CN101277971A - 含cmv/r-核酸构建体的抗aids疫苗 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了引起包括预防性免疫应答在内的抗人免疫缺陷病毒免疫应答的组合物。该组合物包括编码多种进化枝或病毒株的HIV抗原性多肽的核酸构建体。还提供了通过将该组合物向个体给药来引起免疫应答的方法。

Description

含CMV/R-核酸构建体的抗AIDS疫苗
相关申请的交叉引用
本申请要求了2004年7月16日提交的第60/588,378号美国临时专利申请和同时待审的PCT申请PCT/US2004/030284(2004年9月15日提交)和PCT/US2005/12291(2005年4月12日提交)的优先权和权益。在此引入这些申请的每一申请的全部的公开内容。
技术领域
本申请涉及疫苗领域。更特别地，本申请涉及预防人免疫缺陷病毒(HIV)的多质粒疫苗。
政府支持的致谢
本公开的各个方面是用政府支持进行的。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
全世界四千多万人被HIV-1感染并且每天估计有14,000新感染病例。自从1981年鉴定了第一例AIDS以来，超过250万人死于HIV/AIDS(CDC，MMWR Morb.Mortal WkIy.Rep.，52：1145-1148，2003；UNAIDS，2003Report on the Global AIDS Epidemic Executive Summary，2004)。全球相关的HIV-1疫苗的开发对于控制HIV/AIDS全球流行是至关重要的。
高转录错误率和频繁重组的结合导致HIV-1病毒株中存在显著量的遗传多样性，并为选择病毒抗原提出了挑战。HIV遗传性变异的其它潜在影响为每个个体内的高突变率，这为从表位特异的免疫应答中逃离的病毒创造了机会且为基于T细胞的疫苗途径提出了特别挑战(Altfield等人，J.Virol.，77：12764-12772，2002；Bhardwaj等人，Nat.Med.，9：13-14，2003；Brander等人，Curr.Opin.Immunol，11：451-459，1999；Letvin等人，Nat.Med.，9：861-866，2003)。已探究了引起对HIV-1的有效免疫性的多种疫苗策略。在这些策略中，通过编码HIV蛋白抗原的基因的质粒DNA的免疫法是有希望的疫苗途径(Mascola等人，Curr.Opin.Immunol，13：489-494，2001；Nabel，GJ.，Nature，410：1002-1007，2001)。基于基因的免疫法促进宿主细胞合成和病毒抗原的表达及细胞细胞质中生理性翻译后加工和折叠。因此，DNA免疫法在动物模型中引起对多种免疫原的CD4+和CD8+T淋巴细胞应答(Graham，B.S.，Annu.Rev.Med.，53：207-221，2002；Rollman et al.，Gene Ther.，11：1146-1154，2004；Barouch et al.，Science，290：486-492，2000；Subbramanian et al.，J.Virol，77：10113-10118，2003；Mascola et al.，J.Virol，79：771-779，2005)。
相对于其它载体输送系统，通过DNA质粒疫苗载体输送病毒抗原具有潜在的优点，特别是没有抗载体免疫性。尽管许多例子显示DNA免疫法在小鼠和非人的灵长类中存在疫苗诱导的预防(Rollman et al.，GeneTher.，11：1146-1154，2004；Donnelly et al.，Nat.Med.，1：583-587，1995)，但是，其在人体内只显示出有限的免疫原性。证实在抗原-初始型(antigen-
Figure A20058003120700091
)人类中具有免疫原性的第一个DNA疫苗是由Biojector
Figure A20058003120700092
输送的、表达来自恶性疟原虫的环子孢子抗原的构建体。在此研究中，仅在效应物的体外扩张后检测到CD8+CTL应答(Wang et al.，Science，282：476-480，1998)。另一报导描述了由不同的无针注射装置，PowderjectTM，输送的表达乙型肝炎表面抗原的DNA质粒在抗原-初始型人类中诱导抗体以及疫苗-特异性T细胞应答(Roy et al.，Vaccine，19：764-778，2000)。在HIV-感染的和HIV-未感染的个体中测试(MacGregoret al.，J.Infect.Dis.，178：92-100，1998)的表达HIV-1Env和Rev蛋白的DNA质粒疫苗与不良反应不相关，但是只观察到散在的淋巴组织增生和抗体应答(MacGregor et al.，J.Infect.Dis.，181：406，2000；MacGregor et al.，AIDS，16：2137-2143，2002)。
本公开描述了疫苗组合物，该疫苗组合物通过提供对应于人免疫缺陷病毒1的多进化枝和病毒株的重要的免疫原性表位的HIV抗原的强烈表达，引起广谱的抗HIV的免疫性。本发明的前述及其它目的、特征和优点通过参考附图的如下详细说明更显而易见。
概述
本公开涉及编码HIV抗原的核酸构建体。这些核酸构建体能够引起抗HIV多种变体的免疫应答，并适于治疗性(例如，预防性)给药。在免疫原性组合物的情况下，将多种核酸组合，每一核酸编码HIV抗原性多肽，例如，不同的HIV抗原性多肽(例如，Gag、Pol和Nef)。单个的免疫原性组合物包括编码HIV的多进化枝和病毒株的抗原性多肽的核酸构建体，该HIV的多进化枝和病毒株为例如Gag、Pol或Nef的多进化枝或病毒株，或者Gag、Pol和Nef上的多进化枝或病毒株。因此，当向个体给药时，所述组合物引起抗在人类中流行的多种进化枝或病毒株的免疫应答。
还描述了使用所述组合物的方法。这类方法包括例如，为了引起抗HIV的多种进化枝或病毒株的免疫应答，将包括所公开的核酸构建体的组合物向个体给药。可将所述组合物单独地，或与另外的免疫原性组合物联合给药。
本发明的前述及其它目的、特征和优点通过参考附图的如下详细说明更显而易见。
附图的简要说明
图1为多进化枝、多价HIV疫苗组合物的示意图。
图2是质粒VRC 4401的示意图。
图3是质粒VRC 4409的示意图。
图4是质粒VRC 4404的示意图。
图5是质粒VRC 5736的示意图。
图6是质粒VRC 5737的示意图。
图7是质粒VRC 5738的示意图。
图8A示意表示具有不同转录调节序列的抗原性表达构建体。图8B是显示不同构建体的相对表达的Western印迹图。
图9A和9B是说明在用具有不同转录调节序列的表达质粒免疫的小鼠中CD4+和CD8+T细胞应答的条形图。
图10A、10B和10C为说明在用具有CMV/R转录控制序列或CMV IE转录控制序列的核酸构建体免疫的小鼠中抗HIV Gag、Pol和Nef抗原的相对免疫应答的条形图。
图11A、11B和11C为说明在用不同疫苗组合物免疫的短尾猴猕猴中抗HIV Gag、Pol、Nef和Env抗原的相对免疫应答的条形图。
图12A、12B和12C为说明在使用不同疫苗组合物的短尾猴猕猴的免疫接种后，产生抗HIV免疫应答时程的条形图。
图13为说明在用VRC-HIVDNA016-00-VP免疫的人中，通过细胞内细胞因子染色(ICS)测定的细胞免疫应答的一系列的条形图。
序列表的简要说明
SEQ ID NOs：1-6分别表示VRC-HIVDNA016-00-VP质粒4401、4409、4404、5736、5737和5738。这些质粒中每一质粒是表达单一的HIV抗原性多肽的核酸构建体。
SEQ ID NOs：7-15表示嵌合Env质粒。
SEQ ID NOs：16-19表示腺病毒载体。
SEQ ID NOs：20-25分别表示示例性的Gag、Pol、Nef、进化枝A Env、进化枝B Env和进化枝C Env多肽。
SEQ ID NO：26表示CMV/R转录调节序列。
详细说明
本公开涉及适于用作预防性HIV-1疫苗的核酸构建体。相对于现有的HIV疫苗候选物，本文公开的组合物的具体实例提供了两个显著优点。这类组合物表现了增加的表达和免疫原性，并能够引起抗HIV的多种趋异病毒株的免疫应答。所述疫苗包括不同核酸构建体的混合物，并被设计成产生Gag、Pol、Nef和Env HIV-1蛋白以引起广泛的抗人体感染中分离出的多种HIV-1亚型的免疫应答。最典型地，将所述核酸结合在质粒载体内。多质粒疫苗的示例性临床实施方案被指定为WC-HIVDNA016-00-VP。
本文所公开的示例性疫苗的开发原理是将gag、pol和nef基因分散在分别的核酸构建体内，例如质粒，而不是具有一个产生融合蛋白免疫原的构建体，先前开发的HIV疫苗就是此种情况。在示例性实施方案中，该核酸构建体已被修饰以在体内增加免疫原性蛋白产物的产生。所述修饰包括：1)改变结合在这些质粒内的启动子和/或2)向gag基因中加入68个氨基酸(例如，在VRC 4401(仅Gag蛋白)质粒中)。然而，先前的HIV疫苗质粒最通常使用巨细胞病毒(CMV)即早期启动子以调节编码抗原性多肽的多核苷酸序列的转录，在本文公开的核酸构建体中，将编码免疫原性HIV多肽的核苷酸序列与称为CMV/R的启动子可操作性连接。该CMV/R启动子先前在公开的第20040259825号美国专利申请中进行了描述，在此引入其全部的公开内容。
只要包括对应于多进化枝和/或病毒株的抗原，本文公开的核酸构建体可结合本质上编码任何HIV抗原性多肽的多核苷酸序列。参照共同指定为VRC-HIVDNA016-00-VP疫苗组合物的核酸构建体的具体实例，详细地描述了该组合物。图1中描述了此示例性实施方案。
所述疫苗组合物VRC-HIVDNA016-00-VP包括6个闭环的质粒DNA大分子，VRC 4401、VRC 4409、VRC 4404、VRC 5736、VRC 5737和VRC 5738，该质粒DNA大分子可例如以相等浓度(mg/mL)组合。VRC4401编码进化枝B HIV-I Gag结构核心蛋白，该核心蛋白包壳病毒RNA并存在高度的保守域。VRC 4409编码进化枝B聚合酶(Pol)，其也是高度保守的，以及VRC 4404编码进化枝B Nef，辅助蛋白，在天然感染中增加了强烈的抗该辅助蛋白的T细胞应答。通过引入影响蛋白酶、逆转录酶和整合酶活性的区域变化，将表达HIV-1 Pol的DNA质粒进行了修饰以减少潜在的毒性。将在HIV-1 nef基因内的豆蔻酰化位点中的两个氨基酸删除以消除I类MHC和由Nef蛋白引起的CD4+下调。未对Gag的氨基酸序列进行修饰。其它三种质粒表达来自HIV-1的三种病毒株，VRC5736(进化枝A)、VRC 5737(进化枝B)和VRC 5738(进化枝C)的修饰的、截短的包膜糖蛋白(gρ145)的合成形式。用于产生编码Env的DNA质粒的序列源于病毒的三种HIV-1CCR5趋向的病毒株。已将这些基因修饰以改进免疫原性，这已在小鼠和猴子中证实。将所述疫苗设计为对广泛的HIV-1病毒株引发免疫应答。
在特别实例中，含Gag、Pol、Nef和Env互补DNA(cDNAs)的质粒用于将相关插入片段亚克隆在质粒DNA表达载体内，该载体使用CMV/R启动子和牛生长激素多腺苷酸化序列。使用序列合成产生了表达HIV-1基因的所有质粒，从而增加基因表达，该序列是为通过使用通常在人中发现的密码子破坏限制蛋白表达的病毒RNA结构而设计的。用1型人T-细胞白血病病毒(HTLV-1)长末端重复(LTR)的5’-非翻译HTLV-1R-U5区替代CMV即早期区1增强子的翻译增强子区，以进一步优化基因表达。
通常在含卡那霉素选择性培养基的细菌细胞培养中产生所述DNA质粒。在所有这类情况中，细菌细胞生长都依赖于由该质粒DNA的一部分编码的耐卡那霉素蛋白的细胞表达。在含有所述质粒的细菌细胞生长后，从细胞组分中纯化出该质粒DNA。在特别实例中，所述Gag质粒(VRC4401)为5886个核苷酸对长度并具有约3.9MDa的分子量；所述Pol质粒(VRC 4409)为7344个核苷酸对长度并具有约4.8MDa的分子量；所述Nef质粒(VRC 4404)为5039个核苷酸对长度并具有约3.3MDa的分子量；所述进化枝A、B和C Env质粒(VRC 5736、5737和5738)分别为6305、6338和6298核苷酸长度，并均具有约4.2MDa的分子量。
因此，本公开一方面涉及能够引起抗HIV的免疫应答的组合物。例如，当单独或与至少一种另外的免疫原性组合物联合给药时，本公开的组合物能够引起抗HIV的保护性免疫应答。本领域内的技术人员应当理解暴露于抗原后产生免疫应答的能力是复杂的细胞和体液处理的作用，并且不同的个体具有不同的对免疫刺激应答的能力。据此，本文公开的组合物能够在免疫活性个体中引起免疫应答，即该个体通过产生基本正常的免疫应答，在生理上能够对免疫刺激进行应答，例如，该免疫应答包括产生特异性地与该免疫刺激相互作用的抗体，和/或产生具有特异性地与该免疫刺激相互作用的受体的功能性T细胞(CD4+和/或CD8+T细胞)。还应理解，有HIV感染的特殊作用是使先前的免疫活性个体免疫缺陷。因此，关于如下讨论的治疗方法，通常期望的是在暴露于HIV之前将所述组合物向个体给药(即，预防性，例如，作为疫苗)或者是暴露于HIV后某一时间的治疗性的给药，但是在此期间，该个体能够对诸如抗原性多肽的刺激产生免疫应答。
所述组合物包括多种(即两种、三种、四种、五种、六种或甚至更多种)不同的核酸构建体。通常存在该不同核酸构建体中每一个核酸构建体的多拷贝。不同核酸构建体中每一核酸构建体包括编码HIV抗原性多肽的多核苷酸序列，该多核苷酸序列与能够在系统或局部给药后在个体细胞内指引其表达的转录调节序列可操作性地连接。在所述核酸构建体中，包括编码HIV的多于一种(多种)进化枝或病毒株的抗原性多肽的多核苷酸序列。因此，所述组合物包括多种核酸构建体，多种核酸构建体中至少两种引入了编码来自不同进化枝或病毒株的HIV抗原性多肽的多核苷酸序列。通常，所述组合物包括编码来自至少三种不同进化枝或病毒株的HIV抗原性多肽的核酸构建体。
在一实施方案中，所述组合物包括多种单独的核酸构建体，每一核酸构建体包括与CMV/R转录控制序列可操作性连接的编码HIV抗原性多肽的多核苷酸序列。在一实例中，所述CMV/R转录控制序列具有SEQID NO：26的序列。在另一实施方案中，所述组合物包括多种单独的核酸构建体，每一核酸构建体包括编码单一的HIV抗原性多肽的多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述核酸构建体为质粒。
所述组合物通常包括含有编码HIV Gag多肽的多核苷酸序列的第一核酸构建体、含有编码HIV Pol多肽的多核苷酸序列的第二核酸构建体，含有编码HIV Nef多肽的多核苷酸序列的第三核酸构建体，和含有编码HIV Env多肽的多核苷酸序列的至少一种另外的核酸构建体。所述组合物还可包括一种或多种另外的含有编码不同HIV进化枝或病毒株的Env多肽的多核苷酸序列的核酸构建体。
例如，所述第一核酸构建体能够包括编码进化枝B Gag多肽的多核苷酸序列，第二核酸构建体能够包括编码进化枝B Pol多肽的多核苷酸序列，以及第三核酸构建体能够包括编码进化枝B Nef多肽的多核苷酸序列。或者，第一、第二和第三核酸构建体能够包括编码诸如进化枝A或进化枝C等等不同进化枝的Gag、Pol和Nef多肽的多核苷酸序列。例如，所述组合物可包括如下核酸构建体：包含编码与SEQ ID NO：20具有至少约95％序列同一性的Gag多肽的多核苷酸序列的核酸构建体；包含编码与SEQ ID NO：21具有至少约95％序列同一性的Pol多肽的多核苷酸序列的核酸构建体和/或包含编码与SEQ ID NO：22具有至少约95％序列同一性的Nef多肽的多核苷酸序列的核酸构建体。在一实施方案中，所述免疫原性组合物包括具有编码SEQ ID NO：20的Gag多肽的多核苷酸序列的第一核酸构建体，具有编码SEQ ID NO：21的Pol多肽的多核苷酸序列的第二核酸构建体，和具有编码SEQ ID NO：22的Nef多肽的多核苷酸序列的第三核酸构建体。例如，所述组合物可包括如下核酸构建体：包含与SEQ ID NO：1的第1375-2883位具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列的核酸构建体；包含与SEQ ID NO：2的第1349-4357位具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列的核酸构建体和/或包含与SEQ ID NO：3的第1392-2006位具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列的核酸构建体，或具有通过一个或多个简并密码子的替代与该提及序列不同的多核苷酸序列。在一实施方案中，所述组合物包括由SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3(质粒VRC 4401、VRC 4409和VRC 4404)表示的核酸构建体，或与其具有至少95％序列同一性的构建体。
另外，所述组合物可包括编码来自不同进化枝或病毒株的Env多肽的多种核酸构建体。例如，该组合物能够包括含有编码进化枝A Env多肽的多核苷酸序列的第一另外的核酸构建体，含有编码进化枝B Env多肽的多核苷酸序列的第二另外的核酸构建体和含有编码进化枝C Env多肽的多核苷酸序列的第三另外的核酸构建体。通常，因为进化枝A、B和C共同地在世界范围内的HIV感染中占最高比例，所以使用进化枝A、进化枝B和进化枝C Env多肽。但是，本领域技术人员应理解可产生包含来自HIV进化枝或病毒株的任意组合的Env多肽的组合物。在某些实施方案中，所述免疫原性组合物包括如下核酸构建体：含有编码与SEQ IDNO：23有至少95％序列同一性的进化枝A Env多肽的多核苷酸序列的第一另外的核酸构建体；含有编码与SEQ ID NO：24有至少95％序列同一性的进化枝B Env多肽的多核苷酸序列的第二另外的核酸构建体；和/或编码与SEQ ID NO：25有至少95％序列同一性的进化枝C Env多肽的多核苷酸序列的第三另外的核酸构建体。在一实施方案中，所述组合物包括如下核酸构建体：具有编码SEQ ID NO：23的进化枝A Env多肽的多核苷酸序列的第一另外的核酸构建体；具有编码SEQ ID NO：24的进化枝B Env多肽的多核苷酸序列的第二另外的核酸构建体；和具有编码SEQ IDNO：25的进化枝C Env多肽的多核苷酸序列的第三另外的核酸构建体。例如，所述免疫原性组合物能够包括如下核酸构建体：与SEQ ID NO：4的第1392-3272位具有至少约95％同一性的多核苷酸序列的核酸构建体；与SEQ ID NO：5的第1384-3312位具有至少约95％同一性的多核苷酸序列的核酸构建体和/或与SEQ ID NO：6的第1392-3272位具有至少约95％同一性的多核苷酸序列的核酸构建体。在一实施方案中，所述免疫原性组合物包括SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的核酸构建体(分别为质粒VRC 5736、5737和5738)，或具有至少95％序列同一性的构建体，或通过简并密码子的替代与该提及序列不同的构建体。
因此，在某些实施方案中，所述免疫原性组合物包括具有编码Gag多肽的多核苷酸序列的第一核酸构建体、具有编码Pol多肽的多核苷酸序列的第二核酸构建体、具有编码Nef多肽的多核苷酸序列的第三核酸构建体、具有编码进化枝A Env多肽的多核苷酸序列的第四核酸构建体、具有编码进化枝B Env多肽的多核苷酸序列的第五核酸构建体和具有编码进化枝C Env多肽的多核苷酸序列的第六核酸构建体。在一这种实施方案中，第一核酸构建体编码与SEQ ID NO：20具有至少95％序列同一性的多肽，第二核酸构建体编码与SEQ ID NO：21具有至少95％序列同一性的多肽；第三核酸构建体编码与SEQ ID NO：22具有至少95％序列同一性的多肽；第四核酸构建体编码与SEQ ID NO：23具有至少95％序列同一性的多肽；第五核酸构建体编码与SEQ ID NO：24具有至少95％序列同一性的多肽和第六核酸构建体编码与SEQ ID NO：25具有至少95％序列同一性的多肽。在实施方案中，所述免疫原性组合物包括6种核酸构建体，其中一种或多种核酸构建体与SEQ ID NO：1的第1375-2883位；SEQ IDNO：2的第1349-4357位；SEQ ID NO：3的第1392-2006位；SEQ ID NO：4的第1392-3272位；SEQ ID NO：5的第1384-3312位和SEQ ID NO：6的第1392-3272位具有至少95％同一性。例如，所述组合物能够包括具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的多核苷酸序列的6种核酸构建体(分别位质粒VRC4401、VRC 4409、VRC 4404、VRC 5736、VRC 5737和VRC 5738)，或具有至少95％序列同一性的构建体，或通过简并密码子的替代与所提及序列不同的构建体。当在免疫原性组合物中被组合时，所述核酸构建体可以基本相等的重量比(大约1∶1∶1∶1∶1∶1的比例)组合。
在某些情况中，所述组合物包括核酸构建体，每一该构建体编码单一进化枝或病毒株的HIV抗原性多肽。在其它情况中，包括引入编码嵌合Env多肽的多核苷酸序列的核酸构建体是有用的。因此，在某些实施方案中，所述核酸构建体可编码与SEQ ID NOs：7-15之一编码的多肽具有至少95％同一性的嵌合Env多肽。
通常，当组方向个体给药时，所述组合物还可包括药物可接受的载体或赋形剂，例如，水性载体，如磷酸盐缓冲液(PBS)或其它中性的生理盐溶液。所述组合物还可包括佐剂或其它免疫刺激性分子。所述组合物可一次或多次向个体给药以引起免疫应答。例如，所述组合物可每隔至少约28天或如逻辑关系或治疗关系所指示的在不同间隔时多次给药。
因此，本公开的特征包括用于HIV感染的治疗性或预防性治疗的药物组合物或药物。还特别地关注本文公开的组合物在用于HIV感染的治疗性或预防性治疗的药物的制备中的用途。上文公开的关于组合物的任何限制或制剂适用于其用于或作为治疗HIV感染的药物。
本公开的另一方面涉及通过将上述的组合物向人类个体给药来引起抗HIV的免疫应答的方法。当向免疫活性给体给药时，所述组合物能够引起抗HIV的多种进化枝或病毒株的免疫应答。例如，在一实施方案中，所述方法涉及将包括多个不同核酸构建体的组合物给药，每一该核酸构建体包括与CMV/R转录控制序列可操作地连接的编码HIV抗原性多肽的多核苷酸序列。在另一实施方案中，所述方法涉及将包括多个不同核酸构建体的组合物给药，每一该核酸构建体包括编码单一的HIV抗原性多肽的多核苷酸序列。在某些实施方案中，所给药的核酸构建体是质粒。的确，任一上述组合物在本文公开的方法中均适于向人类个体给药。
可将一个剂量或多个剂量的所述组合物向个体给药以引起具有所要特征的免疫应答，该免疫应答包括产生HIV特异性抗体、或产生与HIV反应的功能性T细胞。在某些实施方案中，将所述组合物肌肉内给药，例如采用无针输送装置给药。或者，可将所述组合物通过诸如静脉内、经皮肤、鼻内、口服(或通过其它粘膜)的其它途径给药。
在一些实施方案中，所述方法还涉及将编码HIV抗原性多肽的病毒载体给药或者与一种或多种已述的核酸构建体联合给药。在某些情况中，该病毒载体是腺病毒载体(例如复制缺陷型腺病毒载体)。例如，可将一个剂量或多个剂量的“引发剂”组合物(如上述公开的)向个体给药，随后将一个剂量或多个剂量的包括编码HIV抗原性多肽的多种腺病毒载体在内的“加强剂”组合物给药。在某些实施方案中，所述腺病毒载体编码一种或多种的与该引发剂组合物中前给药的HIV抗原性多肽是完全相同的HIV抗原性多肽。示例性重组腺病毒载体如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示。当然，还可使用可替代的腺病毒载体，例如编码与这些序列之一编码的多肽有至少约95％序列同一性的多肽的腺病毒载体，或与这些序列之一享有至少约95％序列同一性的腺病毒载体。
在另一方面，本公开关注分离的或重组的核酸，该核酸包括与CMV/R转录调节序列可操作地连接的编码HIV抗原性多肽的多核苷酸序列。例如，这种核酸可以是质粒或病毒载体。该多核苷酸序列可编码HIV Gag多肽、HIV Pol多肽、HIV Nef多肽或HIV Env多肽。在一些实例中，所述核酸构建体编码的HIV多肽只是分离的或重组的核酸编码的HIV抗原。这些核酸编码的示例性多肽由SEQ ID NOs：20-25表示，并包括与SEQID NOs：20-25氨基酸序列具有至少95％同一性的序列。例如，这种核酸可包括与SEQ ID NO：1的第1375-2883位；SEQ ID NO：2的1349-4357位；SEQ ID NO：3的1392-2006位；SEQ ID NO：4的1392-3272位；SEQ IDNO：5的1384-3312位或SEQ TD NO：6的1392-3272位具有至少95％同一性的多核苷酸序列，可将任一序列与CMV/R转录调节序列操作地连接。例如，该CMV/R转录控制序列可以与SEQ ID NO：26具有至少95％序列同一性、这类核酸的示例性实施方案包括分别由SEQ ID NOs：1-6表示的质粒VRC 4401、VRC 4409、VRC 4404、VRC 5736、VRC 5737和VRC5738。
在其它实施方案中，所述核酸包括编码引入多种HIV进化枝或病毒株的至少一个亚序列的嵌合HIV多肽的多核苷酸序列。例如，该嵌合HIV多肽可以是包括不同HIV进化枝或病毒株的亚序列在内的嵌合Env多肽。这类核酸的实例包括SEQ ID NOs：7-15，以及基本上类似的多核苷酸序列，例如与SEQ ID NOs：7-15之一具有至少约95％序列同一性的序列，或一个或多个简并密码子已相互替代的多核苷酸序列。或者，所述核酸可包括与转录调节序列而不是与CMV/R转录调节区(例如，CMV即早期启动子增强子或如下讨论的其它启动子和/或强化剂增强子)可操作地连接的编码嵌合HIV Env多肽的多核苷酸序列。嵌合Env多肽也是本公开的特征。
在下文具体的主题标题中提供了另外的技术细节。为了更容易地理解本公开的多种实施方案，提供具体术语的下列解释。
术语
除非另有解释，本文所用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域内普通技术人员通常所了解的含意相同的含意。在分子生物学中普通术语的定义可在Benjamin Lewin，Genes V，由Oxford UniversityPress出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(eds.)，TheEncyclopedia of Molecular Biology，由Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(ed.)，Molecular Biology andBiotechnology：a Comprehensive Desk Reference，由VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)中找到。
单数的术语“a”、“an”和“the”除非上下文清楚地表示否则包括复数指示物。相似地，词语“或者”除非上下文清楚地表示否则应包括“和”。术语“多个”指两个或更多。还应理解给定的核酸或多肽的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有的分子量或分子质量值是近似值，且提供用于描述。尽管可在本公开的实践或试验中使用相似的或等同于本文所描述的方法和材料，下文描述了适合的方法和材料。术语“包含”是指“包括”。缩略语“e.g.(如)”是源于拉丁语exempli gratia(例如)，并本文用于表示非限制性例子。因此，缩略语“如”是与术语“例如”是同义的。
为了更容易的评述本公开的多种实施方案，提供特殊术语的下列解释：
佐剂：用于增强抗原性的介质(vehicle)；例如抗原被吸附在其上的矿物(明矾、氢氧化铝、磷酸铝)的混悬液；或油包水型乳液，其中抗原溶液被乳化于油中(MF-59，弗氏不完全佐剂)，有时包括被杀死的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性(抑制抗原的降解和/或引起巨噬细胞的流入)。佐剂还包括免疫刺激性分子，如细胞因子、共刺激分子，和例如免疫刺激性DNA或RNA分子，如CpG寡核苷酸。
抗原：可在动物体内刺激抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质，包括被注入、吸收或引入动物体内的组合物。术语“抗原”包括所有相关的抗原表位。“抗原性多肽”是可刺激诸如T细胞应答或抗体应答的免疫应答的多肽。“表位”或“抗原决定簇”指B细胞和/或T细胞应答的在抗原上的位点。在一实施方案中，当表位以与MHC分子连同存在时，T细胞对该表位应答。表位可由连续氨基酸或由通过抗原性多肽的三级折叠并列的非连续氨基酸形成。暴露于变性溶剂时，由连续氨基酸形成的表位通常能够保留，而用变性溶剂处理时，通常失去通过三级折叠形成的表位。表位通常包括以独特的空间构象存在的至少3个氨基酸、且更通常包括至少5个、约9个或约8-10个氨基酸。测定表位的空间构象的方法包括，例如，x-射线衍射晶体分析法和多维核磁共振光谱法。
抗体：免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原(与抗原免疫应答)的抗原结合部位的分子。天然存在的抗体(例如，IgG、IgM、IgD)包括四个多肽链，通过二硫键互连的两个重链(H)和两个轻链(L)。短语“抗体应答”指抗抗原的免疫应答，包括分泌对抗原特异的抗体。抗体应答是通过抗原(或表位)与B细胞表面上的B细胞受体(膜结合的IgD)相互作用开始的B细胞介导的免疫应答。B细胞受体被其同源抗原刺激并结合后，该B细胞分化为分泌抗原特异性免疫球蛋白以产生抗体应答的浆细胞。“中和抗体”是结合病毒上的表位来例如在噬菌斑中和分析中测定的抑制感染和/或复制的抗体。
cDNA(互补DNA)：缺乏内在的非编码区段(内含子)和决定转录的调节序列的一类DNA。cDNA通常在实验室中由从细胞中提取的信使RNA通过反转录来合成。在制备包括编码HIV抗原性多肽的多核苷酸序列在内的核酸构建体的上下文中，可例如由HIV RNA基因组(或基因组片断)通过反转录或扩增(例如，通过聚合酶链反应，PCR)来制备cDNA。
宿主细胞：细胞，可在其中繁殖诸如多核苷酸载体或病毒载体的多核苷酸并表达其DNA。该细胞可以是原核的或真核的。该术语还包括个体宿主细胞的任何子代。应理解所有子代可以不与其亲代细胞完全相同，因为在复制过程可发生突变。但是，当使用术语“宿主细胞”时包括这种子代。因此，可将本文描述的核酸构建体引入宿主细胞内，在该宿主细胞中可表达其多核苷酸序列(包括编码HIV抗原性多肽的多核苷酸序列)。
免疫应答：诸如B细胞、T细胞或单核细胞的免疫系统细胞对刺激的应答。在某些情况下，该应答对特定抗原是特异的(即，“抗原特异性应答”)。在某些情况下，免疫应答是T细胞应答，如CD4+应答或CD8+应答。或者，该应答是B细胞应答，并导致特异抗体的产生。“保护性免疫应答”是抑制病原体(如HIV)的有害功能或活性、减少由该病原体引起的感染，或减轻因感染该病原体引起的症状(包括死亡)的免疫应答。可例如通过空斑减少分析或ELISA中和分析(NELISA)中抑制病毒复制或空斑形成，或通过在实验性系统中体内测定对病毒激发的抵抗力来测定保护性免疫应答。
免疫原性组合物：包含病原生物的至少一种表位的组合物，当给予免疫活性个体时，其诱导可测的CTL反应，或诱导可测的B细胞应答(例如，产生特异性结合该表位的抗体)，或者诱导两者。因此，免疫原性组合物为能够在免疫活性个体中引起免疫应答的组合物。例如，免疫原性组合物可以包括编码HIV抗原性多肽的一个或多个免疫原性表位的分离的核酸构建体(例如质粒或病毒载体)，该HIV抗原性多肽可用来表达表位(并因此可以用于引起抗该多肽或由病原体表达的相关多肽的免疫应答)。对于体外应用，所述免疫原性组合物可由分离的核酸、蛋白质或肽组成。对于体内应用，所述免疫原性组合物通常包括在药物可接受的载体或赋形剂和/或诸如佐剂的其它试剂中表达免疫原性抗原表位的核酸或病毒。可通过本领域公认的分析容易地测试免疫原性多肽(例如HIV抗原)或编码该多肽的核酸的诱导CTL或抗体应答的能力。
药物可接受的载体和/或药物可接受的赋形剂：所用的药物可接受的载体或赋形剂是常规的。E.W.Martin的Remington’s PharmaceuticalSciences(雷明顿制药学)，Mack Publishing Co.，Easton，PA，第15版(1975)描述了适用于本文所公开的多肽和多核苷酸的药物输送的组合物和制剂。
一般而言，所述载体的性质依赖于所使用的特殊给药方式。例如，肠胃外给药制剂经常包含可注射的液体，该可注射的流体包括药物及生理可接受的液体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油或其它类似物作为介质。对于固体组合物(例如粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体包括，例如药品级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性的载体外，欲给药的药物组合物可以包含小量的无毒辅料，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂，及pH缓冲剂等等，例如醋酸钠或山梨醇单月桂酸酯。
“治疗有效剂量”是用于在个体内达到预期效应的组合物的量。例如，可以为抑制病毒(或其它病原体)复制，或预防或可测定地改变病毒(或其它病原体)感染的外在症状的所必需的组合物量。当向给体给药时，通常使用达到靶组织浓度(例如，在淋巴细胞中)的剂量，该剂量已表现出获得体外作用。
抑制或治疗疾病：抑制HIV感染指抑制由暴露于人类免疫缺陷病毒引起的疾病的全部发展。例如，抑制HIV感染指减轻由于感染该病毒而产生的症状，例如在已知已暴露于该病毒的人中预防症状的发展，或在暴露于该病毒的个体中减少病毒负载或病毒感染。“治疗”指改善或抑制或避免与个体感染了病毒相关的疾病或病理学状态的病征或症状的治疗性或预防性干预。
个体：活的多细胞脊椎动物生物，包括人和兽医学个体的种类，包括人和非人类动物。在关于HIV的临床情况中，个体通常是人。免疫活性个体通常是能够对抗原刺激产生基本正常的免疫应答的个体。
T细胞：对免疫应答至关重要的白细胞。T细胞包括，但不限于CD4+T细胞和CD8+T细胞。CD4+T淋巴细胞是在其表面上携带称为CD4的标记的免疫细胞，例如“辅助”T细胞。这些细胞液称为辅助T细胞，帮助编排包括抗体应答和杀伤性T细胞应答在内的免疫应答。CD8+T细胞携带CD8标记，并包括具有细胞毒性功能或“杀伤性”效应子功能的T细胞。
转导或转染：转导细胞是例如通过分子生物技术已将核酸分子引入其内的细胞。如本文所用，术语引入或转导包括可将核酸分子引入这类细胞的所有技术，该技术包括用质粒载体进行转化，用病毒载体进行转染和通过电穿孔术、脂质转染法和基因枪加速来引入裸露DNA。
疫苗：疫苗是在个体内引起预防性或治疗性免疫应答的药物组合物。在某些情况中，该免疫应答是保护性免疫应答。通常，疫苗引起对病原体抗原的抗原特异性免疫应答。在本公开的上下文中，所述疫苗引起抗HIV的免疫应答。本文描述的疫苗包括编码HIV抗原的诸如质粒或病毒载体的核酸构建体。
载体：引入宿主细胞内的核酸分子，从而产生被转化的宿主细胞。载体可包括允许其在宿主细胞内复制的核酸序列，如复制起始区。载体还可包括在一种或多种可选择的标记基因和本领域内公知的其它遗传元件。术语载体包括质粒、线性核酸分子和诸如腺病毒载体和腺病毒的病毒载体。术语腺病毒载体本文用来指包括在宿主细胞内产生病毒颗粒的腺病毒的一种或多种组分的核酸。这种颗粒可以能够感染和复制一轮或多轮或可以是例如由突变引起的复制缺陷。腺病毒包括编码至少一部分组装病毒的核酸。因此，在许多情况下，该术语可互换使用。
编码HIV抗原的核酸构建体
本公开关注包括编码人免疫缺陷病毒-1(“HIV-1”或简言之“HIV”)抗原性多肽的多核苷酸序列的核酸构建体。术语多核苷酸或核酸序列指至少10个碱基长度的核苷酸的聚合形式。所述核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或任一种核苷酸的修饰形式。该术语包括单链或双链形式的DNA。在本公开中，该核酸构建体是“重组”核酸。重组核酸是具有非天然存在的序列的核酸或是具有由两种单独的序列片断的人工重组形成的序列的核酸，例如异源序列，其不与两个编码序列直接相邻，在其来源的生物体的天然存在的基因组中其与该两个编码序列直接相邻(一个在5’端及一个在3’端)。通常通过化学合成，或更通常地例如通过基因工程技术将分离的核酸片断进行人工操作来实现人工重组。
在某些情况中，所述核酸是“分离的”核酸。“分离的”核酸(以及类似地，分离的蛋白)已从天然存在该核酸的生物体细胞中其它生物组分中基本上分离或纯化，该其它生物组分例如其它染色体的和染色体外的DNA和RNA、蛋白质和细胞器。已被“分离的”核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。该术语还包括通过在宿主细胞内重组表达制备的核酸和蛋白以及化学合成的核酸。
“HIV抗原性多肽”或“HIV抗原”可包括能够在免疫活性的哺乳动物体内引起免疫应答的任何蛋白质HIV分子或其部分。“HIV分子”是人免疫缺陷病毒的一部分的分子，由人免疫缺陷病毒的核酸序列进行编码，或衍生于或合成性地基于任一这类分子。编码引起免疫应答的HIV抗原的核酸的给药优选地导致抗HIV的保护性免疫。在这点上，对HIV的“免疫应答”是对任何一种或多种HIV抗原的免疫应答。
合适的HIV抗原的实例包括所有的或部分的HIV Gag、Pol、Nef或Env蛋白。在该病毒中，Gag蛋白是病毒衣壳的组分。Pol多蛋白提供了逆转录酶(RT)；整合酶(IN)和蛋白酶(PR)功能，其将病毒RNA反转录为整合在宿主细胞的染色体内的双链DNA，并分别将gag-pol衍生的蛋白剪切成功能性多肽。Nef多肽是参与确定该病毒感染后的病原性的负调节因子。Env蛋白是参与将病毒附着并融合进靶细胞的包膜蛋白。本领域内技术人员理解可改变多肽的功能性性质(例如，删除)，而未改变该多肽的抗原性质。每一Gag、Pol、Nef或Env的免疫原性变体或片段也是可包括在本文公开的免疫原性组合物内的HIV抗原性多肽。免疫原性变体包括例如与SEQ ID NOs：20-25具有至少90％、95％或98％序列同一性的变体，或其免疫原性片段。本文公开的核酸疫苗可包括SEQ ID NOs：1-19、或者编码SEQ ID NOs：20-25所示的HIV抗原或与SEQ ID NOs：20-25具有至少90％、95％或98％序列同一性的HIV抗原的序列。
合适的Env蛋白是本领域内公知的，并包括，例如gp160、gp120、gp41和gp140。HIV的任何进化枝对抗原选择是恰当的，包括HIV进化枝A、B、C等等。因此，应理解以下HIV抗原的任意一种或者组合可用在所发明的方法中：HIV进化枝A gp140、Gag、Pol、Nef和/或Env；HIV进化枝B gp140、Gag、Pol、Nef和/或Env蛋白；以及HIV进化枝C gp140、Gag、Pol、Nef和/或Env蛋白。尽管详细描述了关于Gag、Pol、Nef和/或Env蛋白的所述组合物和方法，但是能够在哺乳动物体内诱导免疫应答的任何HIV蛋白或其部分可用在所发明的方法中。来自HIV进化枝A、B、C的HIV Gag、Pol、Nef和/或Env蛋白以及编码这类蛋白的核酸序列以及操作和将这类核酸序列插入载体的方法是公知的(参见，例如，HIV Sequence Compendium，Division of AIDS，National Institute ofAllergy and Infectious Diseases，2003，HIV Sequence Database(在世界范围的网址是hiv-web.lanl.gov/content/hiv-db/mainpage.html)，Sambrook等人，Molecular Cloning，a Laboratory Manual(分子克隆，实验手册)，第二版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989，和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学的当前方案)，GreenePublishing Associates and John Wiley & Sons，New York，N.Y.，1994)。
Gag、Pol、Nef和Env多肽序列在本领域内是公知的，且多数氨基酸序列可从公众易接近的诸如GENBANK
Figure A20058003120700251
的数据库中获得。例如，对应链HXB2的氨基酸序列的Gag多肽由GENBANK
Figure A20058003120700252
登录号K03455序列表示。对应链NL4-3的氨基酸序列的Pol和Nef多肽由GENBANK
Figure A20058003120700253
登录号M19921表示。示例性Env多肽，例如，对应进化枝A、B和C的Env多肽分别由ENBANK
Figure A20058003120700254
登录号U08794、K03455和AF286227表示。由本文公开的核酸构建体编码的特定的示例性序列由SEQ ID NOs：20-25表示，分别对应Gag、Pol、Nef、进化枝A Env、进化枝B Env和进化枝C Env。这些示例性多肽的某些多肽已被功能修饰(如在实施例中进一步详细表明)但是仍保留了天然存在蛋白的重要的抗原特性。
不需要全部的、完整的HIV蛋白产生免疫应答。实际上，HIV蛋白的大多数抗原表位在大小上相对较小。因此，HIV蛋白的片段(例如，表位或其它抗原片段)，例如本文公开的HIV蛋白的任何片段可用作HIV抗原。HIV Gag、Pol、Nef和/或Env蛋白的抗原片段和表位以及编码这类抗原片段和表位的核酸序列是公知的(参见，例如，HIV Immunology andHlV/SrV Vaccine Databases(HIV免疫学和HIV/SIV疫苗数据库)，第一卷，Division of AIDS，National Institute of Allergy and Infectious Diseases，2003)。
当引入在构建体内的多核苷酸序列包括一个或多个开放阅读框时，则认为该核酸构建体“编码”抗原，当该开放阅读框被细胞转录和翻译过程识别和活化时，其产生组成该抗原的氨基酸序列。
如果HIV抗原包含不同的抗原性氨基酸序列，则它们是“不同的”。当提及多种不同的HIV抗原时，两种或多种不同的HIV抗原可以是任何HIV抗原，如两种或多种(或三种、或四种、或五种、或六种、或更多种)本文公开的HIV抗原。不同的HIV抗原性多肽可以是两种或多种来自不同HIV蛋白的抗原性多肽，该HIV蛋白是由HIV基因组中的不同基因编码的蛋白(例如，HIV Gag多肽与HIV Pol多肽不同，其与HIV Nef多肽不同，其还与HIV Env多肽不同)。因此，Gag、Pol、Nef和Env是不同的HIV蛋白或抗原性多肽。或者，如果不同的HIV抗原性多肽是由来自HIV的不同病毒株或进化枝的同源基因组区段(或基因)编码，则该HIV抗原性多肽是不同的。因此，进化枝A Env多肽与进化枝B Env多肽不同，与进化枝C Env多肽不同等等。关于本文公开的免疫原性(例如，疫苗)组合物，两个或多个不同的HIV抗原包括来自两种或多种不同的HIV进化枝或病毒株的HIV抗原，例如来自三种或多种不同的HIV进化枝(例如，进化枝A、B和C)或来自同一进化枝的两种或多种变体HIV病毒株。与将哺乳动物的免疫系统暴露于仅仅单一的HIV抗原中相比，将该免疫系统暴露于不同HIV抗原的“鸡尾酒”中可引起更广泛的和更有效的免疫应答。
因此，多种单独的核酸构建体可包括相同进化枝或病毒株(例如，全部为进化枝B)的多种编码的多肽或不同进化枝或病毒株的(例如，一些为进化枝A的，另一些为进化枝B的)编码的多肽，每一该核酸构建体包含编码单一的HIV抗原性多肽的多核苷酸序列，其中该多个核酸构建体编码多种抗原性多肽或多种HIV进化枝或病毒株。
在一些特别公开的实施方法案种，所述组合物包括多种不同的核酸构建体。该核酸构建体包括与转录控制序列可操作地连接的编码单一的(不超过一次)HIV抗原的多核苷酸序列，以及该单一的HIV抗原对于不同的核酸构建体是不同的。在特别实例中，该不同核酸构建体的不同的单一HIV抗原是相同进化枝或病毒株的不同的编码的多肽，但是还可包含由不同构建体表达的、与共享相同进化枝或病毒株的编码的多肽不同的进化枝或病毒株的不同的编码的多肽。例如，编码相同进化枝或病毒株的HIV抗原的不同核酸构建体可以是分别编码Gag、Pol和Nef的三种单独的构建体，该Gag、Pol和Nef作为仅由每一该构建体表达的HIV抗原，且每一Gag、Pol和Nef是相同进化枝或病毒株的(例如，所有为进化枝B的)。另外，在一些实施方案中，所述组合物还可包括编码不同进化枝或病毒株的Env抗原的多个单独的核酸构建体。例如，至少三个单独的构建体独立地编码作为其仅有的被编码的HIV抗原的进化枝A Env、进化枝B Env和进化枝C Env。
例如，核酸构建体可包含编码单一HIV抗原性多肽的多核苷酸序列。在本文提供的具体实例中，所述核酸构建体编码单一的Gag多肽，单一的Pol多肽、单一的Nef多肽或单一的Env多肽。例如，所述核酸构建体可包含编码诸如进化枝B Gag多肽(例如，SEQ ID NO：20的氨基酸序列)的单一的Gag多肽的多核苷酸序列；编码诸如进化枝B Pol多肽(例如，SEQ ID NO：21)的单一的Pol多肽的多核苷酸序列；编码诸如进化枝B Nef多肽(例如，SEQ ID NO：22)的单一的Nef多肽的多核苷酸序列；或编码诸如进化枝A、进化枝B或进化枝C Env多肽(例如，SEQ ID NO：23、SEQID NO：24和SEQ ID NO：25)的单一的Env多肽的多核苷酸序列。编码这些多肽的示例性核酸构建体分别由SEQ ID NOs：1-6表示。
可选择地，核酸构建体可包括编码HIV抗原性多肽的多核苷酸序列，该HIV抗原性多肽包含多种进化枝或病毒株的亚序列，即为“嵌合的”HIV多肽。嵌合的HIV抗原性多肽可包括两种或多种进化枝或病毒株的亚序列，例如三种或更多种不同的进化枝或病毒株的亚序列。例如，嵌合的HIV Env多肽可包含进化枝A Env多肽的一种或多种亚序列与进化枝B Env多肽的一种或多种亚序列和/或进化枝C Env多肽的一种或多种亚序列的组合，或者与具有不同氨基酸序列的、HIV的不同进化枝A病毒株(或病毒株类)的一种或多种亚序列的组合。类似地，进化枝B和C Env多肽的亚序列可以与其它进化枝和/或病毒株的亚序列组合。包含嵌合的Env多肽的核酸构建体由SEQ ID NOs：7-15表示。
通常，编码所述HIV抗原性多肽的所述核酸构建体是质粒。但是，其它载体(例如，病毒载体，噬菌体、黏粒等等)可用于复制所述核酸。在本公开中，所述核酸构建体通常是表达载体，该表达载体含有促进宿主中所插入的遗传序列的有效转录的启动子序列。该表达载体通常包含复制起点，启动子，以及允许转化细胞表型选择的特异的核酸序列。在示例性的核酸构建体中，将所述编码序列可操作地连接使其处于人巨细胞病毒(CMV)即早期(IE)增强子/启动子的转录控制下，该即早期增强子/启动子已被修饰为包含来自1型人T-细胞白血病病毒(HTLV-1)的长末端重复(LTR)的R区的调节序列。该转录调节序列被指定为“CMV/R”或“CMV/R启动子”。该CMV/R转录调节序列(或者称为“转录控制序列”)以5’至3’方向包含：CMV IE增强子/启动子；HTLV-1R区；以及CMV IE3’内含子的123碱基对(bp)片段。该CMV/R转录调节序列给予在其控制下可操作连接的HIV抗原基本上增强的表达和改进的细胞免疫应答。示例性CMV/R由SEQ ID NO：26表示。但是，可使用保留调节特性或已被修饰以增强表达的、包含与SEQ ID NO：26具有至少约90％或95％或98％同一性的转录调节区的转录控制序列。
更通常地，可将编码HIV抗原性多肽的多核苷酸序列与引入至宿主细胞后能够引发所述核酸表达的任何启动子和/或增强子操作地连接。启动子是指导核酸转录的核酸控制序列。启动子包含(可以)邻近转录起始位点的必要的核酸序列，例如II型聚合酶启动子(TATA元件)的情况。启动子还可包含可位于距转录起始位点有数千个碱基对远的远端增强子或阻抑物元件。包括组成型和诱导型两种启动子(参见，例如，Bitter等人，Methods in Enzymology 153：516-544，1987)。启动子的具体的非限制性例子包括源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如，可使用细胞巨化病毒即早期基因启动子、逆转录病毒长末端重复；腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。还可使用由重组DNA或合成技术产生的启动子。当将第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，可将该第一核酸序列与该第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则可将该启动子与该编码序列可操作地连接。
为了产生这类核酸构建体，将编码HIV抗原性多肽的多核苷酸序列插入合适的表达载体内，该表达载体例如为使用所述CMV/R启动子和牛生长激素多腺苷酸化序列以调节表达的质粒表达载体。该CMV/R启动子由用1型人T-细胞白血病病毒(HTLV-1)长末端重复(LTR)的5’-非翻译HTLV-1R-U5区替代CMV即早期1区增强子(CMV-IE)的翻译增强子区组成以优化基因表达。该HIV-1多核苷酸序列通常被修饰以优化在人细胞中的表达。将该质粒表达载体引入至细菌细胞内，例如在卡那霉素选择性培养基中的培养中生长的大肠杆菌。在所有情况中，细菌的细胞生长依赖于由一部分该质粒DNA编码的耐卡那霉素蛋白的细胞表达。在含有所述质粒的细菌细胞生长后，将该质粒DNA从细胞组分中纯化出来。产生编码HIV抗原性多肽的多核苷酸序列和在体外操作它们的方法是本领域内技术人员公知的，并可参见上述引用的Sambrook和Ausubel。
除了编码本文公开的由SEQ ID NOs：20-25所示多肽的多核苷酸序列外，例如本文公开的SEQ ID NOs：1-6(以及编码由SEQ ID NOs：7-15所示的嵌合的Env多肽的核酸和编码由SEQ ID NOs：16-19所示的腺病毒载体的核酸)、所述核酸构建体可包含编码基本上与SEQ ID NOs：20-25相似的多肽的变体多核苷酸序列(例如，基本上与SEQ ID NOs：1-6和/或SEQID NOs：16-19相似的多核苷酸序列)。类似地，所述核酸构建体可包含编码基本上与SEQ ID NOs：7-15编码的多肽相似的嵌合型多肽的多核苷酸。氨基酸(和多核苷酸)序列之间的相似性以序列之间的相似性方式表达，或另外指序列同一性。序列同一性通常以同一性(或相似性)百分比的方式测定；百分比越高，则两个序列的一级结构越相似。通常，两个氨基酸序列的一级结构越相似，则由折叠和装配产生的高级结构越相似。HIV抗原性多肽的变体(例如，特定进化枝的多肽)可具有一个或小量的氨基酸缺失、添加或替代，但是其氨基酸(和通常其多核苷酸序列)依然享有非常高百分比的同一性。就相互不同的亚型的变体来说，保持其全部的抗原特征。相反，不同进化枝的HIV抗原享有较少的序列同一性和/或是相互不同的，因此其抗原特征不再是同一的。因此，所述核酸构建体可包含编码在氨基酸序列上与SEQ ID NOs：20-25具有至少约90％或95％或98％同一性的多肽的多核苷酸，或者可包含与一种或多种SEQ ID NOs；1-19具有至少约90％或95％或98％序列同一性的多核苷酸和/或通过简并密码子的替代与这些序列之一不同的多核苷酸。
测定序列同一性的方法是本领域公知的。多种方案和比对公式在如下文献中描述：Smith and Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981；Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.48：443，1970；Higgins and Sharp，Gene73：237，1988；Higgins and Sharp，CABIOS 5：151，1989；Corpet et al，NucleicAcids Research 16：10881，1988；和Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988。Altschul et al，Nature Genet.6：119，1994提供了序列比对方法和同源性计算的详细讨论。Basic Local Alignment SearchTool(NCBI基本局部比对探索工具)(BLAST)(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403，1990)可从包括the National Center for BiotechnologyInformation(国立生物技术信息中心)(NCBI，Bethesda，MD)和因特网在内的多种来源中得到，用于与序列分析方案blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx相关联。在因特网上的NCBI网站上获得如何使用该方案来测定序列同一性的说明。
两核酸之间的序列相似性的另一标记是杂交的能力。两个核酸序列越相似，则它们杂交的条件越严紧。杂交条件的严紧性是序列依赖的，且在不同的环境参数下是不同的。因此，导致特定严紧度的杂交条件将依赖于所选择的杂交方法的性质和杂交核酸序列的组成和长度而变化。通常，杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是Na+和/或Mg++浓度)决定杂交的严紧性，虽然漂洗时间也影响严紧性。通常，在确定的离子强度和pH中，所选择的严紧条件是比特定序列的热熔点(Tm)低约5℃至20℃。该Tm是(在确定的离子强度和pH中)50％的靶序列杂交至优先配对的探针上的温度。核酸杂交的条件和严紧性的计算可例如在如下文献中找到：Sambrook et al，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001；Tijssen，Hybridization With Nucleic Acid Probes，Part I：Theory and Nucleic AcidPreparation，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Elsevier Science Ltd.，NY，NY，1993和Ausubel et al.Short Protocols inMolecular Biology，第四版，John Wiley & Sons，Inc.，1999。
对了本公开的目的，“严紧条件”包含如果在杂交分子和靶序列之间存在少于25％的不匹配才发生杂交的条件。“严紧条件”可分解至更精确定义的特定的严紧性水平。因此，如本文所用的，“轻度严紧性”条件是具有多于25％序列不匹配的分子不杂交的条件；“中度严紧性”条件是具有多于15％不匹配的分子不杂交的条件；“高严紧性”的条件是具有多于10％不匹配的序列不杂交的条件。“非常高严紧性”的条件是具有多于6％不匹配的序列不杂交的条件。相反，在“低严紧性条件”下杂交的核酸包括具有更少序列同一性的核酸，或仅在该核酸的短亚序列上具有序列同一性的核酸。例如，核酸构建体可包含在高严紧性或非常高严紧性或甚至更高严紧性条件下与编码任一SEQ ID NOs：20-25的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列。类似地，该核酸构建体可在这类条件下与任一SEQ ID NOs：1-19杂交。
因此，除了编码由SEQ ID NOs：20-25所示的特定氨基酸序列的多核苷酸以外，例如由密码子优化的SEQ ID NO：s1-19构建体所示的那些多核苷酸，用于所述疫苗组合物的所述核酸构建体可包含具有高百分比序列同一性的多核苷酸序列，例如，在高严紧性或非常高严紧性(或甚至更高严紧性)条件下与这些序列之一杂交的多核苷酸序列。在天然存在的或突变的HIV病毒株中发现的在一个或多个位置处的密码子组合也包含在本文公开的核酸构建体内。本领域的技术人员可易于鉴别众多HIV多核苷酸序列，且确定可改变哪个核苷酸而基本上不改变所编码的多肽的氨基酸内容。另外，编码具有少量氨基酸增加、缺失或替代的变体的多核苷酸序列也包含在本文描述的核酸构建体内。通常，任何氨基酸增加、缺失和/或替代均位于不改变所述抗原表位且不干扰折叠或其它翻译或翻译后过程的位置。最通常地，任何氨基酸替代是保守的氨基酸替代。例如，变体多核苷酸序列可编码具有一个或两个或三个或四个或五个或多个氨基酸增加、缺失或替代的HIV抗原性多肽。
特定氨基酸的保守变体是本领域内公知的，并可例如从表1中所列的组中选择。
表1：保守性氨基酸替代
Figure A20058003120700321
免疫原性组合物
联合应用的所述核酸构建体，例如由SEQ ID NOs：1-6示例性描述的核酸构建体可用于提供引起广谱的抗HIV免疫应答的免疫原性组合物。该核酸构建体的具体组合本文称为VRC-HIVDNA016-00-VP，且包含分别对应SEQ ID NOs：1-6的所述质粒VRC-4401、VRC-4409、VRC-4404、VRC-5736、VRC 5737和VRC-5738。
包含编码不同HIV抗原的两种或多种核酸构建体的所述组合物通常由包含多种核酸构建体的组合物来提供，每一核酸构建体编码单一的HIV抗原。集合起来，该两种或多种核酸构建体编码来自多于一种进化枝或病毒株的抗原，例如来自两种或更多种进化枝或病毒株的抗原、或来自三种或更多种进化枝或病毒株的抗原。在某些情况中，所述组合物包含编码具有多于一种进化枝或病毒株的亚序列的嵌合的HIV抗原的多核苷酸序列。
为了临床目的，诸如在制备所述疫苗中使用的质粒和宿主大肠杆菌菌株的所有核酸构建体由如下文献中的有关部分来表征：“Points toConsider in the Production and Testing of New Drugs and BiologicalsProduced by Recombinant DNA Technology”(由重组DNA技术产生的新药物和生物剂的产生和测试中的关注点)(1985)，the“Supplement：NucleicAcid Characterization and Genetic Stability”(增补：核酸表征和遗传稳定性)(1992)，和“Points to Consider in Human Somatic Cell Therapy and GeneTherapy”(人体细胞治疗和基因治疗中的关注点)(1991，1998)，“Points toConsider on Plasmid DNA Vaccines for Preventive Infectious DiseaseIndications”(适于预防传染病适应症的质粒DNA疫苗)(1996)。另外对于临床试验和用途，根据current Good Manufacturing Practices(现行优良生产管理规范)(cGMP)的方式产生所有组合物。
因此，在一实施方案中，所述免疫原性组合物是VRC-HIVDNA016-00-VP，6种组分的多进化枝质粒DNA疫苗，表达来自进化枝B HIV-1的Gag、Pol和Nef蛋白和来自进化枝A、B和C的Env糖蛋白。该组合物适于HIV的预防性治疗，即作为预防的HIV-1疫苗。该疫苗已被设计为引起抗来自许多种HIV-1病毒株的多种蛋白的免疫应答。该疫苗在两个显著方面与先前的多进化枝疫苗组合物不同。首先，先前的组合物依赖于编码Gag-Pol-Nef融合蛋白的单一质粒。在本文公开的特定实例中，这些三个蛋白被分散在三个单独编码Gag(VRC4401)、Pol(VRC 4409)和Nef(VRC 4404)的不同质粒内。另外，与该先前的融合蛋白组合物相比，在gag基因中增加了68个氨基酸。第二，所述启动子被修饰为包含1型人T-细胞白血病病毒(HTLV-1)长末端重复(LTR)的5’-非翻译的HTLV-1R-U5区，而不是包含在先前构建体中使用的CMV即早期1区增强子的翻译增强子区的一部分。例如，用含有CMV/R转录调节区的质粒向非人类的灵长类进行接种与用未修饰的CVM IE启动子/增强子序列构建的质粒进行接种相比，引起更高和更一致的HIV-1特异性细胞免疫应答。
将VRC-HIVDNA016-00-VP设计为引起抗来自许多种HIV-1病毒株的多种蛋白的免疫应答。该疫苗产品是由编码HIV-1进化枝B Gag-Pol融合蛋白的初期的HIV-1DNA质粒产品(VRC-4302；BB-IND 9782)进化的。证实在小动物中免疫原性蛋白表达的临床前研究，以及正在进行的I期临床试验表明迄今为止在测试剂量下无安全性问题。该VRC-HIVDNA016-00-VP疫苗(BB-IND 10681)在产品概念上扩展至包含来自HIV-1多种亚型(进化枝)的蛋白，并将疫苗组分的数量增加以包含高度免疫原性调节蛋白(Nef)，和能够在猕猴体内产生免疫应答修饰的包膜糖蛋白。
根据在猕猴和小鼠中实施的临床前免疫原性研究以及由四种质粒和两种另外的Gag-Pol-Nef表达质粒组成的疫苗产品(VRC-HIVDNA006-00-VP)的临床前安全性研究，选择该四种质粒的产品，VRC-HIVDNA009-00-VP进行临床试验。根据这些质粒产品的生物安全性测试，以及在该候选疫苗VRC-HIVDNA009-00-VP(BB-IND 10681)和VRC-HIVDNA016-00-VP之间的高度的同源性，确定该六种质粒疫苗对人临床试验是安全的。
治疗方法
本文描述的编码HIV抗原性多肽的核酸构建体例如联合用作适用于治疗方案、例如预防方案(如疫苗)的药物组合物(药物)，以及向个体(例如，人类个体)给药以引起抗HIV的一种或多种进化枝或病毒株的免疫应答。例如，在注射HIV之前，可将本文描述的组合物向人类(或非人类)个体给药以抑制由该病毒引起的感染或抑制病毒复制。因此，可将上述药物组合物向个体给药以引起抗HIV的预防性免疫应答。为了引起免疫应答，将治疗有效(例如，免疫有效)剂量的所述核酸构建体向诸如人类(或非人类)个体的个体给药。
“治疗有效量”是化学组合物(例如，核酸构建体或载体)在进行治疗的个体中用于达到预期效应的量。例如，其可以是表达足够量的抗原以引起抗体应答或T细胞应答所需要的量，或者是抑制或预防由病毒引起的感染或病毒复制所需要的量，或者是预防、减轻或改善由病毒感染引起的症状所需要的量。当向给体给药时，通常使用到达靶组织或达到为获得体外作用根据经验确定的全身浓度的剂量。本领域内技术人员无需进行过多试验就可确定这种剂量。在实施例中详细描述了示例性剂量。
包括HIV编码核酸构建体在内的药物组合物可通过本领域技术人员公知的任何方式来给药(参见Banga，A.，Therapeutic Peptides and Proteins中的“Parenteral Controlled Delivery of Therapeutic Peptides andProteins，”(治疗性肽和蛋白的肠胃外控制输送)，Technomic Publishing Co.，hie，Lancaster，PA，1995；Douglas B.Lowrie和Robert G.Whalen(Eds.)的DNA Vaccines：Methods and Protocols(Methods in Molecular Medicine)，Humana Press，2000)，例如通过肌肉内、皮下或静脉内注射给药，但是甚至考虑口服、鼻内或肛门给药。在一实施方案中，给药是通过皮下或肌肉内注射实现的。制备可给药组合物的实际方法是本领域技术人员公知的或显而易见的，并在诸如Remingtons Pharmaceutical Sciences(雷明顿制药学)，第19版，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，1995年的出版物中更详细地描述。
诸如本文公开的初始物(primer)或强化剂(booster)组合物的所述核酸构建体的合适制剂包括可含有抗氧化剂、缓冲液和抑菌剂的水溶液和非水溶液、等渗无菌溶液，可包含助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的含水无菌混悬液和非水无菌混悬液。所述制剂可提供在诸如安瓿和小瓶的单位剂量或多次剂量密封容器中，并可在冷冻干燥(冻干)条件下贮存，只需要在使用前即刻加入诸如水的无菌液体载体。可由无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备临时溶液和混悬液。优选地，所述载体为缓冲盐溶液。更优选地，将在所述发明方法中使用的组合物组方以便在给药前保护所述核酸构建体使其免于被破坏。例如，可将所述组合物组方以减少所述腺病毒载体在诸如玻璃器皿、注射器或针的用于制备、贮存或给药所述表达载体的装置上损失。可将所述组合物组方以降低所述组分的光敏感性和/或温度敏感性。为此目的，所述组合物优选含有诸如上述液体载体的药物可接受液体载体和选自如下的稳定剂：聚山梨醇酯80、L-精氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及其组合。这种腺病毒载体组合物的应用将延长该载体的贮存期限、便于给药和增加所述发明方法的有效性。含腺病毒载体的组合物的制剂还在如下专利中描述：第6,225,289、6,514,943号美国专利、第2003/0153065A1号美国专利申请公开和第WO 00/34444号国际专利申请公开。还可将腺病毒载体组合物组方以增强转导效率。
另外，本领域技术人员应理解所述组合物可包含其它治疗剂或生物活性剂。例如，诸如布洛芬或类固醇的控制炎症的试剂可以是腺病毒载体组合物的一部分以减少与该腺病毒载体的体内给药相关的肿胀和炎症。如本文所讨论的，可将免疫系统刺激物给药以增强对所述抗原的任何免疫应答。可提供抗菌素，即杀微生物剂和杀真菌剂以治疗存在的感染和/或减少将来感染的风险，如与基因转移操作相关的感染。
可将所述组合物给药以用于治疗性治疗。在治疗应用中，在暴露于HIV或HIV感染之前或之后，将治疗有效量的所述组合物向给体给药。当在暴露前给药，该治疗应用可称为预防性给药(例如，疫苗)。根据所述个体需要和耐受的剂量和频率，可将所述组合物单次或多次给药。在一实施方案中，将所述剂量以大丸剂(bolus)的形式一次给药，但是在另一实施方案中，周期性地使用所述剂量直到获得诸如保护性免疫应答的治疗结果为止。通常，所述剂量足以治疗或缓解疾病的症状或体征，而不对所述个体产生不可接受的毒性。可使用全身给药或局部给药。
可将控释的肠胃外给药制剂制备为埋植剂、油性注射剂或为颗粒体系。颗粒体系包括微球、微粒、微囊、纳米囊、纳米球和纳米颗粒。比约1μm小的颗粒、微球和微囊通常分别称为纳米颗粒、纳米球和纳米囊。毛细血管具有约5μm的直径，因此只有纳米颗粒可静脉内给药。微粒通常直径为约100μm，可皮下或肌肉内给药(参见Kreuter，Colloidal DrugDelivery Systems，J.Kreuter，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，NY，pp.219-342，1994；Tice & Tabibi，Treatise on Controlled Drug Delivery，A.Kydonieus，ed.，Marcel Dekker，Inc.New York，NY，pp.315-339，1992)。
在某些实施方案中，所述药物组合物包含佐剂。佐剂可以是诸如明矾、氢氧化铝、磷酸铝的矿物混悬液，抗原吸附于该矿物上；或油包水型乳液，其中抗原溶液被乳化在油中(MF-59，弗氏不完全佐剂)，有时包含被杀死的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性(抑制抗原的降解和/或引起巨噬细胞流入)。关于核酸疫苗，结合并刺激参与先天免疫的受体的天然存在或合成的免疫刺激性组合物可与编码所述HIV抗原性多肽的核酸构建体一起给药。例如，刺激某些Toll样受体(例如TLR7、TLR8和TLR9)的试剂可与编码HIV抗原性多肽的所述核酸构建体联合给药。在一些实施方案中，所述核酸构建体可与免疫刺激性CpG寡核苷酸联合给药。
可将编码HIV抗原性多肽的核酸构建体作为裸露DNA质粒引入体内。通过本领域内公知的方法可将DNA载体引入至预期的宿主细胞内，该方法包括但不限于转染、电穿孔(例如，经皮肤的电穿孔)、显微注射、转导、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀、基因枪的应用或DNA载体转运体的应用(参见，例如Wu et al. J.Biol.Chem.，267：963-967，1992；Wu and Wu J.Biol.Chem.，263：14621-14624，1988；和Williams et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：2726-2730，1991)。如在实施例中详细描述的，可使用诸如BIOJECTOR
Figure A20058003120700371
无针注射装置的无针输送装置以体内引入所述治疗性核酸构建体。还可使用受体-介导的DNA输送途径(Curiel et al.Hum.Gene Ther.，3：147-154，1992；和Wu and Wu，J.Biol.Chem.，262：4429-4432，1987)。配制并将裸露DNA向哺乳动物肌肉组织给药的方法在第5,580,859和5,589,466号美国专利中公开，在此将这两个专利引入作为参考。其它分子也可用于促进核酸在体内转染，例如阳离子寡肽(例如WO95/21931)、源于DNA结合蛋白的肽(例如WO96/25508)或阳离子聚合物(例如WO95/21931)。
可选择地，可方便使用电穿孔以将编码HIV抗原的核酸构建体引入细胞内。电穿孔是本领域内技术人员公知的(参见，例如：Lohr et al.CancerRes.61：3281-3284，2001；Nakano et al.Hum Gene Ther.12：1289-1297，2001；Kim et al.Gene Ther.10：1216-1224，2003；Dean et al.Gene Ther.10：1608-1615，2003；和Young et al.Gene Ther 10：1465-1470，2003)。例如，在电穿孔中，向宿主细胞(例如分离的自体外周血细胞或骨髓细胞)的混悬液中加入高浓度的DNA载体，并用电场休克该混合物。可将透皮的电穿孔用于动物和人类以在体内将异源的核酸引入实体组织(例如，肌肉)内。通常，通过将含所述DNA的溶液引入靶组织内，例如，使用与输送一次或多次电脉冲的电极连接的针或套管针来在体内将所述核酸构建体引入组织中。例如，可使用一系列的电脉冲以优化转染，例如3至10次的100V和50毫秒脉冲。在某些情况下，实施多阶段或给药。
可用来将编码HIV抗原的核酸构建体引入宿主细胞内的另一公知的方法是粒子轰击(也称为生物射弹转化)。通常以多种方式之一实现生物射弹转化。一种普通方法涉及推进在细胞处的惰性或生物活性粒子。在Sanford等人的第4,945,050、5,036,006和5,100,792号美国专利中公开了该技术，在此引入作为参考。通常，该方法涉及在有效穿透细胞的外表面并引入至细胞内部的条件下，推进在细胞处的惰性或生物活性粒子。当使用惰性粒子时，可通过用含有外源性DNA的质粒包被该粒子来将该质粒引入细胞。或者，可用所述质粒包围靶细胞以便通过粒子的觉醒来将该质粒运载进该细胞内。
可选择地，可通过脂质转染法体内引入所述载体。对于过去十年多来，脂质体越来越多地用于包囊和体内转染核酸。为减少脂质体介导的转染所遇到的困难和危险而设计的合成的阳离子脂质可用于制备适于将编码标记的基因进行体内转染的脂质体(Feigner et.al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7417，1987；Mackey，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：8027-8031，1988；Ulmer et al.Science 259：1745-1748，1993)。阳离子脂质的应用可促进与带有负电荷的细胞膜融合(Feigner and Ringold Science337：387-388，1989)。用于转移核酸的特别适用的脂质化合物和组合物在WO95/18863和WO96/17823以及在第5,459,127的美国专利中描述，在此引入作为参考。
在其它实施方案中，所述核酸构建体是病毒载体。用于构建并使用病毒载体的方法是本领域公知的(参见，例如Miller and Rosman，BioTeck，7：980-990，1992)。优选地，该病毒载体是复制缺陷型，即，其不能够在所述靶细胞中自主复制。通常，在本公开范围内使用的该复制缺陷型病毒载体的基因组缺乏至少一个在受感染的细胞中病毒复制所必需的区。这些区可以是去除的(全部或部分)，或者通过本领域技术人员公知的任何技术使其无功能性。这些技术包括全部去除、替代(被其它序列替代，特别被所插入的核酸替代)、部分缺失或向(复制)必需区增加一个或多个碱基。这类技术可在体外(例如，在分离的DNA上)实施。
在某些情况在，所述复制缺陷型病毒保留使病毒颗粒壳体化所必需的基因组的序列。DNA病毒载体通常包括减弱的或缺陷的DNA病毒，包括但不限于单纯疱疹病毒(HSV)、乳头瘤病毒属、EB病毒(EBV)、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、莫洛尼白血病病毒(MLV)和人免疫缺陷病毒(HIV)等等。因为在引入细胞内后缺陷病毒不具有感染性，因此优选完全或几乎完全缺乏病毒基因的缺陷病毒。缺陷病毒载体的应用允许向特定的局部区域中的细胞给药，而无需考虑该载体可感染其它细胞。因此，可特异性地靶向特定组织。特殊载体的实例包括但不限于缺陷型疱疹病毒1(HSV1)载体(Kaplitt et al.MoL Cell.Neurosci，2：320-330，1991)、缺乏糖蛋白L基因的缺陷型疱疹病毒载体(参见，例如，专利公开RD 371005A)、或其它缺陷型疱疹病毒载体(参见，例如WO 94/21807和WO 92/05263)；减毒的腺病毒载体，如Stratford-Perricaudet等人描述的载体(J.Clin.Invest.，90：626-6301992；La Salle et al.，Science 259：988-990，1993)；和缺陷型腺伴随病毒载体(Samulski et al.，J.Virol.，61：3096-3101，1987；Samulski et al.，J.Virol，63：3822-3828，1989和Lebkowski et al.，Mol.Cell.Biol，8：3988-3996，1988)。
在一实施方案中，所述载体是腺病毒载体。腺病毒是可被修饰以有效地向许多种细胞类型输送本公开的核酸的真核DNA病毒。存在多种血清型腺病毒。这些血清型中，在本公开的范围内，优选2型或5型人腺病毒(Ad 2或Ad 5)或动物来源的腺病毒(参见，例如WO94/26914)。那些可用在本公开范围内的动物来源的腺病毒包括犬、牛、鼠(例如Mavl，Beard et al.Virol，75-81，1990)、猪、禽和猿(例如SAV)来源的腺病毒。在一些实施方案中，该动物来源的腺病毒是犬腺病毒、如CAV2腺病毒(例如Manhattan或A26/61病毒株(ATCC VR-800))。
本文所述的复制缺陷型腺病毒载体包括ITRs、所关注的壳体化序列和多核苷酸序列。在一些实施方案中，至少该腺病毒的E1区是无功能性的。在该E1区的缺失优选地从Ad5腺病毒序列中的核苷酸455扩展至核苷酸3329(PvuII-BglII片段)或从382扩展至3446(HinfII-Sau3A片段)。还可修饰其它区，特别是E3区(例如WO95/02697)、E2区(例如WO94/28938)、E4区(例如WO94/28152、WO94/12649和WO95/02697)或任一晚期基因L1-L5。
在其它实施方案中，所述腺病毒载体在E1区有缺失(Ad 1.0)。在欧洲专利185,573中公开了E1-缺失的腺病毒的实例，在此将其内容引入作为参考。在另一实施方案中，所述腺病毒载体在E1和E4区具有缺失(Ad3.0)。在WO95/02697和WO96/22378中公开了E1/E4缺失的腺病毒的实例。
本公开所述的复制缺陷型重组腺病毒可通过本领域技术人员公开的任何技术来制备(参见，例如Levrero et al.Gene 101：195，1991；EP 185573和Graham EMBO J，3：2917，1984)。特别地，可通过腺病毒与质粒之间的同源重组来制备它们，该质粒格外包括所关注的DNA序列。，将该腺病毒和质粒共转染进适合的细胞株内后完成该同源重组。所用的细胞株优选地(i)可被待使用的元件所转化，以及(ii)含有能够补充该复制缺陷型腺病毒的部分基因组的序列，优选地采用整合形式以便避免重组的危险。可使用的细胞株的例子为人胚肾细胞系293(Graham et al.J.Gen.Virol.36：59，1977)，其含有整合在其基因组内的Ad5腺病毒基因组的左手部分(12％)，以及为能够补充E1和E4功能的细胞株，如在申请WO94/26914和WO95/02697中所述。采用本领域技术人员公知的标准分子生物技术回收和纯化重组腺病毒。还可使用其它病毒载体来引入编码HIV抗原的核酸，该病毒载体例如逆转录病毒载体，如慢病毒属载体或腺病毒-伴随病毒(AAV)载体。
如在实施例中详细描述的，在一实施方案中，在暴露于HIV之前将包含核酸构建体的药物组合物引入个体内以引发保护性免疫应答，该核酸构建体编码对应HIV多种进化枝或病毒的抗原性多肽的HIV抗原。通常，该核酸构建体是质粒。例如，可将包含编码不同HIV抗原的多核苷酸序列的多种质粒包括在药物组合物内。例如，可将编码不同HIV进化枝或病毒株的抗原性多肽的一组质粒包括在该组合物内，以引发免受HIV的多种进化枝或病毒株感染的免疫性。在示例性实施方案中，所述组合物包括六种质粒。每种质粒包括与促进抗原性多肽体内表达的转录调节序列可操作地连接的编码不同HIV抗原的多核苷酸序列。例如，所述组合物可包括编码Gag多肽、Pol多肽、Nef多肽和任选的不同进化枝或病毒株的Env多肽(例如，进化枝A Env多肽、进化枝B Env多肽和/或进化枝C Env多肽)的不同质粒。在一具体实施方案中，所述疫苗组合物包括该六种质粒(分别为SEQ ID NOs：1-6所示的VRC 4409、VRC 4401、VRC-4404、VRC 5736、VRC 5737和VRC 5738)。将该特定实施方案指定为VRC-HIVDNA016-00-VP，并在实施例中进一步描述。
通常，所述多质粒组合物包括基本上等比例(例如大约1∶1∶1∶1∶1∶1)的所述六种质粒。该药物组合物可以单次剂量或多次剂量向个体给药。该剂量范围可根据所述个体的身体特征、代谢特征和免疫特征而变化，但是通常给药至少约1mg并不超过约12mg的剂量。例如，单次剂量可以是至少约2mg，或至少约3mg，或至少约4mg的组合DNA。通常，单次剂量不超过约6mg、或约8mg或约10mg的组合DNA。如在实施例中描述的，约4mg组合质粒的剂量通常在免疫活性成体中有效引发保护性免疫应答。
可将单次剂量或由时间间隔分开的多次剂量给药以引发抗HIV的免疫应答。例如，可在数周、数月或甚至数年的时间内将两次剂量、或三次剂量、或四次剂量、或五次剂量或六次剂量或更多次剂量向个体给药以优化免疫应答。
在一些情况中，可将包含所述核酸构建体的药物组合物，例如所述多质粒疫苗VRC-HIVDNA016-00-VP包括在联合治疗方案内，将其用作DNA疫苗初始物，随后腺病毒载体加强。初始-加强方案在HIV感染的非人类模型中显示出前景。这种方案具有增加高水平的免疫应答的潜在性。例如，可将包含编码至少一种HIV抗原的一种或多种核酸构建体的“初始物”组合物向个体给药，该HIV抗原与由腺病毒载体组合物中的腺病毒载体编码的HIV抗原相同。例如，可在将包含一种或多种腺病毒载体的该“加强剂”组合向个体给药至少约前1周，将该初始物组合物给药。可将该初始物组合物(例如VRC-HIVDNA016-00-VP)的一种或多种核酸序列作为基因转移载体的一部分或作为裸露DNA给药。任何基因转移载体均可用于该初始物组合物中，其包括但不限于质粒、逆转录病毒、腺伴随病毒、疫苗病毒、疱疹病毒或腺病毒。在示例性实施方案中，该转移载体是质粒。
因此，上述多质粒组合物与包含一种或多种编码HIV抗原的腺病毒载体的组合物联合给药时，其可用于引发抗HIV的免疫应答。例如，该腺病毒载体组合物可包括(i)编码两种或更多种HIV抗原的单个腺病毒载体，例如，作为多蛋白或融合蛋白，如编码Gag-Pol-Nef多肽的融合蛋白。或者，该腺病毒载体组合物可包括(ii)多种腺病毒载体，每种载体编码单一HIV抗原，例如两种或多种，如三种、或四种或更多种腺病毒载体，每一腺病毒载体编码一种诸如Env多肽的HIV抗原。与配置(i)一致，在本发明范围内使用包含编码多于两种不同HIV抗原(例如，三种或更多种、四种或更多种、或甚至五种或更多种不同的HIV抗原)或编码同一抗原的多种拷贝的核酸序列的腺病毒载体，只要该腺病毒载体编码至少两种或多种不同HIV抗原。同样的，与配置(ii)一致，在本发明范围内使用包含多种核酸序列(例如，三种或更多种、四种或更多种、或甚至五种或更多种不同的核酸序列)的腺病毒载体，每一核酸序列编码不同的HIV抗原或同一抗原的不同拷贝，只要该腺病毒载体编码至少两种不同的HIV抗原。无论是配置(i)或(ii)，该腺病毒载体组合物优选包含编码三种或更多种、甚至四种或更多种不同HIV抗原的一种或多种腺病毒载体(例如，其中每一载体包含编码三种或更多种、或四种或更多种不同HIV抗原的核酸序列，或者其中每一载体包含三种或更多种、或四种或更多种核酸序列，且每一核酸序列编码不同的HIV抗原)。在某些实施方案种，所述两种或更多种、三种或更多种、或四种或更多种不同HIV抗原来自两种或更多种、三种或更多种、或四种或更多种不同HIV进化枝。所用的腺病毒载体的数目或由其编码的不同HIV抗原的数目没有上限。
当然，上述配置的腺病毒载体的组合可用于单一组合物中。例如，根据本发明使用的所述腺病毒载体组合物可包含编码单一HIV抗原的第一腺病毒载体和编码与该第一腺病毒载体编码的HIV抗原不同的两种或更多种HIV抗原的第二腺病毒载体。本领域技术人员可易于确定本文公开的腺病毒载体配置的其它类似组合和排列。
在某些实施方案中，所述加强剂组合物包含多种腺病毒载体。例如，该加强剂可包括多种腺病毒载体，每一载体编码HIV Env多肽，如不同进化枝或病毒株的Env多肽。另外，该加强剂组合物可包含编码Gag、Pol和/或Nef多肽的腺病毒载体。在一具体实施方案种，命名为VRC-HIVDNA014-00VP的加强剂组合物包括四种腺病毒载体，其中三种腺病毒载体编码不同进化枝(即，进化枝A、进化枝B和进化枝C)的Env多肽和编码(进化枝B的)Gag和Pol抗原的腺病毒载体。当然，本领域技术人员可易于设计众多种变体，该变体结合了或多或少的腺病毒载体，和/或编码了相同或不同HIV进化枝或病毒株的抗原。
虽然由所述加强剂组合物的一种或多种核酸序列编码的HIV抗原通常与由所述初始物组合物的核酸构建体编码的HIV抗原相同，但是在一些实施方案中，适合使用包含一种或多种核酸序列的初始物组合物，该核酸序列编码与所述腺病毒载体组合物编码的抗原不同的HIV抗原。例如，不同进化枝或病毒株的Gag和/或Pol和/或Nef抗原或不同进化枝或病毒的Env抗原。
将所述初始物组合物向所述哺乳动物给药以初始化对HIV的免疫应答。可在任何合适的时帧内(例如，加强前至少约1周、2周、4周、8周、12周、16周或更多周)提供多于一个剂量的初始物组合物。优选地，在将所述加强剂组合物给药前至少3个月(例如，3个月、6个月、9个月、12个月或更多个月)将所述初始物组合物向所述哺乳动物给药。最优选地，在将所述加强剂组合物给药前至少约6个月至约9个月，将所述初始物组合物向所述哺乳动物给药。可在任何合适的时帧内提供多于一个剂量的加强剂组合物以维持免疫性。
可采用任何给药途径来向所述哺乳动物输送所述腺病毒载体组合物和/或所述初始物组合物。实际上，可采用多于一种的途径来给药所述腺病毒载体组合物和/或所述初始物组合物，但是特别的途径可比其它途径提供更迅速和更有效的反应。最通常地，所述腺病毒载体组合物和/或所述初始物组合物通过肌肉内注射给药。还可将该腺病毒载体组合物和/或该初始物组合物涂敷或慢慢灌输体腔内，经皮肤(例如，通过透皮贴剂)吸收，吸入，摄取、局部应用于组织、或通过诸如静脉内给药、腹膜给药或动脉内给药来进行肠胃外给药。
可将所述腺病毒初始物组合物和/或所述加强剂组合物在允许控释或缓释的装置内或装置上给药，该装置例如海绵、生物相容的网状物、机械贮库或机械埋植系统。植入剂(参见，例如第5,443,505号美国专利)、装置(参见，例如第4,863,457号美国专利)，例如可植入的装置，如机械贮库或埋植系统或包含聚合组合物的装置特别适用于所述组合物的给药。还将所述腺病毒载体组合物和/或所述初始物组合物以缓释制剂(参见，例如第5,378,475号美国专利)的形式给药，该缓释制剂包含例如凝胶泡沫、透明质酸、明胶、硫酸软骨素、聚磷酸酯、例如对苯二甲酸双-2-羟乙酯(BHET)、和/或聚乳酸-乙醇酸。
加强剂组合物可包括单次剂量的含有至少约1×105个腺病毒载体颗粒(也称为颗粒单位)的腺病毒载体。该剂量优选至少约1×106个所述腺病毒载体颗粒(例如，约1×106至1×1012个颗粒)，更优选至少约1×107个颗粒，更优选至少约1×108个颗粒(例如，约1×108至1×1011个颗粒或约1×108至1×1012个颗粒)，且最优选至少约1×109个颗粒(例如，约1×109至1×1010个颗粒或约1×109至1×1012个颗粒)。或者，该剂量包含不超过约1×1014个颗粒，优选不超过约1×1013个颗粒，甚至更优选不超过约1×1012个颗粒，甚至更优选不超过约1×1011个颗粒，且最优选不超过约1×1010个颗粒(例如，不超过约1×109个颗粒)。换言之，所述腺病毒载体组合物可包含单次剂量的腺病毒载体，该腺病毒载体含有例如约1×106颗粒单位(pu)、2×106pu、4×106pu、1×107pu、2×107pu、4×107pu、1×108pu、2×108pu、4×108pu、1×109pu、2×109pu、4×109pu、1×1010pu、2×1010pu、4×1010pu、1×1011pu、2×1011pu、4×1011pu、1×1012pu、2×1012pu或4×1012pu的腺病毒载体
实施例
实施例1：质粒的构建
所述核酸构建体衍生于含有人CMV即早期(IE)增强子、启动子和内含子的亲代1012DNA疫苗质粒。为了构建CMV/R调节元件，用HTLV-1R区的227bp EcoRV/HpaI片段置换该含有CMV IE内含子的大主要部分的1012质粒的SacII/HapI片段(Seiki et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：3618-3622，1983)。所得到的CMV/R质粒因此含有人CMV IE增强子/启动子，接着是HTLV-1R区和CMV IE 3’内含子的123bp片段。R区中的剪接供体和CMV IE 3’内含子中的剪接受体用作剪接信号对。类似地分别通过劳斯肉瘤病毒(RSV)增强子/启动子的381bp AflIII/HindIII片段或小鼠泛素B(mUB)增强子/启动子的842bp SpeI/EcoRV片段置换CMV/R质粒的CMV增强子/启动子区来构建RSV/R和mUB/R质粒。先前已描述了该mUB增强子/启动子(Yew et al.，Mol.Ther.4：75-82，2001)。
CMV/R进化枝B Gag/h(VRC-4401)的构建
为了构建图1中图示的DNA质粒VRC-4401，采用为在人细胞中表达而优化的密码子，将来自HXB2(GENBANK
Figure A20058003120700451
登录号K03455)的gag多蛋白(Pr55，氨基酸1-432)的蛋白序列用于产生gag基因的合成版本。该合成的gag基因的核酸序列显示出与HXB2基因具有很少的同源性，但是所编码的蛋白是相同的。将包含编码Gag(B)的该合成基因的SalI/BamHI片段从质粒VRC3900中切除，该质粒VRC3900含有与pVR1012骨架中的插入片段相同的插入片段，并克隆在上述CMV/R骨架的SalI/BamHI位点内。表2中提供了预测的VRC-4401结构域的概述。该质粒长度为5886个核苷酸碱基对(bp)且具有约3.9MDa的分子量。在SEQ ID NO：1中提供了VRC-4401的序列。
表2：质粒VRC-4401的描述
  片段名称或蛋白结构域   片段大小(bp)   预测的片段
  pUC18质粒衍生的   247   1-247
  CMV-IE增强子/启动子   742   248-989
  HTLV-1R区   231   990-1220
  CMV IE剪接受体   123   1221-1343
  合成接头   31   1344-1374
  HIV-1Gag(进化枝B)   1509   1375-2883
  合成接头   23   2884-2906
  牛生长激素聚腺苷酸   548   2907-3454
  pUC18质粒衍生的   1311   3455-4765
  耐卡那霉素基因   816   4766-5581
  pUC18质粒衍生的   305   5582-5886
CMV/R进化枝B Pol/h(VRC-4409)的构建
为了构建图2中图示的DNA质粒VRC-4409，采用为在人细胞中表达而优化的密码子，将来自NL4-3(GENBANK
Figure A20058003120700461
登录号M19921)的Pol多蛋白(氨基酸3-1003)的蛋白序列用于产生pol基因的合成版本。为了在pol的起点处开始翻译，向所合成的聚合酶基因的5’-端加入蛋氨酸密码子以产生Pol/h基因。另外，在氨基酸553处引入蛋白酶(PR)突变(AGG-＞GGC或氨基酸R-＞G)，在氨基酸771处引入逆转录酶(RT)突变(GAC-＞CAC或氨基酸D-＞H)。将表达Pol的基因插入上述的CMV/R骨架内。表3中提供了预测的VRC-4409结构域的概述。该质粒长度为7344个核苷酸碱基对(bp)并具有约4.8MDa的分子量。SEQ ID NO：2中提供了VRC-4409的序列。
表3：质粒VRC-4409的描述
  片段名称或蛋白结构域   片段大小(bp)   预测的片段
  pUC18质粒衍生的   247   1-247
  CMV-IE增强子/启动子   742   248-989
  HTLV-1R区   231   990-1220
  CMV IE剪接受体   123   1221-1343
  合成接头   5   1344-1348
  HIV-1Pol(进化枝B)(Pr-、RT-、IN-)   3009   1349-4357
  合成接头   7   4358-4364
  牛生长激素聚腺苷酸   548   4365-4912
  pUC18质粒衍生的   1311   4913-6223
  耐卡那霉素基因   816   6224-7039
  pUC18质粒衍生的   305   7040-7344
CMV/RHIV-1Nef/h fVRC-4404)的构建
为了构建图3中图示的DNA质粒VRC-4404，采用为在人细胞中表达而优化的密码子，将来自HIV-1NY5/BRU(LAV-1)克隆pNL4-3(GENBANK
Figure A20058003120700471
登录号M19921)的Nef蛋白的蛋白序列用于产生Nef基因(Nef/h)的合成版本。该核酸序列Nef/h显示出与该病毒基因具有很少的同源性，但是所编码的蛋白相同。删除豆蔻酰位点(GGC-Gly，氨基酸2-3)。从利用XbaI/BamHI从所述的pVR1012骨架中消化出编码Nef的片段，该片段最初被插入在该骨架内，然后将该片段克隆在上述CMV/R骨架的XbaI/BamHI位点内。表4中提供了预测的VRC-4404域的总结。该质粒长度位5039个核苷酸碱基对(bp)并具有约3.3MDa的分子量。SEQID NO：3中提供了VRC-4404的序列。
表4：质粒VRC-4404的描述
  片段名称或蛋白结构域   片段大小(bp)   预测的片段
  pUC18质粒衍生的   247   1-247
  CMV-IE增强子/启动子   742   248-989
  HTLV-1R区   231   990-1220
  CMV IE剪接受体   123   1221-1343
  合成接头   48   1344-1391
  HIV-1Nef(进化枝B)(δMyr)   615   1392-2006
  合成接头   19   2007-2025
  牛生长激素聚腺苷酸   548   2026-2573
  pUC18质粒衍生的   1345   2574-3918
  耐卡那霉素基因   816   3919-4734
  pUC18质粒衍生的   305   4735-5039
CMV/R-HIV-1进化枝A Env/h(VRC-5736)
为了构建图4中图示的DNA质粒VRC-5736，采用为在人细胞中表达而改变的密码子，将来自92rw020(R5-趋向性的，GENBANK
Figure A20058003120700481
登录号U08794)的包膜多蛋白(gp160)的蛋白序列用于产生基因(进化枝-Agp145delCFI)的合成版本。采用通过使用通常在人细胞中发现的密码子来破坏限制蛋白表达的病毒RNA结构而设计的序列合成产生表达所述HIV-1基因的质粒。该核苷酸序列R5gp145delCFI显示出与该92rw020基因具有很少的同源性，但是所编码的蛋白是相同的。所截短的包膜多蛋白含有完整的SU蛋白和TM结构域，但是缺乏融合和胞浆结构域。七重复(Heptad)(H)1、七重复2及其间隔(IS)参与寡聚化。删除了融合和裂解(F/CL)结构域，从氨基酸486至519。删除了七重复(H)1和2之间的间隔(IS)，从氨基酸576至604。将包含5’端的多聚接头、Kozak序列和ATG的XbaI(从ATG开始的上游18个氨基酸)至BamH1(从ATG开始的下游1912个氨基酸)片段克隆在上述CMV/R骨架的XbaI至BamH1位点内。表5提供了预测的VRC-5736域的EnvA总结。该质粒长度为6305个核苷酸碱基对(bp)并具有约4.2MDa的分子量。SEQ ID NO：4中提供了VRC-5736的序列。
表5：质粒VRC-5736的描述
  片段名称或蛋白结构域   片段大小(bp)   预测的片段
  pUC18质粒衍生的   247   1-247
  CMV-IE增强子/启动子   742   248-989
  HTLV-1R区   231   990-1220
  CMV IE剪接受体   123   1221-1343
  合成接头   48   1344-1391
  HIV-1Env(进化枝A)，gp145(delCFI)/h   1881   1392-3272
  合成接头   19   3273-3291
  牛生长激素聚腺苷酸   548   3292-3839
  pUC18质粒衍生的   1345   3840-5184
  耐卡那霉素基因   816   5185-6000
  pUC18质粒衍生的   305   6001-6305
CMV/R进化枝B Env/h(VRC-5737)的构建
为了构建图5中图示的DNA质粒VRC-5737，采用为在人细胞中表达而优化的密码子，使用来自HXB2(X4-趋向性的，GENBANK
Figure A20058003120700491
登录号K03455)的包膜多蛋白(gp160)的蛋白序列以产生基因(X4gp160/h)的合成版本。该核苷酸序列X4gp160/h显示出与该HXB2基因具有很少的同源性，但是所编码的蛋白与具有如下氨基酸替代的蛋白是相同：F53L、N94D、K192S、I215N、A224T、A346D和P470L。为了产生该包膜蛋白的趋向R5版本(R5gp160/h)，将来自X4gp160/h(VRC3300)的编码HIV-1包膜多蛋白氨基酸275至361的区用来自HIV-1的BaL病毒株(GENBANK
Figure A20058003120700492
登录号M68893，再次使用人优选的密码)的相应的区置换。全长的来自pR5gp160/h(VRC3000)的包膜蛋白基因的趋向R5版本在704位氨基酸之后的密码子处终止。该截短的包膜多蛋白(gp145)包含完整的SU蛋白和一部分TM蛋白，其包括融合域、跨膜结构域和对低聚物形成重要的区。七重复(H)1、七重复2及其间隔(IS)参与寡聚化。删除了融合和卵裂(F/CL)结构域，从氨基酸503至536。删除了七重复(H)1和2之间的间隔(IS)，从氨基酸593至620。该表达载体骨架是CMV/R，如上所述。表6中提供了预测的VRC-5737域的总结。该质粒长度位6338个核苷酸碱基对(bp)并具有约4.2MDa的分子量。SEQ ID NO：5中提供了VRC-5737的序列。
表6：质粒VRC-5737的描述
  片段名称或蛋白结构域   片段大小(bp)   预测的片段
  pUC18质粒衍生的   247   1-247
  CMV-IE增强子/启动子   742   248-989
  HTLV-1R区   231   990-1220
  CMV IE剪接受体   123   1221-1343
  合成接头   40   1344-1383
  HIV-1Env(进化枝B)，gp145(delCFI)/h   1929   1384-3312
  合成接头   12   3313-3324
  牛生长激素聚腺苷酸   548   3325-3872
  pUC18质粒衍生的   1345   3873-5217
  耐卡那霉素基因   816   5218-6033
  pUC18质粒衍生的   305   6034-6338
CMV/R HIV-1进化枝C Env/h(VRC-5738)的构建
为了构建图6中图示的DNA质粒VRC-5738，采用为在人细胞中表达而优化的密码子，使用来自97ZA012(R5-趋向性的，GENBANK
Figure A20058003120700501
登录号AF286227)的包膜多蛋白(gp145delCFI)的蛋白序列来产生基因(进化枝-C gp145delCFI)的合成版本。该核酸序列R5gp145delCFI显示出与该基因97ZA012具有很少的同源性，但是所编码的蛋白相同。所截短的包膜多蛋白含有完整的SU蛋白和TM域，但是缺乏融合和胞浆结构域。七重复(H)1、七重复2及其间隔(IS)参与寡聚化。从氨基酸487至520，删除了融合和裂解(F/CL)域。从氨基酸577至605，删除了七重复(H)1和2之间的间隔(IS)。将包含5’端的多聚接头、Kozak序列和ATG的XbaI(ATG上游的18个氨基酸)至BamH1(ATG下游的1914个氨基酸)片段克隆在所述CMV/R骨架的XbaI至BamH1位点内。表7中提供了预测的VRC-5738域的EnvA总结。该质粒长度为6298个核苷酸碱基对(bp)并具有约4.2MDa的分子量。SEQ ID NO：6中提供了VRC-5738的序列。
表7：质粒VRC-5738的描述
  片段名称或蛋白结构域   片段大小(bp)   预测的片段
  pUC18质粒衍生的   247   1-247
  CMV-IE增强子/启动子   742   248-989
  HTLV-1R区   231   990-1220
  CMV IE剪接受体   123   1221-1343
  合成接头   48   1344-1391
  HIV-1Env(进化枝C)，gp145(delCFI)/h   1881   1392-3272
  合成接头   12   3273-3284
  牛生长激素聚腺苷酸   548   3285-3283
  pUC18质粒衍生的   1345   3833-5177
  耐卡那霉素基因   816   5178-5993
  pUC18质粒衍生的   305   5994-6289
实施例2：由CMV/R转录调节序列增加HIV抗原性多肽的表达
为了评价来自含有所述CMV/R转录调节元件的质粒的抗原表达，用上述表达载体转染3T3细胞，并用Western印迹法测定gp145ΔCFI表达。使用磷酸钙，在6孔板中用均表达HIV-1Env gp145ΔCFI(9)的0.5μg的亲代1012(CMV)、CMV/R、RSV、RSV/R、mUB和mUB/R DNA疫苗转染鼠成纤维细胞3T3细胞。转染后24小时，收获细胞并在50mM HEPES、150mM NaCl、含有蛋白酶抑制剂的1％NP-40中裂解。用SDS-PAGE将10μg总蛋白电泳，并用Western印迹分析评价gp145表达。将人HIV-IgG的1∶5000稀释液用作一抗。将HRP-轭合的山羊抗人IgG的1∶5000稀释液用作二抗。用ECL Western印迹显影体系(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)显影印迹。
来自CMV/R质粒的gp145ΔCFI的表达比来自所述亲代1012质粒的表达高5倍至10倍(图8)。因此，该HILV-1R元件的添加基本上增加了由CMV启动子引发的抗原表达。来自mUB质粒的基线表达高于来自该1012质粒的基线表达，但是其不受所述R元件的添加而进一步增强(图8)，这证实添加该R元件的效应是启动子-依赖性的。与RSV质粒相比，在RSV/R中观察到表达增加(图8)。来自RSV质粒的表达常规地低于来自该1012质粒的表达。
实施例3：CMV/R介导的HIV疫苗的免疫原性
用包含所述DNA质粒疫苗VRC-HIVDNA016-00-VP的质粒构建体以及用使用重组腺病毒载体疫苗VRC-HIVADV014-00-VP的DNA质粒初始/腺病毒载体加强方案在小鼠和非人类灵长类中实施非临床性免疫原性研究。在这些非临床性免疫原性研究中通过γ干扰素(IFN-γ)ELISPOT分析测试细胞免疫应答，该分析通过来自免疫动物的外周血单个核细胞(PBMC)定量测定IFN-γ的产生。将该细胞体外暴露于HIV-1抗原(跨越在所述疫苗中表达的蛋白的长度的一系列短的重叠肽)中。由抗原致敏的T-淋巴细胞产生的IFN-γ与包被分析板的抗体结合，并可作为斑点形成细胞(SFC)通过使用碱性磷酸酯酶轭合的读出系统比色定量计数。该结果以SFC每百万PBMC的形式表达。
采用表达HIV-1基因的、组成与临床级疫苗VRC-HIVDNA009-00-VP(4质粒疫苗，第WO/05034992号PCT公开)或VRC-HIVDNA016-00-VP相同的质粒实施DNA质粒初始方案。在临床前免疫学研究中使用的所述重组腺病毒载体疫苗由GMP级VRC-HIVADV014-00-VP(批号026-03017，2005年4月12日提交的第PCT/US2005/12291号PCT申请)组成，该VRC-HIVADV014-00-VP由编码进化枝B gag/pol和进化枝A、B和C Env组成，由GenVec，Inc.Gaithersburg，MD提供。表8提供了所述质粒的总结。
表9中总结了在小鼠和非人类灵长类中实施的免疫学研究的列表式概要。
表8：VRC DNA疫苗的临床前和临床研究概要
Figure A20058003120700531
表9：在小鼠和非人类灵长类中疫苗免疫原性研究概要
Figure A20058003120700532
Figure A20058003120700541
使用编码gag-pol-nef融合蛋白的CMV/R质粒的接种与编码同一融和蛋白 的未修饰的1012质粒相比在小鼠体内引发更高的HIV-1特异性细胞应答
为了探索增强的抗原表达导致体内改进这些新DNA疫苗的免疫原性的可能性，用均表达HIV-1Env gp145ΔCFI的50μg的亲代1012DNA疫苗或CMV/R、RSV/R、mUB或mUB/R DNA疫苗免疫Balb/c小鼠(N＝5只/组)。在第0周、第2周和第6周将小鼠免疫三次。最后一次免疫接种后第10天，通过IFN-γ和TNF-α细胞内细胞因子染色(ICS)分析评价脾细胞的Env-特异性细胞免疫应答。与表达同一抗原的该亲代1012DNA疫苗相比，该CMV/R DNA疫苗引起约2倍高的CD4+(p＝0.15)和CD8+(p＝0.043)T淋巴细胞应答(图9)。相反，该RSV/R、mUB和mUB/RDNA疫苗不引起增强的CD8+免疫应答，这表明关于所述CMV启动子，所述HTLV-1R元件选择性地改进免疫原性。
随后将均表达其它抗原的所述亲代1012DNA疫苗和所述CMV/RDNA疫苗的免疫原性进行了比较。用假质粒或用表达HIV-1 Gag-Pol-Nef融合蛋白的这些DNA疫苗免疫小鼠(N＝8只/组)。在第0周和第6周时将小鼠免疫两次，并用在首次免疫或加强免疫后3周收获的脾细胞通过IFN-γELISPOT分析评价细胞免疫应答。采用生理盐水中稀释的质粒的如下方案将BALB/c雌性小鼠组(每组8只小鼠)免疫：
进化枝B g-p-n(1012)：VRC-4306(50μg/动物)；该质粒表达作为融合蛋白的Gag-Pol-Nef，且被包含在四质粒疫苗VRC-HIVDNA009-00-VP(BB-IND 10681)中；
进化枝g-p-n(CMV/R)：VRC-4400(50μg/动物)；该质粒表达作为融和蛋白的Gag-Pol-Nef。
第0天时用50μl总DNA向小鼠的四头肌中进行单次肌内(i.m.)注射免疫接种。免疫接受后第21天，将小鼠处死以进行免疫分析。
ICS分析。通过γ干扰素(IFN-γ)和α肿瘤坏死因子的细胞内细胞因子染色(ICS)评价CD4+和CD8+T淋巴细胞应答。简而言之，收获来自免疫小鼠的脾细胞，并用覆盖全部HIV-1Env蛋白的11个氨基酸重叠的15氨基酸肽(每个2.5μg/ml)池孵育该细胞，随后用10μg/ml的布雷菲德菌素A(Sigma，St.Louis，MO)处理该细胞。然后将细胞固定、通透、并用大鼠抗小鼠CD3、CD4、CD8、IFN-γ和TNF-α单克隆抗体(BD Pharmingen，圣地亚哥，CA)进行染色。用FlowJo方案(Tree Star，Ashland，OR)分析在CD4+和CD8+细胞群中的IFN-γ和TNF-α阳性细胞。
无菌取出脾细胞并将其均浆以产生单细胞混悬液。然后用接种小鼠的脾细胞实施IFN-γELISPOT分析已评价疫苗-引起的细胞免疫应答的量值。用100μl/孔的含10μg/ml大鼠抗小鼠IFN-γ(Pharmingen，圣地亚哥，CA)的PBS包被过夜的96孔多筛板用含0.25％Tween-20的无内毒素的Dulbecco’s PBS(Life Technologies，Gaithersburg，MD)洗涤，并在37℃用含5％FBS的PBS封闭2小时。将该培养板用含0.25％Tween-20的Dulbecco’s PBS洗涤三次，用含10％FBS的RPMI 1640漂洗，并在含有混合肽的100μl反应容积中用5×105脾细胞每孔进行重复三份的孵育。使用HTV-1Gag、Pol和Nef肽池(VRC，Bethesda，MD)测定应答。孵育18小时后，用含0.25％Tween-20的Dulbecco’s PBS洗涤9次，并用蒸馏水洗涤一次。然后将该培养板用75μl/孔的5μg/ml生物素化的大鼠抗小鼠IFN-γ(Pharmingen，圣地亚哥，CA)孵育2小时，用Coulter Wash(CoulterCorporation，Miami，FL)洗涤6次，并用链霉抗生物素AP(SouthernBiotechnology Associates，伯明翰，AL)的1∶500稀释液孵育2小时。用Coulter Wash洗涤5次并用PBS洗涤1次后，将该培养板用NBT/BCIP(Pierce，Rockford，IL)色原显影，通过用自来水洗涤来终止，空气干燥并用ELISPOT读数器(Hitech Instruments，Edgemont，PA)读数。
免疫数据用带有标准误的平均值表示。用GraphPad Prism4.01版本(GraphPad软件有限公司，2004)实施统计分析。通过两尾非参数Mann-Whitney检验进行动物组之间平均细胞免疫应答的比较。在所有情况中，认为小于0.05的p值是显著的。
与先前的试验一致，我们观察到在首次免疫后，与所述亲代1012DNA疫苗相比，由所述CMV/R DNA疫苗引起大约2倍高的Gag-特异性(p＝0.038)和Pol-特异性(p＝0.020)应答(图10A)。在加强免疫后，使用未分级的脾细胞(图10B)和CD-8衰竭的脾细胞(图10C)时，由该CMV/R DNA疫苗引起的应答仍然比由该亲代DNA疫苗引起的应答高大约2倍。
DNA初始/重组腺病毒载体加强免疫的猕猴的免疫原性
在猕猴中，将表达多种HIV-1抗原的CMV/R DNA疫苗与所述亲代1012DNA疫苗的免疫原性进行比较。用1012或CMV/R DNA疫苗的表达来自进化枝A、B和C的HIV-1Env gp145ΔCFI和来自进化枝B的Gag-Pol-Nef融合蛋白的4种质粒的1∶1∶1∶3混合物免疫两组成年猕猴(N＝6/组)。该多进化枝、多价DNA疫苗先前已进行了描述并且目前正在临床试验中进行评价(VRC-HIVDNA009-00-VP；第WO/05034992号PCT公开)。第三组猴子用来调查将Gag-Pol-Nef融合蛋白分离到由单独质粒编码的单独基因内是否增加对这些抗原的免疫应答(VRC-HIVDNA016-00-VP)。该第三组猴子接受编码来自进化枝A、B和C的HIV-1Env gp145和来自进化枝B的Gag、Pol和Nef蛋白的六种质粒的1∶1∶1∶1∶1∶1混合物。所有的猴子均在第0周、第4周和第8周时接受8mg总DNA疫苗的三次免疫。
表达HΓV-1 Gag、Pol、Nef蛋白或Gag-Pol-Nef融合蛋白和进化枝A、B和C Env的质粒DNA载体(Althea Technologies，Inc.，圣地亚哥CA)用于所述DNA初始免疫。该质粒表达与4-质粒疫苗VRC-HIVDNA009-00-VP和6-质粒疫苗VRC-HIVDNA016-00-VP中所含的蛋白相同的蛋白。
用1012质粒VRC 4306(进化枝B Gag-Pol-Nef)、VRC 5305(进化枝AEnv)、VRC 2805(进化枝B Env)和VRC 5309(进化枝C Env)配制4-质粒组合。为了在动物研究中达到三次预定注射的需要量，制备三批配制的材料。将该三批材料混合在50mL圆锥管中。将该试管倒置数次以混合，将15.6-15.7mL的该混合物等分在三个50mL圆锥管的每一个管中。用研究号、批号、质粒数、试管号和制备日期标记试管。将试管在-20℃下贮存直到被分配为止。
用CMV/R质粒VRC 4401(进化枝B Gag)、VRC 4409(进化枝B Pol)、VRC 4404(进化枝B Nef)、VRC 5736(进化枝A Env)、VRC 5737(进化枝B Env)和VRC 5738(进化枝C Env)配制6-质粒组合。为了在动物研究中达到三次预定注射的需要量，制备三批配制的材料。将该三批材料混合在无菌容器中。将该容器倒置数次以混合，将16.8mL的该混合物等分在三个50mL圆锥管的每一个管中。用研究号、批号、质粒数、试管号和制备日期标记试管并在-20℃下贮存直到被分配为止。
VRC-HIVADV014-00-VP(批号026-03024)用作rAd加强剂。
用DNA疫苗初始物接种远交的成年猕猴(每组6只猴)，在第0周、第4周和第8周时用Biojector肌内输送该疫苗。在每种情况中，用3号Biojector注射器(BIOJECT)向四头肌内2次注射0.5ml的质粒疫苗以进行输送。通过针和注射器在第38周(组1)和第24周(组2)时肌内输送rAd疫苗加强剂。实施如下接种方法：
组1：1012质粒DNA初始物(4-质粒组合)：以进化枝B Gag-Pol-Nef融合蛋白(4mg)、进化枝A Env(1.3mg)、进化枝B Env(1.3mg)和进化枝C Env(1.3mg)的组合输送8mg总剂量。其是所述VRC-HIVDNA009-00-VP临床产品(BB-IND 10681)的非-GMP版本。rAd 疫苗加强剂：VRC-HIVADV014-00-VP(1011PU总剂量；GMP批号026-03024)。
组2：CMV/R质粒DNA(6-质粒组合)：以进化枝B Gag(1.3mg)、进化枝B Pol(1.3mg)、进化枝B Nef(1.3mg)、进化枝A Env(1.3mg)、进化枝B Env(1.3mg)和进化枝C Env(1.3mg)的组合输送8mg总剂量。其是所述VRC-HIVDNA016-00-VP临床产品(该IND提交物)的非-GMP版本。rAd疫苗加强剂：VRC-HIVADV014-00-VP(GMP批号026-03024)。
组3：CMV/R质粒DNA(4质粒组合)：以进化枝B Gag-Pol-Nef融合蛋白(4mg)、进化枝A Env(1.3mg)、进化枝B Env(1.3mg)和进化枝CEnv(1.3mg)的组合输送8mg总剂量。rAd疫苗加强剂：VRC-HIVADV014-00-VP(GMP批号026-03024)。
组4：1012质粒DNA(6质粒组合)：以进化枝B Gag(1.3mg)、进化枝B Pol(1.3mg)、进化枝B Nef(1.3mg)、进化枝A Env(1.3mg)、进化枝B Env(1.3mg)和进化枝C Env(1.3mg)的组合输送8mg总剂量。rAd疫苗 加强剂：VRC-HIVADV014-00-VP(GMP批号026-03024)。
免疫后42周内在不同时间间隔内对猴子采血。
ELISPOT分析用于监测疫苗引起的对多种病毒抗原的T细胞免疫应答的出现。采用涵盖与所述疫苗免疫原的序列匹配的所述HTV-1 Gag、Pol、Nef、进化枝A Env、进化枝B Env和进化枝C Env蛋白的11个氨基酸重叠的15氨基酸肽池对每只动物实施单独分析。用100μl/孔的含5μg/ml抗人IFN-γ(B27；BD Pharmingen)的无内毒素的Dulbecco’sPBS(D-PBS)将96孔多筛板包被过夜。然后将该培养板用含0.25％Tween-20的D-PBS(D-PBS/Tween)洗涤三次，在37℃下用含5％FBS的D-PBS封闭2小时，用D-PBS/Tween洗涤三次，用含10％FBS的RPMI 1640漂洗以除去该Tween-20，并用肽池和含2×105PBMC的100μl反应容积重复三份进行孵育。在37℃下孵育18小时后，将该培养板用D-PBS/Tween洗涤9次并用蒸馏水洗涤1次。然后在室温下将该培养板用2μg/ml的生物素化的家兔抗人IFN-γ(Biosource)孵育2小时，用Coulter Wash(Beckman-Coulter)洗涤6次，并用链霉抗生物素蛋白-AP(Southern Biotechnology)的1∶500稀释液孵育2.5小时。在用CoulterWash洗涤5次和用PBS洗涤1次后，将该培养板用NBT/BCIP色原(Pierce)显影，通过用自来水洗涤来终止，空气干燥并用ELISPOT读数器(HitechInstruments)读数。计算斑点形成细胞(SFC)每106PBMC。培养基背景始终如一为＜15斑点形成细胞每106PBMC。
在CMV(1012)(组1)或CMV/R调节元件(组3)的控制下，在接受所述4质粒混合物的猴子中将抗Env进化枝A、Env进化枝B、Env进化枝C和来自进化枝B的Gag、Pol和Nef的细胞免疫应答进行比较。在第6周进行第二次免疫后2周时，用所述亲代1012DNA疫苗免疫的猴子对Env产生低且散发的IFN-γELISPOT应答，以及未检测到对Gag、Pol和Nef的清晰的高于背景的应答(图11A)。相反，用所述类似物CMV/R DNA疫苗免疫的猴子对所有抗原表现出显著增高的应答(图11B)。与该亲代1012DNA疫苗相比，该CMV/R DNA疫苗在此时间点上对Gag(p＝0.0022)、Pol(p＝0.0043)和Nef(p＝0.041)引起＞10倍高的ELISPOT应答，以及对Env进化枝A(p＝0.026)、B(p＝0.0087)和C(p＝0.030)引起7至9倍高的应答。这些结果证实与该亲代1012DNA疫苗相比，在非人类灵长类中该CMV/R DNA疫苗对多种HIV-1抗原具有明显更多的免疫原性。
将所述Gag-Pol-Nef融合蛋白分离在不同质粒上编码的单独基因内可进一步改进这些应答。特别地，与接受包括该Gag-Pol-Nef融合蛋白在内的CMV/R DNA疫苗的4质粒混合物的动物相比(图11B)，接受所述CMV/R DNA疫苗的6质粒混合物的猴子(组2)对Gag(p＝0.0022)产生4倍高的应答，对Pol(p＝0.19)产生2倍高的应答趋势和对Nef(p＝0.049)产生4倍高的应答(图11C)。在接受CMV/R DNA疫苗的4质粒混合物和6质粒混合物的两组猴子之间，Env-特异性应答是可比的(p＝0.48)。
在第0周、第2周、第6周、第10周和第12周时评价了这些组猴子中平均IFN-γELISPOT应答的发展。在第8周进行第三次DNA免疫后，在所有的猴子组中应答增加(图12)。在第10周时，所述亲代1012DNA疫苗在大多数动物中引起Env-和Pol-特异性应答，虽然Gag-和Nef-特异性应答仍然低(图12A)。相反，所述CMV/R DNA疫苗对所有抗原引起有效且广泛的应答(图12B-C)。与所述4质粒亲代1012DNA疫苗相比(图12A)，在第10周时，所述4质粒CMV/R DNA疫苗(图12B)对Gag(p＝0.0022)和Nef(p＝0.0022)引起＞10倍高的ELISPOT应答，对Pol(p＝0.043)引起4倍高的ELISPOT应答，且对Env进化枝A、B和C引起1.5至4倍高的应答趋势(图12B)。在接受所述的具有在单独质粒上编码的这些基因的6质粒CMV/R DNA疫苗的动物中，Gag-、Pol-和Nef-特异性应答保持最高(图12C)。rAd良好地加强了所有应答。这些研究证实与所述亲代1012
DNA疫苗相比，所述CMV/R DNA疫苗对多种抗原基本上引起较高的量值及较广的细胞免疫应答。因此，将包括所述HTLV-l R元件和单独的所述Gag、Pol和Nef基因可在非人类的灵长类中显著增强HIV-1DNA疫苗的免疫原性。
在小鼠和猕猴中，表达HIV-1抗原的CMV/R DNA疫苗比表达同一抗原的所述亲代1012DNA疫苗引起更高的细胞免疫应答。但是，在两个物种之间所观察到的效应的量值基本上不同。虽然该CMV/R DNA疫苗在小鼠中只引起2倍高的应答(图10)，但是在两次免疫后该CMV/RDNA疫苗在猕猴中对Gag、Pol和Nef引起＞10倍高的细胞免疫应答，且对Env引起7至9倍高的应答(图11和12)。这些差异反映出该亲代1012DNA疫苗在非人类的灵长类中具有较低的基线免疫原性且表明所述R元件的有益作用在有限的情况中是更明显的。与该观察一致，该R元件在增强由该亲代1012DNA疫苗引起的抗Gag和Nef的最弱的应答方面具有最大的作用。但是，与该亲代1012DNA疫苗相比，当由CMV/R DNA疫苗诱发时，Env-和Pol-特异性细胞免疫也是明显增高的。
与包括所述Gag-Pol-Nef融合蛋白在内的CMV/R DNA疫苗的4-质粒混合物相比，包括单独质粒上的Gag、Pol和Nef的CMV/R DNA疫苗的6-质粒混合物显著引起对这些抗原的显著增高的细胞免疫应答。这些作用特别值得注意，因为该单独的Gag、Pol和Nef质粒每一个均以所述编码Gag-Pol-Nef融合蛋白的质粒的三分之一剂量应用。不受理论束缚，与该融合基因相比，该增加的免疫原性可反映出所述较短基因的增强的翻译或mRNA稳定性，这可有效地影响抗原加工和呈递。
累积的数据证实细胞免疫应答在控制人体内HIV-1复制和猕猴体内SIV复制方面具有重要性。此外，旨在引起病毒特异性细胞免疫应答的疫苗在猕猴中提供部分控制SHIV和SIV激发。因此，在本研究中，在非人类灵长类中由所述CMV/R DNA疫苗提供的HIV-1特异性细胞免疫应答的量度和宽度的显著增加被认为在HIV-1和其它病原体的第二代DNA疫苗的开发中是有益的。特别地，引入所述HTLV-1R元件并用单独的基因代替融合基因表现了简单且实用的策略以改进DNA疫苗，产生这些适于临床应用的疫苗。
实施例4：临床应用的材料的制备
用于制造，填充和包装所述VRC-HIVDNA016-00-VP药品的方法包括大肠杆菌发酵、纯化和配制为用于肌内注射的无菌液体注射剂型。该裸露DNA产品不包含脂质、病毒或细胞载体组分。
所述疫苗VRC-HIVDNA016-00-VP由六种闭合的环状质粒DNA大分子(VRC-4401、4409、4404、5736、5737和5738)的组合组成。为了制备用于临床应用的质粒，制备用于每种来源的质粒(VRC-4401、4409、4404、5736、5737和5738)的肥大细胞带(MCB)。通过序列分析确证来自这些MCB中每种MCB的质粒DNA样品的同一性和组成。还实施限制酶分析和微生物分析(包括霉菌和酵母)以证实同一性和无菌。
从含有卡那霉素选择培养基的细菌细胞培养物中制备大批质粒制剂。在所有情况中，细菌细胞生长是依赖于由所述质粒DNA的一部分编码耐卡那霉素蛋白的细胞表达。含所述质粒的细菌细胞生长后，从细胞组分中纯化出该质粒DNA。
在cGMP条件下制备临床试验疫苗。给药前该疫苗符合分批发放规格。将所述DNA疫苗以4.0mg的剂量在磷酸缓冲盐水(PBS)中制备。将小药瓶无菌填充1∶1∶1∶1∶1∶1比例的所述六种质粒至1.2mL容积。将该4.0mg质粒DNA疫苗小药瓶在干冰上运至(非盲化)研究药剂师，并贮存在-20℃或以下直到使用为止。从Bell-More Labs，Incorporated(Hampstead，MD)中获得2.4mL PBS(pH7.2±0.2)的安慰剂对照小药瓶。
在发放所述疫苗产品之前，进行所述单独的质粒和所述最终配制的药品的表达测试。通过将Western印迹上的反应蛋白带与相同条件下跑胶的标准物进行比较来检验所述质粒蛋白的定量表达。一旦将所述质粒组合，用相同的分析操作检验表达。通过检测由转染的293人胚肾(HEK)细胞表达的蛋白测定表达。对于转染，采用磷酸钙方法，用1-5μg的质粒DNA转染105至106细胞。将细胞孵育14-20小时以允许DNA摄取。更换培养基后，在收获前将细胞再生长另外24-48小时。采用公知的具有相同骨架类似载体监测转染率。细胞裂解后，将10μg的适当量的总细胞蛋白负载在SDS-PAGE凝胶上以分离粗溶胞产物蛋白。
电泳约1.5小时后，将所述蛋白转染到硝酸纤维素膜(0.45μm)上以进行Western印迹分析。在用所述一抗孵育60分钟后，将该膜用脱脂乳封闭以阻止非特异性结合相互作用。洗涤后，将该膜用HRP轭合的二抗孵育45分钟。通过用化学发光底物孵育该膜并暴露在X-射线胶片2分钟或适当时间完成所述蛋白带的显色。通过观察表达的蛋白在Western印迹上的强度测定由转染的细胞产生的蛋白的表达。将该分析进一步发展以允许对所述疫苗质粒的蛋白表达进行半定量分析。
实施例5：人体内的临床安全性
对于临床应用，VRC-HIVDNA016-00-VP由6中闭合的环状DNA质粒组成，每种该质粒为该疫苗的16.67％(重量比)。在该6种疫苗中每一种质粒表达单一基因产物。将质粒VRC 4401、VRC 4409和VRC 4404设计为分别表达进化枝B HIV-1Gag、Pol和Nef。将VRC 5736、VRC 5737和VRC 5738设计为分别表达来自进化枝A、进化枝B和进化枝C的HIV-1Env糖蛋白。以4mg/mL提供疫苗小药瓶。采用Biojector 2000
Figure A20058003120700621
Needle-Free Injection Management SystemTM(无针注射操作系统)肌内(三角肌内)输送1mL所述疫苗组合物来进行每种DNA给药。
所述疫苗的安全性评价包括临床医师进行的实验室研究、医学史、体格评价以及日志卡片上记录的受试者的自我评价。在继续所述免疫程序之前还评价潜在的不良反应。第0天被确定为登记并进行首次注射的日期。在进行首次注射前的第0天评价是随后安全性评价的基线。接种程序是第0天、第28±7天和第56±7天(在每次注射之间至少有21天)。通过采用Biojector 2000
Figure A20058003120700622
无针注射系统将VRC-HIVDNA016-00-VP以4mg的剂量肌内给药来进行全部的研究注射。研究注射被给药入三角肌。
进行研究注射后，观察受试者最少30分钟。在免疫后30-45分钟时获得生命征象(体温、血压、脉搏和呼吸频率)。检查注射部位是否有局部反应的迹象。给受试者“日志卡片”以在该卡片上记录5天内每天的体温和症状。在每次注射后第一天或第二天通过电话进行的健康受试者追踪观察。如果电话会谈表明，则进行诊所就诊。在每次注射当天(注射前)及每次注射后第14±3天，通过临床检查和实验室测试评价所研究的受试者。长期的追踪就诊是第12周±7天、第24周±14天和第32周±14天。在全部过程的间隔，对所研究受试者抽血以进行免疫分析。将未使用的任何细胞、血清或血浆贮存以将来进行病毒学分析和免疫分析。还在最后的临床就诊(第32周)时关于社会伤害与受试者会谈，该社会伤害包括就业问题、旅行、移民、获得保险、医疗护理或牙科护理以及来自家庭、朋友和同事的负面反应。
产品安全性的评价包括临床观察和血液和化学参数的监测。将评价以下参数：局部反应原性体征和症状；全身反应原性体征和症状；安全性的实验室测定；以及不良和严重不良经历。
在第0周(基线)和第6、8、10和12周(对于细胞免疫应答)时测定主要免疫原性终点，该终点由通过细胞内细胞因子染色(ICS)分析测定的HIV-1-特异性T细胞应答组成。在其它研究时间点的ICS以及由HIV-特异性抗体分析测定的HIV-1-特异性体液免疫应答将作为探索性评价来完成。
按该公司指导，采用BIOJECTOR 2000
Figure A20058003120700631
NEEDLE-FREE INJECTIONMANAGEMENT SYSTEM
Figure A20058003120700632
进行所述疫苗组合物的给药。所注射的材料和三角肌注射部位皮肤的准备均按标准操作。简而言之，将该注射部位消毒并使该区域完全干燥。当所述注射器相对于注射部位以90°角放置时，将该注射部位周围的皮肤稳固地固定。按压执行器并将该材料释放到肌肉内。继续稳固地保持3秒。注射后，将该部位用无菌覆盖物覆盖并用3根手指按压1分钟。BIOJECTOR 2000
Figure A20058003120700633
使用适于最高达1.0mL的可变剂量药物给药的无菌一次性注射器。通过贮存在BIOJECTOR
Figure A20058003120700634
内的压缩的CO2气药筒在压力下将所研究的试剂输送。当压下BIOJECTOR
Figure A20058003120700635
的执行器时，释放CO2，使活塞将所研究的试剂推出无菌注射器通过皮肤进入下面的组织。所研究的试剂以高速在不到一秒内通过微孔喷出，刺穿皮肤。CO2不与注射剂接触并且所设计的注射器防止任何后溅或防止该装置被受试者的组织污染。
十五名受试者按照第0月、第1月、第2月的程序表以4mg/mL三次接受1mL的剂量。使用BIOJECTOR 2000肌内给药来进行接种。15名受试者中14名接受了三次通过BIOJECTOR 2000
Figure A20058003120700642
给药的肌内注射的4mg剂量的疫苗；一名受试者在两次接种后未再追踪观察。接种后没有受试者报告发烧。除了两名受试者报告注射部位中度疼痛以及一名受试者报告中度恶心和不适之外，反应性为无至轻微。需要速报给IND召集者仅有的不良事件是3级全身荨麻疹。受试者已报告在第一次接种后约2周开始服用抗组织胺药，但是那时报告原因是橡胶过敏症。当VRC 010被筛选以进行再加强剂研究时，了解到当停止抗组织胺药供给时，受试者大约在第二次接种后经历全身荨麻疹。受试者患有慢性荨麻疹，并被抗组织胺药良好地控制。进行评价。病因学是未知的，但是此时因为其可能与所研究的疫苗相关，所以评估慢性荨麻疹。迄今为止，存在两个可能归因于疫苗的中度(2级)不良事件。在一名受试者(该受试者接受第三次接种而没有症状再发生)中这些不良事件是在第二次接种接后第13天开始，持续2天的间歇头晕，以及在另一名受试者中这些不良事件是无症状的低血糖，首先在第三次接种后第14天追踪观察就诊时注意到。未再追踪观察的那名受试者的最后一次安全性评价是在第二次接种后第一天通过电话进行的；那时该受试者报告没有来自接种引起的副作用。
已观察到了该DNA疫苗的未预料到的局部注射部位反应。在44例接种中有4例接种(9％)给药后，在所接种的部位出现轻度皮肤损伤(直径0.5-1.0cm)，15名受试者中有三名受试者(20％)出现这些损伤。在所研究的接种后如果受试者经历任何异常问题，均按常规要求访问该受试者。该接种部位的皮肤损伤程度不足以警告患者促使其在下一次按规律排定的就诊前联系VRC诊所。在回顾中，三名受试者报告他们经历了皮肤损伤，该皮肤损伤在接种后三天内以小丘疹或小水泡的形式出现。
几天后，该丘疹或小水泡除去盖并形成结痂。在周围有轻度红斑和轻度硬结。在结痂脱落后，无需处理皮肤愈合。该皮肤损伤不与脓泡渗出液、发热、疹或荨麻疹相关。它们似乎不是局部感染或变态反应。
在第一次接种后诊所就诊(第14±3天)时发现前三例皮肤损伤；那时它们大多都没问题了。在该诊所中检查出第四例皮肤损伤，虽然其仍处于活动期并在接种后第6天被活组织检查。该活组织检查证明显微可见的皮下和皮肤血管周围淋巴细胞浸润。该浸润几乎只由CD3阳性细胞组成，包括CD4+和CD8+细胞。存在很少的嗜酸性粒细胞和很少的巨细胞。该过程似乎对主要是具有皮肤现象的接种的皮下和皮肤反应。
这些反应是否与所述疫苗诱导的免疫应答的强度相关依然是未知的。14名保持追踪观察的受试者中8名受试者由商业测试表明在一个或多个时间点上具有疫苗诱导的阳性HIV ELISA反应；这包括具有皮肤损伤的所有三名受试者。所述6-质粒DNA的初步免疫原性数据表明Env-特异性T细胞应答与在所述4-质粒DNA中看见的应答相似，且也存在Gag-和Nef-特异性应答。
在用表达所述病毒抗原的肽池刺激后，通过细胞内细胞因子染色(ICS)和流式细胞计测定受试者体内细胞应答以检测在CD4+和CD8+T淋巴细胞中的IFN-γ或IL-2(图13)。每名单独受试者的数据显示于列中。对每一肽池的应答显示于行中。每一条柱表示从接种前至12周(最后一次接种后4周)的全部的时程。每一条柱的刻度为所测试的总CD4+或CD8+群的0-0.2％。CD4+应答显示为红色以及CD8+应答显示为绿色。几乎所有的受试者可检测到对Env肽的应答。相反，对于所述4-质粒产品，大多数受试者可检测到对Gag的应答以及也存在Nef应答者。
实施例6：嵌合的Env蛋白的免疫原性
为了证实不同遗传序列在诱导中和抗体中的作用，产生了表达嵌合的抗原性多肽的核酸构建体，该抗原性多肽具有来自两种不同进化枝的病毒包膜的不同区。分析编码进化枝C Env多肽和进化枝B Env多肽的不同部分的核酸构建体并将其与进化枝C Env多肽进行比较。在进化枝B背景上进化枝C的近25％的转座，显示增加了抗多种进化枝B分离物的中和的有效性和广度，并改进了进化枝C分离物的中和。用进化枝C Env置换进化枝B的远侧区导致改进了抗进化枝B分离物的中和，这表明含有该进化枝B分离物内的V3的区对其抑制多种不同病毒分离物的能力起作用。这些核酸构建体由SEQ ID NOs：7-15表示。因此，所公开的组合物的某些实施方案可包括编码组合多种进化枝的嵌合的Env多肽的构建体。
为了证实其它进化枝中V区的作用，在进化枝A、B和C的V1V2和V3区内产生突变。为了证实进化枝A中V1V2的作用，将进化枝A原型与包含V1和V2区缺失的进化枝A比较。V1V2和/或V3的去除增强了所述进化枝A Env多肽引起中和多种进化枝B分离物的免疫应答的能力，这表明这些区的缺失增加了所述抗原性多肽引起广泛地中和抗体的能力(例如，通过增加对引起可交叉反应的抗体的特异性表位的可接近性)。因此，在本文公开的某些实施方案中，所述核酸构建体包括V1、V2和/或V3区的缺失。
为了证实进化枝B中的V1V2抗来自进化枝C的异源V3的作用，将来自南非进化枝C分离物的V3插入来置换来自进化枝B的V3并与已显示出增强中和的采用进化枝B V3环的茎缩短的版本比较。评价了这些质粒DNA载体与重组腺病毒加强剂联合引起抗所示病毒株的中和抗体的能力。用两个V3替代进行的免疫使来自进化枝A、B和C的病毒分离物中和，虽然应答的量值比该茎缩短的1AB V3更大。另外，所述肽抑制表明在该应答中引起的中和抗体具有更大广度并与来自不同进化枝A、B和C的V3区相互作用。因此，该进化枝C V3环似乎引起广泛反应的V3中和抗体。
这些包膜中V1和V2区的缺失改善了引起中和抗体应答的能力。这些应答大多是抗不同进化枝中的V3区。衍生于不同进化枝的其它V区的应用证实这些V区在引起病毒株特异性应答的能力方面表现出差异。例如，包含来自进化枝C的V3区允许中和多种进化枝B分离物并通过来自不同病毒株的V3肽进行更大广度的中和。因此，消除V1和V2区以及存在具有更广泛反应性的V3可增强由Env抗原性多肽介导的中和。
除了V3-介导的中和外，当V3不被暴露时，其它可变区也可起病毒中和的作用。在这些区中，鉴定了V1中的高度暴露区。虽然该区很可能显示病毒株特异性变异，但是在V1内还存在保守区，该保守区起增加对该可变环的免疫应答的广度的作用。
使用基于病毒多样性的遗传信息来定义改进的免疫原的能力可改进设计有效的HIV疫苗的能力。上述结果表明所述基因型序列变异可产生不依赖于进化枝的中和灵敏度。此发现在设计基于遗传序列的改进的HIV免疫原方面具有重要的意义。
本公开发明的原理可应用到的许多可能的实施方案中，应认识到所述示例性实施方案只是本发明的优选实施方案并不应理解为限制本发明的范围。本发明的范围受权利要求所定义。我们因此要求保护在这些权利要求范围和精神内的我们的发明。
序列表
<110>美国政府健康及人类服务部
     金维克有限公司
     加里·J·内伯
     黄越
     徐凌
     比马尔·沙克拉博蒂
     吴岚
     杨志勇
     贾森·G·D·加尔
     里克特·C·金
<120>含CMV/R-核酸构建体的抗AIDS疫苗
<130>07C80008CN
<150>US 60/588,378
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<151>2005-04-12
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<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>5886
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒VRC4401
<400>1
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca     60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg    120
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gctcgcctgc gccatagtca atacggccgg tcgcgagact gggggcgtac actggatggc  21600
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caccccctca ttatcatatt ggcttcaatc caaaataagg tatattattg atgatg      33476
<210>19
<211>33589
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>腺病毒载体Adgp140(C).11D
<400>19
catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt     60
ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt    120
gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg    180
gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag    240
taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga    300
agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggcccggga    360
tcggtgatca ccgatccaga catgataaga tacattgatg agtttggaca aaccacaact    420
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accattataa gctgcaataa acaagttccc ggatctttct agctagtcta gactagctag     540
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ggagatgtcg aaccaggacc acaggttttt ccaggagtcc agagccagca ggtctttttc     660
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gttaccacca cccggacgga agatttcttc ggttttgttg tcttcaccac cgtcacgaac    1080
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tcattatcat attggcttca atccaaaata aggtatattattgatgatg               33589
<210>20
<211>500
<212>PRT
<213>HIV
<400>20
Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp
1               5                   10                  15
Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys
            20                  25                  30
His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro
        35                  40                  45
Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu
    50                  55                  60
Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln Arg Ile Glu Ile Lys Asp
                85                  90                  95
Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys
            100                 105                 110
Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Asn Gln Val
        115                 120                 125
Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His
    130                 135                 140
Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu
145                 150                 155                 160
Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser
                165                 170                 175
Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly
            180                 185                 190
Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu
        195                 200                 205
Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala
    210                 215                 220
Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr
225                 230                 235                 240
Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile
                245                 250                 255
Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys
            260                 265                 270
Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly
        275                 280                 285
Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu
    290                 295                 300
Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr
305                 310                 315                 320
Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala
                325                 330                 335
Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly
            340                 345                 350
Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser
        355                 360                 365
Gln Val Thr Asn Ser Ala Thr Ile Met Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg
    370                 375                 380
Asn Gln Arg Lys Ile Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His
385                 390                 395                 400
Thr Ala Arg Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys
                405                 410                 415
Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn
            420                 425                 430
Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro Ser His Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe
        435                 440                 445
Leu Gln Ser Arg Pro Glu Pro Thr Ala Pro Pro Glu Glu Ser Phe Arg
    450                 455                 460
Phe Gly Glu Glu Thr Thr Thr Pro Ser Gln Lys Gln Glu Pro Ile Asp
465                 470                 475                 480
Lys Glu Leu Tyr Pro Leu Ala Ser Leu Arg Ser Leu Phe Gly Ser Asp
                485                 490                 495
Pro Ser Ser Gln
            500
<210>21
<211>1002
<212>PRT
<213>HIV
<400>21
Met Arg Glu Asp Leu Ala Phe Pro Gln Gly Lys Ala Arg Glu Phe Ser
1               5                   10                  15
Ser Glu Gln Thr Arg Ala Asn Ser Pro Thr Arg Arg Glu Leu Gln Val
            20                  25                  30
Trp Gly Arg Asp Asn Asn Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Asp Arg Gln
        35                  40                  45
Gly Thr Val Ser Phe Ser Phe Pro Gln Ile Thr Leu Trp Gln Arg Pro
    50                  55                  60
Leu Val Thr Ile Lys Ile Gly Gly Gln Leu Lys Glu Ala Leu Leu Asp
65                  70                  75                  80
Thr Gly Ala Asp Asp Thr Val Leu Glu Glu Met Asn Leu Pro Gly Arg
                85                  90                  95
Trp Lys Pro Lys Met Ile Gly Gly Ile Gly Gly Phe Ile Lys Val Gly
            100                 105                 110
Gln Tyr Asp Gln Ile Leu Ile Glu Ile Cys Gly His Lys Ala Ile Gly
        115                 120                 125
Thr Val Leu Val Gly Pro Thr Pro Val Asn Ile Ile Gly Arg Asn Leu
    130                 135                 140
Leu Thr Gln Ile Gly Cys Thr Leu Asn Phe Pro Ile Ser Pro Ile Glu
145                 150                 155                 160
Thr Val Pro Val Lys Leu Lys Pro Gly Met Asp Gly Pro Lys Val Lys
                165                 170                 175
Gln Trp Pro Leu Thr Glu Glu Lys Ile Lys Ala Leu Val Glu Ile Cys
            180                 185                 190
Thr Glu Met Glu Lys Glu Gly Lys Ile Ser Lys Ile Gly Pro Glu Asn
        195                 200                 205
Pro Tyr Asn Thr Pro Val Phe Ala Ile Lys Lys Lys Asp Ser Thr Lys
    210                 215                 220
Trp Arg Lys Leu Val Asp Phe Arg Glu Leu Asn Lys Arg Thr Gln Asp
225                 230                 235                 240
Phe Trp Glu Val Gln Leu Gly Ile Pro His Pro Ala Gly Leu Lys Gln
                245                 250                 255
Lys Lys Ser Val Thr Val Leu Asp Val Gly Asp Ala Tyr Phe Ser Val
            260                 265                 270
Pro Leu Asp Lys Asp Phe Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Thr Ile Pro Ser
        275                 280                 285
Ile Asn Asn Glu Thr Pro Gly Ile Arg Tyr Gln Tyr Asn Val Leu Pro
    290                 295                 300
Gln Gly Trp Lys Gly Ser Pro Ala Ile Phe Gln Cys Ser Met Thr Lys
305                 310                 315                 320
Ile Leu Glu Pro Phe Arg Lys Gln Asn Pro Asp Ile Val Ile Tyr Gln
                325                 330                 335
Tyr Met Asp His Leu Tyr Val Gly Ser Asp Leu Glu Ile Gly Gln His
            340                 345                 350
Arg Thr Lys Ile Glu Glu Leu Arg Gln His Leu Leu Arg Trp Gly Phe
        355                 360                 365
Thr Thr Pro Asp Lys Lys His Gln Lys Glu Pro Pro Phe Leu Trp Met
    370                 375                 380
Gly Tyr Glu Leu His Pro Asp Lys Trp Thr Val Gln Pro Ile Val Leu
385                 390                 395                 400
Pro Glu Lys Asp Ser Trp Thr Val Asn Asp Ile Gln Lys Leu Val Gly
                405                 410                 415
Lys Leu Asn Trp Ala Ser Gln Ile Tyr Ala Gly Ile Lys Val Arg Gln
            420                 425                 430
Leu Cys Lys Leu Leu Arg Gly Thr Lys Ala Leu Thr Glu Val Val Pro
        435                 440                 445
Leu Thr Glu Glu Ala Glu Leu Glu Leu Ala Glu Asn Arg Glu Ile Leu
    450                 455                 460
Lys Glu Pro Val His Gly Val Tyr Tyr Asp Pro Ser Lys Asp Leu Ile
465                 470                 475                 480
Ala Glu Ile Gln Lys Gln Gly Gln Gly Gln Trp Thr Tyr Gln Ile Tyr
                485                 490                 495
Gln Glu Pro Phe Lys Asn Leu Lys Thr Gly Lys Tyr Ala Arg Met Lys
            500                 505                 510
Gly Ala His Thr Asn Asp Val Lys Gln Leu Thr Glu Ala Val Gln Lys
        515                 520                 525
Ile Ala Thr Glu Ser Ile Val Ile Trp Gly Lys Thr Pro Lys Phe Lys
    530                 535                 540
Leu Pro Ile Gln Lys Glu Thr Trp Glu Ala Trp Trp Thr Glu Tyr Trp
545                 550                 555                 560
Gln Ala Thr Trp Ile Pro Glu Trp Glu Phe Val Asn Thr Pro Pro Leu
                565                 570                 575
Val Lys Leu Trp Tyr Gln Leu Glu Lys Glu Pro Ile Ile Gly Ala Glu
            580                 585                 590
Thr Phe Tyr Val Asp Gly Ala Ala Asn Arg Glu Thr Lys Leu Gly Lys
        595                 600                 605
Ala Gly Tyr Val Thr Asp Arg Gly Arg Gln Lys Val Val Pro Leu Thr
    610                 615                 620
Asp Thr Thr Asn Gln Lys Thr Glu Leu Gln Ala Ile His Leu Ala Leu
625                 630                 635                 640
Gln Asp Ser Gly Leu Glu Val Asn Ile Val Thr Asp Ser Gln Tyr Ala
                645                 650                 655
Leu Gly Ile Ile Gln Ala Gln Pro Asp Lys Ser Glu Ser Glu Leu Val
            660                 665                 670
Ser Gln Ile Ile Glu Gln Leu Ile Lys Lys Glu Lys Val Tyr Leu Ala
        675                 680                 685
Trp Val Pro Ala His Lys Gly Ile Gly Gly Asn Glu Gln Val Asp Gly
    690                 695                 700
Leu Val Ser Ala Gly Ile Arg Lys Val Leu Phe Leu Asp Gly Ile Asp
705                 710                 715                 720
Lys Ala Gln Glu Glu His Glu Lys Tyr His Ser Asn Trp Arg Ala Met
                725                 730                 735
Ala Ser Asp Phe Asn Leu Pro Pro Val Val Ala Lys Glu Ile Val Ala
            740                 745                 750
Ser Cys Asp Lys Cys Gln Leu Lys Gly Glu Ala Met His Gly Gln Val
        755                 760                 765
Asp Cys Ser Pro Gly Ile Trp Gln Leu Ala Cys Thr His Leu Glu Gly
    770                 775                 780
Lys Val Ile Leu Val Ala Val His Val Ala Ser Gly Tyr Ile Glu Ala
785                 790                 795                 800
Glu Val Ile Pro Ala Glu Thr Gly Gln Glu Thr Ala Tyr Phe Leu Leu
                805                 810                 815
Lys Leu Ala Gly Arg Trp Pro Val Lys Thr Val His Thr Asp Asn Gly
            820                 825                 830
Ser Asn Phe Thr Ser Thr Thr Val Lys Ala Ala Cys Trp Trp Ala Gly
        835                 840                 845
Ile Lys Gln Glu Phe Gly Ile Pro Tyr Asn Pro Gln Ser Gln Gly Val
    850                 855                 860
Ile Glu Ser Met Asn Lys Glu Leu Lys Lys Ile Ile Gly Gln Val Arg
865                 870                 875                 880
Asp Gln Ala Glu His Leu Lys Thr Ala Val Gln Met Ala Val Phe Ile
                885                 890                 895
His Asn Phe Lys Arg Lys Gly Gly Ile Gly Gly Tyr Ser Ala Gly Glu
            900                 905                 910
Arg Ile Val Asp Ile Ile Ala Thr Asp Ile Gln Thr Lys Glu Leu Gln
        915                 920                 925
Lys Gln Ile Thr Lys Ile Gln Asn Phe Arg Val Tyr Tyr Arg Asp Ser
    930                 935                 940
Arg Asp Pro Val Trp Lys Gly Pro Ala Lys Leu Leu Trp Lys Gly Glu
945                 950                 955                 960
Gly Ala Val Val Ile Gln Asp Asn Ser Asp Ile Lys Val Val Pro Arg
                965                 970                 975
Arg Lys Ala Lys Ile Ile Arg Asp Tyr Gly Lys Gln Met Ala Gly Asp
            980                 985                 990
Asp Cys Val Ala Ser Arg Gln Asp  Glu Asp
        995                 1000
<210>22
<211>204
<212>PRT
<213>HIV
<400>22
Met Lys Trp Ser Lys Ser Ser Val Ile Gly Trp Pro Ala Val Arg Glu
1               5                   10                  15
Arg Met Arg Arg Ala Glu Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala Val Ser
            20                  25                  30
Arg Asp Leu Glu Lys His Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr Ala Ala
        35                  40                  45
Asn Asn Ala Ala Cys Ala Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val
    50                  55                  60
Gly Phe Pro Val Thr Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys
65                  70                  75                  80
Ala Ala Val Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu
                85                  90                  95
Gly Leu Ile His Ser Gln Arg Arg Gln Asp Ile Leu Asp Leu Trp Ile
            100                 105                 110
Tyr His Thr Gln Gly Tyr Phe Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr Pro Gly
        115                 120                 125
Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Tyr Lys Leu Val
    1301                 35                 140
Pro Val Glu Pro Asp Lys Val Glu Glu Ala Asn Lys Gly Glu Asn Thr
145                 150                 155                 160
Ser Leu Leu His Pro Val Ser Leu His Gly Met Asp Asp Pro Glu Arg
                165                 170                 175
Glu Val Leu Glu Trp Arg Phe Asp Ser Arg Leu Ala Phe His His Val
            180                 185                 190
Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Phe Lys Asn Cys
        195                 200
<210>23
<211>626
<212>PRT
<213>HIV
<400>23
Met Arg Val Arg Gly Ile Gln Thr Ser Trp Gln Asn Leu Trp Arg Trp
1               5                    10                  15
Gly Thr Met Ile Leu Gly Met Leu Val Ile Tyr Ser Ala Ala Glu Asn
            20                  25                  30
Leu Trp Val Ala Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Asp Ala Glu
        35                  40                  45
Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu Val
    50                  55                  60
His Asn Val Trp Glu Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro
65                  70                  75                  80
Gln Glu Ile His Leu Glu Asn Val Thr Glu Asp Phe Asn Met Trp Arg
                85                  90                  95
Asn Asn Met Val Glu Gln Met His Thr Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp
            100                 105                 110
Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr Leu
        115                 120                 125
Asp Cys Asn Ala Thr Ala Ser Asn Val Thr Asn Glu Met Arg Asn Cys
    130                 135                 140
Ser Phe Asn Ile Thr Thr Glu Leu Lys Asp Lys Lys Gln Gln Val Tyr
145                 150                 155                 160
Ser Leu Phe Tyr Lys Leu Asp Val Val Gln Ile Asn Glu Lys Asn Glu
                165                 170                 175
Thr Asp Lys Tyr Arg Leu Ile Asn Cys Asn Thr Ser Ala Ile Thr Gln
            180                 185                 190
Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala
        195                 200                 205
Pro Ala Gly Phe Ala Ile Leu Lys Cys Lys Asp Thr Glu Phe Asn Gly
    210                 215                 220
Thr Gly Pro Cys Lys Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile
225                 230                 235                 240
Arg Pro Val Ile Ser Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu
                245                 250                 255
Glu Gly Ile Gln Ile Arg Ser Glu Asn Ile Thr Asn Asn Ala Lys Thr
            260                 265                 270
Ile Ile Val Gln Leu Asp Lys Ala Val Lys Ile Asn Cys Thr Arg Pro
        275                 280                 285
Asn Asn Asn Thr Arg Lys Gly Val Arg Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe
    290                 295                 300
Tyr Ala Thr Gly Gly Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln Ala His Cye His
305                 310                 315                 320
Val Ser Arg Ala Lys Trp Asn Asp Thr Leu Arg Gly Val Ala Lys Lys
                325                 330                 335
Leu Arg Glu His Phe Lys Asn Lys Thr Ile Ile Phe Glu Lys Ser Ser
            340                 345                 350
Gly Gly Asp Ile Glu Ile Thr Thr His Ser Phe Ile Cys Gly Gly Glu
        355                 360                 365
Phe Phe Tyr Cys Asn Thr Ser Gly Leu Phe Asn Ser Thr Trp Glu Ser
    370                 375                 380
Asn Ser Thr Glu Ser Asn Asn Thr Thr Ser Asn Asp Thr Ile Thr Leu
385                 390                 395                 400
Thr Cys Arg Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Lys Val Gly Gln
                405                 410                 415
Ala Met Tyr Pro Pro Pro Ile Gln Gly Val Ile Arg Cys Glu Ser Asn
            420                 425                 430
Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly Asn Asn Ser Thr Asn
        435                 440                 445
Glu Ile Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asn Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser
    450                 455                 460
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala
465                 470                 475                 480
Pro Ser Arg Ala Lys Leu Thr Ala Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly
                485                 490                 495
Ile Val Gln Gln Gln Ser Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln
            500                 505                 510
His Met Leu Lys Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg
        515                 520                 525
Val Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Glu Ile Trp
    530                 535                 540
Asp Asn Met Thr Trp Leu Gln Trp Asp Lys Glu Ile Ser Asn Tyr Thr
545                 550                 555                 560
Gln Ile Ile Tyr Asn Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys
                565                 570                 575
Asn Glu Gln Asp Leu Leu Ala Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn
            580                 585                 590
Trp Phe Asp Ile Ser Arg Trp Leu Trp Tyr Ile Lys Ile Phe Ile Met
        595                 600                 605
Ile Val Gly Gly Leu Ile Gly Leu Arg Ile Val Phe Ala Val Leu Ser
    610                 615                 620
Val Ile
625
<210>24
<211>642
<212>PRT
<213>HIV
<400>24
Met Arg Val Lys Glu Lys Tyr Gln His Leu Trp Arg Trp Gly Trp Arg
1               5                   10                  15
Trp Gly Thr Met Leu Leu Gly Met Leu Met Ile Cys Ser Ala Thr Glu
            20                  25                  30
Lys Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala
        35                  40                  45
Thr Thr Thr Leu Leu Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu
    50                  55                  60
Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn
65                  70                  75                  80
Pro Gln Glu Val Val Leu Val Asn Val Thr Glu Asn Phe Asp Met Trp
                85                  90                  95
Lys Asn Asp Met Val Glu Gln Met His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp
            100                 105                 110
Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Ser
        115                 120                 125
Leu Lys Cys Thr Asp Leu Lys Asn Asp Thr Asn Thr Asn Ser Ser Ser
    130                 135                 140
Gly Arg Met Ile Met Glu Lys Gly Glu Ile Lys Asn Cys Ser Phe Asn
145                 150                 155                 160
Ile Ser Thr Ser Ile Arg Gly Lys Val Gln Lys Glu Tyr Ala Phe Phe
                165                 170                 175
Tyr Lys Leu Asp Ile Ile Pro Ile Asp Asn Asp Thr Thr Ser Tyr Ser
            180                 185                 190
Leu Thr Ser Cys Asn Thr Ser Val Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val
        195                 200                 205
Ser Phe Glu Pro Ile Pro Asn His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala
    210                 215                 220
Ile Leu Lys Cys Lys Asp Lys Lys Phe Asn Gly Lys Gly Pro Cys Thr
225                 230                 235                 240
Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile Arg Pro Val Val Ser
                245                 250                 255
Thr Gln Leu Leu Val Thr Gly Asn Leu Ala Glu Glu Glu Val Val Ile
            260                 265                 270
Arg Ser Ala Asn Phe Ala Asp Asn Ala Lys Val Ile Ile Val Gln Leu
        275                 280                 285
Asn Glu Ser Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg
    290                 295                 300
Lys Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Gly Glu
305                 310                 315                 320
Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln Ala His Cys Asn Leu Ser Arg Ala Lys
                325                 330                 335
Trp Asn Asp Thr Leu Asn Lys Ile Val Ile Lys Leu Arg Glu Gln Phe
            340                 345                 350
Gly Asn Lys Thr Ile Val Phe Lys His Ser Ser Gly Gly Asp Pro Glu
        355                 360                 365
Ile Val Thr His Ser Phe Asn Cys Gly Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn
    370                 375                 380
Ser Thr Gln Leu Phe Asn Ser Thr Trp Phe Asn Ser Thr Trp Ser Thr
385                 390                 395                 400
Glu Gly Ser Asn Asn Thr Glu Gly Ser Asp Thr Ile Thr Leu Pro Cys
                405                 410                 415
Arg Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Lys Val Gly Lys Ala Met
            420                 425                 430
Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile Arg Cys Ser Ser Asn Ile Thr
        435                 440                 445
Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly Asn Ser Asn Asn Glu Ser Glu
    450                 455                 460
Ile Phe Arg Leu Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu
465                 470                 475                 480
Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro
                485                 490                 495
Thr Lys Ala Lys Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile
            500                 505                 510
Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His
        515                 520                 525
Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Thr
    530                 535                 540
Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Glu Gln Ile
545                 550                 555                 560
Trp Asn His Thr Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr
                565                 570                 575
Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln His Glu
            580                 585                 590
Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp
        595                 600                 605
Asn Trp Phe Asn Ile Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys Leu Phe Ile
    610                 615                 620
Met Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg Ile Val Phe Ala Val Leu
625                 630                 635                 640
Ser Ile
<210>25
<211>626
<212>PRT
<213>HIV
<400>25
Met Arg Val Arg Gly Ile Pro Arg Asn Trp Pro Gln Trp Trp Met Trp
1               5                   10                  15
Gly Ile Leu Gly Phe Trp Met Ile Ile Ile Cys Arg Val Val Gly Asn
            20                  25                  30
Met Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Thr Asp Ala Lys
        35                  40                  45
Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Thr Lys Ala Tyr Asp Arg Glu Val
    50                  55                  60
His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro
65                  70                  75                  80
Gln Glu Ile Val Leu Glu Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp Lys
                85                  90                  95
Asn Asp Met Val Asp Gln Met His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp
            100                 105                 110
Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr Leu
        115                 120                 125
His Cys Thr Asn Ala Thr Phe Lys Asn Asn Val Thr Asn Asp Met Asn
    130                 135                 140
Lys Glu Ile Arg Asn Cys Ser Phe Asn Thr Thr Thr Glu Ile Arg Asp
145                 150                 155                 160
Lys Lys Gln Gln Gly Tyr Ala Leu Phe Tyr Arg Pro Asp Ile Val Leu
                165                 170                 175
Leu Lys Glu Asn Arg Asn Asn Ser Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Leu Ile
            180                 185                 190
Asn Cys Asn Ala Ser Thr Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Asn Phe
        195                 200                 205
Asp Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Tyr Ala Ile Leu
    210                 215                 220
Lys Cys Asn Asn Lys Thr Phe Ser Gly Lys Gly Pro Cys Asn Asn Val
225                 230                 235                 240
Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile Lys Pro Val Val Ser Thr Gln
                245                 250                 255
Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Lys Glu Ile Ile Ile Arg Ser
            260                 265                 270
Glu Asn Leu Thr Asp Asn Val Lys Thr Ile Ile Val His Leu Asn Lys
        275                 280                 285
Ser Val Glu Ile Val Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser
    290                 295                 300
Met Arg Ile Gly Pro Gly Gln Thr Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile Ile
305                 310                 315                 320
Gly Asp Ile Arg Gln Ala Tyr Cys Asn Ile Ser Gly Ser Lys Trp Asn
                325                 330                 335
Glu Thr Leu Lys Arg Val Lys Glu Lys Leu Gln Glu Asn Tyr Asn Asn
            340                 345                 350
Asn Lys Thr Ile Lys Phe Ala Pro Ser Ser Gly Gly Asp Leu Glu Ile
        355                 360                 365
Thr Thr His Ser Phe Asn Cys Arg Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Thr
    370                 375                 380
Thr Arg Leu Phe Asn Asn Asn Ala Thr Glu Asp Glu Thr Ile Thr Leu
385                 390                 395                 400
Pro Cys Arg Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Gly Val Gly Arg
                405                 410                 415
Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Ala Gly Asn Ile Thr Cys Lys Ser Asn
            420                 425                 430
Ile Thr Gly Leu Leu Leu Val Arg Asp Gly Gly Glu Asp Asn Lys Thr
        435                 440                 445
Glu Glu Ile Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asn Met Lys Asp Asn Trp Arg
    450                 455                 460
Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Ile Glu Leu Lys Pro Leu Gly Ile
465                 470                 475                 480
Ala Pro Thr Gly Ala Lys Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser
                485                 490                 495
Ser Ile Val Gln Gln Gln Ser Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln
            500                 505                 510
Gln His Met Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Thr
        515                 520                 525
Arg Val Leu Ala Ile Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Glu Ile
    530                 535                 540
Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Ser Asn Tyr
545                 550                 555                 560
Thr Asp Thr Ile Tyr Arg Leu Leu Glu Asp Ser Gln Thr Gln Gln Glu
                565                 570                 575
Lys Asn Glu Lys Asp Leu Leu Ala Leu Asp Ser Trp Lys Asn Leu Trp
            580                 585                 590
Ser Trp Phe Asp Ile Ser Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys Ile Phe Ile
        595                 600                 605
Met Ile Val Gly Gly Leu Ile Gly Leu Arg Ile Ile Phe Ala Val Leu
    610                 615                 620
Ser Ile
625
<210>26
<211>973
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CMV/R启动子
<400>26
ccattgcata cgttgtatcc atatcataat atgtacattt atattggctc atgtccaaca     60
ttaccgccat gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca    120
ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct    180
ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta    240
acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac    300
ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt    360
aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag    420
tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat    480
gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat    540
gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc    600
ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt    660
ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga    720
caccgggacc gatccagcct ccatcggctc gcatctctcc ttcacgcgcc cgccgcccta    780
cctgaggccg ccatccacgc cggttgagtc gcgttctgcc gcctcccgcc tgtggtgcct    840
cctgaactgc gtccgccgtc taggtaagtt taaagctcag gtcgagaccg ggcctttgtc    900
cggcgctccc ttggagccta cctagactca gccggctctc cacgctttgc ctgaccctgc    960
ttgctcaact cta                                                       973

Claims (36)

1. 能够在免疫活性个体中引起抗HIV的免疫应答的组合物，所述组合物包含：
多种不同的核酸构建体，每种核酸构建体包含与CMV/R转录控制序列可操作地连接的编码HIV抗原性多肽的多核苷酸序列，
其中所述多种核酸构建体编码多种HIV进化枝或病毒株的抗原性多肽。
2. 能够在免疫活性个体中引起抗HIV的免疫应答的组合物，所述组合物包含：
多种不同的核酸构建体，每种核酸构建体包含编码单个HIV抗原性多肽的多核苷酸序列，其中所述多种核酸构建体编码多种HIV进化枝或病毒株的抗原性多肽。
3. 如权利要求1或2所述的组合物，其中所述多种核酸构建体包含：
包含编码HIV Gag多肽的多核苷酸序列的第一核酸构建体；
包含编码HIV Pol多肽的多核苷酸序列的第二核酸构建体；
包含编码HIV Nef多肽的多核苷酸序列的第三核酸构建体；以及
包含编码HIV Env多肽的多核苷酸序列的至少一种另外的核酸构建体。
4. 如权利要求3所述的组合物，还包含多种另外的核酸构建体，每一另外的核酸构建体包含编码不同HIV进化枝或病毒株的Env多肽的多核苷酸序列。
5. 如权利要求3所述的疫苗组合物，其中
所述第一核酸构建体包含编码进化枝B Gag多肽的多核苷酸序列；
所述第二核酸构建体包含编码进化枝B Pol多肽的多核苷酸序列；
所述第三核酸构建体包含编码进化枝B Nef多肽的多核苷酸序列。
6. 如权利要求5所述的组合物，其中
所述第一核酸构建体编码与SEQ ID NO：20具有至少95％序列同一性的多肽；
所述第二核酸构建体编码与SEQ ID NO：21具有至少95％序列同一性的多肽；和/或
所述第三核酸构建体编码与SEQ ID NO：22具有至少95％序列同一性的多肽。
7. 如权利要求5所述的组合物，所述组合物还包含多种另外的核酸构建体，其中
第一另外的核酸构建体包含编码进化枝A Env多肽的多核苷酸序列；
第二另外的核酸构建体包含编码进化枝B Env多肽的多核苷酸序列；和/或
第三另外的核酸构建体包含编码进化枝C Env多肽的多核苷酸序列。
8. 如权利要求7所述的组合物，其中
所述第一另外的核酸构建体编码与SEQ ID NO：23具有至少95％序列同一性的多肽；
所述第二核酸构建体编码与SEQ ID NO：24具有至少95％序列同一性的多肽；和/或
所述第三核酸构建体编码与SEQ ID NO：25具有至少95％序列同一性的多肽。
9. 如权利要求1所述的组合物，包含至少一种另外的核酸构建体，所述另外的核酸构建体包含编码嵌合的Env多肽的多核苷酸序列，所述嵌合的Env多肽包含至少多种不同HIV进化枝或病毒株的亚序列。
10. 如权利要求1或2所述的组合物，其中所述多种不同的核酸构建体包含：
包含编码Gag多肽的多核苷酸序列的第一核酸构建体；
包含编码Pol多肽的多核苷酸序列的第二核酸构建体；
包含编码Nef多肽的多核苷酸序列的第三核酸构建体；
包含编码进化枝A的Env多肽的多核苷酸序列的第四核酸构建体；
包含编码进化枝B的Env多肽的多核苷酸序列的第五核酸构建体；和
包含编码进化枝C的Env多肽的多核苷酸序列的第六核酸构建体。
11. 如权利要求10所述的组合物，其中：
所述第一核酸构建体包含与SEQ ID NO：1具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列；
所述第二核酸构建体包含与SEQ ID NO：2具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列；
所述第三核酸构建体包含与SEQ ID NO：3具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列；
所述第四核酸构建体包含与SEQ ID NO：4具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列；
所述第五核酸构建体包含与SEQ ID NO：5具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列；和/或
所述第六核酸构建体包含与SEQ ID NO：6具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列。
12. 如权利要求11所述的组合物，其中：
所述第一核酸构建体包含SEQ ID NO：1的多核苷酸序列；
所述第二核酸构建体包含SEQ ID NO：2的多核苷酸序列；
所述第三核酸构建体包含SEQ ID NO：3的多核苷酸序列；
所述第四核酸构建体包含SEQ ID NO：4的多核苷酸序列；
所述第五核酸构建体包含SEQ ID NO：5的多核苷酸序列；和/或
所述第六核酸构建体包含SEQ ID NO：6的多核苷酸序列。
13. 如权利要求10所述的组合物，包含基本上等重量比的所述六种核酸构建体中的每种核酸构建体。
14. 如权利要求1或2所述的组合物，其中当单独或与至少一种另外的免疫原性组合物联合给药时，所述组合物能够在具有免疫活性的人类个体中引起抗HIV的保护性免疫应答。
15. 如权利要求1或2所述的组合物，其中所述多种不同构建体包含多种质粒。
16. 如权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物还包含药物可接受的载体。
17. 如权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物还包含佐剂。
18. 如权利要求1所述的组合物，其中所述CMV/R转录控制序列包含SEQ ID NO：26的多核苷酸序列。
19. 能够在免疫活性个体中引起抗HIV的免疫应答的组合物，所述组合物包含：
多种不同的核酸构建体，每种核酸构建体包含编码与转录控制序列可操作地连接的单个HIV抗原的多核苷酸序列。
20. 引起抗HIV免疫应答的方法，包括将权利要求1、2或19所述的组合物向人类个体给药。
21. 如权利要求20所述的方法，其中所述免疫应答是抗HIV的多种进化枝或病毒株的保护性免疫应答。
22. 如权利要求20所述的方法，包括将所述多种核酸构建体肌肉内给药。
23. 如权利要求20所述的方法，所述方法包括采用无针输送装置将所述多种核酸构建体给药。
24. 如权利要求20所述的方法，还包括将多种病毒载体给药，其中所述多种病毒载体包含编码HIV抗原性多肽的至少一种多核苷酸序列，其中所述至少一种多核苷酸编码与所述组合物中的核酸编码的多肽相同的抗原性多肽。
25. 如权利要求24所述的方法，其中所述病毒载体包括重组腺病毒载体。
26. 如权利要求25所述的方法，其中所述重组腺病毒载体是复制缺陷型腺病毒载体。
27. 如权利要求26所述的方法，其中所述多种腺病毒载体包括：
包含编码HIV Gag多肽和HIV Pol多肽的多核苷酸序列的第一重组腺病毒载体；
包含编码进化枝A的Env多肽的多核苷酸序列的第二重组腺病毒载体；
包含编码进化枝B的Env多肽的多核苷酸序列的第三重组腺病毒载体；和
包含编码进化枝C的Env多肽的多核苷酸序列的第四重组腺病毒载体。
28. 如权利要求27所述的方法，其中
所述第一重组腺病毒载体包含SEQ ID NO：16；
所述第二重组腺病毒载体包含SEQ ID NO：17；
所述第三重组腺病毒载体包含SEQ ID NO：18；和
所述第四重组腺病毒载体包含SEQ ID NO：19。
29. 分离的或重组的核酸，包含编码与CMV/R转录调节序列可操作地连接的HIV抗原性多肽的多核苷酸序列。
30. 如权利要求29所述的核酸，其中所述核酸包括质粒。
31. 如权利要求29所述的核酸，其中所述核酸包括病毒载体。
32. 如权利要求29、30或31所述的核酸，其中所述多核苷酸序列编码HIV Gag多肽、HIV Pol多肽、HIV Nef多肽或HIV Env多肽。
33. 如权利要求32所述的核酸，其中所述多核苷酸序列编码嵌合的HIV多肽，所述嵌合的HIV多肽包含多种HIV进化枝或病毒株的至少一种亚序列。
34. 如权利要求33所述的核酸，其中所述嵌合的HIV多肽是HIV Env多肽。
35. 如权利要求29、30或31所述的核酸，其中所述多核苷酸序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ IED NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15。
36. 由权利要求35所述的多核苷酸序列编码的多肽。
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