CN102177235A - 切割来自谷氨酰胺合成酶基因的dna靶序列的大范围核酸酶变体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种I-CreI变体，其中两个I-CreI单体之一具有至少两个替换，其中LAGLIDADG核心结构域的两个功能性亚结构域中各有一个，所述亚结构域分别位于I-CreI的28到40位以及44到77位，所述变体能够切割来自谷氨酰胺合成酶基因的DNA靶序列。本发明还涉及所述变体和其衍生产物在改进用于重组蛋白质生产的表达系统中的用途。

Description

切割来自谷氨酰胺合成酶基因的DNA靶序列的大范围核酸酶变体及其用途

本发明涉及切割来自谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase，GS)基因的DNA靶序列的大范围核酸酶(meganuclease)变体，编码所述变体的载体，经所述载体修饰的细胞、动物或植物以及所述大范围核酸酶变体及衍生产物用于基因组工程(genome engineering)以及体内和离体基因组疗法(基因细胞疗法)的用途。

谷氨酰胺合成酶(GS)也称为谷氨酸-氨连接酶(glutamate-ammonia ligase，GLUL)，是一种负责从谷氨酸和氨进行谷氨酰胺生物合成的遍在管家酶，其使用ATP水解成ADP和磷酸来驱动反应。因此，其是三羧酸循环和氨基酸代谢之间的重要连接(Meister et al.，1980，Glutamine metabolism，enzymology and regulation，Academic Press，N.Y.，p.1-40 and 319-329)。该酶促反应是哺乳动物细胞中谷氨酰胺形成的通路。培养基中不存在谷氨酰胺时，GS酶在培养哺乳动物细胞的存活中起到关键性作用。谷氨酰胺合成酶由基因进化历史中最古老的功能性基因之一所编码，可被认为是原核生物和真核生物代谢中一个关键的酶(Kumada et al.，2003，PNAS USA，90：3009-3013)。由于其生物学功能，GS基因用作基因组工程(靶向和随机基因操作)的阳性选择标记。

在大多数高等脊椎动物细胞中发现GS为低水平(可溶性蛋白的0.01％-0.1％)，在某些特化细胞类型例如肝细胞、脂肪细胞和神经胶质细胞中水平较高(＞总蛋白的1％)(Tiemeier et al.，1972，J.Biol.Chem.，247：2272-2277；Gebhardt et al.，1983，EMBO J.，2：567-570；Miller et al.，1978，PNAS USA，75：1418-1422；Linser et al.，1979，PNAS USA，76：6476-6480)。在细胞内，多种调节信号影响GS水平，例如糖皮质激素类固醇和cAMP，培养基中的谷氨酰胺似乎通过ADP核糖基化而对GS水平进行翻译后调节(Milman et al.，1975，J.Biol.Chem.，250：1393-1399；Arad et al.，1976，Cell，8：59-101)。

一些哺乳动物细胞系(例如小鼠骨髓瘤细胞系)不表达足以在不添加谷氨酰胺的情况下存活的GS。在这些细胞系中，转染的GS基因可用作允许其在无谷氨酰胺培养基中生长的选择标记。其他细胞系(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系)表达足以在没有外源谷氨酰胺的情况下存活的GS。在这些情况下，可使用GS抑制剂如甲硫氨酸砜亚胺(methionine sulphoximine，Msx)来抑制内源GS活性，使得只有具有额外GS活性的转染子可存活。

对于蛋白质生产来说，哺乳动物细胞是具有吸引力的，因为与市场上通常的细菌细胞表达的蛋白质不同，这些蛋白质一般正确折叠、合适地进行了修饰并且具有完全的功能。

称为GS System^TM的哺乳动物表达系统由Lonza Biologics所开发，其使用CHO-K1细胞来生产所需蛋白质。CHO-K1细胞产生内源GS，但是它们可通过转染GS基因并使用添加Msx(以足以抑制内源酶的水平)的无谷氨酰胺培养基来提供选择压力以及转染目的基因而用于产生稳定细胞系。

GS System^TM已用于产生多种重组蛋白质，特别是已获得管理部门批准的治疗性产品。目前，有超过50种使用GS System^TM的产品在进行临床试验，5种产品已上市，例如Zenapax

(Roche)和Synagis

(MedImmune)。

尽管如此，为抑制GS内源表达的GS抑制剂的使用仍不完全令人满意，因为残余表达仍然存在。该问题可通过直接失活内源GS基因来克服。该失活可通过使用能够在活细胞中产生DNA双链断裂(DSB)以及切割独特位点的位点特异性核酸内切酶例如大范围核酸酶来实现。随后可通过同源重组(图3A)或非同源末端连接(Non Homologous End Joining，NHEJ)(图3B)来修复该切割。因此，靶向GS基因的人工大范围核酸酶可用于失活GS基因。

谷氨酰胺合成酶在人体中也普遍表达，在肝、脑和肌肉组织中具有高浓度(

D et al.，1984，Glutamate Metabolism in Mammalian Tissues.Berlin：Springer Verlag，3-15)。GS在氨和谷氨酰胺解毒、器官间氮流、pH内稳态和细胞信号转导中起重要作用(

D，1998，Adv Enzymol RAMB 72：43-86)。已经在具有早期致死病程的两个新生儿中描述了基于谷氨酰胺合成酶缺陷的谷氨酰胺先天系统性缺陷

et al.，2006，J Inherit Metab Dis，29，352-358)。在其血清、尿和脑脊液中大量缺少谷氨酰胺。在两个患者中均检测到谷氨酰胺合成酶外显子7的纯合突变。一个患者中精氨酸324替换为半胱氨酸(R324C)，另一个中精氨酸341替换为半胱氨酸(R341C)。谷氨酰胺合成酶酶学研究证实了这些突变导致谷氨酰胺合成酶活性严重降低。

靶向同源重组将允许原位对突变进行精确矫正(correction)(图3C)。因此，可使用靶向GS基因的人工大范围核酸酶来修复与谷氨酰胺先天系统性缺陷相关的突变。

同源重组(HR)是一种非常保守的DNA修复途径，其涉及DNA双链断裂(DSB)和其他DNA损伤的修复(Rothstein，Methods Enzymol.，1983，101，202-211；Paques等，Microbiol Mol Biol Rev，1999，63，349-404；Sung等，Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.，2006，7，739-750)，但是也是许多生物学现象的基础，例如减数分裂中等位基因的减数分裂再分布(Roeder，Genes Dev.，1997，11，2600-2621)、酵母中的接合型互换(Haber，Annu.Rev.Genet.，1998，32，561-599)以及I类内含子和蛋白内含子(intein)到新等位基因的“归巢”。HR通常促进内源序列之间遗传信息的交换，但是在基因靶向实验中，其被用于促进内源染色体序列与外源DNA构建体之间的交换。基本上，向细胞核中引入与所靶向的序列具有同源性的DNA，内源的同源重组机器提供了接下来的步骤(图3C)。

同源基因靶向策略已用于在染色体中敲除内源基因(Capecchi，M.R.，Science，1989，244，1288-1292；Smithies，O.，Nature Medicine，2001，7，1083-1086)或敲入(knock-in)外源序列。其同样也可用于基因矫正，并原则上用于矫正与单基因疾病相关的突变。然而，由于该过程的低效率(转染细胞的10^-6到10^-9)，该应用事实上是困难的。

增强重组效率的几种策略之一是使用大范围核酸酶向靶基因座中递送DNA双链断裂。大范围核酸酶定义为识别大序列的序列特异性内切核酸酶(Thierry，A.and B.Dujon，Nucleic Acids Res.，1992，20，5625-5631)。它们能够在活细胞中切割独特的位点，从而将切割位点附近的基因靶向增强1000倍或更多(Puchta等，Nucleic Acids Res.，1993，21，5034-5040；Rouet等，Mol.Cell.Biol.，1994，14，8096-8106；Choulika等，Mol.Cell.Biol.，1995，15，1968-1973；Puchta等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1996，93，5055-5060；Sargent等，Mol.Cell.Biol.，1997，17，267-277；Cohen-Tannoudji等，Mol.Cell.Biol.，1998，18，1444-1448；Donoho，等，Mol.Cell.Biol.，1998，18，4070-4078；Elliott等，Mol.Cell.Biol.，1998，18，93-101)。这样的大范围核酸酶可用于矫正造成单基因遗传疾病的突变。

矫正遗传缺陷的最精准方法是使用带有未突变基因拷贝的修复基质(repair matrix)，得到突变的回复。然而，基因矫正的效率随着突变与DSB之间距离的增长而降低，200bp的距离降低五倍。因此，可使用给定的大范围核酸酶矫正仅在其DNA靶标附近的突变(图3C)。

图3D中展示了称为“外显子敲入”的替代方案。在该情况下，可以使用在基因5′部分进行切割的大范围核酸酶将功能性外显子序列敲入有害突变的上游。尽管该方法将转基因置于其常规位置，但是它也引起外显子重复(exons duplication)，其长期影响尚待评价。另外，如将天然顺式作用元件置于切割下游的内含子中，则其直接环境将被改变，其固有功能也有待于探索。然而，该方法具有一个巨大的优点：一种大范围核酸酶可用于大范围核酸酶切割位点下游的许多不同突变。

然而，尽管鉴定了数百种天然的大范围核酸酶(也称作“归巢内切核酸酶”)(Chevalier，et al.，2001 Nucleic Acids Res.，29，3757-3774)，但可切割序列的种类过于有限而不能应对基因组的复杂度，例如在GS基因中没有切割位点。理论上，产生具有选定特异性的人造序列特异性内切核酸酶能够缓解这一局限性。因此，具有定制特异性的大范围核酸酶的产生处于紧张的研究中。

最近，使用了锌指蛋白(ZFPs)与FokI(一种IIS类限制性内切核酸酶)催化结构域的融合物来产生功能性序列特异性内切核酸酶(Smith等，Nucleic Acids Res.，1999，27，674-681；Bibikova等，Mol.Cell.Biol.，2001，21，289-297；Bibikova等，Genetics，2002，161，1169-1175；Bibikova等，Science，2003，300，764；Porteus，M.H.and D.Baltimore，Science，2003，300，763-；Alwin等，Mol.Ther.，2005，12，610-617；Urnov等，Nature，2005，435，646-651；Porteus，M.H.，Mol.Ther.，2006，13，438-446)。

Cys2-His2型锌指蛋白的结合特异性是容易操纵的，可能因为它们代表了简单(特异性基本上由每个锌指上的四个残基决定)和模块化的系统(Pabo等，Annu.Rev.Biochem.，2001，70，313-340；Jamieson等，Nat.Rev.Drug Discov.，2003，2，361-368)。来自Pabo(Rebar，E.J.和C.O.Pabo，Science，1994，263，671-673；Kim，J.S.和C.O.Pabo，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A，1998，95，2812-2817)、Klug(Choo，Y.和A.Klug，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，91，11163-11167；Isalan M.和A.Klug，Nat.Biotechnol.，2001，19，656-660)和Barbas(Choo，Y.和A.Klug，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，91，11163-11167；Isalan M.和A.Klug，Nat.Biotechnol.，2001，19，656-660)实验室的研究产生了能够结合大部分G/ANNG/ANNG/ANN序列的多种新人工ZFP。

然而，ZFP可能具有其局限性，特别是对于需要极高水平特异性的应用(如治疗应用)而言。融合物中的FokI核酸酶活性以二聚体发挥作用，但是最近显示其仅在两个单体之一与DNA结合或者两个单体结合两个远离的DNA序列时切割DNA(Catto等，Nucleic Acids Res.，2006，34，1711-1720)。因此，特异性可以是高度简并(degenerate)的，如在哺乳动物细胞(Porteus，M.H.和D.Baltimore，Science，2003，300，763)和果蝇(Bibikova等，Genetics，2002，161，1169-1175；Bibikova等，Science，2003，300，764-)中的毒性所显示的。

在自然界中，大范围核酸酶基本上由归巢内切核酸酶(Homing Endonuclease)代表。归巢内切核酸酶(HE)是一种广泛的天然大范围核酸酶家族，包括数百个蛋白质家族(Chevalier，B.S.和B.L.Stoddard，Nucleic Acids Res.，2001，29，3757-3774)。这些蛋白质由可动遗传因子编码，所述可动遗传因子通过称作“归巢”的过程繁殖：内切核酸酶切割其中不存在该可动遗传因子的同源等位基因，从而刺激同源重组事件，所述事件将该可动DNA复制进受者基因座。考虑到它们在效率和特异性方面的特有切割特性，它们可代表产生新的高度特异性内切核酸酶的理想骨架(scaffold)。

HE属于四个主要的家族。LAGLIDADG家族(根据涉及催化中心的保守肽基序命名)是分布最广和最充分表征的一组。目前能够获得七种结构。尽管来自该家族的大部分蛋白质是单体的并展示两种LAGLIDADG基序，但是少数仅具有一个基序，因而发生二聚化以切割回文或假回文的靶序列。

尽管LAGLIDADG肽是该家族成员中唯一的保守区，但是这些蛋白质共有非常类似的结构(图1A)。催化核心侧翼是两个DNA结合结构域，对同二聚体(如I-CreI(Chevalier，等，Nat.Struct.Biol.，2001，8，312-316)，I-MsoI(Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003，329，253-269)和I-CeuI(Spiegel et al.，Structure，2006，14，869-880))而言具有完全的二重对称性，对单体(如I-SceI(Moure等，J.Mol.Biol.，2003，334，685-69)，I-DmoI(Silva等，J.Mol.Biol.，1999，286，1123-1136)或I-AniI(Bolduc等，Genes Dev.，2003，17，2875-2888))而言具有假对称性。两个单体和两个结构域(对于单体蛋白质而言)组成组织在二价阳离子周围的催化核心。就在催化核心上方的两个LAGLIDADG肽也在二聚化界面中起关键作用。DNA结合依赖于位于DNA大沟上的两个典型的鞍形αββαββα折叠。其他结构域可见于蛋白内含子(如PI-PfuI(Ichiyanagi等，J.Mol.Biol.，2000，300，889-901)和PI-SceI(Moure等，Nat.Struct.Biol.，2002，9，764-770)中，其蛋白质剪接结构域也参与DNA结合。

通过将N端I-DmoI结构域与I-CreI单体融合来产生功能性嵌合大范围核酸酶(Chevalier等，Mol.Cell.，2002，10，895-905；Epinat等，Nucleic Acids Res，2003，31，2952-62；国际PCT申请WO 03/078619和WO 2004/031346)已证明了LAGLIDADG蛋白的可塑性。

不同的小组还使用半推理性方法来局部改变I-CreI(Seligman等，Genetics，1997，147，1653-1664；Sussman等，J.Mol.Biol.，2004，342，31-41；国际PCT申请WO 2006/097784，WO 2006/097853，WO 2007/060495，和WO 2007/049156；Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458；Rosen等，Nucleic Acids Res.，2006，34，4791-4800；Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149)，I-SceI(Doyon等，J.Am.Chem.Soc.，2006，128，2477-2484)，PI-SceI(Gimble等，J.Mol.Biol.，2003，334，993-1008)和I-MsoI(Ashworth等，Nature，2006，441，656-659)的特异性。

另外，通过将半推理方法和高通量筛选组合在一起，改造了具有局部改变之特异性的数百种I-CreI衍生物：

-诱变I-CreI的残基Q44，R68和R70或Q44，R68，D75和I77，并通过筛选(国际PCT申请WO 2006/097784和WO 2006/097853；Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458；Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149)鉴定在DNA靶标(5NNN DNA靶标)的±3到5位中具有改变特异性的变体集合。

-诱变I-CreI的残基K28，N30和Q38，N30，Y33和Q38或K28，Y33，Q38和S40，并通过筛选(Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149；国际PCT申请WO 2007/060495和WO 2007/049156)鉴定在DNA靶标(10NNN DNA靶标)的±8到10位中具有改变特异性的变体集合。

将两个不同的变体组合并装配在能切割嵌合靶标的一个功能性异二聚体内切核酸酶中，所述嵌合靶标得自每个变体DNA靶序列中不同一半的融合物(Arnould等，precited；国际PCT申请WO 2006/097854和WO 2007/034262)，如图1B中所示。

另外，I-CreI的28到40位以及44到77位残基显示形成两个可分离的功能性亚结构域，其能够结合归巢内切核酸酶半位点的不同部分(Smith等Nucleic Acids Res.，2006，34，e149；国际PCT申请WO 2007/049095和WO 2007/057781)

在相同单体内组合I-CreI中两个亚结构域的突变使得能够设计出新的嵌合分子(同二聚体)，其能切割含有通过各亚结构域结合的±3至5位以及±8至10位的核苷酸的回文组合DNA靶序列(Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149；国际PCT申请WO 2007/049095和WO 2007/057781)。

在国际PCT申请WO 2004/067736；Epinat et al.，Nucleic Acids Res.，2003，31，2952-2962；Chames et al.，Nucleic Acids Res.，2005，33，e178和Arnould et al.，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458中，描述了在哺乳动物或酵母细胞中产生大范围核酸酶变体的方法以及基于切割诱导重组的测定，其用于筛选特异性改变的变体。这些测定产生可通过标准方法监测的功能性LacZ报告基因。

所述两个前述步骤的组合允许进行包括4种不同亚结构域的更大的组合方法。可分别修饰不同的亚结构域，并将其组合以获得完全重新设计的具有选定特异性的大范围核酸酶变体(异二聚体或单链分子)，如图1C所示。在第一步中，将几对新的大范围核酸酶组合在切割来自希望切割之靶标的回文靶标的新分子(“半大范围核酸酶”)中。然后，这种“半大范围核酸酶”的组合可得到切割目的靶标的异二聚体种类。在Smith等(Nucleic Acids Res.，2006，34，e149)和Arnould等，(J.Mol.Biol.，2007，371，49-65)和WO2008/059382中分别描述了将4组突变组装成切割模型靶序列或来自人RAG1、XPC和HPRT基因的序列的异二聚体内切核酸酶。

这些变体可用于切割天然染色体序列，并在包括基因治疗的几个领域中开辟了具有新前景的道路。

然而，尽管±1和±2位碱基对不显示与蛋白质有任何接触，但是已显示这些位置并非没有信息含量(Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003，329，253-269)(特别是对于±1位碱基对而言)，并且可以是额外的底物特异性的来源(Argast等，J.Mol.Biol.，1998，280，345-353；Jurica等，Mol.Cell.，1998，2，469-476；Chevalier，B.S.and B.L.Stoddard，Nucleic Acids Res.，2001，29，3757-3774)。对随机诱变的可切割的I-CreI靶标(Argast等，前文所述)进行的体外选择揭示了这四个碱基对对于蛋白质结合和切割活性的重要性。已提出，存在于活性位点中的有序水分子网络对于DNA靶标的定位是重要的(Chevalier等，Biochemistry，2004，43，14015-14026)。另外，I-CreI结合后该区域中出现的广泛的构象改变表明，四个中心核苷酸可对底物特异性做出贡献，可能是通过序列依赖性的构象偏好来实现(Chevalier等，2003，前文所述)。

因此，尚不清楚在10NNN和5NNN DNA靶标上被鉴定为切割回文序列(四个中心核苷酸为gtac)之同二聚体的变体是否允许设计新的内切核酸酶，所述内切核酸酶会切割在四个中心核苷酸中含有改变的靶标。

本发明人在GS基因中鉴定了一系列能够被I-CreI变体切割的DNA靶标(图18-20)。使用图1D中描述的组合方法完全重新设计I-CreI蛋白质的DNA结合结构域，并进而改造出具有完全改造的特异性的新大范围核酸酶，以切割一种DNA靶标(GSCHO1)。GSCHO1靶标存在于小鼠(图2A)和中国仓鼠(Criteculus griseus，图2B)GS基因中，其与I-CreI C1221 22bp回文位点的区别在于包含四个中心核苷酸中两个(+1、+2位)的15个核苷酸(图4)。

在第一个步骤中，将一对新大范围核酸酶组合成切割来源于想要切割的靶标的回文靶标的新分子(“半-大范围核酸酶”)。然后，此“半-大范围核酸酶”的组合可产生切割目的靶标的异二聚体种类。之前Smith et al.，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149已经描述了将四组突变组装成切割模型靶序列或者来自人RAG1基因之序列的异二聚体核酸内切酶。

尽管最初分别针对核苷酸10NNN和5NNN鉴定了组合变体，并且观察到靶标的四个中心核苷酸对经改造大范围核酸酶之活性的强烈影响，但是仍然选择出具有重大的特异性改变的功能性大范围核酸酶。另外，与I-CreI蛋白质的活性相比，可以通过随机和/或定点诱变和筛选显著改进所改造蛋白质的活性。

这些能够切割来自GS基因的基因组DNA靶标的I-CreI变体可用于失活GS基因座(敲除或敲入)(图3A和3B)，由此使得GS在任何座位用作基因组工程的选择标记，例如用于产生转基因动物和重组细胞系。此外，这些I-CreI变体可用于修复与先天系统性谷氨酰胺缺陷相关的GS突变(图3C和3D)。

本发明涉及I-CreI变体，其中两个I-CreI单体的至少一个中含有至少两个替换，其中LAGLIDADG核心结构域的两个功能性亚结构域中各含一个，所述功能性亚结构域分别位于I-CreI的位置28到40和44到77，所述变体能够切割来自GS基因的DNA靶序列。

可以通过任何公知的体外或体内切割测定法测量本发明变体的切割活性，例如国际PCT申请WO 2004/067736；Epinat等，Nucleic Acids Res.，2003，31，2952-2962；Chames等，Nucleic Acids Res.，2005，33，e178；Arnould et al.，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458，和Arnould等，J.Mol.Biol.，2007，371，49-65中所述的测定法。例如，可通过直接重复重组测定法，使用报告载体在酵母或哺乳动物细胞中测量本发明变体的切割活性。报告载体在间插序列内包含报告基因的两个截短的非功能性拷贝(直接重复)和基因组(非回文)DNA靶序列，所述间插序列克隆到酵母或哺乳动物表达载体中。通常，基因组DNA靶序列包含每种(回文或假回文)亲本同二聚体I-CreI大范围核酸酶靶序列的不同的一半。变体的表达产生功能性内切核酸酶，其能够切割基因组DNA靶序列。该切割诱导直接重复之间的同源重组，产生功能性报告基因，其表达可以通过合适的测定法监测。可将变体对基因组DNA靶标的切割活性与野生型I-CreI或I-SceI对其天然靶标的活性进行比较。

定义

-多肽序列中的氨基酸残基在本文中根据单字母代码命名，其中例如Q表示Gln或谷氨酰胺残基，R表示Arg或精氨酸残基，D表示Asp或天冬氨酸残基。

-核苷酸如下命名：使用单字母代码命名核苷的碱基：a为腺嘌呤，t为胸腺嘧啶，c为胞嘧啶，g为鸟嘌呤。对于简并核苷酸而言，r表示g或a(嘌呤核苷酸)，k表示g或t，s表示g或c，w表示a或t，m表示a或c，y表示t或c(嘧啶核苷酸)，d表示g，a或t，v表示g，a或c，b表示g，t或c，h表示a，t或c，n表示g，a，t或c。

-“大范围核酸酶”是指具有12到45pb双链DNA靶序列的内切核酸酶。所述大范围核酸酶是其中各结构域位于单体上的二聚体酶，或是在单个多肽上包含两个结构域的单体酶。

-“大范围核酸酶结构域”是指这样的区域，其与大范围核酸酶DNA靶标的一半相互作用，并能够与相同大范围核酸酶的另一结构域结合，形成能够切割DNA靶标的功能性大范围核酸酶，所述另一结构域与所述DNA靶标的另一半相互作用。

-“大范围核酸酶变体”或“变体”是指通过将野生型大范围核酸酶(天然大范围核酸酶)氨基酸序列中的至少一个残基替换为不同的氨基酸而获得的大范围核酸酶。

-“功能性变体”是指能够切割DNA靶序列的变体，优选地所述靶标是不被母体大范围核酸酶切割的新靶标。例如，这些变体在接触DNA靶序列的位置或与所述DNA靶标直接或间接相互作用的位置上具有氨基酸改变。

-“I-CreI”是指具有pdb登录号1g9y序列(对应于序列表中的序列SEQ ID NO：1)的野生型I-CreI。

-“具有新特异性的I-CreI变体”是指具有与母体大范围核酸酶不同的靶标切割模式的变体。等价且无差异地使用的术语“新特异性”，“经修饰的特异性”，“新切割特异性”，“新底物特异性”是指变体针对DNA靶序列中核苷酸的特异性。

-“I-CreI位点”是指被I-CreI切割的22到24bp双链DNA序列。I-CreI位点包括野生型(天然)非回文I-CreI归巢位点和衍生的回文序列，如序列5’-t_-12c_-11a_-10a_-9a_-8a_-7c_-6g_-5t_-4c_-3g_-2t_-1a₊₁c₊₂g₊₃a₊₄c₊₅g₊₆t₊₇t₊₈t₊₉t₊₁₀g₊₁₁a₊₁₂(SEQ ID NO：2)，也称为C1221(图4)。

-“结构域”或“核心结构域”是指“LAGLIDADG归巢内切核酸酶 核心结构域”，它是LAGLIDADG家族归巢内切核酸酶的特征性α₁β₁β₂α₂β₃β₄α₃折叠，对应于约一百个氨基酸残基的序列。所述结构域包含在折叠成反向平行β-片层的四条β链(β₁β₂β₃β₄)，所述β-片层与DNA靶标的一半相互作用。该结构域能够与另一LAGLIDADG归巢内切核酸酶结构域结合，形成能够切割DNA靶标的功能性内切核酸酶，所述另一结构域与所述DNA靶标的另一半相互作用。例如，在二聚体归巢内切核酸酶I-CreI(163个氨基酸)的情况下，LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域对应于残基6到94。

-“亚结构域”是指LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域中的区域，其与归巢内切核酸酶DNA靶标半位点的不同部分相互作用。

-“β-发夹”是指LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域反向平行β-片层的两条连续β-链(β₁β₂或β₃β₄)，其通过环或转角相连。

-“单链大范围核酸酶”，“单链嵌合大范围核酸酶”，“单链大范围核酸酶衍生物”，“单链嵌合大范围核酸酶衍生物”或“单链衍生物”是指包含通过肽间隔区连接的两个LAGLIDADG归巢内切核酸酶结构域或核心结构域的大范围核酸酶。单链大范围核酸酶能够切割嵌合DNA靶序列，所述靶序列包含各母体大范围核酸酶靶序列中不同的一半。

-“DNA靶标”，“DNA靶序列”，“靶序列”，“靶位点”，“靶标”，“位点”；“目的位点”；“识别位点”，“识别序列”，“归巢识别位点”，“归巢位点”，“切割位点”是指被LAGLIDADG归巢内切核酸酶(例如I-CreI或其变体，或来自于I-CreI的单链嵌合大范围核酸酶)识别并切割的20到24bp双链回文，局部回文(假回文)或非回文的多核苷酸序列。这些术语是指大范围核酸酶要在其中诱导双链断裂(切割)的独特DNA定位，优选地为基因组定位。DNA靶标通过双链多核苷酸一条链的5′到3′序列来定义，如上文针对C1221所指出的。DNA靶标的切割分别发生在有义和反义链位置+2和-2的核苷酸处。除非另有说明，否则I-Cre I大范围核酸酶变体对DNA靶标进行切割的位置对应于DNA靶标有义链上的切割位点。

-“DNA靶标半位点”，“半切割位点”或“半位点”是指DNA靶标中与各个LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域结合的部分。

-“嵌合DNA靶标”或“杂合DNA靶标”是指两条母体大范围核酸酶靶序列不同的一半的融合物。另外，所述靶标的至少一半可包含与至少两个独立的亚结构域结合的核苷酸组合(组合DNA靶标)。

-“GS基因”是指谷氨酰胺合成酶或谷氨酸-氨连接酶(GLUL)基因，优选脊椎动物的GS基因，更优选哺乳动物的GS基因例如人、小鼠和中国仓鼠(Criteculus griseus)的GS基因。GS基因序列可得自序列数据库，例如NCBI/GenBank数据库。人GS基因序列(9282bp；SEQ ID NO：272)可以登录号NC_000001.9(180618292至180627573位的反向互补序列)获得。小鼠GS基因序列(9770bp；SEQ ID NO：3)可以登录号NC_000067.5(155747075至155756844位的反向互补序列)获得。两个基因都具有7个外显子。小鼠GS基因在图2A显示(外显子1(1至115位)，外显子2(2990至3168位)，外显子3(4593至4754位)，外显子4(6405至6551位)，外显子5(7076至7203位)，外显子6(7342至7541位)和外显子7(7920至9770位))。人GS基因包含：外显子1(1至137位)，外显子2(3066至3244位)，外显子3(4524至4685位)，外显子4(5414至5560位)，外显子5(5929至6056位)，外显子6(6260至6459位)和外显子7(7093至9282位)。从外显子2(3003位(小鼠GS))或3079位(人GS))开始处至外显子7(8238位(小鼠GS)或7411位(人GS))开始处的ORF的侧翼是分别位于5’和3’末端的长非翻译区。小鼠基因转录为2782bp mRNA(GenBank NM_008131)，其含有129至1250位的GS ORF。中国仓鼠(Criteculus griseus)GS mRNA是含有147至1268位的GS ORF的1421bp序列(登录号GenBank X03495)(图2B)。

“来自GS基因的DNA靶序列”，“基因组DNA靶序列”，“基因 组DNA切割位点”，“基因组DNA靶标”或“基因组靶标”是指如上所述GS基因中被大范围核酸酶变体或单链嵌合大范围核酸酶衍生物识别并切割的20到24bp序列。

-“载体”是指能够转运与之连接的另一核酸的核酸分子。

-“同源”是指一条序列与另一序列具有足够导致序列间同源重组的同一性，更具体地具有至少95％的同一性，优选97％的同一性，更优选99％的同一性。

-“同一性”是指两个核酸分子或多肽之间的序列同一性。可通过比较各序列中可为比较目的而比对的位置来测定同一性。当所比较序列中的一个位置被相同的碱基占据时，则这些分子在该位置上是相同的。核酸或氨基酸序列之间的相似性或同一性程度是核酸序列间共有的位置上相同或匹配的核苷酸数量的函数。可使用多种比对算法和/或程序计算两条序列之间的同一性，包括FASTA或BLAST，它们可作为GCG序列分析包(University of Wisconsin，Madison，Wis.)的一部分获得，并可以例如默认设定使用。

-突变是指在多核苷酸(cDNA，基因)或多肽序列中替换，缺失，添加一个或多个核苷酸/氨基酸。所述突变可影响基因的编码序列或其调节序列。其还可影响基因组序列的结构或所编码mRNA的结构/稳定性。

本发明的变体可以是同二聚体或异二聚体。优选地，异二聚体的两个单体在28到40位和/或44到77位中被突变。更优选地，两个单体均在I-CreI的28到40位以及44到77位中具有不同的替换。

在所述变体的一个优选的实施方案中，位于I-CreI中44到77位的亚结构域中的所述替换位于44，68，70，75和/或77位。

在所述变体的另一个优选的实施方案中，位于I-CreI中28到40位的亚结构域中的所述替换位于28，30，32，33，38和/或40位。

在所述变体的另一个优选实施方案中，其在直接或通过水分子与DNA骨架或核苷酸碱基相互作用或与DNA靶序列接触的其他氨基酸残基位置上包含一个或多个突变；这些残基是本领域公知的(Jurica等，Molecular Cell.，1998，2，469-476；Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003，329，253-269)。具体地，可在与磷酸骨架接触的位置例如最终的C端环(137到143位；Prieto等，Nucleic Acids Res.，Epub 22April 2007)上引入另外的替换。优选地，所述残基涉及所述DNA切割位点的结合和切割。更优选地，所述残基处于I-CreI的138，139，142或143位上。可以在一个变体中突变两个残基，条件是各个突变在选自以下的不同残基对中：138和139位残基对以及142和143位残基对。所引入的突变改变最终C端环中所述氨基酸与I-CreI位点中磷酸主链的相互作用。优选地，用疏水氨基酸替换138或139位上的残基，以避免与DNA切割位点的磷酸主链形成氢键。例如，用丙氨酸替换138位的残基，或用甲硫氨酸替换139位的残基。有利地用小氨基酸(例如甘氨酸)替换142或143位的残基，以减小这些氨基酸残基侧链的大小。更优选地，最终C端环中的所述替换改变了变体针对I-CreI位点中±1到2，±6到7和/或±11到12位的特异性。

在所述变体的另一个优选实施方案中，其包含一个或多个额外的突变，所述突变改善变体对来自谷氨酰胺合成酶基因之DNA靶序列的结合和/或切割特性。

被突变的额外残基可位于整个I-CreI序列上，尤其是I-CreI的C端一半(80到163位)。I-CreI的两个单体均有利地被突变；每个单体上的突变可以相同或不同。例如，变体在2、3、6、7、12、19、24、35、39、43、45、47、50、54、57、59、60、64、66、80、87、92、96、105、107、110、114、117、118、119、120、125、129、132、137、139、153、154、160和161位上包含一个或多个额外的替换。所述替换有利地选自以下：N2S、T3A、N6K、K7E、Y12H、G19S、G19A、I24V、F35L、L39V、F43L、V45L、V45M、Q47K、Q50R、F54L、K57E、V59A、D60Y、V64A、Y66H、E80K、F87L、F87I、Q92R、K96R、V105A、K107R、E110V、S114F、S114P、E117V、S118T、P119L、D120A、D120E、V125I、V129A、I132V、D137N、D137Y、K139R、D153N、S154G、K160R、S161P和S161T。更优选地，变体包含至少一个选自G19S、F54L、E80K、F87L、V105A和I132V的替换。所述变体还可在C端包含额外的残基。例如，分别可在I-CreI的164和165位插入甘氨酸(G)和/或脯氨酸(P)残基。

根据所述变体的一个更优选的实施方案，所述额外的突变还削弱了功能性同二聚体的形成。更优选地，所述突变是G19S突变。G19S突变被有利地引入异二聚体I-CreI变体的两个单体之一中，从而获得具有增强的切割活性和增强的切割特异性的大范围核酸酶。另外，为了进一步增强切割特异性，另一单体可带有削弱功能性同二聚体的形成或者有助于异二聚体的形成的不同突变。

在所述变体的另一个优选的实施方案中，所述替换是用选自A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、V、L、M、F、I和W的氨基酸代替原始氨基酸。

本发明的变体可以衍生自野生型I-CreI(SEQ ID NO：1)或者与SEQ ID NO：1具有至少85％同一性、优选至少90％同一性、更优选至少95％同一性的I-CreI骨架蛋白，例如在I-CreI序列中具有2位丙氨酸插入、和在C端(164到166位)AAD插入的称为I-CreI N75的骨架(167个氨基酸；SEQ ID NO：4)。

另外，本发明的变体可包含一个或多个在序列NH₂端和/或COOH端插入的残基。例如，在NH₂端和/或COOH端引入标签(表位或多聚组氨酸序列)；所述标签可用于所述变体的检测和/或纯化。变体也可以包含核定位信号(NLS)；所述NLS可用于将所述变体输入细胞核中。NLS可以被恰好插入变体的第一甲硫氨酸后，或恰好插入N-端标签后。

本发明的变体可以是能够切割回文或假回文DNA靶序列的同二聚体。

或者，所述变体是异二聚体，其得自I-CreI中28到40位和44到77位中具有不同替换的第一和第二单体的结合，所述异二聚体能够切割来自GS基因的非回文DNA靶序列。

被I-CreI变体切割的DNA靶序列存在于至少一种哺乳动物GS基因中，其选自人、小鼠和/或中国仓鼠(Criteculus griseus)GS基因。DNA靶序列位于GS ORF中，这些序列覆盖所有的GS ORF(图18至20)。

例如，DNA靶序列SEQ ID NO：5至28(图18)存在于人GS基因中。DNA靶序列SEQ ID NO：19和29至48存在于小鼠GS基因中(图19)。DNA靶序列SEQ ID NO：19、29、30、34、46、47和49至60存在于中国仓鼠GS基因中(图20)。

DNA靶序列SEQ ID NO：19存在于人、小鼠和中国仓鼠GS基因中。因此，切割DNA靶序列SEQ ID NO：19的I-CreI变体能够诱导人、小鼠和中国仓鼠GS基因中的位点特异性修饰。DNA靶序列SEQ ID NO：29、30、34、46和47存在于小鼠和中国仓鼠GS基因中。因此，切割DNA靶序列SEQ ID NO：29、30、34、46和47的I-CreI变体能够诱导小鼠和中国仓鼠GS基因中的位点特异性修饰。

此外，人、小鼠和中国仓鼠DNA靶序列SEQ ID NO：7、31和49在±3至5和±8至10位核苷酸具有序列同一性。因此，切割DNA靶序列SEQ ID NO：49的I-CreI变体能够诱导中国仓鼠中的位点特异性修饰，其中一些也能够在人和/或小鼠GS基因中诱导。

切割每个DNA靶标的异二聚体变体的实例显示于图18至20，表I至III。

表I：切割来自人GS基因的DNA靶标的异二聚体I-CreI变体的序列

^*下划线变体可切割其他物种GS基因中的相同靶标。

表II：切割来自小鼠GS基因的DNA靶标的异二聚体I-CreI变体的序列

^*下划线变体可切割中国仓鼠GS基因中的相同靶标.

表III：切割来自中国仓鼠GS基因的DNA靶标的异二聚体I-CreI变体的序列

^*下划线变体可切割小鼠GS基因中的相同靶标。

每个I-CreI变体的序列由所示位置的突变残基来定义。例如，表I的第一种异二聚体变体由第一单体和第二单体组成，第一单体在30、33、44、68、75、77和80位分别具有T、G、V、E、N、R和K，第二单体在30、32、33、40、44、70、75和77位分别具有R、T、N、Q、D、S、R和T。位置参照I-CreI序列(SEQ ID NO：1)来表示；I-CreI在30、32、33、38、40、44、68、70、75、77和80位分别具有N、S、Y、Q、S、Q、R、R、D、I和E。

本发明异二聚体变体的每个单体(第一单体和第二单体)也可以根据如上文所示突变的28、30、32、33、38、40、44、68和70、75以及77位十一个残基以及其他残基的字母代码命名。例如，KTSGQS/ENRNR+80K或28K30T32S33G38Q40S/44E68N70R75N77R+80K代表I-CreIK28、T30、S32、G33、S38、S40/E44、N68、R70、N75、R77和K80。

上述异二聚体变体可仅有如上所示的氨基酸替换。在此情况下，未指出的位置没有突变，由此分别对应于野生型I-CreI(SEQ ID NO：1)或I-CreI N75骨架(SEQ ID NO：4)序列。切割图18至20的GS DNA靶标(核苷酸序列SEQ ID NO：5至60)的此异二聚体I-CreI变体的实例包括由对应于下列序列对的第一和第二单体组成的变体：分别为SEQ ID NO：61至84(第一单体)和SEQ ID NO：85至108(第二单体；图18和表I)；分别为SEQID NO：109至123、75、124至128(第一单体)和SEQ ID NO：129至146、99、147至151(第二单体；图19和表II)；分别为SEQ ID NO：109、110、152至155、114、156至159、75、160至162、126、127、163(第一单体)和SEQ ID NO：129至133、164至167、137、168至171、99、172至174、149、150和175(第二单体；图20，表III和X)。

或者，异二聚体变体可由包含上述氨基酸替换的I-CreI序列组成。在后者的情况下，未指出的位置可包含另外的突变，例如一个或多个上述突变。

特别地，异二聚体变体的一个或两个单体有利地包含提高变体对GS靶标切割活性的额外替换。

例如，由第一变体和第二变体形成的异二聚体变体具有提高对GSCHO1靶标(SEQ ID NO：30)的切割活性的替换，所述第一变体具有SEQ ID NO：211至229、242至244和271(表XI和XII)中的任意序列，所述第二变体具有SEQ ID NO：245至268(表XIII和XIV)中的任意序列。

切割GSCHO1靶标的优选异二聚体变体显示于表IV.

表IV：切割GSCHO1靶标的优选异二聚体I-CreI变体

^*改善变体对GSCHO.1靶标的切割活性的额外突变以粗体显示

本发明包括与上文定义的序列具有至少85％同一性、优选地至少90％同一性、更优选地至少95％(96％、97％、98％、99％)同一性的I-CreI变体，所述变体能够切割来自GS基因的DNA靶标。

异二聚体变体有利地是专性异二聚体变体，其具有至少一对突变，其对应于第一和第二单体中使两个I-CreI单体之间发生分子间相互作用的对应残基，其中所述突变对的第一突变处于第一单体中，所述对的第二突变处于第二单体中，所述突变对防止每个单体形成功能性同二聚体，并且允许形成能够切割来自GS基因的基因组DNA靶标的功能性异二聚体。

为了形成专性异二聚体，单体有利地具有至少一个以下突变对，分别针对第一和第二单体：

a)用碱性氨基酸(优选精氨酸)替换8位的谷氨酸(第一单体)，和用酸性氨基酸(优选谷氨酸)替换7位的赖氨酸(第二单体)；第一单体还可包含用精氨酸替换7和96位的至少一个赖氨酸残基。

b)用碱性氨基酸(优选精氨酸)替换61位的谷氨酸(第一单体)，和用酸性氨基酸(优选谷氨酸)替换96位的赖氨酸(第二单体)；第一单体还可包含用精氨酸替换7和96位的至少一个赖氨酸残基。

c)用芳香氨基酸(优选苯丙氨酸)替换97位的亮氨酸(第一单体)，和用小氨基酸(优选甘氨酸)替换54位的苯丙氨酸(第二单体)；第一单体还可包含用色氨酸替换54位的苯丙氨酸，第二单体还可包含用甲硫氨酸替换58位的亮氨酸或57位的赖氨酸，和

d)用碱性氨基酸(优选精氨酸)替换137位的天冬氨酸(第一单体)，和用酸性氨基酸(优选谷氨酸)替换51位的精氨酸(第二单体)。

例如，第一单体可具有突变D137R，第二单体可具有突变R51D。专性异二聚体大范围核酸酶有利地包含至少两对在上文a)、b)、c)或d)中定义的突变；突变对之一有利地如c)或d)所定义。优选地，一个单体包含用酸性氨基酸(天冬氨酸(D)或谷氨酸(E))优选谷氨酸替换7位和96位的赖氨酸残基(K7E和K96E)，另一单体包含用碱性氨基酸(赖氨酸(R)或赖氨酸(K))替换8位和61位的谷氨酸残基(例如E8K和E61R)。更优选地，专性异二聚体大范围核酸酶包含在上文a)、b)和c)中定义的三对突变。专性异二聚体大范围核酸酶有利地由第一单体(A)和第二单体(B)组成，所述第一单体具有至少下列突变：(i)E8R、E8K或E8H、E61R、E61K或E61H和L97F、L97W或L97Y；(ii)K7R、E8R、E61R、K96R和L97F，或(iii)K7R、E8R、F54W、E61R、K96R和L97F，以及所述第二单体(B)至少具有下列突变：(iv)K7E或K7D、F54G或F54A和K96D或K96E；(v)K7E、F54G、L58M和K96E，或(vi)K7E、F54G、K57M和K96E。例如，第一单体可具有突变K7R、E8R或E8K、E61R、K96R和L97F或K7R、E8R或E8K、F54W、E61R、K96R和L97F，第二单体可具有突变K7E、F54G、L58M和K96E或K7E、F54G、K57M和K96E。专性异二聚体可包含上文定义的至少一个NLS和/或一个标签；所述NLS和/或标签可以在第一和/或第二单体中。

本发明的主题还包括衍生自如上所述的I-CreI变体的单链嵌合大范围核酸酶(融合蛋白)。所述单链大范围核酸酶可包含两个I-CreI单体、两个I-CreI核心结构域(I-CreI的6到94位)或二者的组合。优选地，两个单体/核心结构域或二者的组合通过肽连接子连接。

本发明的主题还包括编码如上所述的变体或单链嵌合大范围核酸酶的多核苷酸片段；所述多核苷酸可编码同二聚体或异二聚体变体的一个单体，或编码单链嵌合大范围核酸酶的两个结构域/单体。

本发明的主题还包括用于表达本发明变体或单链大范围核酸酶的重组载体。所述重组载体包含至少一个编码变体或单链大范围核酸酶的多核苷酸片段，如上所述。在一个优选的实施方案中，所述载体包含两个不同的多核苷酸片段，每个片段各编码异二聚体变体的单体之一。

可在本发明中使用的载体包括但不限于病毒载体、质粒、RNA载体，或者线性或环形DNA或RNA分子，可由染色体、非染色体、半合成或合成的核酸所组成。优选的载体是能够自主复制与之连接之核酸的载体(附加型载体)和/或表达与之连接之核酸的载体(表达载体)。大量的合适载体是本领域技术人员已知的，并可以商品获得。

病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(parvovirus)(例如腺相关病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒如正粘病毒(orthomyxovirus)(例如流感病毒)、杆状病毒(例如狂犬病毒和疱疹性口炎病毒(vesicular stomatitis virus))、副粘病毒(paramyxovirus)(例如麻疹病毒和仙台病毒(Sendai))、正链RNA病毒如小RNA病毒(picornavirus)和α病毒，以及双链DNA病毒，其包括腺病毒、疱疹病毒(例如1和2型单纯疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如牛痘病毒、禽痘病毒和金丝雀痘病毒)。其他病毒包括例如诺瓦克病毒、披膜病毒(togavirus)、黄病毒(flavivirus)、呼肠病毒(reoviruses)、乳多空病毒(papovavirus)、嗜肝DNA病毒(hepadnavirus)和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：禽白血病-肉瘤、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV组、慢病毒、泡沫病毒(spumavirus)(Coffin，J.M.，Retroviridae：The viruses and their replication，In Fundamental Virology，第三版，B.N.Fields，等编辑，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996)。

优选的载体包括慢病毒载体，尤其是自失活(self inactivacting)的慢病毒载体。

载体可包含选择标记，例如：用于真核细胞培养的新霉素磷酸转移酶、组氨醇脱氢酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素磷酸转移酶、单纯疱疹病毒胸苷激酶、腺苷脱氨酶、谷氨酰胺合成酶和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶；用于酿酒酵母(S.Cerevisiae)的TRP1、URA3和LEU2；大肠杆菌(E.coli)中的四环素、利福平或氨苄青霉素抗性。

优选地，所述载体是表达载体，其中编码本发明变体/单链大范围核酸酶专性异二聚体大范围核酸酶/单链衍生物的序列置于适当的转录和翻译控制元件的控制下，以允许产生或合成所述变体。因此，所述多核苷酸包含在表达盒中。更具体地，载体包含复制起点、与所述多核苷酸有效连接的启动子、核糖体结合位点、RNA剪接位点(使用基因组DNA时)、多腺苷酸化位点和转录终止位点。其还可包含增强子。启动子的选择将取决于其中表达多肽的细胞。优选地，当所述变体是异二聚体时，编码各个单体的两种多核苷酸包含在一个载体中，所述载体能够驱动两种多核苷酸同时表达。合适的启动子包括组织特异性和/或诱导型启动子。诱导型启动子的实例是：由提高重金属水平诱导的真核金属硫蛋白(metallothionine)启动子，应答于异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)诱导的原核lacZ启动子，和由提高温度诱导的真核热休克启动子。组织特异性启动子的实例是骨骼肌肌酸激酶、前列腺特异性抗原(PSA)、α-抗胰蛋白酶、人表面活性剂(SP)A和B蛋白、β-酪蛋白和酸性乳清蛋白基因。

根据所述载体的另一个有利的实施方案，其包括靶向DNA构建体，所述靶向DNA构建体含有与上文定义的基因组DNA切割位点周围区域有同源性的序列。

例如，所述与变体基因组DNA切割位点周围区域具有同源性的序列是小鼠GS基因的片段，其包含SEQ ID NO：3的以下位置：2913-3112、2971-3170、2999-3198、3045-3244、4653-4852、6360-6559、6400-6599、6445-6644、7083-7282、7105-7304、7234-7433、7266-7465、7302-7501、7314-7513、7316-7515、7423-7622、7882-8081、7906-8105、7998-8197、8005-8204和8012-8211。或者，所述与变体基因组DNA切割位点周围区域具有同源性的序列是人GS基因的片段，其包含SEQ ID NO：272的以下位置：2988-3187、3073-3272、3075-3274、3081-3280、3121-3320、3127-3326、4540-4739、5405-5604、5425-5624、5454-5653、5823-6022、5936-6135、5954-6153、6272-6471、6341-6540、6986-7185、7046-7245、7055-7254、7079-7278、7089-7288、7136-7335、7171-7370、7178-7377和7185-7384

或者，编码I-CreI变体/单链大范围核酸酶的载体和包含靶向构建体的载体是不同的载体。

更优选地，靶向DNA构建体包含：

a)与如上述基因组DNA切割位点周围的区域共有同源性的序列，和

b)侧翼是a)中序列或包含在a)中序列内的待引入序列。

优选使用至少50bp、优选多于100bp、更优选多于200bp的同源序列。因此，靶向DNA构建体优选地从200bp到6000bp，更优选地从1000bp到2000bp。事实上，共有的DNA同源性位于断裂位点上游和下游的侧翼区域中，且待引入的DNA序列应位于两臂之间。待引入的序列可以是任何用以通过某些特定方式改变染色体DNA的序列，包括下述序列：用以修复GS基因中突变、恢复功能性GS基因以替换突变基因、修饰GS基因中特定序列、弱化或活化GS基因、失活或缺失GS基因或其部分、用于向目的位点中引入突变或用于引入外源基因或其部分的序列。这些染色体DNA改变被用于基因组改造(动物模型/重组细胞系)或基因组治疗(基因矫正或功能性基因恢复)。靶向构建体有利地在两条同源性臂之间包含阳性选择标记，并最终在第一同源性臂上游或第二同源性臂下游包含阴性选择标记。所述标记允许选择通过同源重组在靶位点上插入了目的序列的细胞。

例如，图18至20标出了来自人、小鼠和中国仓鼠GS基因的靶标，能够切割所述靶标的变体实例以及修复每个靶位点上切割的最小修复基质。

待引入的序列优选是用于失活或缺失GS基因或其部分的序列(图3A)。此类染色体DNA改变可用于制备遗传修饰的细胞系，其中内源GS基因失活，并且转基因表达盒最终插入到GS基因座。此类染色体DNA改变还可用于制备敲除和敲入细胞/动物，其中GS基因失活(敲除)，最终由目的外源基因所替代(敲入)。

内源GS基因失活之后，谷氨酰胺合成酶可在进一步的基因组工程策略(靶向或随机基因操作)中在GS缺陷细胞/动物基因组的任何基因座处用作阳性选择标记。

对于制备敲入细胞/动物，靶向DNA构建体包含：用以修复切割的侧翼是I-CreI变体靶位点的至少200bp同源序列的GS基因片段、表达盒中包含的外源目的基因序列以及最后的选择标记例如新霉素抗性基因。

为了插入序列，DNA同源性通常位于紧邻断裂位点上游和下游的区域中(与断裂紧邻的序列；最小修复基质)。然而，当插入伴随着切割位点两侧ORF序列的缺失时，所具有的DNA同源性位于缺失区域上游和下游的区域中。

或者，待引入序列是修复GS基因中突变(基因矫正或恢复功能性基因)的序列，目的在于基因组治疗(图3C和3D)。为了矫正GS基因，在突变邻近处切割基因，优选在突变的500bp之内(图3C)。靶向构建体包含用于修复切割的GS基因片段，其靶位点侧翼至少有200bp同源序列(最小修复基质)，并且包含编码野生型GS基因一部分的序列，其对应于突变区域，用以修复突变(图3C)。因而，用于基因矫正的靶向构建体包含最小修复基质或由其组成；其优选200pb至6000pb，更优选1000pb至2000pb。优选地，当变体的切割位点与突变重叠时，修复基质包含经修饰的切割位点以及编码不改变GS基因开放读码框的野生型GS的序列，其中所述经修饰切割位点不被用于诱导GS基因中所述切割的变体所切割。

或者，对于恢复功能性基因(图3D)，基因的切割发生在突变的上游。优选地，所述突变是基因序列中的第一个已知突变，使得可同时矫正基因所有下游突变。靶向构建体包含框内融合(如同在cDNA中那样)的切割位点下游外显子，其具有多腺苷化位点以在3’停止转录。待引入序列(外显子敲入构建体)侧翼是切割位点周围的内含子或外显子序列，使得允许改造基因(外显子敲入基因)转录成能够编码功能性蛋白质的mRNA(图3D)。例如，外显子敲入构建体侧翼是切割位点上游和下游的序列，来自如上文所定义的最小修复基质。

本发明的主题还包括如上所定义的靶向DNA构建体。

本发明的主题还包括组合物，其特征在于包含至少一种上文定义的大范围核酸酶(变体或单链嵌合大范围核酸酶)和/或至少一种上文定义的编码所述大范围核酸酶的表达载体。

在所述组合物的一个优选实施方案中，其包含如上文所述的靶向DNA构建体。

优选地，所述靶向DNA构建体被包含在重组载体中或被包含在表达载体中，所述载体包含编码本发明大范围核酸酶的多核苷酸。

本发明的主题还包括上文所定义的大范围核酸酶、一种或两种多核苷酸(优选包含在表达载体中)为非治疗目的用于对GS基因进行基因组改造的用途。所述GS基因可以是在其基因组座位的内源GS基因或者是被插入动物或细胞系中的转基因(例如GS敲入动物或细胞系)。

根据所述用途的一个有利的实施方案，其用于在包含基因组DNA靶序列的GS基因目的位点中诱导双链断裂，从而诱导DNA重组事件、DNA丢失或细胞死亡。

根据本发明，所述双链断裂是用于：修复GS基因中的特定序列、修饰GS基因中的特定序列、恢复功能性GS基因以替换突变基因，弱化或活化GS基因、将突变引入到GS基因的目的位点中、引入外源基因或其部分、失活或消灭GS基因或其部分、使染色体臂易位或者使DNA不被修复并被降解。

优选地，是为了：(i)通过与失活盒同源重组使得GS基因失活(敲除动物/细胞系(图3A))，最终将转基因表达盒插入到GS基因座((敲入动物/细胞系(图3A)或(ii)通过非同源末端连接使GS基因失活(图3B))。

本发明主题还包括制备GS敲除或敲入重组细胞的方法，包括至少下列步骤：

(a)同时或依次地，将如上定义的大范围核酸酶(I-CreI变体或单链衍生物)引入细胞，使得在包含所述大范围核酸酶的DNA识别和切割位点的GS基因的目的位点处诱导双链切割，

(b)将靶向DNA引入步骤(a)的细胞，所述靶向DNA包含(1)与切割位点周围的区域具有同源性的DNA和(2)在靶向DNA和染色体DNA之间重组后修复目的位点的DNA，使得产生具有通过同源重组而修复了目的位点的重组细胞，

(c)通过任何合适方式分离步骤(b)的重组细胞。

本发明的主题还包括制备GS敲除或敲入动物的方法，其包括至少下列步骤：

(a)同时或依次地，将上文所述大范围核酸酶引入动物多能前体细胞或胚胎，中使得在包含所述大范围核酸酶的DNA识别和切割位点的GS基因目的位点处诱导双链切割，

(b)将靶向DNA引入步骤(a)的动物前体细胞或胚胎中，其中所述靶向DNA包含(1)与切割位点周围的区域具有同源性的DNA和(2)在靶向DNA和染色体DNA之间重组后修复目的位点的DNA，使得产生具有通过同源重组而修复了目的位点的基因组修饰的动物前体细胞或胚胎，

(c)使步骤(b)的基因组修饰动物前体细胞或胚胎发育成嵌合动物，和

(d)从步骤(c)的嵌合动物产生转基因动物。

优选地，步骤(c)包括将步骤(b)产生的基因组修饰前体细胞引入囊胚从而产生嵌合动物。

在适于将靶向DNA引入目的位点的条件下将靶向DNA引入细胞。

为了制备敲除细胞/动物，修复目的位点的DNA包含使得GS基因失活的序列。

为了制备敲入细胞/动物，修复目的位点的DNA包含外源目的基因的序列，以及最后的选择标记，例如新霉素抗性基因。

在一个优选实施方案中，所述靶向DNA构建体插入到载体中。

或者，可通过非同源末端连接修复双链断裂来使得GS基因失活(图3B)。

本发明的主题还包括制备GS缺陷型细胞的方法，其包括至少下列步骤：

(a)将上文所述大范围核酸酶引入细胞中，使得在包含所述大范围核酸酶的DNA识别和切割位点的GS基因目的位点处诱导双链切割，由此产生已通过非同源末端连接而修复了双链断裂的基因组修饰的GS缺陷型细胞，和

(b)通过任何合适手段分离步骤(a)的基因组修饰GS缺陷型细胞。

本发明的主题还包括制备GS敲除动物的方法，其包括至少下列步骤：

(a)将上文所述大范围核酸酶引入动物多能前体细胞或胚胎中，使得在包含所述大范围核酸酶的DNA识别和切割位点的GS基因目的位点处诱导双链切割，由此产生已通过非同源末端连接修复了双链断裂的基因组修饰的前体细胞或胚胎，

(b)使步骤(a)的基因组修饰动物前体细胞或胚胎发育成嵌合动物，和

(c)从步骤(b)的嵌合动物产生转基因动物。

优选地，步骤(b)包括将步骤(a)中获得的基因组修饰前体细胞引入囊胚，从而产生嵌合动物。

修饰的细胞可以是任何目的细胞。为了产生敲入/转基因小鼠，所述细胞是多能前体细胞如胚胎来源干细胞(ES细胞)，其为本领域所公知。为了产生重组人细胞系，细胞可有利地是PerC6(Fallaux等，Hum.Gene Ther.9，1909-1917，1998)或HEK293(ATCC#CRL-1573)细胞。为了制备小鼠细胞系，细胞可有利地是NSO、SP2/0(BALB/c骨髓瘤；ECACC#85110503和#85072401)或L(ATCC#CRL-2648)细胞。为了制备中国仓鼠细胞系，细胞可以有利地是CHO-K1(ATCC#CCL-61，DG44(Invitrogen)或CHO-S(Invitrogen)细胞。

动物优选地是哺乳动物，更优选实验室啮齿类动物(小鼠、大鼠、豚鼠)或牛、猪、马或山羊。

所述大范围核酸酶可以直接提供至细胞，或通过表达载体提供，所述表达载体包含编码所述大范围核酸酶并适于在所用细胞中表达的多核苷酸序列。

为了产生表达异源目的蛋白质的重组细胞系，靶向DNA包含编码目的产物(蛋白质或RNA)的序列，并最终包含标记基因，其侧翼是上文定义的切割位点的上游和下游序列，从而产生经基因组修饰的细胞，所述细胞通过同源重组而在GS基因中整合了外源目的序列。

目的序列可以是编码某目的蛋白质/多肽的任何基因，包括但不限于：报告基因、报告子、信号转导分子、转录因子、有药物活性的蛋白质和肽、致病的基因产物和毒素。所述序列也可以编码目的RNA分子，包括如siRNA。

外源基因的表达可以由内源GS启动子驱动，或者由上文定义的组成型或诱导型异源启动子(优选遍在型或组织特异型启动子)驱动。另外，目的序列的表达可以是有条件的；表达可以由位点特异性重组酶(Cre、FLP等)诱导。

因此，将目的序列插入合适的盒中，所述盒可包含与所述目的基因有效连接的异源启动子以及一个或多个功能序列，所述功能序列包括但不限于(选择)标记基因、重组酶识别位点、多腺苷酸化信号、剪接受体序列、内含子、用于蛋白质检测的标签和增强子。

本发明的主题还包括用于制备GS敲除或敲入细胞/动物的试剂盒，其包含至少如上所述的大范围核酸酶和/或表达载体。优选地，所述试剂盒还包含靶向DNA，其包含使得GS基因失活的序列，其侧翼是与所述大范围核酸酶DNA切割位点周围GS基因区域具有同源性的序列。此外，为了制备敲入细胞/动物，该试剂盒还包含载体，该载体包含待引入到所述细胞/动物基因组中的目的序列以及如上所述的选择标记。

本发明的主题还包括至少一种如上所述大范围核酸酶和/或一种表达载体在制备用于在有此需要的个体中预防、改善或治愈如上定义的GS基因的突变所造成的病理状况的药物中的用途。

优选地，所述病理状况是先天性谷氨酰胺系统性缺陷。

所述大范围核酸酶的使用可包括至少下列步骤：(a)通过将切割位点与所述大范围核酸酶相接触，在供体/个体的体细胞组织中在包含所述大范围核酸酶至少一个识别和切割位点的GS基因目的位点处诱导双链切割，和(b)将靶向DNA引入所述体细胞组织，其中所述靶向DNA包含(1)与切割位点周围区域有同源性的DNA，和(2)在靶向DNA与染色体DNA之间重组后修复GS基因的DNA，如上所述。在适于靶向DNA引入目的位点的条件下，将靶向DNA引入体组织。

根据本发明，可通过将所述大范围核酸酶引入来自患病个体的体细胞来离体诱导所述双链切割，然后将修饰的细胞移植回患病个体。

本发明的主题还包括在有此需要的个体中预防、改善或治愈由GS基因中的突变造成的疾病状况的方法，所述方法包括至少通过任意方式将上文定义的组合物施用到所述个体的步骤。大范围核酸酶可作为多肽使用或作为编码所述多肽的多核苷酸构建体使用。其通过本领域技术人员公知的任何适用于特定细胞种类的便利手段而(单独地或与至少一种合适的媒介或运载体和/或与靶向DNA组合)引入小鼠细胞内。

根据本发明的用途的一个有利的实施方案，所述大范围核酸酶(多肽)与以下组合：

-脂质体、聚乙烯亚胺(PEI)；在这些情况下施用所述组合并因此将其引入躯体靶细胞内。

-膜易位肽(Bonetta，The Scientist，2002，16，38；Ford等，Gene Ther.，2001，8，1-4；Wadia和Dowdy，Curr.Opin.Biotechnol.，2002，13，52-56)；在这样的情况下，将变体/单链大范围核酸酶的序列与膜易位肽的序列融合(融合蛋白)。

根据本发明的用途的另一有利的实施方案，将大范围核酸酶(编码所述大范围核酸酶的多核苷酸)和/或靶向DNA插入载体中。可通过大量方法(例如注射、直接摄入、发射物轰击、脂质体、电穿孔)将包含靶向DNA和/或编码大范围核酸酶的载体引入细胞中。可使用表达载体在细胞中稳定或瞬时地表达大范围核酸酶。在真核细胞中表达的技术是本领域技术人员公知的(见Current Protocols in Human Genetics：第12章“Vectors For Gene Therapy”&第13章“Delivery Systems for Gene Therapy”)。任选地，可优选在重组蛋白中掺入核定位信号以确保其在核内表达。

一旦进入细胞内，大范围核酸酶和包含靶向DNA和/或编码大范围核酸酶的核酸的载体(如果存在的话)被细胞从胞质输入或易位至核内的作用位点。

对治疗的目的而言，以治疗有效量施用大范围核酸酶和可药用赋形剂。如果施用量是有生理意义的，则这样的组合被称作以“治疗有效量”施用。如果一种药剂的存在导致可检测的接受者生理学改变，则它是有生理意义的。在本文中，如果药剂的存在导致目标疾病的一个或多个症状的严重程度减轻以及损伤或异常的基因组矫正，则它是有生理意义的。

在根据本发明的用途的一个实施方案中，大范围核酸酶基本上是非免疫原性的，即不引发或几乎不引发不利的免疫应答。根据本发明可使用大量改善或消除这类有害免疫反应的方法。在一个优选的实施方案中，大范围核酸酶基本不含N-甲酰基甲硫氨酸。避免不想要的免疫反应的另一种方式是将大范围核酸酶与聚乙二醇(″PEG″)或聚丙二醇(″PPG″)(优选500到20,000道尔顿的平均分子量(MW))缀合。与PEG或PPG缀合(例如Davis等(US 4,179,337)所述)能够提供具有抗病毒活性的非免疫原性的生理活性水溶性内切核酸酶缀合物。Saifer等(US 5,006,333)中还描述了使用聚乙-聚丙二醇共聚物的类似方法。

本发明还涉及通过上文所述的多核苷酸或载体(优选表达载体)修饰的原核或真核宿主细胞。

本发明还涉及非人转基因动物或转基因植物，其特征是其所有或部分细胞通过上文所述的多核苷酸或载体进行了修饰。

本文使用的“细胞”是指原核细胞如细菌细胞，或真核细胞如动物、植物或酵母细胞。

本发明的主题还包括如上所述的至少一种大范围核酸酶变体作为制造其他大范围核酸酶的骨架的用途。例如，为了制造新的大范围核酸酶的目的，可例如对所述变体进行更多轮诱变和选择/筛选。

大范围核酸酶的不同用途以及本发明大范围核酸酶的使用方法还包括使用I-CreI变体、衍生自所述变体的单链嵌合大范围核酸酶、编码所述变体或单链嵌合大范围核酸酶的多核苷酸、载体、细胞、转基因植物或非人转基因哺乳动物的用途，如上所述。

可通过改造能够切割来自GS基因的基因组DNA靶序列的I-CreI变体的方法来获得本发明的I-CreI变体，所述方法包括以下步骤：

(a)构建第一系列I-CreI变体，其在LAGLIDADG核心结构域的第一功能性亚结构域中具有至少一个替换，所述第一功能性亚结构域位于I-CreI的28到40位，

(b)构建第二系列I-CreI变体，其在LAGLIDADG核心结构域的第二功能性亚结构域中具有至少一个替换，所述第二功能性亚结构域位于I-CreI的44到77位，

(c)从来自步骤(a)的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CreI位点的变体，所述突变体位点中(i)I-CreI位点-10到-8位的核苷酸三联体已被替换为存在于所述基因组靶标中-10到-8位的核苷酸三联体，且(ii)+8到+10位的核苷酸三联体已被替换为存在于所述基因组靶标中-10到-8位的核苷酸三联体的反向互补序列，

(d)从来自步骤(b)的第二系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CreI位点的变体，所述突变体位点中(i)I-CreI位点-5到-3位的核苷酸三联体已被替换为存在于所述基因组靶标中-5到-3位的核苷酸三联体，且(ii)+3到+5位的核苷酸三联体已被替换为存在于所述基因组靶标中-5到-3位的核苷酸三联体的反向互补序列，

(e)从来自步骤(a)的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CreI位点的变体，所述突变体位点中(i)I-CreI位点+8到+10位的核苷酸三联体已被替换为存在于所述基因组靶标中+8到+10位的核苷酸三联体，且(ii)-10到-8位的核苷酸三联体已被替换为存在于所述基因组靶标中+8到+10位的核苷酸三联体的反向互补序列，

(f)从来自步骤(b)的第二系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CreI位点的变体，所述突变体位点中(i)I-CreI位点+3到+5位的核苷酸三联体已被替换为存在于所述基因组靶标中+3到+5位的核苷酸三联体，且(ii)-5到-3位的核苷酸三联体已被替换为存在于所述基因组靶标中+3到+5位的核苷酸三联体的反向互补序列，

(g)将来自步骤(c)和步骤(d)的两个变体中28到40位和44到77位的突变组合在单个变体中，获得切割以下序列的新的同二聚体I-CreI变体，所述序列中(i)-10到-8位的核苷酸三联体与存在于所述基因组靶标中-10到-8位的核苷酸三联体相同，(ii)+8到+10位的核苷酸三联体与存在于所述基因组靶标中-10到-8位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(iii)-5到-3位的核苷酸三联体与存在于所述基因组靶标中-5到-3位的核苷酸三联体相同，和(iv)+3到+5位的核苷酸三联体与存在于所述基因组靶标中-5到-3位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，和/或

(h)将来自步骤(e)和步骤(f)的两个变体中28到40位和44到77位的突变组合在单个变体中，获得切割以下序列的新的同二聚体I-CreI变体，所述序列中(i)+3到+5位的核苷酸三联体与存在于所述基因组靶标中+3到+5位的核苷酸三联体相同，(ii)-5到-3位的核苷酸三联体与存在于所述基因组靶标中+3到+5位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(iii)I-CreI位点+8到+10位的核苷酸三联体被替换为存在于所述基因组靶标中+8到+10位的核苷酸三联体，和(iv)-10到-8位的核苷酸三联体与存在于所述基因组靶标中+8到+10位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，

(i)将步骤(g)和(h)中获得的变体相组合，以形成异二聚体，和

(j)选择和/或筛选来自步骤(i)的能够切割来自GS基因的所述DNA靶序列的异二聚体。

可省略步骤(c)、(d)、(e)或(f)之一。例如，如果省略步骤(c)，则步骤(d)用这样的突变体I-CreI位点进行，所述突变中-10到-8位和-5到-3位的两个核苷酸三联体已被分别替换为存在于所述基因组靶标-10到-8位和-5到-3位的核苷酸三联体，且+3到+5位和+8到+10位的核苷酸三联体已分别被替换为存在于所述基因组靶标-5到-3位和-10到-8位的核苷酸三联体的反向互补序列。

可根据公知的重叠PCR技术，通过扩增包含两个亚结构域中之每一个的重叠片段来进行步骤(g)和(h)中的(分子内)突变组合。

步骤(i)中的(分子内)变体组合是通过将步骤(g)的一种变体与步骤(h)的一种变体共表达从而允许形成异二聚体来进行的。例如，可通过编码所述变体的一种或两种重组表达载体修饰宿主细胞。然后在允许表达所述变体的条件下培养所述细胞，从而在所述宿主细胞中形成异二聚体，如先前在PCT国际申请WO 2006/097854，Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458中所述的。

可如国际PCT申请WO 2004/067736，Epinat等，Nucleic Acids Res.，2003，31，2952-2962和Chames等，Nucleic Acids Res.，2005，33，e178或Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458中所述，通过使用体外或体内切割测定来进行步骤(c)、(d)、(e)、(f)和/或(j)中的选择和/或筛选。

根据所述方法的另一个优选的实施方案，通过重组介导的DNA双链断裂的修复在下述条件下在体内进行步骤(c)、(d)、(e)、(f)和/或(j)，在所述条件下，由所述变体产生的突变DNA靶序列中的双链断裂导致阳性选择标记或报告基因的激活或者阴性选择标记或报告基因的失活。

另外，有利地对步骤(g)或(h)中获得的同二聚化组合变体进行选择/筛选步骤，以鉴定能够切割假回文序列的变体，所述假回文序列中至少-11至-3位(步骤(g)的组合变体)或+3至+11位(步骤(h)的组合变体)的核苷酸与所述基因组靶标的-11至-3位(步骤(g)的组合变体)或+3至+11位(步骤(h)的组合变体)核苷酸相同，并且+3至+11位(步骤(g)的组合变体)或-11至-3位(步骤(h)的组合变体)的核苷酸与所述基因组靶标的-11至-3位(步骤(g)的组合变体)或+3至+11位(步骤(h)的组合变体)核苷酸的反向互补序列相同。

优选地，对步骤(g)或步骤(h)(或其两者)的组合变体组进行额外的选择/筛选步骤，以鉴定能够切割假回文序列的变体，所述假回文序列中：-2至+2位核苷酸(四个中心碱基)与所述基因组靶标的-2至+2位核苷酸相同，(ii)-11至-3位(步骤(g)的组合变体)或+3至+11位(步骤(h)的组合变体)的核苷酸与所述基因组靶标的-11至-3位(步骤(g)的组合变体)或+3至+11位(步骤(h)的组合变体)核苷酸相同，以及(iii)+3至+11位(步骤(g)的组合变体)或-11至-3位(步骤(h)的组合变体)的核苷酸与所述基因组靶标的-11至-3位(步骤(g)的组合变体)或+3至+11位(步骤(h)的组合变体)核苷酸的反向互补序列相同。此额外筛选步骤增加了分离能够切割目的基因组靶标的异二聚体的概率(步骤(j))。

步骤(a)、(b)、(g)、(h)和(i)还可包括将额外突变引入与DNA靶序列接触或者直接或间接与所述DNA靶标相互作用的其他位置、改善变体的结合和/或切割特征的位置或者阻止或阻碍功能性同二聚体的形成或者利于异二聚体的形成的位置，如上所述。

可根据本领域公知的标准诱变方法(例如通过使用PCR)通过对变体或变体库进行定点诱变和/或随机诱变来引入所述额外突变。

特别地，可在整个变体或变体的一部分(特别是变体的C端一半(80-163位))中引入随机突变，以改善变体对来自目的基因的DNA靶标的结合和/或切割特性。在改善变体结合和/或切割特性的位置处(例如19、54、80、87、105和/或132位)的定点诱变也可与随机诱变组合。可根据本领域公知的标准诱变方法通过对变体库产生随机/定点诱变文库来进行诱变。如上所述，可根据公知的重叠PCR技术，有利地通过扩增包含突变位置的重叠片段进行定点诱变。此外，可有利地对变体或变体库进行多位点定点诱变。

优选地，对步骤(i)中形成的或步骤(j)中获得的异二聚体的一个单体进行诱变，有利地对单体库进行诱变，有利地对步骤(i)或(j)的异二聚体的两个单体进行诱变。

优选地，根据Arnould et al.，J.Mol.Biol.，2007，371，49-65的图4所示方法，进行至少两轮选择/筛选。在第一轮中，对异二聚体的一个单体进行诱变(图4中的单体Y)，与另一个单体共表达(图4中的单体X)形成异二聚体，针对来自目的基因的靶标选择改善的单体Y⁺。在第二轮中，诱变另一个单体(单体X)，与改善的单体Y⁺共表达形成异二聚体，针对来自目的基因的靶标进行选择，获得具有改善活性的大范围核酸酶(X⁺Y⁺)。诱变可以是对单体或单体库进行随机诱变或定点诱变，如上所示。有利地将两种类型诱变组合。可对单体之一或两者进行额外轮的选择/筛选，以改善变体的切割活性。

可通过在酵母或哺乳动物细胞中使用报告载体与原始大范围核酸酶进行比较的直接重复重组测定来测量根据本发明方法获得的改善的大范围核酸酶的切割活性。所述报告载体包含报告基因的两个截短的非功能性拷贝(直接重复)以及在克隆于酵母或哺乳动物表达载体的插入序列中包含被原始大范围核酸酶切割的基因组DNA靶序列。大范围核酸酶的表达导致基因组DNA靶序列的切割。此切割诱导直接重复之间的同源重组，产生功能性报告基因(例如LacZ)，可通过合适测定对其表达进行监测。相比于原始大范围核酸酶，使用改善的大范围核酸酶观察到更强的信号。或者，可以在哺乳动物细胞中使用染色体测定，将改善的大范围核酸酶针对其基因组DNA靶标的活性与I-CreI对相同基因座处I-CreI位点的活性进行比较(Arnould et al.，J.Mol.Biol.，2007，371，49-65)。

本发明的主题还包括在I-CreI的28到40位和/或44到77位具有突变的I-CreI变体，其适用于改造能够切割来自GS基因的DNA靶标的本发明变体。具体地，本发明包括如上所述改造I-CreI变体(包括表V和VII中给出的28、30、32、33、38和40、或者44、68、70、75和77位的变体)的方法的步骤(c)到(f)中定义的I-CreI变体。本发明还包括如上所述改造I-CreI变体的方法的步骤(g)和(h)中定义的I-CreI变体，包括表V至表VII的组合变体。

能够切割来自目的基因的DNA靶标的单链嵌合大范围核酸酶根据本领域公知的方法衍生自本发明的变体(Epinat等，Nucleic Acids Res.，2003，31，2952-62；Chevalier等，Mol.Cell.，2002，10，895-905；Steuer等，Chembiochem.，2004，5，206-13；国际PCT申请WO 03/078619和WO 2004/031346)。任何这些方法都可用于构建衍生自本发明所述变体的单链嵌合大范围核酸酶。

编码本发明所述变体的多核苷酸序列可通过本领域技术人员已知的任何方法制备。例如，通过使用特定引物的聚合酶链式反应从cDNA模板扩增它们。优选将所述cDNA的密码子选择成有助于所述蛋白质在期望的表达系统中表达。

可通过公知的重组DNA和和遗传工程技术获得包含所述多核苷酸的重组载体并将其引入宿主细胞中。

通过表达如上所述的多肽来产生本发明所述的I-CreI变体或单链衍生物；优选在适合多肽表达或共表达的条件下在以一个或两个表达载体(仅在变体的情况下)修饰的宿主细胞或转基因动物/植物中表达或共表达(仅在变体的情况下)所述多肽，并从宿主细胞培养物或从转基因动物/植物中回收变体或单链衍生物。

除非另有说明，否则本发明的实施将使用本领域内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。这些技术在文献中有详尽解释。参阅，例如Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL，2000，Wiley和son Inc，Library of Congress，USA)；Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，(Sambrook等，2001，Cold Spring Harbor，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑，1984)；Mullis等美国专利号4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harries & S.J.Higgins编辑1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins编辑1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(主编J.Abelson和M.Simon，Academic Press，Inc.，New York)，尤其是第154和155卷(Wu等编辑)以及第185卷，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel编辑)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos编辑，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker编辑，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑，1986)；以及Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

除了上述特征以外，本发明还包括在以下描述中显现的其他特征，所述描述涉及说明本发明的I-CreI大范围核酸酶变体及其用途的实施例、以及附图，在附图中：

-图1：归巢核酸内切酶的模块化结构以及用于定制大范围核酸酶设计的组合方法。A.与其DNA靶标相结合的I-CreI归巢核酸内切酶的三维结构。催化核心被两个αββαββα折叠所围绕，其在DNA大沟上形成鞍形相互作用界面。B.不同I-CreI变体结合来源于I-CreI靶序列的不同序列(右上和左下)，获得切割非回文嵌合靶标的异二聚体或单链融合分子(右下)。C.更小的独立亚基的鉴定，即单个单体或αββαββα折叠中的亚基(右上和左下)将允许通过将突变组合在同一单体中来设计新嵌合分子(右下)。此类分子会切割回文嵌合靶标(右下)。D.两个前述步骤的组合将允许进行更大的组合方法，其涉及四个不同亚结构域。在第一步骤中，可将一对新大范围核酸酶组合为新分子(“半-大范围核酸酶”)，其切割来源于要切割靶标的回文靶标。然后，这些“半-大范围核酸酶”的组合可产生切割目的靶标的异二聚体种类。因此，对每个亚结构域鉴定少量新切割酶允许设计非常大量的新核酸内切酶。

-图2：谷氨酰胺合成酶编码序列。A.小鼠谷氨酰胺合成酶基因(登录号NC000067.5)。外显子以灰色框显示。GSCHO1靶标以其序列和位置表示。B.中国仓鼠(Criteculus griseus)谷氨酰胺合成酶mRNA(登录号X03495)。ORF以灰色框显示。GSCHO1基因组靶标位点以其相对于谷氨酰胺合成酶mRNA序列的序列和位置标出。

-图3：应用切割谷氨酰胺合成酶(GS)基因的大范围核酸酶的策略。A.基因插入和/或基因失活。用大范围核酸酶切割并同侧翼为与切割位点周围序列具有同源性的序列的目的基因(基因插入)或失活盒(基因失活)的修复基质重组之后，发生基因插入或基因失活。B.通过非同源末端连接的基因失活。大范围核酸酶切割之后，DNA末端降解，通过非同源末端连接(Non-Homologous-End-Joining，NHEJ)重新连接，发生基因失活。C.基因矫正。GS基因中发生突变。在大范围核酸酶切割以及与修复基质重组之后，有害突变被矫正。D.外显子序列敲入。GS基因中发生突变。突变的mRNA转录本在基因下方标出。在修复基质中，位于切割位点下游的外显子与多腺苷化位点框内融合(如同在cDNa中那样)，以在3’端终止转录。内含子和外显子序列可用作同源区。外显子序列的敲入产生经改造的基因，转录为能够编码功能性蛋白质的mRNA。

-图4：GSCHO1靶序列及其衍生物。10GCC_P、10GGA_P、5AGG_P和5TTC_P是被之前获得的I-CreI变体切割的关系密切的衍生物。它们与C1221的区别在于加框的基序。C1221、10GCC_P、10GGA_P、5AGG_P和5TTC_P最初被描述为24bp的序列，但是结构数据提示，仅有22bp与蛋白质/DNA相互作用相关。但是，括号中显示了±12位。GSCHO1是位于小鼠和中国仓鼠谷氨酰胺合成酶基因中的DNA序列。在GSCHO1.2靶标中，靶标中间的GTGA序列被C1221中存在的碱基GTAC所替换。GSCHO1.3是来源于GSCHO1.2左部分的回文序列，GSCHO1.4是来源于GSCHO1.2右部分的回文序列。如图所示，来自10GCC_P、10GGA_P、5AGG_P和5TTC_P的加框基序存在于GSCHO1系列靶标中。

-图5：pCLS1055质粒图。

-图6：pCLS0542质粒图。

-图7：组合变体对GSCHO1.3靶标切割。该图显示用GSCHO1.3靶标筛选I-CreI组合变体的实施例。滤膜上，位置H2的阳性变体序列为KRSRES/DYSYQ(根据表VI的命名法)。H10、H11、H12是不同强度的阴性和阳性对照。

-图8：pCLS1107质粒图。

-图9：组合变体对GSCHO1.4靶标的切割。该图显示GSCHO1.4靶标筛选I-CreI组合变体的实施例。H10、H11和H12是不同强度的阴性和阳性对照。滤膜上，D4、F3和F9位置的阳性变体序列分别为KRDYQS/RHRDI、KRGYQS/KARDI和KRDYQS/RNRDI(根据表VII的命名法)。

-图10：异二聚体组合变体对GSCHO1.2和GSCHO1靶标序列的切割。A.用GSCHO1.2靶标对I-CreI变体进行组合筛选的实施例。B.用GSCHO1靶标对相同的I-CreI变体组合进行的筛选。

所测试的所有异二聚体导致GSCHO1.2靶标的切割。在D3、D7、D9和E2位置观察到显示对GSCHO1靶标信号最强的异二聚体，对应于分别共表达GSCHO1.3变体KRSRES/DYSYQ和GSCHO1.4变体KRGYQS/KHRDI、KRGYQS/KNRDI、KRCYQS/RHRDI或KRGYQS/RHRDI的酵母。E10、E11和E12是不同强度的阴性和阳性对照。

-图11：GSCHO1靶标的切割。针对GSCHO1靶标，对通过对切割GSCHO1.3的变体进行随机诱变(实施例5)并与切割GSCHO1.4的变体(根据表VIII的KRGYQS/KNRDI)共表达而获得的I-CreI精细化变体进行筛选的实例。每个簇含有6个点：在左边4个点，含有GSCHO1靶标和GSCHO1.4变体的酵母菌株与来自文库的4个不同克隆接合(除了H10、H11和H12：不同强度的阴性和阳性对照)。右上的点是与初始GSCHO1.3变体之一KRSRES/DYSYQ(根据表VI的命名法)接合的GSCHO1.4变体/GSCHO1靶标菌株；右下点是内部对照。滤膜上，在C11、E12和F1位的阳性变体的序列分别为30R、33R、38E、44D、66H、68Y、70S、75Y、77Q、132V；7E、19A、30R、33R、38E、44D、68Y、70S、75Y、77Q、120A；以及30R、33R、38E、44D、68Y、70S、75Y、77Q、87L。

-图12：GSCHO1靶标的切割。针对GSCHO1靶标，对实施例6中通过对切割GSCHO1.3靶标的初始变体进行定点诱变并且与切割GSCHO1.4的变体(根据表VIII的KRGYQS/KNRDI)共表达而构建的文库进行筛选的实例。每个簇含有6个点：对于每个点，含有GSCHO1靶标和GSCHO1.4变体的酵母菌株与来自含E80K替换之文库的2个不同克隆(左侧点)、来自含F87L替换之文库的2个不同克隆(中间点)或者实施例3中所述切割GSCHO1.3的变体KRSRES/DYSYQ(右上点)接合。右下点是内部对照。H10、H11和H12是不同强度的阴性和阳性对照。B7和G6位的阳性变体序列分别是30R、33R、38E、44D、68Y、70S、75Y、77Q、80K和30R、33R、38E、44D、68Y、70S、75Y、77Q、87L。

-图13：GSCHO1靶标的切割。针对GSCHO1靶标，对通过对切割GSCHO1.4的变体进行随机诱变(实施例7)并与切割GSCHO1.3的变体(根据表VI的KRSRES/DYSYQ)共表达而获得的I-CreI精细化变体进行筛选的实例。每个簇含有6个点：在左边4个点，含有GSCHO1靶标和GSCHO1.3变体的酵母菌株与来自文库的4个不同克隆接合(除了H10、H11和H12：不同强度的阴性和阳性对照)。右上的点是与初始GSCHO1.4变体之一KRGYQS/KYSNI(根据表VIII的命名法)接合的GSCHO1.3变体/GSCHO1靶标菌株；右下点是内部对照。滤膜上，在E6、D9和H3位的阳性变体的序列分别为30R、32G、44R、68H、132V、154G；30R、33H、68A、77R；以及2S、30R、33H、68A、77R。

-图14：GSCHO1靶标的切割。针对GSCHO1靶标，对实施例8中通过对切割GSCHO1.4靶标的初始变体的定点诱变并且与切割GSCHO1.3(根据表VI的KRSRES/DYSYQ)的变体共表达而构建的文库进行筛选的实例。每个簇含有6个点：对于每个点，含有GSCHO1靶标和GSCHO1.3变体的酵母菌株与来自含G19S替换之文库的2个不同克隆(上方2个点)，来自含F54L替换之文库的2个不同克隆(下方2个点)或者实施例4中所述切割GSCHO1.4的变体KRGYQS/KYSNI(右上点)接合。右下点是内部对照。H10、H11和H12是不同强度的阴性和阳性对照。B2、F1和H2位的阳性变体序列分别是30R、32G、44R、54L、68H；19S、30R、32G、44K、45M、68H；以及19S、30R、33H、68A、77R。

-图15：pCLS1058质粒图。

-图16：pCLS1768质粒图。

-图17：CHO细胞中的GSCHO1靶标切割。将GSCHO1靶标序列在哺乳动物细胞中的染色体外切割效率与十二种异二聚体组合进行比较。所测试变体的序列描述于表XV。阴性对照pCLS1768是空表达载体。

-图18表示人GS基因中存在的大范围核酸酶靶标序列，以及能够切割所述DNA靶标的I-CreI变体实例；对于每个靶标显示至少一个变体实例(第一和第二I-CreI变体单体形成的异二聚体)。显示了最靠近靶序列的外显子以及外显子接合处(第1和2栏)，给出了DNA靶标的序列(第3栏)及其序列识别号(第4栏)和其参考人GS基因序列(9782bp；登录号NC_000001.9)的第一个核苷酸位置(第5栏)。以其第一(起始，第10栏)和最后一个核苷酸(末端，第11栏)来表示用于修复靶位点处切割的最小修复基质。每个I-CreI变体的序列由所示位置突变的残基(第6和8栏)以及对应的序列识别号(第7和9栏)来定义。例如，图18的第一个异二聚体变体由第一单体和第二单体组成，所述第一单体分别在30、33、44、68、75、77和80位具有T、G、V、E、N、R和K，所述第二单体分别在30、32、33、40、44、68、70、75和77位具有R、T、N、Q、D、S、R和T。所述位置参照I-CreI序列(SEQ ID NO：1)表示；I-CreI在30、32、33、40、44、68、70、75、77和80位分别具有N、S、Y、S、Q、R、R、D、I和E。

-图19显示小鼠GS基因中的大范围核酸酶靶序列，以及能够切割所述DNA靶标的I-CreI变体实例；对于每个靶标显示至少一个变体实例(第一和第二I-CreI变体单体形成的异二聚体)。显示了最靠近靶序列的外显子和外显子接合处(第1和2栏)，给出了DNA靶标的序列(第3栏)以及其序列识别号(第4栏)和其参考小鼠GS基因序列(SEQ ID NO：3)的第一个核苷酸位置(第5栏)。由其第一(起始，第10栏)和最后一个核苷酸(末端，第11栏)显示用于修复靶位点处切割的最小修复基质。每个I-CreI变体的序列由所示位置突变的残基(第6和8栏)以及对应的序列识别号(第7和9栏)定义。例如，图19的第一异二聚体变体由第一单体和第二单体组成，所述第一单体分别在32、33、38、44、68、70和75位具有C、C、H、K、Y、S和N，以及所述第二单体分别在30、44、68、70、75和77位具有R、T、Y、S、R和T。所述位置参照I-CreI序列(SEQ ID NO：1)表示；I-CreI在30、32、33、38、44、68、70、75、77和80位分别具有N、S、Y、Q、Q、R、R、D、I和E。

-图20显示中国仓鼠(Criteculus griseus)GS基因中的大范围核酸酶靶序列，以及能够切割所述DNA靶标的I-CreI变体实例；对于每个靶标显示至少一个变体实例(第一和第二I-CreI变体单体形成的异二聚体)。显示了最靠近靶序列的外显子(第1栏)，给出了DNA靶标的序列(第2栏)，以及其序列识别号(第3栏)和其参考中国仓鼠GS mRNA序列(GenBank X03495)的第一个核苷酸位置(第4栏)。每个I-CreI变体的序列由所示位置突变的残基(第5和7栏)以及对应的序列识别号(第6和8栏)定义。例如，图20的第一异二聚体变体由第一单体和第二单体组成，所述第一单体分别在32、33、38、44、68、70和75位具有C、C、H、K、Y、S和N，以及所述第二单体分别在30、44、68、70、75和77位具有R、T、Y、S、R和T。所述位置参照I-CreI序列(SEQ ID NO：1)表示；I-CreI在30、32、33、40、44、68、70、75、77和80位分别具有N、S、Y、Q、Q、R、R、D、I和E。

实施例1：改造出切割来自谷氨酰胺合成酶(GS)基因的靶标的新大范围核酸酶的策略

GSCHO1是位于小鼠和中国仓鼠谷氨酰胺合成酶基因编码序列中的22bp(非回文)靶标。靶序列对应于小鼠谷氨酰胺合成酶基因(登录号NC000067.5；图2A)的3060-3083位和中国仓鼠谷氨酰胺合成酶(GS)cDNA(登录号X03495；图2B)的204至227位。

GSCHO1序列部分地是被之前定义的如国际PCT申请WO 2006/097784和WO 2006/097853；Arnould et al.，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458；Smith et al.，Nucleic Acids Res.，2006中所述获得的大范围核酸酶切割的10GCC_P、10GGA_P、5AGG_P和5TTC_P靶标(图4)的拼贴物。因此，GSCHO1可被之前鉴定的大范围核酸酶产生的组合变体所切割。

10GCC_P、10GGA_P、5AGG_P和5TTC_P靶序列是被I-CreI切割的回文序列C1221的24bp衍生物(Arnould et al.，上文所引)。然而，与其DNA靶标结合的I-CreI的结构表明这些靶标的两个外侧碱基对(-12和12位)对结合和切割没有影响(Chevalier et al.，Nat.Struct.Biol.，2001，8，312-316；Chevalier and Stoddard，Nucleic Acids Res.，2001，29，3757-3774；Chevalier et al.，J.Mol.Biol.，2003，329，253-269)，在本研究中，仅考虑-11至11位。相应地，将GSCHO1系列靶标定义为22bp序列，而不是24bp。GSCHO1与C1221的差异在于4bp中心区域。根据与其靶标结合的I-CreI蛋白质的结构，4个中心碱基对(-2至2位)与I-CreI蛋白之间没有接触(Chevalier et al.，Nat.Struct.Biol.，2001，8，312-316；Chevalier and Stoddard，Nucleic Acids Res.，2001，29，3757-3774；Chevalier et al.，J.Mol.Biol.，2003，329，253-269)。因此，这些位置的碱基不应影响结合效率。但是，它们可影响切割，切割是由此区域边缘的两个切口产生的。因此，-2至2的gtga序列首先被来自C1221的gtac序列所替换，得到靶标GSCHO1.2(图4)。然后，两个回文靶标GSCHO1.3和GSCHO1.4来源于GSCHO1.2(图4)。因为GSCHO1.3和GSCHO1.4是回文的，所以它们应由同二聚体蛋白质所切割。因此，首先设计同二聚体形式的能够切割GSCHO1.3和GSCHO1.4序列的蛋白质(实施例2和3)，然后共表达获得切割GSCHO1的异二聚体(实施例4)。可鉴定切割GSCHO1.2和GSCHO1靶标的异二聚体。为了改善对GSCHO1靶标的切割活性，选择了一系列切割GSCHO1.3和GSCHO1.4的变体，然后精细化。对所选变体进行随机诱变或定点诱变，用于形成新的异二聚体，将其针对GSCHO1靶标进行筛选(实施例5、6、7和8)。可鉴定对GSCHO1靶标的切割活性改善的异二聚体。然后，将所选异二聚体克隆进哺乳动物表达载体，在CHO细胞中针对GSCHO1靶标进行筛选(实施例9)。可观察到这些异二聚体在哺乳动物细胞中对GSCHO1靶标的强切割活性。

实施例2：切割GSCHO1.3的大范围核酸酶的鉴定

本实施例显示，I-CreI变体可切割来源于GSCHO1.2靶标左部分的回文形式的GSCHO1.3DNA靶标(图4)。本实施例所述靶序列是22bp回文序列。因此，仅通过前11个核苷酸对其进行描述，后面跟着后缀_P(例如靶标GSCHO1.3表示为tgccccagggt_P)。

GSCHO1.3在±1、±2、±6、±8、±9和±10位与10GCC_P相似，在±1、±2、±3、±4、±5和±6位与5AGG_P相似。猜想±7和±11位对结合和切割活性没有什么作用。通过如Smith et al.Nucleic Acids Res.，2006，34，e149；国际PCT申请WO 2007/060495和WO 2007/049156所述在28、30、32、33、38、40和70位诱变I-CreI N75或D75，获得能够切割10GCC_P靶标的变体。通过如Arnould et al.，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458；Smith et al.Nucleic Acids Res.，2006，34，e149；国际PCT申请WO 2006/097784，WO 2006/097853，WO 2007/060495和WO 2007/049156所述在24、44、68、70、75和77位诱变I-CreI N75，获得能够切割5AGG_P的变体。

两组蛋白质都在70位突变。但是，推测存在两个分离的功能性亚结构域。这暗示，该位置对靶标10至8位碱基的特异性几乎没有影响。切割5AGG_P靶标的变体中发现的24位的突变将在组合过程中丢失。但是，猜想这对组合变体切割GSCHO1.3靶标的能力将几乎没有影响。

因此，为了检查合并变体是否切割GSCHO1.3靶标，将来自切割5AGG_P的蛋白质的44、68、70、75和77位的突变与来自切割10GCC_P的蛋白质的28、30、32、33、38和40位突变相组合。

A)材料和方法

a)构建靶标载体

如下克隆靶标：侧翼是gateway克隆序列的对应于GSCHO1.3靶序列的寡核苷酸从Proligo定购：5’tggcacaagttttactgccccagggtaccctggggcagcaatcgtctgtca 3’(SEQ ID NO：183)。使用Gateway方案(INVITROGEN)，将通过PCR扩增单链寡核苷酸而产生的双链靶DNA克隆进酵母报告载体(pCLS1055，图5)中。将酵母报告载体转化进酿酒酵母菌株FYBL2-7B(MATα，ura3Δ851，trp1Δ63，leu2Δ1，lys2Δ202)中，得到报告菌株。

b)酵母中大范围核酸酶表达克隆的接合和筛选

如先前在Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149；国际PCT申请WO 2007/060495、WO 2007/049156和Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458；国际PCT申请WO 2006/097784和WO 2006/097853中所述，分别针对10GCC_P或5AGG_P靶标鉴定了切割10GCC_P或5AGG_P的I-CreI变体。为了产生含有来自两个系列的突变的来自I-CreI的编码序列，分别进行扩增I-CreI编码序列5’端(1-43位aa)或3’端(39-167位)的重叠PCR反应。对5’和3’两端而言，使用对载体(pCLS0542，图6)特异的引物Gal10F(5’-gcaactttagtgctgacacatacagg-3’；SEQ ID NO：186)或Gal10R(5’-acaaccttgattggagacttgacc-3’；SEQ ID NO：187)以及对I-CreI编码序列氨基酸39-43特异性的引物(assF 5’-ctannnttgaccttt-3’(SEQ ID NO：188)或assR 5’-aaaggtcaannntag-3’(SEQ ID NO：189)(其中nnn编码40位残基))进行PCR扩增。合并用相同引物从扩增反应获得并且对40位残基而言具有相同编码序列的PCR片段。然后，将从与引物Gal10F和assR或者assF和Gal10R的反应获得的每个PCR片段库以等摩尔比混合。最后，使用高效LiAc转化方案(Gietz和Woods，Methods Enzymol.，2002，350，87-96)，使用通过NcoI和EagI消化而线性化的75ng载体DNA(pCLS0542，图6)和25ng两种重叠PCR片段的每种最终库，转化酵母酿酒酵母菌株FYC2-6A(MATα，trp1Δ63，leu2Δ1，his3Δ200)。通过酵母中的体内同源重组产生同时含有两组突变的完整编码序列。

c)接合表达大范围核酸酶的克隆并在酵母中筛选：

筛选如先前所述进行(Arnould等，J.Mol.Biol.2006，355，443-458)。使用菌落网格(gridder)(QpixII，Genetix)进行接合。使用低网格密度(约4-6个点/cm²)将变体在覆盖YPD平板的尼龙滤膜上划网格。在相同的滤膜上进行第二次划网格的过程从而印上第二层，所述第二层由具有报告子的酵母菌株组成。将膜置于富含固体琼脂YPD的培养基上，并在30℃孵育一夜，以允许接合。接着，将滤膜转移至合成培养基上并在37℃孵育五天，以选择带有表达载体和靶标载体的二倍体，所述合成培养基缺乏亮氨酸和色氨酸，并含有半乳糖(2％)作为碳源。5天后，将滤膜置于固体培养基上并在37℃孵育，以监测β-半乳糖苷酶活性，所述固体琼脂糖培养基在0.5M磷酸钠缓冲液pH 7.0中含有0.02％X-Gal、0.1％SDS、6％二甲基甲酰胺(DMF)、7mM β-巯基乙醇、1％琼脂糖。通过扫描分析结果，并使用合适的软件进行量化。

d)变体测序

为了回收变体表达质粒，使用标准方案提取酵母DNA并用于转化大肠杆菌。然后通过MILLEGEN SA对质粒进行变体ORF的测序。或者，通过PCR从酵母DNA中扩增ORF(Akada等，Biotechniques，2000，28，668-670)并通过MILLEGEN SA直接对PCR产物进行测序。

2)结果

通过在I-CreI N75骨架上将来自切割5AGG_P的蛋白质的44、68、70、75和77位的突变与来自切割10GCC_P的蛋白质的28、30、32、33、38和40位的突变相结合来构建I-CreI组合变体，得到复杂度2303的文库。组合变体的例子展示于表V中。将该文库转化进酵母中，并针对对GSCHO1.3DNA靶标(tgccccagggt_P)的切割筛选了4608个克隆(多样性的2倍)。发现了2个阳性克隆(一个强切割酶，一个弱切割酶)，其在测序后显示对应于2种不同的新内切核酸酶变体(表VI)。图7中显示阳性实例。这两个变体在28、30、32、33、38、40或44、68、70、75、77位显示非亲本组合。这样的组合很可能来自于组合过程中的PCR产物。或者，所述变体可以是来自酵母中体内同源重组过程中两个初始变体微重组的I-CreI组合变体。

表V：组合文库中理论上存在的变体组^*

^*显示2303个组合中的264个。在阳性克隆中它们无一被鉴定到。

表VI：能够切割GSCHO1.3DNA靶标的I-CreI变体

实施例3：制备切割GSCHO1.4的大范围核酸酶

本实施例显示，I-CreI变体可切割来自GSCHO1.2靶标右侧部分的回文形式GSCHO1.4DNA靶序列(图4)。本实施例中描述的所有靶序列是22bp回文序列。因此，仅以前11个核苷酸描述它们，随后是后缀_P(例如，GSCHO1.4称为tggactttcgt_P)。

GSCHO1.4在±1、±2、±3、±4、±5和±8位与5TTC_P相似，并在±1、±2、±3、±4、±8、±9和±10位与10GGA_P相似。推测±6、±7和±11位对结合和切割活性几乎没有影响。如之前所述通过在44、68、70、75和77位诱变I-CreI N75获得了能够切割5TTC_P的变体(Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458；Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149和国际PCT申请WO 2006/097784，WO 2006/097853，WO 2007/060495和WO 2007/049156)。如之前Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149和国际PCT申请WO 2007/060495和WO 2007/049156中所述，通过在28、30、32、33、38、40和70位上诱变I-CreI N75或D75获得了能够切割10GGA_P靶标的变体。

两组蛋白质均在70位上被突变。然而，推测存在两个可分离的功能性亚结构域。这意味着该位置对针对靶标碱基10到8的特异性几乎没有影响。

因此，为了检验组合突变体是否能够切割GSCHO1.4靶标，将来自切割5TTC_P的蛋白质的44、68、70、75和77位的突变与来自切割10GGA_P的蛋白质的28、30、32、33、38和40突变相组合。

A)材料和方法

a)构建靶标载体

实验步骤如实施例2中所述，区别在于使用对应于GSCHO1.4靶序列的寡核苷酸：5’tggcatacaagtttttggactttcgtacgaaagtccaacaatcgtctgtca 3’(SEQ ID NO：185)。

b)构建组合变体

如先前在Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149；国际PCT申请WO 2007/060495、WO 2007/049156和Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458；国际PCT申请WO 2006/097784和WO 2006/097853中所述，分别针对10GGA_P和5TTC_P靶标鉴定了切割10GGA_P或5TTC_P的I-CreI变体。为了产生含有来自两个系列的突变的来自I-CreI的编码序列，分别进行扩增I-CreI编码序列5’端(1-43位aa)或3’端(39-167位)的重叠PCR反应。对5’和3’两端而言，使用对载体(pCLS1107，图8)特异的引物Gal10F(5’-gcaactttagtgctgacacatacagg-3’；SEQ ID NO：186)或Gal10R(5’-acaaccttgattggagacttgacc-3’；SEQ ID NO：187)以及对I-CreI编码序列氨基酸39-43特异性的引物(assF 5’-ctannnttgaccttt-3’(SEQ ID NO：188)或assR 5’-aaaggtcaannntag-3’(SEQ ID NO：189)(其中nnn编码40位残基))进行PCR扩增。合并用相同引物从扩增反应获得并且对40位残基而言具有相同编码序列的PCR片段。然后，将从与引物Gal10F和assR或者assF和Gal10R的反应获得的每个PCR片段库以等摩尔比混合。最后，使用高效LiAc转化方案(Gietz和Woods，Methods Enzymol.，2002，350，87-96)，使用通过DraIII和NgoMIV消化而线性化的75ng载体DNA(pCL1107，图8)和约25ng两种重叠PCR片段的每种最终库，转化酵母酿酒酵母菌株FYC2-6A(MATα，trp1Δ63，leu2Δ1，his3Δ200)。通过酵母中的体内同源重组产生同时含有两组突变的完整编码序列。

c)接合表达大范围核酸酶的克隆并在酵母中筛选：

筛选如先前所述进行(Arnould等，J.Mol.Biol.2006，355，443-458)。使用菌落网格(QpixII，Genetix)进行接合。使用低网格密度(4-6个点/cm²)将变体在覆盖YPD平板的尼龙滤膜上划网格。在相同的滤膜上进行第二次划网格的过程从而印上第二层，所述第二层由具有报告子的酵母菌株组成。将膜置于富含固体琼脂YPD的培养基上，并在30℃孵育一夜，以允许接合。接着，将滤膜转移至合成培养基上并在37℃孵育五天，以选择带有表达载体和靶标载体的二倍体，所述合成培养基缺乏色氨酸，添加G418并含有半乳糖(2％)作为碳源。5天后，将滤膜置于固体培养基上并在37℃孵育，以监测β-半乳糖苷酶活性，所述固体琼脂糖培养基在0.5M磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中含有0.02％X-Gal、0.1％SDS、6％二甲基甲酰胺(DMF)、7mMβ-巯基乙醇、1％琼脂糖。通过扫描分析结果，并使用合适的软件进行量化。如实施例2中所述，通过测序(MILLEGEN)验证所得阳性克隆。

2)结果

通过在I-CreI N75骨架上将来自切割5TTC_P的蛋白质的44、68、70、75和77位的突变与来自切割10GGA_P的蛋白质的28、30、32、33、38和40位的突变相结合来构建I-CreI组合变体，得到复杂度1600的文库。组合的例子展示于表VII中。将该文库转化进酵母中，并针对对GSCHO1.4DNA靶标(tggactttcgt_P)的切割筛选了3456个克隆(多样性的2.2倍)。发现了共250个阳性克隆切割GSCHO1.4。通过对91个最佳I-CreI变体的第二次筛选的测序和验证鉴定到57个不同的新内切核酸酶。图9中显示阳性实例。所鉴定到的这些变体中一些的序列在28、30、32、33、38、40或44、68、70、75、77位显示非亲本组合以及其他突变(参见例如表VIII)。这些变体类似地来自于组合过程中的PCR产物。或者，所述变体可以是来自酵母中体内同源重组过程中两个初始变体微重组的I-CreI组合变体。

表VII：组合文库中理论上存在的变体组^*

^*仅显示1600个组合中的220个。

+表示，在所鉴定到的阳性中发现切割GSCHO1.4靶标的功能性组合变体。

表VIII：能够切割GSCHO1.4DNA靶标的具有额外突变的I-CreI变体

实施例4：制备切割GSCHO1.2和GSCHO1的大范围核酸酶

在实施例2和3中鉴定了能够切割回文的GSCHO1.2衍生靶标(GSCHO1.3和GSCHO1.4)的I-CreI变体。将这些变体对(一个切割GSCHO1.3，一个切割GSCHO1.4)在酵母中共表达。共表达后，应有三种活性分子物质：两种同二聚体和一种异二聚体。测定应该形成的异二聚体是否切割GSCHO1.2和非回文GSCHO1靶标。

A)材料和方法

a)构建靶标载体

实验步骤如实施例2中所述，区别在于使用对应于GSCHO1.2靶序列：5’tggcatacaagtttctgccccagggtacgaaagtccaacaatcgtctgtca 3’(SEQ ID NO：201)或GSCHO1靶序列：5’tggcatacaagtttctgccccagggtgagaaagtccaacaatcgtctgtca 3’(SEQ ID NO：202)的寡核苷酸。

b)变体的共表达

使用标准方案从切割pCLS1107表达载体中GSCHO1.4靶标的变体提取酵母DNA，并用于转化大肠杆菌。然后，将所得质粒DNA用于转化表达切割pCLS0542表达载体中GSCHO1.3靶标之变体的酵母菌株。在缺少亮氨酸且含有G418的合成培养基上选择转化子。

c)大范围核酸酶共表达克隆的接合和酵母中的筛选

使用菌落网格(QpixII，Genetix)进行接合。使用低网格密度(4-6个点/cm²)将变体在覆盖YPD平板的尼龙滤膜上划网格。在相同的滤膜上进行第二次划网格的过程从而印上第二层，所述第二层由针对每个靶标具有不同报告子的酵母菌株组成。将膜置于富含固体琼脂YPD的培养基上，并在30℃孵育一夜，以允许接合。接着，将滤膜转移至合成培养基上并在37℃孵育五天，以选择带有表达载体和靶标载体的二倍体，所述合成培养基缺乏亮氨酸和色氨酸，添加G418并含有半乳糖(2％)作为碳源。5天后，将滤膜置于固体培养基上并在37℃孵育，以监测β-半乳糖苷酶活性，所述固体培养基在0.5M磷酸钠缓冲液pH 7.0中含有0.02％X-Gal、0.1％SDS、6％二甲基甲酰胺(DMF)、7mMβ-巯基乙醇、1％琼脂糖。通过扫描分析结果，并使用合适的软件进行量化。

B)结果

切割GSCHO1.4靶标的变体(选自表VII和表VIII中所述那些的14个变体)与切割GSCHO1.3靶标的两个变体(表VI中所述)的共表达在所有情形中都导致GSCHO1.2靶标的有效切割(图10A)。此外，这些组合中的一些能够切割GSCHO1天然靶标，其与GSCHO1.2序列的区别在1和2位的2bp(图10B)。功能性组合综述于表IX和表X。

表IX：异二聚体变体对GSCHO1.2靶标的切割

+表示功能性组合

表X：异二聚体变体对GSCHO1靶标的切割

+表示功能性组合

^*表示组合微弱地切割GSCHO1靶标.

实施例5：切割GSCHO1.3的蛋白质的随机诱变以及与切割GSCHO1.4的蛋白质的组装对切割GSCHO1的大范围核酸酶的改进

之前在实施例4中已经鉴定了通过组装切割回文GSCHO1.3和GSCHO1.4靶标的变体而获得的能够切割GSCHO1.2和GSCHO1靶标的I-CreI变体。但是，这些变体显示对GSCHO1.2靶标的活性高于对GSCHO1靶标的活性。

因此，对切割GSCHO1.3的两个组合变体进行诱变，筛选变体在与切割GSCHO1.4的变体共表达时对GSCHO1的切割活性。根据与其靶标结合的I-CreI蛋白质的结构，4个中央碱基对(-2至2位)与I-CreI蛋白质之间没有接触(Chevalier et al.，Nat.Struct.Biol.，2001，8，312-316；Chevalier and Stoddard，Nucleic Acids Res.，2001，29，3757-3774；Chevalier et al.，J.Mol.Biol.，2003，329，253-269)。因此，难以通过推理来选择一组位置进行诱变，于是对整个蛋白质进行诱变。随机诱变导致高复杂度的文库。因此，为了限制待测试变体文库的复杂度，仅诱变切割GSCHO1的异二聚体两组分中的一个。

因此，在第一步骤中，诱变切割GSCHO1.3的蛋白质，在第二步骤中，评估它们在与切割GSCHO1.4的蛋白质共表达时是否能切割GSCHO1。

A)材料和方法

a)通过随机诱变构建文库

通过使用Mn²⁺的PCR对所选的变体库进行随机诱变。使用以下引物进行PCR反应以扩增I-CreI编码序列：preATGCreFor(5’-gcattataaactatacttctatagacacgcaaacacaaatacacagcggccttgccacc-3’；SEQ ID NO：209)和ICreIpostRev(5’-ggctcgaggagctcgtctagaggatcgctcgagttatcagtcggccgc-3’；SEQ ID NO：210)，其为pCLS0542(图6)和pCLS1107(图8)载体所共有。约25ng的PCR产物和75ng用NcoI和EagI消化来线性化的载体DNA(pCLS0542)用于转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株FYC2-6A(MATα，trp1Δ63，leu2Δ1，his3Δ200)，其使用高效LiAc转化方案(Gietz and Woods，Methods Enzymol.，2002，350，87-96)。通过酵母中的体内同源重组产生含有I-CreI变体完整编码序列的表达质粒。

b)变体-靶标酵母菌株、筛选和测序

使用高效LiAc转化方案，用卡那霉素载体(pCLS1107)中切割GSCO1.4靶标的变体转化在酵母报告载体(pCLS1055，图5)中含有GSCHO1靶标的酵母菌株FYBL2-7B(MATa，ura3Δ851，trp1Δ63，leu2Δ1，lys2Δ202)。变体-靶标酵母菌株用作实施例4中所述接合测定的靶标菌株。通过实施例2中所述的测序(MILLEGEN)验证所得阳性克隆。

B)结果

合并切割GSCHO1.3、KRSRES/TYSNI和KRSRES/DYSYQ(I-CreI 30R，33R，38E，44T，68Y，70S，75N和I-CreI30R，33R，38E，44D，68Y，70S，75Y，77Q，根据表VI的命名法也称为KRSRES/TYSNI，和KRSRES/DYSYQ)的两个变体，随机诱变并转化进酵母。然后，将2304个转化克隆与含有(i)报告质粒中的GSCHO1靶标(ii)切割GSCHO1.4靶标之变体(I-CreI 30R，32G，44K，68N或根据表VIII的命名法的KRGYQS/KNRDI)的表达质粒的酵母菌株接合。与此酵母菌株接合之后，发现38个克隆比初始变体更有效地切割GSCHO1靶标。因此，38个阳性含有能够与KRGYQS/KNRDI形成具有高GSCHO1靶标切割活性的异二聚体的蛋白质。阳性的实例显示于图11。对这38个阳性克隆的测序表明，鉴定到表XI中所列的19个不同变体。

表XI：显示强GSCHO1切割活性的功能性变体组合

^*由随机诱变所得的突变以粗体显示.

实施例6：通过切割GSCHO1.3的蛋白质的定点诱变以及与切割GSCHO1.4的蛋白质的组装来对切割GSCHO1的大范围核酸酶进行改进

还通过在蛋白质中引入所选氨基酸替换并筛选与切割GSCHO1.4的变体组合后更有效切割GSCHO1的变体，对表VI中所述以及随机诱变中使用的切割GSCHO1.3的初始I-CreI变体进行了诱变。

在之前的研究中发现六种氨基酸替换增强I-CreI衍生物的活性：这些突变对应于以下替换：19位甘氨酸替换为丝氨酸(G19S)，54位苯丙氨酸替换为亮氨酸(F54L)，80位谷氨酸替换为赖氨酸(E80K)，87位苯丙氨酸替换为亮氨酸(F87L)，105位缬氨酸替换为丙氨酸(V105A)以及132位异亮氨酸替换为缬氨酸(I132V)。将这些突变分别引入切割GSCHO1.3的蛋白质的编码序列，测试所得蛋白质在与切割GSCHO1.4的变体共表达后诱导GSCHO1靶标切割的能力。

A)材料和方法

a)定点诱变

通过对所选变体库进行PCR来产生定点诱变文库。例如，为向变体编码序列中引入G19S替换，进行两个独立的重叠PCR反应，以扩增I-CreI编码序列的5’端(1-24位残基)或3’端(14-167位残基)。对于5’和3’端，都使用与载体具有同源性的引物(Gal10F 5’-gcaactttagtgctgacacatacagg-3’(SEQ ID NO：186)或Gal10R 5’-acaaccttgattggagacttgacc-3’(SEQ ID NO：187))以及含有替换突变G19S的I-CreI编码序列14-24位氨基酸特异性的引物(G19SF 5’-gccggctttgtggactctgacggtagcatcatc-3’(SEQ ID NO：230)或G19SR 5’-gatgatgctaccgtcagagtccacaaagccggc-3’(SEQ ID NO：231))进行PCR扩增。所得PCR产物含有彼此33bp的同源性。纯化PCR片段。各约25ng的两个重叠PCR片段和75ng用NcoI和EagI消化来线性化的载体DNA(pCLS0542，图6)用于转化酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株FYC2-6A(MATα，trp1Δ63，leu2Δ1，his3Δ200)，其使用高效LiAc转化方案(Gietz and Woods，Methods Enzymol.，2002，350，87-96)。通过酵母中的体内同源重组产生含有G19S替换的完整编码序列。

分别使用下列寡核苷酸对进行相同的策略以产生含有F54L，E80K，F87L，V105A和I132V替换的其他文库：

*F54LF：5’-acccagcgccgttggctgctggacaaactagtg-3’和F54LR：5’-cactagtttgtccagcagccaacggcgctgggt-3’(SEQ ID NO：232和233)；

*E80KF：5’-ttaagcaaaatcaagccgctgcacaacttcctg-3’和E80KR：5’-caggaagttgtgcagcggcttgattttgcttaa-3’SEQ ID NO：234和235)；

*F87LF：5’-aagccgctgcacaacctgctgactcaactgcag-3’和F87LR：5’-ctgcagttgagtcagcaggttgtgcagcggctt-3’SEQ ID NO：236和237)；

*V105AF：5’-aaacaggcaaacctggctctgaaaattatcgaa-3’和V105AR：5’-ttcgataattttcagagccaggtttgcctgttt-3’SEQ ID NO：238和239)；

*I132VF：5’-acctgggtggatcaggttgcagctctgaacgat-3’和I132VR：5’-atcgttcagagctgcaacctgatccacccaggt-3’SEQ ID NO：240和241).

c)酵母中大范围核酸酶表达克隆的接合和筛选

实验步骤如实施例5中所述。

d)变体的测序

实验步骤如实施例2中所述。

B)结果

针对切割GSCHO1.3KRSRES/TYSNI和KRSRES/DYSYQ(I-CreI 30R，33R，38E，44T，68Y，70S，75N和I-CreI 30R，33R，38E，44D，68Y，70S，75Y，77Q，根据表VI的命名法也分别称为KRSRES/TYSNI和KRSRES/DYSYQ)的两种变体的库构建了含有六个氨基酸替换(甘氨酸19替换为丝氨酸，苯丙氨酸54替换为亮氨酸，谷氨酸80替换为赖氨酸，苯丙氨酸87替换为亮氨酸，缬氨酸105替换为丙氨酸以及异亮氨酸132替换为缬氨酸)之一的文库。然后，将每个文库192个转化克隆与含有(i)报告质粒中的GSCHO1靶标(ii)实施例3中所述切割GSCHO1.4靶标之变体(I-CreI 30R，32G，44K，68N或KRGYQS/KNRDI)的表达质粒的酵母菌株接合。

与此酵母菌株接合之后，除了含有苯丙氨酸54替换为亮氨酸的氨基酸替换之外，发现每个文库的大量克隆(＞20)比初始变体更有效的切割GSCHO1靶标。阳性的实例显示于图12。在与KRGYQS/KNRDI变体形成异二聚体时五种最佳切割GSCHO1靶标的I-CreI变体的序列列于表XII。

表XII：显示强GSCHO1切割活性的功能性变体组合

^*由定点诱变产生的突变以粗体显示。

实施例7：通过对切割GSCHO1.4的蛋白质进行随机诱变并与切割GSCHO1.3的蛋白质进行组装，对切割GSCHO1的大范围核酸酶进行改进

作为实施例4的补充，我们还决定对切割GSCHO1.4的变体进行随机诱变。然后，测试切割GSCHO1.4的诱变蛋白质以确定其在与切割GSCHO1.3的蛋白质共表达时是否可有效切割GSCHO1。

A)材料和方法

a)通过随机诱变构建文库

通过使用Mn²⁺的PCR对所选的变体库进行随机诱变。使用以下引物进行PCR反应以扩增I-CreI编码序列：preATGCreFor(5’-gcataaattactatacttctatagacacgcaaacacaaatacacagcggccttgccacc-3’；SEQ ID NO：209)和ICreIpostRev(5’-ggctcgaggagctcgtctagaggatcgctcgagttatcagtcggccgc-3’；SEQ ID NO：210)。约25ng的PCR产物和75ng用DraIII和NgoMIV消化来线性化的载体DNA(pCLS1107，图8)用于转化酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株FYC2-6A(MATα，trp1Δ63，leu2Δ1，his3Δ200)，其使用高效LiAc转化方案(Gietz and Woods，Methods Enzymol.，2002，350，87-96)。通过酵母中的体内同源重组产生含有I-CreI变体完整编码序列的表达质粒。

b)变体-靶标酵母菌株、筛选和测序

使用高效LiAc转化方案，用亮氨酸载体(pCLS0542)中切割GSCO1.3靶标的变体转化在酵母报告载体(pCLS1055，图5)中含有GSCHO1靶标的酵母菌株FYBL2-7B(MATa，ura3Δ851，trp1Δ63，leu2Δ1，lys2Δ202)。变体-靶标酵母菌株用作实施例4中所述接合测定的靶标菌株。通过实施例2中所述的测序(MILLEGEN)验证所得阳性克隆。

合并切割GSCHO1.4的九个变体(I-CreI 30R，32G，44K，68Y，70S，75N，I-CreI 33H，38N，44K，47K，68N，70S，75N，I-CreI 30K，33A，75N，I-CreI 30R，32G，44K，59A，68N，70A，75N，I-CreI 30R，33T，38R，44K，68N，70S，75N，I-CreI 30R，32G，44K，45M，68Y，70S，75N，77V，I-CreI 30R，32G，44K，68N，70S，75N，I-CreI 30R，32G，44R，68Y，70S，75N和I-CreI 32A，33H，44K，68P，70S，75N，根据表VII和表VIII的命名法也分别称为KRGYQS/KYSNI，KNSHNS/KNSNI+47K，KKSAQS/QRRNI，KRGYQS/KNANI+59A，KRSTRS/KNSNI，KRGYQS/KYSNV+45M，KRGYQS/KNSNI，KRGYQS/RYSNI和KNAHQS/KPSNI)，随机诱变并转化进酵母。然后，将4608个转化克隆与含有(i)报告质粒中的GSCHO1靶标(ii)切割GSCHO1.3靶标之变体(I-CreI 30R，33R，38E，44D，68Y，70S，75Y，77Q或根据表VI的命名法的KRSRES/DYSYQ)的表达质粒的酵母菌株接合。与此酵母菌株接合之后，发现254个克隆比初始变体更有效地切割GSCHO1靶标。因此，254个阳性含有能够与KRSRES/DYSYQ形成具有高GSCHO1靶标切割活性的异二聚体的蛋白质。阳性的实例显示于图13。对最强阳性克隆中32个的测序表明，鉴定到表XIII中所列的18个不同变体。

表XIII：显示强GSCHO1切割活性的功能性变体组合

^*由随机诱变产生的突变以粗体显示。

^**变体来源于I-CreI N75骨架，在随机诱变循环中75位突变为天冬氨酸(D)。

实施例8：通过对切割GSCHO1.4的蛋白质进行定点诱变并与切割GSCHO1.3的蛋白质进行组装，对切割GSCHO1的大范围核酸酶进行改进

还通过在蛋白质中引入所选氨基酸替换并筛选与切割GSCHO1.3的变体组合后更有效切割GSCHO1的变体，对表3和4中所述以及实施例7的随机诱变中使用的切割GSCHO1.4的初始I-CreI变体进行了诱变。

在之前的研究中发现六种氨基酸替换增强I-CreI衍生物的活性：这些突变对应于以下替换：甘氨酸19替换为丝氨酸(G19S)，苯丙氨酸54替换为亮氨酸(F54L)，谷氨酸80替换为赖氨酸(E80K)，苯丙氨酸87替换为亮氨酸(F87L)，缬氨酸105替换为丙氨酸(V105A)以及异亮氨酸132替换为缬氨酸(I132V)。将这些突变分别引入切割GSCHO1.3的蛋白质的编码序列，测试所得蛋白质在与切割GSCHO1.4的变体共表达后诱导GSCHO1靶标切割的能力。

A)材料和方法

a)定点诱变

通过对所选变体库进行PCR产生定点诱变文库。例如，为向变体编码序列中引入G19S替换，进行两个独立的重叠PCR反应，以扩增I-CreI编码序列的5’端(1-24位残基)或3’端(14-167位残基)。对于5’和3’端，都使用与载体具有同源性的引物(Gal10F 5’-gcaactttagtgctgacacatacagg-3’或Gal10R 5’-acaaccttgattggagacttgacc-3’)以及含有替换突变G19S的I-CreI编码序列14-24位氨基酸特异性的引物(G19SF 5’-gccggctttgtggactctgacggtagcatcatc-3’(SEQ ID NO：230)或G19SR 5’-gatgatgctaccgtcagagtccacaaagccggc-3’(SEQ ID NO：231))进行PCR扩增。所得PCR产物含有彼此33bp的同源性。纯化PCR片段。将各约25ng的两种重叠PCR片段和75ng用DraIII和NgoMIV消化来线性化的载体DNA(pCLS1107，图8)用于转化酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株FYC2-6A(MATα，trp1Δ63，leu2Δ1，his3Δ200)，其使用高效LiAc转化方案(Gietz and Woods，Methods Enzymol.，2002，350，87-96)。通过酵母中的体内同源重组产生含有G19S替换的完整编码序列。

分别使用下列寡核苷酸对进行相同的策略以产生含有F54L，E80K，F87L，V105A和I132V替换的其他文库：

*F54LF：5’-acccagcgccgttggctgctggacaaactagtg-3’和F54LR：5’-cactagtttgtccagcagccaacggcgctgggt-3’(SEQ ID NO：232和233)；

*E80KF：5’-ttaagcaaaatcaagccgctgcacaacttcctg-3’和E80KR：5’-caggaagttgtgcagcggcttgattttgcttaa-3’SEQ ID NO：234和235)；

*F87LF：5’-aagccgctgcacaacctgctgactcaactgcag-3’和F87LR：5’-ctgcagttgagtcagcaggttgtgcagcggctt-3’SEQ ID NO：236和237)；

*V105AF：5’-aaacaggcaaacctggctctgaaaattatcgaa-3’和V105AR：5’-ttcgataattttcagagccaggtttgcctgttt-3’SEQ ID NO：238和239)；

*I132VF：5’-acctgggtggatcaggttgcagctctgaacgat-3’和I132VR：5’-atcgttcagagctgcaacctgatccacccaggt-3’SEQ ID NO：240和241).

c)酵母中大范围核酸酶表达克隆的接合和筛选

实验步骤如实施例7中所述。

d)变体的测序

实验步骤如实施例2中所述。

B)结果

针对切割GSCHO1.4的九种变体(I-CreI 30R，32G，44K，68Y，70S，75N，I-CreI 33H，38N，44K，47K，68N，70S，75N，I-CreI 30K，33A，75N，I-CreI 30R，32G，44K，59A，68N，70A，75N，I-CreI 30R，33T，38R，44K，68N，70S，75N，I-CreI 30R，32G，44K，45M，68Y，70S，75N，77V，I-CreI 30R，32G，44K，68N，70S，75N，I-CreI 30R，32G，44R，68Y，70S，75N和I-CreI 32A，33H，44K，68P，70S，75N，根据表VII和表VIII的命名法也分别称为KRGYQS/KYSNI，KNSHNS/KNSNI+47K，KKSAQS/QRRNI，KRGYQS/KNANI+59A，KRSTRS/KNSNI，KRGYQ S/KYSNV+45M，KRGYQS/KNSNI，KRGYQS/RYSNI和KNAHQS/KPSNI)的库构建了含有六种氨基酸替换(甘氨酸19替换为丝氨酸，苯丙氨酸54替换为亮氨酸，谷氨酸80替换为赖氨酸，苯丙氨酸87替换为亮氨酸，缬氨酸105替换为丙氨酸以及异亮氨酸132替换为缬氨酸)之一的文库。然后，将每个文库192个转化克隆与含有(i)报告质粒中的GSCHO1靶标(ii)实施例2中所述切割GSCHO1.3靶标之变体(I-CreI 30R，33R，38E，44D，68Y，70S，75Y，77Q或KRSRES/DYSYQ)的表达质粒的酵母菌株接合。

与此酵母菌株接合之后，对于含有甘氨酸19替换为丝氨酸、苯丙氨酸54替换为亮氨酸以及异亮氨酸132替换为缬氨酸的氨基酸替换的文库，发现大量克隆(＞20)比初始变体更有效的切割GSCHO1靶标。阳性的实例显示于图14。在与KRSRES/DYSYQ变体形成异二聚体时来自每个文库的两种最佳切割GSCHO1靶标的I-CreI变体的序列列于XIV。这些变体在28，30，32，33，38，40或44，68，70，75，77位显示非亲本组合。这些组合有可能产生自组合过程中PCR诱导的突变。

表XIV：显示强GSCHO1切割活性的功能性变体组合

^*由随机诱变产生的突变以粗体显示.

^**变体来源于I-CreI N75骨架，在随机诱变循环中75位突变为天冬氨酸(D)。

实施例9：在CHO细胞中的染色体外模型中验证GSCHO1靶标切割

在形成异二聚体时能够在酵母中有效切割GSCHO1靶标的I-CreI变体描述于实施例4，5，6，7和8。为了鉴定在CHO细胞中对GSCHO1靶标有最大切割活性的异二聚体，在CHO细胞中使用染色体外测定比较所选变体组合切割GSCHO1靶标的效率。CHO细胞中的筛选是基于单链退火(single-strand annealing，SSA)的测定，其中大范围核酸酶对靶标的切割诱导LagoZ报告基因(细菌lacZ基因的衍生物)的同源重组和表达。

1)材料和方法

a)用于CHO筛选的载体中GSCHO1靶标的克隆

如下所述克隆靶标：侧翼是gateway克隆序列的对应于GSCHO1靶序列的寡核苷酸购自PROLIGO：5’tggcatacaagtttctgccccagggtgagaaagtccaacaatcgtctgtca 3’(SEQ ID NO：202)。使用Gateway方案(INVITROGEN)将通过PCR扩增单链寡核苷酸而产生的双链靶DNA克隆进CHO报告载体(pCLS1058，图15)。通过测序(MILLEGEN)验证克隆的靶标。

b)大范围核酸酶的再克隆

在pCLS1768中对实施例3、5、6、7和8中所鉴定的切割GSCHO1.3和GSCHO1.4靶标的I-CreI变体ORF进行再克隆(图16)。使用引物attB1-ICreIFor(5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcgaaggagatagaaccatggccaataccaaatataacaaagagttcc-3’；SEQ ID NO：269)和attB2-ICreIRev(5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttagtcggccgccggggaggatttcttcttctcgc-3’；SEQ ID NO：270)对酵母DNA进行PCR，来扩增ORF。使用Gateway方案(INVITROGEN)将PCR产物克隆进CHO表达载体pCLS1768(图16)。通过测序(MILLEGEN)验证所得克隆。

c)哺乳动物细胞中的染色体外测定

根据制造商的方案(QIAGEN)使用Polyfect

转染试剂转染CHO细胞。转染后72小时，使用Beta-Glo

Assay System(Promega)对每个转染的β半乳糖苷酶水平进行定量。Beta-Glo测定含有可被β半乳糖苷酶切割形成萤光素的萤光素-半乳糖苷底物(6-O-β-半乳吡喃糖基萤光素)，萤光素随后用于萤火虫萤光素酶反应产生光。对于每个转染，将100μl培养基中约100,000个细胞与等体积Beta-Glo裂解/显色缓冲液合并，如制造商所述(Promega)。室温孵育30分钟后，使用荧光光度计(Perkin Elmer Victor多标记平板读数器)测量信号。

每个测定，将150ng靶标载体与25ng两种变体之每一种共转染(切割回文GSCHO1.3靶标的25ng变体以及切割回文GSCHO1.4靶标的25ng变体)。

2)结果

首先在pCLS1768中再克隆实施例3、5、6、7和8中所述的一些变体(图16)。然后，为了鉴定在CHO细胞中对GSCHO1靶标显示最大切割活性的异二聚体，在CHO染色体外测定中，将切割GSCHO1.3或GSCHO1.4靶标的I-CreI变体(实施例3、5、6、7和8中所述)共同作为异二聚体针对GSCHO1靶标进行测试。

图17显示所测12个异二聚体获得的结果，不同组合的值在表XV中显示。切割GSCHO1序列的效率的分析证明，12个I-CreI变体组合中的10个能够在CHO细胞中有效切割GSCHO1靶标。

表XV：在CHO细胞中切割GSCHO1靶标的功能性异二聚体组合

Claims (45)

1.I-CreI变体，其特征为两个I-CreI单体中的至少一个具有至少两个替换，其中LAGLIDADG核心结构域的两个功能性亚结构域中各有一个，所述亚结构域分别位于I-CreI的28到40位和44到77位，所述变体能够切割来自谷氨酰胺合成酶基因的DNA靶序列，并可通过至少包括下述步骤的方法获得：

(a)构建第一系列I-CreI变体，其在LAGLIDADG核心结构域的第一功能性亚结构域中具有至少一个替换，所述第一功能性亚结构域位于I-CreI的28到40位，

(b)构建第二系列I-CreI变体，其在LAGLIDADG核心结构域的第二功能性亚结构域中具有至少一个替换，所述第二功能性亚结构域位于I-CreI的44到77位，

(c)从来自步骤(a)的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CreI位点的变体，所述突变体位点中至少(i)I-CreI位点-10到-8位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三联体，且(ii)+8到+10位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三联体的反向互补序列，

(d)从来自步骤(b)的第二系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CreI位点的变体，所述突变体位点中至少(i)I-CreI位点-5到-3位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三联体，且(ii)+3到+5位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三联体的反向互补序列，

(e)从来自步骤(a)的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CreI位点的变体，所述突变体位点中至少(i)I-CreI位点+8到+10位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三联体，且(ii)-10到-8位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三联体的反向互补序列，

(f)从来自步骤(b)的第二系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CreI位点的变体，所述突变体位点中至少(i)I-CreI位点+3到+5位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三联体，且(ii)-5到-3位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三联体的反向互补序列，

(g)将来自步骤(c)和步骤(d)的两个变体中26到40位和44到77位的突变组合在单个变体中，获得切割以下序列的新的同二聚体I-CreI变体，所述序列中(i)-10到-8位的核苷酸三联体与存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三联体相同，(ii)+8到+10位的核苷酸三联体与存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(iii)-5到-3位的核苷酸三联体与存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三联体相同，和(iv)+3到+5位的核苷酸三联体与存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，和/或

(h)将来自步骤(e)和步骤(f)的两个变体中26到40位和44到77位的突变组合在单个变体中，获得切割以下序列的新的同二聚体I-CreI变体，所述序列中(i)+3到+5位的核苷酸三联体与存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三联体相同，(ii)-5到-3位的核苷酸三联体与存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(iii)I-CreI位点+8到+10位的核苷酸三联体被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三联体，和(iv)-10到-8位的核苷酸三联体与存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，

(i)将步骤(g)和/或(h)中获得的变体相组合，以形成异二聚体，和

(j)选择和/或筛选来自步骤(i)的能够切割来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列的异二聚体。

2.权利要求1的变体，其中位于I-CreI之44到77位的亚结构域中的所述替换是在44、68、70、75和/或77位。

3.权利要求1的变体，其中位于I-CreI之28到40位的亚结构域中的所述替换是在28、30、32、33、38和/或40位。

4.权利要求1到3中任一项的变体，其中所述替换是用选自A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、V、L、M、F、I和W的氨基酸替换原始氨基酸。

5.权利要求1到4中任一项的变体，所述变体为第一和第二单体结合所得到的异二聚体，所述第一和第二单体在I-CreI的28到40位和/或44到77位具有不同的突变，所述异二聚体能够切割来自谷氨酰胺合成酶基因的非回文DNA靶序列。

6.权利要求5的变体，其中所述DNA靶标来自人GS基因，并且选自序列SEQ ID NO：5到28。

7.权利要求5的变体，其中所述DNA靶标来自小鼠GS基因，并且选自序列SEQ ID NO：19和29至48。

8.权利要求5的变体，其中所述DNA靶标来自中国仓鼠GS基因，并且选自SEQ ID NO：19、29、30、34、46、47和49至60。

9.权利要求1到8中任一项的变体，其在I-CreI的137到143位上包含至少一个替换，所述替换改变所述变体对I-CreI位点中±1到2、±6到7和/或±11到12位核苷酸的特异性。

10.权利要求1到9中任一项的变体，其在I-CreI全序列中包含至少一个替换，所述替换改进所述变体对来自谷氨酰胺合成酶基因之所述DNA靶标序列的结合和/或切割特性。

11.权利要求10的变体，其包含选自下列的至少一个替换：N2S、T3A、N6K、K7E、Y12H、G19S、G19A、I24V、F35L、L39V、F43L、V45L、V45M、Q47K、Q50R、F54L、K57E、V59A、D60Y、V64A、Y66H、E80K、F87L、F87I、Q92R、K96R、V105A、K107R、E110V、S114F、S114P、E117V、S118T、P119L、D120A、D120E、V125I、V129A、I132V、D137N、D137Y、K139R、D153N、S154G、K160R、S161P和S161T。

12.权利要求11的变体，其包含选自下列的至少一个替换：G19S、F54L、E80K、F87L、V105A和I132V。

13.权利要求6和10至12中任一项的变体，其中第一和第二单体在28、30、32、33、38、40、44、68、70、75、77位以及最后在80位分别具有选自下列的氨基酸：KTSGQS/VERNR+K80和KRTNQQ/DRSRT、KNGCAS/IRSNR和KNSRDR/YASRI、KRTCQT/KYSEV和KRTNQQ/LRNNI+K80、KNSCAS/NTSRY和KNSTAS/MERNR、KNSRNQ/RYSEV和ENSRRK/NRSRY、KNTCQS/LRANV和KYTCQS/DYSSR、KNHHQS/NQSSV和KNSEQE/AYSYK、KRCCQE/KTTNI和KNRDQS/ARSRL、KRSYQS/QESRR和KSSHKS/NYSRV、KNSTQS/ARSER和KNSPQQ/KYSEV、KDSRTS/RRSND和KNCCHS/RRSND、KNHHQS/YYSST和KTSGQS/QRSYR、KTSGQS/KRSRR和KNSRAQ/NRSRY、KNSYQS/KYSNQ和ENSRRK/KYSQN、KSSHKS/IRSNR和KNDYCS/KESDR、KNSTQT/QNSQR和KNSRAQ/AQNNI、KNSRDR/IRCNR和KRANQE/ARSER、KNSPKS/NKHNI和RNSAYQ/DYSSR、KNSCAS/IRANR和KNTCQS/QRSHY、KNTYWS/ARSRL和KNSRNQ/YSSSD、KDSRSS/YRSDV和KNTYWS/DYSSR、KTSGQS/KRSDK和NNSSRK/AYSRI、KNSRNQ/SRSYT和KDSRQS/KESDR、KNSCAS/ARSER和KRSRQS/QYRNI。

14.权利要求7和10至12中任一项的变体，其中第一和第二单体在28、30、32、33、38、40、44、68、70、75、77位以及最后在24或80位分别具有选自下列的氨基酸：KNCCHS/KYSNI和KRSYQS/TYSRT、KRSRES/DYSYQ和KRGYQS/RHRDI、KRGYQS/KHRDI、KRGYQS/KNRDI、KRCYQS/RHRDI、KRGYQS/NYSRY、KRGYQS/RTRDI、KRGYQS/TYSRV、KRGYQS/KARDI、KRGYQS/QYSRY、KKSAQS/NYSRY、KRDYQS/QRSRT+K80、或KRDYQS/TRSRI+K80、KHHCQT/RYSEV和KRTNQQ/IRCNR、KNSRAQ/RYSER和KNSHAS/VERNR+K80、KRGRQA/RYSER和KNRDQS/TYSRT、KNSYQS/LRNNI+K80和KNSYQS/NYSYN+V24、KDSRQS/YRSDV和KHHCAS/DRSRQ、KNSTQS/DYSSR和KNSRAQ/RNSQI、KNHHQS/QHSNR和KNSGQQ/QYSRV、KDSRTS/AYSYK和KRTYQS/RSSNT、KNSCQQ/QRSNR和KNDYYS/TYSRV、KRYSQS/RYSEQ和KNSYRK/KSSNI、KNSCAS/NYSRV和KNTYQS/QHSNR、KNSSRD/QRSNI和KNSYQS/KESDR、KNTCQS/ECSNI和KNNGQS/KYSNI、KSSHKS/IRSNR和KNDYCS/KESDR、KTSHRS/NRSRY和KNTYWS/DYSSR、KNSYHS/AYSRV和KDSRGS/QNSRV、KDSRQS/KESDR和NNSYRK/ARRNI、KNSRNQ/ARSRL和KWSCQS/KASDK、KGSYKS/TRSER和KNSYGQ/KYSNQ。

15.权利要求8和10至12中任一项的变体，其中第一和第二单体在28、30、32、33、38、40、44、68、70、75、77位以及最后在24或80位分别具有选自下列的氨基酸：KNCCHS/KYSNI和KRSYQS/TYRST、KRSRES/DYSYQ和KRGYQS/RHRDI、KRGYQS/KHRDI、KRGYQS/KNRDI、KRCYQS/RHRDI、KRGYQS/NYSRY、KRGYQS/RTRDI、KRGYQS/TYSRV、KRGYQS/KARDI、KRGYQS/QYSRY、KKSAQS/NYSRY、KRDYQS/QRSRT+K80、或KRDYQS/TRSRI+K80、KNHCQA/RYSER和KRTNQ/IRSNR、KNSRDR/KYSEV和KNSGQG/TYSYR、KNSNQR/KYSEV和KRDYQS/NYSYQ、KRSYQS/KESDR和KNHHQS/RYSEY、KNSYQS/LRNNI+K80和KNSYQS/NYSYN+V24、KRSYQS/KSSNV和KSTSRS/AYSDH、KSSCQA/NKHNI和KNGHQS/QESRR、KRSYQS/QHSNR和KTSGQS/QYSRV、KNRDQS/ECSNI和KNSNYR/QRDNR、KSSHKS/IRSNR和KNDCQS/KESDR、KNSHQT/NRSRY和KRSYES/DYSSR、KNSCQH/VERNR+K80和SNSYRK/NRSRY、KDSRTS/YRSDV和KKSSQS/DYSSR、KDSRQS/KESDR和NNSYRK/ARRNI、KNSRNQ/ARSRL和KWSCQS/KASDK、KGSYKS/ARSER和KNSRQR/ARGNI。

16.权利要求13至15中任一项的变体，其中第一单体和第二单体分别选自以下序列对：SEQ ID NO：61至84(第一单体)和SEQ ID NO：85至108(第二单体)；SEQ ID NO：109、110、63、111至128(第一单体)和SEQ ID NO：129至134、89、135至151(第二单体)；SEQ ID NO：109、110、63、152至154、113、155至158、123、159至162、127、163(第一单体)和SEQ ID NO：164、130至133、198-200、203和206至208、134、89、165、166、136、167至170、146、147、171至175(第二单体)。

17.权利要求7、8、10至12、14和15中任一项的变体，其切割来自小鼠和仓鼠(Critechulus sp.)谷氨酰胺合成酶基因的DNA靶序列SEQ ID NO：30，并包含第一和第二单体，其中第一单体和第二单体在28、30、32、33、38、40、44、68、70、75和77位和额外的位置具有选自下列的氨基酸：KRSRES/DYSYQ+H66+132V，KRSRES/DYSYQ+A19+120A或KRSRES/DYSYQ+S19+E57+T118+V132(第一单体)和KRGQS/RHRDI，KRGYQS/QARDR+119L或KRSRQS/QARDR(第二单体)；KRSRES/DYSYQ+H66+132V(第一单体)和KRGYQS/KHRDI+S19+M45(第二单体)。

18.权利要求7、8、10至12、14、15和17中任一项的变体，其切割来自小鼠和仓鼠(Critechulus sp.)谷氨酰胺合成酶基因的DNA靶序列SEQ ID NO：30，并包含具有SEQ ID NO：211至229、242至244和271中任一序列的第一单体和具有SEQ ID NO：245至268中任一序列的第二单体。

19.权利要求1到15和17中任一项的变体，其与权利要求16或权利要求18所定义的序列之一具有至少95％的序列同一性。

20.权利要求1到19中任一项的变体，其包含核定位信号和/或标签。

21.权利要求5到20中任一项的变体，其为专性异二聚体，其中所述第一单体还包含D137R突变，第二单体还包含R51D突变。

22.权利要求5到20中任一项的变体，其为专性异二聚体，其中所述第一单体还包含E8R或E8K以及E61R突变，第二单体还包含K7E和K96E突变。

23.单链大范围核酸酶，其包含权利要求1至22中任一项所述变体之一的两个单体或核心结构域，或二者的组合。

24.权利要求23的单链大范围核酸酶，其包含权利要求13至18中任一项定义的第一和第二单体，二者通过肽连接子连接。

25.多核苷酸片段，其编码权利要求1至22中任一项的所述变体或者权利要求23或权利要求24所述单链大范围核酸酶。

26.表达载体，其包含至少一个权利要求25所述多核苷酸片段。

27.权利要求26的表达载体，其包含两个不同的多核苷酸片段，每个多核苷酸片段编码权利要求5到22中任一项所定义之异二聚体变体的单体之一。

28.权利要求26或权利要求27的载体，其包含靶向构建体，所述靶向构建体包含待引入谷氨酰胺合成酶基因中的序列，以及与权利要求1和5至8中任一项所定义I-CreI变体之基因组DNA切割位点侧翼的谷氨酰胺合成酶基因序列同源的序列。

29.权利要求28的载体，其中所述待引入序列是使得谷氨酰胺合成酶基因失活的序列，其侧翼是与I-CreI变体之基因组DNA切割位点侧翼谷氨酰胺合成酶基因序列同源的序列。

30.权利要求28的载体，其中所述待引入序列是修复人谷氨酰胺合成酶基因中突变的序列。

31.权利要求30的载体，其中所述序列编码人野生型谷氨酰胺合成酶的一部分。

32.权利要求28的载体，其中所述与I-CreI变体之基因组DNA切割位点侧翼的谷氨酰胺合成酶基因序列同源的序列包含权利要求31所定义的编码野生型谷氨酰胺合成酶之一部分的序列。

33.权利要求30的载体，其中修复所述突变的序列包含人谷氨酰胺合成酶开放读码框以及位于3’的多腺苷酸化位点以终止转录，侧翼是与I-CreI变体之基因组DNA切割位点侧翼的人谷氨酰胺合成酶基因序列同源的序列。

34.组合物，其至少包含权利要求1到22中任一项的变体、权利要求23或24的单链大范围核酸酶和/或权利要求26到33中任一项的表达载体。

35.权利要求34的组合物，其包含权利要求28到33中任一项定义的靶向DNA构建体。

36.权利要求35的组合物，其中所述靶向DNA构建体包含在重组载体中。

37.宿主细胞，其至少用权利要求25或27中定义的多核苷酸片段或权利要求26到33中任一项所述载体进行了修饰。

38.非人转基因动物，其包含权利要求25或权利要求27中定义的一种或两种多核苷酸片段。

39.转基因植物，其包含权利要求25或权利要求27中所定义的一种或两种多核苷酸片段。

40.权利要求1到22中任一项的变体、权利要求23或24的单链大范围核酸酶和/或权利要求26到33中任一项的表达载体中的至少之一用于基因组工程的非治疗目的的用途。

41.权利要求40的用途，其用于制备谷氨酰胺合成酶敲除动物/细胞系。

42.权利要求41的用途，其中所述动物/细胞系是转基因动物/细胞系，其中转基因插入于谷氨酰胺合成酶基因座。

43.权利要求41的用途，其中所述动物/细胞系是转基因动物/细胞系，其中转基因插入于任何基因组座位。

44.权利要求1到22中任一项的变体、权利要求23或24的单链大范围核酸酶和/或权利要求26到33中任一项的表达载体中的至少之一用于制备药物的用途，所述药物用于预防、改善或治愈由谷氨酰胺合成酶基因中的突变造成的病理状况。

45.权利要求40至44中任一项的用途，其中所述变体、单链大范围核酸酶或者载体与权利要求28至33中任一项定义的靶向DNA构建体相关联。

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