KR20140008749A

KR20140008749A - 탯줄 추출물의 제조방법 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20140008749A
Application number: KR20120075754A
Authority: KR
Inventors: 최용수; 김선미; 김호진; 이광형; 정광회; 윤태기; 이영준; 한규범; 정형민
Original assignee: (주)차바이오메드; 의료법인 성광의료재단; (주)차바이오앤디오스텍
Priority date: 2011-07-11
Filing date: 2012-07-11
Publication date: 2014-01-22
Also published as: WO2013009100A2; KR101462004B1; CN103998048A; JP2014520843A; WO2013009100A3; US20140295554A1

Abstract

본 발명은 탯줄로부터 유용성분을 효과적으로 추출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 유용성분을 포함하는 탯줄 추출물을 제공한다. 본 발명의 탯줄 추출물은 동물 유래의 일반 세포 및 줄기세포 배양을 위한 혈청 대체물로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 탯줄 추출물은 조직 수복용 필러, 드레싱 및 피부상태 개선용 화장료 조성물에 이용할 수 있다. 또한, 탯줄 추출물을 이용하여 탯줄, 지방 등의 조직 유래 줄기세포 분리 및 배양용 배지 조성물 그리고 이를 이용한 조직 유래 줄기세포 분리 및 배양 방법에 관한 것이다.

Description

탯줄 추출물의 제조방법 및 그의 용도{Methods for preparing extract of umbilical cord and uses thereof}

본 발명은 탯줄 추출물의 제조방법 및 이렇게 제조된 탯줄 추출물의 혈청 대체재, 줄기세포 분리 및 배양용 조성물 및 상처 수복용 필러 등의 용도에 대한 것이다.

체외에서 동물세포배양 시스템이 확립된 이래로 혈청은 동물세포의 증식을 촉진하기 위하여 통상적으로 사용되어 왔다. 초대세포(primary cells) 및 확립된 세포주(established cell lines)의 생존 및 증식에 광범위하게 사용되어온 혈청은 그 구성성분이 일부만 밝혀진 혼합물로서 세포배양에서의 생리적 활성이 완전히 파악되고 있지는 않다. 또한, 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)은 우태아로부터 채취되기 때문에 mycoplasma, viruses, prions, bacterial mitogens, hormones, extraneous protein, growth factors, proteases 등의 위해 요소를 지니고 있으며 공급자의 설비 및 기술수준 및 생산 롯트(lot)에 따라 그 조성이 달라지는 품질의 차이를 가져올 수 있다. 현재까지 보고된 대부분의 무혈청 배지는 특정 세포만을 성장하게 하고, 혈청 대신에 사용하는 세포 성장인자, 부착인자 등이 고가이며, 무혈청 배지에서는 혈청을 포함한 배지에서 보다 성장 및 산물생산이 안정적이지 못하다고 알려져 있다(Cruz J. H. et al., Cytotechnology, 26: 59-64(1998), 이희찬, 동물세포배양에서의 무혈청배지, Biotechnology News, 2(3):242-252(1994)).

또한, 성체줄기세포를 미분화 상태로 유지하면서 지속적으로 배양하기 위해서는 우태아혈청을 함유하는 배지가 통상적으로 사용되며, 배양과정에서 우태아혈청을 포함한 동물유래 단백질원이 사용됨으로써 임상적용을 위한 줄기세포 치료제의 개발시 종간 오염 등의 안전성 문제를 배제하기가 곤란하다. 따라서, 이러한 종래의 배양 방법으로부터 얻어진 줄기세포를 임상에 적용하는데 많은 한계를 내포하고 있다.

상기한 동물 유래 단백질원(즉, 우태아혈청) 사용에 따른 문제점을 회피할 수 있는 방안으로서, 무혈청 배지를 이용하는 방법 및 인간 혈청을 함유하는 배지를 이용하는 방법을 이용할 수 있다. 무혈청 배지를 이용하는 방법은 성장호르몬 등을 포함한 다량의 사이토카인(cytokine)들을 배지에 함유시켜 줄기세포를 배양하여야 하므로 복잡할 뿐만 아니라 비경제적이다. 또한, 인간 혈청을 함유하는 배지를 이용하는 방법도 재조합 방법으로 만들어진 사이토카인을 대량으로 사용하여야 하며, 고가의 인간혈청을 배양용 단백질원으로 사용하고 있어, 경제적으로 많은 부담이 되는 문제점이 있다.

한편, 줄기세포는 성체의 여러 조직 및 기관에서 발견되는 성체줄기세포(adult stem cells)와 발달단계 중 배반포 단계의 세포에서 얻을 수 있는 배아줄기세포(embryonic stem cells)로 나누어진다. 배아줄기세포는 신경, 혈액세포, 췌장 등 다양한 세포로 분화할 수 있는 전분화능을 갖고 있지만, 사람으로 성장할 수 있는 배아로부터 얻어야 하기 때문에 윤리적 문제점이 있다. 따라서 윤리적인 문제를 배제할 수 있을 뿐만 아니라 분리 및 배양이 쉬우며 여러 가지 세포로 분화 가능한 성체줄기세포가 세포치료제의 재료로서 각광받고 있다.

성체줄기세포는 다양한 조직으로부터 분리할 수 있으며, 지방세포, 골세포, 연골세포, 심장세포, 간세포, 신경세포 등 다양한 조직세포로 분화할 수 있는 미분화 상태의 줄기세포이다. 그 중 골수유래 중간엽 줄기세포(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSC)가 그 대표적 예이다.

그러나 골수 유래 중간엽줄기세포는 제공자의 나이가 증가함에 따라 줄기세포의 수 및 증식 능력이 감소하며, 골수를 채취하기 위해서는 고통이 수반된다. 이에 따라 다른 조직에서부터 중간엽줄기세포를 분리하려는 시도를 하고 있으며, 최근 성체와 태아의 말초 혈액, 탯줄, 태반, 탯줄 혈액 등에서 분리할 수 있다는 보고들이 발표되면서, 다양한 조직에서 얻어지는 중간엽줄기세포가 새로운 세포 치료제의 공급원으로 관심을 끌고 있다.

탯줄은 혈관과 그 주위의 와튼 젤리(Wharton's jelly)라고 불리는 결합조직으로 구성되어 있다. 임신 기간 동안 탯줄의 길이는 30-60 cm. 무게는 40-50 g이며, 태아에게 공급하는 영양분이 풍부하고, 줄기세포와 전구세포를 포함하고 있다. 최근에는 탯줄에서 유래한 세포가 골수에서 유래된 중간엽줄기세포의 특징을 가지고 있다고 보고되고 있다. 이 탯줄 유래 줄기세포는 골수 및 다른 조직 유래 중간엽줄기세포와 유사하게 CD73, CD90, CD105, CD10, CD13, CD29, CD44, HLA-ABC 세포표면단백질을 발현하며, 조혈모세포 표지 인자인 CD34, CD45와 조직적합성항원인 CD14, CD31, CD33, HLA-DRα 세포표면단백질은 발현하지 않는다. 뿐만아니라, 탯줄에서 분리한 줄기세포는 배아줄기세포 마커인 Oct4, Sox2, Nanog 등이 동시에 발현이 된다고 보고되고 있다.

탯줄 유래 줄기세포는 골세포, 연골세포, 지방세포로 분화할 수 있고, 체외 배양시 골수나 지방유래 줄기세포보다 분열 능력이 뛰어나다. 이 세포를 이용하여 심근세포, 신경세포로 분화 가능하다는 연구도 보고되었다. 이처럼 탯줄은 임상적 사용을 위한 줄기세포를 공급할 수 있는 조직으로 기대되며, 나아가 세포치료제로서 사용이 가능할 것으로 보인다.

그러나, 탯줄 유래 줄기세포를 효율적으로 이용하기 위하여는 많은 수의 탯줄 유래 줄기세포가 필요로 한다. 그러나, 탯줄에서 얻을 수 있는 줄기세포의 수에는 한계가 있으며, 그 줄기세포가 배양 중에 분화능을 상실하는 경우가 많다. 그러나, 현재까지 탯줄 유래 줄기세포를 무혈청 배지에서 효율적으로 분리하고 배양하는 방법이 알려져 있지 않은 실정이다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 연구 중, 탯줄 유래 추출물을 이용시 효과적으로 탯줄 유래 줄기 세포를 분리하고 배양할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

Cruz J. H. et al., Cytotechnology, 26: 59-64(1998) 이희찬, 동물세포배양에서의 무혈청배지, Biotechnology News, 2(3):242-252(1994)

본 발명의 목적은 탯줄 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 목적은 탯줄 추출물을 포함하는 혈청 대체재를 제공하는 것이다.

또 다른 목적은 상기 혈청 대체재를 포함하는 세포 배양액을 제공하는 것이다.

또 다른 목적은 상기 탯줄 추출물을 포함하는 탯줄 유래 줄기세포를 탯줄로부터 분리하는 방법 및 탯줄 유래 줄기세포를 배양하는 방법에 관한 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

일 양상은 탯줄 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

일 구체예는 탯줄을 절단하는 단계; 상기 절단된 탯줄을 완충액에 넣는 단계; 상기 완충액에 함침된 탯줄을 교반하는 단계; 및 교반하여 얻은 산물을 원심분리하여 탯줄 추출물로서 상층액을 수득하는 단계를 포함하는 포유동물 탯줄 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 종래 방법의 문제점을 보완하여 세포외기질에 결합되어 있는 성장인자, 싸이토카인, 케모카인 및 GAG(glycaosminoglycan) 등의 당단백질을 비교적 단순한 공정으로 분리하여 세포에 유용한 성분들을 가능한 활성이 있는 자연 상태로(natural-occurring) 수득할 수 있는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 방법을 각 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다.

먼저, 탯줄을 절단하는 단계를 포함한다.

일 구체예에 따르면, 우선 탯줄을 절단한다. 일 구체예에 있어서, 탯줄의 절단은 완충액과의 접촉 면적을 넓혀 탯줄 조직에 존재하는 유용물질의 용출을 용이하게 하기 위하여 실시한다.

일 구체예에서 이용될 수 있는 탯줄은 다양한 포유동물의 탯줄을 포함한다. 바람직하게는 인간, 돼지, 말, 소, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 염소 및 양이며, 보다 바람직하게는 인간, 돼지, 말 및 소이고, 가장 바람직하게는 인간을 의미한다.

탯줄 절단은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 탯줄은 0.5-3.0 cm, 보다 바람직하게는 0.7-2.5 cm, 보다 더 바람직하게는 1-2 cm의 길이로 절단한다.

특히, 상기 탯줄 추출물은 탯줄 조직 중에서 와튼 젤리(Wharton's jelly) 부분에서 추출하는 것이 바람직하다. 그러므로, 탯줄내의 혈액 및/또는 혈관을 제거하는 단계가 추가적으로 포함될 수 있다.

이후, 상기 절단된 탯줄을 완충액에 넣는 단계를 포함할 수 있다.

상기에서 절단된 탯줄을 완충액에 넣는다. 본 발명에서 이용되는 완충액은 완충력(buffering power)을 가지는 어떠한 완충액도 사용 가능하며 예를 들어, 소듐 아세테이트, 소듐 포스페이트, 글리신-HCl, Tris-HCl 및 PBS(Phosphate buffered saline)를 포함한다. 특히, PBS를 이용할 수 있고, pH는 2-11, 바람직하게는 4-10, 보다 바람직하게는 5-8, 보다 더 바람직하게는 6.8-7.6 이다.

절단된 탯줄을 함침시키는 완충액의 양은 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 탯줄 중량의 2-5배, 보다 바람직하게는 2-4배, 보다 더 바람직하게는 2.5-3.2배의 완충액을 이용한다. 또한, 절단된 탯줄을 완충액에 넣기 전에 적합한 용액(예컨대, 완충액)으로 세척할 수 있다.

이후, 상기 완충액에 함침된 탯줄을 교반하는 단계를 포함할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 교반은 4℃-10℃, 바람직하게는 4℃-6℃에서 실시한다. 또한 교반은 7-24시간, 바람직하게는 12-24시간, 보다 바람직하게는 18-24시간 동안 실시할 수 있다.

교반은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있으며, 마그네틱 바를 이용하여 교반할 수 있다.

이후, 교반하여 얻은 산물을 원심분리하여 탯줄 추출물로서 상층액을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.

교반하여 얻은 산물을 원심분리하여 최종적으로 탯줄 추출물로서 상층액을 수득한다. 상기 상층액은 성장인자 및 싸이토카인 등 세포외기질에 결합되어 있는 다양한 유용 단백질을 포함한다.

일 구체예에 따르면, 원심분리는 3,000-6,000 rpm, 바람직하게는 4,000-4,500 rpm의 조건에서 실시한다. 원심분리는 4℃-10℃, 바람직하게는 4℃-6℃에서 실시한다. 일 구체예에 따르면, 원심분리는 2분-30분, 바람직하게는 5분-20분, 보다 바람직하게는 10분-15분 동안 실시한다.

또 다른 양상은 상술한 일 양상의 방법에 의해 제조된 탯줄 추출물을 제공한다.

일 구체예에 따르면, 상기 탯줄 추출물은 IGFBP-7 (insulin-like growth factor binding protein-7), Lipocallin-1, CXCL14, Leptin R, IL-23, MIP-1a, Angiogenin, Thrombospondin-2, IL-29, IL-4R 등(도 31)을 주요 성분으로 포함한다.

탯줄 추출물의 상기 주요 싸이토카인들은 항신생 혈관생성(anti-angiogenesis), 항 세포사멸(anti-apoptosis), 성장(growth) 및 염증(inflammation)에 관련된 효과는 기지의 사실로 잘 알려져 있다.

또 다른 양상은 탯줄 추출물을 포함하는 혈청 대체재를 제공하는 것이다.

용어, "혈청"은 혈장에서 섬유소를 제거한 나머지 부분을 의미한다. 혈청은 체외에서 동물세포배양 시스템이 확립된 이래로 동물세포의 증식을 촉진하기 위하여 통상적으로 사용되어 왔다.

용어, "혈청 대체재"는 혈청을 대신하여 혈청과 동일하거나 유사한 효과를 얻기 위하여 사용할 수 있는 물질을 의미하며, 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)과 같은 혈청의 사용없이도 그와 동일하거나 우수한 효과를 얻을 수 있는 물질을 의미한다.

상기의 탯줄 추출물은 일반적인 방법으로 수득되는 탯줄 추출물일 수 있으나, 바람직하게는 상기에서 기술된 일 구체예를 통하여 얻어지는 것이다. 특히, 탯줄에서 혈액을 제거하여 혈청 성분이 포함되지 않는 것이 바람직하다.

상기 혈청 대체재는 혈청이 적용될 수 있는 모든 분야에 적용될 수 있다. 특히, 세포의 배양에 이용될 수 있으며, 바람직하게는 동물 세포의 배양에 이용될 수 있다. 특히 줄기 세포의 분리, 배양 등에 이용될 수 있다. 상기 줄기세포에는 성체줄기세포, 중간엽줄기세포, 역분화줄기세포 및 조직 유래 줄기세포와 같이 모든 종류의 줄기세포가 포함될 수 있다.

또 다른 양상은 상기 혈청 대체재를 포함하는 세포 배양액을 제공하는 것이다.

일 구체예의 세포 배양액은 다양한 동물의 세포, 바람직하게는 포유동물의 세포, 보다 바람직하게는 인간, 돼지, 말, 소, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 염소 및 양의 세포, 보다 더 바람직하게는 인간, 돼지, 말 및 소의 세포, 가장 바람직하게는 인간의 세포이다.

일 구체예의 배양액은 줄기세포 배양에 적용될 수 있다. 본 발명이 적용되는 줄기세포는 제한이 없으며, 줄기세포의 특성, 즉 미분화, 무한정 증식 및 특정세포로의 분화능을 갖는 세포는 본 발명이 적용될 수 있는 세포이다. 상기 줄기세포는 배아줄기세포 (ES) 및 배아생식세포 (EG)를 포함하는 전능성 줄기세포(pluripotent stem cell)와 다능성 줄기세포 (multipotent stem cell)를 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 줄기세포는 탯줄 유래 줄기세포인 것일 수 있다.

일 구체예의 배양액은 혈청 대체재로서 탯줄 추출물 이외에, 동물세포 배양용 배지의 기본적인 조성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 배양액은 Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)) 등을 기반으로 하여 조성될 수 있다.

또 다른 양상은 상기 탯줄 추출물을 포함하는 조직 수복용 필러를 제공한다.

용어 “조직 수복용 필러”란 피부의 주름 및 피부의 미세 선을 효과적으로 은폐하는 목적으로 사용되는 의약 조성물 또는 화장료 조성물을 의미한다.

일 구체예의 조직 수복용 필러는 탯줄 추출물 이외에, 필러의 기본적인 성분, 바람직하게는 콜라겐, 히아루론산, 폴리아크릴아미드 겔, 아테콜, 오토로겐(자가 콜라겐) 또는 폴리메틸메타크릴레이트 및 콜라겐의 혼합물을 포함한다.

일 구체예의 필러는 왁스, 엘라스토머, 고급알코올, 계면활성제, 오일, 분체, 보습제, 수분산성 고분자, 피부보호성분, 방부제 및/또는 향을 포함할 수 있다.

또한, 상기의 탯줄 추출물은 일반적인 방법으로 수득되는 탯줄 추출물일 수 있으나, 바람직하게는 상기에서 기술된 일 구체예를 통하여 얻어지는 것이다. 특히, 탯줄에서 혈액을 제거하여 혈청 성분이 포함되지 않는 것이 바람직하다.

또 다른 양상은, 상기 탯줄 추출물을 포함하는 드레싱 제공한다.

용어 “드레싱”은 치료 또는 미용 목적의 피부 처치를 위해 인간 또는 동물 신체의 일부에 적용되는 약제학적 조성물을 의미한다. 바람직하게는 손상된 피부, 피부 병변, 피부 표면의 임의의 장애(interruption)(예를 들어, 피부 궤양, 화상, 베인 상처, 천자, 찢긴 상처, 둔기 외상, 여드름 병변 및 종기)의 처치를 위한 드레싱이다. 상기 드레싱은 제제의 전달을 용이하게 하기 위해 패치, 플라스터, 붕대 및 거즈를 포함할 수 있다. 드레싱은 바람직하게는, 신체의 내부 조직 및 외부 조직, 보다 바람직하게는 신체 표면에 적용할 수 있다.

또 다른 양상은, 상기 탯줄 추출물을 포함하는 주름 개선 또는 피부 노화 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

일 구체예의 화장료 조성물은 다양한 피부 상태 (conditions)의 개선에 이용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 주름개선 및 피부노화 개선에 유효하다.

일 구체예의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 성장인자 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

일 구체예의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

일 구체예의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

일 구체예의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

일 구체예의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

일 구체예의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

일 구체예의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또 다른 양상은 탯줄로부터 줄기세포를 분리하는 방법을 제공한다.

일 구체예는 세포배양용기에 포유류의 탯줄 추출물을 포함하는 배지 조성물과 세절된 탯줄 조직을 넣어 배양하는 단계; 상기 탯줄 조직에 줄기세포 분리 효소를 처리하는 단계; 및 탯줄 조직에서 줄기세포를 분리하는 단계를 포함하는 포유류의 탯줄로부터 줄기세포 분리 방법을 제공한다.

상기 포유류는 인간, 돼지, 말, 소, 마우스(mouse), 랫트(rat), 햄스터, 토기, 염소 또는 양일 수 있다.

상기 조직은 지방, 탯줄, 간 및 골막으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 세포배양용기는 세포 부착 단백질(cell adhesion protein)로 코팅된 세포배양용기일 수 있다. 이때, 상기 세포 부착 단백질은 포유류 탯줄 유래 콜라겐, 젤라틴(gelatin), 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin) 또는 폴리-D-라이신(poly-D-lysin)일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.

상기 포유류의 탯줄 유래 콜라겐은 (i) 과산화수소로 처리된 포유류의 탯줄 조직을 분쇄하는 단계; (ii) 상기 분쇄된 탯줄 조직을 아세트산 및 펩신으로 처리한 후 원심분리하는 단계; (iii) 상기 원심분리에 의해 얻은 상등액의 pH를 7로 맞추고 NaCl을 첨가하여 콜라겐을 침전시키는 단계; 및 (iv) 상기 침전된 콜라겐을 분리하는 단계를 포함하는 포유류의 탯줄 유래 콜라겐 제조 방법에 의해 제조될 수 있다.

일 구체예의 포유류의 탯줄로부터 줄기세포 분리 방법에 있어서, 상기 (ii) 단계는 상기 (i) 단계 개시 후 1일 내지 3일 후에 수행하는 것이 바람직하다.

상기 (ii) 단계의 줄기세포 분리 효소는 콜라게나제일 수 있고, 바람직하게는, 상기 콜라게나제는 I형 콜라게나제일 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 (ii) 단계에서, 상기 I형 콜라게나제가 180 U/ml 내지 220 U/ml 포함되며, 2시간 내지 6시간 동안 처리될 수 있다.

또한, 탯줄 추출물은 상기의 구체예에 의한 방법으로 제조되는 것이 바람직하다.

또 다른 양상은 탯줄 추출물을 이용하여 줄기 세포를 배양하는 방법을 제공한다.

일 구체예는 줄기세포 배양액에 탯줄 추출물을 첨가하는 단계; 세포배양용기에서 상기 세포 배양액을 이용하여 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 배양 방법을 제공한다.

상기 세포배양용기는 세포 부착 단백질로 코팅된 것일 수 있다. 상기 줄기세포는 조직 유래 줄기세포인 것인 줄기세포일 수 있다. 또한, 상기 줄기세포는 동물 줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 인간 유래 줄기세포일 수 있다. 또한, 상기 줄기세포는 성체줄기세포, 중간엽줄기세포, 역분화줄기세포 및 조직 유래 줄기세포와 같이 모든 종류의 줄기세포가 포함될 수 있다.

또한, 상기 세포 부착 단백질은 콜라겐, 젤라틴(gelatin), 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin) 또는 폴리-D-라이신(poly-D-lysin)일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.

상기 조직은 지방, 탯줄, 간 및 골막으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 줄기 세포 배양액은 혈청을 포함하지 않을 수 있다.

또한, 상기 줄기세포는 모든 동물 줄기세포일 수 있으며, 배아줄기세포, 성체줄기세포, 및 역분화줄기세포일 수 있으며, Oxt4, Sox2, KLF4 및 Nanog 유전자로 이루어진 그룹에서 적어도 하나의 유전자가 발현이 되는 세포일 수 있다. 특히, 계대배양을 하여도 상기 배아줄기세포에 특이적인 유전자인 Oxt4, Sox2, KLF4 및 Nanog로 이루어진 그룹에서 적어도 하나의 유전자가 지속적으로 발현되는 세포일 수 있다.

또한, 상기 줄기세포는 CD29, CD73, CD90, CD105 및 CD166에 선택적으로 양성을 나타내는 세포이고 CD34 및 CD45에 선택적으로 음성을 나타내는 세포일 수 있다.

본 발명의 탯줄 유래 줄기세포 분리 및 배양 방법에 따르면, 탯줄 조직으로부터 줄기세포를 분리하는 초대배양시의 FBS를 첨가하지 않은 배지를 이용하여 생존률과 증식능, 분화능이 우수한 줄기세포를 단기간(15일)에 최대로 획득할 수 있고(약 2.0×10⁸개의 세포), 계대배양 2-3회만으로도 매우 많은 양(탯줄 조직 약 50 g으로부터 1.0 × 10¹⁰ 개의 세포)을 분리할 수 있어 향후 줄기세포치료제 개발에 유용한 방법으로 이용될 수 있다.

도 1은 교반 시간에 따른 단백질 용출량을 나타낸 그래프이다.
도 2는 배지를 교체하는 경우와 교체하지 않은 경우 교반 시간에 따른 단백질 용출량을 비교한 그래프이다.
도 3 및 도 4는 탯줄 크기에 따른 단백질 용출량을 나타낸 그래프이다.
도 5 및 도 6은 완충액의 pH에 따른 단백질 용출량과 용출된 단백질의 차이를 확인하기 위하여 SDS-PAGE 결과를 나타낸 그림이다.
도 7 및 도 8은 용출방법에 따른 단백질 용출량을 나타낸 그림이다.
도 9 및 도 10은 신선한 탯줄조직과 냉동보관 했던 탯줄조직으로부터 용출한 단백질의 차이를 나타낸 그림이다.
도 11은 완충액 양에 따른 단백질 용출량을 나타낸 그림이다.
도 12, 도 13 및 도 14는 탯줄 추출물(Umbilical cord extract, UCE) 싸이토카인 정량 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15, 도 16, 도 17 및 도 18은 무혈청 배지(basal media)의 배양첨가물에 따른 세포 증식 효과를 나타낸 그래프 및 그림이다.
도 19 및 도 20은 탯줄 추출물을 포함하는 무혈청 배지에서 골수 및 탯줄 유래 줄기세포를 각각 배양한 후 중간엽줄기세포의 마커를 처리하고 FACS 분석을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
이때, x축은 강도(intensity)이며, Y축은 세포갯수(카운트)이다. x축 및 y축의 변화로 위에 기재되어 있는 CD 마커를 식별할 수 있다. 상기 도면에서 FBS 첨가한 것에서 키운 세포와 탯줄 추출물을 첨가한 것에서 키운 세포 비교한 그림이다.
도 21 및 도 22는 탯줄 추출물(UCE)을 포함하는 히알루론산 유도체(hyaluronic acid derivative, HAD) 필러를 마우스에 피하 주사한 후 헤마톡실린&에오신(Hematoxylin & Eosin) 염색을 수행한 결과로 탯줄추출물을 포함한 경우 필러 안쪽으로 주변 조직 유래 세포의 유입이 많아진 것을 나타낸 그림이다.
도 23은 일 구체예의 무혈청 배지에서 탯줄 추출물의 농도에 따른 탯줄 유래 줄기세포 증식 효과를 보여 준다.
도 24는 일 구체예에 따라 탯줄 유래 콜라겐을 코팅한 배양접시에서 탯줄 유래 줄기세포의 부착 및 증식(배양) 증대 효과를 보여 준다.
도 25는 콜라겐을 농도에 따라 코팅한 배양 접시에서 탯줄 유래 줄기세포를 배양한 후 2일 뒤 증식한 탯줄 유래 줄기세포의 수를 비교한 결과이다.
도 26은 종래의 탯줄 유래 줄기세포 분리 방법과 일 구체예의 탯줄 유래 줄기세포 분리 방법을 비교한 그림이다.
도 27은, 도 26에 나타난 6개의 방법으로 분리하여 배양 중인 세포의 모습을 보여 주는 사진이다.
도 28은 탯줄 유래 줄기세포 분리 후 15일째에 회수된 총 세포수 결과를 보여 준다.
도 29는, 도 26의 6가지 분리 및 배양 방법으로 분리 및 배양된 세포의 면역표시자 분석 결과를 비교한 것이다.
이때, x축은 강도(intensity)이며, Y축은 세포갯수(카운트)이다. x축 및 y축의 변화로 위에 기재되어 있는 CD 마커를 식별할 수 있다.
도 30은 공여자가 다른 3개의 탯줄에서 분리한 추출물에 포함되어 있는 인간 싸이토카인, 케모카인, 성장인자 등 총 507종에 대하여 cytokine arrray를 수행한 결과와 각 탯줄 별로 가장 많이 포함되어 있는 싸이토카인 10개를 나타낸 것이다.
도 31은 서로 다른 3개의 탯줄에서 분리한 추출물에 공통으로 포함되어 있는 물질을 나타낸 상대적인 정량 그래프이다. 공통으로 가장 많이 포함되어 있는 것은 IGFBP-7, lipocalin-1이다.
도 32는 서로 다른 3개의 서로 다른 탯줄에서 확인된 총 62종의 인간 싸이토카인을 가장 많은 양부터 순서대로 도시한 것이다.
도 33은 기능이 잘 알려진 10개의 싸이토카인에 대하여 인체 내에서 수행하는 기능을 설명한 것이다.
도 34는 탯줄 추출물을 이용하여 배양한 줄기세포와 10% FBS를 첨가한 배지로 배양한 세포의 계속적인 계대배양에 따른 줄기세포의 줄기세포능(stemnes) 유지능을 비교하기 위한 실험으로 계대배양 초기와 10회 이상 계대배양 후 줄기세포의 분열 시간(doubling time)(Td)을 비교한 값을 나타낸 것이다.
도 35는 탯줄 추출물을 이용하여 탯줄 조직에서 분리한 줄기세포(UC-MSCs)가 배아줄기세포(ESCs) 특이적인 마커를 발현하고 있음을 확인한 결과이다.
도 36은 3명의 다른 공여자로부터 얻은 조직으로부터 얻은 탯줄 추출물을 이용하여 분리한 줄기세포가 중간엽 줄기세포 특이적 세포표면마커인 CD29, CD73, CD90, CD105, CD166에 3개 다른 공여자로부터 분리한 줄기세포에서 공통적으로 양성을 나타내고 있으며, CD34, CD45에 음성을 나타내고 있음을 보여주는 결과이다.
도 37은 탯줄 추출물을 이용하여 배양할 경우 줄기세포 분리한 초기에 확인되었던 배아줄기세포 특이적 마커가 FBS를 첨가하여 배양하는 경우에는 발현양이 사라지지만 탯줄 추출물(UCE)를 첨가하여 배양하는 경우 계속 유지되고 있음을 보여주는 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예 또는 도면에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 교반 시간에 따른 단백질 용출량 비교

탯줄을 0.5-2.0 cm 길이로 절단하여, PBS(pH 7.0)로 2회 이상 세척한 후 탯줄 무게의 3배 정도의 PBS를 넣고 4℃에서 30분-24시간 동안 PBS를 교체하지 않고 교반하고, 24시간-200시간 동안 PBS를 교체하면서 교반하였다. 4,500rpm, 4℃에서 10분 동안 원심 분리하여 수거한 상층액을 탯줄 유래 추출물로 사용하였고, 브래드포드 분석법으로 단백질 정량을 실시하였다.

교반 시간이 증가함에 따라 용출되는 단백질의 양 또한 증가하는 결과를 보였고, 교반 7시간 경과 후 평균적으로 2.5 ug/ml의 단백질이 용출되었으며 교반 24시간 경과 후에는 평균적으로 2.7 ug/ml의 단백질이 용출되었다(도 1).

또한, 교반 시작 시점부터 24시간 경과 지점까지는 교반 시간이 증가함에 따라 용출되는 단백질의 양도 증가하는 결과를 보였으나, PBS를 교체하며 교반하는 경우, 교반 시작 후 약 60시간이 경과한 시점부터 용출되는 단백질의 양이 급격히 감소하였다(도 2).

<실시예 2> 탯줄 크기에 따른 단백질 용출량 비교

탯줄을 0.5-2.0 cm 길이로 절단(도 3)하여, PBS(pH 7.0)로 2회 이상 세척한 후 탯줄 무게의 3배 정도의 PBS를 넣고 4℃에서 4일간 교반 하였다. 4,500 rpm, 4℃에서 10분 동안 원심 분리하여 수거한 상층액을 탯줄 유래 추출물로 사용하였고, 브래드포드 분석법으로 단백질 정량을 실시하였다. 탯줄 절단 크기에 따른 단백질 용출량의 변화는 크지 않았으며, 교반시 PBS를 교체하는 경우 단백질 용출량이 급격히 감소하였다(도 4).

<실시예 3> 완충액의 pH에 따른 단백질 용출량 비교

탯줄을 0.5-2.0 cm 길이로 절단하여, 탯줄 무게의 3배 정도의 PBS(pH 2, pH 7 또는 pH 11)를 넣고 4℃에서 24시간 동안 교반하였다. 4,500rpm, 4℃에서 10분 동안 원심 분리하여 수거한 상층액을 탯줄 유래 추출물로 사용하였고, 브래드포드 분석법으로 단백질 정량을 실시하였다.

pH 2의 PBS를 이용한 경우 총 47.2 mg(2.36 mg/ml), pH 7의 PBS를이용한 경우 총 49 mg(2.45 mg/ml), pH 11의 PBS를 이용한 경우 총 43.8 mg(2.19mg/ml)의 단백질이 용출되어, PBS의 pH에 따른 단백질 용출량의 차이(도 5)는 크지 않았으나, pH 2의 PBS를 이용한 경우, 교반 후의 결과물에서 점도(viscosity)가 증가하였다.

또한, 단백질 정량한 각 탯줄 추출물에 대한 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 쿠마시 염색을 수행한 결과, 각 탯줄 추출물의 단백질밴드 양상이 유사함을 확인하였다(도 6).

<실시예 4> 용출방법에 따른 단백질 용출량 비교

탯줄을 0.5-2.0 cm 길이로 절단하여, PBS(pH 7.0)로 2회 이상 세척한 후 약 8g의 탯줄에 약 15 ml의 PBS를 넣고 균질화(homogenization), 교반(stirring, 4℃에서 24시간) 또는 배양(incubation, 37℃에서 24시간)하였다. 4,500 rpm, 4℃에서 10분 동안 원심 분리하여 수거한 상층액을 탯줄 유래 추출물로 사용하였고, 브래드포드 분석법으로 단백질 정량을 실시하였다.

균질화한 경우 총 27.3 mg(1.95 mg/ml), 교반한 경우 총 30.72mg(3.61 mg/ml), 배양한 경우 총 19.34 mg(2.28 mg/ml)의 단백질이 용출되었다.그 결과, 4℃에서 교반한 경우, 가장 많은 양의 단백질의 용출되는 것을 확인하였다(도 7).

또한, 단백질 정량한 상기 조건의 각 탯줄 추출물에 대한 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 쿠마시 염색을 수행한 결과, 각 탯줄 추출물의 단백질 밴드 양상이 유사함을 확인하였다(도 8).

따라서, 4℃에서 교반하는 방법이 균질화(homogenization) 및 37℃ 배양 방법에 의해 발생할 수 있는 단백질 변성 및 단백질의 안정성 저하를 방지하면서 다량의 단백질을 수득할 수 있는 방법임을 확인하였다.

<실시예 5> 탯줄 조직 보관방법에 따른 단백질 용출량 비교

탯줄을 0.5-2.0 cm 길이로 절단하여, PBS(pH 7.0)로 2회 이상 세척한 후 약 11 g의 탯줄에 약 33 ml의 PBS를 넣고 교반(4℃에서 24시간) 또는 냉동(-80℃에서 6일간) 후 교반(4℃에서 24시간)하였다. 4,500 rpm, 4℃에서 10분 동안원심 분리하여 수거한 상층액을 탯줄 유래 추출물로 사용하였고, 브래드포드 분석법으로 단백질 정량을 실시하였다.

냉동 보관했던 탯줄의 경우, 신선한 탯줄 조직에 비해약 7 mg의 단백질이 더 용출되었으나(도 9).단백질 정량한 상기 조건의 각 탯줄 추출물에 대한 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 쿠마시 염색을 수행한 결과, 각 탯줄 추출물의 단백질 밴드 양상이 유사함을 확인하였다(도 10).

<실시예 6> 완충액 양에 따른 단백질 용출량 비교

탯줄을 0.5-2.0 cm 길이로 절단하여, PBS(pH 7.0)로 2회 이상 세척한 후 약 11g의 탯줄에 약 22 ml(1:2), 양 33 ml(1:3) 또는 약 55 ml(1:5)의 PBS를넣고 4℃에서 24시간 동안 교반하였다. 4,500 rpm, 4℃에서 10분 동안 원심 분리하여 수거한 상층액을 탯줄 유래 추출물로 사용하였고, 브래드포드 분석법으로 단백질 정량을 실시하였다.

절단된 탯줄을 탯줄 무게의 2배의 PBS에 교반한 경우 총 53.76mg(3.16 mg/ml), 3배의 PBS에 교반한 경우 총 64.23 mg(2.47 mg/ml), 5배의 PBS에교반한 경우 총 73.78 mg(1.48 mg/ml)의 단백질이 용출되어, PBS의 양이 증가할수록 단백질 용출량 또한 증가하는 것으로 나타났다(도 11). PBS양이 증가할수록 총단백질양은 증가하나, 최종 탯줄 추출물의 단백질 농도가 낮아지므로 적정 농도로 생산하기 위해서 별도의 농축과정이 필요하며 이 과정에서 추출된 단백질이 손실되는 단점이 있다.

<실시예 7> 탯줄 추출물에 주요성분 단백질의 정성 및 정량분석

탯줄 추출물에 포함된 단백질 중 성장인자, 케모카인, 싸이토카인 등의 주요성분의 종류 및 상대적인 정량 분석을 위하여 507종의 분석이 가능한 RayBio Human cytokine array kit를 사용하여 분석을 수행하였다. 공여자가 다른 3종의 탯줄 추출물 각 1 mg을 준비 후 막(membrane)에 처리하고 반응시켰다. 그 후 검출된 dot는 MultiGauge 프로그램을 이용하여 dot의 강도를 분석하였다.

그 결과를 도면 및 표에 표시하였다.

도 30은 공여자가 다른 3개의 탯줄에서 분리한 추출물에 포함되어 있는 인간 싸이토카인, 케모카인, 성장인자 등 총 507종에 대하여 cytokine array를 수행한 결과와 각기 다른 공여자로부터 용출된 추출물 내에 가장 많이 포함되어 있는 싸이토카인 10개를 나타낸 것이다.

도 31은 서로 다른 3개의 탯줄에서 분리한 추출물에 공통으로 포함되어 있는 물질을 나타낸 상대적인 정량 그래프이다. 공통으로 가장 많이 포함되어 있는 것은 IGFBP-7, lipocalin-1 등이다.

도 32는 3개의 서로 다른 탯줄에서 확인된 총 62종의 인간 싸이토카인을 가장 많은 양부터 순서대로 나열한 것이다.

도 33은 추출물 내에 다량으로 포함되어 있고 기능이 잘 알려진 10개의 싸이토카인으로 인체 내에서 수행하는 기능을 설명한 표이다.

탯줄 추출물 내에 존재하는 싸이토카인 중 잘 알려진 42종에 대하여 정량 분석을 수행하였다. 1 mg/ml의 탯줄 추출물 시료를 Millipore사의 MILLIPLEX™ Human Cytokine/Chemokine panel(42-plex: EGF, Eotaxin, FGF-2, Flt-3 Ligand, Fractalkine, G-CSF, GM-CSF, GRO, IFNα2, IFNγ, IL-1ra, IL-1α, IL-1β, IL-2, sIL-2Rα, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-13, IL-15, IL-17, IP-10, MCP-1, MCP-3, MDC, MIP-1α,MIP-1β, PDGF-AA, PDGF-AB/BB, RANTES, sCD40L, TGFα, TNFα, TNFβ 및 VEGF)을이용하여 42개의 싸이토카인에 대한 항원-항체반응 후 Luminex 200 System을 이용하여 정량분석을 수행하였다.

싸이토카인 정량분석 결과, 평균 1,400 pg/ml FGF-2, 1,480 pg/mlG-CSF, 860 pg/ml MCP-1, 900 pg/ml GRO, 700 pg/ml IL-1ra 및 620 pg/ml IP-10이추출되는 싸이토카인 중에서 주된 성분으로 확인되었다(도 12).

<실시예 8> 무혈청 배지의 배양첨가물에 따른 세포 증식 효과

탯줄 추출물을 혈청이 제거된 배지에 0, 0.1, 0.2, 0.5 또는 1 ㎎/㎖의 농도로 처리하였다. 대조군으로 10% 혈청(Hyclone, SH30919.03)이 첨가된배지에서 탯줄 유래 줄기세포(UC-MSC), 골수 유래 줄기세포(BM-MSC) 및 피부 섬유아세포(skin fibroblast)를 각각 배양한 후 10% WST-1 assay (Daeillab, EZ-3000)를 이틀 간격으로 총 7일간 측정하였다. WST-1 assay 시약을 배지의 10%가되게 첨가하고 배양 조건과 동일하게 약 1시간 정도 반응 시킨 후 450 nm 에서 흡광도를 측정하였다.

WST-1 assay 결과, 무혈청배지에 탯줄 추출물을 농도별로 처리했을때 0.2 mg/ml 농도에서 탯줄 유래 줄기세포, 골수 유래 줄기세포 및 피부 섬유아세포가 10% FBS 첨가 배지 조건의 세포와 동등한 세포 증식을 보이는 것을 확인하였으며, 탯줄 추출물을 0.5 mg/ml 농도 이상으로 처리한 경우, 10% FBS 첨가 배지 조건의 세포보다 세포 증식이 증가하는 것을 확인하였다(도 15-17).

또한, 세포 배양 시 나타나는 형태(morphology)는 탯줄 추출물을 포함한 무혈청배지에서 배양한 세포가 10% FBS 첨가 배지 조건의 세포보다 더욱 작은 형태를 유지하면서 성장하는 것을 확인하였다(도 18).

<실시예 9> 탯줄 추출물의 줄기세포 분화능 유지 효과

10% FBS와 0.2 mg/ml의 탯줄 추출물을 첨가한 배지에서 골수 및 탯줄 유래 줄기세포를 각각 배양한 후 중간엽줄기세포의 마커를 처리하고 FACS 분석을 수행하였다.

FACS 분석 결과, 탯줄 추출물을 포함하는 무혈청배지에서 배양한 줄기세포는 중간엽줄기세포 특이적 세포표면 마커가 유지되는 것으로 보아 분화를 일으키는 등의 줄기세포의 특성에 변화를 일으키지 않는 것을 확인하였다(도 19 및 20).

또한, 탯줄 추출물을 이용하여 계속적인 계대배양을 하면서 줄기세포능(stemness) 및 세포분열 시간(doubling time)을 3일 간격으로 계대배양 하면서 10% FBS를 첨가한 배지에서 배양된 줄기세포와 비교하였다.

그 결과는 도 34와 같다. 도 34는 탯줄 추출물을 이용하여 배양한 줄기세포와 10% FBS를 첨가한 배지로 배양한 세포의 계속적인 계대배양에 따른 줄기세포의 stemness(줄기세포능) 유지능을 비교하기 위한 실험으로 계대배양 초기와 10회 이상 계대배양 후 줄기세포의 Td 시간을 비교하는 결과이다.

10% FBS를 사용하지 않고 0.3 mg/ml 탯줄 추출물(umbilical cord extract, UCE)만을 첨가한 줄기세포의 경우 세포의 증식 속도 및 Td가 크게 차이 나지 않고 있으며 오히려 근소한 차이로 보다 빨리 증식하였다. 0.3 mg/ml의 탯줄 추출물 농도는 10% FBS와 비슷한 증식력을 보이는 농도를 선택한 것이다. UCE 농도를 높여 처리하는 경우 보다 더 빨리 증식하였다.

<실시예 10> 탯줄 유래 추출물 및 콜라겐 제조

탯줄을 1~2 cm 길이로 절단한 후, DPBS로 2회 이상 세척하였다. 상기 탯줄을 70% 에탄올 용액으로 처리하고 4℃에서 1시간 반응시킨 후, 정제수로 2회 이상 세척하여 탯줄의 무게를 측정하였다. 탯줄 무게 기준 3배 정도의 DPBS를 처리하고 4℃에서 24시간 처리 한 후, 탯줄 추출물(umbilical cord extracts, UCE)을 회수하였다. 회수된 탯줄 추출물을 최종 0.22 μm 필터로 여과하여 4℃에서 보관하였다.

남은 탯줄에 3% H₂O₂ 용액을 가한 후, 4 ℃에서 12~24시간 처리하였다. 이후, 거품이 사라질 때까지 정제수로 2회 이상 세척하였다. 탯줄 무게 기준 10배 정도의 0.5 M 아세트산 용액을 처리한 후, 블렌더(blender)와 균질기(homogenizer)를 사용하여 조직을 분쇄하였다. 탯줄 무게 기준 10% 펩신을 처리하고 4℃에서 24시간 반응시켰다. 10,000 rpm, 4℃에서 30분 동안 원심분리 하였다. 원심분리 후, NaOH를 사용하여 수거한 상층액의 pH를 7로 맞추어 펩신 효소의 활성을 제거하였다. pH를 조정한 용액의 부피를 측정한 후, 용액 부피 기준 2.4 M이 되도록 NaCl을 처리하였다. NaCl이 다 녹을 때까지 교반 후, 4℃에서 콜라겐이 염석이 되어 침전이 되도록 12~24시간 정치하였다. 10,000 rpm, 4℃에서 30분 동안 원심분리 후, 염석이 된 콜라겐 펠렛(pellet)을 분리하여 무게를 측정하였다. 상기 펠렛 무게를 기준으로 10배 정도의 정제수에 희석한 후, 한외여과 장치 (ultrafiltration system)로 탈염 및 농축하였다. 최종적으로 여과방법으로 제균한 후 동결 건조한 후 보관하였다.

회수한 탯줄 추출물은 브래드포드(Bradford) 분석법으로 정량하였으며, 제조된 콜라겐은 하이드록시프로린(hydroxyprolin) 분석법으로 정량하였다.

<실시예 11> 무혈청 배지에서의 탯줄 추출물과 콜라겐 코팅을 이용한 세포배양

콜라겐을 D.W.에 50 μg/ml 의 농도로 용해 한 후 배양 접시에 처리하여 1시간 동안 배양기에서 코팅하였다. 코팅 후 콜라겐 용액을 제거하고 포스페이트 완충용액으로 2회 이상 세척하였으며, 상온에서 완전히 건조시킨 후 세포를 배양하였다. 탯줄 추출물을 혈청이 제거된 배지에 0, 0.1, 0.2 mg/ml의 농도로 처리하여 세포를 배양하였으며, 대조군으로서 10% FBS가 첨가된 배지를 사용하였고, 세포 성장을 비교하기 위해 WST-1 assay(Daeillab, EZ-3000)를 이틀 간격으로 총 7일간 측정하였다. WST-1 assay 시약을 배지의 10%가 되게 첨가하고 배양 조건과 동일하게 약 1 시간 정도 반응시킨 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다(도 23 및 도 24).

<실시예 12> 탯줄 줄기세포 분리방법에 따른 세포 회수율 및 증식능 비교

탯줄 외부의 혈액을 Ca²⁺과 Mg²⁺이 포함되지 않은 DPBS로 제거한 후, 외부 양막을 벗기고 동맥 2개를 제거한 뒤 다음과 같은 6가지 세포 분리 방법을 비교하였다.

<12-1> 탯줄 줄기세포 분리 방법 1

조직에 콜라게나제 처리 후 10% FBS가 첨가된 배지에서 세포 배양을 하였다. 구체적으로, 혈액 제거한 조직을 1 mm³ 크기로 자른 후 200 U/ml의 Ι형 콜라게나제(collagenase type Ι)가 포함된 α-MEM을 5시간 처리하여 세포를 분리 한 후 100 U/ml의 페니실린, 0.1 μg/ml의 스트렙토마이신, 10% FBS가 포함된 α-MEM에 배양접시 1 cm² 당 2×10³개의 세포를 넣어 37℃ 온도에서 5%의 CO₂가 공급되는 배양기내에서 배양하였다.

<12-2> 탯줄 줄기세포 분리 방법 2

조직에 콜라게나제 처리 후 0.2 mg/ml의 UCE가 첨가된 배지에서 세포 배양을 하였다. 구체적으로, 혈액 제거한 조직을 1 mm³ 크기로 자른 후 200 U/ml의 Ι형 콜라게나제가 포함된 α-MEM을 5시간 처리하여 세포를 분리 한 후 100 U/ml의 페니실린, 0.1 μg/ml의 스트렙토마이신, 0.2 mg/ml 탯줄 추출물이 포함된 α-MEM을 넣은 콜라겐 코팅된 배양접시 1 cm² 당 2×10³ 개의 세포를 넣어 37℃ 온도에서 5%의 CO₂가 공급되는 배양기 내에서 배양하였다.

<12-3> 탯줄 줄기세포 분리 방법 3

10% FBS가 첨가된 배지에서 조직 배양하고 콜라게나제 처리 후 10% FBS가 첨가된 배지에서 세포 배양을 하였다. 구체적으로, 혈액 제거한 조직을 1 mm³ 크기로 자른 후 100 U/ml의 페니실린, 0.1 μg/ml의 스트렙토마이신, 10%의 FBS가 포함된 α-MEM에 넣고 7일 동안 배양 후 바닥에 부착된 세포가 보이기 시작하면 200 U/ml의 Ι형 콜라게나제가 포함된 α-MEM을 4시간 처리하여 세포외기질이 모두 분해되면 원심분리 및 PBS로 세척하여 세포만을 분리하였다. 그 후 100 U/mL의 페니실린, 0.1 μg/ml의 스트렙토마이신, 10%의 FBS가 포함된 α-MEM에 배양접시 1 cm² 당 2×10³ 개의 세포를 넣어 넣고 37℃ 온도에서 5%의 CO₂가 공급되는 배양기 내에서 배양하였다.

<12-4> 탯줄 줄기세포 분리 방법 4

0.2 mg/ml 탯줄 추출물이 첨가된 배지에서 조직 배양하고 콜라게나제 처리 후 0.2 mg/ml 탯줄 추출물이 첨가된 배지에서 세포 배양을 하였다. 구체적으로, 혈액 제거한 조직을 1 mm³ 크기로 자른 후 콜라겐 코팅된 디쉬에 넣어 100 U/ml의 페니실린, 0.1 μg/ml의 스트렙토마이신, 0.2 mg/ml UCE가 포함된 α-MEM에 넣고 7일 동안 배양 후 바닥에 부착된 세포가 보이기 시작하면 200 U/ml의 Ι형 콜라게나제가 포함된 α-MEM을 4시간 처리하여 세포를 분리하였다. 그 후 100 U/ml의 페니실린, 0.1 μg/ml의 스트렙토마이신, 0.2 mg/ml UCE 가 포함된 α-MEM을 넣은 콜라겐 코팅된 배양접시 1 cm² 당 2×10³ 개의 세포를 넣어 37℃ 온도에서 5%의 CO₂가 공급되는 배양기 내에서 배양하였다.

<12-5> 탯줄 줄기세포 분리 방법 5

10% FBS가 첨가된 배지에서 조직 배양을 하였다. 구체적으로, 혈액 제거한 조직을 1mm³ 크기로 자른 후 100U/ml의 페니실린, 0.1 μg/ml의 스트렙토마이신, 10%의 FBS가 포함된 α-MEM에 넣은 후 37℃ 온도에서 5%의 CO₂가 공급되는 배양기 내에서 배양하였다.

<12-6> 탯줄 줄기세포 분리 방법 6

0.2 mg/ml 탯줄 추출물이 첨가된 배지에서 조직 배양을 하였다. 구체적으로, 혈액 제거한 조직을 1 mm³ 크기로 자른 후 콜라겐이 코팅된 배양접시에 넣어 100 U/ml의 페니실린, 0.1 μg/ml의 스트렙토마이신, 0.2 mg/ml의 UCE가 포함된 α-MEM을 넣은 후 37℃ 온도에서 5%의 CO₂가 공급되는 배양기 내에서 배양하였다.

<실시예 13> RT-PCR를 통한 배아줄기세포 마커 확인

세포 펠렛(pellet)을 Ca²⁺과 Mg²⁺이 포함되지 않은 DPBS를 이용하여 세척하고 1 ml의 세포용해 완충액(lysis buffer)(iNtRON Biotechnology)를 첨가한 다음 제조회사 사용설명서에 따라 전RNA(total RNA)를 분리하였다. 1 μg의 RNA는 cDNA 합성 키트(iNtRON Biotechnology)를 사용하여 반응 완충액(reaction buffer), 1 mM의 dNTP 혼합액(mixture), 0.5 μg/μL의 oligo(dT)15, 20 U의 RNA분해효소 저해제(RNase inhibitor), 20 U의 AMV 역전사효소(reverse transcriptase)가 혼합된 20 μL 반응 용액에서 역전사시켰다. 상기 반응은 42℃에서 60분간 진행되었다. 얻어진 RT 산물(cDNAs)을 2X PCR 마스터 믹스 용액 키트(Master mix solution kit)(iNtRON Biotechnology)를 사용하여 1×의 Taq 완충액, 0.25 U의 Taq 중합효소 (polymerase), 10 pM의 센스(sense)와 안티센스(antisense) 유전자-특이적 프라이머(gene-specific primers)가 혼합된 10 μL 반응 용액으로 PCR을 수행하였다. 증폭은 총 32 싸이클을 수행하였으며 각 싸이클은 94℃에서 30초 간의 변성(denaturation) 과정, 30초간의 어닐링(annealing) 과정, 72℃에서 30초간의 신장(extension) 과정으로 구성되었다. 반응 종결 후 PCR 생성물은 2% 아가로스 겔 (agarose gel)에 충전(loading)하여 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하고 자외선을 이용하여 DNA의 영상을 얻었다.

프라이머 염기서열 정보

유전자(gene)		프라이머 서열(5'-3')		온도(℃)
OCT 4	Sense	agaaggagtggtccgagtg	서열번호 1	60
OCT 4	Antisense	agagtggtgacggagacagg	서열번호 2	60
Nanog	Sense	atacctcagcctccagcaga	서열번호 3	59
Nanog	Antisense	cctgattgrrccaggattgg	서열번호 4	59
KLF4	Sense	accctgggtcttgaggaagt	서열번호 5	59
KLF4	Antisense	tgccttgagatgggaactct	서열번호 6	59
Sox2	Sense	gatgcacaactcggagatcag	서열번호 7	60
Sox2	Antisense	gccgttcatgtaggtctgcga	서열번호 8	60
GAPDH	Sense	gaaggtgaaggtcggagtca	서열번호 9	60
GAPDH	Antisense	ggaggcattgctgatgatct	서열번호 10	60

<실시예 14> FACS 분석을 통한 중간엽줄기세포 마커의 발현 분석

분리된 세포의 특성을 분석하기 위해 유세포 분석법을 수행하였다. 유세포 분석을 위해 세포들을 PBS를 사용하여 세척 후 트립신-EDTA를 처리하여 단일 세포군으로 만든 뒤, 2% FBS가 함유된 PBS로 세척한다. 그 후 플루오레신 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate(FITC)) 또는 피코에리트린(phycoerythrin (PE))이 결합된 각각의 매트릭스 수용체(matrix receptors)(CD44, CD105), 인테그린(integrin)(CD29), PECAM (CD31), VCAM-1 (CD106), SH2 (CD105), SH3 및 SH4 (CD73), Thy-1 (CD90), 조혈 마커(hematopoietic marker)(CD14, CD34) 및 MHC 마커(HLA-DR, HLA-Class I)를 20분간 반응시킨 후, 유세포 분석기(FACSCalibur, Becton-Dickinson)를 통해 분석하였다.

<실시예 15> 탯줄 추출물이 포함된 필러의 효력시험

히알루론산 유도체와 히알루론산유도체에 탯줄 추출물을 500 ug/ml의 농도로 혼합한 후, 실험용 마우스(BALB/c-nuSlc, female, 5주)에 처리하여 실험을 진행하였다. 각 처리군을 200 ul씩 피하주사하고 1주, 4주, 8주 및 12주 후에 샘플을 채취하였다. 마우스는 경추 탈골 후 샘플 주위에 붙어 있는 조직을 모두 제거하고, 각 샘플의 무게를 측정한 후 4% 포르말린(Neutral buffered formalin)으로 고정하여 헤마톡실린&에오신(Hematoxylin& Eosin) 염색을 진행하였다.

그 결과, 탯줄 추출물을 조직수복용 필러에 혼합하여 사용하는 경우 주변 조직의 세포를 끌어들이는 역할을 하여 조직수복의 효과를 지속시키는 것을 확인하였다(도 21 및 22).

<110> chabio&diostech <120> Methods for Preparing Extract of Umbilical Cord andUses thereof <130> PN097345 <150> KR 2011/0068261 <151> 2011-07-11 <150> KR 2011/0068761 <151> 2011-07-12 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for OCT 4 <400> 1 agaaggagtg gtccgagtg 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for OCT 4 <400> 2 agagtggtga cggagacagg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Nanog <400> 3 atacctcagc ctccagcaga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Nanog <400> 4 cctgattgrr ccaggattgg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for KLF4 <400> 5 accctgggtc ttgaggaagt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for KLF4 <400> 6 tgccttgaga tgggaactct 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Sox2 <400> 7 gatgcacaac tcggagatca g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Sox2 <400> 8 gccgttcatg taggtctgcg a 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for GAPDH <400> 9 gaaggtgaag gtcggagtca 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for GAPDH <400> 10 ggaggcattg ctgatgatct 20

Claims

탯줄을 절단하는 단계;
상기 절단된 탯줄을 완충액에 넣는 단계;
상기 완충액에 함침된 탯줄을 교반하는 단계; 및
교반하여 얻은 산물을 원심분리하여 탯줄 추출물로서 상층액을 수득하는 단계를 포함하는 포유동물 탯줄 추출물의 제조방법.
제1항에 의해 제조된 탯줄 추출물.
제2항에 있어서, 상기 탯줄 추출물은 IGFBP-7 (insulin-like growth factor binding protein-7), Lipocallin-1, CXCL14, Leptin R, IL-23, MIP-1a, Angiogenin, Thrombospondin-2, IL-29, IL-4R의 단백질을 성분으로 포함하는 탯줄 추출물.
탯줄 추출물을 포함하는 혈청 대체재.
제4항에 있어서, 상기 탯줄 추출물은 제1항의 방법에 의해 제조된 것인 혈청 대체재.
제4항의 혈청 대체재를 포함하는 세포 배양액.
제6항에 있어서, 상기 세포는 동물 세포인 것인 세포 배양액.
제7항에 있어서, 상기 동물 세포는 줄기 세포인 것인 세포 배양액.
제8항에 있어서, 상기 줄기 세포는 탯줄 유래 줄기세포인 것인 세포 배양액.
탯줄 추출물을 포함하는 조직 수복용 필러.
제10항에 있어서, 상기 탯줄 추출물은 제1항의 방법에 의해 제조된 것인 조직 수복용 필러.
세포배양용기에 포유류의 탯줄 추출물을 포함하는 배지 조성물과 세절된 탯줄 조직을 넣어 배양하는 단계;
상기 탯줄 조직에 효소를 처리하는 단계; 및
탯줄 조직에서 줄기세포를 분리하는 단계를 포함하는 포유류의 탯줄로부터 줄기세포 분리 방법.
제12항에 있어서, 상기 세포배양용기는 세포 부착 단백질(cell adhesion protein)로 코팅된 것인 줄기세포 분리 방법.
제12항에 있어서, 상기 세포 부착 단백질은 포유류 태반유래 콜라겐, 젤라틴, 피브로넥틴, 라미닌 및 폴리-D-라이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 줄기세포 분리 방법.
줄기 세포 배양액에 탯줄 추출물을 첨가하는 단계;
세포배양용기에서 상기 세포 배양액을 이용하여 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 배양 방법.
제15항에 있어서, 상기 세포배양용기는 세포 부착 단백질(cell adhesion protein)로 코팅된 것인 줄기세포 배양 방법.
제15항에 있어서, 상기 줄기세포는 조직 유래 줄기세포인 것인 줄기세포 배양 방법.
제16항에 있어서, 상기 조직은 지방, 탯줄, 간 및 골막으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인 줄기세포 배양 방법.
제15항에 있어서, 상기 줄기 세포 배양액은 혈청을 포함하지 않는 것인 줄기세포 배양 방법.
제15항에 있어서, 상기 세포 부착 단백질은 포유류 태반유래 콜라겐, 젤라틴, 피브로넥틴, 라미닌 및 폴리-D-라이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 줄기세포 배양 방법.
제15항에 있어서, 상기 줄기세포는 Oxt4, Sox2, KLF4 및 Nanog 유전자로 이루어진 그룹에서 적어도 어느 하나가 발현이 되는 세포인 것인 줄기세포 배양 방법.
제15항에 있어서, 상기 줄기세포는 CD29, CD73, CD90, CD105 및 CD166에 선택적으로 양성을 나타내는 세포이고 CD34 및 CD45에 선택적으로 음성을 나타내는 세포인 것인 줄기세포 배양 방법.
제15항에 있어서, 상기 줄기세포는 탯줄 추출물을 이용하여 배양하는 경우 배아줄기세포 특이적 유전자인 Oxt4, Sox2, KLF4 및 Nanog로 이루어진 그룹에서 적어도 어느 하나가 계대배양을 반복하여도 지속적으로 발현되는 세포인 것인 줄기세포 배양 방법.