KR20130008178A

KR20130008178A - 포유류의 탯줄유래 줄기세포 분리 또는 배양용 배지 조성물, 그리고 이를 이용한 포유류의 탯줄유래 줄기세포 분리 또는 배양 방법

Info

Publication number: KR20130008178A
Application number: KR1020110068761A
Authority: KR
Inventors: 최용수; 김선미; 김호진; 이영준; 한규범; 정형민
Original assignee: (주)차바이오메드; (주)차바이오앤디오스텍; 의료법인 성광의료재단
Priority date: 2011-07-12
Filing date: 2011-07-12
Publication date: 2013-01-22

Abstract

본 발명은 포유류의 탯줄유래 줄기세포 분리 및 배양용 배지 조성물 그리고 이를 이용한 탯줄유래 줄기세포 분리 및 배양 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 포유류의 탯줄 추출물을 포함하고, 혈청을 포함하지 아니하는 포유류의 탯줄유래 줄기세포 분리 또는 배양용 배지 조성물, 및 이를 이용하여 포유류의 탯줄로부터 탯줄유래 줄기세포의 분리 및 배양 방법에 대한 것이다.

Description

포유류의 탯줄유래 줄기세포 분리 또는 배양용 배지 조성물, 그리고 이를 이용한 포유류의 탯줄유래 줄기세포 분리 또는 배양 방법{Medium for Separation or Culture of Mammalian Umbilical Cord-Derived Stem Cells, and Methods for Separation or Culture of Mammalian Umbilical Cord-Derived Stem Cells}

줄기세포(stem cells)는 성체의 여러 조직 및 기관에서 발견되는 성체줄기세포(adult stem cells)와, 발달단계 중 배반포 단계의 세포 내괴에서 얻을 수 있는 배아줄기세포(embryonic stem cells)로 나누어진다.

배아줄기세포는 신경, 혈액세포, 췌장 등 다양한 세포로 분화할 수 있는 전분화능을 갖고 있지만, 사람으로 성장할 수 있는 배아로부터 얻어야 하기 때문에 윤리적 문제점이 있다.

따라서 윤리적인 문제를 배제할 수 있을 뿐만 아니라 분리 및 배양이 쉬우며 여러 가지 세포로 분화 가능한 성체줄기세포가 세포치료제의 재료로서 각광받고 있다.

성체줄기세포는 다양한 조직으로부터 분리할 수 있으며, 지방세포, 골세포, 연골세포, 심장세포, 간세포, 신경세포 등 다양한 조직세포로 분화할 수 있는 미분화 상태의 줄기세포이다. 그 중 골수유래 중간엽 줄기세포(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSC)가 그 대표적 예이다.

그러나 골수 유래 중간엽줄기세포는 제공자의 나이가 증가함에 따라 줄기세포의 수 및 증식 능력이 감소하며, 골수를 채취하기 위해서는 고통이 수반된다. 이에 따라 다른 조직에서부터 중간엽줄기세포를 분리하려는 시도를 하고 있으며, 최근 성체와 태아의 말초 혈액, 탯줄, 태반, 탯줄 혈액 등에서 분리할 수 있다는 보고들이 발표되면서, 다양한 조직에서 얻어지는 중간엽줄기세포가 새로운 세포치료제의 공급원으로 관심을 끌고 있다.

탯줄은 혈관과 그 주위의 와튼 젤리(Wharton's jelly)라고 불리는 결합조직으로 구성되어 있다. 임신 기간 동안 탯줄의 길이는 30-60cm, 무게는 40-50g 이며, 태아에게 공급하는 영양분이 풍부하고, 줄기세포와 전구세포를 포함하고 있다.

최근에는 탯줄에서 유래한 세포가 골수에서 유래된 중간엽줄기세포의 특징을 가지고 있다고 보고되고 있다. 이 탯줄유래 줄기세포는 골수 및 다른 조직유래 중간엽줄기세포와 유사하게 CD73, CD90, CD105, CD10, CD13, CD29, CD44, HLA-ABC 유전자를 발현하며, 조혈모세포 표지 인자인 CD34, CD45와 조직적합성항원인 CD14, CD31, CD33, HLA-DRα 유전자는 발현하지 않는다.

탯줄유래 줄기세포는 골세포, 연골세포, 지방세포로 분화할 수 있고, 체외 배양 시 골수나 지방유래 줄기세포보다 분열 능력이 뛰어나다. 이 세포를 이용하여 심근세포, 신경세포로 분화 가능하다는 연구도 보고되었다.

이처럼 탯줄은 임상적 사용을 위한 줄기세포를 공급할 수 있는 조직으로 기대되며, 나아가 세포치료제로서 사용이 가능할 것으로 보인다.

탯줄에서 세포를 분리하기 위해서 많이 이용되는 방법은 콜라게나제(collagenase)를 처리하는 효소처리 방법인데, 각 연구 그룹에서 다양한 방법으로 처리된다. 트립신(Trypsin) 또는 하이알루로니다제(hyaluronidase)와 같은 다른 효소들도 자주 사용되지만, 일반적으로 콜라게나제와 함께 처리하며, 그 처리 시간 또한 4-24시간으로 다양하다. 또한, 어떤 연구 그룹은 효소를 사용하지 않고, 탯줄을 작은 조각(1-3 mm³)으로 잘라 배양하기도 한다.

이렇듯, 탯줄에서 세포를 분리하는 방법은 각 연구 그룹마다 각기 다른 방법을 사용하고 있으며, 보다 단기간에 증식력이 우수한 많은 양의 세포를 재현성 있게 분리하는 방법을 개발하기 위한 연구들이 보고되고 있다.

대한민국 특허 제10-0902569호는 인간 탯줄로부터 고순도로 중간엽 줄기세포를 분리 및 배양하는 방법으로서, 탯줄에서 분리된 동맥에 콜라게나제, 프로나제 및 디에나제를 처리함으로써 줄기세포를 확립하는 방법을 개시하고 있다. 그러나 본 발명은 탯줄의 동맥을 사용하지 아니하고, 와튼 젤리 부분을 사용한다.

또한, 국제특허출원 PCT/CA2004/000182호는 인간 제대의 말초혈관계 대역 내에 위치하는 워튼 젤리로부터 추출된 전구세포를 개시하고 있다. PCT/CA2004/000182호는 단지 콜라게나제만으로 처리하여 전구세포를 배양하는 방법이다.

또한, 미합중국 특허 제7,736,892호는 탯줄에 효소를 처리하여 세포를 분리하고 EGF(epidermal growth factor)와 PDGF(platelet-derived growth factor)를 참가하여 배양하는 방법을 개시하고 있다. 이렇게 분리된 세포의 부착성은 CD34 및 CD45에 음성이고, 텔로미어 활성이 존재하며 연속적으로 계대배양이 가능한 세포이다. 그러나 본 발명에서는 EGF 및 PDGF를 사용하지 않으면서 줄기세포를 배양하고, 또한, 본 발명은 탯줄 추출물을 사용하여 줄기세포를 분리 및 배양한다.

Nekanti 등(Long term expansion and pluripotent marker array analysis of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 19:117-130, 2010)은 탯줄 하나에 효소를 처리하는 방법으로 5~6×10⁴ 개의 세포를 얻을 수 있다고 보고하였다.

Lu 등(Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica 91:1017-1026, 2006)도 효소처리 방법으로 탯줄 30 cm에서 평균 2.6×10⁷ 개의 줄기세포를 분리하였다고 보고하였다.

최근 Bruyn 등(A rapid, simple, and reproducible method for isolation of mesenchymal stromal cells from Wharton's jelly without enzymatic treatment, Stem Cell Dev. 3:1-11, 2011)은 효소를 사용하지 않고 탯줄을 세로로 길게 자르는 방법(longitudinally cut)으로 5일간 배지에 배양하여 세포를 분리하였다. 보고에 따르면 5~10 cm의 탯줄로부터 분리 시작 20일 후에 2.8×10⁶ 개의 세포를 회수하였고 최종 32일 후 1.4×10⁸ 개의 세포를 획득할 수 있다고 보고하였다.

상기 선행 발표된 논문을 통해 알 수 있듯이, 효소를 이용하여 탯줄에서 줄기세포를 분리하는 방법으로는 같은 기간 안에 많은 수의 세포를 획득할 수 없다는 것을 알 수 있다. 또한 효소를 사용하지 않는 방법은 실험하는 사람과 조직에서 5일 분리되는 세포의 수가 항상 일정하게 나오지 않기 때문에 실험자 및 실험간의 오차가 많이 존재할 수 있다는 한계점을 지니고 있다.

본 발명은 전술한 선행기술의 단점을 극복함으로써, 소혈청(fetal bovine serum, FBS)을 사용하지 않는 무혈청 배지 조성물을 제공하며, 재현성 있는 탯줄유래 줄기세포의 분리 및 배양 방법을 제공한다.

본 발명의 기본적인 목적은 포유류의 탯줄 추출물을 포함하고, 혈청을 포함하지 아니하는 포유류의 탯줄유래 줄기세포 분리 또는 배양용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 (i) 포유류의 탯줄 추출물을 포함하고 혈청을 포함하지 아니하는 포유류의 탯줄유래 줄기세포 분리 또는 배양용 배지 조성물을 함유하며 세포 부착 단백질(cell adhesion protein)로 코팅된 용기에 혈액이 제거되고 세절된 포유류의 탯줄 조직을 넣어 배양하는 단계; 및 (ii) 상기 배양 후 줄기세포 분리 효소를 함유하는 배지로 처리하여 포유류의 탯줄유래 줄기세포를 분리하는 단계를 포함하는, 포유류의 탯줄로부터 줄기세포 분리 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 포유류의 탯줄 추출물을 포함하고 혈청을 포함하지 아니하는 포유류의 탯줄유래 줄기세포 분리 또는 배양용 배지 조성물을 함유하며 세포 부착 단백질(cell adhesion protein)로 코팅된 용기에 포유류의 탯줄유래 줄기세포를 넣어 배양하는 단계를 포함하는 포유류의 탯줄유래 줄기세포 배양 방법을 제공하는 것이다.

전술한 본 발명의 기본적인 목적은 포유류의 탯줄 추출물을 포함하고, 혈청을 포함하지 아니하는 포유류의 탯줄유래 줄기세포 분리 또는 배양용 배지 조성물을 제공함으로써 달성될 수 있다.

상기 포유류는 인간, 돼지, 말, 소, 마우스(mouse), 라트(rat), 햄스터, 토기, 염소 또는 양일 수 있다.

또한, 상기 포유류의 탯줄 추출물은 (i) 세절된 탯줄을 완충액에 넣어 교반하는 단계; 및 (ii) 상기 (i) 단계에서 얻은 용액의 상등액을 회수하는 단계를 포함하는 포유류의 탯줄 추출물 제조 방법에 의해 제조될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 배지 조성물에 사용되는 탯줄 추출물은, 탯줄 조직 중에서 와튼 젤리(Warton's jelly) 부분에서 추출된 추출물을 사용할 수 있다.

전술한 본 발명의 다른 목적은 (i) 포유류의 탯줄 추출물을 포함하고 혈청을 포함하지 아니하는 포유류의 탯줄유래 줄기세포 분리 또는 배양용 배지 조성물을 함유하며 세포 부착 단백질(cell adhesion protein)로 코팅된 용기에 혈액이 제거되고 세절된 포유류의 탯줄 조직을 넣어 배양하는 단계; 및 (ii) 상기 배양 후 줄기세포 분리 효소를 함유하는 배지로 처리하여 포유류의 탯줄유래 줄기세포를 분리하는 단계를 포함하는, 포유류의 탯줄로부터 줄기세포 분리 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 포유류의 탯줄로부터 줄기세포 분리 방법에 있어서, 상기 포유류의 탯줄유래 추출물은 (i) 세절된 탯줄을 완충액에 넣어 교반하는 단계; 및 (ii) 상기 (i) 단계에서 얻은 용액의 상등액을 회수하는 단계를 포함하는 포유류의 탯줄 추출물 제조 방법에 의해 제조될 수 있다.

또한, 상기 세포 부착 단백질은 포유류 탯줄유래 콜라겐, 젤라틴(gelatin), 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin) 또는 폴리-D-라이신(poly-D-lysin)일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.

상기 포유류의 탯줄유래 콜라겐은 (i) 과산화수소로 처리된 포유류의 탯줄 조직을 분쇄하는 단계; (ii) 상기 분쇄된 탯줄 조직을 아세트산 및 펩신으로 처리한 후 원심분리하는 단계; (iii) 상기 원심분리에 의해 얻은 상등액의 pH를 7로 맞추고 NaCl을 첨가하여 콜라겐을 침전시키는 단계; 및 (iv) 상기 침전된 콜라겐을 분리하는 단계를 포함하는 포유류의 탯줄유래 콜라겐 제조 방법에 의해 제조될 수 있다. 이때, 상기 포유류는 인간, 돼지, 말, 소, 마우스(mouse), 라트(rat), 햄스터, 토기, 염소 또는 양일 수 있다.

본 발명의 포유류의 탯줄로부터 줄기세포 분리 방법에 있어서, 상기 (ii) 단계는 상기 (i) 단계 개시 후 1일 내지 10일 후에 수행하는 것이 바람직하다.

상기 (ii) 단계의 줄기세포 분리 효소는 콜라게나제일 수 있고, 바람직하게는, 상기 콜라게나제는 I형 콜라게나제일 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 (ii) 단계에서, 상기 I형 콜라게나제가 180 U/ml 내지 220 U/ml 포함되며, 2시간 내지 6시간 동안 처리될 수 있다.

전술한 본 발명의 또 다른 목적은 포유류의 탯줄 추출물을 포함하고 혈청을 포함하지 아니하는 포유류의 탯줄유래 줄기세포 분리 또는 배양용 배지 조성물을 함유하며 세포 부착 단백질(cell adhesion protein)로 코팅된 용기에 포유류의 탯줄유래 줄기세포를 넣어 배양하는 단계를 포함하는 포유류의 탯줄유래 줄기세포 배양 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 포유류의 탯줄유래 줄기세포 배양 방법에 있어서, 상기 포유류의 탯줄유래 줄기세포는, 전술한 본 발명의 포유류의 탯줄로부터 줄기세포 분리 방법에 의해 제조된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.

또한, 상기 포유류의 탯줄유래 추출물은 (i) 세절된 탯줄을 완충액에 넣어 교반하는 단계; 및 (ii) 상기 (i) 단계에서 얻은 용액의 상등액을 회수하는 단계를 포함하는 포유류의 탯줄 추출물 제조 방법에 의해 제조될 수 있다.

또한, 상기 포유류는 인간, 돼지, 말, 소, 마우스(mouse), 라트(rat), 햄스터, 토기, 염소 또는 양일 수 있다.

또한, 상기 세포 부착 단백질은 포유류 태반유래 콜라겐, 젤라틴(gelatin), 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin) 또는 폴리-D-라이신(poly-D-lysin)일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.

또한, 상기 포유류의 탯줄유래 콜라겐은 (i) 과산화수소로 처리된 포유류의 탯줄 조직을 분쇄하는 단계; (ii) 상기 분쇄된 탯줄 조직을 아세트산 및 펩신으로 처리한 후 원심분리하는 단계; (iii) 상기 원심분리에 의해 얻은 상등액의 pH를 7로 맞추고 NaCl을 첨가하여 콜라겐을 침전시키는 단계; 및 (iv) 상기 침전된 콜라겐을 분리하는 단계를 포함하는 포유류의 탯줄유래 콜라겐 제조 방법에 의해 제조될 수 있다. 이때, 상기 포유류는 인간, 돼지, 말, 소, 마우스(mouse), 라트(rat), 햄스터, 토기, 염소 또는 양일 수 있다.

본 발명의 탯줄유래 줄기세포 분리 및 배양 방법에 따르면, 탯줄 조직으로부터 줄기세포를 분리하는 초대배양 시의 생존률과 증식능, 분화능이 우수한 줄기세포를 단기간(15일)에 최대로 획득할 수 있고(약 2.0×10⁸개의 세포), 계대배양 2-3회만으로도 매우 많은 양(탯줄 조직 약 50 g으로부터 1.0 × 10¹⁰개의 세포)을 분리할 수 있어 향후 줄기세포치료제 개발에 유용한 방법으로 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 무혈청 배지에서 탯줄 추출물의 농도에 따른 탯줄유래 줄기세포 증식 효과를 보여 준다.
도 2a는 본 발명에 따라 탯줄유래 콜라겐을 코팅한 배양접시에서 탯줄유래 줄기세포의 부착 및 증식(배양) 증대 효과를 보여 준다. 도 2b는 콜라겐을 농도에 따라 코팅한 배양 접시에서 탯줄유래 줄기세포를 배양한 후 2일 뒤 증식한 탯줄유래 줄기세포의 수를 비교한 결과이다.
도 3은 종래의 탯줄유래 줄기세포 분리 방법과 본 발명의 탯줄유래 줄기세포 분리 방법을 비교한 그림이다.
도 4는, 도 3에 나타난 6개의 방법으로 분리하여 배양 중인 세포의 모습을 보여 주는 사진이다.
도 5는 실시예 3의 탯줄유래 줄기세포 분리 후 15일째에 회수된 총 세포수 결과를 보여 준다.
도 6은, 도 3의 6가지 분리 및 배양 방법으로 분리 및 배양된 세포의 면역표시자 분석 결과를 비교한 것이다.

이하, 다음의 실시예 또는 도면을 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 다음의 실시예 또는 도면에 대한 설명은 본 발명의 구체적인 실시 태양을 특정하여 설명하고자 하는 것일 뿐이며, 본 발명의 권리 범위를 이들에 기재된 내용으로 한정하거나 제한해석하고자 의도하는 것은 아니다.

실시예 1. 탯줄 유래 추출물 및 콜라겐 제조

탯줄을 1~2 cm 길이로 절단한 후, DPBS로 2회 이상 세척하였다. 상기 탯줄을 70% 에탄올 용액으로 처리하고 4℃에서 1시간 반응시킨 후, 정제수로 2회 이상 세척하여 탯줄의 무게를 측정하였다. 탯줄 무게 기준 3배 정도의 DPBS를 처리하고 4℃에서 24시간 처리 한 후, 탯줄 추출물(umbilical cord extracts, UCE)을 회수하였다. 회수된 탯줄 추출물을 최종 0.22 μm 필터로 여과하여 4℃에서 보관하였다.

남은 탯줄에 3% H₂O₂ 용액을 가한 후, 4 ℃에서 12~24시간 처리하였다. 이후, 거품이 사라질 때까지 정제수로 2회 이상 세척하였다. 탯줄 무게 기준 10배 정도의 0.5 M 아세트산 용액을 처리한 후, 블렌더(blender)와 균질기(homogenizer)를 사용하여 조직을 분쇄하였다. 탯줄 무게 기준 10% 펩신을 처리하고 4℃에서 24시간 반응시켰다. 10,000 rpm, 4℃에서 30분 동안 원심분리 하였다. 원심분리 후, NaOH를 사용하여 수거한 상층액의 pH를 7로 맞추어 펩신 효소의 활성을 제거하였다. pH를 조정한 용액의 부피를 측정한 후, 용액 부피 기준 2.4 M이 되도록 NaCl을 처리하였다. NaCl이 다 녹을 때까지 교반 후, 4℃에서 콜라겐이 염석이 되어 침전이 되도록 12~24시간 정치하였다. 10,000 rpm, 4℃에서 30분 동안 원심분리 후, 염석이 된 콜라겐 펠렛(pellet)을 분리하여 무게를 측정하였다. 상기 펠렛 무게를 기준으로 10배 정도의 정제수에 희석한 후, 한외여과 장치(ultrafiltration system)로 탈염 및 농축하였다. 최종적으로 여과방법으로 제균한 후 동결 건조한 후 보관하였다.

회수한 UCE는 브래드포드(Bradford) 분석법으로 정량하였으며, 제조된 콜라겐은 하이드록시프로린(hydroxyprolin) 분석법으로 정량하였다.

실시예 2. 무혈청 배지에서의 탯줄 추출물과 콜라겐 코팅을 이용한 세포배양

콜라겐을 D.W.에 50 μg/ml 의 농도로 용해 한 후 배양 접시에 처리하여 1시간 동안 배양기에서 코팅하였다. 코팅 후 콜라겐 용액을 제거하고 포스페이트 완충용액으로 2회 이상 세척하였으며, 상온에서 완전히 건조시킨 후 세포를 배양하였다. 탯줄 추출물을 혈청이 제거된 배지에 0, 0.1, 0.2 mg/ml의 농도로 처리하여 세포를 배양하였으며, 대조군으로서 10% 혈청이 첨가된 배지를 사용하였고, 세포 성장을 비교하기 위해 WST-1 assay(Daeillab, EZ-3000)를 이틀 간격으로 총 7일간 측정하였다. WST-1 assay 시약을 배지의 10%가 되게 첨가하고 배양 조건과 동일하게 약 1 시간 정도 반응시킨 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 3. 탯줄 줄기세포 분리방법에 따른 세포 회수율 및 증식능 비교

탯줄 외부의 혈액을 Ca² ⁺과 Mg² ⁺이 포함되지 않은 DPBS로 제거한 후, 외부 양막을 벗기고 동맥 2개를 제거한 뒤 다음과 같은 6가지 세포 분리 방법을 비교하였다.

(1) 조직에 콜라게나제 처리 후 10% FBS가 첨가된 배지에서 세포 배양: 혈액 제거한 조직을 1 mm³ 크기로 자른 후 200 U/ml의 Ι형 콜라게나제(collagenase type Ι)가 포함된 α-MEM을 5시간 처리하여 세포를 분리 한 후 100 U/ml의 페니실린, 0.1 μg/ml의 스트렙토마이신, 10% FBS가 포함된 α-MEM에 배양접시 1 cm² 당 2×10³개의 세포를 넣어 37℃ 온도에서 5%의 CO₂가 공급되는 배양기 내에서 배양하였다.

(2) 조직에 콜라게나제 처리 후 0.2 mg/ml의 UCE가 첨가된 배지에서 세포 배양: 혈액 제거한 조직을 1 mm³ 크기로 자른 후 200 U/ml의 Ι형 콜라게나제가 포함된 α-MEM을 5시간 처리하여 세포를 분리 한 후 100 U/ml의 페니실린, 0.1 μg/ml의 스트렙토마이신, 0.2 mg/ml UCE가 포함된 α-MEM을 넣은 콜라겐 코팅된 배양접시 1 cm² 당 2×10³개의 세포를 넣어 37℃ 온도에서 5%의 CO₂가 공급되는 배양기 내에서 배양하였다.

(3) 10% FBS가 첨가된 배지에서 조직 배양하고 콜라게나제 처리 후 10% FBS가 첨가된 배지에서 세포 배양: 혈액 제거한 조직을 1 mm³ 크기로 자른 후 100 U/ml의 페니실린, 0.1 μg/ml의 스트렙토마이신, 10%의 FBS가 포함된 α-MEM에 넣고 7일 동안 배양 후 바닥에 부착된 세포가 보이기 시작하면 200 U/ml의 Ι형 콜라게나제가 포함된 α-MEM을 4시간 처리하여 세포를 분리 하였다. 그 후 100 U/mL의 페니실린, 0.1 μg/ml의 스트렙토마이신, 10%의 FBS가 포함된 α-MEM에 배양접시 1 cm² 당 2×10³개의 세포를 넣어 넣고 37℃ 온도에서 5%의 CO₂가 공급되는 배양기 내에서 배양하였다.

(4) 0.2 mg/ml UCE가 첨가된 배지에서 조직 배양하고 콜라게나제 처리 후 0.2 mg/ml UCE가 첨가된 배지에서 세포 배양: 혈액 제거한 조직을 1 mm³ 크기로 자른 후 콜라겐 코팅된 디쉬에 넣어 100 U/ml의 페니실린, 0.1 μg/ml의 스트렙토마이신, 0.2 mg/ml UCE가 포함된 α-MEM에 넣고 7일 동안 배양 후 바닥에 부착된 세포가 보이기 시작하면 200 U/ml의 Ι형 콜라게나제가 포함된 α-MEM을 4시간 처리하여 세포를 분리하였다. 그 후 100 U/ml의 페니실린, 0.1 μg/ml의 스트렙토마이신, 0.2 mg/ml UCE 가 포함된 α-MEM을 넣은 콜라겐 코팅된 배양접시 1 cm² 당 2×10³개의 세포를 넣어 37℃ 온도에서 5%의 CO₂가 공급되는 배양기 내에서 배양하였다.

(5) 10% FBS가 첨가된 배지에서 조직 배양: 혈액 제거한 조직을 1 mm³ 크기로 자른 후 100U/ml의 페니실린, 0.1 μg/ml의 스트렙토마이신, 10%의 FBS 가 포함된 α-MEM에 넣은 후 37℃ 온도에서 5%의 CO₂가 공급되는 배양기 내에서 배양하였다.

(6) 0.2 mg/ml UCE가 첨가된 배지에서 조직 배양: 혈액 제거한 조직을 1 mm³ 크기로 자른 후 콜라겐이 코팅된 배양접시에 넣어 100 U/ml의 페니실린, 0.1 μg/ml의 스트렙토마이신, 0.2 mg/ml의 UCE가 포함된 α-MEM을 넣은 후 37℃ 온도에서 5%의 CO₂가 공급되는 배양기 내에서 배양하였다.

실시예 4. 탯줄 줄기세포의 특성 분석

분리된 세포의 특성을 분석하기 위해 유세포 분석법을 수행하였다. 유세포 분석을 위해 세포들을 PBS를 사용하여 세척 후 트립신-EDTA를 처리하여 단일 세포군으로 만든 뒤, 2% FBS가 함유된 PBS로 세척한다. 그 후 플루오레신 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate(FITC)) 또는 피코에리트린(phycoerythrin (PE))이 결합된 각각의 매트릭스 수용체(matrix receptors)(CD44, CD105), 인테그린(integrin)(CD29), PECAM (CD31), VCAM-1 (CD106), SH2 (CD105), SH3 및 SH4 (CD73), Thy-1 (CD90), 조혈 마커(hematopoietic marker)(CD14, CD34) 및 MHC 마커(HLA-DR, HLA-Class I)를 아이스에서 20분간 반응시킨 후, 유세포 분석기(FACSCalibur, Becton-Dickinson)를 통해 분석하였다.

Claims

포유류의 탯줄 추출물을 포함하고, 혈청을 포함하지 아니하는 포유류의 탯줄유래 줄기세포 분리 또는 배양용 배지 조성물.
제1항에 있어서, 상기 포유류는 인간, 돼지, 말, 소, 마우스(mouse), 라트(rat), 햄스터, 토기, 염소 및 양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 포유류의 탯줄유래 줄기세포 분리 또는 배양용 배지 조성물.
제1항에 있어서, 상기 포유류의 탯줄 추출물은 (i) 세절된 탯줄을 완충액에 넣어 교반하는 단계; 및 (ii) 상기 (i) 단계에서 얻은 용액의 상등액을 회수하는 단계를 포함하는 포유류의 탯줄 추출물 제조 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 포유류의 탯줄유래 줄기세포 분리 또는 배양용 배지 조성물.
(i) 포유류의 탯줄 추출물을 포함하고 혈청을 포함하지 아니하는 포유류의 탯줄유래 줄기세포 분리 또는 배양용 배지 조성물을 함유하며 세포 부착 단백질(cell adhesion protein)로 코팅된 용기에 혈액이 제거되고 세절된 포유류의 탯줄 조직을 넣어 배양하는 단계; 및
(ii) 상기 배양 후 줄기세포 분리 효소를 함유하는 배지로 처리하여 포유류의 탯줄유래 줄기세포를 분리하는 단계를 포함하는, 포유류의 탯줄로부터 줄기세포 분리 방법.
제4항에 있어서, 상기 포유류의 탯줄유래 추출물은 (i) 세절된 탯줄을 완충액에 넣어 교반하는 단계; 및 (ii) 상기 (i) 단계에서 얻은 용액의 상등액을 회수하는 단계를 포함하는 포유류의 탯줄 추출물 제조 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 포유류의 탯줄로부터 줄기세포 분리 방법.
제5항에 있어서, 상기 포유류는 인간, 돼지, 말, 소, 마우스(mouse), 라트(rat), 햄스터, 토기, 염소 및 양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 포유류의 탯줄로부터 줄기세포 분리 방법.
제4항에 있어서, 상기 세포 부착 단백질은 포유류 탯줄유래 콜라겐, 젤라틴(gelatin), 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin) 및 폴리-D-라이신(poly-D-lysin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 포유류의 탯줄로부터 줄기세포 분리 방법.
제7항에 있어서, 상기 포유류의 탯줄유래 콜라겐은 (i) 과산화수소로 처리된 포유류의 탯줄 조직을 분쇄하는 단계; (ii) 상기 분쇄된 탯줄 조직을 아세트산 및 펩신으로 처리한 후 원심분리하는 단계; (iii) 상기 원심분리에 의해 얻은 상등액의 pH를 7로 맞추고 NaCl을 첨가하여 콜라겐을 침전시키는 단계; 및 (iv) 상기 침전된 콜라겐을 분리하는 단계를 포함하는 포유류의 탯줄유래 콜라겐 제조 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 포유류의 탯줄로부터 줄기세포 분리 방법.
제8항에 있어서, 상기 포유류는 인간, 돼지, 말, 소, 마우스(mouse), 라트(rat), 햄스터, 토기, 염소 및 양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 포유류의 탯줄로부터 줄기세포 분리 방법.
제4항에 있어서, 상기 (ii) 단계는 상기 (i) 단계 개시 후 1일 내지 10일 후에 수행되는 것을 특징으로 하는 포유류의 탯줄로부터 줄기세포 분리 방법.
제4항에 있어서, 상기 (ii) 단계의 줄기세포 분리 효소는 콜라게나제인 것임을 특징으로 하는 포유류의 탯줄로부터 줄기세포 분리 방법.
제9항에 있어서, 상기 콜라게나제는 I형 콜라게나제이고, 상기 I형 콜라게나제가 180 U/ml 내지 220 U/ml 포함되며, 2시간 내지 6시간 동안 처리하는 것임을 특징으로 하는 포유류의 탯줄로부터 줄기세포 분리 방법.
포유류의 탯줄 추출물을 포함하고 혈청을 포함하지 아니하는 포유류의 탯줄유래 줄기세포 분리 또는 배양용 배지 조성물을 함유하며 세포 부착 단백질(cell adhesion protein)로 코팅된 용기에 포유류의 탯줄유래 줄기세포를 넣어 배양하는 단계를 포함하는 포유류의 탯줄유래 줄기세포 배양 방법.
제13항에 있어서, 상기 포유류의 탯줄유래 줄기세포는 제4항의 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 포유류의 탯줄유래 줄기세포의 배양 방법.
제13항에 있어서, 상기 포유류의 탯줄유래 추출물은 (i) 세절된 탯줄을 완충액에 넣어 교반하는 단계; 및 (ii) 상기 (i) 단계에서 얻은 용액의 상등액을 회수하는 단계를 포함하는 포유류의 탯줄 추출물 제조 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 포유류의 탯줄유래 줄기세포의 배양 방법.
제15항에 있어서, 상기 포유류는 인간, 돼지, 말, 소, 마우스(mouse), 라트(rat), 햄스터, 토기, 염소 및 양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 포유류의 탯줄유래 줄기세포의 배양 방법.
제13항에 있어서, 상기 세포 부착 단백질은 포유류 태반유래 콜라겐, 젤라틴(gelatin), 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin) 및 폴리-D-라이신(poly-D-lysin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 포유류의 탯줄유래 줄기세포의 배양 방법.
제17항에 있어서, 상기 포유류의 탯줄유래 콜라겐은 (i) 과산화수소로 처리된 포유류의 탯줄 조직을 분쇄하는 단계; (ii) 상기 분쇄된 탯줄 조직을 아세트산 및 펩신으로 처리한 후 원심분리하는 단계; (iii) 상기 원심분리에 의해 얻은 상등액의 pH를 7로 맞추고 NaCl을 첨가하여 콜라겐을 침전시키는 단계; 및 (iv) 상기 침전된 콜라겐을 분리하는 단계를 포함하는 포유류의 탯줄유래 콜라겐 제조 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 포유류의 탯줄유래 줄기세포의 배양 방법.
제18항에 있어서, 상기 포유류는 인간, 돼지, 말, 소, 마우스(mouse), 라트(rat), 햄스터, 토기, 염소 및 양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 포유류의 탯줄유래 줄기세포의 배양 방법.