JPWO2018088519A1 - 遺伝子導入細胞の製造方法 - Google Patents

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Abstract

本発明の課題は、細胞の種類に関わらず多くに任意の細胞、特にヒト初代細胞であっても遺伝子を効率よく導入することができる、遺伝子導入細胞の製造方法を提供することである。本発明によれば、（ｉ）抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質と、外来遺伝子とを含むウイルスと、（ｉｉ）標的細胞と前記標的細胞に特異的な抗体、及び／又は膜型抗体を含む標的細胞とをインビトロで接触させることにより標的細胞にウイルスをインビトロで感染させる工程を含む、遺伝子導入細胞の製造方法が提供される。

Description

本発明は、キメラエンベロープタンパク質を含むウイルスを用いて外来遺伝子を標的細胞に導入することを含む、遺伝子導入細胞の製造方法に関する。より詳細には、本発明は、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質を含むウイルスを用いて遺伝子導入を行うことを含む、遺伝子導入細胞の製造方法に関する。
真核細胞に目的遺伝子を導入して発現させることを目的として、様々なウイルス由来ベクターが使用されている。標的細胞において機能を有するプロモーターに機能し得る形で連結された目的遺伝子を、ウイルス遺伝子に挿入することによって、ウイルスベクターを作製することができる。ウイルスベクターは標的細胞に感染し、ウイルス遺伝子の代わりに目的遺伝子を発現することができる。ウイルス遺伝子の全てがそのウイルスベクターに存在するわけではないので、ウイルスベクターが標的細胞に感染しても、ウイルス粒子は産生しない。ヒト等の哺乳動物の標的細胞の感染のために使用されているウイルスとしては、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレトロウイルスなどがある。
特許文献１には、プロテインＡのIgG結合ドメインの部分を含むキメラ・エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含む、標的細胞に形質導入を起こさせるウイルスベクターであって、該エンベロープタンパク質がマウス白血病ウイルスまたはトリ白血病ウイルスのgp70タンパク質の部分を含み、かつ該エンベロープタンパク質がウイルス粒子への断片の組立てを指令するように機能する、上記ウイルスベクターが記載されている。
非特許文献１においては、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ のＺ ｄｏｍａｉｎ発現する遺伝子配列を外皮にＶＳＶ−Ｇを発現するプラスミドに挿入することで、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのＺ ｄｏｍａｉｎ とＶＳＶ−Ｇの融合タンパク質を発現するプラスミドを作製し、このプラスミドをウイルスベクター生産細胞である２９３ＦＴ細胞に遺伝子導入することで目的の外皮タンパク質を発現しているレンチウイルスベクターを生産させている。その後、ヒトＩｇＧ 抗体でコートしたプレートに、上記のレンチウイルスベクターを添加し、洗浄した後、そのプレートに接着細胞を播種することでウイルスベクターを感染させることが記載されている。すなわち、プレート表面に抗体を固定し、その抗体とＺ ｄｏｍａｉｎとの相互作用を利用してプレート表面にレンチウイルスベクターを濃縮し、接着細胞がプレート表面に接着することを介してウイルスベクターを感染させることが記載されている。
特表２００２−５１６５７０号公報
Y.Kameyama et al., Journal of Virological Methods 153 (2008) 49-54
特許文献１においては、マウス白血病ウイルスまたはトリ白血病ウイルスのgp70タンパク質を含むキメラタンパク質を含むレトロウイルスを使用しているが、標的細胞の種類が制限されるという問題があった。非特許文献１においては、ウイルスを固定したプレート上に接着細胞である標的細胞を播種して、遺伝子導入を行っており、標的細胞へのウイルス感染は抗体を介したものではない。従って、非特許文献１の方法は、接着細胞以外の細胞（例えば、浮遊細胞等）には応用が困難であり、またウイルス感染において抗体の指向性を利用していないことから、遺伝子導入が困難であるとされているヒト初代細胞に対して遺伝子を導入することも困難である。
本発明は、細胞の種類に関わらず多くに任意の細胞、特にヒト初代細胞であっても遺伝子を効率よく導入することができる、遺伝子導入細胞の製造方法を提供することを解決すべき課題とする。さらに本発明は、上記の遺伝子導入細胞の製造方法に使用することができる、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質を含むウイルス、並びに前記ウイルスを含む遺伝子治療剤を提供することを解決すべき課題とする。さらに本発明は、上記の遺伝子導入細胞の製造方法により得られる遺伝子導入細胞を提供することを解決すべき課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質を含むウイルスと、標的細胞と前記標的細胞に特異的な抗体、及び／又は膜型抗体を含む標的細胞とを接触させることにより、標的細胞にウイルスを高効率で感染させることができ、これにより標的細胞に遺伝子を導入できることを見出した。
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１） （ｉ）抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質と、外来遺伝子とを含むウイルスと；
（ｉｉ）標的細胞と前記標的細胞に特異的な抗体、及び／又は膜型抗体を含む標的細胞；
とをインビトロで接触させることにより標的細胞にウイルスをインビトロで感染させる工程を含む、遺伝子導入細胞の製造方法。
（２） 抗体結合タンパク質が、プロテインAのIgG結合ドメイン及びプロテインLのIgG結合ドメインのうちの何れか又は両方を含む、（１）に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（３） 抗体結合タンパク質が、プロテインAのIgG結合ドメインを３個以上含む、（２）に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（４） 抗体結合タンパク質が、プロテインLのIgG結合ドメインを３個以上含む、（２）又は（３）に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（５） 前記キメラタンパク質において、抗体結合タンパク質が、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質のＮ末端側に存在している、（１）から（４）の何れか一に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（６） ウイルスが、レトロウイルスである、（１）から（５）の何れか一に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（７） レトロウイルスが、レンチウイルスである、（６）に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（８） 標的細胞が、ヒト初代細胞、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、ヒト間葉系幹細胞、及び前記細胞から分化誘導された細胞の何れか一種以上である、（１）から（７）の何れか一に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（９） 標的細胞が末梢血単核球細胞である、（１）から（８）の何れか一に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（１０） 標的細胞が、ヒトＢ細胞、ヒトＴ細胞又はヒト間葉系幹細胞である、（１）から（８）の何れか一に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（１１） 標的細胞が、ヒトＴ細胞であり、標的細胞に特異的な抗体が、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ８ａ抗体及び抗ヒトＣＤ１１ａ抗体から選択される少なくとも一以上である、（１）から（１０）の何れか一に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（１２） 標的細胞が、ヒトＢ細胞であり、ＩＬ−４、ＯＤＮ ２００６、ＣＤ４０受容体を介した刺激、及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激から選択される少なくとも一以上の存在下において前記ウイルスと前記標的細胞とをインビトロで接触させる、（１）から（１０）の何れか一に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（１３） 標的細胞が、ヒト間葉系幹細胞であり、標的細胞に特異的な抗体が、抗ヒトＣＤ９０抗体である、（１）から（１０）の何れか一に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（１４） 抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質を含むウイルスが、前記キメラタンパク質以外に、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質を含む、（１）から（１１）の何れか一に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（１５） 前記ウイルスにおける、前記キメラタンパク質と、前記水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質のモル比が、１：１〜１：５１２の範囲内である、（１４）に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（１６） 抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質を含むウイルスが、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターと、抗体結合タンパク質をコードする塩基配列を含まず、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターとを組み合わせて使用することによって製造されたものである、（１）から（１５）の何れか一に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（１７） 抗体結合タンパク質をコードする塩基配列を含まず、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターと、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターとの質量比が６４：１〜６４：２５６の範囲内である、（１６）に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（１８） 抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質と、外来遺伝子とを含むウイルスであって、抗体結合タンパク質が、プロテインLのIgG結合ドメインを含むか、及び／又はプロテインAのIgG結合ドメインを３個以上含む、ウイルス。
（１９） ウイルスが、レトロウイルスである、（１８）に記載のウイルス。
（２０） レトロウイルスが、レンチウイルスである、（１９）に記載のウイルス。
（２１） （１８）から（２０）の何れか一に記載のウイルスを含む遺伝子治療剤。
（２２） （１）から（１７）の何れか一に記載の遺伝子導入細胞の製造方法により得られる遺伝子導入細胞。
（２３） （１８）から（２０）の何れか一に記載のウイルスが感染している遺伝子導入細胞。
（２４） 抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクター。
（２５） ヒト初代細胞、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又はヒト間葉系幹細胞から選択される標的細胞と、前記標的細胞に特異的な抗体とを含む、（１）から（１７）の何れか一に記載の遺伝子導入細胞の製造方法を行うためのキット。
本発明による遺伝子導入細胞の製造方法によれば、標的細胞に遺伝子を効率よく導入することができる。
図１は、本発明の実施例１におけるキメラエンベロープタンパク質発現ベクターの模式図である。 図２は、本発明の実施例１におけるキメラエンベロープタンパク質発現ベクターの模式図である。 図３は、本発明の実施例６におけるＶＳＶ−Ｇベクター濃度と力価の関係を示す図である。各欄において、ｐＶＳＶ−Ｇは左のグラフ、ｐＣＩ−ＶＳＶ−Ｇは真ん中のグラフ、ｐＣＩ−ＳＰ−ＶＳＶ−Ｇは右のグラフを示す。 図４は、本発明の実施例７におけるキメラエンベロープタンパク質発現ベクターの評価結果を示す図である。 図５は、本発明の実施例８における抗体結合タンパク質のドメイン数と感染効率の評価結果を示す図である。 図６は、本発明の実施例９におけるｐＶＳＶ−ＧとｐＣＩ−ＳＰ−ＰＬ６ｄ−ＶＳＶ−Ｇとの比率の評価結果を示す図である。 図７は、本発明の実施例９におけるｐＶＳＶ−Ｇとキメラエンベロープタンパク質発現ベクターとの比率の評価結果を示す図である。各欄において、ｐＶＳＶ−Ｇ：ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＡ６ｄ−ＶＳＶ−Ｇは左のグラフ、ｐＶＳＶ−Ｇ：ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＬ６ｄ−ＶＳＶ−Ｇは右のグラフを示す。 図８は、本発明の実施例９におけるｐＣＩ−ＳＰ−ＶＳＶ−Ｇとキメラエンベロープタンパク質発現ベクターとの比率の評価結果を示す図である。各欄において、ｐＣＩ−ＳＰ−ＶＳＶ−Ｇ：ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＡ６ｄ−ＶＳＶ−Ｇは左のグラフ、ｐＣＩ−ＳＰ−ＶＳＶ−Ｇ：ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＬ６ｄ−ＶＳＶ−Ｇは右のグラフを示す。 図９は、本発明の実施例１０における抗体を介したＴ細胞への感染評価結果を示す図である。 図１０は、本発明の実施例１１におけるキメラエンベロープタンパク質を有するレトロウイルスのＢ細胞への感染評価結果を示す図である。各欄において、ＦＢＳは左のグラフ、Ultra-Low IgGＦＢＳは右のグラフを示す。 図１１は、本発明の実施例１２における濃縮レンチウイルスのＢ細胞への感染評価結果を示す図である。 図１２は、本発明の実施例１３における濃縮レンチウイルスのＭＳＣへの感染評価結果を示す図である。
本発明の実施の形態について以下に説明する。
本発明による遺伝子導入細胞の製造方法は、
（ｉ）抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質と、外来遺伝子とを含むウイルスと；
（ｉｉ）標的細胞と前記標的細胞に特異的な抗体、及び／又は膜型抗体を含む標的細胞；
とをインビトロで接触させることにより標的細胞にウイルスをインビトロで感染させる工程を含む、遺伝子導入細胞の製造方法である。
（１）抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質と、外来遺伝子とを含むウイルス
本発明で用いるウイルスは、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質を含む。
本発明で用いるウイルスとしては、レトロウイルス、バキュロウイルス、日本脳炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスなどを使用することができるが、特に限定されない。
レトロウイルスとしては、例えばＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）又はＳＩＶ（Ｓｉｍｉａｎ Ｉｍｍｕｎｏ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）又はＢＩＶ（Ｂｏｖｉｎｅ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）由来レンチウイルスベクター、あるいはマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）由来レトロウイルスベクター、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）由来レトロウイスルベクター等を使用することができる。特に、複製能を欠損したレトロウイルスベクターが好適である。
本発明において用いるウイルスは、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質を含む。
水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質は、エンベロープタンパク質である。VSV-Gの受容体は膜成分であるリン脂質であり、動物細胞の膜に広く存在することから、本発明の方法によれば種々の動物細胞に所望の外来遺伝子を導入することができる。
本発明において好ましくは、抗体結合タンパク質は、プロテインAのIgG結合ドメイン及びプロテインLのIgG結合ドメインのうちの何れか又は両方を含む。
プロテインＡは、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）によって生産される細胞壁タンパク質の１種であり、シグナル配列Ｓ、５つの免疫グロブリン結合ドメイン（IgG結合ドメイン）（Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン）、および、細胞壁結合ドメインであるＸＭ領域から構成されている（特許第５９５２１８５号公報）。本発明におけるプロテインAのIgG結合ドメインは、IgGに結合できる限り、変異体でもよい。
プロテインLとしては、フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）の２つの株由来のものが知られている。１つは3316株由来のプロテインLであり、もう１つの312株由来のプロテインLである。3316株由来のプロテインLは４つの免疫グロブリン結合ドメイン（IgG結合ドメイン）を有し、312株由来のプロテインLは５つの免疫グロブリン結合ドメイン（IgG結合ドメイン）を有している（特開２０１６−７９１４９号公報の図１）。本発明におけるプロテインＬのIgG結合ドメインは、IgGに結合できる限り、変異体でもよい。
好ましくは、抗体結合タンパク質は、プロテインAのIgG結合ドメインを３個以上含むことができ、例えば、３個〜１５個、３個〜１２個、３個〜９個、又は３個〜６個でもよい。
好ましくは、抗体結合タンパク質は、プロテインLのIgG結合ドメインを３個以上含むことができ、例えば、３個〜１５個、３個〜１２個、３個〜９個、又は３個〜６個でもよい。
抗体結合タンパク質がプロテインAのIgG結合ドメイン及びプロテインLのIgG結合ドメインの両方を含む場合には、上記ドメインの合計数は、好ましくは３個以上であり、例えば、３個〜１５個、３個〜１２個、３個〜９個、又は３個〜６個でもよい。
本発明で用いるウイルスの一例としては、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質と、外来遺伝子とを含むウイルスであって、抗体結合タンパク質が、プロテインLのIgG結合ドメインを含むか、及び／又はプロテインAのIgG結合ドメインを３個以上含む、ウイルスを挙げることができる。
キメラタンパク質において、抗体結合タンパク質は、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質のＮ末端側に存在していてもよいし、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質のＣ末端側に存在していてもよいし、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質の内部に存在してもよいが、好ましくは、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質のＮ末端側に存在している。
抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質を含むウイルスは、前記キメラタンパク質以外に、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質を含むものでもよい。ウイルスが、前記キメラタンパク質以外に、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質を含む場合、ウイルスにおける、前記キメラタンパク質と、前記水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質のモル比は、好ましくは１：１〜１：５１２の範囲内であり、より好ましくは１：１〜１：２５６の範囲内であり、さらに好ましくは１：１〜１：１２８の範囲内であり、さらに好ましくは１：１〜１：６４の範囲内であり、さらに好ましくは１：２〜１：６４の範囲内である。
また、ウイルスが、前記キメラタンパク質以外に、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質を含む場合、ウイルスは、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターと、抗体結合タンパク質をコードする塩基配列を含まず、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターとを組み合わせて使用することによって製造することができる。この場合、抗体結合タンパク質をコードする塩基配列を含まず、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターと、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターとの質量比は好ましくは６４：１〜６４：２５６の範囲内であり、例えば、６４：２〜６４：２５６、６４：４〜６４：２５６、６４：８〜６４：２５６、６４：１６〜６４：２５６、６４：３２〜６４：２５６でもよいし、６４：１〜６４：１２８、６４：１〜６４：６４、６４：１〜６４：３２でもよいし、又は、６４：２〜６４：１２８、６４：４〜６４：１２８、６４：８〜６４：１２８、６４：１６〜６４：６４でもよい。
キメラタンパク質は、分泌シグナルペプチドを含むことができる。分泌シグナルペプチドとしては、例えば、ＶＳＶ−Ｇのシグナルペプチド、又はBiochemicaland BiophysicalResearch Communications 294 (2002) 835-842に記載されているシグナルペプチド（hidden Markov Modelによるヒト分泌シグナルペプチド）等を使用することができる。
キメラタンパク質は、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とを連結するためのリンカーを含んでいてもよい。リンカーは、好ましくは柔軟な構造を有し、これにより可動性を付与することができる。後記する実施例においては、リンカーとしてグリシン4つとセリン1つの合計５アミノ酸を基本単位とした15アミノ酸残基からなるフレキシブルなグリシンセリンリンカーを用いているが、リンカーの種類は特に限定されるものではない。
抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質を含むウイルスは、以下の方法で作製することができる。
レトロウイルスの作製方法としては、レトロウイルスの構造タンパク質を有さない細胞に、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子を有する発現ベクター（パッケージングプラスミド）と、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターと、外来遺伝子を搭載した発現ベクターとを導入することによって、レトロウイルスを産生させる方法を挙げることができる。あるいは、予めｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子をコードする遺伝子が染色体上に組み込まれたレトロウイルスパッケージング細胞に、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターと、外来遺伝子を搭載した発現ベクターを導入することによってレトロウイルスを産生させる方法でもよい。
レンチウイルス (lentivirus) はレトロウイルス (retrovirus) 科に属するウイルスであり、gag、pol及びenv の 3つの必須遺伝子以外にも、多くの遺伝子をゲノム内に持っている。レンチウイルスベクターはレンチウイルスのゲノム配列を利用したベクターで、増殖中および増殖停止中の細胞に感染させることができる。外来遺伝子は細胞の染色体に挿入されるため、細胞を継体しても導入遺伝子の発現は安定している。
レンチウイルス由来のレンチウイルスベクターとしては、HIV-1 (human immunodeficiency virus type 1)、HIV-2、simian immunodeficiency virus、feline immunodeficiency virus、bovine immunodeficiency virus、equine infectious anemia virus、caprine arthritisencephalitis virus、jembrana disease virus、visna virusなどが知られている。さらにgag、pol及びenvの 3つの構造タンパク質からウイルスを産生するためには、rev 遺伝子が必要である。Rev は転写後の RNA に作用し、スプライシングを受けていない gag、gag-pol mRNA を選択的に核外に運び出す。この働きによって構造タンパク質が翻訳される。
発現ベクターとしては、好ましくはプラスミドベクターを使用することができる。プラスミドベクターを用いてレンチウイルスを作製する場合には、
・外来遺伝子を有するプラスミドベクター（後記する実施例では、CSIV-CMV-Venus）；
・gag遺伝子及びpol遺伝子を有するパッケージングプラスミドベクター（後記する実施例では、pLenti-P3A）；
・rev遺伝子を有するパッケージングプラスミドベクター（後記する実施例ではpLenti-P3B）；及び
・抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質をコードする塩基配列を有するプラスミドベクター：
を使用することができる。
本発明における外来遺伝子は、適当なプロモーター、例えば、ウイルスベクター中に存在するＬＴＲのプロモーターや外来プロモーターの制御下に連結されていてもよい。外来プロモーターとしては、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、ＲＳＶ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０）、ＨＳＶ ＴＫ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＥＦ−１ α ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋｉｍら Ｇｅｎｅ ９１， ｐ．２１７−２２３ （１９９０））、ＣＡＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ １０８， ｐ．１９３−２００ （１９９１））、ＳＲ α ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８， ｐ．４６６ （１９８８））、βアクチンプロモーター(例えば、特許第5198747号)等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。効率のよい外来遺伝子の転写を達成するためには、プロモーターや転写開始部位と共同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列やターミネーター配列、イントロン配列がベクター内に存在していてもよい。
外来遺伝子としては、任意の遺伝子を選ぶことができる。例えば、外来遺伝子は、治療の対象となる疾患に関連している酵素やタンパク質をコードする遺伝子、Ｔ細胞レセプター遺伝子、増殖因子をコードする遺伝子、アンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を起こすＲＮＡをコードする遺伝子、リボザイムをコードする遺伝子等を挙げることができる。あるいは、外来遺伝子としては、ヒトモノクローナル抗体などの産業上有用な抗体、酵素、又はその他の生理活性物質をコードする遺伝子でもよい。遺伝子としてはｃＤＮＡを使用することができ、コドンを最適化したｃＤＮＡを使用することもできる。
本発明で用いるウイルスは、遺伝子導入された細胞の選択を可能にするような適当なマーカー遺伝子を含有していてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、細胞に抗生物質に対する耐性を付与する薬剤耐性遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等）や、酵素活性や蛍光によって遺伝子導入された細胞を見分けることができるレポーター遺伝子（ＬａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）又はその類縁体等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子）、細胞表面に局在する細胞表面マーカー遺伝子等が利用できる。細胞表面マーカー遺伝子は、細胞内領域の一部及び／又は全部を欠損させたものやシグナル伝達能を無くした変異体でも良い。
抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターは、本発明の一側面を構成する。上記プラスミドベクターには、上記キメラタンパク質を発現できるような適当なプロモーター含んでいてもよい。プロモーターとしては、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、ＲＳＶ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０）、ＨＳＶ ＴＫ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＥＦ−１ α ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋｉｍら Ｇｅｎｅ ９１， ｐ．２１７−２２３ （１９９０））、ＣＡＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ １０８， ｐ．１９３−２００ （１９９１））、ＳＲ α ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８， ｐ．４６６ （１９８８））、βアクチンプロモーター(例えば、特許第5198747号)等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。効率のよい外来遺伝子の転写を達成するためには、プロモーターや転写開始部位と共同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリＡ配列、イントロン配列がベクター内に存在していてもよい。
本発明においては、上記した各種発現ベクターを、動物細胞（パッケージング細胞）に導入することによって、動物細胞内においてウイルスを産生させることができる。動物細胞の培養上清を回収することによって、産生したウイルスを回収することができる。動物細胞（パッケージング細胞）としては、２９３Ｔ細胞、及びＣＯＳ−１細胞などを使用することができる。
ウイルスの調製や標的細胞への感染に用いる培地に添加する血清として、一般に動物細胞培養に用いられる血清を用いることができるが、免疫グロブリンを含まないものや低減した血清を用いることが好ましい。また、免疫グロブリンを含まない完全合成培地を使用してもよい。
（２）標的細胞及び抗体
本発明による遺伝子導入細胞の製造方法においては、（ｉ）ウイルスと、（ｉｉ）標的細胞と前記標的細胞に特異的な抗体、及び／又は膜型抗体を含む標的細胞とを接触させることにより標的細胞にウイルスを感染させる。
本発明の方法において遺伝子導入の標的となる標的細胞の種類は特に限定されないが、例えば、幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞（ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）など）、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等）、造血細胞、単核細胞（末梢血単核球細胞、臍帯血単核球細胞等）、胚細胞、プライモディアル・ジャーム・セル（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ）、卵母細胞、卵原細胞、卵子、精母細胞、精子、赤血球系前駆細胞、リンパ球母細胞、成熟血球、リンパ球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、線維芽細胞、神経芽細胞、神経細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝細胞、筋芽細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、横紋筋細胞、心筋細胞、ガン細胞、骨髄腫細胞及び白血病細胞等を使用することができる。また、標的細胞は、ヒト初代細胞、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、又は前記細胞から分化誘導された細胞の何れか一種以上でもよい。好ましい標的細胞としては、末梢血単核球細胞、ヒトＢ細胞、又はヒトＴ細胞などを挙げることができるが、特に限定されない。
血液や骨髄より得られる造血系の細胞は入手が比較的容易であり、またその培養や維持の手法が確立されていることから、本発明の方法において使用するのに好適である。特に導入された遺伝子の生体内での長期にわたる発現が目的の場合には、多能性を有する幹細胞（造血幹細胞、間葉系幹細胞等）や種々の前駆細胞が標的細胞として適している。また、遺伝子治療法をＡＩＤＳの治療に適用する場合には、ＣＤ４陽性Ｔ細胞等の免疫系細胞やその前駆細胞が標的細胞として好適である。
ヒト初代細胞、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又はヒト間葉系幹細胞から選択される標的細胞と、前記標的細胞に特異的な抗体とを含むキットは、上記した本発明による遺伝子導入細胞の製造方法を行うためのキットとして有用である。
本発明においては、（ｉ）ウイルスと、（ｉｉ）標的細胞と前記標的細胞に特異的な抗体、及び／又は膜型抗体を含む標的細胞とをインビトロで接触させる。
標的細胞に特異的な抗体としては、細胞表面に存在する抗原に特異的な抗体を使用することができる。細胞表面に存在する抗原としては、以下のものを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
細胞表面分化抗原（ＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）分類されている抗原）；
クラスＩおよびクラスＩＩの主要組織適合性抗原；
サイトカイン及び成長ホルモン（例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＴＮＦ）、コロニー刺激因子、内皮増殖因子、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、グリア細胞由来神経栄養因子、グリア細胞増殖因子、ｇｒｏ−ｂｅｔａ／ｍｉｐ ２、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、インターフェロン類（α−ＩＦＮ、β−ＩＦＮ、γ−ＩＦＮ、コンセンサスＩＦＮ）、インターロイキン類（ＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−７，ＩＬ−８，ＩＬ−９，ＩＬ−１０，ＩＬ−１１，ＩＬ−１２，ＩＬ−１３，ＩＬ−１４）、角質細胞増殖因子、白血病阻害因子、マクロファージ／単球走化性活性化因子、神経成長因子、好中球活性化プロテイン２、血小板由来成長因子、幹細胞因子、トランスフォーミング増殖因子、腫瘍壊死因子および血管内皮増殖因子）の受容体；
細胞接着分子；
アミノ酸などの代謝物の輸送分子；
Ｂ−およびＴ−リンパ球の抗原受容体；及び
リポタンパク質の受容体がある。
特定の標的細胞と、それに特異的な細胞表面マーカーの組み合わせを以下に示す。
なお、特定の標的細胞と、それに特異的な細胞表面マーカーの組み合わせは、下記以外についても、BioGPS(http://biogps.org/)、又はUniProt (http://www.uniprot.org/)から探索することができる。
多能性幹細胞（ＥＳＣｓ 及び ｉＰＳＣｓ）：ＳＳＥＡ−４，ＳＳＥＡ−３，ＴＲＡ−１−８１，ＴＲＡ−１−６０
造血幹細胞（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：ＨＳＣｓ）：ＣＤ３４，ＣＤ４９，ＣＤ９０／Ｔｈｙ１
多能性前駆細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ：ＭＰＰ）：ＣＤ３４
リンパ系共通前駆細胞（Ｃｏｍｍｏｎ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ：ＣＬＰ）：ＣＤ３４，ＣＤ３８，ＣＤ１０，ＣＤ４５ＲＡ
骨髄球性共通前駆細胞（ｃｏｍｍｏｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ：ＣＭＰ）：ＣＤ３４，ＣＤ３８，ＣＤ１３５
巨核球・赤芽球共通前駆細胞（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ／ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ：ＭＥＰ）：ＣＤ３４，ＣＤ３８
顆粒球／マクロファージ前駆細胞（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ：ＧＭＰ）：ＣＤ３４，ＣＤ３８，ＣＤ４５ＲＡ，ＣＤ１２３，ＣＤ１３５
ＮＫ細胞：ＣＤ５６，ＣＤ９４，ＮＫｐ４６
Ｔ細胞：ＣＤ３
Ｂ細胞：ＣＤ１９
単球：ＣＤ１４
マクロファージ：ＣＤ１１ｂ，ＣＤ６８，ＣＤ１６３
樹状細胞：ＣＤ１１ｃ，ＨＬＡ−ＤＲ
好中球：ＣＤ１１ｂ，ＣＤ１６，ＣＤ１８，ＣＤ３２，ＣＤ４４，ＣＤ５５
好酸球：ＣＤ４５，ＣＤ１２５，ＣＤ１９３，Ｆ４／８０，Ｓｉｇｌｅｃ−８
好塩基球：ＣＤ２２，ＣＤ４５ｌｏｗ，ＣＤ１２３
マスト細胞：ＣＤ３２，ＣＤ３３，ＣＤ１１７，ＣＤ２０３ｃ，ＦｃεＲＩ
巨核球：ＣＤ４１ｂ，ＣＤ４２ａ，ＣＤ４２ｂ，ＣＤ６１
間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＭＳＣ）：ＣＤ４４，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，ＣＤ１４６，ＣＤ２７１
神経幹細胞（Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ：ＮＳＣ）：ＣＤ１５ｍｉｄ，ＣＤ２４，ＣＤ１８４
ニューロン：ＣＤ１５ｌｏｗ，ＣＤ２４
腫瘍：ＣＤ１５，ＣＤ２４，ＣＤ３４，ＣＤ４４，ＣＤ４５，ＣＤ４９ｆ，ＣＤ１６６，ＣＤ３２６，ＣＤ３３８，Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕ，Ｌｇｒ５
本発明においては、細胞表面に存在する抗原として、分化抗原を使用することにより、細胞型の特異的感染が可能になる。
本発明の一例においては、標的細胞が、ヒトＴ細胞であり、標的細胞に特異的な抗体が、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ８ａ抗体及び抗ヒトＣＤ１１ａ抗体から選択される少なくとも一以上である。
本発明の別の例においては、標的細胞が、ヒトＢ細胞であり、ＩＬ−４、ＯＤＮ ２００６、ＣＤ４０受容体を介した刺激、及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激から選択される少なくとも一以上の存在下において前記ウイルスと前記標的細胞とをインビトロで接触させることができる。これにより、細胞の増殖を誘導したり、細胞を活性化することができる。
本発明のさらに別の例においては、標的細胞が、ヒト間葉系幹細胞であり、標的細胞に特異的な抗体が、抗ヒトＣＤ９０抗体である。
（３）標的細胞へのウイルスの感染
本発明によれば、目的遺伝子を標的細胞へ導入することができる。 即ち、本発明による遺伝子導入細胞の製造方法は、遺伝子導入方法として利用することができる。
本発明においては、標的細胞にウイルスをインビトロで接触させて感染させることができる。ウイルスに感染した標的細胞は通常の条件下で培養することによって、導入した遺伝子を発現させることができる。即ち、標的細胞を培養液中において培養することにより、導入された外来遺伝子によってコードされるタンパク質を得ることができる。あるいは、インビトロで形質導入された標的細胞を被験者に移植することもできる。
本発明による遺伝子導入細胞の製造方法により得られる遺伝子導入細胞、即ち、上記した本発明のウイルスが感染している遺伝子導入細胞も本発明の範囲内のものである。
（４）遺伝子治療剤
本明細書に記載したウイルスは遺伝子治療剤の有効成分として有用である。即ち、本発明によれば、本明細書に記載したウイルスを含む遺伝子治療剤が提供される。より具体的には、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質と、外来遺伝子とを含むウイルスであって、抗体結合タンパク質が、プロテインLのIgG結合ドメインを含むか、及び／又はプロテインAのIgG結合ドメインを３個以上含む、ウイルスを含む遺伝子治療剤が提供される。本発明の遺伝子治療剤は、有効成分であるウイルスと組み合せて、薬学上許容できる担体又は希釈剤等のその他の成分を含んでいてもよい。本明細書に記載したウイルスを含む遺伝子治療剤を被験者（患者など）に投与することを含む遺伝子治療方法も本発明の範囲内である。
本発明においては、本発明の遺伝子治療剤と、所望により抗体とを、被験者に直接投与してもよい。被験者に対する投与経路は、ウイルスと標的細胞とが接触できる限り、特に限定されず、任意の投与経路を採用できる。例えば、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、循環系または造血系の標的細胞については、静脈投与が適切である。ウイルスは、標的器官につながる動脈または静脈へのカテーテル注入によって投与することもでき、それによれば局所投与が可能である。標的細胞が呼吸器系である場合には、ウイルスは吸気によって投与することもできる。
本発明の遺伝子治療剤の投与量は、ウイルスに含まれる外来遺伝子の種類、治療対象である疾患の種類及び投与部位、重篤度、並びに患者の年齢、体重、性別及び健康状態などに応じて、当業者が適宜選択することができる。ウイルスの力価としては、１０の５乗cfu/mlより大きい力価を有することが好ましく、さらに好ましくは１０の６乗cfu/mlより大きい力価を有することが好ましく、さらに好ましくは１０の７乗cfu/mlよ り大きい力価を有することが好ましく、さらに好ましくは１０の８乗cfu/mlより大きい力価を有することが好ましく、さらに好ましくは１０の９乗cfu/mlより大きい力価を有することが好ましく、さらに好ましくは１０の１０乗cfu/mlより大きい力価を有することが好ましく、さらに好ましくは１０の１１乗cfu/mlより大きい力価を有することが好ましい。本発明のウイルスは、物理的に強く超遠心により容易に濃縮が可能である。
本発明の遺伝子治療剤を患者に投与することによって、標的領域における所定の細胞に導入された遺伝子は上記細胞の染色体に組み込まれ、外来遺伝子を安定的に発現させることができる。この遺伝子導入方法を利用して、ヒト等の霊長類を含む哺乳動物の各種疾患について遺伝子治療を実施することが可能である。
例えば、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を標的細胞とした遺伝子治療法は、以下の手順で行うことができる。ドナーよりＣＤ４陽性Ｔ細胞を含有する材料として、例えば、骨髄組織、末梢血液、又は臍帯血液等を採取する。採取した材料はそのまま遺伝子導入に用いてもよいが、密度勾配遠心分離等の方法により単核細胞画分を調製することができる。さらにＣＤ４分子を指標とした細胞の精製、ＣＤ８陽性Ｔ細胞および／または単球の除去、ならびにＣＤ４陽性Ｔ細胞数を拡大する培養操作を行うこともできる。これらの細胞集団について、必要に応じて予備刺激（例えばＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンド、またはＩＬ−２による刺激）を行った後、本発明の方法により、外来遺伝子を搭載したウイルスを感染させる。上記により得られた遺伝子導入細胞は、例えば、静脈内投与によってレシピエントに移植することができる。レシピエントは、好ましくはドナー自身であるが、同種異系移植を行うことも可能である。
造血幹細胞を標的とした遺伝子治療法としては、患者において欠損しているか、異常が見られる遺伝子を補完するものがあり、例えば、ＡＤＡ欠損症やゴーシェ病の遺伝子治療法などを挙げることができる。この他、例えば、ガンや白血病の治療に使用される化学療法剤による造血細胞の障害を緩和するために、造血幹細胞への薬剤耐性遺伝子の導入を行うことも挙げられる。
癌の遺伝子治療法としては、腫瘍抗原を認識するＴ細胞レセプターをコードする遺伝子を導入することにより、リンパ球に当該抗原を発現する癌細胞に対する特異的な細胞傷害活性を付与する方法が研究されている。さらに、ＡＩＤＳを遺伝子治療法によって治療しようという試みも行われている。この場合には、ＡＩＤＳの原因であるＨＩＶが感染するＣＤ４陽性Ｔ細胞等のＴ細胞に、ＨＩＶの複製や遺伝子発現を妨げるような核酸分子（一本鎖特異的エンドリボヌクレアーゼ、アンチセンス核酸、リボザイム等）をコードする遺伝子を導入することが考えられている。
以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。遺伝子操作について特に記述のないものに関しては代表的な方法に従った（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ， Ｅ．Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ ， ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。細胞培養について特に記述のないものに関しては代表的な方法に従った（小山 秀機編集「細胞培養ラボマニュアル」シュプリンガー・フェアラーク東京 第１判）。商品名を記載している場合は特に記載のない限り添付の説明書の指示に従った。
（実施例１）抗体結合タンパク質とＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルスＧ）タンパク質とのキメラエンベロープタンパク質発現ベクター作製
ｐＶＳＶ−Ｇ（クロンテック社）をＸｈｏＩで部分消化（消化箇所が２箇所以上あるが全部が消化されないように処理している）後、平滑化、電気泳動し約６５００ｂｐのバンドを回収し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ.２．１（タカラバイオ社）を用いてライゲーションし、ＶＳＶ−ＧのＯＲＦ下流のＸｈｏ Ｉ部位がＰｖｕＩに変換されたプラスミド（ｐＶＳＶ-Ｇ（ｂａｃｋ ＸｈｏＩ ｔｏ ＰｖｕＩ））を作製した。配列番号１及び配列番号２を全合成し、ＸｈｏＩとＳｗａＩで消化後、電気泳動しそれぞれ約５５０ｂｐのバンド及び約５６０ｂｐのバンドを回収、精製した。ｐＶＳＶ-Ｇ（ｂａｃｋ ＸｈｏＩ ｔｏ ＰｖｕＩ）をＸｈｏＩとＳｗａＩで消化し、脱リン酸化処理後、電気泳動し約６４００ｂｐのバンドを回収、精製した。配列番号１及び配列番号２由来の断片それぞれとｐＶＳＶ−Ｇ（ｂａｃｋ ＸｈｏＩ ｔｏ ＰｖｕＩ）由来の断片をライゲーションしプラスミドｐＰＡ２ｄ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＰＧ２ｄ−ＶＳＶ−Ｇを作製した（図１）。ライゲーションしたプラスミドを用い大腸菌ＪＭ１０９（ＴＯＹＯＢＯ社）を形質転換し最終濃度１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む２×ＹＴ寒天培地及び２×ＹＴ培地で培養し、配列解析やプラスミド調製を行なった。プラスミドの精製は、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）やＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉ（タカラバイオ社）を用いた。
ｐＣＩ−ｎｅｏ（プロメガ社）をＣｌａＩで消化後、電気泳動し約３５００ｂｐのバンドを回収、精製、ライゲーションし、ｐＣＩを作製した。ｐＣＩをＥｃｏＲＩで十分に消化（消化箇所が複数ありが全部が完全に消化されるように処理している）し、脱リン酸化処理後、電気泳動し約３５００ｂｐのバンドを回収、精製した。ｐＶＳＶ−ＧをＥｃｏＲＩで十分に消化後、電気泳動し約２８００ｂｐのバンドを回収、精製した。ｐＣＩ由来の断片とｐＶＳＶ−Ｇ由来の断片をライゲーションし、ＣＭＶプロモーター側に開始コドンが挿入されたプラスミドを選択し、ｐＣＩ−ＶＳＶ−Ｇを作製した（図１）。ｐＣＩ−ＶＳＶ−ＧをＸｈｏＩとＳｗａＩで消化し、脱リン酸化処理後、電気泳動し約５０００ｂｐのバンドを回収、精製した。配列番号３及び配列番号４を全合成し、ＸｈｏＩとＳｗａＩで消化後、電気泳動しそれぞれ約１８０ｂｐ及び約２２０ｂｐのバンドを回収、精製した。ｐＣＩ−ＶＳＶ−Ｇ由来の断片と配列番号３及び配列番号４由来の断片をそれぞれライゲーションし、ｐＣＩ−ＳＰ−ＶＳＶ−Ｇ及びｐＣＩ−ＳＰ−ＧＳ２−ＶＳＶ−Ｇを作製した（図１）。ＨＭＭ−３８ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅはBiochem Biophys Res Commun. 2002 Jun 21;294(4):835-42.を参照した。
ｐＣＩ−ＳＰ−ＧＳ２−ＶＳＶ−ＧをＮａｅＩで消化し、脱リン酸化処理後、電気泳動し約５７００ｂｐのバンドを回収、精製した。配列番号５及び配列番号６及び配列番号７を全合成しそれぞれＥｈｅＩ、ＮａｅＩ及びＳｃａＩ、ＳａｃＩ及びＭｌｙＩ、ＮａｅＩで消化後、電気泳動しそれぞれ約５００ｂｐ及び約５８０ｂｐ及び約６２０ｂｐのバンドを回収、精製した。ｐＣＩ−ＳＰ−ＧＳ２ ＶＳＶ−Ｇ由来の断片と配列番号５及び配列番号６及び配列番号７由来の断片をそれぞれライゲーションし、ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＡ３ｄ−ＧＳ２−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＧ３ｄ−ＧＳ２−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＬ３ｄ−ＧＳ２−ＶＳＶ−Ｇを作製した（図１）。配列番号５及び／又は配列番号７由来の断片を直鎖状 ＤＮＡを生成するライゲーションし、目的のバンドを回収、精製しｐＣＩ−ＳＰ−ＧＳ２−ＶＳＶ−Ｇ由来の断片とライゲーションし、プロモーターに対して正しい方向に挿入された断片を選抜することにより、ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＡ６ｄ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＡ９ｄ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＡ１２ｄ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＬ６ｄ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＬ９ｄ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＬ１２ｄ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＡ３ｄ-ＰＬ３ｄ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＬ３ｄ-ＰＡ３ｄ−ＶＳＶ−Ｇを得た（図２）。
（実施例２）ベクタープラスミドの作製
細胞への感染効率を測定するレンチウイルスベクタープラスミドとして、ＣＳＩＶ−ＣＭＶ−Ｖｅｎｕｓを用いた。ＣＳＩＶ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ２−Ｖｅｎｕｓ（Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ. ２０１４ Ａｐｒ；１０５４：４０２−８．）をＢａｌＩで部分消化し、Ａｏｒ５１ＨＩで消化後、電気泳動し約９０３０ｂｐのバンドを回収、精製、ライゲーションし、ＣＳＩＶ−ＣＭＶ−Ｖｅｎｕｓを作製した。レンチウイルス作製時に用いる、パッケージングプラスミドとしては、３ｒｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐＬｅｎｔｉ−Ｃｏｍｂｏ Ｍｉｘ（アプライドバイオロジカル社）のｐＬｅｎｔｉ−Ｐ３Ａ（ｇａｇ、ｐｏｌのパッケージングプラスミド）及びｐＬｅｎｔｉ−Ｐ３Ｂ（ｒｅｖのパッケージングプラスミド）を用いた。ｅｎｖのパッケージングプラスミドとしては実施例１に記載のパッケージングプラスミドを用いた。
細胞への感染効率を測定するレトロウイルスベクタープラスミドとして、ｐＭＳＣＶ−ｂａｃｔ−Ｖｅｎｕｓ−ｗｐｒｅを用いた。ｐＭＳＣＶ−ｎｅｏ−ｂａｃｔ−ｆＥＰＯ−ｗｐｒｅ（特許第５１９８７４７号）をＮｏｔＩで消化後、電気泳動し約６２００ｂｐのバンドを回収、精製、ライゲーションし、ｐＭＳＣＶ−ｂａｃｔ−ｆＥＰＯ−ｗｐｒｅを作製した。ｐＭＳＣＶ−ｂａｃｔ−ｆＥＰＯ−ｗｐｒｅをＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、脱リン酸化処理後、電気泳動し約５０５０ｂｐのバンドを回収、精製した。ＣＳＩＶ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ２−Ｖｅｎｕｓを鋳型とし、配列番号８、配列番号９プライマーとしてＰＣＲにより増幅した断片をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）により精製、回収しＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、電気泳動し約７９０ｂｐのバンドを回収、精製した。ｐＭＳＣＶ−ｂａｃｔ−ｆＥＰＯ−ｗｐｒｅ由来の断片とＣＳＩＶ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ２−Ｖｅｎｕｓ由来の断片をライゲーションし、ｐＭＳＣＶ−ｂａｃｔ−Ｖｅｎｕｓ−ｗｐｒｅを作製した。
（実施例３）フィーダー細胞の作製
ヒトＢ細胞培養のためヒトＣＤ４０リガンドとヒトＢＡＦＦを発現するフィーダー細胞を作製した。ヒトＣＤ４０リガンド（例えば、Eur J Immunol. 1992 Dec;22(12):3191-4.及び、EMBO J. 11 (12), 4313-4321 (1992)、NCBI Reference Sequence: NM_000074）参照）を及びヒトＢＡＦＦ（例えば、J Exp Med. 1999 Jun 7;189(11):1747-56. 、Science. 1999 Jul 9;285(5425):260-3. 、NCBI Reference Sequence: NM_006573）は文献情報等を元に全合成した。ｐＭＳＣＶ−ｂａｃｔ−ｆＥＰＯ−ｗｐｒｅをＮｏｔＩとＣｌａＩで消化し、脱リン酸化処理後、電気泳動し約５０００ｂｐのバンドを回収、精製した。配列番号１０、配列番号１１の５’末端をリン酸化した１本鎖ＤＮＡを合成し、混合し熱処理後、穏やかに冷却し２本鎖ＤＮＡとし、ｐＭＳＣＶ−ｂａｃｔ−ｆＥＰＯ−ｗｐｒｅ由来の断片とライゲーションし、ｐＭＳＣＶ−ＭＣＳ−ｗｐｒｅを作製した。ｐＭＳＣＶ−ＭＣＳ−ｗｐｒｅをＮｏｔＩとＸｈｏＩで消化し、脱リン酸化処理後、電気泳動し約５１００ｂｐのバンドを回収、精製した。ＣＳＩＶ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ２−ＶｅｎｕｓをＮｏｔＩとＸｈｏＩで消化後、電気泳動し約１３００ｂｐのバンドを回収、精製した。ｐＭＳＣＶ−ＭＣＳ−ｗｐｒｅ由来の断片とＣＳＩＶ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ２−Ｖｅｎｕｓ由来の断片をライゲーションし、ｐＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ２−Ｖｅｎｕｓ−ｗｐｒｅを作製した。ｐＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ２−Ｖｅｎｕｓ−ｗｐｒｅをＮｏｔＩとＥｃｏＲＩで消化し、脱リン酸化処理後、電気泳動し約５０００ｂｐのバンドを回収、精製した。ＣＳＩＶ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ２−Ｖｅｎｕｓを鋳型とし、配列番号１２、配列番号１３をプライマーとしてＰＣＲにより増幅後、電気泳動し約１３００ｂｐのバンドを回収、精製した。合成したヒトＣＤ４０リガンドｃＤＮＡを鋳型として、配列番号１４、配列番号１５をプライマーとしてＰＣＲにより増幅後、電気泳動し約８３０ｂｐのバンドを回収、精製した。約１３００ｂｐのバンドと約８３０ｂｐのバンドを鋳型として、配列番号１２、配列番号１５をプライマーとしてＰＣＲにより増幅後、精製した。これをＮｏｔＩとＥｃｏＲＩで消化し、電気泳動し約１４００ｂｐのバンドを回収、精製し、ｐＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ２−Ｖｅｎｕｓ−ｗｐｒｅ由来の断片とライゲーションし、ｐＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ２−ＣＤ４０Ｌ−ｗｐｒｅを作製した。ｐＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ２−ＣＤ４０Ｌ−ｗｐｒｅをＮｏｔＩで消化し、脱リン酸化処理後、電気泳動し約６４００ｂｐのバンドを回収、精製した。合成したヒトＢＡＦＦｃＤＮＡを鋳型として、配列番号１６、配列番号１７をプライマーとしてＰＣＲにより増幅後、精製し、ＮｏｔＩで消化し、電気泳動し約９００ｂｐのバンドを回収、精製しｐＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ２−ＣＤ４０Ｌ−ｗｐｒｅ由来の断片とライゲーションし、５`ＬＴＲプロモーター側にヒトＢＡＦＦの開始コドンが挿入されたプラスミドを選択し、ｐＭＳＣＶ−ＢＡＦＦ−ＩＲＥＳ２−ＣＤ４０Ｌ−ｗｐｒｅを作製した。特許第５１９８７４７号に従って、レトロウイルスベクターを作製し、Ｂａｌｂ/c ３Ｔ３細胞に感染させた。ＢＡＦＦの発現はＨｕｍａｎ ＢＡＦＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＣＤ４０Ｌの発現はＦＩＴＣ ａｎｔｉ-ｈｕｍａｎ ＣＤ１５４ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（バイオレジェンド社）を用いてフローサイトメーターで評価した。ＢＡＦＦとＣＤ４０Ｌの発現を指標にクローン化してｈ４０ＬＢとした。
（実施例４）ｓＣＤ４０Ｌ、ｓＢＡＦＦの調製
Ｅ. ｃｏｌｉ ＨＳＴ０４ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社）をｐＩＲＥＳ（タカラバイオ社）で形質転換し、最終濃度１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む２×ＹＴ培地で培養し、プラスミド調製を行なった。ｐＩＲＥＳをＣｌａＩで消化後、電気泳動し約４１００ｂｐのバンドを回収、精製、ライゲーションし、ｄｐＩＲＥＳを作製した。ｄｐＩＲＥＳをＳｍａＩで完全に消化し、脱リン酸化処理後、電気泳動し約４１００ｂｐのバンドを回収、精製した。ｐＬＶＳＩＮ−ＥＦ１α Ｐｕｒ（タカラバイオ社）を鋳型とし、配列番号１８、配列番号１９をプライマーとしてＰＣＲにより増幅した断片を精製、回収し、リン酸化後、電気泳動し約６００ｂｐのバンドを回収、精製した。ｄｐＩＲＥＳ由来の断片とｐＬＶＳＩＮ−ＥＦ１α Ｐｕｒ由来の断片をライゲーションし、ＩＲＥＳ側に開始コドンが挿入されたプラスミドを選択しｄｐＩＲＥＳ−Ｐｕｒを作製した。ｄｐＩＲＥＳ−ＰｕｒをＸｈｏＩとＭｌｕＩで消化し、脱リン酸化処理後、電気泳動し約４７００ｂｐのバンドを回収、精製した。配列番号２０、配列番号２１の５’末端をリン酸化した１本鎖ＤＮＡを合成し、混合し熱処理後、穏やかに冷却し２本鎖ＤＮＡとし、ｄｐＩＲＥＳ−Ｐｕｒ由来の断片とライゲーションし、ｄｐＣＭＶ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒを作製した。配列番号２２を全合成し、ＮｈｅＩとＥｃｏＩで消化後、電気泳動しそれぞれ約９００ｂｐのバンドを回収、精製した。ｄｐＣＭＶ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒをＮｈｅＩとＥｃｏＩで消化し、脱リン酸化処理後、電気泳動し約４７００ｂｐのバンドを回収、精製した。配列番号２２由来の断片とｄｐＣＭＶ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒ由来の断片をライゲーションし、ｄｐＣＭＶ−ｓＣＤ４０Ｌ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒを作製した。ｄｐＣＭＶ−ｓＣＤ４０Ｌ ＩＲＥＳ−Ｐｕｒを用いて２９３Ｔ細胞を形質転換し、ピューロマイシン存在下で安定発現細胞を選択し２９３Ｔ（ｓＣＤ４０Ｌ）をクローン化した。２９３Ｔ（ｓＣＤ４０Ｌ）を２９３ ＳＦＭ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）（２×ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含む）で培養し、上清をＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｃｏｌｕｍｎ（ＩＢＡ社）で精製した。溶出した精製溶液はＶｉｖａｓｐｉｎ Ｔｕｒｂｏ １５ （ＭＷＣＯ：１０，０００）（ザルトリウス社）を用いてＰＢＳに置換した（精製ｓＣＤ４０Ｌ）。配列番号２３を全合成し、同様の実験を行うことによって、精製ｓＢＡＦＦを得ることができる。ＣＤ４０ＬやＢＡＦＦはＴＮＦスーパーファミリーに属するホモ三量体のII型膜タンパク質である。ＣＤ４０ＬやＢＡＦＦの細胞外領域と配列番号２４のコイルドコイル配列(Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 1995 Apr 29;348(1323):81-8.)を融合させることにより、活性型の三量体タンパク質として生産することができる。
（実施例５）血液からの細胞分離
血液の使用は社内の倫理委員会によって承認され、インフォームドコンセントを条件として行なった。医師・看護師によりテルモ血液バッグＣＰＤＡ（テルモ社）に採血し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ Ｔｕｂｅ （ｔｕｂｅ ｓｉｚｅ： ５０ｍＬ）（Ａｌｅｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＡＳ社）を用いて単核球分離を行ないＰＢＭＣとした。常法により、ビオチン−抗ヒトＣＤ２抗体(バイオレジェンド社）、ビオチン−抗ヒトＣＤ２３５ａ抗体(ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社)を反応させ、ＣＤ２、ＣＤ２３５陰性の細胞を、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｌｕｓ−ＤＭ、ＢＤ ＩＭａｇｎｅｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いて回収した。これに、常法によりＰＥ/Ｃｙ７抗ヒトＣＤ１９抗体を反応させ、ＡＲＩＡIII（ＢＤ バイオサイエンス社）でＣＤ１９陽性の細胞ソーティングし、ヒトＢ細胞を得た。これを、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ２（タカラバイオ社）で凍結保存し、凍結Ｂ細胞とした。また、採血した血液をＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてＢ細胞を分離し新鮮Ｂ細胞とした。
（実施例６）ｐＶＳＶ−Ｇ、ｐＣＩ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＣＩ−ＳＰ−ＶＳＶ−Ｇの評価
２９３Ｔ細胞をコラーゲンコートした２４ウェルプレートに６×１０5となるように播種し、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと１０％ＦＢＳを含む）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で一晩培養した。翌日、０．５ ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳを含む）に交換し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてＣＳＩＶ−ＣＭＶ−Ｖｅｎｕｓを０．５ μｇ及びｐＬｅｎｔｉ−Ｐ３Ａを０．５ μｇ及びｐＬｅｎｔｉ−Ｐ３Ｂを０．５ μｇと、エンベロープタンパク質発現ベクター（ｐＶＳＶ−Ｇ、ｐＣＩ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＣＩ−ＳＰ−ＶＳＶ−Ｇ）をトランスフェクションした。エンベロープタンパク質発現ベクターは、２μｇから１／６４μｇで検討した。トランスフェクションから４時間後に２ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳを含む）に交換し２日間培養しレンチウイルスベクターを作製した。作製したレンチウイルスベクターは０．８μｍのフィルターでろ過してウイルス上清液ストックとし、１ｍＬずつを２４ウェルプレートに２×１０5で播種した２９３Ｔ細胞に一晩感染させた。翌日培地交換し、感染から２日後にＡｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で剥離させた細胞をヨウ化プロピジウム溶液（ＳＩＧＭＡ社）で染色後、フローサイトメーターで解析し、感染時細胞数（２×１０5）×生細胞Ｖｅｎｕｓ陽性／総生細胞から力価（ｔｉｔｅｒ (ＴＵ／ｍｌ））を算出した。ＶＳＶ-Ｇベクター濃度と力価の関係の結果を図３に示す。どのＶＳＶ−Ｇベクターでもウイルスが産生するが、至適ベクター濃度が異なった。これは、ベクター毎にＶＳＶ−Ｇの発現量が異なるためで、各ベクターの発現量はｐＣＩ−ＶＳＶ−Ｇ＜ｐＣＩ−ＳＰ−ＶＳＶ−Ｇ＜ｐＶＳＶ−Ｇと推察される。ウイルス力価はｐＶＳＶ−Ｇ（１／１６ μｇ／２４ ウェルプレート)、ｐＣＩ−ＳＰ−ＶＳＶ−Ｇ（１／２ μｇ／２４ ウェルプレート)、ｐＣＩ−ＶＳＶ−Ｇ（１ μｇ／２４ ウェルプレート)で高くなっため、ｐＣＩ−ＶＳＶ−ＧはｐＶＳＶ−Ｇの１／１６前後、ｐＣＩ−ＳＰ−ＶＳＶ−ＧはｐＶＳＶ−Ｇの１／８前後の発現量であると推察される。
（実施例７）抗体結合タンパク質（プロテインＡ：ＰＡ、プロテインＧ：ＰＧ、プロテインＬ：ＰＬ）とＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルスＧ）タンパク質のキメラエンベロープタンパク質発現ベクターの評価
レンチウイルスベクターの作製と力価測定は、実施例６と同様に行なった（図４）。但し、エンベロープタンパク質発現ベクターは、表１のような量比で用いた。Ｂ細胞への感染検討は、凍結Ｂ細胞を１．２５×１０の５乗となるように遠心分離し、ウイルス上清液（ＩＬ−４ ５０ ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−２ ２５ Ｕ／ｍＬ、ｓＣＤ４０Ｌ ４００ ｎｇ／ｍＬ、ｓＢＡＦＦ １００ ｎｇ／ｍＬを含む）１ ｍＬで懸濁し２４ウェルプレートに播種し一晩感染させた。翌日、細胞を遠心分離し、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０（２％ ＦＢＳ、ＩＬ−４ ５０ ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−２ ２５ Ｕ／ｍＬ、ｓＣＤ４０Ｌ ４００ ｎｇ／ｍＬ、ｓＢＡＦＦ １００ ｎｇ／ｍＬ、Ａ２８６９８２ ２ μＭ) に懸濁し培養を続けた。３日後、細胞を遠心分離し、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０（２％ ＦＢＳ、ＩＬ−２１ １０ ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−２ ２５ Ｕ／ｍＬ、ｓＣＤ４０Ｌ ４００ ｎｇ／ｍＬ、ｓＢＡＦＦ １００ ｎｇ／ｍＬ、Ａ２８６９８２ ２ μＭ)に懸濁し培養を続けた。３日後、ヨウ化プロピジウム溶液染色後、フローサイトメーターで解析し、Ｖｅｎｕｓ陽性細胞の割合い（％）を算出した。結果を図４に示す。ＰＡ又はＰＬとＶＳＶ−Ｇタンパク質のキメラエンベロープタンパク質発現ベクターを用いることにより、Ｂ細胞への感染効率が顕著に増加している。ＰＧとＶＳＶ−Ｇタンパク質のキメラエンベロープタンパク質発現ベクターでは、ｐＶＳＶ−ＧよりもＢ細胞への感染効率は低下した。また、ＰＡでドメイン数を、２ドメインから３ドメインに増やすことにより力価あたりの感染効率が約１．８倍に増加した。
（実施例８）抗体結合タンパク質のドメイン数と感染効率の評価
２９３Ｔ細胞をコラーゲンコートした１２ウェルプレートに１．１×１０6となるように播種し、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ１６４０培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと１０％ＦＢＳを含む）で一晩培養した。翌日、１ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ１６４０培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ＩｇＧ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含む）に交換し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００ Ｒｅａｇｅｎｔを用いてＣＳＩＶ−ＣＭＶ−Ｖｅｎｕｓを１ μｇ及びｐＬｅｎｔｉ−Ｐ３Ａを１μｇ及びｐＬｅｎｔｉ−Ｐ３Ｂを１μｇとｐＶＳＶ−Ｇを０．１２５μｇとキメラエンベロープタンパク質発現ベクター０．２５μｇをトランスフェクションした。トランスフェクションから４時間後に５ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ１６４０培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ＩｇＧ）を含む）に交換し２日間培養しレンチウイルスベクターを作製した。作製したレンチウイルスベクターは０．８μｍのフィルターでろ過してウイルス上清液ストックとした。２４ウェルプレートに２９３Ｔ細胞を１．３×１０5で播種し、１ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳを含む）で培養した。これに、０．２ｍＬずつのウイルス上清液ストックを添加し一晩感染させた。翌日培地交換し、感染から５日後にＡｃｃｕｍａｘで剥離させた細胞をヨウ化プロピジウム溶液で染色後、フローサイトメーターで解析し、感染時細胞数（１．３×１０5）×生細胞Ｖｅｎｕｓ陽性／総生細胞から力価（ｔｉｔｅｒ (ＴＵ／ｍｌ））を算出した。抗体結合タンパク質のドメイン数と力価の関係の結果を図５に示す。凍結Ｂ細胞をＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ１６４０（２％ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ＩｇＧ）、ＩＬ−４ ５０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−２ ２５Ｕ／ｍＬ、ｓＣＤ４０Ｌ ４００ｎｇ／ｍＬ、ｓＢＡＦＦ １００ｎｇ／ｍＬ、Ａ２８６９８２ ２μＭを含む)で２日間培養した。これを遠心分離し、５０００個のＢ細胞にウイルス上清液ストック１ｍＬを感染させた。２時間後遠心分離し、Ｂ細胞をフィーダー細胞（前日に２４ウェルプレートに１×１０5となるように播種したｈ４０ＬＢ）上に播種し、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ１６４０（２％ ＦＢＳ、ＩＬ−２１ １０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−２ ２５Ｕ／ｍＬを含む)で培養した。５日後、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で細胞を剥離、遠心分離した。これに常法により、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗ヒトＣＤ１９抗体を反応させ、ヨウ化プロピジウム溶液染色後、フローサイトメーターで解析し、ＣＤ１９陽性細胞をＢ細胞として、生存Ｂ細胞中のＶｅｎｕｓ陽性Ｂ細胞の割合い（％）を算出した。抗体結合タンパク質のドメイン数とＢ細胞への感染効率の結果を図５に示す。ｐＶＳＶ−Ｇでは、感染効率は１％未満であったが、キメラエンベロープタンパク質ではどのドメイン数でも６％以上の感染効率を示した。ＰＬとＰＡを組み合わせたものでも、Ｂ細胞への感染効率は７％以上であった。ＰＡ、ＰＬどちらにおいても、６〜１２ドメインで３ドメインより高いＢ細胞への感染効率を示した。
（実施例９）ＶＳＶ−Ｇベクターとキメラエンベロープタンパク質発現ベクターとの比率の評価
２９３Ｔ細胞をコラーゲンコートした２４ウェルプレートに６×１０5となるように播種し、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと１０％ＦＢＳを含む）で一晩培養した。翌日、０．５ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ＩｇＧ）と１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含む）に交換し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００ Ｒｅａｇｅｎｔを用いてＣＳＩＶ−ＣＭＶ−Ｖｅｎｕｓを０．５μｇ及びｐＬｅｎｔｉ−Ｐ３Ａを０．５μｇ及びｐＬｅｎｔｉ−Ｐ３Ｂを０．５μｇと、エンベローププラスミドを表２、３、４の量比でトランスフェクションした。トランスフェクションから４時間後に２ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ＩｇＧ）と１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む）に交換し２日間培養しレンチウイルスベクターを作製した。作製したレンチウイルスベクターは０．８μｍのフィルターでろ過してウイルス上清液ストックとした。１０μＬずつを２４ウェルプレートに５×１０5で播種した２９３Ｔ細胞に一晩感染させた（２ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳを含む）で培養）。翌日培地交換し、感染から２日後にＡｃｃｕｍａｘで剥離させた細胞をヨウ化プロピジウム溶液で染色後、フローサイトメーターで解析し、感染時細胞数（５×１０5）×生細胞Ｖｅｎｕｓ陽性／総生細胞から力価（ｔｉｔｅｒ (ＴＵ／ｍｌ））を算出した。表２、３、４の結果を図６、７、８に示す。凍結Ｂ細胞を５×１０4となるように遠心分離し、ウイルス上清液（ＩＬ−４ ５０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−２ ２５Ｕ／ｍＬ、ｓＣＤ４０Ｌ ４００ｎｇ／ｍＬ、ｓＢＡＦＦ １００ｎｇ／ｍＬを含む）１ｍＬで懸濁し２４ウェルプレートに播種し一晩感染させた。これを遠心分離し、Ｂ細胞をフィーダー細胞（前日に２４ウェルプレートに１×１０5となるように播種したｈ４０ＬＢ）上に播種し、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ１６４０（２％ ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ＩｇＧ）、ＩＬ−２１ １０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−２ ２５Ｕ／ｍＬを含む)で培養した。５日後、Ａｃｃｕｔａｓｅで細胞を剥離、遠心分離した。これに常法により、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗ヒトＣＤ１９抗体とＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１抗マウスＨ−２Ｋｄ抗体を反応させ、ヨウ化プロピジウム溶液染色後、フローサイトメーターで解析し、ヒトＣＤ１９陽性、マウスＨ−２Ｋｄ陰性細胞をＢ細胞として、生存Ｂ細胞中のＶｅｎｕｓ陽性Ｂ細胞の割合い（％）を算出した。表２、３、４の結果を図６、７、８に示す。図６からキメラエンベロープベクターの比率が増えるに連れてウイルス力価が低下する傾向が見られる。一方で、Ｂ細胞への感染は、ｐＶＳＶ−Ｇ：ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＬ６ｄ−ＶＳＶ−Ｇが６４：３２で最大となった。実施例６（図３）の結果から、ｐＣＩ−ＳＰ−ＶＳＶ−ＧはｐＶＳＶ−Ｇの１／８前後であったため、ウイルスベクター上でＶＳＶ−Ｇタンパク質：キメラエンベロープタンパク質が１６：１前後でＢ細胞への感染効率が高いと推定される。図７でｐＶＳＶ−Ｇとキメラエンベロープベクターの比率をより細かく調べた。ｐＶＳＶ−Ｇ：ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＡ６ｄ−ＶＳＶ−Ｇでは５：５、ｐＶＳＶ−Ｇ：ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＬ６ｄ−ＶＳＶ−Ｇでは５：４でＢ細胞への感染効率が最大となった。ｐＶＳＶ−Ｇ：ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＡ６ｄ−ＶＳＶ−Ｇでは、ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＡ６ｄ−ＶＳＶ−Ｇの比率がもっと多くてもよい可能性がある。図８でｐＣＩ−ＳＰ−ＶＳＶ−Ｇとキメラエンベロープベクターの比率を調べた。ｐＣＩ−ＳＰ−ＶＳＶ−Ｇ：ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＡ６ｄ−ＶＳＶ−Ｇでは１６：８、ｐＣＩ−ＳＰ−ＶＳＶ−Ｇ：ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＬ６ｄ−ＶＳＶ−Ｇでは１６：２でＢ細胞への感染効率が最大となった。ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＡ６ｄ−ＶＳＶ−Ｇでは、ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＬ６ｄ−ＶＳＶ−Ｇに比べてより多くのベクター量が必要となる。
（実施例１０）抗体を介したＴ細胞への感染評価
２９３Ｔ細胞をコラーゲンコートした６ウェルプレートに３×１０6となるように播種し、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと１０％ＦＢＳを含む）で一晩培養した。翌日、２ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ＩｇＧ）とを含むと１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む）に交換し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００ Ｒｅａｇｅｎｔを用いてＣＳＩＶ−ＣＭＶ−Ｖｅｎｕｓを２．５μｇ及びｐＬｅｎｔｉ−Ｐ３Ａを２．５μｇ及びｐＬｅｎｔｉ−Ｐ３Ｂを２．５μｇと、ｐＶＳＶ−Ｇを０．６２５μｇ、又はｐＶＳＶ−Ｇを０．６２５μｇとｐＣＩ−ＳＰ−ＰＡ６ｄ−ＧＳ２−ＶＳＶ−Ｇ、又はｐＶＳＶ−Ｇを０．６２５μｇとｐＣＩ−ＳＰ−ＰＬ６ｄ−ＧＳ２−ＶＳＶ−Ｇを０．６２５μｇをトランスフェクションした。トランスフェクションから４時間後に１２ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ＩｇＧ）と１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む）に交換し２日間培養しレンチウイルスベクターを作製した。作製したレンチウイルスベクターは０．８μｍのフィルターでろ過してウイルス上清液ストックとした。１０μＬずつを２４ウェルプレートに５×１０5で播種した２９３Ｔ細胞に一晩感染させた（２ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳを含む）で培養）。翌日培地交換し、感染から５日後にＡｃｃｕｍａｘで剥離させた細胞をＤＲＡＱ７（ＢｉｏＳｔａｔｕｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）で染色後、フローサイトメーターで解析し、感染時細胞数（５×１０5）×生細胞Ｖｅｎｕｓ陽性／総生細胞から力価（ｔｉｔｅｒ (ＴＵ／ｍｌ））を算出した。結果を図９に示す。１×１０6のＰＢＭＣを常法により、抗ヒトＣＤ３抗体、又は、抗ヒトＣＤ８ａ抗体、又は、抗ヒトＣＤ１１ａ抗体、又は、抗ヒトＣＤ１９抗体（バイオレジェンド社）と１．０ μｇ/ｍｌの濃度で反応させ、ＰＢＳによる洗浄で余剰の抗体をよく取り除いた後、１ ｍＬのウイルス上清液ストックを用い、３７℃で３０分間感染させた。遠心分離でウイルス液を除いた後、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ１６４０（２％ ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ＩｇＧ）、ＩＬ−２ ６００Ｕ／ｍＬ、抗ヒトＣＤ３抗体 ３０ｎｇ／ｍＬを含む)で４日間培養した。これに常法により、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ３抗体とＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１抗ヒトＣＤ１９抗体を反応させ、ヨウ化プロピジウム溶液染色後、フローサイトメーターで解析し、ＣＤ３陽性、ＣＤ１９陰性細胞をＴ細胞として、生存Ｔ細胞中のＶｅｎｕｓ陽性Ｔ細胞の割合い（％）を算出した。結果を図９に示す。ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＡ６ｄ−ＧＳ２−ＶＳＶ−Ｇを用いた際、Ｔ細胞表面に発現していると考えられるＣＤ３、又はＣＤ８ａ、又はＣＤ１１ａと、抗ヒトＣＤ３抗体、又は、抗ヒトＣＤ８ａ抗体、又は、抗ヒトＣＤ１１ａ抗体とを介してＴ細胞への感染効率が向上した。ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＬ６ｄ−ＧＳ２−ＶＳＶ−Ｇでは、ｐＶＳＶ−Ｇよりは感染効率が高いが、ｐＣＩ−ＳＰ−ＰＡ６ｄ−ＧＳ２−ＶＳＶ−Ｇほどの感染効率の向上は見られない。ＰＡとＰＬでは、抗体への結合領域が違うため抗体を介した感染効率に影響している可能性がある。
（実施例１１）キメラエンベロープタンパク質を有するレトロウイルス（レンチウイルス以外のレトロウイルス）のＢ細胞への感染評価
ＧＰ２９３細胞をコラーゲンコートした１２ウェルプレートに１．５×１０6となるように播種し、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと１０ｍＭ ＨＥＰＥＳと１０％ＦＢＳを含む）で一晩培養した。翌日、１ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと１０ｍＭ ＨＥＰＥＳと１０％ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ＩｇＧ）を含む）に交換し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００ Ｒｅａｇｅｎｔを用いてｐＭＳＣＶ−ｂａｃｔ−Ｖｅｎｕｓ−ｗｐｒｅを２μｇと、ｐＶＳＶ−Ｇを０．５μｇ又はｐＶＳＶ−Ｇを０．５μｇとｐＣＩ−ＳＰ−ＰＡ６ｄ−ＧＳ２−ＶＳＶ−Ｇを０．５μｇ又はｐＶＳＶ−Ｇを０．５μｇとｐＣＩ−ＳＰ−ＰＬ６ｄ−ＧＳ２−ＶＳＶ−Ｇを０．５ μｇをトランスフェクションした。トランスフェクションから４時間後に５ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと１０％ＦＢＳ又は１０％ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ＩｇＧ）を含む）に交換し２日間培養しレトロウイルスベクターを作製した。作製したレトロウイルスベクターは０．８μｍのフィルターでろ過してウイルス上清液ストックとした。２０μＬずつを２４ウェルプレートに５.０×１０5で播種した２９３Ｔ細胞に一晩感染させた（２ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳを含む）で培養）。翌日培地交換し、感染から５日後にＡｃｃｕｍａｘで剥離させた細胞をヨウ化プロピジウム溶液染色後、フローサイトメーターで解析し、感染時細胞数（５．０×１０5）×生細胞Ｖｅｎｕｓ陽性／総生細胞から力価（ｔｉｔｅｒ (ＴＵ／ｍｌ））を算出した。結果を図１０に示す。凍結Ｂ細胞を解凍、遠心分離し、８０００個のＢ細胞にウイルス上清液ストック１ｍＬを感染させた。２時間後遠心分離し、Ｂ細胞をフィーダー細胞（前日に２４ウェルプレートに１×１０5となるように播種したｈ４０ＬＢ）上に播種し、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ１６４０（２％ ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ＩｇＧ）、ＩＬ−２１ １０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−２ ２５Ｕ／ｍＬを含む)で培養した。５日後、Ａｃｃｕｔａｓｅで細胞を剥離、遠心分離した。これに常法により、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗ヒトＣＤ１９抗体とＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１抗マウスＨ−２Ｋｄ抗体を反応させ、ヨウ化プロピジウム溶液染色後、フローサイトメーターで解析し、ヒトＣＤ１９陽性、マウスＨ−２Ｋｄ陰性細胞をＢ細胞として、生存Ｂ細胞中のＶｅｎｕｓ陽性Ｂ細胞の割合い（％）を算出した。結果を図１０に示す。レンチウイルス以外のレトロウイルスでは、レンチウイルスの場合よりＢ細胞への感染効率は低いが、ｐＶＳＶ−Ｇに比べてキメラエンベロープタンパク質発現ベクター用いた際に感染効率が向上している。また、キメラエンベロープタンパク質発現ベクター用いた際にＦＢＳ（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ＩｇＧ）の利用で力価、Ｂ細胞への感染効率ともに向上している。
（実施例１２）濃縮レンチウイルスのＢ細胞への感染評価
レンチウイルス上清液ストックを実施例６と同様に調製した。２０ｍＬを、４２,２００ ×ｇ、４℃で２時間遠心分離した。それぞれの沈殿を１ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ１６４０（ＩＬ−４ ５０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−２ ２５Ｕ／ｍＬ、ｓＣＤ４０Ｌ ４００ｎｇ／ｍＬ、ｓＢＡＦＦ １００ｎｇ／ｍＬ、ＯＤＮ ２００６（ミルテニーバイオテク社） ２．５μｇ/ｍＬを含む）に懸濁し、濃縮レンチウイルス液を作製した。濃縮レンチウイルス液１μＬずつを２４ウェルプレートに２×１０5で播種した２９３Ｔ細胞に一晩感染させた。翌日培地交換し、感染から２日後にＡｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で剥離させた細胞をヨウ化プロピジウム溶液（ＳＩＧＭＡ社）で染色後、フローサイトメーターで解析し、感染時細胞数（２×１０5）×生細胞Ｖｅｎｕｓ陽性／総生細胞から力価（ｔｉｔｅｒ (ＴＵ／ｍｌ））を算出した。ＶＳＶ-Ｇベクター濃度と力価の関係の結果を図１１に示す。新鮮Ｂ細胞を遠心分離し、１×１０5個とし、これに濃縮レンチウイルス液１ｍＬを感染させた。６時間後遠心分離し、Ｂ細胞をフィーダー細胞（前日に６ウェルプレートに５×１０5となるように播種したｈ４０ＬＢ）上に播種し、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０（２％ ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ＩｇＧ）、ＩＬ−４ ５０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−２ ２５Ｕ／ｍＬを含む)で培養した。２日後、培地をＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０（２％ ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ＩｇＧ）、ＩＬ−２１ １０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−２ ２５Ｕ／ｍＬを含む)に交換し培養を続けた。２日後、Ａｃｃｕｔａｓｅで細胞を剥離、遠心分離した。これに常法により、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗ヒトＣＤ１９抗体を反応させ、ヨウ化プロピジウム溶液染色後、フローサイトメーターで解析し、ヒトＣＤ１９陽性細胞をＢ細胞として、生存Ｂ細胞中のＶｅｎｕｓ陽性Ｂ細胞の割合い（図１１）を算出した。結果を図１１に示す。新鮮Ｂ細胞や濃縮レンチウイルスやＴＯＬＬ様受容体からの刺激を組み合わせることによってＢ細胞への感染効率を向上させることができる。また、新鮮Ｂ細胞はＢ細胞に対する抗体は添加せずに調製している。抗体を別途添加しなくてもＢ細胞上のＢＣＲを介してキメラエンベロープタンパク質発現ベクターを利用することにより、効率よくＢ細胞にウイルスベクターを感染させることが出来た。
（実施例１３）抗体を介した間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：ＭＳＣ）への感染評価
２９３Ｔ細胞をコラーゲンコートした６ウェルプレートに３×１０6となるように播種し、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと１０％ＦＢＳを含む）で一晩培養した。翌日、２ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ＩｇＧ）とを含むと１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む）に交換し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００ Ｒｅａｇｅｎｔを用いてＣＳＩＶ−ＣＭＶ−Ｖｅｎｕｓを２．５μｇ及びｐＬｅｎｔｉ−Ｐ３Ａを２．５μｇ及びｐＬｅｎｔｉ−Ｐ３Ｂを２．５μｇとｐＶＳＶ−Ｇを０．６２５μｇとｐＣＩ−ＳＰ−ＰＡ６ｄ−ＧＳ２−ＶＳＶ−Ｇを０．６２５μｇをトランスフェクションした。トランスフェクションから４時間後に１２ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ＩｇＧ）と１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む）に交換し２日間培養しレンチウイルスベクターを作製した。作製したレンチウイルスベクターは０．８μｍのフィルターでろ過してウイルス上清液ストックとした。Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳを含む）で培養した５×１０5のヒト骨髄ＭＳＣ（プロモセル社）を常法により、抗ヒトＣＤ９０抗体（バイオレジェンド社）と１．０ μｇ/ｍｌの濃度で反応させ、ＰＢＳによる洗浄で余剰の抗体をよく取り除いた後、２ ｍＬのウイルス上清液ストックを用い、３７℃で１時間感染させた。遠心分離でウイルス液を除いた後、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ＩｇＧ）を含む)で２４ウェルプレートに播種した。翌日培地交換し、感染から３日後にＡｃｃｕｍａｘで剥離させた細胞をＤＲＡＱ７で染色後、フローサイトメーターで解析し、生存ＭＳＣ中のＶｅｎｕｓ陽性細胞の割合い（％）を算出した。結果を図１２に示す。ＭＳＣ上に発現しているＣＤ９０に対する抗ＣＤ９０抗体を添加して感染させたときは、抗体を添加せずに感染させたときに比べて感染効率の向上が見られた。

Claims (25)

  1. （ｉ）抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質と、外来遺伝子とを含むウイルスと；
    （ｉｉ）標的細胞と前記標的細胞に特異的な抗体、及び／又は膜型抗体を含む標的細胞；
    とをインビトロで接触させることにより標的細胞にウイルスをインビトロで感染させる工程を含む、遺伝子導入細胞の製造方法。
  2. 抗体結合タンパク質が、プロテインAのIgG結合ドメイン及びプロテインLのIgG結合ドメインのうちの何れか又は両方を含む、請求項１に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  3. 抗体結合タンパク質が、プロテインAのIgG結合ドメインを３個以上含む、請求項２に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  4. 抗体結合タンパク質が、プロテインLのIgG結合ドメインを３個以上含む、請求項２又は３に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  5. 前記キメラタンパク質において、抗体結合タンパク質が、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質のＮ末端側に存在している、請求項１から４の何れか一項に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  6. ウイルスが、レトロウイルスである、請求項１から５の何れか一項に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  7. レトロウイルスが、レンチウイルスである、請求項６に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  8. 標的細胞が、ヒト初代細胞、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、ヒト間葉系幹細胞、及び前記細胞から分化誘導された細胞の何れか一種以上である、請求項１から７の何れか一項に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  9. 標的細胞が末梢血単核球細胞である、請求項１から８の何れか一項に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  10. 標的細胞が、ヒトＢ細胞、ヒトＴ細胞又はヒト間葉系幹細胞である、請求項１から８の何れか一項に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  11. 標的細胞が、ヒトＴ細胞であり、標的細胞に特異的な抗体が、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ８ａ抗体及び抗ヒトＣＤ１１ａ抗体から選択される少なくとも一以上である、請求項１から１０の何れか一項に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  12. 標的細胞が、ヒトＢ細胞であり、ＩＬ−４、ＯＤＮ ２００６、ＣＤ４０受容体を介した刺激、及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激から選択される少なくとも一以上の存在下において前記ウイルスと前記標的細胞とをインビトロで接触させる、請求項１から１０の何れか一項に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  13. 標的細胞が、ヒト間葉系幹細胞であり、標的細胞に特異的な抗体が、抗ヒトＣＤ９０抗体である、請求項１から１０の何れか一項に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  14. 抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質を含むウイルスが、前記キメラタンパク質以外に、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質を含む、請求項１から１１の何れか一項に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  15. 前記ウイルスにおける、前記キメラタンパク質と、前記水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質のモル比が、１：１〜１：５１２の範囲内である、請求項１４に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  16. 抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質を含むウイルスが、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターと、抗体結合タンパク質をコードする塩基配列を含まず、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターとを組み合わせて使用することによって製造されたものである、請求項１から１５の何れか一項に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  17. 抗体結合タンパク質をコードする塩基配列を含まず、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターと、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターとの質量比が６４：１〜６４：２５６の範囲内である、請求項１６に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  18. 抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質と、外来遺伝子とを含むウイルスであって、抗体結合タンパク質が、プロテインLのIgG結合ドメインを含むか、及び／又はプロテインAのIgG結合ドメインを３個以上含む、ウイルス。
  19. ウイルスが、レトロウイルスである、請求項１８に記載のウイルス。
  20. レトロウイルスが、レンチウイルスである、請求項１９に記載のウイルス。
  21. 請求項１８から２０の何れか一項に記載のウイルスを含む遺伝子治療剤。
  22. 請求項１から１７の何れか一項に記載の遺伝子導入細胞の製造方法により得られる遺伝子導入細胞。
  23. 請求項１８から２０の何れか一項に記載のウイルスが感染している遺伝子導入細胞。
  24. 抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクター。
  25. ヒト初代細胞、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又はヒト間葉系幹細胞から選択される標的細胞と、前記標的細胞に特異的な抗体とを含む、請求項１から１７の何れか一項に記載の遺伝子導入細胞の製造方法を行うためのキット。
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