KR20190141234A - 간엽계 줄기세포의 제조 방법, 간엽계 줄기세포의 치료 효과 마커, 치료 효과 판정 방법, 및 간엽계 줄기세포를 포함하는 세포 제제 - Google Patents

간엽계 줄기세포의 제조 방법, 간엽계 줄기세포의 치료 효과 마커, 치료 효과 판정 방법, 및 간엽계 줄기세포를 포함하는 세포 제제 Download PDF

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미네코 후지미야
유키 사이토
마사코 나카노
미호 오타니
유카 미즈에
타카시 마츠무라
코즈에 카미야
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훗카이도 코리츠 다이가쿠 호진 삿포르 이카 다이가쿠
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Abstract

본 발명은 치료 효과가 높은 MSC를 포함한 세포 제제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖는 세포 배양 담체를 이용하여 포유류의 태아 부속물 유래의 활성화제를 포함하는 배지에서 MSC를 배양하는 단계를 포함하는 활성된 MSC의 제조 방법이 제공된다. 또한 p16ink4a, p14ARF, CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 MSC의 치료 효과 마커와 같은 마커를 이용한 치료 효과 판정 방법, 치료 효과를 높이기 위한 처리에 대한 MSC의 적응성 판정 방법, MSC를 포함하는 세포 제제 및 이의 제조 방법도 제공된다.

Description

간엽계 줄기세포의 제조 방법, 간엽계 줄기세포의 치료 효과 마커, 치료 효과 판정 방법, 및 간엽계 줄기세포를 포함하는 세포 제제
본 발명은 간엽계 줄기세포의 제조 방법, 간엽계 줄기세포의 치료 효과를 평가하기 위한 마커, 간엽계 줄기세포의 치료 효과를 판정하는 방법, 치료 효과를 높이기 위한 처리에 대한 간엽계 줄기세포의 적응성을 확인하는 방법 및 간엽계 줄기세포를 포함하는 세포 제제에 관한 것이다.
간엽계 줄기세포(mesenchymal stem cell, 이하 MSC라고도 함)는 분화능과 자기 복제 능력을 갖는 줄기세포이며, 조골세포, 연골세포, 지방세포, 근육세포 등 간엽계에 속하는 세포로 분화할 뿐만 아니라, 신경세포나 간세포 등에도 배엽을 넘어 분화하는 능력을 가진다. 또한 MSC는 자신이 생산하는 액체 인자에 의한 파라클라인 효과 및 세포 접착 상호 작용도 있는 것으로 알려져 있다. MSC는 이러한 작용에 따라 표적 조직이나 세포의 복구, 재생 기능 및 항염증 등의 면역 제어 기능을 발휘하고 그 결과 다양한 질환에 대한 치료 효과를 나타내는 것으로 생각되고 있다.
MSC는 분리 배양이 쉽고 증식 능력이 왕성하고 단기간에 이식 가능한 세포 수를 확보할 수 있으며, 면역 거부 없는 자가 이식이 가능하고, 윤리적 문제도 적으며, 낮은 면역원성에 의해 전 처치를 필요로 하지 않고 동종 이식이 현실적인 점 등에서 이상적인 세포 이식 치료의 재료로서 다양한 질환에 대한 치료에의 응용의 검토가 진행되고 있다.
본 발명자들은 MSC를 이용한 세포 이식 요법을 확립하는 과정에서 환자, 예를 들면 당뇨병 환자의 MSC가 구체적으로는 전술한 바와 같은 다양한 능력을 상실하거나 또는 이들의 능력이 정상적인 MSC과 비교해서 감소한 결과로서, 질병 치료 효과를 잃거나 또는 치료 효과가 정상적인 MSC와 비교하여 감소한 비정상적인 MSC임을 확인하였고, 포유 동물의 태아 부속물의 추출물이 상기 이상한 MSC를 활성화하여 치료 효과를 회복시킬 수 있고 이러한 활성화된 MSC를 이용한 자가 이식 치료가 가능하다는 것 등을 확인하여 포유 동물의 태아 부속물의 추출물을 유효 성분으로 함유하는 이상한 MSC에 대한 활성화제를 발명, 특허 출원하였다(특허문헌 1). 이 활성화제는 특히 치료가 필요해진 단계의 환자에 대해서도 MSC의 자가이식을 가능하게 한다는 점에서 중요한 의의를 갖는다.
특허문헌 1에 기재된 비정상 MSC에 대한 활성화제는 포유 동물의 태아 부속물, 예를 들면 인간의 탯줄 조직과 태반 조직에서 추출물로 제조할 수 있다. 다행히도 인간을 포함한 포유 동물의 태아 부속물은 비교적 입수가 용이하고 일정한 공급량도 예상할 수 있는 생물학적 시료이다. 그러나 MSC를 이용한 세포 이식 요법의 적용이 바람직한 환자, 예를 들어 세계적으로 증가 일로를 걷고 있는 많은 당뇨병 환자에 대해 MSC의 자가 이식을 가능하게 하려면 포유 동물의 태아 부속물 및 이로부터 추출되는 활성화제의 공급량은 충분하다고는 말하기 어렵다.
국제공개공보 WO 2015/137419호
본 발명자들의 연구에 의해 활성화제는 비정상적인 MSC뿐만 아니라 정상인의 MSC의 치료 효과도 높일 수 있고, 한편으로 활성화제로 처리해도 치료 효과의 상승이 거의 인정되지 않는 MSC가 있다는 것 등이 밝혀졌다. 전술한 바와 같이, 포유동물의 태아 부속물로부터의 추출물을 유효 성분으로 함유하는 활성화제는 유효 이용이 요구되는 중요한 물질이며, 치료 효과의 상승이 거의 인정되지 않는 MSC에 사용하는 것은 결과적인 일에도 바람직하지 않다. 또한 활성화제로 처리해도 치료 효과의 상승이 인정되지 않는 MSC는 환자에게 투여하여도 그 효과를 기대할 수 없으므로 투여 전에 그 활성을 확인하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명은 포유동물의 태아 부속물로부터의 추출물을 유효성분으로 함유하는 활성화제를 이용한 활성화된 MSC의 제조에 있어서 보다 효율적으로 MSC를 활성시키는 수단을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 또한 MSC의 치료 효과를 평가하는 방법을 제공하는 것, 대상으로부터 분리된 MSC가 활성화제의 처리 등의 치료 효과를 높이는 것을 의도한 처리에 적합한지 여부를 판정하는 방법을 제공하는 것 및 치료 효과가 높은 MSC를 포함한 세포 제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖는 세포 배양 담체 상에서 비정상적인 MSC를 활성화함으로써 보다 소량의 활성화제에서 더 치료 효과가 높은 활성된 MSC를 제조할 수 있는 것, 및 상기 세포 배양 담체 상에서 활성화제의 존재 하에서 배양함으로써 정상적인 MSC도 활성하게 된 것을 발견했다. 또한 본 발명자들은 치료 효과가 높은 MSC의 유전자 발현 프로파일을 분석하고 특정 유전자 발현 변화를 발견했다. 아래의 각 발명은 이러한 지견에 기초하여 완성된 것이다.
(1) 포유동물의 태아 부속물로부터의 추출물을 유효 성분으로 함유하는 활성화제로 MSC를 처리하는 활성화 단계를 포함하되, 활성화 단계는 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖는 세포 배양 담체를 사용하여 상기 활성화제를 포함하는 배지에서 MSC을 배양하는 단계인, 활성화된 MSC의 제조 방법.
(2) 상기 (1)에 있어서, 상기 세포 배양 담체가 나노미터 내지 마이크로미터 단위의 평균 섬유 직경을 갖는 섬유에 의해 세포와의 접촉면에 형성된 개구부를 갖는 것인, 기재된 제조 방법.
(3) 상기 (2)에 있어서, 상기 개구부의 평균 직경이 500 ㎚ 내지 1000 ㎛인, 제조 방법.
(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 배양 담체가 생분해성 고분자로 이루어진 나노섬유를 함유하는 것인, 제조 방법.
(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 배지의 활성화제의 농도는 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖지 않는 세포 배양 담체를 사용하여 MSC를 배양하는 활성화 단계에서 배지 중의 활성화제 농도의 1/10 내지 1/100000인 것인, 제조방법.
(6) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 배지의 활성화제의 농도는 단백질 환산으로 0.01 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖인 것인, 제조방법.
(7) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 활성화 단계에서의 세포의 계대 횟수가 2회 이하인, 제조방법.
(8) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 있어서, MSC는 골수 유래 MSC인 것인, 제조방법.
(9) 상기 (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, MSC가 질환 대상에서 분리된 MSC인 것인, 제조방법.
(10) CD47 양성 세포의 비율이 2% 이하인 MSC를 포함하는 세포 제제.
(11) 상기 (10)에 있어서, MSC가 상기 (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 제조되는 것인, 세포 제제.
(12) MSC 집단 속에서 CD47 음성의 MSC를 농축하는 단계를 포함하는 MSC를 포함한 세포 제제의 제조 방법.
(13) p16ink4a 및 p14ARF로 이루어진 군에서 선택되는 MSC의 치료 효과와 직접 연관되는 MSC의 치료 효과 평가를 위한 마커.
(14) CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 MSC의 치료 효과와 부정적으로 연관되는 MSC의 치료 효과 평가를 위한 마커.
(15) 피험 MSC에서 p16ink4a, p14ARF, CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량을 측정하는 측정 단계, 측정된 발현량을 대조 MSC의 발현량과 비교하는 비교 단계, 및 p16ink4a 및 p14ARF 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 대조 MSC보다 피험 MSC에서 많은 경우 및/또는 CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 대조 MSC보다 피험 MSC에서 적은 경우, 피험 MSC는 대조 MSC보다 치료 효과가 더 높다고 판정하는 판정 단계를 포함하는, MSC의 치료 효과를 판정하는 방법.
(16) 상기 (15)에 있어서, 상기 피험 MSC의 측정 단계는
(A) DNMT1, Nanog, SOX2, OCT4, IDO, TSG6, IL-6 및 TERT로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질, 및/또는
(B) p53 및 α-SMA로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량을 측정하는 것을 추가로 포함하고,
상기 판정 단계는 p16ink4a 및 p14ARF 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 대조 MSC보다 피험 MSC에서 많은 경우 및/또는 CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 대조 MSC보다 피험 MSC에서 적은 경우에 더하여,
상기 (A) 유전자 또는 단백질의 발현량이 대조 MSC보다 피험 MSC에서 많은 경우 및/또는 상기 (B)의 유전자 또는 단백질의 발현량이 대조 MSC보다 피험 MSC에서 적은 경우, 피험 MSC는 대조 MSC보다 치료 효과가 높다고 판정하는 것인, MSC의 치료 효과를 판정하는 방법.
(17) 상기 (15) 또는 (16)에 있어서, 상기 방법은 측정 단계에서 CD47 유전자 또는 단백질의 발현량에 대신하여 MSC 중의 CD47 양성세포의 비율을 측정하고, 판정 단계는 CD47 유전자 또는 단백질의 발현량이 대조 MSC보다 피험 MSC에서 적은 것으로 대신하고 MSC 중에서 CD47 양성세포의 비율이 대조 MSC보다 피험 MSC에서 낮은 경우 피험 MSC는 대조 MSC보다 치료 효과가 높다고 판정하는 것인, MSC의 치료 효과를 판정하는 방법.
(18) 상기 (15) 내지 (17) 중 어느 하나에 있어서, 상기 피험 MSC가 포유동물의 태아 부속물로부터의 추출물을 유효성분으로 함유하는 활성화제를 포함하는 배지에서 배양된 MSC인 것인, MSC의 치료 효과를 판정하는 방법.
(19) 상기 (15) 내지 (18) 중 어느 하나에 있어서, 상기 피험 MSC가 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖는 세포 배양 담체를 이용하여 배양된 MSC인 것인, MSC의 치료 효과를 판정하는 방법.
(20) 상기 (15) 내지 (19) 중 어느 하나에 있어서, 상기 피험 MSC가 MSC의 자가이식요법을 받으려는 대상에서 분리된 MSC인 것인, MSC의 치료 효과를 판정하는 방법.
(21) 상기 (15) 내지 (20) 중 어느 하나에 있어서, 상기 피험 MSC가 골수 유래 MSC인 것인, MSC의 치료 효과를 판정하는 방법.
(22) 처리된 MSC에서 p16ink4a, p14ARF, CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량을 측정하는 측정 단계, 측정된 발현량을 미처리 MSC의 발현량과 비교하는 비교 단계, 및 p16ink4a 및 p14ARF로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 미처리 MSC보다 처리된 MSC에서 많은 경우 및/또는 CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 미처리 MSC보다 처리된 MSC에서 적은 경우 해당 MSC는 당해 처리에 적합하다고 판정하는 판정 단계를 포함하는 MSC의 치료 효과를 높이기 위한 처리에 대한 MSC의 적응성을 확인하는 방법.
(23) 상기 (22)에 있어서, 상기 처리된 MSC와 미처리 MSC의 각각의 측정 단계는
(A) DNMT1, Nanog, SOX2, OCT4, IDO, TSG6, IL-6 및 TERT로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질, 및/또는
(B) p53 및 α-SMA로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량을 측정하는 것을 추가로 포함하고,
판정 단계는 p16ink4a 및 p14ARF로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 미처리 MSC보다 처리된 MSC에서 많은 경우 및/또는 CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 미처리 MSC보다 처리된 MSC에서 적은 경우에 더하여, 상기 (A) 유전자 또는 단백질의 발현량이 미처리 MSC보다 처리된 MSC에서 많은 경우 및/또는 상기 (B)의 유전자 또는 단백질의 발현량이 미처리 MSC보다 처리된 MSC에서 적은 경우에 해당 MSC는 당해 처리에 적합하다고 판정하는 것인, MSC의 치료 효과를 높이기 위한 처리에 대한 MSC의 적응성을 확인하는 방법.
(24) 상기 (22) 또는 (23)에 있어서, 상기 측정 단계는 CD47 유전자 또는 단백질의 발현량 대신 MSC 중의 CD47 양성세포의 비율을 측정하고, 판정 단계는 CD47 유전자 또는 단백질의 발현량이 미처리 MSC보다 처리된 MSC에서 적은 것에 대신하여 MSC 중의 CD47 양성세포의 비율이 미처리 MSC보다 처리된 MSC에서 낮은 경우에 해당 MSC는 당해 처리에 적합하다고 판정하는 것인, MSC의 치료 효과를 높이기 위한 처리에 대한 MSC의 적응성을 확인하는 방법.
(25) 상기 (22) 내지 (24) 중 어느 하나에 있어서, 상기 처리가 포유동물의 태아 부속물로부터의 추출물을 유효성분으로 함유하는 활성화제를 포함하는 배지에서 MSC를 배양하는 과정인 것인, MSC의 치료 효과를 높이기 위한 처리에 대한 MSC의 적응성을 확인하는 방법.
(26) 상기 (22) 내지 (25) 중 어느 하나에 있어서, 상기 처리가 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖는 세포 배양 담체를 이용하여 MSC를 배양하는 과정인 것인, MSC의 치료 효과를 높이기 위한 처리에 대한 MSC의 적응성을 확인하는 방법.
(27) 상기 (22) 내지 (26) 중 어느 하나에 있어서, 상기 MSC는 MSC의 자가 이식 요법을 받으려는 대상으로부터 분리된 MSC인 것인, MSC의 치료 효과를 높이기 위한 처리에 대한 MSC의 적응성을 확인하는 방법.
(28) 상기 (22) 내지 (27) 중 어느 하나에 있어서, 상기 MSC는 골수 유래 MSC인 것인, MSC의 치료 효과를 높이기 위한 처리에 대한 MSC의 적응성을 확인하는 방법.
본 발명의 MSC 제조 방법에 의하면, MSC의 활성화를 종래보다 훨씬 적은 양의 활성화제를 이용해 실시할 수 있어 귀중한 활성화제의 소비량을 절약할 수 있게 된다. 또한 해당 제조 방법으로 제조할 수 있는 본 발명의 세포 제제는 높은 치료 효과를 가지고 있어 치료 등에 필요한 세포 수를 줄일 수 있게 된다. 투여 세포수의 감소는 세포 배양의 계대 횟수의 감소로 이어져 세포 제제의 제조에 필요한 기간 단축 및 비용 절감이라는 효과를 가져온다. 또한, 본 발명의 치료 효과 마커 및 판정 방법에 의하면, MSC의 치료 효과를 대상으로 투여하기 전에 판정할 수 있다. 또한, 본 발명의 적응성 판정 방법에 의하면, 활성화 처리 등의 처리에 대한 MSC의 적응성을 치료에 필요한 양의 MSC를 준비하기 전에 판정할 수 있다.
도 1은 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖는 세포 배양 담체(이하, 3차원 배양 담체라고도 함)에서 활성화제의 존재 하에서 배양한 변형성 고관절증 환자 MSC (이하, OA-MSC)의 유전자 발현 프로파일을 클러스터 분석한 결과를 나타낸다.
도 2는 기존의 2차원 구조의 세포 배양 담체(이하, 2차원 배양 담체)에서 활성화제의 존재 하에서 배양한 OA-MSC 및 3차원 배양 담체에서 활성화제의 존재 하에서 배양한 OA-MSC의 마커 유전자의 상대적 발현량을 2차원 배양 담체에서 활성화제의 부재 하에서 배양한 OA-MSC와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 3차원 배양 담체에서 배양한 OA-MSC 및 2차원 배양 담체에서 배양한 OA-MSC의 모양을 나타내는 전자 현미경 관찰 사진이다. 좌측 상단이 활성화제를 첨가하지 않고 3차원 배양 담체에서 배양한 OA-MSC (배율 600배), 우측 상단이 활성화제를 첨가하여 3차원 배양 담체에서 배양한 OA-MSC (배율 200배), 좌측 하단이 활성화제를 첨가하지 않고 2차원 배양 담체에서 배양한 OA-MSC (배율 700배), 우측 하단이 활성화제를 첨가하여 2차원 배양 담체에서 배양한 OA-MSC (배율 500배)에 대응한다.
도 4는 3차원 배양 담체에서 배양한 OA-MSC 및 2차원 배양 담체에서 배양한 OA-MSC의 모양을 나타내는 고배율 전자 현미경 관찰 사진이다. 좌측 상단이 활성화제를 첨가하지 않고 3차원 배양 담체에서 배양한 OA-MSC (배율 3500배), 우측 상단이 활성화제를 첨가하여 3차원 배양 담체에서 배양한 OA-MSC (배율 2500배), 좌측 하단이 활성화제를 첨가하지 않고 2차원 배양 담체에서 배양한 OA-MSC (배율 7000배), 우측 하단이 활성화제를 첨가하여 2차원 배양 담체에서 배양한 OA-MSC (배율 8000배)에 대응한다.
도 5는 비교예의 세포 배양 담체 또는 다른 3차원 배양 담체에서 활성화제의 존재 하에서 배양한 OA-MSC의 유전자 발현 프로파일을 3차원 배양 담체의 그것과 함께 클러스터 분석한 결과를 나타낸다.
도 6은 다른 3차원 배양 담체에서 활성화제를 첨가하여 배양한 OA-MSC의 모양을 나타내는 전자 현미경 관찰 사진 (배율 3500배)이다.
도 7은 2차원 배양 담체에서 활성화제의 존재 하에서 배양한 정상인 MSC 및 3차원 배양 담체에서 활성화제의 존재 하에서 배양한 정상인 MSC의 OCT4, SOX2 및 TSG-6 유전자의 상대적 발현량을 2차원 배양 담체에서 활성화제의 부존재 하에서 배양한 정상인 MSC와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 활성화제로 처리된 OA-MSC를 투여한 피부 결손 모델 랫트의 피부 절제 후 3일차와 7일차의 잔존 결손 면적을 나타내는 그래프이다.
도 9는 활성화제로 처리된 OA-MSC를 투여한 피부 결손 모델 랫트의 피부 절제 7일 후 피부 결손 부분을 나타내는 사진이다.
도 10은 활성화제로 처리된 OA-MSC를 투여한 피부 결손 모델 랫트의 피부 절제 21일 후 피부 조직의 파단 응력을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 활성화제로 처리된 OA-MSC를 투여한 알츠하이머 모델 랫트의 모리스 물 미로 학습 테스트의 결과를 나타내는 그래프이다. 세로축의 회피 지연(Escape latency)은 마우스가 풀 내에 놓인 플랫폼에 도달할 때까지의 시간, 가로축은 학습 테스트 시작부터의 날짜를 나타낸다.
도 12는 활성화제로 처리된 OA-MSC를 투여한 알츠하이머 모델 랫트의 모리스 물 미로에서 기억 테스트의 결과를 나타내는 그래프이다. 세로축의 4분면 시간(Time in quadrant)는 학습 과정에서 총 유영 시간에 대한 플랫폼이 있던 4분면 영역에서 유영한 시간의 비율을 나타낸다.
도 13은 항암제 처치 후 활성화제로 처리된 OA-MSC를 이식한 당뇨병성 신장증 랫트의 혈청 크레아티닌의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 14는 항암제 처치 후 활성화제로 처리된 OA-MSC를 이식한 당뇨병성 신장증 랫트의 이식 후 11주까지의 생존율 추이를 나타내는 그래프이다. 굵은 선은 각 군의 평균치를, 가는 선은 각 군의 95% CI(신뢰 구간)를 나타낸다.
도 15는 OA-MSC(n=10)의 유전자 발현 프로파일을 클러스터 분석한 결과를 나타낸다.
도 16은 OA-MSC (n=10)의 유전자 발현 프로파일을 클러스터 분석한 결과를 나타낸다.
도 17은 활성화제로 처리된 OA-MSC의 유전자 발현량을 미처리 MSC와 비교하여 산출한 OCT4, SOX2, NANOG, IDO 및 TSG6 각각의 상대적 발현량과 p16ink4a의 상대적 발현량과의 상관 관계를 나타낸다.
도 18은 활성화제로 처리된 OA-MSC의 유전자 발현량을 미처리 MSC와 비교하여 산출한 p14ARF의 상대적 발현량과 p16ink4a의 상대적 발현량과의 상관 관계를 나타낸다.
도 19는 OA-MSC (BM-021, BM-022, BM-023)에서의 OCT4, p16ink4a 및 RB 유전자의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다. 도면에서 활성화제로 처리된 OA-MSC는 PE+ 또는 PE+MSC로, 미처리 OA-MSC는 PE- 또는 PE-MSC로 표시한다(이하 도면에서도 동일함).
도 20은 3차원 배양 담체에서 활성화제로 처리된 OA-MSC (BM-010)에서의 OCT4, SOX2 및 p16ink4a 유전자의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 21은 3차원 배양 담체에서 활성화제로 처리된 류마티스 관절염 환자의 MSC(RA), 고령자 MSC(Aged), 간경변 환자 MSC 및 청년 MSC(Young) 각각의 CD47 유전자의 상대적인 발현량을 2차원 배양 담체에서 활성화제의 부재 하에서 배양한 MSC와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 22는 미처리 청년 MSC 및 고령자 MSC 각각의 세포 표면의 CD47 발현량을 나타내는 히스토그램이다.
도 23은 3차원 배양 담체에서 활성화제로 처리된 청년 MSC 및 고령자 MSC 각각의 세포 표면의 CD47 발현량을 나타내는 히스토그램이다.
도 24는 OA-MSC (BM-008, BM-021, BM-005)의 p16ink4a 유전자의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 25는 OA-MSC (BM-008, BM-021, BM-005)와 함께 배양한 RAW264.7 세포의 탐식 능력을 나타내는 그래프이다.
도 26은 OA-MSC (BM-008, BM-021, BM-005)와 함께 배양한 RAW264.7 세포에서 Fpr2 (Formyl Peptide Receptor-2) 유전자의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 27은 OA-MSC (BM-021)에서 OCT4, SOX2 및 p16ink4a 유전자의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 28은 활성화제로 처리 또는 미처리된 OA-MSC (BM-021) 또는 PBS를 국소 투여한 다발성 근염 모델 랫트에서 죽은 세포를 제외한 단핵 세포의 총수에 대한 총 대식세포(MΦ), M1 대식세포 및 M2 대식세포의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 29는 활성화제로 처리 또는 미처리된 OA-MSC (BM-021)를 국소 투여한 다발성 근염 모델 랫트의 후지 근육 기능을 나타내는 그래프이다.
도 30은 OA-MSC (BM-008)에서 OCT4, SOX2 및 p16ink4a 유전자의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 31은 활성화제로 처리 또는 미처리된 OA-MSC (BM-008) 또는 PBS를 전신 투여한 다발성 근염 모델 랫트의 근육 기능을 나타내는 그래프이다.
도 32는 활성화제로 처리 또는 미처리된 OA-MSC (BM-008) 또는 PBS를 전신 투여한 다발성 근염 모델 랫트의 근육 조직의 HE 염색 이미지이다.
도 33은 활성화제로 처리 또는 미처리된 OA-MSC (BM-008) 또는 PBS를 전신 투여한 다발성 근염 모델 랫트의 힘줄 단면적을 나타낸다.
도 34는 2차원 배양 담체 또는 3차원 배양 담체에서 활성화제로 처리된 OA-MSC(BM-021)의 OCT4, SOX2 및 p16ink4a 유전자의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 35는 항암제 처치 후의 당뇨병성 신장증 랫트에 이식된 활성화제 처리된 OA-MSC에서 OCT4, SOX2, NANOG, p16ink4a, p14ARF, IDO, α-SMA 및 TERT 각각의 유전자의 상대적 발현량을 2차원 배양 담체에서 활성화제의 부재 하에서 배양한 MSC의 그것과 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 36은 3차원 배양 담체에서 활성화제로 처리한 CDKN2A 녹아웃 OA-MSC에서 p16ink4a의 발현을 나타내는 이미지이다.
도 37은 3차원 배양 담체에서 활성화제로 처리한 CDKN2A 녹아웃 OA-MSC를 하퇴 삼두근에 국소 투여한 다발성 근염 모델 랫트의 근육 조직의 라미닌 염색 이미지(좌) 및 근단 면적을 나타내는 이미지(우)이다.
도 38은 CD47을 과다 발현시킨 OA-MSC를 투여한 피부 결손 모델 랫트의 피부 절제 후 3일차부터 9일차의 창상 면적 변화량을 나타내는 그래프(좌) 및 피부 절제 후 9일차 피부 결손 부분의 대표적 사진(우)이다.
도 39는 CD47 양성세포의 비율이 상이한 2종의 OA-MSC를 투여한 알츠하이머 모델 랫트의 모리스 물 미로 학습 시험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 40은 CD47 양성세포의 비율이 상이한 2종의 OA-MSC를 투여한 알츠하이머 모델 랫트의 모리스 물 미로에서 기억 시험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 41은 추출 방법이 상이한 별도의 활성화제의 존재 하에서 2차원 배양 담체 또는 3차원 배양 담체에 배양한 OA-MSC 및 활성화제의 부재 하에서 3차원 배양 담체에 배양한 OA-MSC에서 OCT4, SOX2 및 TSG-6 유전자의 상대적 발현량을 2차원 배양 담체에서 활성화제의 부재 하에서 배양한 정상인 MSC와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 42는 추출 방법이 상이한 별도의 활성화제의 존재 하에서 2차원 배양 담체 또는 3차원 배양 담체에 배양한 OA-MSC 및 활성화제의 부재 하에서 3차원 배양 담체에 배양한 OA-MSC에서 p16ink4a 유전자의 상대적 발현량을 2차원 배양 담체에서 활성화제의 부재 하에서 배양한 정상인 MSC와 비교하여 나타낸 그래프이다.
활성된 MSC의 제조 방법
본 발명의 제1 양태는 포유동물의 태아 부속물로부터의 추출물을 유효성분으로 함유하는 활성화제로 MSC를 처리하는 활성화 단계를 포함하는 활성된 MSC의 제조 방법으로, 상기 제조 방법에서 활성화 단계는 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖는 세포 배양 담체를 사용하여 상기 활성화제를 포함하는 배지에서 MSC를 배양하는 단계이다.
본 발명에서 사용되는 MSC는 정상인 대상에서 분리된 MSC이거나 질환을 가진 대상으로부터 분리된 MSC라도 좋다. 또한, 본 발명에서 사용되는 MSC는 유도 만능 줄기세포 (iPS 세포), 배아 줄기세포 (ES 세포), 배아 종양세포 (EC 세포), 배아 생식 줄기세포 (EG 세포) 등의 다능성 줄기 세포에서 분화를 유도하여 얻어진 것이어도 좋다.
본 명세서에서 용어 "대상", "질환 대상에서 분리된 MSC" 및 "포유동물의 태아 부속물의 추출물"은 모두 특허문헌 1인 국제공개 WO2015/137419호 문헌 및 이에 대응하는 미국 출원인 미국 특허 출원 공개 US2017/0071984호 공보에 기재된 각 용어와 같은 의미를 갖는 것으로 해석된다. 이러한 문헌은 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함되지만, 이러한 문헌 및 본 명세서에서 있어서의 각 용어의 의미를 간략히 다음과 같다.
"대상"이란 MSC를 갖는 임의의 동물을 의미하며, 바람직하게는 포유동물의 개체, 예를 들어, 인간, 침팬지 등의 영장류, 랫트, 랫트, 기니피그, 햄스터 등의 설치류, 소, 염소, 양, 돼지 등 우제목, 말 등의 기제목, 토끼, 개, 고양이 등의 개체이며, 더욱 바람직하게는 인간 개체이다.
특허문헌 1에 기재되어 있는 바와 같이, 특정 질환이 있는 개체 및 노화된 개체의 MSC는 정상인의 MSC와 비교하여 치료 효과가 낮은 것으로 알려져 있으며, 이러한 개체에 자기 MSC를 그대로 이식하여 높은 치료 효과는 기대할 수 없다. 한편, 제1 양태의 제조 방법에 따르면, 이러한 치료 효과가 낮은 MSC도 활성하게 하여 치료 효과를 높일 수 있다. 치료 효과가 낮은 MSC를 갖는 대상이 앓고 있는 질환은 만성 질환이며, 그 예는 특허문헌 1에 MSC가 이상적인 질환으로 기재되어 있다.
MSC는 그 후의 세포 이식 요법에 있어서의 안전성을 고려하면 세포를 투여하는 개체와 동종 또는 근연종의 개체에서 채취하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 인간 개체에 세포 이식을 실시하는 경우, 바람직하게는 동종인 사람에서 채취된 세포, 보다 바람직하게는 투여를 받는 동일한 인간 개체에서 채취된 세포, 즉 자기 MSC가 사용된다.
본 발명에서 사용되는 MSC는 개체의 골수액, 지방 조직, 태아 부속 조직, 치수 등의 시료에서 일반적인 방법으로 채취할 수 있다. 예를 들어, 시료로 골수액을 사용하는 경우, 밀도 구배 원심법, 골수 파종법 등의 공지의 방법에 의해 MSC를 분리하는 것이 가능하다. 본 발명의 바람직한 실시양태 중 하나에서 MSC는 골수 유래의 MSC이다.
"포유동물의 태아 부속물의 추출물"은 포유동물, 바람직하게는 인간의 태아 만출 후에 후산으로 모체로부터 만출되거나 또는 제왕 절개에 의해 모체로부터 적출된 태아 부속물, 바람직하게는 탯줄 조직, 태반 조직 또는 난막을 그대로 또는 절단 또는 파쇄하고, 증류수, 생리 식염수, 인산 완충 생리 식염수, 세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지 등의 추출 매체에 침지하는 등의 방법으로 제조된 추출물이다. 추출물은 특히 기증자인 포유동물 유래의 증식 능력을 갖는 세포를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 구체적인 추출 조작 및 조건은 특허문헌 1에 기재된 조작 및 조건에 따르면 된다.
또한, "포유동물의 태아 부속물의 추출물"은 태아 부속물, 일반적으로 태반에서 생리 활성 물질을 추출할 때 당업자가 통상적으로 사용하는 처리, 예를 들어 산이나 효소를 이용한 가수분해 등의 처리를 태아 부속물에 실시하는 것에 의해서도 제조할 수 있다. 이러한 추출물의 예는 메루스몬 제약 회사에서 판매되고 있는 인간 태반 추출물 "메루스몬", 주식회사 일본 생물 제제에서 판매되고 있는 인간 태반 추출물 "라엔넥크(ラエンネック)", 기타 시판 태반 제제 및 태반 추출물이라 불리는 다양한 상용 제품이다.
본 발명에 있어서, "포유동물의 태아 부속물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 활성화제"는 전술한 추출물을 유효성분으로 함유하는 MSC의 치료 효과를 증대시키기 위한 제제를 말하며, 이하 이를 "활성화제"라 한다. 여기서 "활성화"란 어떠한 처리를 받은 MSC가 미처리된 경우에 비해 더 높은 치료 효과를 나타내게 되는 것을 의미한다.
제1 양태의 제조 방법에 있어서, 활성화 단계는 시험관 내에서 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖는 세포 배양 담체를 사용하여 상기 활성화제를 포함하는 배지에서 MSC를 배양하여 이루어진다. 구체적으로는 3차원 배양 담체를 발판으로 사용하고 활성화제의 존재 하에서 MSC를 배양함으로써 이루어진다.
바람직한 실시 양태에서, 3차원 배양 담체는 나노미터(㎚) 내지 마이크로미터(㎛) 단위의 평균 섬유 직경을 갖는 섬유로 이루어진다. 여기서 "평균 섬유 직경"은 배양 담체를 세포 접착면 측에서, 일반적으로는 위에서 관찰했을 때 섬유의 길이 방향에 직교하는 방향의 길이로 측정되는 섬유 직경의 산술 평균을 말한다. 더욱 바람직한 실시 양태에서, 3차원 배양 담체는 나노미터(㎚) 내지 마이크로미터(㎛) 단위의 평균 섬유 직경을 갖는 섬유에 의해 세포와 접촉하는 면에 형성된 개구부를 가진다. 여기서 "개구부"는 상기 섬유에 의해 형성되는 담체와 세포와의 접촉면에 있는 홈을 말한다. 덧붙여 특별히 지정이 없는 한, 본 명세서에 있어서의 평균이란 수 평균을 의미한다.
개구부의 평균 직경은 섬유끼리 접하고 있는 경우는 배양 담체를 위에서 관찰했을 때 인정되는 섬유를 윤곽으로 한 도형의 지름의 평균값을 말한다. 도형의 지름과 모양이 다각형인 경우 각 정점에서의 대각선 길이의 산술 평균에, 모양이 원형인 경우는 그 직경에, 모양이 타원형 또는 이와 유사한 형상의 경우는 그 장경에 해당한다.
또한 섬유끼리 접해 있지 않은 경우, 개구부의 평균 직경은 ASTM-F316에 규정된 방법으로 얻어지는 평균 유량 공경이 바람직하며, 이것은 예를 들어 폴로미터 (콜타르사제 등)를 사용하여 민플로포인트법에 의해 측정할 수 있다.
3차원 배양 담체를 구성하는 섬유의 평균 섬유 직경은 ㎚ ~ ㎛ 단위의 범위 내에, 바람직하게는 10 ㎚ ~ 500 ㎛, 보다 바람직하게는 10 ㎚ ~ 300 ㎛의 범위 내에 있을 수 있다. 특정 실시 양태에서, 평균 섬유 직경은, 예를 들어 10 ㎚ ~ 1 ㎛, 100 ㎚ ~ 1 ㎛, 500 ㎚ ~ 1 ㎛, 1 ㎛ ~ 10 ㎛, 1 ㎛ ~ 100 ㎛, 1 ㎛ ~ 300 ㎛ 또는 1 ㎛ ~ 500 ㎛의 범위 내에서, 바람직하게는 10nm ~ 1 ㎛, 1 ㎛ ~ 10 ㎛ 또는 10 ㎛ ~ 300 ㎛ 중 하나의 범위 내에 있으면 좋다. 본 발명은 일반적으로 나노섬유라고 불리는 섬유를 사용할 수도 있다.
세포의 접착면에 개구부를 갖는 3차원 배양 담체에서 개구부의 평균 직경은 500 ㎚ ~ 1000 ㎛이면 되고, 바람직하게는 700 ㎚ ~ 600 ㎛, 보다 바람직하게는 900 ㎚ ~ 400 ㎛의 범위 내에 있을 수 있다. 특정 실시 양태에서, 개구부의 평균 직경은 예를 들어 500 ㎚ ~ 100 ㎛, 5 ㎛ ~ 100 ㎛, 10 ㎛ ~ 100 ㎛, 20 ㎛ ~ 100 ㎛, 100 ㎛ ~ 200 ㎛, 100 ㎛ ~ 400 ㎛ 또는 100 ㎛ ~ 600 ㎛의 범위 내에, 바람직하게는 500 ㎚ ~ 100 ㎛ 또는 100 ㎛ ~ 400 ㎛의 범위 내에 있으면 좋다.
특정 실시 양태에서, 3차원 배양 담체는 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 특히 바람직하게는 80% 이상의 공극율을 가진다.
다른 실시 양태에서, 3차원 배양 담체의 개구부의 평균 면적은 0.1 ~ 100 ㎛2, 바람직하게는 0.2 ~ 60 ㎛2, 더욱 바람직하게는 0.5 ~ 30 ㎛2이다. 개구부가 구멍인 경우, 개구부 면적은 구멍의 크기에 해당한다.
3차원 배양 담체는 섬유가 3차원적으로 통합된, 즉 섬유가 3차원 방향으로 겹겹이 쌓인 구조를 가지는 것으로, 섬유의 배치가 규칙적이거나 아니어도 좋고, 또 섬유끼리 결합하고 있어도 결합하고 있지 않아도 된다.
3차원 배양 담체는 세포 접착면에 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖는 것이면 좋고, 세포와 접착하지 않는 부분, 일반적으로는 섬유로 이루어진 3차원 구조 아래에 기본이 되는 부재를 가지고 있어도 좋다. 기본 부재는 상기 3차원 구조를 유지할 수 있는 것이면 어떤 구조도 좋고, 예를 들면, 부직포, 편물, 직물, 다공성 발판 재료 등 일 수 있다.
3차원 배양 담체의 세포 접착면은 그 주된 부분이 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖는 부분이면 되고, 구체적으로는 배양 담체를 세포 접착면의 측면에서 일반적으로는 위에서 관찰했을 때 배양 담체의 면적의 50% 이상이 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖는 부분이 차지하고 있으면 된다. 따라서 3차원 배양 담체는 세포 접착면의 일부에 "섬유로 이루어진 3차원 구조"가 아닌 부분, 예를 들어 3차원 구조를 갖지 않는 평탄한 막 형태의 부분 등을 접착면에 있어서 해당 부분의 면적이 50%에 미치지 않는 범위에서, 바람직하게는 40% 미만의 범위에서, 더욱 바람직하게는 30% 미만의 범위에 포함할 수 있다.
섬유를 형성하는 소재로는 특별한 제한은 없고, 폴리불화 에틸렌, 폴리스티렌 등의 고분자 화합물, 실리카 등의 무기 화합물, 생분해성 폴리머 등을 들 수 있다. 생분해성 고분자로는 생체 적합성이 있고, 원하는 기간 동안 배양 담체에서 3차원 구조를 유지할 수 있는 것이면 좋고, 예를 들면 합성 고분자 재료로는 폴리 글리콜산, 폴리 젖산, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리 카프로락톤, 폴리디옥사논, 기타 젖산-글리콜산 공중합체 등의 상기 공중합체; 무기 재료로는 β-인산 삼칼슘, 탄산 칼슘 등; 천연 고분자 재료로는 콜라겐, 젤라틴, 알긴산, 히알루론산, 아가로스, 키토산, 피브린, 피브로인, 키틴, 셀룰로오스, 실크 등을 들 수 있다.
3차원 배양 담체는 배양시 세포가 섬유로 이루어진 3차원 구조에 접촉할 수 있는 한 형상에 제한은 없다. 3차원 배양 담체는 세포 배양 용기에 설치되어 사용되는 인서트 모양의 형상이어도 좋고, 또는 세포 배양 용기의 내면, 예를 들어 웰의 바닥 등에 섬유로 이루어진 3차원 구조가 일체적으로 성형된 형상이어도 좋다.
본 발명에서 사용 가능한 3차원 배양 담체의 예로는 베델 주식회사의 VECELL (등록상표) (폴리 테트라 플루오로 에틸렌, 평균 섬유 지름: <1 ㎛, 평균 개구부 크기: 1 ~ 20 ㎛2, 개구부의 평균 지름: 20 ~ 100 ㎛, 공극률: 80~90%), 일본 바이린 주식회사의 Cellbed(등록상표) (고순도 실리카 섬유, 평균 섬유 지름: 1 ㎛, 평균 유량 공경: 7~8 ㎛, 공극률:>95%), 3D Biotek의 3D Insert-PS 시리즈 (폴리스티렌 섬유, 평균 섬유 지름: PS-200 ~ 150 ㎛, PS-400 ~ 300 ㎛, 개구부의 평균 지름: PS-200는 200 ㎛, PS-400는 400 ㎛), 국제 공개공보 WO2014/196549호 팜플렛에 기재된 세포 배양기 재료, 국제 공개 WO2016/068266호 팜플렛 및 이에 대응하는 미국 출원인 미국 특허출원 공개 US2017/319747호 공보에 기재된 세포 배양기 재료 (생분해성 폴리머, 평균 섬유 지름 50 ㎚~5 ㎛), Liu L, Kamei K et al. Biomaterials 124 (2017) 47-54에 기재된 세포 배양기 재료 (폴리 글리콜산, 평균 섬유 지름: 345±91 ㎚, 평균 개구부 크기: 0.68±0.02 ㎛2, 평균 개구부 크기에서 산출되는 개구부 평균 지름: 0.93 ㎛ (0.68 ㎛2/π)1/2)Х2), 네오베일 및 네오베일 나노 (군제 주식회사) 등 상용의 조직 보강재 등을 들 수 있다. 상기의 각 문헌은 참조에 의해 그 전체로서 본 명세서에 포함된다.
3차원 배양 담체에서의 MSC의 배양은 24시간 내지 144시간, 바람직하게는 24시간 내지 96시간, 보다 바람직하게는 48 내지 96시간 진행된다. 활성화 단계의 배양 온도 및 가스 농도는 MSC 배양에 통상적으로 사용되는 온도 및 가스 농도의 범위 내이면 좋고, 온도는 예를 들어 25℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 37℃, 보다 바람직하게는 37℃이며, 산소 농도는 예를 들어 2% 내지 30%, 바람직하게는 2% 내지 20%이다. 활성화 처리는 충분한 활성화가 달성 될 때까지 여러 번 수행할 수 있다.
활성화 단계에 있어서 배지 중의 활성화제의 농도는 단백질 환산 최종 농도로 0.01 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖이면 충분하지만, 바람직하게는 0.02 ㎍/㎖ 내지 300 ㎍/㎖, 0.03 ㎍/㎖ 내지 200 ㎍/㎖, 보다 바람직하게는 0.04 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖이고, 특정 실시 양태에서는 0.05 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖일 수 있다. 특허문헌 1에 예시된 활성화제의 보다 바람직한 농도 0.1 ㎎/㎖ (100 ㎍/㎖) 내지 5 ㎎/㎖ (5000 ㎍/㎖)과 상기 특정 양태의 활성화제의 농도를 비교하는 것으로 나타내지게, 3차원 배양 담체를 사용하여 활성화제의 농도를 기존의 1/10 ~ 1/100,000까지 줄일 수 있다. 활성화제의 농도 범위의 하한은 예를 들어 기존의 2차원 배양 담체를 이용하는 경우에 사용되는 농도의 1/100000, 1/50000, 1/20000, 1/10000, 1/5000 또는 1/2000에 있고, 활성화제의 농도 범위의 상한은 예를 들어 종래의 2차원 배양 담체를 이용하는 경우에 사용되는 농도의 1/10, 1/20, 1/50, 1/100, 1/200, 1/500 또는 1/1000이다.
배지는 MSC의 배양에 통상적으로 사용되는 배지, 예를 들면 α-MEM, DMEM 등을 이용할 수 있다. 이들 매체는 활성화를 방해하지 않는 한 MSC의 증식에 필요한 각종 성분, 예를 들면 혈청 성분 등을 함유하고 있어도 된다.
후의 실시예와 같이 3차원 배양 담체에서 활성화제의 존재 하에서 배양한 MSC는 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖지 않는 배양 담체, 예를 들면 코닝(등록상표) 코스타(등록상표) 세포 배양 플레이트 (써모 피셔 사이언스사) 등의 폴리스티렌 등으로 이루어진 2차원 배양 담체에서 활성화제의 존재 하에서 배양한 MSC와 비교하여 보다 높은 치료 효과를 갖는다. 치료 효과가 높은 MSC라면 더 적은 세포 수에서도 효과를 기대할 수 있다는 점에서, 본 발명의 활성화 단계의 MSC의 계대 횟수는 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖지 않는 세포 배양 담체를 사용하여 MSC를 배양하는 활성화 단계에 있어서 보다 적게 하는 것이 가능해진다. 활성화 단계의 MSC의 계대 횟수는 바람직하게는 2회 이하이며, 1회, 심지어 0번이라도 좋다. 또한 제1 양태의 제조 방법에 의해 제조되는 활성된 MSC는 바람직하게는 계대가 3, 즉 P3 이하이며, P2, 심지어 P1이어도 좋다.
MSC의 활성 여부의 판정은 특허문헌 1에 기재된 방법과 기준에 따라 할 수 있다. 예를 들어, 질환 모델 동물이나 질환 모델 동물 유래 세포 등의 질환을 반영한 평가에서 3차원 배양 담체에서 활성화제의 존재 하에서 배양한 MSC(이하 "3D 활성화 처리 MSC"라고도 함)의 치료 효과가 2차원 배양 담체에서 활성화제의 부존재 하에서 배양한 MSC(이하 "비교 대상 MSC"라고도 함)보다 높은 경우, 3D 활성화 처리 MSC는 활성된 것으로 판정된다.
또한, 세포 및 세포내 소기관의 형태, 세포 증식능, 분화능, 및 치료 효과가 있는 MSC의 마커로 알려진 성장 인자, 분화 관련 인자 및 사이토카인, 케모카인 등 각종 인자의 단백질 발현량, 유전자 발현량 세포외 분비량 등의 평가 지표를 이용함으로써도 활성화를 판정할 수 있다.
예를 들어, 3D 활성화 처리 MSC의 세포 증식능 또는 분화능이 비교 대상 MSC보다 높은 경우, 3D 활성화 처리 MSC의 치료 효과가 높은, 즉 활성된 것으로 판단 할 수 있다.
또한, 줄기 세포성에 관여하는 인자 (예를 들면, DNMT1, Nanog, SOX2 및 OCT4 등), 면역 제어·항염증 기능에 관여하는 인자(예를 들면, IDO, TSG6 및 IL-6 등) 또는 텔로머라제 활성에 관여하는 인자(예를 들면, TERT 등)의 유전자 또는 단백질 발현량이 3D 활성화 처리 MSC에서 비교 대상 MSC보다 많은 경우, 또는 세포 노화에 관여하는 인자(예를 들면, P53 등) 또는 세포 골격에 관여하는 인자(예를 들면, α-SMA 등)의 유전자 또는 단백질 발현량이 3D 활성화 처리 MSC에서 비교 대상 MSC보다 적은 경우에 그 3D 활성화 처리 MSC의 치료 효과가 높은, 즉 활성된 것으로 판단할 수 있다.
또한, 3D 활성화 처리 후 MSC의 세포 두께의 증가, 돌기 수의 증가, 네트워크 구조의 형성 과다, 분비 소포의 형성 과다 등이 관찰된 경우에 그 3D 활성화 처리 MSC의 치료 효과가 높은, 즉 활성된 것으로 판단 할 수 있다.
또한, 이후에 설명하는 바와 같이, 본 발명자들이 새롭게 발견한 MSC의 치료 효과와 긍정적인 상관 관계가 높은 p16ink4a 및 p14ARF, 그리고 또한 본 발명자들이 새롭게 발견한 MSC의 치료 효과와 부정적인 상관 관계가 높은 CDK4, CDK6, RB 및 CD47 유전자 또는 단백질 발현을 지표로 3D 활성화 처리한 MSC의 치료 효과가 비교 대상 MSC의 그것보다 높은지 여부, 즉 3D 활성화 처리 MSC가 활성되었는지 여부를 판정할 수 있다.
활성화된 MSC는 미분화 상태로 유지해도 되고, 또는 원하는 세포로 분화시킬 수 있다. MSC의 미분화 상태의 유지는 미분화 상태의 유지에 적합한 배지, 예를 들면 HyClone AdvanceSTEM Mesenchymal Stem Cell Expansion Kit (써모피셔 사이언티픽), MesenCult(상표) MSC Basal Medium (스템셀 테크놀로지), 스트로말 셀루션스(Stromal Cellutions)(상표) 미디아 (DV 바이오로직스), MSC 전용 배지 키트 (MSCGM 불렛키트, 론자) 등을 이용하여 MSC를 배양함으로써 할 수 있다. 또한, MSC의 분화는 원하는 세포로의 분화 유도 작용을 가지는 인자를 더한 분화 유도 배지에서의 배양 등의 일반적으로 알려진 방법으로 할 수 있다. 예를 들어, 조골세포로의 분화에서는 골 형성 단백질 (Bone Morphogenetic Proteins, BMP) 4, BMP2 등이 지방세포로의 분화에 있어서 덱사메타손, 3-이소부틸-1-메틸 크산틴, 인슐린 등이 분화 유도 인자로 사용된다.
또한 MSC는 활성화, 증식 배양, 분화 유도 배양 등의 처리 전후에 동결보존 등의 일반적인 방법에 의해 보존할 수 있다. 예를 들어, 활성화된 MSC를 배양하여 증식시킨 후 일정한 세포 수가 되도록 나누어 보존해 두고 투여할 때마다 필요량을 해동하여 사용하는 것이 가능하다.
MSC의 치료 효과 마커 및 MSC의 치료 효과의 판정 방법
본 발명의 또 다른 측면은 p16ink4a 및 p14ARF로 이루어진 군에서 선택되는 MSC의 치료 효과와 바로 연관되는 MSC의 치료 효과 평가를 위한 마커에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 또 다른 측면은 CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 MSC의 치료 효과와 부정적인 상관 관계인 MSC의 치료 효과 평가를 위한 마커에 관한 것이다.
p16ink4a은 안키린 반복을 갖는 사이클린 의존성 인산화효소 억제 인자이다. p16ink4a은 암 억제 인자의 하나로 알려져 있으며 세포가 분열 수명에 도달하고, 발암 스트레스에 노출되는 등으로 DNA 손상이 발생했을 때 발현량이 증가하는 노화 관련 유전자로 알려져 있다 (E.Hara et al., Mol.Cell.Biol., 1996, Vol.16, p.859-867; B.G.Childs et al., Nature Medicine 2015, vol.21, p.1424-1435).
p16ink4a는 사이클린 의존성 인산화효소인 CDK4 및 CDK6, 세포주기 조절 인자인 RB (레티노블라스토마 단백질, RB를 코딩하는 유전자는 Rb라고도 함)와 함께 p16ink4a-RB 경로라는 신호 전달 경로를 형성한다. 이 경로에서 p16ink4a은 CDK4/6와 특이적으로 결합하여 그 작용을 저해한다. CDK4/6의 저해는 활성형의 탈인산화 RB를 증가시켜 세포주기의 진행을 정지시킨다. 이하, 이러한 요인을 정리해 p16ink4a-RB 경로 인자라고도 부른다.
인간의 p16ink4a 유전자 및 단백질로 번역되는 mRNA의 염기 서열은 데이터베이스 이름 GenBank/NCBI에 액세스 세션 번호 NM_000077 및 NM_001195132, 단백질의 아미노산 서열은 데이터베이스 이름 GenPept (NCBI Protein Database)에 액세스 세션 번호 NP_000068로 각각 등록되어 있다.
인간의 CDK4 및 CDK6의 유전자 및 단백질로 번역되는 mRNA의 염기 서열은 데이터베이스 이름 GenBank/NCBI에 액세스 세션 번호 NM_000075 및 NM_001259, 단백질의 아미노산 서열은 데이터베이스 이름 GenPept (NCBI Protein Database)에 액세스 세션 번호 NP_000066 및 NP_001138778(또는 NP_001250)로 각각 등록되어 있다.
인간의 RB 유전자 및 단백질로 번역되는 mRNA의 염기 서열은 데이터베이스 이름 GenBank/NCBI에 액세스 세션 번호 NM_000321, 단백질의 아미노산 서열은 데이터베이스 이름 GenPept (NCBI Protein Database)에 액세스 세션 번호 NP_000312로 각각 등록되어 있다.
p14ARF는 p16ink4a의 스플라이싱 변형이며, 양자는 CDKN2A 유전자에 의해 코딩된다. p14ARF는 p53 안정화 단백질인 MDM2에 결합하여 p53의 분해를 억제하는 기능을 가지고 있어 p16ink4a와 같이 암 억제 인자의 하나로 알려져 있다.
인간의 p14ARF 유전자 및 단백질로 번역되는 mRNA의 염기 서열은 데이터베이스 이름 GenBank/NCBI에 액세스 세션 번호 NM_058195, 단백질의 아미노산 서열은 데이터베이스 이름 GenPept (NCBI Protein Database)에 액세스 세션 번호 NP_478102로 각각 등록되어 있다.
CD47(인테그린 관련 단백질(IAP)이라고도 불린다)은 면역 글로불린 슈퍼 패밀리에 속하는 막 관통형 단백질이다. 정상 세포의 세포막에 발현되는 CD47은 대식세포 세포막의 신호 제어 단백질 α(SIRPα)와 결합하고 이를 통해 대식세포의 탐식 작용을 억제하는 것으로 알려져 있다. 세포 이식 요법에 사용되는 세포는 대식세포에 의한 탐식을 회피하기 위해 CD47을 발현하는 것이 바람직하다고 생각되고 있다. 또한 CD47은 MSC의 호밍 및 조직 복구 효과를 증대시키는 것으로 보고되고 있어(Int J Clin Exp Pathol.2015; 8 (9): 10555-10564), MSC의 질환 치료 효과를 높이는 기능을 갖는 것으로 추측되고 있다.
인간의 CD47 유전자 및 단백질로 번역되는 mRNA의 염기 서열은 데이터베이스 이름 GenBank/NCBI에 액세스 세션 번호 NM_001777 및 NM_198793, 단백질의 아미노산 서열은 데이터베이스 이름 GenPept (NCBI Protein Database)에 액세스 세션 번호 NP_001768로 각각 등록되어 있다.
놀랍게도, 활성화된 MSC의 유전자 발현 프로파일을 분석한 결과, 활성화 처리에 의한 p16ink4a-RB 경로 인자의 발현 변화, 구체적으로는 p16ink4a의 유전자 발현량의 증가 및 p16ink4a의 하류 인자인 CDK4, CDK6 및 RB의 유전자 발현량의 감소 등이 나타났다. 또한, p14ARF의 유전자 발현량은 p16ink4a와 같이 증가한 것으로 나타나는 한편, CD47 유전자의 발현량은 감소했다. 또한 활성화 처리를 하여도 치료 효과가 상승했다고 인정되지 않는 MSC에서는 위와 같은 p16ink4a-RB 경로 인자, p14ARF 및 CD47의 발현 변화는 일어나지 않는 것도 실험적으로 확인되었다.
또한, 활성화된 MSC는 줄기 세포성에 관여하는 인자인 OCT4, SOX2 및 Nanog, 면역 제어, 항염증 기능에 관여하는 인자인 IDO 및 TSG-6 등의 MSC의 치료 효과와 관련된 유전자의 발현량이 증가하는 것을 본 발명자들은 확인하고 있지만, p16ink4a의 유전자 발현은 상기 유전자들의 발현과 매우 높은 양의 상관 관계를 갖는 것으로 확인되었다. p16ink4a의 유전자 발현은 또한 p14ARF 유전자 발현과도 직접적 상관 관계가 있었다.
또한, p16ink4a 및 p14ARF는 상기의 치료 효과와 관련된 유전자와 마찬가지로 치료 효과가 높은 MSC에서 발현량의 증가가 인정되고 CD47은 치료 효과가 높은 MSC에서 발현량의 감소가 인정되었다. 게다가 p16ink4a 및 p14ARF를 결핍시킨 MSC, CD47을 강제 발현한 MSC 모두 치료 효과가 감소하는 것이 실험으로 확인되었다.
이러한 결과에 따르면, p16ink4a 및 p14ARF는 MSC의 질환 치료 효과와 바로 상관되는 MSC의 치료 효과 평가를 위한 마커로, p16ink4a의 하류 인자인 CDK4, CDK6 및 RB, 및 CD47은 MSC의 질환 치료 효과와 부정정인 상관 관계인 MSC의 치료 효과 평가를 위한 마커로 이용할 수 있다. 또한, 이러한 마커를 이용해 MSC의 치료 효과를 평가할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 피실험 MSC에서 p16ink4a, p14ARF, CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1개의 유전자 또는 단백질의 발현량을 측정하는 측정 단계, 측정된 발현량을 대조 MSC의 발현량과 비교하는 비교 단계 및 p16ink4a 및 p14ARF로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1개의 유전자 혹은 단백질의 발현량이 대조 MSC보다 피실험 MSC에서 많은 경우 및/또는 CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1개의 유전자 혹은 단백질의 발현량이 대조 MSC보다 피실험 MSC에서 적은 경우, 피실험 MSC는 대조 MSC보다 치료 효과가 높다고 판정하는 판정 단계를 포함하는, MSC의 치료 효과를 판정하는 방법에 관한 것이다.
상기 측면의 치료 효과 판정 방법은 피실험 MSC의 p16ink4a, p14ARF, CDK4, CDK6, RB 및 CD47(이하, 치료 효과 마커라고도 함)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1개, 바람직하게는 2, 3 또는 모든 유전자 또는 단백질의 발현량을 측정하는 측정 단계를 포함한다.
피험 MSC는 치료 효과의 판정을 원하는 MSC이면된다. 피험 MSC의 예는 세포 이식 치료에 사용 예정인 MSC이다. 자가 이식 요법의 사용이 예정되어 있는 경우, 피험 MSC는 자가 이식 요법을 받고자 하는 대상으로부터 분리된, 바람직하게는 골수 유래의 MSC이다. 이 MSC의 치료 효과를 이식 전에 판정함으로써 환자에게 불필요한 세포 이식을 피할 수 있고, 세포 이식 요법의 성공률을 높일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 피험 MSC는 치료 효과를 높이는 처리가 실시된 MSC일 수 있고, 이러한 MSC의 예는 활성화제를 포함하는 배지에서 배양된, 즉 활성화 처리된 MSC나 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖는 세포 배양 담체를 이용하여 배양된 MSC이다.
MSC에서 치료 효과 마커 유전자 또는 단백질 발현량의 측정은 염기서열 또는 아미노산 서열이 공지된 유전자 또는 단백질의 발현량을 측정할 수 있는 당업자에게 공지된 각종 방법을 채택해 실시할 수 있다.
마커 단백질의 발현량 측정은 이에 특이적인 항체를 이용하여 직접 경합법, 간접 경합법, 샌드위치법 등의 ELISA 법, RIA 법, 인사이츠 혼성화, 이뮤노블롯 분석, 웨스턴 블롯 분석 및 조직 어레이 분석 등의 공지의 방법으로 할 수 있다. 이 경우 특이 항체는 유래하는 동물종에 의해 제한되지 않고, 또한 폴리클로날 항체 또는 단클론 항체일 수 있으며, 면역 글로불린 길이로 구성된 항체 또는 Fab 단편 또는 F(ab ')2 단편 등의 부분 조각 등도 바람직하다. 특이 항체는 형광 물질(예를 들어 FITC, 로다민, 팔로이딘 등), 금 등의 콜로이드 입자, Luminex (등록상표 루미넥스 사) 등의 형광 마이크로 비드, 중금속(예를 들면 금, 백금 등), 색소 단백질 (예를 들어, 피코에리트린, 피코시아닌 등), 방사성 동위 원소 (예를 들어, 3H, 14C, 32P, 35S, 125I, 131I 등), 효소 (예를 들어, 과산화효소, 알칼리 포스파타제 등), 비오틴, 스트렙타비딘 기타 표지 화합물로 표지되어 있어도 좋다.
마커 유전자의 발현량 측정은 그 염기 서열을 바탕으로 설계되는 적당한 염기 서열로 이루어진 프라이머 핵산을 이용한 PCR법, 특히 실시간 PCR법 및 핵산의 절대 정량이 가능한 디지털 PCR법, 그 mRNA 의 염기 서열에 조건 하에서 혼성화할 수 있는 염기 서열로 이루어진 프로브 핵산을 이용한 혼성화법, 그 mRNA의 염기 서열에 혼성화할 수 있는 염기 서열로 이루어진 프로브 핵산이 고정화된 칩을 이용한 마이크로어레이법, RNA 시퀀싱법, 기타 해당 마커 유전자의 발현을 검출할 수 있는 공지의 방법으로 할 수 있다. 프라이머 핵산 또는 프로브 핵산은 사용되는 방법에 따라 형광 물질, 방사성 동위 원소, 효소, 비오틴, 스트렙타비딘 기타 표지 화합물로 표지되어 있어도 좋다.
상기 측면의 치료 효과 판정 방법은 또한 측정된 발현량을 대조 MSC의 발현량과 비교하는 비교 단계를 포함한다. 여기에서 대조 MSC는 치료 효과 판정의 기준이 되는 MSC이다. 예를 들어, 피험 MSC가 세포 이식 요법에 사용 예정인 MSC인 경우에는 대조 MSC로는 세포 이식 요법에서 사용 가능한 최소 수준의 치료 효과를 갖는 MSC를 사용할 수 있다. 대조 MSC의 치료 효과 마커 유전자 또는 단백질 발현량은 피험 MSC와 동시에 측정된 것이거나, 미리 준비된 것이어도 좋다.
상기 측면의 치료 효과 판정 방법은 p16ink4a 및 p14ARF로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 대조 MSC보다 피험 MSC에서 많은 경우 및/또는 CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 대조 MSC보다 피험 MSC에서 적은 경우, 피험 MSC는 대조 MSC보다 치료 효과가 높다고 판정하는 판정 단계를 추가로 포함한다.
판정 단계에서는 측정 단계에서 측정한 치료 효과 마커가 p16ink4a 또는 p14ARF인 경우, p16ink4a 또는 p14ARF 유전자 또는 단백질의 발현량이 대조 MSC보다 피험 MSC에서 많을 때, 피험 MSC는 대조 MSC보다 치료 효과가 높다고 판정할 수 있다. 또한 측정 단계에서 측정한 치료 효과 마커가 CDK4, CDK6, RB 또는 CD47인 경우, 이들 유전자 또는 단백질의 발현량이 대조 MSC보다 피험 MSC에서 적을 때, 피험 MSC는 대조 MSC보다 치료 효과가 높다고 판정할 수 있다.
복수의 치료 효과 마커를 이용하여 MSC의 치료 효과를 판정하는 경우, 클러스터 분석을 이용하는 것도 가능하다. 구체적으로는 피험 MSC에서 측정한 각 치료 효과 마커의 상대적인 발현 데이터를 치료 효과가 높은 양성 대조군의 MSC, 즉 세포 이식 요법에서 사용하기에 충분한 수준의 치료 효과를 갖는 MSC 및 치료 효과가 낮은 음성 대조군의 MSC, 즉 세포 이식 치료에 사용하기에는 불충분한 수준의 치료 효과 밖에 갖지 않는 MSC에서의 각 치료 효과 마커의 상대적인 발현 데이터와 함께 클러스터 분석에 제공하고, 피험 MSC가 양성 대조군 MSC와 같은 클러스터에 속한 경우 치료 효과가 높고, 음성 대조군 MSC와 같은 클러스터에 속한 경우 치료 효과가 낮다고 판정할 수 있다.
클러스터 분석은 R version 3.0.1 (Various R programming tools for plotting data; gplots) 등의 통계 소프트웨어를 사용하여 적절한 클러스터링 기법, 예를 들어 워드법이나 군 평균법 등의 계층적 방법을 사용하여 실시할 수 있다.
또한 치료 효과가 높은 MSC는 상기 치료 효과 마커 외에 줄기세포성 지표인 DNMT1, Nanog, SOX2 및 OCT4 유전자, 텔로머라제 활성에 관여하는 유전자인 TERT 유전자 등도 미처리 MSC의 발현 수준보다 높고, 또한 세포 노화에 관여하는 유전자로 여겨지는 p53 및 세포 골격에 관여하는 유전자로 생각되는 α-SMA의 발현량이 미처리 MSC의 발현 수준보다 낮은 것으로 본 발명자에 의해 확인되고 있다. 따라서 측정 과정에서 상기 치료 효과 마커 유전자 또는 단백질 발현량의 측정뿐만 아니라,
(A) DNMT1, Nanog, SOX2, OCT4, IDO, TSG6, IL-6 및 TERT로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 모든 유전자 또는 단백질, 및/또는
(B) p53 및 α-SMA로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나, 바람직하게는 모든 유전자 또는 단백질의 발현량을 측정하여 판정 단계에서 그 결과를 상기 치료 효과 마커 유전자 또는 단백질 발현량의 변화와 조합, 구체적으로는
p16ink4a 및 p14ARF로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 대조 MSC보다 피험 MSC에서 많은 경우 및/또는 CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현량이 대조 MSC보다 피험 MSC에서 적은 경우에 더하여, 상기 (A) 유전자 또는 단백질의 발현량이 대조 MSC보다 피험 MSC에서 많은 경우 및/또는 상기 (B) 유전자 또는 단백질의 발현량이 대조 MSC보다 피험 MSC에서 적은 경우에 그 MSC는 치료 효과가 높은 것으로 판정할 수 있다.
또한, 상기 측면의 치료 효과 판정 방법의 측정 단계에서 CD47 유전자 또는 단백질의 발현량에 대신하여 MSC 중의 CD47 양성 세포의 비율을 측정하고, 판정 단계에서 CD47 유전자 또는 단백질의 발현량이 대조 MSC보다 피험 MSC에서 적은 것에 대신하여 MSC 중의 CD47 양성 세포의 비율이 대조 MSC보다 피험 MSC에서 낮은 경우 피험 MSC는 대조 MSC보다 치료 효과가 높다고 판정하는 방법도 본 발명에 포함된다.
MSC 중의 CD47 양성 세포의 비율은 MSC를 CD47에 대한 표지 항체로 표지하고, 아이소타입 대조군 등을 음성 대조군으로 하여 유동세포 계측법 등으로 분석함으로써 결정할 수 있다.
치료 효과를 높이기 위한 처리에 대한 MSC의 적응성 판정 방법
본 발명의 또 다른 양태는 처리된 MSC에서 p16ink4a, p14ARF, CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량을 측정하는 측정 단계, 측정된 발현량을 미처리 MSC의 발현량과 비교하는 비교 단계, 및 p16ink4a 및 p14ARF로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 미처리 MSC보다 처리된 MSC에서 많은 경우 및/또는 CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 미처리 MSC보다 처리된 MSC에서 적은 경우에 그 MSC는 당해 처리에 적합하다고 판정하는 판정 단계를 포함하는 MSC의 치료 효과를 높이기 위한 처리에 대한 MSC의 적응성을 확인하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태는 처리된 MSC에서 p16ink4a, p14ARF, CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량을 측정하는 측정 단계, 측정된 발현량을 미처리 MSC의 발현량과 비교하는 비교 단계, 및 p16ink4a 및 p14ARF로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 미처리 MSC보다 처리된 MSC에서 적거나 또는 동등한 경우 및/또는 CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 미처리 MSC보다 처리된 MSC에서 많거나 또는 동등한 경우에 그 MSC는 당해 처리에 적합하지 않은 것으로 판정하는 제외 판정 단계를 포함하는 MSC의 치료 효과를 높이기 위한 처리에 대한 MSC의 적응성을 확인하는 방법에 관한 것이다.
상기의 적응성 판정 방법에서 "처리된 MSC"는 MSC의 치료 효과를 높이기 위한 어떠한 처리를 받은 MSC를 말한다. 또한 "미처리 MSC"는 관련된 처리를 받지 않은 MSC 또는 관련된 처리의 대조가 되는 처리를 받은 MSC를 말한다. 이러한 처리와 대조 처리의 예로는 활성화제 존재 하에서 배양/활성화제 부존재 하에서 배양, 3차원 배양 담체에서의 배양/2차원 배양 담체에서의 배양, 낮은 산소 농도 아래 또는 낮은 영양 하에서 배양/보통 산소 농도 아래 또는 통상 영양 하에서 배양, 미세 중력 환경 또는 과도한 중력 환경에서 배양/보통 중력 환경에서 배양, bFGF, TNF-α, IL-6, TGF-β 또는 PDGF와 같은 성장 인자, 사이토카인, 케모카인 등의 존재 하에서 배양/부존재 하에서 배양, 유전자 도입 형질 전환 처리/미처리 등을 들 수 있다.
위에서 언급한 바와 같이, p16ink4a 및 p14ARF는 MSC의 치료 효과와 바로 연관하고, CDK4, CDK6, RB 및 CD47은 MSC의 치료 효과와 부정적인 상관 관계인 것으로부터, MSC는 치료 효과를 높이기 위한 처리를 한 MSC와 처리되지 않은 MSC에서 이러한 발현량을 비교하여 그 MSC가 해당 처리에 응답성일지 여부, 해당 처리에 대한 적응성이 있는지 여부를 판정할 수 있다.
상기의 적응성 판정 방법의 측정 단계와 비교 단계는 전술의 치료 효과 판정 방법의 대응하는 단계에서 설명된 바와 같다. 또한 미처리 MSC의 치료 효과 마커 유전자 또는 단백질의 발현량은 처리된 MSC와 동시에 측정된 것이거나, 미리 준비된 것이어도 좋다.
처리된 MSC에서 p16ink4a 및 p14ARF로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 미처리 MSC보다 처리된 MSC에서 많은 경우 및/또는 CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 미처리 MSC보다 처리된 MSC에서 적은 경우에 그 MSC는 당해 처리에 의해 치료 효과가 증가되는 MSC인 것으로 예측되어 해당 처리에 적합한 MSC, 즉 그 MSC는 해당 처리에 적응성이 있다고 판정할 수 있다. 상기 예의 적응성 판정 방법은 또한, 상기 측정 단계와 비교 단계에서, p16ink4a 및 p14ARF로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 미처리 MSC보다 처리된 MSC에서 많은 경우 및/또는 CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 미처리 MSC보다 처리된 MSC에서 적은 경우에 그 MSC의 치료 효과가 해당 처리에 의해 상승했다고 판정하는 단계를 포함하는 MSC의 치료 효과를 높이기 위한 처리에 대한 MSC의 치료 효과의 상승을 확인하는 방법으로 나타낼 수도 있다.
한편, 처리된 MSC에서 p16ink4a 및 p14ARF로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 미처리 MSC보다 처리된 MSC에서 적거나 또는 동등한 경우 및/또는 CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 미처리 MSC보다 처리된 MSC에서 많거나 혹은 동등한 경우에는 그 MSC는 치료 효과를 높이기 위한 처리를 하여도 치료 효과가 향상될 가능성이 낮은 MSC인 것으로 예측되어 그 MSC는 해당 처리에 적응성이 낮거나 또는 없다고 판정 할 수 있다. 상기 예의 적응성 판정 방법은 또한, 상기 측정 단계와 비교 단계에서, p16ink4a 및 p14ARF로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 미처리 MSC보다 처리된 MSC에서 적거나 또는 동등한 경우 및/또는 CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 미처리 MSC보다 처리된 MSC에서 많거나 혹은 동등한 경우에는 그 MSC의 치료 효과가 해당 처리에 의해 상승되지 않았다고 판정하는 단계를 포함하는 MSC의 치료 효과를 높이기 위한 처리에 대한 MSC의 치료 효과의 상승의 부존재를 판정하는 방법으로 나타낼 수도 있다.
상기 예의 적응성 판정 방법에 있어서는, 전술의 치료 효과 판정 방법과 같이 복수의 치료 효과 마커를 이용한 적응성 판정 때의 클러스터 분석의 이용, 줄기세포성에 관여하는 인자, 면역 억제항염증 기능에 관여하는 인자 및 텔로머라제 활성에 관여하는 인자와 조합해서 판정, 및 CD47 유전자 또는 단백질의 발현량을 대신하여 MSC 중의 CD47 양성 세포의 비율도 사용이 가능하며, 그 자세한 내용은 위의 치료 효과 판정 방법에 설명된 대로이다.
또한, 상기 양태의 적응성 판정 방법에서 MSC의 치료 효과를 높이기 위한 처리를 대신하여 MSC의 치료 효과를 높일지 여부가 불분명한 처리를 하고, 그 MSC에서 p16ink4a 및 p14ARF로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 미처리 MSC보다 처리된 MSC에서 많은 경우 및/또는 CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 미처리 MSC보다 처리된 MSC에서 적은 경우 해당 처리가 MSC의 치료 효과를 높이는데 적합하다고 판정할 수도 있다. 본 발명은 이러한 판정 방법도 제공한다.
상기의 치료 효과 판정 방법 및 적응성 판정 방법에 의해 치료 효과가 높거나, 치료 효과를 높이기 위한 처리에 대한 적응성이 높거나, 치료 효과가 상승했다고 판정된 MSC에 대해서는 해당 처리에 의한 이식용 MSC의 제조 또는 그 검토를 더욱 진행하면 된다. 한편, 치료 효과가 낮거나, 적응성이 낮거나 또는 치료 효과가 상승하지 않은 것으로 판정된 MSC에 대해서는 해당 처리에 의한 이식용 MSC의 제조를 실시하지 않고, MSC 및 처리에 필요한 활성화제 등의 약제의 소비를 억제할 수 있다.
세포 제제
본 발명의 또 다른 측면은 CD47 양성 세포의 비율이 2% 이하인 MSC를 포함하는 세포 제제에 관한 것이다.
전술한대로, CD47은 MSC의 치료 효과와 부정적인 상관 관계의 치료 효과 마커인 것이 확인되었다. 본 발명자는 제1 양태의 제조 방법에 따라 CD47 양성 세포의 비율이 매우 낮은 MSC를 제조할 수 있는 것을 찾아냈다. 관련된 MSC는 치료 효과가 매우 높을 것으로 예상되기 때문에 이를 포함하는 세포 제제는 MSC를 이용한 세포 이식 요법이 효과적인 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 의약으로 이용할 수 있다.
세포 제제는 제1 양태의 제조 방법에 따라 제조한 MSC를 이용하여 제조할 수 있다. 세포 제제에 포함된 MSC는 CD47 양성 세포의 비율이 2% 미만이라는 특징이 있다. 이후의 실시예와 같이 치료 효과가 높다고 생각되는 청년층에서 채취한 MSC에서조차 CD47 양성 세포의 비율이 2%를 초과하는 것을 감안하면 CD47 양성 세포의 비율이 매우 낮은 MSC는 종래에 없는 높은 치료 효과를 갖는 것으로 기대된다.
세포 제제에 포함되는 MSC에서 CD47 양성 세포의 비율은 2% 이하, 바람직하게는 1.5% 이하이다. MSC 중의 CD47 양성 세포의 비율은 전술한 치료 효과 판정 방법에서 이미 언급된 방법으로 확인할 수 있다.
세포 제제는 대상에서 분리된 MSC 등의 MSC 집단 속에서 CD47 음성의 MSC를 농축하는 것에 의해서도 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명은 MSC 집단 속에서 CD47 음성의 MSC를 농축하는 공정을 포함하는 MSC를 포함한 세포 제제의 제조 방법도 제공하는 것이다.
CD47 음성 MSC의 농축은 특정 세포 표면 마커를 갖지 않는 세포의 농축에 사용되는 공지의 기술, 예를 들어 CD47의 음성 선별에 의해 할 수 있다. CD47의 음성 선별에서 MSC 집단은 CD47 특이 항체가 결합된 비드와 CD47 특이 항체를 이용한 유동세포 계측법에 제공되고, 항체와 결합하지 않는 MSC가 회수된다.
세포 제제는 유효량의 MSC를 포함한다. "유효량"은 질환을 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 양을 의미한다. 필요 유효량은 질환의 종류, 증상의 심각도, 투여 경로, 환자의 기타 의학적 요인에 의해 적절하게 조절된다. 바람직한 실시 양태에서, MSC의 유효량은 전신 투여의 경우에 투여되는 개체의 체중 1 ㎏당 104 세포 ~ 109 세포, 바람직하게는 105 세포 ~ 108 세포이며, 국소 투여의 경우에는 투여되는 개체의 체중 1 ㎏당 102 세포 ~ 109 세포, 바람직하게는 104 세포 ~ 106 세포이다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 제1 측면에 따른 제조 방법에 의해 제조되는 MSC는 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖지 않는 배양 담체에서 일반적으로는 2차원 배양 담체에서 활성화제를 이용하여 활성된 MSC와 비교하여 높은 치료 효과를 갖고 있기 때문에 세포 제제 중 MSC의 유효량은 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖지 않는 세포 배양 담체를 사용하여 제조되는 활성된 MSC의 유효량의 1/20 ~ 1/2의 양, 바람직하게는 1/10 ~ 1/4의 양이 될 수 있다. 이러한 유효량의 세포 제제는 1회 또는 여러번에 나누어 투여할 수 있다.
또한, MSC의 배양물에는 MSC가 생산하는 다양한 액상 인자가 포함되어 있어 역시 질환 치료 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서 상기 양태의 세포 제제에 포함된 MSC를 배양하여 얻어지는 배양물 또한 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 의약으로서 이용할 수 있다. 배양물은 바람직하게는 배양 상청이며, MSC의 배양에 통상적으로 사용되는 배지, 예를 들면 α-MEM, DMEM 등에서 활성화제의 존재 하에 MSC를 배양함으로써, 또는 활성화된 후의 MSC를 배양함으로써 얻을 수 있다. MSC 배양물을 포함한 의약의 배양물의 유효량은 투여되는 개체의 체중 1 ㎏당 0.01 ㎎ ~ 100 ㎎, 바람직하게는 0.02 ㎎ ~ 50 ㎎, 보다 바람직하게는 0.05 ㎎ ~ 20 ㎎이며, 이것을 1회 또는 여러번에 나누어 투여 할 수 있다.
상기의 세포 제제 및 배양물을 포함하는 의약(이하, 정리하여 본 발명의 의약이라 한다)은 일반적으로 주사제 등의 비경구 제제의 양태로 사용된다. 비경구 제제에 사용할 수 있는 담체로는 예를 들면, 생리 식염수나 포도당, D-소르비톨 등을 포함한 등장액이라고 하는 수성 담체를 포함한다. 또한, 본 발명의 의약은 약학적으로 허용되는 완충제, 안정제, 보존제 기타 성분을 함유 약학 조성물이어도 좋다.
본 발명의 의약의 투여 방법은 특별히 제한되지 않지만, 비경구 제제인 경우, 예를 들어 혈관 내 투여(바람직하게는 정맥 투여), 복강 내 투여, 장관 내 투여, 피하 투여, 피막 하 투여 등의 국소 투여(피막은 각종 장기를 덮는 막 조직을 의미한다)를 들 수 있다. 바람직한 실시 양태 중 하나에서, 본 발명의 의약은 정맥 투여에 의해 생체에 투여된다. 또한, 본 발명의 의약은 치료 및/또는 예방되는 질병에 따라 기타 의약과 함께 사용할 수 있다.
세포 제제는 3차원 배양 담체에 부착된 양태로 생체 내에서 질병이 발생한 부위, 발생할 우려가 있는 부위 또는 질환의 원인이 되는 부위 또는 그 근방에 부착하여 생체에 국소 투여할 수 있다. 본 실시 예에서, 3차원 배양 담체의 섬유를 형성하는 소재는 생체 적합성 재료, 특히 생분해성 폴리머인 것이 바람직하다.
본 발명의 의약은 MSC를 이용한 세포 이식 요법이 효과적인 질환, 예를 들어 당뇨병 및 그 합병증, 뇌 혈관 질환, 뇌 변성 질환, 탈수성 질환, 기능성 발작성 질환, 치매 질환, 말초 신경 질환, 심혈관 질환, 자가 면역 질환, 간·담도·장 질환, 위·십이지장 질환, 소장·대장 질환, 갑상선 질환, 혈액·조혈 질환, 폐 질환, 급성 신장 장애 및 만성 신장 질환, 안과 질환, 피부 질환, 근육·뼈 질환, 외상 및 GVHD(이식편 대 숙주질환)의 치료 및/또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 이러한 질환으로는 구체적으로, 제1 형 당뇨병과 제2 형 당뇨병 및 그 합병증, 예를 들어 당뇨병성 신장증, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신경 장애, 당뇨병성 괴저 등; 뇌졸중(뇌경색 및 뇌출혈) 등의 뇌 혈관 질환, 파킨슨병, 헌팅턴 질환, 대뇌 기저핵 변성, 다계통 위축증, 척수 소뇌 변성증, 근육 위축 측삭 경화증 등의 뇌 퇴행성 질환; 다발성 경화증, 급성 산재성 뇌 척수염, 시신경 척수염 등의 탈수성 질환; 간질이나 뇌성 마비 등의 기능성 발작; 혈관성 치매, 알츠하이머병, 레비 소체형 치매, 전두 측두형 치매, 당뇨병성 치매 등 치매 질환; 길랑-바레 증후군, 말초 신경 장애, 안면 신경 마비, 삼차 신경통, 배뇨 장애, 발기 장애, 자율 신경 실조증 등의 말초 신경 질환; 심근 경색, 협심증, 폐쇄성 동맥 경화증, 심근증 등의 심혈관 질환; 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 다발성 근염, 피부 근염, 피부 경화증, 혼합성 결합 조직 질환, 류마티스성 다발 근육통, 호산구 증가증 , 베체트병, 유육종증, 스틸(Still) 질환, 척추 관절염, 가와사키병 등의 자가 면역 질환; 급만성 간염, 간경변, 자가 면역성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 원발성 경화성 담관염, 급만성 췌장염, 자가 면역성 췌장염 등의 간담도췌장 질환; 급성만성 위염, 위십이지장 궤양 등의 위십이지장 질환; 크론병, 궤양성 대장염, 허혈성 대장염, 과민성 대장 증후군 등의 소장대장 질환; 바세도 질환, 급성만성 갑상선염 등의 갑상선 질환; 자가 면역성 용혈성 빈혈, 진성 다혈증, 특발성 혈소판 감소성 자반증 등 혈액조혈 장애; 만성 폐쇄성 폐 질환, 사이질성 폐렴, 폐 섬유증, 진폐, 기관지 천식, 호산구성 폐렴, ARDS(급성 호흡 곤란 증후군) 등의 폐 질환; 체액량 감소나 허혈에 따른 급성 신장 장애, ANCA 관련 신장염, 현미경적 다발 혈관염, 다발성 혈관염성 육아종증, 호산구성 다발성 혈관염성 육아종, 악성 고혈압, 클리오 글로불린 혈증, 감염 후 사구체 신장염, IgA 신장증 급성 간질성 신장염, 약제성 신장 장애, 골수종 신장, 통풍 신장, 횡문근 융해증, 급성 세뇨관 괴사 등의 급성 신장 장애; 막성 신장증, 막성 증식성 사구체 신장염, 미세 변화형 네프로제 증후군, 소상 사구체 경화증, 루푸스 신장염, 아밀로이드-시스 신장 경화증, 자반병성 신장염, IgG4 관련 신장 질환, 쇼그렌 증후군, 강피증 신장, 만성 간질성 신장염, 다발성 낭포성 신장 등의 만성 신장 질환; 황반 변성증, 시신경염, 포도막염 등의 안과 질환; 아토피성 피부염, 매끄러운 통증, 수포성 피부 질환, 스티븐스-존슨(Stevens-Johnson) 증후군 등 피부 질환; 중증 근무력증, 근 위축증, 변형성 관절증, 대퇴골머리 괴사, 골다공증, 수근관 증후군 등의 근육뼈 질환; 척수 손상, 뇌 좌상 등의 외상; 욕창 등의 창상, 구강 궤양, GVHD (이식편 대 숙주질환), 봉합 부전 장기의 손상을 들 수 있다. 본 발명의 의약이 적용되는 질환은 바람직하게는 당뇨병성 신장증, 급성 신장 장애, 만성 신장 질환, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신경 장애, 당뇨병성 괴저, 알츠하이머병, 당뇨병성 치매, 류마티스성 관절염, 다발성 근염 및 창상이다.
본 명세서에서 사용되는 치료 및/또는 예방은 질환 또는 증상의 치료, 일시적 관해, 예방 등을 목적으로 하는 의학적으로 허용되는 모든 유형의 치료적 및/또는 예방적 개입을 포함한다. 즉, 질환 또는 증상의 치료 및/또는 예방은 질병 또는 증상의 진행의 지연 또는 정지, 병변의 퇴축 또는 소실, 발병의 예방 또는 재발의 방지 등을 포함하는 다양한 목적의 의학적으로 허용되는 개입을 포함한다.
본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 의약을 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는 MSC를 이용한 세포 이식 요법이 효과적인 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법도 다른 양태로 포함한다. 본 실시 예에서 각 용어의 의미는 위에서 설명한 바와 같다.
이하의 실시예에 따라 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이러한 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 3차원 배양 담체에서 활성화 처리된 MSC의 제조
1) 활성화제의 제조
특허문헌 1에 설명된 대로 인간 태반 조직에서 활성화제를 제조하였다. 간략하게 세절된 인간 태반 조직을 습윤 중량 50 g에, 100 ㎖의 비율로 혈청 배지(alpha-MEM)에 넣어 4℃에서 72시간 진탕하였다. 원심분리로 상청을 회수하여 태반 조직 추출물인 활성화제를 얻었다.
2) 활성화 처리
변형성 고관절증 환자의 인공 관절 치환술시 채취한 골수 유래 MSC (OA-MSC)를 활성화제를 포함하지 않는 MSC 배양 배지(15% FBS, 1% 페니실린, 1% 스트렙토마이신 및 100 ㎎/dL 포도당을 함유하는 DMEM)에서 배양하였다. 세포를 회수하여 각각 3차원 배양 담체인 Preset VECELL 6웰(등록상표)(베셀 주식회사)에 8x104 세포/웰, Cellbed 24웰 (등록상표)(일본 바이린 주식회사)에 2x104 세포/웰, 3D-insert PS-200 12웰 및 3D-insert PS-400 12웰(3D 바이오텍사)에 3.8x104 세포/웰로 파종하고, MSC 배양 배지를 이용하여 37℃에서 72시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 단백질 환산으로 10 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖ 또는 0.1 ㎍/㎖의 상기 활성화제를 포함 또는 활성화제를 포함하지 않는 MSC 배양 배지를 각각 Preset VECELL 6 웰에 2 ㎖, Cellbed 24웰에 0.6 ㎖, 3D-insert PS-200 12웰 및 3D-insert PS-400 12웰에 1 ㎖씩 넣고 37℃에서 4일 배양하였다. 이 배양을 1 내지 3회 실시한 후, 세포를 회수하여 계대수 1 내지 3의 OA-MSC를 준비하였다.
또한 평판 모양의 2차원 세포 배양 담체인 코닝(등록상표) 코스타 (등록상표) 세포 배양 6웰 플레이트(써모 피셔 사이언스사)에 6x104 세포/웰로 파종하여 100 ㎍/㎖의 활성화제의 존재 또는 부존재 하에서 배양하였다. 이 배양을 1회 더 반복하여 계대수 2의 대조 OA-MSC를 준비하였다.
실시예 2: 3차원 배양 담체에서 활성화 처리된 OA-MSC의 유전자 발현 분석 및 양태 관찰
1) 유전자 발현 분석
실시예 1의 2)에서 준비한 각 OA-MSC에서 Tri 시약(몰레큘러 리서치 센터, 주식회사)을 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 역전사 반응으로 클론 DNA를 합성하고 OCT4, Nanog, SOX2, DNMT1, TERT, IL-6, IDO, TSG-6, p21, p53, α-SMA 및 18sRNA에 대하여 표 1에 나타낸 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용한 실시간 PCR을 수행하였다.
표 안의 (F)는 전방향 프라이머, (R)은 역방향 프라이머를 의미한다.
Figure pct00001
18sRNA를 하우스키핑 유전자로 하여 2차원 배양 담체에서 100 ㎍/㎖의 활성화제의 존재 하에서 배양한 대조 OA-MSC를 바탕으로 ΔΔCT 값을 산출하고, 유전자 발현 프로파일을 분석하여 클러스터화하였다. Preset VECELL에서 0.1 ㎍/㎖의 활성화제의 존재 하에서 배양한 OA-MSC (VECELL_0.1), Cellbed에서 0.1, 1 또는 10 ㎍/㎖의 활성화제의 존재 하에서 배양한 OA-MSC (각각 CellBed_0.1, CellBed_1, CellBed_10), 3D-insert PS-200에서 0.1 ㎍/㎖의 활성화제의 존재 하에서 배양한 OA-MSC (3D.insert200_0.1), 3D-insert PS-400에서 10 ㎍/㎖의 활성화제의 존재 하에서 배양한 OA-MSC (3D.insert400_10) 및 2차원 배양 담체에서 100 ㎍/㎖의 활성화제의 존재 하에서 배양한 대조 OA-MSC (2D_100)의 결과를 도 1에 나타내었다. 또한, 2차원 배양 담체에서 활성화제의 부존재 하에서 배양한 OA-MSC(2D_0)에 대한 2D_100 및 VECELL_0.1의 OCT4, SOX2 및 TERT의 상대적 유전자 발현량을 도 2에 나타내었다.
2D_100 및 2D_0과 비교하여 3차원 배양 담체에서 활성화 처리된 OA-MSC는 모두 줄기세포성에 관여하는 유전자인 DNMT1, Nanog, SOX2 및 OCT4, 면역 제어항염증 기능에 관여하는 유전자인 IDO, TSG6 및 IL-6, 텔로머라제 활성에 관여하는 유전자인 TERT의 발현량이 증가하고, 세포 노화에 관여하는 유전자인 P53, 세포 골격에 관여하는 유전자인 α-SMA의 발현량이 감소한 것으로 확인되었다. 이 결과는 치료 효과가 있는 MSC의 마커로 알려진 유전자군의 발현 경향이 2차원 배양 담체에서 활성화 처리된 MSC보다 3차원 배양 담체에서 활성화 처리된 MSC에서 강하게 나타난다는 것을 나타낸다.
2) 형태 관찰
다음으로, Preset VECELL에서 0.1 ㎍/㎖의 활성화제의 존재 또는 부존재 하에서 배양한 OA-MSC(MSC(3D·활성화제+) 및 MSC(3D·활성화제-)) 및 2차원 배양 담체에서 100 ㎍/㎖의 활성화제의 존재 또는 부존재 하에서 배양한 OA-MSC (MSC(2D·활성화제+) 및 MSC(2D·활성화제-))를 2.5% 글루타르알데히드 및 2% 파라포름알데히드를 포함하는 0.1M 인산 완충액으로 4℃에서 1시간 고정하고, 1% 오스뮴을 포함하는 0.1M 인산 완충액에서 1시간, 4℃에서 후고정하였다. 그 후, 탈수건조하여 금속 코팅을 하고 주사 전자 현미경으로 관찰하였다.
2차원 배양 담체에서 배양한 경우 활성화제의 첨가에 의해 MSC의 돌기 수가 증가하고 세포의 두께가 증가하며(도 3 하단), 또한 엑소좀으로 추정되는 소포가 더 많이 형성된다(도 4 하단). 3차원 배양 담체에서 활성화제를 첨가하지 않고 배양하면 MSC는 활성화제 존재 하에서의 2차원 배양과 동등 이상의 양태 변화를 보였다(도 3 좌측 상단 및 우측 하단, 도 4의 좌측 상단 및 우측 하단). 또한, 활성화제의 존재 하에 3차원 배양 담체에서의 배양은 MSC의 돌기 수를 비약적으로 증가시켜 네트워크 구조를 형성시키고(도 3의 우측 상단), 또한 소포 형성을 증가시켰다(도 4의 우측 상단). 또한, 도 4의 우측 상단의 MSC(3D·활성화제+)에서는 다량으로 형성된 소포가 방출된 흔적이 다수의 구멍으로 나타나고 있다.
3) 다른 배양 담체에서 활성화 처리된 OA-MSC의 유전자 발현 분석 및 형태 관찰
비교예의 배양 담체로 세포 배양 기재 A (평균 섬유 직경 0.1 ~ 0.5 ㎛, 공극률 70% 이하, 평균 구멍 면적 0.2 ㎛2, 24웰)를 이용하여 활성화제 농도 1 ㎍/㎖ 또는 0.1 ㎍/㎖로 실시예 1의 2) Cellbed 24웰의 경우와 같이, OA-MSC의 활성화 처리를 실시하였다. 기재 A는 그 일부에 섬유로 이루어진 3차원 구조를 가지고 있지만, 3차원 구조를 가지지 않는 평탄한 막 형태의 부분이 세포 접착면의 약 50%를 차지하는 기본 기재이다.
또 다른 3차원 배양 담체로 세포 배양 기재 B를 이용하여 OA-MSC의 활성화 처리를 실시하였다. 세포 배양 기재 B는 국제 공개 WO2016/068266호 공보 및 Liu L, Kamei K et al. Biomaterials 124 (2017) 47-54에 기재된 방법으로 제조되는 폴리 글리콜산으로 이루어진 베이스 부재에 폴리 글리콜산으로 이루어진 나노 섬유를 함유하는 3차원 배양 담체이다.
활성화제를 포함하지 않는 MSC 배양 배지 (15% FBS, 1% 페니실린, 1% 스트렙토마이신 및 100 ㎎/dL 포도당을 함유하는 DMEM)에서 OA-MSC를 배양하였다. 세포를 회수하고 2차원 배양 담체(코닝(등록상표) 코스타 (등록상표) 세포 배양 6웰 플레이트, 써모 피셔 사이언스사)에 2.5 ㎝x2.5 ㎝의 세포 배양 기재 B를 넣고 8x104 세포의 MSC를 파종하고 1 ㎍/㎖의 활성화제를 포함하는 MSC 배양 배지 2 ㎖를 첨가가하여 37℃에서 72시간 배양함으로써, 계대수 1의 활성화 처리된 MSC 시트를 제조하였다. 이 방법으로 제조된 MSC 시트는 대략 8,500 세포/㎠의 MSC를 포함한다.
기재 A와 B에서 MSC를 회수하여 각 유전자의 발현량을 실시간 PCR로 측정하고 이전의 실시간 PCR 결과와 함께 클러스터하였다. 결과를 도 5에 나타내었다. 기재 A에서 활성화 처리된 OA-MSC는 2D_100과 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타내어, 기재 A 상에서의 활성화 처리는 2차원 배양 담체에서의 활성화 처리와 같은 정도의 효과 밖에 가져 오지 않는 것이 확인되었다. 또한 기재 B에서 활성화 처리된 OA-MSC는 다른 3차원 배양 담체와 유사한 유전자 발현 프로파일을 보여 주고, 활성화 처리의 효과는 다른 3차원 배양 담체와 비슷한 것으로 추측되었다.
또한 기재 B에서 활성화 처리된 OA-MSC의 주사 전자 현미경 관찰 사진을 도 6에 나타내었다. 상기 Preset VECELL에서 활성화 처리를 한 OA-MSC와 마찬가지로 수많은 소포가 관찰되었다.
실시예 3: 3차원 배양 담체에 활성화 처리된 정상인 유래 MSC의 유전자 발현 분석
전방 십자 인대 파열 이외에 소견이 인정되지 않는 22세 여성에서 채취한 골수 유래 MSC(정상인 유래 MSC)를 활성화제를 포함하지 않는 MSC 배양 배지에서 배양하였다. 세포를 회수하여 Preset VECELL 6웰 (등록상표)(베델 주식회사)에 8x104 세포/웰로 파종하고 MSC 배양 배지를 이용하여 37℃에서 72시간 배양 하였다. 배지를 제거하고, 1 ㎍/㎖의 활성화제를 포함하는 MSC 배양 배지 2 ㎖를 첨가하여 배양함으로써 계대수 1의 활성화 처리된 정상인 유래 MSC (3D·활성화제+)를 제조하였다.
또한, 2차원 배양 담체 (코닝(등록상표) 코스타(등록상표) 세포 배양 6웰 플레이트, 써모 피셔 사이언스사)에 6x104 세포/웰로 정상인 유래 MSC를 파종하고 100 ㎍/㎖의 활성화제의 존재 또는 부존재 하에서 배양하였다. 이 배양을 1회 더 반복하여 계대수 2의 활성화 처리된 또는 활성화 처리되지 않은 정상인 유래 MSC(2D·활성화제+, 2D·활성화제-)를 제조하였다.
상기 3종의 MSC에서 각 유전자의 발현량을 실시예 2의 1)과 동일하게 실시간 PCR로 측정하였다. 활성화 처리되지 않은 MSC(2D·활성화제-)에 대한 활성화 처리된 MSC(2D·활성화제+ 및 3D·활성화제+)의 OCT4, SOX2 및 TSG-6의 상대적 유전자 발현량을 도 7에 나타내었다. 모든 유전자의 발현량이 2D·활성화제-, 2D·활성화제+, 3D·활성화제+ 순으로 높아졌으며, 특히 OCT4 및 TSG-6의 발현량은 3D·활성화제+에서 현저하게 높은 값을 나타내었다. 이것은 3차원 배양 담체에서의 활성화 처리가 질환 환자 유래의 MSC뿐만 아니라 정상인 유래의 MSC도 활성화시키고 그 치료 효과를 높일 수 있음을 시사한다.
실시예 4: 3차원 배양 담체에서 활성화 처리된 MSC의 치료 효과 (피부 결손)
10주령 레비스 랫트의 등에 3 ㎝x3 ㎝의 피부를 절제한 부위를 2개 마련하여 피부 결손 모델 랫트를 제작하였다. 피부 절제 1일 후에 실시예 1의 2)에서 조제한 MSC(2D·활성화제-)(5x105 세포/마리), MSC (2D·활성화제+)(5x105 세포/마리), MSC(3D·활성화제+)(1x105 세포/마리) 또는 PBS(비히클)를 랫트에 정맥 내 투여하여 21일 동안 사육하였다.
피부 절제 3일 후 및 7일 후 피부 결손 부위의 잔존 결손 면적을 측정하여 창상 치유 정도를 평가하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다. 또한, 7일 후 피부 결손 부위를 촬영한 사진을 도 9에 나타내었다. MSC(3D·활성화제+)를 투여한 랫트에서는 MSC(2D·활성화제+)를 투여한 랫트와 비교하여 투여한 세포 수가 1/5임에도 불구하고 창상 치유가 빠른 것으로 확인되었다.
또한, 피부 절제 21일 후에 피부 결손 부위의 주위 2 ㎝x2 ㎝의 피부를 랫트에서 적출하고 정밀 만능 시험기(AG-1)(주식회사 시마즈 제작소)를 이용하여 피부의 파단 응력을 측정하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다. MSC (3D·활성화제+)를 투여한 랫트의 피부 조직은 MSC(2D·활성화제+)를 투여한 랫트의 피부 조직과 비교하여 투여한 세포 수가 1/5임에도 불구하고 더 높은 파단 응력이 있는 것으로 확인되었다.
실시예 1에서 활성화에 사용된 활성화제의 농도를 바탕으로 인간의 태반 1개에서 제조되는 활성화제를 이용하고, 활성화된 MSC로 치료 등을 할 수 있는 인간 환자 수를 계산하면 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖지 않는 세포 배양 담체를 이용한 활성화에서는 약 10명인 반면, 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖는 세포 배양 담체를 이용한 활성화에서는 약 10,000명이 될 것으로 추정되었다.
또한, 실시예 4에서 확인된 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖는 세포 배양 담체를 이용하여 활성화된 MSC의 높은 치료 효과는 투여 세포수가 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖지 않는 2차원 배양 담체를 이용하여 활성화된 MSC의 투여 세포 수의 1/5 인 것을 고려하면 치료 및/또는 예방에 필요한 세포수를 크게 감소시킬 수 있게 한다. 이는 투여 시간의 단축 및 부작용의 감소 등 환자의 치료 부담의 경감이라는 장점을 가지고. 또한 필요한 세포수를 확보하기 위한 계대 배양의 계대 횟수를 줄일 수 있어 세포 생산 기간의 단축 및 비용 절감 등의 이점을 가져온다.
실시예 5: 3차원 배양 담체에서 활성화된 MSC의 치료 효과 (인지 기능)
Preset VECELL 6웰(등록상표)(베델 주식회사)에 8x104 세포/웰의 OA-MSC를 파종하고 MSC 배양 배지를 이용하여 37℃에서 72시간 배양하였다. 배지를 제거하고, 0.1 ㎍/㎖의 활성화제를 포함하는 MSC 배양 배지를 2 ㎖/웰로 첨가하여 37℃에서 4일 동안 배양한 후 세포를 회수하여 계대수 1의 활성화 처리된 OA-MSC(3D·활성화제+)를 제조하였다. 또한, 2차원 배양 담체 (코닝(등록상표) 코스타(등록상표) 세포 배양 6웰 플레이트, 써모 피셔 사이언스사)에 6x104 세포/웰로 OA-MSC를 파종하고, 활성화제를 포함하지 않는 MSC 배양 배지를 1.3 ㎖/웰로 첨가하여 37℃에서 4일 동안 배양하여 계대수 1의 미처리 MSC(2D·활성화제-)를 제조하였다.
17월령의 웅성 APP/PS1 마우스(찰스 리버)에 상기에서 제조한 MSC(2D·활성화제-)(2.5x104 세포/마리) 또는 MSC(3D·활성화제+)(2.5x104 세포/마리)를 골수강 내에 투여하여 28일 동안 사육하였다. 골수강 내 투여 21일 후부터 6일 동안 모리스 물 미로 시험을 실시하였다. 모리스 물 미로 시험에서 물(25±1℃)이 담긴 원형 수영장(직경 1.2 m)의 가장자리에 마우스를 넣고, 마우스의 다리가 수면 바로 아래에 설치된 접지 가능한 플랫폼(직경 10 ㎝)에 도달하는 시간을 측정하였다. 플랫폼의 위치는 일정하게 하고, 마우스를 넣는 위치를 바꾸면서 1일 4회씩 5일 동안 시행하여 플랫폼의 위치를 학습하는 능력을 평가하였다(숨겨진 플랫폼 시험). 숨겨진 플랫폼 시험(Hidden platform tests) 종료 다음날 수영장에서 플랫폼을 제거하고 총 유영 시간(60초)에 대한 숨겨진 플랫폼 시험에서 플랫폼이 있던 4분할 영역에서 유영하는 시간의 비율을 측정하여 마우스의 기억 능력을 평가하였다(프로브 시험(probe test)).
모리스 물 미로 학습 시험 결과를 도 11에, 기억 테스트의 결과를 도 12에 나타내었다. MSC(3D·활성화제+)를 투여한 마우스는 MSC(2D·활성화제-)를 투여한 마우스와 비교하여 학습 능력과 기억 능력이 높고, MSC(3D·활성화제+)의 높은 치료 효과가 확인되었다.
실시예 6: 3차원 배양 담체에서 활성화된 MSC의 치료 효과 (당뇨병성 신장증)
당뇨병성 신장증을 앓고 있는 14월령 수컷 OLETF 랫트(호시노 시험 동물)에 리툭시맙(중외제약) 5 ㎎/마리를 1일 1회, 4일 동안 꼬리 정맥에 투여하였다. 리툭시맙 첫 회 투여에서 10 내지 14일 후, 실시예 2의 3)에서 기재 B를 이용하여 제조한 MSC 시트를 리툭시맙을 투여한 랫트의 신장에 이식하였다(3D활성화제+MSC군, n=6). 리툭시맙 투여만을 비히클(Vehicle)로 하였다(비히클군, n=7). 이소플루란 흡입 마취 하에서, 옆으로 누운 랫트의 최하위 갈비뼈 아래에서 피부 절개를 넣고 근층을 절개하여 한쪽 신장을 체외로 끌어냈다. 게로타 근막, 지방층 및 섬유 피막을 부신을 손상하지지 않도록 조심스럽게 절개하여 신장 표면에서 벗겨 내고 신장 문부로 끌어 당겼다. 2.5 ㎝x2.5 ㎝의 MSC 시트 1장 및 1/3로 자른 동일한 MSC 시트 1장을 신장 전체에 감싸듯이 부착하였다. 다른 신장에도 동일하게 MSC 시트를 부착하였다. MSC 시트를 이식한 날, 이식 후 3주 및 6주 때 랫트에서 혈액을 채취하고 효소법 (SRL)을 이용하여 혈청 크레아티닌을 측정하였다.
이식 후 11주 동안 생존한 동물(비히클군, 3D활성화제+MSC군 모두 n=2)의 혈청 크레아티닌의 추이를 도 13에 나타내었다. 비히클군에서는 혈청 크레아티닌의 시간 경과적 상승이 인정되는 반면, 3D활성화제+MSC군에서는 혈청 크레아티닌 수치의 상승은 인정되지 않았다. 또한 이식 후 11주까지의 생존율을 나타내는 카플란 마이어 곡선을 도 14에 나타내었다. 3D활성화제+MSC군은 비히클군에 비해 높은 생존율을 보였다.
본 시험에서 사용한 랫트는 당뇨병성 신장증과 더불어 항암제 치료에 의해 더욱 급성 신장 손상을 유도할 수 있는 정도를 갖춘 심각한 만성 신장 질환을 발병하는 모델 동물이며, 신장증 제4기(신부전 기)에 해당하는 매우 심각한 말기 신장 장애를 보이고 있었다. 3차원 배양 담체에 활성화된 MSC 시트는 이 같은 심각한 질병에 대해서도 치료 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 7: 활성화 처리된 OA-MSC의 치료 효과 마커 유전자의 발현 분석
1)MSC의 활력화 처리
변형성 고관절증 환자(n=13)의 인공 고관절 치환 수술시에 채취한 골수에서 유래한 MSC(OA-MSC)를 활성화제를 포함하지 않는 MSC 배양 배지(15% FBS, 1% 페니실린, 1% 스트렙토마이신 및 100 ㎎/dL 포도당을 함유하는 DMEM)에서 배양하였다. 세포를 회수하여 코닝(등록상표) 코스타(등록상표) 세포 배양 6웰 플레이트(써모 피셔 사이언스사)에 6x104 세포/웰로 파종하고 활성화제를 포함하거나 또는 활성화제를 포함하지 않는 MSC 배양 배지를 1.3 ㎖/웰로 첨가하여 37℃에서 4일 동안 배양하였다. 이 배양을 1회 더 반복하여 계대수 2의 활성화 처리된 OA-MSC 및 미처리된 OA-MSC을 제조하였다.
또한 전방 십자 인대 파열 이외에 소견이 인정되지 않는 22세 여성에서 채취한 골수 유래 MSC(정상인 MSC)를 상기 OA-MSC와 마찬가지로 배양, 활성화 처리를 함으로써, 활성화 처리된 정상인 MSC 및 미처리된 정상인 MSC를 제조하였다.
2) 유전자 발현 분석
상기 1)에서 제조한 각 OA-MSC에서 각 유전자(OCT4, Nanog, SOX2, DNMT1, TERT, IL-6, IDO, TSG-6, p16ink4a, RB, p21, p53, α-SMA, 18sRNA)의 발현량을 실시예 2의 1)과 마찬가지로 실시간 PCR로 측정하였다.
18sRNA를 하우스키핑 유전자로 하여 미처리 OA-MSC를 바탕으로 활성화 처리된 OA-MSC에서 각 유전자 발현의 ΔΔCT 값을 산출하고, 유전자 발현 프로파일을 분석하여 클러스터하였다. 10개 증례의 OA-MSC에 대한 분석 결과를 도 15에 나타내었다.
또한, 동일한 증례의 OA-MSC를 이용하여 표 2에 나타낸 염기서열로 이루어진 프라이머를 이용한 실시간 PCR로 p14ARF 및 CD47 유전자의 발현량을 측정하고 먼저 측정한 유전자 발현의 결과와 함께 클러스터하였다. 결과를 도 16에 나타내었다.
Figure pct00002
이러한 결과로부터 분리원인 환자마다 MSC의 유전자 발현 프로파일이 다르고, MSC가 분리된 환자마다 활성화 처리에 반응성이 다른 것으로 밝혀졌다.
또한, MSC의 치료 효과의 부정적인 마커로 여겨졌던 p16ink4a 및 p14ARF는 놀랍게도 MSC의 치료 효과의 긍정적인 마커로 알려진 DNMT1, Nanog, SOX2, OCT4, IDO, TSG6 및 TERT와 동일한 클러스터에 속해 있었다. 9증례의 OA-MSC에서, OCT4, SOX2, Nanog, IDO 및 TSG6 유전자의 상대적 발현량과 p16ink4a 유전자의 상대적 발현량과의 상관 관계를 도 17에, p14ARF의 상대적 발현량과 p16ink4a 유전자의 상대적 발현량과의 상관 관계를 도 18에 나타내었다. OCT4, SOX2, Nanog, IDO 및 TSG6과 p16ink4a 및 p14ARF와 및 p16ink4a에는 높은 상관 관계가 나타났다.
또한, p16ink4a의 하류 인자인 CDK4, CDK6 및 RB, 및 세포 치료에 사용하는 세포에서 발현하는 것이 바람직하다고 생각되었던 CD47 유전자 발현은 p16ink4a과는 반대 경향을 나타내고 있었다. 실시간 PCR로 측정한 3가지 경우 OA-MSC(BM-021, BM-022, BM-023)에서 OCT4, p16ink4a 및 RB 유전자의 상대적 발현량을 도 19에 나타내었다. 모든 MSC에서 활성화 처리에 의해 OCT4 및 p16ink4a 발현은 증가한 반면, RB 발현은 감소하였다.
이 3개 증례의 OA-MSC의 총 RNA에 대하여 어피매트릭스 클라리옴 (Affymetrix Clariom)(등록상표) S 어레이를 사용하여 마이크로어레이 분석을 실시하였다. 데이터는 어피매트릭스 트랜스크립톰 분석 콘솔 (Affymetrix Transcriptome Analysis Console)(TAC) 소프트웨어를 사용하여 분석했다. 어느 MSC에서도 활성화 처리에 의해 CDK6의 발현량은 약 2.04배 감소하였다(데이터는 도시하지 않음).
활성화 처리에 의한 상기 인자의 발현 변화의 경향은 정상인 MSC에서도 인정되고, 예를 들어 SOX2 및 p16ink4a의 유전자 발현량은 활성화 처리에 의해 2배 이상 증가하였다(데이터는 도시하지 않음). 이상에서 p16ink4a는 상기 알려진 인자와 마찬가지로 MSC의 치료 효과의 긍정적인 마커로, 또한 CDK4, CDK6 및 RB는 치료 효과의 부정적인 마커로 사용될 수 있는 것이 시사되었다.
실시예 8: 3차원 배양 담체에서 활성화 처리된 OA-MSC의 치료 효과 마커 유전자의 발현 분석
1) OCT4, SOX2 및 p16ink4a
OA-MSC를 이용하여 3차원 배양 담체에서의 활성화 처리에 의한 유전자 발현의 변화를 분석하였다. Preset VECELL 6웰 (등록상표)(베델 주식회사)에 8x104 세포/웰로 OA-MSC를 파종하고, MSC 배양 배지를 이용하여 37℃에서 72시간 배양하였다. 배지를 제거하고, 0.1 ㎍/㎖의 활성화제를 포함 또는 활성화제를 포함하지 않는 MSC 배양 배지를 2 ㎖/웰로 첨가하여 37℃에서 4일 동안 배양한 후 세포를 회수하여 계대수 1의 활성화 처리된 OA-MSC 및 미처리된 OA-MSC를 준비하였다. 이들 OA-MSC에서 각 인자의 발현량을 실시간 PCR로 측정하였다.
1개 증례의 OA-MSC(BM-010)에서 OCT4, SOX2 및 p16ink4a 유전자의 상대적 발현량을 도 20에 나타내었다. 실시예 7의 2차원 배양 담체에서의 활성화 처리와 마찬가지로 3차원 배양 담체에서 활성화 처리를 하여도 각 인자의 발현량이 증가하는 것이 확인되었다.
2) CD47
류마티스 관절염 환자, 72세 남성, 간경변 환자 및 38세 남성으로부터 채취한 골수 유래 MSC(각각 RA, 고령자(Aged), 간경변, 청년(Young))를 이용하여 2종의 활성화제 농도(1 ㎍/㎖, 0.1 ㎍/㎖)에서 상기 1)로 동일하게 3차원 배양 담체에서 활성화 처리를 하여 계대수 1의 활성화 처리된 MSC를 준비하였다. 또한, 2차원 배양 담체(코닝(등록상표) 코스타(등록상표) 세포 배양 6웰 플레이트, 써모 피셔 사이언스사)에 동일한 MSC를 6x104 세포/웰로 파종하고 활성화제를 포함하지 않는 MSC 배양 배지를 1.3 ㎖/웰로 첨가하여 37℃에서 4일 동안 배양하여 계대수 1의 미처리 MSC를 준비하였다.
이들 MSC의 CD47 유전자 발현량을 실시간 PCR로 측정하였다. 미처리 MSC에 대한 3차원 배양 담체에서 활성화 처리한 MSC의 CD47의 상대적 유전자 발현량을 도 21에 나타내었다. 모든 MSC에서 활성화 처리에 의하여 CD47 유전자 발현량은 감소하고 그 경향은 류마티스 관절염 환자, 72세 남성, 간경변 환자의 MSC에서 더 뚜렷하였다. 질환을 가진 대상 및 노인의 MSC는 일반적으로 치료 효과가 낮은 것을 고려하면 CD47은 치료 효과의 부정적인 마커로 사용될 수 있는 것이 시사되었다.
실시예 9: 세포 표면 마커 CD47의 발현 분석
38세 남성과 72세 남성으로부터 채취한 골수 유래 MSC (각각 청년 MSC, 고령자 MSC)를 이용하여 활성화제 농도 0.1 ㎍/㎖에서 실시예 8의 2)와 같은 방법으로 계대수 1의 활성화 처리된 MSC 및 미처리 MSC를 준비하였다. 이들 MSC는 죽은 세포를 염색하기 위해 좀비 바이올렛(Zombie Violet)(상표) 염료 (Biolegend)와 반응시킨 FITC 항-인간 CD47 항체(바이오레전드)로 분류하고, FACSCanto(상표) II (BD 바이오사이언스)로 유동세포 계측법 분석을 실시하였다. 음성 대조군은 아이소타입 대조군(isotype control) 또는 2차 항체만 반응시킨 MSC를 사용하였다. 데이터 분석은 FACSDiva(상표)(BD 바이오사이언스) 및 Kaluza V1.5a (베크만 쿨터)로 수행하였다.
미처리 MSC의 결과를 도 22에 나타내었다. 신호 강도가 음성 대조군에서 검출된 신호 강도보다 높은 MSC는 CD47 양성, 음성 대조군에서 검출된 신호 강도보다 낮은 MSC는 CD47 음성으로 판정하였다. 청년 MSC에서 CD47 양성 세포율, 즉 해당 MSC 집단의 CD47 양성 MSC의 비율은 2.34%로 낮은 값인 반면, 고령자 MSC에서 CD47 양성 세포율은 90.10%라는 높은 값을 보여 주었다.
활성화 처리된 MSC의 결과를 도 23에 나타내었다. 청년 MSC, 고령자 MSC 모두에서 활성화 처리에 의해 CD47 양성 세포율은 저하되고, 특히 고령자 MSC에서 현저한 저하를 보였다. 고령자 MSC는 일반적으로 질병 치료 효과가 낮은 것을 고려하면 CD47은 치료 효과의 부정적인 마커로 사용될 수 있는 것이 시사되었다.
실시예 10: p16ink4a 고발현 MSC의 기능 평가 (대식세포에 대한 작용)
실시예 7의 1)에서 활성화 처리를 한 OA-MSC 중 발현 변화의 정도가 다른 3가지 경우의 OA-MSC(BM-008, BM-021, BM-005)에 대하여 기능 평가를 실시하였다. 이러한 OA-MSC에서 p16ink4a 유전자의 상대적 발현량을 도 24에 나타내었다. p16ink4a 발현량은 BM-008에서는 활성화 처리에 의해 약 1.4배, BM-021에서는 약 1.6배 증가한 반면, BM-005에서는 0.2배 정도 감소하였다.
활성화 처리된 상기 3종의 OA-MSC 및 이에 대응하는 미처리 OA-MSC, 총 6종의 MSC를 마우스 대식세포주인 RAW264.7와 공동 배양하였다. 세포 배양 인서트(Falcon(등록상표))에서 인서트의 막 부분에 PKH 적색 색소로 염색한 MSC를 2x104 세포로 파종하고, 플라스틱 플레이트 부분에 PKH 녹색 색소로 염색한 2x105 세포의 RAW264.7 세포를 파종하여 DMEM 배지를 이용하여 37℃에서 24시간 공동 배양하였다.
공동 배양 종료 후 인서트의 막에서 MSC를 트립신으로 떼어 내고, RAW264.7 세포가 존재하는 플라스틱 플레이트 부분으로 옮겨 접촉 공동 배양을 24시간 실시하였다. 접촉 공동 배양 후 4% 파라포름알데히드로 고정하고 유동세포 계측법 분석을 실시하였다.
유동세포 계측법 분석에 의해 PKH 적색과 PKH 녹색의 이중 양성을 나타내는 세포가 죽은 세포를 제외한 단핵세포의 총수에서 차지하는 비율을 도 25에 나타내었다. 이중 양성 세포는 MSC 유래의 죽은 세포 파편을 탐식한 대식세포에 해당하는 세포인 것으로 간주하기 때문에 이러한 세포수의 증가는 대식세포의 탐식 기능의 항진을 의미한다. 이중 양성 세포의 비율은 BM-008 및 BM-021에서는 활성화 처리에 의해 증가한 반면, BM-005에서는 감소하였다.
또한, 공동 배양 후 RAW264.7 세포를 회수하여 Tri Reagent (몰레큘러 리서치 센터, 주식회사)로 총 RNA를 추출하였다. 역전사 반응으로 클론 DNA를 합성하고 M1 대식세포 마커인 Fpr2 (Formyl Peptide Receptor-2)의 발현량을 다음의 프라이머 세트를 이용한 실시간 PCR로 측정하였다.
Fpr (F): 5'-TCTACCATCTCCAGAGTTCTGTGG-3' (배열번호 33)
Fpr (R): 5'-TTACATCTACCACAATGTGAACTA-3' (배열번호 34)
OA-MSC(BM-008, BM-021, BM-005)와 공동 배양한 RAW264.7 세포에서 Fpr의 상대적 발현량을 도 26에 나타내었다. Fpr 발현량은 BM-008 및 BM-021에서는 활성화 처리에 의해 증가한 반면, BM-005에서는 변화가 없었다.
최근 기존에 만성 염증성 질환으로 알려져 있던 질환 이외에 다양한 질환에서도 만성 염증의 관여가 확인되고 있다. 만성 염증이 관여하는 질환으로는 만성 염증성 질환뿐만 아니라 알레르기성 질환, 자가 면역 질환, 암, 동맥 경화성 질환 (허혈성 심장 질환, 뇌졸중 등), 신경 퇴행성 질환 (알츠하이머병), 대사증후군생활·습관 질환(비만, 당뇨병, 고지혈증, 만성 신장 질환, 비알코올성 지방간염 등), 배뇨 장애 등을 들 수 있고, 심지어 노화에서도 만성 염증의 관여가 알려져 있다.
급성 염증에서 염증 초기에 M1 대식세포가 증가하고 수명이 끝난 노화 세포나 손상된 세포 등 다양한 세포를 탐식한다. M1 대식세포의 탐식에 의한 제거 후 조직에는 M2 대식세포가 출현하고, 사이토카인 등의 자극을 받아 주변 세포에서의 콜라겐 등의 생성을 촉진하고 조직을 복구에 이르게 하는 것으로 생각된다. 한편, 만성 염증에서는 M2 대식세포가 우위인 상태가 계속되어 섬유아세포 등 다양한 세포가 탐식에 의해 제거되지 않고 계속 존재하기 때문에 조직 복구가 일어나지 않고 염증이 계속되어 조직의 섬유화가 조장되는 것으로 생각되고 있다(J.G.Tidbal et al., Nature Medicine 2015, vol.21, p.665-666; X.M.Meng et al., Nature Reviews Nephrology 2014, vol. 10, p.493-503; A.Pellicoro et al., Nature Reviews Immunology 2014, vol.14, p.181-194). 만성 염증이 관여하는 질환의 치료에는 M1 대식세포가 우위인 상태를 유도하는 것이 중요하다고 추측되며, 따라서 M1 대식세포의 증가는 이러한 만성 염증이 관여하는 질환에서 치료 효과의 지표로 이용될 수 있다.
실시예 10의 시험에 따르면, 활성화 처리에 의해 p16ink4a 발현량이 증가한 MSC는 공동 배양한 대식세포의 탐식 기능을 높여 M1형으로의 전환을 유도했지만, 활성화 처리에 의해 p16ink4a 발현량이 감소한 MSC는 대식세포에 대해 이러한 작용을 나타내지 않는 것으로 확인되었다. M1 대식세포의 증가는 만성 염증이 관여하는 질환에서 치료 효과의 지표로 이용될 수 있는 것으로부터, 활성화 처리에 의해 p16ink4a 발현량이 증가한 MSC는 활성화 처리에 의해 치료 효과가 증가한, 즉 활성화된 반면, 활성화 처리에 의해 p16ink4a 발현량이 감소한 MSC는 활성화 처리에 의해 치료 효과가 증가하지 않는, 즉 활성화되지 않은 것으로 여겨졌다.
실시예 11: p16ink4a 고발현 MSC의 기능 평가 (다발성 근염)
1) 국소 투여
활성화 처리에 의해 p16ink4a 발현량이 증가한 OA-MSC(BM-021)를 이용하여 만성 염증이 관여하는 질환인 다발성 근염에 대한 치료 효과를 확인하였다. BM-021의 OCT4, SOX2 및 p16ink4a 유전자의 상대적 발현량을 도 27에 나타내었다. 모든 인자가 활성화 처리에 의해 발현량이 증가하였다.
8주령의 Balb/c 마우스의 림프절 근처에 다른 Balb/c 마우스의 골격근에서 준비한 미오신 분획(1 ㎎/마리)과 완전 프로인트 보조제(콘드렉스사, 200 ㎍/마리)와의 에멀젼을 투여하고, 동시에 백일해 독소(리스트 바이오로지컬 래보래토리스사, 500 ng/마리)를 복강 투여하여 면역을 실시하였다. 첫 회 면역 1주 후 및 2주 후, 상기 에멀젼을 마우스 림프절 근처에 투여하여 추가 면역을 실시함으로써 다발성 근염 모델 마우스를 제작하였다. 첫 회 면역에서 4주 후, 마우스를 3개 군(n=9)으로 나누어 실시예 7에서 제조한 활성화 처리된 MSC(1x105 세포/마리의 BM-021), 미처리 MSC (1x105 세포/마리의 BM-021) 또는 PBS(비히클)을 후지 종아리 삼두근에 국소 투여하였다.
MSC 투여 2일 후 하퇴 삼두근을 채취하고, 콜라게나제 효소 처리 후에 RBC 용해 버퍼로 적혈구를 제거하고 단세포 현탁액을 만들었다. 이후 죽은 세포 마커(Zonbi Dye), PE-Cy7-CD11b 항체, APC-F4/80 항체, FITC-Ly6C 항체로 항원 항체 반응을 실시하여 유동세포 계측법 분석을 수행하했다. 그 결과를 도 28에 나타내었다. 활성화 처리된 MSC를 투여한 마우스(PE+)에서는 미처리 MSC를 투여한 마우스(PE-)와 비교하여 총 마크로파지 및 M1 대식세포의 비율이 유의하게 증가하였다.
MSC 투여 7일 후 및 13일 후에, 다음과 같이 후지 근육 기능 평가를 실시하였다. 마우스의 경부와 꼬리를 잡고, 직경 1 ㎜의 금속제 와이어에 후지를 올리고, 마우스가 양쪽 후지로 금속제 와이어를 파지(꽉 쥐는 것)하는 것을 육안으로 확인 후, 마우스가 금속제 와이어를 파지할 수 없게 될 때까지 마우스를 와이어로부터 떼어 놓았다. 파지할 수 없게 된 시점의 견인력(gram)을 후지 근력으로 기록하였다. 견인력은 전자 저울로 측정하고, 그 분해능은 0.01 g이었다(A&D사). 측정은 각 마우스당 3회 실시하고 그 중간값을 대표값으로 사용하였다. 결과를 도 29에 나타내었다. PE+ 마우스는 PE- 마우스에 비해 후지 근육 기능이 더욱 향상되었다.
2) 전신 투여
다음으로 활성화 처리에 의해 p16ink4a 발현량이 증가한 OA-MSC(BM-008)를 이용하여 다발성 근염에 대한 치료 효과를 확인하였다. BM-008의 OCT4, SOX2 및 p16ink4a 유전자의 상대적 발현량을 도 30에 나타내었다. BM-021과 마찬가지로 모든 인자가 활성화 처리에 의해 발현량이 증가하였다.
상기 1)과 마찬가지로 다발성 근염 모델 마우스를 제작하여 첫 회 면역에서 4주 후, 실시예 7에서 제조한 활성화 처리된 MSC(1x106 세포/마리의 BM-008), 미처리 MSC (1x106 세포/마리의 BM-008) 또는 PBS(비히클)를 정맥 투여하였다. MSC 투여 0, 7 및 14일 후, 다음과 같이 역상 스크린 테스트(inverted screen test)에 의한 근육 기능 평가를 실시하였다. 직경 1 ㎜, 그물코 5 ㎜의 금속 메쉬 위에 마우스를 올려 놓고 금속 메쉬를 거꾸로 하여 앞후지로 매달려 있는 시간을 측정하였다. 마우스의 체중(gram)과 매달려 있는 시간(초)의 곱을 근육 기능 데이터로 했다. 미처리 MSC를 투여한 마우스(PE-MSC)와 비교하여 활성화 처리된 MSC를 투여한 마우스 (PE+MSC)는 근육 기능이 더욱 향상되었다(도 31).
MSC 투여 14일 후에 채취한 마우스 근육 조직의 HE 염색 이미지의 한 예를 도 32에 나타내었다. PE+MSC 마우스에서는 PE-MSC 마우스와 비교해 근육 조직에 염증 세포의 침윤이 적었다. 또한, MSC 투여 14일 후에 채취한 마우스 근육 조직(각 군 n=3)에 대하여 근단 면적을 분석하였다. 근단 면적은 8 ㎛의 동결 절편을 만들고, 1차 항체로 토끼 항라미닌 항체(에이비캠사), 2차 항체로 항토끼 Cy3 표지 항체를 이용하여 염색하여 공초점 현미경(니콘사)으로 이미지 데이터를 취득하였다. 라미닌은 근육 기저막을 검출하기 때문에 라미닌으로 둘러싸인 폐쇄 공간이 근단 면적이 된다. 폐쇄 공간의 면적은 이미지J를 사용하여 이미지 데이터로부터 계산하였다. 미처리 MSC를 투여한 마우스(MSC PE-)와 비교하여 활성화 처리된 MSC를 투여한 마우스(MSC PE+)는 근단 면적이 더 컸다(도 33).
상기 1), 2)와 같이 활성화 처리에 의해 p16ink4a 발현량이 증가한 MSC는 미처리 MSC와 비교하여 총 마크로파지 및 M1 대식세포의 비율을 증가시키고, 또한 염증에 의해 손상된 조직의 복구를 촉진하는 것이 확인되었다. 이는 MSC의 p16ink4a 유전자의 발현 항진이 MSC의 활성화, 즉 치료 효과의 상승과 상관 관계가 있는 사항임을 의미하는 것이다.
실시예 12: p16ink4a 고발현 MSC의 기능 평가 (피부 결손)
실시예 4에서 랫트에 투여한 3종의 MSC에 대해 OCT4, SOX2 및 p16ink4a의 유전자 발현량을 실시간 PCR로 측정하였다. 2차원 배양 담체에서 활성화제의 부재 하에서 배양한 MSC(PE-(2D))에 대한 상대적인 발현량을 도 34에 나타내었다. 활성화 처리에 의해 각 인자의 발현량은 증가하고 특히 3차원 배양 담체를 사용할 때 현저하게 증가하였다. 실시예 4에서 확인된 창상 치유 효과의 경향에서 p16ink4a의 발현량이 증가한 MSC는 미처리 MSC와 비교하여 보다 신속하게 창상 치유를 가져오는 것-특히 p16ink4a의 발현량이 크게 증가한 MSC는 세포수가 적어도 매우 높은 창상 치유 능력이 있음이 확인되었다.
실시예 13: p16ink4a 고발현 MSC의 기능 평가 (당뇨병성 신장증)
실시예 6에서 랫트에 투여한 MSC 대해 OCT4, SOX2, Nanog, p16ink4a, p14ARF, IDO, α-SMA 및 TERT의 발현량을 실시간 PCR로 측정하였다. 2차원 배양 담체에서 활성화제의 부재 하에서 배양한 MSC에 대한 상대적인 발현량을 도 35에 나타내었다. 3차원 배양 담체에서 활성화 처리에 의해 OCT4, SOX2, Nanog, p16ink4a, p14ARF, IDO 및 TERT의 발현량은 증가하고, α-SMA의 발현량은 감소하였다. 실시예 6에서 확인된 신장증 치료 효과에서 p16ink4a 및 p14ARF의 발현량이 증가한 MSC는 높은 신부전 치료 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 14: p16ink4 결손 MSC의 기능 분석 (다발성 근염)
1) p16ink4a 녹아웃 MSC의 준비
OA-MSC에서 채취한 골수 유래 MSC에 대해 p14ARF/p16 CRISPR/Cas9 KO 플라스미드(산타 크루즈 바이오테크놀로지)를 이용하여 p16ink4a 및 p14ARF을 암호화하는 CDKN2A 유전자 녹아웃을 실시하였다. CDKN2A 유전자 녹아웃을 위한 표적 gRNA을 통합시킨 CRISPR/Cas9 녹아웃 플라스미드 또는 대조군으로 표적 gRNA 대신 스크램블 gRNA을 통합시킨 스크램블 플라스미드를 MSC에 형질주입 (transfection)하였다. 이들 MSC를 실시예 8의 2)와 같이 활성화 처리를 받게 한 후 1차 항체로 항 p16ink4a 항체(항-p16INK4A 인간, 프로테인테크)를 반응시키고, 2차 항체로 알렉사 647 항-토끼 IgG(잭슨)를 이용하여 표지하고 면역 염색하였다.
MSC의 형광 관찰 사진을 도 36에 나타내었다. 녹아웃 플라스미드를 도입한 MSC(녹아웃 MSC)에서만 p16ink4a의 형광이 관찰되지 않는 것으로부터 당해 MSC는 p16ink4a 녹아웃인 것이 확인되었다.
2) 다발성 근염 모델 마우스에서 MSC의 치료 효과
실시예 11의 1)과 동일하게 하여 상기 1)의 활성화 처리 후의 녹아웃 MSC, 스크램블 MSC 또는 PBS를 다발성 근염 모델 마우스의 종아리 삼두근에 국소 투여하여 치료 효과를 평가하였다. MSC 투여 11일 후에 채취한 마우스 근육 조직의 라미닌 염색 이미지의 일 예 및 근단 면적의 해석 결과를 도 37에 나타내었다. PBS를 투여한 마우스(비히클)에 비해 스크램블 MSC를 투여한 마우스(SC)의 근단 면적은 증가했지만, 녹아웃 MSC를 투여한 마우스(CDKN2A KO)에서 근단 면적의 증가는 없었다. 이처럼 p16ink4a를 제거한 MSC는 치료 효과가 감소하는 것이 확인되었고, p16ink4a는 치료 효과의 긍정적인 마커가 될 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 15: CD47 고발현 MSC의 기능 평가 (피부 결손)
1) CD47 고발현 MSC의 준비
38세 남성으로부터 채취한 골수 유래 MSC에 대해 CD47 CRISPR 활성화 플라스미드(산타 크루즈 바이오테크놀로지)를 이용하여 CD47을 활성화시키기 위한 표적 gRNA를 포함하는 플라스미드를 형질주입하여 CD47을 과다 발현시킨 MSC를 제조하였다.
2) 피부 결손 모델 마우스에서 MSC의 치료 효과
35주령의 Balb/c 마우스의 등에 1.5 ㎝x1.5 ㎝의 피부를 절개한 부위를 2 개 마련하여 피부 결손 모델 마우스를 제작하였다. 피부 절제 1일 후에 상기 1)에서 제조한 MSC (2.5x104 세포/마리), 플라스미드를 형질주입하지 않은 대조 MSC (2.5x104 세포/마리) 또는 PBS(비히클)를 마우스에 정맥 투여하여 9일 동안 사육하였다.
피부 절제 후 3일차부터 9일까지 창상 면적의 변화량 및 9일차의 피부 결손 부위를 촬영한 사진을 도 38에 나타내었다. CD47 과발현 MSC를 투여한 마우스(CD47활성화)는 대조 MSC를 투여한 마우스(대조군)와 비교하여 창상 면적의 변화량이 작은, 즉 창상 치유가 느린 것으로 확인되어 CD47이 치료 효과의 부정적인 마커가 될 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 16: CD47 발현량이 다른 MSC의 기능 평가 (인지 기능)
1) CD47 발현량이 다른 MSC의 준비
OA-MSC에서 채취한 골수 유래 MSC를 이용하여 활성화제 농도 0.0001 ㎎/㎖에서 실시예 8의 2)와 동일한 방법으로 3차원 배양 담체에서 활성화 처리를 하여 계대수 1의 활성화 처리된 MSC를 준비하였다. 또한, 2차원 배양 담체 (코닝(등록상표) 코스타(등록상표) 세포 배양 6웰 플레이트, 써모 피셔 사이언트사)에 동일한 MSC를 6x104 세포/웰의 양으로 파종하고 활성화제를 포함하지 않는 MSC 배양 배지를 1.3 ㎖/웰로 첨가한 후 37℃에서 4일 동안 배양하여 계대수 1의 미처리 MSC를 준비하였다. 이들 MSC에서 CD47 양성 세포율을 실시예 9와 동일한 방법으로 측정한 결과, 활성화 처리된 MSC에서 <20%, 미처리 MSC에서 >90%였다.
2) 알츠하이머 모델 마우스에서 MSC의 치료 효과
실시예 5와 동일한 방법으로 상기 1)의 2종의 MSC를 APP/PS1 마우스의 골수강 내에 투여하여 치료 효과를 평가하였다. 모리스 물 미로 학습 테스트 결과를 도 39에, 기억 테스트의 결과를 도 40에 나타내었다. CD47 양성 세포율이 높은 MSC를 투여한 마우스는 CD47 양성 세포율이 낮은 MSC를 투여한 마우스와 비교하여 학습 능력과 기억 능력이 낮아 CD47는 치료 효과의 부정적인 마커가 될 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 17: 추출 방법이 다른 활성화제를 이용한 MSC의 활성화 처리
시판의 인간 태반 추출물("메루스몬" 메루스몬 제약 주식회사)을 증발기로 농축하여 활성화제를 제조하고, 이를 이용하여 Preset VECELL 및 2차원 배양 담체에서 OA-MSC의 활성화 처리를 실시예 8의 2)와 동일하게 수행하였다. 이들 OA-MSC에서 각 유전자의 발현량을 실시간 PCR로 측정하였다. 2차원 배양 담체에서 활성화제의 부재 하에서 배양한 MSC(2D·활성화제 없음)에 대한 각 MSC의 OCT4, SOX2, TERT 및 p16ink4a의 상대적 유전자 발현량을 도 41 및 도 42에 나타내었다. 인간 태반 추출물에서 제조한 활성화제는 실시예 1의 1)에서 조제한 활성화제와 마찬가지로 3차원 배양 담체에서 더 강한 활성화 효과를 나타냈다.
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Claims (28)

  1. 포유 동물의 태아 부속물의 추출물을 유효 성분으로 함유하는 활성화제로 간엽계 줄기세포를 처리하는 활성화 단계를 포함하되, 상기 활성화 단계는 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖는 세포 배양 담체를 사용하여 상기 활성화제를 포함하는 배지에서 간엽계 줄기세포를 배양하는 것인, 활성화된 간엽계 줄기세포의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포 배양 담체는 나노미터 내지 마이크로미터 단위의 평균 섬유 직경을 갖는 섬유에 의해 세포와의 접촉면에 형성된 개구부를 갖는 것인, 활성화된 간엽계 줄기세포의 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 개구부의 평균 직경이 500 ㎚ 내지 1000 ㎛인, 활성화된 간엽계 줄기세포의 제조 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 담체는 생분해성 고분자로 이루어진 나노 섬유를 함유하는 것인, 활성화된 간엽계 줄기세포의 제조 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 배지의 활성화제의 농도는 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖지 않는 세포 배양 담체를 사용하여 간엽계 줄기세포를 배양하는 활성화 단계에 있어서의 배지의 활성화제 농도의 1/10 내지 1/100000인 것인, 활성화된 간엽계 줄기세포의 제조 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 배지의 활성화제의 농도는 단백질 환산으로 0.01 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖인 것인, 활성화된 간엽계 줄기세포의 제조 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화 단계에서의 세포의 계대 횟수가 2회 이하인, 활성화된 간엽계 줄기세포의 제조 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 간엽계 줄기세포가 골수 유래 간엽계 줄기세포인 것인, 활성화된 간엽계 줄기세포의 제조 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 간엽계 줄기세포가 질환 대상에서 분리된 간엽계 줄기세포인 것인, 활성화된 간엽계 줄기세포의 제조 방법.
  10. CD47 양성 세포의 비율이 2% 이하인, 간엽계 줄기세포를 포함하는 세포 제제.
  11. 제10항에 있어서, 간엽계 줄기세포가 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조된 것인, 세포 제제.
  12. 간엽계 줄기세포 집단 중에서 CD47 음성의 간엽계 줄기세포를 농축하는 단계를 포함하는, 간엽계 줄기세포를 포함하는 세포 제제의 제조 방법.
  13. p16ink4a 및 p14ARF로 이루어진 군에서 선택되는 간엽계 줄기세포의 치료 효과와 긍정적으로 연관되는 간엽계 줄기세포의 치료 효과 평가를 위한 마커.
  14. CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 간엽계 줄기세포의 치료 효과와 부정적으로 연관되는 간엽계 줄기세포의 치료 효과 평가를 위한 마커.
  15. 피험 간엽계 줄기세포에서 p16ink4a, p14ARF, CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량을 측정하는 측정 단계;
    측정된 발현량을 대조 간엽계 줄기세포의 발현량과 비교하는 비교 단계; 및
    p16ink4a 및 p14ARF로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 대조 간엽계 줄기세포보다 피험 간엽계 줄기세포에서 많은 경우 및/또는 CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 대조 간엽계 줄기세포보다 피험 간엽계 줄기세포에서 적은 경우, 피험 간엽계 줄기세포는 대조 간엽계 줄기세포보다 치료 효과가 더 높다고 판정하는 판정 단계를 포함하는, 간엽계 줄기세포의 치료 효과를 판정하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 피험 간엽계 줄기세포의 측정 단계는
    (A) DNMT1, Nanog, SOX2, OCT4, IDO, TSG6, IL-6 및 TERT로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질, 및/또는
    (B) p53 및 α-SMA로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량을 측정하는 것을 추가로 포함하고,
    판정 단계는 p16ink4a 및 p14ARF로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 대조 간엽계 줄기세포보다 피험 간엽계 줄기세포에서 많은 경우 및/또는 CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량이 대조 간엽계 줄기세포보다 피험 간엽계 줄기세포에서 적은 것에 더하여,
    상기 (A) 유전자 또는 단백질의 발현량이 대조 간엽계 줄기세포보다 피험 간엽계 줄기세포에서 많은 경우 및/또는 상기 (B)의 유전자 또는 단백질의 발현량이 대조 간엽계 줄기세포보다 피험 간엽계 줄기세포에서 적은 경우, 피험 간엽계 줄기세포는 대조 간엽계 줄기세포보다 치료 효과가 높다고 판정하는 것인, 간엽계 줄기세포의 치료 효과를 판정하는 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 방법은 측정 단계에서 CD47 유전자 또는 단백질의 발현량에 대신하여 간엽계 줄기세포 중의 CD47 양성 세포의 비율을 측정하고, 판정 단계에서 CD47 유전자 또는 단백질의 발현량이 대조 간엽계 줄기세포보다 피험 간엽계 줄기세포에서 적은 것으로 대신하고, 간엽계 줄기세포 중의 CD47 양성 세포의 비율이 대조 간엽계 줄기 세포보다 피험 간엽계 줄기세포에서 낮은 경우 피험 간엽계 줄기세포는 대조 간엽계 줄기세포보다 치료 효과가 높다고 판정하는 것인, 간엽계 줄기세포의 치료 효과를 판정하는 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험 간엽계 줄기세포가 포유동물의 태아 부속물에서 추출물을 유효성분으로 함유하는 활성화제를 포함하는 배지에서 배양된 간엽계 줄기세포인 것인, 간엽계 줄기세포의 치료 효과를 판정하는 방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험 간엽계 줄기세포가 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖는 세포 배양 담체를 이용하여 배양된 간엽계 줄기세포인 것인, 간엽계 줄기세포의 치료 효과를 판정하는 방법.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험 간엽계 줄기세포가 간엽계 줄기세포의 자가이식요법을 받으려는 대상에서 분리된 간엽계 줄기세포인 것인, 간엽계 줄기세포의 치료 효과를 판정하는 방법.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험 간엽계 줄기세포가 골수유래의 간엽계 줄기세포인 것인, 간엽계 줄기세포의 치료 효과를 판정하는 방법.
  22. 처리된 간엽계 줄기세포에서 p16ink4a, p14ARF, CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 발현량을 측정하는 측정 단계;
    측정된 발현량을 미처리 간엽계 줄기 세포의 발현량과 비교하는 단계; 및
    p16ink4a 및 p14ARF로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 혹은 단백질의 발현량이 미처리 간엽계 줄기세포보다 처리된 간엽계 줄기세포에서 많은 경우 및/또는 CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 혹은 단백질의 발현량이 미처리 간엽계 줄기세포보다 처리된 간엽계 줄기세포에서 적은 경우 해당 간엽계 줄기세포는 해당 처리에 적합하다고 판정하는 단계;를 포함하는 간엽계 줄기세포의 치료 효과를 높이기 위한 처리에 대한 간엽계 줄기세포의 적응성을 판정하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 처리된 간엽계 줄기세포와 미처리 간엽계 줄기세포의 각각의 측정 단계는
    (A) DNMT1, Nanog, SOX2, OCT4, IDO, TSG6, IL-6 및 TERT로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 혹은 단백질, 및/또는
    (B) p53 및 α-SMA로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 혹은 단백질 발현량을 측정하는 것을 추가로 포함하고,
    판정 단계는 p16ink4a 및 p14ARF로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 혹은 단백질의 발현량이 미처리 간엽계 줄기 세포보다 처리된 간엽계 줄기 세포에서 많은 것 및/또는 CDK4, CDK6, RB 및 CD47로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 혹은 단백질의 발현량이 미처리 간엽계 줄기 세포보다 처리된 간엽계 줄기 세포에서 적은 것에 더하여 상기 (A)의 유전자 혹은 단백질의 발현량이 미처리 간엽계 줄기 세포보다 처리된 간엽계 줄기 세포에서 많은 경우 및/또는 상기 (B)의 유전자 혹은 단백질의 발현량이 미처리 간엽계 줄기 세포보다 처리된 간엽계 줄기 세포에서 적은 경우에 해당 간엽계 줄기 세포는 해당 처리에 적합하다고 판정하는 것인, 간엽계 줄기세포의 치료 효과를 높이기 위한 처리에 대한 간엽계 줄기세포의 적응성을 판정하는 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 측정 단계는 CD47 유전자 또는 단백질의 발현량에 대신하여 간엽계 줄기 세포 중의 CD47 양성 세포의 비율을 측정하고, 상기 판정 단계는 CD47 유전자 또는 단백질의 발현량이 미처리 간엽계 줄기 세포보다 처리된 간엽계 줄기 세포에서 적은 것에 대신하여 간엽계 줄기 세포 중의 CD47 양성 세포의 비율이 미처리 간엽계 줄기 세포보다 처리된 간엽계 줄기 세포에서 낮은 경우 해당 간엽계 줄기 세포는 당해 처리에 적합하다고 판정하는 것인, 간엽계 줄기세포의 치료 효과를 높이기 위한 처리에 대한 간엽계 줄기세포의 적응성을 판정하는 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 처리는 포유동물의 태아 부속물로부터의 추출물을 유효성분으로 함유하는 활성화제를 포함하는 배지에서 간엽계 줄기 세포를 배양하는 것인, 간엽계 줄기세포의 치료 효과를 높이기 위한 처리에 대한 간엽계 줄기세포의 적응성을 판정하는 방법.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 처리는 섬유로 이루어진 3차원 구조를 갖는 세포 배양 담체를 이용하여 간엽계 줄기 세포를 배양하는 것인, 간엽계 줄기세포의 치료 효과를 높이기 위한 처리에 대한 간엽계 줄기세포의 적응성을 판정하는 방법.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간엽계 줄기세포는 간엽계 줄기세포의 자가이식요법을 받으려는 대상에서 분리된 간엽계 줄기세포인 것인, 간엽계 줄기세포의 치료 효과를 높이기 위한 처리에 대한 간엽계 줄기세포의 적응성을 판정하는 방법.
  28. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간엽계 줄기세포는 골수 유래의 간엽계 줄기세포인 것인, 간엽계 줄기세포의 치료 효과를 높이기 위한 처리에 대한 간엽계 줄기세포의 적응성을 판정하는 방법.
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