JP2014520843A - 臍帯抽出物の製造方法及びその用途 - Google Patents

Abstract

臍帯から有用成分を効果的に抽出する方法に係り、該有用成分を含む臍帯抽出物を提供し、該臍帯抽出物は動物由来の一般細胞及び幹細胞培養のための血清代替物として使用可能であり、該臍帯抽出物は組織修復用フィラ、ドレッシング及び肌状態改善用化粧料組成物に利用可能であり、該臍帯抽出物を利用して、臍帯、脂肪などの組織由来幹細胞の分離用及び培養用の培地組成物、並びにそれを利用した組織由来幹細胞の分離方法及び培養方法である。
【選択図】図１５

Description

本発明は臍帯抽出物の製造方法並びにかように製造された臍帯抽出物の血清代替材、幹細胞分離用及び培養用の組成物及び傷修復用フィラなどの用途に関する。

体外で、動物細胞培養システムが確立されて以来、血清は動物細胞の増殖を促進するために、一般的に使用されてきた。初代細胞（primary cells）及び確立された細胞株（established cell lines）の生存並びに増殖に広範囲に使用されてきた血清はその構成成分が一部だけ明らかにされた混合物であり、細胞培養での生理的活性が完全に把握されていない。また、ウシ胎児血清（ＦＢＳ：fetal bovine serum）はウシ胎児から採取されるので、マイコプラズマ（mycoplasma）、ウィルス（viruses）、プリオン（prions）、細菌マイトジェン（bacterial mitogens）、ホルモン（hormones）、外来蛋白質（extraneous protein）、成長因子（growth factors）、プロテアーゼ（proteases）などの危害要素を有しており、供給者の設備及び技術レベル、並びに生産ロット（lot）によって、その組成が変わる品質差をもたらす。現在まで報告されたほとんどの無血清培地は特定細胞のみを成長させ、血清の代わりに使用する細胞成長因子、細胞付着因子などが高価であり、無血清培地では血清を含んだ培地におけるよりも、成長及び産物生産が安定的ではないと知られている（非特許文献１，２）。

また、成体幹細胞（adult stem cells）を未分化状態で維持しながら、持続的に培養するためにはウシ胎児血清を含む培地が一般的に使用され、培養過程で、ウシ胎児血清を含んだ動物由来タンパク質源が使用されることにより、臨床適用のための幹細胞治療剤の開発時、種間汚染などの安全性問題を排除し難い。従って、かような従来の培養方法から得られた幹細胞を臨床に適用するのに、多くの限界を内包している。

前記動物由来タンパク質源（即ち、ウシ胎児血清）使用による問題点を回避する方案として、無血清培地を利用する方法、及びヒト血清を含む培地を利用する方法を利用することができる。無血清培地を利用する方法は成長ホルモンなどを含んだ多量のサイトカイン（cytokine）を培地に含有させて幹細胞を培養しなければならないので、複雑であるばかりではなく、非経済的である。また、ヒト血清を含む培地を利用する方法も、組み換え方法で作られたサイトカインを大量に使用しなければならず、高価のヒト血清を培養用タンパク質源として使用しており、経済的に多くの負担になるという問題点がある。

一方、幹細胞は成体のさまざまな組織及び器官で発見される成体幹細胞と、発逹段階中の胚盤胞段階の細胞から得ることができる胚芽幹細胞（embryonic stem cells）とに分けられる。胚芽幹細胞は神経、血液細胞、膵臓など多様な細胞に分化することができる全分化能を有しているがヒトに成長する胚芽から得なければならないので、倫理的問題点がある。従って、倫理的な問題を排除するだけではなく、分離及び培養が容易であり、さまざまな細胞に分化可能な成体幹細胞が細胞治療剤の材料として脚光を浴びている。

成体幹細胞は多様な組織から分離され、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、心臓細胞、肝細胞、神経細胞など、多様な組織細胞に分化する未分化状態の幹細胞である。そのうち、骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ：bone marrow-derived mesenchymal stem cells）がその代表的例である。

しかし、骨髄由来間葉系幹細胞は提供者の年齢が増すに連れて、幹細胞の数及び増殖能が低下し、骨髄を採取するためには苦痛が伴う。それにより、他の組織から間葉系幹細胞を分離する試みを行っており、最近、成体と胎児との末梢血液、臍帯、胎盤、臍帯血液などから分離可能であるという報告が発表されながら、多様な組織で得られる間葉系幹細胞が新たな細胞治療剤の供給源として関心を集めている。

臍帯は血管と、その周りのワルトン膠質（Wharton's jelly）と呼ばれる結合組織とから構成されている。姙娠期間の間、臍帯の長さは３０〜６０ｃｍであり、重さは４０〜５０ｇであり、胎児に供給する営養分が豊かであり、幹細胞と前駆細胞とを含んでいる。最近には臍帯に由来した細胞が骨髄に由来した間葉系幹細胞の特徴を有していると報告されている。該臍帯由来幹細胞は骨髄及びその他組織に由来の間葉系幹細胞と類似して、ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，ＣＤ１０，ＣＤ１３，ＣＤ２９，ＣＤ４４，ＨＬＡ−ＡＢＣ細胞表面タンパク質を発現し、造血幹細胞標識因子であるＣＤ３４，ＣＤ４５細胞表面タンパク質と、組織適合性抗原であるＣＤ１４，ＣＤ３１，ＣＤ３３，ＨＬＡ−ＤＲα細胞表面タンパク質とは発現しない。それだけではなく、臍帯から分離した幹細胞は胚芽幹細胞マーカーであるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇなどが同時に発現されると報告されている。

臍帯由来幹細胞は骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞に分化し、体外培養時、骨髄や脂肪に由来の幹細胞より分裂能に優れる。該細胞を利用して、心筋細胞、神経細胞に分化可能であるという研究も報告されている。このように、臍帯は臨床的使用のための幹細胞を供給することができる組織として期待され、更には細胞治療剤として使用が可能であると見込まれる。

しかし、臍帯由来幹細胞を効率的に利用するためには多くの数の臍帯由来幹細胞が必要である。しかし、臍帯から得ることができる幹細胞の数には限界があり、その幹細胞が培養中に分化能を喪失する場合が多い。しかし、現在まで、臍帯由来幹細胞を無血清培地で効率的に分離して培養する方法が知られていないという実情である。かような問題点を解決するために研究している中で、臍帯由来抽出物を利用するとき、効果的に臍帯由来幹細胞を分離して培養することができるということを確認し、本発明の完成に至った。

Cruz J. H. et al., Cytotechnology, 26: 59-64(1998) イーヒーチャン、動物細胞培養での無血清培地，Biotechnology News，2(3): 242-252 (1994)

本発明の目的は臍帯抽出物を製造する方法を提供するところにある。

本発明の他の目的は臍帯抽出物を含む血清代替材を提供するところにある。

本発明の更に他の目的は前記血清代替材を含む細胞培養液を提供するところにある。

本発明の更に他の目的は前記臍帯抽出物を含む臍帯由来幹細胞を臍帯から分離する方法、及び臍帯由来幹細胞を培養する方法を提供するところにある。

前記課題を解決するために、本発明は臍帯を切断する段階と、前記切断した臍帯を緩衝液に入れる段階と、前記緩衝液に含浸された臍帯を撹拌する段階と、撹拌して得た産物を遠心分離し、臍帯抽出物として上澄み液を収得する段階と、を含む哺乳動物臍帯抽出物の製造方法を提供する。

前記課題を解決するために、本発明はまた、臍帯抽出物を含む血清代替材を提供する。

前記課題を解決するために、本発明はまた、前記血清代替材を含む細胞培養液を提供する。

前記課題を解決するために、本発明はまた、細胞培養容器に哺乳類の臍帯抽出物を含む培地組成物と、細切りにされた臍帯組織と、を入れて培養する段階と、前記臍帯組織に酵素を処理する段階と、臍帯組織から幹細胞を分離する段階と、を含む哺乳類の臍帯からの幹細胞分離方法を提供する。

本発明の臍帯由来幹細胞の分離方法及び培養方法によれば、臍帯組織から幹細胞を分離する初代培養時のＦＢＳを添加していない培地を利用して、生存率、増殖能及び分化能に優れる幹細胞を短期間（１５日）に最大に獲得することができ（約２．０×１０^８個の細胞）、継代培養２，３回だけでも、非常に多くの量（臍帯組織約５０ｇから、１．０×１０^１０個の細胞）を分離することができ、今後の幹細胞治療剤の開発に有用な方法として利用可能である。

撹拌時間によるタンパク質溶出量を示したグラフである。 培地を入れ替る場合と入れ替えていない場合とで、撹拌時間によるタンパク質溶出量を比較したグラフである。 臍帯サイズを示すイメージである。 臍帯サイズによるタンパク質溶出量を示したグラフである。 緩衝液のｐＨによるタンパク質溶出量と、溶出されたタンパク質の差とを確認するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示したイメージである。 緩衝液のｐＨによるタンパク質溶出量と、溶出されたタンパク質の差とを確認するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示したイメージである。 溶出方法によるタンパク質溶出量を示したイメージである。 溶出方法によるタンパク質溶出量を示したイメージである。 新鮮な臍帯組織と、冷凍保管した臍帯組織とから溶出したタンパク質の差を示したイメージである。 新鮮な臍帯組織と、冷凍保管した臍帯組織とから溶出したタンパク質の差を示したイメージである。 緩衝液量によるタンパク質溶出量を示したイメージである。 臍帯抽出物（ＵＣＥ：umbilical cord extract）サイトカイン定量分析結果を示したグラフである。 臍帯抽出物サイトカイン定量分析結果を示したグラフである。 臍帯抽出物サイトカイン定量分析結果を示したグラフである。 無血清培地（basal media）の培養添加物による細胞増殖効果を示したグラフである。 無血清培地の培養添加物による細胞増殖効果を示したグラフである。 無血清培地の培養添加物による細胞増殖効果を示したグラフである。 無血清培地の培養添加物による細胞増殖効果を示したイメージである。 臍帯抽出物を含む無血清培地で、骨髄由来幹細胞及び臍帯由来幹細胞をそれぞれ培養した後、間葉系幹細胞のマーカーを処理してＦＡＣＳ分析を行った結果を示したグラフであり、このとき、ｘ軸は強度（intensity）であり、Ｙ軸は細胞数（カウント）であり、ｘ軸及びｙ軸の変化により、ＣＤマーカーを識別することができ、ＦＢＳ添加によって育てた細胞と、臍帯抽出物を添加して育てた細胞とを比較したものである。 臍帯抽出物を含む無血清培地で、骨髄由来幹細胞及び臍帯由来幹細胞をそれぞれ培養した後、間葉系幹細胞のマーカーを処理してＦＡＣＳ分析を行った結果を示したグラフであり、このとき、ｘ軸は強度であり、Ｙ軸は細胞数（カウント）であり、ｘ軸及びｙ軸の変化により、ＣＤマーカーを識別することができ、ＦＢＳ添加によって育てた細胞と、臍帯抽出物を添加して育てた細胞とを比較したものである。 臍帯抽出物（ＵＣＥ）を含むヒアルロン酸誘導体（ＨＡＤ：hyaluronic acid derivative）フィラをマウスに皮下注射した後、ヘマトキシリン＆エオシン（hematoxylin ＆ eosin）染色を行った結果であり、臍帯抽出物を含んだ場合、フィラの内側に周辺組織由来細胞の流入が多くなったということを示したイメージである。 臍帯抽出物（ＵＣＥ）を含むヒアルロン酸誘導体フィラをマウスに皮下注射した後、ヘマトキシリン＆エオシン（hematoxylin ＆ eosin）染色を行った結果であり、臍帯抽出物を含んだ場合、フィラの内側に周辺組織由来細胞の流入が多くなったということを示したイメージである。 一具体例の無血清培地で、臍帯抽出物の濃度による臍帯由来幹細胞増殖効果を示すグラフである。 一具体例によって、臍帯由来コラーゲンをコーティングした培養皿において、臍帯由来幹細胞の付着及び増殖（培養）の増大効果を示すイメージである。 コラーゲンを濃度によってコーティングした培養皿において、臍帯由来幹細胞を培養した後、２日後に増殖した臍帯由来幹細胞の数を比較した結果のグラフである。 従来の臍帯由来幹細胞の分離方法と、一具体例の臍帯由来幹細胞の分離方法とを比較した図面である。 図２６に示された６個の方法で分離し、培養中の細胞の様子を示す写真である。 臍帯由来幹細胞の分離後１５日目に回収された全細胞数結果を示すグラフである。 図２６の６種の分離方法及び培養方法で分離及び培養された細胞の免疫表示子分析結果を比較した図面であり、このとき、ｘ軸は強度であり、Ｙ軸は細胞数（カウント）であり、ｘ軸及びｙ軸の変化により、ＣＤマーカーを識別することができる。 供与者が異なる３個の臍帯から分離した抽出物に含まれているヒトサイトカイン、ヒトケモカイン、ヒト成長因子など全５０７種に対して、サイトカインアレイ（cytokine array）を遂行した結果と、各臍帯別に最も多く含まれているサイトカイン１０個とを示した図面である。 互いに異なる３個の臍帯から分離した抽出物に共通して含まれている物質を示した相対的な定量グラフであり、共通して最も多く含まれているのはＩＧＦＢＰ−７、リポカイン（lipocalin）−１である。 互いに異なる３個の互いに異なる臍帯で確認された全６２種のヒトサイトカインを最大量から順に図示した表である。 機能が公知されている１０個のサイトカインに対して、人体内で遂行する機能を説明した表である。 臍帯抽出物を利用して培養した幹細胞と、１０％のＦＢＳを添加した培地で培養した細胞の継続的な継代培養による幹細胞との幹細胞能（stemnes）維持能を比較するための実験でもって、継代培養初期と、１０回以上継代培養後との幹細胞の分裂時間（doubling time）（Ｔｄ）を比較した値を示したグラフである。 臍帯抽出物を利用して培養した幹細胞と、１０％のＦＢＳを添加した培地で培養した細胞の継続的な継代培養による幹細胞との幹細胞能（stemnes）維持能を比較するための実験でもって、継代培養初期と、１０回以上継代培養後との幹細胞の分裂時間（Ｔｄ）を比較した値を示したグラフである。 臍帯抽出物を利用して、臍帯組織で分離した幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣｓ）が胚芽幹細胞（ＥＳＣｓ）特異的なマーカーを発現していることを確認した結果である。 ３人の異なる供与者から得た組織から得た臍帯抽出物を利用して分離した幹細胞が間葉系幹細胞特異的細胞表面マーカーであるＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６に、３人の異なる供与者から分離した幹細胞で共通して陽性を示しており、ＣＤ３４、ＣＤ４５で陰性を示していることを示す結果である。 臍帯抽出物を利用して培養する場合、幹細胞分離した初期に確認された胚芽幹細胞特異的マーカーがＦＢＳを添加して培養する場合には発現量が消えるが臍帯抽出物（ＵＣＥ）を添加して培養する場合、続けて維持されていることを示す結果である。

取り立てて定義されない限り、本明細書で使用された全ての技術的及び科学的な用語は本技術分野で当業者によって、一般的に理解されるところと同一の意味を有する。一般的に、本明細書で使用された命名法は本技術分野で周知されており、一般的に使用されるものである。

一様相は臍帯抽出物を製造する方法を提供するものである。

一具体例は臍帯を切断する段階と、前記切断した臍帯を緩衝液に入れる段階と、前記緩衝液に含浸された臍帯を撹拌する段階と、撹拌して得た産物を遠心分離し、臍帯抽出物として上澄み液を収得する段階と、を含む哺乳動物臍帯抽出物の製造方法を提供する。

本発明は従来方法の問題点を補完し、細胞外基質に結合されている成長因子、サイトカイン、ケモカイン及びＧＡＧ（glycaosminoglycan）などの糖蛋白質を比較的単純な工程で分離し、細胞に有用な成分を可能な限り活性ある自然状態で（natural-occurring）収得することができる方法を提供するものである。

本発明の方法について、各段階別に詳細に説明すれば、次の通りである。

まず、臍帯を切断する段階を含む。

一具体例によれば、まず臍帯を切断する。一具体例において、臍帯の切断は緩衝液との接触面積を広げ、臍帯組織に存在する有用物質の溶出を容易にするために実施する。

一具体例において利用される臍帯は多様な哺乳動物の臍帯を含む。望ましくはヒト、豚、馬、牛、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ及び羊であり、更に望ましくはヒト、豚、馬及び牛であり、最も望ましくはヒトを意味する。

臍帯切断は当業界に公知の多様な方法を介して実施される。

一具体例によれば、臍帯は０．５〜３．０ｃｍ、更に望ましくは０．７〜２．５ｃｍ、一層望ましくは１〜２ｃｍの長さに切断する。

特に、前記臍帯抽出物は臍帯組織において、ワルトン膠質（Wharton's jelly）部分からの抽出が望ましい。それにより、臍帯内の血液及び／または血管を除去する段階が追加して含まれる。

その後、前記切断した臍帯を緩衝液に入れる段階を含んでもよい。

前記で切断した臍帯を緩衝液に入れる。本発明で利用される緩衝液は緩衝力（buffering power）を有するいかなる緩衝液も使用可能であり、例えば、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、グリシン−ＨＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及びＰＢＳ（phosphate buffered saline）を含む。特に、ＰＢＳを利用することができ、ｐＨは２〜１１、望ましくは４〜１０、更に望ましくは５〜８、一層望ましくは６．８〜７．６である。

切断された臍帯を含浸させる緩衝液の量は特別に制限されるものではなく、望ましくは臍帯重量の２〜５倍、更に望ましくは２〜４倍、一層望ましくは２．５〜３．２倍の緩衝液を利用する。また、切断された臍帯を緩衝液に入れる前に、適する溶液（例えば、緩衝液）で洗浄することができる。

その後、前記緩衝液に含浸された臍帯を撹拌する段階を含んでもよい。

一具体例によれば、撹拌は４℃〜１０℃、望ましくは４℃〜６℃で実施する。また撹拌は７〜２４時間、望ましくは１２〜２４時間、更に望ましくは１８〜２４時間実施することができる。

撹拌は当業界に公知の多様な方法を介して実施することができ、マグネチックバーを利用して撹拌することができる。

その後、撹拌して得た産物を遠心分離し、臍帯抽出物として上澄み液を収得する段階を含んでもよい。

撹拌して得た産物を遠心分離し、最終的に臍帯抽出物として上澄み液を収得する。前記上澄み液は成長因子及びサイトカインなど細胞外基質に結合されている多様な有用タンパク質を含む。

一具体例によれば、遠心分離は３，０００〜６，０００ｒｐｍ、望ましくは４，０００〜４，５００ｒｐｍの条件で実施する。遠心分離は４℃〜１０℃、望ましくは４℃〜６℃で実施する。一具体例によれば、遠心分離は２分〜３０分、望ましくは５分〜２０分、更に望ましくは１０分〜１５分間実施する。

他の様相は前述の一様相の方法によって製造された臍帯抽出物を提供する。

一具体例によれば、前記臍帯抽出物はＩＧＦＢＰ−７（insulin-like growth factor binding protein-7）、リポカリン（lipocallin）−１、ＣＸＣＬ１４、レプチン（leptin） Ｒ、ＩＬ−２３、ＭＩＰ−１ａ、アンジオゲニン（angiogenin）、トロンボスポンジン（thrombospondin）−２、ＩＬ−２９、ＩＬ−４Ｒなど（図３１）を主要成分として含む。

臍帯抽出物の前記主要サイトカインは血管新生抑制（anti-angiogenesis）、抗細胞死滅（anti-apoptosis）、成長（growth）及び炎症（inflammation）に係わる効果は既知の事実として周知されている。

更に他の様相は臍帯抽出物を含む血清代替材を提供するものである。

用語「血清」は血漿から纎維素を除去した残りの部分を意味する。血清は体外で動物細胞培養システムが確立されて以来、動物細胞の増殖を促進するために一般的に使用されてきた。

用語「血清代替材」は血清を代替して血清と同一であるか、あるいは類似した効果を得るために使用することができる物質を意味し、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）のような血清の使用なしにも、それと同一であるか、あるいはそれより優れた効果を得ることができる物質を意味する。

前記臍帯抽出物は一般的な方法によって収得される臍帯抽出物であってもよいが望ましくは前述の一具体例を介して得られる。特に、臍帯から血液を除去して血清成分が含まれないものが望ましい。

前記血清代替材は血清が適用される全ての分野に適用される。特に、細胞の培養に利用され、望ましくは動物細胞の培養に利用される。特に、幹細胞の分離、培養などに利用される。前記幹細胞には成体幹細胞、間葉系幹細胞、逆分化幹細胞及び組織由来幹細胞のように、全種類の幹細胞が含まれてもよい。

更に他の様相は前記血清代替材を含む細胞培養液を提供するものである。

一具体例の細胞培養液は多様な動物の細胞、望ましくは哺乳動物の細胞、更に望ましくはヒト、豚、馬、牛、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ及び羊の細胞、一層望ましくはヒト、豚、馬及び牛の細胞、最も望ましくはヒトの細胞である。

一具体例の培養液は幹細胞培養に適用される。本発明が適用される幹細胞は制限がなく、幹細胞の特性、即ち、未分化能、無制限増殖能、及び特定細胞への分化能を有する細胞は本発明が適用される細胞である。前記幹細胞は胚芽幹細胞（ＥＳ）及び胚芽生殖細胞（ＥＧ）を含む全能性幹細胞（totipotent stem cell）と、多能性幹細胞（multipotent stem cell）とを含んでもよい。望ましくは前記幹細胞は臍帯由来幹細胞でもある。

一具体例の培養液は血清代替材として臍帯抽出物以外に、動物細胞培養用培地の基本的な組成を含んでもよい。例えば、本発明の培養液はEagles’s ＭＥＭ（Eagle’s minimum essential medium，Eagle，Ｈ．Science １３０：４３２（１９５９））、α−ＭＥＭ（Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. ２３０：５２（１９７１））、Iscove's ＭＥＭ（Iscove、Ｎ．et al., J. Exp. Med. １４７：９２３（１９７８））、１９９培地（Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., ７３：１（１９５０））、ＣＭＲＬ １０６６、ＲＰＭＩ １６４０（Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. １９９：５１９（１９６７））、Ｆ１２（Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ５３：２８８（１９６５））、Ｆ１０（Ham，Ｒ．Ｇ．Exp. Cell Res., ２９：５１５（１９６３））、ＤＭＥＭ（Dulbecco's modification of Eagle's medium，Dulbecco，Ｒ．et al., Virology ８：３９６（１９５９））、ＤＭＥＭとＦ１２との混合物（Barnes，Ｄ．et al., Anal. Biochem., １０２：２５５（１９８０））、Way-mouth's ＭＢ７５２／１（Waymouth，Ｃ．Ｊ．Natl. Cancer Inst., ２２：１００３（１９５９））、McCoy's ５Ａ（McCoy，Ｔ．Ａ．，et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., １００：１１５（１９５９））及びＭＣＤＢシリーズ（Ham，Ｒ．Ｇ．et al., In Vitro １４：１１（１９７８））などを基として組成される。

更に他の様相は前記臍帯抽出物を含む組織修復用フィラを提供する。

用語「組織修復用フィラ」とは肌のしわ及び肌の微細線を効果的に隠蔽する目的で使用される医薬組成物または化粧料組成物を意味する。

一具体例の組織修復用フィラは臍帯抽出物以外に、フィラの基本的な成分、望ましくはコラーゲン、ヒアルロン酸、ポリアクリルアミドゲル、アルテコール、オートロゲン（自家コラーゲン）、またはポリメチルメタクリレート及びコラーゲンの混合物を含む。

一具体例のフィラはワックス、エラストマ、高級アルコール、界面活性剤、オイル、粉体、湿潤剤、水分散性高分子、肌保護成分、防腐剤及び／または香を含んでもよい。

また、前記臍帯抽出物は一般的な方法によって収得される臍帯抽出物であってもよいが望ましくは前述の一具体例を介して得られる。特に、臍帯から血液を除去し、血清成分が含まれないものが望ましい。

更に他の様相は前記臍帯抽出物を含むドレッシングを提供する。

用語「ドレッシング」は治療目的または美容目的の肌処置のためにヒト身体または動物身体の一部に適用される薬剤学的組成物を意味する。望ましくは損傷された肌、肌病変、肌表面の任意の障害（interruption）（例えば、肌潰瘍、火傷、切り傷、穿刺、裂傷、鈍器外傷、にきび病変及び腫気）の処置のためのドレッシングである。前記ドレッシングは製剤の伝達を容易にするために、パッチ、プラスター、包帯及びガーゼを含んでもよい。ドレッシングは望ましくは身体の内部組織及び外部組織、更に望ましくは身体表面に適用することができる。

また、前記臍帯抽出物は一般的な方法によって収得される臍帯抽出物であってもよいが望ましくは前述の一具体例を介して得られる。特に、臍帯から血液を除去し、血清成分が含まれないものが望ましい。

更に他の様相は前記臍帯抽出物を含むしわ改善用または肌老化改善用の化粧料組成物を提供する。

一具体例の化粧料組成物は多様な肌状態（conditions）の改善に利用される。望ましくは本発明の組成物はしわ改善及び肌老化改善に有効である。

一具体例の化粧料組成物に含まれる成分は有効成分としての成長因子以外に、化粧料組成物に一般的に利用される成分を含み、例えば、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料のような一般的な補助剤、及び運搬体を含む。

一具体例の化粧料組成物は当業界で一般的に製造されるいかなる剤形にも製造され、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、せっけん、界面活性剤含有クリンシング、オイル、粉末ファウンデーション、乳濁液ファウンデーション、ワックスファウンデーション及びスプレーなどに剤形化されるがそれらに限定されるものではない。更に詳細には柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレーまたはパウダーの剤形に製造される。

一具体例の剤形がペースト、クリームまたはゲルである場合には運搬体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが利用される。

一具体例の剤形がパウダーまたはスプレーである場合には運搬体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムまたはポリアミドパウダーが利用され、特に、スプレーである場合には追加してクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体を含んでもよい。

一具体例の剤形が溶液または乳濁液である場合には運搬体成分として、溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が利用され、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルがある。

一具体例の剤形が懸濁液である場合には運搬体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤；エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁液剤；微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガまたはトラカントなどが利用される。

一具体例の剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合には運搬体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが利用される。

更に他の様相は臍帯から幹細胞を分離する方法を提供する。

一具体例は細胞培養容器に、哺乳類の臍帯抽出物を含む培地組成物と、細切りにされた臍帯組織とを入れて培養する段階と、前記臍帯組織に、幹細胞分離酵素を処理する段階と、臍帯組織から幹細胞を分離する段階と、を含む哺乳類の臍帯からの幹細胞分離方法を提供する。

前記哺乳類はヒト、豚、馬、牛、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギまたは羊でもある。

前記組織は脂肪、臍帯、肝臓及び骨膜からなる群から選択される。

前記細胞培養容器は細胞付着タンパク質（cell adhesion protein）でコーティングされた細胞培養容器であってもよい。このとき、前記細胞付着タンパク質は哺乳類臍帯由来コラーゲン、ゼラチン（gelatin）、フィブロネクチン（fibronectin）、ラミニン（laminin）またはポリ−Ｄ−リシン（poly-D-lysin）でもあるがそれらに制限されるものではない。

前記哺乳類の臍帯由来コラーゲンは（ｉ）過酸化水素で処理された哺乳類の臍帯組織を粉砕する段階と、（ｉｉ）前記粉砕された臍帯組織を酢酸及びペプシンで処理した後、遠心分離する段階と、（ｉｉｉ）前記遠心分離によって得た上澄み液のｐＨを７に合わせ、ＮａＣｌを添加してコラーゲンを沈澱させる段階と、（ｉｖ）前記沈澱されたコラーゲンを分離する段階と、を含む哺乳類の臍帯由来コラーゲン製造方法によって製造される。

一具体例の哺乳類の臍帯からの幹細胞分離方法において、前記（ｉｉ）段階は前記（ｉ）段階開始後１日ないし３日の後に遂行することが望ましい。

前記（ｉｉ）段階の幹細胞分離酵素はコラゲナーゼであり、望ましくは前記コラゲナーゼはＩ型コラゲナーゼであってもよい。更に望ましくは前記（ｉｉ）段階で、前記Ｉ型コラゲナーゼが１８０Ｕ／ｍｌないし２２０Ｕ／ｍｌ含まれ、２時間ないし６時間処理される。

また、臍帯抽出物は前記具体例の一方法によって製造されることが望ましい。

更に他の様相は臍帯抽出物を利用して幹細胞を培養する方法を提供する。

一具体例は幹細胞培養液に臍帯抽出物を添加する段階と、細胞培養容器で、前記細胞培養液を利用して幹細胞を培養する段階と、を含む幹細胞培養方法を提供する。

前記細胞培養容器は細胞付着タンパク質でコーティングされたものであってもよい。前記幹細胞は組織由来幹細胞である幹細胞であってもよい。また、前記幹細胞は動物幹細胞であり、望ましくはヒト由来幹細胞であってもよい。また、前記幹細胞は成体幹細胞、間葉系幹細胞、逆分化幹細胞及び組織由来幹細胞のように、全種類の幹細胞が含まれてもよい。

また、前記細胞付着タンパク質はコラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニンまたはポリ−Ｄ−リシンでもあるがそれらに制限されるものではない。

前記組織は脂肪、臍帯、肝臓及び骨膜からなる群から選択されたいずれか一つでもあるがそれらに制限されるものではない。

前記幹細胞培養液は血清を含まないこともある。

また、前記幹細胞は全ての動物幹細胞であり、胚芽幹細胞、成体幹細胞及び逆分化幹細胞であり、Ｏｘｔ４，Ｓｏｘ２，ＫＬＦ４及びＮａｎｏｇ遺伝子からなるグループにおいて、少なくとも１つの遺伝子が発現される細胞である。特に、継代培養を行うとしても、前記胚芽幹細胞に特異的な遺伝子であるＯｘｔ４，Ｓｏｘ２，ＫＬＦ４及びＮａｎｏｇからなるグループにおいて、少なくとも１つの遺伝子が持続的に発現される細胞である。

また、前記幹細胞はＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ１６６に選択的に陽性を示す細胞であり、ＣＤ３４及びＣＤ４５に選択的に陰性を示す細胞である。

以下、実施例を介して、本発明について更に詳細に説明する。それら実施例は単に本発明について更に具体的に説明するためのものに過ぎず、本発明の要旨によって、本発明の範囲がそれら実施例または図面によって制限されるものではないということは当業界で当業者においてて自明であろう。

＜実施例１＞撹拌時間によるタンパク質溶出量の比較
臍帯を０．５〜２．０ｃｍ長に切断し、ＰＢＳ（phosphate buffered saline）（ｐＨ７．０）で２回以上洗浄した後、臍帯重量の３倍ほどのＰＢＳを入れ、４℃で３０分〜２４時間ＰＢＳを交換せずに撹拌し、２４時間〜２００時間ＰＢＳを交換しながら撹拌した。４，５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して回収した上澄み液を臍帯由来抽出物として使用し、ブラッドフォード分析法でタンパク質定量を実施した。

撹拌時間が長くなるにつれ、溶出されるタンパク質の量も増加するという結果を示し、撹拌７時間経過後、平均して２．５μｇ／ｍｌのタンパク質が溶出され、撹拌２４時間経過後には平均して２．７μｇ／ｍｌのタンパク質が溶出された（図１）。

また、撹拌開始時点から２４時間経過地点までは撹拌時間が長くなるにつれ、溶出されるタンパク質の量も増加するという結果を示したがＰＢＳを交換しながら撹拌する場合、撹拌開始後約６０時間が経過した時点から、溶出されるタンパク質の量が急激に減少した（図２）。

＜実施例２＞臍帯サイズによるタンパク質溶出量の比較
臍帯を０．５〜２．０ｃｍ長に切断し（図３）、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で２回以上洗浄した後、臍帯重量の３倍ほどのＰＢＳを入れ、４℃で４日間撹拌した。４，５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して回収した上澄み液を臍帯由来抽出物として使用し、ブラッドフォード分析法で、タンパク質定量を実施した。臍帯切断サイズによるタンパク質溶出量の変化は大きくなく、撹拌時、ＰＢＳを交換する場合、タンパク質溶出量が急減した（図４）。

＜実施例３＞緩衝液のｐＨによるタンパク質溶出量の比較
臍帯を０．５〜２．０ｃｍ長に切断し、臍帯重量の３倍ほどのＰＢＳ（ｐＨ２、ｐＨ７またはｐＨ１１）を入れて４℃で２４時間撹拌した。４，５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して回収した上澄み液を臍帯由来抽出物として使用し、ブラッドフォード分析法でタンパク質定量を実施した。

ｐＨ２のＰＢＳを利用した場合、全てで４７．２ｍｇ（２．３６ｍｇ／ｍｌ）、ｐＨ７のＰＢＳを利用した場合、全てで４９ｍｇ（２．４５ｍｇ／ｍｌ）、ｐＨ１１のＰＢＳを利用した場合、全てで４３．８ｍｇ（２．１９ｍｇ／ｍｌ）のタンパク質が溶出され、ＰＢＳのｐＨによるタンパク質溶出量の差は大きくなかった（図５）がｐＨ２のＰＢＳを利用した場合、撹拌後の結果物において、粘度（viscosity）が上昇した。

また、タンパク質定量を行った各臍帯抽出物に対するドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルCoomassie染色を行った結果、各臍帯抽出物のタンパク質バンド様相が類似しているということを確認した（図６）。

＜実施例４＞溶出方法によるタンパク質溶出量の比較
臍帯を０．５〜２．０ｃｍ長に切断し、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で２回以上洗浄した後、約８ｇの臍帯に、約１５ｍｌのＰＢＳを入れ、均質化（homogenization）、撹拌（stirring；４℃で２４時間）または培養（incubation；３７℃で２４時間）した。４，５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して回収した上澄み液を臍帯由来抽出物として使用し、ブラッドフォード分析法でタンパク質定量を実施した。

均質化した場合、全てで２７．３ｍｇ（１．９５ｍｇ／ｍｌ）、撹拌した場合、全てで３０．７２ｍｇ（３．６１ｍｇ／ｍｌ）、培養した場合、全てで１９．３４ｍｇ（２．２８ｍｇ／ｍｌ）のタンパク質が溶出された。その結果、４℃で撹拌した場合、最大量のタンパク質の溶出されるということを確認した（図７）。

また、タンパク質定量を行った前記条件の各臍帯抽出物に対するドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルCoomassie染色を行った結果、各臍帯抽出物のタンパク質バンド様相が類似しているということを確認した（図８）。

従って、４℃で撹拌する方法が均質化、並びに３７℃培養方法によって発生しうるタンパク質変性及びタンパク質の安定性低下を防止しながら、多量のタンパク質を収得する方法であるということを確認した。

＜実施例５＞臍帯組織保管方法によるタンパク質溶出量の比較
臍帯を０．５〜２．０ｃｍ長に切断し、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で２回以上洗浄した後、約１１ｇの臍帯に、約３３ｍｌのＰＢＳを入れ、撹拌（４℃で２４時間）または冷凍（−８０℃で６日間）した後で撹拌（４℃で２４時間）した。４，５００ｒｐｍ、４℃で１０分の間遠心分離して回収した上澄み液を臍帯由来抽出物として使用し、ブラッドフォード分析法でタンパク質定量を実施した。

冷凍保管した臍帯の場合、新鮮な臍帯組織に比べ、約７ｍｇのタンパク質が更に溶出されたが（図９）、タンパク質定量を行った前記条件の各臍帯抽出物に対するドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルCoomassie染色を行った結果、各臍帯抽出物のタンパク質バンド様相が類似しているということを確認した（図１０）。

＜実施例６＞緩衝液量によるタンパク質溶出量の比較
臍帯を０．５〜２．０ｃｍ長に切断し、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で２回以上洗浄した後、約１１ｇの臍帯に、およそ２２ｍｌ（１：２）、およそ３３ｍｌ（１：３）または約５５ｍｌ（１：５）のＰＢＳを入れ、４℃で２４時間撹拌した。４，５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して回収した上澄み液を臍帯由来抽出物として使用し、ブラッドフォード分析法でタンパク質定量を実施した。

切断された臍帯を臍帯重量の２倍のＰＢＳで撹拌した場合、全てで５３．７６ｍｇ（３．１６ｍｇ／ｍｌ）、３倍のＰＢＳで撹拌した場合、全てで６４．２３ｍｇ（２．４７ｍｇ／ｍｌ）、５倍のＰＢＳで撹拌した場合、全てで７３．７８ｍｇ（１．４８ｍｇ／ｍｌ）のタンパク質が溶出され、ＰＢＳの量が増加するほど、タンパク質の溶出量も増加するということが分かった（図１１）。ＰＢＳ量が増加するほど、総タンパク質量は増加するが最終臍帯抽出物のタンパク質濃度が低くなるので、適正濃度で生産するために、別途の濃縮過程が必要であり、該過程で抽出されたタンパク質が損失されるという短所がある。

＜実施例７＞臍帯抽出物に主要成分タンパク質の定性分析及び定量分析
臍帯抽出物に含まれたタンパク質のうち、成長因子、ケモカイン、サイトカインなどの主要成分の種類、及び相対的な定量分析のために、５０７種の分析が可能なRayBio Human cytokine array kitを使用して分析を行った。供与者が異なる３種の臍帯抽出物それぞれ１ｍｇを準備した後、膜（membrane）で処理して反応させた。その後、検出されたドットはMultiGaugeプログラムを利用して、当該強度を分析した。

その結果をイメージ及び表に表示した。

図３０は供与者が異なる３個の臍帯から分離した抽出物に含まれているヒトサイトカイン、ヒトケモカイン、ヒト成長因子など全５０７種に対して、cytokine arrayを遂行した結果と、それぞれ異なる供与者から溶出された抽出物内に最も多く含まれているサイトカイン１０個とを示したものである。

図３１は互いに異なる３個の臍帯から分離した抽出物に、共通して含まれている物質を示した相対的な定量グラフである。共通して最も多く含まれているのはＩＧＦＢＰ−７、lipocalin−１などである。

図３２は３個の互いに異なる臍帯で確認された全６２種のヒトサイトカインを最大量から順に並べたものである。

図３３は抽出物内に多量に含まれており、機能が公知されている１０個のサイトカインであり、人体内で遂行する機能を説明した表である。

臍帯抽出物内に存在するサイトカインにおいて、公知されている４２種に対して定量分析を行った。１ｍｇ／ｍｌの臍帯抽出物試料をMillipore社のMILLIPLEX（商標） Human Cytokine／Chemokine panel（４２−plex：ＥＧＦ、Eotaxin、ＦＧＦ−２、Ｆｌｔ−３リガンド、Fractalkine、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＲＯ、ＩＦＮα２、ＩＦＮγ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ｓＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＤＣ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ／ＢＢ、ＲＡＮＴＥＳ、ｓＣＤ４０Ｌ、ＴＧＦα、ＴＮＦα、ＴＮＦβ及びＶＥＧＦ）を利用し、４２個のサイトカインに対する抗原・抗体反応後、Luminex ２００ Systemを利用して定量分析を行った。

サイトカイン定量分析の結果、平均１，４００ｐｇ／ｍｌ ＦＧＦ−２、１，４８０ｐｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、８６０ｐｇ／ｍｌ ＭＣＰ−１、９００ｐｇ／ｍｌ ＧＲＯ、７００ｐｇ／ｍｌ ＩＬ−１ｒａ及び６２０ｐｇ／ｍｌＩＰ−１０が抽出されるサイトカインにおいて、主な成分として確認された（図１２）。

＜実施例８＞無血清培地の培養添加物による細胞増殖効果
臍帯抽出物を血清が除去された培地に、０，０．１，０．２，０．５または１ｍｇ／ｍｌの濃度で処理した。対照群として、１０％血清（Hyclone、ＳＨ３０９１９．０３）が添加された培地で、臍帯由来幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ）、骨髄由来幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）及び線維芽細胞（skin fibroblast）をそれぞれ培養した後、１０％のＷＳＴ−１ assay（Daeillab、ＥＺ−３０００）を二日間隔で全てで７日間測定した。ＷＳＴ−１ assay試薬を培地の１０％になるように添加し、培養条件と同一に、１時間ほど反応させた後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。

ＷＳＴ−１ assayの結果、無血清培地で臍帯抽出物を濃度別に処理したとき、０．２ｍｇ／ｍｌ濃度で、臍帯由来幹細胞、骨髄由来幹細胞及び線維芽細胞が１０％ＦＢＳ添加培地条件の細胞と同等な細胞増殖を示すということを確認し、臍帯抽出物を０．５ｍｇ／ｍｌ濃度以上で処理した場合、１０％ＦＢＳ添加培地条件の細胞より、細胞増殖が増加するということを確認した（図１５〜図１７）。

また、細胞培養時に示される形態（morphology）は臍帯抽出物を含んだ無血清培地で培養した細胞が１０％ＦＢＳ添加培地条件の細胞より、更に小さい形態を維持しながら成長するということを確認した（図１８）。

＜実施例９＞臍帯抽出物の幹細胞分化能維持効果
１０％のＦＢＳと、０．２ｍｇ／ｍｌの臍帯抽出物とを添加した培地で、骨髄由来幹細胞及び臍帯由来幹細胞をそれぞれ培養した後、間葉系幹細胞のマーカーを処理し、ＦＡＣＳ分析を行った。

ＦＡＣＳ分析の結果、臍帯抽出物を含む無血清培地で培養した幹細胞は間葉系幹細胞特異的細胞表面マーカーが維持されるということより、分化を起こすというような幹細胞の特性に変化を起こさないということを確認した（図１９及び図２０）。

また、臍帯抽出物を利用して、継続的な継代培養を行いながら、幹細胞能（stemness）及び細胞分裂時間（doublingtime）を３日間隔で継代培養しながら、１０％のＦＢＳを添加した培地で培養された幹細胞と比較した。

その結果は図３４及び図３５の通りである。図３４及び図３５は臍帯抽出物を利用して培養した幹細胞と、１０％のＦＢＳを添加した培地で培養した細胞との継続的な継代培養による幹細胞の幹細胞能の維持能を比較するための実験であり、継代培養初期、及び１０回以上継代培養後の幹細胞のＴｄ時間を比較する結果である。

１０％のＦＢＳを使用せず、０．３ｍｇ／ｍｌ臍帯抽出物（ＵＣＥ：umbilical cord extract）のみを添加した幹細胞の場合、細胞の増殖速度及びＴｄが大きく差がなく、かえって僅差であって、更に迅速に増殖した。０．３ｍｇ／ｍｌの臍帯抽出物濃度は１０％のＦＢＳと類似した増殖力を示す濃度を選択した。ＵＣＥ濃度を高くして処理する場合より、更に迅速に増殖した。

＜実施例１０＞臍帯由来抽出物及びコラーゲンの製造
臍帯を１〜２ｃｍ長に切断した後、ＤＰＢＳで２回以上洗浄した。前記臍帯を７０％エタノール溶液で処理し、４℃で１時間反応させた後、精製水で２回以上洗浄し、臍帯の重量を測定した。臍帯重量を基準に３倍ほどのＤＰＢＳを処理し、４℃で２４時間処理した後、臍帯抽出物（ＵＣＥ）を回収した。回収された臍帯抽出物を最終０．２２μｍフィルタで濾過して４℃で保管した。

残った臍帯に、３％のＨ_２Ｏ_２溶液を加えた後、４℃で１２〜２４時間処理した。その後、泡が消えるまで精製水で２回以上洗浄した。臍帯重量を基準に１０倍ほどの０．５Ｍ酢酸溶液を処理した後、ブレンダ（blender）と均質機（homogenizer）とを使用して組織を粉砕した。臍帯重量を基準に１０％のペプシンを処理し、４℃で２４時間反応させた。１０，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。遠心分離後、ＮａＯＨを使用して、回収した上澄み液のｐＨを７に合わせ、ペプシン酵素の活性を除去した。ｐＨを調整した溶液の体積を測定した後、溶液体積基準２．４Ｍになるように、ＮａＣｌを処理した。ＮａＣｌが全て溶けるまで撹拌した後、４℃でコラーゲンが塩析されて沈澱するように、１２〜２４時間静置した。１０，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間の遠心分離後、塩析されたコラーゲンペレット（pellet）を分離して重量を測定した。前記ペレット重量を基準に、１０倍ほどの精製水に希釈した後、限外濾過装置（ultrafiltration system）で脱塩及び濃縮を行った。最終的に、濾過方法によって除菌し、凍結乾燥させた後で保管した。

回収した臍帯抽出物はブラッドフォード（Bradford）分析法で定量し、製造されたコラーゲンはヒドロキシプロリン（hydroxyprolin）分析法で定量した。

＜実施例１１＞無血清培地での臍帯抽出物とコラーゲンコーティングとを利用した細胞培養
コラーゲンをＤ．Ｗ．に５０μｇ／ｍｌの濃度で溶解させた後、培養皿に処理し、１時間培養器でコーティングした。コーティング後、コラーゲン溶液を除去し、リン酸塩緩衝溶液で２回以上洗浄し、常温で完全に乾燥させた後、細胞を培養した。臍帯抽出物を血清が除去された培地に、０，０．１，０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で処理して細胞を培養し、対照群として、１０％のＦＢＳが添加された培地を使用し、細胞成長を比較するために、ＷＳＴ−１ assay（Daeillab、ＥＺ−３０００）を二日間隔で全７日間測定した。ＷＳＴ−１ assay試薬を培地の１０％になるように添加し、培養条件と同一に、約１時間ほど反応させた後、４５０ｎｍで吸光度を測定した（図２３及び図２４）。

＜実施例１２＞臍帯幹細胞分離方法による細胞回収率及び増殖能の比較
臍帯外部の血液をＣａ^２＋とＭｇ^２＋とが含まれていないＤＰＢＳで除去した後、外部量膜を剥がし、動脈２個を除去した後、次のような６種細胞の分離方法を比較した。

＜１２−１＞臍帯幹細胞の分離方法１
組織のコラゲナーゼ処理後、１０％のＦＢＳが添加された培地で細胞培養を行った。具体的には血液を除去した組織を１ｍｍ^３サイズに切った後、２００Ｕ／ｍｌのΙ型コラゲナーゼ（collagenase type Ι）が含まれたα−ＭＥＭを５時間処理し、細胞を分離した後、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０％のＦＢＳが含まれたα−ＭＥＭに、培養皿１ｃｍ^２当たり２×１０^３個の細胞を入れ、３７℃温度で、５％のＣＯ^２が供給される培養器内で培養した。

＜１２−２＞臍帯幹細胞の分離方法２
組織のコラゲナーゼ処理後、０．２ｍｇ／ｍｌのＵＣＥが添加された培地で、細胞培養を行った。具体的には血液除去した組織を１ｍｍ^３サイズに切った後、２００Ｕ／ｍｌのΙ型コラゲナーゼが含まれたα−ＭＥＭを５時間処理し、細胞を分離した後、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．２ｍｇ／ｍｌ臍帯抽出物が含まれたα−ＭＥＭを入れたコラーゲンコーティングされた培養皿１ｃｍ^２当たり２×１０^３個の細胞を入れ、３７℃温度で、５％のＣＯ２が供給される培養器内で培養した。

＜１２−３＞臍帯幹細胞の分離方法３
１０％のＦＢＳが添加された培地で組織培養し、コラゲナーゼ処理後、１０％のＦＢＳが添加された培地で細胞培養を行った。具体的には血液除去した組織を１ｍｍ^３サイズに切った後、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０％のＦＢＳが含まれたα−ＭＥＭに入れ、７日間培養した後、底に付着した細胞が見え始めれば、２００Ｕ／ｍｌのΙ型コラゲナーゼが含まれたα−ＭＥＭを４時間処理し、細胞外基質がいずれも分解されれば、遠心分離及びＰＢＳで洗浄し、細胞のみを分離した。その後、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、０．１μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０％のＦＢＳが含まれたα−ＭＥＭに、培養皿１ｃｍ^２当たり２×１０^３個の細胞を入れ、３７℃温度で５％のＣＯ^２が供給される培養器内で培養した。

＜１２−４＞臍帯幹細胞の分離方法４
０．２ｍｇ／ｍｌ臍帯抽出物が添加された培地で組織培養し、コラゲナーゼ処理後、０．２ｍｇ／ｍｌ臍帯抽出物が添加された培地で細胞培養を行った。具体的には血液除去した組織を１ｍｍ^３サイズに切った後、コラーゲンコーティングされた皿に入れ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．２ｍｇ／ｍｌ ＵＣＥが含まれたα−ＭＥＭに入れ、７日間培養した後、底に付着した細胞が見え始めれば、２００Ｕ／ｍｌのΙ型コラゲナーゼが含まれたα−ＭＥＭを４時間処理し、細胞を分離した。その後、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．２ｍｇ／ｍｌ ＵＣＥが含まれたα−ＭＥＭを入れたコラーゲンコーティングされた培養皿１ｃｍ^２当たり２×１０^３個の細胞を入れ、３７℃温度で、５％のＣＯ２が供給される培養器内で培養した。

＜１２−５＞臍帯幹細胞の分離方法５
１０％のＦＢＳが添加された培地で組織培養を行った。具体的には血液除去した組織を１ｍｍ^３サイズに切った後、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０％のＦＢＳが含まれたα−ＭＥＭに入れた後、３７℃温度で、５％のＣＯ^２が供給される培養器内で培養した。

＜１２−６＞臍帯幹細胞の分離方法６
０．２ｍｇ／ｍｌ臍帯抽出物が添加された培地で組織培養を行った。具体的には血液除去した組織を１ｍｍ^３サイズに切った後、コラーゲンがコーティングされた培養皿に入れ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．２ｍｇ／ｍｌのＵＣＥが含まれたα−ＭＥＭを入れた後、３７℃温度で、５％のＣＯ^２が供給される培養器内で培養した。

＜実施例１３＞ＲＴ−ＰＣＲを介した胚芽幹細胞マーカー確認
細胞ペレットをＣａ^２＋とＭｇ^２＋とが含まれていないＤＰＢＳを利用して洗浄し、１ｍｌの細胞溶解緩衝液（lysis buffer）（ｉＮｔＲＯＮ Biotechnology）を添加した後、メーカー使用マニュアルによって、全ＲＮＡ（total ＲＮＡ）を分離した。１μｇのＲＮＡはｃＤＮＡ合成キット（ｉＮｔＲＯＮ Biotechnology）を使用して、反応緩衝液（reaction buffer）、１ｍＭのｄＮＴＰ混合液（mixture）、０．５μｇ／μＬのoligo（ｄＴ）１５、２０ＵのＲＮＡ分解酵素阻害剤（ＲＮａｓｅ inhibitor）、２０ＵのＡＭＶ逆転写酵素（reverse transcriptase）が混合された２０μＬ反応溶液で逆転写させた。前記反応は４２℃で６０分間進められた。得られたＲＴ産物（ｃＤＮＡｓ）に対して、２Ｘ ＰＣＲマスターミックス溶液キット（Master mix solution kit）（ｉＮｔＲＯＮ Biotechnology）を使用して、１×のＴａｑ緩衝液、０．２５ＵのＴａｑ重合酵素（polymerase）、１０ｐＭのセンス（sense）とアンチセンス（antisense）との遺伝子特異的プリマー（gene-specific primers）が混合された１０μＬ反応溶液でＰＣＲを遂行した。増幅は全３２サイクル遂行し、各サイクルは９４℃で３０秒間の変性（denaturation）過程、３０秒間のアニーリング（annealing）過程、７２℃で３０秒間の伸張（extension）過程によって構成された。反応終結後、ＰＣＲ生成物は２％のアガロースゲル（agarose gel）に充填（loading）し、電気泳動を実施した。電気泳動後、臭化エチジウム（ethidium bromide）で染色し、紫外線を利用してＤＮＡの映像を得た。

＜実施例１４＞ＦＡＣＳ分析を介した間葉系幹細胞マーカーの発現分析
分離された細胞の特性を分析するために、柔細胞分析法を遂行した。柔細胞分析のために、細胞をＰＢＳを使用して洗浄した後、トリプシン−ＥＤＴＡを処理し、単一細胞群にした後、２％のＦＢＳが含有されたＰＢＳで洗浄する。その後、フルオレシンイソチオシアネート（ＦＩＴＣ：fluorescein isothiocyanate）またはフィコエリトリン（ＰＥ：phycoerythrin）が結合されたそれぞれのマトリックス受容体（matrix receptors）（ＣＤ４４、ＣＤ１０５）、インテグリン（integrin）（ＣＤ２９）、ＰＥＣＡＭ（ＣＤ３１）、ＶＣＡＭ−１（ＣＤ１０６）、ＳＨ２（ＣＤ１０５）、ＳＨ３及びＳＨ４（ＣＤ７３）、Ｔｈｙ−１（ＣＤ９０）、造血マーカー（hematopoietic marker）（ＣＤ１４、ＣＤ３４）及びＭＨＣマーカー（ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＣｌａｓｓＩ）を２０分間反応させた後、柔細胞分析機（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、Becton-Dickinson）を介して分析した。

＜実施例１５＞臍帯抽出物が含まれたフィラの効力試験
ヒアルロン酸誘導体と、臍帯抽出物とを５００μｇ／ｍｌの濃度で混合した後、実験用マウス（ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕＳｌｃ、メス、５週齢）に処理して実験を進めた。各処理群を２００μｌずつ皮下注射し、１週間後、４週間後、８週間後及び１２週間後にサンプルを採取した。マウスは頚椎脱骨後、サンプル周囲に付いている組織をいずれも除去し、各サンプルの重量を測定した後、４％のホルマリン（neutral buffered formalin）で固定し、ヘマトキシリン＆エオシン（hematoxylin ＆ eosin）染色を進めた。

その結果、臍帯抽出物を組織修復用フィラに混合して使用する場合、周辺組織の細胞を取り込む役割を行い、組織修復の効果を持続させるということを確認した（図２１及び図２２）。

本発明の臍帯抽出物は動物由来の一般細胞及び幹細胞培養のための血清代替物として使用可能である。また、本発明の臍帯抽出物は組織修復用フィラ、ドレッシング及び肌状態改善用の化粧料組成物に利用可能である。

Claims (23)

1. 臍帯を切断する段階と、
   前記切断された臍帯を緩衝液に入れる段階と、
   前記緩衝液に含浸された臍帯を撹拌する段階と、
   撹拌して得た産物を遠心分離し、臍帯抽出物として上澄み液を収得する段階と、
   を含む哺乳動物臍帯抽出物の製造方法。
2. 請求項１に記載の方法によって製造された臍帯抽出物。
3. 前記臍帯抽出物はＩＧＦＢＰ−７（insulin-like growth factor binding protein−７）、Lipocallin−１、ＣＸＣＬ１４、Leptin Ｒ、ＩＬ−２３、ＭＩＰ−１ａ、Angiogenin、Thrombospondin−２、ＩＬ−２９、ＩＬ−４Ｒのタンパク質を成分として含むことを特徴とする請求項２に記載の臍帯抽出物。
4. 臍帯抽出物を含む血清代替材。
5. 前記臍帯抽出物は請求項１に記載の方法によって製造されたことを特徴とする請求項４に記載の血清代替材。
6. 請求項４に記載の血清代替材を含む細胞培養液。
7. 前記細胞は動物細胞であることを特徴とする請求項６に記載の細胞培養液。
8. 前記動物細胞は幹細胞であることを特徴とする請求項７に記載の細胞培養液。
9. 前記幹細胞は臍帯由来幹細胞であることを特徴とする請求項８に記載の細胞培養液。
10. 臍帯抽出物を含む組織修復用フィラ。
11. 前記臍帯抽出物は請求項１に記載の方法によって製造されたことを特徴とする請求項１０に記載の組織修復用フィラ。
12. 細胞培養容器に哺乳類の臍帯抽出物を含む培地組成物と、細切りにされた臍帯組織をと入れて培養する段階と、
    前記臍帯組織に酵素を処理する段階と、
    臍帯組織から幹細胞を分離する段階と、
    を含む哺乳類の臍帯からの幹細胞分離方法。
13. 前記細胞培養容器は細胞付着タンパク質でコーティングされたことを特徴とする請求項１２に記載の幹細胞分離方法。
14. 前記細胞付着タンパク質は哺乳類胎盤由来のコラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン及びポリ−Ｄ−リシンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の幹細胞分離方法。
15. 幹細胞培養液に臍帯抽出物を添加する段階と、
    細胞培養容器で、前記細胞培養液を利用して幹細胞を培養する段階と、
    を含む幹細胞培養方法。
16. 前記細胞培養容器は細胞付着タンパク質でコーティングされたことを特徴とする請求項１５に記載の幹細胞培養方法。
17. 前記幹細胞は組織由来幹細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の幹細胞培養方法。
18. 前記組織は脂肪、臍帯、肝臓及び骨膜からなる群から選択されたいずれか１つであることを特徴とする請求項１６に記載の幹細胞培養方法。
19. 前記幹細胞培養液は血清を含まないことを特徴とする請求項１５に記載の幹細胞培養方法。
20. 前記細胞付着タンパク質は哺乳類胎盤由来のコラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン及びポリ−Ｄ−リシンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の幹細胞培養方法。
21. 前記幹細胞はＯｘｔ４，Ｓｏｘ２，ＫＬＦ４及びＮａｎｏｇ遺伝子からなるグループにおいて、少なくともいずれか一つが発現される細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の幹細胞培養方法。
22. 前記幹細胞はＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ１６６に選択的に陽性を示す細胞であり、ＣＤ３４及びＣＤ４５に選択的に陰性を示す細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の幹細胞培養方法。
23. 前記幹細胞は臍帯抽出物を利用して培養する場合、胚芽幹細胞特異的遺伝子であるＯｘｔ４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４及びＮａｎｏｇからなるグループにおいて、少なくともいずれか一つが継代培養を反復しても、持続的に発現される細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の幹細胞培養方法。

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