JP2024515690A - 疾患の治療のための間葉系間質細胞からの細胞外小胞 - Google Patents
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Abstract
本発明は、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）などの細胞から細胞外小胞（ＥＶ）を得るための方法であって、前記細胞を細胞外マトリックスタンパク質のラミニンα５、ラミニンα４またはそれらの機能的断片からのポリペプチドの存在下またはヒトＭＣＡＭタンパク質の細胞外ドメインを含むポリペプチドの存在下で培養する方法に関する。本発明はさらに、上記方法によって得られる細胞外小胞（ＥＶ）に関する。本ＥＶは、炎症性疾患、虚血性心疾患および急性呼吸窮迫症候群などの病状の治療および予防において有用である。【選択図】図１
Description
本発明は、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）などの細胞から細胞外小胞（ＥＶ）を得るための方法であって、前記細胞を細胞外マトリックスタンパク質のラミニンα５、ラミニンα４またはそれらの機能的断片からのポリペプチドの存在下またはヒトＭＣＡＭタンパク質の細胞外ドメインを含むポリペプチドの存在下で培養する方法に関する。本発明はさらに、上記方法によって得られる細胞外小胞（ＥＶ）に関する。本ＥＶは炎症性疾患、虚血性心疾患および急性呼吸窮迫症候群などの病状の治療および予防において有用である。
細胞外小胞（ＥＶ）は大多数の細胞によって産生される脂質膜で囲まれた小胞である１。ＥＶはタンパク質、核酸および脂質を含有し、かつＥＶの膜上の受容体によって促進される重要な細胞間情報伝達物質として機能する１，２。エキソソーム、マイクロベシクルおよびアポトーシス小体はＥＶの主要なサブタイプを表す。エキソソームは細胞内部で産生され、エンドソーム経路を介して放出され、かつ直径は約３０～１００ｎｍの範囲である。マイクロベシクルは細胞血漿膜から出芽し、かつ約５０～１０００ｎｍの範囲である。アポトーシス小体は細胞死の間に放出され、細胞の様々な部分を含有し、かつ約５０～５０００ｎｍの範囲である。
ＥＶは正常および異常な条件下で各種分子を細胞に送達することができるため、医学のための有望なツールである。従ってＥＶは、各種外来性分子の細胞内への送達のための媒体として使用することができる３～５。また、いくつかの種類の細胞、特に間葉系間質細胞および樹状細胞によって産生されるＥＶは医薬として試験されている６～８。
間葉系間質細胞（ＭＳＣ）はインビトロおよびインビボ試験において、（１）特定の細胞膜マーカー（ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋）の発現、（２）特定のマーカー（ＣＤ１１ｂ－、ＣＤ１４－、ＣＤ３４－、ＣＤ４５－、ＣＤ１９－、ＣＤ７９ａ－、ＨＬＡ－ＤＲ－）の発現の欠如、（３）プラスチック接着、および（４）３胚葉多分化能（骨芽細胞、軟骨細胞および脂肪細胞に分化する能力）によって定められる９。ＭＳＣは骨髄、ホウォートンゼリー、脂肪組織、口腔、心臓および歯などの体の多くの組織および臓器から得ることができる１０。あるいは、ＭＳＣは幹細胞から分化させることができる。ＭＳＣは再生および免疫調節能力を有し、故に各種疾患の治療のための前臨床および臨床試験で使用される１０。ＭＳＣの効果は、少なくとも部分的に傍分泌性であり１１、かつＭＳＣによって産生されるＥＶは主要な傍分泌因子の１つであることが実証されている。ＭＳＣの再生および免疫調節効果とそれらのＥＶとを比較することは難しいが、ＥＶは部分的な効果のみであって、それらの由来元であるＭＳＣよりも弱い効果を発揮するものと広くみなされてきた１２。
重要なことに、ＭＳＣによって産生されるＥＶの生物学的効果は培養条件によって決まる１３。従って、異なる細胞培養条件下においてインビトロで培養した同じＭＳＣによって産生されるＥＶは完全に異なる特性を有している場合があり、それらの生物学的活性において完全に不活性な状態から生物学的に活性な状態まで非常に異なる場合があり、異なる集団のＥＶとみなさなければならない。細胞に生物学的に活性なＥＶを産生させるインビトロでの細胞培養条件を見つけることが重要である。
生細胞は超低温（液体窒素の温度）で貯蔵し、かつ患者への注射前に遠心機および無菌層流フードを用いて前処理しなければならない。細胞の貯蔵および前処理のための機器は大多数の病院で欠いており、これが医学におけるＭＳＣおよびあらゆる他の細胞の使用にかなりの貯蔵および輸送問題を課す。他方、ＥＶは標準的な冷凍庫を用いて貯蔵し、前処理を必要とすることなく解凍直後に患者に注射することができる。従って生物学的に活性なＥＶは、細胞治療の貯蔵および輸送問題を克服することができる。
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質は、全ての臓器および組織において細胞間に存在しており、恒常性および病態生理学的プロセスにとって極めて重要である１４。ＥＣＭは細胞のために機械的支持を与えるだけでなく、細胞の正しい機能および表現型安定性のために必要なシグナル伝達も与える。特に心筋梗塞および心不全を有する患者において、ＥＣＭの異常な再構築と有害な臨床的転帰との間に有力な臨床的証拠が存在する１４。従って、Ｉ型コラーゲンなどのフィブリルコラーゲンの蓄積およびＩＶ型コラーゲンなどの基底膜コラーゲンの減少は、心不全を有する患者における予後不良に関連している１４。罹患した臓器および組織におけるＥＣＭの異常な再構築を防止することは重要な医学的問題である。
マクロファージは炎症反応の重要な調節因子である。それらのうち、Ｍ１マクロファージは炎症反応を促進し、Ｍ２マクロファージは炎症の消散を引き起こす１５。Ｍ１およびＭ２極性化マクロファージは、特定のサイトカインおよび細胞受容体の発現において異なる。従ってＭ２マクロファージは、Ｍ１マクロファージと比較してＩＬ－１０（抗炎症性サイトカイン）とＩＬ－１２発現レベルとの有意により高い比、ＣＤ－２０６のより高い発現およびＣＤ－８０の発現の不存在を特徴とする１６。ＭＳＣは、炎症性疾患のインビトロアッセイおよびインビボモデルにおいてＭ１をＭ２表現型に変換させることができることが分かっている１７。
損傷後の臓器の修復は外部炎症性刺激、例えばＩＬ－６からのシグナルまたは活性酸素種の結果である線維芽細胞の活性化に大きく依存している３０。活性化された線維芽細胞は新規に産生されるＥＣＭの主要源である２７。過剰な数の活性化された線維芽細胞は、過剰な硬化を引き起こす進行した線維症、好ましくないＥＣＭ環境、およびその後に臓器の機能喪失をもたらす場合がある２７。従って左心室の進行した線維症は、心筋梗塞後の患者では心機能不全およびさらには心不全に至る場合がある。活性化された線維芽細胞の１つの重要なマーカーは、血小板由来増殖因子受容体β（ＰＤＧＦＲ－β）である２８，２９。
ラミニン（ＬＮ）は基底膜タンパク質の主要なファミリーであり、α、βおよびγ鎖からなるヘテロ三量体糖タンパク質である１８。これらの鎖はそれぞれ、５、４および３つの遺伝的に特徴的な種類で存在する。それらは鎖の組成に従って命名されており、例えばＬＮ－５１１はα５、β１およびγ１鎖からなる。ラミニンは細胞膜受容体との相互作用を介して細胞にシグナルを伝達し、かつ細胞の機能に大きく影響を与えることができる１８。ＬＮの１つの細胞膜受容体は、同種親和性相互作用することもできるＭＣＡＭ（ＣＤ１４６としても知られている）である１９，２０。ＭＣＡＭの発現はＭＳＣの多分化能と相関している２１，２２。
ラミニンＥ８断片は、α、βおよびγ鎖のＣ末端領域からなる切断型タンパク質である。ラミニンＥ８断片は全長ラミニンの酵素消化によって２５、あるいは組換えタンパク質として２６得ることができる。著しくより小さいサイズであるが、ラミニンＥ８断片は細胞受容体結合のかなりの部分および全長ラミニン分子のシグナル伝達活動を保存している２６。
Ｍａ，Ｙ．ら３１は、増殖培地を含むラミニンでコーティングされた培養皿上でＮＰＣを培養することおよびＥＶを培養物上澄みから単離することを含む、ＥＶを得るための方法を開示している。しかしＭａらは、α５鎖またはα４鎖を含むラミニンなどの具体的なラミニンを開示していない。
国際公開第２０１７／１８６２７３号は、低酸素条件下であって、（ｉ）α５鎖を含む少なくとも１種のラミニンおよび／または（ｉｉ）α４鎖を含む少なくとも１種のラミニンの存在下で間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を培養するための方法を開示している。しかし先行技術では、ヒトラミニンまたはヒトＭＣＡＭポリペプチドの存在下で培養される細胞から得られる細胞外小胞が以前から知られているＥＶと比較して発明の効果を有するという開示は存在しない。従って、医学的治療および予防において向上した有用性などの向上した特性を有するＥＶを得るための新しい方法が必要とされている。
本発明の目的は、上記問題を克服し、かつ医学で使用するための生物学的に活性なＥＶ源を提供することにある。
驚くべきことに、α５もしくはα４鎖を含有するラミニンの存在下、ＭＣＡＭの存在下、あるいはこれらのポリペプチドの組み合わせの存在下で培養したＭＳＣで馴化させた細胞培養培地から単離したＥＶが、（ｉ）心筋梗塞および重症疾患などのいくつかの疾患の動物モデルにおいていくつかの臓器の機能をレスキューし、かつ（ｉｉ）臓器における細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の組成物をレスキューすることが分かった。標準的な条件下で培養した同じＭＳＣから単離したＥＶは臓器の機能をレスキューせず、かつＥＣＭに影響を与えない。別の予期せぬ発見は、ラミニン、ＭＣＡＭまたはそれらの組み合わせの存在下で培養したＭＳＣから単離したＥＶが親のＭＳＣよりも強力な治療効果を示すことである。
従って第１の態様では、本発明は、
（ａ）以下：
（ｉ）ヒトラミニンα５鎖またはその機能的バリアントを含むポリペプチド、
（ｉｉ）ヒトラミニンα４鎖またはその機能的バリアントを含むポリペプチド、および
（ｉｉｉ）ヒトＭＣＡＭの細胞外ドメインまたはその機能的バリアントを含むポリペプチド
からなる群から選択される、少なくとも１種のポリペプチドを含む組成物の存在下で細胞培養培地において多分化能性幹細胞、多分化能性前駆細胞または内皮細胞を培養すること、および
（ｂ）細胞培養培地から細胞外小胞を単離すること
を含む、細胞外小胞（ＥＶ）を得るための方法を提供する。
（ａ）以下：
（ｉ）ヒトラミニンα５鎖またはその機能的バリアントを含むポリペプチド、
（ｉｉ）ヒトラミニンα４鎖またはその機能的バリアントを含むポリペプチド、および
（ｉｉｉ）ヒトＭＣＡＭの細胞外ドメインまたはその機能的バリアントを含むポリペプチド
からなる群から選択される、少なくとも１種のポリペプチドを含む組成物の存在下で細胞培養培地において多分化能性幹細胞、多分化能性前駆細胞または内皮細胞を培養すること、および
（ｂ）細胞培養培地から細胞外小胞を単離すること
を含む、細胞外小胞（ＥＶ）を得るための方法を提供する。
好ましくは、前記「多分化能性幹細胞、多分化能性前駆細胞または内皮細胞」は、多分化能性幹細胞または多分化能性前駆細胞である。
好ましくは、前記多分化能性幹細胞または多分化能性前駆細胞は間葉系間質細胞（ＭＳＣ）である。ＭＳＣは骨髄、ホウォートンゼリー、脂肪組織、口腔、心臓および歯からなる群から選択される提供源から得ることができる。例えばＭＳＣは骨髄から得られる。あるいは、ＭＳＣは幹細胞から分化させるか体幹細胞を含む体細胞から分化転換させることができる。
前記組成物は細胞培養培地に直接存在していても、細胞培養のための基材として使用してもよい。細胞培養のための基材として使用する場合、前記組成物は好ましくは少なくとも２０％、２５％、３０％、４０％、５０％または１００％（ｗ／ｗ）などの少なくとも１０％（ｗ／ｗ）の前記少なくとも１種のポリペプチドを含む。
好ましくは、ヒトラミニンα５もしくはα４鎖またはその機能的バリアントを含む前記ポリペプチドは、β１またはβ２鎖などのヒトラミニンβ鎖、ならびにγ１、γ２またはγ３鎖などのγ鎖をさらに含む。前記βおよびγ鎖はα鎖と共にヘテロ三量体ラミニン構造を形成している。当該ポリペプチドが切断型α５もしくはα４鎖などの機能的バリアントを含む場合、前記βおよびγ鎖は好ましくは切断型βおよびγ鎖などの機能的バリアントに対応している。切断型ラミニン鎖の例はラミニンＥ８断片に含まれる鎖である。
本発明の一態様では、ヒトラミニンα５鎖またはその機能的バリアントを含む前記ポリペプチドは、ラミニンＥ８－５１１などのそのＥ８断片を含む、ラミニン－２０、ラミニン－５２１、ラミニン－５２２およびラミニン－５２３からなる群から選択される。好ましくは、当該ポリペプチドはラミニン－５２１またはラミニンＥ８－５１１である。
好ましくは、ヒトラミニンα５鎖またはその機能的バリアントを含む前記ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１として示されているヒトラミニンα５アミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｉｉ）配列番号１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性などの少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド、および（ｉｉｉ）配列番号１において位置２５３４～３３２３として示されているラミニンα５鎖の断片を含むポリペプチドからなる群から選択される。
本発明の別の態様では、ヒトラミニンα４鎖またはその機能的バリアントを含む前記ポリペプチドは、ラミニンＥ８－４１１などのそのＥ８断片を含む、ラミニン－４１１、ラミニン－４２１、ラミニン－４２２およびラミニン－４２３からなる群から選択される。好ましくは、当該ポリペプチドはラミニン－４２１またはラミニンＥ８－４１１である。
好ましくは、ヒトラミニンα４鎖またはその機能的バリアントを含む前記ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２として示されているヒトラミニンα４アミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｉｉ）配列番号２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性などの少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド、および（ｉｉｉ）配列番号２において位置６３６～１４５６として示されているラミニンα４鎖の断片を含むポリペプチドからなる群から選択される。
本発明のさらなる態様では、ヒトＭＣＡＭの細胞外ドメインまたはその機能的バリアントを含む前記ポリペプチドは、（ｉ）配列番号３または配列番号４として示されているアミノ酸配列を含むポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号３または配列番号４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性などの少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される。配列表に示されているように、配列番号３はヒトＭＣＡＭの全長配列を表し、配列番号４はヒトＭＣＡＭの細胞外ドメインを表す。
任意に、ヒトＭＣＡＭの細胞外ドメインまたはその機能的バリアントを含む前記ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分などの一部に融合されている。ヒトＩｇＧ１の好適なＦｃ部分は、配列番号６として示されているアミノ酸配列を含んでいてもよい。ＩｇＧ１ポリペプチドは、配列番号５として示されているリンカーなどのペプチドリンカーによってＭＣＡＭポリペプチドに結合されていてもよい。ＭＣＡＭ－Ｆｃ融合タンパク質は、好ましくは各単量体がヒトＭＣＡＭポリペプチド、リンカーおよびヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を含むホモ二量体の形態である。好適なＭＣＡＭ－Ｆｃ融合タンパク質はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から商業的に入手可能であり（カタログ番号：９７０９－ＭＡ）、配列番号４、５および６を含む。
本発明によれば、使用される組成物は、（ｉ）ラミニン－５２１とラミニン－４２１との混合物などのα５鎖を含むラミニンとα４鎖を含むラミニンとの混合物、または（ｉｉ）ヒトＭＣＡＭの細胞外ドメインを含むポリペプチドとα５鎖もしくはα４鎖を含む１種以上のラミニンとの混合物などのポリペプチドの混合物を含んでいてもよい。
本発明に係る方法では本細胞外小胞は、Ｗｉｋｌａｎｄｅｒらによって開示されているような当該技術分野で知られている方法によって細胞培養培地から単離することができる１３。好適な方法としては、例えば超遠心分離、ショ糖密度勾配超遠心、分画遠心分離、タンジェンシャルフローろ過、サイズ排除クロマトグラフィおよびそれらの組み合わせが挙げられる。
別の態様では、本発明は、上に開示されている方法によって得られる細胞外小胞（ＥＶ）を提供する。少なくとも１種の薬学的に許容される成分と組み合わせたそのような細胞外小胞を含む医薬組成物も本発明に含まれる。
本発明に係る細胞外小胞は、医療目的のため、特に駆出率が保たれた心不全および駆出率が低下した心不全を含む虚血性および非虚血性心不全；心機能不全；心筋梗塞；先天性心疾患；心筋炎；弁機能不全；急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）；重症疾患ミオパチー（ＣＩＭ）；人工呼吸器誘発性横隔膜機能不全（ＶＩＤＤ）；移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）；実質臓器拒絶反応；細胞もしくは組織移植拒絶反応；クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；関節炎などのリウマチ様疾患；多発性硬化症、ＡＬＳ、サルコイドーシス、特発性肺線維症、乾癬、皮膚炎または湿疹などの炎症誘発性もしくは免疫反応性疾患；食物、動物、植物、医薬品、化学物質、金属または埃に対するアレルギーなどのアレルギー；天疱瘡、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）またはギラン・バレー症候群などの自己免疫疾患；２型糖尿病；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）；インターロイキン１受容体拮抗分子欠損症（ＤＩＲＡ）；子宮内膜症；自己免疫性肝炎；強皮症；筋炎；脳卒中；急性脊髄損傷；脈管炎；腎不全、肝不全、肺不全または心不全などの臓器不全；肺癌および皮膚癌を含む癌；ならびに熱傷および化学的火傷を含む火傷からなる群から選択される病状の治療または予防のために有用である。
本発明に係る細胞外小胞は、特に心臓の虚血再灌流傷害などの心血管疾患または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）などの呼吸器疾患の治療または予防において有用である。
本発明は、それを必要とする対象に本発明に従って得られた治療的有効量の細胞外小胞を投与することを含む、病状の治療または予防のための方法をさらに含む。前記病状は上に記載されているもののいずれか１つであってもよく、特に心臓の虚血再灌流傷害などの心血管疾患および急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）などの呼吸器疾患が挙げられる。
本発明のさらなる態様では、本細胞外小胞は人工弁および生体弁を含む人工器官または移植片などの医療装置のコーティングにおいて有用である。本明細書に開示されている方法によって得られる細胞外小胞でコーティングされたそのような医療装置も本発明に含まれる。
定義
「細胞外小胞またはＥＶ」は、大多数の細胞によって産生される脂質膜で囲まれた小胞である１。ＥＶは、タンパク質、核酸および脂質を含有し、かつＥＶの膜上の受容体によって促進される重要な細胞間情報伝達物質として機能する１，２。「細胞外小胞」という用語は、ＥＶの主要なサブタイプを表すエキソソーム、マイクロベシクルおよびアポトーシス小体を含む。エキソソームは細胞内部で産生され、エンドソーム経路を介して放出され、かつ直径は約３０～１００ｎｍの範囲である。マイクロベシクルは細胞血漿膜から出芽し、かつ約５０～１０００ｎｍの範囲である。アポトーシス小体は細胞死の間に放出され、細胞の様々な部分を含有し、かつ約５０～５０００ｎｍの範囲である。
「細胞外小胞またはＥＶ」は、大多数の細胞によって産生される脂質膜で囲まれた小胞である１。ＥＶは、タンパク質、核酸および脂質を含有し、かつＥＶの膜上の受容体によって促進される重要な細胞間情報伝達物質として機能する１，２。「細胞外小胞」という用語は、ＥＶの主要なサブタイプを表すエキソソーム、マイクロベシクルおよびアポトーシス小体を含む。エキソソームは細胞内部で産生され、エンドソーム経路を介して放出され、かつ直径は約３０～１００ｎｍの範囲である。マイクロベシクルは細胞血漿膜から出芽し、かつ約５０～１０００ｎｍの範囲である。アポトーシス小体は細胞死の間に放出され、細胞の様々な部分を含有し、かつ約５０～５０００ｎｍの範囲である。
「多分化能性幹細胞」という用語は、（ｉ）１つ以上の種類の体細胞（完全分化細胞）および（ｉｉ）それらの高い増殖能をもたらすそのような細胞の能力を指す。「多分化能性前駆細胞」という用語は、体細胞の直接的な先祖である多分化能性細胞を指す。「多分化能性」という用語は、別々の細胞型または体細胞の１つのみの細胞型に分化する能力を意味する。但し幹細胞とは異なり、前駆細胞は限られた増殖能を有する。
「内皮細胞」は、管腔内の循環血液またはリンパと血管壁の残りとの界面を形成する血管およびリンパ管の内面を覆う薄膜内皮を作り出す細胞である。
「間葉系間質細胞」または「ＭＳＣ」という用語は、以下の定義：インビトロおよびインビボ試験における（１）特定の細胞膜マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の発現、（２）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ７９ａおよびＨＬＡ－ＤＲの発現の欠如、（３）プラスチック接着、および（４）３胚葉多分化能（骨芽細胞、軟骨細胞および脂肪細胞に分化する能力）に従う細胞を指す９。ＭＳＣは全てではないとしても骨髄、ホウォートンゼリー、脂肪組織、口腔、心臓および歯などの体の多くの組織および臓器から得ることができる１０。あるいは、ＭＳＣは幹細胞から分化させるか細胞の他の種類から分化転換させることができる。例えば、ＭＳＣはヒトの多能性細胞から分化させることができる。
「生物学的に活性な」または「活性な」ＥＶという用語は、疾患、特に炎症性疾患のインビボモデルにおいて臓器および組織の機能を著しく向上させるそれらの能力を指す。
「馴化培地」という用語は、細胞と接触しており、かつ細胞によって産生される因子を含有する細胞培養培地を指す。
「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、そのサイズまたは機能に関わらず２０個のタンパク質アミノ酸またはアミノ酸類似体からなるポリマーを指す。従って例示的なポリペプチドとしては、遺伝子産物、天然に生じるか未変性のタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片および他の同等物、上記のバリアントおよび類似体が挙げられる。
「基材」または「基板」という用語は、生物（細胞）が住んでいる表面を指す。前記表面は、多分化能性幹細胞、多分化能性前駆細胞および内皮細胞などの細胞を培養するのに適している。基材を使用して、細胞の培養のための細胞培養皿、ビーズ、多孔構造体、バイオリアクターのためのマイクロキャリア、バイオリアクターの内面、または細胞を培養するのに適した他の表面などの支持表面をコーティングすることができる。
本明細書および特許請求の範囲によれば、特定の特徴「を含む」生成物または方法への言及は、それがそれらの特徴を含むが本発明を実施不可能にさせない限り他の特徴の存在を排除しないという意味として解釈されるべきである。本発明に係る化合物または組成物に関して「本質的に～からなる」という用語は、特定のさらなる成分、すなわちその化合物または組成物の本質的な特性に実質的に影響を与えないものが存在してもよいことを意味する。
「バリアント」という用語は、１つ以上のアミノ酸（例えば１つ以上のアミノ酸の置換、逆位、挿入（付加）または欠失）だけ参照タンパク質とは異なるアミノ酸配列を指すように本明細書で使用される。参照タンパク質のバリアントは、参照タンパク質の断片のバリアントも指す。バリアントは、バリアントが本明細書に記載されている参照タンパク質の活性のいくつかまたは全てを保持している「機能的バリアント」であってもよい。
「断片」という用語は、タンパク質を参照して使用する場合、参照タンパク質それ自体と比較した場合にアミノ酸残基が欠失されているが残りのアミノ酸配列は参照タンパク質中の対応する位置と通常は同一であるタンパク質を指す。そのような欠失は参照タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端あるいは両方で生じる可能性がある。また断片は「機能的断片」であってもよく、その場合、断片は本明細書に記載されている参照タンパク質の活性のいくつかまたは全てを保持している。機能的断片はラミニンＥ８断片などの切断型断片であってもよい（以下を参照）。
本発明に係るポリペプチドおよび組成物に関する「活性」および「機能的」という用語は、例えば（１）活性もしくは機能的ポリペプチドの存在下で培養した細胞が、本発明の実施例に記載されているように線維芽細胞の過剰な活性化の阻害により炎症性疾患の動物モデルにおいて臓器および組織中のＥＣＭの異常な再構築を防止することができるＥＶを産生する、（２）活性もしくは機能的ポリペプチドの存在下で培養した細胞が、本発明の実施例に記載されているようにインビトロアッセイにおいてＭ１をＭ２マクロファージに変換することができるＥＶを産生する、（３）活性もしくは機能的ポリペプチドの存在下で培養した細胞が、炎症性疾患のインビボ治療においてＭ１をＭ２マクロファージに変換することができるＥＶを産生する、（４）活性もしくは機能的ポリペプチドの存在下で培養した細胞が、動物モデルおよび患者における炎症性疾患を治療することができるＥＶを産生する、（５）活性もしくは機能的ポリペプチドがそれらの由来元であるタンパク質と同様に、インテグリン、ジストログリカン受容体、ルテラン受容体およびＭＣＡＭなどの細胞の表面上の細胞受容体に結合することができる、および（６）活性もしくは機能的ポリペプチドがそれらの由来元であるタンパク質と同様のシグナル伝達を細胞内部で誘導することができる、という特徴のうちの１つ以上の特徴を指す。
ラミニンの機能的断片の１つの例はそのＥ８断片である。「ラミニンＥ８断片」という用語は、α、βおよびγ鎖のＣ末端領域からなる約１５０ｋＤａの切断型タンパク質を指す。ラミニンＥ８断片は、α鎖のラミニン球状１－３ドメインを含む活性なインテグリン結合部位を含有する。前記球状１－３ドメインは、ラミニンα５鎖（配列番号１）の位置２７３６～３２９２およびラミニンα４鎖（配列番号２）の位置８３３～１４０２によって表される。ラミニンＥ８断片は、配列番号１における位置２５３４～３３２３によって表されるα５鎖または配列番号２において位置６３６～１４５６によって表されるα４鎖を含んでいてもよい。
本発明によれば、医薬組成物は、溶媒、緩衝液、担体、安定化剤、防腐剤などの各種薬学的に許容される成分を含んでいてもよい。「薬学的に許容される」という用語は、一般に安全であり、非毒性であり、かつ生物学的またはそれ以外のどちらにおいても望ましくないものでない医薬組成物を調製するのに有用であることを意味し、かつ獣医学用途ならびにヒトの医薬用途のために有用であることを含む。
実験方法
細胞培養基材
ヒト組換えラミニンはＢｉｏＬａｍｉｎａ ＡＢ社（スウェーデン）から購入した。ヒト組換えＥ８ラミニン分子はＡＭＳＢＩＯ社（英国）から購入した。
細胞培養基材
ヒト組換えラミニンはＢｉｏＬａｍｉｎａ ＡＢ社（スウェーデン）から購入した。ヒト組換えＥ８ラミニン分子はＡＭＳＢＩＯ社（英国）から購入した。
組換えヒトＭＣＡＭのＦｃキメラはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した（カタログ番号：９７０９－ＭＡ）。このキメラはジスルフィド結合されたホモ二量体であり、この各単量体は、（ｉ）ヒトＭＣＡＭ（Ｖａｌ２４－Ｇｌｙ５５９、配列番号４）、（ｉｉ）ペプチドリンカーＩＥＧＲＭＤ（配列番号５）、および（ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（配列番号６）を含む。
細胞培養皿のコーティング
ラミニンコーティング：ＴＰＰ社（スイス）製の組織細胞培養プレートを、全てがリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に１０μｇ／ｍｌ（１．５μｇ／ｃｍ２）の濃度のヒト組換えラミニン－５２１、ラミニン－４２１またはラミニン－１１１などのラミニンの無菌溶液を用いて＋４℃で一晩コーティングした。２種類のラミニンの混合物を使用する場合、それらをそれぞれ０．７５μｇ／ｃｍ２の濃度で等しい重量：重量比で取った。
ラミニンコーティング：ＴＰＰ社（スイス）製の組織細胞培養プレートを、全てがリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に１０μｇ／ｍｌ（１．５μｇ／ｃｍ２）の濃度のヒト組換えラミニン－５２１、ラミニン－４２１またはラミニン－１１１などのラミニンの無菌溶液を用いて＋４℃で一晩コーティングした。２種類のラミニンの混合物を使用する場合、それらをそれぞれ０．７５μｇ／ｃｍ２の濃度で等しい重量：重量比で取った。
ラミニンＥ８断片コーティング：ＴＰＰ社（スイス）製の組織細胞培養プレートをＰＢＳ中に１．５μｇ／ｃｍ２の濃度のＥ８ラミニン－５１１およびＥ８ラミニン－４１１などのラミニンＥ８断片の無菌溶液を用いて＋４℃で一晩コーティングした。
ＭＣＡＭコーティング：ＴＰＰ社（スイス）製の２５ｃｍ２の細胞培養表面処理済みフラスコを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に４．２μｇ／ｍｌ（０．５μｇ／ｃｍ２）の濃度の組換えヒトＭＣＡＭキメラ分子の無菌溶液を用いて＋４℃で一晩コーティングした。
本発明の以下の実施例における「ＭＣＡＭキメラ分子」という用語は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した配列番号４、５および６を含むＭＣＡＭ－Ｆｃ融合タンパク質を指す（カタログ番号：９７０９－ＭＡ）。
使用前にフラスコを＋３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、予め温めた細胞培養培地を添加した。
ＭＳＣの培養
骨髄由来ＭＳＣ（ＢＭ－ＭＳＣ）を、１０％ウシ血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）が添加された低グルコース（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、あるいはＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）ＭＳＣ増殖培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）において、コーティングを有するか有しない細胞培養表面処理済みフラスコ上で培養した。継代のために細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＧＩＢＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ社、米国）への約５分間の曝露によりフラスコから除去した。次に、培養培地を添加してＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを阻害し、細胞懸濁液を１８０×ｇおよび室温で５分間遠心分離し、上澄みを捨てた。その後に、細胞を予め温めた培養培地に再懸濁させ、計数し、約６０００細胞／ｃｍ２で播種した。全ての培養を加湿された細胞培養インキュベータの中で５％ＣＯ２中＋３７℃で行った。
骨髄由来ＭＳＣ（ＢＭ－ＭＳＣ）を、１０％ウシ血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）が添加された低グルコース（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、あるいはＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）ＭＳＣ増殖培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）において、コーティングを有するか有しない細胞培養表面処理済みフラスコ上で培養した。継代のために細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＧＩＢＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ社、米国）への約５分間の曝露によりフラスコから除去した。次に、培養培地を添加してＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを阻害し、細胞懸濁液を１８０×ｇおよび室温で５分間遠心分離し、上澄みを捨てた。その後に、細胞を予め温めた培養培地に再懸濁させ、計数し、約６０００細胞／ｃｍ２で播種した。全ての培養を加湿された細胞培養インキュベータの中で５％ＣＯ２中＋３７℃で行った。
培養した細胞からの細胞外小胞の単離
９０％のコンフルエンシーになるまで上記のように細胞を培養した。その後に培地を、血清を含まないＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、米国）に変え、細胞を加湿された細胞培養インキュベータの中で５％ＣＯ２中＋３７℃でさらに４８時間インキュベートした。培地（馴化培地）を回収し、１２０×ｇで１０分間遠心分離して浮遊細胞を除去し、次いで３００×ｇでさらに１０分間遠心分離して細胞デブリを除去した。その後に、０．２μｍのフィルタを用いて培地を濾過し、１１０，０００×ｇでの１時間の超遠心分離を用いてＥＶを回収し、少量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に可溶化した。ＥＶの調製をＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ５００を用いて分析してＥＶのサイズ分布および濃度を決定した。
９０％のコンフルエンシーになるまで上記のように細胞を培養した。その後に培地を、血清を含まないＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、米国）に変え、細胞を加湿された細胞培養インキュベータの中で５％ＣＯ２中＋３７℃でさらに４８時間インキュベートした。培地（馴化培地）を回収し、１２０×ｇで１０分間遠心分離して浮遊細胞を除去し、次いで３００×ｇでさらに１０分間遠心分離して細胞デブリを除去した。その後に、０．２μｍのフィルタを用いて培地を濾過し、１１０，０００×ｇでの１時間の超遠心分離を用いてＥＶを回収し、少量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に可溶化した。ＥＶの調製をＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ５００を用いて分析してＥＶのサイズ分布および濃度を決定した。
マウスにおける虚血再灌流傷害のモデル化およびＥＶによる治療
全ての動物実験はスウェーデンの農業委員会のガイドラインに従って行い、倫理委員会によって認可された。マウスにイソフルランによる一般的な麻酔をかけ、経口挿管し、齧歯類のために設計された人工呼吸器システムによって人工呼吸させた。左側の開胸により心臓を露出し、心膜を開き、次に左前下行枝動脈（ＬＡＤ）を細いチューブの上で４０分間結紮し（７－０ポリプロピレン縫合）、その後にチューブを除去し、それにより血流を回復させた。心臓を再灌流し、過去に虚血性であった領域に最大３０μｌの総量でＥＶ（または対照溶液）を注射した。全ての注射を盲検で行った。６－０ポリプロピレンモノフィラメント縫合糸で開胸を閉じ、層ごとに閉じた。吸入麻酔を停止し、その後にマウスは目覚め、最初の数時間にわたって経過観察した。全ての手順を盲検で行った。Ｐｄｇｆｒｂ遺伝子発現の分析のために注射から２４時間後にマウスを屠殺し、その後のＲＮＡ単離のために心臓全体を得た（以下のｍＲＮＡの定量化を参照）。
全ての動物実験はスウェーデンの農業委員会のガイドラインに従って行い、倫理委員会によって認可された。マウスにイソフルランによる一般的な麻酔をかけ、経口挿管し、齧歯類のために設計された人工呼吸器システムによって人工呼吸させた。左側の開胸により心臓を露出し、心膜を開き、次に左前下行枝動脈（ＬＡＤ）を細いチューブの上で４０分間結紮し（７－０ポリプロピレン縫合）、その後にチューブを除去し、それにより血流を回復させた。心臓を再灌流し、過去に虚血性であった領域に最大３０μｌの総量でＥＶ（または対照溶液）を注射した。全ての注射を盲検で行った。６－０ポリプロピレンモノフィラメント縫合糸で開胸を閉じ、層ごとに閉じた。吸入麻酔を停止し、その後にマウスは目覚め、最初の数時間にわたって経過観察した。全ての手順を盲検で行った。Ｐｄｇｆｒｂ遺伝子発現の分析のために注射から２４時間後にマウスを屠殺し、その後のＲＮＡ単離のために心臓全体を得た（以下のｍＲＮＡの定量化を参照）。
超音波心臓検査法
長期実験のために、外科手術の前日、外科手術の翌日、外科手術後１４日および２８日目に、マウスを一般的な麻酔（イソフルラン）下で超音波心臓検査法に供した。これらの時点で左心室の局所および全体の機能を調べてベースライン（１日目）と比較した。全ての分析を盲検で行った。
長期実験のために、外科手術の前日、外科手術の翌日、外科手術後１４日および２８日目に、マウスを一般的な麻酔（イソフルラン）下で超音波心臓検査法に供した。これらの時点で左心室の局所および全体の機能を調べてベースライン（１日目）と比較した。全ての分析を盲検で行った。
集中治療室（ＩＣＵ）ラットモデル
成体の雌のＳＤラットを５日間にわたって制御された機械的換気、神経筋遮断および深鎮静に曝した２３，２４。全てのラットを機械的に換気し、イソフルランで鎮静させ（最小肺胞内濃度＜０．５％に維持し、かつ血行動態の安定性を維持するように調整し）、かつコブラトキシンでシナプス後性に薬理学的に麻痺させた（持続注入（１８７ｍｇ／日）により維持した）。機械的換気期間を通して、全ての実験動物においてタンパク質および体液平衡を維持した。５日間の実験期間の最後に、あるいはラットが悪化した場合に、動物を安楽死させた。
成体の雌のＳＤラットを５日間にわたって制御された機械的換気、神経筋遮断および深鎮静に曝した２３，２４。全てのラットを機械的に換気し、イソフルランで鎮静させ（最小肺胞内濃度＜０．５％に維持し、かつ血行動態の安定性を維持するように調整し）、かつコブラトキシンでシナプス後性に薬理学的に麻痺させた（持続注入（１８７ｍｇ／日）により維持した）。機械的換気期間を通して、全ての実験動物においてタンパク質および体液平衡を維持した。５日間の実験期間の最後に、あるいはラットが悪化した場合に、動物を安楽死させた。
単球由来マクロファージの単離およびＭ１極性化への分化
ウプサラのＢｌｏｄｃｅｎｔｒａｌｅｎにおいて雄の健康なドナーからの軟膜を得た。ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＣＰＴ（商標）管（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国）を用いて、ヒトの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を軟膜から単離した。単球を単離するために、抗ヒトＣＤ１４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に結合させた磁気ビーズを用いて磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）により細胞を選別した。非極性化マクロファージを得るために、１０％ウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）、５％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）および２５ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＵＫ）が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）において単球を６日間培養した。Ｍ１極性化を達成するために、追加で非極性化マクロファージに１０ｎｇ／ｍＬのインターフェロン－γ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＵＫ）および大腸菌からの１００ｎｇ／ｍＬのリポ多糖（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を４８時間添加した。全ての培養を、加湿された細胞培養インキュベータの中で５％ＣＯ２中＋３７℃で行った。
ウプサラのＢｌｏｄｃｅｎｔｒａｌｅｎにおいて雄の健康なドナーからの軟膜を得た。ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＣＰＴ（商標）管（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国）を用いて、ヒトの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を軟膜から単離した。単球を単離するために、抗ヒトＣＤ１４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に結合させた磁気ビーズを用いて磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）により細胞を選別した。非極性化マクロファージを得るために、１０％ウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）、５％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）および２５ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＵＫ）が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）において単球を６日間培養した。Ｍ１極性化を達成するために、追加で非極性化マクロファージに１０ｎｇ／ｍＬのインターフェロン－γ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＵＫ）および大腸菌からの１００ｎｇ／ｍＬのリポ多糖（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を４８時間添加した。全ての培養を、加湿された細胞培養インキュベータの中で５％ＣＯ２中＋３７℃で行った。
ＥＶアッセイによるＭ１からＭ２マクロファージへの変換
各実験のために、上記のように５×１０５個のＰＢＭＣをＭ１マクロファージに分化させた。Ｍ１からＭ２マクロファージへの変換の有効性を試験するために、１×１０９個のＥＶを細胞に添加し、さらに３日間培養した。その後に細胞を２つの等しい部分に細分した。それらのうちの一方を、Ｍ１マクロファージのマーカーであるＣＤ－８０の発現についてＦＡＣＳを用いて分析し、他方を使用して、ＩＬ－１０およびＩＬ－１２ｍＲＮＡの発現のその後の分析のためにｍＲＮＡを調製した。全ての実験を３回行った。
各実験のために、上記のように５×１０５個のＰＢＭＣをＭ１マクロファージに分化させた。Ｍ１からＭ２マクロファージへの変換の有効性を試験するために、１×１０９個のＥＶを細胞に添加し、さらに３日間培養した。その後に細胞を２つの等しい部分に細分した。それらのうちの一方を、Ｍ１マクロファージのマーカーであるＣＤ－８０の発現についてＦＡＣＳを用いて分析し、他方を使用して、ＩＬ－１０およびＩＬ－１２ｍＲＮＡの発現のその後の分析のためにｍＲＮＡを調製した。全ての実験を３回行った。
ＩＬ－１０についてのＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
酵素結合ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ（ＥＬＩＳｐｏｔ）キット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国ミネソタ州ミネアポリス）を用い、製造業者の説明書に従ってＰＢＭＣ産生ＩＬ－１０を検出した。簡単に言えば、１０００万個のＰＢＭＣを２００万個の細胞／ｍｌの濃度で５％のＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ培地に再懸濁させ、各種調製物からの４×１０９個のＥＶの存在下で、２５Ｇｙで予め照射した別のドナーからの１０００万個のＰＢＭＣと混合することにより活性化させた。これらの細胞をキットと共に提供されるＩＬ－１０に対する抗体で予めコーティングした９６ウェルプレート（１ウェル当たり１００μｌ）に添加し、２４時間インキュベートした。その後に、これらの細胞を洗い流し、ビオチン化抗体を添加し、このプレートを＋４℃で一晩インキュベートした。そのシグナルを５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－リン酸／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を用いて可視化し、そのコロニーを各ウェルにおいて計数した。全ての実験を４回行った。
酵素結合ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ（ＥＬＩＳｐｏｔ）キット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国ミネソタ州ミネアポリス）を用い、製造業者の説明書に従ってＰＢＭＣ産生ＩＬ－１０を検出した。簡単に言えば、１０００万個のＰＢＭＣを２００万個の細胞／ｍｌの濃度で５％のＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ培地に再懸濁させ、各種調製物からの４×１０９個のＥＶの存在下で、２５Ｇｙで予め照射した別のドナーからの１０００万個のＰＢＭＣと混合することにより活性化させた。これらの細胞をキットと共に提供されるＩＬ－１０に対する抗体で予めコーティングした９６ウェルプレート（１ウェル当たり１００μｌ）に添加し、２４時間インキュベートした。その後に、これらの細胞を洗い流し、ビオチン化抗体を添加し、このプレートを＋４℃で一晩インキュベートした。そのシグナルを５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－リン酸／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を用いて可視化し、そのコロニーを各ウェルにおいて計数した。全ての実験を４回行った。
ＦＡＣＳ分析
これらの細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ハンクス緩衝液中に２％ウシ胎児血清、０．１％窒化ナトリウム）に再懸濁させ、ＣＤ－８０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）に対する抗体で染色し、氷上および暗所でＰＥ蛍光体による標識を１時間行った。次いで、これらの細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）で分析した。対照細胞を同様にＰＥで標識したアイソタイプの対照抗体と共にインキュベートした。データを分析し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いてＣＤ－８０陽性細胞の割合を決定した。
これらの細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ハンクス緩衝液中に２％ウシ胎児血清、０．１％窒化ナトリウム）に再懸濁させ、ＣＤ－８０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）に対する抗体で染色し、氷上および暗所でＰＥ蛍光体による標識を１時間行った。次いで、これらの細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）で分析した。対照細胞を同様にＰＥで標識したアイソタイプの対照抗体と共にインキュベートした。データを分析し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いてＣＤ－８０陽性細胞の割合を決定した。
ｍＲＮＡの定量化
ＲＮＡｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ社、米国）を用い、製造業者の説明書に従って、細胞またはマウスの心臓全体から全ＲＮＡを単離した。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）を用い、製造業者の説明書に従って、２０μＬの反応混合物中に０．２μｇの全ＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成した。ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社、米国）を用いて、ＩＬ－１０およびＩＬ－１２ｍＲＮＡの発現のために定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）Ｔａｑｍａｎアッセイを行った。目的のメッセンジャーＲＮＡのためのプライマーおよびプローブを含む先に開発された遺伝子発現アッセイミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）を用いて、全ての反応を４回行った。さらに各実験はＲＮＡインプットの正規化のためにＧＡＰＤＨのためのアッセイミックスを含んでいた。全てのデータをＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒバージョン３．０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いて分析した。
ＲＮＡｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ社、米国）を用い、製造業者の説明書に従って、細胞またはマウスの心臓全体から全ＲＮＡを単離した。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）を用い、製造業者の説明書に従って、２０μＬの反応混合物中に０．２μｇの全ＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成した。ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社、米国）を用いて、ＩＬ－１０およびＩＬ－１２ｍＲＮＡの発現のために定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）Ｔａｑｍａｎアッセイを行った。目的のメッセンジャーＲＮＡのためのプライマーおよびプローブを含む先に開発された遺伝子発現アッセイミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）を用いて、全ての反応を４回行った。さらに各実験はＲＮＡインプットの正規化のためにＧＡＰＤＨのためのアッセイミックスを含んでいた。全てのデータをＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒバージョン３．０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いて分析した。
統計
統計的有意性は、不等分散のためのスチューデントの両側ｔ検定により決定した。
統計的有意性は、不等分散のためのスチューデントの両側ｔ検定により決定した。
実施例１：マウスの心臓の虚血再灌流傷害の治療のためにヒトの骨髄間葉系間質細胞から単離した細胞外小胞（ＥＶ）
同じ数の分割を経た骨髄間葉系間質細胞を、（１）標準的な条件下での標準的なＥＶの調製物を得るために１０％のウシ血清が添加された低グルコースを含むＤＭＥＭ内のプラスチック上、および（２）生物学的に活性なＥＶ（ｂａＥＶ）の調製物を得るためのＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）ＭＳＣ増殖培地中のラミニン－５２１上で培養した。ＥＶおよびｂａＥＶの両方を「実験方法」という見出しで上に記載されているように単離した。治療可能性を比較するために、心臓の虚血再灌流傷害を有する２４匹のマウスを３つの等しい群、すなわち（１）ＰＢＳで治療した対照群（８匹の動物）、（２）ＢＭ－ＭＳＣの標準的な培養物から単離した４×１０９個のＥＶで治療したＥＶ群、および（３）ラミニン上で培養したＢＭ－ＭＳＣから単離した４×１０９個のｂａＥＶで治療したｂａＥＶ群に分けた。全ての治療を上記のように行った。治療から４週間後に対照マウスは、心臓の機能の有意な低下を示す左心室駆出率（ＬＶＥＦ）および左室内径短縮率の有意な低下を示した（図１Ａおよび図１Ｂ）。標準的なＥＶで治療したマウスは対照群との統計的有意差を示さなかった。対照的に、生物学的に活性なＥＶで治療したマウスは、両パラメータが正常な健康な心臓のための範囲である状態で有意に（ｐ＜０．０５）より高いＬＶＥＦおよび左室内径短縮率を示し、これはｂａＥＶが虚血再灌流傷害後に心臓の機能を保存していたことを示している。
ＥＣＭの異常な再構築は心不全の主要な機序であり、かつ活性化された線維芽細胞は新規に産生されるＥＣＭの主要源であるため（「背景技術」の箇所を参照）、活性化された線維芽細胞ＰＢＧＦＲ－βのマーカーの発現レベルを注射から２４時間後に、ＥＶの各種調製物およびＰＢＳで治療した再灌流傷害を有するマウスの心臓において比較した（図２）。各実験群は再灌流傷害を有する４匹のマウスを含んでいた。これらの群を、（１）ＰＢＳ、（２）ＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）ＭＳＣ増殖培地内のプラスチック上で培養したＢＭ－ＭＳＣから単離した４×１０９個のＥＶ、（３）ＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）ＭＳＣ増殖培地内のラミニン－５２１上で培養したＢＭ－ＭＳＣから単離した４×１０９個のＥＶ、および（４）ＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）ＭＳＣ増殖培地内のラミニン－４２１上で培養したＢＭ－ＭＳＣから単離した４×１０９個のＥＶで治療した。ラミニン－５２１またはラミニン－４２１上で培養した細胞から産生されたＥＶでの治療により、ＰＢＳでの治療と比較して、活性化された線維芽細胞ＰＢＧＦＲ－βのマーカーの発現レベルが有意に低下し、プラスチック上で培養した細胞から産生されたＥＶでの治療ではそのような効果は示されなかった（図２）。
実施例２：ＩＣＵラットモデルにおける生物学的に活性なＥＶおよびそれらの親のＢＭ－ＭＳＣの治療効果
骨髄ＭＳＣを「実験方法」という見出しで上に記載されているように、１０％ウシ血清が添加された低グルコースを含むＤＭＥＭ内のラミニン－５２１およびラミニン－４２１の混合物上で培養した。ＭＳＣは、（１）ＩＣＵラットモデルの治療のために生物学的に活性なＥＶを単離するために使用し、（２）ヒトのＡＲＤＳおよび人工呼吸器誘発性横隔膜機能不全（ＶＩＤＤ）に関連するＩＣＵラットモデルの治療のために直接使用した（Ｄｗｏｒｋｉｎら２３を参照）。ＩＣＵラットモデルの誘導のために１５匹のラットを使用し、それぞれ５匹の動物を含む３つの群に細分した。対照、ｂａＥＶおよびＭＳＣ群を実験の開始時に、それぞれ１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水、３．６×１０９個のｂａＥＶおよび５０万個のＭＳＣの静脈内投与により治療した。ＥＶおよびＭＳＣの両方を１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁させた。ＥＶ濃度測定によれば、５０万個のＭＳＣは約４×１０９個のＥＶを産生し、従ってこれらの数の細胞とＥＶの治療の効果とを直接比較することができた。ｂａＥＶ群の全てのラットが実験の終了時まで生存していたが、対照およびＭＳＣ群の両方は有意により高い死亡率を示し（図３）、これは親の細胞と比較してｂａＥＶの有意により高い治療効果を示している。
実施例３：インビトロ免疫学的検定において、プラスチックおよびラミニン－１１１上で培養したＭＳＣから単離したＥＶの活性と比較したラミニン－５２１、ラミニン－４２１、Ｅ８ラミニン－５１１断片、Ｅ８－ラミニン－４１１断片またはＭＣＡＭキメラ分子上で培養したＢＭ－ＭＳＣから単離したＥＶの活性
「実験方法」という見出しで上に記載されているように、ラミニン－５２１、ラミニン－４２１、Ｅ８ラミニン－５１１断片、Ｅ８ラミニン－４１１断片、ＭＣＡＭキメラ分子、ラミニン－１１１あるいはプラスチック上で培養したＭＳＣからＥＶ調製物を単離した。それらの生物学的活性を比較するために、「実験方法」という見出しで上に記載されているように５種類のＥＶ調製物からのＥＶを用いてＭ１からＭ２への変換アッセイを行い（「ＥＶアッセイによるＭ１からＭ２へのマクロファージの変換」）、「実験方法」という見出しで上に記載されているように、ＦＡＣＳおよびｑＲＴ－ＰＣＲを用いて分析した。ラミニン－５２１、ラミニン－４２１、Ｅ８ラミニン－５１１断片、Ｅ８ラミニン－４１１またはＭＣＡＭキメラ分子上で培養したＭＳＣから単離したＥＶで治療したマクロファージは、Ｍ２マクロファージに特徴的な有意に（ｐ＜０．０１）より高いＩＬ－１０／ＩＬ－１２のｍＲＮＡ比およびＬＮ－１１１またはプラスチック（対照）上で培養したＭＳＣによって産生されたＥＶで治療した細胞よりも有意に（ｐ＜０．０１）より低いＭ１マクロファージのマーカーであるＣＤ－８０陽性細胞の割合を示した（図４Ａおよび図４Ｂ）。ＩＬ－１０／ＩＬ－１２ｍＲＮＡ比の増加は、Ｍ２マクロファージの有意により高い存在を示し、ＣＤ－８０細胞の割合の低下はＭ１の有意により低い存在を示し、これは標準的な条件下またはラミニン－１１１上で培養した同じＭＳＣから単離したＥＶと比較して、ラミニン－５２１、ラミニン－４２１、Ｅ８ラミニン－５１１断片、Ｅ８ラミニン－４１１またはＭＣＡＭキメラ分子上で培養したＭＳＣから単離したＥＶによる有意により高いＭ１からＭ２への変換を示している。
インビトロ免疫学的検定においてＥＶ調製物の活性をさらに調べるために、本発明者らは「実験方法」という見出しで上に記載されているように、ＥＶ調製物の追加により、活性化されたヒトＰＢＭＣに対してＩＬ－１０ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行った（「ＩＬ－１０」のためのＥＬＩＳｐｏｔアッセイ）。ラミニン－５２１、ラミニン－４２１、Ｅ８ラミニン－５１１断片、Ｅ８ラミニン－４１１またはＭＣＡＭキメラ分子上で培養したＭＳＣから単離したＥＶで治療した活性化されたＰＢＭＣは、ＬＮ－１１１またはプラスチック（対照）上で培養したＭＳＣによって産生されたＥＶで治療した細胞よりも有意に（ｐ＜０．０１）高い数の抗炎症性サイトカインであるＩＬ－１０コロニーを示した（図５）。
結論：ラミニン－５２１、ラミニン－４２１、Ｅ８ラミニン－５１１断片、Ｅ８ラミニン－４１１またはＭＣＡＭ上で培養したＭＳＣから単離したＥＶは、プラスチック上で増殖させたＭＳＣから産生されたＥＶ（対照ＥＶ）とは異なる集団とみなすべきであり、それは、
・それらはインビボアッセイにおいて臓器の機能を正常化させるが、対照ＥＶはそうすることができず、
・それらは線維芽細胞の過剰な活性化を阻害し、従って損傷後の臓器におけるＥＣＭの異常な再構築を妨げるが、対照ＥＶはそうすることができず、
・それらはインビトロアッセイにおいて炎症反応の重要な調節因子に有意により強力な影響を与える
という理由からである。
・それらはインビボアッセイにおいて臓器の機能を正常化させるが、対照ＥＶはそうすることができず、
・それらは線維芽細胞の過剰な活性化を阻害し、従って損傷後の臓器におけるＥＣＭの異常な再構築を妨げるが、対照ＥＶはそうすることができず、
・それらはインビトロアッセイにおいて炎症反応の重要な調節因子に有意により強力な影響を与える
という理由からである。
参考文献
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Claims (23)
- （ａ）以下：
（ｉ）ヒトラミニンα５鎖またはその機能的バリアントを含むポリペプチド、
（ｉｉ）ヒトラミニンα４鎖またはその機能的バリアントを含むポリペプチド、および
（ｉｉｉ）ヒトＭＣＡＭの細胞外ドメインまたはその機能的バリアントを含むポリペプチド
からなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドを含む組成物の存在下で細胞培養培地において多分化能性幹細胞、多分化能性前駆細胞または内皮細胞を培養すること、および
（ｂ）前記細胞培養培地から細胞外小胞を単離すること
を含む、細胞外小胞（ＥＶ）を得るための方法。 - 前記多分化能性幹細胞または多分化能性前駆細胞は間葉系間質細胞（ＭＳＣ）である、請求項１に記載の方法。
- 前記ＭＳＣは骨髄、ホウォートンゼリー、脂肪組織、口腔、心臓および歯からなる群から選択される提供源から得られる、請求項２に記載の方法。
- 前記ＭＳＣは幹細胞から分化させるか体細胞から分化転換させる、請求項２に記載の方法。
- 前記組成物は細胞培養のための基材として使用し、かつ少なくとも１０％（ｗ／ｗ）の前記少なくとも１種のポリペプチドを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
- ヒトラミニンα５鎖またはその機能的バリアントを含む前記ポリペプチドは、そのＥ８断片を含む、ラミニン－５１１、ラミニン－５２１、ラミニン－５２２およびラミニン－５２３からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
- ヒトラミニンα５鎖またはその機能的バリアントを含む前記ポリペプチドはラミニン－５２１またはラミニンＥ８－５１１である、請求項６に記載の方法。
- ヒトラミニンα５鎖またはその機能的バリアントを含む前記ポリペプチドは、
（ｉ）配列番号１として示されているラミニンα５鎖アミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド、および
（ｉｉｉ）配列番号１において位置２５３４～３３２３として示されているラミニンα５鎖の断片を含むポリペプチド
からなる群から選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。 - ヒトラミニンα４鎖またはその機能的バリアントを含む前記ポリペプチドは、そのＥ８断片を含む、ラミニン－４１１、ラミニン－４２１、ラミニン－４２２およびラミニン－４２３からなる群から選択される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
- ヒトラミニンα４鎖またはその機能的バリアントを含む前記ポリペプチドは、ラミニン－４２１またはラミニンＥ８－４１１である、請求項９に記載の方法。
- ヒトラミニンα４鎖またはその機能的バリアントを含む前記ポリペプチドは、
（ｉ）配列番号２として示されているラミニンα４鎖アミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号２と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド、および
（ｉｉｉ）配列番号２において位置６３６～１４５６として示されているラミニンα４鎖の断片を含むポリペプチド
からなる群から選択される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。 - ヒトＭＣＡＭの細胞外ドメインまたはその機能的バリアントを含む前記ポリペプチドは、
（ｉ）配列番号３または配列番号４として示されているアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
（ｉｉ）配列番号３または配列番号４と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。 - 前記組成物を使用して細胞培養皿、ビーズ、バイオリアクターのためのマイクロキャリアおよびバイオリアクターの内面からなる群から選択される支持体をコーティングする、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞外小胞を、超遠心分離、ショ糖密度勾配超遠心、分画遠心分離、タンジェンシャルフローろ過、サイズ排除クロマトグラフィまたはそれらの組み合わせを含む方法により前記細胞培養培地から単離する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法によって得られる細胞外小胞。
- 少なくとも１種の薬学的に許容される成分と組み合わせた、請求項１５に記載の細胞外小胞を含む医薬組成物。
- 医学に使用するための請求項１５に記載の細胞外小胞。
- 駆出率が保たれた心不全および駆出率が低下した心不全を含む虚血性および非虚血性心不全；心機能不全；心筋梗塞；先天性心疾患；心筋炎；弁機能不全；急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）；重症疾患ミオパチー（ＣＩＭ）；人工呼吸器誘発性横隔膜機能不全（ＶＩＤＤ）；移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）；実質臓器拒絶反応；細胞もしくは組織移植拒絶反応；クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；関節炎などのリウマチ様疾患；多発性硬化症、ＡＬＳ、サルコイドーシス、特発性肺線維症、乾癬、皮膚炎または湿疹などの炎症誘発性もしくは免疫反応性疾患；食物、動物、植物、医薬品、化学物質、金属または埃に対するアレルギーなどのアレルギー；天疱瘡、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）またはギラン・バレー症候群などの自己免疫疾患；２型糖尿病；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）；インターロイキン１受容体拮抗分子欠損症（ＤＩＲＡ）；子宮内膜症；自己免疫性肝炎；強皮症；筋炎；脳卒中；急性脊髄損傷；脈管炎；腎不全、肝不全、肺不全または心不全などの臓器不全；肺癌および皮膚癌を含む癌；ならびに熱傷および化学的火傷を含む火傷からなる群から選択される病状の治療または予防に使用するための請求項１５に記載の細胞外小胞。
- 心血管疾患または呼吸器疾患の治療または予防に使用するための請求項１５に記載の細胞外小胞。
- 前記心血管疾患は心臓の虚血再灌流傷害である、請求項１９に記載の使用のための細胞外小胞。
- 前記呼吸器疾患は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）である、請求項１９に記載の使用のための細胞外小胞。
- 人工弁および生体弁を含む人工器官または移植片などの医療装置のコーティングに使用するための請求項１５に記載の細胞外小胞。
- 請求項１５に記載の細胞外小胞でコーティングされた医療装置。
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