JP2021532794A - マルチエフェクター核酸塩基エディターおよびそれを用いて核酸標的配列を改変する方法 - Google Patents

マルチエフェクター核酸塩基エディターおよびそれを用いて核酸標的配列を改変する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、標的核酸内の複数の異なる塩基において改変を誘導することができるマルチエフェクター核酸塩基エディター、およびそのようなエディターを使用する方法を特徴とする。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2018年8月3日に出願された米国仮特許出願第62/714,550号の利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
背景
核酸配列の標的化された編集、例えば、ゲノムDNAへの標的化された切断または特異的修飾の標的化された導入は、遺伝子機能の研究のための非常に有望なアプローチであり、また、ヒト遺伝病のための新しい治療を提供する可能性を有する。現在利用可能な塩基エディターには、標的C・GをT・Aに変換するシチジン塩基エディター(例えばBE4)および標的A・TをG・Cに変換するアデニン塩基エディター(例えばABE7.10)が含まれる。
標的配列内に新しい種類の修飾を導入することができる塩基エディターの必要性が本技術分野に存在する。
以下に記述するように、本発明は、標的核酸内の複数の異なる塩基で変化を誘導することができるマルチエフェクター核酸塩基エディターおよびそのようなエディターを使用する方法を特徴とする。
1つの態様において、本発明は、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、および/またはDNAグリコシラーゼのドメインを含むマルチエフェクター核酸塩基編集ポリペプチドを特徴とし、ここで、前記ドメインは、ポリヌクレオチド結合ドメインに融合され、それによって、核酸分子内の複数の異なる塩基で変化を誘導することができる核酸塩基エディターを形成する。一実施形態では、ポリペプチドは、一つ以上の核局在化シグナル (NLS) をさらに含む。別の実施形態では、NLSは二部分（bipartite）NLSである。別の実施形態では、ポリペプチドはN末端NLSおよびC末端NLSを含む。別の実施形態では、ポリペプチドはさらに一つ以上のウラシルDNAグリコシラーゼ阻害因子 (UGI) を含む。別の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadAデアミナーゼである。別の実施形態において、TadAデアミナーゼは、天然に存在しない改変アデノシンデアミナーゼである。別の実施形態では、ポリペプチドは、同一または異なる2つのアデノシンデアミナーゼを含む。別の実施形態において、2つのアデノシンデアミナーゼは、ヘテロまたはホモ二量体を形成することができる。別の実施形態において、アデノシンデアミナーゼドメインは、野生型TadAおよびTadA7.10である。別の実施形態では、核酸配列特異的結合活性を有するドメインは、核酸プログラミング可能DNA結合タンパク質（napDNAbp：nucleic acid programmable DNA binding protein）である。別の実施形態では、napDNAppドメインは、ヌクレアーゼ不活Cas9（dCas9：dead Cas9）、Cas9ニッカーゼ（nCas9）、またはヌクレアーゼ活性Cas9を含む。別の実施形態では、napDNAbpは、Cas9、Cas12a/Cpfl、Cas12b/C2cl、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12 h、およびCas12iまたはそれらの活性断片からなる群より選択される。特定の実施形態では、napDNAbpドメインは、Cas9ドメイン、Cas12aドメイン、Cas12bドメイン、Cas12cドメイン、Cas12dドメイン、Cas12eドメイン、Cas12fドメイン、Cas12gドメイン、Cas12hドメイン、Cas12iドメイン、またはアルゴノート（argonaute）ドメインを含む。別の実施形態では、napDNAbpドメインは、核酸配列の逆相補鎖を切断することができる触媒ドメインを含む。別の実施形態では、napDNAbpドメインは、核酸配列を切断することができる触媒ドメインを含まない。別の実施形態では、Cas9はdCas9またはnCas9である。別の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、Petromyzon marinusシトシンデアミナーゼ1（pCDM）または活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（AICDA）である。別の実施形態では、ポリペプチドは、脱塩基核酸塩基エディターをさらに含む。別の実施形態では、UGIはBacillus subtilisバクテリオファージPBS1に由来するものであり、ヒトUDG活性を阻害する。
別の態様において、本発明は、一つ以上の核局在化シグナル (NLS) 、napDNAbp、ウラシルDNAグリコシラーゼ阻害因子、アデノシンデアミナーゼ、およびシチジンデアミナーゼを含むマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチドを特徴とする。1つの実施形態において、ポリペプチドは2つのNLSを含む。1つの実施形態において、1つのNLSは二部分NLSである。別の実施形態において、ポリペプチドは2つのウラシルDNAグリコシラーゼ阻害因子を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、2つのアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ、または脱塩基核酸塩基エディターおよびシチジンデアミナーゼ、または脱塩基核酸塩基エディターおよびアデノシンデアミナーゼを含む。
1つの態様において、本発明は、以下のドメインA〜C、A〜D、またはA〜Eを含むマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチドを特徴とし、
NH2-[A-B-C]-COOH、
NH2-[A-B-C-D]-COOH、または
NH2-[A-B-C-D-E]-COOH
ここで、AおよびCまたはA、CおよびEは、それぞれ以下のものの1つ以上を含み、
アデノシンデアミナーゼドメインまたはその活性断片、
シチジンデアミナーゼドメインまたはその活性断片、
DNAグリコシラーゼドメインまたはその活性断片
BまたはBおよびDは、それぞれ核酸配列特異的結合活性を有する1つ以上のドメインを含む。1つの実施形態において、上記態様のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチドは、
NH2-[An-Bo-Cn]-COOH、
NH2-[An-Bo-Cn-Do]-COOH、または
NH2-[An-Bo-Cp-Do-Eq]-COOH
を含み、ここで、AおよびCまたはA、CおよびEは、それぞれ以下のものの1つ以上を含み、
アデノシンデアミナーゼドメインまたはその活性断片、
シチジンデアミナーゼドメインまたはその活性断片、
DNAグリコシラーゼドメインまたはその活性断片
nは1、2、3、4または5の整数であり、pは0、1、2、3、4または5の整数であり、qは0、1、2、3、4、または5の整数であり、BまたはBおよびDはそれぞれ、核酸配列特異的結合活性を有するドメインを含み、oは1、2、3、4、または5の整数である。1つの実施形態において、ポリペプチドは、1つ以上の核局在化配列を含む。1つの実施形態において、ポリペプチドは、N末端またはC末端にある前記核局在化配列の少なくとも1つを含む。1つの実施形態において、ポリペプチドは、二部分核局在化シグナルである核局在化シグナルを含む。1つの実施形態において、ポリペプチドは、リンカーによって連結された1つ以上のドメインを含む。1つの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadAデアミナーゼである。1つの実施形態において、TadAは、天然に存在しない改変アデノシンデアミナーゼである。別の実施形態では、ポリペプチドは、同一のまたは異なる2つのアデノシンデアミナーゼドメインを含む。1つの実施形態において、2つのアデノシンデアミナーゼドメインは、ヘテロまたはホモ二量体を形成することができる。一実施形態において、アデノシンデアミナーゼドメインは野生型TadAおよびTadA7.10である。1つの実施形態において、ポリペプチドは、核酸プログラミング可能DNA結合タンパク質 (napDNAbp) である、核酸配列特異的結合活性を有するドメインを含む。1つの実施形態において、napDNAbpドメインは、ヌクレアーゼ不活Cas9 (dCas9) 、Cas9ニッカーゼ (nCas9) 、またはヌクレアーゼ活性Cas9を含む。1つの実施形態において、napDNAbpは、Cas9、Cas12a/Cpfl、Cas12b/C2cl、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、およびCas12i、またはそれらの活性断片からなる群より選択される。1つの実施形態において、napDNAbpドメインは、核酸配列の逆相補鎖を切断することができる触媒ドメインを含む。1つの実施形態において、napDNAbpドメインは、核酸配列を切断することができる触媒ドメインを含まない。1つの実施形態において、Cas9はdCas9またはnCas9である。一実施形態では、napDNAbpは、核酸塩基エディターを含む。一実施形態において、核酸塩基エディターは、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼである。一つの実施形態において、シチジンデアミナーゼは、Petromyzon marinusシトシンデアミナーゼ1 (pCDM) または活性化誘導型シチジンデアミナーゼ (AICDA) である。或る実施態様では、ポリペプチドは、0、1または2個のウラシルグリコシラーゼ阻害因子またはその活性断片を含む。
別の態様では、本発明は、前述の態様のいずれか１つに係る、または本明細書に記載される、マルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を特徴とする。1つの実施形態において、ポリヌクレオチドはコドン最適化される。
別の態様において、本発明は、前述のクレームのポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターを特徴とする。1つの実施形態において、発現ベクターは哺乳動物発現ベクターである。一実施形態において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス (AAV) 、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、およびヘルペスウイルスベクターからなる群より選択されるウイルスベクターである。別の実施形態では、ベクターはプロモーターを含む。
別の態様において、本発明は、先述の態様のいずれかのポリヌクレオチドまたは前述のベクターを含む細胞を特徴とする。1つの実施形態において、細胞は、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞である。
もう1つの態様において、本発明は、前述のクレームのマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチドと、ガイドRNA、tracrRNAまたは標的DNA分子のうちの1つ以上を含む分子複合体を特徴とする。
もう1つの態様において、本発明は、先述の態様のマルチエフェクター核酸塩基編集ポリペプチド、先述の態様のポリヌクレオチド、先述の態様のベクター、または先述の態様の分子複合体を含むキットを特徴とする。
もう1つの態様において、本発明は、核酸配列の核酸塩基を編集する方法を特徴とし、この方法は、先述の態様のいずれかのマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチドを含む塩基エディターに核酸配列を接触させることと、前記DNA配列の第1の核酸塩基を第2の核酸塩基に変換することとを含む。一実施形態において、第1の核酸塩基はシトシンであり、第2の核酸塩基はチミンである。一実施形態において、第1の核酸塩基はアデニンであり、第2の核酸塩基はグアニンである。別の実施形態では、この方法は、第3の核酸塩基を第4の核酸塩基に変換することをさらに含む。一実施形態において、第3の核酸塩基はグアニンであり、第4の核酸塩基はアデニンである。別の実施形態では、第3の核酸塩基はチミンであり、第4の核酸塩基はシトシンである。別の実施形態では、核酸配列は相補性決定領域 (CDR) をコードする。
もう1つの態様において、本発明は、細胞のゲノムに存在する調節配列を編集する方法を特徴とし、この方法は、調節配列を、いずれかの先述の態様のマルチエフェクター核酸塩基編集ポリペプチドを含む塩基エディターと接触させることと、DNA配列の第1および第2の核酸塩基を第3および第4の核酸塩基に変換することとを含む。
さらにもう1つの態様において、本発明は、細胞のゲノムを編集する方法を特徴とし、この方法は、ゲノムを、いずれかの先述の態様のマルチエフェクター核酸塩基編集ポリペプチドを含む塩基エディターと接触させることと、DNA配列の第1および第2の核酸塩基を第3および第4の核酸塩基に変換することとを含む。1つの実施形態において、本方法は、ゲノムに対する編集の影響を解析することをさらに含む。
本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
定義
以下の定義は、当該技術分野の定義を補足するものであって本出願を対象としており、関連するまたは関連性のない案件、例えば共通の所有に係る特許または出願に帰するものではない。本明細書に記載されたものと同様または同等の任意の方法および材料を、本開示の試験の実施において使用することができるが、好ましい材料および方法を本明細書で説明する。従って、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのためのものであり、限定することを意図するものではない。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、当業者に、本発明において使用される多くの用語の一般的な定義を提供する: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で使用される場合、以下の用語は、特に示されない限り以下に記載される意味を有する。
本出願において、単数形の使用は、特に断りのない限り、複数形を含む。本明細書で使用されるように、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明確にそうでないことを指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。本出願において、「又は」の使用は、別段の記載がない限り、「及び/又は」を意味する。さらに、用語「含む(including)」、ならびに「含む(include)」、「含む(includes)」、および「含まれる(included)」などの他の形態の使用は、非限定的である。
本明細書及びクレームにおいて使用される場合、用語「含む(comprising)」(および「含む(comprise)」および「含む(comprises)」などのそのあらゆる形態)、「有する(having)」(「有する(have)」および「有する(has)」などのそのあらゆる形態)、「含む(including)」(「含む(include)」および「含む(includes)」などのそのあらゆる形態)又は「含む(containing)」(「含む(contains)」および「含む(contain)」などのそのあらゆる形態)は、包括的又は開放的であり、追加の、記載されていない要素又は方法工程を排除しない。本明細書で議論される任意の実施形態は、本開示の任意の方法または組成物に関して実施することができ、逆もまた同様であると考えられる。さらに、本開示の組成物を用いて、本開示の方法を達成することができる。
用語「約(about)」または「およそ(approximately)」は、当業者によって決定されるように、特定の値について許容可能な誤差範囲内であることを意味し、これは、値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、当該技術分野における実務によれば、1以内または1を超える標準偏差内であることを意味し得る。あるいは、「約」は、所定の値の最大20%、最大10%、最大5%、または最大1%の範囲を意味し得る。別法として、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、同じ桁以内、例えば5倍以内、2倍以内の値を意味することができる。特定の値が出願及び特許請求の範囲に記載されている場合、別段の記載がない限り、その特定の値について許容可能な誤差範囲内にあることを意味する「約」という用語が推定されるべきである。
明細書における「いくつかの実施形態」、「ある実施形態」、「一実施形態」、または「他の実施形態」という言及は、その実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、または特性が、本開示の少なくともいくつかの実施形態に含まれるが、必ずしもすべての実施形態に含まれるとは限らないことを意味する。
「脱塩基（abasic）塩基エディター」とは、核酸塩基を切り出してDNA核酸塩基(A、T、C、またはG)を挿入することができる薬剤を意味する。脱塩基塩基エディターは、核酸グリコシラーゼポリペプチドまたはその断片を含む。一実施形態において、核酸グリコシラーゼは、下記の配列のアミノ酸204またはウラシルDNAグリコシラーゼの対応位置においてAspを含み（例えば、アミノ酸204におけるAsnを置換して）、かつシトシン-DNAグリコシラーゼ活性を有する、変異型ヒトウラシルDNAグリコシラーゼまたはその活性断片である。一実施形態において、核酸グリコシラーゼは、下記の配列のアミノ酸147またはウラシルDNAグリコシラーゼの対応位置においてAla、Gly、Cys、またはSerを含み（例えば、アミノ酸147におけるTyrを置換して）、かつチミン-DNAグリコシラーゼ活性を有する、変異型ヒトウラシルDNAグリコシラーゼまたはその活性断片である。例示的なヒトウラシル-DNAグリコシラーゼ、アイソフォーム1の配列は以下の通りである：
1 mgvfclgpwg lgrklrtpgk gplqllsrlc gdhlqaipak kapagqeepg tppssplsae
61 qldriqrnka aallrlaarn vpvgfgeswk khlsgefgkp yfiklmgfva eerkhytvyp
121 pphqvftwtq mcdikdvkvv ilgqdpyhgp nqahglcfsv qrpvppppsl eniykelstd
181 iedfvhpghg dlsgwakqgv lllnavltvr ahqanshker gweqftdavv swlnqnsngl
241 vfllwgsyaq kkgsaidrkr hhvlqtahps plsvyrgffg crhfsktnel lqksgkkpid
301 wkel
ヒトのウラシル-DNAグリコシラーゼ、アイソフォーム2の配列は以下の通りである。
1 migqktlysf fspsparkrh apspepavqg tgvagvpees gdaaaipakk apagqeepgt
61 ppssplsaeq ldriqrnkaa allrlaarnv pvgfgeswkk hlsgefgkpy fiklmgfvae
121 erkhytvypp phqvftwtqm cdikdvkvvi lgqdpyhgpn qahglcfsvq rpvppppsle
181 niykelstdi edfvhpghgd lsgwakqgvl llnavltvra hqanshkerg weqftdavvs
241 wlnqnsnglv fllwgsyaqk kgsaidrkrh hvlqtahpsp lsvyrgffgc rhfsktnell
301 qksgkkpidw kel
他の実施形態では、脱塩基エディターは、PCT/JP205/080958およびUS20170321210に記載されている脱塩基エディターのいずれかであり、これらは参照により本明細書に組み入れられる。特定の実施形態では、脱塩基エディターは、上記の配列に太字、下線で示された位置、または当該技術分野で知られる任意の他の脱塩基エディターまたはウラシルデグリコシラーゼにおける対応アミノ酸において突然変異を含む。一実施形態では、脱塩基エディターは、Y147、N204、L272、および/またはR276または対応位置に突然変異を含む。別の実施形態では、脱塩基エディターは、Y147AもしくはY147G突然変異または対応する突然変異を含む。別の実施形態では、脱塩基エディターは、N204D突然変異または対応する突然変異を含む。別の実施形態では、脱塩基エディターは、L272A突然変異または対応する突然変異を含む。別の実施形態では、脱塩基エディターは、R276EもしくはR276C突然変異または対応する突然変異を含む。
「アデノシンデアミナーゼ」とは、アデニンまたはアデノシンの加水分解的脱アミノ化を触媒することができるポリペプチドまたはその断片を意味する。ある態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、アデノシンからイノシン、またはデオキシアデノシンからデオキシイノシンへの加水分解的脱アミノ化を触媒するアデノシンデアミナーゼである。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸 (DNA) 中のアデニンまたはアデノシンの加水分解的脱アミノ化を触媒する。本明細書中で提供されるアデノシンデアミナーゼ(例えば、遺伝子操作されたアデノシンデアミナーゼ、進化させたアデノシンデアミナーゼ)は、細菌などの任意の生物由来であり得る。
ある実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、以下の配列における改変を含む：
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
（TadA*7.10とも呼ばれる）。
ある態様において、TadA*7.10は、アミノ酸82または166における改変を含む。特定の実施形態では、上記参照配列のバリアント（改変体）は、以下の改変のうちの一つ以上を含む：Y147T、Y147R、Q154S、Y123H、V82S、T166R、およびQ154R。改変Y123Hは、TadA*7.10における改変H123YがY123H TadA(wt)に戻された改変を指す。他の実施形態では、TadA*7.10配列のバリアントは、Y147R+Q154R+Y123H；Y147R+Q154R+I76Y；Y147R+Q154R+T166R；Y147T+Q154R；Y147T+Q154S；V82S+Q154S；およびY123H + Y147R + Q154R + I76Yからなる群より選択される改変の組み合わせを含む。さらに他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼのバリアントは、2つのアデノシンデアミナーゼドメインを含むホモ二量体であり、各ドメインが、以下の改変のうちの1つ以上を有する：Y147T、Y147R、Q154S、Y123H、V82S、T166R、Q154R。
特定の実施形態において、アデノシンデアミナーゼドメインは、以下のうちの1つから選択される：
Staphylococcus aureus (S. aureus) TadA:
MGSHMTNDIYFMTLAIEEAKKAAQLGEVPIGAIITKDDEVIARAHNLRETLQQPTAH AEHIAIERAAKVLGSWRLEGCTLYVTLEPCVMCAGTIVMSRIPRVVYGADDPKGGCSGS LMNLLQQSNFNHRAIVDKGVLKEACSTLLTTFFKNLRANKKSTN
Bacillus subtilis (B. subtilis) TadA:
MTQDELYMKEAIKEAKKAEEKGEVPIGAVLVINGEIIARAHNLRETEQRSIAHAEML VIDEACKALGTWRLEGATLYVTLEPCPMCAGAVVLSRVEKVVFGAFDPKGGCSGTLMN LLQEERFNHQAEVVSGVLEEECGGMLSAFFRELRKKKKAARKNLSE
Salmonella typhimurium (S. typhimurium) TadA:
MPPAFITGVTSLSDVELDHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNHRVIGEG WNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVLQNYRLLDTTLYVTLEPCVMCAGAMVHSRIG RVVFGARDAKTGAAGSLIDVLHHPGMNHRVEIIEGVLRDECATLLSDFFRMRRQEIK ALKKADRAEGAGPAV
Shewanella putrefaciens (S. putrefaciens) TadA:
MDEYWMQVAMQMAEKAEAAGEVPVGAVLVKDGQQIATGYNLSISQHDPTAHAEI LCLRSAGKKLENYRLLDATLYITLEPCAMCAGAMVHSRIARVVYGARDEKTGAAGT VVNLLQHPAFNHQVEVTSGVLAEACSAQLSRFFKRRRDEKKALKLAQRAQQGIE
Haemophilus influenzae F3031 (H. influenzae) TadA:
MDAAKVRSEFDEKMMRYALELADKAEALGEIPVGAVLVDDARNIIGEGWNLSIVQSDPTΑΗAEIIALRNGAKNIQNYRLLNSTLYVTLEPCTMCAGAILHSRIKRLVFGASDYK TGAIGSRFHFFDDYKMNHTLEITSGVLAEECSQKLSTFFQKRREEKKIEKALLKSLSDK
Caulobacter crescentus (C. crescentus) TadA:
MRTDESEDQDHRMMRLALDAARAAAEAGETPVGAVILDPSTGEVIATAGNGPIAAH DPTAHAEIAAMRAAAAKLGNYRLTDLTLVVTLEPCAMCAGAISHARIGRVVFGADD PKGGAVVHGPKFFAQPTCHWRPEVTGGVLADESADLLRGFFRARRKAKI
Geobacter sulfurreducens (G. sulfurreducens) TadA:
MSSLKKTPIRDDAYWMGKAIREAAKAAARDEVPIGAVIVRDGAVIGRGHNLREGSN DPSAHAEMIAIRQAARRSANWRLTGATLYVTLEPCLMCMGAIILARLERVVFGCYDP KGGAAGSLYDLSADPRLNHQVRLSPGVCQEECGTMLSDFFRDLRRRKKAKATPALF IDERKVPPEP
TadA*7.10:
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD.
「投与すること」は、本明細書に記載される1以上の組成物を患者または対象に提供することとして本明細書で言及される。例として、限定するものではないが、組成物の投与、例えば注射は、静脈内 (i.v.) 注射、皮下(s.c.) 注射、皮内 (i.d.) 注射、腹腔内(i.p.) 注射又は筋肉内(i.m.) 注射によって行われ得る。1つ以上のそのような経路を用いることができる。非経口投与は、例えば、ボーラス注射によって、または経時的に徐々に灌流することによって行うことができる。あるいは、または同時に、投与は経口経路によることができる。
「薬剤（agent）」とは、任意の小分子化合物、抗体、核酸分子、またはポリペプチド、またはそれらの断片を意味する。
「改変」とは、本明細書に記載されるような標準技術の公知の方法によって検出されるような、遺伝子またはポリペプチドの発現レベルまたは活性の変化（増加または減少）を意味する。本明細書で使用される場合、改変は、発現レベルの10%の変化、25%の変化、40%の変化、50%以上の発現レベルの変化を含む。
「改善する(ameliorate)」とは、疾患の発生または進行を減少させる、抑制する、減衰させる、低減させる、停止させる、または安定させることを意味する。
「アナログ」とは、同一ではないが、類似の機能的または構造的特徴を有する分子を意味する。例えば、ポリペプチドアナログは、対応する天然ポリペプチドの生物学的活性を保持しながら、天然ポリペプチドと比較してそのアナログの機能を増強させる特定の生化学的修飾を有する。そのような生化学的修飾は、例えばリガンド結合を変化させることなく、アナログのプロテアーゼ抵抗性、膜透過性、または半減期を増加させることができる。アナログは、非天然アミノ酸を含み得る。
「塩基エディター（BE）」あるいは「核酸塩基エディター（NBE）」とは、ポリヌクレオチドに結合して核酸塩基修飾活性を有する薬剤を意味する。様々な実施形態において、塩基エディターは、核酸塩基修飾ポリペプチド（例えば、1以上のデアミナーゼ）およびポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインを、ガイドポリヌクレオチド（例えばガイドRNA）と共に含む。様々な実施形態において、該薬剤は、塩基編集活性を有するタンパク質ドメイン、すなわち、核酸分子（例えばDNA）内の塩基（例えばA、T、C、G、U）を改変することができるドメインを含む生体分子複合体である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドプログラミング可能なDNA結合ドメインは、1つ以上のデアミナーゼドメインに融合または連結される。1つの実施形態において、該薬剤は、塩基編集活性を有する1つ以上のドメインを含む融合タンパク質である。別の態様において、塩基編集活性を有するタンパク質ドメインは、ガイドRNAに連結される（例えば、ガイドRNA上のRNA結合モチーフおよびデアミナーゼに融合されたRNA結合ドメインを介して）。ある態様において、塩基編集活性を有するドメインは、核酸分子内の塩基を脱アミノ化することができる。ある態様において、塩基エディターは、DNA分子内の1つ以上の塩基を脱アミノ化することができる。ある態様において、塩基エディターは、DNA内のシトシン (C) またはアデノシン (A) を脱アミノ化することができる。ある態様において、塩基エディターは、DNA内のシトシン (C) およびアデノシン (A) を脱アミノ化することができる。ある態様において、塩基エディターは、シチジン塩基エディター (CBE) である。一部の実施形態では、塩基エディターはアデノシン塩基エディター (ABE) である。いくつかの実施形態において、塩基エディターは、アデノシン塩基エディター (ABE) およびシチジン塩基エディター (CBE) である。ある態様において、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼを含む融合タンパク質である。ある態様において、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼおよび/またはシチジンデアミナーゼに融合されたCas9タンパク質である。ある態様において、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼおよびアデノシンデアミナーゼに融合されたCas9ニッカーゼ (nCas9) である。ある態様において、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼに融合されたヌクレアーゼ不活性Cas9 (dCas9) である。いくつかの実施形態において、Cas9は、循環置換体（circular permutant）のCas9（例えばspCas9またはsaCas9）である。循環置換体Cas9は当該分野で公知であり、例えば、Oakes et al., Cell 176, 254-267, 2019に記載されている。いくつかの態様において、塩基エディターは、塩基除去修復の阻害因子、例えばUGIドメイン、またはdISNドメインに融合される。ある態様において、融合タンパク質は、デアミナーゼと、UGIまたはdISNドメインのような塩基除去修復の阻害因子に融合されたCas9ニッカーゼを含む。他の実施形態では、塩基エディターは脱塩基塩基エディターである。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadAから進化される。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラミング可能なDNA結合ドメインは、CRISPR関連(例えばCasまたはCpf1)酵素である。ある態様において、塩基エディターは、デアミナーゼドメインに融合された、触媒的には死んだCas9 (dCas9) である。ある態様において、塩基エディターは、デアミナーゼドメインに融合されたCas9ニッカーゼ(nCas9) である。ある態様において、塩基エディターは、塩基除去修復 (BER) の阻害因子に融合される。ある態様において、塩基除去修復の阻害因子は、ウラシルDNAグリコシラーゼ阻害因子 (UGI) である。ある態様において、塩基除去修復の阻害因子は、イノシン塩基除去修復阻害因子である。塩基エディターの詳細は、国際PCT出願番号PCT/2017/045381(国際公開第2018/027078号)およびPCT/US 2016/058344(国際公開第2017/070632号)に記載されており、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Komor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage” Nature 551, 464-471 (2017); Komor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017), および Rees, H.A., et al., “Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells.” Nat Rev Genet. 2018 Dec;19(12):770-788. doi: 10.1038/s41576-018-0059-1も参照のこと (その内容全体を参照により本明細書に組み込む) 。
例として、本明細書に記載の塩基編集組成物、システム、および方法において使用されるシチジン塩基エディター (CBE) は、下記の核酸配列（8877塩基対）（Addgene, Watertown, MA.; Komor AC, et al., 2017, Sci Adv., 30;3(8):eaao4774. doi: 10.1126/sciadv.aao4774）を有する。BE4核酸配列に対して少なくとも95%以上の同一性を有するポリヌクレオチド配列も包含される。
1 ATATGCCAAG TACGCCCCCT ATTGACGTCA ATGACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCATTATG
61 CCCAGTACAT GACCTTATGG GACTTTCCTA CTTGGCAGTA CATCTACGTA TTAGTCATCG
121 CTATTACCAT GGTGATGCGG TTTTGGCAGT ACATCAATGG GCGTGGATAG CGGTTTGACT
181 CACGGGGATT TCCAAGTCTC CACCCCATTG ACGTCAATGG GAGTTTGTTT TGGCACCAAA
241 ATCAACGGGA CTTTCCAAAA TGTCGTAACA ACTCCGCCCC ATTGACGCAA ATGGGCGGTA
301 GGCGTGTACG GTGGGAGGTC TATATAAGCA GAGCTGGTTT AGTGAACCGT CAGATCCGCT
361 AGAGATCCGC GGCCGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAG CCGCCACCAT GAGCTCAGAG
421 ACTGGCCCAG TGGCTGTGGA CCCCACATTG AGACGGCGGA TCGAGCCCCA TGAGTTTGAG
481 GTATTCTTCG ATCCGAGAGA GCTCCGCAAG GAGACCTGCC TGCTTTACGA AATTAATTGG
541 GGGGGCCGGC ACTCCATTTG GCGACATACA TCACAGAACA CTAACAAGCA CGTCGAAGTC
601 AACTTCATCG AGAAGTTCAC GACAGAAAGA TATTTCTGTC CGAACACAAG GTGCAGCATT
661 ACCTGGTTTC TCAGCTGGAG CCCATGCGGC GAATGTAGTA GGGCCATCAC TGAATTCCTG
721 TCAAGGTATC CCCACGTCAC TCTGTTTATT TACATCGCAA GGCTGTACCA CCACGCTGAC
781 CCCCGCAATC GACAAGGCCT GCGGGATTTG ATCTCTTCAG GTGTGACTAT CCAAATTATG
841 ACTGAGCAGG AGTCAGGATA CTGCTGGAGA AACTTTGTGA ATTATAGCCC GAGTAATGAA
901 GCCCACTGGC CTAGGTATCC CCATCTGTGG GTACGACTGT ACGTTCTTGA ACTGTACTGC
961 ATCATACTGG GCCTGCCTCC TTGTCTCAAC ATTCTGAGAA GGAAGCAGCC ACAGCTGACA
1021 TTCTTTACCA TCGCTCTTCA GTCTTGTCAT TACCAGCGAC TGCCCCCACA CATTCTCTGG
1081 GCCACCGGGT TGAAATCTGG TGGTTCTTCT GGTGGTTCTA GCGGCAGCGA GACTCCCGGG
1141 ACCTCAGAGT CCGCCACACC CGAAAGTTCT GGTGGTTCTT CTGGTGGTTC TGATAAAAAG
1201 TATTCTATTG GTTTAGCCAT CGGCACTAAT TCCGTTGGAT GGGCTGTCAT AACCGATGAA
1261 TACAAAGTAC CTTCAAAGAA ATTTAAGGTG TTGGGGAACA CAGACCGTCA TTCGATTAAA
1321 AAGAATCTTA TCGGTGCCCT CCTATTCGAT AGTGGCGAAA CGGCAGAGGC GACTCGCCTG
1381 AAACGAACCG CTCGGAGAAG GTATACACGT CGCAAGAACC GAATATGTTA CTTACAAGAA
1441 ATTTTTAGCA ATGAGATGGC CAAAGTTGAC GATTCTTTCT TTCACCGTTT GGAAGAGTCC
1501 TTCCTTGTCG AAGAGGACAA GAAACATGAA CGGCACCCCA TCTTTGGAAA CATAGTAGAT
1561 GAGGTGGCAT ATCATGAAAA GTACCCAACG ATTTATCACC TCAGAAAAAA GCTAGTTGAC
1621 TCAACTGATA AAGCGGACCT GAGGTTAATC TACTTGGCTC TTGCCCATAT GATAAAGTTC
1681 CGTGGGCACT TTCTCATTGA GGGTGATCTA AATCCGGACA ACTCGGATGT CGACAAACTG
1741 TTCATCCAGT TAGTACAAAC CTATAATCAG TTGTTTGAAG AGAACCCTAT AAATGCAAGT
1801 GGCGTGGATG CGAAGGCTAT TCTTAGCGCC CGCCTCTCTA AATCCCGACG GCTAGAAAAC
1861 CTGATCGCAC AATTACCCGG AGAGAAGAAA AATGGGTTGT TCGGTAACCT TATAGCGCTC
1921 TCACTAGGCC TGACACCAAA TTTTAAGTCG AACTTCGACT TAGCTGAAGA TGCCAAATTG
1981 CAGCTTAGTA AGGACACGTA CGATGACGAT CTCGACAATC TACTGGCACA AATTGGAGAT
2041 CAGTATGCGG ACTTATTTTT GGCTGCCAAA AACCTTAGCG ATGCAATCCT CCTATCTGAC
2101 ATACTGAGAG TTAATACTGA GATTACCAAG GCGCCGTTAT CCGCTTCAAT GATCAAAAGG
2161 TACGATGAAC ATCACCAAGA CTTGACACTT CTCAAGGCCC TAGTCCGTCA GCAACTGCCT
2221 GAGAAATATA AGGAAATATT CTTTGATCAG TCGAAAAACG GGTACGCAGG TTATATTGAC
2281 GGCGGAGCGA GTCAAGAGGA ATTCTACAAG TTTATCAAAC CCATATTAGA GAAGATGGAT
2341 GGGACGGAAG AGTTGCTTGT AAAACTCAAT CGCGAAGATC TACTGCGAAA GCAGCGGACT
2401 TTCGACAACG GTAGCATTCC ACATCAAATC CACTTAGGCG AATTGCATGC TATACTTAGA
2461 AGGCAGGAGG ATTTTTATCC GTTCCTCAAA GACAATCGTG AAAAGATTGA GAAAATCCTA
2521 ACCTTTCGCA TACCTTACTA TGTGGGACCC CTGGCCCGAG GGAACTCTCG GTTCGCATGG
2581 ATGACAAGAA AGTCCGAAGA AACGATTACT CCATGGAATT TTGAGGAAGT TGTCGATAAA
2641 GGTGCGTCAG CTCAATCGTT CATCGAGAGG ATGACCAACT TTGACAAGAA TTTACCGAAC
2701 GAAAAAGTAT TGCCTAAGCA CAGTTTACTT TACGAGTATT TCACAGTGTA CAATGAACTC
2761 ACGAAAGTTA AGTATGTCAC TGAGGGCATG CGTAAACCCG CCTTTCTAAG CGGAGAACAG
2821 AAGAAAGCAA TAGTAGATCT GTTATTCAAG ACCAACCGCA AAGTGACAGT TAAGCAATTG
2881 AAAGAGGACT ACTTTAAGAA AATTGAATGC TTCGATTCTG TCGAGATCTC CGGGGTAGAA
2941 GATCGATTTA ATGCGTCACT TGGTACGTAT CATGACCTCC TAAAGATAAT TAAAGATAAG
3001 GACTTCCTGG ATAACGAAGA GAATGAAGAT ATCTTAGAAG ATATAGTGTT GACTCTTACC
3061 CTCTTTGAAG ATCGGGAAAT GATTGAGGAA AGACTAAAAA CATACGCTCA CCTGTTCGAC
3121 GATAAGGTTA TGAAACAGTT AAAGAGGCGT CGCTATACGG GCTGGGGACG ATTGTCGCGG
3181 AAACTTATCA ACGGGATAAG AGACAAGCAA AGTGGTAAAA CTATTCTCGA TTTTCTAAAG
3241 AGCGACGGCT TCGCCAATAG GAACTTTATG CAGCTGATCC ATGATGACTC TTTAACCTTC
3301 AAAGAGGATA TACAAAAGGC ACAGGTTTCC GGACAAGGGG ACTCATTGCA CGAACATATT
3361 GCGAATCTTG CTGGTTCGCC AGCCATCAAA AAGGGCATAC TCCAGACAGT CAAAGTAGTG
3421 GATGAGCTAG TTAAGGTCAT GGGACGTCAC AAACCGGAAA ACATTGTAAT CGAGATGGCA
3481 CGCGAAAATC AAACGACTCA GAAGGGGCAA AAAAACAGTC GAGAGCGGAT GAAGAGAATA
3541 GAAGAGGGTA TTAAAGAACT GGGCAGCCAG ATCTTAAAGG AGCATCCTGT GGAAAATACC
3601 CAATTGCAGA ACGAGAAACT TTACCTCTAT TACCTACAAA ATGGAAGGGA CATGTATGTT
3661 GATCAGGAAC TGGACATAAA CCGTTTATCT GATTACGACG TCGATCACAT TGTACCCCAA
3721 TCCTTTTTGA AGGACGATTC AATCGACAAT AAAGTGCTTA CACGCTCGGA TAAGAACCGA
3781 GGGAAAAGTG ACAATGTTCC AAGCGAGGAA GTCGTAAAGA AAATGAAGAA CTATTGGCGG
3841 CAGCTCCTAA ATGCGAAACT GATAACGCAA AGAAAGTTCG ATAACTTAAC TAAAGCTGAG
3901 AGGGGTGGCT TGTCTGAACT TGACAAGGCC GGATTTATTA AACGTCAGCT CGTGGAAACC
3961 CGCCAAATCA CAAAGCATGT TGCACAGATA CTAGATTCCC GAATGAATAC GAAATACGAC
4021 GAGAACGATA AGCTGATTCG GGAAGTCAAA GTAATCACTT TAAAGTCAAA ATTGGTGTCG
4081 GACTTCAGAA AGGATTTTCA ATTCTATAAA GTTAGGGAGA TAAATAACTA CCACCATGCG
4141 CACGACGCTT ATCTTAATGC CGTCGTAGGG ACCGCACTCA TTAAGAAATA CCCGAAGCTA
4201 GAAAGTGAGT TTGTGTATGG TGATTACAAA GTTTATGACG TCCGTAAGAT GATCGCGAAA
4261 AGCGAACAGG AGATAGGCAA GGCTACAGCC AAATACTTCT TTTATTCTAA CATTATGAAT
4321 TTCTTTAAGA CGGAAATCAC TCTGGCAAAC GGAGAGATAC GCAAACGACC TTTAATTGAA
4381 ACCAATGGGG AGACAGGTGA AATCGTATGG GATAAGGGCC GGGACTTCGC GACGGTGAGA
4441 AAAGTTTTGT CCATGCCCCA AGTCAACATA GTAAAGAAAA CTGAGGTGCA GACCGGAGGG
4501 TTTTCAAAGG AATCGATTCT TCCAAAAAGG AATAGTGATA AGCTCATCGC TCGTAAAAAG
4561 GACTGGGACC CGAAAAAGTA CGGTGGCTTC GATAGCCCTA CAGTTGCCTA TTCTGTCCTA
4621 GTAGTGGCAA AAGTTGAGAA GGGAAAATCC AAGAAACTGA AGTCAGTCAA AGAATTATTG
4681 GGGATAACGA TTATGGAGCG CTCGTCTTTT GAAAAGAACC CCATCGACTT CCTTGAGGCG
4741 AAAGGTTACA AGGAAGTAAA AAAGGATCTC ATAATTAAAC TACCAAAGTA TAGTCTGTTT
4801 GAGTTAGAAA ATGGCCGAAA ACGGATGTTG GCTAGCGCCG GAGAGCTTCA AAAGGGGAAC
4861 GAACTCGCAC TACCGTCTAA ATACGTGAAT TTCCTGTATT TAGCGTCCCA TTACGAGAAG
4921 TTGAAAGGTT CACCTGAAGA TAACGAACAG AAGCAACTTT TTGTTGAGCA GCACAAACAT
4981 TATCTCGACG AAATCATAGA GCAAATTTCG GAATTCAGTA AGAGAGTCAT CCTAGCTGAT
5041 GCCAATCTGG ACAAAGTATT AAGCGCATAC AACAAGCACA GGGATAAACC CATACGTGAG
5101 CAGGCGGAAA ATATTATCCA TTTGTTTACT CTTACCAACC TCGGCGCTCC AGCCGCATTC
5161 AAGTATTTTG ACACAACGAT AGATCGCAAA CGATACACTT CTACCAAGGA GGTGCTAGAC
5221 GCGACACTGA TTCACCAATC CATCACGGGA TTATATGAAA CTCGGATAGA TTTGTCACAG
5281 CTTGGGGGTG ACTCTGGTGG TTCTGGAGGA TCTGGTGGTT CTACTAATCT GTCAGATATT
5341 ATTGAAAAGG AGACCGGTAA GCAACTGGTT ATCCAGGAAT CCATCCTCAT GCTCCCAGAG
5401 GAGGTGGAAG AAGTCATTGG GAACAAGCCG GAAAGCGATA TACTCGTGCA CACCGCCTAC
5461 GACGAGAGCA CCGACGAGAA TGTCATGCTT CTGACTAGCG ACGCCCCTGA ATACAAGCCT
5521 TGGGCTCTGG TCATACAGGA TAGCAACGGT GAGAACAAGA TTAAGATGCT CTCTGGTGGT
5581 TCTGGAGGAT CTGGTGGTTC TACTAATCTG TCAGATATTA TTGAAAAGGA GACCGGTAAG
5641 CAACTGGTTA TCCAGGAATC CATCCTCATG CTCCCAGAGG AGGTGGAAGA AGTCATTGGG
5701 AACAAGCCGG AAAGCGATAT ACTCGTGCAC ACCGCCTACG ACGAGAGCAC CGACGAGAAT
5761 GTCATGCTTC TGACTAGCGA CGCCCCTGAA TACAAGCCTT GGGCTCTGGT CATACAGGAT
5821 AGCAACGGTG AGAACAAGAT TAAGATGCTC TCTGGTGGTT CTCCCAAGAA GAAGAGGAAA
5881 GTCTAACCGG TCATCATCAC CATCACCATT GAGTTTAAAC CCGCTGATCA GCCTCGACTG
5941 TGCCTTCTAG TTGCCAGCCA TCTGTTGTTT GCCCCTCCCC CGTGCCTTCC TTGACCCTGG
6001 AAGGTGCCAC TCCCACTGTC CTTTCCTAAT AAAATGAGGA AATTGCATCG CATTGTCTGA
6061 GTAGGTGTCA TTCTATTCTG GGGGGTGGGG TGGGGCAGGA CAGCAAGGGG GAGGATTGGG
6121 AAGACAATAG CAGGCATGCT GGGGATGCGG TGGGCTCTAT GGCTTCTGAG GCGGAAAGAA
6181 CCAGCTGGGG CTCGATACCG TCGACCTCTA GCTAGAGCTT GGCGTAATCA TGGTCATAGC
6241 TGTTTCCTGT GTGAAATTGT TATCCGCTCA CAATTCCACA CAACATACGA GCCGGAAGCA
6301 TAAAGTGTAA AGCCTAGGGT GCCTAATGAG TGAGCTAACT CACATTAATT GCGTTGCGCT
6361 CACTGCCCGC TTTCCAGTCG GGAAACCTGT CGTGCCAGCT GCATTAATGA ATCGGCCAAC
6421 GCGCGGGGAG AGGCGGTTTG CGTATTGGGC GCTCTTCCGC TTCCTCGCTC ACTGACTCGC
6481 TGCGCTCGGT CGTTCGGCTG CGGCGAGCGG TATCAGCTCA CTCAAAGGCG GTAATACGGT
6541 TATCCACAGA ATCAGGGGAT AACGCAGGAA AGAACATGTG AGCAAAAGGC CAGCAAAAGG
6601 CCAGGAACCG TAAAAAGGCC GCGTTGCTGG CGTTTTTCCA TAGGCTCCGC CCCCCTGACG
6661 AGCATCACAA AAATCGACGC TCAAGTCAGA GGTGGCGAAA CCCGACAGGA CTATAAAGAT
6721 ACCAGGCGTT TCCCCCTGGA AGCTCCCTCG TGCGCTCTCC TGTTCCGACC CTGCCGCTTA
6781 CCGGATACCT GTCCGCCTTT CTCCCTTCGG GAAGCGTGGC GCTTTCTCAT AGCTCACGCT
6841 GTAGGTATCT CAGTTCGGTG TAGGTCGTTC GCTCCAAGCT GGGCTGTGTG CACGAACCCC
6901 CCGTTCAGCC CGACCGCTGC GCCTTATCCG GTAACTATCG TCTTGAGTCC AACCCGGTAA
6961 GACACGACTT ATCGCCACTG GCAGCAGCCA CTGGTAACAG GATTAGCAGA GCGAGGTATG
7021 TAGGCGGTGC TACAGAGTTC TTGAAGTGGT GGCCTAACTA CGGCTACACT AGAAGAACAG
7081 TATTTGGTAT CTGCGCTCTG CTGAAGCCAG TTACCTTCGG AAAAAGAGTT GGTAGCTCTT
7141 GATCCGGCAA ACAAACCACC GCTGGTAGCG GTGGTTTTTT TGTTTGCAAG CAGCAGATTA
7201 CGCGCAGAAA AAAAGGATCT CAAGAAGATC CTTTGATCTT TTCTACGGGG TCTGACGCTC
7261 AGTGGAACGA AAACTCACGT TAAGGGATTT TGGTCATGAG ATTATCAAAA AGGATCTTCA
7321 CCTAGATCCT TTTAAATTAA AAATGAAGTT TTAAATCAAT CTAAAGTATA TATGAGTAAA
7381 CTTGGTCTGA CAGTTACCAA TGCTTAATCA GTGAGGCACC TATCTCAGCG ATCTGTCTAT
7441 TTCGTTCATC CATAGTTGCC TGACTCCCCG TCGTGTAGAT AACTACGATA CGGGAGGGCT
7501 TACCATCTGG CCCCAGTGCT GCAATGATAC CGCGAGACCC ACGCTCACCG GCTCCAGATT
7561 TATCAGCAAT AAACCAGCCA GCCGGAAGGG CCGAGCGCAG AAGTGGTCCT GCAACTTTAT
7621 CCGCCTCCAT CCAGTCTATT AATTGTTGCC GGGAAGCTAG AGTAAGTAGT TCGCCAGTTA
7681 ATAGTTTGCG CAACGTTGTT GCCATTGCTA CAGGCATCGT GGTGTCACGC TCGTCGTTTG
7741 GTATGGCTTC ATTCAGCTCC GGTTCCCAAC GATCAAGGCG AGTTACATGA TCCCCCATGT
7801 TGTGCAAAAA AGCGGTTAGC TCCTTCGGTC CTCCGATCGT TGTCAGAAGT AAGTTGGCCG
7861 CAGTGTTATC ACTCATGGTT ATGGCAGCAC TGCATAATTC TCTTACTGTC ATGCCATCCG
7921 TAAGATGCTT TTCTGTGACT GGTGAGTACT CAACCAAGTC ATTCTGAGAA TAGTGTATGC
7981 GGCGACCGAG TTGCTCTTGC CCGGCGTCAA TACGGGATAA TACCGCGCCA CATAGCAGAA
8041 CTTTAAAAGT GCTCATCATT GGAAAACGTT CTTCGGGGCG AAAACTCTCA AGGATCTTAC
8101 CGCTGTTGAG ATCCAGTTCG ATGTAACCCA CTCGTGCACC CAACTGATCT TCAGCATCTT
8161 TTACTTTCAC CAGCGTTTCT GGGTGAGCAA AAACAGGAAG GCAAAATGCC GCAAAAAAGG
8221 GAATAAGGGC GACACGGAAA TGTTGAATAC TCATACTCTT CCTTTTTCAA TATTATTGAA
8281 GCATTTATCA GGGTTATTGT CTCATGAGCG GATACATATT TGAATGTATT TAGAAAAATA
8341 AACAAATAGG GGTTCCGCGC ACATTTCCCC GAAAAGTGCC ACCTGACGTC GACGGATCGG
8401 GAGATCGATC TCCCGATCCC CTAGGGTCGA CTCTCAGTAC AATCTGCTCT GATGCCGCAT
8461 AGTTAAGCCA GTATCTGCTC CCTGCTTGTG TGTTGGAGGT CGCTGAGTAG TGCGCGAGCA
8521 AAATTTAAGC TACAACAAGG CAAGGCTTGA CCGACAATTG CATGAAGAAT CTGCTTAGGG
8581 TTAGGCGTTT TGCGCTGCTT CGCGATGTAC GGGCCAGATA TACGCGTTGA CATTGATTAT
8641 TGACTAGTTA TTAATAGTAA TCAATTACGG GGTCATTAGT TCATAGCCCA TATATGGAGT
8701 TCCGCGTTAC ATAACTTACG GTAAATGGCC CGCCTGGCTG ACCGCCCAAC GACCCCCGCC
8761 CATTGACGTC AATAATGACG TATGTTCCCA TAGTAACGCC AATAGGGACT TTCCATTGAC
8821 GTCAATGGGT GGAGTATTTA CGGTAAACTG CCCACTTGGC AGTACATCAA GTGTATC
ある態様において、シチジン塩基エディターは、以下のうちの1つから選択される核酸配列を有するBE4である：
元のBE4核酸配列:
ATGagctcagagactggcccagtggctgtggaccccacattgagacggcggatcgagccccatgagtttgaggtattcttcgatccgagagagctccgcaaggagacctgcctgctttacgaaattaattgggggggccggcactccatttggcgacatacatcacagaacactaacaagcacgtcgaagtcaacttcatcgagaagttcacgacagaaagatatttctgtccgaacacaaggtgcagcattacctggtttctcagctggagccgcgaatgtagtagggccatcactgaattcctgtcaaggtatccccacgtcactctgtttatttacatcgcaaggctgtaccaccacgctgacccccgcaatcgacaaggcctgcgggatttgatctcttcaggtgtgactatccaaattatgactgagcaggagtcaggatactgctggagaaactttgtgaattatagcccgagtaatgaagcccactggcctaggtatccccatctgtgggtacgactgtacgttcttgaactgtactgcatcatactgggcctgcctccttgtctcaacattctgagaaggaagcagccacagctgacattctttaccatcgctcttcagtcttgtcattaccagcgactgcccccacacattctctgggccaccgggttgaaatctggtggttcttctggtggttctagcggcagcgagactcccgggacctcagagtccgccacacccgaaagttctggtggttcttctggtggttctgataaaaagtattctattggtttagccatcggcactaattccgttggatgggctgtcataaccgatgaatacaaagtaccttcaaagaaatttaaggtgttggggaacacagaccgtcattcgattaaaaagaatcttatcggtgccctcctattcgatagtggcgaaacggcagaggcgactcgcctgaaacgaaccgctcggagaaggtatacacgtcgcaagaaccgaatatgttacttacaagaaatttttagcaatgagatggccaaagttgacgattctttctttcaccgtttggaagagtccttccttgtcgaagaggacaagaaacatgaacggcaccccatctttggaaacatagtagatgaggtggcatatcatgaaaagtacccaacgatttatcacctcagaaaaaagctagttgactcaactgataaagcggacctgaggttaatctacttggctcttgcccatatgataaagttccgtgggcactttctcattgagggtgatctaaatccggacaactcggatgtcgacaaactgttcatccagttagtacaaacctataatcagttgtttgaagagaaccctataaatgcaagtggcgtggatgcgaaggctattcttagcgcccgcctctctaaatcccgacggctagaaaacctgatcgcacaattacccggagagaagaaaaatgggttgttcggtaaccttatagcgctctcactaggcctgacaccaaattttaagtcgaacttcgacttagctgaagatgccaaattgcagcttagtaaggacacgtacgatgacgatctcgacaatctactggcacaaattggagatcagtatgcggacttatttttggctgccaaaaaccttagcgatgcaatcctcctatctgacatactgagagttaatactgagattaccaaggcgccgttatccgcttcaatgatcaaaaggtacgatgaacatcaccaagacttgacacttctcaaggccctagtccgtcagcaactgcctgagaaatataaggaaatattctttgatcagtcgaaaaacgggtacgcaggttatattgacggcggagcgagtcaagaggaattctacaagtttatcaaacccatattagagaagatggatgggacggaagagttgcttgtaaaactcaatcgcgaagatctactgcgaaagcagcggactttcgacaacggtagcattccacatcaaatccacttaggcgaattgcatgctatacttagaaggcaggaggatttttatccgttcctcaaagacaatcgtgaaaagattgagaaaatcctaacctttcgcataccttactatgtgggacccctggcccgagggaactctcggttcgcatggatgacaagaaagtccgaagaaacgattactccatggaattttgaggaagttgtcgataaaggtgcgtcagctcaatcgttcatcgagaggatgaccaactttgacaagaatttaccgaacgaaaaagtattgcctaagcacagtttactttacgagtatttcacagtgtacaatgaactcacgaaagttaagtatgtcactgagggcatgcgtaaacccgcctttctaagcggagaacagaagaaagcaatagtagatctgttattcaagaccaaccgcaaagtgacagttaagcaattgaaagaggactactttaagaaaattgaatgcttcgattctgtcgagatctccggggtagaagatcgatttaatgcgtcacttggtacgtatcatgacctcctaaagataattaaagataaggacttcctggataacgaagagaatgaagatatcttagaagatatagtgttgactcttaccctctttgaagatcgggaaatgattgaggaaagactaaaaacatacgctcacctgttcgacgataaggttatgaaacagttaaagaggcgtcgctatacgggctggggacgattgtcgcggaaacttatcaacgggataagagacaagcaaagtggtaaaactattctcgattttctaaagagcgacggcttcgccaataggaactttatgcagctgatccatgatgactctttaaccttcaaagaggatatacaaaaggcacaggtttccggacaaggggactcattgcacgaacatattgcgaatcttgctggttcgccagccatcaaaaagggcatactccagacagtcaaagtagtggatgagctagttaaggtcatgggacgtcacaaaccggaaaacattgtaatcgagatggcacgcgaaaatcaaacgactcagaaggggcaaaaaaacagtcgagagcggatgaagagaatagaagagggtattaaagaactgggcagccagatcttaaaggagcatcctgtggaaaatacccaattgcagaacgagaaactttacctctattacctacaaaatggaagggacatgtatgttgatcaggaactggacataaaccgtttatctgattacgacgtcgatcacattgtaccccaatcctttttgaaggacgattcaatcgacaataaagtgcttacacgctcggataagaaccgagggaaaagtgacaatgttccaagcgaggaagtcgtaaagaaaatgaagaactattggcggcagctcctaaatgcgaaactgataacgcaaagaaagttcgataacttaactaaagctgagaggggtggcttgtctgaacttgacaaggccggatttattaaacgtcagctcgtggaaacccgccaaatcacaaagcatgttgcacagatactagattcccgaatgaatacgaaatacgacgagaacgataagctgattcgggaagtcaaagtaatcactttaaagtcaaaattggtgtcggacttcagaaaggattttcaattctataaagttagggagataaataactaccaccatgcgcacgacgcttatcttaatgccgtcgtagggaccgcactcattaagaaatacccgaagctagaaagtgagtttgtgtatggtgattacaaagtttatgacgtccgtaagatgatcgcgaaaagcgaacaggagataggcaaggctacagccaaatacttcttttattctaacattatgaatttctttaagacggaaatcactctggcaaacggagagatacgcaaacgacctttaattgaaaccaatggggagacaggtgaaatcgtatgggataagggccgggacttcgcgacggtgagaaaagttttgtccatgccccaagtcaacatagtaaagaaaactgaggtgcagaccggagggttttcaaaggaatcgattcttccaaaaaggaatagtgataagctcatcgctcgtaaaaaggactgggacccgaaaaagtacggtggcttcgatagccctacagttgcctattctgtcctagtagtggcaaaagttgagaagggaaaatccaagaaactgaagtcagtcaaagaattattggggataacgattatggagcgctcgtcttttgaaaagaaccccatcgacttccttgaggcgaaaggttacaaggaagtaaaaaaggatctcataattaaactaccaaagtatagtctgtttgagttagaaaatggccgaaaacggatgttggctagcgccggagagcttcaaaaggggaacgaactcgcactaccgtctaaatacgtgaatttcctgtatttagcgtcccattacgagaagttgaaaggttcacctgaagataacgaacagaagcaactttttgttgagcagcacaaacattatctcgacgaaatcatagagcaaatttcggaattcagtaagagagtcatcctagctgatgccaatctggacaaagtattaagcgcatacaacaagcacagggataaacccatacgtgagcaggcggaaaatattatccatttgtttactcttaccaacctcggcgctccagccgcattcaagtattttgacacaacgatagatcgcaaacgatacacttctaccaaggaggtgctagacgcgacactgattcaccaatccatcacgggattatatgaaactcggatagatttgtcacagcttgggggtgactctggtggttctggaggatctggtggttctactaatctgtcagatattattgaaaaggagaccggtaagcaactggttatccaggaatccatcctcatgctcccagaggaggtggaagaagtcattgggaacaagccggaaagcgatatactcgtgcacaccgcctacgacgagagcaccgacgagaatgtcatgcttctgactagcgacgcccctgaatacaagccttgggctctggtcatacaggatagcaacggtgagaacaagattaagatgctctctggtggttctggaggatctggtggttctactaatctgtcagatattattgaaaaggagaccggtaagcaactggttatccaggaatccatcctcatgctcccagaggaggtggaagaagtcattgggaacaagccggaaagcgatatactcgtgcacaccgcctacgacgagagcaccgacgagaatgtcatgcttctgactagcgacgcccctgaatacaagccttgggctctggtcatacaggatagcaacggtgagaacaagattaagatgctctctggtggttctAAAAGGACGGCGGACGGATCAGAGTTCGAGAGTCCGAAAAAAAAACGAAAGGTCGAAtaa
BE4コドン最適化1核酸配列:
ATGTCATCCGAAACCGGGCCAGTGGCCGTAGACCCAACACTCAGGAGGCGGATAGAACCCCATGAGTTTGAAGTGTTCTTCGACCCCAGAGAGCTGCGCAAAGAGACTTGCCTCCTGTATGAAATAAATTGGGGGGGTCGCCATTCAATTTGGAGGCACACTAGCCAGAATACTAACAAACACGTGGAGGTAAATTTTATCGAGAAGTTTACCACCGAAAGATACTTTTGCCCCAATACACGGTGTTCAATTACCTGGTTTCTGTCATGGAGTCCATGTGGAGAATGTAGTAGAGCGATAACTGAGTTCCTGTCTCGATATCCTCACGTCACGTTGTTTATATACATCGCTCGGCTTTATCACCATGCGGACCCGCGGAACAGGCAAGGTCTTCGGGACCTCATATCCTCTGGGGTGACCATCCAGATAATGACGGAGCAAGAGAGCGGATACTGCTGGCGAAACTTTGTTAACTACAGCCCAAGCAATGAGGCACACTGGCCTAGATATCCGCATCTCTGGGTTCGACTGTATGTCCTTGAACTGTACTGCATAATTCTGGGACTTCCGCCATGCTTGAACATTCTGCGGCGGAAACAACCACAGCTGACCTTTTTCACGATTGCTCTCCAAAGTTGTCACTACCAGCGATTGCCACCCCACATCTTGTGGGCTACTGGACTCAAGTCTGGAGGAAGTTCAGGCGGAAGCAGCGGGTCTGAAACGCCCGGAACCTCAGAGAGCGCAACGCCCGAAAGCTCTGGAGGGTCAAGTGGTGGTAGTGATAAGAAATACTCCATCGGCCTCGCCATCGGTACGAATTCTGTCGGTTGGGCCGTTATCACCGATGAGTACAAGGTCCCTTCTAAGAAATTCAAGGTTTTGGGCAATACAGACCGCCATTCTATAAAAAAAAACCTGATCGGCGCCCTTTTGTTTGACAGTGGTGAGACTGCTGAAGCGACTCGCCTGAAGCGAACTGCCAGGAGGCGGTATACGAGGCGAAAAAACCGAATTTGTTACCTCCAGGAGATTTTCTCAAATGAAATGGCCAAGGTAGATGATAGTTTTTTTCACCGCTTGGAAGAAAGTTTTCTCGTTGAGGAGGACAAAAAGCACGAGAGGCACCCAATCTTTGGCAACATAGTCGATGAGGTCGCATACCATGAGAAATATCCTACGATCTATCATCTCCGCAAGAAGCTGGTCGATAGCACGGATAAAGCTGACCTCCGGCTGATCTACCTTGCTCTTGCTCACATGATTAAATTCAGGGGCCATTTCCTGATAGAAGGAGACCTCAATCCCGACAATTCTGATGTCGACAAACTGTTTATTCAGCTCGTTCAGACCTATAATCAACTCTTTGAGGAGAACCCCATCAATGCTTCAGGGGTGGACGCAAAGGCCATTTTGTCCGCGCGCTTGAGTAAATCACGACGCCTCGAGAATTTGATAGCTCAACTGCCGGGTGAGAAGAAAAACGGGTTGTTTGGGAATCTCATAGCGTTGAGTTTGGGACTTACGCCAAACTTTAAGTCTAACTTTGATTTGGCCGAAGATGCCAAATTGCAGCTGTCCAAAGATACCTATGATGACGACTTGGATAACCTTCTTGCGCAGATTGGTGACCAATACGCGGATCTGTTTCTTGCCGCAAAAAATCTGTCCGACGCCATACTCTTGTCCGATATACTGCGCGTCAATACTGAGATAACTAAGGCTCCCCTCAGCGCGTCCATGATTAAAAGATACGATGAGCACCACCAAGATCTCACTCTGTTGAAAGCCCTGGTTCGCCAGCAGCTTCCAGAGAAGTATAAGGAGATATTTTTCGACCAATCTAAAAACGGCTATGCGGGTTACATTGACGGTGGCGCCTCTCAAGAAGAATTCTACAAGTTTATAAAGCCGATACTTGAGAAAATGGACGGTACAGAGGAATTGTTGGTTAAGCTCAATCGCGAGGACTTGTTGAGAAAGCAGCGCACATTTGACAATGGTAGTATTCCACACCAGATTCATCTGGGCGAGTTGCATGCCATTCTTAGAAGACAAGAAGATTTTTATCCGTTTCTGAAAGATAACAGAGAAAAGATTGAAAAGATACTTACCTTTCGCATACCGTATTATGTAGGTCCCCTGGCTAGAGGGAACAGTCGCTTCGCTTGGATGACTCGAAAATCAGAAGAAACAATAACCCCCTGGAATTTTGAAGAAGTGGTAGATAAAGGTGCGAGTGCCCAATCTTTTATTGAGCGGATGACAAATTTTGACAAGAATCTGCCTAACGAAAAGGTGCTTCCCAAGCATTCCCTTTTGTATGAATACTTTACAGTATATAATGAACTGACTAAAGTGAAGTACGTTACCGAGGGGATGCGAAAGCCAGCTTTTCTCAGTGGCGAGCAGAAAAAAGCAATAGTTGACCTGCTGTTCAAGACGAATAGGAAGGTTACCGTCAAACAGCTCAAAGAAGATTACTTTAAAAAGATCGAATGTTTTGATTCAGTTGAGATAAGCGGAGTAGAGGATAGATTTAACGCAAGTCTTGGAACTTATCATGACCTTTTGAAGATCATCAAGGATAAAGATTTTTTGGACAACGAGGAGAATGAAGATATCCTGGAAGATATAGTACTTACCTTGACGCTTTTTGAAGATCGAGAGATGATCGAGGAGCGACTTAAGACGTACGCACATCTCTTTGACGATAAGGTTATGAAACAATTGAAACGCCGGCGGTATACTGGCTGGGGCAGGCTTTCTCGAAAGCTGATTAATGGTATCCGCGATAAGCAGTCTGGAAAGACAATCCTTGACTTTCTGAAAAGTGATGGATTTGCAAATAGAAACTTTATGCAGCTTATACATGATGACTCTTTGACGTTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTATCCGGCCAAGGGGATAGCCTCCATGAACACATAGCCAACCTGGCCGGCTCACCAGCTATTAAAAAGGGAATATTGCAAACCGTTAAGGTTGTTGACGAACTCGTTAAGGTTATGGGCCGACACAAACCAGAGAATATCGTGATTGAGATGGCTAGGGAGAATCAGACCACTCAAAAAGGTCAGAAAAATTCTCGCGAAAGGATGAAGCGAATTGAAGAGGGAATCAAAGAACTTGGCTCTCAAATTTTGAAAGAGCACCCGGTAGAAAACACTCAGCTGCAGAATGAAAAGCTGTATCTGTATTATCTGCAGAATGGTCGAGATATGTACGTTGATCAGGAGCTGGATATCAATAGGCTCAGTGACTACGATGTCGACCACATCGTTCCTCAATCTTTCCTGAAAGATGACTCTATCGACAACAAAGTGTTGACGCGATCAGATAAGAACCGGGGAAAATCCGACAATGTACCCTCAGAAGAAGTTGTCAAGAAGATGAAAAACTATTGGAGACAATTGCTGAACGCCAAGCTCATAACACAACGCAAGTTCGATAACTTGACGAAAGCCGAAAGAGGTGGGTTGTCAGAATTGGACAAAGCTGGCTTTATTAAGCGCCAATTGGTGGAGACCCGGCAGATTACGAAACACGTAGCACAAATTTTGGATTCACGAATGAATACCAAATACGACGAAAACGACAAATTGATACGCGAGGTGAAAGTGATTACGCTTAAGAGTAAGTTGGTTTCCGATTTCAGGAAGGATTTTCAGTTTTACAAAGTAAGAGAAATAAACAACTACCACCACGCCCATGATGCTTACCTCAACGCGGTAGTTGGCACAGCTCTTATCAAAAAATATCCAAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTTTACGGTGACTATAAAGTATACGACGTTCGGAAGATGATAGCCAAATCAGAGCAGGAAATTGGGAAGGCAACCGCAAAATACTTCTTCTATTCAAACATCATGAACTTCTTTAAGACGGAGATTACGCTCGCGAACGGCGAAATACGCAAGAGGCCCCTCATAGAGACTAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTATGGGACAAAGGACGGGACTTTGCGACCGTTAGAAAAGTACTTTCAATGCCACAAGTGAATATTGTTAAAAAGACAGAAGTACAAACAGGGGGGTTCAGTAAGGAATCCATTTTGCCCAAGCGGAACAGTGATAAATTGATAGCAAGGAAAAAAGATTGGGACCCTAAGAAGTACGGTGGTTTCGACTCTCCTACCGTTGCATATTCAGTCCTTGTAGTTGCGAAAGTGGAAAAGGGGAAAAGTAAGAAGCTTAAGAGTGTTAAAGAGCTTCTGGGCATAACCATAATGGAACGGTCTAGCTTCGAGAAAAATCCAATTGACTTTCTCGAGGCTAAAGGTTACAAGGAGGTAAAAAAGGACCTGATAATTAAACTCCCAAAGTACAGTCTCTTCGAGTTGGAGAATGGGAGGAAGAGAATGTTGGCATCTGCAGGGGAGCTCCAAAAGGGGAACGAGCTGGCTCTGCCTTCAAAATACGTGAACTTTCTGTACCTGGCCAGCCACTACGAGAAACTCAAGGGTTCTCCTGAGGATAACGAGCAGAAACAGCTGTTTGTAGAGCAGCACAAGCATTACCTGGACGAGATAATTGAGCAAATTAGTGAGTTCTCAAAAAGAGTAATCCTTGCAGACGCGAATCTGGATAAAGTTCTTTCCGCCTATAATAAGCACCGGGACAAGCCTATACGAGAACAAGCCGAGAACATCATTCACCTCTTTACCCTTACTAATCTGGGCGCGCCGGCCGCCTTCAAATACTTCGACACCACGATAGACAGGAAAAGGTATACGAGTACCAAAGAAGTACTTGACGCCACTCTCATCCACCAGTCTATAACAGGGTTGTACGAAACGAGGATAGATTTGTCCCAGCTCGGCGGCGACTCAGGAGGGTCAGGCGGCTCCGGTGGATCAACGAATCTTTCCGACATAATCGAGAAAGAAACCGGCAAACAGTTGGTGATCCAAGAATCAATCCTGATGCTGCCTGAAGAAGTAGAAGAGGTGATTGGCAACAAACCTGAGTCTGACATTCTTGTCCACACCGCGTATGACGAGAGCACGGACGAGAACGTTATGCTTCTCACTAGCGACGCCCCTGAGTATAAACCATGGGCGCTGGTCATCCAAGATTCCAATGGGGAAAACAAGATTAAGATGCTTAGTGGTGGGTCTGGAGGGAGCGGTGGGTCCACGAACCTCAGCGACATTATTGAAAAAGAGACTGGTAAACAACTTGTAATACAAGAGTCTATTCTGATGTTGCCTGAAGAGGTGGAGGAGGTGATTGGGAACAAACCGGAGTCTGATATACTTGTTCATACCGCCTATGACGAATCTACTGATGAGAATGTGATGCTTTTaACGTCAGACGCTCCCGAGTACAAACCCTGGGCTCTGGTGATTCAGGACAGCAATGGTGAGAATAAGATTAAAATGTTGAGTGGGGGCTCAAAGCGCACGGCTGACGGTAGCGAATTTGAGAGCCCCAAAAAAAAACGAAAGGTCGAAtaa
BE4コドン最適化2核酸配列:
ATGAGCAGCGAGACAGGCCCTGTGGCTGTGGATCCTACACTGCGGAGAAGAATCGAGCCCCACGAGTTCGAGGTGTTCTTCGACCCCAGAGAGCTGCGGAAAGAGACATGCCTGCTGTACGAGATCAACTGGGGCGGCAGACACTCTATCTGGCGGCACACAAGCCAGAACACCAACAAGCACGTGGAAGTGAACTTTATCGAGAAGTTTACGACCGAGCGGTACTTCTGCCCCAACACCAGATGCAGCATCACCTGGTTTCTGAGCTGGTCCCCTTGCGGCGAGTGCAGCAGAGCCATCACCGAGTTTCTGTCCAGATATCCCCACGTGACCCTGTTCATCTATATCGCCCGGCTGTACCACCACGCCGATCCTAGAAATAGACAGGGACTGCGCGACCTGATCAGCAGCGGAGTGACCATCCAGATCATGACCGAGCAAGAGAGCGGCTACTGCTGGCGGAACTTCGTGAACTACAGCCCCAGCAACGAAGCCCACTGGCCTAGATATCCTCACCTGTGGGTCCGACTGTACGTGCTGGAACTGTACTGCATCATCCTGGGCCTGCCTCCATGCCTGAACATCCTGAGAAGAAAGCAGCCTCAGCTGACCTTCTTCACAATCGCCCTGCAGAGCTGCCACTACCAGAGACTGCCTCCACACATCCTGTGGGCCACCGGACTTAAGAGCGGAGGATCTAGCGGCGGCTCTAGCGGATCTGAGACACCTGGCACAAGCGAGTCTGCCACACCTGAGAGTAGCGGCGGATCTTCTGGCGGCTCCGACAAGAAGTACTCTATCGGACTGGCCATCGGCACCAACTCTGTTGGATGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAATCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACTCTGGCGAAACAGCCGAAGCCACCAGACTGAAGAGAACCGCCAGGCGGAGATACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGATGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGAGACTGATCTACCTGGCTCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTTCTGATCGAGGGCGATCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCTCTGGCGTGGACGCCAAGGCTATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGAAGGCTGGAAAACCTGATCGCCCAGCTGCCTGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGACTGACCCCTAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCGATCAGTACGCCGACTTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGATATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACAAAGGCCCCTCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGATCTGACCCTGCTGAAGGCCCTCGTTAGACAGCAGCTGCCAGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGATCAGTCCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGATGGCGGAGCCAGCCAAGAGGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAATGGCTCTATCCCTCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGAGACAAGAGGACTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCAGGATCCCCTACTACGTGGGACCACTGGCCAGAGGCAATAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACACCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCTCAGTCCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCTAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACTCCCTGCTGTATGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTTCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATTGTGGATCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACAGCGTGGAAATCAGCGGCGTGGAAGATCGGTTCAATGCCAGCCTGGGCACATACCACGACCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAGAACGAGGACATTCTCGAGGACATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACATACGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAACTGAAGCGGAGGCGGTACACAGGCTGGGGCAGACTGTCTCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGATAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAAGGCGATTCTCTGCACGAGCACATTGCCAACCTGGCCGGATCTCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTTGTGAAAGTGATGGGCAGACACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACACAGAAGGGCCAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGACGGGATATGTACGTGGACCAAGAGCTGGACATCAACCGGCTGAGCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCCCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGATAACAAGGTCCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGATAACGTGCCCTCCGAAGAGGTGGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGACAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGCGGAAGTTCGATAACCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTTGATAAGGCCGGCTTCATTAAGCGGCAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACCAAACACGTGGCACAGATTCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTCATCACCCTGAAGTCTAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTCTACAAAGTGCGGGAAATCAACAACTACCATCACGCCCACGACGCCTACCTGAATGCCGTTGTTGGAACAGCCCTGATCAAGAAGTATCCCAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAACAAGAGATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTTTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACAGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAAAGACCCCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCAGAGATTTTGCCACAGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAGAAAACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCTAAGCGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGATAGCCCTACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAAAAGCTCAAGAGCGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTTGAGAAGAACCCGATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTCAAGAAGGACCTCATCATCAAGCTCCCCAAGTACAGCCTGTTCGAGCTGGAAAATGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCTCAGCAGGCGAACTGCAGAAAGGCAATGAACTGGCCCTGCCTAGCAAATACGTCAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAATGAGCAAAAGCAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAACCTGGATAAGGTGCTGTCTGCCTATAACAAGCACCGGGACAAGCCTATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAACCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACACTGATCCACCAGTCTATCACCGGCCTGTACGAAACCCGGATCGACCTGTCTCAGCTCGGCGGCGATTCTGGTGGTTCTGGCGGAAGTGGCGGATCCACCAATCTGAGCGACATCATCGAAAAAGAGACAGGCAAGCAGCTCGTGATCCAAGAATCCATCCTGATGCTGCCTGAAGAGGTTGAGGAAGTGATCGGCAACAAGCCTGAGTCCGACATCCTGGTGCACACCGCCTACGATGAGAGCACCGATGAGAACGTCATGCTGCTGACAAGCGACGCCCCTGAGTACAAGCCTTGGGCTCTCGTGATTCAGGACAGCAATGGGGAGAACAAGATCAAGATGCTGAGCGGAGGTAGCGGAGGCAGTGGCGGAAGCACAAACCTGTCTGATATCATTGAAAAAGAAACCGGGAAGCAACTGGTCATTCAAGAGTCCATTCTCATGCTCCCGGAAGAAGTCGAGGAAGTCATTGGAAACAAACCCGAGAGCGATATTCTGGTCCACACAGCCTATGACGAGTCTACAGACGAAAACGTGATGCTCCTGACCTCTGACGCTCCCGAGTATAAGCCCTGGGCACTTGTTATCCAGGACTCTAACGGGGAAAACAAAATCAAAATGTTGTCCGGCGGCAGCAAGCGGACAGCCGATGGATCTGAGTTCGAGAGCCCCAAGAAGAAACGGAAGGTgGAGtaa
「塩基編集活性」とは、ポリヌクレオチド内の塩基を化学的に改変させるように作用することを意味する。一実施形態では、第1の塩基が第2の塩基に変換される。一実施形態では、塩基編集活性は、シチジンデアミナーゼ活性、例えば標的C・GをT・Aに変換する活性である。別の実施形態では、塩基編集活性は、アデノシンまたはアデニンデアミナーゼ活性、例えばA・TをG・Cに変換する活性である。別の実施形態では、塩基編集活性は、シチジンデアミナーゼ活性、例えば標的C・GをT・Aに変換する活性であり、アデノシンまたはアデニンデアミナーゼ活性、例えばA・TをG・Cに変換する活性である。
用語「塩基エディターシステム」あるいは「BEシステム」とは、標的ヌクレオチド配列の核酸塩基を編集するための系を指す。様々な実施形態において、塩基エディター (BE) システムは、 (1) 標的ヌクレオチド配列中の核酸塩基を脱アミノ化するための、ポリヌクレオチドによりプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメイン、デアミナーゼドメイン、およびシチジンデアミナーゼドメインと、(2) ポリヌクレオチドプログラミング可能ヌクレオチド結合ドメインに付随する一つ以上のガイドポリヌクレオチド（例えばガイドRNA）とを含む。様々な実施形態において、塩基エディター (BE) システムは、アデノシンデアミナーゼおよび/またはシチジンデアミナーゼおよびDNAグリコシラーゼから選択される2つ以上の核酸塩基エディタードメイン、および核酸配列特異的結合活性を有するドメインを含む。いくつかの態様において、塩基エディターシステムは、 (1) ポリヌクレオチドによりプログラミング可能なDNA結合ドメインと、標的ヌクレオチド配列中の1以上の核酸塩基を脱アミノ化するための1以上のデアミナーゼドメインとを含む、塩基エディター (BE)、および(2) ポリヌクレオチドプログラミング可能DNA結合ドメインに付随する1つ以上のガイドRNAを含む。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラミング可能ヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラミング可能DNA結合ドメインである。いくつかの実施形態では、塩基エディターはシチジン塩基エディター (CBE) である。ある態様において、塩基エディターは、アデニンまたはアデノシン塩基エディター (ABE) である。いくつかの実施形態において、塩基エディターは、アデニンまたはアデノシン塩基エディター (ABE) とシチジン塩基エディター (CBE) 、例えばマルチエフェクター塩基エディターである。
用語「Cas9」または「Cas9ドメイン」は、Cas9タンパク質またはその断片（例えばCas9の活性、不活性、または部分的に活性なDNA切断ドメイン、および/またはCas9のgRNA結合ドメインを含むタンパク質）を含むRNA誘導ヌクレアーゼを指す。Cas9ヌクレアーゼは、casnlヌクレアーゼまたはCRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）結合ヌクレアーゼと呼ばれることもある。例示的なCas9は、Streptococcus pyogenes Cas9（spCas9）であり、そのアミノ酸配列は以下に提供される。
Figure 2021532794
（一重下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）
「保存的アミノ酸置換」または「保存的変異」という用語は、あるアミノ酸が共通の特性を有する別のアミノ酸に置き換わることを指す。個々のアミノ酸間の共通の性質を定義するための機能的な方法は、相同的な生物の対応するタンパク質間のアミノ酸変化の正規化された頻度を分析することである(Schulz, G. E. and Schirmer, R. H., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979))。このような分析によれば、グループ内のアミノ酸が互いに優先的に交換され、それゆえに全体的なタンパク質構造に対するそれらの影響において互いに最も類似しているところアミノ酸のグループを定義することができる(上記Schulz, G. E. and Schirmer, R. H.)。保存変異の非限定的な例としては、例えば正電荷を維持することができるアミノ酸アルギニンからリジンおよびその逆；負電荷を維持することができるアスパラギン酸からグルタミン酸およびその逆；遊離の-OHが維持されるトレオニンからセリン；および遊離NH2を維持できるアスパラギンからグルタミンのようなアミノ酸置換が挙げられる。
本明細書中で交換可能に使用される用語「コード配列」または「タンパク質コード配列」とは、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのセグメントをいう。この領域または配列は、5’末端に近い方が開始コドンで境界され、3’末端に近い方が停止コドンで境界される。コード配列はオープンリーディングフレームとも呼ばれる。
「シチジンデアミナーゼ」とは、アミノ基をカルボニル基に変換する脱アミノ化反応を触媒することができるポリペプチドまたはその断片を意味する。1つの実施形態において、シチジンデアミナーゼは、シトシンをウラシルに、または5-メチルシトシンをチミンに変換する。Petromyzon marinus由来のPmCDA1（Petromyzon marinus cytosine deaminase 1）、または哺乳動物（例えば、ヒト、ブタ、ウシ、ウマ、サル等）由来のAID（活性化誘導シチジンデアミナーゼ; AICDA）、およびAPOBECは、例示的シチジンデアミナーゼである。
本明細書中で使用する場合、用語「デアミナーゼ」または「デアミナーゼドメイン」とは、脱アミノ化反応を触媒するタンパク質または酵素を指す。ある態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、それぞれウリジンまたはデオキシウリジンへのシチジンまたはデオキシシチジンの加水分解的脱アミノ化を触媒するシチジンデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインはシトシンデアミナーゼであり、ウラシルへのシトシンの加水分解的脱アミノ化を触媒する。ある態様において、デアミナーゼは、ヒポキサンチンへのアデニンの加水分解的脱アミノ化を触媒するアデノシンデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、アデノシンまたはアデニン (A) からイノシン(I) への加水分解的脱アミノ化を触媒するアデノシンデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、アデノシンデアミナーゼであり、それぞれイノシンまたはデオキシイノシンへのアデノシンまたはデオキシアデノシンの加水分解的脱アミノ化を触媒する。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸 (DNA) 中のアデノシンの加水分解的脱アミノ化を触媒する。本明細書中で提供されるアデノシンデアミナーゼ(例えば、遺伝子操作されたアデノシンデアミナーゼ、進化されたアデノシンデアミナーゼ)は、細菌などの任意の生物由来であり得る。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、E. coli、S. aureus、S. typhi、S. putrefaciens、H. influenzae、またはC. crescentusなどの細菌に由来する。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadAデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、例えばヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、またはマウスなどの生物由来の天然デアミナーゼのバリアントである。ある態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、非天然のものである。例えば、いくつかの実施形態において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、天然のデアミナーゼに対して少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.1%、少なくとも99.2%、少なくとも99.3%、少なくとも99.4%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%、または少なくとも99.9%の同一性を有する。
「検出」は、検出されるべき分析物の存在、不在または量を同定することを指す。1つの実施形態において、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおける配列変化が検出される。別の実施形態では、インデル（indel）の存在が検出される。
「検出可能な標識」とは、目的の分子に連結されたときに、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段を介して、後者を検出可能にする組成物を意味する。例えば、有用な標識には、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA) で一般的に用いられるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンが含まれる。
「疾患」とは、細胞、組織または器官の正常な機能を損傷または妨害するあらゆる状態または障害を意味する。
「有効量」とは、未治療の患者、または疾患のない個体すなわち健康な個体と比較して、疾患の症状を改善するために必要な薬剤または活性化合物（例えば本明細書に記載の塩基エディター）の量、または所望の生物学的応答を誘導するために十分な薬剤または活性化合物の量を意味する。疾患の治療的処置のために本発明を実施するために使用される活性化合物（複数可）の有効量は、投与態様、対象の年齢、体重、および全般的健康状態に依存して変化する。最終的には、主治医または獣医が適切な量および用量を決定する。このような量は「有効」量と呼ばれる。一実施形態では、有効量は、細胞(例えば、インビトロまたはインビボの細胞)内の目的の遺伝子に改変を導入するのに十分な本発明の塩基エディターの量である。一実施形態では、有効量は、治療効果を達成するために必要な塩基エディターの量である。このような治療効果は、対象、組織または器官の全ての細胞において病原性遺伝子を変化させるのに十分である必要はなく、対象、組織または器官に存在する細胞の約1%、5%、10%、25%、50%、75%またはそれ以上において病原性遺伝子を変化させるだけでよい。一実施形態では、有効量は、疾患の一つ以上の症状を改善するのに十分である。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される融合タンパク質（例えばnCas9ドメインおよび一つ以上のデアミナーゼドメイン（例えばアデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ）を含むマルチエフェクター核酸塩基エディターの有効量は、本明細書に記載されるマルチエフェクター核酸塩基エディターによって特異的に結合され編集される標的部位の編集を誘導するのに十分な量を指す。当業者には理解されるように、作用物質（例えば融合タンパク質）の有効量は、例えば、望まれる生物学的応答、例えば編集されるべき特定のアリル、ゲノム、もしくは標的部位、標的化される細胞もしくは組織、および/または使用される作用物質などの種々の因子に応じて変化し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される融合タンパク質（例えばnCas9ドメインを含む融合タンパク質）の有効量は、その融合タンパク質によって特異的に結合され編集される標的部位の編集を誘導するために十分な融合タンパク質の量を表し得る。当業者には理解されるように、作用物質（例えば、融合タンパク質、ヌクレアーゼ、メチラーゼ、ハイブリッドタンパク質、タンパク質二量体、タンパク質（もしくはタンパク質二量体）とポリヌクレオチドとの複合体、またはポリヌクレオチド）の有効量は、例えば、望まれる生物学的応答、例えば、編集されるべき特定のアリル、ゲノム、もしくは標的部位、標的化される細胞もしくは組織、及び/又は使用される作用物質などの種々の因子に応じて変化し得る。
「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部を意味する。この部分は、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%を含む。断片は、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000のヌクレオチドまたはアミノ酸を含み得る。
「ガイドRNA」あるいは「gRNA」は、標的配列に特異的であってポリヌクレオチドプログラミング可能ヌクレオチド結合ドメインタンパク質（例えばCas9またはCpf1）と複合体を形成することができるポリヌクレオチドを意味する。一実施形態において、ガイドポリヌクレオチドはガイドRNA (gRNA) である。gRNAは2個以上のRNAの複合体として存在することもあれば、1個のRNA分子として存在することもある。単一のRNA分子として存在するgRNAは、単一ガイドRNA（sgRNA）と呼ばれることがあるが、 「gRNA」は、単一の分子として、または2つ以上の分子の複合体として存在するガイドRNAを指すために互換的に使用される。典型的には、単一のRNA種として存在するgRNAは、(1) 標的核酸と相同性を共有するドメイン（例えば、標的へのCas9複合体の結合を指示する）；および(2) Cas9タンパク質に結合するドメインという二つのドメインを含む。ある態様において、ドメイン (2) は、tracrRNAとして知られる配列に対応し、ステム-ループ構造を含む。例えば、いくつかの態様において、ドメイン (2) は、Jinek et al., Science 337:816-821(2012)（その全内容が参照により本明細書に組み入れられる）に提供されるようなtracrRNAと同一または相同である。gRNA (例えばドメイン2を含むもの)の他の例は、「Switchable Cas9 Nucleases and Uses Thereof」と題されるUS20160208288および「Delivery System For Functional Nucleases」と題されるUS9,737,604に見出され得、それら各々の全内容が参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの実施形態において、gRNAは、ドメイン (1) および (2) の二つ以上を含み、「伸長されたgRNA。」と称され得る。伸長されたgRNAは、本明細書に記載されるように、二つ以上のCas9タンパク質と結合し、二つ以上の異なる領域における標的核酸と結合する。gRNAは、標的部位を相補するヌクレオチド配列を含み、これが標的部位へのヌクレアーゼ/RNA複合体の結合を媒介し、ヌクレアーゼ：RNA複合体の配列特異性を提供する。
「ハイブリダイゼーション」は、相補的な核酸塩基間の水素結合を意味し、ワトソン-クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であり得る。たとえば、アデニンとチミンは相補的な核酸塩基で、水素結合を形成して対を形成する。
「増加」とは、少なくとも10%、25%、50%、75%、または100%の正の変化を意味する。
用語「塩基修復の阻害因子」、「塩基修復阻害因子」、「IBR」あるいはそれらの文法的同等物は、核酸修復酵素、例えば塩基除去修復酵素の活性を阻害することができるタンパク質を指す。ある態様において、IBRは、イノシン塩基除去修復の阻害因子である。塩基修復の阻害因子の例としては、APE1、Endo III、Endo IV、Endo V、Endo VIII、Fpg、hOGGl、hNEILl、T7 Endol、T4 PDG、UDG、hSMUGLおよびhAAGの阻害因子が挙げられる。ある実施形態では、塩基修復阻害因子は、Endo VまたはhAAGの阻害因子である。ある実施形態では、IBRは、Endo VまたはhAAGの阻害因子である。ある実施形態では、IBRは、触媒的に不活性なEndoVまたは触媒的に不活性なhAAGである。ある実施形態では、塩基修復阻害因子は、触媒的に不活性なEndoVまたは触媒的に不活性なhAAGである。ある実施形態では、塩基修復阻害因子は、ウラシルグリコシラーゼ阻害因子 (UGI) である。UGIとは、ウラシル-DNAグリコシラーゼの塩基除去修復酵素を阻害することができるタンパク質を指す。いくつかの実施形態において、UGIドメインは、野生型UGIまたはその断片を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるUGIタンパク質は、UGIの断片、および、UGIまたはUGI断片に相同的なタンパク質を含む。ある態様において、塩基修復阻害因子は、イノシン塩基除去修復の阻害因子である。いくつかの態様において、塩基修復阻害因子は、「触媒的に不活性なイノシン特異的ヌクレアーゼ」または「死んだイノシン特異的ヌクレアーゼ」である。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、触媒的に不活性なイノシングリコシラーゼ（例えば、アルキルアデニングリコシラーゼ (AAG)）は、イノシンに結合することができるが、脱塩基部位を作ることもイノシンを除去することもできず、それによって、新たに形成されるイノシン部分をDNA損傷/修復機構から立体的にブロックする。いくつかの実施形態において、触媒的に不活性なイノシン特異的ヌクレアーゼは、核酸中のイノシンに結合することができるが、核酸を切断しない。代表的な、触媒的に不活性なイノシン特異的ヌクレアーゼの非限定的例としては、（例えばヒト由来の）触媒的に不活性なアルキルアデノシングリコシラーゼ(AAGヌクレアーゼ)、および（例えばE.coli由来の）触媒的に不活性なエンドヌクレアーゼV (EndoVヌクレアーゼ)が挙げられる。いくつかの実施形態において、触媒的に不活性なAAGヌクレアーゼは、E125Q突然変異または別のAAGヌクレアーゼにおける対応する突然変異を含む。
「インテイン（intein）」は、それ自身を切り出してそして残った断片（エクステイン（extein））をタンパク質スプライシングとして知られるプロセスにおいてペプチド結合で連結することができるタンパク質の断片である。インテインは「タンパク質イントロン」とも呼ばれる。インテインがそれ自身を切り出し、タンパク質の残りの部分を連結するプロセスは、本明細書において、「タンパク質スプライシング」または「インテイン媒介タンパク質スプライシング」と呼ばれる。ある態様において、前駆体タンパク質（インテイン媒介タンパク質スプライシングの前のインテイン含有タンパク質）のインテインは、二つの遺伝子に由来する。そのようなインテインは、本明細書では分割（split）インテインと呼ばれる（例えば、分割インテイン-Nおよび分割インテイン-C）。たとえば、シアノバクテリアでは、DNAポリメラーゼIIIの触媒サブユニットaであるDnaEは2つの別々の遺伝子dnaE-nおよびdnaE-cによってコードされている。dnaE-n遺伝子によってコードされるインテインは本明細書において「インテインN」と称され得る。dnaE-c遺伝子によってコードされるインテインは本明細書において「インテインC」と称され得る。
他のインテイン系も使用され得る。例として、dnaEインテイン、すなわちCfa-N（例えば分割インテイン-N）およびCfa-C（例えば分割インテイン-C）のインテイン対に基づく合成インテインが記述されている（例えば、参照により本明細書に組み入れられるStevens et al., J Am Chem Soc. 2016 Feb. 24; 138(7):2162-5）。本開示に従って使用することができるインテイン対の非限定的な例としては、Cfa DnaEインテイン、Ssp GyrBインテイン、Ssp DnaXインテイン、Ter DnaE3インテイン、Ter ThyXインテイン、Rma DnaBインテイン、およびCne Prp8インテイン（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第8,394,604号に記載のようなもの）が挙げられる。
インテインの例示的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する。
DnaE インテイン-N DNA: TGCCTGTCATACGAAACCGAGATACTGACAGTAGAATATGGCCTTCTGCCAATCGGGAAGATTGTGGAGAAACGGATAGAATGCACAGTTTACTCTGTCGATAACAATGGTAACATTTATACTCAGCCAGTTGCCCAGTGGCACGACCGGGGAGAGCAGGAAGTATTCGAATACTGTCTGGAGGATGGAAGTCTCATTAGGGCCACTAAGGACCACAAATTTATGACAGTCGATGGCCAGATGCTGCCTATAGACGAAATCTTTGAGCGAGAGTTGGACCTCATGCGAGTTGACAACCTTCCTAAT
DnaE インテイン-N タンパク質: CLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDR GEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNL PN
DnaE インテイン-C DNA: ATGATCAAGATAGCTACAAGGAAGTATCTTGGCAAACAAAACGTTTATGA TATTGGAGTCGAAAGAGATCACAACTTTGCTCTGAAGAACGGATTCATAG CTTCTAAT
インテイン-C: MIKIATRKYLGKQNVYDIGVERDHNFALKNGFIASN
Cfa-N DNA: TGCCTGTCTTATGATACCGAGATACTTACCGTTGAATATGGCTTCTTGCCTATTGGAAAGATTGTCGAAGAGAGAATTGAATGCACAGTATATACTGTAGACAAGAATGGTTTCGTTTACACACAGCCCATTGCTCAATGGCACAATCGCGGCGAACAAGAAGTATTTGAGTACTGTCTCGAGGATGGAAGCATCATACGAGCAACTAAAGATCATAAATTCATGACCACTGACGGGCAGATGTTGCCAATAGATGAGATATTCGAGCGGGGCTTGGATCTCAAACAAGTGGATGGATTGCCA
Cfa-N タンパク質:
CLSYDTEILTVEYGFLPIGKIVEERIECTVYTVDKNGFVYTQPIAQWHNRGEQEVFEYCLEDGSIIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERGLDLKQVDGLP
Cfa-C DNA: ATGAAGAGGACTGCCGATGGATCAGAGTTTGAATCTCCCAAGAAGAAGAGGAAAGTAAAGATAATATCTCGAAAAAGTCTTGGTACCCAAAATGTCTATGATATTGGAGTGGAGAAAGATCACAACTTCCTTCTCAAGAACGGTCTCGTAGCCAGCAAC
Cfa-C タンパク質: MKRTADGSEFESPKKKRKVKIISRKSLGTQNVYDIGVEKDHNFLLKNGLVASN
分割Cas9のN末端部と分割Cas9のC末端部とを接合するために、インテインNおよびインテインCをそれぞれ分割Cas9のN末端部および分割Cas9のC末端部に融合させ得る。例えば、いくつかの実施形態において、インテイン-Nが、分割されたCas9のN-末端部分のC-末端に融合され、すなわち、N--[分割Cas9のN末端部分]-[インテイン-N]--Cの構造を形成する。いくつかの実施形態において、インテイン-Cが、分割されたCas9のC-末端部分のN-末端に融合され、すなわち、N-[インテイン-C]--[分割Cas9のC末端部分]-Cの構造を形成する。インテインが融合されたところのタンパク質（例えば分割Cas9）を連結するためのインテイン媒介性タンパク質スプライシングの機構は、例えば、参照により本明細書に組み入れられるShah et al., Chem Sci. 2014; 5(1):446-461に記載されているように、当該技術分野において公知である。インテインを設計および使用する方法は当該技術分野で公知であり、例えばWO2014004336、WO2017132580、US20150344549およびUS20180127780によって記載されており、これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる
用語「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」とは、その天然状態で見出される場合に通常それに付随する成分が、様々な程度まで除去されている物質を指す。「単離」は、元の入手源又は周囲環境からの分離の程度を示す。「精製」は、単離よりも高い分離度を示す。「精製された」又は「生物学的に純粋な」タンパク質は、不純物がタンパク質の生物学的特性に実質的に影響を与えたり他の有害な結果を引き起こさないように、他の物質が十分に除去されている。すなわち、本発明の核酸またはペプチドは、組換えDNA技術によって産生された場合には細胞物質、ウイルス物質または培地を実質的に含まない場合、あるいは化学的に合成された場合には化学的前駆体その他の化学物質を実質的に含まない場合には、精製されている。純度および均一性は、典型的には、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを用いて決定される。用語「精製された」は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に1つのバンドを生じることを意味し得る。修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化を受けることができるタンパク質については、異なる修飾は、別々に精製することができる異なる単離されたタンパク質を生じ得る。
「単離ポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子が由来する生物の天然ゲノムにおいて当該遺伝子に隣接する遺伝子を含まない核酸(例えばDNA)を意味する。したがって、この用語は、例えば、ベクターに組み込まれた；自律的に複製するプラスミドやウイルスに組み込まれた；原核生物や真核生物のゲノムDNAに組み込まれた；または他の配列とは独立した別の分子(例えば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成されたcDNAまたはゲノムもしくはcDNA断片)として存在する組換えDNAを含む。さらに、この用語は、DNA分子から転写されるRNA分子、ならびに、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAを含む。
「単離ポリペプチド」とは、天然状態で付随する成分から分離された本発明のポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、それが天然状態で会合しているタンパク質および天然有機分子から重量で少なくとも60%フリーである場合に、単離されている。ある実施形態において、調製物は、重量で少なくとも75%、少なくとも90%、または少なくとも99%が本発明のポリペプチドである。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然源からの抽出、そのようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現；または化学的にタンパク質を合成することにより得ることができる。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析によって測定することができる。
本明細書において使用される用語「リンカー」は、二つの分子もしくは部分（例えばタンパク質複合体もしくはリボ核複合体の二つの成分、または融合タンパク質の二つのドメイン、例えば、ポリヌクレオチドプログラミング可能DNA結合ドメイン(例dCas9)とデアミナーゼドメイン(例えばアデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼとシチジンデアミナーゼ)）を連結する共有結合リンカー(例えば共有結合)、非共有結合リンカー、化学基、または分子を指すことができる。リンカーは、塩基エディターシステムの異なるコンポーネントまたはコンポーネントの異なる部分を繋げることができる。例えば、いくつかの実施形態において、リンカーは、ポリヌクレオチドプログラミング可能ヌクレオチド結合ドメインのガイドポリヌクレオチド結合ドメインおよびデアミナーゼの触媒ドメインを繋げることができる。ある態様において、リンカーは、CRISPRポリペプチドおよびデアミナーゼを結合することができる。ある態様において、リンカーは、Cas9およびデアミナーゼを繋げることができる。ある態様において、リンカーは、dCas9およびデアミナーゼを繋げることができる。ある態様において、リンカーは、nCas9およびデアミナーゼを繋げることができる。ある態様において、リンカーは、ガイドポリヌクレオチドおよびデアミナーゼを繋げることができる。いくつかの実施形態において、リンカーは、塩基エディター系の脱アミノ化成分およびポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合成分を繋げることができる。いくつかの実施形態において、リンカーは、塩基エディターシステムの脱アミノ化成分のRNA結合部分と、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合成分とを繋げることができる。いくつかの実施形態において、リンカーは、塩基エディタ系の脱アミノ化成分のRNA結合部分と、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合成分のRNA結合部分とを結合することができる。リンカーは、2つの基、分子、または他の部分の間に配置され、またはそれらによって挟まれ、共有結合または非共有結合相互作用を介してそれぞれに連結され、かくして2つを連結することができる。ある態様において、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学的部分であり得る。ある態様において、リンカーはポリヌクレオチドであり得る。ある態様において、リンカーはDNAリンカーであり得る。ある態様において、リンカーはRNAリンカーであり得る。ある態様において、リンカーは、リガンドに結合することができるアプタマーを含むことができる。ある態様において、リガンドは、炭水化物、ペプチド、タンパク質、または核酸であり得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、リボスイッチに由来するアプタマーを含むことができる。アプタマーが由来するリボスイッチは、テオフィリンリボスイッチ、チアミンピロリン酸 (TPP) リボスイッチ、アデノシンコバラミン (AdoCbl) リボスイッチ、S-アデノシルメチオニン (SAM) リボスイッチ、SAHリボスイッチ、フラビンモノヌクレオチド(FMN) リボスイッチ、テトラヒドロ葉酸リボスイッチ、リジンリボスイッチ、グリシンリボスイッチ、プリンリボスイッチ、GlmSリボスイッチ、またはプレクエオシン1 (PreQ1) リボスイッチから選択され得る。ある態様において、リンカーは、ポリペプチドまたはポリペプチドリガンドなどのタンパク質ドメインに結合したアプタマーを含み得る。ある態様において、ポリペプチドリガンドは、K相同(KH) ドメイン、MS2コートタンパク質ドメイン、PP7コートタンパク質ドメイン、SfMu Comコートタンパク質ドメイン、無菌のαモチーフ、テロメラーゼKu結合モチーフおよびKuタンパク質、テロメラーゼSm7結合モチーフおよびSm7タンパク質、またはRNA認識モチーフであり得る。ある態様において、ポリペプチドリガンドは、塩基エディター系成分の一部であり得る。例えば、核酸塩基編集成分は、デアミナーゼドメインおよびRNA認識モチーフを含み得る。
ある態様において、リンカーは、アミノ酸または複数のアミノ酸(例えばペプチドまたはタンパク質)であり得る。ある態様において、リンカーは、長さが約5〜100アミノ酸、例えば、長さが約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、20-30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90または90〜100アミノ酸であり得る。ある態様において、リンカーは、長さが約100〜150、150〜200、200〜250、250〜300、300〜350、350〜400、400〜450、または450〜500アミノ酸であり得る。より長いまたはより短いリンカーも考えられる。
ある態様において、リンカーは、Cas9ヌクレアーゼドメインを含むRNAプログラム可能ヌクレアーゼのgRNA結合ドメインと、核酸編集タンパク質(例えば、シチジンまたはアデノシンデアミナーゼ)の触媒ドメインとを繋げる。ある態様において、リンカーは、dCas9および核酸編集タンパク質を繋げる。例えば、リンカーは、2つの基、分子、または他の部分の間に配置されるか、または2つの基、分子、または他の部分によって隣接され、共有結合を介してそれぞれに連結され、したがって2つを連結する。ある態様において、リンカーは、アミノ酸または複数のアミノ酸(例えば、ペプチドまたはタンパク質)である。ある態様において、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学的部分である。ある態様において、リンカーは、長さが5〜200アミノ酸、例えば、長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、35、45、50、55、60、60、65、70、70、75、80、85、90、90、95、100、101、102、103、104、105、110、120、130、140、150、160、175、180、190、または200アミノ酸である。
ある態様において、塩基エディターのドメインは、SGGSSGSETPGTSESATPESSGGS, SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS, またはGGSGGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGGSGGSのアミノ酸配列を含むリンカーを介して融合される。ある態様において、塩基エディターのドメインは、XTENリンカーとも呼ばれ得るアミノ酸配列SGSETPGTSESATPESを含むリンカーを介して融合される。ある態様において、リンカーは、長さが24アミノ酸である。ある態様において、リンカーは、アミノ酸配列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESを含む。ある態様において、リンカーは、40アミノ酸長である。ある態様において、リンカーは、アミノ酸配列SGGSSGGSSGSETPGTESATPESSGGSSGGSSGSSGGSを含む。ある態様において、リンカーは、64アミノ酸長である。ある態様において、リンカーは、アミノ酸配列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSを含む。ある態様において、リンカーは、長さが92アミノ酸である。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSを含む。
「マーカー」とは、疾患または障害に関連する発現レベルまたは活性の変化を有する任意のタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。
本明細書中で使用される場合、用語「変異」とは、配列内、例えば核酸もしくはアミノ酸配列内の残基が、別の残基により置換されること、または配列内の1以上の残基の欠失もしくは挿入をいう。変異は、本明細書中において典型的には、元の残基を同定し、次いで配列内の残基の位置を同定し、そして新たに置換された残基を同定することによって、記載される。本明細書中に提供されるアミノ酸置換 (変異) を作製するための種々の方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))によって提供されている。いくつかの態様において、本開示の塩基エディターは、有意な数の非意図的な変異、例えば非意図的な点突然変異を生成することなく、核酸(例えば対象のゲノム内の核酸)において「意図された変異」例えば点突然変異を効率的に生成することができる。いくつかの実施形態において、意図された変異は、その意図された変異を生じさせるように特に設計された、ガイドポリヌクレオチド(例えばgRNA)に結合した特定の塩基エディター(例えばシチジン塩基エディターまたはアデノシン塩基エディター)によって生じる変異である。
一般に、配列(例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列)においてなされるか又は同定される変異は、参照(または野生型)配列、すなわち、その変異を含まない配列に関連して番号付けされる。当業者は、参照配列に対するアミノ酸および核酸配列における突然変異の位置を決定する方法を容易に理解するであろう。
「非保存的変異」という用語は、異なるグループの間のアミノ酸置換に関し、例えば、トリプトファンからリジン、またはセリンからフェニルアラニンなどである。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能性バリアントの生物学的活性を妨害または阻害しないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性が野生型タンパク質と比較して増加するように、機能的バリアントの生物学的活性を増強することができる。
「核局在化配列」、「核局在化シグナル」または「NLS」という用語は、タンパク質の細胞核への移入を促進するアミノ酸配列を意味する。核局在化配列は当該技術分野において公知であり、例えば、2000年11月23日に出願され2001年5月31日にWO/2001/038547として公開された国際PCT出願PCT/EP 2000/011690のPlank et al.に記載されており、その内容は、例示的な核局在化配列の開示について参照により本明細書に組み入れられる。他の実施形態では、NLSは、例えばKoblan et al., Nature Biotech. 2018 doi:10.1038/nbt.4172によって記載された、最適化されたNLSである。本発明の方法において有用な最適化配列が図8A-8F (Koblan et al.、上記)に示されている。ある態様において、NLSは、アミノ酸配列KRTADGSEFESPKKKRKV, KRPAATKKAGQAKKKK, KKTELQTTNAENKTKKL, KRGINDRNFWRGENGRKTR, RKSGKIAAIVVKRPRK, PKKKRKV,または MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLCを含む。
用語「核酸塩基」、「窒素塩基」、または「塩基」は、本明細書中で互換的に使用され、ヌクレオシドを形成する窒素含有生物学的化合物を指し、ヌクレオシドはヌクレオチドの成分である。塩基対を形成し、互いに積み重なる核酸塩基の能力は、直接、リボ核酸 (RNA) およびデオキシリボ核酸 (DNA) のような長鎖らせん構造をもたらす。アデニン (A) 、シトシン (C) 、グアニン (G) 、チミン(T) 、ウラシル (U) の5種類の核酸塩基は、一次塩基または標準塩基と呼ばれる。アデニンとグアニンはプリンに由来し、シトシン、ウラシル、チミンはピリミジンに由来する。DNAとRNAは修飾された他の (非一次) 塩基を含むこともある。非限定的な例示的修飾核酸塩基としては、ヒポキサンチン、キサンチン、7-メチルグアニン、5,6-ジヒドロウラシル、5-メチルシトシン (m5C) 、および5-ヒドロメチルシトシンが挙げられる。ヒポキサンチンとキサンチンは変異原の存在によって生成され得、どちらも脱アミノ化(アミン基のカルボニル基への置換)によって生成される。ヒポキサンチンはアデニンから修飾され得る。キサンチンはグアニンから修飾され得る。ウラシルはシトシンの脱アミノ化によって生じ得る。「ヌクレオシド」は核酸塩基と五炭糖(リボースまたはデオキシリボース)からなる。ヌクレオシドの例としては、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、5-メチルウリジン (m5U) 、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン、およびデオキシシチジンが挙げられる。修飾核酸塩基を有するヌクレオシドとしては、イノシン (I) 、キサントシン (X) 、7-メチルグアノシン (m7G) 、ジヒドロウリジン (D) 、5-メチルシチジン (m5C) 、プソイドウリジン (Ψ) 等が挙げられる。ヌクレオチドは、核酸塩基、五炭糖(リボースまたはデオキシリボース)、および少なくとも一つのリン酸基からなる。
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」および「核酸分子」とは、核酸塩基および酸性部分を含む化合物、例えばヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオチドのポリマーをいう。典型的には、ポリマー核酸、例えば3つ以上のヌクレオチドを含む核酸分子は、隣接するヌクレオチドがホスホジエステル結合を介して互いに連結されている直鎖分子である。ある態様において、「核酸」は、個々の核酸残基(例えばヌクレオチドおよび/またはヌクレオシド)を指す。ある態様において、「核酸」は、三つ以上の個々のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖をいう。本明細書中で使用される、用語「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、および「ポリ核酸」は、ヌクレオチドのポリマー(例えば少なくとも3つのヌクレオチドの鎖)を指すために交換可能に使用され得る。ある態様において、「核酸」は、RNAならびに一本鎖および/または二本鎖DNAを包含する。核酸は、例えば、ゲノム、転写物、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、snRNA、プラスミド、コスミド、染色体、染色分体、または他の天然に存在する核酸分子との関連において、天然に存在し得る。他方、核酸分子は、例えば非天然に存在する分子、組換えDNAもしくはRNA、人工染色体、操作されたゲノム、もしくはその断片、または合成DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、または非天然に存在するヌクレオチドもしくはヌクレオシドを含む、非天然に存在する分子であり得る。さらに、用語「核酸」、「DNA」、「RNA」、および/または類似の用語は、核酸アナログ、例えばホスホジエステル骨格以外を有するアナログを含む。核酸は、天然源から精製される、組換え発現系を用いて産生され必要に応じて精製される、化学的に合成される、等が可能である。化学的に合成された分子の場合、核酸は、適切な場合には、例えば、化学的に修飾された塩基または糖、および骨格修飾を有するアナログなどのヌクレオシドアナログを含み得る。核酸配列は、特に示されない限り、5’〜3’方向に示される。ある態様において、核酸は、天然ヌクレオシド(例えばアデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン)；ヌクレオシド類似体(例えば2-アミノアデノシン、2-チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、3-メチルアデノシン、5-メチルシチジン、2-アミノアデノシン、C5-ブロモウリジン、C5-フルオロウリジン、C5-ヨードウリジン、C5-プロピニル-ウリジン、C5-プロピニル-シチジン、C5-メチルシチジン、2-アミノアデノシン、7-デアザアデノシン、7-デアザグアノシン、8-オキソアデノシン、8-オキソグアニン、O6-メチルグアニン、および2-チオシチジン)；化学修飾塩基；生物学的に修飾された塩基(例えばメチル化塩基)；挿入塩基；修飾糖(例えば2’-フルオロリボース、リボース、2’-デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース)；および/または修飾リン酸基(例えばホスホロチオエートおよび5’-N-ホスホロアミダイト結合)であるか、またはそれらを含む。
「核酸プログラミング可能DNA結合タンパク質」あるいは「napDNAbp」という用語は、「ポリヌクレオチドプログラミング可能ヌクレオチド結合ドメイン」と互換的に使用され得、特異的な核酸配列にnapDNAbpをガイドするガイド核酸またはガイドポリヌクレオチド（例えばgRNA）のような核酸（例えばDNAまたはRNA）と会合するタンパク質を指す。ある態様において、ポリヌクレオチドによりプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドによりプログラミング可能なDNA結合ドメインである。ある態様において、ポリヌクレオチドによりプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドによりプログラミング可能なRNA結合ドメインである。ある態様において、ポリヌクレオチドによりプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインは、Cas9タンパク質である。Cas9タンパク質は、ガイドRNAに相補的な特異的DNA配列にCas9タンパク質を誘導するガイドRNAと結合することができる。ある態様において、napDNAbpは、Cas9ドメイン、例えばヌクレアーゼ活性Cas9、Cas9ニッカーゼ (nCas9) 、またはヌクレアーゼ不活性Cas9 (dCas9) である。核酸プログラミング可能DNA結合タンパク質の非限定的な例としては、Cas9（例えばdCas9およびnCas9）、Cas12a/Cpfl、Cas12b/C2cl、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、およびCas12iが挙げられる。Cas酵素の非限定的な例としては、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5d、Cas5t、Cas5h、Cas5a、Cas6、Cas7、Cas8、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9（Csn1またはCsx12とも呼ばれる）、Cas10、Cas10d、Cas12a/Cpfl、Cas12b/C2cl、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Csy1、Csy2、Csy3、Csy4、Cse1、Cse2、Cse3、Cse4、Cse5e、Csc1、Csc2、Csa5、Csn1、Csn2、Csm1、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csx11、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Csd1、Csd2、Cst1、Cst2、Csh1、Csh2、Csa1、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5、タイプII Casエフェクタータンパク質、タイプV Casエフェクタータンパク質、タイプVI Casエフェクタータンパク質、CARF、DinG、それらのホモログ、またはそれらの改変または操作されたバージョンが挙げられる。他の核酸プログラミング可能なDNA結合タンパク質も、本開示に具体的に列記されていないかもしれないが、本開示の範囲内である。例えばMakarova et al. “Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?” CRISPR J. 2018 Oct;1:325-336. doi: 10.1089/crispr.2018.0033; Yan et al., “Functionally diverse type V CRISPR-Cas systems” Science. 2019 Jan 4;363(6422):88-91. doi: 10.1126/science.aav7271を参照（それぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる）。
「核酸塩基編集ドメイン」または「核酸塩基編集タンパク質」という用語は、本明細書において使用される場合、シトシン(もしくはシチジン)からウラシル(もしくはウリジン)またはチミン(もしくはチミジン)への、およびアデニン(もしくはアデノシン)からヒポキサンチン(もしくはイノシン)への脱アミノ化、ならびに非鋳型ヌクレオチド付加および挿入のような、RNAまたはDNAにおける核酸塩基修飾を触媒することができるタンパク質または酵素を指す。ある態様において、核酸塩基編集ドメインは、デアミナーゼドメイン(例えば、アデニンデアミナーゼもしくはアデノシンデアミナーゼ；またはシチジンデアミナーゼもしくはシトシンデアミナーゼ)である。ある態様において、核酸塩基編集ドメインは、複数のデアミナーゼドメイン(例えば、アデニンデアミナーゼもしくはアデノシンデアミナーゼと、シチジンもしくはシトシンデアミナーゼ)である。ある態様において、核酸塩基編集ドメインは、天然に存在する核酸塩基編集ドメインであり得る。いくつかの実施形態において、核酸塩基編集ドメインは、天然に存在する核酸塩基編集ドメインから操作または進化された核酸塩基編集ドメインであり得る。核酸塩基編集ドメインは、細菌、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、またはマウスなどの任意の生物由来であり得る。
本明細書で使用される場合、「薬剤を取得する」におけるような「取得する」は、その薬剤を合成すること、購入すること、または他の方法で獲得することを含む。
本明細書で使用される「患者」または「対象」は、疾患または障害と診断されている、それらを生じるリスクがある、またはそれらを有するかもしくは生ずる疑いがある哺乳動物対象または個体を指す。ある態様において、用語「患者」は、疾患または障害を生ずる可能性が平均より高い哺乳動物対象を指す。例示的な患者は、ヒト、ヒト以外の霊長類、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ、ウマ、ラクダ、ラマ、ヤギ、ヒツジ、齧歯類(例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット)および本明細書に開示される治療から利益を得ることができる他の哺乳動物であり得る。例示的なヒト患者は、男性および/または女性であり得る。
「それを必要とする患者」または「それを必要とする対象」は、本明細書では、疾患または障害と診断された、またはそれを有するリスクがある、またはそれを有することがあらかじめ決定された、またはそれを有することが疑われる患者として言及される。
「病原性変異」、「病原性バリアント」、「疾患原因変異」、「疾患原因バリアント」、「有害変異」または「素因となる変異」という用語は、特定の疾患または障害に対する個体の感受性または素因を増大させる遺伝子変化または突然変異を指す。ある態様において、病原性変異は、遺伝子によってコードされるタンパク質中の少なくとも1つの野生型アミノ酸が少なくとも1つの病原性アミノ酸によって置換されたものを含む。
用語「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」、およびそれらの文法的等価物は、本明細書において交換可能に使用され、ペプチド (アミド) 結合によって互いに連結されたアミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、任意のサイズ、構造または機能のタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドを指す。典型的には、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、少なくとも3アミノ酸長である。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、個々のタンパク質または一群のタンパク質を指すことができる。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中の1以上のアミノ酸は、例えば炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、結合のためのリンカー、官能化、または他の修飾などの化学的実体の添加によって、修飾され得る。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドはまた、単一分子であってもよく、または多分子複合体であってもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在するタンパク質またはペプチドの単なる断片であり得る。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在するもの、組換え体、もしくは合成のもの、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。本明細書中で使用される場合、用語「融合タンパク質」とは、少なくとも二つの異なるタンパク質由来のタンパク質ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをいう。1つのタンパク質は、融合タンパク質のアミノ末端 (N末端) 部分またはカルボキシ末端 (C末端) タンパク質に位置することができ、かくして、それぞれ、アミノ末端融合タンパク質またはカルボキシ末端融合タンパク質を形成する。タンパク質は、異なるドメイン、例えば、核酸結合ドメイン(例えば、標的部位へのタンパク質の結合を誘導するCas9のgRNA結合ドメイン)および核酸切断ドメイン、あるいは核酸編集タンパク質の触媒ドメインを含み得る。ある態様において、タンパク質は、タンパク質性部分、例えば、核酸結合ドメインを構成するアミノ酸配列、および有機化合物、例えば、核酸切断剤として作用し得る化合物を含む。ある態様において、タンパク質は、核酸 (例えば、RNAまたはDNA) と複合体化されているか、または核酸と会合している。本明細書で提供される任意のタンパク質は、当技術分野で公知の任意の方法によって生産することができる。例えば、本明細書で提供されるタンパク質は、組換えタンパク質発現および精製を介して生産することができ、これは、ペプチドリンカーを含む融合タンパク質に特に適している。組換えタンパク質の発現および精製のための方法はよく知られており、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))によって記載されているものを含み、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書に開示されるポリペプチドおよびタンパク質(機能的部分およびその機能的バリアントを含む)は、一つ以上の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含むことができる。そのような合成アミノ酸は当該分野で公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α-アミノn-デカン酸、ホモセリン、S-アセチルアミノメチル-システイン、trans-3-およびtrans-4-ヒドロキシプロリン、4-アミノフェニルアラニン、4-ニトロフェニルアラニン、4-クロロフェニルアラニン、4-カルボキシフェニルアラニン、β-フェニルセリンβ-ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α-ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン-2-カルボン酸、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、N'-ベンジル-N'-メチルリジン、N',N'-ジベンジル-リジン、6-ヒドロキシリジン、オルニチン、α-アミノシクロペンタンカルボン酸、アミノシクロヘキサンカルボン酸、アミノシクロヘキサンカルボン酸、α-アミノシクロヘプタンカルボン酸、α-(2-アミノ-2-ノルボルナン)-カルボン酸、α,γ-ジアミノ酪酸、α,β-ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、およびα-tert-ブチルグリシンが挙げられる。ポリペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチド構築物の1つ以上のアミノ酸の翻訳後修飾と結合することができる。翻訳後修飾の非限定的な例としては、リン酸化、アセチル化およびホルミル化を含むアシル化、グリコシル化(N-リンクおよびO-リンクを含む)、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化およびエチル化を含むアルキル化、ユビキチン化、ピロリドンカルボン酸の添加、ジスルフィド架橋の形成、硫酸化、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、ファルネシル化、ゲラニル化、グリピエーション、リポイル化およびヨード化が挙げられる。
タンパク質または核酸に関連して本明細書中で使用される用語「組み換え体」とは、自然界には存在しないが、人間の工学の産物であるタンパク質または核酸を指す。例えば、いくつかの実施形態において、組換えタンパク質または核酸分子は、任意の天然に存在する配列と比較して、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、または少なくとも7つの変異を含むアミノ酸またはヌクレオチド配列を含む。
「減少する」とは、少なくとも10%、25%、50%、75%、または100%の負の変化を意味する。
「参照（reference）」は、基準または対照の条件を意味する。1つの実施形態において、参照は野生型または健常な細胞である。他の実施形態において、限定されないが、参照は、試験条件に晒されていないか、またはプラセボもしくは通常の食塩水、培地、緩衝液、および/または、目的のポリヌクレオチドを保持しない対照ベクターに晒される、非処理細胞である。
「参照配列」は、配列比較の基礎として使用される定義済み配列である。参照配列は、特定の配列のサブセット又は全体であり得る；例えば、完全長のcDNAもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全なcDNAまたは遺伝子配列。ポリペプチドについては、参照ポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約16アミノ酸、少なくとも約20アミノ酸、少なくとも約25アミノ酸、約35アミノ酸、約50アミノ酸、または約100アミノ酸である。核酸については、参照核酸配列の長さは、一般に、少なくとも約50ヌクレオチド、少なくとも約60ヌクレオチド、少なくとも約75ヌクレオチド、約100ヌクレオチドまたは約300ヌクレオチドまたはそれらの周辺もしくはそれらの間の任意の整数である。いくつかの実施形態において、参照配列は、目的タンパク質の野生型配列である。他の実施形態では、参照配列は、野生型タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列である。
用語「RNAプログラム可能なヌクレアーゼ」および「RNA誘導ヌクレアーゼ」は、切断の標的ではない一つ以上のRNAをとともに使用される(例えば、それに結合または付随する)。ある態様において、RNAプログラム可能ヌクレアーゼは、RNAと複合体である場合、ヌクレアーゼ:RNA複合体と称され得る。典型的には、結合したRNAはガイドRNA (gRNA) と呼ばれる。ある態様において、RNAプログラム可能ヌクレアーゼは、(CRISPR関連システム) Cas9エンドヌクレアーゼ、例えば、Streptococcus pyogenes由来のCas9 (Csnl) である（例えば、"Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C, Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma CM., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)参照）。
用語「一塩基多型 (SNP)」は、ゲノム中の特定の位置で起こる単一ヌクレオチドの変異であり、ここで、各変異は集団内で認識できるある程度(例>1%)まで存在する。たとえば、ヒトゲノムの特定の塩基位置では、ほとんどの個体でCヌクレオチドが出現しうるが、少数の個体ではその位置がAで占められている。これは、この特定の位置にSNPがあり、CまたはAという2つのヌクレオチドのバリエーションがこの位置のアリルであることを意味する。SNPは疾患に対する感受性の差の根底にある。病気の重症度や治療に対する体の反応も、遺伝的バリエーションの表れである。SNPは、遺伝子のコード領域、遺伝子の非コード領域、または遺伝子間領域(遺伝子と遺伝子の間の領域)に存在しうる。ある態様において、コード配列内のSNPは、遺伝子コードの縮重のために、産生されるタンパク質のアミノ酸配列を必ずしも変化させない。コード領域のSNPには、同義SNPと非同義SNPの2種類がある。同義SNPはタンパク質配列に影響しないが、非同義SNPはタンパク質のアミノ酸配列を変化させる。非同義SNPにはミスセンスとナンセンスの2種類がある。タンパク質をコードする領域にないSNPは、遺伝子のスプライシング、転写因子の結合、メッセンジャーRNAの分解、または非コードRNAの配列に影響を与えることがある。この種のSNPによって影響を受ける遺伝子発現はeSNP (発現SNP)と呼ばれ、遺伝子の上流または下流にあり得る。一塩基バリアント (SNV) は、頻度に制限のない一塩基のバリエーションであり、体細胞で生じ得る。体細胞一塩基バリエーションは一塩基改変とも呼ばれ得る。
「特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチドおよび/または核酸分子を認識および結合するが、試料（例えば生物学的試料）中の他の分子を実質的に認識および結合しない核酸分子、ポリペプチド、もしくはそれらの複合体（例えば、核酸プログラミング可能DNA結合タンパク質およびガイド核酸）、化合物、または分子を意味する。
本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。そのような核酸分子は、内因性核酸配列と100%同一である必要はないが、典型的には実質的同一性を示す。内因性配列に対して「実質的同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも一つの鎖とハイブリダイズすることができる。本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。そのような核酸分子は、内因性核酸配列と100%同一である必要はないが、典型的には実質的同一性を示す。内因性配列に対して「実質的同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも一つの鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズする」とは、種々のストリンジェンシー条件下で相補的ポリヌクレオチド配列(例えば、本明細書に記載の遺伝子)の間、またはその一部の間に二本鎖分子を形成する対をなすことを意味する。(例えばWahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507参照)。
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約750 mM未満 NaClおよび75 mMクエン酸三ナトリウム、好ましくは約500 mM未満 NaClおよび50 mMクエン酸三ナトリウム、より好ましくは約250 mM未満 NaClおよび25 mMクエン酸三ナトリウムである。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドの非存在下で得ることができ、一方、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約35%ホルムアミド、より好ましくは少なくとも約50%ホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約30℃、より好ましくは少なくとも約37℃、最も好ましくは少なくとも約42℃の温度を含むであろう。ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤 (例えば、ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) ) の濃度、および担体DNAの含入または排除などの様々な追加のパラメーターは、当業者によく知られている。必要に応じてこれら様々な条件を組み合わせることによって、様々なレベルのストリンジェンシーが達成される。好ましい一実施形態では、ハイブリダイゼーションは、30℃で、750 mM NaCl、75 mMクエン酸三ナトリウムおよび1% SDS中で起こる。より好ましい一実施形態では、ハイブリダイゼーションは、37℃で、500 mM NaCl、50 mMクエン酸三ナトリウム、1% SDS、35%ホルムアミドおよび100μg/ml変性サケ精子DNA (ssDNA) 中で起こる。最も好ましい一実施形態において、ハイブリダイゼーションは、42℃において、250 mM NaCl、25 mMクエン酸三ナトリウム、1% SDS、50%ホルムアミドおよび200μg/ml ssDNA中で起こる。これらの条件の有用なバリエーションは、当業者には容易に明らかになるであろう。
ほとんどの用途では、ハイブリダイゼーションに続く洗浄工程もまた、ストリンジェンシーが異なる。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度および温度によって定義することができる。上記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を低下させるか、または温度を上昇させることによって増加させることができる。例えば、洗浄工程のためのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約30 mM未満NaClおよび3 mMクエン酸三ナトリウムであり、最も好ましくは約15 mM未満 NaClおよび1.5 mMクエン酸三ナトリウムであり得る。洗浄工程のためのストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約25℃、より好ましくは少なくとも約42℃、さらにより好ましくは少なくとも約68℃の温度を含む。一実施形態において、洗浄工程は、25℃で、30 mM NaCl、3 mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中で行われる。別の実施形態において、洗浄工程は、42℃で、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中で行われる。より好ましい実施形態において、洗浄工程は、68℃で、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中で行われる。これらの条件のさらなるバリエーションは、当業者には容易に明らかになるであろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者によくしられており、例えば、Benton and Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); および Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記述されている。
「分割（split）」とは、2つ以上の断片に分割されることを意味する。
「分割されたCas9タンパク質」あるいは「分割Cas9」とは、二つの別個のヌクレオチド配列によってコードされるN末端断片およびC末端断片として提供されるCas9タンパク質をいう。Cas9タンパク質のN末端部分およびC末端部分に対応するポリペプチドは、スプライスされて「再構成」Cas9タンパク質を形成することができる。特定の実施形態において、Cas9タンパク質は、例えば、Nishimasu et al., Cell, Volume 156, Issue 5, pp. 935-949, 2014に記載されるように、またはJiang et al. (2016) Science 351: 867-871. PDB file: 5F9Rに記載されるように（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）、タンパク質の非秩序的な領域内で2つの断片に分割される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、SpCas9のおよそアミノ酸A292-G364、F445-K483、もしくはE565-T637の間の領域内の任意のC、T、A、もしくはSにおいて、または任意の他のCas9、Cas9バリアント（例えばnCas9、dCas9）、もしくは他のnapDNAbpにおける対応位置において、二つの断片に分割される。ある態様において、タンパク質は、SpCas9 T310、T313、A456、S469、またはC574において2つの断片に分割される。いくつかの実施形態において、タンパク質を2つの断片に分割するプロセスは、タンパク質を「分割（スプリッティング）する」と称される。
他の実施形態において、Cas9タンパク質のN末端部分は、S. pyogenes Cas9野生型（SpCas9）（NCBI参照配列：NC_002737.2、Uniprot参照配列：Q99ZW2）のアミノ酸1〜573または1〜637を含み、Cas9タンパク質のC末端部分は、SpCas9野生型のアミノ酸574〜1368または638〜1368の部分を含む。
分割されたCas9のC末端部分は、分割されたCas9のN末端部分と連結されて完全なCas9タンパク質を形成することができる。いくつかの実施形態において、Cas9タンパク質のC末端部分は、Cas9タンパク質のN末端部分が終わるところから始まる。このように、いくつかの実施態様において、分割Cas9のC末端部分は、spCas9のアミノ酸 (551-651) -1368の部分を含む。「(551-651) -1368」とは、アミノ酸551〜651（両端を含む）のあいだのアミノ酸から始まり、アミノ酸1368で終わることを意味する。例えば、分割Cas9のC末端部分は、spCas9のアミノ酸551-1368、552-1368、553-1368、554-1368、555-1368、556-1368、557-1368、558-1368、559-1368、560-1368、561-1368、562-1368、563-1368、564-1368、565-1368、566-1368、567-1368、568-1368、569-1368、570-1368、571-1368、572-1368、573-1368、574-1368、575-1368、576-1368、577-1368、578-1368、579-1368、580-1368、581-1368、582-1368、583-1368、584-1368、585-1368、586-1368、587-1368、588-1368、589-1368、590-1368、591-1368、592-1368、593-1368、594-1368、595-1368、596-1368、597-1368、598-1368、599-1368、600-1368、601-1368、602-1368、603-1368、604-1368、605-1368、606-1368、607-1368、608-1368、609-1368、610-1368、611-1368、612-1368、613-1368、614-1368、615-1368、616-1368、617-1368、618-1368、619-1368、620-1368、621-1368、622-1368、623-1368、624-1368、625-1368、626-1368、627-1368、628-1368、629-1368、630-1368、631-1368、632-1368、633-1368、634-1368、635-1368、636-1368、637-1368、638-1368、639-1368、640-1368、641-1368、642-1368、643-1368、644-1368、645-1368、646-1368、647-1368、648-1368、649-1368、650-1368、または651-1368のいずれか１つの部分を含み得る。いくつかの実施形態において、分割されたCas9タンパク質のC末端部分は、SpCas9のアミノ酸574-1368または638-1368の部分を含む。
「対象」とは、哺乳動物を意味し、ヒト、または、非ヒト霊長類 (サル) 、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、もしくはネコのような非ヒト哺乳動物を含むが、これらに限定されない。
「実質的に同一である」とは、参照アミノ酸配列(例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか1つ)または核酸配列(例えば、本明細書に記載の核酸配列のいずれか1つ)に対して少なくとも50%の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。ある実施形態では、そのような配列は、比較のために使用される配列とアミノ酸レベルまたは核酸レベルにおいて少なくとも60%、80%、85%、90%、95%または99%までもの同一性を有する。
配列同一性は、典型的には、配列解析ソフトウェア(例えば、Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705のSequence Analysis Software Package、BLAST、BESTFIT、GAP、またはPILEUP/PRETTYBOXプログラム)を用いて測定される。そのようなソフトウェアは、種々の置換、欠失、および/または他の改変に相同性の程度を割り当てることによって、同一または類似の配列をマッチさせる。保存的置換は、典型的には、以下の群内の置換を含む:グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；フェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定するための例示的なアプローチにおいて、BLASTプログラムを使用することができ、e -3とe -100の間の確率スコアが密接に関連した配列を示す。COBALTは、たとえば次のパラメータとともに使用される：
a) アラインメントパラメータ：Gap penalties-11,-1 and End-Gap penalties-5,-1,
b) CDDパラメータ：Use RPS BLAST on; Blast E-value 0.003; Find Conserved columns and Recompute on
c) クエリー・クラスタリング・パラメータ：Use query clusters on; Word Size 4; Max cluster distance 0.8; Alphabet Regular。
EMBOSS Needleは、たとえば次のパラメータで使用される。
a) Matrix: BLOSUM62;
b) GAP OPEN: 10;
c) GAP EXTEND: 0.5;
d) OUTPUT FORMAT: pair;
e) END GAP PENALTY: false;
f) END GAP OPEN: 10; and
g) END GAP EXTEND: 0.5.
用語「標的部位」とは、核酸分子内の配列であって、核酸塩基エディターによって改変される配列をいう。一実施形態において、標的部位は、デアミナーゼまたはそれを含む融合タンパク質（例えば、本明細書に開示されるdCas9-アデノシンデアミナーゼ融合タンパク質またはマルチエフェクター塩基エディター）によって脱アミノ化される。
RNAプログラム可能なヌクレアーゼ(例:Cas9)は、DNA切断部位を標的とするためにRNA:DNAハイブリダイゼーションを使用するので、これらのタンパク質は、原理的に、ガイドRNAによって指定されるあらゆる配列を標的とすることができる。部位特異的切断のためにCas9のようなRNAプログラム可能なヌクレアーゼを使用する方法(例えばゲノムを改変するために)は、当該技術分野において公知である(例えば、Cong, L. et al., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013); Mali, P. et al., RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013); Hwang, W.Y. et al., Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229 (2013); Jinek, M. et al., RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013); Dicarlo, J.E. et al., Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research (2013); Jiang, W. et al., RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239 (2013)を参照。これらの各々の全内容は参照により本明細書に組み入れられる)。
本明細書中で使用される、用語「治療する(treat)」、「治療する(treating)」、「治療(treatment)」などは、障害および/またはそれに関連する症状を軽減もしくは改善すること、または所望の薬理学的および/または生理学的効果を得ることを指す。障害または状態を治療することは、関連する障害、状態または症状を完全に除去することを必要としないことが理解されるであろう（完全な除去が除外されるわけでもない）。いくつかの態様において、効果は、治療的であり、すなわち、限定されるものではないが、効果は、疾患および/またはそれに起因する有害症状を部分的または完全に低減、減少、除去、軽減、緩和、強度低下、または治癒する。ある態様において、効果は予防的であり、すなわち効果は、疾患または状態の発生または再発を保護または予防する。この目的のために、本開示の方法は、本明細書に記載されるような治療的に有効な量の組成物を投与することを含む。
「ウラシルグリコシラーゼ阻害因子」、あるいは「UGI」とは、ウラシル除去修復系を阻害する因子を意味する。1つの実施形態において、該因子は、宿主ウラシル-DNAグリコシラーゼに結合してDNAからのウラシル残基の除去を妨げるタンパク質またはその断片である。一実施形態において、UGIは、ウラシル-DNAグリコシラーゼ塩基除去修復酵素を阻害することができるタンパク質、その断片、またはドメインである。いくつかの態様において、UGIドメインは、野生型UGIまたはその改変バージョンを含む。いくつかの実施形態において、UGIドメインは、下記に提示される例示的アミノ酸配列の断片を含む。いくつかの実施形態において、UGI断片は、下記に提供される例示的UGI配列の少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、UGIは、以下に記載されるように、例示的UGIアミノ酸配列またはその断片に対して相同的なアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、UGIまたはその一部は、以下に記載されるように、野生型UGIもしくUGI配列またはその一部に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.9%または100%の同一性を有する。例示的なUGIは、以下のアミノ酸配列を含む：
>splP14739IUNGI_BPPB2 Uracil-DNA glycosylase inhibitor

MTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLT S D APE YKPW ALVIQDS NGENKIKML.
本明細書で提供される範囲は、範囲内のすべての値についての省略形であると理解される。例えば、1〜50の範囲は、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, または 50からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、またはサブ範囲を含むと理解される。
本明細書における可変物の定義における化学基のリストの記載は、リストされた基の任意の単一の基または組合せとしてのその可変物の定義を含む。本明細書における可変物または態様に関する実施形態の説明は、任意の単一の実施形態としての、または任意の他の実施形態もしくはその一部と組み合わせられた、その実施形態を含む。
本明細書に提供される組成物または方法は、本明細書に提供される他の組成物および方法の1つ以上と組み合わせることができる。
本明細書における説明および例は、本開示の実施形態を詳細に例示する。本開示は、本明細書に記載される特定の実施形態に限定されず、したがって変化し得ることが理解されるべきである。当業者であれば、本開示には、その範囲内に包含される多数の変形および修正があることを認識するであろう。
全ての用語は、当業者によって理解されるところのものとして理解されることが意図されている。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本開示が関係する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書に開示される実施形態の実施は、別段の指示がない限り、当業者の技量の範囲内にある、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えDNAの従来の技術を使用する。例えば、Sambrook and Green, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition (2012); the series Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds.); the series Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.), PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 6th Edition (R.I. Freshney, ed. (2010))参照。
本開示の種々の特徴は、単一の実施形態に関連して説明され得るが、これらの特徴は、分離されて、または任意の適切な組み合わせで提供することもできる。逆に、本開示は、明確にするために別々の実施形態の文脈で説明され得るが、本開示はまた、単一の実施形態で実施することもできる。本明細書中で使用されるセクション見出しは、まとめる目的のみのためであり、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。
本開示の特徴は、添付の特許請求の範囲に特に記載されている。下記の詳細な説明（これは本開示の原理が利用される例示的実施形態を提示する）を参照することによって、そして下記において説明する添付図面を考慮して、本開示の特徴および利点のよりよい理解が得られる。
図1は、従来の塩基エディターABE7.10 (上) と、マルチエフェクター核酸塩基エディターであるpNMG-B79 (中央) との塩基修飾活性の比較を、未処理配列 (下) と対比させて示す。
図2は、マルチエフェクター核酸塩基エディターの3つのバージョンを示す概略図を提供する。
図3Aは、図3Bに示されるゲノムDNAを改変するために使用されたマルチエフェクター核酸塩基エディターの概略図を提供する。図3Bは、図3Aに示されるマルチエフェクター核酸塩基エディターの塩基改変活性の比較を示す。
図4Aは、図4Bおよび4Cに示されるようにHBG1部位を改変するために使用されたマルチエフェクター核酸塩基エディターに存在するドメインを示す概略図を提供する。
図5Aは、従来の塩基エディターABE7.10 (上) とpNMG-B79 (中央) との塩基編集活性の比較を、未処理配列 (下) と対比させて示す。pNMG-B79マルチエフェクター核酸塩基エディターの概略図も提供されている。図5Bは、図5Aに要約された配列決定結果の例示的リード（reads）を示す。図5Cは、従来型の塩基エディターABE7.10 (上) とpNMG-B79との活性を比較する実験についての配列決定結果を示す。
図6は、ABE7.10とpNMG-B79との間のインデル率の比較を示す。
図7Aおよび図7Bは、指定されたマルチエフェクター核酸塩基エディターおよび図7Bの下の未処理配列と対比される従来の塩基エディターABE7.10 (上)の塩基編集活性の比較を示す。生じたインデルのパーセントを図の右端に示している。
図8Aおよび8Bは、それぞれ、pCMV_ABEmaxについてのプラスミドマップおよびコドン最適化ヌクレオチド配列である。図8Cおよび8Dは、それぞれ、pCMV_AncBE4maxについてのプラスミドマップおよびコドン最適化ヌクレオチド配列である。図8Eおよび8Fは、それぞれ、pCMV_BE4 maxについてのプラスミドマップおよびコドン最適化ヌクレオチド配列である。
本発明は、マルチエフェクター核酸塩基エディター、およびそれらを使用して標的核酸塩基配列において改変を生成する方法を特徴とする。本発明は、シチジンデアミナーゼドメイン、nCas9ドメイン、およびアデノシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質が標的配列に二重の塩基編集を導入することができるという驚くべき発見に少なくとも部分的に基づく。特に、単一ポリペプチドのマルチエフェクター核酸塩基エディターは、例えばHEK293T細胞などの哺乳動物細胞で発現させた場合に、DNA中でAをGに、CをTに変換した。
本発明のマルチエフェクター核酸塩基エディターは、とりわけ核酸配列の標的化編集に有用な融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、インビトロでのDNAの標的化編集のために使用され得、例えば、調節配列の活性を変化させる突然変異、または抗体の相補性決定領域 (CDR) のようなコードされたタンパク質の活性を変化させる突然変異を導入するために使用され得る。
［核酸塩基エディター］
ポリヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列を編集、修飾または改変するための塩基エディターまたは核酸塩基エディターが本明細書に開示される。本明細書に記載されるのは、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインおよび核酸塩基編集ドメインを含む核酸塩基エディターまたは塩基エディターである。特定の実施形態において、マルチエフェクター核酸塩基エディターが提供され、これは、アデノシンデアミナーゼドメインおよびシチジンデアミナーゼドメインのうちの1つ以上（例えば2つ）、ならびにDNAグリコシラーゼドメインを含み、上記のドメインはポリヌクレオチド結合ドメインに融合されており、それによって核酸分子内の複数の異なる塩基で変化を誘導することができる核酸塩基エディターを形成するものである。ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインは、結合されたガイドポリヌクレオチド（例えばgRNA）と一緒である場合に、（結合されたガイド核酸の塩基と標的ポリヌクレオチド配列の塩基との間の相補的塩基対形成を介して）標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合することができ、それによって、編集されることが所望される標的核酸配列に塩基エディターを局在化させることができる。或る実施態様では、標的ポリヌクレオチド配列は一本鎖DNAまたは二本鎖DNAを含む。或る実施態様では、標的ポリヌクレオチド配列はRNAを含む。或る実施態様では、標的ポリヌクレオチド配列はDNA-RNAハイブリッドを含む。
［ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメイン］
ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインはまた、RNAに結合する核酸プログラム可能タンパク質を含むことができることを理解されたい。例えば、ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインをRNAにガイドする核酸と結合され得る。他の核酸プログラム可能DNA結合タンパク質もまた、本開示の範囲内にあるが、それらは本開示には特に列記されていない。
塩基エディターのポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインは、それ自体が1つ以上のドメインを含むことができる。例えば、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインは、1つ以上のヌクレアーゼドメインを含むことができる。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインのヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼを含むことができる。本明細書において、用語「エキソヌクレアーゼ」は、核酸(例えばRNAまたはDNA)を遊離末端から消化することができるタンパク質またはポリペプチドを指し、用語「エンドヌクレアーゼ」は、核酸(例えばDNAまたはRNA)の内部領域を触媒(例えば劈開)することができるタンパク質またはポリペプチドを指す。ある態様において、エンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸の一本鎖を切断することができる。ある態様において、エンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸分子の両方の鎖を切断することができる。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインは、デオキシリボヌクレアーゼであり得る。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインは、リボヌクレアーゼであり得る。
ある態様において、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインのヌクレアーゼドメインは、標的ポリヌクレオチドの0本、1本または2本の鎖を切断することができる。ある場合には、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインは、ニッカーゼドメインを含むことができる。本明細書において、用語「ニッカーゼ」は、二本鎖核酸分子(例えばDNA)中の二本鎖の一方の鎖のみを切断することができるヌクレアーゼドメインを含むポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインを指す。ある態様において、ニッカーゼは、活性なポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインに一つ以上の突然変異を導入することによって、ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインの完全に触媒活性な(例えば天然の)形態から誘導することができる。例えば、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインがCas9に由来するニッカーゼドメインを含む場合、Cas9に由来するニッカーゼドメインは、D10A突然変異および位置840におけるヒスチジンを含むことができる。そのような場合、残基H 840は触媒活性を保持し、それによって核酸二本鎖の一本鎖を切断することができる。別の例において、Cas9由来ニッカーゼドメインは、H840A突然変異を含むことができ、一方、位置10におけるアミノ酸残基は、Dのままである。いくつかの実施形態において、ニッカーゼは、ニッカーゼ活性に必要ではないヌクレアーゼドメインの全部または一部を除去することによって、ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインの完全に触媒活性な(例えば天然の)形態から誘導することができる。例えば、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインがCas9に由来するニッカーゼドメインを含む場合、Cas9に由来するニッカーゼドメインは、RuvCドメインまたはHNHドメインの全部または一部の欠失を含むことができる。
例示的な触媒活性Cas9のアミノ酸配列は以下の通りである：
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD.
したがって、ニッカーゼドメインを含むポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインを含む塩基エディターは、特定のポリヌクレオチド標的配列(例えば結合したガイド核酸の相補的配列によって決定される)において一本鎖DNA切断 (ニック) を生成することができる。ある態様において、ニッカーゼドメイン(例えばCas9由来のニッカーゼドメイン)を含む塩基エディターによって切断される核酸二本鎖標的ポリヌクレオチド配列の鎖は、塩基エディターによって編集されない鎖である(すなわち、塩基エディタによって切断される鎖は、編集される塩基を含む鎖とは反対の鎖である)。他の態様において、ニッカーゼドメイン(例えばCas9由来のニッカーゼドメイン)を含む塩基エディターは、編集のために標的とされるDNA分子の鎖を切断することができる。このような場合、非標的鎖は切断されない。
触媒的に死んだ(すなわち標的ポリヌクレオチド配列を切断することができない)ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインを含む塩基エディターも本明細書中に提供される。本明細書において、用語「触媒的に死んだ」および「ヌクレアーゼ不活」は、核酸の鎖を切断することができない結果となる一つ以上の突然変異および/または欠失を有するポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインを指すために交換可能に使用される。いくつかの実施形態において、触媒的に死んだポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメイン塩基エディターは、1つ以上のヌクレアーゼドメインにおける特定の点突然変異の結果としてヌクレアーゼ活性を欠くことができる。例えば、Cas9ドメインを含む塩基エディターの場合、Cas9は、D10A突然変異およびH840A突然変異の両方を含むことができる。このような変異は両方のヌクレアーゼドメインを不活性化し、その結果ヌクレアーゼ活性を失う。他の実施形態において、触媒的に死んだポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインは、触媒ドメイン(例えばRuvC1および/またはHNHドメイン)の全部又は一部の一つ以上の欠失を含むことができる。さらなる態様において、触媒的に死んだポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインは、点突然変異(例えばD10AまたはH840A)ならびにヌクレアーゼドメインの全部または一部の欠失を含む。
また、本明細書では、ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインの以前に機能していたバージョンから、触媒的に死んだポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインを生成することができる突然変異も企図される。例えば、触媒的に死んだCas9 (「dCas9」) の場合、D10AおよびH840A以外の突然変異を有してヌクレアーゼ不活性化Cas9をもたらすバリアントが提供される。このような突然変異は、例えば、D10およびH840における他のアミノ酸置換、またはCas9のヌクレアーゼドメイン内の他の置換(例えば、HNHヌクレアーゼサブドメインおよび/またはRuvC1サブドメインにおける置換)を含む。さらなる適切なヌクレアーゼ不活性dCas9ドメインは、本開示および当該分野における知識に基づいて当業者に明らかとなり得、本開示の範囲内である。このようなさらなる例示的な適切なヌクレアーゼ不活性Cas9ドメインには、限定されるものではないが、D10A/H840A、D10A/D839A/H840A、およびD10A/D839A/H840A/N863A突然変異体ドメインが含まれる(例えば、Prashant et al., CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838を参照されたい (その全内容は参照により本明細書に組み込まれる))。
塩基エディターに組み込むことができるポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインの非限定的な例としては、CRISPRタンパク質由来ドメイン、制限ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、TALヌクレアーゼ(TALEN) 、およびジンクフィンガーヌクレアーゼ (ZFN) が挙げられる。いくつかの場合において、塩基エディターは、核酸のCRISPR (すなわちClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)媒介修飾の際に、結合ガイド核酸を介して核酸配列に結合することができる天然もしくは修飾されたタンパク質またはその一部を含むポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインを含む。そのようなタンパク質は、本明細書において「CRISPRタンパク質」と呼ばれる。従って、本明細書に開示されているのは、CRISPRタンパク質の全部または一部を含むポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインを含む塩基エディター（すなわち、CRISPRタンパク質の全部または一部をドメインとして含む塩基エディター（それは塩基エディターの「CRISPRタンパク質由来ドメイン」とも呼ばれる））である。塩基エディターに組み込まれたCRISPRタンパク質由来ドメインは、野生型または天然型のCRISPRタンパク質と比較して改変され得る。例えば、以下に記載するように、CRISPRタンパク質由来ドメインは、野生型または天然型のCRISPRタンパク質と比較して、1以上の突然変異、挿入、欠失、再配列および/または組換えを含み得る。
CRISPRは、可動遺伝要素(ウイルス、転移因子、接合プラスミド)に対する防御を提供する適応免疫系である。CRISPRクラスターは、スペーサー、先行する可動要素に相補的な配列、および標的侵入核酸を含む。CRISPRクラスターは転写され、CRISPR RNA (crRNA) にプロセシングされる。II型CRISPRシステムでは、pre‐crRNAの正しいプロセシングはトランスコード小RNA (tracrRNA)、内因性リボヌクレアーゼ3 (rnc) 、およびCas9タンパク質を必要とする。tracrRNAはリボヌクレアーゼ3によるpre-crRNAのプロセシングのガイドとなる。続いて、Cas9/crRNA/tracrRNAが、スペーサーに相補的な線状または環状のdsDNA標的をエンドヌクレアーゼで切断する。crRNAに相補的でない標的鎖は、最初にエンドヌクレアーゼ的に切断され、次にエキソヌクレアーゼ的に3’-5’にトリムされる。自然界では、DNA結合と切断にはタンパク質と両方のRNAが必要である。しかしながら、crRNAおよびtracrRNAの両方の側面を単一のRNA種に組み込むように、単一ガイドRNA (「sgRNA」、あるいは単に「gRNA」)を作製することができる。例えばJinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)を参照されたい（その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる）。Cas9は、CRISPR反復配列中の短いモチーフ(PAMまたはプロトスペーサー隣接モチーフ)を認識して、「自己」と「非自己」を区別することを助ける。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、組み換え操作された（engineered）Casタンパク質を利用することができる。ガイドRNA (gRNA) は、Cas結合に必要な足場配列と、修飾されるゲノム標的を規定するユーザー定義の約20塩基スペーサーとからなる短い合成RNAである。したがって、当業者はCasタンパク質特異性のゲノム標的を変化させることができ、これは、ゲノムの他の部分と比較してgRNA標的化配列がゲノム標的に対していかに特異的であるかによって部分的に決定される。
いくつかの実施形態において、gRNA足場配列は以下の通りである：GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU。
いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたCRISPRタンパク質由来ドメインは、結合ガイド核酸と組み合わせられた場合に標的ポリヌクレオチドに結合することができるエンドヌクレアーゼ(例えばデオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼ)である。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたCRISPRタンパク質由来ドメインは、結合ガイド核酸と組み合わせられた場合に標的ポリヌクレオチドに結合することができるニッカーゼである。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたCRISPRタンパク質由来ドメインは、結合ガイド核酸と組み合わせられた場合に標的ポリヌクレオチドに結合することができる触媒的に死んだドメインである。或る実施態様では、塩基エディターのCRISPRタンパク質由来ドメインに結合する標的ポリヌクレオチドはDNAであり、或る実施態様では、塩基エディターのCRISPRタンパク質由来ドメインに結合する標的ポリヌクレオチドはRNAである。
本明細書中で用いることができるCAsタンパク質は、クラス1およびクラス2を含む。Casタンパク質の非限定的な例としては、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5d、Cas5t、Cas5h、Cas5a、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(Csn1またはCsx12とも呼ばれる)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Csy4、Cse1、Cse2、Cse3、Cse4、Cse5、Csn1、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Cssx16、Cx16、Cx、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Csd1、Csd2、Cst1、Cst2、Csh1、Csh2、Csa1、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5、Cas12a/Cpf1、Cas12b/C2c1、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、Cas12i、CARF、DinG、それらのホモログ、またはそれらの改変体が挙げられる。未改変のCRISPR酵素は、Cas9のように、2つの機能性エンドヌクレアーゼ領域、RuvCおよびHNHを有するDNA切断活性を有することができる。CRISPR酵素は、標的配列内および/または標的配列の相補鎖内などの標的配列において、一方または両方の鎖の切断を誘導することができる。例えば、CRISPR酵素は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドから約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500塩基対またはそれ以上にある一方または両方の鎖の切断を誘導することができる。
標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠失するように、対応する野生型酵素に対して変異されたCRISPR酵素をコードするベクターを用いることができる。Cas9は、野生型の例示的なCas9ポリペプチド(例えばS. pyogenesからのCas9)と少なくとも、または少なくともおよそ、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性および/または配列相同性を有するポリペプチドを指すことができる。Cas9は、野生型の例示的なCas9ポリペプチド(例えばS.pyogenesからのもの)に対して、最大で、または最大でおよそ、約50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性および/または配列相同性を有するポリペプチドを指すことができる。Cas9は、野生型、または欠失、挿入、置換、バリアント、突然変異、融合、キメラ、またはそれらの任意の組合せなどのアミノ酸変化を含み得るCas9タンパク質の改変型を指すことができる。
ある態様において、塩基エディターのCRISPRタンパク質由来ドメインは、Corynebacterium ulcerans (NCBI Refs: NC_015683.1, NC_017317.1); Corynebacterium diphtheria (NCBI Refs: NC_016782.1, NC_016786.1); Spiroplasma syrphidicola (NCBI Ref: NC_021284.1); Prevotella intermedia (NCBI Ref: NC_017861.1); Spiroplasma taiwanense (NCBI Ref: NC_021846.1); Streptococcus iniae (NCBI Ref: NC_021314.1); Belliella baltica (NCBI Ref: NC_018010.1); Psychroflexus torquis (NCBI Ref: NC_018721.1); Streptococcus thermophilus (NCBI Ref: YP_820832.1); Listeria innocua (NCBI Ref: NP_472073.1); Campylobacter jejuni (NCBI Ref: YP_002344900.1); Neisseria meningitidis (NCBI Ref: YP_002342100.1), Streptococcus pyogenes, または Staphylococcus aureus由来のCas9の全部または一部を含むことができる。
［核酸塩基エディターのCas9ドメイン］
Cas9ヌクレアーゼの配列および構造は、当業者によく知られている(例えば“Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes.” Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C, Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); “CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.” Deltcheva E., Chylinski K., Sharma CM., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011); および “A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.” Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)参照。その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。)。Cas9オーソログは、限定されるものではないが、S.pyogenesおよびS.thermophilusを含む種々の種において記述されてきた。さらなる適切なCas9ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づいて当業者に明らかとなり、そのようなCas9ヌクレアーゼおよび配列は、Chylinski, Rhun, and Charpentier, “The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems” (2013) RNA Biology 10:5, 726-737に開示されている生物および遺伝子座由来のCas9配列を含む。その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、核酸プログラミング可能DNA結合タンパク質 (napDNAbp) は、Cas9ドメインである。非限定的な例示的Cas9ドメインが本明細書で提供される。Cas9ドメインは、ヌクレアーゼ活性Cas9ドメイン、ヌクレアーゼ不活性Cas9ドメイン、またはCas9ニッカーゼであり得る。ある態様において、Cas9ドメインは、ヌクレアーゼ活性ドメインである。例えば、Cas9ドメインは、二本鎖核酸の両方の鎖（例えば二本鎖DNA分子の両方の鎖）を切断するCas9ドメインであり得る。いくつかの実施形態において、Cas9ドメインは、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。いくつかの実施形態において、Cas9ドメインは、本明細書に記載されたアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Cas9ドメインは、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか１つと比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはそれ以上の突然変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Cas9ドメインは、本明細書に記載されたアミノ酸配列のいずれか１つと比較して、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100、または少なくとも1200個の同一の一続きのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
ある態様において、Cas9の断片を含むタンパク質が提供される。例えば、いくつかの実施形態において、タンパク質は、以下の2つのCas9ドメインのうちの1つを含む：(1) Cas9のgRNA結合ドメイン;(2) Cas9のDNA切断ドメイン。ある態様において、Cas9またはその断片を含むタンパク質は、「Cas9バリアント」と称される。Cas9バリアントは、Cas9またはその断片と相同性を共有する。例えば、Cas9バリアントは、野生型Cas9と少なくとも約70%同一、少なくとも約80%同一、少なくとも約90%同一、少なくとも約95%同一、少なくとも約96%同一、少なくとも約97%同一、少なくとも約98%同一、少なくとも約99%同一、少なくとも約99.5%同一、または少なくとも約99.9%同一である。いくつかの実施形態において、Cas9変異体は、野生型Cas9と比較して、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50またはそれ以上のアミノ酸変化を有し得る。いくつかの実施形態において、Cas9バリアントは、Cas9の断片 (例えばgRNA結合ドメインまたはDNA切断ドメイン)を含み、その断片は、野生型Cas9の対応する断片と少なくとも約70%同一であり、少なくとも約80%同一であり、少なくとも約90%同一であり、少なくとも約95%同一であり、少なくとも約96%同一であり、少なくとも約97%同一であり、少なくとも約98%同一であり、少なくとも約99%同一であり、少なくとも約99.5%同一であり、または少なくとも約99.9%同一である。ある態様において、断片は、対応する野生型Cas9のアミノ酸長の少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%である。ある態様において、断片は、長さが少なくとも100アミノ酸である。ある態様において、断片は、少なくとも100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, または少なくとも 1300アミノ酸の長さである。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるCas9融合タンパク質は、Cas9タンパク質の全長アミノ酸配列、例えば、本明細書に提供されるCas9配列の1つを含む。しかしながら、他の実施形態において、本明細書に提供される融合タンパク質は、全長Cas9配列を含まず、その1つ以上の断片のみを含む。好適なCas9ドメインおよびCas9断片の例示的アミノ酸配列が本明細書に提供され、Cas9ドメインおよび断片のさらなる好適な配列は、当業者には明らかであろう。
Cas9タンパク質は、そのガイドRNAに相補的な特定のDNA配列にCas9タンパク質をガイドする、ガイドRNAと結合することができる。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインは、Cas9ドメイン、例えばヌクレアーゼ活性Cas9、Cas9ニッカーゼ (nCas9) 、またはヌクレアーゼ不活性Cas9 (dCas9) である。核酸プログラム可能なDNA結合タンパク質の例としては、Cas9 (例:dCas9およびnCas9)、Cas12a/Cpfl、Cas12b/C2cl、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、およびCas12iが挙げられるが、これらに限定されない。
ある態様において、野生型Cas9は、Streptococcus pyogenes由来のCas9に対応する（NCBI参照配列：NC_017053.1、ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列は以下の通り）。

ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGATTATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGGCAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGCAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAATCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTAGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAGAAATGGCTTGTTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGATTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATAGTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAGCGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAGGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGCGCCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGGGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGATATTCAAAAAGCACAGGTGTCTGGACAAGGCCATAGTTTACATGAACAGATTGCTAACTTAGCTGGCAGTCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAATTGTTGATGAACTGGTCAAAGTAATGGGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTACAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCATTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTACTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA

Figure 2021532794
（一重下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）
いくつかの実施形態において、野生型Cas9は、以下のヌクレオチドおよび/またはアミノ酸配列に対応するか、またはこれらを含む：
ATGGATAAAAAGTATTCTATTGGTTTAGACATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAACTTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATTACTCCATGGAATTTTGAGGAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAACTTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCACAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATCACATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAAATCACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCCTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGACGGATCCCCCAAGAAGAAGAGGAAAGTCTCGAGCGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGGCTGCAGGA

Figure 2021532794
（一重下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）
ある態様において、野生型Cas9は、Streptococcus pyogenesからのCas9（NCBI Reference Sequence: NC_002737.2（ヌクレオチド配列は以下の通り）およびUniprot Reference Sequence: Q99ZW2（アミノ酸配列は以下の通り）に対応する：
ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGTAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAACCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTGGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATGGCTTATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATACTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAACGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGATAGTTTACATGAACATATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAGTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTCTTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA

Figure 2021532794
（一重下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）
いくつかの実施態様において、Cas9は、Corynebacterium ulcerans (NCBI Refs: NC_015683.1, NC_017317.1); Corynebacterium diphtheria (NCBI Refs: NC_016782.1, NC_016786.1); Spiroplasma syrphidicola (NCBI Ref: NC_021284.1); Prevotella intermedia (NCBI Ref: NC_017861.1); Spiroplasma taiwanense (NCBI Ref: NC_021846.1); Streptococcus iniae (NCBI Ref: NC_021314.1); Belliella baltica (NCBI Ref: NC_018010.1); Psychroflexus torquisI (NCBI Ref: NC_018721.1); Streptococcus thermophilus (NCBI Ref: YP_820832.1), Listeria innocua (NCBI Ref: NP_472073.1), Campylobacter jejuni (NCBI Ref: YP_002344900.1) もしくは Neisseria meningitidis (NCBI Ref: YP_002342100.1) からのCas9を表し、または任意の他の生物からのCas9を表す。
追加的なCas9タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ不活（dead）Cas9（dCas9）、Cas9ニッカーゼ（nCas9）、またはヌクレアーゼ活性Cas9)は、そのバリアントおよびホモログを含めて、本開示の範囲内にあることを理解されたい。例示的なCas9タンパク質は、限定されるものではないが、以下に提供されるものを含む。ある態様において、Cas9タンパク質は、ヌクレアーゼ不活Cas9 (dCas9) である。ある態様において、Cas9タンパク質は、Cas9ニッカーゼ(nCas9) である。いくつかの実施形態において、Cas9タンパク質はヌクレアーゼ活性Cas9である。
ある態様において、Cas9ドメインは、ヌクレアーゼ不活性Cas9ドメイン(dCas9) である。例えば、dCas9ドメインは、二本鎖核酸分子のいずれの鎖も切断することなく、二本鎖核酸分子に結合し得る(例えば、gRNA分子を介して)。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ不活性dCas9ドメインは、本明細書中に記載されたアミノ酸配列のD10X突然変異およびH840X突然変異、または本明細書中に提供されたアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、Xは任意のアミノ酸変化である。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ不活性dCas9ドメインは、本明細書に記載のアミノ酸配列のD10A突然変異およびH840A突然変異、または本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。一例として、ヌクレアーゼ不活性Cas9ドメインは、クローニングベクターpPlatTET-gRNA 2 (アクセス番号BAV54124)中に提供される以下のアミノ酸配列を含む：
例示的な、触媒的に不活性なCas9 (dCas9) のアミノ酸配列は、以下の通りである：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
（例えばQi et al., “Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.” Cell. 2013; 152(5):1173-83参照（その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる））。
ある態様において、Cas9ヌクレアーゼは、不活性な(例えば不活化された) DNA切断ドメインを有し、すなわち、Cas9は、「nCas9」タンパク質（「nickase」Cas9の意）と呼ばれるニッカーゼである。ヌクレアーゼ不活性化Cas9タンパク質は、互換的に「dCas9」タンパク質（nuclease-“dead” Cas9の意）または触媒的に不活性なCas9とも称され得る。不活性なDNA切断ドメインを有するCas9タンパク質(又はその断片)を生成する方法は公知である(例えばJinek et al, Science. 337:816-821(2012); Qi et al, “Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression” (2013) Cell. 28; 152(5): 1173-83参照 (各内容は参照により本明細書に組み込まれる))。例えば、Cas9のDNA切断ドメインは、HNHヌクレアーゼサブドメインとRuvC1サブドメインという2つのサブドメインを含むことが知られている。HNHサブドメインはgRNAに相補的な鎖を切断し、RuvC1サブドメインは非相補的な鎖を切断する。これらのサブドメイン内の変異はCas9のヌクレアーゼ活性を抑制し得る。例えば、突然変異D10AおよびH840Aは、S. pyogenes Cas9 のヌクレアーゼ活性を完全に不活性化する（Jinek et al, Science. 337:816-821(2012); Qi et al, Cell. 28;152(5): 1173-83 (2013)）。
いくつかの実施形態において、dCas9ドメインは、本明細書に提供されるdCas9ドメインのいずれかに対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Cas9ドメインは、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれかと比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれ以上の突然変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Cas9ドメインは、本明細書に記載されたアミノ酸配列のいずれかと比較して、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100、または少なくとも1200の同一の連続したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
ある態様において、dCas9は、Cas9ヌクレアーゼ活性を不活性化する1以上の突然変異を有するCas9アミノ酸配列に対応するか、またはその一部もしくは全体を含む。例えば、いくつかの実施形態において、dCas9ドメインは、D10AおよびH840A突然変異または別のCas9における対応する突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、dCas9は、dCas9 (D10AおよびH840A)のアミノ酸配列を含む：
Figure 2021532794
（一重下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）
いくつかの実施形態において、Cas9ドメインはD10A突然変異を含み、一方、上記で提供したアミノ酸配列における位置840における残基、または本明細書で提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する位置における残基は、ヒスチジンのままである。
他の実施形態において、例えばヌクレアーゼ不活性化Cas9 (dCas9) をもたらす、D10AおよびH840A以外の突然変異を有するdCas9バリアントが提供される。このような突然変異は、例えば、D10およびH840における他のアミノ酸置換、またはCas9のヌクレアーゼドメイン内の他の置換(例えば、HNHヌクレアーゼサブドメインおよび/またはRuvC1サブドメインにおける置換)を含む。ある態様において、dCas9のバリアントまたはホモログであって、少なくとも約70%同一、少なくとも約80%同一、少なくとも約90%同一、少なくとも約95%同一、少なくとも約98%同一、少なくとも約99%同一、少なくとも約99.5%同一、または少なくとも約99.9%の同一性を有するものが提供される。ある態様において、約5アミノ酸、約10アミノ酸、約15アミノ酸、約20アミノ酸、約25アミノ酸、約30アミノ酸、約40アミノ酸、約50アミノ酸、約75アミノ酸、約100アミノ酸またはそれ以上だけ短いまたは長いアミノ酸配列を有するdCas9のバリアントが提供される。
ある態様において、Cas9ドメインは、Cas9ニッカーゼである。Cas9ニッカーゼは、二本鎖核酸分子(例えば二本鎖DNA分子)の一方の鎖のみを切断することができるCas9タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、Cas9ニッカーゼは、二本鎖核酸分子の標的鎖を切断し、これは、Cas9ニッカーゼが、Cas9に結合しているgRNA（例えばsgRNA）と塩基対を形成している（相補的である）鎖を切断することを意味する。ある態様において、Cas9ニッカーゼは、D10A突然変異を含み、位置840にヒスチジンを有する。いくつかの実施形態において、Cas9ニッカーゼは、二本鎖核酸分子の非標的、非塩基編集鎖を切断し、これは、Cas9ニッカーゼが、Cas9に結合しているgRNA（例えばsgRNA）と塩基対を形成していない鎖を切断することを意味する。ある態様において、Cas9ニッカーゼは、H840A突然変異を含み位置10にアスパラギン酸残基を有するか、または対応する突然変異。いくつかの実施形態において、Cas9ニッカーゼは、本明細書に提供されるCas9ニッカーゼのいずれかと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性であるアミノ酸配列を含む。さらなる適切なCas9ニッカーゼは、本開示および当該分野における知識に基づいて当業者に明らかであり、本開示の範囲内である。
例示的な触媒的Cas9ニッカーゼ (nCas9) のアミノ酸配列は、以下の通りである：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
ある態様において、Cas9は、単細胞原核微生物のドメインおよび界を構成する古細菌(例えばナノアーキア)由来のCas9を指す。ある態様において、プログラミング可能なヌクレオチド結合タンパク質は、例えば、Burstein et al., "New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes." Cell Res. 2017 Feb 21. doi: 10.1038/cr.2017.21に記載されているCasXまたはCasYタンパク質であり得、その全体の内容は参照により本明細書に組み込まれる。ゲノム分解メタゲノミクスを用いて、生命の古細菌ドメインにおいて最初に報告されたCas9を含め、多くのCRISPR‐Cas系が同定された。この分岐Cas9タンパク質は、ほとんど研究されていないナノアーキアにおいて、活性CRISPR‐Cas系の一部として発見された。細菌では、それまで知られていなかった二つの系、CRISPR-CasXとCRISPR-CasYが発見され、それらは、これまでに発見された中でも最もコンパクトな系に入る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される塩基エディターシステムにおいて、Cas9は、CasXまたはCasXのバリアントによって置き換えられる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される塩基エディターシステムにおいて、Cas9は、CasYまたはCasYのバリアントによって置き換えられる。核酸プログラム可能DNA結合タンパク質 (napDNAbp) として他のRNA誘導DNA結合タンパク質も使用され得、本開示の範囲内であることが理解されるべきである。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかの核酸プログラム可能DNA結合タンパク質 (napDNAbp) は、CasXまたはCasYタンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、napDNAbpはCasXタンパク質である。いくつかの実施形態において、napDNAbpはCasYタンパク質である。いくつかの実施形態において、napDNAbpは、天然に存在するCasXまたはCasYタンパク質に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、プログラミング可能なヌクレオチド結合タンパク質は、天然に存在するCasXまたはCasYタンパク質である。いくつかの実施形態において、プログラミング可能なヌクレオチド結合タンパク質は、本明細書に記載されるいずれかのCasXまたはCasYタンパク質に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の細菌種由来のCasXおよびCasYもまた、本開示に従って使用され得ることが理解されるべきである。
例示的なCasX ((uniprot.org/uniprot/F0NN87; uniprot.org/uniprot/F0NH53) tr|F0NN87|F0NN87_SULIHCRISPR-associatedCasx protein OS = Sulfolobus islandicus (strain HVE10/4) GN = SiH_0402 PE=4 SV=1) のアミノ酸配列は以下のとおりである：
MEVPLYNIFGDNYIIQVATEAENSTIYNNKVEIDDEELRNVLNLAYKIAKNNEDAAAERRGKAKKKKGEEGETTTSNIILPLSGNDKNPWTETLKCYNFPTTVALSEVFKNFSQVKECEEVSAPSFVKPEFYEFGRSPGMVERTRRVKLEVEPHYLIIAAAGWVLTRLGKAKVSEGDYVGVNVFTPTRGILYSLIQNVNGIVPGIKPETAFGLWIARKVVSSVTNPNVSVVRIYTISDAVGQNPTTINGGFSIDLTKLLEKRYLLSERLEAIARNALSISSNMRERYIVLANYIYEYLTG SKRLEDLLYFANRDLIMNLNSDDGKVRDLKLISAYVNGELIRGEG.
例示的なCasX (>tr|F0NH53|F0NH53_SULIR CRISPR associated protein, Casx OS = Sulfolobus islandicus (strain REY15A) GN=SiRe_0771 PE=4 SV=1) のアミノ酸配列は以下のとおりである：
MEVPLYNIFGDNYIIQVATEAENSTIYNNKVEIDDEELRNVLNLAYKIAKNNEDAAAERRGKAKKKKGEEGETTTSNIILPLSGNDKNPWTETLKCYNFPTTVALSEVFKNFSQVKECEEVSAPSFVKPEFYKFGRSPGMVERTRRVKLEVEPHYLIMAAAGWVLTRLGKAKVSEGDYVGVNVFTPTRGILYSLIQNVNGIVPGIKPETAFGLWIARKVVSSVTNPNVSVVSIYTISDAVGQNPTTINGGFSIDLTKLLEKRDLLSERLEAIARNALSISSNMRERYIVLANYIYEYLTGSKRLEDLLYFANRDLIMNLNSDDGKVRDLKLISAYVNGELIRGEG.
Deltaproteobacteria CasX
MEKRINKIRKKLSADNATKPVSRSGPMKTLLVRVMTDDLKKRLEKRRKKPEVMPQVISNNAANNLRMLLDDYTKMKEAILQVYWQEFKDDHVGLMCKFAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPVKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDfAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPVVERRENEVDWWNTINEVKKLIDAKRDMGRVFWSGVTAEKRNTILEGYNYLPNENDHKKREGSLENPKKPAKRQFGDLLLYLEKKYAGDWGKVFDEAWERIDKKIAGLTSHIEREEARNAEDAQSKAVLTDWLRAKASFVLERLKEMDEKEFYACEIQLQKWYGDLRGNPFAVEAENRVVDISGFSIGSDGHSIQYRNLLAWKYLENGKREFYLLMNYGKKGRIRFTDGTDIKKSGKWQGLLYGGGKAKVIDLTFDPDDEQLIILPLAFGTRQGREFIWNDLLSLETGLIKLANGRVIEKTIYNKKIGRDEPALFVALTFERREVVDPSNIKPVNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLPEFKDSSGGPTDILRIGEGYKEKQRAIQAAKEVEQRRAGGYSRKFASKSRNLADDMVRNSARDLFYHAVTHDAVLVFANLSRGFGRQGKRTFMTERQYTKMEDWLTAKLAYEGLTSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITYADMDVMLVRLKKTSDGWATTLNNKELKAEYQITYYNRYKRQTVEKELSAELDRLSEESGNNDISKWTKGRRDEALFLLKKRFSHRPVQEQFVCLDCGHEVHAAEQAALNIARSWLFLNSNSTEFKSYKSGKQPFVGAWQAFYKRRLKEVWKPNA
例示的なCasY ((ncbi.nlm.nih.gov/protein/APG80656.1) >APG80656.1 CRISPR-associated protein CasY [uncultured Parcubacteria group bacterium]) のアミノ酸配列は以下のとおりである：
MSKRHPRISGVKGYRLHAQRLEYTGKSGAMRTIKYPLYSSPSGGRTVPREIVSAINDDYVGLYGLSNFDDLYNAEKRNEEKVYSVLDFWYDCVQYGAVFSYTAPGLLKNVAEVRGGSYELTKTLKGSHLYDELQIDKVIKFLNKKEISRANGSLDKLKKDIIDCFKAEYRERHKDQCNKLADDIKNAKKDAGASLGERQKKLFRDFFGISEQSENDKPSFTNPLNLTCCLLPFDTVNNNRNRGEVLFNKLKEYAQKLDKNEGSLEMWEYIGIGNSGTAFSNFLGEGFLGRLRENKITELKKAMMDITDAWRGQEQEEELEKRLRILAALTIKLREPKFDNHWGGYRSDINGKLSSWLQNYINQTVKIKEDLKGHKKDLKKAKEMINRFGESDTKEEAVVSSLLESIEKIVPDDSADDEKPDIPAIAIYRRFLSDGRLTLNRFVQREDVQEALIKERLEAEKKKKPKKRKKKSDAEDEKETIDFKELFPHLAKPLKLVPNFYGDSKRELYKKYKNAAIYTDALWKAVEKIYKSAFSSSLKNSFFDTDFDKDFFIKRLQKIFSVYRRFNTDKWKPIVKNSFAPYCDIVSLAENEVLYKPKQSRSRKSAAIDKNRVRLPSTENIAKAGIALARELSVAGFDWKDLLKKEEHEEYIDLIELHKTALALLLAVTETQLDISALDFVENGTVKDFMKTRDGNLVLEGRFLEMFSQSIVFSELRGLAGLMSRKEFITRSAIQTMNGKQAELLYIPHEFQSAKITTPKEMSRAFLDLAPAEFATSLEPESLSEKSLLKLKQMRYYPHYFGYELTRTGQGIDGGVAENALRLEKSPVKKREIKCKQYKTLGRGQNKIVLYVRSSYYQTQFLEWFLHRPKNVQTDVAVSGSFLIDEKKVKTRWNYDALTVALEPVSGSERVFVSQPFTIFPEKSAEEEGQRYLGIDIGEYGIAYTALEITGDSAKILDQNFISDPQLKTLREEVKGLKLDQRRGTFAMPSTKIARIRESLVHSLRNRIHHLALKHKAKIVYELEVSRFEEGKQKIKKVYATLKKADVYSEIDADKNLQTTVWGKLAVASEISASYTSQFCGACKKLWRAEMQVDETITTQELIGTVRVIKGGTLIDAIKDFMRPPIFDENDTPFPKYRDFCDKHHISKKMRGNSCLFICPFCRANADADIQASQTIALLRYVKEEKKVEDYFERFRKLKNIKVLGQMKKI.
ある態様において、核酸プログラム可能DNA結合タンパク質 (napDNAbp) は、微生物CRISPR-Cas系の単一のエフェクターである。微生物CRISPR-Cas系の単一エフェクターは、Cas9、Cas12a/Cpfl、Cas12b/C2cl、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、およびCas12iを含むが、これらに限定されない。典型的には、微生物CRISPR-Cas系はクラス1およびクラス2系に分けられる。クラス1の系は多サブユニットエフェクター複合体をもち、クラス2の系は単一のタンパク質エフェクターをもつ。たとえば、Cas9とCpf1はクラス2エフェクタである。Cas9およびCpf1に加えて、三つの異なるクラス2 CRISPR-Casシステム(Cas12b/C2c1およびCas12c/C2c3)がShmakov et al., “Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems”, Mol. Cell, 2015 Nov. 5; 60(3): 385-397によって記載されている(その全体の内容は参照により本明細書に組み込まれる) 。2つの系、Cas12b/C2c1とCas12c/C2c3のエフェクターはCpf1に関連するRuvC様エンドヌクレアーゼ領域を含む。第3の系は、2つの予測されるHEPN RNaseドメインをもつエフェクターを含む。Cas12b/C2c1によるCRISPR RNAの産生とは異なり、成熟CRISPR RNAの産生がtracrRNA非依存性である。Cas12b/C2c1はDNA切断にCRISPRRNAとtracrRNAの両方に依存する。
Alicyclobaccillus acidoterrastris Cas12b/C2c1 (AacC2c1) の結晶構造が、キメラ単一分子ガイドRNA (sgRNA) との複合体として報告されている。例えば、Liu et al., “C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism”, Mol. Cell, 2017 Jan. 19; 65(2):310-322参照 (その内容全体を参照により本明細書に組み込む) 。また、三元複合体として標的DNAに結合したAlicyclobacillus acidoterrestris C2c1においても結晶構造が報告されている。例えば、Yang et al., “PAM-dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2C1 CRISPR-Cas endonuclease”, Cell, 2016 Dec. 15; 167(7):1814-1828参照（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。標的DNA鎖および非標的DNA鎖の両方と共に、AacC2c1の触媒的にコンピテントな立体配座は、1つのRuvC触媒ポケット内に独立して捕捉され、Cas12b/C2c1媒介切断は標的DNAのスタガード7ヌクレオチドの切断を生じる。Cas 12b/C2c1三元複合体と以前に同定されたCas9およびCpf1対応物の間の構造比較は、 CRISPR‐Cas9システムにより使用される機構の多様性を示す。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかの核酸プログラム可能DNA結合タンパク質 (napDNAbp) は、Cas12b/C2c1またはCas12c/C2c3タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、napDNAbpはCas12b/C2c1タンパク質である。いくつかの実施形態において、napDNAbpはCas12c/C2c3タンパク質である。いくつかの実施形態において、napDNAbpは、天然に存在するCas12b/C2c1またはCas12c/C2c3タンパク質に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、napDNAbpは、天然に存在するCas12b/C2c1またはCas12c/C2c3タンパク質である。いくつかの実施形態において、napDNAbpは、本明細書に提供されるnapDNAbp配列のいずれかに対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の細菌種由来のCas12b/C2c1またはCas12c/C2c3も本開示に従って使用することができることが理解されるべきである。
Cas12b/C2c1 ((uniprot.org/uniprot/T0D7A2#2) sp|T0D7A2|C2C1_ALIAG CRISPR-associated endonuclease C2c1 OS = Alicyclobacillus acido-terrestris (strain ATCC 49025 / DSM 3922/ CIP 106132 / NCIMB 13137/GD3B) GN=c2c1 PE=1 SV=1) のアミノ酸配列は以下の通りである：
MAVKSIKVKLRLDDMPEIRAGLWKLHKEVNAGVRYYTEWLSLLRQENLYRRSPNGDGEQECDKTAEECKAELLERLRARQVENGHRGPAGSDDELLQLARQLYELLVPQAIGAKGDAQQIARKFLSPLADKDAVGGLGIAKAGNKPRWVRMREAGEPGWEEEKEKAETRKSADRTADVLRALADFGLKPLMRVYTDSEMSSVEWKPLRKGQAVRTWDRDMFQQAIERMMSWESWNQRVGQEYAKLVEQKNRFEQKNFVGQEHLVHLVNQLQQDMKEASPGLESKEQTAHYVTGRALRGSDKVFEKWGKLAPDAPFDLYDAEIKNVQRRNTRRFGSHDLFAKLAEPEYQALWREDASFLTRYAVYNSILRKLNHAKMFATFTLPDATAHPIWTRFDKLGGNLHQYTFLFNEFGERRHAIRFHKLLKVENGVAREVDDVTVPISMSEQLDNLLPRDPNEPIALYFRDYGAEQHFTGEFGGAKIQCRRDQLAHMHRRRGARDVYLNVSVRVQSQSEARGERRPPYAAVFRLVGDNHRAFVHFDKLSDYLAEHPDDGKLGSEGLLSGLRVMSVDLGLRTSASISVFRVARKDELKPNSKGRVPFFFPIKGNDNLVAVHERSQLLKLPGETESKDLRAIREERQRTLRQLRTQLAYLRLLVRCGSEDVGRRERSWAKLIEQPVDAANHMTPDWREAFENELQKLKSLHGICSDKEWMDAVYESVRRVWRHMGKQVRDWRKDVRSGERPKIRGYAKDVVGGNSIEQIEYLERQYKFLKSWSFFGKVSGQVIRAEKGSRFAITLREHIDHAKEDRLKKLADRIIMEALGYVYALDERGKGKWVAKYPPCQLILLEELSEYQFNNDRPPSENNQLMQWSHRGVFQELINQAQVHDLLVGTMYAAFSSRFDARTGAPGIRCRRVPARCTQEHNPEPFPWWLNKFVVEHTLDACPLRADDLIPTGEGEIFVSPFSAEEGDFHQIHADLNAAQNLQQRLWSDFDISQIRLRCDWGEVDGELVLIPRLTGKRTADSYSNKVFYTNTGVTYYERERGKKRRKVFAQEKLSEEEAELLVEADEAREKSVVLMRDPSGIINRGNWTRQKEFWSMV NQRIEGYLVKQIRSRVPLQDSACENTGDI.
BhCas12b (Bacillus hisashii) NCBI Reference Sequence: WP_095142515
MAPKKKRKVGIHGVPAAATRSFILKIEPNEEVKKGLWKTHEVLNHGIAYYMNILKLIRQEAIYEHHEQDPKNPKKVSKAEIQAELWDFVLKMQKCNSFTHEVDKDEVFNILRELYEELVPSSVEKKGEANQLSNKFLYPLVDPNSQSGKGTASSGRKPRWYNLKIAGDPSWEEEKKKWEEDKKKDPLAKILGKLAEYGLIPLFIPYTDSNEPIVKEIKWMEKSRNQSVRRLDKDMFIQALERFLSWESWNLKVKEEYEKVEKEYKTLEERIKEDIQALKALEQYEKERQEQLLRDTLNTNEYRLSKRGLRGWREIIQKWLKMDENEPSEKYLEVFKDYQRKHPREAGDYSVYEFLSKKENHFIWRNHPEYPYLYATFCEIDKKKKDAKQQATFTLADPINHPLWVRFEERSGSNLNKYRILTEQLHTEKLKKKLTVQLDRLIYPTESGGWEEKGKVDIVLLPSRQFYNQIFLDIEEKGKHAFTYKDESIKFPLKGTLGGARVQFDRDHLRRYPHKVESGNVGRIYFNMTVNIEPTESPVSKSLKIHRDDFPKVVNFKPKELTEWIKDSKGKKLKSGIESLEIGLRVMSIDLGQRQAAAASIFEVVDQKPDIEGKLFFPIKGTELYAVHRASFNIKLPGETLVKSREVLRKAREDNLKLMNQKLNFLRNVLHFQQFEDITEREKRVTKWISRQENSDVPLVYQDELIQIRELMYKPYKDWVAFLKQLHKRLEVEIGKEVKHWRKSLSDGRKGLYGISLKNIDEIDRTRKFLLRWSLRPTEPGEVRRLEPGQRFAIDQLNHLNALKEDRLKKMANTIIMHALGYCYDVRKKKWQAKNPACQIILFEDLSNYNPYEERSRFENSKLMKWSRREIPRQVALQGEIYGLQVGEVGAQFSSRFHAKTGSPGIRCSVVTKEKLQDNRFFKNLQREGRLTLDKIAVLKEGDLYPDKGGEKFISLSKDRKCVTTHADINAAQNLQKRFWTRTHGFYKVYCKAYQVDGQTVYIPESKDQKQKIIEEFGEGYFILKDGVYEWVNAGKLKIKKGSSKQSSSELVDSDILKDSFDLASELKGEKLMLYRDPSGNVFPSDKWMAAGVFFGKLERILISKLTNQYSISTIEDDSSKQSMKRPAATKKAGQAKKKK
いくつかの実施形態では、Cas12bはBvCas12Bであり、これはBhCas12bのバリアントであってBhCas12Bに対して以下の変化を含む：S893R、K846R、およびE837G。
BvCas12b (Bacillus sp. V3-13) NCBI Reference Sequence: WP_101661451.1
MAIRSIKLKMKTNSGTDSIYLRKALWRTHQLINEGIAYYMNLLTLYRQEAIGDKTKEAYQAELINIIRNQQRNNGSSEEHGSDQEILALLRQLYELIIPSSIGESGDANQLGNKFLYPLVDPNSQSGKGTSNAGRKPRWKRLKEEGNPDWELEKKKDEERKAKDPTVKIFDNLNKYGLLPLFPLFTNIQKDIEWLPLGKRQSVRKWDKDMFIQAIERLLSWESWNRRVADEYKQLKEKTESYYKEHLTGGEEWIEKIRKFEKERNMELEKNAFAPNDGYFITSRQIRGWDRVYEKWSKLPESASPEELWKVVAEQQNKMSEGFGDPKVFSFLANRENRDIWRGHSERIYHIAAYNGLQKKLSRTKEQATFTLPDAIEHPLWIRYESPGGTNLNLFKLEEKQKKNYYVTLSKIIWPSEEKWIEKENIEIPLAPSIQFNRQIKLKQHVKGKQEISFSDYSSRISLDGVLGGSRIQFNRKYIKNHKELLGEGDIGPVFFNLVVDVAPLQETRNGRLQSPIGKALKVISSDFSKVIDYKPKELMDWMNTGSASNSFGVASLLEGMRVMSIDMGQRTSASVSIFEVVKELPKDQEQKLFYSINDTELFAIHKRSFLLNLPGEVVTKNNKQQRQERRKKRQFVRSQIRMLANVLRLETKKTPDERKKAIHKLMEIVQSYDSWTASQKEVWEKELNLLTNMAAFNDEIWKESLVELHHRIEPYVGQIVSKWRKGLSEGRKNLAGISMWNIDELEDTRRLLISWSKRSRTPGEANRIETDEPFGSSLLQHIQNVKDDRLKQMANLIIMTALGFKYDKEEKDRYKRWKETYPACQIILFENLNRYLFNLDRSRRENSRLMKWAHRSIPRTVSMQGEMFGLQVGDVRSEYSSRFHAKTGAPGIRCHALTEEDLKAGSNTLKRLIEDGFINESELAYLKKGDIIPSQGGELFVTLSKRYKKDSDNNELTVIHADINAAQNLQKRFWQQNSEVYRVPCQLARMGEDKLYIPKSQTETIKKYFGKGSFVKNNTEQEVYKWEKSEKMKIKTDTTFDLQDLDGFEDISKTIELAQEQQKKYLTMFRDPSGYFFNNETWRPQKEYWSIVNNIIKSCLKKKILSNKVEL
Cas9ヌクレアーゼはRuvCとHNHという二つの機能性エンドヌクレアーゼ領域をもっている。Cas9は標的DNAに結合するとコンホメーション変化を起こし、これがヌクレアーゼドメインを位置付け、標的DNAの反対側の鎖を切断させる。Cas9を介したDNA切断の最終結果は、標的DNA内の二本鎖切断 (DSB) である(PAM配列の約3〜4ヌクレオチド上流)。生じたDSBは、次の二つの一般的修復経路のうちの一つにより修復される: (1) 効率的だが誤りがちな非相同末端結合 (NHEJ) 経路；または (2) 効率は低いが忠実度の高い相同性誘導修復 (HDR) 経路。
非相同末端結合 (NHEJ) および/または相同性指向修復 (HDR) の「効率」は、任意の簡便な方法によって計算することができる。例えば、ある場合には、効率は、成功したHDRのパーセンテージで表すことができる。例えば、検査用ヌクレアーゼ分析を用いて切断産物を生成し、基質に対する産物の比を用いてパーセンテージを計算することができる。たとえば、HDRが成功した結果として新たに組み込まれた制限配列を含むDNAを直接切断する測量用ヌクレアーゼ酵素を使用することができる。切断される基質が多いほどHDRの割合が高かった(HDRの効率がより高かった)ことを示す。例示的な例として、HDRの割合 (パーセンテージ) は、以下の式を用いて計算することができる[(切断産物)/(基質+切断産物)] （例えば、 (b+c) / (a+b+c) ここで、「a」はDNA基質のバンド強度であり、「b」および「c」は切断生成物である。)。
場合によっては、効率はNHEJの成功率で表すことができる。例えば、T7エンドヌクレアーゼIアッセイを用いて切断産物を生成し、基質に対する産物の比を用いてNHEJのパーセンテージを計算することができる。T7エンドヌクレアーゼIは、野生型および突然変異体DNA鎖（NHEJは最初の切断部位に小さなランダムな挿入（insertion）や欠失（deletion）（インデル：indel）を生じる）のハイブリダイゼーションから生じるミスマッチのヘテロ二本鎖DNAを切断する。切断が多いほどNHEJの割合が高いこと(NHEJの効率が高いこと)を示す。例示的な例として、NHEJの割合 (パーセンテージ) は、式(1-(1-(b+c)/(a+b+c))1/2) ×100を用いて計算することができ、ここで、「a」はDNA基質のバンド強度であり、「b」および「c」は切断生成物である（Ran et. al., Cell. 2013 Sep. 12; 154(6):1380-9; and Ran et al., Nat Protoc. 2013 Nov.; 8(11): 2281-2308）。
NHEJ修復経路は最も活性な修復機構であり、DSB部位での小ヌクレオチド挿入または欠失 (インデル) を頻繁に引き起こす。NHEJ媒介DSB修復のランダム性は、Cas9およびgRNAまたはガイドポリヌクレオチドを発現する細胞集団が多様な突然変異のアレイをもたらし得るので、重要な実際的意味を有する。ほとんどの場合、NHEJは標的DNAに小さなインデルを生じさせ、その結果、標的遺伝子のオープンリーディングフレーム (ORF) 内に未熟な終止コドンをもたらすアミノ酸欠失、挿入、またはフレームシフト突然変異が生じる。理想的な最終結果は、標的遺伝子内の機能喪失型変異である。
NHEJ媒介DSB修復はしばしば遺伝子のオープンリーディングフレームを破壊するが、相同性指向修復 (HDR) は単一ヌクレオチド変化からフルオロフォアまたはタグの付加のような大きな挿入までの範囲の特異的ヌクレオチド変化を生成するために使用できる。
HDRを遺伝子編集に利用するために、所望の配列を含むDNA修復テンプレートを、gRNAおよびCas9またはCas9ニッカーゼと共に目的の細胞型に送達することができる。修復テンプレートは、所望の編集ならびにその標的のすぐ上流および下流(左右相同アームと呼ばれる)にさらなる相同配列を含むことができる。各相同アームの長さは導入される変化の大きさに依存し得、より大きな挿入はより長い相同アームを必要とする。修復鋳型は、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、または二本鎖DNAプラスミドであり得る。HDRの効率は、Cas9、gRNAおよび外因性修復テンプレートを発現する細胞においても、一般的に低い(10%未満の修正アリル)。HDRは細胞周期のS期とG2期の間に起こるので、細胞を同調させることによってHDRの効率を高めることができる。NHEJに関与する遺伝子を化学的または遺伝的に阻害することもHDR頻度を増加させ得る。
いくつかの実施態様において、Cas9は、修飾Cas9である。所与のgRNA標的配列は、ゲノム全体にわたり、部分的な相同性が存在するさらなる部位を有し得る。これらの部位はオフターゲットと呼ばれ、gRNAを設計する際に考慮する必要があるが、gRNAの設計を最適化することに加えて、Cas9を修飾することによってCRISPRの特異性を高めることもできる。Cas9は2つのヌクレアーゼドメイン、RuvCおよびHNHの組合せ活性を介して二本鎖切断 (DSB) を生成する。SpCas9のD10A変異体であるCas9ニッカーゼは1つのヌクレアーゼドメインを保持し、DSBではなくDNAニックを生成する。特異的遺伝子編集のためのHDR媒介遺伝子編集にニッカーゼを組み合わせることもできる。
ある場合には、Cas9はバリアントCas9タンパク質である。バリアントCas9ポリペプチドは、野生型Cas9タンパク質のアミノ酸配列と比較して、一アミノ酸単位で異なる(例えば、欠失、挿入、置換、融合を有する)アミノ酸配列を有する。いくつかの例において、バリアントCas9ポリペプチドは、Cas9ポリペプチドのヌクレアーゼ活性を低下させるアミノ酸変化(例えば欠失、挿入、または置換)を有する。例えば、いくつかの例において、バリアントCas9ポリペプチドは、対応する野生型Cas9タンパク質のヌクレアーゼ活性の50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、10%未満、5%未満、または1%未満を有する。ある場合には、バリアントCas9タンパク質は実質的なヌクレアーゼ活性をもたない。対象Cas9タンパク質が、実質的なヌクレアーゼ活性を有さないバリアントCas9タンパク質である場合、それは「dCas9」と称され得る。
ある場合には、バリアントCas9タンパク質はヌクレアーゼ活性を低下させる。例えば、バリアントCas9タンパク質は、野生型Cas9タンパク質（例えば野生型Cas9タンパク質）のエンドヌクレアーゼ活性の約20%未満、約15%未満、約10%未満、約5%未満、約1%未満、または約0.1%未満を示す。
ある場合には、バリアントCas9タンパク質は、ガイド標的配列の相補鎖を切断することができるが、二本鎖ガイド標的配列の非相補鎖を切断する能力が低下している。例えば、バリアントCas9タンパク質は、RuvCドメインの機能を低下させる突然変異(アミノ酸置換)を有することができる。非限定的な例として、いくつかの実施形態において、バリアントCas9タンパク質は、D10A (アミノ酸位置10におけるアスパラギン酸からアラニン)を有し、したがって、二本鎖ガイド標的配列の相補鎖を切断することができるが、二本鎖ガイド標的配列の非相補鎖を切断する能力が低下している(したがって、このバリアントCas9タンパク質が二本鎖標的核酸を切断するとき、二本鎖切断 (DSB) の代わりに一本鎖切断 (SSB) を生じる) (例えばJinek et al., Science. 2012 Aug. 17; 337(6096):816-21参照)。
ある場合には、バリアントCas9タンパク質は、二本鎖ガイド標的配列の非相補鎖を切断することができるが、ガイド標的配列の相補鎖を切断する能力が低下している。例えば、バリアントCas9タンパク質は、HNHドメインの機能を低下させる変異(アミノ酸置換)を有することができる(RuvC/HNH/RuvCドメインモチーフ)。非限定的な例として、いくつかの実施形態において、バリアントCas9タンパク質は、H840A (アミノ酸位置840におけるヒスチジンからアラニン)突然変異を有し、したがって、ガイド標的配列の非相補的ストランドを切断することができるが、ガイド標的配列の相補的ストランドを切断する能力が低下している(したがって、このバリアントCas9タンパク質が二本鎖ガイド標的配列を切断すると、DSBの代わりにSSBが生じる)。このようなCas9タンパク質は、ガイド標的配列(例えば一本鎖ガイド標的配列)を切断する能力が低下しているが、ガイド標的配列(例えば一本鎖ガイド標的配列)に結合する能力を保持している。
ある場合には、バリアントCas9タンパク質は、二本鎖標的DNAの相補鎖および非相補鎖の両方を切断する能力が低下している。非限定的な例として、ある場合には、バリアントCas9タンパク質は、D10AおよびH840A突然変異の両方を有し、その結果、ポリペプチドは、二本鎖標的DNAの相補鎖および非相補鎖の両方を切断する能力が低下している。このようなCas9タンパク質は、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力が低下しているが、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力は保持している。
別の非限定的な例として、いくつかの場合において、バリアントCas9タンパク質は、W476AおよびW1126A突然変異を有し、その結果、ポリペプチドは、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力が低下しているが、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力は保持している。
別の非限定的な例として、いくつかの場合において、バリアントCas9タンパク質は、P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A、およびD1127A突然変異を有し、その結果、ポリペプチドは、標的DNAを切断する能力が低下している。そのようなCas9タンパク質は、標的DNAを切断する能力を低下しているが(例えば一本鎖標的DNA)、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力を保持している。
別の非限定的な例として、いくつかの場合において、バリアントCas9タンパク質は、H840A、W476A、およびW1126A突然変異を有し、その結果、ポリペプチドは、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力が低下しているが、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力は保持している。別の非限定的な例として、いくつかの場合において、バリアントCas9タンパク質は、H840A、D10A、W476A、およびW1126A突然変異を有し、その結果、ポリペプチドは、標的DNAを切断する能力が低下している。このようなCas9タンパク質は、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力が低下しているが、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力は保持している。いくつかの実施形態において、バリアントCas9は、Cas9 HNHドメインの位置840における触媒的His残基が回復されている(A840H)。
別の非限定的な例として、いくつかの場合において、バリアントCas9タンパク質は、H840A、P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A、およびD1127A突然変異を有し、その結果、ポリペプチドは、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力を低下させるが、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力を保持する。別の非限定的な例として、いくつかの場合において、バリアントCas9タンパク質は、D10A、H840A、P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A、およびD1127A突然変異を有し、その結果、ポリペプチドは、標的DNAを切断する能力が低下している。そのようなCas9タンパク質は、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力を低下しているが、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力を保持している。バリアントCas9タンパク質がW476AおよびW1126A変異を有する場合、またはバリアントCas9タンパク質がP475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A、およびD1127A変異を有する場合、バリアントCas9タンパク質はPAM配列に効率的に結合しない。したがって、このような場合には、このようなバリアントCas9タンパク質を結合の方法に用いると、この方法はPAM配列を必要としない。換言すれば、ある場合には、このようなバリアントCas9タンパク質を結合の方法に用いる場合、この方法はガイドRNAを含み得るが、この方法は、PAM配列の非存在下で行うことができる(したがって、結合の特異性はガイドRNAの標的セグメントによってもたらされる)。上記の効果を達成するために、他の残基を変異させ得る(すなわち一方または他方のヌクレアーゼ部分を不活性化する)。非限定的な例として、残基D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986、および/またはA987を変更(すなわち置換)することができる。また、アラニン置換以外の変異も好適である。
ある態様において、低下した触媒活性を有するバリアントCas9タンパク質（例えばCas9タンパク質がD10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986、および/またはA987突然変異、例えばD10A、G12A、G17A、E762A、H840A、N854A、N863A、H982A、H983A、A984A、および/またはD986Aを有する場合）は、それがガイドRNAと相互作用する能力を保持する限り、部位特異的様式で標的DNAに結合することができる（ガイドRNAによって標的DNA配列に誘導されるからである）。
いくつかの実施形態では、バリアントCasタンパク質はspCas9、spCas9-VRQR、spCas9-VRER、xCas9 (sp)、saCas9、saCas9-KKH、spCas9-MQKSER、spCas9-LRKIQK、またはspCas9-LRVSQLであり得る。
S. pyogenes Cas9の代替としては、哺乳動物細胞において切断活性を示すCpf1ファミリー由来のRNA誘導エンドヌクレアーゼが挙げられ得る。PrevotellaおよびFrancisella 1由来のCRISPR (CRISPR/Cpf1) は、CRISPR/Cas9システムに類似したDNA編集技術である。Cpf1はクラスII CRISPR/Cas系のRNA誘導エンドヌクレアーゼである。この獲得免疫機構はPrevotellaやFrancisella細菌に見られる。Cpf1遺伝子はCRISPR遺伝子座に関連しており、ウイルスDNAを見出して切断するためにガイドRNAを用いるエンドヌクレアーゼをコードしている。Cpf1はCas9より小さく単純なエンドヌクレアーゼであり、CRISPR/Cas9系の制限のいくつかを克服する。Cas9ヌクレアーゼとは異なり、Cpf1を介したDNA切断の結果は、短い3'突出を伴う二本鎖切断である。Cpf1の互い違いの切断パターンは、伝統的な制限酵素クローニングに類似した、方向性のある遺伝子導入の可能性を開くことができ、これは遺伝子編集の効率を高め得る。上述したCas9のバリアントおよびオーソログと同様に、Cpf1は、CRISPRが標的とすることができる部位の数を、SpCas9が好むNGG PAM部位を欠くATに富む領域またはATに富むゲノムに拡大することもできる。Cpf1遺伝子座はα/β混合ドメイン、RuvC‐Iとそれに続くらせん領域、RuvC‐IIおよびジンクフィンガー様ドメインを含む。Cpf1タンパク質は、Cas9のRuvCドメインに類似したRuvC様エンドヌクレアーゼドメインを有する。さらに、Cpf1はHNHエンドヌクレアーゼ領域をもたず、Cpf1のN末端はCas9のαヘリックス認識ローブをもたない。Cpf1 CRISPR‐Casドメイン構成は、Cpf1が機能的にユニークであり、クラス2、タイプV CRISPRシステムとして分類されることを示した。Cpf1遺伝子座は、II型系よりもI型およびIII型に類似したCas1、Cas2およびCas4タンパク質をコードしていた。機能的Cpf1はトランス活性化CRISPR RNA (tracrRNA) を必要としない;したがって、CRISPR (crRNA) だけを要する。Cpf1はCas9より小さいだけでなく、より小さいsgRNA分子(Cas9の約半分の数のヌクレオチド)を有するので、これはゲノム編集に有益である。Cas9が標的とするGリッチPAMとは対照的に、Cpf1-crRNA複合体は、モチーフ5'-YTN-3'に隣接するプロトスペーサーの同定によって標的DNAまたはRNAを切断する。PAMの同定後、Cpf1は、4または5ヌクレオチドの突出を有するスティッキーエンド様のDNA二本鎖切断を導入する。
本開示のある側面は、核酸プログラミング可能なDNA結合タンパク質として作用するドメインを含む融合タンパク質を提供し、これは、塩基エディターのようなタンパク質を特異的な核酸（例えばDNAまたはRNA）配列に誘導するために使用され得る。特定の実施形態において、融合タンパク質は、核酸プログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインとデアミナーゼドメインとを含む。DNA結合タンパク質としては、限定されないが、Cas9（例えばdCas9 および nCas9）、Cas12a/Cpfl、Cas12b/C2cl、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、およびCas12iが挙げられる。Cas9とは異なるPAM特異性を有するプログラミング可能ポリヌクレオチド結合タンパク質の一例はPrevotella およびFrancisella1由来のClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（Cpf1）である。Cas9と同様に、Cpf1もクラス2 CRISPRエフェクターである。Cpf1はCas9とは異なる特徴でロバストなDNA干渉を媒介することが示されている。Cpf1は、tracrRNAを欠く単一RNA誘導エンドヌクレアーゼであり、Tに富むプロトスペーサ隣接モチーフ(TTN、TTTN、またはYTN)を利用する。さらに、Cpf1はDNAを互い違いの二本鎖切断で切断する。16のCpf1ファミリータンパク質のうち、AcidaminococcusとLachnospiraceaeからの二つの酵素がヒト細胞において効率的なゲノム編集活性を有することが示されている。Cpf1タンパク質は当技術分野で知られており、例えば過去にYamano et al., “Crystal structure of Cpf1 in complex with guide RNA and target DNA.” Cell (165) 2016, p. 949-962に記載されており、その全体の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
また、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ポリヌクレオチド結合タンパク質ドメインとして使用され得るヌクレアーゼ不活性Cpf1 (dCpf1) バリアントも、本発明の組成物および方法において有用である。Cpf1タンパク質は、Cas9のRuvCドメインに類似したRuvC様エンドヌクレアーゼドメインを有するが、HNHエンドヌクレアーゼドメインを有さず、Cpf1のN末端はCas9のアルファ-ヘリックス認識ローブを有さない。Zetsche et al., Cell, 163, 759-771, 2015 (参照により本明細書に組み込まれる)は、Cpf1のRuvC様ドメインが両方のDNA鎖の切断を担い、RuvC様ドメインの不活性化はCpf1ヌクレアーゼ活性を不活化することを示した。例えば、Francisella novicida Cpf1におけるD917A、E1006A、またはD1255Aに対応する突然変異は、Cpf1ヌクレアーゼ活性を不活化する。いくつかの実施形態において、本開示のdCpf1は、D917A、E1006A、D1255A、D917A/E1006A、D917A/D1255A、E1006A/D1255A、またはD917A/E1006A/D1255Aに対応する突然変異を含む。Cpf1のRuvCドメインを不活性化する任意の突然変異、例えば、置換変異、欠失、または挿入が、本開示に従って使用され得ることを理解されたい。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかの核酸プログラミング可能ヌクレオチド結合タンパク質は、Cpf1タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、Cpf1タンパク質は、Cpf1ニッカーゼ (nCpf1) である。ある態様において、Cpf1タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性Cpf1 (dCpf1) である。いくつかの実施形態において、Cpf1、nCpf1、またはdCpf1は、本明細書に開示されたCpf1配列に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、dCpf1は、本明細書に開示されたCpf1配列に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、D917A、E1006A、D1255A、D917A/E1006A、D917A/D1255A、E1006A/D1255A、またはD917A/E1006A/D1255Aに対応する突然変異を含む。他の細菌種からのCpf1もまた本開示に従って使用され得ることが理解されるべきである。
野生型Francisella novicida Cpf1のアミノ酸配列は以下のとおりである。D917, E1006, およびD1255は太字で下線を引いている。
MSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFKGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLANGWDKNKEPDNTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYKLLPGANKMLPKVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTLYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIPKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIDRGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFEDLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESDKKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDADANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNN.
Francisella novicida Cpf1 D917Aのアミノ酸配列は以下のとおりである。（A917, E1006, およびD1255は太字で下線を引いている。）
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Francisella novicida Cpf1 E1006Aのアミノ酸配列は以下のとおりである。（D917, A1006,および D1255は太字で下線を引いている。）
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Francisella novicida Cpf1 D1255Aのアミノ酸配列は以下のとおりである。（D917, E1006, および A1255の変異位置は太字で下線を引いている。）
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Francisella novicida Cpf1 D917A/E1006Aのアミノ酸配列は以下のとおりである。（A917, A1006, およびD1255は太字で下線を引いている。）
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Francisella novicida Cpf1 D917A/D1255Aのアミノ酸配列は以下のとおりである。（A917, E1006, および A1255は太字で下線を引いている。）
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Francisella novicida Cpf1 E1006A/D1255Aのアミノ酸配列は以下のとおりである。（D917, A1006, および A1255は太字で下線を引いている。）
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Francisella novicida Cpf1 D917A/E1006A/D1255Aのアミノ酸配列は以下のとおりである。（A917, A1006, および A1255は太字で下線を引いている。）
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いくつかの実施形態において、融合タンパク質中に存在するCas9ドメインの1つは、PAM配列を必要としないガイドヌクレオチド配列プログラミング可能DNA結合タンパク質ドメインで置換され得る。
ある実施形態において、Casドメインは、Staphylococcus aureus由来のCas9ドメイン (SaCas9)である。ある態様において、SaCas9ドメインは、ヌクレアーゼ活性SaCas9、ヌクレアーゼ不活性SaCas9 (SaCas9d) 、またはSaCas9ニッカーゼ (SaCas9 n) である。いくつかの実施形態において、SaCas9ドメインは、N579A突然変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、SaCas9ドメイン、SaCas9dドメイン、またはSaCas9nドメインは、非標準PAMを有する核酸配列に結合することができ、いくつかの実施形態において、SaCas9ドメイン、SaCas9dドメイン、またはSaCas9nドメインは、NNGRRTまたはNNGRRT PAM配列を有する核酸配列に結合することができる。いくつかの実施形態において、SaCas9ドメインは、E781X、N967X、およびR1014X突然変異の1以上、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、ここでXは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、SaCas9ドメインは、E781K、N967K、およびR1014H突然変異のうちの1つ以上、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける1つ以上の対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、SaCas9ドメインは、E781K、N967K、またはR1014H突然変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。
例示的なSaCas9のアミノ酸配列は、以下の通りである：
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG.
この配列において、太字で下線を付している残基N579は、（例えばA579に）変異されてSaCas9ニッカーゼを生じ得る。
例示的なSaCas9nのアミノ酸配列は、以下の通りである：
KRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEEASKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG.
この配列において、N579から変異されてSaCas9ニッカーゼを生じることができる残基A579には太字で下線を付している。
例示的なSaKKH Cas9のアミノ酸配列は、以下の通りである：
Figure 2021532794
上記の残基A579は、N579から変異されてSaCas9ニッカーゼを生じることができるものであり、太字で下線を付している。上記の残基K781、K967、およびH1014は、E781、N967、およびR1014から変異されてSaKKH Cas9を生じることができるものであり、斜体で下線を付している。
［高忠実度Cas9ドメイン］
本開示のいくつかの態様は、高忠実度Cas9ドメインを提供する。いくつかの実施形態において、高忠実度Cas9ドメインは、対応する野生型Cas9ドメインと比較して、Cas9ドメインとDNAの糖-リン酸骨格との間の静電相互作用を減少させる1つ以上の突然変異を含む人工Cas9ドメインである。DNAの糖-リン酸骨格との静電相互作用を減少させた高忠実度Cas9ドメインは、より少ないオフターゲット効果を有し得る。ある態様において、Cas9ドメイン(例えば、野生型Cas9ドメイン)は、Cas9ドメインとDNAの糖-リン酸骨格との間の結合を低減させる一つ以上の突然変異を含む。ある態様において、Cas9ドメインは、Cas9ドメインとDNAの糖-リン酸骨格との間の結合を少なくとも1%、少なくとも2%、少なくとも3%、少なくとも4%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、または少なくとも70%だけ低減させる一つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCas9融合タンパク質のいずれかは、N497X、R661X、Q695X、および/またはQ926X突然変異の1以上、または本明細書で提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、ここでXは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCas9融合タンパク質のいずれかは、N497A、R661A、Q695A、および/またはQ926A突然変異の1以上、または本明細書で提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、Cas9ドメインは、D10A突然変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。高い忠実度を有するCas9ドメインは当技術分野で公知であり、当業者には明らかであろう。例えば、高い忠実度を有するCas9ドメインは、Kleinstiver, B.P., et al. “High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects.” Nature 529, 490-495 (2016); およびSlaymaker, I.M., et al. “Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity.” Science 351, 84-88 (2015)に記述されており、それぞれの全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
ある態様において、改変されたCas9は、高忠実度Cas9酵素である。いくつかの実施形態において、高忠実度Cas9酵素は、SpCas9(K855A)、eSpCas9(1.1)、SpCas9-HF1、または高精度Cas9バリアント(HypaCas9)である。修飾Cas9eSpCas9(1.1)は、HNH/RuvCグルーブと非標的DNA鎖との間の相互作用を弱めるアラニン置換を含み、オフターゲット部位での鎖分離と切断を防止する。同様に、SpCas9-HF1は、DNAリン酸骨格とのCas9の相互作用を破壊するアラニン置換を介して、オフターゲット編集を低下させる。HypaCas9は、Cas9の校正と標的識別を増加させる突然変異をREC3ドメインに含む(SpCas9 N692A/M694A/Q695A/H698A)。3つの高忠実度酵素はすべて、野生型Cas9よりもオフターゲット編集が少ない。
例示的な高忠実度Cas9を以下に示す。Cas9に対する高忠実度Cas9ドメイン突然変異を太字および下線で示している
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTAFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGALSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMALIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRAITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
［ガイドポリヌクレオチド］
一実施形態では、ガイドポリヌクレオチドはガイドRNAである。RNA/Cas複合体は、Casタンパク質を標的DNAに「ガイド」するのを補助することができる。Cas9/crRNA/tracrRNAは、スペーサーに相補的な線状または環状dsDNA標的をエンドヌクレアーゼ的に切断する。crRNAに相補的でない標的鎖が最初にエンドヌクレアーゼで切断され、次いでエキソヌクレアーゼ的に3’-5’方向にトリムされる。自然界では、DNA結合と切断にはタンパク質と両方のRNAが通常必要とされる。しかしながら、crRNAおよびtracrRNAの両方の側面を単一のRNA種に組み込むように、単一ガイドRNA (「sgRNA」、または単に「gRNA」)を作製することができる。例えば、Jinek M. et al., Science 337:816-821(2012)を参照されたい（その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる）。Cas9は、CRISPR反復配列中の短いモチーフ(PAMまたはプロトスペーサー隣接モチーフ)を認識して、自己と非自己を区別するのを助ける。Cas9ヌクレアーゼの配列および構造は、当業者によく知られている（例えば“Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes.” Ferretti, J.J. et al., Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); “CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.” Deltcheva E. et al., Nature 471:602-607(2011); および “Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.” Jinek M.et al, Science 337:816-821(2012)参照。その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる）。Cas9オーソログは、限定されるものではないが、S. pyogenes および S. thermophilusを含む様々な種において記述されている。さらなる適切なCas9ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づいて当業者に明らかとなり得、そのようなCas9ヌクレアーゼおよび配列には、Chylinski, Rhun, and Charpentier, “The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems” (2013) RNA Biology 10:5, 726-737に開示されている生物および遺伝子座からのCas9配列が含まれる（その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。ある態様において、Cas9ヌクレアーゼは、不活性(例えば不活化) DNA切断ドメインを有し、すなわち、Cas9はニッカーゼである。
ある態様において、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも一つの単一ガイドRNA (「sgRNA」または「gRNA」)である。ある態様において、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも一つのtracrRNAであり、ある態様において、ガイドポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメイン(例:Cas9またはCpf1)を標的ヌクレオチド配列に導くためにPAM配列を必要としない。
本願明細書に開示される塩基エディターのポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメイン(例えばCRISPR由来ドメイン)は、ガイドポリヌクレオチドと会合することによって標的ポリヌクレオチド配列を認識することができる。ガイドポリヌクレオチド(例えばgRNA)は、典型的には一本鎖であり、ポリヌクレオチドの標的配列に部位特異的に結合(すなわち相補的塩基対形成を介して)するようにプログラムすることができ、それによって、ガイド核酸を伴った塩基エディターを標的配列に導く。ガイドポリヌクレオチドはDNAであり得る。ガイドポリヌクレオチドはRNAであり得る。場合によっては、ガイドポリヌクレオチドは天然ヌクレオチド(例えばアデノシン)を含む。場合によっては、ガイドポリヌクレオチドは、非天然(または不自然)ヌクレオチド(例えばペプチド核酸またはヌクレオチドアナログ)を含む。ある場合には、ガイド核酸配列の標的化領域は、長さが少なくとも15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチドであり得る。ガイド核酸の標的化領域は、長さが10〜30ヌクレオチドの間、または長さが15〜25ヌクレオチドの間、または長さが15〜20ヌクレオチドの間であり得る。
いくつかの実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、例えば相補的塩基対形成を介して互いに相互作用できる、二つ以上の個別のポリヌクレオチドを含む(例えば二重ガイドポリヌクレオチド)。例えば、ガイドポリヌクレオチドは、CRISPR RNA (crRNA) およびトランス活性化CRISPR RNA (tracrRNA) を含むことができる。例えば、ガイドポリヌクレオチドは、1以上のトランス活性化CRISPR RNA (tracrRNA) を含むことができる。
II型CRISPRシステムにおいて、CRISPRタンパク質(例Cas9)による核酸の標的化は、典型的には、標的配列を認識する配列を含む第一のRNA分子(crRNA) と、ガイドRNA-CRISPRタンパク質複合体を安定化させる足場領域を形成する反復配列を含む第二のRNA分子(trRNA) との間の相補的塩基対形成を必要とする。このような二重ガイドRNAシステムは、本明細書に開示された塩基エディターを標的ポリヌクレオチド配列に導くためのガイドポリヌクレオチドとして利用され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される塩基エディターは、単一ガイドポリヌクレオチド(例えばgRNA)を利用する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される塩基エディターは、デュアル（二重）ガイドポリヌクレオチド(例えばデュアルgRNA)を利用する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される塩基エディターは、一つ以上のガイドポリヌクレオチド(例えば複数のgRNA)を利用する。いくつかの実施形態において、単一ガイドポリヌクレオチドが、本明細書に記載される異なる塩基エディターのために利用される。例えば、単一ガイドポリヌクレオチドを、シチジン塩基エディターおよびアデノシン塩基エディターのために利用することができる。
他の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、核酸のポリヌクレオチド標的化部分および核酸の足場部分の両方を単一分子(すなわち単一分子ガイド核酸)中に含むことができる。例えば、単一分子ガイドポリヌクレオチドは、単一ガイドRNA (sgRNAまたはgRNA)であり得る。本明細書において、「ガイドポリヌクレオチド配列」という用語は、塩基エディターと相互作用し標的ポリヌクレオチド配列に塩基エディターを導くことができる任意の単一、二重または複数分子核酸を企図する。
典型的には、ガイドポリヌクレオチド(例えばcrRNA/trRNA複合体またはgRNA)は、標的ポリヌクレオチド配列を認識しそれに結合することができる配列を含む「ポリヌクレオチド標的セグメント」と、塩基エディターのポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメイン成分内でガイドポリヌクレオチドを安定化させる「タンパク質結合セグメント」とを含む。或る実施態様では、ガイドポリヌクレオチドのポリヌクレオチド標的セグメントは、DNAポリヌクレオチドを認識してそれに結合し、それによりDNA中の塩基の編集を促進する。他の実施態様では、ガイドポリヌクレオチドのポリヌクレオチド標的セグメントは、RNAポリヌクレオチドを認識しそれに結合し、それによりRNA中の塩基の編集を促進する。ここで、「セグメント」とは、分子の一部分または領域、例えばガイドポリヌクレオチド中の連続したヌクレオチドのストレッチをいう。また、セグメントは、複合体の領域/セクションも表し得、従ってセグメントは2つ以上の分子の領域を含むことができる。例えば、ガイドポリヌクレオチドが複数の核酸分子を含む場合、タンパク質結合セグメントは、例えば相補性の領域に沿ってハイブリダイズした複数の別個の分子の全てまたは一部を含むことができる。ある態様において、二つの別個の分子を含むDNA標的化RNAのタンパク質結合セグメントは、 (i) 長さが100塩基対である第一のRNA分子の塩基対40〜75；および(ii) 長さが50塩基対である第二のRNA分子の10〜25塩基対を含み得る。「セグメント」の定義は、特定の文脈において特に定義されない限り、全塩基対のうちの特定の数に限定されず、所与のRNA分子からの塩基対の特定の数に限定されず、複合体内の別個の分子の特定の数に限定されず、任意の全長のRNA分子の領域を含み得、他の分子に対する相補性を有する領域を含み得る。
ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドは、2つ以上のRNA、例えばCRISPR RNA (crRNA) およびトランス活性化crRNA (tracrRNA) を含むことができる。ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドは、時に、crRNAおよびtracrRNAの一部分(例えば機能的部分) の融合によって形成される単一鎖RNA、あるいは単一ガイドRNA (sgRNA) を含み得る。ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドは、crRNAおよびtracrRNAを含む二重RNAであってもよい。さらに、crRNAは標的DNAとハイブリダイズし得る。
上述のように、ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドは、発現産物であり得る。例えば、ガイドRNAをコードするDNAは、ガイドRNAをコードする配列を含むベクターであり得る。ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドは、単離されたガイドRNA、またはガイドRNAをコードする配列およびプロモーターを含むプラスミドDNAを細胞にトランスフェクトすることによって、細胞に導入することができる。ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドは、ウイルス媒介遺伝子送達の使用など、他の方法で細胞に導入することもできる。
ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドを単離することができる。例えば、ガイドRNAは、単離されたRNAの形態で細胞または生物にトランスフェクトされ得る。ガイドRNAは、当技術分野で公知の任意のインビトロ転写系を用いたインビトロ転写によって調製することができる。ガイドRNAは、ガイドRNAをコードする配列を含むプラスミドの形態ではなく、単離されたRNAの形態で細胞に移入され得る。
ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドは、以下の3つの領域を含み得る：染色体配列中の標的部位に相補的であり得る5’末端における第1の領域、ステムループ構造を形成し得る第2の内部領域、および一本鎖であり得る第3の3’領域。各ガイドRNAが融合タンパク質を特異的な標的部位にガイドするように、各ガイドRNAの第1の領域を異ならせることもできる。さらに、各ガイドRNAの第2および第3の領域は、すべてのガイドRNAにおいて同一であり得る。
ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドの第1の領域は、そのガイドRNAの第1の領域が標的部位と塩基対を形成できるように、染色体配列の標的部位における配列に相補的であり得る。場合によっては、ガイドRNAの第一の領域は、約10ヌクレオチド〜25ヌクレオチド(すなわち、10ヌクレオチドからヌクレオチドまで;または約10ヌクレオチドから約25ヌクレオチドまで;または10ヌクレオチドから約25ヌクレオチドまで;または約10ヌクレオチドから25ヌクレオチドまで)またはそれ以上を含むことができる。例えば、ガイドRNAの第一の領域と染色体配列中の標的部位との間の塩基対形成の領域は、長さが約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25またはそれ以上のヌクレオチドであり得るか、またはおよそその長さであり得る。ときに、ガイドRNAの第一の領域は、長さが19、20、もしくは21ヌクレオチド、または約19、20、もしくは21ヌクレオチドであり得る。
ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドは、二次構造を形成する第2の領域を含むこともできる。例えば、ガイドRNAによって形成される二次構造は、ステム（またはヘアピン）およびループを含むことができる。ループとステムの長さはさまざまであり得る。例えば、ループの長さは（約）3から10ヌクレオチドの範囲であり得、ステムの長さは（約）6から20塩基対の範囲であり得る。ステムは、1から10または約10ヌクレオチドの一つ以上のバルジを含むことができる。第二の領域の全長は、約16から60ヌクレオチド長の範囲であり得る。例えば、ループは長さが（約）4ヌクレオチドであり得、ステムは（約）12塩基対であり得る。
ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドは、本質的に一本鎖状態であり得る3'末端の第3の領域も含むこともできる。たとえば、第3の領域は、対象とする細胞のいずれの染色体配列とも相補的でないこともあれば、ガイドRNAの残りの部分と相補的でないこともある。さらに第3の領域の長さはさまざまであり得る。第3の領域は、長さが約4ヌクレオチド以上であり得る。例えば、第3の領域の長さは、（約）5から60ヌクレオチド長の範囲であり得る。
ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドは、遺伝子標的の任意のエクソンまたはイントロンを標的とすることができる。場合によっては、ガイドは遺伝子のエキソン1または2を標的にすることができる;他の場合には、ガイドは遺伝子のエキソン3または4を標的にすることができる。組成物は、全てが同じエクソンを標的とする複数のガイドRNA、または場合によっては、異なるエクソンを標的とする複数のガイドRNAを含むことができる。遺伝子のエキソンとイントロンが標的とされ得る。
ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドは、（約）20ヌクレオチドの核酸配列を標的とし得る。標的核酸は、（約）20ヌクレオチド未満であり得る。標的核酸は、長さが少なくとも（約）5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、または1〜100ヌクレオチドの間の任意の長さであり得る。標的核酸は、長さが多くとも約5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50ヌクレオチド、または1〜100ヌクレオチドの間の任意の長さであり得る。標的核酸配列は、PAMの最初のヌクレオチドの5’直近の（約）20塩基であり得る。ガイドRNAは、核酸配列を標的化し得る。標的核酸は、少なくとも（約）1〜10、1〜20、1〜30、1〜40、1〜50、1〜60、1〜70、1〜80、1〜90、または1〜100ヌクレオチドであり得る。
ガイドポリヌクレオチド、例えば、ガイドRNAは、別の核酸、例えば、細胞のゲノム中の標的核酸またはプロトスペーサーにハイブリダイズし得る核酸を指すことができる。ガイドポリヌクレオチドはRNAであり得る。ガイドポリヌクレオチドはDNAであり得る。ガイドポリヌクレオチドは、核酸の配列に部位特異的に結合するようにプログラムまたは設計することができる。ガイドポリヌクレオチドは、一ポリヌクレオチド鎖を含み得、単一ガイドポリヌクレオチドと呼ばれ得る。ガイドポリヌクレオチドは、2つのポリヌクレオチド鎖を含み得、二重ガイドポリヌクレオチドと呼ばれ得る。ガイドRNAはRNA分子として細胞や胚に導入され得る。例えば、RNA分子は、インビトロで転写され得、および/または化学的に合成され得る。RNAは、合成DNA分子、例えばgBlocks（登録商標）遺伝子断片から転写され得る。ガイドRNAはRNA分子として細胞や胚に導入され得る。ガイドRNAはまた、非RNA核酸分子、例えばDNA分子の形態で細胞または胚に導入され得る。例えば、ガイドRNAをコードするDNAが、対象の細胞または胚におけるガイドRNAの発現のためにプロモーター制御配列に作動可能に連結され得る。RNAコード配列は、RNAポリメラーゼIII (Pol III)によって認識されるプロモーター配列に作動可能に連結され得る。ガイドRNAを発現するために使用することができるプラスミドベクターは、px330ベクターおよびpx333ベクターを含むが、これらに限定されない。場合によっては、プラスミドベクター(例えばpx333ベクター)は、少なくとも二つのガイドRNAをコードするDNA配列を含むことができる。
ガイドポリヌクレオチド（例えばガイドRNA）およびターゲティング配列を選択、設計および検証するための方法は、本明細書中に記載され、当業者に知られている。例えば、核酸塩基エディター系におけるデアミナーゼドメイン(例えばAIDドメイン)の潜在的基質混合性（promiscuity）の影響を最小限にするために、意図せず脱アミノ化の標的となり得る残基(例えば、標的核酸遺伝子座内のssDNA上に潜在的に位置し得るオフターゲットC残基)の数を最小限にすることができる。さらに、ソフトウェアツールを使用して、標的核酸配列に対応するgRNAを最適化することができ、例えば、ゲノム全体の総オフターゲット活性を最小限化することができる。例えば、S. pyogenes Cas9を用いた標的化ドメイン選択肢の各可能性について、(例えばNAGまたはNGGなどの選択されたPAMに先行する)ある数(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10)までのミスマッチ塩基対を含むすべてのオフターゲット配列をゲノムにわたって同定することができる。標的部位に相補的なgRNAの第一の領域を同定することができ、すべての第一の領域(例:crRNA)をその総予測オフターゲットスコアに従ってランク付けすることができ;上位にランクされた標的化ドメインは、最大のオンターゲット活性と最小のオフターゲット活性を持つ可能性が高いものを表す。候補標的化gRNAは、当技術分野で公知の方法および/または本明細書に記載の方法を用いて機能的に評価することができる。
非限定的な例として、Cas9と共に使用するためのガイドRNAのcrRNAにおける標的DNAハイブリダイズ配列は、DNA配列探索アルゴリズムを用いて同定することができる。gRNA設計は、Bae S., Park J., & Kim J.-S. Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics 30, 1473-1475 (2014)に記載されているような公開ツールcas-offinderに基づくカスタムgRNA設計ソフトウェアを用いて実施することができる。このソフトウェアは、ガイドのゲノム全体的オフターゲット傾向を計算した後にガイドにスコアを付ける。通常、完全マッチから7個のミスマッチまでの範囲の一致が、17から24までの長さの範囲のガイドについて考慮される。いったんオフターゲットサイトが計算的に決定されると、各ガイドについて集約スコアが計算され、ウェブインターフェースを使用した表形式の出力に要約される。PAM配列に隣接する潜在的な標的部位を同定することに加えて、ソフトウェアは、選択された標的部位から1、2、3または3超のヌクレオチドだけ異なるすべてのPAM隣接配列も同定する。標的核酸配列、例えば標的遺伝子についてのゲノムDNA配列を得て、反復エレメントを、公に入手可能なツール、例えば、RepeatMaskerプログラムを用いてスクリーニングすることができる。RepeatMaskerは、入力されたDNA配列から、反復エレメントや低複雑性領域を探し出す。所与のクエリー配列に存在する反復の詳細な注釈が出力となる。
同定後、ガイドRNA（例えばcrRNA）の第１の領域が、標的部位へのそれらの距離、それらの直交性（orthogonality）、および関連するPAM配列との密接な一致のための5’ヌクレオチドの存在(例えば、関連するPAM (例えば、化膿レンサ球菌についてのNGG PAM、黄色ブドウ球菌についてのNNGRRTまたはNNGRRV PAM) を含むヒトゲノムにおける密接な一致の同定に基づく5’G)に基づいて、階層にランク付けされ得る。本明細書において使用される場合、直交性とは、標的配列に対して最小数のミスマッチを含む、ヒトゲノムにおける配列の数を表す。「高レベルの直交性」または「良好な直交性」は、例えば、意図された標的以外にヒトゲノムにおいて同一の配列を有さず、標的配列において一または二のミスマッチを含有する配列も有さない20マー標的化ドメインを指し得る。良好な直交性を有する標的化ドメインは、オフターゲットDNA切断を最小化するように選択され得る。
いくつかの実施形態において、塩基編集活性を検出すること、および候補ガイドポリヌクレオチドを試験することのためにレポーターシステムが使用され得る。いくつかの態様において、レポーターシステムは、塩基編集活性がレポーター遺伝子の発現をもたらす、レポーター遺伝子ベースのアッセイを含むことができる。例えば、レポーターシステムは、不活性化開始コドン、例えば、鋳型鎖上の3'-TAC-5'から3'-CAC-5'への突然変異を含むレポーター遺伝子を含み得る。標的Cの脱アミノ化に成功すると、対応するmRNAは5'-GUG-3'ではなく5'-AUG-3'として転写され、レポーター遺伝子の翻訳を可能にする。適切なレポーター遺伝子は、当業者には明らかであろう。レポーター遺伝子の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質 (GFP) 、赤色蛍光タンパク質 (RFP) 、ルシフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ (SEAP) 、または、発現が検出可能であり当業者には明らかである他の任意の遺伝子をコードする遺伝子が挙げられる。レポーター系を用いて、多くの異なるgRNAを試験することができ、例えば、標的DNA配列に関してどの残基を、それぞれの対応デアミナーゼが標的とするかを決定することができる。非鋳型鎖を標的とするsgRNAも、特定の塩基編集タンパク質（例えばCas9デアミナーゼ融合タンパク質）のオフターゲット効果を評価するために試験することができる。いくつかの実施形態において、そのようなgRNAは、変異開始コドンがgRNAと塩基対を形成しないように設計することができる。ガイドポリヌクレオチドは、標準リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド(例えば、プソイドウリジン)、リボヌクレオチド異性体、および/またはリボヌクレオチド類似体を含むことができる。いくつかの実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも1つの検出可能な標識を含むことができる。検出可能な標識は、フルオロフォア(例えば、FAM、TMR、Cy3、Cy5、テキサスレッド、オレゴングリーン、Alexa Fluor、Haloタグ、または適切な蛍光色素)、検出タグ(例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン等)、量子ドット、または金粒子であり得る。
ガイドポリヌクレオチドは、化学的に合成され得るか、酵素的に合成され得るか、またはそれらの組み合わせであり得る。例えば、ガイドRNAは、標準的なホスホロアミダイトベースの固相合成法を用いて合成することができる。あるいは、ガイドRNAをコードするDNAを、ファージRNAポリメラーゼにより認識されるプロモーター制御配列に作動可能に連結することによって、ガイドRNAをインビトロで合成することができる。適切なファージプロモーター配列の例は、T7、T3、SP6プロモーター配列、またはそれらのバリアントを含む。ガイドRNAが二つの別々の分子(例えば、crRNAとtracrRNA)を含む実施形態において、crRNAは化学的に合成することができ、tracrRNAは酵素的に合成することができる。
ある態様において、塩基エディター系は、複数のガイドポリヌクレオチド、例えばgRNAを含み得る。例えば、gRNAは、塩基エディター系に含まれる一つ以上の標的遺伝子座(例えば少なくとも1 gRNA、少なくとも2 gRNA、少なくとも5 gRNA、少なくとも10 gRNA、少なくとも20 gRNA、少なくとも30 gRNA、少なくとも50 gRNA)を標的とすることができる。前記複数のgRNA配列はタンデムに配置され得、好ましくは直接反復によって分離される。
ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドをコードするDNA配列がベクターの一部であってもよい。さらに、ベクターは、追加の発現制御配列(例えばエンハンサー配列、Kozak配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など。)、選択可能なマーカー配列(例えばGFPまたはピューロマイシンなどの抗生物質耐性遺伝子)、複製起点などを含むことができる。ガイドRNAをコードするDNA分子は線状であってもよい。ガイドRNAまたはガイドポリヌクレオチドをコードするDNA分子も環状であってもよい。
いくつかの態様において、塩基エディター系の1つ以上の構成要素は、DNA配列によってコードされ得る。このようなDNA配列は、発現系（例えば細胞）に一緒に、または別々に導入することができる。例えば、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインおよびガイドRNAをコードするDNA配列を細胞に導入することができ、各DNA配列は別個の分子の一部であることができ(例えばポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインのコード配列を含む1つのベクターおよびガイドRNAコード配列を含む第2のベクター)、または両方が同じ分子の一部であることができる(例えばポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメイン及びガイドRNAの両方のためのコード(および調節)配列を含む一つのベクター)。
ガイドポリヌクレオチドは、新しいまたは増強された特徴を有する核酸を提供するための1以上の改変を含むことができる。ガイドポリヌクレオチドは、核酸親和性タグを含むことができる。ガイドポリヌクレオチドは、合成ヌクレオチド、合成ヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド誘導体、および/または修飾ヌクレオチドを含むことができる。
場合によっては、gRNAまたはガイドポリヌクレオチドは修飾（改変）を含むことができる。修飾は、gRNAまたはガイドポリヌクレオチドの任意の位置に施され得る。単一のgRNAまたはガイドポリヌクレオチドに対して複数の修飾を行うことができる。gRNAまたはガイドポリヌクレオチドは、修飾後に品質管理を受けることができる。場合によっては、品質管理は、PAGE、HPLC、MS、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
gRNAまたはガイドポリヌクレオチドの修飾は、置換、挿入、欠失、化学的修飾、物理的修飾、安定化、精製、またはそれらの任意の組合せであり得る。
gRNAまたはガイドポリヌクレオチドはまた、5’アデニル酸、5’グアノシン三リン酸キャップ、5’N 7-メチルグアノシン三リン酸キャップ、5’三リン酸キャップ、3’リン酸、3’チオリン酸、5’リン酸、5’チオリン酸、Cis-Synチミジン二量体、三量体、C12スペーサー、C3スペーサー、C6スペーサー、dスペーサー、PCスペーサー、rスペーサー、スペーサー18、スペーサー9、3’-3’修飾、5’-5’修飾、塩基脱落、アクリジン、アゾベンゼン、ビオチン、ビオチンBB、ビオチンTEG、コレステロールTEG、デスチオビオチンTEG、DNP TEG、DNP-X、DOTA、dT-ビオチン、二重ビオチン、ソラレン、ソラレンC2、ソラレンC6、TINA、3’DABCYL、ブラックホールクエンチャー1、ブラックホールクエンチャー2、DABCYL SE、dT-DABCYL、IRDye QC-1、QSY-21、QSY-35、QSY-7、QSY-9、カルボキシルリンカー、チオールリンカー、2’-デオキシリボヌクレオシド類似体プリン、2’-デオキシリボヌクレオシド類似体ピリミジン、リボヌクレオシド類似体、2’-O-メチルリボヌクレオシド類似体、糖修飾類似体、ウォブル/ユニバーサル塩基、蛍光色素標識、2’-フルオロRNA、2’-O-メチルRNA、メチルホスホネート、ホスホジエステルDNA、ホスホジエステルRNA、ホスホチオエステルDNA、ホスホロチオネートRNA、UNA、プソイドリジン-5’-トリホスフェート、5’-メチルシジン-5’-トリホスフェート、またはそれらの任意の組合せでも修飾され得る。
場合によっては、修飾は永続的である。その他の場合、修飾は一時的である。場合によっては、gRNAまたはガイドポリヌクレオチドに対して複数の修飾が行われる。gRNAまたはガイドポリヌクレオチドの修飾は、それらのコンホメーション、極性、疎水性、化学反応性、塩基対形成相互作用、またはそれらの組み合わせなどの、ヌクレオチドの物理化学的特性を変化させることができる。
PAM配列は、当該技術分野で公知の任意のPAM配列であり得る。適切なPAM配列には、以下が含まれるが、これらに限定されない：NGG, NGA, NGC, NGN, NGT, NGCG, NGAG, NGAN, NGNG, NGCN, NGCG, NGTN, NNGRRT, NNNRRT, NNGRR(N), TTTV, TYCV, TYCV, TATV, NNNNGATT, NNAGAAW, または NAAAAC。Yはピリミジンであり、Nは任意のヌクレオチド塩基であり、WはAまたはTである。
修飾はホスホロチオエート置換でもあり得る。ある場合には、天然のホスホジエステル結合は細胞のヌクレアーゼによって急速に分解されやすく、ホスホロチオエート (PS) 結合置換体を用いたヌクレオチド間結合の修飾は、細胞分解による加水分解に対してより安定である。修飾は、gRNAまたはガイドポリヌクレオチドの安定性を増大させることができる。修飾は生物学的活性を増強させることもできる。ある場合には、ホスホロチオエート強化RNA gRNAは、RNアーゼA、RNアーゼT1、子牛血清ヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせを阻害することができる。これらの特性は、in vivoまたはin vitroでヌクレアーゼへの暴露がある可能性が高いアプリケーションにおいて、PS-RNA gRNAの使用を可能にする。例えば、ホスホロチオエート (PS) 結合をgRNAの5'末端または''末端における最後の3〜5ヌクレオチドの間に導入することができ、それはエキソヌクレアーゼ分解を阻害し得る。ある場合には、ホスホロチオエート結合をgRNA全体に加えてエンドヌクレアーゼによる攻撃を減らすことができる。
［プロトスペーサ隣接モチーフ］
「プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)」またはPAM様モチーフは、CRISPR細菌適応免疫系においてCas9ヌクレアーゼによって標的化されるDNA配列の直後の2〜6塩基対DNA配列を指す。いくつかの実施形態では、PAMは5’PAM (すなわちプロトスペーサの5’末端の上流に位置する)であり得る。他の実施形態では、PAMは3’PAM (すなわちプロトスペーサの5’末端の下流に位置する)であり得る。
PAM配列は標的結合に必須であるが、正確な配列はCasタンパク質の種類に依存する。
本明細書で提供される塩基エディターは、標準的または非標準的プロトスペーサー隣接モチーフ (PAM) 配列を含むヌクレオチド配列に結合することができるCRISPRタンパク質由来ドメインを含むことができる。PAM部位は、標的ポリヌクレオチド配列に近接するヌクレオチド配列である。本開示のいくつかの側面は、異なるPAM特異性を有するCRISPRタンパク質の全部または一部を含む塩基エディターを提供する。例えば、S. pyogenes由来のCas9 (spCas9) などのCas9タンパク質は、典型的に、特定の核酸領域に結合するために標準的なNGG PAM配列を必要とし、ここで「NGG」中の「N」はアデニン (A) 、チミン(T) 、グアニン (G) 、またはシトシン (C) であり、Gはグアニンである。PAMはCRISPRタンパク質特異的であり得、異なるCRISPRタンパク質由来ドメインを含む異なる塩基エディター間で異なり得る。PAMは標的配列の5’または3’にあり得る。PAMは、標的配列の上流または下流にあり得る。PAMは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。多くの場合、PAMは2〜6ヌクレオチドの長さである。いくつかのPAMバリアントが下記表1に記載されている。
Figure 2021532794
いくつかの実施形態において、PAMはNGTである。いくつかの実施形態において、NGT PAMはバリアントである。いくつかの実施形態において、NGT PAMバリアントは、残基1335、1337、1135、1136、1218、および/または1219の一つまたは複数における標的化突然変異を通じて作成される。いくつかの実施形態において、NGT PAMバリアントは、残基1219、1335、1337、1218の一つまたは複数における標的化突然変異を通じて作成される。いくつかの実施形態において、NGT PAMバリアントは、残基1135、1136、1218、1219、および1335の一つまたは複数における標的化突然変異を通じて作成される。いくつかの実施形態において、NGT PAMバリアントは、下記表2および3に提供される標的化突然変異のセットから選択される。
Figure 2021532794
Figure 2021532794
いくつかの実施形態において、NGT PAMバリアントは、表2および3のバリアント5、7、28、31、または36から選択される。いくつかの実施形態において、バリアントは、改善されたNGT PAM認識を有する。
いくつかの実施形態では、NGT PAMバリアントは、残基1219、1335、1337および/または1218において突然変異を有する。いくつかの実施形態では、NGT PAMバリアントは、下記表4に提供されるバリアントから、認識を改善するための変異を伴って選択される。
Figure 2021532794
いくつかの実施形態において、NGT PAMは、下記表5に提供されるバリアントから選択される。
Figure 2021532794
ある態様において、Cas9ドメインは、Streptococcus pyogenes由来のCas9ドメインである (SpCas9)。ある態様において、SpCas9ドメインは、ヌクレアーゼ活性SpCas9、ヌクレアーゼ不活性SpCas9 (SpCas9d) 、またはSpCas9ニッカーゼ (SpCas9n) である。いくつかの実施形態において、SpCas9は、D9X突然変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、ここでXはD以外のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、SpCas9は、D9A突然変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。ある態様において、SpCas9ドメイン、SpCas9dドメインまたはSpCas9nドメインは、非標準PAMを有する核酸配列に結合することができる。ある態様において、SpCas9ドメイン、SpCas9dドメインまたはSpCas9nドメインは、NGG、NGAまたはNGCG PAM配列を有する核酸配列に結合することができる。
いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135X、R1335X、およびT1336X突然変異の1つ以上、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、ここでXは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135E、R1335Q、およびT1336R突然変異の1つ以上、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135E、R1335Q、およびT1336R突然変異、または本明細書に提供されるアミノ配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135X、R1335X、およびT1336X突然変異のうちの1つ以上、または本明細書において提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、ここでXは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135V、R1335Q、およびT1336R突然変異の1以上、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135V、R1335Q、およびT1337R突然変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135X、G1217X、R1335X、およびT1336X突然変異の1以上、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、ここでXは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135V、G1217R、R1335Q、およびT1336R突然変異の1つ以上、または本明細書に提供されるアミノ配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135V、G1217R、R1335Q、およびT1336R突然変異、または本明細書において提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかのCas9ドメインは、本明細書に記載されるCas9ポリペプチドに対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかのCas9ドメインは、本明細書に記載される任意のCas9ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかのCas9ドメインは、本明細書に記載される任意のCas9ポリペプチドのアミノ酸配列からなる。
いくつかの例において、本明細書に開示される塩基エディターのCRISPRタンパク質由来ドメインによって認識されるPAMは、塩基エディターをコードするインサート(例えばAAVインサート)とは別個のオリゴヌクレオチド上で細胞に提供され得る。そのような実施形態では、別個のオリゴヌクレオチド上にPAMを提供することは、さもなくば標的配列と同じポリヌクレオチド上に隣接するPAMが存在しないために切断することができない標的配列の切断を可能にする。
一実施形態において、S. pyogenes Cas9 (SpCas9) を、ゲノム工学のためのCRISPRエンドヌクレアーゼとして使用することができる。ただし、他のものも使用され得る。いくつかの実施形態では、異なるエンドヌクレアーゼを用いて特定のゲノム標的を標的化することができる。いくつかの実施形態では、非NGG PAM配列を有する合成SpCas9由来バリアントを使用することができる。さらに、様々な種からの他のCas9オルソログが同定されており、これらの 「非SpCas9」は、本開示でも有用になり得る種々のPAM配列に結合し得る。例えば、比較的大きなサイズのSpCas9（約4キロベース（kb）のコード配列）は、細胞内で効率的に発現することができないSpCas9 cDNAプラスミドをもたらすこともあり得る。逆に、Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) のコード配列は、SpCas9よりも約1キロベース短いので、細胞内で効率的に発現させ得る。SpCas9と同様に、SaCas9エンドヌクレアーゼは、in vitroの哺乳類細胞およびin vivoのマウスにおいて標的遺伝子を修飾する能力がある。ある実施形態では、Casタンパク質は異なるPAM配列を標的とすることができる。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、Cas9 PAM、例えば、5’-NGGに隣接し得る。他の実施形態では、他のCas9オーソログは異なるPAM要件を有し得る。例えば、S. thermophilus のもののようなPAM（CRISPR1の場合は5’-NNAGAA、CRISPR3の場合は5’-NGGNG）およびNeisseria meningiditis のもの（5’-NNNNGATT）のような他のPAMも標的遺伝子に隣接して見出され得る。
いくつかの実施形態において、S. pyogenes系について、標的遺伝子配列は、5’-NGG PAMの前(すなわち、その5’側)にあり得、20 ntガイドRNA配列が、反対側の鎖と塩基対を形成して、PAMに隣接するCas9切断を媒介することができる。ある実施形態では、隣接切断は、PAMの（約）3塩基対上流であり得る。ある実施形態では、隣接切断は、PAMの（約）10塩基対上流であり得る。ある実施形態では、隣接切断は、PAMの（約）0〜20塩基対上流であり得る。例えば、隣接切断は、PAM上流の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30塩基対の隣であり得る。隣接切断はPAMの1〜30塩基対下流でもあり得る。PAM配列に結合することができる例示的なSpCas9タンパク質の配列は、以下の通りである:
例示的なPAM結合SpCas9のアミノ酸配列は以下の通りである：
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD.
例示的なPAM結合SpCas9nのアミノ酸配列は以下の通りである：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD.
例示的なPAM結合SpEQR Cas9のアミノ酸配列は以下のとおりである：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFESPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKQYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD.
この配列において、D1135、R1335およびT1337から変異されてSpEQR Cas9を生じることができる残基E1135、Q1335およびR1337には太字で下線を付している。
例示的なPAM結合SpVQR Cas9のアミノ酸配列は以下の通りである：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFVSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKQYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD.
この配列において、D1135、R1335、およびT1336から変異されてSpVQR Cas9を生じることができる残基V1135、Q1335、およびR1336には太字で下線を付している。
例示的なPAM結合SpVRER Cas9のアミノ酸配列は以下の通りである：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFVSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASARELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKEYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD.
ある態様において、Cas9ドメインは、組換えCas9ドメインである。ある態様において、組換えCas9ドメインは、SpyMacCas9ドメインである。いくつかの実施形態において、SpyMacCas9ドメインは、ヌクレアーゼ活性SpyMacCas9、ヌクレアーゼ不活性SpyMacCas9 (SpyMacCas9d) 、またはSpyMacCas9ニッカーゼ(SpyMacCas9n) である。いくつかの実施形態において、SaCas9ドメイン、SaCas9dドメイン、またはSaCas9nドメインは、非標準PAMを有する核酸配列に結合することができる。いくつかの実施形態において、SpyMacCas9ドメイン、SpCas9dドメイン、またはSpCas9nドメインは、NAA PAM配列を有する核酸配列に結合することができる。
例示的SpyMacCas9
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDDYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFGSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLADSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQIYNQLFEENPINASRVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKRNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNSEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGAYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDRGMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGHSLHEQIANLAGSPAIKKGILQTVKIVDELVKVMGHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFIKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEIQTVGQNGGLFDDNPKSPLEVTPSKLVPLKKELNPKKYGGYQKPTTAYPVLLITDTKQLIPISVMNKKQFEQNPVKFLRDRGYQQVGKNDFIKLPKYTLVDIGDGIKRLWASSKEIHKGNQLVVSKKSQILLYHAHHLDSDLSNDYLQNHNQQFDVLFNEIISFSKKCKLGKEHIQKIENVYSNKKNSASIEELAESFIKLLGFTQLGATSPFNFLGVKLNQKQYKGKKDYILPCTEGTLIRQSITGLYETRVDLSKIGED.
ある場合には、バリアントCas9タンパク質はH840A、P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A、D1218A の突然変異を有し、その結果、標的DNAまたはRNAを切断する能力が低下している。このようなCas9タンパク質は、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力は低下しているが、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力は保持している。別の非限定的な例として、いくつかの場合において、バリアントCas9タンパク質は、D10A、H840A、P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A、およびD1218A 突然変異を有し、その結果、ポリペプチドは、標的DNA(例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力が低下している。そのようなCas9タンパク質は、標的DNA(例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力を低下しているが、標的DNA(例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力を保持している。バリアントCas9タンパク質がW476AおよびW1126A変異を有する場合、またはバリアントCas9タンパク質がP475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A、およびD1218A 変異を有する場合、バリアントCas9タンパク質はPAM配列に効率的に結合しない。したがって、このような場合には、このようなバリアントCas9タンパク質を結合の方法に用いると、この方法はPAM配列を必要としない。換言すれば、ある場合には、このようなバリアントCas9タンパク質を結合の方法に用いる場合、この方法はガイドRNAを含み得るが、この方法は、PAM配列の非存在下で行うことができる(したがって、結合の特異性はガイドRNAの標的セグメントによってもたらされる)。上記の効果を達成するために、他の残基が変異され得る(すなわち一方または他方のヌクレアーゼ部分を不活性化する)。非限定的な例として、残基D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986、および/またはA987を変更(すなわち置換)することができる。また、アラニン置換以外の変異も好適である。
ある態様において、塩基エディターのCRISPRタンパク質由来ドメインは、標準的PAM配列(NGG) を有するCas9タンパク質の全部または一部を含み得る。他の実施形態では、塩基エディターのCas9由来ドメインは、非標準的PAM配列を用いることができる。そのような配列は本技術分野で記述されており当業者には明らかであろう。例えば、非標準的PAM配列に結合するCas9ドメインは、Kleinstiver, B. P., et al., “Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities” Nature, 523, 481-485 (2015); および Kleinstiver, B. P., et al., “Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition”Nature Biotechnology, 33, 1293-1298 (2015)に記述されており、それぞれの全内容を参照によりここに組み込む。
［核局在化配列 (NLS) を含む融合タンパク質］
いくつかの態様において、本明細書で提供される融合タンパク質は、一つ以上 (例:2, 3, 4, 5) の核ターゲティング配列、例えば、核局在化配列 (NLS) をさらに含む。一実施形態では、二部分（bipartite）NLSが使用される。いくつかの態様において、NLSは、NLSを含むタンパク質の細胞核中への輸入(例えば核輸送によるもの)を促進するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される融合タンパク質のいずれかは、核局在化配列 (NLS) をさらに含む。いくつかの実施形態において、NLSは融合タンパク質のN末端に融合される。いくつかの実施形態において、NLSは融合タンパク質のC末端に融合される。いくつかの実施形態において、NLSはCas9ドメインのN末端に融合される。いくつかの実施形態において、NLSはnCas9ドメインまたはdCas9ドメインのC末端に融合される。いくつかの実施形態において、NLSはデアミナーゼのN末端に融合される。いくつかの実施形態において、NLSはデアミナーゼのC末端に融合される。いくつかの実施形態において、NLSは、1つ以上のリンカーを介して融合タンパク質に融合される。ある態様において、NLSは、リンカーなしで融合タンパク質に融合される。いくつかの実施形態において、NLSは、本明細書において提供または参照されるNLS配列のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。さらなる核局在化配列は当技術分野で公知であり、当業者には明らかであろう。例えば、NLS配列は、Plank et al., PCT/EP2000/011690に記載されており、その内容は、例示的な核局在化配列の開示について参照により本明細書に組み込まれる。ある態様において、NLSは、アミノ酸配列PKKKRKVEGADKRTADGSEFESPKKKRKV, KRTADGSEFESPKKKRKV, KRPAATKKAGQAKKKK, KKTELQTTNAENKTKKL, KRGINDRNFWRGENGRKTR, RKSGKIAAIVVKRPRKPKKKRKV, またはMDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLCを含む。いくつかの実施形態において、NLSはリンカー中に存在するか、またはNLSはリンカー、例えば本明細書に記載されるリンカーによって隣接される。いくつかの実施形態において、N末端またはC末端NLSは、二部分NLSである。二部分NLSは、比較的短いスペーサー配列によって分離される二つの塩基性アミノ酸クラスターを含む（それゆえにbipartite、二部分と呼ばれ、一部分（monopartite）NLSは異なる）。ヌクレオプラスミンのNLSであるKR[PAATKKAGQA]KKKKは遍在的な二部シグナルのプロトタイプであり、塩基性アミノ酸の二つのクラスターが約10アミノ酸のスペーサーによって隔てられたものである。例示的な二部NLSの配列は、PKKKRKVEGADKRTADGSEFES PKKKRKVである。
いくつかの態様において、本発明の融合タンパク質は、リンカー配列を含まない。ある態様において、1以上のドメインまたはタンパク質の間にリンカー配列が存在する。
本開示の融合タンパク質は、1つ以上のさらなる特徴を含み得ることが理解されるべきである。例えば、いくつかの態様において、融合タンパク質は、阻害因子、細胞質局在化配列、核外輸送配列などの輸送配列、または他の局在化配列、ならびに融合タンパク質の可溶化、精製、または検出に有用な配列タグを含むことができる。本明細書において提供される適切なタンパク質タグには、限定されるものではないが、ビオチンカルボキシラーゼキャリアータグ (BCCP) タグ、myc-タグ、カルモジュリンタグ、FLAG-タグ、ヘマグルチニン (HA) -タグ、ポリヒスチジンタグ（ヒスチジンタグまたはHis-タグとも呼ばれる）、マルトース結合タンパク質 (MBP) -タグ、nus-タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ (GST) -タグ、緑色蛍光タンパク質 (GFP) -タグ、チオレドキシンタグ、S-タグ、ソフタグ(例えばSoftag1、Softag3)、ストレプトタグ、ビオチンリガーゼタグ、FLAsHタグ、V5タグ、およびSBP-タグが含まれる。さらなる適切な配列は、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、1つ以上のHisタグを含む。
1以上の核局在化配列 (NLS) を含むCRISPR酵素をコードするベクターを使用することができる。例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個のNLSを使用することができる。CRISPR酵素は、アミノ末端またはその近傍のNLS、カルボキシ末端またはその近傍の約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ以上のNLS、またはこれらの任意の組み合わせ(例えばアミノ末端における1以上のNLSおよびカルボキシ末端における1以上のNLS)を含むことができる。複数のNLSが存在する場合、各NLSは他から独立して選択することができ、したがって1つのNLSが1つ以上のコピーで存在することができ、および/または1つ以上のコピーで存在する1つ以上の他のNLSと組み合わせて存在することができる。
法において使用されるCRISPR酵素は、約6個のNLSを含むことができる。NLSに最も近いアミノ酸がN-またはC-末端からポリペプチド鎖に沿って約50アミノ酸内（例えば1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、または50アミノ酸内）にあるとき、そのNLSはN-またはC-末端の近傍にあると考えられる。
［排他性が低減されたCas9ドメイン］
典型的には、S. pyogenes由来のCas9 (spCas9) などのCas9タンパク質は、特定の核酸領域に結合するために標準的なNGG PAM配列を必要とし、ここで「NGG」の「N」はアデノシン (A) 、チミジン (T) またはシトシン (C) であり、Gはグアノシンである。これは、ゲノム内の所望の塩基を編集する能力を制限し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される塩基編集融合タンパク質は、正確な位置、例えばPAMの上流にある標的塩基を含む領域に配置することが必要になり得る。例えばKomor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016)参照（これらの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。従って、いくつかの実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかは、標準的（例えばNGG）PAM配列を含まないヌクレオチド配列に結合することができるCas9ドメインを含み得る。非標準的PAM配列に結合するCas9ドメインは本技術分野において記述されており当業者には明らかであろう。例えば、非標準PAM配列に結合するCas9ドメインは、Kleinstiver, B. P., et al., “Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities” Nature 523, 481-485 (2015); およびKleinstiver, B. P., et al., “Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition” Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015); Nishimasu, H., et al., “Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space” Science. 2018 Sep 21;361(6408):1259-1262, Chatterjee, P., et al., Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog” Sci Adv. 2018 Oct 24;4(10):eaau0766. doi: 10.1126/sciadv.aau0766に記述されており、それぞれの全内容を参照によりここに組み込む。
［核酸塩基編集ドメイン］
ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインおよび核酸塩基編集ドメイン(例えば1つ以上のデアミナーゼドメイン)を含む融合タンパク質を含む塩基エディターを本明細書に記載する。塩基エディターは、標的配列を認識することができるガイドポリヌクレオチドと相互作用することによって、標的ポリヌクレオチド配列中の1以上の塩基を編集するようにプログラムすることができる。標的配列がいったん認識されると、編集が行われるポリヌクレオチド上に塩基エディターが固定され、次いで、塩基エディターの1つ以上のデアミナーゼドメイン成分が標的塩基を編集することができる。
ある態様において、核酸塩基編集ドメインは、1つ以上のデアミナーゼドメインを含む。本明細書で特に説明されているように、デアミナーゼドメインは、シトシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼと、アデニンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼとを含む（例えばマルチエフェクター塩基エディター）。いくつかの実施形態では、「シトシンデアミナーゼ」および「シチジンデアミナーゼ」という用語は、交換可能に使用され得る。いくつかの実施形態では、「アデニンデアミナーゼ」および「アデノシンデアミナーゼ」という用語は、交換可能に使用され得る。核酸塩基編集タンパク質の詳細は、国際PCT出願番号PCT/2017/045381 (WO2018/027078) およびPCT/US2016/058344 (WO2017/070632) に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。Komor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage”Nature 551, 464-471 (2017); および Komor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017)も参照（その全内容が参照により本明細書に組み込まれる）。
［AからGへの編集］
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼを含むデアミナーゼドメインを含むことができる。塩基エディターのこのようなアデノシンデアミナーゼドメインは、Aを脱アミノ化して、Gの塩基対形成特性を示すイノシン (I) を形成することによって、アデニン (A) 核酸塩基からグアニン (G) 核酸塩基への編集することを促進することができる。アデノシンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸 (DNA) 中のデオキシアデノシン残基のアデニンを脱アミノ化すること(すなわちアミン基を除去すること)ができる。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される核酸塩基エディターは、1つ以上のタンパク質ドメインを融合させ、それによって融合タンパク質を生成することによって作製することができる。ある態様において、本明細書において提供される融合タンパク質は、融合タンパク質の塩基編集活性(例えば効率、選択性、特異性)を改善する一つ以上の特徴を含む。例えば、本明細書中に提供される融合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性が低下したCas9ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、本明細書中で提供される融合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有さないCas9ドメイン (dCas9) 、または、Cas9ニッカーゼ (nCas9) と呼ばれる、二本鎖DNA分子の一鎖を切断するCas9ドメインを有することができる。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、触媒残基(例えばH840)の存在が、標的Aと反対のTを含有する非編集（例えば非脱アミノ化）鎖を切断するCas9の活性を維持する。Cas9の触媒残基の突然変異(例えばD10からA10)は、標的A残基を含有する編集鎖の切断を妨げる。このようなCas9バリエーションは、gRNAによって規定される標的配列に基づく特定の位置で単一鎖DNA切断 (ニック) を生じさせることができ、非編集鎖の修復を導き、最終的には編集鎖においてTからCへの変化をもたらす。ある態様において、AからGへの塩基エディターは、イノシン塩基除去修復の阻害因子、例えば、ウラシルグリコシラーゼ阻害因子 (UGI) ドメインまたは触媒的に不活性なイノシン特異的ヌクレアーゼをさらに含む。いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、UGIドメインまたは触媒的に不活性なイノシン特異的ヌクレアーゼは、脱アミノ化されたアデノシン残基(例えばイノシン)の塩基除去修復を阻害または防止することができ、これが、塩基エディターの活性または効率を改善させることができる。
アデノシンデアミナーゼを含む塩基エディターは、DNA、RNAおよびDNA-RNAハイブリッドを含む任意のポリヌクレオチドに作用することができる。特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼを含む塩基エディターは、RNAを含むポリヌクレオチドの標的Aを脱アミノ化することができる。例えば、塩基エディターは、RNAポリヌクレオチドおよび/またはDNA-RNAハイブリッドポリヌクレオチドの標的Aを脱アミノ化することができるアデノシンデアミナーゼドメインを含むことができる。一実施形態によると、塩基エディターに組み込まれたアデノシンデアミナーゼは、RNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR、例えばADAR1またはADAR2)の全部または一部を含む。別の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたアデノシンデアミナーゼは、tRNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAT)の全部または一部を含む。アデノシンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターはまた、DNAポリヌクレオチドのA核酸塩基を脱アミノ化する能力も有し得る。一実施形態では、塩基エディターのアデノシンデアミナーゼドメインは、1以上の突然変異を含むADATの全部または一部を含み、これがDNA中の標的AをADATが脱アミノ化することを可能にする。例えば、塩基エディターは、D108N、A106V、D147Y、E155V、L84F、H123Y、I157F、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異の1以上を含む大腸菌由来のADAT (EcTadA)の全部または一部を含むことができる。
アデノシンデアミナーゼは、任意の適切な生物（例えば大腸菌）に由来することができる。ある態様において、アデニンデアミナーゼは、天然に存在するアデノシンデアミナーゼが本明細書に提供される突然変異のいずれかに対応する一つ以上の突然変異を含むものである(例えば、ecTadAにおける突然変異)。任意の相同タンパク質中の対応する残基は、例えば、配列アラインメントおよび相同残基の決定によって同定することができる。本明細書中に記載された突然変異のいずれか(例えば、ecTadAで同定された突然変異のいずれか)に対応する、任意の天然アデノシンデアミナーゼ(例えば、ecTadAに対して相同性を有するもの)における突然変異を、それに応じて生成することができる。
［TadA］
特定の実施形態では、TadAは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるPCT/US2017/045381(国際公開第2018/027078号)または本明細書に記載されているTadAのいずれかである。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかのアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼは、一つ以上の突然変異(例えば本明細書に提供される突然変異のいずれか)を含み得ることが理解されるべきである。本開示は、特定のパーセント同一性を有するとともに、本明細書に記載される突然変異のいずれかまたはそれらの組合せを伴うデアミナーゼドメインを提供する。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、参照配列と比較して、または本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個またはそれ以上の変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、当該技術分野において既知であるかまたは本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれかと比較して、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも35個、少なくとも40個、少なくとも45個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、少なくとも100個、少なくとも110個、少なくとも120個、少なくとも130個、少なくとも140個、少なくとも150個、少なくとも160個、または少なくとも170個の同一の一続きのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、TadAデアミナーゼは、全長大腸菌TadAデアミナーゼである。例えば、特定の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、以下のアミノ酸配列を含む：
MRRAFITGVFFLSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEI KAQKKAQSSTD.
しかしながら、本出願において有用なさらなるアデノシンデアミナーゼが当業者には明らかであり、本開示の範囲内であることが理解されるべきである。例えば、アデノシンデアミナーゼは、tRNAに作用するアデノシンデアミナーゼ（ADAT）のホモログであり得る。限定されるものではないが、例示的なAD ATホモログのアミノ酸配列は以下のものを含む：
Staphylococcus aureus TadA:
MGSHMTNDIYFMTLAIEEAKKAAQLGEVPIGAIITKDDEVIARAHNLRETLQQPTAHAEHIAIERAAKVLGSWRLEGCTLYVTLEPCVMCAGTIVMSRIPRVVYGADDPKGGCSGS LMNLLQQSNFNHRAIVDKGVLKEACSTLLTTFFKNLRANKKSTN
Bacillus subtilis TadA:
MTQDELYMKEAIKEAKKAEEKGEVPIGAVLVINGEIIARAHNLRETEQRSIAHAEMLVIDEACKALGTWRLEGATLYVTLEPCPMCAGAVVLSRVEKVVFGAFDPKGGCSGTLMNLLQEERFNHQAEVVSGVLEEECGGMLSAFFRELRKKKKAARKNLSE
Salmonella typhimurium (S. typhimurium) TadA:
MPPAFITGVTSLSDVELDHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNHRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVLQNYRLLDTTLYVTLEPCVMCAGAMVHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLIDVLHHPGMNHRVEIIEGVLRDECATLLSDFFRMRRQEIKALKKADRAEGAGPAV
Shewanella putrefaciens (S. putrefaciens) TadA:
MDEYWMQVAMQMAEKAEAAGEVPVGAVLVKDGQQIATGYNLSISQHDPTAHAEILCLRSAGKKLENYRLLDATLYITLEPCAMCAGAMVHSRIARVVYGARDEKTGAAGTVVNLLQHPAFNHQVEVTSGVLAEACSAQLSRFFKRRRDEKKALKLAQRAQQGIE
Haemophilus influenzae F3031 (H. influenzae) TadA:
MDAAKVRSEFDEKMMRYALELADKAEALGEIPVGAVLVDDARNIIGEGWNLSIVQSDPTΑΗAEIIALRNGAKNIQNYRLLNSTLYVTLEPCTMCAGAILHSRIKRLVFGASDYKTGAIGSRFHFFDDYKMNHTLEITSGVLAEECSQKLSTFFQKRREEKKIEKALLKSLSDK
Caulobacter vibrioides (C. vibrioides) TadA:
MRTDESEDQDHRMMRLALDAARAAAEAGETPVGAVILDPSTGEVIATAGNGPIAAHDPTAHAEIAAMRAAAAKLGNYRLTDLTLVVTLEPCAMCAGAISHARIGRVVFGADDPKGGAVVHGPKFFAQPTCHWRPEVTGGVLADESADLLRGFFRARRKAKI
Geobacter sulfurreducens (G. sulfurreducens) TadA:
MSSLKKTPIRDDAYWMGKAIREAAKAAARDEVPIGAVIVRDGAVIGRGHNLREGSNDPSAHAEMIAIRQAARRSANWRLTGATLYVTLEPCLMCMGAIILARLERVVFGCYDPKGGAAGSLYDLSADPRLNHQVRLSPGVCQEECGTMLSDFFRDLRRRKKAKATPALF IDERKVPPEP
E. coli TadA (ecTadA) の実施形態は以下のものを含む：
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、原核生物由来である。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、細菌由来である。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、Escherichia coli、Staphylococcus aureus、Salmonella typhi、Shewanella putrefaciens、Haemophilus influenzae、Caulobacter crescentus、またはBacillus subtilisに由来する。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌由来である。
1つの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、TadA7.10に連結された野生型TadAがCas9ニッカーゼに連結されたものを含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、単一のTadA7.10ドメイン(例えば、モノマーとして提供される)を含む。他の実施形態では、ABE7.10エディターは、TadA7.10およびTadA(wt) を含み、これらはヘテロ二量体を形成することができる。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかに記載のアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性であるアミノ酸配列を含む。本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼは、一つ以上の突然変異(例えば、本明細書に提供される突然変異のいずれか)を含み得ることが理解されるべきである。本開示は、特定のパーセント同一性を有するデアミナーゼドメインが加えて本明細書に記載される突然変異のいずれかまたはその組合せを含むものを提供する。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、参照配列または本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはそれ以上の変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、当該技術分野において既知であるかまたは本明細書に記載されたアミノ酸配列のいずれかと比較して、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも35個、少なくとも40個、少なくとも45個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、少なくとも100個、少なくとも110個、少なくとも120個、少なくとも130個、少なくとも140個、少なくとも150個、少なくとも160個、または少なくとも170個の同一の連続するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書に提供される突然変異（例えばTadA参照配列に基づくもの）のいずれもが、大腸菌TadA（ecTadA）、黄色ブドウ球菌TadA（saTadA）、または他のアデノシンデアミナーゼ（例えば細菌アデノシンデアミナーゼ）などの他のアデノシンデアミナーゼに導入され得ることが理解されるべきである。さらなるデアミナーゼを同様にアラインメントして、本明細書中に提供されるように変異させ得る相同的アミノ酸残基を同定できることは、当業者には明らかであろう。したがって、TadA参照配列において同定された突然変異のいずれも、相同的なアミノ酸残基を有する他のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTada）において作製することができる。また、本明細書中に提供される突然変異のいずれも、TadA参照配列または別のアデノシンデアミナーゼにおいて、個々にまたは任意の組合せで作製できることが理解されるべきである。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるD108X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ(例えばecTadA)における対応する突然変異を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、D108G、D108N、D108V、D108A、またはD108Y突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるA106X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるA106V突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば野生型TadAまたはecTadA）における対応する突然変異を含む。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるE155X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるE155D、E155G、またはE155V突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるD147X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるD147Y突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるA106X、E155X、またはD147X、突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、E155D、E155G、またはE155V突然変異を含む。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、D147Yを含む。
例えば、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるD108N、A106V、E155V、および/またはD147Y突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み得る。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列における以下の突然変異群（突然変異の群は「；」によって分離されている）、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む：D108NおよびA106V；D108NおよびE155V；D108NおよびD147Y；A106VおよびE155V；A106VおよびD147Y；E155VおよびD147Y；D108N, A106V,およびE55V；D108N, A106V,およびD147Y；D108N, E55V,およびD147Y；A106V, E55V,およびD 147Y；およびD108N, A106V, E55V,およびD147Y。ただし、ここで提供される対応する突然変異の任意の組合せを、アデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）において作製することができることを理解されたい。
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8X、T17X、L18X、W23X、L34X、W45X、R51X、A56X、E59X、E85X、M94X、I95X、V102X、F104X、A106X、R107X、D108X、K110X、M118X、N127X、A138X、F149X、M151X、R153X、Q154X、I156X、および/またはK157X突然変異のうちの1以上、または他のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における1以上の対応する突然変異を含み、ここで、Xの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を示す。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に関連するH8Y、T17S、L18E、W23L、L34S、W45L、R51H、A56E、またはA56S、E59G、E85K、またはE85G、M94L、1951、V102A、F104L、A106V、R107C、またはR107H、またはR107P、D108G、またはD108N、またはD108A、D108Y、K110I、M118K、N127S、A138V、F149Y、M151V、R153C、Q154L、I156D、および/またはK157R突然変異のうちの1つ以上、または他のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における1つ以上の対応する突然変異を含む。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8X、D108X、および/またはN127X突然変異のうちの1つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における1つ以上の対応する突然変異を含み、Xは任意のアミノ酸の存在を示す。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、D108N、および/またはN127S突然変異の1以上、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における1以上の対応する突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8X、R26X、M61X、L68X、M70X、A106X、D108X、A109X、N127X、D147X、R152X、Q154X、E155X、K161X、Q163X、および/またはT166X突然変異の1以上、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における1以上の対応する突然変異を含み、ここでXは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、R26W、M61I、L68Q、M70V、A106T、D108N、A109T、N127S、D147Y、R152C、Q154HもしくはQ154R、E155GもしくはE155VもしくはE155D、K161Q、Q163H、および/もしくはT166P突然変異の1つ以上、または他のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における1つ以上の対応する突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8X、D108X、N127X、D147X、R152X、およびQ154Xからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異（複数可）を含み、ここでXは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8X、M61X、M70X、D108X、N127X、Q154X、E155X、およびQ163Xからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、または8つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異（複数可）を含み、ここでXは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8X、D108X、N127X、E155X、およびT166Xからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異（複数可）を含み、ここでXは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、H8X、A106X、D108X、別のアデノシンデアミナーゼにおける突然変異（複数可）からなる群から選択される1、2、3、4、5、または6個の突然変異を含み、ここでXは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、H8X、R126X、L68X、D108X、N127X、D147X、およびE155Xからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、または8つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異（複数可）を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8X、D108X、A109X、N127X、およびE155Xからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異（複数可）を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、D108N、N127S、D147Y、R152C、およびQ154Hからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、M61I、M70V、D108N、N127S、Q154R、E155GおよびQ163Hからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つまたは8つの突然変異、または他のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、D108N、N127S、E155V、およびT166Pからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、A106T、D108N、N127S、E155D、およびK161Qからなる群から選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの突然変異、または他のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、R126W、L68Q、D108N、N127S、D147Y、およびE155Vからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、または8つの突然変異、または他のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、D108N、A109T、N127S、およびE155Gからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異（複数可）を含む。
本明細書に提供される突然変異のいずれか、および任意のさらなる突然変異(例えばecTadAアミノ酸配列に基づくもの)は、任意の他のアデノシンデアミナーゼに導入することができる。本明細書に提供される突然変異のいずれも、TadA参照配列または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）において、個々に、または任意の組合せで作製することができる。
AからGへの核酸塩基編集タンパク質の詳細は、国際PCT出願第PCT/2017/045381号(国際公開第2018/027078号)およびGaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage” Nature, 551, 464-471 (2017)に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）において一つ以上の対応する突然変異を含む。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列においてD108N、D108G、もしくはD108V突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）において対応する突然変異を含む。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるA106VおよびD108N突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるR107CおよびD108N突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、D108N、N127S、D147Y、およびQ154H突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、R24W、D108N、N127S、D147Y、およびE155V突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるD108N、D147Y、およびE155V突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、D108N、およびN127S突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるA106V、D108N、D147YおよびE155V突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、tadA参照配列におけるS2X、H8X、I49X、L84X、H123X、N127X、I156Xおよび/またはK160X突然変異の1つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含み、Xの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を示す。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるS2A、H8Y、I49F、L84F、H123Y、N127S、I156Fおよび/またはK160S突然変異のうちの1つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における1つ以上の対応する突然変異を含む。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、L84X突然変異アデノシンデアミナーゼを含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるL84F突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH123X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH123Y突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるI157X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるI157F突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列において、L84X、A106X、D108X、H123X、D147X、E155X、およびI156Xからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、または7つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異（複数可）を含み、ここでXは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、tadA参照配列においてS2X、I49X、A106X、D108X、D147X、およびE155Xからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異（複数可）を含み、ここでXは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列においてH8X、A106X、D108X、N127X、およびK160Xからなる群より選択される1、2、3、4、または5個の突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異（複数可）を含み、ここでXは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列において、L84F、A106V、D108N、H123Y、D147Y、E155V、およびI156Fからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、または7つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列において、S2A、I49F、A106V、D108N、D147Y、およびE155Vからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列においてH8Y、A106T、D108N、N127S、およびK160Sからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異もしくは突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列においてE 25 X、R 26 X、R 107 X、A 142 X、および/またはA 143 X突然変異のうちの1以上、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における1以上の対応する突然変異を含み、Xの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA基準配列においてE25M, E25D, E25A, E25R, E25V, E25S, E25Y, R26G, R26N, R26Q, R26C, R26L, R26K, R107P, R07K, R107A, R107N, R107W, R107H, R107S, A142N, A142D, A142G, A143D, A143G, A143E, A143L, A143W, A143M, A143S, A143Q および/または A143R突然変異のうちの1以上、または他のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における1以上の対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対応する本明細書に記載の突然変異のうちの1つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異のうちの1つ以上を含む。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるE25X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるE25M、E25D、E25A、E25R、E25V、E25S、またはE25Y突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるR26X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるR26G、R26N、R26Q、R26C、R26L、またはR26K突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるR107X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるR107P、R07K、R107A、R107N、R107W、R107H、またはR107S突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるA142X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるA142N、A142D、A142G突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるA143X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるA143D、A143G、A143E、A143L、A143W、A143M、A143S、A143Qおよび/またはA143Rの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH36X、N37X、P48X、I49X、R51X、M70X、N72X、D77X、E134X、S146X、Q154X、K157X、および/またはK161X突然変異の1つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における1つ以上の対応する突然変異を含み、ここでXの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を示す。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH36L、N37T、N37S、P48T、P48L、I49V、R51H、R51L、M70L、N72S、D77G、E134G、S146R、S146C、Q154H、K157N、および/またはK161T突然変異の1以上、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における1以上の対応する突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH36X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、ここでXは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH36L突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるN37X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるN37TまたはN37S突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるP48X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、ここでXは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるP48TまたはP48L突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるR51X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるR51HまたはR51L突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるS146X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるS146RまたはS146C突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるK157X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるK157N突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるP48X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、ここでXは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるP48S、P48T、またはP48A突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるA142X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるA142N突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるW23X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、ここでXは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるW23RまたはW23L突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるR152X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含み、ここでXは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるR152PまたはR52H突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）における対応する突然変異を含む。
一実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、突然変異H36L、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、E155V、I156F、およびK157Nを含むことができる。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、tadA基準配列に関連する突然変異の以下の組合せを含み、ここで、組合せの各突然変異は「_」によって分離され、突然変異の各組合せは括弧内にある：
(A106V_D108N),
(R107C_D108N),
(H8Y_D108N_N127S_D147Y_Q154H),
(H8Y_R24W_D108N_N127S_D147Y_E155V),
(D108N_D147Y_E155V),
(H8Y_D108N_N127S),
(H8Y_D108N_N127S_D147Y_Q154H),
(A106V_D108N_D147Y_E155V),
(D108Q_D147Y_E155V),
(D108M_D147Y_E155V),
(D108L_D147Y_E155V),
(D108K_D147Y_E155V),
(D108I_D147Y_E155V),
(D108F_D147Y_E155V),
(A106V_D108N_D147Y),
(A106V_D108M_D147Y_E155V),
(E59A_A106V_D108N_D147Y_E155V),
(E59A cat dead_A106V_D108N_D147Y_E155V),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156Y),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),
(D103A_D104N),
(G22P_D103A_D104N),
(G22P_D103A_D104N_S138 A),
(D103A_D104N_S138A),
(R26G_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F),
(E25G_R26G_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V
_I156F), (E25D_R26G_L84F_A106V_R107K_D108N_H123Y_A142N_A143G_D147Y_E155V_
I156F),
(R26Q_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F),
(E25M_R26G_L84F_A106V_R107P_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V
_I156F),
(R26C_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F), (L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_A143L_D147Y_E155V_I156F),
(R26G_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F),
(E25A_R26G_L84F_A106V_R107N_D108N_H123Y_A142N_A143E_D147Y_E155V
_I156F),
(R26G_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F),
(A106V_D108N_A142N_D147Y_E155V),
(R26G_A106V_D108N_A142N_D147Y_E155V),
(E25D_R26G_A106V_R107K_D108N_A142N_A143G_D147Y_E155V),
(R26G_A106V_D108N_R107H_A142N_A143D_D147Y_E155V),
(E25D_R26G_A106V_D108N_A142N_D147Y_E155V),
(A106V_R107K_D108N_A142N_D147Y_E155V),
(A106V_D108N_A142N_A143G_D147Y_E155V),
(A106V_D108N_A142N_A143L_D147Y_E155V),
(H36L_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F _K157N),
(N37T_P48T_M70L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_I49V_E155V_I156F),
(N37S_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K161T),
(H36L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_Q154H_E155V_I156F),
(N72S_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F),
(H36L_P48L_L84F_A106V_D108N_H123Y_E134G_D147Y_E155V_I156F),
(H36L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K157N), (H36L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F_K161T),
(N37S_R51H_D77G_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),
(R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K157N),
(D24G_Q71R_L84F_H96L_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K160E),
(H36L_G67V_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146T_D147Y_E155V_I156F),
(Q71L_L84F_A106V_D108N_H123Y_L137M_A143E_D147Y_E155V_I156F),
(E25G_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_Q159L),
(L84F_A91T_F104I_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),
(N72D_L84F_A106V_D108N_H123Y_G125A_D147Y_E155V_I156F),
(P48S_L84F_S97C_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),
(W23G_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),
(D24G_P48L_Q71R_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_Q159L),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F),
(H36L_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F
_K157N), (N37S_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F_K161T),
(L84F_A106V_D108N_D147Y_E155V_I156F),
(R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N_K161T),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K161T),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N_K160E_K161T),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N_K160E),
(R74Q_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),
(R74A_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),
(R74Q_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),
(L84F_R98Q_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_R129Q_D147Y_E155V_I156F),
(P48S_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F),
(P48S_A142N),
(P48T_I49V_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F_L157N),
(P48T_I49V_A142N),
(H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N),
(H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_A142N_D147Y_E155V_I156F (H36L_P48T_I49V_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F _K157N),
(H36L_P48T_I49V_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_ I156F _K157N),
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N),
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F _K157N),
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_A142N_D147Y_E155V_I156F _K157N),
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F _K157N),
(W23R_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F _K157N),
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F _K161T),
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152H_E155V_I156F _K157N),
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F _K157N),
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V _I156F _K157N),
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142A_S146C_D147Y_E155V
_I156F _K157N),
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142A_S146C_D147Y_R152P _E155V_I156F_K157N),
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F _K161T),
(W23R_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V _I156F _K157N),
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_R152P_E155V
_I156F _K157N).
特定の実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質は、融合タンパク質の塩基編集活性を改善する1つ以上の特徴を含む。例えば、本明細書に提供される融合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性が低下したCas9ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有さないCas9ドメイン (dCas9) 、またはCas9ニッカーゼ (nCas9) と呼ばれる、二本鎖DNA分子の1鎖を切断するCas9ドメインを有し得る。
［アデノシンデアミナーゼ］
本発明の融合タンパク質は、1以上のアデノシンデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼは、アデニンを脱アミノ化することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼは、DNAのデオキシアデノシン残基中のアデニンを脱アミノ化することができる。アデノシンデアミナーゼは、任意の適切な生物（例えば大腸菌）に由来することができる。ある態様において、アデニンデアミナーゼは、本明細書に提供される突然変異のいずれか（例えばecTadAにおける突然変異）に対応する一つ以上の突然変異を含む、天然に存在するアデノシンデアミナーゼである。当業者は、例えば配列アラインメントおよび相同的残基の決定によって、任意の相同的タンパク質中の対応する残基を同定することができる。従って、当業者は、任意の天然に存在するアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA対する相同性を有するもの）において、本明細書に記載された突然変異のいずれか（例えば、ecTadAにおいて同定される突然変異のいずれか）に対応する突然変異を生成することができる。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは原核生物由来である。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、細菌由来である。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、Escherichia coli、Staphylococcus aureus、Salmonella typhi、Shewanella putrefaciens、Haemophilus influenzae、Caulobacter crescentus、またはBacillus subtilisに由来する。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌由来である。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼは、アデニンを脱アミノ化することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼは、DNAのデオキシアデノシン残基中のアデニンを脱アミノ化することができる。ある態様において、アデニンデアミナーゼは、本明細書に提供される突然変異のいずれか（例えばecTadAにおける突然変異）に対応する一つ以上の突然変異を含む、天然に存在するアデノシンデアミナーゼである。当業者は、例えば配列アラインメントおよび相同的残基の決定によって、任意の相同的タンパク質中の対応する残基を同定することができる。従って、当業者は、任意の天然に存在するアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA対する相同性を有するもの）において、本明細書に記載された突然変異のいずれか（例えば、ecTadAにおいて同定される突然変異のいずれか）に対応する突然変異を生成することができる。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは原核生物由来である。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、細菌由来である。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、Escherichia coli、Staphylococcus aureus、Salmonella typhi、Shewanella putrefaciens、Haemophilus influenzae、Caulobacter crescentus、またはBacillus subtilisに由来する。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌由来である。
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかに記載のアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性であるアミノ酸配列を含む。本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼは、一つ以上の突然変異(例えば、本明細書に提供される突然変異のいずれか)を含み得ることが理解されるべきである。本開示は、特定のパーセント同一性を有するデアミナーゼドメインが加えて本明細書に記載される突然変異のいずれかまたはその組合せを含むものを提供する。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、参照配列または本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはそれ以上の変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、当該技術分野において既知であるかまたは本明細書に記載されたアミノ酸配列のいずれかと比較して、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも35個、少なくとも40個、少なくとも45個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、少なくとも100個、少なくとも110個、少なくとも120個、少なくとも130個、少なくとも140個、少なくとも150個、少なくとも160個、または少なくとも170個の同一の連続するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
［CからTへの編集］
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される塩基エディターは、ポリヌクレオチドの標的シチジン (C) 塩基を脱アミノ化してチミンの塩基対形成特性を有するウリジン (U) を生成することができる、シチジンデアミナーゼを含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、例えば、ポリヌクレオチドが二本鎖(例えばDNA)である場合、ウリジン塩基は次いで、チミジン塩基で置換されて(例えば細胞修復機構により)、C:GからT:Aへの転移を生じさせることができる。他の実施形態において、塩基エディターによる核酸中のCからUへの脱アミノ化は、UからTへの置換を伴うことができない。
ポリヌクレオチド中の標的Cを脱アミノ化してUを生じさせることは、本明細書に記載の塩基エディターによって実行することができるタイプの塩基編集の非限定的な例である。別の例において、シチジンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターは、シトシン (C) 塩基からグアニン (G) 塩基への変換を媒介することができる。例えば、塩基エディターのシチジンデアミナーゼドメインによるシチジンの脱アミノ化によって生成されたポリヌクレオチドのUは、塩基除去修復機構(例えばウラシルDNAグリコシラーゼ (UDG) ドメインによるもの)によってポリヌクレオチドから切り出され、脱塩基部位を生成することができる。次に、脱塩基部位の反対側の核酸塩基が、Cのような別の塩基で置換され得(例えば塩基修復機構により)、例えばこれは損傷乗り越えポリメラーゼによって行われる。脱塩基部位の反対側の核酸塩基がCで置換されるのが典型的であるが、他の置換(例えばA、G、T)も起こりうる。
従って、いくつかの実施形態において、本明細書に記載される塩基エディターは、ポリヌクレオチド中の標的Cを脱アミノ化してUにすることができる脱アミノ化ドメイン(例えばシチジンデアミナーゼドメイン)を含む。さらに、以下に記載するように、塩基エディターは、脱アミノ化から生じるUの、ある態様においてはTまたはGへの、変換を促進させるさらなるドメインを含むことができる。例えば、シチジンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターは、さらにウラシルグリコシラーゼ阻害因子 (UGI) ドメインを含み、TによるUの置換を媒介し、CからTへの塩基編集事象を完了することができる。損傷乗り越えポリメラーゼは脱塩基部位の反対側でCの取り込みを促進することができるので(すなわち脱塩基部位でのGの取り込みをもたらし、CからGへの塩基編集事象を完了する)、別の例では塩基エディターは損傷乗り越えポリメラーゼを組み込んで、CからGへの塩基編集の効率を改善させることができる。
ドメインとしてシチジンデアミナーゼを含む塩基エディターは、DNA、RNAおよびDNA-RNAハイブリッドを含む任意のポリヌクレオチドにおいて標的Cを脱アミノ化することができる。典型的には、シチジンデアミナーゼは、ポリヌクレオチドの一本鎖部分の文脈に配置されるC核酸塩基を触媒する。ある態様において、標的Cを含むポリヌクレオチド全体が一本鎖であり得る。例えば、塩基エディターに組み込まれたシチジンデアミナーゼは、一本鎖RNAポリヌクレオチド中の標的Cを脱アミノ化することができる。他の実施形態において、シチジンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターは、二本鎖ポリヌクレオチドに作用することができるが、標的Cは、脱アミノ化反応の時点で一本鎖状態になるポリヌクレオチドの一部に位置し得る。例えば、NAGPBドメインがCas9ドメインを含む実施形態において、いくつかのヌクレオチドは、Cas9-gRNA-標的DNA複合体の形成の際に対合しないままにしておくことができ、その結果、Cas9「Rループ複合体」が形成される。これらの不対ヌクレオチドは、一本鎖特異的ヌクレオチドデアミナーゼ酵素(例えばシチジンデアミナーゼ)の基質として作用し得る一本鎖DNAのバブルを形成することができる。
ある態様において、塩基エディターのシチジンデアミナーゼは、アポリポタンパク質B mRNA編集複合体 (APOBEC) ファミリーデアミナーゼの全部または一部を含むことができる。APOBECは進化的に保存されたシチジンデアミナーゼファミリーである。このファミリーのメンバーはCからUへの編集酵素である。APOBEC様タンパク質のN末端ドメインは触媒ドメインであり、C末端ドメインは偽触媒ドメインである。より具体的には、触媒ドメインは亜鉛依存性のシチジンデアミナーゼドメインであり、シチジンの脱アミノ化にとって重要である。APOBECファミリーメンバーには、APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D(今では「APOBEC3E」はこれを指す)、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4、および活性化誘導 (シチジン) デアミナーゼが含まれる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、APOBEC1デアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、APOBEC2デアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、APOBEC3デアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、APOBEC3Aデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、APOBEC3Bデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、APOBEC3Cデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、APOBEC3Dデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、APOBEC3Eデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、APOBEC3Fデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、APOBEC3Gデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、APOBEC3Hデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、APOBEC4デアミナーゼの全部または一部を含む。ある態様において、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、活性化誘導デアミナーゼ (AID) の全部または一部を含む。ある態様において、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、シチジンデアミナーゼ1 (CDA1) の全部または一部を含む。塩基エディターは、任意の適切な生物(例えばヒトまたはラット)からのデアミナーゼを含むことができることを理解されるべきである。ある態様において、塩基エディターのデアミナーゼドメインは、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、またはマウス由来である。ある態様において、塩基エディターのデアミナーゼドメインは、ラットに由来する(例えばラットAPOBEC1)。ある態様において、塩基エディターのデアミナーゼドメインは、ヒトAPOBEC1である。ある態様において、塩基エディターのデアミナーゼドメインは、PmCDA1である。
PmCDA1のアミノ酸配列および核酸配列を下記に示す。
>tr|A5H718|A5H718_PETMA Cytosine deaminase OS=Petromyzon marinus OX=7757 PE=2 SV=1 amino acid sequence:
MTDAEYVRIHEKLDIYTFKKQFFNNKKSVSHRCYVLFELKRRGERRACFWGYAVNKPQSGTERGIHAEIFSIRKVEEYLRDNPGQFTINWYSSWSPCADCAEKILEWYNQELRGNGHTLKIWACKLYYEKNARNQIGLWNLRDNGVGLNVMVSEHYQCCRKIFIQSSHNQLNENRWLEKTLKRAEKRRSELSIMIQVKILHTTKSPAV
核酸配列: >EF094822.1 Petromyzon marinus isolate PmCDA.21 cytosine deaminase mRNA, complete cds:
TGACACGACACAGCCGTGTATATGAGGAAGGGTAGCTGGATGGGGGGGGGGGGAATACGTTCAGAGAGGACATTAGCGAGCGTCTTGTTGGTGGCCTTGAGTCTAGACACCTGCAGACATGACCGACGCTGAGTACGTGAGAATCCATGAGAAGTTGGACATCTACACGTTTAAGAAACAGTTTTTCAACAACAAAAAATCCGTGTCGCATAGATGCTACGTTCTCTTTGAATTAAAACGACGGGGTGAACGTAGAGCGTGTTTTTGGGGCTATGCTGTGAATAAACCACAGAGCGGGACAGAACGTGGAATTCACGCCGAAATCTTTAGCATTAGAAAAGTCGAAGAATACCTGCGCGACAACCCCGGACAATTCACGATAAATTGGTACTCATCCTGGAGTCCTTGTGCAGATTGCGCTGAAAAGATCTTAGAATGGTATAACCAGGAGCTGCGGGGGAACGGCCACACTTTGAAAATCTGGGCTTGCAAACTCTATTACGAGAAAAATGCGAGGAATCAAATTGGGCTGTGGAACCTCAGAGATAACGGGGTTGGGTTGAATGTAATGGTAAGTGAACACTACCAATGTTGCAGGAAAATATTCATCCAATCGTCGCACAATCAATTGAATGAGAATAGATGGCTTGAGAAGACTTTGAAGCGAGCTGAAAAACGACGGAGCGAGTTGTCCATTATGATTCAGGTAAAAATACTCCACACCACTAAGAGTCCTGCTGTTTAAGAGGCTATGCGGATGGTTTTC
ヒト活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（AID）のコード配列（CDS）のアミノ酸配列および核酸配列を下記に示す。
>tr|Q6QJ80|Q6QJ80_HUMAN Activation-induced cytidine deaminase OS=Homo sapiens OX=9606 GN=AICDA PE=2 SV=1 amino acid sequence:
MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLCYVVKRRDSATSFSLDFGYLRNKNGCHVELL
FLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVADFLRGNPNLSLRIFTARLYFCEDRK
AEPEGLRRLHRAGVQIAIMTFKAPV
ヒト活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（AID）のコード配列（CDS）のアミノ酸配列および核酸配列を下記に示す。
>tr|Q6QJ80|Q6QJ80_HUMAN Activation-induced cytidine deaminase OS=Homo sapiens OX=9606 GN=AICDA PE=2 SV=1 amino acid sequence:
MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLCYVVKRRDSATSFSLDFGYLRNKNGCHVELL
FLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVADFLRGNPNLSLRIFTARLYFCEDRK
AEPEGLRRLHRAGVQIAIMTFKAPV
核酸配列: >NG_011588.1:5001-15681 Homo sapiens activation induced cytidine deaminase (AICDA), RefSeqGene (LRG_17) on chromosome 12:
AGAGAACCATCATTAATTGAAGTGAGATTTTTCTGGCCTGAGACTTGCAGGGAGGCAAGAAGACACTCTGGACACCACTATGGACAGGTAAAGAGGCAGTCTTCTCGTGGGTGATTGCACTGGCCTTCCTCTCAGAGCAAATCTGAGTAATGAGACTGGTAGCTATCCCTTTCTCTCATGTAACTGTCTGACTGATAAGATCAGCTTGATCAATATGCATATATATTTTTTGATCTGTCTCCTTTTCTTCTATTCAGATCTTATACGCTGTCAGCCCAATTCTTTCTGTTTCAGACTTCTCTTGATTTCCCTCTTTTTCATGTGGCAAAAGAAGTAGTGCGTACAATGTACTGATTCGTCCTGAGATTTGTACCATGGTTGAAACTAATTTATGGTAATAATATTAACATAGCAAATCTTTAGAGACTCAAATCATGAAAAGGTAATAGCAGTACTGTACTAAAAACGGTAGTGCTAATTTTCGTAATAATTTTGTAAATATTCAACAGTAAAACAACTTGAAGACACACTTTCCTAGGGAGGCGTTACTGAAATAATTTAGCTATAGTAAGAAAATTTGTAATTTTAGAAATGCCAAGCATTCTAAATTAATTGCTTGAAAGTCACTATGATTGTGTCCATTATAAGGAGACAAATTCATTCAAGCAAGTTATTTAATGTTAAAGGCCCAATTGTTAGGCAGTTAATGGCACTTTTACTATTAACTAATCTTTCCATTTGTTCAGACGTAGCTTAACTTACCTCTTAGGTGTGAATTTGGTTAAGGTCCTCATAATGTCTTTATGTGCAGTTTTTGATAGGTTATTGTCATAGAACTTATTCTATTCCTACATTTATGATTACTATGGATGTATGAGAATAACACCTAATCCTTATACTTTACCTCAATTTAACTCCTTTATAAAGAACTTACATTACAGAATAAAGATTTTTTAAAAATATATTTTTTTGTAGAGACAGGGTCTTAGCCCAGCCGAGGCTGGTCTCTAAGTCCTGGCCCAAGCGATCCTCCTGCCTGGGCCTCCTAAAGTGCTGGAATTATAGACATGAGCCATCACATCCAATATACAGAATAAAGATTTTTAATGGAGGATTTAATGTTCTTCAGAAAATTTTCTTGAGGTCAGACAATGTCAAATGTCTCCTCAGTTTACACTGAGATTTTGAAAACAAGTCTGAGCTATAGGTCCTTGTGAAGGGTCCATTGGAAATACTTGTTCAAAGTAAAATGGAAAGCAAAGGTAAAATCAGCAGTTGAAATTCAGAGAAAGACAGAAAAGGAGAAAAGATGAAATTCAACAGGACAGAAGGGAAATATATTATCATTAAGGAGGACAGTATCTGTAGAGCTCATTAGTGATGGCAAAATGACTTGGTCAGGATTATTTTTAACCCGCTTGTTTCTGGTTTGCACGGCTGGGGATGCAGCTAGGGTTCTGCCTCAGGGAGCACAGCTGTCCAGAGCAGCTGTCAGCCTGCAAGCCTGAAACACTCCCTCGGTAAAGTCCTTCCTACTCAGGACAGAAATGACGAGAACAGGGAGCTGGAAACAGGCCCCTAACCAGAGAAGGGAAGTAATGGATCAACAAAGTTAACTAGCAGGTCAGGATCACGCAATTCATTTCACTCTGACTGGTAACATGTGACAGAAACAGTGTAGGCTTATTGTATTTTCATGTAGAGTAGGACCCAAAAATCCACCCAAAGTCCTTTATCTATGCCACATCCTTCTTATCTATACTTCCAGGACACTTTTTCTTCCTTATGATAAGGCTCTCTCTCTCTCCACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAAACACACACCCCGCCAACCAAGGTGCATGTAAAAAGATGTAGATTCCTCTGCCTTTCTCATCTACACAGCCCAGGAGGGTAAGTTAATATAAGAGGGATTTATTGGTAAGAGATGATGCTTAATCTGTTTAACACTGGGCCTCAAAGAGAGAATTTCTTTTCTTCTGTACTTATTAAGCACCTATTATGTGTTGAGCTTATATATACAAAGGGTTATTATATGCTAATATAGTAATAGTAATGGTGGTTGGTACTATGGTAATTACCATAAAAATTATTATCCTTTTAAAATAAAGCTAATTATTATTGGATCTTTTTTAGTATTCATTTTATGTTTTTTATGTTTTTGATTTTTTAAAAGACAATCTCACCCTGTTACCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTGCAATCATAGCTTTCTGCAGTCTTGAACTCCTGGGCTCAAGCAATCCTCCTGCCTTGGCCTCCCAAAGTGTTGGGATACAGTCATGAGCCACTGCATCTGGCCTAGGATCCATTTAGATTAAAATATGCATTTTAAATTTTAAAATAATATGGCTAATTTTTACCTTATGTAATGTGTATACTGGCAATAAATCTAGTTTGCTGCCTAAAGTTTAAAGTGCTTTCCAGTAAGCTTCATGTACGTGAGGGGAGACATTTAAAGTGAAACAGACAGCCAGGTGTGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTCTGGGAGGCTGAGGTGGGTGGATCGCTTGAGCCCTGGAGTTCAAGACCAGCCTGAGCAACATGGCAAAACGCTGTTTCTATAACAAAAATTAGCCGGGCATGGTGGCATGTGCCTGTGGTCCCAGCTACTAGGGGGCTGAGGCAGGAGAATCGTTGGAGCCCAGGAGGTCAAGGCTGCACTGAGCAGTGCTTGCGCCACTGCACTCCAGCCTGGGTGACAGGACCAGACCTTGCCTCAAAAAAATAAGAAGAAAAATTAAAAATAAATGGAAACAACTACAAAGAGCTGTTGTCCTAGATGAGCTACTTAGTTAGGCTGATATTTTGGTATTTAACTTTTAAAGTCAGGGTCTGTCACCTGCACTACATTATTAAAATATCAATTCTCAATGTATATCCACACAAAGACTGGTACGTGAATGTTCATAGTACCTTTATTCACAAAACCCCAAAGTAGAGACTATCCAAATATCCATCAACAAGTGAACAAATAAACAAAATGTGCTATATCCATGCAATGGAATACCACCCTGCAGTACAAAGAAGCTACTTGGGGATGAATCCCAAAGTCATGACGCTAAATGAAAGAGTCAGACATGAAGGAGGAGATAATGTATGCCATACGAAATTCTAGAAAATGAAAGTAACTTATAGTTACAGAAAGCAAATCAGGGCAGGCATAGAGGCTCACACCTGTAATCCCAGCACTTTGAGAGGCCACGTGGGAAGATTGCTAGAACTCAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGGCAACACAGTGAAACTCCATTCTCCACAAAAATGGGAAAAAAAGAAAGCAAATCAGTGGTTGTCCTGTGGGGAGGGGAAGGACTGCAAAGAGGGAAGAAGCTCTGGTGGGGTGAGGGTGGTGATTCAGGTTCTGTATCCTGACTGTGGTAGCAGTTTGGGGTGTTTACATCCAAAAATATTCGTAGAATTATGCATCTTAAATGGGTGGAGTTTACTGTATGTAAATTATACCTCAATGTAAGAAAAAATAATGTGTAAGAAAACTTTCAATTCTCTTGCCAGCAAACGTTATTCAAATTCCTGAGCCCTTTACTTCGCAAATTCTCTGCACTTCTGCCCCGTACCATTAGGTGACAGCACTAGCTCCACAAATTGGATAAATGCATTTCTGGAAAAGACTAGGGACAAAATCCAGGCATCACTTGTGCTTTCATATCAACCATGCTGTACAGCTTGTGTTGCTGTCTGCAGCTGCAATGGGGACTCTTGATTTCTTTAAGGAAACTTGGGTTACCAGAGTATTTCCACAAATGCTATTCAAATTAGTGCTTATGATATGCAAGACACTGTGCTAGGAGCCAGAAAACAAAGAGGAGGAGAAATCAGTCATTATGTGGGAACAACATAGCAAGATATTTAGATCATTTTGACTAGTTAAAAAAGCAGCAGAGTACAAAATCACACATGCAATCAGTATAATCCAAATCATGTAAATATGTGCCTGTAGAAAGACTAGAGGAATAAACACAAGAATCTTAACAGTCATTGTCATTAGACACTAAGTCTAATTATTATTATTAGACACTATGATATTTGAGATTTAAAAAATCTTTAATATTTTAAAATTTAGAGCTCTTCTATTTTTCCATAGTATTCAAGTTTGACAATGATCAAGTATTACTCTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGATGGAGTTTTGGTCTTGTTGCCCATGCTGGAGTGGAATGGCATGACCATAGCTCACTGCAACCTCCACCTCCTGGGTTCAAGCAAAGCTGTCGCCTCAGCCTCCCGGGTAGATGGGATTACAGGCGCCCACCACCACACTCGGCTAATGTTTGTATTTTTAGTAGAGATGGGGTTTCACCATGTTGGCCAGGCTGGTCTCAAACTCCTGACCTCAGAGGATCCACCTGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGATGTAGGCCACTGCGCCCGGCCAAGTATTGCTCTTATACATTAAAAAACAGGTGTGAGCCACTGCGCCCAGCCAGGTATTGCTCTTATACATTAAAAAATAGGCCGGTGCAGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAAGCCAAGGCGGGCAGAACACCCGAGGTCAGGAGTCCAAGGCCAGCCTGGCCAAGATGGTGAAACCCCGTCTCTATTAAAAATACAAACATTACCTGGGCATGATGGTGGGCGCCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGGATCCGCGGAGCCTGGCAGATCTGCCTGAGCCTGGGAGGTTGAGGCTACAGTAAGCCAAGATCATGCCAGTATACTTCAGCCTGGGCGACAAAGTGAGACCGTAACAAAAAAAAAAAAATTTAAAAAAAGAAATTTAGATCAAGATCCAACTGTAAAAAGTGGCCTAAACACCACATTAAAGAGTTTGGAGTTTATTCTGCAGGCAGAAGAGAACCATCAGGGGGTCTTCAGCATGGGAATGGCATGGTGCACCTGGTTTTTGTGAGATCATGGTGGTGACAGTGTGGGGAATGTTATTTTGGAGGGACTGGAGGCAGACAGACCGGTTAAAAGGCCAGCACAACAGATAAGGAGGAAGAAGATGAGGGCTTGGACCGAAGCAGAGAAGAGCAAACAGGGAAGGTACAAATTCAAGAAATATTGGGGGGTTTGAATCAACACATTTAGATGATTAATTAAATATGAGGACTGAGGAATAAGAAATGAGTCAAGGATGGTTCCAGGCTGCTAGGCTGCTTACCTGAGGTGGCAAAGTCGGGAGGAGTGGCAGTTTAGGACAGGGGGCAGTTGAGGAATATTGTTTTGATCATTTTGAGTTTGAGGTACAAGTTGGACACTTAGGTAAAGACTGGAGGGGAAATCTGAATATACAATTATGGGACTGAGGAACAAGTTTATTTTATTTTTTGTTTCGTTTTCTTGTTGAAGAACAAATTTAATTGTAATCCCAAGTCATCAGCATCTAGAAGACAGTGGCAGGAGGTGACTGTCTTGTGGGTAAGGGTTTGGGGTCCTTGATGAGTATCTCTCAATTGGCCTTAAATATAAGCAGGAAAAGGAGTTTATGATGGATTCCAGGCTCAGCAGGGCTCAGGAGGGCTCAGGCAGCCAGCAGAGGAAGTCAGAGCATCTTCTTTGGTTTAGCCCAAGTAATGACTTCCTTAAAAAGCTGAAGGAAAATCCAGAGTGACCAGATTATAAACTGTACTCTTGCATTTTCTCTCCCTCCTCTCACCCACAGCCTCTTGATGAACCGGAGGAAGTTTCTTTACCAATTCAAAAATGTCCGCTGGGCTAAGGGTCGGCGTGAGACCTACCTGTGCTACGTAGTGAAGAGGCGTGACAGTGCTACATCCTTTTCACTGGACTTTGGTTATCTTCGCAATAAGGTATCAATTAAAGTCGGCTTTGCAAGCAGTTTAATGGTCAACTGTGAGTGCTTTTAGAGCCACCTGCTGATGGTATTACTTCCATCCTTTTTTGGCATTTGTGTCTCTATCACATTCCTCAAATCCTTTTTTTTATTTCTTTTTCCATGTCCATGCACCCATATTAGACATGGCCCAAAATATGTGATTTAATTCCTCCCCAGTAATGCTGGGCACCCTAATACCACTCCTTCCTTCAGTGCCAAGAACAACTGCTCCCAAACTGTTTACCAGCTTTCCTCAGCATCTGAATTGCCTTTGAGATTAATTAAGCTAAAAGCATTTTTATATGGGAGAATATTATCAGCTTGTCCAAGCAAAAATTTTAAATGTGAAAAACAAATTGTGTCTTAAGCATTTTTGAAAATTAAGGAAGAAGAATTTGGGAAAAAATTAACGGTGGCTCAATTCTGTCTTCCAAATGATTTCTTTTCCCTCCTACTCACATGGGTCGTAGGCCAGTGAATACATTCAACATGGTGATCCCCAGAAAACTCAGAGAAGCCTCGGCTGATGATTAATTAAATTGATCTTTCGGCTACCCGAGAGAATTACATTTCCAAGAGACTTCTTCACCAAAATCCAGATGGGTTTACATAAACTTCTGCCCACGGGTATCTCCTCTCTCCTAACACGCTGTGACGTCTGGGCTTGGTGGAATCTCAGGGAAGCATCCGTGGGGTGGAAGGTCATCGTCTGGCTCGTTGTTTGATGGTTATATTACCATGCAATTTTCTTTGCCTACATTTGTATTGAATACATCCCAATCTCCTTCCTATTCGGTGACATGACACATTCTATTTCAGAAGGCTTTGATTTTATCAAGCACTTTCATTTACTTCTCATGGCAGTGCCTATTACTTCTCTTACAATACCCATCTGTCTGCTTTACCAAAATCTATTTCCCCTTTTCAGATCCTCCCAAATGGTCCTCATAAACTGTCCTGCCTCCACCTAGTGGTCCAGGTATATTTCCACAATGTTACATCAACAGGCACTTCTAGCCATTTTCCTTCTCAAAAGGTGCAAAAAGCAACTTCATAAACACAAATTAAATCTTCGGTGAGGTAGTGTGATGCTGCTTCCTCCCAACTCAGCGCACTTCGTCTTCCTCATTCCACAAAAACCCATAGCCTTCCTTCACTCTGCAGGACTAGTGCTGCCAAGGGTTCAGCTCTACCTACTGGTGTGCTCTTTTGAGCAAGTTGCTTAGCCTCTCTGTAACACAAGGACAATAGCTGCAAGCATCCCCAAAGATCATTGCAGGAGACAATGACTAAGGCTACCAGAGCCGCAATAAAAGTCAGTGAATTTTAGCGTGGTCCTCTCTGTCTCTCCAGAACGGCTGCCACGTGGAATTGCTCTTCCTCCGCTACATCTCGGACTGGGACCTAGACCCTGGCCGCTGCTACCGCGTCACCTGGTTCACCTCCTGGAGCCCCTGCTACGACTGTGCCCGACATGTGGCCGACTTTCTGCGAGGGAACCCCAACCTCAGTCTGAGGATCTTCACCGCGCGCCTCTACTTCTGTGAGGACCGCAAGGCTGAGCCCGAGGGGCTGCGGCGGCTGCACCGCGCCGGGGTGCAAATAGCCATCATGACCTTCAAAGGTGCGAAAGGGCCTTCCGCGCAGGCGCAGTGCAGCAGCCCGCATTCGGGATTGCGATGCGGAATGAATGAGTTAGTGGGGAAGCTCGAGGGGAAGAAGTGGGCGGGGATTCTGGTTCACCTCTGGAGCCGAAATTAAAGATTAGAAGCAGAGAAAAGAGTGAATGGCTCAGAGACAAGGCCCCGAGGAAATGAGAAAATGGGGCCAGGGTTGCTTCTTTCCCCTCGATTTGGAACCTGAACTGTCTTCTACCCCCATATCCCCGCCTTTTTTTCCTTTTTTTTTTTTTGAAGATTATTTTTACTGCTGGAATACTTTTGTAGAAAACCACGAAAGAACTTTCAAAGCCTGGGAAGGGCTGCATGAAAATTCAGTTCGTCTCTCCAGACAGCTTCGGCGCATCCTTTTGGTAAGGGGCTTCCTCGCTTTTTAAATTTTCTTTCTTTCTCTACAGTCTTTTTTGGAGTTTCGTATATTTCTTATATTTTCTTATTGTTCAATCACTCTCAGTTTTCATCTGATGAAAACTTTATTTCTCCTCCACATCAGCTTTTTCTTCTGCTGTTTCACCATTCAGAGCCCTCTGCTAAGGTTCCTTTTCCCTCCCTTTTCTTTCTTTTGTTGTTTCACATCTTTAAATTTCTGTCTCTCCCCAGGGTTGCGTTTCCTTCCTGGTCAGAATTCTTTTCTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAACAAACAAACAAAAAACCCAAAAAAACTCTTTCCCAATTTACTTTCTTCCAACATGTTACAAAGCCATCCACTCAGTTTAGAAGACTCTCCGGCCCCACCGACCCCCAACCTCGTTTTGAAGCCATTCACTCAATTTGCTTCTCTCTTTCTCTACAGCCCCTGTATGAGGTTGATGACTTACGAGACGCATTTCGTACTTTGGGACTTTGATAGCAACTTCCAGGAATGTCACACACGATGAAATATCTCTGCTGAAGACAGTGGATAAAAAACAGTCCTTCAAGTCTTCTCTGTTTTTATTCTTCAACTCTCACTTTCTTAGAGTTTACAGAAAAAATATTTATATACGACTCTTTAAAAAGATCTATGTCTTGAAAATAGAGAAGGAACACAGGTCTGGCCAGGGACGTGCTGCAATTGGTGCAGTTTTGAATGCAACATTGTCCCCTACTGGGAATAACAGAACTGCAGGACCTGGGAGCATCCTAAAGTGTCAACGTTTTTCTATGACTTTTAGGTAGGATGAGAGCAGAAGGTAGATCCTAAAAAGCATGGTGAGAGGATCAAATGTTTTTATATCAACATCCTTTATTATTTGATTCATTTGAGTTAACAGTGGTGTTAGTGATAGATTTTTCTATTCTTTTCCCTTGACGTTTACTTTCAAGTAACACAAACTCTTCCATCAGGCCATGATCTATAGGACCTCCTAATGAGAGTATCTGGGTGATTGTGACCCCAAACCATCTCTCCAAAGCATTAATATCCAATCATGCGCTGTATGTTTTAATCAGCAGAAGCATGTTTTTATGTTTGTACAAAAGAAGATTGTTATGGGTGGGGATGGAGGTATAGACCATGCATGGTCACCTTCAAGCTACTTTAATAAAGGATCTTAAAATGGGCAGGAGGACTGTGAACAAGACACCCTAATAATGGGTTGATGTCTGAAGTAGCAAATCTTCTGGAAACGCAAACTCTTTTAAGGAAGTCCCTAATTTAGAAACACCCACAAACTTCACATATCATAATTAGCAAACAATTGGAAGGAAGTTGCTTGAATGTTGGGGAGAGGAAAATCTATTGGCTCTCGTGGGTCTCTTCATCTCAGAAATGCCAATCAGGTCAAGGTTTGCTACATTTTGTATGTGTGTGATGCTTCTCCCAAAGGTATATTAACTATATAAGAGAGTTGTGACAAAACAGAATGATAAAGCTGCGAACCGTGGCACACGCTCATAGTTCTAGCTGCTTGGGAGGTTGAGGAGGGAGGATGGCTTGAACACAGGTGTTCAAGGCCAGCCTGGGCAACATAACAAGATCCTGTCTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAGAGAGGGCCGGGCGTGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGCCGGGCGGATCACCTGTGGTCAGGAGTTTGAGACCAGCCTGGCCAACATGGCAAAACCCCGTCTGTACTCAAAATGCAAAAATTAGCCAGGCGTGGTAGCAGGCACCTGTAATCCCAGCTACTTGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGCTTGAACCCAGGAGGTGGAGGTTGCAGTAAGCTGAGATCGTGCCGTTGCACTCCAGCCTGGGCGACAAGAGCAAGACTCTGTCTCAGAAAAAAAAAAAAAAAAGAGAGAGAGAGAGAAAGAGAACAATATTTGGGAGAGAAGGATGGGGAAGCATTGCAAGGAAATTGTGCTTTATCCAACAAAATGTAAGGAGCCAATAAGGGATCCCTATTTGTCTCTTTTGGTGTCTATTTGTCCCTAACAACTGTCTTTGACAGTGAGAAAAATATTCAGAATAACCATATCCCTGTGCCGTTATTACCTAGCAACCCTTGCAATGAAGATGA
GCAGATCCACAGGAAAACTTGAATGCACAACTGTCTTATTTTAATCTTATTGTACATAAGTTTGTAAAAGAGTTAAAAATTGTTACTTCATGTATTCATTTATATTTTATATTATTTTGCGTCTAATGATTTTTTATTAACATGATTTCCTTTTCTGATATATTGAAATGGAGTCTCAAAGCTTCATAAATTTATAACTTTAGAAATGATTCTAATAACAACGTATGTAATTGTAACATTGCAGTAATGGTGCTACGAAGCCATTTCTCTTGATTTTTAGTAAACTTTTATGACAGCAAATTTGCTTCTGGCTCACTTTCAATCAGTTAAATAAATGATAAATAATTTTGGAAGCTGTGAAGATAAAATACCAAATAAAATAATATAAAAGTGATTTATATGAAGTTAAAATAAAAAATCAGTATGATGGAATAAACTTG
本開示の態様に従ってCas9に融合され得る他の例示的デアミナーゼが、以下に提供される。ある実施形態では、デアミナーゼは活性化誘導型デアミナーゼ（AID）である。いくつかの実施形態において、それぞれの配列の活性ドメイン、例えば、局在化シグナル(核局在化配列、核外搬出シグナル、細胞質局在化シグナル)を伴わないドメインが使用され得ることが理解されるべきである。
Human AID:
Figure 2021532794
（下線：核局在化配列；二重下線：核外輸送シグナル）
Mouse AID:
Figure 2021532794
（下線：核局在化配列；二重下線：核外輸送シグナル）
Canine AID:
Figure 2021532794
（下線：核局在化配列；二重下線：核外輸送シグナル）
Bovine AID:
Figure 2021532794
（下線：核局在化配列；二重下線：核外輸送シグナル）
Rat AID:
Figure 2021532794
（下線：核局在化配列；二重下線：核外輸送シグナル）
Mouse APOBEC-3-(2):
Figure 2021532794
（斜体：核酸編集ドメイン）
Rat APOBEC-3:
Figure 2021532794
（斜体：核酸編集ドメイン）
Rhesus macaque APOBEC-3G:
Figure 2021532794
（斜体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在化シグナル）
Chimpanzee APOBEC-3G:
Figure 2021532794
（斜体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在化シグナル）
Green monkey APOBEC-3G:
Figure 2021532794
（斜体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在化シグナル）
Human APOBEC-3G:
Figure 2021532794
（斜体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在化シグナル）
Human APOBEC-3F:
Figure 2021532794
（斜体：核酸編集ドメイン）
Human APOBEC-3B:
Figure 2021532794
（斜体：核酸編集ドメイン）
Rat APOBEC-3B:
MQPQGLGPNAGMGPVCLGCSHRRPYSPIRNPLKKLYQQTFYFHFKNVRYAWGRKNNFLCYEVNGMDCALPVPLRQGVFRKQGHIHAELCFIYWFHDKVLRVLSPMEEFKVTWYMSWSPCSKCAEQVARFLAAHRNLSLAIFSSRLYYYLRNPNYQQKLCRLIQEGVHVAAMDLPEFKKCWNKFVDNDGQPFRPWMRLRINFSFYDCKLQEIFSRMNLLREDVFYLQFNNSHRVKPVQNRYYRRKSYLCYQLERANGQEPLKGYLLYKKGEQHVEILFLEKMRSMELSQVRITCYLTWSPCPNCARQLAAFKKDHPDLILRIYTSRLYFWRKKFQKGLCTLWRSGIHVDVMDLPQFADCWTNFVNPQRPFRPWNELEKNSWRIQRRLRRIKESWGL
Bovine APOBEC-3B:
DGWEVAFRSGTVLKAGVLGVSMTEGWAGSGHPGQGACVWTPGTRNTMNLLREVLFKQQFGNQPRVPAPYYRRKTYLCYQLKQRNDLTLDRGCFRNKKQRHAERFIDKINSLDLNPSQSYKIICYITWSPCPNCANELVNFITRNNHLKLEIFASRLYFHWIKSFKMGLQDLQNAGISVAVMTHTEFEDCWEQFVDNQSRPFQPWDKLEQYSASIRRRLQRILTAPI
Chimpanzee APOBEC-3B:
MNPQIRNPMEWMYQRTFYYNFENEPILYGRSYTWLCYEVKIRRGHSNLLWDTGVFRGQMYSQPEHHAEMCFLSWFCGNQLSAYKCFQITWFVSWTPCPDCVAKLAKFLAEHPNVTLTISAARLYYYWERDYRRALCRLSQAGARVKIMDDEEFAYCWENFVYNEGQPFMPWYKFDDNYAFLHRTLKEIIRHLMDPDTFTFNFNNDPLVLRRHQTYLCYEVERLDNGTWVLMDQHMGFLCNEAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGQVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFEYCWDTFVYRQGCPFQPWDGLEEHSQALSGRLRAILQVRASSLCMVPHRPPPPPQSPGPCLPLCSEPPLGSLLPTGRPAPSLPFLLTASFSFPPPASLPPLPSLSLSPGHLPVPSFHSLTSCSIQPPCSSRIRETEGWASVSKEGRDLG
Human APOBEC-3C:
Figure 2021532794
（斜体：核酸編集ドメイン）
Gorilla APOBEC-3C
Figure 2021532794
（斜体：核酸編集ドメイン）
Human APOBEC-3A:
Figure 2021532794
（斜体：核酸編集ドメイン）
Rhesus macaque APOBEC-3A:
Figure 2021532794
（斜体：核酸編集ドメイン）
Bovine APOBEC-3A:
Figure 2021532794
（斜体：核酸編集ドメイン）
Human APOBEC-3H:
Figure 2021532794
（斜体：核酸編集ドメイン）
Rhesus macaque APOBEC-3H:
MALLTAKTFSLQFNNKRRVNKPYYPRKALLCYQLTPQNGSTPTRGHLKNKKKDHAEIRFINKIKSMGLDETQCYQVTCYLTWSPCPSCAGELVDFIKAHRHLNLRIFASRLYYHWRPNYQEGLLLLCGSQVPVEVMGLPEFTDCWENFVDHKEPPSFNPSEKLEELDKNSQAIKRRLERIKSRSVDVLENGLRSLQLGPVTPSSSIRNSR
Human APOBEC-3D:
Figure 2021532794
（斜体：核酸編集ドメイン）
Human APOBEC-1:
MTSEKGPSTGDPTLRRRIEPWEFDVFYDPRELRKEACLLYEIKWGMSRKIWRSSGKNTTNHVEVNFIKKFTSERDFHPSMSCSITWFLSWSPCWECSQAIREFLSRHPGVTLVIYVARLFWHMDQQNRQGLRDLVNSGVTIQIMRASEYYHCWRNFVNYPPGDEAHWPQYPPLWMMLYALELHCIILSLPPCLKISRRWQNHLTFFRLHLQNCHYQTIPPHILLATGLIHPSVAWR
Mouse APOBEC-1:
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSVWRHTSQNTSNHVEVNFLEKFTTERYFRPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRHPYVTLFIYIARLYHHTDQRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQEYCYCWRNFVNYPPSNEAYWPRYPHLWVKLYVLELYCIILGLPPCLKILRRKQPQLTFFTITLQTCHYQRIPPHLLWATGLK
Rat APOBEC-1:
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLK
Human APOBEC-2:
MAQKEEAAVATEAASQNGEDLENLDDPEKLKELIELPPFEIVTGERLPANFFKFQFRNVEYSSGRNKTFLCYVVEAQGKGGQVQASRGYLEDEHAAAHAEEAFFNTILPAFDPALRYNVTWYVSSSPCAACADRIIKTLSKTKNLRLLILVGRLFMWEEPEIQAALKKLKEAGCKLRIMKPQDFEYVWQNFVEQEEGESKAFQPWEDIQENFLYYEEKLADILK
Mouse APOBEC-2:
MAQKEEAAEAAAPASQNGDDLENLEDPEKLKELIDLPPFEIVTGVRLPVNFFKFQFRNVEYSSGRNKTFLCYVVEVQSKGGQAQATQGYLEDEHAGAHAEEAFFNTILPAFDPALKYNVTWYVSSSPCAACADRILKTLSKTKNLRLLILVSRLFMWEEPEVQAALKKLKEAGCKLRIMKPQDFEYIWQNFVEQEEGESKAFEPWEDIQENFLYYEEKLADILK
Rat APOBEC-2:
MAQKEEAAEAAAPASQNGDDLENLEDPEKLKELIDLPPFEIVTGVRLPVNFFKFQFRNVEYSSGRNKTFLCYVVEAQSKGGQVQATQGYLEDEHAGAHAEEAFFNTILPAFDPALKYNVTWYVSSSPCAACADRILKTLSKTKNLRLLILVSRLFMWEEPEVQAALKKLKEAGCKLRIMKPQDFEYLWQNFVEQEEGESKAFEPWEDIQENFLYYEEKLADILK
Bovine APOBEC-2:
MAQKEEAAAAAEPASQNGEEVENLEDPEKLKELIELPPFEIVTGERLPAHYFKFQFRNVEYSSGRNKTFLCYVVEAQSKGGQVQASRGYLEDEHATNHAEEAFFNSIMPTFDPALRYMVTWYVSSSPCAACADRIVKTLNKTKNLRLLILVGRLFMWEEPEIQAALRKLKEAGCRLRIMKPQDFEYIWQNFVEQEEGESKAFEPWEDIQENFLYYEEKLADILK
Petromyzon marinus CDA1 (pmCDAl):
MTDAEYVRIHEKLDIYTFKKQFFNNKKSVSHRCYVLFELKRRGERRACFWGYAVNKPQSGTERGIHAEIFSIRKVEEYLRDNPGQFTINWYSSWSPCADCAEKILEWYNQELRGNGHTLKIWACKLYYEKNARNQIGLWNLRDNGVGLNVMVSEHYQCCRKIFIQSSHNQ LNENRWLEKTLKRAEKRRSELSFMIQVKILHTTKSPAV
Human APOBEC3G D316R D317R:
MKPHFRNTVERMYRDTFSYNFYNRPILSRRNTVWLCYEVKTKGPSRPPLDAKIFRGQVYSELKYHPEMRFFHWFSKWRKLHRDQEYEVTWYISWSPCTKCTRDMATFLAEDPKVTLTIFVARLYYFWDPDYQEALRSLCQKRDGPRATMKFNYDEFQHCWSKFVYSQRELFEPWNNLPKYYILLHFMLGEILRHSMDPPTFTFNFNNEPWVRGRHETYLCYEVERMHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHGFLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLDQDYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISKKHVSLCIFTARIYRRQGRCQEGLRTLAEAGAKISFTYSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQDLSGRLRAILQNQEN
Human APOBEC3G chain A:
MDPPTFTFNFNNEPWWGRHETYLCYEVERMHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHGFLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLDQDYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISKNKHVSLCIFTARIYDDQGRCQEGLRTLAEAGAKISFTYSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLD EHSQDLSGRLRAILQ
Human APOBEC3G chain A D120R D121R:
MDPPTFTFNFNNEPWVRGRHETYLCYEVERMHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHGFLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLDQDYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISKNKHVSLCIFTARIYRRQGRCQEGLRTLAEAGAKISFMTYSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQDLSGRLRAILQ
本開示のいくつかの態様は、例えばデアミナーゼドメインに点突然変異を生じさせることによって、本明細書に記載される融合タンパク質のいずれかのデアミナーゼドメイン触媒活性を調節することが、融合タンパク質(例えば塩基エディター)のプロセス特性に影響を及ぼすという認識に基づく。例えば、塩基編集融合タンパク質内のデアミナーゼドメインの触媒活性を減少させるが除去はしない突然変異は、デアミナーゼドメインが標的残基に隣接する残基の脱アミノ化を触媒する可能性を低くし、それによって脱アミノ化のウィンドウを狭めることができる。脱アミノ化のウィンドウを狭める能力は、特定の標的残基に隣接する残基の望まれない脱アミノ化を防ぐことができ、それは、オフターゲット効果を減少させるか、または防ぐことができる。
例えば、いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のH121X、H122X、R126X、R126X、R118X、W90X、W90X、およびR132Xからなる群より選択される1以上の突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1以上の対応する突然変異を含むことができ、ここでXは任意のアミノ酸である。ある態様において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のH121R、H122R、R126A、R126E、R118A、W90A、W90Y、およびR132Eからなる群より選択される1以上の突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1以上の対応する突然変異を含むことができる。
ある態様において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、hAPOBEC3GのD316X、D317X、R320X、R320X、R313X、W285X、W285X、R326Xからなる群より選択される1以上の突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1以上の対応する突然変異を含むことができ、ここでXは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかは、hAPOBEC3GのD316R、D317R、R320A、R320E、R313A、W285A、W285Y、R326Eからなる群から選択される1以上の突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。
ある態様において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のH121RおよびH122R突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のR126A突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のR126E突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のR118A突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のW90A突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のW90Y突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のR132E突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のW90YおよびR126E突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のR126EおよびR132E突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のW90YおよびR132E突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、rAPOBEC1のW90Y、R126E、およびR132E突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。
いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、hAPOBEC3GのD316RおよびD317R突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかは、hAPOBEC3GのR320A突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、hAPOBEC3GのR320E突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、hAPOBEC3GのR313A突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、hAPOBEC3GのW285A突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、hAPOBEC3GのW285Y突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、hAPOBEC3GのR326E突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、hAPOBEC3GのW285YおよびR320E突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、hAPOBEC3GのR320EおよびR326E突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、hAPOBEC3GのW285YおよびR326E突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれたAPOBECデアミナーゼは、hAPOBEC3GのW285Y、R320E、およびR326E突然変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含むAPOBECデアミナーゼを含むことができる。
限定されるものではないが、Addgeneから入手できるSaBE3、SaKKH-BE3、VQR-BE3、EQR-BE3、VRER-BE3、YE1-BE3、EE-BE3、YE2-BE3、およびYE-BE3（プラスミド85169、85170、85171、85172、85173、85174、85175、85176、85177）を含め、多数の改変シチジンデアミナーゼが市販されている。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるデアミナーゼは、APOBEC1デアミナーゼの全部または一部を含む。
CからTへの核酸塩基編集タンパク質の詳細は、国際PCT出願番号PCT/US2016/058344 (WO2017/070632) およびKomor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016) に記載されており、これらの全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
［シチジンデアミナーゼ］
本明細書で提供される融合タンパク質は、１つ以上のシチジンデアミナーゼを含む。ある態様において、本明細書において提供されるシチジンデアミナーゼは、シトシンまたは5-メチルシトシンを脱アミノ化してウラシルまたはチミンにすることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるシチジンデアミナーゼは、DNA中のシトシンを脱アミノ化することができる。シチジンデアミナーゼは、任意の適切な生物に由来することができる。いくつかの実施形態において、シチジンデアミナーゼは、天然に存在するシチジンデアミナーゼが本明細書に提供される突然変異のいずれかに対応する1つ以上の突然変異を含むところのものである。当業者は、例えば、配列アラインメントおよび相同的残基の決定によって、任意の相同的タンパク質中の対応する残基を同定することができる。従って、当業者は、本明細書に記載された突然変異のいずれかに対応する突然変異を、任意の天然に存在するシチジンデアミナーゼにおいて生じさせることができる。ある態様において、シチジンデアミナーゼは、原核生物由来である。ある態様において、シチジンデアミナーゼは、細菌由来である。ある態様において、シチジンデアミナーゼは、哺乳動物(例えば、ヒト)由来である。
いくつかの実施形態において、シチジンデアミナーゼは、本明細書に記載されるシチジンデアミナーゼアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性であるアミノ酸配列を含む。本明細書において提供されるシチジンデアミナーゼは、一つ以上の突然変異(例えば、本明細書に提供される突然変異のいずれか)を含み得ることを理解されたい。本開示は、特定のパーセント同一性を有する任意のデアミナーゼドメインに、本明細書に記載される突然変異またはその組合せのいずれかが加えられたものを提供する。いくつかの実施形態において、シチジンデアミナーゼは、参照配列または本明細書に提供されるいずれかのシチジンデアミナーゼと比較して、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50個またはそれ以上の変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、シチジンデアミナーゼは、当技術分野において既知であるかまたは本明細書に記載されたアミノ酸配列のいずれかと比較して、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、少なくとも160、または少なくとも170個の同一の連続するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
本発明の融合タンパク質は、２つ以上の核酸編集ドメインを含む。ある態様において、核酸編集ドメインは、CからUへの塩基変化を触媒することができる。ある態様において、核酸編集ドメインは、デアミナーゼドメインであり、特に、２つのデアミナーゼドメインである。いくつかの実施形態では、デアミナーゼはシチジンデアミナーゼとアデノシンデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、アポリポタンパク質B mRNA編集複合体 (APOBEC) ファミリーデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEClデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC 2デアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3デアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Aデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Bデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Cデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Dデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Eデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Fデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Gデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Hデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC4デアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、活性化誘導デアミナーゼ (AID) である。ある態様において、デアミナーゼは、脊椎動物デアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、無脊椎動物デアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、またはマウスデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、ヒトデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、ラットデアミナーゼ、例えば、rAPOBEClである。ある態様において、デアミナーゼは、Petromyzon marinusシチジンデアミナーゼ1 (pmCDAl) である。ある態様において、デアミナーゼは、ヒトAPOBEC3Gである。ある態様において、デアミナーゼは、ヒトAPOBEC3Gの断片である。ある態様において、デアミナーゼは、D316R D317R突然変異を含むヒトAPOBEC3Gバリアントである。ある態様において、デアミナーゼは、ヒトAPOBEC3Gの断片であり、D316R D317R突然変異に対応する突然変異を含む。ある態様において、核酸編集ドメインは、本明細書に記載される任意のデアミナーゼのデアミナーゼドメインに対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%) 、または少なくとも99.5%の同一性である。
特定の実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質は、融合タンパク質の塩基編集活性を改善する1つ以上の特徴を含む。例えば、本明細書に提供される融合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性が低下したCas9ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有さないCas9ドメイン (dCas9) 、またはCas9ニッカーゼ (nCas9) と呼ばれる、二本鎖DNA分子の1鎖を切断するCas9ドメインを有し得る。
［ガイドRNAを伴うCas9複合体］
本開示のいくつかの態様は、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかと、融合タンパク質のCas9ドメインに結合したガイドRNA（例えばdCas9、ヌクレアーゼ活性Cas9、またはCas9ニッカーゼ）とを含む複合体を提供する。ある態様において、ガイド核酸(例えばガイドRNA)は、15〜100ヌクレオチド長であり、標的配列に相補的である少なくとも10個の連続するヌクレオチドの配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイドRNAは、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、ガイドRNAは、標的配列に相補的な15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40個の連続したヌクレオチドの配列を含む。ある態様において、標的配列はDNA配列である。ある態様において、標的配列は、細菌、酵母、真菌、昆虫、植物または動物のゲノムにおける配列である。ある態様において、標的配列は、ヒトのゲノムにおける配列である。いくつかの実施形態において、標的配列の3’末端は、標準PAM配列 (NGG) にすぐ隣接している。いくつかの実施形態において、標的配列の3’末端は、非標準PAM配列（例えば、表１に記載されている配列または5’-NAA-3’）にすぐ隣接している。ある態様において、ガイド核酸（例えばガイドRNA）は、目的遺伝子（例えば疾患または障害に関連する遺伝子）における配列に相補的である。
本開示のいくつかの態様は、本明細書に提供される融合タンパク質または複合体を使用する方法を提供する。例えば、本開示のいくつかの局面は、DNA分子を、本明細書中に提供される融合タンパク質のいずれか、および少なくとも一つのガイドRNAと接触させることを含む方法を提供し、ここで、ガイドRNAは、約15〜100ヌクレオチド長であり、標的配列に相補的である少なくとも10個の連続したヌクレオチドの配列を含む。いくつかの実施形態において、標的配列の3’末端は、AGC、GAG、TTT、GTG、またはCAA配列にすぐ隣接している。いくつかの実施形態において、標的配列の3’末端は、NGA、NGCG、NGN、NNGRRT、NNNRRT、NGCG、NGCN、NGTN、NGTN、NGTN、または5’ (TTTV) 配列にすぐ隣接している。
それぞれの配列における特定の位置または残基の番号付けは、使用される特定のタンパク質および番号付けスキームに依存することが理解されるであろう。たとえば、成熟タンパク質の前駆体と成熟タンパク質そのものとでは番号付けが異なることがあり、種ごとの配列の違いが番号付けに影響することがある。当業者は、当業者に周知の方法、例えば、配列アラインメントおよび相同的残基の決定によって、任意の相同的タンパク質およびそれぞれのコード核酸中のそれぞれの残基を同定することができる。
本明細書に開示された融合タンパク質のいずれかを標的部位、例えば、編集される突然変異を含む部位にターゲティングするためには、融合タンパク質をガイドRNAと共に共発現させることが典型的に必要であることは当業者には明らかであろう。本明細書の他の箇所でより詳細に説明されるように、ガイドRNAは、典型的には、Cas9結合を可能にするtracrRNAフレームワークと、Cas9:核酸編集酵素/ドメイン融合タンパク質に配列特異性を付与するガイド配列とを含む。あるいは、ガイドRNAおよびtracrRNAは、2つの核酸分子として別々に提供され得る。いくつかの態様において、ガイドRNAは、ガイド配列が標的配列に相補的な配列を含むという構造を含む。ガイド配列は典型的には20ヌクレオチド長である。Cas9:核酸編集酵素/ドメイン融合タンパク質を特定のゲノム標的部位にターゲティングするための適切なガイドRNAの配列は、本開示に基づいて当業者に明らかであろう。そのような適切なガイドRNA配列は、典型的には、編集される標的ヌクレオチドの50ヌクレオチド以内の上流または下流内の核酸配列に相補的なガイド配列を含む。提供された融合タンパク質のいずれかを特定の標的配列に標的化するのに適したいくつかの例示的なガイドRNA配列が本明細書に提供される。
［追加的ドメイン］
本明細書に記載される塩基エディターは、ポリヌクレオチドの核酸塩基の編集、修飾、または改変を促進させるのを助ける任意のドメインを含むことができる。ある態様において、塩基エディターは、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメイン(例えばCas9)、核酸塩基編集ドメイン(例えばデアミナーゼドメイン)、および一つ以上のさらなるドメインを含む。場合によっては、追加のドメインは、塩基エディターの酵素的または触媒的機能、塩基エディターの結合機能を促進することができ、または所望の塩基編集結果に干渉し得る細胞機構(例えば酵素)の阻害因子であり得る。ある態様において、塩基エディターは、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、リコンビナーゼ、デアミナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、転写アクチベーター、または転写リプレッサードメインを含むことができる。
ある態様において、塩基エディターは、ウラシルグリコシラーゼ阻害因子 (UGI) ドメインを含むことができる。UGIドメインは、例えば、Cの脱アミノ化によって形成されるUがC核酸塩基に再変換されることを阻害することによって、シチジンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターの効率を改善することができる。ある場合には、U:Gヘテロ二本鎖DNAの存在に対する細胞DNA修復応答が、細胞における核酸塩基編集効率の低下の原因となりうる。ある場合には、ウラシルDNAグリコシラーゼ (UDG)が、細胞内のDNAからのUの除去を触媒し得、それが塩基除去修復 (BER) を開始し得、大部分がU:G対からC:G対への復帰をもたらす。このような場合、一本鎖に結合する、編集された塩基をブロックする、UGIを阻害する、BERを阻害する、編集された塩基を保護する、および/または編集されていない鎖の修復を促進する、1以上のドメインを含む塩基エディターにおいてBERは阻害され得る。したがって、本開示は、UGIドメインを含む塩基編集融合タンパク質を企図する。
ある態様において、塩基エディターは、二本鎖切断 (DSB) 結合タンパク質の全部または一部をドメインとして含む。例えば、DSB結合タンパク質は、バクテリオファージMuのGamタンパク質を含み得、これはDSBの末端に結合してそれらを分解から保護することができる。Komor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity”Science Advances 3:eaao4774 (2017)を参照されたい（その全内容が参照により本明細書に組み入れられる）。
ある態様において、塩基エディターは、核酸ポリメラーゼ (NAP) の全てまたは一部をドメインとして含むことができる。例えば、塩基エディターは、真核生物NAPの全部または一部を含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれるNAPまたはその一部は、DNAポリメラーゼである。ある態様において、塩基エディターに組み込まれるNAPまたはその一部は、損傷乗り越えポリメラーゼ活性を有する。場合によっては、塩基エディターに組み込まれるNAPまたはその一部は損傷乗り越えDNAポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれるNAPまたはその一部は、Rev7、Rev1複合体、ポリメラーゼイオタ、ポリメラーゼカッパ、またはポリメラーゼイタである。いくつかの実施形態において、塩基エディターに組み込まれるNAPまたはその一部は、真核生物ポリメラーゼアルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、イプシロン、ガンマ、イータ、イオタ、カッパ、ラムダ、ミュー、またはニュー成分である。ある態様において、塩基エディターに組み込まれるNAPまたはその一部は、核酸ポリメラーゼ（例えば損傷乗り越えDNAポリメラーゼ）に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.5%の同一性であるアミノ酸配列を含む。
［塩基エディターシステム］
本明細書で提供される塩基エディターシステムの使用は、 (a) 対象のポリヌクレオチド（例えば、二本鎖DNAまたはRNA、一本鎖DNAまたはRNA）の標的ヌクレオチド配列を、アデノシンデアミナーゼドメイン、シチジンデアミナーゼドメイン、およびDNAグリコシラーゼドメインのうちの２つ以上を含むマルチエフェクター核酸塩基エディターであって、前述のドメインはポリヌクレオチド結合ドメインに融合されており、それによって、本明細書に記載されるように核酸分子内の複数の異なる塩基において変化を誘導することができる核酸塩基エディターを形成している、マルチエフェクター核酸塩基エディターと、少なくとも一つのガイドポリ核酸（例えばgRNA）とを含む塩基エディターシステムと接触させ、ここで、標的ヌクレオチド配列は標的核酸塩基対を含む、工程と；(b) 標的領域の鎖分離を誘導する工程と；(c) 標的領域の一本鎖における標的核酸塩基対の第1の核酸塩基を第2の核酸塩基に変換する工程と；(d) 標的領域の鎖を2本以上は切断することなく、第1の核酸塩基に相補的な第3の核酸塩基が、第2の核酸塩基に相補的な第4の核酸塩基に置換される工程とを含む。一部の実施形態では、ステップ (b) は省略されることを理解されたい。ある態様において、標的核酸塩基対は、1以上の遺伝子における複数の核酸塩基対である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される塩基エディターシステムは、1以上の遺伝子における複数の核酸塩基対の多重編集を可能にする。ある態様において、複数の核酸塩基対は、同一遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態において、複数の核酸塩基対は、1またはそれより多い遺伝子に位置し、ここで、少なくとも1つの遺伝子は、異なる遺伝子座に位置する。
いくつかの実施形態において、切断された一本鎖(ニック鎖)は、ガイド核酸にハイブリダイズされる。いくつかの実施態様において、切断された一本鎖は、第一の核酸塩基を含む鎖と反対である。一部の実施形態では、塩基エディターはCas9ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第1の塩基はアデニンであり、第2の塩基はG、C、AまたはTではない。いくつかの実施形態において、第2の塩基はイノシンである。
本明細書に提供される塩基編集システムは、触媒的に欠陥のあるStreptococcus pyogenes Cas9と、シチジンデアミナーゼと、塩基除去修復の阻害因子とを含む融合タンパク質を用いて、二本鎖DNA切断を生じることなく、ドナーDNA鋳型を必要とせず、かつ過剰な確率的挿入および欠失を誘導することなく、DNAにおけるプログラム可能な一塩基(C→TまたはA→G)変化を誘導する、ゲノム編集の新規なアプローチを提供する。
本明細書では、塩基エディター系を用いて核酸塩基を編集するためのシステム、組成物、および方法を提供する。いくつかの実施形態において、塩基エディターシステムは、核酸塩基を編集するための、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインおよび１つまたは複数（例えば２つ）の核酸塩基編集ドメイン（例えば２つのデアミナーゼドメイン）を含む塩基エディター（BE）と、ポリヌクレオチドプログラミング可能ヌクレオチド結合ドメインに付随するガイドポリヌクレオチド（例えばガイドRNA）とを含む。いくつかの実施形態において、塩基エディターシステムは、核酸塩基を編集するための、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインおよび１つまたは複数の（例えば２つの）核酸塩基編集ドメイン（例えば、同じまたは異なる２つのデアミナーゼドメイン）を含む塩基エディター（BE）と、ポリヌクレオチドプログラミング可能ヌクレオチド結合ドメインに付随するガイドポリヌクレオチド（例えばガイドRNA）とを含む。いくつかの実施形態において、塩基エディターシステムは、シトシン塩基エディター (CBE)とアデノシン塩基エディター (ABE)とを含む。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラミング可能なDNA結合ドメインである。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラミング可能なRNA結合ドメインである。ある態様において、核酸塩基編集ドメインは、１つまたは複数の（例えば２つの）デアミナーゼドメインを含む。場合によっては、デアミナーゼドメインは、シトシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼと、アデニンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼとであり得る。いくつかの実施形態では「シトシンデアミナーゼ」および「シチジンデアミナーゼ」という用語は交換可能に使用され得る。いくつかの実施形態では「アデニンデアミナーゼ」および「アデノシンデアミナーゼ」という用語は交換可能に使用され得る。場合によっては、デアミナーゼドメインは、シトシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼであり得る。場合によっては、デアミナーゼドメインは、アデニンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼであり得る。核酸塩基編集タンパク質の詳細は、国際PCT出願番号PCT/2017/045381 (WO2018/027078) およびPCT/US2016/058344 (WO2017/070632) に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。Komor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage” Nature 551, 464-471 (2017); および Komor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity”Science Advances 3:eaao4774 (2017)も参照のこと（その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
一部の実施形態では、核酸塩基エディターシステムは、複数の塩基編集コンポーネントを含むことができる。例えば、本明細書に記載されるように、核酸塩基エディターシステムは、複数のデアミナーゼを含むことができる。ある態様において、ヌクレアーゼ塩基編集システムは、1以上のシチジンデアミナーゼおよび/または1以上のアデノシンデアミナーゼを含み得る。いくつかの実施形態において、単一のガイドポリヌクレオチドを利用して、異なるデアミナーゼを標的核酸配列にターゲティングすることができる。ある態様において、一対のガイドポリヌクレオチドが、異なるデアミナーゼを標的核酸配列にターゲティングするために利用され得る。
塩基エディター系の核酸塩基成分およびポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合成分は、互いに共有結合的または非共有結合的により結合され得る。例えば、いくつかの実施形態において、デアミナーゼドメインが、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインによって標的ヌクレオチド配列にターゲティングされ得る。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインは、デアミナーゼドメインに融合または連結され得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインは、デアミナーゼドメインと非共有結合的に相互作用または結合することによって、デアミナーゼドメインを標的ヌクレオチド配列にターゲティングすることができる。例えば、いくつかの実施形態において、核酸塩基編集成分、例えばデアミナーゼ成分は、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインの一部をなすさらなる異種部分またはドメインと相互作用し、会合し、または複合体を形成することができる、さらなる異種部分またはドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリペプチドと結合し、相互作用し、会合し、または複合体を形成することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドと結合し、相互作用し、会合し、または複合体を形成することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ガイドポリヌクレオチドに結合することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリペプチドリンカーに結合することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドリンカーに結合することができる。追加の異種部分は、タンパク質ドメインであってもよい。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、K相同(KH) ドメイン、MS2コートタンパク質ドメイン、PP7コートタンパク質ドメイン、SfMu Comコートタンパク質ドメイン、ステリルαモチーフ、テロメラーゼKu結合モチーフおよびKuタンパク質、テロメラーゼSm7結合モチーフおよびSm7タンパク質、またはRNA認識モチーフであり得る。
塩基編集システムは、ガイドポリヌクレオチド成分をさらに含むことができる。塩基編集システムの構成要素は、共有結合、非共有結合的相互作用、またはそれらの結合および相互作用の任意の組合せを介して互いに結合され得ることが理解されるべきである。ある態様において、デアミナーゼドメインは、ガイドポリヌクレオチドによって標的ヌクレオチド配列にターゲティングされ得る。例えば、いくつかの実施形態において、塩基エディター系の核酸塩基編集成分、例えばデアミナーゼ成分は、ガイドポリヌクレオチドの一部またはセグメント(例えばポリヌクレオチドモチーフ) と相互作用し、結合し、または複合体を形成し得るさらなる異種部分またはドメイン(例えばRNAまたはDNA結合タンパク質のようなポリヌクレオチド結合ドメイン)を含み得る。いくつかの実施形態において、追加の異種部分またはドメイン(例えばRNAまたはDNA結合タンパク質などのポリヌクレオチド結合ドメイン)は、デアミナーゼドメインに融合または連結され得る。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリペプチドと結合し、相互作用し、会合し、またはポリペプチドと複合体を形成することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドと結合し、相互作用し、会合し、またはポリヌクレオチドと複合体を形成することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ガイドポリヌクレオチドに結合することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリペプチドリンカーに結合することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドリンカーに結合することができる。追加の異種部分は、タンパク質ドメインであってもよい。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、K相同(KH) ドメイン、MS2コートタンパク質ドメイン、PP7コートタンパク質ドメイン、SfMu Comコートタンパク質ドメイン、無菌アルファモチーフ、テロメラーゼKu結合モチーフおよびKuタンパク質、テロメラーゼSm7結合モチーフおよびSm7タンパク質、またはRNA認識モチーフであり得る。
ある態様において、塩基編集システムは、塩基除去修復 (BER) コンポーネントの阻害因子をさらに含むことができる。塩基編集システムの構成要素は、共有結合、非共有結合的相互作用、またはそれらの結合および相互作用の任意の組み合わせを介して互いに結合され得ることが理解されるべきである。BER成分の阻害因子は、塩基除去修復阻害因子を含み得る。ある態様において、塩基除去修復の阻害因子は、ウラシルDNAグリコシラーゼ阻害因子 (UGI) であり得る。ある態様において、塩基除去修復の阻害因子は、イノシン塩基除去修復阻害因子であり得る。ある態様において、塩基除去修復の阻害因子は、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインにより標的ヌクレオチド配列にターゲティングされ得る。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインは、塩基除去修復の阻害因子に融合または連結され得る。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインは、デアミナーゼドメインおよび塩基除去修復の阻害因子に融合または連結され得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインは、塩基除去修復の阻害因子と非共有結合的に相互作用するか、または塩基除去修復の阻害因子と会合することによって、塩基除去修復の阻害因子を標的ヌクレオチド配列へとターゲティングすることができる。例えば、いくつかの実施形態において、塩基除去修復成分の阻害因子は、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインの一部であるさらなる異種部分またはドメインと相互作用、会合、または複合体形成し得るさらなる異種部分またはドメインを含み得る。ある態様において、塩基除去修復の阻害因子は、ガイドポリヌクレオチドにより標的ヌクレオチド配列にターゲティングされ得る。例えば、いくつかの実施形態において、塩基除去修復の阻害因子は、ガイドポリヌクレオチドの一部またはセグメント(例えば、ポリヌクレオチドモチーフ)と相互作用、会合、または複合体形成し得るさらなる異種部分またはドメイン(例えば、RNAまたはDNA結合タンパク質のようなポリヌクレオチド結合ドメイン)を含み得る。いくつかの実施形態において、ガイドポリヌクレオチドのさらなる異種部分またはドメイン(例えば、RNAまたはDNA結合タンパク質のようなポリヌクレオチド結合ドメイン)は、塩基除去修復の阻害因子に融合または連結され得る。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドと結合、相互作用、会合、または複合体形成することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ガイドポリヌクレオチドに結合することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリペプチドリンカーに結合することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドリンカーに結合することができる。追加の異種部分は、タンパク質ドメインであってもよい。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、K相同(KH) ドメイン、MS2コートタンパク質ドメイン、PP7コートタンパク質ドメイン、SfMu Comコートタンパク質ドメイン、無菌アルファモチーフ、テロメラーゼKu結合モチーフおよびKuタンパク質、テロメラーゼSm7結合モチーフおよびSm7タンパク質、またはRNA認識モチーフであり得る。
ある態様において、塩基エディターは、編集された鎖の塩基除去修復を阻害する。いくつかの実施形態において、塩基エディターは、編集されていない鎖を保護または結合する。一部の実施形態では、塩基エディターはUGI活性を含む。ある態様において、塩基エディターは、触媒的に不活性なイノシン特異的ヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディターはニッカーゼ活性を含む。ある態様において、塩基対の意図された編集は、PAM部位の上流にある。ある態様において、塩基対の意図された編集は、PAM部位の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド上流にある。いくつかの実施形態において、塩基対の意図された編集は、PAM部位の下流にある。ある態様において、意図される編集された塩基対は、PAM部位の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド下流にある。
いくつかの実施形態では、本方法は、標準(例えばNGG) PAMサイトを必要としない。いくつかの実施態様において、核酸塩基エディターは、リンカー又はスペーサーを含む。ある態様において、リンカーまたはスペーサーは、長さが1〜25アミノ酸である。ある態様において、リンカーまたはスペーサーは、長さが5〜20アミノ酸である。ある態様において、リンカーまたはスペーサーは、長さが10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸である。
一部の実施形態では、標的領域は標的ウィンドウを含み、標的ウィンドウは標的核酸塩基対を含む。ある態様において、標的ウィンドウは、1〜10ヌクレオチドを含む。ある態様において、標的ウィンドウは、長さが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、塩基対の意図された編集は、標的ウィンドウ内にある。いくつかの実施態様において、標的ウィンドウは、塩基対の意図された編集を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかを用いて実施される。いくつかの実施態様において、標的ウィンドウは、脱アミノ化ウィンドウである。
いくつかの実施形態では、非限定的な例示的シチジン塩基エディター (CBE) として、BE1 (APOBEC1-XTEN-dCas9) 、BE2 (APOBEC1-XTEN-dCas9-UGI) 、BE3 (APOBEC1-XTEN-dCas9(A840H)-UGI) 、BE3-Gam、saBE3、saBE4-Gam、BE4、BE4-Gam、saBE4、またはsaB4E-Gamが挙げられる。BE4はAPOBEC1‐Cas9n(D10A)リンカーを32アミノ酸まで、Cas9n‐UGIリンカーを9アミノ酸まで拡張し、単一塩基エディター構築物のC末端に別の9アミノ酸リンカーと共にUGIの第二コピーを付加する。塩基性エディタsaBE3およびsaBE4では、S. pyogenes Cas9n(D10A) をより小さいS. aureus Cas9n(D10A) で置き換えた。BE3-Gam、saBE3-Gam、BE4-Gam、およびsaBE4-Gamは、174残基のGamタンパク質が、16アミノ酸のXTENリンカーを介してBE3、saBE3、BE4、およびsaBE4のN末端に融合されたものを有する。
一部の実施形態において、アデノシン塩基エディター（ABE）は、DNA中のアデニンを脱アミノ化することができる。ある態様において、ABEは、BE3のAPOBEC1成分を、天然または操作された大腸菌TadA、ヒトADAR2、マウスADA、またはヒトADAT2で置換することによって生成される。いくつかの実施形態において、ABEは、進化されたTadAバリアントを含む。いくつかの実施態様では、ABEはABE 1.2 (TadA*-XTEN-nCas9-NLS) である。ある態様において、TadA*はA106VおよびD108N突然変異を含む。
ある態様において、ABEは第二世代ABEである。ある態様において、ABEはABE 2.1であり、これは、TadA* (TadA*2.1) において追加の突然変異D147YおよびE155Vを含むものである。いくつかの実施形態において、ABEはABE 2.2であり、これはABE 2.1が触媒的に不活性化されたバージョンのヒトアルキルアデニンDNAグリコシラーゼ(E125Q変異を伴うAAG)に融合されたものである。いくつかの実施形態において、ABEはABE 2.3であり、こではABE 2.1が触媒的に不活性化された大腸菌Endo V (D35A変異で不活化される)に融合されたものである。いくつかの態様において、ABEはABE 2.6であり、これはABE 2.1におけるリンカーの二倍の長さ(32アミノ酸、(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2)のリンカーを有する。いくつかの実施態様において、ABEはABE 2.7であり、これはABE 2.1が追加の野生型TadAモノマーと連結されたものである。いくつかの実施態様では、ABEはABE 2.8であり、これはABE 2.1が追加のTadA*2.1モノマーでつながれたものである。いくつかの実施形態において、ABEはABE 2.9であり、これは進化されたTadA (TadA*2.1) とABE 2.1のN末端との直接融合体である。いくつかの実施形態において、ABEはABE 2.10であり、これは野生型TadAとABE 2.1のN末端との直接融合体である。いくつかの実施形態において、ABEはABE 2.11であり、これは、TadA*モノマーのN末端において不活性化E59A突然変異を有するABE 2.9である。いくつかの実施形態において、ABEはABE 2.12であり、これは、内部TadA*モノマーにおいて不活性化E59A突然変異を有するABE 2.9である。
ある態様において、ABEは、第三世代ABEである。ある態様において、ABEはABE 3.1であり、これは、三つのさらなるTadA突然変異(L84F、H123Y、およびI157F)を伴うABE 2.3である。
いくつかの実施形態において、ABEは第四世代ABEである。いくつかの実施形態において、ABEはABE4.3であり、これはさらなるTadA突然変異A142N (TadA*4.3) を伴うABE 3.1である。
いくつかの実施形態において、ABEは第五世代ABEである。いくつかの実施形態において、ABEはABE 5.1であり、これは生存クローンからの突然変異のコンセンサスセット(H36L、R51L、S146C、およびK157N) をABE 3.1に輸入することによって生成される。いくつかの実施形態において、ABEはABE 5.3であり、これは内部の進化されたTadA*に融合された野生型大腸菌TadAを含むヘテロ二量体構築物を有する。ある態様において、ABEは、以下の表6に示されるように、ABE 5.2、ABE 5.4、ABE 5.5、ABE 5.6、ABE 5.7、ABE 5.8、ABE 5.9、ABE 5.10、ABE 5.11、ABE 5.12、ABE 5.13、またはABE 5.14である。一部の実施形態では、ABEは第6世代ABEである。一部の実施形態では、ABEは、以下の表6に示されるように、ABE 6.1、ABE 6.2、ABE 6.3、ABE 6.4、ABE 6.5、またはABE 6.6である。いくつかの実施形態において、ABEは、第七世代ABEである。いくつかの実施形態において、ABEは、以下の表6に示されるように、ABE7.1、ABE7.2、ABE7.3、ABE7.4、ABE7.5、ABE7.6、ABE7.7、ABE7.8、ABE7.9、またはABE7.10である。
Figure 2021532794
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ある態様において、塩基エディターは、ウラシルグリコシラーゼ阻害因子 (UGI) の全部または一部を含むドメインをさらに含む。ある態様において、塩基エディターは、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)などの、ウラシル結合タンパク質(UBP)の全部または一部を含むドメインを含む。ある態様において、塩基エディターは、核酸ポリメラーゼの全てまたは一部を含むドメインを含む。ある態様において、塩基エディターに組み込まれる核酸ポリメラーゼまたはその一部は、損傷乗り越えDNAポリメラーゼである。
いくつかの実施形態では、塩基エディターのドメインは、複数のドメインを含むことができる。例えば、Cas9に由来するポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインを含む塩基エディターは、野生型または天然のCas9のRECローブおよびNUCローブに対応するRECローブおよびNUCローブを含むことができる。別の例では、塩基エディターは、RuvCIドメイン、BHドメイン、REC1ドメイン、REC2ドメイン、RuvCIIドメイン、L1ドメイン、HNHドメイン、L2ドメイン、RuvCIIIドメイン、WEDドメイン、TOPOドメインまたはCTDドメインのうちの1つ以上を含むことができる。ある態様において、塩基エディターの一つ以上のドメインは、そのドメインを含むポリペプチドの野生型バージョンに対する突然変異(例えば置換、挿入、削除)を含む。例えば、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインのHNHドメインは、H840A置換を含むことができる。別の例では、ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメインのRuvCIドメインは、D10A置換を含むことができる。
本明細書に開示される塩基エディターの異なるドメイン（例えば隣接ドメイン）は、一つ以上のリンカードメイン（例えばXTENリンカードメイン）を使用して、または使用せずに、互いに接続することができる。いくつかの実施形態では、リンカードメインは、二つの分子もしくは部分（例えば、第一のドメイン（例えばCas9由来ドメイン）および第二のドメイン（例えばアデノシンデアミナーゼドメインまたはシチジンデアミナーゼドメイン）のような融合タンパク質の二つのドメイン）をつなげる結合（例えば共有結合）、化学基、または分子であり得る。ある態様において、リンカーは、共有結合（例えば炭素−炭素結合、ジスルフィド結合、炭素−ヘテロ原子結合など。）である。ある態様において、リンカーは、アミド結合における炭素窒素結合である。特定の実施形態では、リンカーは、環状もしくは非環状、置換もしくは非置換、分枝もしくは非分枝の脂肪族もしくはヘテロ脂肪族リンカーである。ある態様において、リンカーは、ポリマー（例えばポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステルなど)である。特定の実施態様では、リンカーは、アミノアルカン酸のモノマー、ダイマー又はポリマーを含む。ある態様において、リンカーは、アミノアルカン酸（例えばグリシン、エタン酸、アラニン、β-アラニン、3-アミノプロパン酸、4-アミノブタン酸、5-ペンタン酸等）を含む。いくつかの実施態様において、リンカーは、アミノヘキサン酸(Ahx) のモノマー、ダイマー又はポリマーを含む。ある態様において、リンカーは炭素環部分（例えばシクロペンタン、シクロヘキサン）に基づく。他の態様において、リンカーはポリエチレングリコール部分 (PEG) を含む。ある態様において、リンカーは、アリールまたはヘテロアリール部分を含む。ある態様において、リンカーは、フェニル環に基づく。リンカーは、ペプチドからリンカーへの求核剤（例えばチオール、アミノ）の結合を促進させる官能化部分を含むことができる。リンカーの一部として任意の求電子剤を使用することができる。例示的な求電子剤としては、活性化エステル、活性化アミド、マイケル受容体、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アシル、およびイソチオシアナートが挙げられるが、これらに限定されない。ある態様において、リンカーは、Cas9ヌクレアーゼドメインを含むRNAプログラム可能ヌクレアーゼのgRNA結合ドメインと、核酸編集タンパク質の触媒ドメインとを結合する。ある態様において、リンカーは、dCas9と第二のドメイン（例えばUGI、シチジンデアミナーゼ等）とを連結する。
典型的には、リンカーは、2つの基、分子、または他の部分の間に配置されるか、または2つの基、分子、または他の部分によって隣接され、共有結合を介してそれぞれに連結され、したがって2つを連結する。ある態様において、リンカーは、アミノ酸または複数のアミノ酸(例えばペプチドまたはタンパク質)である。ある態様において、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学的部分である。ある態様において、リンカーは、長さが2〜100アミノ酸であり、例えば、長さが2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30〜35、35〜40、40〜45、45〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜150〜200アミノ酸である。ある態様において、リンカーは、長さが約3〜約104 (例えば5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100)アミノ酸である。より長いまたはより短いリンカーも考えられる。ある態様において、リンカードメインは、XTENリンカーとも呼ばれ得るアミノ酸配列SGSETPGTSESATPESを含む。融合タンパク質ドメインを連結するための任意の方法を用いて (例えば、(SGGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n、および(G)nの形態の非常に柔軟なリンカーから、(EAAAK)n、 (GGS)n、SGSETPGTSESATPESの形態のより剛性の高いリンカーまで(例えばGuilinger JP, Thompson DB, Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014; 32(6): 577-82参照。その全内容は参照によりここに組み込まれる)、または (XP)nモチーフ)、核酸塩基エディターの活性のための最適な長さを達成することができる。いくつかの実施態様において、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15である。ある態様において、リンカーは、(GGS)nモチーフを含み、ここで、nは、1、3、または7である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質のCas9ドメインは、アミノ酸配列SGSETPGTSESATPESを含むリンカーを介して融合される。いくつかの実施形態において、リンカーは、複数のプロリン残基を含み長さが5〜21、5〜14、5〜9、5〜7アミノ酸であり、例えば、PAPAP、PAPAPA、PAPAPAP、PAPAPAPA、P(AP)4、P(AP)7、P(AP)10である(例えば、Tan J, Zhang F, Karcher D, Bock R. Engineering of high-precision base editors for site-specific single nucleotide replacement. Nat Commun. 2019 Jan 25;10(1):439を参照；その全内容は参照によりここに組み込まれる)。このようなプロリンに富むリンカーはまた、「硬質」リンカーとも呼ばれる。
［リンカー］
ある実施形態において、本発明のペプチドまたはペプチドドメインのいずれかを連結するためにリンカーが使用され得る。リンカーは、共有結合のように単純であり得、またはそれは、多原子の長さであるポリマーリンカーであり得る。ある実施形態において、リンカーは、ポリペプチドであるか、またはアミノ酸に基づくものである。他の実施形態において、リンカーはペプチド様ではない。ある実施形態において、リンカーは、共有結合（例えば、炭素-炭素結合、ジスルフィド結合、炭素-ヘテロ原子結合、等）である。ある実施形態において、リンカーは、アミド連結の炭素-窒素結合である。特定の実施形態では、リンカーは、環状又は非環状、置換又は非置換、分枝又は非分枝の脂肪族又はヘテロ脂肪族リンカーである。ある実施形態において、リンカーは、ポリマー（例えばポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステル、その他）である。特定の実施形態では、リンカーは、アミノアルカン酸のモノマー、ダイマー又はポリマーを含む。ある実施形態において、リンカーは、アミノアルカン酸（例えば、グリシン、エタン酸、アラニン、ベータ-アラニン、3-アミノプロパン酸、4-アミノブタン酸、5-ペンタン酸、等）を含む。特定の実施形態では、リンカーは、アミノヘキサン酸 (Ahx) のモノマー、ダイマー又はポリマーを含む。ある態様において、リンカーは、炭素環部分（例えばシクロペンタン、シクロヘキサン）に基づく。他の実施形態において、リンカーは、ポリエチレングリコール部分 (PEG) を含む。他の実施形態において、リンカーはアミノ酸を含む。ある態様において、リンカーはペプチドを含む。ある実施形態において、リンカーは、アリールまたはヘテロアリール部分を含む。ある実施形態において、リンカーは、フェニル環に基づく。リンカーは、ペプチドからの求核剤（例えばチオール、アミノ）がリンカーに結合することを促進するための官能化部分を含み得る。リンカーの一部として任意の求電子剤を使用することができる。例示的な求電子剤としては、活性化エステル、活性化アミド、マイケル受容体、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アシル、およびイソチオシアナートが挙げられるが、これらに限定されない。
ある実施形態において、リンカーは、一アミノ酸または複数のアミノ酸（例えばペプチドまたはタンパク質）である。いくつかの実施形態において、リンカーは、結合（例えば共有結合）、有機分子、基、ポリマー、または化学的部分である。ある実施形態において、リンカーは、長さが約3〜約104（例えば5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100）アミノ酸である。
ある実施形態において、シチジンデアミナーゼおよびアデノシンデアミナーゼおよびnapDNAbpは、長さが4、16、32または104アミノ酸であるリンカーを介して融合される。ある実施形態において、リンカーは、長さが約3〜約104アミノ酸である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかは、リンカーを介して互いに融合されたシチジンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、およびCas9ドメインを含む。マルチエフェクター核酸塩基エディターの活性のための最適な長さを達成するために、シチジンデアミナーゼおよびアデノシンデアミナーゼドメイン（例えば、設計されたecTadA）およびCas9ドメインの間で種々のリンカーの長さおよび柔軟性を利用することができる（例えば、(GGGS)n、(GGGGS)n、および(G)nの形態の非常に柔軟なリンカーから、(EAAAK)n、 (SGGS)n、SGSETPGTSESATPESの形態のより剛性の高いリンカーまで(例えばGuilinger JP, Thompson DB, Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014; 32(6): 577-82参照。その全内容は参照によりここに組み込まれる)、および (XP)n）。いくつかの実施態様において、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15である。ある実施形態において、リンカーは、(GGS)nモチーフを含み、ここで、nは、1、3、または7である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかのシチジンデアミナーゼおよびアデノシンデアミナーゼおよびCas9ドメインは、アミノ酸配列SGSETPGTSESATPESを含むリンカー（例えばXTENリンカー）を介して融合される。
一部の実施形態では、標的領域は標的ウィンドウを含み、標的ウィンドウは標的核酸塩基対を含む。ある態様において、標的ウィンドウは、1〜10ヌクレオチドを含む。ある態様において、標的ウィンドウは、長さが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、塩基対の意図された編集は、標的ウィンドウ内にある。いくつかの実施態様において、標的ウィンドウは、塩基対の意図された編集を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかを用いて実施される。いくつかの実施態様において、標的ウィンドウは、脱アミノ化ウィンドウである。
さらに、場合によっては、Gamタンパク質を塩基エディターのN末端に融合させることができる。場合によっては、Gamタンパク質を塩基エディタのC末端に融合させることができる。バクテリオファージMuのGamタンパク質は二本鎖切断 (DSB) の末端に結合し、それらを分解から保護することができる。いくつかの実施形態において、Gamを使用してDSBの遊離末端を結合することにより、塩基編集のプロセス中のインデル形成を低減することができる。いくつかの実施形態において、174残基のGamタンパク質は、塩基エディターのN末端に融合される。Komor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017)を参照されたい。場合によっては、1つまたは複数の突然変異が、野生型ドメインと比較して、塩基編集ドメインの長さを変化させることができる。例えば、少なくとも1つのドメインにおける少なくとも1つのアミノ酸の欠失は、塩基エディターの長さを短くすることができる。別の例では、1つまたは複数の突然変異は、野生型ドメインに対するドメインの長さを変化させない。例えば、いずれかのドメインにおける置換（複数可）は塩基エディターの長さを変えない。
いくつかの実施形態において、本明細書中で提供される塩基編集融合タンパク質は、正確な位置、例えば、標的塩基が規定された領域(例えば「脱アミノ化ウィンドウ」)内に配置されるような位置に配置される必要がある。場合によっては、標的は4塩基領域内にあり得る。場合によっては、そのような規定された標的領域は、PAMの約15塩基上流にあり得る。Komor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage”Nature 551, 464-471 (2017); and Komor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017) 参照；その全内容が参照により本明細書に組み入れられる。
定義された標的領域は、脱アミノ化ウィンドウであり得る。脱アミノ化ウィンドウは、塩基エディターが標的ヌクレオチドに作用して脱アミノ化する、規定された領域であり得る。いくつかの実施態様において、脱アミノ化ウィンドウは、2、3、4、5、6、7、8、9又は10塩基領域内にある。いくつかの実施態様において、脱アミノ化ウィンドウは、PAMの5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24又は25塩基上流にある。
本開示の塩基エディターは、標的ポリヌクレオチド配列の編集を促進させる任意のドメイン、特徴またはアミノ酸配列を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態において、塩基エディターは、核局在化配列 (NLS) を含む。いくつかの実施形態において、塩基エディターのNLSは、デアミナーゼドメインとポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインとの間に位置する。いくつかの実施形態において、塩基エディターのNLSは、ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインに対してC末端に位置する。
本明細書に開示される塩基エディターに存在し得る他の例示的特徴は、細胞質局在化配列、核輸出配列などの輸出配列、または他の局在化配列などの局在化配列、ならびに融合タンパク質の可溶化、精製、または検出に有用な配列タグである。本明細書において提供される適切なタンパク質タグには、限定されるものではないが、ビオチンカルボキシラーゼキャリアータグ (BCCP) タグ、myc-タグ、カルモジュリンタグ、FLAG-タグ、ヘマグルチニン (HA) -タグ、ヒスチジンタグまたはHis-タグとも呼ばれるポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質 (MBP) -タグ、nus-タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ (GST) -タグ、緑色蛍光タンパク質 (GFP) -タグ、チオレドキシンタグ、S-タグ、ソフタグ(例ソフタグ1、ソフタグ3)、ストレプトタグ、ビオチンリガーゼタグ、FLASHタグ、V5タグ、およびSBP-タグが含まれる。さらなる適切な配列は、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、1つ以上のHisタグを含む。
融合タンパク質に含まれ得るタンパク質ドメインの非限定的な例としては、デアミナーゼドメイン(例えばシチジンデアミナーゼおよび/またはアデノシンデアミナーゼ)、ウラシルグリコシラーゼ阻害因子 (UGI) ドメイン、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、および/または以下の活性の一つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる:メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、RNA切断活性、および核酸結合活性。追加のドメインは、異種の機能的ドメインであり得る。そのような異種機能ドメインは、DNAメチル化、DNA損傷、DNA修復、標的DNAと結合した標的ポリペプチド(例えばヒストン、DNA結合タンパク質など)の修飾などの機能活性を付与し、例えばヒストンメチル化、ヒストンアセチル化、ヒストンユビキチン化などをもたらすことができる。
付与される他の機能には、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、SUMO化活性、脱SUMO化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、リモデリング活性、プロテアーゼ活性、酸化還元酵素活性、トランスフェラーゼ活性、ヒドロラーゼ活性、イソメラーゼ活性、シンターゼ活性、シンテターゼ活性、および脱ミリストイル化活性、またはこれらの任意の組合せが含まれる。
エピトープタグの非限定的な例は、ヒスチジン (His) タグ、V5タグ、FLAGタグ、インフルエンザヘマグルチニン (HA) タグ、Mycタグ、VSV-Gタグ、およびチオレドキシン (Trx) タグを含む。レポーター遺伝子の例としては、グルタチオン-5-トランスフェラーゼ (GST) 、西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ (CAT) 、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質 (GFP) 、HcRed、DsRed、シアン蛍光タンパク質 (CFP) 、黄色蛍光タンパク質 (YFP) 、および青色蛍光タンパク質 (BFP) を含む自己蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。さらなるタンパク質配列には、DNA分子に結合するかまたは他の細胞分子に結合するアミノ酸配列が含まれ得、これらには、マルトース結合タンパク質 (MBP) 、Sタグ、Lex A DNA結合ドメイン (DBD) 融合体、GAL4 DNA結合ドメイン融合体、および単純ヘルペスウイルス (HSV) BP16タンパク質融合体が挙げられるが、これらに限定されない。
［その他の核酸塩基エディター］
本発明は、モジュラー式マルチエフェクター核酸塩基エディターを提供し、ここでは、実質的にあらゆる当技術分野で知られる核酸塩基エディターが、本明細書中に記載された融合タンパク質に挿入され得、または、シチジンデアミナーゼもしくはアデノシンデアミナーゼ、またはシチジンデアミナーゼとアデノシンデアミナーゼの両方の代わりに交換され得る。1つの実施形態において、本発明は、脱塩基型核酸塩基エディタードメインを含むマルチエフェクター核酸塩基エディターを特徴とする。脱塩基型核酸塩基エディターは当技術分野で公知であり、例えば、Kavli et al., EMBO J. 15:3442-3447, 1996によって記述されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。
［Cas9ドメイン、アデノシンデアミナーゼ、およびシチジンデアミナーゼを含む融合タンパク質］
本開示のいくつかの態様は、Cas9ドメインまたは他の核酸プログラミング可能DNA結合タンパク質と、1つ以上のアデノシンデアミナーゼドメイン、シチジンデアミナーゼドメイン、および/またはDNAグリコシラーゼドメインとを含む融合タンパク質を提供する。このCas9ドメインは、本明細書に提供されるCas9ドメインまたはCas9タンパク質（例えばdCas9またはnCas9）のいずれでもあり得ることが理解されるべきである。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるCas9ドメインまたはCas9タンパク質（例えばdCas9またはnCas9）のいずれかが、本明細書に提供されるシチジンデアミナーゼおよびアデノシンデアミナーゼのいずれかと融合され得る。本明細書に開示される塩基エディターのドメインは、任意の順序で配列され得る。例えば、限定するものではないが、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、以下の構造を含む：
NH2-[シチジンデアミナーゼ]-[Cas9ドメイン]-[アデノシンデアミナーゼ]-COOH;
NH2-[アデノシンデアミナーゼ]-[Cas9ドメイン]-[シチジンデアミナーゼ]-COOH;
NH2-[アデノシンデアミナーゼ]-[シチジンデアミナーゼ]-[Cas9ドメイン]-COOH;
NH2-[シチジンデアミナーゼ]-[アデノシンデアミナーゼ]-[Cas9ドメイン]-COOH;
NH2-[Cas9ドメイン]-[アデノシンデアミナーゼ]-[シチジンデアミナーゼ]-COOH; または
NH2-[Cas9ドメイン]-[シチジンデアミナーゼ]-[アデノシンデアミナーゼ]-COOH。
ある実施形態において、シチジンデアミナーゼ、脱塩基エディター、およびアデノシンデアミナーゼ、ならびにnapDNAbp（例えばCas9ドメイン）を含む融合タンパク質は、リンカー配列を含まない。ある実施形態において、リンカーが、シチジンデアミナーゼおよびアデノシンデアミナーゼドメインならびにnapDNAbpの間に存在する。いくつかの実施形態において、上記の一般的な構築で使用される「-」は、任意のリンカーの存在を示す。いくつかの実施形態において、シチジンデアミナーゼおよびアデノシンデアミナーゼおよびnapDNAbpは、本明細書に提供される任意のリンカーを介して融合される。例えば、いくつかの実施形態において、シチジンデアミナーゼおよびアデノシンデアミナーゼおよびnapDNAbpは、「リンカー」と題されたセクションにおいて以下に提供されるリンカーのいずれかを介して融合される。
いくつかの実施形態において、シチジンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼおよびCas9ドメインを有する典型的なCas9融合タンパク質の一般的な構築は、以下の構造のいずれかを含み、ここで、NLSは核局在化配列（例えば本明細書に提供される任意のNLS）であり、NH2は融合タンパク質のN末端であり、COOHは融合タンパク質のC末端である。
NH2-NLS-[シチジンデアミナーゼ]-[Cas9ドメイン]-[アデノシンデアミナーゼ]-COOH;
NH2-NLS-[アデノシンデアミナーゼ]-[Cas9ドメイン]-[シチジンデアミナーゼ]-COOH;
NH2-NLS-[アデノシンデアミナーゼ] [シチジンデアミナーゼ]-[Cas9ドメイン]-COOH;
NH2-NLS-[シチジンデアミナーゼ]-[アデノシンデアミナーゼ]-[Cas9ドメイン]-COOH;
NH2-NLS-[Cas9ドメイン]-[アデノシンデアミナーゼ]-[シチジンデアミナーゼ]-COOH;
NH2-NLS-[Cas9ドメイン]-[シチジンデアミナーゼ]-[アデノシンデアミナーゼ]-COOH;

NH2-[シチジンデアミナーゼ]-[Cas9ドメイン]-[アデノシンデアミナーゼ]-NLS-COOH;
NH2-[アデノシンデアミナーゼ]-[Cas9ドメイン]-[シチジンデアミナーゼ]-NL2-COOH;
NH2-[アデノシンデアミナーゼ] [シチジンデアミナーゼ]-[Cas9ドメイン]-NLS-COOH;
NH2-[シチジンデアミナーゼ]-[アデノシンデアミナーゼ]-[Cas9ドメイン]-NLS-COOH;
NH2-[Cas9ドメイン]-[アデノシンデアミナーゼ]-[シチジンデアミナーゼ]-NLS-COOH; または
NH2-[Cas9ドメイン]-[シチジンデアミナーゼ]-[アデノシンデアミナーゼ]-NLS-COOH.
いくつかの実施形態において、NLSはリンカー中に存在するか、またはNLSはリンカー、例えば本明細書に記載されるリンカーによって隣接される。いくつかの実施形態において、N末端またはC末端のNLSは、二部分NLSである。二部分NLSは、比較的短いスペーサー配列によって分離される二つの塩基性アミノ酸クラスターを含む（それゆえにbipartite、二部分と呼ばれ、一部分（monopartite）NLSは異なる）。ヌクレオプラスミンのNLSであるKR[PAATKKAGQA]KKKKは遍在的な二部シグナルのプロトタイプであり、塩基性アミノ酸の二つのクラスターが約10アミノ酸のスペーサーによって隔てられたものである。例示的な二部NLSの配列は、PKKKRKVEGADKRTADGSEFES PKKKRKVである。
ある実施形態において、シチジンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、Cas9ドメインおよびNLSを含む融合タンパク質は、リンカー配列を含まない。ある実施形態において、一つ以上のドメインまたはタンパク質（例えばシチジンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、Cas9ドメインまたはNLS）の間にリンカー配列が存在する。
本開示の融合タンパク質は、1つ以上のさらなる特徴を含み得ることが理解されるべきである。例えば、いくつかの態様において、融合タンパク質は、阻害因子、細胞質局在化配列、核輸出配列などの輸出配列、または他の局在化配列、ならびに融合タンパク質の可溶化、精製、または検出に有用な配列タグを含むことができる。本明細書において提供される適切なタンパク質タグには、限定されるものではないが、ビオチンカルボキシラーゼキャリアータグ (BCCP) タグ、myc-タグ、カルモジュリンタグ、FLAG-タグ、ヘマグルチニン (HA) -タグ、ポリヒスチジンタグ（ヒスチジンタグまたはHis-タグとも呼ばれる）、マルトース結合タンパク質 (MBP) -タグ、nus-タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ (GST) -タグ、緑色蛍光タンパク質 (GFP) -タグ、チオレドキシンタグ、S-タグ、ソフタグ(例えばSoftag1、Softag3)、ストレプトタグ、ビオチンリガーゼタグ、FLAsHタグ、V5タグ、およびSBP-タグが含まれる。さらなる適切な配列は、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、1つ以上のHisタグを含む。
［塩基エディターの効率性］
CRISPR-Cas9ヌクレアーゼは、標的ゲノム編集を媒介するために広く使用されている。ほとんどのゲノム編集応用において、Cas9はガイドポリヌクレオチド(例えば単一ガイドRNA (sgRNA))と複合体を形成し、sgRNA配列により指定される標的部位で二本鎖DNA切断 (DSB) を誘導する。細胞は主に非相同末端結合 (NHEJ) 修復経路を介してこのDSBに応答し、遺伝子を破壊するフレームシフト変異を生じる確率的挿入または欠失 (インデル) を生じる。DSBに隣接する配列と高度の相同性を有するドナーDNA鋳型の存在下で、相同性指向性修復 (HDR) として知られる代替経路を介して遺伝子補正が達成され得る。残念ながら、ほとんどの非侵襲的条件下では、HDRは非効率であり、細胞状態および細胞型に依存し、より高いインデルの頻度によって支配される。ヒトの疾患に関連する既知の遺伝的変異の大部分は点突然変異であるため、より効率的かつクリーンに正確な点突然変異を作製できる方法が必要である。本明細書に提供される塩基編集システムは、二本鎖DNA切断を生じることなく、ドナーDNA鋳型を必要とせず、かつ過剰な確率的挿入および欠失を誘導することなく、ゲノム編集を提供するための新しい方法を提供する。
本明細書に提供される塩基エディターは、著しい割合のインデルを生成することなく、特定のヌクレオチド塩基を改変することができる。「インデル（indel）」という用語は、本明細書において使用される場合、核酸内のヌクレオチド塩基の挿入または欠失を指す。このような挿入または欠失は、遺伝子のコード領域内でフレームシフト突然変異を引き起こす可能性がある。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列において多数の挿入（insertion）または欠失（deletion）（すなわちインデル：indel）を生じることなく、核酸内の特定のヌクレオチドを効率的に改変（例えば変異または脱アミノ化）する塩基エディターを生成することが望ましい。特定の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターのいずれも、インデルに対して意図された改変（例えば点突然変異または脱アミノ化）のより大きな割合を生成することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される塩基エディター系のいずれも、標的ポリヌクレオチド配列において、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、19%未満、18%未満、17%未満、16%未満、15%未満、14%未満、13%未満、12%未満、11%未満、10%未満、9%未満、8%未満、7%未満、6%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、1%未満、0.9%未満、0.8%未満、未満、0.7%未満、0.6%未満、0.5%未満、0.4%未満、0.3%未満、0.2%未満、0.1%未満、0.09%未満、0.08%未満、0.07%未満、未満、0.06%未満、0.05%未満、0.04%未満、0.03%未満、0.02%未満、または0.01%未満のインデル形成をもたらす。
本開示のいくつかの態様は、本明細書に提供される塩基エディターが、有意な数の非意図的な突然変異（例えば非意図的な点突然変異など）を生成することなく、核酸(例えば対象のゲノム内の核酸)において、意図する突然変異（例えば点突然変異など）を効率的に生成することができるという認識に基づく。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される塩基エディターは、少なくとも0.01%の意図された突然変異(すなわち少なくとも0.01%の編集効率)を生じることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される塩基エディターは、少なくとも0.01%、1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%の意図された突然変異を生成することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される塩基エディターは、1:1より大きい、意図された点突然変異対インデルの比を生成することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される塩基エディターは、少なくとも1.5:1、少なくとも2:1、少なくとも2.5:1、少なくとも3:1、少なくとも3.5:1、少なくとも4:1、少なくとも4.5:1、少なくとも5:1、少なくとも5.5:1、少なくとも6:1、少なくとも6.5:1、少なくとも7:1、少なくとも7.5:1、少なくとも8:1、少なくとも8.5:1、少なくとも9:1、少なくとも10:1、少なくとも11:1、少なくとも12:1、少なくとも13:1、少なくとも14:1、少なくとも15:1、少なくとも20:1、少なくとも25:1、少なくとも30:1、少なくとも40:1、少なくとも50:1、少なくとも100:1、少なくとも200:1、少なくとも300:1、少なくとも400:1、少なくとも500:1、少なくとも600:1、少なくとも700:1、少なくとも800:1、少なくとも900:1、もしくは少なくとも1000:1、またはそれ以上の、意図される点突然変異対インデルの比を生じることができる。
意図された突然変異およびインデルの数は、例えば、国際PCT出願番号PCT/2017/045381 (WO2030/027078) およびPCT/US2016/058344 (WO2017/070632)；Komor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage”Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage”Nature 551, 464-471 (2017); および Komor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity,” Science Advances 3:eaao4774 (2017)（その全内容は参照によりここに組み込まれる）に記載されているもののような、任意の適切な方法を用いて決定することができる。
いくつかの実施形態において、インデル頻度を計算するために、インデルが生じ得るウィンドウの両側に隣接する二つの10 bp配列に対する正確なマッチについて配列決定リードがスキャンされる。完全マッチが見つからない場合、そのリードは解析から除外される。このインデルウィンドウの長さが参照配列と完全にマッチする場合、リードはインデルを含まないものとして分類される。インデルウィンドウが参照配列よりも2塩基以上長いかまたは短い場合、配列決定リードは、それぞれ挿入または欠失として分類される。いくつかの態様において、本明細書において提供される塩基エディターは、核酸の領域におけるインデルの形成を制限することができる。ある態様において、その領域は、塩基エディターによって標的化されるヌクレオチドのところにあるか、または塩基エディターによって標的化されるヌクレオチドの2、3、4、5、6、7、8、9または10ヌクレオチド以内の領域である。
標的ヌクレオチド領域で形成されるインデルの数は、核酸(例えば細胞のゲノム内の核酸)が塩基エディターに曝される時間の量に依存し得る。いくつかの実施形態において、インデルの数または割合は、標的ヌクレオチド配列(例えば細胞のゲノム内の核酸)を塩基エディターに曝してから少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも6時間、少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも36時間、少なくとも48時間、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日、少なくとも7日、少なくとも10日、または少なくとも14日後に決定される。本明細書に記載される塩基エディターの特徴は、本明細書に提供される融合タンパク質、または融合タンパク質を使用する方法のいずれにも適用され得ることが理解されるべきである。
［多重編集］
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される塩基エディターシステムは、1以上の遺伝子における複数の核酸塩基対の多重編集を可能にする。ある態様において、複数の核酸塩基対は、同一遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態において、複数の核酸塩基対は、1つまたはそれより多い遺伝子に位置し、ここで、少なくとも1つの遺伝子は、異なる遺伝子座に位置する。ある態様において、多重編集は、1以上のガイドポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、多重編集は、1つ以上の塩基エディターシステムを含むことができる。いくつかの実施形態において、多重編集は、単一のガイドポリヌクレオチドを有する1つ以上の塩基エディターシステムを含むことができる。いくつかの実施形態において、多重編集は、複数のガイドポリヌクレオチドを有する1つ以上の塩基エディターシステムを含むことができる。いくつかの実施形態において、多重編集は、単一の塩基エディター系を有する1以上のガイドポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態において、多重編集は、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的化するためにPAM配列を必要としない少なくとも1つのガイドポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態において、多重編集は、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的化するためにPAM配列を必要とする少なくとも1つのガイドポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態において、多重編集は、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的化するためにPAM配列を必要としない少なくとも1つのガイドポリヌクレオチドと、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的化するためにPAM配列を必要とする少なくとも1つのガイドポリヌクレオチドとの混合物を含むことができる。本明細書に記載される塩基エディターのいずれかを使用する多重編集の特徴は、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかを使用する方法の任意の組み合わせに適用され得ることを理解されたい。また、本明細書に記載される塩基エディターのいずれかを使用する多重編集は、複数の核酸塩基対の順次的編集を含むことができることを理解されたい。
いくつかの実施形態において、複数の核酸塩基対は、1つ以上の遺伝子内にある。ある実施形態において、複数の核酸塩基対は、同じ遺伝子内にある。いくつかの実施形態において、1つ以上の遺伝子における少なくとも1つの遺伝子は、異なる遺伝子座に位置する。
いくつかの実施形態において、編集は、少なくとも1つのタンパク質コード領域における複数の核酸塩基対の編集である。いくつかの実施形態において、編集は、少なくとも1つのタンパク質非コード領域における複数の核酸塩基対の編集である。いくつかの実施形態において、編集は、少なくとも1つのタンパク質コード領域および少なくとも1つのタンパク質非コード領域における複数の核酸塩基対の編集である。
いくつかの態様において、編集は、1以上のガイドポリヌクレオチドを伴う。いくつかの実施形態では、塩基エディターシステムは、1つ以上の塩基エディターシステムを含むことができる。いくつかの実施形態では、塩基エディターシステムは、単一のガイドポリヌクレオチドとともに1つ以上の塩基エディターシステムを含むことができる。いくつかの実施形態において、塩基エディターシステムは、複数のガイドポリヌクレオチドとともに1つ以上の塩基エディターシステムを含むことができる。いくつかの実施形態において、編集は、単一の塩基エディター系を有する1以上のガイドポリヌクレオチドを伴う。いくつかの実施形態において、編集は、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的化するためにPAM配列を必要としない少なくとも1つのガイドポリヌクレオチドを伴う。いくつかの実施形態において、編集は、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的化するためにPAM配列を必要とする少なくとも1つのガイドポリヌクレオチドを伴う。いくつかの実施形態において、編集は、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的化するためにPAM配列を必要としない少なくとも1つのガイドポリヌクレオチドと、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的化するためにPAM配列を必要とする少なくとも1つのガイドポリヌクレオチドとの混合物を伴う。本明細書に記載される塩基エディターのいずれかを使用する多重編集の特徴は、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかを使用する方法の任意の組み合わせに適用され得ることを理解されたい。また、編集は、複数の核酸塩基対の順次的編集を含むことができることを理解されたい。
塩基エディターを使用する方法
［シチジンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼおよびCas9ドメインを含む融合タンパク質を使用する方法］
本明細書において、融合タンパク質、または複合体（例えばマルチエフェクター塩基エディター）を使用する方法が提供される。例えば、本開示のいくつかの局面は、DNA分子を、本明細書中に提供される融合タンパク質のいずれか、および少なくとも一つのガイドRNAと接触させることを含む方法を提供し、ここで、ガイドRNAは、約15〜100ヌクレオチド長であり、標的配列に相補的である少なくとも10個の連続したヌクレオチドの配列を含む。いくつかの実施形態において、標的配列の3’末端は、カノニカルPAM配列 (NGG) にすぐ隣接している。いくつかの実施形態において、標的配列の3’末端は、カノニカルPAM配列(NGG) にすぐ隣接していない。いくつかの実施形態において、標的配列の3’末端は、AGC、GAG、TTT、GTG、またはCAA配列にすぐ隣接している。いくつかの実施形態において、標的配列の3’末端は、NGA、NGCG、NGN、NNGRRT、NNNRRT、NGCG、NGCN、NGTN、NGTN、NGTN、または5’ (TTTV) 配列にすぐ隣接している。
いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、目的の標的に変異誘発するために使用される。特に、本明細書に記載されるマルチエフェクター核酸塩基エディターは、標的配列内に複数の突然変異を作製することができる。これらの変異は標的の機能に影響を及ぼし得る。例えば、マルチエフェクター核酸塩基エディターを使用して調節領域を標的とすると、調節領域の機能が変化し、下流のタンパク質の発現が減少する。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法の目的は、ゲノム編集を介して機能不全遺伝子の機能を回復することである。本明細書において提供されるマルチエフェクター核酸塩基エディター融合タンパク質は、例えばヒト細胞培養物中のポリヌクレオチド (遺伝子) 配列における疾患関連突然変異を補正することによって、遺伝子編集に基づくヒト治療についてインビトロで検証され得る。本明細書で提供される融合タンパク質、例えばCas9ドメイン、シチジンデアミナーゼ、およびアデノシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質は、例えば、GからTへの突然変異またはCからAへの突然変異などの任意の単一点突然変異を補正するために使用され得ることが、当業者によって理解されるであろう。
それぞれの配列における特定の位置または残基の番号付けは、使用される特定のタンパク質および番号付けスキームに依存することが理解されるであろう。例えば成熟タンパク質の前駆体と成熟タンパク質そのものの番号付けは異なることがあり、種間の配列の違いが番号付けに影響することがある。当業者は、任意の相同的タンパク質およびそれぞれのコード核酸中のそれぞれの残基を、当技術分野で周知の方法、例えば配列アラインメントおよび相同的残基の決定によって同定することができる。
本明細書に開示された、Cas9ドメインならびにシチジンデアミナーゼおよびアデノシンデアミナーゼを含む融合タンパク質のいずれかを標的部位、例えば、編集される突然変異を含む部位にターゲティングするためには、融合タンパク質をガイドRNA（例えばsgRNA）と共に共発現させることが典型的に必要であることは当業者には明らかであろう。本明細書の他の箇所でより詳細に説明されるように、ガイドRNAは、典型的には、Cas9結合を可能にするtracrRNAフレームワークと、Cas9:核酸編集酵素/ドメイン融合タンパク質に配列特異性を付与するガイド配列とを含む。あるいは、ガイドRNAおよびtracrRNAは、2つの核酸分子として別々に提供され得る。いくつかの態様において、ガイドRNAは、ガイド配列が標的配列に相補的な配列を含むという構造を含む。限定する意図ではないが、ガイド配列は典型的には20ヌクレオチド長である。Cas9:核酸編集酵素/ドメイン融合タンパク質を特定のゲノム標的部位にターゲティングするための適切なガイドRNAの配列は、本開示に基づいて当業者に明らかであろう。そのような適切なガイドRNA配列は、典型的には、編集される標的ヌクレオチドの50ヌクレオチド以内の上流または下流内の核酸配列に相補的なガイド配列を含む。提供された融合タンパク質のいずれかを特定の標的配列に標的化するのに適したいくつかの例示的なガイドRNA配列が本明細書に提供される。
［核酸を編集する方法］
本開示のいくつかの態様は、核酸を編集するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、核酸の核酸塩基（例えば二本鎖DNA配列の塩基対）を編集するための方法である。いくつかの実施形態において、本方法は、a) 核酸（例えば二本鎖DNA配列）の標的領域を、塩基エディター（例えばシチジンデアミナーゼおよびアデノシンデアミナーゼに融合されたCas9ドメイン）およびガイド核酸（例えばgRNA）を含む複合体と接触させ、ここで、標的領域は、標的核酸塩基対を含む、工程と、b) 前記標的領域の鎖分離を誘導する工程と、c) 標的領域の一本鎖における前記標的核酸塩基対の第一の核酸塩基を第二の核酸塩基に変換する工程と、d) 前記標的領域の、一本を超えない数の鎖を切断する工程とを含み、ここで、第一の核酸塩基に相補的な第三の核酸塩基が、第二の核酸塩基に相補的な第四の核酸塩基によって置き換えられる。ある実施形態において、本方法は、核酸において20%未満のインデル形成をもたらす。一部の実施形態では、工程bが省略されることが理解されるべきである。いくつかの実施形態において、本方法は、19%未満、18%未満、16%未満、14%未満、12%未満、10%未満、8%未満、6%未満、4%未満、2%未満、1%未満、0.5%未満、0.2%未満、または0.1%未満のインデル形成をもたらす。いくつかの実施態様において、本方法は、第二の核酸塩基を、第四の核酸塩基に相補的な第五の核酸塩基で置き換え、それによって意図された編集塩基対（例えばG・CからA・T）を生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、意図された塩基対の少なくとも5%が編集される。いくつかの実施形態では、意図された塩基対の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、または50%が編集される。
ある実施形態において、標的ヌクレオチドにおける意図された生成物対意図されない生成物の比は、少なくとも2:1、少なくとも5:1、少なくとも10:1、少なくとも20:1、少なくとも30:1、少なくとも40:1、少なくとも50:1、少なくとも60:1、少なくとも70:1、少なくとも80:1、少なくとも90:1、少なくとも100:1、もしくは少なくとも200:1、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、意図された突然変異対インデル形成の比は、1:1超、10:1超、50:1超、100:1超、500:1超、もしくは1000:1超、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、切断された一本鎖（ニック鎖）が、ガイド核酸にハイブリダイズされる。いくつかの実施態様において、切断された一本鎖は、第一の核酸塩基を含む鎖とは反対の鎖である。一部の実施形態では、塩基エディターはCas9ドメインを含む。いくつかの実施形態において、塩基エディターは、編集されていない鎖を保護または結合する。一部の実施形態では、塩基エディターはニッカーゼ活性を含む。いくつかの実施形態において、意図される編集塩基対は、PAM部位の上流にある。ある実施形態において、意図される編集塩基対は、PAM部位の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド上流である。いくつかの実施形態において、意図される編集塩基対は、PAM部位の下流にある。いくつかの実施形態において、意図される編集塩基対は、PAM部位の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド下流にある。いくつかの実施形態において、本方法は、正準（例えばNGG）PAMサイトを必要としない。一部の実施形態では、核酸塩基エディターはリンカーを含む。ある態様において、リンカーは、長さが1〜25アミノ酸である。ある態様において、リンカーは、長さが5〜20アミノ酸である。ある実施形態において、リンカーは、長さが10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸である。一実施形態において、リンカーは、長さが32アミノ酸である。別の実施形態では、「長いリンカー（long linker）」は、長さが少なくとも約60アミノ酸である。他の実施形態において、リンカーは、長さが約3〜100アミノ酸である。一部の実施形態では、標的領域は標的ウィンドウを含み、標的ウィンドウは標的核酸塩基対を含む。ある実施形態において、標的ウィンドウは、1〜10ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、標的ウィンドウは、長さが1〜9、1〜8、1〜7、1〜6、1〜5、1〜4、1〜3、1〜2、または1ヌクレオチドである。ある態様において、標的ウィンドウは、長さが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、意図される編集塩基対は、標的ウィンドウ内にある。いくつかの実施態様において、標的ウィンドウは、意図される編集塩基対を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかを用いて実施される。
いくつかの実施形態において、本開示は、ヌクレオチドを編集するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、二本鎖DNA配列の核酸塩基対を編集するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、a) 二本鎖DNA配列の標的領域を、塩基エディターおよびガイド核酸（例えばgRNA）を含む複合体と接触させ、ここで、標的領域が標的核酸塩基対を含む、工程と、b) 上記標的領域の鎖分離を誘導する工程と、c) 標的領域の一本鎖における前記標的核酸塩基対の第一の核酸塩基を第二の核酸塩基に変換する工程と、d) 前記標的領域の一本を超えない数の鎖を切断する工程と、を含み、ここで、第一の核酸塩基に相補的な第三の核酸塩基が、第二の核酸塩基に相補的な第四の核酸塩基によって置き換えられ、第二の核酸塩基が、第四の核酸塩基に相補的な第五の核酸塩基によって置き換えられ、それによって、意図された編集塩基対を生成し、ここで意図された塩基対を生成する効率は少なくとも5%である。一部の実施形態では、工程bは省略されることが理解されるべきである。いくつかの実施形態では、意図された塩基対の少なくとも5%が編集される。いくつかの実施形態では、意図された塩基対の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、または50%が編集される。いくつかの態様において、本方法は、19%未満、18%未満、16%未満、14%未満、12%未満、10%未満、8%未満、6%未満、4%未満、2%未満、1%未満、0.5%未満、0.2%未満、または0.1%未満のインデル形成を引き起こす。ある実施形態において、標的ヌクレオチドにおける意図された生成物対意図されない生成物の比は、少なくとも2:1、少なくとも5:1、少なくとも10:1、少なくとも20:1、少なくとも30:1、少なくとも40:1、少なくとも50:1、少なくとも60:1、少なくとも70:1、少なくとも80:1、少なくとも90:1、少なくとも100:1、もしくは少なくとも200:1、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、意図された突然変異対インデル形成の比は、1:1超、10:1超、50:1超、100:1超、500:1超、もしくは1000:1超、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、切断された一本鎖が、ガイド核酸にハイブリダイズされる。いくつかの実施態様において、切断された一本鎖は、第一の核酸塩基を含む鎖とは反対の鎖である。一部の実施形態では、核酸塩基エディターは、ニッカーゼ活性を含む。いくつかの実施形態において、意図される編集塩基対は、PAM部位の上流にある。ある実施形態において、意図される編集塩基対は、PAM部位の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド上流である。いくつかの実施形態において、意図される編集塩基対は、PAM部位の下流にある。いくつかの実施形態において、意図される編集塩基対は、PAM部位の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド下流にある。いくつかの実施形態において、本方法は、正準（例えばNGG）PAMサイトを必要としない。一部の実施形態では、核酸塩基エディターはリンカーを含む。ある態様において、リンカーは、長さが1〜25アミノ酸である。ある態様において、リンカーは、長さが5〜20アミノ酸である。ある実施形態において、リンカーは、長さが10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸である。一部の実施形態では、標的領域は標的ウィンドウを含み、標的ウィンドウは標的核酸塩基対を含む。ある実施形態において、標的ウィンドウは、1〜10ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、標的ウィンドウは、長さが1〜9、1〜8、1〜7、1〜6、1〜5、1〜4、1〜3、1〜2、または1ヌクレオチドである。ある態様において、標的ウィンドウは、長さが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、意図される編集塩基対は、標的ウィンドウ内で起こる。いくつかの実施態様において、標的ウィンドウは、意図される編集塩基対を含む。いくつかの実施形態において、核酸塩基エディターは、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかである。
［宿主細胞における融合タンパク質の発現］
本発明の融合タンパク質は、当業者に知られるルーチンの方法を用いて、細菌、酵母、真菌、昆虫、植物、および動物細胞を含むがこれらに限定されない実質的にあらゆる目的宿主細胞において発現され得る。核酸塩基修飾活性（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、DNAグリコシラーゼ）を有する一つ以上のドメインをコードする一つ以上のポリヌクレオチドを、napDNAbpをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結して、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製することにより、融合タンパク質が生成される。いくつかの実施形態において、napDNAbqをコードするポリヌクレオチド、および核酸塩基修飾活性を有するドメインをコードするDNAは、それぞれ、結合ドメインまたはその結合パートナーをコードするDNAと融合されてもよく、または、両方のDNAが、分離インテインをコードするDNAと融合されてもよく、それによって、核酸配列認識変換モジュールおよび核酸塩基変換酵素は、宿主細胞中で翻訳されて複合体を形成する。これらの場合、所望であれば、リンカーおよび/または核局在化シグナルがDNAの一方または両方の適切な位置に連結され得る。
本明細書中に記載されるタンパク質ドメインをコードするDNAは、例えばDNA鎖を化学的に合成することによる方法、PCRによる方法、またはGibsonアセンブリ法による方法など、当技術分野で公知の任意の方法によって得ることができる。化学合成またはPCR法の組み合わせまたはGibsonアセンブリ法によって全長DNAを構築する利点は、コドンを最適化して、融合タンパク質が宿主細胞において高レベルで発現されることを確実にできることである。最適化されたコドンは、上総DNA研究所のホームページに開示されている遺伝子コード使用頻度データベース（http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html）を用いて選択することができる。一旦得られれば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、適切な発現ベクターに組み込まれる。
適切な発現ベクターとしては、Escherichia coli由来プラスミド（例えばpBR322、pBR325、pUC12、pUC13）；Bacillus subtilis由来プラスミド（例えばpUB110、pTP5、pC194）；酵母由来のプラスミド（例えばpSH19、pSH15）；昆虫細胞での発現に適したプラスミド（例えばpFast-Bac）；哺乳動物細胞における発現に適したプラスミド（例えばpA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo）；そしてラムダファージなどのバクテリオファージが挙げられ、使用され得る他のベクターとしては、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター（例えばBmNPV、AcNPV）；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど、哺乳類細胞での発現に適したウイルスベクターが挙げられる。
ポリヌクレオチドをコードする融合タンパク質は、典型的には、所望の宿主細胞における発現のために有用な適切なプロモーターの制御下で発現される。例えば、宿主が動物細胞である場合には、SRアルファプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV (サイトメガロウイルス) プロモーター、RSV (ラウス肉腫ウイルス)プロモーター、MoMuLV (モロニーマウス白血病ウイルス) LTR、HSV-TK (単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ)プロモーター等が用いられる。一実施形態において、プロモーターはCMVプロモーターまたはSRアルファプロモーターである。宿主細胞が大腸菌である場合、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、ラムダPLプロモーター、lppプロモーター、T7プロモーター等のいずれかのプロモーターを使用することができる。宿主がバチルス属である場合、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等のいずれかのプロモーターを使用することができる。宿主が酵母の場合には、Gal1/10プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター等のいずれかのプロモーターを用いることができる。宿主が昆虫細胞である場合には、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーター等を用いてもよい。宿主が植物細胞である場合、CaMV35Sプロモーター、CaMV19Sプロモーター、NOSプロモーター等のいずれかのプロモーターを用いることができる。
所望であれば、発現ベクターは、エンハンサー、スプライシングシグナル、ターミネーター、ポリA付加シグナル、選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子等）、または複製起点のいずれか一つ以上も含む。
本明細書に記載されるタンパク質ドメインをコードするRNAは、例えば、インビトロ転写系においてmRNAを転写することによって調製することができる。
融合タンパク質をコードする発現ベクターを宿主細胞に導入し、該宿主細胞を培養することにより、本発明の融合タンパク質を発現させることができる。本発明において有用な宿主細胞としては、細菌細胞、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞などが挙げられる。
Escherichia属には、Escherichia coli K12.cndot.DH1［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)］、Escherichia coli JM103［Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)］、Escherichia coli JA221［Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)］、Escherichia coli HB101［Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)］、Escherichia coli C600［Genetics, 39, 440 (1954)］等が含まれる。
Bacillus属には、Bacillus subtilis M1114 [Gene, 24, 255 (1983)]、Bacillus subtilis 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] 等が含まれる。
本発明の融合タンパク質を発現するために有用な酵母としては、Saccharomyces cerevisiae AH22、AH22R.sup.-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12、Schizosaccharomyces pombe NCYC1913、NCYC2036、Pichia pastoris KM71等が用られる。
融合タンパク質は、例えばAcNPVのようなウイルスベクターを用いて昆虫細胞で発現される。昆虫宿主細胞としては、ヨトウガ幼虫由来樹立株（Spodoptera frugiperda細胞；SF細胞）、Trichoplusianiの中腸由来MG1細胞、High Five、Trichoplusianiの卵由来の細胞、Mamestra brassicae由来細胞、Estigmena acrea由来細胞等のいずれかの細胞株が用いられる。ウイルスがBmNPVの場合には、Bombyx mori由来株の細胞（Bombyx mori N 細胞；BmN細胞）等を用いる。Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞（ATCC CRL1711）、Sf 21細胞［上記すべて、In Vivo, 13, 213-217 (1977)］等が挙げられる。
昆虫に関しては、Bombyx moriの幼虫、Drosophila、コオロギなどを用いて融合タンパク質が発現される[Nature, 315,592 (1985)]。
融合タンパク質を発現するために哺乳動物細胞株が使用され得る。このような細胞株としては、サルCOS-7細胞、サルVero細胞、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞、dhfr遺伝子欠損CHO細胞、マウスL細胞、マウスAtT-20細胞、マウスミエローマ細胞、ラットGH3細胞、ヒトFL細胞などが挙げられる。ヒトその他の哺乳動物のiPS細胞、ES細胞などの多能性幹細胞、および種々の組織から調製された初代培養細胞が使用される。また、ゼブラフィッシュ胚、Xenopus卵母細胞などを用いることもできる。
当業者によく知られる方法を用いて植物細胞が培養物中に維持され得る。植物細胞培養には、様々な植物（例えば、イネ、コムギ、トウモロコシ、トマト、キュウリ、ナス、カーネーション、Eustoma russellianum、タバコ、Arabidopsis thaliana）から調製される、懸濁培養細胞、カルス、プロトプラスト、葉断片、根断片等が関わる。
上記の宿主細胞は全て、ハプロイド（一倍体）または倍数体（例えば二倍体、三倍体、四倍体など）であり得る。
本発明の融合タンパク質をコードする発現ベクターは、任意のトランスフェクション法を用いて宿主細胞に導入される（例えばリゾチーム、PEG、CaCl2共沈法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、粒子銃、リポフェクション、アグロバクテリウム等を使用して）。トランスフェクション方法は、トランスフェクションされるべき宿主細胞に基づいて選択される。Escherichia coliは、例えばProc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)、Gene, 17, 107 (1982)等に記載された方法に従って形質転換され得る。バチルス属で形質導入する方法は、例えば、Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979) に記載されている。
酵母細胞は、例えばMethods in Enzymology, 194, 182-187 (1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978) 等に記載された方法を用いて形質導入され得る。
昆虫細胞は、例えばBio/Technology, 6, 47-55 (1988)等に記載された方法を用いてトランスフェクトされる。
哺乳動物細胞は、例えば、Cell Engineering additional volume 8, New Cell Engineering Experiment Protocol, 263-267 (1995)（Shujunsha刊行）、およびVirology, 52, 456 (1973) に記載されている方法を用いてトランスフェクトされる。
本発明の発現ベクターを含む細胞は、宿主に応じて変わる公知の方法に従って培養される。
例えば、Escherichia coliまたはBacillus属細胞を培養する場合、液体培地が使用される。培地は、好ましくは、炭素源、窒素源、無機物質、および形質転換体の成長に必要な他の成分を含む。炭素源の例としては、グルコース、デキストリン、可溶性デンプン、スクロースなどが挙げられる。窒素源の例としては、アンモニウム塩、硝酸塩、コーンスティープリカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆ケーキ、ジャガイモエキス等のような無機又は有機物質が挙げられ、無機物質としては、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。培地はまた、酵母エキス、ビタミン、成長促進因子などを含有してもよい。培地のpHは好ましくは約5〜約8である。
Escherichia coliを培養するための培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むM 9培地が用いられる［Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972］。Escherichia coliは通常約15〜約43℃で培養される。必要に応じて曝気及び攪拌を行ってもよい。
Bacillus属は一般に約30〜約40°Cで培養する。必要に応じて曝気及び攪拌が行われる。
酵母の培養に適した培地の例としては、バークホルダー最少培地［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)］、0.5%カザミノ酸含有SD培地［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)］等が挙げられる。培地のpHは好ましくは約5〜約8である。培養は、一般に約20℃〜約35℃で行う。必要に応じて曝気及び攪拌を行ってもよい。
昆虫細胞や昆虫を培養するための培地としては、不活化10%ウシ血清の添加剤を含有するグレース昆虫培地（Nature, 195, 788 (1962)）等が用いられる。培地のpHは好ましくは約6.2〜約6.4である。細胞は約27℃で培養される。必要に応じて通気および撹拌を行ってもよい。
哺乳動物細胞は、例えば、約5〜約20%のウシ胎児血清を含有する最小必須培地 (MEM)（Science, 122, 501 (1952)）、Dulbecco改変イーグル培地 (DMEM)（Virology, 8, 396 (1959)）、RPMI 1640培地（The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)）、199培地（Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)）等のいずれかで培養される。培地のpHは好ましくは約6〜約8である。培養は、約30℃〜約40℃で行われる。必要に応じて通気および撹拌を行ってもよい。
植物細胞を培養するための培地としては、例えば、MS培地、LS培地、B5培地等が用いられる。培地のpHは好ましくは約5〜約8である。培養は、一般に約20℃〜約30℃で行われる。必要に応じて曝気及び攪拌を行ってもよい。
融合タンパク質の発現は、誘導性プロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター（重金属イオンによって誘導される）、熱ショックタンパク質プロモーター（熱ショックによって誘導される）、Tet-ON/Tet-OFF系プロモーター（テトラサイクリンまたはその誘導体の追加または除去によって誘導される）、ステロイド応答性プロモーター（ステロイドホルモンまたはその誘導体によって誘導される）等）を用いて調節することができ、誘導剤が適切な段階で培地に添加されて（または培地から除去されて）融合タンパク質の発現を誘導する。
大腸菌などの原核細胞は誘導プロモーターを利用することができる。誘導性プロモーターの例としては、lacプロモーター（IPTGによって誘導される）、cspAプロモーター（寒冷ショックによって誘導される）、araBADプロモーター（アラビノースによって誘導される）などが挙げられるが、これらに限定されない。
［送達システム］
本開示によるマルチエフェクター核酸塩基エディターをコードする核酸は、当技術分野で公知の方法により、または本明細書に記載されるように、対象に投与され得、または細胞に送達され得る。例えば、マルチエフェクター核酸塩基エディターは、例えばベクター（例えばウイルス性または非ウイルス性ベクター）、ベクターに基づかない方法（例えば、裸のDNAまたはDNA複合体の使用）、またはそれらの組合せによって送達することができる。
本願明細書に開示されるマルチエフェクター核酸塩基エディターは、ウイルスベクターに含まれる核酸上にコードされ得る。例示的なウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター（例えばMaloneyマウス白血病ウイルス、MML-V）、アデノウイルスベクター（例えばAD100）、レンチウイルスベクター（例えば、HIVおよびFIVベースのベクター）、ヘルペスウイルスベクター（例えばHSV-2）、およびアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。
［アデノ随伴ウイルスベクター (AAV)］
アデノ随伴ウイルス (「AAV」) ベクターは、標的核酸で細胞を形質導入するために使用することもでき、例えば、核酸およびペプチドのインビトロでの産生において、ならびにインビボおよびエクスビボでの遺伝子治療手順のために使用され得る（例えば、West et al., Virology 160:38-47 (1987); U.S. Patent No. 4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)）。組換えAAVベクターの構築は、米国特許第5,173,414号；Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); および Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989)を含む多くの刊行物に記載されている。
in vivo送達に関して、AAVは他のウイルスベクターよりも有利であり得る。いくつかの実施形態では、AAVベクターは低い毒性を有する。毒性は、免疫応答を活性化させ得る細胞粒子の超遠心分離を精製方法が必要としない場合に起こり得る。ある実施形態では、AAVベクターは、宿主ゲノムに組み込まれないため、挿入突然変異を引き起こす確率の低さを有する。
AAVはパルボウイルスファミリーに属する小さな一本鎖DNA依存性ウイルスである。4.7 kbの野生型 (wt) AAVゲノムは、それぞれ四つの複製タンパク質および三つのキャプシドタンパク質をコードする二つの遺伝子からなり、両側に145 bpの逆方向末端反復配列 (ITR) がある。ビリオンは三つのキャプシドタンパク質Vp1、Vp2およびVp3から成り、これらは同じオープンリーディングフレームから1:1:10比で産生されるが、異なるスプライシング (Vp1) および選択的翻訳開始部位(Vp2とVp3のそれぞれ)から産生される。Vp3はビリオン中に最も豊富に存在するサブユニットであり、細胞表面での受容体認識に関与し、それによってウイルスの指向性を規定する。ウイルス感染性に寄与するホスホリパーゼドメインがVp1のユニークなN末端に同定されている。
AAVのパッケージング限界は4.5または4.75 Kbである。従って、開示されたマルチエフェクター核酸塩基エディター並びにプロモーター及び転写ターミネーターは、単一のウイルスベクターに収容することができる。4.5 Kbまたは4.75 Kbを超える構築物は、ウイルス産生を有意に減少させ得る。例えば、SpCas9は非常に大きく、遺伝子自体が4.1 Kbを超え、AAVに詰め込むことが困難であるため、本開示の実施形態は、従来の塩基エディターよりも短い長さの開示された塩基エディターを利用することを含む。いくつかの例では、塩基エディターは4 kb未満である。開示される塩基エディターは、4.5 kb、4.4 kb、4.3 kb、4.2 kb、4.1 kb、4 kb、3.9 kb、3.8 kb、3.7 kb、3.6 kb、3.5 kb、3.4 kb、3.3 kb、3.2 kb、3.1 kb、3 kb、2.9 kb、2.8 kb、2.7 kb、2.6 kb、2.5 kb、2 kb、または1.5 kb未満であり得る。いくつかの実施形態において、開示された塩基エディターは、長さが4.5 kb以下である。
AAVは、AAV1、AAV2、AAV5、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。標的とする細胞に関してAAVのタイプを選択することができる。例えば、AAV血清型1、2、5またはハイブリッドキャプシドAAV1、AAV2、AAV5またはそれらの任意の組合せを選択して、脳または神経細胞を標的化することができる；また、心臓組織を標的とするAAV4を選択することができる。AAV8は肝臓への送達に有用である。これらの細胞に関する特定のAAV血清型の表は、Grimm, D. et al, J. Virol. 82: 5887-5911 (2008)に見出され得る。
組換えAAV (rAAV) は、wt AAVと同様に、ベクター導入遺伝子カセットを挟むシス作用性145 bp ITRを利用し、外来DNAのパッケージングのために最大4.5 kbを提供する。感染後、rAAVは本発明の融合タンパク質を発現することができ、環状の頭・尾コンカテマーの状態のエピソームとして存在することにより、宿主ゲノムに組み込まれることなく存続することができる。このシステムを用いたrAAVの成功例は数多くあるが、in vitroおよびin vivoでは、パッケージング能力が限られているため、遺伝子のコード配列の長さがwt AAVゲノムの長さ以上である場合にAAV媒介遺伝子送達の使用が制限されている。
AAVベクターの小さいパッケージング能力は、このサイズを超える多数の遺伝子の送達および/または大きな生理学的調節エレメントの使用を困難にする。これらの課題は、例えば、送達されるタンパク質を2つ以上の断片に分割することによって（例えば分割インテイン系を使用して）、対処することができる。
［インテイン］
インテイン（介在タンパク質）は、多種多様な生物に見出される自己プロセシングドメインであり、タンパク質スプライシングとして知られるプロセスを行うものである。タンパク質スプライシングは、ペプチド結合の切断と形成の両方からなる多段階の生化学的反応である。タンパク質スプライシングの内因性基質は、インテインを含む生物に見出されるタンパク質であるが、インテインはまた、実質的にあらゆるポリペプチド骨格を化学的に操作するために使用することもできる。
タンパク質スプライシングでは、インテインは、二つのペプチド結合を切断することによって一前駆体ポリペプチドから自身を切り出し、それによって、隣接するエクステイン（外部タンパク質）配列を、新しいペプチド結合の形成を介して連結する。この転位は翻訳後に起こる（翻訳と同時に起こる可能性もある）。インテイン媒介性タンパク質スプライシングは自発的に起こり、インテインドメインの折りたたみだけを必要とする。
インテインの約5%が分割インテインであり、これらはN-インテインとC-インテインという二つの別々のポリペプチドとして転写され翻訳され、その各々が一つのエクステインに融合している。翻訳の際に、インテイン断片は、自発的にかつ非共有結合的に標準インテイン構造へとアセンブルし、トランスにタンパク質スプライシングを行う。タンパク質スプライシングの機序には一連のアシル転移反応が関わっており、これが、インテイン-エキステイン接合部における2つのペプチド結合の切断と、N-エキステインとC-エキステインの間の新しいペプチド結合の形成とをもたらす。このプロセスは、N‐エクステインとインテインのN‐末端とを繋げるペプチド結合の活性化によって開始される。事実上すべてのインテインは、N末端にシステインまたはセリンを有し、これがN-エクステインのC末端残基のカルボニル炭素を攻撃する。このNからO/Sへのアシル基の移動は、保存されたトレオニンとヒスチジン（TXXHモチーフと呼ばれる）、および一般的に見出されるアスパラギン酸によって促進され、直鎖状 (チオ)エステル中間体の形成をもたらす。次に、この中間体は、システイン、セリン、またはトレオニンであるC-エクステインの最初の残基 (+1) の求核攻撃によってトランス-(チオ)エステル化される。生成した分枝 (チオ)エステル中間体は、インテインの高度に保存されたC末端アスパラギンの環化というユニークな変換によって、解消される。この過程は、ヒスチジン（高度に保存されたHNFモチーフに見出されるもの）と最後から2番目のヒスチジンによって促進され、アスパラギン酸も関与し得る。このスクシンイミド生成反応は、反応複合体からインテインを切除し、非ペプチド結合を介して結合されたエクステインを残す。この構造は、インテイン非依存的態様で迅速に転位し、安定なペプチド結合になる。
いくつかの実施形態では、塩基エディター（例えばABE、CBE）のN末端断片が分割インテイン-Nに融合され、C末端断片が分割インテイン-Cに融合される。そしてこれらの断片を2つ以上のAAVベクターにパッケージングする。異種タンパク質断片を連結するための特定のインテインの使用は、例えば、Wood et al., J. Biol. Chem. 289(21); 14512-9 (2014)に記載されている。例えば、インテインIntNおよびIntCは、別々のタンパク質断片に融合された場合、互いを認識して、自身をスプライスして排出し、それと同時に、融合している上記タンパク質断片の隣接するN-およびC-末端エクステインをライゲートして、それによってそれによって2つのタンパク質断片から完全長タンパク質を再構成する。他の適切なインテインは当業者に明らかであろう。
ABE融合タンパク質がSpCas9の選択された領域内のAla、Ser、ThrまたはCys残基でN-およびC-末端断片に分割されるように、spCas9の3つの領域を選択した。これらの領域は、Cas9結晶構造解析により同定されたループ領域に対応する。各断片のN-末端をインテイン-Nに融合させ、各断片のC-末端を、アミノ酸位置S303、T310、T313、S355、A456、S460、A463、T466、S469、T472、T474、C574、S577、A589、およびS590（下記配列で太字の大文字で示されている）においてインテインCに融合させた。
Figure 2021532794
本発明の融合タンパク質の断片は、長さを変えることができる。ある態様において、タンパク質断片は、長さが2アミノ酸〜約1000アミノ酸の範囲である。ある態様において、タンパク質断片は、長さが約5アミノ酸〜約500アミノ酸の範囲である。ある態様において、タンパク質断片は、長さが約20アミノ酸〜約200アミノ酸の範囲である。ある態様において、タンパク質断片は、長さが約10アミノ酸〜約100アミノ酸の範囲である。他の長さの適切なタンパク質断片は、当業者には明らかであろう。
ある態様において、ヌクレアーゼ(例えばCas9)の一部または断片は、インテインに融合される。ヌクレアーゼは、インテインのN末端またはC末端に融合され得る。ある態様において、融合タンパク質の一部または断片は、インテインに融合され、AAVキャプシドタンパク質に融合される。インテイン、ヌクレアーゼおよびキャプシドタンパク質は、任意の配置(例えば、ヌクレアーゼ-インテイン-キャプシド、インテイン-ヌクレアーゼ-キャプシド、キャプシド-インテイン-ヌクレアーゼなど)で一緒に融合され得る。いくつかの実施形態において、インテインのN末端は融合タンパク質のC末端に融合され、インテインのC末端はAAVキャプシドタンパク質のN末端に融合される。
一実施形態では、大きな導入遺伝子発現カセットを二つの別々の半分(5’および3’末端、またはヘッドおよびテール)に分割することによって二重AAVベクターが生成され、カセットの各半分が単一のAAVベクター(5 kb未満)内にパッケージングされる。次いで、両方の二重AAVベクターによる同一細胞の同時感染に続いて、(1) 5’および3’ゲノム（二重AAV重複ベクター）間の相同組換え (HR)；(2) ITRを介した5′及び3′ゲノム(二重AAVトランススプライシングベクター)の尾・頭コンカテマー化；または (3) それら二つのメカニズムの組み合わせ(二重AAVハイブリッドベクター)により、完全長トランスジーン発現カセットの再構築が達成される。in vivoでの二重AAVベクターの使用は完全長タンパク質の発現をもたらす。二重AAVベクタープラットフォームの使用は、>4.7 kbの大きさの導入遺伝子のための効率的で実行可能な遺伝子導入戦略を表す。
［他のウイルスベクター］
塩基エディターの送達のためのRNAまたはDNAウイルスベースのシステムの使用は、培養中または宿主中の特定の細胞にウイルスをターゲティングし、ウイルスの積荷を核または宿主細胞ゲノムに輸送する、高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、培養中の細胞、患者に直接投与することができ(in vivo)、またはそれらを用いて細胞をin vitroで処理し得、改変された細胞を任意で患者に投与することができる(ex vivo)。従来のウイルスベースのシステムは、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴及び単純ヘルペスウイルスベクターを含み得る。レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスの遺伝子導入法では、宿主ゲノムへの組み込みが可能であり、しばしば挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、多くの異なる細胞型および標的組織において高い形質導入効率が観察されている。
塩基エディターを設計するための開示された戦略は、ウイルスベクターにパッケージングされることができる塩基エディターを生成するために有用となり得る。塩基エディターの送達のためのRNAまたはDNAウイルスベースのシステムの使用は、培養中または宿主中の特定の細胞にウイルスをターゲティングし、ウイルスのペイロードを核または宿主細胞ゲノムに輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、培養中の細胞、患者（in vivo）に直接投与することができ、または、それらを用いて細胞をインビトロで処理することができ、その改変された細胞を任意で患者に投与することができる（ex vivo）。従来のウイルスベースのシステムは、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴及び単純ヘルペスウイルスベクターを含むことができる。レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスの遺伝子導入法では、宿主ゲノムへの組み込みが可能であり、挿入された導入遺伝子の長期発現を多くの場合もたらす。さらに、多くの異なる細胞型および標的組織において高い形質導入効率が観察されている。
レトロウイルスの指向性は、外来のエンベロープタンパク質を組み込み、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することによって変化させることができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染させることができ、典型的には高いウイルス力価を産生するレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルス遺伝子導入系の選択は標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、6〜10 kbまでの外来配列のパッケージング能力を有するシス作用性の長い末端反復から構成される。最小シス作用性LTRは、ベクターの複製およびパッケージングのために十分であり、次いでそれを用いて治療遺伝子が標的細胞に組み込まれ、永続的な導入遺伝子発現が提供される。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス (MuLV) 、テナガザル白血病ウイルス (GaLV) 、サル免疫不全ウイルス (SIV) 、ヒト免疫不全ウイルス (HIV) 、およびそれらの組み合わせに基づくものが含まれる(例えばBuchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommnerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700参照)。
レトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターは、標的細胞への効率的な組み込みのために所定の長さより小さいポリヌクレオチド配列を必要とし得る。例えば、9 kbを超える長さのレトロウイルスベクターは、より小さいサイズのものと比較して低いウイルス力価をもたらし得る。いくつかの態様において、本開示の塩基エディターは、レトロウイルスベクターを介して効率的なパッケージングおよび標的細胞への送達を可能にするのに十分なサイズである。場合によっては、塩基エディターは、ガイド核酸および/またはターゲティング可能なヌクレアーゼ系の他の成分と共に発現された場合でも、効率的なパッキングおよび送達を可能にするサイズである。
一過性発現が好ましい用途では、アデノウイルスベースのシステムを使用することができる。アデノウイルスベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。このようなベクターでは、高い力価および発現レベルが得られている。このベクターは比較的簡単な系で大量に生成できる。アデノ随伴ウイルス（「AAV」）ベクターもまた、例えば核酸およびペプチドのインビトロ生成において、ならびにインビボおよびエクスビボの遺伝子治療手順のために、標的核酸で細胞を形質導入することに使用され得る（例えば、West et al., Virology 160:38-47 (1987); 米国特許第4,797,368号; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)を参照）。組換えAAVベクターの構築は、
米国特許第5,173,414号; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); およびSamulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989)を含む多くの刊行物に記載されている。
従って、本明細書に記載されるマルチエフェクター核酸塩基エディターは、ウイルスベクターを用いて送達され得る。塩基エディターシステムの1つ以上のコンポーネントは、1つ以上のウイルスベクター上にコードされ得る。例えば、塩基エディターおよびガイド核酸が、単一のウイルスベクター上にコードされ得る。他の場合には、塩基エディターおよびガイド核酸は、異なるウイルスベクター上にコードされる。いずれの場合にも、塩基エディターおよびガイド核酸は、各々、プロモーターおよびターミネーターに作動可能に連結され得る。
ウイルスベクター上にコードされる成分の組み合わせは、選択されたウイルスベクターのカーゴサイズ制約によって決定され得る。
任意の適切なプロモーターを使用して、塩基エディターおよび、適当な場合には、ガイドポリヌクレオチドの発現を誘導することができる。遍在性発現のために使用することができるプロモーターとしては、CMV、CAG、CBh、PGK、SV40、フェリチン重鎖または軽鎖などのプロモーターが挙げられる。脳または他のCNS細胞での発現については、適切なプロモーターとしては、全てのニューロンについてのシナプシンI、興奮性ニューロンについてのCaMKIIαプロモーター、GABA作動性ニューロンについてのGAD67もしくはGAD65またはVGATなどのプロモーターが挙げられ得る。肝細胞での発現については、適切なプロモーターとしては、アルブミンプロモーターが挙げられる。肺細胞の発現については、適切なプロモーターはSP-Bプロモーターを含むことができ、内皮細胞については、適切なプロモーターはICAMプロモーターを含むことができ、造血細胞については、適切なプロモーターはIFNβまたはCD45プロモーターを含むことができる。骨芽細胞については、適当なプロモーターにはOG-2プロモーターが含まれ得る。
核酸分子発現をコードする塩基エディターを駆動するために使用されるプロモーターは、AAV ITRを含み得る。これは、ベクター中のスペースを占領してしまい得るさらなるプロモーター要素の必要性を排除するために有利であり得る。解放された追加のスペースは、ガイド核酸または選択マーカーなどの追加のエレメントの発現を駆動するために使用することができる。ITR活性は比較的弱いので、これは選択したヌクレアーゼの過剰発現による潜在的毒性を低減するために使用できる。
いくつかの実施形態において、本開示の塩基エディターは、同じ核酸分子内で別々のプロモーターが塩基エディターおよび適合性ガイドポリヌクレオチドの発現を駆動することを可能にするのに十分な大きさである。例えば、ベクターまたはウイルスベクターは、塩基エディターをコードする核酸に作動可能に連結された第1のプロモーター、およびガイド核酸に作動可能に連結された第2のプロモーターを含むことができる。
ガイドポリヌクレオチドの発現を駆動するために使用されるプロモーターには、U6またはH1などのPol IIIプロモーター、ならびにgRNAアデノ随伴ウイルス (AAV) を発現するためのPol IIプロモーターとイントロンのカセットの使用が含まれ得る。
一以上のガイド核酸を伴うまたは伴わない本明細書に記載されるマルチエフェクター核酸塩基エディターは、アデノ随伴ウイルス (AAV) 、レンチウイルス、アデノウイルス、または他のプラスミドもしくはウイルスベクター型を用いて、特に、例えば、米国特許第8,454,972号(アデノウイルスの製剤、用量)、米国特許第8,404,658号(AAVの製剤、用量)、米国特許第5,846,946号(DNAプラスミドの製剤、用量)からの製剤および用量、ならびにレンチウイルス、AAVおよびアデノウイルスが関わる臨床試験およびそれに関する出版物からの製剤および用量を用いて送達することができる。例えば、AAVについては、投与経路、製剤化および用量は、米国特許第8,454,972号およびAAVが関わる臨床試験におけるようにすることができる。アデノウイルスについては、投与経路、製剤化および用量は、米国特許第8,404,658号およびアデノウイルスが関わる臨床試験におけるようにすることができる。プラスミド送達については、投与経路、処方および用量は、米国特許第5,846,946号およびプラスミドが関わる臨床試験におけるようにすることができる。投与量は平均的な70 kgの個体(例えば成人男性)に基づいて算出するか、またはそれに外挿することができ、患者、被験者、体重および動物種の異なる哺乳動物について調整することができる。投与の頻度は、年齢、性別、全般的な健康状態、患者又は対象の他の状態及び対処される特定の状態又は症状を含む通常の要因に依存して、医学又は獣医学の実施者(例えば医師、獣医師)の技量の範囲内である。ウイルスベクターを対象組織に注射することができる。細胞型特異的塩基編集のために、塩基エディターおよび任意のガイド核酸の発現を、細胞型特異的プロモーターによって駆動し得る。
レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、有糸分裂細胞と有糸分裂後細胞の両方に感染してその遺伝子を発現する能力をもつ。最も一般的に知られているレンチウイルスはヒト免疫不全ウイルス (HIV) であり、これは広範囲の細胞型を標的とするために他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を使用する。
レンチウイルスは以下のように調製できる。レンチウイルス伝達プラスミド骨格を含むpCasES 10 (をクローニングした後、低継代(p=5)のHEK293FTを、T-75フラスコ中に播種し、抗生物質なしで、10%ウシ胎児血清を含むDMEM中でトランスフェクションの前日に50%コンフルエンスにする。20時間後、培地をOptiMEM (無血清) 培地に変え、トランスフェクションを4時間後に行う。10μgのレンチウイルストランスファープラスミド (pCasES 10) および以下のパッケージングプラスミド：5μgのpMD2.G (VSV-g偽型)および7.5μgのpsPAX2 (gag/pol/rev/tat) で細胞をトランスフェクトする。トランスフェクションは4 mlのOptiMEM中でカチオン性脂質送達剤(50μlのリポフェクタミン2000および100μlのプラス試薬)を用いて行うことができる。6時間後、培地を10%ウシ胎児血清を含む抗生物質不含DMEMに変更する。これらの方法は細胞培養中に血清を用いるが、無血清法が好ましい。レンチウイルスは以下のように精製できる。ウイルス上清を48時間後に回収する。上清をまずデブリから除去し、0.45μm低タンパク質結合 (PVDF) フィルターを通して濾過する。次いで、これらを24,000 rpmで2時間超遠心機で遠心する。ウイルスペレットを50μlのDMEM中に4℃で一晩再懸濁する。次いでそれらを等分し、直ちに-80℃で凍結する。
別の実施形態では、ウマ伝染性貧血ウイルス (EIAV) に基づく最小の非霊長類レンチウイルスベクターも考えられる。別の実施形態では、血管静止タンパク質エンドスタチンおよびアンジオスタチンを発現するウマ感染性貧血ウイルスに基づくレンチウイルス遺伝子治療ベクター、RETINOSTAT（登録商標）を、網膜下注射を介して送達することが考えられる。別の実施形態では、自己不活化レンチウイルスベクターの使用が考えられる。
あらゆるガイドポリヌクレオチド、または塩基エディターをコードするポリヌクレオチドを、RNAの形態で細胞に送達することができる。塩基エディターをコードするmRNAは、インビトロ転写により生成することができる。例えば、ヌクレアーゼmRNAは、以下の要素を含むPCRカセットを用いて合成することができる：T7プロモーター、任意でコザック配列 (GCCACC) 、ヌクレアーゼ配列、およびβグロビン-ポリAテールからの3’UTRのような3’UTR。このカセットは、T7ポリメラーゼにより転写され得る。ガイドポリヌクレオチド(例えばgRNA)もまた、インビトロ転写を用いて、T7プロモーター、次いで配列「GG」、およびガイドポリヌクレオチド配列を含有するカセットから転写され得る。
発現を増強し、毒性の可能性を低減するために、塩基エディターコード配列および/またはガイド核酸は、1以上の修飾ヌクレオシド（例えば擬似Uまたは5-メチル-C）を含むように修飾され得る。
本開示はいくつかの態様において、細胞または生物を改変する方法を含む。細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。細胞は哺乳動物細胞であり得る。哺乳動物細胞は、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、齧歯類またはマウス細胞であり得る。本開示の塩基エディター、組成物および方法によって細胞に導入される改変は、細胞および細胞の子孫が、抗体、澱粉、アルコールまたは他の所望の細胞アウトプットなどの生物学的産物の生産を改善するために改変されるようなものであり得る。本開示の方法によって細胞に導入される改変は、細胞およびその子孫が、産生される生物学的産物を変化させる改変を含むようなものであり得る。
システムは、1つまたは複数の異なるベクターを含むことができる。一態様では、塩基エディターは、所望の細胞型における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、例えば哺乳類細胞またはヒト細胞のような真核細胞において発現される。
一般に、コドン最適化とは、目的の宿主細胞における発現を増強するために、天然配列の少なくとも一つのコドン(例えば約1個、2個、3個、4個、5個、10個、15個、20個、25個、50個以上のコドン)を、天然アミノ酸配列を維持しながら、その宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置換することによって、核酸配列を改変するプロセスをいう。様々な種は特定のアミノ酸の特定のコドンについて偏りを示す。コドンバイアス(生物間のコドン利用の違い)は、メッセンジャーRNA (mRNA) の翻訳効率としばしば相関し、それは特に、翻訳されるコドンの性質および特定のトランスファーRNA (tRNA) 分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞内の選択されたtRNAの優位性は、一般にペプチド合成で最も頻繁に使われるコドンを反映している。従って、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現に合わせて調整することができる。コドン使用表は、例えば、「コドン使用データベース」www.kazusa.orjp/codon/ (2002年7月9日に訪問した)で容易に入手可能であり、これらの表は、多くの方法で適合させることができる。Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)参照。例えばGene Forge (Aptagen; Jacobus, Pa.)のような、特定の宿主細胞における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも利用可能である。ある態様において、操作されたヌクレアーゼをコードする配列中の一つ以上のコドン(例えば1、2、3、4、5、10、15、20、25、50以上、または全てのコドン)は、特定のアミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンに対応する。
パッケージング細胞は、典型的には、宿主細胞に感染し得るウイルス粒子を形成するために使用される。そのような細胞は、アデノウイルスをパッケージングする293細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするpsi.2細胞またはPA317細胞を含む。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージする細胞株を作製することによって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主への組み込みに必要な最小のウイルス配列を含み、他のウイルス配列は、発現されるべきポリヌクレオチドのための発現カセットによって置き換えられる。欠けているウイルス機能は、典型的にはパッケージング細胞株によってトランスに供給される。例えば、遺伝子治療に使用されるAAVベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組み込みに必要なAAVゲノムからのITR配列のみを有する。ウイルスDNAは、他のAAV遺伝子、すなわちrepおよびcapをコードするがITR配列を欠くヘルパープラスミドを含む細胞株においてパッケージングされ得る。細胞株は、ヘルパーとしてのアデノウイルスによっても感染され得る。ヘルパーウイルスは、AAVベクターの複製およびヘルパープラスミドからのAAV遺伝子の発現を促進することができる。ある実施形態では、ヘルパープラスミドは、ITR配列の欠如のために、有意な量ではパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えばAAVよりもアデノウイルスの方が感受性である熱処理によって減少させることができる。
［塩基エディターの非ウイルス性送達］
マルチエフェクター核酸塩基エディターをコードする核酸は、例えばトランスフェクションもしくはエレクトロポレーションによって、裸のDNAもしくはRNAとして細胞に直接送達することができ、または、標的細胞による取り込みを促進する分子（例えばN-アセチルガラクトサミン）に結合させることができる。ベクターなどの核酸ベクターも使用できる。
核酸ベクターは、本明細書中に記載される融合タンパク質のドメインをコードする1以上の配列を含むことができる。ベクターはまた、タンパク質をコードする配列に付随する（例えば、挿入されているか、融合されている）シグナルペプチド（例えば、核局在化、核小体局在化、またはミトコンドリア局在化のためのもの）をコードする配列も含むことができる。一例として、核酸ベクターは、一つ以上の核局在化配列（例えばSV40からの核局在化配列）を含むCas9コード配列と、一つ以上のデアミナーゼを含むことができる。
核酸ベクターはまた、任意の適切な数の調節/制御エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、Kozakコンセンサス配列、または内部リボソームエントリー部位 (IRES) を含むことができる。これらのエレメントは当技術分野でよく知られている。
本開示による核酸ベクターは、組換えウイルスベクターを含む。例示的なウイルスベクターは、本明細書中で上記した。当技術分野で知られる他のウイルスベクターも使用することができる。さらに、ウイルス粒子を用いて、核酸および/またはペプチドの形態のゲノム編集システム成分を送達することができる。例えば、「空の」ウイルス粒子は、任意の適切なカーゴを含有するようにアセンブルされ得る。ウイルスベクターおよびウイルス粒子はまた、標的化リガンドを組み込んで標的組織特異性を変化させるように操作することができる。
ウイルス性ベクターに加えて、開示された塩基エディターのために非ウイルス性送達アプローチも利用可能である。非ウイルス性核酸送達の1つの重要なカテゴリーは、有機または無機であり得るナノ粒子のものである。ナノ粒子は当技術分野でよく知られており、任意の適切なナノ粒子設計を用いて、ゲノム編集システム構成要素またはそのような構成要素をコードする核酸を送達することができる。例えば、有機（例えば、脂質および/またはポリマー）ナノ粒子が、本開示の特定の実施形態における送達ビヒクルとして使用され得る。ナノ粒子製剤、および/または遺伝子導入において使用するための例示的な脂質を、下記表7に示す。
Figure 2021532794
下記表8は、遺伝子導入および/またはナノ粒子製剤における使用のための例示的ポリマーを列挙する。
Figure 2021532794
表9は、本明細書で記述される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのための送達法を要約する。
Figure 2021532794
別の局面において、例えばマルチプレックス塩基エディターおよび／またはCas9もしくはそのバリアントなどの核酸結合タンパク質および目的のゲノム核酸配列を標的とするgRNAのような、塩基編集システム構成要素またはそのような構成要素をコードする核酸の送達は、リボ核タンパク質 (RNP) を細胞に送達することによって達成され得る。RNPは、標的化gRNAと複合体を形成した核酸結合タンパク質、例えば、Cas9を含む。RNPは、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、またはカチオン性脂質媒介方法、例えば、Zuris, J.A. et al., 2015, Nat. Biotechnology, 33(1):73-80によって報告されているもののような、公知の方法を用いて細胞に送達することができる。RNPは、CRISPR塩基編集システムにおける使用のために有利であり、特に一次細胞のようなトランスフェクトが困難な細胞のために有利である。さらに、RNPは、細胞におけるタンパク質発現で起こり得る困難を軽減することもでき、特に、CRISPRプラスミドにおいて使用され得るCMVまたはEF1Aなどの真核生物プロモーターがよく発現されない場合にはそうである。有利なことに、RNPの使用は、細胞への外来DNAの送達を必要としない。さらに、核酸結合タンパク質およびgRNA複合体を含むRNPは、経時的に分解されるので、RNPの使用は、オフターゲット効果を制限する可能性を有する。プラスミドベースの技術の場合と同様の方法で、RNPは、結合タンパク質(例えばCas9バリアント)を送達するために、そして相同性依存修復（HDR）を導くために使用され得る。
［マルチエフェクター核酸塩基エディターのスクリーニング］
候補マルチエフェクター核酸塩基エディターの適合性を、様々なスクリーニングアプローチで評価することができる。試験される各融合タンパク質が、レポーター（例えばGFP）をコードする少量のベクターと共に目的の細胞にトランスフェクトされる。予備実験において、これらの細胞を293T、K562またはU20Sなどのヒト細胞株中で不死化することができる。あるいは、一次ヒト細胞を使用してもよい。この場合、細胞は、最終的な治療細胞標的に関連したものであり得る。
トランスフェクションは、脂質トランスフェクション(LipofectamineやFugeneなど)を用いて、またはエレクトロポレーションによって実施することができる。トランスフェクション後、GFPの発現を蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーのいずれかによって測定して、一貫した高レベルのトランスフェクションを確認することができる。最も高い活性を与えるエディターの組み合わせを決定するために、これらの予備的なトランスフェクションは異なる複数の核酸塩基エディターを含むことができる。
核酸塩基エディターの活性は、本明細書に記載のように、すなわち細胞のゲノムを配列決定して標的配列の変化を検出することによって評価される。サンガー配列決定のためには、精製されたPCRアンプリコンをプラスミド骨格中にクローン化し、形質転換し、ミニプレップし、単一のプライマーで配列決定する。配列決定はまた、次世代配列決定技術を用いて実施されてもよい。次世代配列決定を使用する場合、アンプリコンは、意図された切断部位が非対称に配置された300〜500 bpであり得る。PCRに続いて、次世代配列決定のアダプターおよびバーコード(たとえば、Illumina multiplexアダプターとインデックス)をアンプリコンの末端に付加し得る（例えば高スループット配列決定(例えばIllumina MiSeq上でのもの)で使用するために）。
最初の試験で最大レベルの標的特異的改変を誘導する融合タンパク質を、さらなる評価のために選択し得る。
［マルチエフェクター核酸塩基エディターのアプリケーション］
マルチエフェクター核酸塩基エディターを用いて、目的のポリヌクレオチドを標的とし、タンパク質発現を改変する変化を作り出すことができる。一実施形態では、マルチエフェクター核酸塩基エディターは、スプライス部位、エンハンサー、および転写調節エレメントを含むがこれらに限定されない非コード配列または調節配列を改変するために使用される。次いで、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて、その調節エレメントによって制御される遺伝子の発現に対する当該改変の影響をアッセイする。特定の実施形態において、マルチエフェクター核酸塩基エディターは、調節配列を実質的に変化させて、それによって、遺伝子発現を調節するその能力を消失させることができる。有利なことに、これは、他のRNAプログラミング可能ヌクレアーゼとは対照的に、ゲノム標的配列に二本鎖切断を生じることなく行うことができる。
マルチエフェクター核酸塩基エディターを用いて、目的のポリヌクレオチドを標的とし、タンパク質活性を改変する変化を作り出すことができる。例えば、突然変異誘発の文脈において、マルチエフェクター核酸塩基エディターは、エラープローンPCRおよび他のポリメラーゼベースの方法と比べて多くの利点を有する。本発明のマルチエフェクター核酸塩基エディターは、標的領域内の複数の塩基に変化を生じるので、そのような変異は、エラープローンPCRによって導入される変異と比較して、タンパク質レベルで発現される可能性がより高い。エラープローンPCRによって導入される変異は、コドン中の単一ヌクレオチド変化が依然として同じアミノ酸をコードし得ること（コドンの縮重のため）を考慮すると、タンパク質レベルで発現される可能性がより低い。ポリヌクレオチド全体にわたってランダムな変化を誘導するエラープローンPCRとは異なり、本発明のマルチエフェクター核酸塩基エディターは、対象タンパク質の小さな領域または限定された領域内の特定のアミノ酸を標的化するために使用できる。
他の実施形態において、本発明のマルチエフェクター核酸塩基エディターは、生物のゲノム内の目的のポリヌクレオチドを標的化するために使用される。一実施形態において、生物は、微生物叢の細菌（例えばBacteriodetes、Verrucomicrobia、Firmicutes；ガンマプロテオバクテリア、アルファプロテオバクテリア、Bacteriodetes、Clostridia、Erysipelotrichia、Bacilli；Enterobacteriales、Bacteriodales、Verrucomicrobiales、Clostridiales、Erysiopelotrichales、Lactobacillales；Enterobacteriaceae、Bacteroidaceae、Erysiopelotrichaceae、Prevotellaceae、Coriobacteriaceae、およびAlcaligenaceae；Escherichia、Bacteroides、Alistipes、Akkermansia、Clostridium、Lactobacillus）である。別の実施形態では、生物は農業上重要な動物（例えば牛、羊、山羊、馬、鶏、七面鳥）または植物（例えば大豆、小麦、トウモロコシ、米、タバコ、リンゴ、ブドウ、モモ、プラム、チェリー）である。1つの実施形態において、本発明のマルチエフェクター核酸塩基エディターは、細胞のゲノム内の種々の配列を標的化するために使用されるガイドRNAのライブラリーと共に細胞に送達され、それによってゲノム全体の配列を系統的に変化させる。1つの実施形態において、本発明のマルチエフェクター核酸塩基エディターは、細胞のゲノム内の種々の配列を標的化するために使用されるガイドRNAのライブラリーと共に細胞に送達され、それによってゲノム全体の配列を系統的に変化させる。
突然変異を、種々のタンパク質のいずれかにおいて作製して、構造-機能分析を促進ささせ、またはタンパク質の内因性活性を変化させ得る。突然変異は、例えば、酵素（例えばキナーゼ、ホスファターゼ、カルボキシラーゼ、ホスホジエステラーゼ）または酵素基質、受容体またはそのリガンド、ならびに抗体およびその抗原において作製され得る。一実施形態では、マルチエフェクター核酸塩基エディターは、酵素の活性部位、受容体のリガンド結合部位、または抗体もしくは抗原結合分子の相補性決定領域 (CDR) をコードする核酸分子を標的とする。酵素の場合、活性部位に変異を導入すると、酵素活性が増加、減少、または消失し得る。酵素に対する突然変異の影響は、当技術分野で知られるおよび/または当業者には明らかである多くのアッセイのいずれかを含む、酵素活性アッセイを実施することによって特徴付けされる。受容体の場合、リガンド結合部位に生成された変異は、リガンドに対する受容体の親和性を増加、減少、または消失させ得る。このような突然変異の効果は、当技術分野で知られるおよび/または当業者には明らかである多くのアッセイのいずれかを含む、受容体/リガンド結合アッセイにおいて典型的にアッセイされる。抗体CDRの場合、CDR内に生成された突然変異は、同族抗原への結合を増加、減少、または消失させ得る。あるいは、CDR内に生成された突然変異は、抗原に対する抗体または抗原結合分子の特異性を変化させ得る。次いで、例えばその抗原に対するCDRの特異的結合を測定することによって、または当業者には明らかであり関連技術分野で一般的に使用される任意の他の種類のイムノアッセイにおいて、CDR機能に対するこれらの改変の影響がアッセイされる。
［医薬組成物］
本開示の他の態様は、本明細書に記載されるマルチエフェクター塩基エディター、融合タンパク質、または融合タンパク質-ガイドポリヌクレオチド複合体のいずれかを含む医薬組成物に関する。用語「医薬組成物」は、本明細書中で使用される場合、薬学的使用のために処方される組成物を指す。いくつかの態様において、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。ある態様において、薬学的組成物は、さらなる剤(例えば特異的送達、半減期の延長のためのもの、または他の治療化合物)を含む。
ここで使用されるところの用語「薬学的に許容される担体」は、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤(例えば潤滑剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムまたはステアリン酸亜鉛、あるいはステアリン酸)、または溶媒カプセル化材料などの、身体のある部位(例えば送達部位)から別の部位(例えば器官、組織または身体の一部)への化合物の運搬または輸送に関与する薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルを意味する。薬学的に許容される担体は、製剤の他の成分と適合し、対象の組織に有害でないという意味で許容される(例えば生理的適合性、無菌性、生理的pH等)。
薬学的に許容される担体として役立つことができる物質のいくつかの非限定的な例は、以下を含む: (1) ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖;(2) コーンスターチ、ジャガイモでん粉等のでん粉;(3) セルロース及びその誘導体 (カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、酢酸セルロース等);(4) トラガント末;(5) モルト;(6)ゼラチン;(7) ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク等の潤滑剤;(8) ココアバター、坐剤用ワックス等の添加剤;(9) 落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、大豆油等の油;(10) プロピレングリコール等のグリコール;(11) ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール (PEG); (12) エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど;(13) 寒天;(14) 水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム等の緩衝剤;(15) アルギン酸;(16) パイロジェンフリー水;(17) 生理食塩液;(18) リンガー液;(19)エチルアルコール;(20) pH緩衝液;(21) ポリエステル、ポリカーボネート及び／又はポリ無水物;(22) ポリペプチドおよびアミノ酸のような増量剤 (23) エタノールのような血清アルコール;及び (23) 製剤に使用される他の非毒性適合性物質。湿潤剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、風味料、香料、保存剤および抗酸化剤も製剤中に存在させることができる。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」、「ビヒクル」などの用語は、本明細書では交換可能に使用される。
薬学的組成物は、約5.0〜約8.0の範囲などの生理学的pHを反映する所定のレベルに製剤のpHを維持するために、一つ以上のpH緩衝化合物を含むことができる。水性液体製剤で使用されるpH緩衝化合物は、アミノ酸またはヒスチジンなどのアミノ酸の混合物、またはヒスチジンおよびグリシンなどのアミノ酸の混合物であり得る。あるいは、pH緩衝化合物は、製剤のpHを所定のレベル、例えば約5.0〜約8.0の範囲に維持し、カルシウムイオンをキレートしない剤である。このようなpH緩衝化合物の典型的な例としては、イミダゾールおよび酢酸イオンが挙げられるが、これらに限定されない。pH緩衝化合物は、製剤のpHを所定のレベルに維持するのに適した任意の量で存在し得る。
薬学的組成物はまた、一つ以上の浸透圧調節剤、すなわち、処方物の浸透圧特性(例えば、等張性、オスモラリティ、および／または浸透圧)をレシピエント個体の血流および血液細胞にとって許容可能なレベルに調節する化合物を含有することができる。浸透圧調節剤は、カルシウムイオンをキレートしない薬剤であり得る。浸透圧調節剤は、製剤の浸透圧特性を調節する当業者に公知または入手可能な任意の化合物であり得る。当業者は、本発明の処方における使用のための所定の浸透圧調節剤の適合性を経験的に決定することができる。適切なタイプの浸透圧調節剤の例示的な例としては、塩化ナトリウムおよび酢酸ナトリウムのような塩；スクロース、デキストロース、マンニトールなどの糖;グリシンなどのアミノ酸;これらの薬剤および/または薬剤タイプの1つ以上の混合物が挙げられるが、これらに限定されない。浸透圧調節剤は、製剤の浸透圧特性を調節するのに十分な任意の濃度で存在し得る。
いくつかの態様において、薬学的組成物は、対象への送達のために、例えば遺伝子編集のために製剤化される。本明細書に記載の医薬組成物を投与する適切な経路は、限定されるものではないが、局所、皮下、経皮、皮内、病巣内、関節内、腹腔内、膀胱内、経粘膜、歯肉、歯内、蝸牛内、経鼓膜、器官内、硬膜外、髄腔内、筋肉内、静脈内、血管内、骨内、眼周囲、腫瘍内、脳内、および脳室内投与を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載される薬学的組成物は、患部（例えばCNS、運動ニューロン）に局所的に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される薬学的組成物は、注射、カテーテル、坐剤、またはインプラントによって、対象に投与され、インプラントは、多孔質、非多孔質、またはゼラチン質材料であり、例えば、シアラスティック膜、または繊維などの膜を含む。
他の態様において、本明細書に記載される薬学的組成物は、制御放出システムにおいて送達される。一実施形態では、ポンプを使用することができる(例えばLanger, 1990, Science 249: 1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574参照)。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。(例えばMedical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61. See also Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et ah, 1989, J. Neurosurg. 71: 105.)。他の制御放出システムは、例えば、上記Langerに記載されている。
いくつかの態様において、薬学的組成物は、対象、例えばヒトへの静脈内または皮下投与に適合された組成物として、ルーチンの手順に従って製剤化される。いくつかの態様において、注射による投与のための医薬組成物は、可溶化剤としての無菌等張使用の溶液および注射部位の痛みを緩和するためのリグノカインなどの局所麻酔薬である。一般に、成分は、単位投与形態、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェットのような密閉容器内の乾燥凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、別々にまたは一緒に供給される。薬剤が注入によって投与される場合には、無菌の医薬グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルを用いてそれを分注することができる。医薬組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分を混合することができるように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
全身投与のための医薬組成物は、液体、例えば滅菌生理食塩水、乳酸化リンゲル液またはハンク液であり得る。さらに、医薬組成物は、固体形態であって、使用の直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形態もまた考えられる。医薬組成物は、非経口投与にも適した、リポソームまたは微結晶などの脂質粒子または小胞内に含有することができる。粒子は、組成物がその中に含まれる限り、単ラメラまたは複数ラメラのような任意の適切な構造であり得る。化合物は、融合性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、低量(5-10モル%)のカチオン性脂質を含み、ポリエチレングリコール (PEG) コーティングにより安定化された、「安定化プラスミド脂質粒子」(SPLP)中に捕捉され得る (Zhang Y. P. et ah, Gene Ther. 1999, 6: 1438-47)。このような粒子および小胞には、N-[l-(2,3-ジオレオイルキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチル-アモニウムメチル硫酸塩、あるいは「DOTAP」のような正電荷脂質が特に好ましい。このような脂質粒子の調製はよく知られている。例えば、米国特許第4,880,635；4,906,477；4,911,928；4,917,951；4,920,016;および4,921,757号参照（その各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。
本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、単位用量として投与または包装することができる。「単位用量」という用語は、本開示の薬学的組成物に関して使用される場合、対象のための単一用量として適した物理的に個別の単位を指し、各単位は、必要な希釈剤（例えば担体、またはビヒクル）と合わせて所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性物質を含有する。
さらに、この薬学的組成物は、 (a) 凍結乾燥形態の本発明の化合物を含有する容器、および (b) 本発明の凍結乾燥化合物の再構成または希釈のために使用される、薬学的に許容される希釈剤 (例えば無菌のもの) を含有する第2の容器を含む薬学的キットとして提供することができる。必要に応じて、そのような容器には、医薬品又は生物学的製剤の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された様式の通知であって、人に投与するための製造、使用又は販売の機関による承認を反映するものとすることができる。
別の態様では、上記疾患の治療に有用な材料を含む製品が含まれる。いくつかの実施態様において、製品は、容器及びラベルを含む。適切な容器は、例えばボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を含む。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。いくつかの実施形態において、容器は、本明細書に記載される疾患を治療するために有効である組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る。例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、または皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアルであり得る。組成物中の活性剤は、本発明の化合物である。いくつかの態様において、容器上のまたは容器に付随するラベルは、選択される疾患を治療するために組成物が使用されることを示す。製品は、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、またはデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第2の容器をさらに含むことができる。さらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、注射器、および使用説明書付き添付文書を含め、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の物質を含むことができる。
いくつかの態様において、本明細書に記載される融合タンパク質、gRNA、および/または複合体のいずれかは、薬学的組成物の一部として提供される。いくつかの態様において、薬学的組成物は、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかを含む。いくつかの態様において、薬学的組成物は、本明細書に提供される複合体のいずれかを含む。いくつかの態様において、薬学的組成物は、gRNAおよびカチオン性脂質と複合体を形成するRNA-ガイドヌクレアーゼ(例えばCas9)を含むリボ核タンパク質複合体を含む。ある態様において、薬学的組成物は、gRNA、核酸プログラム可能DNA結合タンパク質、カチオン性脂質、および薬学的に許容される賦形剤を含む。薬学的組成物は、場合により、1つ以上の追加の治療活性物質を含むことができる。
種々の動物への投与に適した組成物を与えるための、ヒトへの投与に適した医薬組成物の改変は十分に理解されており、通常の熟練した獣医薬理学者は、もし必要だとしても単に通常の実験で、そのような改変を設計および/または実施することができる。薬学的組成物の投与が意図される対象には、限定されるものではないが、ヒトおよび/または他の霊長類;哺乳動物、家畜、ペット、およびウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および/またはラットなどの商業的に関連のある哺乳動物;ニワトリ、カモ、ガチョウ及び/又は七面鳥のような商業的に関連のある鳥類が含まれる。
本明細書に記載される薬学的組成物の製剤は、薬学の分野において公知の、または今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、このような調製方法は、活性成分を賦形剤および/または1つ以上の他の補助成分と会合させ、次いで、必要および/または所望であれば、製品を所望の単回または複数回投与単位に成形および/または包装する工程を含む。薬学的製剤はさらに、薬学的に許容される賦形剤を含むことができ、それは、本明細書で使用される場合、所望の特定の剤形に適した、溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固体結合剤、潤滑剤などのいずれかおよび全てを含む。Remington’s The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、薬学的組成物を製剤化する際に使用される種々の賦形剤およびその調製のための公知の技術を開示する。ヌクレアーゼを含む医薬組成物を製造するためのさらなる適切な方法、試薬、賦形剤および溶媒については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるPCT出願PCT/US2010/055131(2010年11月2日出願、公開番号WO2011053982 A8)も参照のこと。
あらゆる従来の賦形剤媒体は、望ましくない生物学的効果を生じさせること、または他のかたちで医薬組成物の何らかの他の成分と有害な様式で相互作用することなどによって、物質またはその誘導体と不適合である場合を除き、その使用が本開示の範囲内にあると考えられる。
上記の組成物は、有効量で投与することができる。有効量は、投与方法、治療される特定の状態、および所望の結果に依存する。それはまた、状態のステージ、対象の年齢および身体的状態、もしあれば併用療法の性質、および医師によく知られた同様の因子に依存し得る。治療用途のためには、それは医学的に望ましい結果を達成するのに十分な量である。
［疾患または障害を治療する方法］
疾患または障害を治療する方法も提供され、本方法は、対象(例えばヒト等の哺乳動物)に、本明細書に記載される塩基エディター系(例えば、マルチエフェクター塩基エディターとgRNA)をコードするポリヌクレオチドを含む薬学的組成物の治療有効量を投与することを含む。ある態様において、塩基エディターは、ポリヌクレオチドプログラム可能なDNA結合ドメイン、１つまたは複数のデアミナーゼドメイン（例えばアデノシンデアミナーゼドメインおよびシチジンデアミナーゼドメイン）を含む融合タンパク質である。対象の細胞は、標的核酸配列のA・TからG・Cへの変化およびC・GからU・Aへの変化（細胞がアデノシンデアミナーゼドメインおよびシチジンデアミナーゼドメインで形質導入される場合）をもたらすために、マルチエフェクター塩基エディターおよびそれをターゲティングする一つ以上のガイドポリヌクレオチドとともに形質導入される。
本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の組成物の有効量を対象(そのような治療を必要としていると特定された対象、又は疾患のリスクがありそのような治療を必要としていると疑われる対象を含む)に投与することを含む。このような治療を必要とする対象を同定することは、対象または医療専門家の判断にあり得、主観的(例えば所見)または客観的(例えば、検査または診断方法によって測定可能)であり得る。
治療方法は、一般的に、例えば、それを必要とする対象（例えば、ヒト患者）の疾患または障害に関連するポリヌクレオチド配列、例えばポリヌクレオチド配列（遺伝子）を標的とする、マルチエフェクター塩基エディターおよびgRNAをコードするベクターを含む薬学的組成物の治療有効量の投与を含む。このような治療は、その疾患または障害を患っている、それを有している、それに罹患しやすい、またはその罹患のリスクがある対象、特にヒト対象に適切に投与される。
一実施形態では、治療の進行を監視する方法が提供される。本方法は、疾患もしくは障害またはその症状に罹患しているかまたは罹患しやすい対象において、診断マーカー（マーカー）または診断測定(例えば、スクリーニング、アッセイ) のレベルを決定する工程を含み、ここでその対象は、疾患またはその症状を治療するのに十分な本明細書中の組成物の治療量を投与された対象である。この方法で測定されたマーカーのレベルを、健康な正常対照または他の罹患患者のいずれかにおけるマーカーの既知のレベルと比較して、対象の疾患状態を確立することができる。好ましい態様において、第1のレベルの決定よりも後の時点で、対象におけるマーカーの第2のレベルが決定され、疾患の経過または治療の有効性をモニターするためにこの2つのレベルが比較される。特定の好ましい実施形態では、対象における治療前のマーカーのレベルが、本発明による治療を開始する前に決定される。このマーカーの治療前レベルを治療開始後の対象のマーカーレベルと比較して、治療の有効性を判定することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるマルチエフェクター塩基エディターを含む組成物は、対象内で標的化ゲノム改変を行うために、対象、例えばヒト対象に投与される。ある態様において、細胞が対象から取得され、本明細書に提供される薬学的組成物のいずれかと接触される。いくつかの態様において、対象から取り出されてex vivoで薬学的組成物と接触された細胞は、場合により、所望のゲノム改変が細胞において実行または検出された後に、対象に再導入される。
ヌクレアーゼを含む薬学的組成物を送達する方法は公知であり、例えば、米国特許第6,453,242; 6,503,717; 6,534,261; 6,599,692; 6,607,882; 6,689,558; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; および7,163,824号に記載されており、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に提供される薬学的組成物の説明は、主に、ヒトへの投与に適した薬学的組成物に向けられているが、そのような組成物は、一般に、あらゆる種類の動物または生物への投与、例えば、獣医学的使用に適していることが、当業者によって理解されるであろう。
［キット］
本開示の様々な態様は、ベースエディターシステムを含むキットを提供する。一実施形態では、キットは、デオキシリボ核酸 (DNA) 分子内の核酸塩基を脱アミノ化することができるマルチエフェクター核酸塩基エディターをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含む。特定の実施形態では、マルチエフェクター核酸塩基エディターは、シチジンデアミナーゼおよび/またはアデノシンデアミナーゼ活性を有する。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、マルチエフェクター核酸塩基エディターの発現を駆動する異種プロモーターを含む。
ある態様において、 (a) 本明細書に提供されるようにアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼに融合されたCas9ドメインをコードするヌクレオチド配列と、(b) (a)の配列の発現を駆動する異種プロモーターとを含む、核酸構築物を含むキット;およびが提供される。
別の態様では、本明細書に提供されるマルチエフェクター核酸塩基編集/融合タンパク質のいずれかを含む細胞が提供される。ある実施形態において、細胞は、本明細書に提供されるヌクレオチドまたはベクターのいずれかを含む。
いくつかの実施形態では、キットは、そのキットを使用して本明細書に開示されたシステムを用いたマルチエフェクター塩基編集を実行するための説明書を提供する。説明書は、一般に、核酸分子を編集するためのキットの使用に関する情報を含む。他の実施形態では、説明書は、以下のうちの少なくとも1つを含む：注意事項；警告；臨床試験；および/または参考資料。使用説明書は、容器（もしあれば）に直接印刷するか、容器に貼付するラベルとして印刷するか、または容器内にもしくは容器と共に提供される独立したシート、パンフレット、カードまたはフォルダーとして印刷され得る。さらなる実施形態では、キットは、適切な動作パラメータのためのラベルまたは別個のインサート(添付文書)の形態で説明書を含むことができる。さらに別の実施形態では、キットは、検出、較正、または正規化のための標準として使用される、適切なポジティブおよびネガティブコントロールまたは対照サンプルを有する1つ以上の容器を含むことができる。キットは、(滅菌) リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、またはデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第2の容器をさらに含むことができる。さらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、注射器、および使用説明書付きの添付文書を含む、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の物質を含むことができる。
本発明の実施は、別段の表示がない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を利用し、これらは当業者の技量の範囲内である。そのような技術は、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition (Sambrook, 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (Gait, 1984); “Animal Cell Culture” (Freshney, 1987); “Methods in Enzymology” “Handbook of Experimental Immunology” (Weir, 1996); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (Miller and Calos, 1987); “Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel, 1987); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis, 1994); “Current Protocols in Immunology” (Coligan, 1991)などの文献で詳しく説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に適用可能であり、したがって、本発明の製造および実施において考慮され得る。特定の実施形態のために特に有用な技術は、以下のセクションで論じられる。
以下の実施例は、当業者に本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療方法をいかに作って使用するかの完全な開示および説明を提供するために記載されており、本発明者らがその発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。
［実施例１：マルチエフェクター核酸塩基エディター］
pNMG-B79と称されるプラスミド構築物において、Cas9核酸プログラミング可能DNA結合ドメイン、野生型TadAおよびTadA7.10のヘテロ二量体、Pteromyzon marinusシチジンデアミナーゼ、および2つのウラシルDNAグリコシラーゼ阻害因子ドメインを含むマルチエフェクター核酸塩基エディターを開発した。TadA7.10ドメインはアデノシンデアミナーゼ活性を有する。S. pyogenes nCas9 (D10A) ドメインはニッカーゼ活性を有する。Pteromyzon marinusシチジンデアミナーゼ (pmCDA) はシチジンデアミナーゼ活性を有する。それはまた二つのウラシルDNAグリコシラーゼ阻害因子ドメイン (UGI) を含む。UGIはBacillus subtilisバクテリオファージPBS1由来の83残基蛋白質であり、ヒトUDGの活性を強力にブロックする（IC50=12 pM）。pNMG-B79ポリペプチドは、そのN末端およびC末端に核局在化シグナルを含む。
pNMG-B79の配列は以下のとおりである：
pNMG-B79：−NLS太字−wtTadA下線−32 a.a.リンカー斜体−TadA*7.10下線−23 a.a.リンカー斜体−nCas9−32 a.a.リンカー斜体−pmCDA-UGI-UGI太字下線−NLS-BP-NLS太字斜体
Figure 2021532794
pNMG-B92：−NLS太字−wtTadA下線−32 a.a.リンカー斜体−TadA*7.10下線−23 a.a.リンカー斜体−nCas9−105 a.a.リンカー斜体−pmCDA下線−リンカー斜体-UGI-UGI太字下線−NLS-BP-NLS太字斜体
Figure 2021532794
Figure 2021532794
pNMG-B93−NLS−wtTadA−32 a.a.リンカー斜体-TadA*7.10下線−23 a.a.リンカー斜体−nCas9−105 a.a.リンカー斜体−rAPOBEC1下線−リンカー斜体−UGI-UGI太字下線−NLS-BP-NLS太字斜体
Figure 2021532794
Figure 2021532794
HEK 293 T細胞を、pNMG-B79、またはABE7.10をコードするプラスミド、および適切なsgRNAと共トランスフェクトした。ベクターは、融合タンパク質の発現を駆動するCMVプロモーターを含んでいた。細胞を5日間培養中に維持して、核酸塩基の編集を起こさせた。その後、ゲノムDNAを細胞から抽出し、ハイスループット配列決定 (HTS) により遺伝子座を分析した。sgRNAは、図1に示されるようにPAM配列の5’側の20塩基対を標的とした。アデノシンデアミナーゼであるアデニン塩基エディター（ABE）7.10は、配列決定されたポリヌクレオチドの約80%において、位置5（A5）のアデノシンをGに変換し（図1）、配列決定されたポリヌクレオチドの29%においてA7をGに変換した（図1）。同様の条件下でインキュベートしたが塩基エディターを不在とした未処理ポリヌクレオチドが対照として含ませ、それはそのような修飾を有さなかった（図1下）。
驚くべきことに、pNMG‐B79はアデノシンデアミナーゼ活性とシトシンデアミナーゼ活性の両方を示した（図1中央）。pNMG-B79は、配列決定されたポリヌクレオチドの41%においてC4をTに変換し、配列決定されたポリヌクレオチドの66%においてA5をGに変換し、配列決定されたポリヌクレオチドの約35%においてC6をTに変換し、配列決定されたポリヌクレオチドの約15%でAをGに変換した。これは、標的ポリヌクレオチド上のすべての遷移（transition）突然変異を生じさせることができる塩基エディターの最初の実証である。
pNMG‐B79バリアントの塩基編集活性を試験した。塩基エディターpNMG‐90および92では、nCas9 (D10A) ドメインとシチジンデアミナーゼドメインとの間のリンカーの長さを、pNMG‐B 79における32から104アミノ酸に増加させた。別の例において、塩基エディターpNMG-91および93では、pmCDAがrAPOBEC1と交換され、長いリンカー（long linker）がnCas9 (D10A) とrAPOBEC1との間に含まれた（図2）。図3Aは、マルチエフェクター核酸塩基エディターの概略図を提供する。ゲノムDNAを修飾する塩基エディターの能力をアッセイした（図3B）。pNMG-B79は、配列決定されたポリヌクレオチドの58%においてA5をGに変換し、配列決定されたポリヌクレオチドの約25%においてC6をTに変換した。pNMG‐90と92は異なる活性度を示した。pNMG-92は、配列決定されたポリヌクレオチドの50%においてA5をGに変換し、配列決定されたポリヌクレオチドの約9.8%においてC6をTに変換した。pNMG-90は、配列決定されたポリヌクレオチドのいずれにおいてもA5をGに変換しなかったが、配列決定されたポリヌクレオチドの約13%においてC6をTに変換した。別の例では、塩基エディターpNMG-93は、配列決定されたポリヌクレオチドの77%においてA5をGに変換し、配列決定されたポリヌクレオチドの約13%においてC6をTに変換した。別の例において、塩基エディターpNMG-91は、配列決定されたポリヌクレオチドの約17%においてC6をGに変換し、配列決定されたポリヌクレオチドの58%においてC6をTに変換した。他の塩基エディターは、CDA BEmax、CDAmax、およびABEを含む。ABEmaxは、配列決定されたポリヌクレオチドのそれぞれ約8%または61%においてC6をGまたはTに変換した（図8A、8B）。CDAmaxは、それぞれ約5%または43%においてCをGまたはTに変換した。ABEは、配列決定されたポリヌクレオチドの約80%においてA5をGに変換し、配列決定されたポリヌクレオチドの約10%においてA8をGに変換した。
図4Aに示される種々の塩基エディターの塩基編集活性を、HBG1標的部位上で評価した（図4B、4C）。pNMG-B79は、配列決定されたポリヌクレオチドの約23%においてA5をGに変換し、配列決定されたポリヌクレオチドの約8%においてC6をTに変換した。pNMG-B92は、配列決定されたポリヌクレオチドの15%においてA5をGに変換し、配列決定されたポリヌクレオチドの約9.8%においてC6をTに変換した。pNMG-90は、配列決定されたポリヌクレオチドのいずれにおいてもA5をGに変換しなかったが、配列決定されたポリヌクレオチドの約4%においてC6をTに変換し、配列決定されたポリヌクレオチドの約15%においてC7をTに変換し、配列決定されたポリヌクレオチドの約2%においてA8をGに変換した。別の例において、塩基エディターpNMG-B93は、配列決定されたポリヌクレオチドの19%においてA5をGに変換し、配列決定されたポリヌクレオチドの約20%においてC6をTに変換し、ポリヌクレオチド配列の約18%においてC7をTに変換し、配列決定されたポリヌクレオチドの16%においてA8をGに変換した。別の例において、塩基エディターpNMG-90は、配列決定されたポリヌクレオチドの約8%においてC6をGに変換し、配列決定されたポリヌクレオチドの28%においてC7をTに変換した。BEmaxは、配列決定されたポリヌクレオチドの約27%においてC6をTに変換し、配列決定されたポリヌクレオチドの約35%においてC7をTに変換した。ABEは配列決定されたポリヌクレオチドの約35%においてA5をGに変換し、配列決定されたポリヌクレオチドの約47%においてA8をGに変換し、配列決定されたポリヌクレオチドの8.6%においてA9をGに変換した。
デュアル核酸塩基エディターpNMG‐79および従来型核酸塩基エディターABE7.10の活性をHBG1サイト上で試験した。ABE7.10の結果を図5A、5Bの上部に示し、未処理対照の結果を図の下部に示す。pNMG-B79は、配列決定されたポリヌクレオチドの41%においてC4をTに変換し、配列決定されたポリヌクレオチドの67%においてA5をGに変換し、配列決定されたポリヌクレオチドの35%においてC6をTに変換し、配列決定されたポリヌクレオチドの約15%においてAをGに変換した。図5Bは、図5Aに要約された結果の例示的な配列決定リードを提供する。図5Cは、ABE7.10と比較したpNMG-B79についての配列決定リードの完全なリストを提供する。pNMG‐B79は2.68%の率でインデルを生成した一方、ABE7.10は同様の条件下で0.56%の率でインデルを生成した（図6）。
HBG1標的に対して種々のマルチエフェクター核酸塩基エディターを試験した。これらの塩基エディターが標的を改変する能力は図7Aおよび7Bに示されている。生成されたインデルの割合が図の右端に示されている。
これら結果で証明されているように、試験された核酸塩基エディターは、所与の標的の編集ウィンドウにおいて、AとCの両方を首尾よく脱アミノ化した。アンプリコンは、同じアンプリコン上にA→GとC→Tを示す。CDAまたはApolipoprotein B mRNA Editing Catalytic Polypeptide-like（rAPOBEC1）の使用もまた所望の部位で試験することができる。
上述のマルチエフェクター核酸塩基エディターは、ウラシル-DNAグリコシラーゼをベクターに挿入することによってさらに修飾される。
［他の実施形態］
上記の説明から、種々の用途および条件に適用させるために、本明細書に記述する本発明に変形および修正を加えることができることが明らかであろう。そのような実施形態もまた、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本明細書における可変要素の定義における要素のリストの記載は、リストされた要素のいずれかの単一要素または組合せ（またはサブコンビネーション）としてのその可変要素の定義を含む。本明細書における実施形態の説明は、いずれかの単一の実施形態としての、または任意の他の実施形態もしくはその一部との組合せにおける、その実施形態を含む。
［参照による組み込み］
本明細書に言及されているすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。別段の表示がない限り、本明細書に言及されている刊行物、特許および特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (66)

  1. 核酸配列特異的結合活性を有するドメインと、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、および脱塩基エディターからなる群から選択される２つ以上の核酸塩基エディタードメインとを含む、マルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチド。
  2. １つ以上の核局在化シグナル（NLS）をさらに含む、請求項1に記載のポリペプチド。
  3. NLSが二部分NLSである、請求項2に記載のポリペプチド。
  4. N末端NLSおよびC末端NLSを含む、請求項3に記載のポリペプチド。
  5. １つ以上のウラシルDNAグリコシラーゼ阻害因子（UGI）をさらに含む、請求項1に記載のポリペプチド。
  6. 前記核酸塩基エディターがアデノシンデアミナーゼまたはその触媒的に活性なその断片を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
  7. 前記アデノシンデアミナーゼがTadAデアミナーゼである、請求項6に記載のポリペプチド。
  8. 前記TadAデアミナーゼが、天然に存在しない改変アデノシンデアミナーゼである、請求項7に記載のポリペプチド。
  9. 同じまたは異なる２つのアデノシンデアミナーゼを含む、請求項8に記載のポリペプチド。
  10. 前記２つのアデノシンデアミナーゼがヘテロ二量体またはホモ二量体を形成することができる、請求項9に記載のポリペプチド。
  11. 前記２つのアデノシンデアミナーゼのドメインが野生型TadAおよびTadA7.10である、請求項10に記載のポリペプチド。
  12. 前記核酸配列特異的結合活性を有するドメインが、核酸プログラミング可能DNA結合タンパク質（napDNAbp）である、請求項1に記載のポリペプチド。
  13. 前記napDNAbpドメインが、ヌクレアーゼ不活Cas9（dCas9）、Cas9ニッカーゼ（nCas9）、またはヌクレアーゼ活性Cas9を含む、請求項12に記載のポリペプチド。
  14. 前記napDNAbpが、Cas9、Cas12a/Cpfl、Cas12b/C2cl、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、およびCas12i、またはそれらの活性断片からなる群より選択される、請求項13に記載のポリペプチド。
  15. 前記napDNAbpドメインが、前記核酸配列の逆相補鎖を切断することができる触媒ドメインを含む、請求項14に記載のポリペプチド。
  16. 前記napDNAbpドメインが、前記核酸配列を切断することができる触媒ドメインを含まない、請求項14に記載のポリペプチド。
  17. 前記Cas9がdCas9またはnCas9である、請求項14に記載のポリペプチド。
  18. 前記Cas9がdCas9である、請求項14に記載のポリペプチド。
  19. 前記Cas9がnCas9である、請求項14に記載のポリペプチド。
  20. 前記シチジンデアミナーゼがPetromyzon marinusシトシンデアミナーゼ1（pCDM）、または活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（AICDA）である、請求項1に記載のポリペプチド。
  21. 脱塩基核酸塩基エディターを含む、請求項1に記載のポリペプチド。
  22. 前記１つ以上のUGIが、Bacillus subtilisバクテリオファージPBS1に由来しヒトUDG活性を阻害するものである、請求項5に記載のポリペプチド。
  23. １つ以上の核局在化シグナル（NLS）、napDNAbp、ウラシルDNAグリコシラーゼ阻害因子、アデノシンデアミナーゼ、およびシチジンデアミナーゼを含む、マルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチド。
  24. ２つのNLSを含む、請求項23に記載のポリペプチド。
  25. １つのNLSが二部分NLSである、請求項23に記載のポリペプチド。
  26. ２つのウラシルDNAグリコシラーゼ阻害因子を含む、請求項23に記載のポリペプチド。
  27. ２つのアデノシンデアミナーゼとシチジンデアミナーゼとを含むか、または脱塩基核酸塩基エディターとシチジンデアミナーゼとを含むか、または脱塩基核酸塩基エディターとアデノシンデアミナーゼとを含む、請求項23に記載のポリペプチド。
  28. 以下のドメインA〜C、A〜D、またはA〜Eを含む、マルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチドであって：
    NH2-[A-B-C]-COOH、
    NH2-[A-B-C-D]-COOH、または
    NH2-[A-B-C-D-E]-COOH
    ここで、AおよびCまたはA、CおよびEは、それぞれ以下のうちの1つ以上を含み：
    アデノシンデアミナーゼドメインまたはその活性断片、
    シチジンデアミナーゼドメインまたはその活性断片、
    DNAグリコシラーゼドメインまたはその活性断片、
    BまたはBおよびDは、それぞれ核酸配列特異的結合活性を有する1つ以上のドメインを含む、
    マルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチド。
  29. 以下のものを含み：
    NH2-[An-Bo-Cn]-COOH、
    NH2-[An-Bo-Cn-Do]-COOH、または
    NH2-[An-Bo-Cp-Do-Eq]-COOH
    ここで、AおよびCまたはA、CおよびEは、それぞれ以下のうちの１つ以上を含み：
    アデノシンデアミナーゼドメインまたはその活性断片、
    シチジンデアミナーゼドメインまたはその活性断片、および
    DNAグリコシラーゼドメインまたはその活性断片；
    nは1、2、3、4、または5の整数であり、pは0、1、2、3、4、または5の整数であり、qは0、1、2、3、4、または5の整数であり、
    BまたはBおよびDは、それぞれ核酸配列特異的結合活性を有するドメインを含み、oは1、2、3、4、または5の整数である、
    請求項28に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチド。
  30. １つ以上の核局在化配列を含む、請求項28または29に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチド。
  31. 前記核局在化配列のうちの少なくとも一つがN末端またはC末端にある、請求項30に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチド。
  32. 前記核局在化シグナルが二部分核局在化シグナルである、請求項31に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチド。
  33. １つ以上のドメインがリンカーによって連結されている、請求項28または29に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチド。
  34. 前記アデノシンデアミナーゼがTadAデアミナーゼである、請求項28または29に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチド。
  35. 前記TadAは、天然に存在しない改変アデノシンデアミナーゼである、請求項34に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチド。
  36. 同じまたは異なる２つのアデノシンデアミナーゼドメインを含む、請求項35に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチド。
  37. 前記２つのアデノシンデアミナーゼドメインがヘテロまたはホモ二量体を形成することができる、請求項36に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチド。
  38. 前記アデノシンデアミナーゼドメインが野生型TadAおよびTadA7.10である、請求項36に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチド。
  39. 前記核酸配列特異的結合活性を有するドメインが、核酸プログラミング可能DNA結合タンパク質（napDNAbp）である、請求項28または29に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチド。
  40. 前記napDNAbpドメインが、ヌクレアーゼ不活Cas9（dCas9）、Cas9ニッカーゼ（nCas9）、またはヌクレアーゼ活性Cas9を含む、請求項39に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチド。
  41. 前記napDNAbpが、Cas9、Cas12a/Cpfl、Cas12b/C2cl、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、およびCas12iまたはその活性断片からなる群から選択される、請求項40に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチド。
  42. 前記napDNAbpドメインが、前記核酸配列の逆相補鎖を切断することができる触媒ドメインを含む、請求項41に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチド。
  43. 前記napDNAbpドメインが、前記核酸配列を切断することができる触媒ドメインを含まない、請求項41に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチド。
  44. 前記Cas9がdCas9またはnCas9である、請求項41に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチド。
  45. 前記napDNAbpが核酸塩基エディターを含む、請求項41に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチド。
  46. 前記核酸塩基エディターが、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼを含む、請求項45に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチド。
  47. 前記シチジンデアミナーゼが、Petromyzon marinusシトシンデアミナーゼ1（pCDM）または活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（AICDA）である、請求項46に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチド。
  48. ２つのウラシルDNAグリコシラーゼ阻害因子を含む、請求項23に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチド。
  49. 請求項1〜48のいずれか一項に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド分子。
  50. ポリヌクレオチドがコドン最適化されている、請求項49に記載のポリヌクレオチド分子。
  51. 請求項49または請求項50に記載のポリヌクレオチド分子を含む、発現ベクター。
  52. 哺乳類発現ベクターである、請求項51に記載の発現ベクター。
  53. アデノ随伴ウイルス（AAV）、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、およびヘルペスウイルスベクターからなる群より選択されるウイルスベクターである、請求項51に記載の発現ベクター。
  54. プロモーターを含む、請求項51〜53のいずれか一項に記載の発現ベクター。
  55. 請求項49または請求項50に記載のポリヌクレオチドまたは請求項51〜54のいずれか一項に記載のベクターを含む、細胞。
  56. 細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞である、請求項55に記載の細胞。
  57. 請求項1〜48のいずれか一項に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチドと、ガイドRNA、tracrRNA、または標的DNA分子のうちの１つ以上とを含む、分子複合体。
  58. 請求項1〜48のいずれか一項に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチド、請求項49もしくは50に記載のポリヌクレオチド、請求項51〜54のいずれか一項に記載の発現ベクター、または請求項57に記載の分子複合体を含む、キット。
  59. 核酸配列を、請求項1〜48のいずれか一項に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチドを含む塩基エディターに接触させることと、前記核酸配列の第１の核酸塩基を第２の核酸塩基に変換することとを含む、核酸配列の核酸塩基を編集する方法。
  60. 前記第１の核酸塩基がシトシンであり前記第２の核酸塩基がチミジンであるか、または前記第１の核酸塩基がアデニンであり前記第２の核酸塩基がグアニンである、請求項59に記載の方法。
  61. 第３の核酸塩基を第４の核酸塩基に変換することをさらに含む、請求項59に記載の方法。
  62. 前記第３の核酸塩基がグアニンであり前記第４の核酸塩基がアデニンであるか、または前記第３の核酸塩基がチミンであり前記第４の核酸塩基がシトシンである、請求項61に記載の方法。
  63. 前記核酸配列が相補性決定領域（CDR）をコードする、請求項59に記載の方法。
  64. 細胞のゲノム中に存在する調節配列を編集する方法であって、調節配列を、請求項1〜48のいずれか一項に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチドを含む塩基エディターに接触させることと、DNA配列の第１および第２の核酸塩基を、第３および第４の核酸塩基に変換することとを含む、方法。
  65. 細胞のゲノムを編集する方法であって、前記ゲノムを、請求項1〜48のいずれか一項に記載のマルチエフェクター核酸塩基エディターポリペプチドを含む塩基エディターに接触させることと、DNA配列の第１および第２の核酸塩基を第３および第４の核酸塩基に変換することとを含む、方法。
  66. 前記編集が前記ゲノムに及ぼす影響の特徴付けをすることをさらに含む、請求項65に記載の方法。

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Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
WO2019023680A1 (en) 2017-07-28 2019-01-31 President And Fellows Of Harvard College METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
JP2021500036A (ja) 2017-10-16 2021-01-07 ザ ブロード インスティテュート, インコーポレーテッドThe Broad Institute, Inc. アデノシン塩基編集因子の使用
ES2952978T3 (es) * 2018-03-14 2023-11-07 Arbor Biotechnologies Inc Sistemas y enzimas novedosos de direccionamiento a ADN de CRISPR
US20210198664A1 (en) 2018-05-16 2021-07-01 Arbor Biotechnologies, Inc. Novel crispr-associated systems and components
EP3921417A4 (en) 2019-02-04 2022-11-09 The General Hospital Corporation ADENINE DNA BASE EDITOR VARIANTS WITH REDUCED OFF-TARGET RNA EDITING
AU2020223314A1 (en) * 2019-02-13 2021-08-12 Beam Therapeutics Inc. Compositions and methods for treating alpha-1 antitrypsin deficiency
SG11202107045PA (en) 2019-02-13 2021-07-29 Beam Therapeutics Inc Compositions and methods for treating hemoglobinopathies
BR112021018607A2 (pt) 2019-03-19 2021-11-23 Massachusetts Inst Technology Métodos e composições para editar sequências de nucleotídeos
WO2020241869A1 (ja) * 2019-05-30 2020-12-03 国立大学法人東京大学 ２種の核酸塩基変換酵素が融合されたＣａｓタンパク質を利用したゲノム編集システム
WO2021042062A2 (en) * 2019-08-30 2021-03-04 Joung J Keith Combinatorial adenine and cytosine dna base editors
WO2021155109A1 (en) * 2020-01-30 2021-08-05 Pairwise Plants Services, Inc. Compositions, systems, and methods for base diversification
AU2021218811A1 (en) * 2020-02-13 2022-09-01 Beam Therapeutics Inc. Compositions and methods for engraftment of base edited cells
US20230116627A1 (en) * 2020-02-14 2023-04-13 Ohio State Innovation Foundation Nucleobase editors and methods of use thereof
WO2021222318A1 (en) 2020-04-28 2021-11-04 The Broad Institute, Inc. Targeted base editing of the ush2a gene
CN116096873A (zh) 2020-05-08 2023-05-09 布罗德研究所股份有限公司 同时编辑靶标双链核苷酸序列的两条链的方法和组合物
EP4165172A2 (en) * 2020-06-16 2023-04-19 Arbor Biotechnologies, Inc. Cells modified by a cas12i polypeptide
WO2022242660A1 (en) * 2021-05-17 2022-11-24 Wuhan University System and methods for insertion and editing of large nucleic acid fragments
KR20230074819A (ko) * 2021-07-05 2023-05-31 주식회사 진코어 절단비활성 cas12f1, 절단비활성 cas12f1 기반 융합 단백질, 이를 포함하는 crispr 유전자 조절 시스템, 그 제조방법 및 용도
CN115704015A (zh) * 2021-08-12 2023-02-17 清华大学 基于腺嘌呤和胞嘧啶双碱基编辑器的靶向诱变系统
WO2023050169A1 (zh) * 2021-09-29 2023-04-06 深圳先进技术研究院 一种在基因组上高通量实现tag到taa转换的方法
WO2023102550A2 (en) 2021-12-03 2023-06-08 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for efficient in vivo delivery
CN114582419B (zh) * 2022-01-29 2023-02-10 苏州大学 一种基于滑动窗口的基因序列多聚腺苷酸尾巴提取方法
CN114606227B (zh) * 2022-02-22 2024-03-08 复旦大学 高精度腺嘌呤碱基编辑器及其应用
CN116836962B (zh) * 2023-06-28 2024-04-05 微光基因(苏州)有限公司 工程化的腺苷脱氨酶及碱基编辑器

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015133554A1 (ja) * 2014-03-05 2015-09-11 国立大学法人神戸大学 標的化したｄｎａ配列の核酸塩基を特異的に変換するゲノム配列の改変方法及びそれに用いる分子複合体
WO2016072399A1 (ja) * 2014-11-04 2016-05-12 国立大学法人神戸大学 脱塩基反応により標的化したｄｎａ配列に特異的に変異を導入する、ゲノム配列の改変方法、並びにそれに用いる分子複合体
JP2017504312A (ja) * 2013-12-12 2017-02-09 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド ゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用
WO2017070632A2 (en) * 2015-10-23 2017-04-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
WO2018027078A1 (en) * 2016-08-03 2018-02-08 President And Fellows Of Harard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070117114A1 (en) * 2005-07-07 2007-05-24 Quanta Biosciences, Inc. Compositions and methods for increasing amplification efficiency
PT3138910T (pt) * 2012-12-06 2017-10-18 Sigma Aldrich Co Llc Modificação e regulação de genoma baseado em crispr
WO2017043573A1 (ja) * 2015-09-09 2017-03-16 国立大学法人神戸大学 標的化したｄｎａ配列の核酸塩基を特異的に変換するゲノム配列の改変方法及びそれに用いる分子複合体
US10745677B2 (en) * 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017504312A (ja) * 2013-12-12 2017-02-09 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド ゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用
WO2015133554A1 (ja) * 2014-03-05 2015-09-11 国立大学法人神戸大学 標的化したｄｎａ配列の核酸塩基を特異的に変換するゲノム配列の改変方法及びそれに用いる分子複合体
WO2016072399A1 (ja) * 2014-11-04 2016-05-12 国立大学法人神戸大学 脱塩基反応により標的化したｄｎａ配列に特異的に変異を導入する、ゲノム配列の改変方法、並びにそれに用いる分子複合体
WO2017070632A2 (en) * 2015-10-23 2017-04-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
WO2018027078A1 (en) * 2016-08-03 2018-02-08 President And Fellows Of Harard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MOLECULAR PLANT, vol. 11, JPN6023029003, 2018, pages 631 - 634, ISSN: 0005108835 *
NATURE, vol. 533, JPN6023029000, 2016, pages 420 - 424, ISSN: 0005108838 *
NATURE, vol. 551, JPN6023029002, 2017, pages 464 - 471, ISSN: 0005108836 *
SCI. ADV., vol. Vol.3, eaao4774, JPN6023029001, 2017, pages 1 - 9, ISSN: 0005108837 *

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