KR101917287B1 - 자가-조립식 리보뉴클레오단백질 나노입자 - Google Patents

자가-조립식 리보뉴클레오단백질 나노입자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Single guide RNA(sgRNA) 영역과 small interfering RNA(siRNA) 영역을 갖는 복수 개의 제1 반복단위를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드; 및 하나 이상의 상기 sgRNA 영역에 결합된 뉴클레아제 단백질을 포함하는, 스스로 조립되는 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체 및 그 용도에 관한 것이다.

Description

자가-조립식 리보뉴클레오단백질 나노입자 {self-assembled ribonucleoprotein nanoparticles}
본 발명은 표적 유전자를 특이적으로 방해하는 시스템이 세포 내로 고효율로 운반되도록 하는 리보뉴클레오단백질 나노입자에 관한 것이다.
균일하게 군집된 간극 단 회귀성 반복서열(clustered regularly interspaced short palindromic repeat; CRISPR)-연관된 단백질-9 뉴클리아제(Cas9)은 유전자 변형을 위한 매우 편리한 도구로서 사용된다. Cas9 단백질은 표적 DNA에서의 프로토간극자 적합 모티프(protospace adjacent motif; PAM) 서열 및 상기 단백질에서 복합체를 이루는 단쇄성 가이드 RNA(single-stranded guide RNA; sgRNA)에서의 20개-뉴클레오티드 가이드 서열을 통해 이중나선 표적 DNA를 인식하여 상기 표적 DNA를 절단한다. Cas9에 의해 DNA가 분해된 후, 삽입물 및 삭제물(indel)이 비-균일성 말단 연결(non-homologous end joining)을 통해 제공되어, 표적 DNA의 방해를 유발시킨다(Cell 156(5): 935-949 (2014), Nat Rev Genet 15(5): 321-334 (2014)). 이 RNA-가이드된 게놈 편집 시스템은 영구적으로 표적 유전자를 녹아웃 할 수 있어, 표적 유전자 치료를 위한 효과적인 전략으로서 가능성을 제공하고, 기능성 게놈을 스크리닝하고 질병 동물 모델을 생성시키는 데에 잠재력을 보인다.
이러한 CRISPR/Cas9 시스템을 효과적으로 운반하기 위하여 Cas9을 코딩하는 플라스미드 및 sgRNA의 형질주입하기 위해 바이러스 벡터 또는 전기천공에 의존하고있다. 그러나, 이러한 방식은 전기 천공에 의한 세포 손상 때문에 의도되지 않은 유전자 위치에 벡터 DNA가 개입하여 유전적 기능상실을 유발시켜 안전성 면에서 문제가 제기되고 있다(Curr Gene Ther 8(1): 54-65 (2008)). Cas9 및 sgRNA 플라스미드로의 표적 세포에 대한 형질주입을 대신하여, 양성자성 지질 및 세포-관통성 펩티드와 같은 비-바이러스성 담체를 이용함으로써 세포 내 위치에 Cas9-sgRNA 리보뉴클레오티드 복합체(RNP)를 직접적으로 운반하려는 시도가 있었으나(Nat Biotechnol 33(1): 73-80 (2015)), 효율면에서 개선되어야 할 필요성이 있다.
여기에, 본 발명자들은 CRISPR/Cas9 시스템을 운반하는 신규한 방법을 공개한다.
일 양상은 single guide RNA(sgRNA) 영역과 small interfering RNA(siRNA) 영역을 갖는 복수 개의 제1 반복단위를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드; 및 하나 이상의 상기 sgRNA 영역에 결합된 뉴클레아제(nuclease) 단백질을 포함하는 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체를 제공한다.
다른 양상은 상기 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체를 포함하는 조성물로서,
상기 조성물은 진핵 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 것인 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 sgRNA 영역과 siRNA 영역을 갖는 복수 개의 제1 반복단위를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드에 복수의 뉴클레아제 단백질을 접촉시키는 단계를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 개체로부터 분리된 세포에 상기 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체를 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
일 양상은 single guide RNA(sgRNA) 영역과 small interfering RNA(siRNA) 영역을 갖는 복수 개의 제1 반복단위를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드; 및 하나 이상의 상기 sgRNA 영역에 결합된 뉴클레아제(nuclease) 단백질을 포함하는 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체를 제공한다.
일 구체예에서 상기 뉴클레아제 단백질은 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질 일 수 있다. 용어 '뉴클레아제'는 폴리뉴클레오티드에서 뉴클레오티드 사이의 결합을 가수분해하는 촉매를 의미하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 달리 정의하지 않는 한 용어 '뉴클레오티드'는 리보뉴클레오티드 또는 디옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.
상기 sgRNA는 표적 유전자와 혼성화할 수 있는 것으로서, Cas 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, crRNA 영역, 연결 고리(linker loop) 및 tracrRNA 영역을 포함하는 것일 수 있다. 또한 상기 표적 유전자의 뉴클레오티드 서열은 sgRNA와 상보적인 뉴클레오티드 서열 및 프로토간극자 적합 모티프(protospace adjacent motif; PAM)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 프로토간극자 적합 모티프는 당업계에 잘 알려진 서열로서 뉴클레아제 단백질(구체적으로, Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질)이 인식하기에 적합 서열을 갖는 것일 수 있다. sgRNA는 표적 유전자의 뉴클레오티드 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있고, 구체적으로 crRNA가 상기 표적 유전자의 뉴클레오티드 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있는데, 상기 표적 유전자의 뉴클레오티드 서열는 프로토간극자 요소(protospacer element)를 의미하는 것일 수 있고, 약 20개의 뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 표적 유전자는 핵산 물질을 의미하는 것으로서, 내재적 유전자 또는 외래적 유전자일 수 있고, 염색체, DNA, mtDNA, plasmid, RNA, 또는 mRNA를 의미할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
용어 'Cas9 단백질 (또는 폴리펩티드)'은 CRISPR/Cac 시스템을 구성하는 단백질을 의미하고, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA (trans-activating crRNA; tracrRNA)와 복합체를 형성할 수 있으며, Cas9 단백질-crRNA-tracrRNA 복합체는 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제 (nickase)로서 역할할 수 있다. 상기 Cas9 단백질은 다수의 이소형(isoform)을 가질 수 있다. Cas 단백질을 암호화하는 CRISPR-연관 유전자는 약 40 개 이상의 서로 다른 Cas 단백질 패밀리가 존재하는 것으로 알려져 있으며, cas 유전자 및 반복 구조 (repeat structure)의 특정 조합에 따라 8개의 CRISPR 하위 유형 (Ecoli, Ypest, Nmeni, Dvulg, Tneap, Hmari, Apern, 및 Mtube)을 정의할 수 있다. 따라서 상기 각 CRISPR 하위 유형이 반복단위를 이루어 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체를 형성할 수 있다. 일 구체예에서 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 속(Streptococcus genus)으로부터 유래된 것일 수 있고, 상기 스트렙토코커스 속은 스트렙토코커스 피오젠스 (Streptococcus pyogenes)일 수 있다. 상기 스트렙토코커스 피요젠스로부터 유래한 Cas 단백질은 NGG 트리뉴클레오타이드(trinucleotide)를 인식할 수 있다. 따라서 상기 표적 유전자의 뉴클레오티드 서열은 NGG를 더 포함하는 것일 수 있다.
또한 Cpf1 단백질은 상기 Cas9 단백질과 유사하게 guide RNA(sg RNA)를 이용하여 표적 유전자를 절단하는 능력을 가지고 있으나, 더 짧은 sgRNA를 갖는 CRISPR/Cpf1 시스템을 형성한다. Cpf1 단백질은 악시다미노코커스 속(Acidaminococcus)으로부터 유래된 것일 수 있고, 상기 악시다미노코커스는 악시다미노코커스 sp. BV3L6일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 Cas9 단백질은 'UniProtKB/Swiss-Prot: Q99ZW2.1'의 폴리펩티드 서열로서 서열번호 1의 폴리펩티드 서열 또는 상기 Cas9 단백질을 코딩하는 서열번호 3(CP014139.1 중 protein ID "AMA70685.1" 해당 구역)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 Cpf1 단백질은 WP_021736722.1의 폴리펩티드 서열로서 서열번호 2의 폴리펩티드 서열 또는 상기 Cpf1 단백질을 코딩하는 서열번호 4(NZ_AWUR01000016.1로서 "HMPREF1246_RS03730" 구역 유전자 서열)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 Cas9 단백질 및 Cpf1 단백질은 각각 서열번호 1 및 2의 서열과 60% 이상, 예를 들면, 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 99%이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 Cas9 단백질 및 Cpf1 단백질은 각각 서열번호 1 및 2의 서열의 아미노산 서열에서 1개 이상의 아미노산 잔기, 2개 이상의 아미노산 잔기, 3개 이상의 아미노산 잔기, 4개 이상의 아미노산 잔기, 5개 이상의 아미노산 잔기, 6개 이상의 아미노산 잔기 또는 7개 이상의 아미노산 잔기가 변화된 서열을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.
상기 Cas9 단백질 및 Cpf1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드는 각각 서열번호 3 및 4의 서열과 60% 이상, 예를 들면, 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 99%이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 염기 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 Cas9 단백질 및 Cpf1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드는 상기 서열번호 3 및 4의 서열에서 1개 이상의 염기, 2개 이상의 염기, 3개 이상의 염기, 4개 이상의 염기, 5개 이상의 염기, 6개 이상의 염기 또는 7개 이상의 염기가 상이한 서열을 갖는 뉴클레오티드일 수 있다.
상기 뉴클레아제 단백질은 유기체로서 분리된 것일 수 있거나 또는 재조합 단백질일 수 있다. 용어 '재조합 단백질'은 이종(heterologous) 핵산 또는 단백질을 도입하거나, 또는 내재적(endogenous) 핵산 또는 단백질을 변경하여 생성된 단백질, 또는 변형된 세포로부터 유래된 단백질을 의미하는 것으로서, 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 단리되어 추출된 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 뉴클레아제 단백질은 상기 스트렙토코커스 속 또는 악시다미노코커스 속에 과발현시킨 후 단백질 정제에 의해 추출된 것일 수 있다.
본 발명의 폴리리보뉴클레오티드는 sgRNA 및 siRNA를 포함하는 복수 개의 제1 반복단위를 갖는데, 상기 제1 반복단위는 일정한 패턴으로 반복되는 것일 수 있다. 상기 제1 반복단위는 뉴클레아제 단백질을 더 포함하여 제2 반복단위를 형성할 수 있고, 따라서 본원발명의 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체는 복수 개의 제2 반복단위를 포함하는 것일 수 있다. 상기 일정한 패턴은 제1 반복단위에 있어서, 상기 sgRNA 영역이 siRNA 영역의 5' 상류에 위치하는 것이거나, 상기 sgRNA 영역이 siRNA 영역의 3' 하류에 위치하는 것이거나, 또는 이들의 조합으로 위치하는 것일 수 있다. 또한 상기 일정한 패턴은 sgRNA 영역 및 siRNA 영역 사이에 1 내지 20 bp의 간격을 갖는 것일 수 있고, 또는 상기 제1 반복단위 사이에 1 내지 20 bp의 간격을 갖는 것일 수 있다. 상기 제1 반복단위 내 sgRNA 및 siRNA는 1:1로 존재하는 것일 수 있으나, 1:2, 1:3, 2:1, 또는 3:1 등 sgRNA 및 siRNA 중 어느 하나가 특정 배수로 존재하는 것일 수 있다. 제1 반복단위에 대한 뉴클레아제 단백질의 비율은 1:1일 수 있으나, 1:2, 1:3, 2:1, 또는 3:1 등 제1 반복단위 및 뉴클레아제 단백질 중 어느 하나가 특정 배수로 존재하는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체는 나노입자를 형성하는 것일 수 있다. 뉴클레오티드는 인산기 등에 의해 음이온성을 갖고, 이 음이온성 부분과 단백질의 아미노기 등에 의해 발생한 양이온성 부분이 상호작용 할 수 있고, 또한 Dicer 기질로 활용되는 siRNA 서열이 형성하는 헤어핀 모양의 폴리뉴클레오티드의 이차구조 형성 과정이 복합적으로 작용하여 상기 복합체가 나노입자로 뭉칠 수 있게 된다. 따라서, 상기 나노입자는 상기 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체가 자기조립되어 형성된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 나노입자는 일정한 크기를 갖는 것일 수 있다. 상기 나노입자의 크기는 폴리리보뉴클레오티드의 길이(bp), sgRNA 또는 siRNA의 2차 구조적 특징, 및 뉴클레아제 단백질 양 등의 변형요소에 따라 달라질 수 있고, 상기 나노입자 크기를 조절하기 위해 상기 변형요소들을 조작할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 나노입자는 10 내지 1000nm, 또는 50nm 내지 100nm의 직경을 갖는 것일 수 있고, 상기 직경은 평균 크기를 의미하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 약 80nm의 평균 직경을 갖는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
다른 양상은 상기 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 진핵 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 것인 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 상기 세포 내 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체의 전달 효율을 증가시키기 위해, 형질주입 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 형질주입 시약은 형질주입 방법에 따라 다양할 수 있으나, 일 구체예에서 양성자성 지질을 포함하는 것일 수 있다.
상기 진핵 세포는 효모, 곰팡이, 원생동물 (protozoa), 식물, 고등 식물 및 곤충, 또는 양서류의 세포, 또는 CHO, HeLa, HEK293, 및 COS-1과 같은 포유 동물의 세포를 포함하는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 진핵 세포는 예를 들어 포유동물의 난자 또는 정자를 포함하는 것일 수 있으며, 따라서 본 발명의 복합체를 포함하는 조성물은 작물, 가축, 양식어류, 애완동물 등의 품종 개량 등에 적용될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 염을 더 포함하여 개체에 투여되어 유전자 치료를 하기 위한 것일 수 있다. 용어 '유전자 치료'는 개체 내 질병의 원인이 되는 특정 유전자의 발현을 억제시킴으로써 질병을 치료하는 것을 의미한다. 본 발명의 복합체를 이용하면 적은 양의 시약을 사용하여 형질 주입시킬 수 있으므로 시약에 의한 부작용을 방지할 수 있으며, 혈장에서 매우 안정한 특징을 가지므로 혈장 내로 투여되어 효과적으로 세포 내까지 CRIPSR/cas9 시스템을 운반할 수 있다.
용어 '약학적으로 허용가능한 염'은 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 본 발명의 조성물 내 화합물의 이로운 효능을 떨어뜨리지 않는 것이며, 화합물의 어떠한 유기 또는 무기 부가염을 의미한다. 이들 염은 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 질산, 황산, 과염소산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 아스파르트산, 옥살산, (D) 또는 (L) 말산, 말레산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 4-톨루엔술폰산, 살리실산, 시트르산, 벤조산 또는 말론산 등을 사용할 수 있다. 또한, 이들 염은 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등) 및 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염 등) 등을 포함한다. 예를 들면, 산부가염으로는 아세테이트, 아스파테이트, 벤즈에이트, 베실레이트, 바이카보네이트/카보네이트, 바이설페이트/설페이트, 보레이트, 캄실레이트, 시트레이트, 에디실레이트, 에실레이트, 포메이트, 퓨마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루큐로네이트, 헥사플루오로포스페이트, 하이벤제이트, 하이드로클로라이드/클로라이드, 하이드로브로마이드/브로마이드, 하이드로요오디드/요오디드, 이세티오네이트, 락테이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 나프틸레이트, 2-나프실레이트, 니코티네이트, 나이트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트/수소 포스페이트/이수소 포스페이트, 사카레이트, 스테아레이트, 석시네이트, 타르트레이트, 토실레이트, 트리플루오로아세테이트, 알루미늄, 알기닌, 벤자틴, 칼슘, 콜린, 디에틸아민, 디올아민, 글라이신, 라이신, 마그네슘, 메글루민, 올아민, 칼륨, 나트륨, 트로메타민, 아연염 등이 포함될 수 있으며, 이들 중 하이드로클로라이드 또는 트리플루오로아세테이트일 수 있다.
다른 양상은 sgRNA 영역과 siRNA 영역을 갖는 복수 개의 제1 반복단위를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드에 복수의 뉴클레아제 단백질을 접촉시키는 단계를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 폴리리보뉴클레오티드 내 sgRNA 영역을 포함하고 있으므로, 뉴클레아제 단백질이 상기 sgRNA 구조를 인식하여 상기 폴리리보뉴클레오티드와 결합하여 복합체를 형성할 수 있다. 따라서, 상기 폴리리보뉴클레오티드 및 뉴클레아제 단백질은 각각 제조된 후 혼합하여 접촉시키는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 폴리리보뉴클레오티드를 제조하는 단계 중에 본 발명의 복합체를 형성시키는 방법으로서, 상기 접촉시키는 단계는 주형 핵산, 상기 주형에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 갖는 프라이머, NTP, RNA 폴리머라제 및 뉴클레아제 단백질을 포함하는 반응 혼합물을 인큐베이션 시켜 상기 프라이머를 연장시키는 단계; 및 상기 폴리리보뉴클레오티드를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 주형 핵산은 상기 폴리리보뉴클레오티드를 증폭시키기 위해 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있고, 상기 폴리리보뉴클레오티드가 sgRNA 영역 및 sgRNA 영역을 포함하도록 하기 위해서, 상기 sgRNA 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열 및 상기 siRNA 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 더 포함할 수 있다.
용어 '프라이머'는 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 15 내지 35개의 뉴클레오티드 서열로 상보적인 핵산의 주형과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로부터 기능하는 것을 의미할 수 있다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서, RNA 또는 DNA 폴리머라제 또는 역전사효소를 이용한 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 또는 RNA 합성을 개시할 수 있다.
용어 '폴리머라제'는 핵산의 긴 사슬 또는 폴리머를 합성하는 효소로서, 상기 폴리머라제가 RNA 폴리머라제인 경우 RNA 폴리머라제 I, RNA 폴리머라제 Ⅱ, RNA 폴리머라제 Ⅲ 및 T7 RNA 폴리머라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 또한 상기 폴리머라제는 말단 데옥시뉴클레오티드 전달효소(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase; TDT) 또는 역전사효소(Reverse Transcriptase)일 수 있다.
용어 '연장'은 상기 폴리머라제가 상기 프라이머로부터 NTP를 연결하여 뉴클레오티드로 이루어진 사슬 또는 폴리머를 합성하는 것을 의미하고, 용어 '인큐베이션'은 상기 폴리머라제가 상기 프라이머를 연장시키는 기능을 수행할 수 있는 조건을 만들어 상기 폴리머라제의 활성 반응이 일어나도록 하는 것을 의미한다. 예를 들어, 상기 폴리머라제가 RNA 폴리머라제인 경우, NTP(바람직하게는, rNTP), 프라이머, RNA 폴리머라제 및 상기 폴리머라제가 활성하기에 적절한 완충액(제조사의 지침에 따름)을 포함하는 반응 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 방치하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 방법에 사용되는 폴리머라제의 종류, 프라이머의 길이, 프라이머의 뉴클레오티드 서열 조성, 주형 핵산의 뉴클레오티드 서열 및 생성되는 폴리뉴클레오티드(또는 폴리리보뉴클레오티드)의 길이, 양 또는 조성 등에 따라 상기 조건은 달라질 수 있다.
상기 '인큐베이션'에 의해 프라이머가 연장되어 폴리리보뉴클레오티드가 형성되면, sgRNA 영역 및 siRNA 영역이 갖는 특징적인 뉴클레오티드 서열에 의해 스스로 접힘(folding)이 일어나 2차 구조를 형성할 수 있고, sgRNA 영역 내 뉴클레아제가 인지할 수 있는 서열에 의해 뉴클레아제 단백질이 결합함으로써 본 발명의 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체를 형성할 수 있게 된다.
용어 '증폭'은 시작 폴리뉴클레오티드(또는 폴리리보뉴클레오티드) 또는 1회의 반응에 따라 생성된 폴리뉴클레오티드(또는 폴리리보뉴클레오티드)가 반복적인 반응에 의하여 다수 또는 기하급수적으로 복제되는 것을 의미하며, 이는 예를 들어, 프라이머 신장법(primer extension), 회전환 증폭법(rolling circle amplification), 회전환 전사(rolling circle transcription), 인 비트로 전사(in vitro transcription), 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction) 및 핵산 말단 트란스퍼라제 반응(nucleotide terminal transferase reaction)으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 수행될 수 있다.
상기 주형 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 상기 주형 핵산이 DNA인, DNA 주형을 이용하여 폴리머라제(인간의 경우 RNA 폴리머라제 Ⅱ일 수 있음)에 의한 전사(transcription) 과정을 통해 RNA 가닥(이 경우 상기 RNA 가닥은 mRNA일 수 있음)을 생성할 수 있거나, 상기 주형 핵산이 RNA인, RNA 주형을 이용하여 RNA-의존적 RNA 폴리머라제에 의한 복제 과정을 통해 RNA를 복제할 수 있다. 상기 RNA 주형을 이용한 복제는 상기 복제 과정을 위해 상기 RNA-의존적 RNA 폴리머라제를 사용하는 RNA 바이러스(예를 들어, 폴리오바이러스)에 의해 가능할 수 있다. 상기 DNA 또는 RNA 주형의 구성, 형태(단일 가닥, 이중가닥, 원형 또는 선형 등), 및 뉴클레오티드 서열은 상기 방법을 이용하여 생성하고자 하는 폴리뉴클레오티드(또는 폴리리보뉴클레오티드)의 종류 및 뉴클레오티드 서열에 따라 달라질 수 있다.
상기 주형 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 상기 주형 핵산이 이중 가닥일 경우, 목적하는 폴리뉴클레오티드(또는 폴리리보뉴클레오티드)를 증폭시키기 위하여 상기 폴리뉴클레오티드(또는 폴리리보뉴클레오티드)를 증폭시키는 방법은 상기 주형 핵산에 프라이머가 결합하고, 폴리머라제가 활성하기 위해 필요한 인큐베이션 조건을 달리할 수 있다. 예를 들어, 상기 주형 핵산이 이중 가닥인 DNA이고 상기 인큐베이션이 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)인 경우, 이중 가닥 DNA를 단일 가닥 DNA로 분리시키는 DNA를 변성(Denaturation)시키는 단계; 상기 주형 핵산에 적어도 부분적으로 상보적인 프라이머를 상기 주형 핵산에 결합시키는 단계; 및 Tag 폴리머라제가 프라이머를 신장시키는 단계를 포함하는 반응에 의하여 목적하는 폴리뉴클레오티드(또는 폴리리보뉴클레오티드)인 DNA를 증폭시킬 수 있다. 이 경우, 상기 변성시키는 단계는 90℃ 내지 95℃로 가열하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 결합시키는 단계는 50℃ 내지 65℃로 냉각시키는 단계를 포함할 수 있으며, 및 상기 신장시키는 단계는 70℃ 내지 75℃로 가열하는 단계를 포함할 수 있으나, 상기 각 단계의 조건은 주형 핵산의 길이 또는 뉴클레오티드 서열의 조성; 프라이머의 길이, 주형 핵산과의 상보성 정도, 또는 뉴클레오티드 서열의 조성; 및 Tag 폴리머라제의 종류 또는 효율성 정도에 따라 달라질 수 있다. 또한 상기 주형 핵산이 단일 가닥일 경우에도, 상기 주형 핵산의 길이, 종류, 및 뉴클레오티드 서열의 조성 또는 특징 등에 따라 폴리머라제가 상기 주형 핵산에 결합하여 목적하는 폴리뉴클레오티드(또는 폴리리보뉴클레오티드)를 생성시키기 위해 적절한 인큐베이션 조건을 달리할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 주형은 원형일 수 있다. 상기 원형인 주형 핵산은 플라스미드 또는 벡터일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 프라이머를 연장시키는 단계에서 인큐베이션은 중합효소 반응일 수 있고, 상기 중합효소 반응은 회전환 전사(rolling circle transcription) 또는 인 비트로 전사(in vitro transcription)일 수 있다.
용어 '회전환 전사(rolling circle transcription; RCT)'는 단일 가닥 환형 DNA를 주형으로 하고, 여기에 상보적인 프라이머를 사용하여 등온에서 중합반응을 수행하여, 상기 환형 DNA에 상보적인 RNA가 연속적으로 합성 및 증폭되도록 하는 것을 의미한다. 상기 합성을 위하여 T7 또는 E. coli RNA 폴리머라제가 이용될 수 있다. 일 구체예에서 상기 주형 DNA가 연속적으로 증폭되어 상기 복수의 제1 반복단위를 포함하는 mRNA가 생성될 수 있다.
용어 '인 비트로 전사(in vitro transcription)'는 시험관 상으로 DNA 주형으로부터 RNA를 합성하는 것을 의미하며, 상기 인 비트로 전사를 이용하여 블롯 혼성화 분석 또는 핵산분해효소 방어 분석(nuclease protection assay) 등에 이용될 수 있는 RNA(예를 들어, 방사선 표지된 RNA 프로브)를 생산할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 인 비트로 전사를 위해서는 프로모터 서열을 함유하는 정제된 DNA 주형, NTP(특히, ribonucleotide triphosphate), 반응 완충액, 및 적절한 파지 RNA 폴리머라제를 포함하는 반응 혼합물을 인큐베이션하는 단계를 필요로 할 수 있으며, 상기 인큐베이션 조건은 목적하는 RNA의 양, 뉴클레오티드 서열 및 구조적 특징 등에 의해 달라질 수 있다.
다른 양상은 개체로부터 분리된 세포에 본 발명의 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체를 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서 상기 세포 내 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체의 전달 효율을 증가시키기 위해, 상기 접촉시키는 단계는 상기 복합체와 형질주입 시약을 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 형질주입은 미세주입법 (microinjection), 전기천공법 (electroporation), DEAE-덱스트란 처리 (DEAE-dextran treatment), 리포펙션 (lipofection), 나노파티클-매개 형질주입, 단백질 전달 도메인 매개 도입, 바이러스-매개 유전자 전달, 및 원생동물에서 PEG-매개 형질주입 등과 같은 당업계 잘 알려진 방법에 의해 이루어질 수 있다.
또 다른 양상은 본 발명의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있으며, 상기 포유동물은 인간일 수 있으며, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있다.
상기 투여는 경구 투여 또는 정맥, 복강, 피내, 피하, 상피 또는 근육투여 등과 같은 비경구 투여를 위해 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 사용될 수 있는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 Single guide RNA(sgRNA) 영역과 small interfering RNA(siRNA) 영역을 갖는 복수 개의 제1 반복단위를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드; 및 하나 이상의 상기 sgRNA 영역에 결합된 뉴클레아제 단백질을 포함하는 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체에 의하여, siRNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드(또는 폴리리보뉴클레오티드)의 안정성을 증진시키고 세포 내로의 전달 효율을 증진시킬 수 있다.
다른 양상에 따른 상기 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체 및 이를 포함하는 조성물을 세포에 접촉시키거나 개체에 투여함으로써 표적 유전자의 발현을 억제시키고 유전자 치료에 사용할 수 있다.
또 다른 양상에 따른 sgRNA 영역과 siRNA 영역을 갖는 복수 개의 제1 반복단위를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드에 복수의 뉴클레아제 단백질을 접촉시키는 단계를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체를 제조하는 방법에 따라, 안정성 및 세포 내 전달 효율이 증가된 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체, 이를 포함하는 나노 입자 및 조성물을 효율적으로 제조할 수 있다.
도 1A는 RCT를 이용한 폴리-RNP 나노입자의 가공을 도식적으로 나타낸 것이고, 도 1B는 폴리-RNP 나노입자의 AFM 이미지로서 고배율 이미지 (왼쪽) 및 고배율 TEM 이미지 (오른쪽)를 나타낸 것이고, 도 1C는 Cas9 단백질 없이 증폭된 폴리-RNA 미세해면의 SEM 이미지, 도 1D는 TMR-표지된 Cas9(적색, 왼쪽), SYBR 녹색으로 염색된 RNA(녹색, 중간), 및 합쳐진 색 (오른쪽)을 보여주는 폴리-RNP 나노입자의 형광 이미지를 나타낸 것이고, 도 1E는 TMR-표지된 Cas9(오렌지) 및 비-표지된 Cas9(흑색)에 대해 유동세포계측 결과를 나타낸 것이다. 도 1F는 Cas9에 의해 파괴된 이중나선을 평가하기 위한 겔 전기영동 결과를 나타낸 것이고, 도 1G는 폴리-RNP 및 모노-RNP의 혈청 안정성을 비교한 것을 나타낸 것이다.
도 2A는 폴리-RNP 나노입자 및 양이온성 지질 (Stemfect)에 의해 형성된 리포플렉스 나노입자의 Stemfect 처리 전후 제타포텐셜을 나타낸 것이고, 도 2B는 폴리-RNP 및 Stemfect로 형성된 리포플렉스 나노입자의 입자 분포(3회 측정 후 평균) 및 AFM 이미지를 나타낸 것이고, 도 2C는 모노-RNP 및 폴리-RNP의 세포 내 uptake 효율 정도를 나타낸 것이다.
도 3은 stemfect 처리 전(왼쪽) 및 후(오른쪽)에 모노-RNP 및 폴리-RNP 나노입자의 경우 세포 생존성 정도를 나타낸 것이다.
도 4A는 HeLa/GFP 세포에서 폴리-RNP 나노입자의 유전자 방해 효율을 평가하기 위한 전기영동 결과를 나타낸 것이고, 도 4B는 HeLa/GFP 세포의 형광 현미경 이미지(핵은 청색, 및 GFP는 녹색)를 나타낸 것이고, 도 4C는 폴리-RNP로 처리된 세포에서의 GFP의 웨스턴 블롯 이미지 (위) 및 그 정도를 수치화한 그래프(아래)를 나타낸 것이고, 도 4D는 폴리-RNP 나노입자로 처리된 세포에서의 GFP 발현의 세포계측적 분석을 나타낸 것이다 (평균±s.d.(3개 시료), ***P<0.005 vs. PBS).
도 5는 폴리-RNP로 처리된 HeLa/GFP 세포의 유동세포계측 분석으로 수득된 스캐터링 닷 플롯 vs. GFP 형광을 나타낸 것이다.
도 6A는 폴리-RNP 나노입자의 유전자 방해 활성을 인비보에서 수행한 것으로서, 폴리-RNP로 처리된 HeLa/GFP 종양을 갖는 마우스의 인비보 형광 세기를 나타내고, 도 6B는 종양 무게에 의해 평준화된 종양 용해물의 형광 세기로서, 생성물은 평균 ±s.d.(4개 시료)를 나타낸다. ***P<0.005 및 **P<0.01 vs. PBS. 도 6C는 폴리-RNP로 처리된 마우스로부터의 종양 부분의 형광 현미경 이미지를 보여주는 것이고, 도 6D는 폴리-RNP로 처리된 마우스로부터의 종양에서 GFP의 웨스턴 블롯 이미지(위)를 나타낸 것으로서, 두 개의 독립적 실험으로부터의 평균 밴드 세기를 나타낸다(아래).
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 폴리 - RNP의 제조 및 특징 확인
(1) Cas9 발현 및 정제
중합성 RNP의 구성요소인 Cas9 단백질 수득하기 위하여, pET-NLS-Cas9-6xHis를 Addgene (plasmid #62934, USA)으로부터 구매하고 종래에 기재된 바와 같이 정제하였다11. 간략하게, pET-NLS-Cas9-6xHis를 RosettaTM 2(DE3)pLysS 컴피턴트 세포(Novagen, USA)에 형질전환시켰다. 생성된 단일 콜로니를 Luria-Bertani (LB) 배지에 성장시키고 상기 배양물 5 mL을 1L LB에 100 ㎍/mL 암피실린 및 50 ㎍/mL 클로람페니콜 존재 하에 37 ℃에서 접종 후 배양하였다. NLS-Cas9 단백질을 1 mM 이소프로필-D-1-티오갈락토피라노시드로 18℃에서 16 내지 18시간 유도하였다. 펠렛을 수확하고, 완충액 A (50 mM 트리(히드록시메틸)아미노메탄 히드로클로리드 (Tris-HCl), pH 8.0, 1M NaCl, 20% 글리세롤, 20 mM 이미다졸 및 2 mM 트리(2-카복시에틸)포스핀 (TCEP, Sigma-Aldrich, USA))에 재현탁하고 초음파분해(sonication)로 용해시켰다. 4℃에서 8,000g로 40분 동안 원심분리 후, NLS-Cas9을 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피를 이용하여 분리하였다. 용출된 NLS-Cas9을 Hiprep SP HP 16/10 컬럼 (GE Health-care Life Sciences, USA) 상에 로딩하고 완충액 B(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 20% 글리세롤, 및 2 mM TCEP) 중에 0.1 M에서 1M의 직선형 농도로 정제하였다. NLS-Cas9의 최종 순도 및 농도를 SDS PAGE 겔 및 Bradford 단백질 분석(Bio-Rad, USA)으로 단백질 표준으로서 소 혈청 알부민을 이용하여 각각 결정하였다.
(2) 폴리 - RNP의 제조하기 위한 RCA 반응
자가-조립식 리보뉴클레오단백질 나노입자인 중합성 RNP를 제조하기 위하여 RCT 반응을 수행하였다.
중합성 RNP를 형성하기 위한 중합성 RNA 서열을 제조하기 위해, sgRNA 및 siRNA 전구체의 상보적 서열로 구성된 선형 DNA 주형을 고안하였다. 상기 선형 DNA 주형을 합성하기 위하여, 먼저 DNA 올리고뉴클레오티드를 Integrated DNA Technologies (USA)로부터 구매하였다. RCT 반응을 위한 환형 DNA를 합성하기 위하여, 표 1의 서열을 갖는 4 종류의 선형 ssDNA (1 μM)를 PCR thermal cycler (Bio-Rad)를 이용하여 표 1의 서열을 갖는 RNA에 대한 등몰(equimolar) 양의 프라이머로 95℃에서 2분 동안 가열하고 1시간 넘게 25℃로 서서히 냉각함으로써 혼성화하였다. 환형화된 DNA에서 간극(nick)을 연결(ligate)하기 위해, 상기 용액을 T4 DNA ligase (3 U/㎕, Promega) 및 리가제 완충액 (300 mMTris-HCl, 100 mM MgCl2, 100 mM 디티오트레이톨(DTT) 및 10 mM 아데노신 트리포스페이트(ATP), pH 7.8)을 온화한 회전기 상에 실온에서 밤새 인큐베이션하였다.
나선 서열
항- GFP siRNA 및 sgRNA 나선을 위한
선형 DNA (sgRNA/siRNA) 		5'-인산-ATA GTG AGT CGT ATT A AA A AAA AGC ACC GAC TCG GTG CCA CTT TTT CAA GTT GAT AAC GGA CTA GCC TTA TTT TAA CTT GCT ATT TCT AGC TCT AAA AC C　 GG TGA ACA GCT CCT CGC CC TAC AGT GAT GTC CAG AA GA TGA ACT TCA GGG TCA GCT TGC A CTTG GCA AGC TGA CCC TGA AGT TCA TC TT ATC CCT -3'
항- GFP sgRNA
나선을 위한
선형 DNA (sgRNA) 		5'-인산-AT AGT GAG TCG TAT TA AAA AAA AGC ACC GAC TCG GTG CCA 　　 CTT TTT CAA GTT GAT AAC GGA CTA GCC TTA TTT TAA CTT GCT ATT TCT AGC TCT AAA AC CGG TGA ACA GCT CCT CGC CC ATC CCT -3'
스크램블된 siRNA 및
항- GFP sgRNA
나선을 위한
선형 DNA (sgRNA/nsiRNA) 		5'-인산-AT AGT GAG TCG TAT TA AAA AAAA GCA CCG ACT CGG TGC CA　C TTT TTC AAG TTG ATA ACG GAC TAG CCT TA TTT TAA CTT GCT ATT TCT AGC TCT AAA AC C GGT GAA CAG CTC CTC GC CC TAC AGT GAT GTC CAG AA CTT ACG CTG AGT ACT TCG ATT ACTTG AAT CGA AGT ACT CAG CGT AAG　 TTAT CCC T -3'
스크램블된 sgRNA
나선을 위한
선형 DNA
( nsgRNA ) 		5'-인산-AT AGT GAG TCG TAT TA AAAAAAA GCA CCG ACT CGG TGC CA　 CTT TTT CAA GTT GAT AAC GG 　　 A CTA GCC TTA TTT TAA CTT G　　 CT ATT TCT AGC TCT AAA ACG GCA AGA GCA ACT CG G TC GC GAATCC AT CCC T-3'
프라이머 5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA T-3'
[표 1] RCT 반응을 위해 사용된 DNA 서열
중합성 CRISPR/Cas9-siRNA의 기능을 시험하기 위해, 상기 표 1에서 상기 sgRNA 및 siRNA는 각각 모델 시스템으로서 녹색 형광 단백질 (GFP)의 게놈 DNA 및 GFP의 mRNA를 표적하도록 고안된 것을 사용하였다. 표적 서열로서 상기 표 1에서 sgRNA/siRNA, sgRNA, 및 sgRNA/nsiRNA 각 서열은 'CGGTGAACAGCTCCTCGCCC'(상기 표 1의 서열 중 이텔릭체로 표시)의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 표 1에서 밑줄은 sgRNA 서열 (102bp)을 나타내고, 굵은 글씨는 Dicer의 기질이 되는 siRNA 부분이다.
(3) 폴리 - RNP 나노입자의 자가-조립
중합성 CRISPR/Cas9-siRNA인 폴리-RNP 나노입자는 도 1A에서 도식화하여 보여주는 바와 같이 자기-조립식이므로, 상기 RCA 반응 중 T7 RNA 폴리머라제를 제조된 환형 DNA와 함께 혼합하여 RCT에 의해 계속적으로 단쇄 RNA를 생산시켰다.
구체적으로, 환형 DNA(최종 농도 0.03μM)를 T7 RNA 폴리머라제 (10unit/μL, New England Biolabs, USA), rNTP mix (8 mM, New England Biolabs, USA), 반응 완충액(80 mMTris-HCl, 12 mM MgCl2, 2 mM DTT, 4 mM 스페르미딘, New England Biolabs, USA) 및 Cas9 단백질 (73 ng/㎕)로 혼합하였다. 그런 다음 상기 혼합된 용액을 효소적 과정을 위해 37℃에서 20시간 동안 인큐베이션하였다.
(4) 폴리 - RNP 나노입자 특징의 시각적 확인
생성된 폴리-RNP 나노입자의 특징을 시각화하여 확인하기 위해 상기 생산된 산물을 원자력 현미경 (atomic force microscopy; AFM) 및 투과전자현미경(transmission electron microscopy; TEM)을 이용하여 시각화하였다,
먼저 원자력 현미경(AFM, Park NX10, Korea)을 상기 RNA-Cas9 리보뉴클레오단백질 입자의 고화질 디지털 이미지를 수득하기 위해 사용하였다. 상기 The AFM 시료를 실리콘 와퍼 상에 점적한 후 건조시켰다. 모든 AFM 이미지를 실온에서 비-접촉 모드로 Non-Contact Cantilever (PPP-NCHR 5M, Nanosensors, 한국)으로 기록하였다. 상기 이미지를 XEI 소프트웨어 (Park Systems, 한국)를 이용하여 분석하였다. 나노입자의 내부 이미지를 200 kV에서 작동된 JEM-2100F TEM (JEOL, 일본)으로 시험하였다.
나노입자를 현상하기 위해 형광현미경 (Nikon, Eclipse Ti, Japan) 및 핵계수기 (NC-3000, Chemometec, Denmark)를 사용하였다. RNP 나노입자의 형광현미경을 가공하고 유동세포계측 분석을 현상하기 위해, 상기 Cas9 단백질을 RCT 반응 전에 TMR(tetramethylrhodamine)으로 표지하였다. RNP 나노 입자의 제조 후, 이들을 SYBR 녹색으로 염색하여, 상기 입자의 용액을 NC-Slide A2 (Chemometec) 상에 분석하고, 그 결과를 NucleoViews NC-3000 소프트웨어 (Chemometec)를 이용하여 시각화하였다.
또한 유동세포계측적 결과에 의해 측정하였으며, 그 TMF에 대하여 FlowJo (USA)로 재구성하고, 나노입자의 제타 포텐셜 및 크기 분포를 Zetasizer (Nano-ZS90, Malvern, UK)를 이용하여 측정해 그 결과를 Zetasizer 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 1B의 AFM 이미지에서 확인할 수 있는 바와 같이 상기 반응에 의한 생성물이 지름 약 50nm인 단분산 구형 나노구조를 나타냄을 알 수 있었다. 도 1B 내 삽입 이미지로 나타낸 바와 같이 TEM 이미지 또한 밀도 높게 조립된 구형 나노입자를 보여주는데, 대조군으로서 Cas9 단백질을 첨가하지 않은 일반적인 RCT 산물은 도 1C에서 알 수 있는 바와 같이 약 지름 1.5 ㎛의 스폰지-유사한 구형 구조물을 보여주는 것과 대비된다. 폴리-RNP 나노입자의 구성을 확인하기 위해, 상기 RCT를 테트라메틸로다민(TMF)-표지된 Cas9 단백질을 사용하였는데, RCT 후, 입자를 RNA 염색제(SYBR 녹색)로 염색한 것을 확인 한 결과 도 1D로 나타낸 바와 같이, 형광현미경의 이미지는 상기 나노 입자가 적색 및 녹색 형광을 동시에 발산하는 것을 보여줌으로써, 상기 입자가 RNA 및 Cas9 단백질 모두로 구성된다는 것을 알 수 있다.
(4) 폴리 - RNP 나노입자의 안정성 확인
생성된 폴리-RNP 나노입자의 안정성을 확인하기 위해, 겔 전기영동에서 파괴된 이중나선을 평가하고, 혈청 내 안정성 평가를 수행하였다.
구체적으로, 10% FBS(Gibco) 중에 표적 서열을 포함하는 4.7 kb DNA duplex인 기질 DNA 첨가하고 폴리-RNP 및 모노-RNP 각각을 RNA 농도로 10ng/㎕하여 37℃에서 1 내지 24시간 인큐베이션 하였다.
그 결과, 도 1E에서 볼 수 있는 바와 같이 나노입자로 뭉쳐진 상태의 RNP라 할지라도 유전자 절단 활성이 어느 정도 유지됨을 알 수 있었고, 도 1F에 나타낸 바와 같이, RNP의 Cas9에 의해 파괴된 이중나선이 모노-RNP에서 선명하게 관찰되었다. 혈청 내 안정성을 비교한 경우 도 1G에 나타낸 바와 같이, Cas9 (400nM)의 동일한 농도에서, 폴리-RNP는 모노-RNP와 비교하여 높은 혈청 안정성을 보여줬는데, 이는 폴리-RNP가 핵산(예를 들어, siRNA)의 효율적인 운반에 요구되는 세포 내 및 인비보에서 장기적인 안정성을 갖는다는 것을 의미한다.
실시예 2: 폴리 - RNP 나노입자의 세포 활성 확인
폴리-RNP 나노입자의 세포 내에서 갖는 활성 효율을 기존의 모노-RNP 시스템과 비교하기 위해 하기의 실시예를 수행하였다.
(1) 폴리 - RNP의 세포 내 형질 주입
폴리-RNP 나노입자의 세포 섭취를 증가시키기 위해 형질주입 전에, RNA-기반된 입자의 높은 음성 전하 밀도 때문에, 상기 양성자성 지질을 정전기성 상호작용으로서 상기 입자에 흡수시킬 수 있는, 양성자성 지질-기반된 시약인 Stemfect로 상기 입자를 정형화하였다. 그 결과, 도 2A에 나타낸 바와 같이 -12mV (RNP 나노입자)에서 +29mV (RNP/양성자성-지질 입자)의 상기 입자 표면 전하의 변화 (제타 포텐셜)가 유발됨을 확인함으로써, 양성자성 지질을 갖는 폴리-RNP 나노 입자의 성공적인 조립이 이루어졌음을 알 수 있었고, 도 2B에 나타낸 바와 같이 상기 Stemfect로의 복합체화 후 입자의 크기가 평균적으로 약 80nm임을 알 수 있다.
HeLa 및 HeLa/GFP 세포를 10% FBS 및 1% 항생제(1% 페니실린 및 1% 스트렙토마이신)를 함유하는 DMEM 중에 CO2 인큐베이터 (37℃, 5% CO2)에서 배양하고, 상기 생성된 정형화된 폴리-RNP 리포플렉스-나노입자를 상기 배양된 HeLa 및 HeLa/GFP 세포에 형질 주입하였다. 형질 주입은 구체적으로, 10% FBS, 1% 페니실린 및 1% 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 배지에 상기 세포를 배양하고 DPBS 완충액 2mL로 3회 세척한 후, serum-free DMEM 배지 2mL을 가해주었다. 이후, 폴리-RNP 나노입자와 stemfect (1㎕)를 섞어서 형성한 리포플렉스 나노입자(RNA 농도 500ng/mL, Cas9 농도 6.3 ㎍/mL)를 배지에 가해 준 뒤, 세포를 4시간 동안 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다.
(2) RNP 나노입자의 세포독성 확인
핵산 물질 등이 세포 내로 형질 주입되는 경우 갖게 되는 세포 독성 측면에서 폴리-RNP 나노입자가 갖는 안전성을 확인하기 위해 RNP 나노입자 형질 주입 후 세포 생존률에 대해 분석하였다.
RNP 나노입자의 세포독성을 평가하기 위해 CCK-8을 수행하였다. 간략하게, 1×104 포유동물 세포를 배지 (100㎕)를 함유하는 96 웰 플레이트에 접종하고 80% 이상의 컨플루언스에 도달할 때까지 밤새 인큐베이션하였다. 그런 다음 상기 세포를 RNP 나노입자를 함유하는 (각각, RNA에 대해 100 ng/mL 내지 800 ng/mL 및 Cas9에 대해 1.26 ㎍/mL 내지 10.08 ㎍/mL) 신선한 배지에 인큐베이션하였다. 리포플렉스 독성에 대해, RNP 용액 대비 Stemfect RNA 형질주입 시약의 부피적으로 동량을 CO2 인큐베이터(5% CO2)에서 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포 계수 키트-8(CCK-8, Dojindo, Japan) 용액 (10㎕)을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존성을 나타내는 450 nm에서의 흡수율을 마이크로플레이트 측정기(SPECTRA MAX 340 Molecular Devices, USA)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 상기 세포에 RNP 나노입자를 처리하자, 도 2C로 알 수 있는 바와 RNP 나노입자가 성공적으로 세포로 운반됨을 알 수 있다. 또한 폴리-RNP가 모노-RNP 보다 더 높은 세포적 섭취 효율을 가짐을 알 수 있다. 그러나, Cas9 단독은 양이온성 지질의 존재에서 세포 내로 효율적으로 전달되지 않았다. 세포 독성 측면에서 살펴본 결과 도 3으로 알 수 있는 바와 같이, 내부화 후 RNP 그 자체는 상당한 세포 사멸을 유도하지 않은 반면(왼쪽), 리포플렉스에 의한 경우 높은 농도에서 약간 세포독성을 가짐을 알 수 있다(오른쪽). 따라서, RNP 나노입자는 형질주입에 사용되는 시약의 양을 감소시켜도 세포 내로 효율적으로 유전자 가위 시스템을 전달시킬 수 있으므로, 종래의 형질주입 방식에 비해 유리하고 개선된 효과를 가짐을 알 수 있다.
(4) RNP 나노입자의 세포 내 활성 평가
RNP 나노 입자가 세포 내 활성을 유지하는지 평가하기 위해 세포 내로 운반된 RNP 나노입자에 의한 GFP 발현의 방해를 측정하였다. 구체적으로, 각 RNP를 GFP-발현성 HeLa 세포에 운반 한 후, 상기 표적 지역을 PCR로 증폭하였고, 삽입-결실률을 평가할 수 있는 T7 엔도뉴클리아제 1 (T7E1) 분석을 폴리-nsgRNA(siRNA 서열 없이 중합화된 비-표적화 sgRNA), 폴리-sgRNA(siRNA 서열 없이 중합화된 표적화 sgRNA), 또는 폴리-sgRNA/nsiRNA(비 표적화 siRNA 서열로 중합화된 표적화 sgRNA)와 같은 폴리 RNA의 각 타입을 함유하는 중합체 RNP 복합체에 대해 수행하였다. 게놈 DNA를 MagListoTM 5 M 게놈 DNA 추출 키트를 이용함으로써 추출하였다. 표적 서열을 표 2의 서열을 갖는 프라이머를 이용하여 RNP 나노입자-처리된 세포로부터 추출된 DNA로부터 PCR 증폭하였다. 표적화된 sgRNA는 102 bp의 염기 서열 내 GFP 게놈 DNA와 상보적인 20 bp의 표적 서열을 포함하므로 Cas9이 이를 인식하여 표적 부위를 선택적으로 절단할 수 있으나, 비표적화된 nsgRNA는 이 표적 부위가 GFP 유전자와 상보적인 결합을 하지 않는 염기서열로 이루어져 있어 GFP를 표적할 수 없다. 또한 비표적화된 nsiRNA는 표적화된 siRNA와 달리 염기 서열 내 GFP mRNA와 무관한 서열로 대체되어 있는 것을 사용하였다.
유전자 프라이머 서열
표적 유전자 순방향 5'-TTTCTTACCTGGTGGCGTTCCAAA
역방향 5'-ATGCTTCTACACCAGCCCATGGCG
염색체 7에
오프타겟 유전자 		순방향 5'-TGCCTTGGACACATGTAAGA
역방향 5'-AAGGGCGGGCCTTGCCGGCGG
염색체 4에
오프타겟 유전자 		순방향 5'-TAGGCTATCTAACTTTATAAT
역방향 5'-ATGTCTGCCCTGCATGACAG
[표 2] 유전자의 PCR 증폭을 위해 사용된 프라이머 서열
제조사에 의해 공급된 반응 완충액 (50㎕) 중에 상기 서열 (200ng)을 10분 간 95℃로 가열하였다. 그런 다음, 80℃ 워터 배스에서 트랜스퍼하고 5분간 인큐베이션하였고, 그런 다음 추가적으로 45분 동안 실온에서 천천히 냉각하였다. T7E1 (20 ㎕)을 상기 용액에 첨가하고, 상기 혼합물을 37℃에서 15분간 인큐베이션하였다. 상기 반응물을 70 V에서 0.5XTBE 완충액에 내린 아가로스 겔 (1.2%) 상에 겔 전기영동으로써 분석하였다. 상기 겔 상의 DNA 밴드를 SYBR 골드로 염색하였다. 밴드 세기를 ImageJ로 분석하였다.
그 결과, 도 4A로 알 수 있는 바와 같이 상기 표적 지역의 8.7 내지 63.9% 의 방해가 T7E1 분석의 겔 분석에 따라 RNP로 처리된 세포에서 생성되었다. 폴리-RNP는 일반적으로 단량체 RNP보다 더 높은 방해율을 보였고, 상기 방해가 폴리-RNP에서 sgRNA/siRNA 키메라가 사용될 경우 증가함을 알 수 있었다.
(5) RNP 나노입자에 의한 GFP 발현 방해의 형광 현미경 분석
유리-바닥 35nm 접시 중에 HeLa/GFP(5 X 104)를 제조사의 프로토콜에 따라 2 ㎍ RNA 및 25.2 ㎍ Cas9로 구성된 RNP 나노입자를 인큐베이션함으로써 형성된 리포플렉스로, 실온에서 15분 동안 stemfect로 처리하였다. 그런 다음, 상기 세포를 CO2 인큐베이터(5% CO2)에서 4시간 동안 37℃에서 배지 (2ml) 중에 인큐베이션 하였다. DPBS (2 mL, 3 회)로 세척한 후, 상기 세포를 15분 동안 DPBS (2 mL)에서 Hoechst 34580 (3 ㎍/mL, Thermo Fisher Scientific, USA)와 함께 인큐베이션 하고, DPBS (1 mL, 3 회)로 세척하였다. 상기 세포의 형광 이미지를 LSM 700 Axio Observer (Carl Zeiss, Germany)를 이용하여 수득하였다. Hoechst 34580 및 GFP에 대해 사용된 여기(excitation)/발산 여과는 각각 340 내지 380/432 내지 482 nm 및 480 내지 540/509 내지 549 nm였다.
그 결과, 도 4B에 나타낸 바와 같이 nsgRNA, sgRNA/nsiRNA 및 sgRNA/siRNA의 경우 모두 폴리-RNP로 처리된 세포에서 모노-RNP 만큼 또는 그보다 현저히 녹색 형광 신호가 감소하는 것을 확인함으로써 폴리-RNP가 세포 내에서 활성을 가짐을 알 수 있다.
(7) 단백질 수준에서의 RNP 나노입자에 의한 GFP 발현 방해의 측정
RNP로 처리된 세포에서의 GFP 발현의 하향-조절을 단백질 수준에서 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하였다.
먼저 세포를 수확하여 RIPA 완충액으로 세척하였다. 용해물 중에 용해성 단백질 (20 μg)을 SDS-폴리아클릴아미드 겔 전기영동(PAGE)에 의해서 분리하여 폴리비닐리덴 디플로리드 (PVDF) 막으로 블롯팅하였다. PVDF 막을 항-GFP 항체 (1 : 1,000) 및 항- β액틴 항체 (1 : 5,000)로 인큐베이션하고 그런 다음 홀스라디쉬 과산화효소 (HRP)-복합된 2차 항체(1 : 10,000)와 인큐베이션하였다. 세척 후, 단백질 밴드를 SuperSignalTM West Pico Chemiluminescent를 이용하여 시각화하고, WSE-6100 LuminoGraph (ATTO, Japan)에 의해서 이미지화하였다.
그 결과 도 4C에 나타낸 바와 같이, nsgRNA, sgRNA/nsiRNA 및 sgRNA/siRNA의 경우 모두 폴리-RNP로 처리된 세포에서 모노-RNP 만큼 또는 그보다 현저히 녹색 형광 신호가 감소하는 것을 확인함으로써 폴리-RNP가 세포 내에서 활성을 가짐을 알 수 있다.
(8) RNP 나노입자에 의한 GFP 발현 방해의 유동세포계측적 분석
GFP 발현의 더욱 정량적인 분석을 위해 유동세포계측적 분석을 수행하였다.
세포를 0.05 X Tripsin-EDTA (100 ㎕, Invitrogen, USA)의 처리에 의해서 트립신화하고, 펠렛을 형성 한 후, DPBS (1 mL, 3 회)로 세척하였다. 그런 다음 상기 세포를 DPBS (1 mL) 중에 재현탁하고, 형광 세포의 정량 분석을 위해 유동세포계측(Guava easyCyte, Merck Millipore, Germany)하였다.
그 결과, 도 4D에 나타낸 바와 같이, 모노-sgRNA, 폴리-sgRNA, 폴리-sgRNA/siRNP와 같은 RNP는 각각 약 39%, 28%, 및 58% GFP-음성 세포로 나타났다. 주목할 점은, 상기 폴리 sgRNA/nsiRNA RNP로 처리된 세포는 폴리-sgRNA/siRNA RNP-처리된 세포에서와 비교하여 유사한 GFP 발현 수준을 나타내었다. siRNA 서열과 관계 없이, siRNA를 함유하는 폴리-RNP는 표적 유전자의 방해율을 증가시켰고, 따라서 siRNA가 없는 폴리-sgRNA RNP와 비교하여 GFP 발현이 현저히 감소하였다. 이는 표적 유전자에 더욱 자유롭게 접근가능한 다중 모노-RNP를 생산하는 세포 내 운반 후 내장된 siRNA 서열의 다이서 소화 때문일 수 있다. sgRNA가 비 표적화된 경우, 상기 폴리 RNP(폴리-nsgRNA)가 기능하지 않는데, 이는 폴리-RNP에서 sgRNA에 의한 표적-특이적 유전자 조절을 증명한다. 전체적으로, 다이서-분열 위치가 중합성 RNA에 존재하는 경우에만 유전자 방해에서 모노-RNP 보다 더 효과적이었다.
실시예 3: 폴리 - RNP 나노입자의 인 비보 활성 확인
폴리-CRISPR/Cas9 시스템이 세포적 실험에서 상기 표적 유전자의 증가된 녹-아웃을 제공하는 것과 같이, 그러한 CRISPR/Cas9의 중합성 제작이 또한 인 비보 환경에서 유전자 방해에 기반된 표적 표현형의 발현을 억제하는데 효과적인지 여부를 시험하였다.
(1) 동물로의 RNP -나노입자의 주입 및 이미지화
생후 4주 된 BALB/c 수컷 누드 마우스를 RaonBio(한국)로부터 구매한 후 동물 실험에 사용하였다. 마우스의 몸무게는 20 내지 22g이었다. 모든 마우스를 표준 실험 조건으로 처리하였다. 모든 동물 실험을 동물 실험을 위한 협회 가이드라인에 따라 수행하고 KIST 내 동물 실험을 위한 협의회에 의해 승인되었다(2016-01-022).
HeLa/GFP 세포의 현탁액(5 X 106)을 Balb/c 누드 마우스의 등으로 피사 내 주입하였다. 주사 후 2주 째에, 상기 종양을 갖는 마우스를 무작위로 6개 그룹으로 나눴다 (각 그룹당 4마리). 제조사의 프로토콜에 따라 Stemfect로 처리된 PBS, 모노-RNP, 또는 폴리-RNP 나노입자(2.5 μg RNA 및 31.5 μg Cas9)의 용액을 마우스로 종양 내 주입하였다. HeLa 종양에서의 GFP로부터의 인비보 형광 발산을 0일 째 및 7일째에 IVIS 이미징 Spectrum System(491 nm에서 발산 및 509 nm에서 여기 여과)에 의해서 모니터링하고 IVIS Living Imaging 3.0 소프트웨어에 의해서 분석하였다.
그 결과, 도 6A로 알 수 있는 바와 같이 0일에 상기 형광 세기에 비해, 단백질의 형광이 폴리-sgRNA/nsiRNA RNP 및 폴리-sgRNA/siRNA RNP로 주사된 마우스를 제외한 모든 그룹에서 유의하게 감소되지 않았다. 세포성 실험 결과와 대조적으로, 종양에서 GFP 발현의 억제가 모노-sgRNA RNP 및 폴리-sgRNA RNP가 주입된 마우스에서 뚜렷하게 관찰되지 않았는데, 이는 모노-sgRNA RNP의 불충분한 안정성 및 인비보 환경에서 폴리-sgRNA RNP의 불완전한 활성 때문일 수 있다.
(2) 종양 분석 및 종양 용해물 분석
유전자 방해의 동일한 경향을 다시 상기 전체 종양 조직에서의 평균적 활성을 평가하기 위해 종양 분석 및 종양 용해물 분석을 수행하였다.
종양 분석을 위해 나노입자의 주입 후 7일 째에, 상기 마우스를 희생시키고, 종양을 수확하였다. 상기 마우스로부터 수확된 HeLa/GFP 종양을 30분 동안 PBS에서 인큐베이션 하였다. PBS를 제거한 후, 상기 종양을 수크로스 용액(PBS 중에 20%)으로 이들이 침전될 때까지 흡입하였다. 상기 용액을 제거한 후, 종양을 최적의 절단 온도(Optimal Cutting Temperature; OCT)의 화합물(TissueTec, Sakura, Japan) 을 갖는 고리 구조의 몰드 (지름 15mm)에 깊게 잠기게 하고, 드라이아이스 중에 냉각시켰다. 크리오섹션(Cryosection)을 현미경 슬라이드(Microscope slides, Menzel, Germany) 상에 수집하였다. 상기 부분의 두께는 15㎛였다. Hoechst 34580 (DPBS 중에 3 ㎍/mL의 5 mL)을 갖는 핵을 염색한 후, 상기 부분의 이미지를 LSM 700 Axio Observer (Carl Zeiss, Germany)를 이용하여 수득하였다.
종양 용해물 분석을 위해 나노입자의 주입 후 7일 째에, 상기 마우스를 희생시키고, 종양을 수확하였다. 상기 절단된 조직을 액체 질소 하에 균질화하고 RIPA 완충액으로 용해시켰다. 상기 용해된 조직을 원심분리(12000 rpm, 10 min, 4°C)하고 각 시료의 상등액을 형광 분광광도계(F7000, Hitachi, Japan)에 의해서 분석하였다. 480 nm에서 여기시킨 후, 발광의 최대 세기를 490 내지 600 nm에서 측정된 프로필 중에 510 nm에서 얻었다.
그 결과, 형광 이미지화하여 살펴 본 도 6A의 결과와 마찬가지로 GFP 발현의 억제가 모노-sgRNA RNP 및 폴리-sgRNA RNP가 주입된 마우스에서는 뚜렷하게 관찰되지 않았으나, 폴리-sgRNA/nsiRNA RNP 및 폴리-sgRNA/siRNA RNP 그룹에서는 현저하게 GFP 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있는데(도 6B), 이는 종양에 수행된 조직학적 분석에서 다이서 분해에 민감한 중합성 RNP에 의해서만 GFP 발현의 녹아웃이 증가됨을 뒷받침한다 (도 6C). 도 6D에 나타낸 바와 같이, 웨스턴 블롯에 의해 측정된 GFP 발현의 총량 또한 폴리-sgRNA/nsiRNA RNP 및 폴리-sgRNA/siRNA RNP 그룹에서 모노-RNP보다 더 높게 나타났다.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> self-assembled ribonucleoprotein nanoparticles <130> PN116106 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1368 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 1 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile 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BV3L6 <400> 2 Met Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr Asn Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr 1 5 10 15 Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Lys His Ile Gln 20 25 30 Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp Lys Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys 35 40 45 Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln 50 55 60 Cys Leu Gln Leu Val Gln Leu Asp Trp Glu Asn Leu Ser Ala Ala Ile 65 70 75 80 Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys Thr Glu Glu Thr Arg Asn Ala Leu Ile 85 90 95 Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn Ala Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly 100 105 110 Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp Ala Ile Asn Lys Arg His Ala Glu Ile 115 120 125 Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala Glu Leu Phe Asn Gly Lys Val Leu Lys 130 135 140 Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr Thr Glu His Glu Asn Ala Leu Leu Arg 145 150 155 160 Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Phe Tyr Glu Asn Arg 165 170 175 Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp Ile Ser Thr Ala Ile Pro His Arg 180 185 190 Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro Lys Phe Lys Glu Asn Cys His Ile Phe 195 200 205 Thr Arg 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tatcaagttc 1380 actcaaacct ccacgttcag ctttcgttaa attatcaaac ttacgttgag tgattaactt 1440 ggcgtttaga agttgtctcc aatagttttt catctttttg actacttctt cacttggaac 1500 gttattcgat ttaccacgat ttttatcaga acgcgttaag accttattgt ctattgaatc 1560 gtctttaatg aaactttgtg gaacaatgtg atcgacatca taatcactta aacgattaat 1620 atctaattct tggtccacat acatgtctct tccattttgg agataataga gatagagctt 1680 ttcattttgc aattgagtat tttcaacagg atgctcttta agaatctgac ttcctaattc 1740 tttgatacct tcttcaatac gtttcatacg ctcacgcgaa tttttctggc ccttttgagt 1800 tgtctgattt tcacgtgcca tttcaataac gatattttct ggcttatgcc gccccattac 1860 tttgaccaat tcatcaacaa cttttacagt ctgtaaaata ccttttttaa tagcagggct 1920 accagctaaa tttgcaatat gttcatgtaa actatcgcct tgtccagaca cttgtgcttt 1980 ttgaatgtct tctttaaatg tcaaactatc atcatggatc agctgcataa aattgcgatt 2040 ggcaaaacca tctgatttca aaaaatctaa tattgttttg ccagattgct tatccctaat 2100 accattaatc aattttcgag acaaacgtcc ccaaccagta taacggcgac gtttaagctg 2160 tttcatcacc ttatcatcaa agaggtgagc atatgtttta agtctttcct 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tataccttct 3900 acgagctgtc cgtttgagac gagtcgcttc cgctgtctct ccactgtcaa ataaaagagc 3960 ccctataaga ttttttttga tactgtggcg gtctgtattt cccagaacct tgaacttttt 4020 agacggaacc ttataatcat cagtgatcac cgcccatccg acgctatttg tgccgatatc 4080 taagcctatt gagtatttct tatccat 4107 <210> 4 <211> 3924 <212> DNA <213> Acidaminococcus sp. BV3L6 <400> 4 atgacccaat ttgaaggttt taccaattta taccaagttt cgaagaccct tcgttttgaa 60 ctgattcccc aaggaaaaac actcaaacat atccaggagc aagggttcat tgaggaggat 120 aaagctcgca atgaccatta caaagagtta aaaccaatca ttgaccgcat ctataagact 180 tatgctgatc aatgtctcca actggtacag cttgactggg agaatctatc tgcagccata 240 gactcctatc gtaaggaaaa aaccgaagaa acacgaaatg cgctgattga ggagcaagca 300 acatatagaa atgcgattca tgactacttt ataggtcgga cggataatct gacagatgcc 360 ataaataagc gccatgctga aatctataaa ggacttttta aagctgaact tttcaatgga 420 aaagttttaa agcaattagg gaccgtaacc acgacagaac atgaaaatgc tctactccgt 480 tcgtttgaca aatttacgac ctatttttcc ggcttttatg aaaaccgaaa aaatgtcttt 540 agcgctgaag atatcagcac ggcaattccc catcgaatcg tccaggacaa tttccctaaa 600 tttaaggaaa actgccatat ttttacaaga ttgataaccg cagttccttc tttgcgggag 660 cattttgaaa atgtcaaaaa ggccattgga atctttgtta gtacgtctat tgaagaagtc 720 ttttcctttc ccttttataa tcaacttcta acccaaacgc aaattgatct ttataatcaa 780 cttctcggcg gcatatctag ggaagcaggc acagaaaaaa tcaagggact taatgaagtt 840 ctcaatctgg ctatccaaaa aaatgatgaa acagcccata taatcgcgtc cctgccgcat 900 cgttttattc ctctttttaa acaaattctt tccgatcgaa atacgttatc ctttattttg 960 gaagaattca aaagcgatga ggaagtcatc caatccttct gcaaatataa aaccctcttg 1020 agaaacgaaa atgtactgga gactgcagaa gcccttttca atgaattaaa ttccattgat 1080 ttgactcata tctttatttc ccataaaaag ttagaaacca tctcttcagc gctttgtgac 1140 cattgggata ccttgcgcaa tgcactttac gaaagacgga tttctgaact cactggcaaa 1200 ataacaaaaa gtgccaaaga aaaagttcaa aggtcattaa aacatgagga tataaatctc 1260 caagaaatta tttctgctgc aggaaaagaa ctatcagaag cattcaaaca aaaaacaagt 1320 gaaattcttt cccatgccca tgctgcactt gaccagcctc ttcccacaac attaaaaaaa 1380 caggaagaaa aagaaatcct caaatcacag ctcgattcgc ttttaggcct ttatcatctt 1440 cttgattggt ttgctgtcga tgaaagcaat gaagtcgacc cagaattctc agcacggctg 1500 acaggcatta aactagaaat ggaaccaagc ctttcgtttt ataataaagc aagaaattat 1560 gcgacaaaaa agccctattc ggtggaaaaa tttaaattga attttcaaat gccaaccctt 1620 gcctctggtt gggatgtcaa taaagaaaaa aataatggag ctattttatt cgtaaaaaat 1680 ggtctctatt accttggtat catgcctaaa cagaaggggc gctataaagc cctgtctttt 1740 gagccgacag aaaaaacatc agaaggattc gataagatgt actatgacta cttcccagat 1800 gccgcaaaaa tgattcctaa gtgttccact cagctaaagg ctgtaaccgc tcattttcaa 1860 actcatacca cccccattct tctctcaaat aatttcattg aacctcttga aatcacaaaa 1920 gaaatttatg acctgaacaa tcctgaaaag gagcctaaaa agtttcaaac ggcttatgca 1980 aagaagacag gcgatcaaaa aggctataga gaagcgcttt gcaaatggat tgactttacg 2040 cgggattttc tctctaaata tacgaaaaca acttcaatcg atttatcttc actccgccct 2100 tcttcgcaat ataaagattt aggggaatat tacgccgaac tgaatccgct tctctatcat 2160 atctccttcc aacgaattgc tgaaaaggaa atcatggatg ctgtagaaac gggaaaattg 2220 tatctgttcc aaatctacaa taaggatttt gcgaagggcc atcacgggaa accaaatctc 2280 cacaccctgt attggacagg tctcttcagt cctgaaaacc ttgcgaaaac cagcatcaaa 2340 cttaatggtc aagcagaatt gttctatcga cctaaaagcc gcatgaagcg gatggcccat 2400 cgtcttgggg aaaaaatgct gaacaaaaaa ctaaaggacc agaagacacc gattccagat 2460 accctctacc aagaactgta cgattatgtc aaccaccggc taagccatga tctttccgat 2520 gaagcaaggg ccctgcttcc aaatgttatc accaaagaag tctcccatga aattataaag 2580 gatcggcggt ttacttccga taaatttttc ttccatgttc ccattacact gaattatcaa 2640 gcagccaata gtcccagtaa attcaaccag cgtgtcaatg cctaccttaa ggagcatccg 2700 gaaacgccca tcattggtat cgatcgtgga gaacgcaatc taatctatat taccgtcatt 2760 gacagtactg ggaaaatttt ggagcagcgt tccctgaata ccatccagca atttgactac 2820 caaaaaaaat tggacaacag ggaaaaagag cgtgttgccg cccgtcaagc ctggtccgtc 2880 gtcggaacga tcaaagacct taaacaaggc tacttgtcac aggtcatcca tgaaattgta 2940 gacctgatga ttcattacca agctgttgtc gtccttgaaa acctcaactt cggatttaaa 3000 tcaaaacgga caggcattgc cgaaaaagca gtctaccaac aatttgaaaa gatgctaata 3060 gataaactca actgtttggt tctcaaagat tatcctgctg agaaagtggg aggcgtctta 3120 aacccgtatc aacttacaga tcagttcacg agctttgcaa aaatgggcac gcaaagcggc 3180 ttccttttct atgtaccggc cccttatacc tcaaagattg atcccctgac tggttttgtc 3240 gatccctttg tatggaagac cattaaaaat catgaaagtc ggaagcattt cctagaagga 3300 tttgatttcc tgcattatga tgtcaaaaca ggtgatttta tcctccattt taaaatgaat 3360 cggaatctct ctttccagag agggcttcct ggcttcatgc cagcttggga tattgttttc 3420 gaaaagaatg aaacccaatt tgatgcaaaa gggacgccct tcattgcagg aaaacgaatt 3480 gttcctgtaa tcgaaaatca tcgttttacg ggtcgttaca gagacctcta tcccgctaat 3540 gaactcattg cccttctgga agaaaaaggc attgtcttta gagacggaag taatatatta 3600 cccaaacttt tagaaaatga tgattctcat gcaattgata cgatggtcgc cttgattcgc 3660 agtgtactcc aaatgagaaa cagcaatgcc gcaacggggg aagactacat caactctccc 3720 gttagggatc tgaacggggt gtgtttcgac agtcgattcc aaaatccaga atggccaatg 3780 gatgcggatg ccaacggagc ttatcatatt gccttaaaag ggcagcttct tctgaaccac 3840 ctcaaagaaa gcaaagatct gaaattacaa aacggcatca gcaaccaaga ttggctggcc 3900 tacattcagg aactgagaaa ctga 3924

Claims (22)

  1. Single guide RNA(sgRNA) 영역과 small interfering RNA(siRNA) 영역을 갖는 복수 개의 제1 반복단위를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드; 및
    상기 sgRNA 영역에 결합된 복수 개의 뉴클레아제 단백질(nuclease)을 포함하는 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체로서,
    상기 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체는 자기조립되어 나노입자를 형성하는 것인 복합체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 뉴클레아제 단백질은 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질인 복합체.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 나노입자는 일정한 크기를 갖는 것인 복합체.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 나노입자는 10 내지 1000nm의 직경을 갖는 것인 복합체.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 sgRNA는 표적 유전자와 혼성화할 수 있는 것으로서, crRNA 영역, 연결 고리(linker loop) 및 tracrRNA 영역을 포함하는 것인 복합체.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 표적 유전자의 뉴클레오티드 서열은 sgRNA와 상보적인 뉴클레오티드 서열 및 프로토간극자 적합 모티프(protospace adjacent motif; PAM)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 복합체.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 sgRNA는 상기 표적 유전자와 상보적인 20개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 복합체.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리리보뉴클레오티드는 상기 제1 반복단위가 일정한 패턴으로 반복되는 것인 복합체.
  11. 청구항 2에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 속(Streptococcus genus)으로부터 유래된 것이고, Cpf1 단백질은 악시다미노코커스 속(Acidaminococcus)으로부터 유래된 것인 복합체.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 스트렙토코커스 속은 스트렙토코커스 피오젠스 (Streptococcus pyogenes)이고, 상기 악시다미노코커스 속은 악시다미노코커스 sp. BV3L6(Acidaminococcus sp. BV3L6)인 복합체.
  13. 청구항 1의 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체를 포함하는 조성물로서,
    상기 조성물은 진핵 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 것인 조성물.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 조성물은 개체에 투여되어 유전자 치료를 하기 위한 것인 조성물.
  15. sgRNA 영역과 siRNA 영역을 갖는 복수 개의 제1 반복단위를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드에 복수의 뉴클레아제 단백질을 접촉시키는 단계를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체를 제조하는 방법으로서,
    상기 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체는 자기조립되어 나노입자를 형성하는 것인 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 주형 핵산, 상기 주형에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 갖는 프라이머, NTP, RNA 폴리머라제 및 뉴클레아제 단백질을 포함하는 반응 혼합물을 인큐베이션 시켜 상기 프라이머를 연장시키는 단계; 및 상기 폴리리보뉴클레오티드를 증폭시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 주형 핵산은 상기 sgRNA 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열 및 상기 siRNA 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 주형은 원형인 방법.
  19. 청구항 16에 있어서, 상기 인큐베이션은 중합효소 반응인 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 중합효소 반응은 회전환 전사(rolling circle transcription) 또는 인 비트로 전사(in vitro transcription)인 방법.
  21. 개체로부터 분리된 세포에 청구항 1의 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체를 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법.
  22. 청구항 13의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 질환을 치료하는 방법으로서,
    상기 개체는 인간을 제외한 것인 방법.
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