CN115804791A - 间充质干细胞来源的外泌体治疗ilk信号通路相关疾病的方法和药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于治疗ILK信号通路相关疾病的药物组合物，其含有间充质干细胞来源特别是诱导万能干细胞来源的间充质干细胞的外泌体。本发明还提供了用所述外泌体治疗ILK信号通路相关疾病的方法。

Description

间充质干细胞来源的外泌体治疗ILK信号通路相关疾病的方 法和药物组合物

本申请要求2021年9月15日提交的、申请号为202111078183.5、发明名称为“间充质干细胞来源的外泌体治疗ILK信号通路相关疾病的方法和药物组合物”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及细胞学和药物学领域。具体的，本发明提供了一种采用间充质干细胞来源的外泌体治疗ILK信号通路相关疾病的方法和用于治疗ILK信号通路相关疾病的药物组合物。

背景技术

整合素连接激酶(Integrin-linked kinase，即ILK，另外也称为p59ILK)最初是从人胎盘cDNA文库的双杂交筛选中通过其结合和磷酸化B1-整合素胞质结构域的能力鉴定出来的(Hannigan等，Nature，1996)。在对ILK的研究中发现，其过表达会导致IEC18细胞的上皮形态破坏、细胞对细胞外基质基质的粘附降低。研究还发现了ILK在Wnt信号级联反应中激活转录中的作用(Novak等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998)。ILK的活性已被证明在其他信号通路中受到调节，包括那些涉及G蛋白(Tu等人，Mol.Cell.Biol.，1999)、磷脂酰肌醇3-激酶，蛋白激酶B和糖原合酶激酶3(Delcommenne等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1998)的信号通路。本领域还已知ILK信号通路和血管生成相关，其对生理和病理血管生成具有重要意义。内皮性ILK通过整合素-基质相互作用在血管发育和内皮细胞(EC)存活中发挥关键作用。

间充质干细胞是干细胞家族的重要成员。天然的间充质干细胞来源于发育早期的中胚层。间充质干细胞可从各种组织分离出来并培养。间充质干细胞还可从万能干细胞分化得到。其中，诱导万能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)，也称为诱导多能干细胞或人工万能干细胞，是人工制备的具有胚胎干细胞的干性的细胞。诱导万能干细胞由日本科学家山中伸弥(Shinya Yamanaka)于2006年首次制备成功，是利用病毒载体将四个转录因子(Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc)的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞和胚胎APSC多能细胞的一种细胞类型。诱导万能干细胞已广泛在生物技术和医学研究领域得到应用。

最近围绕干细胞分泌的细胞外囊泡(EVs，40-100纳米的小颗粒)功能的发现，使得再生医学取得重大进展。干细胞移植疗法的再生作用有些是得益于EV释放的旁分泌效应。EVs不包含MHC I或MHC II蛋白，不会增加免疫原性的风险，并且不具有致瘤性，因此克服了细胞移植疗法的几个缺点。研究发现，来自间充质干细胞的外泌体(MSC EVs)可以帮助修复受伤的组织(Harrell等人，2019；Tang等人，2021)。人类诱导多能干细胞来源的间充质干细胞(iPSC-MSCs)也已应用在再生医学上。iPSC-MSCs分泌的EVs促进伤口修复(Zhang等，2015)，血管生成(Hu等，2015)，骨质血管生成(Hu等，2015)和骨再生(Qi等，2016)。有研究发现，来自间充质干细胞的EV可以将功能性miRNA转移到靶细胞以调节其功能，从而在受损组织中产生治疗效果。例如，干细胞中的miR-644-5p通过靶向P53改善化疗诱导的卵巢损伤大鼠的卵巢功能(Sun等人，2019)。类似地，人羊膜间充质干细胞分泌的EV释放miRNA-320a，其调节SIRT4以保护POI小鼠免受卵巢氧化应激(Ding等人，2020a)。来源于人脐带间充质干细胞的miRNA-17-5p通过调节SIRT7改善化疗后的卵巢功能(Ding等人，2020b)。骨髓间充质干细胞产生的外泌体可以通过传递mir-144-5p靶向PTEN，从而改善化疗诱导的卵巢功能不全大鼠的卵巢功能(杨等人，2020)。然而，这些研究也发现，不同来源的干细胞及其分泌的EV在靶细胞中所起作用、作用机制以及涉及的通路成员(蛋白、基因或其调节因子等)都存在明显区别。

本领域还需要对干细胞或其它各种来源的细胞外泌体对细胞的影响，包括对整合素连接激酶即ILK通路的影响，以及其在治疗ILK信号通路相关疾病的作用进行研究，由此提供新的对治疗ILK信号通路相关疾病有效和安全的疗法和药物。

发明内容

本申请提供了新的采用间充质干细胞来源的外泌体治疗ILK相关疾病的疗法和药物组合物。本申请人的发明人首次发现了间充质干细胞来源的外泌体对细胞的ILK信号通路的相关蛋白包括ILK等具有调节其表达的作用，能够用于治疗与ILK相关的疾病。

在本发明的其中一个方面，提供了调节细胞中ILK信号通路的方法，其包括对组织或培养基中的细胞施加间充质干细胞来源的外泌体。

在本发明中，术语间充质干细胞也被称作多潜能间质细胞，主要是从脂肪或者骨髓中获得，能够分化为中胚层起源的多种细胞，例如骨、脂肪、软骨、肌腱和肌肉等。间充质干细胞可从各种组织分离出来并培养，但它们的能力和细胞表面标记依据其来源而互不相同。间充质干细胞通常由可分化为骨细胞、软骨细胞和肌细胞的细胞界定，并且表达CD73(+)、CD105(+)、CD34(-)和CD45(-)等细胞表面标记。

在本发明的其中一个方面，所述间充质干细胞为骨髓来源、脂肪来源、脐带血来源、牙齿来源或万能干细胞来源的间充质干细胞。在本发明的其中又一个方面，所述间充质干细胞为万能干细胞来源的间充质干细胞。

在本发明中，术语万能干细胞指能够产生所有的胚胎细胞类型的干细胞。天然的万能干细胞包括胚胎干细胞。诱导万能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)，也称为诱导多能干细胞或人工万能干细胞，是人工制备的具有胚胎干细胞的干性的细胞，例如可以利用病毒载体将四个转录因子(Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc)的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到。

在本发明的其中一个方面，所述间充质干细胞为人诱导万能干细胞来源的间充质干细胞。

细胞外囊泡是由细胞分泌的膜囊泡。细胞外囊泡可以具有在约10nm至约5000nm之间的直径(在颗粒不是球体的情况下，指其最大尺寸)。在本发明中，外泌体指的是小的分泌型囊泡，通常具有在约30nm至约250nm之间的直径(在颗粒不是球体的情况下，指其最大尺寸)，例如具有约30nm至约200nm之间的直径。外泌体包含核酸、蛋白或其他生物分子，或在其膜中具有核酸、蛋白或其他生物分子，并且可以在身体或生物系统中的不同位置之间充当载体。

外泌体可以从包括哺乳动物诸如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猫、牛、马、山羊、绵羊、灵长类动物或人类的多种生物来源分离。外泌体可以从生物流体诸如血清、血浆、全血、尿液、唾液、母乳、泪液、汗液、关节液、脑脊液、精液、阴道液、腹水液和羊水分离。外泌体也可以从实验样品诸如从培养的细胞取得的培养基分离。

在本发明的其中一个方面，提供了一种在培养细胞中调节ILK信号通路的方法，其包括在细胞培养液中加入诱导万能干细胞来源的间充质干细胞来源的外泌体。在本发明的其中一个方面，所述间充质干细胞为经1-15次传代的细胞，优选为经1-10次传代的细胞，最优选为经3-7次传代的细胞。

在本发明的其中一个方面，在培养液中加入的外泌体的量为约1-500ug/ml，优选为约5-250ug/ml，更优选为约10-200ug/ml。

在本发明的其中一个方面，所述细胞为ILK通路(如PTEN/ILK/AKT通路)异常(下调)的细胞。在本发明的其中又一个方面，所述方法中使得所述细胞的ILK通路活性恢复，例如为使得所述细胞ILK活性上调。

在本发明的其中一个方面，所述方法包括检测ILK通路(如PTEN/ILK/AKT通路)相关基因的步骤，所述基因例如为Ilk，Pten，Krt18，Ccnd 1，Cdkn 2a，Vegfa、Ptgs 2。

在本发明的其中一个方面，提供了一种治疗ILK信号通路相关疾病的方法，其包括将诱导万能干细胞来源的间充质干细胞来源的外泌体给予患者。在本发明的其中一个方面，还提供了一种间充质干细胞来源的外泌体用于制备治疗ILK相关疾病的药物的用途。

在本发明的其中一个方面，提供了一种用于治疗ILK相关疾病的药物组合物，其含有间充质干细胞来源的外泌体。

在本发明的其中一个方面，提供了一种间充质干细胞来源的外泌体在治疗ILK相关疾病的药物组合物中的用途。

在本文中，ILK相关疾病也称为ILK信号通路相关疾病，其包括与ILK表达和/或活性改变相关的疾病或病症，其中包括对ILK表达调节有反应的疾病或病症。本领域已知ILK在Wnt信号级联反应中激活转录中的作用。另外也已知ILK在其他信号通路中发挥作用，包括那些涉及G蛋白、磷脂酰肌醇3-激酶，蛋白激酶B和糖原合酶激酶3的信号通路。ILK的上游调节信号包括如PTEN(一种负调节ILK活化的脂质磷酸酶)等。已知的ILK信号通路还包括下游的AKT通路等。在本发明的其中一个方面，ILK信号通路包括PTEN/ILK/AKT通路。

本领域已知ILK信号通路和血管生成相关，其对生理和病理血管生成具有重要意义。内皮性ILK通过整合素-基质相互作用在血管发育和内皮细胞(EC)存活中发挥关键作用。整合素介导的信号与血管内皮生长因子(VEGF)受体协同促进内皮细胞的形态变化、细胞增殖和运动。因此，ILK信号通路相关疾病包括与异常或病理性血管生成相关的疾病，例如但不限于多种癌症、银屑病和年龄相关性黄斑变性。

异常或病理性血管生成相关的疾病包括癌症，例如脑癌、食道癌、膀胱癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、头颈癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾癌和卵巢癌，黑色素瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤和任何其他癌症疾病等。在这方面，ILK信号通路相关疾病还包括心脏病(例如，心肌病、心血管疾病、先天性心脏病、冠心病、心力衰竭、高血压性心脏病、炎症性心脏病、瓣膜性心脏病疾病)。

ILK信号通路相关疾病还包括多种已知代谢紊乱包括遗传性代谢紊乱。所述代谢紊乱包括但不限于糖尿病、高脂血症、乳酸性酸中毒、苯丙酮尿症、酪氨酸血症、尿素循环障碍等。

另外，本领域已知ILK信号通路和炎症密切相关：白细胞外渗是炎症的重要步骤，其中整合素已被证明通过介导白细胞与血管内皮和内皮下细胞外基质的相互作用而发挥重要作用。作为整合素和细胞骨架系统之间的纽带，ILK是参与细胞-细胞和细胞-基质相互作用的关键分子。

在这方面，ILK信号通路相关疾病包括各种炎性疾病，例如但不限于哮喘、慢性阻塞性肺病、炎症性肠病、强直性脊柱炎、Reiter综合征、克罗恩病、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、银屑病、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、骨关节炎或多发性硬化症。

有研究发现，ILK下游的AKT通路是卵泡生成的关键，AKT通路的破坏会损害原始卵泡的存活，导致POI的发生(Kalich-Philosoph等，2013；Wang等，2019)。在这方面，ILK信号通路相关疾病还包括卵巢相关生殖障碍，例如化疗引起的卵巢功能下降，卵巢储备功能减退(DOR)、早发性卵巢功能不全(POI)，卵巢早衰(POF)等，特别是卵巢早衰(POF)。

在本发明的其中一个方面，前述方法和药物组合物中用于提取外泌体的间充质干细胞为从诱导万能干细胞等分化形成的间充质干细胞进行传代培养后得到的间充质干细胞。例如，所述间充质干细胞为经1-15次传代的细胞，优选为经1-10次传代的细胞，最优选为经3-7次传代的细胞。在本发明中，用于传代培养的初代细胞，即P0细胞，通常是指将所述间充质干细胞来源细胞在经诱导和分化后最早出现的间充质干细胞，即在细胞种群中出现具有间充质干细胞特性(例如具有间充质干细胞特异性表面标记等)细胞占细胞总数的50％以上，或优选75％以上，或更优选超过90％以上。初代细胞可直接用于传代培养，也可在冷冻保藏后经复苏后用于传代培养。本申请的发明人出乎意料地发现，本发明提供的采从诱导万能干细胞等分化形成的间充质干细胞提取外泌体，对受损组织的细胞(例如卵巢中的各阶段卵细胞和颗粒细胞等)具有修复活性。本申请的发明人发现，在经过传代培养的间充质干细胞中，较早期代次间充质干细胞(如经15次或15次以下传代的细胞，特别是经7次或7次以下传代的细胞)产生的外泌体对受损组织的细胞(例如卵巢中的各阶段卵细胞和颗粒细胞等)的修复活性要明显优于较晚期代次间充质干细胞(如经10-15次或以上传代的细胞)产生的外泌体的活性。同时，本申请的发明人出乎意料地发现，相对于从组织(例如骨、脂肪、软骨、脐带)分离出来的间充质干细胞，从诱导万能干细胞等分化形成的间充质干细胞中成功获得具有所述修复受损组织活性外泌体的机会大大增加，其中一个表现在于在经15次或15次以下传代培养的间充质干细胞中收集的外泌体的数量和品质和对受损组织的细胞(例如卵巢中的各阶段卵细胞和颗粒细胞等)的修复活性水平在不同生产批次中检测发现的差异基本可维持在20％以内。而采用从脂肪或脐带分离出来的间充质干细胞中收集到的外泌体，在经10次左右传代培养的数量和修复活性差异为约50％或更高。

用于本发明的外泌体可以通过本领域已知的各种方法进行。分离外泌体的方法包括超滤法、聚合物沉淀法、尺寸色谱法或超速离心法等。优选的，用于本发明的外泌体可以通过超滤法制备得到。

在本发明的其中一个方面，用于本发明的外泌体通过超滤法从细胞培养液中制备得到。在用于本发明的超滤法中，采用截留分子量为约100kDa的超滤膜对外泌体进行筛选。外泌体存在于未能够通过截留分子量为约100kDa的超滤膜的组分中。

在用于本发明的超滤法中，还可以采用多过滤系统和方法，即通过不同孔径的过滤器逐步过滤。在本发明的其中又一个方面，所述超滤法在截留分子量为约100kDa的超滤膜之前还包括采用4μm孔径的过滤器和/或0.22μm孔径的过滤器进行过滤的步骤。例如，可以通过4μm孔径的细胞过滤器，0.22μm孔径的过滤器和具MWCO(分子量截止值)为100kD的过滤器逐步进行过滤。

本发明提供的用于预防或治疗ILK信号通路相关疾病的药物组合物中含有药学有效量的上述外泌体。所述外泌体可单独或与一种或更多种可药用载体、赋形剂或稀释剂一起包含在所述药物组合物中。药学有效量意指足以预防、改善或治疗ILK信号通路相关疾病的症状的量。

在本发明的其中一个方面，本发明提供的药物组合物中所述外泌体的剂量为约1-500ug，优选为约5-250ug，更优选为约10-200ug。在本发明的其中又一个方面，所述外泌体的剂量为约40-5000ug/kg体重，优选为约400-4000ug/kg体重。

在本发明的其中一个方面，本发明提供的药物组合物中所述外泌体的剂量为约1×10⁹至1×10¹²个，优选为约1×10¹⁰至1×10¹¹个。在本发明的其中又一个方面，所述外泌体的剂量为约1×10¹⁰至4×10¹³个/kg体重，优选为约1×10¹¹至4×10¹²个/kg体重。

此外，本发明提供的药物组合物可制备成适合于根据药学领域中常用的方法施用至患者体内的单位剂量制剂，并且所述制剂含有通过一次或数次施用有效的施用量。本发明提供的药物组合物可为单次或多次给药的剂型。药学有效量可根据病症的严重程度，患者的年龄、体重、健康状况和性别，施用途径，治疗期等适当地改变。

本发明的提供的药物组合物中采用的外泌体特别适合通过多次给药用于治疗。在其中一个方面，本发明提供的药物组合物为多次给药的剂型。在本发明的其中又一个方面，本发明提供的药物组合物为间隔约1天-7天给药的剂型。优选的，所述药物组合物为间隔约2-7天给药的剂型。

在其中一个方面，本发明提供的药物组合物的剂型中，特别是在所述多次给药的剂型中，所述外泌体的每次给药剂量为约1-500ug，优选为约5-250ug，更优选为约10-200ug。在本发明的另一个方面，本发明提供的药物组合物的剂型中，特别是在所述多次给药的剂型中，所述外泌体的每次给药剂量为约40-5000ug/kg体重，优选为约400-4000ug/kg体重。

在其中一个方面，本发明提供的药物组合物的剂型中，特别是在所述多次给药的剂型中，所述外泌体的每次给药剂量为约1×10⁹至1×10¹²个，优选为约1×10¹⁰至1×10¹1个。在本发明的另一个方面，本发明提供的药物组合物的剂型中，特别是在所述多次给药的剂型中，所述外泌体的每次给药剂量为约1×10¹⁰至4×10¹³个/kg体重，优选为约1×10¹¹至4×10¹²个/kg体重。

本发明提供的药物组合物是生理学上可接受的，并且当施用于人时，通常不会引起变态反应，例如胃肠病或头晕或类似反应。载体、赋形剂和稀释剂的实例可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。此外，还可包含填充剂、抗絮凝剂、润滑剂、保湿剂、食用香料、乳化剂、防腐剂等。

除活性成分外，药物制剂还可含有一种或更多种可药用常见惰性载体，例如用于注射的防腐剂、止痛剂、增溶剂、稳定剂等或者用于表面制剂的基质、赋形剂、润滑剂或防腐剂等。

如上所述制备的本公开内容的组合物或药物制剂可通过包括肠胃外和经口途径的多种途径施用于哺乳动物，例如大鼠、小鼠、家畜、人等。可使用本领域常用的任何施用方式。

本发明还提供了治疗ILK相关疾病的方法，其包括将间充质干细胞来源的外泌体给予患者。患者可以为哺乳动物，例如大鼠、小鼠、家畜、人等。可使用本领域常用的任何施用方式。

在本发明的其中一个方面，所述治疗ILK相关疾病的方法中所述间充质干细胞为骨髓来源、脂肪来源、脐带血来源、牙齿来源或万能干细胞来源的间充质干细胞。在本发明的其中一个方面，所述治疗ILK信号通路相关疾病的方法中所述间充质干细胞为诱导万能干细胞来源的间充质干细胞。

在本发明的其中一个方面，所述治疗ILK相关疾病的方法中所述间充质干细胞为经1-10次传代的细胞，优选为经3-7次传代的细胞。

在本发明的其中一个方面，所述治疗ILK相关疾病的方法中所述外泌体通过超滤法制备得到，所述超滤法中采用截留分子量为约100kDa的超滤膜对外泌体进行筛选。优选的，所述超滤法在截留分子量为约100kDa的超滤膜之前还包括采用4μm孔径的过滤器和/或0.22μm孔径的过滤器进行过滤的步骤。

在本发明的其中一个方面，所述治疗ILK相关疾病的方法中给予患者约1-500ug，优选为约5-250ug，更优选为约10-200ug的外泌体。在本发明的其中又一个方面，所述治疗ILK信号通路相关疾病的方法中给予患者40-5000ug/kg体重，优选为约400-4000ug/kg体重的外泌体。

在本发明的其中一个方面，所述治疗ILK相关疾病的方法中给予患者约1×10⁹至1×10¹²个，优选为约1×10¹⁰至1×10¹¹个外泌体。在本发明的其中又一个方面，所述治疗ILK信号通路相关疾病的方法中给予患约者1×10¹⁰至4×10¹³个/kg体重，优选为约1×10¹¹至4×10¹²个/kg体重的外泌体。

在本发明的其中一个方面，所述治疗ILK相关疾病的方法中将所述外泌体一次或多次给予患者。

在本发明的其中一个方面，所述治疗ILK相关疾病的方法中将所述外泌体间隔约1天-7天给予患者，优选的，间隔约2-7天给予患者。

在本发明的其中一个方面，所述治疗ILK相关疾病的方法中，特别是在所述多次给药的治疗方法中，所述外泌体的每次给药剂量为约1-500ug，优选为约5-250ug，更优选为约10-200ug。在本发明的另一个方面，本发明提供的所述治疗ILK信号通路相关疾病的方法中，特别是在所述多次给药的治疗方法中，所述外泌体的每次给药剂量为约40-5000ug/kg体重，优选为约400-4000ug/kg体重。

在本发明的其中一个方面，所述治疗ILK相关疾病的方法中，所述外泌体的每次给药剂量为约1×10⁹至1×10¹²个，优选为约1×10¹⁰至1×10¹¹个。在本发明的另一个方面，本发明提供的所述治疗ILK信号通路相关疾病的方法中，特别是在所述多次给药的治疗方法中，每次给药剂量为约1×10¹⁰至4×10¹³个/kg体重，优选为约1×10¹¹至4×10¹²个/kg体重。

在本发明的其中一个方面，所述治疗ILK相关疾病的方法为治疗为异常或病理性血管生成相关的疾病例如癌症、心脏病、代谢紊乱、炎性疾病或卵巢相关生殖障碍的方法。

附图说明

图1为对人诱导多能干细胞分化的间充质干细胞(iPSC-MSCs)得到的外泌体(iPSC-MSCs-EVs)进行鉴定的结果。分别通过免疫印迹(图1A)、透射电子显微镜(图1B)和RNA分布分析(图1C)确定iPSC-MSCs-EVs的特征。

图2显示iPSC-MSCs-Evs调节化疗损伤模型颗粒细胞中ILK信号通路。图2A显示RNA测序差异基因火山图。图2B显示显示IPA软件分析的结果图。图2C显示Qlucore软件分析的基因变化差异。图2D为ILK信号通路相关差异基因的热图分析。图2E为ILK信号通路相关表达差异基因的qPCR结果分析。

图3显示iPSC-MSCs-EVs可以在体内或体外实验中逆转CTX引起的PTEN/ILK/AKT通路下调。图3A为免疫印迹法检测颗粒细胞中ILK信号通路相关蛋白的表达的结果图。图3B为免疫印迹法检测体外培养卵巢中ILK信号通路相关蛋白的表达的结果图。图3C为免疫组化法检测体外培养卵巢和成年鼠卵巢中ILK蛋白的表达的结果图。

图4为iPSC-MSCs-EVs处理CTX诱导凋亡颗粒细胞的结果图。图4A为MTS检测结果图。图4B为免疫印迹法检测颗粒细胞中凋亡标志物的表达的结果图。

图5为iPSC-MSCs-EVs与4HC-CTX处理的卵巢共培养的作用的结果图。图5A为卵泡计数结果图。图5B为免疫组化实验结果图。

图6为对小鼠进行CTX处理以及与iPSC-MSCs-EVs共培养后对卵巢的作用的结果图。图6A为HE染色实验结果图。图6B为卵泡计数结果图。图6C为免疫组化检测凋亡级增殖相关蛋白实验结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例进一步说明本发明的实质内容和有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。

实施例1人诱导多能干细胞分化的间充质干细胞的外泌体的分离与鉴定

诱导多能干细胞iPSCs(induced pluripotent stem cells)的诱导

用NEPA21电转仪将10⁶个人真皮成纤维细胞(Human Dermal fibroblasts，ATCC#PCS-201-010)和3微克的质粒(UL(addgene#27080)，OP(addgene#27077)，SK(addgene#27078))的混合液共同电转。然后将电转的细胞种在涂有基质胶的平板上，用mTeSR(STEMCELL#85850)培养24-29天后逆使用碱性磷酸酶(AP)染色对细胞的干性进行评估，判断导入特定的转录因子是否将终末分化的体细胞重编程为多能性干细胞。

iPSC-MSCs(induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stemcells)的诱导

根据试剂盒的说明书指示方法，采用间质祖先试剂盒(Mesenchymal ProgenitorKit)将前一步骤获得的人iPSCs诱导为人诱导多能干细胞分化的间充质干细胞(iPSC-MSCs)

iPSC-MSCs外泌体的分离

收集从第3代到第7代培养的iPSC-MSCs的细胞上清液，使用超滤法(Milipore，100kDa)从中分离出外泌体(EVs)。

实验材料：冷冻离心机(Eppendorf 5804R)，

Ultra-15CentrifugalFilter Unit(Millipore，100KD#UFC910096)。

超滤法主要实验步骤：

1)将收集到的细胞上清液在300g，4℃离心1Omin除去残余细胞；

2)2000g离心20min除去细胞碎片；

3)小心收集上清并用0.22μm孔径过滤器进行过滤；

4)将收集到的上清液加入

Ultra-15中，3000g离心；

5)待上清液超滤完毕后，加入PBS并再次超滤，重复2次洗涤，最终用200μl PBS溶解留着滤膜上的外泌体，得到外泌体溶液。

对MSC产生的外泌体进行鉴定和观察，包括利用电镜和对EV形态和尺寸进行观察，以及利用蛋白质印迹技术对EV表面标志物CD9，CD63，CD81的表达进行鉴定。

图1为对人诱导多能干细胞分化的间充质干细胞(iPSC-MSCs)得到的外泌体(iPSC-MSCs-EVs)进行鉴定的结果。

如图1所示，分别通过免疫印迹、透射电子显微镜(TEM)和RNA分布分析确定iPSC-MSCs-EVs的特征。免疫印迹(图1A)显示，分离出的外泌体对外泌体表面标志物CD63、CD9、CD81和Hsp70呈阳性，但对外泌体阴性标志物Calnexin呈阴性。通过TEM(图1B)，iPSC-MSCs-EVs显示出典型的直径约40-150纳米的圆杯状外泌体结构。另外，通过安捷伦2100生物分析系统(Agilent 2100Bioanalyzer)对从iPSC-MSCs-EVs中提取的RNA的分布进行检测(图1C)，结果显示RNA的峰值集中在20-200nt之间，与细胞中的RNA大小分布有明显不同。

以上鉴定特征表明，从iPSC-MSCs细胞上清液中提取得到了外泌体。

实施例2在体外实验中验证iPSC-MSCs-EV处理可调节颗粒细胞中ILK信号通路

通过制备模拟化疗损伤的颗粒细胞以及对损伤后的颗粒细胞进行与外泌体共培养的处理，观察其中ILK信号通路的变化。

分离出生20到23天小鼠的颗粒细胞，将其分为对照组，环磷酰胺(CTX)诱导凋亡组，环磷酰胺与外泌体(CTX-EVs)共处理组。其中，CTX按2mg/ml浓度加入到细胞培养液中，外泌体(iPSC-MSCs-EVs)按20μg/ml浓度加入细胞培养液中。外泌体浓度使用蛋白总量测量试剂盒Pierce^TM BCA Protein Assay Kit进行测定。培养24小时后进行下一步检测。

将上述实验组颗粒细胞进行体外实验处理后，用TRIzol提取RNA，采用BGISEQ-500系统(华大基因，中国深圳)进行转录组RNA测序。测序结果发现CTX处理组与CTX-EVs组比较有1451个表达差异基因(differentially expressed gene，DEG)(图2A)。对其进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析，发现这些表达差异基因主要集中在细胞信号转移与细胞代谢变化通路；IPA软件分析显示ILK信号通路在CTX处理组中被抑制，而在CTX-EV组中被重新激活(图2B)。

使用Qlucore软件进行进一步的基因筛选，在表达差异倍数大于1.5，p值小于1.5e的基因中选取差异最大的1000个(图2C)，然后使用IPA软件分析这些基因，结果显示ILK信号通路是变化最显著通路之一。对ILK信号通路相关差异基因的热图分析，进一步确认与对照组比较，这些表达差异基因在CTX处理组被下调，而在CTX-EV组被上调(图2D)。

进一步通过QPCR对ILK相关基因(包括Ilk，Pten，Krt 18，Ccnd 1，Cdkn 2a，Vegfa、Ptgs 2)进行分析和确认其发生上述变化。

QPCR采用QuantStudio 7Flex Real-time PCR System(Applied Biosystems)andSYBR Green Master Premix Ex Taq(Takara)进行。其中使用的引物包括：.

ILK：正向，5’-GAACGACCTCAATCAGGGGG-3’；反向，5’-CATTAATCCGTGCTCCACGC-3’；

Bcl2：正向，5’-GAACTGGGGGAGGATTGTGG-3’；反向，5’-GCATGCTGGGGCCATATAGT-3’；

Bax：正向，5’-TGAAGACAGGGGCCTTTTTG-3’；反向，5’-AATTCGCCGGAGACACTCG-3’；

Krt18：正向，5’-ACCACCAAGTCTGCCGAAAT-3’；反向，5’-CCGAGGCTGTTCTCCAAGTT-3’；

Ccnd1：正向，5’-CAACTTCCTCTCCTGCTACCG-3’；反向，5’-GATGGAGGGGGTCCTTGTTTAG-3’；

Vegfa：正向，5’-GCACATAGAGAGAATGAGCTTCC-3’；反向，5’-CTCCGCTCTGAACAAGGCT-3’；

Ptgs2：正向，5’-CATCCCCTTCCTGCGAAGTT-3’；反向，5’-CATGGGAGTTGGGCAGTCAT-3’；

Cdkn2a：正向，5’-CGCTTCTCACCTCGCTTGT-3’；反向，5’-AGTGACCAAGAACCTGCGAC-3’；

Pten：正向，5’-TGGATTCGACTTAGACTTGACCT-3’；反向，5’-GCGGTGTCATAATGTCTCTCAG-3’；

Gapdh-：正向，5’-GAGAGTGTTTCCTCGTCCCG-3’；反向，5’-ACTGTGCCGTTGAATTTGCC-3’。

以大鼠-Gapdh为内参进行标准化。采用2-ΔΔCt method测定相对mRNA表达水平。

结果如图2E所示，与对照组比较，Ptgs2(促进卵丘颗粒细胞在扩增过程存活)在CTX处理组中被下调，但在CTX加EV处理组显著上调(p＜0.05)。CTX组中的凋亡基因Bax的表达显著增加(p＜0.05)，但在CTX加EV组显著降低(p＜0.05)。抗凋亡基因Bcl2在各组之间没有显着差异。高通量miRNA测序显示在iPSC-MSC-EV中表达的前50个microRNA(miRNA)中的9个靶向PTEN(一种负调节ILK活化的脂质磷酸酶)。这些结果显示iPSC-MSC EVs通过调节ILK信号通路来保护颗粒细胞免于凋亡并维持正常功能，例如通过转移功能性miRNAs(transferring functional miRNAs)来逆转CTX诱导的颗粒细胞中ILK通路的下调。

实施例3iPSC-MSCs-EVs在体内或体外实验中逆转PTEN/ILK/AKT通路下调

进一步分析ILK信号通路相关蛋白的具体表达情况，对上述实验组颗粒细胞的蛋白质进行免疫印迹检测。如结果(图3A)显示，CTX组中ILK的表达低于对照组，CTX-EV组中ILK的表达显著上升。同时，PTEN的表达在CTX处理后明显上调，但在同时加入iPSC-MSCs-EVs后被抑制。ILK的表达在CTX处理后明显下降，但在加入iPSC-MSCs-EVs后明显上升。p-AKT/AKT比率在CTX治疗后明显下降，但在加入iPSC-MSC-EVs后明显抑制了这种下降。这意味着CTX处理通过上调PTEN的表达来抑制ILK/AKT通路，但iPSC-MSCs-EVs处理可以逆转这一效果。

由于ILK通路也参与调控细胞周期G1/S/G2期，实验中同时检测了细胞周期相关蛋白Ccnb1、Ccnd1和P27。结果显示，P27的表达在加入化疗药后显著上升，但加入iPSC-MSCs-EVs后P27表达下降。Ccnd1的表达在加入化疗药后显著下降，但加入iPSC-MSCs-EVs会显著上升。Ccnb1无明显变化(图3B)。使用Western Blot检测体外培养的卵巢中ilk通路表达的变化，结果显示，加入iPSC-MSCs-EVs后可显著抑制PTEN的表达。IIK的表达在加入化疗药后显著下降，但加入iPSC-MSCs-EVs又使其显著上升。p-AKT/AKT的比值在加入化疗药后显著下降，但加入iPSC-MSCs-EVs会显著抑制这一下降(图3C)。

通过对成年鼠卵巢和体外培养卵巢的IHC染色，检测ILK的表达在卵巢中的表达。结果显示，在成年鼠中，ILK的表达在经过化疗处理后减少，但在iPSC-MSCs-EVs移植后增加。卵巢体外培养的结果与成年鼠一致(图3D)。这些结果显示iPSC-MSCs-EVs在体内活体外实验中逆转CTX引起的PTEN/ILK/AKT通路下调。

实施例4体外实验证明iPSC-MSCs-EVs调节ILK信号通路抑制颗粒细胞的凋亡

分离了出生20到23天小鼠的颗粒细胞(GCs)，将其分为对照组，环磷酰胺(CTX)诱导凋亡组，CTX与iPSC-MSCs-EVs共处理组。

CTX按4mg/ml浓度加入到细胞培养液中。iPSC-MSCs-EVs按2μg/ml、20μg/ml或100μg/ml的浓度加入到细胞培养液中。培养24小时后进行下一步检测。

图4为iPSC-MSCs-EVs处理CTX诱导凋亡颗粒细胞的结果图。通过MTS检测，结果显示，与CTX处理组相比，iPSC-MSCs-EVs能以剂量依赖的方式极大地提高细胞存活率(图4A)。免疫印迹结果显示(图4B)，CTX明显增加了颗粒细胞中凋亡标志物Cleaved Caspase 3的表达。而iPSC-MSCs-EVs处理可明显抑制化疗诱导的颗粒细胞凋亡，包括减少CleavedCaspase 3的表达，并增加颗粒细胞中细胞增殖标志物PCNA的表达。

结果显示，iPSC-MSCs-EVs处理可通过调节ILK信号通路抑制因CTX诱导的颗粒细胞的凋亡并促进其增殖。

实施例5卵巢体外培养实验证明iPSC-MSCs-EVs调节ILK信号通路保护卵泡发育，并抑制细胞凋亡

将2.5天大的小鼠卵巢解剖后取出，分为对照组，含有10μM 4-羟基环磷酰胺(4HC-CTX)的模拟化疗组，或10μM 4HC-CTX与100μg/ml的iPSC-MSC-EVs的共处理组。培养72小时。

图5为iPSC-MSCs-EVs与4HC-CTX处理的卵巢共培养的结果图。

卵泡计数结果(图5A)显示，用4HC-CTX培养的卵巢的原始卵泡比对照组明显减少。但在4HC-CTX与EVs共处理的卵巢中，原始卵泡的数量比4HC-CTX组明显增加。免疫组化实验结果(图5B)表明，与4HC-CTX组相比，iPSC-MSC-EVs降低了Cleaved Caspase 3的表达，增加了PCNA的表达。

结果显示，iPSC-MSC-EVs可以抑制因CTX诱导引起的细胞凋亡，促进卵巢的恢复。

实施例6体内实验证明hiPSC-MSCs-EVs对小鼠的卵巢细胞凋亡具有保护作用。

将28天的小鼠分为处理组，包括对照组、CTX组和CTX-EV组。对于CTX组的小鼠，使用CTX(120mg/ml)每周腹腔注射一次，共两次，同时进行尾静脉注射生理盐水200ul，分别在第1、3、5、10、12、14天注射共六次。对于CTX-EV组的小鼠，使用CTX(120mg/ml)每周腹腔注射一次，共两次，同时进行尾静脉注射EV 200ug/次，分别在第1、3、5、10、12、14天给药共六次。对于对照组的小鼠，注射相同剂量的生理盐水。

图6为对小鼠进行CTX处理以及与iPSC-MSCs-EVs共培养后对卵巢的作用的结果图。

如图6A所示，在对照组中，卵巢内可观察到不同时期大量正常卵泡。CTX组小鼠的原始卵泡和初级卵泡数量显著减少，但在CTX-EV组中，原始卵泡的数量比CTX组显著增加，初级卵泡的数目也显著增加。卵泡计数结果(图6B)进一步证明，相比之下，CTX组小鼠的原始卵泡和初级卵泡数量在统计学上显著减少。但在CTX-EV组中，原始卵泡的数量比CTX组显著增加，初级卵泡的数目也显著增加。对于次级卵泡与成熟卵泡，三组之间并无明显差异。

免疫组化实验结果(图6C)同样证明，iPSC-MSC-EVs可以降低凋亡标志物CleavedCaspase 3的表达，增加了细胞增殖标记物Ki67的表达。

结果表明，iPSC-MSC-EVs可过调节ILK信号通路抑制化疗引起的细胞凋亡，促进卵巢的恢复。

上面是对本发明进行的说明，不能将其看成是对本发明进行的限制。除非另外指出，本发明的实践将使用有机化学、聚合物化学、生物技术等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。

在本发明中，“约”表示±10％，优选为±5％，更优选为±2％，例如为±1％、±0.5％或±0.1％。

Claims (12)

1.在细胞中调节ILK信号通路的方法，其包括对细胞给予诱导万能干细胞来源的间充质干细胞来源的外泌体，

例如其为在体外培养细胞中调节ILK信号通路的方法，其包括在细胞培养液中加入诱导万能干细胞来源的间充质干细胞来源的外泌体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述间充质干细胞为为经1-15次传代的细胞，优选为经1-10次传代的细胞，最优选为经3-7次传代的细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其中加入的外泌体的量为约1-500ug/ml，优选为约5-250ug/ml，更优选为约10-200ug/ml。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞为ILK通路异常(如ILK活性下调)的细胞。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使得所述细胞的ILK通路活性恢复，例如为使得所述细胞ILK活性上调。

6.诱导万能干细胞来源的间充质干细胞来源的外泌体在用于制备治疗ILK信号通路相关疾病的药物中的用途，优选的，其中所述间充质干细胞为经1-15次传代的细胞，优选为经1-10次传代的细胞，最优选为经3-7次传代的细胞。

7.根据权利要求6所述的用途，其中给予患者约1-500ug，优选为约5-250ug，更优选为约10-200ug的外泌体。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述ILK信号通路相关疾病为异常或病理性血管生成相关的疾病(例如癌症或心脏病)、代谢紊乱、炎性疾病或卵巢相关生殖障碍。

9.一种用于治疗ILK信号通路相关疾病的药物组合物，其含有诱导万能干细胞来源的间充质干细胞来源的外泌体，所述ILK信号通路相关疾病例如为异常或病理性血管生成相关的疾病(例如癌症或心脏病)、代谢紊乱、炎性疾病或卵巢相关生殖障碍。

10.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述外泌体的剂量为约1-500ug，优选为约5-250ug，更优选为约10-200ug。

11.根据权利要求9所述的药物组合物，其为单次或多次给药的剂型，优选为多次给药的剂型，例如为间隔约1天-7天给药的剂型。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中每次给药剂量为约1-500ug，优选为约5-250ug，更优选为约10-200ug，

例如为约40-5000ug/kg体重，优选为约400-4000ug/kg体重。

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