ES2773891T3 - Procedimientos para la producción de líneas celulares de mamífero modificadas con transgenes amplificados - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la inserción de una secuencia exógena en un locus que se pueda amplificar de una célula de mamífero que comprende: (a) proporcionar una célula de mamífero que tiene un sitio diana endógeno proximal a un gen de selección endógeno en el locus que se puede amplificar, en el que el sitio diana endógeno está de 0 a 100.000 pares de bases corriente abajo de la región reguladora 3' del gen de selección endógeno o de 0 a 100.000 pares de bases corriente arriba de la región reguladora 5' del gen de selección endógeno, en el que el sitio diana endógeno comprende: (i) una secuencia de reconocimiento para una endonucleasa específica del sitio; (ii) una región flanqueante 5' en 5' de la secuencia de reconocimiento; y (iii) una región flanqueante 3' en 3' de la secuencia de reconocimiento; y (b) introducir una rotura de doble cadena entre las regiones flanqueantes 5' y 3' del sitio diana endógeno; (c) poner en contacto la célula con un vector donante que comprende de 5' a 3': (i) una región flanqueante donante 5' homóloga de la región flanqueante 5' del sitio diana endógeno; (ii) una secuencia exógena; y (iii) una región flanqueante donante 3' homóloga de la región flanqueante 3' del sitio diana endógeno; de manera que la región flanqueante donante 5', la secuencia exógena y la región flanqueante donante 3' se insertan entre las regiones flanqueantes 5' y 3' del sitio diana endógeno mediante recombinación homóloga para proporcionar una célula modificada.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos para la producción de líneas celulares de mamífero modificadas con transgenes amplificados

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de la biología molecular y tecnología de ácido nucleico recombinante. En particular, la invención se refiere a procedimientos de inserción de genes en localizaciones determinadas del ADN cromosómico de líneas celulares de mamífero cultivadas que se someten a amplificación genética. La invención también de refiere a meganucleasas, vectores y líneas celulares modificadas necesarios para llevar a cabo los procedimientos, las líneas celulares resultantes de la aplicación de los procedimientos, y el uso de las líneas celulares para producir productos proteicos de interés.

Antecedentes de la invención

Las proteínas terapéuticas son el director primario del crecimiento en el mercado farmacéutico global (Kresse, Eur J Pharm Biopharm 72, 479 (2009)). En 2001, los biofarmacéuticos suponían 24,3 mil millones de $ en ventas. En 2007, este número se había más que doblado a 54,4 mil millones de $. Se estima actualmente que alcanza los 78 mil millones de $ en 2012 (Pickering, Spectrum Pharmaceutical Industry Dynamics Report, Decision Resources, Inc., 5 (2008)). Esto incluye las ventas de fármacos más “populares” tales como la eritropoyetina, activador del plasminógeno tisular, e interferón, así como numerosos fármacos “especializados” tales como terapias de reposición de enzimas para trastornos de almacenamiento lisosómico. El crecimiento del tamaño de mercado no es paralelo, sin embargo, está dirigido primariamente por la demanda meteórica de anticuerpos monoclonales completamente humanos y humanizados (Reichert, Curr Pharm Biotechnol 9, 423 (2008)). Debido a que tienen la capacidad de conferir un espectro virtualmente ilimitado de actividades biológicas, los anticuerpos monoclonales se están convirtiendo rápidamente en la clase de agentes terapéuticos más potentes disponibles para los médicos, No es sorprendente que más del 25 % de las moléculas que actualmente se someten a ensayos clínicos en los Estados Unidos y Europa son anticuerpos monoclonales (Reichert, Curr Pharm Biotechnol 9, 423 (2008)).

A diferencia de los agentes farmacéuticos más tradicionales, las proteínas terapéuticas se producen en células vivas. Esto complica mucho el procedimiento de fabricación e introduce una heterogeneidad significativa en las formulaciones del producto (Field, Recombinant Human IgG Production from Myeloma and Chinese Hamster Ovary Cells, in Cell Culture and Upstream Processing, Butler, ed., (Taylor y Francis Group, New York, 2007)). Además, los fármacos proteicos se necesitan a dosis inusualmente altas, que necesitan procedimientos de fabricación altamente escalables y hace que los costes de fabricación sean un determinante del precio principal. Por estas razones, el tratamiento con un anticuerpo terapéutico típico (por ejemplo, el monoclonal anti-HER2-neu Herceptin® cuesta de 60.000$- 80,000$ para un curso completo de tratamiento (Fleck, Hastings Center Report 36, 12 (2006)). Para complicar más la economía de la producción biofarmacéutica está el hecho de que muchos de losbiofarmacéuticos populares anteriores están fuera de patente (o estarán fuera de patente pronto) y los gobiernos de EE. UU. y EU esperan optimizar el procedimiento regulador de aprobación para agentes terapéuticos “biogenéricos” y “biosimilares” (Kresse, Eur J Pharm Biopharm 72, 479 (2009)). Estos factores deberían dar lugar a un aumento significativo de la competición por las ventas de muchos biofarmacéuticos destacados (Pickering, Spectrum Pharmaceutical Industry Dynamics Report, Decision Resources, Inc., 5 (2008)). Por lo tanto, existe un enorme interés en tecnologías que reduzcan los costes de fabricación de proteínas terapéuticas (Seth y col., Curr Opin Biotechnol 18, 557 (2007)).

Muchas de las proteínas farmacéuticas del mercado son glicoproteínas que no se pueden producir fácilmente en sistemas biológicos fáciles de manipular tales como bacterias o levaduras. Por esta razón, las proteínas terapéuticas recombinantes se producen casi exclusivamente en líneas celulares de mamífero, primariamente de ovario de hámster chino (por ejemplo, CHO-K1), mieloma de ratón (por ejemplo, NS0), riñón de hámster recién nacido (BHK), C127 murinas, riñón embrionario humano (por ejemplo, HEK 293), o células derivadas de la retina humana (por ejemplo, PER-C6) (Andersen y Krummen, Curr Opin Biotechnol 13, 117 (2002)). De estas, las células CHO son con mucho, la plataforma más común para la bioproducción debido a que ofrecen la mejor combinación de altos niveles de expresión proteica, poco tiempo de doblaje, tolerancia a un amplio intervalo de condiciones de medio, protocolos de transfección amplificación establecidos, una incapacidad para propagar la mayoría de patógenos humanos, insuficiencia de bloquear la propiedad intelectual, y el mayor récord de recorrido de aprobación por la FDA (Field, Recombinant Human IgG Production from Myeloma and Chinese Hamster Ovary Cells, in Cell Culture and Upstream Processing, Butler, ed. (Taylor y Francis Group, New York, 2007)).

Los productos farmacéuticos para el gran mercado se producen normalmente en enormes depósitos biorreactores con agitado que contienen cientos de litros de células c Ho que expresan establemente el producto proteico de interés (Chu y Robinson, Curr Opin Biotechnol 12, 180 (2001), Coco-Martin y Harmsen, Bioprocess International 6, 28 (2008)). En condiciones industriales optimizadas, dichos procedimientos de fabricación pueden dar lugar más de 5 g de proteína por litro de células por día (Coco-Martin y Harmsen, Bioprocess International 6, 28 (2008)). Debido al gran número de células implicadas (~ 50 mil millones de células por litro), el nivel de expresión proteico por célula tiene un efecto muy drástico sobre el resultado. Por esta razón, todas las células implicadas en la producción de un producto biofarmacéutico en particular se deben derivar de un único clon “de alta producción”, cuya producción constituye una de las etapas más exigentes en tiempo y recursos del procedimiento de fabricación (Clarke y Compton, Bioprocess International 6, 24 (2008)).

La primera etapa en la fabricación a gran escala de un producto biofarmacéutico es la transfección de células de mamífero con un ADN plasmídico que codifique el producto proteico de interés bajo el control de un promotor constitutivo fuerte. Los transfectantes estables se seleccionan utilizando como marcador un gen de selección también albergado en el plásmido. Más frecuentemente, este marcador es un gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR), que cuando se transfecta en una línea celular deficiente en DHFR tal como DG44 permite la selección de transfectantes estables utilizando un medio deficiente en hipoxantina. La razón primaria para utilizar la DHFR como marcador genético es que hace posible un proceso denominado “amplificación genética”. Cultivando los transfectantes estables en concentraciones gradualmente crecientes de metotrexato (MTX), un inhibidor de la DHFR, es posible amplificar el número de copias del gen DHFR presente en el genoma. Debido a que el gen que codifica el producto proteico de interés está acoplado físicamente al gen DHFR, esto resulta en la amplificación de ambos genes con un aumento concomitantes el nivel de expresión de la proteína terapéutica (Butler, Cell Line Development for Culture Strategies: Future Prospects to Improve Yields, in Cell Culture and Upstream Processing, Butler, ed., (Taylor y Francis Group, New York, 2007)). Los sistemas relacionados para la creación de líneas de bioproducción estables utiliza los genes de la glutamina sintetasa (GS) o la hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT) como marcadores genéticos y necesitan el uso de líneas celulares deficientes en GS o HPRT como huéspedes de la transfección (Clarke y Compton, Bioprocess International 6, 24 (2008)). En el caso del sistema HPRT, la amplificación genética se consigue cultivando las células en medio HAT, que contiene aminopterina, hipoxantina, y timidina (Kellems, ed. Gene amplification in mammalian cells: a comprehensive guide, Marcel Dekker, New York, 1993).

En todos estos sistemas el ADN plasmídico inicial comprende un casete de expresión del gen bioterapéutico y un marcador genético integrado en una localización aleatoria del genoma, dando como resultado una extrema variabilidad en la expresión de la proteína terapéutica de un transfectante estable a otro (Collingwood y Urnov, Targeted Gene Insertion to Enhance Protein Production from Cell Lines, in Cell Culture and Upstream Processing, Butler, ed. (Taylor y Francis Group, New York, 2007)). Por esta razón, es necesario explorar cientos o miles de transfectantes iniciales para identificar las células que expresan aceptablemente altos niveles de producto genético sea antes y después de la amplificación genética (Butler, Cell Line Development for Culture Strategies: Future Prospects to Improve Yields, in Cell Culture and Upstream Processing, Butler, ed. (Taylor y Francis Group, New York, 2007)). Una segunda consecuencia y más problemática de la integración genética aleatoria es el fenómeno del silenciamiento del transgén, en el que la expresión de la proteína recombinante se enlentece o cesa completamente con el tiempo (Collingwood y Urnov, Targeted Gene Insertion to Enhance Protein Production from Cell Lines, in Cell Culture and Upstream Processing, Butler, ed. (Taylor y Francis Group, New York, 2007)). Debido a que estos efectos a menudo no se manifiestan durante semanas o meses después de la transfección inicial y el proceso de exploración, generalmente es necesario llevar a cabo y expandir docenas de líneas clónicas independientes para identificar una que exprese la proteína de interés constantemente a lo largo del tiempo (Butler, Cell Line Development for Culture Strategies: Future Prospects to Improve Yields, in Cell Culture and Upstream Processing, Butler, ed. (Taylor y Francis Group, New York, 2007)).

Este gran número de etapas de exploración y expansión da como resultado un procedimiento muy largo y caro para generar simplemente la línea celular que, en último término, producirá el producto terapéutico de interés. Además, utilizando procedimientos convencionales, se necesita un mínimo de 10 meses (con una media de 18 meses) y un adelanto en investigación de decenas de millones de dólares en trabajo y material para producir un agrupamiento inicial de células que expresan la proteína adecuado para la fabricación industrial (Butler, Cell Line Development for Culture Strategies: Future Prospects to Improve Yields, in Cell Culture and Upstream Processing, Butler, ed. (Taylor y Francis Group, New York, 2007)). Si se tiene en cuenta la pérdida de tiempo en el mercado de una proteína terapéutica popular, las ineficacias en la producción de la línea celular pueden costar a los fabricantes biofarmacéuticos cientos de millones de dólares (Seth y col., Curr Opin Biotechnol 18, 557 (2007)).

Mucho del tiempo y gasto de la creación de la línea celular de bioproducción se puede atribuir a la integración genómica aleatoria del gen del bioproducto que da como resultado una variabilidad de clon a clon en el genotipo, por lo tanto, una variabilidad en la expresión genética. Una manera de superar esto es dirigir la integración genética en una localización determinada que se sepa que soporta un alto nivel de expresión genética. En este extremo, se han descrito varios sistemas que utilizan la Cree, Flp o OC31 recombinasas para dirigir la inserción de un gen de bioproducto (revisado en Collingwood y Urnov, Targeted Gene Insertion to Enhance Protein Production from Cell Lines, in Cell Culture and Upstream Processing, Butler, ed. (Taylor y Francis Group, New York, 2007)). Recientes realizaciones de estos sistemas, más notablemente el sistema Flp-in® comercializado por Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA), acoplan la integración del gen del bioproducto con la reconstitución de un indicador genético de división de manera que se pueden seleccionar las células con los genes dirigidos correctamente. Como se esperaba, estos sistemas dan como resultado una heterogeneidad muy reducida de la expresión genética, y en algunos casos, los transfectantes estables individuales se pueden agrupar, obviando el tiempo y gasto asociado con la expansión de un único clon.

El principal inconveniente de los sistemas de direccionamiento genético basados en recombinasa es que los sitios de reconocimiento de recombinasa (sitios IoxP, FRT, o attB/attP) no existente en los genomas de mamífero de origen natural. Por lo tanto, las células se tienen que modificar previamente para incorporar el sitio un sitio de reconocimiento para la recombinasa antes de que el sitio se pueda dirigir posteriormente la inserción genética. Debido a que el propio sitio de recombinasa se integra aleatoriamente en el genoma, sigue siendo necesario someterlo a una exploración y evaluación extensas para identificar los clones que albergan el sitio en una localización que sea adecuada para la expresión genética con un nivel alto, y a largo plazo (Collingwood y Urnov, Targeted Gene Insertion to Enhance Protein Production from Cell Lines, in Cell Culture and Upstream Processing, Butler, ed. (Taylory Francis Group, New York, 2007)). Además, la industria bioproductora tiene dudas para adoptar “nuevas” líneas celulares, tal como las que se han modificado para que alberguen un sitio de recombinasa, que no tienen un registro trazable de aprobación por la FDA. Por estas razones, los sistemas de modificación celular basados en recombinasa pueden no adoptarse fácilmente por la industria y es preferible una estrategia que permita a los biofabricantes utilizar sus líneas celulares existentes.

Sumario de la invención

La presente invención depende, en parte, del desarrollo de las líneas celulares de mamífero en las que se inserten las secuencias de interés (por ejemplo, transgenes transcritos activamente, exógenos) de manera proximal a un gen indicador endógeno en un locus que se puede amplificar, y el descubrimiento de que (a) la inserción de dichas secuencias exógenas de interés no inhibe la amplificación del gen de selección endógeno, (b) la secuencia exógena de interés se puede co-amplificar con el gen de selección endógeno, y (c) las líneas celulares resultantes, con una región amplificada que comprende múltiples copias del gen de selección endógeno y la secuencia exógena de interés, son estables durante periodos extensos incluso en ausencia del régimen de selección que se empleaba para inducir la amplificación. Por lo tanto, en un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la producción de líneas celulares que se pueden utilizar para la biofabricación de un producto proteico de interés dirigiendo específicamente la inserción de una secuencia exógena de interés capaz de expresar activamente el producto proteico de interés proximal a un gen de selección endógeno. En otro aspecto, la invención proporciona líneas celulares modificadas que se pueden utilizar para producir productos proteicos de interés (por ejemplo, proteínas terapéuticas tales como anticuerpos monoclonales) con altos niveles.

Se entiende que cualquiera de las realizaciones descritas posteriormente se puede combinar de cualquier manera deseada y se puede aplicar cualquier realización o combinación de realizaciones a cada uno de los aspectos descritos posteriormente, a menos de que el contexto dicte otra cosa.

En un aspecto, la invención proporciona una célula de mamífero recombinante que comprende un sitio diana modificado integrado establemente en un gen de selección con un locus que se puede amplificar, en el que el sitio diana modificado altera la función del gen de selección y en el que el sitio diana modificado comprende una secuencia de reconocimiento para una endonucleasa específica del sito.

En algunas realizaciones, el gen de selección es de la glutamina sintetasa (GS) y el locus es de metionina sulfoximina (MSX) que se puede amplificar. En algunas realizaciones, el gen de selección es de la dihidrofolato reductasa (DHFR) y el locus es del metotrexato (MTX) que se puede amplificar.

En algunas realizaciones, el gen de selección se selecciona de entre el grupo que consiste en Dihidrofolato reductasa, glutamina sintetasa, hipoxantina fosforribosil transferasa, treonil ARNt sintetasa, Na-K-ATPasa, asparagina sintetasa, ornitina descarboxilasa, inosina-5'-fosfato deshidrogenasa, adenosina desaminasa, timidilato sintetasa, aspartato transcarbamilasa, metalotioneína, adenilato desaminasa (1,2), UMP-sintetasa y ribonucleótido reductasa.

En algunas realizaciones, el gen de selección se puede amplificar por selección con un agente de selección seleccionado de entre el grupo que consiste en metotrexato (MTX), metionina sulfoximina (MSX), aminopterina, hipoxantina, timidina, Borrelidina, ouabaína, albizina, beta-aspartil hidroxamato, alfa-difluorometilornitina (DFMO), ácido micofenólico, adenosina, alanosina, 2'desoxicoformicina, fluorouracilo, pirazofurano, hidroxiurea, motexafin gadolinio, fludarabina, cladribina, gemcitabina, tezacitabina y triapina.

En algunas realizaciones, el sitio diana modificado se inserta en un exón del gen de selección. En algunas realizaciones, el sitio específico de endonucleasa es una meganucleasas, una nucleasa en dedos de zinc o una efector TAL nucleasa. En alguna realización, la célula recombinante comprende adicionalmente el sitio específico de endonucleasa.

En un aspecto, la invención proporciona una célula de mamífero recombinante que comprende un sitio diana modificado integrado establemente proximal a un gen de selección en un locus que se puede amplificar, en el que el sitio diana modificado comprende una secuencia de reconocimiento para un sitio específico de endonucleasa.

En algunas realizaciones, el sitio diana modificado está corriente abajo de la región reguladora 3' del gen de selección. En algunas realizaciones, el sitio diana modificado está de 0 a 100.000 pares de bases corriente abajo de la región reguladora 3' del gen de selección. En otras realizaciones, el sitio diana modificado está corriente arriba de la región reguladora 5' del gen de selección. En algunas realizaciones, el sitio diana modificado está de 0 a 100.000 pares de bases corriente arriba de la región reguladora 5' del gen de selección.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la inserción de una secuencia exógena en un locus que se puede amplificar de una célula de mamífero que comprende: (a)proporcionar una célula de mamífero que tiene un sitio diana endógena proximal a un gen de selección en un locus que se puede amplificar, en el que el sitio diana endógeno comprende : (i) una secuencia de reconocimiento para una meganucleasas modificada; (ii) una región flanqueante 5' en 5' de la secuencia de reconocimiento; y

(iii) una región 3' en 3' de la secuencia de reconocimiento; y (b) la introducción de una rotura de cadena doble entre las regiones flanqueantes 5' y 3' del sitio diana endógeno; (c) poner en contacto la célula con vector donante que comprende de 5' a 3': (i) una región 5' flanqueante donante homóloga a la región flanqueante 5' del sitio diana endógeno; (ii) una secuencia exógena; y (iii) una región flanqueante 3' donante homóloga de la región flanqueante 3' del sitio diana endógeno; de esta manera la región flanqueante 5' donante , la secuencia exógena y la región flanqueante 3' donante se insertan entre las regiones flanqueantes 5' y 3' del sitio diana endógeno mediante recombinación homóloga para proporcionar una célula modificada.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende adicionalmente el cultivo de la célula modificada en presencia de un compuesto que inhibe la función del gen de selección para amplificar el número de copias del gen de selección. En algunas realizaciones, la secuencia exógena comprende un gen de interés.

En algunas realizaciones, el sitio diana endógeno está corriente abajo de la región reguladora 3' del gen de selección. En algunas realizaciones, el sitio diana endógeno está de 0 a 100.000 pares de bases corriente abajo de la región reguladora 3' del gen de selección. En otras realizaciones, el sitio diana endógeno está corriente arriba de la región reguladora 5' del gen de selección. En algunas realizaciones, el sitio diana endógeno está de 0 a 100.000 pares de bases corriente arriba de la región reguladora 5' del gen de selección.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la inserción de una secuencia exógena en un locus que se puede amplificar de una célula de mamífero que comprende: (a) proporcionar una célula de mamífero que tiene un sitio diana endógeno proximal a un gen de selección en el locus que se puede amplificar, en el que el sitio diana endógeno comprende: (i) una secuencia de reconocimiento para una meganucleasa modificada; (ii) una región flanqueante 5' en 5' de la secuencia de reconocimiento; y (iii) una región flanqueante 3' en 3' de la región de reconocimiento; y (b) introducir una rotura de doble cadena entre las regiones flanqueantes 5' y 3' del sitio diana endógeno; (c) poner en contacto la célula con un vector donante de un sitio diana modificado que comprende de 5' a 3': (i) una región 5' flanqueante donante homóloga con la región 5' flanqueante del sitio diana endógeno; (ii) una secuencia exógena que comprende un sitio diana modificado; y (iii) una región flanqueante 3' donante homóloga de la región flanqueante 3' del sitio diana endógeno por recombinación homóloga para proporcionar una célula de mamífero que comprende el sitio diana modificado; de manera que la región flanqueante 5' donante, la secuencia exógena y la región flanqueante 3' donante se insertan entere las regiones flanqueantes 5' y 3' del sitio diana endógeno mediante recombinación homóloga para proporcionar una célula de mamífero que comprende el sitio diana modificado; (d) introducir una rotura de doble cadena entre las regiones flanqueantes 3' y 5' del sitio diana modificado; (e) poner en contacto la célula que comprende el sitio diana modificado con un vector donante de la secuencia de interés que comprende de 5' a 3': (i) una región flanqueante donante 5' homóloga de la región flanqueante 5' del sitio diana modificado; (ii) una secuencia exógena que comprende una secuencia de interés ; y (iii) una región flanqueante 3' donante homóloga de la región flanqueante 3' del sitio diana modificado; de manera que la región flanqueante 5', la secuencia exógena que comprende la secuencia de interés y la región flanqueante 3' donante se inserta entre las regiones flanqueantes 5' y 3' del sitio diana modificado por recombinación homóloga para proporcionar una célula de mamífero modificada que comprende la secuencia de interés.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende adicionalmente el cultivo de la célula de mamífero modificada en presencia de un compuesto que inhiba la función del gen indicador para amplificar el número de copias del gen de selección. En algunas realizaciones, la secuencia de interés comprende un gen.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para insertar una secuencia exógena en un locus que se puede amplificar de una célula de mamífero que comprende: (a) proporcionar una célula de mamífero que tiene un sitio diana endógeno en un gen de selección en el locus que se puede amplificar, en el que el sitio diana endógeno comprende: (i) una secuencia de reconocimiento para una meganucleasa modificada; (ii) una región flanqueante 5' en 5' de la secuencia de reconocimiento; y

(iii) una región flanqueante 3' en 3' de la secuencia de reconocimiento; y (b) introducir una rotura de cadena doble en las regiones flanqueantes 5' y 3' del sitio diana endógeno; (c) poner en contacto la célula con un vector donante del sitio diana modificado que comprende de 5' a 3': (i) una región flanqueante 5' donante homóloga con la región flanqueante 5' del sitio diana endógeno; (ii) una secuencia exógena que comprende un sitio diana modificado; y (iii) una región flanqueante 3' donante homóloga de la región flanqueante 3' del sitio diana endógeno; de manera que la región flanqueante 5' donante, la secuencia exógena y la región flanqueante 3' donante se insertan entre las regiones flanqueantes 5' y 3' del sitio diana endógeno por recombinación homóloga para proporcionar una célula de mamífero que comprende el sitio diana modificado; (d) introducir una rotura de doble cadena entre las regiones flanqueantes 5' y 3' del sitio diana modificado; (e) poner en contacto la célula que comprende el sitio diana modificado con un vector donante de la secuencia de interés que comprende de 5' a 3': (i) una región flanqueante 5' donante homóloga de la región flanqueante 5' del sitio diana modificado; (ii) una secuencia exógena que comprende una secuencia de interés; y (iii) una región flanqueante 3' donante homóloga de la región flanqueante 3' del sitio diana modificado; de manera que la región flanqueante 5', la secuencia exógena que comprende la secuencia de interés y la región flanqueante 3' donante se insertan entre las regiones flanqueantes 5' y 3' del sitio diana modificado mediante recombinación homóloga para proporcionar una célula de mamífero modificada que comprende la secuencia de interés.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende adicionalmente el cultivo de la célula de mamífero modificada en presencia de un compuesto que inhibe la función del gen de selección para amplificar el número de copias del gen de selección.

En algunas realizaciones, la secuencia de interés comprende un gen.

En algunas realizaciones, el sitio diana endógeno está en un intrón del gen de selección. En otras realizaciones, el sitio diana endógeno está en un exón del gen de selección.

En un aspecto, la invención proporciona una meganucleasa recombinante que comprende un polipéptido que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la s Eq ID NO: 15.

En otro aspecto, la invención proporciona una meganucleasa recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.

En otro aspecto, la invención proporciona una meganucleasa recombinante que reconoce un escinde un sitio de reconocimiento que tiene un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 14. En una realización, la meganucleasa reconoce y escinde un sitio de reconocimiento de SEQ ID NO: 14.

En otro aspecto, la invención proporciona una meganucleasa recombinante que comprende un polipéptido que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9. En una realización, la meganucleasa recombinante tiene la secuencia de la meganucleasa de SEQ ID NO: 9.

En otro aspecto, la invención proporciona una meganucleasa recombinante que reconoce un escinde un sitio de reconocimiento de al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7. En una realización, la meganucleasa reconoce y escinde un sitio de reconocimiento de SEQ ID NO: 7.

En otro aspecto, la invención proporciona una meganucleasa recombinante que comprende un polipéptido que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la s Eq ID n O: 10. En una realización, la meganucleasa recombinante comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 10.

En otro aspecto, la invención proporciona una meganucleasa recombinante que reconoce y escinde un sitio de reconocimiento que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8. En una realización, la meganucleasa recombinante reconoce y escinde un sitio de reconocimiento de SEQ ID NO: 8.

En otro aspecto, la invención proporciona una meganucleasa recombinante que comprende un polipéptido que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la s Eq ID n O: 13. En una realización, la meganucleasa recombinante comprende el polinucleótido de SEQ ID NO: 13.

En otro aspecto, la invención proporciona una meganucleasa recombinante que reconoce y escinde un sitio de reconocimiento que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 12. En una realización, la meganucleasa reconoce y escinde un sitio de reconocimiento de SEQ ID NO: 12.

En otro aspecto, la invención proporciona una meganucleasa recombinante que comprende un polipéptido que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la s Eq ID n O: 29. En una realización, la meganucleasa recombinante comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 29.

En otro aspecto, la invención proporciona una meganucleasa recombinante que reconoce y escinde un sitio de reconocimiento que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 30. En una realización, la meganucleasa que y escinde un sitio de reconocimiento de SEQ ID NO: 30.

En otro aspecto la invención proporciona líneas celulares de mamífero recombinantes que continúan expresando un producto proteico de interés a partir de una secuencia exógena de interés presente en una región amplificada del genoma(es decir, presente en 2-1.000 copias, co-amplificado con un gen de selección en un locus que se puede amplificar) durante un periodo de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 semanas después de retirar el agente de amplificación selección, y con una reducción de los niveles de expresión y/o número de copias de menos de 20, 25, 30, 35 o 40 %.

En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos de producción de células recombinantes con regiones amplificadas que incluyen una secuencia de interés y un gen de selección sometiendo las células recombinantes descritas anteriormente a selección con un agente de selección que produce la co-amplificación de la secuencia de interés y el gen de selección.

En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos de producción de un producto proteico de interés cultivando las células recombinantes descritas anteriormente, o las células recombinantes descritas con regiones amplificadas, y la obtención de un producto proteico de interés a partir del medio del cultivo o un lisado celular.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Una estrategia general para el direccionamiento de una secuencia de interés a un locus que se puede amplificar.

Figura 2. (A) Esquema del locus DHFR de CHO que muestra una región preferida para el direccionamiento de una secuencia de interés 5.000 a 60.000 pares de bases corriente abajo del gen DHFR. (B) Esquema del locus GS de CHO que muestra una región preferida para el direccionamiento de una secuencia de interés 5.000-55.000 pares de base corriente abajo del gen GS.

Figura 3. Estrategia para la inserción de una secuencia de interés en un locus que se puede amplificar en un procedimiento de dos etapas que implican una secuencia diana modificada integrada previamente.

Figura 4. Estrategia para la inserción de una secuencia diana modificada en un locus que se puede amplificar con la retirada concomitante de una parte del gen de selección, seguido por la inserción de una secuencia de interés y reconstitución del gen de selección.

Figura 5. Estrategia para la inserción de una secuencia diana modificada en un locus que se puede amplificar con alteración concomitante de la secuencia codificante de un gen de selección, seguido por inserción de una secuencia de interés y reconstitución del gen de selección.

Figura 6. Estrategia para la inserción de una secuencia diana modificada en un locus que se puede amplificar con la alteración concomitante del procesamiento de ARNm, seguido por la inserción de una secuencia de interés y reconstitución del gen de selección.

Figura 7. (A) Un ensayo de recombinación repetida directa para la actividad de endonucleasa específica del sitio. (B) resultados del ensayo en (A) aplicada a las meganucleasas CHO-23/24 y CHO-51/52. (C) Alineamiento de secuencias obtenidas de células CHO transfectadas con ARNm que codifica la meganucleasa CHO-23/24. (D) Alineamiento de secuencias obtenidas de células CHO transfectadas con ARNm que codifica la meganucleasa CHO-51/52.

Figura 8. (A) Estrategia para la inserción de una secuencia de ADN exógeno en el locus DHFR de CHO utilizando la meganucleasa CHO-51/52. (B) Productos de la PCR que demuestran la inserción de una secuencia diana modificada.

Figura 9. (A) Estrategia para la inserción de una secuencia diana modificada en el locus DHFR de CHO utilizando la meganucleasa CHO-23/24, seguido por la inserción mediada por Flp recombinasa de una secuencia de interés. (B) los productos PCR de clones resistentes a higromicina producidos en (A). (C) expresión de GFP por los 24 clones producidos en (B).

Figura 10. Resultados de los experimentos con una línea de CHO que expresa GFP producida integrando un casete de expresión del gen GFP en el locus DHFR utilizando una estrategia de secuencia diana como se muestra en la Figura 9.

Figura 11. (A) Un ensayo de recombinación repetida directa, como en la Figura 5A. (B) el ensayo de (A) aplicado a las meganucleasas CHO-13/14 y CGS-5/6. (C) Alineamiento de secuencias obtenidas a partir de células CHO transfectadas con ARNm que codifica la meganucleasa CGS-5/6.

Descripción detallada de la invención

1.1 Introducción

La presente invención depende, en parte, del desarrollo de líneas celulares de mamífero en las que se habían insertado transgenes transcritos activamente exógenos proximales a un locus endógeno que se puede amplificar, y el descubrimiento de que (a) la inserción de dichos transgenes transcritos activamente exógenos no evitan o inhiben sustancialmente la amplificación del locus endógeno que se puede amplificar, (b) el transgén exógeno transcrito activamente puede co-amplifcarse con el locus endógeno que se puede amplificar, y (c) la línea celular resultante, con una región amplificada que comprende múltiples copias del locus endógeno que se puede amplificar y el transgén exógeno transcrito activamente es estable durante periodos extensos incluso en ausencia del régimen de selección que se emplee para inducir la amplificación. Por lo tanto, en un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la producción de líneas celulares que se pueden utilizar para biofabricar un producto proteico de interés direccionando específicamente la inserción de un gen exógeno capaz de expresar activamente el producto proteico de interés proximal al locus endógeno que se puede amplificar. En otro aspecto, la invención proporciona líneas celulares modificadas que se pueden utilizar para producir productos proteicos de interés (por ejemplo, proteínas terapéuticas tales como anticuerpos monoclonales) a altos niveles.

1.2 Referencias y definiciones

La patente y bibliografía científica a la que se hace referencia en el presente documento establece un conocimiento que está disponible para los expertos en la técnica. Las divulgaciones completas de las patentes de Estados Unidos expedidas, las solicitudes pendientes, las solicitudes extranjeras publicadas y las referencias científicas y técnicas citadas en el presente documento, incluyendo las secuencias de bases de datos de proteínas y ácidos nucleicos, se incorporan por referencia en la misma medida que si cada una de ellas se indicara específica e individualmente como incorporada por referencia.

Como se utiliza en el presente documento “meganucleasas” se refiere a endonucleasas de asentamiento (a las que también se hace referencia como endonucleasas codificadas por el intrón del Grupo I) o endonucleasas no de origen natural (por ejemplo, diseñadas o modificadas racionalmente) basadas en la secuencia de aminoácidos de una endonucleasa de asentamiento de origen natural. Ejemplos de meganucleasas de origen natural incluyen I-SceI, I­ CreI, I-Ceul, I-Dmol, I-Msol, I-Anil, etc. Las meganucleasas diseñadas racionalmente se desvelan por ejemplo en los documentos WO 2007/047859 y WO 2009/059195, y se pueden alterar para tener una especificidad de unión al ADN modificada, actividad de escisión de ADN, afinidad de unión al ADN o propiedades de dimerización modificadas con respecto a la meganucleasas de origen natural. Una meganucleasa se puede unir a un ADN de doble cadena como un homodímero (por ejemplo, la I-CreI de tipo silvestre), o se puede unir al ADN como un heterodímero (por ejemplo, las meganucleasas modificadas desveladas en el documento WO 2007/047859). Una meganucleasas modificada también puede ser una “meganucleasas de cadena sencilla” en la que se une un par de dominios de unión al ADN derivados de una meganucleasas natural en un único polipéptido utilizando un engarce peptídico (por ejemplo, las meganucleasas de cadena sencilla desveladas en el documento WO 2009/059195).

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “meganucleasas de cadena sencilla” se refiere a un polipéptido que comprende un par de subunidades de meganucleasas unidas por un engarce. Una meganucleasas de cadena sencilla tiene la organización: subunidad del extremo N - engarce - subunidad del extremo C. Las dos subunidades de meganucleasas en general no serán idénticas en la secuencia de aminoácidos y no reconocerán secuencias de ADN idénticas. Por lo tanto, las meganucleasas de cadena sencilla normalmente escindirán secuencias de reconocimiento pseudo palindrómicas o no palindrómicas. Los procedimientos de producción de meganucleasas de cadena sencilla se desvelan en el documento WO 2009/059195.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “endonucleasa específica del sitio” significa una meganucleasas, nucleasa en dedos de zinc o nucleasa efectora TAL.

Como se utiliza en el presente documento, con respecto a una proteína, el término “recombinante” significa que tiene una secuencia de aminoácidos alterada como resultado de la aplicación de técnicas de modificación genética a los ácidos nucleicos que codifican la proteína, y las células u organismos que expresan la proteína. Con respecto a un ácido nucleico, el término “recombinante” significa que tienen una secuencia de ácido nucleico alterada como resultado de la aplicación de técnicas de modificación genéticas. Las técnicas de modificación genético incluyen, pero no se limitan a, tecnologías de PCR y clonación de ADN; transfección, transformación y otras tecnologías de transferencia genética; recombinación genética, mutagénesis dirigida el sitio; y fusión genética. De acuerdo con esta definición, una proteína que tenga una secuencia de aminoácidos idéntica a una proteína de origen natural, pero producida por clonación y expresión en un huésped heterólogo, no se considera recombinante. Como se utiliza en el presente documento, el término “modificado” es sinónimo del término “recombinante”.

Como se utiliza en el presente documento, con respecto a una meganucleasas, la expresión “de tipo silvestre” se refiere a cualquier forma de meganucleasas de origen natural. La expresión “de tipo silvestre” no pretende significar la variante alélica más común de la enzima en la naturaliza sino más bien, cualquier variante alélica que se encuentra en la naturaleza. Las endonucleasas de asentamiento de tipo silvestre se distinguen de las meganucleasas recombinantes o de origen no natural.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “secuencia de reconocimiento” se refiere a una secuencia de ADN que se une y se escinde por una meganucleasas. Una secuencia de reconocimiento comprende un par de “medios sitios” de 9 pares de bases que están separadas por cuatro pares de bases. En el caso de las meganucleasas homo- o heterodiméricas, cada uno de los dos monómeros hace contactos específicos de base con un medio sitio. En el caso de una meganucleasa heterodimérica de cadena sencilla, el dominio del extremo N de la proteína se pone en contacto con un primer medio sitio y el dominio del extremo C de la proteína se pone en contacto con un segundo medio sitio. En el caso de I-CreI, por ejemplo, la secuencia de reconocimiento tiene 22 pares de bases y comprende un par de “medios sitios” de 9 pares de bases que están separados por cuatro pares de bases.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “sitio diana” se refiere a una región del ADN cromosómico de una célula que comprende una secuencia diana en la cual se puede insertar una secuencia de interés. Como se utiliza en el presente documento, la expresión “sitio diana modificado” se refiere a una secuencia exógena de ADN integrada en el ADN cromosómico de una célula que comprende una secuencia diana modificada en la que se puede insertar una secuencia de interés.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “secuencia diana” significa una secuencia de ADN en un sitio diana que incluye una o más secuencias de reconocimiento para una nucleasa, integrasa, transposasa y/o recombinasa. Por ejemplo, una secuencia diana puede incluir una secuencia de reconocimiento para una meganucleasa. Como se utiliza en el presente documento, una “secuencia diana modificada” significa una secuencia diana exógena que se introduce en un cromosoma que sirve como punto de inserción para otra secuencia.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “región flanqueante” o “secuencia flanqueante” se refiere a una secuencia de > 3 o preferentemente, > 50 o, más preferentemente, > 200 o, más preferentemente, > 400 pares de bases de ADN que está inmediatamente 5' o 3' de una secuencia de referencia (por ejemplo, una secuencia diana o una secuencia de interés).

Como se utiliza en el presente documento, las expresiones “locus que se puede amplificar” se refiere a una región del ADN cromosómico de una célula que se puede amplificar mediante la selección con uno o más compuestos (por ejemplo, fármacos) en el medio de cultivo. Un locus que se puede amplificar normalmente comprenderá un gen que codifica una proteína que, en condiciones apropiadas, es necesario para la supervivencia de la célula. Inhibiendo la función de dicha proteína esencial, por ejemplo, con un fármaco de molécula pequeña, el locus que se pueden amplificar se duplica muchas veces como medio de aumento del número de copias del gen esencial. Un gen de interés, si se integra en un locus que se puede amplificar, también se duplicaría con el gen esencial. Ejemplos de loci que se pueden amplificar incluyen las regiones cromosómicas que comprenden genes de DHFR, GS y HPRT.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “ locus amplificado” o “gen amplificado” o “secuencia amplificada” se refiere a un locus, gen o secuencia que está presente en 2-1.000 copias como resultado de la amplificación genética en respuesta a la selección de un indicador genético. Un gen o secuencia amplificados puede ser un gen o secuencia que se co-amplifica debido a la selección de un gen de selección en el mismo locus que se puede amplificar. En realizaciones preferidas, una secuencia de interés se amplifica hasta al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 copias.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “gen de selección” se refiere a un gen endógeno que es esencial para la supervivencia celular en algunas condiciones de cultivo específicas (por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente, toxina o fármaco). Los genes de selección son endógenos de la célula y se distinguen de los “marcadores genéticos” exógenos tal como genes de resistencia a antibióticos. Los genes indicadores existen en su contexto natural en el ADN cromosómico de la célula. Por ejemplo, el DHFR es un gen de selección que es necesario para la supervivencia celular en presencia de MTX en el medio del cultivo. El gen es esencial para el reconocimiento en ausencia de hipoxantina y timidina. Si se elimina el gen de selección de DHFR endógeno, las células son capaces de crecer en ausencia de hipoxantina y timidina si se les da una copia exógena del gen DHFR. Esta copia exógena del gen DHFR es un marcador genético, pero no es un gen de selección. Un locus que se puede amplificar comprende un gen de selección y un sitio diana. Un sitio diana se encuentra fuera de un gen de selección de manera que un gen de selección no comprende un sitio diana. Ejemplos de genes de selección se dan en la Tabla 1.

Como se utiliza en el presente documento, cuando se utiliza en conexión con la posición de un sitio diana, secuencia de reconocimiento o secuencia de interés insertada con respecto a la posición de un gen de selección, el término “proximal” significa que el sitio diana, secuencia de reconocimiento, o secuencia de interés insertada están en el mismo locus que se puede amplificar que el gen de selección, sea corriente arriba (5') o corriente abajo (3') del gen de selección, y preferentemente entre el gen de selección y el siguiente gen en la región (sea corriente arriba (5') o corriente abajo (3')). Normalmente, un sitio diana, secuencia de reconocimiento, o secuencia de interés insertada “proximales” estarán a < 100.000 pares de bases del gen de selección, según se mide desde el primer o último nucleótido del primer o último elemento regulador del gen de selección.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “recombinación homóloga” se refiere al proceso celular natural en el que una rotura de ADN de doble cadena se reparar utilizando una secuencia de ADN homóloga como matriz de reparación (véase, por ejemplo, Cahill y col. (2006), Front. Biosci. 11:1958-1976). La secuencia de ADN homóloga puede ser una secuencia cromosómica endógena o un ácido nucleico exógeno que se suministra a la célula. Por lo tanto, para algunas aplicaciones de las meganucleasas modificadas, se suministra una nucleasa que se utiliza para escindir una secuencia de reconocimiento en una secuencia diana de un genoma y un ácido nucleico exógeno con homología o similitud de secuencia sustancial con la secuencia diana a la célula y se utiliza como una matriz para la reparación por recombinación homóloga. La secuencia de ADN del ácido nucleico exógeno, que puede ser significativamente diferente de la secuencia diana, se inserta o incorpora de esta manera en la secuencia cromosómica. El proceso de recombinación homóloga se produce primariamente en organismos eucariotas. El término “homología” se utiliza en el presente documento de manera equivalente a “similitud de secuencia” y no pretende que se necesite una identidad por relación descendente o filogenética.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “integrada establemente” significa que una secuencia de ADN exógeno o heteróloga se ha insertado covalentemente en un cromosoma (por ejemplo, por recombinación homóloga, unión de extremos no homóloga, transposición, etc.) y se mantiene en el cromosoma durante un periodo de al menos 8 semanas.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “unión de extremos no homóloga” o “NHEJ” se refiere al proceso celular natural en el que la rotura de ADN de doble cadena se repara por la unión directa de dos segmentos de ADN no homólogos (véase, por ejemplo, Cahill y col. (2006), Front. Biosci. 11:1958-1976). La reparación de ADN por unión de extremos no homólogos tiene tendencia a errores y frecuentemente da como resultado la adición o eliminación no de la matriz de secuencias de ADN en el sitio de reparación. Por lo tanto, para ciertas aplicaciones, se puede utilizar una meganucleasas modificada para producir una rotura de doble cadena en una secuencia de reconocimiento en un locus que se puede amplificar y se puede capturar una molécula de ácido nucleico exógena, tal como un producto de una PCR en el sitio de la rotura de EN mediante NHEJ (véase, por ejemplo, Salomon y col. (1998), e Mb O J. 17:6086-6095). En tales casos, el ácido nucleico exógeno puede tener huna homología o no, con la secuencia diana. El proceso de unión de extremos no homólogos se produce tanto en eucariotas como procariotas tales como bacterias.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “secuencia de interés” significa cualquier secuencia de ácido nucleico, si codifica una proteína, ARN o elemento regulador (por ejemplo, un amplificador, silenciador o secuencia promotora), que pueden insertarse en un genoma o utilizarse para remplazar una secuencia de ADN genómico. Las secuencias de interés pueden tener secuencias de ADN heterólogo que permitan la marcación de una proteína o ARN que se expresa a partir de la secuencia de interés. Por ejemplo, se puede marcar una proteína con marcadores que incluyen, pero no se limitan a, un epítopo (por ejemplo, c-myc, FLAG) u otro ligando (por ejemplo, poli-His). Además, una secuencia de interés puede codificar una proteína de fusión de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley 1999). En realizaciones preferidas, la secuencia de interés comprende un promotor unido operativamente a un gen que codifica una proteína de valor medicinal tal como un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, citocina, factor de crecimiento, hormona o enzima. Para algunas aplicaciones, la secuencia de interés está flanqueada por una secuencia de ADN que es reconocida por la meganucleasa modificada para la escisión. Por lo tanto, las secuencias flanqueantes se escinden permitiendo la inserción apropiada de la secuencia de interés en las secuencias genómicas de reconocimiento escindidas por una meganucleasa modificada. Para algunas aplicaciones, la secuencia de interés está flanqueada por secuencias de ADN con homología o similitud de secuencia sustancial con el sitio diana de manera que se inserta por recombinación homóloga la secuencia de interés en el genoma en el locus de la secuencia diana.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “ADN donante” se refiere a una molécula de ADN que comprende una secuencia de interés flanqueado por secuencias de ADN homóloga de un sitio diana. El ADN donante puede servir como armazón para la reparación de ADN por recombinación homóloga si se suministra a una célula con una nucleasa específica del sitio tal como una meganucleasa, nucleasa en dedos de zinc, o nucleasa efectora TAL. El resultado de dicha reparación de ADN es la inserción de la secuencia de interés en el ADN cromosómico de la célula. El ADN donante puede ser lineal, tal como un producto de la PCR, o circular, tal como un plásmido. En los casos en los que el ADN donante es un plásmido circular, se puede hacer referencia a este como un “plásmido donante”.

Como se utiliza en el presente documento, a menos de que se indique específicamente otra cosa, la palabra “o” se utiliza en sentido incluyente de “y/o” y no en el sentido excluyente de “o/o”.

2.1 Transgén direccionado a loci que se pueden amplificar

La presente invención proporciona procedimientos para la generación de líneas celulares de mamífero transgénicas que expresen un producto proteico deseado de interés, incluyendo líneas celulares de “alta producción”, dirigiendo la inserción de un gen que codifica el producto proteico de interés (por ejemplo, un casete de expresión genética de una proteína terapéutica) en regiones del genoma que se pueden amplificar. Dichas regiones de las células de mamífero incluyen los genes de DHFR, GS, y HPRT, así como otros que se muestran en la Tabla 1.

El mecanismo preciso de la amplificación genética no se conoce. Además, es muy probable que no haya un único mecanismo por el que se produce la amplificación genética, sino que se produce una variedad de diferentes aberraciones cromosómicas aleatorias, en combinación con una fuerte selección por amplificación, resulta en un número de copias genéticas creciente (revisado en Omasa (2002), J. Biosci. Bioeng. 94:600-605). Está claro que la localización cromosómica tiene un papel principal en la amplificación y el mantenimiento estable de genes amplificados (Brinton y Heintz (1995), Chromosoma 104:143-51). Se ha descubierto que los transgenes integrados en localizaciones cromosómicas adyacentes a los telómeros se amplifican más fácilmente y, una vez amplificados tienden a ser estables en un alto número de copias después de retirar el agente de selección (Yoshikawa y col. (2000), Cytotechnology 33:37-46; Yoshikawa y col. (2000), Biotechnol Prog. 16:710-715). Esto es significativo debido a que los agentes de selección tales como MTX y MSX son tóxicos y no se pueden incluir en el medio de cultivo en un procedimiento de biofabricación comercial. Por el contrario, los transgenes integrados en las regiones del genoma de CHO que no es adyacente a los telómeros se amplifican de manera ineficaz y pierden rápidamente el número de copias después de retirar los agentes de selección del medio. Por ejemplo, Yoshikawa y col. describieron que los transgenes integrados aleatoriamente unidos a un marcador genético DHFR se amplificada hasta más de 10 veces de número de copias cuando el sitio de integración estaba adyacente el telómero (Yoshikawa y col. (2000), Biotechnol Prog. 16:710-715). Estos investigadores también descubrieron que un transgén integrado en una región no telomérica perdería > 50 % de sus copias en solo 20 días después de la retirada de MTX del medio de cultivo. Ninguno de los genes de selección identificados en la Tabla 1 es adyacente al están en regiones no teloméricas en el genoma de ratón (www. ensembl.com) telómero y la similitud con la organización del genoma entre el ratón y CHO, hace que sea probable que estos genes estén también en la región no telomérica de las CHO (Xu y col. (2011), Nat. Biotechnol.

29:735-741). Por lo tanto, la técnica anterior instruye que los loci identificados en la Tabla 1, incluyendo los loci DHFR y GS, son localizaciones no preferidas para dirigir la inserción del transgén si el objetivo es la amplificación genética eficaz y estable.

Además, en el caso de la amplificación de un gen endógeno, está calor que las secuencias cromosómicas fuera de la secuencia del gen de selección tienen un papel importante facilitando la amplificación y definiendo la longitud de la secuencia de ADN que se co-amplifica con el gen seleccionado (Looney y Hamlin (1987), Mol. and Cell. Biol. 7:569-577). En particular, se ha demostrado que la secuencia y localización del origen de replicación del ADN en relación con el gen de selección tiene un papel principal en la amplificación. Por ejemplo, se ha demostrado que la amplificación del locus DHFR endógeno de CHO es dependiente al encontrar un par de orígenes de replicación descubiertos en la región 5.000-60.000 pares de bases corriente abajo del gen que codifica la secuencia de DHFR (Anachkova y Hamlin (1989), Mol. and Cell. Biol. 9:532-540; Milbrandt y col. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6042-6047). Además, Brinton y Heintz en demostrado que esos mismos orígenes de replicación fallan en la promoción de la amplificación genética cuando se incorporan aleatoriamente en el genoma con una secuencia DHFR transgénica (Brinton y Heintz (1995), Chromosoma. 104:143-51). Esto demuestra claramente la importancia del mantenimiento de la secuencia y un contexto cromosómico apropiado de estos orígenes de replicación para promover la amplificación del gen de DHFR. Por lo tanto, la técnica instruye que la región corriente abajo del DFHr es crítica para la amplificación genética y no debería alterarse, por ejemplo, insertando un casete de expresión genética transgénica como se describe en la presente invención.

Sorprendentemente, los inventores han descubierto que las secuencias de ADN, incluyendo las secuencias exógenas transcripcionalmente activas, que se insertan proximales a (por ejemplo, en <100.000 pares de bases) los genes de selección en líneas celulares de mamífero (por ejemplo, CHO-K1) se co-amplificarán en presencia de los compuestos apropiados que se seleccionan para la amplificación. Por lo tanto, la presente invención proporciona procedimientos para la producción de líneas celulares isogénicas en las que se pueden amplificar transgenes que codifican productos proteicos de interés (por ejemplo, casetes de expresión genética bioterapéutica) pero en las que no es necesario explorar un gran número de líneas celulares generadas aleatoriamente para identificar las que expresan altos niveles del producto proteico de interés y son resistentes al silenciamiento genético.

Además, los inventores han descubierto sorprendentemente que las líneas celulares de mamífero de la invención, en las que se co-amplifica una secuencia de interés con un gen de selección en un locus que se puede amplificar son estables con respecto a la expresión de la secuencia de interés y/o número de copias de la secuencia de interés incluso en ausencia de una selección continua. Es decir, mientras que la técnica enseña que las secuencias amplificadas se reducirán a lo largo del tiempo si no se mantiene la selección (véase, por ejemplo, Yoshikawa y col. (2000), Biotechnol Prog. 16:710-715), los inventores han descubierto que las líneas celulares de acuerdo con los procedimientos de la invención continúan produciendo los productos proteicos de interés (codificados por las secuencias de interés) a niveles del 20 %-25 % de los niveles iniciales, incluso 14 semanas después de la retirada de la agente de selección. Esto es significativo, como se ha señalado anteriormente, debido a que los agentes de selección tales como MTX y MSX son tóxicos, y sería altamente deseable producir proteínas bioterapéuticas en líneas celulares que no necesitan continuar con la exposición a dichos agentes de selección. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona líneas celulares de mamífero que continúan expresando un producto proteico de interés a partir de una secuencia exógena de interés presente en una región amplificada del genoma (es decir, presente en 2-1.000 copias, co-amplificada con un gen de selección en un locus que se puede amplificar) durante un periodo de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, o 14 semanas después de la retirada del agente de selección amplificación, y con una reducción de los niveles de expresión y/o número de copias de menos del 20, 25, 30, 35, o 40 %.

La presente invención también proporciona los productos necesarios para practicar los procedimientos, y dirigir la inserción de secuencias de interés en loci que se pueden amplificar en líneas celulares de mamífero. Un procedimiento común para la inserción o modificación de una secuencia de ADN implica la introducción de una secuencia de ADN transgénica flanqueada por secuencias homólogas de la diana genómica y la selección o exploración de un evento de recombinación homóloga satisfactoria. La recombinación con el ADN transgénico se produce raramente, pero se puede estimular por una rotura de doble cadena en el ADN genómico en el sitio diana (Porteus y col. (2005), Nat. Biotechnol. 23: 967-73; Tzfira y col. (2005), Trends Biotechnol. 23: 567-9; McDaniel y col. (2005), Curr. Opin. Biotechnol. 16: 476-83). Se han empleado muchos procedimientos para crear roturas de ADN de doble cadena, incluyendo tratamientos con radiación y químicos. Aunque estos procedimientos estimulan eficazmente la recombinación, las roturas de doble cadena se dispersan aleatoriamente en el genoma, que pueden ser altamente mutagénicas y tóxicas. Hasta el presente, la incapacidad para dirigir modificaciones genéticas a sitios únicos en un escenario cromosómico es un impedimento principal de la modificación del genoma de rutina.

Una estrategia para conseguir este objetivo es estimular la recombinación homóloga en una rotura de cadena doble en un locus diana utilizando una nucleasa con especificidad por una secuencia que es lo suficientemente grande para estar presente en un único sitio en el genoma (véase, por ejemplo, Porteus y col. (2005), Nat. Biotechnol. 23: 967-73). La eficacia de esta estrategia se ha demostrado en una variedad de organismos utilizando ZFN (Porteus (2006), Mol Ther 13: 438-46; Wright y col. (2005), Plant J. 44: 693-705; Urnov y col. (2005), Nature 435: 646-51). Las endonucleasas de asentamiento son un grupo de nucleasas de origen natural que reconocen sitios de escisión de 15­ 40 pares de bases que se encuentran comúnmente en los genomas de plantas y hongos. Se asocian frecuentemente con elementos de ADN parásitos, tales como intrones e inteínas de auto corte y empalme del Grupo I. Promueven naturalmente la recombinación homóloga o inserción genética en localizaciones específicas del genoma huésped produciendo una doble rotura en el cromosoma, que recluta la maquinaria de reparación de ADN celular (Stoddard (2006), Q. Rev. Biophys. 38: 49-95). Las endonucleasas de asentamiento se agrupan comúnmente en cuatro familias: la familia LAGLIDADG, la familia GIY-YIG, la familia de la caja His-Cys y la familia HNH. Estas familias se caracterizan por motivos estructurales que afectan actividad catalítica y la secuencia de reconocimiento. Por ejemplo, los miembros de la familia LAGLIDADG se caracterizan por tener una o dos copias del motivo conservado LAGLIDADG (véase Chevalier y col. (2001), Nucleic Acids Res. 29(18): 3757-3774). Las endonucleasas de asentamiento LAGLIDADG con una única copia del motivo LAGLIDADG forma homodímeros, mientras que los miembros con dos copias del motivo LAGLIDADG se encuentran como monómeros.

Las endonucleasas de asentamiento, primariamente de la familia LAGLIDADG, se han utilizado para promover eficazmente la modificación del genoma específica del sitio en plantas, levaduras, Drosophila, células de mamífero y ratones, pero esta estrategia se ha limitado a la modificación de genes homólogos que conservan la secuencia de reconocimiento de endonucleasa (Monnat y col. (1999), Biochem. Biophys. Res. Commun. 255: 88-93) o en genomas modificados previamente en los que se ha introducido una secuencia de reconocimiento (Rouet y col. (1994), Mol. Cell. Biol. 14: 8096-106; Chilton y col. (2003), Plant Physiol. 133: 956-65; Puchta y col. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5055-60; Rong y col. (2002), Genes Dev. 16: 1568-81; Gouble y col. (2006), J. Gene Med. 8(5):616-622).

La implementación sistemática de modificación genética estimulada por nucleasas necesita el uso de enzimas modificadas con especificidades a medida para dirigirse a las roturas de ADN en sitios existentes en un genoma, y, por lo tanto, ha habido gran interés en adaptar las endonucleasas de asentamiento para promover modificaciones genéticas en sitios médica o biotecnológicamente relevantes (Porteus y col. (2005), Nat. Biotechnol. 23: 967-73; Sussman y col. (2004), J. Mol. Biol. 342: 31-41; Epinat y col. (2003), Nucleic Acids Res. 31: 2952-62).

La I-CreI (SEQ ID NO: 1) es un miembro de la familia LAGLIDADG de endonucleasas de asentamiento que reconoce y corta una secuencia de reconocimiento de 22 pares de bases en el cromosoma de cloroplastos de las algas Chlamydomonas reinhardtii. Se han utilizado técnicas de selección genética para modificar la preferencia de sitio de escisión por la I-CreI (Sussman y col. (2004), J. Mol. Biol. 342: 31-41; Chames y col. (2005), Nucleic Acids Res. 33: e178; Seligman y col. (2002), Nucleic Acids Res. 30: 3870-9, Arnould y col. (2006), J. Mol. Biol. 355: 443-58). Más recientemente, se ha descrito un procedimiento para diseñar racionalmente endonucleasas de asentamiento mono-LAGLIDADG que sean capaces de rediseñar completamente la I-CreI y otras endonucleasas de asentamiento para dirigirse a sitios de ADN ampliamente divergentes, incluyendo sitios en genomas de mamíferos, levaduras, plantas, bacterianos y víricos (documento WO 2007/047859).

Por lo tanto, en una realización la invención proporciona meganucleasas modificadas derivadas de la secuencia de aminoácidos de I-CreI que reconoce y corta sitios de ADN en regiones que se pueden amplificar de genomas de mamífero. Estas meganucleasas modificadas se pueden utilizar de acuerdo con la invención para dirigir la inserción de casetes de expresión genética en localizaciones determinadas del ADN cromosómico de líneas celulares tales como de células CHO. La presente invención optimizará enormemente la producción de líneas celulares deseadas reduciendo el número de líneas que se deben explorar para identificar un clon de “alta producción” adecuados para la producción a escala comercial de una glicoproteína terapéutica.

La presente invención implica el direccionamiento las “secuencias de interés” de ADN transgénico en loci que se pueden amplificar. Los loci que se pueden amplificar son regiones del ADN cromosómico que contiene genes de selección que se convierten en amplificados en presencia de agentes de selección (por ejemplo, fármacos). Por ejemplo, el locus DHFR de la célula de ovario de hámster chino (CHO) se puede amplificar hasta ~1.000 copias cultivando las células en presencia de metotrexato (MTX), un inhibidor de la DHFR. La Tabla 1 enumera ejemplos adicionales de genes indicadores que se pueden amplificar utilizando fármacos de molécula pequeña (Kellems, ed. Gene amplification in mammalian cells: a comprehensive guide. Marcel Dekker, New York, 1993; Omasa (2002), J. Biosci. Bioeng. 94:6600-605).

Tabla 1. Genes de selección

(continuación)

Deben tenerse en cuenta varias consideraciones cuando se selecciona un sitio diana específico para la inserción de una secuencia de interés en un locus que se puede amplificar. Primero, el sitio de inserción seleccionado debe co­ amplificarse con el gen bajo selección. En muchos casos, ya existen datos experimentales en la técnica que delimita la cantidad de secuencia cromosómica flanqueante que se co-amplifica con un gen indicador de interés. Estos datos, que definen con precisión la extensión del locus que se puede amplificar, existen para DHFR de CHO (Ma y col. (1988), Mol Cell Biol. 8(6):2316-27), DHFR humano (Morales y col. (2009), Mol Cancer Ther. 8(2):424-432), y GS de CHO (Sanders y col. (1987), Dev Biol Stand. 66:55-63). Cuando dichos datos no existen aún en la técnica, los inventores predijeron que las secuencias de ADN <100.000 pares de bases corriente arribo o corriente abajo del gen de selección que codifica la secuencia es probable que se co-amplfiquen. Por lo tanto, estas regiones podrían ser sitios adecuados para el direccionamiento de la inserción de una secuencia de interés.

Segundo, los sitios diana se deberían seleccionar de manera que no tuvieran mucho impacto en la función del gen de selección (por ejemplo, el gen endógeno de la DHFR, GS, o HPRT). Debido a que la amplificación necesita una copia funcional del gen de selección, se deberían evitar los sitios de inserción en el promotor, exones, intrones, señales de poliadenilación, u otras secuencias reguladoras que, si se alteran, impactaría enormemente en la transcripción o traducción del gen de selección. Por ejemplo, el documento WO 2008/059317 desvela meganucleasas que escinden los sitios de ADN diana en el gen HPRT. Hasta el punto en el que el documento WO 2008/059317 desvela la inserción de genes en el locus del HPRT, enseña de que la secuencia codificante del gen de HPRT se debería alterar en el proceso de inserción del transgén para facilitar la selección para el direccionamiento apropiado utilizando 6-tioguanina. La 6-tioguanina es un análogo de nucleótido tóxico que destruye las células que tienen una actividad funcional de HPRT. Debido a que las células producidas de acuerdo con el documento WO 2008/059317 no tienen actividad de HPRT, no amplificarán un transgén insertado en respuesta al tratamiento con un inhibidor de HPRT, y, por lo tanto, no se pueden utilizar en la presente invención. Para la presente invención, a menos de que ya se conozcan los límites precisos de todas las secuencias reguladoras para un gen de selección particular, se deberían seleccionar sitios de inserción >1.000 pares de bases, >2.000 pares de bases, >3.000 pares de bases, >4.000 pares de bases, o, preferentemente, >5.000 pares de bases, corriente arriba o corriente abajo de la secuencia codificante del gen. Sin embargo, si se conocen la localización de las secuencias reguladoras, la secuencia de interés se puede insertar inmediatamente adyacente a la secuencia regulador más 5' o 3' (por ejemplo, inmediatamente 3' de la señal de poliadenilación).

Por último, los sitios diana se deberían seleccionar para que no alteren otros genes cromosómicos que pueden ser importantes para la fisiología celular normal. En general, los sitios de inserción genética deberían de estar a >1.000 pares de bases, >2.000 pares de bases, >3.000 pares de bases, >4.000 pares de bases, o, preferentemente, >5.000 pares de bases de cualquier secuencia genética codificante.

Se describen esquemáticamente distintos procedimientos de la invención en las figuras de la siguiente manera:

La Figura 1 representa una estrategia general para dirigir una secuencia de interés a un locus que se puede amplificar. En la primera etapa, una endonucleasa específica del sitio introduce una rotura de doble cadena en el ADN cromosómico de una célula en un sitio que está proximal a un gen de selección endógeno. El ADN cromosómico escindido se somete entonces a recombinación homóloga con una molécula de ADN donante que comprende una secuencia de interés flanqueada por secuencias de ADN homólogas de las secuencias que flanquean la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa del sitio diana. Como resultado, se inserta la secuencia de interés en el ADN cromosómico de la célula adyacente al gen de selección endógeno. La célula modificada se cultiva entonces en presencia de uno o más compuestos que inhiben la función del gen de selección para inducir un aumento del número de copias (es decir, una amplificación) del gen de selección. La secuencia de interés, que está unida genéticamente al gen de selección, se co-amplificará con el gen de selección. El resultado es una línea celular transgénica estable que comprende múltiples copias de la secuencia de interés.

La Figura 2(A) representa un esquema del locus de DHFR de CHO que muestra una región preferida para el direccionamiento de una secuencia de interés 5.000-60.000 pares de bases corriente abajo del gen de DHFR. La Figura 2(B) representa un esquema del locus GS de CHO que muestra una región preferida para el direccionamiento de una secuencia de interés 5.000-55.000 pares de bases corriente abajo del gen de Gs . Los promotores se muestran como flechas. Los exones se muestran como rectángulo, con los exones no codificantes en blanco y los exones codificantes de proteínas en gris.

La Figura 3 representa una estrategia para la inserción de una secuencia de interés en un locus que se puede amplificar en un procedimiento de dos etapas que implica una secuencia diana integrada previamente. En la primera etapa, el ADN cromosómico de una célula se escinde por una endonucleasa específica del sitio en un sitio que está proximal a un gen de selección. El ADN cromosómico escindido se somete entonces a recombinación homóloga con una molécula de ADN donante que comprende una secuencia diana exógena flanqueada por secuencias de ADN homólogas a las secuencias flanqueantes del sitio diana endógeno. Esto da como resultado la inserción de una secuencia diana modificada nueva en el ADN cromosómico de la célula proximal al gen de selección. Se puede direccionar posteriormente una secuencia de interés proximal al mismo gen de selección utilizando una nucleasa, integrasa, transposasa, o recombinasa que reconozca específicamente la secuencia diana modificada integrada previamente. La célula modificada se cultiva entones en presencia de uno o más compuestos que co-amplifican el gen de selección y la secuencia de interés.

La Figura 4 representa una estrategia para la inserción de una secuencia diana modificada en un gen de selección (por ejemplo, DHFR) con la retirada concomitante de una parte del gen de selección. Se utilizó primero una endonucleasa específica del sitio para escindir el ADN cromosómico de la célula, proximal a o en la secuencia del gen de selección. Como se muestra en la figura, el sitio diana endógeno está entre los exones 2 y 3 del gen de DHFR de CHO (aunque el sitio diana podría estar en cualquier otro intrón o exón, y el gen de selección podría ser cualquier gen sometido a amplificación). El ADN cromosómico se somete entonces a recombinación homóloga con un primer ADN donante (“ADN donante n° 1”) de manera que la secuencia del primer ADN donante se inserta en el ADN cromosómico de la célula. Como se muestra en la figura, esto da como resultado la sustitución del promotor y los dos primeros exones de DHFR por la secuencia diana modificada nueva (aunque el primer ADN donante podía remplazar más o menos del ADN cromosómico, tal como solo una parte del exón). Si dicha sustitución se hace en todos los alelos DHFR de una célula, la línea celular resultante es DHFR (-/-). Se puede dirigir posteriormente una secuencia de interés proximal a un gen de selección en la línea celular utilizando una endonucleasa, integrasa, transposasa, o recombinasa que reconoce la secuencia diana modificada. Como se muestra en la figura, el segundo ADN donante (“ADN donante n° 2”) comprende una secuencia de interés, así como un promotor y los primeros dos exones de DHFR. El direccionamiento apropiado de esta segunda molécula de ADN donante da como resultado la inserción de la secuencia de interés en la secuencia diana modificada mientras que se reconstituye simultáneamente un gen DHFR funcional. Por lo tanto, las líneas celulares direccionadas apropiadamente serán DHFR+ y se pueden seleccionar utilizando medios deficientes en hipoxantina/timidina. Además, los que se representa en un diagrama aquí para la DHFR se puede aplicar a cualquier gen de selección en un locus que se pueda amplificar.

La Figura 5 representa una estrategia para la inserción de una secuencia diana modificada en un locus que se puede amplificar con una alteración concomitante de la secuencia codificante de un gen de selección. Primero se utiliza una endonucleasa específica del sitio para escindir el ADN cromosómico de la célula en la secuencia codificante del gen de selección. Como se muestran en la figura, el sitio diana endógeno está en el tercer exón del gen GS de CHO. El ADN cromosómico se somete entonces a recombinación genética con un primer ADN donante (“ADN donante n° 1”) de manera que la secuencia del primer ADN donante se inserta en el ADN cromosómico de la célula. Esto da como resultado la inserción de una secuencia diana modificada nueva en la secuencia codificante de GS. Si se produce dicha inserción en ambos alelos del gen GS y da como resultado una mutación con cambio de fase u otra manera de alteración de la función del gen GS, la línea celular resultante será GS (-/-). Una secuencia de interés se puede direccionar posteriormente en proximal al locus que se puede amplificar de la línea celular utilizando una endonucleasa, integrasa, transposasa, o recombinasa que reconozca la secuencia diana modificada. Como se muestra en la figura, un segundo ADN donante (“ADN donante n° 2”) comprende una secuencia de interés unida operativamente a un promotor así como la parte 3' de la secuencia codificante de GS que comprende los exones 3,4, 5, y 6 (La figura muestra los exones 3, 4, 5 y 6 unidos en una única secuencia de nucleótidos (es decir, con intrones retirados), pero también se podría utilizar una secuencia que incluya o intrones de origen natural o uno o más intrones artificiales. El direccionamiento apropiado de la segunda molécula de ADN donante da como resultado la inserción de la secuencia de interés en la secuencia diana modificada a la vez que se reconstituye simultáneamente un gen de GS funcional. Por lo tanto, las líneas direccionadas apropiadamente serán GS+ y se pueden seleccionar utilizando medios deficientes en L-glutamina. Además, la secuencia de interés se puede co-amplificar con el gen GS utilizando una selección con MSX. La estrategia representada mediante diagramas aquí para GS se puede aplicar a cualquier gen de selección en un locus que se pueda amplificar. La Figura 6 representa una estrategia para la inserción de una secuencia diana modificada en un locus que se puede amplificar con la alteración concomitante del procesamiento del ARNm de un gen de selección. Primero se utiliza una endonucleasa para escindir el ADN cromosómico de la célula en un intrón del gen de selección. Como se representa, el sitio diana endógeno está en el intrón entre el tercer y cuarto exones codificantes del gen de GS de CHO. El ADN cromosómico se somete entonces a recombinación homóloga con un ADN donante n° 1 de manera que la secuencia del ADN donante se inserta en el ADN cromosómico de la célula. Esto da como resultado la inserción de una nueva secuencia diana modificada en la secuencia codificante de GS con una secuencia adicional que produce que el ARNm de GS se procese incorrectamente. Como se representa, esta secuencia adicional comprende un fuerte receptor de corte y empalme. Si dicha inserción se produce en ambos alelos del gen GS, el receptor artificial de corte y empalme producirá que el ARNm de GS se corte y empalme incorrectamente, dando como resultado una pérdida de expresión de GS y la necesidad de crecimiento en cultivos que contengan L-glutamina. Se puede dirigir posteriormente una secuencia de interés a locus que se puede amplificar en la línea celular utilizando una endonucleasa, integrasa, transposasa, o recombinasa que reconozca la secuencia diana modificada. Como se representa mediante diagramas, el ADN donante n° 2 comprende una secuencia de interés unida operativamente a un promotor, así como ola parte 3' de la figura muestra los exones 4, 5, y 6 unido a una secuencia de nucleótidos única. (La figura muestra los exones 4, 5, y 6 unido en una secuencia de nucleótidos única (es decir, con los intrones retirados), pero también se podría emplear una secuencia que incluye intrones de origen natural o uno o más intrones artificiales). El direccionamiento apropiado de esta molécula de ADN donante n° 2 da como resultado la inserción de la secuencia de interés en la secuencia diana modificada mientras se reconstituye simultáneamente un gen GS funcional. Por lo tanto, las líneas celulares direccionadas apropiadamente serán GS+ y se pueden seleccionar utilizando medios deficientes en L-glutamina y la secuencia de interés se puede co-amplificar con el gen de GS utilizando una selección con MSX. La estrategia representada mediante diagramas aquí para GS se puede aplicar a cualquier gen de selección en un locus que se pueda amplificar.

La Figura 7(A) representa un ensayo de recombinación repetida directa de la actividad de endonucleasa específica del sitio. Se produce un plásmido indicador que comprende los dos tercios 5' del gen GFP (“GF”), seguido por una secuencia de reconocimiento por la endonucleasa, seguido por los dos tercios 3' del gen GFP (“FP”). Las células de mamífero se transfectaron con este plásmido indicador, así como el gen que codifica la endonucleasa. La escisión de la secuencia de reconocimiento por la endonucleasa estimula la recombinación homóloga entre repeticiones directas del gen de GFP para restaurar la función de GFP. Las células GFP+ se pueden contar y/o clasificar en un citómetro de flujo.

La Figura 7(B) representa los resultados del ensayo de la Figura 7(A) según se aplica a las meganucleasas CHO-23/24 y CHO-51/52. Las barras claras indican el porcentaje de células GFP+ cuando se transfectan las células con el plásmido indicador solo (-endonucleasa). Las barras oscuras indican el porcentaje de células GFP+ cuando se co-transfectan con el plásmido indicador y el gen de meganucleasas correspondiente (+endonucleasa). El ensayo se llevó a cabo por triplicado y se muestra la desviación típica.

La Figura 7(C) representa el alineamiento de secuencias obtenidas de las células CHO transfectadas con el ARNm que codifica la meganucleasa CHO-23/24. La secuencia superior es de una célula CHO de tipo silvestre (TS) con la secuencia de reconocimiento para la CHO-23/24 subrayada.

La Figura 7(D) representa el alineamiento de secuencias obtenidas de las células CHO transfectadas con el ARNm que codifica la meganucleasas CHO-51/52. La secuencia superior es de una célula CHO de tipo silvestre (TS) con la secuencia de reconocimiento para la CHO-51/52 subrayada.

La Figura 8(A) representa una estrategia para la inserción de una secuencia de ADN exógena en el locus de DHFR de CHO utilizando la meganucleasa CHO-51/52. Las células CHO se co-transfectaron con el ARNm que codifica la CHO-51/52 y un plásmido donante que comprendía un sitio EcoRI flanqueado por 543 pares de bases de la secuencia de ADN homóloga de la región corriente arriba del sitio de reconocimiento de CHO-51/52 y 461 pares de bases de la secuencia de ADN homologa de la región corriente arriba del sitio de reconocimiento de CHO-51/52. 48 horas después de la transfección, el ADN genómico se aisló y se sometió a PCR utilizando cebadores específicos para la región corriente abajo del locus de DHFR (flechas discontinuas).

La Figura 8(B) representa los productos de la PCR que se clonaron en el pUC-19 y 48 clones plasmídicos individuales y se digirieron con EcoRI y se visualizaron en gel de agarosa. 10 plásmidos (calles numeradas) daban lugar a un fragmento de restricción de 647 bases, consistente con la escisión de un primer sitio EcoRI en el vector pUC-19 y un segundo sitio EcoRI en el fragmento de PCR clonado. Estos 10 plásmidos se secuenciaron para confirmar que albergaban un fragmento de la PCR que comprendían una parte corriente abajo del locus DHFR con un sitio de restricción EcoRI insertado en la secuencia de reconocimiento. Este patrón de restricción no se observó cuando se transfectaron las células con el plásmido donante solo.

La Figura 9(A) representa una estrategia para la inserción de una secuencia diana modificada en el locus de DHFR de CHO utilizando la meganucleasas CHO-23/24. Las células CHO se co-transfectaron con el ARNm que codifica la CHO-23/24 y un plásmido donante que comprende, en la orientación 5' a 3', un promotor SV40, un codón de inicio ATG, un sitio FRT, y un gen de resistencia a la Zeocina (Zeo). Las células resistentes a zeocina se clonaron por dilución limitante y se exploraron por PCR para identificar una línea celular clónica en la que se integra en la secuencia del plásmido donante en el sitio de reconocimiento para la CHO-23/24. Después de la expansión, esta línea celular se co-transfectó con un primer plásmido que codifica la Flp recombinasa unida operativamente a un promotor y un segundo plásmido (plásmido donante n° 2) que comprende un gen de la GFP bajo el control de un promotor CMV, un sitio FRT, y un gen de resistencia a la higromicina (Hig) que carece de un codón de inicio. Los sitios FRT entre la recombinación mediada por Flp resultaba en la integración de la secuencia del plásmido donante n° 2 en la secuencia diana modificada (es decir, el sitio FRT) de manera que se producía un casete de expresión genética Hig funcional. La Figura 9(B) representa los productos de PCR de clones resistentes a la higromicina producidos como en (A) que se clonaron por dilución limitante. Se extrajo el ADN genómico de 24 clones individuales y se amplificó por PCR utilizando un primer cebador en el locus DHFR y un segundo cebador en el gen Hig (líneas discontinuas). Los 24 clones daban lugar a un producto de la PCR consistente con la inserción del gen HIG en la secuencia diana modificada. La Figura 9(C) representa la expresión de los 24 clones producidos en (B) utilizando citometría de flujo. Se descubrió que todos los genes expresan altos niveles de GFP con una relativamente poca variabilidad clon a clon.

Figura 10. Se produjo una línea de CHO que expresa GFP integrando un casete de expresión del gen GFP en el locus DHFR utilizando una estrategia de secuencia diana modificada como se muestra en la Figura 9. Esta línea celular se cultivó entonces en MTX como se describe en el Ejemplo 2 para amplificar el gen GFP integrado. (A) gráficos de citometría de flujo que muestran la intensidad de g Fp en el eje Y. En la línea celular pre-MTX, la intensidad de GFP tenía un promedio de aproximadamente 2 x 103 mientras que en la línea celular cultivada en 250 nM de MTX, era visible una subpoblación distinta (en un círculo) en el que la intensidad de GFP se aproxima a 104 (B) Las líneas celulares tratadas con MTX se clasificaron por FACS para identificar células individuales que expresan grandes cantidades de GFP. Cinco de dichas células de alta expresión se expandieron y se determinó la intensidad de GFP por citometría de flujo. Se descubrió que los cinco clones tenían un aumento significativo de la expresión de GFP con respecto a la línea celular pre-MTX. (C) El ADN genómico se aisló a partir de cinco líneas celulares clónicas producidas en (B) y se sometieron a PCR cuantitativa utilizando un par de cebadores específico para el gen de GFP. Se descubrió que los cinco clones de alta expresión tenían significativamente más copias del gen GFP que la línea celular pre-MTX. Estos resultados demuestran que el número de copias y el nivel de expresión de un transgén integrado corriente abajo del DHFR de CHO puede amplificarse en respuesta al tratamiento con MTX.

Figura 11. (A) Un ensayo de recombinación repetida directa, como en la Figura 5A. (B) El ensayo en (A) aplicado a las meganucleasas CHO-13/14 y CGS-5/6. Las barras claras indican el porcentaje de células GFP+ cuando se transfectan las células con el plásmido indicador solo (-endonucleasa). Las barras oscuras indican el porcentaje de células GFP+ cuando las células se co-transfectan con un plásmido indicador y el gen correspondiente de la meganucleasa (+endonucleasa). El ensayo se llevó a cabo por triplicado y se muestra la desviación típica. (C) Alineamiento de secuencias obtenidas de células CHO transfectadas con ARNm que codifica la meganucleasas CGS-5/6. La secuencia superior es de la célula CHO de tipo silvestre (TS) con la secuencia de reconocimiento para la CGS-5/6 subrayada. Los puntos indican bases eliminadas. Las bases que están en cursiva y negrita son mutaciones o inserciones puntuales con respecto a la secuencia de tipo silvestre. Nótese que se espera que las mutaciones observadas en al menos los clones 6d4, 6g5, 3b7, 3d11, 3e5, 6f10, 6hH8, 6d10, 6d7, 3g8 y 3a9 inactive la función del gen GS.

2.1.1 Direccionamiento genético al locus DHFR de CHO

El locus DHFR de CHO se representa en forma de diagrama en la Figura 2A. El locus comprende el gen de DHFR que codifica una secuencia en 6 exones que abarcan ~24.500 pares de bases. El gen Msh3 se localiza inmediatamente corriente arriba del DHFR y se transcribe divergentemente del mismo promotor de DHFR. Se puede encontrar un hipotético gen, 2BE2121, ~65.000 pares de bases corriente abajo de la secuencia codificante de DHFR. Por lo tanto, hay una región de ~65.000 pares de bases corriente abajo del gen DHFR que no alberga ningún gen conocido y es una localización adecuada para dirigir la inserción de secuencias de interés. Los sitios diana para la inserción de una secuencia de interés, en general no se debería seleccionar si son <1.000 pares de bases, y preferentemente no <5.000 pares de bases de los genes DHFR o 2BE2121. Esto limita la ventana de sitios diana preferidos en la región de 1.000­ 60.000 pares de bases corriente abajo de la secuencia codificante de la DHFR. La secuencia de esta región se proporciona como la SEQ ID NO: 2.

Los loci de DHFR humano y de ratón tienen una organización similar al locus de CHO. En ambos casos, el gen Msh3 está inmediatamente corriente arriba del DHFR, pero hay una gran área que carece de secuencias codificantes corriente abajo del DHFR. En los seres humanos el gen ANKRD34B tiene ~55.000 pares de bases corriente abajo del DHFR mientras que el gen ANKRD34B tiene ~37.000 pares de bases corriente abajo del DHFR de ratón. Por lo tanto, la región corriente abajo del DHFR es una localización apropiada para insertar genes de interés en líneas celulares y células CHO humanas y de ratón. Además, los casetes de expresión genética insertados en esta región se expresarán con un nivel alto, serán resistentes al silenciamiento genético y capaces de amplificarse mediante el tratamiento con MTX. Los procedimientos para la amplificación del locus DHFR en células CHO se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Kellems, ed., Gene amplification in mammalian cells: a comprehensive guide. Marcel Dekker, New York, 1993) y normalmente implican una concentración creciente gradualmente de la concentración de MTX en los medios de cultivo desde 0 hasta 0,8 mM durante un periodo de varias semanas.

2.1.2 Direccionamiento genético al locus de GS

Los loci en CHO humana y de ratón de la glutamina sintetasa (también conocida como “glutamato-amonio ligasa” o “GluL”) comparten una organización común (Fig. 2B). El gen TEDDM1 está inmediatamente corriente arriba de GS en todas las especies (~5.000 pb corriente arriba en el caso de los seres humanos, ~7.000 pb corriente arriba en el caso del ratón y CHO). El gen corriente abajo más cercano está, sin embargo, ~46.000 pb más lejos en el caso del ser humano y ~117.000 pb más lejos en el caso del ratón y las CHO. Por lo tanto, los inventores predijeron que la región cromosómica de 1.000-41.000 pb o 5.000-41.000 pb corriente abajo del GS en células humanas y 1.000-100.000 pb, o 5.000-100.000 pb corriente abajo del GS en el ratón y células de CHO eran localizaciones apropiadas para dirigir la inserción de secuencias de interés. Debido a que los sitios de ADN distales a la secuencia codificante de GS es más probable que sean susceptibles al silenciamiento genético, se prefiere una región cromosómica de 5.000-60.000 pb corriente abajo de GS para dirigir la inserción de una secuencia de interés tanto en ratón o células CHO. La secuencia de esta región del genoma de CHO se proporciona como la SEQ ID NO: 3. Los casetes de expresión genética insertados en esta región se expresarán a un nivel alto, serán resistentes al silenciamiento genético y capaces de amplificarse mediante el tratamiento con MSX. Las regiones menos preferidas incluyen la región cromosómica entre los genes TEDDM1 y GS o la región <10.000 pb corriente abajo de TEDDM1 (véase la Figura 2B). Los procedimientos para la amplificación del locus de GS se conocen en la técnica (Bebbington y col. (1992), Biotechnology (N Y).

10(2):169-75).

2.2 Endonucleasas modificadas para el direccionamiento genético

Se puede insertar una secuencia de interés en un locus que se pueda amplificar utilizando una endonucleasa específica del sitio modificada. Los procedimientos para la generación de endonucleasas específicas del sitio que puedan dirigir roturas de ADN en loci predeterminados en un genoma se conocen en la técnica. Estas incluyen las nucleasas en dedos de zinc (Le Provost y col. (2010), Trends Biotechnol. 28(3):134-41), nucleasas efectoras TAL (Li y col. (2011), Nucleic Acids Res. 39(1):359-72), y meganucleasas modificadas (documentos WO 2007/047859; WO 2007/049156; WO 2009/059195). En una realización, la invención proporciona meganucleasas modificadas derivadas de I-CreI que se pueden utilizar para dirigir la inserción de un gen de interés en un locus que se pueda amplificar. Los procedimientos para producir dichas meganucleasas modificadas se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, los documentos w O 2007/047859; WO 2007/049156; WO 2009/059195). En realizaciones preferidas, se utiliza una meganucleasas de “cadena sencilla” para dirigir la inserción genética en una región que se puede amplificar del genoma. Los procedimientos para la producción de dichas meganucleasas de “cadena sencilla” se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, los documentos WO 2009/059195 y WO 2009/095742). En algunas realizaciones, la nucleasa modificada se fusiona a una señal de localización nuclear (NLS) para facilitar la captación nuclear. Ejemplos de señales de localización nuclear incluyen la NLS de SV40 (secuencia de aminoácidos MAPKKKRKV) que se pueden fusionar en el extremo C o, preferentemente, en el extremo N de la proteína. Además, se puede marcar una nucleasa modificada con un epítopo peptídico (por ejemplo, un epítopo hA, FLAG o Myc) para monitorizar los niveles de expresión o localización o para facilitar la purificación.

2.3 Líneas celulares modificadas con secuencias de interés dirigidas a loci que se puedan amplificar

En algunas realizaciones, la invención proporciona procedimientos para la utilización de nucleasas modificadas en el direccionamiento de la inserción de transgenes en loci que se puedan amplificar en células de mamífero cultivadas. Este procedimiento tiene dos componentes primarios: (1) una nucleasa modificada; y (2) una molécula donante de ADN que comprende una secuencia de interés. El procedimiento comprende poner en contacto el ADN de la célula con la nucleasa modificada para crear una rotura de la doble cadena del ADN en una secuencia de reconocimiento endógena de un locus que se pueda amplificar seguido por la inserción de la molécula de ADN donante en el sitio de la rotura del ADN. Dicha inserción del ADN donante se facilita por la maquinaria de reparación de ADN y puede producirse por la ruta de unión de extremos no homólogos o por recombinación homóloga (Figura 1).

La nucleasa modificada se puede suministrar a la célula en forma de proteína o, preferentemente, como un ácido nucleico que codifique la nucleasa modificada. Dicho ácido nucleico puede ser un ADN (por ejemplo, un ADN plasmídico circular o que se ha hecho lineal o productos de PCR) o un ARN. Para las realizaciones en las que la secuencia codificante de nucleasa modificada se suministra en forma de ADN, debería estar unida operativamente a un promotor para facilitar la transcripción del gen de la nucleasa modificada. Los promotores de mamífero adecuados para la invención incluyen los promotores constitutivos tales como el promotor temprano de citomegalovirus (CMV) (Thomsen y col. (1984), Proc Natl Acad Sci USA. 81(3):659-63) o el promotor temprano del SV40 (Benoist y Chambon (1981), Nature. 290(5804):304-10), así como los promotores inducibles tales como el promotor inducible por tetraciclina (Dingermann y col. (1992), Mol Cell Biol. 12(9):4038-45).

En algunas realizaciones, se suministra a la célula el ARNm que codifica la nucleasa modificada debido a que esto reduce la probabilidad de que el gen que codifica la nucleasa modificada se integre en el genoma de la célula. Dicho ARNm que codifica la nucleasa modificada se puede producir utilizando procedimientos conocidos en la técnica tales como la transcripción in vitro. En algunas realizaciones, el ARN está protegido utilizando 7-metil-guanosina. En algunas realizaciones, el ARNm puede estar poliadenilado.

Las nucleasas proteicas modificadas purificadas se pueden suministrar a las células para escindir el ADN genómico, lo que permite la recombinación homóloga o la unión de extremos no homólogos en el sitio de escisión con una secuencia de interés, mediante una variedad de diferentes mecanismos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la nucleasa proteica recombinante se puede introducir en la célula mediante técnicas que incluyen, pero no se limitan a, microinyección o transfecciones liposómica (véase, por ejemplo, Lipofectamine™, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). La formulación de liposomas se puede utilizar para facilitar la fusión de la bicapa lipídica con una célula diana, permitiendo de esta manera que los contenidos del liposoma o las proteínas asociadas con su superficie se introduzcan en la célula. De manera alternativa, la enzima se puede fusionar con un péptido de captación apropiado tal como el de la proteína TAT del VIH para dirigir la captación celular (véase, por ejemplo, Hudecz y col. (2005), Med. Res. Rev. 25: 679-736).

De manera alternativa, las secuencias genéticas que codifican la nucleasa proteica modificada se insertan en un vector y se transfectan en una célula eucariota utilizando técnicas conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley 1999). La secuencia de interés se puede introducir en el mismo vector, un vector diferente, o por otros medios conocidos en la técnica. Ejemplos no limitantes de vectores para la transfección de ADN incluyen vectores víricos, plásmidos, cósmidos y vectores YAC. La transfección de secuencias de ADN se puede conseguir mediante una variedad de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se utilizan liposomas e inmunoliposomas para suministrar secuencias de ADN a las células (véase, por ejemplo, Lasic y col. (1995), Science 267: 1275-76). Además, se pueden utilizar virus para introducir vectores en las células (véase, por ejemplo, la Pat. de EE. UU. N.° 7.037.492). De manera alternativa, las estrategias de transfección se pueden utilizar de manera que los vectores se introduzcan como ADN desnudo (véase, por ejemplo, Rui y col. (2002), Life Sci. 71(15): 1771-8).

Los procedimientos generales para el suministro de ácidos nucleicos en las células incluyen: (1) procedimientos químicos (Graham y col. (1973), Virology 54(2):536-539; Zatloukal y col. (1992), Ann. N. Y. Acad. Sci., 660:136-153; (2) procedimientos físicos tales como la microinyección (Capecchi (1980), Cell 22(2):479-488, electroporación (Wong y col. (1982), Biochim. Biophys. Res. Commun. 107(2):584-587; Fromm y col. (1985), Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82(17):5824-5828; Pat. de EE. UU. N.° 5.384.253) e inyección balística (Johnston y col. (1994), Methods Cell. Biol.

43(A): 353-365; Fynan y col. (1993), Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90(24): 11478-11482); (3) vectores víricos (Clapp (1993), Clin. Perinatol. 20(1): 155-168; Lu y col. (1993), J. Exp. Med. 178(6):2089-2096; Eglitis y col. (1988), Avd. Exp. Med. Biol. 241:19-27; Eglitis y col. (1988), Biotechniques 6(7):608-614); y (4) mecanismos mediados por un receptor (Curiel y col. (1991), Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88(19):8850-8854; Curiel y col. (1992), Hum. Gen. Ther. 3(2):147-154; Wagner y col. (1992), Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89 (13):6099-6103). En algunas realizaciones preferidas, el ARNm protegido con 7-metil-guanosina que codifica la nucleasa modificada se suministra a las células utilizando electroporación.

La molécula donante de ADN comprende un gen de interés unido operativamente a un promotor. En muchos casos, una molécula donante puede comprender múltiples genes unidos operativamente al mismo o diferentes promotores. Por ejemplo, las moléculas donantes que comprende casetes de expresión de anticuerpos monoclonales pueden comprender un gen que codifica la cadena pesada del anticuerpo y un segundo gen que codifica la cadena ligera del anticuerpo. Ambos genes pueden estar bajo el control de diferentes promotores o pueden estar bajo el control del mismo promotor utilizando, por ejemplo, un sitio interno de entrada en el ribosoma (IRES). Las moléculas donantes pueden comprender también un gen indicador genético unido operativamente a un promotor para facilitar la identificación de las células transgénicas. Dichos indicadores genéticos se conocen en la técnica e incluyen los genes de la neomicina fosfotransferasa (NEO), hipoxantina fosforribosiltransferasa (HPRT), glutamina sintetasa (GS), dihidrofolato reductasa (DHFR) y la higromicina fosfotransferasa (HIG).

En algunas realizaciones, las moléculas donantes de ADN comprenderán adicionalmente secuencias flanqueantes homólogas de las secuencias diana del ADN de la célula. Dichas secuencias flanqueantes homólogas comprenden > 3 o, preferentemente, < 50 o más preferentemente > 200 o más preferentemente > 400 pares de bases de ADN que son idénticas o casi idénticas en secuencia al locus cromosómico reconocido por la nucleasa modificada (Figura 1). Dichas secuencias de ADN homólogas facilitan la integración de la secuencia donante de ADN en el locus que se puede amplificar por recombinación homóloga.

La molécula “donante” de ADN puede ser circular (por ejemplo, un ADN plasmídico) o lineal (por ejemplo, un plásmido que se ha hecho lineal o productos de una PCR). Los procedimientos para el suministro de moléculas de ADN se conocen en la técnica como se ha expuesto anteriormente.

En algunas realizaciones, el gen de nucleasa modificada y el ADN donante se llevan a cabo en moléculas de ácido nucleico separadas que se co-transfectan en las células o líneas celulares. Por ejemplo, el gen de la nucleasa modificada unida operativamente a un promotor puede transfectarse en forma de plásmido simultáneamente con una molécula de ADN donante diferente en forma de plásmido o de producto de PCR. En una realización alternativa, la nucleasa modificada se puede suministrar en forma de ARNm con una molécula de ADN donante en forma de plásmido o de producto de PCR. En una tercera realización, el gen de la nucleasa modificada y el ADN donante se llevan en la misma molécula de ADN, tal como un plásmido. En una cuarta realización, las células se co-transfectan con una nucleasa proteica modificada y una molécula de ADN en forma de plásmido o producto de PCR.

Después de la transfección con la nucleasa modificada y el ADN donante, normalmente se permite a las células que se recuperen de la transfección (24-72 horas) antes de clonarse utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Los procedimientos comunes para la clonación de una línea celular modificada genéticamente incluyen “dilución limitante” en la que las células transfectadas se transfieren a las placas de cultivo tisular (por ejemplo, placas de 48 pocillos, 96 pocillos, etc.) a una concentración de < 1 célula por pocillo y se expanden en poblaciones clónicas. Otras estrategias de clonación incluyen sistemas de aislamiento/identificación de clones robóticos tal como ClonePix™ (Genetix, Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA). Las líneas celulares clónicas se pueden entonces explorar para identificar líneas celulares en las que se ha integrado la secuencia de interés en el sitio diana pretendido. Las líneas celulares pueden explorarse fácilmente utilizando análisis moleculares conocidos en la técnica tales como PCR o Transferencia de Southern. Por ejemplo, se puede aislar el ADN genómico de una línea celular clónica y someterse a amplificación por PCR utilizando un primer cebador (en sentido de la cadena) que se hibrida a una secuencia de ADN en la secuencia de interés y un segundo cebador (de cadena antisentido) que se hibrida a una secuencia del locus que se puede amplificar. Si la molécula de ADN donante comprende una secuencia de ADN homóloga del sitio diana, es importante que el segundo cebador se diseñe para hibridarse a una secuencia en el locus que se puede amplificar que está más allá de los límites de homología que lleva la molécula donante para evitar resultados falsos positivos. De manera alternativa, las líneas celulares se pueden explorar en cuanto a la expresión de la secuencia de interés. Por ejemplo, si la secuencia de interés codifica una proteína secretada tal como un anticuerpo, el medio de cultivo se tiene que muestrear de las líneas celulares clónicas aisladas y se ensaya en cuanto a la presencia del anticuerpo proteico utilizando procedimientos conocidos en la técnica tales como Transferencia de Western o ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Este tipo de exploración funcional se puede utilizar para determinar cuál de estas líneas celulares transgénicas llevan la secuencia de interés dirigida al locus que se puede amplificar de interés, como se ha descrito anteriormente.

El procedimiento de la invención se puede utilizar en cualquier tipo de célula que es pueda transfectar y cultivar tal como líneas celulares inmortalizadas y células madre. En realizaciones preferidas, el procedimiento de la invención se utiliza para modificar genéticamente líneas celulares inmortalizadas que se utilizan comúnmente para la biofabricación. Esto incluye:

1. Las líneas celulares de hámster tal como células de riñón recién nacido de hámster (BHK) y todas las variantes de células ováricas de hámster chino (CHO), por ejemplo, CHO-K1, CHO-S (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), DG44, o Potelligent™ (Lonza Group Ltd., Basel, Suiza). Debido a que las secuencias genómicas de las diferentes líneas celulares de hámster son casi idénticas, una meganucleasa modificada que se pueda utilizar para practicar la invención en un tipo celular de hámster (por ejemplo, células BHK) se puede utilizar en general para practicar la invención en otro tipo celular de hámster (por ejemplo, CHO-K1).

2. Las líneas celulares de ratón tal como las células de hibridoma de ratón o mieloma de ratón (por ejemplo, NS0). Debido a que las secuencias del genoma de las diferentes líneas celulares de ratón son casi idénticas, una meganucleasa modificada que se pueda utilizar para practicar la invención en un tipo celular de ratón (por ejemplo, células de hibridoma de ratón) se puede utilizar en general para practicar la invención en otro tipo celular de ratón (por ejemplo, NS0).

3. Las líneas celulares humanas tales como las células renales embrionarias humanas (por ejemplo, HEK-293 o 293S) y las células retinianas humanas (por ejemplo, PER.C6). Debido a que las secuencias genómicas de diferentes líneas celulares humanas son casi idénticas, una meganucleasa modificada que se pueda utilizar para practicar la invención en un tipo celular humano (por ejemplo, células HEK-293) se pueden utilizar en general para practicar la invención en otro tipo celular humano (por ejemplo, PER.C6).

2.6 Líneas celulares modificadas previamente con secuencias diana modificadas en loci que se puedan amplificar

En una realización, la invención proporciona líneas celulares que están modificadas previamente para que comprendan una “secuencia diana modificada” que se pueda direccionar para la inserción genética en un locus que se puede amplificar en una línea celular de mamífero (Figura 3). Una secuencia diana modificada comprende una secuencia de reconocimiento para una enzima que es útil para la inserción de ácidos nucleicos transgénicos en secuencias de ADN cromosómico. Dichas secuencias diana modificadas pueden incluir secuencias de reconocimiento para meganucleasas modificadas derivadas de I-CreI (por ejemplo, las SEQ ID NO: 37-87 del documento WO 2009/076292), secuencias de reconocimiento para nucleasas en dedos de zinc, secuencias de reconocimiento para nucleasas efectoras TAL (TALEN), el sitio LoxP (SEQ ID NO: 4) que es reconocido por la Cre recombinasa, el sito FRT (SEQ ID NO: 5) que es reconocido por la recombinasa FLP , el sitio attB (SEQ ID NO: 6) que es reconocidos por la recombinasa lambda, o cualquier otra secuencia de ADN conocida en la técnica que es reconocida por una endonucleasa, recombinasa, integrasa, o transposasa específicas del sitio que sean útiles para el direccionamiento de la inserción de ácidos nucleicos en un genoma. Por lo tanto, la invención permite a un experto en la técnica utilizar una nucleasa modificada (por ejemplo, una meganucleasas, nucleasa en dedos de zinc, o nucleasa efectora TAL) para insertar una secuencia diana modificada en un locus que se puede amplificar en una línea celular de mamífero. La línea celular resultante comprende dicha secuencia diana modificada en un locus que se puede amplificar se puede poner en contacto con la enzima apropiada (por ejemplo, una segunda meganucleasas modificada, una segunda nucleasa en dedos de zinc, una segunda nucleasa efectora TAL, una recombinas, una integrasa, o una transposasa) para dirigir la inserción de un gen de interés en el locus que se pueda amplificar en la secuencia diana modificada. Esta estrategia en dos etapas puede ser ventajosa debido a la eficacia de la inserción genética que se puede conseguir utilizando una meganucleasas óptima, nucleasa en dedos de zinc, recombinasa, integrasa, o transposasa puede ser mayor que la que se puede conseguir utilizando la endonucleasa inicial (por ejemplo, meganucleasas o nucleasa en dedos de zinc) que escinda el sitio diana endógeno para promover la inserción de la secuencia diana modificada.

En una realización alternativa, se produce una línea celular insertando una secuencia diana modificada en un locus que se puede amplificar con la retirada concomitante de todo o una parte del marcador genético endógeno adyacente (Figura 4). Por ejemplo, se puede utilizar una meganucleasa modificada, nucleasa en dedos de zinc o nucleasa efectora TAL para retirar los dos primeros exones en ambos alelos del gen DHFR de CHO y sustituirlos con una secuencia diana modificada por una meganucleasa modificada, ZFN, TALEN, recombinasa, integrasa, o transposasa diferentes. La línea celular resultante será deficiente en DHFR e incapaz de crecer en ausencia de hipoxantina/timidina. De manera alternativa, por ejemplo, se puede utilizar una meganucleasa modificada, ZFN o TALEN para retirar el primer exón de ambos alelos del gen GS de CHO y sustituirlo con una secuencia diana modificada para una meganucleasa modificada, ZFN, TALEN, recombinasa, integrasa, o transposasa diferentes (Figura 4). La línea celular resultante será deficiente en GS e incapaz de crecer en ausencia de L-glutamina. Dicha línea celular es útil debido a que se puede insertar un gen de interés en la secuencia diana modificada en la línea celular modificada previamente mientras que simultáneamente se reconstituye el gen de selección (por ejemplo, DHFR o GS). Por lo tanto, es posible seleccionar los transfectantes que albergan el gen de interés en el locus que se puede amplificar utilizando las condiciones del medio que seleccionan las células DHFR+ o GS+.

En una realización alternativa, se produce una línea celular en la que la secuencia diana modificada se inserta en un locus que se puede amplificar con alternación del gen de selección (Figuras 5, 6). Esto se puede conseguir, por ejemplo, utilizando una meganucleasas que reconoce un sitio de ADN en la secuencia codificante del gen de selección. Dicha meganucleasas se puede utilizar para dirigir la inserción de una secuencia diana modificada en una secuencia codificante del gen de selección dando como resultado una alteración de la función del gen, por ejemplo, introduciendo un cambio de fase (Figura 5). De manera alternativa, por ejemplo, se puede insertar una secuencia diana modificad en un intrón de la secuencia del gen de selección con una secuencia adicional que promueve un procesamiento impropio de la transcripción del gen de selección (Figura 6). Dichas secuencias que promueven un procesamiento impropio incluyen, por ejemplo, receptores de corte y empalme artificiales o señales de poliadenilación. Las secuencias receptoras de corte y empalme se conocen en la técnica (Clancy (2008), "RNA Splicing: Introns, Exons and Spliceosome," Nature Education 1:1) y comprenden normalmente una secuencia rica en pirimidina de 20-50 pares de bases seguida por una secuencia (C/T)AG(A/G). La SEQ ID NO: 33 es un ejemplo de secuencia receptores de corte y empalme. De la misma manera, las señales de poliadenilación se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, la señal de poliadenilación de SV40 (SEQ ID NO: 34) y la señal de poliadenilación BGH (SEQ ID NO: 35). En algunas realizaciones, la línea celular resultante que alberga la nueva secuencia diana modificada en todos los alelos del gen de selección será deficiente en la función del gen debido a la mala transcripción o mala traducción del gen de selección y será capaz de crecer solo en condiciones permisivas. Por ejemplo, una secuencia diana modificada se puede insertar en la secuencia del gen de GS utilizando una meganucleasas dando como resultado una línea celular que es GS-/-que solo puede crecer en presencia de L-glutamina en el medio de cultivo. En una etapa posterior, se puede insertar un gen de interés en la secuencia diana modificada mientras se reconstituye simultáneamente el gen indicador (por ejemplo, DHFR o GS). Por lo tanto, es posible seleccionar los transfectantes que albergan el gen de interés en el locus que se puede amplificar utilizando las condiciones del medio que seleccionan las células DHFR+ o GS+.

2.5 Líneas celulares transgénicas para la biofabricación

En algunas realizaciones, la invención proporciona líneas celulares transgénicas adecuadas para la producción de fármacos proteicos. Dichas líneas celulares transgénicas comprenden una población de células en la que se inserta un gen de interés, unido operativamente a un promotor en el genoma de la célula en un locus que se pueda amplificar en el que el gen de interés codifica una proteína terapéutica. Ejemplos de terapéuticos proteicos incluyen: anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpo, eritropoyetina, activador del plasminógeno de tipo tisular, Factor VIII, Factor IX, insulina, factores estimulantes de colonias, interferones (por ejemplo, interferón-a, interferón-p e interferón-Y), interleucinas (por ejemplo, interleucina-2), vacunas, factor de necrosis tumoral, y glucocerebrosidasa. También se hace referencia a los terapéuticos proteicos como “biológicos” o “biofarmacéuticos”.

Para utilizarse para la biofabricación, una línea celular transgénica de la invención debería someterse a: (1) la adaptación de medio de cultivo libre de suero en suspensión; y (2) amplificación del gen de interés. En algunas realizaciones, la invención se practica en líneas celulares adherentes que se pueden adaptar al medio de cultivo en suspensión para facilitar su mantenimiento en biorreactores de matraces con agitado o contenedores con agitado como es típica de la biofabricación industrial. Los procedimientos para la adaptación de células adherentes a crecer en suspensión se conocen en la técnica (Cell Culture and Upstream Processing, Butler, ed. (Taylor y Francis Group, New York, 2007)). Es necesario en general adaptar adicionalmente las líneas celulares de biofabricación a medios definidos químicamente que carecen de componentes derivados de animales (es decir, medios “libres de suero”). Los procedimientos para la preparación de dichos medios y la adaptación de líneas celulares a este se conocen en la técnica (Cell Culture and Upstream Processing, Butler, ed. (Taylor y Francis Group, New York, 2007)). Dichos medios también se pueden adquirir comercialmente (por ejemplo, medio CD-3 para el mantenimiento de células CHO, disponible en Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y las células se pueden adaptar a este siguiendo las instrucciones del fabricante. En algunas realizaciones, la línea celular se adapta al cultivo en suspensión y/o el medio libre de suero antes de transfectarse con la nucleasa modificada.

Finalmente, los procedimientos para la amplificación genética se conocen en la técnica (Cell Culture and Upstream Processing, Butler, ed. (Taylor y Francis Group, New York, 2007)). En general, el procedimiento implica la adición de un inhibidor de un producto genético de selección al medio de cultivo para seleccionar las células que expresan anormalmente grandes cantidades del producto genético debido a los eventos de duplicación genética. En general, la concentración de inhibidor añadido al medio de cultivo se aumenta lentamente durante un periodo de semanas hasta que se alcanza el nivel deseado de amplificación. El inhibidor se retira entonces en general del medio antes de iniciar la ejecución de la bioproducción para evitar la posibilidad de que el inhibidor contamine la formulación proteica terapéutica. Por ejemplo, se puede amplificar el locus DHFR de CHO aumentando lentamente la concentración de MTX en el medio de cultivo de 0 mM hasta 0,8 mM durante un periodo de varias semanas. El locus GS puede, de la misma manera, amplificarse en el medio de 0 pM hasta 100 pM durante un periodo de varias semanas. Los procedimientos para la evaluación de la amplificación genética se conocen en la técnica e incluyen la Transferencia de Southern y PCR en tiempo real cuantitativa (rtPCR). Además, o como alternativa, los niveles de expresión de la secuencia de interés, que se correlaciona en general con el número de copas del gen, se pueden evaluar determinando la concentración de proteína terapéutica en el medio de cultivo utilizando procedimientos convencionales tales como Transferencia de Western o ELISA. Después de la producción de la línea celular, adaptación, y amplificación, las proteínas terapéuticas se pueden producir y purificar utilizando procedimientos que son convencionales en la industria biofarmacéutica.

Ejemplos

La presente invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes. Los expertos en la materia reconocerán, o podrán determinar, utilizando no más que la experimentación de rutina, numerosos equivalentes de las sustancias y procedimientos específicos descritos en el presente documento. Se pretende que dichos equivalentes estén abarcados en el ámbito de las reivindicaciones que siguen a los siguientes ejemplos. El Ejemplo 1 se refiere a meganucleasas modificadas que se pueden utilizar para dirigir la inserción de un gen de interés corriente abajo del gen DHFR en células CHO. El Ejemplo 2 se refiere a meganucleasas modificadas que se pueden utilizar para dirigir la inserción de una secuencia diana modificada en el gen DHFR de CHO con la retirada concomitante de los exones 1 y 2 de DHFR. El Ejemplo 2 también se refiere a meganucleasas modificadas que se pueden utilizar para dirigir la inserción de una secuencia diana modificada en el gen GS de CHO. El Ejemplo 3 se refiere a meganucleasas que se pueden utilizar para dirigir la inserción de un gen de interés corriente abajo del gen GS en células CHO.

Ejemplo 1

Inserción genética dirigida en el locus DHFR de CHO utilizando meganucleasas modificadas

La secuencia de ADN genómico de CHO de 10.000-55.000 pares de bases corriente abajo del gen DHFR se exploró para identificar sitios de ADN susceptibles para el direccionamiento con meganucleasas modificadas. Se seleccionaron dos sitios (SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8) que tienen, respectivamente, 35.699 y 15.898 pares de bases corriente abajo de la secuencia codificante de DHFR (Tabla 2).

Tabla 2. Ejemplo de sitios de reconocimiento para meganucleasas modificadas en el locus DHFR de CHO

1. Meganucleasas que reconocen la SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8

Se produjo una meganucleasas modificada (SEQ ID NO: 9) que reconoce y escinda la SEQ ID NO: 7. Esta meganucleasa se denominó “CHO-23/24”. Se produjo una segunda meganucleasa modificada (SEQ ID NO: 10) que reconoce y escinde la SEQ ID NO: 8. Esta nucleasa se llamó “CHO-51/52”. Cada meganucleasas comprende una señal de localización de nucleasa en el extremo N derivada de SV40, una primera subunidad de meganucleasas, una secuencia de engarce, y una segunda subunidad de meganucleasas.

2. Escisión específica del sitio del ADN plasmídico por las meganucleasas CHO-23/24 y CHO-51/52

La CHO-23/24 y CHO-51/52 se evaluaron utilizando un ensayo de recombinación repetida directa como se ha descrito previamente (Gao y col. (2010), Plant J. 61(1):176-87, Figure 7A). Un casete indicador GFP deficiente se generó un casete clonando primero un fragmento 5' de 480 pb del gen GFP en pcDNA5/FRT digerido con NheI/HindIII (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) dando como resultado el plásmido pGF. A continuación, se clonó un fragmento 3' de 480 pb del gen GFP (incluyendo una secuencia de 240 pb duplicada en el fragmento 5' de 480 pb) en el pGF digerido por BamHI/XhoI. El plásmido resultante, pGFFP, consiste en dos tercios 5' del gen GFP seguido por dos tercios 3' del gen GFP, interrumpido por 24 pb del pcDNA/poliengarce FRT. Para insertar los sitios de reconocimiento de meganucleasas, se hibridaron los oligonucleótidos complementarios que comprenden la secuencia en sentido y antisentido de cada sitio de reconocimiento y se ligaron en el pGFFP digerido con HindIII/BamHI.

Las secuencias codificantes de las meganucleasas modificadas se insertaron en el vector de expresión de mamífero pCP bajo el control de un promotor constitutivo (CMV). Las células de ovario de hámster chino (CHO) con una confluencia aproximada del 90 % se transfectaron en placas de 96 pocillos con 150 ng de plásmido indicador pGFFP y 50 ng de vector de expresión de meganucleasas o para determinar el fondo, 50 ng de pCP vacío utilizando Lipofectamina 2000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Para determinar la eficacia de la transfección, las células CHO se transfectaron con 200 ng de pCP GFP. Las células se lavaron en PBS 24 h después de la transfección, se tripsinizaron y se resuspendieron en PBS suplementado con un 3 % de suero bovino fetal. Las células se ensayaron en cuanto a la actividad de GFP utilizando un citómetro de flujo Cell Lab Quanta SC MPL y el software Cell Lab Quanta adjunto (Beckman Coulter, Brea, CA).

Los resultados se muestran en la Figura 7B. Se descubrió que ambas meganucleasas modificadas serán capaces de escindir sus sitios de reconocimiento pretendidos por encima del fondo en el contexto de un ensayo indicador basado en plásmido.

3. Escisión específica del sitio del locus DHFR de CHO por las meganucleasas CHO-23/24 y CHO-51/52

Para determinar si las CHO-23/24 y CHO-51/52 son capaces o no de escindir sus sitios diana pretendidos en el locus DHFR de CHO, los inventores exploraron el ADN genómico de células CHO que expresan o CHO-23/24 o CHO-51/52 para identificar las pruebas de la escisión cromosómica en el sitio diana pretendido. Ese ensayo se basa en el hecho de que las roturas del ADN cromosómico se reparan frecuentemente por NHEJ de una manera que introduce mutaciones en el sitio de la rotura de ADN. Estas mutaciones, normalmente pequeñas eliminaciones o inserciones (conocidas colectivamente como “indel”) dejan una cicatriz delatora que se puede detectar por secuenciación (Gao y col. (2010), Plant J. 61(1): 176-87).

Las células CHO se transfectaron con ARNm que codifican CHO-23/24 o CHO-51/52. El ARNm se preparó produciendo primero una matriz de PCR para una reacción de transcripción in vitro (SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 21). Cada producto de PCR incluía un promotor T7 y 609 pb de la secuencia de vector corriente abajo del gen de meganucleasas. El producto de PCR se purificó en gel para asegurar una única matriz. El ARN protegido (m7G) se generó utilizando el kit RiboMAX (Promega Corp., Fitchburg, WI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y el análogo Ribo cap m7G (Promega Corp., Fitchburg, WI) se incluyó en la reacción y 0,5 |jg del producto de PCR meganucleasas purificad servía como la matriz del ADN. El ARN protegido se purificó utilizando el Sistema de Aislamiento de ARN total SV (Promega Corp., Fitchburg, WI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se nucleofectaron 1,5 x 106 células CHO-K1 con 3 x 1012 copias de ARNm de CHO-23/24 O CHO-51/52 (2 x 106 copias/célula) utilizando el dispositivo Amaxa Nucleofector II (Lonza Group Ltd., Basel, Suiza) y el programa U-23 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A las 48 horas después de la transfección, se aisló el ADN de las células utilizando un kit FlexiGene (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN genómico se sometió entonces a una PCR para amplificar el sitio diana correspondiente. En el caso de las células transfectadas con el ARNm que codificaba la CHO-23/24, los cebadores de la p Cr directo e inverso eran de las SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17. En el caso de las células transfectadas con el ARNm que codificaba la CHO-51/52, los cebadores de la PCR directo e inverso eran de las SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19. Los productos de la PCR se purificaron en gel y se clonaron en pUC-19. Se secuenciaron 40 plásmidos que albergaban los productos de la PCR derivados de las células transfectadas con el ARNm de la CHO-23/24, de los cuales se descubrió que 13 tenían mutaciones en el sitio diana de CHO-23/24 (Figura 7C). Se secuenciaron 44 plásmidos que albergaban los productos de la PCR derivados de las células transfectadas con el ARNm de la CHO-51/52, de los que se descubrió que 10 de los cuales tenían mutaciones en el sitio diana de la CHO-51/52 (Figura 7D). Estos resultados indican que c HO-23/24 y CHO-51/52 son capaces de cortar sus sitios diana pretendidos corriente abajo del gen de DHFR de CHO.

4. Integración específica del sitio en el locus DHFR de CHO utilizando una meganucleasas modificada.

Para evaluar la eficacia de la inserción de ADN en el locus DHFR de CHO utilizando una meganucleasas modificada, los inventores prepararon un plásmido donante (SEQ ID NO: 11) que comprende un sitio de la enzima de restricción EcoRI flanqueado por una secuencia homóloga de ADN al sitio de reconocimiento de la CHO-51/52 (Figura 8A). específicamente, el plásmido donante de SEQ ID NO: 11 comprende un vector pUC-19 que alberga un casete de recombinación homóloga insertado entre los sitios de restricción KpnI e HindIII. El casete de recombinación homóloga comprende, en el orden 5' a 3': (i) 543 pares de bases de un ADN idéntico a la secuencia inmediatamente corriente arriba del medio sitio de la secuencia de reconocimiento de la CHO-51/52 y la “secuencia central” de cuatro pares de bases que separa los dos medio sitios que comprenden la secuencia de reconocimiento de CHO-51/52; (ii) un sitio de enzima de restricción EcoRI (5'-GAATTC-3'); y (iii) 461 pares de bases de ADN idéntico a la secuencia inmediatamente corriente abajo del sitio de corte de la CHO-51/52, incluyendo el medio sitio corriente abajo de la secuencia de reconocimiento y la “secuencia central” de cuatro pares de bases que separan los dos medio sitios que comprenden la secuencia de reconocimiento de CHO-51/52. Nótese que esto da como resultado una duplicación de la “secuencia central” de cuatro pares de bases (5'-TTGC-3') para maximizar la probabilidad de la invasión de cadena por las tres protuberancias 3' generados por la escisión con CHO-51/52. Los inventores han descubierto que los plásmidos donantes que comprenden dicha duplicación de la secuencia central son sustratos óptimos para el direccionamiento genético por recombinación homóloga.

Se preparó el ARNm que codificaba la CHO-51/52 como se ha descrito anteriormente. Se nucleofectaron 1,5 x 106 células CHO-K1 con 3 x 1012 copias de ARNm de CHO-51/52 (2 x 106 copias/célula) y 1,5 jg de plásmido donante (SEQ ID NO: 11). La nucleofección se llevó a cabo utilizando el dispositivo Amaxa Nucleofector II (Lonza Group Ltd., Basel, Suiza) y el programa U-23 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A las 48 horas después de la transfección se aisló el ADN de las células utilizando un kit FlexiGene (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN genómico se sometió entonces a una PCR utilizando los cebadores que flanquean el sitio de reconocimiento de la CHO-51/52 (SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19). De manera importante, estos cebadores están más allá de los límites de la secuencia homóloga que lleva el plásmido donante, y, por lo tanto, se amplificará solo la secuencia de ADN cromosómica y no el plásmido donante. Los productos de la PCR se clonaron en un plásmido pUC-19 y se purificaron 48 clones y se digirieron con EcoRI (Figura 8B). 10 plásmidos daban lugar a un patrón de restricción consistente con la inserción de un sitio EcoRI en la secuencia de reconocimiento de CHO-51/52. Estos datos demuestran que es posible utilizar la CHO-51/52 para insertar un ADN corriente abajo del gen DHFR de CHO en la SEQ ID NO: 8.

5. Integración específica del sitio de una secuencia diana modificada en el locus DHFR de CHO

Se produjo un plásmido donante (SEQ ID NO: 25) que comprende una secuencia FRT (SEQ ID NO: 5) adyacente a un gen de resistencia de zeocina bajo el control de un promotor temprano de SV40 (Figura 9A). Este casete estaba flanqueado por una secuencia de ADN homóloga al locus DHFR de CHO inmediatamente corriente arriba o corriente abajo de la secuencia de reconocimiento de la CHO-23/24. Las células CHO se co-transfectaron con este plásmido donante y el ARNm que codifica la CHO-23/24 como se ha descrito anteriormente. A las 72 horas después de la cotransfección, las células resistentes a la zeocina se clonaron por dilución limitante y se expandieron durante aproximadamente 3 semanas. Las poblaciones clónicas se exploraron entonces por PCR utilizando un primer cebador en el promotor SV40 (SEQ ID NO: 26) y un segundo cebador en el locus DHFR (SEQ ID NO: 16) para identificar las líneas celulares que llevaban la secuencia FRT/zeocina corriente abajo del gen DHFR. Una de dichas células que llevaba la inserción se la secuencia diana FRT se co-transfectó posteriormente con un segundo plásmido donante (SEQ ID NO: 27) y un plásmido que codifica Flp recombinasa. La SEQ ID NO: 27 comprende un gen GFP bajo el control de un promotor CMV, una secuencia FRT, y un gen de resistencia a higromicina no funcional que carece del codón de inicio ATG. La recombinación estimulada por Flp entre los sitios FRT en el genoma y el plásmido resultaba en la incorporación de la secuencia completa del plásmido en el genoma de CHO en el sitio de la secuencia diana modificada. Dicha recombinación restauraba la función del gen de resistencia a higromicina orientándolo corriente abajo de un codón de inicio ATG integrado como parte de la secuencia diana modificada. Como tal, las integraciones satisfactorias se podrían seleccionar utilizando higromicina.

Las células resistentes a la higromicina se clonaron por dilución limitante y se ensayaron 24 líneas clónicas individuales por PCR utilizando un primer cebador en el gen de resistencia a la higromicina (s Eq ID NO: 28). Los 24 clones daban lugar al producto de p Cr esperado (Figura 9B), indicando que el casete de expresión del gen GFP se había insertado satisfactoriamente en la secuencia diana DHFR modificada en todos los casos. Entonces se evaluaron las 24 líneas celulares por citometría de flujo y se descubrió que expresaban niveles consistentes de GFP (Figura 9C).

6. Amplificación de transgenes

Se sembró una línea de CHO que expresaba GFP como se ha descrito anteriormente, con una densidad de 3 x 105 células/ml en 30 ml de medio que contenía 50 nM de MTX. Las células se cultivaron durante 14 días antes de resembrarse con la misma densidad en un medio que contenía 100 nM de MTX. Las células se cultivaron durante otros 14 días antes de resembrarse en un medio que contenía 250 nM de MTX. Después de los 14 días de cultivo, se evaluó la expresión de GFP en las células tratadas por citometría de flujo y se comparó con la expresión de GFP en la población celular parental (pre-MTX) (Figura 10A). Se descubrió que las células tratadas con MTX tenían una subpoblación distinta en las que la expresión de GFP estaba significativamente aumentada. Las células individuales con alta expresión de la población tratada con MTX se aislaron entonces utilizando un clasificador celular y se expandieron 5 clones durante 14 días en ausencia de MTX. La expresión de GFP en las 5 poblaciones celulares clónicas se evaluaron entonces por citometría de flujo y se compararon con la población celular parental (pre-MTX). Se descubrió que los clones tratados con MTX tenían aproximadamente 4-6 veces la intensidad de GFP que las células pre-MTX. La PCR cuantitativa se llevó a cabo entonces utilizando un conjunto de cebadores específicos del gen GFP y se descubrió que los clones tratados con MTX tenían todos aproximadamente 5-9 veces más copias del gen GFP que la población pre-MTX. Estos datos proporcionan una prueba concluyente de que un transgén insertado corriente abajo del gen DHFR de CHO se puede amplificar con el tratamiento de MTX.

7. Estabilidad de la amplificación genética

Las cinco líneas celulares clónicas que expresaban altos niveles de GFP que se produjeron en (6) anteriormente se pasaron entonces durante un periodo de 14 semanas con o sin 250 nM de MTX para evaluar la estabilidad de la amplificación genética. Se determinó en una base semanal y el ensayo de PCR cuantitativa usado para determinar el número de copias del gen GRP descrito anteriormente se repitió al final del periodo de evaluación de 14 semanas. Como se esperaba, los clones que se pasaron en el medio con MTX mantenían un alto nivel de expresión de GFPR sin que ningún clon se desviara más del 20 % de la intensidad de GFP determinada la semana 1. La PCR cuantitativa reveló que el número de copias al igual se desviaba menos del 20 % para todos los clones. Sorprendentemente, la amplificación era igualmente estable en las líneas celulares cultivadas en medio que carecía de MTX. Al contrario de lo que se había predicho basándose en la técnica existente, la expresión del gen GFP no se reducía más del 18 % en cualquiera de las cinco líneas celulares durante el periodo de evaluación de 14 semanas. El número de copias del gen determinado por PCR cuantitativa también era estable con menos de un 24 % de desviación a lo largo del tiempo para todas las líneas celulares. Estos resultados indican que un transgén amplificado en el locus DHFR de CHO es estable durante un periodo de tiempo extendido, obviando la necesidad de cultivar las células en agentes de selección tóxicos que podría contaminar las formulaciones de bioproducto.

Ejemplo 2

Inserción de una secuencia diana modificada en las regiones codificantes del gen DHFR o GS de CHO

Como se representa mediante diagramas en la Figura 4, un procedimiento alternativo para direccionar una secuencia de interés a un locus que se puede amplificar implica la producción de una línea celular en la que una parte de un gen de selección se sustituye por una secuencia diana modificada. La ventaja de esta estrategia es que la posterior inserción de una secuencia de interés se puede acoplar con la reconstitución del gen de selección de manera que las líneas celulares que albergan la secuencia direccionada apropiadamente de interés se pueden seleccionar utilizando

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para la inserción de una secuencia exógena en un locus que se pueda amplificar de una célula de mamífero que comprende:

(a) proporcionar una célula de mamífero que tiene un sitio diana endógeno proximal a un gen de selección endógeno en el locus que se puede amplificar, en el que el sitio diana endógeno está de 0 a 100.000 pares de bases corriente abajo de la región reguladora 3' del gen de selección endógeno o de 0 a 100.000 pares de bases corriente arriba de la región reguladora 5' del gen de selección endógeno, en el que el sitio diana endógeno comprende:

(i) una secuencia de reconocimiento para una endonucleasa específica del sitio;

(ii) una región flanqueante 5' en 5' de la secuencia de reconocimiento; y

(iii) una región flanqueante 3' en 3' de la secuencia de reconocimiento; y

(b) introducir una rotura de doble cadena entre las regiones flanqueantes 5' y 3' del sitio diana endógeno;

(c) poner en contacto la célula con un vector donante que comprende de 5' a 3':

(i) una región flanqueante donante 5' homóloga de la región flanqueante 5' del sitio diana endógeno;

(ii) una secuencia exógena; y

(iii) una región flanqueante donante 3' homóloga de la región flanqueante 3' del sitio diana endógeno;

de manera que la región flanqueante donante 5', la secuencia exógena y la región flanqueante donante 3' se insertan entre las regiones flanqueantes 5' y 3' del sitio diana endógeno mediante recombinación homóloga para proporcionar una célula modificada.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente el cultivo de la célula modificada en presencia de un compuesto que inhibe la función del gen de selección endógeno para co-amplificar el número de copias del gen de selección endógeno y el número de copias de la secuencia exógena, y opcionalmente/o en el que la secuencia exógena comprende un gen de interés.

3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que:

(a) el gen de selección endógeno es de la glutamina sintetasa (GS) y el locus es de metionina sulfoximina (MSX) que se puede amplificar;

(b) el gen de selección endógeno es de la dihidrofolato reductasa (DHFR) y el locus es de metotrexato (MTX) que se puede amplificar; o

(c) el gen de selección endógeno se selecciona de entre el grupo que consiste en dihidrofolato reductasa, glutamina sintetasa, hipoxantina fosforribosil transferasa, treonil ARNt sintetasa, Na,K-ATPasa, asparagina sintetasa, ornitina descarboxilasa, inosina-5' - monofosfato deshidrogenasa, adenosina desaminasa, timidilato sintetasa, aspartato transcarbamilasa, metalotioneína, adenilato desaminasa (1,2), UMP-sintetasa y ribonucleótido reductasa, preferentemente en el que el gen de selección se puede amplificar por selección con un agente de selección seleccionado de entre el grupo que consiste en metotrexato (MTX), metionina sulfoximina (MSX), aminopterina, hipoxantina, timidina, borrelidina, ouabaína, albizina, beta-aspartil hidroxamato, alfa-difluorometilornitina (DFMO), ácido micofenólico, adenosina, alanosina, 2'desoxicoformicina, fluorouracilo, N-fosfonacetil-L-aspartato (PALA), cadmio, adenina, azaserina, coformicina, 6-azauridina, pirazofurano, hidroxiurea, motexafin gadolinio, fludarabina, cladribina, gemcitabina, tezacitabina y triapina.

4. Un procedimiento para la inserción de una secuencia exógena en un locus que se pueda amplificar de una célula de mamífero que comprende:

(a) proporcionar una célula de mamífero que tiene un sitio diana endógeno proximal a un gen de selección endógeno en el locus que se puede amplificar, en el que el sitio diana endógeno está de 0 a 100.000 pares de bases corriente abajo de la región reguladora 3' del gen de selección endógeno o de 0 a 100.000 pares de bases corriente arriba de la región reguladora 5' del gen de selección endógeno, en el que el sitio diana endógeno comprende:

(i) una secuencia de reconocimiento para una endonucleasa específica del sitio;

(ii) una región flanqueante 5' en 5' de la secuencia de reconocimiento; y

(iii) una región flanqueante 3' en 3' de la secuencia de reconocimiento; y

(b) introducir una rotura de doble cadena entre las regiones flanqueantes 5' y 3' del sitio diana endógeno;

(c) poner en contacto la célula con un vector donante del sitio diana modificado que comprende de 5' a 3':

(i) una región flanqueante donante 5' homóloga de la región flanqueante 5' del sitio diana endógeno;

(ii) una secuencia exógena que comprende un sitio diana modificado; y

(iii) una secuencia flanqueante donante 3' homóloga de la región flanqueante 3' del sitio diana endógeno;

de manera que la región flanqueante donante 5', la secuencia exógena y la región flanqueante donante 3' se insertan entre las regiones flanqueantes 5' y 3' del sitio diana endógeno mediante recombinación homóloga para proporcionar una célula de mamífero que comprende el sitio diana modificado;

(d) introducir una rotura de doble cadena entre las regiones flanqueantes 5' y 3' del sitio diana modificado;

(e) poner en contacto la célula que comprende el sitio diana modificado con un vector donante de la secuencia de interés que comprende de 5' a 3':

(i) una región flanqueante donante 5' homóloga de la región flanqueante 5' del sitio diana modificado;

(ii) una secuencia exógena que comprende una secuencia de interés; y

(iii) una región flanqueante donante 3' homóloga de la región flanqueante 3' del sitio diana modificado;

de manera que la región flanqueante donante 5', la secuencia exógena que comprende la secuencia de interés y la región flanqueante donante 3' se insertan entre las regiones flanqueantes 5' y 3' del sitio diana modificado mediante recombinación homóloga para proporcionar una célula de mamífero modificada que comprende la secuencia de interés.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, que comprende adicionalmente el cultivo de la célula de mamífero modificada en presencia de un compuesto que inhiba la función del gen de selección endógeno para co-amplificar el número de copias del gen de selección endógeno y el número de copias de la secuencia de interés, y opcionalmente/o en el que la secuencia de interés comprende un gen.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 4-5, en el que:

(a) el gen de selección endógeno es de la glutamina sintetasa (GS) y el locus es de metionina sulfoximina (MSX) que se puede amplificar;

(b) el gen de selección endógeno es de la dihidrofolato reductasa (DHFR) y el locus es de metotrexato (MTX) que se puede amplificar; o

(c) el gen de selección endógeno se selecciona de entre el grupo que consiste en dihidrofolato reductasa, glutamina sintetasa, hipoxantina fosforribosil transferasa, treonil ARNt sintetasa, Na,K-ATPasa, asparagina sintetasa, ornitina descarboxilasa, inosina-5' - monofosfato deshidrogenasa, adenosina desaminasa, timidilato sintetasa, aspartato transcarbamilasa, metalotioneína, adenilato desaminasa (1,2), UMP-sintetasa y ribonucleótido reductasa, preferentemente en el que el locus es metotrexato (MTX), metionina sulfoximina (MSX), aminopterina, hipoxantina, timidina, borrelidina, ouabaína, albizina, beta-aspartil hidroxamato, alfa-difluorometilornitina (DFMO), ácido micofenólico, adenosina, alanosina, 2'desoxicoformicina, fluorouracilo, N-Fosfonacetil-L-Aspartato (PALA), cadmio, adenina, azaserina, coformicina, 6-azauridina, pirazofurano, hidroxiurea, motexafin gadolinio, fludarabina, cladribina, gemcitabina, tezacitabina y/o triapina que se puedan amplificar.