JPWO2018199194A1 - 間葉系幹細胞の製造方法、間葉系幹細胞の治療効果マーカー及び治療効果判定方法、並びに間葉系幹細胞を含む細胞製剤 - Google Patents
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Abstract
Description
(2)細胞培養担体が、ナノメートル〜マイクロメートル単位の平均繊維径を有するファイバーによって細胞との接触面上に形成された開口部を有する、(1)に記載の製造方法。
(3)開口部の平均径が500nm〜1000μmである、(2)に記載の製造方法。
(4)細胞培養担体が、生分解性ポリマーからなるナノファイバーを含有してなる細胞培養担体である、(1)から(3)のいずれか一項に記載の製造方法。
(5)培地中の賦活化剤の濃度が、ファイバーからなる3次元構造を有さない細胞培養担体を用いてMSCを培養する賦活化工程における培地中の賦活化剤濃度の1/10〜1/100000である、(1)から(4)のいずれか一項に記載の製造方法。
(6)培地中の賦活化剤の濃度が、タンパク質換算で0.01μg/mL〜500μg/mLである、(1)から(5)のいずれか一項に記載の製造方法。
(7)賦活化工程における細胞の継代回数が2回以下である、(1)から(6)のいずれか一項に記載の製造方法。
(8)MSCが骨髄由来のMSCである、(1)から(7)のいずれか一項に記載の製造方法。
(9)MSCが疾患を有する対象から分離されたMSCである、(1)から(8)のいずれか一項に記載の製造方法。
(10)CD47陽性細胞の割合が2%以下である、MSCを含む細胞製剤。
(11)MSCが、(1)から(9)のいずれか一項に記載の方法により製造される賦活化されたMSCである、(10)に記載の細胞製剤。
(12)MSC集団の中からCD47陰性のMSCを濃縮する工程を含む、MSCを含む細胞製剤の製造方法。
(13)p16ink4a及びp14ARFよりなる群から選択される、MSCの治療効果と正に相関するMSCの治療効果評価のためのマーカー。
(14)CDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される、MSCの治療効果と負に相関するMSCの治療効果評価のためのマーカー。
(15)被験MSCにおけるp16ink4a、p14ARF、CDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する測定工程、測定された発現量を対照MSCにおける発現量と比較する比較工程、並びにp16ink4a及びp14ARFよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照MSCよりも被験MSCにおいて多い場合並びに/又はCDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照MSCよりも被験MSCにおいて少ない場合に、被験MSCは対照MSCより治療効果が高いと判定する判定工程を含む、MSCの治療効果を判定する方法。
(16)測定工程が、被験MSCにおける
(A)DNMT1、Nanog、SOX2、OCT4、IDO、TSG6、IL−6及びTERTよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質、並びに/又は
(B)p53及びα−SMAよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質
の発現量を測定することをさらに含み、
判定工程が、p16ink4a及びp14ARFよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照MSCよりも被験MSCにおいて多いこと並びに/又はCDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照MSCよりも被験MSCにおいて少ないことに加えて、前記(A)の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照MSCよりも被験MSCにおいて多い場合及び/又は前記(B)の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照MSCよりも被験MSCにおいて少ない場合に、被験MSCは対照MSCより治療効果が高いと判定する工程である、(15)に記載の方法。
(17)(15)又は(16)に記載の方法の測定工程においてCD47遺伝子又はタンパク質の発現量に代えてMSC中のCD47陽性細胞の割合を測定し、判定工程においてCD47遺伝子又はタンパク質の発現量が対照MSCよりも被験MSCにおいて少ないことに代えてMSC中のCD47陽性細胞の割合が対照MSCよりも被験MSCにおいて低い場合に被験MSCは対照MSCより治療効果が高いと判定する、MSCの治療効果を判定する方法。
(18)被験MSCが、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤を含む培地中で培養されたMSCである、(15)から(17)のいずれか一項に記載の方法。
(19)被験MSCが、ファイバーからなる3次元構造を有する細胞培養担体を用いて培養されたMSCである、(15)から(18)のいずれか一項に記載の方法。
(20)被験MSCが、MSCの自家移植療法を受けようとする対象から分離されたMSCである、(15)から(19)のいずれか一項に記載の方法。
(21)被験MSCが骨髄由来のMSCである、(15)から(20)のいずれか一項に記載の方法。
(22)処理されたMSCにおけるp16ink4a、p14ARF、CDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する測定工程、測定された発現量を処理されていないMSCにおける発現量と比較する比較工程、並びにp16ink4a及びp14ARFよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないMSCよりも処理されたMSCにおいて多い場合並びに/又はCDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないMSCよりも処理されたMSCにおいて少ない場合に、そのMSCは当該処理に適していると判定する判定工程を含む、MSCの治療効果を高めるための処理に対するMSCの適応性を判定する方法。
(23)測定工程が、処理されたMSCと処理されていないMSCのそれぞれにおける
(A)DNMT1、Nanog、SOX2、OCT4、IDO、TSG6、IL−6及びTERTよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質、並びに/又は
(B)p53及びα−SMAよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質
の発現量を測定することをさらに含み、
判定工程が、p16ink4a及びp14ARFよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないMSCよりも処理されたMSCにおいて多いこと並びに/又はCDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないMSCよりも処理されたMSCにおいて少ないことに加えて、前記(A)の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないMSCよりも処理されたMSCにおいて多い場合及び/又は前記(B)の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないMSCよりも処理されたMSCにおいて少ない場合に、そのMSCは当該処理に適していると判定する工程である、(22)に記載の方法。
(24)(22)又は(23)に記載の方法の測定工程においてCD47遺伝子又はタンパク質の発現量に代えてMSC中のCD47陽性細胞の割合を測定し、判定工程においてCD47遺伝子又はタンパク質の発現量が処理されていないMSCよりも処理されたMSCにおいて少ないことに代えてMSC中のCD47陽性細胞の割合が処理されていないMSCよりも処理されたMSCにおいて低い場合にそのMSCは当該処理に適していると判定する、処理に対するMSCの適応性を判定する方法。
(25)処理が、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤を含む培地中でMSCを培養する処理である、(22)から(24)のいずれか一項に記載の方法。
(26)処理が、ファイバーからなる3次元構造を有する細胞培養担体を用いてMSCを培養する処理である、(22)から(25)のいずれか一項に記載の方法。
(27)MSCが、MSCの自家移植療法を受けようとする対象から分離されたMSCである、(22)から(26)のいずれか一項に記載の方法。
(28)MSCが骨髄由来のMSCである、(22)から(27)のいずれか一項に記載の方法。
本発明の第1の態様は、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤でMSCを処理する賦活化工程を含む、賦活化されたMSCの製造方法であって、賦活化工程が、ファイバーからなる3次元構造を有する細胞培養担体を用いて、前記賦活化剤を含む培地中でMSCを培養する工程である、前記製造方法に関する。
本発明の別の態様は、p16ink4a及びp14ARFよりなる群から選択される、MSCの治療効果と正に相関するMSCの治療効果評価のためのマーカーに関する。また、本発明のさらなる別の態様は、CDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される、MSCの治療効果と負に相関するMSCの治療効果評価のためのマーカーに関する。
(A)DNMT1、Nanog、SOX2、OCT4、IDO、TSG6、IL−6及びTERTよりなる群から選択される少なくとも1つ、好ましくは2、3、4、5、6、7個若しくは全ての遺伝子若しくはタンパク質、並びに/又は
(B)p53及びα−SMAよりなる群から選択される少なくとも1つ、好ましくは全ての遺伝子若しくはタンパク質
の発現量を測定し、判定工程においてその結果を上記治療効果マーカーの遺伝子又はタンパク質発現量の変化と組み合わせること、具体的には
p16ink4a及びp14ARFよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照MSCよりも被験MSCにおいて多いこと並びに/又はCDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照MSCよりも被験MSCにおいて少ないことに加えて、前記(A)の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照MSCよりも被験MSCにおいて多い場合及び/又は前記(B)の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照MSCよりも被験MSCにおいて少ない場合に、そのMSCは治療効果が高いと判定することも可能である。
本発明のさらなる態様は、処理されたMSCにおけるp16ink4a、p14ARF、CDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する測定工程、測定された発現量を処理されていないMSCにおける発現量と比較する比較工程、並びにp16ink4a及びp14ARFよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないMSCよりも処理されたMSCにおいて多い場合並びに/又はCDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないMSCよりも処理されたMSCにおいて少ない場合に、そのMSCは当該処理に適していると判定する判定工程を含む、MSCの治療効果を高めるための処理に対するMSCの適応性を判定する方法に関する。
本発明の別の態様は、CD47陽性細胞の割合が2%以下である、MSCを含む細胞製剤に関する。
1)賦活化剤の調製
特許文献1の記載にしたがって、ヒト胎盤組織から賦活化剤を調製した。簡潔には、細切したヒト胎盤組織を湿重量50gに対して、100mLの割合で無血清培地(alpha−MEM)に入れ、4℃で72時間、振とうした。遠心分離により上清を回収し、胎盤組織抽出物である賦活化剤を得た。
変形性股関節症患者の人工関節置換術時に採取した骨髄由来のMSC(OA−MSC)を、賦活化剤を含まないMSC培養培地(15%FBS、1%ペニシリン、1%ストレプトマイシン及び100mg/dLグルコースを含有するDMEM)で培養を行った。細胞を回収して、それぞれ3次元培養担体であるPreset VECELL 6well(登録商標)(ベセル株式会社)に8×104細胞/well、Cellbed 24well(登録商標)(日本バイリーン株式会社)に2×104細胞/well、3D−insert PS−200 12well及び3D−insert PS−400 12well(3DBiotek社)に3.8×104細胞/wellを播種し、MSC培養培地を用いて37℃で72時間培養した。培地を除去した後、タンパク質換算で10μg/mL、1μg/mL若しくは0.1μg/mLの上記賦活化剤を含む又は賦活化剤を含まないMSC培養培地を、それぞれPreset VECELL 6wellに2mL、Cellbed 24wellに0.6mL、3D−insert PS−200 12well及び3D−insert PS−400 12wellに1mLを加えて37℃で4日間培養を行った。この培養を1〜3回行った後、細胞を回収して、継代数1〜3のOA−MSCを調製した。
1)遺伝子発現解析
実施例1の2)で調製した各OA−MSCからTri Reagent(Molecular Research Center,Inc)を用いてtotal RNAを抽出した。逆転写反応によりclone DNAを合成し、OCT4、Nanog、SOX2、DNMT1、TERT、IL−6、IDO、TSG−6、p21、p53、α−SMA及び18sRNAについて、表1に示した塩基配列からなるプライマーセットを用いてリアルタイムPCRを実施した。
表中の(F)はフォワードプライマーを、(R)はリバースプライマーを意味する。
次に、Preset VECELL上で0.1μg/mLの賦活化剤の存在下又は不存在下で培養したOA−MSC(MSC(3D・賦活剤+)及びMSC(3D・賦活剤−))、並びに2次元培養担体上で100μg/mLの賦活化剤の存在下又は不存在下で培養したOA−MSC(MSC(2D・賦活剤+)及びMSC(2D・賦活剤−))を2.5%グルタールアルデヒド及び2%パラフォルムアルデヒドを含む0.1Mリン酸緩衝液で4℃で1時間固定し、その後1%オスミウムを含む0.1Mリン酸緩衝液で1時間、4℃で後固定した。その後、脱水・乾燥して、金属コーティングを行い、走査電子顕微鏡で観察した。
比較例の培養担体として細胞培養基材A(平均繊維径0.1〜0.5μm、空隙率70%以下、平均孔面積0.2μm2、24well)を用いて、賦活化剤濃度1μg/mL又は0.1μg/mLで、実施例1の2)のCellbed 24wellの場合と同様に、OA−MSCの賦活化処理を行った。基材Aは、その一部にファイバーからなる3次元構造を有するが、3次元構造を持たない平坦な膜状の部分が細胞接着面の約50%を占める基材である。
前十字靭帯断裂以外に所見が認められない22歳女性から採取した骨髄由来のMSC(健常者由来MSC)を、賦活化剤を含まないMSC培養培地で培養を行った。細胞を回収して、Preset VECELL 6well(登録商標)(ベセル株式会社)に8×104細胞/wellを播種し、MSC培養培地を用いて37℃で72時間培養した。培地を除去し、1μg/mLの賦活化剤を含むMSC培養培地2mLを加えて培養を行うことで、継代数1の賦活化処理された健常者由来MSC(3D・賦活剤+)を調製した。
10週齢のLewisラットの背部に3cm×3cmの皮膚を切除した部位を2箇所設けることで、皮膚欠損モデルラットを作製した。皮膚切除から1日後に、実施例1の2)で調製したMSC(2D・賦活剤−)(5×105細胞/匹)、MSC(2D・賦活剤+)(5×105細胞/匹)、MSC(3D・賦活剤+)(1×105細胞/匹)又はPBS(vehicle)をラットに静脈内投与して、21日間飼育した。
Preset VECELL 6well(登録商標)(ベセル株式会社)に8×104細胞/wellのOA−MSCを播種し、MSC培養培地を用いて37℃で72時間培養した。培地を除去し、0.1μg/mLの賦活化剤を含むMSC培養培地を2mL/wellで加えて37℃で4日間培養を行った後、細胞を回収して、継代数1の賦活化処理されたOA−MSC(3D・賦活剤+)を調製した。また、2次元培養担体(Corning(登録商標)Costar(登録商標)細胞培養 6wellプレート、Thermo Fisher Science社)に6×104細胞/wellのOA−MSCを播種し、賦活化剤を含まないMSC培養培地を1.3mL/wellで加えて37℃で4日間培養を行い、継代数1の未処理MSC(2D・賦活剤−)を調製した。
実施例7 賦活化処理されたOA−MSCにおける治療効果マーカー遺伝子の発現解析
1)MSCの賦活化処理
変形性股関節症患者(n=13)の人工関節置換術時に採取した骨髄由来のMSC(OA−MSC)を、賦活化剤を含まないMSC培養培地(15%FBS、1%ペニシリン、1%ストレプトマイシン及び100mg/dLグルコースを含有するDMEM)で培養した。細胞を回収して、Corning(登録商標)Costar(登録商標)細胞培養 6wellプレート(Thermo Fisher Science社)に6×104細胞/wellを播種し、賦活化剤を含む又は賦活化剤を含まないMSC培養培地を1.3mL/wellで加えて37℃で4日間培養を行った。この培養をさらに1回繰り返すことで、継代数2の賦活化処理されたOA−MSC及び未処理のOA−MSCを調製した。
上記1)で調製した各OA−MSCにおける各遺伝子(OCT4、Nanog、SOX2、DNMT1、TERT、IL−6、IDO、TSG−6、p16ink4a、RB、p21、p53、α−SMA、18sRNA)の発現量を、実施例2の1)と同様にリアルタイムPCRによって測定した。
1)OCT4、SOX2及びp16 ink4a
OA−MSCを用いて、3次元培養担体上での賦活化処理による遺伝子発現の変動を解析した。Preset VECELL 6well(登録商標)(ベセル株式会社)に8×104細胞/wellのOA−MSCを播種し、MSC培養培地を用いて37℃で72時間培養した。培地を除去し、0.1μg/mLの賦活化剤を含む又は賦活化剤を含まないMSC培養培地を2mL/wellで加えて37℃で4日間培養を行った後、細胞を回収して、継代数1の賦活化処理されたOA−MSC及び未処理のOA−MSCを調製した。これらのOA−MSCにおける各因子の発現量をリアルタイムPCRにより測定した。
関節リウマチ患者、72歳男性、肝硬変患者及び38歳男性から採取した骨髄由来のMSC(それぞれRA、Aged、肝硬変、Young)を用いて、2種類の賦活化剤濃度(1μg/mL、0.1μg/mL)で、上記1)と同様にして3次元培養担体上での賦活化処理を行い、継代数1の賦活化処理されたMSCを調製した。また、2次元培養担体(Corning(登録商標)Costar(登録商標)細胞培養 6wellプレート、Thermo Fisher Science社)に同じMSCを6×104細胞/wellの量で播種し、賦活化剤を含まないMSC培養培地を1.3mL/wellで加えて37℃で4日間培養を行い、継代数1の未処理MSCを調製した。
38歳男性及び72歳男性から採取した骨髄由来のMSC(それぞれ若年者MSC、高齢者MSC)を用いて、賦活化剤濃度0.1μg/mLで、実施例8の2)と同様にして継代数1の賦活化処理されたMSC及び未処理のMSCを調製した。これらのMSCを死細胞染色のためZombie Violet(商標) Dye(Biolegend)で反応し、その後FITC anti−human CD47 抗体(Biolegend)で標識し、FACSCanto(商標) II(BD Biosciences)でフローサイトメトリー解析を行なった。ネガティブコントロールは、isotype controlもしくは2次抗体のみを反応させたMSCを用いた。データ解析は、FACSDiva(商標)(BD Biosciences)及びKaluza V1.5a(Beckman Coulter)で行なった。
実施例7の1)で賦活化処理を行ったOA−MSCのうち、発現変動の程度が異なる3症例のOA−MSC(BM−008、BM−021、BM−005)について、機能評価を行った。これらのOA−MSCにおけるp16ink4a遺伝子の相対的発現量を図24に示す。p16ink4a発現量は、BM−008においては賦活化処理によって約1.4倍、BM−021においては約1.6倍増加した一方、BM−005においては0.2倍程度に減少していた。
Fpr(F):5’−TCTACCATCTCCAGAGTTCTGTGG−3’(配列番号33)
Fpr(R):5’−TTACATCTACCACAATGTGAACTA−3’(配列番号34)
1)局所投与
賦活化処理によりp16ink4a発現量が増加したOA−MSC(BM−021)を用いて、慢性炎症が関与する疾患である多発性筋炎に対する治療効果の確認を行った。BM−021におけるOCT4、SOX2及びp16ink4a遺伝子の相対的発現量を図27に示す。いずれの因子も賦活化処理により発現量が増加していた。
次に、賦活化処理によりp16ink4a発現量が増加したOA−MSC(BM−008)を用いて、多発性筋炎に対する治療効果の確認を行った。BM−008におけるOCT4、SOX2及びp16ink4a遺伝子の相対的発現量を図30に示す。BM−021と同じく、いずれの因子も賦活化処理により発現量が増加していた。
実施例4においてラットに投与した3種類のMSCについて、OCT4、SOX2及びp16ink4aの遺伝子発現量をリアルタイムPCRにより測定した。2次元培養担体上で賦活化剤の不存在下で培養したMSC(PE−(2D))に対する相対的発現量を図34に示す。賦活化処理により各因子の発現量は増加し、特に3次元培養担体を用いたときに著しく増加していた。実施例4で確認された創傷治癒効果の傾向から、p16ink4aの発現量が増加したMSCは、未処理のMSCと比較してより速やかに創傷治癒をもたらすこと、特にp16ink4aの発現量が著しく増加したMSCは細胞数が少なくても極めて高い創傷治癒能力を有することが確認された。
実施例6においてラットに投与したMSCについて、OCT4、SOX2、Nanog、p16ink4a、p14ARF、IDO、α−SMA及びTERTの発現量をリアルタイムPCRによって測定した。2次元培養担体上で賦活化剤の不存在下で培養したMSCに対する相対的発現量を図35に示す。3次元培養担体上での賦活化処理により、OCT4、SOX2、Nanog、p16ink4a、p14ARF、IDO及びTERTの発現量は増加し、α−SMAの発現量は減少していた。実施例6で確認された腎症治療効果から、p16ink4a及びp14ARFの発現量が増加したMSCは高い腎症治療効果を奏することが確認された。
1)p16 ink4a ノックアウトMSCの調製
OA−MSCから採取した骨髄由来MSCに対して、p14 ARF/p16 CRISPR/Cas9 KO plasmids(Santa Cruz Biotechnology)を用いて、p16ink4a及びp14ARFをコードするCDKN2A遺伝子のノックアウトを行った。CDKN2A遺伝子ノックアウトのための標的gRNAを組み込んだCRISPR/Cas9ノックアウトプラスミド、又は対照としての標的gRNAの代わりにスクランブルgRNAを組み込んだスクランブルプラスミドをMSCにトランスフェクションした。これらのMSCを、実施例8の2)と同様に賦活化処理に供した後、1次抗体として抗p16ink4a抗体(anti−p16INK4A human,Proteintech)を反応させ、2次抗体としてAlxa 647 Anti−rabbit IgG(Jackson)を用いて標識し、免疫染色した。
実施例11の1)と同様にして、上記1)の賦活化処理後のノックアウトMSC、スクランブルMSC又はPBSを多発性筋炎モデルマウスの下腿三頭筋に局所投与し、治療効果を評価した。MSC投与の11日後に採取したマウス筋組織のラミニン染色像の一例、及び筋断面積の解析結果を図37に示す。PBSを投与したマウス(Vehicle)と比べて、スクランブルMSCを投与したマウス(SC)の筋断面積は増加したが、ノックアウトMSCを投与したマウス(CDKN2A KO)では筋断面積の増加は認められなかった。このように、p16ink4aをノックアウトしたMSCは治療効果が低減することが確認され、p16ink4aは治療効果の正のマーカーとなることが示された。
1)CD47高発現MSCの調製
38歳男性から採取した骨髄由来MSCに対して、CD47 CRISPR activation plasmid(Santa Cruz Biotechnology)を用いてCD47を活性化させるための標的gRNAを組み込んだプラスミドをトランスフェクトし、CD47を過剰発現させたMSCを作成した。
35週齢のBalb/cマウスの背部に1.5cm×1.5cmの皮膚を切除した部位を2箇所設けることで、皮膚欠損モデルラットを作製した。皮膚切除から1日後に、上記1)で調製したMSC(2.5×104細胞/匹)、プラスミドのトランスフェクトを行わない対照のMSC(2.5×104細胞/匹)又はPBS(Vehicle)をマウスに静脈内投与して、9日間飼育した。
1)CD47発現量の異なるMSCの調製
OA−MSCから採取した骨髄由来のMSCを用いて、賦活化剤濃度0.0001mg/mLで、実施例8の2)と同様にして3次元培養担体上での賦活化処理を行い、継代数1の賦活化処理されたMSCを調製した。また、2次元培養担体(Corning(登録商標)Costar(登録商標)細胞培養 6wellプレート、Thermo Fisher Science社)に同じMSCを6×104細胞/wellの量で播種し、賦活化剤を含まないMSC培養培地を1.3mL/wellで加えて37℃で4日間培養を行い、継代数1の未処理MSCを調製した。これらのMSCにおけるCD47陽性細胞率を実施例9と同様にして測定したところ、賦活化処理されたMSCで<20%、未処理MSCで>90%であった。
実施例5と同様にして、上記1)の2種類のMSCをAPP/PS1マウスに髄腔内投与し、治療効果を評価した。モリス水迷路での学習テストの結果を図39に、記憶テストの結果を図40に示す。CD47陽性細胞率の高いMSCを投与したマウスは、CD47陽性細胞率の低いMSCを投与したマウスと比較して学習能力及び記憶能力が低く、CD47は治療効果の負のマーカーとなることが示された。
市販のヒト胎盤抽出物(「メルスモン」、メルスモン製薬株式会社)をエバポレーターで濃縮することで賦活化剤を調製し、これを用いてPreset VECELL及び2次元培養担体上でのOA−MSCの賦活化処理を実施例8の2)と同様に行った。これらのOA−MSCにおける各遺伝子の発現量をリアルタイムPCRによって測定した。2次元培養担体上で賦活化剤の不存在下で培養したMSC(2D・賦活剤なし)に対する各MSCにおけるOCT4、SOX2、TERT及びp16ink4aの相対的遺伝子発現量を図41及び図42に示す。ヒト胎盤抽出物から調製した賦活化剤は、実施例1の1)で調製した賦活化剤と同様に、3次元培養担体上でより強い賦活化効果を示した。
Claims (28)
- 哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤で間葉系幹細胞を処理する賦活化工程を含む、賦活化された間葉系幹細胞の製造方法であって、賦活化工程が、ファイバーからなる3次元構造を有する細胞培養担体を用いて、前記賦活化剤を含む培地中で間葉系幹細胞を培養する工程である、前記製造方法。
- 細胞培養担体が、ナノメートル〜マイクロメートル単位の平均繊維径を有するファイバーによって細胞との接触面上に形成された開口部を有する、請求項1に記載の製造方法。
- 開口部の平均径が500nm〜1000μmである、請求項2に記載の製造方法。
- 細胞培養担体が、生分解性ポリマーからなるナノファイバーを含有してなる細胞培養担体である、請求項1から3のいずれか一項に記載の製造方法。
- 培地中の賦活化剤の濃度が、ファイバーからなる3次元構造を有さない細胞培養担体を用いて間葉系幹細胞を培養する賦活化工程における培地中の賦活化剤濃度の1/10〜1/100000である、請求項1から4のいずれか一項に記載の製造方法。
- 培地中の賦活化剤の濃度が、タンパク質換算で0.01μg/mL〜500μg/mLである、請求項1から5のいずれか一項に記載の製造方法。
- 賦活化工程における細胞の継代回数が2回以下である、請求項1から6のいずれか一項に記載の製造方法。
- 間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求項1から7のいずれか一項に記載の製造方法。
- 間葉系幹細胞が疾患を有する対象から分離された間葉系幹細胞である、請求項1から8のいずれか一項に記載の製造方法。
- CD47陽性細胞の割合が2%以下である、間葉系幹細胞を含む細胞製剤。
- 間葉系幹細胞が、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法により製造される賦活化された間葉系幹細胞である、請求項10に記載の細胞製剤。
- 間葉系幹細胞集団の中からCD47陰性の間葉系幹細胞を濃縮する工程を含む、間葉系幹細胞を含む細胞製剤の製造方法。
- p16ink4a及びp14ARFよりなる群から選択される、間葉系幹細胞の治療効果と正に相関する間葉系幹細胞の治療効果評価のためのマーカー。
- CDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される、間葉系幹細胞の治療効果と負に相関する間葉系幹細胞の治療効果評価のためのマーカー。
- 被験間葉系幹細胞におけるp16ink4a、p14ARF、CDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する測定工程、測定された発現量を対照間葉系幹細胞における発現量と比較する比較工程、並びにp16ink4a及びp14ARFよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において多い場合並びに/又はCDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において少ない場合に、被験間葉系幹細胞は対照間葉系幹細胞より治療効果が高いと判定する判定工程を含む、間葉系幹細胞の治療効果を判定する方法。
- 測定工程が、被験間葉系幹細胞における
(A)DNMT1、Nanog、SOX2、OCT4、IDO、TSG6、IL−6及びTERTよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質、並びに/又は
(B)p53及びα−SMAよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質
の発現量を測定することをさらに含み、
判定工程が、p16ink4a及びp14ARFよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において多いこと並びに/又はCDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において少ないことに加えて、前記(A)の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において多い場合及び/又は前記(B)の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において少ない場合に、被験間葉系幹細胞は対照間葉系幹細胞より治療効果が高いと判定する工程である、請求項15に記載の方法。 - 請求項15又は16に記載の方法の測定工程においてCD47遺伝子又はタンパク質の発現量に代えて間葉系幹細胞中のCD47陽性細胞の割合を測定し、判定工程においてCD47遺伝子又はタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において少ないことに代えて間葉系幹細胞中のCD47陽性細胞の割合が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において低い場合に被験間葉系幹細胞は対照間葉系幹細胞より治療効果が高いと判定する、間葉系幹細胞の治療効果を判定する方法。
- 被験間葉系幹細胞が、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤を含む培地中で培養された間葉系幹細胞である、請求項15から17のいずれか一項に記載の方法。
- 被験間葉系幹細胞が、ファイバーからなる3次元構造を有する細胞培養担体を用いて培養された間葉系幹細胞である、請求項15から18のいずれか一項に記載の方法。
- 被験間葉系幹細胞が、間葉系幹細胞の自家移植療法を受けようとする対象から分離された間葉系幹細胞である、請求項15から19のいずれか一項に記載の方法。
- 被験間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求項15から20のいずれか一項に記載の方法。
- 処理された間葉系幹細胞におけるp16ink4a、p14ARF、CDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する測定工程、測定された発現量を処理されていない間葉系幹細胞における発現量と比較する比較工程、並びにp16ink4a及びp14ARFよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において多い場合並びに/又はCDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において少ない場合に、その間葉系幹細胞は当該処理に適していると判定する判定工程を含む、間葉系幹細胞の治療効果を高めるための処理に対する間葉系幹細胞の適応性を判定する方法。
- 測定工程が、処理された間葉系幹細胞と処理されていない間葉系幹細胞のそれぞれにおける
(A)DNMT1、Nanog、SOX2、OCT4、IDO、TSG6、IL−6及びTERTよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質、並びに/又は
(B)p53及びα−SMAよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質
の発現量を測定することをさらに含み、
判定工程が、p16ink4a及びp14ARFよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において多いこと並びに/又はCDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において少ないことに加えて、前記(A)の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において多い場合及び/又は前記(B)の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において少ない場合に、その間葉系幹細胞は当該処理に適していると判定する工程である、請求項22に記載の方法。 - 請求項22又は23に記載の方法の測定工程においてCD47遺伝子又はタンパク質の発現量に代えて間葉系幹細胞中のCD47陽性細胞の割合を測定し、判定工程においてCD47遺伝子又はタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において少ないことに代えて間葉系幹細胞中のCD47陽性細胞の割合が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において低い場合にその間葉系幹細胞は当該処理に適していると判定する、処理に対する間葉系幹細胞の適応性を判定する方法。
- 処理が、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤を含む培地中で間葉系幹細胞を培養する処理である、請求項22から24のいずれか一項に記載の方法。
- 処理が、ファイバーからなる3次元構造を有する細胞培養担体を用いて間葉系幹細胞を培養する処理である、請求項22から25のいずれか一項に記載の方法。
- 間葉系幹細胞が、間葉系幹細胞の自家移植療法を受けようとする対象から分離された間葉系幹細胞である、請求項22から26のいずれか一項に記載の方法。
- 間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求項22から27のいずれか一項に記載の方法。
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