KR20220007596A - 고도로 기능적인 제조된 abcb5+ 중간엽 줄기 세포 - Google Patents

고도로 기능적인 제조된 abcb5+ 중간엽 줄기 세포 Download PDF

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KR20220007596A
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마르쿠스 하. 프랑크
마르크 안드레아스 클루트
크리스토프 간스
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칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션
티체바 게엠베하
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Abstract

합성 ABCB5+ 줄기 세포의 집단이 제공되며, 여기서 집단의 96.8% 초과는 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손이다. 또한 이러한 합성 세포를 제조하는 방법 및 그의 사용 방법이 제공된다.

Description

고도로 기능적인 제조된 ABCB5+ 중간엽 줄기 세포
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C § 119(e) 하에 "고도로 기능적인 제조된 줄기 세포"라는 명칭으로 2019년 3월 28일에 출원된 미국 가출원 번호 62/825,785 및 "고도로 기능적인 제조된 줄기 세포"라는 명칭으로 2019년 3월 29일에 출원된 미국 가출원 번호 62/826,931을 우선권 주장하며, 이들 가출원 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
제대로 정의되지는 않았지만, 자기-재생 성체 만능성 중간엽 줄기 세포 (MSC)는 진피를 포함한 거의 모든 성체 결합 조직 내에 상주한다 [1, 2]. 그들의 가장 중요한 기능은 틈새 환경을 유지하는 것이며, 이는 조직 항상성, 복구 및 기관 유지에 필수적인 자신의 줄기세포성 및 장기 자기-재생 능력을 보호하기 위한 중요한 요구 사항이다 [3].
P-당단백질 ABCB5로서 공지되기도 한 ATP-결합 카세트 서브패밀리 B 구성원 5, 약칭 ABCB5는 원형질 막 관통 단백질이다 (Allikmets, et al., 1996). 암 환자에서 약물 내성을 일으키는 원인이 되는 것으로 제안된 바 있는 (문헌 [Moitra and Dean, 2011]) ABCB1 (MDR1), ABCB4 (MDR2/3) 및 ABCG2 (Bcrp1, MXR1)와 같은 수송체를 포함한 능동 수송체의 ABC 슈퍼패밀리는 비악성 세포 유형에서 정상적인 세포 수송, 분화 및 생존 기능을 제공한다. 이러한 널리 공지된 ABC 수송체는 줄기 및 전구 세포 집단에서 높은 수준으로 발현되는 것으로 제시된 바 있다. 이들 및 관련 ABC 수송체에 의해 매개되는 형광 염료 로다민123 및 훽스트 33342에 대한 유출 능력은 여러 조직으로부터 이러한 세포 서브세트를 단리하는데 활용되었다.
최근, ATP-결합 카세트, 서브패밀리 B, 구성원 5 (ABCB5)가 시험관내 및 생체내에서 조절 T 세포를 증강시키면서도, MSC 마커를 추가로 발현하고 이펙터 T 세포에 대한 억제 효과를 발휘하는 새로운 진피 면역조정 하위집단을 확인하는 것으로 제시되었다 [5]. ABCB5는 눈의 윤부 줄기 세포에서도 발현되는 다중 약물 내성 세포막 고정 단백질에 속하며, 이 단백질의 부재는 실명을 초래한다 [6].
ABCB5는 부가의 구조 분석에 의해 ABC 수송체 슈퍼패밀리의 새로운 P-당단백질인 것으로 확인되었다 (Frank, et al., 2003). 염색체 7p21-15.3에 위치한 지정된 ABCB5 단백질은 인간 표피 멜라닌 세포 중 CD133을 발현하는 전구 세포를 표시한다. ABCB5 유전자는 19개의 엑손을 함유하고 108 kb의 게놈 DNA에 걸쳐 있다. 추론된 812-아미노산 ABCB5 단백질은 세포외 및 세포내 ATP-결합 도메인 둘 다에 의해 플랭킹된 5개의 막횡단 나선을 갖는다.
P-당단백질 ABCB5는 막 전위의 조절 및 피부 전구 세포의 세포 융합, 로다민-123 유출 수송체로서의 기능 및 인간 피부에서 배양 성장 및 분화에 기여하는 배수체 전구 세포 융합 하이브리드의 표시와 같은 몇 가지 특징과 연관된다. 생리학적 피부 전구 세포에서, ABCB5는 막 과분극을 부여하고, 막 전위의 결정 요인으로서 이러한 세포 하위집단이 미분화 상태를 유지하거나 분화를 겪는 경향을 조절한다 (Frank, et al., 2005, Frank, et al., 2003). 또한 ABCB5-양성 세포는 항염증, 혈관신생 유발 및 면역조정 특성을 갖는 것으로 제시되었다 (Schatton, et al., 2015, Webber, et al., 2017).
ABCB5+ 줄기 세포 집단이 조직으로부터 안정적으로 단리될 수 있고 GMP 표준에 따라 프로세싱되어 고도로 기능적인 합성 줄기 세포를 생성할 수 있다는 것이 본원에 제시된다.
일부 측면에서, 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 집단을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 집단의 96% 초과는 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손이다. 일부 실시양태에서, 집단의 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손이다. 일부 실시양태에서, 집단의 100%는 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손이다.
일부 실시양태에서 집단 내 합성 줄기 세포의 90% 초과가 CD90을 공동-발현한다. 다른 실시양태에서, 합성 줄기 세포의 집단은 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 저산소증 하에 VEGF를 분비할 수 있다. 다른 실시양태에서, 합성 줄기 세포의 집단은 Mi-분극화된 대식세포와의 공동-배양 후 IL-1RA를 분비할 수 있다. 다른 실시양태에서, 합성 줄기 세포의 집단은 단리된 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포에 비해 대식세포 공동-배양에서 감소된 TNF-알파 및 IL-12/IL-23p40 분비 및 증가된 IL-10 분비를 유도한다. 다른 실시양태에서 합성 줄기 세포의 집단은 다능성 분화 능력을 보유한다. 다른 실시양태에서, 합성 줄기 세포의 집단은 내배엽, 중배엽 및 외배엽인 3가지 배아 층 모두로부터 유래된 세포로 분화할 수 있는 능력을 보유한다. 다른 실시양태에서 합성 줄기 세포의 집단은 각막 상피 분화 능력을 보유한다. 다른 실시양태에서, 합성 줄기 세포의 집단은 단리된 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포에 비해 SOX2, NANOG 및 SOX3을 포함한 줄기 세포 마커의 증가된 발현을 나타낸다. 다른 실시양태에서, 합성 줄기 세포의 집단은 단리된 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포에 비해 MCAM, CRIG1 및 ATXN1을 포함한 중간엽 기질 분화 마커의 감소된 발현을 나타낸다. 다른 실시양태에서 합성 줄기 세포 집단의 적어도 5%는 외인성 유전자를 포함한다. 다른 실시양태에서, 합성 줄기 세포 집단의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%는 외인성 유전자를 포함한다. 다른 실시양태에서, 외인성 유전자는 조직-특이적 귀소 인자, 분비된 조직 리모델링 단백질, 성장 인자, 시토카인, 호르몬 및 신경전달물질로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 유전자이다. 다른 실시양태에서 합성 줄기 세포 집단의 적어도 5%는 유전자에서의 변형을 포함한다. 다른 실시양태에서, 합성 줄기 세포 집단의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%는 유전자에서의 변형을 포함한다. 다른 실시양태에서 합성 줄기 세포는 CRISPR RNA-가이드된 뉴클레아제 및 유전자를 표적화하는 gRNA를 포함하는 복합체를 전달함으로써 변형된다. 또 다른 실시양태에서, 변형된 유전자는 ABCB5+ 세포 내 COL7A 또는 결함 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자이다.
일부 측면에서 본 발명은 인간 대상체로부터의 피부 조직으로부터 1차 세포를 단리하는 단계; 세포가 혼합 세포의 60% 초과의 전면생장에 도달하기에 충분한 자손을 생산할 때까지 배양 배지에서 1차 세포를 배양하는 단계, 혼합 세포를 수거하는 단계, 이와 같이 수거된 혼합 세포를 배양하는 단계, 세포 집단이 적어도 99% 제조된 합성 세포에 도달하고 10% 미만이 1차 생리학적으로 발생하는 피부-유래 세포가 될 때까지 적어도 5회 계대를 통해 세포를 재수거 및 배양하는 단계; 및 ABCB5+ 항체를 사용하여 ABCB5-양성 세포를 단리하는 단계에 의해 세포 집단을 제조하는 방법이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16회 계대를 통해 세포를 재수거 및 배양하는 단계를 수반한다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 세포 집단이 적어도 99.99% 제조된 합성 세포에 도달하고 0.01% 미만이 1차 생리학적으로 발생하는 피부-유래 세포가 될 때까지 세포를 재수거 및 배양하는 단계를 수반한다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 세포 집단이 적어도 99.9995% 제조된 합성 세포에 도달하고 0.0005% 미만이 1차 생리학적으로 발생하는 피부-유래 세포가 될 때까지 세포를 재수거 및 배양하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 세포 집단이 적어도 99.999997% 제조된 합성 세포에 도달하고 0.000003% 미만이 1차 생리학적으로 발생하는 피부-유래 세포가 될 때까지 세포를 재수거 및 배양하는 단계를 수반한다. 다른 실시양태에서, 단리 단계는 자성 비드에 접합된 ABCB5 항체를 수반한다. 다른 실시양태에서 세포는 기본 배지로서 햄스 F-10을 사용하여 제조된 배양 배지에서 배양된다. 다른 실시양태에서, 세포 전면생장 및 세포 형태는 각각의 세포 확장 단계에서 평가된다. 다른 실시양태에서, 적어도 3일이 최종 배양과 단리 단계 사이를 이격한다. 다른 실시양태에서, 세포는 EDTA를 사용하여 수거된다.
일부 측면에서 조직 생성을 유도하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단의 분화를 촉진하는 것을 수반하며, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 분화된 조직으로 되는 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손이다.
다른 측면에서, 본 발명은 동계 이식을 갖는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단을 투여하는 것을 포함하는, 동계 이식을 촉진하는 방법이며, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손이다.
다른 측면에서, 본 발명은 말초 동맥 폐쇄성 질환 (PAOD)이 있는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단을 투여하는 것을 포함하는, PAOD를 치료하는 방법이며, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 상기 질환을 치료하는데 유효한 양의 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손이다.
다른 측면에서, 본 발명은 급만성 간 부전 (AOCLF)이 있는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단을 투여하는 것을 포함하는, AOCLF를 치료하는 방법이며, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 상기 질환을 치료하는데 유효한 양의 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손이다.
다른 측면에서 본 발명은 윤부 줄기 세포 결핍증 (LSCD)이 있는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단을 투여하는 것을 포함하는, LSCD를 치료하는 방법이며, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 상기 질환을 치료하는데 유효한 양의 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손이다.
다른 측면에서, 본 발명은 각막 질환이 있는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단을 투여하는 것을 포함하는, 각막 질환을 치료하는 방법이며, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 상기 질환을 치료하는데 유효한 양의 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손이다.
다른 측면에서, 본 발명은 수포성 표피박리증 (EB)이 있는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단을 투여하는 것을 포함하는, EB를 치료하는 방법이며, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 상기 질환을 치료하는데 유효한 양의 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손이다.
다른 측면에서 본 발명은 상처를 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단과 접촉시키는 것을 포함하는, 피부 상처를 치유하는 방법이며, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 상처의 치유를 촉진시키는데 유효한 양의 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손이다. 일부 실시양태에서, 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단은 매트릭스 또는 스캐폴드 상에 시딩된다. 다른 실시양태에서, 매트릭스는 중합체성 메쉬 또는 스펀지, 중합체성 히드로겔, 또는 콜라겐 매트릭스이다.
다른 측면에서, 본 발명은 기관 이식을 받은 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법이며, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 동종이식편 생존을 촉진시키기 위한 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손이다.
다른 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환이 있는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환을 치료하는 방법이며, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 자가면역 질환을 치료하기 위한 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손이다.
다른 측면에서, 본 발명은 간 질환이 있는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 간 질환을 치료하는 방법이며, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 간 질환을 치료하기 위한 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손이다.
다른 측면에서, 본 발명은 신경변성 질환이 있는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 신경변성 질환을 치료하는 방법이며, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 신경변성 질환을 치료하기 위한 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손이고, 여기서 신경변성 질환은 숙주 세포에 대항한 면역 반응과 연관된다.
다른 측면에서, 본 발명은 심혈관 질환이 있는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 심혈관 질환을 치료하는 방법이며, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 심혈관 질환을 치료하기 위한 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손이고, 여기서 심혈관 질환은 조직 리모델링과 연관된다.
다른 측면에서, 본 발명은 신장 질환이 있는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 신장 질환을 치료하는 방법이며, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 신장 질환을 치료하기 위한 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손이다.
다른 측면에서, 본 발명은 염증성 장애가 있는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 염증성 장애를 치료하는 방법이며, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 염증성 장애를 치료하기 위한 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장애는 심혈관 질환, 허혈성 졸중, 알츠하이머병 및 노화로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 측면에서, 본 발명은 염증성 장애가 있는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 근골격 장애를 치료하는 방법이며, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 근골격 장애를 치료하기 위한 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손이다. 일부 실시양태에서 근골격 장애는 유전성 근이영양증이다. 다른 실시양태에서 합성 줄기 세포의 집단은 본원에 기재된 합성 세포이다.
다른 측면에서, 본 발명은 만능성에 의한 세포성 재프로그래밍을 위한 기질로서 청구범위 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 합성 줄기 세포의 집단을 사용함으로써 세포성 재프로그래밍하는 방법이다.
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같고 외인성 PAX6 유전자를 추가로 포함하는 합성 줄기 세포의 집단이다.
본원에 기재된 바와 같은 장애 중 임의의 것을 치료하는 것, 조직 공학, 또는 상처 치유를 위한 본 발명의 줄기 세포 집단의 용도가 또한 본 발명의 측면으로서 제공된다.
본원에 기재된 바와 같은 장애 중 임의의 것을 치료하는 것, 조직 공학, 또는 상처 치유를 위한 본 발명의 줄기 세포 집단의 의약을 제조하는 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 각각의 제한은 본 발명의 다양한 실시양태를 포괄할 수 있다. 따라서, 어느 하나의 요소 또는 요소들의 조합을 수반하는 본 발명의 각각의 제한이 본 발명의 각각의 측면에 포함될 수 있는 것으로 예상된다. 본 발명은 하기 설명에 제시되거나 또는 도면에 예시된 구성 요소의 배열 및 구축의 세부사항에 대한 적용으로 제한되지 않는다. 본 발명은 다른 실시양태가 가능하고 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다. 또한, 본원에 사용된 어구 및 전문 용어는 설명을 위한 것이며 제한적으로 간주되서는 안된다. 본원에서 "포함한", "포함하는" 또는 "갖는", "함유하는", "수반하는" 및 그의 변형의 사용은 이후에 열거된 항목 및 그의 등가물 뿐만 아니라 부가의 항목을 포괄하는 것을 의미한다.
첨부된 도면은 축척에 맞게 그려진 것이 아니다. 본 도면에서, 다양한 도면에 예시된 각각의 동일하거나 거의 동일한 구성 요소는 유사한 번호로 표시된다. 명확성을 위해, 모든 도면에 모든 구성 요소가 표지되지 않을 수 있다. 본 도면에서:
도 1: 합성 줄기 세포의 제조 프로세스를 요약한 플로우 차트.
도 2A-2G: ABCB5+ MSC는 하부 섬유모세포 계통보다는 상부에 속할 수 있다. (2A) 낮은 (2-3) 및 높은 (10 초과) 계대된 ABCB5+-유래 MSC로부터의 샘플 (n=3)의 전사체 프로파일링을 도시하는 히트맵. 색상은 상대적 발현의 log2 스케일을 반영한다. (2B) 초기 및 후기 계대된 ABCB5+-유래 MSC로부터의 줄기세포성의 유지에 수반되는 유전자를 도시하는 히트맵. (2C) 줄기 세포 마커 SSEA-4와 ABCB5의 명확한 공동-국재화가 진피 세포의 별개의 하위집단에서 관찰되었다. (2D-2E) ABCB5 및 "상부 계통" 섬유모세포의 두 마커 단백질에 대한 이중 면역형광 염색을 받은 인간 피부의 현미경 사진은 ABCB5와 DPP4 (CD26)의 공동-발현 및 ABCB5와 PRDM1 (BLIMP1)의 부분적인 공동-국재화를 밝혀내었다. (2F) 줄기 세포 마커 POU5F1 (OCT-4)과 ABCB5의 공동-국재화. (2G) ABCB5는 하부 계통 섬유모세포 및 근섬유모세포 마커 α-평활근 액틴 (α-SMA)과 공동-발현되는 것으로 일관되게 발견되지 않았다. 연구된 모든 피부 절편의 핵은 DAPI로 대조염색되었다. 스케일 바: 50 μm; e = 표피; d = 진피. 점선은 진피 층으로부터의 표피를 묘사한다.
일부 측면에서, 본 발명은 시험관내 제조된 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 집단이다. 이들 세포는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 단리된 1차 세포 집단에 비해 상당한 발전을 나타낸다. 전형적으로 일단 1차 세포가 시험관내에서 단리되고 배양되면, 세포는 원래 1차 세포와 연관된 중요한 특성을 상실한다. 본 발명에 따르면, 적절한 조건 하에, 인간 조직으로부터 단리된 ABCB5+ 줄기 세포가 배양물에서 계대되어 조직으로부터 단리된 원래의 1차 세포와 구조적으로 및 기능적으로 구별되는 세포 집단을 생산할 수 있다는 것이 발견되었다. 이들 세포는 본원에서 합성 또는 제조된 ABCB5+ 줄기 세포로서 지칭된다. 이들 세포는 거의 모든 세포가 인체의 맥락에서 결코 존재하지 않는 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손이 되도록 시험관내에서 제조된다. 오히려, 이들은 새로 정립된 배양 방법에 따라 새롭게 창출된다. 이들 세포 집단은 원래의 1차 세포와 구별되지만, 치료 용도가 많은 고도로 기능적인 만능성 세포이다.
본원에 사용된 바와 같은 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 하기 특성 중 하나 이상을 가지고 있다:
Figure pct00001
CD90 >90%를 공동-발현함;
Figure pct00002
ELISA에 의해 측정된 바와 같이 저산소증 하에 VEGF를 분비할 수 있음;
Figure pct00003
Mi-분극화된 대식세포와의 공동-배양 후 IL-1RA를 분비할 수 있음;
Figure pct00004
대식세포 공동-배양에서 감소된 TNF-알파 및 IL-12/IL-23p40 분비 및 증가된 IL-10 분비를 유도함;
Figure pct00005
다능성 분화 능력을 보유함; 또는
Figure pct00006
상이한 유전자 발현 프로파일을 나타냄.
본 발명의 조성물은 세포 집단이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포 집단"은 적어도 2개, 예를 들어 2개 이상, 예를 들어 1개 초과의 합성 ABCB5+ 줄기 세포를 포함하는 조성물을 지칭하며, 달리 명시되지 않는 한 순도의 임의의 수준 또는 다른 세포 유형의 존재 또는 부재를 의미하지 않는다. 예시적인 실시양태에서, 집단은 다른 세포 유형이 실질적으로 없다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 집단은 명시된 세포 유형의 적어도 2개의 세포를 포함하거나, 또는 예를 들어, 상기 열거된 바와 같은 명시된 기능 또는 특성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 합성 줄기 세포는 감소된 TNF-알파 및 IL-12/IL-23p40 분비를 유도한다. 세포의 이러한 특성은 항염증 기능에 중요하다. 이러한 시토카인의 결과로서, 세포는 수많은 염증성 질환을 치료하는데 유용하다. 다른 실시양태에서, 세포는 대식세포 공동-배양에서 증가된 IL-10 분비를 초래한다. IL-10의 생산은 합성 줄기 세포의 관용성 기능을 지원하는데 중요하다.
본 발명의 세포는 또한 다능성 분화 능력을 보유한다. 다시 말해서, 이들 세포는 중간엽 기질 세포 (지방형성, 연골형성, 골형성 분화) 뿐만 아니라 3가지 배아 층 모두로부터 유래된 세포로의 분화를 포함하여 다른 능력을 정의한다: 즉, 1. 내배엽 (예를 들어 혈관신생 - 예를 들어 관 형성, CD31 및 VEGFR1 발현), 2. 중배엽 (예를 들어 근육발생 - 예를 들어, 스펙트린, 데스민 발현) 및 3. 외배엽 (예를 들어 신경발생 - 예를 들어 Tuj1 발현).
더욱이, 시험관내 제조된 세포는 각막 상피 분화 능력 (예를 들어 KRT12 발현)을 보유하며, 이는 생체내에서 윤부 줄기 세포 결핍증 및 다른 각막 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 중요하게도, 이러한 합성 세포 집단에서의 KRT12의 존재는 이들 세포에 각막 장애를 치료할 수 있는 독특한 능력을 제공한다. 이러한 인자는 종종 인간 조직으로부터 단리된 줄기 세포 집단에서 누락된다. 이들 단리된 인간 세포를 사용하여 각막 질환을 치료하기 위해서는 세포에 KRT12를 부가해야 한다는 제안이 있었다.
본 발명의 합성 세포는 또한 인간 조직으로부터 단리된 1차 줄기 세포에 비해 뚜렷한 유전자 발현 프로파일을 갖는다. 도 2를 포함하여 본원에 미리 설정된 실시예에 제시된 바와 같이, 합성 세포 (높은 계대로부터 단리된 ABCB5+ 세포로서 지칭되기도 함)의 집단은 1차 세포 (살아있는 유기체에서 발견된 천연 ABCB5+ 세포를 함유하는 낮은 계대 배양으로부터 유래된 세포)와 상이하다. 예를 들어, 특정 줄기 세포 마커는 높은 계대 세포, 예를 들어 SOX2, NANOG 및 SOX3에서 증가하는 반면, 특정 중간엽 기질 분화 마커는, 예를 들어 MCAM, CRIG1 및 ATXN1에서 감소된다. 단백질 수준에서 인간 피부의 ABCB5+ 세포에서의 선택된 줄기세포성 마커 예컨대 SSEA-4, DPP4 (CD26), PRDM1 (BLIMP1) 및 POU5F1 (OCT-4)의 발현은 면역염색에 의해 확인되었다. 반면, 인간 피부의 ABCB5+ 세포에는 하부 섬유모세포 계통 마커인 α-평활근 액틴 (α-SMA)의 발현이 없었다. 이들 데이터는 이러한 후기 계대 합성 세포가 ABCB5+ 세포의 만능성 특성을 유지하고 심지어 원래 세포에 비해 향상된 특성을 갖는다는 발견을 뒷받침해준다.
본원에 기재된 방법은 고도로 순수한 합성 세포 집단을 초래한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 세포의 100%는 합성이고, 세포의 0%는 인간 조직으로부터 유래한다. 본 발명의 프로세스는 최대 16회의 계대를 허용하며, 이는 25회의 세포 배가와 동일하다. 따라서 시험관내에서 합성된 세포의 백분율은 하기 공식으로 추정되는, 각각의 계대에서 적어도 하기와 같아야 한다:
[1 - 1/(2n)] x 100%, 여기서 n은 각각의 계대에 대한 2배 수임 (즉, 계대 16의 경우 25, 또는 계대 수 x의 경우 x/16 x 25).
제2 및 제3 계대에서는, 세포의 구조가 변화하기 시작한다. 예를 들어, 상기 논의되고 본 실시예에 제시된 유전자 발현 프로파일링에서의 데이터는 낮은 계대 (2 내지 3)에 대해 제시되었다. 따라서, 3의 비교적 낮은 계대 (3/16 x 25 = 4.6875 배가)는 시험관내 제조되거나 또는 합성 세포의 적어도 96.12%를 초래할 것이다. 적어도 10/16x25 = 15.625 배가를 수반한 높은 계대 (>10 계대 배양)는 시험관내 제조되거나 또는 합성 세포의 적어도 99.998%를 초래할 것이다. 25의 배가로 본원에서 시험된 가장 높은 계대된 세포 집단 (16회 계대)은 시험관내 제조되거나 또는 합성 세포의 적어도 99.999997%를 초래할 것이다.
줄기 세포는 또한 대칭적 및 비대칭적으로 분열할 수 있기 때문에, 고도로 계대된 세포는 100% 합성 세포에 도달할 수 있다. 프로세스에서의 전형적인 계대 범위는 6회 (9.375 배가) 내지 최대 16회 계대 (25 배가)이며, 즉 산물의 합성 순도의 범위는 전형적으로 [1 - 1/(29.375)] x 100% 내지 [1 - 1/(225)] x 100%, 즉 99.85 내지 99.999997%이다.
세포 제조 프로세스
세포의 제조 및 프로세싱은 GMP와 일치하는 지침 및 표준에 따라 수행된다. 제조 프로세스는 클린룸 환경에서 수행될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 생산된 제조된 세포는 액체 질소의 기체 상태 (≤ -130℃)에서 냉동보존 및 저장된다.
기본 제조 프로세스는 전형적으로 하기 4가지 단계를 수반한다: 조직 조달; 피부 조직의 프로세싱; 세포의 증식; 및 ABCB5-양성 세포의 단리. 피부 조직은 복부성형술 (또는 피부 조직이 남게 되는 다른 의학적 개입)과 같은 인간의 외과적 표본으로부터 채취할 수 있다. 피부 공여자 조직 (≥ 10 cm2)으로 시작하여 본원에 개시된 합성 줄기 세포를 생산하는데 필요한 제조 단계를 묘사하는 일반적인 플로우 차트가 도 1에 제시되어 있다. 인 프로세스 및 방출 제어는 오렌지색으로 표시된다. T25, T75, T175는 세포 배양 플라스크의 성장 영역 및 연관 명칭을 지칭한다 (cm2). 냉동은 액체 질소의 기체 상태에서 세포를 극저온 저장하는 것을 지칭한다. BC는 바코드부착된 냉동 바이알이다. mCcP는 세포성 산물의 미생물학적 제어를 지칭한다. 부가적으로, 피부의 콜라게나제/트립제안(TrypZean) 해리 [%], 세포 형태, 계대 사이의 시간, 전면생장, 트립제안 적용 후 세포의 분리, 인큐베이션 시간을 포함한 다른 인 프로세스 제어 (IPC)를 활용할 수 있다.
한 번의 단리 (항체-커플링된 자성 비드 사용)로부터 생성된 ABCB5-양성 세포가 "단일 배치"로서 지칭된다. 병렬 단리 (동일한 피부 조직으로부터 유래되고 동일한 계대 수 및 시간에서 단리됨)로부터 생성된 단일 배치를 풀링하고 ("마스터 배치" 생성), 적어도 2 x 106개 세포/바코드부착된 냉동 바이알 (BC)을 함유하여 냉동보존시킨다. 제조 프로세스와 병행하여, 모든 단계 뿐만 아니라 사용된 시약 및 중요 재료의 모든 로트 번호가 구체적 배치 문서에 문서화되어 있다. 고유 BC-번호, 고유 배치 번호 및 저장 위치 (질소 탱크 내)의 명확한 할당을 통해 생산된 세포 배치를 명확하게 할당할 수 있다. 이러한 속성은 배치 문서와 부가적으로 각각의 질소 저장 탱크의 '저장 위치 목록'에 문서화되어 있다.
조직 조달:
출발 물질은 전문화된 제거 센터에서 시행되는 복부성형술 또는 다른 의학적 개입과 같은 외과적 절차로부터 남은 피부 조직이다.
피부 조직의 프로세싱
피부는 그 크기가 결정되기 전에 과도한 피하 지방으로부터 제거된다 (피부 크기는 ≥ 10cm2이어야 한다). 그런 다음 피부를 동일한 절편 (각각 약 2.5cm2)으로 커팅한다. 프로세스 일당 최대 30개 조각이 프로세싱될 수 있다 (나머지 조각은 프로세싱될 때까지 HTS-FRS 생검 수송 용액에서 +2 - +8℃ 하에 저장된다). 두 조각을 각각 조합하여, 프로세스 일당 전체 여러 가지 준비 작업을 병렬로 수행할 수 있다. 소독을 위해, 피부 조각을 먼저 수성 포비돈-아이오딘 용액 [브라우놀(Braunol)®]에서 인큐베이션한 다음, 실온 (RT)에서 알콜-기반 포비돈-아이오딘 용액 [브라우노덤(Braunoderm)®]에서 인큐베이션한다. 이후, 각각의 세척 단계마다 PBSCa/Mg를 사용하여 피부 조직을 3회 세척한다. 피부는 가위와 핀셋을 사용하여 해부된다. 그 결과로 생성된 피부 조각은 콜라게나제 효소를 사용하여 추가로 해리된다: 피부 샘플은 콜라게나제/PBSCa/Mg/Pen/Strep 용액에서 1.5 - 6시간 동안 37℃에서 인큐베이션한다 (IPC). 인큐베이션 기간 후 소화 효율은 60% 초과여야 하며 (IPC) 시각적으로 결정된다. 피부-세포 용액을 여과하고, 잔류 피부를 비-동물성 재조합 트립신 [트립제안®; 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich)]을 사용하여 37℃에서 10 - 60분 동안 추가로 인큐베이션한다 (IPC). 필터 관류 뿐만 아니라 반복적으로 여과된 트립제안 처리된 잔류 피부 (소화 효율: > 85%, 시각적으로 결정됨) (IPC)를 원심분리 (500 x g, RT에서 5분)하여 세척한다. 원심분리 후, 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 줄기 세포 배지 (15% FCS, 2 mM L-글루타민, 0.6 ng/ml bFGF/FGF-2, 6 mM HEPES, 2.8 μg/ml 히드로코르티손, 10 μg/ml 인슐린, 1.12 mg/ml 글리코스, 6.16 ng/ml PMA, 0.5 μg/ml 암포테리신 및 1 x Pen/Strep로 보충된 햄스 F10)에 재현탁한다. 세포를 풀링하고, 최대 30개 웰의 C6-세포 배양 플레이트 상에 균등하게 분배하고, 세포 배양 인큐베이터 (CO2 함량: 3.1%, 습도: 90%, 온도: 37℃)에서 인큐베이션한다.
세포의 증식 (혼합 세포 배양)
혼합 세포 배양은 단리 전에 ABCB5-양성 및 ABCB5-음성 세포로 이루어진 분리되지 않은 세포 배양으로서 정의된다.
세포 전면생장 (훈련된 직원에 의해 시각적으로 결정됨)의 첫 번째 평가는 C6-웰에서 1차 피부 세포를 배양한 후 1 내지 4일 (IPC)에 이루어진다. 전면생장이 < 70% (IPC)이면, 배양 배지를 교체하고, 세포를 C6-웰에서 추가로 배양한다. 세포가 ≥ 70% 전면생장 (IPC)에 도달할 때까지 이러한 절차를 반복한다. 1차 피부 세포는 초기 4 - 6일 (IPC) 동안만 항생제/항진균제 함유 배양 배지에 보관된다는 점에 유의해야 한다. 이러한 초기 기간 후에는, 세포를 무항생제 배지에서만 배양한다. 또한, C6-웰에서의 최대 배양 시간은 16일 (IPC)이다. 세포가 이러한 기간 내에 전면생장 ≥ 70% (IPC)에 도달하지 못하면, 이들 세포는 폐기된다.
≥ 70% (IPC)의 표적 전면생장에 도달하면, 트립제안®을 사용하여 세포를 수거하고 추가 확장을 위해 T25 플레이트에서 배양한다. 세포 전면생장은 계대 후 1 - 4일 (IPC)에 다시 결정된다. 세포 전면생장이 < 70% (IPC)이면, 배지를 교체하고 T25 용기에서 총 7일 (IPC)까지 추가로 인큐베이션한다 (세포 전면생장이 다시 < 70%이면, 세포를 폐기한다) (IPC). 7일 이내에 세포 전면생장이 ≥ 70%에 도달하면, 트립제안®을 사용하여 세포를 수거하고 확장을 위해 T75 플레이트에서 배양한다. 이러한 시점에서는, 2.6.7. E.P.에 따른 미코플라스마 시험을 위한 샘플을 채취한다 (IPC). 추가의 세포 확장은 동일한 방식을 따른다.
MK 냉동보존
트립제안을 사용하여 세포를 수거하고 세포 카운트와 활력을 결정하기 위해 세포 샘플을 채취한다. 세포 현탁액을 원심분리하고, 세포를 DMSO-함유 냉동배지 CS10 (DMSO를 함유하는 동결 배지)에 재현탁시킨다. 미코플라스마 시험을 위한 샘플은 세포가 결정된 세포 카운트에 따라 규정된 수의 바코드 표지된 냉동 튜브 ("BC")로 옮겨지기 전에 채취된다. MK의 냉동보존을 위해서는 적어도 8 x 106개 세포가 필요하다. 최소 하나의 BC (더 높은 세포 수에서 더 많음)는 5 - 12 x 106개 세포로 채워진다 (최종 세포-CS10 용액 용적은 1.5 ml이다). 더욱이, 혼합 1차 배양물의 무균성을 결정하기 위해, mCcP를 시험하기 위한 세포 샘플을 채취한다.
계대배양
잔류 4 x T175 플라스크는 세포를 16 x T175 배양 플라스크로 통과시키는데 사용된다. 이러한 16 x T175 플라스크는 ABCB5-양성 세포 (합성 줄기 세포)를 단리하는데 사용된다. 첫 번째 단리의 경우, 마지막 계대 이후의 시간은 3 - 10일이어야만 하며, 세포가 특정 전면생장에 도달해야만 한다. 일반적으로, 추가 생산 단계를 시작하려면 전면생장이 40% - 95%일 필요가 있다.
ABCB5-양성 세포의 단리를 위해 16 x T175 플라스크 중 12개가 사용된다. 나머지 4 x T175 용기의 세포는 최대 계대 수 16에 도달하거나 또는 세포 형태가 변경되거나 (예를 들어, 보다 분화된 세포 형태) 또는 세포가 노화될 때까지, 그 다음 라운드의 합성 줄기 세포 단리를 위해 세포를 성장시키기 위해 이미 기재된 바와 같이 16 x T175 플라스크에 분배된다.
ABCB5-양성 세포 (합성 줄기 세포)의 단리
단리 프로세스는 2개 부분으로 나눈다:
Figure pct00007
ABCB5-양성 세포의 자성 단리 - ABCB5-양성 세포의 단일 배치의 생성
Figure pct00008
동일한 계대 수를 가진 하나의 공여자의 단일 배치의 풀링 (동일한 피부 조직으로부터 유래한 병렬 세포 단리 - 마스터 배치의 생성)
ABCB5-양성 세포의 자성 단리
(16 x T175 플라스크의) 세포가 75% - 95%의 전면생장에 도달하면, 12 x T175 플라스크의 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척한다. 부가적으로, 미코플라스마 오염가능성을 결정하기 위해 샘플을 채취한다. 수거를 위해, 세포의 > 90%가 배양 용기로부터 분리될 때까지 세포를 37℃에서 20 - 30분 동안 베르센(Versene)® (PBS 중 0.02% EDTA)과 함께 인큐베이션한다. 트립제안 처리로 인해 항체-기반 세포 단리에 필요한 에피토프가 상실되기 때문에, 이러한 프로세스 단계의 경우에는 베르센이 트립제안 대신 사용된다. 세포는 PBS를 세포 현탁액에 부가하여 희석한 다음, 실온에서 500 x g 하에 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 제거하고 모든 세포를 총 14 ml HRG (49.5 Vol/5% HSA의 %/49.5 Vol/% 링거 락테이트/1 Vol/40% 글루코스의 %) 용액에 재현탁하고 50-ml 반응 튜브로 옮겼다. 샘플을 제거하고 세포 카운트 및 활력의 결정을 위해 품질 관리 부서로 이전하고, 세포 주기 분석을 위해 샘플 (106개 세포)을 옮긴다.
400 μl ABCB5-표적화 항체-접합된 자성 비드를 세포에 부가하고 HRG를 사용하여 최종 용적을 16 ml로 조정한다. 항체-표지된 비드-세포 혼합물을 샘플 회전기를 사용하여 실온에서 20분 동안 인큐베이션한다.
29 ml의 HRG를 용액에 부가하고 샘플을 자석에서 인큐베이션하여 자성 비드를 용기 벽에 4분 동안 끌어당긴다. 이러한 인큐베이션 기간 후에, 주로 ABCB5 음성 또는 낮은 발현 세포를 함유하는 상청액을 조심스럽게 제거한다. 나머지 항체-비드-세포 혼합물은 45 ml HRG 용액을 사용하여 세척된다. ABCB5 함량 결정을 위해 샘플을 제거하고 (비드-세포 혼합물), 품질 관리 부서로 이전한다 (방출 파라미터).
나머지 용액은 자석에서 추가로 4분 동안 인큐베이션한다. 상청액을 버린 후, 3 ml의 분리 용액 (트립제안)을 부가하여 ABCB5 양성 세포로부터 항체-표지된 비드를 효소적으로 제거한다. 이는 트립제안 처리가 항체 결합된 에피토프의 비특이적 제거 (펩티드 절단)를 초래하므로 세포로부터 항체-비드의 분리로 이어지기 때문에 가능하다.
37℃에서 3분 동안 인큐베이션한 후, 반응 튜브에 HRG 용액 3 ml를 부가하고 다시 자석 위에 올려놓고 6분 동안 자성 비드와 결합시킨다. 분리된 ABCB5 양성 세포를 함유하는 상청액을 신선한 15 ml 반응 튜브로 옮긴다. 50 ml 반응 튜브는 3.5 ml HRG 용액을 부가함으로써 2회 세정하고, 4분 동안 자석 인큐베이션한다. 그런 다음 상청액을 또한 신선한 15 ml 튜브로 옮긴다.
잔류 비드로부터 ABCB5 양성 세포를 추가로 정제하기 위해, 이들 세포를 다시 4분 동안 자석에 고정시킨다. 상청액 (13 ml 세포 현탁액)을 새로운 15 ml 반응 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 및 500 x g 하에 원심분리한다. 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 10 ml HRG 용액에 재현탁하고, 세포 현탁액을 새로운 15 ml 반응 튜브로 옮기기 전에 6분 동안 자석에서 다시 인큐베이션한다. 미코플라스마 시험 (방출 파라미터) 및 단리된 ABCB5-양성 세포의 세포 카운트의 결정 (IPC)을 위한 샘플을 채취하여 품질 관리 부서로 이전한다. 용액을 실온에서 5분 동안 및 500 x g 하에 원심분리한다. 상청액을 버리기 전에, 100 μl를 내독소 결정 (방출 파라미터)에 사용되는 내독소가 없는 튜브로 옮긴다 (내독소가 없는 피펫 팁을 사용함). 나머지 상청액도 조심스럽게 제거한다.
마스터 배치를 생성하기 위한 풀링 단계
마스터 배치 (합성 줄기 세포의 하나의 최종 배치)는 하기와 같은 단일 배치로 이루어진다:
Figure pct00009
동일한 출발 물질 (동일한 공여자)로부터 유래됨
Figure pct00010
동일한 계대 수로 동일자로 병렬로 단리됨.
단일 배치의 세포 펠릿을 CryoStorTM CS10에 재현탁시킨다. CS10의 총량과 바코드 튜브 (BC)의 연관 수는 이용가능한 세포 수에 따라 다르다. 각각의 BC는 CS10에서의 1.5 ml 세포 현탁액으로 채워진다.
바이알은 최소 2 x 106개 세포 (2 - 18 x 106개 세포/BC)로 채워진다. BC를 동결시키기 전에, 하나의 BC가 "QC를 위한 분석 BC"로서 선택되고 (BC-번호 1) 하기 샘플이 제거되어 분석 시험를 위해 품질 관리 부서로 이전된다 (방출 시험):
Figure pct00011
세포 카운트 및 활력
Figure pct00012
생육력, CD90 공동-발현, 비드 잔류물
Figure pct00013
세포성 산물의 미생물학적 제어 (mCcP).
BC-튜브는 제어 속도 냉동고 (동결 속도: -100℃까지 1℃/min, -150℃까지 5℃/min)를 사용하여 -150℃로 동결되고, 방출될 때까지 검역 저장 탱크로 옮겨진다.
3가지 효력 검정 (관 형성 검정, VEGF ELISA 및 IL-1RA ELISA)을 모두 시행하기 위해, "QC를 위한 분석 BC"를 품질 관리에 의해 해동하고 검정 시험을 위한 세포 샘플을 채취한다.
이러한 경우, 냉동보존된 혼합 배양액 (MK)을 해동하여 추가 세포 생산에 사용할 수 있다. 따라서, 하나의 단일 피부 조직으로부터 많은 양의 ABCB5-양성 세포를 단리하여 임상용 "바이오뱅크"를 만들 수 있다.
이러한 방법으로 생산된 합성 줄기 세포는 하기 사양을 갖는 것으로 결정되었다:
Figure pct00014
이들 사양을 평가하는데 사용되는 분석 절차는 하기에 더 자세히 기재되어 있다.
1. mCcP (세포성 산물의 미생물학적 제어)
산물 합성 줄기 세포의 무균 시험을 위해 "mCcP" 방법이 사용된다. 샘플링 및 프로빙은 제조 부서의 숙련된 직원에 의해 층류 후드 아래 클린룸 시설 내에서 수행된다. 인큐베이션 및 분석은 상기 부서의 숙련된 직원에 의해 수행된다.
절차의 설명:
산물의 총 최종 용적의 1%가 mCcP 시험에 사용된다. mCcP 시험를 위한 2x15 μl는 각각의 단리된 합성 줄기 세포 배치의 각각의 냉동 바이알 (1.5 ml)로부터 직접 취한다.
mCcP는 BacT/Alert 3D 60 시스템 [비오메리으(Biomerieux)]으로 수행된다. BacT/Alert 3D 60 시스템은 60개의 개별 샘플 내에서 동시에 인큐베이션하고 오염을 검출할 수 있는 능력을 가진 2개의 모듈, 즉 1개의 컨트롤러 모듈과 1개의 인큐베이터 모듈로 이루어진다. 배지 함유 병을 진탕 메커니즘이 장착된 인큐베이터 모듈에 배치한다.
하기 배양 배지 (병에 제공됨)가 사용된다:
Figure pct00015
BPA (호기성): 산소 중 CO2의 40 ml 보충된 TSB 대기
Figure pct00016
BPN (혐기성): 질소 중 CO2의 40 ml 보충된 TSB 대기
mCcP 시험의 경우, 시험 물질 15 μl를 BPN 또는 BPA 플라스크 각각에 옮긴다.
샘플의 크기가 매우 작기 때문에, NaCl-펩톤 완충 용액으로 4 ml 용적이 되도록 희석시킨다. mCcP 시험를 위해, 4 ml 샘플 용액 (15 μl 세포/CS10 용액 함유)을 멸균 주사기를 사용하여 BPA 및 BPN 병에 주사한다. 각각의 배양 병 바닥에 있는 특수 액체 에멀젼 센서 (LES)는 미생물에 의해 생산되는 바와 같은 CO2에서의 상승으로 인해 pH가 변할 때 색상이 눈에 띄게 변한다 (회색에서 황색으로 변함). BacT/ALERT® 3D 기기는 10분마다 색상 변화를 측정하고 변화를 분석한다. 일단 성장이 검출되면, 시스템은 청각적 및 시각적 경보 둘 다를 울리고 샘플 데이터를 기록한다.
민감한 절차로 7일 이내에 정확한 진술이 가능하다. 이러한 시간이 지나면 모든 음성 프로브에 대해 고체 배양 배지 상으로의 시딩이 수행된다. 더욱이, 모든 양성 샘플은 일반적으로 검출 순간에 고체 배양 배지 상으로 시딩된다.
샘플링을 위한 계획된 진행
계획된 샘플링 절차의 경우, mCcP에 대한 샘플 크기 계산은 냉동 바이알의 용적 대신 총 배치 용적을 기반으로 하며 전체 샘플 용적은 하나의 전용 장치로부터 가져온다.
산물의 총 최종 용적의 적어도 1%가 mCcP 시험에 사용된다. 이는 mCcP 시험를 위한 100 μl (총 산물 용적 ≤ 10ml) 또는 총 산물 용적의 1% (용적 > 10 ml)를 합성 줄기 세포 배치의 "QC를 위한 분석 BC" (BC-번호 1)로부터 직접적으로 취한다는 것을 의미한다.
작은 샘플 크기는 NaCl-펩톤 완충 용액으로 4 ml의 용적이 되도록 희석시킨다 (E.P.에 따름). mCcP 시험를 위해 4 ml 샘플 용액 (100 μl - 300 μl 세포/CS10 용액 함유)을 멸균 주사기를 사용하여 BPA 및 BPN 병에 주사한다.
인큐베이션 시간 후에, 미생물학적 성장이 검출되지 않을 수 있다. 이러한 허용 기준이 충족되면, 산물은 사양 파라미터인 "세포성 산물의 미생물학적 성장"의 "성장 없음" 요구 사항을 충족시킨다.
2. 미코플라스마 시험
산물 합성 줄기 세포의 미코플라스마 시험를 위해 qPCR 방법이 수행된다. 정량적 실시간-PCR 기반 미코플라스마 시험를 위해, 열거된 모든 미코플라스마 종에 대한 검출 한계, 세포 배양물의 특이성과 견고성 및 자가 세포 이식과 관련하여 제조업체 [미네르바 바이오랩스(Minerva Biolabs)]에 의해 검증된 마이크로사르트(Microsart)® ATMP 미코플라스마 키트 (미네르바 바이오랩스)가 사용된다. 미코플라스마 검출은 미코플라스마 게놈 내의 16S rRNA-코딩 영역인 고도로 보존된 RNA-오페론의 증폭 및 검출을 기반으로 한다.
미코플라스마 qPCR의 수행을 위해, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)로부터의 스텝원(StepOne)™ 실시간 PCR 시스템이 사용된다.
미코플라스마 시험를 위해, 200 μl 세포 현탁액은 세포의 풀링 및 냉동보존 이전에 자석에 대한 마지막 세척 단계 동안 ABCB5-양성 세포를 단리한 후 채취한다. 샘플을 원심분리 (13000 rpm, 15분)한 후, 펠릿을 200 μl 트리스 완충액에 현탁시킨다.
샘플에 내부 대조군 DNA를 스파이킹하고 게놈 DNA를 마이크로사르트 AMP 추출 키트를 사용하여 단리한다. 10 μl의 단리된 DNA는 48-웰 플레이트에서 수행되는 qPCR에 사용된다. qPCR은 감도에 대한 표준으로서 미코플라스마 종 미코플라스마 오랄레(Mycoplasma orale) (MO), 미코플라스마 페르멘탄스(Mycoplasma fermentans) (MF) 및 미코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae) (MP)에 대한 내부 단리 대조군 및 10 CFUTM 감도 표준 뿐만 아니라 양성 및 음성 대조군 (마이크로사르트® ATMP 미코플라스마 키트에 의해 제공됨)을 포함한다.
qPCR 결과의 분석이 수행된다. 음성 대조군은 Ct-값 ≥ 40을 나타내야만 하고, 양성 대조군 뿐만 아니라 감도 표준은 Ct-값 < 40을 나타내야만 한다. 프로세스로부터 채취한 샘플은 Ct-값 < 40인 미코플라스마 양성 및 Ct-값 ≥ 40인 미코플라스마 음성이다.
시험된 세포 현탁액에서, 미코플라스마 DNA의 증폭이 검출가능하지 않을 수 있다 (검출 한계 10 CFU/ml). 이러한 허용 기준이 충족되면 (마스터 배치의 모든 단일 배치에 대함), 그 산물은 사양 파라미터 "미코플라스마"의 "검출가능하지 않음, < 10 CFU/ml" 요건을 충족한다.
3. 내독소 수준
내독소 수준의 정량적 결정을 위해, 발색-역학 LAL-시험이 사용된다. 이것은 정량적 측광 방법이다. 측정은 엔도세이프(Endosafe)®-PTS™ 및 매칭 LAL-카트리지 [둘 다 찰스 리버 래버러토리(Charles River Laboratories)로부터의 것]를 사용하여 수행된다. 엔도세이프®-PTS 카트리지는 약리학적 산물의 인 프로세스 제어 및 산물 최종 제어를 위한 LAL-시험 방법으로서 FDA 승인을 받았다. 내독소 시험은 용해물의 제조업자가 권장하는 37℃ ± 1℃의 인큐베이션 온도에서 수행된다. 각각의 카트리지는 규정된 양의 FDA 승인 LAL-시약, 발색 기질 및 내독소 표준 대조군 (CSE)을 함유한다.
ABCB5-양성 세포의 단리, 항체-비드 복합체로부터의 분리 및 세포의 원심분리 후, 100 μl 상청액을 내독소 시험를 위해 취하고 LAL 시약 물 (LRW-물)로 1:10이 되도록 희석한다. 각각의 측정에 대해 25 μl 샘플을 LAL-카트리지 (엔도세이프®-PTS™에 삽입됨)의 4개 샘플 저장소 각각에 피펫팅한다. PTS™ 판독기는 2개의 채널 각각에서 LAL-시약 (샘플 채널) 또는 LAL-시약 및 양성 대조군 (스파이크 채널)과 샘플을 혼합한다. 인큐베이션 및 발색 기질의 부가 후, 각각의 웰의 광학 밀도는 동역학적으로 분석되고 내부 배치-특이적 표준 곡선을 기반으로 측정된다.
중복 결정의 평가는 두 측정 간의 반응 시간의 변동을 계산함으로써 수행된다. 중복 측정의 반응 시간의 변동이 25 퍼센트 미만이면, 내독소 측정이 유효한 것으로 간주된다.
사양에 따라, 측정된 샘플에 의해 내독소 수준 ≤ 2 EU/ml를 달성해야만 한다 (마스터 배치의 모든 단일 배치에 대함).
4. 세포 카운트 및 세포 활력
세포 카운트 및 세포 활력의 결정을 위한 자동화 방법은 유동 세포측정법을 사용하여 수행된다. 유동 세포측정법 (BD AccuriTM C6 유동 세포측정기)은 세포 현탁액 중의 살아있는 세포를 정량화하는 신속하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다. 세포 활력을 평가하는 한 가지 방법은 염료 배제를 사용하는 것이다. 살아있는 세포는 생육불가능한 세포의 손상된 투과성 막을 쉽게 관통하는 다양한 염료를 배제한 무손상 막을 가지고 있다.
프로피듐 아이오다이드 (PI)는 일반적으로 생육성 세포로부터 제외되지만 죽어가거나 죽은 세포의 세포막을 투과할 수 있는 막 불투과성 염료이다. 그것은 염기쌍 사이에 삽입되어 이중 가닥 DNA와 결합한다. PI는 488 nm에서 여기되고, 상대적으로 큰 스톡스 이동으로 최대 파장 617 nm에서 방출된다.
세포 카운트 뿐만 아니라 활력의 결정은 합성 줄기 세포를 단리한 후 냉동보존 직전에 수행된다.
분석을 위해 10 μl 세포 현탁액을 냉동 바이알로부터 1.5 ml 반응 튜브 (80 μl 베르센 함유)로 피펫팅하고 품질 관리 부서에 전달한다. 10 μl PI 용액 (1 mg/ml)을 부가한 후, 베르센을 사용하여 총 용적을 500 μl로 조정하고 작업 지시에 따라 BD AccuriTM C6 유동 세포측정기로 측정을 수행한다. 각각의 측정 실행은 55 μl 샘플 용액으로 수행된다. 세포 카운트와 활력이 계산되고 시험 보고서에 문서화된다.
세포 활력에 대해 명시된 허용 기준은 ≥ 90%이다. 단리된 합성 줄기 세포의 각각의 배치의 세포 카운트에 대한 명시된 허용 기준은 2x106 내지 18x106개 세포/냉동 바이알이다.
5. 세포 생육력
세포 생육력의 결정을 위한 자동화 방법은 유동 세포측정법을 사용하여 수행된다. 생육력을 결정하기 위해, 세포를 칼세인-AM (칼세인 아세톡시메틸에스테르)으로 염색한다. 칼세인 AM은 무손상의 살아있는 세포에 쉽게 침투하는 비-형광성 소수성 화합물이다. 세포에 들어가면, 세포내 에스테라제는 아세톡시메틸 (AM) 에스테르 기를 절단하여, 세포질에 잘 유지되는 친수성의 강한 형광성 화합물인 칼세인을 생산한다.
손상된 세포막을 가진 아폽토시스 및 죽은 세포는 칼세인을 보유하지 않는다. 칼세인은 495 nm에서 최적으로 여기되고 515 nm의 피크 방출을 갖는다.
세포의 냉동보존 직전에 단리된 ABCB5-양성 세포 (합성 줄기 세포)에 대해 세포 생육력 측정을 수행한다. 세포 생육력은 살아있는 세포와 죽은 세포만을 구별하는 PI를 이용한 세포 활력 결정과 달리 단리된 세포의 실제 대사 활성에 관한 정보를 제공한다.
측정을 위해 100 μl 세포 현탁액 (냉동배지 CS10 중)을 냉동 튜브로부터 취하고, 1 ml 베르센 (0.02% EDTA)을 함유하는 1.5 ml 반응 튜브로 옮기고 품질 관리 부서에 전달한다. 샘플은 최대 2시간 동안 2-8℃에서 저장할 수 있다. 샘플 제조를 위해, 세포를 원심분리하고 (5분, 1500 rpm), 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 200 μl 베르센에 재현탁시킨다. 2 μl 칼세인-AM (1:200 희석됨, f.c. 0.1 μM) (및 1 μl CD90-항체)을 부가한 후 샘플을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 1 ml 베르센으로 세척 단계를 수행하고, 원심분리 (5분, 1500 rpm) 및 200 μl 베르센에서의 펠릿의 재현탁을 수행한다. 세포 생육력의 측정은 BD AccuriTM C6 유동 세포측정기로 수행된다. 생육력은 검출된 칼세인 형광을 사용하여 계산되고 시험 보고서에 문서화된다.
세포 생육력에 대해 명시된 허용 기준은 ≥ 90%이다.
6. CD-90 표면 마커
단리된 ABCB5+ 세포가 실제로 줄기 세포임을 제시하기 위해, 중간엽 줄기 세포 마커인 표면 단백질 CD90의 발현을 유동 세포측정법 (BD AccuriTM C6 유동 세포측정기)으로 분석하였다. CD90의 검출을 위해 CD90에 대항하여 유도된 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® 647-접합된 항체가 사용된다. 알렉사 플루오르® 647 염료는 594 nm 또는 633 nm 레이저 라인에 이상적으로 적합한 여기 기능이 있는 유동 세포측정법 적용 분야에 매우 적합한 밝은 원적색 형광 염료이다. 영상화 및 유동 세포측정법에서 안정적인 신호 생성을 위해, 알렉사 플루오르® 647 염료는 넓은 몰 범위 전체에 걸쳐 pH-비감수성이다. 알렉사 플루오르® 647 및 칼세인의 상이한 여기 및 방출 파장으로 인해 (생육력 시험 참조), 알렉사 플루오르® 647 CD90 및 칼세인-AP의 병렬 유동 세포측정법 분석을 수행할 수 있다.
측정을 위해 100 μl 세포 현탁액 (냉동배지 CS10 중)을 냉동 튜브로부터 취하여, 1 ml 베르센 (0.02% EDTA)을 함유하는 1.5 ml 반응 튜브로 옮기고 품질 관리 부서에 전달한다. 샘플은 최대 2시간 동안 2-8℃에서 저장할 수 있다. 샘플 제조를 위해 세포를 원심분리하고 (5분, 1500 rpm), 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 200 μl 베르센에 재현탁시킨다. 1 μl CD90-알렉사 플루오르® 647 항체 (1:200) 및 2 μl 칼세인-AM (1:200 희석됨, f.c. 0.1 μM)을 부가한 후, 샘플을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 1 ml 베르센으로 세척 단계를 수행하고, 원심분리 (5분, 1500 rpm) 및 200 μl 베르센에서의 펠릿의 재현탁을 수행한다. CD-90 발현의 측정은 BD AccuriTM C6 유동 세포측정기로 수행된다. CD90+ 세포는 높은 알렉사 플루오르® 647 형광에 의해 검출되며, 그 함량을 계산하고 시험 보고서에 문서화한다.
명시된 허용 기준은 ≥ 90% CD90 양성 세포이다.
7. 비드 잔류물
단리된 합성 줄기 세포가 분리 용액에 의해 ABCB5-항체-비드로부터 효율적이고 완전하게 분리되었는지 여부를 검사하기 위해, 세포에 비드 잔류물이 있는지 시험한다. 이러한 분석 방법은 또한 생육력 및 CD90 발현 시험과 병행하여 유동 세포측정법으로 수행된다.
단리된 ABCB5-양성 세포는 효소 활성으로 인해 ABCB5 단백질의 세포외 루프에서 mAb-결합 부위가 완전히 절단되는 트립제안으로 처리된다. 비드의 불충분한 분리 또는 세포의 세척은 단리된 합성 줄기 세포에 잔류 비드로 이어질 수 있으므로 분석해야만 한다.
유동 세포측정법에 의한 잔류 비드의 시각화/검출을 위해, BD AccuriTM C6이 사용된다. 첫 번째 분석 전에 비드 잔류물을 시각화하기 위해 무세포 ABCB5-비드 용액을 사용하여 FSC/SSA-도트 플롯에 게이트를 설정하였다. 세포는 또한 그 게이트에서 카운팅/검출된다는 것을 배제할 수 없기 때문에, 분석은 생육력 시험의 칼세인 염색과 조합된다. 분석을 위해, 비드 게이트에 있고 칼세인 음성인 이벤트만 고려된다. 따라서, 생육가능한 세포는 분석으로부터 제외되고 비드만 카운팅된다.
샘플 제조 및 BD AccuriTM C6 유동 세포측정기를 사용한 측정은 이미 "세포 생육력" 및 "CD90-표면 마커"에 기재된 바와 같이 작업 지시에 따라 수행된다. 잔류 비드의 비율을 계산하고 시험 보고서에 문서화한다.
명시된 허용 기준은 합성 줄기 세포 내 ≤ 0.5% 잔류 비드이다.
8. ABCB5 함량 결정
합성 줄기 세포의 단리 후, ABCB5-양성 세포의 실제 함량은 유동 세포측정법에 의해 결정된다.
ABCB5-양성 세포는 당나귀 α-마우스 알렉사-647 항체를 사용하여 검출된다. 이러한 2차 항체는 모노클로날 α-ABCB5 항체에 대항하여 유도된다. 부가적으로, 2차 항체는 형광색소 알렉사-647과 커플링되어 유동 세포측정법으로 검출할 수 있다. 이로써, 방출된 형광은 결합된 항체의 수와 직접적으로 상관이 있지만 유리/비-결합된 비드-항체 복합체도 검출되기 때문에 항체 결합된 ABCB5-양성 세포의 실제 양과는 상관이 없다. ABCB5-양성 세포의 실제 수를 수득하기 위해, 칼세인-AM으로 부가의 염색을 수행하여 세포 (생육가능함)와 비드-항체 복합체 (생육불가능함)를 구별할 수 있다. 분석을 위한 칼세인 양성 이벤트만 고려하여, 유리 비드-항체 복합체는 제외된다.
트립제안으로 세포로부터 자성 비드를 분리하면 세포 표면 상의 ABCB5 단백질이 손실되기 때문에, 분리 후 항체로 ABCB5를 검출할 수 없다. 따라서, 함량 결정을 위한 200 μl 샘플은 자성 비드의 부가, 인큐베이션 및 자성 분리 후, 그러나 트립제안을 부가하기 전에 채취한다. 자성 항체 커플링된 비드와 결합된 세포는 품질 관리 부서에 전달되어 분석에 직접 사용되거나 최대 2시간 동안 2-8℃에서 저장된다. 원심분리 후, 세포를 200 μl 2차 항체 용액 (당나귀 α-마우스 알렉사 647, 베르센으로 1:500 희석됨) 및 7 μl 칼세인-AM에 재현탁하고 37℃에서 20-30분 동안 인큐베이션한다. 세포를 원심분리하고, 베르센으로 세척하고 최종적으로 200 μl 베르센에서 분석하기 위해 재현탁시킨다.
BD AccuriTM C6 유동 세포측정기로 ABCB5 함량을 측정하는 것은 작업 지시에 따라 수행된다. 높은 칼세인 형광을 가진 세포만 게이팅함으로써, 결합되지 않은 비드-항체 복합체는 분석으로부터 제외된다. ABCB5 양성 세포의 비율은 2차 항체의 알렉사-647 형광으로부터 계산된다.
합성 줄기 세포의 단리 후 ABCB5-양성 세포 함량에 대한 명시된 허용 기준은 ≥ 90%이다 (마스터 배치의 각각의 단일 배치에 대함).
9. 효력 검정 1: 혈관신생 분화 (관 형성 검정)
합성 줄기 세포의 방출에 대한 중요한 기준은 세포가 트랜스-분화할 수 있는 효력이다. 이러한 프로세스 내에서는, 합성 줄기 세포가 혈관신생 분화를 겪을 수 있는지 여부를 시험한다. 분화 잠재력/능력은 혈관신생을 측정하기 위해 가장 널리 사용되는 시험관내 검정 중 하나인, 소위 관 형성 검정을 사용하여 시험된다. 이러한 신속한 검정을 통해 세포외 매트릭스의 존재 하에 3차원 구조를 구축할 수 있는 세포의 능력 (관 형성)이 시험된다.
3가지 효력 검정 모두의 시험를 위해, 정의된 "QC를 위한 분석 BC"를 사용하고 해동한다. 분화 검정은 작업 지시에 따라 수행된다. 관 형성 검정의 경우, 1 x 105 및 1.5 x 105개 세포를 24-웰 플레이트 (ECM 매트릭스로 코팅됨)의 2개 웰에 시딩하고 (줄기 세포 배지 중), CO2-인큐베이터에서 19시간 - 22시간 동안 인큐베이션한다. 사진은 현미경 (40x 배율)으로 촬영하고 분석을 위해 저장한다.
효력 검정에 대해 명시된 허용 기준은 2개의 시험된 세포 농도 중 적어도 하나에 대한 관의 형성 (정성적 분석)이다.
10. 효력 검정 2: 저산소증 후 VEGF 분비
저산소 배양 후 단리된 세포의 VEGF 분비는 제2 효력 검정으로서 제공된다. 이러한 방법을 사용하여, ABCB5-양성 세포가 측분비 인자를 통해 혈관신생을 향상시킬 수 있는 능력을 시험한다.
시험를 위해, 정의된 "QC를 위한 분석 BC"가 사용되고 해동된다. 검정을 위해, 3x105개 세포를 세포 배양 디쉬 (35 x 10 mm)에 시딩하고 (줄기 세포 배지 중) 37℃에서 48시간 (± 2시간) 동안 저산소 조건 (저산소 챔버 내 1% O2) 하에 배양한다. 상청액을 수집하고, 이를 VEGF ELISA에 사용한다.
명시된 허용 기준은 검증 데이터를 기반으로 한 저산소 배양 후 세포 상청액 중의 > 46.9 pg/ml VEGF이다.
11. 효력 검정 3: M1-분극화된 대식세포와의 공동-배양 후 IL-1RA 분비
M1-분극화된 대식세포와의 공동-배양 후 IL-1RA 분비 및 염증 환경의 자극을 결정하는 것은 ABCB5-양성 세포의 면역조정 능력을 입증해야 할 것이다.
검정의 시작 시, THP-1 세포는 세포 배양 배지에 PMA (150 nmol/ml)를 부가하여 대식세포 (Mφ)로 분화된다. 48시간 후 대식세포를 ABCB5-양성 세포 (합성 줄기 세포)와 공동-배양한다. 따라서, 정의된 "QC를 위한 분석 BC"가 사용되고 해동된다. 24-웰 플레이트의 2개 웰에서 2x104개 ABCB5-양성 세포를 48시간 동안 1x105개 대식세포와 공동-배양한다. 하나의 웰에서는, 공동-배양 시작 시 50 IU/ml IFN-g를 부가하여 염증 환경을 자극한다. 20 ng/ml LPS를 부가하고 50 IU/ml IFN-g를 다시 부가함으로써 공동-배양 24시간 후 자극을 반복한다. 공동-배양 2일 후 상청액을 수집하여 IL-1RA ELISA에 사용한다.
명시된 허용 기준은 검증 데이터 (및 염증 환경의 자극)를 기반으로 한 대식세포와의 공동-배양 후 > 125 pg/ml IL-1RA의 분비이다.
본 발명의 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 많은 상이한 치료 목적을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 합성 세포는 동계 이식 피부 상처 치유, 동종이계 이식, 말초 동맥 폐쇄성 질환 - PAOD, 급만성 간 부전 - AOCLF, 수포성 표피박리증 - EB 및 다른 많은 질환에 사용될 수 있다. 예를 들어, 윤부 줄기 세포 결핍증 (LSCD) 및 다른 각막 장애의 치료를 위해, 새로 입증된 KRT12+ 각막 분화 능력을 기반으로 한다 (이미 동종이식편으로서 임상 시험 중인 윤부 ABCB5+ 줄기 세포와 유사하지만, ABCB5+ 피부 줄기 세포는 이식 거부를 피하기 위해 환자 피부로부터 단리 시 LSCD 또는 각막 장애에서 자가 환자-동계 이식편으로서 사용될 수 있었다는 이점을 지닌다).
문헌 [Dinarello et al. Nat Rev Drug Discov. 2012 paper]에 요약된 바와 같이, IL1베타를 수반하고 IL-1RA에 반응성인 염증 유발 및 또는 면역 유발 장애의 치료, 또는 TNF-알파에 의해 구동된 장애 (예를 들어, 류마티스성 관절염) 또는 IL-12/IL-23p40에 의해 구동된 장애 (예를 들어, 건선), 또는 IL-10/조절 T 세포 치료를 받을 수 있는 질환 (예를 들어, 이식 거부)의 치료가 또한 구상된다. 염증 유발 질환 과정에 대한 잠재적 적용은 매우 크며, 이는 예를 들어, 심혈관 질환, 허혈성 졸중, 알츠하이머병 및 노화를 포함한다. 유사하게, 면역 장애 예컨대 이식 거부 또는 이식편 대 숙주 질환은 이러한 세포성 치료제로 치료될 수 있어야 한다.
이러한 합성 세포성 제제의 신경성 및 근육성 분화 능력을 기반으로 하는 질환의 추가 치료는 개선을 위해 조직 복구에 의존하는 졸중 또는 다른 CNS 장애, 또는 근육 복구에 의존하는 유전성 근이영양증을 포함한 근골격 장애일 것이다.
세포 조성물은 또한 ABCB5+ 줄기 세포에서, 예를 들어 특이적 조직을 표적화하는 조직-특이적 귀소 인자, 조직 리모델링에 수반되는 분비된 분자, 및 환자에서 조절 장애를 일으킬 수 있는 성장 인자, 시토카인, 호르몬 및 신경전달물질의 발현을 유도하기 위한 유전자 형질감염을 포함한 추가의 개선에 유용할 것으로 예상된다. 부가적으로, 교정된 유전자를 형질감염시켜, 특정한 유전자에 결함이 있는 유전 질환의 줄기 세포-기반 복구를 허용할 수 있거나 (예를 들어, RDEB에서의 COL7A) 또는 ABCB5+ 줄기 세포에서의 결함 유전자를 다양한 유전자 편집 기술로 교정한 후 동계 환자에 이식할 수 있다.
부가적으로, 이들 세포는 만능성 또는 전구 유전자에 의한 세포성 재프로그래밍을 위한 조성물로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명자들은 이들 세포가 ABCB5- 세포보다 iPSC로 더 쉽게 재프로그래밍될 수 있다는 것을 입증하였다. 더욱이, 이들 세포에서의 PAX6 과다발현은 다른 피부 선조에 대해 제시된 바와 같이, 각막 분화 능력을 추가로 개선시킬 수 있다.
상처 치유 촉진 인자를 생착시키고 방출할 수 있는 능력으로 인해, 급성 및 만성 상처로 고통받는 환자를 위한 진전된 MSC-기반 요법에 깊은 관심이 생겼다. 현재까지 선진국 인구의 1 내지 2%가 치유되지 않은 상처를 앓고 있으며, 전 세계적으로 고령자, 비만, 당뇨병 환자의 증가로 인해 만성 상처의 발병률이 증가하는 것으로 추정된다 [4]. 임상 실습에서 대규모 MSC-기반 요법의 성공적인 구현을 여전히 방해하는 주요 장애물 중 하나는 재현가능한 측분비 효능 및 효력을 위해 MSC를 확실하게 풍부하게 하고 확장시킬 수 있는 세포 표면 마커가 없다는 것이다.
병인은 상이하지만, 만성 상처는 지속적으로 많은 수의 과다 활성화된 염증 유발성 M1 대식세포 [7, 8]와 TNFα 및 다른 염증 유발성 시토카인의 방출을 증가시키는 공통된 특징을 공유한다. 프로테아제 및 반응성 산소 종과 함께 이들 염증 유발성 시토카인은 조직 파괴를 초래하고 상주 상처 부위 섬유모세포에 노화 프로그램을 설치하여, 이러한 상처의 치유되지 않은 상태를 영속화한다. 철 축적은 혈압 상승 및 정맥 판막 기능 부전으로 인한 상처 부위의 지속적인 적혈구 유출의 결과로서 만성 하지 정맥 궤양에 있는 대식세포에서 이전에 확인되었다. 이들 상처에 있는 철 과부하 대식세포는 염증 유발성 M1 상태에서 조직 리모델링 복원에 필요한 항염증성 M2 대식세포로 전환되지 못한다 [7]. M2 대식세포는 M1 대응물과 대조적으로 더 낮은 염증성 시토카인 방출을 나타내고 조직 복구 및 상처 치유를 자극하는 성장 인자 및 대사 산물을 생산한다 [9]. 반대로, 특히 M1 대식세포에 의해 방출되는 TNFα 및 IL-1β와 같은 이펙터 분자는 M1 대식세포의 자가분비 동원과 지속적인 활성화의 악순환을 유지하므로, 지속적인 염증의 치유되지 않은 상태에서 상처를 사실상 잠그고 있다 [7, 8].
지속되는 염증에 대응하고, 우세한 M1 대식세포를 만성 상처의 치유를 위한 전제 조건인 조직 복구 촉진 M2 대식세포로 전환시키기 위해 ABCB5+-유래 MSC에 의해 이용되는 측분비 메커니즘을 수반하는 것을 구체적으로 다루었다.
임의의 생착 또는 세포 융합 효과를 배제하기 위해, 이종이식 모델은 인간 ABCB5+-유래 MSC를 철 과부하 뮤린 모델의 만성 상처에 국소 주사하여 의도적으로 사용되었으며, 이는 인간 만성 상처에서 억제되지 않은 M1 대식세포 활성화의 주요 병원성 측면을 밀접하게 반영한다 [7]. 임상 등급 승인된 ABCB5+ MSC 제제는 문서화된 클론 삼계통 분화 능력, 향상된 클론 성장 및 시험관내 TNFα 억제 활성과 함께 생체내 만성 상처의 성공적인 치료를 위한 귀중한 예측 인자로서 이용되어 왔다. 철 과부하 상처에 주사된 ABCB5+-유래 MSC는 측분비 IL-1 수용체 길항제 (IL-1RA)의 방출을 증강시키고, 실제로 만성 철 과부하 뮤린 상처에서 과도하게 증가된 우세한 M1 염증 유발성 대식세포 표현형을 전반적인 상처 치유를 촉진하는 항염증성 M2 대식세포로 전환시키는 것으로 밝혀졌다. 주사된 ABCB5+-유래 MSC로부터 IL-1RA의 측분비 방출의 인과적 역할은 인간 재조합 IL-1RA의 주사가 상처 치유를 가속화시킨 반면, IL-1RA 침묵된 ABCB5+-유래 MSC의 주사는 그렇지 않았다는 발견에 의해 뒷받침되었다. 특히, 이들 데이터는 인간화 NOD-scid IL2rγ null (NSG) 마우스에서 반복되며, 인간 염증 유발성 M1에서 항염증성 M2 대식세포로의 이동은 환자의 장기적인 혜택을 위해 마커-강화된 ABCB5+ MSC 요법을 임상 실습으로 성공적으로 번역할 수 있는 길을 추가로 열어주었다.
합성 ABCB5+ 줄기 세포는 바람직하게 단리된다. 본원에 사용된 바와 같은 "단리된 합성 ABCB5+ 줄기 세포"는 자연 환경 이외의 조건에 놓인 세포의 제제를 지칭한다. 용어 "단리된"은 이후에 이들 세포를 다른 세포와 조합 또는 혼합하여 사용하거나 또는 생체내 환경에서 사용하는 것을 배제하지 않는다.
합성 ABCB5+ 줄기 세포는 실질적으로 순수한 제제로서 제조될 수 있다. 용어 "실질적으로 순수한"은 제제에 ABCB5 양성 줄기 세포 이외의 세포가 실질적으로 없다는 것을 의미한다. 예를 들어, ABCB5 세포는 존재하는 총 세포의 적어도 70 퍼센트를 구성해야 하며, 더 큰 백분율, 예를 들어, 적어도 85, 90, 95 또는 99 퍼센트가 바람직하다. 세포는 요망될 수 있는 임의의 다른 성분, 예를 들어 세포를 보존하거나 박테리아 성장을 감소시키기 위한 작용제와 함께 완성된 제약 용기, 예컨대 주사 바이알, 앰풀 또는 주입 봉지에 패키징될 수 있다. 조성물은 단위 투여 형태여야 한다.
합성 ABCB5+ 줄기 세포는 면역 매개 질환을 치료하기 위한 일부 실시양태에서 유용하다. 면역 매개 질환은 유해한 면역 반응, 즉 조직을 손상시키는 것과 연관된 질환이다. 이러한 질환은 이식, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 간 질환, 신장 질환 및 신경변성 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
항원(들)에 대한 면역 반응이 감소되거나 제거될 수 있도록 합성 ABCB5+ 줄기 세포가 면역 체계에 의한 반응을 개선하기 위해 이식에 사용될 수 있다는 것이 발견되었다. 이식은 조직 또는 기관을 하나의 신체 또는 신체 부위에서 또 다른 신체 또는 신체 부위로 이식하는 행위 또는 프로세스이다. 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 숙주에 대해 자가이거나 (동일한 숙주로부터 수득됨) 또는 숙주에 대해 동종이계 또는 동계인 세포와 같은 비-자가일 수 있다. 비-자가 세포는 환자 또는 기관의 공여자가 아닌 다른 사람으로부터 유래된다. 또 다른 한편으론 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 숙주에 대해 이종인 공급원으로부터 수득될 수 있다.
동종이계는 숙주 또는 공여자와 동일한 종에 속하거나 또는 이로부터 수득되긴 하지만 유전적으로 상이한 세포를 지칭한다. 따라서, 동종이계 인간 중간엽 줄기 세포는 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 의도된 수용자 또는 기관 공여자가 아닌 인간으로부터 수득된 중간엽 줄기 세포이다. 동계는 유전적으로 동일하거나 밀접하게 관련되고 면역학적으로 숙주 또는 공여자와 양립되는 세포, 즉 동일한 유전자형을 가진 개체 또는 조직으로부터의 세포를 지칭한다. 이종은 숙주 또는 공여자와 상이한 종의 유기체로부터 유래되거나 또는 그로부터 수득된 세포를 지칭한다.
따라서, 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 이식 수용자에게 이러한 이식에 대항한 면역 반응을 억제 또는 개선하기에 유효한 양의 합성 ABCB5+ 줄기 세포를 투여함으로써 이식 (조직, 기관, 세포 등)에 대한 면역 반응을 억제 또는 개선하기 위해 사용된다.
따라서, 상기 방법들은 공여자 조직의 수용자를 합성 ABCB5+ 줄기 세포와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 이식 전 또는 이식과 동시에 또는 이식 후에 수용자에게 투여될 수 있다. 이식 전에 줄기 세포를 투여하는 경우, 전형적으로 줄기 세포는 수술 전 14일까지, 바람직하게 수술 전 7일까지 투여해야 한다. 그 이후에는 정기적으로 투여를 반복할 수 있다 (예를 들어, 주 1회).
합성 ABCB5+ 줄기 세포는 이식의 일부로서 수용자에게 투여될 수도 있다. 예를 들어, 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 이식 전에 기관 또는 조직 내로 관류될 수 있다. 또 다른 한편으론 조직을 이식한 다음 수술 동안 처리할 수 있다.
이식에 대항한 거부 에피소드의 중증도를 감소시키거나 또는 거부 에피소드를 제거하기 위해, 이식을 받은 환자의 치료는 또한 공여자 조직이 수용자에게 이식된 후 공여자 조직의 수용자에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포를 투여함으로써 달성될 수 있다.
수용자에 대항한 공여자 조직, 기관 또는 세포에 의한 면역 반응, 즉 이식편 대 숙주 반응을 감소시키는 것은 공여자 조직, 기관 또는 세포를 수용자에게 이식하기 전에 생체외에서 공여자 조직, 기관 또는 세포를 합성 ABCB5+ 줄기 세포로 처리함으로써 달성될 수 있다. 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 이식편에서의 T 세포의 반응성을 감소시키며, 이는 숙주에 대한 이식편의 불리한 반응의 발생 없이, 또는 이러한 불리한 반응에서의 감소를 동반하면서 이식편이 수용자 (숙주)의 신체 내로 도입될 수 있도록 수용자 항원 제시 세포에 대항하여 후속적으로 활성화될 수 있다. 따라서, "이식편 대 숙주" 질환으로서 공지된 것을 예방할 수 있다.
합성 ABCB5+ 줄기 세포는, 예를 들어 이식 전에 수용자 또는 공여자로부터 수득될 수 있다. 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 단리되어 필요할 때까지 동결 저장할 수 있다. 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 또한 원하는 양으로 배양 확장되고 필요할 때까지 저장될 수 있다. 또 다른 한편으론 사용 직전에 수득될 수 있다.
합성 ABCB5+ 줄기 세포는 숙주에 대항한 공여자 이식편에 의해 유발되는 진행 중인 불리한 면역 반응을 감소 또는 제거하는데 유효한 양으로 수용자에게 투여된다. 이식편에 의해 유발된 불리한 면역 반응을 겪는 숙주에 합성 ABCB5+ 줄기 세포를 제시하면, 진행 중인 반응이 억제되고 T 세포의 재자극이 방지됨으로써, 숙주 조직에 대한 활성화된 T 세포에 의한 불리한 반응이 감소 또는 제거된다.
이식 절차의 일부로서, 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 또한 보호 효과를 향상시키는 분자, 예컨대 세포 사멸을 유도하는 분자를 발현하도록 변형될 수 있다. 하기에 보다 자세히 기재되는 바와 같이, 진피 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 외인성으로 부가된 핵산을 사용하여 단백질을 생산하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 분자에 대한 수용체를 운반하는 활성화된 T 세포의 아폽토시스를 유도하는 분자를 면역 체계에 전달하는데 사용될 수 있다. 그 결과, 활성화된 T 림프구가 결실되고 이식편에 대한 원치 않는 면역 반응이 억제된다. 따라서, 진피 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 세포 사멸 분자를 발현하도록 변형될 수 있다. 본원에 기재된 방법의 바람직한 실시양태에서, 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 세포 사멸 분자 Fas 리간드 또는 TRAIL 리간드를 발현한다.
모든 경우에 세포의 유효 용량 (즉, 동종이식편 생존을 연장시키기에 충분한 수)을 환자에게 제공해야 한다. 투여되는 세포의 수는 일반적으로 1 x 107 - 1 x 1010개의 범위에 있어야 하며 대부분의 경우 1 x 108 내지 5 x 109개여야 한다. 실제 투여량 및 투여 스케줄은 환자의 연령, 체중 및 신체 상태와 같은 요인을 고려하여 임상 의학 분야에서 표준적인 방법을 사용하여 주치의에 의해 사례별로 결정될 것이다. 환자가 이식 거부의 징후를 보이는 경우, 투여량 및/또는 투여 빈도를 증가시킬 수 있다. 세포는 통상적으로 정맥내 주사 또는 주입에 의해 투여되지만, 예를 들어 기관 체내 이식 부위 근처에 세포를 체내 이식하는 방법이 사용될 수도 있다.
합성 ABCB5+ 줄기 세포는 유일한 면역조정제로서 또는 다른 면역조정제를 또한 포함하는 치료 계획의 일부로서 이식 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 환자에게 하기를 제공할 수도 있다: CD40과 CD40L 간의 상호작용을 차단하는 모노클로날 항체 또는 다른 화합물; 림프구 활성화 및 후속 증식의 억제제, 예컨대 시클로스포린, 타크로리무스 및 라파마이신; 또는 다른 메커니즘에 의해 작용하는 면역억제제, 예컨대 메토트렉세이트, 아자티오프린, 시클로포스파미드 또는 항염증 화합물(예를 들어, 부신피질 스테로이드 예컨대 덱사메타손 및 프레드니솔론) 동반.
본 발명의 진피 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 또한 자가면역 질환의 치료 및 예방에 유용하다. 자가면역 질환은 대상체 자신의 항체가 숙주 조직과 반응하거나 또는 면역 이펙터 T 세포가 내인성 자기 펩티드에 자가반응하여 조직의 파괴를 유발하는 질환의 한 부류이다. 따라서, 면역 반응은 자기 항원으로서 지칭된 대상체 자신의 항원에 대항하여 장착된다. 자가면역 질환은 류마티스성 관절염, 크론병, 다발성 경화증, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 자가면역 뇌척수염, 중증 근무력증 (MG), 하시모토 갑상선염, 굿패스쳐 증후군, 천포창 (예를 들어, 심상성 천포창), 그레이브병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 혈소판감소성 자반병, 항콜라겐 항체가 있는 경피증, 혼합 결합 조직 질환, 다발근염, 악성 빈혈, 특발성 애디슨병, 자가면역-연관 불임, 사구체신염 (예를 들어, 초승달 사구체신염, 증식성 사구체신염), 수포성 천포창, 쇼그렌 증후군, 인슐린 저항성 및 자가면역성 당뇨병을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 바와 같은 "자기-항원"은 정상적인 숙주 조직의 항원을 지칭한다. 정상적인 숙주 조직은 암 세포를 포함하지 않는다.
자가면역 질환의 예는 항사구체 기저막 (GBM) 질환이다. GBM 질환은 유형 IV 콜라겐의 3개 쇄의 비-콜라겐성 도메인 1 (3(IV)NC1)에 대항하여 유도된 자가면역 반응의 결과이며, 급속하게 진행되는 사구체신염 (GN) 및 고통받는 환자에서 궁극적으로 신부전을 유발한다. 하기 실시예에 기재되는 바와 같이, GBM 모델에서 진피 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 유효성이 입증되었다. 3(IV)NC1을 인식하는 자가반응성 항체는 상기 질환의 특징으로 간주된다. 또한, 3(IV)NC1-자가반응성 T 헬퍼 (Th)1-매개 세포성 면역이 발병기전에 연루되어 있다. 항-GBM 질환은 재조합 3(IV)NC1 (r3(IV)NC1)을 함유하는 항원 제제로 면역화하여 감수성 마우스 계통에서 실험적으로 유도될 수 있으며, 이는 치료 면역조정에 대한 반응을 연구하기 위한 귀중한 질환 모델 시스템을 제공한다. 항원-의존성 T 세포 활성화와 그 결과로 일어나는 인터류킨 2 (IL-2)의 생산에는 2가지 별개의 신호가 필요하다: 항원과의 만남에서, 나이브 T 세포는 항원 제시 세포 (APC) 상의 주요 조직적합성 복합체 (MHC)-플러스 항원 펩티드 복합체와의 T 세포 수용체 맞물림을 통해 신호 1을 수신하고, 완전한 활성화로 이어지는 양성 공동자극 경로를 통해 신호 2를 수신한다. 이러한 양성 공동자극 경로 중 하나의 중요한 역할인, APC-발현된 CD40과 그의 Th 리간드 CD40L과의 상호작용은 실험적인 항-GBM 자가면역 GN에서의 질환 발생을 위한 것으로 최근에 입증되었으며, CD40-CD40L 경로 차단은 자가면역 GN의 발생을 예방하는 것으로 밝혀졌다. 다른 한편으로는, 음성 T 세포 공동자극 신호는 면역 반응을 하향-조절하는 기능을 한다. 조절 T 세포 (TREG) 및 가용성 시토카인 매개인자, 예컨대 인터류킨 10 및 형질전환 성장 인자 β (TGF-β) 패밀리의 구성원이 또한 T 세포 활성화 및 면역 이펙터 반응을 약화시킬 수 있다.
또 다른 자가면역 질환은 크론병이다. 합성 ABCB5+ 줄기 세포를 사용한 크론병 치료에 대한 임상 시험이 시행되었다. 크론병은 장 및 위장관의 염증과 연관된 만성 병태이다. 시행된 시험에 기초하여 크론병 치료를 위한 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 사용은 유망한 것으로 보인다.
자가면역 질환의 치료에 사용되는 경우, 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 바람직하게 정맥내 주사에 의해 투여될 것이고 유효 용량은 질환 진행을 늦추거나 질환과 연관된 한 가지 이상의 증상을 완화하는데 필요한 양일 것이다. 예를 들어, 재발성 다발성 경화증의 경우, 유효 용량은 적어도 발작의 빈도 또는 중증도를 감소시키는데 필요한 양이어야 한다. 류마티스성 관절염의 경우, 유효량은 적어도 환자가 경험하는 통증과 염증을 감소시키는데 필요한 세포 수일 것이다. 세포의 단일 단위 용량은 전형적으로 1 x 107 내지 1 x 1010개 세포여야 하며 주치의가 적절하다고 결정한 대로 정기적인 간격 (예를 들어, 매주, 매월 등)으로 투여를 반복해야 한다.
합성 ABCB5+ 줄기 세포는 또한 간 질환의 치료에 유용하다. 간 질환은 간 조직에 손상을 일으키는 질환, 예컨대 간염을 포함한다. 보다 일반적으로, 본 발명의 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 하기를 포함하나 그에 제한되지는 않는 간 질환, 장애 또는 병태의 치료에 사용될 수 있다: 알콜성 간 질환, 간염 (A형, B형, C형, D형 등), 국소 간 병변, 원발성 간세포 암종, 간의 거대 낭성 병변, 국소 결절 과형성 육아종성 간 질환, 간 육아종, 혈색소 침착증 예컨대 유전성 혈색소증, 철 과부하 증후군, 급성 지방간, 임신 충혈, 임신 중 병발성 간 질환, 간내 담즙정체, 간 부전, 전격성 간부전, 황달 또는 무증상 고빌리루빈혈증, 간세포에 대한 손상, 크리글러-나자르 증후군, 윌슨병, 알파-1-항트립신 결핍증, 길버트 증후군, 고빌리루빈혈증, 비알콜성 지방간염, 포르피린증, 비간경변성 문맥 고혈압, 비간경변성 문맥 고혈압, 문맥 섬유증, 주혈흡충증, 원발성 담즙성 간경변증, 버드-키아리 증후군, 골수이식에 따른 간정맥 폐쇄성 질환 등.
신체에 가해지는 스트레스는 성체 줄기 세포가, 손상된 부위로 이동하여 손상을 복구하는데 도움이 되는 특수 세포로 변하도록 촉발할 수 있다. 예를 들어, 손상된 간은 이러한 손상된 간을 위한 간 세포를 생성함으로써 반응하는 줄기 세포에 신호를 보낼 수 있다 (Journal of Clinical Investigation 2003 July 15;112(2):160-169).
일부 실시양태에서, 본 발명은 진피 합성 ABCB5+ 줄기 세포를 사용하여 신경변성 질환을 치료하는 것에 관한 것이다. 일부 경우에, 본 발명은 신경변성 질환, 또는 신경변성을 유발할 수 있는 신경 세포 손상을 갖는 대상체의 치료를 고려한다. 신경 세포는 주로 국소/영역 시냅스 연결 (예를 들어, 국소 회로 중간 신경 세포 대 장거리 투영 신경 세포) 및 수용체 세트, 및 연관 2차 메신저 시스템에 기초하여 분류된다. 신경 세포는 중추 신경계 (CNS) 뉴런과 말초 신경계 (PNS) 뉴런 둘 다를 포함한다. 많은 상이한 신경 세포 유형이 있다. 그 예는 감각 및 교감 신경 뉴런, 콜린작동성 뉴런, 후근 신경절 뉴런, 고유수용성 뉴런 (삼차 중뇌핵), 모양체 신경절 뉴런 (부교감 신경계) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 전형적으로 세포 형태학적 특징, 세포-특이적 마커의 발현, 특정 분자의 분비 등을 활용하여, 신경 세포를 쉽게 확인하고 신경 세포를 비-신경 세포, 예컨대 신경교 세포와 구별할 수 있을 것이다.
"신경변성 장애" 또는 "신경변성 질환"은 본원에서 말초 신경계 또는 중추 신경계에서 뉴런의 점진적인 손실이 발생하는 장애로서 정의된다. 신경변성 장애의 비-제한적인 예는 하기를 포함한다: (i) 만성 신경변성 질환, 예컨대 가족성 및 산발성 근위축성 측삭 경화증 (각각 FALS 및 ALS), 가족성 및 산발성 파킨슨병, 헌팅턴병, 가족성 및 산발성 알츠하이머병, 다발성 경화증, 올리보폰토소뇌 위축, 다계통 위축, 진행성 핵상 마비, 미만성 루이소체 질환, 피질치석 변성, 진행성 가족성 근간대성 간질, 선조체 변성, 비틀림 근긴장이상, 가족성 떨림, 다운 증후군, 질 드 라 투렛 증후군, 할러보르덴-스파츠병, 당뇨병성 말초 신경병증, 권투 선수 치매, AIDS 치매, 연령 관련 치매, 연령 연관 기억 장애, 및 아밀로이드증-관련 신경변성 질환, 예컨대 전염성 해면상뇌증과 연관된 프리온 단백질 (PrP)에 의해 유발되는 질환 [크로이츠펠트-야콥병, 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커 증후군, 스크래피, 및 쿠루] 및 과도한 시스타틴 C 축적에 의해 유발되는 질환 (유전성 시스타틴 C 혈관병증); 및 (ii) 급성 신경변성 장애, 예컨대 외상성 뇌 손상 (예를 들어, 수술-관련 뇌 손상), 뇌 부종, 말초 신경 손상, 척수 손상, 리병, 길랭-바레 증후군, 리소좀 축적 장애, 예컨대 리포푸신증, 알퍼병, CNS 변성으로 인한 현기증; 예를 들어, 청반 및 소뇌의 뉴런 변성을 포함한 만성 알콜 또는 약물 남용으로 인해 발생하는 병리; 인지 및 운동 장애를 유발하는 소뇌 뉴런 및 피질 뉴런의 변성을 포함한 노화로 인해 발생하는 병리; 및 운동 장애로 이어지는 기저핵 뉴런의 변성을 포함한 만성 암페타민 남용으로 인해 발생하는 병리; 국소 외상, 예컨대 졸중, 국소 허혈증, 혈관 부전, 저산소-허혈성 뇌병증, 고혈당증, 저혈당증 또는 직접적인 외상으로 인한 병리학적 변화; 치료 약물 및 치료의 부정적인 부작용으로서 발생하는 병리 (예를 들어, NMDA 부류의 글루타메이트 수용체의 길항제의 항경련 용량에 반응하여 대상 및 내후각 피질 뉴런의 변성), 및 베르니케-코르사코프 관련 치매. 감각 뉴런에 영향을 미치는 신경변성 질환은 프리드라이히 운동실조, 당뇨병, 말초 신경병증 및 망막 신경 세포 변성을 포함한다. 윤부 및 피질계의 신경변성 질환은 대뇌 아밀로이드증, 픽 위축 및 레츠 증후군을 포함한다. 전술한 예는 포괄적인 것을 의미하는 것이 아니라 "신경변성 장애" 또는 "신경변성 질환"이라는 용어를 예시하는 것일 뿐이다.
만성 신경변성 질환의 대부분은 중년기에 발병하는 것이 특징이며 신경계 내의 특이적 뉴런 서브세트의 급속한 변성으로 이어져 궁극적으로 조기 사망을 초래한다. 진피 합성 ABCB5+ 줄기 세포를 포함하는 조성물은 신경변성 질환을 치료하기 위해 대상체에게 단독으로 투여되거나 또는 이들 장애 또는 질환의 치료 또는 예방을 위한 다른 치료 화합물의 투여와 조합하여 투여될 수 있다. 이들 약물 중 다수가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 항파킨슨병 작용제는 벤즈트로핀 메실레이트; 비페리덴; 비페리덴 히드로클로라이드; 비페리덴 락테이트; 카르만타딘; 실라도파 히드로클로라이드; 도파만틴; 에토프로파진 히드로클로라이드; 라자베미드; 레보도파; 로메트랄린 히드로클로라이드; 모페길린 히드로클로라이드; 낙사골리드 히드로클로라이드; 파렙티드 술페이트; 프로시클리딘 히드로클로라이드; 퀴넬로란 히드로클로라이드; 로피니롤 히드로클로라이드; 셀레길린 히드로클로라이드; 톨카폰; 트리헥시페니딜 히드로클로라이드을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 근위축성 측삭 경화증 치료용 약물은 릴루졸을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 파제트병 치료용 약물은 틸루드로네이트 이나트륨을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
신경변성 질환의 치료에 있어서 성체 줄기 세포의 유용성이 설명되었다. 졸중을 경험한 마우스에서 합성 ABCB5+ 줄기 세포가 뉴런 유사 세포로 변할 수 있다는 것이 입증되었다 (Journal of Cell Transplantation Vol. 12, pp. 201-213, 2003). 부가적으로, 골수로부터 유래된 줄기 세포가 신경 세포로 발전하여 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 척수 손상 환자를 치료할 가능성이 있다.
본 발명의 방법은 또한 신장 질환과 연관된 장애의 치료에 유용하다. 이전에 신장에 주사된 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 신장 기능과 세포 재생에서 거의 즉각적인 개선을 초래하는 것으로 입증되었다 (Resnick, Mayer, Stem Cells Brings Fast Direct Improvement, Without Differentiation, in Acute Renal Failure, EurekAlert!, August 15, 2005). 따라서, 본 발명의 진피 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 신장 기능과 세포 재생을 개선하기 위해, 단독으로 또는 다른 치료제 또는 절차, 예컨대 투석와 조합하여 신장 질환이 있는 대상체에게 투여될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 다른 질환은 각막 및 폐의 질환을 포함한다. 이들 조직에서의 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 투여에 근거한 요법은 긍정적인 결과를 입증해주었다. 예를 들어, 인간 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 손상된 각막을 재건하는데 사용되었다 (Ma Y et al., Stem Cells, August 18, 2005). 부가적으로, 골수로부터 유래된 줄기 세포는 폐 복구 및 폐 손상에 대항한 보호에 중요한 것으로 밝혀졌다 (Rojas, Mauricio, et al., American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, Vol. 33, pp. 145-152, May 12, 2005). 따라서 본 발명의 진피 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 또한 각막 조직 또는 폐 조직의 복구에 사용될 수 있다.
골수와 같은 공급원으로부터의 합성 ABCB5+ 줄기 세포가 또한 심혈관 질환의 치료를 위한 요법에 사용되었다. 골수 줄기 세포는 심장이 새롭고 기능적인 조직을 발생하도록 도와줌으로써 손상된 심장 근육을 복구하는데 도움이 될 수 있다 (Goodell MA, Jackson KA, Majka SM, Mi T, Wang H, Pocius J, Hartley CJ, Majesky MW, Entman ML, Michael LH, Hirschi KK. Stem cell plasticity in muscle and bone marrow. Ann N Y Acad Sci. 2001 Jun;938:208-18). 심근 경색 후 손상된 심장에 골수 줄기 세포를 이식한 결과, 심장의 펌핑 능력이 80% 만큼 향상되었다 (Nature Medicine Journal September 2003 vol. 9 no. 9: 1195-1201).
심혈관 질환은 심장 및/또는 혈관을 수반하는 질환의 부류를 지칭한다. 이러한 용어는 기술적으로 심장 및/또는 혈관에 영향을 미치는 질환을 지칭하지만, 다른 기관, 예컨대 예를 들어, 폐 및 관절이 질환에 영향을 받거나 수반될 수 있다. 심혈관 질환의 예는 아테롬성동맥경화증, 동맥경화증, 동맥류, 협심증, 만성 안정형 협심증, 불안정형 협심증, 심근 허혈 (MI), 급성 관상 동맥 증후군, 관상 동맥 질환, 졸중, 관상 동맥 재협착증, 관상 동맥 스텐트 재협착증, 관상 동맥 스텐트 재혈전증, 혈관재생, 심근 경색 (MI) 후 리모델링 (예를 들어 좌심실의 MI 후 리모델링), MI 후 좌심실 비대, 혈관 성형술, 일과성 허혈 발작, 폐색전증, 혈관 폐쇄, 정맥 혈전증, 부정맥, 심근병증, 울혈성 심부전, 선천성 심장병, 심근염, 판막 질환, 확장성 심근병증, 확장기 기능 장애, 심내막염, 류마티스성 열, 고혈압 (높은 혈압), 비대성 심근병증, 동맥류 및 승모판 탈출증을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
아테롬성동맥경화증은 크고 중간 크기의 근육 동맥의 질환이며 내피 기능 장애, 혈관 염증, 및 혈관 벽의 내막 층 내에 지질, 콜레스테롤, 칼슘 및/또는 세포성 파편이 축적되는 것을 특징으로 한다. 이러한 축적은 플라크 (죽종성 플라크) 형성, 혈관 리모델링, 급성 및 만성 내강 폐쇄, 혈류 이상 및 표적 기관으로의 감소된 산소 공급을 초래한다.
아테롬성동맥경화증은 두 가지 주요 문제를 일으킬 수 있다. 첫째, 죽종성 플라크는 동맥의 플라크 파열 및 협착 (협소화)을 유발할 수 있으며, 이에 따라 공급되는 기관에 혈액 공급이 불충분할 수 있다. 또 다른 한편으론, 동맥류가 발생한다. 이러한 합병증은 만성적이고 천천히 진행되며 누적된다. 가장 통상적으로, 플라크(들)가 갑자기 파열 ("취약한 플라크")되어 혈전이 형성되며, 이는 혈류를 신속하게 늦추거나 중지시켜 (예를 들어, 몇 분 동안) 동맥에 의해 공급되는 조직을 사멸시킨다. 이러한 사건을 경색이라고 한다. 가장 흔히 인식되고 있는 시나리오 중 하나는 심근 경색 (MI) (통상적으로 심장 마비로서 공지됨)을 유발하는 관상 동맥의 관상 동맥 혈전증이라고 한다. 매우 진행된 질환의 또 다른 통상적인 시나리오는 다리로의 불충분한 혈액 공급으로 인한 파행이며, 이는 전형적으로 혈전으로 좁아진 동맥류 분절과 협착증 둘 다의 조합으로 인해 발생한다. 아테롬성동맥경화증은 전신적인 과정이기 때문에, 뇌, 내장, 신장, 다리 등에 대한 동맥에서도 유사한 사건이 발생한다.
아테롬성동맥경화증은 청소년기에 시작될 수 있으며, 통상적으로 대부분의 주요 동맥에서 발견되지만 증상이 없으며 대부분의 진단 방법으로 평생 검출되지 않는다. 심장에 혈액을 공급하는 관상 동맥 순환 또는 뇌에 혈액을 공급하는 뇌 순환을 방해할 때 가장 흔히 심각한 증상이 나타나며, 이는 졸중, 심장 마비, 울혈성 심부전을 포함한 다양한 심장 질환, 및 일반적으로 대부분의 심혈관 질환의 가장 중요한 근본 원인으로 여겨진다. 신체 내의 임의의 동맥이 수반될 수 있지만, 통상적으로 일부 동맥의 심각한 협착 또는 폐색만 발생할 수 있지만, 보다 결정적으로 중요한 기관에 공급되는 동맥이 인식된다. 심장 근육에 혈액을 공급하는 동맥이 막히면 심장 마비가 발생한다. 뇌에 혈액을 공급하는 동맥이 막히면 졸중이 발생한다. 팔 또는 다리 동맥에서의 죽종성 플라크(들)가 혈류 감소를 유발하여 말초 동맥 폐쇄성 질환 (PAOD)을 유발한다.
심장 스트레스 시험은 혈류 제한에 대해 가장 통상적으로 수행되는 비-침습적 시험 방법 중 하나이다. 이는 일반적으로 ~75% 이상의 내강 협착을 검출한다. 혈관 조영술에 의해 검출가능한 중증 협착 부위와 그보다는 덜하지만 "스트레스 시험"는 일반적으로 심혈관 질환에 대한 인간 진단 기술의 초점이었다. 가장 심각한 사건은 플라크가 많은 위치에서 발생한다. 플라크 파열은 몇 초에서 몇 분 내에 동맥 내강 폐쇄로 이어질 수 있으며, 잠재적인 영구적 조직 손상과 때로는 급사를 초래할 수 있다.
아테롬성동맥경화증에 대한 다양한 해부학적, 생리학적 및 행동적 위험 인자가 공지되어 있다. 이러한 위험 인자는 고령, 남성, 당뇨병, 이상지질혈증 (혈청 콜레스테롤 또는 중성지방 수치 상승), 높은 혈청 농도의 저밀도 지단백질 (LDL, "나쁜 콜레스테롤"), 지단백질(a) (LDL의 변종) 및 /또는 초저밀도 지단백질 (VLDL) 입자, 기능성 고밀도 지단백질 (HDL, "좋은 콜레스테롤") 입자의 낮은 혈청 농도, 담배 흡연, 고혈압, 비만 (예를 들어, 복부 비만 또는 남성형 비만으로서 지칭되기도 하는 중심성 비만), 심혈관 질환 (예를 들어, 관상 동맥 심장 질환 또는 졸중)의 가족력, 상승된 수준의 염증 마커 (예를 들어, C-반응성 단백질 (CRP 또는 hs-CRP), sCD40L, sICAM 등), 상승된 혈청 수준의 호모시스테인, 상승된 혈청 수준의 요산, 상승된 혈청 피브리노겐 농도를 포함한다.
용어 심근 경색 (MI)은 심근 (심장 근육)과 경색 (산소 결핍으로 인한 조직 사멸)으로부터 유래된다. MI는 심장의 일부에 혈액 공급이 중단될 때 발생하는 질환 상태이다. 급성 MI (AMI)은 급성 관상 동맥 증후군의 일종으로, 관상 동맥 질환의 가장 빈번한 (항상 그런 것은 아님) 징후이다. 가장 흔한 촉발 사건은 심장외막 관상 동맥에서의 아테롬성동맥경화성 플라크가 파괴되어 응고 캐스케이드를 유발하고, 때로는 동맥이 완전히 폐쇄되는 결과를 초래한다. 그 결과로 생성된 허혈 또는 산소 부족은 심장 조직의 손상 및 잠재적인 사망을 유발한다.
MI 또는 AMI에 대한 중요한 위험 인자는 혈관 질환, 예컨대 아테롬성동맥경화성 관상 동맥 심장 질환 및/또는 협심증의 과거력, 이전의 심장 마비 또는 졸중, 비정상적인 심장 박동 또는 실신의 임의의 이전 에피소드, 고령 (예를 들어 40세 이상의 남성 및 50세 이상의 여성), 담배 흡연, 과도한 알콜 섭취, 높은 중성지방 수치, 높은 LDL ("저밀도 지단백질") 및 낮은 HDL ("고밀도 지단백질"), 당뇨병, 고혈압, 비만 및 스트레스를 포함한다.
MI 또는 AMI의 증상은 흉통, 숨가쁨, 메스꺼움, 구토, 두근거림, 발한, 및 불안 또는 임박한 운명의 느낌을 포함한다. 대상체는 종종 갑자기 아프다고 느낀다. 모든 심근 경색의 대략 3분의 1은 흉통 또는 다른 증상 없이 무증상이다.
MI가 의심되는 대상체는 여러 진단 검사, 예컨대 심전도 (ECG, EKG), 흉부 X-레이 및 상승된 크레아틴 키나제 (CK) 또는 트로포닌 수치 (손상된 조직, 특히 심근에 의해 방출되는 마커)를 검출하기 위한 혈액 검사를 받는다. 관상 동맥 조영술을 통해 심장 혈관의 협착 또는 폐쇄를 시각화할 수 있다.
심근 경색은 심장 근육 세포의 비가역적 손실을 일으켜 심장 기능에 기여할 수 없는 얇은 섬유성 흉터를 유발한다. 줄기 세포 요법은 심근 경색 후 심 부전 뿐만 아니라 리모델링과 연관된 아테롬성동맥경화증의 치료에 대한 가능한 접근법을 제공한다. 줄기 세포 요법의 기본 개념은 미성숙한 심장 근육 세포를 손상된 심장 벽에 직접 주사함으로써 기능적 심장 근육 세포 수를 증가시키는 것이다. 심근 경색은 심근 세포의 손실로 이어진 다음, 병리학적 리모델링 및 심 부전으로 진행된다. 줄기 세포 요법의 한 가지 목표는 허혈 후 손실된 심근 세포를 대체하고, 손상된 부위의 혈관 재생을 유도하는 것이다. 또 다른 목표는 심근 경색 후 아테롬성동맥경화증과 연관된 유해한 병리학적 리모델링을 예방하는 것이다. 자가 또는 동종이계 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 줄기 세포 요법을 위한 잠재적인 세포 공급원 중 하나로 간주된다. 따라서, 본 발명의 진피 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 심혈관 질환의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 진피 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 또 다른 용도는 조직 재생에 있다. 본 발명의 이러한 측면에서, ABCB5 양성 세포는 분화의 유도에 의해 조직을 생성하는데 사용된다. 단리 및 정제된 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 특이적 배지에서 유사분열 확장을 통해 미분화 상태로 성장할 수 있다. 그런 다음 이러한 세포는 수거되고 활성화되어 기계적, 세포적 및 생화학적 자극을 포함한 여러 요인에 의해 뼈, 연골 및 다른 다양한 유형의 결합 조직으로 분화될 수 있다. 인간 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 다양한 중간엽 조직 세포 뿐만 아니라 힘줄, 인대 및 진피를 생산하는 세포, 예컨대 조골 세포 및 연골 세포로 분화할 수 있는 잠재력을 보유하고 있으며, 이러한 잠재력은 단리 후에도 배양 중인 여러 집단 확장을 위해 유지된다. 따라서, 합성 ABCB5+ 줄기 세포를 단리, 정제, 크게 증식한 다음 활성화하여 원하는 중간엽 세포의 특이적 유형, 예컨대 골격 및 결합 조직, 예컨대 뼈, 연골, 힘줄, 인대, 근육, 및 지방으로 분화할 수 있어서, 골격 및 다른 결합 조직 장애를 치료하기 위한 프로세스가 존재한다. 용어 결합 조직은 본원에서 특수 요소를 지지하는 신체의 조직을 포함하기 위해 사용되며, 뼈, 연골, 인대, 힘줄, 기질, 근육 및 지방 조직을 포함한다.
본 발명의 방법 및 장치는 특정 조건 하에서 원하는 결합 조직의 상이한 유형, 예컨대 뼈 또는 연골 형성 세포로 분화되고 이를 생산하도록 유도될 수 있는 단리된 진피 중간엽 전구 세포를 활용한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 결합 조직 손상을 복구하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 세포를 복구에 필요한 결합 조직 유형으로 분화시키기에 적합한 조건 하에 결합 조직 손상 부위에 진피 중간엽 줄기를 적용하는 단계를 포함한다.
용어 "결합 조직 결함"은 외상, 질환, 연령, 선천적 결함, 외과적 처치 등으로 인해 발생할 수 있는 정상적인 결합 조직과 비교하여 임의의 손상 또는 불규칙성을 포함하는 결함을 지칭한다. 결합 조직 결함은 또한 손상되지 않은 부위를 지칭하며, 여기서 뼈 형성은, 예를 들어 미용 확대를 위해 전적으로 필요하다.
진피 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 임의의 공지된 투여 방식에 의해 대상체에게 직접 투여될 수 있거나 또는 매트릭스 또는 임플란트 상으로 시딩될 수 있다. 매트릭스 또는 임플란트는 중합체성 매트릭스, 예컨대 섬유성 또는 히드로겔 기반 장치를 포함한다. 합성 ABCB5+ 줄기 세포가 연골 또는 뼈로 분화할 때 이를 지원하기 위해 2가지 유형의 매트릭스가 흔히 사용된다. 한 가지 형태의 매트릭스는 중합체성 메쉬 또는 스폰지이며; 다른 하나는 중합체성 히드로겔이다. 매트릭스는 생분해성 또는 비생분해성일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 생분해성은 일단 약 25℃ 내지 38℃의 온도를 갖는 pH 6-8의 생리학적 용액에 노출되면, 원하는 적용에서 허용되는 기간 (약 6개월 미만, 가장 바람직하게 약 12주 미만) 내에 용해되거나 분해되는 중합체를 의미한다. 매트릭스는 일정 기간, 예를 들어 1년 미만, 보다 바람직하게 6개월 미만, 가장 바람직하게 2주 내지 10주에 걸쳐 생분해될 수 있다.
섬유성 매트릭스는 상업적으로 이용가능한 재료를 사용하여 제조되거나 구축될 수 있다. 매트릭스는 전형적으로 자연 또는 합성 중합체로 형성된다. 생분해성 중합체는 새로 형성된 연골이 자체적으로 유지되고 활액 관절에 존재하는 하중을 받는 상태에서 정상적으로 기능할 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 1주 내지 24주 이내에 분해되는 중합체가 바람직하다. 합성 중합체는 분해 속도를 더 정확하게 결정할 수 있고 자연 중합체보다 로트 간 일관성이 더 높고 면역원성이 적기 때문에 선호된다. 사용될 수 있는 자연 중합체는 단백질, 예컨대 콜라겐, 알부민, 및 피브린; 및 폴리사카라이드, 예컨대 알기네이트 및 히알루론산의 중합체를 포함한다. 합성 중합체는 생분해성 중합체와 비생분해성 중합체 둘 다를 포함한다. 생분해성 중합체의 예는 히드록시 산의 중합체, 예컨대 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산 (PGA), 및 폴리락트산-글리콜산 (PLGA), 폴리오르토에스테르, 폴리무수물, 폴리포스파젠, 및 그의 조합을 포함한다. 비생분해성 중합체는 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 에틸렌 비닐 아세테이트 및 폴리비닐 알콜을 포함한다. 연골에 존재하면 필연적으로 기계적 손상과 연골 파괴로 이어질 수 있으므로 이들은 피해야 한다.
일부 실시양태에서, 중합체는 100 내지 300 마이크론의 틈새 간격을 갖는 매트릭스를 형성하기 위해 얽히거나, 직조되거나, 또는 메쉬되는 섬유를 형성한다. 사용될 수 있는 폴리글리콜산의 메쉬는 수술 용품 회사, 예컨대 에티콘 (Ethicon; 미국 뉴저지주)으로부터 수득될 수 있다. 스폰지가 또한 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "섬유성"은 얽히거나, 직조되거나 또는 메쉬되는 매트릭스 또는 스펀지 매트릭스를 지칭한다.
매트릭스는 바람직하게 결함을 채우도록 성형된다. 대부분의 경우에, 이것은 중합체 섬유를 가위 또는 칼로 트리밍함으로써 달성될 수 있고; 또 다른 한편으론, 매트릭스는 휘발성 용매에서의 가열 또는 용해에 의해 형성된 중합체 용액으로부터 주조될 수 있다.
합성 ABCB5+ 줄기 세포는 세포 현탁액을 매트릭스에 적용함으로써 매트릭스 상으로 시딩된다. 이것은 세포 배양 용기에 매트릭스를 침지시키거나 또는 매트릭스에 세포를 주사하거나 다른 직접으로 적용함으로써 달성될 수 있다.
세포가 시딩된 매트릭스는 표준 외과 기술을 사용하여 결함 부위에 체내 이식된다. 매트릭스는 체내 이식 전에 시험관내에서 시딩 및 배양되거나, 시딩 및 즉시 체내 이식되거나, 또는 체내 이식 후 세포로 시딩될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 매트릭스 상으로 및 매트릭스 내로 시딩되고 대략 16시간 내지 2주 동안 시험관내에서 배양된다. 세포가 매트릭스에 부착되는 것이 중요하다. 2주가 세포 배양에 선호되는 시간이지만, 더 오래 걸릴 수도 있다. 시딩 또는 체내 이식 시 세포 밀도는 대략 25,000개 세포/mm3이어야 한다.
가단성 있는 이온성 또는 공유적으로 가교 결합된 히드로겔을 형성할 수 있는 중합체는 세포를 캡슐화하는데 사용된다. 예를 들어, 히드로겔은 해조류로부터 단리된 탄수화물 중합체인 알긴산과 같은 중합체의 음이온성 염을, 칼슘 이온 또는 알기네이트의 농도가 증가함에 따라 그의 강도가 증가하는 칼슘 양이온과 가교 결합함으로써 생산된다. 알기네이트 용액은 체내 이식될 세포와 혼합되어 알기네이트 현탁액을 형성한다. 그런 다음 현탁액이 경화되기 전에 환자에게 직접 현탁액을 주사한다. 그런 다음 현탁액은 생체내에서 생리학적 농도의 칼슘 이온이 존재하기 때문에 단기간에 걸쳐 경화된다.
체내로 이식하기 위해 세포와 혼합되는 중합체성 물질은 히드로겔을 형성해야 한다. 히드로겔은 유기 중합체 (자연 또는 합성)가 공유 결합, 이온 결합 또는 수소 결합을 통해 가교 결합되어, 물 분자를 가두어 겔을 형성하는 3차원 개방 격자 구조를 생성할 때 형성되는 물질로서 정의된다. 히드로겔을 형성하는데 사용될 수 있는 재료의 예는 이온적으로 가교 결합되는 폴리사카라이드, 예컨대 알기네이트, 폴리포스파진 및 폴리아크릴레이트, 또는 블록 공중합체, 예컨대 플루로닉스.TM 또는 테트로닉스.TM, 온도 또는 pH 각각에 의해 가교 결합되는 폴리에틸렌 옥시드-폴리프로파일렌 글리콜 블록 공중합체를 포함한다. 다른 재료는 단백질, 예컨대 피브린, 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 히알루론산 및 콜라겐을 포함한다.
일반적으로, 이들 중합체는 하전된 측기, 또는 그의 1가 이온성 염을 갖는 수용액, 예컨대 물, 완충 염 용액 또는 수성 알콜 용액에 적어도 부분적으로 가용성이다. 양이온과 반응할 수 있는 산성 측기를 갖는 중합체의 예는 폴리(포스파젠), 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 아크릴산과 메타크릴산의 공중합체, 폴리(비닐 아세테이트), 및 술폰화된 중합체, 예컨대 술폰화된 폴리스티렌이다. 아크릴산 또는 메타크릴산과 비닐 에테르 단량체 또는 중합체의 반응에 의해 형성된 산성 측기를 갖는 공중합체가 또한 사용될 수 있다. 산성 기의 예는 카르복실산 기, 술폰산 기, 할로겐화된 (바람직하게 플루오린화된) 알콜 기, 페놀성 OH 기 및 산성 OH 기이다.
음이온과 반응할 수 있는 염기성 측기를 갖는 중합체의 예는 폴리(비닐 아민), 폴리(비닐 피리딘), 폴리(비닐 이미다졸) 및 일부 이미노 치환된 폴리포스파젠이다. 중합체의 암모늄 또는 4차 염은 또한 골격 질소 또는 펜던트 이미노 기로부터 형성될 수 있다. 염기성 측기의 예는 아미노 및 이미노 기이다.
알기네이트는 실온 하의 물에서 2가 양이온과 이온적으로 가교 결합되어 히드로겔 매트릭스를 형성할 수 있다. 이러한 온화한 조건으로 인해, 알기네이트는, 예를 들어 미국 특허 번호 4,352,883 (Lim)에 기재된 바와 같이, 하이브리도마 세포 캡슐화에 가장 흔히 사용되고 있는 중합체였다. 상기 특허 (Lim) 프로세스에서는, 캡슐화될 생물학적 재료를 함유하는 수용액을 수용성 중합체 용액에 현탁시키고, 현탁액을 다가 양이온과 접촉시킴으로써 별개의 마이크로캡슐로 구성된 비말을 형성한 다음, 마이크로캡슐의 표면이 폴리아미노산과 가교 결합되어 캡슐화된 재료 주위에 반투과성 막을 형성한다.
폴리포스파젠은 단일 결합과 이중 결합이 교대로 분리되어 있는 질소와 인으로 구성된 골격을 가진 중합체이다. 가교 결합에 적합한 폴리포스파젠은, 산성이고 2가 또는 3가 양이온과 염 브릿지를 형성할 수 있는 대다수의 측쇄 기를 가지고 있다. 바람직한 산성 측기의 예는 카르복실산 기 및 술폰산 기이다. 이미다졸, 아미노산 에스테르 또는 글리세롤 측기를 갖는 단량체를 혼입함으로써 가수분해에 의해 분해되는 중합체를 합성할 수 있다. 예를 들어, 다가음이온성 폴리[비스(카르복실라토페녹시)]포스파젠 (PCPP)을 합성할 수 있으며, 이는 실온 이하에서 수성 매질에 용해된 다가 양이온과 가교 결합되어 히드로겔 매트릭스를 형성한다.
하전된 측기를 갖는 수용성 중합체는 반대 전하의 다가 이온, 중합체가 산성 측기를 갖는 경우 다가 양이온 또는 중합체가 염기성 측기를 갖는 경우 다가 음이온을 함유하는 수용액과 중합체를 반응시킴으로서 이온적으로 가교 결합된다. 히드로겔을 형성하기 위한 산성 측기와 중합체의 가교 결합에 바람직한 양이온은 2가 및 3가 양이온, 예컨대 구리, 칼슘, 알루미늄, 마그네슘, 스트론튬, 바륨, 아연 및 주석이지만, 이작용성, 삼작용성 또는 사작용성 유기 양이온, 예컨대 알킬암모늄 염이다. 이들 양이온 염의 수용액은 중합체에 부가되어 부드럽고 고도로 팽창된 히드로겔 및 막을 형성한다. 양이온의 농도가 더 높을수록 또는 원자가가 더 높을수록, 중합체의 가교 결합도가 더 커진다. 0.005 M 만큼 낮은 농도에서 중합체가 가교 결합되는 것으로 입증되었다. 더 높은 농도는 염의 용해도에 의해 제한된다.
바람직하게, 중합체는 생리학적 pH에서 수용액, 바람직하게 0.1 M 인산칼륨 용액에서 중합체성 히드로겔을 형성하는 농도, 예를 들어 알기네이트의 경우 0.5 내지 2 중량%, 바람직하게 1% 알기네이트로 용해된다. 단리된 세포는 1 내지 1천만 개 세포/ml, 가장 바람직하게 1천만 개 내지 2천만 개 세포/ml의 농도로 중합체 용액에 현탁된다.
한 실시양태에서, 세포를 히드로겔 용액과 혼합하고, 히드로겔을 경화시키기 전에 세포를 체내 이식하고자 하는 부위에 직접 주사한다. 그러나, 매트릭스는 또한 특정한 적용에 적합하도록 신체의 하나 이상의 상이한 부위에 성형 및 체내 이식될 수 있다. 이러한 적용은 특이적 구조 설계가 필요한 경우 또는 세포가 체내 이식될 부위에 세포의 성장 및 증식을 촉진하기 위한 특이적 구조 또는 지원이 결여된 경우에 특별히 관련이 있다.
세포가 체내 이식될 부위 또는 부위들은 개인의 필요에 따라 결정되며 필요한 세포 수도 결정된다. 주사된 용액을 성형하기 위해 외부 몰드를 적용할 수도 있다. 부가적으로, 중합 속도를 제어함으로써, 세포-히드로겔 주사된 임플란트를 성형하는 것이 가능하다.
또 다른 한편으론, 혼합물을 몰드 내로 주사하고, 히드로겔을 경화시킨 다음, 재료를 체내 이식할 수 있다.
현탁액은 증량제가 필요한 특이적 부위, 특히 연질 조직 결손 부위에 주사기와 바늘을 통해 직접 주사할 수 있다. 현탁액은 또한 선천성 또는 후천성 질환 상태, 또는 외상, 화상 등에 이차적인 경질 조직 결함, 예컨대 뼈 또는 연골 결함에 대한 증량제로서 주사될 수 있다. 이것의 예는 외상에 이차적인 뼈 변형이 존재하는 두개골 주변 영역에 주사하는 것이다. 이러한 경우 주사는 국소 또는 전신 마취 하에 바늘과 주사기를 사용하여 필요한 부위에 직접 수행할 수 있다.
진피 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 하기에 보다 상세히 기재되는 바와 같이, 치료 적응증에도 유용한 단백질을 발현하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 세포는 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 분화된 계통으로의 분화를 추가로 유도하거나 가속화하는 적어도 하나의 생리활성 인자를 생산하는 핵산을 포함할 수 있다. 뼈가 형성되는 경우, 생리활성 인자는 다양한 조직 성장 인자, 특히 뼈 형태형성 단백질, 예컨대 BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-6 및 BMP-7로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 TGF-베타 슈퍼패밀리의 구성원일 수 있다.
본 발명의 세포는 시험관내에서 T 세포 아네르기를 유도하는 방법에 유용할 수 있다. T 세포 아네르기의 유도는 T 세포 및/또는 T 세포 선조의 형성을 유도하고 형성된 T 세포 및/또는 T 세포 선조의 활성화를 억제하기에 충분한 조건 하에 항원의 존재 하에 진피 합성 ABCB5+ 줄기 세포를 배양하는 것을 수반한다. 아네르기는 T 세포의 무반응 상태로서 정의된다 (즉, 재자극 시 IL-2를 생산하지 못하거나 또는 재자극될 때 증식하지 못한다) (Zamoyska R, Curr Opin Immunol, 1998, 10(1):82-87; Van Parijs L, et al., Science, 1998, 280(5361):243-248; Schwartz RH, Curr Opin Immunol, 1997, 9(3):351-357; Immunol Rev, 1993, 133:151-76). 아네르기는 처리된 T 세포를 취하고 APC의 존재 하에 항원으로 재자극함으로써 측정될 수 있다. 세포가 아네르기성이면, 이러한 세포는 APC의 맥락에서 적절한 농도에서 항원에 반응하지 않을 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 대상체는 인간, 비-인간 영장류, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 또는 설치류이다. 인간 진피 합성 ABCB5+ 줄기 세포 및 인간 대상체는 특히 중요한 실시양태이다.
본원에 기재된 본 발명의 또 다른 측면에서, 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 관심 유전자로 유전적으로 조작 (또는 형질도입 또는 형질감염)될 수 있다. 형질도입된 세포는, 예를 들어 유전 장애 또는 질환을 치료하기 위해 이를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다.
합성 ABCB5+ 줄기 세포 및 그의 자손은 유전적으로 변경될 수 있다. 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 유전적 변경은 외인성 유전 물질의 부가에 의해 생성되는 세포성 유전 물질의 모든 일시적이고 안정적인 변화를 포함한다. 유전적 변경의 예는 임의의 유전자 요법 절차, 예컨대 돌연변이되거나 또는 비발현된 유전자를 대체하기 위한 기능적 유전자의 도입, 우성 음성 유전자 산물을 코딩하는 벡터의 도입, 리보자임을 발현하도록 조작된 벡터의 도입 및 치료 유전자 산물을 코딩하는 유전자의 도입을 포함한다. 임의의 작용제의 도입 없이 자연적인 유전적 변화, 예컨대 T 세포 수용체 유전자의 자발적인 재배열은 이러한 개념에 포함되지 않는다. 외인성 유전 물질는 진피 합성 ABCB5+ 줄기 세포 내로 도입되는 자연 또는 합성의 핵산 또는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 외인성 유전 물질은 세포에 자연적으로 존재하는 것의 카피일 수 있거나, 또는 세포에서 자연적으로 발견되지 않을 수 있다. 이는 전형적으로 벡터 구축물에서 프로모터의 작동가능한 제어 하에 배치된 자연적으로 발생하는 유전자의 적어도 일부분이다.
핵산을 세포 내로 도입하기 위해 다양한 기술이 이용될 수 있다. 이러한 기술은 핵산-CaPO4 침전물의 형질감염, DEAE와 연관된 핵산의 형질감염, 관심 핵산을 포함한 레트로바이러스로의 형질감염, 리포솜 매개된 형질감염 등을 포함한다. 특정 용도의 경우, 핵산이 특정한 세포를 표적화하는 것이 바람직하다. 이러한 경우에, 본 발명에 따른 핵산을 세포 내로 전달하기 위해 사용되는 비히클 (예를 들어, 레트로바이러스, 또는 다른 바이러스; 리포솜)은 그에 부착된 표적화 분자를 가질 수 있다. 예를 들어, 표적 세포 상의 표면 막 단백질에 특이적인 항체 또는 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드와 같은 분자는 핵산 전달 비히클과 결합되거나 또는 그 내에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 리포솜이 본 발명의 핵산을 전달하기 위해 이용되는 경우, 세포내이입과 연관된 표면 막 단백질과 결합하는 단백질은 표적화를 위해 및/또는 흡수를 촉진하기 위해 리포솜 제형 내로 혼입될 수 있다. 이러한 단백질은 특정한 세포 유형에 대해 지향성인 단백질 또는 그의 단편, 순환에서 내재화되는 단백질에 대한 항체, 세포내 국재화를 표적화하고 세포내 반감기를 향상시키는 단백질 등을 포함한다. 중합체성 전달 시스템은 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 핵산을 세포 내로 전달하기 위해 성공적으로 사용되어 왔다. 이러한 시스템은 심지어 핵산의 경구 전달을 허용한다.
외인성 유전 물질을 진피 합성 ABCB5+ 줄기 세포 내로 도입하는 한 가지 방법은 복제-결핍 레트로바이러스를 사용하여 세포를 형질도입하는 것이다. 복제-결핍 레트로바이러스는 모든 비리온 단백질의 합성을 지시할 수 있지만, 감염성 입자를 만들 수는 없다. 따라서, 이러한 유전적으로 변경된 레트로바이러스 벡터는 배양된 세포에서 유전자의 고효율 형질도입을 위한 일반적인 유용성을 갖는다. 레트로바이러스는 유전 물질을 세포로 옮기는데 광범위하게 사용되었다. 복제-결핍 레트로바이러스를 생산하기 위한 표준 프로토콜 (외인성 유전 물질을 플라스미드 내로 혼입하는 단계, 패키징 세포주를 플라스미드로 형질감염시키는 단계, 패키징 세포주에 의해 재조합 레트로바이러스를 생산하는 단계, 조직 배양 배지로부터 바이러스 입자를 수집하는 단계, 및 표적 세포를 바이러스 입자로 감염시키는 단계 포함)이 관련 기술분야에 제공된다.
레트로바이러스를 사용하는 주요 이점은 이러한 바이러스가 치료제를 코딩하는 유전자의 단일 카피를 숙주 세포 게놈 내로 효율적으로 삽입함으로써, 세포가 분열될 때 외인성 유전 물질이 그 세포의 자손에게 전달될 수 있도록 하는 것이다. 또한, LTR 영역에서의 유전자 프로모터 서열은 다양한 세포 유형에서 삽입된 코딩 서열의 발현을 향상시키는 것으로 보고되었다. 레트로바이러스 발현 벡터 사용의 주요 단점은 (1) 삽입 돌연변이 유발, 즉 예를 들어, 비조절된 세포 성장을 유도하는 표적 세포 게놈의 바람직하지 않은 위치 내로의 치료 유전자의 삽입 및 (2) 벡터에 의해 운반되는 치료 유전자가 표적 게놈에 통합되도록 하기 위해서는 표적 세포 증식이 필요하다는 것이다. 이러한 명백한 한계에도 불구하고, 레트로바이러스를 통한 치료제의 치료상 유효량의 전달은 형질도입의 효율이 높고/높거나 형질도입에 이용가능한 표적 세포의 수가 많은 경우에 효과적일 수 있다.
진피 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 형질전환을 위한 발현 벡터로서 유용한 또 다른 바이러스 후보는 이중 가닥 DNA 바이러스인 아데노바이러스이다. 레트로바이러스와 마찬가지로, 아데노바이러스 게놈은 유전자 형질도입을 위한 발현 벡터로서 사용하기에 적합하며, 즉 바이러스 자체의 생산을 제어하는 유전 정보를 제거한다. 아데노바이러스는 통상적으로 염색체외 방식으로 기능하기 때문에, 재조합 아데노바이러스는 삽입 돌연변이 유발의 이론적 문제가 없다. 다른 한편으론, 표적 진피 중간엽 줄기 세포의 아데노바이러스 형질전환은 안정적인 형질도입을 초래하지 않을 수 있다. 그러나, 보다 최근에 특정 아데노바이러스 서열이 운반체 서열에 염색체내 통합 특이성을 부여하므로, 외인성 유전 물질의 안정적인 형질도입을 초래하는 것으로 보고되었다.
따라서, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 외인성 유전 물질을 진피 합성 ABCB5+ 줄기 세포로 전달하기 위해 다양한 적합한 벡터가 이용가능하다. 유전자 대체 요법이 가능한 특정한 조건에 대해 치료제를 전달하기 위한 적절한 벡터의 선택 및 선택된 발현 벡터를 세포 내로 삽입하기 위한 조건의 최적화는 과도한 실험의 필요성 없이 관련 기술분야의 통상의 기술 중 하나의 범주 내에 있다. 프로모터는 특징적으로, 전사를 시작하는데 필요한 특이적 뉴클레오티드 서열을 가지고 있다. 임의로, 외인성 유전 물질은 원하는 유전자 전사 활성을 수득하는데 필요한 부가의 서열 (즉, 인핸서)을 추가로 포함한다. 이러한 논의의 목적을 위해, "인핸서"는 단순히, 프로모터에 의해 지시된 기본 전사 수준을 변화시키기 위해 코딩 서열과 인접하여 작동하는 (시스로) 임의의 비번역된 DNA 서열이다. 바람직하게, 외인성 유전 물질은 프로모터로부터 바로 하류에 있는 진피 중간엽 줄기 세포 게놈 내로 도입되어, 프로모터와 코딩 서열이 코딩 서열의 전사를 허용하도록 작동적으로 연결된다. 바람직한 레트로바이러스 발현 벡터는 삽입된 외인성 유전자의 전사를 제어하기 위한 외인성 프로모터 요소를 포함한다. 이러한 외인성 프로모터는 구성적 프로모터와 유도성 프로모터 둘 다를 포함한다.
자연적으로 발생하는 구성적 프로모터는 필수 세포 기능의 발현을 제어한다. 그 결과, 구성적 프로모터의 제어 하에 있는 유전자는 세포 성장의 모든 조건에서 발현된다. 예시적인 구성적 프로모터는 특정 구성적 또는 "하우스키핑" 기능을 코딩하는 하기 유전자에 대한 프로모터를 포함한다: 히포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HPRT), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) (문헌 [Scharfmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4626-4630 (1991)]), 아데노신 데아미나제, 포스포글리세롤 키나제 (PGK), 피루베이트 키나제, 포스포글리세롤 뮤타제, 액틴 프로모터 (문헌 [Lai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10006-10010 (1989)]), 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 구성적 프로모터. 또한, 많은 바이러스 프로모터가 진핵 세포에서 구성적으로 기능한다. 이들은 특히 하기를 포함한다: SV40의 초기 및 후기 프로모터; 몰로니 백혈병 바이러스 및 다른 레트로바이러스의 장 말단 반복부 (LTRS); 및 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터. 따라서, 상기 언급된 구성적 프로모터 중 임의의 것이 이종 유전자 삽입체의 전사를 제어하는데 사용될 수 있다.
유도성 프로모터의 제어 하에 있는 유전자는 유도제의 존재 하에서만 또는 더 큰 정도로 발현된다 (예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터의 제어 하에 있는 전사는 특정 금속 이온의 존재 하에 크게 증가된다). 유도성 프로모터는 유도 인자가 결합될 때 전사를 자극하는 반응성 요소 (RE)를 포함한다. 예를 들어, 혈청 인자, 스테로이드 호르몬, 레티노산 및 시클릭 AMP에 대한 RE가 있다. 특정한 RE를 함유하는 프로모터는 유도성 반응을 수득하기 위해 선택될 수 있으며 일부 경우에는 RE 자체가 상이한 프로모터에 부착됨으로써, 재조합 유전자에 유도성을 부여할 수 있다. 따라서, 적절한 프로모터 (구성적 대 유도성; 강함 대 약함)를 선택함으로써, 유전적으로 변형된 진피 중간엽 줄기 세포에서의 치료제의 존재 및 발현 수준 둘 다를 제어할 수 있다. 특정한 치료제의 치료상 유효 용량의 전달을 위한 이들 인자의 선택 및 최적화는 상기 개시된 인자 및 대상체의 임상 프로파일을 고려하여 과도한 실험 없이 관련 기술분야의 통상의 기술 중 하나의 범주 내에 있는 것으로 간주된다.
치료제를 코딩하는 적어도 하나의 이종 핵산 및 적어도 하나의 프로모터에 더하여, 발현 벡터는 바람직하게, 발현 벡터로 형질감염 또는 형질도입된 진피 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 선택을 용이하게 하기 위해 선택 유전자, 예를 들어 네오마이신 내성 유전자를 포함한다. 또 다른 한편으론, 진피 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 2개 이상의 발현 벡터, 즉 치료제(들)를 코딩하는 유전자(들)를 함유하는 적어도 하나의 벡터, 선택 유전자를 함유하는 다른 벡터로 형질감염된다. 적합한 프로모터, 인핸서, 선택 유전자 및/또는 신호 서열의 선택은 과도한 실험 없이 관련 기술분야의 통상의 기술 중 하나의 범주 내에 있는 것으로 간주된다.
단리된 진피 중간엽 줄기 세포에서 특이적 유전자 산물을 발현하기 위한 특정한 발현 벡터의 선택 및 최적화는 바람직하게, 하나 이상의 적절한 제어 영역 (예를 들어, 프로모터, 삽입 서열)을 갖는 유전자를 수득하는 단계; 상기 유전자가 삽입된 벡터를 포함하는 벡터 구축물을 제조하는 단계; 배양된 진피 합성 ABCB5+ 줄기 세포를 시험관내에서 벡터 구축물로 형질감염 또는 형질도입하는 단계; 및 유전자 산물이 배양된 세포에 존재하는지 여부를 결정하는 단계에 의해 달성된다.
따라서, 본 발명은 생물학적으로 유의미한 양으로 인간 줄기 세포에서 정상적으로 생산되지 않거나 또는 소량이지만 과잉 생산이 치료 혜택을 초래할 것인 상황에서 생산되는 폴리펩티드, 호르몬 및 단백질을 생산하는 방식으로 진피 합성 ABCB5+ 줄기 세포를 유전적으로 조작하는 것을 가능하게 한다. 그런 다음 이들 산물은 혈류 또는 신체의 다른 영역, 예컨대 중추 신경계 내로 분비될 것이다. 이러한 방식으로 형성된 인간 줄기 세포는 필요한 물질의 주기적인 투여 (섭취, 주사, 데포 주입 등에 의함)를 필요로 하는 현재 요법을 대체하기 위한 연속 약물 전달 시스템으로서 작용할 수 있다. 본 발명은 이러한 물질을 필요로 하는 인간에게 호르몬, 효소 및 약물을 제공하는데 적용할 수 있다. 이는 장기간 지속 용량으로 필요한 호르몬 (예를 들어 부갑상선 호르몬, 인슐린)과 같은 물질을 제공하는데 특히 유용하다.
예를 들어, 인슐린을 지속적으로 전달하는데 사용할 수 있으며, 그 결과 매일 인슐린을 주사할 필요가 없다. 유전적으로 조작된 인간 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 또한 응고 인자, 예컨대 인자 VIII의 생산을 위해 사용되거나 또는 근이영양증을 위한 근육 세포로의 디스트로핀의 지속적인 전달을 위해 사용될 수 있다.
관심 유전 물질을 진피 합성 ABCB5+ 줄기 세포 내로 혼입하는 것은 유전성 및 후천성 질환의 치료에 특히 유용하다. 유전성 질환의 경우, 이러한 접근법은 유전적으로 변형된 인간 합성 ABCB5+ 줄기 세포 및 대사 싱크로서 사용될 수 있는 다른 세포를 제공하는데 사용된다. 즉, 이러한 진피 합성 ABCB5+ 줄기 세포는 잠재적으로 독성인 물질을 분해하는 역할을 할 것이다. 예를 들어, 이것은 페닐알라닌 히드록실라제에서의 결함으로 인한 고페닐알라닌혈증; 시스타티오닌 베타-신타제에서의 결함으로 인한 호모시스테인혈증을 포함한 아미노산 이화 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 설명에 제시되거나 또는 도면에 예시된 구성요소의 배열 및 구축의 세부사항에 대한 적용에 제한되지 않는다. 본 발명은 다른 실시양태가 가능하고 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다. 또한, 본원 사용된 어구 및 용어는 설명을 위한 것이며 제한적인 것으로서 간주되서는 안된다. 본원에서 "포함한", "포함하는" 또는 "갖는", "함유하는", "수반하는" 및 그의 변형의 사용은 이후에 열거된 항목 및 그의 등가물 뿐만 아니라 부가의 항목을 포괄하는 것을 의미한다.
실시예
치유되지 않은 상처의 요법을 위한 ATP-결합 카세트 서브패밀리 B 구성원 5 (ABCB5)를 발현하는 새로 확인된 진피 세포 하위집단의 유익한 효과가 본원에서 보고되었다. 진피 ABCB5+-유래 MSC의 국소 투여는 대식세포 지배 염증을 약화시켰고, 이로써 인간 하지 정맥 궤양의 치유되지 않은 상태를 모방한 철 과부하 마우스 모델에서 전체 두께 절단 상처의 치유를 가속화하였다. 관찰된 유익한 효과는 ABCB5+-유래 MSC에 의해 분비된 인터류킨-1 수용체 길항제 (IL-1RA)로 인한 것으로, 염증을 약화시키고, 상처 부위에서 우세한 억제되지 않은 염증 유발성 M1 대식세포를 복구 촉진 항염증성 M2 대식세포로 전환시켰다. 인간 상처 대식세포에 대한 ABCB5+-유래 MSC로부터 방출된 IL-1RA의 유익한 항염증 효과는 인간화 NOD-scid IL2rγ null 마우스에서 보존되었다. 결론적으로, 인간 진피 ABCB5+ 세포는 인간에서의 치유되지 않은 만성 상처를 성공적으로 치료할 실질적인 가능성을 지닌 MSC의 새롭고, 쉽게 접근가능하며 마커가 풍부한 공급원을 나타낸다.
단일 분자 마커인 ATP-결합 카세트 단백질 ABCB5는 내인성 틈새로부터 다능성 중간엽 기질 세포 (MSC) 특징을 가진 피부의 진피 세포 하위집단을 단리하는데 사용될 수 있다. ABCB5+ MSC는 대규모 시험관내 확장 배양 동안 그의 줄기세포성 및 중간엽 마커의 대부분을 유지할 뿐만 아니라 클론 자기-재생 능력을 유지하고 중요하게는 뮤린 모델에서 치유되지 않은 철 과부하 상처의 치유를 촉진시키며, 이는 인간 환자에서의 만성 하지 정맥 궤양에 대한 잠재적인 재생 요법으로서 활용될 수 있다.
인간 및 뮤린의 진피는 혈관주위 및 모낭간 틈새에 ABCB5 + 기질 세포를 정착시킨다
건강한 인간 피부 절편의 면역염색을 사용하여, ABCB5+ 세포가 이전에 진피를 포함한 상이한 성체 조직에서 MSC 상에 발현되는 것으로 보고된 배아 생식 및 줄기 세포 마커 [10]인 탄수화물 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4)에 대해 공동-염색된다는 것이 입증되었다 [11, 12, 13].
흥미롭게도, ABCB5+ 세포는 CD31+ 내피 세포와 밀접하게 연관되어 혈관주위 내인성 틈새에 국한되거나 또는 모낭과 독립적인 모낭간 진피 내에 분산되었다. ABCB5+ 세포는 10명의 상이한 공여자의 피부에 있는 모든 진피 세포의 2.45% ± 0.61%를 구성했으며, ABCB5+ 세포 중 55.3% ± 23.9%가 혈관주위에 국한되었으며, 이는 CD31+ 내피 세포와 ABCB5+ 세포 사이에 최대 하나의 부가의 세포로서 정의되었다. 이중 면역염색된 인간 피부 절편에서 NG2와 ABCB5의 공동-국재화가 거의 없었기 때문에, 혈관주위 ABCB5+ 세포는 신경/신경교 항원 2 (NG2) 양성 혈관주위세포와 뚜렷이 구별되었다 [14]. 내인성 틈새에서 ABCB5+ 세포의 유사한 분포가 뮤린 피부에서 발견되었다.
더욱이, ABCB5+ 농축 MSC로부터의 RNA 서열 분석은 배양에서 높은 계대 수로 확장된 경우에도, 중간엽 마커 유전자 뿐만 아니라 뚜렷한 줄기세포성의 발현을 보여주었다. 더욱이, 단백질 수준에서 인간 피부 내의 ABCB5+ 세포에서의 선택된 줄기세포성 마커, 예컨대 SSEA-4, DPP4 (CD26), PRDM1 (BLIMP1) 및 POU5F1 (OCT-4)의 발현을 면역염색으로 확인하였다. 인간 피부의 ABCB5+ 세포에는 하부 섬유모세포 계통 마커인 α-평활근 액틴 (α-SMA)의 발현이 없었다. 취합하면 이들 결과는 시험관내에서 적어도 부분적으로 유지되고 치유되지 않은 상처의 치료를 위해 치료상 활용될 수 있는 ABCB5+ 세포의 줄기세포성 특성을 뒷받침해준다.
인간 진피 ABCB5 세포는 중간엽 줄기 세포 특성을 나타낸다
ABCB5에 대한 선택이 MSC 특성을 가진 세포 분획을 초래하는지 여부를 평가하기 위해, 효소적으로 소화된 피부로부터 유래된 진피 단일 세포 현탁액을 ABCB5 자성 비드 분류의 여러 라운드로 분리하였다. 그 결과, 2개의 상이한 세포 분획, 즉 평균 98.33% ± 1.12% ABCB5+ 세포를 함유하는 이중 ABCB5 농축 분획과 3배 ABCB5- 고갈 분획이 생성되었으며, 이는 공여자 B01로부터의 세포에 대한 유동 세포측정법 도트 플롯으로 예시된 바와 같이 ABCB5+ 세포의 매우 낮은 백분율만을 함유하였다 (표 1A-B). ABCB5+ 분획과 ABCB5- 분획 둘 다는 섬유모세포, 방추형 세포 형태를 나타내었고 중간엽 계통 마커 CD90, CD105 및 CD73의 특징적인 최소 세트를 발현한 반면, 조혈 줄기 세포 및 계통 마커 CD34, CD14, CD20 및 CD45의 발현 [15]은 유동 세포측정법에 의해 검출되지 않았다. 지방형성, 골형성 및 연골형성 계통 분화에 대한 일관되고 유의미하게 증가된 잠재력이 공여자 일치 ABCB5-고갈 세포와 비교 시 ABCB5+ 세포에 대해 관찰되었으며, 이로써 ABCB5+ 분획을 ABCB5- 인간 진피 섬유모세포 (HDF)로부터의 다능성 성체 MSC로서 묘사하였다. 이것은 ABCB5+ 분류된 세포가 단일 세포 유래 콜로니를 생성하는 반면, ABCB5-고갈 분획은 그렇지 않았다는 발견에 의해 추가로 확인되었다. 진피 ABCB5+-유래 MSC의 시험관내 자기-재생 능력을 평가하기 위해, 6명의 상이한 공여자로부터 ABCB5+ 분류된 MSC의 54개 클론 배양물의 서브클론생성 성장 및 삼계통 분화 잠재력이 결정되었다. 흥미롭게도, 클론 콜로니의 75.61 ± 16.86%가 다시 클론생성 성장을 나타내었고, 연구된 모든 클론의 62.40 ± 7.54%가 단일 세포로부터 생성되었으며, 3가지 모든 중간엽 세포 계통으로 분화할 수 있는 잠재력을 유지하였다. 이들 클론의 부가의 29.84 ± 11.57%는 이분화능이었고 7.77 ± 10.02%는 골형성 분화에 대해 단능성이었다. 6명의 공여자로부터의 클론 중, 3가지 계통 모두에 대해 음성인 클론은 없었다. 200개 초과의 연구된 단일 세포 클론에서 34%의 삼계통 분화 능력을 가진 골수 유래 MSC의 황금 표준과 비교할 때 [16], >70%의 삼계통 분화 능력은 ABCB5+ 피부-유래 MSC에서 명백하게 더 우수하였다.
삼중 ABCB5-고갈 세포와 대조적으로, ABCB5+ 분류된 세포 분획은 뚜렷한 줄기 세포 연관 SSEA-4 [17] 발현을 나타냈다. 이것은 인간 피부에서 관찰된 ABCB5+ 세포와 SSEA-4의 공동-발현과 일치한다. 슬라이드 상에서 성장한 ABCB5+ 세포의 핵은 줄기 세포-연관 전사 인자 성 결정 영역 Y-박스 2인 SOX2에 대해 양성으로 염색된 반면, ABCB5- 세포는 그렇지 않았다. ABCB5+ 또는 ABCB5- 피부 플라스틱 부착 세포 분획 중 어느 것도, 부가적으로 시험된 세포 표면 마커인 멜란-A (멜라닌 세포), CD133 (암 줄기 세포), CD318 (상피 세포) 및 CD271 (다른 MSC 집단에서 발견되는 신경영양 인자)을 발현하지 않았다.
인간 ABCB5 + - 유래 MSC는 M1에서 M2 대식세포로의 전환을 촉발하여 철 과부하 마우스에서 상처 치유를 가속화한다
여기에서 특징 규명된 진피 ABCB5+-유래 MSC가 고전적으로 활성화된 M1 대식세포에 대해 항염증 효과를 발휘하는지 여부를 다루기 위해, ABCB5+-유래 MSC를 재조합 인간 IFN-γ 및 LPS로 활성화시킨 동종이계 PBMC CD14+ 단핵구-유래 대식세포와 공동-배양하였다. 주목할 만하게, 공여자 일치 ABCB5- HDF와의 공동-배양물 또는 단독으로 배양된 대식세포와는 대조적으로, 활성화된 대식세포가 ABCB5+-유래 MSC와 공동-배양된 경우에 상청액에서 M1 대식세포 유래 염증 유발성 시토카인 TNFα 및 IL-12/IL-23p40이 훨씬 더 적게 검출되었다. 반대로, M2 대식세포 유래 항염증성 시토카인인 IL-10의 증가된 양은 공여자 일치 ABCB5- HDF 또는 단독으로 배양된 대식세포와 대조적으로, ABCB5+-유래 MSC와 공동-배양된 대식세포의 상청액에서 발견되었다. 주목할 만하게, 6명의 상이한 공여자로부터 풀링된 ABCB5+-유래 MSC는 단일 ABCB5+-유래 MSC와 비교할 때 M2 대식세포 시토카인 IL-10의 동시 상향-조절과 함께 M1 대식세포 시토카인에 대해 유사한 억제 작용을 나타냈다. 이들 데이터는 ABCB5+-유래 MSC의 풀링된 제제가 임상 일상에서 치유되지 않은 상처의 치료에 실제적으로 적절한 옵션이 될 것임을 암시한다.
인간 ABCB5+-유래 MSC와 인간 대식세포의 공동-배양과 유사하게, 인간 ABCB5+-유래 MSC는 종간 환경에서 뮤린 대식세포에 대해 동일한 효과를 발휘함으로써, 뮤린 이종이식 모델에서 후속 상처 치유 연구에 대한 기능적 관련성을 확인시켜 준다.
다음으로, 억제되지 않은 활성화로 인해 만성 인간 상처의 치유되지 않은 상태를 담당하는 M1 대식세포의 억제에 대한 ABCB5+-유래 MSC의 측분비 효과를 구체적으로 조사하기 위해, 이종이식 설정에서 전체 두께의 절제 상처가 있는 철 과부하 마우스 모델이 이용되었다 [7]. 철 과부하 상처 모델은 만성 하지 정맥 궤양의 주요 병원성 측면을 충실하게 반복한다 [7]. ABCB5+-유래 및 ABCB5-고갈 인간 진피 세포를 상처 형성 후 제1일에 상처 가장자리 주변의 진피에 주사하였다. 상처 형성 후 제3일에 주사된 인간 세포의 지속성은 인간 주요 조직적합성 복합체 I 불변 서브유닛 β2-마이크로글로불린 (β2M)에 대한 면역염색에 의해 확인되었다. 상처 절편으로부터 단리된 게놈 DNA에 대한 인간-특이적 베타 액틴 서열 PCR을 통해, 인간-특이적 베타 액틴 신호의 지속성이 지시된 시점에 ABCB5+-유래 MSC 또는 ABCB5- 세포를 주사한 상처에서 유사한 정도로 확인되었다. 따라서, ABCB5+ 세포와 ABCB5- 세포 간의 지속성의 차이는 결과를 혼동하지 않았다.
철 과부하 모델에서 ABCB5+-유래 MSC의 주사가 상처 봉합을 가속화하는지 여부에 대한 질문은 다음으로 해결되었다. 예상대로, 지연된 상처 봉합이 덱스트란 처리된/PBS 주사된 대조군 마우스와 비교 시 철 처리된/PBS 주사된 마우스에서 관찰되었다. 주목할 만하게, 공여자 일치 ABCB5- HDF 또는 PBS 단독의 주사와 비교하여 4개의 상처 (마우스당) 주위에 106개 ABCB5+-유래 MSC의 피내 주사 후 상당히 가속화된 상처 봉합이 관찰되었다. ABCB5+-유래 MSC를 사용한 치료는 상처 봉합 속도를 덱스트란 처리된/PBS 주사된 대조군 마우스의 상처 봉합 속도로 완전히 회복시켰다.
취합하면, 이러한 발견은 치유되지 않은 만성 상처의 치료를 위한 ABCB5+-유래 MSC의 유익한 효과를 시사한다.
인간 ABCB5 + -유래 MSC는 염증을 억제하고 철 과부하 마우스에서 모든 후속 상처 단계를 개선시킨다
만성 상처는 억제되지 않은 M1 대식세포 활성화를 수반한 염증성 상처 단계에서 지속되며, 상처 치유의 정상적인 단계를 통해 진행되지 않는다. ABCB5+-유래 MSC의 주사가 억제되지 않은 M1 대식세포-의존성 염증을 억제하고 상처가 상이한 상처 단계의 정상적인 순서를 따르도록 할 수 있는지 여부가 본원에서 연구되었다. 이중 면역염색을 이용하여, ABCB5+-유래 MSC는 철 과부하 상처에 주사되었을 때 내인성 뮤린 대식세포와 밀접한 연관이 있는 것으로 밝혀졌으며, 이는 ABCB5+-유래 MSC가 대식세포에 미치는 측분비 효과가 상처 조직에서 가능하다는 것을 암시한다. 철 과부하 상처에서 대식세포 지배 염증에 대한 ABCB5+-유래 MSC의 측분비 영향을 조사하기 위한 첫 번째 시도에서, 전체 상처 시토카인 프로파일은 단백질 용해물에 대한 ELISA에 의해 연구되었다. 특히, 상처 형성 후 제5일에, 염증성 시토카인 TNFα의 상처 조직 단백질 수준이 감소한 반면, 항염증성 IL-10은 ABCB5+-유래 MSC가 주사된 철 과부하 상처에서는 증가되었지만, ABCB5- HDF 대조군이 주사된 상기 상처에서는 그렇지 못하였다. 더욱이, 인간 CVU 및 철 과부하 뮤린 모델에서 전형적으로 상향-조절되는 염증성 시토카인 IL-1β는 ABCB5+-유래 MSC로 처리 시 유의미하게 억제되었다.
ABCB5- HDF 주사된 상처와 대조적으로 ABCB5+-유래 MSC를 주사했을 때 제7일 철 과부하 상처에서, 성공적인 피부 복구의 핵심 특징인 전체 상처층을 덮고 있는 완전히 회복된 K14+ 상피 세포층을 동반한 더 빠른 재상피화가 또한 관찰되었다. 제7일에 상처층 내에 CD31+ 혈관 싹의 수 및 면적 증가로써 확인된 바와 같이 신생혈관증식의 상당한 개선이 관찰되었다. 또한, 철 과부하 마우스의 상처 가장자리에 ABCB5+-유래 MSC를 주사하면, 콜라겐 섬유의 성숙도가 증가하고 육아 조직 깊이가 감소하고 더 조밀하게 바구니로 짜여진 원섬유 구조에서 콜라겐 섬유의 조직이 개선되어 조직 리모델링이 현저하게 개선되었다. 주목할 만하게, ABCB5+-유래 MSC가 주사된 철 과부하 상처는 흉터 조직의 인장 강도가 상당히 더 높은 것으로 나타났으며, 이는 ABCB5- HDF 또는 PBS 처리된 철 과부하 상처의 흉터 조직에서의 인장 강도가 낮은 것과 비교 시, 복원 조직의 품질 개선에 대한 강력한 지표이다. 이들 데이터는 ABCB5+-유래 MSC가 여러 상처 치유 단계에 긍정적인 영향을 미치고 조직 복구를 가속화할 뿐만 아니라 중요하게는 흉터가 감소하고 품질이 개선된 복원 조직으로 이어진다는 것을 제시한다.
ABCB5 + -유래 MSC는 IL-1RA의 적응 분비를 통해 대식세포 지배 염증을 억제한다
급성 상처에서 일시적으로 유도된 낮은 IL-1β 농도와 대조적으로 만성 상처에서 풍부한 IL-1β와 그의 염증 증폭 이펙터 TNFα [7]를 감안할 때, 인간 진피 ABCB5+-유래 MSC가 IL-1 신호전달의 자연 길항제인 IL-1RA를 생산할 수 있는지에 대한 질문이 해결되었다. 배양에서 자극되지 않은 ABCB5+-유래 MSC는 특이적 ELISA에 의해 평가된 바와 같이 IL-1RA를 쉽게 생산하지 않는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 공여자 일치 ABCB5- HDF와 달리, ABCB5+-유래 MSC는 IFN-γ/LPS로 자극될 때 높은 IL-1RA 수준을 방출하였다. 주목할 만하게, IL-1RA 농도는 ABCB5+-유래 MSC와 IFN-γ/LPS 활성화 M1 대식세포의 공동-배양에서 훨씬 더 높았다. 주사한 지 6시간 후, 철 과부하 마우스의 상처 부위에서 ABCB5+-유래 MSC에서 특이적 IL-1RA 발현이 관찰되었으며, 이는 명백하게 공동-국소화된 인간-특이적 β2M 및 IL-1RA를 사용한 이중 면역염색에 의해 제시된 바와 같다. 웨스턴 블롯 분석을 이용하여, ABCB5- HDF 또는 PBS 주사된 대조군 상처 용해물에서 IL-1RA 발현이 없는 것과 비교 시 철 과부하 ABCB5+-유래 MSC 주사된 상처로부터 제조된 풀링된 제3일 상처 용해물에서 높은 IL-1RA 발현이 확인되었다. 주목할 만하게, 이전에 보고되지 않은 IL-1RA 발현은 또한 철 과부하 모델 상처 치유에서 내인성 뮤린 ABCB5+ MSC에서 관찰되었지만, 건강한 피부에서는 뮤린이나 인간 내인성 ABCB5+-유래 MSC 모두가 IL-1RA를 발현하지 않는 것으로 밝혀졌다. 이들 데이터는 철 과부하 상처의 염증 환경에 대한 반응으로 진피 ABCB5+ MSC에 의한 IL-1RA의 적응 생산을 암시한다. 뮤린 대식세포의 작은 분획 (호중구는 아님)은 철 과부하 만성 상처에서 IL-1RA를 방출한다. 그러나, 철 과부하 상처의 치유 촉진에 대한 ABCB5+-유래 MSC로부터 방출된 IL-1RA의 치료 효과가 훨씬 더 중요한데, 이는 IL-1RA 침묵 MSC가 철 과부하 상처에 주사될 때 지연된 상처 치유를 회복시킬 수 없기 때문이다. 다음으로 ABCB5+-유래 MSC에 의해 방출된 IL-1RA가 시험관내 및 생체내에서 M1 대식세포 유래 TNFα의 억제를 담당하는지 여부를 조사하였다. ABCB5+-유래 MSC는 IL-1RA 침묵 또는 적격한 ABCB5+-유래 MSC가 주사된 철 과부하 마우스의 상처 상청액에서 TNFα 방출에 대해 평가되었다. 특히, ABCB5+-유래 MSC에서 IL-1RA의 침묵은 인간 또는 뮤린 대식세포와의 공동-배양에서 TNFα 억제를 적어도 부분적으로 폐지하였다. 예상대로, 스크램블된 대조군 siRNA 형질감염된 IL-1RA 적격한 대조군 ABCB5+-유래 MSC는 시험관내에서 활성화된 대식세포로부터의 TNFα 방출에 대한 완전한 억제 효과를 나타냈다. 놀랍게도, 철 과부하 마우스의 상처 가장자리에 IL-1RA 침묵 ABCB5+-유래 MSC를 피내 주사하면, 가속화된 상처 봉합이 완전히 상실되었다. 대조적으로, 스크램블된 siRNA 형질감염된 IL-1RA 적격한 ABCB5+ MSC는 생체내 표시된 시점에서 상처 치유를 가속화할 수 있는 능력을 유지하였다. 철 과부하 상처에서의 치유를 가속화할 수 있는 IL-1RA 침묵 ABCB5+ MSC의 능력 상실은 TNFα 및 IL-1β 억제 및 IL-10 상향-조절의 역전과 연관이 있었다. 이들 데이터는 상처 부위에서 자극 시 ABCB5+ MSC로부터 적응적으로 방출된 IL-1RA가 IL-1 신호전달을 억제할 뿐만 아니라 하류 이펙터 TNFα도 억제하고 중요하게는 항염증성 IL-10까지 유도한다는 것을 나타낸다. 상처 부위에서 ABCB5+-유래 MSC로부터 방출된 IL-1RA가 개선된 상처 치유와 함께 억제되지 않은 M1 활성화를 억제한다는 개념은, 철 과부하 상처 주위에 재조합 인간 IL-1RA를 피내 주사하는 것이 또한 상처 봉합을 가속화한다는 발견에 의해 추가로 뒷받침된다. 대조적으로, 급성 상처에 재조합 IL-1RA를 주사하면 치유가 가속화되지 않았다. TSG-6은 또한 철 과부하 상처의 ABCB5 인간 MSC에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 재조합 TSG-6을 철 과부하 상처에 주사했을 때, 상처 봉합의 개선은 일어나지 않았다. 이러한 결과는 IL-1RA가 실제로 철 과부하 상처에서 중심적인 역할을 하는 반면, 재조합 인간 TSG-6 단독은 철 과부하 상황에서 치유를 가속화하기에 충분하지 않다는 것을 암시한다. 이것은 상이한 상처 유형이 치유의 치료 가속에 대한 뚜렷한 요구 사항을 나타낸다는 것을 암시한다.
ABCB5 + -유래 MSC는 철 과부하 마우스의 상처에서 M1 대식세포 지속성을 파괴한다
ABCB5+-유래 MSC를 사용한 상처 치료가 철 과부하 마우스의 상처에서 M1 대식세포의 장기간 지속성을 IL-1RA 의존적으로 파괴할 것이라는 가설을 추가로 유지하기 위해, 제5일 상처 절편의 일련의 이중 면역염색을 수행하였다. 사실, TNFα 발현 F4/80+ 대식세포는 ABCB5+-유래 MSC가 주사된 철 과부하 상처에서 사실상 존재하지 않았다. 극명하게 대조적으로, 많은 TNFα+ F4/80+ 이중 양성 대식세포는 덱스트란 사전 처리된 급성 치유 대조군 마우스와 유사한 IL-1RA 침묵 ABCB5+-유래 MSC의 주사 시 상처 가장자리에 지속되었다. 이들 데이터는 ABCB5+-유래 MSC가 생체내에서 상처 대식세포 방출된 TNFα 생산을 IL-1RA 의존적으로 억제한다는 것을 나타낸다. 흥미롭게도, CD206+ F4/80+ 상처 치유 촉진 M2 대식세포는 상처 형성 후 제5일에 ABCB5+-유래 MSC 주사된 상처에서 IL-1RA 의존적으로 풍부한 것으로 나타났다. 사실, ABCB5+-유래 MSC가 주사된 제5일 상처의 단일 세포 제제의 면역 표현형 분류는 표면 마커의 별개의 세트에 의해 정의된 바와 같이 상처 치유 촉진 M2 대식세포를 향한 염증성 M1의 IL-1RA-의존적 전환을 정량적으로 확인시켜 주었다. 따라서, 시토카인 (TNFα, IL-12/IL-23p40) 및 유도성 산화질소 신타제 (NOS2)를 포함한 M1 활성화 마커는 하향-조절되었고 M2 활성화 마커인 만노스 수용체 CD206, β-글리칸 덱틴-1 및 아르기나제-1 (ARG1)은 ABCB5+-유래 MSC 주사 후 F4/80+ 상처 대식세포에서 상향조절되었다. 이러한 M1에서 M2로의 이동은 스크램블된 siRNA 형질감염된 ABCB5+-유래 MSC에서 유지되었지만, IL-1RA siRNA 형질감염된 ABCB5+-유래 MSC를 주사한 후에는 거의 완전히 폐지되었다. 종합하면, 이러한 결과는 ABCB5+-유래 MSC에 의해 분비되는 만성 상처에서 M1 대식세포의 지속성을 없애는 IL-1RA에 대한 인과적 역할을 밝혀낸다.
ABCB5 + -유래 MSC-의존적인 M1에서 M2로의 대식세포 이동이 인간화 NSG 마우스에서 보존된다
PBMC로 인간화된 NSG 마우스는 생체내에서 인간 조혈 계통 유래 세포에 대한 치료적 개입의 효과를 조사하기 위한 매우 적합한 전임상 모델을 나타낸다 [18]. 이러한 모델은 NSG 철 과부하 마우스에서 인간 기원의 M1/M2 상처 대식세포 표현형에 대한 ABCB5+-유래 MSC 주사의 효과를 검증하기 위해 본원에서 이용되었다. 이러한 목적을 위해, PBMC 인간화 NSG 마우스에 전체 두께 상처를 가하고, 인간 동종이계 ABCB5+-유래 MSC, 공여자 일치 ABCB5- HDF, 또는 PBS 단독을 상처 가장자리에 후속 피내 주사하였다. 상기 발견과 일치하게, PBMC-인간화 NSG 마우스에서 상처의 PBS 및 ABCB5- HDF 주사와 비교하여 ABCB5+-유래 MSC 주사 시 전체 두께 상처의 가속화된 봉합이 관찰되었다. 인간 특이적 항-CD68 및 항-CD206 또는 항-TNFα를 사용한 제5일 상처의 공동-면역염색은 PBS-주사된 상처와 비교하여 ABCB5+-유래 MSC-주사된 상처층에서 더 많은 수의 CD68+ CD206+ 인간 M2 대식세포를 제시하였다. 주목할 만하게, CD68+ TNFα+ 염증 유발성 대식세포의 수는 PBS 주사된 상처와 비교하여 ABCB5+-유래 MSC에서 감소되었다. 상처 부위에서 인간 CD68+ M1 및 M2 대식세포의 수를 확인하기 위해 제5일 상처 조직으로부터 유래된 단일 세포 현탁액을 다색 유동 세포측정법으로 분석하였다. 인간 M2 대 M1 대식세포 마커 발현 CD68+ 인간 대식세포의 비율은 덱틴-1/IL-12p40 및 CD206/TNFα 발현 세포의 비율 둘 다에 대해 PBS와 비교하여 ABCB5+-유래 MSC로 처리된 상처 조직에서 증가하였다. 이들 데이터는 인간 상처 대식세포에 대한 ABCB5+-유래 MSC로부터 방출된 IL-1RA의 유익한 항염증 효과가 인간화 NOD-scid IL2rγ null 마우스에서 보존되었다는 것을 나타낸다.
논의
MSC 특징을 갖는 피부의 새롭게 정의된 진피 세포 하위집단은 높은 순도 및 균질성에서 단일 마커인 P-당단백질 ABCB5에 의해 내인성 틈새로부터 성공적으로 단리될 수 있다고 보고되어 있다. 이와 같이 단리된 ABCB5+ MSC 하위집단은 시험관내에서 클론 자기-재생 및 클론 삼계통 분화 능력을 안정적으로 유지한다. 이전에 보고되지 않은 주요 발견은 상처 주위에 새로 기재된 ABCB5+ 계통-유래 MSC의 주사가 측분비 IL-1RA 방출을 통해, 만성 철 과부하 상처에서 억제되지 않은 활성화를 수반한 염증 유발성 M1 대식세포를 항염증성 상처 복구 촉진 M2 대식세포로 전환시키고, 결과적으로 생체내에서 손상된 상처 치유를 가속화한다는 것이다 (그래픽 요약). 이것은 적절한 선택 마커의 결여로 인해 지금까지 일관되지 않은 효능과 효력을 가진 덜 특징 규명된 MSC 집단의 치료 적용으로 어려움을 겪었던 번역 의학에서 MSC-기반 요법의 최전선에서 주요 전임상 돌파구를 구성한다 [19].
피부로부터 MSC를 단리하고 확장하여 높은 균질성을 확보하는 것은 MSC 상에서의 ABCB5의 독점적인 발현에 달려 있지만, 피부 내의 다른 세포에는 영향을 미치지 않는다. 포괄적인 전사체 접근법을 이용하여, MSC 특징적인 세포 표면 발현 프로파일을 갖는 진피 ABCB5+ 세포의 존재가 여기에서 확인되었으며 [1, 15], 부가의 만능성 및 줄기 세포 마커와의 공동-발현이 여기에 보고되었다 (10-13). ABCB5+ 농축 MSC가 배양에서 높은 계대 수로 확장된 경우에도 피부의 내인성 ABCB5+ 세포의 줄기세포성, MSC 및 중간엽 마커 발현을 적어도 부분적으로 유지한다는 증거가 RNA 서열 분석으로부터 또한 제공된다. 그러나, 내인성 ABCB5+ MSC 및 그의 유도체가 이전에 특징 규명된 섬유모세포 계통과 관련이 있는지 여부는 불분명하다 [20, 21]. 사실, ABCB5+-유래 MSC에서 PDGFα 섬유모세포 계통 추적 마우스 [20]의 일부 상위 계통 마커, 예컨대 B 림프구에 대한 성숙 마커인 Prdm1/Blimp-1, 및 펩티드, 예컨대 성장 인자, 케모카인, 신경펩티드 및 혈관활성 펩티드로부터 디펩티드를 절단하는 디펩티딜 펩티다제인 CD26/Dpp4의 발현이 발견되었다. 그러나, ABCB5+ 세포와 피부에서 더 낮은 흉터 촉진 섬유모세포 계통 마커인 αSMA+의 공동-발현은 발견되지 않았다 [20]. 이들 데이터는 본원에서 이용된 ABCB5+-유래 MSC가 흉터 감소 상부 계통 섬유모세포의 일부 발현 특징을 공유할 수 있음을 시사한다. 발현 프로파일에 관해서는, ABCB5+-유래 MSC와 엔그레일드-1(Engrailed-1) 유래 섬유모세포 계통의 관계를 배제할 수 없다 [21].
섬유모세포 계통과의 정확한 관계와는 독립적으로, 주요 의도는 피부로부터 MSC의 강화를 위한 단일 마커로서 ABCB5를 이용하여, 치료하기 어려운 상처에서 MSC 기반 요법에 이를 활용하는 것이었다. 연구된 철 과부하 상처의 거의 모든 단계에서 손상된 상처 치유의 인상적인 구조는 실제로, 우세한 불리한 M1 대식세포를 상처 치유 촉진 M2 대식세포로 적극적으로 이동시킨, 주사된 ABCB5+-유래 MSC로부터의 향상된 IL-1RA 방출에 의존한다. 이러한 발견은 인간의 치료하기 어려운 만성 상처에서 손상된 상처 치유를 유발하는 염증 유발성 M1 대식세포의 억제되지 않은 활성화의 공유된 병원성 역할을 고려할 때 특히 임상적 관심의 대상이다 [7, 8, 22]. 여러 증거가 이러한 발견을 뒷받침해준다.
첫째, ABCB5+-유래 MSC를 주사하면, 철 과부하 마우스에서 손상된 상처 치유의 복구가 향상되었지만, ABCB5-고갈 진피 세포를 주사한 경우는 그렇지 않았다. 철 과부하 마우스의 상처층 내에서, PBS 또는 ABCB5-고갈 진피 세포 분획의 주사 후 철 과부하 상처에서 발견되는 바와 같이 과다 활성화된 M1 대식세포의 높은 수가 지속되는 것과 대조적으로 ABCB5+-유래 MSC 주사 후에는 M2 대식세포가 더 풍부하였다. 둘째, ABCB5+-유래 MSC 주사된 철 과부하 상처의 상처층에서의 M2 대식세포의 발생은 염증을 억제하는 전형적인 M2 시토카인인 항염증성 IL-10의 증가와 연관이 있었다. 동시에, 살균성 M1 대식세포를 동원하고 활성화하는 초기 상처 치유 단계 동안에만 중요한 고전적인 M1 대식세포 시토카인 TNFα, IL-1, IL-12 및 IL-23의 감소가 관찰되었다 [23]. 셋째, 이전 데이터는 M1 대식세포 고갈 조건 하에서 철 과부하 상처가 비-철 과부하 상처와 유사한 개선된 상처 치유를 수반한 M2 대식세포로의 완전히 회복된 전환을 나타낸다는 것을 제시하였다 [7].
IL-1RA가 IL-1β와 별개로 TNFα를 또한 상당히 감소시킬 수 있는 이유에 대한 질문에 관해서, 하기 시나리오가 가장 가능성이 높다. TNFα와 더 높은 정도의 IL-1β 농도 둘 다는 철 과부하 뮤린 상처 모델에서 증가하며, 상기 시토카인 둘 다는 염증 세포, 특히 대식세포의 활성화를 구동시킨다. IL-1β와 TNFα 둘 다는 NFκB를 활성화할 수 있으며 [24, 25], 그 자체는 다른 염증 유발성 시토카인 및 케모카인 중에서 IL-1β, IL-6 및 TNFα와 같은 표적 유전자를 트랜스-활성화시킨다. 결과적으로, IL-1RA가 다량의 IL-1β를 중화하면, IL-1β 및 TNFα와 같은 표적 유전자의 활성화 및 발현이 전반적으로 감소하여 NFκB 활성화의 악순환이 크게 감소할 것으로 예상된다. IL-1β는 주로 IL-6 유도를 통해 그 효과를 시행하기 때문에 [24, 26], IL-1RA는 전반적인 IL-6 농도에 영향을 미치고, 결과적으로 NFκB 활성화 및 하류 표적 유전자에 영향을 미칠 가능성이 높다. 확실히, IL-1β 및 TNFα 이외의 다른 드라이버 시토카인을 배제할 수 없다. 그 데이터로부터 결론지을 수 있는 것은 ABCB5+ MSC로부터 방출된 IL-1RA가 만성 철 과부하 상처의 적대적인 미세환경의 균형을 재조정하는데 인과적 역할을 한다는 것이다.
다단백질 복합체인 인플라마솜은 철 과부하 상처 모델에서 IL-1β의 향상된 방출을 담당하는 것으로 예상된다. 사실, 철 뿐만 아니라 만성 상처를 오염시키는 박테리아의 구성 성분 둘 다는 인플라마솜 과다활성화를 촉진시킨다 [27, 28]. 급성 및 만성 조직 손상에서 인플라마솜의 역할은 복잡하고 완전히 이해되지 않았다. 생리적 상처 치유 동안 인플라마솜의 일시적인 활성화는 미생물 침입에 대항한 방어에 있어서 염증 반응을 조정하고 조직 파편을 효과적으로 제거하기 위한 전제 조건이다 [28]. IL-1β의 인플라마솜-의존적 성숙은 카스파제 1을 통한 프로-펩티드의 절단을 통해 발생하며 손상 부위로 호중구와 대식세포를 동원하고 활성화하는데 필요하다. 카스파제 1이 결핍된 마우스에서 IL-1β의 이러한 인플라마솜-의존적 성숙 단계의 억제는 상처 치유를 지연시키는 것으로 밝혀졌다 [29]. IL-1 수용체 길항제 IL-1RA가 결핍된 마우스에서 IL-1β의 억제되지 않은 활성화는 클라미디아 뉴모니아에(chlamydia pneumoniae) 감염 모델에서 폐 조직의 섬유화 반응을 초래하였다 [30]. 현재 데이터와 유사하게, 당뇨병성 마우스에서 IL-1β의 지속적인 인플라마솜-의존적 활성화는 또한 인플라마솜의 억제에 의해 정상적인 치유로 거의 완전히 회복될 수 있는 피부 상처의 지연된 상처 치유 [31]와 상관관계가 있다 [32]. 상기 보고서와 연계된 발견은 균형 잡힌 인플라마솜 활성화가 조정된 조직 복구에 중요하며, 이러한 균형이 무너지면 상처 치유가 손상된다는 것을 제시한다.
MSC가 시험관내에서 [33, 34, 35, 36, 37] 및 심지어 급성 상처 모델에서도 대식세포 활성화의 단일 측면을 약화시킨다는 설명적 증거가 보고되었다 [33, 36, 37, 38]. 그러나, M1에서 M2 대식세포로의 전환 또는 책임 있는 측분비 메커니즘에 대한 철저한 특징 규명이 부족하다. 따라서, 현재의 접근법은 만성 상처의 치유에 대한 ABCB5+-유래 MSC의 측분비 효과에 대한 보다 완전한 평가의 유용성을 강조하고 염증 유발성의 유해한 M1 대식세포에서 항염증성 M2 대식세포로의 엄격한 전환을 담당하는 주요 이펙터 분자로서 IL-1RA를 확인하는데 도움이 되었다.
ABCB5+-유래 MSC로부터 방출된 IL-1RA의 측분비 효과에 대한 데이터는 이전의 발견과 일치한다 [39]. 이와 관련하여, IL-1RA 녹아웃 마우스는 급성 상처의 지연된 상처 치유를 나타내었다 [39]. 더욱이, IL-1 수용체 (IL-1R)의 표적화된 결실을 나타내는 마우스에서 또는 야생형 마우스 [40] 및 당뇨병성 마우스 [8]의 급성 상처를 재조합 IL-1RA로 치료한 후에 개선된 치유가 보고되었다. 덜 특징 규명된 MSC로부터의 IL-1RA 분비는 전임상 연구에서 다양한 병리학적 조건에서 유익한 것으로 보고되었다 [41]. 억제되지 않은 염증 유발성 M1에서 항염증성 M2 대식세포로의 이동이 대식세포 지배 조직 염증을 안정적으로 제어하는 유익한 IL-1RA 효과 때문이라는 이해가 본원에서 뚜렷하게 발전되었다.
그러한 개념 및 데이터에 일치하여, 인간 IL-1RA가 높은 친화도로 뮤린 세포와 효율적으로 결합하여 뮤린 IL-1β 결합 및 신호전달을 억제할 수 있다는 문헌 [42]으로부터의 명백한 증거가 있다. 이와 관련하여, 인간 IL-1RA는 이전에, 인간 IL-1α 및 IL-1β의 결합과 동일한 150 pM의 친화도로 뮤린 세포 상의 유형 I IL-1 수용체와 결합하는 것으로 나타났다.
본 연구 결과는 IL1RA 외에 다른 메커니즘이 억제되지 않은 M1 대식세포 활성화로 인한 조직 손상을 중화하는데 기여할 수 있다는 것을 배제할 수 없다. 사실, 본 발명자들을 포함한 몇몇 연구자들은 MSC가 염증을 약화시키고 결과적으로 종양 괴사 인자-유도성 유전자 6 단백질 (TSG-6)의 방출을 통해 조직 복구에서 흉터 형성을 감소시킨다는 것을 이전에 보여주었다 [36, 43]. 상처 부위에 주사된 MSC로부터 TSG-6이 방출된 후 전체 두께 상처의 치유가 가속화되는 것과 대조적으로 [36], TSG-6은 철 과부하 상처의 상처 부위에서 발현되지만, TSG-6은 철 과부하 상처의 치유를 가속화하는데 있어서 명백하게 중요한 역할을 하지 않는다. 사실, 급성 상처 치유를 향상시키는 농도에서의 재조합 TSG-6의 주사는 철 과부하 상처의 치유를 향상시키지 않는다. 미세환경에서의 차이는 주사된 MSC에 의해 감지되며, 이는 결과적으로, 방출되는 항염증 인자의 관점에서 상이한 적응 반응을 일으킬 수 있다.
IL-1RA 외에도 다른 요인이 치유 가속화에 기여할 수 있다. 이와 관련하여 MSC는 항염증성 IL-10의 방출을 증가시키기 위해 대식세포의 PGE2-의존적 재프로그래밍을 통해 패혈증 동안 산화적 손상을 억제하는 것으로 보고되었다 [44]. 또한, MSC는 IL-6 및 TGF-β 방출을 강화하여 시토카인 활성화된 내피 세포에 의한 호중구 동원을 억제한다 [45].
이용된 뮤린 상처 모델의 사소한 제한은 환자의 치유되지 않은 CVU와 비교하여 상처 봉합이 약간 지연된다는 것이다. 그럼에도 불구하고, 이러한 모델은 염증 및 조직 파괴가 장기간 지속되는 상처 M1 대식세포의 철-유도된 억제되지 않은 활성화를 모방하므로, 이러한 특이적 병태생리학적 형질에 대한 치료 전략의 효과를 연구하는데 매우 적합한 모델을 나타낸다 [7].
종합적으로, 그 결과는 임상 루틴으로의 계획된 구현에 상당한 임상 영향을 미친다. 본원에서, 철 과부하 만성 상처에서 조절 장애된 조직 복구의 기본이 되는 억제되지 않은 M1 대식세포 지배 염증을 효율적으로 약화시키는 핵심 인자의 적응 방출을 처음으로 밝혀내었다. 둘째, 단일 마커 전략을 이용하면, GMP 등급 품질을 가진 인간 피부로부터 쉽게 접근가능한 균질한 ABCB5+-유래 MSC 집단을 강화시킬 수 있으며, 임상으로의 전환에 사용할 준비가 된다. 셋째, 만성 뮤린 상처 모델에서 이용된 MSC 제제의 성공적인 작용을 예측하는 시험관내 검정이 개발되었다. 상이한 공여자로부터의 ABCB5+-유래 MSC 제제는 단독으로 또는 합동으로, M1 대식세포 시토카인의 방출을 성공적으로 억제했으며, 이러한 억제 효과는 상응하는 ABCB5+-유래 MSC를 철 과부하 상처에 주사했을 때의 치유 개선과 좋은 상관관계가 있었다.
따라서, 상기 데이터는 새로 기재된 진피 ABCB5+-유래 MSC의 향상된 효능과 효력을 나타내며, 이는 치유되지 않은 상처의 성공적인 임상 요법에 대한 실질적인 가능성을 가지고 있다. 사실, 최근 임상 II상 연구 (EudraCT 번호: 2015-000399-81)가 시작되어 첫 번째 연구된 환자에 대해 유망한 결과를 나타냈다.
재료 및 방법
연구 설계
본 연구의 목적은 인간 진피 ABCB5+ 세포가 MSC이고 세포 치료 적용에서 만성 상처 치유에 유익한 영향을 미치는지 여부를 결정하는 것이었다. 시험관내에서, 적어도 6명의 상이한 공여자로부터의 ABCB5+ MSC 및 공여자 일치 ABCB5- HDF (표 1: B02-B07)를, MSC의 특징적인 삼계통 분화, 표면 마커 발현, 클론생성 성장, 자기-재생, 및 정량적 측정 기준에 의한 활성화된 대식세포에 대한 항염증 효과에 대해 시험하였다. 생체내에서, 지연된 상처 봉합, 연장된 염증 및 M1 활성화된 대식세포 풍부를 특징으로 하는 만성 정맥 궤양에 대한 마우스 철 과부하 전체 두께 절제 상처 모델에서 항염증 메커니즘에 의한 상처 치유의 개선이 평가되었다 [7]. 이러한 동물 연구의 경우, 웰치(Welch) 시험에 의해 5%의 유의미한 수준과 80%의 통계적 검정력에 도달하기 위해 유전적으로 변형된 마우스 [46]에서 지연된 상처 치유를 확인하는 이전 연구로부터의 상처 봉합에서의 차이를 기반으로 샘플 크기가 추정되었으며, 상기 시험은 가우스 분포로부터 벗어나지 않도록 보호하기 위해 한 마리의 부가의 동물 (4개 상처)이 포함되었다. ABCB5+-유래 MSC 및 공여자 일치 ABCB5- HDF 주사를 사용한 주요 동물 실험은 3명의 상이한 공여자로부터의 세포로 3회 수행되었다 (표 1: B01, B13, B14). 샘플 수집을 위한 반복 실험은 세포 제제 순도 및 상처 봉합 데이터가 여기에 제시된 내부 번호 B01을 가진 공여자로부터의 인간 진피 세포를 사용하거나, 또는 6명의 상이한 공여자로부터의 세포의 표현형 및 기능적으로 검증된 풀링된 샘플을 사용하여 수행되었다 (표 1). 이러한 풀링된 진피 ABCB5+-유래 MSC 제제는 또한 IL-1RA 녹다운 및 인간화 NSG 마우스 상처 봉합 실험에 사용되었다. 독립적인 생물학적 샘플의 양이 각각의 정량적 검정에서 분석되었다. 현미경 영상은 처리군당 6개의 상처 샘플을 대표한다. 상처 절편에 대한 인간-특이적 베타 액틴 qPCR 및 상처 시토카인 역가의 ELISA 정량화에 의한 이종이식된 ABCB5+-유래 MSC 지속성의 분석을 위한 생물학적 샘플은 각각 2개의 독립적인 상처로부터 풀링되고 hIL-1RA 웨스턴 블롯 및 4개의 독립적인 상처로부터 상처 대식세포 유동 세포측정법을 위해 풀링된다.
인간 피부 샘플
본 연구에서 ABCB5+ 및 ABCB- 세포 분획의 단리에 사용된 피부 생검은 1cm2로 측정되었으며, 사전 서면 동의를 얻은 후에 헬싱키 원칙 선언에 따라 울름(Ulm) 대학교 윤리 위원회의 승인 후 울름 대학교 피부과 및 알레르기 질환 클리닉, 대학교 산부인과 클리닉에서의 젊고 건강한 지원자 (축소 유방 성형술을 받은 건강한 여성으로부터의 피부) (공여자 B02-B07)로부터 채취하거나, 또는 티세바 게엠베하 (Ticeba GmbH; 독일 하이델베르그)의 고객으로부터 직접 유래되었다 (공여자 B01, B08-B14). 피부의 태양에 노출된 영역으로부터의 세포의 단리를 피하기 위해 국소화가 선택되었다. 국소화에서의 변동 (둔부 부위, 팔 안쪽 또는 왼쪽 귀 뒤)은 외과적 표준과 공여자의 선호도에 따라 다르다. 모든 생검은 임의의 병리에 대해 조직학적으로 평가되었다. 병리가 없는 생검만이 면역염색에 이용되거나, 또는 ABCB5+ 및 ABCB- 세포 분획의 단리를 위해 이용되었다. 채취한 생검 중 어느 것도 ABCB5+ 세포를 생성하지 못하였다. 익명의 공여자 데이터는 표 1에서 찾을 수 있다. 프랭크(Frank) 등 [47]으로부터 변형된 플라스틱 부착 진피 세포 및 ABCB5-기반 분리의 확장이 표시된 바와 같이 수행되었다 (자세한 내용은 재료 및 방법 참조). 세포 생육력은 시험관내 실험 전에 평가되었으며, ABCB5+ 집단과 ABCB5- 집단 둘 다에서 그 차이가 발견되지 않았다 (> 90%). 또한, 상처에 주사하기 위해 아큐타제에 의해 ABCB5+ MSC 및 ABCB5- 세포 분획을 수거할 때, 생육력은 트립판 블루 배제에 의해 일상적으로 검사되며 ABCB5+ 및 ABCB5- 집단 둘 다에서 일관되게 매우 높다 (>90%).
생체내 상처 치유 실험에 적용하기 전에, ABCB5+ 세포 제제를 IFN-γ/LPS 활성화된 뮤린 골수-유래 대식세포와의 공동-배양에서 M1 대식세포 억제 기능에 대해 시험하고 TNFα의 방출을 마우스-특이적 TNFα ELISA [알앤디 시스템즈(R&D Systems)]에 의해 평가하였다.
분화 및 클론생성 성장 검정
시험관내 지방형성, 골형성 및 연골형성 분화 능력은 상업용 분화 배지 [론자(Lonza)]; TGF-β3 [셀시스템즈(CellSystems)] 및 제조업체의 설명에 따른 절차를 사용하여 조사되었다. 지방형성 분화를 위해, 지질 비말 축적은 오일 레드 O (시그마 알드리치)로 염색함으로써 검증되었고, 이전에 기재된 바와 같이 염료 추출에 의해 정량화되었다 [48]. 조골세포의 세포외 매트릭스의 광물화는 알리자린 레드 S 염색 (시그마 알드리치)에 의해 검증되었고, 기재된 바와 같이 후속 염료 추출에 의해 정량화되었다 [49]. 연골형성 분화를 시각화하기 위해, 3D 마이크로매스 배양물을 표준 절차에 따라 아그레칸(Aggrecan) (알앤디 시스템즈, AF1220)에 대해 면역염색하였다 (섹션 "면역형광 염색" 참조). 연골형성의 정량화를 위해, 제조업체의 지침에 따라 블리스칸 글리코사미노글리칸 검정 키트 [바이오콜러(Biocolor)]를 사용하여 마이크로매스에서 형성된 연골-특이적 황산화 프로테오글리칸 및 글리코사미노글리칸을 측정하였다. 클론생성 성장의 평가를 위해, ABCB5+ 진피 MSC 및 공여자 일치 ABCB5- HDF를 100 mm 배양 디쉬당 200개 세포의 밀도로 시딩하였다. 14일 후, 콜로니를 0.5% 크리스탈 바이올렛 (시그마 알드리치)으로 염색하고 샘플당 3 내지 5개의 평행 디쉬에서 콜로니 ≥ 25개 세포를 카운팅하였다. 클론 확장 검정을 위해, ABCB5+-유래 MSC를 100 mm 배양 디쉬당 100개 세포로 시딩하였다. 14일 후, 적어도 하나의 현미경 필드에 의해 이웃 콜로니로부터 분리된 12개의 콜로니를 골라내어 확장시켰다. 잘 성장하는 클론 배양물이 2차 삼계통 분화 및 클론생성 성장 검정을 위해 선택되었다.
인간과 마우스 대식세포 공동-배양물
마우스 골수-유래 대식세포를 대퇴골로부터 단리하고 기재된 바와 같이 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF) 함유 L929 세포 상청액을 보충하면서 6일 동안 성숙시켰다 [46]. 인간 대식세포는 20 ng/ml 재조합 인간 M-CSF [밀테니이 바이오텍(Miltenyi Biotec)]의 존재 하에 8일 동안 순도 > 95%로 양성 자성 비드 선택 (밀테니이 바이오텍)에 의해 CD14 발현을 위해 분류된 PBMC-유래 단핵구로부터 성숙되었다. 구배 원심분리 (PAA)에 의한 PBMC 단리를 위한 신선한 버피 코트는 독일 적십자사로부터 수득하였다. 공동-배양 실험을 위해, ABCB5+-유래 MSC 또는 공여자 일치 ABCB5- HDF를 10% 고품질 소 태아 혈청, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민을 포함한 0.5 ml DMEM의 24-웰 플레이트에서 2x104개 세포/웰로 부착되도록 플레이팅하였다. 24시간 후, 대식세포를 0.5 ml의 1x105개 세포/웰로 상단에 시딩하여, 상이하게 표시되지 않는 한 1:5 세포 비율을 초래하였다. 공동-배양물을 50 U ml-1 재조합 마우스 또는 인간 IFN-γ (알앤디 시스템즈)와 24시간 동안 인큐베이션한 다음, 20 ng ml-1 LPS (시그마 알드리치) 및 50 U ml-1 IFN-γ로 24시간 더 자극한 후, 상청액을 수거하고 ELISA (알앤디 시스템즈)에 의해 분석하였다.
마우스 및 상처 치유 모델
암컷 C57BL/6N [찰스 리버(Charles River), 계통 027] 및 암컷 또는 수컷 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ [잭스(Jax) 계통 005557] 마우스 둘 다는 실험 시작 시 10 내지 12주령이었으며, 울름 대학교 동물 시설의 개별적으로 통풍이 있는 케이지에서 특이적 병원균이 없는 조건 하에 유지되었다. 실험은 독일 실험 동물 복지법에 따라 수행되었으며 바덴 뷔르템베르크 정부 검토 위원회의 승인을 받았다.
CVU 생리병리학과 관련된 C57BL/6 마우스 모델은 이전에 기재된 바와 같이 수행되었다 [7]. 인간 진피 ABCB5+-유래 MSC 또는 상응하는 ABCB5- HDF를 사용한 세포성 치료를 위해, 마우스당 PBS에 현탁된 1x106개 세포를 각각의 상처 가장자리 주위의 3개의 50 μl 주사 지점에서 진피 내로 주사하였다.
상처 봉합 평가를 위해, NSG 마우스를 상처 형성되기 8일 전에 이전에 기재된 바와 같이 [18] 꼬리 정맥 주사에 의해 200 μl PBS 중 2x107개 인간 PBMC로 인간화시켰다. 상처 형성 후 제1일에, 마우스를 6개 공여자 풀 ABCB5+ MSC 제제 (표 1: B01 + B08 + B09 + B10 + B11 + B12), 공여자 일치 ABCB5- HDF 또는 PBS 단독 중 하나의 피내 주사를 받은 처리군에 무작위로 할당하였다. 대식세포 표현형 이동의 평가를 위해, NSG 마우스를 상처 형성되기 하루 전에 인간화시켰다. 상처 형성 후 제1일에, 무작위 군을 상기 기재된 바와 같이 공여자 B01로부터의 ABCB5+ MSC 또는 PBS로 처리하였다. 상처 형성 후 제5일에, 면역형광 염색을 위해 각각의 마우스의 2개의 독립적인 상처 반쪽을 프로세싱하고, 나머지는 유동 세포측정법을 위해 풀링하였다.
ABCB5 + -유래 MSC에서의 IL-1RA 발현의 siRNA-매개 녹다운
ABCB5+-유래 MSC는 제조업체의 지침에 따라 최소 권장 농도에서 인간 IL-1RA에 특이적인 4개의 siRNA의 조합 중 어느 하나 20 nM로 일시적으로 형질감염시키거나, 또는 수반되는 형질감염 배지와 함께 스크램블된 대조군-A siRNA로 일시적으로 형질감염시켰다 [모든 제품은 산타 크루즈 바이오테크놀로지스(Santa Cruz Biotechnologies)로부터의 것이다]. 성공적인 녹다운은 생체내 실험에서 사용하기 전에 IFN-γ/LPS 활성화된 마우스 골수-유래 대식세포 및 인간 IL-1RA (알앤디 시스템즈)에 대한 배양 상청액 배지 ELISA로 시험관내 염증 자극 시 단백질 수준에서 시험되었으며, 이는 전형적으로 ~ 80%였다.
조직학 및 면역형광 염색
인간 피부 조직 샘플은 O.C.T. 화합물 [티슈텍(TissueTek)]에 포매시키고, -80℃에서 동결하여 5 μm 절편으로 프로세싱하며 아세톤에 고정시킨다. 마우스 상처를 4% PFA로 밤새 고정시키고, 중간을 통해 커팅하고, 파라핀을 포매하고, 상처 가장자리를 피하기 위해 5 μm 절편의 첫 번째 시리즈만 사용하였다. 부착 세포를 유리 커버슬립에서 배양하고, 4% PFA로 고정하고, PBS 중 0.5% 트리톤X-100으로 투과시켰다. 절편 또는 슬라이드는 제조업체 권장 사항에 따라 4℃에서 밤새 항체 희석제 (DAKO)에 희석시킨 보충 재료에 열거된 1차 항체와 함께 인큐베이션하였다 (표 3). 마우스 항-ABCB5는 14 μg ml-1의 농도로 사용되었고, 냉동절편의 염색을 위해 37℃에서 40분간 인큐베이션되었으며, 부착 세포의 염색을 위해 4℃에서 밤새 4 μg ml-1을 사용하였다. PBS로 세척한 후, 절편 또는 슬라이드를 알렉사플루오르488 또는 알렉사플루오르555 접합된 상응하는 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다 [모두 제품은 인비트로젠(Invitrogen)으로부터의 것이다]. 형광 장착 배지 (DAKO)에 장착하기 전에 핵을 DAPI로 대조염색하였다. 배경 염색은 적절한 이소형 일치 대조군 항체에 의해 제어되었다. 항-ABCB5 염색의 특이성은 면역형광 염색 전에 항체를 에피토프 아미노산 서열 [47], RFGAYLIQAGRMTPEG, 진크러스트(GeneCrust)의 200배 몰 과량의 펩티드와 사전 인큐베이션하는 펩티드 경쟁 검정에 의해 평가되었으며, 이는 형광 신호의 손실을 제시한다.
마손 트리크롬 (시그마 알드리치) 및 피크로시리우스 레드 [폴리사이언시스(Polysciences)] 염색은 파라핀 절편에 대한 제조업체의 지침에 따라 수행되었으며 피크로시리우스 레드 염색된 슬라이드는 원형 편광으로 분석되었다. 악시오이미저(AxioImager).M1 현미경, 악시오캠 MRc 카메라 및 악시오비젼 소프트웨어 [칼 자이스(Carl Zeiss)]로 영상을 캡처하였다.
인간-특이적 베타 액틴 서열 특이적 qPCR
마우스 상처 절편 내에 주사된 인간 ABCB5+-유래 MSC 및 ABCB5- HDF의 정량화는 인간-특이적 베타 액틴 서열 PCR에 의해 수행되었다. 간단히 말해서, 게놈 DNA는 QIAamp DNA FFPE 조직 키트 [56404, 퀴아젠(Qiagen)]를 이용한 PFA 고정 파라핀 포매 상처 절편으로부터 단리된 후, 인간 특이적 베타 액틴 프라이머 (정방향 프라이머: CACCACCGCCGAGACCGC 및 역방향 프라이머: GCTGGCCGGGCTTACCTG)를 사용하는 PCR을 수행한다. 그런 다음 농도계 분석을 수행하여 겔 영상에서 분리된 PCR 산물의 밀도를 정량화하고 마우스 특이적 베타 액틴 서열 PCR 산물로 정규화하였다. 마우스 베타 액틴의 PCR은 마우스 특이적 베타 액틴 프라이머 (정방향 프라이머: CCTTCCTTCTTGGGTAAGTTGTAGC 및 역방향 프라이머: CCATACCTAAGAGAAGAGTGACAGAAATC)로 수행되었다.
ELISA 및 웨스턴 블롯
동결된 다진 상처 조직 샘플을 20초 냉각 진동력의 3 라운드를 적용한 용해 D 컬럼 [MP 바이오메디칼즈(Biomedicals)]에서 프로테아제-억제제 칵테일 [로슈(Roche)] 및 포스파타제 억제제 Na3VO4 (2 mM) 및 NaF (10 mM)가 보충된 RIPA 완충액 (시그마)에 용해시켰다. 단백질 수율은 BSA-표준 희석액에 대항한 브래드포드(Bradford) 검정 및 분광광도계 분석에 의해 측정되었다. 모든 ELISA 검정은 제조업체의 지침에 따라 듀오세트(DuoSet) 키트 (알앤디 시스템즈)를 사용하여 수행되었다. IL-1RA에 대한 웨스턴 블롯 분석은 이전에 공개된 바와 같이 수행되었다 [50]. 1:1000의 희석에서 인간 및 뮤린 IL-1RA를 검출하는 토끼 항-IL-1RA IgG1 항체 [압캠(Abcam) #ab124962] 및 1:10,000의 희석에서 2차 HRP-커플링된 항-토끼 IgG (H+L) 항체 [디아노바(Dianova)]를 사용하였다. 동일한 로딩은 액틴에 의해 검증되었다. 빌베르 퓨전 Fx7 [빌베르 루르마트(Vilber Lourmat)]과 함께 TMB 기질 (BD OptEIA)을 부가한 후 화학발광이 검출되었다.
유동 세포측정법
ABCB5에 대한 유동 세포측정법은 항-ABCB5 마우스 IgG1 (클론 3C2-1D12; [47]) 및 2차 알렉사플루오르647-접합된 당나귀 항-마우스 IgG (H+L) [피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)]를 사용하여 수행되었다. 제조업체의 지침에 따라 인간 MSC 표현형 키트 (밀테니이 바이오텍)를 사용하여 MSC 마커 패널 CD90, CD73 및 CD105 뿐만 아니라 CD34, CD14, CD20 및 CD45에 대한 세포의 다색 표지화를 수행하였다. 항-인간 SSEA4-PE, CD271-FITC, CD133, CD318 및 멜란-A 항체 (표 3)를 제조업체에 의해 권장되는 농도에서 4℃ 하에 45분 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. CD133, CD318 및 멜란-A의 검출을 위해, FACS-완충액 (PBS 중 1% BSA)으로 세척한 세포를 4℃에서 45분 동안 형광색소-접합된 2차 항체와 함께 후속 인큐베이션하였다. 죽은 세포는 SYTOX 블루 (인비트로젠)로 공동-염색하여 배제시켰다. 이소형 일치 대조군 항체는 게이트 설정에 사용되었다.
상처 대식세포 단리를 위해, 마우스 상처는 이전에 기재된 바와 같이 소화시켰다 [33, 36]. 간단히 말해서, 다진 조직을 37℃에서 1시간 동안 HEPES 완충 식염수에서 1.5 mg/ml 콜라게나제 I 및 1.5 mg/ml 히알루로니다제 I (시그마 알드리치)과 함께 인큐베이션하였다. 단일 세포 제제를 여과하고 FcR 차단 (MACS)과 함께 15분 동안 인큐베이션한 후, 보충 재료에 열거된 항체로 염색하였다 (표 3). 제조업체의 프로토콜에 따라 상업용 키트 (BD)를 사용하여 고정 및 투과화 후에 부가의 세포내 염색을 수행하였다. 블랭크 및 단일 염색된 샘플은 PMT 및 보정 설정에 사용되었다. 상처 대식세포의 경우, C57BL/6N 샘플 내의 일중항 F4/80+ 마우스 대식세포와 인간화 NSG 마우스 샘플 내의 일중항 CD68+ 인간 대식세포는 상대 형광 단위 (RFU = 이소형 대조군 샘플과 비교한 기하 평균 형광 강도) 또는 대식세포 집단 내에서의 % 양성 이벤트를 기반으로 한 후속 M1 및 M2 마커 발현 분석을 위해 게이팅되었다. 여기에서, 관련 형광-접합된 이소형 대조군 및 대식세포 게이팅 마커 염색된 대조군 샘플에 대항한 양성 임계값을 설정하였다. FACS칸토 II, FACS아리아 퓨전 또는 아쿠리 유동 세포측정기 (BD 바이오사이언시스) 상에서 유동 세포측정법을 수행한 후, 플로조(FlowJo) 분석 소프트웨어 [트리스타 인크.(TreeStar Inc.)]를 사용하여 데이터를 분석하였다.
포괄적인 전사체 프로파일링 및 정량적 PCR
총 RNA-Seq 라이브러리를 제조하기 위해, 500 ng의 총 RNA를 입력으로서 사용하였다. 먼저, 500 ng의 총 RNA를 사용하여 약간의 변형을 가한 매뉴얼에 기재된 바와 같이 상업적으로 이용가능한 키트 [저 입력 리보미누스 진핵 시스템 v2, 써모(Thermo)]를 사용하여 rRNA를 고갈시켰다. 간단히 말해서, 리보미누스(RiboMinus)™ 진핵생물 프로브 믹스를 사용하여 rRNA를 고갈시킨 후, rRNA 고갈된 RNA를 함유하는 상청액을 수집하고 얼음 위에서 3x 아젠코트(Agencourt) RNA클린 XP 비드와 함께 20분 동안 인큐베이션한 다음, 상청액을 제거하고 RNA클린 XP 비드를 80% 에탄올로 2회 세척하고, 최종적으로 rRNA 고갈된 RNA를 10 μl의 뉴클레아제 무함유 수에서 비드로부터 용리시켰다. 이러한 rRNA 고갈된 RNA는 일부 변형을 포함한 NEBNext 울트라 II 방향성 RNA 라이브러리 프렙 키트 (NEB)를 사용하여 일루미나(Illumina) 플랫폼용 RNASeq 라이브러리를 제조하는데 사용되었다. RNASeq 라이브러리의 품질 관리는 애질런트(Agilent) 바이오분석기에 의해 수행되었고 라이브러리의 농도는 dsDNA HS 검정 키트 (써모)를 사용하여 큐비트에서 측정되었다. 라이브러리는 각각 NextSeq 500/550 v2 키트 [마이크로싱스 아게 (Microsynth AG, 스위스)]를 사용하여 75주기 (1 x 75 단일 말단 판독값)의 시퀀싱 및 8주기의 2개의 인덱스 판독값에 대해 일루미나 NextSeq 500 시스템에서 시퀀싱되었다. 역다중화 원시 판독값 (fastq)은 앞서 기재된 바와 같이 유전자 발현 분석에 사용되었다 [51]. 간단히 말해서, fastq/span> 파일을 사용하여 Hisat2를 사용하여 인간 게놈 참조 (GRCh38)에 정렬한 다음, 전사체 어셈블리, 존재비 추정 및 차등 발현을 각각 cufflinks 및 cuffdiff에 의해 수행하였다. RNASeq 데이터 분석의 시각화는 맞춤형 스크립트를 사용하여 R 패키지, cummeRbund, gplots, ggplot2에 의해 수행되었다.
데이터 가용성
RNASeq 데이터는 수탁 번호 GEO GSE125829로 GEO에 업로드되었다. 2906개 염기쌍 ABCB5 cDNA 서열은 수탁 번호 AY234788로 NCBI 젠뱅크(GenBank)에서 찾을 수 있다.
통계 분석
이분산 데이터 세트로부터 보호하기 위해 웰치 보정이 포함된 양측 비-대응표본 스튜던트 t-시험을 사용하여 각각의 두 처리군 간의 독립적인 정량적 측정 기준에서 시험관내 및 생체내 차이의 통계 분석을 수행하였다. ABCB5+ 및 공여자 일치 ABCB5- 세포 분획에 대한 시험관내 비교는 쌍을 이룬 t-시험에 의해 분석되었다. 드물게, 데이터의 육안 검사로 검출된 이상치는 α = 5%에서 그럽스(Grubbs) 시험에 의한 사후 검증 후 분석으로부터 배제되었다. 통계 데이터 분석은 그래프패드 프리즘 6 소프트웨어 (과학용 소프트웨어)를 사용하여 수행되었다. 그래프는 평균을 제시하고, 오차 막대는 달리 표시되지 않는 한 표준 편차를 나타내고 별표는 유의미한 수준을 나타낸다: ns = 유의미하지 않음; * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001.
재료 및 방법
ABCB5 + 및 ABCB5 - 진피 세포 분획의 확장 및 단리
플라스틱 부착 진피 세포는 16회 계대 동안 최대로 확장되었으며 이는 누적 집단 배가 25와 동일하며, 마우스 항-인간 ABCB5 IgG1 항체 (클론 UG3C2-2D12;(51))를 사용한 자성 비드 분류의 각각의 2회 및 3회 연속 라운드에 의해 ABCB5+ 및 ABCB5- 분획으로 분리되었다. 90% 초과의 분류 순도는 GMP 등급 진피 ABCB5+ 세포의 방출 기준 중 하나이다 (표 2). 유동 세포측정법에 의해, ABCB5+ 세포의 평균 순도는 98.33% ± 1.12% (n = 243)였다. 실험을 위해, 분류된 세포를 최대 72시간 동안 냉동보존하거나 배양하였다. 이러한 시점에서 순도는 전형적으로 >70%였다. ABCB5+ 진피 MSC는 37℃ 및 3% CO2 하에 15% 열 불활성화 고 품질 소 태아 혈청, 6 mM HEPES, 2.8 μg/ml 히드로코르티손, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 10 μg/ml 인슐린, 0.2 mg/ml 글루코스, 6.16 ng/ml PMA (시그마 알드리치) 및 0.6 ng/ml 재조합 인간 염기성 섬유모세포 성장 인자 [프로스펙바이오(Prospecbio)]가 보충된 햄스 F10에서 배양되었다. 베르센 [깁코(Gibco)]을 사용하여 배양 플라스틱으로부터 ABCB5+ 진피 세포를 분리하였다. ABCB5- HDF는 37℃ 및 5% CO2 하에 10% 고 품질 소 태아 혈청, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민 [바이오크롬(Biochrom)]이 포함된 DMEM에서 유지되었다.
CVU 병태생리학과 관련된 C57BL/6 마우스 모델
C57/BL/6 마우스에 5 mg/200 μl 철-덱스트란 또는 200 μl PBS-덱스트란 (시그마 알드리치)을 3일 간격으로 7회 복강내로 주사하였다. 마지막 철 주사 하루 후, 마취하에 면도한 마우의 등쪽 피부에 생검 펀처 [스티펠(Stiefel)]로 4개의 6 mm 전체 절제 상처를 가하였다. 어도비 포토샵 소프트웨어 [어도비 시스템즈(Adobe Systems)]를 사용하여 상처 부위를 정량화하기 위해 선형 측정 옆의 상처를 촬영하였다.
IL-1β 정량적 PCR
제조업체에 의해 기재된 바와 같이 상업용 키트 (RNeasy 마이크로어레이 조직 미니 키트, 퀴아젠)를 사용하여 인간 만성 하지 정맥 궤양 (CVU), 뮤린 상처 및 상응하는 건강한 대조군 피부로부터 총 RNA를 단리하였다. 샘플당 2 μg의 RNA를 일루스트라 레디 투 고 RT-PCR 비드 [지이 헬스케어(GE Healthcare)]를 사용하여 역전사하였다. 총 RNA 및 cDNA의 양과 품질은 나노드롭 1000 (써모 사이언티픽) 및 QIAxcel 어드밴스 시스템 (퀴아젠)을 사용하여 평가되었다. 7300 실시간 PCR 시스템 [어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 라이프 테크놀로지스]을 사용하여 파워 SYBR 그린 마스터 믹스 (어플라이드 바이오시스템즈, 라이프 테크놀로지스)를 사용하여 cDNA를 증폭시켰다. 인간 IL-1β에 특이적인 프라이머 (FW: 5'-CCCAAGCAATACCCAAAGA-3' 및 REV: 5'-CCACTTTGCTCTTGACTTCTA-3') 및 마우스 IL-1β에 특이적인 프라이머 (FW: 5'-TCACAAGCAGAGCACAAG-3' 및 REV: 5'-GAAACAGTCCAGCCCATAC-3')는 도 S4에 제공된 데이터에 사용되었다.
지연된 상처 치유에 대한 인간 재조합 IL-1RA 피내 주사의 효과
철 과부하 만성 상처 치유 모델 마우스를 (i) 덱스트란/PBS 급성 상처 치유 대조군, (ii) 철/PBS 군 및 (iii) 철/rhIL-1RA 처리군을 포함한 3개의 처리군으로 무작위로 나누었으며, 급성 모델에 대해 이전에 기재된 바와 같이 제2일 및 제4일에 상처 가장자리 주위에 250 ng/상처 재조합 인간 IL-1RA를 피내 주사하였다 (36). 급성 상처 치유 모델 마우스는 만성 모델에 대해 기재된 바와 같이 (i) PBS-주사된 대조군 및 (ii) rhIL-1RA 처리군으로 무작위로 할당되었다. 시간 경과에 따른 상처 봉합은 제3일, 제5일, 제7일 및 제10일에 제0일과 비교한 상처 표면적에 의해 정량화되었다 (도 S5).
표 1. 인간 피부 공여자. (A) ABCB5+ 진피 세포의 생체내 특징 규명을 위해 본 연구에 사용된 건강한 피부의 공여자 데이터, 및 CVU 및 정상 인간 피부의 IL-1β 면역염색을 위한 CVU의 공여자 데이터. (B) 진피 세포 ABCB5 분류를 위해 본 연구에 사용된 건강한 피부의 공여자 데이터.
Figure pct00017
*풀링된 공여자 세포 샘플
표 2. 본 연구에 사용된 GMP 준수 진피 ABCB5+ MSC 제제에 대한 방출 기준.
Figure pct00018
표 3. 본 연구에 사용된 항체의 목록.
A: 면역 염색에 사용되는 1차 항체.
Figure pct00019
B: 유동 세포측정법 항체.
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
본원에 인용된 모든 참고문헌은 완전히 참조로 포함된다. 이와 같이 본 발명의 적어도 하나의 실시양태의 여러 측면을 기재하였지만, 다양한 변경, 변형 및 개선이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 일어날 것임을 인지해야 한다. 그러한 변경, 변형 및 개선은 본 개시의 일부인 것으로 의도되고, 본 발명의 취지 및 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 따라서, 전술한 설명 및 도면은 예시에 불과하다.

Claims (54)

  1. 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 집단을 포함하는 조성물로서, 여기서 집단의 96% 초과는 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 집단의 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과가 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 집단의 100%가 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손인 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 집단 내 합성 줄기 세포의 90% 초과가 CD90을 공동-발현하는 것인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 줄기 세포의 집단이 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 저산소증 하에 VEGF를 분비할 수 있는 것인 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 줄기 세포의 집단이 Mi-분극화된 대식세포와의 공동-배양 후 IL-1RA를 분비할 수 있는 것인 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 줄기 세포의 집단이, 단리된 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포에 비해 대식세포 공동-배양에서 감소된 TNF-알파 및 IL-12/IL-23p40 분비 및 증가된 IL-10 분비를 유도하는 것인 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 줄기 세포의 집단이 다능성 분화 능력을 보유하는 것인 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 줄기 세포의 집단이 내배엽, 중배엽 및 외배엽인 3가지 배아 층 모두로부터 유래된 세포로 분화할 수 있는 능력을 보유하는 것인 조성물.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 줄기 세포의 집단이 각막 상피 분화 능력을 보유하는 것인 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 줄기 세포의 집단이, 단리된 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포에 비해 SOX2, NANOG 및 SOX3을 포함한 줄기 세포 마커의 증가된 발현을 나타내는 것인 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 줄기 세포의 집단이, 단리된 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포에 비해 MCAM, CRIG1 및 ATXN1을 포함한 중간엽 기질 분화 마커의 감소된 발현을 나타내는 것인 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 줄기 세포 집단의 적어도 5%가 외인성 유전자를 포함하는 것인 조성물.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 줄기 세포 집단의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가 외인성 유전자를 포함하는 것인 조성물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 외인성 유전자가 조직-특이적 귀소 인자, 분비된 조직 리모델링 단백질, 성장 인자, 시토카인, 호르몬 및 신경전달물질로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 유전자인 조성물.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 줄기 세포 집단의 적어도 5%가 유전자에서의 변형을 포함하는 것인 조성물.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 줄기 세포 집단의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가 유전자에서의 변형을 포함하는 것인 조성물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 합성 줄기 세포가 CRISPR RNA-가이드된 뉴클레아제 및 유전자를 표적화하는 gRNA를 포함하는 복합체를 전달함으로써 변형되는 것인 조성물.
  19. 제13항 또는 제14항에 있어서, 변형된 유전자가 ABCB5+ 세포 내 COL7A 또는 결함 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자인 조성물.
  20. 인간 대상체로부터의 피부 조직으로부터 1차 세포를 단리하는 단계; 세포가 혼합 세포의 60% 초과의 전면생장에 도달하기에 충분한 자손을 생산할 때까지 배양 배지에서 1차 세포를 배양하는 단계, 혼합 세포를 수거하는 단계, 이와 같이 수거된 혼합 세포를 배양하는 단계, 세포 집단이 적어도 99% 제조된 합성 세포에 도달하고 10% 미만이 1차 생리학적으로 발생하는 피부-유래 세포가 될 때까지 적어도 5회 계대를 통해 세포를 재수거 및 배양하는 단계; 및 ABCB5+ 항체를 사용하여 ABCB5-양성 세포를 단리하는 단계를 포함하는, 세포 집단을 제조하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16회 계대를 통해 세포를 재수거 및 배양하는 단계를 수반하는 방법.
  22. 제20항에 있어서, 세포 집단이 적어도 99.99% 제조된 합성 세포에 도달하고 0.01% 미만이 1차 생리학적으로 발생하는 피부-유래 세포가 될 때까지 세포를 재수거 및 배양하는 단계를 수반하는 방법.
  23. 제20항에 있어서, 세포 집단이 적어도 99.9995% 제조된 합성 세포에 도달하고 0.0005% 미만이 1차 생리학적으로 발생하는 피부-유래 세포가 될 때까지 세포를 재수거 및 배양하는 단계를 수반하는 방법.
  24. 제20항에 있어서, 세포 집단이 적어도 99.999997% 제조된 합성 세포에 도달하고 0.000003% 미만이 1차 생리학적으로 발생하는 피부-유래 세포가 될 때까지 세포를 재수거 및 배양하는 단계를 수반하는 방법.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 단리 단계가 자성 비드에 접합된 ABCB5 항체를 수반하는 것인 방법.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 기본 배지로서 햄스 F-10을 사용하여 제조된 배양 배지에서 배양되는 것인 방법.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 전면생장 및 세포 형태가 각각의 세포 확장 단계에서 평가되는 것인 방법.
  28. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 3일이 최종 배양과 단리 단계 사이를 이격하는 것인 방법.
  29. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 EDTA를 사용하여 수거되는 것인 방법.
  30. 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단의 분화를 촉진하는 것을 포함하는, 조직 생성을 유도하는 방법으로서, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는, 분화된 조직으로 되는 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손인 방법.
  31. 동계 이식을 갖는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단을 투여하는 것을 포함하는, 동계 이식을 촉진하는 방법으로서, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손인 방법.
  32. 말초 동맥 폐쇄성 질환 (PAOD)이 있는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단을 투여하는 것을 포함하는, PAOD를 치료하는 방법으로서, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 상기 질환을 치료하는데 유효한 양의 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손인 방법.
  33. 급만성 간 부전 (AOCLF)이 있는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단을 투여하는 것을 포함하는, AOCLF를 치료하는 방법으로서, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 상기 질환을 치료하는데 유효한 양의 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손인 방법.
  34. 윤부 줄기 세포 결핍증 (LSCD)이 있는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단을 투여하는 것을 포함하는, LSCD를 치료하는 방법으로서, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 상기 질환을 치료하는데 유효한 양의 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손인 방법.
  35. 각막 질환이 있는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단을 투여하는 것을 포함하는, 각막 질환을 치료하는 방법으로서, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 상기 질환을 치료하는데 유효한 양의 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손인 방법.
  36. 수포성 표피박리증 (EB)이 있는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단을 투여하는 것을 포함하는, EB를 치료하는 방법으로서, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 상기 질환을 치료하는데 유효한 양의 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손인 방법.
  37. 상처를 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단과 접촉시키는 것을 포함하는, 피부 상처를 치유하는 방법으로서, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 상처의 치유를 촉진시키는데 유효한 양의 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단이 매트릭스 또는 스캐폴드 상에 시딩되는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 매트릭스가 중합체성 메쉬 또는 스펀지, 중합체성 히드로겔, 또는 콜라겐 매트릭스인 방법.
  40. 기관 이식을 받은 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법으로서, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 동종이식편 생존을 촉진시키기 위한 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손인 방법.
  41. 자가면역 질환이 있는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환을 치료하는 방법으로서, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 자가면역 질환을 치료하기 위한 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손인 방법.
  42. 간 질환이 있는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 간 질환을 치료하는 방법으로서, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 간 질환을 치료하기 위한 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손인 방법.
  43. 신경변성 질환이 있는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 신경변성 질환을 치료하는 방법으로서, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 신경변성 질환을 치료하기 위한 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손이고, 여기서 신경변성 질환은 숙주 세포에 대항한 면역 반응과 연관되는 것인 방법.
  44. 심혈관 질환이 있는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 심혈관 질환을 치료하는 방법으로서, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 심혈관 질환을 치료하기 위한 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손이고, 여기서 심혈관 질환은 조직 리모델링과 연관되는 것인 방법.
  45. 신장 질환이 있는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 신장 질환을 치료하는 방법으로서, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 신장 질환을 치료하기 위한 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손인 방법.
  46. 염증성 장애가 있는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 염증성 장애를 치료하는 방법으로서, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 염증성 장애를 치료하기 위한 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 염증성 장애가 심혈관 질환, 허혈성 졸중, 알츠하이머병 및 노화로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  48. 염증성 장애가 있는 대상체에게 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 단리된 집단의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 근골격 장애를 치료하는 방법으로서, 여기서 집단의 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과는 근골격 장애를 치료하기 위한 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 근골격 장애가 유전성 근이영양증인 방법.
  50. 제30항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 줄기 세포의 집단이 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 청구된 합성 세포인 방법.
  51. 만능성에 의한 세포성 재프로그래밍을 위한 기질로서 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 합성 줄기 세포의 집단을 사용하는 것을 포함하는, 세포성 재프로그래밍하는 방법.
  52. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같고 외인성 PAX6 유전자를 추가로 포함하는 합성 줄기 세포의 집단.
  53. 합성 ABCB5+ 줄기 세포의 집단을 포함하는 조성물로서, 여기서 세포의 집단은 KRT12를 발현하는 것인 조성물.
  54. 제53항에 있어서, 집단의 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5%, 99.7%, 99.9%, 99.99%, 99.998%, 99.999%, 또는 99.999997% 초과가 생리학적으로 발생하는 피부-유래 ABCB5-양성 중간엽 줄기 세포의 시험관내 자손인 조성물.
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