WT; t (14) = 2.626, p < 0.0139; HET; t (16) = 0.1392, p > 0.8464; NT-HET; t (12) = 0.4597, p > 0.6553). 인상적으로, 본 출원인은 Ube3a-HET 처리된 그룹에서 인지 구제를 관찰하였다(도 23a: Ube3a-HET; t (14) = 3.271, p < 0.0026. 모든 그룹은 친숙화 단계 동안 2개의 동일한 물체를 유사하게 탐색하였다(도 14b: WT; t (14) = 0.3698, p = 0.7193; HET; t (16) = 0.2968, p = 0.8903; NT-HET; t (12) = 0.1331, p = 0.8952; Ube3a-HET; t (14) = 0.1392, p = 0.6488).
Ube3a 벡터 형질도입된 세포가 이식된 성체 Ube3a -/+ 마우스에서의 Ube3a의 발현
Ube3a 벡터 형질도입된 세포가 이식된 성체 Ube3a-/+ 마우스의 뇌에서 Ube3a가 발현되는지 여부를 평가하기 위해, DAB/항-Ube3a 항체 검출 분석을 수행하였다. 이 분석을 위한 방법은 위에 기술되어 있다. 도 15에 도시된 바와 같이, 각각 이식되지 않은 Ube3a-/+ 마우스(HET) 및 비형질도입된 세포가 이식된 Ube3a-/+ 마우스(NT-HET)와 비교하여 Ube3a 벡터 형질도입된 세포가 이식된 Ube3a-/+ 마우스(Ube3a-HET)의 뇌에서 Ube3a 발현의 유의한 증가(p=0.0058 및 p=0.0124)가 관찰되었다. Ube3a-HET 코호트에서의 Ube3a 발현 수준은 WT BGU 마우스에서의 발현 수준과 유사하였다(p=0.9867). Tukey의 다중 비교 검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다.
종합하면, 상기 데이터는 Ube3a 발현 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 인간 CD34+ HSC를 성체 Ube3a-/+ BGU 마우스에 정맥내 이식한 후, 이미 발달된 AS 표현형의 교정이 달성되었음을 강력하게 입증한다. Ube3a 발현 세포를 제공받은 마우스는 운동, 행동, 및 인지 기능이 WT 마우스와 유사한 수준으로 개선되었다. Ube3a-/+ 마우스의 뇌에서 Ube3a의 발현 수준은 또한 Ube3a 벡터 형질도입된 세포의 이식 후에 WT 수준으로 회복되었다. 이러한 결과는 AS 표현형이 발달된 후 치료 세포를 이식함으로써 이러한 표현형이 교정될 수 있음을 입증한다. 이러한 결과는 또한 Ube3a 발현 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 인간 CD34+ HSC의 성공적인 생착 및 기능을 입증하는데, 이는 이들이 말초 혈액에서 검출될 수 있고 정맥 경로를 통해 이식된 마우스의 뇌에서 Ube3a의 발현을 입증하기 때문이다.
실험 번호 5 - 임상
본 출원인은 또한 인간 CD34+ HSC의 형질도입 및 후속적인 Ube3a의 과발현이 CFU 분석에서 나타난 바와 같은 CD34+ 세포 기능, 생착 또는 정상 면역 세포로의 분화, 시험관내 유래된 표현형적으로 정상인 대식세포의 추가의 분화, 및 NRG 마우스에서 T 세포, B 세포 및 대식세포의 생체내 생착 및 추가 분화에 해로운 영향을 미치지 않았음을 입증하였다.
HSC 가동화 및 말초 줄기 세포 수집
모든 성분채집 절차에는 중심 정맥 카테터(CVC)의 삽입이 필요하다. 환자는 연속 5일간의 10mg/kg의 G-CSF의 피하 주사를 사용하여 줄기 세포 가동화를 받는다. 플레릭사포 240μg/kg/용량이 치료 의사의 재량에 기반하여 수집 결과를 개선하기 위해 허용되며 성분채집 시작 4-6시간 전에 투여된다. 수집 동안의 일상적인 모니터링, 환자 지지 치료, 활력 징후 및 CBC 모니터링은 기관 지침을 따른다. 수집 당일, 대상체는 수집 5시간 전에 플레릭사포(240μg/kg)의 피하 주사를 제공받는다.
대상체는 적절한 세포 용량을 달성하기 위해 최대 2회의 가동화 주기를 겪을 수 있다. HSPC 수확을 용이하게 하기 위해 임시 성분채집 카테터의 삽입이 강력하게 권장된다.
의약품 세포 용량은 각 대상체에 대해 다음으로부터 선택되며 모든 q방출 기준을 충족한다: 적어도 약 1 x 104개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 2 x 104개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 3 x 104개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 4 x 104개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 5 x 104개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 6 x 104개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 7 x 104개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 8 x 104개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 9 x 104개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 1 x 105개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 2 x 105개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 3 x 105개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 4 x 105개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 5 x 105개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 6 x 105개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 7 x 105개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 8 x 105개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 9 x 105개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 1 x 106개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 2 x 106개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 3 x 106개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 4 x 106개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 5 x 106개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 6 x 106개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 7 x 106개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 8 x 106개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 9 x 106개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 1 x 107개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 2 x 107개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 3 x 107개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 4 x 107개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 5 x 107개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 6 x 107개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 7 x 107개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 8 x 107개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 9 x 107개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 1 x 108개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 2 x 108개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 3 x 108개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 4 x 108개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 5 x 108개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 6 x 108개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 7 x 108개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 8 x 108개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 9 x 108개 CD34+ 세포/kg, 또는 적어도 약 1 x 109개 CD34+ 세포/kg 체중.
HSC 용량
일부 실시양태에서, 용량은 1 x 109개 미만, 또는 9 x 108개 미만, 또는 8 x 108개 미만, 또는 7 x 108개 미만, 또는 6 x 108개 미만, 또는 5 x 108개 미만, 또는 4 x 108개 미만, 또는 3 x 108개 미만, 또는 2 x 108개 미만, 또는 1 x 108개 미만, 또는 9 x 107개 미만, 또는 8 x 107개 미만, 또는 7 x 107개 미만, 또는 6 x 107개 미만, 또는 5 x 107개 미만, 또는 4 x 107개 미만, 또는 3 x 107개 미만, 또는 2 x 107개 미만, 또는 1 x 107개 미만, 또는 9 x 106개 미만, 또는 8 x 106개 미만, 또는 7 x 106개 미만, 또는 6 x 106개 미만, 또는 5 x 106개 미만, 또는 4 x 106개 미만, 또는 3 x 106개 미만, 또는 2 x 106개 미만, 또는 1 x 106개 미만, 또는 9 x 105개 미만, 또는 8 x 105개 미만, 또는 7 x 105개 미만, 또는 6 x 105개 미만, 또는 5 x 105개 미만, 또는 4 x 105개 미만, 또는 3 x 105개 미만, 또는 2 x 105개 미만, 또는 1 x 105개 미만 CD34+ HSC/kg 체중이다.
일부 실시양태에서, 용량은 1 x 109개 미만, 또는 9 x 108개 미만, 또는 8 x 108개 미만, 또는 7 x 108개 미만, 또는 6 x 108개 미만, 또는 5 x 108개 미만, 또는 4 x 108개 미만, 또는 3 x 108개 미만, 또는 2 x 108개 미만, 또는 1 x 108개 미만, 또는 9 x 107개 미만, 또는 8 x 107개 미만, 또는 7 x 107개 미만, 또는 6 x 107개 미만, 또는 5 x 107개 미만, 또는 4 x 107개 미만, 또는 3 x 107개 미만, 또는 2 x 107개 미만, 또는 1 x 107개 미만, 또는 9 x 106개 미만, 또는 8 x 106개 미만, 또는 7 x 106개 미만, 또는 6 x 106개 미만, 또는 5 x 106개 미만, 또는 4 x 106개 미만, 또는 3 x 106개 미만, 또는 2 x 106개 미만, 또는 1 x 106개 미만, 또는 9 x 105개 미만, 또는 8 x 105개 미만, 또는 7 x 105개 미만, 또는 6 x 105개 미만, 또는 5 x 105개 미만, 또는 4 x 105개 미만, 또는 3 x 105개 미만, 또는 2 x 105개 미만, 또는 1 x 105개 미만 유전자 변형된 CD34+/kg 체중이다.
세포는 IV 부설판 또는 근절제 요법(myoablative therapy)의 최종 투여 후 72 내지 84시간 사이에 투여될 수 있다.
치료
표 2에 기술된 예비 섭생(preparative regimen)은 치료 프로토콜의 예시이다.
[표 2]
Figure pct00002
* BU 약동학은 경로당 1차 및 3차 투여 후에 수행된다. 매일 투여를 위해, 0600에 시작되는 3시간 주입이 기준 현장에서 BU PK 연구를 위한 혈장 샘플의 배송을 가능하게 한다. 샘플은 3시간 주입 말기에, 주입 종료 후 15분, 1시간, 2시간 및 4시간 후에 수득된다.
감염 예방
환자는 감염 예방 및 영양 지원을 받을 수 있다. 감염 예방은 세균, 단순 포진, CMV, HHV-6, EBV, 폐포자충(Pneumocystis jiroveci) 및 진균 감염의 위험을 줄이기 위한 제제 또는 전략(예를 들어, PCR 스크리닝 및 선제 요법)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
유치 중심 정맥 카테터
이중 내강 중심 정맥 카테터는 성분채집시 삽입될 수 있으며 IV 약물 투여, 혈액 제제 수혈 및 줄기 세포 투여를 위해 이식 동안 삽입된 상태를 유지할 수 있다. 이러한 카테터는 임상적으로 지시된 대로 제거 및 교체될 수 있다. 그러나, 이식편은 중심선을 통해 주입해야 한다.
이식을 위한 예비 섭생
환자는 정맥내(IV) 부설판으로 골수소멸성 조건화 요법을 받을 수 있다. 4일 동안 1일 1회 3.2mg/kg의 단일 제제 부설판을 골수소멸성 조건화 섭생으로서 중심 정맥 카테터를 통해 정맥내 투여한다. 이러한 섭생은 성공적인 생착 및 허용 가능한 독성으로 다중 유전자 요법 줄기 세포 이식 시험에 사용되었다.
예시적인 이식 일정이 아래에 제공되어 있다:
1. -5 내지 -3일에 단일 약제 부설판.
2. 유전자 변형 조혈 줄기 세포는 동결되어 있다면 해동시키고 부설판의 마지막 투여 후 적어도 72시간에 0일째에 주입된다.
3. 예비 조혈 줄기 세포는 ANC <500인 환자에서는 30일 이후에, ANC <500 및 생명을 위협하는 합병증이 있는 환자에서는 20일 이후에 주입될 수 있다.
등가물
본 발명이 상기 실시양태와 관련하여 기술되었지만, 상기 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하지 않고 예시하기 위한 것임을 이해해야 한다. 본 발명의 범위 내의 다른 측면, 이점 및 수정은 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자들에게 명백할 것이다.
본 개시내용이 특정 실시양태 및 임의의 특징에 의해 구체적으로 개시되었지만, 당업계의 숙련가들은 본원에 개시된 실시양태의 수정, 개선 및 변형에 의지할 수 있으며, 이러한 수정, 개선 및 변형은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 간주된다고 이해해야 한다. 본원에 제공된 재료, 방법 및 실시예는 특정 실시양태를 대표하고, 예시적이며, 본 개시내용의 범위에 대한 제한으로 의도되지 않는다.
본 개시내용의 범위는 본원에 광범위하고 일반적으로 기술되었다. 일반적인 개시내용에 속하는 보다 좁은 종 및 아속 그룹 각각이 또한 개시내용의 일부를 형성한다. 이것은 삭제된 자료가 본원에 구체적으로 인용되었는지 여부에 관계없이 속에서 임의의 주제를 제거하는 단서 또는 부정적인 제한이 있는 일반적인 설명을 포함한다.
또한, 본 발명의 특징 또는 측면이 마쿠쉬 그룹의 관점에서 기술되는경우, 당업계의 숙련가들은 본 발명이 마쿠쉬 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위그룹의 관점에서도 기술된다는 것을 인식할 것이다.
본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 각각이 개별적으로 참고로 포함된 것과 동일한 정도로 전문이 참고로 명시적으로 포함된다. 충돌하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다.
참고문헌
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
서열 목록
서열 번호 1, CMV 프로모터 서열 1:
Figure pct00006
서열 번호 2, CMV 프로모터 서열 2:
Figure pct00007
서열 번호 3, MNDU3 프로모터
Figure pct00008
서열 번호 4, PGK 프로모터
Figure pct00009
서열 번호 5, MNDU 프로모터 서열:
Figure pct00010
서열 번호 6, EF1 알파 프로모터 서열:
Figure pct00011
서열 번호 7, WT 인간 Ube3a 이소형 1
Figure pct00012
Figure pct00013
서열 번호 8, WT 인간 Ube3a 이소형 1 aa 서열
Figure pct00014
서열 번호 9, WT 인간 Ube3a 이소형 2
Figure pct00015
Figure pct00016
서열 번호 10, WT 인간 Ube3a 이소형 2 aa 서열
Figure pct00017
서열 번호 11, WT 인간 Ube3a 이소형 3
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
서열 번호 12, WT 인간 Ube3a 이소형 3 aa 서열
Figure pct00021
변형된 인간 이소형 #1
뉴클레오티드 위치 190, 293, 310, 661, 662, 1066, 1067, 1771, 1773, 1870, 1871, 2413, 2414, 2417, 및 2418
AA 위치 64, 98, 104, 221, 356, 591, 624, 805, 및 806
서열 번호 13, 8x N-글리칸 부위 (볼드체) 및 IL2 분비 신호 (밑줄)를 갖는 인간 Ube3a 이소형 1. 볼드체의 대문자 글꼴은 글리코실화 부위를 생성하기 위한 돌연변이의 예를 제공한다.
Figure pct00022
Figure pct00023
서열 번호 14, 8x N-글리칸 부위 (볼드체) 및 IL2 분비 서열 (밑줄친 처음 20개 아미노산) aa 서열을 갖는 인간 Ube3a 이소형 1. 이탤릭체는 글리코실화를 위한 돌연변이된 부위이다.
Figure pct00024
변형된 인간 이소형 #2
뉴클레오티드 위치 259, 362, 379, 730, 731, 1135, 1136, 1840, 1842, 1939, 1940, 2482, 2483, 2486, 및 2487
AA 위치 87, 121, 127, 244, 379, 614, 647, 828, 및 829
서열 번호 15, 8x N-글리칸 부위 (볼드체) 및 IL2 분비 신호 (밀줄)를 갖는 인간 Ube3a 이소형 2. 볼드체의 대문자 글꼴은 글리코실화 부위를 생성하기 위한 돌연변이의 예를 제공한다.
Figure pct00025
Figure pct00026
서열 번호 16, 8x N-글리칸 부위 (볼드체) 및 IL2 분비 신호 (밑줄) aa 서열을 갖는 인간 Ube3a 이소형 2
Figure pct00027
변형된 인간 이소형 #3
뉴클레오티드 위치 250, 353, 370, 721, 722, 1126, 1127, 1831, 1833, 1930, 1931, 2473, 2474, 2477, 및 2478
AA 위치 84, 118, 124, 241, 376, 611, 644, 825, 및 826
서열 번호 17, 8x N-글리칸 부위 (볼드체) 및 IL2 분비 신호 (밑줄)를 갖는 인간 Ube3a 이소형 3. 볼드체의 대문자 글꼴은 글리코실화 부위를 생성하기 위한 돌연변이의 예를 제공한다.
Figure pct00028
Figure pct00029
서열 번호 18, 8x N-글리칸 부위 (볼드체) 및 IL2 분비 신호 (밑줄) aa 서열을 갖는 인간 Ube3a 이소형 3
Figure pct00030
서열 번호 19, WT 마우스 Ube3a 이소형 1
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
서열 번호 20, WT 마우스 Ube3a 이소형 1 aa 서열
Figure pct00034
서열 번호 21, WT 마우스 Ube3a 이소형 2
Figure pct00035
Figure pct00036
서열 번호 22, WT 마우스 Ube3a 이소형 2 aa 서열
Figure pct00037
서열 번호 23, WT 마우스 Ube3a 이소형 3
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
서열 번호 24, WT 마우스 Ube3a 이소형 3 aa 서열
Figure pct00041
변형된 마우스 이소형 #1
뉴클레오티드 위치 253, 356, 373, 715, 716, 1120, 1121, 1825, 1827, 1828, 1829, 1924, 1925, 2467, 및 2468
AA 위치 85, 119, 125, 239, 374, 609, 610, 642, 및 823
서열 번호 25, 8x N-글리칸 부위 (볼드체) 및 분비 신호 (밑줄)를 갖는 마우스 Ube3a 이소형 1. 볼드체의 대문자 글꼴은 글리코실화 부위를 생성하기 위한 돌연변이의 예를 제공한다.
Figure pct00042
Figure pct00043
서열 번호 26, 8x N-글리칸 부위 (볼드체) 및 분비 신호 (밑줄) aa 서열을 갖는 마우스 Ube3a 이소형 1
Figure pct00044
변형된 마우스 이소형 #2
뉴클레오티드 위치 253, 356, 373, 715, 716, 1120, 1121, 1825, 1827, 1828, 1829, 1924, 1925, 2467, 및 2468
AA 위치 85, 119, 125, 239, 374, 609, 610, 642, 및 823
서열 번호 27, 8x N-글리칸 부위 (볼드체) 및 분비 신호 (밑줄)를 갖는 마우스 Ube3a 이소형 2. 볼드체의 대문자 글꼴은 글리코실화 부위를 생성하기 위한 돌연변이의 예를 제공한다.
Figure pct00045
Figure pct00046
서열 번호 28, 8x N-글리칸 부위 (볼드체) 및 분비 신호 (밑줄) aa 서열을 갖는 마우스 Ube3a 이소형 2
Figure pct00047
Figure pct00048
변형된 마우스 이소형 #3
뉴클레오티드 위치 190, 293, 310, 652, 653, 1057, 1058, 1762, 1764, 1765, 1766, 1861, 1862, 2404, 및 2405
AA 위치 64, 98, 104, 218, 353, 588, 589, 621, 및 802
서열 번호 29, 8x N-글리칸 부위 (볼드체) 및 분비 신호 (밑줄)를 갖는 마우스 Ube3a 이소형 3. 볼드체의 대문자 글꼴은 글리코실화 부위를 생성하기 위한 돌연변이의 예를 제공한다.
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
서열 번호 30, 8x N-글리칸 부위 (볼드체) 및 분비 신호 (밑줄) aa 서열을 갖는 마우스 Ube3a 이소형 3
Figure pct00052
서열 번호 31, 대문자 ATG로 시작하여 대문자 TAA로 끝나는 야생형 Ube3a CDS (즉, 서열 번호 7)을 포함하고 NCBI 참조 번호 NM_001354506을 갖는, 호모 사피엔스 유비퀴틴 단백질 리가제 E3A (UBE3A)의 단편, 전사체 변이체 5인 도 16A에 도시된 뉴클레오티드 서열. 다른 대문자 뉴클레오티드 잔기는 글리코실화 부위를 생성하기 위한 잠재적인 돌연변이 부위를 제공한다.
Figure pct00053
Figure pct00054
서열 번호 32, 서열 번호 8의 야생형 Ube3a 단백질을 포함하는 도 16A에 도시된 아미노산 서열. 비-대문자 글꼴은 NetNGlyC 예측된 N-글리코실화 부위를 나타낸다 (도 16A에 82,579,700,719로 표시되어 서열 번호 8에 글리코실화 부위의 시작의 잔기 번호로서 제공됨). 볼드체 글꼴은 본원에 확인된 바와 같은 돌연변이에 의해 생성될 수 있는 몇 가지 잠재적인 글리코실화 부위를 제공한다. 이탤릭체 글꼴은 두 개의 아미노산이 S 또는 T 앞에 오는 돌연변이에 의해 생성될 수 있는 잠재적인 글리코실화 부위를 나타낸다. 밑줄은 두 개의 아미노산이 N 다음에 오는 돌연변이에 의해 생성될 수 있는 잠재적인 글리코실화 부위를 나타낸다.
Figure pct00055
서열 번호 33, 도 16A에 도시된 아미노산 서열.
Figure pct00056
서열 번호 34, CMV 프로모터 서열 3.
Figure pct00057
서열 번호 35, CCLc-MNDU3-X 벡터, 여기서 서열 변호 34의 CMV 프로모터는 볼드체, 이탤릭체 및 대문자 글꼴로 표시되며 서열 번호 3의 MNDU3 프로모터는 볼드체, 이탤릭체 및 비-대문자 글꼴로 표시된다.
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060

Claims (89)

  1. 하나 이상의 자연 발생 또는 비-자연 발생 글리코실화 부위를 포함하는 유비퀴틴 단백질 리가제(Ubiquitin Protein Ligase) E3A(Ube3a) 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이의 생물학적 등가물을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 글리코실화가 N-연결된 글리코실화이고, 글리코실화 부위가 NXaaT 또는 NXaaS의 컨센서스 서열(consensus sequence)을 포함하며, 여기서 Xaa가 임의로 프롤린(P)을 제외한 임의의 아미노산 잔기인 재조합 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 글리코실화 부위가 하기로부터 선택된 것들 중 하나 이상에 상응하는 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 등가물의 아미노산(aa) 위치에 있고:
    서열 번호 14의 aa62 내지 aa64, 서열 번호 14의 aa96 내지 aa98, 서열 번호 14의 aa102 내지 aa104, 서열 번호 14의 aa219 내지 aa221, 서열 번호 14의 aa354 내지 aa356, 서열 번호 14의 aa591 내지 aa 593, 서열 번호 14의 aa622 내지 aa624, 서열 번호 14의 aa 805 내지 aa 807;
    서열 번호 16의 aa85 내지 aa87, 서열 번호 16의 aa119 내지 aa121, 서열 번호 16의 aa125 내지 aa127, 서열 번호 16의 aa242 내지 aa244, 서열 번호 16의 aa377 내지 aa379, 서열 번호 16의 aa614 내지 aa616, 서열 번호 16의 aa645 내지 aa647, 서열 번호 16의 aa828 내지 aa830;
    서열 번호 18의 aa82 내지 aa84, 서열 번호 18의 aa116 내지 aa118, 서열 번호 18의 aa 122 내지 aa124, 서열 번호 18의 aa239 내지 aa241, 서열 번호 18의 aa374 내지 aa376, 서열 번호 18의 aa611 내지 aa613, 서열 번호 18의 aa642 내지 aa644, 서열 번호 18의 aa825 내지 aa827;
    서열 번호 26 또는 28의 aa83 내지 aa85, 서열 번호 26 또는 28의 aa117 내지 aa119, 서열 번호 26 또는 28의 aa123 내지 aa125, 서열 번호 26 또는 28의 aa 237 내지 aa239, 서열 번호 26 또는 28의 aa372 내지 aa374, 서열 번호 26 또는 28의 aa609 내지 aa 611, 서열 번호 26 또는 28의 aa640 내지 aa642, 서열 번호 26 또는 28의 aa823 내지 aa825;
    서열 번호 30의 aa62 내지 aa64, 서열 번호 30의 aa96 내지 aa98, 서열 번호 30의 aa102 내지 aa104, 서열 번호 30의 aa216 내지 aa218, 서열 번호 30의 aa351 내지 aa353, 서열 번호 30의 aa588 내지 aa590, 서열 번호 30의 aa619 내지 aa621, 또는 서열 번호 30의 aa802 내지 aa804,
    임의로 여기서, 적어도 하나의 글리코실화 부위에서 임의의 하나 또는 임의의 2개 또는 모든 3개의 아미노산 잔기(들)가 야생형 Ube3a 폴리펩티드 또는 단백질에 비해 돌연변이되어 글리코실화 부위를 구성하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물이 하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에서 확인된 바와 같은 8개의 아미노산(aa) 위치에 상응하는 aa 위치에 8개의 글리코실화 부위를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드:
    (a) 서열 번호 14의 aa62 내지 aa64, 서열 번호 14의 aa96 내지 aa98, 서열 번호 14의 aa102 내지 aa104, 서열 번호 14의 aa219 내지 aa221, 서열 번호 14의 aa354 내지 aa356, 서열 번호 14의 aa591 내지 aa 593, 서열 번호 14의 aa622 내지 aa624, 서열 번호 14의 aa 805 내지 aa 807;
    (b) 서열 번호 16의 aa85 내지 aa87, 서열 번호 16의 aa119 내지 aa121, 서열 번호 16의 aa125 내지 aa127, 서열 번호 16의 aa242 내지 aa244, 서열 번호 16의 aa377 내지 aa379, 서열 번호 16의 aa614 내지 aa616, 서열 번호 16의 aa645 내지 aa647, 서열 번호 16의 aa828 내지 aa830;
    (c) 서열 번호 18의 aa82 내지 aa84, 서열 번호 18의 aa116 내지 aa118, 서열 번호 18의 aa 122 내지 aa124, 서열 번호 18의 aa239 내지 aa241, 서열 번호 18의 aa374 내지 aa376, 서열 번호 18의 aa611 내지 aa613, 서열 번호 18의 aa642 내지 aa644, 서열 번호 18의 aa825 내지 aa827;
    (d) 서열 번호 26 또는 28의 aa83 내지 aa85, 서열 번호 26 또는 28의 aa117 내지 aa119, 서열 번호 26 또는 28의 aa123 내지 aa125, 서열 번호 26 또는 28의 aa 237 내지 aa239, 서열 번호 26 또는 28의 aa372 내지 aa374, 서열 번호 26 또는 28의 aa609 내지 aa 611, 서열 번호 26 또는 28의 aa640 내지 aa642, 서열 번호 26 또는 28의 aa823 내지 aa825;
    (e) 서열 번호 30의 aa62 내지 aa64, 서열 번호 30의 aa96 내지 aa98, 서열 번호 30의 aa102 내지 aa104, 서열 번호 30의 aa216 내지 aa218, 서열 번호 30의 aa351 내지 aa353, 서열 번호 30의 aa588 내지 aa590, 서열 번호 30의 aa619 내지 aa621, 또는 서열 번호 30의 aa802 내지 aa804.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물이 다음으로부터 선택된 것들 중 하나 이상에 상응하는 aa 위치(들)에 돌연변이된 아미노산 잔기(들) 중 하나 이상을 포함함으로써 글리코실화 부위(들) 중 하나 이상을 형성하는 재조합 폴리뉴클레오티드:
    서열 번호 14의 aa64, 서열 번호 14의 aa98, 서열 번호 14의 aa104, 서열 번호 14의 aa221, 서열 번호 14의 aa356, 서열 번호 14의 aa591, 서열 번호 14의 aa624, 서열 번호 14의 aa 805, 서열 번호 14의 aa 806;
    서열 번호 16의 aa87, 서열 번호 16의 aa121, 서열 번호 16의 aa127, 서열 번호 16의 aa244, 서열 번호 16의 aa379, 서열 번호 16의 aa614, 서열 번호 16의 aa647, 서열 번호 16의 aa828, 서열 번호 16의 aa829;
    서열 번호 18의 aa84, 서열 번호 18의 aa118, 서열 번호 18의 aa124, 서열 번호 18의 aa241, 서열 번호 18의 aa376, 서열 번호 18의 aa611, 서열 번호 18의 aa644, 서열 번호 18의 aa825, 서열 번호 18의 aa826;
    서열 번호 26 또는 28의 aa85, 서열 번호 26 또는 28의 aa119, 서열 번호 26 또는 28의 aa125, 서열 번호 26 또는 28의 aa239, 서열 번호 26 또는 28의 aa374, 서열 번호 26 또는 28의 aa609, 서열 번호 26 또는 28의 aa610, 서열 번호 26 또는 28의 aa642, 서열 번호 26 또는 28의 aa823;
    서열 번호 30의 aa64, 서열 번호 30의 aa98, 서열 번호 30의 aa104, 서열 번호 30의 aa218, 서열 번호 30의 aa353, 서열 번호 30의 aa5880, 서열 번호 30의 aa589, 서열 번호 30의 aa621, 또는 서열 번호 30의 aa802.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물이 하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에서 확인된 것들에 상응하는 aa 위치에 9개의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함함으로써 8개의 글리코실화 부위를 형성하는 재조합 폴리뉴클레오티드:
    (a) 서열 번호 14의 aa64, 서열 번호 14의 aa98, 서열 번호 14의 aa104, 서열 번호 14의 aa221, 서열 번호 14의 aa356, 서열 번호 14의 aa591, 서열 번호 14의 aa624, 서열 번호 14의 aa 805, 및 서열 번호 14의 aa 806;
    (b) 서열 번호 16의 aa87, 서열 번호 16의 aa121, 서열 번호 16의 aa127, 서열 번호 16의 aa244, 서열 번호 16의 aa379, 서열 번호 16의 aa614, 서열 번호 16의 aa647, 서열 번호 16의 aa828, 및 서열 번호 16의 aa829;
    (c) 서열 번호 18의 aa84, 서열 번호 18의 aa118, 서열 번호 18의 aa124, 서열 번호 18의 aa241, 서열 번호 18의 aa376, 서열 번호 18의 aa611, 서열 번호 18의 aa644, 서열 번호 18의 aa825, 및 서열 번호 18의 aa826;
    (d) 서열 번호 26 또는 28의 aa85, 서열 번호 26 또는 28의 aa119, 서열 번호 26 또는 28의 aa125, 서열 번호 26 또는 28의 aa239, 서열 번호 26 또는 28의 aa374, 서열 번호 26 또는 28의 aa609, 서열 번호 26 또는 28의 aa610, 서열 번호 26 또는 28의 aa642, 및 서열 번호 26 또는 28의 aa823; 또는
    (e) 서열 번호 30의 aa64, 서열 번호 30의 aa98, 서열 번호 30의 aa104, 서열 번호 30의 aa218, 서열 번호 30의 aa353, 서열 번호 30의 aa588, 서열 번호 30의 aa589, 서열 번호 30의 aa621, 및 서열 번호 30의 aa802.
  7. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물이 하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에서 확인된 것에 상응하는 aa 위치에 8개의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함함으로써 7개의 글리코실화 부위를 형성하는 재조합 폴리뉴클레오티드:
    (a) 서열 번호 14의 aa64, 서열 번호 14의 aa98, 서열 번호 14의 aa221, 서열 번호 14의 aa356, 서열 번호 14의 aa591, 서열 번호 14의 aa624, 서열 번호 14의 aa 805, 및 서열 번호 14의 aa 806;
    (b) 서열 번호 16의 aa87, 서열 번호 16의 aa121, 서열 번호 16의 aa244, 서열 번호 16의 aa379, 서열 번호 16의 aa614, 서열 번호 16의 aa647, 서열 번호 16의 aa828, 및 서열 번호 16의 aa829;
    (c) 서열 번호 18의 aa84, 서열 번호 18의 aa118, 서열 번호 18의 aa241, 서열 번호 18의 aa376, 서열 번호 18의 aa611, 서열 번호 18의 aa644, 서열 번호 18의 aa825, 및 서열 번호 18의 aa826;
    (d) 서열 번호 26 또는 28의 aa85, 서열 번호 26 또는 28의 aa119, 서열 번호 26 또는 28의 aa239, 서열 번호 26 또는 28의 aa374, 서열 번호 26 또는 28의 aa609, 서열 번호 26 또는 28의 aa610, 서열 번호 26 또는 28의 aa642, 및 서열 번호 26 또는 28의 aa823; 또는
    (e) 서열 번호 30의 aa64, 서열 번호 30의 aa98, 서열 번호 30의 aa218, 서열 번호 30의 aa353, 서열 번호 30의 aa588, 서열 번호 30의 aa589, 서열 번호 30의 aa621, 및 서열 번호 30의 aa802.
  8. 제5항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 형성된 글리코실화 부위가 NXaaT 또는 NXaaS의 컨센서스 서열을 포함하고, 여기서 Xaa가 임의로 프롤린(P)을 제외한 임의의 아미노산 잔기인 재조합 폴리뉴클레오티드.
  9. 제5항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이된 아미노산 잔기(들)가 다음 중의 하나 이상으로부터 선택되는 재조합 폴리뉴클레오티드:
    서열 번호 14의 aa64에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 14의 aa98에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 14의 aa104에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 14의 aa221에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 14의 aa356에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 14의 aa591에 상응하는 aa 위치에 N, 서열 번호 14의 aa624에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 14의 aa 805에 상응하는 aa 위치에 N, 및 서열 번호 14의 aa 806에 상응하는 aa 위치에 N;
    서열 번호 16의 aa87에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 16의 aa121에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 16의 aa127에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 16의 aa244에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 16의 aa379에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 16의 aa614에 상응하는 aa 위치에 N, 서열 번호 16의 aa647에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 16의 aa828에 상응하는 aa 위치에 N, 및 서열 번호 16의 aa829에 상응하는 aa 위치에 N;
    서열 번호 18의 aa84에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 18의 aa118에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 18의 aa124에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 18의 aa241에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 18의 aa376에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 18의 aa611에 상응하는 aa 위치에 N, 서열 번호 18의 aa644에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 18의 aa825에 상응하는 aa 위치에 N, 및 서열 번호 18의 aa826에 상응하는 aa 위치에 N;
    서열 번호 26 또는 28의 aa85에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 26 또는 28의 aa119에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 26 또는 28의 aa125에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 26 또는 28의 aa239에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 26 또는 28의 aa374에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 26 또는 28의 aa609에 상응하는 aa 위치에 N, 서열 번호 26 또는 28의 aa610에 상응하는 aa 위치에 N, 서열 번호 26 또는 28의 aa642에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 및 서열 번호 26 또는 28의 aa823에 상응하는 aa 위치에 N; 또는
    서열 번호 30의 aa64에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 30의 aa98에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 30의 aa104에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 30의 aa218에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 30의 aa353에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 30의 aa588에 상응하는 aa 위치에 N, 서열 번호 30의 aa589에 상응하는 aa 위치에 N, 서열 번호 30의 aa621에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 및 서열 번호 30의 aa802에 상응하는 aa 위치에 N.
  10. 제1항 내지 제6항, 제8항 및 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물이 하나?坪鵑瓚? 비-자연 발생 글리코실화 부위를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물이 다음으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드:
    서열 번호 14의 aa21 내지 aa 872, 서열 번호 16의 aa21 내지 aa 895, 서열 번호 18의 aa21 내지 aa 892, 서열 번호 26의 aa21 내지 aa 890, 서열 번호 28의 aa21 내지 aa 890, 서열 번호 30의 aa21 내지 aa 869, 또는 이의 각각에 대해 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 동일성(identity)을 갖는 서열.
  12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  13. 제12항에 있어서, 상기 신호 펩티드가 분비 신호인 재조합 폴리뉴클레오티드.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 다음으로부터 선택된 신호 펩티드 또는 분비(secretion) 신호를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드: 항체 중쇄/경쇄 분비 신호, 쌍-아르기닌 수송 단백질(twin-arginine transport protein) 분비 신호, 인터루킨-2(IL2) 분비 신호, 인터루킨-4(IL4) 분비 신호, 인터루킨-10(IL10) 분비 신호, 인터루킨-3(IL3) 분비 신호, 인터루킨-7(IL7) 분비 신호, 인간 IL2 분비 신호, 인간 OSM 분비 신호, VSV-G 분비 신호, 마우스 Ig 카파 분비 신호, 인간 IgG2 H 분비 신호, BM40 분비 신호, 세크레콘(Secrecon) 분비 신호, 인간 IgKVIII 분비 신호, CD33 분비 신호, tPA 분비 신호, 인간 키모트립시노겐 분비 신호, 인간 트립시노겐-2 분비 신호, 가우스 luc 분비 신호, 알부민(HSA) 분비 신호, 인플루엔자 혈구응집소 분비 신호, 인간 인슐린 분비 신호, 또는 누에 피브로인 LC.
  15. 제12항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 신호 펩티드 또는 분비 신호가 서열 번호 14의 aa1 내지 aa20의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  16. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물이 서열 번호 14, 16, 18, 26, 28 및 30 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이들 각각에 대해 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  17. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 다음 중 어느 하나로부터 선택된 뉴클레오티드(nt) 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드:
    서열 번호 13의 nt 61 내지 nt 2619, 서열 번호 15의 nt 61 내지 nt 2688, 서열 번호 17의 nt 61 내지 nt 2679, 서열 번호 25의 nt 61 내지 nt 2673, 서열 번호 27의 nt 61 내지 nt 2673, 서열 번호 29의 nt 61 내지 nt 2610; 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 또는 이들 각각에 대해 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열.
  18. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물이 야생형 인간 Ube3a 단백질 또는 야생형 뮤린 Ube3a 단백질로부터 유래되는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  19. 제18항에 있어서, 상기 야생형 인간 Ube3a 단백질이 서열 번호 8, 10, 또는 12 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 야생형 뮤린 Ube3a 단백질이 서열 번호 20, 22 또는 24 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  20. 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, Ube3a 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 생물학적 등가물의 발현을 지시하는 조절 서열을 추가로 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  21. 제20항에 있어서, 상기 조절 서열이 프로모터, 인트론, 인핸서(enhancer), 폴리아데닐화 신호, 종결인자(terminator), 침묵인자(silencer), TATA 상자, 또는 우드척(Woodchuck) 간염 바이러스(WHP) 전사후 조절 요소(WPRE) 중 하나 이상을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  22. 제21항에 있어서, 상기 프로모터가 MNDU3 프로모터, CMV 프로모터, PGK 프로모터, MNDU 프로모터, 또는 EF1알파 프로모터로부터 선택되는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 프로모터가 MNDU3 프로모터인 재조합 폴리뉴클레오티드.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 MNDU3 프로모터가 서열 번호 3의 서열을 포함하고, CMV 프로모터가 서열 번호 1, 2, 또는 34로부터 선택된 서열을 포함하고, PKG 프로모터가 서열 번호 4의 서열을 포함하고, MNDU 프로모터가 서열 번호 5의 서열을 포함하고, EF1알파 프로모터가 서열 번호 6의 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  25. 제1항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 있어서, 다음 중 하나 이상을 추가로 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드:
    폴리퓨린 관(polypurine tract) 서열(PPT), 중심 PPT(cPPT), R 영역, U5, 캡시드화 신호(Psi), Rev-반응 요소(RRE), 전장 U3 또는 이의 단편,
    검출 가능한 마커 또는 선택 마커, 검출 가능한 폴리펩티드 또는 선택 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 검출 가능한 폴리펩티드 또는 선택 폴리펩티드의 발현을 지시하는 조절 서열, 또는 검출 가능한 폴리펩티드 또는 선택 폴리펩티드에 대한 코딩 서열과 Ube3a 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이의 생물학적 등가물을 암호화하는 서열 사이에 위치한 자가-절단 펩티드에 대한 코딩 서열(coding sequence).
  26. 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드에 역전(reversing)하거나 보체이거나 역-보체인 재조합 폴리뉴클레오티드.
  27. 제1항 내지 제26항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(vector).
  28. 제27항에 있어서, 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터인 벡터.
  29. 제28항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 또는 헤르페스 바이러스 벡터로부터 선택되는 벡터.
  30. 제29항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인 벡터.
  31. 제30항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 TATA 상자 및 임의로 하나 이상의 전사 인자 결합 부위(들)가 결여된 U3 영역을 갖는 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터인 벡터.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래되는 벡터.
  33. 제32항에 있어서, 상기 비-바이러스 벡터가 플라스미드인 벡터.
  34. 제27항 내지 제33항 중의 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결되고 재조합 폴리뉴클레오티드의 복제를 지시하는 조절 서열을 추가로 포함하는 벡터.
  35. 1개 이상, 또는 2개 이상, 또는 3개 이상, 또는 4개 이상, 또는 5개 이상, 또는 6개 이상, 또는 7개 이상, 또는 8개 이상, 또는 9개 이상, 또는 10개 이상, 또는 11개 이상의 자연 발생 또는 비-자연 발생 글리코실화 부위를 포함하고, 야생형 Ube3a 단백질이 아닌, 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 글리코실화가 N-연결된 글리코실화이고, 글리코실화 부위가 NXaaT 또는 NXaaS의 컨센서스 서열을 포함하며, 여기서 Xaa가 임의로 프롤린(P)을 제외한 임의의 아미노산 잔기인 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 글리코실화 부위가 다음으로부터 선택된 것들 중 하나 이상에 상응하는 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노산 (aa) 위치에 있는 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물:
    서열 번호 14의 aa62 내지 aa64, 서열 번호 14의 aa96 내지 aa98, 서열 번호 14의 aa102 내지 aa104, 서열 번호 14의 aa219 내지 aa221, 서열 번호 14의 aa354 내지 aa356, 서열 번호 14의 aa591 내지 aa 593, 서열 번호 14의 aa622 내지 aa624, 서열 번호 14의 aa 805 내지 aa 807;
    서열 번호 16의 aa85 내지 aa87, 서열 번호 16의 aa119 내지 aa121, 서열 번호 16의 aa125 내지 aa127, 서열 번호 16의 aa242 내지 aa244, 서열 번호 16의 aa377 내지 aa379, 서열 번호 16의 aa614 내지 aa616, 서열 번호 16의 aa645 내지 aa647, 서열 번호 16의 aa828 내지 aa830;
    서열 번호 18의 aa82 내지 aa84, 서열 번호 18의 aa116 내지 aa118, 서열 번호 18의 aa 122 내지 aa124, 서열 번호 18의 aa239 내지 aa241, 서열 번호 18의 aa374 내지 aa376, 서열 번호 18의 aa611 내지 aa613, 서열 번호 18의 aa642 내지 aa644, 서열 번호 18의 aa825 내지 aa827;
    서열 번호 26 또는 28의 aa83 내지 aa85, 서열 번호 26 또는 28의 aa117 내지 aa119, 서열 번호 26 또는 28의 aa123 내지 aa125, 서열 번호 26 또는 28의 aa 237 내지 aa239, 서열 번호 26 또는 28의 aa372 내지 aa374, 서열 번호 26 또는 28의 aa609 내지 aa 611, 서열 번호 26 또는 28의 aa640 내지 aa642, 서열 번호 26 또는 28의 aa823 내지 aa825;
    서열 번호 30의 aa62 내지 aa64, 서열 번호 30의 aa96 내지 aa98, 서열 번호 30의 aa102 내지 aa104, 서열 번호 30의 aa216 내지 aa218, 서열 번호 30의 aa351 내지 aa353, 서열 번호 30의 aa588 내지 aa590, 서열 번호 30의 aa619 내지 aa621, 또는 서열 번호 30의 aa802 내지 aa804.
  38. 제35항 내지 제37항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 Ube3a 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이의 생물학적 등가물이 하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에서 확인된 바와 같은 8개의 아미노산(aa) 위치에 상응하는 aa 위치에 8개의 글리코실화 부위를 포함하는 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물:
    (a) 서열 번호 14의 aa62 내지 aa64, 서열 번호 14의 aa96 내지 aa98, 서열 번호 14의 aa102 내지 aa104, 서열 번호 14의 aa219 내지 aa221, 서열 번호 14의 aa354 내지 aa356, 서열 번호 14의 aa591 내지 aa 593, 서열 번호 14의 aa622 내지 aa624, 서열 번호 14의 aa 805 내지 aa 807;
    (b) 서열 번호 16의 aa85 내지 aa87, 서열 번호 16의 aa119 내지 aa121, 서열 번호 16의 aa125 내지 aa127, 서열 번호 16의 aa242 내지 aa244, 서열 번호 16의 aa377 내지 aa379, 서열 번호 16의 aa614 내지 aa616, 서열 번호 16의 aa645 내지 aa647, 서열 번호 16의 aa828 내지 aa830;
    (c) 서열 번호 18의 aa82 내지 aa84, 서열 번호 18의 aa116 내지 aa118, 서열 번호 18의 aa 122 내지 aa124, 서열 번호 18의 aa239 내지 aa241, 서열 번호 18의 aa374 내지 aa376, 서열 번호 18의 aa611 내지 aa613, 서열 번호 18의 aa642 내지 aa644, 서열 번호 18의 aa825 내지 aa827;
    (d) 서열 번호 26 또는 28의 aa83 내지 aa85, 서열 번호 26 또는 28의 aa117 내지 aa119, 서열 번호 26 또는 28의 aa123 내지 aa125, 서열 번호 26 또는 28의 aa 237 내지 aa239, 서열 번호 26 또는 28의 aa372 내지 aa374, 서열 번호 26 또는 28의 aa609 내지 aa 611, 서열 번호 26 또는 28의 aa640 내지 aa642, 서열 번호 26 또는 28의 aa823 내지 aa825;
    (e) 서열 번호 30의 aa62 내지 aa64, 서열 번호 30의 aa96 내지 aa98, 서열 번호 30의 aa102 내지 aa104, 서열 번호 30의 aa216 내지 aa218, 서열 번호 30의 aa351 내지 aa353, 서열 번호 30의 aa588 내지 aa590, 서열 번호 30의 aa619 내지 aa621, 또는 서열 번호 30의 aa802 내지 aa804.
  39. 제35항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 있어서, 다음으로부터 선택된 것들 중 하나 이상에 상응하는 aa 위치(들)에 돌연변이된 아미노산 잔기(들) 중 하나 이상을 포함함으로써 글리코실화 부위(들) 중 하나 이상을 형성하고:
    서열 번호 14의 aa64, 서열 번호 14의 aa98, 서열 번호 14의 aa104, 서열 번호 14의 aa221, 서열 번호 14의 aa356, 서열 번호 14의 aa591, 서열 번호 14의 aa624, 서열 번호 14의 aa 805, 서열 번호 14의 aa 806;
    서열 번호 16의 aa87, 서열 번호 16의 aa121, 서열 번호 16의 aa127, 서열 번호 16의 aa244, 서열 번호 16의 aa379, 서열 번호 16의 aa614, 서열 번호 16의 aa647, 서열 번호 16의 aa828, 서열 번호 16의 aa829;
    서열 번호 18의 aa84, 서열 번호 18의 aa118, 서열 번호 18의 aa124, 서열 번호 18의 aa241, 서열 번호 18의 aa376, 서열 번호 18의 aa611, 서열 번호 18의 aa644, 서열 번호 18의 aa825, 서열 번호 18의 aa826;
    서열 번호 26 또는 28의 aa85, 서열 번호 26 또는 28의 aa119, 서열 번호 26 또는 28의 aa125, 서열 번호 26 또는 28의 aa239, 서열 번호 26 또는 28의 aa374, 서열 번호 26 또는 28의 aa609, 서열 번호 26 또는 28의 aa610, 서열 번호 26 또는 28의 aa642, 서열 번호 26 또는 28의 aa823;
    서열 번호 30의 aa64, 서열 번호 30의 aa98, 서열 번호 30의 aa104, 서열 번호 30의 aa218, 서열 번호 30의 aa353, 서열 번호 30의 aa5880, 서열 번호 30의 aa589, 서열 번호 30의 aa621, 또는 서열 번호 30의 aa802,
    임의로 여기서, 적어도 하나의 글리코실화 부위에서 임의의 하나 또는 임의의 2개 또는 모든 3개의 아미노산 잔기(들)가 야생형 Ube3a 폴리펩티드 또는 단백질에 비해 돌연변이되어 글리코실화 부위를 구성하는 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물.
  40. 제35항 내지 제39항 중의 어느 한 항에 있어서, 하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에서 확인된 것들에 상응하는 aa 위치에 9개의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함함으로써 8개의 글리코실화 부위를 형성하는 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물:
    (a) 서열 번호 14의 aa64, 서열 번호 14의 aa98, 서열 번호 14의 aa104, 서열 번호 14의 aa221, 서열 번호 14의 aa356, 서열 번호 14의 aa591, 서열 번호 14의 aa624, 서열 번호 14의 aa 805, 및 서열 번호 14의 aa 806;
    (b) 서열 번호 16의 aa87, 서열 번호 16의 aa121, 서열 번호 16의 aa127, 서열 번호 16의 aa244, 서열 번호 16의 aa379, 서열 번호 16의 aa614, 서열 번호 16의 aa647, 서열 번호 16의 aa828, 및 서열 번호 16의 aa829;
    (c) 서열 번호 18의 aa84, 서열 번호 18의 aa118, 서열 번호 18의 aa124, 서열 번호 18의 aa241, 서열 번호 18의 aa376, 서열 번호 18의 aa611, 서열 번호 18의 aa644, 서열 번호 18의 aa825, 및 서열 번호 18의 aa826;
    (d) 서열 번호 26 또는 28의 aa85, 서열 번호 26 또는 28의 aa119, 서열 번호 26 또는 28의 aa125, 서열 번호 26 또는 28의 aa239, 서열 번호 26 또는 28의 aa374, 서열 번호 26 또는 28의 aa609, 서열 번호 26 또는 28의 aa610, 서열 번호 26 또는 28의 aa642, 및 서열 번호 26 또는 28의 aa823; 또는
    (e) 서열 번호 30의 aa64, 서열 번호 30의 aa98, 서열 번호 30의 aa104, 서열 번호 30의 aa218, 서열 번호 30의 aa353, 서열 번호 30의 aa588, 서열 번호 30의 aa589, 서열 번호 30의 aa621, 및 서열 번호 30의 aa802.
  41. 제35항 내지 제39항 중의 어느 한 항에 있어서, 하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에서 확인된 것들에 상응하는 aa 위치에 8개의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함함으로써 7개의 글리코실화 부위를 형성하는 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물:
    (a) 서열 번호 14의 aa64, 서열 번호 14의 aa98, 서열 번호 14의 aa221, 서열 번호 14의 aa356, 서열 번호 14의 aa591, 서열 번호 14의 aa624, 서열 번호 14의 aa 805, 및 서열 번호 14의 aa 806;
    (b) 서열 번호 16의 aa87, 서열 번호 16의 aa121, 서열 번호 16의 aa244, 서열 번호 16의 aa379, 서열 번호 16의 aa614, 서열 번호 16의 aa647, 서열 번호 16의 aa828, 및 서열 번호 16의 aa829;
    (c) 서열 번호 18의 aa84, 서열 번호 18의 aa118, 서열 번호 18의 aa241, 서열 번호 18의 aa376, 서열 번호 18의 aa611, 서열 번호 18의 aa644, 서열 번호 18의 aa825, 및 서열 번호 18의 aa826;
    (d) 서열 번호 26 또는 28의 aa85, 서열 번호 26 또는 28의 aa119, 서열 번호 26 또는 28의 aa239, 서열 번호 26 또는 28의 aa374, 서열 번호 26 또는 28의 aa609, 서열 번호 26 또는 28의 aa610, 서열 번호 26 또는 28의 aa642, 및 서열 번호 26 또는 28의 aa823; 또는
    (e) 서열 번호 30의 aa64, 서열 번호 30의 aa98, 서열 번호 30의 aa218, 서열 번호 30의 aa353, 서열 번호 30의 aa588, 서열 번호 30의 aa589, 서열 번호 30의 aa621, 및 서열 번호 30의 aa802.
  42. 제39항 내지 제41항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 형성된 글리코실화 부위가 NXaaT 또는 NXaaS의 컨센서스 서열을 포함하고, 여기서 Xaa가 임의로 프롤린(P)을 제외한 임의의 아미노산 잔기인 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물.
  43. 제39항 내지 제42항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이된 아미노산 잔기(들)가 다음 중의 하나 이상으로부터 선택되는 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물:
    서열 번호 14의 aa64에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 14의 aa98에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 14의 aa104에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 14의 aa221에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 14의 aa356에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 14의 aa591에 상응하는 aa 위치에 N, 서열 번호 14의 aa624에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 14의 aa 805에 상응하는 aa 위치에 N, 및 서열 번호 14의 aa 806에 상응하는 aa 위치에 N;
    서열 번호 16의 aa87에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 16의 aa121에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 16의 aa127에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 16의 aa244에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 16의 aa379에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 16의 aa614에 상응하는 aa 위치에 N, 서열 번호 16의 aa647에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 16의 aa828에 상응하는 aa 위치에 N, 및 서열 번호 16의 aa829에 상응하는 aa 위치에 N;
    서열 번호 18의 aa84에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 18의 aa118에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 18의 aa124에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 18의 aa241에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 18의 aa376에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 18의 aa611에 상응하는 aa 위치에 N, 서열 번호 18의 aa644에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 18의 aa825에 상응하는 aa 위치에 N, 및 서열 번호 18의 aa826에 상응하는 aa 위치에 N;
    서열 번호 26 또는 28의 aa85에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 26 또는 28의 aa119에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 26 또는 28의 aa125에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 26 또는 28의 aa239에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 26 또는 28의 aa374에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 26 또는 28의 aa609에 상응하는 aa 위치에 N, 서열 번호 26 또는 28의 aa610에 상응하는 aa 위치에 N, 서열 번호 26 또는 28의 aa642에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 및 서열 번호 26 또는 28의 aa823에 상응하는 aa 위치에 N; 또는
    서열 번호 30의 aa64에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 30의 aa98에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 30의 aa104에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 30의 aa218에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 30의 aa353에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 서열 번호 30의 aa588에 상응하는 aa 위치에 N, 서열 번호 30의 aa589에 상응하는 aa 위치에 N, 서열 번호 30의 aa621에 상응하는 aa 위치에 T 또는 S, 및 서열 번호 30의 aa802에 상응하는 aa 위치에 N.
  44. 제35항 내지 제43항 중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 비-자연 발생 글리코실화 부위를 포함하는 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물.
  45. 제35항 내지 제44항 중의 어느 한 항에 있어서, 다음으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물:
    서열 번호 14의 aa21 내지 aa 872, 서열 번호 16의 aa21 내지 aa 895, 서열 번호 18의 aa21 내지 aa 892, 서열 번호 26의 aa21 내지 aa 890, 서열 번호 28의 aa21 내지 aa 890, 서열 번호 30의 aa21 내지 aa 869, 또는 이의 각각에 대해 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열.
  46. 제35항 내지 제45항 중의 어느 한 항에 있어서, 신호 펩티드를 추가로 포함하는 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물.
  47. 제46항에 있어서, 상기 신호 펩티드가 분비 신호인 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 신호 펩티드 또는 분비 신호가 다음으로부터 선택되는 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물: 항체 중쇄/경쇄 분비 신호, 쌍-아르기닌 수송 단백질 분비 신호, 인터루킨-2(IL2) 분비 신호, 인터루킨-4(IL4) 분비 신호, 인터루킨-10(IL10) 분비 신호, 인터루킨-3(IL3) 분비 신호, 인터루킨-7(IL7) 분비 신호, 인간 IL2 분비 신호, 인간 OSM 분비 신호, VSV-G 분비 신호, 마우스 Ig 카파 분비 신호, 인간 IgG2 H 분비 신호, BM40 분비 신호, 세크레콘 분비 신호, 인간 IgKVIII 분비 신호, CD33 분비 신호, tPA 분비 신호, 인간 키모트립시노겐 분비 신호, 인간 트립시노겐-2 분비 신호, 가우스 luc 분비 신호, 알부민(HSA) 분비 신호, 인플루엔자 혈구응집소 분비 신호, 인간 인슐린 분비 신호, 또는 누에 피브로인 LC.
  49. 제46항 내지 제48항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 신호 펩티드 또는 분비 신호가 서열 번호 14의 aa1 내지 aa20의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물.
  50. 제35항 내지 제49항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 Ube3a 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이의 생물학적 등가물이 서열 번호 14, 16, 18, 26, 28 및 30 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이들 각각에 대해 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물.
  51. 제35항 내지 제50항 중의 어느 한 항에 있어서, 임의의 자가-절단 펩티드 및 검출 가능한 폴리펩티드 또는 선택 폴리펩티드를 추가로 포함하는 재조합 Ube3a 단백질, 또는 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물.
  52. 제1항 내지 제26항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드, 제27항 내지 제34항 중의 어느 한 항의 벡터, 또는 제35항 내지 제51항 중의 어느 한 항의 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물 중의 하나 이상을 포함함으로써 제35항 내지 제51항 중의 어느 한 항의 재조합 Ube3a 단백질 또는 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물을 발현 및 분비하는 단리된 또는 조작된 세포.
  53. 제52항에 있어서, 포유동물 세포인 단리된 또는 조작된 세포.
  54. 제53항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 뮤린 세포 또는 인간 세포인 단리된 또는 조작된 세포.
  55. 제52항 내지 제54항 중의 어느 한 항에 있어서, 줄기 세포, 전구 세포(progenitor cell), 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 배아 줄기 세포, 성체 또는 체세포 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포 또는 이들 각각의 자손으로부터 선택되는 단리된 또는 조작된 세포.
  56. 제52항 내지 제55항 중의 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 세포 또는 이의 자손인 단리된 또는 조작된 세포.
  57. 제56항에 있어서, CD34+인 단리된 또는 조작된 세포.
  58. 제52항 내지 제57항 중의 어느 한 항에 있어서, 검출 가능한 마커를 추가로 포함하는 단리된 또는 조작된 세포.
  59. 제52항 내지 제58항 중의 어느 한 항의 세포 또는 이의 자손을 포함하는 단리된 세포 집단.
  60. 제59항에 있어서, 상기 세포 집단이 CD4, CD14 및 HLADR을 발현하는 단리된 세포 집단.
  61. 제60항에 있어서, 상기 집단에서 세포의 적어도 90%가 CD4+이고, 집단에서 세포의 적어도 95%가 CD14+이고 집단에서 세포의 적어도 95%가 HLADR+인 단리된 세포 집단.
  62. 제59항 내지 제61항 중의 어느 한 항에 있어서, 적합한 조건하에서 대식세포를 유도하는 단리된 세포 집단.
  63. 제59항 내지 제62항 중의 어느 한 항에 있어서, 실질적으로 대식세포를 포함하는 단리된 세포 집단.
  64. 제59항 내지 제63항 중의 어느 한 항에 있어서, 실질적으로 균일한 단리된 세포 집단.
  65. 제59항 내지 제64항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 집단의 세포가 검출 가능한 마커를 추가로 포함하는 단리된 세포 집단.
  66. 제1항 내지 제26항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드, 제27항 내지 제34항 중의 어느 한 항의 벡터, 제35항 내지 제51항 중의 어느 한 항의 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물, 제52항 내지 제58항 중의 어느 한 항의 세포, 또는 제59항 내지 제65항 중의 어느 한 항의 세포 집단 중의 하나 이상을 대상체(subject)에게 국소 또는 전신 투여함으로써 대상체에서 엔젤만 증후군(Angelman syndrome)을 치료함을 포함하여, 대상체에서 엔젤만 증후군을 치료, 예방, 중지 또는 역전시키는 방법.
  67. 제1항 내지 제26항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드, 제27항 내지 제34항 중의 어느 한 항의 벡터, 제35항 내지 제51항 중의 어느 한 항의 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물, 제52항 내지 제58항 중의 어느 한 항의 세포, 또는 제59항 내지 제65항 중의 어느 한 항의 세포 집단 중의 하나 이상을 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 Ube3a를 발현시킴을 포함하여, 대상체에서 Ube3a 단백질 또는 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물을 발현시키는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 대상체가 결함이 있는 Ube3a 유전자를 지니는 방법.
  69. 제66항 내지 제68항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 또는 세포 집단이 약 1.0 x 104개 내지 약 1 x 1015개 세포/대상체 체중 kg의 용량으로 투여되는 방법.
  70. 제66항 내지 제69항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 엔젤만 증후군에 대해 증상이 있거나 무증상인 방법.
  71. 제66항 내지 제70항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 포유동물인 방법.
  72. 제66항 내지 제71항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 방법.
  73. 제66항 내지 제72항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 태아인 방법.
  74. 제66항 내지 제72항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 유아 또는 사춘기전 대상체인 방법.
  75. 제66항 내지 제72항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 성인인 방법.
  76. 제1항 내지 제26항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드, 제27항 내지 제34항 중의 어느 한 항의 벡터, 제35항 내지 제51항 중의 어느 한 항의 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물 중의 하나 이상을 포함함으로써 폴리뉴클레오티드, 벡터, 또는 재조합 Ube3a 단백질 또는 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물을 생산하는 단리된 또는 조작된 세포.
  77. 제76항에 있어서, 진핵 또는 원핵 세포인 단리된 또는 조작된 세포.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 포유류 세포인 단리된 또는 조작된 세포.
  79. 제76항 내지 제78항 중의 어느 한 항의 세포의 클론 집단(clonal population).
  80. (a) 제27항 내지 제34항 중의 어느 한 항의 벡터; (b) 패키징 플라스미드(packaging plasmid); 및 (c) 외피 플라스미드(envelope plasmid)를 포함하는 바이러스 패키징 시스템.
  81. 제80항에 있어서, (d) 패키징 세포주를 추가로 포함하는 바이러스 패키징 시스템.
  82. 제81항에 있어서, 상기 패키징 세포주가 HEK-293 세포주인 바이러스 패키징 시스템.
  83. 바이러스 입자를 패키징하기에 적합한 조건하에서 제80항의 시스템으로 패키징 세포주를 형질도입함을 포함하여, 바이러스 입자를 생산하는 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 패키징 세포주가 HEK-293 세포주인 방법.
  85. 재조합 Ube3a 단백질 또는 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물의 발현을 허용하는 조건하에서 제52항 내지 제58항 및 제76항 내지 제78항 중의 어느 한 항의 세포를 성장시킴을 포함하여, 분비된 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물을 발현시키는 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 세포가 시험관내 또는 생체내 세포인 방법.
  87. 담체, 및 제1항 내지 제26항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드, 제27항 내지 제34항 중의 어느 한 항의 벡터, 제35항 내지 제51항 중의 어느 한 항의 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물, 제52항 내지 제58항 및 제76항 내지 제78항 중의 어느 한 항의 세포, 제59항 내지 제65항 중의 어느 한 항의 세포 집단, 또는 제79항의 클론 집단 중 하나 이상을 포함하는 조성물.
  88. 제87항에 있어서, 상기 담체가 약제학적으로 허용되는 담체인 조성물.
  89. 제1항 내지 제26항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드, 제27항 내지 제34항 중의 어느 한 항의 벡터, 제35항 내지 제51항 중의 어느 한 항의 재조합 Ube3a 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 등가물, 제52항 내지 제58항 및 제76항 내지 제78항 중의 어느 한 항의 세포, 제59항 내지 제65항 중의 어느 한 항의 세포 집단, 또는 제79항의 클론 집단 중 하나 이상, 및 임의로 사용 설명서를 포함하는 키트(kit).
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