CN101678126A - 切割来自β-2-微球蛋白基因之DNA靶序列的大范围核酸酶变体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种I－CreI变体，其具有至少两个替换，所述替换各自位于LAGLIDADG核心结构域的两个功能性亚结构域之一中，所述亚结构域分别位于I－CreI的26到40位以及44到77位，所述变体能够切割来自β－2－微球蛋白基因的DNA靶序列。本发明还涉及所述变体和衍生产物用于预防和治疗异体移植排斥以及与β－2－微球蛋白的纤丝构象相关之病症的用途，以及用于制备表达异源目的蛋白的转基因动物和重组细胞系的用途。
Description
本发明涉及切割来自β-2-微球蛋白基因之DNA靶序列的大范围核酸酶(meganuclease)变体、编码所述变体的载体、经所述载体修饰的细胞、动物或植物，还涉及所述大范围核酸酶变体及其衍生产物用于离体基因组治疗(基因细胞治疗)和基因组工程的用途。
来自主要组织相容性复合物(MHC，对人来说也被称为HLA)的蛋白质在同种异体识别中起重要作用。这些蛋白质将抗原肽呈递给T细胞。它们可以被分为两类不同的复合物：I类MHC和II类MHC。I类MHC复合物是配体或者特异性T细胞和NK细胞免疫球蛋白样受体。它们包括高度多态性蛋白质和小的多肽(β2-微球蛋白)，其是在细胞表面组装MHC I复合物所必需的(Zijlstra等，Nature，1990，344，742-746)。因为该复合物的其它组分由多基因家族编码，所以敲除β2-微球蛋白基因(在人中为B2M)是抑制MHC I复合物的最简单方法(Koller等，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，1989，86，8932-8935；Zijlstra等，Nature，1990，344，742-746)。
由于MHC蛋白质在同种异体识别中的关键作用，其在移植排斥中也起到重要作用。可以推测破坏I类MHC蛋白至少可以部分减轻移植排斥。但是，在小鼠中的研究提供了获得更大减轻的结果。来自β2m-/-小鼠的造血干细胞迅速被排斥(Bix等等，Nature，1991，349，329-331；Liao等，Science，1991，253，199-202；Huang等，J.Immunol.，2005，175，3753-3761；Ruggeri等，Immunol Rev，2006，214，202-218)，明显是由于NK细胞的活化，但来自这些基因敲除动物的肾和胰岛异体移植物具有更好的耐受性(Markmann等，Transplantation，1992，54，1085-1089；Coffman等，J.Immunol.，1993，151，425-435)。因此，至少对于某些组织来说，人B2M基因的失活可以为移植中最常发生的问题之一提供解决方案。这可以用于针对胰、肾和包括心脏在内的肌肉组织之细胞治疗的许多应用中：可培养、离体处理前体细胞并将其重新移植回患者体内。
另外，同在阿尔茨海默病的淀粉样蛋白中发现的免疫球蛋白、前清蛋白和β蛋白(APP)类似，β-2-微球蛋白主要是β折叠片层结构，其在某些疾病状态中可采取淀粉样蛋白的纤丝构象(Cunningham等，Biochemistry，1973，12：4811-4821)。这包括与血液透析相关的淀粉样变性(HRA；Gorevic等，1986，Proc.Nat.Acad.Sci.83：7908-7912)。Zingraff等(New Eng.J.Med.，1990，323：1070-1071)描述了尽管从未进行过透析却具有β-2-微球蛋白淀粉样变性的严重肾功能不全患者。作者还提出，一些B2M变体比其它变体更具有致淀粉样变的能力。因此，人B2M基因的失活还可为治疗与β-2-微球蛋白(例如HRA)的纤丝构象有关的疾病提供解决方案。
另外，β-2-微球蛋白在大多数细胞中高度表达；在β-2-微球蛋白基因座处插入外源目的基因具有使重组蛋白达到可重复表达水平的优点。因此，基因靶向β-2-微球蛋白基因座处使得可改造出产生高水平目的蛋白质的转基因动物或重组细胞系。
同源基因打靶策略已用于敲除内源基因(Capecchi，M.R.，Science，1989，244，1288-1292)(所述内源基因包括小鼠B2M(或β2m)基因(Koller等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1989，86，8932-8935))或者在染色体上敲入外源序列。基本上，将与靶序列具有同源性的DNA引入细胞核，内源性同源重组机制提供了之后的步骤(图1a)。同源重组(Homologous recombination，HR)是一种非常保守的DNA维持途径，其参与DNA双链断裂(double-strand break，DSB)和其它DNA损伤的修复(Rothstein，MethodsEnzymol.，1983，101，202-211；Paques等，Microbiol Mol Biol Rev，1999，63，349-404；Sung等，Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.，2006，7，739-750)，但是它也是许多生物学现象的基础，例如减数分裂中等位基因的减数分裂重排(Roeder，Genes Dev.，1997，11，2600-2621)，酵母中的接合型转变(Haber，Annu.Rev.Genet.，1998，32，561-599)，以及I类内含子和蛋白内含子(intein)“归巢”成为新等位基因。HR通常促进遗传信息在内源序列之间的交换，但是在基因靶向实验中，它用于促进内源染色体序列与外源DNA构建体之间的交换。但是，该过程的效率很低(转染细胞中10-6至10-9)。
可通过靶标基因座处的DNA双链断裂(DSB)来增强此效率。可通过大范围核酸酶产生这样的DSB，所述大范围核酸酶的定义是识别大序列的序列特异性核酸内切酶(Thierry，A.和B.Dujon，Nucleic Acids Res.，1992，20，5625-5631)。这些蛋白质可切割活细胞中的独特位点，从而将切割位点附近的基因打靶增强1000倍或更多(Puchta等，Nucleic Acids Res.，1993，21，5034-5040；Rouet等，Mol.Cell.Biol.，1994，14，8096-8106；Choulika等，Mol.Cell.Biol.，1995，15，1968-1973；Puchta等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1996，93，5055-5060；Sargent等，Mol.Cell.Biol.，1997，17，267-277；Cohen-Tannoudji等，Mol.Cell.Biol.，1998，18，1444-1448；Donoho，等，Mol.Cell.Biol.，1998，18，4070-4078；Elliott等，Mol.Cell.Biol.，1998，18，93-101)，(图1b)。然而，尽管已经鉴定出数百种天然的大范围核酸酶(也被称为“归巢核酸内切酶”)(Chevalier，B.S.和B.L.Stoddard，Nucleic Acids Res.，2001，29，3757-3774)，但是可切割序列的种类太有限以至于无法应对基因组的复杂性，在所选择基因中经常没有可切割的位点。理论上，产生具有所选特异性的人工序列特异性核酸内切酶可以减少此限制。因此，正在大规模研究产生具有定制特异性的大范围核酸酶。
最近，利用锌指蛋白(Zinc-Finger Protein)与IIS型限制性核酸内切酶FokI催化结构域的融合来产生功能性序列特异性核酸内切酶(Smith等，Nucleic Acids Res.，1999，27，674-681；Bibikova等，Mol.Cell.Biol.，2001，21，289-297；Bibikova等，Genetics，2002，161，1169-1175；Bibikova等，Science，2003，300，764；Porteus，M.H.and D.Baltimore，Science，2003，300，763-；Alwin等，Mol.Ther.，2005，12，610-617；Urnov等，Nature，2005，435，646-651；Porteus，M.H.，Mol.Ther.，2006，13，438-446)。这些核酸酶最近可用于改造来自淋巴瘤细胞系的人细胞中的ILR2G基因(Urnov等，Nature，2005，435，646-651)。
Cys2-His2型锌指蛋白(ZFP)的结合特异性易于操纵，这可能是由于它们很简单(基本上由每个指结构中的四个残基来驱动特异性)，并且是模块化系统(Pabo等，Annu.Rev.Biochem.，2001，70，313-340；Jamieson等，Nat.Rev.Drug Discov.，2003，2，361-368)。来自Pabo(Rebar，E.J.和C.O.Pabo，Science，1994，263，671-673；Kim，J.S.和C.O.Pabo，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A，1998，95，2812-2817)，Klug(Choo，Y.和A.Klug，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，91，11163-11167；Isalan M.和A.Klug，Nat.Biotechnol.，2001，19，656-660)和Barbas(Choo，Y.和A.Klug，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，91，11163-11167；Isalan M.和A.Klug，Nat.Biotechnol.，2001，19，656-660)实验室的研究得到大量的能够结合大多数G/ANNG/ANNG/ANN序列的新型人工ZFP。
尽管如此，ZFP可能有其自身的限制，尤其是对于需要很高水平特异性的应用(例如治疗性应用)来说更是如此。最近有显示，融合蛋白中FokI核酸酶活性与一个识别位点或两个由DNA环以不同距离隔开的位点作用，包括在一些DNA结合缺陷FokI突变体存在下(Catto等，Nucleic Acids Res.，2006，34，1711-1720)。因此，特异性可能具有很高的简并性，如哺乳动物细胞和果蝇(Drosophila)中的毒性所证明的(Bibikova等，Genetics，2002，161，1169-1175；Bibikova等，Science，2003，300，764-.)。
在自然界中，大范围核酸酶基本上由归巢核酸内切酶(homingendonuclease)所代表。归巢核酸内切酶(HE)是广泛存在的天然大范围核酸内切酶家族，其包括数百种蛋白质家族(Chevalier，B.S.和B.L.Stoddard，Nucleic Acids Res.，2001，29，3757-3774)。这些蛋白质由可移动遗传元件编码，其通过被称为“归巢”的过程增殖为：核酸内切酶切割没有可移动元件的同源等位基因，由此促进同源重组事件，其将可移动DNA复制进接受基因座中。由于它们在切割的效率和特异性方面具有优异的性能，因此它们可以作为产生新型高特异性核酸内切酶的理想框架。
HE分属四个主要家族。以催化中心中所包含的保守性肽基序命名的LAGLIDADG家族是最广泛且表征得最为清楚的类型。目前有七种结构是可用的。尽管此家族中的大多数蛋白质是单体并显示出两个LAGLIDADG基序，但是一少部分仅有一个基序，发生二聚化以切割回文或假回文靶序列。
尽管LAGLIDADG肽是该家族成员中仅有的保守区域，但是这些蛋白质具有非常类似的结构(图2)。其催化核心的两侧是两个DNA结合结构域，其对于同二聚体例如I-CreI(Chevalier，等，Nat.Struct.Biol.，2001，8，312-316)和I-MsoI(Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003，329，253-269)而言具有完全二重对称性，而对于单体例如I-SceI(Moure等，J.Mol.Biol.，2003，334，685-69，I-DmoI(Silva等，J.Mol.Biol.，1999，286，1123-1136)或I-AniI(Bolduc等，Genes Dev.，2003，17，2875-2888)而言具有假对称性。两个单体或者两个结构域(对于单体蛋白而言)都对在二价阳离子周围形成结构的所述催化核心有所贡献。就在所述催化核心的上方，两个LAGLIDADG肽还在二聚化界面中起重要作用。DNA结合依赖于位于DNA大沟上的两个典型鞍形ββαββ折叠。还可见其它结构域，例如存在于蛋白内含子如PI-PfuI(Ichiyanagi等，J.Mol.Biol.，2000，300，889-901)和PI-SceI(Moure等，Nat.Struct.Biol.，2002，9，764-770)之中，所述蛋白剪接结构域也参与DNA结合。
通过将N端I-DmoI结构域与I-CreI单体融合产生功能性嵌合大范围核酸酶(Chevalier等，Mol.Cell.，2002，10，895-905；Epinat等，NucleicAcids Res，2003，31，2952-62；PCT国际公开WO 03/078619和WO2004/031346)已证明了LAGLIDADG蛋白质的可塑性。
此外，不同的研究小组已经使用了推理性方法(rational approach)来局部改变I-CreI(Seligman等，Genetics，1997，147，1653-1664；Sussman等，J.Mol.Biol.，2004，342，31-41；International PCT Applications WO2006/097784和WO 2006/097853；Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458；Rosen等，Nucleic Acids Res.，2006，34，4791-4800；Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149)、I-SceI(Doyon等，J.Am.Chem.Soc.，2006，128，2477-2484)，PI-SceI(Gimble等，J.Mol.Biol.，2003，334，993-1008)和I-MsoI(Ashworth等，Nature，2006，441，656-659)的特异性。
另外，通过将半推理性方法(semi-rational approach)与高通量筛选结合而改造出了具有局部改变特异性的数百种I-CreI衍生物：
-诱变了I-CreI的残基Q44、R68和R70或者Q44、R68、D75和I77，并通过筛选鉴定了DNA靶标(5NNN DNA靶标)中的±3至5位的特异性改变的变体组(国际PCT申请WO 2006/097784和WO 2006/097853；Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458；Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149)。
-诱变了I-CreI的残基K28、N30和Q38，N30、Y33和Q38或者K28、Y33、Q38和S40，通过筛选鉴定了DNA靶标(10NNN DNA靶标)的±8至10位特异性改变的变体组(Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149)。
I-CreI的28至40以及44至77残基显示形成两个可分离的功能性亚结构域，其能够结合归巢核酸内切酶半位点的不同部分(Smith等，NucleicAcids Res.，2006，34，e149)。
同一单体中I-CreI的两个亚结构域中的突变组合使得可以设计能够切割在±3至5和±8至10位包含与每个亚结构域相结合的核苷酸的回文组合DNA靶序列的新型嵌合分子(同二聚体)(Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149)。
将两个不同变体结合并组装成功能性异二聚化核酸内切酶，其能够切割由不同的每个变体DNA半靶序列融合所得的嵌合靶标(Arnould等，precited；PCT国际申请Application WO 2006/097854)。有意思的是，新蛋白质已保留了正确的折叠以及稳定性、高活性和窄特异性。
两个前述步骤的组合允许进行包括四种不同亚结构域的更大的组合方法。可以分别修饰不同的亚结构域，并将其组合以获得具有所选特异性的完全重新设计的大范围核酸酶变体(异二聚体或单链分子)，如图3所示。在第一个步骤中，将一对新型大范围核酸酶组合成切割来自待切割靶标的回文靶标的新型分子(“半大范围核酸酶”)。然后，这些“半大范围核酸酶”的组合可产生切割目的靶标的异二聚体。Smith等(Nucleic Acids Res.，2006，34，e149)描述了将四组突变组装成异二聚化核酸内切酶，其切割模型靶序列或来自人RAG1基因的序列。
这些变体可用来切割天然染色体序列，并在包括基因治疗在内的一些领域中开辟了新的道路。
发明人已鉴定了可被I-CreI变体切割的β-2-微球蛋白基因中的一系列DNA靶标(图4)。图3中描述的组合方法用于完全重新设计I-CreI蛋白的DNA结合结构域，由此改造出具有完全改造特异性的新型大范围核酸酶，以切割来自人B2M基因的DNA靶标。所述能够切割来自人B2M基因之基因组DNA靶标的I-CreI变体可用于离体失活人B2M基因(图6)，以便防止人中的异体移植排斥。其它可能的应用包括与β-2-微球蛋白纤丝构象相关之疾病的基因组治疗，以及在β-2-微球蛋白基因座处的基因组工程(敲除和敲入)。
本发明涉及I-CreI变体，其中两种I-CreI单体中至少一种具有至少两个替换，各位于I-CreI的26至40以及44至77位的LAGLIDADG核心结构域的两个功能性亚结构域中的每一个中，并且所述变体能够切割来自β-2-微球蛋白基因的DNA靶序列。
可以通过任何众所周知的体外或体内切割测定来测量根据本发明的变体的切割活性，例如PCT国际申请WO 2004/067736；Epinat等，NucleicAcids Res.，2003，31，2952-2962；Chames等，Nucleic Acids Res.，2005，33，e178和Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458中描述的。例如，可通过同向重复重组测定在酵母或哺乳动物细胞中使用报告载体测量本发明变体的切割活性。所述报告载体包含克隆在酵母或哺乳动物表达载体中报告基因的两个截短的非功能性拷贝(同向重复)以及间插序列之中的基因组DNA靶序列。变体的表达产生能够切割基因组DNA靶标序列的功能性核酸内切酶。此切割诱导同向重复之间的同源重组，产生功能性报告基因，可通过合适的测定来监测该基因的表达。
定义
-多肽序列中的氨基酸残基在本文中由单字母代码表示，其中例如Q意为Gln或谷氨酰胺残基，R意为Arg或精氨酸残基，D意为Asp或天冬氨酸残基。
-核苷酸按如下表示：使用单字母代码表示核苷碱基：a是腺嘌呤，t是胸腺嘧啶，c是胞嘧啶，g是鸟嘌呤。对于简并核苷酸来说，r代表g或a(嘌呤核苷酸)，k代表g或t，s代表g或c，w代表a或t，m代表a或c，y代表t或c(嘧啶核苷酸)，d代表g、a或t，v代表g、a或c，b代表g、t或c，h代表a、t或c，n代表g、a、t或c。
-“大范围核酸酶”是指具有12到45bp的双链DNA靶序列的内切核酸酶。所述大范围核酸酶是其中各结构域位于单体上的二聚体酶，或是在单个多肽上包含两个结构域的单体酶。
-“大范围核酸酶结构域”是指这样的区域，其与大范围核酸酶DNA靶标的一半相互作用，并能够与相同大范围核酸酶的另一结构域结合，形成能够切割所述DNA靶标的功能性大范围核酸酶，所述另一结构域与所述DNA靶标的另一半相互作用。
-“大范围核酸酶变体”或“变体”是指通过将野生型大范围核酸酶(天然大范围核酸酶)氨基酸序列中的至少一个残基替换为不同的氨基酸而获得的大范围核酸酶。
-“功能性变体”是指能够切割DNA靶序列的变体，优选地所述靶标是不被亲本大范围核酸酶切割的新靶标。例如，这些变体在接触DNA靶序列的位置上或与所述DNA靶标直接或间接相互作用的位置上具有氨基酸改变。
-“具有新特异性的大范围核酸酶Cre变体”是指具有与亲本大范围核酸酶不同的靶标切割模式的变体。等价且无差异地使用的术语“新特异性”、“经改变的特异性”、“新切割特异性”、“新底物特异性”是指变体针对DNA靶序列中核苷酸的特异性。
-“I-CreI”是指具有序列SWISSPROT P05725或pdb登录号1g9y的野生型I-CreI，对应于序列表中的序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：107。
-“结构域”或“核心结构域”是指“LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结 构域”，它是LAGLIDADG家族归巢内切核酸酶的特征性α1β1β2α2β3β4α3折叠，对应于约一百个氨基酸残基的序列。所述结构域包含折叠成反向平行β-片层的四条β链(β1β2β3β4)，所述β-片层与DNA靶标的一半相互作用。该结构域能够与另一LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域结合，形成能够切割所述DNA靶标的功能性内切核酸酶，所述另一结构域与所述DNA靶标的另一半相互作用。例如，在二聚体归巢内切核酸酶I-CreI(163个氨基酸)的情况下，LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域对应于残基6到94。
-“单链大范围核酸酶”是指包含通过肽间隔区连接的两个LAGLIDADG归巢内切核酸酶结构域或核心结构域的大范围核酸酶。单链大范围核酸酶能够切割嵌合DNA靶序列，所述靶序列包含各亲本大范围核酸酶靶序列中不同的一半。
-“亚结构域”是指LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域中的区域，其与归巢内切核酸酶DNA靶标半位点的不同部分相互作用。
-“β-发夹”是指LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域反向平行β-片层的两条连续β-链(β1β2或β3β4)，其通过环或转角相连。
-“I-CreI位点”是指被I-CreI切割的22到24bp的双链DNA序列。I-CreI位点包括野生型(天然)非回文I-CreI归巢位点和衍生的回文序列，如序列5’-t-12c-11a-10a-9a-8a-7c-6g-5t-4c-3g-2t-1a+1c+2g+3a+4c+5g+6t+7t+8t+9t+10g+11a+12，也称为C1221(SEQ ID NO：2，图5)。
-“DNA靶标”、“DNA靶序列”、“靶序列”、“靶位点”、“靶标”、“位点”；“目的位点”；“识别位点”、“识别序列”、“归巢识别位点”、“归巢位点”、“切割位点”是指被LAGLIDADG归巢内切核酸酶识别并切割的20到24bp的双链回文、局部回文(假回文)或非回文的多核苷酸序列，例如I-CreI，或变体，或来自于I-CreI的单链嵌合型大范围核酸酶。这些术语是指大范围核酸酶要在其中诱导双链断裂(切割)的独特DNA定位，优选地为基因组定位。DNA靶标通过双链多核苷酸一条链的5′到3′序列来定义，如上文针对C1221所指出的。DNA靶标的切割分别发生在有义和反义链位置+2和-2的核苷酸处。除非另有说明，否则I-Cre I大范围核酸酶变体对DNA靶标进行切割的位置对应于DNA靶标有义链上的切割位点。
-“DNA靶标半位点”、“半切割位点”或“半位点”是指DNA靶标中与各个LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域结合的部分。
-“嵌合DNA靶标”或“杂合DNA靶标”是指两条亲本大范围核酸酶靶序列中不同之一半的融合物。另外，所述靶标的至少一半可包含与至少两个独立的亚结构域结合的核苷酸组合(组合DNA靶标)。
-“β-2-微球蛋白基因”是指哺乳动物的β-2-微球蛋白基因。例如，人β-2-微球蛋白基因(B2M，6673bp)位于登录号NC_000015对应序列的42790977至42797649位。B2M基因包含四个外显子(外显子1：1-127位；外显子2：3937-4215位；外显子3：4843-4870位；外显子4：6121-6673位)。从61位(外显子1)至4856位(外显子3)的ORF的两侧是分别位于其5”和3端的短的和长的非翻译区域(图4)。
-“来自β-2-微球蛋白基因的DNA靶序列”、“基因组DNA靶序列”、“基 因组DNA切割位点”、“基因组DNA靶标”或“基因组靶标”是指β-2-微球蛋白基因中被大范围核酸酶变体识别并切割的20到24bp序列。
-“载体”是指能够转运与之连接的另一核酸的核酸分子。
-“同源”是指一条序列与另一序列具有足够导致序列间发生同源重组的同一性，更具体地具有至少95％的同一性，优选97％的同一性，更优选99％的同一性。
-“同一性”是指两条核酸分子或多肽之间的序列同一性。可通过比较各序列中可为比较目的而排列的位置来测定同一性。当所比较序列中的一个位置被相同的碱基占据时，则这些分子在该位置上是相同的。核酸或氨基酸序列之间的相似性或同一性程度是核酸序列间共有的位置上相同或匹配的核苷酸数量的函数。可使用多种比对算法和/或程序来计算两条序列之间的同一性，包括FASTA或BLAST，它们可作为GCG序列分析包(University of Wisconsin，Madison，Wis.)的一部分获得，并可以例如默认设置使用。
-“个体”包括哺乳动物，以及其它脊椎动物(例如鸟类、鱼和爬行动物)。本文使用的术语“哺乳动物”是指任何这样的脊椎动物，包括单孔类、有袋类和胎盘动物，它们对其幼仔哺乳，并且分娩活的幼仔(真哺乳亚纲(eutharian)或胎盘哺乳动物)或者产卵(后兽亚纲(metatharian)或非胎盘(nonplacental)哺乳动物)。哺乳动物物种的实例包括人和其它灵长类(例如猴、猩猩)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠)和其它，例如：牛、猪和马。
-突变是指在多核苷酸(cDNA、基因)或多肽序列中替换、缺失、插入一个或多个核苷酸/氨基酸。所述突变可影响基因的编码序列或其调节序列。其还可影响基因组序列的结构或所编码mRNA的结构/稳定性。
本发明的变体可以是同二聚体或异二聚体。优选地，其为异二聚体，其中两个单体均在Cre26到40位以及44到77位中具有突变。更优选地，两个单体均在I-CreI的26到40位以及44到77位中具有不同的替换。
在所述变体的一个优选实施方案中，位于I-CreI中44到77位的亚结构域中的所述替换位于44、68、70、75和/或77位。
在所述变体的另一个优选实施方案中，位于I-CreI中26到40位的亚结构域中的所述替换位于26、28、30、32、33、38和/或40位。
在所述变体的另一个优选实施方案中，它包含接触DNA靶序列或者与DNA主链或核苷酸碱基直接或通过水分子相互作用的其它氨基酸残基位置上的一个或多个突变；这些残基是本领域众所周知的(Jurica等，Molecular Cell.，1998，2，469-476；Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003，329，253-269)。特别的，可以在接触磷酸骨架的位置引入额外替换，例如在最后一个C端环中(137至143位)。优选地，所述残基参与所述DNA切割位点的结合和切割。更优选地，所述残基是I-CreI的138、139、142或143位。可以在一个变体中突变两个残基，只要各突变属于选自138和139位残基对、142和143位残基对的不同残基对即可。引入的突变改变了最后一个C端环中所述氨基酸与I-CreI位点磷酸骨架的相互作用。优选地，138或139位残基被疏水氨基酸所替换，以避免与DNA切割位点的磷酸骨架形成氢键。例如138位残基被丙氨酸替换，或者139位残基被甲硫氨酸替换。142或143位残基有利地被小氨基酸如甘氨酸所替换，以减小这些氨基酸残基侧链的尺寸。更优选地，最后一个C端环中的所述替换改变变体对I-CreI位点±1至2，±6至7和/或±11至12位核苷酸的特异性。
在所述变体的另一个优选实施方案中，它包含一个或多个改善所述变体对来自β-2-微球蛋白基因的DNA靶序列的结合和/或切割特性的额外突变。
额外的突变碱基可以在整个I-CreI序列上，特别地，可以在I-CreI的C端一半(80至163位)内。例如，所述变体包含在以下位置上的一个或多个额外替换：2、4、19、24、31、43、49、50、53、54、56、57、59、60、64、66、69、72、73、80、81、82、83、85、87、89、92、94、96、100、103、105、107、110、111、117、120、128、129、132、135、140、142、147、153、154、155、156、157、158、159、161、163。优选地，所述替换选自：N2I、N2Y、K4Q、G19S、I24F、I24V、Q31L、F43L、T49A、Q50R、W53R、F54L、D56E、D56G、K57N、V59A、D60E、D60G、D60N、V64A、V64D、Y66C、D69G、D69E、S72F、S72P、S72T、V73I、E80G、I81T、I81V、K82E、K82R、P83Q、P83A、H85R、F87L、T89A、T89I、Q92L、Q92R、F94L、F94Y、K96R、K100R、K100Q、N103T、N103S、V105A、K107R、E110D、E110G、Q111L、E117G、D120G、W128R、V129A、I132V、L135P、T140M、K142R、T147A、T147N、D153G、D153V、S154G、L155Q、S156N、S156R、E157V、K158N、K159Q、K159R、S161P、S161F、S162F、P163L和P163Q。更优选地，所述突变选自：G19S、I24V、F54L、F87L和I132V。
所述变体还可包含插入到I-CreI序列C端(164和165位)的一个或两个额外残基；例如，可以在164位插入G，在165位插入T或P。
在所述变体的另一个优选实施方案中，所述替换是原始氨基酸被替代为以下的氨基酸：A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、V、L和W。
本发明的变体可来自野生型I-CreI(SEQ ID NO：1)或I-CreI骨架蛋白(scaffold protein)，例如具有Cre2位丙氨酸插入、D75N替换以及I-CreI序列C端的AAD插入(164位至166位)的SEQ ID NO：106的骨架(167个氨基酸)。
另外，本发明的变体可包含在序列的NH2端和/或COOH端插入的一个或多个残基。例如，在NH2端和/或COOH端引入标签(表位或多聚组氨酸序列)；所述标签可用于所述变体的检测和/或纯化。
本发明的变体可以是能切割回文或假回文DNA靶序列的同二聚体。
或者，所述变体是异二聚体，其来自在I-CreI的26至40和44至77位具有不同替换的第一和第二单体的结合，所述异二聚体能切割来自β-2-微球蛋白基因的非回文DNA靶序列。
所述变体切割的DNA靶序列可以是β-2-微球蛋白基因的外显子或内含子。
在所述变体的另一个优选实施方案中，所述DNA靶序列来自人β-2-微球蛋白基因(B2M基因)。优选地，所述DNA靶序列选自序列SEQ IDNO：82至91(24bp；图4和15)以及在所述24bp序列的一端或两端缺少一个或两个末端碱基对的20至22bp的衍生序列。因为编码外显子只占基因的一小部分(图4)，所以发现大多数潜在靶位点位于内含子序列或非翻译外显子序列中。但是，例如B2M18和B2M20的靶标(SEQ ID NO：89和90)位于B2M的开放读码框中。
更优选地，对于所述第一和第二单体而言，所述变体的单体分别具有至少下列替换：
-Y33R、Q38A、Q44D、R68A、R70S、D75K和I77R(第一单体)，以及K28R、Y33A、Q38Y、S40Q、Q44A、R68Y、R70S、D75Y和I77K(第二单体)；该变体切割位于第一内含子中的B2M4靶标(图4和15)，
-S32T、Y33T、Q44T、R68Y、R70S、D75Y和I77V(第一单体)，以及Y33R、Q38A、Q44N、R68Q、R70S、D75S和I77V(第二单体)；该变体切割位于第一内含子中的B2M10靶标(图4和15)，
-S32G、Y33H、Q44A、R68Y、R70S、D75Y和I77K或者S32A、Y33H、Q44A、R68Y、R70S、D75Y和I77K(第一单体)和N30Q、Y33G、Q38C、R68N、R70S、D75N和I77R(第二单体)；该变体切割位于第一内含子中的B2M11靶标(图4和15)，
-S32G、Y33H、Q44A、R68Y、R70S、D75Y和I77K(第一单体)，和S32T、Q38S、Q44K、R70S和I77A(第二单体)；该变体切割位于第一内含子的B2M13靶标(图4和15)，
-S32T、Y33T、Q44K、R68E、R70S和I77R(第一单体)，以及N30A、Y33T、Q44N、R68K、R70S、D75H和I77F(第二单体)；该变体切割位于第一内含子中的B2M14靶标(图4和15)，
-S32R、Y33D、Q44A、R70S、D75E和I77R(第一单体)，以及N30D、Y33R、Q44K、R68Y、R70S、D75N和I77Q(第二单体)；该变体切割位于第一内含子中的B2M16靶标(图4和15)，
-S32T、Q38W、Q44A、R70S、D75R和I77Y(第一单体)，以及Y33H、S40Q、Q44N、R70S、D75R和I77Y(第二单体)；该变体切割位于第一内含子中的B2M17靶标(图4和15)，
-Y33H、Q38G、Q44N、R68Y、R70S、D75R和I77V(第一单体)，第二单体选自：N30A、Y33T、Q44N、R68Y、R70S、D75R和I77V；N30H、Y33C、R68Y、R70S、D75R和I77Q；S32G、Y33C、R68Y、R70S、D75R和I77Q；S32R、Y33T、R68Y、R70S、D75R和I77Q；S32G、Y33C、Q44N、R68Y、R70S、D75R和I77Q；S32A、Y33C、Q44N、R68Y、R70S、D75R和I77Q；S32G、Y33S、Q44N、R68Y、R70S、D75R和I77Q；N30H、Y33C、Q44N、R68Y、R70S、D75R和I77V；S32G、Y33C、Q44N、R68Y、R70S、D75R和I77V；Y33C、S40Q、Q44N、R68Y、R70S、D75R和I77V；S32G、Y33S、Q44N、R68Y、R70S、D75R和I77V；S32G、Y33C、Q44T、R68Y、R70S、D75R和I77Q；S32A、Y33C、Q44T、R68Y、R70S、D75R和I77Q；S32G、Y33C、R68Y、R70S、D75R和I77V；S32G、Y33C、R68Y、R70S和D75R；S32G、Y33C、Q44N、R68Y、R70S、D75R和I77Y；S32A、Y33C、Q44N、R68Y、R70S、D75R和I77Y；S32R、Y33T、R68Y、R70S、D75R、I77Q和D153G；N30H、Y33C、Q44R、R68Y、R70S、D75R和I77Q；这些变体切割位于外显子2中的B2M18靶标(图4和15、表VII)，
-Y33T、S40N、Q44T、R68Y、R70S、D75R和I77V(第一单体)，第二单体选自：K28R、Y33A、Q38Y、S40Q、Q44A、R68S、R70S、D75S和I77R；K28A、Y33S、S40R、R70S和D75N；K28A、Y33T、S40R、R70S和D75N；K28R、Y33A、Q38Y、S40Q、R70S和D75N；K28R、Y33N、Q38R、S40Q、R70S和D75N；K28R、Y33R、Q38Y、S40Q、R70S和D75N；K28R、Y33S、Q38R、S40Q、R70S和D75N；K28R、Y33S、Q38Y、S40Q、R70S和D75N；K28T、Y33T、S40D、R70S和D75；K28T、Y33T、S40R、R70S和D75N；S32G、Y33C和D75N；Y33C和D75N；Y33S、S40R和D75N；Y33S和S40R；N30A和Y33G；N30A和Y33T；N30C和Y33A；N30G和Y33C；N30S、Y33S和Q38T；N30A和S32W；N30H和Y33K；N30R和Y33P；N30K和Y33T；N30P和Y33W；S32G和Y33P；S32T和Y33A；Y33T和S40E；这些变体切割位于内含子2-外显子3接合处的B2M20靶标(图4和15；表VIII)，以及
-K28T、Y33R、S40R、Q44T、R70S和D75Y(第一单体)，以及N30D、Y33R、Q44N、R68Y、R70S、D75Y和I77Q(第二单体)；该变体切割位于外显子4中的B2M33靶标(图4和15)。
更优选地，所述变体由第一单体和第二单体组成，所述第一单体具有SEQ ID NO：24至28、126至134中任一的序列，所述第二单体具有SEQ IDNO：37至77和135中任一的序列，如上所述的来自于切割B2M11靶标之单体的此变体具有增加B2M11靶标切割的额外替换(图4和15，表IV、V和VI)。
所述异二聚化变体有利地是专性(obligate)异二聚体变体，其具有针对在两个I-CreI单体之间产生分子间相互作用的第一和第二单体对应残基的至少一对突变，其中所述突变对的第一突变在第一单体，第二突变在第二单体，所述突变对阻碍各单体形成功能性同二聚体，却不阻碍形成能切割来自β-2-微球蛋白基因的基因组DNA靶标的功能性异二聚体。
分别对第一和第二单体而言，所述单体有利地具有至少下述突变对之一：
a)8位的谷氨酸被碱性氨基酸所替换，优选精氨酸(第一单体)，以及7位的赖氨酸被酸性氨基酸所替换，优选谷氨酸(第二单体)；第一单体还可包含7位和96位的至少一个赖氨酸残基被精氨酸替换。
b)61位的谷氨酸被碱性氨基酸所替换，优选精氨酸(第一单体)，以及96位的赖氨酸被酸性氨基酸所替换，优选谷氨酸(第二单体)；第一单体还可包含7位和96位的至少一个赖氨酸残基被精氨酸替换。
c)97位的亮氨酸被芳香族氨基酸所替换，优选苯丙氨酸(第一单体)，以及54位的苯丙氨酸被小氨基酸所替换，优选甘氨酸(第二单体)；第一单体还可包含54位的苯丙氨酸被色氨酸替换，第二单体还可包含58位的亮氨酸或57位的赖氨酸被甲硫氨酸所替换，以及
d)137位的天冬氨酸被碱性氨基酸所替换，优选精氨酸(第一单体)，51位的精氨酸被酸性氨基酸所替换，优选谷氨酸(第二单体)。
例如，第一单体可具有突变D137R，第二单体可具有突变R51D。
专性异二聚体大范围核酸酶有利地包含至少两对如上文a)、b)、c)或d)中所述的突变，其中一对突变对有利地如c)或d)中所述。优选地，一个单体包含7位和96位的赖氨酸残基被酸性氨基酸替换，另一个单体包含8和61位的谷氨酸残基被碱性氨基酸替换。更优选地，专性异二聚体大范围核酸酶包含三对如上文a)、b)和c)中所述的突变。所述专性异二聚体大范围核酸酶有利地由第一单体(A)和第二单体(B)组成，所述第一单体具有至少选自以下的突变：(i)E8R、E8K或E8H、E61R、E61K或E61H和L97F、L97W或L97Y；(ii)K7R、E8R、E61R、K96R和L97F、或者(iii)K7R、E8R、F54W、E61R、K96R和L97F，所述第二单体(B)具有至少选自以下的突变：iv)K7E或K7D、F54G或F54A和K96D或K96E；(v)K7E、F54G、L58M和K96E、或者(vi)K7E、F54G、K57M和K96E。例如，所述第一单体可具有突变K7R、E8R、E61R、K96R和L97F，或者K7R、E8R、F54W、E61R、K96R和L97F，所述第二单体可具有突变K7E、F54G、L58M和K96E，或者K7E、F54G、K57M和K96E。
本发明的主题还包括来自如上所述I-CreI变体的单链嵌合型大范围核酸酶(融合蛋白)。所述单链大范围核酸酶可包含两个I-CreI单体、两个I-CreI核心结构域(I-CreI的6至94位)或两者的组合。优选地，所述两个单体/核心结构域或两者的组合由肽接头连接。
本发明的主题还包括编码如上所述的变体或单链嵌合型大范围核酸酶的多核苷酸片段，所述多核苷酸可编码同二聚化或异二聚化变体的一个单体，或者单链嵌合型大范围核酸酶的两个结构域/单体。
本发明的主题还包括用于表达本发明的变体或单链大范围核酸酶的重组载体。所述重组载体包含至少一个编码如上所述的变体或单链大范围核酸酶的多核苷酸片段。在一个优选的实施方案中，所述载体包含两个不同的多核苷酸片段，各自编码异二聚化变体的一个单体。
可在本发明中使用的载体包括但不限于病毒载体、质粒、RNA载体，或者可由染色体、非染色体、半合成或合成的核酸所组成的线性或环形DNA或RNA分子。优选的载体是能够自主复制与其连接之核酸的载体(附加型载体)和/或表达与之连接的核酸的载体(表达载体)。大量的合适载体是本领域技术人员已知的，并可以商品获得。
病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(parvovirus)(例如腺相关病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒如正粘病毒(orthomyxovirus)(例如流感病毒)、杆状病毒(例如狂犬病毒和疱疹性口炎病毒(vesicularstomatitis virus))、副粘病毒(paramyxovirus)(例如麻疹病毒和仙台病毒(Sendai))、正链RNA病毒如小RNA病毒(picornavirus)和α病毒，以及双链DNA病毒，其包括腺病毒、疱疹病毒(例如1和2型单纯疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如牛痘病毒、禽痘病毒和金丝雀痘病毒)。其他病毒包括例如诺瓦克病毒、披膜病毒(togavirus)、黄病毒(flavivirus)、呼肠病毒(reoviruses)、乳多空病毒(papovavirus)、嗜肝DNA病毒(hepadnavirus)和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：禽白血病-肉瘤、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒，HTLV-BLV组、慢病毒、泡沫病毒(spumavirus)(Coffin，J.M.，Retroviridae：The viruses and their replication，In Fundamental Virology，第三版，B.N.Fields，等编辑，Lippincott-RavenPublishers，Philadelphia，1996)。
优选的载体包括慢病毒载体，尤其是自失活(self inactivacting)的慢病毒载体。
载体可包含选择标记，例如：用于真核细胞培养的新霉素磷酸转移酶、组氨醇脱氢酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素磷酸转移酶、单纯疱疹病毒胸苷激酶、腺苷脱氨酶、谷氨酰胺合成酶和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶；用于酿酒酵母(S.cerevisiae)的TRP1；大肠杆菌(E.coli)中的四环素、利福平或氨苄青霉素抗性。
优选地，所述载体是表达载体，其中编码本发明变体/单链大范围核酸酶的序列置于适当的转录和翻译控制元件的控制下，以允许产生或合成所述变体。因此，所述多核苷酸包含在表达盒中。更具体地，载体包含复制起点、与所述编码多核苷酸有效连接的启动子、核糖体结合位点、RNA剪接位点(使用基因组DNA时)、多腺苷酸化位点和转录终止位点。其还可包含增强子。启动子的选择将取决于其中表达多肽的细胞。优选地，当所述变体是异二聚体时，编码各个单体的两种多核苷酸包含在一个载体中，所述载体能够驱动两种多核苷酸同时表达。合适的启动子包括组织特异性和/或诱导型启动子。诱导型启动子的实例是：由提高重金属水平诱导的真核金属硫蛋白(metallothionine)启动子，应答于异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)诱导的原核lacZ启动子，和由提高温度诱导的真核热休克启动子。组织特异性启动子的实例是骨骼肌肌酸激酶、前列腺特异性抗原(PSA)、α-抗胰蛋白酶、人表面活性剂(SP)A和B蛋白、β-酪蛋白和酸性乳清蛋白基因。
根据所述载体的另一个有利的实施方案，其包含靶向构建体，所述靶向构建体包含与如上所述的基因组DNA切割位点周围的区域有同源性的序列。
或者，编码I-CreI变体/单链大范围核酸酶的载体和包含所述靶向构建体的载体是不同的载体。
更优选地，所述靶向DNA构建体包含：
a)与如上所述的基因组DNA切割位点周围的区域有同源性的序列，和
b)两侧是a)中序列的待引入序列。
对于基因组治疗或产生基因敲除动物/细胞而言，待引入序列是失活β-2-微球蛋白基因的序列。必须使得两条同源染色体都被靶向，以使得完全失活该基因的功能。此外，所述序列还可缺失β-2-微球蛋白基因或其部分，最终引入外源基因或其部分(敲入/基因置换)。对于产生基因敲入的动物/细胞而言，修复目的位点的DNA包含外源目的基因序列，以及最终地选择标记，例如HPRT基因。或者，待引入序列可以是用于以某些定方式改变染色体DNA的任何其它序列(包括用于改变特异性序列的序列)，以弱化或激活内源目的基因或者向目的位点引入突变。这些染色体DNA改变可用于基因组工程(动物模型和重组细胞系，包括人细胞系)。
可以通过插入使转录中断的转录终止信号来失活β-2-微球蛋白基因，其产生截短的蛋白质(图6a)。在此情况下，待引入序列以5’至3’的顺序包含：至少转录终止序列(多聚A1)，优选地，所述序列还包含标记物盒，所述标记物盒包含启动子和标记开放读码框(ORF)以及第二转录终止序列(多聚A2；图6a)。可以利用任何切割位于B2M启动子下游和位于B2M终止密码子上游之靶标的大范围核酸酶来实施此策略，例如下述任一靶标：B2M4、B2M10、B2M11、B2M13、B2M14、B2M16、B2M17、B2M18和B2M20(SEQ ID NO：82至90；图4和15)。
还可以通过在B2M开放读码框(ORF)中插入标记基因来失活β-2-微球蛋白基因，其破坏编码序列(图6b)。所述插入还可以与切割位点两侧ORF序列的缺失相结合，并最终与插入外源目的基因(基因置换)相结合。可以利用切割外显子序列的大范围核酸酶来实施此策略，例如切割B2M18或B2M20的大范围核酸酶(SEQ ID NO：90，91)。
另外，还可以通过插入使转录本不稳定的序列来失活β-2-微球蛋白基因。可以利用任何切割B2M启动子下游靶标的大范围核酸酶来实施此策略，例如图4和15中列出的任一靶标(SEQ ID NO：82至91)。
优选地，使用至少50bp，优选大于100bp，更优选大于200bp的同源序列。事实上，共有的DNA同源序列位于断裂位点上游和下游的两侧区域，待引入DNA序列应位于两个臂之间。
因此，靶向构建体优选200pb至6000pb，更优选1000pb至2000pb，它包含具有在靶位点两侧至少200bp的同源序列的β-2-微球蛋白基因片段以修复切割，还包含使β-2-微球蛋白基因失活的序列，以及有可能包含用于如上所述置换β-2-微球蛋白基因的目的外源基因序列。
对于插入序列而言，DNA同源序列一般位于断裂位点上游和下游紧邻的区域(紧邻所述断裂的序列；最小修复基质)。但是，当所述插入与切割位点两侧ORF序列的缺失相结合时，共有的DNA同源序列位于缺失区域的上游和下游区域。
例如，由如上所述各个变体切割的B2M靶标以及用于修复各个变体之切割的最小基质在图15中显示。
本发明的主题还包括组合物，其特征在于包含至少一种上述大范围核酸酶(变体或单链衍生嵌合大范围核酸酶)和/或编码上述大范围核酸酶的至少一种表达载体。
在所述组合物的一个优选实施方案中，其包含靶向DNA构建体，所述构建体包含使β-2-微球蛋白基因失活的序列，其两侧是与所述变体的基因组DNA切割位点有同源性的序列，如上所述。
优选地，所述靶向DNA构建体包含在重组载体中，或者包含在表达载体中，所述载体包含编码本发明大范围核酸酶的多核苷酸。
本发明的主题还包括如上所述的至少一种大范围核酸酶和/或一种表达载体在制备用于将细胞从供体移植到有此需要的个体(接受者)内期间预防、改善或治疗异体移植排斥的药物中的用途。
本发明的主题还包括如上所述的至少一种大范围核酸酶和/或一种表达载体在制备用于在有此需要的个体中预防、改善或治疗与β-2-微球蛋白的纤丝构象相关病症的药物中的用途。
所述大范围核酸酶的使用可至少包括步骤(a)和(b)，步骤(a)：在供体/个体的体细胞组织中通过使所述切割位点与所述大范围核酸酶相接触而在包含所述大范围核酸酶的至少一个识别和切割位点的β-2-微球蛋白基因的目的位点处诱导双链断裂，步骤(b)：将靶向DNA引入所述体细胞组织，其中所述靶向DNA包含(1)与所述切割位点周围区域有同源性的DNA和(2)在靶向DNA与染色体DNA重组时使β-2-微球蛋白基因失活的DNA，如上所述。在适于向目的位点引入所述靶向DNA的条件下，将所述靶向DNA引入体细胞组织中。所述靶向构建体可包含缺失β-2-微球蛋白基因的序列，并且可能包含外源目的基因的序列(基因置换)。
或者，可通过非同源末端连接来修复双链断裂通过诱变开放读码框来失活β-2-微球蛋白基因(图6c)。在不存在修复基质时，外显子中的DNA双链断裂主要由易错的非同源末端连接途径(Non HomologousEnd Joining，NHEJ)来修复，得到少量缺失(数个核苷酸)，这会使所述切割位点失活，得到移码突变。
在该情况下，大范围核酸酶的使用包括至少下述步骤：在供体/个体的体细胞组织中在包含所述大范围核酸酶的至少一个识别和切割位点的β-2-微球蛋白基因的目的位点处诱导双链切割，这通过将所述切割位点与所述大范围核酸酶相接触来实现，由此通过非同源末端连接修复双链断裂来诱导β-2-微球蛋白基因开放读码框发生突变。
根据本发明，可以通过将所述大范围核酸酶引入到来自供体/个体的体细胞(胰腺、肾、心脏、肌肉)中，然后将经修饰的细胞移植进接受者(异体移植)或移植回患病个体(与β-2-微球蛋白基因的纤丝构象相关的疾病)，从而离体诱导所述双链切割。
本发明的主题还包括在有此需要的个体中在移植期间预防、改善或治疗异体移植排斥的方法，所述方法包括至少下述步骤：将如上所述组合物通过任何方式施用给所述个体。
本发明的主题还包括在有此需要的个体中预防、改善或治疗与β-2-微球蛋白纤丝构象相关之病症的方法，所述方法包括至少下述步骤：将如上所述组合物通过任何方式施用给所述个体。
本发明的主题还包括如上所述的大范围核酸酶、一种或两种多核苷酸(优选包含在表达载体中)用于在β-2-微球蛋白基因座处的基因组工程(动物模型和重组细胞产生：基因敲入或敲除)的用途，其是用于非治疗目的。
根据所述用途的一个有利的实施方案，其用于在包含基因组DNA靶序列的β-2-微球蛋白基因的目的位点诱导双链断裂，由此诱导DNA重组事件、DNA丢失或细胞死亡。
根据本发明，所述双链断裂是用于：修复β-2-微球蛋白基因中的特定序列，修饰β-2-微球蛋白基因中的特定序列，恢复功能性β-2-微球蛋白基因而代替突变的β-2-微球蛋白基因，弱化或活化内源β-2-微球蛋白基因，将突变引入到β-2-微球蛋白基因的目的位点中，引入外源基因或其部分，失活或缺失内源β-2-微球蛋白基因或其部分，使染色体臂易位，或者使DNA不被修复并降解。
根据所述用途的另一个有利实施方案，所述变体、多核苷酸、载体与如上所述的靶向DNA构建体相关联。
在根据本发明的大范围核酸酶用途的第一个实施方案中，它包括至少下列步骤：1)通过使切割位点与所述大范围核酸酶相接触而在包含所述大范围核酸酶的至少一个识别和切割位点的β-2-微球蛋白基因的目的位点处引入双链断裂；2)提供包含两侧是靶标基因座同源序列的待引入序列的靶向DNA构建体。所述大范围核酸酶可以直接提供给细胞或者通过表达载体提供，所述表达载体包含编码所述大范围核酸酶的多核苷酸序列并适于在所使用细胞中表达所述大范围核酸酶。此策略用于在靶位点引入DNA序列，例如用来产生可用于药物测试的基因敲入或敲除动物模型或细胞系。
在根据本发明的大范围核酸酶用途的第二个实施方案中，其包括至少下列步骤：1)通过使所述切割位点与所述大范围核酸酶相接触而在包含所述大范围核酸酶的至少一个识别和切割位点的β-2-微球蛋白基因的目的位点处引入双链断裂；2)在适于同与所述切割位点周围区域具有同源序列的染色体DNA发生同源重组的条件下维持所述断裂基因组座位。
在根据本发明的大范围核酸酶用途的第三个实施方案中，其包括至少下列步骤：1)通过使所述切割位点与所述大范围核酸酶相接触而在包含所述大范围核酸酶的至少一个识别和切割位点的β-2-微球蛋白基因的目的位点处引入双链断裂；2)在适于通过非同源末端连接修复所述双链断裂的条件下维持所述断裂基因组座位。
本发明的主题还包括制备β-2-微球蛋白基因敲入或敲除动物的方法，其至少包括下述步骤：
(a)将如上所述的大范围核酸酶引入动物的多能前体细胞或胚中，从而在包含所述大范围核酸酶的DNA识别和切割位点的β-2-微球蛋白基因的目的位点处诱导双链切割；与此同时或者依次地；
(b)将靶向DNA引入步骤(a)的动物前体细胞或胚中，其中所述靶向DNA包含(1)与所述切割位点周围区域具有同源性的DNA和(2)在所述靶向DNA和所述染色体DNA重组时修复目的位点的DNA，从而产生已通过同源重组修复了目的位点的经基因组修饰的动物前体细胞或胚，
(c)使步骤(b)中经基因组修饰的动物前体细胞或胚发育成嵌合动物，以及
(d)从步骤(c)的嵌合动物产生转基因动物。
优选地，步骤(c)包括将步骤(b)中产生的经基因组修饰的前体细胞引入囊胚中，以产生嵌合动物。
本发明的主题还包括产生β-2-微球蛋白敲入或敲除细胞的方法，其至少包括下述步骤：
(a)如上所述将大范围核酸酶引入细胞中，从而在包含所述大范围核酸酶的DNA识别和切割位点的β-2-微球蛋白基因的目的位点处诱导双链切割；与此同时或者依次地；
(b)将靶向DNA引入步骤(a)的细胞中，其中所述靶向DNA包含(1)与所述切割位点周围区域具有同源性的DNA和(2)在所述靶向DNA和所述染色体DNA重组时修复目的位点的DNA，从而产生已通过同源重组修复了目的位点的重组细胞，
(c)通过任意适当方式分离步骤(b)的重组细胞。
在适于将所述靶向DNA引入所述目的位点中的条件下将所述靶向DNA引入细胞中。
在一个优选的实施方案中，所述靶向DNA构建体插入到载体中。
或者，可以通过非同源末端连接修复双链断裂来失活β-2-微球蛋白基因(图6c)。
本发明的主题还包括制备β-2-微球蛋白基因敲除动物的方法，其至少包括下述步骤：
(a)将如上所述的大范围核酸酶引入动物多能前体细胞或胚中，从而在包含所述大范围核酸酶的DNA识别和切割位点的β-2-微球蛋白基因的目的位点处诱导双链切割，由此产生已通过非同源末端连接修复了目的位点的经基因组修饰的前体细胞或胚；
(b)使步骤(a)中经基因组修饰的动物前体细胞或胚胎发育成嵌合动物，以及
(c)从步骤(b)的嵌合动物产生转基因动物。
优选地，步骤(b)包括将步骤(a)中得到的经基因组修饰的前体细胞引入囊胚中，从而产生嵌合动物。
本发明的主题还包括产生β-2-微球蛋白缺陷型细胞的方法，其至少包括下述步骤：
(a)如上所述将大范围核酸酶引入细胞中，从而在包含所述大范围核酸酶的DNA识别和切割位点的β-2-微球蛋白基因的目的位点处诱导双链切割，由此产生已通过非同源末端连接修复了双链断裂的经基因组修饰的HPRT型缺陷细胞，
(b)通过任意合适方式分离步骤(a)的经基因组修饰的HPRT型缺陷细胞。
所述经修饰的细胞可以是任何目的细胞。为产生转基因/基因敲除动物，所述细胞是多能前体细胞，例如胚胎来源干细胞(ES cell)，其是本领域众所周知的。为产生重组细胞系，所述细胞可以有利地为人细胞，例如PerC6(Fallaux等，Hum.Gene Ther.9，1909-1917，1998)或HEK293(ATCC # CRL-1573)细胞。所述大范围核酸酶可以直接提供给细胞或者通过表达载体提供，所述表达载体包含编码所述大范围核酸酶的多核苷酸序列，并且适于所述大范围核酸酶在所用细胞中的表达。
为产生转基因动物/重组细胞系(包括表达异源目的蛋白的人细胞系)，所述靶向DNA包含编码目的蛋白的外源基因序列，并最终包含标记基因，如上所述其两侧是β-2-微球蛋白基因的上游和下游序列，从而产生经基因组修饰的细胞(动物前体细胞或胚胎/动物或人细胞)，所述细胞的β-2-微球蛋白基因已通过同源重组被外源目的基因置换。
如上所述，将所述外源基因和所述标记基因插入到合适表达盒中，从而使得在所述转基因动物/重组细胞系中表达异源蛋白/标记。
所述大范围核酸酶可以以多肽或编码所述多肽的多核苷酸构建体的形式使用。通过本领域技术人员公知的适于特定细胞类型的任何合适方式，将其单独或者至少与合适的介质(vehicle)或运载体(carrier)和/或所述靶向DNA组合在一起引入个体的体细胞中。
根据本发明用途的一个有利的实施方案，所述大范围核酸酶(多肽)与下列项组合：
-脂质体、聚乙烯亚胺(PEI)；在这些情况下施用所述组合并因此将其引入体细胞靶细胞内。
-膜易位肽(Bonetta，The Scientist，2002，16，38；Ford等，Gene Ther.，2001，8，1-4；Wadia和Dowdy，Curr.Opin.Biotechnol.，2002，13，52-56)；在这样的情况下，将变体/单链大范围核酸酶的序列与膜易位肽的序列融合(融合蛋白)。
根据本发明用途的另一个有利的实施方案，将所述大范围核酸酶(编码所述大范围核酸酶的多核苷酸)和/或所述靶向DNA插入载体中。可通过多种方法(例如注射、直接摄入、基因枪轰击、脂质体、电穿孔)将包含靶向DNA和/或编码大范围核酸酶的核酸的载体引入细胞中。可使用表达载体在细胞中稳定或瞬时地表达大范围核酸酶。在真核细胞中表达的技术是本领域技术人员公知的(见Current Protocols in Human Genetics：第12章“Vectors For Gene Therapy”&第13章“Delivery Systems for GeneTherapy”)。任选地，可优选在重组蛋白中掺入核定位信号以确保其在核内表达。
一旦进入细胞内，大范围核酸酶和包含靶向DNA和/或编码大范围核酸酶的核酸的载体(如果存在的话)被细胞从胞质输入或易位至核内的作用位点。
对治疗目的而言，以治疗有效量施用所述大范围核酸酶和可药用赋形剂。如果施用量是有生理意义的，则这样的组合被称作以“治疗有效量”施用。如果一种药剂的存在导致接受者生理学可检测的改变，则它是生理学显著的。在本文中，如果一种药剂的存在导致目标疾病的一个或多个症状的严重程度减轻以及损伤或异常的基因组矫正，则它是生理学显著的。
在根据本发明用途的一个实施方案中，所述大范围核酸酶基本上是非免疫原性的，即不引发或几乎不引发不利的免疫应答。根据本发明，可使用改善或消除这类有害免疫反应的大量方法。在一个优选的实施方案中，所述大范围核酸酶基本不含N-甲酰基甲硫氨酸。避免不想要的免疫反应的另一个方法是将大范围核酸酶与聚乙二醇(″PEG″)或聚丙二醇(″PPG″)(优选500到20,000道尔顿的平均分子量(MW))缀合。与PEG或PPG缀合(例如Davis等(US 4,179,337)所述)可提供具有抗病毒活性的非免疫原性的生理活性水溶性内切核酸酶缀合物。Saifer等(US5,006,333)描述了还使用聚乙烯-聚丙二醇共聚物的类似方法。
本发明还涉及通过上文所述的多核苷酸或载体(优选表达载体)修饰的原核或真核宿主细胞。
本发明还涉及非人转基因动物或转基因植物，其特征是其所有或部分细胞通过上文所述的多核苷酸或载体进行修饰。
本文使用的“细胞”是指原核细胞如细菌细胞，或真核细胞如动物、植物或酵母细胞。
本发明的主题还包括如上所述的至少一种大范围核酸酶变体作为产生其它大范围核酸酶的骨架的用途。例如，可以对所述变体进行第三轮诱变和选择/筛选，以产生新型第三代大范围核酸酶。
如上所述，根据本发明的所述大范围核酸酶的不同用途以及使用所述大范围核酸酶的方法包括使用所述I-CreI变体、来源于所述变体的单链嵌合型大范围核酸酶、编码所述变体或单链嵌合型大范围核酸酶的多核苷酸、载体、细胞、转基因植物或非人转基因哺乳动物。
可以通过改造能够切割来自β-2-微球蛋白基因的基因组DNA靶序列的I-CreI变体的方法来获得本发明的I-CreI变体，所述方法至少包括下列步骤：
(a)构建第一系列I-CreI变体，其在LAGLIDADG核心结构域的第一功能性亚结构域中具有至少一个替换，所述第一功能性亚结构域位于I-CreI的26到40位，
(b)构建第二系列I-CreI变体，其在LAGLIDADG核心结构域的第二功能性亚结构域中具有至少一个替换，所述第二功能性亚结构域位于I-CreI的44到77位，
(c)从步骤(a)的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变I-CreI位点的变体，所述位点中(i)I-CreI位点中-10到-8位的核苷酸三联体已被存在于所述基因组靶标中-10到-8位的核苷酸三联体所替换，且(ii)+8到+10位的核苷酸三联体已被存在于所述基因组靶标中-10到-8位的核苷酸三联体的反向互补序列所替换，
(d)从步骤(b)的第二系列中选择和/或筛选能够切割突变I-CreI位点的变体，所述位点中(i)I-CreI位点中-5到-3位的核苷酸三联体已被存在于所述基因组靶标中-5到-3位的核苷酸三联体所替换，且(ii)+3到+5位的核苷酸三联体已被存在于所述基因组靶标-5到-3位的核苷酸三联体的反向互补序列所替换，
(e)从步骤(a)的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变I-CreI位点的变体，所述位点中(i)I-CreI位点中+8到+10位的核苷酸三联体已被存在于所述基因组靶标中+8到+10位的核苷酸三联体所替换，且(ii)-10到-8位的核苷酸三联体已被存在于所述基因组靶标+8到+10位的核苷酸三联体的反向互补序列所替换，
(f)从步骤(b)的第二系列中选择和/或筛选能够切割突变I-CreI位点的变体，所述位点中(i)I-CreI位点中+3到+5位的核苷酸三联体已被存在于所述基因组靶标+3到+5位的核苷酸三联体所替换，且(ii)-5到-3位的核苷酸三联体已被存在于所述基因组靶标+3到+5位的核苷酸三联体的反向互补序列所替换，
(g)将步骤(c)和步骤(d)的两个变体的26到40位和44到77位中的突变在单个变体中组合，以获得切割下述序列的新的同二聚体I-CreI变体，所述序列中(i)-10到-8位的核苷酸三联体与存在于所述基因组靶标-10到-8位的核苷酸三联体相同，(ii)+8到+10位的核苷酸三联体与存在于所述基因组靶标-10到-8位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(iii)-5到-3位的核苷酸三联体与存在于所述基因组靶标-5到-3位的核苷酸三联体相同，和(iv)+3到+5位的核苷酸三联体与存在于所述基因组靶标-5到-3位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，和/或
(h)将来自步骤(e)和步骤(f)的两个变体的26到40位和44到77位中的突变在单个变体中组合，以获得切割下述序列的新的同二聚体I-CreI变体，所述序列中(i)+3到+5位的核苷酸三联体与存在于所述基因组靶标+3到+5位的核苷酸三联体相同，(ii)-5到-3位的核苷酸三联体与存在于所述基因组靶标+3到+5位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(iii)I-CreI位点中+8到+10位的核苷酸三联体已被存在于所述基因组靶标+8到+10位的核苷酸三联体所替换，和(iv)-10到-8位的核苷酸三联体与存在于所述基因组靶标+8到+10位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，
(i)将步骤(g)和(h)中获得的变体组合，形成异二聚体，和
(j)选择和/或筛选来自步骤(i)的能够切割来自β-2-微球蛋白基因的所述基因组DNA靶标的异二聚体。
步骤(a)、(b)、(g)和(h)可包括引入另外的突变以改善突变体的结合和/或切割特性，特别是在接触DNA靶序列或者直接或间接地与所述DNA靶标相互作用的其它位置上。这可通过如PCT国际申请WO 2004/067736中所述的产生组合文库来进行。
此外，步骤(g)和/或(h)还可包括在整个变体上或变体的一部分(尤其是变体的C端一半(80到163位))上引入随机突变。可根据本领域公知的并可以商品获得的标准诱变方法，通过对变体池(pool)产生随机诱变文库来进行随机突变。
可根据公知的重叠PCR技术，通过扩增包含两个亚结构域中各一个的重叠片段来进行步骤(g)和(h)中的(分子内)突变组合。
通过将来自步骤(g)的一个变体与来自步骤(h)的一个变体共表达以允许其形成异二聚体来进行步骤(i)中的(分子间)变体组合。例如，可利用编码所述变体的一种或两种重组表达载体来修饰宿主细胞。然后在允许变体表达的条件下培养细胞，从而在宿主细胞中形成异二聚体，如先前在PCT国际申请WO 2006/097854和Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458中所述的。
可如PCT申请国际WO 2004/067736，Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458，Epinat等，Nucleic Acids Res.，2003，31，2952-2962和Chames等，Nucleic Acids Res.，2005，33，e178中所述，通过利用体外或体内切割测定来进行步骤(c)、(d)、(e)、(f)和/或(j)中的选择和/或筛选。
根据所述方法的另一个优选的实施方案，通过重组介导的DNA双链断裂修复，在下述条件下在体内进行步骤(c)、(d)、(e)、(f)和/或(j)，在所述条件下，由所述变体产生的突变DNA靶序列中的双链断裂导致阳性选择标记或报告基因的激活或者阴性选择标记或报告基因的失活。
本发明的主题还包括在I-CreI的26到40位和/或44到77位具有突变的I-CreI变体，其可用于改造出能够切割来自β-2-微球蛋白基因的DNA靶标的本发明变体。具体地，本发明包括如上所述改造I-CreI变体的方法的步骤(c)到(f)中所定义的I-CreI变体(包括SEQ ID NO：78，79，80，81和105的变体)。本发明还包括如上所述改造I-CreI变体的方法的步骤(g)和(h)中定义的I-CreI变体(包括SEQ ID NO：29至36的变体)。
能够切割来自目的基因的DNA靶标的单链嵌合型大范围核酸酶根据本领域公知的方法衍生自本发明的变体(Epinat等，Nucleic Acids Res.，2003，31，2952-62；Chevalier等，Mol.Cell.，2002，10，895-905；Steuer等，Chembiochem.，2004，5，206-13；PCT国际申请WO 03/078619和WO2004/031346)。任何这些方法都可用于构建衍生自本发明所述变体的单链嵌合型大范围核酸酶。
编码本发明所述变体的多核苷酸序列可通过本领域技术人员已知的任何方法来制备。例如，通过使用特定引物的聚合酶链式反应从cDNA模板来扩增它们。优选将所述cDNA的密码子选择成有利于所述蛋白质在期望的表达系统中表达。
可通过公知的重组DNA和遗传工程技术获得包含所述多核苷酸的重组载体并将其引入宿主细胞中。
通过表达如上所述的多肽来产生本发明所述的I-CreI变体或单链衍生物；优选在适合多肽表达或共表达的条件下，在以一种表达载体或两种表达载体(仅在变体的情况下)修饰的宿主细胞或转基因动物/植物中表达或共表达(仅在变体的情况下)所述多肽，并从宿主细胞培养物或从转基因动物/植物中回收变体或单链衍生物。
除非另有说明，否则本发明的实施将使用本领域内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。这些技术在文献中有详尽解释。参阅，例如CurrentProtocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL，2000，Wiley和son Inc，Library of Congress，USA)；Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第三版，(Sambrook等，2001，Cold Spring Harbor，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait编辑，1984)；Mullis等美国专利4,683,195；NucleicAcid Hybridization(B.D.Harries & S.J.Higgins编辑1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins编辑1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，APractical Guide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods InENZYMOLOGY(主编J.Abelson和M.Simon，Academic Press，Inc.，New York)，尤其是第154和155卷(Wu等编辑)和第185卷，″GeneExpression Technology″(D.Goeddel，编辑)；Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos编辑，1987，Cold SpringHarbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And MolecularBiology(Mayer和Walker，编辑，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell，编辑，1986)；以及Manipulating the Mouse Embryo，(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
除了上述特征以外，本发明还包括在以下说明以及附图中所体现的其他特征，其中参考举例说明本发明I-CreI大范围核酸酶变体及其用途的实施例，在附图中：
-图1图示说明基因打靶策略。(a)可将含有标记(其周围是靶标基因座同源序列)的线性序列引入细胞核中，并与同源靶标基因座重组。此实验设计方案是目前最广泛使用的基因敲入和基因敲除方案。注意，标记的插入可以与靶标基因座中的缺失相结合，导致基因置换。(b)大范围核酸酶诱导的基因打靶。在此情况下，所述靶向序列经常是环形质粒的一部分。
-图2显示与其DNA靶标相结合的I-CreI归巢内切核酸酶的三维结构。由两个αββαββα折叠围绕催化核心，在DNA大沟上形成鞍形相互作用界面。
-图3图示说明用于产生重新设计的归巢内切核酸酶的组合方法。产生特异性局部改变的大的I-CreI衍生物文库。然后，使用两步组合方法将这些突变体组装成同二聚化蛋白(通过组合在同一单体内的突变)，然后组装成异二聚体，得到具有完全重新设计特异性的大范围核酸酶。
一图4显示人B2M基因(登录号NC_000015；6673pb)。外显子由方框表示(外显子1：1-127位，外显子2：3937至4215位，外显子3：4843至4870位，外显子4：6121至6673位)。ORF从61位(外显子1)至4856位(外显子3)。标出了多个大范围核酸酶位点(B2Mn)。
-图5显示B2M系列靶标。B2M11.2和B2M11.3是来源于B2M靶标的通过对一半靶标进行镜像复制而获得的两个回文序列。如果认为B2M11.2和B2M11.3靶标中±11、±7和±6位核苷酸对切割没有影响的话，则可将这两个靶标视为发现其被I-CreI靶标切割的10GAA_P与5TAG_P的组合(B2M11.2)以及10CTG_P与5TTT_P靶标的组合(B2M11.3)Cre。所有靶标与I-CreI切割的回文序列C1221靶标排列在一起。
-图6显示通过大范围核酸酶诱导重组进行基因失活的三种策略。注意在所有这三种情况下，两条同源染色体都必须被靶向，以使得基因的功能完全失活。(a)通过在内含子中切割产生的失活：转录终止序列(多聚A1)和标记盒，其包含启动子、标记ORF和第二转录终止序列(多聚A2)。转录终止序列会产生截短的转录本，从而产生截短的蛋白质。(b)通过在外显子中切割以及敲入标记盒产生的失活。标记基因敲入可以与外显子序列缺失相结合(参见图1)。(c)通过在外显子中切割以及易错非同源末端连接途径产生的失活。在修复基质不存在时，DNA双链断裂基本上通过NHEJ进行修复，使得多数情况下大范围核酸酶切割导致的3’粘末端完美再连接。在此情况下，恢复的切割位点可以再次被大范围核酸酶切割。但是此易错修复途径还可导致少量缺失(少数核苷酸)，这会使所述切割位点失活，并导致移码突变。
-图7图示说明通过组合突变体对B2M11.2靶标的切割。该图显示了用B2M11.2靶标对I-CreI组合突变体进行初次筛选的实例。H12是阳性对照(C)。在上面的顶层滤纸中，B3位阳性突变体序列(圆)是KNAHQS/AYSYK(命名法同表I)。在下面的第二滤纸中，F7位的阳性突变体序列是KNGHQS/AYSYK。
-图8图示说明优化突变体对B2M11.2靶标的切割。由突变体KNAHQS/AYSYK和KNGHQS/AYSYK的随机诱变获得一系列切割B2M11.2的I-CreI N75优化突变体。使用B2M11.2靶标测试切割。将切割B2M11.2的突变体环化。例如，B3位的阳性突变体序列对应于28K30N32A33H38Q40S44A68Y70S75Y77K/2Y53R66C(命名法同表II)。H12是阳性对照。
-图9图示说明组合突变体对B2M11.3靶标的切割。该图显示了用B2M11.3靶标对I-CreI组合突变体进行初次筛选的实例。H10、H11和H12分别是阴性对照(C1)和不同长度的两个阳性对照(C2和C3)。在所述滤纸中，G5位阳性突变体序列(圆)是KQSGCS/QNSNR(命名法同表III)。
-图10图示说明异二聚化组合突变体对B2M11靶标的切割。该图显示了用B2M11靶标对I-CreI突变体组合进行的初次筛选。圈出了一列阳性异二聚化组合突变体。在实例滤纸中，(1)和(2)是分别带有B2M11靶标和突变体28K30N32G33H38Q40S44A68Y70S75Y77K/2I96R105A(1)和28K30N32A33H38Q40S44A68Y70S75Y77K/132V(2)的酵母菌株，其与带有28K30Q32S33G38C40S44Q68N70S75N77R(M1)的酵母菌株接合(命名法同表IV)。
-图11图示说明优化异二聚化组合突变体对B2M11靶标的切割。将一系列切割B2M11.3的I-CreI N75优化突变体与切割B2M11.2的突变体共表达。使用B2M11靶标测试切割。圈出了切割B2M11的突变体(例如G9，对应于28K30Q32S33G38C40S44Q68N70S75N77R和28K30N32A33H38Q40S44A68Y70S75Y77K/2Y53R66C的异二聚体)。在实例滤纸中，带有B2M11靶标和突变体28K30N32A33H38Q40S44A68Y70S75Y77K/2Y53R66C的酵母菌株与带有28K30Q32S33G38C40S44Q68N70S75N77R的酵母菌株(MI)(命名法同表V)或对照(C1至C3)以对角方式接合。H10、H11和H12同样分别是阴性对照(C1)和不同长度的两个阳性对照(C2和C3)。
-图12显示pCLS1055载体图。
-图13显示pCLS0542载体图。
-图14显示pCLS1107载体图。
-图15显示可见于人B2M基因中的大范围核酸酶靶序列以及能切割所述DNA靶标的相应I-CreI变体。指出了与靶序列最近的外显子，以及外显子连接(第2栏和第3栏)，显示了DNA靶标序列(第4栏)及其位置(第5栏)。在靶位点修复切割的最小修复基质由其第一个核苷酸(起点，第8栏)和最后一个核苷酸(终点，第9栏)表示。各变体序列由在所示位置上突变的残基来定义。例如，图15的第一异二聚化变体由第一单体和第二单体组成，所述第一单体在28、30、32、33、38、40、44、68、70、75和77位分别是K、N、S、R、A、S、D、A、S、K、R，所述第二单体在28、30、32、33、38、40、44、68、70、75和77位分别是R、N、S、A、Y、Q、A、Y、S、Y和K。参考I-CreI序列SWISSPROT P05725(SEQ ID NO：1)来标示位置，I-CreI在28、30、32、33、38、40、44、68、70、75和77位分别是K、N、S、Y、Q、S、Q、R、R、D和I。
-图16显示pCLS1069载体图。
-图17显示pCLS1058载体图。
-图18显示B2M18系列靶标。B2M18.3和B2M18.4是来自于B2M18靶标的通过对一半靶标进行镜像复制而得到的两个回文序列。如果认为B2M18.3和B2M18.4靶标中±11、±7和±6位核苷酸对切割没有影响的话，则这两个靶标可以视为发现其被I-CreI靶标切割的10NNN和5NNN靶标的组合Cre。所有靶标与I-CreI切割的回文序列C1221靶标排列在一起。
-图19图示说明组合突变体对B2M18.4靶标的切割。该图显示了用B2M18.4靶标对I-CreI组合突变体进行初次筛选的实例。每四分之一图上的右侧双点(C)分别是阴性对照(C1)和不同长度的两个阳性对照(C2和C3)。滤纸中左侧双点(M)是测试的组合克隆。B10位阳性突变体序列(圆)是KNGCQS/QYSRQ(命名法同表VII)。
-图20显示B2M20系列靶标。B2M20.3和B2M20.4是来自于B2M20靶标的通过对一半靶标进行镜像复制而得到的两个回文序列。如果认为B2M20.3和B2M20.4靶标中±11、±7和±6位核苷酸对切割没有影响的话，则这两个靶标可以视为发现其被I-CreI靶标切割的10NNN和5NNN靶标的组合Cre。所有靶标与I-CreI切割的回文序列C1221靶标排列在一起。
-图21图示说明组合突变体对B2M20.4靶标的切割。该图显示了用B2M20.4靶标对I-CreI组合突变体进行初次筛选的实例。每四分之一图上的右侧双点(C)分别是阴性对照(C1)和不同长度的两个阳性对照(C2和C3)。滤纸中左侧双点(M)是测试的组合克隆。F6位阳性突变体序列(圆)是KNSTQE/QRRDI(命名法同表VIII)。
实施例1：改造出切割人B2M基因的新型大范围核酸酶的策略
使用Smith等，Nucleic Acids Res.，2006中所描述的且在图3中显示的组合方法改造I-CreI的DNA结合结构域，并切割B2M靶标之一B2M11(图5和15)，其为位于人B2M基因(登录号NC_000015.8，42790977至42797649位)2892至2915位的24bp(非回文)的靶标(图5)。切割B2M11的大范围核酸酶可用来通过插入中断转录并得到截短蛋白质的转录终止信号而失活B2M基因(图6a)。
B2M11序列的一部分是被先前鉴定的大范围核酸酶所切割的10GAA_P、10CTG_P、5TAG_P和5TTT_P靶标的拼凑物(图5)，所述大范围核酸酶如PCT国际申请WO 2006/097784，WO 2006/097853；Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458和Smith等，Nucleic AcidsRes.，2006，34，e149中所述获得。因此B2M11可被组合切割这四个靶标的I-CreI衍生物中所发现突变的Cre大范围核酸酶切割。
10GAA_P、10CTG_P、5TAG_P和5TTT_P序列是I-CreI所切割的回文序列C1221的24bp衍生物(PCT国际申请WO 2006/097784、WO2006/097853；Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458和Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149)。
然而，Cre与其DNA靶标结合的I-CreI的结构提示，这些靶标的两个外侧碱基对(-12和12位)对结合和切割没有影响(Chevalier等，Nat.Struct.Biol.，2001，8，312-316；Chevalier B.S.和Stoddard B.L.，NucleicAcids Res.，2001，29，3757-3754；Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003，329，253-269)，在此研究中，仅考虑-11至11位。因此，B2M11系列靶标被确定为22bp序列，而不是24bp。
两种回文靶标B2M11.2和B2M11.3来源于B2M11(图5)。因为B2M11.2和B2M11.3是回文的，因此它们应该被同二聚化蛋白质切割。因此，首先设计同二聚体形式的能切割B2M11.2和B2M11.3序列的蛋白质(实施例2和3)，然后优化能更有效切割B2M11.2靶标的同二聚体(实施例4)，接着共表达以获得切割B2M11.1的异二聚体(实施例5)。然后对切割B2M11.3的所选突变体进行精制，随机诱变所选突变体，用于形成针对B2M11靶标进行筛选的新型异二聚体(实施例6)。
实施例2：切割B2M11.2的大范围核酸酶的制备
该实施例显示I-CreI突变体可切割B2M11.2DNA靶序列，其为来源于B2M11靶标左侧部分的回文形式(图5)。
本实施例中所述靶序列是22bp回文序列。因此，仅通过前11个核苷酸后接后缀_P对它们进行描述。例如，靶标B2M11.2也被记做tgaaattaggt_P；SEQ ID NO：96。
B2M11.2在±1，±2，±3，±4，±5和±7位类似于5TAG_P，而在±1，±2，±7，±8，±9和±10位类似于10GAA_P。推测±6和±11位对结合和切割活性影响很小。之前通过对I-CreI N75的44，68，70，75和77位的诱变获得了能切割5TAG_P靶标(caaaactaggt_P；SEQ ID NO：94)的突变体，如Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458和PCT国际申请WO 2006/097784、WO 2006/097853中所述。通过对I-CreI N75和D75的28，30，32，33，38，40位的诱变获得了能切割10GAA_P靶标(cgaaacgtcgt_P；SEQ ID NO：92)的突变体，如之前Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149中所述。因此，将这些突变体对组合会使得可以切割B2M11.2靶标。
因此，为检验组合的突变体是否能切割B2M11.2靶标，将来自切割5TAG_P(caaaactaggt_P；SEQ ID NO：94)的蛋白质的44，68，70，75和77位的突变与来自切割10GAA_P(cgaaacgtcgt_P；SEQ ID NO：92)的蛋白质的28，30，32，33，38和40位的突变相组合。
1)材料与方法
PCT国际申请WO 2004/067736；Epinat等，Nucleic Acids Res.，2003，31，2952-2962；Chames等，Nucleic Acids Res.，2005，33，e178和Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458中描述了产生大范围核酸酶变体的方法和哺乳动物或酵母细胞中基于切割诱导重组的测定，其用于筛选具有改变的特异性的变体。这些测定产生可通过标准方法监测的功能性LacZ报告基因。
a)构建靶标载体
如下克隆靶标：从PROLIGO定购对应于两侧是gateway克隆序列的靶序列的寡核苷酸：5′tggcatacaagttttgttctcaggtacctgagaacaacaatcgtctgtca 3′(SEQ ID NO：98)。使用Gateway方案(INVITROGEN)，将通过PCR扩增单链寡核苷酸而产生的双链靶DNA克隆进酵母报告载体(pCLS1055，图12)中。将酵母报告载体转化进酿酒酵母菌株FYBL2-7B(MATα，ura3Δ851，trp1Δ63，leu2Δ1，lys2Δ202)中。
b)构建组合突变体
如之前Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149以及Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458，PCT国际申请WO 2006/097784、WO2006/097853中所述，分别针对10GAA_P或5TAG_P靶标鉴定切割10GAA_P或5TAG_P的I-CreI突变体。为产生同时含有来自两个系列突变的I-CreI衍生编码序列，进行了扩增I-CreI编码序列5′端(1-43位氨基酸)或3′端(39-167位)的独立的重叠PCR反应。对5′和3′端二者而言，均使用对载体(pCLS0542，图13)具有特异性的Gal10F(5’-gcaactttagtgctgacacatacagg-3’；SEQ ID NO：99)或Gal10R(5’-acaaccttgattggagacttgacc-3’；SEQ ID NO：100)引物和对氨基酸39-43的I-CreI编码序列具有特异性的引物(assF 5’-ctannnttgaccttt-3’(SEQ IDNO：101)或assr5’-aaaggtcaannntag-3’(SEQ ID NO：102))进行PCR反应，其中nnn编码残基40。将得自利用相同引物进行的扩增反应并对残基40具有相同编码序列的PCR片段合并。然后，将得自使用引物Gal10F和assR或assF和Gal10R的反应的各个PCR片段库以等摩尔比混合。最后，利用高效LiAc转化方案(Gietz和Woods，Methods Enzymol，2002，350，87-96)，使用两种重叠PCR片段最终集合物各约25ng以及75ng经NcoI和EagI消化而线性化的载体DNA(pCLS0542)转化酵母即酿酒酵母菌株FYC2-6A(MATα，trp1Δ63，leu2Δ1，his3Δ200)。通过在酵母中的同源重组来产生含有两组突变的完整编码序列。
c)在酵母中接合表达大范围核酸酶的克隆并筛选：
如前文所述进行筛选(Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458)。使用菌落网格(QpixII，Genetix)进行接合。使用低网格密度(约4点/cm2)将突变体在尼龙滤膜覆盖的YPD平板上划成网格状。在同一滤膜上进行第二次划网格，从而将第二层点于其上，所述第二层由针对每个靶标的带有不同报告基因的酵母菌株组成。将膜置于富含固体琼脂YPD的培养基上，在30℃孵育一夜，使其接合。接着，将滤膜转移到缺少亮氨酸和色氨酸的含半乳糖(2％)作为碳源的合成培养基上，在37℃孵育五天，以选择带有表达和靶标载体的二倍体。五天后，将滤膜置于在0.5M磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中的含0.02％X-Gal、0.1％SDS、6％二甲基甲酰胺(DMF)、7mM β-巯基乙醇、1％琼脂糖的固体琼脂糖培养基中，在37℃孵育，以检测β-半乳糖苷酶活性。通过扫描分析结果，使用合适的软件进行定量。
d)突变体测序
为了回收突变体表达质粒，使用标准方案提取酵母DNA并用于转化大肠杆菌(E.coli.)。然后在MILLEGEN SA提供的质粒上进行突变体ORF的测序。或者，通过PCR从酵母DNA中扩增ORF(Akada等，Biotechniques，2000，28，668-670)并在MILLEGEN SA提供的PCR产物上直接进行测序。
2)结果
通过将I-CreI N75或D75骨架中44、68、70、75和77位的突变与28、30、33、38和40位突变组合来构建I-CreI组合突变体，产生有2014复杂度的文库。组合的实例显示在表1中。将这些文库转化进酵母中，并对4464个克隆(多样性的2.2倍)的针对B2M11.2DNA靶标(tgaaattaggt_P；SEQ ID NO：96)的切割进行了筛选。发现了2个活性水平非常低的阳性克隆，其在测序和二次筛选验证后证实对应于2种不同的新的内切核酸酶(参见表I)。阳性克隆显示在图7中。
在全文和附图中，组合突变体序列用28、30、32、33、38、40、44、68和70、75以及77位残基的11个字母的代码命名。例如，KNGHQS/AYSYK代表I-CreI K28，N30，G32，H33，Q38，S40，A44，Y68，S70，Y75和K77(I-CreI 28K30N32G33H38Q40S44A68Y70S75Y77K)。亲本突变体用28、30、32、33、38和40位残基的6字母代码命名，或者用44、68、70、75和77位残基的5字母代码表示。例如，KNGHQS代表I-CreIK28，N30，G32，H33，Q38和S40，AYSYK代表I-CreI A44，Y68，S70，Y75和K77。
表I：组合变体对B2M11.2靶标的切割
＊仅显示2014个组合中的176个
+表示组合变体对B2M11.2靶标的切割
实施例3：通过对切割B2M11.2的大范围核酸酶进行随机诱变来制备以更高效率切割B2M11.2的大范围核酸酶。
已经通过组装切割回文10GAA_P和5TAG_P靶标的突变体鉴定出能切割回文B2M11.2靶标的I-CreI突变体(实施例2)。但是，这些组合中仅有两个能切割B2M11.2，且效率很低。
因此，对切割B2M11.2的两个蛋白质组合进行诱变，并筛选以更高效率切割B2M11.2的变体。根据与其靶标结合的I-CreI蛋白质的结构，I-CreI蛋白质中用于第一组合方法的残基(28，30，32，33，38和40以及44，68，70，75和77)之间没有接触(Chevalier等，Nat.Struct.Biol.，2001，8，312-316；Chevalier B.S.和Stoddard B.L.，Nucleic Acids Res.，2001，29，3757-3754；Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003，329，253-269)。因此，很难通过推理选择一组位置来诱变，由此，针对蛋白质的C端部分(后83个氨基酸)或整个蛋白质进行了诱变。
1)材料和方法
通过在两步PCR过程中使用Mn2+或dNTP衍生物(如8-氧代-dGTP和dPTP)进行的PCR，在所选突变体集合的基础上建立随机诱变文库，如JENA BIOSCIENCE GmbH的JBS dNTP-Mutagenis试剂盒中的方案所述。所用引物是preATGCreFor(5’-gcataaattactatacttctatagacacgcaaacacaaatacacagcggccttgccacc-3’；SEQID NO：103)和ICreIpostRev(5’-ggctcgaggagctcgtctagaggatcgctcgagttatcagtcggccgc-3’；SEQ ID NO：104)。将新文库在酵母体内克隆进线性化卡那霉素载体中，所述线性化卡那霉素载体带有半乳糖诱导型启动子、作为选择标记的KanR以及2μ复制起点。通过测序验证阳性结果克隆(MILLEGEN)。
通过使用亮氨酸载体(pCLS0542，图13)和卡那霉素载体(pCLS1107，图14)共用的这些引物进行的PCR反应扩增突变体集合。利用高效LiAc转化方案，使用约75ng PCR片段和用NcoI与EagI线性化的75ng载体DNA(pCLS0542)转化酵母即酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株FYC2-6A(MATα，trp1Δ63，leu2Δ1，his3Δ200)。通过酵母中的体内同源重组产生I-CreI突变体的完整编码序列文库。
如实施例2中所述进行接合测定。
2)结果：
合并切割B2M11.2的两个突变体：I-CreI28K30N32G33H38Q40S44A68Y70S75Y77K和I-CreI28K30N32A3338Q40SH44A68Y70S75Y77K(根据表I的命名法也被称为KNGHQS/AYSYK和KNAHQS/AYSYK)，随机诱变并转化进酵母(图13)；然后将4464个转化克隆与含有处于报告质粒之中的B2M11.2靶标的酵母菌株接合。在与这些酵母菌株接合时，发现32个克隆引发B2M11.2靶标的切割，对应于至少13个不同的新型核酸内切酶(参见表II)。阳性实例显示在图8中。
表II：针对B2M11.2靶标的优化突变体
+B2M11.2靶标切割
＊优化的突变以粗体显示
实施例4：切割B2M11.3的大范围核酸酶的制备
本实施例表明，I-CreI突变体可切割来源于B2M11.1靶标右侧部分的回文形式的B2M11.3 DNA靶序列(图5)。该实施例中所述的所有靶序列都是22bp回文序列。因此，仅用前11个核苷酸和其后的后缀_P对它们进行描述，用于表明这一点(例如，B2 M11.3被称为tctgactttgt_P；SEQID NO：97)。
B2M11.3在±1，±2，±3，±4，±5，±6和±7位类似于5TTT_P，在±1，±2，±6，±7，±8，±9和±10位类似于10CTG_P。有假说认为±11位对结合和切割活性影响很小。之前通过对I-CreI N75的44，68，70，75和77位进行诱变获得了能切割5TTT_P靶标(caaaactttgt_P；SEQ ID NO：95)的突变体，如Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458和PCT国际申请WO2006/097784、WO 2006/097853所述。通过对I-CreI N75和D75的28，30，32，33，38，40和70位进行诱变获得了能切割10CTG_P靶标(cctgacgtcgt_P；SEQ ID NO：93)的突变体，如Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149所述。因此，将这些突变体对进行组合将使得能够切割B2M11.3靶标。
在70位突变这两组蛋白质。然而，之前曾证明了I-CreI中存在两个可分离的功能性结构域(Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149)。这说明此位置对于所述靶标10至8位碱基的特异性影响很小。因此，为检验组合突变体是否能切割B2M11.3靶标，将切割5TTT_P(caaaactttgt_P；SEQ ID NO：95)的蛋白质在44、68、70、75和77位的突变与切割10CTG_P(cctgacgtcgt_P；SEQ ID NO：93)的蛋白质在28，30，32，33，38，40位的突变相组合。
1)材料和方法
如之前的Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149，和Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458；PCT国际申请WO 2006/097784、WO2006/097853中分别针对10CTG_P或5TTT_P靶标所述，鉴定切割10CTG_P或5TTT_P的I-CreI突变体。
为了从两个序列中得到含有突变的I-CreI来源的编码序列，分别进行重叠PCR反应，其扩增I-CreI编码序列的5’端(1-43位氨基酸)或3’端(39-167位氨基酸)。对于5’和3’端，都使用载体(pCLS0542，图13)特异性的Gal10F(5’-gcaactttagtgctgacacatacagg-3’：SEQ ID NO：99)或Gal10R(5’-acaaccttgattggagacttgacc-3’：SEQ ID NO：100)引物以及I-CreI编码序列39-43位氨基酸特异性的引物(assF 5’-ctannnttgaccttt-3’(SEQ IDNO：101)或assR 5’-aaaggtcaannntag-3’(SEQ ID NO：102)，其中nnn编码40位残基)进行PCR扩增。合并由使用相同引物和40位残基的相同编码序列实现的扩增反应而得到的PCR片段。然后将由使用引物Gal10F和assR或assF和Gal10R的反应得到的PCR片段的每个集合以等摩尔比例相混合。最后，利用高效LiAc转化方案(Gietz和Woods，methodsEnzymol.，2002，350，87-96)，使用两种重叠PCR片段的每个最终集合约25ng、通过利用DraIII和NgoMIV消化而线性化的75ng载体DNA(卡那霉素抗性酵母表达载体，pCLS1107，图14)来转化酵母即酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株FYC2-6A(MATα，trp1Δ63，leu2Δ1，his3Δ200)。通过酵母中的体内同源重组产生含有两组突变Cre的完整编码序列。
2)结果
通过将44、68、70、75和77位的突变与28、30、33、38和40位的突变在I-CreI N75或D75骨架中相组合来构建I-CreI组合突变体，得到复杂度1600的文库。组合突变体的实例显示于表III中。将该文库转化进酵母，针对B2M11.3DNA靶标(tctgactttgt_P；SEQ ID NO：97)的切割筛选了3348个克隆(多样性的2.1倍)。发现一个阳性克隆，随后将其测序并通过二次筛选进行验证，发现其对应于新型核酸内切酶(参见表III)。
阳性显示于图9中。
表III：组合突变体对B2M11.3靶标的切割＊
＊仅显示1600个组合中的240个.
+显示组合突变体对B2M11.3靶标的切割。
实施例5：通过共表达与切割B2M11.3的蛋白质组装在一起的切割B2M11.2的大范围核酸酶来制备切割B2M11的大范围核酸酶
在实施例2、3和4中鉴定了能切割来自B2M11的每个回文靶标(B2M11.2和B2M11.3)的I-CreI突变体。这些突变体对(一个切割B2M11.2，一个切割B2M11.3)在酵母中共表达。共表达后，应该有三种活性分子类型，两种同二聚体和一种异二聚体。检测所应该形成的异二聚体是否切割B2M11靶标。
1)材料和方法
a)在B2M11靶标酵母中，将优化的突变体克隆于亮氨酸载体中
使用高效LiAc转化方案，将切割B2M11.2靶标的优化突变体转化进含有包含在酵母报告载体(pCLS1055，图12)中的B2M11靶标的酵母菌株FYBL2-7B(MAT a，ura3Δ851，trp1Δ63，leu2Δ1，lys2Δ202)，所述优化突变体克隆于亮氨酸载体(pCLS0542，图13)中。使用突变体-靶标酵母作为针对切割卡那霉素载体(pCLS1107)中B2M11.3的突变体进行接合测定的靶标，如实施例2和4中所述。
b)酵母中共表达大范围核酸酶克隆的接合和筛选
使用菌落网格(QpixII，Genetix)进行接合。使用低网格密度(约4点/cm2)将突变体在尼龙滤膜覆盖的YPD平板上划成网格状。在同一滤膜上进行第二次划网格，从而将第二层点于其上，所述第二层由针对每个突变体-靶标的含有不同报告基因的酵母菌株组成。将膜置于富含YPD的固体琼脂培养基上，在30℃孵育一夜，使其接合。接着，将滤膜转移到缺少亮氨酸和色氨酸的含半乳糖(1％)作为碳源且加入G418的合成培养基上，在37℃孵育五天，以选择带有表达载体和靶标载体的二倍体。五天后，将滤膜置于在0.5M、pH 7.0磷酸钠缓冲液中的含0.02％X-Gal、0.1％SDS、6％二甲基甲酰胺(DMF)、7mM β-巯基乙醇、1％琼脂糖的固体琼脂糖培养基中，在37℃孵育，以检测β-半乳糖苷酶活性。通过扫描分析结果，使用合适的软件进行定量。
2)结果
在大多数情况下，切割B2M11.2和B2M11.3的突变体的共表达得到对B2M11靶标的切割(图10)。功能性组合归纳于表IV中。
表IV：导致切割B2M11靶标的组合
| 突变体B2M11.3 | 优化的突变体B2M11.2 | B2M11靶标切割 |
| I-CreIK28Q30S32G33C38S40Q44N68S70N75R77(KQSGCS/QNSNR) | I-CreI 28K30N32A33H38Q40S44A68Y70S75Y77K/2Y53R66CI-CreI 28K30N32A33H38Q40S44A68Y70S75Y77K/2Y53RI-CreI 28K30N32A33H38Q40S 44A68Y70S75Y77K/132VI-CreI 28K30N32G33H38Q40S 44A68Y70S75Y77K/2I96R105AI-CreI 28K30N32G33H38Q40S 44A68Y70S75Y77K/120GI-CreI 28K30N32A33H38Q40S 44A68Y70S75Y77K/43L105A159RI-CreI 28K30N32G33H38Q40S 44A68Y70S75Y77K/50RI-CreI 28K30N32G33H38Q40S 44A68Y70S75Y77K/49A50RI-CreI 28K30N32G33H38Q40S 44A68Y70S75Y77K/81V129A154GI-CreI 28K30N32G33H38Q40S 44A68Y70S75Y77K/129A161PI-CreI 28K30N32G33H38Q40S 44A68Y70S75Y77K/117GI-CreI 28K30N32G33H38Q40S 44A68Y70S75Y77K/81TI-CreI 28K30N32G33H38Q40S 44A68Y70S75Y77K/103T | +++++ |
+表示异二聚突变体切割B2M11靶标
实施例6：通过将切割B2M11.3的大范围核酸酶进行随机诱变并与切割B2M11.2的蛋白质共表达来制备以更高效率切割B2M11的大范围核酸酶
通过共表达切割回文B2M11.2和B2M11.3靶标的突变体鉴定出能切割回文B2M11靶标的I-CreI突变体(实施例5)。但是，能切割B2M11的阳性组合的效率和数量都很低。
因此，诱变切割B2M11.3的蛋白质，并筛选在与B2M11.2的优化突变体相组合时具有更高效率的切割B2M11的变体。根据与其靶标结合的I-CreI蛋白质的结构，I-CreI蛋白质中用于第一组合方法的残基(28，30，32，33，38和40以及44，68，70，75和77)之间没有接触(Chevalier等，Nat.Struct.Biol.，2001，8，312-316；Chevalier B.S.和Stoddard B.L.，NucleicAcids Res.，2001，29，3757-3754；Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003，329，253-269)。因此，很难通过推理选择一组位置来诱变，由此，针对蛋白质的C端部分(后83个氨基酸)或整个蛋白质进行了诱变。
1)材料和方法
通过在两步PCR过程中使用Mn2+或dNTP衍生物(如8-氧代-dGTP和dPTP)进行的PCR，在所选突变体的基础上建立随机诱变文库，如JENABIOSCIENCE GmbH的JBS dNTP-Mutagenis试剂盒中的方案所述。所用引物是preATGCreFor(5’-gcataaattactatacttctatagacacgcaaacacaaatacacagcggccttgccacc-3’；SEQID NO：103)和ICreIpostRev(5’-ggctcgaggagctcgtctagaggatcgctcgagttatcagtcggccgc-3’；SEQ ID NO：104)。将新文库在酵母体内克隆于线性化卡那霉素载体中，所述卡那霉素载体带有半乳糖诱导型启动子、作为选择标记的KanR以及2μ复制起点。通过测序验证阳性结果克隆(MILLEGEN)。
通过使用亮氨酸载体(pCLS0542，图13)和卡那霉素载体(pCLS1107，图14)共用的那些引物进行的PCR反应来扩增突变体集合。利用高效LiAc转化方案，使用约75ng PCR片段和用DraIII与NgoMIV消化而线性化的75ng载体DNA(pCLS1107)来转化酵母即酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株FYC2-6A(MATα，trp1Δ63，leu2Δ1，his3Δ200)。通过酵母中的体内同源重组产生I-CreI突变体的完整编码序列文库。
制备突变体-靶标酵母并用做接合测定的靶标，如实施例5中所述。
2)结果：
将切割B2M11.3的突变体(I-CreI28K30Q32S33G38C40S44Q68N70S75N77R，根据表III的命名法也称作KQSGCS/QNSNR)进行随机诱变，并转化进酵母。然后将6696个转化克隆与酵母菌株接合，所述酵母菌株为(i)在报告质粒中含有B2M11靶标的，(ii)表达在实施例5中所述变体中选择的切割B2M11.2靶标的优化变体。使用四个这样的菌株，其表达I-CreI28K30N32A33H38Q40S44A68Y70S75Y77K/132V突变体，I-CreI28K30N32G33H38Q40S44A68Y70S75Y77K/2I96R105A突变体，28K30N32G33H38Q40S44A68Y70S75Y77K/120G突变体或28K30N32A33H38Q40S44A68Y70S75Y77K/2Y53R66C突变体(参见表V)。在与这些酵母菌株接合时，发现101个克隆引起B2M11靶标的切割。在对照实验中，在没有KQSGCS/QNSNR蛋白共表达的情况下，在这些克隆中没有发现引起B2M11的切割。于是认为101个阳性克隆在与KQSGCS/QNSNR形成异二聚体时含有能切割B2M11的蛋白质。这些异二聚化突变体的实例列于表V中。阳性克隆的实例显示于图11中。
表V：导致切割B2M11靶标的组合
+：表示异二聚化变体切割B2M11靶标。
优化突变体以粗体显示
实施例7：通过将切割B2M11.3的大范围核酸酶进行随机诱变并与切割B2M11的蛋白质共表达制备在CHO细胞的染色体外模型中以更高效率切割B2M11.2的大范围核酸酶
已经通过共表达切割回文B2M11.2和B2M11.3靶标的突变体(优化的或未优化的)在酵母中鉴定了能以更高效率切割回文B2M11靶标的I-CreI突变体(实施例5)。但是，CHO细胞中的功能性异二聚体引人注意，在使用染色体外测定的哺乳动物细胞中能切割B2M11的阳性组合的效率和数目不同于酵母细胞中的。
因此，如实施例5中将切割B2M11.2的最佳蛋白质进行诱变，并筛选在与针对B2M11.3的优化变体组合时高效切割B2M11的变体。根据与其靶标结合的I-CreI蛋白质的结构，I-CreI蛋白质中用于第一组合方法的残基(28，30，32，33，38和40以及44，68，70，75和77)之间没有接触(Chevalier等，Nat.Struct.Biol.，2001，8，312-316；Chevalier B.S.和Stoddard B.L.，Nucleic Acids Res.，2001，29，3757-3754；Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003，329，253-269)。因此，很难通过推理选择一组位置来诱变，由此，针对蛋白质的C端部分(后83个氨基酸)或整个蛋白质进行了诱变。
1)材料和方法
a)通过随机诱变构建文库
通过在两步式PCR过程中使用Mn2+或dNTP衍生物(如8-氧代-dGTP和dPTP)进行的PCR，在所选突变体集合的基础上建立随机诱变文库，如JENA BIOSCIENCE GmbH的JBS dNTP-Mutagenis试剂盒中的方案所述。所用引物是attB1-ICreIFor(5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcgaaggagatagaaccatggccaataccaaatataacaaagagttcc-3′：(SEQ ID NO：120)和attB2-ICreIRev(5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttagtcggccgccggggaggatttcttcttctcgc-3’：SEQID NO：121)。将所得PCR产物体外克隆于INVITROGEN的CHOGateway表达载体pCDNA6.2中(pCLS1069，图16)。同时，将用于文库的所选突变体以相同方式克隆于此载体中。通过测序验证所克隆的突变体和文库的阳性结果克隆(MILLEGEN)。
b)在用于在CHO细胞中筛选的载体中构建B2M11靶标
通过两步式PCR使用引物M1s(5’-aaaaagcaggctgattggcatacaagtt-3’：SEQ ID NO：122)和M2s(5’-agaaagctgggtgattgacagacgattg-3’：SEQ IDNO：123)，然后使用attB1adapbis(5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagca-3’：SEQID NO：124)和attB2adapbis(5’-ggggaccactttgtacaagaaagct-3′：SEQ IDNO：125)从酵母靶标载体(如实施例1)扩增B2M11靶标。引物来自PROLIGO。使用Gateway方案(INVITROGEN)将最终PCR产物克隆进CHO报告载体(pCLS1058，图17)。通过测序验证所克隆的靶标(MILLEGEN)。
c)哺乳动物细胞中的染色体外测定
根据供应商的方案(QIAGEN)使用Polyfect转染试剂转染CHO细胞。转染后72小时，除去培养基，加入150μl裂解/显示(revelation)缓冲液，用于进行β-半乳糖苷酶液体测定(通常1升缓冲液含有100ml裂解缓冲液(Tris-HCl 10mM pH7.5，NaCl 150mM，Triton X100 0.1％，BSA0.1mg/ml，蛋白酶抑制剂)、10ml Mg 100X缓冲液(MgCl2 100mM，β-巯基乙醇35％)、110ml ONPG 8mg/ml和780ml磷酸钠0.1M pH7.5)。在37℃孵育之后，测定420nm处的光密度(OD)。整个过程在自动化Velocity11 BioCel平台上进行。每个测定中，将150ng靶标载体与两种突变体各12.5ng(12.5ng切割回文B2M11.2靶标的突变体和12.5ng切割回文B2M11.3靶标的突变体)共转染。
2)结果
将切割B2M11.2的优化突变体(I-CreI32G33H44A68Y70S75Y77K/120G，32A33H44A68Y70S75Y77K/2Y53R66C，32G33H44A68Y70S75Y77K/2I96R105A和32A33H44A68Y70S75Y77K/132V，如表V中所述)进行随机诱变，并转化进Gateway载体(图16)。纯化1920个转化克隆的DNA质粒，然后与CHO B2M11靶标载体和选自实施例6中所述的那些切割B2M11.3靶标的优化变体共转染。为了进行比较，包括了转化克隆与CHO B2M11靶标载体和切割B2M11.3的初始突变体(30Q33G38C68N70S77R)的共转染。在与切割B2M11.3靶标的优化变体共转染时，发现60个克隆引起B2M11靶标的切割。
在对照实验中，在不与切割B2M11.3靶标的变体(优化的或未优化的)共转染的情况下，这些克隆中未发现有引起B2M11的切割。因此，结论认为，60个阳性克隆含有在与切割B2M11.3靶标的优化变体形成异二聚体时能切割B2M11的蛋白质。来源于切割B2M11.3靶标的两种优化变体(30Q33G38C68N70S77R/43L115T117G和30Q33G38C68N70S77R/110D)的这些异二聚化突变体的实例列于表VI中。
表VI：导致在CHO细胞中切割＊B2M11靶标的组合
＊(-)：＜0.25.(±)：0.25≤＜0,5.(+)：0,5≤＜1,2.(++)：≥1,2.值(吸收单位)对应于CHO细胞中染色体外测定的平均实验结果
实施例8：切割B2M18的大范围核酸酶的制备
两个新的回文靶标系列：B2M18.3和B2M18.4来自于B2M18，B2M20.3和B2M20.4来自于B2M20(图18和21)。因为B2M18.3、B2M18.4、B2M20.3和B2M20.4是回文的，所以它们应该被同二聚化蛋白质切割。首先，设计同二聚体形式的能切割B2M18.4序列的蛋白质(实施例8)，然后设计同二聚体形式的能切割B2M20.4序列的蛋白质(实施例9)。
本实施例表明I-CreI变体可切割回文形式的B2M18.4 DNA靶序列，其来自于B2M18靶标的右侧部分(图18)。本实施例中描述的所有靶序列都是22bp回文序列。因此，仅用前11个核苷酸后接后缀_P对它们进行描述。例如，B2M18.4也被记做TTAACTATCGT_P(SEQ ID NO：113)。
B2M18.4在±1，±2，±3，±4，±5，±8和±9位类似于5ATC_P，在±1，±2，±3，±4，±8，±9和±10位类似于10TAA_P。有假说认为±6，±7和±11位对结合和切割活性影响很小。之前通过对I-CreI N75的44，68，70，75和77位的诱变获得了能切割5ATC_P靶标(CAAAACATCGT_P)的突变体，如Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458和PCT国际申请WO2006/097784、WO 2006/097853中所述。通过对I-CreI N75和D75的28，30，32，33，38，40和70位的诱变获得了能切割5ATC_P靶标(CTAAACGTCGT_P)的突变体，如之前Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149中所述。因此，将这些突变体对组合将使得能够切割B2M18.4靶标。
两组蛋白质都在70位突变。但是，猜想存在两个可分离的功能性亚结构域。这暗示该位置对靶标的10至8碱基的特异性影响很小。因此，将切割5ATC_P(CAAAACATCGT_P)的蛋白质的44，68，70，75和77位的突变与的切割10TAA_P(CTAAACGTCGT_P)的蛋白质的28，30，32，33，38，40位的突变相组合，以验证组合突变体是否能切割B2M18.4靶标。
1)材料和方法
实验步骤同实施例2中所述。
2)结果
通过将I-CreI N75或D75骨架中44、68、70、75和77位的突变与28、30、33、38和40位的突变相组合来构建I-CreI组合突变体，得到复杂度1600的文库。组合突变体的实例显示于表VII中。将该文库转化进酵母，针对切割B2M18.4 DNA靶标(TTAACTATCGT_P)筛选了3348个克隆(多样性的2.1倍)。得到59个阳性克隆，随后将其测序并通过二次筛选进行验证，证明其对应于18种新型核酸内切酶(SEQ ID NO：136至152和179，参见表VII)。阳性结果显示于图19中。一个阳性克隆在153位有一个另外的突变。此克隆的序列是KNRTQS/QYSRQ-153G。
表VII：组合突变体对B2M18.4靶标的切割＊
＊仅显示组合文库中理论上存在的1600个组合中的138个
+表示在所鉴定的阳性克隆中发现的组合突变体。
实施例9：切割B2M20的大范围核酸酶的制备
本实施例表明I-CreI变体可切割回文形式的B2M20.4 DNA靶序列，其来自于B2M20.1靶标的右侧部分(图19)。本实施例中描述的所有靶序列都是22bp回文序列。因此，仅用前11个核苷酸后接后缀_P对它们进行描述。例如，靶标B2M20.4被记做TTACATGTCGT_P：SEQ ID NO：119。
B2M18.4在±1，±2，±3，±4，±5和±7位类似于5GTC_P，在±1，±2，±3，±4，±5，±7，±8，±9和±10位类似于10TAC_P。有假说认为±6和±11位对结合和切割活性影响很小。之前通过对I-CreI的70和77位的诱变获得了能切割5GTC_P靶标(CAAAACGTCGT_P)的突变体，如Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458和PCT国际申请WO 2006/097784、WO2006/097853中所述。通过对I-CreI N75和D75的28，30，32，33，38，40和70位的诱变获得了能切割10TAC_P靶标(CTACACGTCGT_P)的突变体，如之前Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149中所述。因此，将这些突变体对组合将使得能够切割B2M20.4靶标。
两组蛋白质都在70位突变。但是，猜想存在两个可分离的功能性亚结构域。这暗示该位置对靶标的10至8碱基的特异性影响很小。因此，将切割5GTC_P(CAAAACGTCGT_P)的蛋白质的70和75位的突变与切割10TAC_P(CTACACGTCGT_P)的蛋白质的28，30，32，33，38，40位的突变相组合，以验证组合突变体是否能切割B2M20.4靶标。
1)材料和方法
实验步骤如实施例2中所述。
2)结果
通过将I-CreI N75或D75骨架中70和75位的突变与28、30、33、38和40位的突变相组合来构建I-CreI组合突变体，得到复杂度1536的文库。组合突变体的实例显示于表VIII中。将该文库转化进酵母，针对切割B2M20.4 DNA靶标(TTACATGTCGT_P)筛选了6696个克隆(多样性的4.4倍)。发现了196个阳性克隆，随后将其测序并通过二次筛选进行验证，证明其对应于164种新型核酸内切酶(参见表VIII显示SEQ ID NO：153至178)。阳性结果显示于图21中。12个阳性克隆有另外的突变(56G，82R，147A或161F)，如实施例8。
表VIII：组合突变体时B2M20.4靶标的切割＊
＊仅显示组合文库中理论上存在的1536个组合中的230个
+表示在所鉴定的阳性克隆中发现的组合突变体。
序列表
<110>赛莱克蒂斯公司
西尔万.阿尔努
安德烈.舒利卡
<120>切割来自β-2微球蛋白基因之DNA靶序列的大范围核酸酶变体及其用途
<130>1546PCT16
<160>179
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>163
<212>PRT
<213>菜茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)
<400>1
Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe
1 5 10 15
Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser
20 25 30
Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Ala Phe Gln Val Thr Gln Lys
35 40 45
Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val
50 55 60
Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu
65 70 75 80
Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys
85 90 95
Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Trp Arg Leu
100 105 110
Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp
115 120 125
Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr
130 135 140
Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys
145 150 155 160
Ser Ser Pro
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>C1221靶标
<400>2
tcaaaacgtc gtacgacgtt ttga
<210>3
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>3
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
20 25 30
Ser Arg Lys Phe Lys His Ala Leu Ser Leu Thr Phe Asp Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Ala Asp Ser Gly Ser Val Ser Lys Tyr Arg Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>4
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>4
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
20 25 30
Thr Thr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Thr Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Tyr Tyr Val Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>5
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>5
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
20 25 30
Ala His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Ala Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Tyr Tyr Lys Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>6
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>6
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
20 25 30
Gly His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Ala Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Tyr Tyr Lys Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala ASn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>7
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>7
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
20 25 30
Gly His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Ala Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Tyr Tyr Lys Leu Ser
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<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
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<220>
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<223>I-CreI变体
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<223>I-CreI变体
<400>46
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65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Arg Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
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145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Thr Asp
165
<210>47
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>47
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Gln Gln
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<211>167
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<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>48
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
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<210>49
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<213>人工序列
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<223>I-CreI变体
<400>49
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Gln Gln
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Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Gln Gln
20 25 30
Ser Gly Lys Phe Lys His Cys Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Asn Asp Ser Gly Ser Val Ser Asn Tyr Arg Leu Ser
65 70 75 80
Glu Val Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Gln
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>71
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>71
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Gln Gln
20 25 30
Ser Gly Lys Phe Lys His Cys Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Asn Asp Ser Gly Ser Val Ser Asn Tyr Arg Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Glu Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Arg Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>72
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>72
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Gln Gln
20 25 30
Ser Gly Lys Phe Lys His Cys Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Asn Asp Ser Gly Ser Val Ser Asn Tyr Arg Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu Arg Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>73
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>73
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Gln Gln
20 25 30
Ser Gly Lys Phe Lys His Cys Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Asn Asp Ser Gly Ser Val Ser Asn Tyr Arg Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Leu Leu Thr Gln Leu GlnPro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>74
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>74
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Gln Gln
20 25 30
Ser Gly Lys Phe Lys His Cys Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Asn Asp Ser Gly Ser Val Ser Asn Tyr Arg Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Leu Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Pro Asn Asp Ser Lys Thr Arg Arg Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Gly Pro Asp
165
<210>75
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>75
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Gln Gln
20 25 30
Ser Gly Lys Phe Lys His Cys Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Asn Asp Ser Gly Ser Val Ser Asn Tyr Arg Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Arg Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp 5er Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>76
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>76
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Gln Gln
20 25 30
Ser Gly Lys Phe Lys His Cys Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Thr Val Ser Asn Tyr Arg Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Met Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>77
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>77
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Gln Gln
20 25 30
Ser Gly Lys Phe Lys His Ser Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Asn Asp Ser Gly Ser Val Ser Asn Tyr Arg Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>78
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>78
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
20 25 30
Ser Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Ala Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Tyr Tyr Lys Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>79
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>79
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
20 25 30
Gly His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asn Tyr Ile Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>80
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>80
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
20 25 30
Ala His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asn Tyr Ile Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
63
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>81
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>81
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Gln Gln
20 25 30
Ser Gly Lys Phe Lys His Cys Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asn Tyr Ile Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>82
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶标
<400>82
ttgtaatccc agcacttagg gaga
<210>83
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶标
<400>83
tttagctcat gaaattaggt acaa
<210>84
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶标
<400>84
atgaaattag gtacaaagtc agag
<210>85
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶标
<400>85
ttgaacccag gaggcggagg ttga
<210>86
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶标
<400>86
tctagacact tcatacagtt taga
<210>87
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶标
<400>87
ttcatacagt ttagaaaatc agat
<210>88
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶标
<400>88
gtacaataac atgagtaatt tgat 24
<210>89
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶标
<400>89
ttgtcacagc ccaagatagt taag 24
<210>90
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶标
<400>90
ttttcataga tcgagacatg taag 24
<210>91
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶标
<400>91
atgaaacatt ttgtcatata agat 24
<210>92
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M衍生靶标
<400>92
tcgaaacgtc gtacgacgtt tcga 24
<210>93
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M衍生靶标
<400>93
tcctgacgtc gtacgacgtc agga 24
<210>94
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M衍生靶标
<400>94
tcaaaactag gtacctagtt ttga 24
<210>95
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M衍生靶标
<400>95
tcaaaacttt gtacaaagtt ttga 24
<210>96
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>BM衍生靶标
<400>96
tgaaattagg tacctaattt ca 22
<210>97
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M衍生靶标
<400>97
tctgactttg tacaaagtca ga 22
<210>98
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>98
tggcatacaa gttttgttct caggtacctg agaacaacaa tcgtctgtca 50
<210>99
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>99
gcaactttag tgctgacaca tacagg 26
<210>100
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>100
acaaccttga ttggagactt gacc 24
<210>101
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(6)
<223>n是a，c，g，或t
<400>101
ctannnttga ccttt 15
<210>102
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(12)
<223>n是a，c，g，或t
<400>102
aaaggtcaan nntag 15
<210>103
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>103
gcataaatta ctatacttct atagacacgc aaacacaaat acacagcggc cttgccacc 59
<210>104
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>104
ggctcgagga gctcgtctag aggatcgctc gagttatcag tcggccgc 48
<210>105
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>105
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
20 25 30
Ser Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Asn Asp Ser Gly Ser Val Ser Asn Tyr Arg Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>106
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI N75骨架蛋白
<400>106
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
20 25 30
Ser Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asn Tyr Ile Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>107
<211>163
<212>PRT
<213>莱茵衣藻
<400>107
Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe
1 5 10 15
Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser
20 25 30
Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys
35 40 45
Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val
50 55
Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu
65 70 75 80
Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys
85 90 95
Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu
100 105 110
Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp
115 120 125
Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr
130 135 140
Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys
145 150 155 160
Ser Ser Pro
<210>108
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶标
<400>108
tcgtcacgtc gtacgacgtg acga 24
<210>109
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶标
<400>109
tctaaacgtc gtacgacgtt taga 24
<210>110
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶标
<400>110
tcaaaacagc gtacgctgtt ttga 24
<210>111
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶标
<400>111
tcaaaacatc gtacgatgtt ttga 24
<210>112
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶标
<400>112
tgtcacagcg tacgctgtga ca 22
<210>113
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶标
<400>113
ttaactatcg tacgatagtt aa 22
<210>114
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<220>
<223>I-CreI变体
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>165
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
20 25 30
Ser Ser Lys Phe Lys His Gln Leu Arg Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>166
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>166
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Ala Gln
20 25 30
Ser Gly Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>167
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>167
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1 5 10 15
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35 40 45
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
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<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>168
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20 25 30
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100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
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145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
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<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>169
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20 25 30
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115 120 125
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130 135 140
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Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>170
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>170
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Ser Gln
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Val Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser
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Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
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130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>171
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>171
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<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>172
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro His Gln
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Val Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
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Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
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Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
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Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
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Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>173
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>173
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Arg Gln
20 25 30
Ser Pro Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
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Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
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Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
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Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>174
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>174
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1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Lys Gln
20 25 30
Ser Thr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
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Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>175
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>175
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Pro Gln
20 25 30
Ser Trp Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
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Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
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Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
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Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
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145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>176
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>176
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
20 25 30
Gly Pro Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>177
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>177
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
20 25 30
Thr Ala Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>178
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>178
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
20 25 30
Ser Thr Lys Phe Lys His Gln Leu Glu Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>179
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI变体
<400>179
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro His Gln
20 25 30
Ser Cys Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Arg Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Arg Tyr Gln Leu Ser
55 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
Claims (41)
1.一种I-CreI变体，其特征为两个I-CreI单体中的至少一个具有至少两个替换，所述替换各自位于LAGLIDADG核心结构域的两个功能性亚结构域之一中，所述亚结构域位于I-CreI的26到40位和44到77位，所述变体能够切割来自β-2-微球蛋白基因的DNA靶序列，并且所述变体可通过至少包括下述步骤的方法而获得：
(a)构建第一系列I-CreI变体，其在LAGLIDADG核心结构域的第一功能性亚结构域中具有至少一个替换，所述第一功能性亚结构域位于I-CreI的26到40位，
(b)构建第二系列I-CreI变体，其在LAGLIDADG核心结构域的第二功能性亚结构域中具有至少一个替换，所述第二功能性亚结构域位于I-CreI的44到77位，
(c)从步骤(a)的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变I-CreI位点的变体，在所述突变位点中，(i)I-CreI位点中-10到-8位的核苷酸三联体已被存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三联体所替换，且(ii)+8到+10位的核苷酸三联体已被存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三联体的反向互补序列所替换，
(d)从步骤(b)的第二系列中选择和/或筛选能够切割突变I-CreI位点的变体，在所述突变位点中，(i)I-CreI位点中-5到-3位的核苷酸三联体已被存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三联体所替换，且(ii)+3到+5位的核苷酸三联体已被存在于所述来自β-2-微球蛋白基因的DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三联体的反向互补序列所替换，
(e)从步骤(a)的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变I-CreI位点的变体，在所述突变位点中，(i)I-CreI位点中+8到+10位的核苷酸三联体已被存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三联体所替换，且(ii)-10到-8位的核苷酸三联体已被存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三联体的反向互补序列所替换，
(f)从步骤(b)的第二系列中选择和/或筛选能够切割突变I-CreI位点的变体，在所述突变位点中，(i)I-CreI位点中+3到+5位的核苷酸三联体已被存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三联体所替换，且(ii)-5到-3位的核苷酸三联体已被存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三联体的反向互补序列所替换，
(g)将来自步骤(c)和步骤(d)的两个变体中26到40位和44到77位的突变在单个变体中组合，以获得切割以下序列的新的同二聚体I-CreI变体，在所述序列中，(i)-10到-8位的核苷酸三联体与存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三联体相同，(ii)+8到+10位的核苷酸三联体与存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(iii)-5到-3位的核苷酸三联体与存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三联体相同，并且(iv)+3到+5位的核苷酸三联体与存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，和/或
(h)将来自步骤(e)和步骤(f)的两个变体中26到40位和44到77位的突变在单个变体中组合，以获得切割以下序列的新的同二聚体I-CreI变体，在所述序列中，(i)+3到+5位的核苷酸三联体与存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三联体相同，(ii)-5到-3位的核苷酸三联体与存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(iii)I-CreI位点中+8到+10位的核苷酸三联体已被存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三联体所替换，并且(iv)-10到-8位的核苷酸三联体与来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，
(i)将步骤(g)和(h)中所获得的变体相组合以形成异二聚体，以及
(j)选择和/或筛选来自步骤(i)的能够切割来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列的异二聚体。
2.权利要求1的变体，其中所述位于I-CreI中44到77位的亚结构域中的替换位于44、68、70、75和/或77位。
3.权利要求1的变体，其中所述位于I-CreI中26到40位的亚结构域中的替换位于26、28、30、32、33、38和/或40位。
4.权利要求1至3中任一项的变体，其包含I-CreI的137至143位中的一个或多个替换，所述替换改变了所述变体对所述I-CreI位点中±1至2、±6至7和/或±11至12位核苷酸的特异性。
5.权利要求1至4中任一项的变体，其包含完整I-CreI序列上的一个或多个替换，所述替换提高了所述变体对来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列的结合和/或切割特性。
6.权利要求1至5中任一项的变体，其中所述替换是用选自A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、W、L和V的氨基酸替代原始氨基酸。
7.权利要求1至6中任一项的变体，其为异二聚体，来自于在I-CreI的26至40位和44至77位具有不同突变的第一单体和第二单体的结合，所述异二聚体能切割来自β-2-微球蛋白基因的非回文DNA靶序列。
8.权利要求7的变体，其中所述第一单体和第二单体分别至少具有下列替换：
-Y33R，Q38A，Q44D，R68A，R70S，D75K，I77R和K28R，Y33A，Q38Y，S40Q，Q44A，R68Y，R70S，D75Y，I77K，
-S32T，Y33T，Q44T，R68Y，R70S，D75Y，I77V和Y33R，Q38A，Q44N，R68Q，R70S，D75S，I77V，
-S32G，Y33H，Q44A，R68Y，R70S，D75Y，I77K或S32A，Y33H，Q44A，R68Y，R70S，D75Y，I77K和N30Q，Y33G，Q38C，R68N，R70S，D75N，I77R，
-S32G，Y33H，Q44A，R68Y，R70S，D75Y，I77K和S32T，Q38S，Q44K，R70S，I77A，
-S32T，Y33T，Q44K，R68E，R70S，I77R和N30A，Y33T，Q44N，R68K，R70S，D75H，I77F，
-S32R，Y33D，Q44A，R70S，D75E，I77R和N30D，Y33R，Q44K，R68Y，R70S，D75N，I77Q，
-S32T，Q38W，Q44A，R70S，D75R，I77Y和Y33H，S40Q，Q44N，R70S，D75R，I77Y，
-Y33H，Q38G，Q44N，R68Y，R70S，D75R，I77V和N30A，Y33T，Q44N，R68Y，R70S，D75R，I77V，
-Y33T，S40N，Q44T，R68Y，R70S，D75R，I77V和K28R，Y33A，Q38Y，S40Q，Q44A，R68S，R70S，D75S，I77R，以及
-K28T，Y33R，S40R，Q44T，R70S，D75Y和N30D，Y33R，Q44N，R68Y，R70S，D75Y，I77Q。
9.权利要求8的变体，其中所述第一单体的序列是序列SEQ ID NO：24至28、126至134中的任一个，所述第二单体的序列是序列SEQ ID NO：37至77、135至179中的任一个。
10.权利要求1-9中任一项的变体，其中所述DNA靶序列来自人β-2-微球蛋白基因。
11.权利要求10的变体，其中所述DNA靶标选自序列SEQ ID NO：82至91。
12.权利要求7至11中任一项的变体，其为专性异二聚体，其中所述第一单体和第二单体还分别包含D137R突变和R51D突变。
13.权利要求7至12中任一项的变体，其为专性异二聚体，其中所述第一单体还包含K7R、E8R、E61R、K96R和L97F或者K7R、E8R、F54W、E61R、K96R和L97F突变，所述第二单体还包含K7E、F54G、L58M和K96E或者K7E、F54G、K57M和K96E突变。
14.单链嵌合型大范围核酸酶，其包含权利要求1至13中任一项的一个或两个变体的两个单体或核心结构域，或二者的组合。
15.权利要求14的单链大范围核酸酶，其包含由肽接头相连接的权利要求7、8、12和13中任一项定义的所述第一单体和第二单体。
16.多核苷酸片段，其编码权利要求1到13中任一项的变体或者权利要求14或15的单链嵌合型大范围核酸酶。
17.一种表达载体，其包含根据权利要求16的至少一个多核苷酸片段。
18.权利要求17的表达载体，其包含两个不同的多核苷酸片段，所述每个多核苷酸片段编码权利要求7、8、12和13中任一项的异二聚体变体的单体之一。
19.一种载体，其包括靶向构建体，所述靶向构建体包含待引入序列，如权利要求1、10和11中任一项所定义，所述待引入序列的两侧是与β-2-微球蛋白基因中存在的基因组DNA切割位点周围区域有同源性的序列。
20.权利要求17或权利要求18的载体，其包括靶向构建体，所述靶向构建体包含待引入序列，如权利要求1、10和11中任一项中所定义，所述待引入序列的两侧是与β-2-微球蛋白基因中存在的基因组DNA切割位点周围区域有同源性的序列。
21.权利要求19或权利要求20的载体，其中所述待引入序列是使β-2-微球蛋白基因失活的序列。
22.权利要求21的载体，其中所述使β-2-微球蛋白基因失活的序列以5’至3’的方向包含：第一转录终止序列以及包含启动子、标记物开放读码框和第二转录终止序列的标记物盒，并且所述序列中断所述编码序列的转录。
23.权利要求22的载体，其中所述基因组DNA切割位点是SEQ IDNO：82至90。
24.权利要求21的载体，其中所述使β-2-微球蛋白基因失活的序列包含标记物基因，从而允许破坏β-2-微球蛋白编码序列。
25.权利要求24的载体，其中所述使β-2-微球蛋白基因失活的序列包含外源目的基因，从而允许通过所述外源基因置换β-2-微球蛋白基因。
26.权利要求24或权利要求25的载体，其中所述基因组DNA切割位点是SEQ ID NO：89或90。
27.权利要求19至26中任一项的载体，其中所述与β-2-微球蛋白基因中存在的基因组DNA切割位点周围区域具有同源性的序列是包含选自下述位置序列的人β-2-微球蛋白基因片段：1164至1363、2795至2994、2803至3002、3074至3273、3275至3474、3284至3483、3387至3586、4099至4298、4765至4944和6451至6650。
28.权利要求24至26中任一项的载体，其中所述与β-2-微球蛋白基因中存在的基因组DNA切割位点周围区域具有同源性的序列是包含所述切割位点上游和下游序列的β-2-微球蛋白基因的片段，从而允许缺失紧邻所述切割位点两侧的编码序列。
29.一种组合物，其包含根据权利要求1到13中任一项的至少一种变体，根据权利要求14或权利要求15的一种单链嵌合型大范围核酸酶，和/或根据权利要求17到28中任一项的至少一种表达载体。
30.权利要求29的组合物，其包含有使β-2-微球蛋白基因失活之序列的靶向DNA构建体，如权利要求21-28中任一项所限定的，该序列的两侧是与所述变体的基因组DNA靶标切割位点周围的区域有同源性的序列。
31.根据权利要求1至13中任一项的至少一种变体、根据权利要求14或权利要求15的一种单链嵌合大范围核酸酶、和/或根据权利要求17至28中任一项的一种表达载体在制备用于在从供体个体向有此需要的受体个体进行细胞移植期间预防、改善或治疗异体移植排斥的药物中的用途。
32.权利要求31的用途，其中所述移植是肾、胰脏、肌肉或心脏细胞移植。
33.根据权利要求1至13中任一项的至少一种变体，根据权利要求14或权利要求15的一种单链嵌合型大范围核酸酶，和/或根据权利要求17至28中任一项的一种表达载体在制备用于在有此需要的个体中预防、改善或治疗与β-2-微球蛋白的纤丝构象相关之病症的药物中的用途。
34.经权利要求16的多核苷酸或权利要求17到28中任一项的载体修饰的宿主细胞。
35.包含根据权利要求16或权利要求18中所定义的一个或两个多核苷酸片段的非人转基因动物。
36.包含根据权利要求16或权利要求18中所定义的一个或两个多核苷酸片段的转基因植物。
37.根据权利要求1到13中任一项的至少一种变体、根据权利要求14或权利要求15的一种单链嵌合型大范围核酸酶、根据权利要求17到28中任一项的一种载体用于基因组工程的非治疗目的的用途。
38.权利要求36的用途，其中所述变体、单链嵌合型大范围核酸酶或载体与权利要求19到28中任一项所定义的靶向DNA构建体相关联。
39.权利要求38的用途，其中所述靶向DNA构建体包含外源目的基因，并最终包含标记物基因，其两侧是β-2-微球蛋白基因座上游和下游的序列，使得β-2-微球蛋白基因被该外源目的基因所替换。
40.权利要求37至39中任一项的用途，用于制备表达异源目的蛋白的转基因动物或重组细胞系。
41.权利要求40的用途，其中所述重组细胞系是人重组细胞系。
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