KR101259564B1 - 항산화 활성을 가지는 피부 보호용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항산화 활성을 가지는 피부 보호용 조성물에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 태반 또는 탯줄로부터 유래한 단백질을 포함하는 피부 보호용 조성물 및/또는 그 단백질을 포함하는 항산화 조성물에 관한 것이다.

항산화, 피부 보호, 태반, 탯줄, 단백질

Description

항산화 활성을 가지는 피부 보호용 조성물{COMPOSITION FOR PROTECTING SKIN WITH ANTIOXIDANT ACTIVITY}

본 발명은 항산화 활성을 가지는 피부 보호용 조성물에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 태반 또는 탯줄로부터 유래한 단백질을 포함하는 피부 개선용 조성물 및/또는 그 단백질을 포함하는 항산화 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 농림부의 바이오그린 21사업의 일환으로 수행된 연구로부터 도출된 것이다[과제 고유번호 : 20070501034009, 과제명: 돼지 태반 추출물의 생리활성 기능 탐지 및 마커 발굴].

일반적으로 활성산소종 (ROS: reactive oxygen species)은 높은 반응성을 나타내는 작은 분자들로서, UV나 특정 약물 등에 의해 생성되며, superoxide (O₂ ^·-.), hydrogen peroxide (H₂O₂) 및 highly reactive hydroxyl (OH^·)radical 등이 포함된다. 세포 내에서 일정 농도의 활성산소종은 유익한 역할을 수행하는 것으로 알려 져 있으나, 과다하게 존재할 경우 세포생존에 악영향을 끼칠 수 있다. 이러한 활성산소종 중 H₂O₂ (hydrogen peroxide, 과산화수소)는 거의 모든 oxygen radical들로부터 생성되기 때문에 중요하게 여겨지고 있다. 높은 농도의 H₂O₂는 세포 안팎의 단백질, 지질, DNA와 같은 macromolecule들을 변형시켜 세포를 파괴하며, 그것으로 인해서 세포자살 (apoptosis)이나 세포괴사 (necrosis)와 같은 세포사를 유도한다고 보고되어 있다(Barbouti A, Free Rad Biol Med 33: 691702, 2002).

피부는 외부 환경으로부터 신체를 보호하는 1차 보호시스템이기 때문에 물리, 화학적인 외부 물질에 끊임없이 노출되고 있다. UV나 특정 약물 등은 피부 내의 활성산소종 생성을 유도하며, 이러한 활성산소종 생성은 피부의 상피세포 (epidermal cells)에 부정적인 효과를 나타낸다. 현재 피부세포 내 활성산소종 생성에 대한 예방 혹은 치료에 관한 연구가 광범위하게 진행되고 있으며, 그 중 대표적인 하나가 노화와 관련된 연구이다. 사람들은 아주 오래 전부터 노화를 늦추는 것에 대한 관심을 많이 가져왔고, 노화의 진행 속도를 늦추기 위한 그 메커니즘에 대한 연구가 최근까지 이어지고 있다. 그 결과 여러 가지 노화의 원인들이 제시되고 있고, 활성산소종이 그 원인 중 하나로 여겨지고 있다. 더 나아가, 미백은 피부미용에 있어 노화만큼 지속적인 관심이 이어져오고 있는 분야이며, UV 등에 의해 생성된 활성산소종은 피부세포에서 멜라닌 생성을 유도 할 수 있으며 이러한 멜라닌 생성을 억제하는 연구가 활발히 진행되고 있다(Hedley SJ, Pigment Cell Res 15: 4956, 2003 / HIROSHI YANASE, PIGMENT CELL RES 14: 103-109. 2001 / Brozyna AA, Int J Cancer 15;123(6):1448-56, 2008).

태반은 여성의 임신과 동시에 생성되는 기관으로 혈액을 통하여 모체로부터 영양, 산소, 항체 등 태아 발달에 필수적인 물질들을 공급해주는 매개체이다. 예로부터 사람의 여러 질환에 대한 태반의 효과가 구전으로 내려오고 있고, 피부 미용과 관련된 제품의 생산과 판매가 이루어지고 있다. 실제로 태반 추출물의 창상치유 (wound healing), 항염증 작용 (anti-inflammatory effect)과 관련된 여러 보고들이 있다(Wu CH, Br J Dermatol 148: 236245, 2003 / Tapas S, Acta Pharmacol Sin 24(2): 187-192, 2003).

본 발명에서는 사람 피부세포의 한 모델인 human keratinocyte HaCaT 세포에 H₂O₂에 의한 산화적 스트레스를 유발하였을 때 발생하는 세포사멸에 대한 태반 추출액 (Plx)의 방어효과를 알아보고 그로부터 효과있는 물질을 동정하는 것에 목적을 두고 있다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 항산화 활성을 가지는 피부 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

알파-피토프로틴을 유효성분으로 함유하는 피부 보호용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 알파-피토프로틴은 알파-피토프로틴 전구체와 그 아미노산 서열이 같아서 알파-피토프로틴 전구체도 본 발명의 알파-피토프로틴과 동일한 작용을 할 수 있어서, 본 발명의 권리범위에 포함될 수 있다.

서열번호 1에 기재된 서열을 가지는 것이 바람직하나, 서열번호 1에 기재된 단백질에서 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 전치와 같은 돌연변이를 통하여 본 발명의 피부 보호 목적을 달성할 수 있는 변이 단백질도 본 발명의 단백질에 포함된다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 알파-피토프로틴은 태반 또는 탯줄 추출물로부터 분리된 것이 바람직하고, 돼지의 태반 또는 탯줄 추출물로부터 유래한 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 태반 또는 탯줄 추출물은 균질화 과정을 통하여 얻은 것이 더욱 바람직하다.

또한 본 발명은 알파-피토프로틴을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 알파-피토프로틴은 서열번호 1에 기재된 서열을 가지는 것이 바람직하나, 서열번호 1에 기재된 단백질에서 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 전치와 같은 돌연변이를 통하여 본 발명의 항산화 활성을 달성할 수 있는 변이 단백질도 본 발명의 단백질에 포함된다.

본 발명에서 "피부 보호"란 피부세포가 증식되고, 피부세포 내의 활성산소종 증가가 현저하게 억제되고, H₂O₂ 등에 의해 유도되던 세포사멸이 억제 되는 것을 의미한다.

본 발명의 상기 단백질은 피부보호 효과를 가지고 있어서, 화장품 또는 의약품의 용도로 사용될 수 있을 것이다.

본 발명에 따르는 조성물은 또한 조성물을 피부에 적용하였을 때 그의 분산을 용이하게 하기 위하여 조성물내의 태반 또는 탯줄 추출물에 대한 희석제, 분산제 또는 담체로서 작용하는 화장품 또는 약제학적으로 허용가능한 비히클을 함유한다.

물이 아닌 또는 물 이외의 비히클에는 액체 또는 고체 피부 연화제 (emollients), 용매, 보습제, 농조화제 (thickener) 및 분말이 포함될 수 있다. 특히 바람직한 비수성 담체는 폴리디메틸실록산 및/또는 폴리디메틸페닐실록산이다.

화장품 또는 약제학적으로 허용가능한 비히클은 통상적으로 조성물의 중량을 기준으로 하여 5 내지 99.9 %, 바람직하게는 25 내지 80 %이며, 다른 화장품 또는 약제학적 보조제가 없는 경우에는 조성물의 나머지를 구성할 수 있다. 바람직하게는, 비히클은 비히클의 중량을 기준으로 하여 적어도 80 중량 %가 물이다. 바람직하게는, 물은 본 발명의 조성물의 50 중량 % 이상, 보다 바람직하게는 조성물의 중량을 기준으로 하여 60 내지 80 중량 %를 차지한다.

주로 사용된 유화제의 평균 친수성-친유성 평형 (hydrophilic-lipophilic balance; HLB)에 따라 유중수 에멀젼 또는 수중 유 에멀젼을 제공하는 유화제와 함께 오일 또는 오일성 물질이 존재할 수도 있다.

본 발명의 조성물은 바람직하게는 차광제 (sunscreens)를 함유한다. 차광제에는 자외선을 차단하기 위해 통상적으로 사용되는 물질이 포함된다. 화합물의 구체적인 예는 PABA의 유도체, 신나메이트 및 살리실레이트이다. 예를 들어, 옥틸메톡시신나메이트 및 2-하이드록시-4-메톡시벤조페논 (옥시벤존으로도 알려져 있음)이 사용될 수 있다. 옥틸메톡시신나메이트 및 2-하이드록시-4-메톡시벤조페논은 각각 상품명 파르솔 (Parsol) MCX 및 벤조페논-3 (Benzophenone-3)으로 시판되는 것을 이용할 수 있다. 에멀젼에서 사용되는 차광제의 정확한 양은 태양의 UV 조사에 대해 원하는 방어도에 따라 달라질 수 있다.

본 발명이 화장료 조성물로 사용되는 경우, 그 화장품 조성물 내에는 피부 연화제가 종종 혼입된다. 이러한 피부 연화제의 레벨은 전체 조성물의 중량을 기준으로 하여 0.5 내지 50 %, 바람직하게는 5 내지 30 %의 범위일 수 있다. 피부 연화제는 에스테르, 지방산 및 지방 알콜, 폴리올 및 탄화수소와 같은 일반적인 화학적 카테고리로 분류될 수 있다.

에스테르는 모노- 또는 디-에스테르일 수 있다. 허용가능한 지방산 디-에스테르의 예에는 디부틸아디페이트, 디에틸세바케이트, 디이소프로필다이머레이트 및 디옥틸숙시네이트가 포함된다. 허용가능한 측쇄 지방산 에스테르에는 2-에틸-헥

실미리스테이트, 이소프로필스테아레이트 및 이소스테아릴팔미테이트가 포함된다. 허용가능한 3염기산 에스테르에는 트리이소프로필트리리놀리에이트 및 트리라우릴시트레이트가 포함된다. 허용가능한 직쇄 지방산 에스테르에는 라우릴팔미테이트, 미리스틸락테이트 및 스테아릴올리에이트가 포함된다. 바람직한 에스테르에는 코코-카프릴레이트/카프레이트(코코-카프릴레이트와 코코-카프레이트의 배합물), 프로필렌글리콜 미리스틸에테르 아세테이트, 디이소프로필아디페이트 및 세틸옥타노에이트가 포함된다.

적절한 지방 알콜 및 지방산에는 10 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 화합물이 포함된다. 특히 바람직한 것은 세틸, 미리스틸, 팔미틸 및 스테아릴 알콜 및 산과 같은 화합물이다.

피부 연화제로 작용할 수 있는 폴리올중에는 직쇄 및 측쇄 알킬폴리하이드록실 화합물이 있다. 예를 들어, 프로필렌글리콜, 소르비톨 및 글리세린이 바람직하다. 또한, 폴리-프로필렌글리콜 및 폴리에틸렌글리콜과 같은 중합체 폴리올이 유용

하게 사용될 수 있다. 부틸렌 및 프로필렌 글리콜은 또한 침투 증진제로서 특히 바람직하다.

피부 연화제로서 작용할 수 있는 탄화수소의 예로는 어떤 경우든 12 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소 사슬을 갖는 것이다. 구체적인 예로는 광유, 와셀 린 (petroleum jelly), 스쿠알렌 및 이소파라핀이 포함된다.

본 본 발명의 단백질이 화장품의 용도로 사용되는 경우에는 조성물 내의 또다른 카테고리의 기능성 성분은 농조화제이다. 농조화제는 어떤 경우든지 통상으로는 조성물의 중량을 기준으로 0.1 내지 20 %, 바람직하게는 약 0.5 내지 10 %의 양으로 존재한다. 농조화제의 예는 비.에프.구드리치 컴퍼니 (B.F. Goodrich Company)로부터 상품명 카보폴 (Carbopol)로 시판되는 가교된 폴리아크릴레이트 물질이다. 크산탄, 카라기닌, 젤라틴, 카라야, 펙틴 및 로커스트빈 (locust bean) 고무와 같은 고무가 사용될 수도 있다. 특정한 환경하에서 농조화 기능은 실리콘 또는 피부 연화제로서 작용하기도 하는 물질에 의해 제공될 수도 있다. 예를 들어, 10 센티스토크 이상인 실리콘고무 및 글리세롤스테아레이트와 같은 에스테르는 이중적인 기능성을 갖는다.

분말이 본 발명의 화장품 조성물내에 혼입될 수도 있다. 이들 분말에는 초크 (chalk), 탈크, 카올린, 전분, 스멕타이트(smectite) 점토, 화학적으로 변형된 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 유기적으로 변형된 몬모릴로나이트 점토, 수화된 알

루미늄 실리케이트, 훈증 실리카, 알루미늄 전분 옥테닐숙시네이트 및 이들의 혼합물이 포함된다.

그밖의 다른 보조적인 미량 성분이 또한 본 발명의 화장품 조성물 내에 혼입될 수 있다. 이들 성분에는 착색제, 유백화제 및 향료가 포함될 수 있다. 이들 다른 보조적 미량 성분의 양은 어떤 경우든 조성물의 중량을 기준으로 0.001 내지 20 % 까지의 범위일 수 있다.

본 발명에 따르는 조성물은 일차적으로 사람의 피부에 국소 적용하기 위한 제품, 특히 피부의 컨디쇼닝, 보습(moisturizing) 및 유연화 (smoothening), 피부의 두께, 유연성 및 탄력성의 증가, 및 주름살이 있거나, 주름지거나 노화된

피부의 출현의 방지 또는 감소를 위한 제제로서 사용된다.

사용시에는 소량, 예를 들어 1 내지 100 ㎖의 조성물을 적절한 용기 또는 도포기 (applicator)를 이용하여 피부의 노출된 면적에 적용하고, 필요에 따라, 그 후에 손 또는 손가락 또는 적절한 기구를 사용하여 피부에 펴바르고(거나) 문지른다.

본 발명의 국소적 피부 보호 조성물은 로숀, 크림 또는 겔로서 제제화될 수 있다. 조성물은 그의 점도 및 소비자가 목적하는 용도에 맞는 적절한 용기로 포장될 수 있다. 예를 들어, 로숀 또는 크림은 병 또는 롤-볼 (roll-ball) 도포기, 또는 추진제-구동된 에어로졸 장치 또는 손가락 가동에 적절한 펌프가 장착된 용기내에 포장될 수 있다. 조성물이 크림인 경우에, 이것은 간단히 비-변형성 병 또는 스퀴즈 (squeeze) 용기, 예를 들어 튜브 또는 뚜껑이 있는 자아 (jar) 또는 캡슐 내에 저장될 수 있다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명에서는 돈태반 추출액이 H₂O₂에 의한 인간 피부세포에서의 산화적 스 트레스로부터 세포를 보호하여 H₂O₂에 대한 세포 생존율을 높여준다는 결과를 얻었고, 그 추출방법에 있어서 산분해보다 균질화시키는 방법이 더욱 효과적임을 확인할 수 있었다. 이것은 돈태반 조직에 강산을 처리함으로써 H₂O₂에 대한 항산화적 효과를 갖는 물질이 분해되거나 성질이 변했기 때문일 것이라 추측된다.

균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)의 산화적 스트레스에 대한 방어작용을 조사한 결과, H₂O₂에 의해 세포 내에 산화적 스트레스가 가해지면, 세포자살이나 세포괴사와 같은 세포사멸이 일어나게 되는데, 이것을 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)이 효과적으로 억제함을 Sytox-Hoechst 염색과 western blotting 방법을 통하여 증명하였다. H₂O₂가 세포에 가해지는 농도에 따라 또는 세포주의 종류에 따라 세포사멸의 양상이 조금씩 다르다고 알려져 있다. 실제로 본 발명에서도 0.5 mM과 1 mM의 H₂O₂가 가해진 세포들의 경우, 그 농도에 따라 세포 모양, 특히 핵의 모양에서 차이를 나타내었다. Sytox와 Hoechst는 모두 세포 내의 핵을 염색할 수 있는 시약이나, Sytox는 정상적인 상태의 세포에는 염색되지 않고 세포괴사가 일어나는 세포을 염색하는 시약으로 알려져 있다. 본 발명에서는 1 mM의 H₂O₂를 처리한 군에서만 Sytox의 염색이 관찰되었으며, 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)을 함께 처리한 군에서는 관찰되지 않았다. Hoechst을 사용하여 정상적인 상태의 세포와 세포사멸이 일어나는 세포 모두의 핵을 염색하여 본 결과, 세포자살이 일어나는 세포의 특징인 핵의 응축이나 DNA의 분절을 비교 관찰할 수 있었다. 0.5 mM의 H₂O₂를 처리한 군에서 H₂O₂를 처리하지 않은 대조군에 비하여 약 5배정도 높은 수의 핵의 응축이나 DNA의 분절이 관찰되었으나, 1 mM의 H₂O₂를 처리한 군에서는 상대적으로 관찰하기 어려웠다. 또한 0.5 mM의 H₂O₂와 H-Plx를 함께 처리한 군에서는 이러한 핵의 응축이나 DNA의 분절이 0.5 mM의 H₂O₂만 처리한 군보다 아무것도 처리하지 않은 대조군과 유사한 수준으로 적게 관찰되었다. 이와 같은 결과는 또 다른 실험 방법인 western blotting을 통해서도 증명되었다. 본 발명에서 관찰한 PARP (Poly ADP ribose polymerase) 단백질은 손상된 DNA를 복구하는데 중요한 역할을 하는 단백질로, caspase-3나 7과 같이 이것의 상위에 있는 단백질에 의하여 잘리게 되면 DNA를 복구하는 기능을 잃기 때문에 세포자살과 같은 세포사멸이 일어난다고 널리 알려져 있다. 특히 western blotting 결과에서 약 89 kDa에 해당하는 PARP 단백질 절편을 세포자살이 일어나는 세포에서 관찰한 연구결과들을 많이 볼 수 있다. 하지만 세포괴사가 일어나는 세포에서 세포자살이 일어나는 세포에서는 관찰되지 않는 약 50 kDa의 PARP 단백질 절편이 나타난다는 선행연구가 있기 때문에, PARP 단백질 절편의 비교를 통하여 H₂O₂에 의해 유발되는 HaCaT 세포의 세포자살과 세포괴사를 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)이 방어한다는 것을 관찰할 수 있었다.

세포 내의 활성산소종이 증가하면 세포자살과 세포괴사와 같은 세포사멸이 유발된다는 것은 이미 널리 알려진 사실이다(H.-U. Simon, Apoptosis 5: 415-418, 2000 / Takeda M, Nephron 81(2):234-8, 1999).). 본 발명에서 HaCaT 세포의 세포자살과 세포괴사가 일어나는 0.5 mM과 1 mM H₂O₂ 각각의 농도로 처리된 세포 내의 활성산소종 수치가 증가된 결과는 세포사멸과 세포 내 활성산소종 증가가 밀접하게 연관되어 있음을 보여준다. 또한 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)을 추가적으로 처리한 세포 내의 활성산소종 수치가 H₂O₂만 처리한 세포보다 낮게 측정된 것은 앞서 확인한 H-Plx가 H₂O₂에 의한 세포사멸을 막는다는 결과와 일치한다. 이 결과들은 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)이 H₂O₂에 대한 효과적인 항산화제 역할을 수행함을 암시한다.

균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx) 내의 항산화적 기능을 갖는 물질에 더욱 접근하기위하여 세 가지의 크로마토그래피를 각각 시행하였다. 사용된 column 내의 bead가 갖는 전자적 성향에 따라 cation exchange와 anion exchange 크로마토그래피로 나뉘는데, cation exchange에서 사용되는 bead는 양전하를 띠기 때문에 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx) 내의 음전하를 띠는 물질을 분리할 수 있고, 시간이 지날수록 강한 음전하를 띠는 물질이 분리되었다. 이와 반대로 anion exchange에서의 bead는 음전하를 띠기 때문에 양전하 물질을 분리할 수 있었다. 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx) 내의 물질은 size exclusion 크로마토그래피를 통하여 크기별 분리를 할 수 있었다. Size exclusion 크로마토그래피에 사용되는 bead에는 여러 pore가 존재하여 fractionation 과정 초기에는 pore를 통과하지 못한 큰 크기의 물질이 분리되었지만, 시간이 지날수록 bead의 pore를 통과한 작은 크기의 물질을 얻을 수 있었다. 앞서 시행한 실험들에서 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)이 H₂O₂에 의해 유발되는 HaCaT 세포 내 활성산소종의 증가를 억제하며, 또한 세포사멸을 억제하는 것을 확인하였기 때문에 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)으로부터 분리된 분획들의 항산화 효과를 통해 H₂O₂에 의해 유발되는 HaCaT의 세포 사멸을 억제함을 알 수 있었다. 그 결과 anion exchange와 size exclusion 크로마토그래피가 본 연구에 알맞은 단백질 분리방법임을 밝혔고, 그와 같은 방법에 의하여 항산화물질을 포함한 좀 더 정제된 chromatographic 분획을 얻을 수 있었다. 본 발명에서는 태반뿐만 아니라 태아와 태반을 매개하는 탯줄 추출액 (H-Ux)의 항산화 효과를 확인한 선행연구를 바탕으로 태반 추출액과 같은 방법의 fractionation을 실시하여 각각의 분획들에 대한 항산화 효과를 확인하였다. 그 결과, 항산화 물질은 돈태반뿐만 아니라 탯줄에도 존재하는 단백질로서 α-fetoprotein을 포함하는 분획에 존재함을 할 수 있었다.

이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

인간 피부세포의 증식률과 생존율에 미치는 돈태반 추출액의 효과

피부는 외부 자극으로부터 인체를 보호하는 1차 방어시스템이며 동시에 외부 유해물질들에 많이 노출되는 기관이다. 그렇기 때문에 이런 방어시스템의 유지를 위해 피부를 보호하는 물질에 대한 연구가 많이 이루어지고 있고, 자연적으로 immortalization되어 만들어진 epithelial cell line인 HaCaT keratinocyte 세포가 in vitro 상의 피부 모델로 널리 사용되고 있다. 먼저 HaCaT 세포에 산분해 과정을 통한 돈태반 추출액 (A-Plx)과 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)을 다양한 농도로 처리하여 세포에 미치는 영향을 관찰하였다.

표 1은 A-Plx와 H-Plx 내의 총 아미노산 함량 비교 표이다.

두 가지 서로 다른 방법에 의하여 얻어진 추출액 H-Plx와 A-Plx는 표 1에서 볼 수 있듯이 각각의 추출액이 함유하고 있는 총 아미노산 함량이 비슷한 수준이 되도록 준비하였다. 이렇게 얻어진 각각의 태반 추출액을 최종 농도가 5~ 40%가 되도록 처리하였을 때, A-Plx를 처리한 군에서는 두드러진 변화를 보이지 않으나, H-Plx를 처리한 군에서는 최종 농도 20%에서 증식률 (proliferation)이 증가하는 결과를 보였다 (도 1A). 따라서 이 결과로부터 돈태반 추출액이 HaCaT 세포에 유해한 물질이 아니며, 세포 증식을 증가시키는데 기여한다는 것을 알 수 있었다. 다음으로 HaCaT 세포에 세포 내 활성산소종 생성을 유도 할뿐만 아니라 세포 사멸 유도물질인 H₂O₂를 0.5 mM과 1 mM의 농도로 처리한 실험군과 각각의 태반 추출액을 함께 처리한 실험군을 관찰한 결과, H₂O₂와 H-Plx를 함께 처리한 군에서 H₂O₂만 처리한 군에 비해 매우 높은 비율의 세포 생존율을 관찰할 수 있었다 (도 1B, C). 이 결과로부터 돈태반 추출액은 H₂O₂로 인해 유발되는 세포사를 억제함을 알 수 있었고, 추출 방법에 있어서는 산분해 보다는 균질화 방법이 더욱 효과적임을 알 수 있었다.

인간 피부세포에서 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)이 H ₂ O ₂ 에 의한 세포사멸과 세포괴사에 미치는 영향

H₂O₂는 농도에 따라 세포에서 세포자살 또는 세포괴사를 유발하며, 세포의 종류마다 적용되는 농도가 다르다고 알려져 있다. 본 연구에서는 0.5 mM과 1 mM의 서로 다른 농도의 H₂O₂를 이용하여 HaCaT 세포에서 세포자살과 세포괴사를 유도하였으며, 이러한 환경에서 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)이 H₂O₂에 의한 세포자살과 세포괴사를 억제하는지를 Sytox-Hoechst 염색을 통하여 관찰하였다. 세포자살을 보이는 세포는 Hoechst 용액으로 염색된 응축된 핵이나 DNA의 분절에 의해 결정되었고, 세포괴사를 보이는 세포는 Sytox 용액으로 염색된 세포의 비율에 의해 결정되었다. 0.5 mM의 H₂O₂에 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)을 추가적으로 처리한 군에서는 H₂O₂에 의해 유도되던 세포사멸이 억제되는 것을 관찰되었다. 또한, 1 mM의 H₂O₂를 처리하여 세포괴사를 유도한 군에서도 Sytox 용액으로 염색된 세포가 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)이 추가적으로 처리된 처리군에서 현저하게 감소하는 결과를 얻었다 (도 3a). 결국 0.5 mM 농도의 H₂O₂만 처리한 군에서는 세포자살이, 1 mM 농도의 H₂O₂를 처리한 군에서는 세포괴사가 HaCaT 세포의 세포사멸의 주된 원인임을 확인하였고, 이들 세포사멸들을 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)이 효과적으로 억제하고 있음을 알 수 있었다.

위와 같은 사실을 더욱 확실히 증명하기 위하여 또 다른 실험 방법인 PARP 단백질에 대한 웨스턴 블럿팅을 실시하였다. 세포자살이 일어나는 세포 내의 PARP (Poly ADP ribose polymerase) 단백질은 western blotting을 통하여 89 kDa의 단백질 절편이 관찰되는 것으로 많이 알려져 있으며 세포괴사가 일어나는 세포 내의 PARP 단백질은 약 50 kDa에서 주요 단백질 절편이 나타난다고 보고되고 있다(Wu YT, Autophagy 16:4(4): 457-66, 2008 / Girish M, Biochemical and Biophysical Research Communications 229: 838844, 1999 / Dean S, Toxicology and Applied Pharmacology 171: 107116, 2001). 이에 본 발명에서 western blotting을 실시한 결과 0.5 mM 농도의 H₂O₂만 처리한 군에서 89 kDa의 단백질 절편을 관찰할 수 있었고, 0.5 mM 농도의 H₂O₂와 H-Plx를 동시에 처리한 군에서 그 단백질의 양이 감소하는 것을 관찰하였다. 또한, 1 mM 농도의 H₂O₂만 처리한 군에서도 89 kDa의 단백질 절편을 관찰할 수 있었을 뿐만아니라, 50 kDa의 단백질 절편이 특이적으로 관찰되었다. 하지만 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)을 추가로 처리한 군에서는 PARP의 89 kDa과 50 kDa의 절편이 거의 관찰되지 않았다 (도 3b). 이 결과들로부터 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)이 H₂O₂에 의해 유발되는 피부세포의 세포자살과 세포괴사를 매우 효과적으로 방어한다는 것을 확인할 수 있었다.

균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)이 H ₂ O ₂ 에 의해 유발되는 피부세포 내 활성산소종 변화에 미치는 영향

UV와 같은 외부 자극에 의하여 세포 내의 활성산소종 증가가 세포사멸을 유도한다는 많은 보고가 있다. 본 발명에서는 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)이 H₂O₂에 의해 유발되는 피부세포의 사멸을 억제할 때 세포 내 활성산소종의 변화를 관찰하였다. 세포내 생성된 활성산소종의 양은 활성산소종을 특이적으로 염색하는 DCFH-DA로 세포를 염색하여 FACS 분석을 통하여 실시하였다. 그 결과 0.5 mM과 1 mM 농도의 H₂O₂만 처리한 군과 비교할 때, 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)을 함께 처리한 군의 피부세포내의 활성산소종 증가가 현저하게 억제됨을 관찰할 수 있었다 (도 4). 따라서 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)이 H₂O₂에 의해 유발되는 피부세포 내 활성산소종의 증가를 억제시킴으로써 세포사멸을 감소시킬 것으로 예상되었다.

다양한 크로마토그래피를 이용한 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx) 내의 유효성분 분리와 피부세포의 생존율 (cell viability)에 미치는 영향

균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx) 내의 항산화적 기능을 갖는 물질 규명을 위하여, 다양한 방법 (cation exchange, anion exchange, 또는 size exclusion chromatography)으로 분획화를 시행하였다 (도 5). 이렇게 세 가지 각각 다른 방법으로 얻어진 돈태반 추출액 (H-Plx)의 chromatographic 분획들에 대한 항산화 효과를 관찰하였다. 그 결과 cation exchange 크로마토그래피에 의해 얻어진 60개의 분획들을 1 mM의 H₂O₂와 함께 HaCaT 세포에 처리한 결과, 2~ 4번 분획에서만 H₂O₂에 의한 세포 생존율 감소를 억제시키는 것을 관찰할 수 있었다 (도 6a). 그러나 anion exchange 크로마토그래피에 의해 얻어진 60개의 분획들을 1 mM의 H₂O₂와 함께 HaCaT 세포에 처리한 결과, 2~ 4번뿐만 아니라 22~ 24번 분획을 함께 처리한 HaCaT 세포에서도 세포 생존율 감소를 억제 시키는 결과를 얻었으며, 그 중 24번 분획을 함께 처리한 HaCaT 세포에서 현저히 높은 세포 생존율을 확인할 수 있었다 (도 6b). 각각의 물질들이 분리되면서 얻어진 chromatogram은 해당 분획 내의 단백질 함량을 나타하며 전압량 (voltage, mV)으로 표현되었다. Cation과 anion exchange 크로마토그래피를 통하여 얻은 2~ 4번 분획들은 chromatogram 상의 전압량 (단백질 함량)이 높은 것으로 미루어 볼 때, 이들 분획 내에는 비드에 붙지 않고 컬럼을 통과한 물질들 (Flow-through)을 다량 포함하고 있을 것으로 예측되었다. 반면에 22~ 24번 분획은 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx) 내의 항산화 물질을 함유하고 있을 것으로 예상할 수 있었다. 다음으로 size exclusion 크로마토그래피에 의해 얻어진 40개의 분획들을 1 mM의 H₂O₂와 함께 HaCaT 세포에 처리한 결과, 16~ 18번 분획이 H₂O₂에 의한 HaCaT 세포 생존율 감소를 특이적으로 억제함을 알 수 있었다. 또한 16~ 18번 분획 내에 존재하는 물질들의 크기를 산출하기 위하여 standard 물질들을 size exclusion 크로마토그래피를 실시하여 얻은 chromatogram과 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)의 chromatogram을 비교하였다. 총 5개의 standard 물질들로부터 얻은 chromatogram 상에서 각각 a는 thyroglobulin으로 670 kDa을, b는 r-globulin으로 158 kDa을, c는 ovalbumin으로 44 kDa을 d는 myoglobin으로 17 kDa을 e는 vitamin B12로 1.35 kDa을 의미하는 5개의 주된 peak를 확인하였다. Chromatogram 상의 각각의 standard 물질의 위치와 16-18번 size exclusion chromatographic 분획에 해당되는 위치를 비교한 결과, 그 물질은 약 74 kDa~ 139 kDa일 것으로 추정되었다 (Figure 6C). 이러한 결과들을 통하여 22~ 24번 anion exchange chromatographic 분획과 16~ 18번 size exclusion chromatographic 분획이 H₂O₂에 의한 세포 생존율의 감소를 억제하는 강력한 항산화 효과를 나타내고, 그 크기는 약 74 kDa~ 139 kDa임을 알 수 있었다.

다양한 크로마토그래피를 이용한 돼지 탯줄 추출액 (H-Ux)의 분리 및 이들 분획이 피부세포의 생존율 (cell viability)에 미치는 영향

탯줄은 태반과 함께 생성되고, 모체유래의 영양분이나 산소 등은 태반을 거쳐 탯줄을 통하여 태아로 전달된다. 그렇기 때문에 탯줄 내에도 태반과 같이 많은 유효성분들이 많이 포함되어 있을 것으로 예상되어, 선행 연구에서 이를 확인하기 위하여 H-Plx와 같은 방법으로 준비된 돼지 탯줄 추출액 (U-Px)을 세포에 처리하여 이들 추출액에도 항산화 효과를 나타내는 성분이 함유되어 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 H-Plx와 같은 방법으로 H-Ux 내의 항산화적 기능을 갖는 물질을 규명하기 위하여 크로마토그래피을 시행하였다. 이렇게 세 가지 각각 다른 방법으로 얻어진 H-Ux의 chromatographic 분획들 각각에 대한 항산화 효과를 H₂O₂에 의해 유발되는 HaCaT의 세포 생존율 (cell viability) 감소의 억제를 관찰하여 확인하였다. 그 결과 cation exchange 크로마토그래피에 의해 얻어진 60개의 분획들을 1 mM의 H₂O₂와 함께 HaCaT 세포에 처리한 결과, H₂O₂ 처리 시 세포 생존율이 현저히 감소되는 반면 2~ 4번 분획에서만 H₂O₂에 의한 세포 생존율 감소를 억제시키는 것을 관찰할 수 있었다 (도 7a). 그러나 anion exchange 크로마토그래피에 의해 얻어진 60개의 분획들을 1 mM의 H₂O₂와 함께 HaCaT 세포에 처리한 결과, 2~ 4번뿐만 아니라 20~ 26번 분획을 함께 처리한 HaCaT 세포에서도 H₂O₂만 처리한 군보다 높은 세포 생존률이 관찰되었으며, 그 중 22~ 24번 분획을 함께 처리한 HaCaT 세포에서 현저히 높은 세포 생존율을 확인할 수 있었다 (도 7b). 그러나 cation과 anion exchange 크로마토그래피를 통하여 얻은 2~ 4번 분획들은 chromatogram 상의 전압량 (단백질 함량)이 높은 것으로 미루어 볼 때, 이들 분획 내에는 비드에 붙지 않고 컬럼을 통과한 물질들 (Flow-through)을 다량 포함하고 있을 것으로 예측되기 때문에 실제로 이것을 확인하기 위하여 coomassie blue 염색을 실시하였다. 염색된 gel 상의 단백질 밴드의 양상을 볼 때 2~ 4번 분획 (C2~ C4와 A2~ A4) 내에는 매우 다양한 단백질이 포함되어 있는 것이 확인 되었고 (도 8A, B), 22~ 24번 anion exchange chromatographic 분획 (A22~ A24)에 나타나는 단백질 밴드도 포함되어있는 것이 관찰되었다 (도 8B). 따라서 22~ 24번 anionic exchange chromatographic 분획이 목표물질 규명에 더욱 근접하게 정제된 상태라고 예상할 수 있었다. 다음으로 size exclusion 크로마토그래피에 의해 얻어진 45개의 분획들을 1 mM의 H₂O₂와 함께 HaCaT 세포에 처리한 결과, 16~ 17번 분획이 H₂O₂에 의한 HaCaT 세포 생존율의 감소를 특이적으로 억제하는 것이 관찰되었다 (도 7c). 이러한 결과들을 통하여 22-24번 anion exchange chromatographic 분획과 16-17번 size exclusion chromatographic 분획이 H₂O₂에 의한 세포 생존율의 감소를 억제하는 강력한 항산화 효과를 보임을 확인할 수 있었고, 이는 태반을 이용한 크로마토그래피 결과와 유사한 경향을 보여 같은 물질일 가능성을 제시하고 있다.

돈태반 및 돈탯줄 유래 Chromatographic 분획이 H ₂ O ₂ 에 의해 유발되는 피부세포 내 활성산소종 변화에 미치는 영향

본 발명에서는 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)이 H₂O₂에 의해 유발되는 피부세포의 사멸을 억제할 때 세포 내 활성산소종의 증가를 억제시킴을 확인하였다. Chromatographic 분획의 H₂O₂에 대한 항산화 작용은 H₂O₂에 의해 유발되는 피부세포의 생존율을 통하여 확인하였으나, 조금 더 명확한 증거를 제시하기 위하여 세포 내 활성산소종의 변화를 관찰하였다. 활성산소종의 양을 측정하기 위하여 DCFH-DA로 세포를 염색하여 FACS 분석을 통하여 실시한 결과, 1 mM 농도의 H₂O₂만 처리한 군과 비교할 때, 돈태반 유래의 24번 anion exchange나 16번 size exclusion chromatographic 분획 을 함께 처리한 군의 피부세포내의 활성산소종 증가가 현저하게 억제됨을 관찰할 수 있었다 (도 9A). 또한 같은 방법으로 얻어진 탯줄 유래의 chromatographic 분획을 처리한 군의 세포 내 활성산소종 수치를 측정한 결과, 1 mM 농도의 H₂O₂만 처리한 군보다 활성산소종이 다량 감소함을 관찰할 수 있었다 (도 9B). 이 결과는 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)을 처리하여 관찰한 결과와 일치하며, 이를 통하여 돈태반과 탯줄유래의 24번 anion exchange와 16번 size exclusion chromatographic 분획 내에 H₂O₂에 대한 항산화 물질이 포함되어있음을 한 번 더 확인할 수 있었다.

Chromatographic 분획 내의 단백질 분석

균질화 과정을 통해 얻어진 돈태반 추출액 (H-Plx)으로부터 분리된 분획들 중 항산화 효과를 갖는 분획들 내의 단백질을 비교, 분석하기 위하여 silver 염색을 실시하였다. 염색된 주요 단백질 밴드의 양상을 비교하여, 22~ 24번 anion exchange chromatographic 분획 (A22~ A24)과 16~ 17번 size exclusion chromatographic 분획 (S16~ S17) 내에 공통적으로 존재하는 단백질을 SDS-PAGE 상에서 조사하였다. 그 중 각 분획의 활성을 의미하는 세포 생존율의 상대적 값 (도 6, 7)을 괄호 안에 표시하여, 그것과 후보 밴드의 변화 양상을 비교하였다. 그 결과 분획의 활성과 해당 단백질 양의 변화 양상이 일치하고, 화살표로 표시된 것과 같이 55~ 72 kDa 사이에 존재하는 단백질 밴드를 확인할 수 있었다(도 10). 그 단백질을 규명하기위하여 같은 분획 시료로 SDS-PAGE를 한 번 더 실시하여 coomassie blue 염색으로 단백질 밴드를 확인한 후 MALDI-TOF를 실시하였고, MASCOT 프로그램을 이용하여 결과를 도출하였다. 분석 결과, Alpha-fetoprotein precursor, Prefoldin subunit 5, Heat shock factor protein 4, Vimentin, Lebercilin-like protein Cholecystockinins precursor, Long palate, lung and nasal epithelium carcinoma-associated protein 1 precursor 등 여러 가지 후보 단백질들을 얻을 수 있었으나, 단백질 서열의 일치 정도를 의미하는 Score가 53 이상일 때 의미가 있기 때문에 약 69 kDa 크기의 돼지유래 α-fetoprotein precursor만이 가장 유력한 후보 단백질임을 확인하였다 (표 2).

표 2는 MALDI-TOF를 이용한 단백질 분석 결과이다.

본 발명의 균질화 과정을 통한 태반 특히 돈태반 추출액 (H-Plx)과 탯줄 추출액 (H-Ux) 및 이들로부터 유래된 α-fetoprotein(또는 Alpha-fetoprotein precursor)은 피부세포를 증식시키고, 피부세포 내의 활성산소종 증가가 현저하게 억제되고, H₂O₂ 등에 의해 유도되던 세포사멸이 억제하는 효과가 있다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위하여 기재한 것이므로, 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되어지지 아니한다.

실시예 1:세포배양

Immortalized human keratinocyte HaCaT 세포주는 10% fetal bovine serum과 항생제 (100 μg/ml streptomycin 및 100 U/ml penicillin)가 첨가된 DMEM으로 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. MTT assay를 위하여 HaCaT 세포를 96 well 배양조에서 1X10⁴ 의 세포를, western blotting을 위하여 100 mm 배양조에서 2X10⁶의 세포를, 그 이외의 실험에서는 35 mm 배양조에서 3X10⁵의 세포를 배양액과 함께 24시간 배양하였다.

실시예 2: 돈태반 및 탯줄 유래 물질들의 추출 방법 및 과정

정상적인 임신을 한 돼지로부터 분만 후 즉시 얻어진 태반의 양막을 제거하여, 그것을 탯줄과 분리한 뒤 태반과 탯줄 각각의 조직을 차가운 0.9% NaCl 용액으로 혈액을 충분히 제거하였다. 추출의 전 과정은 4℃에서 이루어졌다. 먼저 균질화를 통한 돈태반 추출액 (Homogenized Placenta extract; H-Plx)과 탯줄 추출액(Homogenized Umbilical cord extract; H-Ux)을 확보하기 위하여 각각의 조직과 phosphate-buffered saline (PBS, 0.01 M Na2HPO4, 0.01 M NaHPO4, 및 0.14 M, pH 7.4)용액을 50% w/v의 비율로 knife homogenizer (대성아트론)와 Polytron Homogenizer (독일의 ART-moderne Labortechnik)를 이용하여 균질화를 실시하였다. 균질 과정을 거친 태반 조직에서 태반 유래 물질들을 액상으로 추출하기 위하여 5,000 rpm에서 15분 동안 원심 분리를 통하여 상층액만 분리해 내었다. 이것을 세포에 처리하기 위하여 55℃에서 1시간동안 heat-inactivation을 시킨 후 다시 한 번 5,000 rpm에서 15분 동안 원심 분리를 통하여 상층액만 분리해 내었다. 산분해 과정을 통한 돈태반 추출액 (Acid hydrolyzed Placenta extract; A-Plx)을 확보하기위하여 태반조직 (2.1 kg)에 6 N HCl 용액을 첨가하여 5시간 동안 105℃의 열을 가하였다. 이를 세포에 처리하기 위하여 10 N NaOH 용액으로 중화시킨 후 0.2 um의 cellulose acetate membrane을 이용하여 여과과정을 거쳤다.

실시예 3:아미노산 함량 분석

아미노산 함량을 분석하기위하여 시료를 두 가지 실험군으로 나누었다. 첫 번째는 황을 포함하지 않는 아미노산을 분석하기위한 것으로 시료에 6 N HCl 용액을 첨가하여, 105℃의 온도에서 24시간 동안 가수분해 시킨 후, 방냉하여 약 80℃~ 90℃ waterbath에서 산과 물을 증발시켰다. 증발 후 남은 시료에 희석용 완충액을 첨가하여 sonicator로 용해시킨 후, 0.2 um의 cellulose acetate membrane을 이용하여 여과과정을 거쳤다. 두 번째는 황 함유 아미노산을 분석하기위한 것으로 시료에 몇 가지 전처리가 실행되었다. 분석하고자하는 시료에 performic acid를 첨가하여 4℃에서 24시간 동안 정치시킨 후, 실온에서 HBr을 1시간 동안 처리하여 다시 4℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 다음으로 Rotary Vacuum Evapoator를 이용하여 감 압 농축하였고, 증류수를 첨가한 후 다시 한 번 농축시켜 전처리가 완료되었다. 그 다음 과정은 6 N HCl 용액을 첨가하는 것으로 이후 과정은 황 불포함 아미노산 분석 방법과 동일하게 진행하였다. 최종적으로 얻은 두 종류의 시료 모두의 아미노산 함량을 HPLC (SYKAM Amino Acid Analyzer)를 이용하여 측정하였다.

실시예 4: 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)의 열처리 방법 및 과정

균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)에 열처리를 하기 위하여 추출액을 서로 다른 튜브에 분주하였고, 각각을 60℃- 100℃의 서로 다른 온도에 1시간 동안 정치시켰다. 시간별 열처리를 위하여 서로 다른 튜브에 분주해 놓은 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx) 각각을 60℃에서 1분-60분의 서로 다른 시간 동안 정치시켰다.

실시예 5:MTT assay

돈태반 추출액 (H-Plx, A-Plx)과 H₂O₂를 처리하여 100 ul/well의 배지에 24시간 배양시킨 96 well의 HaCaT 세포에 Cell Counting Kit 8 (CCK-8, Dojindo사)를 10 ul/well로 처리한 후 2시간 동안 배양기에서 배양시켰다. 세포 생존율은 ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여 450 nm 파장에서 측정한 흡광도에 의하여 결정되었다. 세포의 증식율과 생존율은 MTT assay에 의해 측정되었고, 결과는 대조군(control)을 100%로 하여 상대적인 백분율로 표시하였다.

실시예 6:Sytox-Hoechst 염색

35mm의 배양조에 배양시킨 HaCaT세포를 돈태반 추출액 (H-Plx, A-Plx)이나 H₂O₂를 처리하여, 24시간 후 형광을 띠며 DNA에 결합하는 Hoechst33342와 Sytox 용액 (Molecular probe사)을 각각의 최종농도가 5 ug/ml과 5 uM이 되도록 혼합하여 배지에 첨가시킨 후 37℃에서 5분 동안 배양시켰다. 염색된 세포는 형광현미경으로 관찰하였고, 이 중 세포자살을 보이는 세포는 DNA가 분절되거나 응축된 핵에 의해 결정되었다. 세포괴사를 보이는 세포는 FACS (Beckton Dickinson사)를 이용하여 Sytox 용액에 의해 염색된 세포의 비율로 결정되었다. 결과는 대조군(control)을 1로 하였을 때 상대적인 비율로 표시하였다.

실시예 7:Western blotting

전기영동을 위한 단백질 추출을 위하여 세포에 lysis 용액을 첨가하여 용해시켰다. 용해된 세포는 4℃ 상태에서 12,000 rpm에서 15분 동안 원심 분리시켜 얻고, 상층액은 Bradfoard 방법을 이용하여 정량하였다. 40 ug의 단백질이 함유되도록 만들어진 시료를 polyacrylamide gel에 전기영동한 후, 단백질을 nitocellulose membrane에 transfer하였다. Membrane을 항체와의 비 특이적 결합을 차단시키기 위하여 5% skimmed milk를 함유한 용액으로 상온에서 1시간 동안 반응시키고, 1차 항체 (anti-PARP, anti-actin)를 4℃에서 12시간 이상 반응시킨 후, 0.1% Tween 20을 포함한 TBST 용액으로 여러 번 수세하였다. 각각의 1차 항체에 대한 2차 항체 (horseradish peroxidase-conjugaed anti-rabbit과 anti-mouse)를 membrane과 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, TBST 용액으로 여러 번 수세하였다. 세척된 membrane상의 단백질은 ECL 반응액 (GE Healthcare사)을 이용하여 X-ray film을 통하여 검증하였다.

실시예 8:세포 내 활성산소종 측정

35 mm의 배양조에 배양시킨 HaCaT 세포에 돈태반 추출액 (H-Plx)과 H₂O₂ 등을 12시간 동안 처리하였다. 양성 대조군으로 널리 사용되고 있는 항산화제인 NAC (N-acetyl-cysteine, Sigma사)를 사용하였고, NAC는 1 mM의 농도로 DCFH-DA 염색 전 1시간 동안 처리한 후 제거하고, DMEM으로 세포를 한 차례 수세시켰다. 세포는 oxidant-sensitive fluorescent probe인 DCFH-DA 염색액을 최종 농도 10 uM이 되도록 첨가시킨 후 37℃에서 30분간 반응시켰다. 세포 내 활성산소종은 FACS를 이용해 측정하였다.

실시예 9: High-performance strong cation exchange 크로마토그래피

균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)으로 strong cation exchange HPLC (High Performance Liquid Chromatography)를 실행하기에 앞서, HiTrap SPFF strong cation exchange column에 pH 8.8의 0.05 M의 sodium phosphate 용액 (buffer A)을 통과시켰다. 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)의 분리는 1 ml/min의 속도로 step gradient programming에 의하여 buffer A에서 buffer B (0.05 M sodium phosphate, 1 M NaCl, pH 8.0)로, 처음 10분까지는 0%의 buffer B, 그 후 50분까지는 0~100%의 buffer B, 마지막 50~60분까지는 100%의 buffer B로 바꾸면서 진행하였으며, 60분 동안 1분 간격으로 서로 다른 분획들로 분리하였다. 각각의 단백질들이 분리되면서 얻어진 chromatogram은 해당 분획 내의 단백질 함량을 의미하며 전압량 (voltage)으로 표현였다.

실시예 10:High-performance strong anion exchange 크로마토그래피

균질화 과정을 통해 얻어진 돈태반 추출액 (H-Plx)으로 strong anion exchange HPLC (High Performance Liquid Chromatography)를 실행하기에 앞서, HiTrap QFF strong anion exchange column에 pH 7.4인 0.02 M의 TrisHCl 용액 (buffer A)을 통과시켰다. 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)은 1 ml/min의 속도로 step gradient programming에 의하여 buffer A에서 buffer B (0.02 M TrisHCl, 1 M NaCl, pH 7.4)로 처음 10분까지는 0%의 buffer B, 그 후 50분까지는 0~100%의 buffer B, 마지막 50~60분까지는 100%의 buffer B로 바꾸면서 진행하였고, 60분 동안 1분 간격으로 서로 다른 분획들로 분리하였다. 각각의 단백질들이 분리되면서 얻어진 chromatogram은 해당 분획 내의 단백질 함량을 의미하며 전압량 (voltage)으로 표현하였다.

실시예 11:High-performance size exclusion 크로마토그래피

돈 태반 추출액 (H-Plx)과 탯줄 추출액 (H-Ux)의 분리에 앞서 superdex 200 10/300 GL size exclusion 크로마토그래피 column (300 X 10 mm)에 0.05 M의 sodium phosphate, 0.15 M의 NaCl 용액 (pH 7.0)을 통과시켰다. 균질화 과정을 통한 돈태반 추출액 (H-Plx)의 분리는 앞의 과정을 거친 column과 동일 buffer를 이용하여 0.5 ml/min의 속도로 진행하였으며, 60분 동안 2분 간격으로 서로 다른 분획들로 분리하였다. 분리된 분획들 내의 물질들의 크기는 standard protein (BIO-RAD사)들과 비교하여 분석하였다. 각각의 단백질이 분리되면서 얻어진 chromatogram은 해당 분획 내의 단백질 함량을 의미하며 전압량 (voltage)으로 표현하였다.

실시예 12:Silver 염색

다양한 크로마토그래피를 통해 얻어진 시료를 polyacrylamide gel에 전기영동을 실시였고, silver staining kit (GE healthcare사)를 이용하여 silver 염색과정을 진행하였다. 먼저 전기영동을 통해 얻어진 gel에 30% (v/v) ethanol and 10% (v/v) acetic acid가 함유된 용액을 1시간 동안 처리한 후 그 용액을 제거하였다. 다음으로 gel에 30% (v/v) ethanol, 0.2% (w/v) sodim thiosulphate 및 6.8% (w/v) sodium acetate가 함유된 용액을 1시간 동안 처리한 후 증류수로 15분 동안 수세하는 과정을 4차례 반복하였다. 0.25% (w/v) silver nitrate 용액으로 gel을 1시간 동안 염색한 후 증류수로 1분 동안 수세과정을 2차례 반복하였으며, 마지막으로 2.5% (w/v) sodium carbonate과 0.04% (v/v) formaldehyde가 함유된 용액을 5 -10분 동안 gel에 반응시켜 염색된 단백질 밴드를 관찰하였다.

실시예 13:Coomassie blue 염색

Coomassie blue 염색을 위하여 전기영동을 거친 gel을 여과된 염색용액 (45 ml 증류수, 45 ml methanol, 0.25 g Coomassie Brilliant)에 1시간 동안 염색하여 탈색용액 (50 ml methanol, 50 ml acetic acid, 400 ml 증류수)에 넣어 단백질 밴드가 선명하게 보일 때까지 상온에 방치하였다. 탈색용액은 20분 간격으로 수차례 교체해 주었다.

실시예 14:MALDI-TOF 방법 및 단백질 규명 방법

Coomassie blue 염색을 통해 확인한 gel 상의 해당 단백질 밴드를 잘라내어 염색액을 제거한 후, trypsin을 처리하여 단백질을 펩티드 수준으로 분해시켰다. 분해된 펩티드 혼합물을 완전히 탈수 및 건조시킨 시료를 준비하였고, Voyager DE STR MALDITOF spectrometer (Applied Biosystems)를 이용하여 질량 스펙트럼을 얻어 MASCOT 프로그램을 통하여 결과를 도출하였다. 도출된 단백질이 실제 규명하고자 하는 물질인지 확인하기위하여 인간 α-fetoprotein (abcam사)을 구매하여, 이를 HaCaT 세포에 처리하여 MTT assay를 통하여 효과를 확인하였다.

도 1은 A-Plx와 H-Plx의 HaCaT 세포의 증식과 H₂O₂에 대한 생존율에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

도 2는 열처리한 H-Plx의 HaCaT 세포의 H₂O₂에 대한 생존율에 미치는 영향, 도 2의 세로축은 세포 생존률(%)를 나타낸다.

도 3은 HaCaT 세포에서 H₂O₂에 의해 유발되는 세포자살과 세포괴사에 대한 H-Plx의 억제작용을 나타내 것이다.

도 4는 H₂O₂에 의한 HaCaT 세포 내의 활성산소종 증가에 대한 돈태반 추출액의 억제작용을 나타낸다.

도 5는 Ion exchange 및 size exclusion 크로마토그래피에 대하여 나타낸 그림이다.

도 6은 H₂O₂에 의한 HaCaT 세포의 생존율 저하에 대한 태반 유래 ion (cation, anion) exchange 및 size exclusion chromatographic 분획의 억제작용을 나타낸다.

도 7은 H₂O₂에 의한 HaCaT 세포의 생존율 저하에 대한 탯줄 유래 ion (cation, anion) exchange 및 size exclusion chromatographic fraction의 억제작용을 나타낸다

도 8은 2~ 4번 ion (cation, anion) exchange와 22-24번 anion exchange chromatographic 분획 내 단백질 양상의 비교한 것이다.

도 9는 H₂O₂에 의한 HaCaT 세포 내의 활성산소종 증가에 대한 chromatographic 분획의 억제 작용을 나타낸 것이다.

도 10은 태반과 탯줄 유래 항산화 물질을 함유한 chromatographic fraction 내 단백질 양상의 비교한 것이다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> COMPOSITION FOR PROTECTING SKIN WITH ANTIOXIDANT ACTIVITY <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 610 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 1 Met Lys Trp Val Val Ser Ile Phe Leu Ile Val Leu Leu Asn Phe Thr 1 5 10 15 Glu Ser Arg Thr Met His Glu Asn Ala Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu 20 25 30 Asp Ser Ser Gln Cys Ser Ala Glu Met Asn Leu Val Asp Leu Ala Thr 35 40 45 Ile Phe Phe Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Asn 50 55 60 Gln Met Val Lys Asp Val Leu Thr Val Ile Glu Lys Ser Thr Gly Ser 65 70 75 80 Glu Gln Pro Ala Gly Cys Leu Glu Asn Gln Val Ser Val Phe Leu Glu 85 90 95 Glu Ile Cys His Glu Glu Glu Ile Pro Glu Lys Tyr Gly Leu Ser His 100 105 110 Cys Cys Ser Gln Ser Gly Glu Glu Arg His Asn Cys Phe Leu Ala Arg 115 120 125 Lys Lys Ala Ala Pro Ala Ser Ile Pro Pro Phe Gln Val Pro Glu Pro 130 135 140 Val Thr Ser Cys Lys Ala Tyr Glu Glu Asn Arg Glu Leu Phe Met Thr 145 150 155 160 Arg Tyr Ile Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro 165 170 175 Thr Ile Leu Ser Leu Ala Ala Gln Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Pro Cys 180 185 190 Cys Lys Ala Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Ser 195 200 205 Ile Thr Lys Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Met Cys 210 215 220 Thr Val Met Arg Gln Phe Gly Ala Arg Thr Phe Arg Ala Ile Thr Val 225 230 235 240 Thr Lys Leu Ser Gln Lys Phe Pro Lys Ala Asn Phe Thr Glu Ile Gln 245 250 255 Lys Leu Val Leu Asp Val Ala His Ile His Glu Glu Cys Cys Arg Gly 260 265 270 Asn Val Leu Glu Cys Leu Gln Asp Ala Glu Arg Val Val Ser Tyr Val 275 280 285 Cys Ser Gln Gln Asp Thr Leu Ser Ser Lys Ile Ala Glu Cys Cys Lys 290 295 300 Leu Pro Thr Thr Leu Glu Leu Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn 305 310 315 320 Asp Asp Lys Pro Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly 325 330 335 Glu Arg Asp Phe Asn Gln Leu Ser Ser Arg Glu Lys Asp Leu Ser Met 340 345 350 Ala Arg Phe Thr Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Lys Leu Ala Val 355 360 365 Pro Val Ile Leu Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys 370 375 380 Cys Ser Gln Ser Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu 385 390 395 400 Glu Leu Glu Lys Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser 405 410 415 Cys Gly Leu Phe Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Ala Phe 420 425 430 Leu Val Ala Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Pro Pro Glu Leu 435 440 445 Met Ala Leu Thr Arg Lys Met Ala Thr Thr Gly Ala Ala Cys Cys His 450 455 460 Leu Ser Glu Asp Arg Gln Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala Ala Asp Leu 465 470 475 480 Ile Ile Gly Gln Leu Cys Ile Arg His Glu Glu Met Pro Ile Asn Pro 485 490 495 Gly Val Gly Gln Cys Cys Thr Ser Ser Tyr Ala Asn Arg Arg Pro Cys 500 505 510 Phe Ser Ser Leu Val Leu Asp Glu Thr Tyr Val Pro Pro Pro Phe Ser 515 520 525 Asp Asp Lys Phe Ile Phe His Lys Asp Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val 530 535 540 Ala Leu Gln Thr Met Lys Gln Gln Phe Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln 545 550 555 560 Lys Pro Gln Ile Thr Glu Glu Gln Leu Glu Ala Val Ile Ala Asp Phe 565 570 575 Ser Gly Leu Leu Glu Lys Cys Cys Gln Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys 580 585 590 Phe Ala Glu Glu Gly Pro Ala Leu Ile Ser Lys Thr Arg Ala Ser Leu 595 600 605 Gly Val 610

Claims (10)

1. 알파-피토프로틴을 인 비트로에서 세포에 처리하여 인 비트로에서 H₂O₂에 의해 유발되는 세포내 활성산소종 증가를 억제하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 알파-피토프로틴은 서열번호 1에 기재된 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 인 비트로에서 H₂O₂에 의해 유발되는 세포내 활성산소종 증가를 억제하는 방법.
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