CN114245741A

CN114245741A - 高功能性的制造的abcb5+间充质干细胞

Info

Publication number: CN114245741A
Application number: CN202080039666.1A
Authority: CN
Inventors: 马库斯·H·弗兰克; 马克·安德烈亚斯·克卢特; 克里斯托夫·甘斯
Original assignee: Taixinbo Co ltd; Boston Childrens Hospital
Current assignee: Rui Nuosheng; Boston Childrens Hospital
Priority date: 2019-03-28
Filing date: 2020-03-27
Publication date: 2022-03-25
Also published as: CA3135436A1; EP3946389A1; WO2020198611A1; BR112021019349A2; AU2020248464A1; US20220184136A1; JP2022527998A; EP3946389A4; US20210095254A1; KR20220007596A

Abstract

提供了合成ABCB5+干细胞群，其中所述群的大于96.8％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。还提供了制造所述合成细胞的方法及其使用方法。

Description

高功能性的制造的ABCB5+间充质干细胞

相关申请

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2019年3月28日提交的题为“HIGHLYFUNCTIONAL MANUFACTURED STEM CELLS”的美国临时申请序列No.62/825,785和于2019年3月29日提交的题为“HIGHLY FUNCTIONAL MANUFACTURED STEM CELLS”的美国临时申请序列No.62/826,931的权益，其各自的全部内容通过引用并入本文。

背景技术

虽然难以明确限定，但自我更新的成体多能间充质干细胞(mesenchymal stemcell，MSC)几乎存在于所有成体结缔组织中，包括真皮[1、2]。它们最重要的功能是维持其生态位环境，这是保护它们自身对组织稳态、修复和器官维持至关重要的干细胞特性(stemness)和长期自我更新能力的关键要求[3]。

ATP结合盒亚家族B成员5，简称ABCB5，也称为P-糖蛋白ABCB5，是跨质膜蛋白(Allikmets，et al.，1996)。活性转运体的ABC超家族，包括被认为是在癌症患者中引起耐药性的原因(Moitra和Dean，2011)的如ABCB1(MDR1)、ABCB4(MDR2/3)和ABCG2(Bcrp1、MXR1)的转运体，在非恶性细胞类型中发挥正常的细胞转运、分化和生存功能。这些公知的ABC转运体在干细胞群和祖细胞群上显示以高水平表达。由这些和相关的ABC转运体介导的荧光染料罗丹明123和Hoechst 33342的外排(efflux)能力已用于从多个组织分离这样的细胞亚类。

最近，显示ATP结合盒亚家族B成员5(ATP-binding cassette,sub-family B,member 5，ABCB5)鉴定了新的皮肤免疫调节亚群，该亚群还表达MSC标志物并对效应T细胞发挥抑制作用，同时在体外和体内增强调节T细胞[5]。ABCB5属于多重耐药细胞膜锚定蛋白，也在眼的角膜缘(limbal)干细胞上表达，缺乏ABCB5导致失明[6]。

通过另外的结构分析，ABCB5被证实是ABC转运体超家族的新的P-糖蛋白(Frank，et al.，2003)。在人表皮黑素细胞中位于染色体7p21-15.3上的指定ABCB5蛋白标记了表达CD133的祖细胞。ABCB5基因包含19个外显子并且跨越108kb的基因组DNA。推断的812个氨基酸的ABCB5蛋白质具有5个侧翼为胞外和胞内ATP结合结构域二者的跨膜螺旋。

有助于人皮肤中培养物的生长和分化的一些特征与P-糖蛋白ABCB5相关，如调节皮肤祖细胞的膜电位和细胞融合、作为罗丹明-123外排转运体的功能以及多倍体祖细胞融合杂交体的标记。在生理学的皮肤祖细胞中，ABCB5赋予膜以超极化(hyperpolarization)，并作为膜电位的决定因素调节该细胞亚群保持未分化或经历分化的倾向(Frank，et al.，2005，Frank，et al.，2003)。此外，ABCB5阳性细胞显示具有抗炎、促血管生成和免疫调节特性(Schatton,et al.,2015,Webber,et al.,2017)。

发明内容

本文显示ABCB5⁺干细胞群可以可靠地从组织中分离，并根据GMP标准进行处理，以产生高功能性的合成干细胞。

在一些方面，提供了组合物，其包含合成ABCB5+干细胞群，其中所述群的大于96％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。在一些实施方案中，所述群的大于96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。在一些实施方案中，所述群的100％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

在一些实施方案中，所述群中大于90％的合成干细胞共表达CD90。在另一些实施方案中，如通过ELISA测量的，所述合成干细胞群能够在缺氧下分泌VEGF。在另一些实施方案中，所述合成干细胞群能够在与Mi极化的巨噬细胞共培养之后分泌IL-1RA。在另一些实施方案中，所述合成干细胞群相对于分离的生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞在巨噬细胞共培养中诱导降低的TNF-α和IL-12/IL-23p40分泌以及提高的IL-10分泌。在另一些实施方案中，所述合成干细胞群具有多能分化能力。在另一些实施方案中，所述合成干细胞群具有分化为来源于所有三个胚层即内胚层、中胚层和外胚层之细胞的能力。在另一些实施方案中，所述合成干细胞群具有角膜上皮分化能力。在另一些实施方案中，所述合成干细胞群相对于分离的生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞，表现出包括SOX2、NANOG和SOX3在内的干细胞标志物的表达提高。在另一些实施方案中，所述合成干细胞群相对于分离的生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞，表现出包括MCAM、CRIG1和ATXN1在内的间充质基质分化标志物的表达降低。在另一些实施方案中，所述合成干细胞群的至少5％包含外源性基因。在另一些实施方案中，所述合成干细胞群的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％包含外源性基因。在另一些实施方案中，所述外源性基因是编码选自组织特异性归巢因子、分泌性组织重塑蛋白、生长因子、细胞因子、激素和神经递质的蛋白质的基因。在另一些实施方案中，所述合成干细胞群的至少5％包含基因中的修饰。在另一些实施方案中，所述合成干细胞群的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％包含基因中的修饰。在另一些实施方案中，所述合成干细胞通过递送包含CRISPR RNA引导的核酸酶和靶向所述基因的gRNA的复合物来修饰。在又一些实施方案中，所述经修饰基因是选自COL7A或ABCB5+细胞中缺陷基因的基因。

本发明在一些方面中是用于制备细胞群的方法，所述方法通过从来自人对象的皮肤组织分离原代细胞；在培养基中培养所述原代细胞，直到所述细胞产生足够的后代以使混合细胞达到大于60％汇合，收获所述混合细胞，培养所收获的混合细胞，对所述细胞进行再收获并通过至少5次传代对所述细胞进行培养，直到所述细胞群达到至少99％为制造的合成细胞，并且少于10％为原代生理上存在的皮肤来源的细胞；以及使用ABCB5+抗体分离ABCB5阳性细胞。

在一些实施方案中，所述方法包括对所述细胞进行再收获并通过至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16次传代对所述细胞进行培养。在另一些实施方案中，所述方法包括再收获和培养所述细胞，直到所述细胞群达到至少99.99％为制造的合成细胞，并且少于0.01％为原代生理上存在的皮肤来源的细胞。在另一些实施方案中，所述方法包括再收获和培养所述细胞，直到所述细胞群达到至少99.9995％为制造的合成细胞，并且少于0.0005％为原代生理上存在的皮肤来源的细胞。在另一些实施方案中，所述方法包括再收获和培养所述细胞，直到所述细胞群达到至少99.999997％为制造的合成细胞，并且少于0.000003％为原代生理上存在的皮肤来源的细胞。在另一些实施方案中，所述分离步骤涉及与磁珠缀合的ABCB5抗体。在另一些实施方案中，所述细胞在用Ham's F-10作为基础培养基制备的培养基中培养。在另一些实施方案中，在每个细胞扩增步骤时评价细胞汇合和细胞形态。在另一些实施方案中，最终的培养和分离步骤间隔至少3天。在另一些实施方案中，使用EDTA收获所述细胞。

在一些方面中，提供了用于诱导组织产生的方法。所述方法包括促进分离的合成ABCB5+干细胞群分化为已分化组织，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

在另一些方面中，本发明是用于促进同基因移植物的方法，所述方法包括向具有同基因移植物的对象施用分离的合成ABCB5+干细胞群，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

在另一些方面中，本发明是用于治疗周围动脉闭塞性病(peripheral arterialocclusive disease，PAOD)的方法，所述方法包括向患有PAOD的对象以治疗所述疾病的有效量施用分离的合成ABCB5+干细胞群，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

在另一些方面中，本发明是用于治疗慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liverfailure，AOCLF)的方法，所述方法包括向患有AOCLF的对象以治疗所述疾病的有效量施用分离的合成ABCB5+干细胞群，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

在另一些方面中，本发明是用于治疗角膜缘干细胞缺乏(limbal stemcelldeficiency，LSCD)的方法，所述方法包括向患有LSCD的对象以治疗所述疾病的有效量施用分离的合成ABCB5+干细胞群，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

在另一些方面中，本发明是用于治疗角膜疾病的方法，所述方法包括向患有角膜疾病的对象以治疗所述疾病的有效量施用分离的合成ABCB5+干细胞群，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

在另一些方面中，本发明是用于治疗大疱性表皮松解症(epidermolysisbullosa，EB)的方法，所述方法包括向患有EB的对象以治疗所述疾病的有效量施用分离的合成ABCB5+干细胞群，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

在另一些方面中，本发明是用于皮肤伤口愈合的方法，所述方法包括以促进伤口愈合的有效量将伤口与分离的合成ABCB5+干细胞群接触，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。在一些实施方案中，所述分离的合成ABCB5+干细胞群被接种到基质或支架上。在另一些实施方案中，所述基质是聚合物网或海绵、聚合物水凝胶或者胶原基质。

在另一些方面中，本发明是包括向具有器官移植物的对象施用有效量的分离的合成ABCB5+干细胞群以促进同种异体移植物存活的方法，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

在另一些方面中，本发明是治疗自身免疫病的方法，所述方法包括向患有自身免疫病的对象施用有效量的分离的合成ABCB5+干细胞群以治疗所述自身免疫病，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

在另一些方面中，本发明是治疗肝病的方法，所述方法包括向患有肝病的对象施用有效量的分离的合成ABCB5+干细胞群以治疗所述肝病，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

在另一些方面中，本发明是治疗神经退行性疾病的方法，所述方法包括向患有神经退行性疾病的对象施用有效量的分离的合成ABCB5+干细胞群以治疗所述神经退行性疾病，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代，并且其中所述神经退行性疾病与针对宿主细胞的免疫应答相关。

在另一些方面中，本发明是治疗心血管疾病的方法，所述方法包括向患有心血管疾病的对象施用有效量的分离的合成ABCB5+干细胞群以治疗所述心血管疾病，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代，并且其中所述心血管疾病与组织重塑相关。

在另一些方面中，本发明是治疗肾病的方法，所述方法包括向患有肾病的对象施用有效量的分离的合成ABCB5+干细胞群以治疗所述肾病，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

在另一些方面中，本发明是治疗炎性病症的方法，所述方法包括向患有炎性病症的对象施用有效量的分离的合成ABCB5+干细胞群以治疗所述炎性病症，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。在一些实施方案中，所述炎性病症选自心血管疾病、缺血性发作、阿尔茨海默病和衰老。

在另一些方面中，本发明是治疗肌肉骨骼病症的方法，所述方法包括向患有炎性病症的对象施用有效量的分离的合成ABCB5+干细胞群以治疗所述肌肉骨骼病症，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。在一些实施方案中，所述肌肉骨骼病症是遗传性肌营养不良。在另一些实施方案中，所述合成干细胞群是本文所述的合成细胞。

在另一些方面中，本发明是用于细胞重编程的方法，所述方法通过使用如权利要求1至18中任一项所述的合成干细胞群作为通过多能性进行细胞重编程的底物。

在另一些方面中，本发明是如本文所述的合成干细胞群，并且所述合成干细胞群还包含外源性PAX6基因。

作为本发明的一个方面还提供了本发明的干细胞群用于治疗如本文所述的任一种病症、组织工程或伤口愈合的用途。

还提供了用于制造本发明干细胞群的药物的方法，所述药物用于治疗如本文所述的任一种病症、组织工程或伤口愈合。

本发明的每个限制都可以涵盖本发明的多种实施方案。因此，预料到涉及任何一个要素或要素组合的本发明的每个限制可以包含在本发明的每个方面中。本发明的应用不限于在以下描述中阐述的或附图中举例说明的组分之构造和布置的细节。本发明可以是另一些实施方案，并且能够以多种方式实践或实施。此外，本文所使用的措辞和术语是为了描述的目的，而不应被视为是限制性的。本文中“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变型的使用意味着涵盖其后所列出的项及其等同物以及附加项。

附图说明

附图不旨在按比例绘制。在附图中，各图中描绘的每个相同或几乎相同的组件由相同的数字表示。为了清楚起见，并非在每个附图中都标出每个组件。在附图中：

图1：总结合成干细胞制造过程的流程图。

图2A至2G：ABCB5+MSC可属于较高而非较低的成纤维细胞谱系。(2A)描绘了来自低(2至3)和高(10以上)传代的ABCB5+来源的MSC的样品(n＝3)的转录物组谱分析的热图。颜色反映了相对表达的log2比例。(2B)描绘了参与维持来自传代早期和晚期的ABCB5+来源的MSC的干细胞特性的基因的热图。(2C)在不同的真皮细胞亚群中观察到ABCB5与干细胞标志物SSEA-4的明确共定位。(2D至2E)经受对ABCB5和“较高谱系(upper lineage)”成纤维细胞的两种标志物蛋白的双重免疫荧光染色的人皮肤显微照片揭示，ABCB5与DPP4(CD26)共表达且ABCB5和PRDM1(BLIMP1)部分共定位。(2F)ABCB5与干细胞标志物POU5F1(OCT-4)的共定位。(2G)始终未发现ABCB5与较低谱系成纤维细胞和肌成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)共表达。所有经研究的皮肤切片的细胞核均用DAPI复染。比例尺：50μm；e＝表皮；d＝真皮。虚线描绘将表皮层与真皮层分开。

具体实施方式

在一些方面中，本发明是体外制造的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞群。这些细胞代表了皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的分离的原代细胞群的重大进步。通常来说，一旦原代细胞被分离和在体外培养，这些细胞就会失去与原始原代细胞相关的重要特性。根据本发明已发现，在适当条件下，从人组织分离的ABCB5+干细胞可在培养中传代以产生在结构和功能上不同于从该组织分离的原始原代细胞的细胞群。这些细胞在本文中称为合成的或制造的ABCB5+干细胞。这些细胞是在体外制造的，因此几乎所有细胞都是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代，其在人体的背景下从未存在。相反，它们是根据新建立的培养方法新创造的。尽管这些细胞群不同于原始的原代细胞，但它们是具有许多治疗用途的具有高功能性的多能干细胞。

如本文所用的合成ABCB5+干细胞具有一种或更多种以下特性：

·共表达CD90>90％；

·如通过ELISA测量的，能够在缺氧下分泌VEGF；

·在与Mi极化的巨噬细胞共培养之后能够分泌IL-1RA；

·在巨噬细胞共培养中诱导降低的TNF-α和IL-12/IL-23p40分泌以及提高的IL-10分泌；

·具有多能分化能力；或

·不同的基因表达谱。

本发明的组合物为细胞群。如本文所使用的术语“细胞群”指包含至少两种(例如，两种或更多种，例如，多于一种)合成ABCB5+干细胞的组合物，并且不表示任何纯度水平或者其他细胞类型的存在或不存在，除非另有规定。在一个示例性实施方案中，该群基本上不存在其他细胞类型。在另一个示例性实施方案中，该群包含至少两种细胞，所述细胞具有规定的细胞类型或者具有规定的功能或特性，例如，如上所列出的。

在一些实施方案中，合成干细胞诱导降低的TNF-α和IL-12/IL-23p40分泌。细胞的这些特性对其抗炎功能很重要。由于这些细胞因子，因此细胞可用于治疗多种炎性疾病。在另一些实施方案中，在巨噬细胞共培养中，细胞产生提高的IL-10分泌。IL-10的产生对于支持合成干细胞的致耐受性功能很重要。

本发明的细胞还具有多能分化能力。换句话说，这些细胞不仅限定了间充质基质细胞(脂肪形成、软骨形成、成骨的分化)，还限定了其他能力，包括分化为来源于所有三个胚层的细胞，所述三个胚层即1.内胚层(例如血管生成–例如管形成，CD31和VEGFR1表达)，2.中胚层(例如肌生成-例如血影蛋白、结蛋白表达)和3.外胚层(例如神经生成-例如Tuj1表达)。

此外，体外制造的细胞具有角膜上皮分化能力(例如KRT12表达)，其可用于在体内治疗角膜缘干细胞缺乏和其他角膜病症。重要的是，KRT12在该合成细胞群中的存在为这些细胞提供了治疗角膜病症的独特能力。从人组织分离的干细胞群经常缺少这种因子。有人提出，为了用这些分离的人细胞治疗角膜疾病，应将KRT12添加至细胞。

本发明的合成细胞相对于从人组织分离的原代干细胞也具有不同的基因表达谱。如本文呈现的实例(包括图2)所示，合成细胞(也称为从高传代分离的ABCB5+细胞)群不同于原代细胞(来源于含有在活生物体中发现的天然ABCB5+细胞的低传代培养物的那些)。例如，高传代细胞中某些干细胞标志物提高，例如SOX2、NANOG和SOX3，而某些间充质基质分化标志物降低，例如MCAM、CRIG1和ATXN1。所选的干细胞特性(stemness)标志物例如SSEA-4、DPP4(CD26)、PRDM1(BLIMP1)和POU5F1(OCT-4)在人皮肤中的ABCB5+细胞中的蛋白水平上的表达通过免疫染色证实。而在人皮肤的ABCB5⁺细胞中，较低成纤维细胞谱系标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达缺失。这些数据支持这样的发现，即这些传代晚期的合成细胞保持ABCB5⁺细胞的多能性，甚至相对于原始细胞具有增强的特性。

本文所述的方法产生高纯度的合成细胞群。在一些优选实施方案中，100％的细胞是合成的，而0％的细胞来源于人组织。本发明的过程允许等于25次细胞倍增的多至16次传代。因此，体外合成细胞百分比在每次传代时用以下公式估算应至少为以下：

[1–1/(2ⁿ)]×100％，其中n是每次传代的倍增数(即，16次传代为25，或x次传代数为x/16×25)。

从第2和第3次传代开始，细胞结构开始改变。例如，对于低传代(2至3)，示出了上面讨论的和实例中呈现的基因表达谱分析中的数据。因此，相对低的3次传代(3/16×25＝4.6875次倍增)将导致至少96.12％的体外制造或合成细胞。具有至少10/16×25＝15.625次倍增的高(>10次传代培养)将导致至少99.998％的体外制造或合成细胞。本文所测试的25次倍增的最高传代的细胞群(16次传代)将导致至少99.999997％的体外制造或合成细胞。

由于干细胞也可对称和不对称分裂，因此高传代的细胞可达到100％合成细胞。过程中的通常的传代的范围为6(9.375次倍增)直到16次传代(25次倍增)，即产物的合成纯度范围通常为[1-1/(2⁹.375)]×100％至[1-1/(2²⁵)]×100％，即从99.85％至99.999997％。

细胞制造过程

细胞的制备和处理按照符合GMP的指南和标准进行。制造过程可在洁净室环境中进行。如本文所述产生的制造细胞被冷冻保存并储存在液氮的气相中(≤-130℃)。

基本制造过程通常涉及四个步骤：组织获得；皮肤组织处理；细胞增殖；和分离ABCB5阳性细胞。皮肤组织可取自人手术标本，例如腹壁成形术(或导致剩余(left-over)皮肤组织的其他医疗干预)。描绘从皮肤供体组织(≥10cm2)开始产生本文公开的合成干细胞所需的制造步骤的一般流程图在图1中示出。过程中(in-process)和放行控制的颜色为橙色。T25、T75、T175指细胞培养瓶的生长面积和相关名称(cm2)。Cryo是指在液氮的气相中对细胞进行冷冻储存。BC是带条形码的冷冻小瓶。mCcP是指细胞产物的微生物控制。此外，可使用其他过程中控制(in-process control，IPC)，包括皮肤的胶原酶/TrypZean解离[％]、细胞形态、传代间隔时间、汇合、应用TrypZean后的细胞脱离、孵育时间。

一次分离产生的ABCB5阳性细胞(带有抗体偶联的磁珠)称为“单个批次”。将平行分离产生的单个批次(来源于相同皮肤组织且在相同传代次数和时间时分离)进行合并(产生“母料(Masterbatch)”)，并冷冻保存，其中含有至少2×10⁶个细胞/带条形码的冷冻小瓶(barcoded cryovial，BC)。与制造过程平行，将所有步骤以及所用试剂和关键材料的所有批号均记录在特定批次文件中。独特的BC-编号、独特的批号和储存位置(在氮气罐中)的明确分配允许对产生的细胞批次进行明确分配。将这些属性记录在批次文件中，另外还记录在相应氮气储罐的“储存位置列表”中。

组织获得：

起始材料是来自在专门的切除中心进行的例如腹壁成形术或其他医疗干预的手术程序中剩余的皮肤组织。

皮肤组织的处理

将皮肤取出，与多余的皮下脂肪分离，然后确定皮肤尺寸(皮肤尺寸需要≥10cm²)。然后将皮肤切成相等的切片(每片约2.5cm²)。每个处理日最多可处理30片(剩余片储存在+2至+8℃的HTS-FRS活检运输溶液中，直至处理)。每两片进行组合，因此每个处理日总共可以并行进行几项准备工作。对于消毒，在室温(RT)下将皮肤片首先在水性聚维酮-碘溶液

中孵育，然后在醇基聚维酮-碘溶液

中孵育。此后，对于每个洗涤步骤，使用PBSCa/Mg洗涤皮肤组织3次。使用剪刀和镊子切开皮肤。使用胶原酶进一步分离所得皮肤片：将皮肤样品在胶原酶/PBSCa/Mg/Pen/Strep溶液中在37℃下孵育1.5至6小时(IPC)。孵育期之后的消化效率需要大于60％(IPC)，并通过目视确定。过滤皮肤细胞溶液，并使用非动物重组胰蛋白酶(

Sigma-Aldrich)在37℃下继续孵育剩余皮肤10至60分钟(IPC)。通过离心(500×g，室温下5分钟)洗涤过滤器流通物(flow-through)以及反复过滤的经TrypZean处理的剩余皮肤(消化效率：>85％，目视确定)(IPC)。离心之后，去除上清液，将细胞沉淀重悬在干细胞培养基(补充有15％FCS、2mM L-谷氨酰胺、0.6ng/ml bFGF/FGF-2、6mM HEPES、2.8μg/ml氢化可的松、10μg/ml胰岛素、1.12mg/ml葡萄糖、6.16ng/ml PMA、0.5μg/ml两性霉素和1×Pen/Strep的HAM′s F10)中。将细胞合并，使其均匀分布在多至30孔的C6细胞培养板上，并在细胞培养箱中孵育(CO2含量：3.1％，湿度：90％；温度：37℃)。

细胞(混合细胞培养物)的增殖

混合细胞培养物定义为指在分离前由ABCB5阳性和ABCB5阴性细胞组成的未分离细胞培养物。

在C6孔中培养原代皮肤细胞之后1至4天(IPC)进行细胞汇合的首次评估(由经过培训的员工目视确定)。如果汇合<70％(IPC)，则更换培养基，并在C6孔中继续培养细胞。重复此程序，直到细胞达到≥70％汇合(IPC)。应注意的是，仅在最初的4至6天将原代皮肤细胞保持在含抗生素/抗真菌剂的培养基中(IPC)。在这个初始阶段之后，只在无抗生素培养基中培养细胞。此外，C6孔中的最长培养时间为16天(IPC)。如果细胞在此期间不能达到汇合≥70％(IPC)，则丢弃它们。

如果达到了≥70％的目标汇合(IPC)，则使用

收获细胞并在T25板中培养以进一步扩增。传代之后1至4天(IPC)再次确定细胞汇合。如果细胞汇合<70％(IPC)，则更换培养基，并将细胞在T25容器中继续孵育至多7天(IPC)(如果细胞汇合再次<70％，则丢弃细胞)(IPC)。在该7天内达到细胞汇合≥70％时，使用

收获细胞，并在T75板中培养以进行扩增。此时，按照2.6.7.E.P.采集用于支原体检测的样品(IPC)。进一步的细胞扩增遵循相同的方案。

MK冷冻保存

使用TrypZean收获细胞，并采集细胞样品以测定细胞计数和活力。将细胞悬液离心，将细胞重悬在含DMSO的冷冻培养基CS10(含DMSO的冷冻培养基)中。采集用于支原体检测的样品，然后将细胞转移到规定数量的条形码标记的冷冻管(“BC”)中，该数量取决于确定的细胞计数。MK的冷冻保存需要至少8×10⁶个细胞。最少一个BC(细胞数较高时更多)填充有5至12×10⁶个细胞(最终细胞-CS10溶液体积为1.5ml)。此外，为了确定混合的原代培养物的无菌性，采集细胞样品用于测试mCcP。

转种(subcultivation)

剩余的4×T175烧瓶用于将细胞传代至16×T175培养瓶。这些16×T175烧瓶用于分离ABCB5阳性细胞(合成干细胞)。对于第一次分离，从最后一次传代开始的时间必须在3至10天之间，并且细胞必须已达到一定的汇合。一般来说，为了启动进一步的生产步骤，汇合需要在40％至95％之间。

为了分离ABCB5阳性细胞，使用了16×T175烧瓶中的12个。如已经描述的，将剩余的4×T175容器的细胞分配到16×T175烧瓶中以使细胞生长，用于下一轮合成干细胞分离，直到达到16次的最大传代数或细胞形态变化(例如，更加分化的细胞形态)或细胞开始衰老。

ABCB5阳性细胞(合成干细胞)的分离

分离过程分为两部分：

·ABCB5阳性细胞的磁性分离-ABCB5阳性细胞单个批次的产生

·具有相同传代数的一个供体单个批次的合并(源自相同皮肤组织的平行细胞分离-母料的产生

ABCB5阳性细胞的磁性分离

当细胞(16×T175烧瓶的细胞)达到75％至95％的汇合时，去除12×T175烧瓶的培养基，并用PBS洗涤细胞。此外，取样以确定可能的支原体污染)。对于收获，将细胞与

(PBS中0.02％EDTA)在37℃下孵育20至30分钟，直到>90％的细胞从培养容器上脱离。对于这个过程步骤，使用Versene代替TrypZean，因为TrypZean处理导致基于抗体的细胞分离所需的表位丢失。通过向细胞悬液添加PBS来稀释细胞，然后将细胞在室温下以500×g离心5分钟。去除上清液，将所有细胞重悬在总共14ml HRG(49.5体积/％的5％HSA/49.5体积/％的乳酸林格液/1体积/％的40％葡萄糖)溶液中，并转移到50ml反应管。取出样品并转移至质量控制，以测定细胞计数和活力，和用于细胞周期分析的样品(10⁶个细胞)。

将400μl与靶向ABCB5的抗体缀合的磁珠添加至细胞，并用HRG将最终体积调节至16ml。使用样品旋转器在室温下将经抗体标记的珠-细胞混合物孵育20分钟。

向溶液中添加29ml HRG，并将样品在将磁珠吸到容器壁上的磁体上孵育4分钟。在此孵育期之后，小心去除主要含有ABCB5阴性或低表达细胞的上清液。使用45ml HRG溶液洗涤剩余的抗体-珠-细胞混合物。取出样品(珠-细胞混合物)用于ABCB5含量测定，并转移至质量控制(放行参数)。

剩余溶液在磁体上再孵育4分钟。丢弃上清液之后，添加3ml脱离溶液(TrypZean)以相对于ABCB5阳性细胞而酶促地去除经抗体标记的珠。这是可能的，因为TrypZean处理导致抗体结合表位的非特异性去除(肽裂解)，从而导致抗体-珠与细胞的分离。

在37℃下孵育3分钟之后，将3ml HRG溶液添加至反应管，将反应管再次放置在磁体上6分钟以结合磁珠。然后将含有分离的ABCB5阳性细胞的上清液转移到新鲜的15ml反应管中。通过添加3.5ml HRG溶液将50ml反应管冲洗两次，并磁体孵育4分钟。然后将上清液也转移至新鲜的15ml管中。

为了相对于剩余的珠而进一步纯化ABCB5阳性细胞，再次将其保持在磁体上4分钟。将上清液(13ml细胞悬液)转移到新的15ml反应管中，并在室温下以500×g离心5分钟。丢弃上清液，将细胞沉淀重悬在10ml HRG溶液中，并再次在磁体上孵育6分钟，然后将细胞悬液转移到新的15ml反应管。采集用于支原体测试(放行参数)和确定分离的ABCB5阳性细胞细胞计数的样品(IPC)，并转移至质量控制。将溶液在室温下以500×g离心5分钟。将100μl上清液转移(用无内毒素移液管尖端)至用于内毒素确定(放行参数)的无内毒素管中，然后丢弃上清液。剩余的上清液也被小心地去除。

生成母料的合并步骤

母料(最后一批合成干细胞)由以下单个批次组成：

·来源于相同起始材料(相同供体)

·以相同传代数在同一天平行分离

将单个批次的细胞沉淀在CryoStorTM CS10中重悬。CS10的总量和相关的条形码管(BC)的数量取决于可用细胞的数量。每个BC填充有CS10中的1.5ml细胞悬液。

最少2×10⁶个细胞(2至18×10⁶个细胞/BC)被填充到小瓶中。在冷冻BC之前，选择一个BC作为“用于QC的分析BC”(BC-No.1)，并取出以下样品并将其转移至质量控制用于分析测试(放行测试)：

·细胞计数与活力

·生存力，CD90共表达，珠剩余物

·细胞产物的微生物控制(mCcP)

将BC管用受控速率冷冻器冷冻至-150℃(冷冻速率：1℃/分钟，直到-100℃；5℃/分钟，直到-150℃)，并转移至隔离(quarantine)储罐中，直至它们被放行。

对于进行所有三种效能测定(管形成测定、VEGF ELISA和IL-1RAELISA)，通过质量控制解冻“用于QC的分析BC”，并采集用于测定试验的细胞样品。

在这些情况下，可解冻冷冻保存的混合培养物(MK)并用于进一步的细胞产生。因此，可从一个单个皮肤组织中分离出大量ABCB5阳性细胞，产生“生物库”用于临床使用。

通过这些方法产生的合成干细胞被确定具有以下规格(specification)：

以下更详细地描述了用于评估这些规格的分析程序。

1.mCcP(细胞产物的微生物控制)

对于产物合成干细胞的无菌性测试，使用“mCcP”方法。取样和探测由制造部门经过培训的员工在层流罩下的洁净室设施内完成。孵育和分析由该部门经过培训的员工完成。

程序描述：

将产物总最终体积的1％用于mCcP测试。用于mCcP测试的2×15μl直接取自每个分离的合成干细胞批次的每个冷冻小瓶(1.5ml)。

mCcP由BacT/Alert 3D 60系统(Biomerieux)执行。BacT/Alert 3D 60系统由2个模块，即一个控制器模块和一个培养箱模块组成，能够同时孵育60个单一样品和检测60个单一样品内的污染。将含有培养基的瓶放入配备有摇动机构的培养箱模块中。

使用以下培养基(以瓶提供)：

·BPA(好氧)：40ml补充的TSB，CO2气氛，在氧气中

·BPN(厌氧)：40ml补充的TSB，CO2气氛，在氮气中

对于mCcP测试，将15μl的测试材料分别转移到BPN或BPA烧瓶中。

由于样品量非常小，因此用NaCl-蛋白胨缓冲溶液将其稀释至4ml的体积。对于mCcP测试，使用无菌注射器将4ml样品溶液(含15μl细胞/CS10溶液)注入BPA和BPN瓶中。当由于微生物产生的CO₂提高使pH值变化时，每个培养瓶底部的专用液体乳化传感器(LiquidEmulsion Sensor，LES)会明显改变颜色(从灰色变为黄色)。BacT/

3D仪器每十分钟测量颜色变化并分析该变化。一旦检测到生长，系统就发出听觉和视觉二者的警报，并记录样品数据。

灵敏度程序允许在7天内作出准确呈现。这个时间之后，将所有阴性探针接种到固体培养基上。此外，通常在检测时将所有阳性样品接种到固体培养基上。

计划的取样程序

对于计划的取样程序，mCcP的样品量计算基于总批次体积，而不是冷冻小瓶的体积，整个样品体积取自一个专用单元。

将产物总最终体积的至少1％用于mCcP测试。这意味着用于mCcP测试的100μl(总产物体积≤10ml)或总产物体积(体积>10ml)的1％直接取自合成干细胞批次的“用于QC的分析BC”(BC-No.1)。

用NaCl-蛋白胨缓冲溶液(根据E.P.)将低样品量稀释至4ml的体积。对于mCcP测试，使用无菌注射器将4ml样品溶液(含100μl至300μl细胞/CS10溶液)注入BPA和BPN瓶中。

孵育时间之后，可能检测不到微生物生长。如果满足该验收标准，则产物满足规格参数“细胞产物的微生物生长”的“无生长”要求。

2.支原体测试

对于产物合成干细胞的支原体测试，进行了qPCR方法。对于基于定量实时PCR的支原体测试，使用

ATMP支原体试剂盒(Minerva Biolabs)，该试剂盒由制造商(Minerva Biolabs)在所有列出的支原体物种的检测限、细胞培养物和自体细胞移植物的特异性和稳健性方面进行验证。支原体检测基于高度保守的RNA操纵子(支原体基因组内的16SrRNA编码区)的扩增和检测。

对于支原体qPCR的表现，使用来自Life technologies的StepOneTM实时PCR系统。

对于支原体测试，在对细胞进行合并和冷冻保存之前的在磁体上的最后的洗涤步骤期间分离ABCB5阳性细胞之后，取200μl细胞悬液。离心(13000rpm，15分钟)样品之后，将沉淀悬浮在200μl Tris缓冲液中。

向样品加入内部对照DNA，并使用Microsart AMP提取试剂盒分离基因组DNA。将10μl分离的DNA用于在48孔板中进行的qPCR。qPCR包括阳性对照和阴性对照(由

ATMP Mykoplasm试剂盒提供)以及内部分离对照，和作为灵敏度标准品的用于支原体物种口腔支原体(Mycoplasma orale，MO)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans，MF)和肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)的10CFUTM灵敏度标准品。

完成了对qPCR结果的分析。阴性对照必须显示Ct值≥40，阳性对照以及灵敏度标准品必须显示Ct值<40。从该过程中采集的样品为Ct值<40的支原体阳性和Ct值≥40的支原体阴性。

在受试细胞悬液中，可能检测不到支原体DNA的扩增(检测限10CFU/ml)。如果满足该验收标准(对于母料的所有单个批次)，则产物满足规格参数“支原体”的“未检测到，<10CFU/ml”要求。

3.内毒素水平

对于内毒素水平的定量测定，使用显色动力学LAL测试。这是一种定量光度法。使用

-PTS^TM和匹配的LAL筒(均来自Charles River实验室)进行测量。

-PTS筒是FDA许可作为用于药物产物的过程中控制和产物端控制的LAL测试方法。内毒素测试在由裂解物制造商推荐的37℃±1℃的孵育温度下进行。每个筒含有限定量的FDA批准的LAL试剂、显色底物和内毒素标准对照(CSE)。

分离ABCB5阳性细胞、从抗体-珠复合物分离和离心细胞之后，取100μl上清液用于内毒素测试，并用LAL试剂水(LRW-水)以1:10稀释。对于每次测量，用移液管将25μl样品移入LAL筒(插入

-PTS^TM中)的4个样品贮存器中的每个。PTS^TM读数器将样品与LAL试剂(样品通道)或与LAL试剂和阳性对照(尖峰通道(spike channel))在2个通道中各自混合。在孵育和添加显色底物之后，对每个孔的光密度进行动力学分析，并基于内部批次特定的标准曲线进行测量。

通过计算两次测量之间响应时间的变化来完成重复测定的评价。如果重复测量的响应时间变化小于25％，则认为内毒素测量有效。

根据规格，经测量的样品(对于母料的所有单个批次)必须实现内毒素水平≤2EU/ml。

4.细胞计数与细胞活力

用于确定细胞计数和细胞活力的自动化方法(通过使用流式细胞术来使用)。流式细胞术(BD AccuriTM C6流式细胞仪)提供了快速和可靠的方法来定量细胞悬液中的活细胞。评估细胞活力的一种方法是使用染料排除。活细胞具有排除多种容易穿透非活细胞受损的可透膜的染料的完整的膜。

碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)是不可透膜染料，通常被排除在活细胞之外，但可以穿透濒死或死亡细胞的细胞膜。它通过插入碱基对之间与双链DNA结合。PI在488nm处激发，并且具有相对大的斯托克斯位移，在617nm的最大波长处发射。

细胞计数和活力的确定是在分离合成干细胞之后，直接在冷冻保存它们之前进行的。

对于分析，用移液管将10μl细胞悬液从冷冻小瓶移入1.5ml反应管(含有80μlVersene)中，并交给质量控制部门。根据工作说明，添加10μl PI溶液(1mg/ml)之后，用Versene将总体积调节至500μl，并用BD AccuriTM C6流式细胞仪进行测量。每次测量运行用55μl样品溶液进行。计算细胞计数和活力，并将其记录在测试报告中。

规定的细胞活力验收标准为≥90％。分离的合成干细胞的每批次的细胞计数的规定验收标准为2×10⁶-18×10⁶细胞/冷冻小瓶。

5.细胞生存力

用于确定细胞生存力的自动化方法通过使用流式细胞术来进行。用钙黄绿素-AM(钙黄绿素乙酰氧基甲基酯)对细胞染色来确定生存力。钙黄绿素AM是容易渗透完整的活细胞的非荧光、疏水性化合物。进入细胞之后，细胞内的酯酶裂解乙酰氧基甲基(AM)酯基团，产生钙黄绿素(很好地保留在细胞胞质中的亲水性、强荧光化合物)。

具有受损的细胞膜的凋亡细胞和死亡细胞不保留钙黄绿素。钙黄绿素在495nm处被最佳激发，并具有515nm的发射峰。

对分离的ABCB5阳性细胞(合成干细胞)进行细胞生存力测量，然后冷冻保存细胞。细胞生存率提供有关分离的细胞的实际代谢活性的信息，与用仅区分活细胞和死细胞的PI进行的细胞活力确定不同。

对于测量，从冷冻管中取出100μl细胞悬液(在冷冻介质CS10中)，转移到含有1mlVersene(0.02％EDTA)的1.5ml反应管中，并交给质量控制。样品可在2至8℃下最多储存2小时。对于样品制备，将细胞离心(5分钟，1500rpm)，去除上清液，并将细胞沉淀重悬在200μlVersene中。添加2μl钙黄绿素-AM(以1:200稀释，f.c.0,1μM)(和1μl CD90抗体)之后，将样品在37℃下孵育30分钟，然后用1ml Versene进行洗涤步骤，离心(5分钟，1500rpm)并在200μl Versene中重悬沉淀。使用BD AccuriTM C6流式细胞仪进行细胞生存力的测量。使用检测到的钙黄绿素荧光计算生存力，并记录在测试报告中。

细胞生存力的规定验收标准为≥90％。

6.CD-90表面标志物

为了显示分离的ABCB5+细胞确实是干细胞，通过流式细胞术(BD AccuriTM C6流式细胞仪)分析表面蛋白CD90(是间充质干细胞标志物)的表达。对于CD90的检测，使用直接针对CD90的Alexa

647缀合的抗体。Alexa

647染料是高度适合流式细胞术应用的明亮的远红-荧光染料，其激发理想地适合594nm或633nm激光线。对于成像和流式细胞术中稳定的信号产生，Alexa

647染料在宽摩尔范围内对pH不敏感。由于Alexa

647和钙黄绿素的激发和发射波长不同(参见生存力测试)，因此可对Alexa

647CD90和钙黄绿素-AP进行平行流式细胞术分析。

对于测量，从冷冻管中取出100μl细胞悬液(在冷冻介质CS10中)，转移到含有1mlVersene(0.02％EDTA)的1.5ml反应管中，并交给质量控制。样品可在2至8℃下储存最多2小时。对于样品制备，将细胞离心(5分钟，1500rpm)，去除上清液，并将细胞沉淀重悬在200μlVersene中。添加1μl CD90-Alexa

647抗体(1:200)和2μl钙黄绿素-AM(以1:200稀释，f.c.0,1μM)之后，将样品在37℃下孵育30分钟，然后用1ml Versene进行洗涤步骤，离心(5分钟，1500rpm)并在200μl Versene中重悬沉淀。使用BD AccuriTM C6流式细胞仪进行CD-90表达的测量。CD90+细胞通过其高Alexa

647荧光进行检测，计算其含量并记录在测试报告中。

规定的验收标准为≥90％的CD90阳性细胞。

7.珠剩余物

为了检查分离的合成干细胞是否已通过脱离溶液有效且完全地从ABCB5-抗体-珠中分离，对细胞进行珠剩余物检测。该分析方法还用流式细胞术与生存力和CD90表达测试平行进行。

将分离的ABCB5阳性细胞用TrypZean处理，TrypZean的酶活性引起ABCB5蛋白的胞外环上的mAb结合位点完全裂解。珠的脱离或细胞的洗涤的不充分可能导致分离的合成干细胞中存在剩余珠，因此必须进行分析。

对于通过流式细胞术的剩余珠的可视化/检测，使用BD AccuriTM C6。在第一次分析之前，使用无细胞ABCB5-珠溶液在FSC/SSA-Dot Plot中设置门，以可视化珠剩余物。由于不能排除在该门中也对细胞进行计数/检测，因此该分析与生存力测试的钙黄绿素染色组合。对于分析，仅考虑位于珠门(bead gate)中且为钙黄绿素阴性的事件。因此，活细胞被排除在分析之外，仅对珠进行计数。

如在“细胞生存力”和“CD90表面标志物”中已经描述的，根据工作说明用BDAccuriTM C6流式细胞仪进行样品制备和测量。计算剩余珠的比例，并将其记录在测试报告中。

规定的验收标准为合成干细胞中≤0.5％的剩余珠。

8.ABCB5含量确定

分离合成干细胞之后，通过流式细胞术确定ABCB5阳性细胞的实际含量。

ABCB5阳性细胞通过使用驴α-小鼠Alexa-647抗体来检测。这种二抗直接针对单克隆α-ABCB5抗体。此外，该第二抗体与允许用流式细胞术进行检测的荧光色素Alexa-647偶联。因此，发射的荧光与结合的抗体的数量直接相关，但与抗体结合的ABCB5阳性细胞的实际数量无关，因为也检测到游离/未结合的珠-抗体复合物。为了获得ABCB5阳性细胞的实际数量，用钙黄绿素-AM进行另外染色，以允许区分细胞(活)和珠-抗体复合物(非活)。通过仅考虑用于分析的钙黄绿素阳性事件，游离珠-抗体复合物被排除在外。

由于用TrypZean使磁珠相对于细胞脱离而导致细胞表面的ABCB5蛋白丢失，因此脱离后不可能用抗体检测到ABCB5。因此，在添加磁珠、孵育和磁分离之后但在添加TrypZean之前，取200μl样品用于含量确定。将仍与抗体偶联的磁珠结合的细胞交给质量控制，并直接用于分析或在2-8℃下储存最多2小时。离心后，将细胞重悬在200μl二抗溶液(驴α-小鼠Alexa 647，用Versene以1:500稀释)和7μl钙黄绿素-AM中，并在37℃下孵育20至30分钟。将细胞离心，用Versene洗涤，最后重悬，用于在200μl Versene中进行分析。

根据工作说明，使用BD AccuriTM C6流式细胞仪进行ABCB5含量的测量。通过设门(gating)，只有具有高钙黄绿素荧光未结合珠-抗体复合物的细胞被排除在分析之外。ABCB5阳性细胞的比例从二抗的Alexa-647荧光来计算。

分离合成干细胞之后ABCB5阳性细胞含量的规定验收标准为≥90％(对于母料中的每个单个批次)。

9.效能测定1：血管生成分化(管形成测定)

合成干细胞放行的重要标准是细胞的转分化效能。在此过程内，测试了合成干细胞是否能够经历血管生成分化。分化潜能/能力使用所谓的管形成测定(最广泛用于测量血管生成的体外测定之一)进行测试。通过这种快速测定测试了细胞在胞外基质存在下构建三维结构(管形成)的能力。

对于所有三种效能测定的测试，使用定义的“用于QC的分析BC”并解冻。根据工作说明进行分化测定。对于管形成测定，将1×105和1.5×105个细胞接种(在干细胞培养基中)在24孔板(包被有ECM基质)的两个孔中，并在CO2培养箱中孵育19小时至22小时。在显微镜下(放大40倍)拍摄照片并保存用于分析。

效能测定的规定验收标准是两个受试细胞浓度中的至少一个的管形成(定性分析)。

10.效能测定2：缺氧之后VEGF分泌

缺氧培养之后分离的细胞的VEGF分泌作为第二效能测定。使用该方法测试了ABCB5阳性细胞通过旁分泌因子增强血管生成的能力。

对于测试，使用定义的“用于QC的分析BC”并解冻。对于测定，将3×105个细胞接种(在干细胞培养基中)到细胞培养皿(35×10mm)中，并在缺氧条件下(缺氧室中1％O2)在37℃下培养48小时(±2小时)。收集上清液并用于VEGF ELISA。

基于验证数据，规定的验收标准为缺氧培养之后细胞上清液中>46.9pg/ml VEGF。

11.效能测定3：与M1极化的巨噬细胞共培养之后的IL-1RA分泌

与M1极化的巨噬细胞共培养并刺激炎性环境之后IL-1RA分泌的确定应表明ABCB5阳性细胞的免疫调节能力。

在测定开始时，通过向细胞培养基中添加PMA(150nmol/ml)使THP-1细胞分化为巨噬细胞

48小时之后，将巨噬细胞与ABCB5阳性细胞(合成干细胞)共培养。因此，使用并解冻定义的“用于QC的分析BC”。在24孔板的两个孔中，将2×10⁴个ABCB5阳性细胞与1×10⁵个巨噬细胞共培养48小时。在一个孔中，通过在共培养开始时添加50IU/ml IFN-g刺激炎性环境。共培养24小时之后，通过添加20ng/ml LPS和再次添加50IU/ml IFN-g重复刺激。共培养2天之后，收集上清液并用于IL-1RA ELISA。

规定的验收标准是基于验证数据(和炎性环境的刺激)的与巨噬细胞共培养之后>125pg/ml IL-1RA分泌。

本发明的合成ABCB5+干细胞可用于多种不同的治疗目的。例如，合成细胞可用于同基因移植物皮肤伤口愈合、同种异体移植物、周围动脉闭塞性病–PAOD、慢加急性肝衰竭–AOCLF、大疱性表皮松解症–EB和许多其他疾病。例如，基于最新表明的KRT12+角膜分化能力，用于治疗角膜缘干细胞缺乏(LSCD)和其他角膜病症(类似于已经作为同种异体移植物在临床试验中的角膜缘ABCB5+干细胞，但具有ABCB5+皮肤干细胞在从患者皮肤分离后可用作LSCD或角膜病症中的自体患者同基因移植物，避免移植排斥的优点)。

还预期了如Dinarello et al Nat Rev Drug Discov.2012论文中概述的对于涉及IL1β并对IL-1RA有响应的炎症引起的和/或免疫引起的病症的治疗，或者由TNF-α(例如类风湿性关节炎)或IL-12/IL-23p40(例如银屑病)驱动的病症或可接受IL-10/调节T细胞治疗(例如移植物排斥)的疾病的治疗。用于炎症驱动的疾病过程的潜在应用非常广泛，包括例如心血管疾病、缺血性发作、阿尔茨海默病和衰老。类似地，例如移植物排斥或移植物抗宿主病的免疫病症应适合用这种细胞治疗进行治疗。

进一步治疗基于这种合成细胞制备物的神经源性和肌源性分化能力的疾病将是取决于组织修复来改善的卒中或其他CNS病症，或者取决于肌肉修复的肌肉骨骼病症，包括例如遗传性肌营养不良。

细胞组合物也被预期用于进一步的改善，包括基因转染以诱导参与组织重塑的分泌的分子，以及可能在患者中失调的生长因子、细胞因子、激素和神经递质在ABCB5+干细胞中的表达，例如特异性归巢因子，以将其靶向特定组织。此外，可转染校正的基因以允许基于干细胞修复其中特定基因有缺陷(例如RDEB中的COL7A)的遗传疾病，或者可以在移植到同基因患者之前通过多种基因编辑技术校正ABCB5+干细胞中的缺陷基因。

此外，这些细胞可被用作用于通过多能性或祖细胞基因进行细胞重编程的组合物。例如，我们已经表明，这些细胞比ABCB5-细胞更容易重编程为iPSC。此外，这些细胞中PAX6的过表达可进一步改善其角膜分化能力，如对于其他皮肤祖细胞所显示的。

由于先进的基于MSC的治疗的移植和释放伤口愈合促进因子的能力，人们对对患有急性和慢性伤口患者的所述治疗产生了浓厚的兴趣。迄今为止，发达国家1至2％的人口患有不愈合的伤口，且由于衰老、肥胖和糖尿病患者在全球范围内的增加，慢性伤口的发病率被估计为增加[4]。仍然阻碍大规模的基于MSC的治疗在临床实践中成功实施的一个主要障碍是缺乏可靠地允许富集和扩增MSC用于可重复的旁分泌效力和效能的细胞表面标志物。

尽管病因不同，但慢性伤口的共同特征是持续大量过度激活的促炎性M1巨噬细胞[7、8]伴随TNFα和其他促炎性细胞因子的释放增强。这些促炎性细胞因子，连同蛋白酶和活性氧种类，导致组织分解，并在常驻伤口部位成纤维细胞中安装老化程序，从而使这些伤口保持不愈合状态。由于血压提高和静脉瓣膜功能不全，导致伤口部位红细胞持续外渗，因此先前在位于慢性静脉腿溃疡中的巨噬细胞中鉴定了铁积聚。这些伤口中的铁过载的巨噬细胞无法从其促炎性M1状态转换为组织重塑和修复所需的抗炎性M2巨噬细胞[7]。与其M1对应物相反，M2巨噬细胞显示出较低的炎性细胞因子释放，并产生刺激组织修复和伤口愈合的生长因子和代谢物[9]。相反，由M1巨噬细胞释放的其他效应分子中的如TNFα和IL-1β维持了M1巨噬细胞自分泌募集和持续激活的恶性循环，从而几乎将伤口锁定在持续炎症的不愈合状态[7、8]。

ABCB5⁺来源的MSC采用的为了抵消持续的炎症并将占优势的M1巨噬细胞转变为促进组织修复的M2巨噬细胞(这是慢性伤口愈合的先决条件)的旁分泌机制的参与得到了特别的解决。

为了排除任何植入或细胞融合效应，特意使用异种移植模型，将人ABCB5⁺来源的MSC局部注射到铁过载鼠模型的慢性伤口中，该模型密切反映了人慢性伤口中无限制的M1巨噬细胞活化的主要致病方面[7]。临床级批准的ABCB5⁺MSC制备物已被使用，其具有明确的克隆三谱系分化能力、增强的克隆生长和体外TNFα抑制活性作为成功治疗体内慢性伤口的有价值的预测指标。发现将ABCB5⁺来源的MSC注射到铁过载伤口中增强了旁分泌IL-1受体拮抗剂(IL-1receptor antagonist，IL-1RA)的释放，事实上，将慢性铁过载鼠伤口中过度增加的占优势的M1促炎性巨噬细胞表型转变为促进整体伤口愈合的抗炎性M2巨噬细胞。从注射的ABCB5⁺来源的MSC旁分泌释放IL-1RA的因果作用得到了以下发现的支持：注射人重组IL-1RA加速了伤口愈合，而注射IL-1RA沉默的ABCB5⁺来源的MSC则不能。值得注意的是，这些数据在人源化NOD-scid IL2rγ^null(NSG)小鼠中重现，具有从人促炎性M1向抗炎性M2巨噬细胞的转变，进一步为将富含标志物的ABCB5⁺MSC治疗成功转化为使患者长期受益的临床实践铺平了道路。

合成ABCB5+干细胞优选是经分离的。本文所用的“经分离的合成ABCB5+干细胞”指被置于其自然环境以外的条件下的细胞制备物。术语"经分离的"不排除这些细胞随后与其他细胞组合或混合或在体内环境中的后续使用。

合成ABCB5+干细胞可被制备为基本上纯的制备物。术语"基本上纯的"意指制备物中基本不含除ABCB5阳性干细胞外的细胞。例如，ABCB5细胞应占存在的总细胞的至少70％，其中更高的百分比，例如至少85％、90％、95％或99％是优选的。可将细胞包装在成品药物容器中，例如注射瓶、安瓿或输注袋中，连同可能期望的任何其他组分，例如用于保存细胞或降低细菌生长的药剂。组合物应为单位剂型。

合成ABCB5+干细胞在一些实施方案中可用于治疗免疫介导的疾病。免疫介导的疾病是与有害免疫应答相关的疾病，即损害组织的疾病。这些疾病包括但不限于移植、自身免疫病、心血管疾病、肝病、肾病和神经退行性疾病。

已经发现，合成ABCB5+干细胞可用于移植以缓解通过免疫系统的应答，以使对抗原的免疫应答将降低或消除。移植是将组织或器官从一个身体或身体部位移植到另一个身体或身体部位的行为或过程。合成ABCB5+干细胞对于宿主可以是自体的(从同一宿主获得)或对于宿主是非自体的，例如同种异体或同种同基因的细胞。非自体细胞来源于患者或器官供体以外的某些来源。或者，合成ABCB5+干细胞可对于宿主而言为异种的来源获得。

同种异体是指尽管属于或获自与宿主或供体相同的物种但在遗传上不同的细胞。因此，同种异体人间充质干细胞是从人获得的间充质干细胞，而非从合成ABCB5+干细胞或器官供体的预期接受者获得。同基因指与宿主或供体在基因上相同或密切相关且免疫学相容的细胞，即来自具有相同基因型的个体或组织。异种是指来源于或者获自于与宿主或供体不同物种的生物体的细胞。

因此，合成ABCB5+干细胞用于通过向移植接受体施用其量有效抑制或缓解针对移植物(组织、器官、细胞等)的免疫应答的合成ABCB5+干细胞来抑制或缓解对该移植物的免疫应答。

因此，可通过将合成ABCB5+干细胞与供体组织的接受体接触来实现该方法。合成ABCB5+干细胞可在移植之前或与移植同时或在移植之后施用于接受体。当在移植之前施用干细胞时，通常应在手术之前多至14天施用干细胞，优选在手术之前多至7天施用。此后可定期重复施用(例如，每周一次)。

合成ABCB5+干细胞也可作为移植物的一部分施用于受体。例如，合成ABCB5+干细胞可在移植前灌注到器官或组织中。或者，可移植组织，然后在手术期间进行处理。

为了降低针对移植物的排斥反应的严重程度或消除针对移植物的排斥反应，对接受移植物的患者的治疗也可通过在供体组织被移植到接受体后向供体组织的接受体施用合成ABCB5+干细胞来实现。

降低由供体组织、器官或细胞对接受体的免疫应答，即移植物抗宿主应答，可通过在将该组织、器官或细胞移植到接受体中之前用合成ABCB5+干细胞离体处理该供体组织、器官或细胞来完成。合成ABCB5+干细胞降低移植中的T细胞响应性，其可针对受体抗原呈递细胞被随后激活以使移植物被引入接受体(宿主)的体内，而不会发生或会减少移植物对宿主的不良应答。因此，可避免称为“移植物抗宿主”的疾病。

合成ABCB5+干细胞可例如在移植前从接受体或供体获得。合成ABCB5+干细胞可被分离并冷冻储存，直至需要。也可将合成ABCB5+干细胞培养物扩增至期望的量并储存直至需要。或者，可在使用前立即获得它们。

将合成ABCB5+干细胞以有效降低或消除由供体移植物针对宿主引起的持续不良免疫应答的量施用于受体。将合成ABCB5+干细胞呈递给经历由移植物引起的不良免疫应答的宿主抑制了该持续的免疫应答以及防止T细胞的再刺激，从而降低或消除活化的T细胞对宿主组织的不良应答。

作为移植程序的一部分，合成ABCB5+干细胞也可被修饰以表达增强保护作用的分子(例如诱导细胞死亡的分子)。如下文更详细描述的，可使用外源添加的核酸将真皮合成ABCB5+干细胞改造以产生蛋白质。例如，合成ABCB5+干细胞可用于向免疫系统递送分子，该分子诱导携带该分子受体的活化T细胞凋亡。这导致活化的T淋巴细胞缺失，并导致抑制对移植物的不需要的免疫应答。因此，真皮合成ABCB5+干细胞可被修饰以表达细胞死亡分子。在本文所述方法的一些优选实施方案中，合成ABCB5+干细胞表达细胞死亡分子Fas配体或TRAIL配体。

在所有情况下，均应给予患者有效剂量的细胞(即，应给予患者足以延长同种异体移植物存活的数量)。施用的细胞数量通常应在1×10⁷至1×10¹⁰的范围中，并且在大多数情况下应在1×10⁸和5×10⁹之间。实际剂量和给药计划表将由主治医师使用临床医学领域的标准方法并考虑到例如患者的年龄、体重和身体状况的因素来逐例确定。在患者表现出移植物排斥迹象的情况下，施用剂量和/或频率可增加。细胞通常通过静脉内注射或输注进行施用，尽管也可使用植入细胞(例如在器官植入位点附近)的方法。

合成ABCB5+干细胞可作为唯一的免疫调节剂或作为包括其他免疫调节剂的治疗计划的一部分施用于移植患者。例如，也可以给予患者：单克隆抗体或其他阻断CD40和CD40L之间相互作用的化合物；淋巴细胞活化和随后的增殖的抑制剂，例如环孢霉素(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)和雷帕霉素(rapamycin)；或者通过其他机制发挥作用的免疫抑制剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)或抗炎性化合物(例如肾上腺皮质类固醇，例如地塞米松(dexamethasone)和泼尼松龙(prednisolone))。

本发明的真皮合成ABCB5+干细胞也可用于治疗和预防自身免疫病。自身免疫病是一类这样的疾病，其中对象自身的抗体与宿主组织反应，或者其中免疫效应T细胞对内源性自身肽具有自身反应性并引起组织破坏。因此，针对对象的自身抗原(称为自体抗原)产生了免疫应答。自身免疫病包括但不限于类风湿性关节炎；克罗恩病(Crohn's disease)；多发性硬化；系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)；自身免疫性脑脊髓炎；重症肌无力(myasthenia gravis，MG)；桥本甲状腺炎(Hashimoto'sthyroiditis)；肺出血-肾炎综合征(Goodpasture's syndrome)；天疱疮(例如，寻常型天疱疮)；格雷夫斯病(Grave's disease)；自身免疫性溶血性贫血；自身免疫性血小板减少性紫癜；具有抗胶原蛋白抗体的硬皮病；混合性结缔组织病；多肌炎；恶性贫血；特发性艾迪生病(idiopathicAddison'sdisease)；自身免疫性相关不育；肾小球肾炎(例如，新月体性肾小球肾炎、增生性肾小球肾炎)；大疱性类天疱疮；干燥综合征(

syndrome)；胰岛素抵抗和自身免疫性糖尿病。本文使用的“自身抗原”指正常宿主组织的抗原。正常宿主组织不包括癌细胞。

自身免疫病的一个实例是抗肾小球基底膜(GBM)疾病。GBM疾病起因于直接针对IV型胶原3链的非胶原结构域1(3(IV)NC1)的自身免疫应答，并在患病患者中引起快速进展性肾小球肾炎(glomerulonephritis，GN)并最终引起肾功能衰竭。如以下实例中所述，已证明真皮合成ABCB5+干细胞在GBM模型中的有效性。识别3(IV)NC1的自身反应性抗体被认为是该疾病的标志。此外，3(IV)NC1自身反应性T辅助(T helper，Th)1介导的细胞免疫参与了其发病机制。通过使用含有重组3(IV)NC1(r3(IV)NC1)的抗原制备物进行免疫接种，可在易感小鼠品系中通过实验诱导抗GBM疾病，为研究对治疗性免疫调节的应答提供了有价值的疾病模型系统。抗原依赖性T细胞活化和由此产生的白介素2(IL-2)需要两种不同的信号：在遇到抗原时，初始T细胞(naive T cell)通过T细胞受体与抗原呈递细胞(antigenpresenting cell，APC)上的主要组织相容性复合体(Major HistocompatibilityComplex，MHC)加抗原肽复合体结合接收信号1，并通过导致完全激活的正共刺激途径接收信号2。最近证明了一种这样的正共刺激途径，即表达APC的CD40与其Th配体CD40L的相互作用，在实验性抗GBM自身免疫性GN疾病发展中的关键作用，并且发现CD40-CD40L途径阻断阻止自身免疫性自身免疫性GN的发展。另一方面，负T细胞共刺激信号的功能是下调免疫应答。调节性T细胞(TREG)和可溶性细胞因子中介物，例如白介素10和转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)家族的成员，也可减弱T细胞活化和免疫效应应答。

另一种自身免疫病是克罗恩病。已经进行了使用合成ABCB5+干细胞治疗克罗恩病的临床试验。克罗恩病是与肠道和胃肠道炎症相关的慢性病症。基于进行的试验，使用合成ABCB5+干细胞治疗克罗恩病显示很有希望。

当用于治疗自身免疫病时，合成ABCB5+干细胞将优选通过静脉内注射施用，且有效剂量将为减缓疾病进展或缓解与该疾病相关的一个或更多个症状所需的量。例如，在复发性多发性硬化的情况下，有效剂量应是至少降低发作频率或严重程度所需的剂量。在类风湿性关节炎的情况下，有效量将是至少降低患者经历的疼痛和炎症所需的细胞数量。细胞的单个单位剂量通常应在1×10⁷和1×10¹⁰个细胞之间，并且应按照主治医师确定适当的间隔(例如，每周、每月等)定期重复给药。

合成ABCB5+干细胞也用于治疗肝疾病。肝疾病包括例如导致损害肝组织的肝炎的疾病。更一般而言，本发明的合成ABCB5+干细胞可用于治疗肝疾病、障碍或病症，包括但不限于：酒精性肝病、肝炎(A、B、C、D等)、肝局灶性病变、原发性肝细胞癌、肝大囊性病变(large cystic lesions of the liver)、局灶性结节性增生肉芽肿性肝病(focalnodular hyperplasia granulomatous liver disease)、肝肉芽肿、血色素沉积症例如遗传性血色素沉积症、铁过载综合征、急性脂肪肝、妊娠恶阻、妊娠期并发肝病、肝内胆汁淤积、肝衰竭、暴发性肝衰竭、黄疸或无症状高胆红素血症、肝细胞损伤、Crigler-Najjar综合征、威尔逊氏症、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、吉尔伯特综合征、高胆红素血症、非酒精性脂肪性肝炎、卟啉症、非肝硬化门静脉高压症、非肝硬化门静脉高压症、门静脉纤维化、血吸虫病、原发性胆汁性肝硬化、Budd-Chiari综合征、骨髓移植后肝静脉闭塞症等。

身体上的的压力可触发成体干细胞转变为迁移到受损区域并帮助修复损伤的特化细胞。例如，受损的肝可向干细胞发送信号，干细胞通过为受损肝制造肝细胞来作出响应。(Journal of Clinical Investigation 2003July15；112(2):160-169)。

在一些实施方案中，本发明涉及使用真皮合成ABCB5+干细胞治疗神经退行性疾病。在一些情况下，本发明考虑治疗具有神经退行性疾病或对神经细胞有损伤(其可导致神经退行性变)的对象。神经细胞主要基于其局部/区域的突触连接(例如，局部回路中间神经元vs.远程投射神经元(longrange projection neuron))和受体组以及相关的第二信使系统来进行分类。神经细胞包括中枢神经系统(central nervous system，CNS)神经元和外周神经系统(peripheral nervous system，PNS)神经元二者。存在许多不同的神经元细胞类型。实例包括但不限于感觉和交感神经元、胆碱能神经元、背根神经节神经元、本体感觉神经元(三叉神经中脑核内)、睫状神经节神经元(副交感神经系统内)等。本领域普通技术人员将能够容易地鉴定神经元细胞并通常利用细胞形态特征、细胞特异性标志物的表达、特定分子的分泌等将其与非神经元细胞(例如胶质细胞)区分开来。

本文所定义的“神经退行性病症”或“神经退行性疾病”是指在周围神经系统中或中枢神经系统中发生神经元的进行性丧失的病症。神经退行性疾病的非限制性实例包括：(i)慢性神经退行性疾病，例如家族性和散发性肌萎缩侧索硬化症(分别为FALS和ALS)、家族性和散发性帕金森病、亨廷顿病、家族性和散发性阿尔茨海默病、多发性硬化、橄榄体脑桥小脑萎缩、多系统萎缩、进行性核上性麻痹、弥漫性路易体病、corticodentatonigral变性、进行性家族性肌阵挛性癫痫、纹状体黑质变性(strionigral degeneration)、扭转张力障碍、家族性震颤、唐氏综合征、抽动秽语综合征、哈勒沃登-施帕茨病、糖尿病周围神经病、拳击性痴呆、艾滋病痴呆、年龄相关性痴呆、年龄相关性记忆障碍和淀粉样变性相关神经退行性疾病，例如由与传染性海绵状脑病相关的朊蛋白(prion protein，PrP)引起的疾病(克罗伊茨费尔特-雅各布病、Gerstmann-Straussler-Scheinker综合征、羊瘙痒病和库鲁病)，以及由过量半胱氨酸蛋白酶抑制剂C积聚引起的疾病(遗传性半胱氨酸蛋白酶抑制剂C血管病)；以及(ii)急性神经退行性病症，例如创伤性脑损伤(例如手术相关脑损伤)，脑水肿，周围神经损伤，脊髓损伤，利氏病，格林-巴利综合征，溶酶体贮积症，例如脂褐质沉积症，阿尔珀斯病，CNS变性引起的眩晕；慢性酒精或药物滥用引起的病理学，包括例如蓝斑和小脑神经元变性；衰老引起的病理学，包括小脑神经元和皮质神经元的导致认知和运动损伤的变性；以及慢性苯丙胺滥用引起的病理学，包括基底神经节神经元的导致运动损伤的变性；局灶性创伤，例如卒中、局灶性缺血、血管功能不全、缺氧缺血性脑病、高血糖、低血糖或直接创伤引起的病理学变化；治疗性药物和治疗的负性副作用引起的病理学(例如，扣带回和内嗅皮质神经元响应于谷氨酸受体NMDA类拮抗剂的抗惊厥剂量的变性)，以及韦尼克-科尔萨科夫相关痴呆。影响感觉神经元的神经退行性疾病包括弗里德里希共济失调、糖尿病、周围神经病变和视网膜神经元变性。边缘和皮质系统的神经退行性疾病包括脑淀粉样变性、Pick萎缩和Retts综合征。上述实例不意味着是全面的，而仅用作术语“神经退行性病症”或“神经退行性疾病”的说明。

大多数的慢性神经退行性疾病通常发生在中年时期并导致神经系统内特定的神经元亚群的快速退行性变，最终导致过早死亡。包含真皮合成ABCB5+干细胞的组合物可单独施用于对象或者与治疗或预防这些病症或疾病的其他治疗化合物组合施用于对象以治疗神经退行性疾病。这些药物的许多为本领域所知。例如，抗帕金森病药剂包括但不限于甲磺酸苯扎托品(Benztropine Mesylate)、比哌立登(Biperiden)、盐酸比哌立登(BiperidenHydrochloride)、乳酸比哌立登(Biperiden Lactate)、卡金刚酸(Carmantadine)、盐酸西拉多巴(Ciladopa Hydrochloride)；多巴金刚(Dopamantine)；盐酸普罗吩胺(Ethopropazine Hydrochloride)；拉扎贝胺(Lazabemide)；左旋多巴(Levodopa)；盐酸洛美曲林(Lometraline Hydrochloride)；盐酸莫非吉兰(Mofegiline Hydrochloride)；盐酸那高利特(Naxagolide Hydrochloride)；硫酸帕立太特(Pareptide Sulfate)；盐酸丙环定(Procyclidine Hydrochloride)；盐酸喹洛雷(Quinelorane Hydrochloride)；盐酸罗匹尼罗(Ropinirole Hydrochloride)；盐酸司来吉兰(Selegiline Hydrochloride)；托卡朋(Tolcapone)；盐酸苯海索(Trihexyphenidyl Hydrochloride)。用于治疗肌萎缩侧索硬化症的药物包括但不限于利鲁唑(Riluzole)。用于治疗佩吉特氏病(Paget's disease)的药物包括但不限于替鲁膦酸二钠(Tiludronate Disodium)。

已经描述了成体干细胞在治疗神经退行性疾病中的效用。已经表明，在经历了卒中的小鼠中，合成ABCB5+干细胞可转变为神经元样细胞。Journal of CellTransplantation第12卷,pp.201-213,2003。另外，来源于骨髓的干细胞发展成有望用于治疗患有帕金森病、肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)和脊椎损伤的患者的神经细胞。

本发明的方法也可用于治疗与肾病相关的病症。已表明，先前注射到肾脏的合成ABCB5+干细胞导致几乎立即改善肾功能和细胞更新。Resnick,Mayer,Stem Cells BringsFast Direct Improvement,Without Differentiation,in Acute Renal Failure,EurekAlert！,August 15,2005。因此，本发明的真皮合成ABCB5+干细胞可单独或与其他治疗或程序(例如透析)组合施用于患有肾病的患者以改善肾功能和细胞更新。

根据本发明的方法可治疗的其他疾病包括角膜和肺疾病。基于将合成ABCB5+干细胞施用于这些组织的治疗表现出了积极的结果。例如，已将人合成ABCB5+干细胞用于重建受损的角膜。Ma Y et al,Stem Cells,August 18,2005。此外，已发现来源于骨髓的干细胞对肺修复和针对肺损伤进行保护是重要的。Rojas,Mauricio,et al.,American Journalof Respiratory Cell and Molecular Biology,第33卷,pp.145-152,May 12,2005。因此，本发明的真皮合成ABCB5+干细胞也可用于角膜组织或肺组织的修复。

来自例如骨髓的来源的合成ABCB5+干细胞也被用于治疗心血管疾病的治疗。骨髓干细胞可通过帮助心脏发育新的、功能性组织来帮助修复受损的心肌。Goodell MA,Jackson KA,Majka SM,Mi T,Wang H,Pocius J,Hartley CJ,Majesky MW,Entman ML,Michael LH,Hirschi KK.Stem cell plasticity in muscle and bone marrow.Ann N YAcad Sci.2001Jun；938:208-18。在心肌梗死后将骨髓干细胞放置在受损的心脏中可使心脏的泵送能力提高80％。Nature Medicine Journal September 2003第9卷no.9:1195-1201。

心血管疾病是指涉及心脏和/或血管的疾病类型。虽然该术语在技术上指影响心脏和/或血管的疾病，但其他器官，例如如肺和关节可能会受到影响或参与该疾病。心血管疾病的实例包括但不限于动脉粥样硬化、动脉硬化、动脉瘤、心绞痛、慢性稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、心肌缺血(myocardial ischemia，MI)、急性冠状动脉综合征、冠心病、卒中、冠状动脉再狭窄、冠状动脉支架再狭窄、冠状动脉支架再血栓形成、血运重建、心肌梗死(myocardial infarction，MI)后重塑(例如MI后左心室重塑)，MI后左心室肥大、血管成形术、短暂性脑缺血发作、肺栓塞、血管闭塞、静脉栓塞形成、心律失常、心肌病、充血性心力衰竭、先天性心脏病、心肌炎、瓣膜病、扩张型心肌病、舒张功能障碍、心内膜炎、风湿热、高血压(高血压)、肥厚型心肌病、动脉瘤和二尖瓣脱垂。

动脉粥样硬化是大和中型肌肉动脉疾病，其特征是内皮功能障碍、血管炎症以及血管壁内膜层内脂质、胆固醇、钙和/或细胞碎片的堆积。这种堆积导致斑块(粥样斑块)形成、血管重塑、急性和慢性腔闭塞、血流异常和靶器官供氧减少。

动脉粥样硬化可引起两个主要问题：首先，粥样斑块可导致斑块破裂和动脉狭窄(变窄)，因此导致其供血的器官供血不足。或者导致动脉瘤。这些并发症是慢性的、进展缓慢的和累积的。最常见的是斑块突然破裂(“易损斑块”)引起血栓形成，血栓将迅速减慢或停止血流(例如，几分钟)导致由动脉供血的组织的终结(death)。这种事件称为梗死形成。最常见的公认情况之一称为冠状动脉的冠状动脉血栓形成，引起心肌梗死(MI)(通常称为心脏病发作)。另一种非常严重疾病的常见情况是来自腿部供血不足的跛行，通常由于狭窄和动脉瘤节段因凝块而变窄二者的结合。由于动脉粥样硬化是全身性过程，类似事件也发生在通往脑、肠、肾、腿等的动脉中。

动脉粥样硬化可开始于青春期，通常见于大多数主要动脉，但无症状，且在一生中大多数诊断方法都无法检测到。当干扰供应心脏的冠状动脉循环或供应脑的脑循环时，它最通常成为严重症状，并被认为是卒中、心脏病发作、多种心脏疾病(通常包括充血性心力衰竭和大多数心血管疾病)的重要潜在原因。尽管身体中的任何动脉都可能被波及，但通常只有一些动脉严重狭窄或闭塞，那些供应更重要器官的动脉被识别。闭塞供应心肌的动脉闭塞导致心脏病发作。供应脑的动脉闭塞导致卒中。手臂或腿部动脉中的粥样斑块产生减少的血流，引起周围动脉闭塞性病(PAOD)。

心脏压力测试是血流限制最常用的非侵入性测试方法之一。它通常检测到约75％或更大的管腔狭窄。通过血管造影可检测到严重狭窄的区域，并且通常在较小程度上进行“压力测试”长期以来一直是心血管疾病的人诊断技术的重点。大多数严重事件发生在具有重斑块(heavy plaque)的部位。斑块破裂可导致动脉管腔在几秒钟到几分钟内闭塞，并可能导致永久性组织损伤，有时导致猝死。

已知动脉粥样硬化的多种解剖学、生理学和行为学风险因素。这些风险因素包括高龄；男性性别；糖尿病；血脂异常(血清胆固醇或甘油三酯水平提高)；低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein，LDL，“坏胆固醇”)、脂蛋白(a)(LDL的变体)和/或极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)颗粒的高血清浓度；功能性高密度脂蛋白(highdensity lipoprotein，HDL，“好胆固醇”)颗粒的低血清浓度；吸烟；高血压；肥胖(例如，向心性肥胖，也称为腹型或男性型肥胖)；心血管疾病(例如冠心病或卒中)家族史；炎症标志物(例如C反应性蛋白(CRP或hs-CRP)、sCD40L、sICAM等)水平提高；同型半胱氨酸的血清水平提高；尿酸的血清水平提高和血清纤维蛋白原浓度提高。

术语心肌梗死(MI)来源于心肌(心脏肌肉)和梗死(因缺氧导致的组织死亡)。MI是发生于当向心脏的一部分的供血中断时的疾病状态。急性MI(AMI)是一类急性冠状动脉综合征，最常见(但不总是)为冠状动脉疾病的表现。最常见的触发事件是心外膜冠状动脉动脉粥样硬化斑块破裂，导致凝血级联，有时导致动脉完全闭塞。由此产生的缺血或氧不足引起心脏组织损伤和潜在终结。

MI或AMI的重要危险因素包括血管疾病的既往史例如动脉粥样硬化性冠心病和/或心绞痛的既往史、既往心脏病发作或卒中、心律失常或晕厥的任何既往发作、较年长的年龄(例如，40岁以上男性和50岁以上女性)、吸烟、过量饮酒、高甘油三酯水平、高LDL(“低密度脂蛋白”)和低HDL(“高密度脂蛋白”)、糖尿病、高血压、肥胖和应激。

MI或AMI的症状包括胸痛、呼吸急促、恶心、呕吐、心悸、出汗、和焦虑或大难临头感(feeling of impending doom)。对象经常突然感到不适。大约所有心肌梗死的三分之一是无症状的(silent)，无胸痛或其他症状。

怀疑患有MI的对象接受多项诊断测试，例如心电图(ECG、EKG)、胸部X光和血液测试，以检测肌酸激酶(creatine kinase，CK)或肌钙蛋白水平(由受损组织，尤其是心肌释放的标志物)提高。冠状动脉血管造影术允许可视化心脏血管的狭窄或闭塞。

心肌梗死引起心肌细胞不可逆的丢失，导致不能促进心脏功能的薄纤维化瘢痕。干细胞治疗为治疗心肌梗死后心力衰竭以及与重塑相关的动脉粥样硬化提供了可能的方法。干细胞治疗的基本概念是通过将未成熟的心肌细胞直接注射到受损心脏的壁中来增加功能性心肌细胞的数量。心肌梗死导致心肌细胞损失，随后是病理性重塑并进展为心力衰竭。干细胞治疗的一个目标是替换缺血后损失的心肌细胞，诱导损伤区域的血运重建。另一个目标是防止心肌梗死后有害的并与动脉粥样硬化相关的病理学重塑。自体或同种异体合成ABCB5+干细胞被认为是干细胞治疗的潜在细胞来源之一。因此，本发明的真皮合成ABCB5+干细胞可用于治疗心血管疾病。

本发明的真皮合成ABCB5+干细胞的另一用途是在组织再生方面。在本发明的这一方面中，使用ABCB5阳性细胞以通过诱导分化来产生组织。分离且纯化的合成ABCB5+干细胞经过在特定培养基中的有丝分裂扩增可以以未分化状态生长。然后可收获这些细胞并可通过大量因素(包括机械刺激、细胞刺激及生物化学刺激)将其活化以分化成骨、软骨以及多种其他类型的结缔组织。人合成ABCB5+干细胞具有分化成细胞(例如成骨细胞和软骨细胞)的潜力，其可产生广泛多种间充质组织细胞以及腱、韧带和真皮，并且为了在培养时扩增多个细胞群，分离后仍保留该潜力。因此，通过能够分离、纯化、大量扩增及随后活化合成ABCB5+干细胞以分化为所需的特定类型间充质细胞，例如骨骼组织和结缔组织(例如骨、软骨、腱、韧带、肌肉和脂肪)，存在治疗骨骼和另一些结缔组织病症的方法。本文使用的术语结缔组织包括支持特定要素的身体组织，并且包括骨、软骨、韧带、腱、基质、肌肉和脂肪组织。

本发明的方法和装置利用分离的真皮间充质祖细胞，其在特定条件下可被诱导分化成并产生不同类型的所需结缔组织，例如分化成骨或软骨形成细胞。

在另一方面中，本发明涉及用于修复结缔组织损伤的方法。所述方法包括步骤：在适于将真皮间充质干细胞分化为修复所需的结缔组织类型的条件下，将该细胞施加于结缔组织损伤区域。

术语“结缔组织缺陷”是指包括与正常结缔组织相比，由于创伤、疾病、年龄、出生缺陷、手术干预等而可能发生的任何损伤或失调(irregularity)的缺陷。结缔组织缺陷也指其中仅需要骨形成(例如，用于美容填充)的非受损区域。

真皮合成ABCB5+干细胞可通过任何已知的施用模式直接施用于对象，或可接种在基质或植入物上。基质或植入物包括聚合物基质，例如基于纤维或水凝胶的装置。当合成ABCB5+干细胞分化为软骨或骨时，通常使用两种类型的基质来支持它们。基质的一种形式是聚合物网或海绵；另一种是聚合物水凝胶。基质可以是生物可降解的或生物不可降解的。如本文所用，术语生物可降解意指一旦暴露于温度在约25℃和38℃之间的pH值6至8的生理溶液中，聚合物就会在期望应用中可接受的时间段内(小于约六个月，最优选小于约十二周)溶解或降解。基质可在一段时间内(例如，小于一年，更优选小于六个月，最优选在两至十周内)生物降解。

纤维基质可使用可商购材料制造或构建。基质通常由天然或合成的聚合物形成。优选生物可降解聚合物，以使新形成的软骨可在滑膜关节处的承重下保持自身和功能正常。在一至二十四周内降解的聚合物是优选的。合成的聚合物是优选的，因为它们的降解率可以更准确地测定，并且它们比天然聚合物具有更多的批次间一致性和更少的免疫原性。可使用的天然聚合物包括例如胶原蛋白、白蛋白和纤维蛋白的蛋白质；以及例如藻酸盐和透明质酸聚合物的多糖。合成的聚合物包括生物可降解和生物不可降解聚合物二者。生物可降解聚合物的实例包括羟基酸的聚合物，例如聚乳酸(polylactic acid，PLA)、聚乙醇酸(polyglycolic acid，PGA)和聚乳酸-乙醇酸(polylactic acid-glycolic acid，PLGA)、聚原酸酯类、聚酸酐类、聚磷腈类及其组合。生物不可降解聚合物包括聚丙烯酸酯类、聚甲基丙烯酸酯类、乙烯乙酸乙烯酯和聚乙烯醇类。这些应被避免，因为它们在软骨中的存在将不可避免地导致软骨的机械损伤和破坏。

在一些实施方案中，聚合物形成缠绕、编织或网状的纤维，以形成间隙间距在100至300微米之间的基质。可使用的聚乙醇酸网可从手术供应公司，例如Ethicon，N.J获得。也可使用海绵。如本文所用，术语“纤维”指缠绕、编织或网状的基质或者海绵基质。

将基质优选成形以填充缺陷。在大多数情况下，这可通过用剪刀或小刀修剪聚合物纤维来实现；或者，可从通过加热或在挥发性溶剂中溶解形成的聚合物溶液浇铸基质。

通过将细胞悬液施加到基质来将合成ABCB5+干细胞接种到基质上。这可通过将基质浸泡在细胞培养容器中、或者将细胞注射或另外直接施加到基质来实现。

使用标准的手术技术将接种有细胞的基质植入缺陷部位。基质可在植入前接种和在体外培养，接种并立即植入，或植入后再接种细胞。在一些优选实施方案中，将细胞接种到基质上和基质中，并在体外培养约16小时至两周。将细胞附着在基质上是唯一重要的。两周是细胞培养的优选时间，尽管时间可以更长。接种或植入时的细胞密度应为约25,000个细胞/mm³。

可形成离子或可延展共价交联水凝胶的聚合物用于包封细胞。例如，水凝胶通过使聚合物例如藻酸(从海藻中分离的碳水化合物聚合物)的阴离子盐与钙阳离子交联来制备，其强度随着钙离子或藻酸盐浓度的提高而提高。将藻酸盐溶液与待植入的细胞混合以形成藻酸盐混悬液。然后，在混悬液硬化之前，将混悬液直接注射到患者中。然后，由于体内存在生理浓度的钙离子，混悬液在短时间内硬化。

与细胞混合以植入体内的聚合物材料应形成水凝胶。水凝胶被定义为是当有机聚合物(天然或合成的)通过共价键、离子键或氢键交联以形成三维开放晶格结构(其捕获水分子以形成凝胶)时形成的物质。可用于形成水凝胶的材料的实例包括多糖，例如离子交联的藻酸盐、聚磷嗪和聚丙烯酸酯，或分别通过温度或pH交联的嵌段共聚物，例如Pluronics.TM.或Tetronics.TM.、聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物。其他材料包括蛋白质例如纤维蛋白，聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸和胶原蛋白。

一般而言，这些聚合物至少部分可溶于水溶液，例如水、缓冲盐溶液或具有带电荷侧基的水性醇溶液，或者其单价离子盐。可与阳离子反应的具有酸性侧基的聚合物的实例为聚(磷腈)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(乙酸乙烯酯)和磺化聚合物，例如磺化聚苯乙烯。也可使用具有由丙烯酸或甲基丙烯酸与乙烯基醚单体或聚合物反应形成的酸性侧基的共聚物。酸性基团的实例为羧酸基团、磺酸基团、卤代(优选氟代)醇基团、酚OH基团和酸性OH基团。

具有可与阴离子反应的碱性侧基的聚合物的实例为聚(乙烯基胺)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基咪唑)和一些亚氨基取代的聚磷腈类。聚合物的铵盐或季盐也可由骨架氮或侧链亚氨基形成。碱性侧基的实例是氨基和亚氨基。

藻酸盐可在室温下在水中与二价阳离子离子交联形成水凝胶基质。由于这些温和的条件，藻酸盐已成为杂交瘤细胞包封最常用的聚合物，如例如美国专利No.4,352,883至Lim中所述。在Lim过程中，将含有待包封生物材料的水性溶液悬浮在水溶性聚合物溶液中，将混悬液形成液滴，通过与多价阳离子接触将液滴配置成分离的微胶囊，然后，微胶囊的表面与聚氨基酸交联，以在包封材料周围形成半透膜。

聚磷腈类是骨架由氮和磷组成并通过交替的单键和双键分开的聚合物。适于交联的聚磷腈类具有大多数为酸性并且能够与二价或三价阳离子形成盐桥的侧链基团。优选的酸性侧基的实例为羧酸基和磺酸基。可通过并入具有咪唑、氨基酸酯或甘油侧基的单体来合成通过水解降解的聚合物。例如，可合成聚阴离子聚[双(羧基苯氧基)]磷腈(PCPP)，其在室温或更低温度下与水性介质中溶解的多价阳离子交联以形成水凝胶基质。

通过将具有带电荷侧基的水溶性聚合物与含有相反电荷的多价离子(如果该聚合物具有酸性侧基，则为多价阳离子；或如果该聚合物具有碱性侧基，则为多价阴离子)的水性溶液反应而使所述水溶性聚合物进行离子交联。用于交联具有酸性侧基的聚合物以形成水凝胶的优选阳离子为二价和三价阳离子，例如铜、钙、铝、镁、锶、钡、锌和锡，尽管二、三或四官能有机阳离子例如烷基铵盐。将这些阳离子的盐的水性溶液添加至聚合物，形成柔软、高度膨胀的水凝胶和膜。阳离子浓度越高或价态越高，聚合物的交联程度越高。已证明从低至0.005M的浓度起交联聚合物。较高的浓度受盐的溶解度限制。

优选地，将聚合物溶解在水性溶液中，优选生理pH下的0.1M磷酸钾溶液，至形成聚合物水凝胶的浓度，例如对于藻酸盐在以重量计0.5％至2％之间，优选1％藻酸盐。使经分离的细胞悬浮在聚合物溶液中，至100万至1000万细胞/ml，最优选1000万至2000万细胞/ml的浓度。

在一个实施方案中，在水凝胶硬化之前，将细胞与水凝胶溶液混合，并直接注射到期望植入该细胞的位点。然而，也可将基质模制并植入身体的一个或更多个不同区域以适合特定应用。当期望特定的结构设计或当细胞待植入的区域缺乏促进细胞生长和增殖的特定结构或支持物时，该应用特别相关。

细胞待植入的一个或更多个位点基于个体需要确定，细胞的必要数量也是如此。也可应用外部模具来塑造注射溶液的形状。此外，通过控制聚合速率，可以模制细胞-水凝胶注射植入物。

或者，可将混合物注射入模具，使水凝胶硬化，然后植入材料。

混悬液可通过注射器和针直接注射到需要填充剂的任何特定区域，尤其是软组织缺陷处。混悬液也可作为填充剂注射用于硬组织缺陷，例如骨或软骨缺陷，所述缺陷是先天性或获得性疾病状态，或者继发于创伤、烧伤等。这方面的一个实例是注射到存在继发于创伤的骨畸形的颅骨周围的区域。在这些情况下，可在局部或全身麻醉下，使用针和注射器直接注射到所需区域。

可对真皮合成ABCB5+干细胞进行修饰以表达也可用于治疗适应症的蛋白质，如下文中更详细的描述。例如，细胞可包含产生至少一种生物活性因子的核酸，所述生物活性因子进一步诱导或加速合成ABCB5+干细胞分化为已分化的谱系。在正在形成骨的情况下，生物活性因子可为包括多种组织生长因子的TGF-β超家族的成员，特别是骨形态发生蛋白，例如选自BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6和BMP-7的至少一种。

本发明的细胞可用于体外诱导T细胞失能(anergy)的方法。T细胞失能的诱导涉及在抗原存在下，在足以诱导T细胞和/或T细胞祖细胞的形成并抑制形成的T细胞和/或T细胞祖细胞的活化的条件下培养真皮合成ABCB5+干细胞。失能被定义为T细胞的无应答状态(即它们在再刺激时不能产生IL-2，或在再刺激时不能增殖)(Zamoyska R,Curr OpinImmunol,1998,10(1):82-87；Van Parijs L,et al.,Science,1998,280(5361):243-248；Schwartz RH,Curr Opin Immunol,1997,9(3):351-357；Immunol Rev,1993,133:151-76)。失能可以通过获取经处理的T细胞并在存在APC的情况下用抗原再刺激它们来衡量。如果细胞是失能的，在APC的情况下，它们不会对适当浓度的抗原应答。

如本文所述，对象是人、非人灵长类、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿动物。人真皮合成ABCB5+干细胞和人对象是特别重要的实施方案。

在本文所述的本发明的另一方面中，合成ABCB5+干细胞可用目标基因进行遗传性改造(或转导或转染)。经转导的细胞可施用于有此需要的患者，例如用于治疗遗传性病症或疾病。

合成ABCB5+干细胞及其后代可被遗传性改变。合成ABCB5+干细胞的遗传改变包括通过添加外源性遗传物质而产生的细胞遗传物质的所有瞬时和稳定变化。遗传改变的实例包括任何基因治疗程序，例如引入功能性基因以替换突变或非表达基因，引入编码显性负基因产物的载体，引入经改造以表达核酶的载体，和引入编码治疗性基因产物的基因。天然遗传变化，例如不引入任何物质的T细胞受体基因的自发重排不包括在这个概念中。外源性遗传物质包括天然或合成的核酸或寡核苷酸，它们被引入真皮合成ABCB5+干细胞中。外源性遗传物质可能是细胞中天然存在的物质的拷贝物，也可能不是细胞中发现的天然的物质。它通常是已置于载体构建体中启动子的可操作控制下的天然存在的基因的至少一部分。

多种技术可用于将核酸引入细胞中。这样的技术包括核酸-CaPO₄沉淀的转染、与DEAE关联的核酸的转染、用包含目的核酸之逆转录病毒的转染，脂质体介导的转染等。对于某些用途，优选将核酸靶向特定细胞。在这些情况下，根据本发明，用于将核酸递送到细胞中的载体(例如逆转录病毒或其他病毒、脂质体)可具有附着在其上的靶向分子。例如，可将分子(例如靶细胞上对表面膜蛋白质特异的抗体或靶细胞上受体的配体)结合到或整合入核酸递送载剂。例如，当使用脂质体递送本发明的核酸时，与和内吞作用相关的表面膜蛋白质结合的蛋白质可被整合入脂质体制备物中，以靶向和/或促进摄取。这样的蛋白质包括对特定细胞类型具有向性的蛋白质或其片段、针对在循环中经历内化的蛋白质的抗体、靶向细胞内定位并提高细胞内半衰期的蛋白质等。如本领域技术人员所知，聚合物递送系统也已成功用于将核酸递送到细胞中。这样的系统甚至允许经口递送核酸。

将外源性遗传物质引入真皮合成ABCB5+干细胞中的一种方法为通过使用复制缺陷型逆转录病毒对细胞进行转导。复制缺陷型逆转录病毒能够指导合成所有病毒体蛋白质，但是不能产生感染性颗粒。因此，这些遗传改变的逆转录病毒载体对于培养的细胞中的高效基因转导具有一般性效用。逆转录病毒已被广泛用于将遗传物质转移到细胞中。本领域提供了用于产生复制缺陷型逆转录病毒的标准方案(包括以下步骤：将外源遗传物质并入质粒中，用所述质粒转染包装细胞系，通过所述包装细胞系产生重组逆转录病毒，从组织培养基收集病毒颗粒以及用所述病毒颗粒感染靶细胞)。

使用逆转录病毒的主要优势在于病毒有效地将编码治疗剂的基因的单拷贝插入到宿主细胞基因组中，从而允许在细胞分裂时将外源性遗传物质递送给细胞后代。另外，已报道在LTR区中的基因启动子序列增强多种细胞类型中插入的编码序列的表达。使用逆转录病毒表达载体的主要缺点是(1)插入诱变，即将治疗基因插入靶细胞基因组的非期望位置中，这例如导致未调节的细胞生长以及(2)为使载体携带的治疗基因整合入靶基因组需要靶细胞增殖。尽管存在这些明显的局限性，如果转导效率高和/或可用于转导的靶细胞数目多，则通过逆转录病毒递送治疗有效量的治疗剂可以有效。

可用作真皮合成ABCB5+干细胞转化的表达载体的另一种病毒候选物为腺病毒，其是一种双链DNA病毒。与逆转录病毒一样，腺病毒基因组适合用作基因转导的表达载体，即通过除去控制病毒自身产生的遗传信息。因为腺病毒通常以染色体外方式发挥作用，所以重组腺病毒没有插入诱变的理论问题。另一方面，靶标真皮间充质干细胞的腺病毒转化不能产生稳定转导。然而，最近有报道称某些腺病毒序列赋予对载体序列的染色体内整合特异性，从而产生外源遗传物质的稳定转导。

因此，对于本领域普通技术人员明显的是，多种合适的载体可用于将外源性遗传物质转移到真皮合成ABCB5+干细胞中。对在适合于基因替代治疗的特定条件下递送治疗剂的合适载体的选择和将所选择的表达载体插入细胞中的条件的优化在本领域普通技术人员的技术范围内，无需过度实验。启动子典型地具有引发转录所需的特定核苷酸序列。任选地，外源性遗传物质还包括获得期望基因转录活性所需的另外序列(即增强子)。对于本讨论的目的，“增强子”简单地说是与编码序列(顺式)连续操作以改变启动子指示的基础转录水平的任何非翻译DNA序列。优选地，将外源性遗传物质引入启动子紧接下游的真皮间充质干细胞基因组中，以使启动子和编码序列有效连接以允许编码序列的转录。优选的逆转录病毒表达载体包括用于控制插入的外源性基因转录的外源性启动子元件。这种外源性启动子包括组成型启动子和诱导型启动子二者。

天然存在的组成型启动子控制基本细胞功能的表达。因此，在组成型启动子控制下的基因在所有细胞生长条件下都表达。示例性组成型启动子包括编码某些组成型或“持家”功能的以下基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthinephosphoribosyl transferase，HPRT)、二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)(Scharfmann et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4626-4630(1991))、腺苷脱氨酶、磷酸甘油激酶(phosphoglycerol kinase，PGK)，丙酮酸激酶、磷酸甘油变位酶、肌动蛋白启动子(Lai et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10006-10010(1989))，以及本领域技术人员已知的其他组成型启动子。此外，许多病毒启动子在真核细胞中组成性地作用。这些包括：SV40的早期和晚期启动子；Moloney白血病病毒和其他逆转录病毒的长末端重复(longterminal repeat，LTR)；以及单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子等。因此，任何上文引用的组成型启动子可用于控制异源基因插入物的转录。

在诱导型启动子控制下的基因仅在或在更大程度上在存在诱导剂的情况下表达(例如，在金属硫蛋白启动子控制下的转录在存在某些金属离子的情况下大大增加)。诱导型启动子包括当其诱导因子结合时刺激转录的响应性元件(responsive element，RE)。例如，有血清因子、类固醇激素、视黄酸和环AMP的RE。可选择含有特定RE的启动子以获得可诱导响应，并且在某些情况下，可将RE本身与不同的启动子连接，从而赋予重组基因以可诱导性。因此，通过选择适当的启动子(组成型启动子与诱导型启动子；强启动子与弱启动子)，可控制经遗传修饰的真皮间充质干细胞中治疗剂的存在和表达水平二者。考虑到上文公开的因素和对象的临床表现，将这些用于递送治疗有效剂量的特定治疗剂的因素的选择和优化视为在本领域普通技术人员的范围内，而无需过度实验。

除了至少一个启动子和至少一种编码治疗剂的异源核酸外，表达载体优选包括选择基因，例如新霉素抗性基因，用于促进选择已用表达载体转染或转导的真皮合成ABCB5+干细胞。或者，用两种或更多种表达载体转染真皮合成ABCB5+干细胞，至少一个载体含有编码治疗剂的基因，其他载体含有选择基因。合适的启动子、增强子、选择基因和/或信号序列的选择被视为在本领域普通技术人员的范围内，而无需过度实验。

用于在分离的真皮间充质干细胞中表达特定基因产物的特定表达载体的选择和优化通过以下来实现：获得基因，优选具有一个或更多个适当的控制区域(例如，启动子、插入序列)的基因；制备包含插入该基因的载体的载体构建体；用该载体构建体体外转染或转导经培养的真皮合成ABCB5+干细胞；以及确定该基因产物是否存在于该经培养的细胞中。

因此，本发明使得以真皮合成ABCB5+干细胞产生不通常在人干细胞中以生物学显著量产生或少量产生(然而在过度产生会导致治疗益处的情况中)的多肽、激素和蛋白质的方式对真皮合成ABCB5+干细胞进行遗传改造成为可能。这些产物将被分泌到血流或身体的其他区域(例如中枢神经系统)中。以这种方式形成的人干细胞可以作为持续的药物递送系统以取代目前需要定期施用(通过摄入、注射、贮存输注(depot infusion)等)所需物质的方案。本发明适用于为需要这些物质的人提供激素、酶和药物。它对提供这样的需要长时间持续剂量的物质例如激素(例如甲状旁腺素、胰岛素)特别有价值。

例如，它可用于提供胰岛素的连续递送，并因此不需要每天注射胰岛素。经遗传改造的人合成ABCB5+干细胞也可用于产生凝血因子，例如因子VIII，或用于对肌营养不良的肌细胞连续递送抗肌萎缩蛋白。

将目标遗传物质引入真皮合成ABCB5+干细胞在治疗遗传性和获得性疾病方面特别有价值。在遗传性疾病的情况下，该方法用于提供经遗传性修饰的人合成ABCB5+干细胞和其他可用作代谢库的细胞。也就是说，这样的真皮合成ABCB5+干细胞将用于降解潜在的有毒物质。例如，这可用于治疗氨基酸分解代谢病症，包括由于苯丙氨酸羟化酶缺陷引起的高苯丙氨酸血症；由于胱硫醚β合酶的缺陷引起的高同型半胱氨酸血症。

本发明的应用不限于在以下描述中阐述的或附图中举例说明的组分之构造和布置的细节。本发明可以是另一些实施方案，并且能够以多种方式实践或实施。此外，本文所使用的措辞和术语是为了描述的目的，而不应被视为是限制性的。在本文中使用“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变型意指涵盖其后列出的项目及其等同内容和另外的项目。

实施例

在此报道了新鉴定的表达ATP结合盒亚家族B成员5(ABCB5)的真皮细胞亚群用于治疗不愈合伤口的有益效果。在模拟人静脉腿溃疡不愈合状态的铁过载小鼠模型中，局部施用真皮ABCB5⁺来源的MSC减轻了巨噬细胞主导的炎症，从而加速了全厚度切除伤口的愈合。观察到的有益效果是由于ABCB5⁺来源的MSC分泌的白介素-1受体拮抗剂(IL-1RA)，其抑制炎症，并在伤口部位处将不受限制的促炎性M1巨噬细胞的流行转向促进修复的抗炎性M2巨噬细胞。ABCB5⁺来源的MSC释放的IL-1RA对人伤口巨噬细胞的有益抗炎效果在人源化NOD-scid IL2rγ^null小鼠中是保守的。总之，人真皮ABCB5⁺细胞代表了新的、易获得且富含标志物的MSC来源，它有望成功治疗人中的慢性不愈合伤口。

单一分子标志物ATP结合盒蛋白ABCB5可用于从其内源性生态位分离具有多能间充质基质细胞(MSC)特征的皮肤的真皮细胞亚群。ABCB5⁺MSC在大规模体外扩增培养期间保持其大部分干细胞特性和间充质标志物，以及克隆自我更新的能力，重要的是，促进鼠模型中不愈合铁过载伤口的愈合，这可被用作用于治疗人患者中的慢性静脉腿溃疡的潜在的再生治疗。

人和鼠真皮在血管周生态位和滤泡间生态位中含有ABCB5⁺基质细胞

利用健康人皮肤切片的免疫染色，表明了ABCB5⁺细胞共染色碳水化合物阶段特异性胚胎抗原-4(stage-specific embryonic antigen-4，SSEA-4)，这是一种胚胎胚芽和干细胞标志物[10]，早期报道其在不同成体组织(包括真皮)的MSC上表达[11、12、13]。

令人感兴趣的是，ABCB5⁺细胞局限于血管周的内源性生态位，与CD31+内皮细胞密切缔合，或分散在独立于毛囊的滤泡间真皮内。ABCB5⁺细胞占十个不同供体的皮肤中所有真皮细胞的2.45％±0.61％，并且ABCB5⁺细胞的55.3％±23.9％位于血管周，这被定义为在CD31+内皮细胞和ABCB5⁺细胞之间最多有一种另外的细胞。血管周ABCB5⁺细胞不同于神经/胶质抗原2(NG2)阳性周细胞[14]，因为在双重免疫染色的人皮肤切片中，NG2与ABCB5几乎没有共定位。在鼠皮肤中发现ABCB5⁺细胞在其内源性生态位中的类似分布。

此外，来自富含ABCB5⁺的MSC的RNAseq分析——甚至当在培养中扩增到高传代数——揭示了不同的干细胞特性以及间充质标志物基因的表达。此外，通过免疫染色，在蛋白质水平上证实了在人皮肤中的ABCB5⁺细胞中的所选干细胞特性标志物例如SSEA-4、DPP4(CD26)、PRDM1(BLIMP1)和POU5F1(OCT-4)的表达。而在人皮肤的ABCB5⁺细胞中，较低成纤维细胞谱系标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达缺失。这些结果共同支持ABCB5⁺细胞的干细胞特性，其至少在体外部分维持，并且可治疗性地用于治疗不愈合伤口。

人真皮ABCB5细胞揭示间充质干细胞特性

为了评估ABCB5的选择是否导致具有MSC特性的细胞级分，通过多轮ABCB5磁珠分选来分离来源于经酶消化的皮肤的真皮单一细胞悬液。这导致了两种不同的细胞级分，一种是含有平均98.33％±1.12％ABCB5⁺细胞的双倍ABCB5富集级分，另一种是三倍ABCB5^-耗竭级分，其仅含有非常低百分比的ABCB5⁺细胞，如来自供体B01的细胞流式细胞术点图所示(表1A至B)。ABCB5⁺和ABCB5^-级分均展示成纤维样、梭形细胞形态，并表达特征性的最小组的间充质谱系标志物CD90、CD105和CD73，而通过流式细胞术未检测到造血干细胞和谱系标志物CD34、CD14、CD20和CD45[15]的表达。与供体匹配的ABCB5耗竭的细胞相比，观察到ABCB5⁺细胞的成脂、成骨和成软骨谱系分化潜力一致且显著的增加，从而将ABCB5⁺级分描绘为来自ABCB5-人真皮成纤维细胞(human dermal fibroblast，HDF)的多能成体MSC。ABCB5⁺分选的细胞导致单细胞来源的集落，而ABCB5耗竭的级分则没有的这一发现进一步证实了这一点。为了评估真皮ABCB5⁺来源的MSC的体外自我更新能力，确定了来自6个不同供体的ABCB5⁺分选的MSC的54个克隆培养物的亚克隆形成生长和三谱系分化潜能。令人感兴趣的是，75.61％±16.86％的克隆集落再次展示克隆形成生长，且62.40％±7.54％的所有研究的克隆由单个细胞产生，并保持其分化为所有三种间充质细胞谱系的潜力。对于成骨分化，这些克隆的另外的29.84％±11.57％是双能的(bipotent)，7.77％±10.02％是单能的(unipotent)。来自六个供体的克隆中没有一个对所有三种谱系都为阴性。当与在多于200种研究的单细胞克隆中具有34％三谱系分化能力的骨髓来源的MSC的金标准相比时[16]，ABCB5⁺皮肤来源的MSC中三谱系分化能力>70％明显更好。

与三重ABCB5耗竭的细胞相反，ABCB5⁺分选的细胞级分揭示不同的干细胞相关SSEA-4[17]表达。这与观察到的在人皮肤中ABCB5⁺细胞与SSEA-4的共表达相匹配。在玻片上生长的ABCB5⁺细胞的细胞核针对SOX2(干细胞相关转录因子性别决定区Y-box 2)染色为阳性，而ABCB5-细胞则不是。ABCB5⁺和ABCB5^-真皮塑料黏附(plastic-adherent)细胞级分均不表达另外测试的细胞表面标志物Melan-A(黑素细胞)、CD133(癌干细胞)、CD318(上皮细胞)和CD271(在其他MSC群中发现的神经营养因子)。

人ABCB5⁺来源的MSC通过触发从M1到M2巨噬细胞的转换，加速铁过载小鼠的伤口愈合

为了研究此处表征的真皮ABCB5⁺来源的MSC是否对经典活化的M1巨噬细胞发挥抗炎作用，将ABCB5⁺来源的MSC与经重组人IFN-γ和LPS活化的同种异体PBMC CD14⁺单核细胞来源的巨噬细胞共培养。值得注意的是，当活化的巨噬细胞与ABCB5⁺来源的MSC共培养时，上清液中检测到了M1巨噬细胞来源的促炎性细胞因子TNFα和IL-12/IL-23p40的显著减少，这与和供体匹配的ABCB5^-HDF的共培养物或单独培养的巨噬细胞相反。相反，在与ABCB5⁺来源的MSC共培养的巨噬细胞的上清液中发现IL-10(M2巨噬细胞来源的抗炎性细胞因子)的含量增加，这与供体匹配的ABCB5^-HDF或单独培养的巨噬细胞相反。值得注意的是，当与单个ABCB5⁺来源的MSC相比时，来自6个不同供体的合并的ABCB5⁺来源的MSC揭示了对M1巨噬细胞细胞因子的类似抑制作用，同时伴有M2巨噬细胞细胞因子IL-10的上调。这些数据表明，ABCB5⁺来源的MSC的合并制备物将是临床常规治疗不愈合伤口的实际相关选择。

与人ABCB5⁺来源的MSC与人巨噬细胞的共培养物类似，人ABCB5⁺来源的MSC在跨物种环境中对鼠巨噬细胞发挥相同的作用，从而证实了在鼠异种移植模型中后续伤口愈合研究的功能相关性。

接下来，为了具体研究ABCB5⁺来源的MSC对抑制M1巨噬细胞的旁分泌作用，由于M1巨噬细胞不受限制的活化而导致慢性人伤口的不愈合状态，在异种移植环境下采用了具有全厚度切除伤口的铁过载小鼠模型[7]。铁过载伤口模型忠实地重现了慢性静脉腿溃疡的主要致病方面[7]。受伤之后第1天，将ABCB5⁺来源和ABCB5耗竭的真皮人细胞注射到伤口边缘周围的真皮中。通过对人主要组织相容性复合体I恒定亚基β2-微球蛋白(β2-microglobulin，β2M)的免疫染色，证实了在受伤之后第三天时所注射的人细胞的持久性。通过对从伤口切片分离的基因组DNA进行人特异性β肌动蛋白序列PCR，在指定时间点注射⁺来源的MSC或ABCB5^-细胞的伤口中人特异性β肌动蛋白信号的持久性得到了类似程度的证实。因此，ABCB5⁺和ABCB5^-细胞之间的持久性差异不混淆结果。

在铁过载模型中，注射ABCB5⁺来源的MSC是否加速伤口闭合的问题在下一步解决。如预期，与经右旋糖酐处理/注射PBS的对照小鼠相比，在经铁处理/注射PBS的小鼠中观察到伤口闭合延迟。值得注意的是，与注射与供体匹配的ABCB5-HDF或单独PBS相比，在4个伤口周围(每只小鼠)皮内注射106个ABCB5⁺来源的MSC之后，伤口闭合显著加快。用ABCB5⁺来源的MSC治疗将伤口闭合率完全恢复到经右旋糖酐处理/注射PBS的对照小鼠的水平。

这些发现共同表明了ABCB5⁺来源的MSC对治愈不愈合的慢性伤口的有益效果。

人ABCB5⁺来源的MSC在铁过载小鼠中抑制炎症并改善所有随后的伤口阶段

慢性伤口在炎性伤口阶段持续，伴随不受限制的M1巨噬细胞活化，并且无法进展通过伤口愈合的正常阶段。这里研究了注射ABCB5⁺来源的MSC是否可以抑制不受限制的M1巨噬细胞依赖性炎症，并允许伤口遵循不同伤口阶段的正常顺序。采用双重免疫染色，当在铁过载伤口中注射时，发现ABCB5⁺来源的MSC与内源性鼠巨噬细胞密切相关，意味着ABCB5⁺来源的MSC对巨噬细胞的旁分泌作用可能在伤口组织中。在首次尝试探索ABCB5⁺来源的MSC对铁过载伤口中巨噬细胞主导的炎症的旁分泌影响时，通过ELISA对蛋白质裂解物进行了全伤口细胞因子谱研究。值得注意的是，在受伤之后第五天，炎性细胞因子TNFα的伤口组织蛋白水平被减弱，而在注射ABCB5⁺来源的MSC(而非ABCB5-HDF对照)的铁过载伤口中，抗炎性IL-10提高。此外，在人CVU和铁过载鼠模型中通常上调的炎性细胞因子IL-1β在经ABCB5⁺来源的MSC治疗后被显著抑制。

与注射ABCB5^-HDF的伤口相反，在当注射ABCB5⁺来源的MSC的第七天铁过载伤口中，也观察到更快的上皮细胞再生，伴随覆盖整个伤口床的完全恢复的K14+上皮细胞层(成功皮肤修复的关键特征)。第七天时，观察到新生血管形成的显著改善，如通过伤口床内CD31⁺血管芽的数量和面积增加所证实的。此外，在铁过载小鼠伤口边缘注射ABCB5⁺来源的MSC显著改善了组织重塑，伴随提高胶原纤维的成熟度，降低肉芽组织深度，和改善了较密集的编织(basket-woven)纤维性结构中的胶原纤维的组织。值得注意的是，与ABCB5^-HDF或PBS处理的铁过载伤口瘢痕组织的抗拉强度较低相比，注射ABCB5⁺来源的MSC的铁过载伤口示出瘢痕组织的抗拉强度显著更高，这是修复组织质量改善的有力指标。这些数据显示，ABCB5⁺来源的MSC对几个伤口愈合阶段产生积极影响，不仅加速了组织修复，而且重要的是，导致瘢痕减小的、质量改善的修复组织。

ABCB5⁺来源的MSC通过适应性分泌IL-1RA抑制巨噬细胞主导的炎症

与在急性伤口中瞬时诱导的低IL-1β浓度相反，鉴于慢性伤口中大量的IL-1β及其炎症放大效应物TNFα[7]，人真皮ABCB5⁺来源的MSC是否能够产生IL-1信号传导的天然拮抗剂IL-1RA的问题被解决。通过特异性ELISA的评估，发现培养中未经刺激的ABCB5⁺来源的MSC不容易产生IL-1RA。然而，与供体匹配的ABCB5^-HDF相反，当用IFN-γ/LPS刺激时，ABCB5⁺来源的MSC释放出高IL-1RA水平。值得注意的是，在ABCB5⁺来源的MSC与IFN-γ/LPS活化的M1巨噬细胞的共培养中，IL-1RA浓度甚至更高。注射6小时之后，在铁过载小鼠伤口部位处的ABCB5⁺来源的MSC中观察到特异性IL-1RA表达，如通过用明显共定位的人特异性β2M和IL-1RA的双重免疫染色所示。采用Western印迹分析，与ABCB5^-HDF或注射PBS的对照伤口裂解物中无IL-1RA表达相比，从注射ABCB5⁺来源的MSC的铁过载伤口制备的合并的第三天伤口裂解物中证实了高IL-1RA表达。值得注意且先前未报道的是，在铁过载模型伤口愈合中，在内源性鼠ABCB5⁺MSC中也观察到IL-1RA的表达，而在健康皮肤中，无论是鼠还是人内源性ABCB5⁺来源的MSC都未发现表达IL-1RA。这些数据表明，真皮ABCB5⁺MSC响应于铁过载伤口的炎性环境而适应性地产生IL-1RA。一小部分鼠巨噬细胞(而非中性粒细胞)在铁过载的慢性伤口中释放IL-1RA。然而，从ABCB5⁺来源的MSC中释放的IL-1RA对加速铁过载伤口愈合的治疗性影响显著更为重要，因为IL-1RA沉默的MSC当注射到铁过载伤口时，无法恢复延迟的伤口愈合。接下来探讨了ABCB5⁺来源的MSC所释放的IL-1RA是否导致在体外和体内抑制M1巨噬细胞来源的TNFα。在注射IL-1RA沉默或感受态的ABCB5⁺来源的MSC的铁过载小鼠伤口上清液中，评估了ABCB5⁺来源的MSC的TNFα释放。值得注意的是，在ABCB5⁺来源的MSC中沉默IL-1RA至少部分地消除了与人或鼠巨噬细胞共培养的TNFα抑制。如预期，被扰乱的(scramble)对照siRNA转染的IL-1RA感受态对照ABCB5⁺来源的MSC揭示了它们在体外对来自活化的巨噬细胞的TNFα释放的完全抑制作用。引人注目的是，将IL-1RA沉默的ABCB5⁺来源的MSC皮内注射至铁过载小鼠的伤口边缘，导致加速的伤口闭合完全丧失。相反的是，在体内在指定的时间点，被扰乱的siRNA转染的IL-1RA感受态ABCB5⁺MSC保持其加速伤口愈合的能力。IL-1RA沉默的ABCB5⁺MSC加速铁过载伤口愈合能力的丧失与TNFα和IL-1β抑制的逆转以及IL-10的上调有关。这些数据表明，ABCB5⁺MSC在伤口部位处的刺激之后适应性释放的IL-1RA不仅抑制了IL-1信号传导，而且抑制了下游效应物TNFα，更重要的是，甚至诱导了抗炎性IL-10。从ABCB5⁺来源的MSC在伤口部位处释放的IL-1RA抑制了M1的无限制活化，伴随改善了伤口愈合，这一观点进一步得到以下发现的支持：在铁过载伤口周围皮内注射重组人IL-1RA也加速了伤口闭合。相反的是，将重组IL-1RA注射到急性伤口中并没有加速愈合。还发现TSG-6在铁过载伤口的ABCB5人MSC中表达。然而，当将重组TSG-6注射到铁过载伤口时，伤口闭合没有发生改善。结果表明，IL-1RA确实在铁过载伤口中发挥着核心作用，而单独的重组人TSG-6不足以在铁过载情况下加速愈合。这意味着不同的伤口类型揭示对其愈合的治疗性加速的不同要求。

ABCB5⁺来源的MSC破坏铁过载小鼠伤口中M1巨噬细胞的持久性

为了进一步支持用ABCB5⁺来源的MSC进行伤口治疗会IL-1RA依赖性地破坏铁过载小鼠伤口中M1巨噬细胞的延长的存在的假设，对第五天的伤口切片进行了一系列双重免疫染色。事实上，在注射ABCB5⁺来源的MSC的铁过载伤口中，几乎不存在表达TNFα的F4/80+巨噬细胞。与之形成鲜明对比的是，注射IL-1RA沉默的ABCB5⁺来源的MSC后，许多TNFα+F4/80+双阳性巨噬细胞持续存在于伤口边缘，类似于经右旋糖酐预处理的急性愈合对照小鼠。这些数据表明，ABCB5⁺来源的MSC IL-1RA依赖性地在体内抑制伤口巨噬细胞释放的TNFα的产生。令人感兴趣的是，促进CD206⁺F4/80⁺伤口愈合的M2巨噬细胞显示在受伤后第五天在注射ABCB5⁺来源的MSC的伤口中呈IL-1RA依赖性富集。事实上，注射ABCB5⁺来源的MSC的第五天伤口的单细胞制备物的免疫表型定量地证实了炎性M1向促进伤口愈合的M2巨噬细胞的IL-1RA依赖性转换，如由不同的表面标志物组所限定的。因此，在注射ABCB5⁺来源的MSC之后的F4/80⁺伤口巨噬细胞中，包括细胞因子(TNFα、IL-12/IL-23p40)和诱导型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS2)的M1活化标志物被下调，而如甘露糖受体CD206、β-聚糖Dectin-1和精氨酸酶-1(arginase-1，ARG1)的M2活化标志物被上调。这种M1到M2的转变在被扰乱的siRNA转染的ABCB5⁺来源的MSC中得以维持，而在注射IL-1RAsiRNA转染的ABCB5⁺来源的MSC之后几乎完全消除。总之，这些结果揭示了由ABCB5⁺来源的MSC分泌的IL-1RA在慢性伤口中消除M1巨噬细胞持久性的因果作用。

ABCB5⁺来源的MSC依赖性的M1向M2巨噬细胞的转变在人源化NSG小鼠中是保守的

用PBMC进行人源化的NSG小鼠代表了用于研究体内治疗性干预对人造血谱系来源细胞的影响的高度合适的临床前模型[18]。该模型在此用于验证ABCB5⁺来源的MSC注射对NSG铁过载小鼠中人来源的M1/M2伤口巨噬细胞表型的影响。为此目的，在PBMC人源化NSG小鼠上造成全厚度伤口，随后将人同种异体ABCB5⁺来源的MSC、与供体匹配的ABCB5-HDF或仅PBS注射到伤口边缘。与以上发现一致，在PBMC人源化的NSG小鼠中，与注射PBS和ABCB5-HDF的伤口相比，观察到注射ABCB5⁺来源的MSC之后全厚度伤口的闭合加速。用人特异性抗CD68以及抗CD206或抗TNFα对第五天伤口进行的共免疫染色显示，与注射PBS的伤口相比，注射ABCB5⁺来源的MSC的伤口床中CD68+CD206+人M2巨噬细胞的数量更多。值得注意的是，与注射PBS的伤口相比，ABCB5⁺来源的MSC中CD68+TNFα+促炎性巨噬细胞的数量减少。通过多色流式细胞术分析来源于第5天伤口组织的单一细胞悬液，以确认伤口部位处的人CD68+M1和M2巨噬细胞的数量。在表达Dectin-1/IL-12p40和CD206/TNFα的细胞的比率二者方面，与PBS相比，经ABCB5⁺来源的MSC处理的伤口组织中表达CD68+巨噬细胞标志物的人M2与M1巨噬细胞的比率提高。这些数据表明，从ABCB5⁺来源的MSC中释放的IL-1RA对人伤口巨噬细胞的有益抗炎作用在人源化NOD-scid IL2rγ^null小鼠中是保守的。

讨论

本文报道了新限定的具有MSC特征的皮肤真皮细胞亚群可通过单个标志物(P-糖蛋白ABCB5)在高纯度和均一性下成功地从其内源性生态位中分离。经分离的ABCB5⁺MSC亚群在体外可靠地维持了克隆性自我更新和克隆性三谱系分化的能力。先前未报道的主要发现是，在慢性铁过载伤口中，在伤口周围注射新描述的ABCB5⁺谱系来源的MSC——通过旁分泌IL-1RA释放——将无限制活化的促炎性M1巨噬细胞转变为促进抗炎性伤口修复的M2巨噬细胞，并且因此加速体内受损伤口愈合(图形摘要)。这构成了转化医学中基于MSC的治疗的前沿的一个主要临床前突破——由于缺乏适当的选择标志物——迄今为止该治疗受到效力和效能不一致的表征较少的MSC群的治疗应用的影响[19]。

从皮肤分离和扩增MSC以获得高均一性的进展取决于ABCB5在MSC上，而不是在皮肤中的其他细胞上的排他表达。采用全局转录组学方法，本文证实了具有MSC特征性细胞表面表达谱的真皮ABCB5⁺细胞的存在[1、15]，并报道了与其他多能性和干细胞标志物的共表达(10-13)。RNA seq分析也提供了证据，即富含ABCB5⁺的MSC——即使当在培养中扩增到高传代数——保持至少部分其干细胞特性、MSC和内源性ABCB5⁺细胞的间充质标志物在皮肤中的表达。然而，不清楚内源性ABCB5⁺MSC及其衍生物是否与先前表征的成纤维细胞谱系有关[20、21]。事实上，发现了PDGFα成纤维细胞谱系追踪小鼠[20]的一些较高谱系标志物在ABCB5⁺来源的MSC中的表达，如B淋巴细胞成熟标志物Prdm1/Blimp-1和从例如生长因子、趋化因子、神经肽和血管活性肽的肽中裂解二肽的二肽基肽酶CD26/Dpp4。然而，未发现ABCB5⁺细胞和皮肤中促进瘢痕的成纤维细胞较低谱系标志物αSMA+共表达[20]。这些数据表明，本文使用的ABCB5⁺来源的MSC可能共享降低瘢痕的较高谱系成纤维细胞的一些表达特征。就它们的表达谱而言，不能排除ABCB5⁺来源的MSC与Engrailed-1来源的成纤维细胞谱系的关系[21]。

独立于与成纤维细胞谱系的确切关系，主要目的是利用ABCB5作为从皮肤中富集MSC的单一标志物，将其用于难治伤口的基于MSC的治疗。事实上，在几乎所有研究阶段的铁过载伤口中，对受损伤口愈合的令人印象深刻的救护取决于从注射的ABCB5⁺来源的MSC中释放IL-1RA的增强，其积极地将占优势的不利的M1巨噬细胞转化为促进伤口愈合的M2巨噬细胞。鉴于促炎性M1巨噬细胞无限制活化的共有的致病作用引起人难治慢性伤口中伤口愈合受损，这一发现具有特别的临床意义[7、8、22]。有几条证据支持这一发现。

首先，注射ABCB5⁺来源的MSC，而不是ABCB5耗竭的真皮细胞，导致增强铁过载小鼠中受损伤口愈合的修复。在铁过载小鼠的伤口床内，注射ABCB5⁺来源的MSC后，M2巨噬细胞更为丰富，与之相反，在注射PBS或ABCB5耗竭的真皮细胞级分后，发现铁过载伤口中持续存在大量过度活化的M1巨噬细胞。其次，在ABCB5⁺来源的注射MSC的铁过载伤口的伤口床中M2巨噬细胞的出现与抑制炎症的典型M2细胞因子抗炎性IL-10的增加有关。同时，观察到经典的M1巨噬细胞细胞因子TNFα、IL-1、IL-12和IL-23的降低，这仅在早期伤口愈合阶段期间对募集和活化杀微生物的M1巨噬细胞重要[23]。第三，先前的数据显示，在M1巨噬细胞耗竭条件下，铁过载伤口描绘了完全恢复为M2巨噬细胞的转换，具有改善的伤口愈合，类似于非铁过载伤口[7]。

关于为何IL-1RA——除了IL-1β外，还可显著降低TNFα的问题，以下情况最有可能。在铁过载鼠伤口模型中，TNFα和更高程度上的IL-1β浓度均提高，这两种细胞因子均驱使活化炎性细胞，特别是巨噬细胞。IL-1β和TNFα二者均可激活NFκB[24、25]，NFκB自身反式激活靶基因，例如IL-1β、IL-6和TNFα等促炎性细胞因子和趋化因子。因此，如果IL-1RA中和了大量的IL-1β，预期NFκB激活的恶性循环将显著降低，伴随靶基因例如IL-1β和TNFα的总体上更低的激活和表达。由于IL-1β主要通过IL-6诱导来增强其作用[24、26]，IL-1RA最有可能影响IL-6的总体浓度，因此影响NFκB激活和下游靶基因。当然，不能排除IL-1β和TNFα以外的其他驱动细胞因子。从数据中可归纳的是，从ABCB5⁺MSC中释放的IL-1RA确实在重新平衡慢性铁过载伤口的不利微环境中发挥了因果作用。

炎性体(多蛋白复合物)可能是铁过载伤口模型中IL-1β释放增强的原因。事实上，铁以及污染慢性伤口的细菌成分二者都促进炎性体过度激活[27、28]。炎性体在急性和慢性组织损伤中的作用是复杂的且远未被完全理解。生理上伤口愈合期间炎性体的瞬时激活是协调炎性响应以抵御微生物入侵和有效去除组织碎片的先决条件[28]。IL-1β的炎性体依赖性成熟是通过半胱天冬酶1裂解前肽发生的，并且是募集和活化中性粒细胞和巨噬细胞至损伤部位所必需的。在缺乏半胱天冬酶1的小鼠中抑制这种IL-1β的炎性体依赖性成熟步骤揭示了伤口愈合延迟[29]。在衣原体肺炎感染模型中，在缺乏IL-1受体拮抗剂IL-1RA的小鼠中IL-1β的无限制激活导致肺组织的纤维化响应[30]。与目前的数据类似，糖尿病小鼠中IL-1β的持续炎性体依赖性激活也与皮肤伤口的延迟愈合相关[31]，通过抑制该炎性体，皮肤伤口几乎可完全恢复至正常愈合[32]。结合以上报道的发现显示，平衡的炎性体激活对于协调的组织修复至关重要，如果这种平衡被破坏，伤口愈合将受到损害。

描述性证据报道了MSC在体外[33、34、35、36、37]和甚至在急性伤口模型[33、36、37、38]中抑制巨噬细胞活化的单个方面。然而，缺乏对从M1到M2巨噬细胞的转换或负责的旁分泌机制全面的表征。因此，目前的方法强调了更全面地评估ABCB5⁺来源的MSC对慢性伤口愈合的旁分泌作用的有用性，并有助于鉴定IL-1RA作为导致从促炎性、有害的M1巨噬细胞向抗炎性M2巨噬细胞的严格转变的关键效应物分子。

从ABCB5⁺来源的MSC中释放的IL-1RA的旁分泌作用的数据与先前的发现一致[39]。在这方面，IL-1RA敲除小鼠展示出急性伤口的伤口愈合延迟[39]。此外，报道了在IL-1受体(IL-1R)靶向缺失的小鼠中，或在用重组IL-1RA处理野生型小鼠[40]和糖尿病小鼠[8]的急性伤口后的愈合改善。临床前研究中描述了来自表征不那么充分的MSC的IL-1RA分泌在多种病理学条件下都是有益的[41]。从不受限制的促炎性M1向抗炎性M2巨噬细胞的转变是由于可靠的控制巨噬细胞主导的组织炎症的有益IL-1RA效应，这一认识在本文中得到了明显的增进。

与该概念和数据一致，文献[42]中有明确证据表明，人IL-1RA可以以高亲和力与鼠细胞有效结合，从而抑制鼠IL-1β结合和信号传导。在这方面，人IL-1RA先前已显示以150pM的亲和力与鼠细胞上的I型IL-1受体结合，相当于与人IL-1α和IL-1β的结合。

目前的发现不能排除，除了IL1RA外，其他机制也可能有助于抵消由于M1巨噬细胞不受限制的活化引起的组织损伤。事实上，包括我们在内的几个研究者早些时候已经表示，MSC通过释放肿瘤坏死因子诱导基因6蛋白(TSG-6)来抑制炎症，从而降低组织修复中的瘢痕形成[36、43]。与伤口部位处注射的MSC释放TSG-6之后全厚度伤口的加速的愈合相反[36]，尽管TSG-6在铁过载伤口的伤口部位处表达，但TSG-6显然在加速铁过载伤口的愈合中不发挥主要作用。事实上，以增强急性伤口愈合的浓度注射重组TSG-6不增强铁过载伤口的愈合。微环境的差异将被注射的MSC感知，其因此可能在释放的抗炎性因子方面引起不同的适应性响应。

除IL-1RA外，其他因素可能有助于加速愈合。在这方面，报道了MSC在脓毒症期间通过PGE2依赖性巨噬细胞重编程以提高抗炎性IL-10的释放来抑制氧化损伤[44]。此外，通过增强的IL-6和TGF-β的释放，MSC通过细胞因子活化的内皮细胞来抑制中性粒细胞的募集[45]。

采用的鼠伤口模型的一个较小的局限是，与患者中的未愈合CVU相比，伤口闭合有适度延迟。然而，该模型模拟了铁诱导的伤口M1巨噬细胞的无限制活化伴有延长的炎症和组织破坏，因此，它代表了一个非常适合的研究治疗策略对这些特定病理生理学特征的影响的模型[7]。

总的来说，这些发现对计划的临床常规中的实施具有实质性的临床影响。在这里，首次发现了在铁过载慢性伤口中有效抑制作为组织修复失调之基础的无限制的M1巨噬细胞主导的炎症的关键因子的适应性释放。第二，采用单一标志物策略允许从具有GMP级质量的人皮肤富集易于获得的同质的ABCB5⁺来源的MSC群，准备用于过渡到临床。第三，开发了预测所用MSC制备物在慢性鼠伤口模型中的成功作用的体外测定。来自不同供体的ABCB5⁺来源的单独或混合的MSC制备物，成功地抑制了M1巨噬细胞细胞因子的释放，并且这种抑制作用与当相应的ABCB5⁺来源的MSC注射到铁过载伤口中时愈合的改善密切相关。

因此，以上数据揭示了新描述的真皮ABCB5⁺来源的MSC的效力和效能增强，这为不愈合伤口的成功临床治疗提供了巨大的希望。事实上，最近启动了一项临床II期研究(EudraCT编号：2015-000399-81)，首批研究的患者的结果令人鼓舞。

材料和方法

研究设计

本研究的目的是确定人真皮ABCB5⁺细胞是否为MSC，以及其在细胞治疗性应用中对慢性伤口愈合是否具有有益效果。在体外，通过定量测量，对来自至少六个不同供体(表1：B02至B07)的ABCB5⁺MSC和与供体匹配的ABCB5-HDF的MSC特征性三谱系分化、表面标志物表达、克隆形成生长(clonogenic growth)、自我更新和对活化的巨噬细胞的抗炎性作用进行了测试。在体内，在慢性静脉溃疡的小鼠铁过载全厚度切除伤口模型中评估了抗炎性机制对伤口愈合的改善，慢性静脉溃疡的特征是伤口闭合延迟、炎症延长和M1活化的巨噬细胞丰度[7]。对于这些动物研究，样品量是基于相对于鉴定经遗传修饰小鼠中的伤口愈合延迟的先前研究[46]的伤口闭合的差异进行估算的，以通过Welch测试达到5％的显著性水平和80％的统计功效，包括一只另外的动物(四个伤口)以防止偏离高斯分布。使用来自三个不同供体(表1：B01、B13、B14)的细胞，用ABCB5⁺来源的MSC和与供体匹配的ABCB5-HDF注射进行了三次关键动物实验。使用来自内部编号为B01的供体(此处示出了其细胞制备物纯度和伤口闭合数据)的人真皮细胞，或使用来自六个不同供体的经表型和功能验证的细胞合并样品来进行样品收集的重复实验(表1)。该合并的真皮ABCB5⁺来源的MSC制备物也用于Il-1RA敲低和人源化NSG小鼠伤口闭合实验。每次定量测定中分析独立生物样品的量。显微图像代表每个治疗组的六个伤口样品。用于通过对伤口切片进行人特异性β-肌动蛋白qPCR来分析异种移植的ABCB5⁺来源的MSC持久性和用于伤口细胞因子滴度的ELISA定量的生物样品分别合并自两个独立伤口，并用于四个独立伤口的hIL-1RAWestern印迹和伤口巨噬细胞流式细胞术。

人皮肤样品

本研究中用于分离ABCB5⁺和ABCB^-细胞级分的皮肤活检物测量为1cm2，经Ulm大学伦理委员会批准后取自Ulm大学皮肤病和过敏性疾病大学诊所、大学妇科诊所的年轻健康志愿者(来自经历乳房缩小成形术的健康女性的皮肤)(供体B02至B07)，或者在获得书面知情同意后根据赫尔辛基原则声明直接来源于Ticeba GmbH(Heidelberg，Germany)的客户(供体B01、B08至B14)处。选择定位以避免细胞从皮肤暴露在阳光下的区域分离。定位的差异(臀区、内上臂或左耳后)取决于手术标准和供体偏好。对所有活检物对于任何病理学进行组织学评估。只有无病理学的活检物用于免疫染色或分离ABCB5⁺和ABCB-细胞级分。所有活检物均未产生ABCB5⁺细胞。匿名供体数据可在表1中找到。塑料黏附真皮细胞的扩增和由Frank等人[47]修饰的基于ABCB5的分离如指示进行(详见材料和方法)。在体外实验之前对细胞生存力进行了评估，在ABCB5⁺和ABCB5^-群中均未发现差异(>90％)。此外，当通过Accutase收获ABCB5⁺MSC和ABCB5-细胞级分用于注射到伤口中时，通过台盼蓝排除法常规检查生存力，并且在ABCB5⁺和ABCB5^-群二者中生存力始终非常高(>90％)。

在应用于体内伤口愈合实验之前，在与IFN-γ/LPS活化的鼠骨髓来源巨噬细胞的共培养中测试ABCB5⁺细胞制备物的M1巨噬细胞抑制功能，并通过小鼠特异性TNFαELISA(R&D Systems)评估TNFα的释放。

分化和克隆形成生长测定

使用商业的分化培养基(Lonza)、TGF-β3(CellSystems)和程序根据制造商的说明检测体外成脂、成骨和成软骨的分化能力。对于成脂分化，脂滴积聚通过用Oil Red O(Sigma-Aldrich)染色进行验证，并通过染料提取进行定量，如前所述[48]。成骨细胞的细胞外基质的矿化通过Alizarin Red S染色(Sigma-Aldrich)进行验证，并通过随后的染料提取进行定量，如所述[49]。为了可视化成软骨细胞分化，根据标准程序(见“免疫荧光染色”章节)，对3D微团培养物进行聚集蛋白聚糖(Aggrecan)(R&D Systems，AF1220)免疫染色。为了量化软骨形成，根据制造商的说明，使用Blyscan糖胺聚糖测定试剂盒(Biocolor)测量微团中形成的软骨特异性硫酸化蛋白聚糖和糖胺聚糖。为了评估克隆形成生长，将ABCB5⁺真皮MSC和与供体匹配的ABCB5^-HDF以每100mm培养皿200个细胞的密度接种。14天之后，将集落用0.5％结晶紫(Sigma-Aldrich)染色，且在每个样品的三至五个平行培养皿中计数集落≥25个细胞。对于克隆扩增测定，将ABCB5⁺来源的MSC以每100mm培养皿100个细胞接种。14天之后，对通过至少一个显微视野相对于相邻集落而分离出的12个集落进行挑选和扩增。选择生长良好的克隆培养物进行二级三谱系分化和克隆形成生长测定。

人和小鼠巨噬细胞共培养

如所述，从股骨中分离小鼠骨髓来源的巨噬细胞，并用含有巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的L929细胞上清液补充物使其成熟6天[46]。人巨噬细胞在20ng/ml重组人M-CSF(Miltenyi Biotec)存在下成熟8天，重组人M-CSF来自通过阳性磁珠选择(MiltenyiBiotec)分选CD14表达的PBMC来源的单核细胞，纯度>95％。通过梯度离心(PAA)分离PBMC的新鲜血沉棕黄层从德国红十字会获得。在共培养实验中，将ABCB5⁺来源的MSC或与供体匹配的ABCB5-HDF在具有10％高质量胎牛血清、100U/ml青霉素/链霉素和2mM L-谷氨酰胺的0.5ml DMEM中在24孔培养板上以2×104细胞/孔铺板以贴壁。除非另有说明，24小时之后，将巨噬细胞最高以0.5ml中1×105个细胞/孔接种，导致1:5的细胞比例。共培养物与50Uml-1重组小鼠或人IFN-γ(R&D Systems)孵育24小时，然后用20ng ml-1LPS(Sigma-Aldrich)和50U ml-1IFN-γ刺激另外24小时，然后收获上清液并通过ELISA(R&D Systems)进行分析。

小鼠与伤口愈合模型

雌性C57BL/6N(Charles River，品系027)和雌性或雄性NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(Jax品系005557)小鼠在实验开始时为10至12周，并在特定的无病原体条件下在Ulm大学动物设施中单独通风的笼子中保存。实验按照德国实验动物福利法进行，并经Baden-Württemberg政府审查委员会批准。

与CVU生理病理学相关的C57BL/6小鼠模型如前所述进行[7]。对于使用人真皮ABCB5⁺来源的MSC或相应的ABCB5-HDF进行的细胞处理，将每只小鼠1×106个悬浮在PBS中的细胞在每个伤口边缘周围的三个50μl注射点处注射到真皮中。

为了评估伤口闭合，在受伤之前8天，对NSG小鼠通过尾静脉注射如前所述[18]用200μl PBS中的2×107人PBMC进行人源化。受伤之后第1天，将小鼠随机分配到接受六种供体池ABCB5⁺MSC制备物(表1:B01+B08+B09+B10+B11+B12)、与供体匹配的ABCB5^-HDF或单独PBS的皮内注射的处理组。为了评估巨噬细胞表型转变，对NSG小鼠在受伤之前一天进行人源化。受伤之后第1天，如上所述，随机组用来自供体B01的ABCB5⁺MSC或PBS处理。在受伤之后第五天，对每只小鼠的一半两个独立伤口进行免疫荧光染色，将其他伤口合并用于流式细胞术。

ABCB5⁺来源的MSC中siRNA介导的IL-1RA表达敲低

根据制造商的说明，将ABCB5⁺来源的MSC用20nM的四种人IL-1RA特异性siRNA的组合瞬时转染，或用最低推荐浓度的具有伴随转染培养基的被扰乱的对照-A siRNA(所有产品均来自Santa Cruz Biotechnologies)瞬时转染。在用IFN-γ/LPS活化的小鼠骨髓来源巨噬细胞进行体外炎性刺激和人IL-1RA(R&D Systems)的培养物上清液培养基ELISA之后，在蛋白质水平上测试成功的敲低，然后用于体内实验，并且敲低通常为约80％。

组织学和免疫荧光染色

将人皮肤组织样品包埋到O.C.T.化合物(TissueTek)中，在-80℃下冷冻，处理成5μm切片，并在丙酮中固定。用4％PFA过夜固定小鼠伤口，从中间切开，石蜡包埋，仅使用第一系列5μm切片来避开伤口边缘。将贴壁细胞在玻璃盖玻片上培养，用4％PFA固定，并用PBS中的0.5％TritonX-100透化。将切片或玻片与补充材料(表3)中列出的一抗一起孵育，这些一抗按照制造商的建议在4℃下在抗体稀释剂(DAKO)中稀释过夜。小鼠抗ABCB5以14μg ml-1的浓度使用，在37℃下孵育40分钟用于冷冻切片染色，并以4μg ml-1的浓度使用，在4℃下过夜用于贴壁细胞染色。用PBS洗涤之后，将切片或玻片用AlexaFluor488或AlexaFluor555缀合的相应的二抗(均来自Invitrogen)孵育。用DAPI对细胞核进行复染，然后在荧光固定介质(DAKO)中封固。通过适当的同种型匹配的对照抗体控制背景染色。通过肽竞争测定评估抗ABCB5染色的特异性，将抗体与200倍摩尔过量的表位氨基酸序列肽[47]，RFGAYLIQAGRMTPEG，GeneCrust)预孵育，然后进行免疫荧光染色，显示荧光信号丢失。

按照制造商的说明对石蜡切片进行Masson三色(Sigma-Aldrich)和天狼星红(Polysciences)染色，并使用圆偏振光分析天狼星红染色的玻片。用AxioImager.M1显微镜、AxioCam MRc相机和AxioVision软件(Carl Zeiss)捕获图像。

人特异性β-肌动蛋白序列特异性qPCR

通过人特异性β-肌动蛋白序列PCR对小鼠伤口切片内注射的人ABCB5⁺来源的MSC和ABCB5-HDF进行定量。简单地说，使用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒(56404，Qiagen)从PFA固定的石蜡包埋的伤口切片中分离基因组DNA，然后使用人特异性β-肌动蛋白引物(正向引物：CACCACCGCCGAGACCGC和反向引物：GCTGGCCGGGCTTACCTG)进行PCR。然后进行密度测定法分析，以量化凝胶图像上分散的PCR产物的密度，并用小鼠特异性β-肌动蛋白序列PCR产物归一化。用小鼠特异性β-肌动蛋白引物(正向引物：CCTTCCTTCTTGGGTAAGTTGTAGC和反向引物：CCATACCTAAGAGAAGAGTGACAGAAATC)对小鼠β-肌动蛋白进行PCR。

ELISA与Western印迹

将冷冻切碎的伤口组织样品溶解在补充有蛋白酶抑制剂混合物(Roche)和磷酸酶抑制剂Na3VO4(2mM)和NaF(10mM)的RIPA缓冲液(Sigma)中，在Lysing D柱(MPBiomedicals)中经受三轮20秒的冷却振动力。蛋白质产量通过Bradford测定和针对BSA标准稀释的分光光度分析测量。使用DuoSet试剂盒(R&D Systems)按照制造商的说明进行所有ELISA测定。IL-1RA的Western印迹分析如较早发表的那样进行[50]。使用以1∶1000的稀释度检测人和鼠IL-1RA的兔抗IL-1RA IgG1抗体(Abcam#ab124962)和以1∶10,000的稀释度的二级HRP偶联的抗兔IgG(H+L)抗体(Dianova)。通过肌动蛋白验证了等负载。在添加TMB底物(BD OptEIA)之后用Vilber Fusion Fx7(Vilber Lourmat)检测化学发光。

流式细胞术

使用抗ABCB5小鼠IgG1(克隆3C2-1D12；[47])和二级AlexaFluor647缀合的驴抗小鼠IgG(H+L)(Fisher Scientific)对ABCB5进行流式细胞术。使用人MSC表型试剂盒(Miltenyi Biotec)按照制造商的说明对细胞进行针对MSC-标志物组CD90、CD73和CD105以及针对CD34、CD14、CD20和CD45的多色标记。将抗人SSEA4-PE、CD271-FITC、CD133、CD318和Melan-A抗体(表3)与细胞在4℃下在制造商建议的浓度下孵育45分钟。对于检测CD133、CD318和Melan-A，将使用FACS缓冲液(PBS中的1％BSA)洗涤的细胞随后在4℃下用荧光色素缀合的二抗孵育45分钟。通过与SYTOX蓝(Invitrogen)共染色排除死亡细胞。使用同种型匹配的对照抗体设置门。

对于伤口巨噬细胞分离，如前所述消化小鼠伤口[33、36]。简单地说，将切碎的组织与1.5mg/ml胶原蛋白酶I和1.5mg/ml透明质酸酶I(Sigma-Aldrich)在HEPES缓冲盐水中在37℃下孵育1小时。过滤单细胞制备物并用FcR阻断剂(MACS)孵育15分钟，然后使用补充材料(表3)中列出的抗体进行染色。在固定和透化后，使用可商购试剂盒(BD)根据制造商的方案进行另外的细胞内染色。空白和单一染色样品用于PMT和补偿设置。对于伤口巨噬细胞，C57BL/6N样品中的单峰F4/80+小鼠巨噬细胞和人源化NSG小鼠样品中的单峰CD68+人巨噬细胞被设门，用于随后基于相对荧光单位(RFU＝相对于同种型对照样品的几何平均荧光强度)或巨噬细胞群内阳性事件的％的M1和M2标志物表达分析。在此，针对相关荧光缀合的同种型对照和经巨噬细胞设门标志物染色的对照样品设置阳性阈值。在FACSCanto II、FACSAria Fusion或Accuri流式细胞仪(BD Biosciences)上进行流式细胞术，然后使用FlowJo分析软件(TreeStar Inc.)分析数据。

全面的转录物组谱分析和定量PCR

为了制备总RNA-Seq文库，使用500ng总RNA作为输入物。首先使用可商购试剂盒(Low Input Ribominus Eukaryotic System v2,Thermo)如手册所述(稍加修改)使用500ng总RNA来使rRNA耗竭。简言之，在使用RiboMinus^TMEukaryote Probe Mix使rRNA耗竭之后，收集含有rRNA被耗竭的RNA的上清液，并与3×Agencourt RNAClean XP珠在冰上孵育20分钟，然后去除上清液并用80％乙醇洗涤RNAClean XP珠两次，最后在10μl无核酸酶水中从珠中洗脱rRNA被耗竭的RNA。使用NEBNext Ultra II定向RNA文库制备试剂盒(NEB)并进行一些修改，使用该rRNA被耗竭的RNA制备Illumina平台的RNASeq文库。通过Agilent生物分析仪进行RNASeq文库的质量控制，并使用dsDNA HS测定试剂盒(Thermo)以量子位测量文库的浓度。在Illumina NextSeq 500系统中，使用NextSeq 500/550v2试剂盒(MicrosynthAG，Switzerland)对文库进行75个周期(1×75个单端读取)的测序和2个每次8个周期的索引读取。如前所述[51]，解复用原始读取(fastq)用于基因表达分析。简言之，使用Hisat2使用fastq/span>文件与人基因组参考(GRCh38)比对，然后分别通过cufflinks和cuffdiff进行转录本组装、丰度估计和差异表达。RNASeq数据分析的可视化由R软件包、cummeRbund、gplots、ggplot2使用定制脚本进行。

数据可用性

将RNASeq数据上传至GEO，登录号为GEO GSE125829。2906个碱基对的ABCB5 cDNA序列可以以登录号AY234788在NCBI GenBank中找到。

统计学分析

使用双侧未配对Student t检验以及Welch校正进行两个处理组各自之间独立定量量度的体外和体内差异的统计学分析，以防止异方差数据集。通过配对t检验分析ABCB5⁺和与供体匹配的ABCB5-细胞级分的体外比较。在极少数情况下，通过Grubbs检验在α＝5％下进行事后验证之后，通过目视检查数据检测的离群值被排除在分析之外。使用GraphPadPrism 6软件(科学软件)完成统计学数据分析。图示出了平均值，并且误差棒代表标准偏差，除非另有说明，并且星代表显著性水平：ns＝不显著；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

材料和方法

ABCB5⁺和ABCB5^-真皮细胞级分的扩增和分离

通过用小鼠抗人ABCB5 IgG1抗体(克隆UG3C2-2D12；(51))分别进行连续两轮和三轮磁珠分选将塑料黏附真皮细胞扩增最多16次传代，相当于累积群倍增25倍，并分离为ABCB5⁺和ABCB5-级分。大于90％分选纯度是GMP级真皮ABCB5⁺细胞的放行标准之一(表2)。通过流式细胞术，ABCB5⁺细胞的平均纯度为98.33％±1.12％(n＝243)。对于实验，将分选的细胞冷冻保存或培养至多最大72小时。在这个时间点的纯度通常＞70％。将ABCB5⁺真皮MSC在补充有15％热灭活优质胎牛血清、6mM HEPES、2.8μg/ml氢化可的松、100U/ml青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺、10μg/ml胰岛素、0.2mg/ml葡萄糖、6.16ng/ml PMA(Sigma-Aldrich)和0.6ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(Prospecbio)的Ham′s F10中在37℃和3％CO2下培养。Versene(Gibco)用于使ABCB5⁺真皮细胞从培养塑料中脱离。ABCB5-HDF在具有10％优质胎牛血清、100U/ml青霉素/链霉素和2mM L-谷氨酰胺(Biochrom)的DMEM中在37℃和5％CO2下维持。

与CVU病理生理学柑关的C57BL/6小鼠模型

对C57/BL/6小鼠以三天的间隔腹膜内注射5mg/200μl铁-右旋糖酐或200μl PBS-右旋糖酐(Sigma-Aldrich)七次。在最后一次铁注射之后一天，在麻醉下，用活检穿孔机(Stiefel)在经剃毛的小鼠背部皮肤上造成四个6mm全切除伤口。为了使用AdobePhotoshop软件(Adobe Systems)对伤口区域进行定量，在贴近线状量度处对伤口拍摄照片。

IL-1β定量PCR

使用商业试剂盒(RNeasy微阵列组织迷你试剂盒，Qiagen)，如制造商所述从人慢性静脉腿溃疡(CVU)、鼠伤口和相应的健康对照皮肤分离总RNA。使用illustra Ready-To-Go RT-PCR珠(GE Healthcare)逆转录2μg的RNA/样品。使用Nanodrop 1000(ThermoScientific)和QIAxcel Advance系统(Qiagen)评估总RNA和cDNA的数量和质量。7300实时PCR系统(Applied Biosystems，Life Technologies)用于使用Power SYBR green mastermix(Applied Biosystems，Life Technologies)扩增cDNA。对于图S4中给出的数据，使用了人IL-1β(FW：5’-CCCAAGCAATACCCAAAGA-3’和REV：5’-CCACTTTGCTCTTGACTTCTA-3’)以及小鼠IL-1β(FW：5’-TCACAAGCAGAGCACAAG-3’和REV：5’-GAAACAGTCCAGCCCATAC-3’)的特异性引物。

人重组IL-1RA皮内注射对延迟的伤口愈合的影响

如前对于急性模型所述(36)，将铁过载慢性伤口愈合模型小鼠随机分为三个处理组，包括(i)右旋糖酐/PBS急性伤口愈合对照(ii)铁/PBS组和(iii)铁/rhIL-1RA处理组，在第2天和第4天在伤口边缘周围皮内注射250ng/伤口重组人IL-1RA。如对于慢性模型所述，将急性伤口愈合模型小鼠随机分为(i)注射PBS对照组和(ii)rhIL-1RA处理组。在第三天、第五天、第七天和第十天，通过相对于第0天的伤口表面积来量化伤口随时间的闭合(图S5)。

表1.人皮肤供体。(A)本研究中使用的用于ABCB5⁺真皮细胞的体内表征的健康皮肤供体数据，和用于CVU和正常人皮肤的IL-1β免疫染色的CVU供体数据。(B)本研究中用于真皮细胞ABCB5-分选的健康皮肤供体数据。

*合并的供体细胞样品

表2.本研究中使用的符合GMP的真皮ABCB5⁺MSC制备物的放行标准。

表3.本研究中使用的抗体列表。

A：用于免疫染色的一抗。

B：流式细胞术抗体。

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本文中引用的所有参考文献均通过引用全部并入。因此，已经描述了本发明的至少一个实施方案的几个方面，应理解，本领域技术人员将容易想到多种改变、修改和改进。这样的改变、修改和改进旨在作为本公开内容的一部分，并且旨在在本发明的精神和范围内。因此，前述描述和附图仅为示例。

Claims

1.组合物，其包含：

合成ABCB5+干细胞群，其中所述群的大于96％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

2.权利要求1所述的组合物，其中所述群的大于96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

3.权利要求1所述的组合物，其中所述群的100％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

4.权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述群中大于90％的合成干细胞共表达CD90。

5.权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中如通过ELISA测量的，所述合成干细胞群能够在缺氧下分泌VEGF。

6.权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述合成干细胞群能够在与Mi极化的巨噬细胞共培养之后分泌IL-1RA。

7.权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述合成干细胞群相对于分离的生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞，在巨噬细胞共培养中诱导降低的TNF-α和IL-12/IL-23p40分泌以及提高的IL-10分泌。

8.权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述合成干细胞群具有多能分化能力。

9.权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述合成干细胞群具有分化为来源于所有三个胚层即内胚层、中胚层和外胚层之细胞的能力。

10.权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述合成干细胞群具有角膜上皮分化能力。

11.权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述合成干细胞群相对于分离的生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞，表现出包括SOX2、NANOG和SOX3在内的干细胞标志物的表达提高。

12.权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述合成干细胞群相对于分离的生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞，表现出包括MCAM、CRIG1和ATXN1在内的间充质基质分化标志物的表达降低。

13.权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述合成干细胞群的至少5％包含外源性基因。

14.权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述合成干细胞群的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％包含外源性基因。

15.权利要求13或14所述的组合物，其中所述外源性基因是编码选自组织特异性归巢因子、分泌性组织重塑蛋白、生长因子、细胞因子、激素和神经递质的蛋白质的基因。

16.权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述合成干细胞群的至少5％包含基因中的修饰。

17.权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述合成干细胞群的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％包含基因中的修饰。

18.权利要求16或17所述的组合物，其中所述合成干细胞通过递送包含CRISPR RNA引导的核酸酶和靶向所述基因的gRNA的复合物来进行修饰。

19.权利要求13或14所述的组合物，其中所述经修饰基因是选自COL7A或ABCB5+细胞中缺陷基因的基因。

20.用于制备细胞群的方法，所述方法包括：从来自人对象的皮肤组织分离原代细胞；在培养基中培养所述原代细胞，直到所述细胞产生足够的后代以使混合细胞达到大于60％汇合，收获所述混合细胞，培养所收获的混合细胞，再收获所述细胞并通过至少5次传代对所述细胞进行培养，直到所述细胞群达到至少99％为制造的合成细胞，并且少于10％为原代生理上存在的皮肤来源的细胞；以及使用ABCB5+抗体分离ABCB5阳性细胞。

21.权利要求20所述的方法，其中所述方法包括再收获所述细胞并通过至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16次传代对所述细胞进行培养。

22.权利要求20所述的方法，其中所述方法包括再收获和培养所述细胞，直到所述细胞群达到至少99.99％为制造的合成细胞，并且少于0.01％为原代生理上存在的皮肤来源的细胞。

23.权利要求20所述的方法，其中所述方法包括再收获和培养所述细胞，直到所述细胞群达到至少99.9995％为制造的合成细胞，并且少于0.0005％为原代生理上存在的皮肤来源的细胞。

24.权利要求20所述的方法，其中所述方法包括再收获和培养所述细胞，直到所述细胞群达到至少99.999997％为制造的合成细胞，并且少于0.000003％为原代生理上存在的皮肤来源的细胞。

25.权利要求20至24中任一项所述的方法，其中所述分离步骤涉及与磁珠缀合的ABCB5抗体。

26.权利要求20至25中任一项所述的方法，其中所述细胞在用Ham'sF-10作为基础培养基制备的培养基中培养。

27.权利要求20至26中任一项所述的方法，其中在每个细胞扩增步骤时评价细胞汇合和细胞形态。

28.权利要求20至27中任一项所述的方法，其中最终的培养和分离步骤间隔至少3天。

29.权利要求20至26中任一项所述的方法，其中使用EDTA收获所述细胞。

30.用于诱导组织产生的方法，所述方法包括促进分离的合成ABCB5+干细胞群分化为已分化组织，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

31.用于促进同基因移植物的方法，所述方法包括向具有同基因移植物的对象施用分离的合成ABCB5+干细胞群，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

32.用于治疗周围动脉闭塞性病(PAOD)的方法，所述方法包括向患有PAOD的对象以治疗所述疾病的有效量施用分离的合成ABCB5+干细胞群，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

33.用于治疗慢加急性肝衰竭(AOCLF)的方法，所述方法包括向患有AOCLF的对象以治疗所述疾病的有效量施用分离的合成ABCB5+干细胞群，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

34.用于治疗角膜缘干细胞缺乏(LSCD)的方法，所述方法包括向患有LSCD的对象以治疗所述疾病的有效量施用分离的合成ABCB5+干细胞群，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

35.用于治疗角膜疾病的方法，所述方法包括向患有角膜疾病的对象以治疗所述疾病的有效量施用分离的合成ABCB5+干细胞群，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

36.用于治疗大疱性表皮松解症(EB)的方法，所述方法包括向患有EB的对象以治疗所述疾病的有效量施用分离的合成ABCB5+干细胞群，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

37.用于皮肤伤口愈合的方法，所述方法包括以促进所述伤口愈合的有效量将伤口与分离的合成ABCB5+干细胞群接触，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

38.权利要求37所述的方法，其中所述分离的合成ABCB5+干细胞群被接种到基质或支架上。

39.权利要求38所述的方法，其中所述基质是聚合物网或海绵、聚合物水凝胶或者胶原基质。

40.方法，其包括向具有器官移植物的对象施用有效量的分离的合成ABCB5+干细胞群以促进同种异体移植物存活，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

41.治疗自身免疫病的方法，所述方法包括向患有自身免疫病的对象施用有效量的分离的合成ABCB5+干细胞群以治疗所述自身免疫病，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

42.治疗肝病的方法，所述方法包括向患有肝病的对象施用有效量的分离的合成ABCB5+干细胞群以治疗所述肝病，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

43.治疗神经退行性疾病的方法，所述方法包括向患有神经退行性疾病的对象施用有效量的分离的合成ABCB5+干细胞群以治疗所述神经退行性疾病，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代，并且其中所述神经退行性疾病与针对宿主细胞的免疫应答相关。

44.治疗心血管疾病的方法，所述方法包括向患有心血管疾病的对象施用有效量的分离的合成ABCB5+干细胞群以治疗所述心血管疾病，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代，并且其中所述心血管疾病与组织重塑相关。

45.治疗肾病的方法，所述方法包括向患有肾病的对象施用有效量的分离的合成ABCB5+干细胞群以治疗所述肾病，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

46.治疗炎性病症的方法，所述方法包括向患有炎性病症的对象施用有效量的分离的合成ABCB5+干细胞群以治疗所述炎性病症，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

47.权利要求46所述的方法，其中所述炎性病症选自心血管疾病、缺血性发作、阿尔茨海默病和衰老。

48.治疗肌肉骨骼病症的方法，所述方法包括向患有炎性病症的对象施用有效量的分离的合成ABCB5+干细胞群以治疗所述肌肉骨骼病症，其中所述群的大于99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。

49.权利要求48所述的方法，其中所述肌肉骨骼病症是遗传性肌营养不良。

50.权利要求30至49中任一项所述的方法，其中所述合成干细胞群是根据权利要求1至19中任一项所述的合成细胞。

51.用于细胞重编程的方法，所述方法包括，

使用如权利要求1至19中任一项所述的合成干细胞群作为通过多能性进行细胞重编程的底物。

52.如权利要求1至19中任一项所述的合成干细胞群，其还包含外源性PAX6基因。

53.组合物，其包含：

合成ABCB5+干细胞群，其中所述细胞群表达KRT12。

54.权利要求53所述的组合物，其中所述群的大于97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.7％、99.9％、99.99％、99.998％、99.999％或99.999997％是生理上存在的皮肤来源的ABCB5阳性间充质干细胞的体外后代。