JP2020511141A - 新規Ｃａｓ１３ｂオルソログＣＲＩＳＰＲ酵素及び系 - Google Patents

新規Ｃａｓ１３ｂオルソログＣＲＩＳＰＲ酵素及び系 Download PDF

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Abstract

本発明は、核酸を標的化する系、方法及び組成物を提供する。詳細には、本発明は、新規ＲＮＡターゲティングＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と、少なくとも１つのガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡのようなターゲティング核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされたＲＮＡターゲティング系を提供する。かかる系の作製及び使用方法、並びに使用、方法及び組成物、並びにかかる方法及び使用からの産物も開示及び特許請求される。

Description

関連出願及び参照による援用
２０１７年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／４７１，７１０号明細書及び２０１７年１０月２日に出願された米国仮特許出願第６２／５６６，８２９号明細書に対する優先権を主張する。
２０１６年１０月２１日に出願された、特に米国を指定国とする出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１６／０５８３０２号明細書を含むＰＣＴ出願が参照される。２０１５年１０月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／２４５，２７０号明細書、２０１６年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／２９６，５４８号明細書並びに２０１６年８月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／３７６，３６７号明細書及び同第６２／３７６，３８２号明細書が参照される。更に、２０１７年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／４７１，７９２号明細書及び２０１７年４月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／４８４，７８６号明細書が参照される。Ｓｍａｒｇｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７），“Ｃａｓ１３ｂ Ｉｓ ａ Ｔｙｐｅ ＶＩ−Ｂ ＣＲＩＳＰＲ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ ＲＮａｓｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｓｘ２７ ａｎｄ Ｃｓｘ２８”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６５，６１８−６３０（Ｆｅｂ．１６，２０１７）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１６．１２．０２３．Ｅｐｕｂ Ｊａｎ ５，２０１７及びＳｍａｒｇｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７），“Ｃａｓ１３ｂ Ｉｓ ａ Ｔｙｐｅ ＶＩ−Ｂ ＣＲＩＳＰＲ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ ＲＮａｓｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｓｘ２７ ａｎｄ Ｃｓｘ２８”，ｂｉｏＲｘｉｖ ０９２５７７；ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／０９２５７７．Ｐｏｓｔｅｄ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ９，２０１７が挙げられる。前述の出願及び文献引用の各々は、本明細書によって参照により本明細書に援用される。
実際、本明細書及び本明細書に引用される文献中で引用又は参照される全ての文献は、本明細書で言及されるか又は本明細書に参照によって援用される任意の文献中にある任意の製品に関する任意の製造者の指示書、説明書、製品仕様書及びプロダクトシートと共に、本明細書によって参照により本明細書に援用され、且つ本発明の実施に用いられ得る。より具体的には、参照される全ての文献は、各個別の文献について参照によって援用されることが具体的且つ個別に指示されたものとするのと同程度に参照によって援用される。
連邦政府支援研究に関する記載事項
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）から付与された助成金第ＭＨ１００７０６号及び第ＭＨ１１００４９号に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、概して、遺伝子転写物の摂動又は核酸編集など、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）及びその構成成分に関するベクター系を使用し得る配列ターゲティングを含む遺伝子発現の制御に用いられる系、方法及び組成物に関する。
細菌及び古細菌のＣＲＩＳＰＲ−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）適応免疫系は、タンパク質組成及びゲノム遺伝子座構成について極めて高い多様性を示す一部のかかる系である。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系遺伝子座は、５０を超える遺伝子ファミリーを有し、厳密な意味で普遍的な遺伝子が存在しないことから、急速な進化及び遺伝子座構成の極めて高度な多様性が示唆される。これまで、多方向からの手法をとることにより、９３個のＣａｓタンパク質について約３９５個のプロファイルのｃａｓ遺伝子が包括的に同定されている。分類に含まれるのは、シグネチャ遺伝子プロファイル＋遺伝子座構成のシグネチャである。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の新規分類が提案されており、ここで、これらの系が大まかに２つのクラス、マルチサブユニットエフェクター複合体を有するクラス１と、Ｃａｓ９タンパク質に例示される単一サブユニットエフェクターモジュールを有するクラス２とに分けられる。クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に関連する新規エフェクタータンパク質は、強力なゲノムエンジニアリングツールとして開発することができ、推定上の新規エフェクタータンパク質の予測並びにそれらのエンジニアリング及び最適化が重要である。新規Ｃａｓ１３ｂオルソログ及びその使用が望ましい。
本願中のいずれの文献の引用又は特定も、かかる文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものではない。
エフェクタータンパク質は、２つのサブグループ、ＶＩ−Ｂ１型及びＶＩ−Ｂ２型を含み、ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼである、ＲＮＡ干渉性の、且つＲＮＡファージに対する細菌性養子免疫に関与し得るメンバーを含む。Ｃａｓ１３ｂ系は、大型の単一のエフェクター（約１１００アミノ酸長）を含み、且つＣＲＩＳＰＲアレイの近傍にある２つの低分子推定アクセサリータンパク質（約２００アミノ酸長）の一方を含むもの又はそのいずれも含まないものであり得る。この近傍の低分子タンパク質に基づき、この系は、２つの遺伝子座Ａ及びＢに分かれる。アレイから上流又は下流に２５キロベース対まで、各遺伝子座を有する種間で保存されている追加的なタンパク質はない。僅かな例外はあるが、ＣＲＩＳＰＲアレイは、ダイレクトリピート配列３６ヌクレオチド長及びスペーサー配列３０ヌクレオチド長を含む。ダイレクトリピートは、概して、良く保存されており、特に末端で良く保存され、５’末端のＧＴＴＧ／ＧＵＵＧは、３’末端のＣＡＡＣと逆相補的である。この保存は、遺伝子座内のタンパク質と相互作用する可能性のある、ＲＮＡループ構造に向かう強力な塩基対合を示唆している。ダイレクトリピートに相補的なモチーフ検索から、アレイの近傍に候補ｔｒａｃｒＲＮＡは、明らかになっておらず、おそらくＣｐｆ１遺伝子座に見られるような単一のｃｒＲＮＡを示すものである。
本発明の実施形態において、ＶＩ−Ｂ型系は、新規Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と、任意選択でＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質の上流又は下流にコードされる低分子アクセサリータンパク質とを含む。特定の実施形態において、低分子アクセサリータンパク質は、Ｃａｓ１３ｂエフェクターがＲＮＡを標的化する能力を亢進させる。
本発明は、以下を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を提供する。
ｉ）ある種の新規Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質、及び
ｉｉ）ｃｒＲＮＡ、
ここで、ｃｒＲＮＡは、ａ）標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズする能力を有するガイド配列と、ｂ）ダイレクトリピート配列とを含み、
それにより、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体化されたＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ複合体が形成される。複合体は、インビトロ又はエキソビボで形成して細胞に導入されるか、又はＲＮＡと接触されるか、又はインビボで形成され得る。
一部の実施形態において、本発明の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物は、ＶＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエフェクタータンパク質活性を亢進させるアクセサリータンパク質を含み得る。
特定のかかる実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質活性を亢進させるアクセサリータンパク質は、ｃｓｘ２８タンパク質である。かかる実施形態において、ＶＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエフェクタータンパク質とＶＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓアクセサリータンパク質とは、同じ供給源に由来するか、又は異なる供給源に由来し得る。
一部の実施形態において、本発明の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物は、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質活性を抑制するアクセサリータンパク質を含む。
特定のかかる実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質活性を抑制するアクセサリータンパク質は、ｃｓｘ２７タンパク質である。かかる実施形態において、ＶＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエフェクタータンパク質とＶＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓアクセサリータンパク質とは、同じ供給源に由来するか、又は異なる供給源に由来し得る。本発明の特定の実施形態において、ＶＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエフェクタータンパク質は、表１からのものである。特定の実施形態において、ＶＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓアクセサリータンパク質は、表１からのものである。
一部の実施形態において、本発明の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物は、２つ以上のｃｒＲＮＡを含む。
一部の実施形態において、本発明の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物は、原核細胞の標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズするガイド配列を含む。
一部の実施形態において、本発明の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物は、真核細胞の標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズするガイド配列を含む。
一部の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。
本発明のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、表１からの又はそれに示されるとおりのかかるタンパク質であるか、又はそれにあるか、又はそれを含むか、又はそれから本質的になるか、又はそれからなるか、又はそれに関わるか若しくは関する。本発明は、表１からの又はそれに示されるとおりのタンパク質を、本明細書に示されるとおりのその突然変異又は改変を含めて提供するか、又はそれに関するか、又はそれに関わるか、又はそれを含むか、又はそれから本質的になるか、又はそれからなることが意図される。表１Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、表１と併せて本明細書で更に詳細に考察される。
本発明の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の一部の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインと会合されている。会合は、エフェクタータンパク質が機能ドメインに直接連結することによるものであり得、又はｃｒＲＮＡとの会合によるものであり得る。非限定的な例では、ｃｒＲＮＡは、例えば、アプタマー又は核酸結合アダプタータンパク質に結合するヌクレオチドを含め、目的の機能ドメインと会合することのできる配列の付加又は挿入を含む。
特定の非限定的な実施形態において、本発明の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物は、標的ＲＮＡ配列を切断する機能ドメインを含む。
特定の非限定的な実施形態において、本発明の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物は、標的ＲＮＡ配列の転写又は翻訳を改変する機能ドメインを含む。
本発明の組成物の一部の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインと会合されており、及びエフェクタータンパク質は、ＨＥＰＮドメイン内に１つ以上の突然変異を含み、それにより、複合体は、後成的改変因子又は転写若しくは翻訳活性化若しくは抑制シグナルを送達することができる。複合体は、インビトロ又はエキソビボで形成して細胞に導入されるか、又はＲＮＡと接触されるか、又はインビボで形成され得る。
本発明の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の一部の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質とアクセサリータンパク質とは、同じ生物に由来する。
本発明の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の一部の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質とアクセサリータンパク質とは、異なる生物に由来する。
本発明は、ＶＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクター系であって、
Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１の調節エレメント、及び
ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２の調節エレメント
を含む１つ以上のベクターを含むＶＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクター系も提供する。
特定の実施形態において、本発明のベクター系は、ＶＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓアクセサリータンパク質のヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節エレメントを更に含む。
適切な場合、ＶＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列及び／又はＶＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓアクセサリータンパク質をコードするヌクレオチド配列は、真核細胞での発現にコドン最適化される。
本発明のベクター系の一部の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質及びアクセサリータンパク質をコードするヌクレオチド配列は、真核細胞での発現にコドン最適化される。
一部の実施形態において、本発明のベクター系は、単一のベクターで含む。
本発明のベクター系の一部の実施形態において、１つ以上のベクターは、ウイルスベクターを含む。
本発明のベクター系の一部の実施形態において、１つ以上のベクターは、１つ以上のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴又は単純ヘルペスウイルスベクターを含む。
本発明は、
ｉ）Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質、及び
ｉｉ）ｃｒＲＮＡ、
を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質及び１つ以上の核酸成分を送達するように構成された送達系であって、
ｃｒＲＮＡは、ａ）細胞の標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズするガイド配列と、ｂ）ダイレクトリピート配列とを含み、
Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、ｃｒＲＮＡと複合体を形成し、
ガイド配列は、標的ＲＮＡ配列への配列特異的結合を導き、
それにより、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体化されたＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ複合体が形成される、送達系を提供する。複合体は、インビトロ又はエキソビボで形成して細胞に導入されるか、又はＲＮＡと接触されるか、又はインビボで形成され得る。
本発明の送達系の一部の実施形態において、この系は、１つ以上のベクター又は１つ以上のポリヌクレオチド分子を含み、この１つ以上のベクター又はポリヌクレオチド分子は、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質及び１つ以上の核酸成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む。
一部の実施形態において、本発明の送達系は、リポソーム、粒子、エキソソーム、微小胞、遺伝子銃又は１つ以上のウイルスベクターを含む送達媒体を含む。
一部の実施形態において、本発明の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物は、治療的処置方法又は研究プログラムにおける使用のためのものである。
一部の実施形態において、本発明の天然に存在しない又はエンジニアリングされたベクター系は、治療的処置方法又は研究プログラムにおける使用のためのものである。
一部の実施形態において、本発明の天然に存在しない又はエンジニアリングされた送達系は、治療的処置方法又は研究プログラムにおける使用のためのものである。
本発明は、目的の標的遺伝子の発現を改変する方法であって、標的ＲＮＡを、
ｉ）Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質、及び
ｉｉ）ｃｒＲＮＡ、
を含む１つ以上の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物に接触させることを含み、
ｃｒＲＮＡは、ａ）細胞の標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズするガイド配列と、ｂ）ダイレクトリピート配列とを含み、
Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、ｃｒＲＮＡと複合体を形成し、
ガイド配列は、細胞における標的ＲＮＡ配列への配列特異的結合を導き、
それにより、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体化されたＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ複合体が形成され、
それにより、目的の標的遺伝子座の発現が改変される、方法を提供する。複合体は、インビトロ又はエキソビボで形成して細胞に導入されるか、又はＲＮＡと接触されるか、又はインビボで形成され得る。
一部の実施形態において、目的の標的遺伝子の発現を改変する方法は、標的ＲＮＡを、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質活性を亢進させるアクセサリータンパク質に接触させることを更に含む。
目的の標的遺伝子の発現を改変する方法の一部の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質活性を亢進させるアクセサリータンパク質は、ｃｓｘ２８タンパク質である。
一部の実施形態において、目的の標的遺伝子の発現を改変する方法は、標的ＲＮＡを、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質活性を抑制するアクセサリータンパク質に接触させることを更に含む。
目的の標的遺伝子の発現を改変する方法の一部の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質活性を抑制するアクセサリータンパク質は、ｃｓｘ２７タンパク質である。
一部の実施形態において、目的の標的遺伝子の発現を改変する方法は、標的ＲＮＡを切断することを含む。
一部の実施形態において、目的の標的遺伝子の発現を改変する方法は、標的ＲＮＡの発現を増加又は減少させることを含む。
目的の標的遺伝子の発現を改変する方法の一部の実施形態において、標的遺伝子は、原核細胞にある。
目的の標的遺伝子の発現を改変する方法の一部の実施形態において、標的遺伝子は、真核細胞にある。
本発明は、改変された目的の標的を含む細胞であって、目的の標的は、本明細書に開示される方法のいずれかによって改変されている、細胞を提供する。
本発明の一部の実施形態において、細胞は、原核細胞である。
本発明の一部の実施形態において、細胞は、真核細胞である。
一部の実施形態において、細胞における目的の標的の改変は、
少なくとも１つの遺伝子産物の変化した発現を含む細胞、
少なくとも１つの遺伝子産物の変化した発現を含む細胞であって、少なくとも１つの遺伝子産物の発現は、増加される、細胞、又は
少なくとも１つの遺伝子産物の変化した発現を含む細胞であって、少なくとも１つの遺伝子産物の発現は、減少される、細胞
をもたらす。
一部の実施形態において、細胞は、哺乳類細胞又はヒト細胞である。
本発明は、本明細書に開示される細胞又は本明細書に開示される方法のいずれかによって改変された細胞若しくはその子孫の又はそれを含む細胞株を提供する。
本発明は、本明細書に開示される１つ以上の細胞又は本明細書に開示される方法のいずれかによって改変された１つ以上の細胞を含む多細胞生物を提供する。
本発明は、本明細書に開示される１つ以上の細胞又は本明細書に開示される方法のいずれかによって改変された１つ以上の細胞を含む植物又は動物モデルを提供する。
本発明は、本明細書に開示される細胞、又は細胞株、又は生物、又は植物若しくは動物モデルからの遺伝子産物を提供する。
一部の実施形態において、発現される遺伝子産物の量は、変化した発現を有しない細胞からの遺伝子産物の量より多いか又は少ない。
本発明は、表１を含むか、又はそれから本質的になるか、又はそれからなるか、又はそれに示されるとおりの単離されたＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質を提供する。表１のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、表１と併せて本明細書で更に詳細に考察されるとおりである。本発明は、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質をコードする単離核酸を提供する。本発明の一部の実施形態において、単離核酸は、ＤＮＡ配列を含み、ｃｒＲＮＡをコードする配列を更に含む。本発明は、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質をコードする核酸を含む単離真核細胞を提供する。従って、本明細書では、「Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質」、又は「エフェクタータンパク質」、又は「Ｃａｓ」、又は「Ｃａｓタンパク質」、又は「ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質」、又は「ＲＮＡターゲティングタンパク質」、又は類似の表現は、表１との関連で理解されるべきであり、表１のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と読むことができ；「ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系」などの表現は、表１との関連で理解されるべきであり、表１のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質ＣＲＩＳＰＲ系と読むことができ；及びガイドＲＮＡ又はｓｇＲＮＡへの言及は、Ｃａｓ１３ｂ系ｃｒＲＮＡの本明細書における考察と併せて読まれるべきであり、例えば、他の系におけるｓｇＲＮＡであるものは、本発明におけるｃｒＲＮＡとして又はそのようなものと見なされ得る。
本発明は、本発明のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質（例えば、表１）に好適なガイド配列の要件を同定する方法であって、
（ａ）生物内の必須遺伝子の組を選択すること、
（ｂ）これらの遺伝子の領域、コード領域並びにこれらの遺伝子の５’及び３’ＵＴＲにハイブリダイズする能力を有するターゲティングガイド配列のライブラリを設計すること、
（ｃ）前記生物のゲノム内のいかなる領域にもハイブリダイズしないランダム化されたガイド配列を対照ガイドとして作成すること、
（ｄ）ＲＮＡターゲティングタンパク質と第１の耐性遺伝子とを含むプラスミド及び前記ターゲティングガイドのライブラリと前記対照ガイドと第２の耐性遺伝子とを含むガイドプラスミドライブラリを調製すること、
（ｅ）前記プラスミドを宿主細胞に共導入すること、
（ｆ）前記第１及び第２の耐性遺伝子のための選択培地に前記宿主細胞を導入すること、
（ｇ）成長する宿主細胞の必須遺伝子をシーケンシングすること、
（ｈ）対照ガイドによる細胞の枯渇を比較することにより、ターゲティングガイドで形質転換した細胞の枯渇の有意性を決定すること、及び
（ｉ）枯渇したガイド配列に基づいて好適なガイド配列の要件を決定すること
を含む方法を提供する。
かかる方法の一態様において、ＲＮＡターゲティングタンパク質の好適なガイド配列に対するＰＦＳ配列の決定は、枯渇細胞においてガイドの標的となる配列の比較による。かかる方法の一態様において、本方法は、異なるレプリケート実験における異なる条件についてのガイド存在量を比較することを更に含む。かかる方法の一態様において、対照ガイドは、それがレプリケート実験でのガイド枯渇について限られた偏差を示すと決定される点で選択される。かかる方法の一態様において、枯渇の有意性は、（ａ）最も枯渇した対照ガイドより高い枯渇、又は（ｂ）対照ガイドについての平均枯渇＋標準偏差の２倍より高い枯渇として決定される。かかる方法の一態様において、宿主細胞は、細菌宿主細胞である。かかる方法の一態様において、プラスミドを共導入するステップは電気穿孔により、宿主細胞は、エレクトロコンピテントな宿主細胞である。
Ｃａｓ１３ｂ
本発明は、目的の標的遺伝子座に関連するか又はそこにある配列を改変する方法を提供し、この方法は、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、ここで、エフェクタータンパク質は、１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質は、目的の標的遺伝子座に関連するか又はそこにある配列の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は、鎖切断の導入である。好ましい実施形態において、目的の標的遺伝子座に関連するか又はそこにある配列は、ＲＮＡを含むか又はＲＮＡからなる。
本発明は、目的の標的遺伝子座に関連するか又はそこにある配列を改変する方法を提供し、この方法は、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と、任意選択で低分子アクセサリータンパク質と、１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、ここで、エフェクタータンパク質は、１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質は、目的の標的遺伝子座に関連するか又はそこにある配列の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は、鎖切断の導入である。好ましい実施形態において、目的の標的遺伝子座に関連するか又はそこにある配列は、ＲＮＡを含むか又はＲＮＡからなる。
本発明は、目的の標的遺伝子座に関連するか又はそこにある配列を改変する方法を提供し、この方法は、Ｃａｓ１３ｂ遺伝子座エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を遺伝子座に関連するか又はそこにある前記配列に送達することを含み、ここで、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質は、目的の標的遺伝子座に関連するか又はそこにある配列の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は、鎖切断の導入である。好ましい実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、１つの核酸成分、有利にはエンジニアリングされた又は天然に存在しない核酸成分と複合体を形成する。目的の標的遺伝子座に関連するか又はそこにある配列の改変の誘導は、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質−核酸ガイド下であり得る。好ましい実施形態において、１つの核酸成分は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）である。好ましい実施形態において、１つの核酸成分は、成熟ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡであり、ここで、成熟ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡは、スペーサー配列（又はガイド配列）及びダイレクトリピート（ＤＲ）配列又はこれらの誘導体を含む。好ましい実施形態において、スペーサー配列又はその誘導体は、シード配列を含み、ここで、シード配列は、標的遺伝子座における配列の認識及び／又はそれとのハイブリダイゼーションに決定的に重要である。本発明の好ましい実施形態において、ｃｒＲＮＡは、短鎖ＤＲ配列に会合され得る短鎖ｃｒＲＮＡである。本発明の別の実施形態において、ｃｒＲＮＡは、長鎖ＤＲ配列（又は二重ＤＲ）に会合され得る長鎖ｃｒＲＮＡである。本発明の態様は、１つ以上の天然に存在しない、又はエンジニアリングされた、又は改変された、又は最適化された核酸成分を有するＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質複合体に関する。好ましい実施形態において、核酸成分は、ＲＮＡを含む。好ましい実施形態において、複合体の核酸成分は、ダイレクトリピート配列に連結したガイド配列を含み得、ここで、ダイレクトリピート配列は、１つ以上のステムループ又は最適化された二次構造を含む。本発明の好ましい実施形態において、ダイレクトリピートは、短鎖ＤＲ又は長鎖ＤＲ（二重ＤＲ）であり得る。好ましい実施形態において、ダイレクトリピートは、１つ以上のタンパク質結合ＲＮＡアプタマーを含むように改変され得る。好ましい実施形態において、ダイレクトリピートは、１つ以上のタンパク質結合ＲＮＡアプタマーを含むように改変され得る。好ましい実施形態において、１つ以上のアプタマーは、最適化された二次構造の一部として含まれ得る。かかるアプタマーは、バクテリオファージコートタンパク質との結合能を有し得る。バクテリオファージコートタンパク質は、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、ＭＳ２、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ及びＰＲＲ１を含む群から選択され得る。好ましい実施形態において、バクテリオファージコートタンパク質は、ＭＳ２である。本発明は、３０以上、４０以上又は５０以上のヌクレオチド長である複合体の核酸成分も提供する。
本発明は、目的の標的遺伝子座に関連するか又はそこにある配列をゲノム編集又は改変する方法を提供し、この方法は、任意の所望の細胞型、原核細胞又は真核細胞にＣａｓ１３ｂ複合体を導入することを含み、それにより、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質複合体は、有効に機能して真核生物又は原核細胞のＲＮＡと相互作用する。好ましい実施形態において、細胞は、真核細胞であり、ＲＮＡは、哺乳類ゲノムから転写されるか又は哺乳類細胞に存在する。ヒト細胞におけるＲＮＡ編集又はゲノム編集の好ましい方法において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、限定されないが、本明細書に開示されるＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質の特定の種を含み得る。
本発明は、目的の標的遺伝子座を改変する方法も提供し、この方法は、Ｃａｓ１３ｂ遺伝子座エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、ここで、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質は、目的の標的遺伝子座の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は、鎖切断の導入である。
かかる方法において、目的の標的遺伝子座は、ＲＮＡ分子内に含まれ得る。かかる方法において、目的の標的遺伝子座は、インビトロでＲＮＡに含まれ得る。
かかる方法において、目的の標的遺伝子座は、細胞内のＲＮＡ分子に含まれ得る。細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。細胞は、哺乳類細胞であり得る。本発明によって細胞に導入される改変は、抗体、デンプン、アルコール又は他の所望の細胞産出物などの生物学的産物の産生向上のために細胞及び細胞の子孫を変化させるようなものであり得る。本発明によって細胞に導入される改変は、産生される生物学的産物を変える変化が細胞及び細胞の子孫に含まれるようなものであり得る。
哺乳類細胞は、非ヒト哺乳動物、例えば霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、げっ歯類、ウサギ科（Ｌｅｐｏｒｉｄａｅ）、例えばサル、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウサギ、ラット又はマウス細胞であり得る。細胞は、非哺乳類真核細胞、例えば家禽類のトリ（例えば、ニワトリ）、脊椎動物魚類（例えば、サケ）又は甲殻類（例えば、カキ、ハマグリ（ｃｌａｉｍ）、ロブスター、エビ）細胞であり得る。細胞は、植物細胞でもあり得る。植物細胞は、単子葉植物又は双子葉植物のもの又は作物又は穀物植物のもの、例えばキャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、ダイズ、コムギ、オートムギ又はコメであり得る。植物細胞は、藻類、樹木又は生産植物、果実又は野菜のもの（例えば、柑橘類の木、例えばオレンジ、グレープフルーツ又はレモンの木などの木；モモ又はネクタリンの木；リンゴ又はセイヨウナシの木；アーモンド又はクルミ又はピスタチオの木などの堅果類の木；ナス科植物；アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の植物；アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）の植物；ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）の植物；トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の植物；綿、タバコ、アスパラガス、ニンジン、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、トマト、ナス、コショウ、レタス、ホウレンソウ、イチゴ、ブルーベリー、ラズベリー、ブラックベリー、ブドウ、コーヒー、ココア等）でもあり得る。
本発明は、目的の標的遺伝子座を改変する方法を提供し、この方法は、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、ここで、エフェクタータンパク質は、１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質は、目的の標的遺伝子座の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は、鎖切断の導入である。
かかる方法において、目的の標的遺伝子座は、ＲＮＡ分子内に含まれ得る。好ましい実施形態において、目的の標的遺伝子座は、ＲＮＡを含むか又はそれからなる。
本発明は、目的の標的遺伝子座を改変する方法も提供し、この方法は、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、ここで、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質は、目的の標的遺伝子座の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は、鎖切断の導入である。
好ましくは、かかる方法において、目的の標的遺伝子座は、インビトロでＲＮＡ分子に含まれ得る。また、好ましくは、かかる方法において、目的の標的遺伝子座は、細胞内のＲＮＡ分子に含まれ得る。細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。細胞は、哺乳類細胞であり得る。細胞は、げっ歯類細胞であり得る。細胞は、マウス細胞であり得る。
記載される方法の任意のものにおいて、目的の標的遺伝子座は、目的のゲノム又はエピゲノム遺伝子座であり得る。記載される方法の任意のものにおいて、複合体は、多重化した使用向けに複数のガイドと共に送達され得る。記載される方法の任意のものにおいて、２つ以上のタンパク質が用いられ得る。
本発明の更なる態様において、核酸成分は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列を含み得る。エフェクタータンパク質がＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質であることに伴い、核酸成分は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列を含み得、概していかなるトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒ ＲＮＡ）配列も含まなくてよい。
記載される方法の任意のものにおいて、エフェクタータンパク質及び核酸成分は、そのタンパク質及び／又は核酸成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子によって提供され得、ここで、１つ以上のポリヌクレオチド分子は、タンパク質及び／又は核酸成分を発現するように作動可能に構成されている。１つ以上のポリヌクレオチド分子は、タンパク質及び／又は核酸成分を発現するように作動可能に構成された１つ以上の調節エレメントを含み得る。１つ以上のポリヌクレオチド分子は、１つ以上のベクター内に含まれ得る。記載される方法のいずれにおいても、目的の標的遺伝子座は、目的のゲノム、エピゲノム又はトランスクリプトーム遺伝子座であり得る。記載される方法のいずれにおいても、複合体は、多重化用途のために複数のガイドを伴い送達され得る。記載される方法のいずれにおいても、２つ以上のタンパク質が用いられ得る。
記載される方法のいずれにおいても、鎖切断は、一本鎖切断又は二本鎖切断であり得る。好ましい実施形態において、二本鎖切断とは、一本鎖ＲＮＡ分子が自らを折り畳んだときに形成されるＲＮＡの２つのセクション又は自己相補配列を含むＲＮＡ分子がそのＲＮＡの一部の折り畳み及び自己対合を許容することにより形成される推定二重ヘリックスなど、ＲＮＡの２つのセクションの切断を指し得る。
調節エレメントは、誘導性プロモーターを含み得る。ポリヌクレオチド及び／又はベクター系は、誘導性系を含み得る。
記載される方法の任意のものにおいて、１つ以上のポリヌクレオチド分子は、送達系に含まれ得、又は１つ以上のベクターが送達系に含まれ得る。
記載される方法の任意のものにおいて、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物は、リポソーム、ナノ粒子を含む粒子、エキソソーム、微小胞、遺伝子銃又は１つ以上のウイルスベクターによって送達され得る。
本発明は、本明細書で考察するとおりの特徴を有するか又は本明細書に記載される方法のいずれかに定義される組成物である、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物も提供する。
特定の実施形態において、従って、本発明は、特に目的の標的遺伝子座を改変する能力を有するか又は改変するように構成されている組成物など、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を提供し、前記組成物は、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含み、ここで、エフェクタータンパク質は、１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質は、目的の標的遺伝子座の改変を誘導する。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質であり得る。
本発明は、更なる態様において、特に目的の標的遺伝子座を改変する能力を有するか又は改変するように構成されている組成物など、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物も提供し、前記組成物は、（ａ）ガイドＲＮＡ分子（又はガイドＲＮＡ分子の組み合わせ、例えば第１のガイドＲＮＡ分子及び第２のガイドＲＮＡ分子）又はガイドＲＮＡ分子をコードする核酸（又はガイドＲＮＡ分子の組み合わせをコードする１つ以上の核酸）、（ｂ）Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質を含む。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質であり得る。
本発明は、更なる態様において、（Ｉ．）（ａ）ポリヌクレオチド遺伝子座の標的配列にハイブリダイズする能力を有するガイド配列、（ｂ）ｔｒａｃｒメイト配列、及び（ｃ）ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む１つ以上のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列と、（ＩＩ．）Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド配列とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物も提供し、ここで、転写時、ｔｒａｃｒメイト配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にハイブリダイズし、且つガイド配列は、ＣＲＩＳＰＲ複合体による標的配列への配列特異的結合を導き、ここで、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体化されたＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質を含む。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質であり得る。
特定の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡは、必要でないこともある。従って、本発明は、特定の実施形態において、（Ｉ．）（ａ）ポリヌクレオチド遺伝子座の標的配列にハイブリダイズする能力を有するガイド配列、及び（ｂ）ダイレクトリピート配列を含む１つ以上のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列と、（ＩＩ．）Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド配列とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物も提供し、ここで、転写時、ガイド配列は、ＣＲＩＳＰＲ複合体による標的配列への配列特異的結合を導き、ここで、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、及び（２）ダイレクトリピート配列と複合体化されたＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質を含む。好ましくは、エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質であり得る。限定なしに、本出願人らは、そのような場合、ｃｒＲＮＡをエフェクタータンパク質に負荷するのに十分な二次構造がダイレクトリピート配列に含まれ得ると仮定する。例として且つ限定なしに、かかる二次構造は、ダイレクトリピート内のステムループ（１つ以上のステムループなど）を含み得るか、それから本質的になり得るか、又はそれからなり得る。
本発明は、１つ以上のベクターを含むベクター系も提供し、この１つ以上のベクターは、本明細書に記載される方法に定義されるとおりの特徴を有する組成物である、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む。
本発明は、１つ以上のベクター又は１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む送達系も提供し、この１つ以上のベクター又はポリヌクレオチド分子は、本明細書で考察するとおりの特徴を有するか又は本明細書に記載される方法のいずれかに定義される組成物である、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む。
本発明は、療法的治療方法に用いられる、天然に存在しない若しくはエンジニアリングされた組成物、又は前記組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、又は前記組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター又は送達系も提供する。療法的治療方法には、遺伝子若しくは遺伝子編集又は遺伝子療法が含まれ得る。
本発明は、エフェクタータンパク質の１つ以上のアミノ酸残基が改変され得る方法及び組成物、例えば表１のタンパク質の、又はそれを含むか、又はそれからなるか、又はそれから本質的になるエンジニアリングされた又は天然に存在しないＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質も提供する。ある実施形態において、改変は、エフェクタータンパク質の１つ以上のアミノ酸残基の突然変異を含み得る。１つ以上の突然変異は、エフェクタータンパク質の１つ以上の触媒活性ドメインにあり得る。このエフェクタータンパク質は、前記１つ以上の突然変異を欠くエフェクタータンパク質と比較してヌクレアーゼ活性が低下又は消失し得る。このエフェクタータンパク質は、目的の標的遺伝子座における１つのＲＮＡ鎖の切断を誘導しないことがあり得る。好ましい実施形態において、１つ以上の突然変異は、２つの突然変異を含み得る。好ましい実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質、例えばエンジニアリングされた又は天然に存在しないＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質において１つ以上のアミノ酸残基が改変される。本発明の特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、１つ以上のＨＥＰＮドメインを含む。好ましい実施形態において、エフェクタータンパク質は、２つのＨＥＰＮドメインを含む。別の好ましい実施形態において、エフェクタータンパク質は、タンパク質のＣ末端に１つのＨＥＰＮドメインを含み、Ｎ末端にもう１つのＨＥＰＮドメインを含む。特定の実施形態において、１つ以上の突然変異又は２つ以上の突然変異は、ＨＥＰＮドメインを含むエフェクタータンパク質の触媒活性ドメイン又はＨＥＰＮドメインと相同な触媒活性ドメインにあり得る。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、以下の突然変異の１つ以上を含む：Ｒ１１６Ａ、Ｈ１２１Ａ、Ｒ１１７７Ａ、Ｈ１１８２Ａ（ここで、アミノ酸位置は、バージイエラ・ズーヘルカム（Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ）ＡＴＣＣ ４３７６７に由来するグループ２９タンパク質のアミノ酸位置に対応する）。当業者は、異なるＣａｓ１３ｂタンパク質の対応するアミノ酸位置を同じ効果となるように突然変異させ得ることを理解するであろう。特定の実施形態において、１つ以上の突然変異は、タンパク質の触媒活性を完全に又は部分的に無効にする（例えば、切断速度の変更、特異性の変更等）。特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりのエフェクタータンパク質は、「デッド」エフェクタータンパク質、例えばデッドＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質（即ちｄＣａｓ１３ｂ）である。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、ＨＥＰＮドメイン１に１つ以上の突然変異を有する。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、ＨＥＰＮドメイン２に１つ以上の突然変異を有する。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、ＨＥＰＮドメイン１及びＨＥＰＮドメイン２に１つ以上の突然変異を有する。エフェクタータンパク質は、１つ以上の異種機能ドメインを含み得る。１つ以上の異種機能ドメインは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメインを含み得る。１つ以上の異種機能ドメインは、少なくとも２つ以上のＮＬＳドメインを含み得る。１つ以上のＮＬＳドメインは、エフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質）の末端に又はその近傍に又はそれに近接して位置し得、及び２つ以上のＮＬＳの場合、それらの２つの各々がエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質）の末端に又はその近傍に又はそれに近接して位置し得る。１つ以上の異種機能ドメインは、１つ以上の転写活性化ドメインを含み得る。好ましい実施形態において、転写活性化ドメインは、ＶＰ６４を含み得る。１つ以上の異種機能ドメインは、１つ以上の転写抑制ドメインを含み得る。好ましい実施形態において、転写抑制ドメインは、ＫＲＡＢドメイン又はＳＩＤドメイン（例えば、ＳＩＤ４Ｘ）を含み得る。１つ以上の異種機能ドメインは、１つ以上のヌクレアーゼドメインを含み得る。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１を含む。
本発明は、１つ以上の異種機能ドメインが以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、一本鎖ＲＮＡ切断活性、二本鎖ＲＮＡ切断活性、一本鎖ＤＮＡ切断活性、二本鎖ＤＮＡ切断活性及び核酸結合活性の１つ以上を有することも提供する。少なくとも１つ以上の異種機能ドメインは、エフェクタータンパク質のアミノ末端にあるか又はその近傍にあり得、及び／又はここで、少なくとも１つ以上の異種機能ドメインは、エフェクタータンパク質のカルボキシ末端にあるか又はその近傍にある。１つ以上の異種機能ドメインは、エフェクタータンパク質に融合され得る。１つ以上の異種機能ドメインは、エフェクタータンパク質に繋留され得る。１つ以上の異種機能ドメインは、リンカー部分を介してエフェクタータンパク質に連結され得る。
特定の実施形態において、本明細書で意図されるとおりのＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、３０〜４０ｂｐ長、より典型的には３４〜３８ｂｐ長、更により典型的には３６〜３７ｂｐ長、例えば３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０ｂｐ長の短鎖ＣＲＩＳＰＲリピートを含む遺伝子座と会合され得る。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリピートは、８０〜３５０ｂｐ長、例えば８０〜２００ｂｐ長、更により典型的には８６〜８８ｂｐ長、例えば８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９又は９０ｂｐ長の長鎖又は二重リピートである。
特定の実施形態では、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）又はＰＡＭ様モチーフは、本明細書に開示されるとおりのエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質）複合体による目的の標的遺伝子座への結合を導く。一部の実施形態において、ＰＡＭは、５’ＰＡＭであり得る（即ちプロトスペーサーの５’末端の上流に位置する）。他の実施形態において、ＰＡＭは、３’ＰＡＭであり得る（即ちプロトスペーサーの５’末端の下流に位置する）。他の実施形態では、５’ＰＡＭ及び３’ＰＡＭの両方が必要である。本発明の特定の実施形態において、エフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質）の結合を導くのにＰＡＭ又はＰＡＭ様モチーフは、不要であり得る。特定の実施形態において、５’ＰＡＭは、Ｄ（即ちＡ、Ｇ又はＵ）である。特定の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクターについて、５’ＰＡＭは、Ｄである。本発明の特定の実施形態において、リピート配列における切断により、５’末端に短鎖ヌクレオチド（例えば、５、６、７、８、９又は１０ｎｔ又はそれが二重リピートの場合にはそれを超える）リピート配列（これは、ｃｒＲＮＡ「タグ」と称され得る）及び３’末端にリピートの残りの部分が隣接する完全なスペーサー配列を含むｃｒＲＮＡ（例えば、短鎖又は長鎖ｃｒＲＮＡ）が生じ得る。特定の実施形態において、本明細書に記載されるエフェクタータンパク質によるターゲティングには、ｃｒＲＮＡタグと標的５’隣接配列との間に相同性がないことが必要であり得る。この要件は、Ｓａｍａｉ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｄｕｒｉｎｇ Ｔｙｐｅ ＩＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ”Ｃｅｌｌ １６１，１１６４−１１７４，Ｍａｙ ２１，２０１５に更に記載されているものと同様であり得、ここで、要件は、侵入核酸上の本当の標的をＣＲＩＳＰＲアレイ自体との間で区別すると考えられ、リピート配列の存在は、ｃｒＲＮＡタグとの完全な相同性につながり、自己免疫を防ぐことになる。
特定の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、エンジニアリングされ、ヌクレアーゼ活性を低下又は消失させて、それによりＲＮＡ干渉活性を低下又は消失させる１つ以上の突然変異を含むことができる。突然変異は、隣接残基、例えばヌクレアーゼ活性に関与するものの近傍にあるアミノ酸に作られ得る。一部の実施形態では、１つ以上の推定触媒ヌクレアーゼドメインが不活性化され、エフェクタータンパク質複合体が切断活性及びＲＮＡ結合複合体としての機能を欠く。好ましい実施形態では、得られたＲＮＡ結合複合体は、本明細書に記載されるとおりの１つ以上の機能ドメインに連結され得る。
特定の実施形態において、１つ以上の機能ドメインは、制御可能、即ち誘導可能である。
本発明の特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ又は成熟ｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート配列とガイド配列又はスペーサー配列とを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ又は成熟ｃｒＲＮＡは、ガイド配列又はスペーサー配列に連結したダイレクトリピート配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。本発明の好ましい実施形態において、成熟ｃｒＲＮＡは、ステムループ又は最適化ステムループ構造又は最適化二次構造を含む。好ましい実施形態において、成熟ｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート配列中にステムループ又は最適化ステムループ構造を含み、ここで、ステムループ又は最適化ステムループ構造は、切断活性に重要である。特定の実施形態において、成熟ｃｒＲＮＡは、好ましくは、単一のステムループを含む。特定の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、好ましくは、単一のステムループを含む。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質複合体の切断活性は、ステムループＲＮＡ二重鎖構造に影響を及ぼす突然変異を導入することによって改変される。好ましい実施形態において、ステムループのＲＮＡ二重鎖を維持する突然変異が導入され得、それによってエフェクタータンパク質複合体の切断活性が維持される。他の好ましい実施形態において、ステムループのＲＮＡ二重鎖構造を破壊する突然変異が導入され得、それによってエフェクタータンパク質複合体の切断活性が完全に無効にされる。
本明細書に提供されるとおりのＣＲＩＳＰＲ系は、ｃｒＲＮＡ又はガイド配列を含む類似のポリヌクレオチドを利用することができ、ここで、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡとの混合物であり、及び／又はここで、ポリヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオチド類似体を含む。配列は、限定されないが、バルジ、ヘアピン又はステムループ構造などの天然ｃｒＲＮＡの構造を含め、任意の構造を含むことができる。特定の実施形態において、ガイド配列を含むポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡ配列であり得る第２のポリヌクレオチド配列と二重鎖を形成する。
特定の実施形態において、本方法は、化学的に改変されたガイドＲＮＡを利用する。ガイドＲＮＡ化学改変の例としては、限定なしに、１つ以上の末端ヌクレオチドにおける２’−Ｏ−メチル（Ｍ）、２’−Ｏ−メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）又は２’−Ｏ−メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）の取り込みが挙げられる。かかる化学的に改変されたガイドＲＮＡは、非改変ガイドＲＮＡと比較したときに安定性の増加及び活性の増加を含むことができ、しかし、オンターゲット対オフターゲット特異性は、予測不可能である。（Ｈｅｎｄｅｌ，２０１５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（９）：９８５−９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３２９０，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２９ Ｊｕｎｅ ２０１５を参照されたい）。化学的に改変されたガイドＲＮＡとしては、限定なしに、ホスホロチオエート結合を有するＲＮＡ及びリボース環の２’炭素と４’炭素との間にメチレン架橋を含むロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドが更に挙げられる。
本発明は、本明細書に記載される方法又は組成物のいずれかにおける真核生物又は真核細胞での発現にコドン最適化されたエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列も提供する。本発明のある実施形態において、コドン最適化されたエフェクタータンパク質は、本明細書で考察されるいずれかのＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質であり、真核細胞又は生物、例えば本明細書の他の部分で挙げるような細胞又は生物、例えば、限定なしに、酵母細胞又は哺乳類細胞又は生物、例えばマウス細胞、ラット細胞及びヒト細胞又は非ヒト真核生物、例えば植物における作動性に関してコドン最適化される。
本発明の特定の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質をコードする核酸配列に少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）が付加される。好ましい実施形態において、少なくとも１つ以上のＣ末端又はＮ末端ＮＬＳが付加される（従って、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質をコードする核酸分子がＮＬＳのコーディングを含むことができ、そのため発現した産物にＮＬＳが付加又は接続されていることになる）。好ましい実施形態において、Ｃ末端ＮＬＳは、真核細胞、好ましくはヒト細胞における最適発現及び核ターゲティングのために付加される。本発明は、複数の核酸成分を送達する方法も包含し、ここで、各核酸成分は、異なる目的の標的遺伝子座に特異的であり、それにより複数の目的の標的遺伝子座を改変する。複合体の核酸成分は、１つ以上のタンパク質結合ＲＮＡアプタマーを含み得る。１つ以上のアプタマーは、バクテリオファージコートタンパク質との結合能を有し得る。バクテリオファージコートタンパク質は、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、ＭＳ２、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ及びＰＲＲ１を含む群から選択され得る。好ましい実施形態において、バクテリオファージコートタンパク質は、ＭＳ２である。本発明は、３０以上、４０以上又は５０以上のヌクレオチド長である複合体の核酸成分も提供する。
更なる態様において、本発明は、改変された目的の標的遺伝子座を含む真核細胞を提供し、ここで、目的の標的遺伝子座は、本明細書に記載される方法のいずれかによって改変されている。更なる態様は、前記細胞の細胞株を提供する。別の態様は、１つ以上の前記細胞を含む多細胞生物を提供する。
特定の実施形態において、目的の標的遺伝子座の改変は、少なくとも１つの遺伝子産物の変化した発現を含む真核細胞、少なくとも１つの遺伝子産物の変化した発現を含む真核細胞であって、少なくとも１つの遺伝子産物の発現は、増加される、真核細胞、少なくとも１つの遺伝子産物の変化した発現を含む真核細胞であって、少なくとも１つの遺伝子産物の発現は、減少される、真核細胞、又は編集されたゲノムを含む真核細胞をもたらし得る。
特定の実施形態において、真核細胞は、哺乳類細胞又はヒト細胞であり得る。
更なる実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系は、部位特異的遺伝子ノックアウト、部位特異的ゲノム編集、ＲＮＡ配列特異的干渉又は多重ゲノムエンジニアリングに用いられ得る。
また、本明細書に記載されるとおりの細胞、細胞株又は生物からの遺伝子産物も提供される。特定の実施形態において、発現される遺伝子産物の量は、変化した発現又は編集されたゲノムを有しない細胞からの遺伝子産物の量より多いか又は少ないこともある。特定の実施形態において、遺伝子産物は、変化した発現又は編集されたゲノムを有しない細胞からの遺伝子産物と比較して変化したものであり得る。
別の態様において、本発明は、新規核酸改変エフェクターを同定する方法を提供し、この方法は、遺伝子座の保存されたゲノムエレメントから一定の距離内にある、一定のサイズ制限を上回る少なくとも１つのタンパク質を含むか、又は両方の推定核酸改変酵素遺伝子座をコードする核酸配列の組から推定核酸改変遺伝子座を同定すること、同定された推定核酸改変遺伝子座を、相同タンパク質を含むサブセットにまとめること、以下の１つ以上：他のサブセットの遺伝子座と比べて既知のタンパク質ドメインとのドメイン相同性マッチが低い推定エフェクタータンパク質を有する遺伝子座を含むサブセット、他のサブセットの遺伝子座と比べて保存されたゲノムエレメントまでの距離が最小の推定タンパク質を含むサブセット、他のサブセットの大型エフェクタータンパク質と比べて推定隣接アクセサリータンパク質と同じ向きを有する大型エフェクタータンパク質を含む遺伝子座を有するサブセット、他の遺伝子座と比べて低い既存の核酸改変分類を有する推定エフェクタータンパク質を含むサブセット、他のサブセットと比べて既知の核酸改変遺伝子座への近接性が低い遺伝子座を含むサブセット、及び各サブセットにおける候補遺伝子座の総数に基づいて、１つ以上のサブセットから核酸改変遺伝子座を選択することにより、最終的な候補核酸改変遺伝子座の組を同定することを含む。
一実施形態において、核酸配列の組は、原核生物ゲノム配列又はメタゲノム配列を含むゲノム又はメタゲノムデータベースなど、ゲノム又はメタゲノムデータベースから入手される。
一実施形態において、保存されたゲノムエレメントから一定の距離は、１ｋｂ〜２５ｋｂである。
一実施形態において、保存されたゲノムエレメントは、ＣＲＩＳＰＲアレイなどの反復エレメントを含む。具体的な実施形態において、保存されたゲノムエレメントから一定の距離は、ＣＲＩＳＰＲアレイから１０ｋｂ以内である。
一実施形態において、推定核酸改変（エフェクター）遺伝子座内に含まれるタンパク質の一定のサイズ制限は、２００アミノ酸超、又はより詳細には、一定のサイズ制限は、７００アミノ酸超である。一実施形態において、推定核酸改変遺伝子座は、９００〜１８００アミノ酸である。
一実施形態において、保存されたゲノムエレメントは、ＰＩＬＥＲ−ＣＲなど、核酸の組のリピート又はパターン発見分析を用いて同定される。
一実施形態において、本明細書に記載される方法のまとめるステップは、少なくとも一部には、ドメイン相同性検索又はＨＨｐｒｅｄタンパク質ドメイン相同性検索の結果に基づく。
一実施形態において、一定の閾値は、０〜１ｅ−７のＢＬＡＳＴ最近傍カットオフ値である。
一実施形態において、本明細書に記載される方法は、９００〜１８００アミノ酸の推定タンパク質を有する遺伝子座のみを含むフィルタリングステップを更に含む。
一実施形態において、本明細書に記載される方法は、核酸改変エフェクターをコードする核酸構築物の組を作成すること、及び細菌コロニーにおけるＰＡＭバリデーション、インビトロ切断アッセイ、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ法、哺乳類細胞における実験、ＰＦＳバリデーション又はこれらの組み合わせを用いるなど、１つ以上の生化学的バリデーションアッセイを実施することを含む、候補核酸改変エフェクターの核酸改変機能の実験的検証を更に含む。
一実施形態において、本明細書に記載される方法は、同定された核酸改変遺伝子座からの１つ以上のタンパク質を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を調製することを更に含む。
一実施形態において、同定された遺伝子座は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲエフェクターを含み、又は同定された遺伝子座は、Ｃａｓ１又はＣａｓ２を欠き、又は同定された遺伝子座は、単一のエフェクターを含む。
一実施形態において、単一の大型のエフェクタータンパク質は、９００アミノ酸長超又は１１００アミノ酸長超であり、又は少なくとも１つのＨＥＰＮドメインを含む。
一実施形態において、少なくとも１つのＨＥＰＮドメインは、エフェクタータンパク質のＮ末端又はＣ末端の近傍にあり、又はエフェクタータンパク質の内部位置に位置する。
一実施形態において、単一の大型のエフェクタータンパク質は、Ｎ末端及びＣ末端にＨＥＰＮドメインを含み、且つタンパク質の内部に２つのＨＥＰＮドメインを含む。
一実施形態において、同定された遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲアレイから２ｋｂ〜１０ｋｂ以内に１つ又は２つの小型推定アクセサリータンパク質を更に含む。
一実施形態において、低分子アクセサリータンパク質は、７００アミノ酸未満である。一実施形態において、低分子アクセサリータンパク質は、５０〜３００アミノ酸長である。
一実施形態において、低分子アクセサリータンパク質は、複数の予測膜貫通ドメインを含み、又は４つの予測膜貫通ドメインを含み、又は少なくとも１つのＨＥＰＮドメインを含む。
一実施形態において、低分子アクセサリータンパク質は、少なくとも１つのＨＥＰＮドメインと少なくとも１つの膜貫通ドメインとを含む。
一実施形態において、遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲアレイから２５ｋｂまで追加的なタンパク質を含まない。
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイは、約３６ヌクレオチド長を含むダイレクトリピート配列を含む。具体的な実施形態において、ダイレクトリピートは、３’末端のＣＡＡＣと逆相補的なＧＴＴＧ／ＧＵＵＧを５’末端に含む。
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイは、約３０ヌクレオチド長を含むスペーサー配列を含む。
一実施形態において、同定された遺伝子座は、低分子アクセサリータンパク質を欠く。
本発明は、新規ＣＲＩＳＰＲエフェクターを同定する方法を提供し、この方法は、ａ）ゲノム又はメタゲノムデータベースにおいて、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードする配列を同定すること、ｂ）前記選択された配列において、ＣＲＩＳＰＲアレイから１０ｋｂ以内にある１つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定すること、ｃ）９００〜１８００アミノ酸のサイズの推定ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の存在に基づいて遺伝子座を選択すること、ｄ）５０〜３００アミノ酸の推定アクセサリータンパク質をコードする遺伝子座を選択すること、及びｅ）推定ＣＲＩＳＰＲエフェクター及びＣＲＩＳＰＲアクセサリータンパク質をコードする遺伝子座を同定し、且つ任意選択でそれらを構造解析に基づいて分類することを含む。
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲエフェクターである。ある実施形態において、ステップ（ａ）は、ｉ）ゲノム及び／又はメタゲノムデータベース中の配列と、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードする少なくとも１つの予め同定されたシード配列とを比較し、且つ前記シード配列を含む配列を選択すること、又はｉｉ）ＣＲＩＳＰＲアルゴリズムに基づいてＣＲＩＳＰＲアレイを同定することを含む。
ある実施形態において、ステップ（ｄ）は、ヌクレアーゼドメインを同定することを含む。ある実施形態において、ステップ（ｄ）は、ＲｕｖＣ、ＨＰＮ及び／又はＨＥＰＮドメインを同定することを含む。
ある実施形態において、Ｃａｓ１又はＣａｓ２をコードするＯＲＦは、ＣＲＩＳＰＲアレイから１０ｋｂ以内に存在しない。
ある実施形態において、ステップ（ｂ）におけるＯＲＦは、５０〜３００アミノ酸の推定アクセサリータンパク質をコードする。
ある実施形態において、ステップ（ｄ）において入手される推定新規ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、ゲノム及び／又はメタゲノム配列の更なる比較及び続く請求項１のステップａ）〜ｄ）に記載されるとおりの目的の遺伝子座の選択のためのシード配列として使用される。ある実施形態において、予め同定されたシード配列は、（ａ）ゲノム又はメタゲノムデータベースにおいてＣＲＩＳＰＲモチーフを同定すること、（ｂ）前記同定されたＣＲＩＳＰＲモチーフにおいて複数の特徴を抽出すること、（ｃ）教師なし学習を用いてＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を分類すること、（ｄ）前記分類に基づき、保存された遺伝子座エレメントを同定すること、及び（ｅ）そこからシード配列として好適な推定ＣＲＩＳＰＲエフェクターを選択することを含む方法によって入手される。
ある実施形態において、特徴には、タンパク質エレメント、リピート構造、リピート配列、スペーサー配列及びスペーサーマッピングが含まれる。ある実施形態において、ゲノム及びメタゲノムデータベースは、細菌及び／又は古細菌ゲノムである。ある実施形態において、ゲノム及びメタゲノム配列は、Ｅｎｓｅｍｂｌ及び／又はＮＣＢＩゲノムデータベースから入手される。ある実施形態において、ステップ（ｄ）における構造解析は、二次構造予測及び／又は配列アラインメントに基づく。ある実施形態において、ステップ（ｄ）は、それがコードするタンパク質に基づく残りの遺伝子座のクラスタリング及び得られたクラスターの手動でのキュレーションによって実現される。
従って、本発明の目的は、本出願人らが権利を留保し、且つ任意の以前に公知の製品、プロセス又は方法のディスクレーマーを本明細書によって開示するような以前に公知のいかなる製品、製品の作製プロセス又は製品の使用方法も本発明の範囲内に包含しないことである。更に、本発明は、本出願人らが権利を留保し、且つ任意の以前に記載された製品、製品の作製プロセス又は製品の使用方法のディスクレーマーを本明細書によって開示するような、米国特許商標庁（ＵＳＰＴＯ）（米国特許法第１１２条第一段落）又は欧州特許庁（ＥＰＯ）（ＥＰＣ第８３条）の明細書の記載及び実施可能要件を満たさないいかなる製品、製品の作製プロセス又は製品の使用方法も本発明の範囲内に包含しないよう意図されることが注記される。本発明の実施では、第５３条（ｃ）ＥＰＣ及び規則２８（ｂ）及び（ｃ）ＥＰＣに準拠することが有利であり得る。本明細書におけるいかなる事項も見込みであると解釈されてはならない。
本開示及び特に特許請求の範囲及び／又は段落において、「含む」、「含んだ」、「含んでいる」などの用語は、米国特許法においてそれに帰される意味を有し得る。例えば、これらは、「包含する」、「包含した」、「包含している」などを意味し得ることと、「から本質的になっている」及び「から本質的になる」などの用語は、米国特許法におけるそれらに帰される意味を有し、例えば、これらの用語は、明示的に記載されていない要素を許容するが、先行技術に見られる要素又は本発明の基本的な若しくは新規の特徴に影響を及ぼす要素を除外することとが注記される。
上記及び他の実施形態は、開示されるか、又は以下の詳細な説明から明らかであり、且つそれに包含される。
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に示される。本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明及びその添付の図面を参照することにより、本発明の特徴及び利点の更なる理解が得られるであろう。
図１Ａ〜図１Ｂは、Ｃａｓ１３ｂオルソログの木アラインメントを示す。 図１Ａ〜図１Ｂは、Ｃａｓ１３ｂオルソログの木アラインメントを示す。
図２Ａ〜図２Ｃは、Ｃ２ｃ２及びＣａｓ１３ｂオルソログの木アラインメントを示す。 図２Ａ〜図２Ｃは、Ｃ２ｃ２及びＣａｓ１３ｂオルソログの木アラインメントを示す。 図２Ａ〜図２Ｃは、Ｃ２ｃ２及びＣａｓ１３ｂオルソログの木アラインメントを示す。
図３は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における活性に関するＣａｓ１３ｂオルソログの例示的試験結果を示し、それによりＢ．ズーヘルカム（Ｂ．ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ）由来のＣａｓ１３ｂの導入をエンプティベクターの導入と比較する。
図４は、表１の異なるオルソログで得られた特異的ＲＮＡ切断活性の一般的比較を示す。
図５は、図１及び図２に提供されるとおりの異なるＣａｓ１３ｂオルソログのアラインメントを示す。
（Ａ）は、ＲＮＡ干渉を試験してＰＦＳを同定するＭＳ２ファージドロッププラークアッセイのプロトスペーサー設計を示す。（Ｂ）は、ＲＮＡ干渉アッセイ概略図を示す。標的配列は、インフレームでアンピシリン耐性を付与する転写ｂｌａ遺伝子の始点又は同じ標的プラスミドの逆鎖上の非転写領域に置かれる。標的プラスミドは、クロラムフェニコール耐性を付与するｂｚｃａｓ１３ｂプラスミド又はエンプティベクターと共形質転換し、二重選択抗生物質プレート上にプレーティングした。枯渇したコロニーを同定し、対応する標的をシーケンシングしてＰＦＳを同定した。
図７は、ｃｓｘ２７アクセサリータンパク質の非存在下及び存在下におけるオルソログ１、１３及び１６についての安全に枯渇したスペーサーからの正規化ＰＦＳスコアのヒートマップを示す。
図８は、ｃｓｘ２８アクセサリータンパク質の非存在下及び存在下におけるオルソログ２、３、８、９、１４、１９及び２１についての安全に枯渇したスペーサーからの正規化ＰＦＳスコアのヒートマップを示す。
図９は、オルソログ５、６、７、１０、１２及び１５についての安全に枯渇したスペーサーからの正規化ＰＦＳスコアのヒートマップを示す。
図１０Ａ〜図１０ＢＢは、異なるオルソログについての安全に枯渇したスペーサーからの正規化ＰＦＳスコアのヒートマップ及び導き出されたＰＦＳを示す。 図１０Ａ〜図１０ＢＢは、異なるオルソログについての安全に枯渇したスペーサーからの正規化ＰＦＳスコアのヒートマップ及び導き出されたＰＦＳを示す。 図１０Ａ〜図１０ＢＢは、異なるオルソログについての安全に枯渇したスペーサーからの正規化ＰＦＳスコアのヒートマップ及び導き出されたＰＦＳを示す。 図１０Ａ〜図１０ＢＢは、異なるオルソログについての安全に枯渇したスペーサーからの正規化ＰＦＳスコアのヒートマップ及び導き出されたＰＦＳを示す。 図１０Ａ〜図１０ＢＢは、異なるオルソログについての安全に枯渇したスペーサーからの正規化ＰＦＳスコアのヒートマップ及び導き出されたＰＦＳを示す。 図１０Ａ〜図１０ＢＢは、異なるオルソログについての安全に枯渇したスペーサーからの正規化ＰＦＳスコアのヒートマップ及び導き出されたＰＦＳを示す。 図１０Ａ〜図１０ＢＢは、異なるオルソログについての安全に枯渇したスペーサーからの正規化ＰＦＳスコアのヒートマップ及び導き出されたＰＦＳを示す。 図１０Ａ〜図１０ＢＢは、異なるオルソログについての安全に枯渇したスペーサーからの正規化ＰＦＳスコアのヒートマップ及び導き出されたＰＦＳを示す。 図１０Ａ〜図１０ＢＢは、異なるオルソログについての安全に枯渇したスペーサーからの正規化ＰＦＳスコアのヒートマップ及び導き出されたＰＦＳを示す。 図１０Ａ〜図１０ＢＢは、異なるオルソログについての安全に枯渇したスペーサーからの正規化ＰＦＳスコアのヒートマップ及び導き出されたＰＦＳを示す。 図１０Ａ〜図１０ＢＢは、異なるオルソログについての安全に枯渇したスペーサーからの正規化ＰＦＳスコアのヒートマップ及び導き出されたＰＦＳを示す。 図１０Ａ〜図１０ＢＢは、異なるオルソログについての安全に枯渇したスペーサーからの正規化ＰＦＳスコアのヒートマップ及び導き出されたＰＦＳを示す。 図１０Ａ〜図１０ＢＢは、異なるオルソログについての安全に枯渇したスペーサーからの正規化ＰＦＳスコアのヒートマップ及び導き出されたＰＦＳを示す。 図１０Ａ〜図１０ＢＢは、異なるオルソログについての安全に枯渇したスペーサーからの正規化ＰＦＳスコアのヒートマップ及び導き出されたＰＦＳを示す。
図１１は、試験したガイドで哺乳類細胞において活性が低かったＣａｓ１３ｂオルソログに関するルシフェラーゼ干渉データの概要を提供する。
図１２は、試験したガイドで哺乳類細胞において低い乃至中程度の活性を示したＣａｓ１３ｂオルソログに関するルシフェラーゼ干渉データの概要を提供する。
図１３は、試験したガイドで哺乳類細胞において有意な活性を示した一部のＣａｓ１３ｂオルソログに関するルシフェラーゼ干渉データの概要を提供する。
図１４Ａ〜図１４Ｂは、試験したガイドで哺乳類細胞において有意な活性を示した一部のＣａｓ１３ｂオルソログに関するルシフェラーゼ干渉データの概要を提供する。 図１４Ａ〜図１４Ｂは、試験したガイドで哺乳類細胞において有意な活性を示した一部のＣａｓ１３ｂオルソログに関するルシフェラーゼ干渉データの概要を提供する。
図１５は、試験したガイドで哺乳類細胞において有意な活性を示したＣａｓ１３ｂオルソログに関するルシフェラーゼ干渉データの概要及びＣ２ｃ２活性との比較を提供する。
図１６は、同じガイド配列で真核細胞において有意な活性を有するオルソログからの合成データを示す。
図１７Ａ〜図１７Ｇは、２つの異なるレポーター遺伝子、Ｇ−ルシフェラーゼ及びＣ−ルシフェラーゼを使用した哺乳類細胞におけるＣａｓ１３ｂオルソログのコラテラル効果を示す。 図１７Ａ〜図１７Ｇは、２つの異なるレポーター遺伝子、Ｇ−ルシフェラーゼ及びＣ−ルシフェラーゼを使用した哺乳類細胞におけるＣａｓ１３ｂオルソログのコラテラル効果を示す。 図１７Ａ〜図１７Ｇは、２つの異なるレポーター遺伝子、Ｇ−ルシフェラーゼ及びＣ−ルシフェラーゼを使用した哺乳類細胞におけるＣａｓ１３ｂオルソログのコラテラル効果を示す。 図１７Ａ〜図１７Ｇは、２つの異なるレポーター遺伝子、Ｇ−ルシフェラーゼ及びＣ−ルシフェラーゼを使用した哺乳類細胞におけるＣａｓ１３ｂオルソログのコラテラル効果を示す。
図１８は、ＲＮＡノックダウンに関する高活性Ｃａｓ１３ｂオルソログの特徴付けを示す。Ａ）ステレオタイプのＣａｓ１３遺伝子座及び対応するｃｒＲＮＡ構造の概略図。Ｂ）２つの異なるガイドを使用したルシフェラーゼノックダウンに関する１９個のＣａｓ１３ａ、１５個のＣａｓ１３ｂ及び７個のＣａｓ１３ｃオルソログの判定。両方のガイドを使用したノックダウンが効率的なオルソログについて、その宿主生物名を表示する。Ｃ）Ｇｌｕｃに対してガイドをタイリングしてルシフェラーゼ発現を測定することにより、ＰｓｐＣａｓ１３ｂとＬｗａＣａｓ１３ａとのノックダウン活性を比較する。Ｄ）Ｃｌｕｃに対してガイドをタイリングしてルシフェラーゼ発現を測定することにより、ＰｓｐＣａｓ１３ｂとＬｗａＣａｓ１３ａとのノックダウン活性を比較する。Ｅ）ＬｗａＣａｓ１３ａ（赤色）及びｓｈＲＮＡ（黒色）についてのＧｌｕｃターゲティング条件（ｙ軸）と比較したノンターゲティング対照（ｘ軸）のＲＮＡ−ｓｅｑライブラリに検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。３つのバイオロジカルレプリケートの平均値を示す。Ｇｌｕｃ転写物データ点に表示を付す。Ｆ）ＰｓｐＣａｓ１３ｂ（青色）及びｓｈＲＮＡ（黒色）についてのＧｌｕｃターゲティング条件（ｙ軸）と比較したノンターゲティング対照（ｘ軸）のＲＮＡ−ｓｅｑライブラリに検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値による発現レベル。３つのバイオロジカルレプリケートの平均値を示す。Ｇｌｕｃ転写物データ点に表示を付す。Ｇ）Ｅ及びＦにおけるトランスクリプトームワイド分析からのＬｗａＣａｓ１３ａ、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ及びｓｈＲＮＡについてのＧｌｕｃノックダウンからの有意なオフターゲットの数。
図１９は、ＲＮＡ編集のためのｄＣａｓ１３ｂ−ＡＤＡＲ融合物のエンジニアリングを示す。Ａ）ｄＣａｓ１３ｂ−ＡＤＡＲ融合タンパク質によるＲＮＡ編集の概略図。Ｂ）ウミホタルルシフェラーゼＷ８５Ｘ標的及びターゲティングガイド設計の概略図。Ｃ）長さ３０、５０、７０又は８４ｎｔのガイドをタイリングしたＣａｓ１３ｂ−ｄＡＤＡＲ１（左）及びＣａｓ１３ｂ−ＡＤＡＲ２−ｃｄ（右）についてのルシフェラーゼ活性回復の定量化。Ｄ）ウミホタルルシフェラーゼＷ８５Ｘのターゲティングに関する標的部位の概略図。Ｅ）ウミホタルルシフェラーゼＷ８５Ｘを標的とする５０ｎｔガイドについてのＡ→Ｉ編集のシーケンシング定量化。
図２０は、ＲＥＰＡＩＲｖ１によるＲＮＡ編集についての配列柔軟性の測定を示す。Ａ）ＲＥＰＡＩＲｖ１によるＲＮＡ編集のプロトスペーサー隣接部位（ＰＦＳ）優先性を決定するためのスクリーニングの概略図。Ｂ）２つの異なる編集部位における４−Ｎ ＰＦＳの全ての組み合わせに関するＲＮＡ編集効率の分布。Ｃ）可能な全ての３塩基モチーフでのＣｌｕｃ Ｗ８５におけるＲＥＰＡＩＲｖ１のパーセント編集率の定量化。Ｄ）可能な全ての３塩基モチーフに関するＣｌｕｃ Ｗ８５におけるＲＮＡ編集の５’及び３’塩基優先性のヒートマップ。
図２１は、ＲＥＰＡＩＲｖ１による疾患関連突然変異の修正を示す。Ａ）ＡＶＰＲ２ ８７８Ｇ＞Ａのターゲティングに関する標的及びガイド設計の概略図。Ｂ）ＡＶＰＲ２における８７８Ｇ＞Ａ突然変異が３つの異なるガイド設計のＲＥＰＡＩＲｖ１を使用して様々なパーセンテージに修正される。Ｃ）ＦＡＮＣＣ １５１７Ｇ＞Ａのターゲティングに関する標的及びガイド設計の概略図。Ｄ）ＦＡＮＣＣにおける１５１７Ｇ＞Ａ突然変異が３つの異なるガイド設計のＲＥＰＡＩＲｖ１を使用して様々なパーセンテージに修正される。Ｅ）ＲＥＰＡＩＲｖ１を使用した３４個の異なる疾患関連Ｇ＞Ａ突然変異のパーセント編集率の定量化。Ｆ）ＣｌｉｎＶａｒデータベースによってアノテートされるとおり修正し得る可能な全てのＧ＞Ａ突然変異の分析。Ｇ）ＣｌｉｎＶａｒにおける全てのＧ＞Ａ突然変異に関する編集モチーフの分布を、Ｇｌｕｃ転写物で定量化したときのモチーフ毎のＲＥＰＡＩＲｖ１による編集効率に対して示す。
図２２は、ＲＥＰＡＩＲｖ１の特異性の特徴付けを示す。Ａ）ＫＲＡＳ標的部位及びガイド設計の概略図。Ｂ）タイリングしたＫＲＡＳターゲティングガイドに関するパーセント編集率の定量化。オンターゲット及び隣接アデノシン部位における編集率パーセンテージを示す。各ガイドについて、二重鎖ＲＮＡの領域を赤色の枠で示す。Ｃ）ＣｌｕｃターゲティングガイドでのＲＥＰＡＩＲｖ１による有意なＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド部位。オンターゲット部位Ｃｌｕｃ部位（２５４ Ａ＞Ｇ）をオレンジ色で強調表示する。Ｄ）ノンターゲティングガイドでのＲＥＰＡＩＲｖ１による有意なＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド部位。
図２３は、ＲＥＰＡＩＲｖ１の特異性を向上させるＡＤＡＲ２の合理的な突然変異誘発を示す。Ａ）様々なｄＣａｓ１３−ＡＤＡＲ２突然変異体によるルシフェラーゼシグナル回復の定量化並びに主要なＡＤＡＲ２デアミナーゼ残基とｄｓＲＮＡ標的との間の接触に関する概略図に沿ってプロットしたその特異性スコア。特異性スコアは、ターゲティングガイド条件とノンターゲティングガイド条件との間のルシフェラーゼシグナル比として定義される。Ｂ）その特異性スコアに対する様々なｄＣａｓ１３−ＡＤＡＲ２突然変異体によるルシフェラーゼシグナル回復の定量化。Ｃ）オンターゲット編集割合の測定並びにｍＲＮＡのトランスクリプトームワイドシーケンシングによる各ｄＣａｓ１３−ＡＤＡＲ２突然変異体に関する有意なオフターゲットの数。Ｄ）Ｃｌｕｃにおける中途終止部位を標的とするガイドでのＲＥＰＡＩＲｖ１及びＲＥＰＡＩＲｖ２による有意なＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド部位。オンターゲットＣｌｕｃ部位（２５４ Ａ＞Ｇ）をオレンジ色で強調表示する。Ｅ）ＲＥＰＡＩＲｖ１とＲＥＰＡＩＲｖ２との間のオフターゲット編集の差を強調表示するオンターゲットＣｌｕｃ編集部位（２５４ Ａ＞Ｇ）の周囲のＲＮＡシーケンシングリード。全てのＡ＞Ｇ編集を赤色で強調表示する一方、シーケンシングエラーを青色で強調表示する。Ｆ）内因性ＫＲＡＳ及びＰＰＩＢ転写物のフレーム外ＵＡＧ部位を標的とするガイドでのＲＥＰＡＩＲｖ１及びＲＥＰＡＩＲｖ２によるＲＮＡ編集。各条件の行についてオンターゲット編集割合を右側に横棒グラフとして示す。ガイドＲＮＡによって形成された二重鎖領域は、赤色の囲み枠によって示す。
図２４は、インビボ効率に関するＣａｓ１３ｂオルソログの細菌スクリーニング及びＰＦＳ決定を示す。Ａ）Ｃａｓ１３ｂオルソログのＰＦＳを決定するための細菌アッセイの概略図。β−ラクタマーゼターゲティングスペーサーを有するＣａｓ１３ｂオルソログをβ−ラクタマーゼ発現プラスミドと共形質転換し、二重選択に供する。Ｂ）コロニー形成単位（ｃｆｕ）によって測定したときのβ−ラクタマーゼを標的とするＣａｓ１３ｂオルソログの干渉活性の定量化。Ｃ）細菌アッセイからの枯渇配列によって決定したときのＣａｓ１３ｂオルソログのＰＦＳロゴ。
図２５は、Ｃａｓ１３ｂノックダウンの最適化及びミスマッチ特異性の更なる特徴付けを示す。Ａ）種々の核局在化タグ及び核外移行タグに融合した上位２つのＣａｓ１３ａ及び上位４つのＣａｓ１３ｂオルソログを使用して、２つの異なるガイドによるＧｌｕｃノックダウンを測定する。Ｂ）４つの異なるガイドでのＬｗａＣａｓ１３ａ、ＲａｎＣａｓ１３ｂ、ＰｇｕＣａｓ１３ｂ及びＰｓｐＣａｓ１３ｂについてＫＲＡＳのノックダウンを測定し、４つの位置対応ｓｈＲＮＡ対照と比較する。Ｃ）ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｐＣａｓ１３ｂノックダウンの特異性の評価に用いられるシングル及びダブルミスマッチプラスミドライブラリの概略図。標的配列並びに標的部位の５’末端及び３’末端に直接隣接する３つの位置に可能な全てのシングル及びダブルミスマッチが存在する。Ｄ）ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｐＣａｓ１３ｂの両方の条件について、指示されるシングルミスマッチでの転写物の枯渇レベルをヒートマップとしてプロットする。Ｅ）ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｐＣａｓ１３ｂの両方の条件について、指示されるダブルミスマッチでの転写物の枯渇レベルをヒートマップとしてプロットする。
図２６は、ｄＣａｓ１３−ＡＤＡＲ２ ＲＮＡ編集の設計パラメータの特徴付けを示す。Ａ）野生型Ｃａｓ１３ｂ及び触媒不活性なＨ１３３Ａ／Ｈ１０５８Ａ Ｃａｓ１３ｂ（ｄＣａｓ１３ｂ）に関するＧｌｕｃターゲティングのノックダウン効率。Ｂ）野生型ＡＤＡＲ２触媒ドメイン又は高活性Ｅ４８８Ｑ突然変異体ＡＤＡＲ２触媒ドメインのいずれかに融合したｄＣａｓ１３ｂによるルシフェラーゼ活性回復の定量化、Ｃｌｕｃターゲティングガイドをタイリングして試験した。Ｃ）ウミホタルルシフェラーゼＷ８５Ｘを標的とする３０ｎｔガイドに関するガイド設計及びＡ→Ｉ編集のシーケンシング定量化。Ｄ）ＰＰＩＢを標的とする５０ｎｔガイドに関するガイド設計及びＡ→Ｉ編集のシーケンシング定量化。Ｅ）リンカー選択がＲＥＰＡＩＲｖ１によるルシフェラーゼ活性回復に及ぼす影響。Ｆ）標的アデノシンの対向する塩基アイデンティティがＲＥＰＡＩＲｖ１によるルシフェラーゼ活性回復に及ぼす影響。
図２７は、Ｇ＞Ａ突然変異に関するｃｌｉｎＶａｒモチーフ分布を示す。全てのＧ＞Ａ突然変異についてのＣｌｉｎＶａｒデータベース中に観察される可能な各トリプレットモチーフの数。
図２８Ａ〜図２８Ｂは、ｄＣａｓ１３ｂのトランケーションによるＲＮＡ結合を示す。ｄＣａｓ１３ｂの様々なＮ末端及びＣ末端トランケーションを図示する。ターゲティング及びノンターゲティングガイドを使用した活性を比較して、ルシフェラーゼシグナルの回復によって測定されるとおりのＡＤＡＲ依存的ＲＮＡ編集がある場合にＲＮＡ結合が示される。アミノ酸位置は、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５−１２５ Ｃａｓ１３ｂタンパク質のアミノ酸位置に対応する。
図２９は、他のプログラム可能なＡＤＡＲ系とｄＣａｓ１３−ＡＤＡＲ２編集体との比較を示す。Ａ）２つのプログラム可能なＡＤＡＲスキーム：ＢｏｘＢベースのターゲティング及び完全長ＡＤＡＲ２ターゲティングの概略図。ＢｏｘＢスキーム（上）では、ＡＤＡＲ２デアミナーゼドメイン（ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ））がラムダＮ（λＮ）と呼ばれる低分子細菌ウイルスタンパク質に融合しており、これは、ＢｏｘＢ−λと呼ばれる低分子ＲＮＡ配列に特異的に結合する。次に、２つのＢｏｘＢ−λヘアピンを含むガイドＲＮＡが部位特異的編集のためＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）、−λＮをガイドすることができる。完全長ＡＤＡＲ２スキーム（下）では、ＡＤＡＲ２のｄｓＲＮＡ結合ドメインがガイドＲＮＡのヘアピンに結合することにより、プログラム可能なＡＤＡＲ２編集が可能となる。Ｂ）Ｃｌｕｃを標的とするガイド及びノンターゲティングガイドでのＢｏｘＢ−ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）による有意なＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド部位。オンターゲットＣｌｕｃ部位（２５４ Ａ＞Ｇ）をオレンジ色で強調表示する。Ｃ）Ｃｌｕｃを標的とするガイド及びノンターゲティングガイドでのＡＤＡＲ２による有意なＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド部位。オンターゲットＣｌｕｃ部位（２５４ Ａ＞Ｇ）をオレンジ色で強調表示する。Ｄ）Ｃｌｕｃを標的とするガイド及びノンターゲティングガイドでのＲＥＰＡＩＲｖ１による有意なＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド部位。オンターゲットＣｌｕｃ部位（２５４ Ａ＞Ｇ）をオレンジ色で強調表示する。Ｅ）Ｃｌｕｃに対するターゲティングガイドについてのＢｏｘＢ−ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）、ＡＤＡＲ２及びＲＥＰＡＩＲｖ１のオンターゲット編集率パーセンテージの定量化。Ｆ）プログラム可能なＡＤＡＲ系に関する異なるターゲティング及びノンターゲティング条件間のオフターゲット部位のオーバーラップ。
図３０は、ｄＣａｓ１３ｂ−ＡＤＡＲ２突然変異体の効率及び特異性を示す。Ａ）Ｃｌｕｃターゲティング及びノンターゲティングガイドに関するｄＣａｓ１３ｂ−ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）突然変異体によるルシフェラーゼ活性回復の定量化。Ｂ）ターゲティング及びノンターゲティングガイドの比と、トランスクリプトームワイドシーケンシングによって定量化したときのＲＮＡ編集オフターゲット数との間の関係。Ｃ）ｄＣａｓ１３ｂ−ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）突然変異体に関するオンターゲットＣｌｕｃ編集効率に対するトランスクリプトームワイドなオフターゲットＲＮＡ編集部位の数の定量化。
図３１は、ｄＣａｓ１３ｂ−ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）突然変異体によるＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイドな特異性を示す。Ａ）Ｃｌｕｃを標的とするガイドでのｄＣａｓ１３ｂ−ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）突然変異体による有意なＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド部位。オンターゲットＣｌｕｃ部位（２５４ Ａ＞Ｇ）をオレンジ色で強調表示する。Ｂ）ノンターゲティングガイドでのｄＣａｓ１３ｂ−ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）突然変異体による有意なＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド部位。
図３２は、ｄＣａｓ１３ｂ−ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）編集のオフターゲットにおけるモチーフバイアスの特徴付けを示す。Ａ）各ｄＣａｓ１３ｂ−ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）突然変異体について、トランスクリプトーム内の全てのＡ＞Ｇオフターゲット編集にわたって存在するモチーフを示す。Ｂ）ターゲティング及びノンターゲティングガイドでのＲＥＰＡＩＲｖ１について、モチーフアイデンティティ毎のオフターゲットＡ＞Ｇ編集の分布を示す。Ｃ）ターゲティング及びノンターゲティングガイドでのＲＥＰＡＩＲｖ２について、モチーフアイデンティティ毎のオフターゲットＡ＞Ｇ編集の分布を示す。
図３３は、ＲＥＰＡＩＲｖ１及びＲＥＰＡＩＲｖ２オフターゲットの更なる特徴付けを示す。Ａ）ＲＥＰＡＩＲｖ１についての１転写物当たりのオフターゲット数のヒストグラム。Ｂ）ＲＥＰＡＩＲｖ２についての１転写物当たりのオフターゲット数のヒストグラム。Ｃ）ＲＥＰＡＩＲｖ１オフターゲットの変異効果予測。Ｄ）ＲＥＰＡＩＲｖ１オフターゲットの潜在的発癌効果の分布。Ｅ）ＲＥＰＡＩＲｖ２オフターゲットの変異効果予測。Ｆ）ＲＥＰＡＩＲｖ２オフターゲットの潜在的発癌効果の分布。
図３４は、ＲＥＰＡＩＲｖ１及びＲＥＰＡＩＲｖ２のＲＮＡ編集効率及び特異性を示す。Ａ）ＲＥＰＡＩＲｖ１及びＲＥＰＡＩＲｖ２についての標的アデノシン及び隣接部位におけるＫＲＡＳターゲティングガイド１によるＫＲＡＳのパーセント編集率の定量化。Ｂ）ＲＥＰＡＩＲｖ１及びＲＥＰＡＩＲｖ２についての標的アデノシン及び隣接部位におけるＫＲＡＳターゲティングガイド３によるＫＲＡＳのパーセント編集率の定量化。Ｃ）ＲＥＰＡＩＲｖ１及びＲＥＰＡＩＲｖ２についての標的アデノシン及び隣接部位におけるＰＰＩＢターゲティングガイド２によるＰＰＩＢのパーセント編集率の定量化。
図３５は、Ａ＞Ｇ ＲＮＡ編集体によるあらゆる潜在的コドン変化の実証を示す。Ａ）Ａ＞Ｉ編集によって可能になる全ての潜在的コドン転換の表。Ｂ）Ａ＞Ｉ編集によって可能になる全ての潜在的コドン転換を実証するコドン表。Ｃ）。
図３６Ａ〜図３６Ｂは、Ｃｓｘタンパク質がＲＮＡ干渉に及ぼす効果を示す。Ａ）Ｃａｓ１３ｂ及びＣａｓ１３ｂ＋Ｃｓｘ２７干渉の比較；Ｂ）Ｃａｓ１３ｂ及びＣａｓ１３ｂ＋Ｃｓｘ２８干渉の比較。
図３７Ａ〜図３７Ｆは、ルシフェラーゼアッセイを用いたＣａｓ１３ｂ及びＣａｓ１３ｂ＋Ｃｓｘ２８による転写物ノックダウンの比較を示す。Ａ）Ｐｉｎ Ｃａｓ１３ｂ（ＷＰ＿０３６８６０８９９）；Ｂ）Ｐｂｕ Ｃａｓ１３ｂ（ＷＰ＿００４３４３９７３）；Ｃ）Ｒｉｎ Ｃａｓ１３ｂ（ＷＰ＿００４９１９７５５）；Ｄ）Ｐａｕ Ｃａｓ１３ｂ（ＷＰ０２５０００９２６）；Ｅ）Ｐｇｕ Ｃａｓ１３ｂ（ＷＰ＿０３９４３４８０３）；Ｆ）Ｐｉｇ Ｃａｓ１３ｂ（ＷＰ＿０５３４４４４１７）。 図３７Ａ〜図３７Ｆは、ルシフェラーゼアッセイを用いたＣａｓ１３ｂ及びＣａｓ１３ｂ＋Ｃｓｘ２８による転写物ノックダウンの比較を示す。Ａ）Ｐｉｎ Ｃａｓ１３ｂ（ＷＰ＿０３６８６０８９９）；Ｂ）Ｐｂｕ Ｃａｓ１３ｂ（ＷＰ＿００４３４３９７３）；Ｃ）Ｒｉｎ Ｃａｓ１３ｂ（ＷＰ＿００４９１９７５５）；Ｄ）Ｐａｕ Ｃａｓ１３ｂ（ＷＰ０２５０００９２６）；Ｅ）Ｐｇｕ Ｃａｓ１３ｂ（ＷＰ＿０３９４３４８０３）；Ｆ）Ｐｉｇ Ｃａｓ１３ｂ（ＷＰ＿０５３４４４４１７）。
本明細書の図は、例示を目的としているに過ぎず、且つ必ずしも一定の尺度で描かれているとは限らない。
一般に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ系は、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関連して「ダイレクトリピート」及びｔｒａｃｒＲＮＡによってプロセシングされる部分的ダイレクトリピートを包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関連して「スペーサー」とも称される）又はこの用語が本明細書において使用されるとおりの「ＲＮＡ」（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓをガイドするＲＮＡ、例えばＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡ又はシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物を含めた、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与し又はその活性を導く転写物及び他のエレメントをまとめて指す。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関連してプロトスペーサーとも称される）の部位においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。ＣＲＩＳＰＲタンパク質がクラス２ ＶＩ−Ｂ型エフェクターであるとき、ｔｒａｃｒＲＮＡは、不要である。本発明のエンジニアリングされた系では、ダイレクトリピートは、天然に存在する配列又は天然に存在しない配列を含み得る。本発明のダイレクトリピートは、天然に存在する長さ及び配列に限定されない。ダイレクトリピートは、３６ｎｔ長であり得、しかし、それより長い又は短いダイレクトリピートが様々であり得る。例えば、ダイレクトリピートは、３０ｎｔ以上、例えば３０〜１００ｎｔ又はそれを超え得る。例えば、ダイレクトリピートは、３０ｎｔ、４０ｎｔ、５０ｎｔ、６０ｎｔ、７０ｎｔ、７０ｎｔ、８０ｎｔ、９０ｎｔ、１００ｎｔ長又はそれを超える長さであり得る。一部の実施形態において、本発明のダイレクトリピートは、天然に存在するダイレクトリピートの５’末端と３’末端との間に挿入された合成ヌクレオチド配列を含み得る。特定の実施形態において、挿入された配列は、自己相補的、例えば２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％自己相補的であり得る。更に、本発明のダイレクトリピートは、アプタマー又はアダプタータンパク質に結合する配列など、ヌクレオチドの挿入を（機能ドメインとの会合のために）含み得る。特定の実施形態において、かかる挿入を含むダイレクトリピートの一方の末端は、およそ短鎖ＤＲの前半分であり、この末端は、およそ短鎖ＤＲの後ろ半分である。
ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関連して、「標的配列」とは、ガイド配列がそれに対して相補性を有するように設計される配列を指し、ここで、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、標的配列は、細胞の核又は細胞質に位置する。一部の実施形態において、ダイレクトリピートは、以下の基準の一部又は全部を満たす繰り返しモチーフを検索することによりインシリコで同定され得る：１．ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に隣接する２Ｋｂウィンドウのゲノム配列に存在する；２．２０〜５０ｂｐにわたる；及び３．２０〜５０ｂｐの間隔が空いている。一部の実施形態では、これらの基準の２つ、例えば１及び２、２及び３又は１及び３が用いられ得る。一部の実施形態では、３つの基準の全てが用いられ得る。
本発明の実施形態において、用語のガイド配列及びガイドＲＮＡ、即ちＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質を標的遺伝子座にガイドする能力を有するＲＮＡは、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６６７号明細書）など、本明細書の引用文献中にあるとおり同義的に使用される。一般に、ガイド配列（又はスペーサー配列）は、標的配列とハイブリダイズしてＣＲＩＳＰＲ複合体による標的配列への配列特異的結合を導くのに十分な標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上であるか又はそれより高い。最適アラインメントは、配列のアラインメントに好適な任意のアルゴリズムを用いて決定することができ、その非限定的な例としては、スミス・ウォーターマンアルゴリズム、ニードルマン・ブンシュアルゴリズム、バローズ・ホイーラー変換に基づくアルゴリズム（例えば、バローズ・ホイーラーアライナー）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍにおいて利用可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。一部の実施形態において、ガイド配列（又はスペーサー配列）は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド長以上であるか又はそれより長い。一部の実施形態において、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド長未満か又はそれより短い。好ましくは、ガイド配列は、１０〜４０ヌクレオチド長、例えば２０〜３０若しくは２０〜４０ヌクレオチド長又はそれを超える長さ、例えば３０ヌクレオチド長又は約３０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクターに対するガイド配列は、１０〜３０ヌクレオチド長、例えば２０〜３０若しくは２０〜４０ヌクレオチド長又はそれを超える長さ、例えば３０ヌクレオチド長又は約３０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ガイド配列は、１０〜３０ヌクレオチド長、例えば２０〜３０ヌクレオチド長、例えば３０ヌクレオチド長である。ガイド配列が標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導く能力は、任意の好適なアッセイによって評価し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成成分が、試験しようとするガイド配列を含め、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成成分をコードするベクターのトランスフェクションなどにより対応する標的配列を有する宿主細胞に提供され得、続いて本明細書に記載されるとおりのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどにより、標的配列内における優先的な切断を評価し得る。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験しようとするガイド配列を含めたＣＲＩＳＰＲ複合体の構成成分及び供試ガイド配列と異なる対照ガイド配列を提供して、供試ガイド配列と対照ガイド配列との反応間の標的配列における結合又は切断速度を比較することにより試験管内で判定することができる。他のアッセイも可能であり、当業者には想起されるであろう。
本発明は、特定のＣａ１３ｂエフェクター、核酸、系、ベクター及び使用方法を提供する。いずれのＶＩ−Ｂも、ＶＩ−Ａ（Ｃａｓ１３ｂ）と構造によって及びまたＨＥＰＮドメインの位置によって区別可能である）。低分子アクセサリータンパク質を欠くＣａｓ１３ｂと、それを有するＣａｓ１３ｂとを分け得るものは、ほとんどないように見え、但し、例外的に、ＶＩ−Ｂ２遺伝子座は、はるかに高度に保存された低分子アクセサリータンパク質を有するように見える。
本明細書で使用されるとき、用語のＣａ１３ｂ−ｓ１アクセサリータンパク質、Ｃａｓ１３ｂ−ｓ１タンパク質、Ｃａｓ１３ｂ−ｓ１、Ｃｓｘ２７及びＣｓｘ２７タンパク質は、同義的に使用され、用語のＣａｓ１３ｂ−ｓ２アクセサリータンパク質、Ｃａｓ１３ｂ−ｓ２タンパク質、Ｃａｓ１３ｂ−Ｓ２、Ｃｓｘ２８及びｃｓｘ２８タンパク質は、同義的に使用される。
古典的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％若しくは１００％以上又はそれより高いことができ；ガイド又はＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド長以上又はそれより長いことができ；又はガイド又はＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド長未満又はそれより短いことができ；及び有利には、ｔｒａｃｒ ＲＮＡは、３０又は５０ヌクレオチド長である。しかしながら、本発明のある態様は、オフターゲット相互作用を低下させること、例えばガイドが相補性の低い標的配列と相互作用するのを低下させることである。実際、例において、８０％〜約９５％超の相補性、例えば８３％〜８４％又は８８〜８９％又は９４〜９５％の相補性を有する標的配列とオフターゲット配列との間を区別する（例えば、１８ヌクレオチドを有する標的を、１、２又は３個のミスマッチを有する１８ヌクレオチドのオフターゲットと区別する）ことが可能なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をもたらす突然変異が本発明に関わることが示される。従って、本発明との関連において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、９４．５％又は９５％又は９５．５％又は９６％又は９６．５％又は９７％又は９７．５％又は９８％又は９８．５％又は９９％又は９９．５％又は９９．９％超又は１００％である。オフターゲットはその配列とガイドとの間で１００％又は９９．９％又は９９．５％又は９９％又は９９％又は９８．５％又は９８％又は９７．５％又は９７％又は９６．５％又は９６％又は９５．５％又は９５％又は９４．５％又は９４％又は９３％又は９２％又は９１％又は９０％又は８９％又は８８％又は８７％又は８６％又は８５％又は８４％又は８３％又は８２％又は８１％又は８０％未満の相補性であり、有利には、オフターゲットは、その配列とガイドとの間で１００％又は９９．９％又は９９．５％又は９９％又は９９％又は９８．５％又は９８％又は９７．５％又は９７％又は９６．５％又は９６％又は９５．５％又は９５％又は９４．５％の相補性である。
本発明に係る特に好ましい実施形態において、ガイドＲＮＡ（Ｃａｓを標的遺伝子座にガイドする能力を有する）は、（１）真核細胞の標的遺伝子座（ＲＮＡ標的遺伝子座などのポリヌクレオチド標的遺伝子座）にハイブリダイズする能力を有するガイド配列；（２）シングルＲＮＡ、即ちｓｇＲＮＡ（５’から３’方向に配置される）又はｃｒＲＮＡにあるダイレクトリピート（ＤＲ）配列）を含み得る。
詳細な実施形態において、野生型Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、ＲＮＡ結合及び切断機能を有する。
詳細な実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、ＤＮＡ切断機能を有し得る。これらの実施形態において、方法は、本明細書に提供されるエフェクタータンパク質に基づいて提供され得、これは、細胞に本明細書で考察するとおりのベクターを送達することを含む本明細書で考察するとおり真核細胞において（インビトロ、即ち単離された真核細胞において）１つ以上の突然変異を誘導することを包含する。この突然変異には、ガイドＲＮＡ、又はｓｇＲＮＡ、又はｃｒＲＮＡを介した細胞の各標的配列における１つ以上のヌクレオチドの導入、欠失又は置換が含まれ得る。この突然変異には、ガイドＲＮＡ、又はｓｇＲＮＡ、又はｃｒＲＮＡを介した前記細胞の各標的配列における１〜７５ヌクレオチドの導入、欠失又は置換が含まれ得る。この突然変異には、ガイドＲＮＡ、又はｓｇＲＮＡ、又はｃｒＲＮＡを介した前記細胞の各標的配列における１、５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０又は７５ヌクレオチドの導入、欠失又は置換が含まれ得る。この突然変異には、ガイドＲＮＡ、又はｓｇＲＮＡ、又はｃｒＲＮＡを介した前記細胞の各標的配列における５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０又は７５ヌクレオチドの導入、欠失又は置換が含まれ得る。この突然変異には、ガイドＲＮＡ、又はｓｇＲＮＡ、又はｃｒＲＮＡを介した前記細胞の各標的配列における１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０又は７５ヌクレオチドの導入、欠失又は置換が含まれ得る。この突然変異には、ガイドＲＮＡ、又はｓｇＲＮＡ、又はｃｒＲＮＡを介した前記細胞の各標的配列における２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０又は７５ヌクレオチドの導入、欠失又は置換が含まれ得る。この突然変異には、ガイドＲＮＡ、又はｓｇＲＮＡ、又はｃｒＲＮＡを介した前記細胞の各標的配列における４０、４５、５０、７５、１００、２００、３００、４００又は５００ヌクレオチドの導入、欠失又は置換が含まれ得る。
毒性及びオフターゲット効果を最小限に抑えるため、送達されるＣａｓ１３ｂ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの濃度を制御することが重要となり得る。Ｃａｓ１３ｂ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの最適濃度は、細胞モデル又は非ヒト真核生物動物モデルにおける種々の濃度の試験及びディープシーケンシングを用いた潜在的なオフターゲットゲノム遺伝子座における改変の程度の分析によって決定することができる。或いは、毒性レベル及びオフターゲット効果を最小限に抑えるため、Ｃａｓ１３ｂニッカーゼｍＲＮＡ（例えば、Ｄ１０Ａ突然変異を有する化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）は、目的の部位を標的とするガイドＲＮＡの対と共に送達され得る。毒性及びオフターゲット効果を最小限に抑えるためのガイド配列及び戦略は、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６６７号明細書）にあるとおりであり得るか、又は本明細書にあるとおりの突然変異を用い得る。
典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関連して、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズし、且つ１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体を形成したガイド配列を含む）が形成されると、標的配列又はその近傍（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０塩基対又はそれを超える範囲内）において一方又は両方の鎖（該当する場合）の切断が生じる。
Ｃａｓ１３ｂをコードする核酸分子は、有利には、コドン最適化される。コドン最適化された配列の例は、この場合、真核生物、例えばヒトでの発現に最適化されるか（即ちヒトでの発現に最適化されている）、又は本明細書で考察されるとおりの別の真核生物、動物若しくは哺乳動物に最適化された配列である；例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６６７号明細書）のＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照されたい。これが好ましいが、他の例が可能であることが理解され、ヒト以外の宿主種に対するコドン最適化又は特定の器官に対するコドン最適化が公知である。一部の実施形態において、Ｃａｓをコードする酵素コード配列が、特定の細胞、例えば真核細胞での発現にコドン最適化される。真核細胞は、特定の生物、例えば、限定されないが、ヒトを含めた哺乳動物又は本明細書で考察されるとおりの非ヒト真核生物又は動物又は哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜又は非ヒト哺乳動物又は霊長類のものであるか、又はそれに由来し得る。一部の実施形態において、ヒト又は動物に対するいかなる実質的な医学的利益もなくそれらに苦痛を生じさせる可能性のあるヒトの生殖細胞系列遺伝子アイデンティティの改変方法及び／又は動物の遺伝子アイデンティティの改変方法、更にかかる方法から得られる動物は除外され得る。一般に、コドン最適化とは、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０個以上又はそれより多いコドン）を、天然のアミノ酸配列を維持しつつ、その宿主細胞の遺伝子においてより高頻度で又は最も高頻度で使用されるコドンに置き換えることにより、目的の宿主細胞における発現を増強するための核酸配列の改変方法を指す。様々な種が、特定のアミノ酸のある種のコドンについて特定のバイアスを呈する。コドンバイアス（生物間でのコドン使用の違い）は、多くの場合にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関し、次に、それが、数ある中でも特に、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞において選択のｔＲＮＡが優勢であることは、概して、ペプチド合成で最も高頻度に使用されるコドンを反映するものである。従って、コドン最適化に基づいて所与の生物における最適な遺伝子発現に合わせて遺伝子を調整することができる。コドン使用表が、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で利用可能な「コドン使用データベース」で容易に利用可能であり、これらの表を幾つもの方法で適合させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。特定の配列を特定の宿主細胞における発現にコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも利用可能であり、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）なども利用可能である。一部の実施形態において、Ｃａｓをコードする配列中の１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０以上又は全てのコドン）が、特定のアミノ酸について最も高頻度に使用されるコドンに対応する。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの方法は、１つ以上の目的の遺伝子のプロモーターを含む調節エレメントと細胞内で作動可能に接続した１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸が提供又は導入されるＣａｓ１３ｂトランスジェニック細胞を提供することを含み得る。本明細書で使用されるとき、用語「Ｃａｓ１３ｂトランスジェニック細胞」は、Ｃａｓ１３ｂ遺伝子がゲノム的に組み込まれている真核細胞などの細胞を指す。細胞の性質、タイプ又は起源は、本発明によれば特に限定されない。また、Ｃａｓ１３ｂトランス遺伝子を細胞に導入する方法も様々であり得、当該技術分野において公知のとおりの任意の方法であり得る。特定の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂトランスジェニック細胞は、単離細胞にＣａｓ１３ｂトランス遺伝子を導入することによって得られる。特定の他の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂトランスジェニック細胞は、Ｃａｓ１３ｂトランスジェニック生物から細胞を単離することによって得られる。例として且つ限定なしに、本明細書において言及されるとおりの１３ｂＣａｓトランスジェニック細胞は、Ｃａｓ１３ｂノックイン真核生物など、Ｃａｓ１３ｂトランスジェニック真核生物に由来し得る。国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第１３／７４６６７号明細書）（参照により本明細書に援用される）が参照される。Ｒｏｓａ遺伝子座のターゲティングに関するＳａｎｇａｍｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願公開第２０１２００１７２９０号明細書及び同第２０１１０２６５１９８号明細書の方法を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を利用するように改変し得る。Ｒｏｓａ遺伝子座の標的化に関するＣｅｌｌｅｃｔｉｓに譲渡された米国特許出願公開第２０１３０２３６９４６号明細書の方法も本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を利用するように改変され得る。更なる例として、Ｃａｓ９ノックインマウスについて記載しているＰｌａｔｔ ｅｔ．ａｌ．（Ｃｅｌｌ；１５９（２）：４４０−４５５（２０１４））（参照により本明細書に援用される）が参照される。Ｃａｓ１３ｂトランス遺伝子はＬｏｘ−Ｓｔｏｐ−ポリＡ−Ｌｏｘ（ＬＳＬ）カセットを更に含み得、それによりＣａｓ１３ｂ発現をＣｒｅリコンビナーゼによって誘導可能なものにすることができる。或いは、Ｃａｓ１３ｂトランスジェニック細胞は、単離細胞にＣａｓ１３ｂトランス遺伝子を導入することによって得ることができる。トランス遺伝子の送達系は、当該技術分野において周知である。例として、Ｃａｓ１３ｂトランス遺伝子は、同様に本明細書の他の部分に記載されるとおり、例えば真核細胞においてベクター（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス）及び／又は粒子及び／又は粒子送達を用いて送達し得る。
当業者は、本明細書において参照されるとおりのＣａｓ１３ｂトランスジェニック細胞などの細胞が、例えば且つ限定なしに、Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）又はＫｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．．（２００９）に記載されるとおり、組み込まれたＣａｓ１３ｂ遺伝子を有することに加えて更なるゲノム変化を含むか、又はＣａｓ１３ｂを標的遺伝子座にガイドすることが可能なＲＮＡと複合体を形成したときＣａｓ１３ｂの配列特異的作用によって生じる突然変異、例えば１つ以上の発癌突然変異などを含み得ることを理解するであろう。
一部の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂ配列は、１個以上の核局在化配列（ＮＬＳ）、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上又はそれより多いＮＬＳ又はＮＥＳに融合される。一部の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂは、アミノ末端又はその近傍に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上又はそれより多いＮＬＳを含むか、カルボキシ末端又はその近傍に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上又はそれより多いＮＬＳを含むか、又はこれらの組み合わせ（例えば、アミノ末端にゼロ個又は少なくとも１個以上のＮＬＳ又及びカルボキシ末端にゼロ個又は１個以上のＮＬＳ）である。２個以上のＮＬＳが存在する場合、各々を他と独立して選択し得、従って単一のＮＬＳが２つ以上のコピーで存在し得、且つ／又は１つ以上のコピーで存在する１つ以上の他のＮＬＳとの組み合わせで存在し得る。本発明の好ましい実施形態において、Ｃａｓ１３ｂは高々６個のＮＬＳを含む。一部の実施形態において、ＮＬＳは、ＮＬＳの最も近いアミノ酸がＮ末端又はＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０又はそれより多いアミノ酸の範囲内にあるとき、Ｎ末端又はＣ末端の近傍にあると見なされる。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号Ｘ）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号Ｘ）を有するヌクレオプラスミンビパルタイトＮＬＳ；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号Ｘ）又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号Ｘ）を有するｃ−ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号Ｘ）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチン−αのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号Ｘ）；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号Ｘ）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号Ｘ）；ヒトｐ５３の配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ（配列番号Ｘ）；マウスｃ−ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号Ｘ）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号Ｘ）及びＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号Ｘ）；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号Ｘ）；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号Ｘ）；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号Ｘ）；及びステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号Ｘ）に由来するＮＬＳ配列が挙げられる。一般に、１つ以上のＮＬＳは、真核細胞の核における検出可能な量のＣａｓの蓄積をドライブするのに十分な強度である。一般に、核局在化活性の強度は、Ｃａｓ内のＮＬＳの数、用いられる詳細なＮＬＳ又はこれらの組み合わせ要因から導き出すことができる。核内での蓄積の検出は、任意の好適な技法によって実施し得る。例えば、検出可能なマーカーをＣａｓに融合し得、それにより、核（例えば、ＤＡＰＩなど、核に特異的な染色）の位置を検出する手段と組み合わせるなどして細胞内での位置を可視化し得る。細胞核はまた、細胞から単離され、次にその内容物を、免疫組織化学、ウエスタンブロット又は酵素活性アッセイなど、任意の好適なタンパク質検出方法によって分析され得る。核内における蓄積は、ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の効果に関するアッセイ（例えば、標的配列におけるＤＮＡ切断又は突然変異に関するアッセイ又はＣＲＩＳＰＲ複合体形成及び／又はＣａｓ酵素活性の影響を受けて変化した遺伝子発現活性に関するアッセイ）によるなどして、Ｃａｓ又は複合体に曝露されていない対照又は１つ以上のＮＬＳを欠くＣａｓに曝露された対照と比較して間接的にも決定され得る。
特定の態様において、本発明は、例えば、Ｃａｓ１３ｂ及び／又はＣａｓ１３ｂを標的遺伝子座に案内する能力を有するＲＮＡ（即ちガイドＲＮＡ）を細胞に送達又は導入するための、またこれらの成分を（例えば、原核細胞において）増殖させるための、ベクターに関する。本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、ある実体を１つの環境から別の環境に移すことを可能にする又は促進するツールである。これは、別のＤＮＡセグメントが挿入されて挿入セグメントの複製をもたらし得るレプリコン、例えばプラスミド、ファージ又はコスミドである。概して、ベクターは適切な制御エレメントと会合しているとき複製能を有する。一般に、用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターとしては、限定されないが、一本鎖、二本鎖又は部分的二本鎖の核酸分子；１つ以上の遊離末端を含む、遊離末端のない（例えば、環状の）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ又は両方を含む核酸分子；及び当該技術分野において公知の他の各種ポリヌクレオチドが挙げられる。ある種のベクターは、「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術によるなどして追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、ベクターには、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））へのパッケージングのためのウイルス由来ＤＮＡ又はＲＮＡ配列が存在する。ウイルスベクターは、宿主細胞へのトランスフェクションのためのウイルスが担持するポリヌクレオチドも含む。特定のベクターは、それが導入される宿主細胞での自己複製能を有する（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクターは、それが作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことが可能である。かかるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。組換えＤＮＡ技法において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態で本発明の核酸を含むことができ、これは、即ち、組換え発現ベクターが、発現させる核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節エレメント（これは、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択され得る）を含むことを意味する。組換え発現ベクターの範囲内において、「作動可能に連結された」は、ヌクレオチド配列の（例えば、インビトロ転写／翻訳系における又はベクターが宿主細胞に導入される場合に宿主細胞における）発現が可能となる形で目的のヌクレオチド配列が調節エレメントに連結されていることを意味するように意図される。組換え及びクローニング方法に関して、２００４年９月２日に米国特許出願公開第２００４−０１７１１５６ Ａ１号明細書として公開された米国特許出願第１０／８１５，７３０号明細書（この内容は、本明細書において全体として参照により援用される）が挙げられる。
ベクターは、調節エレメント、例えばプロモーターを含み得る。ベクターは、Ｃａｓ１３ｂコード配列及び／又は単一の、しかし少なくとも３又は８又は１６又は３２又は４８又は５０個を含み得る可能性もあるガイドＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ）コード配列、例えば１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、３〜６、３〜７、３〜８、３〜９、３〜１０、３〜８、３〜１６、３〜３０、３〜３２、３〜４８、３〜５０個のＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ）を含み得る。単一のベクターには、有利には約１６個以下のＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ）がある場合、各ＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ）にプロモーターがあり得；及び単一のベクターが１６個より多いＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ）を提供する場合、１つ以上のプロモーターがそれらのＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ）の２個以上の発現をドライブし得、例えば３２個のＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ）がある場合、各プロモーターが２個のＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ）の発現をドライブし得、且つ４８個のＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ）がある場合、各プロモーターが３個のＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ）の発現をドライブし得る。単純な算術的な十分に確立されたクローニングプロトコル及び本開示の教示により、当業者は、例えば、ＡＡＶなどの好適な例示的ベクターに対するＲＮＡ、例えばｓｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ及びＵ６プロモーターなどの好適なプロモーター、例えばＵ６−ｓｇＲＮＡ又は−ｃｒＲＮＡに関して本発明を容易に実施することができる。例えば、ＡＡＶのパッケージング限界は、約４．７ｋｂである。当業者は、単一のベクターに約１２〜１６個、例えば１３個のＵ６−ｓｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡカセットを容易に収めることができる。これは、ＴＡＬＥアセンブリに用いられるゴールデンゲート戦略（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ／ｔａｌｅｆｆｅｃｔｏｒｓ／）など、任意の好適な手段によってアセンブルすることができる。当業者は、Ｕ６−ｓｇＲＮＡ又は−ｃｒＲＮＡの数を約１．５倍増加させるため、例えば１２〜１６、例えば１３から約１８〜２４、例えば約１９個のＵ６−ｓｇＲＮＡ又は−ｃｒＲＮＡに増加させるため、タンデムガイド戦略も用いることができる。従って、当業者は、単一のベクター、例えばＡＡＶベクター中に約１８〜２４個、例えば約１９個のプロモーター−ＲＮＡ、例えばＵ６−ｓｇＲＮＡ又は−ｃｒＲＮＡに容易に至ることができる。ベクター中のプロモーター及びＲＮＡ、例えばｓｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡの数を増加させる更なる手段は、単一のプロモーター（例えば、Ｕ６）を使用して、切断可能な配列によって分離されたＲＮＡ、例えばｓｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡのアレイを発現させることである。及びベクター中のプロモーター−ＲＮＡ、例えばｓｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡの数を増加させる更に別の手段は、コード配列又は遺伝子のイントロンにおいて切断可能な配列によって分離されたプロモーター−ＲＮＡ、例えばｓｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡのアレイを発現させることである；及びこの場合、ポリメラーゼＩＩプロモーターを使用することが有利であり、それにより発現が増加し、組織特異的様式での長いＲＮＡの転写が可能となり得る（例えば、ｎａｒ．ｏｘｆｏｒｄｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／３４／７／ｅ５３．ｓｈｏｒｔ、ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｍｔ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ１６／ｎ９／ａｂｓ／ｍｔ２００８１４４ａ．ｈｔｍｌを参照されたい）。有利な実施形態において、ＡＡＶは、最大約５０遺伝子を標的とするＵ６タンデムｓｇＲＮＡをパッケージングし得る。従って、当該技術分野における知識及び本開示の教示から、当業者は、１つ以上のプロモーターの制御下にあるか、又はそれに作動可能に若しくは機能的に連結された複数のＲＮＡ、又はガイド、又はｓｇＲＮＡ、又はｃｒＲＮＡを発現するベクター、例えば単一のベクターを（特に本明細書で考察されるＲＮＡ、又はガイド、又はｓｇＲＮＡ、又はｃｒＲＮＡの数に関して）いかなる過度の実験もなく容易に作製及び使用することができる。
ガイドＲＮＡ、例えばｓｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡのコード配列及び／又はＣａｓ１３ｂコード配列は、調節エレメントに機能的に又は作動可能に連結され得、従って調節エレメントが発現をドライブする。プロモーターは構成的プロモーター及び／又は条件的プロモーター及び／又は誘導性プロモーター及び／又は組織特異的プロモーターであり得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ、Ｔ７、Ｕ６、Ｈ１、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター及びＥＦ１αプロモーターからなる群から選択され得る。有利なプロモーターは、プロモーターはＵ６である。
本発明のある態様において、本願のＲＮＡ−又はＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系とも称される新規ＲＮＡターゲティング系は、本明細書で同定されたＣａｓ１３ｂタンパク質をベースとし、これは特異的ＲＮＡ配列を標的化するのにカスタマイズしたタンパク質を作成する必要はなく、むしろ単一の酵素をＲＮＡ分子によって特異的ＲＮＡ標的を認識するようにプログラムすることができ、換言すれば前記ＲＮＡ分子を用いて酵素を特異的ＲＮＡ標的に動員することができる。
一部の実施形態では、核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントは、内因性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡターゲティング系を含む特定の生物に由来する。特定の実施形態において、このＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡターゲティング系は、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）に見られる。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、標的化した及びコラテラルなｓｓＲＮＡ切断活性を含む。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、デュアルＨＥＰＮドメインを含む。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ａのヘリカル−１ドメインに対するカウンターパートを欠いている。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、これまでに特徴付けられているクラス２ ＣＲＩＳＰＲエフェクターよりも小さく、サイズ中央値が９２８ａａである。このサイズ中央値は、Ｃａｓ１３ｃよりも１９０ａａ（１７％）小さく、Ｃａｓ１３ｂよりも２００ａａ（１８％）超小さく、且つＣａｓ１３ａよりも３００ａａ（２６％）超小さい。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、フランキング配列（例えば、ＰＦＳ、ＰＡＭ）の要件を有しない。
特定の実施形態において、エフェクタータンパク質遺伝子座構造は、アクセサリータンパク質を含有するＷＹＬドメインを含む（当初同定されたこれらのドメイン群内で保存されていた３アミノ酸にちなんでこのように呼称される；例えば、ＷＹＬドメインＩＰＲ０２６８８１を参照されたい）。特定の実施形態において、ＷＹＬドメインアクセサリータンパク質は、少なくとも１つのヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）又はリボン−ヘリックス−ヘリックス（ＲＨＨ）ＤＮＡ結合ドメインを含む。特定の実施形態において、アクセサリータンパク質を含有するＷＹＬドメインは、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の標的化した及びコラテラルなｓｓＲＮＡ切断活性を両方とも増加させる。特定の実施形態において、アクセサリータンパク質を含有するＷＹＬドメインは、Ｎ末端ＲＨＨドメイン並びに元のＷＹＬモチーフに対応するインバリアントなチロシン−ロイシンダブレットを含めた、あるパターンの主に疎水性の保存された残基を含む。特定の実施形態において、アクセサリータンパク質を含有するＷＹＬドメインは、ＷＹＬ１である。ＷＹＬ１は、主にルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）に関連する単一のＷＹＬドメインタンパク質である。
他の例示的実施形態において、ＶＩ型ＲＮＡターゲティングＣａｓ酵素は、Ｃａｓ １３ｄである。特定の実施形態において、Ｃａｓ１３ｄは、ユーバクテリウム・シラエウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ）ＤＳＭ １５７０２（ＥｓＣａｓ１３ｄ）又はルミノコッカス属種（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）Ｎ１５．ＭＧＳ−５７（ＲｓｐＣａｓ１３ｄ）である（例えば、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｃａｓ１３ｄ Ｉｓ ａ Ｃｏｍｐａｃｔ ＲＮＡ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｙｐｅ ＶＩ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｂｙ ａ ＷＹＬ−Ｄｏｍａｉｎ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ（２０１８），ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１８．０２．０２８を参照されたい）。ＲｓｐＣａｓ１３ｄ及びＥｓＣａｓ１３ｄは、フランキング配列要件（例えば、ＰＦＳ、ＰＡＭ）を有しない。
本明細書に記載される核酸ターゲティング系、ベクター系、ベクター及び組成物は、様々な核酸ターゲティング適用、タンパク質などの遺伝子産物の合成の変化又は改変、核酸切断、核酸編集、核酸のスプライシング；標的核酸の輸送、標的核酸の追跡、標的核酸の単離、標的核酸の可視化等において用いられ得る。
有利な実施形態において、本発明は、表１に関連したＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質を包含する。表１のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、表１と併せて本明細書で更に詳細に考察されるとおりである。
Ｃａｓ１３ｂヌクレアーゼ
本発明のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、表１からの又はそれに示されるとおりのかかるタンパク質であるか、又はそれにあるか、又はそれを含むか、又はそれから本質的になるか、又はそれからなるか、又はそれに関わるか若しくは関する。本発明は、表１からの又はそれに示されるとおりのタンパク質を、本明細書に示されるとおりのその突然変異又は改変を含めて提供するか、又はそれに関するか、又はそれに関わるか、又はそれを含むか、又はそれから本質的になるか、又はそれからなることが意図される。表１のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、表１と併せて本明細書で更に詳細に考察されるとおりである。
従って、一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、デッドＣａｓ型エフェクタータンパク質などのＲＮＡ結合タンパク質であり得、これは、任意選択で、本明細書に記載されるとおり、例えば転写アクチベーター又はリプレッサードメイン、ＮＬＳ又は他の機能ドメインで機能化され得る。一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、ＲＮＡの一本鎖を切断するＲＮＡ結合タンパク質であり得る。結合するＲＮＡがｓｓＲＮＡである場合、そのｓｓＲＮＡは完全に切断される。一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、例えば、それが２つのＲＮアーゼドメインを含む場合、ＲＮＡの二本鎖を切断するＲＮＡ結合タンパク質であり得る。結合するＲＮＡがｄｓＲＮＡである場合、そのｄｓＲＮＡは完全に切断される。一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、ニッカーゼ活性を有するＲＮＡ結合タンパク質であり得、即ち、それは、ｄｓＲＮＡに結合するが、ＲＮＡ鎖の一方のみを切断する。
ＣＲＩＳＰＲ系におけるＲＮアーゼ機能は、公知であり、例えばある種のＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系についてｍＲＮＡターゲティングが報告されており（Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，ｖｏｌ． ２８，２４３２−２４４３；Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１３９，９４５−９５６；Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．４３，４０６−４１７）、多大な利点をもたらす。従って、本エフェクタータンパク質によってＲＮＡを標的とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、組成物又は方法が提供される。
標的ＲＮＡ、即ち目的のＲＮＡは、標的ＲＮＡ上の目的の標的部位へのエフェクタータンパク質の動員及び結合につながる本発明によって標的とされるべきＲＮＡである。標的ＲＮＡは、任意の好適な形態のＲＮＡであり得る。これには、一部の実施形態では、ｍＲＮＡが含まれ得る。他の実施形態において、標的ＲＮＡにはｔＲＮＡ又はｒＲＮＡが含まれ得る。
干渉性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）
他の実施形態において、標的ＲＮＡには、干渉性ＲＮＡ、即ちＲＮＡ干渉経路に関与するＲＮＡ、例えばｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどが含まれ得る。他の実施形態において、標的ＲＮＡにはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれ得る。干渉性ＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの制御は、インビボ又はインビトロで干渉性ＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの寿命を短縮することによる手法で見られるオフターゲット効果（ＯＴＥ）を低減することを促進し得る。
エフェクタータンパク質及び好適なガイドが（例えば、空間的又は時間的に好適なプロモーター、例えば組織特異的又は細胞周期特異的プロモーター及び／又はエンハンサーの制御下で）選択的に発現するならば、これを用いて細胞又は系を（インビボ又はインビトロで）その細胞におけるＲＮＡｉから「保護」することができるであろう。これは、ＲＮＡｉが必要ない隣接組織又は細胞において、又はエフェクタータンパク質及び好適なガイドが発現する及び発現しない（即ちそれぞれＲＮＡｉが制御されない及びそれが制御される）細胞又は組織を比較する目的で有用であり得る。エフェクタータンパク質を使用して、リボザイム、リボソーム又はリボスイッチなど、ＲＮＡを含む又はそれからなる分子を制御しするか又はそれに結合し得る。本発明の実施形態では、ＲＮＡガイドがエフェクタータンパク質をそうした分子に動員することにより、エフェクタータンパク質はそれらに結合することが可能になる。
リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）
例えば、アジスロマイシンなどのアザライド系抗生物質は、周知である。これは、５０Ｓリボソームサブユニットを標的としてそれを破壊する。本エフェクタータンパク質は、５０Ｓリボソームサブユニットを標的とする好適なガイドＲＮＡと共に、一部の実施形態において、５０Ｓリボソームサブユニットに動員されて、それに結合し得る。従って、リボソーム（特に５０ｓリボソームサブユニット）標的に向けられた好適なガイドと合わせた本エフェクタータンパク質が提供される。リボソーム（特に５０ｓリボソームサブユニット）標的に向けられた好適なガイドと合わせたこの使用エフェクタータンパク質の使用には、抗生物質としての使用が含まれ得る。詳細には、抗生物質としての使用は、アジスロマイシンなどのアザライド系抗生物質の作用と類似している。一部の実施形態では、原核生物リボソームサブユニット、例えば原核生物の７０Ｓサブユニット、上述の５０Ｓサブユニット、３０Ｓサブユニット並びに１６Ｓ及び５Ｓサブユニットが標的とされ得る。他の実施形態では、真核生物リボソームサブユニット、例えば真核生物の８０Ｓサブユニット、６０Ｓサブユニット、４０Ｓサブユニット並びに２８Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ及び５Ｓサブユニットが標的とされ得る。
エフェクタータンパク質は、本明細書に記載されるとおりの任意選択で機能化されたＲＮＡ結合タンパク質であり得る。一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、ＲＮＡの一本鎖を切断するＲＮＡ結合タンパク質であり得る。いずれの場合にも、しかし、特にＲＮＡ結合タンパク質がＲＮＡの一本鎖を切断する場合、リボソーム機能が調節され得、詳細にはそれが低減又は破壊され得る。これは、任意のリボソームＲＮＡ及び任意のリボソームサブユニットに適用され得、ｒＲＮＡの配列は周知である。
従って、リボソーム標的に対する好適なガイドと合わせた本エフェクタータンパク質の使用によるリボソーム活性の制御が想定される。これは、リボソームの切断又はそれへの結合によるものであり得る。詳細には、リボソーム活性の低減が想定される。これはリボソーム機能のインビボ又はインビトロアッセイにおいて、また、リボソーム活性に基づく治療をインビボ又はインビトロで制御する手段としても有用であり得る。更に、インビボ系又はインビトロ系におけるタンパク質合成の制御（即ち低減）が想定され、かかる制御には抗生物質としての使用並びに研究及び診断上の使用が含まれる。
リボスイッチ
リボスイッチ（アプタザイムとしても知られる）は、小分子に結合するメッセンジャーＲＮＡ分子の調節性セグメントである。これは典型的には、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生の変化をもたらす。従って、リボスイッチ標的に対する好適なガイドと合わせた本エフェクタータンパク質の使用によるリボスイッチ活性の制御が従って想定される。これは、リボスイッチの切断又はそれへの結合によるものであり得る。詳細には、リボスイッチ活性の低減が想定される。これは、リボスイッチ機能のインビボ又はインビトロアッセイにおいて、また、リボスイッチ活性に基づく治療をインビボ又はインビトロで制御する手段としても有用であり得る。更に、インビボ系又はインビトロ系におけるタンパク質合成の制御（即ち低減）が想定される。この制御には、ｒＲＮＡに関する限りは、抗生物質としての使用並びに研究及び診断上の使用が含まれ得る。
リボザイム
リボザイムは、酵素（これは、当然ながら、タンパク質である）と類似した、触媒特性を有するＲＮＡ分子である。リボザイムは、天然に存在するものも、及びエンジニアリングされたものも、両方ともＲＮＡを含むか又はそれからなるため、同様に本ＲＮＡ結合エフェクタータンパク質の標的となり得る。一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、リボザイムを切断して、それによりそれを無効にするＲＮＡ結合タンパク質であり得る。従って、リボザイム標的に対する好適なガイドと合わせた本エフェクタータンパク質の使用によるリボザイム活性の制御が想定される。これは、リボザイムの切断又はそれへの結合によるものであり得る。詳細には、リボザイム活性の低減が想定される。これは、リボザイム機能のインビボ又はインビトロアッセイにおいて、また、リボザイム活性に基づく治療をインビボ又はインビトロで制御する手段としても有用であり得る。
ＲＮＡプロセシングを含めた遺伝子発現
エフェクタータンパク質は、好適なガイドと共に、ＲＮＡプロセシングの制御によることを含めた遺伝子発現のターゲティングにも使用され得る。ＲＮＡプロセシングの制御には、ＲＮＡｐｏｌのターゲティングによる選択的スプライシングを含めたＲＮＡスプライシング；植物のウイロイドを含め、ウイルス複製（詳細には、サテライトウイルス、バクテリオファージ及びレトロウイルス、例えばＨＢＶ、ＨＢＣ及びＨＩＶ並びに本明細書に挙げられる他のウイルスのもの）；及びｔＲＮＡ生合成などのＲＮＡプロセシング反応が含まれ得る。エフェクタータンパク質及び好適なガイドは、ＲＮＡ活性化（ＲＮＡａ）の制御にも使用され得る。ＲＮＡａは遺伝子発現の促進につながり、そのため遺伝子発現の制御はＲＮＡａの破壊又は低減、従って遺伝子発現の促進低下による形で実現し得る。
ＲＮＡｉスクリーン
ＲＮＡｉスクリーンにより、そのノックダウンが表現型の変化に関連する遺伝子産物を同定して、生物学的経路を調べ及び構成要素を同定することができる。エフェクタータンパク質及び好適なガイドを使用してスクリーンにおけるＲＮＡｉの活性を除去し又は低下させ、従って（それまで干渉を受けていた）遺伝子産物の活性を（干渉／抑制を除去し又は低下させることで）回復させることにより、こうしたスクリーンにも又はスクリーンの間も制御を及ぼし得る。
サテライトＲＮＡ（ｓａｔＲＮＡ）及びサテライトウイルスも処理し得る。
ＲＮアーゼ活性に関連する本明細書の制御は、概して、低減、負の破壊又はノックダウン若しくはノックアウトを意味する。
インビボＲＮＡ適用
遺伝子発現の阻害
本明細書に提供される標的特異的ＲＮアーゼは、標的ＲＮＡの極めて特異的な切断が可能である。ＲＮＡレベルでの干渉は、空間的及び時間的の両方の、且つゲノムが改変されないため非侵襲的な方法での調節が可能である。
幾つもの疾患がｍＲＮＡターゲティングによって治療可能であることが実証されている。それらの研究のほとんどはｓｉＲＮＡの投与に関するが、本明細書に提供されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を同じように適用し得ることは明らかである。
ｍＲＮＡ標的（及び対応する疾患治療）の例は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｒ１及びＲＴＰ８０１（ＡＭＤ及び／又はＤＭＥの治療に）、カスパーゼ２（Ｎａｉｏｎの治療に）、ＡＤＲＢ２（眼圧の治療に）、ＴＲＰＶＩ（ドライアイ症候群の治療に、Ｓｙｋキナーゼ（喘息の治療に）、Ａｐｏ Ｂ（高コレステロール血症の治療に）、ＰＬＫ１、ＫＳＰ及びＶＥＧＦ（固形腫瘍の治療に）、Ｂｅｒ−Ａｂｌ（ＣＭＬの治療に）である（Ｂｕｒｎｅｔｔ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１２，１９（１）：６０−７１））。同様に、ＲＮＡターゲティングは、ＨＩＶ（ＨＩＶ Ｔｅｔ及びＲｅｖのターゲティング）、ＲＳＶ（ＲＳＶヌクレオカプシドのターゲティング）及びＨＣＶ（ｍｉＲ−１２２のターゲティング）など、ＲＮＡウイルス媒介性疾患の治療に有効であることが実証されている（Ｂｕｒｎｅｔｔ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１２，１９（１）：６０−７１）。
更に、本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を突然変異特異的又はアレル特異的ノックダウンに使用し得ることが想定される。突然変異を含む転写されたｍＲＮＡの配列又はアレル特異的配列を特異的に標的化するガイドＲＮＡを設計することができる。かかる特異的ノックダウンは、突然変異した又はアレル特異的な遺伝子産物に伴う障害に関する治療適用に特に好適である。例えば、家族性低βリポ蛋白血症（ＦＨＢＬ）のほとんどの症例はＡｐｏＢ遺伝子の突然変異によって引き起こされる。この遺伝子は、２つのバージョンのアポリポタンパク質Ｂタンパク質：短いバージョン（ＡｐｏＢ−４８）及びより長いバージョン（ＡｐｏＢ−１００）をコードする。ＦＨＢＬにつながる幾つかのＡｐｏＢ遺伝子突然変異は、両方のバージョンのＡｐｏＢを異常に短くする。突然変異したＡｐｏＢ ｍＲＮＡ転写物を本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質で特異的にターゲティング及びノックダウンすることは、ＦＨＢＬの治療において有益であり得る。別の例として、ハンチントン病（ＨＤ）は、ハンチンチンタンパク質をコードする遺伝子のＣＡＧトリプレットリピートの伸長により異常なタンパク質が生じて引き起こされる。ハンチンチンタンパク質をコードする突然変異した又はアレル特異的なｍＲＮＡ転写物を本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質で特異的にターゲティング及びノックダウンすることは、ＨＤの治療において有益であり得る。
これに関連して且つより一般的に本明細書に記載されるとおりの様々な適用について、スプリットバージョンのＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の使用を想定し得ることが注記される。実際、これは特異性の増加を可能にし得るのみならず、送達にも有利であり得る。Ｃａｓ１３ｂは、Ｃａｓ１３ｂ酵素の２つのパートが実質的に機能性Ｃａｓ１３ｂをなすという意味でスプリットである。理想的には、スプリットは常に触媒ドメインが影響を受けないようなものでなければならない。このＣａｓ１３ｂはヌクレアーゼとして機能し得、又はそれは、典型的にはその触媒ドメインの突然変異に起因して、本質的に触媒活性をほぼ又は全く持たないＲＮＡ結合タンパク質であるデッドＣａｓ１３ｂであり得る。
スプリットＣａｓ１３ｂの各半分は、二量化パートナーに融合され得る。例として且つ限定ではなく、ラパマイシン感受性二量化ドメインを用いると、Ｃａｓ１３ｂ活性を時間的に制御するための化学的に誘導可能なスプリットＣａｓ１３ｂの作成が可能となる。従って、Ｃａｓ１３ｂは、２つの断片に分割することにより化学的に誘導可能にすることができ、このラパマイシン感受性二量化ドメインを使用してＣａｓ１３ｂを制御された形で再アセンブルし得る。スプリットＣａｓ１３ｂの２つのパートは、スプリットＣａｓ１３ｂのＮ’末端パート及びＣ’末端パートと考えることができる。この融合は、典型的にはＣａｓ１３ｂのスプリット点である。換言すれば、スプリットＣａｓ１３ｂのＮ’末端パートのＣ’末端が二量体半体の一方に融合する一方、Ｃ’末端パートのＮ’末端が他方の二量体半体に融合する。
Ｃａｓ１３ｂは、切断点が新しく作り出されるという意味で分割される必要はない。スプリット点は典型的にはインシリコで設計され、構築物にクローニングされる。一緒になって、スプリットＣａｓ１３ｂの２つのパート、Ｎ’末端パート及びＣ’末端パートは、好ましくは、野生型アミノ酸（又はそれをコードするヌクレオチド）の少なくとも７０％以上、好ましくは野生型アミノ酸（又はそれをコードするヌクレオチド）の少なくとも８０％以上、好ましくは少なくとも９０％以上、好ましくは少なくとも９５％以上及び最も好ましくは少なくとも９９％以上を含む完全なＣａｓ１３ｂを形成する。何らかのトリミングがある可能性があり得、突然変異体が想定される。非機能性ドメインは完全に除去され得る。重要な点は、２つのパートが一体にされ得ること、及び所望のＣａｓ１３ｂ機能が回復し又は元に戻ることである。二量体はホモ二量体又はヘテロ二量体であり得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ１３ｂエフェクターは、突然変異特異的又はアレル特異的ノックダウンなど、突然変異特異的又はアレル特異的ターゲティングに用いられ得る。
ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、更に、相乗作用してＲＮアーゼ活性を増加させるか又はメッセージの更なる分解を確実にする、非特異的ＲＮアーゼ又はアルゴノート２などの別の機能性ＲＮア−ゼドメインに融合することができる。
ＲＮＡ機能の調節による遺伝子発現の調節
ｍＲＮＡの切断による遺伝子発現への直接的な効果を別として、ＲＮＡターゲティングは、細胞内でのＲＮＡプロセシングの特定の側面に影響を与えるためにも使用することができ、これにより遺伝子発現をより繊細に調節することが可能となり得る。概して調節は、例えば、タンパク質の結合を遮断したり、又はＲＮＡ結合タンパク質を動員したりするなど、例えばＲＮＡへのタンパク質の結合に干渉することにより媒介され得る。実際、調節は、ｍＲＮＡのスプライシング、輸送、局在、翻訳及び代謝回転など、種々のレベルで確実とし得る。治療に関連しても同様に、ＲＮＡ特異的ターゲティング分子を使用することにより、これらのレベルの各々において（病原性の）機能不全に対処することが想定され得る。これらの実施形態では、多くの場合、ＲＮＡターゲティングタンパク質が、本明細書に記載される突然変異型のＣａｓ１３ｂなど、ＲＮＡ標的を切断する能力を失った、しかし、それに結合するその能力を維持している「デッド」Ｃａｓ１３ｂであることが好ましい。
ａ）選択的スプライシング
ヒト遺伝子は多くが選択的スプライシングの結果として複数のｍＲＮＡを発現する。種々の疾患が、発現した遺伝子の機能喪失又は機能獲得につながる異常なスプライシングに関係することが示されている。こうした疾患には、スプライシング欠損を引き起こす突然変異によって引き起こされるものもあるが、そうでないものも多数ある。１つの治療選択肢は、スプライシング機構を直接標的化することである。本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、例えば、スライシングの遮断又は促進、エクソンのインクルージョン又はエクスクルージョン及び特異的アイソフォームの発現への影響付与及び／又は代替的タンパク質産物の発現の刺激に使用することができる。かかる適用について、以下に更に詳細に記載する。
ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質が標的ＲＮＡに結合すると、ＲＮＡ配列へのスプライシング因子の接近を立体的に遮断することができる。スプライス部位を標的とするＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、その部位でスプライシングを遮断し、任意選択でスプライシングを隣接する部位に向け直し得る。例えば、５’スプライス部位に結合するＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の結合は、スプライソソームのＵ１成分の動員を遮断することができ、そのエクソンのスキッピングに有利である。或いは、スプライシングエンハンサー又はサイレンサーを標的とするＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、標的部位におけるトランス作用性調節性スプライシング因子の結合を妨げ、スプライシングを有効に遮断又は促進することができる。更に、本明細書に記載されるとおりのＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質によってＩＬＦ２／３を前駆ｍＲＮＡのエクソン近傍に動員することにより、エクソンエクスクルージョンを実現することができる。更に別の例として、ｈｎＲＮＰ Ａ１の動員及びエクソンエクスクルージョンのため、グリシンリッチドメインを付加することができる（Ｄｅｌ Ｇａｔｔｏ−Ｋｏｎｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９９ Ｊａｎ；１９（１）：２５１−６０）。
特定の実施形態において、ｇＲＮＡの適切な選択により、特定のスプライス変異体が標的化され得る一方、他のスプライス変異体が標的化されないことになる。
ある場合には、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、スライシングを促進することができる（例えば、スプライシングが欠損している場合）。例えば、更なるスプライシングのため、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質をスプライシング調節性ステム−ループの安定化能のあるエフェクターに会合させることができる。ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を特定のスプライシング因子のコンセンサス結合部位配列に連結すると、タンパク質を標的ＤＮＡに動員することができる。
異常なスプライシングと関連付けられている疾患の例としては、限定されないが、シナプスで機能するタンパク質のスプライシングを調節するＮｏｖａタンパク質の喪失によって起こる傍腫瘍性眼球クローヌス・ミオクローヌス運動失調（又はＰＯＭＡ）及び非機能性クロライドチャネルの産生をもたらす、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子のスプライシング欠損によって引き起こされる嚢胞性線維症が挙げられる。他の疾患では、異常なＲＮＡスプライシングは機能獲得をもたらす。これには、例えば、スプライシング欠損を生じさせるｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおけるＣＵＧトリプレットリピート伸長（５０〜＞１５００リピート）によって引き起こされる筋強直性ジストロフィーが該当する。
ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、スプライシング因子（Ｕ１など）を５’スプライシング部位に動員して所望のエクソンの周りにあるイントロンの切出しを促進することにより、エクソンを除外することができる。かかる動員は、スプライシングアクチベーターとして機能するアルギニン／セリンリッチドメインとの融合によって媒介される可能性がある（Ｇｒａｖｅｌｙ ＢＲ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．１９９８（５）：７６５−７１）。
ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して所望の遺伝子座におけるスプライシング機構を遮断し、それによりエクソン認識及び別のタンパク質産物の発現を妨げ得ることが想定される。治療し得る障害の例は、ジストロフィンタンパク質をコードする遺伝子の突然変異によって引き起こされるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。ほぼ全てのＤＭＤ突然変異がフレームシフトにつながり、ジストロフィン翻訳が障害されることになる。ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質をスプライスジャンクション又はエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）と組み合わせて、それによってエクソン認識を妨げることにより、部分的に機能性のタンパク質の翻訳をもたらすことができる。これは致死性デュシェンヌ表現型を重篤度の低いベッカー表現型に変換する。
ｂ）ＲＮＡ改変
ＲＮＡ編集は、ＲＮＡの小さい改変によって所与の配列の遺伝子産物の多様性が増加する自然の過程である。典型的には、この改変には、そのゲノムによってコードされるものと異なるＲＮＡ配列をもたらすアデノシン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への変換が関わる。ＲＮＡ改変は、概してＡＤＡＲ酵素によって確実となり、これによればｐｒｅ−ＲＮＡ標的が、編集されるアデノシンを含むエクソンとイントロン非コードエレメントとの間の塩基対合によって不完全な二重鎖ＲＮＡを形成する。Ａ−Ｉ編集の古典的な例はグルタミン酸受容体ＧｌｕＲ−Ｂ ｍＲＮＡであり、これによればこの変化によってチャネルのコンダクタンス特性が改変されることになる（Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．１９９３；７５：１３６１−７０）。
ヒトでは、ＡＤＡＲ１遺伝子におけるヘテロ接合機能的ヌル突然変異は皮膚疾患、ヒト色素性遺伝性皮膚症につながる（Ｍｉｙａｍｕｒａ Ｙ， ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２００３；７３：６９３−９）。本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して機能不全のＲＮＡ改変を修正し得ることが想定される。
更に、ＲＮＡアデノシンメチラーゼ（Ｎ（６）−メチルアデノシン）を本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質に融合して目的の転写物に標的化し得ることが想定される。このメチラーゼは可逆的なメチル化を引き起こし、調節的役割を有し、且つ複数のＲＮＡ関連細胞経路を調節することにより遺伝子発現及び細胞運命決定に影響を及ぼし得る（Ｆｕ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１４；１５（５）：２９３−３０６）。
ｃ）ポリアデニル化
ｍＲＮＡのポリアデニル化はｍＲＮＡの核輸送、翻訳効率及び安定性に重要であり、これらの全て及びまたポリアデニル化の過程が特定のＲＢＰに依存する。多くの真核生物ｍＲＮＡは転写後に約２００ヌクレオチドの３’ポリ（Ａ）テールを受け取る。ポリアデニル化には、ポリ（Ａ）ポリメラーゼの活性を刺激する種々のＲＮＡ結合タンパク質複合体が関わる（Ｍｉｎｖｉｅｌｌｅ−Ｓｅｂａｓｔｉａ Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９９；１１：３５２−７）。本明細書に提供されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用してＲＮＡ結合タンパク質とＲＮＡとの間の相互作用に干渉するか又はそれを促進し得ることが想定される。
ポリアデニル化に関わる欠陥タンパク質と関係付けられている疾患の例は、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）である（Ｂｒａｉｓ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９８；１８：１６４−７）。
ｄ）ＲＮＡ核外輸送
ｐｒｅ−ｍＲＮＡプロセシング後、ｍＲＮＡは、核から細胞質に輸送される。これは、キャリア複合体の生成を含む細胞機構によって確実となり、キャリア複合体は、次に、核膜孔を通って移動し、細胞質でｍＲＮＡを放出し、続いてキャリアは再利用される。
ＲＮＡの核外輸送において役割を果たすタンパク質（ＴＡＰなど）の過剰発現は、アフリカツメガエルにおいて本来非効率的に核外輸送される転写物の核外輸送を増加させることが分かっている（Ｋａｔａｈｉｒａ Ｊ， ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９９；１８：２５９３−６０９）。
ｅ）ｍＲＮＡ局在
ｍＲＮＡ局在は、空間的に調節されたタンパク質産生を確実にする。細胞の特定の領域への転写物の局在は、局在化エレメントによって確実となり得る。詳細な実施形態において、本明細書に記載されるエフェクタータンパク質を使用して局在化エレメントを目的のＲＮＡに標的化し得ることが想定される。エフェクタータンパク質は、標的転写物に結合して、それをそのペプチドシグナルタグによって決まる細胞内の位置にシャトル輸送するように設計することができる。例えば、より詳細には、核局在化シグナル（ＮＬＳ）に融合したＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用してＲＮＡの局在性を変化させることができる。
局在化シグナルの更なる例としては、幾つかの非対称細胞型における細胞質へのβ−アクチンの局在を確実にするジップコード結合タンパク質（ＺＢＰ１）、ＫＤＥＬ保持配列（小胞体への局在化）、核外移行シグナル（細胞質への局在化）、ミトコンドリア標的シグナル（ミトコンドリアへの局在化）、ペルオキシソーム標的シグナル（ペルオキシソームへの局在化）及びｍ６Ａ標識／ＹＴＨＤＦ２（ｐボディへの局在化）が挙げられる。想定される他の手法は、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質と既知の局在（例えば、膜、シナプス）のタンパク質の融合である。
或いは、本発明に係るエフェクタータンパク質は、例えば、局在依存性ノックダウンに使用され得る。エフェクタータンパク質を適切な局在化シグナルと融合することにより、エフェクターが特定の細胞内区画に標的化される。この区画にある標的ＲＮＡのみが有効に標的化されることになる一方、他の同一の、しかし別の細胞内区画にある標的が標的化されず、従って局在依存性ノックダウンを成立させることができる。
ｆ）翻訳
本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して翻訳を増進させる又は抑制することができる。翻訳の上方制御は、細胞回路を制御する極めてロバストな方法であることが想定される。更に、機能研究には、転写物の上方制御がタンパク質産生の増加につながらないという欠点がある転写上方制御スクリーンと比べてタンパク質翻訳スクリーンが有利であり得る。
本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用してＥＩＦ４Ｇなどの翻訳開始因子を目的のメッセンジャーＲＮＡの５’非翻訳リピート（５’ＵＴＲ）の近傍に持っていき、翻訳をドライブし得ることが想定される（非再プログラム可能ＲＮＡ結合タンパク質についてＤｅ Ｇｒｅｇｏｒｉｏ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９９；１８（１７）：４８６５−７４に記載されるとおり）。別の例として、細胞質ポリ（Ａ）ポリメラーゼのＧＬＤ２をＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質によって標的ｍＲＮＡに動員することができる。これによれば、標的ｍＲＮＡの指向性のポリアデニル化と、それによる翻訳の刺激が可能となり得る。
同様に、本明細書において想定されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、ＺＢＰ１など、ｍＲＮＡの翻訳リプレッサーを遮断することができる（Ｈｕｔｔｅｌｍａｉｅｒ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２００５；４３８：５１２−５）。標的ＲＮＡの翻訳開始部位への結合により、翻訳が直接影響を受け得る。
加えて、ＲＮアーゼ阻害薬など、ｍＲＮＡを例えばその分解の防止によって安定化させるタンパク質にＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を融合すると、目的の転写物からのタンパク質産生を増加させることが可能である。
本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、ＲＮＡ転写物の５’ＵＴＲ領域に結合し、且つリボソームの形成及び翻訳開始を妨げることにより翻訳を抑制し得ることが想定される。
更に、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用してＣＣＲ４−ＮＯＴデアデニラーゼ複合体の一成分であるＣａｆ１を標的ｍＲＮＡに動員することにより、標的転写物の脱アデニル化及びタンパク質翻訳の阻害をもたらすことができる。
例えば、本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、治療的に関連性のあるタンパク質の翻訳を増加又は減少させることができる。ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して翻訳を下方制御又は上方制御し得る治療適用の例は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び心血管障害である。ＡＬＳ運動皮質及び脊髄ではグリアグルタミン酸トランスポーターＥＡＡＴ２レベルの低下が報告されていると共に、ＡＬＳ脳組織でも複数の異常なＥＡＡＴ２ ｍＲＮＡ転写物が報告されている。ＥＡＡＴ２タンパク質及び機能の喪失は、ＡＬＳにおける興奮毒性の主な原因であると考えられている。ＥＡＡＴ２タンパク質レベル及び機能の回復は治療利益をもたらし得る。従って、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を例えば上記に記載したとおりの翻訳リプレッサーの遮断又はｍＲＮＡの安定化によるＥＡＡＴ２タンパク質の発現の上方制御に有益に使用することができる。アポリポタンパク質Ａ１は高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の主要なタンパク質成分であり、ＡｐｏＡ１及びＨＤＬは、概して、アテローム形成抑制性であると考えられる。ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を例えば上記に記載したとおりの翻訳リプレッサーの遮断又はｍＲＮＡの安定化によるＡｐｏＡ１の発現の上方制御に有益に使用し得ることが想定される。
ｇ）ｍＲＮＡ代謝回転
翻訳は、ｍＲＮＡ代謝回転及び調節性ｍＲＮＡ安定性と密接に結び付いている。転写物の安定性には特異的タンパク質が関わることが記載されている（ニューロンにおけるＥＬＡＶ／Ｈｕタンパク質、Ｋｅｅｎｅ ＪＤ，１９９９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９６：５−７）及びトリステトラプロリン（ＴＴＰ）など。これらのタンパク質は、細胞質におけるメッセージの分解を保護することにより標的ｍＲＮＡを安定化させる（Ｐｅｎｇ ＳＳ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＥＭＢＯ Ｊ．１７：３４６１−７０）。
本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、ｍＲＮＡ代謝回転が影響を受けるように、ｍＲＮＡ転写物を安定化させる役割を果たすタンパク質の活性に干渉し得るか又はそれを促進し得ることが想定され得る。例えば、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用してヒトＴＴＰを標的ＲＮＡに動員すれば、アデニル酸−ウリジル酸リッチエレメント（ＡＵリッチエレメント）媒介性翻訳抑制及び標的分解が可能となり得る。ＡＵリッチエレメントは、癌原遺伝子をコードする多くのｍＲＮＡの３’ＵＴＲ、核内転写因子及びサイトカインに見られ、ＲＮＡ安定性を促進する。別の例として、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を、別のｍＲＮＡ安定化タンパク質であるＨｕＲ（Ｈｉｎｍａｎ ＭＮ ａｎｄ Ｌｏｕ Ｈ，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ２００８；６５：３１６８−８１）に融合してそれを標的転写物に動員することにより、その寿命を延ばすか又は短命なｍＲＮＡを安定化させることができる。
更に、本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して標的転写物の分解を促進し得ることが想定される。例えば、ｍ６Ａメチルトランスフェラーゼを標的転写物に動員して転写物をＰボディに局在させることにより、標的の分解をもたらすことができる。
更に別の例として、本明細書に記載されるとおりのＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を非特異的エンドヌクレアーゼドメインＰｉｌＴ Ｎ末端（ＰＩＮ）に融合することにより、それを標的転写物に動員し、且つその分解を可能にすることができる。
傍腫瘍性神経障害（ＰＮＤ）関連脳脊髄炎及びニューロパチーの患者は、中枢神経系外の腫瘍におけるＨｕタンパク質に対する自己抗体を生成し（Ｓｚａｂｏ Ａ ｅｔ ａｌ．１９９１，Ｃｅｌｌ．；６７：３２５−３３、それが次に血液脳関門を通過する患者である。本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用してｍＲＮＡ転写物への自己抗体の結合に干渉し得ることが想定され得る。
筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の３’ＵＴＲにおける（ＣＵＧ）ｎの伸長によって引き起こされるジストロフィー１型（ＤＭ１）の患者は、核内へのかかる転写物の蓄積によって特徴付けられる。（ＣＵＧ）ｎリピートを標的とするエンドヌクレアーゼと融合した本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質であれば、かかる異常な転写物の蓄積を阻害し得ることが想定される。
ｈ）多機能タンパク質との相互作用
一部のＲＮＡ結合タンパク質は、多くのＲＮＡ上の複数の部位に結合して多様な過程で機能する。例えば、ｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質は、エクソンスプライシングサイレンサー配列に結合してスプライシング因子をアンタゴナイズし、テロメア末端に会合し（それによりテロメア活性を刺激する）、且つｍｉＲＮＡに結合してドローシャ媒介性プロセシングを促進し、それにより成熟に影響を及ぼすことが分かっている。本発明のＲＮＡ結合エフェクタータンパク質が１つ以上の位置でＲＮＡ結合タンパク質の結合に干渉し得ることが想定される。
ｉ）ＲＮＡフォールディング
ＲＮＡは、その生物学的活性を発揮するため、定義付けられた構造をとる。代替的三次構造間でのコンホメーションの移行は多くのＲＮＡ媒介性プロセスに決定的に重要である。しかしながら、ＲＮＡフォールディングは幾つかの問題に関連し得る。例えば、ＲＮＡは不適切な代替的コンホメーションに折り畳まれて、それに維持される傾向があることもあり、且つ／又は正しい三次構造が代替的構造と比べて十分に熱力学的に好ましいとはいえないこともある。本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質、詳細には切断欠損又はデッドＲＮＡターゲティングタンパク質を使用して（ｍ）ＲＮＡのフォールディングを仕向け、且つ／又はその正しい三次構造を確保し得る。
細胞状態の調節におけるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の使用
特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡと複合体化したＣａｓ１３ｂは、標的ＲＮＡへの結合時に活性化され、続いて任意の近接したｓｓＲＮＡ標的を切断する（即ち「コラテラル」又は「バイスタンダー」効果）。Ｃａｓ１３ｂは、コグネイト標的によってプライミングされると、他の（非相補的な）ＲＮＡ分子を切断することができる。このような無差別的なＲＮＡ切断は潜在的に細胞毒性を引き起こし、又は他に細胞生理若しくは細胞状態に影響を及ぼす可能性がある。
従って、特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系は、細胞の休眠の誘導に使用され、又はそれにおける使用のためのものである。特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系は、細胞周期停止の誘導に使用され、又はそれにおける使用のためのものである。特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系は、細胞成長及び／又は細胞増殖の低減に使用され、又はそれにおける使用のためのものである。特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系は、細胞アネルギーの誘導に使用され、又はそれにおける使用のためのものである。特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系は、細胞アポトーシスの誘導に使用され、又はそれにおける使用のためのものである。特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系は、細胞壊死の誘導に使用され、又はそれにおける使用のためのものである。特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系は、細胞死の誘導に使用され、又はそれにおける使用のためのものである。特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系は、プログラム細胞死の誘導に使用され、又はそれにおける使用のためのものである。
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系を導入又は誘導することを含む、細胞の休眠の誘導方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系を導入又は誘導することを含む、細胞周期停止の誘導方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系を導入又は誘導することを含む、細胞成長及び／又は細胞増殖の低減方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系を導入又は誘導することを含む、細胞アネルギーの誘導方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系を導入又は誘導することを含む、細胞アポトーシスの誘導方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系を導入又は誘導することを含む、細胞壊死の誘導方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系を導入又は誘導することを含む、細胞死の誘導方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系を導入又は誘導することを含む、プログラム細胞死の誘導方法に関する。
本明細書に記載されるとおりの方法及び使用は、治療的又は予防的であり得、特定の細胞、細胞（部分）集団又は細胞型／組織型を標的とし得る。詳細には、本明細書に記載されるとおりの方法及び使用は治療的又は予防的であり得、１つ以上の標的配列、例えば１つ以上の特定の標的ＲＮＡ（例えば、ｓｓＲＮＡ）を発現する特定の細胞、細胞（部分）集団又は細胞型／組織型を標的とし得る。限定なしに、標的細胞は、例えば、特定の転写物を発現する癌細胞、例えば所与のクラスのニューロン、例えば自己免疫を引き起こす（免疫）細胞又は特異的な（例えば、ウイルス性の）病原体に感染した細胞等であり得る。
従って、特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系を導入又は誘導することを含む、望ましくない細胞（宿主細胞）の存在によって特徴付けられる病的状態を治療する方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、望ましくない細胞（宿主細胞）の存在によって特徴付けられる病的状態を治療するための、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系の使用に関する。特定の実施形態において、本発明は、望ましくない細胞（宿主細胞）の存在によって特徴付けられる病的状態の治療における使用のための、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系に関する。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、望ましくない細胞に特異的な標的を標的とすることが理解されるべきである。特定の実施形態において、本発明は、癌を治療、予防又は軽減するための、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系の使用に関する。特定の実施形態において、本発明は、癌の治療、予防又は軽減における使用のための、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系を導入又は誘導することを含む、癌を治療、予防又は軽減する方法に関する。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、癌細胞に特異的な標的を標的とすることが理解されるべきである。特定の実施形態において、本発明は、病原体による細胞の感染を治療、予防又は軽減するための、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系の使用に関する。特定の実施形態において、本発明は、病原体による細胞の感染の治療、予防又は軽減における使用のための、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系を導入又は誘導することを含む、病原体による細胞の感染を治療、予防又は軽減する方法に関する。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、病原体に感染した細胞に特異的な標的（例えば、病原体由来の標的）を標的とすることが理解されるべきである。特定の実施形態において、本発明は、自己免疫障害を治療、予防又は軽減するための、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系の使用に関する。特定の実施形態において、本発明は、自己免疫障害の治療、予防又は軽減における使用のための、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系に関する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系又は送達系を導入又は誘導することを含む、自己免疫障害を治療、予防又は軽減する方法に関する。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、自己免疫障害に関与する細胞に特異的な標的（例えば、特異的免疫細胞）を標的とすることが理解されるべきである。
ＲＮＡ検出におけるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の使用
更に、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質をノーザンブロットアッセイに使用し得ることが想定される。ノーザンブロッティングには、電気泳動を用いたＲＮＡ試料のサイズによる分離が関わる。ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して標的ＲＮＡ配列を特異的に結合し、検出することができる。
ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、蛍光タンパク質（ＧＦＰなど）に融合して、生細胞におけるＲＮＡ局在の追跡に使用することができる。より詳細には、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、それがもはやＲＮＡを切断しない点で不活性化することができる。詳細な実施形態では、より精密な可視化を確保するため、スプリットＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用し得ることが想定され、これによればシグナルが両方のサブタンパク質の結合に依存する。或いは、複数のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質複合体が標的転写物に結合すると再構成されるスプリット蛍光タンパク質を使用することができる。更に、転写物がｍＲＮＡに沿った複数の結合部位で標的とされ、そのため蛍光シグナルが真のシグナルを増幅して限局的な識別を可能にし得ることが想定される。更に別の代替形態として、蛍光タンパク質がスプリットインテインから再構成され得る。
ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、例えば、ＲＮＡ又は特異的スプライス変異体の局在、ｍＲＮＡ転写物のレベル、転写物の上方又は下方制御及び疾患特異的診断の決定に好適に使用される。ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、例えば、蛍光顕微鏡法又はフローサイトメトリー、例えば細胞のハイスループットスクリーニング及び細胞選別後の生細胞の回収を可能にする蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などを用いた（生）細胞におけるＲＮＡの可視化に使用することができる。更に、種々の転写物の発現レベルをストレス下、例えば分子阻害薬又は細胞に対する低酸素条件を用いた癌成長の阻害下で同時に評価することができる。別の適用は、２つの光子顕微鏡を用いて神経刺激中のシナプス結合への転写物の局在を追跡することであり得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの本発明に係る成分又は複合体は、例えば、（蛍光）標識したＣａｓ１３ｂエフェクターによるなど、多重化エラーロバスト蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＭＥＲＦＩＳＨ；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ；２０１５；３４８（６２３３））において使用することができる。
インビトロＡＰＥＸ標識
細胞過程は、タンパク質、ＲＮＡ及びＤＮＡ間の分子相互作用のネットワークに依存する。タンパク質−ＤＮＡ及びタンパク質−ＲＮＡ相互作用の正確な検出は、かかる過程の理解に重要である。インビトロ近接標識技術は、アフィニティータグを例えば光活性化可能なプローブと組み合わせて利用して、インビトロで目的のタンパク質又はＲＮＡの近くにあるポリペプチド及びＲＮＡを標識する。ＵＶ照射後、光活性化可能な基が、タグ付加分子にごく近接しているタンパク質及び他の分子と反応し、それによりそれらを標識する。標識された相互作用分子は、続いて回収して同定することができる。本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、例えばプローブを選択のＲＮＡ配列に標的化することができる。
これらの適用は、疾患に関連する適用又は培養が困難な細胞型のインビボイメージングのため動物モデルにおいても適用し得る可能性がある。
ＲＮＡ折り紙／インビトロアセンブリラインにおけるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の使用 − コンビナトリクス
ＲＮＡ折り紙とは、ＲＮＡを組み込まれた鋳型として使用して二次元又は三次元構造を作り出すためのナノスケールの折り畳み構造を指す。折り畳み構造はＲＮＡにコードされ、従って得られるＲＮＡの形状は合成されるＲＮＡ配列によって決まる（Ｇｅａｒｙ，ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４５（６１９８）．ｐｐ．７９９−８０４）。ＲＮＡ折り紙は、タンパク質などの他の成分を複合体となるように配列するための足場としての役割を果たし得る。本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用すると、例えば好適なガイドＲＮＡを使用して目的のタンパク質をＲＮＡ折り紙に標的化することができる。
これらの適用は、疾患に関連性のある適用又は培養が困難な細胞型のインビボイメージングのための動物モデルでも適用することができる。
ＲＮＡ単離又は精製、エンリッチメント又は枯渇におけるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の使用
更に、ＲＮＡと複合体化したときのＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用してＲＮＡを単離及び／又は精製し得ることが想定される。例えば、ＲＮＡ−ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質複合体の単離及び／又は精製に使用し得るアフィニティータグにＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を融合することができる。かかる適用は、例えば、細胞における遺伝子発現プロファイルの分析において有用である。詳細な実施形態において、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して特異的非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を標的化し、それによりその活性を遮断して、有用な機能性プローブを提供し得ることが想定され得る。特定の実施形態では、本明細書に記載されるとおりのエフェクタータンパク質を使用して特定のＲＮＡを特異的にエンリッチし得（限定されないが、安定性を増加させることなどを含む）、或いは特定のＲＮＡ（限定なしに、例えば特定のスプライス変異体、アイソフォームなど）を特異的に枯渇させ得る。
ｌｉｎｃＲＮＡ機能及び他の核ＲＮＡの検査
ｓｉＲＮＡなどの現在のＲＮＡノックダウン戦略は、タンパク質機構が細胞質性であるため、ほとんどが細胞質転写物のターゲティングに限られるという不都合さがある。細胞機能に必須でない外因系である本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の利点は、それを細胞のどの区画においても使用できることである。ＮＬＳシグナルをＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質に融合することにより、それを核に誘導することができ、核ＲＮＡのターゲティングが可能となる。例えば、ｌｉｎｃＲＮＡの機能をプローブすることが想定される。長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）は、極めて広範に調査されている研究分野である。多くのｌｉｎｃＲＮＡが、今のところ依然として解明されていない機能を有し、これは本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用した研究となる可能性がある。
ＲＮＡ結合タンパク質の同定
特異的ＲＮＡに結合するタンパク質の同定は、多くのＲＮＡの役割を理解するのに有用であり得る。例えば、多くのｌｉｎｃＲＮＡは転写の制御に転写及び後成的調節因子が関連する。どのようなタンパク質が所与のｌｉｎｃＲＮＡに結合するかを理解することは、所与の調節経路の構成成分を解明することを促進し得る。結合したタンパク質をビオチンで局所的に標識するため、ビオチンリガーゼを特異的転写物に動員するように本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を設計することができる。次に、タンパク質をプルダウンし、質量分析法により分析して、それを同定することができる。
ＲＮＡへの複合体のアセンブリ及び基質シャトリング
更に、本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、ＲＮＡに複合体をアセンブルすることができる。これは、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を複数の関連するタンパク質（例えば、特定の合成経路の構成成分）で機能化することにより実現し得る。或いは、かかる種々の関連するタンパク質で複数のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を機能化して、同じ又は隣接する標的ＲＮＡに標的化し得る。ＲＮＡへの複合体のアセンブリの有用な適用は、例えば、タンパク質間の基質シャトリングの促進である。
合成生物学
生物学的システムの開発には、臨床応用を含め、広い有用性がある。本発明のプログラム可能なＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、例えば癌関連ＲＮＡを標的転写物として使用した標的細胞死のため毒性ドメインのスプリットタンパク質に融合し得ることが想定される。更に、合成生物学的システムにおいて、例えばキナーゼ又は他の酵素などの適切なエフェクターとの融合複合体により、タンパク質間相互作用を含む経路に影響を与えることができる。
タンパク質スプライシング：インテイン
タンパク質スプライシングは、インテインと称される介在ポリペプチドが、エクステインと称される、それに隣接するポリペプチドからのそれ自体の切出し並びに続くエクステインのライゲーションを触媒する翻訳後プロセスである。本明細書に記載されるとおりの２つ以上のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を標的転写物にアセンブルすることを用いてスプリットインテインの放出を仕向け（Ｔｏｐｉｌｉｎａ ａｎｄ Ｍｉｌｌｓ Ｍｏｂ ＤＮＡ．２０１４ Ｆｅｂ ４；５（１）：５）、それによりｍＲＮＡ転写物の存在に関する直接計算及び続く代謝酵素又は転写因子などの（転写経路の下流作動のための）タンパク質産物の放出を可能にし得る。本願は合成生物学（上記を参照されたい）又は大規模バイオ生産（一定の条件下でのみ産物を産生する）において多大な意義を有し得る。
誘導性システム、投与システム及び自己不活性化システム
一実施形態において、本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質及びエフェクター成分を含む融合複合体は、誘導性、例えば光誘導性又は化学誘導性となるように設計される。かかる誘導能により、エフェクター成分を所望の時点で活性化させることが可能となる。
光誘導能は、例えば、融合にＣＲＹ２ＰＨＲ／ＣＩＢＮ対形成が用いられる融合複合体を設計することにより実現される。このシステムは、生細胞におけるタンパク質相互作用の光誘導に特に有用である（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１３；５００：４７２−４７６）。
化学誘導能は、例えば、融合にＦＫＢＰ／ＦＲＢ（ＦＫ５０６結合タンパク質／ＦＫＢＰラパマイシン結合）対形成が用いられる融合複合体を設計することにより提供される。このシステムを使用すると、タンパク質の結合にラパマイシンが必要である（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５；３３（２）：１３９−４２が、Ｃａｓ９へのこのシステムの使用について記載している）。
更に、本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、細胞にＤＮＡとして導入すると、テトラサイクリン又はドキシサイクリン制御転写活性化（Ｔｅｔ−Ｏｎ及びＴｅｔ−Ｏｆｆ発現系）、例えばエクジソン誘導性遺伝子発現系などのホルモン誘導性遺伝子発現系及びアラビノース誘導性遺伝子発現系など、誘導性プロモーターによって調節することができる。ＲＮＡとして送達すると、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の発現をリボスイッチで調節することができ、これはテトラサイクリンのような小分子を検知することができるものである（Ｇｏｌｄｆｌｅｓｓ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１２；４０（９）：ｅ６４に記載されるとおり）。
一実施形態において、本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の送達を調節して細胞内のタンパク質又はｃｒＲＮＡの量を変化させ、それにより所望の効果又は任意の望ましくないオフターゲット効果の大きさを変化させることができる。
一実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、自己不活性化するように設計することができる。これは、ｍＲＮＡ又は複製ＲＮＡ治療薬（Ｗｒｏｂｌｅｓｋａ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５ Ａｕｇ；３３（８）：８３９−８４１）のいずれかの、ＲＮＡとして細胞に送達すると、自己ＲＮＡを破壊して、それにより常在性及び潜在的に望ましくない効果を低減することにより、発現及び続く効果を自己不活性化し得る。
本明細書に記載されるとおりのＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の更なるインビボ適用については、Ｍａｃｋａｙ ＪＰ ｅｔ ａｌ（Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１ Ｍａｒ；１８（３）：２５６−６１）、Ｎｅｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ（Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ．２０１５ Ｊｕｌ；３７（７）：７３２−９）及びＡｂｉｌ Ｚ ａｎｄ Ｚｈａｏ Ｈ（Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓｔ．２０１５ Ｏｃｔ；１１（１０）：２６５８−６５）が参照され、これらは参照により本明細書に援用される。詳細には、本発明の特定の実施形態において、好ましくは触媒不活性Ｃａｓ１３ｂを使用することによる特定の実施形態において以下の適用が想定される：翻訳の亢進（例えば、Ｃａｓ１３ｂ−翻訳促進因子融合物（例えば、ｅＩＦ４融合物））；翻訳の抑制（例えば、リボソーム結合部位を標的とするｇＲＮＡ）；エクソンスキッピング（例えば、スプライスドナー及び／又はアクセプター部位を標的とするｇＲＮＡ）；エクソンインクルージョン（例えば、特定のエクソンスプライスドナー及び／又はアクセプター部位が含まれるように標的化するｇＲＮＡ又はスプライソソーム成分（例えば、Ｕ１ ｓｎＲＮＡ）に融合した若しくはそれを動員するＣａｓ１３ｂ）；ＲＮＡ局在への接近（例えば、Ｃａｓ１３ｂ−マーカー融合物（例えば、ＥＧＦＰ融合物））；ＲＮＡ局在の変化（例えば、Ｃａｓ１３ｂ−局在化シグナル融合物（例えば、ＮＬＳ又はＮＥＳ融合物））；ＲＮＡ分解（この場合、Ｃａｓ１３ｂの活性に依存するならば触媒不活性Ｃａｓ１３ｂは使用されないものとし、或いは及び特異性の増加のため、スプリットＣａｓ１３ｂが使用され得る）；ｇＲＮＡの分解又は機能部位への結合によるなど（場合によりＣａｓ１３ｂ−シグナル配列融合物による再局在化によって特異的部位でタイトレートアウトする）、非コードＲＮＡ機能（例えば、ｍｉＲＮＡ）の阻害。
本明細書において上記に記載され、且つ実施例で実証されるとおり、Ｃａｓ１３ｂ機能は、ｃｒＲＮＡの５’又は３’伸長及びｃｒＲＮＡループの伸長に対してロバストである。従って、複合体形成及び標的転写物への結合に影響を及ぼすことなくｃｒＲＮＡにＭＳ２ループ及び他の動員ドメインを付加し得ることが想定される。様々なエフェクタードメインを動員するためのｃｒＲＮＡに対するかかる改変は、上記に記載したＲＮＡ標的化エフェクタータンパク質の使用において適用可能である。
Ｃａｓ１３ｂは、ＲＮＡファージ耐性を媒介する能力を有する。従って、Ｃａｓ１３ｂを使用して、限定されないが、エボラウイルス及びジカウイルスを含めたＲＮＡ単独病原体に対して例えば動物、ヒト及び植物を免疫し得ることが想定される。
特定の実施形態では、Ｃａｓ１３ｂは、それ自体のアレイをプロセシング（切断）できる。これは、野生型Ｃａｓ１３ｂタンパク質と、本明細書で考察されるような１つ以上の突然変異アミノ酸残基を含む突然変異Ｃａｓ１３ｂタンパク質との両方に適用される。従って、種々の標的転写物及び／又は適用に向けて設計された複数のｃｒＲＮＡを単一のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡとして又は１つのプロモーターによってドライブされる単一の転写物として送達し得ることが想定される。かかる送達方法には、実質的によりコンパクトで、合成がより容易で、且つウイルス系での送達がより容易であるという利点がある。本明細書におけるＣａｓ１３ｂのオルソログについて正確なアミノ酸位置は、異なることもあり、これは、当該技術分野において公知のとおり且つ本明細書において他の部分に記載されるとおり、タンパク質アラインメントによって適切に決定し得ることは理解されるであろう。本発明の態様は、原核細胞又は真核細胞におけるインビトロ、インビボ又はエキソビボでのゲノムエンジニアリングにおける、例えば１つ以上の遺伝子又は１つ以上の遺伝子産物の発現を変化させる又は操作するための、本明細書に記載される組成物及び系の方法及び使用も包含する。
ある態様において、本発明は、細胞における標的ＲＮＡの発現を調節する、例えば低下させるための方法及び組成物を提供する。本方法では、ＲＮＡの転写、安定性及び／又は翻訳に干渉する本発明のＣａｓ１３ｂ系が提供される。
特定の実施形態において、有効量のＣａｓ１３ｂ系を使用してＲＮＡが切断され、又は他にＲＮＡ発現が阻害される。これに関連して、この系はｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡと同様の使用を有し、従ってまたかかる方法に代えることもできる。この方法は、限定なしに、例えば干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなど）又はその転写鋳型、例えばｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡの代わりとしてのＣａｓ１３ｂ系の使用を含む。Ｃａｓ１３ｂ系は、例えば、標的細胞を含む哺乳類への投与によって標的細胞に導入される。
有利には、本発明のＣａｓ１３ｂ系は、特異的である。例えば、干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなど）ポリヌクレオチド系は設計及び安定性の問題並びにオフターゲット結合に悩まされるが、本発明のＣａｓ１３ｂ系は高い特異性で設計することができる。
不安定化Ｃａｓ１３ｂ
特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの本発明に係るエフェクタータンパク質は、不安定化ドメイン（ＤＤ）に会合又は融合される。一部の実施形態において、ＤＤは、ＥＲ５０である。このＤＤの対応する安定化リガンドは、一部の実施形態において４ＨＴである。そのため、一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＤの１つがＥＲ５０であり、従って安定化リガンドが４ＨＴ又はＣＭＰ８である。一部の実施形態において、ＤＤは、ＤＨＦＲ５０である。このＤＤの対応する安定化リガンドは、一部の実施形態においてＴＭＰである。そのため、一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＤの１つがＤＨＦＲ５０であり、従って安定化リガンドがＴＭＰである。一部の実施形態において、ＤＤは、ＥＲ５０である。このＤＤの対応する安定化リガンドは、一部の実施形態においてＣＭＰ８である。従って、ＣＭＰ８は、ＥＲ５０系における４ＨＴの代替となる安定化リガンドであり得る。ＣＭＰ８及び４ＨＴを競合的に使用し得る／使用すべきである可能性があり得るが、一部の細胞型はこれらの２つのリガンドのいずれか一方の影響を受け易いこともあり、本開示及び当該技術分野における知識から、当業者はＣＭＰ８及び／又は４ＨＴを使用することができる。
一部の実施形態において、１つ又は２つのＤＤがＣａｓ１３ｂのＮ端側末端に融合され、１つ又は２つのＤＤがＣａｓ１３ｂのＣ端側に融合され得る。一部の実施形態では、少なくとも２つのＤＤがＣａｓ１３ｂと会合し、及びそれらのＤＤは、同じＤＤであり、即ち、ＤＤは、同種である。従って、ＤＤの両方（又は２つ以上）がＥＲ５０ ＤＤであり得る。一部の実施形態ではこれが好ましい。或いは、ＤＤの両方（又は２つ以上）がＤＨＦＲ５０ ＤＤであり得る。これも一部の実施形態では好ましい。一部の実施形態において、少なくとも２つのＤＤがＣａｓ１３ｂと会合し、及びそれらのＤＤは、異なるＤＤであり、即ち、ＤＤは、異種である。従って、ＤＤの１つがＥＲ５０であり得る一方、ＤＤの１つ以上又は任意の他のＤＤがＤＨＦＲ５０であり得る。異種である２つ以上のＤＤを有することは、より高い分解制御レベルをもたらし得るため有利であり得る。Ｎ端又はＣ端における２つ以上のＤＤのタンデム融合が分解を増強し得る；及びかかるタンデム融合は、例えば、ＥＲ５０−ＥＲ５０−Ｃａｓ１３ｂ又はＤＨＦＲ−ＤＨＦＲ−Ｃａｓ１３ｂであり得る。いずれの安定化リガンドも存在しないならば高レベルの分解が起こり、一方の安定化リガンドが存在せず、他方の（又は別の）安定化リガンドが存在するならば中間レベルの分解が起こり得る一方、安定化リガンドの両方（又は２つ以上）が存在するならば低レベルの分解が起こり得ることが想定される。制御は、Ｎ端側ＥＲ５０ ＤＤ及びＣ端側ＤＨＦＲ５０ ＤＤを有することによってももたらされ得る。
一部の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂとＤＤの融合は、ＤＤとＣａｓ１３ｂとの間にリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーはＧｌｙＳｅｒリンカーである。一部の実施形態において、ＤＤ−Ｃａｓ１３ｂは、少なくとも１つの核外移行シグナル（ＮＥＳ）を更に含む。一部の実施形態において、ＤＤ−Ｃａｓ１３ｂは、２つ以上のＮＥＳを含む。一部の実施形態において、ＤＤ−Ｃａｓ１３ｂは、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。これは、ＮＥＳに加えて含むのであり得る。一部の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂは、Ｃａｓ１３ｂとＤＤとの間のリンカーとして又はその一部として、局在化（核内移行又は核外移行）シグナルを含むか、又はそれから本質的になるか、又はそれからなる。ＨＡ又はＦｌａｇタグもリンカーとしての本発明の範囲内にある。本出願人らは、ＮＬＳ及び／又はＮＥＳをリンカーとして使用し、また、ＧＳほどの短さのものから最大（ＧＧＧＧＳ）３に至るまでのグリシンセリンリンカーも使用する。
不安定化ドメインには、広範囲のタンパク質に不安定性を付与する一般的な有用性がある；例えば、Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．Ｍａｒ ７，２０１２；１３４（９）：３９４２−３９４５（参照により本明細書に援用される）を参照されたい。ＣＭＰ８又は４−ヒドロキシタモキシフェンは不安定化ドメインであり得る。より一般的には、Ｎ末端規則による不安定化残基である哺乳類ＤＨＦＲの温度感受性突然変異体（ＤＨＦＲｔｓ）が、許容温度で安定であるが、３７℃で不安定であることが分かった。ＤＨＦＲｔｓを発現する細胞に哺乳類ＤＨＦＲの高親和性リガンドであるメトトレキサートを加えると、タンパク質の分解が部分的に阻害された。これは、細胞において本来分解の標的となるタンパク質を小分子リガンドが安定化させ得るという重要な実証であった。ラパマイシン誘導体を使用すると、ｍＴＯＲのＦＲＢドメインの不安定突然変異体（ＦＲＢ＊）が安定化し、融合したキナーゼＧＳＫ−３βの機能が回復した６，７。この系は、リガンド依存的な安定性が、複雑な生物学的環境にある特異的タンパク質の機能を調節する魅力的な戦略に相当することを実証した。タンパク質活性の制御系には、ラパマイシンによって誘導されたＦＫ５０６結合タンパク質とＦＫＢＰ１２との二量体化によってユビキチン相補性が生じると機能性になるＤＤが関与し得る。ヒトＦＫＢＰ１２又はｅｃＤＨＦＲタンパク質の突然変異体は、その高親和性リガンド、それぞれＳｈｉｅｌｄ−１又はトリメトプリム（ＴＭＰ）が存在しない場合には代謝的に不安定であるようにエンジニアリングすることができる。これらの突然変異体は、本発明の実施において有用な可能な不安定化ドメイン（ＤＤ）の一部であり、及びＣａｓ１３ｂとの融合物としてのＤＤの不安定性が、プロテアソームによる融合タンパク質全体のＣａｓ１３ｂ分解をもたらす。Ｓｈｉｅｌｄ−１及びＴＭＰは用量依存的にＤＤに結合してそれを安定化させる。エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ＥＲＬＢＤ、ＥＲＳ１の残基３０５〜５４９）も不安定化ドメインとしてエンジニアリングすることができる。エストロゲン受容体シグナル伝達経路は乳癌などの種々の疾患に関与するため、この経路は広く研究されており、多くのエストロゲン受容体作動薬及び拮抗薬が開発されている。従って、ＥＲＬＢＤと薬物との適合性のあるペアが公知である。突然変異形態のＥＲＬＢＤに結合するが、野生型形態のＥＲＬＢＤには結合しないリガンドがある。３つの突然変異（Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ）をコードするこれらの突然変異ドメインの１つを使用することにより１２、内因性エストロゲン感受性ネットワークを乱すことのないリガンドを用いてＥＲＬＢＤ由来のＤＤの安定性を調節することが可能である。追加の突然変異（Ｙ５３７Ｓ）を導入してＥＲＬＢＤを更に不安定化させ、それを潜在的なＤＤ候補として構成することができる。この四重突然変異体は、有利なＤＤ展開である。この突然変異ＥＲＬＢＤをＣａｓ１３ｂに融合させることができ、且つリガンドを用いてその安定性を調節し又は撹乱させることができ、これによりＣａｓ１３ｂがＤＤを有する。別のＤＤは、Ｓｈｉｅｌｄ１リガンドによって安定化する、突然変異ＦＫＢＰタンパク質をベースとする１２ｋＤａ（１０７アミノ酸）タグであり得る；例えば、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５，（２００８）を参照されたい。例えば、ＤＤは、合成の生物学的に不活性な小分子、Ｓｈｉｅｌｄ−１に結合し、且つそれによって可逆的に安定化される、改変されたＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）であり得；例えば、Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ ＬＡ，Ｃｈｅｎ ＬＣ，Ｍａｙｎａｒｄ−Ｓｍｉｔｈ ＬＡ，Ｏｏｉ ＡＧ，Ｗａｎｄｌｅｓｓ ＴＪ．“Ａ ｒａｐｉｄ，ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ，ａｎｄ ｔｕｎａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”．Ｃｅｌｌ．２００６；１２６：９９５−１００４；Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ ＬＡ，Ｓｅｌｌｍｙｅｒ ＭＡ，Ｃｏｎｔａｇ ＣＨ，Ｗａｎｄｌｅｓｓ ＴＪ，Ｔｈｏｒｎｅ ＳＨ．“Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｍｉｃｅ”．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００８；１４：１１２３−１１２７；Ｍａｙｎａｒｄ−Ｓｍｉｔｈ ＬＡ，Ｃｈｅｎ ＬＣ，Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ ＬＡ，Ｏｏｉ ＡＧ，Ｗａｎｄｌｅｓｓ ＴＪ．“Ａ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｓｉｌｅｎｔ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００７；２８２：２４８６６−２４８７２；及びＲｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．Ｍａｒ ２３，２０１２；１９（３）：３９１−３９８（これらは、全て参照により本明細書に援用される）を参照されたく、及び本発明の実施においてＣａｓ１３ｂと会合させるＤＤの選択において本発明の実施で用いられ得る。理解し得るとおり、当該技術分野における知識には幾つものＤＤが含まれ、及びＤＤは、Ｃａｓ１３ｂと、有利にはリンカーを伴い会合させる、例えば融合することができ、それによってＤＤをリガンドの存在下で安定化させることができ、且つそれが存在しないときＤＤを不安定化させることができ、それによってＣａｓ１３ｂが全体として不安定化するか、又はＤＤはリガンドが存在しない場合に安定化させることができ、且つリガンドが存在するときにＤＤを不安定化させることができ；ＤＤによってＣａｓ１３ｂ、従ってＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ｂ複合体又は系を調節又は制御する−いわばオン・オフを切り替えることが可能となり、それにより系を例えばインビボ又はインビトロ環境で調節又は制御する手段が提供される。例えば、目的のタンパク質をＤＤタグとの融合物として発現させると、それは、細胞内で不安定化し、例えばプロテアソームによって急速に分解される。従って、安定化リガンドが存在しないと、Ｄが会合したＣａｓの分解につながる。新規ＤＤを目的のタンパク質に融合させると、その不安定性が目的のタンパク質に付与され、融合タンパク質全体の急速な分解が生じる。Ｃａｓのピーク活性は、時にオフターゲット効果の低減に有益である。従って、高い活性の短いバーストが好ましい。本発明はかかるピークを提供することが可能である。ある意味では、この系は、誘導性である。別の意味では、この系は、安定化リガンドの非存在下で抑制され、且つ安定化リガンドの存在下で抑制が解除される。
Ｃａｓ１３突然変異
特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの本発明に係るエフェクタータンパク質（ＣＲＩＳＰＲ酵素；Ｃａｓ１３；エフェクタータンパク質）は、触媒不活性又はデッドＣａｓ１３エフェクタータンパク質（ｄＣａｓ１３）である。一部の実施形態において、ｄＣａｓ１３エフェクターは、ヌクレアーゼドメインに突然変異を含む。一部の実施形態において、ｄＣａｓ１３エフェクタータンパク質は、トランケートされている。Ｃａｓ１３エフェクターと１つ以上の機能ドメインとの融合タンパク質のサイズを低減するため、そのＲＮＡ結合機能をなおも維持しつつ、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端をトランケートすることができる。例えば、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、又は少なくとも１００アミノ酸、又は少なくとも１５０アミノ酸、又は少なくとも２００アミノ酸、又は少なくとも２５０アミノ酸、又は少なくとも３００アミノ酸、又は少なくとも３５０アミノ酸、又は最大１２０アミノ酸、又は最大１４０アミノ酸、又は最大１６０アミノ酸、又は最大１８０アミノ酸、又は最大２００アミノ酸、又は最大２５０アミノ酸、又は最大３００アミノ酸、又は最大３５０アミノ酸、又は最大４００アミノ酸をＣａｓ１３ｂエフェクターのＣ末端でトランケートし得る。Ｃａｓ１３トランケーションの具体的な例としては、Ｃ末端Δ９８４〜１０９０、Ｃ末端Δ１０２６〜１０９０及びＣ末端Δ１０５３〜１０９０、Ｃ末端Δ９３４〜１０９０、Ｃ末端Δ８８４〜１０９０、Ｃ末端Δ８３４〜１０９０、Ｃ末端Δ７８４〜１０９０及びＣ末端Δ７３４〜１０９０が挙げられ、ここで、アミノ酸位置は、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５−１２５ Ｃａｓ１３ｂタンパク質のアミノ酸位置に対応する。図２８を参照されたい。
Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質の調節
本発明は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質機能を調節するアクセサリータンパク質を提供する。特定の実施形態において、アクセサリータンパク質は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の触媒活性を調節する。本発明のある実施形態において、アクセサリータンパク質は、標的化した又は配列特異的なヌクレアーゼ活性を調節する。本発明のある実施形態において、アクセサリータンパク質は、コラテラルヌクレアーゼ活性を調節する。本発明のある実施形態において、アクセサリータンパク質は、標的核酸への結合を調節する。
本発明によれば、調節されるヌクレアーゼ活性は、限定なしに、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及び切断可能なＲＮＡ連結を含む核酸をヌクレオチド類似体と共に含め、ＲＮＡを含む又はそれからなる核酸に対するものであり得る。本発明のある実施形態において、調節されるヌクレアーゼ活性は、限定なしに、切断可能なＤＮＡ連結を含む核酸及び核酸類似体を含め、ＤＮＡを含む又はそれからなる核酸に対するものであり得る。
本発明のある実施形態において、アクセサリータンパク質は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の活性を亢進させる。特定のかかる実施形態において、アクセサリータンパク質は、ＨＥＰＮドメインを含み、ＲＮＡ切断を亢進させる。特定の実施形態において、アクセサリータンパク質は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の活性を阻害する。特定のかかる実施形態において、アクセサリータンパク質は、不活性化したＨＥＰＮドメインを含むか、又はＨＥＰＮドメインが完全に欠損している。
本発明によれば、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ系の天然に存在するアクセサリータンパク質は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の活性を改変する役割を果たす、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座又はその近傍にコードされる低分子タンパク質を含む。一般にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、推定ＣＲＩＳＰＲアレイを含むもの及び／又は推定ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードするものと同定することができる。ある実施形態において、エフェクタータンパク質は、８００〜２０００アミノ酸、又は９００〜１８００アミノ酸、又は９５０〜１３００アミノ酸であり得る。ある実施形態において、アクセサリータンパク質は、推定ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質又はアレイから２５ｋｂ以内、又は２０ｋｂ以内又は１５ｋｂ以内、又は１０ｋｂ以内、又は推定ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質又はアレイから２ｋｂ〜１０ｋｂにコードされ得る。
本発明のある実施形態において、アクセサリータンパク質は、５０〜３００アミノ酸又は１００〜３００アミノ酸又は１５０〜２５０アミノ酸又は約２００アミノ酸である。アクセサリータンパク質の非限定的な例としては、本明細書で同定されるｃｓｘ２７及びｃｓｘ２８タンパク質が挙げられる。
本発明のＣＲＩＳＰＲアクセサリータンパク質の同定及び使用は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質分類と無関係である。本発明のアクセサリータンパク質は、種々のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と会合されて見出され、又はそれと共に機能するようにエンジニアリングされ得る。本明細書で同定及び使用されるアクセサリータンパク質の例は、一般的にＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を代表するものである。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質分類には、相同性、特徴位置（例えば、ＲＥＣドメイン、ＮＵＣドメイン、ＨＥＰＮ配列の位置）、核酸標的（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ ＲＮＡの有無、ダイレクトリピートの５’側又は３’側のガイド／スペーサー配列の位置又は他の基準が関わり得ることが理解される。本発明の実施形態において、アクセサリータンパク質の同定及び使用は、かかる分類を超越する。
ＲＮＡを標的とするＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系では、Ｃａｓタンパク質は、通常、ＲＮＡ切断に関与する２つの保存されたＨＥＰＮドメインを含む。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質がｃｒＲＮＡをプロセシングして成熟ｃｒＲＮＡを生じさせる。ｃｒＲＮＡのガイド配列は、相補配列を有する標的ＲＮＡを認識し、Ｃａｓタンパク質は、標的鎖を分解する。より詳細には、特定の実施形態では、標的結合時にＣａｓタンパク質は、２つのＨＥＰＮドメインを一体に架橋する構造再配列を起こして活性ＨＥＰＮ触媒部位を形成し、次に標的ＲＮＡが切断される。Ｃａｓタンパク質の表面近傍に触媒部位があることにより、非特異的コラテラルｓｓＲＮＡ切断が可能となる。
特定の実施形態において、アクセサリータンパク質は、標的及び／又はコラテラルＲＮＡ切断の増加又は低減に役立つ。理論によって拘束されないが、ＣＲＩＳＰＲ活性を活性化するアクセサリータンパク質（例えば、ｃｓｘ２８タンパク質又はＨＥＰＮドメインを含むオルソログ若しくは変異体）は、Ｃａｓタンパク質と相互作用し、且つそのＨＥＰＮドメインをＣａｓタンパク質のＨＥＰＮドメインと組み合わせて活性ＨＥＰＮ触媒部位を形成する能力を有するものと想定することができる一方、阻害性アクセサリータンパク質（例えば、ＨＥＰＮドメインを欠くｃｓｘ２７）は、Ｃａｓタンパク質と相互作用し、且つ２つのＨＥＰＮドメインを一体にし得るＣａｓタンパク質のコンホメーションを低減又は遮断する能力を有するものと想定することができる。
本発明によれば、特定の実施形態において、ＶＩ型Ｃａｓタンパク質又はその複合体の活性を亢進させることは、ＶＩ型Ｃａｓタンパク質又はその複合体を、Ｃａｓタンパク質を活性化する同じ生物からのアクセサリータンパク質に接触させることを含む。他の実施形態において、ＶＩ型Ｃａｓタンパク質又はその複合体の活性を亢進させることは、ＶＩ型Ｃａｓタンパク質又はその複合体を、同じサブクラス内（例えば、ＶＩ−ｂ型）の異なる生物からのアクチベーターアクセサリータンパク質に接触させることを含む。他の実施形態において、ＶＩ型Ｃａｓタンパク質又はその複合体の活性を亢進させることは、ＶＩ型Ｃａｓタンパク質又はその複合体を、そのサブクラス内にないアクセサリータンパク質に（例えば、ＶＩ−ｂ型以外のＶＩ型Ｃａｓタンパク質をＶＩ−ｂ型アクセサリータンパク質に又はその逆で）接触させることを含む。
本発明によれば、特定の実施形態において、ＶＩ型Ｃａｓタンパク質又はその複合体の活性を抑制することは、ＶＩ型Ｃａｓタンパク質又はその複合体を、Ｃａｓタンパク質を抑制する同じ生物からのアクセサリータンパク質に接触させることを含む。他の実施形態において、ＶＩ型Ｃａｓタンパク質又はその複合体の活性を抑制することは、ＶＩ型Ｃａｓタンパク質又はその複合体を、同じサブクラス内（例えば、ＶＩ−ｂ型）の異なる生物からのリプレッサーアクセサリータンパク質に接触させることを含む。他の実施形態において、ＶＩ型Ｃａｓタンパク質又はその複合体の活性を抑制することは、ＶＩ型Ｃａｓタンパク質又はその複合体を、そのサブクラス内にないリプレッサーアクセサリータンパク質に（例えば、ＶＩ−ｂ型以外のＶＩ型Ｃａｓタンパク質をＶＩ−ｂ型リプレッサーアクセサリータンパク質に又はその逆で）接触させることを含む。
ＶＩ型Ｃａｓタンパク質とＶＩ型アクセサリータンパク質とが同じ生物に由来する特定の実施形態において、これらの２つのタンパク質は、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ系において一体となって機能し得る。特定の実施形態では、例えばタンパク質のいずれか一方若しくは両方又はその発現を改変することにより、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ系の機能を変化させることが望ましいであろう。ＶＩ型Ｃａｓタンパク質とＶＩ型アクセサリータンパク質とが、同じクラス内であることも又は異なるクラス内であることもある異なる生物に由来する実施形態において、これらのタンパク質は、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ系において一体となって機能し得るが、多くの場合、タンパク質のいずれか一方若しくは両方を一体となって機能するように改変することが望ましいか、又はそうすることが必要となるであろう。
従って、本発明の特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質及びアクセサリータンパク質のいずれか一方又は両方は、Ｃａｓタンパク質とアクセサリータンパク質との間のタンパク質間相互作用の側面を調整するように改変され得る。特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質及びアクセサリータンパク質のいずれか一方又は両方は、タンパク質−核酸相互作用の側面を調整するように改変され得る。タンパク質間相互作用及びタンパク質−核酸相互作用を調整する方法としては、限定なしに、分子表面の適合化、極性相互作用、水素結合及びファンデルワールス相互作用の調節が挙げられる。特定の実施形態において、タンパク質間相互作用又はタンパク質−核酸結合を調整することは、結合相互作用を増加又は低下させることを含む。特定の実施形態において、タンパク質間相互作用又はタンパク質−核酸結合を調整することは、タンパク質又は核酸のコンホメーションを有利又は不利に作用するものにする改変を含む。
「適合化」とは、自動的又は半自動的手段によることを含め、Ｃａｓ１３タンパク質の１つ以上の原子とＣａｓ１３アクセサリータンパク質の少なくとも１つの原子との間、又はＣａｓ１３タンパク質の１つ以上の原子と核酸の１つ以上の原子との間、又はＣａｓ１３アクセサリータンパク質の１つ以上の原子と核酸との間の相互作用を決定すること、及びかかる相互作用がどの程度安定しているかを計算することを意味する。相互作用には、電荷によってもたらされる引力及び斥力、立体的考察などが含まれる。
ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質若しくはその複合体又はＶＩ型ＣＲＩＳＰＲアクセサリータンパク質若しくはその複合体の三次元構造は、本発明に関連して、Ｃａｓ１３のオルソログにおける追加的な突然変異を同定するための更なるツールを提供する。結晶構造も新規の特異的なＣａｓ１３及びＣａｓ１３アクセサリータンパク質の設計の基礎となり得る。様々なコンピュータベースの適合化方法が更に記載される。Ｃａ１３、アクセサリータンパク質及び核酸の結合相互作用は、ドッキングプログラムを用いたコンピュータモデリングの使用によって調べることができる。ドッキングプログラムは、公知である；例えば、ＧＲＡＭ、ＤＯＣＫ又はＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，ｖｏｌ．３，ｎｏ．４（１９９８），１６０−１７８及びＤｕｎｂｒａｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ ２（１９９７），２７−４２を参照されたい）。この手順には、結合パートナーの形状及び化学構造がどの程度良好であるかを確かめるコンピュータフィッティングが含まれ得る。ＶＩ型系の活性部位又は結合部位についてコンピュータ支援下に手動で調査が行われ得る。ＧＲＩＤ（Ｐ．Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ，１９８５，２８，８４９−５７） − 様々な官能基を有する分子間の可能性のある相互作用部位を決定するプログラム − などのプログラムも、結合化合物の部分的構造を予測するための活性部位又は結合部位の分析に用いられ得る。コンピュータプログラムを用いると、２つの結合パートナー、例えばＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ系の構成成分又は核酸分子及びＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ系の構成成分の引力、斥力又は立体障害を推定することができる。
アミノ酸置換は、アミノ酸特性（残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の性質など）の違い又は類似性に基づいて行われ得、従ってアミノ酸を機能的なグループにまとめることが有用である。アミノ酸は、その側鎖の特性のみに基づいてまとめられ得る。オルソログの比較では、それらは、構造又は触媒上の理由から保存されている残基である可能性が高い。これらの組は、ベン図の形式で記述することができる（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｃ．Ｄ．ａｎｄ Ｂａｒｔｏｎ Ｇ．Ｊ．（１９９３）“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕｅ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ”Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．９：７４５−７５６）（Ｔａｙｌｏｒ Ｗ．Ｒ．（１９８６）“Ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ”Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９；２０５−２１８）。保存的置換は、例えば、一般に認められているベン図によるアミノ酸分類を記載する以下の表に従い行い得る。
エンジニアリングされたＣａ１３系では、改変は、Ｃａｓ１３タンパク質の１つ以上のアミノ酸残基の改変を含み得、且つ／又はＣａｓ１３アクセサリータンパク質の１つ以上のアミノ酸残基の改変を含み得る。
エンジニアリングされたＣａ１３系では、改変は、非改変Ｃａｓ１３タンパク質及び／又はＣａｓ１３アクセサリータンパク質において正電荷である残基を含む領域に位置する１つ以上のアミノ酸残基の改変を含み得る。
エンジニアリングされたＣａｓ１３系では、改変は、非改変Ｃａｓ１３タンパク質及び／又はＣａｓ１３アクセサリータンパク質において正電荷である１つ以上のアミノ酸残基の改変を含み得る。
エンジニアリングされたＣａｓ１３系では、改変は、非改変Ｃａｓ１３タンパク質及び／又はＣａｓ１３アクセサリータンパク質において正電荷でない１つ以上のアミノ酸残基の改変を含み得る。
改変は、非改変Ｃａｓ１３タンパク質及び／又はＣａｓ１３アクセサリータンパク質において荷電していない１つ以上のアミノ酸残基の改変を含み得る。
改変は、非改変Ｃａｓ１３タンパク質及び／又はＣａｓ１３アクセサリータンパク質において負電荷である１つ以上のアミノ酸残基の改変を含み得る。
改変は、非改変Ｃａｓ１３タンパク質及び／又はＣａｓ１３アクセサリータンパク質において疎水性である１つ以上のアミノ酸残基の改変を含み得る。
改変は、非改変Ｃａｓ１３タンパク質及び／又はＣａｓ１３アクセサリータンパク質において極性である１つ以上のアミノ酸残基の改変を含み得る。
改変は、疎水性アミノ酸又は極性アミノ酸から負電荷アミノ酸又は正電荷アミノ酸であり得る荷電アミノ酸への置換を含み得る。改変は、負電荷アミノ酸から正電荷、又は極性、又は疎水性アミノ酸への置換を含み得る。改変は、正電荷アミノ酸から負電荷、又は極性、又は疎水性アミノ酸への置換を含み得る。
本発明の実施形態は、起こり得る相同置換（置き換え及び置換の両方は、本明細書では既存のアミノ酸残基又はヌクレオチドと代替の残基又はヌクレオチドとの相互交換を意味して用いられる）、即ちアミノ酸の場合に塩基性同士、酸性同士、極性同士等、同種のもの同士の置換を含み得る配列（ポリヌクレオチド又はポリペプチドの両方）を含む。非相同置換、即ちあるクラスから別のクラスの残基への置換、或いはオルニチン（以下、Ｚと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂと称する）、ノルロイシンオルニチン（以下、Ｏと称する）、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシンなどの非天然アミノ酸の取り込みが関わる置換も起こり得る。変異体アミノ酸配列は、グリシン又はβ−アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加え、メチル基、エチル基又はプロピル基などのアルキル基を含む配列の任意の２つのアミノ酸残基の間に挿入され得る好適なスペーサー基を含み得る。更なる形態の変異体（これにはペプトイド形態の１つ以上のアミノ酸残基の存在が関わる）について、当業者は十分に理解し得る。誤解を避けるため、「ペプトイド形態」は、α−炭素置換基がα−炭素上でなく、むしろ残基の窒素原子上にある変異体アミノ酸残基を指して使用される。ペプトイド形態のペプチドの調製方法は、当該技術分野において公知である（例えば、Ｓｉｍｏｎ ＲＪ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０），９３６７−９３７１及びＨｏｒｗｅｌｌ ＤＣ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４），１３２−１３４）。
相同性モデリング：他のＣａｓ１３オルソログにおける対応する残基は、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２（Ｎａｔｕｒｅ；４９０（７４２１）：５５６−６０）及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５（ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ；１１（５）：ｅ１００４２４８）の方法−ドメイン−モチーフ界面によって媒介される相互作用を予測する計算的タンパク質間相互作用（ＰＰＩ）方法によって同定することができる。構造に基づくＰＰＩ予測方法であるＰｒｅＰＰＩ（予測ＰＰＩ）は、ベイズ統計学の枠組みを用いて構造的エビデンスを非構造的エビデンスと組み合わせる。この方法は、クエリタンパク質のペアをとり、構造アラインメントを用いることにより、それらの実験的に決定された構造又は相同性モデルのいずれかに対応する代表的構造を同定することを含む。構造アラインメントは、大域的及び局所的幾何学関係を考慮することにより、近く及び遠くの両方の隣接構造を同定するのに更に用いられる。代表的構造の２つの隣接構造がタンパク質データバンクに報告されている複合体を形成する場合には常に、これが、２つのクエリタンパク質間の相互作用をモデル化するための鋳型を定義付ける。複合体のモデルは、鋳型内の対応する隣接構造上の代表的な構造を重ね合わせることにより作成される。この手法は、Ｄｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３（Ｐｒｏｔ Ｓｃｉ；２２：３５９−６６）にある。
植物及び酵母へのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の適用
定義：
一般に、用語「植物」は、細胞分裂によって特徴的に成長し、葉緑体を含有し、且つセルロースで構成された細胞壁を有する植物界（Ｐｌａｎｔａｅ）の任意の様々な光合成生物、真核生物、単細胞生物又は多細胞生物に関する。用語の植物には単子葉及び双子葉植物が包含される。具体的には、植物には、限定なしに、アカシア、アルファルファ、アマランス、リンゴ、アンズ、チョウセンアザミ、トネリコの木、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ類、テンサイ、カバノキ、ブナノキ、クロイチゴ、ブルーベリー、ブロッコリー、メキャベツ、キャベツ、キャノーラ、カンタループ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、ヒマラヤスギ、穀物、セロリ、クリ、サクランボ、ハクサイ、柑橘類、クレメンタイン、クローバ、コーヒー、トウモロコシ、ワタ、ササゲ、キュウリ、イトスギ、ナス、ニレ、エンダイブ、ユーカリ、ウイキョウ、イチジク、モミ、ゼラニウム、ブドウ、グレープフルーツ、ラッカセイ類、ホオズキ、ガムヘムロック（ｇｕｍ ｈｅｍｌｏｃｋ）、ヒッコリー、ケール、キーウィフルーツ、コールラビ、カラマツ、レタス、ニラ、レモン、ライム、ニセアカシア、マツ、メイデンヘア、トウモロコシ、マンゴー、カエデ、メロン、キビ、キノコ、カラシ、堅果類、オーク、オートムギ、油ヤシ、オクラ、タマネギ、オレンジ、観賞植物又は装飾花又は観賞樹、パパイヤ、ヤシ、パセリ、パースニップ、エンドウマメ、モモ、ピーナッツ、セイヨウナシ、ピート、コショウ、カキ、キマメ、マツ、パイナップル、オオバコ、セイヨウスモモ、ザクロ、ジャガイモ、カボチャ、赤チコリ、ダイコン、ナタネ、キイチゴ、コメ、ライムギ、モロコシ、ベニバナ、サルヤナギ、ダイズ、ホウレンソウ、エゾマツ、カボチャ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、スイートコーン、タンジェリン、茶、タバコ、トマト、樹木、ライ小麦、芝草、カブ、つる植物、クルミ、オランダガラシ、スイカ、コムギ、ヤムイモ、イチイ及びズッキーニなどの被子植物及び裸子植物が含まれることが意図される。用語の植物には、それらに根、葉及び高等植物を特徴付ける他の器官がないことによって主に統一された、大部分が光独立栄養生物である藻類も包含される。
本明細書に記載されるとおりのＲＮＡターゲティング系を使用した遺伝子発現の調節方法を使用して、本質的にいかなる植物にも所望の形質を付与することができる。本明細書に記載される所望の生理学的及び農学的特性について、本開示の核酸構築物及び上述の様々な形質転換方法を用いて多様な植物及び植物細胞系をエンジニアリングし得る。好ましい実施形態において、エンジニアリングの標的となる植物及び植物細胞としては、限定されないが、穀類作物（例えば、コムギ、トウモロコシ、コメ、キビ、オオムギ）、果実作物（例えば、トマト、リンゴ、セイヨウナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（例えば、アルファルファ）、根菜作物（例えば、ニンジン、ジャガイモ、サトウダイコン、ヤムイモ）、葉菜作物（例えば、レタス、ホウレンソウ）；顕花植物（例えば、ペチュニア、バラ、キク）、針葉樹及びマツの木（例えば、モミ、エゾマツ）；ファイトレメディエーションで用いられる植物（例えば、重金属蓄積植物）；油料作物（例えば、ヒマワリ、ナタネ）及び実験目的で用いられる植物（例えば、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ））を含めた作物など、単子葉及び双子葉植物が挙げられる。従って、本方法及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は広範囲の植物にわたり、例えばモクレン目（Ｍａｇｎｉｏｌａｌｅｓ）、シキミ目（Ｉｌｌｉｃｉａｌｅｓ）、クスノキ目（Ｌａｕｒａｌｅｓ）、コショウ目（Ｐｉｐｅｒａｌｅｓ）、ウマノスズクサ目（Ａｒｉｓｔｏｃｈｉａｌｅｓ）、スイレン目（Ｎｙｍｐｈａｅａｌｅｓ）、キンポウゲ目（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｌｅｓ）、ケシ目（Ｐａｐｅｖｅｒａｌｅｓ）、サラセニア科（Ｓａｒｒａｃｅｎｉａｃｅａｅ）、ヤマグルマ目（Ｔｒｏｃｈｏｄｅｎｄｒａｌｅｓ）、マンサク目（Ｈａｍａｍｅｌｉｄａｌｅｓ）、トチュウ目（Ｅｕｃｏｍｉａｌｅｓ）、レイトネリア目（Ｌｅｉｔｎｅｒｉａｌｅｓ）、ヤマモモ目（Ｍｙｒｉｃａｌｅｓ）、ブナ目（Ｆａｇａｌｅｓ）、モクマオウ目（Ｃａｓｕａｒｉｎａｌｅｓ）、ナデシコ目（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｌｅｓ）、バティス目（Ｂａｔａｌｅｓ）、タデ目（Ｐｏｌｙｇｏｎａｌｅｓ）、イソマツ目（Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｌｅｓ）、ビワモドキ目（Ｄｉｌｌｅｎｉａｌｅｓ）、ツバキ目（Ｔｈｅａｌｅｓ）、アオイ目（Ｍａｌｖａｌｅｓ）、イラクサ目（Ｕｒｔｉｃａｌｅｓ）、サガリバナ目（Ｌｅｃｙｔｈｉｄａｌｅｓ）、スミレ目（Ｖｉｏｌａｌｅｓ）、ヤナギ目（Ｓａｌｉｃａｌｅｓ）、フウチョウソウ目（Ｃａｐｐａｒａｌｅｓ）、ツツジ目（Ｅｒｉｃａｌｅｓ）、イワウメ目（Ｄｉａｐｅｎｓａｌｅｓ）、カキノキ目（Ｅｂｅｎａｌｅｓ）、サクラソウ目（Ｐｒｉｍｕｌａｌｅｓ）、バラ目（Ｒｏｓａｌｅｓ）、マメ目（Ｆａｂａｌｅｓ）、カワゴケソウ目（Ｐｏｄｏｓｔｅｍａｌｅｓ）、アリノトウグサ目（Ｈａｌｏｒａｇａｌｅｓ）、フトモモ目（Ｍｙｒｔａｌｅｓ）、ミズキ目（Ｃｏｒｎａｌｅｓ）、ヤマモガシ目（Ｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ビャクダン目（Ｓａｎ ｔａｌｅｓ）、ラフレシア目（Ｒａｆｆｌｅｓｉａｌｅｓ）、ニシキギ目（Ｃｅｌａｓｔｒａｌｅｓ）、トウダイグサ目（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｌｅｓ）、クロウメモドキ目（Ｒｈａｍｎａｌｅｓ）、ムクロジ目（Ｓａｐｉｎｄａｌｅｓ）、クルミ目（Ｊｕｇｌａｎｄａｌｅｓ）、フウロソウ目（Ｇｅｒａｎｉａｌｅｓ）、ヒメハギ目（Ｐｏｌｙｇａｌａｌｅｓ）、セリ目（Ｕｍｂｅｌｌａｌｅｓ）、リンドウ目（Ｇｅｎｔｉａｎａｌｅｓ）、ハナシノブ目（Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｌｅｓ）、シソ目（Ｌａｍｉａｌｅｓ）、オオバコ目（Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｌｅｓ）、ゴマノハグサ目（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｌｅｓ）、キキョウ目（Ｃａｍｐａｎｕｌａｌｅｓ）、アカネ目（Ｒｕｂｉａｌｅｓ）、マツムシソウ目（Ｄｉｐｓａｃａｌｅｓ）及びキク目（Ａｓｔｅｒａｌｅｓ）に属する双子葉植物などで用いることができる；本方法及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、オモダカ目（Ａｌｉｓｍａｔａｌｅｓ）、トチカガミ目（Ｈｙｄｒｏｃｈａｒｉｔａｌｅｓ）、イバラモ目（Ｎａｊａｄａｌｅｓ）、ホンゴウソウ目（Ｔｒｉｕｒｉｄａｌｅｓ）、ツユクサ目（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａｌｅｓ）、ホシクサ目（Ｅｒｉｏｃａｕｌａｌｅｓ）、サンアソウ目（Ｒｅｓｔｉｏｎａｌｅｓ）、イネ目（Ｐｏａｌｅｓ）、イグサ目（Ｊｕｎｃａｌｅｓ）、カヤツリグサ目（Ｃｙｐｅｒａｌｅｓ）、ガマ目（Ｔｙｐｈａｌｅｓ）、パイナップル目（Ｂｒｏｍｅｌｉａｌｅｓ）、ショウガ目（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ）、ヤシ目（Ａｒｅｃａｌｅｓ）、パナマソウ目（Ｃｙｃｌａｎｔｈａｌｅｓ）、タコノキ目（Ｐａｎｄａｎａｌｅｓ）、サトイモ目（Ａｒａｌｅｓ）、ユリ目（Ｌｉｌｌｉａｌｅｓ）及びラン目（Ｏｒｃｈｉｄ ａｌｅｓ）に属するものなどの単子葉植物又は裸子植物類（Ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍａｅ）に属する植物、例えばマツ目（Ｐｉｎａｌｅｓ）、イチョウ目（Ｇｉｎｋｇｏａｌｅｓ）、ソテツ目（Ｃｙｃａｄａｌｅｓ）、ナンヨウスギ目（Ａｒａｕｃａｒｉａｌｅｓ）、ヒノキ目（Ｃｕｐｒｅｓｓａｌｅｓ）及びグネツム目（Ｇｎｅｔａｌｅｓ）に属するもので用いることができる。
本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系及び使用方法は、以下の双子葉類、単子葉類又は裸子植物の属の非限定的なリストに含まれる広範囲にわたる植物種に用いることができる：オオカミナスビ属（Ａｔｒｏｐａ）、アルセオダフネ属（Ａｌｓｅｏｄａｐｈｎｅ）、カシューナットノキ属（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ）、ラッカセイ属（Ａｒａｃｈｉｓ）、ベイルシュミエディア属（Ｂｅｉｌｓｃｈｍｉｅｄｉａ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ベニバナ属（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ）、アオツヅラフジ属（Ｃｏｃｃｕｌｕｓ）、クロトン属（Ｃｒｏｔｏｎ）、ククミス属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）、スイカ属（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、ニチニチソウ属（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ）、ココヤシ属（Ｃｏｃｏｓ）、コーヒーノキ属（Ｃｏｆｆｅａ）、ククルビタ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、ニンジン属（Ｄａｕｃｕｓ）、ドゥグエティア属（Ｄｕｇｕｅｔｉａ）、ハナビシソウ属（Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｚｉａ）、イチジク属（Ｆｉｃｕｓ）、オランダイチゴ属（Ｆｒａｇａｒｉａ）、ツノゲシ属（Ｇｌａｕｃｉｕｍ）、ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、パラゴムノキ属（Ｈｅｖｅａ）、ヒヨス属（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、ランドルフィア属（Ｌａｎｄｏｌｐｈｉａ）、アマ属（Ｌｉｎｕｍ）、ハマビワ属（Ｌｉｔｓｅａ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、ルピナス属（Ｌｕｐｉｎｕｓ）、キャッサバ属（Ｍａｎｉｈｏｔ）、マジョラナ属（Ｍａｊｏｒａｎａ）、リンゴ属（Ｍａｌｕｓ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、オリーブ属（Ｏｌｅａ）、パルセニウム属（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、ケシ属（Ｐａｐａｖｅｒ）、ワニナシ属（Ｐｅｒｓｅａ）、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、カイノキ属（Ｐｉｓｔａｃｉａ）、エンドウ属（Ｐｉｓｕｍ）、ナシ属（Ｐｙｒｕｓ）、サクラ属（Ｐｒｕｎｕｓ）、ダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）、トウゴマ属（Ｒｉｃｉｎｕｓ）、キオン属（Ｓｅｎｅｃｉｏ）、ツヅラフジ属（Ｓｉｎｏｍｅｎｉｕｍ）、ハスノハカヅラ属（Ｓｔｅｐｈａｎｉａ）、シロガラシ属（Ｓｉｎａｐｉｓ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、カカオ属（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）、ジャジクソウ属（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）、フェヌグリーク属（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ）、ソラマメ属（Ｖｉｃｉａ）、ツルニチニチソウ属（Ｖｉｎｃａ）、ブドウ属（Ｖｉｌｉｓ）及びササゲ属（Ｖｉｇｎａ）；及びネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）、ウシクサ属（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ）、スズメガヤ属（Ａｒａｇｒｏｓｔｉｓ）、アスパラガス属（Ａｒａｇｒｏｓｔｉｓ）、カラスムギ属（Ａｖｅｎａ）、ギョウギシバ属（Ｃｙｎｏｄｏｎ）、アブラヤシ属（Ｅｌａｅｉｓ）、ウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）、フェストロリウム属（Ｆｅｓｔｕｌｏｌｉｕｍ）、ワスレグサ属（Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｌｉｓ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、アオウキクサ属（Ｌｅｍｎａ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、バショウ属（Ｍｕｓａ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、チカラシバ属（Ｐａｎｎｅｓｅｔｕｍ）、アワガエリ属（Ｐｈｌｅｕｍ）、イチゴツナギ属（Ｐｏａ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、トウモロコシ属（Ｚｅａ）、モミ属（Ａｂｉｅｓ）、コウヨウザン属（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉａ）、マオウ属（Ｅｐｈｅｄｒａ）、トウヒ属（Ｐｉｃｅａ）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）及びトガサワラ属（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ）。
ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系及び使用方法は、例えば、紅藻植物門（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）（紅藻類）、緑藻植物門（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）（緑藻類）、褐藻植物門（Ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）（褐藻類）、珪藻植物門（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ）（珪藻類）、真正眼点藻植物門（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ）及び渦鞭毛藻類を含む幾つかの真核生物の門並びに原核生物の門、藍色植物門（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）（藍藻類）から選択される藻類（ａｌｇｅａ）を含め、広範囲にわたる「藻類」又は「藻類細胞」にも用いることができる。用語「藻類」には、例えば、アンフォラ属（Ａｍｐｈｏｒａ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、アンキストロデスムス属（Ａｎｉｋｓｔｒｏｄｅｓｍｉｓ）、ボトリオコッカス属（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）、キートケロス属（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）、クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、クロロコックム属（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）、キクロテラ属（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、シリンドロテカ属（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ）、ドナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、エミリアニア属（Ｅｍｉｌｉａｎａ）、ユーグレナ属（Ｅｕｇｌｅｎａ）、ヘマトコッカス属（Ｈｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、イソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）、モノクリシス属（Ｍｏｎｏｃｈｒｙｓｉｓ）、モノラフィディウム属（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）、ナンノクロリス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ナンノクロロプシス属（Ｎａｎｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、フナガタケイソウ属（Ｎａｖｉｃｕｌａ）、ネフロクロリス属（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ネフロセルミス属（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）、ニッチア属（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、ノドゥラリア属（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ）、ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ）、オクロモナス属（Ｏｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）、オオキスティス属（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）、オシラトリア属（Ｏｓｃｉｌｌａｒｔｏｒｉａ）、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ）、フェオダクチラム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）、プラチモナス属（Ｐｌａｙｔｍｏｎａｓ）、プレウロクリシス属（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）、アマノリ属（Ｐｏｒｈｙｒａ）、シュードアナベナ属（Ｐｓｅｕｄｏａｎａｂａｅｎａ）、ピラミモナス属（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）、スチココッカス属（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、テトラセルミス属（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）、タラシオシラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）及びアイアカシオ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ）から選択される藻類が含まれる。
植物の一部、即ち「植物組織」を本発明の方法に従い処理して改良された植物を作り出し得る。植物組織は植物細胞も包含する。用語「植物細胞」は、本明細書で使用されるとき、インタクトな全植物であるか、或いはインビトロ組織培養下に培地又は寒天上で、成長培地又は緩衝液中の懸濁液中で、又は高度に組織化された単位、例えば植物組織、植物器官又は全植物などの一部として成長した単離された形態であるかのいずれかの、生きている植物の個々の単位を指す。
「プロトプラスト」は、その細胞壁を再形成し、増殖し及び再生して適切な成長条件下で全植物に成長することのできる生きている植物のインタクトな生化学的にコンピテントな単位をもたらす機械的又は酵素的手段を例えば用いてその保護細胞壁が完全に又は部分的に除去された植物細胞を指す。
用語「形質転換」は、広義には、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）又は種々の化学的若しくは物理的方法の１つを用いたＤＮＡの導入によって植物宿主が遺伝子改変される方法を指す。本明細書で使用されるとき、用語「植物宿主」は、植物の任意の細胞、組織、器官又は子孫を含め、植物を指す。多くの好適な植物組織又は植物細胞を形質転換することができ、限定されないが、プロトプラスト、体細胞胚、花粉、葉、実生、茎、カルス、走根、微小管及び苗条が挙げられる。植物組織は、有性生殖的に生成されたか、それとも無性生殖的に生成されたかに関わらず、かかる植物、種子、子孫、ムカゴの任意のクローン及び挿し木又は種子など、これらのいずれかの子孫も指す。
用語「形質転換された」は、本明細書で使用されるとき、構築物などの外来性ＤＮＡ分子が導入されている細胞、組織、器官又は生物を指す。導入されたＤＮＡ分子は、導入されたＤＮＡ分子が後続の子孫に伝わるようにレシピエント細胞、組織、器官又は生物のゲノムＤＮＡに組み込まれ得る。これらの実施形態において、「形質転換」又は「トランスジェニック」細胞又は植物には、その細胞又は植物の子孫及び交雑でかかる形質転換植物を親として用いる育種計画から作り出された、且つ導入されたＤＮＡ分子の存在によって生じる表現型の変化を呈する子孫も含まれ得る。好ましくは、トランスジェニック植物は稔性であり、導入されたＤＮＡを、有性生殖を通じて子孫に伝えることが可能である。
トランスジェニック植物の子孫など、用語「子孫」は、植物又はトランスジェニック植物から生まれるか、それから作り出されたか又はそれに由来するものである。導入ＤＮＡ分子は、レシピエント細胞に一過性にも導入され得、そのため導入ＤＮＡ分子は後続の子孫によって受け継がれないことになり、従って「トランスジェニック」とは見なされない。従って、本明細書で使用されるとき、「非トランスジェニック」植物又は植物細胞は、そのゲノムに安定に組み込まれた外来ＤＮＡを含有しない植物である。
用語「植物プロモーター」は、本明細書で使用されるとき、その起源が植物細胞であるか否かに関わらず、植物細胞において転写を開始させる能力を有するプロモーターである。例示的な適した植物プロモーターとしては、限定されないが、植物、植物ウイルス及び植物細胞で発現する遺伝子を含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はリゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などの細菌から得られるものが挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「真菌細胞」は、真菌類の界内にある任意の種類の真核細胞を指す。真菌類の界内にある門としては、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、コウマクノウキン門（Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、グロムス門（Ｇｌｏｍｅｒｏｍｙｃｏｔａ）、微胞子虫門（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）及びネオカリマスティクス門（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｇｏｍｙｃｏｔａ）が挙げられる。真菌細胞には、酵母、カビ及び糸状菌類が含まれ得る。一部の実施形態において、真菌細胞は酵母細胞である。
本明細書で使用されるとき、用語「酵母細胞」は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）及び担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）の範囲内にある任意の真菌細胞を指す。酵母細胞には、出芽酵母細胞、分裂酵母細胞及びカビ細胞が含まれ得る。これらの生物に限定されないが、研究室及び工業環境で使用される多くの種類の酵母が、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）の一部である。一部の実施形態において、酵母細胞はＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｒｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス・マルクシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）又はイサチェンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）細胞である。他の酵母細胞としては、限定なしに、カンジダ属種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）（例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ））、ヤロウイア属種（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐｐ．）（例えば、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））、ピキア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ））、クルイベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）（例えば、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）及びクルイベロミセス・マルクシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ））、アカパンカビ属種（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）（例えば、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ））、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．）（例えば、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ））及びイサチェンキア属種（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｓｐｐ．）（例えば、イサチェンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、別名ピキア・クドリャフツェフィイ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）及びカンジダ・アシドサーモフィルム（Ｃａｎｄｉｄａ ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ））を挙げることができる。一部の実施形態において、真菌細胞は糸状菌細胞である。本明細書で使用されるとき、用語「糸状菌細胞」は、フィラメント状に、即ち菌糸又は菌糸体として成長する任意の種類の真菌細胞を指す。糸状菌細胞の例としては、限定なしに、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）（例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ））、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）（例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ））、リゾプス属種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ．）（例えば、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ））及びモルティエレラ属種（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ．）（例えば、モルティエレラ・イザベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ））を挙げることができる。
一部の実施形態において、真菌細胞は、工業用菌株である。本明細書で使用されるとき、「工業用菌株」は、工業的プロセス、例えば商業的又は工業的規模での製品の生産において使用されるか又はそれから単離される真菌細胞の任意の株を指す。工業用菌株は、典型的に工業的プロセスで使用される真菌種を指し得、又はそれは、非工業目的（例えば、実験研究）にも使用され得る真菌種の分離株を指し得る。工業的プロセスの例としては、発酵（例えば、食品又は飲料製品の生産における）、蒸留、バイオ燃料生産、化合物の生産及びポリペプチドの生産を挙げることができる。工業用菌株の例としては、限定なしに、ＪＡＹ２７０及びＡＴＣＣ４１２４を挙げることができる。
一部の実施形態において、真菌細胞は、倍数体細胞である。本明細書で使用されるとき、「倍数体」細胞は、ゲノムが２つ以上のコピーで存在する任意の細胞を指し得る。倍数体細胞は、天然で倍数体状態において見られる種類の細胞を指し得、又はそれは、倍数体状態で存在するように（例えば、減数分裂、細胞質分裂又はＤＮＡ複製の特異的な調節、変化、不活性化、活性化又は改変によって）誘導された細胞を指し得る。倍数体細胞は、ゲノム全体が倍数体である細胞を指し得、又はそれは、特定の目的のゲノム遺伝子座において倍数体である細胞を指し得る。理論に拘束されることを望むものではないが、一倍体細胞と比べて倍数体細胞のゲノムエンジニアリングではガイドＲＮＡの存在量が律速成分となることが多くなり得るため、本明細書に記載されるＣａｓ１３ｂ ＣＲＩＳＰＲ系を用いた方法は特定の真菌細胞タイプの使用を生かし得ると考えられる。
一部の実施形態において、真菌細胞は、二倍体細胞である。本明細書で使用されるとき、「二倍体」細胞は、ゲノムが２つのコピーで存在する任意の細胞を指し得る。二倍体細胞は、天然で二倍体状態において見られる種類の細胞を指し得、又はそれは、二倍体状態で存在するように（例えば、減数分裂、細胞質分裂又はＤＮＡ複製の特異的な調節、変化、不活性化、活性化又は改変によって）誘導された細胞を指し得る。例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ｓ２２８Ｃは、一倍体又は二倍体状態で維持され得る。二倍体細胞は、ゲノム全体が二倍体である細胞を指し得、又はそれは、特定の目的のゲノム遺伝子座において二倍体である細胞を指し得る。一部の実施形態において、真菌細胞は、一倍体細胞である。本明細書で使用されるとき、「一倍体」細胞は、ゲノムが１つのコピーで存在する任意の細胞を指し得る。一倍体細胞は、天然で一倍体状態において見られる種類の細胞を指し得、又はそれは、一倍体状態で存在するように（例えば、減数分裂、細胞質分裂又はＤＮＡ複製の特異的な調節、変化、不活性化、活性化又は改変によって）誘導された細胞を指し得る。例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ｓ２２８Ｃは、一倍体又は二倍体状態で維持され得る。一倍体細胞は、ゲノム全体が一倍体である細胞を指し得、又はそれは、特定の目的のゲノム遺伝子座において一倍体である細胞を指し得る。
本明細書で使用されるとき、「酵母発現ベクター」は、ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードする１つ以上の配列を含有する核酸であって、且つその核酸の発現を制御する任意の所望のエレメント並びに酵母細胞内部における発現ベクターの複製及び維持を可能にする任意のエレメントを更に含有し得る核酸を指す。多くの好適な酵母発現ベクター及びそれらの特徴が当該技術分野において公知である；例えば、様々なベクター及び技法が、Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｘｉａｏ，Ｗ．，ｅｄ．（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００７）及びＢｕｃｋｈｏｌｚ，Ｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｇｌｅｅｓｏｎ，Ｍ．Ａ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９（１１）：１０６７−７２に例示されている。酵母ベクターは、限定なしに、セントロメア（ＣＥＮ）配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、目的の配列又は遺伝子に作動可能に連結されるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーターなどのターミネーター、複製起点及びマーカー遺伝子（例えば、栄養要求体、抗生物質又は他の選択可能マーカー）を含有し得る。酵母において用いられる発現ベクターの例としては、プラスミド、酵母人工染色体、２μプラスミド、酵母組込みプラスミド、酵母複製プラスミド、シャトルベクター及びエピソームプラスミドを挙げることができる。
植物及び植物細胞のゲノムにおけるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰ系構成成分の安定組込み
詳細な実施形態では、植物細胞のゲノムへの安定組込みのためＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の構成成分をコードするポリヌクレオチドを導入することが想定される。これらの実施形態において、形質転換ベクター又は発現系の設計は、いつ、どこで及びどのような条件下でガイドＲＮＡ及び／又はＲＮＡターゲティング遺伝子を発現させるかに応じて調整することができる。
詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の構成成分を植物細胞のゲノムＤＮＡに安定に導入することが想定される。それに加えて又は代えて、限定されないが、プラスチド、ミトコンドリア又は葉緑体などの植物細胞小器官のＤＮＡへの安定組込みのためＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の構成成分を導入することが想定される。
植物細胞のゲノムに安定に組み込むための発現系は、以下のエレメントの１つ以上を含有し得る：植物細胞においてガイドＲＮＡ及び／又はＲＮＡターゲティング酵素を発現させるために使用し得るプロモーターエレメント；発現を増強する５’非翻訳領域；単子葉植物細胞など、特定の細胞における発現を更に増強するイントロンエレメント；１つ以上のガイドＲＮＡ及び／又はＲＮＡターゲティング遺伝子配列及び他の所望のエレメントを挿入するのに好都合な制限部位を提供する多クローニング部位；及び発現した転写物の効率的な終結をもたらす３’非翻訳領域。
発現系のエレメントは、プラスミド又は形質転換ベクターのように環状又は線状二本鎖ＤＮＡのように非環状のいずれかである１つ以上の発現構築物上にあり得る。
詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ発現系は、少なくとも：
（ａ）植物の標的配列とハイブリダイズするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、ガイド配列とダイレクトリピート配列とを含むガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及び
（ｂ）ＲＮＡターゲティングタンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含み、
ここで、構成成分（ａ）又は（ｂ）は同じ又は異なる構築物上に位置し、及びこれによって異なるヌクレオチド配列が、植物細胞において作動可能な同じ又は異なる調節エレメントの制御下にあることができる。
ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の構成成分を含有するＤＮＡ構築物は、種々の従来技術によって植物、植物部位又は植物細胞のゲノムに導入し得る。このプロセスには、概して、好適な宿主細胞又は宿主組織を選択するステップ、宿主細胞又は宿主組織に構築物を導入するステップ及びそれから植物細胞又は植物を再生するステップが含まれる。
詳細な実施形態では、ＤＮＡ構築物は、限定されないが、電気穿孔、マイクロインジェクション、植物細胞プロトプラストのエアロゾルビーム注入などの技法を用いて植物細胞に導入され得、又はＤＮＡ構築物は、ＤＮＡパーティクルボンバードメントなどの微粒子銃法を用いて植物組織に直接導入され得る（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．２０００ Ｆｅｂ；９（１）：１１−９も参照されたい）。パーティクルボンバードメントの基本は、目的の遺伝子で被覆された粒子を細胞に向けて加速させることにより粒子を原形質に侵入させて、典型的にはゲノムへの安定組込みを得るというものである（例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）、Ｃａｓａｓ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）を参照されたい）。
詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の構成成分を含有するＤＮＡ構築物は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換によって植物に導入し得る。ＤＮＡ構築物を好適なＴ−ＤＮＡフランキング領域と組み合わせて、従来のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）宿主ベクターに導入し得る。外来ＤＮＡは、植物を感染させることによるか、又は植物プロトプラストを、１つ以上のＴｉ（腫瘍誘発）プラスミドを含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌と共にインキュベートすることにより、植物のゲノムに取り入れることができる（例えば、Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８５），Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）及び米国特許第５，５６３，０５５号明細書を参照されたい）。
植物プロモーター
植物細胞における適切な発現を確実にするため、本明細書に記載されるＣａｓ１３ｂ ＣＲＩＳＰＲ系の構成成分は、典型的には植物プロモーター、即ち植物細胞において作動可能なプロモーターの制御下に置かれる。様々な種類のプロモーターの使用が想定される。
構成的植物プロモーターは、それが制御するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を植物の全て又はほぼ全ての発生段階において全て又はほぼ全ての植物組織で発現（「構成的発現」と称される）させることが可能なプロモーターである。構成的プロモーターの非限定的な１つの例はカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターである。本発明は、ＲＮＡ配列の改変方法を想定し、そのため植物生体分子の発現を調節することも想定する。従って、本発明の詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントを調節型であり得るプロモーターの制御下に置くことが有利である。「調節型プロモーター」は、構成的でないものの時間的及び／又は空間的に調節された形で遺伝子発現を導くプロモーターを指し、組織特異的、組織優先的及び誘導性プロモーターが含まれる。異なるプロモーターは、異なる組織又は細胞型において、又は異なる発生段階で、又は異なる環境条件に応答して遺伝子の発現を導き得る。詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ構成成分の１つ以上がカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターなどの構成的プロモーターの制御下で発現し、組織優先的プロモーターを利用することにより、特定の植物組織内のある種の細胞型、例えば葉又は根の維管束細胞又は種子の特異的細胞における発現の増強を標的化することができる。ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系において用いられる詳細なプロモーターの例については、Ｋａｗａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３８：７９２−８０３；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｊ １２：２５５−６５；Ｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ，（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０：２０７−１８、Ｋｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９：７５９−７２及びＣａｐａｎａ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５：６８１−９１が参照される。誘導性で、且つ遺伝子編集又は遺伝子発現の時空間的制御を可能にするプロモーターの例は、ある形態のエネルギーを使用し得る。エネルギーの形態としては、限定されないが、音響エネルギー、電磁放射線、化学エネルギー及び／又は熱エネルギーを挙げることができる。誘導性系の例としては、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆ）、小分子ツーハイブリッド転写活性化システム（ＦＫＢＰ、ＡＢＡ等）又は光誘導性系（フィトクロム、ＬＯＶドメイン又はクリプトクロム）、例えば転写活性の配列特異的変化を導く光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）が挙げられる。光誘導性系の構成成分には、ＲＮＡターゲティングＣａｓ１３ｂ、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来）及び転写活性化／抑制ドメインが含まれ得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及びその使用方法の更なる例が、米国仮特許出願第６１／７３６４６５号明細書及び米国仮特許出願第６１／７２１，２８３号明細書（本明細書によって全体として参照により援用される）に提供される。
詳細な実施形態では、例えば化学物質調節型プロモーターを使用して一過性又は誘導性発現を実現することができ、即ちこれによれば外因性化学物質を加えると遺伝子発現が誘導される。遺伝子発現の調節は、化学物質抑制性プロモーターによっても達成することができ、ここで、化学物質を加えると遺伝子発現が抑制される。化学物質誘導性プロモーターとしては、限定されないが、ベンゼンスルホンアミド系除草剤解毒剤によって活性化するトウモロコシｌｎ２−２プロモーター（Ｄｅ Ｖｅｙｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３８：５６８−７７）、発芽前除草剤として使用される疎水性求電子化合物によって活性化するトウモロコシＧＳＴプロモーター（ＧＳＴ−ＩＩ−２７、国際公開第９３／０１２９４号パンフレット）及びサリチル酸によって活性化するタバコＰＲ−１ａプロモーター（Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６８：８０３−７）が挙げられる。テトラサイクリン誘導性及びテトラサイクリン抑制性プロモーターなど、抗生物質によって調節されるプロモーター（Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２２７：２２９−３７；米国特許第５，８１４，６１８号明細書及び同第５，７８９，１５６号明細書）も本明細書において使用することができる。
特定の植物細胞小器官における移行及び／又はそこでの発現
発現系は、特定の植物細胞小器官への移行及び／又はそこでの発現のためのエレメントを含み得る。
葉緑体ターゲティング
詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系を使用して葉緑体遺伝子の発現及び／又は翻訳を特異的に改変するか、又は葉緑体での発現を確実にすることが想定される。この目的で、葉緑体形質転換方法又はＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ構成成分の葉緑体への区画化が用いられる。例えば、プラスチドゲノムに遺伝子改変を導入すると、花粉を通じた遺伝子流動などのバイオセーフティ問題を軽減することができる。
葉緑体形質転換方法は、当該技術分野において公知であり、パーティクルボンバードメント、ＰＥＧ処理及びマイクロインジェクションが挙げられる。加えて、国際公開第２０１００６１１８６号パンフレットに記載されるとおり、核ゲノムからプラスチドへの形質転換カセットの移行が関わる方法を用いることができる。
或いは、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ構成成分の１つ以上を植物葉緑体に標的化することが想定される。これは、ＲＮＡターゲティングタンパク質をコードする配列の５’領域に作動可能に連結された、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）又はプラスチド輸送ペプチドをコードする配列を発現構築物に取り込むことにより実現する。ＣＴＰは葉緑体への移行中にプロセシング段階で除去される。発現タンパク質の葉緑体ターゲティングは当業者に周知である（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎｔｏ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ，２０１０，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６１：１５７−１８０を参照されたい）。かかる実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡを植物葉緑体に標的化することも望ましい。葉緑体局在化配列を用いてガイドＲＮＡを葉緑体に移行させるために用いることのできる方法及び構築物については、例えば、米国特許出願公開第２００４０１４２４７６号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されている。かかる各種構築物を本発明の発現系に取り込むことにより、ＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡを効率的に移行させることができる。
藻類細胞におけるＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡターゲティング系をコードするポリヌクレオチドの導入
トランスジェニック藻類（又はセイヨウアブラナなどの他の植物）は、植物油又はバイオ燃料、例えばアルコール類（特にメタノール及びエタノール）又は他の生産物の生産に特に有用であり得る。これらは、油又はバイオ燃料産業で使用される高レベルの油又はアルコールを発現又は過剰発現するようにエンジニアリングされ得る。
米国特許第８９４５８３９号明細書は、Ｃａｓ９を用いた微細藻類（コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）細胞）種）のエンジニアリング方法について記載している。同様のツールを使用して、本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の方法をクラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）種及び他の藻類に適用することができる。詳細な実施形態では、Ｈｓｐ７０Ａ−Ｒｂｃ Ｓ２又はβ２−チューブリンなどの構成的プロモーターの制御下でＲＮＡターゲティングタンパク質を発現するベクターを使用して藻類にＲＮＡターゲティングタンパク質及びガイドＲＮＡを導入し、発現させる。ガイドＲＮＡは、任意選択で、Ｔ７プロモーターを含有するベクターを使用して送達される。或いは、藻類細胞にＲＮＡターゲティングｍＲＮＡ及びインビトロ転写ガイドＲＮＡが送達され得る。当業者には、ＧｅｎｅＡｒｔクラミドモナスエンジニアリングキットからの標準的な推奨プロトコルなど、電気穿孔プロトコルが利用可能である。
酵母細胞におけるＲＮＡターゲティング構成成分をコードするポリヌクレオチドの導入
詳細な実施形態では、本発明は、酵母細胞におけるＲＮＡ編集のためのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用に関する。ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系構成成分をコードするポリヌクレオチドの導入に用いることのできる酵母細胞の形質転換方法は当業者に周知であり、Ｋａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｅｎｇ Ｂｕｇｓ．２０１０ Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；１（６）：３９５−４０３）によってレビューされている。非限定的な例としては、酢酸リチウム処理による酵母細胞の形質転換（これはキャリアＤＮＡ及びＰＥＧ処理を更に含み得る）、ボンバードメント又は電気穿孔によるものが挙げられる。
植物及び植物細胞におけるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰ系構成成分の一過性発現
詳細な実施形態では、ガイドＲＮＡ及び／又はＲＮＡターゲティング遺伝子を植物細胞において一過性に発現させることが想定される。これらの実施形態では、細胞内にガイドＲＮＡ及びＲＮＡターゲティングタンパク質の両方が存在するときに限りＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系がＲＮＡ標的分子を改変することが確実となり、従って遺伝子発現を更に制御することができる。ＲＮＡターゲティング酵素の発現は、一過性であるため、かかる植物細胞から再生した植物は、典型的には外来ＤＮＡを含有しない。詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティング酵素は、植物細胞によって安定に発現し、ガイド配列が一過性に発現する。
特に好ましい実施形態において、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系構成成分は、植物ウイルスベクターを使用して植物細胞に導入することができる（Ｓｃｈｏｌｔｈｏｆ ｅｔ ａｌ．１９９６，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．１９９６；３４：２９９−３２３）。更なる詳細な実施形態では、前記ウイルスベクターは、ＤＮＡウイルス由来のベクターである。例えば、ジェミニウイルス（例えば、キャベツ巻葉ウイルス、マメ萎黄ウイルス、コムギ萎縮ウイルス、トマト巻葉ウイルス、トウモロコシ条斑ウイルス、タバコ巻葉ウイルス又はトマトゴールデンモザイクウイルス）又はナノウイルス（例えば、ソラマメ黄化えそウイルス）。他の詳細な実施形態では、前記ウイルスベクターはＲＮＡウイルス由来のベクターである。例えば、トブラウイルス（例えば、タバコ茎えそウイルス、タバコモザイクウイルス）、ポテックスウイルス（例えば、ジャガイモＸウイルス）又はホルデイウイルス（例えば、ムギ斑葉モザイクウイルス）。植物ウイルスの複製ゲノムは非組込みベクターであり、これはＧＭＯ植物の作製の回避との関連で有利である。
詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ構築物の一過性発現に使用されるベクターは、例えば、ｐＥＡＱベクターであり、これはプロトプラストにおけるアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性一過性発現に合わせて調整されているものである（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．２００９ Ｓｅｐ；７（７）：６８２−９３）。Ｃａｓ１３ｂを発現する安定トランスジェニック植物において改変キャベツ巻葉ウイルス（ＣａＬＣｕＶ）ベクターを使用してｇＲＮＡを発現させた、ゲノム位置の正確なターゲティングが実証された（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１４９２６（２０１５），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１４９２６を参照されたい）。
詳細な実施形態では、ガイドＲＮＡ若しくはｃｒＲＮＡ及び／又はＲＮＡターゲティング遺伝子をコードする二本鎖ＤＮＡ断片を植物細胞に一過性に導入することができる。かかる実施形態において、導入される二本鎖ＤＮＡ断片は、細胞においてＲＮＡ分子を改変するのに十分な、しかし企図された時間が経った後又は１回以上の細胞分裂後に残らない量で提供される。植物においてＤＮＡトランスファーを導く方法は当業者に公知である（例えば、Ｄａｖｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９８９ Ｓｅｐ；１３（３）：２７３−８５を参照されたい）
他の実施形態では、ＲＮＡターゲティングタンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドが、ＲＮＡ分子細胞を（少なくとも１つのガイドＲＮＡの存在下で）改変するのに十分な、しかし企図された時間が経った後又は１回以上の細胞分裂後に残らない量で植物細胞に導入され、次に、これが宿主細胞によって翻訳及びプロセシングされて、タンパク質が生成される。植物プロトプラストにｍＲＮＡを一過性発現のため導入する方法は当業者に公知である（例えば、Ｇａｌｌｉｅ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９９３），１３；１１９−１２２を参照されたい）。上記に記載される異なる方法の組み合わせも想定される。
植物細胞へのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ構成成分の送達
詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上の構成成分を植物細胞に直接送達することが有益である。これは特に、非トランスジェニック植物の作成に有益である。詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティング構成成分の１つ以上が植物又は植物細胞の外部で調製され、細胞に送達される。例えば、詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングタンパク質がインビトロで調製された後、植物細胞に導入される。ＲＮＡターゲティングタンパク質は当業者に公知の、組換え産生を含めた様々な方法によって調製することができる。発現後、ＲＮＡターゲティングタンパク質が単離され、必要に応じてリフォールディングされ、精製され、且つ任意選択でＨｉｓタグなどの任意の精製タグを除去するため処理される。粗製の、部分的に精製された又はより完全に精製されたＲＮＡターゲティングタンパク質が得られると、そのタンパク質が植物細胞に導入され得る。
詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングタンパク質が、目的のＲＮＡを標的とするガイドＲＮＡと混合されて、予めアセンブルされたリボ核タンパク質が形成される。
個々の構成成分又は予めアセンブルされたリボ核タンパク質は、電気穿孔を用いるか、ＲＮＡターゲティング関連遺伝子産物で被覆した粒子のボンバードメントによるか、化学的トランスフェクションによるか、又は細胞膜を越えて輸送する他の何らかの手段によって植物細胞に導入することができる。例えば、予めアセンブルされたＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質による植物プロトプラストのトランスフェクションは、植物ゲノムの標的化した改変を確実にすることが実証されている（Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５；ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３３８９による記載のとおり）。これらの方法を修正して、植物におけるＲＮＡ分子の標的化した改変を実現することができる。
詳細な実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系構成成分は、ナノ粒子を用いて植物細胞に導入される。構成成分は、タンパク質又は核酸のいずれとしても、或いはそれらの組み合わせでも、ナノ粒子上にアップロードするか又はそれにパッケージングして植物に適用することができる（例えば、国際公開第２００８０４２１５６号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１３０１８５８２３号明細書の記載など）。詳細には、本発明の実施形態は、国際公開第２０１５０８９４１９号パンフレットに記載されるとおり、ＲＮＡターゲティングタンパク質をコードするＤＮＡ分子、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子及び／又は単離ガイドＲＮＡがアップロード又はパッケージングされたナノ粒子を含む。
ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上の構成成分を植物細胞に導入する更なる手段は、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を用いることによるものである。従って、詳細には、本発明の実施形態は、ＲＮＡターゲティングタンパク質に連結された細胞透過性ペプチドを含む組成物を含む。本発明の詳細な実施形態において、ＲＮＡターゲティングタンパク質及び／又はガイドＲＮＡは、それらを植物プロトプラストの内部に有効に輸送するため１つ以上のＣＰＰにカップリングされる（ヒト細胞におけるＣａｓ９については、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ（２０１４ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１４ Ｊｕｎ；２４（６）：１０２０−７）。他の実施形態において、ＲＮＡターゲティング遺伝子及び／又はガイドＲＮＡは、植物プロトプラスト送達のため１つ以上のＣＰＰにカップリングされた１つ以上の環状又は非環状ＤＮＡ分子によってコードされる。次に、植物プロトプラストは、植物細胞及び更に植物に再生される。ＣＰＰは、概して、生体分子を、受容体非依存的に細胞膜を越えて輸送する能力を有するタンパク質又はキメラ配列のいずれかに由来する３５アミノ酸未満の短鎖ペプチドとして記載される。ＣＰＰは、カチオン性ペプチド、疎水性配列を有するペプチド、両親媒性ペプチド、プロリンリッチな抗微生物性の配列を有するペプチド及びキメラ又は二部ペプチドであり得る（Ｐｏｏｇａ ａｎｄ Ｌａｎｇｅｌ ２００５）。ＣＰＰは生体膜を透過することが可能であり、そのため様々な生体分子の細胞膜を越えて細胞質に入る移動を引き起こし、且つそれらの細胞内輸送を改善することが可能であり、従って生体分子と標的の相互作用を促進する。ＣＰＰの例としては、中でも特に、ＨＩＶ １型によるウイルス複製に必要な核内転写活性化タンパク質であるＴａｔ、ペネトラチン、カポジ線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナルペプチド配列、インテグリンβ３シグナルペプチド配列；ポリアルギニンペプチドＡｒｇ配列、グアニンリッチ分子輸送体、スイートアローペプチド等が挙げられる。
植物、藻類又は真菌適用が想定される標的ＲＮＡ
標的ＲＮＡ、即ち目的のＲＮＡは、本発明によって標的化されるＲＮＡであり、標的ＲＮＡ上の目的の標的部位へのＲＮＡターゲティングタンパク質の動員及びそこにおける結合につながる。標的ＲＮＡは、任意の好適な形態のＲＮＡであり得る。これには、一部の実施形態では、ｍＲＮＡが含まれ得る。他の実施形態では、標的ＲＮＡにはトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）又はリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）が含まれ得る。他の実施形態では、標的ＲＮＡには、干渉性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、マイクロスイッチ、マイクロザイム、サテライトＲＮＡ及びＲＮＡウイルスが含まれ得る。標的ＲＮＡは植物細胞の細胞質に、又は細胞核に、又はミトコンドリア、葉緑体若しくはプラスチドなどの植物細胞小器官に位置し得る。
詳細な実施形態において、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系を使用してＲＮＡが切断され、又は他にＲＮＡ発現が阻害される。
ＲＮＡ調節による植物遺伝子発現の調節のためのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用
ＲＮＡターゲティングタンパク質は、好適なガイドＲＮＡと共に、ＲＮＡプロセシングの制御による遺伝子発現のターゲティングにも使用され得る。ＲＮＡプロセシングの制御には、選択的スプライシングを含めたＲＮＡスプライシング；ウイルス複製（詳細には、植物のウイロイドを含めた植物ウイルスのもの及びｔＲＮＡ生合成などのＲＮＡプロセシング反応が含まれ得る。好適なガイドＲＮＡと組み合わせたＲＮＡターゲティングタンパク質は、ＲＮＡ活性化（ＲＮＡａ）の制御にも使用され得る。ＲＮＡａは遺伝子発現の促進につながり、そのため遺伝子発現の制御はＲＮＡａの破壊又は低減、従って遺伝子発現の促進低下による形で実現し得る。
本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、更に、植物における、特にＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス活性に使用することができる。エフェクタータンパク質は、選択のウイルスＲＮＡ配列に選択的な好適なガイドＲＮＡを使用してウイルスＲＮＡに標的化することができる。詳細には、エフェクタータンパク質は、一本鎖ＲＮＡなど、ＲＮＡを切断する活性ヌクレアーゼであり得る。従って、抗ウイルス剤としての本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の使用が提供される。このように拮抗し得るウイルスの例としては、限定されないが、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トマト黄化えそウイルス（ＴＳＷＶ）、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）、ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）（ＲＴウイルス）、プラムポックスウイルス（ＰＰＶ）、ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）及びジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）が挙げられる。
標的遺伝子改変の代替手段としての、植物、藻類又は真菌におけるＲＮＡ発現の調節の例は、本明細書に更に記載される。
特に、調節されたｍＲＮＡ切断による調節された遺伝子発現制御が興味深い。これは、ＲＮＡターゲティングのエレメントを本明細書に記載されるとおりの調節型プロモーターの制御下に置くことにより実現し得る。
ｔＲＮＡ分子の機能を回復させるためのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用
Ｐｒｉｎｇ ｅｔ ａｌが、ＤＮＡと異なるタンパク質をコードするようにｍＲＮＡ配列を変化させる植物ミトコンドリア及び葉緑体におけるＲＮＡ編集について記載している。（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９３）２１（６）：１１６３−１１７０．ｄｏｉ：１０．１００７／ＢＦ０００２３６１１）。本発明の詳細な実施形態において、ミトコンドリア及び葉緑体ｍＲＮＡを特異的に標的化するＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系のエレメントを植物又は植物細胞に導入することにより、かかる植物細胞小器官で異なるタンパク質を発現させて、インビボで起こる過程を模倣することができる。
ＲＮＡ発現を阻害するためのＲＮＡ干渉の代替手段としてのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用
ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系は、ＲＮＡ阻害又はＲＮＡ干渉と同様の用途があり、従ってかかる方法に代えることもできる。詳細な実施形態において、本発明の方法は、例えば、干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ又はｄｓＲＮＡなど）の代わりとしてのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲの使用を含む。標的遺伝子改変の代替手段としての植物、藻類又は真菌におけるＲＮＡ発現の阻害の例は、本明細書に更に記載される。
ＲＮＡ干渉を制御するためのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用
干渉性ＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの制御は、インビボ又はインビトロで干渉性ＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの寿命を短縮することによる手法で見られるオフターゲット効果（ＯＴＥ）を低減することを促進し得る。詳細な実施形態において、標的ＲＮＡには干渉性ＲＮＡ、即ちＲＮＡ干渉経路に関与するＲＮＡ、例えばｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどが含まれ得る。他の実施形態において、標的ＲＮＡにはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が含まれ得る。
他の詳細な実施形態において、ＲＮＡターゲティングタンパク質及び好適なガイドＲＮＡが（例えば、空間的又は時間的に調節型プロモーター、例えば組織特異的又は細胞周期特異的プロモーター及び／又はエンハンサーの制御下で）選択的に発現する場合、これを用いて細胞又は系を（インビボ又はインビトロで）その細胞におけるＲＮＡｉから「保護」することができる。これは、ＲＮＡｉが必要ない隣接組織又は細胞において、又はエフェクタータンパク質及び好適なガイドが発現する及び発現しない（即ちそれぞれＲＮＡｉが制御されない及びそれが制御される）細胞又は組織を比較する目的で有用であり得る。ＲＮＡターゲティングタンパク質を使用して、リボザイム、リボソーム又はリボスイッチなど、ＲＮＡを含む又はそれからなる分子を制御するか又はそれに結合し得る。本発明の実施形態では、ガイドＲＮＡがＲＮＡターゲティングタンパク質をそうした分子に動員することにより、ＲＮＡターゲティングタンパク質はそれらに結合することが可能になる。
本発明のＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系は、本願がこの系を情報に基づいてエンジニアリングするための基礎を提供するため、本開示から、過度の実験を行うことなく、害虫管理、植物病害管理及び除草剤耐性管理を含め、且つ植物アッセイにおける及び他の適用に向けたインプランタＲＮＡｉ技術の領域において適用することができる（例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（Ｉｍｐａｃｔ Ｆａｃｔｏｒ：２．０１）．０１／２０１５；１２０．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｐｅｓｔｂｐ．２０１５．０１．００２；Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｊｏｕｒｎａｌｓ（２０１５），Ｖｏｌ．１２（１８）ｐｐ２３０３−２３１２）；Ｇｒｅｅｎ Ｊ．Ｍ，ｉｎＰｅｓｔ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ ７０（９），ｐｐ １３５１−１３５７を参照されたい）。
植物、藻類及び真菌においてリボスイッチを改変し、且つ代謝調節を制御するためのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用
リボスイッチ（アプタザイムとしても知られる）は、メッセンジャーＲＮＡの調節性セグメントであり、小分子に結合して、従って遺伝子発現を調節する。この機構により、細胞はそれらの小分子の細胞内濃度を検知することが可能になる。特定のリボスイッチは、典型的にはその隣接遺伝子を、その遺伝子の転写、翻訳又はスプライシングを変化させることによって調節する。従って、本発明の詳細な実施形態では、リボスイッチを標的とする好適なガイドＲＮＡと組み合わせたＲＮＡターゲティングタンパク質を使用することによるリボスイッチ活性の制御が想定される。これは、リボスイッチの切断又はそれへの結合によるものであり得る。詳細な実施形態では、リボスイッチ活性の低減が想定される。最近になってチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）に結合するリボスイッチが特徴付けられ、植物及び藻類におけるチアミン生合成を調節することが分かった。更に、このエレメントは植物における一次代謝の必須調節因子であるものと見られる（Ｂｏｃｏｂｚａ ａｎｄ Ａｈａｒｏｎｉ，Ｐｌａｎｔ Ｊ．２０１４ Ａｕｇ；７９（４）：６９３−７０３．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｔｐｊ．１２５４０．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｊｕｎ １７）。ＴＰＰリボスイッチは、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）など、ある種の真菌にも見られ、ここで、それは、選択的スプライシングを制御して上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）を条件的に産生し、それにより下流遺伝子の発現に影響を及ぼす（Ｃｈｅａｈ ＭＴ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｎａｔｕｒｅ ４４７（７１４３）：４９７−５００．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０５７６９）。本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系を使用して植物、藻類又は真菌の内因性リボスイッチ活性を操作し、そのようにしてそれにより制御される下流遺伝子の発現を変化させ得る。詳細な実施形態において、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰ系は、インビボ又はインビトロでのリボスイッチ機能のアッセイ及び代謝ネットワークに対するその関連性の研究において使用し得る。詳細な実施形態において、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系は、潜在的には、植物及び遺伝子制御プラットフォームにおける代謝産物センサーとしてのリボスイッチのエンジニアリングに使用し得る。
植物、藻類又は真菌のＲＮＡｉスクリーンにおけるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用
ＲＮＡｉスクリーンにより、そのノックダウンが表現型の変化に関連する遺伝子産物を同定して、生物学的経路を調べ及び構成要素を同定することができる。本発明の詳細な実施形態では、本明細書に記載されるガイド２９又はガイド３０タンパク質及び好適なガイドＲＮＡを使用してスクリーンにおけるＲＮＡｉの活性を除去し又は低下させ、従って（それまで干渉を受けていた）遺伝子産物の活性を（干渉／抑制を除去し又は低下させることで）回復させることにより、こうしたスクリーンにも又はスクリーンの間も制御を及ぼし得る。
インビボ及びインビトロでＲＮＡ分子を可視化するためのＲＮＡターゲティングタンパク質の使用
詳細な実施形態において、本発明は、核酸結合系を提供する。ＲＮＡと相補的プローブとのインサイチュハイブリダイゼーションは、強力な技法である。典型的には、ハイブリダイゼーションによる核酸の検出には蛍光ＤＮＡオリゴヌクレオチドが使用される。ロックド核酸（ＬＮＡ）など、ある種の改変によって効率の増加が達成されているが、効率的且つ汎用的な代替手段が依然として必要とされている。このように、インサイチュハイブリダイゼーションのための効率的且つ適合可能な系の代替手段として、ＲＮＡターゲティング系の標識エレメントを使用することができる。
植物及び酵母におけるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の更なる適用
バイオ燃料生産におけるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用
用語「バイオ燃料」は、本明細書で使用されるとき、植物及び植物由来の資源から作られる代替燃料である。再生可能バイオ燃料は、炭素固定の過程を通じてエネルギーを得てきた有機物から抽出することができ、又はバイオマスの使用若しくは変換によって作られる。このバイオマスは、バイオ燃料に直接使用され得、又は熱変換、化学変換及び生化学変換によって好都合なエネルギー含有物質に変換され得る。このバイオマス変換により、固体、液体又は気体形態の燃料が得られ得る。バイオ燃料には、バイオエタノールとバイオディーゼルとの２種類がある。バイオエタノールは、主として、大部分がトウモロコシ及びサトウキビに由来するセルロース（デンプン）の糖発酵プロセスによって生産される。他方でバイオディーゼルは、主として、ナタネ、ヤシ及びダイズなどの油料作物から生産される。バイオ燃料は主として輸送機関に用いられる。
バイオ燃料生産のための植物特性の増強
詳細な実施形態において、発酵に際して糖類がより効率的に放出されるよう主要な加水分解剤を到達し易くするため、本明細書に記載されるとおりのＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲを使用する方法を用いて細胞壁の特性を変化させる。詳細な実施形態では、セルロース及び／又はリグニンの生合成が改変される。セルロースは、細胞壁の主要な構成成分である。セルロース及びリグニンの生合成は共調節される。植物中のリグニンの割合を低下させることにより、セルロースの割合が増加し得る。詳細な実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて植物におけるリグニン生合成が下方制御され、それにより発酵性糖質を増加させる。より詳細には、国際公開第２００８０６４２８９ Ａ２号パンフレットに開示されるとおり、本明細書に記載される方法を用いて、４−クマル酸３−ヒドロキシラーゼ（Ｃ３Ｈ）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、桂皮酸−４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）、ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ（ＨＣＴ）、コーヒー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、カフェオイルＣｏＡ３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＣｏＡＯＭＴ）、フェルラ酸５−ヒドロキシラーゼ（Ｆ５Ｈ）、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）、シンナモイルＣｏＡ−レダクターゼ（ＣＣＲ）、４−クマル酸−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）、モノリグノール−リグニン特異的グリコシルトランスフェラーゼ及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）からなる群から選択される少なくとも第１のリグニン生合成遺伝子が下方制御される。
詳細な実施形態において、本明細書に記載される方法を用いて、発酵中に発生する酢酸レベルがより低い植物マスが作製される（国際公開第２０１００９６４８８号パンフレットも参照されたい）。
バイオ燃料生産のための酵母の改変
詳細な実施形態において、本明細書に提供されるＲＮＡターゲティング酵素は、組換え微生物によるバイオエタノールの生産に使用される。例えば、ＲＮＡターゲティング酵素を使用して酵母などの微生物をエンジニアリングすることにより、発酵性糖類からバイオ燃料又はバイオポリマーを作成することができ、且つ任意選択で発酵性糖類の供給源としての農業廃棄物から得られた植物由来のリグノセルロースを分解することが可能である。より詳細には、本発明は、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ複合体を使用してバイオ燃料生産に必要な内因性遺伝子の発現を改変し、且つ／又はバイオ燃料合成を妨げ得る内因性遺伝子を改変する方法を提供する。より詳細には、本方法は、ピルビン酸からエタノール又は別の目的産物への変換に関与する酵素をコードする１つ以上のヌクレオチド配列の酵母などの微生物における発現を刺激することを含む。詳細な実施形態では、本方法は、セルラーゼなど、微生物によるセルロースの分解を実現する１つ以上の酵素の発現の刺激を確実にする。更に別の実施形態では、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して、バイオ燃料生産経路と競合する内因性代謝経路が抑制される。
植物油又はバイオ燃料の生産のための藻類及び植物の改変
トランスジェニック藻類又はセイヨウアブラナなどの他の植物は、植物油又はバイオ燃料、例えばアルコール類（特にメタノール及びエタノール）の生産に特に有用であり得る。これらは、油又はバイオ燃料産業で使用される高レベルの油又はアルコールを発現又は過剰発現するようにエンジニアリングされ得る。
米国特許第８９４５８３９号明細書は、Ｃａｓ９を用いた微細藻類（コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）細胞）種）のエンジニアリング方法について記載している。同様のツールを使用して、本明細書に記載されるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の方法をクラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）種及び他の藻類に適用することができる。詳細な実施形態では、Ｈｓｐ７０Ａ−Ｒｂｃ Ｓ２又はβ２−チューブリンなどの構成的プロモーターの制御下でＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を発現するベクターを使用して藻類にＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質及びガイドＲＮＡを導入し、発現させる。ガイドＲＮＡは、Ｔ７プロモーターを含有するベクターを使用して送達されることになる。或いは、インビトロ転写されたガイドＲＮＡが藻類細胞に送達され得る。電気穿孔プロトコルは、ＧｅｎｅＡｒｔクラミドモナスエンジニアリングキットの標準的な推奨プロトコルに従う。
植物におけるＲＮＡターゲティング酵素の詳細な適用
詳細な実施形態では、本発明は、ウイルスＲＮＡを切断することが可能であるため、植物系におけるウイルス除去用治療薬として使用することができる。ヒト系における先行研究は、一本鎖ＲＮＡウイルス、Ｃ型肝炎（Ａ．Ｐｒｉｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，２０１５）のターゲティングにおけるＣＲＩＳＰＲの利用の成功を実証している。これらの方法は、植物におけるＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の使用にも適合させ得る。
改良植物
本発明は、本明細書に提供される方法によって得ることのできる及びそれによって得られた植物及び酵母細胞も提供する。本明細書に記載される方法によって得られた改良植物は、例えば、植物害虫、除草剤、乾燥、低温又は高温、過剰な水等に対する耐性を確実にする遺伝子の発現の改変により、食品又は飼料製造において有用となり得る。
本明細書に記載される方法によって得られた改良植物、特に作物及び藻類は、例えば、通常野生型に見られるであろうよりも高いタンパク質、炭水化物、栄養素又はビタミンレベルの発現により、食品又は飼料製造において有用となり得る。この点で、改良植物、特に豆類及び塊茎が好ましい。
改良藻類又はセイヨウアブラナなどの他の植物は、植物油又はバイオ燃料、例えばアルコール類（特にメタノール及びエタノール）の生産に特に有用であり得る。これらは、油又はバイオ燃料産業で使用される高レベルの油又はアルコールを発現又は過剰発現するようにエンジニアリングされ得る。
本発明は、植物の改良された部位も提供する。植物部位としては、限定されないが、葉、茎、根、塊茎、種子、胚乳、胚珠及び花粉が挙げられる。本明細書において想定されるとおりの植物部位は、生育可能、生育不能、再生可能及び／又は再生不能であり得る。
また、本明細書には、本発明の方法によって作成された植物細胞及び植物を提供することも包含される。従来の育種方法によって作製された、遺伝子改変を含む植物の配偶子、種子、胚（接合胚であれ又は体細胞胚であれ）、子孫又は雑種も本発明の範囲内に含まれる。かかる植物は、標的配列に挿入されるか又はそれの代わりに挿入された異種又は外来性ＤＮＡ配列を含有し得る。或いは、かかる植物は、１つ以上のヌクレオチドに、ある変化（突然変異、欠失、挿入、置換）のみを含有し得る。そのため、かかる植物はその先祖植物と特定の改変の存在のみが異なるに過ぎないことになる。
本発明のある実施形態では、Ｃａｓ１３ｂ系を使用して、例えば細菌、真菌又はウイルスによって引き起こされる疾患に対する抵抗性を作り出すことにより、病原体抵抗性植物がエンジニアリングされる。特定の実施形態において、病原体抵抗性は、害虫が摂取して死亡につながるであろうＣａｓ１３ｂ系が作り出されるように作物をエンジニアリングすることにより達成され得る。本発明のある実施形態では、Ｃａｓ１３ｂ系を使用して非生物的ストレス耐性がエンジニアリングされる。別の実施形態では、Ｃａｓ１３ｂ系を使用して干ばつストレス耐性又は塩ストレス耐性又は低温若しくは熱ストレス耐性がエンジニアリングされる。Ｙｏｕｎｉｓ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１０；１１５０は植物育種方法の潜在的標的をレビューしており、その全てが本明細書に記載されるＣａｓ１３ｂ系を使用した修正又は改良に適している。一部の非限定的な標的作物としては、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓ）トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）が挙げられ、タリアナ（ｔｈａｌｉａｎａ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ）、セイヨウスモモ（Ｐｒｕｎｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ Ｌ．）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ニコチアナ・ルスティカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｕｓｔｉｃａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）及びシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）である。
本発明のある実施形態では、Ｃａｓ１３ｂ系は、作物害虫の管理に使用される。例えば、作物害虫において作動可能なＣａｓ１３ｂ系を植物宿主から発現させるか、又は例えばウイルスベクターを使用して標的に直接トランスファーすることができる。
ある実施形態において、本発明は、ヘテロ接合非ヒト出発生物からホモ接合生物を効率的に作製する方法を提供する。ある実施形態において、本発明は植物育種に使用される。別の実施形態において、本発明は動物育種に使用される。かかる実施形態において、植物又は動物などのホモ接合生物は、二本鎖切断、染色体対合及び／又は鎖交換に関与する少なくとも１つの標的遺伝子への干渉によって組換えを防止又は抑制することにより作られる。
最適化された機能性ＲＮＡターゲティング系におけるＣＡＳ１３Ｂタンパク質の適用
ある態様において、本発明は、機能性構成成分をＲＮＡ環境に特異的に送達するための系を提供する。これは、ＲＮＡへの種々の構成成分の特異的ターゲティングを可能にする本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ系を使用して確実にすることができる。より詳細には、かかる構成成分には、ＲＮＡ翻訳、分解等のアクチベーター又はリプレッサーなど、アクチベーター又はリプレッサーが含まれる。この系の適用については、本明細書の他の部分に記載される。
一態様によれば、本発明は、細胞の目的のゲノム遺伝子座内にある標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を提供し、ここで、ガイドＲＮＡは、アダプタータンパク質に結合する１つ以上の個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変される。詳細な実施形態において、ＲＮＡ配列は、２つ以上のアダプタータンパク質（例えば、アプタマー）に結合することができ、及び各アダプタータンパク質が１つ以上の機能ドメインと会合している。本明細書に記載されるＣａｓ１３ｂｃ２ｃ２酵素のガイドＲＮＡは、ガイド配列の改変に適していることが示される。詳細な実施形態において、ガイドＲＮＡは、ダイレクトリピートの５’側、ダイレクトリピート内、又はガイド配列の３’側への個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変される。２つ以上の機能ドメインがあるとき、それらの機能ドメインは、同じであるか又は異なり得、例えば同じ２つの又は２つの異なるアクチベーター又はリプレッサーであり得る。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、１つ以上の機能ドメインがＲＮＡターゲティング酵素に付加されているため、機能ドメインは、標的ＲＮＡに結合すると、機能ドメインがその帰属機能で機能することが可能な空間的配置となる；ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、組成物は、少なくとも３つの機能ドメインであって、そのうちの少なくとも１つがＲＮＡターゲティング酵素と会合し、且つそのうちの少なくとも２つがｇＲＮＡと会合している機能ドメインを有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を含む。
従って、ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりのガイドＲＮＡとＲＮＡターゲティング酵素であるＣａｓ１３ｂとを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ｂ複合体組成物を提供し、ここで、任意選択で、ＲＮＡターゲティング酵素は、ＲＮＡターゲティング酵素がその少なくとも１つの突然変異を有しない酵素の５％以下のヌクレアーゼ活性を有することになる少なくとも１つの突然変異及び任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む１つ以上を含む。詳細な実施形態において、ガイドＲＮＡは、それに加えて又は代えて、ＲＮＡターゲティング酵素の結合はなおも確実にするが、ＲＮＡターゲティング酵素による切断は防ぐように（本明細書の他の部分で詳説するとおり）改変される。
詳細な実施形態において、ＲＮＡターゲティング酵素は、少なくとも１つの突然変異を有しないＣａｓ１３ｂ酵素と比較したときに少なくとも９７％又は１００％の低下したヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ１３ｂ酵素である。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、Ｃａｓ１３ｂ酵素は、本明細書で他に考察される２つ以上の突然変異を含む。
詳細な実施形態において、２つ以上の機能ドメインを含む本明細書において上記に記載されるとおりのＲＮＡターゲティング系が提供される。詳細な実施形態において、２つ以上の機能ドメインは、異種機能ドメインである。詳細な実施形態において、この系は、機能ドメインを含む融合タンパク質であるアダプタータンパク質を含み、融合タンパク質は、任意選択で、アダプタータンパク質と機能ドメインとの間にリンカーを含む。詳細な実施形態において、リンカーはＧｌｙＳｅｒリンカーを含む。それに加えて又は代えて、１つ以上の機能ドメインがリンカー、任意選択でＧｌｙＳｅｒリンカーによってＲＮＡエフェクタータンパク質に付加される。詳細な実施形態において、１つ以上の機能ドメインは、ＨＥＰＮドメインの一方又は両方でＲＮＡターゲティング酵素に付加される。
ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、アダプタータンパク質又はＲＮＡターゲティング酵素と会合している１つ以上の機能ドメインは、ＲＮＡ翻訳を活性化又は抑制する能力を有するドメインである。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、アダプタータンパク質に会合している１つ以上の機能ドメインの少なくとも１つは、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＤＮＡ組込み活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性又は核酸結合活性又は分子スイッチ活性又は化学誘導能若しくは光誘導能を含む１つ以上の活性を有する。
ある態様において、本発明は、アプタマー配列を含む本明細書において考察される組成物を提供する。詳細な実施形態において、アプタマー配列は、同じアダプタータンパク質に特異的な２つ以上のアプタマー配列である。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、アプタマー配列は、異なるアダプタータンパク質に特異的な２つ以上のアプタマー配列である。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、アダプタータンパク質は、ＭＳ２、ＰＰ７、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ、ＰＲＲ１を含む。従って、詳細な実施形態では、アプタマーは、上記に列挙するアダプタータンパク質のいずれか１つを特異的に結合する結合タンパク質から選択される。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、細胞は、真核細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、真核細胞は、哺乳類細胞、植物細胞又は酵母細胞であり、それによって哺乳類細胞は、任意選択で、マウス細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、哺乳類細胞はヒト細胞である。
ある態様において、本発明は、本明細書において上記で考察した組成物を提供し、ここで、２つ以上のガイドＲＮＡ、又はｇＲＮＡ、又はｃｒＲＮＡがあり、及びこれらは、異なる配列を標的化し、それによって本組成物が用いられるとき、多重化がある。ある態様において、本発明は、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変された２つ以上のガイドＲＮＡ、又はｇＲＮＡ、又はｃｒＲＮＡがある組成物を提供する。
ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、１つ以上の機能ドメインと会合した１つ以上のアダプタータンパク質が存在して、ガイドＲＮＡに挿入された個別のＲＮＡ配列に結合する。
ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの非コード機能性ループを有するように改変され；例えば、少なくとも１つの非コード機能性ループは抑制性であり；例えば、少なくとも１つの非コード機能性ループはＡｌｕを含む。
ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりの組成物の１つ以上の宿主への投与又は宿主におけるインビボ発現を含む遺伝子発現の改変方法を提供する。
ある態様において、本発明は、組成物又はそれをコードする核酸分子の送達を含む、本明細書において考察される方法を提供し、ここで、前記核酸分子は調節配列に作動可能に連結され、且つインビボで発現する。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される方法を提供し、ここで、インビボでの発現はレンチウイルス、アデノウイルス又はＡＡＶを介する。
ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりの細胞の哺乳類細胞株を提供し、ここで、細胞株は、任意選択で、ヒト細胞株又はマウス細胞株である。ある態様において、本発明は、トランスジェニック哺乳類モデル、任意選択でマウスを提供し、ここで、このモデルは、本明細書において考察される組成物で形質転換されているか、又は前記形質転換体の子孫である。
ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりのガイドＲＮＡ又はＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ｂ複合体又は組成物をコードする核酸分子を提供する。ある態様において、本発明は、細胞のＲＮＡ標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はｃｒＲＮＡをコードする核酸分子を含むベクターを提供し、ここで、ｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡのダイレクトリピートは、２つ以上のアダプタータンパク質に結合する個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変され、及び各アダプタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインと会合しているか；又はｇＲＮＡは、少なくとも１つの非コード機能性ループを有するように改変される。ある態様において、本発明は、本明細書において考察されるｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡと、ＲＮＡターゲティング酵素［任意選択で、ＲＮＡターゲティング酵素は、少なくとも１つの突然変異を含み、そのためＲＮＡターゲティング酵素は、少なくとも１つの突然変異を有しないＲＮＡターゲティング酵素の５％以下のヌクレアーゼ活性を有し、且つ任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む１つ以上を含む］とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ｂ複合体組成物をコードする核酸分子を含むベクターを提供する。ある態様において、ベクターは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はｃｒＲＮＡをコードする核酸分子及び／又はＲＮＡターゲティング酵素をコードする核酸分子及び／又は任意選択の核局在化配列に作動可能に連結された真核細胞において作動可能な調節エレメントを更に含み得る。
一態様において、本発明は、本明細書に記載される構成成分の１つ以上を含むキットを提供する。一部の実施形態において、本キットは、本明細書に記載されるとおりのベクター系とキットの使用説明書とを含む。
ある態様において、本発明は、機能獲得（ＧＯＦ）又は機能喪失（ＬＯＦ）に関してスクリーニングする方法又は非コードＲＮＡ又は潜在的な調節領域（例えば、エンハンサー、リプレッサー）のスクリーニング方法を提供し、この方法は、ＲＮＡターゲティング酵素を含有し又はそれを発現する本明細書において考察するとおりの細胞株又は本明細書において考察されるモデルの細胞及び本明細書において考察するとおりの組成物を細胞株又はモデルの細胞に導入し、それによってｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡがアクチベーター又はリプレッサーのいずれかを含むこと、及びそれらの細胞に関して導入されたｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡがアクチベーターを含むのはいずれかに関して又はそれらの細胞に関して導入されたｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡがリプレッサーを含むのはいずれかに関して、それぞれＧＯＦ又はＬＯＦをモニタすることを含む。
ある態様において、本発明は、細胞の目的の標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はｃｒＲＮＡ、ＲＮＡターゲティング酵素を各々が含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物のライブラリを提供し、ここで、ＲＮＡターゲティング酵素は、少なくとも１つの突然変異を含み、そのためＲＮＡターゲティング酵素は、少なくとも１つの突然変異を有しないＲＮＡターゲティング酵素の５％以下のヌクレアーゼ活性を有し、ｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変され、及びアダプタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインと会合し、この組成物は、１つ以上又は２つ以上のアダプタータンパク質を含み、各タンパク質は、１つ以上の機能ドメインと会合し、及びｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、複数のＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はｃｒＲＮＡを含むゲノムワイドライブラリを含む。ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりのライブラリを提供し、ここで、ＲＮＡターゲティングＲＮＡターゲティング酵素は、少なくとも１つの突然変異を有しないＲＮＡターゲティング酵素と比較したときに少なくとも９７％又は１００％の低下したヌクレアーゼ活性を有する。ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりのライブラリを提供し、ここで、アダプタータンパク質は、機能ドメインを含む融合タンパク質である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりのライブラリを提供し、ここで、ｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、１つ又は２つ以上のアダプタータンパク質に結合する個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変されない。ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりのライブラリを提供し、ここで、１つ又２つ以上の機能ドメインはＲＮＡターゲティング酵素と会合している。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりのライブラリを提供し、ここで、細胞の細胞集団は、真核細胞の集団である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりのライブラリを提供し、ここで、真核細胞は、哺乳類細胞、植物細胞又は酵母細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりのライブラリを提供し、ここで、哺乳類細胞はヒト細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりのライブラリを提供し、ここで、細胞の集団は、胚性幹（ＥＳ）細胞の集団である。
ある態様において、本発明は、本明細書で考察するとおりのライブラリを提供し、ここで、ターゲティングは、約１００以上のＲＮＡ配列である。ある態様において、本発明は、本明細書で考察するとおりのライブラリを提供し、ここで、ターゲティングは、約１０００以上のＲＮＡ配列である。ある態様において、本発明は、本明細書で考察するとおりのライブラリを提供し、ここで、ターゲティングは、約２０，０００以上の配列である。ある態様において、本発明は、本明細書で考察するとおりのライブラリを提供し、ここで、ターゲティングはトランスクリプトーム全体である。ある態様において、本発明は、本明細書で考察するとおりのライブラリを提供し、ここで、ターゲティングは、関連性のある又は望ましい経路に焦点を置いた標的配列のパネルである。ある態様において、本発明は、本明細書で考察するとおりのライブラリを提供し、ここで、経路は免疫経路である。ある態様において、本発明は、本明細書で考察するとおりのライブラリを提供し、ここで、経路は、細胞分裂経路である。
一態様において、本発明は、発現が改変された遺伝子を含むモデル真核細胞を作成する方法を提供する。一部の実施形態において、疾患遺伝子は、疾患の罹患又は発症リスクの増加に関連する任意の遺伝子である。一部の実施形態において、本方法は、（ａ）本明細書において上記に記載される系の構成成分をコードする１つ以上のベクターを真核細胞に導入すること、及び（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて遺伝子の発現を改変し、それにより遺伝子発現の改変を含むモデル真核細胞を作成することを含む。
本明細書に提供される構造情報により、標的ＲＮＡ及びＲＮＡターゲティング酵素とのガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ相互作用を調べることが可能であり、ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ｂ系全体の機能性が最適化されるようにガイドＲＮＡ構造をエンジニアリングし又は変化させることが可能になる。例えば、ＲＮＡに結合することのできるアダプタータンパク質の挿入によりＲＮＡターゲティングタンパク質との衝突なしにガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡを伸長させることができる。これらのアダプタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインを含むエフェクタータンパク質又は融合物を更に動員することができる。
本発明のある態様は、上記のエレメントが単一の組成物に含まれるか、又は個々の組成物に含まれるものである。これらの組成物は、有利には、ゲノムレベルで機能的効果を誘発するため宿主に適用され得る。
当業者は、ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡに対する改変で、アダプター＋機能ドメインの結合を可能にするが、アダプター＋機能ドメインを適切に位置させることは（例えば、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ｂ複合体の三次元構造内の立体障害に起因して）できないものは、意図されない改変であることを理解するであろう。１つ以上の改変ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピートの５’側、ダイレクトリピート内、又はガイド配列の３’側への個別のＲＮＡ配列の導入によって改変され得る。
改変ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ、不活性化ＲＮＡターゲティング酵素（機能ドメインを有する又は有しない）及び１つ以上の機能ドメインを有する結合タンパク質は、各々が個別に組成物中に含まれ、宿主に個別に又はまとめて投与され得る。或いは、これらの構成成分は、宿主への投与のための単一の組成物中に提供され得る。宿主への投与は、宿主への送達に関して当業者に公知の又は本明細書に記載されるウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター）を用いて実施し得る。本明細書に説明されるとおり、異なる選択マーカー（例えば、レンチウイルスｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ選択のためのもの）及びｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡの濃度（例えば、複数のｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡが用いられるかどうかに依存する）を使用することが、向上した効果を生じさせるのに有利であり得る。
当業者は、提供される組成物を用いて、同じ又は異なる機能ドメインで単一又は複数の遺伝子座を有利に且つ特異的に標的化して、１つ以上のゲノムイベントを誘発することができる。本組成物は、細胞のライブラリにおけるスクリーニング及びインビボでの機能モデリング（例えば、ｌｉｎｃＲＮＡの遺伝子活性化及び機能の同定；機能獲得モデリング；機能喪失モデリング；最適化及びスクリーニング目的の細胞株及びトランスジェニック動物を樹立するための本発明の組成物の使用）のための多様な方法に適用され得る。
本発明は、条件的又は誘導性ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ｂ ＲＮＡターゲティングイベントを樹立し及び利用するための本発明の組成物の使用を包含する。（例えば、Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１４），ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０１４又は本明細書に引用されるＰＣＴ特許公報、例えば国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６６７号明細書）（これらは本発明若しくは本願に先行するとは考えられない）を参照されたい）。例えば、標的細胞がＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＲＰ酵素を条件的に又は誘導性に（例えば、Ｃｒｅ依存性構築物の形態で）含み、且つ／又はアダプタータンパク質を条件的に又は誘導性に含み、及び標的細胞に導入されたベクターの発現時、ベクターは、標的細胞におけるＲＮＡターゲティング酵素発現及び／又はアダプター発現を誘導し、又はその条件を生じるように発現する。ＣＲＩＳＰＲ複合体を作成する公知の方法と共に本発明の教示及び組成物を適用することにより、機能ドメインによって影響を受ける誘導性遺伝子発現も本発明の態様である。或いは、条件的又は誘導性ＲＮＡターゲティング酵素と共にアダプタータンパク質が条件的又は誘導性エレメントとして提供されることにより、スクリーニング目的に有効なモデルが提供され得、これは、有利には、多様な適用に対して、特異的なｇＲＮＡの最小限の設計及び投与のみを必要とするものである。
デッドガイド配列を含む本発明に係るガイドＲＮＡ
一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ｂ複合体の形成及び標的への結合の成功を可能にすると同時にヌクレアーゼ活性の成功を許容するか又は許容しない（即ちヌクレアーゼ活性がない／インデル活性がない）かのいずれであるように改変されるガイド配列を提供する。説明上の問題で、かかる改変ガイド配列は、「デッドガイド」又は「デッドガイド配列」と称される。これらのデッドガイド又はデッドガイド配列は、ヌクレアーゼ活性の点で触媒的に不活性である又は立体構造的に不活性であると考えることができる。実際、デッドガイド配列は、触媒活性を促進する能力又はオンターゲットとオフターゲットとの結合活性を区別する能力の点で生産的な塩基対合に十分に関与しないものであり得る。簡潔に言えば、このアッセイには、ＣＲＩＳＰＲ標的ＲＮＡ及び標的ＲＮＡとのミスマッチを含むガイドＲＮＡを合成すること、それらをＲＮＡターゲティング酵素と組み合わせて、切断産物によって生成されるバンドの存在に基づいたゲルに基づいて切断を分析すること、及び相対バンド強度に基づいて切断を定量化することが関わる。
従って、関連する態様において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの機能性ＲＮＡターゲティング酵素及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はｃｒＲＮＡを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供し、ここで、ｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡはデッドガイド配列を含み、それによってｇＲＮＡは、この系の非突然変異ＲＮＡターゲティング酵素の検出可能なＲＮＡ切断活性なしにＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が細胞内の目的のゲノム遺伝子座に導かれるような標的配列へのハイブリダイゼーション能力を有するものとなる。本明細書の他の部分に記載されるとおりの本発明に係るｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡのいずれも、デッドｇＲＮＡ／デッドガイド配列を含むｃｒＲＮＡとして使用し得ることが理解されるべきである。
ＲＮＡ標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導くデッドガイド配列の能力は、任意の好適なアッセイによって評価され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ｂ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ｂ系の構成成分は、試験しようとするデッドガイド配列を含め、対応する標的配列を有する宿主細胞に対し、その系の構成成分をコードするベクターのトランスフェクションによるなどして提供され得、続いて標的配列内における優先的切断を評価し得る。
本明細書に更に説明されるとおり、幾つかの構造パラメータによって適切なフレームワークをかかるデッドガイドに至らせることが可能である。デッドガイド配列は、典型的には、活性ＲＮＡ切断をもたらすそれぞれのガイド配列よりも短いことができる。詳細な実施形態において、デッドガイドは、同じものに対するそれぞれのガイドよりも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％短い。
以下に説明し且つ当該技術分野において公知のとおり、ｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡの一態様 − ＲＮＡターゲティング特異性は、ダイレクトリピート配列であり、これはかかるガイドに適切に連結されるべきである。詳細には、これは、ダイレクトリピート配列がＲＮＡターゲティング酵素の起源に応じて設計されることを含意する。Ｃａｓ１３ｂ特異的均等物の設計には、検証されたデッドガイド配列に利用可能な構造データが用いられ得る。例えば、２つ以上のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質のオルソロガスなヌクレアーゼドメインＨＥＰＮの間の構造的類似性を用いることにより、均等な設計のデッドガイドをトランスファーし得る。従って、本明細書におけるデッドガイドは、かかるＣａｓ１３ｂ特異的均等物を反映するように長さ及び配列が適切に改変され得、それによりＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ｂ複合体の形成及び標的ＲＮＡへの結合の成功が実現すると同時に、ヌクレアーゼ活性の成功が許容されなくなる。
デッドガイドは、ヌクレアーゼ活性を伴うことのない、遺伝子ターゲティングの手段としてのｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡの使用を可能にすると同時に、誘導的な活性化又は抑制手段を提供する。デッドガイドを含むガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、遺伝子活性の活性化又は抑制を可能にする形でエレメント、詳細には遺伝子エフェクター（例えば、遺伝子活性のアクチベーター又はリプレッサー）を機能的に置くことを可能にする本明細書の他の部分に記載されるとおりのタンパク質アダプター（例えば、アプタマー）を更に含むように改変し得る。一例は、本明細書及び当該技術分野の技術水準で説明されるとおりの、アプタマーの取込みである。デッドガイドを含むｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡがタンパク質相互作用性アプタマーを取り込むようにエンジニアリングすることにより（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｃｏｍｐｌｅｘ”，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４１３６、参照により本明細書に援用される）、複数の個別のエフェクタードメインをアセンブルし得る。これは、天然の過程の後にモデル化し得る。
一般情報
本発明の実施形態において、用語のガイド配列及びガイドＲＮＡ及びｃｒＲＮＡは、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６６７号明細書）などの前述の引用文献にあるとおり同義的に使用される。一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズして標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導くのに十分な標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上であるか又はそれより高い。最適アラインメントは、配列のアラインメントに好適な任意のアルゴリズムを用いて決定することができ、その非限定的な例としては、スミス−ウォーターマンアルゴリズム、ニードルマン−ブンシュアルゴリズム、バローズ・ホイーラー変換に基づくアルゴリズム（例えば、バローズ・ホイーラーアライナー）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍにおいて利用可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。一部の実施形態において、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド長以上であるか又はそれより長い。一部の実施形態において、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド長未満であるか又はそれより短い。好ましくは、ガイド配列は、１０〜３０ヌクレオチド長、例えば３０ヌクレオチド長である。ガイド配列が標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導く能力は、任意の好適なアッセイによって評価し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成成分が、試験しようとするガイド配列を含め、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成成分をコードするベクターのトランスフェクションによるなどして対応する標的配列を有する宿主細胞に提供され得、続いて本明細書に記載されるとおりのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどにより、標的配列内における優先的な切断を評価し得る。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験しようとするガイド配列を含めたＣＲＩＳＰＲ複合体の構成成分及び供試ガイド配列と異なる対照ガイド配列を提供して、それらの供試ガイド配列と対照ガイド配列との反応間の標的配列における結合又は切断速度を比較することにより、試験管内で判定することができる。他のアッセイも可能であり、当業者には想起されるであろう。ガイド配列は、任意の標的配列を標的化するように選択することができる。一部の実施形態において、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。例示的標的配列には、標的ゲノムにおいてユニークなものが含まれる。
一般に且つ本明細書全体を通じて、用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターとしては、限定されないが、一本鎖、二本鎖又は部分的二本鎖の核酸分子；１つ以上の遊離末端を含む、遊離末端のない（例えば、環状の）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ又は両方を含む核酸分子；及び当該技術分野において公知の他の種類のポリヌクレオチドが挙げられる。ある種のベクターは、「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術によるなどして追加のＤＮＡセグメントを挿入することのできる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、ベクターには、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）へのパッケージングのためのウイルス由来ＤＮＡ又はＲＮＡ配列が存在する。ウイルスベクターは、宿主細胞へのトランスフェクションのためのウイルスによって担持されるポリヌクレオチドも含む。特定のベクターは、それが導入される宿主細胞での自己複製能を有する（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクターは、それが作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことが可能である。かかるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。真核細胞における発現のための及びそこでの発現をもたらすベクターは、本明細書では、「真核細胞発現ベクター」と称することができる。組換えＤＮＡ技法において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含むことができ、これは、即ち、組換え発現ベクターが、発現させる核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節エレメント（これは、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択され得る）を含むことを意味する。組換え発現ベクターの範囲内において、「作動可能に連結された」は、ヌクレオチド配列の（例えば、インビトロ転写／翻訳系における又はベクターが宿主細胞に導入される場合に宿主細胞における）発現が可能となる形で目的のヌクレオチド配列が調節エレメントに連結されていることを意味するように意図される。
用語「調節エレメント」には、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列などの転写終結シグナル）が含まれることが意図される。かかる調節エレメントについては、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節エレメントには、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を導くもの及び特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を導くもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。組織特異的プロモーターは、主として、所望の目的組織、例えば筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば、肝臓、膵臓）又は特定の細胞型（例えば、リンパ球）において発現を導き得る。調節エレメントは、細胞周期依存的又は発生段階依存的様式など、時間依存的様式でも発現を導き得、この発現も組織又は細胞型特異的であることも又はそうでないこともある。一部の実施形態において、ベクターは、１つ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個又はそれより多いｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個又はそれより多いｐｏｌ ＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個又はそれより多いｐｏｌ Ｉプロモーター）又はこれらの組み合わせを含む。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例としては、限定されないが、Ｕ６及びＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例としては、限定されないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーと共に）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択でＣＭＶエンハンサーと共に）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照されたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター及びＥＦ１αプロモーターが挙げられる。また、用語「調節エレメント」には、ＷＰＲＥなどのエンハンサーエレメント；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲにおけるＲ−Ｕ５’セグメント（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６−４７２，１９８８）；ＳＶ４０エンハンサー；及びウサギβ−グロビンのエクソン２と３との間のイントロン配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８（３），ｐ．１５２７−３１，１９８１）も包含される。当業者によれば、発現ベクターの設計が、形質転換する宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどの要因に依存し得ることが理解されるであろう。ベクターは宿主細胞に導入することができ、それにより、本明細書に記載されるとおりの核酸によってコードされる転写物、タンパク質又はペプチドが、融合タンパク質又はペプチド（例えば、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、それらの突然変異型、それらの融合タンパク質等）を含め、産生され得る。
有利なベクターとしては、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルスが挙げられ、かかるベクターのタイプも特定のタイプの細胞を標的化するように選択することができる。
本明細書で使用されるとき、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座エフェクタータンパク質の「ｃｒＲＮＡ」、又は「ガイドＲＮＡ」、又は「シングルガイドＲＮＡ」、又は「ｓｇＲＮＡ」、又は「１つ以上の核酸成分」という用語には、標的核酸配列とハイブリダイズして標的ＲＮＡ配列へのＲＮＡターゲティング複合体の配列特異的結合を導くのに十分な標的核酸配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列が含まれる。
特定の実施形態において、本明細書に提供されるとおりのＣＲＩＳＰＲ系は、ｃｒＲＮＡ又はガイド配列を含む同様のポリヌクレオチドを利用することができ、ここで、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡとの混合物であり、及び／又はポリヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオチド類似体を含む。この配列は、限定されないが、バルジ、ヘアピン又はステムループ構造など、天然ｃｒＲＮＡの構造を含め、任意の構造を含み得る。特定の実施形態において、ガイド配列を含むポリヌクチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡ配列であり得る第２のポリヌクレオチド配列と二重鎖を形成する。
特定の実施形態において、本発明のガイドは、天然に存在しない核酸及び／又は天然に存在しないヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体及び／又は化学的改変を含む。天然に存在しない核酸には、例えば、天然に存在するヌクレオチドと天然に存在しないヌクレオチドとの混合物が含まれ得る。天然に存在しないヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体は、リボース、リン酸及び／又は塩基部分が改変され得る。本発明のある実施形態において、ガイド核酸はリボヌクレオチド及び非リボヌクレオチドを含む。１つのかかる実施形態において、ガイドは、１つ以上のリボヌクレオチド及び１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む。本発明のある実施形態において、ガイドは、ホスホロチオエート結合、ボラノホスフェート結合を有するヌクレオチド、リボース環の２’及び４’炭素間にメチレン架橋を含むロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド又は架橋核酸（ＢＮＡ）など、１つ以上の天然に存在しないヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含む。改変ヌクレオチドの他の例には、２’−Ｏ−メチル類似体、２’−デオキシ類似体、２−チオウリジン類似体、Ｎ６−メチルアデノシン類似体又は２’−フルオロ類似体が含まれる。改変塩基の更なる例としては、限定されないが、２−アミノプリン、５−ブロモ−ウリジン、プソイドウリジン（Ψ）、Ｎ１−メチルプソイドウリジン（ｍｅ１Ψ）、５−メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、イノシン、７−メチルグアノシンが挙げられる。ガイドＲＮＡの化学的改変の例としては、限定なしに、１つ以上の末端ヌクレオチドにおける２’−Ｏ−メチル（Ｍ）、２’−Ｏ−メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、Ｓ−拘束エチル（ｃＥｔ）又は２’−Ｏ−メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）の取込みが挙げられる。かかる化学的に改変されたガイドＲＮＡは、改変されていないガイドＲＮＡと比較したときに高い安定性及び高い活性を含むことができ、しかしながら、オンターゲット対オフターゲット特異性は、予測不可能である（Ｈｅｎｄｅｌ，２０１５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（９）：９８５−９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３２９０，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２９ Ｊｕｎｅ ２０１５；Ａｌｌｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００５，４８：９０１−９０４；Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０１２，３：１５４；Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１５，１１２：１１８７０−１１８７５；Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｄＣｈｅｍＣｏｍｍ．，２０１４，５：１４５４−１４７１；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，１，００６６ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５５１−０１７−００６６を参照されたい）。
一部の実施形態において、ガイドＲＮＡの５’及び／又は３’末端は、蛍光色素、ポリエチレングリコール、コレステロール、タンパク質又は検出タグを含め、種々の機能性部分によって改変される（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３３：７４−８３を参照されたい）。特定の実施形態において、ガイドは、標的ＤＮＡに結合する領域にリボヌクレオチドを含み、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１又はＣ２ｃ１に結合する領域に１つ以上のデオキシリボヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体を含む。本発明のある実施形態において、デオキシリボヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体は、限定なしに、５’及び／又は３’末端、ステム−ループ領域及びシード領域など、エンジニアリングされたガイド構造に組み込まれる。特定の実施形態において、改変は、ステム−ループ領域の５’−ハンドルにない。ガイドのステム−ループ領域の５’−ハンドルにおける化学的改変は、その機能を無効にし得る（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，１：００６６を参照されたい）。特定の実施形態において、ガイドの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０又は７５ヌクレオチドが化学的に改変される。一部の実施形態において、ガイドの３’又は５’末端のいずれかの３〜５ヌクレオチドが化学的に改変される。一部の実施形態において、２’−Ｆ改変など、シード領域には軽微な改変のみが導入される。一部の実施形態において、２’−Ｆ改変は、ガイドの３’末端に導入される。特定の実施形態において、ガイドの５’及び／又は３’末端の３〜５ヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル（Ｍ）、２’−Ｏ−メチル−３’−ホスホロチオエート（ＭＳ）、Ｓ−拘束エチル（ｃＥｔ）又は２’−Ｏ−メチル−３’−チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）で化学的に改変される。かかる改変は、ゲノム編集効率を亢進させ得る（Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３（９）：９８５−９８９を参照されたい）。特定の実施形態において、遺伝子破壊レベルを亢進させるため、ガイドの全てのリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート（ＰＳ）に置換される。特定の実施形態において、ガイドの５’及び／又は３’末端の５ヌクレオチド超が２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｆ又はＳ−拘束エチル（ｃＥｔ）で化学的に改変される。かかる化学的に改変されたガイドは、亢進したレベルの遺伝子破壊を媒介することができる（Ｒａｇｄａｒｍ ｅｔ ａｌ．，０２１５，ＰＮＡＳ，Ｅ７１１０−Ｅ７１１１を参照されたい）。本発明のある実施形態において、ガイドは、その３’及び／又は５’末端に化学的部分を含むように改変される。かかる部分としては、限定されないが、アミン、アジド、アルキン、チオ、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）又はローダミンが挙げられる。特定の実施形態において、化学的部分はアルキル鎖などのリンカーによってガイドにコンジュゲートされる。特定の実施形態において、改変されたガイドの化学的部分は、ガイドをＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質又はナノ粒子などの別の分子に取り付けるために使用することができる。かかる化学的に改変されたガイドは、ＣＲＩＳＰＲ系によって遺伝子編集された細胞の同定又は集積に使用することができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ｅＬｉｆｅ，２０１７，６：ｅ２５３１２，ＤＯＩ：１０．７５５４を参照されたい）。
本発明の一態様において、ガイドは、５’−ハンドルを有する、Ｃｐｆ１に対する改変されたｃｒＲＮＡと、シード領域及び３’末端を更に含むガイドセグメントとを含む。一部の実施形態において、改変されたガイドは、アシダミノコッカス種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６ Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）；野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｕ１１２ Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）；Ｌ．バクテリウム（Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７ Ｃｐｆ１（Ｌｂ３Ｃｐｆ１）；ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）Ｃｐｆ１（ＢｐＣｐｆ１）；パルクバクテリア細菌（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７ Ｃｐｆ１（ＰｂＣｐｆ１）；ペレグリニバクテリア細菌（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０ Ｃｐｆ１（ＰｅＣｐｆ１）；レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ）Ｃｐｆ１（ＬｉＣｐｆ１）；スミセラ属種（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．）ＳＣ＿Ｋ０８Ｄ１７ Ｃｐｆ１（ＳｓＣｐｆ１）；Ｌ．バクテリウム（Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０ Ｃｐｆ１（Ｌｂ２Ｃｐｆ１）；ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）Ｃｐｆ１（ＰｃＣｐｆ１）；ポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ）Ｃｐｆ１（ＰｍＣｐｆ１）；カンディダタス・メタノプラズマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ）Ｃｐｆ１（ＣＭｔＣｐｆ１）；ユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ）Ｃｐｆ１（ＥｅＣｐｆ１）；モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７ Ｃｐｆ１（ＭｂＣｐｆ１）；プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ）Ｃｐｆ１（ＰｄＣｐｆ１）；又はＬ．バクテリウム（Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１）のいずれか１つのＣｐｆ１と使用することができる。
一部の実施形態において、ガイドの改変は、化学的改変、挿入、欠失又は分割である。一部の実施形態において、化学的改変には、限定されないが、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）類似体、２’−デオキシ類似体、２−チオウリジン類似体、Ｎ６−メチルアデノシン類似体、２’−フルオロ類似体、２−アミノプリン、５−ブロモ−ウリジン、プソイドウリジン（Ψ）、Ｎ１−メチルプソイドウリジン（ｍｅ１Ψ）、５−メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、イノシン、７−メチルグアノシン、２’−Ｏ−メチル−３’−ホスホロチオエート（ＭＳ）、Ｓ−拘束エチル（ｃＥｔ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）又は２’−Ｏ−メチル−３’−チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）の取り込みが含まれる。一部の実施形態において、ガイドはホスホロチオエート改変の１つ以上を含む。特定の実施形態において、ガイドの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２５ヌクレオチドが化学的に改変される。特定の実施形態において、シード領域の１ヌクレオチド以上が化学的に改変される。特定の実施形態において、３’末端の１ヌクレオチド以上が化学的に改変される。特定の実施形態において、５’−ハンドルのいかなるヌクレオチドも化学的に改変されない。一部の実施形態において、シード領域の化学的改変は、２’−フルオロ類似体の取り込みなど、軽微な改変である。具体的な実施形態において、シード領域の１ヌクレオチドが２’−フルオロ類似体に置き換えられる。一部の実施形態において、３’末端の５又は１０ヌクレオチドが化学的に改変される。Ｃｐｆ１ ＣｒＲＮＡの３’末端のかかる化学的改変は、遺伝子切断効率を向上させる（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，１：００６６を参照されたい）。具体的な実施形態において、３’末端の５ヌクレオチドが２’−フルオロ類似体に置き換えられる。具体的な実施形態において、３’末端の１０ヌクレオチドが２’−フルオロ類似体に置き換えられる。具体的な実施形態において、３’末端の５ヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル（Ｍ）類似体に置き換えられる。
一部の実施形態において、ガイドの５’−ハンドルのループが改変される。一部の実施形態において、ガイドの５’−ハンドルのループは、欠失、挿入、分割又は化学的改変を有するように改変される。特定の実施形態において、ループは、３、４又は５ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ループは、ＵＣＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＡＵＵ又はＵＧＵＵの配列を含む。
一態様において、ガイドは、非リン酸ジエステル結合を介して化学的に連結又はコンジュゲートしている部分を含む。一態様において、ガイドは、非限定的な例において、非ヌクレオチドループを介して化学的に連結又はコンジュゲートしているｔｒａｃｒ配列及びｔｒａｃｒメイト配列部分又はダイレクトリピート及びターゲティング配列を含む。一部の実施形態において、これらの部分は、非リン酸ジエステル共有結合体を介してつなぎ合わされる。共有結合体の例としては、限定されないが、カルバミン酸塩類、エーテル類、エステル類、アミド類、イミン類、アミジン類、アミノトリジン類、ヒドロゾン、ジスルフィド類、チオエーテル類、チオエステル類、ホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、スルホンアミド類、スルホン酸塩類、フルホン類、スルホキシド類、尿素類、チオ尿素類、ヒドラジド、オキシム、トリアゾール、光解離性連結、ディールス・アルダー環化付加対又は閉環メタセシス対などのＣ−Ｃ結合形成基及びマイケル反応対からなる群から選択される化学的部分が挙げられる。
一部の実施形態において、ガイドの部分は、初めに標準的なホスホラミダイト合成プロトコルを用いて合成される（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．，ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｌ ２８８，“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（２０１２））。一部の実施形態において、ノンターゲティングガイド部分は、ライゲーションに適切な官能基を含むように当該技術分野において公知の標準プロトコルを用いて官能化され得る（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０１３））。官能基の例としては、限定されないが、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸活性エステル、アルデヒド、カルボニル、クロロカルボニル、イミダゾリルカルボニル、ヒドロジド、セミカルバジド、チオセミカルバジド、チオール、マレイミド、ハロアルキル、スホニル、アリ、プロパルギル、ジエン、アルキン及びアジドが挙げられる。ガイドのノンターゲティング部分が官能化されると、２つのオリゴヌクレオチド間に共有結合性の化学結合又は連結を形成し得る。化学結合の例としては、限定されないが、カルバミン酸塩類、エーテル類、エステル類、アミド類、イミン類、アミジン類、アミノトリジン類、ヒドロゾン、ジスルフィド類、チオエーテル類、チオエステル類、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート類、スルホンアミド類、スルホン酸塩、フルホン類、スルホキシド類、尿素類、チオ尿素類、ヒドラジド、オキシム、トリアゾール、光解離性連結、ディールス・アルダー環化付加対又は閉環メタセシス対などのＣ−Ｃ結合形成基及びマイケル反応対をベースとするものが挙げられる。
一部の実施形態において、ガイドの１つ以上の部分は、化学的に合成することができる。一部の実施形態において、化学合成は、２’−アセトキシエチルオルトエステル（２’−ＡＣＥ）（Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９８）１２０：１１８２０−１１８２１；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（２０００）３１７：３−１８）又は２’−チオノカルバメート（２’−ＴＣ）化学（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０１１）１３３：１１５４０−１１５４６；Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３：９８５−９８９）を伴う自動化された固相オリゴヌクレオチド合成機を使用する。
一部の実施形態において、ガイド部分は、様々なバイオコンジュゲーション反応、ループ、架橋並びに糖修飾、インターヌクレオチドリン酸ジエステル結合、プリン及びピリミジン残基を介した非ヌクレオチド連結を用いて共有結合的に連結することができる。Ｓｌｅｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２００９）４８：６９７４−６９９８；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２００４）８：５７０−９；Ｂｅｈｌｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（２００８）１８：３０５−１９；Ｗａｔｔｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ（２００８）１３：８４２−５５；Ｓｈｕｋｌａ，ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ（２０１０）５：３２８−４９。
一部の実施形態において、ガイド部分は、クリック化学を用いて共有結合的に連結することができる。一部の実施形態において、ガイド部分は、トリアゾールリンカーを用いて共有結合的に連結することができる。一部の実施形態において、ガイド部分は、高度に安定したトリアゾールリンカーを生じさせるアルキン及びアジドが関わるヒュスゲン１，３−双極性環化付加反応を用いて共有結合的に連結することができる（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ（２０１５）１７：１８０９−１８１２；国際公開第２０１６／１８６７４５号パンフレット）。一部の実施形態において、ガイド部分は、５’−ヘキシン部分と３’−アジド部分とのライゲーションにより共有結合的に連結することができる。一部の実施形態において、５’−ヘキシンガイド部分及び３’−アジドガイド部分のいずれか一方又は両方を２’−アセトキシエチルオルトエステル（２’−ＡＣＥ）基で保護することができ、これは、続いてダーマコン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）プロトコルを用いて取り除くことができる（Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９８）１２０：１１８２０−１１８２１；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（２０００）３１７：３−１８）。
一部の実施形態において、ガイド部分は、スペーサー、アタッチメント、バイオコンジュゲート、発色団、レポーター群、色素標識ＲＮＡ及び天然に存在しないヌクレオチド類似体などの部分を含むリンカー（例えば、非ヌクレオチドループ）を介して共有結合的に連結することができる。より具体的には、本発明の目的に好適なスペーサーとしては、限定されないが、ポリエーテル類（例えば、ポリエチレングリコール類、多価アルコール類、ポリプロピレングリコール又はエチレンとプロピレングリコール類との混合物）、ポリアミン基（例えば、スペンニン（ｓｐｅｎｎｉｎｅ）、スペルミジン及びそのポリマー誘導体）、ポリエステル類（例えば、ポリ（アクリル酸エチル））、ポリホスホジエステル類、アルキレン類及びこれらの組み合わせが挙げられる。好適なアタッチメントとしては、限定されないが、蛍光標識など、リンカーに追加的な特性を加えるためリンカーに加えることのできる任意の部分が挙げられる。好適なバイオコンジュゲートとしては、限定されないが、ペプチド、グリコシド、脂質、コレステロール、リン脂質、ジアシルグリセロール類及びジアルキルグリセロール類、脂肪酸、炭化水素、酵素基質、ステロイド類、ビオチン、ジゴキシゲニン、炭水化物、多糖が挙げられる。好適な発色団、レポーター群及び色素標識ＲＮＡとしては、限定されないが、フルオレセイン及びローダミンなどの蛍光色素、化学発光、電気化学発光及び生物発光マーカー化合物が挙げられる。２つのＲＮＡ成分をコンジュゲートする例示的なリンカーの設計についても国際公開第２００４／０１５０７５号パンフレットに記載されている。
リンカー（例えば、非ヌクレオチドループ）は、任意の長さであり得る。一部の実施形態において、リンカーは、約０〜１６ヌクレオチドに等しい長さを有する。一部の実施形態において、リンカーは、約０〜８ヌクレオチドに等しい長さを有する。一部の実施形態において、リンカーは、約０〜４ヌクレオチドに等しい長さを有する。一部の実施形態において、リンカーは、約２ヌクレオチドに等しい長さを有する。例示的なリンカー設計については、国際公開第２０１１／００８７３０号パンフレットにも記載されている。
一部の実施形態において、相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上であるか又はそれより高い。最適アラインメントは、配列のアラインメントに好適な任意のアルゴリズムを用いて決定することができ、その非限定的な例としては、スミス−ウォーターマンアルゴリズム、ニードルマン−ブンシュアルゴリズム、バローズ−ホイーラー変換に基づくアルゴリズム（例えば、バローズ・ホイーラーアライナー）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍにおいて利用可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。ガイド配列（ＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ内にある）が標的核酸配列への核酸ターゲティング複合体の配列特異的結合を導く能力は、任意の好適なアッセイによって評価し得る。例えば、核酸ターゲティング複合体を形成するのに十分なＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ｂ系の構成成分が、試験しようとするガイド配列を含め、対応する標的核酸配列を有する宿主細胞に、核酸ターゲティング複合体の構成成分をコードするベクターのトランスフェクションによるなどして提供され得、続いて本明細書に記載されるとおりのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどにより、標的核酸配列内における優先的なターゲティング（例えば、切断）を評価し得る。同様に、標的核酸配列の切断は、標的核酸配列、試験しようとするガイド配列を含めた核酸ターゲティング複合体の構成成分及び供試ガイド配列と異なる対照ガイド配列を提供して、それらの供試ガイド配列と対照ガイド配列との反応間で標的配列における結合又は切断速度を比較することにより、試験管内で判定することができる。他のアッセイも可能であり、当業者には想起されるであろう。ガイド配列、従ってＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、任意の標的核酸配列を標的化するように選択し得る。標的配列は、ＤＮＡであり得る。標的配列は、任意のＲＮＡ配列であり得る。一部の実施形態において、標的配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プレｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）及び小さい細胞質ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）からなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。一部の好ましい実施形態において、標的配列は、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ及びｒＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。一部の好ましい実施形態において、標的配列は、ｎｃＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。一部のより好ましい実施形態において、標的配列はｍＲＮＡ分子又はプレｍＲＮＡ分子内の配列であり得る。
一部の実施形態において、ＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、ＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ内の二次構造度が低下するように選択される。一部の実施形態において、ＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡのヌクレオチドのうち、最適に折り畳まれたとき自己相補性塩基対合に関与するのは、約７５％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％以下であるか又はそれより少ない。最適な折り畳みは、任意の好適なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによって決定し得る。一部のプログラムは最小ギブズ自由エネルギーの計算に基づく。かかる１つのアルゴリズムの例は、Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３−１４８）により記載されるとおりのｍＦｏｌｄである。別の例示的な折り畳みアルゴリズムは、ウィーン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙにおいて開発された、セントロイド構造予測アルゴリズムを用いるオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３−２４；及びＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１−６２を参照されたい）。
特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列とガイド配列又はスペーサー配列とを含むか、それから本質的になるか又はそれからなり得る。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、ガイド配列又はスペーサー配列に融合又は連結したダイレクトリピート配列を含むか、それから本質的になるか又はそれからなり得る。特定の実施形態において、ダイレクトリピート配列はガイド配列又はスペーサー配列の上流（即ち５’側）に位置し得る。他の実施形態において、ダイレクトリピート配列はガイド配列又はスペーサー配列の下流（即ち３’側）に位置し得る。他の実施形態において、複数のＤＲ（デュアルＤＲなど）が存在し得る。
特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ステムループ、好ましくは単一のステムループを含む。特定の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、ステムループ、好ましくは単一のステムループを形成する。
特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長さは、１５〜３５ｎｔである。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長さは、少なくとも１５ヌクレオチドである。特定の実施形態において、スペーサー長さは、１５〜１７ｎｔ、例えば１５、１６又は１７ｎｔ、１７〜２０ｎｔ、例えば１７、１８、１９又は２０ｎｔ、２０〜２４ｎｔ、例えば２０、２１、２２、２３又は２４ｎｔ、２３〜２５ｎｔ、例えば２３、２４又は２５ｎｔ、２４〜２７ｎｔ、例えば２４、２５、２６又は２７ｎｔ、２７〜３０ｎｔ、例えば２７、２８、２９又は３０ｎｔ、３０〜３５ｎｔ、例えば３０、３１、３２、３３、３４若しくは３５ｎｔ又は３５ｎｔ以上である。
「ｔｒａｃｒＲＮＡ」配列又は類似の用語は、ハイブリダイズするのに十分なｃｒＲＮＡ配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列を含む。一般に、相補性の程度は、２つの配列のうちの短い方の長さに沿ったｓｃａ配列とｔｒａｃｒ配列との最適アラインメントに関する。最適アラインメントは、任意の好適なアラインメントアルゴリズムによって決定され得、ｓｃａ配列又はｔｒａｃｒ配列のいずれかの範囲内における自己相補性など、二次構造を更に考慮し得る。一部の実施形態において、最適にアラインメントしたときの２つのうちの短い方の長さに沿ったｔｒａｃｒ配列とｓｃａ配列との間の相補性の程度は、約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上又はそれより高い。特定の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡは、不要であり得る。実際、バージイエラ・ズーヘルカム（Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ）及びそのオルソログからのＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、ＲＮＡ標的の切断を確実にするのにｔｒａｃｒＲＮＡが不要である。
更に詳細には、ＲＮＡ標的に関するアッセイは、以下のとおりであり、但し、直接認識するにはＰＡＭ配列が必要である。このアッセイでは、２つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を使用する。一方は、細菌株由来の内因性エフェクタータンパク質遺伝子座をコードするプラスミドを有する。他方の株は空のプラスミドを有する（例えば、ｐＡＣＹＣ１８４、対照株）。可能な全ての７又は８ｂｐ ＰＡＭ配列を抗生物質耐性プラスミド（アンピシリン耐性遺伝子を有するｐＵＣ１９）に提供する。ＰＡＭは、プロトスペーサー１（内因性エフェクタータンパク質遺伝子座における第１のスペーサーに対するＲＮＡ標的）の配列の隣りに位置する。２つのＰＡＭライブラリをクローニングした。一方は、プロトスペーサーの５’側に８ランダムｂｐ（例えば、合計６５５３６個の異なるＰＡＭ配列＝複雑性）を有する。他方のライブラリは、プロトスペーサーの３’側に７ランダムｂｐを有する（例えば、複雑性の合計は、１６３８４個の異なるＰＡＭである）。両方のライブラリをクローニングすると、可能性のある１ＰＡＭ当たり平均５００個のプラスミドを有することになった。試験株及び対照株に別個の形質転換で５’ＰＡＭ及び３’ＰＡＭライブラリを形質転換し、形質転換細胞を別々にアンピシリンプレートに播いた。プラスミドによる認識及び続く切断／干渉によって細胞はアンピシリンに対して脆弱になり、成長が妨げられる。形質転換の約１２時間後、試験株及び対照株によって形成された全てのコロニーを回収し、プラスミドＲＮＡを単離した。プラスミドＲＮＡを鋳型として使用してＰＣＲ増幅し、続いてディープシーケンシングを行った。非形質転換ライブラリ中の全てのＰＡＭの表現が、形質転換細胞におけるＰＡＭの予想される表現を示した。対照株に見られる全てのＰＡＭの表現が、実際の表現を示した。試験株における全てのＰＡＭの表現が、どのＰＡＭが酵素によって認識されないかを示したと共に、対照株との比較により、枯渇したＰＡＭの配列を抽出することが可能である。詳細な実施形態において、ＲＮＡ切断などの切断は、ＰＡＭ依存性でない。実際、バージイエラ・ズーヘルカム（Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ）エフェクタータンパク質及びそのオルソログについて、ＲＮＡ標的切断は、ＰＡＭ非依存性であるものと見られ、従って、本発明の表１のＣａｓ１３ｂは、ＰＡＭ非依存的に作用し得る。
毒性及びオフターゲット効果を最小限に抑えるため、送達されるＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡの濃度を制御することが重要となり得る。核酸ターゲティングガイドＲＮＡの最適濃度は、細胞モデル又は非ヒト真核動物モデルにおける種々の濃度の試験及びディープシーケンシングを用いた潜在的なオフターゲットゲノム遺伝子座における改変の程度の分析によって決定することができる。インビボ送達には、最も高いレベルのオンターゲット改変をもたらす一方、オフターゲット改変レベルを最小限に抑える濃度が選択されるべきである。ＲＮＡターゲティング系は、有利には、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ｂ系から送達される。一部の実施形態において、ＲＮＡターゲティング系の１つ以上のエレメントは、本明細書において考察するとおりの表１のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質系の内因性ＲＮＡターゲティング系を含む特定の生物から送達される。
用語「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書では「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とも称される）及び「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書では「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とも称される）は、当該技術分野において周知である。更なる指針として、本明細書で使用されるとおりのタンパク質の「ホモログ」は、それがそのホモログであるタンパク質と同じ又は同様の機能を果たす同じ種のタンパク質である。しかし、ホモログタンパク質は、構造上関係がなくてもよく、又は構造上部分的にのみ関係している。本明細書で使用されるとおりのタンパク質の「オルソログ」は、それがそのオルソログであるタンパク質と同じ又は同様の機能を果たす異なる種のタンパク質である。しかし、オルソログタンパク質は、構造上関係がなくてもよく、又は構造上部分的にのみ関係している。詳細な実施形態において、本明細書において言及されるとおりのＣａｓ１３ｂタンパク質のホモログ又はオルソログは、以下の表１に示されるＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％などの配列相同性又は同一性を有する。好ましい実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、表１に同定される生物又はその生物が属する属のもの又はそれ由来であり得る。
幾つものＣａｓ１３ｂオルソログが共通のモチーフによって特徴付けられることが分かっている。従って、詳細な実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、ＤＫＨＸＦＧＡＦＬＮＬＡＲＨＮ（配列番号ＸＸ）、ＧＬＬＦＦＶＳＬＦＬＤＫ（配列番号ＸＸ）、ＳＫＩＸＧＦＫ（配列番号ＸＸ）、ＤＭＬＮＥＬＸＲＣＰ（配列番号ＸＸ）、ＲＸＺＤＲＦＰＹＦＡＬＲＹＸＤ（配列番号ＸＸ）及びＬＲＦＱＶＢＬＧＸＹ（配列番号ＸＸ）からなる配列の１つ以上と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むタンパク質である。更なる詳細な実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、これらの配列の少なくとも２、３、４、５つ又は６つ全てと少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。更なる詳細な実施形態において、これらの配列との配列同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％である。更なる詳細な実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、ＧＬＬＦＦＶＳＬＦＬ（配列番号ＸＸ）及びＲＨＱＸＲＦＰＹＦ（配列番号ＸＸ）と１００％の配列同一性を有する配列を含むタンパク質である。更なる詳細な実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクターは、ＲＨＱＤＲＦＰＹ（配列番号ＸＸ）と１００％の配列同一性を有する配列を含むＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質である。
詳細な実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、プレボテラ・ブッカエ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｕｃｃａｅ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プレボテラ・サッカロリティカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）、リエメレラ・アナティペステイファー（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ）からのＣａｓ１３ｂタンパク質と少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれを超える配列同一性を有するＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質である。更なる詳細な実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクターは、バクテロイデス・ピオゲネス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）ＭＡ２０１６、リエメレラ・アナティペステイファー（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ）、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）及びポルフィロモナス属種（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＣＯＴ−０５２ＯＨ４９４６からのＣａｓ１３ｂタンパク質から選択される。
本発明の範囲内にあり得る表１のＣａｓ１３ｂ酵素のオルソログには、表１のＣａｓ１３ｂ酵素の複数のオルソログの断片を含むキメラ酵素が含まれ得ることが理解されるであろう。かかるオルソログの例は、本明細書の他の部分に記載される。キメラ酵素は、表１のＣａｓ１３ｂ酵素の断片と、限定されないが、バージイエラ属（Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）、リエメレラ属（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ）、ミロイデス属（Ｍｙｒｏｉｄｅｓ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、キャプノサイトファーガ属（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）、クリセオバクテリウム属（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フェオダクチリバクター属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｉｂａｃｔｅｒ）、パルディバクター属（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ）又はサイクロフレクサス属（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ）を含む生物の表１のＣａｓ１３ｂ酵素のオルソログなど、別のＣＲＩＳＰＲ酵素からの断片とを含み得る。キメラ酵素は、第１の断片と第２の断片とを含むことができ、これらの断片は、ここで、第１及び第２の断片の一方が表１のＣａｓ１３ｂ酵素のもの又はそれ由来であり、他方の断片が異なる種のＣＲＩＳＰＲ酵素オルソログのもの又はそれ由来である。
実施形態において、本明細書において言及されるＣａｓ１３ｂ ＲＮＡターゲティングＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、エフェクタータンパク質の機能変異体又はそのホモログ若しくはオルソログも包含する。タンパク質の「機能変異体」は、本明細書で使用されるとき、そのタンパク質の活性を少なくとも部分的に保持しているかかるタンパク質の変異体を指す。機能変異体には、本明細書で表１と併せて考察するとおりのものを含め、多型等を含めた突然変異体（これは、挿入、欠失又は置換突然変異体であり得る）が含まれ得る。また、機能変異体の範囲内には、かかるタンパク質と、別の、通常、無関係の核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドとの融合産物も含まれる。機能変異体は、天然に存在するものであり得、又は人工的なものであり得る。ある実施形態において、Ｃａｓ１３ｂ ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質又はそのオルソログ若しくはホモログをコードする核酸分子は、真核細胞での発現にコドン最適化され得る。真核生物は、本明細書で考察するとおりであり得る。核酸分子は、エンジニアリングされたもの又は天然に存在しないものであり得る。
ある実施形態において、Ｃａｓ１３ｂ ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質又はそのオルソログ若しくはホモログは、１つ以上の突然変異を含み得る。突然変異は、人工的に導入された突然変異であり得、限定されないが、触媒ドメインにおける１つ以上の突然変異を含み得、例えばＨＥＰＮドメインの１つ以上に１つ以上の突然変異が導入される。
ある実施形態において、Ｃａｓ１３ｂタンパク質又はそのオルソログ若しくはホモログは、機能ドメインに融合した又はそれに作動可能に連結された汎用核酸結合タンパク質として使用され得る。例示的機能ドメインとしては、限定されないが、翻訳開始因子、翻訳活性化因子、翻訳抑制因子、ヌクレアーゼ、詳細にはリボヌクレアーゼ、スプライソソーム、ビーズ、光誘導可能／制御可能ドメイン又は化学誘導可能／制御可能ドメインを挙げることができる。
一部の実施形態において、非改変ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質（Ｃａｓ１３ｂ）は、切断活性を有し得る。一部の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂは、標的配列内及び／又は標的配列の相補体内にあるか又は標的配列に関連する配列、例えば標的配列の最初又は最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００又はそれを超える塩基対以内にある配列における位置など、標的配列の又はその近傍にある位置における１つ又は２つの核酸鎖の切断を導き得る。一部の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂタンパク質は、標的配列内及び／又は標的配列の相補体内にあるか又は標的配列に関連する配列及び／又は標的配列の最初又は最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００又はそれを超える塩基対以内にある配列における１つ又は２つの鎖の２つ以上の切断（１、２、３、４、５つ又はそれを超える切断など）を導き得る。一部の実施形態において、切断は、平滑型であり、即ち平滑末端を生じ得る。一部の実施形態において、切断は、付着型であり、即ち付着末端を生じ得る。一部の実施形態において、ベクターは、対応する野生型酵素と比べて突然変異し得る核酸ターゲティングＣａｓ１３ｂタンパク質をコードし、そのため、突然変異型核酸ターゲティングＣａｓ１３ｂタンパク質は、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの１つ又は２つの鎖を切断する能力を欠くことになり、例えば、突然変異酵素のＲＮＡ切断活性は、非突然変異型の酵素の核酸切断活性の約２５％以下、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％又はそれ未満である。一例は、突然変異型の核酸切断活性が非突然変異型と比較したときにゼロ又は無視できる程度の場合であり得る。由来するとは、本出願人らは、由来酵素が野生型酵素と高度な配列相同性を有するという意味で概して野生型酵素をベースとするが、しかし、それは、当該技術分野において公知のとおりの又は本明細書に記載されるとおりの何らかの方法で突然変異している（改変されている）ことを意味する。
典型的には、内因性ＲＮＡターゲティング系に関連して、ＲＮＡターゲティング複合体の形成（標的配列にハイブリダイズし、且つ１つ以上のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質と複合体を形成したガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡを含む）は、標的配列内に又はその近傍に（例えば、それから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０塩基対又はそれを超える範囲内に）ＲＮＡ鎖の切断をもたらす。本明細書で使用されるとき、用語「目的の標的遺伝子座と会合した配列」は、標的配列付近の近傍（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０塩基対又はそれを超える範囲内、ここで、標的配列は、目的の標的遺伝子座内に含まれる）にある配列を指す。
コドン最適化された配列の例は、この場合、真核生物、例えばヒトでの発現に最適化されるか（即ちヒトでの発現に最適化されている）、又は別の本明細書で考察されるとおりの真核生物、動物又は哺乳動物に最適化された配列である；例えば、コドン最適化配列の例として国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６６７号明細書）のＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照されたい（当該技術分野及び本開示における知識から、特にエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１３ｂ）に関して、コード核酸分子のコドン最適化は当業者の範囲内にある）。これが好ましいが、他の例が可能であることが理解され、ヒト以外の宿主種に対するコドン最適化又は特定の器官に対するコドン最適化が公知である。一部の実施形態において、ＲＮＡターゲティングＣａｓ１３ｂタンパク質をコードする酵素コード配列が、特定の細胞、例えば真核細胞での発現にコドン最適化される。真核細胞は、特定の生物、例えば、限定されないが、ヒトを含めた哺乳動物又は本明細書で考察されるとおりの非ヒト真核生物又は動物又は哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜又は非ヒト哺乳動物又は霊長類のものであるか又はそれに由来し得る。一部の実施形態において、ヒト又は動物に対するいかなる実質的な医学的利益もなくそれらに苦痛を生じさせる可能性のあるヒトの生殖細胞系列遺伝子アイデンティティの改変方法及び／又は動物の遺伝子アイデンティティの改変方法、更にかかる方法から得られる動物は除外され得る。一般に、コドン最適化とは、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０個以上又はそれより多いコドン）を、天然のアミノ酸配列を維持しつつ、その宿主細胞の遺伝子においてより高頻度で又は最も高頻度で使用されるコドンに置き換えることにより、目的の宿主細胞における発現を増強するための核酸配列の改変方法を指す。様々な種が、特定のアミノ酸のあるコドンについて特定のバイアスを呈する。コドンバイアス（生物間でのコドン使用の違い）は、多くの場合にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関し、次に、それが、数ある中でも特に、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞において選択のｔＲＮＡが優勢であることは、概して、ペプチド合成で最も高頻度に使用されるコドンを反映するものである。従って、コドン最適化に基づいて所与の生物における最適な遺伝子発現に合わせて遺伝子を調整することができる。コドン使用表が、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で利用可能な「コドン使用データベース」で容易に利用可能であり、これらの表を幾つもの方法で適合させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。特定の配列を特定の宿主細胞における発現にコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも利用可能であり、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）なども利用可能である。一部の実施形態において、ＤＮＡ／ＲＮＡターゲティングＣａｓタンパク質をコードする配列中の１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０以上又は全てのコドン）が、特定のアミノ酸について最も高頻度に使用されるコドンに対応する。
（ｉ）Ｃａｓ１３ｂ若しくはそれをコードする核酸分子又は（ｉｉ）ｃｒＲＮＡは、別々に送達することができ；及び有利には、（ｉ）及び（ｉｉ）の一方の少なくとも一方又は両方、例えばアセンブルした複合体は、粒子又はナノ粒子複合体によって送達される。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質に発現する時間を与えるため、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡをＲＮＡ−ターゲティングガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡより先に送達することができる。ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質（Ｃａｓ１３ｂ）ｍＲＮＡは、ＲＮＡ−ターゲティングガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡの投与の１〜１２時間前（好ましくは約２〜６時間前）に投与され得る。或いは、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及びＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、一緒に投与され得る。有利には、ＲＮＡターゲティングエフェクター（Ｃａｓ１３ｂ）タンパク質ｍＲＮＡ＋ガイドＲＮＡの初回投与から１〜１２時間後（好ましくは約２〜６時間後）にガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡの第２のブースター用量が投与され得る。ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及び／又はガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡの追加投与は、最も効率的なゲノム改変レベルを達成するのに有用であり得る。
一態様において、本発明は、ＲＮＡターゲティング系の１つ以上のエレメントの使用方法を提供する。本発明のＲＮＡターゲティング複合体は、一本鎖若しくは二本鎖、直鎖又は超コイルの標的ＲＮＡを改変する有効な手段を提供する。本発明のＲＮＡターゲティング複合体は、非常に多数の細胞型における標的ＲＮＡの改変（例えば、欠失、挿入、転位、不活性化、活性化）を含め、多岐にわたる有用性を有する。このように本発明のＲＮＡターゲティング複合体は、例えば、遺伝子療法、薬物スクリーニング、疾患診断及び予後判定において、広範な適用性を有する。例示的ＲＮＡターゲティング複合体は、目的の標的遺伝子座内の標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡと複合体を形成したＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を含む。
一実施形態において、本発明は、標的ＲＮＡを切断する方法を提供する。本方法は、標的ＲＮＡに結合して前記標的ＤＮＡの切断を生じさせるＲＮＡターゲティング複合体を用いて標的ＲＮＡを改変するステップを含み得る。ある実施形態において、本発明のＲＮＡターゲティング複合体は、細胞に導入されると、ＲＮＡ配列に切断（例えば、一本鎖又は二本鎖切断）を作り出し得る。例えば、本方法を用いて細胞内の疾患ＲＮＡを切断することができる。例えば、組み込もうとする配列に上流配列及び下流配列が隣接した外因性ＲＮＡ鋳型が細胞に導入され得る。これらの上流及び下流配列は、ＲＮＡにおける組込み部位の両側と配列類似性を共有している。必要に応じて、ドナーＲＮＡはｍＲＮＡであり得る。外因性ＲＮＡ鋳型は、組み込もうとする配列（例えば、突然変異型ＲＮＡ）を含む。組込み配列は、細胞にとって内因性又は外因性の配列であり得る。組み込もうとする配列の例としては、タンパク質をコードするＲＮＡ又は非コードＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）が挙げられる。従って、組込み配列は、適切な制御配列に作動可能に連結され得る。或いは、組込み配列が調節機能を提供し得る。外因性ＲＮＡ鋳型中の上流及び下流配列は、目的のＲＮＡ配列とドナーＲＮＡとの間の組換えを促進するように選択される。上流配列は、標的組込み部位の上流のＲＮＡ配列と配列類似性を共有するＲＮＡ配列である。同様に、下流配列は、標的組込み部位の下流のＲＮＡ配列と配列類似性を共有するＲＮＡ配列である。外因性ＲＮＡ鋳型中の上流及び下流配列は、標的ＲＮＡ配列と７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有し得る。好ましくは、外因性ＲＮＡ鋳型中の上流及び下流配列は、標的ＲＮＡ配列と約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。一部の方法において、外因性ＲＮＡ鋳型中の上流及び下流配列は、標的ＲＮＡ配列と約９９％又は１００％の配列同一性を有する。上流又は下流配列は、約２０ｂｐ〜約２５００ｂｐ、例えば約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００又は２５００ｂｐを含み得る。一部の方法において、例示的上流又は下流配列は、約２００ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約１０００ｂｐ又はより詳細には約７００ｂｐ〜約１０００ｂｐを有する。一部の方法において、外因性ＲＮＡ鋳型は、マーカーを更に含み得る。かかるマーカーは、標的組込みのスクリーニングを容易にし得る。好適なマーカーの例としては、制限部位、蛍光タンパク質又は選択可能マーカーが挙げられる。本発明の外因性ＲＮＡ鋳型は組換え技術を用いて構築することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６を参照されたい）。外因性ＲＮＡ鋳型を組み込むことによる標的ＲＮＡの改変方法では、核酸ターゲティング複合体によってＲＮＡ配列に切断（例えば、二本鎖若しくは一本鎖又はＲＮＡにおける二本鎖若しくは一本鎖切断）が導入され、外因性ＲＮＡ鋳型との相同組換えによってこの切断が修復されると、鋳型がＲＮＡ標的に組み込まれる。二本鎖切断の存在が鋳型の組込みを促進する。他の実施形態において、本発明は、真核細胞におけるＲＮＡの発現を改変する方法を提供する。本方法は、ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡ）に結合する核酸ターゲティング複合体を用いて標的ポリヌクレオチドの発現を増加又は減少させるステップを含む。一部の方法では、標的ＲＮＡを不活性化させて細胞の発現の改変を生じさせることができる。例えば、ＲＮＡターゲティング複合体が細胞内の標的配列に結合すると、標的ＲＮＡが不活性化され、そのためその配列は翻訳されないか、コードされたタンパク質が産生されないか、又は配列が野生型配列のようには機能しなくなる。例えば、タンパク質又はマイクロＲＮＡをコードする配列を不活性化して、タンパク質又はマイクロＲＮＡ又はプレマイクロＲＮＡ転写物が産生されないようにし得る。ＲＮＡターゲティング複合体の標的ＲＮＡは、真核細胞にとって内因性又は外因性の任意のＲＮＡであり得る。例えば、標的ＲＮＡは、真核細胞の核に存在するＲＮＡであり得る。標的ＲＮＡは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列（例えば、ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡ）又は非コード配列（例えば、ｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ又はｒＲＮＡ）であり得る。標的ＲＮＡの例としては、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列、例えば生化学的シグナル伝達経路関連ＲＮＡが挙げられる。標的ＲＮＡの例としては、疾患関連ＲＮＡが挙げられる。「疾患関連」ＲＮＡは、非疾患対照の組織又は細胞と比較して罹患組織に由来する細胞において翻訳産物を異常なレベルで又は異常な形態で産生している任意のＲＮＡを指す。それは、異常に高いレベルで発現するようになる遺伝子から転写されるＲＮＡであり得；それは、異常に低いレベルで発現するようになる遺伝子から転写されるＲＮＡであり得、ここで、発現の変化は、疾患の発生率及び／又は進行と相関する。疾患関連ＲＮＡは、疾患の病因に直接関与するか、又はそれに関与する遺伝子との連鎖不平衡がある突然変異又は遺伝的変異を有する遺伝子から転写されるＲＮＡも指す。翻訳産物は既知であっても又は未知であり得、及び正常レベルであっても又は異常レベルであり得る。ＲＮＡターゲティング複合体の標的ＲＮＡは、真核細胞にとって内因性又は外因性の任意のＲＮＡであり得る。例えば、標的ＲＮＡは、真核細胞の核に存在するＲＮＡであり得る。標的ＲＮＡは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列（例えば、ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡ）又は非コード配列（例えば、ｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ又はｒＲＮＡ）であり得る。
一部の実施形態において、本方法は、ＲＮＡターゲティング複合体を標的ＲＮＡに結合させて前記標的ＲＮＡ又はＲＮＡの切断を生じさせ、それにより標的ＲＮＡを改変するステップを含むことができ、ここで、ＲＮＡターゲティング複合体は、前記標的ＲＮＡ内の標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクター（Ｃａｓ１３ｂ）タンパク質を含む。一態様において、本発明は、真核細胞におけるＲＮＡの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、ＲＮＡターゲティング複合体をＲＮＡに結合させて、前記結合により前記ＲＮＡの発現の増加又は減少を生じさせるステップを含み、ここで、ＲＮＡターゲティング複合体は、ガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクター（Ｃａｓ１３ｂ）タンパク質を含む。標的ＲＮＡを改変する方法は、真核細胞におけるものであり得、これは、インビボ、エキソビボ又はインビトロであり得る。一部の実施形態において、本方法は、ヒト又は非ヒト動物から細胞又は細胞集団を試料採取するステップ及び細胞を改変するステップを含む。培養は、任意の段階においてエキソビボで行われ得る。この細胞が、更に非ヒト動物又は植物に再導入され得る。再導入される細胞について、細胞は幹細胞であることが特に好ましい。
２つの異なるアプタマー（各々が個別のＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡと会合している）を用いると、アクチベーター−アダプタータンパク質融合物及びリプレッサー−アダプタータンパク質融合物を異なるＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡと共に使用して、１つのＲＮＡの発現を活性化する一方で別のＤＮＡ又はＲＮＡの発現を抑制することが可能になる。これらは、その異なるガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡと共に、多重化手法で一緒に又は実質的に一緒に投与することができる。比較的少数のエフェクタータンパク質分子を多数の改変ガイドと共に使用することができるため、例えば１０又は２０又は３０個など、多数のかかる改変されたＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡを全て同時に使用し得る一方、１つのみの（又は少なくとも最小数の）エフェクタータンパク質（Ｃａｓ１３ｂ）分子を送達するのみで十分である。アダプタータンパク質は、１つ以上のアクチベーター又は１つ以上のリプレッサーと会合（好ましくは連結又は融合）し得る。例えば、アダプタータンパク質は第１のアクチベーター及び第２のアクチベーターと会合し得る。第１及び第２のアクチベーターは、同じであり得るが、これらは、好ましくは、異なるアクチベーターである。３つ以上又は更に４つ以上のアクチベーター（又はリプレッサー）を使用し得るが、しかし、パッケージサイズにより、個数が５を超える異なる機能ドメインとなることは制限され得る。アダプタータンパク質との直接的な融合と比べて、好ましくはリンカーが用いられ、ここで、２つ以上の機能ドメインがアダプタータンパク質と会合する。好適なリンカーとしてはＧｌｙＳｅｒリンカーを挙げることができる。
ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質−ガイドＲＮＡ複合体が全体として２つ以上の機能ドメインと会合し得ることも想定される。例えば、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質と会合した２つ以上の機能ドメインがあり得、又はガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡと（１つ以上のアダプタータンパク質を介して）会合した２つ以上の機能ドメインがあり得、又はＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質と会合した１つ以上の機能ドメイン及びガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡと（１つ以上のアダプタータンパク質を介して）会合した１つ以上の機能ドメインがあり得る。
アダプタータンパク質とアクチベーター又はリプレッサーとの間の融合は、リンカーを含み得る。例えば、ＧｌｙＳｅｒリンカーＧＧＧＳを使用することができる。これらを３個（（ＧＧＧＧＳ）３）又は６個、９個又は更に１２個又はそれを超える反復で使用することにより、必要に応じて好適な長さを提供することができる。リンカーは、ガイドＲＮＡと機能ドメイン（アクチベーター又はリプレッサー）との間又は核酸ターゲティングエフェクタータンパク質と機能ドメイン（アクチベーター又はリプレッサー）との間に使用することができる。リンカー、使用者は適切な量の「機械的柔軟性」を操作する。
Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質複合体は、機能エフェクターを送達することができる
突然変異によってＲＮＡレベルで発現を消失させるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ｂ媒介性ノックアウトと異なり、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ｂノックダウンは、人工転写因子を用いて遺伝子発現を一時的に低下させることが可能であり、例えばＣａｓ１３ｂタンパク質の切断ドメインにある残基の突然変異により、触媒不活性Ｃａｓ１３ｂタンパク質が生成される。触媒不活性Ｃａｓ１３ｂ複合体は、ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡと複合体を形成し、そのガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡのターゲティングドメインによって特定されるＲＮＡ配列に局在化するが、しかしながら、これは、標的を切断しない。不活性Ｃａｓ１３ｂタンパク質をエフェクタードメイン、例えば転写抑制ドメインと融合させると、ガイドＲＮＡによって特定される任意の部位にそのエフェクターをリクルートすることが可能になる。
最適化された機能性ＲＮＡターゲティング系
ある態様において、従って、本発明は、機能性構成成分をＲＮＡ環境に特異的に送達するための系を提供する。これは、ＲＮＡへの種々の構成成分の特異的ターゲティングを可能にする本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質（表１のＣａｓ１３ｂ）を含むＣＲＩＳＰＲ系を使用して確実にすることができる。より詳細には、かかる構成成分には、ＲＮＡ翻訳、分解等のアクチベーター又はリプレッサーなど、アクチベーター又はリプレッサーが含まれる。
一態様によれば、本発明は、細胞の目的の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を提供し、ここで、ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、アダプタータンパク質に結合する１つ以上の個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変される。詳細な実施形態において、ＲＮＡ配列は、２つ以上のアダプタータンパク質に結合し得（例えば、アプタマー）、ここで、各アダプタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインと会合されている。２つ以上の機能ドメインがあるとき、それらの機能ドメインは、同じであるか又は異なり得、例えば同じ２つの又は２つの異なるアクチベーター又はリプレッサーであり得る。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、１つ以上の機能ドメインがＲＮＡターゲティング酵素に付加されているため、機能ドメインは、標的ＲＮＡへの結合時、機能ドメインがその帰属機能で機能することが可能な空間的配置となる。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここで、組成物は、少なくとも３つの機能ドメインであって、そのうちの少なくとも１つがＲＮＡターゲティング酵素と会合し、且つそのうちの少なくとも２つがｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡと会合されている、少なくとも３つの機能ドメインを有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ｂ複合体を含む。
Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質複合体又はその構成成分の送達
本開示及び当該技術分野における知識から、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はその構成成分又はその核酸分子（例えば、ＨＤＲ鋳型を含む）又はその構成成分をコードし又は提供する核酸分子は、本明細書に概略的にも詳細にも記載される送達系によって送達し得る。
ベクター送達、例えばプラスミド、ウイルス送達：ＣＲＩＳＰＲ酵素及び／又は任意の本ＲＮＡ、例えばガイドＲＮＡは、任意の適切なベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクター、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス若しくは他の種類のウイルスベクター又はこれらの組み合わせを用いて送達することができる。エフェクタータンパク質及び１つ以上のガイドＲＮＡを１つ以上のベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターにパッケージングすることができる。一部の実施形態において、ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターは、例えば、筋肉注射によって目的の組織に送達される一方、送達は、静脈内、経皮、鼻腔内、口腔、粘膜又は他の送達方法によることもある。かかる送達は単回投与又は複数回投与によるものであり得る。当業者は、本明細書で送達される実際の投薬量が、ベクターの選択、標的細胞、生物又は組織、治療する対象の全身状態、求められる形質転換／改変の程度、投与経路、投与様式、求められる形質転換／改変の種類など、種々の要因に応じて大きく異なり得ることを理解する。
かかる用量は、例えば、担体（水、生理食塩水、エタノール、グリセロール、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油など）、希釈剤、薬学的に許容可能な担体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、薬学的に許容可能な賦形剤及び／又は当該技術分野で公知の他の化合物を更に含み得る。投薬量は、１つ以上の薬学的に許容可能な塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩を更に含み得る。加えて、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質、ゲル又はゲル化物質、香料、着色剤、ミクロスフェア、ポリマー、懸濁剤などの補助物質もこの中に存在し得る。加えて、１つ以上の他の従来の医薬成分、例えば防腐剤、湿潤剤、懸濁剤、界面活性剤、酸化防止剤、固化防止剤、充填剤、キレート化剤、コーティング剤、化学安定剤なども、特に投薬形態が再構成可能な形態である場合に存在し得る。好適な例示的成分として、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート８０、フェニルエチルアルコール、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノール、ゼラチン、アルブミン及びこれらの組み合わせが挙げられる。薬学的に許容可能な賦形剤の徹底的な考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）（参照により本明細書に援用される）において利用可能である。
本明細書のある実施形態において、送達は、アデノウイルスを介し、これは、少なくとも１×１０５粒子（粒子単位、ｐｕとも称される）のアデノウイルスベクターを含有する単回ブースター用量であり得る。本明細書のある実施形態において、用量は、好ましくは、少なくとも約１×１０６粒子（例えば、約１×１０６〜１×１０１２粒子）、より好ましくは少なくとも約１×１０７粒子、より好ましくは少なくとも約１×１０８粒子（例えば、約１×１０８〜１×１０１１粒子又は約１×１０８〜１×１０１２粒子）及び最も好ましくは少なくとも約１×１００粒子（例えば、約１×１０９〜１×１０１０粒子又は約１×１０９〜１×１０１２粒子）又は更に少なくとも約１×１０１０粒子（例えば、約１×１０１０〜１×１０１２粒子）のアデノウイルスベクターである。或いは、用量は、約１×１０１４粒子以下、好ましくは約１×１０１３粒子以下、更により好ましくは約１×１０１２粒子以下、更により好ましくは約１×１０１１粒子以下及び最も好ましくは約１×１０１０粒子以下（例えば、約１×１０９粒子以下）を含む。従って、用量は、例えば、約１×１０６粒子単位（ｐｕ）、約２×１０６ｐｕ、約４×１０６ｐｕ、約１×１０７ｐｕ、約２×１０７ｐｕ、約４×１０７ｐｕ、約１×１０８ｐｕ、約２×１０８ｐｕ、約４×１０８ｐｕ、約１×１０９ｐｕ、約２×１０９ｐｕ、約４×１０９ｐｕ、約１×１０１０ｐｕ、約２×１０１０ｐｕ、約４×１０１０ｐｕ、約１×１０１１ｐｕ、約２×１０１１ｐｕ、約４×１０１１ｐｕ、約１×１０１２ｐｕ、約２×１０１２ｐｕ又は約４×１０１２ｐｕのアデノウイルスベクターを含む単回用量のアデノウイルスベクターを含有し得る。例えば、２０１３年６月４日に付与されたＮａｂｅｌ，ｅｔ．ａｌ．に対する米国特許第８，４５４，９７２ Ｂ２号明細書（参照によって本明細書に援用される）のアデノウイルスベクター及びその第２９欄第３６〜５８行にある投薬量を参照されたい。本明細書のある実施形態において、アデノウイルスは、複数回用量で送達される。
本明細書のある実施形態において、送達は、ＡＡＶを介する。ヒトに対するＡＡＶのインビボ送達についての治療上有効な投薬量は、約１×１０１０〜約１×１０１０の機能性ＡＡＶ／ｍｌ溶液を含有する約２０〜約５０ｍｌの生理食塩水の範囲であると考えられる。投薬量は、治療利益と任意の副作用との均衡がとれるように調整され得る。本明細書のある実施形態において、ＡＡＶ用量は、概して、約１×１０５〜１×１０５０ゲノムＡＡＶ、約１×１０８〜１×１０２０ゲノムＡＡＶ、約１×１０１０〜約１×１０１６ゲノム又は約１×１０１１〜約１×１０１６ゲノムＡＡＶの濃度範囲である。ヒト投薬量は、約１×１０１３ゲノムＡＡＶであり得る。かかる濃度は、約０．００１ｍｌ〜約１００ｍｌ、約０．０５〜約５０ｍｌ又は約１０〜約２５ｍｌの担体溶液で送達され得る。他の効果的な投薬量が、当業者により、用量反応曲線を作成するルーチンの試験を用いて容易に確立され得る。例えば、２０１３年３月２６日に付与されたＨａｊｊａｒ，ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第８，４０４，６５８ Ｂ２号明細書、第２７欄、第４５〜６０行を参照されたい。
本明細書のある実施形態において、送達は、プラスミドを介する。かかるプラスミド組成物では、投薬量は、反応を誘発するのに十分な量のプラスミドでなければならない。例えば、プラスミド組成物中のプラスミドＤＮＡの好適な分量は、個体７０ｋｇ当たり約０．１〜約２ｍｇ又は約１μｇ〜約１０μｇであり得る。本発明のプラスミドは、概して、（ｉ）プロモーター；（ｉｉ）前記プロモーターに作動可能に連結された、核酸ターゲティングＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列；（ｉｉｉ）選択可能マーカー；（ｉｖ）複製起点；及び（ｖ）（ｉｉ）の下流で（ｉｉ）に作動可能に連結された転写ターミネーターを含み得る。プラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ複合体のＲＮＡ構成成分もコードし得るが、これらの１つ以上は、代わりに異なるベクター上にコードされ得る。
本明細書の用量は、平均７０ｋｇの個体に基づく。投与頻度は医学又は獣医学の実務者（例えば、医師、獣医師）又は当該技術分野の科学者の裁量の範囲内にある。また、実験に使用されるマウスは、典型的には約２０ｇであり、マウス実験から７０ｋｇの個体にスケールアップし得ることも注記される。
一部の実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、リポソーム製剤又はリポフェクチン製剤などで送達され、当業者に周知の方法により調製することができる。かかる方法は、例えば、米国特許第５，５９３，９７２号明細書、同第５，５８９，４６６号明細書及び同第５，５８０，８５９号明細書（これらは参照により本明細書に援用される）に記載されている。特に哺乳類細胞へのｓｉＲＮＡ送達の増強及び改良を目的とした送達系が開発されており（例えば、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ ＦＥＢＳ Ｌｅｔ．２００３，５３９：１１１−１１４；Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００２，２０：１００６−１０１０；Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｖｉｓｉｏｎ．２００３，９：２１０−２１６；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００３，３２７：７６１−７６６；Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２００２，３２：１０７−１０８及びＳｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ２００３，３１，１１：２７１７−２７２４を参照されたい）、本発明に適用し得る。ｓｉＲＮＡは近年、霊長類における遺伝子発現の抑制への使用が成功しており（例えば、Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｉｎａ ２４（４）：６６０を参照されたい）、これは本発明にも適用し得る。
実際、ＲＮＡ送達は、インビボ送達の有用な方法である。リポソーム又は粒子を用いて核酸ターゲティングＣａｓタンパク質及びガイドＲＮＡ（及び例えばＨＲ修復鋳型）を細胞内に送達することが可能である。従って、核酸ターゲティングＣａｓ１３ｂタンパク質の送達及び／又は本発明のガイドＲＮＡ若しくはｃｒＲＮＡの送達は、ＲＮＡ形態で、微小胞、リポソーム又は粒子を介することができる。例えば、Ｃａｓ１３ｂ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡをインビボ送達のためにリポソーム粒子にパッケージングすることができる。リポソームトランスフェクション試薬、例えばＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのリポフェクタミン及び市販の他の試薬は、ＲＮＡ分子を肝臓に効果的に送達することができる。
同様に好ましいＲＮＡの送達手段としては、ＲＮＡのナノ粒子による送達（Ｃｈｏ，Ｓ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｓｏｎ，Ｓ．，Ｘｕ，Ｑ．，Ｙａｎｇ，Ｆ．，Ｍｅｉ，Ｙ．，Ｂｏｇａｔｙｒｅｖ，Ｓ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，“Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ”，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９：３１１２−３１１８，２０１０）又はエキソソームによる送達（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ａ．，Ｌｅｖｉｎｓ，Ｃ．，Ｃｏｒｔｅｚ，Ｃ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，“Ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２６７：９−２１，２０１０，ＰＭＩＤ：２００５９６４１）も挙げられる。実際、エキソソームは、ＲＮＡターゲティング系とある程度の類似性を有する系であるｓｉＲＮＡの送達に特に有用であることが示されている。例えば、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（“Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ”Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２ Ｄｅｃ；７（１２）：２１１２−２６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｎｏｖ １５）は、エキソソームがいかに種々の生物学的障壁を越えた薬物送達に有望なツールであるか、及びｓｉＲＮＡのインビトロ及びインビボ送達に利用できるかを記載している。その手法は、発現ベクターのトランスフェクションにより、ペプチドリガンドに融合したエキソソームタンパク質を含む標的エキソソームを作成するものである。次に、トランスフェクト細胞上清からエキソソームが精製され、特徴付けられた後、ＲＮＡがエキソソームにロードされる。本発明に係る送達又は投与はエキソソームを用いて、詳細には、限定されないが、脳に対して行うことができる。ビタミンＥ（α−トコフェロール）を核酸ターゲティングＣａｓタンパク質にコンジュゲートさせて、例えばＵｎｏ ｅｔ ａｌ．（ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２２：７１１−７１９（Ｊｕｎｅ ２０１１））によって行われた脳への低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達と同じように、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と共に脳に送達することができる。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はフリーＴｏｃｓｉＢＡＣＥ又はＴｏｃ−ｓｉＢＡＣＥ／ＨＤＬが充填され且つＢｒａｉｎ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｋｉｔ ３（Ａｌｚｅｔ）に接続された浸透圧ミニポンプ（モデル１００７Ｄ；Ａｌｚｅｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）でマウスが注入された。背側第三脳室内への注入のため、正中線上でブレグマから約０．５ｍｍ後方に脳注入カニューレが留置された。Ｕｎｏ ｅｔ ａｌ．は、ＨＤＬを含む僅か３ｎｍｏｌのＴｏｃ−ｓｉＲＮＡが、同じＩＣＶ注入法による同程度の標的の減少を誘導可能であったことを見出した。脳を標的としてＨＤＬと共投与される、α−トコフェロールにコンジュゲートされた同様の投薬量の核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を本発明においてヒトで企図することができ、例えば脳を標的とする約３ｎｍｏｌ〜約３μｍｏｌの核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を企図し得る。Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．（（ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２２：４６５−４７５（Ａｐｒｉｌ ２０１１））は、ラットの脊髄におけるインビボでの遺伝子サイレンシングのためのＰＫＣγを標的とする短鎖ヘアピンＲＮＡのレンチウイルス媒介送達方法を記載している。Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．は、１×１０９形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有する約１０μｌの組換えレンチウイルスをくも膜下カテーテルによって投与した。脳を標的とするレンチウイルスベクターにおいて発現する同様の投薬量の核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を本発明においてヒトに企図することができ、例えば１×１０９形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有するレンチウイルスにおける脳を標的とする約１０〜５０ｍｌの核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を企図し得る。
脳への局所送達に関して、これは、様々な方法で達成することができる。例えば、物質を線条体内に例えば注入によって送達することができる。注入は、開頭により定位的に行うことができる。
パッケージング及びプロモーター概要
インビボでゲノム改変を媒介するためＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質（Ｃａｓ１３ｂタンパク質）コード核酸分子、例えばＤＮＡをベクター、例えばウイルスベクターにパッケージングする方法は、以下を含む：
シングルウイルスベクター：
２つ以上の発現カセットを含むベクター：
プロモーター−核酸ターゲティングエフェクタータンパク質コード核酸分子−ターミネーター
プロモーター−ガイドＲＮＡ１−ターミネーター
プロモーター−ガイドＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター（ベクターサイズの限界まで）
ダブルウイルスベクター：
ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質（Ｃａｓ１３ｂ）の発現をドライブするための１つの発現カセットを含むベクター１
プロモーター−ＲＮＡターゲティングエフェクター（Ｃａｓ１３ｂ）タンパク質コード核酸分子−ターミネーター
１つ以上のガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡの発現をドライブするためのもう１つの発現カセットを含むベクター２
プロモーター−ガイドＲＮＡ１又はｃｒＲＮＡ−ターミネーター
プロモーター−ガイドＲＮＡ１（Ｎ）又はｃｒＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター（ベクターサイズの限界まで）。
ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質コード核酸分子発現のドライブに用いられるプロモーターには、以下が含まれ得る。
ＡＡＶ ＩＴＲはプロモーターとして役立ち得る：これは、追加のプロモーターエレメント（ベクター内で場所をとり得る）の必要性がなくなるため有利である。空いた追加のスペースを用いて、追加のエレメント（ｇＲＮＡなど）の発現をドライブすることができる。また、ＩＴＲ活性は比較的弱いため、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質の過剰発現による潜在的な毒性を低減するために用いることができる。偏在発現には、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＰＧＫ、ＳＶ４０、フェリチン重鎖又は軽鎖等のプロモーターを使用し得る。脳又は他のＣＮＳでの発現には、プロモーター：全てのニューロンのためのシナプシンＩ、興奮性ニューロンのためのＣａＭＫＩＩα、ＧＡＢＡ作動性ニューロンのためのＧＡＤ６７又はＧＡＤ６５又はＶＧＡＴ等を使用することができる。肝臓での発現には、アルブミンプロモーターを使用することができる。肺での発現には、ＳＰ−Ｂを使用することができる。内皮細胞には、ＩＣＡＭを使用することができる。造血細胞には、ＩＦＮβ又はＣＤ４５を使用することができる。骨芽細胞には、ＯＧ−２を使用することができる。ガイドＲＮＡのドライブに用いられるプロモーターには、以下が含まれ得る：Ｕ６又はＨ１などのＰｏｌ ＩＩＩプロモーター；ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡを発現させるためのＰｏｌ ＩＩプロモーター及びイントロンカセット。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
Ｃａｓ１３ｂ及び１つ以上のガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス又は他のプラスミド又はウイルスベクタータイプを使用して、詳細には、例えば、米国特許第８，４５４，９７２号明細書（アデノウイルスのための製剤、用量）、同第８，４０４，６５８号明細書（ＡＡＶのための製剤、用量）及び同第５，８４６，９４６号明細書（ＤＮＡプラスミドのための製剤、用量）並びにレンチウイルス、ＡＡＶ及びアデノウイルスが関わる臨床試験及びそのような臨床試験に関する刊行物からの製剤及び用量を用いて送達することができる。例えば、ＡＡＶについて、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第８，４５４，９７２号明細書及びＡＡＶが関わる臨床試験にあるとおりであり得る。アデノウイルスについて、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第８，４０４，６５８号明細書及びアデノウイルスが関わる臨床試験にあるとおりであり得る。プラスミド送達について、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第５，８４６，９４６号明細書及びプラスミドが関わる臨床試験にあるとおりであり得る。用量は、平均７０ｋｇの個体（例えば、男性成人ヒト）に基づくか又はそれに当てはめ得、異なる体重及び種の患者、対象、哺乳動物のために調整することができる。投与頻度は、患者又は対象の年齢、性別、全般的な健康、他の条件並びに対処される特定の状態又は症状を含めた通常の要因に応じて、医学又は獣医学実務者（例えば、医師、獣医師）の範囲内である。ウイルスベクターは、目的の組織に注射することができる。細胞型特異的ゲノム改変について、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質（Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質）の発現は、細胞型特異的プロモーターによってドライブすることができる。例えば、肝臓特異的発現にはアルブミンプロモーターが用いられ得、及びニューロン特異的発現には（例えば、ＣＮＳ障害を標的化するため）シナプシンＩプロモーターが用いられ得る。インビボ送達に関して、他のウイルスベクターと比べて幾つかの理由でＡＡＶが有利である：低毒性（これは、免疫応答を活性化させ得る細胞粒子の超遠心が不要な精製方法に起因し得る）及び宿主ゲノムに組み込まれないため、挿入突然変異誘発を引き起こす確率の低さ。
ＡＡＶのパッケージング限界は、４．５又は４．７５Ｋｂである。これは、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質（Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質）コード配列並びにプロモーター及び転写ターミネーターを全て同じウイルスベクターに収める必要があることを意味する。ＡＡＶに関して、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はこれらの任意の組み合わせであり得る。標的化しようとする細胞に関連するＡＡＶのＡＡＶを選択することができる；例えば、脳又は神経細胞の標的化にはＡＡＶ血清型１、２、５又はハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はこれらの任意の組み合わせを選択することができ；及び心臓組織の標的化にはＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は肝臓への送達に有用である。本明細書におけるプロモーター及びベクターが個々に好ましい。これらの細胞に関する特定のＡＡＶ血清型の一覧は、以下のとおりである（Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７−５９１１（２００８）を参照されたい）。
レンチウイルス
レンチウイルスは、有糸分裂細胞及び分裂終了細胞の両方でその遺伝子の感染能及び発現能を有する複合的レトロウイルスである。最も一般的には、公知のレンチウイルスはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、これは他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を用いて広範囲の細胞型を標的化する。レンチウイルスは、以下のとおり調製し得る。ｐＣａｓＥＳ１０（これはレンチウイルストランスファープラスミド骨格を含有する）のクローニング後、低継代（ｐ＝５）のＨＥＫ２９３ＦＴをＴ−７５フラスコに５０％コンフルエンスとなるように播種し、その翌日、１０％ウシ胎仔血清含有及び抗生物質不含のＤＭＥＭ中でトランスフェクトした。２０時間後、培地をＯｐｔｉＭＥＭ（無血清）培地に交換し、４時間後にトランスフェクションを行った。細胞に１０μｇのレンチウイルストランスファープラスミド（ｐＣａｓＥＳ１０）及び以下のパッケージングプラスミド：５μｇのｐＭＤ２．Ｇ（ＶＳＶ−ｇシュードタイプ）及び７．５ｕｇのｐｓＰＡＸ２（ｇａｇ／ｐｏｌ／ｒｅｖ／ｔａｔ）をトランスフェクトした。トランスフェクションは、カチオン性脂質デリバリー剤（５０ｕＬ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００及び１００ｕｌ Ｐｌｕｓ試薬）を含む４ｍＬ ＯｐｔｉＭＥＭ中で行った。６時間後、培地を、１０％ウシ胎仔血清を含む抗生物質不含ＤＭＥＭに交換した。これらの方法では細胞培養中に血清を使用するが、無血清方法が好ましい。
レンチウイルスは、以下のとおり精製し得る。４８時間後にウイルス上清を回収した。初めに上清から残屑を除去し、０．４５ｕｍ低タンパク質結合（ＰＶＤＦ）フィルタでろ過した。次に、それを超遠心機において２４，０００ｒｐｍで２時間スピンした。ウイルスペレットを５０ｕｌのＤＭＥＭ中に４℃で一晩再懸濁した。次に、それをアリコートに分け、直ちに−８０℃で凍結した。
別の実施形態において、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）をベースとする最小限の非霊長類レンチウイルスベクターも特に眼遺伝子療法に企図される（例えば、Ｂａｌａｇａａｎ，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００６；８：２７５−２８５を参照されたい）。別の実施形態において、滲出型の加齢黄斑変性症の治療のため網膜下注射によって送達される血管新生抑制タンパク質エンドスタチン及びアンジオスタチンを発現するウマ伝染性貧血ウイルスベースのレンチウイルス遺伝子療法ベクターであるＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）も企図され（例えば、Ｂｉｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２３：９８０−９９１（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１２）を参照されたい）、このベクターは本発明の核酸ターゲティング系向けに改変し得る。
別の実施形態において、ＨＩＶ ｔａｔ／ｒｅｖによって共有される共通のエクソンを標的化するｓｉＲＮＡと、核小体局在ＴＡＲデコイと、抗ＣＣＲ５特異的ハンマーヘッド型リボザイムとを含む自己不活性化レンチウイルスベクター（例えば、ＤｉＧｉｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２：３６ｒａ４３を参照されたい）を本発明の核酸ターゲティング系に使用し及び／又は適合させ得る。患者の体重１キログラム当たり最低２．５×１０６個のＣＤ３４＋ 細胞を収集し、２μｍｏｌ／Ｌ−グルタミン、幹細胞因子（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）（１００ｎｇ／ｍｌ）及びトロンボポエチン（１０ｎｇ／ｍｌ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を含有するＸ−ＶＩＶＯ １５培地（Ｌｏｎｚａ）中２×１０６細胞／ｍｌの密度で１６〜２０時間予備刺激し得る。フィブロネクチン（２５ｍｇ／ｃｍ２）（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）で被覆した７５ｃｍ２組織培養フラスコにおいて、予備刺激した細胞をレンチウイルスによって感染多重度５で１６〜２４時間にわたって形質導入し得る。
レンチウイルスベクターについては、パーキンソン病の治療にあるとおり開示されており、例えば米国特許出願公開第２０１２０２９５９６０号明細書及び米国特許第７３０３９１０号明細書及び同第７３５１５８５号明細書を参照されたい。レンチウイルスベクターは、眼疾患の治療についても開示されており、例えば米国特許出願公開第２００６０２８１１８０号明細書、２００９０００７２８４号明細書、米国特許出願公開第２０１１０１１７１８９号明細書；米国特許出願公開第２００９００１７５４３号明細書；米国特許出願公開第２００７００５４９６１号明細書、米国特許出願公開第２０１００３１７１０９号明細書を参照されたい。レンチウイルスベクターは、脳への送達についても開示されており、例えば米国特許出願公開第２０１１０２９３５７１号明細書；米国特許出願公開第２０１１０２９３５７１号明細書、米国特許出願公開第２００４００１３６４８号明細書、米国特許出願公開第２００７００２５９７０号明細書、米国特許出願公開第２００９０１１１１０６号明細書及び米国特許第７２５９０１５号明細書を参照されたい。
ＲＮＡ送達
ＲＮＡ送達：核酸ターゲティングＣａｓ１３ｂタンパク質及び／又はガイドＲＮＡは、ＲＮＡの形態で送達することもできる。ｍＲＮＡは、以下のエレメントを含むＰＣＲカセットを用いて合成することができる：βグロビン−ポリＡテール（１２０以上の一連のアデニン）由来のＴ７＿プロモーター−コザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）−エフェクタータンパク質−３’ＵＴＲを含有するＰＣＲカセットを用いて合成することができる。このカセットは、Ｔ７ポリメラーゼによる転写に使用することができる。ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、Ｔ７＿プロモーター−ＧＧ−ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ配列を含有するカセットからのインビトロ転写を用いて転写することもできる。
粒子送達系及び／又は製剤：
幾つかのタイプの粒子送達系及び／又は製剤が多様な生物医学的適用において有用であることが知られている。一般に、粒子は、その輸送及び特性の点で一単位として挙動する小さい物体として定義される。粒子は、更に直径に基づいて分類される。粗粒子は、２，５００〜１０，０００ナノメートルの範囲を包含する。微粒子は、１００〜２，５００ナノメートルのサイズを有する。超微粒子又はナノ粒子は、概して１〜１００ナノメートルのサイズである。１００ｎｍ限度の基準は、粒子をバルク材料と区別する新規特性が典型的には１００ｎｍ未満の臨界長さスケールで生じるという事実である。
本明細書で使用されるとき、粒子送達系／製剤は、本発明における粒子を含む任意の生物学的送達系／製剤として定義される。本発明における粒子は、１００ミクロン（μｍ）未満の最大径（例えば、直径）を有する任意の実体である。一部の実施形態において、本発明の粒子は、１０μｍ未満の最大径を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は、２０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大径を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は、１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大径を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ又は１００ｎｍ未満の最大径を有する。典型的には、本発明の粒子は、５００ｎｍ以下の最大径（例えば、直径）を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は、２５０ｎｍ以下の最大径（例えば、直径）を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は、２００ｎｍ以下の最大径（例えば、直径）を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は、１５０ｎｍ以下の最大径（例えば、直径）を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は、１００ｎｍ以下の最大径（例えば、直径）を有する。より小さい粒子、例えば５０ｎｍ以下の最大径を有する粒子が、本発明の一部の実施形態で使用される。一部の実施形態において、本発明の粒子は、２５ｎｍ〜２００ｎｍの範囲の最大径を有する。
粒子の特徴付け（例えば、形態、寸法等を特徴付けることを含む）は、種々の異なる技法を用いて行われる。一般的な技法は、電子顕微鏡法（ＴＥＭ、ＳＥＭ）、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、紫外・可視分光法、二重偏光干渉法及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）である。特徴付け（寸法計測）は、天然粒子（即ち負荷前）に関して行われるか、又はカーゴの負荷後に行われ得（本明細書においてカーゴとは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ｂ系の１つ以上の構成成分、例えばＣａｓ１３ｂ酵素又はｍＲＮＡ又はガイドＲＮＡ又はこれらの任意の組み合わせを指し、且つ更なる担体及び／又は賦形剤を含み得る）、それにより本発明の任意のインビトロ、エキソビボ及び／又はインビボ適用のための送達に最適なサイズの粒子が提供される。特定の好ましい実施形態において、粒子寸法（例えば、直径）の特徴付けは、動的レーザー散乱法（ＤＬＳ）を用いた計測に基づく。粒子、その作製及び使用方法並びにその計測に関して、米国特許第８，７０９，８４３号明細書；米国特許第６，００７，８４５号明細書；米国特許第５，８５５，９１３号明細書；米国特許第５，９８５，３０９号明細書；米国特許第５，５４３，１５８号明細書；及びＪａｍｅｓ Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ ａｎｄ Ｃａｒｍｅｎ Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １１ Ｍａｙ ２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４による発表が挙げられる。Ｄａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．“Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｗｉｔｈ ａ ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３，１１５９−１１６１（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２０１５）も参照されたい。
本発明の範囲内の粒子送達系は、限定されないが、固体、半固体、エマルション又はコロイド粒子を含め、任意の形態で提供され得る。従って、限定されないが、例えば脂質ベースのシステム、リポソーム、ミセル、微小胞、エキソソーム又は遺伝子銃を含め、本明細書に記載される送達系の任意のものが、本発明の範囲内の粒子送達系として提供され得る。
粒子
Ｃａｓ１３ｂ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、粒子又は脂質エンベロープを使用して同時に送達し得る；例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ酵素及びＲＮＡ（例えば、複合体としての）は、７Ｃ１など、Ｄａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開第２０１５０８９４１９ Ａ２号パンフレット及びその引用文献にあるとおりの粒子によって送達することができ（例えば、Ｊａｍｅｓ Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ ａｎｄ Ｃａｒｍｅｎ Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １１ Ｍａｙ ２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４を参照されたい）、例えば、送達粒子は脂質又はリピドイド及び親水性ポリマー、例えばカチオン性脂質及び親水性ポリマーを含み、例えば、カチオン性脂質には、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）又は１，２−ジテトラデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）が含まれ、及び／又は親水性ポリマーには、エチレングリコール又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれ；及び／又は粒子は、コレステロール（例えば、製剤１＝ＤＯＴＡＰ １００、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ ０、コレステロール ０；製剤番号２＝ＤＯＴＡＰ ９０、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ １０、コレステロール ０；製剤番号３＝ＤＯＴＡＰ ９０、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ ５、コレステロール ５からの粒子）を更に含み、粒子は効率的な多段階プロセスを用いて形成され、ここで、初めに、エフェクタータンパク質及びＲＮＡを例えば１：１モル比で、例えば室温で、例えば３０分間、例えば無菌ヌクレアーゼフリー１×ＰＢＳ中において共に混合し；及びそれとは別に、製剤に適用し得るとおりＤＯＴＡＰ、ＤＭＰＣ、ＰＥＧ及びコレステロールをアルコール、例えば１００％エタノール中に溶解し；及びこれらの２つの溶液を共に混合して、複合体を含有する粒子を形成する）。Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、粒子又は脂質エンベロープを使用して同時に送達され得る。このＤａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌの技術は、本発明に適用することができる。エポキシド改変脂質ポリマーを利用して本発明の核酸ターゲティング系を肺細胞、心血管細胞又は腎細胞に送達し得るが、しかしながら、当業者は、この系を応用して他の標的器官に送達し得る。約０．０５〜約０．６ｍｇ／ｋｇの範囲の投薬量が想定される。数日間又は数週間にわたる、合計投薬量を約２ｍｇ／ｋｇとする投薬も想定される。例えば、Ｓｕ Ｘ，Ｆｒｉｃｋｅ Ｊ，Ｋａｖａｎａｇｈ ＤＧ，Ｉｒｖｉｎｅ ＤＪ （“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｌｉｐｉｄ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｐＨ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２０１１ Ｊｕｎ ６；８（３）：７７４−８７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ１００３９０ｗ．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ １）は、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）コアがリン脂質二重層シェルによって被包された生分解性コア−シェル構造化粒子について記載している。これらは、インビボｍＲＮＡ送達のために開発された。ｐＨ応答性ＰＢＡＥ成分はエンドソーム破壊を促進するように選ばれる一方、脂質表面層はポリカチオンコアの毒性を最小限に抑えるように選択された。従って、これは本発明のＲＮＡの送達に好ましい。
一実施形態において、自己集合生体付着性ポリマーをベースとする粒子が企図され、これは、ペプチドの経口送達、ペプチドの静脈内送達及びペプチドの経鼻送達、脳への全てに適用し得る。疎水性薬物の経口吸収及び眼内送達など、他の実施形態も企図される。分子エンベロープ技術は、保護され且つ疾患部位に送達されるエンジニアリングされたポリマーエンベロープを含む（例えば、Ｍａｚｚａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＡＣＳＮａｎｏ，２０１３．７（２）：１０１６−１０２６；Ｓｉｅｗ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（１）：１４−２８；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ，２０１２．１６１（２）：５２３−３６；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１６６５−８０；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１７６４−７４；Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，２０１２．５（５−６）：４５８−６８；Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔ，２０１２．４３（５）：６８１−６８８；Ａｈｍａｄ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ２０１０．７：Ｓ４２３−３３；Ｕｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ，２００６．３（５）：６２９−４０；Ｑｕ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００６．７（１２）：３４５２−９及びＵｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ，２００１．２２４：１８５−１９９を参照されたい）。標的組織に応じて単回又は複数回用量での約５ｍｇ／ｋｇの用量が企図される。
粒子に関して、Ａｌａｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３ Ａｕｇ ６；１１０（３２）：１２８８１−６；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｍａｔｅｒ．２０１３ Ｓｅｐ ６；２５（３３）：４６４１−５；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１３ Ｍａｒ １３；１３（３）：１０５９−６４；Ｋａｒａｇｉａｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１２ Ｏｃｔ ２３；６（１０）：８４８４−７；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１２ Ａｕｇ ２８；６（８）：６９２２−９及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２ Ｊｕｎ ３；７（６）：３８９−９３も参照されたい。
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書は、リピドイド化合物に関し、同様にポリヌクレオチドの投与に特に有用であり、これは、本発明の核酸ターゲティング系の送達に適用し得る。一態様において、アミノアルコールリピドイド化合物が、細胞又は対象に送達される薬剤と組み合わされて、マイクロパーティクル、ナノ粒子、リポソーム又はミセルを形成する。粒子、リポソーム又はミセルによって送達される薬剤は、気体、液体又は固体の形態であり得、及び薬剤は、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド又は小分子であり得る。アミノアルコールリピドイド化合物は、他のアミノアルコールリピドイド化合物、ポリマー（合成又は天然）、界面活性剤、コレステロール、炭水化物、タンパク質、脂質等と組み合わされて粒子を形成し得る。次に、これらの粒子が任意選択で医薬賦形剤と組み合わされて医薬組成物を形成し得る。米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書は、アミノアルコールリピドイド化合物を調製する方法も提供する。アミンの１つ以上の均等物をエポキシド末端化合物の１つ以上の均等物と好適な条件下で反応させると、本発明のアミノアルコールリピドイド化合物が形成される。特定の実施形態において、アミンの全てのアミノ基がエポキシド末端化合物と完全に反応して第三級アミンを形成する。他の実施形態において、アミンの全てのアミノ基がエポキシド末端化合物と完全には反応せずに第三級アミンを形成し、それによりアミノアルコールリピドイド化合物に第一級又は第二級アミンが生じる。これらの第一級又は第二級アミンはそのままにされるか、又は異なるエポキシド末端化合物などの別の求電子剤と反応させ得る。当業者によって理解されるであろうとおり、アミンが過剰未満のエポキシド末端化合物と反応すると、様々な数の末端部を有する複数の異なるアミノアルコールリピドイド化合物が生じることになる。ある種のアミン類は、２つのエポキシド由来化合物末端部で完全に官能化され得る一方、他の分子はエポキシド末端化合物末端部で完全には官能化されない。例えば、ジアミン又はポリアミンは、分子の様々なアミノ部分の１、２、３又は４つのエポキシド由来化合物末端部を含んで第一級、第二級及び第三級アミンを生じ得る。特定の実施形態において、全てのアミノ基が完全には官能化されない。特定の実施形態において、同じタイプのエポキシド末端化合物の２つが使用される。他の実施形態において、２つ以上の異なるエポキシド末端化合物が使用される。アミノアルコールリピドイド化合物の合成は溶媒あり又はなしで実施され、及び合成は、３０〜１００℃、好ましくは約５０〜９０℃の範囲の高温で実施され得る。調製されたアミノアルコールリピドイド化合物は、任意選択で、精製され得る。例えば、アミノアルコールリピドイド化合物の混合物を精製して、特定の数のエポキシド由来化合物末端部を有するアミノアルコールリピドイド化合物を得ることができる。又は混合物を精製して、特定の立体又は位置異性体を得ることができる。アミノアルコールリピドイド化合物は、ハロゲン化アルキル（例えば、ヨウ化メチル）又は他のアルキル化剤を用いてもアルキル化され得、及び／又はそれらはアシル化され得る。
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書は、本発明の方法によって調製されたアミノアルコールリピドイド化合物のライブラリも提供する。これらのアミノアルコールリピドイド化合物は、液体ハンドラー、ロボット、マイクロタイタープレート、コンピュータ等が関わるハイスループット技法を用いて調製され及び／又はスクリーニングされ得る。特定の実施形態において、アミノアルコールリピドイド化合物は、ポリヌクレオチド又は他の薬剤（例えば、タンパク質、ペプチド、小分子）を細胞にトランスフェクトする能力に関してスクリーニングされる。米国特許出願公開第２０１３０３０２４０１号明細書は、コンビナトリアル重合を用いて調製されたポリ（β−アミノアルコール）（ＰＢＡＡ）類の一クラスに関する。本発明のＰＢＡＡは、コーティング（医療器具又はインプラントのフィルム又は多層フィルムコーティングなど）、添加剤、材料、賦形剤、生物付着防止剤、マイクロパターニング剤及び細胞封入剤など、バイオテクノロジー及び生物医学的適用において用いられ得る。表面コーティングとして使用される場合、これらのＰＢＡＡは、インビトロ及びインビボの両方で、その化学構造に応じて様々なレベルの炎症を誘発した。この材料クラスの化学的多様性は大きいため、インビトロでマクロファージ活性化を阻害するポリマーコーティングを同定することが可能であった。更に、これらのコーティングは、カルボキシル化ポリスチレンマイクロパーティクルの皮下移植後の炎症細胞の動員を低減し、且つ線維症を低減する。これらのポリマーを使用して、細胞封入のための高分子電解質複合体カプセルを形成し得る。本発明も、抗菌性コーティング、ＤＮＡ又はｓｉＲＮＡ送達及び幹細胞組織工学など、他の多くの生物学的適用を有し得る。米国特許出願公開第２０１３０３０２４０１号明細書の教示は、本発明の核酸ターゲティング系に適用し得る。
別の実施形態において、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が企図される。抗トランスサイレチン低分子干渉ＲＮＡが脂質ナノ粒子に封入され、ヒトに送達されており（例えば、Ｃｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１３；３６９：８１９−２９を参照されたい）、及びかかるシステムを本発明の核酸ターゲティング系に適合させて応用し得る。静脈内投与される約０．０１〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の用量が企図される。注入関連反応のリスクを低下させる薬物投与が企図され、デキサメタゾン、アセトアミノフェン、ジフェンヒドラミン又はセチリジン及びラニチジンなどが企図される。４週間毎の５用量にわたる約０．３ｍｇ／キログラムの複数回用量も企図される。ＬＮＰは、ｓｉＲＮＡの肝臓への送達に極めて有効であることが示されており（例えば、Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ａｐｒｉｌ ２０１３，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．４，ｐａｇｅｓ ３６３−４７０を参照されたい）、従って核酸ターゲティングエフェクタータンパク質をコードするＲＮＡの肝臓への送達に企図される。２週間毎に６ｍｇ／ｋｇのＬＮＰの約４用量の投薬量が企図され得る。Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．は、０．７ｍｇ／ｋｇで投与するＬＮＰの最初の２サイクル後に腫瘍退縮が観察され、且つ６サイクルの終わりまでに患者がリンパ節転移の完全退縮及び肝腫瘍の実質的な縮小を伴う部分奏効を達成したことを実証した。この患者では４０用量後に完全奏効が得られ、２６ヵ月間にわたって投与を受けた後も患者は寛解を保ったまま治療を完了した。ＶＥＧＦ経路阻害薬による先行治療後に進行していた、腎臓、肺及びリンパ節を含めた肝外疾患部位を有する２人のＲＣＣ患者は、約８〜１２ヵ月間全ての部位で疾患の安定が得られ、及びＰＮＥＴ及び肝転移患者は、１８ヵ月間（３６用量）にわたって延長試験を継続し、疾患は安定していた。しかしながら、ＬＮＰの電荷が考慮されなければならない。カチオン性脂質を負電荷脂質と組み合わせると、細胞内送達を促進する非二重層構造が誘導されるためである。荷電ＬＮＰは静脈内注射後に循環から急速に除去されるため、ｐＫａ値が７未満のイオン化可能なカチオン性脂質が開発された（例えば、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を参照されたい）。ＲＮＡなどの負電荷ポリマーは、低ｐＨ値（例えば、ｐＨ４）でＬＮＰに負荷することができ、ここで、イオン化可能な脂質は正電荷を呈する。しかしながら、生理的ｐＨ値では、ＬＮＰは、より長い循環時間と適合する低い表面電荷を呈する。４種のイオン化可能なカチオン性脂質、即ち１，２−ジリネオイル（ｄｉｌｉｎｅｏｙｌ）−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−ケト−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＫＤＭＡ）及び１，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）が着目されている。これらの脂質を含有するＬＮＰ ｓｉＲＮＡシステムは、インビボで肝細胞において著しく異なる遺伝子サイレンシング特性を呈し、効力は、第ＶＩＩ因子遺伝子サイレンシングモデルを用いて系列ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ＞ＤＬｉｎＫＤＭＡ＞ＤＬｉｎＤＭＡ＞＞ＤＬｉｎＤＡＰに従い様々であることが示されている（例えば、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を参照されたい）。ＬＮＰ又はＬＮＰ中の又はそれに関連するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ＲＮＡの１μｇ／ｍｌの投薬量が、特にＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡを含有する製剤について企図され得る。
ＬＮＰ及びＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ｂ封入の調製は、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１）を使用し及び／又は適合させ得る。カチオン性脂質１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシケト−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＫ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）、（３−ｏ−［２”−（メトキシポリエチレングリコール２０００）サクシノイル］−１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリコール（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ）及びＲ−３−［（ω−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリスチルオクスルプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）がＴｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）によって供給されるか又は合成され得る。コレステロールはＳｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し得る。特定の核酸ターゲティング複合体（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）ＲＮＡは、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＫ−ＤＭＡ及びＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡを含有するＬＮＰに封入し得る（４０：１０：４０：１０モル比のカチオン性脂質：ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＰＥＧＳ−ＤＭＧ又はＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）。必要な場合、０．２％ＳＰ−ＤｉＯＣ１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）を取り入れて細胞取込み、細胞内送達及び体内分布を評価する。封入は、カチオン性脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ（４０：１０：４０：１０モル比）で構成される脂質混合物をエタノール中に１０ｍｍｏｌ／ｌの最終脂質濃度となるように溶解することにより実施し得る。このエタノール脂質溶液を５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、ｐＨ４．０に滴下して加えると、多層小胞が形成され、３０％エタノールｖｏｌ／ｖｏｌの最終濃度が生じ得る。エクストルーダ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を使用して２つの積み重ねた８０ｎｍ Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅポリカーボネートフィルタで多層小胞を押し出した後、大きい単層小胞が形成され得る。封入は、３０％エタノールｖｏｌ／ｖｏｌを含有する５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、ｐＨ４．０中に２ｍｇ／ｍｌのＲＮＡを、押し出されて予め形成された大きい単層小胞に滴下して加え、０．０６／１ｗｔ／ｗｔの最終ＲＮＡ／脂質重量比となるように常に混合しながら３１℃で３０分間インキュベートすることにより達成し得る。Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ２再生セルロース透析膜を使用したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４での１６時間の透析によってエタノールの除去及び製剤化緩衝液の中和を実施した。粒径分布は、ＮＩＣＯＭＰ ３７０粒径測定機、小胞／強度モード及びガウスフィッティング（Ｎｉｃｏｍｐ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を使用した動的光散乱によって決定し得る。３つ全てのＬＮＰ系の粒径が直径約７０ｎｍであり得る。ＲＮＡ封入効率は、透析前及び透析後に収集した試料からＶｉｖａＰｕｒｅＤ ＭｉｎｉＨカラム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して遊離ＲＮＡを除去することにより決定し得る。溶出した粒子から封入されたＲＮＡを抽出し、２６０ｎｍで定量化し得る。Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）からのコレステロールＥ酵素アッセイを用いて小胞中のコレステロール含有量を計測することにより、ＲＮＡ対脂質比を決定した。本明細書におけるＬＮＰ及びＰＥＧ脂質の考察と併せて、ＰＥＧ化リポソーム又はＬＮＰも同様に核酸ターゲティング系又はその構成成分の送達に好適である。大きいＬＮＰの調製は、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を使用し及び／又は応用し得る。エタノール中にＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ及びコレステロールを５０：１０：３８．５モル比で含有する脂質プレミックス溶液（２０．４ｍｇ／ｍｌ総脂質濃度）を調製し得る。酢酸ナトリウムを０．７５：１（酢酸ナトリウム：ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）のモル比でこの脂質プレミックスに加え得る。続いて混合物を１．８５容積のクエン酸塩緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ３．０）と激しく撹拌しながら合わせることにより脂質を水和させると、３５％エタノールを含有する水性緩衝液中でリポソームの自然形成が起こり得る。このリポソーム溶液を３７℃でインキュベートして、粒径を時間依存的に増加させ得る。インキュベーション中様々な時点でアリコートを取り出して、動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）によってリポソームサイズの変化を調べ得る。所望の粒径に達したところで、総脂質の３．５％の最終ＰＥＧモル濃度が得られるようにリポソーム混合物にＰＥＧ脂質水溶液（ストック＝３５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノール中１０ｍｇ／ｍｌ ＰＥＧ−ＤＭＧ）を加え得る。ＰＥＧ−脂質を加えると、リポソームはそのサイズで、更なる成長が事実上クエンチされるはずである。次に、空のリポソームに約１：１０（ｗｔ：ｗｔ）のＲＮＡ対総脂質でＲＮＡを加え、続いて３７℃で３０分間インキュベートすると、負荷されたＬＮＰが形成され得る。続いてこの混合物をＰＢＳで一晩透析し、０．４５μｍシリンジフィルタでろ過し得る。
球状核酸（ＳＮＡ（商標））構築物及び他の粒子（特に金粒子）も、核酸ターゲティング系を意図した標的に送達する手段として企図される。多量のデータが、核酸機能化金粒子をベースとするＡｕｒａＳｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの球状核酸（ＳＮＡ（商標））構築物が有用であることを示している。
本明細書の教示と併せて用い得る文献としては、Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１ １３３：９２５４−９２５７、Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ．２０１１ ７：３１５８−３１６２、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１１ ５：６９６２−６９７０、Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２ １３４：１３７６−１３９１、Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１２ １２：３８６７−７１、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１２ １０９：１１９７５−８０、Ｍｉｒｋｉｎ，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１２ ７：６３５−６３８ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２ １３４：１６４８８−１６９１、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｎａｔｕｒｅ ２０１３ ４９５：Ｓ１４−Ｓ１６、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１３ １１０（１９）：７６２５−７６３０、Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５，２０９ｒａ１５２（２０１３）及びＭｉｒｋｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ，１０：１８６−１９２が挙げられる。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の遠位端に結合したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドリガンドによってポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をＰＥＧ化して、ＲＮＡを含む自己集合性粒子を構築し得る。この系は、例えば、インテグリンを発現する腫瘍新生血管系を標的化し、且つ血管内皮成長因子受容体−２（ＶＥＧＦ Ｒ２）の発現を阻害して、それにより腫瘍血管新生を達成するｓｉＲＮＡを送達する手段として用いられている（例えば、Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．１９を参照されたい）。ナノプレックスは、等容積のカチオン性ポリマーと核酸との水溶液を混合して２〜６の範囲にわたって正味モル過剰のイオン化可能窒素（ポリマー）対リン酸（核酸）を得ることにより調製し得る。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用によって平均粒径分布が約１００ｎｍのポリプレックスが形成され、従ってここではナノプレックスと称された。Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．の自己集合性粒子での送達には、約１００〜２００ｍｇの投薬量の核酸ターゲティング複合体ＲＮＡが想定される。
Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２５，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．３９）のナノプレックスも本発明に適用され得る。Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．のナノプレックスは、等容積のカチオン性ポリマーと核酸との水溶液を混合して２〜６の範囲にわたって正味モル過剰のイオン化可能な窒素（ポリマー）対リン酸（核酸）を得ることにより調製される。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用によって平均粒径分布が約１００ｎｍのポリプレックスが形成され、従ってここではナノプレックスと称された。Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．のＤＯＴＡ−ｓｉＲＮＡは、以下のとおり合成された：１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸モノ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＤＯＴＡ−ＮＨＳエステル）をＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）から注文した。カーボネート緩衝液（ｐＨ９）中１００倍モル過剰のＤＯＴＡ−ＮＨＳ−エステルを有するアミン改変ＲＮＡセンス鎖を微量遠心管に加えた。室温で４時間撹拌することにより内容物を反応させた。ＤＯＴＡ−ＲＮＡセンスコンジュゲートをエタノール沈殿させて、水中に再懸濁し、且つ非改変アンチセンス鎖とアニーリングさせることにより、ＤＯＴＡ−ｓｉＲＮＡを得た。液体は、全てＣｈｅｌｅｘ−１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で前処理して微量金属の汚染が除去された。シクロデキストリン含有ポリカチオンを使用することにより、Ｔｆ標的及び非標的ｓｉＲＮＡ粒子を形成し得る。典型的には、３（±）の電荷比及び０．５ｇ／リットルのｓｉＲＮＡ濃度で水中に粒子が形成された。標的粒子の表面上にある１パーセントのアダマンタン−ＰＥＧ分子をＴｆ（アダマンタン−ＰＥＧ−Ｔｆ）で改変した。注射のために５％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコース担体溶液中に粒子を懸濁した。
Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ ４６４，１５ Ａｐｒｉｌ ２０１０）は、標的粒子送達系を使用するＲＮＡ臨床試験を行う（臨床試験登録番号ＮＣＴ００６８９０６５）。標準ケア療法に抵抗性の固形癌患者に対し２１日間サイクルの１、３、８及び１０日目に用量の標的粒子を３０分間静脈内注入によって投与する。粒子は、（１）線状シクロデキストリン系ポリマー（ＣＤＰ）、（２）癌細胞の表面上のＴＦ受容体（ＴＦＲ）に会合するようにナノ粒子の外側に提示されたヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）標的リガンド、（３）親水性ポリマー（生体液中でのナノ粒子の安定性を促進するために用いられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、及び（４）ＲＲＭ２の発現を低下させるように設計されたｓｉＲＮＡ（臨床で使用された配列は、以前はｓｉＲ２Ｂ＋５と称された）を含有する合成送達系を含むか、それらから本質的になるか又はそれらからなる。ＴＦＲは悪性細胞で上方制御されることが長く知られており、及びＲＲＭ２は確立された抗癌標的である。これらの粒子（臨床版はＣＡＬＡＡ−０１と称される）は、非ヒト霊長類における複数回投与試験で良好に忍容されることが示されている。１人の慢性骨髄性白血病患者にｓｉＲＮＡがリポソーム送達によって投与されているが、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．の臨床試験は、ｓｉＲＮＡを標的送達系で全身送達して固形癌患者を治療する初期ヒト試験である。標的送達系がヒト腫瘍への機能性ｓｉＲＮＡの有効な送達を提供し得るかどうかを確かめるため、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．は、３つの異なる投与コホートからの３人の患者の生検を調べた；患者Ａ、Ｂ及びＣ、全員が転移性黒色腫を有し、それぞれ１８、２４及び３０ｍｇ・ｍ−２ ｓｉＲＮＡのＣＡＬＡＡ−０１の投与を受けた。同程度の用量が本発明の核酸ターゲティング系にも企図され得る。本発明の送達は、線状シクロデキストリン系ポリマー（ＣＤＰ）、癌細胞の表面上のＴＦ受容体（ＴＦＲ）に会合するように粒子の外側に提示されたヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）標的リガンド及び／又は親水性ポリマー（例えば、生体液中での粒子の安定性を促進するために用いられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含有する粒子で達成され得る。
本発明に関して、核酸ターゲティング複合体の１つ以上の構成成分、例えばＲＮＡターゲティングエフェクター（Ｃａｓ１３ｂ）タンパク質若しくはそのｍＲＮＡ又はガイドＲＮＡ若しくはｃｒＲＮＡを粒子又は脂質エンベロープを用いて送達することが好ましい。他の送達系又はベクターを本発明の粒子の態様と併せて用い得る。本発明に包含される粒子は、例えば、固体粒子（例えば、銀、金、鉄、チタンなどの金属）、非金属、脂質ベースの固体、ポリマー）、粒子の懸濁液又はこれらの組み合わせとして、種々の形態で提供され得る。金属、誘電体及び半導体粒子並びにハイブリッド構造（例えば、コアシェル粒子）を調製し得る。半導体材料でできている粒子は、電子エネルギーレベルの量子化が起こるのに十分に小さい（典型的には１０ｎｍ未満）ならば、標識量子ドットでもあり得る。かかるナノスケール粒子は、生物医学的適用において薬物担体又は造影剤として用いられ、本発明における同様の目的に応用し得る。
半固体及び軟質粒子が製造されており、本発明の範囲内にある。半固体の性質のプロトタイプ粒子がリポソームである。各種のリポソーム粒子が現在、抗癌薬及びワクチンの送達系として臨床で用いられている。一方の親水性の半体と他方の疎水性の半体とを有する粒子はヤヌス粒子と呼ばれ、特にエマルションを安定化させるのに有効である。ヤヌス粒子は水／油界面で自己集合して、固体界面活性剤としての役割を果たすことができる。
米国特許第８，７０９，８４３号明細書（参照により本明細書に援用される）は、治療剤含有粒子を組織、細胞及び細胞内区画に標的化して送達するための薬物送達システムを提供する。本発明は、界面活性剤、親水性ポリマー又は脂質にコンジュゲートしたポリマーを含む標的粒子を提供する。米国特許第６，００７，８４５号明細書（参照により本明細書に援用される）は、多官能化合物を１つ以上の疎水性ポリマー及び１つ以上の親水性ポリマーと共有結合的に連結することにより形成されたマルチブロック共重合体のコアを有し、且つ生物学的に活性な材料を含有する粒子を提供する。米国特許第５，８５５，９１３号明細書（参照により本明細書に援用される）は、肺系統への薬物送達のためその表面上に界面活性剤を取り込んだ、タップ密度が０．４ｇ／ｃｍ３未満で平均直径が５μｍ〜３０μｍの空気力学的に軽い粒子を有する粒子状組成物を提供する。米国特許第５，９８５，３０９号明細書（参照により本明細書に援用される）は、界面活性剤及び／又は正電荷又は負電荷治療薬又は診断薬と肺系統への送達のための逆の電荷の荷電分子との親水性又は疎水性複合体を取り込んだ粒子を提供する。米国特許第５，５４３，１５８号明細書（参照により本明細書に援用される）は、生物学的に活性な材料を含有する生分解性固体コア及び表面上のポリ（アルキレングリコール）部分を有する生分解性注射用粒子を提供する。国際公開第２０１２１３５０２５号パンフレット（米国特許出願公開第２０１２０２５１５６０号明細書としても公開されている）（参照により本明細書に援用される）は、コンジュゲート型ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ポリマー及びコンジュゲート型アザ大環状分子（まとめて「コンジュゲート型リポマー」又は「リポマー」と称される）について記載している。特定の実施形態において、本明細書に記載のかかる方法及び材料、例えばコンジュゲート型リポマーを、インビトロ、エキソビボ及びインビボゲノム摂動を達成してタンパク質発現の改変を含めた遺伝子発現の改変を行うため核酸ターゲティング系に関連して使用し得ることを想定し得る。
エキソソーム
エキソソームは、ＲＮＡ及びタンパク質を輸送する内因性のナノ小胞であり、これはＲＮＡを脳及び他の標的器官に送達することができる。免疫原性を低下させるため、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９：３４１）はエキソソーム産生に自己由来の樹状細胞を使用した。ニューロン特異的ＲＶＧペプチドに融合したエキソソーム膜タンパク質Ｌａｍｐ２ｂを発現するように樹状細胞をエンジニアリングすることにより、脳への標的化が達成された。精製エキソソームに電気穿孔によって外因性ＲＮＡが負荷された。静脈内注射されるＲＶＧ標的化エキソソームが、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡを脳内のニューロン、ミクログリア、オリゴデンドロサイトに特異的に送達し、特異的遺伝子ノックダウンが得られた。ＲＶＧエキソソームに予め曝露してもノックダウンは減弱しなかったと共に、他の組織における非特異的取込みは観察されなかった。アルツハイマー病の治療標的であるＢＡＣＥ１の強力なｍＲＮＡ（６０％）及びタンパク質（６２％）ノックダウンにより、エキソソーム媒介ｓｉＲＮＡ送達の治療可能性が実証された。
免疫学的に不活性なエキソソームのプールを得るため、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、同種主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）ハプロタイプの近交系Ｃ５７ＢＬ／６マウスから骨髄を採取した。未熟樹状細胞は、ＭＨＣ−ＩＩ及びＣＤ８６など、Ｔ細胞アクチベーターを欠くエキソソームを多量に産生するため、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、顆粒球／マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を有する樹状細胞を７日間選択した。翌日、十分に確立された超遠心法プロトコルを用いて培養上清からエキソソームを精製した。産生されたエキソソームは物理的に均一であり、粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）及び電子顕微鏡法によって決定したとき分布サイズのピークが直径８０ｎｍであった。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、１０６細胞当たり（タンパク質濃度に基づいて計測して）６〜１２μｇのエキソソームを得た。次に、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、ナノスケール適用に適合させた電気穿孔プロトコルを用いて改変エキソソームに外因性カーゴを負荷する可能性を調べた。ナノメートルスケールでの膜粒子に対する電気穿孔は十分に特徴付けられていないため、非特異的Ｃｙ５標識ＲＮＡを使用して電気穿孔プロトコルを経験的に最適化した。超遠心法及びエキソソームの溶解後に、封入されるＲＮＡの量をアッセイした。４００Ｖ及び１２５μＦでの電気穿孔が最大のＲＮＡ保持をもたらし、以降の全ての実験でこれを使用した。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、１５０μｇのＲＶＧエキソソームに封入された１５０μｇの各ＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡを正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与し、４つの対照とノックダウン効率を比較した：未治療マウス、ＲＶＧエキソソームのみを注入したマウス、インビボカチオン性リポソーム試薬と複合体化したＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡを注入したマウス及びＲＶＧ−９Ｒ（ｓｉＲＮＡに静電的に結合する９つのＤ−アルギニンとコンジュゲートしたＲＶＧペプチド）と複合体化したＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡを注入したマウス。投与３日後に皮質組織試料を分析し、ｓｉＲＮＡ−ＲＶＧ−９Ｒ治療マウス及びｓｉＲＮＡＲＶＧエキソソーム治療マウスの両方で有意なタンパク質ノックダウン（４５％、Ｐ＜０．０５、対６２％、Ｐ＜０．０１）が観察され、ＢＡＣＥ１ ｍＲＮＡレベルの有意な低下がもたらされた（それぞれ６６％±１５％、Ｐ＜０．００１及び６１％±１３％、Ｐ＜０．０１）。更に、本出願人らは、ＲＶＧ−エキソソーム治療動物においてアルツハイマー病におけるアミロイド斑の主要な構成成分である総β−アミロイド１−４２レベルの有意な低下（５５％、Ｐ＜０．０５）を実証した。観察された低下は、正常マウスでＢＡＣＥ１阻害薬の脳室内注射後に実証されたβ−アミロイド１−４０の低下よりも大きかった。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．はＢＡＣＥ１切断産物でｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（ＲＡＣＥ）を実施し、これは、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ媒介性ノックダウンのエビデンスを提供した。最後に、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＴＮＦα及びＩＦＮ−α血清濃度を評価することにより、ＲＮＡ−ＲＶＧエキソソームがインビボで免疫応答を誘導したかどうかを調べた。エキソソーム治療後、ｓｉＲＮＡ−ＲＶＧ−９Ｒと対照的にｓｉＲＮＡ−トランスフェクション試薬治療と同様に全てのサイトカインにおける有意でない変化を記録し、これはＩＬ−６分泌を強力に刺激したことから、エキソソーム治療の免疫学的に不活性なプロファイルが確認された。エキソソームがｓｉＲＮＡの２０％のみを封入することを所与とすれば、対応するレベルの免疫刺激なしに５分の１のｓｉＲＮＡで同等のｍＲＮＡノックダウン及びより大きいタンパク質ノックダウンが達成されたため、ＲＶＧ−エキソソームによる送達はＲＶＧ−９Ｒ送達よりも効率的であるように見える。この実験は、ＲＶＧ−エキソソーム技術の治療可能性を実証したものであり、これは潜在的に神経変性疾患に関連する遺伝子の長期サイレンシングに適している。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．のエキソソーム送達系は、治療標的、特に神経変性疾患への本発明の核酸ターゲティング系の送達に適用し得る。約１００〜１０００ｍｇのＲＶＧエキソソームに封入された約１００〜１０００ｍｇの核酸ターゲティング系の投薬量が本発明に企図され得る。
Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７，２１１２−２１２６（２０１２））は、インビトロ及びインビボでのＲＮＡの送達に利用される、培養細胞に由来するエキソソームを提供している。このプロトコルは、初めに、ペプチドリガンドと融合したエキソソームタンパク質を含む、発現ベクターのトランスフェクションによる標的エキソソームの作成を記載している。次に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．は、トランスフェクト細胞上清からエキソソームをどのように精製し及び特徴付けるかを説明する。次に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．は、ＲＮＡをエキソソームに負荷するために重要なステップを詳説する。最後に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．は、どのようにエキソソームを使用してインビトロで及びマウス脳においてインビボでＲＮＡを効率的に送達するかを概説する。エキソソーム媒介性ＲＮＡ送達の見込まれた結果の例が機能アッセイによって評価され、イメージングも提供される。プロトコル全体は、約３週間かかる。本発明に係る送達又は投与は、自己由来樹状細胞から産生されたエキソソームを使用して実施され得る。本明細書における教示から、これを本発明の実施において用いることができる。
別の実施形態において、Ｗａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．１７ ｅ１３０）の血漿エキソソームが企図される。エキソソームは、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、肥満細胞、上皮細胞及び腫瘍細胞を含めた多くの細胞型によって産生されるナノサイズの小胞（３０〜９０ｎｍサイズ）である。これらの小胞は後期エンドソームの内向きの出芽によって形成され、次に細胞膜との融合時に細胞外環境に放出される。エキソソームは天然で細胞間にＲＮＡを有するため、この特性は遺伝子療法に有用であり得ると共に、本開示から、本発明の実施に用いることができる。血漿からのエキソソームは、バフィーコートを９００ｇで２０分間遠心して血漿を単離し、続いて細胞上清を回収し、３００ｇで１０分間遠心して細胞を除去し、１６ ５００ｇで３０分間遠心し、続いて０．２２ｍｍフィルタでろ過することにより調製することができる。１２０ ０００ｇで７０分間の超遠心によってエキソソームをペレット化する。エキソソームへのｓｉＲＮＡの化学的トランスフェクションをＲＮＡｉヒト／マウススターターキット（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で製造者の指示に従い実施する。ｓｉＲＮＡを１００ｍｌ ＰＢＳに２ｍｍｏｌ／ｍｌの最終濃度で加える。ＨｉＰｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬を加えた後、混合物を室温で１０分間インキュベートする。過剰なミセルを除去するため、アルデヒド／硫酸塩ラテックスビーズを使用してエキソソームを再単離する。エキソソームへの核酸ターゲティング系の化学的トランスフェクションをｓｉＲＮＡと同様に行い得る。エキソソームを健常ドナーの末梢血から単離した単球及びリンパ球と共培養し得る。従って、核酸ターゲティング系を含有するエキソソームをヒトの単球及びリンパ球に導入し、且つヒトに自己再導入し得ることが企図され得る。従って、本発明に係る送達又は投与を、血漿エキソソームを用いて実施し得る。
リポソーム
本発明に係る送達又は投与は、リポソームで実施することができる。リポソームは、内部の水性区画を取り囲む単層又は多重膜脂質二重層及び比較的不透過性の外側の親油性リン脂質二重層からなる球形の小胞構造である。リポソームは、生体適合性であり、非毒性であり、親水性及び親油性の両方の薬物分子を送達することができ、そのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、且つ生体膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）を越えてそのロードを輸送するため、薬物送達担体として大いに注目を集めてきた（例えば、レビューについては、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。リポソームは幾つかの異なるタイプの脂質から作製することができる。しかしながら、薬物担体としてのリポソームの作成には、リン脂質が最も一般的に用いられている。脂質薄膜が水溶液と混合されたときにリポソーム形成は自然に起こるが、また、ホモジナイザー、ソニケーター又は押出し装置を使用して振盪の形態の力を加えることによっても促進し得る（例えば、レビューについては、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。
その構造及び特性を改変するため、リポソームに幾つかの他の添加剤を加え得る。例えば、リポソーム構造の安定化を促進するため及びリポソームの内部カーゴの漏出を防ぐため、リポソーム混合物にコレステロール又はスフィンゴミエリンのいずれかを加え得る。更に、リポソームは、水素化卵ホスファチジルコリン又は卵ホスファチジルコリン、コレステロール及びジセチルリン酸から調製され、その平均小胞サイズは、約５０及び１００ｎｍに調整された（例えば、レビューについては、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。リポソーム製剤は主に、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン及びモノシアロガングリオシドなどの天然リン脂質及び脂質で構成され得る。この製剤はリン脂質のみでできているため、リポソーム製剤は多くの難題に直面しており、その１つが血漿中での不安定性である。これらの難題を解消しようとする幾つかの試みが、特に脂質膜の操作においてなされている。これらの試みの１つは、コレステロールの操作に着目するものであった。従来の製剤にコレステロールを加えると、封入された生物学的活性化合物が血漿又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）中に急速に放出されることが抑えられ、安定性が増す（例えば、レビューについては、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。特に有利な実施形態において、トロイの木馬リポソーム（分子トロイの木馬としても知られる）が望ましく、ｈｔｔｐ：／／ｃｓｈｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｃｓｈｌｐ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／２０１０／４／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４０７．ｌｏｎｇにおいてプロトコルを参照し得る。これらの粒子は、トランス遺伝子を血管内注射後に脳全体に送達することが可能である。制約により拘束されるものではないが、特異抗体が表面にコンジュゲートした中性脂質粒子はエンドサイトーシスによって血液脳関門を通過することが可能であると考えられる。本出願人は、トロイの木馬リポソームを利用してヌクレアーゼのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ｂ複合体を血管内注射によって脳に送達することを仮定し、これにより、胚を操作する必要なしに全脳トランスジェニック動物が実現し得る。リポソームでの生体内投与には、約１〜５ｇのＤＮＡ又はＲＮＡが企図され得る。
別の実施形態において、核酸ターゲティング系又はその構成成分は安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）などのリポソームで投与され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．８，Ａｕｇｕｓｔ ２００５を参照されたい）。ＳＮＡＬＰで標的化される特定の核酸ターゲティング系の毎日の約１、３又は５ｍｇ／ｋｇ／日の静脈内注射が企図される。毎日の治療は、約３日間にわたり、次に毎週、約５週間にわたり得る。別の実施形態において、特定の核酸ターゲティング系が封入されたＳＮＡＬＰの約１又は２．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注射による投与も企図される（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４ Ｍａｙ ２００６を参照されたい）。ＳＮＡＬＰ製剤は、脂質３−Ｎ−［（ｗメトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリスチルオキシ−プロピルアミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及びコレステロールを２：４０：１０：４８モルパーセント比で含有し得る（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４ Ｍａｙ ２００６を参照されたい）。別の実施形態において、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、高度に血管新生したＨｅｐＧ２由来肝腫瘍への分子の送達に有効であるが、血管新生が不十分なＨＣＴ−１１６由来肝腫瘍において有効でないことが分かっている（例えば、Ｌｉ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）１９，７７５−７８０を参照されたい）。ＳＮＡＬＰリポソームは、Ｄ−Ｌｉｎ−ＤＭＡ及びＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡをジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール及びｓｉＲＮＡと共に２５：１脂質／ｓｉＲＮＡ比及び４８／４０／１０／２モル比のコレステロール／Ｄ−Ｌｉｎ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡを用いて製剤化することにより調製し得る。得られたＳＮＡＬＰリポソームは、約８０〜１００ｎｍサイズである。更に別の実施形態において、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）、３−Ｎ−［（ｗ−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミレスチルオキシプロピルアミン及びカチオン性１，２−ジリノレイルオキシ−３−Ｎ，Ｎジメチルアミノアミノプロパンを含み得る（例えば、Ｇｅｉｓｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２０１０；３７５：１８９６−９０５を参照されたい）。例えば、ボーラス静脈内注入として投与される１用量当たり合計約２ｍｇ／ｋｇの核酸ターゲティング系の投薬量が企図され得る。更に別の実施形態において、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ及び１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ；Ｎ−ジメチル）アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含み得る（例えば、Ｊｕｄｇｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１９：６６１−６７３（２００９）を参照されたい）。インビボ研究に用いられる製剤は、約９：１の最終脂質／ＲＮＡ質量比を含み得る。
ＲＮＡｉナノメディシンの安全性プロファイルがＡｌｎｙｌａｍ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＢａｒｒｏｓ ａｎｄ Ｇｏｌｌｏｂによってレビューされている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６４（２０１２）１７３０−１７３７を参照されたい）。安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、４つの異なる脂質−低ｐＨでカチオン性のイオン化可能な脂質（ＤＬｉｎＤＭＡ）、中性ヘルパー脂質、コレステロール及び拡散性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質で構成される。この粒子は直径約８０ｎｍであり、生理的ｐＨで電荷的に中性である。製剤化時、イオン化可能な脂質が粒子形成の間に脂質をアニオン性ＲＮＡと凝縮させる役割を果たす。漸進的に酸性になるエンドソーム条件下で正電荷のとき、イオン化可能な脂質は、ＳＮＡＬＰとエンドソーム膜との融合も媒介し、細胞質中へのＲＮＡの放出を可能にする。ＰＥＧ−脂質は粒子を安定化させ、製剤化時の凝集を低減し、続いて薬物動態特性を改善する中性の親水性外部を提供する。現在まで、ＲＮＡを有するＳＮＡＬＰ製剤を使用して２つの臨床プログラムが開始されている。Ｔｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓは、最近、高ＬＤＬコレステロールの成人ボランティアにおけるＳＮＡＬＰ−ＡｐｏＢの第Ｉ相単回投与試験を完了した。ＡｐｏＢは主に肝臓及び空腸に発現し、ＶＬＤＬ及びＬＤＬのアセンブリ及び分泌に必須である。１７人の対象に単一用量のＳＮＡＬＰ−ＡｐｏＢが投与された（７用量レベルにわたる用量漸増）。肝毒性（前臨床試験に基づいて潜在的用量制限毒性として予想された）のエビデンスはなかった。（２人中）１人の対象が最も高い用量で免疫系刺激と一致してインフルエンザ様症状を起こし、試験終了が決定された。Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓも同様にＡＬＮ−ＴＴＲ０１を進めており、これは上記に記載されるＳＮＡＬＰ技術を用い、ＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）の治療のため突然変異体及び野生型の両方のＴＴＲの肝細胞産生を標的化する。３つのＡＴＴＲ症候群が記載されている：家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）及び家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ） − 両方ともＴＴＲの常染色体優性突然変異によって引き起こされる；及び野生型ＴＴＲによって引き起こされる老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）。ＡＬＮ−ＴＴＲ０１のプラセボ対照単回用量漸増第Ｉ相試験が最近、ＡＴＴＲ患者で完了した。ＡＬＮ−ＴＴＲ０１が１５分間の静脈内注入として３１人の患者に（２３人は試験薬物及び８人はプラセボ）０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇの用量範囲内で（ｓｉＲＮＡに基づく）投与された。治療は良好に忍容され、肝機能検査値の重大な増加はなかった。≧０．４ｍｇ／ｋｇで２３人中３人の患者に注入関連反応が認められた；全員が注入速度の減速に応答し、全員が試験を続行した。２人の患者に１ｍｇ／ｋｇの最も高い用量で血清サイトカインＩＬ−６、ＩＰ−１０及びＩＬ−１ｒａの最小限且つ一過性の上昇が認められた（前臨床及びＮＨＰ試験から予想されたとおり）。ＡＬＮ−ＴＴＲ０１の期待された薬力学的効果である血清ＴＴＲの低下が１ｍｇ／ｋｇで観察された。
更に別の実施形態において、ＳＮＡＬＰは、例えば、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ−脂質をエタノール中に、例えばそれぞれ４０：１０：４０：１０のモル比で可溶化させることにより作製し得る（Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２８ Ｎｕｍｂｅｒ ２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１０，ｐｐ．１７２−１７７を参照されたい）。水性緩衝液（５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４）にそれぞれ３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）及び６．１ｍｇ／ｍｌの最終エタノール及び脂質濃度となるように混合しながら脂質混合物を加え、２２℃で２分間平衡化させた後、押し出した。水和した脂質を、２つの積み重ねた８０ｎｍ細孔径フィルタ（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）で２２℃においてＬｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して、動的光散乱分析によって決定したとき７０〜９０ｎｍの小胞直径が観察されるまで押し出した。これには、概して１〜３回のパスが必要であった。ｓｉＲＮＡ（３０％エタノールを含有する５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４水溶液中に可溶化した）を、予め平衡化した（３５℃）小胞に約５ｍｌ／分の速度で混合しながら加えた。０．０６（ｗｔ／ｗｔ）の最終目標ｓｉＲＮＡ／脂質比に達した後、混合物を３５℃で更に３０分間インキュベートして小胞再構築及びｓｉＲＮＡの封入を可能にした。次に、エタノールを除去し、外部緩衝液を透析又はタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションのいずれかによってＰＢＳ（１５５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）と交換した。制御された段階的希釈方法プロセスを用いてｓｉＲＮＡをＳＮＡＬＰに封入した。ＫＣ２−ＳＮＡＬＰの脂質構成要素は、５７．１：７．１：３４．３：１．４のモル比で用いられたＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（カチオン性脂質）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ）及びＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡであった。負荷粒子が形成されたところで、ＳＮＡＬＰをＰＢＳで透析し、使用前に０．２μｍフィルタで滅菌ろ過した。平均粒径は、７５〜８５ｎｍであり、ｓｉＲＮＡの９０〜９５％が脂質粒子内に封入された。インビボ試験に使用した製剤中の最終的なｓｉＲＮＡ／脂質比は、約０．１５（ｗｔ／ｗｔ）であった。使用直前に、第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡを含有するＬＮＰ−ｓｉＲＮＡ系を滅菌ＰＢＳ中に適切な濃度に希釈し、製剤を１０ｍｌ／ｋｇの合計容積で外側尾静脈から静脈内投与した。この方法及びこれらの送達系は、本発明の核酸ターゲティング系に当てはめることができる。
他の脂質
アミノ脂質２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）などの他のカチオン性脂質を利用して、例えばＳｉＲＮＡと同様に、核酸ターゲティング系又はその構成成分又はそれをコードする核酸分子を封入し得（例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２，５１，８５２９−８５３３を参照されたい）、従って本発明の実施に用い得る。以下の脂質組成を有する予め形成された小胞が企図され得る：アミノ脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール及び（Ｒ）−２，３−ビス（オクタデシルオキシ）プロピル−１−（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバメート（ＰＥＧ−脂質）、それぞれモル比４０／１０／４０／１０及び約０．０５（ｗ／ｗ）のＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ／総脂質比。７０〜９０ｎｍの範囲の狭い粒径分布及び０．１１±０．０４の低い多分散性指数（ｎ＝５６）が確実となるように、粒子を最大３回まで８０ｎｍ膜で押し出し、その後ガイドＲＮＡに加えた。極めて強力なアミノ脂質１６を含有する粒子を使用し得、ここで、４つの脂質構成成分１６、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ−脂質のモル比（５０／１０／３８．５／１．５）は、インビボ活性を増強させるため更に最適化され得る。
Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ Ｄ Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｆｔｅｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ ｉｎ ｍｉｃｅ：Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ：２９，Ｐａｇｅｓ：１５４−１５７（２０１１））は、脂質エンベロープを用いたＲＮＡの送達について記載している。脂質エンベロープの使用は本発明においても好ましい。
別の実施形態では、脂質を本発明のＲＮＡターゲティング系（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ｂ複合体、即ちｃｒＲＮＡと複合体化されたＣａｓ１３ｂ）又はその構成成分又はそれをコードする核酸分子と共に製剤化して、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成し得る。脂質としては、限定されないが、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ４、Ｃ１２−２００及びコリピドジステロイルホスファチジルコリン、コレステロールが挙げられ、且つＰＥＧ−ＤＭＧを、小胞自然形成手順を用いてｓｉＲＮＡの代わりにＲＮＡターゲティング系と共に製剤化し得る（例えば、Ｎｏｖｏｂｒａｎｔｓｅｖａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１２）１，ｅ４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１１．３を参照されたい）。構成成分のモル比は、約５０／１０／３８．５／１．５（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ又はＣ１２−２００／ジステロイルホスファチジルコリン／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ）であり得る。最終的な脂質：ｓｉＲＮＡ重量比は、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ及びＣ１２−２００脂質粒子（ＬＮＰ）の場合、それぞれ約１２：１及び９：１であり得る。製剤は、＞９０％の捕捉効率で約８０ｎｍの平均粒子直径を有し得る。３ｍｇ／ｋｇ用量が企図され得る。Ｔｅｋｍｉｒａは、米国及び米国外に、ＬＮＰ及びＬＮＰ製剤の様々な態様に関する約９５のパテントファミリーのポートフォリオを有し（例えば、米国特許第７，９８２，０２７号明細書；同第７，７９９，５６５号明細書；同第８，０５８，０６９号明細書；同第８，２８３，３３３号明細書；同第７，９０１，７０８号明細書；同第７，７４５，６５１号明細書；同第７，８０３，３９７号明細書；同第８，１０１，７４１号明細書；同第８，１８８，２６３号明細書；同第７，９１５，３９９号明細書；同第８，２３６，９４３号明細書及び同第７，８３８，６５８号明細書及び欧州特許第１７６６０３５号明細書；同第１５１９７１４号明細書；同第１７８１５９３号明細書及び同第１６６４３１６号明細書を参照されたい）、これらは、全て本発明に使用及び／又は応用することができる。
ＲＮＡターゲティング系又はその構成成分又はそれをコードする核酸分子は、タンパク質、タンパク質前駆体又は部分的又は完全にプロセシングされた形態のタンパク質又はタンパク質前駆体をコードし得る改変核酸分子を含む組成物の製剤の態様に関する米国特許出願公開第２０１３０２５２２８１号明細書及び同第２０１３０２４５１０７号明細書及び同第２０１３０２４４２７９号明細書（Ｍｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに譲渡された）に更に記載されるものなど、ＰＬＧＡミクロスフェアに封入して送達し得る。製剤は、モル比５０：１０：３８．５：１．５〜３．０（カチオン性脂質：膜融合性脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質）を有し得る。ＰＥＧ脂質は、限定されないが、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧから選択され得る。膜融合性脂質は、ＤＳＰＣであり得る。また、Ｓｃｈｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、米国特許出願公開第２０１２０２５１６１８号明細書も参照されたい。
Ｎａｎｏｍｅｒｉｃｓの技術は、低分子量疎水性薬物、ペプチド及び核酸ベースの治療薬（プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を含めた広範囲の治療薬に関するバイオアベイラビリティの難題に対処している。この技術が明らかな利点を実証している特定の投与経路には、経口経路、血液脳関門を越える輸送、固形腫瘍への送達並びに眼への送達が含まれる。例えば、Ｍａｚｚａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１３ Ｆｅｂ ２６；７（２）：１０１６−２６；Ｕｃｈｅｇｂｕ ａｎｄ Ｓｉｅｗ，２０１３，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１０２（２）：３０５−１０及びＬａｌａｔｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１２ Ｊｕｌ ２０；１６１（２）：５２３−３６を参照されたい。
米国特許出願公開第２００５００１９９２３号明細書は、ポリヌクレオチド分子、ペプチド及びポリペプチド及び／又は医薬品などの生理活性分子を哺乳類の体に送達するためのカチオン性デンドリマーについて記載している。デンドリマーは、生理活性分子の送達を例えば肝臓、脾臓、肺、腎臓又は心臓に（又は更に脳までも）標的化するのに好適である。デンドリマーは、単純な分岐単量体単位から段階的に調製される合成三次元巨大分子であり、その性質及び機能は容易に制御し、変化させることができる。デンドリマーは、構成要素を多機能コアに（ダイバージェント合成手法）又は多機能コアに向かって（コンバージェント合成手法）反復的に加えることによって合成され、構成要素の三次元シェルを加える毎に、より高世代のデンドリマーの形成につながる。ポリプロピレンイミンデンドリマーはジアミノブタンコアから開始され、それに第一級アミンへのアクリロニトリルの二重マイケル付加によって２倍の数のアミノ基が加えられ、続いてニトリルが水素化される。この結果、アミノ基の倍増がもたらされる。ポリプロピレンイミンデンドリマーは、１００％プロトン化可能な窒素及び最大６４個の末端アミノ基（第５世代、ＤＡＢ ６４）を含有する。プロトン化可能な基は、通常、中性ｐＨでプロトンを受け取ることが可能なアミン基である。デンドリマーの遺伝子デリバリー剤としての使用は、大部分が、コンジュゲート単位としてそれぞれアミン／アミド又はＮ−−Ｐ（Ｏ２）Ｓの混合物を有するポリアミドアミン及び亜リン酸含有化合物の使用に着目したものであり、それより低い世代のポリプロピレンイミンデンドリマーの遺伝子送達への使用に関して報告がない。ポリプロピレンイミンデンドリマーも、周囲アミノ酸性基によって化学的に改変されたとき薬物送達及びゲスト分子のそれらの封入のためのｐＨ感受性制御放出系として研究されている。ＤＮＡを有するポリプロピレンイミンデンドリマーの細胞傷害性及び相互作用並びにＤＡＢ ６４のトランスフェクション有効性も研究されている。米国特許出願公開第２００５００１９９２３号明細書は、先行の報告に反して、ポリプロピレンイミンデンドリマーなどのカチオン性デンドリマーが、特異的標的化及び低毒性など、遺伝物質など、生理活性分子の標的化した送達において用いるのに好適な特性を示すという観察に基づく。加えて、カチオン性デンドリマーの誘導体も生理活性分子の標的化された送達に好適な特性を示す。また、「カチオン性ポリアミンポリマー及びデンドリマーポリマーを含めた様々なポリマーは抗増殖活性を有することが示され、従って、新生物及び腫瘍、炎症性障害（自己免疫障害を含む）、乾癬及びアテローム性動脈硬化症など、望ましくない細胞増殖によって特徴付けられる障害の治療に有用であり得る。ポリマーは単独で活性薬剤として用いられ得、又は遺伝子療法のための薬物分子又は核酸など、他の治療剤の送達ビヒクルとして用いられ得る。そのような場合、ポリマー自体の固有の抗腫瘍活性が、送達される薬剤の活性を補完し得る」ことを開示するＢｉｏａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，米国特許出願公開第２００８０２６７９０３号明細書も参照されたい。これらの特許公報の開示は、核酸ターゲティング系又はその構成成分又はそれをコードする核酸分子の送達に関する本明細書における教示と併せて用いられ得る。
超荷電タンパク質
超荷電タンパク質は、異常に高い理論上の正味正電荷又は負電荷を有するエンジニアリングされた又は天然に存在するタンパク質の一クラスであり、核酸ターゲティング系又はその構成成分又はそれをコードする核酸分子の送達に用いられ得る。超負電荷及び超正電荷の両方のタンパク質とも、熱的又は化学的に誘導される凝集に耐える著しい能力を呈する。超正電荷タンパク質は、哺乳類細胞に侵入することも可能である。プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ又は他のタンパク質など、これらのタンパク質と関連付けるカーゴが、インビトロ及びインビボの両方でこれらの巨大分子を哺乳類細胞に機能的に送達することを可能にし得る。Ｄａｖｉｄ Ｌｉｕの研究室は、２００７年に超荷電タンパク質の作成及び特徴付けを報告した（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２９，１０１１０−１０１１２）。
哺乳類細胞へのＲＮＡ及びプラスミドＤＮＡの非ウイルス性送達は、研究及び治療適用の両方に価値がある（Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６，５６１−５６９）。精製＋３６ ＧＦＰタンパク質（又は他の超正電荷タンパク質）を適切な無血清培地中でＲＮＡと混合して複合体化させた後、細胞に加える。この段階で血清を含めると、超荷電タンパク質−ＲＮＡ複合体の形成が阻害され、治療の有効性が低下する。以下のプロトコルが種々の細胞株に有効であることが分かっている（ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６，６１１１−６１１６。しかしながら、具体的な細胞株に対して手順を最適化するには、タンパク質及びＲＮＡの用量を変化させるパイロット実験を行わなければならない）。（１）処理前日、４８ウェルプレートに１ウェル当たり１×１０５細胞をプレーティングする。（２）処理当日、最終濃度２００ｎＭとなるように精製＋３６ ＧＦＰタンパク質を無血清培地中に希釈する。５０ｎＭの最終濃度となるようにＲＮＡを加える。ボルテックスして混合し、室温で１０分間インキュベートする。（３）インキュベーション中、細胞から培地を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄する。（４）＋３６ ＧＦＰ及びＲＮＡのインキュベーション後、細胞にタンパク質−ＲＮＡ複合体を加える。（５）細胞を複合体と共に３７℃で４時間インキュベートする。（６）インキュベーション後、培地を吸引し、２０Ｕ／ｍＬヘパリンＰＢＳで３回洗浄する。細胞を血清含有培地と共に、活性に関するアッセイに応じて更に４８時間又はそれを超えてインキュベートする。（７）免疫ブロット、ｑＰＣＲ、表現型アッセイ又は他の適切な方法によって細胞を分析する。
＋３６ ＧＦＰは、様々な細胞において有効なプラスミド送達試薬であることが分かった。例えば、ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６，６１１１−６１１６（２００９）；Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５，７４７−７５２（２０１０）；Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ １８，８３３−８３８（２０１１）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ５０３，２９３−３１９（２０１２）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ １９（７），８３１−８４３（２０１２）も参照されたい。超荷電タンパク質の方法は、本発明のＲＮＡターゲティング系又はその構成成分又はそれをコードする核酸分子の送達に使用及び／又は応用することができる。
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）
更に別の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の送達に細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）が企図される。ＣＰＰは、（ナノサイズ粒子から化学的小分子及び大型ＤＮＡ断片に至るまでの）様々な分子カーゴの細胞取込みを促進する短鎖ペプチドである。用語「カーゴ」は、本明細書で使用されるとき、限定されないが、治療剤、診断プローブ、ペプチド、核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミド、タンパク質、ナノ粒子を含めた粒子、リポソーム、発色団、小分子及び放射性物質からなる群を含む。本発明の態様では、カーゴには、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の任意の構成成分又は機能性ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系全体も含まれ得る。本発明の態様は、所望のカーゴを対象に送達する方法を更に提供し、この方法は、（ａ）本発明の細胞透過性ペプチドと所望のカーゴとを含む複合体を調製するステップ、及び（ｂ）複合体を対象に経口的に、関節内に、腹腔内に、くも膜下腔内に、動脈内に、鼻腔内に、実質内に、皮下に、筋肉内に、静脈内に、経皮的に、直腸内に又は局所的に投与するステップを含む。カーゴは、共有結合を介した化学的連結によるか、又は非共有結合性の相互作用によるかのいずれかでペプチドと会合している。ＣＰＰの機能は、カーゴを細胞内に送達することであり、これは、一般的にはエンドサイトーシスを通じて起こるプロセスであって、カーゴは、哺乳類生細胞のエンドソームに送達される。細胞透過性ペプチドのサイズ、アミノ酸配列及び電荷は様々であるが、全てのＣＰＰが、細胞膜を移行し且つ細胞質又は細胞小器官への様々な分子カーゴの送達を促進する能力である１つの個別的な特徴を有する。ＣＰＰの移行は、３つの主な侵入機構に分類し得る：膜における直接の透過、エンドサイトーシスを介する侵入及び一過性構造の形成を通じた移行。ＣＰＰは、癌及びウイルス阻害薬並びに細胞標識のための造影剤を含め、種々の疾患の治療におけるドラッグデリバリー剤として医薬において多くの適用が見出されている。後者の例としては、ＧＦＰ、ＭＲＩ造影剤又は量子ドットの担体としての役割が挙げられる。ＣＰＰには、研究及び医薬に用いられるインビトロ及びインビボ送達ベクターとして大きい可能性がある。ＣＰＰのアミノ酸組成は、典型的には、リジン又はアルギニンなど正電荷アミノ酸の高い相対存在量を含むか、又は極性／荷電アミノ酸と非極性疎水性アミノ酸との交互のパターンを含む配列を有するかのいずれかである。これらの２つの構造タイプは、それぞれポリカチオン性又は両親媒性と称される。第３のＣＰＰクラスは、非極性残基のみを含む疎水性ペプチドであり、これは正味電荷が低いか又は細胞取込みに重要な疎水性アミノ酸基を有する。発見当初のＣＰＰの１つはヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）由来のトランス活性化転写アクチベーター（Ｔａｔ）であり、これは多数の培養下細胞型によって周囲の培地から効率的に取り込まれることが見出された。それ以降、既知のＣＰＰの数は大幅に増え続け、より有効なタンパク質形質導入特性を有する小分子合成類似体が作成されている。ＣＰＰとしては、限定されないが、ペネトラチン、Ｔａｔ（４８−６０）、トランスポータン及び（Ｒ−ＡｈＸ−Ｒ４）（Ａｈｘ＝アミノヘキサノイル）が挙げられる。
米国特許第８，３７２，９５１号明細書は、高い細胞透過性効率及び低毒性を呈する好酸球カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）から送達されるＣＰＰを提供する。ＣＰＰをそのカーゴで脊椎動物対象に送達する態様も提供されている。ＣＰＰ及びそれらの送達の更なる態様は、米国特許第８，５７５，３０５号明細書；８；同第６１４，１９４号明細書及び同第８，０４４，０１９号明細書に記載されている。ＣＰＰは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はその構成成分の送達に使用することができる。ＣＰＰを用いてＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はその構成成分を送達できることは、論稿“Ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｂｙ ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ”，Ｓｕｒｅｓｈ Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ，Ａｂｕ−Ｂｏｎｓｒａｈ Ｋｗａｋｕ Ｄａｄ，Ｊａｇａｄｉｓｈ Ｂｅｌｏｏｒ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１４ Ａｐｒ ２．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］（全体として参照により援用される）にも提供されており、ここで、ＣＰＰコンジュゲート組換えＣａｓ９タンパク質及びＣＰＰ複合体化ガイドＲＮＡによる処理が、ヒト細胞株における内因性遺伝子破壊につながることが実証されている。この論文では、Ｃａｓ９タンパク質はチオエーテル結合によってＣＰＰにコンジュゲートされた一方、ガイドＲＮＡはＣＰＰと複合体化され、縮合した正電荷粒子を形成した。胚性幹細胞、皮膚線維芽細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞及び胚性癌腫細胞を含めたヒト細胞を改変Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡで同時に及び逐次的に処理すると、プラスミドトランスフェクションと比べてオフターゲット突然変異が低下した効率的な遺伝子破壊につながったことが示された。本発明の実施においてＣＰＰ送達を用いることができる。
植込み型デバイス
別の実施形態において、植込み型デバイスも、ＲＮＡターゲティング系又はその構成成分又はそれをコードする核酸分子の送達に企図される。例えば、米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書は、薬物を局所的に長時間溶出する植込み型医療器具を、幾つかのタイプのかかるデバイス、治療の実装形態及び植え込み方法を含めて開示しており、それが提供される。デバイスは、例えば、デバイス本体として用いられるマトリックスなどのポリマー基質及び薬物並びに場合により金属又は更なるポリマーなどの追加的な足場材料及び可視性及びイメージングを増強する材料を含む。植込み型送達デバイスは局所的な長期間にわたる放出を提供するのに有利であり得、ここで、薬物は、腫瘍、炎症、変性などの罹患範囲の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に直接又は症候性の対象のため、又は損傷した平滑筋細胞に、又は予防のため放出される。薬物の一種は上記に開示されるとおりＲＮＡであり、このシステムは本発明の核酸ターゲティング系に使用及び／又は応用することができる。一部の実施形態において植え込み方法は、小線源照射療法及び針生検を含め、現在他の治療向けに開発及び使用されている既存の植え込み手技である。そのような場合、本発明に記載される新規インプラントの寸法は、元のインプラントと同様である。典型的には、同じ治療手技中に数個のデバイスが植え込まれる。米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書は、例えば、任意選択でマトリックスであり得る生体安定性及び／又は分解性及び／又は生体吸収性ポリマー基質を含む、腹腔などの体腔及び／又は薬物送達システムが繋留されたり又は付着したりしない任意の他のタイプの投与に適用可能なシステムを含め、薬物送達植込み型又は挿入型システムを提供する。用語「挿入」には、植込みも含まれることに留意しなければならない。薬物送達システムは、好ましくは、米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書に記載されるとおりの「Ｌｏｄｅｒ」として植え込まれる。ポリマー又は複数のポリマーが生体適合性であり、薬剤及び／又は複数の薬剤を取り入れ、且つ制御された速度での薬剤の放出を可能にし、ここで、マトリックスなどのポリマー基質の総容積は、例えば、一部の実施形態では、任意選択で及び好ましくは、治療レベルの薬剤の放出を可能にする最大容積以下である。非限定的な例として、かかる容積は、薬剤負荷容積による必要に応じて好ましくは０．１〜１０００ｍｍ３の範囲内である。Ｌｏｄｅｒは、任意選択で、例えば及び限定なしに膝関節、子宮内又は子宮頸部リングなど、そのサイズが機能によって決まるデバイスで例えば取り込まれるとき、より大きいことができる。薬物送達システム（組成物を送達するための）は、一部の実施形態において、好ましくは分解性ポリマーを用いるように設計され、ここで、主な放出機構はバルク侵食である；又は一部の実施形態において、非分解性の又は徐々に分解されるポリマーが使用され、ここで、主な放出機構はバルク侵食よりむしろ拡散であり、従って外側部分が膜として機能し、及びその内側部分が、実質的に長期間にわたって（例えば、約１週間〜約数ヵ月）周囲からの影響を受けない薬物リザーバとして機能する。異なる放出機構を有する異なるポリマーの組み合わせも任意選択で用いられ得る。表面の濃度勾配は、好ましくは、相当な期間の全薬物放出期間にわたって事実上一定に維持され、従って拡散速度は事実上一定である（「ゼロモード」拡散と呼ばれる）。用語「一定」とは、好ましくは、治療有効性の下限閾値より高く維持されるが、しかし、なおも任意選択で初期バーストを特徴とし得、及び／又は変動し得る、例えば一定限度増加及び減少し得る拡散速度が意味される。拡散速度は、好ましくは、長期間そのように維持され、及び治療上有効な期間、例えば有効なサイレンシング期間を最適化するのに特定のレベルで一定であると見なすことができる。薬物送達システムは、本質的に化学的であるか、それとも酵素及び対象の体内にある他の因子からの攻撃に起因するかに関わらず、任意選択で及び好ましくは、分解からヌクレオチドベースの治療剤を遮蔽するように設計される。米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の薬物送達システムは、例えば、任意選択で、限定されないが、熱的加熱及び冷却、レーザービーム及び集束超音波を含めた超音波及び／又はＲＦ（高周波）による方法又はデバイスを含め、非侵襲性及び／又は最小侵襲性の起動及び／又は加速／速度方法によって任意選択でデバイスの植込み時及び／又は植込み後に動作させる検知及び／又は起動器具と関連付けられる。米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の一部の実施形態によれば、局所送達部位には、任意選択で、腫瘍、自己免疫疾患状態を含めた活性化及び／又は慢性的炎症及び感染、筋肉及び神経組織を含めた変性組織、慢性痛、変性部位、及び骨折箇所及び組織の再生強化のための他の創傷箇所、及び傷害された心筋、平滑筋及び横紋筋を含め、細胞の高度な異常増殖、及び抑制されたアポトーシスによって特徴付けられる標的部位が含まれ得る。組成物の植込み部位又は標的部位は、好ましくは、標的局所送達に十分に小さい半径、面積及び／又は容積を特徴とする。例えば、標的部位は、任意選択で、約０．１ｍｍ〜約５ｃｍの範囲の直径を有する。標的部位の位置は、好ましくは、治療有効性を最大化するように選択される。例えば、薬物送達システム（任意選択で上記に記載したとおりの植込み用デバイスを伴う）の組成物は、任意選択で及び好ましくは、腫瘍環境又はそれに関連する血液供給の範囲内又はその近くに植え込まれる。例えば、組成物（任意選択でデバイスを伴う）は、任意選択で、脈管系の範囲内などでニップルを用いて膵臓、前立腺、乳房、肝臓の範囲内又はその近くに植え込まれる。標的の位置は、任意選択で、（任意選択で体内の任意の部位がＬｏｄｅｒの植込みに好適であり得るように、あくまでも非限定的な例として）：１．基底核、白質及び灰白質におけるパーキンソン病又はアルツハイマー病のような変性部位の脳；２．筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の場合のような脊椎；３．ＨＰＶ感染症予防のための子宮頸部；４．活性化及び慢性的炎症関節；５．乾癬の場合のような真皮；６．鎮痛効果のための交感神経及び感覚神経部位；７．骨内植え込み；８．急性及び慢性感染部位；９．腟内；１０．内耳−聴覚系、内耳の迷路、前庭系；１１．気管内；１２．心内；冠動脈、心外膜；１３．膀胱；１４．胆管系；１５．限定されないが、腎臓、肝臓、脾臓を含む実質組織；１６．リンパ節；１７．唾液腺；１８．歯肉；１９．関節内（関節の中）；２０．眼内；２１．脳組織；２２．脳室；２３．腹腔を含む腔（例えば、限定されないが、卵巣癌について）；２４．食道内及び２５．直腸内を含むか、それらから本質的になるか又はそれらからなる群から選択される。
任意選択で、システム（例えば、組成物を含有するデバイス）の挿入は、標的部位及びその部位の近傍におけるＥＣＭへの材料の注射により、標的部位及びかかる部位の近傍の局所ｐＨ及び／又は温度及び／又はＥＣＭにおける薬物の拡散及び／又は薬物動態に影響を及ぼす他の生物学的因子に影響を及ぼすことを伴う。任意選択で、一部の実施形態によれば、前記薬剤の放出は、挿入前及び／又は挿入時及び／又は挿入後に、非侵襲性及び／又は最小侵襲性及び／又は他の起動及び／又は加速／減速方法、例えばレーザービーム、放射線照射、熱的加熱及び冷却、及び集束超音波を含めた超音波及び／又はＲＦ（高周波）方法又はデバイス、及び化学的アクチベーターによって動作させるアプライアンスを検知及び／又は起動することを伴い得る。
本発明の実施に用いることのできる米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の実施形態によれば、薬物は、好ましくは、例えば以下に記載するとおり乳房、膵臓、脳、腎臓、膀胱、肺及び前立腺における限局性の癌の場合、ＲＮＡを含む。ＲＮＡｉで例示されるが、多くの薬物がＬｏｄｅｒへの封入に適用可能であり、かかる薬物を、例えばマトリックスなどのＬｏｄｅｒ基質で封入することができる限り、本発明に関連して使用することができ、この系は、本発明の核酸ターゲティング系の送達に使用及び／又は応用することができる。特定の適用の別の例として、異常な遺伝子発現に起因して神経及び筋肉変性疾患が発生する。ＲＮＡの局所送達は、かかる異常な遺伝子発現に干渉する治療特性を有し得る。小薬物及び巨大分子を含めた抗アポトーシス、抗炎症性及び抗変性薬物の局所送達も場合により治療効果があり得る。そのような場合、Ｌｏｄｅｒは、一定の速度での及び／又は別途植え込まれる専用のデバイスを介した長期放出に適用される。
これは、全て本発明のＲＮＡターゲティング系に使用及び／又は応用することができる。本明細書において考察される植込み型デバイス技術は、本明細書における教示と共に用いることができ、従って本開示及び当該技術分野における知識により、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ｂ系、又はその複合体若しくは構成成分、又はその又は構成成分をコード若しくは提供する核酸分子を植込み型デバイスによって送達し得る。
患者特異的スクリーニング方法
ＲＮＡを標的とする核酸ターゲティング系を使用して、特定のＲＮＡの存在に関して患者又は患者試料をスクリーニングすることができる。
ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡ
ＣＲＩＳＰＲエフェクター（Ｃａｓ１３ｂ）タンパク質又はそのｍＲＮＡ（又はより一般的にはその核酸分子）及びガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、別々に、例えば前者がガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡの投与の１〜１２時間前（好ましくは約２〜６時間前）に送達され得るか又は一緒に送達され得る。ガイドＲＮＡ又は、ｃｒＲＮＡの第２のブースター用量を初回投与の１〜１２時間後（好ましくは約２〜６時間後）に投与することができる。
Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、時に本明細書においてＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と称される。エフェクタータンパク質は酵素をベースとし又はそれに由来し、従って一部の実施形態において用語「エフェクタータンパク質」は必ず「酵素」を含むことが理解されるであろう。しかしながら、また、エフェクタータンパク質は、一部の実施形態において必要に応じてＤＮＡ又はＲＮＡ結合を有し得るが、デッドＣａｓエフェクタータンパク質機能を含め、必ずしも切断又はニッキング活性を有するとは限らないことも理解されるであろう。
細胞標的としては、造血幹／前駆細胞（ＣＤ３４＋）；ヒトＴ細胞；及び眼（網膜細胞） − 例えば光受容前駆細胞が挙げられる。
本発明の方法は、鋳型の送達を更に含むことができる。鋳型の送達は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（Ｃａｓ１３ｂ）、又はガイド、又はｃｒＲＮＡの一部又は全部の送達と同時又は別個によるものであり得、且つ同じ又は異なる送達機構によるものであり得る。
誘導性系
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクター（Ｃａｓ１３ｎ）タンパク質は、誘導性系の一成分を形成し得る。この系の誘導可能な性質により、エネルギーの形態を用いた遺伝子編集又は遺伝子発現の時空間的制御が可能となり得る。エネルギーの形態としては、限定されないが、電磁放射線、音響エネルギー、化学エネルギー及び熱エネルギーを挙げることができる。誘導性系の例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆ）、小分子２ハイブリッド転写活性化システム（ＦＫＢＰ、ＡＢＡ等）又は光誘導性系（フィトクロム、ＬＯＶドメイン又はクリプトクロム）が含まれる。一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、配列特異的に転写活性の変化を導く光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）の一部であり得る。光の構成成分には、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来）及び転写活性化／抑制ドメインが含まれ得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及びその使用方法の更なる例は、米国仮特許出願第６１／７３６４６５号明細書及び米国仮特許出願第６１／７２１，２８３号明細書及び国際公開第２０１４０１８４２３ Ａ２号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）に提供される。
自己不活性化系
細胞内のＲＮＡの全てのコピーが編集された後、その細胞においてＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質発現又は活性がそれ以上続行する必要はない。Ｃａｓ１３ｂ又はｃｒＲＮＡに関してガイド標的配列としてＲＮＡの使用に依存する自己不活性化系は、Ｃａｓ１３ｂの発現又は複合体形成を妨げることにより、その系を停止させることができる。
キット
ある態様において、本発明は、上記の方法及び組成物に開示される要素の任意の１つ以上を含むキットを提供する。一部の実施形態において、本キットは、本明細書に教示されるとおりのベクター系又は本明細書に教示されるとおりのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３ｂ系又は複合体の構成成分の１つ以上、例えばｃｒＲＮＡ及び／又はＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又はＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質をコードするｍＲＮＡなど、及びキットの使用説明書を含む。要素は、個々に又は組み合わせで提供され得、且つ任意の好適な容器、例えばバイアル、ボトル又はチューブに提供され得る。一部の実施形態において、本キットは、１つ以上の言語、例えば２つ以上の言語による説明書を含む。説明書は、本明細書に記載される適用及び方法に特異的であり得る。一部の実施形態において、本キットは、本明細書に記載される要素の１つ以上を利用するプロセスで使用するための１つ以上の試薬を含む。試薬は、任意の好適な容器中に提供され得る。例えば、本キットは、１つ以上の反応又は保存緩衝液を提供し得る。試薬は、特定のアッセイで使用可能な形態で提供され得るか、又は使用前に１つ以上の他の構成成分の添加が必要な形態（例えば、濃縮形態又は凍結乾燥形態）で提供され得る。緩衝液は、限定されないが、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、トリス緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液及びこれらの組み合わせを含めた任意の緩衝液であり得る。一部の実施形態において、緩衝液は、アルカリ性である。一部の実施形態において、緩衝液は、ｐＨが約７〜約１０である。一部の実施形態において、本キットは、ガイド又はｃｒＲＮＡ配列と調節エレメントとを作動可能に連結するためベクターに挿入されるガイド配列に対応する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本キットは、相同組換え鋳型ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本キットは、本明細書に記載されるベクターの１つ以上及び／又はポリヌクレオチドの１つ以上を含む。本キットは、有利には、本発明の系の全てのエレメントを提供することが可能であり得る。
本発明は、例えば、遺伝子療法、薬物スクリーニング、疾患診断及び予後判定において、広範な適用性を有する。
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」は、同義的に使用される。これらの用語は、デオキシリボヌクレオチドであれ又はリボヌクレオチドであれ、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド又はその類似体を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、既知又は未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子断片のコード領域又は非コード領域、連鎖解析によって定義される複数の遺伝子座（１つの遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマー。この用語は、合成骨格を有する核酸様構造も包含し、例えばＥｃｋｓｔｅｉｎ，１９９１；Ｂａｓｅｒｇａ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｍｉｌｌｉｇａｎ，１９９３；国際公開第９７／０３２１１号パンフレット；国際公開第９６／３９１５４号パンフレット；Ｍａｔａ，１９９７；Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ，１９９７；及びＳａｍｓｔａｇ，１９９６を参照されたい。ポリヌクレオチドは、１つ以上の改変ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の改変はポリマーをアセンブルする前又はその後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド構成成分で中断され得る。ポリヌクレオチドは、重合後に、標識構成成分とのコンジュゲーションによるなどして更に改変され得る。本明細書で使用されるとき、用語「野生型」は、当業者によって理解される当該技術分野の用語であり、突然変異体又は変異体形態とは区別されるものとして天然に存在するとおりの、典型的な形態の生物、菌株、遺伝子又は特徴を意味する。「野生型」はベースラインであり得る。本明細書で使用されるとき、用語「変異体」は、天然に存在するものから逸脱したパターンを有する質の呈示を意味するものと解釈されなければならない。用語「天然に存在しない」又は「エンジニアリングされた」は、同義的に使用され、人間の手が加えられていることを示す。この用語は、核酸分子又はポリペプチドに言及するとき、核酸分子又はポリペプチドが、自然中ではそれと天然に結び付いている、且つ自然中に見られるとおりの少なくとも１つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する「相補性」は、従来のワトソン・クリック塩基対合又は他の非従来型の対合のいずれかによって核酸が別の核酸配列と水素結合を形成する能力を指す。「相補性」は、従来のワトソン・クリック塩基対合又は他の非従来型のいずれかによって核酸が別の核酸配列と水素結合を形成する能力を指す。パーセント相補性は、核酸分子中で第２の核酸配列と水素結合を形成（例えば、ワトソン・クリック塩基対合）することのできる残基のパーセンテージを示す（例えば、１０個のうちの５、６、７、８、９、１０個は、それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の相補性である）。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が第２の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補的」は、本明細書で使用されるとき、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド又はそれを超える領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％である相補性の程度を指し、又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。本明細書で使用されるとき、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件」とは、標的配列と相補性を有する核酸が標的配列に優先的にハイブリダイズし、且つ非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、概して、配列依存性であり、幾つもの要因に応じて異なる。一般に、配列が長いほど、配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度が高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例が、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に詳述されている。ポリヌクレオチド配列に言及する場合、相補配列又は部分的相補配列も想定される。これらは、好ましくは、高度にストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズ可能なものである。概して、ハイブリダイゼーション速度を最大にするには、比較的低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（熱融点（Ｔｍ）より約２０〜２５℃低い）が選択される。Ｔｍは、特定の標的配列の５０％が規定のイオン強度及びｐＨの溶液中で完全に相補的なプローブにハイブリダイズする温度である。概して、ハイブリダイズした配列の少なくとも約８５％のヌクレオチド相補性を要求する場合、Ｔｍより約５〜１５℃低くなるよう高度にストリンジェントな洗浄条件が選択される。ハイブリダイズした配列の少なくとも約７０％のヌクレオチド相補性を要求する場合、Ｔｍより約１５〜３０℃低くなるよう中程度にストリンジェントな洗浄条件が選択される。高度に許容的な（極めて低いストリンジェンシーの）洗浄条件はＴｍより５０℃も低いものであり得、ハイブリダイズした配列間に高レベルのミスマッチが許容される。当業者は、ハイブリダイゼーション段階及び洗浄段階における他の物理的及び化学的パラメータも、標的配列とプローブ配列との間の特定の相同性レベルからの検出可能なハイブリダイゼーションシグナルの結果に影響を与えるよう変更し得ることを認識するであろう。好ましい高度にストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ及び１％ ＳＤＳ中４２℃でのインキュベーション又は５×ＳＳＣ及び１％ ＳＤＳ中６５℃でのインキュベーションと、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳ中６５℃での洗浄を含む。「ハイブリダイゼーション」とは、１つ以上のポリヌクレオチドが反応することによりヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定した複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対合、フーグステイン（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ）結合によるか、又は任意の他の配列特異的様式で起こり得る。複合体には、二重鎖構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖又はこれらの任意の組み合わせが含まれ得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始又は酵素によるポリヌクレオチドの切断など、より大規模なプロセスで一ステップを構成し得る。所与の配列とハイブリダイズ可能な配列は、その所与の配列の「相補体」と称される。本明細書で使用されるとき、用語「ゲノム遺伝子座」又は「遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）」（複数形ｌｏｃｉ）は、染色体上の遺伝子又はＤＮＡ配列の特定の位置である。「遺伝子」は、ポリペプチドをコードする一続きのＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は生物において機能的役割を果たし、従って生体における分子的遺伝単位であるＲＮＡ鎖を指す。本発明の目的上、遺伝子は、遺伝子産物の産生を調節する領域を含むと（かかる調節配列がコード配列及び／又は転写配列に隣接しているか否かに関わらず）見なし得る。従って、遺伝子には、必ずしも限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位及び配列内リボソーム進入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位及び遺伝子座制御領域が含まれる。本明細書で使用されるとき、「ゲノム遺伝子座の発現」又は「遺伝子発現」は、機能的遺伝子産物の合成に遺伝子からの情報が用いられる過程である。遺伝子発現の産物は、多くの場合にタンパク質であるが、ｒＲＮＡ遺伝子又はｔＲＮＡ遺伝子などの非タンパク質コード遺伝子では、産物は機能性ＲＮＡである。遺伝子発現の過程は、あらゆる既知の生命−真核生物（多細胞生物を含む）、原核生物（細菌及び古細菌）及びウイルスによって生存のための機能性産物の産生に用いられている。本明細書で使用されるとき、遺伝子又は核酸の「発現」には、細胞遺伝子発現のみならず、クローニング系及び任意の他のものに関連して核酸の転写及び翻訳も包含される。本明細書で使用されるとき、「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（ｍＲＮＡ又は他のＲＮＡ転写物などに）転写される過程及び／又は転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳される過程も指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、まとめて「遺伝子産物」と称される。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指して同義的に使用される。ポリマーは線状又は分枝状であり得、それは修飾アミノ酸を含み得、及びそれは非アミノ酸が割り込み得る。これらの用語は、改変されているアミノ酸ポリマー（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化又は他に任意の、標識成分とのコンジュゲーションなどの操作）も包含する。本明細書で使用されるとき、用語「アミノ酸」には、グリシン及びＤ又はＬの両方の光学異性体及びアミノ酸類似体及びペプチド模倣体を含め、天然及び／又は非天然又は合成のアミノ酸が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「ドメイン」又は「タンパク質ドメイン」は、タンパク質配列のうち、残りのタンパク質鎖と独立に存在し及び機能し得る一部分を指す。本発明の態様に記載されるとおり、配列同一性は配列相同性と関係する。相同性比較は目測で行われ得、又はより通例では、容易に利用可能な配列比較プログラムを用いて行われ得る。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間のパーセント（％）相同性を計算することができ、また２つ以上のアミノ酸配列又は核酸配列が共有する配列同一性も計算することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「野生型」は、当業者によって理解される当該技術分野の用語であり、突然変異体又は変異体の形態とは区別されるものとして天然に存在するとおりの、典型的な形態の生物、菌株、遺伝子又は特徴を意味する。「野生型」はベースラインであり得る。
本明細書で使用されるとき、用語「変異体」は、天然に存在するものから逸脱したパターンを有する質の呈示を意味するものと解釈されなければならない。用語「天然に存在しない」又は「エンジニアリングされた」は、同義的に使用され、人間の手が加えられていることを示す。この用語は、核酸分子又はポリペプチドに言及しているとき、核酸分子又はポリペプチドが、自然中ではそれと天然に結び付いている、且つ自然中に見られるとおりの少なくとも１つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。これらの用語を含むか否かに関わらず、あらゆる態様及び実施形態において、好ましくは、それは、任意選択であり得、従って好ましくは含まれ、又は含まれないことは好ましくないことは理解されるであろう。更に、用語「天然に存在しない」及び「エンジニアリングされた」は、同義的に用いられ得、そのため、従って単独で又は組み合わせで用いることができ、いずれか一方を両方とも併せた記述に置き換え得る。詳細には、「天然に存在しない」又は「天然に存在しない及び／又はエンジニアリングされた」の代わりに「エンジニアリングされた」が好ましい。
配列相同性は、当該技術分野において公知の幾つものコンピュータプログラムのいずれか、例えばＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどによって求めることができる。かかるアラインメントの実施に好適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）である。配列の比較を行うことができる他のソフトウェアの例としては、限定されないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ 前掲−Ｃｈａｐｔｅｒ １８を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３−４１０）及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートが挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは、いずれもオフライン及びオンライン検索が利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ 前掲，７−５８〜７−６０頁を参照されたい）。しかしながら、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。パーセンテージ（％）配列相同性は連続配列に関して計算され得、即ち一方の配列を他方の配列とアラインメントして、一方の配列の各アミノ酸又はヌクレオチドが他方の配列の対応するアミノ酸又はヌクレオチドと１残基ずつ直接比較される。これは、「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。かかるギャップなしアラインメントは比較的少数の残基にのみ行われる。これは極めて単純で一貫した方法であるが、例えば、本来は同一の配列ペアにおいて、１つの挿入又は欠失があるために以降のアミノ酸残基がアラインメントから外れる点を考慮に入れることができず、従って大域的アラインメントを行うと潜在的に％相同性が大きく低下し得る。結果的に、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性又は同一性スコアに過度のペナルティーを与えることなく、可能性のある挿入又は欠失を考慮に入れる最適アラインメントを生成するように設計される。これは、局所的な相同性又は同一性を最大化しようと配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。しかしながら、これらの複雑性の高い方法は、アラインメント内に出現する各ギャップに「ギャップペナルティー」を割り当てるため、同数の同一アミノ酸について、ギャップが可能な限り少ない配列アラインメント（２つの比較される配列間の高い関連性を反映する）の方が、ギャップの多い配列よりも高いスコアを達成し得る。典型的には、あるギャップの存在に比較的高いコストを課し、且つそのギャップにおけるそれぞれの後続残基のペナルティーを小さくする「アフィニティギャップコスト」が用いられる。これが、最も一般的に用いられているギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、当然ながら、ギャップがより少ない最適化されたアラインメントを生成し得る。多くのアラインメントプログラムで、ギャップペナルティーを変更することが可能である。しかしながら、配列比較にかかるソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティーは、ギャップが−１２で各伸長が−４である。従って、最大％相同性の計算には、初めにギャップペナルティーを考慮して最適アラインメントを生成する必要がある。かかるアラインメントの実行に好適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２ ｐ３８７）である。配列の比較を行うことができる他のソフトウェアの例としては、限定されないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．−Ｃｈａｐｔｅｒ １８を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートが挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは、いずれもオフライン及びオンライン検索が利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７−５８〜７−６０頁を参照されたい）。しかしながら、一部の適用には、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新規ツールもタンパク質及びヌクレオチド配列の比較に利用可能である（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１９９９ １７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１９９９ １７７（１）：１８７−８及び米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ）のウェブサイトにある国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイトを参照されたい）。最終的な％相同性は同一性の点で計測され得るが、アラインメント過程自体は、典型的にはオール・オア・ナッシングのペア比較に基づくわけではない。代わりに、化学的類似性又は進化距離に基づいて各ペアワイズ比較にスコアを割り当てるスケーリング型類似性スコア行列が概して用いられる。一般的に用いられるかかる行列の例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列−ＢＬＡＳＴプログラムスイートのデフォルト行列−である。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、概して公式のデフォルト値又は供給がある場合にはカスタムの記号比較テーブルのいずれかを使用する（更なる詳細については、ユーザマニュアルを参照されたい）。適用によっては、ＧＣＧパッケージについて公式のデフォルト値を使用し、又は他のソフトウェアの場合、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルト行列を使用することが好ましい。或いは、パーセンテージ相同性は、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ＆Ｓｈａｒｐ ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ ７３（１），２３７−２４４）と同様のアルゴリズムに基づくＤＮＡＳＩＳ（商標）（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）の多重アラインメント機能を用いて計算し得る。ソフトウェアが最適アラインメントを生成すると、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することが可能になる。ソフトウェアは、典型的には配列比較の一部としてこれを行い、数値的な結果を出す。配列は、サイレントな変化を生じて機能的に均等な物質をもたらすようなアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換も有し得る。アミノ酸特性（残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の性質など）の類似性に基づいて計画的なアミノ酸置換が作製され得、従ってアミノ酸を機能的なグループにまとめることが有用である。アミノ酸は、その側鎖の特性のみに基づいてまとめ得る。しかしながら、突然変異データも同様に含めることが更に有用である。このように得られたアミノ酸の組は、構造上の理由から保存されているものと思われる。これらの組はベン図の形式で記述することができる（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｃ．Ｄ．ａｎｄ Ｂａｒｔｏｎ Ｇ．Ｊ．（１９９３）“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕｅ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ”Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．９：７４５−７５６）（Ｔａｙｌｏｒ Ｗ．Ｒ．（１９８６）“Ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ”Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９；２０５−２１８）。保存的置換（また表１と併せた本明細書におけるその考察にも関する）は、例えば、一般に認められているベン図によるアミノ酸分類を記載する下記の表に従い行い得る。
保存的置換に関するその参照のため、表１と併せた保存的置換に関する本明細書における引用も言及される。
用語「対象」、「個体」及び「患者」は、本明細書では、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを指して同義的に使用される。哺乳類としては、限定されないが、ネズミ科動物、サル類、ヒト、農業動物、競技動物及びペットが挙げられる。インビボで得られたか又はインビトロで培養された生物学的実体の組織、細胞及びそれらの子孫も包含される。
用語「療法薬剤」、「療法的能力のある薬剤」又は「治療薬剤」は、同義的に使用され、対象への投与時に何らかの有益な効果を付与する分子又は化合物を指す。有益な効果には、診断上の判断の実施可能性；疾患、症状、障害又は病的状態の改善；疾患、症状、障害又は病態の発症の低減又は予防；及び疾患、症状、障害又は病的状態への一般的な対抗が含まれる。本明細書で使用されるとき、「治療」、又は「治療する」、又は「緩和する」、又は「改善する」は、同義的に使用される。これらの用語は、限定されないが、治療利益及び／又は予防利益を含めた有益な又は所望の結果を達成するための手法を指す。治療利益とは、治療下の１つ以上の疾患、病態又は症状における任意の治療的に関連性のある向上又はそれに対する効果を意味する。予防的利益について、組成物は、特定の疾患、病態又は症状を発症するリスクのある対象、又は疾患、病態又は症状が依然として現れていないことがあり得るにしろ、疾患の生理学的症状の１つ以上を訴えている対象に投与され得る。用語「有効量」又は「治療有効量」は、有益な又は所望の結果を生じさせるのに十分な薬剤の量を指す。治療有効量は、治療下の対象及び疾患状態、対象の体重及び年齢、疾患状態の重症度、投与方法などの１つ以上に応じて異なり得るが、当業者はこれを容易に判断することができる。この用語は、本明細書に記載されるイメージング方法のいずれか１つによる検出のための画像を提供し得る用量にも適用される。具体的な用量は、詳細な選択の薬剤、従うべき投与レジメン、他の化合物と併用して投与されるかどうか、投与タイミング、イメージングする組織及びそれが担持される物理的送達系の１つ以上に応じて異なり得る。
本発明の実施では、特に指示されない限り、当該技術分野の技術の範囲内にある免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス及び組換えＤＮＡの従来技術を利用する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（１９８７））；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ａｎｄ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））を参照されたい。本発明の幾つかの態様は、１つ以上のベクターを含むベクター系又はベクター自体に関する。ベクターは、原核細胞又は真核細胞でのＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質又は酵素）の発現のために設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞又は哺乳類細胞で発現させることができる。好適な宿主細胞については、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に詳述されている。或いは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写及び翻訳され得る。本発明の実施形態は、起こり得る相同置換（置き換え及び置換の両方は、本明細書では既存のアミノ酸残基又はヌクレオチドと代替の残基又はヌクレオチドとの相互交換を意味して用いられる）、即ちアミノ酸の場合に塩基性同士、酸性同士、極性同士等、同種のもの同士の置換を含み得る配列（ポリヌクレオチド又はポリペプチドの両方）を含む。非相同置換、即ちあるクラスから別のクラスの残基への置換、或いはオルニチン（以下、Ｚと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂと称する）、ノルロイシンオルニチン（以下、Ｏと称する）、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシンなどの非天然アミノ酸の取り込みが関わる置換も起こり得る。変異体アミノ酸配列は、グリシン又はβ−アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加え、メチル基、エチル基又はプロピル基などのアルキル基を含む配列の任意の２つのアミノ酸残基の間に挿入され得る好適なスペーサー基を含み得る。更に別の形態（これにはペプトイド形態の１つ以上のアミノ酸残基の存在が関わる）について、当業者は十分に理解し得る。誤解を避けるため、「ペプトイド形態」は、α−炭素置換基がα−炭素上ではなく、むしろ残基の窒素原子上にある変異体アミノ酸残基を指して使用される。ペプトイド形態のペプチドの調製方法は、当該技術分野において公知である（例えば、Ｓｉｍｏｎ ＲＪ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０），９３６７−９３７１及びＨｏｒｗｅｌｌ ＤＣ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４），１３２−１３４）。相同性モデリング：他のＣａｓ１３ｂオルソログにおける対応する残基は、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２（Ｎａｔｕｒｅ；４９０（７４２１）：５５６−６０）及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５（ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ；１１（５）：ｅ１００４２４８）の方法−ドメイン−モチーフ界面によって媒介される相互作用を予測する計算的タンパク質間相互作用（ＰＰＩ）方法によって同定することができる。構造に基づくＰＰＩ予測方法であるＰｒｅＰＰＩ（予測ＰＰＩ）は、ベイズ統計学の枠組みを用いて構造的エビデンスを非構造的エビデンスと組み合わせる。この方法は、クエリタンパク質のペアをとり、構造アラインメントを用いることにより、それらの実験的に決定された構造又は相同性モデルのいずれかに対応する構造表現を同定することを含む。構造アラインメントは、更に、大域的及び局所的幾何学関係を考慮することによって近く及び遠くの両方の隣接構造を同定するのに用いられる。構造表現の２つの隣接構造がタンパク質データバンクに報告されている複合体を形成する場合には常に、これが、これらの２つのクエリタンパク質間の相互作用をモデル化するための鋳型を定義付ける。複合体のモデルは、鋳型内の対応する隣接構造上の代表的な構造を重ね合わせることにより作成される。この手法は、Ｄｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３（Ｐｒｏｔ Ｓｃｉ；２２：３５９−６６）に更に記載される。
本発明の目的上、増幅は、妥当なフィデリティーで標的配列を複製する能力を有するプライマー及びポリメラーゼを用いる任意の方法を意味する。増幅は、天然又は組換えＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑＧｏｌｄ（商標）、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片及び逆転写酵素によって行われ得る。好ましい増幅方法はＰＣＲである。特定の態様において、本発明はベクターに関する。本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、ある実体を１つの環境から別の環境に移すことを可能にする又は促進するツールである。これは、別のＤＮＡセグメントが挿入されて挿入セグメントの複製をもたらし得るレプリコン、例えばプラスミド、ファージ又はコスミドである。概して、ベクターは適切な制御エレメントと会合しているとき複製能を有する。一般に、用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターとしては、限定されないが、一本鎖、二本鎖又は部分的二本鎖の核酸分子；１つ以上の遊離末端を含む、遊離末端のない（例えば、環状の）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ又は両方を含む核酸分子；及び当該技術分野において公知の他の種類のポリヌクレオチドが挙げられる。ある種のベクターは、「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術によるなどして追加のＤＮＡセグメントを挿入することのできる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、ベクターには、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））へのパッケージングのためのウイルス由来ＤＮＡ又はＲＮＡ配列が存在する。ウイルスベクターは、宿主細胞へのトランスフェクションのためのウイルスによって担持されるポリヌクレオチドも含む。特定のベクターは、それが導入される宿主細胞での自己複製能を有する（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクターは、それが作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことが可能である。かかるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。組換えＤＮＡ技法において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含むことができ、これは、即ち、組換え発現ベクターが、発現させる核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節エレメント（これは、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択され得る）を含むことを意味する。組換え発現ベクターの範囲内において、「作動可能に連結された」は、ヌクレオチド配列の（例えば、インビトロ転写／翻訳系における又はベクターが宿主細胞に導入される場合に宿主細胞における）発現が可能となる形で目的のヌクレオチド配列が調節エレメントに連結されていることを意味するように意図される。組換え及びクローニング方法に関して、２００４年９月２日に米国特許出願公開第２００４−０１７１１５６ Ａ１号明細書として公開された米国特許出願第１０／８１５，７３０号明細書（この内容は、本明細書において全体として参照により援用される）が挙げられる。本発明の態様は、ガイドＲＮＡ及び野生型、改変若しくは突然変異ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質／酵素（例えば、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質）のためのバイシストロニックベクターに関する。ガイドＲＮＡ及び野生型、改変若しくは突然変異ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質／酵素（例えば、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質）のためのバイシストロニック発現ベクターが好ましい。概して且つ特に、この実施形態において野生型、改変又は突然変異ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質／酵素（例えば、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質）は、好ましくは、ＣＢｈプロモーターによってドライブされる。ＲＮＡは、好ましくは、Ｕ６プロモーターなどのＰｏｌ ＩＩＩプロモーターによってドライブされ得る。理想的にはこの２つが組み合わされる。
一部の実施形態において、ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ中のループが提供される。これは、ステムループ又はテトラループであり得る。ループは、好ましくは、ＧＡＡＡであるが、この配列に限定されるものではなく、又は実際には、４ｂｐ長であることのみに限定されるものではない。実際には、ヘアピン構造における使用に好ましいループ形成配列は４ヌクレオチド長であり、最も好ましくは配列ＧＡＡＡを有する。しかしながら、代替的な配列であり得るとおり、より長い又は短いループ配列が使用され得る。配列は、好ましくは、ヌクレオチドトリプレット（例えば、ＡＡＡ）及び更なるヌクレオチド（例えば、Ｃ又はＧ）を含む。ループ形成配列の例にはＣＡＡＡ及びＡＡＡＧが含まれる。
本明細書に開示される任意の方法の実施では、限定なしに、マイクロインジェクション、電気穿孔、ソノポレーション、微粒子銃、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、カチオン性トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペイルフェクション、光学的トランスフェクション、専売薬剤により増強される核酸取り込み及びリポソーム、免疫リポソーム、ビロソーム又は人工ビリオンを介した送達を含めた当該技術分野で公知の１つ以上の方法によって細胞又は胚に好適なベクターを導入することができる。一部の方法において、ベクターは、マイクロインジェクションによって胚に導入される。ベクターが胚の核又は細胞質に微量注入され得る。一部の方法において、ベクターはヌクレオフェクションによって細胞に導入され得る。
ベクターは、原核細胞又は真核細胞でのＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質又は酵素）の発現のために設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞又は哺乳類細胞で発現させることができる。好適な宿主細胞については、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に詳しく考察されている。或いは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写及び翻訳され得る。
ベクターは、原核生物又は原核細胞に導入して増殖させ得る。一部の実施形態において、真核細胞に導入するベクターのコピーを増幅させるため、又は真核細胞に導入するベクターの産生における中間ベクターとして（例えば、ウイルスベクターパッケージング系の一部としてプラスミドを増幅する）、原核生物が使用される。一部の実施形態において、原核生物を用いてベクターのコピーを増幅し、１つ以上の核酸を発現させて、それにより例えば宿主細胞又は宿主生物に送達するための１つ以上のタンパク質の供給源を提供する。原核生物でのタンパク質の発現は、多くの場合、融合タンパク質又は非融合タンパク質のいずれかの発現を導く構成的プロモーター又は誘導プロモーターを含むベクターを用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で行われる。融合ベクターが、そこでコードされるタンパク質、例えば組換えタンパク質のアミノ末端に幾つものアミノ酸を付加する。かかる融合ベクターは、（ｉ）組換えタンパク質の発現の増加；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度の増加；及び（ｉｉｉ）アフィニティー精製でリガンドとして作用することによる組換えタンパク質の精製の促進など、１つ以上の目的を果たし得る。多くの場合、融合発現ベクターでは、融合タンパク質の精製後に組換えタンパク質を融合部分と分離することができるように、融合部分と組換えタンパク質との接合部にタンパク質分解切断部位が導入される。かかる酵素及びそのコグネイト認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビン及びエンテロキナーゼが含まれる。融合発現ベクターの例としては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、これらはそれぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質又はプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合させる。好適な誘導性非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）及びｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。一部の実施形態において、ベクターは酵母発現ベクターである。酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）における発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｉｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）及びｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。一部の実施形態において、ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞でのタンパク質発現をドライブする。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）が挙げられる。一部の実施形態において、ベクターは、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞での１つ以上の配列の発現をドライブする能力を有する。哺乳類発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳類細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、典型的には、１つ以上の調節エレメントによって提供される。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス４０及び本明細書に開示される及び当該技術分野において公知の他のウイルスに由来する。原核細胞及び真核細胞の両方に好適な他の発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９のＣｈａｐｔｅｒｓ １６及び１７を参照されたい。一部の実施形態において、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型で優先的に核酸の発現を導くことが可能である（例えば、組織特異的調節エレメントが核酸の発現に使用される）。組織特異的調節エレメントは、当該技術分野において公知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、詳細にはＴ細胞受容体（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９−７３３）及び免疫グロブリン（Ｂａｎｅｉｊｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）及び乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号明細書及び欧州特許出願公開第２６４，１６６号明細書）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーター、例えばマウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）及びαフェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）も包含される。これらの原核生物及び真核生物ベクターに関して、米国特許第６，７５０，０５９号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。本発明の他の実施形態は、ウイルスベクターの使用に関し得、それについては、米国特許出願第１３／０９２，０８５号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。組織特異的調節エレメントは、当該技術分野において公知であり、この点で、米国特許第７，７７６，３２１号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ｂ系又は複合体の又はそれをコードする１つ以上のエレメントの発現をドライブするため、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントに調節エレメントが作動可能に連結される。一般に、ＳＰＩＤＲ（ＳＰａｃｅｒ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｐｅａｔ、スペーサー散在型ダイレクトリピート）としても知られるＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復）は、通常特定の細菌種に特異的なＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：５４２９−５４３３［１９８７］；及びＮａｋａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１：３５５３−３５５６ ［１９８９］）に認められた特徴的なクラスの散在型短鎖配列リピート（ＳＳＲ）及び関連遺伝子を含む。同様の散在型ＳＳＲが、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）及び結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）において同定されている（Ｇｒｏｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０：１０５７−１０６５［１９９３］；Ｈｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，５：２５４−２６３［１９９９］；Ｍａｓｅｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３０７：２６−３０［１９９６］；及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７：８５−９３［１９９５］を参照されたい）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、典型的にはリピートの構造が他のＳＳＲと異なり、短い規則的な間隔のリピート（ＳＲＳＲ）と呼ばれている（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＯＭＩＣＳ Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．，６：２３−３３［２００２］；及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６：２４４−２４６［２０００］）。一般に、このリピートは、実質的に一定長さのユニークな介在配列によって規則的な間隔が置かれたクラスター内に存在する短いエレメントである（Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２０００］、前掲）。リピート配列は株間で高度に保存されているが、散在するリピートの数及びスペーサー領域の配列は、典型的には株毎に異なる（ｖａｎ Ｅｍｂｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２：２３９３−２４０１［２０００］）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、限定されないが、アエロピルム属（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、ピロバキュラム属（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、スルホロブス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アーケオグロブス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロアーキュラ属（Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルシナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノピュルス属（Ｍｅｔｈａｎｏナシ属（Ｐｙｒｕｓ））、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィルス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクウィフェクス属（Ａｑｕｉｆｅｘ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、クロロビウム属（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾアルカス属（Ａｚａｒｃｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、デスルホビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、ミキソコッカス属（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ザントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）及びサーモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）を含め、４０を超える原核生物において同定されている（例えば、Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：１５６５−１５７５ ［２００２］；及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２００５］を参照されたい）。
一般に、「ＲＮＡターゲティング系」は、本願で使用されるとき、まとめて、ＲＮＡターゲティングＣａｓ（エフェクター）タンパク質及びガイドＲＮＡ（又はｃｒＲＮＡ配列）をコードする配列を含めた、本明細書で考察するとおりの表１に関連するＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ関連１３ｂ（「Ｃａｓ１３ｂ」）遺伝子（本明細書ではエフェクタータンパク質とも称される）の発現又はその活性の誘導に関わる転写物及び他のエレメントを指す。一般に、ＲＮＡターゲティング系は、標的配列の部位におけるＲＮＡターゲティング複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。ＲＮＡターゲティング複合体の形成に関連して、「標的配列」は、ガイド配列（又はガイド若しくはｃｒＲＮＡのもの）がそれと相補性を有するように設計されるＲＮＡ配列を指し、ここで、標的配列とガイドＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションが、ＲＮＡターゲティング複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを生じさせ且つＲＮＡターゲティング複合体の形成を促進するのに十分な相補性があるならば、完全な相補性は必ずしも必要でない。一部の実施形態において、標的配列は、細胞の核又は細胞質に位置する。一部の実施形態において、標的配列は、真核細胞の細胞小器官内にあり得る。標的配列を含む標的遺伝子座への組換えに用いられ得る配列又は鋳型は、「編集用鋳型」、又は「編集用ＲＮＡ」、又は「編集用配列」と称される。本発明の態様では、外因性鋳型ＲＮＡが編集用鋳型と称され得る。本発明のある態様では、組換えは相同組換えである。一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズして標的配列への核酸ターゲティング複合体の配列特異的結合を導くのに十分な標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上であるか又はそれより高い。最適アラインメントは、配列のアラインメントに好適な任意のアルゴリズムを用いて決定することができ、その非限定的な例としては、スミス−ウォーターマンアルゴリズム、ニードルマン−ブンシュアルゴリズム、バローズ・ホイーラー変換に基づくアルゴリズム（例えば、バローズ−ホイーラーアライナー）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。一部の実施形態において、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド長以上であるか又はそれより長い。一部の実施形態において、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド長未満か又はそれより短い。ガイド配列が標的配列へのＲＮＡターゲティング複合体の配列特異的結合を導く能力は、任意の好適なアッセイによって評価し得る。鋳型ポリヌクレオチドは、約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、１０００ヌクレオチド長以上又はそれより長いなど、任意の好適な長さであり得る。一部の実施形態において、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部分に相補的である。最適にアラインメントしたとき、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド以上又はそれより長い）と重複し得る。一部の実施形態において、鋳型配列と標的配列を含むポリヌクレオチドとが最適にアラインメントされたとき、鋳型ポリヌクレオチドのうちの最も近いヌクレオチドは、標的配列から約１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、１００００ヌクレオチド以内又はそれを超える範囲内にある。一部の実施形態では、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質に加えて約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上又はそれより多いドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質／酵素は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ｂ酵素に加えて約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上又はそれより多いドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。エフェクタータンパク質に融合させ得るタンパク質ドメインの例としては、限定なしに、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列及び以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性及び核酸結合活性の１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、限定されないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ） β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）及び自己蛍光タンパク質、例えば青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）が挙げられる。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質は、ＤＮＡ分子に結合するか、又は限定されないが、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓタグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合物及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を含めた他の細胞分子に結合するタンパク質又はタンパク質の断片をコードする遺伝子配列と融合し得る。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含む融合タンパク質の一部を形成し得る追加的なドメインは、米国特許出願公開第２０１１００５９５０２号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されている。一部の実施形態では、タグ付加核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を使用して標的配列の位置が同定される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ｂ酵素は、誘導性系の一成分を形成し得る。この系の誘導可能な性質により、エネルギーの形態を用いた遺伝子編集又は遺伝子発現の時空間的制御が可能となり得る。エネルギーの形態としては、限定されないが、電磁放射線、音響エネルギー、化学エネルギー及び熱エネルギーを挙げることができる。誘導性系の例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆ）、小分子２ハイブリッド転写活性化システム（ＦＫＢＰ、ＡＢＡ等）又は光誘導性系（フィトクロム、ＬＯＶドメイン又はクリプトクロム）が含まれる。一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ｂ酵素は、配列特異的に転写活性の変化を導く光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）の一部であり得る。光の構成成分には、ＣＲＩＳＰＲ酵素、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来）及び転写活性化／抑制ドメインが含まれ得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及びその使用方法の更なる例は、米国仮特許出願第６１／７３６４６５号明細書及び米国仮特許出願第６１／７２１，２８３号明細書及び国際公開第２０１４／０１８４２３号パンフレット及び米国特許第８８８９４１８号明細書、米国特許第８８９５３０８号明細書、米国特許出願公開第２０１４０１８６９１９号明細書、米国特許出願公開第２０１４０２４２７００号明細書、米国特許出願公開第２０１４０２７３２３４号明細書、米国特許出願公開第２０１４０３３５６２０号明細書、国際公開第２０１４０９３６３５号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）に提供される。一部の態様において、本発明は、１つ以上のポリヌクレオチド、例えば又は本明細書に記載されるとおりの１つ以上のベクター、その１つ以上の転写物及び／又はそれから転写されるもの又はタンパク質を、宿主細胞に送達するステップを含む方法を提供する。一部の態様において、本発明は、かかる方法によって作製される細胞及びかかる細胞を含むか又はそれから作製される生物（動物、植物又は真菌類など）を更に提供する。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡと組み合わせた（及び任意選択でそれと複合体を形成した）ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質が細胞に送達される。哺乳類細胞又は標的組織における核酸の導入には、従来のウイルスベース及び非ウイルスベースの遺伝子導入方法を用いることができる。かかる方法を用いて、ＲＮＡターゲティング系の構成成分をコードする核酸を培養下の細胞又は宿主生物中の細胞に投与することができる。非ウイルスベクター送達系には、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載されるベクターの転写物）、ネイキッド核酸及び送達ビヒクルと複合体を形成した核酸、例えばリポソームが含まれる。ウイルスベクター送達系にはＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが含まれ、これは、細胞への送達後にエピソームゲノム又は組込みゲノムのいずれかを有する。遺伝子療法手順のレビューに関して、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ＆Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ＆Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ＆Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｅｈｍ（ｅｄｓ）（１９９５）；及びＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６（１９９４）を参照されたい。
核酸の非ウイルス送達方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン及び薬剤で促進するＤＮＡ取込みが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号明細書、同第４，９４６，７８７号明細書；及び同第４，８９７，３５５号明細書に記載され）及びリポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性及び中性脂質には、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレットのものが含まれる。送達は、細胞に対してであり得（例えば、インビトロ又はエキソビボ投与）、又は標的組織に対してであり得る（例えば、生体内投与）。
状態のモデル
本発明の方法を用いることにより、目的の突然変異のモデル又は疾患モデルによるなど、目的の遺伝的又は後成的条件のモデル化及び／又は研究に使用し得る植物、動物又は細胞を作り出すことができる。本明細書で使用されるとき、「疾患」は、対象における疾患、障害又は徴候を指す。例えば、本発明の方法を用いて、疾患に関連する１つ以上の核酸配列に改変を含む動物若しくは細胞又は疾患に関連する１つ以上の核酸配列の発現が変化している植物、動物若しくは細胞を作り出すことができる。かかる核酸配列は、疾患関連タンパク質配列をコードし得るか若しくは翻訳され得、又は疾患関連制御配列であり得る。従って、本発明の実施形態において植物、対象、患者、生物又は細胞は、非ヒトの対象、患者、生物又は細胞であり得ることが理解される。従って、本発明は、本方法により作製された植物、動物若しくは細胞又はその子孫を提供する。子孫は、作製された植物又は動物のクローンであり得るか、又は更に望ましい形質をその子孫に遺伝子移入させるため同じ種の他の個体と交配させることによる有性生殖から生じ得る。細胞は、多細胞生物、特に動物又は植物の場合にインビボ又はエキソビボであり得る。細胞が培養下にある例では、適切な培養条件が満たされる場合、且つ好ましくは細胞がこの目的に好適に適合する場合（例えば、幹細胞）、細胞系が樹立され得る。本発明によって作製される細菌細胞系も想定される。従って、細胞系も想定される。一部の方法において、疾患モデルを使用することにより、疾患の研究で一般的に用いられる尺度を用いて突然変異又はより一般的に遺伝子又は遺伝子産物の発現の変化、例えば低下が動物又は細胞及び疾患の発症及び／又は進行に及ぼす効果を研究することができる。或いは、かかる疾患モデルは、薬学的に活性な化合物が疾患に及ぼす効果の研究に有用である。一部の方法において、疾患モデルを使用して、見込みのある遺伝子療法戦略の有効性を評価することができる。即ち、疾患の発症及び／又は進行が呈示又は阻害又は低減されるように疾患関連ＲＮＡを改変することができ、次に化合物が進行又は阻害又低減に及ぼす効果が試験される。
表１のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質及びその複合体及びそれをコードする核酸分子及びそれを使用した方法を利用する本発明の実施に有用である以下が参照される：“Ｇｅｎｏｍｅ−Ｓｃａｌｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ”．Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｓａｎｊａｎａ，ＮＥ．，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ，Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ，Ｔ．，Ｈｅｃｋｌ，Ｄ．，Ｅｂｅｒｔ，ＢＬ．，Ｒｏｏｔ，ＤＥ．，Ｄｏｅｎｃｈ，ＪＧ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｃ １２．（２０１３）．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］；最終的な改訂版が以下として発表された：Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４ Ｊａｎ ３；３４３（６１６６）：８４−８７。Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．は、ゲノムワイド規模で遺伝子機能を探索する新規方法に関する。その研究は、６４，７５１個のユニークなガイド配列で１８，０８０個の遺伝子を標的化するゲノム規模のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ノックアウト（ＧｅＣＫＯ）ライブラリを送達することにより、ヒト細胞におけるネガティブ選択及びポジティブ選択の両方のスクリーニングが可能になったことを示した。第一に、この著者らは、ＧｅＣＫＯライブラリを用いて癌及び多能性幹細胞における細胞生存能力に必須の遺伝子を同定することを示した。次に、この著者らは、メラノーマモデルにおいて、その欠損がベムラフェニブ（突然変異プロテインキナーゼＢＲＡＦを阻害する治療薬）に対する耐性に関わる遺伝子をスクリーニングした。その研究は、最も上位に位置付けられる候補に、既に検証されている遺伝子ＮＦ１及びＭＥＤ１２並びに新規ヒットＮＦ２、ＣＵＬ３、ＴＡＤＡ２Ｂ及びＴＡＤＡ１が含まれたことを明らかにした。この著者らは、同じ遺伝子を標的化する独立したガイドＲＮＡ間における高度な一貫性及び高いヒット確認率を観察し、従ってＣａｓ９によるゲノム規模のスクリーニングの有望さを実証した。また、米国特許出願公開第２０１４０３５７５３０号明細書；及び国際公開第２０１４０９３７０１号パンフレット（本明細書によって参照により本明細書に援用される）も参照される。
用語「〜と会合している」は、ここで、機能ドメインとＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又はアダプタータンパク質の会合に関して用いられる。これは、例えば、アダプタータンパク質と機能ドメインとの間又はＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と機能ドメインとの間で１つの分子がどのように別の分子と「会合」しているかに関して用いられる。かかるタンパク質間相互作用の場合、この会合は、抗体がエピトープを認識する方法における認識の観点で考えられ得る。或いは、１つのタンパク質が別のタンパク質とそれら２つの融合物を介して会合し得、例えば１つのサブユニットが別のサブユニットに融合し得る。融合は典型的には、例えば、各タンパク質又はサブユニットをコードするヌクレオチド配列を併せてスプライシングすることにより、一方のアミノ酸配列を他方のアミノ酸配列に加えることによって起こる。或いは、これは、本質的に、融合タンパク質など、２つの分子間の結合又は直接的な連結と考えられ得る。いずれにしろ、融合タンパク質は、２つの目的のサブユニット間（即ち酵素と機能ドメインとの間又はアダプタータンパク質と機能ドメインとの間）にリンカーを含み得る。従って、一部の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又はアダプタータンパク質は機能ドメインへの結合によってそれと会合している。他の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質又はアダプタータンパク質は機能ドメインと、それらの２つが任意選択で中間リンカーを介して一体に融合されているため、会合している。リンカーの例としては、本明細書で考察されるＧｌｙＳｅｒリンカーが挙げられる。
Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質複合体は、植物で使用することができる
一部の実施形態における本発明は、細胞又は生物を改変する方法を包含する。細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。細胞は、哺乳類細胞であり得る。哺乳類細胞は、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、げっ歯類又はマウス細胞であり得る。細胞は、家禽、魚類又はエビなどの非哺乳類真核細胞であり得る。細胞は、植物細胞でもあり得る。植物細胞は、キャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ又はコメなどの作物植物であり得る。植物細胞は、藻類、樹木又は野菜でもあり得る。本発明によって細胞に導入される改変は、抗体、デンプン、アルコール又は他の所望の細胞産出物などの生物学的産物の産生向上のために細胞及び細胞の子孫を変化させるようなものであり得る。本発明によって細胞に導入される改変は、産生される生物学的産物を変える変化が細胞及び細胞の子孫に含まれるようなものであり得る。本系は、１つ以上の異なるベクターを含み得る。本発明のある態様において、エフェクタータンパク質は、所望の細胞型、優先的に真核細胞、好ましくは哺乳類細胞又はヒト細胞での発現にコドンが最適化されている。Ｃａｓ１３ｂ系（例えば、単一の又は多重化した）は、作物ゲノミクスにおける近年の進歩と併せて用いることができる。かかるＣＲＩＳＰＲ系を使用して、効率的で且つ対費用効果の高い植物遺伝子又はゲノム又はトランスクリプトームの探索又は編集又は操作を − 例えば、植物遺伝子又はゲノムの迅速な調査及び／又は選択及び／又は探索及び／又は比較及び／又は操作及び／又は形質転換のために実施することができ；例えば、形質又は特徴を作出し、同定し、開発し、最適化し、又は植物に付与し、又は植物ゲノムを形質転換することができる。従って、植物の生産の向上、新規組み合わせの形質又は特徴を有する新規植物又は形質が増強された新規植物があり得る。かかるＣＲＩＳＰＲ系は、植物に関して、部位特異的組込み（ＳＤＩ）又は遺伝子編集（ＧＥ）又は任意の準逆育種（ＮＲＢ）又は逆育種（ＲＢ）技術において使用することができる。従って、本明細書における動物細胞への言及は、特に明らかでない限り、適宜修正して植物細胞に適用され得；及びオフターゲット効果が低下した本明細書における酵素及びかかる酵素を利用する系は、本明細書に記載するものを含め、植物適用に用いることができる。提供されるとおりの、エフェクタータンパク質（表１のＣａｓ１３ｂ）及び好適なガイド（ｃｒＲＮＡ）によって改変されたエンジニアリング植物及びその子孫。これには、コムギ、オオムギ、コメ、ダイズ又はトウモロコシなど、病害又は干ばつ耐性作物；自家授粉能力が取り除かれ又は低下するように改変された（しかし、代わりに、任意選択で、代わりに雑種形成することができる）植物；及びエフェクタータンパク質及び好適なガイドによるターゲティングによって免疫原性タンパク質が無効になった、破壊された又は断たれたピーナッツ及び堅果などのアレルギー誘発性食品が含まれる。古典的ＣＲＩＰＳＲ−Ｃａｓ系を使用する任意の態様をＣａｓタンパク質非依存的なＣＲＩＳＰＲ系、例えばＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質系における使用に適合させることができる。
治療処置
本発明の系は、本願がこの系を情報に基づいてエンジニアリングするための基礎を提供するため、本開示から、過度の実験を行うことなく、治療、アッセイ及び他の適用を含めた旧ＲＮＡ切断技術の領域において適用することができる。本発明は、ＲＮＡの過剰発現、毒性ＲＮＡ及び／又は突然変異したＲＮＡ（例えば、スプライシング欠損又はトランケーションなど）によって引き起こされる疾患の治療処置を提供する。毒性ＲＮＡの発現は、核封入体の形成及び脳、心臓又は骨格筋における遅発性変性変化に関連し得る。最もよく研究された例、筋強直性ジストロフィーでは、毒性ＲＮＡの主要な病原性効果は、結合タンパク質を隔離し、且つ選択的スプライシングの調節を損なうことと見られる（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．（２００６）１５（ｓｕｐｐｌ ２）：Ｒ１６２−Ｒ１６９）。筋強直性ジストロフィー［筋緊張性異栄養症（ＤＭ）］は、極めて幅広い臨床的特徴を生じるため、遺伝学者にとって特に興味深い。一部を挙げれば、筋肉の消耗、白内障、インスリン抵抗性、精巣萎縮、心伝導の減速、皮膚腫瘍及び認知への効果であろう。現在ＤＭ１型（ＤＭ１）と呼ばれている古典的形態のＤＭは、細胞質タンパク質キナーゼをコードする遺伝子ＤＭＰＫの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）におけるＣＴＧリピートの伸長によって引き起こされる。
自然免疫系は、主に感染細胞内部のウイルス核酸を認識することによりウイルス感染を検出し、これは、ＤＮＡ又はＲＮＡセンシングと称される。インビトロＲＮＡセンシングアッセイを用いると、特異的ＲＮＡ基質を検出することができる。例えば、生細胞におけるＲＮＡベースのセンシングにＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用することができる。適用の例は、例えば、疾患特異的ＲＮＡのセンシングによる診断法である。本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質（表１のＣａｓ１３ｂ）は、抗ウイルス活性、詳細にはＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス活性に更に使用することができる。選択のウイルスＲＮＡ配列に選択的な好適なガイドＲＮＡを使用してエフェクタータンパク質（表１のＣａｓ１３ｂ）をウイルスＲＮＡに標的化することができる。詳細には、エフェクタータンパク質は、一本鎖ＲＮＡなどのＲＮＡを切断する活性ヌクレアーゼであり得る。ＲＮＡ、上記で言及したＲＮＡを標的化するための本発明の酵素系の治療投薬量は、約０．１〜約２ｍｇ／ｋｇであることが企図され、これらの投薬量は、応答をモニタしながら、必要であれば繰り返しの投薬量で、患者１人当たり約７〜１０用量まで逐次的に投与され得る。有利には、治療レジメン中に各患者から試料が採取され、治療の有効性が確認される。例えば、ＲＮＡ試料は分離及び定量化され、発現が低下しているか、又は改善しているかどうかが判断され得る。かかる診断法は当業者の範囲内にある。
転写物検出方法
本発明のエフェクタータンパク質（表１のＣａｓ１３ｂ）及び系は、細胞又は他の試料中のＲＮＡの特異的検出に有用である。目的のＲＮＡ標的の存在下では、ガイド依存性Ｃａｓ１３ｂヌクレアーゼ活性に、コラテラル標的に対する非特異的ＲＮアーゼ活性が付随し得る。このＲＮアーゼ活性を利用するには、検出可能に切断されることのできるレポーター基質があれば十分である。例えば、レポーター分子は、一端に蛍光レポーター分子（ｆｌｕｏｒ）及び他端に消光剤のタグを付加したＲＮＡを含み得る。Ｃａｓ１３ｂ ＲＮアーゼ活性が存在しない場合、消光剤が物理的に近接しているため、ｆｌｕｏｒからの蛍光は、低レベルに抑えられる。目的のＲＮＡ標的及び好適なガイドＲＮＡの存在によってＣａｓ１３ｂの標的特異的切断が活性化されると、ＲＮＡ含有レポーター分子は非特異的に切断され、ｆｌｕｏｒと消光剤とが空間的に分離される。これにより、適切な波長の光で励起したときｆｌｕｏｒが検出可能シグナルを発する。１つの例示的アッセイ方法では、Ｃａｓ１３ｂエフェクター、目的の標的に特異的なガイドＲＮＡ及びレポーター分子が細胞試料に加えられる。蛍光の増加が目的のＲＮＡ標的の存在を示す。別の例示的な方法では、検出アレイが提供される。アレイ上の各位置にＣａｓ１３ｂエフェクター、レポーター分子及び目的の標的に特異的なガイドＲＮＡが提供される。実施するアッセイに応じて、アレイの各位置における目的の標的に特異的なガイドＲＮＡは、同じであるか、異なるか、又はこれらの組み合わせであり得る。例えば、単一の供給源試料中にある１つ以上の標的を試験することが所望される場合、目的の標的に特異的なガイドＲＮＡは、異なるものが提供され得る。例えば、同じ標的に関して複数の試料を試験することが所望される場合、目的の標的に特異的なガイドＲＮＡは各位置に同じものが提供され得る。
特定の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂは、インビトロ系で又は細胞で、一過性に又は安定に提供されるか又は発現され、且つ細胞核酸を非特異的に切断するように標的化されるか又は惹起される。一実施形態において、Ｃａｓ１３ｂは、ｓｓＤＮＡ、例えばウイルスｓｓＤＮＡをノックダウンするようにエンジニアリングされる。別の実施形態において、Ｃａｓ１３ｂは、ＲＮＡをノックダウンするようにエンジニアリングされる。この系は、ノックダウンが細胞若しくはインビトロ系に存在する標的ＤＮＡに依存的であるか、又は系若しくは細胞に標的核酸が加わることによって惹起されるように考案され得る。
ある実施形態において、Ｃａｓ１３ｂ系は、異常なＤＮＡ配列の存在によって区別可能な細胞のサブセットにおけるＲＮＡを非特異的に切断するようにエンジニアリングされ、例えば、ここで、異常なＤＮＡの切断は、不完全又は無効であり得る。１つの非限定的な例では、癌細胞に存在して細胞形質転換をドライブするＤＮＡ転座が標的とされる。一方で、染色体ＤＮＡ及び修復を受ける細胞の部分集団は、生き残り得、非特異的コラテラルリボヌクレアーゼ活性が有利に潜在的サバイバーの細胞死につながる。
コラテラル活性は、最近では、多くの臨床診断に有用なＳＨＥＲＬＯＣＫと称される高感度・高特異性核酸検出プラットフォームに利用された（Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．“Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２”．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５６，４３８−４４２（２０１７））。
本発明によれば、エンジニアリングされたＣａｓ１３ｂ系は、ＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性に関して最適化され、哺乳類細胞で発現して標的化することにより細胞のレポーター分子又は転写物を有効にノックダウンすることができる。
等温増幅を伴うエンジニアリングされたＣａｓ１３ｂのコラテラル効果は、高感度及び一塩基ミスマッチ特異性での迅速なＤＮＡ又はＲＮＡ検出を提供するＣＲＩＳＰＲベースの診断法を提供する。Ｃａｓ１３ｂベースの分子検出プラットフォームを使用して、特異的ウイルス株の検出、病原性細菌の識別、ヒトＤＮＡの遺伝子タイピング及び無細胞腫瘍ＤＮＡ突然変異の同定が行われる。更に、反応試薬は、コールドチェーン非依存性及び長期保存のため凍結乾燥して、実地適用向けに紙上で容易に再構成することができる。
携帯プラットフォーム上で核酸を高感度且つ一塩基特異性で迅速に検出可能であることは、疾患診断及びモニタリング、疫学及び一般的な検査室作業において役立ち得る。核酸を検出する方法は存在するが、それらは、感度、特異性、単純さ、コスト及び速さの間でトレードオフを呈する。
微生物のクラスター化した規則的間隔の短いパリンドロームリピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ：ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）適応免疫系は、ＣＲＩＳＰＲベースの診断（ＣＲＩＳＰＲ−Ｄｘ）に利用することができるプログラム可能なエンドヌクレアーゼを含む。Ｃａｓ１３ｂをＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）で再プログラム化することにより、特異的ＤＮＡセンシングのためのプラットフォームを提供し得る。そのＤＮＡ標的を認識すると、活性化したＣａｓ１３ｂは、近傍の標的でない核酸（即ちＲＮＡ及び／又はｓｓＤＮＡ）の「コラテラル」切断に関与する。このｃｒＲＮＡプログラム化コラテラル切断活性により、Ｃａｓ１３ｂは、プログラム細胞死の惹起によってインビボで又は標識されたＲＮＡ又はｓｓＤＮＡの非特異的分解により、特異的ＤＮＡの存在を検出することが可能になる。ここで、標的のリアルタイム検出を可能にする、核酸増幅及び市販のレポーターＲＮＡのＣａｓ１３ｂ媒介性コラテラル切断に基づく高感度のインビトロ核酸検出プラットフォームについて記載する。
特定の例示的実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、表１に同定される生物由来である。特定の例示的実施形態において、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、バージイエラ・ズーヘルカム（Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、プレボテラ・ブッカエ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｕｃｃａｅ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、バクテロイデス・ピオゲネス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アリスティペス属種（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｓｐ．）ＺＯＲ０００９、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）ＭＡ２０１６、リエメレラ・アナティペステイファー（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ）、プレボテラ・アウランティアカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、プレボテラ・サッカロリティカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）、ミロイデス・オドラティミマス（Ｍｙｒｏｉｄｅｓ ｏｄｏｒａｔｉｍｉｍｕｓ）ＣＣＵＧ １０２３０、キャプノサイトファーガ・カニモルサス（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ）、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５−１２５、フラボバクテリウム・ブランキオフィルム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ）、ミロイデス・オドラティミマス（Ｍｙｒｏｉｄｅｓ ｏｄｏｒａｔｉｍｉｍｕｓ）、フラボバクテリウム・コルムナレ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ）又はポルフィロモナス属種（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＣＯＴ−０５２ ＯＨ４９４６から選択される生物由来である。別の実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡは、疾患状態の診断指標となる１つ以上の標的ＲＮＡ配列に結合するように設計される。
特定の例示的実施形態では、ＲＮＡベースのマスキング構築物が検出可能な正のシグナルの生成を抑制し、又はＲＮＡベースのマスキング構築物は、検出可能な正のシグナルをマスキングすることによるか、又は代わりに検出可能な負のシグナルを生成することにより検出可能な正のシグナルの生成を抑制し、又はＲＮＡベースのマスキング構築物は、レポーティング構築物によってコードされる遺伝子産物であって、発現すると検出可能な正のシグナルを生成する遺伝子産物の生成を抑制するサイレンシングＲＮＡを含む。
別の例示的実施形態では、ＲＮＡベースのマスキング構築物は、負の検出可能シグナルを生成するリボザイムであり、ここで、リボザイムが不活性化されると正の検出可能シグナルが生成される。一例示的実施形態において、リボザイムは、基質を第１の色に変え、ここで、基質は、リボザイムが不活性化されると第２の色に変わる。別の例示的実施形態では、ＲＮＡベースのマスキング剤は、酵素を隔離するアプタマーであり、ここで、酵素は、アプタマーから放出されると、基質に作用することにより検出可能シグナルを生成し、又はアプタマーは、アプタマーから放出されると組み合わさって検出可能シグナルを生成する薬剤の対を隔離する。
別の例示的実施形態では、ＲＮＡベースのマスキング構築物は、検出可能リガンドオリゴヌクレオチドとマスキング成分とが結合したＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。特定の例示的実施形態では、検出可能リガンドは、フルオロフォアであり、マスキング成分は消光分子である。
別の態様において、本発明は、試料中の標的ＲＮＡの検出方法を提供し、この方法は、試料又は試料セットを１つ以上の個別独立分離容積に分配することであって、個別独立分離容積は、エフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ系、１つ以上のガイドＲＮＡ、ＲＮＡベースのマスキング構築物を含む、分配すること；１つ以上のガイドＲＮＡを１つ以上の標的分子に結合させるのに十分な条件下で試料又は試料セットをインキュベートすること；１つ以上のガイドＲＮＡによる１つ以上の標的分子への結合によってＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化させることであって、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が活性化すると、ＲＮＡベースのマスキング構築物が改変されて検出可能な正のシグナルが生成される、活性化させること；及び検出可能な正のシグナルを検出することであって、検出可能な正のシグナルの検出は、試料中における１つ以上の標的分子の存在を指し示す、検出することを含む。
別の態様において、本発明は、試料中のペプチドの検出方法を提供し、この方法は、試料又は試料セットを個別独立分離容積セットに分配することであって、個別独立分離容積は、ペプチド検出アプタマー、エフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ系、１つ以上のガイドＲＮＡ、ＲＮＡベースのマスキング構築物を含み、ペプチド検出アプタマーは、マスキングされたＲＮＡポリメラーゼ部位を含み、且つ１つ以上の標的分子と結合するように構成される、分配すること；ペプチド検出アプタマーを１つ以上の標的分子に結合させるのに十分な条件下で試料又は試料セットをインキュベートすることであって、アプタマーが対応する標的分子に結合するとＲＮＡポリメラーゼ結合部位が露出し、トリガーＲＮＡのＲＮＡ合成が起こる、インキュベートすること；１つ以上のガイドＲＮＡによるトリガーＲＮＡへの結合によってＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化させることであって、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が活性化すると、ＲＮＡベースのマスキング構築物が改変されて検出可能な正のシグナルが生成される、活性化させること；及び検出可能な正のシグナルを検出することであって、検出可能な正のシグナルの検出は、試料中における１つ以上の標的分子の存在を指し示す、検出することを含む。
特定の例示的実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡは、疾患状態の診断指標となる１つ以上の標的分子に結合するように設計される。特定の他の例示的実施形態において、疾患状態は、感染症、臓器疾患、血液疾患、免疫系疾患、癌、脳及び神経系疾患、内分泌疾患、妊娠又は分娩関連疾患、遺伝性疾患又は環境的に獲得された疾患、癌又は真菌感染症、細菌感染症、寄生虫感染症又はウイルス感染症である。
特定の例示的実施形態では、ＲＮＡベースのマスキング構築物は、検出可能な正のシグナルの生成を抑制し、又はＲＮＡベースのマスキング構築物は、検出可能な正のシグナルをマスキングすることによるか、又は代わりに検出可能な負のシグナルを生成することにより検出可能な正のシグナルの生成を抑制し、又はＲＮＡベースのマスキング構築物は、レポーティング構築物によってコードされる遺伝子産物であって、発現すると検出可能な正のシグナルを生成する遺伝子産物の生成を抑制するサイレンシングＲＮＡを含み、又はＲＮＡベースのマスキング構築物は、負の検出可能シグナルを生成するリボザイムであり、ここで、リボザイムが不活性化されると正の検出可能シグナルが生成される。他の例示的実施形態において、リボザイムは、基質を第１の状態に変え、基質は、リボザイムが不活性化されると第２の状態に変わり、又はＲＮＡベースのマスキング剤は、アプタマーであり、又はアプタマーは、酵素を隔離し、ここで、酵素は、アプタマーから放出されると、基質に作用することにより検出可能シグナルを生成し、又はアプタマーは、アプタマーから放出されると組み合わさって検出可能シグナルを生成する薬剤の対を隔離する。更に別の実施形態において、ＲＮＡベースのマスキング構築物は、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの第１の端部に検出可能リガンドを有し且つＲＮＡオリゴヌクレオチドの第２の端部にマスキング成分を有するＲＮＡオリゴヌクレオチドを含み、又は検出可能リガンドがフルオロフォアであり、マスキング成分が消光分子である。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、その構成成分及びかかる構成成分の送達に関する一般的な情報に関して、量及び製剤に関することを含めた、全て本発明の実施において有用な、方法、材料、送達ビヒクル、ベクター、粒子、ＡＡＶ並びにその作製及び使用を含め、米国特許第８，９９９，６４１号明細書、同第８，９９３，２３３号明細書、同第８，９４５，８３９号明細書、同第８，９３２，８１４号明細書、同第８，９０６，６１６号明細書、同第８，８９５，３０８号明細書、同第８，８８９，４１８号明細書、同第８，８８９，３５６号明細書、同第８，８７１，４４５号明細書、同第８，８６５，４０６号明細書、同第８，７９５，９６５号明細書、同第８，７７１，９４５号明細書及び同第８，６９７，３５９号明細書；米国特許出願公開第２０１４−０３１０８３０号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０３１号明細書）、同第２０１４−０２８７９３８ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２１３，９９１号明細書）、同第２０１４−０２７３２３４ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２９３，６７４号明細書）、同第２０１４−０２７３２３２ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２９０，５７５号明細書）、同第２０１４−０２７３２３１号明細書（米国特許出願第１４／２５９，４２０号明細書）、同第２０１４−０２５６０４６ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２２６，２７４号明細書）、同第２０１４−０２４８７０２ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２５８，４５８号明細書）、同第２０１４−０２４２７００ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２２２，９３０号明細書）、同第２０１４−０２４２６９９ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，５１２号明細書）、同第２０１４−０２４２６６４ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９９０号明細書）、同第２０１４−０２３４９７２ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４７１号明細書）、同第２０１４−０２２７７８７ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２５６，９１２号明細書）、同第２０１４−０１８９８９６ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０３５号明細書）、同第２０１４−０１８６９５８号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０１７号明細書）、同第２０１４−０１８６９１９ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９７７号明細書）、同第２０１４−０１８６８４３ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９００号明細書）、同第２０１４−０１７９７７０ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，８３７号明細書）及び同第２０１４−０１７９００６ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４８６号明細書）、同第２０１４−０１７０７５３号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４２９号明細書）；欧州特許第２ ７８４ １６２ Ｂ１号明細書及び同第２ ７７１ ４６８ Ｂ１号明細書；欧州特許出願公開第２ ７７１ ４６８号明細書（欧州特許出願公開第１３８１８５７０．７号明細書）、同第２ ７６４ １０３号明細書（欧州特許出願公開第１３８２４２３２．６号明細書）及び同第２ ７８４ １６２号明細書（欧州特許出願公開第１４１７０３８３．５号明細書）；及びＰＣＴ特許公報ＰＣＴ特許公報国際公開第２０１４／０９３６６１号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４７４３号明細書）、同第２０１４／０９３６９４号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４７９０号明細書）、同第２０１４／０９３５９５号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６１１号明細書）、同第２０１４／０９３７１８号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４８２５号明細書）、同第２０１４／０９３７０９号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４８１２号明細書）、同第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６６７号明細書）、同第２０１４／０９３６３５号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６９１号明細書）、同第２０１４／０９３６５５号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４７３６号明細書）、同第２０１４／０９３７１２号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４８１９号明細書）、同第２０１４／０９３７０１号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４８００号明細書）、同第２０１４／０１８４２３号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０５１４１８号明細書）、同第２０１４／２０４７２３号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１７９０号明細書）、同第２０１４／２０４７２４号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８００号明細書）、同第２０１４／２０４７２５号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０３号明細書）、同第２０１４／２０４７２６号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０４号明細書）、同第２０１４／２０４７２７号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０６号明細書）、同第２０１４／２０４７２８号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０８号明細書）、同第２０１４／２０４７２９号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０９号明細書）が参照される。また、それぞれ２０１３年１月３０日；２０１３年３月１５日；２０１３年３月２８日；２０１３年４月２０日；２０１３年５月６日及び２０１３年５月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／７５８，４６８号明細書；同第６１／８０２，１７４号明細書；同第６１／８０６，３７５号明細書；同第６１／８１４，２６３号明細書；同第６１／８１９，８０３号明細書及び同第６１／８２８，１３０号明細書も参照される。また、２０１３年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／８３６，１２３号明細書も参照される。加えて、それぞれ２０１３年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／８３５，９３１号明細書、同第６１／８３５，９３６号明細書、同第６１／８３６，１２７号明細書、同第６１／８３６，１０１号明細書、同第６１／８３６，０８０号明細書及び同第６１／８３５，９７３号明細書が参照される。更に、２０１３年８月５日に出願された米国仮特許出願第６１／８６２，４６８号明細書及び同第６１／８６２，３５５号明細書；２０１３年８月２８日に出願された同第６１／８７１，３０１号明細書；２０１３年９月２５日に出願された同第６１／９６０，７７７号明細書及び２０１３年１０月２８日に出願された同第６１／９６１，９８０号明細書が参照される。なおも更に、それぞれ２０１４年６月１０日、６／１０／１４に出願されたＰＣＴ特許出願：ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０３号明細書、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８００号明細書、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０９号明細書、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０４号明細書及びＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０６号明細書；２０１４年６月１１日に出願されたＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０８号明細書；及び２０１４年１０月２８日に出願されたＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／６２５５８号明細書及びそれぞれ２０１３年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，１５０号明細書、同第６１／９１５，３０１号明細書、同第６１／９１５，２６７号明細書及び同第６１／９１５，２６０号明細書；２０１３年１月２９日及び２０１３年２月２５日に出願された同第６１／７５７，９７２号明細書及び同第６１／７６８，９５９号明細書；２０１３年６月１７日に出願された同第６１／８３５，９３６号明細書、同第６１／８３６，１２７号明細書、同第６１／８３６，１０１号明細書、同第６１／８３６，０８０号明細書、同第６１／８３５，９７３号明細書及び同第６１／８３５，９３１号明細書；両方とも２０１４年６月１１日に出願された同第６２／０１０，８８８号明細書及び同第６２／０１０，８７９号明細書；それぞれ２０１４年６月１０日に出願された同第６２／０１０，３２９号明細書及び同第６２／０１０，４４１号明細書；それぞれ２０１４年２月１２日に出願された同第６１／９３９，２２８号明細書及び同第６１／９３９，２４２号明細書；２０１４年４月１５日に出願された同第６１／９８０，０１２号明細書；２０１４年８月１７日に出願された同第６２／０３８，３５８号明細書；それぞれ２０１４年９月２５日に出願された同第６２／０５４，４９０号明細書、同第６２／０５５，４８４号明細書、同第６２／０５５，４６０号明細書及び同第６２／０５５，４８７号明細書；及び２０１４年１０月２７日に出願された同第６２／０６９，２４３号明細書が参照される。また、２０１４年９月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／０５５，４８４号明細書、同第６２／０５５，４６０号明細書及び同第６２／０５５，４８７号明細書；２０１４年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／９８０，０１２号明細書；及び２０１４年２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９３９，２４２号明細書も参照される。特に米国を指定するＰＣＴ出願、２０１４年６月１０日に出願されたＰＣＴ／米国特許出願公開第１４／４１８０６号明細書が参照される。２０１４年１月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／９３０，２１４号明細書が参照される。それぞれ２０１３年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，２５１号明細書；同第６１／９１５，２６０号明細書及び同第６１／９１５，２６７号明細書が参照される。２０１４年４月１５日に出願された米国特許出願第６１／９８０，０１２号明細書が参照される。特に米国を指定するＰＣＴ出願、２０１４年６月１０日に出願されたＰＣＴ／米国特許出願公開第１４／４１８０６号明細書が参照される。２０１４年１月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／９３０，２１４号明細書が参照される。それぞれ２０１３年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，２５１号明細書；同第６１／９１５，２６０号明細書及び同第６１／９１５，２６７号明細書が参照される。
また、１４年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／０９１，４５５号明細書、「ＰＲＯＴＥＣＴＥＤ ＧＵＩＤＥ ＲＮＡＳ（ＰＧＲＮＡＳ）」；米国仮特許出願第６２／０９６，７０８号明細書、１４年１２月２４日、「ＰＲＯＴＥＣＴＥＤ ＧＵＩＤＥ ＲＮＡＳ（ＰＧＲＮＡＳ）」；米国仮特許出願第６２／０９１，４６２号明細書、１４年１２月１２日、「ＤＥＡＤ ＧＵＩＤＥＳ ＦＯＲ ＣＲＩＳＰＲ ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ ＦＡＣＴＯＲＳ」；米国仮特許出願第６２／０９６，３２４号明細書、１４年１２月２３日、「ＤＥＡＤ ＧＵＩＤＥＳ ＦＯＲ ＣＲＩＳＰＲ ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ ＦＡＣＴＯＲＳ」；米国仮特許出願第６２／０９１，４５６号明細書、１４年１２月１２日、「ＥＳＣＯＲＴＥＤ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬＩＺＥＤ ＧＵＩＤＥＳ ＦＯＲ ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ」；米国仮特許出願第６２／０９１，４６１号明細書、１４年１２月１２日、「ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＧＥＮＯＭＥ ＥＤＩＴＩＮＧ ＡＳ ＴＯ ＨＥＭＡＴＯＰＯＥＴＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ（ＨＳＣｓ）」；米国仮特許出願第６２／０９４，９０３号明細書、１４年１２月１９日、「ＵＮＢＩＡＳＥＤ ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＤＯＵＢＬＥ−ＳＴＲＡＮＤ ＢＲＥＡＫＳ ＡＮＤ ＧＥＮＯＭＩＣ ＲＥＡＲＲＡＮＧＥＭＥＮＴ ＢＹ ＧＥＮＯＭＥ−ＷＩＳＥ ＩＮＳＥＲＴ ＣＡＰＴＵＲＥ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ」；米国仮特許出願第６２／０９６，７６１号明細書、１４年１２月２４日、「ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＥＮＺＹＭＥ ＡＮＤ ＧＵＩＤＥ ＳＣＡＦＦＯＬＤＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ」；米国仮特許出願第６２／０９８，０５９号明細書、１４年１２月３０日、「ＲＮＡ−ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭ」；米国仮特許出願第６２／０９６，６５６号明細書、１４年１２月２４日、「ＣＲＩＳＰＲ ＨＡＶＩＮＧ ＯＲ ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＷＩＴＨ ＤＥＳＴＡＢＩＬＩＺＡＴＩＯＮ ＤＯＭＡＩＮＳ」；米国仮特許出願第６２／０９６，６９７号明細書、１４年１２月２４日、「ＣＲＩＳＰＲ ＨＡＶＩＮＧ ＯＲ ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＷＩＴＨ ＡＡＶ」；米国仮特許出願第６２／０９８，１５８号明細書、１４年１２月３０日、「ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸ ＩＮＳＥＲＴＩＯＮＡＬ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ」；米国仮特許出願第６２／１５１，０５２号明細書、１５年４月２２日、「ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＦＯＲ ＥＸＴＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲ ＥＸＯＳＯＭＡＬ ＲＥＰＯＲＴＩＮＧ」；米国仮特許出願第６２／０５４，４９０号明細書、１４年９月２４日、「ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ ＡＮＤ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＵＳＩＮＧ ＰＡＲＴＩＣＬＥ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ」；米国仮特許出願第６２／０５５，４８４号明細書、１４年９月２５日、「ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ」；米国仮特許出願第６２／０８７，５３７号明細書、１４年１２月４日、「ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ」；米国仮特許出願第６２／０５４，６５１号明細書、１４年９月２４日、「ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＭＯＤＥＬＩＮＧ ＣＯＭＰＥＴＩＴＩＯＮ ＯＦ ＭＵＬＴＩＰＬＥ ＣＡＮＣＥＲ ＭＵＴＡＴＩＯＮＳ ＩＮ ＶＩＶＯ」；米国仮特許出願第６２／０６７，８８６号明細書、１４年１０月２３日、「ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＭＯＤＥＬＩＮＧ ＣＯＭＰＥＴＩＴＩＯＮ ＯＦ ＭＵＬＴＩＰＬＥ ＣＡＮＣＥＲ ＭＵＴＡＴＩＯＮＳ ＩＮ ＶＩＶＯ」；米国仮特許出願第６２／０５４，６７５号明細書、１４年９月２４日、「ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＩＮ ＮＥＵＲＯＮＡＬ ＣＥＬＬＳ／ＴＩＳＳＵＥＳ」；米国仮特許出願第６２／０５４，５２８号明細書、１４年９月２４日、「ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＥ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＯＲ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」；米国仮特許出願第６２／０５５，４５４号明細書、１４年９月２５日、「ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ ＡＮＤ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＵＳＩＮＧ ＣＥＬＬ ＰＥＮＥＴＲＡＴＩＯＮ ＰＥＰＴＩＤＥＳ（ＣＰＰ）」；米国仮特許出願第６２／０５５，４６０号明細書、１４年９月２５日、「ＭＵＬＴＩＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ−ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ ＡＮＤ／ＯＲ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＥＮＺＹＭＥ ＬＩＮＫＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ−ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ」；米国仮特許出願第６２／０８７，４７５号明細書、１４年１２月４日、「ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ」；米国仮特許出願第６２／０５５，４８７号明細書、１４年９月２５日、「ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ」；米国仮特許出願第６２／０８７，５４６号明細書、１４年１２月４日、「ＭＵＬＴＩＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ ＡＮＤ／ＯＲ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＥＮＺＹＭＥ ＬＩＮＫＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ−ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ」；及び米国仮特許出願第６２／０９８，２８５号明細書、１４年１２月３０日、「ＣＲＩＳＰＲ ＭＥＤＩＡＴＥＤ ＩＮ ＶＩＶＯ ＭＯＤＥＬＩＮＧ ＡＮＤ ＧＥＮＥＴＩＣ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＯＦ ＴＵＭＯＲ ＧＲＯＷＴＨ ＡＮＤ ＭＥＴＡＳＴＡＳＩＳ」も挙げられる。
これらの特許、特許公報及び出願の各々並びにそれらの中に又はそれらの審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）及び出願引用文献において引用又は参照される全ての文献は、それらの中で言及される又はそれらの中にある任意の文献において言及される及び参照によって本明細書に援用される任意の製品に関する任意の指示書、説明書、製品仕様書及びプロダクトシートと共に、本明細書によって参照により本明細書に援用され、且つ本発明の実施に用いられ得る。全ての文献（例えば、これらの特許、特許公報及び出願並びに出願引用文献）は、各個別の文献が参照によって援用されることが具体的且つ個別的に示されたものとみなすのと同程度に参照により本明細書に援用される。
また、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に関する一般情報に関して、以下を挙げることができる（同様に参照により本明細書に援用される）：
・“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ”．Ｃｏｎｇ，Ｌ．，Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，Ｃｏｘ，Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｂａｒｒｅｔｔｏ，Ｒ．，Ｈａｂｉｂ，Ｎ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｊｉａｎｇ，Ｗ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．，＆Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８１９−２３（２０１３）；
・“ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ”．Ｊｉａｎｇ Ｗ．，Ｂｉｋａｒｄ Ｄ．，Ｃｏｘ Ｄ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ ＬＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｍａｒ；３１（３）：２３３−９（２０１３）；
・“Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｅ Ｃａｒｒｙｉｎｇ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”．Ｗａｎｇ Ｈ．，Ｙａｎｇ Ｈ．，Ｓｈｉｖａｌｉｌａ ＣＳ．，Ｄａｗｌａｔｙ ＭＭ．，Ｃｈｅｎｇ ＡＷ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ Ｒ．Ｃｅｌｌ Ｍａｙ ９；１５３（４）：９１０−８（２０１３）；
・“Ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｔｅｓ”．Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ，Ｂｒｉｇｈａｍ ＭＤ，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ，Ｈｓｕ ＰＤ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ Ｍ，Ｃｏｎｇ Ｌ，Ｐｌａｔｔ ＲＪ，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ，Ｃｈｕｒｃｈ ＧＭ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ．Ａｕｇ ２２；５００（７４６３）：４７２−６．ｄｏｉ：１０．１０３８／Ｎａｔｕｒｅ１２４６６．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ａｕｇ ２３（２０１３）；
・“Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｉｎｇ ｂｙ ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｌｉｎ，ＣＹ．，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，ＪＳ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ，ＡＥ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｉｎｏｕｅ，Ａ．，Ｍａｔｏｂａ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，＆Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｃｅｌｌ Ａｕｇ ２８．ｐｉｉ：Ｓ００９２−８６７４（１３）０１０１５−５（２０１３−Ａ）；
・“ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ”．Ｈｓｕ，Ｐ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｆｉｎｅ，Ｅ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｃｒａｄｉｃｋ，ＴＪ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，ＬＡ．，Ｂａｏ，Ｇ．，＆Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７（２０１３）；
・“Ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ”．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１−３０８（２０１３−Ｂ）；
・“Ｇｅｎｏｍｅ−Ｓｃａｌｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ”．Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｓａｎｊａｎａ，ＮＥ．，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ，Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ，Ｔ．，Ｈｅｃｋｌ，Ｄ．，Ｅｂｅｒｔ，ＢＬ．，Ｒｏｏｔ，ＤＥ．，Ｄｏｅｎｃｈ，ＪＧ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｃ １２．（２０１３）．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］；
・“Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃａｓ９ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ”．Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｓｈｅｈａｔａ，ＳＩ．，Ｄｏｈｍａｅ，Ｎ．，Ｉｓｈｉｔａｎｉ，Ｒ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，Ｎｕｒｅｋｉ，Ｏ．Ｃｅｌｌ Ｆｅｂ ２７，１５６（５）：９３５−４９（２０１４）；
・“Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃａｓ９ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ”．Ｗｕ Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ．，Ｋｒｉｚ ＡＪ．，Ｃｈｉｕ ＡＣ．，Ｈｓｕ ＰＤ．，Ｄａｄｏｎ ＤＢ．，Ｃｈｅｎｇ ＡＷ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ．，Ｃｈｅｎ Ｓ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ Ｒ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｓｈａｒｐ ＰＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｒ ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８８９（２０１４）；
・“ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｉｎ Ｍｉｃｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ”．Ｐｌａｔｔ ＲＪ，Ｃｈｅｎ Ｓ，Ｚｈｏｕ Ｙ，Ｙｉｍ ＭＪ，Ｓｗｉｅｃｈ Ｌ，Ｋｅｍｐｔｏｎ ＨＲ，Ｄａｈｌｍａｎ ＪＥ，Ｐａｒｎａｓ Ｏ，Ｅｉｓｅｎｈａｕｒｅ ＴＭ，Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ Ｍ，Ｇｒａｈａｍ ＤＢ，Ｊｈｕｎｊｈｕｎｗａｌａ Ｓ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ Ｍ，Ｘａｖｉｅｒ ＲＪ，Ｌａｎｇｅｒ Ｒ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＤＧ，Ｈａｃｏｈｅｎ Ｎ，Ｒｅｇｅｖ Ａ，Ｆｅｎｇ Ｇ，Ｓｈａｒｐ ＰＡ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．Ｃｅｌｌ １５９（２）：４４０−４５５ ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０１４（２０１４）；
・“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，Ｈｓｕ ＰＤ，Ｌａｎｄｅｒ ＥＳ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｃｅｌｌ．Ｊｕｎ ５；１５７（６）：１２６２−７８（２０１４）
・“Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ”，Ｗａｎｇ Ｔ，Ｗｅｉ ＪＪ，Ｓａｂａｔｉｎｉ ＤＭ，Ｌａｎｄｅｒ ＥＳ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｊａｎｕａｒｙ ３；３４３（６１６６）：８０−８４．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４６９８１（２０１４）；
・“Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｓｇＲＮＡｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”，Ｄｏｅｎｃｈ ＪＧ，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ Ｅ，Ｇｒａｈａｍ ＤＢ，Ｔｏｔｈｏｖａ Ｚ，Ｈｅｇｄｅ Ｍ，Ｓｍｉｔｈ Ｉ，Ｓｕｌｌｅｎｄｅｒ Ｍ，Ｅｂｅｒｔ ＢＬ，Ｘａｖｉｅｒ ＲＪ，Ｒｏｏｔ ＤＥ．，（オンライン発行 ３ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｄｅｃ；３２（１２）：１２６２−７（２０１４）；
・“Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９”，Ｓｗｉｅｃｈ Ｌ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ Ｍ，Ｂａｎｅｒｊｅｅ Ａ，Ｈａｂｉｂ Ｎ，Ｌｉ Ｙ，Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ Ｊ，Ｓｕｒ Ｍ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，（オンライン発行 １９ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊａｎ；３３（１）：１０２−６（２０１５）；
・“Ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｃｏｍｐｌｅｘ”，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ，Ｂｒｉｇｈａｍ ＭＤ，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ，Ｊｏｕｎｇ Ｊ，Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ＯＯ，Ｂａｒｃｅｎａ Ｃ，Ｈｓｕ ＰＤ，Ｈａｂｉｂ Ｎ，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ＪＳ，Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ Ｈ，Ｎｕｒｅｋｉ Ｏ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｎａｔｕｒｅ．Ｊａｎ ２９；５１７（７５３６）：５８３−８（２０１５）
・“Ａ ｓｐｌｉｔ−Ｃａｓ９ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ”，Ｚｅｔｓｃｈｅ Ｂ，Ｖｏｌｚ ＳＥ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ０２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｆｅｂ；３３（２）：１３９−４２（２０１５）；
・“Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｃｒｅｅｎ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ”，Ｃｈｅｎ Ｓ，Ｓａｎｊａｎａ ＮＥ，Ｚｈｅｎｇ Ｋ，Ｓｈａｌｅｍ Ｏ，Ｌｅｅ Ｋ，Ｓｈｉ Ｘ，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ，Ｓｏｎｇ Ｊ，Ｐａｎ ＪＱ，Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ Ｒ，Ｌｅｅ Ｈ，Ｚｈａｎｇ Ｆ，Ｓｈａｒｐ ＰＡ．Ｃｅｌｌ １６０，１２４６−１２６０，Ｍａｒｃｈ １２，２０１５（マウスにおける多重スクリーニング）、及び
・“Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９”，Ｒａｎ ＦＡ，Ｃｏｎｇ Ｌ，Ｙａｎ ＷＸ，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ＪＳ，Ｋｒｉｚ ＡＪ，Ｚｅｔｓｃｈｅ Ｂ，Ｓｈａｌｅｍ Ｏ，Ｗｕ Ｘ，Ｍａｋａｒｏｖａ ＫＳ，Ｋｏｏｎｉｎ ＥＶ，Ｓｈａｒｐ ＰＡ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ０１ Ａｐｒｉｌ ２０１５），Ｎａｔｕｒｅ．Ａｐｒ ９；５２０（７５４６）：１８６−９１（２０１５）
・Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９”，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６，２９９−３１１（Ｍａｙ ２０１５）
・Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ”，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５，１１４７−１１５７（Ａｕｇｕｓｔ ２０１５）
・Ｐａｒｎａｓ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｃｒｅｅｎ ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｄｉｓｓｅｃｔ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ”，Ｃｅｌｌ １６２，６７５−６８６（Ｊｕｌｙ ３０，２０１５）
・Ｒａｍａｎａｎ ｅｔ ａｌ．，“ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｖｉｒａｌ ＤＮＡ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：１０８３３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１０８３３（Ｊｕｎｅ ２，２０１５）
・Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９”，Ｃｅｌｌ １６２，１１１３−１１２６（Ａｕｇ．２７，２０１５）
・Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５），“Ｃｐｆ１ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ”，Ｃｅｌｌ １６３，７５９−７７１（Ｏｃｔ．２２，２０１５）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１５．０９．０３８．Ｅｐｕｂ Ｓｅｐ．２５，２０１５
・Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５），“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６０，３８５−３９７（Ｎｏｖ．５，２０１５）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１５．１０．００８．Ｅｐｕｂ Ｏｃｔ ２２，２０１５
・Ｄａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｗｉｔｈ ａ ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３，１１５９−１１６１（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２０１５）
・Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃｐｆ１ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｗｉｔｈ Ａｌｔｅｒｅｄ ＰＡＭ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ”，ｂｉｏＲｘｉｖ ０９１６１１；ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／０９１６１１ Ｅｐｕｂ Ｄｅｃ．４，２０１６
・Ｓｍａｒｇｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７），“Ｃａｓ１３ｂ Ｉｓ ａ Ｔｙｐｅ ＶＩ−Ｂ ＣＲＩＳＰＲ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ ＲＮａｓｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｓｘ２７ ａｎｄ Ｃｓｘ２８”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６５，６１８−６３０（Ｆｅｂ．１６，２０１７）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１６．１２．０２３．Ｅｐｕｂ Ｊａｎ ５，２０１７
この各々が参照により本明細書に援用され、本発明の実施において考慮され得、且つ以下に簡単に考察する：
・Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．は、サーモフィラス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９及びまた化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の両方に基づき、真核細胞で使用されるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をエンジニアリングし、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが低分子ＲＮＡの指図を受けてヒト及びマウス細胞で正確なＤＮＡ切断を誘導し得ることを実証した。この著者らの研究は、ニッキング酵素に変換されるＣａｓ９を使用して、最小限の変異原活性を有する真核細胞での相同性組換え修復を促進し得ることを更に示した。加えて、この著者らの研究は、複数のガイド配列を単一のＣＲＩＳＰＲ配列にコードすることによって哺乳類ゲノム内の内在性ゲノム遺伝子座部位で幾つかを同時に編集することが可能となり得ることを実証し、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ技術の容易なプログラム可能性及び広範な適用性を実証した。このようにＲＮＡを使用して細胞における配列特異的ＤＮＡ切断をプログラムすることが可能となり、ゲノムエンジニアリングツールの新しいクラスが定義された。これらの研究は、他のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が哺乳類細胞に移植可能である可能性があり、哺乳類ゲノム切断も媒介し得ることを更に示した。重要なことに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の幾つかの側面を更に改良してその効率及び多用途性を高め得ることが想定され得る。
・Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．は、デュアルＲＮＡと複合体を形成したクラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを使用して、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のゲノムに正確な突然変異を導入した。この手法は、標的ゲノム部位におけるデュアルＲＮＡ：Ｃａｓ９誘導切断によって非突然変異細胞を死滅させることに依存するもので、選択可能マーカー又は対抗選択系の必要性が回避される。この研究は、単一及び複数のヌクレオチド変化が生じるように短鎖ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の配列を変えることによってデュアルＲＮＡ：Ｃａｓ９特異性を再プログラム化すると、鋳型の編集が行われることを報告した。この研究は、２つのｃｒＲＮＡを同時に使用すると突然変異誘発の多重化が可能であることを示した。更に、この手法を組換えと組み合わせて用いたとき、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）では、記載される手法を用いて回収された細胞のほぼ１００％が所望の突然変異を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では回収された細胞の６５％が突然変異を含んだ。
・Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いることにより、胚性幹細胞における逐次的組換え及び／又は及び／又は時間のかかる単一突然変異を有するマウスの交雑による複数の段階で従来作成された複数の遺伝子に突然変異を保有するマウスを一段階で作成した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は機能的に重複する遺伝子及び上位遺伝子相互作用のインビボ研究を大幅に加速させ得る。
・Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９酵素及びまた転写活性化因子様エフェクターに基づくＤＮＡ結合ドメインの光学的及び化学的調節を可能にする多用途の且つロバストな技術が当該技術分野で必要とされていることに対処した。
・Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３−Ａ）は、Ｃａｓ９ニッカーゼ突然変異体を対のガイドＲＮＡと組み合わせて標的二本鎖切断を導入するという手法を記載した。これは、微生物ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のＣａｓ９ヌクレアーゼがガイド配列によって特異的なゲノム遺伝子座に標的化されるが、ガイド配列は、ＤＮＡ標的との幾らかのミスマッチに耐えることができるため、従って望ましくないオフターゲット突然変異誘発を促進し得るという問題に対処する。ゲノム中の個々のニックは高いフィデリティーで修復されるため、二本鎖切断には適切にオフセットしたガイドＲＮＡによる同時のニッキングが必要であり、標的切断のために特異的に認識される塩基の数が大きくなる。この著者らは、対のニッキングを使用して細胞系におけるオフターゲット活性を５０〜１，５００分の１に減らし、オンターゲット切断効率を犠牲にすることなしにマウス接合体における遺伝子ノックアウトを促進し得ることを実証した。この多用途戦略により、高い特異性が要求される多様なゲノム編集適用が可能となる。
・Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）は、標的部位の選択を知らせ、且つオフターゲット効果を回避するためのヒト細胞におけるＳｐＣａｓ９ターゲティングの特異性を特徴付けた。この研究は、７００個を超えるガイドＲＮＡ変異体並びに２９３Ｔ及び２９３ＦＴ細胞の１００個を超える予測ゲノムオフターゲット遺伝子座におけるＳｐＣａｓ９誘導インデル突然変異レベルを評価した。この著者ら、ＳｐＣａｓ９が、ミスマッチの数、位置及び分布に感受性を示して配列依存的に種々の位置におけるガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間のミスマッチに耐えること。この著者らは、ＳｐＣａｓ９媒介性切断がＤＮＡメチル化の影響を受けないこと、ＳｐＣａｓ９及びｓｇＲＮＡの投与量を滴定してオフターゲット改変を最小限に抑え得ることを更に示した。加えて、哺乳類ゲノムエンジニアリング適用を促進するため、この著者らは、標的配列の選択及び検証並びにオフターゲット解析をガイドするウェブベースのソフトウェアツールの提供を報告した。
・Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３−Ｂ）は、哺乳類細胞における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同性組換え修復（ＨＤＲ）を用いたＣａｓ９媒介性ゲノム編集用並びに下流機能研究のための改変細胞系作成のためのツールの組を記載した。オフターゲット切断を最小限に抑えるため、この著者らは、対のガイドＲＮＡを含むＣａｓ９ニッカーゼ突然変異体を使用した二重ニッキング戦略を更に記載した。この著者らによって提供されるプロトコルから、標的部位の選択、切断効率の評価及びオフターゲット活性の分析に関する指針が実験的に導かれた。この研究は、標的設計から始めて、僅か１〜２週間以内に遺伝子改変を達成し得ると共に、２〜３週間以内に改変クローン細胞系を誘導し得ることを示した。
・Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．は、ゲノムワイドな規模で遺伝子機能を調べる新しい方法を記載した。この著者らの研究は、６４，７５１個のユニークなガイド配列で１８，０８０個の遺伝子を標的化するゲノム規模のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ノックアウト（ＧｅＣＫＯ）ライブラリの送達が、ヒト細胞におけるネガティブ選択及びポジティブ選択の両方のスクリーニングを可能にしたことを示した。第一に、この著者らは、ＧｅＣＫＯライブラリを使用した、癌及び多能性幹細胞における細胞生存にとって不可欠な遺伝子の同定を示した。次に、この著者らは黒色腫モデルにおいて、その欠損が突然変異体プロテインキナーゼＢＲＡＦを阻害する治療薬ベムラフェニブに対する耐性に関わる遺伝子をスクリーニングした。この著者らの研究は、最も上位にランク付けされた候補に、以前検証された遺伝子ＮＦ１及びＭＥＤ１２並びに新規ヒットＮＦ２、ＣＵＬ３、ＴＡＤＡ２Ｂ及びＴＡＤＡ１が含まれたことを示した。この著者らは、同じ遺伝子を標的化する独立したガイドＲＮＡ間における高度な一致及び高率のヒット確認を観察し、従ってＣａｓ９によるゲノム規模スクリーニングの有望さを実証した。
・Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．は、２．５Åの分解能でｓｇＲＮＡ及びその標的ＤＮＡと複合体形成する化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の結晶構造を報告した。この構造から、標的認識ローブとヌクレアーゼローブとで構成された、それらの界面にある正電荷の溝にｓｇＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖を受け入れる２ローブ構成が明らかになった。認識ローブはｓｇＲＮＡ及びＤＮＡの結合に決定的に重要であるのに対し、ヌクレアーゼローブは、ＨＮＨ及びＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含み、これらのドメインは、標的ＤＮＡのそれぞれ相補鎖及び非相補鎖の切断に適切な位置にある。ヌクレアーゼローブは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）との相互作用に関与するカルボキシル末端ドメインも含む。この高分解能構造解析及び付随する機能解析により、Ｃａｓ９によるＲＮＡガイド下ＤＮＡターゲティングの分子機構が明らかになることにより、従って新規の多用途ゲノム編集技術の合理的な設計への道が開かれつつある。
・Ｗｕ ｅｔ ａｌ．は、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）においてシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を負荷した化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の触媒不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）のゲノムワイドな結合部位をマッピングした。この著者らは、試験した４つのｓｇＲＮＡの各々が、多くの場合にｓｇＲＮＡにおける５ヌクレオチドシード領域及びＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）によって特徴付けられる数十個ないし数千個のゲノム部位にｄＣａｓ９を標的化することを示した。クロマチンが接触不可能であることにより、一致するシード配列を含む他の部位に対するｄＣａｓ９結合が減少し；従ってオフターゲット部位の７０％が遺伝子と会合する。この著者らは、触媒活性Ｃａｓ９を形質移入したｍＥＳＣにおける２９５個のｄＣａｓ９結合部位の標的シーケンシングから、バックグラウンドレベルを上回って突然変異した部位は、１つのみ同定されたことを示した。この著者らは、Ｃａｓ９結合及び切断の２状態モデルを提案しており、このモデルではシードの一致が結合を引き起こすが、切断には標的ＤＮＡとの広範な対合が必要である。
・Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．はＣｒｅ依存性Ｃａｓ９ノックインマウスを樹立した。この著者らは、ニューロン、免疫細胞及び内皮細胞においてガイドＲＮＡのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性、レンチウイルス媒介性又は粒子媒介性送達を用いたインビボ並びにエキソビボゲノム編集を実証した。
・Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１４）は、細胞の遺伝子スクリーニングを含めたヨーグルトからゲノム編集に至るまでのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の歴史を広く考察するレビュー論文である。
・Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）は、ゲノム規模のレンチウイルスシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ライブラリを使用するポジティブ選択及びネガティブ選択の両方に好適なプールされた機能喪失型遺伝子スクリーニング手法に関する。
・Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．は、６個の内因性マウス遺伝子及び３個の内因性ヒト遺伝子のパネルの可能な全ての標的部位にわたってタイリングするｓｇＲＮＡのプールを作成し、その標的遺伝子のヌル対立遺伝子を産生するそれらの能力を抗体対比染色及びフローサイトメトリーによって定量的に評価した。この著者らは、ＰＡＭの最適化により活性が向上することを示し、また、ｓｇＲＮＡを設計するためのオンラインツールも提供した。
・Ｓｗｉｅｃｈ ｅｔ ａｌ．は、ＡＡＶ媒介性ＳｐＣａｓ９ゲノム編集により脳における遺伝子機能の逆遺伝学研究が可能となり得ることを実証している。
・Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、複数のエフェクタードメイン、例えば転写アクチベーター、機能及びエピゲノム調節因子をステム又はテトラループなどのガイド上の適切な位置にリンカーを伴い及び伴わず付加する能力を考察している。
・Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．は、Ｃａｓ９酵素が２つにスプリットされることができ、従って活性化のためのＣａｓ９のアセンブリを制御し得ることを実証している。
・Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．は、マウスにおけるゲノムワイドなインビボＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９スクリーニングによって肺転移の調節遺伝子が明らかになることを実証することによる多重スクリーニングに関する。
・Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）はＳａＣａｓ９及びそのゲノム編集能力に関し、生化学アッセイからは推定できないことを実証している。Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、触媒不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）融合物を使用して発現を合成的に抑制（ＣＲＩＳＰＲｉ）又は活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）する方法を記載し、アレイ化且つプール化されたスクリーンを含め、ゲノムスケールのスクリーンのためのＣａｓ９を使用した進歩、ゲノム遺伝子座を不活性化するノックアウト手法及び転写活性を調節する戦略を示している。
末端編集
・Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）の融合物を用いて発現を合成的に抑制（ＣＲＩＳＰＲｉ）又は活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）する方法について記載し、アレイ化及びプール化されたスクリーニングを含めたゲノム規模のスクリーニング、ゲノム遺伝子座を不活性化させるノックアウト手法及び転写活性を調節するストラテジーにＣａｓ９を用いる進歩を示している。
・Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、ＣＲＩＳＰＲベースのスクリーニングにおけるシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の効率に寄与するＤＮＡ配列特徴を評価した。この著者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトの効率及び切断部位におけるヌクレオチド優先度を調査した。この著者らは、ＣＲＩＳＰＲｉ／ａの配列優先度がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトのものと実質的に異なることも見出した。
・Ｐａｒｎａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、ゲノムワイドなプールＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ライブラリを樹状細胞（ＤＣ）に導入することにより、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）による腫瘍壊死因子（Ｔｎｆ）の誘導を制御する遺伝子を同定した。Ｔｌｒ４シグナル伝達の既知の調節因子及びこれまで知られていない候補が同定され、ＬＰＳに対するカノニカルな応答への個別的な効果を有する３つの機能モジュールに分類された。
・Ｒａｍａｎａｎ ｅｔ ａｌ（２０１５）は、感染細胞におけるウイルスエピソームＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の切断を実証した。ＨＢＶゲノムは感染ヘパトサイトの核に、共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）と呼ばれる３．２ｋｂの二本鎖エピソームＤＮＡ種として存在し、ｃｃｃＤＮＡは、現在の治療法によってはその複製が阻害されないＨＢＶライフサイクルの主要な構成成分である。この著者らは、ＨＢＶの高度に保存された領域を特異的に標的化するｓｇＲＮＡがウイルス複製をロバストに抑制し、ｃｃｃＤＮＡを枯渇させることを示した。
・Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、５’−ＴＴＧＡＡＴ−３’ＰＡＭ及び５’−ＴＴＧＧＧＴ−３’ＰＡＭを含有する、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）及びその二本鎖ＤＮＡ標的との複合体中のＳａＣａｓ９の結晶構造を報告した。ＳａＣａｓ９とＳｐＣａｓ９の構造比較により、構造的保存及び多様性の両方が明らかとなり、それらの特徴的なＰＡＭ特異性及びオルソロガスｓｇＲＮＡ認識が説明された。
また、“Ｄｉｍｅｒｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ＦｏｋＩ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ”，Ｓｈｅｎｇｄａｒ Ｑ．Ｔｓａｉ，Ｎｉｃｏｌａｓ Ｗｙｖｅｋｅｎｓ，Ｃｙｄ Ｋｈａｙｔｅｒ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ａ．Ｆｏｄｅｎ，Ｖｉｓｈａｌ Ｔｈａｐａｒ，Ｄｅｅｐａｋ Ｒｅｙｏｎ，Ｍａｔｈｅｗ Ｊ．Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ａｒｙｅｅ，Ｊ．Ｋｅｉｔｈ Ｊｏｕｎｇ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（６）：５６９−７７（２０１４）は、伸長した配列を認識し、且つヒト細胞において内因性遺伝子を高効率で編集することのできる二量体ＲＮＡガイド誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼに関する。加えて、ｓｇＲＮＡ・Ｃａｓ９タンパク質含有粒子を調製する方法であって、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質（及び任意選択でＨＤＲ鋳型）を含む混合物を界面活性剤、リン脂質、生分解性ポリマー、リポタンパク質及びアルコールを含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる混合物と混合するステップを含む方法；及びかかる方法からの粒子に関して、“ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ ＡＮＤ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＵＳＩＮＧ ＰＡＲＴＩＣＬＥ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ”という名称のＰＣＴ出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第１４／７００５７号明細書、代理人整理番号４７６２７．９９．２０６０及びＢＩ−２０１３／１０７（２０１４年９月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／０５４，４９０号明細書；２０１４年６月１０日に出願された同第６２／０１０，４４１号明細書；及びそれぞれ２０１３年１２月１２日に出願された同第６１／９１５，１１８号明細書、同第６１／９１５，２１５号明細書及び同第６１／９１５，１４８号明細書の１つ以上又は全てからの優先権を主張する）（「粒子送達ＰＣＴ」）（参照により本明細書に組み入れられる）が挙げられる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡとが、有利には滅菌ヌクレアーゼフリー緩衝液、例えば１×ＰＢＳ中、好適な、例えば３：１〜１：３又は２：１〜１：２又は１：１のモル比で、好適な温度、例えば１５〜３０℃、例えば２０〜２５℃、例えば室温で好適な時間、例えば１５〜４５、例えば３０分間にわたり共に混合された。それとは別に、界面活性剤、例えばカチオン性脂質、例えば１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；リン脂質、例えばジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）；生分解性ポリマー、例えばエチレングリコールポリマー又はＰＥＧ及びリポタンパク質、例えば低密度リポタンパク質、例えばコレステロールなどの又はそれらを含む粒子構成成分が、アルコール、有利にはＣ１〜６アルキルアルコール、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、例えば１００％エタノール中に溶解された。これらの２つの溶液が共に混合され、Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体を含有する粒子が形成された。従って、粒子として複合体全体を形成する前にｓｇＲＮＡをＣａｓ９タンパク質と予め複合体に形成し得る。細胞への核酸の送達を促進することが知られる種々のモル比の種々の構成成分（例えば、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジテトラデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びコレステロール）を伴って製剤が作製され得、例えば、ＤＯＴＡＰ：ＤＭＰＣ：ＰＥＧ：コレステロールのモル比は、ＤＯＴＡＰ１００、ＤＭＰＣ０、ＰＥＧ０、コレステロール０；又はＤＯＴＡＰ９０、ＤＭＰＣ０、ＰＥＧ１０、コレステロール０；又はＤＯＴＡＰ９０、ＤＭＰＣ０、ＰＥＧ５、コレステロール５、ＤＯＴＡＰ１００、ＤＭＰＣ０、ＰＥＧ０、コレステロール０であり得る。従って、その出願は、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質と、粒子を形成する構成成分とを混合するステップ；及びかかる混合ステップからの粒子を包含する。本発明の態様は、粒子；例えば、本発明のようなｃｒＲＮＡ及び／又はＣａｓ１３ｂを含む混合物と、例えば粒子送達ＰＣＴにあるような、粒子を形成する構成成分とを混合して粒子を形成することにより、例えば粒子送達ＰＣＴと類似した方法を使用する粒子及びかかる混合ステップからの粒子（又は当然ながら、本発明にあるようなｃｒＲＮＡ及び／又はＣａｓ１３ｂを含む他の粒子）を含み得る。
以下の実施例に本発明を更に説明するが、これらの実施例は、あくまでも例示を目的として提供され、決して本発明を限定することを意図されない。
実施例１：Ｃａｓ１３ｂオルソログの同定
以下の表１に示すＣａｓ１３ｂタンパク質は、有利には、哺乳類細胞での発現に関するコドン最適化からのものである。ｍＣｈｅｒｒｙ及び任意選択でＮＬＳ又はＮＥＳを有するＣａｓ１３ｂオルソログの各々の融合構築物を作成し、哺乳類発現ベクターにクローニングする。様々なＣａｓ１３ｂオルソログをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、ｍＣｈｅｒｒｙ発現に基づいて細胞局在化を評価する。Ｃ末端及びＮ末端ＮＥＳに融合した、Ｃ末端及びＮ末端ＮＬＳに融合した、又はＮＥＳ若しくはＮＬＳ融合のない異なるＣａｓ１３ｂオルソログの局在化を決定する。ＮＥＳ融合物は、Ｃａｓ１３ｂタンパク質の細胞質局在化を効率的にもたらす。ＮＬＳ融合物は、Ｃａｓ１３ｂタンパク質の核局在化を効率的にもたらす。一定しないが、ＮＬＳ融合物では核小体局在化も観察することができる。
本発明の表１のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、上記の表１からの又はそれに示されるとおりのかかるタンパク質又は表１に示される生物のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質並びにそれと９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００の同一性を有するタンパク質、例えば前述のパーセンテージの範囲内で１つ以上の変化を有するタンパク質であって、その変化が保存的置換基であるか、それを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなるタンパク質（ここで、保存的置換は、以下の一覧表を参照し得る）であるか、又はそれを含むか、又はそれから本質的になるか、又はそれからなるか、又はそれに関わるか若しくはそれに関する。
又は、保存的置換に関する当該技術分野の知識、例えばＦｒｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．“Ｗｈａｔ ｉｓ ａ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ？”，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，１９（２）：１７１−１７５（Ｍａｒｃｈ １９８３）；Ｙａｍｐｏｌｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７０（４）：１４５９−１４７２（Ａｕｇ ２００５），ｄｏｉ：１０．１５３４／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１０４．０３９１０７；Ｇｅｍｏｖｉｃ，“Ｆｅａｔｕｒｅ−Ｂａｓｅｄ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｏｕｔｓｉｄｅ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｏｍａｉｎｓ”，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌｕｍｅ ２０１３（２０１３），Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ９４８６１７，１０ ｐａｇｅｓ ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０１３／９４８６１７を参照する。また、本発明の表１のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、本明細書において考察するとおりの突然変異、改変又は融合を含めた、上記の表１からの又はそれに示されるとおりのかかるタンパク質又は表１に示される生物のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質並びに本明細書において考察するとおりの突然変異、改変又は融合を含み、且つかかる突然変異、改変又は融合の考慮を伴い又は伴わず、表１に示されるもの又は表１に示される生物のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００の同一性を有するタンパク質であるか、又はそれを含むか、又はそれから本質的になるか、又はそれからなるか、又はそれに関わるか若しくはそれに関する。加えて、表１のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質（本明細書において考察される突然変異、改変又は融合及び／又は表１に示されるもの又は表１に示される生物のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００の同一性を含み得る）は、表１に示されるもの又は表１に示される生物のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質との少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００の同一性及び表１のタンパク質と表３のタンパク質との間に示されるとおりの表３のＣ２ｃ２タンパク質との類似性、相同性又は同一性を有するＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質であり得る。図１、図２も参照されたい。
実施例２：真核細胞におけるＣａｓ１３ｂの活性
Ｇｌｕｃに対する種々のｇＲＮＡでルシフェラーゼターゲティングアッセイを実施した。Ｃａｓ１３ｂオルソログをＮＬＳ又はＮＥＳに融合し、或いは局在化シグナルに融合しなかった。ルシフェラーゼの正規化タンパク質発現を決定し、ノンターゲティング（ＮＴ）ｇＲＮＡと比較した。異なるＣａｓ１３ｂオルソログの結果を図１１〜図１５に提供する。図１６に、同じガイドで最も高活性のオルソログからの合成データをまとめる。バクテロイデス・ピオゲネス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）ＭＡ２０１６、リエメレラ・アナティペステイファー（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ）、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）及びポルフィロモナス属種（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＣＯＴ−０５２ＯＨ４９４６からのＣａｓ１３ｂオルソログが真核細胞において特に活性であることが分かった。
実施例３：Ｃ２ｃ２オルソログ
ある種のＣａｓ１３ｂオルソログは、意外にもＣ２ｃ２と類似している。図２は、Ｃ２ｃ２及びＣａｓ１３ｂタンパク質の木アラインメントを提供する。
上記のＣ２ｃ２種のタンパク質配列を以下の表３に挙げる。
実施例３：Ｃａｓ１３ｂオルソログの特徴付け
Ｓｍａｒｇｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１６に記載されるとおり、且つ図６に示すとおり異なるＣａｓ１３ｂオルソログについてＰＦＳモチーフを決定した。スクリーニング中の全スペーサーに対する安全に枯渇された（ノンターゲティングスペーサーの平均枯渇を＞５σ上回る）スペーサーの比のヒートマップを作成した。一部のオルソログについて、アクセサリータンパク質ｃｓｘ２７又はｃｓｘ２８の存在下で実験を繰り返した。結果は図７〜図１０に提供する。異なるオルソログについて以下のＰＦＳが得られた：
実施例４：Ｃａｓ１３ｂオルソログのコラテラル活性
真核細胞におけるＣａｓ１３ｂオルソログのコラテラル活性を決定するため、真核細胞において標的特異的ガイドを用いた実験をＧ−ルシフェラーゼ又はＣ−ルシフェラーゼレポーター構築物の存在下で行った。結果は、図１７Ａ〜図１７Ｇに提供する。異なるＣａｓ１３ｂオルソログについて、インビボでのコラテラル活性が有効に観察された。
実施例５：更なるＣａｓ１３ｂオルソログの同定
ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又はＣＲＩＳＰＲアレイ自体のいずれかへの近接性に依存するバイオコンピュータパイプラインを使用して更なるＣａｓ１３ｂオルソログを同定することができる。例示的方法は、全ての原核生物ゲノムを（ＮＣＢＩデータベースから）ダウンロードすること、それらのゲノムに対してアルゴリズムを実行してＣＲＩＳＰＲアレイを同定すること、同定されたアレイから１０ｋｂ以内にクラスタリングされるタンパク質を推定ＣＲＩＳＰＲ系として保存すること、及び７００アミノ酸より大きいサイズのタンパク質が存在しないことに基づいて候補系を更に選択することを含み得る。更なる選択基準は、９００〜１８００アミノ酸のサイズのエフェクタータンパク質が１つのみ存在すること並びに機能性及び適合性の考慮に基づき得る。
実施例６：
効率的で正確な核酸編集は、特にＲＮＡレベルでの遺伝性疾患の治療に大いに有望であり、ここで、疾患関連転写物がレスキューされて機能性タンパク質産物が生じ得る。ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、プログラム可能な単一エフェクターＲＮＡ誘導型ＲＮアーゼＣａｓ１３を含有する。ここで、本発明者らは、ロバストなノックダウン能を有するＣａｓ１３オルソログをエンジニアリングするためＶＩ型系の多様性をプロファイリングし、触媒不活性なＣａｓ１３（ｄＣａｓ１３）を使用してアデノシンデアミナーゼ活性を哺乳類細胞における転写物に向けることによるＲＮＡ編集を実証する。ＡＤＡＲ２デアミナーゼドメインをｄＣａｓ１３と融合し、最適なＲＮＡ二重鎖基質が作り出されるようにガイドＲＮＡをエンジニアリングすることにより、本発明者らは、特異的な単一のアデノシンからイノシン（これは、翻訳中にグアノシンとして読み取られる）への標的化した編集をルーチンでは２０〜４０％の範囲及び最高８９％の効率で実現する。プログラム可能なＡからＩへの置換のためのＲＮＡ編集（ＲＮＡ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ａ ｔｏ Ｉ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ：ＲＥＰＡＩＲ）と称されるこの系は、高い特異性を実現するように更にエンジニアリングすることができる。エンジニアリングされた変異体、ＲＥＰＡＩＲｖ２は、ロバストなオンターゲットのＡからＩへの編集を維持しつつ、１７０倍を超える特異性の増加を呈する。本発明者らは、ＲＥＰＡＩＲｖ２を使用して、既知の病原性突然変異を含む完全長転写物を編集し、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにおけるパッケージングに好適な機能性のトランケート型を作り出す。ＲＥＰＡＩＲは、研究、治療法及びバイオテクノロジーへの幅広い適用性を備えた有望なＲＮＡ編集プラットフォームを提供する。正確な核酸編集技術は、細胞機能の研究にとって及び新規治療法として価値がある。Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどの現在の編集ツールは、ゲノム遺伝子座のプログラム可能な改変を実現できるが、挿入又は欠失に起因して編集が不均一なことも多く、又は正確な編集にドナー鋳型が必要である。ｄＣａｓ９−ＡＰＯＢＥＣ融合物などの塩基編集体は、二本鎖切断を生成することなく編集が可能であるが、標的ウィンドウ内の任意のシチジンを編集するシチジンデアミナーゼ活性の性質に起因して正確さに欠くものとなり得る。更に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の要件により、可能な編集部位の数が制限される。ここで、本発明者らは、ＶＩ型の原核生物のクラスター化した規則的間隔の短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）適応免疫系からのＲＮＡ誘導型ＲＮＡターゲティングＣａｓ１３酵素を使用した正確で柔軟性のあるＲＮＡベースの編集ツールの開発について記載する。
正確な核酸編集技術は、細胞機能の研究にとって及び新規治療法として価値がある。現在の編集ツールは、原核生物のクラスター化した規則的間隔の短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連ヌクレアーゼＣａｓ９（１〜４）又はＣｐｆ１（５）などのプログラム可能なヌクレアーゼに基づくもので、標的化したＤＮＡ切断の媒介、次に非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を通じた標的化した遺伝子破壊又は鋳型依存的相同組換え修復（ＨＤＲ）を介した正確な遺伝子編集のドライブに幅広く採用されている（６）。ＮＨＥＪは、分裂細胞及び分裂終了細胞の両方で活性な宿主の機構を利用するもので、タンパク質コード遺伝子のフレームシフトにつながり得る挿入又は欠失（インデル）突然変異混合物の生成によって効率的な遺伝子破壊を提供する。対照的に、ＨＤＲは、発現の大部分が複製細胞に限られている宿主の機構によって媒介される。このように、分裂終了細胞における遺伝子編集能力の開発は、依然として大きい課題である。最近では、触媒不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を使用してシチジンデアミナーゼ活性を特定のゲノム標的に標的化させることにより標的ウィンドウ内でシトシンからチミンへの変換を生じさせるなど、ＤＮＡベースの編集体により、ＤＮＡ二本鎖切断を生成することなく編集が可能であり、インデルの形成が有意に低下する（７、８）。しかしながら、ＤＮＡベースの編集体の標的範囲は、編集部位におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に関するＣａｓ９の要件に起因して制限される（９）。ここで、本発明者らは、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ誘導型ＲＮアーゼＣａｓ１３を使用した正確で柔軟性のあるＲＮＡベースの編集技術の開発について記載する（１０〜１３）。
Ｃａｓ１３酵素は、正確なＲＮＡ切断を媒介する２つの高等真核生物及び原核生物ヌクレオチド結合（ＨＥＰＮ）エンドＲＮアーゼドメインを有する（１０、１１）。現在まで３つのＣａｓ１３タンパク質ファミリーが同定されている：Ｃａｓ１３ａ（旧称Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ及びＣａｓ１３ｃ（１２、１３）。本発明者らは、最近になって、Ｃａｓ１３ａ酵素を核酸検出用（１４）並びに哺乳類及び植物細胞ＲＮＡノックダウン及び転写物トラッキング用（１５）のツールとして適合させ得ることを報告した。Ｃａｓ１３酵素は、そのＲＮＡ誘導型の性質により、ＲＮＡ結合及び摂動適用に魅力的なツールとなる。
ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）酵素ファミリーは、翻訳及びスプライシングにおいて機能上はグアノシンと均等な核酸塩基であるイノシンにアデノシンを加水分解的に脱アミノ化することによる内因性転写物編集を媒介する（１６）。２つの機能性のヒトＡＤＡＲオルソログ、ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２があり、これらは、Ｎ末端二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン及びＣ末端触媒脱アミノ化ドメインからなる。ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２の内因性標的部位は実質的な二本鎖同一性を含み、触媒ドメインは、インビトロ及びインビボでの効率的な編集に二重鎖化した領域を必要とする（１７、１８）。ＡＤＡＲタンパク質は、潜在的なターゲティング柔軟性を制限し得る編集に好ましいモチーフを有するが、ＡＤＡＲ（Ｅ４８８Ｑ）などの高活性突然変異体（１９）は、配列制約を緩和し、アデノシンからイノシンへの編集率を向上させる。ＡＤＡＲはＲＮＡ二重鎖におけるシチジン塩基の対向するアデノシンを優先的に脱アミノ化し（２０）、正確な塩基編集の有望な機会を提供する。以前の手法は、ＲＮＡガイドを介して標的のＡＤＡＲ融合物をエンジニアリングしているが（２１〜２４）、これらの手法の特異性は、報告されておらず、そのそれぞれのターゲティング機構は、標的認識及びストリンジェンシーを亢進させ得るタンパク質パートナーを用いることなくＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションに依存するものである。
ここで、本発明者らは、哺乳類細胞におけるＲＮＡノックダウン活性に関してＣａｓ１３酵素ファミリー全体をアッセイし、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）Ｐ５−１２５（ＰｓｐＣａｓ１３ｂ）からのＣａｓ１３ｂオルソログを哺乳類細胞適用に最も効率的且つ特異的なものと同定する。次に、本発明者らは、ＡＤＡＲ２デアミナーゼドメイン（ＡＤＡＲＤＤ）を触媒不活性ＰｓｐＣａｓ１３ｂに融合させて、レポーター及び内因性転写物並びに疾患関連突然変異のプログラム可能なＡからＩ（Ｇ）への置換のためのＲＮＡ編集（ＲＥＰＡＩＲ）を実証する。最後に、本発明者らは、合理的な突然変異誘発スキームを用いてｄＣａｓ１３ｂ−ＡＤＡＲ２ＤＤ融合物の特異性を向上させることにより、特異性が１７０倍超増加したＲＥＰＡＩＲｖ２を作成する。
方法
細菌構築物の設計及びクローニング
哺乳類コドン最適化Ｃａｓ１３ｂ構築物をＬａｃプロモーターの制御下にクロラムフェニコール耐性ｐＡＣＹＣ１８４ベクターにクローニングした。次に、ＢｓａＩ制限部位によって分けられた２つの対応するダイレクトリピート（ＤＲ）配列をｐＪ２３１１９プロモーターの制御下にＣａｓ１３ｂの下流に挿入した。最後に、Ｔ４ ＰＮＫ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してターゲティングスペーサーのためのオリゴをリン酸化し、Ｔ７リガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）を使用してＢｓａＩ消化ベクターにアニール及びライゲートすることにより、ターゲティングＣａｓ１３ｂベクターを生成した。
細菌ＰＦＳスクリーニング
ＮＥＢ Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、アンピシリン耐性遺伝子ｂｌａの開始コドンの直接下流にある標的部位によって分かれた２つの５’ランダム化ヌクレオチド及び４つの３’ランダム化ヌクレオチドと共にＣａｓ１３ｂ標的を含有するＰＣＲ産物を挿入することにより、ＰＦＳスクリーニングのためのアンピシリン耐性プラスミドをクローニングした。次に、１００ｎｇのアンピシリン耐性標的プラスミドを６５〜１００ｎｇクロラムフェニコール耐性Ｃａｓ１３ｂ細菌ターゲティングプラスミドと共にＥｎｄｕｒａエレクトロコンピテント細胞に電気穿孔した。プラスミドを細胞に加え、氷上で１５分間インキュベートし、製造者のプロトコルを用いて電気穿孔し、次に細胞に９５０ｕＬの回復培地を加えた後、３７℃で１時間アウトグロースさせた。このアウトグロースをクロラムフェニコール及びアンピシリン二重選択プレートにプレーティングした。アウトグロースの段階希釈物を使用してｃｆｕ／ｎｇ ＤＮＡを推定した。プレーティングから１６時間後、プレートから細胞を掻き取り、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して生存プラスミドＤＮＡを回収した。生存Ｃａｓ１３ｂ標的配列及びその隣接領域をＰＣＲ増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑを用いてシーケンシングした。ＰＦＳ優先性を評価するため、カスタムのｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用して元のライブラリでランダム化ヌクレオチドを含有する位置を抽出し、両方のバイオレプリケートに存在するベクター単独条件と比べて枯渇している配列を抽出した。次に、ベクター単独対照と比較したＣａｓ１３ｂ条件におけるＰＦＳ存在量の比の−ｌｏｇ２を使用して好ましいモチーフを計算した。具体的には、特定の閾値を上回る−ｌｏｇ２（試料／ベクター）枯渇比を有する全ての配列を使用して配列モチーフのｗｅｂｌｏｇｏ（ｗｅｂｌｏｇｏ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ）を生成した。各Ｃａｓ１３ｂオルソログのｗｅｂｌｏｇｏの生成に使用した特定の枯渇比値を表９に掲載する。
ＲＮＡ干渉のための哺乳類構築物の設計及びクローニング
哺乳類細胞でＣａｓ１３オルソログを試験するためのベクターを作成するため、哺乳類コドン最適化Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ及びＣａｓ１３ｃ遺伝子をＰＣＲ増幅し、ＥＦ１αプロモーターの制御下において、デュアルＮＬＳ配列及びＣ末端ｍｓｆＧＦＰを含有する哺乳類発現ベクターにゴールデンゲートクローニングした。更に最適化するため、ＥＦ１αプロモーターの制御下において、異なるＣ末端局在化タグを含有するデスティネーションベクターにＣａｓ１３オルソログをゴールデンゲートクローニングした。
ガウシア及びウミホタルルシフェラーゼのコードＤＮＡ、ＥＦ１α及びＣＭＶプロモーターをＰＣＲ増幅し、ＮＥＢ Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してアセンブルすることにより、デュアルルシフェラーゼレポーターをクローニングした。
Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ又はＣａｓ１３ｃオルソログのための哺乳類ガイドＲＮＡの発現のため、対応するダイレクトリピート配列をゴールデンゲートアクセプター部位と共に合成し、制限消化クローニングによってＵ６発現下でクローニングした。次に、個々のガイドをゴールデンゲートクローニングによって各オルソログの対応する発現骨格にクローニングした。
Ｃａｓ１３干渉特異性のためのプールミスマッチライブラリのクローニング
プールミスマッチライブラリ標的部位をＰＣＲによって作成した。ＰＣＲ反応では、標的内の各位置に９４％の正しい塩基と２％のそれぞれ正しくない塩基との混合物を含む半縮重標的配列をＧ−ルシフェラーゼに含むオリゴを１つのプライマーとして使用し、Ｇ−ルシフェラーゼの非標的領域に対応するオリゴを第２のプライマーとして使用した。次に、ＮＥＢ Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してデュアルルシフェラーゼレポーターに野生型Ｇ−ルシフェラーゼの代わりにミスマッチライブラリ標的をクローニングした。
ＲＮＡ編集のための哺乳類構築物の設計及びクローニング
ＨＥＰＮドメインの触媒部位における２つのヒスチジンからアラニンへの突然変異（Ｈ１３３Ａ／Ｈ１０５８Ａ）により、ＰｓｐＣａｓ１３ｂを触媒不活性にした（ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ）。ヒトＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２のデアミナーゼドメインを合成し、ＰＣＲ増幅してｐｃＤＮＡ−ＣＭＶベクター骨格にギブソンクローニングし、ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂとＧＳ又はＧＳＧＧＧＧＳリンカーを介してＣ末端に融合させた。本発明者らが異なるリンカーを試験した実験について、本発明者らは、ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂとＡＤＡＲ２ｄｄとの間に以下の追加的なリンカーをクローニングした：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＥＡＡＡＫ、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ及びＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（ＸＴＥＮ）。適切な突然変異体をｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ−ＧＳＧＧＧＧＳ骨格にギブソンクローニングすることにより、特異性突然変異体を作成した。
ノックダウン実験に使用したルシフェラーゼレポーターベクターにＷ８５Ｘ突然変異（ＴＧＧ＞ＴＡＧ）を作り出すことにより、ＲＮＡ編集活性の測定のためのルシフェラーゼレポーターベクターを作成した。このレポーターベクターは、正規化対照としての機能性Ｇｌｕｃを発現するが、中途終止部位を付加したため、Ｃｌｕｃ欠損である。ＡＤＡＲ編集モチーフ優先性を試験するため、本発明者らは、Ｃｌｕｃのコドン８５におけるアデノシンの周りの可能な全てのモチーフ（ＸＡＸ）をクローニングした。
ＲＥＰＡＩＲのＰＦＳ優先性を試験するため、本発明者らは、標的領域及びアデノシン編集部位の上流に６塩基対縮重ＰＦＳ配列を含むプールプラスミドライブラリをクローニングした。このライブラリは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）からのｕｌｔｒａｍｅｒとして合成し、プライマーのアニーリング及び配列のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）フィルインによって二本鎖にした。次に、縮重配列を含むこのｄｓＤＮＡ断片を消化したレポーターベクターにギブソンクローニングし、次にこれをイソプロパノール沈殿させて精製した。次に、クローニングしたライブラリをＥｎｄｕｒａコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に電気穿孔し、２４５ｍｍ×２４５ｍｍ正方形バイオアッセイプレート（Ｎｕｎｃ）にプレーティングした。１６時間後、コロニーを回収し、エンドトキシン不含ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬミディプレップキットを使用してミディプレップした。クローニングしたライブラリは、次世代シーケンシングによって確認した。
ＲＥＰＡＩＲ活性の試験のための疾患関連突然変異をクローニングするため、ＣｌｉｎＶａｒに定義されるとおりの疾患病因に関係する３４個のＧ＞Ａ突然変異を選択し、これらの突然変異を囲む２００ｂｐ領域をＣＭＶプロモーター下でｍＳｃａｒｌｅｔｔとＥＧＦＰとの間にゴールデンゲートクローニングした。ＡＶＰＲ２及びＦＡＮＣＣにおける２つの追加的なＧ＞Ａ突然変異をＥＦ１αの発現下での全遺伝子配列のゴールデンゲートクローニングに選択した。
ＲＥＰＡＩＲのための哺乳類ガイドＲＮＡの発現のため、ＰｓｐＣａｓ１３ｂダイレクトリピート配列をゴールデンゲートアクセプター部位と共に合成し、制限消化クローニングによってＵ６発現下にクローニングした。次に、ゴールデンゲートクローニングによってこの発現骨格に個々のガイドをクローニングした。
哺乳類細胞培養
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））で哺乳類細胞培養実験を実施し、この細胞株を、高グルコース、ピルビン酸ナトリウム及びＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）含有の、１×ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び１０％ウシ胎仔血清（ＶＷＲ Ｓｅｒａｄｉｇｍ）を更に補足したダルベッコ変法イーグル培地で成長させた。細胞は、８０％未満のコンフルエンシーに維持した。
特に注記されない限り、トランスフェクションは、全てポリ−Ｄ−リジン（ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ）がコートされた９６ウェルプレートにおいてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施した。トランスフェクション時点で９０％のコンフルエンシーが確実となるように、トランスフェクションの１６時間前に細胞を約２０，０００細胞／ウェルでプレーティングした。プレートの各ウェルについて、トランスフェクションプラスミドを総量が２５μｌとなるようにＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ低血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と合わせた。別途、２４．５ｕｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭを０．５ｕｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００と合わせた。次に、プラスミド及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ溶液を合わせ、５分間インキュベートし、その後、細胞にピペッティングした。
ＲＮＡノックダウン哺乳類細胞アッセイ
レポーター構築物での哺乳類細胞におけるＲＮＡターゲティングを評価するため、１５０ｎｇのＣａｓ１３構築物を３００ｎｇのガイド発現プラスミド及び１２．５ｎｇのノックダウンレポーター構築物と共にコトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で細胞から分泌ルシフェラーゼ含有培地を除去し、ＰＢＳ中に１：５希釈し、ＢｉｏＬｕｘウミホタル及びＢｉｏｌｕｘガウシアルシフェラーゼアッセイキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によってプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２）において注入プロトコルで活性に関して測定した。実施したレプリケートは、全てバイオロジカルレプリケートである。
内因性遺伝子のターゲティングのため、１５０ｎｇのＣａｓ１３構築物を３００ｎｇのガイド発現プラスミドと共にコトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で細胞を溶解させ、ＲＮＡを回収し、Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−Ｃｔキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の以前記載されている［ＣＩＴＥ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ］改変を用いて逆転写した。ＫＲＡＳ転写物についてのＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＧＡＰＤＨ対照プローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＦａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｃＤＮＡ発現をｑＰＣＲで測定した。ｑＰＣＲ反応はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）で読み取り、３８４ウェルフォーマットにおいて４つの５ｕｌテクニカルレプリケートとした。
ミスマッチ標的のプールライブラリを使用したＲＮＡ特異性の評価
６ウェルプレートに播いたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を使用して、Ｃａｓ１３がミスマッチ標的ライブラリに干渉する能力を試験した。２４００ｎｇ Ｃａｓ１３ベクター、４８００ｎｇのガイド及び２４０ｎｇのミスマッチ標的ライブラリを使用して、約７０％コンフルエント細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で細胞を回収し、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）及びＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキットを使用してＲＮＡを抽出した。製造者の遺伝子特異的プライミングプロトコルに従うｑＳｃｒｉｐｔ Ｆｌｅｘ ｃＤＮＡ合成キット（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）及びＧｌｕｃ特異的ＲＴプライマーを使用して、１ｕｇの抽出したＲＮＡを逆転写した。次に、ｃＤＮＡを増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑでシーケンシングした。
１配列当たりのリードをカウントすることによりシーケンシングを分析し、ｌｏｇ２（−リードカウント比）値を決定することにより枯渇スコアを計算した。ここで、リードカウント比は、ターゲティングガイド条件対ノンターゲティングガイド条件におけるリードカウントの比である。このスコア値は、配列上でのＣａｓ１３活性レベルを表し、値が高いほど枯渇が強い、従ってＣａｓ１３切断活性が高いことを表す。シングルミスマッチ及びダブルミスマッチ配列について別個の分布を決定し、各ミスマッチアイデンティティについて枯渇スコアでのヒートマップとしてプロットした。ダブルミスマッチ配列について、所与の位置における可能な全てのダブルミスマッチの平均値をプロットした。
ＲＮＡシーケンシングによる哺乳類細胞におけるＣａｓ１３のトランスクリプトームワイドプロファイリング
トランスクリプトームワイドな特異性を測定するため、１５０ｎｇのＣａｓ１３構築物、３００ｎｇのガイド発現プラスミド及び１５ｎｇのノックダウンレポーター構築物をコトランスフェクトした；ｓｈＲＮＡ条件について、３００ｎｇのｓｈＲＮＡターゲティングプラスミド、１５ｎｇのノックダウンレポーター構築物及び１５０ｎｇのＥＦ１−αドライブｍＣｈｅｒｒｙ（レポーター負荷の均衡をとるため）をコトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）でＲＮＡを精製し、ＮＥＢＮｅｘｔポリ（Ａ）ｍＲＮＡ磁気分離モジュール（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してｍＲＮＡを選択し、ＩｌｌｕｍｉｎａのためのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＲＮＡライブラリプレップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）でシーケンシングのために調製した。次に、ＲＮＡシーケンシングライブラリをＮｅｘｔＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でシーケンシングした。
トランスクリプトームワイドなシーケンシングデータを分析するため、Ｂｏｗｔｉｅ及びＲＳＥＭバージョン１．２．３１をデフォルトパラメータで使用してリードをＲｅｆＳｅｑ ＧＲＣｈ３８アセンブリとアラインメントした［ＣＩＴＥ ＲＳＥＭ：参照ゲノムあり又はなしのＲＮＡ−Ｓｅｑデータからの正確な転写物定量化］。転写物発現をｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）として定量化し、ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）＞２．５で遺伝子をフィルタリングした。差次的に発現した遺伝子を選択するため、＞２又は＜０．７５の差次的変化のある遺伝子のみを考慮した。差次的発現の統計的有意性は、３つのターゲティングレプリケート対ノンターゲティングレプリケートでのスチューデントｔ検定で判定し、ベンジャミン・ホッホバーグ法（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）によって＜０．０１％の偽発見率でフィルタリングした。
哺乳類細胞トランスフェクションにおけるＡＤＡＲ ＲＮＡ編集
哺乳類細胞におけるＲＥＰＡＩＲ活性を評価するため、本発明者らは、１５０ｎｇのＲＥＰＡＩＲベクター、３００ｎｇのガイド発現プラスミド及び４０ｎｇのＲＮＡ編集レポーターをトランスフェクトした。４８時間後、細胞からＲＮＡを回収し、遺伝子特異的逆転写プライマーと共に以前記載された方法［ｃｉｔｅ ＪＪ］を用いて逆転写した。次に、抽出したｃＤＮＡをＮＥＢＮｅｘｔ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ ＰＣＲマスターミックスを使用して２ラウンドのＰＣＲに供することにより、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター及び試料バーコードを付加した。次に、ライブラリをＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ又はＭｉＳｅｑで次世代シーケンシングに供した。次に、シーケンシングウィンドウ内にある全てのアデノシンでＲＮＡ編集率を判定した。
ルシフェラーゼレポーターをＲＮＡ編集の標的とする実験では、本発明者らは、ＲＮＡ回収前に、分泌ルシフェラーゼを含む培地も回収した。この場合、補正後のＣｌｕｃは、低レベルである可能性があるため、本発明者らは、培地を希釈しなかった。本発明者らは、ＢｉｏＬｕｘウミホタル及びＢｉｏｌｕｘガウシアルシフェラーゼアッセイキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によってプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２）において注入プロトコルでルシフェラーゼ活性を測定した。実施したレプリケートは、全てバイオロジカルレプリケートである。
ＰＦＳ結合哺乳類スクリーニング
編集効率に対するＰＦＳの寄与を決定するため、２２５ｃｍ２フラスコにプレーティングしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に６２５ｎｇのＰＦＳ標的ライブラリ、４．７ｕｇのガイド及び２．３５ｕｇのＲＥＰＡＩＲをコトランスフェクトした。プラスミドを３３ｕｌのＰＬＵＳ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭで５３３ｕｌにし、５分間インキュベートし、３０ｕｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００及び５００ｕｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと合わせ、更に５分間インキュベートし、次に細胞にピペッティングした。トランスフェクション後４８時間でＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）によってＲＮＡを回収し、ｑＳｃｒｉｐｔ Ｆｌｅｘ（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）により遺伝子特異的プライマーを使用して逆転写し、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ ＰＣＲマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用した２ラウンドのＰＣＲで増幅することによりＩｌｌｕｍｉｎａアダプター及び試料バーコードを付加した。ライブラリをＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑでシーケンシングし、標的アデノシンにおけるＲＮＡ編集率をＰＦＳアイデンティティにマッピングした。カバレッジを増加させるため、ＰＦＳは、計算的に４ヌクレオチドに縮小した。各ＰＦＳについてＲＥＰＡＩＲ編集率を計算し、対応するＰＦＳのノンターゲティング率を差し引いてバイオロジカルレプリケートで平均した。
全トランスクリプトームシーケンシングによるＡＤＡＲ編集特異性の評価
トランスクリプトームにわたるオフターゲットＲＮＡ編集部位を分析するため、本発明者らは、トランスフェクション後４８時間にＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細胞から全ＲＮＡを回収した。次に、ＮＥＢＮｅｘｔポリ（Ａ）ｍＲＮＡ磁気分離モジュール（ＮＥＢ）を使用してｍＲＮＡ画分を集積し、次にＩｌｌｕｍｉｎａのためのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＲＮＡライブラリプレップキット（ＮＥＢ）を使用してこのＲＮＡをシーケンシングのために調製する。次に、ライブラリをＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑでシーケンシングし、１試料当たり少なくとも５００万リードとなるようにロードした。
標的化したトランスクリプトームワイドな実験についてのＲＮＡ編集分析
トランスクリプトームワイドなＲＮＡ編集ＲＮＡシーケンシングデータを分析するため、配列ファイルを５００万リードにランダムにダウンサンプリングした。Ｇｌｕｃ及びＣｌｕｃ配列を加えてＲｅｆＳｅｑ ＧＲＣｈ３８アセンブリを使用してインデックスを生成し、Ｂｏｗｔｉｅ／ＲＳＥＭバージョン１．３．０を使用してリードをアラインメントし、定量化した。次に、アラインメントＢＡＭをソートし、ＲＥＤｉｔｏｏｌｓ［ｃｉｔｅ］を以下のパラメータで使用してＲＮＡ編集部位に関して分析した：−ｔ ８ −ｅ −ｄ −ｌ −Ｕ ［ＡＧ ｏｒ ＴＣ］ −ｐ −ｕ −ｍ２０ −Ｔ６−０ −Ｗ −ｖ １ −ｎ ０．０。非トランスフェクト条件又はＥＧＦＰトランスフェクト条件に見られる任意の有意な編集は、ＳＮＰ又はトランスフェクションのアーチファクトと見なし、オフターゲットの分析から除外した。オフターゲットは、フィッシャーの正確確率検定によって０．５未満のｐ値が得られ、且つ３つのバイオロジカルレプリケートの少なくとも２つで編集部位が同定された場合に有意と見なした。
各オフターゲットの予測変異効果を分析するため、ＳＩＦＴ及びＰｏｌｙＰｈｅｎ−２アノテーションを使用してＵＣＳＣゲノムブラウザツールスイートの一部としての変異体アノテーションインテグレーター（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＶａｉ）を使用してオフターゲット編集部位のリストを分析した。オフターゲット遺伝子が発癌性であるかどうかを宣言するため、癌における体細胞突然変異のＣＯＳＭＩＣカタログ（ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）からの発癌アノテーションのデータベースである。
ＲＥＰＡＩＲ構築物がＲＮＡレベルに摂動を与えたかどうかを分析するため、ＲＳＥＭ分析から出力された転写物百万分率（ＴＰＭ）値を発現カウントに使用し、ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）をとることにより対数空間に変換した。差次的に調節された遺伝子を見つけ出すため、３つのターゲティングガイドレプリケート対３つのノンターゲティングガイドレプリケートに対してスチューデントｔ検定を実施した。統計的分析は、ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）値が２．５より大きい遺伝子に関してのみ実施し、遺伝子は、その倍率変化が２より大きいか又は０．８より小さかった場合にのみ、差次的に調節されたと見なした。遺伝子は、その偽発見率が０．０１未満の場合に報告した。
結果
哺乳類細胞におけるＣａｓ１３ファミリーメンバーの包括的特徴付け
本発明者らは、以前、哺乳類ノックダウン適用のためのＬｗａＣａｓ１３ａを開発したが、それは、効率的なノックダウンにｍｓｆＧＦＰ安定化ドメインが必要であったと共に、特異性は高かったものの、ノックダウン効率は、一貫して５０％を下回った（１５）。本発明者らは、遺伝的に多様なＣａｓ１３ファミリーメンバーの組を特徴付けて哺乳類細胞におけるそのＲＮＡノックダウン活性を評価することにより、よりロバストなＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系を同定しようとした（図３１Ａ）。本発明者らは、Ｎ末端及びＣ末端核外移行シグナル（ＮＥＳ）配列を有し且つＣ末端ｍｓｆＧＦＰを有してタンパク質安定性を高めた発現ベクターに２１個のＣａｓ１３ａ、１５個のＣａｓ１３ｂ及び７個のＣａｓ１３ｃ哺乳類コドン最適化オルソログ（表６）をクローニングした。哺乳類細胞における干渉をアッセイするため、本発明者らは、別個のプロモーターの下に直交性ガウシア（Ｇｌｕｃ）及びウミホタル（Ｃｌｕｃ）ルシフェラーゼを発現する、それにより一方のルシフェラーゼがＣａｓ１３干渉活性の尺度として機能し、他方が内部対照としての役割を果たすことが可能なデュアルレポーター構築物を設計した。各オルソログについて、本発明者らは、アンピシリン干渉アッセイから導き出されたＣａｓ１３ｂ ＰＦＳモチーフ（図５５；表７；補足事項１）及び以前のＣａｓ１３ａ活性の報告からの３’Ｈ ＰＦＳを使用してＰＦＳ適合性ガイドＲＮＡを設計した（１０）。
本発明者らは、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にＣａｓ１３発現、ガイドＲＮＡ及びレポータープラスミドをトランスフェクトし、４８時間後に標的Ｇｌｕｃレベルを定量化した。各Ｃａｓ１３オルソログについて２つのガイドＲＮＡを試験することにより、最近特徴付けられたＬｗａＣａｓ１３ａと比べて両方のガイドＲＮＡで干渉が同程度であるか又はより高い５つのＣａｓ１３ｂオルソログを含め、ある範囲の活性レベルが明らかになった（図４９Ｂ）。本発明者らは、これらの５つのＣａｓ１３ｂオルソログ並びに上位２つのＣａｓ１３ａオルソログを更なるエンジニアリングに選択した。
本発明者らは、次に、ロバストな活性に安定化ドメインが必要でないオルソログを選択するため、ｍｓｆＧＦＰがない場合のＣａｓ１３媒介性Ｇｌｕｃノックダウンを試験した。本発明者らは、ＬｗａＣａｓ１３ａの最適化に関して既報告のとおり、Ｃａｓ１３活性がｍｓｆＧＦＰに加えて細胞内局在性の影響を受ける可能性があると仮定した（１５）。従って、本発明者らは、ｍｓｆＧＦＰなしに６つの異なる局在化タグの１つをＣ末端に融合した７つの選択のＣａｓ１３オルソログの干渉活性を試験した。本発明者らは、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、ＨＩＶ Ｒｅｖ遺伝子ＮＥＳをＣ末端に融合したＰｓｐＣａｓ１３ｂ及びＰｇｕＣａｓ１３ｂ並びにＭＡＰＫ ＮＥＳをＣ末端に融合したＲａｎＣａｓ１３ｂの干渉活性レベルが最も高かったことを見出した（図５６Ａ）。上位オルソログの活性レベルを更に区別するため、本発明者らは、位置対応ガイドを使用してＫＲＡＳ転写物をノックダウンするその能力に関して、これらの３つの最適化Ｃａｓ１３ｂ構築物を最適ＬｗａＣａｓ１３ａ−ｍｓｆＧＦＰ融合物及びｓｈＲＮＡと比較した（図５６Ｂ）。本発明者らは、ＰｓｐＣａｓ１３ｂについて最も高い干渉レベルを観察し（平均ノックダウン６２．９％）、従ってこれをＬｗａＣａｓ１３ａとの更なる比較に選択した。
ＰｓｐＣａｓ１３ｂ及びＬｗａＣａｓ１３ａの活性レベルを更に厳密に定義付けるため、本発明者らは、Ｇｌｕｃ及びＣｌｕｃの両方に沿ってタイリングする位置対応ガイドを設計し、本発明者らのルシフェラーゼレポーターアッセイを用いてその活性をアッセイした。本発明者らは、Ｇｌｕｃ及びＣｌｕｃを標的とするそれぞれ９３個及び２０個の位置対応ガイドを試験し、ＰｓｐＣａｓ１３ｂのノックダウンレベルがＬｗａＣａｓ１３ａと比べて一貫して増加したことを見出した（ＰｓｐＣａｓ１３ｂについて平均９２．３％、対してＬｗａＣａｓ１３ａについて４０．１％のノックダウン）（図４９Ｃ、図４９Ｄ）。
Ｃａｓ１３哺乳類干渉活性の特異性
ＰｓｐＣａｓ１３ｂ及びＬｗａＣａｓ１３ａの干渉特異性を特徴付けるため、本発明者らは、標的配列及び３つの隣接５’及び３’塩基対にわたってシングルミスマッチ及びダブルミスマッチを含むルシフェラーゼ標的のプラスミドライブラリを設計した（図５６Ｃ）。本発明者らは、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に、ＬｗａＣａｓ１３ａ又はＰｓｐＣａｓ１３ｂのいずれか、非改変標的配列を標的とする固定的ガイドＲＮＡ及び適切な系に対応するミスマッチ標的ライブラリをトランスフェクトした。本発明者らは、次に、非切断転写物の標的化したＲＮＡシーケンシングを実施して、ミスマッチ標的配列の枯渇を定量化した。本発明者らは、ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｐＣａｓ１３ｂが、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ標的について塩基対１２〜２６及びＬｗａＣａｓ１３ａ標的について１３〜２４に延在するシングルミスマッチ寛容性が比較的低い中心領域を有したことを見出した（図５６Ｄ）。ダブルミスマッチは、単一の突然変異と比べて寛容性がなおも更に低く、そのそれぞれの標的におけるＰｓｐＣａｓ１３ｂについて塩基対１２〜２９及びＬｗａＣａｓ１３ａについて８〜２７に延在するより大きいウィンドウにかけてノックダウン活性は、ほとんど観察されなかった（図５６Ｅ）。加えて、標的配列の５’末端及び３’末端に隣接する３つのヌクレオチドにもミスマッチが含まれるため、本発明者らは、Ｃａｓ１３ノックダウン活性に対するＰＦＳ制約を評価することができた。シーケンシングが示したところによれば、ほぼ全てのＰＦＳの組み合わせがロバストなノックダウンを実現したことから、試験したいずれの酵素についても、哺乳類細胞における干渉に関するＰＦＳ制約が存在しない可能性があることが指摘される。これらの結果から、Ｃａｓ１３ａ及びＣａｓ１３ｂが同様の配列制約及びミスマッチに対する感度を呈することが指摘される。
本発明者らは、次に、トランスクリプトームのｍＲＮＡ画分にわたるＰｓｐＣａｓ１３ｂ及びＬｗａＣａｓ１３ａの干渉特異性を特徴付けた。本発明者らは、トランスクリプトームワイドｍＲＮＡシーケンシングを実施して、有意な差次的発現遺伝子を検出した。ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｐＣａｓ１３ｂはＧｌｕｃのロバストなノックダウンを実証し（図４９Ｅ、図４９Ｆ）、数百個のオフターゲットを示した位置対応ｓｈＲＮＡと比較して、高度に特異的であった（図４９Ｇ）。
Ｃａｓ１３−ＡＤＡＲ融合物は、標的ＲＮＡ編集を可能にする
ＰｓｐＣａｓ１３ｂが哺乳類細胞において一貫したロバストで特異的なｍＲＮＡノックダウンを実現したことを踏まえて、本発明者らは、プログラム可能なＲＮＡ編集のためＡＤＡＲのデアミナーゼドメイン（ＡＤＡＲＤＤ）をリクルートするＲＮＡ結合プラットフォームとしてこれを適合させることができると想定した。ヌクレアーゼ活性が欠損したＰｓｐＣａｓ１３ｂ（ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ、以下ではｄＣａｓ１３ｂと称される）をエンジニアリングするため、本発明者らは、ＨＥＰＮドメインにおける保存された触媒残基を突然変異させて、ルシフェラーゼＲＮＡノックダウン活性の欠損を観察した（図５７Ａ）。本発明者らは、ガイドＲＮＡによってｄＣａｓ１３ｂ−ＡＤＡＲＤＤ融合物を標的アデノシンにリクルートでき、ハイブリダイズしたＲＮＡがＡＤＡＲ活性に必要な二重鎖基質を作り出すと仮定した（図５０Ａ）。標的アデノシン脱アミノ化率を亢進させるため、本発明者らは、その当初のＲＮＡ編集設計に２つの追加的な改変を導入した。本発明者らは、標的アデノシンの反対側に、脱アミノ化頻度を増加させることが以前報告されているミスマッチシチジンを導入し、ｄＣａｓ１３ｂを、高活性突然変異を含むヒトＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２のデアミナーゼドメインと融合させて触媒活性を亢進させた（ＡＤＡＲ１ＤＤ（Ｅ１００８Ｑ）（２５）又はＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）（１９））。
ｄＣａｓ１３ｂ−ＡＤＡＲＤＤの活性を試験するため、本発明者らは、ナンセンス突然変異（Ｗ８５Ｘ（ＵＧＧ−＞ＵＡＧ））を導入することによりＣｌｕｃ上にＲＮＡ編集レポーターを作成し、これは、Ａ→Ｉ編集を通じて機能的に野生型コドンに修復され（図５０Ｂ）、次にＣｌｕｃルミネセンスの回復として検出することができた。本発明者らは、標的アデノシンにわたってスペーサー３０、５０、７０又は８４ヌクレオチド長でガイドを均等にタイリングして、最適なガイド配置及び設計を決定した（図５０Ｃ）。本発明者らは、ｄＣａｓ１３ｂ−ＡＤＡＲ１ＤＤがＣｌｕｃレポーターの修復に長いガイドを必要とした一方、ｄＣａｓ１３ｂ−ＡＤＡＲ２ＤＤは、試験した全てのガイド長さで機能性であったことを見出した（図５０Ｃ）。本発明者らは、野生型ＡＤＡＲ２ＤＤによるルシフェラーゼ回復が低下したとおり、高活性Ｅ４８８Ｑ突然変異が編集効率を改善したことも見出した（図５７）。このような活性の実証から、本発明者らは、更なる特徴付けにｄＣａｓ１３ｂ−ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）を選択し、この手法をプログラム可能なＡからＩへの置換のためのＲＮＡ編集バージョン１（ＲＥＰＡＩＲｖ１）と命名した。
ルシフェラーゼ活性の回復が本当に編集イベントに起因したことを確認するため、本発明者らは、逆転写及び標的化した次世代シーケンシングによって直接ＲＥＰＡＩＲｖ１に供したＣｌｕｃ転写物の編集を測定した。本発明者らは、標的部位を囲む３０ｎｔ及び５０ｎｔスペーサーを試験し、両方のガイド長さとも期待されたＡからＩへの編集をもたらし、５０ｎｔスペーサーの方が高い編集パーセンテージを実現したことを見出した（図５０Ｄ、図５０Ｅ、図５７Ｃ）。本発明者らは、５０ｎｔスペーサーには、場合により二重鎖ＲＮＡ領域の増加に起因した非標的アデノシンにおける編集傾向の増加があったことも観察した（図５０Ｅ、図５７Ｃ）。
本発明者らは、次に、内因性遺伝子ＰＰＩＢを標的とした。本発明者らは、ＰＰＩＢをタイリングする５０ｎｔスペーサーを設計し、本発明者らが最高２８％の編集効率でＰＰＩＢ転写物を編集できたことを見出した（図５７Ｄ）。ＲＥＰＡＩＲを更に最適化することができるかどうかを試験するため、本発明者らは、ｄＣａｓ１３ｂとＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）との間にリンカーを改変し（図５７Ｅ、表８）、リンカー選択がルシフェラーゼ活性回復にやや影響を及ぼしたことを見出した。
ＲＮＡ編集のための配列パラメータの定義付け
本発明者らが試験部位で正確なＲＮＡ編集を実現できたことを踏まえ、本発明者らは、トランスクリプトームにおける任意のＲＮＡ標的に対する系をプログラムする際の配列制約を特徴付けようとした。配列制約は、ＰＦＳなど、ｄＣａｓ１３ｂターゲティング制限によるか、又はＡＤＡＲ配列優先性によって生じ得た（２６）。ＲＥＰＡＩＲｖ１に関するＰＦＳ制約を調べるため、本発明者らは、Ｃｌｕｃ転写物上の標的部位の５’末端に一連の４つのランダム化ヌクレオチドを担持するプラスミドライブラリを設計した（図５１Ａ）。本発明者らは、ＵＡＧモチーフ又はＡＡＣモチーフのいずれかの範囲内にある中央のアデノシンを標的とし、両方のモチーフについて、全てのＰＦＳが検出可能なレベルのＲＮＡ編集を実証し、大部分のＰＦＳが標的部位において５０％より高い編集であったことを見出した（図５１Ｂ）。次に、本発明者らは、ＲＥＰＡＩＲｖ１中のＡＤＡＲ２ＤＤが、以前ＡＤＡＲ２ＤＤについて報告されているとおり、標的塩基に直接隣接するいずれかの配列制約を有するかどうかを決定しようとした（２６）。本発明者らは、標的アデノシンを直接囲む５’及び３’隣接ヌクレオチドの可能なあらゆる組み合わせを試験し（図５１Ｃ）、ＲＥＰＡＩＲｖ１があらゆるモチーフを編集する能力を有したことを見出した（図５１Ｄ）。最後に、本発明者らは、スペーサー配列における標的Ａに対向する塩基のアイデンティティが編集効率に影響を及ぼしたかどうかを分析し、Ａ−Ｃミスマッチが最も高いルシフェラーゼ回復を呈し、Ａ−Ｇ、Ａ−Ｕ及びＡ−ＡではＲＥＰＡＩＲｖ１活性が大幅に低下したことを見出した（図５７Ｆ）。
ＲＥＰＡＩＲｖ１を使用した疾患関連ヒト突然変異の修正
哺乳類細胞におけるＲＮＡ編集へのＲＥＰＡＩＲｖ１系の幅広い適用性を実証するため、本発明者らは、２つの疾患関連突然変異：Ｘ連鎖性腎性尿崩症における８７８Ｇ＞Ａ（ＡＶＰＲ２ Ｗ２９３Ｘ）及びファンコニー貧血における１５１７Ｇ＞Ａ（ＦＡＮＣＣ Ｗ５０６Ｘ）に対するＲＥＰＡＩＲｖ１ガイドを設計した。本発明者らは、これらの突然変異を有する遺伝子のｃＤＮＡに関する発現構築物をＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトし、ＲＥＰＡＩＲｖ１が突然変異を修正することができたかどうかを試験した。５０ｎｔスペーサーを含むガイドＲＮＡを使用して、本発明者らは、３５％のＡＶＰＲ２の修正及び２３％のＦＡＮＣＣの修正を実現することが可能であった（図５２Ａ〜図５２Ｄ）。次に、本発明者らは、ＲＥＰＡＩＲｖ１が３４個の異なる疾患関連Ｇ＞Ａ突然変異を修正する能力を試験し（表９）、本発明者らは、３３部位において最高２８％の編集効率で有意な編集を実現可能であったことを見出した（図５２Ｅ）。本発明者らが選択した突然変異は、ＣｌｉｎＶａｒデータベース中にある病原性のＧからＡへの突然変異のあくまでも一部に過ぎず（５，７３９個）、このデータベースには、更なる１１，９４３個のＧからＡへの変異体も含まれる（図５２Ｆ及び図５８）。配列制約がないため、特に本発明者らが標的モチーフに関わらず有意な編集を観察したことを踏まえると、ＲＥＰＡＩＲｖ１は、これらの疾患関連突然変異の全てを編集する能力を潜在的に有する（図５１Ｃ及び図５２Ｇ）。
ＲＥＰＡＩＲｖ１系を罹患細胞に送達することは、治療用途には必須であり、従って、本発明者らは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどの治療的に関連性のあるウイルスベクターにパッケージング可能なＲＥＰＡＩＲｖ１構築物を設計しようとした。ＡＡＶベクターは、４．７ｋｂのパッケージング限界を有し、これは、ｄＣａｓ１３ｂ−ＡＤＡＲＤＤ（４４７３ｂｐ）の大きいサイズをプロモーター及び発現調節エレメントと共に収容することができないものである。サイズを低減するため、本発明者らは、ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）に融合したｄＣａｓ１３の種々のＮ末端及びＣ末端トランケーションについてＲＮＡ編集活性を試験した。本発明者らは、試験した全てのＣ末端トランケーションがなおも機能性で、ルシフェラーゼシグナルを回復させることが可能であった（図５９）と共に、最も大きいトランケーション、Ｃ末端Δ９８４〜１０９０（融合タンパク質の総サイズ４，１５２ｂｐ）がＡＡＶベクターのパッケージング限界の範囲内に収まるのに十分な小ささであったことを見出した。
ＲＥＰＡＩＲｖ１のトランスクリプトームワイド特異性
ＰｓｐＣａｓ１３ｂによるＲＮＡノックダウンは、高度に特異的であったが、本発明者らのルシフェラーゼタイリング実験では、本発明者らはガイド：標的二重鎖内にオフターゲットアデノシン編集を観察した（図５０Ｅ）。これが広範囲に及ぶ現象であったかどうかを確かめるため、本発明者らは、内因性転写物ＫＲＡＳをタイリングし、標的アデノシンの近傍におけるオフターゲット編集の程度を測定した（図５３Ａ）。本発明者らは、ＫＲＡＳについて、オンターゲット編集率は、２３％であったが、標的部位の周りに同様に検出可能なＡからＧへの編集を有した部位が多くあったことを見出した（図５３Ｂ）。
ガイド：標的二重鎖内にオフターゲット編集が観察されたため、本発明者らは、全てのｍＲＮＡに関してＲＮＡシーケンシングを実施することにより、可能な全てのトランスクリプトームオフターゲットを評価した。ＲＮＡシーケンシングにより、ＡからＧへのオフターゲットイベントが多数あり、ターゲティング条件で１，７３２個のオフターゲット及びノンターゲティング条件で９２５個のオフターゲットがあり、８２８個のオフターゲットが重複していることが明らかになった（図５３Ｃ、図５３Ｄ）。トランスクリプトームにわたる全ての編集部位のうち、オンターゲット編集部位が最も高い編集率を有し、８９％のＡからＧへの変換であった。
Ｃａｓ１３ターゲティングの高い特異性を踏まえて、本発明者らは、オフターゲットがＡＤＡＲから生じ得ることが妥当と考えた。２つのＲＮＡ誘導型ＡＤＡＲ系が以前記載されている（図６０Ａ）。第１のものは、ＡＤＡＲ２ＤＤと、ＢｏｘＢ−λ ＲＮＡヘアピンに結合する低分子ウイルスタンパク質ラムダＮ（λＮ）との融合物を利用する（２２）。二重ＢｏｘＢ−λヘアピンを有するガイドＲＮＡが、ガイドＲＮＡにコードされた編集部位にＡＤＡＲ２ＤＤをガイドする（２３）。第２の設計は完全長ＡＤＡＲ２（ＡＤＡＲ２）と、ＡＤＡＲ２の二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）が認識するヘアピンを有するガイドＲＮＡとを利用する（２１、２４）。本発明者らは、ＲＥＰＡＩＲｖ１と比較したこれらの２つの系の編集効率を分析し、ＲＥＰＡＩＲｖ１によって達成された８９％の編集率と比較して、ＢｏｘＢ−ＡＤＡＲ２及びＡＤＡＲ２系がそれぞれ６３％及び３６％の編集率を実証したことを見出した（図６０Ｂ〜図６０Ｅ）。加えて、ＢｏｘＢ及びＡＤＡＲ２系は、ＲＥＰＡＩＲｖ１ターゲティングガイド条件での１，２２９個のオフターゲットと比較して、ターゲティングガイド条件でそれぞれ２０１８個及び１７４個の観察されたオフターゲットを作り出した。特に、ＡＤＡＲ２系は、大部分が異なるオフターゲットの組を有した一方、２つのＡＤＡＲ２ＤＤベースの系（ＲＥＰＡＩＲｖ１及びＢｏｘＢ）を含む条件は、全てそのオフターゲットに高い割合の重複を示した（図６０Ｆ）。ターゲティング条件とノンターゲティング条件との間及びＲＥＰＡＩＲｖ１条件とＢｏｘＢと条件の間のオフターゲットの重複は、ＡＤＡＲ２ＤＤがｄＣａｓ１３ターゲティングと無関係にオフターゲットをドライブしたことを示唆している（図６０Ｆ）。
合理的プロテインエンジニアリングによるＲＥＰＡＩＲｖ１の特異性の改善
ＲＥＰＡＩＲの特異性を改善するため、本発明者らは、ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）の構造誘導型プロテインエンジニアリングを用いた。オフターゲットのガイド非依存的性質のため、本発明者らは、ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）−ＲＮＡ結合を不安定化させればオフターゲット編集を選択的に低下させ得るが、標的部位へのＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）のｄＣａｓ１３ｂ係留からの局所濃度の増加に起因してオンターゲット編集は維持され得ると仮定した。本発明者らは、ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）バックグラウンドで、標的ＲＮＡの二重鎖領域に接触することが以前決定されたＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）残基を突然変異させた（図５４Ａ）（１８）。効率及び特異性を評価するため、本発明者らは、ノンターゲティング条件でバックグラウンドルシフェラーゼ回復が検出されれば、より広いオフターゲット活性の指標となり得るという想定の下、ターゲティングガイド及びノンターゲティングガイドの両方で１７個の単一突然変異体を試験した。本発明者らは、ターゲティング及びノンターゲティングガイドについて、選択の残基における突然変異がルシフェラーゼ活性に有意な効果を及ぼしたことを見出した（図５４Ａ、図５４Ｂ、図６１Ａ）。大部分の突然変異体は、ターゲティングガイドについてルシフェラーゼ活性を有意に改善したか、又はターゲティング対ノンターゲティングガイド活性の比（本発明者らはこれを特異性スコアと称した）を増加させたかのいずれかであった（図５４Ａ、図５４Ｂ）。本発明者らは、次世代シーケンシングによるトランスクリプトームワイドな特異性のプロファイリングにこれらの突然変異体のサブセットを選択した（図５４Ｂ）。予想どおり、トランスクリプトームワイドなシーケンシングから測定されたオフターゲットは、突然変異体についての本発明者らの特異性スコアと相関した（図６１Ｂ）。本発明者らは、ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ／Ｒ４５５Ｅ）を例外として、シーケンシングした全てのＲＥＰＡＩＲｖ１突然変異体がレポーター転写物を有効に編集することができ（図５４Ｃ）、多くの突然変異体がオフターゲット数の減少を示した（図６１Ｃ、図６２）ことを見出した。本発明者らは、特異性突然変異体のオフターゲットの周囲モチーフを更に調べ、ＲＥＰＡＩＲｖ１及びほとんどのエンジニアリングした突然変異体が、特徴付けられたＡＤＡＲ２モチーフと一致して、その編集について強力な３’Ｇ優先性を呈したことを見出した（図６３Ａ）（２６）。本発明者らは、更なる実験に、それが４つの突然変異体のうちの最も高いパーセント編集率を有しつつトランスクリプトームワイドなオフターゲットの数が最も少なかったことに伴い突然変異体ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ／Ｔ３７５Ｇ）を選択し、これをＲＥＰＡＩＲｖ２と名付けた。ＲＥＰＡＩＲｖ１と比較して、ＲＥＰＡＩＲｖ２は、特異性の増加を呈し、トランスクリプトームオフターゲットが１７３２個から１０個に減少した（図５４Ｄ）。Ｃｌｕｃにおける標的アデノシンを囲む領域において、ＲＥＰＡＩＲｖ２ではオフターゲット編集が減少し、これは、シーケンシングトレースに見ることができた（図５４Ｅ）。次世代シーケンシングから導き出されたモチーフにおいて、ＲＥＰＡＩＲｖ１は、３’Ｇに強力な優先性を呈したが、全てのモチーフについてオフターゲット編集を示した（図６３Ｂ）。対照的に、ＲＥＰＡＩＲｖ２は、最も強力なオフターゲットモチーフを編集するのみであった（図６３Ｃ）。転写物上の編集分布は、重度に偏っていて、高度に編集された遺伝子は、６０個を超える編集を有する（図６４Ａ、図６４Ｂ）一方、ＲＥＰＡＩＲｖ２は、１個の転写物（ＥＥＦ１Ａ１）のみを複数回編集した（図６４Ｄ〜図６４Ｆ）。ＲＥＰＡＩＲｖ１オフターゲット編集は、１０００個のミスセンス突然変異（図６４Ｃ）と９３個の発癌イベント（図６４Ｄ）とを含め、多数の変異体をもたらすと予測された。対照的に、ＲＥＰＡＩＲｖ２は、６個のミスセンス突然変異を有したのみで（図６４Ｅ）、その中に発癌転帰を有するものはなかった（図６４Ｆ）。予測オフターゲット効果のこの減少は、ＲＥＰＡＩＲｖ２を他のＲＮＡ編集手法と区別するものである。
本発明者らは、ＲＥＰＡＩＲｖ２を内因性遺伝子に標的化させて、特異性を亢進する突然変異が高効率オンターゲット編集を維持しつつ標的転写物における近隣編集を低減するかどうかを試験した。ＫＲＡＳ又はＰＰＩＢのいずれかを標的とするガイドについて、本発明者らは、ＲＥＰＡＩＲｖ２が、ＲＥＰＡＩＲｖ１と異なり、検出可能なオフターゲット編集を有さず、オンターゲットアデノシンをそれぞれ２７．１％及び１３％で有効に編集できたことを見出した（図５４Ｆ、図５４Ｇ）。この特異性は、他のＫＲＡＳ又はＰＰＩＢ標的部位など、ＲＥＰＡＩＲｖ１についてノンターゲティング条件で高レベルのバックグラウンドを示す領域を含め、追加的な標的部位まで及んだ（図６５）。全体的に見て、ＲＥＰＡＩＲｖ２は、編集されたアデノシンを囲む二重鎖領域でのオフターゲットを消失させ、トランスクリプトームワイドな特異性の劇的な亢進を示した。
結論
本発明者らは、ここで、ＲＮＡ誘導型ＲＮＡターゲティングＶＩ−Ｂ型エフェクターＣａｓ１３ｂが極めて効率的且つ特異的なＲＮＡノックダウン能力を有することを明らかにし、必須遺伝子及び非コードＲＮＡを調べると共に、細胞過程をトランスクリプトームレベルで制御するツールを改善する基礎を提供した。触媒不活性Ｃａｓ１３ｂ（ｄＣａｓ１３ｂ）は、プログラム可能なＲＮＡ結合能力を保持し、本発明者らは、ここで、ｄＣａｓ１３ｂをアデノシンデアミナーゼＡＤＡＲ２に融合することによりこれを利用して、本発明者らがＲＥＰＡＩＲｖ１（プログラム可能なＡからＩへの置換のためのＲＮＡ編集バージョン１）と称する系である正確なＡからＩへの編集を実現した。この系の更なるエンジニアリングにより、特異性が劇的に改善された、現在の編集プラットフォームと比べて同等の又は増加した活性を有する方法であるＲＥＰＡＩＲｖ２がもたらされた。
Ｃａｓ１３ｂは、高忠実度を呈するが、ｄＣａｓ１３ｂ−ＡＤＡＲ２ＤＤ融合物による本発明者らの当初の結果では数千個のオフターゲットが明らかになった。これに対処するため、本発明者らは、合理的突然変異誘発戦略を用いてＲＮＡ二重鎖と接触するＡＤＡＲ２ＤＤ残基を変異させることにより、ｄＣａｓ１３ｂと融合したとき正確で、効率的で、且つ高度に特異的な編集能力を有する変異体ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ／Ｔ３７５Ｇ）を同定した。この変異体による編集効率は、現在利用可能な２つの系、ＢｏｘＢ−ＡＤＡＲＤＤ又はＡＤＡＲ２編集で実現したものと同等であるか又はそれより良好であった。更に、ＲＥＰＡＩＲｖ２系は、全トランスクリプトームにおいて観察可能なオフターゲットを１０個のみ作り出し、両方の代替的編集技術と比べて少なくとも良好といえる程度であった。
ＲＥＰＡＩＲ系は、他の核酸編集ツールと比較して多くの利点を提供する。第一に、所望のアデノシンからのものにわたってガイド伸長部内にシチジンを置いてＡＤＡＲ編集活性に理想的な有利なＡ−Ｃミスマッチを作り出すことにより、ガイドに正確な標的部位をコードすることができる。第二に、Ｃａｓ１３は、ＰＦＳ又はＰＡＭなどのターゲティング配列制約を有さず、標的アデノシンの周りのモチーフ優先性がないため、トランスクリプトーム内の任意のアデノシンを潜在的にＲＥＰＡＩＲ系による標的とすることが可能である。しかしながら、本発明者らは、ＤＮＡベースの編集体がセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれを標的とすることもできる一方、ＲＥＰＡＩＲ系は、転写された配列に限られ、そのため標的とすることのできる可能な編集部位の総数が制約を受けることを実に注記しておく。しかしながら、ＲＥＰＡＩＲによるターゲティングのより柔軟性の高い性質に起因して、この系は、ＣｌｉｎＶａｒ内に（図５２Ｃ）Ｃａｓ９−ＤＮＡベースの編集体よりも多くの編集を生じさせることができる。第三に、ＲＥＰＡＩＲ系は、標的アデノシンをイノシンに直接脱アミノ化し、塩基除去修復又はミスマッチ修復などの内因性修復経路に依存せずに所望の編集結果を生じさせる。従って、ＲＥＰＡＩＲは、他の形態の編集をサポートできない非分裂細胞で可能なはずである。第四に、ＲＮＡ編集は、一過性であり得、編集結果を一時的に制御する可能性を許容する。この特性は、局所炎症など、細胞状態の一時的な変化によって引き起こされる疾患の治療に有用であると見込まれ得る。
ＲＥＰＡＩＲ系は、更なるエンジニアリング機会を複数提供する。Ｃａｓ１３ｂはプレｃｒＲＮＡプロセシング活性を有し（１３）、そのため、単独では疾患リスクを変化させない可能性があるが、一緒になると相加効果及び疾患修飾の可能性を有し得る複数の変異体の多重編集が可能である。有望な突然変異を組み合わせるなど、本発明者らの合理設計手法を拡張すれば、この系の特異性及び効率を更に増加させることができる一方、偏りのないスクリーニング手法によってＲＥＰＡＩＲ活性及び特異性を改善するための追加的な残基を同定できる可能性がある。
現在、ＲＥＰＡＩＲによって実現可能な塩基変換は、アデノシンからのイノシンの生成に限られている。ｄＣａｓ１３をＡＰＯＢＥＣなどの他の触媒ＲＮＡ編集ドメインと更に融合すれば、シチジンからウリジンへの編集を実現できる可能性がある。加えて、ＡＤＡＲを突然変異誘発すれば、シチジンを標的とする基質優先性が緩和され、Ｃ→Ｕ編集体によって利用される二重鎖化したＲＮＡ基質要件によって付与される特異性の亢進が可能となる可能性がある。ＤＮＡ基質上におけるアデノシンからイノシンへの編集は、ＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二重鎖標的の形成（２７）又はＡＤＡＲドメインの突然変異誘発のいずれかを通じて、ｄＣａｓ９又はｄＣｐｆ１など、触媒不活性ＤＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲエフェクターでも可能であり得る。
ＲＥＰＡＩＲは、ＡからＩへの（ＡからＧへの）編集が疾患の進行を逆転又は減速させ得る様々な治療適応症に適用できる可能性がある（図６６）。第一に、疾患関連組織における原因となるメンデルのＧからＡへの突然変異を標的とするためのＲＥＰＡＩＲの発現を用いれば、有害な突然変異を復帰させ、疾患を治療できる可能性がある。例えば、脳組織におけるＡＡＶによる安定なＲＥＰＡＩＲ発現を用いれば、焦点性癲癇を引き起こすＧＲＩＮ２Ａミスセンス突然変異ｃ．２１９１Ｇ＞Ａ（Ａｓｐ７３１Ａｓｎ）（２８）又は早期発症型アルツハイマー病を引き起こすＡＰＰミスセンス突然変異ｃ．２１４９Ｇ＞Ａ（Ｖａｌ７１７Ｉｌｅ）（２９）を修正できる可能性がある。第二に、ＲＥＰＡＩＲを用いれば、疾患関連シグナル伝達に関与するタンパク質の機能を改変することにより疾患を治療できる可能性がある。例えば、ＲＥＰＡＩＲ編集によれば、キナーゼの標的である一部のセリン、スレオニン及びチロシン残基の再コーディングが可能となり得る（図６６）。疾患関連タンパク質におけるこれらの残基のリン酸化は、アルツハイマー病及び多発神経変性病態を含め、多くの障害についての疾患の進行に影響を及ぼす（３０）。第三に、ＲＥＰＡＩＲを用いれば、発現したリスク修飾性のＧからＡへの変異体の配列を変化させることにより、患者についての疾患状態に入る可能性を先制して低下させることができる可能性がある。最も興味深いケースは、「防御性」リスク修飾アレルであり、これは疾患状態に入る可能性を劇的に低下させ、場合により更なる健康上の利益を付与する。例えば、ＲＥＰＡＩＲを用いれば、それぞれ心血管疾患及び乾癬性関節炎を防御するＰＣＳＫ９及びＩＦＩＨ１のＡからＧへのアレルを機能的に模倣できる可能性がある（３１）。最後に、ＲＥＰＡＩＲを用いて、エクソン調節療法のためスプライスアクセプター及びドナー部位を治療的に改変することができる。ＲＥＰＡＩＲは、それぞれコンセンサス５’スプライスドナー又は３’スプライスアクセプター部位と機能的に均等なものである、ＡＵをＩＵに又はＡＡをＡＩに変化させて、新規スプライスジャンクションを作り出すことができる。加えて、ＲＥＰＡＩＲ編集は、コンセンサス３’スプライスアクセプター部位をＡＧ→ＩＧに突然変異させて、隣接下流エクソンのスキッピングを促進することができ、これは、ＤＭＤの治療に多大な関心を集めている治療方針である。スプライス部位の調節には、脊髄性筋萎縮症の治療に向けたＳＭＮ２スプライシングの調節のためなど、アンチセンスオリゴが何らかの成功を収めている疾患において幅広い適用性があり得る（３２）。
本発明者らは、ＲＮＡノックダウン及びＲＮＡ編集の両方のツールとしてのＰｓｐＣａｓ１３ｂ酵素の使用を実証した。プログラム可能なＲＮＡ結合のためのｄＣａｓ１３ｂプラットフォームには、ライブ転写物イメージング、スプライシング改変、標的化した転写物局在化、ＲＮＡ結合タンパク質のプルダウン及びエピトランスクリプトーム改変を含め、多くの適用性がある。ここで、本発明者らは、ｄＣａｓ１３を用いて、既存の核酸編集技術スイートに加わるＲＥＰＡＩＲを作り出した。ＲＥＰＡＩＲは、遺伝性疾患の治療又は防御アレルの模倣の新規手法を提供し、ＲＮＡ編集を遺伝子機能の改変に有用なツールとして確立する。

参考文献
１．Ｐ．Ｄ．Ｈｓｕ，Ｅ．Ｓ．Ｌａｎｄｅｒ，Ｆ．Ｚｈａｎｇ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｅｌｌ １５７，１２６２−１２７８（２０１４）．
２．Ａ．Ｃ．Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｈ．Ｂａｄｒａｎ，Ｄ．Ｒ．Ｌｉｕ，ＣＲＩＳＰＲ−Ｂａｓｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｃｅｌｌ １６８，２０−３６（２０１７）．
３．Ｌ．Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８１９−８２３（２０１３）．
４．Ｐ．Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄＨｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８２３−８２６（２０１３）．
５．Ｂ．Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｐｆ１ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ １６３，７５９−７７１（２０１５）．
６．Ｈ．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｓ．Ｋｉｍ，Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １５，３２１−３３４（２０１４）．
７．Ａ．Ｃ．Ｋｏｍｏｒ，Ｙ．Ｂ．Ｋｉｍ，Ｍ．Ｓ．Ｐａｃｋｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｚｕｒｉｓ，Ｄ．Ｒ．Ｌｉｕ，Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ．Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４２０−４２４（２０１６）．
８．Ｋ．Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇＨｙｂｒｉｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，（２０１６）．
９．Ｙ．Ｂ．Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｃｏｐｅ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９−ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｆｕｓｉｏｎｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３５，３７１−３７６（２０１７）．
１０．Ｏ．Ｏ．Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃ２ｃ２ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，ａａｆ５５７３（２０１６）．
１１．Ｓ．Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ６０，３８５−３９７（２０１５）．
１２．Ｓ．Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １５，１６９−１８２（２０１７）．
１３．Ａ．Ａ．Ｓｍａｒｇｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｓ１３ｂ Ｉｓ ａ Ｔｙｐｅ ＶＩ−Ｂ ＣＲＩＳＰＲ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ ＲＮａｓｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｓｘ２７ ａｎｄ Ｃｓｘ２８．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ６５，６１８−６３０ ｅ６１７（２０１７）．
１４．Ｊ．Ｓ．Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５６，４３８−４４２（２０１７）．
１５．Ｏ．Ｏ．Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａ．Ｎａｔｕｒｅ ｉｎ ｐｒｅｓｓ，（２０１７）．
１６．Ｋ．Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＡＤＡＲ ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７９，３２１−３４９（２０１０）．
１７．Ｂ．Ｌ．Ｂａｓｓ，Ｈ．Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ａｎ ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｈａｔ ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｓ ｉｔｓ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ．Ｃｅｌｌ ５５，１０８９−１０９８（１９８８）．
１８．Ｍ．Ｍ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆＨｕｍａｎ ＡＤＡＲ２ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｄｓＲＮＡ ｒｅｖｅａｌ ｂａｓｅ−ｆｌｉｐｐｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｓｉｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２３，４２６−４３３（２０１６）．
１９．Ａ．Ｋｕｔｔａｎ，Ｂ．Ｌ．Ｂａｓｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｅｄｉｔｉｎｇ−ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＡＤＡＲｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０９，Ｅ３２９５−３３０４（２０１２）．
２０．Ｓ．Ｋ．Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｓａｔｏ，Ｄ．Ｗ．Ｌａｚｉｎｓｋｉ，Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ＡＤＡＲ１ ａｎｄ ＡＤＡＲ２．ＲＮＡ ７，８４６−８５８（２００１）．
２１．Ｍ．Ｆｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｕｉｄｅ−ＲＮＡ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｔｉｌｉｓｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ａ−ｔｏ−Ｉ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７，４１４７８（２０１７）．
２２．Ｍ．Ｆ．Ｍｏｎｔｉｅｌ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｉ．Ｖａｌｌｅｃｉｌｌｏ−Ｖｉｅｊｏ，Ｇ．Ａ．Ｙｕｄｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｊ．Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｂｙ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０，１８２８５−１８２９０（２０１３）．
２３．Ｍ．Ｆ．Ｍｏｎｔｉｅｌ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｉ．Ｃ．Ｖａｌｌｅｃｉｌｌｏ−Ｖｉｅｊｏ，Ｊ．Ｊ．Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｌｔｅｒｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｉｎ ｍＲＮＡｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４４，ｅ１５７（２０１６）．
２４．Ｊ．Ｗｅｔｔｅｎｇｅｌ，Ｐ．Ｒｅａｕｔｓｃｈｎｉｇ，Ｓ．Ｇｅｉｓｌｅｒ，Ｐ．Ｊ．Ｋａｈｌｅ，Ｔ．Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ，ＨａｒｎｅｓｓｉｎｇＨｕｍａｎ ＡＤＡＲ２ ｆｏｒ ＲＮＡ ｒｅｐａｉｒ−Ｒｅｃｏｄｉｎｇ ａ ＰＩＮＫ１ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｒｅｓｃｕｅｓ ｍｉｔｏｐｈａｇｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４５，２７９７−２８０８（２０１７）．
２５．Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｈａｖｅｌ，Ｐ．Ａ．Ｂｅａｌ，Ａ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ Ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆＨｕｍａｎ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ＲＮＡ １．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １０，２５１２−２５１９（２０１５）．
２６．Ｋ．Ａ．Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｂ．Ｌ．Ｂａｓｓ，Ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ ＡＤＡＲ１ ａｎｄ ＡＤＡＲ２Ｈａｖｅ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９，１２８７５−１２８８４（２０００）．
２７．Ｙ．Ｚｈｅｎｇ，Ｃ．Ｌｏｒｅｎｚｏ，Ｐ．Ａ．Ｂｅａｌ，ＤＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ＤＮＡ／ＲＮＡＨｙｂｒｉｄｓ ｂｙ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ ｔｈａｔ ａｃｔ ｏｎ ＲＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４５，３３６９−３３７７（２０１７）．
２８．Ｋ．Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｄｅ ｎｏｖｏ ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ＧＲＩＮ２Ａ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｆｏｃａｌ ｅｐｉｌｅｐｓｙ ａｎｄ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ａｐｈａｓｉａ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２，ｅ０１７０８１８（２０１７）．
２９．Ｈ．Ｍ．Ｌａｎｏｉｓｅｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ＡＰＰ，ＰＳＥＮ１，ａｎｄ ＰＳＥＮ２ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｅａｒｌｙ−ｏｎｓｅｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ：Ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｎｄ ｓｐｏｒａｄｉｃ ｃａｓｅｓ．ＰＬｏＳ Ｍｅｄ １４，ｅ１００２２７０（２０１７）．
３０．Ｃ．Ｂａｌｌａｔｏｒｅ，Ｖ．Ｍ．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｑ．Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ，Ｔａｕ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ８，６６３−６７２（２００７）．
３１．Ｙ．Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ ｒａｒｅ ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ ＩＦＩＨ１ ａｒｅ ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １３０，２７６８−２７７２（２０１０）．
３２．Ｒ．Ｓ．Ｆｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｆａｎｔｉｌｅ−ｏｎｓｅｔ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ ｗｉｔｈ ｎｕｓｉｎｅｒｓｅｎ：ａ ｐｈａｓｅ ２，ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌ，ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ ３８８，３０１７−３０２６（２０１６）．
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、説明したが、かかる実施形態は、単に例として提供されるに過ぎないことが当業者に明らかであろう。ここで、当業者には、本発明から逸脱することなく多数の変形形態、変更形態及び代替形態が想起されるであろう。本発明の実施において、本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替形態を用い得ることが理解されなければならない。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すること、及びこの特許請求の範囲内にある方法及び構造並びにその均等物がそれに包含されることが意図される。

Claims (50)

  1. ｉ）表１ＡからのＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質、及び
    ｉｉ）ｃｒＲＮＡ
    を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、
    前記ｃｒＲＮＡは、ａ）標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズする能力を有するガイド配列と、ｂ）ダイレクトリピート配列とを含み、
    それにより、前記標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズする前記ガイド配列と複合体化された前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ複合体が形成される、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物。
  2. Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質活性を亢進させるアクセサリータンパク質を含む、請求項１に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物。
  3. Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質活性を亢進させる前記アクセサリータンパク質は、ｃｓｘ２８タンパク質である、請求項２に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物。
  4. Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質活性を抑制するアクセサリータンパク質を含む、請求項１に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物。
  5. Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質活性を抑制する前記アクセサリータンパク質は、ｃｓｘ２７タンパク質である、請求項４に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物。
  6. ２つ以上のｃｒＲＮＡを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物。
  7. 前記ガイド配列は、原核細胞の標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズする、請求項１に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物。
  8. 前記ガイド配列は、真核細胞の標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズする、請求項１に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物。
  9. 前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項１に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物。
  10. 前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインと会合されている、請求項１に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物。
  11. 前記機能ドメインは、前記標的ＲＮＡ配列を切断する、請求項１０に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物。
  12. 前記機能ドメインは、前記標的ＲＮＡ配列の転写又は翻訳を改変する、請求項１０に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物。
  13. 前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインと会合されており、及び前記エフェクタータンパク質は、ＨＥＰＮドメイン内に１つ以上の突然変異を含み、それにより、前記複合体は、後成的改変因子又は転写若しくは翻訳活性化若しくは抑制シグナルを送達することができる、請求項１に記載の組成物。
  14. 前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と前記アクセサリータンパク質とは、同じ生物に由来する、請求項２又は４に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物。
  15. 前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質と前記アクセサリータンパク質とは、異なる生物に由来する、請求項２又は４に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物。
  16. 請求項１に記載の組成物を提供するためのＣａｓ１３ｂベクター系であって、
    表１ＡからのＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１の調節エレメント、及び
    前記ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２の調節エレメント
    を含む１つ以上のベクターを含むＣａｓ１３ｂベクター系。
  17. アクセサリータンパク質のヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節エレメントを更に含む、請求項１６に記載のベクター系。
  18. 前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は、真核細胞での発現にコドン最適化される、請求項１６に記載のベクター系。
  19. 前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質及び前記アクセサリータンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は、真核細胞での発現にコドン最適化される、請求項１７に記載のベクター系。
  20. 単一のベクターに含まれる、請求項１６に記載のベクター系。
  21. 前記１つ以上のベクターは、ウイルスベクターを含む、請求項１６に記載のベクター系。
  22. 前記１つ以上のベクターは、１つ以上のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴又は単純ヘルペスウイルスベクターを含む、請求項１６又は２０に記載のベクター系。
  23. ｉ）表１ＡからのＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質、及び
    ｉｉ）ｃｒＲＮＡ
    を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質及び１つ以上の核酸成分を送達するように構成された送達系であって、
    前記ｃｒＲＮＡは、ａ）細胞の標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズするガイド配列と、ｂ）ダイレクトリピート配列とを含み、
    前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、前記ｃｒＲＮＡと複合体を形成し、
    前記ガイド配列は、前記標的ＲＮＡ配列への配列特異的結合を導き、
    それにより、前記標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズされる前記ガイド配列と複合体化された前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ複合体が形成される、送達系。
  24. １つ以上のベクター又は１つ以上のポリヌクレオチド分子を含み、前記１つ以上のベクター又はポリヌクレオチド分子は、前記天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質及び１つ以上の核酸成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む、請求項２３に記載の送達系。
  25. リポソーム、粒子、エキソソーム、微小胞、遺伝子銃又は１つ以上のウイルスベクターを含む送達媒体を含む、請求項２３に記載の送達系。
  26. 治療的処置方法における使用のための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の天然に存在しない若しくはエンジニアリングされた組成物、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載のベクター系又は請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の送達系。
  27. 目的の標的遺伝子の発現を改変する方法であって、標的ＲＮＡを、
    ｉ）表１ＡからのＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質、及び
    ｉｉ）ｃｒＲＮＡ
    を含む１つ以上の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物に接触させることを含み、
    前記ｃｒＲＮＡは、ａ）細胞の標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズするガイド配列と、ｂ）ダイレクトリピート配列とを含み、
    前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、前記ｃｒＲＮＡと複合体を形成し、
    前記ガイド配列は、細胞における前記標的ＲＮＡ配列への配列特異的結合を導き、
    それにより、前記標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズされる前記ガイド配列と複合体化された前記Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ複合体が形成され、
    それにより、目的の標的遺伝子座の発現が改変される、方法。
  28. 前記標的ＲＮＡを、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質活性を亢進させるアクセサリータンパク質に接触させることを更に含む、請求項２７に記載の方法。
  29. Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質活性を亢進させる前記アクセサリータンパク質は、ｃｓｘ２８タンパク質である、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記標的ＲＮＡを、Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質活性を抑制するアクセサリータンパク質に接触させることを更に含む、請求項２７に記載の方法。
  31. Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質活性を抑制する前記アクセサリータンパク質は、ｃｓｘ２７タンパク質である、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記標的遺伝子の発現を改変することは、前記標的ＲＮＡを切断することを含む、請求項２７に記載の方法。
  33. 前記標的遺伝子の発現を改変することは、前記標的ＲＮＡの発現を増加又は減少させることを含む、請求項２７に記載の方法。
  34. 前記標的遺伝子は、原核細胞にある、請求項２７に記載の方法。
  35. 前記標的遺伝子は、真核細胞にある、請求項２７に記載の方法。
  36. 改変された目的の標的を含む細胞であって、前記目的の標的は、請求項２７〜３５のいずれか一項に記載の方法によって改変されている、細胞。
  37. 原核細胞である、請求項３６に記載の細胞。
  38. 真核細胞である、請求項３６に記載の細胞。
  39. 前記目的の標的の前記改変は、
    少なくとも１つの遺伝子産物の変化した発現を含む前記細胞、
    少なくとも１つの遺伝子産物の変化した発現を含む前記細胞であって、前記少なくとも１つの遺伝子産物の前記発現は、増加される、前記細胞、又は
    少なくとも１つの遺伝子産物の変化した発現を含む前記細胞であって、前記少なくとも１つの遺伝子産物の前記発現は、減少される、前記細胞
    をもたらす、請求項３６に記載の細胞。
  40. 哺乳類細胞又はヒト細胞である、請求項３８又は３９に記載の真核細胞。
  41. 請求項３８若しくは３９に記載の細胞若しくはその子孫の又はそれを含む細胞株。
  42. 請求項３８又は３９に記載の１つ以上の細胞を含む多細胞生物。
  43. 請求項３８又は３９に記載の１つ以上の細胞を含む植物又は動物モデル。
  44. 請求項３８若しくは３９に記載の細胞、又は請求項４１に記載の細胞株、又は請求項４２に記載の生物、又は請求項４３に記載の植物若しくは動物モデルからの遺伝子産物。
  45. 発現される遺伝子産物の量は、変化した発現を有しない細胞からの遺伝子産物の量より多いか又は少ない、請求項４４に記載の遺伝子産物。
  46. 表１Ａからの単離Ｃａｓ１３ｂエフェクタータンパク質。
  47. 請求項４６に記載のＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質をコードする単離核酸。
  48. ＤＮＡであり、且つｃｒＲＮＡをコードする配列を更に含む、請求項４７に記載の単離核酸。
  49. 請求項４７若しくは４８に記載の核酸又は請求項４６に記載のＣａｓ１３ｂを含む単離真核細胞。
  50. ｉ）表１ＡからのＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質をコードするｍＲＮＡ、及び
    ｉｉ）ｃｒＲＮＡであって、ａ）標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズする能力を有するガイド配列と、ｂ）ダイレクトリピート配列とを含むｃｒＲＮＡ
    を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物。
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Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109153980B (zh) * 2015-10-22 2023-04-14 布罗德研究所有限公司 Vi-b型crispr酶和系统
US11739308B2 (en) 2017-03-15 2023-08-29 The Broad Institute, Inc. Cas13b orthologues CRISPR enzymes and systems
US11174515B2 (en) 2017-03-15 2021-11-16 The Broad Institute, Inc. CRISPR effector system based diagnostics
US11104937B2 (en) 2017-03-15 2021-08-31 The Broad Institute, Inc. CRISPR effector system based diagnostics
WO2018183908A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for treating ovarian tumors
KR20200006054A (ko) * 2017-04-12 2020-01-17 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 신규 타입 vi crispr 오르소로그 및 시스템
US11591601B2 (en) 2017-05-05 2023-02-28 The Broad Institute, Inc. Methods for identification and modification of lncRNA associated with target genotypes and phenotypes
EP3638218A4 (en) 2017-06-14 2021-06-09 The Broad Institute, Inc. COMPOSITIONS AND METHOD OF TARGETING COMPLEMENTING COMPONENT 3 FOR INHIBITION OF TUMOR GROWTH
WO2019005884A1 (en) * 2017-06-26 2019-01-03 The Broad Institute, Inc. CRISPR / CAS-ADENINE DEAMINASE COMPOSITIONS, SYSTEMS AND METHODS FOR TARGETED NUCLEIC ACID EDITION
CN111511388A (zh) 2017-09-21 2020-08-07 博德研究所 用于靶向核酸编辑的系统、方法和组合物
AU2018346527A1 (en) * 2017-10-04 2020-05-07 Massachusetts Institute Of Technology Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
WO2019084062A1 (en) * 2017-10-23 2019-05-02 The Broad Institute, Inc. SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETED NUCLEIC ACID EDITION
US20200332272A1 (en) * 2017-10-23 2020-10-22 The Broad Institute, Inc. Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
US11332736B2 (en) 2017-12-07 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for multiplexing single cell and single nuclei sequencing
AU2019213047A1 (en) * 2018-01-29 2020-07-16 Massachusetts Institute Of Technology CRISPR effector system based diagnostics
US11957695B2 (en) 2018-04-26 2024-04-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions targeting glucocorticoid signaling for modulating immune responses
JP2021526858A (ja) 2018-06-08 2021-10-11 ロックアネイビオ， インコーポレイテッド Ｒｎａ標的化融合タンパク質組成物および使用方法
US20190382759A1 (en) * 2018-06-08 2019-12-19 Locana, Inc. Compositions and methods for the modulation of adaptive immunity
MX2020013836A (es) 2018-06-26 2021-05-27 Massachusetts Inst Technology Métodos, sistemas y diagnósticos de amplificación basados en el sistema efector crispr.
BR112020026246A2 (pt) 2018-06-26 2021-04-20 The Broad Institute Inc. composições, sistemas e métodos de amplificação com base em nickase dupla crispr
EP3830301B1 (en) 2018-08-01 2024-05-22 Mammoth Biosciences, Inc. Programmable nuclease compositions and methods of use thereof
BR112021006844A8 (pt) * 2018-10-12 2023-03-21 Univ Beijing Métodos para editar um rna alvo e para tratar ou prevenir uma doença ou condição, rna editado ou uma célula hospedeira tendo um rna editado, rna que recruta desaminase, construção, biblioteca, composição, célula hospedeira, e, kit para editar um rna alvo .
CN109957568B (zh) * 2018-10-16 2024-02-02 广州普世利华科技有限公司 用于靶向HBB RNA的gRNA及基于C2c2的HBB突变检测方法、检测试剂盒
WO2020124050A1 (en) 2018-12-13 2020-06-18 The Broad Institute, Inc. Tiled assays using crispr-cas based detection
JP2022516515A (ja) * 2018-12-31 2022-02-28 リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル Ｒｎａ標的化ｃｒｉｓｐｒ－ｃａｓ１３ｂを使用するｄｕｘ４ ｒｎａ発現停止
WO2020142754A2 (en) 2019-01-04 2020-07-09 Mammoth Biosciences, Inc. Programmable nuclease improvements and compositions and methods for nucleic acid amplification and detection
US20220154258A1 (en) 2019-03-14 2022-05-19 The Broad Institute, Inc. Crispr effector system based multiplex diagnostics
US20220177863A1 (en) 2019-03-18 2022-06-09 The Broad Institute, Inc. Type vii crispr proteins and systems
WO2021011493A1 (en) * 2019-07-12 2021-01-21 Duke University 3' utr crispr-dcas 13 engineering system and methods of using same
WO2021046257A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 The Broad Institute, Inc. Crispr effector system based multiplex cancer diagnostics
US20220333133A1 (en) 2019-09-03 2022-10-20 Voyager Therapeutics, Inc. Vectorized editing of nucleic acids to correct overt mutations
US20230025039A1 (en) * 2019-09-20 2023-01-26 The Broad Institute, Inc. Novel type vi crispr enzymes and systems
US11844800B2 (en) 2019-10-30 2023-12-19 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for predicting and preventing relapse of acute lymphoblastic leukemia
CN116121251A (zh) * 2020-02-28 2023-05-16 辉大(上海)生物科技有限公司 VI-E型和VI-F型CRISPR-Cas系统及其用途
CN112430586B (zh) * 2020-11-16 2021-09-07 珠海舒桐医疗科技有限公司 一种VI-B型CRISPR/Cas13基因编辑系统及其应用
EP4297801A1 (en) * 2021-02-24 2024-01-03 University of Massachusetts Inducible single aav system and uses thereof
CA3222023A1 (en) 2021-06-01 2022-12-08 Arbor Biotechnologies, Inc. Gene editing systems comprising a crispr nuclease and uses thereof
CN115678872A (zh) * 2021-06-04 2023-02-03 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 新型Cas13蛋白及其筛选方法和应用
CN113832180A (zh) * 2021-08-03 2021-12-24 华中农业大学 CRISPR/Cas13b介导的棉花RNA转录调控方法
WO2023069628A2 (en) * 2021-10-21 2023-04-27 Nanothera Biosciences, Inc. Compositions and methods for silencing kras
WO2023081902A1 (en) * 2021-11-05 2023-05-11 University Of Florida Research Foundation, Inc. Systems and methods for target polynucleotide detection with crispr/cas12a using activators
WO2023220566A1 (en) * 2022-05-09 2023-11-16 The Regents Of The University Of California Crispr-cas effector polypeptides and methods of use thereof
GB202214015D0 (en) * 2022-09-26 2022-11-09 Univ Oxford Innovation Ltd RNA editing vector

Family Cites Families (106)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
DE122007000007I1 (de) 1986-04-09 2007-05-16 Genzyme Corp Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
AU7979491A (en) 1990-05-03 1991-11-27 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
GB9114259D0 (en) 1991-07-02 1991-08-21 Ici Plc Plant derived enzyme and dna sequences
WO1994002620A2 (en) 1992-07-27 1994-02-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. An improved method of agrobacterium-mediated transformation of cultured soybean cells
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
US5789156A (en) 1993-06-14 1998-08-04 Basf Ag Tetracycline-regulated transcriptional inhibitors
US5814618A (en) 1993-06-14 1998-09-29 Basf Aktiengesellschaft Methods for regulating gene expression
US5543158A (en) 1993-07-23 1996-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable injectable nanoparticles
US6007845A (en) 1994-07-22 1999-12-28 Massachusetts Institute Of Technology Nanoparticles and microparticles of non-linear hydrophilic-hydrophobic multiblock copolymers
JPH10510433A (ja) 1995-06-06 1998-10-13 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 高いキラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチド
US5985662A (en) 1995-07-13 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of hepatitis B virus replication
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5846946A (en) 1996-06-14 1998-12-08 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Compositions and methods for administering Borrelia DNA
GB9907461D0 (en) 1999-03-31 1999-05-26 King S College London Neurite regeneration
GB9720465D0 (en) 1997-09-25 1997-11-26 Oxford Biomedica Ltd Dual-virus vectors
NZ520579A (en) 1997-10-24 2004-08-27 Invitrogen Corp Recombinational cloning using nucleic acids having recombination sites and methods for synthesizing double stranded nucleic acids
US6750059B1 (en) 1998-07-16 2004-06-15 Whatman, Inc. Archiving of vectors
GB0024550D0 (ja) 2000-10-06 2000-11-22 Oxford Biomedica Ltd
AU2002336760A1 (en) 2001-09-26 2003-06-10 Mayo Foundation For Medical Education And Research Mutable vaccines
GB0125216D0 (en) 2001-10-19 2001-12-12 Univ Strathclyde Dendrimers for use in targeted delivery
JP2005512598A (ja) 2001-12-21 2005-05-12 オックスフォード バイオメディカ （ユーケー） リミテッド Ｅｉａｖなどのレンチウイルス発現ベクターを使用するトランスジェニック生物の作製方法
DE60334618D1 (de) 2002-06-28 2010-12-02 Protiva Biotherapeutics Inc Verfahren und vorrichtung zur herstellung von liposomen
WO2004015075A2 (en) 2002-08-08 2004-02-19 Dharmacon, Inc. Short interfering rnas having a hairpin structure containing a non-nucleotide loop
GB0220467D0 (en) 2002-09-03 2002-10-09 Oxford Biomedica Ltd Composition
EP1558724A4 (en) 2002-11-01 2006-08-02 New England Biolabs Inc ORGANIC RNA SCREENING AND ITS USE IN INTERRUPTING GENE TRANSMISSION IN THE ENVIRONMENT
ES2559828T3 (es) 2003-07-16 2016-02-16 Protiva Biotherapeutics Inc. ARN de interferencia encapsulado en lípidos
NZ581166A (en) 2003-09-15 2011-06-30 Protiva Biotherapeutics Inc Polyethyleneglycol-modified lipid compounds and uses thereof
GB0325379D0 (en) 2003-10-30 2003-12-03 Oxford Biomedica Ltd Vectors
US7745651B2 (en) 2004-06-07 2010-06-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods of use
AU2005252273B2 (en) 2004-06-07 2011-04-28 Arbutus Biopharma Corporation Lipid encapsulated interfering RNA
AU2005274948B2 (en) 2004-07-16 2011-09-22 Genvec, Inc. Vaccines against aids comprising CMV/R-nucleic acid constructs
GB0422877D0 (en) 2004-10-14 2004-11-17 Univ Glasgow Bioactive polymers
US7838658B2 (en) 2005-10-20 2010-11-23 Ian Maclachlan siRNA silencing of filovirus gene expression
JP5043672B2 (ja) 2005-10-28 2012-10-10 田辺三菱製薬株式会社 新規細胞膜透過ペプチド
AU2006308765B2 (en) 2005-11-02 2013-09-05 Arbutus Biopharma Corporation Modified siRNA molecules and uses thereof
GB0526211D0 (en) 2005-12-22 2006-02-01 Oxford Biomedica Ltd Viral vectors
US7915399B2 (en) 2006-06-09 2011-03-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
JP2008078613A (ja) 2006-08-24 2008-04-03 Rohm Co Ltd 窒化物半導体の製造方法及び窒化物半導体素子
WO2008042156A1 (en) 2006-09-28 2008-04-10 Northwestern University Maximizing oligonucleotide loading on gold nanoparticle
WO2008064289A2 (en) 2006-11-21 2008-05-29 The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. Biofuel production methods and compositions
WO2008149176A1 (en) 2007-06-06 2008-12-11 Cellectis Meganuclease variants cleaving a dna target sequence from the mouse rosa26 locus and uses thereof
AU2008346801A1 (en) 2007-12-31 2009-07-16 Nanocor Therapeutics, Inc. RNA interference for the treatment of heart failure
WO2009127060A1 (en) 2008-04-15 2009-10-22 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
EP2283029A1 (en) 2008-06-04 2011-02-16 Medical Research Council Peptides
WO2010001325A2 (en) 2008-06-30 2010-01-07 Silenseed Ltd Methods, compositions and systems for local delivery of drugs
WO2010004594A1 (en) 2008-07-08 2010-01-14 S.I.F.I. Societa' Industria Farmaceutica Italiana S.P.A. Ophthalmic compositions for treating pathologies of the posterior segment of the eye
US8969353B2 (en) 2008-11-07 2015-03-03 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
GB2465749B (en) 2008-11-25 2013-05-08 Algentech Sas Plant cell transformation method
WO2010096488A1 (en) 2009-02-17 2010-08-26 The Regents Of The University Of California Method of reducing acetylation in plants to improve biofuel production
US8236943B2 (en) 2009-07-01 2012-08-07 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein B
IL292615B2 (en) 2009-07-01 2023-11-01 Protiva Biotherapeutics Inc Nucleic acid-lipid particles, preparations containing them and their uses
WO2011008730A2 (en) 2009-07-13 2011-01-20 Somagenics Inc. Chemical modification of small hairpin rnas for inhibition of gene expression
US8889394B2 (en) 2009-09-07 2014-11-18 Empire Technology Development Llc Multiple domain proteins
US20120003201A1 (en) 2010-04-21 2012-01-05 Nicholas Susanne B Vault agents for chronic kidney disease
SG185367A1 (en) 2010-04-26 2012-12-28 Sangamo Biosciences Inc Genome editing of a rosa locus using zinc-finger nucleases
US8372951B2 (en) 2010-05-14 2013-02-12 National Tsing Hua University Cell penetrating peptides for intracellular delivery
EP2575894B1 (en) 2010-05-28 2015-02-25 Oxford Biomedica (UK) Ltd Delivery of lentiviral vectors to the brain
US9193827B2 (en) 2010-08-26 2015-11-24 Massachusetts Institute Of Technology Poly(beta-amino alcohols), their preparation, and uses thereof
CA2831392C (en) 2011-03-28 2020-04-28 Massachusetts Institute Of Technology Conjugated lipomers and uses thereof
CA2831613A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US20120295960A1 (en) 2011-05-20 2012-11-22 Oxford Biomedica (Uk) Ltd. Treatment regimen for parkinson's disease
ES2923757T3 (es) 2011-12-16 2022-09-30 Modernatx Inc Composiciones de ARNm modificado
US20130185823A1 (en) 2012-01-16 2013-07-18 Academia Sinica Mesoporous silica nanoparticle-mediated delivery of dna into arabidopsis root
US8614194B1 (en) 2012-07-25 2013-12-24 Kaohsiung Medical University Anionic cell penetrating peptide and its use for intracellular delivery
EP3808844A1 (en) 2012-07-25 2021-04-21 The Broad Institute, Inc. Inducible dna binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof
EP3252160B1 (en) 2012-12-12 2020-10-28 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
WO2014093694A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
EP3434776A1 (en) 2012-12-12 2019-01-30 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
ES2553782T3 (es) 2012-12-12 2015-12-11 The Broad Institute, Inc. Ingeniería de sistemas, métodos y composiciones de guía optimizadas para manipulación de secuencias
EP2848690B1 (en) 2012-12-12 2020-08-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
ES2786193T3 (es) 2012-12-12 2020-10-09 Broad Inst Inc Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones enzimáticas mejorados para la manipulación de secuencias
DK2931898T3 (en) 2012-12-12 2016-06-20 Massachusetts Inst Technology CONSTRUCTION AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, PROCEDURES AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH FUNCTIONAL DOMAINS
MX2015007550A (es) 2012-12-12 2017-02-02 Broad Inst Inc Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas.
EP2931899A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
US11332719B2 (en) 2013-03-15 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Recombinant virus and preparations thereof
KR20160034901A (ko) 2013-06-17 2016-03-30 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 서열 조작에 최적화된 ｃｒｉｓｐｒ-ｃａｓ 이중 닉카아제 시스템, 방법 및 조성물
EP3011035B1 (en) 2013-06-17 2020-05-13 The Broad Institute, Inc. Assay for quantitative evaluation of target site cleavage by one or more crispr-cas guide sequences
EP3011033B1 (en) 2013-06-17 2020-02-19 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
DK3011032T3 (da) 2013-06-17 2020-01-20 Broad Inst Inc Fremføring, modificering og optimering af systemer, fremgangsmåder og sammensætninger til målretning mod og modellering af sygdomme og forstyrrelser i postmitotiske celler
SG11201510286QA (en) 2013-06-17 2016-01-28 Broad Inst Inc Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using viral components
DK3011031T3 (da) 2013-06-17 2020-12-21 Broad Inst Inc Fremføring og anvendelse af crispr-cas-systemerne, vektorer og sammensætninger til levermålretning og -terapi
ES2777217T3 (es) 2013-06-17 2020-08-04 Broad Inst Inc Suministro, modificación y optimización de sistemas de guía en tándem, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias
WO2015065964A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
DK3079725T3 (da) * 2013-12-12 2020-01-20 Broad Inst Inc Administration, brug og terapeutiske anvendelser af crispr-cas-systemerne og sammensætninger til genomredigering
KR20160089526A (ko) 2013-12-12 2016-07-27 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 입자 전달 성분을 이용한 표적 장애 및 질병에 대한 ｃｒｉｓｐｒ-ｃａｓ 시스템 및 조성물의 전달, 이용 및 치료 적용
JP6625055B2 (ja) * 2013-12-12 2020-01-08 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 組成物、及びヌクレオチドリピート障害におけるｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ系の使用方法
AU2014361834B2 (en) 2013-12-12 2020-10-22 Massachusetts Institute Of Technology CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products, structural information and inducible modular Cas enzymes
EP3686279B1 (en) 2014-08-17 2023-01-04 The Broad Institute, Inc. Genome editing using cas9 nickases
WO2016049024A2 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling competition of multiple cancer mutations in vivo
WO2016049163A2 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Use and production of chd8+/- transgenic animals with behavioral phenotypes characteristic of autism spectrum disorder
WO2016049258A2 (en) 2014-09-25 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Functional screening with optimized functional crispr-cas systems
WO2016094880A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of crispr systems and compositions for genome editing as to hematopoietic stem cells (hscs)
US20180142236A1 (en) 2015-05-15 2018-05-24 Ge Healthcare Dharmacon, Inc. Synthetic single guide rna for cas9-mediated gene editing
US9790490B2 (en) * 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
CN109153980B (zh) 2015-10-22 2023-04-14 布罗德研究所有限公司 Vi-b型crispr酶和系统
US11788083B2 (en) * 2016-06-17 2023-10-17 The Broad Institute, Inc. Type VI CRISPR orthologs and systems
WO2018107103A1 (en) 2016-12-09 2018-06-14 The Broad Institute, Inc. Crispr-systems for modifying a trait of interest in a plant
US11739308B2 (en) 2017-03-15 2023-08-29 The Broad Institute, Inc. Cas13b orthologues CRISPR enzymes and systems

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"ACCESSION:WP_072319476", NCBI, JPN6022013017, December 2016 (2016-12-01), ISSN: 0004925641 *
MOLECULAR CELL, vol. 65, JPN6022013019, February 2017 (2017-02-01), pages 582 - 584, ISSN: 0004925640 *
MOLECULAR CELL, vol. 65, JPN6022013022, February 2017 (2017-02-01), pages 618 - 630, ISSN: 0004925639 *

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