CN101970649B

CN101970649B - 新的衍生自I-CreI的单链大范围核酸酶及其用途

Info

Publication number: CN101970649B
Application number: CN200980109080.1A
Authority: CN
Inventors: 西尔韦斯特·格里佐
Original assignee: Cellectis SA
Current assignee: Cellectis SA
Priority date: 2008-01-31
Filing date: 2009-02-02
Publication date: 2014-02-12
Anticipated expiration: 2029-02-02
Also published as: US8927247B2; WO2009095742A1; AU2009208732A1; US20110179506A1; CN101970649A; EP2245147A1; JP2011514144A; WO2009095793A1; CA2729124A1

Abstract

一种新的衍生自I-CreI的单链大范围核酸酶，其包含两个结构域，每个结构域各包含亲本I-CreI单体的一部分，其至少从I-CreI中第一个α螺旋的起点延伸到C端环的末端，所述两个结构域由肽接头连接，这个肽接头可使这两个结构域通过折叠形成I-CreI二聚体，其能够结合并切割嵌合DNA靶标，该嵌合DNA靶标包含亲本同二聚体I-CreI大范围核酸酶靶序列中各自不同的一半。衍生自I-CreI的单链大范围核酸酶用于基因工程、基因治疗以及抗病毒治疗的用途。

Description

新的衍生自I-CreI的单链大范围核酸酶及其用途

技术领域

本发明涉及新的衍生自I-CreI的单链大范围核酸酶，涉及编码所述新的衍生自I-CreI的单链大范围核酸酶的载体，涉及经所述载体修饰的细胞、动物或者植物，并涉及所述衍生自I-CreI的单链大范围核酸酶及其衍生产物在基因工程、基因治疗和抗病毒治疗中的用途。

在对给定遗传位点进行基因工程改造的所有方法中，已经开始使用稀少切割DNA的内切酶(如大范围核酸酶)作为非常有效的工具，通过产生DNA双链断裂(double strand break，DSB)来提高同源基因靶向。大范围核酸酶识别大的序列(＞12bp)，因此可在不影响整个基因组完整性的情况下对对应位点进行切割。归巢内切核酸酶(即天然大范围核酸酶)组成了若干大的蛋白质家族，这些蛋白质由可动内含子或蛋白内含子编码。归巢内切核酸酶的靶序列通常是在缺少该内含子或蛋白内含子的同源等位基因内，切割通过DSB诱导的同源重组机制来促使可动元件转移到断裂的序列中。I-SceI是第一个用于刺激同源重组反应的归巢内切核酸酶，使哺乳动物细胞基因靶点的重组反应提高了1000倍以上(Choulika等，Mol.Cell.Biol.，1995，15，1968-1973；Cohen-Tannoudji等，Mol.Cell.Biol.，1998，18，1444-1448；Donoho等，Mol.Cell.Biol.，1998，18，4070-4078；Alwin等，Mol.Ther.，2005，12，610-617；Porteus，M.H.，Mol.Ther.2006，13，438-446；Rouet等，Mol.Cell.Biol.，1994，14，8096-8106)。最近，I-SceI还被用于在体内刺激小鼠肝脏内的定向重组，并且可在高达1％的肝细胞中观察到重组的发生(Gouble等，J.Gene Med.，2006，8，616-22)。

但是，这种方法的固有缺陷是需要事先在目标位点中引入天然切割位点。为了克服这个缺陷，在过去的数年中为了获得具有定制的切割特异性的内切核酸酶，进行了大量的工作。这些蛋白质可用于切割天然染色体序列，这为基因工程的广泛应用打开了新的篇章。例如，大范围核酸酶可用于诱导对那些与单基因遗传病有关的突变的校正，并且避免了由于采用目前的基因治疗方法导致转基因随机插入而产生的风险 (Hacein-Bey-Abina等，Science，2003，302，415-419)。

将锌指蛋白(ZFP)与FokI酶(一种IIS类限制性内切核酸酶)的催化结构域进行融合，来制备功能性序列特异性内切核酸酶(Smith等，Nucleic Acids Res.，1999，27，674-681；Bibikova等，Mol.Cell.Biol.，2001，21，289-297；Bibikova等，Genetics，2002，161，1169-1175；Bibikova等，Science，2003，300，764；Porteus，M.H.and D.Baltimore，Science，2003，300，763-；Alwin等，Mol.Ther.，2005，12，610-617；Urnov等，Nature，2005，435，646-651；Porteus，M.H.，Mol.Ther.，2006，13，438-446)。最近，这样的核酸酶被用于改造来自淋巴谱系的人细胞中的ILR2G基因(Urnov等，Nature，2005，435，646-651)。

Cys2-His2型锌指蛋白的结合特异性易于操作，这可能是因为它们代表了简单(特异性基本上由每个锌指上的四个残基决定)且模块化的系统(Pabo等，Annu.Rev.Biochem.，2001，70，313-340；Jamieson等，Nat.Rev.Drug Discov.，2003，2，361-368)。来自Pabo实验室(Rebar，E.J.和C.O.Pabo，Science，1994，263，671-673；Kim，J.S.and C.O.Pabo，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，2812-2817)、Klug实验室(Choo，Y.和A.Klug，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，91，11163-11167；Isalan M.和A.Klug，Nat.Biotechnol.，2001，19，656-660)和Barbas实验室(Choo，Y.和A.Klug，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，91，11163-11167；Isalan M.和A.Klug，Nat.Biotechnol.，2001，19，656-660)的研究得到了能够结合大多数G/ANNG/ANNG/ANN序列的大量新人工ZFP。

但ZFP也有其局限性，尤其是对于需要极高特异性水平的应用(如治疗应用)而言。融合后的FokI核酸酶以二聚体形式发挥其活性，但是最近的研究发现，在两个单体之一与DNA结合后，或者两个单体与两个远离的DNA序列结合后，FokI核酸酶也可以切割DNA(Catto等，Nucleic Acids Res.，2006，34，1711-1720)。因此，特异性可能是高度简并性的，如在哺乳动物细胞(Porteus，M.H.and D.Baltimore，Science，2003，300，763)和果蝇(Bibikova等，Genetics，2002，161，1169-1175；Bibikova等，Science，2003，300，764-)中的毒性所示。

鉴于其精准的特异性，归巢内切核酸酶可以作为改造定制内切核酸酶的理想骨架。一些研究已经发现，可对LAGLIDADG蛋白(分布最广的归巢内切核酸酶)的DNA结合结构域(Chevalier，B.S.and Stoddard B.L.，Nucleic Acids Res.2001；29：3757-74)进行改造。LAGLIDADG是指整个家族中惟一真正保守的序列，其在蛋白中以一个或多个拷贝(通常为两个拷贝)存在(Lucas等，Nucleic Acids Res.，29：960-969)。含有单个基序的蛋白质(例如I-CreI(蛋白数据库(Protein Data Bank)编号1G9Y)和I-MsoI)形成同二聚体，并对具有回文或假性回文的DNA序列进行切割；而更大的双基序蛋白质(例如I-SceI和I-DmoI)是单体，并对非回文结构的DNA序列进行切割。目前已经对几种不同的LAGLIDADG蛋白进行了结晶，与在一级序列水平不具有相似性相比，它们的蛋白核心结构非常保守(Jurica等，Mol.Cell.，1998；2：469-476；Chevalier等，Nat.Struct.Biol.2001；8：312-316；Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003，329：253-69；Moure等，J.Mol.Biol.，2003，334：685-695；Moure等，J.Mol.Biol.，2003，334，685-695；Moure等，Nat Struct.Biol.，2002，9：764-770；Ichiyanagi等，J.Mol.Biol.，2000，300：889-901；Duan等，Cell，1997，89：555-564：Bolduc等，Genes Dev.，2003，17：2875-2888；Silva等，J.Mol.Biol.，1999，286：1123-1136)。在这个核心结构中，由两个单体构成(或在双LAGLIDADG蛋白中由两个结构域构成)的两个特征性αββαββα折叠通过二重对称彼此相对。DNA结合依赖于每个结构域上的四个β链，它们通过折叠成反向平行的β-片层，并且在DNA螺旋的大沟上形成鞍。催化核心位于中心，两个对称单体/结构域对其均有贡献。除了这个核心结构外，还有其他结构域：比如PI-SceI(蛋白内含子，含有蛋白剪接结构域和额外的DNA结合结构域)(Moure等，Nat Struct.Biol.，2002，9：764-70；Grindl等，Nucleic Acids Res.1998，26：1857-1862)。每个I-CreI单体包含一个由三个螺旋(alpha4(α₄)、alpha5(α₅)、和alpha6(α₆))和位于α₅螺旋和α₆螺旋之间的环构成的C端亚结构域(C端环；见图1)，这是位点识别、DNA结合和切割的关键(Prieto等，Nucleic Acids Res.，2007，35：3267-3271)。

一些LAGLIDAG蛋白，包括PI-SceI(Gimble等，J.Mol.Biol.，2003，334：993-1008)、I-CreI(Seligman等，Nucleic Acids Res，2002，30：3870-3879；Sussman等，J.Mol.Biol.，2004，342：31-41；国际PCT申请WO 2006/097784，WO 2006/097853，WO 2007/060495和WO 2007/049156；Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458；Rosen等，Nucleic Acids Res.，2006，34， 4791-4800；Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149)、I-SceI(Doyon等，J Am Chem Soc.，2006，128：2477-2484)和I-MsoI(Ashworth等，Nature，2006，441：656-659)，可通过推理或半推理性诱变和筛选来进行修饰，以获得新的结合或切割特异性。

另一策略是通过在I-CreI和I-DmoI之间进行结构域交换来获得新的大范围核酸酶，从而获得可切割杂合序列的大范围核酸酶，这个杂合序列对应于两种半亲本靶序列的融合物(Epinat等，Nucleic Acids Res.，2003，31：2952-2962；Chevalier等，Mol.Cell.2002，10：895-905；国际PCT申请WO 03/078619和WO 2004/031346)。

最近，通过半推理设计辅以高通量筛选方法从I-CreI中获得了成千上万的新蛋白(Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149；Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458；国际PCT申请WO 2006/097784，WO 2006/097853，WO 2007/060495和WO 2007/049156)。在这种方法中，在检测蛋白/DNA共结晶的结构后，挑选出有限的蛋白残基组并且随机化。结合高通量筛选(HTS)技术，这种方法可以快速地鉴别出成百上千的特异性被修饰的归巢内切核酸酶衍生物。

此外，那些足够独立而可用于进行组合突变的DNA结合亚结构域也被鉴别出来(Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149；国际PCT申请WO 2007/049095和WO 2007/057781)。这些发现使得可以产生切割选定的DNA靶序列的第二代改造的I-CreI衍生物。这种组合策略已通过产生切割人RAG1基因和XPC基因中天然DNA靶序列的大范围核酸酶而得以证实(Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149；Arnould等，J.Mol.Biol.，2007，371：49-65；国际PCT申请WO 2007/093836，WO 2007/093918和WO 2008/010093)。

切割来自人RAG1基因或XPC基因的天然DNA靶序列的改造大范围核酸酶是异二聚体，其包含两个分别改造的单体，其各与靶序列的一半结合。异二聚体的形成是通过在同一细胞中共表达两种单体来实现的(Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149)。这种两个单体的共表达导致形成了三种分子种类：异二聚体(切割目的靶序列)和两种同二聚体(被认为是副产物)(Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458；国际PCT申请WO 2006/097854和WO 2007/057781；Smith等，Nucleic Acids Res.，2006， 34，e149)。但是，有时同二聚体个体可能导致高水平的毒性(Bibikova等，Genetics，2002，161，1169-1175；Beumer等，Genetics，2006，172，2391-2403)。因此，单LAGLIDADG归巢内切核酸酶(例如I-CreI)的广泛使用还存在一个限制因素，那就是这些蛋白是同二聚体。要解决这个问题有两种可能：对二聚化界面进行重新设计产生专性异二聚体，来抑制功能性同二聚体的形成；或者通过蛋白连接或接头将两个单体融合成单链分子，从而促进不同αββαββα折叠的分子间(而不是分子内)相互作用。后一种方法在载体化方面还有额外的优势，因为只需要将一种编码序列或蛋白引入到细胞核中。这样就可避免使用两种不同载体或者双顺反子载体。值得注意的是，至少在理论上，单链分子不一定会避免来自不同分子的αββαββα折叠的相互作用(尤其在接头长并具有柔性的情况下)，但是至少有利于来自同一分子的αββαββα折叠发生相互作用。此外，制备单链分子和重新设计二聚化界面也不是排他性的策略，而是可以联合使用。

I-CreI单链形式(scI-CreI)的制备已经被验证过了(Epinat等，Nucleic Acids Res.，2003，3：2952-2962；国际PCT申请WO 03/078619)。在这种第一形式中，单链大范围核酸酶的N端结构域(I-CreI氨基酸序列的1～93位)主要由I-CreI单体的αββαββα折叠组成(核心结构域)，而C端(I-CreI氨基酸序列的8～163位)是一个几乎完整的I-CreI单体。接头(MLERIRLFNMR，SEQ ID NO：1)来自连接I-DmoI两个结构域的环。

尽管该第一scI-CreI是功能性的大范围核酸酶，但其稳定性低于I-CreI，这可能是因为其折叠与I-CreI相比不是最佳的。该第一scI-CreI的设计符合双LAGLIDADG内切核酸酶的结构，因此与I-CreI的区别在于N端结构域比C端结构域短，而且缺少可存在于某些双LAGLIDADG内切核酸酶C端结构域中的由三个α螺旋构成的C端亚结构域。

既然最近的研究显示了I-CreI中C端亚结构域在蛋白DNA结合特性和DNA靶标切割活性方面起着重要的作用(Prieto等，Nucleic Acids Res.，2007，35：3267-3271)，那么从该第一单体中移除三个C端螺旋，可能会对该第一scI-CreI的折叠、稳定性产生影响，并因此对其活性产生影响。

但是，这三个C端螺旋在I-CreI二聚体结构的相反一侧终止，远离含LAGLIDADG基序的N端螺旋(图1)。连接一个结构域的C端残基与另一结构域的N端残基的柔性接头(末端-末端融合)的长度会很长。此外，由于必须要跨过这个蛋白表面的很大一部分区域，因此构建这样的接头是十分困难的。而且不能确定是否可获得正确的堆叠。

在此，发明人提出了设计来自I-CreI同二聚体大范围核酸酶的单链分子的新方法。这种策略保留了核心的αββαββα(也称为α₁β₁β₂α₂β₃β₄α₃)折叠和两个所连接I-CreI单元的C端部分。

这种设计在提高效率的同时，很大程度地降低了脱靶切割和毒性。这种单链分子的结构和稳定性与异二聚体变体非常相似，并且这种分子表现为在溶液中以单体形式存在。而且，所得蛋白在活细胞中在人细胞的内源性位点(SCID基因)上启动高效的同源基因靶向(百分数水平)，同时更有效地防止潜在的遗传毒性。在所有方面中，该单链分子的性能与I-CreI(在特异性方面被认为是金标准的单体归巢内切核酸酶)一样好。这些特性使得这种新一代大范围核酸酶成为基因组外科手术策略最好的分子剪刀之一，同时使得对单基因疾病(例如重度联合免疫缺陷(SCID))的基因校正治疗变得更容易，而同时有可能避免以前基因治疗方法存在的恶化效应。

本发明的一个主题是单链I-CreI大范围核酸酶(scI-CreI)，其包含由肽接头连接的两个结构域(N端和C端)，其中：

(a)来自亲本I-CreI单体的每个结构域含有所述亲本I-CreI单体的一部分，至少从I-CreI中第一个α螺旋(α₁)的起点延伸到C端环的末端，并依次包含：α₁β₁β₂α₂β₃β₄α₃核心结构域、α₄螺旋和α₅螺旋以及I-CreI的C端环，并且

(b)这两个结构域通过肽接头连接在一起，该肽接头使得所述两个结构域可折叠形成I-CreI二聚体，其能够结合并切割嵌合DNA靶标，该嵌合DNA靶标包含每种亲本同二聚体I-CreI大范围核酸酶靶序列中各自不同的一半。

定义

-多肽序列中的氨基酸残基在本文中根据单字母代码命名，其中例如Q表示Gln或谷氨酰胺残基，R表示Arg或精氨酸残基，D表示Asp或天冬氨酸残基。

-核苷酸表示如下：单字母代码用于表示核苷的碱基：a是腺嘌呤，t是胸腺嘧啶，c是胞嘧啶，g是鸟嘌呤。对于简并核苷酸而言，r代表g或a(嘌呤核苷酸)，k代表g或t，s代表g或c，w代表a或t，m代表a或c，y代表t或c(嘧啶核苷酸)，d代表g、a或t，v代表g、a或c，b代表g、t或c，h代表a、t或c，和n代表g、a、t或c。

-“大范围核酸酶”是指具有12～45bp双链DNA靶序列的内切核酸酶。所述大范围核酸酶是二聚体酶(其中各结构域位于单体上)或是单体酶(在单个多肽上包含两个结构域)。所述大范围核酸酶可来自于LAGLIDADG归巢内切核酸酶，例如I-CreI。

-“大范围核酸酶结构域”或者“结构域”是指这样的区域，其与大范围核酸酶DNA靶标的一半相互作用，并能够与同一大范围核酸酶的另一结构域结合，形成能够切割所述DNA靶标的功能性大范围核酸酶，所述另一结构域与所述DNA靶标的另一半相互作用。

-“单链大范围核酸酶”是指包含通过肽间隔区连接在一起的两个LAGLIDADG归巢内切核酸酶结构域的大范围核酸酶。单链大范围核酸酶能够切割嵌合DNA靶序列，该嵌合DNA靶序列含两个亲本大范围核酸酶靶序列不同的一半。单链大范围核酸酶又被称为单链衍生物、单链大范围核酸酶、单链大范围核酸酶衍生物或嵌合大范围核酸酶。

-“核心结构域”是指“LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域”，它是LAGLIDADG家族归巢内切核酸酶的特征性α₁β₁β₂α₂β₃β₄α₃折叠，对应于约一百个氨基酸残基的序列。所述核心结构域包含折叠成反向平行β-片层的四条β链(β₁β₂β₃β₄)，所述β-片层与DNA靶标的一半相互作用。该核心结构域能够与另一LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域结合，形成能够切割所述DNA靶标的功能性内切核酸酶，所述另一结构域与所述DNA靶标的另一半相互作用。例如，在二聚体归巢内切核酸酶I-CreI(163个氨基酸)的情形中，核心结构域包含I-CreI的6～94位残基。

-“β-发夹”是指LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域反向平行β-片层的两条连续β-链(β₁β₂或β₃β₄)，其通过环或转角相连。

-“亚结构域”是指LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域中的区域，其与归巢内切核酸酶DNA靶标半位点的不同部分相互作用。

-“大范围核酸酶变体”或“变体”是指通过将野生型大范围核酸酶(天然大范围核酸酶)氨基酸序列中的至少一个残基替换为不同氨基酸而获得的大范围核酸酶。

-“功能性变体”是指能够切割DNA靶序列的变体，优选地，所述靶标是不被亲本大范围核酸酶切割的新靶标。例如，这样的变体在接触DNA靶序列的位置或与所述DNA靶标直接或间接相互作用的位置上具有氨基酸改变。

-“具有新特异性的大范围核酸酶变体”是指具有与其亲本大范围核酸酶不同的靶标切割模式的变体。等价且无差异的术语“新特异性”、“经修饰的特异性”、“新切割特异性”、“新底物特异性”是指变体针对DNA靶序列中核苷酸的特异性。

-“I-CreI”是指野生型I-CreI(蛋白数据库编号1g9y)，对应于序列表中的序列SEQ ID NO：20。

-“亲本I-CreI单体”或者“I-CreI单体”是指全长野生型I-CreI氨基酸序列SEQ ID NO：20(163个氨基酸)，或其在SEQ ID NO：20中含有氨基酸替换的功能性变体。由两个I-CreI单体组成的I-CreI以二聚体形式发挥作用。

-“所述亲本I-CreI单体的一部分，其至少从I-CreI中第一个α螺旋的起点延伸到C端环的末端，并依次包含：α ₁ β ₁ β ₂ α ₂ β ₃ β ₄ α ₃ 核心结构域、α ₄ 螺旋和α ₅ 螺旋以及I-CreI的C端环”是指对应于I-CreI至少8-143位的氨基酸序列。

-“I-CreI位点”是指被I-CreI切割的22-24bp双链DNA序列。I-CreI位点包括野生型(天然)非回文序列I-CreI归巢位点和衍生的回文序列，例如序列5’-c_-11a_-10a_-9a_-8a_-7c_-6g_-5t_-4c_-3g_-2t_-1a₊₁c₊₂g₊₃a₊₄c₊₅g₊₆t₊₇t₊₈t₊₉t₊₁₀g₊₁₁，也称为C1221(SEQ ID NO：21，图3)。

-“DNA靶标”、“DNA靶序列”、“靶序列”、“靶位点”、“靶标”、“位点”、“目的位点”、“识别位点”、“识别序列”、“归巢识别位点”、“归巢位点”、“切割位点”是指被LAGLIDADG归巢内切核酸酶(例如I-CreI，或者衍生自I-CreI的变体或单链嵌合大范围核酸酶)识别并切割的20～24bp双链回文、部分回文(假回文)或非回文的多核苷酸序列。这些术语是指要通过大范围核酸酶引入双链断裂(切割)的独特DNA位置(优选基因组位置)。DNA靶标通过双链多核苷酸中一条链的5′→3′序列来定义，如上文针对C1221所示的。DNA靶标的切割分别发生在有义链和反义链+2和-2位的核苷酸处。除非另有指明，否则DNA靶标被I-CreI大范围核酸酶变体或单链衍生物切割的位置对应于DNA靶标有义链上的切割位点。

-“DNA靶标半位点”、“半切割位点”或“半位点”是指DNA靶标中与各个LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域结合的部分。

-“嵌合DNA靶标”或“杂合DNA靶标”是指两个亲本大范围核酸酶靶序列不同的一半的融合物。另外，所述靶标的至少一半可包含与至少两个独立的亚结构域结合的核苷酸组合(组合DNA靶标)。

-“包含各亲本同二聚体I-CreI大范围核酸酶靶序列中不同的一半的嵌合DNA靶标”是指这样的靶序列，其包含回文靶序列的左侧部分和右侧部分，所述回文靶序列的左侧部分被由一个亲本单体的两个相同单体构成的同二聚体大范围核酸酶切割，所述回文靶序列的右侧部分可被由另一亲本单体的两个相同单体构成的另一同二聚体大范围核酸酶切割。

-“载体”是指能够转运与之连接的另一核酸的核酸分子。

-“同源”是指一条序列与另一序列具有足够导致序列间同源重组的同一性，更特别地具有至少95％的同一性，优选97％的同一性，更优选99％的同一性。

-“同一性”是指两种核酸分子或多肽之间的序列同一性。可通过比较各序列中可为比较目的而比对的位置来测定同一性。当所比较序列中的一个位置被相同的碱基占据时，则这些分子在该位置上是相同的。核酸或氨基酸序列之间的相似性或同一性程度是核酸序列间共有的位置上相同或匹配的核苷酸数的函数。可使用多种比对算法和/或程序来计算两条序列之间的同一性，包括FASTA或BLAST，它们可作为GCG序列分析包(University of Wisconsin，Madison，Wis.)的一部分获得，并可以例如默认设置使用。

-“个体”包括哺乳动物，以及其他脊椎动物(例如鸟类、鱼类和爬行动物)。本文使用的术语“哺乳动物”是指任何这样的脊椎动物(包括单孔类、有袋类和胎盘动物)，它们对其幼仔哺乳，并且分娩活的幼仔(真哺乳亚纲(eutharian)或胎生哺乳动物)或者卵生(后兽亚纲(metatharian)或非胎生哺乳动物)。哺乳动物物种的实例包括人和其他灵长类(例如猴、黑猩猩)、啮齿类(例如大鼠、小鼠、豚鼠)和其他(例如牛、猪和马)。

-“突变”是指在多核苷酸(cDNA、基因)或多肽序列中替换、缺失、插入一个或多个核苷酸/氨基酸。所述突变可影响基因的编码序列或其调节序列。其还可影响基因组序列的结构或所编码mRNA的结构/稳定性。

-“位点特异性突变”是指核酸序列上某个特定核苷酸/密码子的突变，而不是随机突变。

本发明的单链I-CreI大范围核酸酶也称为scI-CreI大范围核酸酶或sc-I-CreI.

根据本发明，将接头序列选择成允许sc-I-CreI的两个结构域折叠成I-CreI二聚体，并且结合和切割嵌合DNA靶标，该嵌合DNA靶标包含各亲本同二聚体I-CreI大范围核酸酶靶序列中不同的一半。

I-CreI二聚体的形成可以通过所熟知的实验(例如用分析性离心进行的沉降平衡实验)进行测定，详细情况见Prieto等，Nucleic Acids Research，2007，35，3267-3271。

DNA的结合可以通过所熟知的实验(例如Prieto等，Nucleic Acids Research，2007，35，3267-3271介绍的电泳迁移率变动测定(EMSA))来进行测定。

本发明单链大范围核酸酶的切割活性可以通过所熟知的任何体外或体内切割测定进行测量，例如在国际PCT申请WO 2004/067736；Epinat等，Nucleic Acids Res，2003，31：2952-2962；Chames等，Nucleic Acids Res.，2005，33，e178；Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458；Arnould等，J.Mol.Biol.，Epub 10 May 2007中介绍的。

例如，本发明单链大范围核酸酶的切割活性可在酵母或哺乳动物细胞中通过使用报告载体的同向重复重组测定来测量，与对应的来自相同亲本I-CreI单体的异二聚体大范围核酸酶或另一单链大范围核酸酶进行比较。报告载体在克隆到酵母或哺乳动物表达载体中的间插序列中包含报告基因的两个截短的非功能性拷贝(同向重复)以及基因组(非回文)DNA靶序列，其包含各(回文或假性回文)亲本同二聚体I-CreI大范围核酸酶靶序列中不同的一半。大范围核酸酶的表达导致基因组嵌合DNA靶序列被切割。这种切割诱导同向重复之间的同源重组，得到功能性报告基因(比如LacZ)，可通过适当的测定来监测其表达。此外，通过在哺乳动物细胞中进行染色体测定，可将单链大范围核酸酶对其基因组DNA靶标的活性与I-CreI对同一基因组位点中I-CreI位点的活性进行比较(Arnould等，J.Mol.Biol.，2007年5月10日电子公开)。此外，单链大范围核酸酶的切割特异性可以通过比较嵌合DNA靶序列的切割情况与亲本I-CreI同二聚体大范围核酸酶对两种回文序列的切割情况来获得。

Sc-I-CreI两个结构域的N端序列可起始于I-CreI的1、2、3、4、5、6或8位。在一个优选实施方案中，N端结构域起始于I-CreI的1或6位，C端结构域起始于I-CreI的2或6位。

两个结构域的C端序列在C端环后即终止，例如I-CreI的143或145位。或者，结构域的C端序列还包括至少α₆螺旋(I-CreI的145～150位)，并且最终包含额外的C端残基。在这种情况下，结构域的C端序列在I-CreI的150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162或163位终止。优选在152～160位终止。例如在152、156、160或163位。在一个优选实施方案中，N端结构域在I-CreI的163位终止。更优选地，两个结构域都在I-CreI的163位终止。

在sc-I-CreI大范围核酸酶的另一个优选的实施方案中，接头包含由10～100个(优选15～50个氨基酸，更优选20～35个氨基酸，更优选25～35个氨基酸)连续氨基酸组成的线性序列，或由其组成。预计接头的序列会形成一个螺旋，可以是α螺旋(用SOPMA，即带比对的自优化预测方法进行预测，Geourjon和Deléage，1995)或者II型聚脯氨酸螺旋。这种聚脯氨酸螺旋的实例以SEQ ID NO：15或16(表1)为代表。更优选地，接头包含α螺旋。接头有利地选自包含SEQ ID NO：2-19或者由其组成的序列。优选地，其选自SEQ ID NO：2-12和14-19的序列。优选地，其选自SEQ ID NO：2-12和14-19的序列。更优选地，所述接头选自序列2、4-8、11、16、18和19。甚至更优选地，所述接头由SEQ ID NO：2的序列组成。

本发明的单链I-CreI大范围核酸酶可衍生自野生型I-CreI单体或其功能性变体。此外，在亲本单体的NH₂端和/或COOH端插入了一个或多个残基。还可在亲本单体的5’端或3’端添加额外的密码子，以引入限制性酶切位点，以便克隆到不同的载体中。所述序列的一个实例是在SEQ ID NO：23中含有丙氨酸残基(A)(被插入到第一个甲硫氨酸残基之后)，丙氨酸和天冬氨酸残基(AD)(被插入到C端脯氨酸残基之后)。这些序列使DNA编码序列包含了NcoI(ccatg)和EagI(cggccg)限制性酶切位点，可被克隆到不同载体中。例如，还可在N端结构域的NH₂末端和/或C端结构域的COOH末端引入一个标签(抗原决定簇或者多聚组氨酸序列)；所述标签可用于检测和/或纯化所述sc-I-CreI大范围核酸酶。

优选地，sc-I-CreI大范围核酸酶衍生自异二聚体I-CreI变体的单体，更优选地，衍生自具有如上文所述新切割特异性的变体(Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458；Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149；Arnould等，J.Mol.Biol.，Epub 10May 2007；国际PCT申请WO2006/097784，WO 2006/097853，WO 2007/049095，WO 2007/057781，WO2007/060495，WO 2007/049156，WO 2007/093836和WO 2007/093918)。

因此，单链I-CreI大范围核酸酶的结构域可在接触DNA靶序列或者与DNA骨架或与核苷酸碱基相互作用(直接或通过水分子)的I-CreI氨基酸残基位置处含有突变，这些残基是该技术领域所熟知的(Jurica等，Molecular Cell.，1998，2，469-476；Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003，329：253-269)。优选地，所述突变改变了大范围核酸酶的切割特异性，产生了具有新特异性的大范围核酸酶，该大范围核酸酶可以切割来自目的基因的DNA靶标。更优选地，所述突变是第一功能性亚结构域(对应于I-CreI氨基酸序列的26～40位)中一个或多个氨基酸的替换，其改变对DNA靶标±8～10位核苷酸的特异性；和/或第二功能性亚结构域(对应于I-CreI氨基酸序的44～77位)中的替换，其改变对DNA靶标±3～5位核苷酸的特异性，这在以前有过介绍(国际PCT申请2006/097784，WO 2006/097853，WO2007/060495，WO 2007/049156，WO 2007/049095和WO 2007/057781； Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458；Smith等，Nucleic Acids Res.，2006)。替换有利地对应于I-CreI氨基酸序列的26、28、30、32、33、38和/或40位、44、68、70、75、和/或77位。对于切割n-4是t或n+4是a的DNA靶标，所述I-CreI结构域有利地在44位为谷氨酰胺(Q)；对于切割n-4是a或n+4是t的DNA靶标，所述结构域的44位为丙氨酸(A)或天冬酰胺；对于切割n-9是g或n+9是c的DNA靶标，所述结构域的38位有利地为精氨酸(R)或赖氨酸(K)。

根据所述scI-CreI大范围核酸酶的另一个优选的实施方案，至少一个结构域在I-CreI的26～40位和/或44～77位具有突变，所述scI-CreI大范围核酸酶能切割非回文DNA序列，其中所述DNA序列中至少+3～+5、+8～+10、-10～-8和-5～-3位的核苷酸对应于来自目的基因的DNA靶标中+3～+5、+8～+10、-10～-8和-5～-3位的核苷酸。优选地，scI-CreI大范围核酸酶的两个结构域都在26～40位和/或44～77位中有突变。更优选地，两个结构域在I-CreI的26～40位和/或44～77位中有不同的突变。

在所述scI-CreI大范围核酸酶的另一个优选的实施方案中，至少一个结构域在I-CreI中与DNA靶序列相互作用的其他氨基酸残基处有一个或多个突变。特别地，可在与磷酸酯骨架接触的位置引入额外的替换，例如最后的C端环中(137～143位；Prieto等，Nucleic Acids Res.2007，35，3262-3271)。优选地，所述残基参与所述DNA切割位点的结合和切割。更优选地，所述残基在I-CreI的138、139、142或143位。可在同一结构域中突变两个残基，只要每个突变在选自138和139位残基对以及142和143位残基对的不同残基对中即可。所引入的突变改变了所述最后的C端环中的氨基酸与I-CreI位点磷酸酯骨架的相互作用。优选地，138或139位的残基被疏水性氨基酸替换，以免与DNA切割位点的磷酸酯骨架形成氢键。例如，138位的残基被丙氨酸替换或者139位的残基被甲硫氨酸替换。有利地，142或143位的残基被小氨基酸(例如甘氨酸)替换，以减少这些氨基酸残基侧链的大小。更优选地，所述最后的C端环中的替换改变了scI-CreI大范围核酸酶对I-CreI的±1～2位、±6～7位和/或±11～12位核苷酸的特异性。

在所述scI-CreI大范围核酸酶的另一个优选的实施方案中，至少一个结构域包含一个或多个额外突变，所述突变提高了结合和/或切割特性，包括scI-CreI大范围核酸酶对来自目的基因的DNA靶序列的切割活性和/或特异性。所述额外的突变残基可能位于整个I-CreI序列中。

根据所述scI-CreI大范围核酸酶的一个更优选的实施方案，所述额外突变减少由scI-CreI大范围核酸酶结构域形成功能性同二聚体。

每个亲本单体最少具有二聚化界面的两个残基Z和Z’，其分别与同一亲本单体或另一亲本单体中的残基Z’和Z相互作用(两对相互作用残基ZZ’)，形成两种同二聚体和一种异二聚体。根据本发明，二聚化界面的两对相互作用残基中的一对被互换，以获得具有两个残基Z或Z’的第一结构域和具有两个残基Z’或Z的第二结构域。这样，各含有两个残基Z或两个残基Z’的第一结构域和第二结构域比其亲本配对残基更不容易形成同二聚体(scI-CreI结构域内部的相互作用)，而scI-CreI两个结构域界面的两对相互作用残基ZZ’则更容易形成异二聚体(scI-CreI结构域之间的相互作用)。

因此，scI-CreI大范围核酸酶的结构域有利地分别在第一结构域(N端或C端结构域)和第二结构域(C端或N端结构域)中含有至少一对以下突变：

a)用碱性氨基酸(优选精氨酸)替换第8位的谷氨酸(第一结构域)，并用酸性氨基酸(优选谷氨酸)替换第7位的赖氨酸(第二结构域)；第一结构域还可包含用精氨酸替换第7和96位的至少一个赖氨酸残基。

b)用碱性氨基酸(优选精氨酸)替换第61位的谷氨酸(第一结构域)，并用酸性氨基酸(优选谷氨酸)替换第96位的赖氨酸(第二结构域)；第一结构域还可包含用精氨酸替换第7和96位的至少一个赖氨酸残基。

c)用芳香族氨基酸(优选苯丙氨酸)替换第97位的亮氨酸(第一结构域)，并用小氨基酸(优选甘氨酸)替换第54位的苯丙氨酸(第二结构域)；第一结构域还可包含用色氨酸替换第54位的苯丙氨酸，第二结构域还可包含用甲硫氨酸替换第58位的亮氨酸或第57位的赖氨酸，以及

d)用碱性氨基酸(优选精氨酸)替换第137位的天冬氨酸(第一结构域)，并用酸性氨基酸(优选谷氨酸)替换第51位的精氨酸(第二结构域)。

例如，第一结构域可具有突变D137R，第二结构域具有突变R51D。

或者，scI-CreI大范围核酸酶包含上文a)、b)、c)或d)中所述的至少两对突变；有利地，其中一对突变如c)或d)中所述。优选地，一个结构域包含用酸性氨基酸(D或E)替换第7位和第96位的赖氨酸残基，另一结构域包含用碱性氨基酸(K或R)替换第8位和第61位的谷氨酸残基。更优选地，scI-CreI大范围核酸酶包含上文a)、b)和c)中所述的三对突变。scI-CreI大范围核酸酶有利地由第一结构域(A)和第二结构域(B)组成，所述第一结构域(A)至少具有选自以下的突变：(i)E8R、E8K或E8H，E61R、E61K或E61H以及L97F、L97W或L97Y；(ii)K7R、E8R、E61R、K96R和L97F；或(iii)K7R、E8R、F54W、E61R、K96R和L97F，所述第二结构域(B)至少具有以下突变：(iv)K7E或K7D，F54G或F54A以及K96D或K96E；(v)K7E、F54G、L58M和K96E；或(vi)K7E、F54G、K57M和K96E。

破坏从scI-CreI大范围核酸酶结构域形成功能性同二聚体的突变的另一个例子是G19S突变。将G19S突变有利地引入到scI-CreI大范围核酸酶两个结构域之一中，以获得具有增强的切割活性和增强的特异性的单链大范围核酸酶。此外，为了进一步增强切割特异性，另一结构域或两个结构域都可携带破坏形成功能性同二聚体或促进形成异二聚体sc-I-CreI大范围核酸酶的不同突变，如上文所述。例如，一个单体包含G19S突变、K7E和K96E或E8K和E61R突变，另一个单体包含E8K和E61R或K7E和K96E突变。

在所述scI-CreI大范围核酸酶的另一个优选的实施方案中，所述突变是用选自A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、V、L和W的氨基酸替换原始氨基酸。

本发明的主题还包括包含SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：97之序列的scI-CreI大范围核酸酶；这些scI-CreI大范围核酸酶对位于人RAG1基因的RAG1靶标(RAG1.10；SEQ ID NO：41以及图16)进行切割。该sc-I-CreI大范围核酸酶可用于修复与SCID综合征有关的RAG1突变，或用于基因组工程改造RAG1基因座。由于RAG1.10在编码序列的上游(图16)，因此这些sc-I-CreI大范围核酸酶可通过外显子敲入来修复RAG1基因中的任何突变，如国际PCT申请WO2008/010093介绍的。

本发明的主题还包括编码上文所述单链大范围核酸酶的多核苷酸片段。根据所述多核苷酸的一个优选实施方案，编码所述单链大范围核酸酶两个I-CreI结构域的核酸序列具有低于80％的核酸序列同一性，优选低于70％的核酸序列同一性。这降低了两个序列发生重组的风险，从而提高所述多核苷酸构建体及其衍生载体的基因遗传稳定性。这可以通过密码子使用和遗传密码简并性改写I-CreI序列而获得。例如，一个结构域来自野生型I-CreI编码序列(SEQ ID NO：22)，另一结构域来自经改写的I-CreI编码序列(SEQ ID NO：24)。此外，选择编码单链大范围核酸酶的cDNA中的密码子以促进所述蛋白在所希望的表达系统中的表达。

本发明的主题还包括用于表达本发明单链大范围核酸酶的重组载体。所述重组载体包含编码上述单链大范围核酸酶的至少一个多核苷酸片段。

可在本发明中使用的载体包括但不限于病毒载体、质粒、RNA载体，或者可由染色体、非染色体、半合成或合成核酸组成的线性或环形DNA或RNA分子。优选的载体是那些能够自主复制的载体(附加型载体)和/或表达与之连接的核酸的载体(表达载体)。大量的合适载体是本领域技术人员已知的并且是商品化的。

病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如腺相关病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒如正粘病毒(例如流感病毒)、杆状病毒(例如狂犬病病毒和疱疹性口腔炎病毒)、副粘病毒(例如麻疹病毒和仙台病毒)、正链RNA病毒如小RNA病毒和甲病毒，以及双链DNA病毒，包括腺病毒、疱疹病毒(例如1型和2型单纯疱疹病毒，EB病毒，巨细胞病毒)和痘病毒(例如牛痘病毒、禽痘病毒和金丝雀痘病毒)。其他病毒包括例如诺瓦克病毒、被膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的例子包括：禽白血病肉瘤病毒、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV组、慢病毒、泡沫病毒(Coffin，J.M.，Retroviridae：The viruses and their replication，In Fundamental Virology，第三版，B.N.Fields等编辑，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996)。

优选的载体包括慢病毒载体，尤其是自失活的慢病毒载体。

载体可包含选择标记，例如：用于真核细胞培养的新霉素磷酸转移酶、组氨醇脱氢酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素磷酸转移酶、单纯疱疹病毒胸苷激酶、腺苷脱氨酶、谷氨酰胺合成酶和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶；用于酿酒酵母(S.cerevisiae)的TRP1、URA3和LEU2；用于大肠杆菌(E.coli)的四环素、利福平或氨苄青霉素抗性。

优选地，所述载体是表达载体，其中编码本发明单链大范围核酸酶的序列置于适当的转录和翻译控制元件的控制下，以允许产生或合成所述大范围核酸酶。因此，所述多核苷酸包含在表达盒中。更具体地，载体包含复制起点、与所述编码多核苷酸有效连接的启动子、核糖体结合位点、RNA剪接位点(使用基因组DNA时)、多聚腺苷酸化位点和转录终止位点。其还可包含增强子。启动子的选择取决于用于表达多肽的细胞。合适的启动子包括组织特异性和/或诱导型启动子。诱导型启动子的例子是：由提高的重金属水平诱导的真核金属硫蛋白启动子，应答于异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)诱导的原核lacZ启动子，和由提高的温度诱导的真核热休克启动子。组织特异性启动子的例子是：骨骼肌肌酸激酶、前列腺特异性抗原(PSA)、α-抗胰蛋白酶、人表面活性剂(SP)A和B蛋白，β-酪蛋白和酸性乳清蛋白基因。

根据所述载体的另一有利的实施方案，其包含靶向构建体，所述靶向构建体包含与如上所述基因组DNA切割位点周围的区域具有同源性的序列。

或者，编码单链大范围核酸酶的载体和包含靶向构建体的载体是不同的载体。

更优选地，靶向DNA构建体包含：

a)与如上所述基因组DNA切割位点周围的区域具有同源性的序列，和

b)侧翼是a)中序列的待引入序列。

优选地，使用至少50bp、优选多于100bp以及更优选多于200bp的同源序列。因此，靶向构建体优选地为200pb～6000pb，更优选地为1000pb～2000pb。事实上，具有的DNA同源性位于断裂位点上游和下游的侧翼区域中，且待引入的DNA序列应位于两臂之间。待引入序列优选是修复目的基因中突变的序列(基因校正或功能性基因的恢复)，以用于基因治疗。或者，待引入序列可以是用于以某特定方式改变染色体DNA的任何其他序列，包括用于修饰某特定序列的序列、用于弱化或激活目的基因的序列，用于失活或缺失目的基因或其部分的序列，用于在目的位点引入突变的序列，或用于引入外源基因或其部分的序列。这些染色体DNA改变可以用于基因组工程改造(动物模型/人重组细胞系)。

本发明还涉及通过上文所述的多核苷酸或载体(优选表达载体)修饰的原核或真核宿主细胞。

本发明还涉及非人转基因动物或转基因植物，其特征是其所有或部分细胞通过上文所述的多核苷酸或载体进行了修饰。

本文使用的“细胞”是指原核细胞如细菌细胞，或真核细胞如动物细胞、植物细胞或酵母细胞。

本发明的主题还涉及上述大范围核酸酶、多核苷酸(优选包含在表达载体、细胞、转基因植物、非人转基因哺乳动物中)在分子生物学、体内或体外遗传工程以及体内或体外基因组工程中的用途(非治疗目的)。

分子生物学包括但不限于DNA限制性处理和DNA作图。非治疗目的的遗传工程和基因组工程包括例如(i)用于蛋白生产的包装细胞系中特定位点的基因靶向，(ii)用于品系改良和代谢工程的农作物中特定位点的基因靶向，(iii)用于移除基因修饰农作物中标志物的靶向重组，(iv)用于移除基因修饰微生物菌株中标志物(例如为了抗体的生产)的靶向重组。

根据所述用途的一个有利的实施方案，其用于在包含DNA靶序列的目的位点引入双链断裂，从而诱导DNA重组事件、DNA丢失或细胞死亡。

根据本发明，所述双链断裂用于：修复特定序列、修饰特定序列、将突变基因恢复成功能基因，弱化或激活内源目的基因，在目的位点引入突变，引入外源基因或其部分，失活或缺失内源基因或其部分，染色体臂移位，或使DNA不被修复并被降解。

本发明的主题也包括遗传工程方法，其特征是其包括目的位点(位于包含如上所述DNA靶标的载体中)产生双链核酸断裂的步骤，其通过将所述载体与如上所述大范围核酸酶的接触来实现，从而诱导与另一载体(其与所述大范围核酸酶切割位点周围序列具有同源性)发生同源重组。

本发明的主题也包括基因组工程方法，其特征是包括以下步骤：1)对包含如上所述大范围核酸酶的至少一个DNA靶标的基因座产生双链断裂，其通过将所述靶标与所述大范围核酸酶接触来实现；2)在适合与靶向DNA构建体(其包含侧翼序列与靶基因座具有同源性的待引入到所述位点的序列)发生同源重组的条件下，维持所述断裂基因座。

本发明的主题也包括基因组工程方法，其特征是包括以下步骤：1)对包含如上所述大范围核酸酶的至少一个DNA靶标的基因座产生双链断裂，其通过将所述切割位点与所述大范围核酸酶接触来实现；2)在适合与染色体DNA(其与切割位点周围的区域具有同源性)发生同源重组的条件下，维持所述断裂基因座。

本发明的主题也包括上述至少一种大范围核酸酶、一种或两种衍生多核苷酸(优选包含在表达载体中)用于制备在有此需要的个体中预防、改善或治疗遗传病的药物的用途，所述药物可通过任何方式施用于所述个体。

本发明的主题也包括预防、改善或治疗有此需要的个体的遗传病的方法，所述方法包括通过任何方式对所述个体施用包含如上所述的至少一种大范围核酸酶的组合物的步骤。

在这种情况下，如上所述的大范围核酸酶的用途至少包含以下步骤：a)诱导个体的体细胞组织在基因(包含所述大范围核酸酶的至少一个识别和切割位点)的目的位点发生双链断裂，和b)将靶向DNA引入到该个体中，所述靶向DNA包含(1)与切割位点周围区域具有同源性的DNA和(2)在靶向DNA与染色体DNA发生重组后修复目的位点的DNA。在适合将靶向DNA引入到目的位点的条件下，将靶向DNA引入到个体中。

根据本发明，通过将所述大范围核酸酶施用于个体(体内)，或者将所述大范围核酸酶引入到从个体中取出的体细胞并在修饰后再输回到个体中(离体)，从而诱导所述双链切割。

在所述用途的一个优选的实施方案中，大范围核酸酶与靶向DNA构建体结合，该靶向DNA构建体包含能修复基因突变的序列，其侧翼为与所述大范围核酸酶基因组DNA切割位点周围的基因区域具有同源性的序列，如上文所述。修复突变的序列既可以是携带校正序列的基因片段，也可以是外显子敲入构建体。

为了校正基因，基因切割发生在突变的附近(优选突变的500bp内)。靶向构建体包含用于修复切割的基因片断，其侧翼为与基因组切割位点具有同源性的至少200bp的序列(最小修复基质)，还包括用于修复突变基因的正确序列。接下来，用于基因校正的靶向构建体包含最小修复基质或由其组成；优选200～6000bp，更优选1000～2000bp。

为了恢复功能性基因，基因的切割发生在突变的上游。优选地，所述突变是基因序列中第一个已知的突变，这样该基因的所有下游突变可同时被校正。靶向构建体包含框内融合的基因组DNA切割位点下游的外显子(像在cDNA中那样)和3’端终止转录的多聚腺苷酸化位点。待引入序列(外显子敲入构建体)的侧翼为在切割位点周围的内含子或外显子序列，以使改造基因(外显子敲入基因)转录成能编码功能性蛋白质的mRNA。例如，外显子敲入构建体的侧翼为上游和下游序列。

本发明的主题还包括上述至少一种大范围核酸酶、多核苷酸(优选包含在表达载体中)用于制备在有此需要的个体中预防、改善或治疗由呈现DNA中间体的感染原引起之疾病的药物的用途，所述药物可通过任何方式施用于所述个体。

本发明的主题也包括预防、改善或治疗有此需要的个体中由呈现DNA中间体的感染原引起的疾病的方法，所述方法包括以任何方式对所述个体施用如上所述组合物的步骤。

本发明的主题也包括上述至少一种大范围核酸酶、多核苷酸(优选包含在表达载体中)在体外在生物衍生产品或旨在用于生物的产品中用于对呈现DNA中间体的感染原进行增殖抑制、失活或缺失或对物品进行消毒的用途。

本发明的主题也包括从产品或材料中去除某种呈现DNA中间体的感染原污染的方法，所述方法至少包括以下步骤，即将生物制品或旨在用于生物利用的产品或物品与上述化合物接触足够的时间，以对所述感染原进行增殖抑制、失活或缺失。

在一个具体实施方案中，所述感染原是病毒。例如，所述病毒是腺病毒(Ad11，Ad21)、疱疹病毒(HSV、VZV、EBV、CMV、疱疹病毒6、7或8)、肝DNA病毒(HBV)、乳多空病毒(HPV)、痘病毒或逆转录病毒(HTLV、HIV)。

本发明的主题也包括组合物，其特征在于包含上述至少一种大范围核酸酶、多核苷酸(优选包含在表达载体中)。

在所述组合物的一个优选实施方案中，其包含靶向DNA构建体，该靶向DNA构建体包含能修复目的位点的序列，其侧翼为与如上所述靶基因座具有同源性的序列。优选地，所述靶向DNA构建体包含在重组载体中或者包含在表达载体中，所述表达载体包含编码本发明大范围核酸酶的多核苷酸。

本发明的主题也包括含有至少一种上述大范围核酸酶、编码所述大范围核酸酶的表达载体以及包含靶向构建体的载体，其作为联合制剂用于同时、分别或者先后用于预防和治疗遗传病。

为了用于治疗，大范围核酸酶和可药用赋形剂可以按照治疗有效量施用。如果施用量有生理意义，则认为这种组合以“治疗有效量”施用。如果某种制剂的存在可使受者发生生理学上可以察觉的改变，就可以认为这种制剂具有生理意义。在本文中，如果某种药剂的存在可以使目标疾病中一个或多个症状的严重程度减轻，并能对病变或异常进行基因组校正，就可以认为这种药剂具有生理学意义。

在本发明用途的一个实施方案中，大范围核酸酶基本上是非免疫原性的，即不引发或几乎不引发不利的免疫应答。根据本发明，可使用大量改善或消除这类有害免疫反应的方法。在一个优选的实施方案中，大范围核酸酶基本不含N-甲酰基甲硫氨酸。避免不想要的免疫反应的另一种方式是将大范围核酸酶与聚乙二醇(″PEG″)或聚丙二醇(″PPG″)(优选500到20,000道尔顿的平均分子量(MW))缀合。与PEG或PPG缀合(例如Davis等(US 4,179,337)所述)能够提供具有抗病毒活性的非免疫原性的生理活性水溶性内切核酸酶缀合物。Saifer等(US 5,006,333)中还介绍了使用聚乙二醇-聚丙二醇共聚物的类似方法。

大范围核酸酶可作为多肽或作为编码所述多肽的多核苷酸构建体载体来使用。通过本领域熟知的任何方便的、适合于特定细胞类型的方法(单独或与至少一种合适的介质或载体和/或与靶向DNA组合)将其引入到细胞中(体外、离体或体内)。一旦进入细胞，大范围核酸酶和包含靶向DNA和/或编码大范围核酸酶的核酸的载体(如果存在的话)就会被细胞从胞质输入或易位至核内的作用位点。

大范围核酸酶(多肽)可以有利地与脂质体、聚乙烯亚胺(PEI)和/或膜易位肽组合(Bonetta，The Scientist，2002，16，38；Ford等，Gene Ther.，2001，8，1-4；Wadia and Dowdy，Curr. Opin.Biotechnol.，2002，13，52-56)；在最后一种情况下，大范围核酸酶的序列与膜易位肽的序列融合(融合蛋白)。

可以用很多方法(例如注射、直接摄入、射弹轰击、脂质体、电穿孔)将包含靶向DNA和/或编码大范围核酸酶的核酸的载体引入到细胞中。可使用表达载体在细胞中稳定或瞬时地表达大范围核酸酶。在真核细胞进行表达的技术是本领域技术人员熟知的(见Current Protocols in Human Genetics：第12章“Vectors For Gene Therapy”&第13章“Delivery Systems for Gene Therapy”)。任选地，可优选在重组蛋白中掺入核定位信号以确保其在核内表达。

本发明的主题还包括上述至少一种大范围核酸酶作为制备其他大范围核酸酶之骨架的用途。例如，为了制备新的归巢内切核酸酶，可对单链大范围核酸酶进行其他轮次的诱变和选择/筛选。

大范围核酸酶的用途以及使用本发明大范围核酸酶的方法还包括使用编码所述大范围核酸酶的多核苷酸、载体、细胞、转基因植物或非人转基因哺乳动物，如上所述。

本发明用途和方法的另一个有利的实施方案中，所述大范围核酸酶、多核苷酸、载体、细胞、转基因植物或非人转基因哺乳动物与如上所述的靶向DNA构建体组合。优选地，所述编码大范围核酸酶的载体包含靶向DNA构建体，如上所述。

制备具有新切割特异性的I-CreI变体的方法已有文献做过介绍(Epinat等，Nucleic Acids Res.，2003，31：2952-2962；Chames等，Nucleic Acids Res.，2005，33，e178，和Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458；Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149；Arnould等，J.Mol.Biol.，Epub 10May 2007；国际PCT申请WO 2004/067736，WO 2006/097784，WO 2006/097853，WO 2007/049095，WO 2007/057781，WO 2007/060495，WO 2007/049156，WO 2007/093836，WO 2007/093918，WO2008/010009，WO2008010093，WO2008/059317，WO2008/059382，WO 2008/093152，WO 2008/093249，WO 2008/02198，WO 2008/02199，WO 2008/02274，WO 2008/149176，WO 2008/152523，WO 2008/152524和WO 2009/001159)。本发明的单链大范围核酸酶可通过熟知的重组DNA技术和遗传工程技术从I-CreI或功能性变体中获得。例如，通过使用特定引物的PCR从DNA模板扩增出序列，其在框内包含在N端结构域编码序列3’端或C端结构域编码序列5’端的接头编码序列。然后将PCR片段通过合适的限制性酶切位点克隆到包含编码另一结构域之序列的载体中。本发明定义的单链大范围核酸酶通过表达上述多肽来产生；优选地，在适于表达该多肽的条件下，在经表达载体修饰的宿主细胞或转基因动物/植物中表达所述多肽，从宿主细胞培养物或从转基因动物/植物中回收单链大范围核酸酶衍生物。

除非另有说明，否则本发明的实施将利用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、DNA重组和免疫学的常规技术，它们为本领域所知。这些技术在文献中有充分的介绍。参阅如Current Protocols in Human Genetics(Frederick M，USUBEL，2000，Wiley and son Inc，Library of Congress，USA)；Molecular Cloning：A laboratory manual，第三版，(Sambrook等，2001，Cold Spring Harbor，New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑，1984)；Mullis等U.S.Pat.No.4683195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.harries & S.J.Higgins编辑.1984)；Transcription And Translation(B.D.harries & S.J.Higgins编辑.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；Methods In ENZYMOLOGY丛书(J，Abelson和M.Simon主编，Academic Press，Inc.，New York)，特别是Vol.154和155(Wu等编辑)和Vol 185，“Gene Expression Technology”(D.Goeddel 编辑)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos编辑，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker编辑，Academic press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑，1986)；和Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

除了上述特征外，本发明还包括如下描述中出现的其他特征，其是指举例说明本发明的单链I-CreI大范围核酸酶及其用途的实例以及附图，其中：

-图1是I-CreI的Cα带状图。

-图2是人XPC基因(GenBank编号NC_000003)的示意图。XPC外显子加框显示，XPC4.1(或C1：SEQ ID NO：26)的序列(20438位)位于外显子9上。

-图3代表被I-CreI或其一些衍生变体(分别是SEQ ID NO：21、27到29、26、30和31)切割的22bp的DNA靶标。C1221是I-CreI靶标。10GAG_P、10GTA_P和5TCT_P是回文靶标，其与C1221的区别在于加框的基序。C1是XPC靶标；C3和C4是回文靶标，分别来自C1的左侧部分和右侧部分。如图所示，10GAG_P、10GTA_P和5TCT_P的加框基序可以在C1靶标中找到。

-图4示意异二聚体联合突变体对C1靶标的切割。该图示意了用C1 靶标对C3和C4切割酶的组合进行二次筛选。H33突变是体在7种C3切割酶中，X2突变是在8种C4切割酶中，X2/H33异二聚体对C1靶标的切割用黑圈标出。

图5代表pCLS0542大范围核酸酶表达载体图。pCLS0542是基于2μ的复制载体，带有LEU2营养缺陷基因标记以及能驱动大范围核酸酶表达的诱导型Gal10启动子。

图6代表在哺乳动物细胞中表达大范围核酸酶所需的质粒pCLS1088的图。

图7代表pCLS1058报告载体图。该报告载体上有杀稻瘟素和氨苄青霉素抗性基因。LacZ串联重复有800bp的同源性，并被长为1.3kb的DNA序列隔开。其周围是EF1-α启动子和终止子序列。靶位点用Gateway方法(INVITROGEN)进行克隆，导致在选定的靶位点替换CmR和ccdB基因。

图8示意针对3种XPC靶标C1、C3和C4对18种单链构建体进行酵母筛选。每个单链分子根据其表1中的编号标出。在每个四点酵母聚簇中，左边的两个点是实验结果，而右边的两个点是内参，用来评价实验的质量和可靠性。

-图9示意在CHO细胞中的染色体外测定中，X2-L1-H33和X2-RM2-H33这两种单链构建体对C1、C3和C4 XPC靶标的切割。背景对应于用空表达载体转染细胞。同一实验中I-SceI对S1234 I-SecI靶标的切割作为阳性对照。

-图10示意在CHO细胞中的染色体外测定中，X2/H33异二聚体和X2-L1-H33_G19S和X2-RM2-H33_G19S这两种单链构建体对C1、C3和C4 XPC靶标的切割。背景对应于用空表达载体转染细胞。同一实验中I-SecI对S1234 I-SecI靶标的切割作为阳性对照。

-图11示意针对3种XPC靶标(C1、C3和C4)对3种XPC单链分子X2-L1-H33、SCX1和SCX2进行酵母筛选。SCX1是X2(K7E)-L1-H33(E8K，G19S)分子，SCX2代表X2(E8K)-L1-H33(K7E，G19S)分子。在每个四点酵母聚簇中，左边的两个点是实验结果，而右边的两个点是内参，用来评价实验的质量和可靠性。

-图12代表中国仓鼠(Cricetulus griseus)次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)mRNA(GenBank编号J00060.1)的示意图。灰色框表示ORF。还显示了HprCH3靶点的序列(SEQ ID NO：34)与其位置。

-图13代表被I-CreI或其一些衍生变体(分别为SEQ ID NO：21、27和32～36)切割的22bp的DNA靶标。C1221是I-CreI靶标。10GAG_P、10CAT_P和5CTT_P是回文靶标，其与C1221的区别在于加框的基序。HprCH3是HPRT靶标，HprCH3.3和HprCH3.4是回文靶标，分别来自HprCH3的左侧部分和右侧部分。如图所示，10GAG_P、10CAT_P和5CTT_P的加框基序可以在HprCH3靶标中找到。

-图14示意MA17和H33同二聚体、HPRT异二聚体和三种HPRT单链分子针对3种HPRT靶标HprCH3、HprCH3.3和HprCH3.4的酵母筛选。H是MA17/H33异二聚体。由于它由MA17和H33的共表达产生，因此实际上在酵母中有3种分子：两种MA17和H33同二聚体和一种MA17/H33异二聚体。同二聚体的形成导致切割HprCH3.3和HprCH3.4靶标。SC1～SC3分别为MA17-L1-H33、MA17-L1-H33_G19S和MA17-RM2-H33。在每个四点酵母聚簇中，左边的两个点是实验结果，而右边的两个点是内参，用来评价实验的质量和可靠性。

图15示意在CHO细胞中的染色体外测定中，MA17/H33异二聚体和4种HPRT单链构建体(MA17-L1-H33、MA17-L1-H33_G19S、MA17-RM2-H33和MA17-RM2-H33_G19S)对HprCH3、HprCH3.3和HprCH3.4HPRT靶标的切割。背景对应于用空表达载体转染细胞。同一实验中I-SecI对S1234I-SecI靶标的切割作为阳性对照。

-图16是人RAG1基因(GenBank编号NC_000011)的示意图。外显子序列加框显示，还显示了外显子-内含子接合处。灰色框表示ORF。还显示了RAG1.10的序列(SEQ ID NO：41)与其位置。

-图17代表被I-CreI或其一些衍生变体(分别是SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：37～43)切割的22bp的DNA靶标。C1221是I-CreI靶标。10GTT_P、5CAG_P、10TGG_P和5GAG_P是回文靶标，其与C1221的区别在于加框的基序。RAG1.10是RAG1靶标。RAG1.10.2和RAG1.10.3是回文靶标，分别来自RAG1.10的左侧部分和右侧部分。如图所示，10GTT_P、5CAG_P、10TGG_P和5GAG_P的加框基序可以在RAG1.10靶标中找到。

-图18示意4种RAG1单链分子针对3种RAG1靶标(RAG1.10、RAG1.10.2和RAG1.10.3)的酵母筛选。SC1～SC4分别代表M2-L1-M3、M2_G19S-L1-H33、M2-RM2-H33和M2_G19S-RM2-M3。图中还显示了M2和M3I-CreI突变体的活性，以及M2/M3异二聚体对3种RAG1靶标的活性。在每个四点酵母聚簇中，左边的两个点是实验结果，而右边的两个点是内参，用来评价实验的质量和可靠性。

-图19示意两种单链分子SC1和SC2针对3种RAG1.10靶标的酵母筛选。SC1是M3-RM2-M2分子，而SC2代表M3(K7E K96E)-RM2-M2(E8K E61R)分子。在每个四点酵母聚簇中，左边的两个点是实验结果，而右边的两个点是内参，用来评价实验的质量和可靠性。

-图20示意6种RAG1单链分子针对3种RAG1靶标(RAG1.10、RAG1.10.2和RAG1.10.3)的酵母筛选。图中还显示了M2/M3异二聚体对3种RAG1靶标的活性。在每个四点酵母聚簇中，左边的两个点是实验结果，而右边的两个点是内参，用来评价实验的质量和可靠性。

-图21示意在CHO细胞中的染色体外测定中，4种单链构建体对RAG1.10、RAG1.10.2和RAG1.10.3靶标的切割。背景对应于用空表达载体转染细胞。结果表示为M2/M3异二聚体针对相同三种靶标之活性的百分比。

-图22示意：A.CHO细胞中染色体测定的原理。B.M2/M3异二聚体以及两种单链分子M3-RM2-M2_G19S和M3^--RM2-M2⁺ _G19S的基因校正活性。LacZ阳性细胞的比率表示为所转染表达质粒数的函数。

-图23示意5种单链分子对RAG1.10、RAG1.10.2和RAG1.10.3靶标的活性。在每个酵母聚簇中，左边的两个点是单链分子，而右边的两个点是实验内参。

-图24是用于内源性RAG1基因座的基因靶向策略的流程图。RAG1 靶序列(RAG1.10：SEQ ID NO：41)位于编码Rag1蛋白的外显子2的上游。外显子2加框显示，开放读码框为白色。大范围核酸酶对天然RAG1基因的切割产生了同源重组的基质，它可利用含1.7kb的外源性DNA(其侧翼是同源性臂)的修复基质作为修复基质。

-图25代表pCLS1969载体图。

-图26示意基因靶向事件的PCR分析。RAG1基因座的野生型克隆和随机插入了供体修复质粒的克隆都不能进行PCR扩增。在RAG1基因座发生了基因靶向事件的克隆可以获得2588bp的PCR产物。

-图27示意细胞克隆的Southern印迹分析。用HindIII消化基因组DNA制备物，然后对位于右侧同源臂外侧的RAG1基因片段进行Southern印迹。基因座图标出了了野生型基因座(5.3kb)和被靶向基因座(3.4kb)的限制性酶切模式。实心黑色框表示探针。对来自单个转染细胞的5个克隆样品(1-5)和来自非转染细胞(293)的DNA进行了分析。在3个样品中，等位基因之一被靶向。H是指HindIII位点。

-图28示意异二聚体和单链分子的生物物理学分析。A；单链大范围核酸酶以及相应异二聚体蛋白的圆二色性谱。B；所有异二聚体和单链变体的热变性。C；分离系数(KAV)与利用分析型Superdex-200 10-300GL柱的四种蛋白标准品(空心圆)分子量的对数的校正曲线图。单链大范围核酸酶的值用实心圆表示(测定MW是34KDa，理论MW是41KDa)。

-图29示意毒理学研究。A.剂量应答研究。用不同量的多种大范围核酸酶表达载体和固定量的修复质粒转染CHO细胞系。◆，M2/M3异二聚体；■，M2_G19S/M3异二聚体；▲，M2⁺/M3^-异二聚体；×，M2⁺ _G19S/M3^-；*，M3-RM2-M2_G19S；●，M2⁺ _G19S-RM2-M3^-；□，I-secI。B.通过细胞存活测定监测的改造大范围核酸酶的毒性。用不同量的大范围核酸酶表达载体和恒定量的编码GFP的质粒共转染CHO-K1细胞。如材料和方法中介绍的，细胞存活以转染后第6天表达GFP的细胞的百分比来表示。完全无活性的M2_G19S/M3_G19S异二聚体作为无毒性对照(◇)。C.通过DNA双链断裂处γH2AX灶点的形成来观察DNA损伤。用10倍大范围核酸酶活性剂量处理的细胞的代表性图像。

实施例1：制备切割人类XPC基因的衍生自单链I-CreI的大范围核酸酶。

着色性干皮病(XP)是一种罕见的常染色体隐性遗传病，其特征为对紫外线(UV)接触过敏并且高度易感于皮肤癌。扫描与着色性干皮病有关的人XPC基因以寻找可能的靶序列。一个可能的22bp的DNA靶标称为C1(cgagatgtcacacagaggtacg；SEQ ID NO：26)，位于XPC第9个外显子的末端(图2)。对能切割C1靶标的I-CreI衍生突变体的改造如之前Arnould等，J.Mol.Biol.，Epub 10 May 2007；国际PCT申请WO 2007/093836和WO 2007/093918所述。简单来说，将C1序列分为两个回文半靶标，分别称为C3和C4(图3)。由于C3靶标与10GAG_P靶标相同，仅在±6位不同，针对C3靶标对能切割10GAG_P靶标的I-CreI衍生突变体进行筛选。与I-CreI野生型序列相比，分离了携带单突变Y33H(用组氨酸残基替换第33位的酪氨酸)的突变体H33作为强C3切割酶。C4靶标是10GTA_P与5TCT_P靶标的组合。将可切割10GTA_P靶标的I-CreI突变体与可切割5TCT_P靶标的I-CreI突变体相组合，并针对C4 DNA靶标进行筛选，如之前Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149；国际PCT申请WO 2007/049095和WO 2007/057781中所述。分离了I-CreI突变体X2作为强C4切割酶。与I-CreI野生型序列相比，X2突变体带有以下突变：Y33H、Q38A、S40Q、Q44K、R68Q、R70S和D75N。最后一步是将H33和X2 I-CreI突变体在酵母中共表达，如之前国际PCT申请WO 2006/097854和Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458所述，这导致了XPC C1 DNA靶标的强切割(图4)。

由于存在两种同二聚体，因此两种突变体共表达获得的X2/H33XPC异二聚体不仅切割C1靶标，还切割C3和C4靶标。为了避免出现这些副作用，构想出设计包含两种I-CreI衍生突变体X2和H33的单链分子的新方法。为了达到这个目的，在单链分子设计中保留全长X2N端突变体，并改造了一些X2-L-H33型构建体，其中L是蛋白接头。在该命名法中，X2将称为N端突变体，H33称为C端突变体。另外一个重要的问题是单链分子中两个突变体的序列同一性。事实上，两个I-CreI突变体X2和H33的核酸序列几乎相同，这提高了该构建体稳定性的问题以及在这两种几乎相同的序列之间发生重组的风险。为了避免或者至少减少这种可能性，使用另一种I-CreI形式(称为I-CreI CLS)来编码H33突变体。I-CreI CLS的核苷酸序列(SEQ ID NO：24)是利用密码子使用和遗传密码简并性从 I-CreI野生型序列(I-CreI wt；SEQ ID NO：22)改写而来的。这意味着I-CreI CLS与I-CreI wt具有73％的核酸序列同一性，并且具有3个单氨基酸突变(T42A、E110W和Q111R)，这些突变不会改变I-CreI的活性。然后将Y33H引入到I-CreI CLS形式(SEQ ID NO：25)中。检测了H33CLS突变体对C3靶标的活性，结果发现其与I-CreI野生型形式中的H33突变体的活性一样强。

利用H33CLS突变体构建了18种X2-L-H33型单链形式(其中L是接头)，它们各不相同。G19S突变也被引入到两种单链分子的C端H33突变体中。然后在酵母中监测不同单链构建体对C1XPC靶标及其两种衍生物C3和C4的活性，对其中一些在CHO细胞中用染色体外测定进行监测。

1)材料和方法

a)在I-CreI CLS形式中引入Y33H突变

用两组引物进行两个重叠PCR反应，第一个片段为Gal10F(5’-gcaactttagtgctgacacatacagg-3’；SEQ ID NO：44)和H33Revp60(5’-ctggtgtttgaacttgtgagattgatttggttt-3’；SEQ ID NO：45)，第二个片段为H33Forp60(5’-aaaccaaatcaatctcacaagttcaaacaccag-3’；SEQ ID NO：46)和Gal10R(5’-acaaccttgattggagacttgacc-3’；SEQ ID NO：47)。使用约25ng的每种PCR片段和经过NcoI和EagI消化而线性化的75ng载体DNApCLS0542(图5)，通过高效LiAc转化方案(Gietz，R.D.和Woods R.A.，Methods Enzymol.，2002，350，87-96)转化酿酒酵母菌株FYC2-6A(MATα，trp1Δ63，leu2Δ1，his3Δ200)。通过在酵母中体内同源重组来产生含有Y33H突变的完整编码序列。

b)突变体测序

为回收表达突变体的质粒，采用标准方法提取酵母DNA并用于转化大肠杆菌。利用MILLEGEN SA对质粒进行突变体ORF测序。

c)克隆18种XPC单链分子

对I-CreI CLS形式中的H33突变体进行了18个独立的PCR反应。每个PCR反应采用相同的反向引物CreCterR60(5’-tagacgagctcctaaggagaggactttttcttctcag-3’；SEQ ID NO：48)和特异性正向引物。所用的18种正向引物如下：

-L1EagI：5’-tatcggccggtggcggaggatctggcggcggtggatccggtggtggaggctccggaggaggtggctctaacaaagagttcctgctgtatcttgctgga-3’(SEQ ID NO：49)

-YPP：5’-tatcggccggtaaatcttccgattccaagggtattgatctgactaatgttactctgcctgatacccctacttattccaaagctgcctctgatgctattcctccagctaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3’(SEQ ID NO：50)

-AOL：5’-tatcggccggtctggagtatcaggctccttactcttcccctccaggtcctccttgttgctccggttcctctggctcctctgctggttgttctaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3’(SEQ ID NO：51)

-CXT：5’-tatcggccggtctgtcctatcattattctaatggtggctcccctacttctgatggtccagctctgggtggcatttctgatggtggcgctactaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3’(SEQ ID NO：52).

-BQY：5’-tatcggccggtgattcctctgtttctaattccgagcacattgctcctctgtctctgccttcctctcctccatctgttggttctaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3’(SEQ ID NO：53)

-VSG：5’-tatcggccggtgcttctcagggttgtaaacctctggctctgcctgagctgcttactgaggattcttataatactgataacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3’(SEQ ID NO：54)

-BYM：5’-tatcggccggtaatcctattcctggtctggatgagctgggtgttggcaactctgatgctgccgctcctggcactaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3’(SEQ ID NO：55)

-MCJ：5’-tatcggccggtgctcctactgagtgttctccttccgctctgacccagcctccatccgcttctggttccctgaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3’(SEQ ID NO：56)

-GSmid：5’-tatcggccggtggaggcggttctggaggcggtggctctggtggaggcggttccggtggaggcggatctggtggaggcggttctaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3’(SEQ ID NO：57)

-GSshort：5’-tatcggccggtggaggcggttctggaggcggtggctctggtggaggcggttccaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3’(SEQ ID NO：58)

-GSxshort：5’-tatcggccggtggaggcggttctggaggcggtggctctaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3(SEQ ID NO：59)

-PPR：5’-tatcggccggtcaggttacttctgctgccggtcctgctactgttccatctggtaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3’(SEQ ID NO：

-SBA1：5’-tatcggccggtggatctcctctgaagccttctgccccaaagattcctataggtggctccaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3’(SEQ ID NO：61)

-SBA2：5’-tatcggccggtggatctcctctgaagccttctgccccaaagattcctataggtggctccccactgaaaccttccgcacctaaaatcccaattggtggctctaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3’(SEQ ID NO：62)

-LP1：5’-tatcggccggtggatctcctctgtctaaaccaattccaggcggttccaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3’(SEQ ID NO：63)

-LP2：5’-tatcggccggtggatctcctctgtctaaaccaattccaggcggttccccactgtcaaagccaatccctggcggttctaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3’(SEQ ID NO：64)

-RM1：5’-tatcggccggtggatctgataagtataatcaggctctgtctgagcgtcgcgcctacggtgtcgccaataacctggtttccggtggaggcggttccaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3’(SEQ ID NO：65)

-RM2：5’-tatcggccggtggatctgataagtataatcaggctctgtctaaatacaaccaagcactgtccaagtacaatcaggccctgtctggtggaggcggttccaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3’(SEQ ID NO：66).

所有PCR片段都被纯化并经EagI和SacI消化，将每种PCR片段连接进也经EagI和SacI消化的X2突变体的酵母表达载体。对克隆进行测序后，获得了酵母表达载体中的所有单链分子。

d)在两种单链分子X2-L1-H33和X2-RM2-H33的C端H33突变体中引入G19S突变

用两组引物进行两个重叠PCR反应：第一个片段为Gal10F(5’-gcaactttagtgctgacacatacagg-3’：SEQ ID NO：44)和G19SRev(5’gcaatgatggagccatcagaatccacaaatccagc-3’：SEQ ID NO：67)，第二个片段为G19For60(5’-gctggatttgtggattctgatggctccatcattgc-3’：SEQ ID NO：68)和Gal10R(5’-acaaccttgattggagacttgacc-3’：SEQ ID NO：47)。使用约25ng的每种PCR片段和经过NcoI和EagI消化而线性化的75ng载体DNA(pCLS0542；图5)，通过高效LiAc转化方案(Gietz，R.D和Woods R.A.，Methods Enzymol.，2002，350，87-96)转化酿酒酵母菌株FYC2-6A(MATα，trp1Δ63，leu2Δ1，his3Δ200)。通过在酵母中体内同源重组来产生含有G19S突变的完整编码序列。

e)在XPC X2-L1-H33单链分子中引入K7E、E8K和G19S突变

首先，将G19S突变引入到X2-L1-H33分子中。对克隆到pCLS0542酵母表达载体中的单链分子进行两个重叠PCR反应。第一个PCR反应所用引物是：Gal10F(5’-gcaactttagtgctgacacatacagg-3’；SEQ ID NO：44)和G19SRev60(5’-gcaatgatggagccatcagaatccacaaatccagc-3’；SEQ ID NO：67)；第二个PCR反应所用引物是：G19For60(5’-gctggatttgtggattctgatggctccatcattgc-3；SEQ ID NO：68)和Gal10R(5’-acaaccttgattggagacttgacc-3’；SEQ ID NO：47)。使用约25ng的每种PCR片段和经过NcoI和EagI消化而线性化的75ng载体DNA(pCLS0542；图5)，通过高效LiAc转化方案(Gietz，R.D和Woods R.A.，Methods Enzymol.，2002，350，87-96)转化酿酒酵母菌株FYC2-6A(MATα，trp1Δ63，leu2Δ1，his3Δ200)。通过在酵母中体内同源重组来产生含有G19S突变体的完整编码序列。

第二步，通过进行3个重叠突变将K7E和E8K突变引入到X2-L2-H33(G19S)分子中。对于SCX1分子，3个PCR反应使用3组引物，分别是Gal10F和K7ERev(5’-gtacagcaggaactcttcgttatatttggtattgg-3’)、K7EFor(5’-aataccaaatataacgaagagttcctgctgtacc-3’；SEQ ID NO：69)和E8KRevSC(5’-aagatacagcaggaactttttgttagagccacc-3’；SEQ ID NO：70)、E8KForSc(5’-ggtggctctaacaaaaagttcctgctgtatctt-3’；SEQ ID NO：71)和Gal10R。对于SCX2分子，3个PCR反应使用3组引物，分别是Gal10F和E8KRev(5’-caggtacagcaggaactttttgttatatttgg-3’；SEQ ID NO：72)、E8KFor(5’- accaaatataacaaaaagttcctgctgtacctgg-3’；SEQ ID NO：73)和K7ERevSC(5’-aagatacagcaggaactcttcgttagagccacc-3’；SEQ ID NO：74)、K7EForSc(5’-ggtggctctaacgaagagttcctgctgtatctt-3’；SEQ ID NO：75)和Gal10R。对这两个构建体，使用约25ng的每种PCR片段和经过NcoI和EagI消化而线性化的75ng载体DNA(pCLS0542；图5)，通过高效LiAc转化方案(Gietz，R.D.和Woods R.A.，Transformation of yeast by lithim aetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method，Methods Enzymol.，2002，350，87-96)转化酿酒酵母菌株FYC2-6A(MATα，trp1Δ63，leu2Δ1，his3Δ200)。通过在酵母中体内同源重组来产生SCX1或SCX2构建体的完整编码序列。

f)表达大范围核酸酶之克隆的接合并在酵母中筛选

如之前(国际PCT申请WO 2004/067736；Epinat等，Nucleic Acids Res.，2003，31：2952-2962；Chames等，Nucleic Acids Res.，2005，33，e178；Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458)所述进行筛选。利用菌落网格(gridder)(QpixII，Genetix)进行接合。使用低网格密度(约4个点/cm²)将突变体置于覆盖在YPD平板上的尼龙滤膜上的网格中。在相同的滤膜上进行第二次划网格的过程，以针对每个靶标点出由不同报告基因之酵母菌株组成的第二层。将膜置于固体琼脂富YPD培养基上，并在30℃孵育一夜，以允许接合。接着，将滤膜转移至缺乏亮氨酸和色氨酸且含有半乳糖(2％)作为碳源的合成培养基上，并在37℃孵育5天，以筛选出带有表达载体和靶标载体的二倍体。5天后，将滤膜置于含有0.02％的X-Gal(在pH7.0的0.5M磷酸钠缓冲液中)、0.1％的SDS、6％二甲基甲酰胺(DMF)、7mM β-巯基乙醇、1％琼脂糖的固体琼脂糖培养基上，并在37℃孵育，以检测β-半乳糖苷酶活性。通过扫描来分析结果，使用适当的软件进行定量。

g)将XPC单链构建体克隆进哺乳动物表达载体中

用以下引物对每个突变体的ORF进行PCR扩增：CCM2For(5’-aagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaccatggccaatacc aaatataacaaagagttcc-3’；SEQ ID NO：76)和CCMRev60(5’-ctgctctagactaaggagaggactttttcttctcag-3’；SEQ ID NO：77)。将PCR片段用限制性内切酶SacI和XbaI消化，然后连接到同样经SacI和XbaI消化的pCLS1088载体中(图6)。通过测序(MILLEGEN)验证所得克隆。

h)在用于在CHO细胞中进行染色体外测定的载体中克隆C1、C3、和C4靶标

如下克隆目的靶标：从PROLIGO订购对应于靶序列(侧翼是gateway克隆序列)的寡核苷酸。使用Gateway方法(INVITROGEN)，将对单链寡核酸进行PCR扩增而产生的双链靶DNA克隆进CHO报告载体中(pCLS1058，图7)。

i)CHO细胞中的染色体外测定

根据供应商(QIAGEN)的方案用Polyfect转染试剂转染CHO细胞。转染后72小时，去除培养基并添加150μl裂解/显色缓冲液(1L缓冲液含有：100ml裂解缓冲液(Tris-HCl 10mM pH7.5、NaCl 150mM、Triton X1000.1％、BSA 0.1mg/ml、蛋白酶抑制剂)，10ml Mg 100×缓冲液(MgCl₂100mM，β-巯基乙醇35％)，110ml ONPG 8mg/ml和780ml磷酸钠0.1M pH7.5)用于β-半乳糖苷酶液体实验。在37℃孵育后，在420nm处测定吸光度。整个过程利用自动化BioCel

(Velocityll)平台进行。

2)结果

a)18种XPC单链大范围核酸酶对3种XPC靶标的切割活性

表1显示了用于构建不同单链分子的不同接头。对于每个单链分子，接头起始于N端X2突变体的最后一个残基(P163)之后，在接头之后，N端H33突变体起始于N6残基。

表1：接头

使用如之前所述的酵母筛选测定(国际PCT申请2004/067736；Epinat等，Nucleic Acids Res.，2003，31：2952-2962；Chames等，Nucleic Acids Res.，2005，33，e178；Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458；)，监测18种XPC单链分子对3种XPC靶标C1、C3和C4的切割活性。如图8所示，所有单链分子构建体都能切割C1靶标，对C3靶标也有很强的切割活性，对C4靶标的切割活性也可以检测到。将两种单链分子X2-L1-H33和X2-RM2-H33克隆进哺乳动物表达载体中，并且在CHO细胞中用染色体外测定检测了它们对XPC靶标的活性(图9)。该测定证实了酵母切割图谱(图9)。进一步地，在CHO细胞中，X2-RM2-H33对C1靶标的活性要高于X2-L1-H33。在CHO细胞中，C4切割几乎检测不到。没有检测出X2对C3的切割，同样地，H33也不切割C4(数据未显示)。因此，单链分子对C3靶标的强切割提示，接头未消除分子间种类的形成，这是两种不同分子中H33单元的二聚化界面相互作用的结果。假H33同二聚体的形成是C3切割的原因。

b)G19S突变单独对XPC单链大范围核酸酶切割特异性的影响

为了验证这一假说，在两个单链分子的H33C端突变体中引入G19S突变。之前已证明，G19S突变(I-CreI第19位残基的突变，根据pdb 1G9Y编号)可消除功能性同二聚体的形成，而增强显示G19S单体的异二聚体的活性(国际PCT申请WO 2008/010093)。在CHO细胞中用染色体外测定，将获得的两种单链分子(X2-L1-H33_G19S和X2-RM2-H33_G19S)针对3种XPC靶标进行表征。图10显示，G19S突变不仅提高对C1靶标的活性，还显著降低对C3靶标的活性。作为比较，图10还列出了X2/H33异二聚体对3种XPC靶标的切割模式。

这些结果证实了由于两个H33单元相互作用而形成分子间种类的假说。同样地，两个X2单元之间的相互作用可能是C4靶标弱切割的原因(图8和图9)。因此，尽管在X2和H33单体之间引入接头有利于分子内相互作用(例如，结果使C4切割降低)，但是不能消除分子间相互作用。

尽管如此，改造的XPC单链分子X2-RM2-H33_G19S对C1 XPC靶标的切割比X2/H33异二聚体更强，而其对两个回文C3和C4靶标的切割活性比X2/H33异二聚体低很多。单链分子X2-RM2-H33_G19S展示了比X2/H33异二聚体好得多的特异性，而且其活性水平与I-SecI相当，后者是检验DNA双链断裂导致同源性重组的金标准。

c)G19S突变与其他破坏形成功能性同二聚体的其他突变的组合对XPC单链大范围核酸酶切割特异性的影响

图11展示了在酵母筛选测定中，3种单链分子X2-L1-H33、SCX1和SCX2对3种XPC靶标的切割活性。原始单链分子对C1和C3靶标有强切割活性，但是引入K7E/E8K突变和G19S突变以产生SCX1和SCX2分子后，对C1靶标的切割活性提高，而对C3靶标的切割活性完全消除。因此，K7E/E8K突变和G19S突变可成功地引入到单链分子中，在不影响对目的DNA靶标切割活性的同时提高其特异性。

实施例2：制备切割中国仓鼠HPRT基因的单链衍生自I-CreI的大范围核酸酶

扫描来自中国仓鼠的次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因以寻找可能的靶位点。在基因的ORF中鉴定了22bp的序列，称为HprCH3 (cgagatgtcatgaaagagatgg：SEQ ID NO：34)(图12)。从HprCH3靶标产生两种回文序列靶标HprCH3.3和HprCH3.4(图13)。由于HprCH3.3靶标与实施例1中描述的C3靶标相同，所以H33 I-CreI突变体对HprCH3.3(C3)靶标产生强切割。HprCH3.4靶标是10CAT_P靶标和5CTT_P靶标的组合。如之前所述获得能切割10CAT_P靶标的I-CreI突变体(Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149；国际PCT申请WO 2007/060495和WO 2007/049156)并如Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458、国际PCT申请WO 2006/097784和WO 2006/097853所述获得能切割5CTT_P靶标的I-CreI突变体。如之前所述(Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149；国际PCT申请WO 2007/049095和WO 2007/057781)将这些突变体组合在一起，然后筛选其对HprCH3.4 DNA靶标的切割。被称为MA17的I-CreI突变体作为HprCH3.4切割酶被分离出来。但是，发现由于其松弛的特异性，MA17也能切割HprCH3.3靶标(图14)。与I-CreI野生型序列相比，MA17突变体具有以下突变：S32T、Y33H、Q44R、R68Y、R70S、S72T、D75N和I77N。最后一步是将H33和MA17I-CreI突变体在酵母中共表达，如之前所述(国际PCT申请WO 2006/097854和Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458)，导致对HprCH3 DNA靶标的切割。

按照与实施例1相同的方案，构建两种HPRT单链构建体。使用了L1和RM2两种接头(见实施例1的表1)，产生了MA17-L1-H33和MA17-RM2-H33单链分子。第二步，在C端H33突变体中引入G19S突变，产生了另外两种单链大范围核酸酶MA17-L1-H33_G19S和MA17-RM2-H33_G19S。然后在酵母和CHO细胞中检测这些不同构建体对HprCH3靶标及其两种衍生物HprCH3.3靶标和HprCH3.4靶标的活性。

1)材料和方法

见实施例1。

2)结果

使用如之前所述的酵母筛选测定(国际PCT申请WO 2004/067736；Epinat等，Nucleic Acids Res.，2003，31：2952-2962；Chames等，Nucleic Acids Res.，2005，33，e178；Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458；)，检测3种单链分子(MA17-L1-H33、MA17-L1-H33_G19S和MA17-RM2-H33) 对3种HPRT靶标HprCH3、HprCH3.3和HprCH3.4的活性。如图14所示，HprCH3靶标不被MA17-L1-H33切割，但可被另外两种单链分子切割。因此，在我们改造单链构建体的方法中RM2接头似乎更适用，这在实施例1中也观察到了。这些结果也证实，G19S突变的存在可增强异二聚体活性。与MA17/H33异二聚体相比，所有3种单链分子对HprCH3.3(与实施例1中的C3靶标相同)都有强切割，但不切割HprCH3.4靶标。在这种情况下，对HprCH3.3(C3)的切割不一定是由于形成了分子间种类：既然MA17突变体和H33突变体都可以作为同二聚体切割HprCH3.3靶标，那么从理论上来说，MA17/H33异二聚体或MA17-RM2-H33单链单体都可以切割HprCH3.3靶标。MA17-L1-H33_G19S和MA17-RM2-H33_G19S仍切割HprCH3.3靶标，这证实了这个假说。下一步，将4种单链分子(MA17-L1-H33、MA17-L1-H33_G19S、MA17-RM2-H33和MA17-RM2-H33_G19S)克隆进哺乳动物表达载体中，在CHO细胞中检测对3种HPRT靶标的切割(图15)。MA17-RM2-H33_G19S单链分子表现出最强的活性。同样地，观察到了对HprCH3.3(C3)靶标的强切割，而对HprCH3.4靶标的切割很弱或者没有。

实施例3：产生切割人RAG1基因的衍生自I-CreI的单链大范围核酸酶

RAG1基因参与V(D)J重组过程，这是免疫球蛋白和T淋巴细胞受体(TCR)成熟的关键步骤。RAG1基因的突变导致T淋巴细胞成熟缺陷，同时伴随有B淋巴细胞功能缺陷，这导致重度联合免疫缺陷(SCID)。鉴定了位于人RAG1基因内含子和第二个外显子接合处的22bp DNA序列(称为RAG1.10，SEQ ID NO：41；图16)作为可能被我们的大范围核酸酶切割的序列(Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149；国际PCT申请WO 2008/010093)。从RAG1.10序列衍生出了两种回文序列RAG1.10.2和RAG1.10.3(图17)。RAG1.10.2靶标是10GTT_P与5CAG_P靶标的组合，RAG1.10.3靶标是10TGG_P与5GAG_P靶标的组合。如之前所述(Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149；国际PCT申请WO 2007/049095、WO 2007/057781、WO 2007/049156、WO 2007/060495、WO 2006/097784和WO 2006/097853；Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458)，通过组合能从一侧切割10GTT_P和5CAG_P靶标和从另一侧切割10TGG_P和5GAG_P靶标的I-CreI突变体，获得对RAG1.10.2和RAG1.10.3靶标的强切割酶。然后如之前所述共表达切割酶(国际PCT 申请WO 2006/097854；Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458；)，导致对RAG1.10靶标的强切割。M2/M3 RAG1.10异二聚体在酵母中表现出最强的切割(国际PCT申请WO 2008/010093)。M2是RAG1.10.2切割酶，其与I-CreI野生型序列相比具有以下的突变：N30R、Y33N、Q44A、R68Y、R70S和I77R。M3是RAG1.10.3切割酶，其与I-CreI野生型序列相比具有以下的突变：K28N、Y33S、Q38R、S40R、Q44Y、R70S、D75Q和I77V。

按照与实施例1和2相同的实验方案，用2种接头L1和RM2(见实施例1的表1)构建3种单链构建体，产生3种单链分子：M2-L1-M3、M2-RM2-M3和M3-RM2-M2。第二步，在M2-L1-M3和M2-RM2-M3单链分子的N端M2突变体中引入G19S突变，产生了另外两种构建体。此外，在M3-RM2-M2的M3突变体中引入K7E、K96E突变，M2突变体中引入E8K、E61R突变，以产生单链分子：M3(K7E K96E)-RM2-M2(E8K E61R)，其又被称为SC_OH。然后在酵母中检测这6种单链构建体对RAG1.10靶标及其两种衍生物RAG1.10.2和RAG1.10.3的切割。

1)材料和方法

见实施例1，只是I-CreI CLS的突变(T42A、E110W和Q111R)，已被复原。

SC_OH单链分子的克隆

对克隆在pCLS0542酵母表达载体中的携带K7E和K96E突变的M2突变体进行PCR反应。PCR反应使用反向引物CreCterSacI(5’-tagacgagctcctacggggaggatttcttcttctcgct-3’；SEQ ID NO：78)和正向引物RM2(5’-tatcggccggtggatctgataagtataatcaggctctgtctaaatacaaccaagcactgtccaagtacaatcaggccctgtctggtggaggcggttccaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3’；SEQ ID NO：66)。

纯化PCR片段并用EagI和SacI消化，连接到也经EagI和SacI消化的携带E8K和E61R突变之M3突变体的酵母表达载体中。对克隆进行测序后，获得SC_OH单链分子。

2)结果

使用如之前所述的酵母筛选测定(国际PCT申请WO 2004/067736；Epinat等，Nucleic Acids Res.，2003，31：2952-2962；Chames等，Nucleic Acids Res.，2005，33，e178；Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458；)，监测4种RAG1单链分子(M2-L1-M3、M2_G19S-L1-M3、M2-RM2-M3和M2_G19S-RM2-M3)对3种RAG1靶标RAG1.10、RAG1.10.2和RAG1.10.3的活性(图18)。如在实施例1和实施例2中观察到的，在构建单链构建体的方法中RM2接头似乎更适用：RAG1.10靶标被M2-RM2-M3切割，但不被M2-L1-M3切割。此外，发现M2-RM2-M3还可切割RAG1.10.2。由于M3不能切割RAG1.10.2(图18)，这些结果提示，分子间相互作用仍可导致两个M2单元相接触，这将形成同二聚体或者假同二聚体种类，导致对回文RAG1.10.2靶标的切割。

在M2突变体中引入G19S突变提高了这两种分子的活性，因为M2_G19S-L1-M3切割RAG1.10靶标，而M2_G19S-RM2-M3的活性比M2-L1-M3更高。此外，如之前所述(见本申请实施例1和国际PCT申请WO 2008/010093)可破坏形成功能性同二聚体的G19S突变消除了RAG1.10.2切割。这个结果与来自不同M2-RM2-M3单链分子的M2单元之间仍可发生相互作用的假说一致。但是，单链结构可能在一定程度上更有利于分子内相互作用，因为与M3相反，M2-RM2-M3分子并不切割RAG1.10.3。总之，在酵母中M2_G19S-RM2-M3RAG1单链分子以饱和水平切割RAG1.10靶标，与用M2/M3异二聚体观察到的相当，并且完全不切割两种衍生的回文靶标RAG1.10.2和RAG1.10.3。

图19所示针对3种RAG1.10靶标对两种单链分子M3-RM2-M2和SC_OH进行的酵母筛选证明，K7E/E8K和E61R/K96E的引入允许消除对RAG1.10.2靶标的异二聚体活性，而不降低对RAG1.10靶标的单链切割活性。因此，可在单链分子中引入这些突变以提高其特异性，而不影响其对目的DNA靶标的活性。

实施例4：制备RAG1单链分子，其中具有构成单链分子的两种突变体的不同定位以及G19S突变的不同定位

为了评价每种突变体和G19S突变的定位对单链分子活性的影响，使用我们的酵母筛选测定，检测6种构建体(M2-RM2-M3、M2_G19S-RM2-M3、M2-RM2-M3_G19S、M3-RM2-M2、M3_G19S-RM2-M2、 M3-RM2-M2_G19S)对3种靶标RAG1.10、RAG1.10.2和RAG1.10.3的切割。

1)材料和方法

见实施例1。

2)结果

如图20所示，所有6种单链分子(M2-RM2-M3、M2_G19S-RM2-M3、M2-RM2-M3_G19S、M3-RM2-M2、M3_G19S-RM2-M2、M3-RM2-M2_G19S)对RAG1.10靶标具有高活性，活性与原始M2/M3异二聚体对相同靶标的活性相当。单链分子中单体M2或M3的相对位置(N端或C端)对分子的总体活性没有影响。例如，M2-RM2-M3蛋白与M3-RM2-M2分子有相同的切割模式，以相同的强度切割RAG1.10和RAG1.10.2靶标，但不切割RAG1.10.3靶标(RR靶标)。

对一些构建体来说，RAG1.10.2回文靶标是可以切割的，这提示可以出现分子间相互作用，并且产生有活性的核酸酶。但是，在引入G19S突变后，这些残留的活性就被消除。图20对分子2和分子3(M2_G19S-RM2-M3和M2-RM2-M3_G19S)活性谱的比较提示，当导致该活性的突变体(这里是M2突变体)携带G19S突变时，G19S突变的定位不影响对RAG1.10靶标的活性，但可破坏残留的同二聚体活性。

实施例5：G19S突变在单链分子中的重要性，如在CHO细胞的染色体外测定中所示

就RAG1.10切割活性而言，前文描述的6种单链分子以及实施例3中描述的SC_OH单链分子在酵母筛选测定中似乎是等效的。但它们均以饱和水平切割该靶标。因此，在CHO细胞中，用染色体外测定(如实施例1中所述)评价2种单链分子在携带或不携带G19S突变的情况下对3种靶标RAG1.10、RAG1.10.2和RAG1.10.3的活性。本测定选择的4种单链分子是：M3-RM2-M2、M3-RM2-M2_G19S、M3^--RM2-M2⁺和M3^--RM2-M2⁺ _G19S。M3^-表示M3突变体携带K7E和K96E突变，M2⁺表示M2突变体携带E8K和E61R突变。

1)材料和方法

将M3 ^- -RM2-M2 ⁺ 和M3 ^- -RM2-M2 ⁺ _G19S 分子克隆进哺乳动物表达载体中方法与实施例1中介绍的完全相同，只是引物CCM2For被替换成引物CCM2ForE8K

(5’-AAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGACCATGGCCAATACCAAATATAACAAAAAGTTCC-3’：SEO ID NO：93)。

2)结果

图21显示了4种单链分子M3-RM2-M2、M3-RM2-M2_G19S、M3^--RM2-M2⁺和M3^--RM2-M2⁺ _G19S对3种靶标RAG1.10、RAG1.10.2和RAG1.10.3在CHO细胞中的染色体外SSA活性。对这3种靶标的活性表示为原始M2/M3异二聚体对相同的3种靶标的活性的百分比。这4种单链分子具有与背景水平相同的同二聚体活性(对RAG1.10.2和RAG1.10.3靶标)。图21还显示，G19S突变是单链分子活性所必需的，因为只有携带了G19S突变的两种单链蛋白表现出与M2/M3异二聚体等效或甚至更高的RAG1.10靶标切割活性。

实施例6：RAG1单链分子在CHO-K1细胞中诱导高水平的基因靶向。

为了进一步评价两种单链分子M3-RM2-M2_G19S(由核苷酸序列SEQ ID NO：94编码的SEQ ID NO：95)和M3^--RM2-M2⁺ _G19S(由核苷酸序列SEQ ID NO：96编码的的SEQ ID NO：97)的切割活性，使用了CHO细胞中的染色体报告系统(图22)。在该系统中，由CMV启动子驱动的单拷贝LacZ基因被RAG1.10序列中断，因此无功能。用编码RAG1单链大范围核酸酶的质粒和LacZ修复质粒转染该细胞系，可以通过同源重组恢复功能性LacZ基因。之前已显示，双链断裂可诱导同源重组；因此，LacZ基因被修复的比率可作为基因组RAG1.10靶位点切割效率的指标。

1)材料和方法

CHO-K1细胞中的染色体测定

将含有报告系统的CHO-K1细胞系按每10cm培养皿2×10⁵个细胞的密度接种到完全培养基(Kaighn改良F-12培养基(F12-K)，补加2mM L-谷氨酰胺、青霉素(100UI/ml)、链霉素(100μg/ml)、两性霉素B(Fongizone)(0.25μg/ml)(INVITROGEN-LIFE SCIENCE)和10％FBS(SIGMA-ALDERICH CHIMIE))。第二天，用Polyfect转染试剂(QIAGEN)转染细胞。简单地说，用2μg LacZ修复基质载体与不同量的大范围核酸酶表达载体共转染。在37℃孵育72小时后，用0.5％的戊二醛在4℃固定细胞10分钟，用100mM含0.02％NP40的磷酸缓冲液洗2次，然后用染色缓冲液(10mM磷酸缓冲液、1mM MgCl₂、33mM六氰化铁(III)、33mM六氰化铁(II)、0.1％(v/v)X-Gal)染色。37℃孵育过夜后，在光学显微镜下观察培养板，并对LacZ阳性细胞克隆数进行计数。LacZ修复的比率以LacZ+灶点数除以转染的细胞数(5×10⁵)表示，并用转染效率校正。

2)结果

图22显示，两种单链分子M3-RM2-M2_G19S和M3^--RM2-M2⁺ _G19S可在CHO细胞中诱导高水平的基因靶向。与原始的M2/M3异二聚体相比，它们甚至可以将基因校正率提高为3.5倍。

实施例7：产生RAG1单链分子，其两个亚单位具有不同的N端和C端末尾

用M2-RM2-M3 RAG1单链分子构建新的单链分子构建体，其两个亚单位具有不同的N端和C端末尾。这些新的构建体使得可以对连接两个I-CreI衍生突变体的接头的最佳可能位置进行定位。I-CreI的N端包含六氨基酸残基的环，其后是LAGLIDADGα-螺旋(从残基K7开始)。在I-CreI的结构中(PDB代码1G9Y)，C端最后的10个残基可能是由于排列混乱，因此是看不见的。在该结构中，C端在残基D153结束，螺旋α6包括145～150位残基。因此，制备了一些单链分子构建体，其中M2或M3突变体的N端起始于残基M1、N2或N6，而C端结束在不同的位置，分别是S145、L152、S156和K160。用之前所述的酵母筛选测定(见实施例1)监测这些不同的RAG1单链分子构建体的活性。

1)材料和方法

a)在酵母表达载体中克隆M2突变体的截短形式

RAG1 M2-RM2-M3单链分子的克隆首先需要获得克隆在酵母表达载体(pCLS0542)中的M2突变体(见实施例3的材料和方法)。为了克隆M2突变体的截短形式，需要用不同的引物对进行PCR反应，这些引物对是：CreNter6/CreCter、CreNter/CreCter160、CreNter/CreCter156、CreNter/CreCter152、CreNter/CreCter145。下面的表2列出了这些不同引物的序列。将不同的PCR片段用NcoI和EagI消化，然后连接进也经NcoI和EagI消化的pCLS0542载体。然后对克隆进行测序。M2突变体的截短形式分别是：M2(6-163)、M2(1-160)、M2(1-156)、M2(1-152)和M2(1-145)，其中的数字表示M2突变体编码序列中包含的I-CreI残基。

b)克隆两个亚单位具有不同末尾的RAG1单链分子

对I-CreI CLS形式的M3突变体进行不同的PCR反应。每个PCR反应使用一种正向引物和一种反向引物。有两种可能的正向引物(RM2和RM2N2)和5种可能的反向引物(CreCterR60、Cre160R60、Cre156R60、Cre152R60和Cre145R60)。正向引物使得可以获得起始于残基N6或N2的M3编码序列，反向引物使得可以获得分别结束于残基P163、K160、S156、L152和S145的M3编码序列。将不同的PCR片段纯化，并用EagI和SacI消化，将每个PCR片段连接进也经EagI和SacI消化的上述M2突变体之一的酵母表达载体中。对克隆进行测序后，获得酵母表达载体中所有可能的单链分子。

表2：引物序列

2)结果

从RAG1M2-RM2-M3单链分子开始，构建了N端M2突变体在其C端末尾被截短的4种新的单链分子。这些蛋白被称为SCtr1、SCtr2、SCtr3和SCtr4，分别对应于M2突变体序列在残基145、152、156和160位终止的单链分子。用我们的酵母筛选测定检测这4种分子以及原始M2-RM2-M3单链分子对3种靶标RAG1.10、RAG1.10.2和RAG1.10.3的切割。图23显示，SCtr1对3种靶标没有切割活性，其他3种截短形式的单链分子可切割RAG1.10靶标，微弱切割RAG1.10.2靶标。这个结果提示，M2突变体中形成螺旋α6的145～152位残基是单链分子活性所必需的。

实施例8：在人细胞中内源Rag1基因座的基因靶向

为了进一步确认改造的单链Rag1大范围核酸酶的切割活性，对其刺激在内源性人RAG1基因座处发生同源重组的能力进行了评价(图24)。用两种单链分子M3-RM2-M2_G19S(SEQ ID NO：95)和M3^--RM2-M2⁺ _G19S(SEQ ID NO：97)中之一的哺乳动物表达质粒和供体修复质粒pCLS1969(图25)转染细胞，所述供体修复质粒含有1.7kb的外源DNA序列，其侧翼为与人RAG1基因座具有同源性的长2kb和1.2kb的两段序列。大范围核酸酶对天然RAG1基因的切割产生了用于同源重组的基质，其可利用供体修复质粒(含有1.7kb的外源性DNA，侧翼是同源臂)作为修复基质。因此，RAG1基因座发生定向整合的比率指示了基因组RAG1.10靶位点的切割效率。

1)材料和方法

a)大范围核酸酶表达质粒

本实施例中所采用的Rag1大范围核酸酶是克隆到哺乳动物表达载体pCLS1088(图6)中的M3-RM2-M2_G19S(SEQ ID NO：95)和M3^--RM2-M2⁺ _G19S(SEQ ID NO：97)。

b)供体修复质粒

用于基因靶向实验的供体质粒包含由PCR产生的2075bp的RAG1基因座片段(第11号染色体的36549341～36551416位，NC_000011.8)和1174bp的RAG1基因座片段(第11号染色体的36551436～36552610位，NC_000011.8)，前者作为左侧同源臂，后者作为右侧同源臂。利用在对RAG1基因座进行PCR扩增时引入的EcoRI和BamHI酶切位点，将包含SV40启动子、新霉素抗性基因和IRES序列的1.8kb的外源DNA片段插入所述两个同源臂之间。所获得的质粒为pCLS1969(图25)。

c)Rag1基因靶向实验

将人肾胚293H细胞(Invitrogen)按每10cm培养皿1×10⁶个细胞的密度接种到完全培养基培养(DMEM，补加2mM L-谷氨酰胺、青霉素(100UI/ml)、链霉素(100μg/ml)、两性霉素B(Fongizone)(0.25μg/ml)(Invitrogen-Life Science)和10％FBS)中。第二天，根据供应商的方案，用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)转染细胞。简单地说，将2μg供体质粒与3μg单链大范围核酸酶表达载体共转染。在37℃孵育72小时后，用胰酶处理细胞，并以96孔板中每孔10个细胞或每10cm培养板200个细胞接种到完全培养基中。随后用ClonePix机器人(Genetix)从10cm培养板中挑选单克隆。根据供应商的方案，用ZR-96基因组DNA试剂盒(Zymo research)提取基因组DNA。

d)基因靶向事件的PCR分析

基因靶向的频率通过基因组DNA的PCR来确定，其中使用引物F20-neo：5’-AGG ATCTCCTGTCATCTCAC-3’(SEQ ID NO：98)和RagEx2-R12：5’-CTTTCACAGTCCTGTACATCTTGT-3’(SEQ ID NO：99)，得到2588bp的基因靶向特异性PCR产物(图26)。F2引物是正向引物，位于新霉素编码序列中。R12引物是反向引物，位于供体修复质粒右侧同源臂外侧的人RAG1基因上。

e)Southern印迹分析

用经HindIII消化的基因组DNA进行Southern印迹分析，并与830bp的RAG1特异性探针杂交，其中该探针位于供体修复质粒右侧同源臂的3’。

2)结果

将人肾胚293H细胞用两种载体共转染：表达两种单链Rag1大范围核酸酶之一的质粒和供体修复质粒pCLS1969(图25)。还仅用供体修复质粒转染293H细胞，作为自发重组的对照。然后将细胞以每孔10个细胞置于96孔板中，或置于10cm培养皿中，然后挑选单克隆。用材料和方法中所述的PCR来分析来自这些细胞的基因组DNA中的基因靶向。结果见表III。在缺少大范围核酸酶(只有修复质粒)的情况下，在被分析的10个细胞池的2560个细胞中或被检测的94个单克隆中没有发现PCR阳性信号。相反，在M3-RM2-M2_G19S大范围核酸酶存在下，在被分析的10个细胞池的2560个细胞中有11个阳性克隆，提示重组率为0.4％。被检测的94个单克隆中没有阳性克隆。在M3^--RM2-M2⁺ _G19S存在下，在被分析的10个细胞池的2560个细胞中有34个阳性克隆(1.4％)，而被检测的94个单个克隆中有4个阳性克隆(4.3％)。这4个单克隆的Southern印迹分析表明，其中3个与Rag1基因座的基因靶向事件相符(图27)。这些结果说明，两种单链分子M3-RM2-M2_G19S和M3^--RM2-M2⁺ _G19S可在内源Rag1基因座处诱导高水平的基因靶向。

表3：人293H细胞中Rag1基因座发生基因靶向的频率

大范围核酸酶	每个孔的细胞数	PCR+事件	基因靶向频率
				M3-RM2-M2_G19S	10	11/2510	0.4％
M3-RM2-M2_G19S	1	0/94	NA
				M3^--RM2-M2⁺ _G19S	10	34/2430	1.4％
M3^--RM2-M2⁺ _G19S	1	4/94	4.3％
				无	10	0/2560	NA
无	1	0/94	NA

NA：不适用

实施例9：衍生自I-CreI的单链大范围核酸酶是稳定的

1)材料和方法

a)蛋白表达和纯化

为了共表达异二聚体I-CreI衍生物，将每个单体ORF克隆进C端带有6×His标签或Strep标签的CDFDuet-1(NOVAGEN)载体中，并按之前所述(P.Redondo等，Nature，2008，456，107-1)纯化双标签异二聚体。将C端带有His₆标签的单链M3-RM2-M2_G19S蛋白序列(实施例4)克隆到pET24d(+)载体中，并在大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS细胞(NOVAGEN)中表达，后者在加入了卡那霉素和氯霉素的LB培养基中培养。用IPTG在37℃诱导5h或者在20℃诱导15h获得了高水平的表达，但是，在裂解缓冲液(含50mM磷酸钠pH 8.0、300mM NaCl、5％甘油和蛋白酶抑制剂)中超声处理并在20000g超速离心1h后，用抗-His抗体对蛋白进行western印迹仅在不可溶级分中发现了蛋白。因此，可先在裂解缓冲液(加入8M尿素)中进行溶解，在变性条件下纯化蛋白。超速离心(40000g，2h)使其澄清后，将样品加到用相同缓冲液平衡的装填有Q-琼脂糖XL树脂(GE Healthcare)的柱中。这个纯化步骤从蛋白质中分离了所有核酸(被保留在柱中)并提高了后续纯化步骤的性能。将蛋白流过用裂解液(加有8M尿素)平衡的装填有Co²⁺的HiTrap螯合HP 5ml柱(GE Healthcare)以回收蛋白。在加样和柱洗脱后，用加有0.5M咪唑的相同缓冲液洗脱蛋白。收集富含蛋白的级分(用SDS-PAGE判定)，并在4℃以20倍(逐滴)稀释到PH6.020mM磷酸钠、300mMNaCl进行再折叠(蛋白的终浓度为 0.13mg/ml)。将再折叠的蛋白加到用相同缓冲液平衡的5ml肝素柱中，用1M NaCl梯度洗脱。合并纯化蛋白级分，并浓缩至1.4mg/ml(35.6nM，用280nm吸光度测定)，然后立即使用，或在液氮中快速冷冻后于-80℃中保存。

b)蛋白的生物化学和生物物理学表征

在Jasco J-810分光光度计上，用0.2cm光路长度的石英杯对磷酸盐缓冲液中的10-4μM蛋白溶液进行圆二色性(CD)测量。通过升温(1℃/min)(使用程序可控的Peltier热电器)来诱导平衡解折叠。在室温下，用Superdex 200 10/300GL柱(在20mM磷酸钠缓冲液pH6.0、1M NaCl中)，在

系统(GE)进行分析型凝胶过滤色谱。将100μL的SC-v3v2G19S构建体样品以0.3mg/ml的浓度注入，以0.2ml/min的流速洗脱。柱已经用蓝色葡聚糖(排出体积)和17～670kDa的分子量标准(BioRad)进行了校准。

2)结果

用质谱证实蛋白质的身份，结果显示，在纯化的多肽链中不存在第一个甲硫氨酸。通过圆二色和NMR发现纯化的蛋白折叠成与野生型相似的结构，通过分析性超速离心和凝胶过滤发现在溶液中为二聚体。单链分子的结构和稳定性与异二聚体变体非常相似，而且这种分子在溶液中似乎以单体形式存在(图28)。

实施例10：衍生自I-CreI的单链大范围核酸酶没有毒性

1)材料和方法

a)细胞存活测定

将CHO-K1细胞系以每10cm培养皿2×10⁵个细胞的密度接种。第二天，用不同量的大范围核酸酶表达载体和恒定量的编码GFP的质粒共转染10cm培养板中的CHO-K1细胞。转染后的第1天和第6天，通过流式细胞术(Guava EasyCyte，Guava technologies)监测GFP的表达。以转染后第1天的转染效率校正的细胞存活计算为[(在第6天表达GFP的大范围核酸酶转染细胞)/(在第1天表达GFP的大范围核酸酶转染细胞)]/[(在第6 天表达GFP的对照载体转染细胞]/(在第1天表达GFP的对照载体转染细胞)]的比值。

b)γH2AX免疫细胞化学

对γH2AX免疫细胞化学，用Polyfect试剂(Qiagen)和4μg的DNA混合物(含不同量的编码带HA标签的大范围核酸酶的质粒，并用空载体作为填充物补至4μg)转染CHO-K1细胞。转染48h后，将细胞用2％多聚甲醛固定30分钟，用0.5％Triton在室温下透化处理5分钟。清洗后，将细胞与PBS/triton 0.3％缓冲液(含10％正常山羊血清(NGS)和3％BSA)孵育1h，以封闭非特异性染色。然后将细胞与抗γH2AX抗体(Upstate：1/10000)和抗HA抗体(Santa Cruz：1/100)(用含3％BSA和10％NGS的PBS/triton 0.3％缓冲液稀释)在室温下孵育1h，再与二抗Alexa Fluor 488山羊抗小鼠抗体(Invitrogen-分子探针：1/1000)和Alexa Fluor546山羊抗兔抗体(用含3％BSA和10％NGS的PBS/triton 0.3％缓冲液稀释)孵育1h。与1μg/ml 4′，6-二氨基-2-苯吲哚(DAPI；Sigma)孵育后，盖上盖玻片，通过荧光显微术可以看到转染(HA阳性)细胞中的γH2AX灶点。

2)结果

毒性是DSB诱导的重组技术的主要问题，尤其是对于活性/毒性比是主要考虑因素的治疗应用而言。RAG1大范围核酸酶(实施例4和5)的毒性在细胞存活测定中进行了评价，如之前所述(M.L.Maeder等，Mol.Cell.，2003，31，2952-)。通过调整该测定来研究效力与毒性之间的联系，以用于CHO-K1细胞进行活性剂量应答测定。在活性剂量(即大范围核酸酶显示最高活性水平时的剂量，图29A)下，无论使用何种大范围核酸酶，都几乎检测不到毒性(图29B)。但是，M2/M3异二聚体在高剂量下会表现出明显的毒性，这可通过专性异二聚体设计来部分减轻。作为再现I-SceI所得模式的最好形式，单链设计也代表了一种提高。序列特异性内切核酸酶的毒性通常是由于脱靶切割的结果，其可导致突变、缺失、易位和其他严重的基因组改变(M.H.Porteus，D.Carroll，Nat.Biotechnol.，2005，23，967-)。通过监测磷酸化H2AX组蛋白(γH2AX)灶点的形成来评价脱靶切割。γH2AX灶点形成是细胞对DNA双链断裂(DSB)的第一反应之一，这为监测活细胞中DSB的发生情况提供了简便的方法(E.P.Rogakou等，J.Biol.Chem.，1998，273，5858)。用两种剂量的大范围核酸酶表达载体(活性剂量和10倍过量)转染CHO-K1细胞。M2(G19S)/M3(G19S)异二聚体作为无毒性对照，因为该分子在该测定中完全没有活性。在活性剂量下，无论使用何种大范围核酸酶变体，均没有发现高于背景的信号，这与报道的结果一致(P.Redondo等，Nature，2008，456，107-)。根据之前的数据，M2(G19S)/M3异二聚体以10倍活性剂量使用时，诱导了显著水平的灶点形成，如图29C所示。而使用专性异二聚体或单链设计使得脱靶切割尽可能低。最后，用单链分子M3-RM2-M2⁺ _G19S获得的信号与用I-SceI大范围核酸酶获得的信号相似。

Claims

1.单链I-CreI大范围核酸酶，其由以肽接头连接在一起的两个结构域组成，其中

(a)衍生自亲本I-CreI单体的每个结构域由所述亲本I-CreI单体的一部分组成，其从I-CreI中第一个α螺旋(α₁)的起点延伸到α₆螺旋(α₆)的末端，并依次包括：I-CreI的α₁β₁β₂α₂β₃β₄α₃核心结构域、α₄螺旋和α₅螺旋、C端环以及α₆螺旋，并且

(b)这两个结构域通过15～35个氨基酸的肽接头连接在一起，其中所述接头由序列SEQ ID NO：2组成，所述肽接头使得所述两个结构域能够折叠成I-CreI二聚体，其能够结合并切割嵌合DNA靶标，该嵌合DNA靶标由各亲本同二聚体I-CreI大范围核酸酶靶序列中不同的一半组成。

2.根据权利要求1的单链I-CreI大范围核酸酶，其中N端结构域起始于I-CreI的1或6位，C端结构域起始于I-CreI的2或6位。

3.根据权利要求1或2的单链I-CreI大范围核酸酶，其中N端和/或C端结构域终止于I-CreI的152、156、160或163位。

4.根据权利要求1的单链I-CreI大范围核酸酶，其中两个结构域包含位于I-CreI的26、28、30、32、33、38和40和/或44、68、70、75和77位中一个或多个位置上的不同替换，所述单链I-CreI大范围核酸酶能切割非回文DNA序列，其中所述DNA序列中至少+3～+5、+8～+10、-10～-8和-5～-3位核苷酸对应于来自目的基因的DNA靶标的+3～+5、+8～+10、-10～-8和-5～-3位核苷酸。

5.根据权利要求4的单链I-CreI大范围核酸酶，其中所述替换是用选自A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、V、L和W中的氨基酸替换原始氨基酸。

6.根据权利要求1的单链I-CreI大范围核酸酶，其包含阻止由这两个结构域形成功能性同二聚体的突变，其中每个结构域各包含选自以下的至少一个突变：对于第一和第二结构域分别为K7E或K7D和E8K或E8R；F54G或F54A和L97F或L97W；K96D或K96E和E61R或E61K；R51D或R51E和D137R或D137K。

7.根据权利要求6的单链I-CreI大范围核酸酶，其中一个结构域包含用选自D和E的酸性氨基酸替换第7位和第96位的赖氨酸残基，另一结构域包含用选自K和R的碱性氨基酸替换第8位和第61位的谷氨酸残基。

8.根据权利要求1的单链I-CreI大范围核酸酶，其中一个结构域包含G19S突变。

9.根据权利要求8的单链I-CreI大范围核酸酶，其中另一结构域中或者这两个结构域中包含至少一个如权利要求6或7所述破坏形成功能性同二聚体的突变。

10.根据权利要求1的单链I-CreI大范围核酸酶，其由序列SEQ IDNO：95或SEQ ID NO：97组成。

11.编码权利要求1至10中任一项所述单链I-CreI大范围核酸酶的多核苷酸片段。

12.根据权利要求11的多核苷酸片段，其中编码所述两个结构域的核苷酸序列具有低于80％的核酸序列同一性。

13.根据权利要求12的多核苷酸片段，其中编码所述两个结构域的序列分别来自序列SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24。

14.包含权利要求11至13中任一项的多核苷酸片段的表达载体，所述多核苷酸片段与允许产生该单链I-CreI大范围核酸酶的调节序列有效连接。

15.权利要求14的载体，其包含靶向DNA构建体，所述靶向DNA构建体包含与所述单链I-CreI大范围核酸酶的基因组DNA靶标周围的区域具有同源性的序列。

16.权利要求15的载体，其中所述靶向DNA构建体包含：a)与所述基因组DNA靶标周围的区域具有同源性的序列，和b)待引入序列，其侧翼是a)的序列。

17.包含权利要求11至13中任一项的多核苷酸片段或权利要求14至16中任一项的载体的宿主细胞。

18.药物组合物，其至少包含权利要求1至10中任一项的单链I-CreI大范围核酸酶、权利要求11至13中任一项的多核苷酸片段或者权利要求14至16中任一项的载体。

19.权利要求18的组合物，还包含靶向DNA构建体，该靶向DNA构建体包含修复目的基因组位点的序列，其侧翼为与所述基因组位点具有同源性的序列。

20.权利要求1至10中任一项的至少一种单链I-CreI大范围核酸酶、权利要求11至13中任一项的至少一种多核苷酸片段、权利要求14至16中任一项的至少一种载体、权利要求17的至少一种宿主细胞用于在分子生物学、体内或体外遗传工程以及体内或体外基因组工程中非治疗目的的用途。

21.权利要求1至10中任一项的至少一种单链I-CreI大范围核酸酶、权利要求11至13中任一项的至少一种多核苷酸片段、权利要求14至16中任一项的至少一种载体用于制备在有此需要的个体中预防、改善或治疗遗传病的药物的用途。

22.权利要求21的用途，其中所述单链I-CreI大范围核酸酶由序列SEQID NO：95或SEQ ID NO：97组成，所述遗传病是与人RAG1基因中的突变有关的SCID综合征。

23.权利要求1至10中任一项的至少一种单链I-CreI大范围核酸酶、权利要求11至13中任一项的至少一种多核苷酸片段、权利要求14至16中任一项的至少一种载体用于制备药物的用途，所述药物用于在有此需要的个体中预防、改善或治疗由呈现DNA中间体的感染原所导致的疾病。

24.权利要求1至10中任一项的至少一种单链I-CreI大范围核酸酶、权利要求11至13中任一项的至少一种多核苷酸片段、权利要求14至16中任一项的至少一种载体用于在生物衍生产品或者旨在用于生物的产品中对呈现DNA中间体的感染原进行增殖抑制、灭活或缺失的用途或用于对物品进行消毒的用途。

25.权利要求23或24中的用途，其中所述感染原是病毒。

26.权利要求20至24中任一项的用途，其中所述大范围核酸酶、多核苷酸、载体、细胞与如权利要求15、16和19中任一项所述靶向DNA构建体相组合。

27.权利要求1至10中任一项的至少一种单链I-CreI大范围核酸酶、权利要求11至13中任一项的至少一种多核苷酸片段、权利要求14至16中任一项的至少一种载体作为用于改造其他大范围核酸酶的骨架的用途。