CN116096753A - 对abcb5具有特异性的抗体及其用途 - Google Patents

对abcb5具有特异性的抗体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN116096753A
CN116096753A CN202180046044.6A CN202180046044A CN116096753A CN 116096753 A CN116096753 A CN 116096753A CN 202180046044 A CN202180046044 A CN 202180046044A CN 116096753 A CN116096753 A CN 116096753A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
abcb5
cell
seq
antibodies
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180046044.6A
Other languages
English (en)
Inventor
马库斯·H·弗兰克
克里斯托夫·甘斯
克里斯托夫·马斯洛
马克·安德烈亚斯·克卢特
扬·雷肯拜尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ruiyasel Co ltd
Ticheba Co ltd
Childrens Medical Center Corp
Original Assignee
Ruiyasel Co ltd
Ticheba Co ltd
Childrens Medical Center Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ruiyasel Co ltd, Ticheba Co ltd, Childrens Medical Center Corp filed Critical Ruiyasel Co ltd
Publication of CN116096753A publication Critical patent/CN116096753A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6865—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from skin, nerves or brain cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/44—Multiple drug resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)

Abstract

本文中公开了具有优异的结合和生物活性的抗ABCB5抗体(例如相对于市售ABCB5抗体)，包含这样的抗ABCB5抗体的药物组合物。本文中还提供了这样的抗ABCB5抗体的治疗性和诊断性应用。

Description

对ABCB5具有特异性的抗体及其用途
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2020年4月30日提交的美国临时申请号63/018,440的权益，其通过引用整体并入本文。
背景技术
癌症，作为死亡的主要原因之一，是特征在于体内细胞生长不受控的的一大类疾病。已经开发出治疗癌症的许多治疗，包括例如手术去除癌症、化学治疗药物和放射治疗。然而，许多癌症仍然没有有效的治愈。特别地，人恶性黑素瘤是高度化学难治性癌症，几乎没有有效的治疗选择。
ABCB5是在多种人恶性肿瘤中表达的多药耐药性(multidrug resistance，MDR)介体，其中其在先前发现代表CSC的治疗抗性CD133(+)肿瘤亚群中特别地过表达。ABCB5赋予癌细胞对化学治疗剂(例如5-氟尿嘧啶(5-FU))的耐药性。
ABCB5+干细胞也存在于正常组织中，并在组织再生和衰老中发挥作用。再生医学涉及使用外源材料(例如支架)来修复、再生、维持和替代组织和器官。支架可以接种有细胞，例如原代细胞或干细胞，以及多种促进组织生长的因子。
发明内容
在一些方面中，提供了与ATP结合盒转运体家族成员B5(ATP-binding cassettetransporter family member B5，ABCB5)结合的抗体。所述抗体包含重链可变结构域(VH)，其包含(i)与如SEQ ID NO:49至56中任一者所示的序列具有至少90％序列同一性的重链互补决定区1(heavy chain complementary determining region 1，HC CDR1)，(ii)与如SEQID NO:57至65中任一者所示的序列具有至少90％序列同一性的重链互补决定区2(heavychain complementary determining region 2，HC CDR2)，和(iii)与如SEQ ID NO:66至72中任一者所示的序列具有至少90％序列同一性的重链互补决定区3(heavy chaincomplementary determining region 3，HC CDR3)；和/或其中所述抗体包含轻链可变结构域(VL)，其包含(i)与如SEQ ID NO：51至54、73至76和80中任一者所示的序列具有至少90％序列同一性的轻链互补决定区1(light chain complementary determining region 1，LCCDR1)；(ii)与如SEQ ID NO：60至63和77至78中任一者所示的序列具有至少90％序列同一性的轻链互补决定区2(light chain complementary determining region 2，LC CDR2)；和(iii)与如SEQ ID NO：67、69、70、79、81和103中任一者所示的序列具有至少90％序列同一性的轻链互补决定区3(light chain complementary determining region 3，LCCDR3)。在一些实施方案中，抗体任选地不是AB100或Ab101。
在另一些方面中，提供了与ATP结合盒转运体家族成员B5(ABCB5)结合的抗体。所述抗体包含重链可变结构域(VH)，其包含(i)如GFTFSSYX1MN(SEQ ID NO：109)或GYTFTX2YYMH(SEQ ID NO：110)所示的重链互补决定区1(HC CDR1)，其中X1是S或D或T，并且X2是S或N，(ii)如YISSSX3X4TIYYADSVKG(SEQ ID NO：111)或IINPSGGSTSYAQKFX5G(SEQ IDNO：112)所示的重链互补决定区2(HC CDR2)，其中X3是S或G，并且X4是S或N；并且X5是K或Q，以及(iii)如NYQYGDYGGY(SEQ ID NO：66)或DX6AVTGTAYYYYYGMDV(SEQ ID NO：113)所示的重链互补决定区3(HC CDR3)，其中X6是Q或L；和/或其中所述抗体包含轻链可变结构域(VL)，其包含(i)如X7AS HDISNFLN(SEQ ID NO：114)或RASX8SVNSX9YLA(SEQ ID NO：115)所示的轻链互补决定区1(LC CDR1)，其中X7是Q或H；X8是L或Q；并且X9是N或K，(ii)如DAYNLQT(SEQ IDNO：77)或GTSSRAT(SEQ ID NO：78)所示的轻链互补决定区2(LC CDR2)，以及(iii)如QQYDYFLSIT(SEQ ID NO：79)或QQFGSSPLT(SEQ ID NO：81)所示的轻链互补决定区3(LCCDR3)，任选地其中所述抗体不是AB100或Ab101。
在另一些方面中，提供了与ATP结合盒转运体家族成员B5(ABCB5)结合的抗体，其中所述抗体与Ab100或Ab101结合相同的表位或者与Ab100或Ab101竞争与ABCB5结合。
在又一些方面中，提供了识别人ABCB5的包含SEQ ID NO.104或与SEQ ID NO.104具有至少80％序列同一性的表位的抗体。
在一些实施方案中，抗体特异性地结合人ABCB5。在另一些实施方案中，抗体与人ABCB5和非人ABCB5交叉反应。在一些实施方案中，抗体结合在细胞表面上表达的ABCB5。在另一些实施方案中，抗体包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，其与Ab100或Ab101的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3相比，总共包含不多于10个氨基酸变化；和/或LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3，其与Ab100或Ab101的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3相比，总共包含不多于10个氨基酸变化。抗体包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，其与另一些实施方案中的Ab100或Ab101的HCCDR1、HC CDR2和HC CDR3相比，总共包含不多于8个氨基酸变化。
在一些实施方案中，抗体包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，其与Ab100或Ab101的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3相比，总共包含不多于5个氨基酸变化。
在一些实施方案中，抗体包含LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其与Ab100或Ab101的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3相比，总共包含不多于8个氨基酸变化。
在一些实施方案中，抗体包含LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其与Ab100或Ab101的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3相比，总共包含不多于5个氨基酸变化。
在一些实施方案中，抗体包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，其中至少一个作为Ab100或Ab101的对应HC CDR包含不多于5个氨基酸变化；和/或LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3，其中至少一个作为Ab100或Ab101的对应LC CDR包含不多于5个氨基酸变化。
在一些实施方案中，抗体包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，其中至少一个作为Ab100或Ab101的对应HC CDR包含不多于2个氨基酸变化。在一些实施方案中，至少一个HCCDR是HC CDR3。在一些实施方案中，抗体包含LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中至少一个作为Ab100或Ab101的对应LC CDR包含不多于2个氨基酸变化。
在一些实施方案中，抗体与Ab100或Ab101包含相同的重链互补决定区(HC CDR)和/或相同的轻链互补决定区(LC CDR)。在一些实施方案中，抗体与Ab100或Ab101包含相同的重链可变结构域和/或与Ab100或Ab101包含相同的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，抗体包含与Ab100或Ab101的重链可变结构域具有至少85％同一性的重链可变结构域和/或与Ab100或Ab101的轻链可变结构域具有至少85％同一性的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，抗体是人抗体或人源化抗体。
在一些实施方案中，抗体是全长抗体。在一些实施方案中，全长抗体是IgG分子。在一些实施方案中，抗体包含与天然存在的对应物相比发生了改变的Fc片段，或者其中所述抗体包含非岩藻糖基化的Fc片段，或者其中所述抗体的抗原结合位点被掩蔽以允许蛋白酶介导的活化。在一些实施方案中，抗体包含改变的IgG1 Fc片段，其包含K214R。在一些实施方案中，抗体包含与如SEQ ID NO:1至8和13至17中任一者所示的重链可变序列和与如SEQID NO:20至23和26至29中任一者所示的轻链可变序列具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗体包含与如SEQ ID NO:31至44中任一者所示的重链序列和与如SEQ IDNO:45至47中任一者所示的轻链序列具有至少90％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，抗体单链双抗体(single-chain diabody，scDb)、二价、三价、四价、五价或六价scFv串联重复(TaFv)是抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段是Fab、Fab'、F(ab')2或Fv。
在一些实施方案中，抗体是单链抗体、双特异性抗体或纳米抗体。
在一些实施方案中，抗体与可检测标记缀合。
在本发明的一些方面中，提供了抗体-药物缀合物(antibody-drug conjugate，ADC)，其包含与治疗剂偶联的本文中公开的抗体。在一些实施方案中，抗体是scFv或其二价、三价、四价、五价或六价scFv串联重复(TaFv)二价串联scFv重复(TaFv)。在一些实施方案中，治疗剂是奥瑞他汀(auristatin)肽、奥瑞他汀E(auristatin E，AE)、单甲基奥瑞他汀E(monomethylauristatin E，MMAE)，或者多拉司他汀(dolastatin)的合成类似物。
在本发明的一些方面中提供了抗体-药物缀合物(ADC)，其包含通过接头与治疗剂偶联的与ATP结合盒转运体家族成员B5(ABCB5)特异性结合的抗体。在一些实施方案中，抗体是scFv或其二价、三价、四价、五价或六价scFv串联重复(TaFv)二价串联scFv重复(TaFv)。在一些实施方案中，治疗剂是奥瑞他汀肽、奥瑞他汀E(AE)、单甲基奥瑞他汀E(MMAE)，或者多拉司他汀的合成类似物。在一些实施方案中，接头是柔性接头。在一些实施方案中，接头选自肽接头、烃接头、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)接头、聚丙二醇(polypropylene glycol，PPG)接头、多糖接头、聚酯接头、由PEG和嵌入杂环组成的混合接头以及烃链。在一些实施方案中，接头是包含2至24个PEG单元的PEG接头。在一些实施方案中，接头是磺酰胺接头。在一些实施方案中，接头是包含GSTSGGGSGGGSGGGGSS(SEQ ID NO：84)或GGGGSS(SEQ ID NO：86)的肽接头。
在一些方面中，本发明是双特异性抗体，其中所述抗体具有对ATP结合盒转运体家族成员B5(ABCB5)具有抗原结合特异性的区域和对免疫效应细胞抗原具有抗原结合特异性的区域。在一些实施方案中，免疫效应细胞抗原是Cd16或CD3。在一些实施方案中，对免疫效应细胞抗原具有抗原结合特异性的区域是抗Cd16 scFv或抗CD3 scFv。在一些实施方案中，对ABCB5具有抗原结合特异性的区域是抗ABCB5 scFv或抗ABCB5单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体包含IgG-scFv融合蛋白[IgG-scFv]。在一些实施方案中，抗体包含单链双抗体(scDb)。在一些实施方案中，抗体包含串联scFv(TaFv)。
提供了核酸或核酸组，其共同编码本文中公开的与ABCB5结合的抗体。在一些实施方案中，核酸是载体或载体组。在一些实施方案中，载体是表达载体。
还提供了宿主细胞，其包含如本文中公开的载体或载体组。在一些实施方案中，宿主细胞选自细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞。
在另一些方面中，提供了经遗传改造的免疫细胞，其表达包含胞外结构域和至少一个胞质信号传导结构域的嵌合受体，其中胞外结构域是与ATP结合盒转运体家族成员B5(ABCB5)结合的单链抗体。在一些实施方案中，单链抗体包含分别在SEQ ID NO：1至8、13至17和20至23、26至29中任一者中所示的重链可变结构域和/或轻链可变结构域。
在一些方面中，提供了药物组合物，其包含(a)如本文中公开的与ABCB5结合的抗体和(b)可药用载体。
在另一些方面中，提供了用于在对象中治疗癌症的方法。所述方法包括向有此需要的对象施用有效量的本文中公开的药物组合物。在一些实施方案中，人患者患有转移性癌症。在一些实施方案中，对象已经经历或正在经历对疾病的另外的治疗。在一些实施方案中，所述疾病是癌症，并且对癌症的治疗是手术、化学治疗、免疫治疗、放射治疗或其组合。
在另一些方面中，提供了用于检测ABCB5的存在的方法。所述方法包括使单独的或与特异性结合和/或捕获其他ABCB5表位的其他抗ABCB5抗体组合的权利要求1至22中所述抗ABCB5抗体与怀疑含有ABCB5的生物样品接触，以及测量抗ABCB5抗体与样品中ABCB5的结合，所述其他ABCB5表位任选地选自
Figure BDA0004022477880000061
在一些实施方案中，治疗包括向对象施用免疫检查点拮抗剂。
在本发明的一些方面中，提供了用于检测ABCB5的存在的方法，其包括使本文中公开的抗ABCB5抗体与怀疑含有ABCB5的生物样品接触以及测量抗ABCB5抗体与样品中ABCB5的结合。在一些实施方案中，生物样品是体内的，并且所述接触步骤通过向对象施用有效的抗ABCB5抗体来进行。
在一些方面中，提供了用于在对象中治疗肿瘤的方法。所述方法包括从患有肿瘤的对象获得免疫白细胞如T细胞、NK细胞单核细胞和/或巨噬细胞或其组合；将T细胞用包含编码含有特异性识别ABCB5的scFv的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)的核酸的载体在体外进行转导，由此经转导的T细胞、NK细胞、单核细胞和/或巨噬细胞免疫细胞表达CAR；在体外扩增经转导TCAR免疫细胞；以及将扩增的经转导TCAR免疫细胞输注到患有肿瘤的对象中，由此产生抗肿瘤免疫T细胞应答，其中肿瘤中的细胞表达ABCB5。在一些实施方案中，抗体与可检测标记缀合。在一些实施方案中，生物样品是体内的并且所述接触步骤通过向对象施用有效的抗ABCB5抗体来进行。
在一些方面中，提供了用于在对象中治疗肿瘤的方法，其包括：从患有肿瘤的对象获得T细胞；将T细胞用包含编码含有特异性识别ABCB5的scFv的嵌合抗原受体(CAR)的核酸的载体在体外进行转导，由此经转导T细胞表达CAR；在体外扩增经转导T细胞；以及将扩增的经转导T细胞输注到患有肿瘤的对象中，由此产生抗肿瘤T细胞应答，其中肿瘤中的细胞表达ABCB5。
在另一些方面中，提供了分离的嵌合抗原受体(CAR)。其包含ABCB5结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中ABCB5结合结构域包含人可变重链(VH)结构域。在一些实施方案中，ABCB5结合结构域包含如本文中所述的抗体。
在本发明的一些方面中，提供了分离的细胞或细胞群，其包含一种或更多种如权利要求69至70中任一项所限定的CAR。在一些实施方案中，所述细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)和调节性T细胞。
在本发明的一些方面中，提供了药物组合物，其包含如本文中公开的细胞或药物组合物以及可药用载体、赋形剂或稀释剂。
在本发明的一些方面中，提供了用于治疗癌症的方法，其包括施用如本文中公开的细胞或药物组合物。
在本发明的一些方面中，提供了如本文中公开的细胞或药物组合物，其用于治疗。
在本发明的一些方面中，提供了如本文中公开的细胞或药物组合物，其用于治疗癌症。
在本发明的一些方面中，提供了如本文中公开的细胞或药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
在一些实施方案中，哺乳动物对象是人。在一些实施方案中，哺乳动物对象是非人灵长类。非人灵长类对象的一些非限制性实例包括恒河猴、狨猴、绢毛猴(tamarin)、猴、狒狒、大猩猩、黑猩猩和猩猩。另一些示例性对象包括驯养动物，例如狗和猫；牲畜，例如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；和另一些动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。
在一些实施方案中，组合物皮下、眼内、玻璃体内、肠胃外、皮下、静脉内、脑室内(intracerebro-ventricularly)、肌内、鞘内、经口、腹膜内、通过经口或鼻吸入，或者通过向一种或更多种细胞、组织或器官直接注射来施用。
在一些方面中，提供了组合物，其用于治疗癌症。
本公开内容的每个限制可涵盖本公开内容的多个实施方案。因此，预期涉及任何一个要素或要素组合的本公开内容的每个限制可包含在本公开内容的每个方面中。本公开内容在其应用中不限于在以下描述中阐述或在附图中举例说明的构造细节和组分的排列。本公开内容能够具有其他实施方案，并且能够以多种方式实践或实施。
附图说明
附图不旨在按比例绘制。在附图中，多个图中示出的每个相同或几乎相同的组件由相同的数字表示。出于清楚的目的，并非在每个附图中都标记每个组件。在附图中：
图1示出了在变性(96℃，5分钟)和还原(100mM DTT)条件下通过SDS-PAGE对抗体批次纯度、稳定性、降解等的基本评估。
图2示出了线性肽ELISA结合研究(20μM肽)的结果。数据示出了对与ABCB5线性表位肽(第三胞外环)以及同源(ABCB1、4、11)蛋白和直系同源(鼠ABCB5)蛋白的相应肽区段的定量结合的比较评估，其特异性/交叉反应性提高。
图3示出了ABCB5重组蛋白ELISA结合研究的结果。数据示出了与重组ABCB5蛋白特异性结合的评价。
图4A至4B示出了环状(生物素化)肽ELISA结合研究(200nM肽)的结果-(ABCB5/无Ab)(图4A)和(ABCB5/BSA)(图4B)。数据示出了对与具有N端生物素修饰以用于固定(固定在链霉亲和素预包被板上)的更天然环状ABCB5肽(通过两端处另外的半胱氨酸之间的二硫键而环化)的特异性结合的评价和亲和力评估。
图5A至5D示出了对具有ABCB5+亚群的人肿瘤细胞系的流式细胞术(FACS)结合研究的结果。数据示出了对与人肿瘤细胞系上的细胞ABCB5特异性结合的评价，表明了用APC标记的第二抗人抗体的检测。人肿瘤细胞系包括MCC13梅克尔细胞癌(Merkel cellcarcinoma)细胞(图5A)、G361黑素瘤细胞(图5B)、A375黑素瘤细胞(图5C)和HT-29结直肠癌细胞(图5D)。
图6示出了具有ABCB5+亚群的人肿瘤细胞系的免疫荧光(immunofluorescence，IF)染色。数据示出了对与人肿瘤细胞系中的细胞ABCB5特异性结合的评价和可视化，表明了用AF594标记的第二抗人抗体进行的检测。
图7A至7B示出了抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cellularcytotoxicity，ADCC)报道子生物测定的结果，并且示出了Ab100(图7A)和b12同种型对照Ab(图7B)对肿瘤细胞系的平均效能/效力。
图8A至8B示出了抗体依赖性细胞吞噬作用(antibody-dependent cellularphagocytosis，ADCP)报道子生物测定的结果，并且示出了Ab100(图8A)和b12同种型对照Ab(图8B)对肿瘤细胞系的平均效能/效力。
图9A至9B示出了(基于细胞的)pAkt/Akt ELISA测定的结果，其中抗ABCB5抗体对pAkt1/Akt1比率的特异性抑制作为抑制PI3K信号传导途径的结果。具有ABCB5+亚群的人肿瘤细胞系是G361细胞(图9A)和A375细胞(图9B)。
图10示出了在小鼠模型中抗ABCB5体内抗肿瘤效力测试的结果。肿瘤模型是A375(CRL-1619)人CDX黑素瘤(肿瘤预防模型)。使用抗体s.c.递送107个细胞。
图11示出了在变性(96℃，5分钟)和还原(100mM DTT)条件下通过SDS-PAGE对抗ABCB5抗体Ab101的抗体批次纯度、稳定性、降解等的评估。
图12示出了在变性(96℃，5分钟)和还原(100mM DTT)条件下通过SDS-PAGE对抗ABCB5抗体Ab42(左)和Ab43(右)的抗体批次纯度、稳定性、降解等的评估。
图13示出了在变性(96℃，5分钟)和还原(100mM DTT)条件下通过SDS-PAGE对抗ABCB5抗体Ab44(左)和Ab45(右)的抗体批次纯度、稳定性、降解等的评估。
图14左图示出了ABCB5抗体Ab101的线性肽ELISA结合研究(20μM肽)的结果。数据示出了对与ABCB5线性表位肽(第三胞外环)以及同源(ABCB1、4、11)蛋白和直系同源(鼠ABCB5)蛋白的相应肽区段的定量结合的比较评估——特异性/交叉反应性提高。右图示出了ABCB5抗体Ab101、Ab42、Ab43、Ab44或Ab45的ABCB5重组蛋白ELISA结合研究的结果，其中数据还示出了BSA阴性对照抗原。数据示出了与重组ABCB5蛋白的特异性结合。
图15左图示出了ABCB5抗体Ab42(左上)、Ab43(左下)、Ab44(右上)或Ab45(右下)的线性肽ELISA结合研究(20μM肽)的结果。数据示出了对与ABCB5线性表位肽(第三胞外环)以及同源(ABCB1、4、11)蛋白和直系同源(鼠ABCB5)蛋白的相应肽区段的定量结合的比较评估，其中乱序肽(scrambled peptide)为阴性对照，特异性/交叉反应性提高。
图16示出了ABCB5抗体Ab101、Ab42、Ab43、Ab44或Ab45的环状(生物素化)肽ELISA结合研究(200nM肽)的结果。数据示出了对与乱序环状肽阴性对照相比的与具有N端生物素修饰以用于固定(固定在链霉亲和素预包被板上)的更天然环状ABCB5肽(通过两端处另外的半胱氨酸之间的二硫键而环化)特异性结合的评价和亲和力评估。
图17示出了在使用广泛单克隆抗体浓度的实验中，ABCB5抗体Ab101、Ab42、Ab43、Ab44或Ab45的环状(生物素化)肽ELISA结合研究(200nM肽)的结果。数据示出了对与乱序环状肽阴性对照相比的与具有N端生物素修饰以用于固定(固定在链霉亲和素预包被板上)的更天然环状ABCB5肽(通过两端处另外的半胱氨酸之间的二硫键而环化)的特异性结合的评价和亲和力评估。
图18示出了流式细胞术(FACS)结合研究的结果——具有ABCB5+亚群的人肿瘤细胞系。数据示出了ABCB5抗体Ab101、Ab43、Ab45、Ab42或Ab44与人肿瘤细胞系上的细胞ABCB5的特异性结合的评价，表明了用APC标记的第二抗人抗体进行的检测。还示出了同种型对照染色。人肿瘤细胞系包括在图中从左至右的MCC13梅克尔细胞癌细胞、G361黑素瘤细胞、A375黑素瘤细胞和HT-29结直肠癌细胞。
图19示出了使用ABCB5抗体Ab101、Ab42、Ab43、Ab44或Ab45或同种型对照的具有ABCB5+亚群的人肿瘤细胞系(上图：MCC13梅克尔细胞癌细胞，下图：A375黑素瘤细胞)的免疫荧光(IF)染色。数据示出了对与这些人肿瘤细胞系中的细胞ABCB5特异性结合的评价和可视化，表明了用AF594标记的第二抗人抗体进行的检测。
图20示出了使用ABCB5抗体Ab101、Ab42、Ab43、Ab44或Ab45或同种型对照的具有ABCB5+亚群的人肿瘤细胞系(上图：HT-29结直肠癌细胞，下图：A549肺癌细胞)的免疫荧光(IF)染色。数据示出了对与这些人肿瘤细胞系中的细胞ABCB5特异性结合的评价和可视化，表明了用AF594标记的第二抗人抗体进行的检测。
图21示出了(基于细胞的)pAkt/Akt ELISA测定的结果，其中抗ABCB5抗体Ab101、Ab42、Ab43、Ab44或Ab45对pAkt1/Akt1比率的特异性抑制作为抑制PI3K信号传导途径的结果。还示出了同种型和无抗体阴性对照。具有ABCB5+亚群的人肿瘤细胞系是A375黑素瘤细胞(左图)和HT-29结直肠癌细胞(右图)。
图22示出了在G361人黑素瘤细胞(左图)或HT-29人结直肠癌细胞(右图)中与pHrodo绿色pH敏感染料缀合的ABCB5抗体Ab101的流式细胞术确定的抗体内化(细胞摄取)评估的结果。设门细胞(％)在上图中示出，并且MFI作为时间的函数在下图中示出。实验在37℃下进行，表明了抗体摄取，并且作为阴性对照在4℃下进行。
图23示出了在MCC13人梅克尔癌细胞(左图)或A549人肺癌细胞(右图)中与pHrodo红色pH敏感染料缀合的ABCB5抗体AB101或Ab42的免疫荧光(IF)可视化确定的抗体内化(细胞摄取)评估的结果。实验表明了测试的ABCB5抗体的特异性抗体摄取。同种型对照抗体用作阴性对照。
图24在左侧4个图中示出了抗ABCB5抗体Ab101/ADC MMAE药物缀合物vs.未经缀合的Ab101在G361黑素瘤细胞(左上图)或MKL-1梅克尔细胞癌细胞(右上图)中对凋亡诱导(胱天蛋白酶3/7Glo)的作用，以及在G361黑素瘤细胞(左下图)或MKL-1梅克尔细胞癌细胞(右下图)中对细胞毒性诱导(CellTiterGlo测定)的作用。右侧4个图为：抗ABCB5抗体Ab101/ADC MMAE药物缀合物vs.同种型对照/ADC MMAE药物缀合物vs.游离MMAE在G361黑素瘤细胞(左上图)或MCC13梅克尔细胞癌细胞(右上图)中对凋亡诱导(胱天蛋白酶3/7Glo)的作用，以及在G361黑素瘤细胞(左下图)或MCC13梅克尔细胞癌细胞(右下图)中对细胞毒性诱导(CellTiterGlo测定)的作用。
具体实施方式
本文中描述了抗ABCB5抗体的组合物(包括药物组合物)和用于设计、制备、制造和/或配制抗ABCB5抗体的方法。还提供了用于选择、设计和/或利用本文中所述的抗体的系统、方法、装置和试剂盒。ATP结合盒(ATP-binding cassette，ABC)转运体在生理和病理学方面发挥关键作用。它们涉及结构多样的分子(范围从小的离子、糖和肽到更复杂的有机分子)的运输。ATP结合盒亚家族B成员5(ATP-binding cassette,sub-family B,member 5，ABCB5)是在多种人恶性肿瘤中表达的多药耐药性(MDR)介体。ABCB5赋予癌细胞对化学治疗剂例如5-氟尿嘧啶(5-FU)的耐药性。本文中所述的“ABCB5+干细胞”或“ABCB5+细胞”是指具有自我更新能力以及分化成多种成体细胞谱系的成熟细胞能力的细胞。
ABCB5+干细胞也存在于正常组织中，并在组织再生和衰老中发挥作用。再生医学涉及使用外源材料(例如支架)来修复、再生、维持和替代组织和器官。支架可接种有细胞，例如原代细胞或干细胞以及多种促进组织生长的因子。
已经在文献中描述了对ABCB5和其他用途例如分离的干细胞和推定的治疗进行研究的抗体。因此，本文中提供了抗体或其部分或编码抗体组合物的核酸，其已被设计为产生治疗结果并任选地改善组织中的一种或更多种稳定性和/或清除率、循环的可及性、蛋白质半衰期和/或细胞状态的调节、抗体靶标亲和力和/或特异性、抗体交叉反应性的降低、抗体纯度的提高、抗体效应功能和/或抗体活性的提高或改变。
本公开内容至少部分基于与已知的抗ABCB5抗体相比具有出乎意料的优异特征的抗ABCB5抗体的开发。例如，本文中公开的抗ABCB5抗体可具有优异/出乎意料的特征，例如，(a)与完整的细胞表面ABCB5结合而不与变性的ABCB5结合，(b)与另一些相关的细胞表面蛋白例如ABCB1和ABCB4没有交叉反应性或有不显著的交叉反应性；(c)相对于市售ABCB5抗体能够诱导显著的癌细胞死亡，(d)能够选择性地结合胞内表位；以及(e)能够选择性地结合胞外表位。
抗体，也称为免疫球蛋白，是由B细胞产生的糖蛋白。使用独特且高度进化的识别系统，抗体可识别靶标并标记靶标表位、外来实体、癌细胞或入侵微生物以由免疫系统进行攻击，从而中和其影响。抗体的产生是体液免疫系统的主要功能。抗体由浆细胞(一种类型的白细胞)分泌。
抗体以两种物理形式出现，一种是从细胞分泌的可溶性形式，以及一种是附着至B细胞表面并且被称为B细胞受体(B cell receptor，BCR)的膜结合的形式。可溶性抗体被释放到血液和组织液以及许多分泌物中以继续勘查入侵微生物和其他非自身抗原。
抗体与抗原的结合通常没有直接的生物学效应。更确切地说，显著的生物学效应是抗体的二级“效应功能”的结果。免疫球蛋白介导多种这些效应功能。这些功能包括补体的固定、对吞噬细胞、淋巴细胞、血小板、肥大细胞和具有免疫球蛋白受体的嗜碱性粒细胞的结合。这种结合可使细胞活化以执行一些功能。
因此，本文中提供了能够结合ABCB5的抗体以及编码所述抗体的核酸及其用于治疗、研究和诊断目的的用途。本文中还提供了抗体的治疗和/或诊断用途的药盒/试剂盒以及用于产生抗ABCB5抗体的方法。另外，本公开内容提供了包含来源于本文中所述的任何抗ABCB5抗体的胞外抗原结合结构域的嵌合抗原受体。
数种ABCB5同种型涉及癌症和疾病。本文中使用的“ABCB5同种型”是具有ABCB5结构的一种变体的ABCB5蛋白。在一些实施方案中，ABCB5同种型是ABCB5同种型1(1257个氨基酸)。ABCB5同种型1包含两个跨膜结构域(transmembrane domain，TMD)，每个跨膜结构域具有6个跨膜(transmembrane，TM)螺旋，即其总共包含12个跨膜螺旋(TM1至12)。在一些实施方案中，ABCB5同种型是同种型2(812个氨基酸)。ABCB5同种型2包含具有6个跨膜(TM)螺旋(TM 1至6)的一个TMD。ABCB5同种型2的TM 1至6对应于ABCB5同种型1的TM 7至12。
因此，本公开内容提供了与ABCB5结合的抗体。在一些实施方案中，抗ABCB5抗体结合胞外环上的细胞表面展示的ABCB5。在另一些实施方案中，抗ABCB5抗体结合ABCB5的胞内环。作为替代或补充，抗ABCB5抗体可对变性ABCB5具有低结合亲和力或不与变性ABCB5结合。
抗体(复数形式可互换使用)是能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点与靶抗原(例如，本公开内容中的ABCB5)特异性结合的免疫球蛋白分子。本文中使用的术语“抗体”不仅涵盖完整(即全长)多克隆或单克隆抗体，而且还涵盖其抗原结合片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、纳米抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰构型，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和经共价修饰的抗体。抗体包括任何类别的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不需要是任何特定类别。根据免疫球蛋白的重链恒定结构域的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可被分配到不同的类别。免疫球蛋白有五大类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的数种可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的。
典型的抗体分子包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，它们通常参与抗原结合。VH和VL区可进一步细分为高变区，也称为“互补决定区”(“CDR”)，散布着更保守的区域，称为“框架区”(“framework region”，“FR”)。每个VH和VL通常由三个CDR和四个FR构成，按以下顺序从氨基末端至羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。因此，抗体可变区由被三个“抗原结合位点”间插的“框架”区组成。使用以下多种术语限定抗原结合位点：(i)互补决定区(CDR)，其在VH中有三个(HCDR1、HCDR2、HCDR3)并且在VL中有三个(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其基于序列变异性；(ii)“高变区”、“HVR”或“HV”，其在VH中有三个(H1、H2、H3)并且在VL中有三个(L1、L2、L3)，是指抗体可变结构域的在如Chothia和Lesk所限定的结构中高变的区域。“框架”或“框架序列”是可变区的除了定义为抗原结合位点的那些之外的其余序列。因为抗原结合位点可通过如上所述的多种术语来定义，因此框架的确切氨基酸序列取决于抗原结合位点如何被定义。
在一些实施方案中，如本文中所述的抗ABCB5抗体可结合并抑制ABCB5受体的活性至少50％(例如，60％、70％、80％、90％、95％或更高)。提供抑制剂效力量度的表观抑制常数(Kiapp或Ki,app)与降低信号传导/转运活性所需的抑制剂浓度有关，并且不依赖于蛋白质浓度。本文中所述的抗ABCB5抗体的抑制剂活性可通过本领域已知的常规方法来确定。
本文中所述的抗体可以是鼠、大鼠、人、灵长类、猪或任何其他来源(包括嵌合或人源化抗体)。这样的抗体是非天然存在的，即在没有人作用的情况下在动物(例如，用期望的抗原或其片段对这样的动物免疫接种)中不会产生。
本文中所述的任何抗体都可以是单克隆或多克隆的。“单克隆抗体”是指同源抗体群，并且“多克隆抗体”是指异源抗体群。这两个术语并不限制抗体的来源或制备其的方式。
在一个实例中，本文中所述方法中使用的抗体是人源化抗体。人源化抗体是指非人(例如鼠)抗体的形式，其是特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列的抗原结合片段。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受体抗体)，其中来自接受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠或兔的具有所期望的特异性、亲和力和能力的CDR的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含在接受体抗体或者导入的CDR或框架序列中均未发现但被包含在内以进一步完善和优化抗体性能的残基。一般而言，人源化抗体将包含至少一个(通常是两个)可变结构域中的基本上全部，其中所有或基本上所有的CDR区域对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR区都是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)(通常是人免疫球蛋白的那些)的至少一部分。抗体可具有如WO 99/58572中所述经修饰的Fc区。其他形式的人源化抗体具有相对于原始抗体改变的一个或更多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，其也被称为“来源于”来自原始抗体的一个或更多个CDR的一个或更多个CDR。人源化抗体还可涉及亲和力成熟。
在另一个实例中，本文中所述的抗体是可包含来自人抗体的重恒定区和轻恒定区的嵌合抗体。嵌合抗体是指具有来自第一物种的可变区或可变区的一部分和来自第二物种的恒定区的抗体。通常来说，在这些嵌合抗体中，轻链和重链二者的可变区模拟来源于一个哺乳动物物种(例如，非人哺乳动物例如小鼠、兔和大鼠)的抗体的可变区，而恒定部分与来源于另一种哺乳动物(例如人)的抗体中的序列同源。在一些实施方案中，可在可变区和/或恒定区中进行氨基酸修饰。
抗体重链和轻链恒定区在本领域是公知的，例如，在IMGT数据库(imgt.org)中或在vbase2.org/vbstat.php.提供的那些，其二者均通过引用并入本文。
在一些实施方案中，抗体是抗原结合片段。本文中使用的术语“抗原结合片段”是指抗体片段，例如，如双抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段，二硫化物稳定的Fv片段(disulfide stabilized Fv fragment，dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫化物稳定的双抗体(disulfide stabilized diabody，ds-diabody)、单链抗体分子(scFv)、单结构域抗体(single domain antibody，sdab)scFv二聚体(二价双抗体)、由包含一个或更多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或与抗原结合但不包含完整抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够和与亲本抗体或亲本抗体片段结合的相同抗原结合。根据一些具体实施方案，抗原结合片段包含轻链可变区、轻链恒定区和Fd区段(即，包含在Fab片段中的重链的一部分)。根据另一些具体实施方案，抗原结合片段包含Fab和F(ab′)。
在另一个实例中，本文中所述的抗体可以是单结构域抗体，其通过仅一个单可变结构域(例如单重链结构域)与靶抗原相互作用(与通过重链和轻链可变结构域与靶抗原相互作用的传统抗体相反)。单结构域抗体可以是仅包含抗体重链并且不含轻链的重链抗体(VHH)。除了可变区(例如，VH)之外，单结构域抗体还可包含恒定区，例如CH1、CH2、CH3、CH4或其组合。
在一些实施方案中，抗体及其抗原结合片段包含片段包含可结晶片段(fragmentcrystallizable，Fc)区。Fc区是抗体及其抗原结合片段的尾部区域，其包含恒定结构域(例如，CH2和CH3)；抗体及其抗原结合片段的另一个区域是Fab区，其包含可变结构域(例如，VH)和恒定结构域(例如CH1)，其中前者限定了结合特异性。
如本文中所述，抗体可包含VH结构域。在一些实施方案中，VH结构域还包含Fc区的一个或更多个恒定结构域(例如，CH2和/或CH3)和/或Fab区的一个或更多个恒定结构域(例如CH1)。在一些实施方案中，一个或更多个恒定结构域(例如，CH1、CH2和/或CH3)中的每一个可包含恒定结构域的一部分或由恒定结构域的一部分组成。例如，在一些实施方案中，恒定结构域包含相应完整序列的99％或更少、98％或更少、97％或更少、96％或更少、95％或更少、90％或更少、80％或更少、70％或更少、60％或更少、50％或更少、40％或更少、30％或更少、20％或更少或者10％或更少。
或者，本文中所述的抗体可在本领域已知和/或本文中举例说明的抗体之一的一个或更多个CDR区域中包含多至5个(例如，4、3、2或1个)氨基酸残基变化，并且以基本类似的亲和力(例如，具有以同级的KD值)结合相同的抗原表位。在一个实例中，氨基酸残基变化是保守的氨基酸残基替换。本文中使用的“保守氨基酸替换”是指不改变其中进行氨基酸替换的蛋白质的相对电荷或尺寸特征的氨基酸替换。变体可根据本领域普通技术人员已知的改变多肽序列的方法，例如见于汇编这样的方法的参考文献(例如Molecular Cloning:ALaboratory Manual,J.Sambrook,et al.,eds.,Second Edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989或Current Protocols inMolecular Biology,F.M.Ausubel,et al.,eds.,John Wiley&Sons,Inc.,New York)中的方法来制备。保守的氨基酸替换包括在以下组内的氨基酸之间进行的替换：(a)M，I，L，V；(b)F，Y，W；(c)K，R，H；(d)A，G；(e)S，T；(f)Q，N；和(g)E，D。
在一些实施方案中，本文中所述的抗ABCB5抗体与相应的靶抗原或其表位特异性地结合。与抗原或表位“特异性结合”的抗体是本领域充分理解的术语。如果分子与特定靶抗原反应比与其与替代靶标反应更频繁、更快、持续时间更长和/或亲和力更高，则称其表现出“特异性结合”。如果抗体以比其与其他物质结合的更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间来结合，则该抗体“特异性结合”靶抗原或表位。例如，与抗原(ABCB5)或其中的抗原表位特异性(或优先)结合的抗体是以比其与其他抗原或相同抗原中的其他表位结合的更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间来结合该靶抗原的抗体。根据该定义还可理解，例如，与第一靶抗原特异性结合的抗体可特异性或优先地与第二靶抗原结合或者或可不与其特异性或优先地结合。因此，“特定结合”或“优先结合”不一定需要(尽管它可包括)排他性结合。在一些实例中，与靶抗原或其表位“特异性结合”的抗体可不与其他抗原或相同抗原中的其他表位结合(例如，在常规测定中不可检出的结合)。
在一些实施方案中，本文中所述的抗体相对于其他相关细胞表面受体(例如ABCB1、4和11)与ABCB5特异性地结合。在一些实施方案中，本文中所述的抗体不与一种或更多种相关细胞表面蛋白(例如本文中所述的那些)结合。在一些实施方案中，本文中所述的抗体不与在干细胞的细胞表面上表达的一种更多种相关蛋白质结合。
在一些实施方案中，本文中所述的抗体相对于来自其他物种的ABCB5与特定物种的ABCB5(例如，人ABCB5)特异性地结合。例如，本文中所述的抗体可相对于小鼠ABCB5与人ABCB5特异性地结合。在另一些实施方案中，本文中所述的抗体可与人ABCB5和来自非人物种(例如，非人灵长类例如恒河猴或猪)的一个或更多个ABCB5交叉反应。在一些实施方案中，抗体以类似的结合亲和力与人、恒河猴和猪ABCB5交叉反应，但对小鼠ABCB5的结合亲和力显著降低。
在一些实施方案中，如本文中所述的抗ABCB5抗体对靶抗原(例如人ABCB5)或其抗原表位具有合适的结合亲和力。本文中使用的“结合亲和力”是指表观缔合常数或KA，其是缔合常数和解离常数(分别是K-on和K-off)的比率。KA是解离常数(KD)的倒数。本文中所述的抗ABCB5抗体可对靶抗原或抗原表位的结合亲和力(KD)为至少10-8、10-9、10-10M或更低。提高的结合亲和力对应于降低的KD值。抗体对第一抗原相对于第二抗原的更高亲和力结合可通过结合第一抗原的KA(或较小的数值KD)比结合第二抗原的KA(或数值KD)更高来指示。在这样的情况下，抗体具有相对于第二抗原(例如，以第二构象的相同第一蛋白质或其模拟物；或第二蛋白质)对第一抗原(例如，以第一构象的第一蛋白质或其模拟物)的特异性。在一些实施方案中，与对另一种膜蛋白(例如，ABCB1、ABCB4和ABCB11)的结合亲和力相比，本文中所述的抗ABCB5抗体对ABCB5具有更高的结合亲和力(更高的KA或更小的KD)。结合亲和力的差异(例如，针对特异性或其他比较)可以是至少1.5、2、2.5、3、4、5、10、15、20、37.5、50、70、80、91、100、500、1000、5000、10000或105倍。在一些实施方案中，任何抗ABCB5抗体可以被进一步亲和力成熟以提高抗体对靶抗原或其抗原表位的结合亲和力。
结合亲和力(或结合特异性)可通过多种方法确定，所述方法包括平衡透析、平衡结合、凝胶过滤、ELISA、表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)、荧光激活细胞分选(fluorescent activated cell sorting，FACS)或光谱术(例如，使用荧光测定)。用于评价结合亲和力的示例性条件是：HBS-P缓冲液(10mM HEPES pH7.4，150mM NaCl，0.005％(v/v)表面活性剂P20)和PBS缓冲液(10mM PO4 -3，137mM NaCl，和2.7mM KCl)。这些技术可用于测量结合蛋白的浓度作为靶蛋白浓度的函数。结合的蛋白([结合])的浓度通过以下等式一般与游离靶蛋白([游离])的浓度相关：[结合]＝[游离]/(Kd+[游离])。
然而并不总是需要精确确定KA，但是因为有时足以获得亲和力的定量测量(如使用例如ELISA或FACS分析的方法确定的)，其与KA成正比，并因此可用于比较，例如，如通过功能测定(例如，体外或体内测定)中的活性来确定亲和力是否更高(例如，2倍高)以获得亲和力的定量测量或获得对亲和力的推理。
在一些实施方案中，本文中公开的抗ABCB5抗体表现出一种或更多种生物活性，包括阻断ABCB5的胞内信号传导或分子转运活性或与市售ABCB5+抗体竞争。因此，除了本文中公开的抗体序列之外，本发明的抗体还可与那些抗体序列共有序列同一性和类似的功能，但具有一些氨基酸差异。
在一些实施方案中，抗体和其抗原结合片段包含这样的重链可变区，其具有与本文中提供的任何氨基酸序列共有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体的氨基酸序列包含本文中提供的氨基酸序列。
鉴定、表征和修饰了数种用于治疗、诊断和研究用途的主要候选抗体，以开发稳健的ABCB5结合剂组。两种全长抗体包括Ab-100和Ab-101。
本文中描述的抗体是独特的，因为它们具有数种作用模式/相关特性，包括：抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性(细胞)吞噬作用(ADCP)、可能的补体依赖性细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)和信号转导过程的抑制。抗体可单独用作治疗剂或诊断剂，或者与其他治疗剂一起使用。例如，与“经典”细胞抑制剂(例如依托泊苷(Etoposide)、紫杉醇、多柔比星(Doxorubicin)等)的协同共治疗提供了增强的治疗益处。抗体还可通过机制上不相关的协同作用与另一些治疗性抗体(例如，抗EGFR西妥昔单抗(Cetuximab)、抗PD-1纳武单抗(Nivolumab)、抗VEGF贝伐单抗(Bevacizumab)或类似物)或通过机制上相关的协同作用与小分子抑制剂(例如BRAF抑制剂维莫非尼(Vemurafenib)、达拉菲尼(Dabrafenib)、曲美替尼(Trametinib)、MEK抑制剂)通过阻断ABCB5介导的药物外排(drug efflux)表现出化学抗性逆转。
因此，Ab-100具有与ADCC、ADCP、CDC和抑制信号转导过程相关的有用特性。Ab-100具有以下氨基酸序列：
重链(hc)肽序列：
Figure BDA0004022477880000191
轻链(lc)肽序列：
Figure BDA0004022477880000192
重链(VH)区和轻链(VL)区的可变结构域加下划线。
Ab-101还具有数种作用模式/相关特性，包括：通过(化学)药物缀合的方式进行修饰的适用性以及在细胞表面上抗原(ABCB5)结合之后对缀合的抗体的细胞摄取(内化)以进行靶向药物递送的能力。抗体可单独使用、与治疗剂组合使用或与治疗剂连接使用。Ab-101具有以下氨基酸序列：
重链(hc)肽序列：
Figure BDA0004022477880000201
轻链(lc)肽序列：
Figure BDA0004022477880000202
重链(VH)区和轻链(VL)区的可变结构域加下划线。
Ab100和Ab101各自均是全人单克隆IgG1κ(同种异型G1m17、nG1m1重链和Km3轻链)，并且二者都以高特异性和亲和力与人ABCB5转录物变体2或β同种型[NCBI登录号NM_178559.5]的第三胞外环(第三EC环)表位(RFGAYLIQAGRMTPEG，SEQ ID NO:104)和所有其他包含该表位的ABCB5+变体结合。
因此，本发明的一些抗体可与人ABCB5的包含SEQ ID NO.104、其片段或与SEQ IDNO.104具有至少75％、80％或90％序列同一性的多肽的表位结合。在一些实施方案中，本发明的抗体可与人ABCB5的胞外环3的表位及其片段以及任选地多种其他相邻和/或暴露的跨膜残基结合。
术语“表位”是指与抗体接触的抗原(例如人ABCB5)的一部分。表位可以是线性的，即涉及与单氨基酸序列的结合，或者是构象的，即涉及与抗原的多个区中可不必是连续的两个或更多个氨基酸序列的结合。本文中提供的抗体可与人ABCB5蛋白的胞外结构域内的不同(重叠或非重叠)表位结合。因此，表位可由连续的氨基酸(通常是线性表位)或通过蛋白质的三级折叠而并列的非连续氨基酸(通常是构象表位)两种情况形成。由连续氨基酸形成的表位通常但不总是在暴露于变性溶剂时保留，然而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时损失。表位通常以独特的空间构象包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。用于确定给定抗体结合什么表位的方法(即，表位作图(epitopemapping))在本领域是公知的，并且包括例如免疫印迹和免疫沉淀测定。确定表位的空间构象的方法包括本领域的技术，例如x射线晶体学、x射线共晶体学、抗原突变分析、二维核磁共振和HDX-MS。术语“表位作图”是指鉴定抗体-抗原识别的分子决定簇的过程。
关于两种或更多种抗体的术语“与相同表位结合”意指抗体与相同的氨基酸残基区段结合，如通过给定方法确定的。用于用本文中所述的抗体来确定抗体与“ABCB5上的相同表位”是否结合的技术包括例如表位作图方法，例如抗原:抗体复合物的晶体的x射线分析(其提供了表位的原子分辨率)和氢/氘交换质谱(hydrogen/deuterium exchange massspectrometry，HDX-MS)。另一些方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变变化形式的结合，其中由于抗原序列内氨基酸残基的修饰而引起的结合损失通常被认为是表位组分的象征。另外，还可使用用于表位作图的计算组合方法。这些方法依赖于目的抗体从组合噬菌体展示肽文库中亲和分离特定短肽的能力。预期具有相同VH和VL或相同CDR1、2和3序列的抗体与相同的表位结合。
“与另一种抗体竞争与靶标结合”的抗体是指抑制(部分或完全)另一种抗体与靶标结合的抗体。可使用已知的竞争实验(例如
Figure BDA0004022477880000211
表面等离子体共振(surfaceplasmon resonance，SPR)分析)来确定两种抗体是否彼此竞争与靶标结合，即，一种抗体是否以及在什么程度上抑制另一种抗体与靶标结合。在一些实施方案中，抗体与另一种抗体竞争与靶标结合并抑制另一种抗体与靶标结合至少50％、60％、70％、80％、90％或100％。抑制或竞争的水平可以是不同的，这取决于哪种抗体是“阻断抗体”(即，首先与靶标孵育的冷性抗体)。如果抗体双向阻断彼此至少50％，则两种抗体“交叉竞争(cross-compete)”，即，与一种或另一种抗体在竞争实验中是否首先与抗原接触无关。用于确定两种抗体是否竞争或交叉竞争结合的竞争性结合测定包括：竞争与表达ABCB5的细胞的结合，例如通过流式细胞术。另一些方法包括：SPR(例如
Figure BDA0004022477880000212
)、固相直接或间接放射免疫测定(radioimmunoassay，RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(enzyme immunoassay，EIA)、夹心竞争测定；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA；固相直接标记测定或固相直接标记夹心测定。
本文中使用的针对IgG抗体的术语“高亲和力”是指对靶抗原具有10-8M或更小、10-9M或更小、或10-10M或更小的KD的抗体。然而，“高亲和力”结合可因其他抗体同种型而异。例如，IgM同种型的“高亲和力”结合是指抗体具有的KD为10-10M或更小、或10-8M或更小。
除了Ab100和Ab101以及与其相同表位结合的抗体之外，还设计了具有增强的特性的数种抗ABCB5抗体。
例如，已经设计了具有框架区(FR)经优化区域的数种抗体。将序列和相对于Ab100的变化在下面的每个序列中突出显示(斜体和加下划线)，并在本申请通篇示出。CDR加下划线并是粗体的。可变重链包含在单括号[]中，并且可变轻链在三括号[[[]]]中。
Ab1：重链(hc)可变结构域(VH)肽序列：
Figure BDA0004022477880000221
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列：
Figure BDA0004022477880000222
来源于Ab100/Ab101的其他增强的抗体种类通过由亲和力成熟方法进行相应选择而具有提高的结合亲和力特性。下面给出了具有增强的亲和力的Ab100来源的种类的序列。CDR加下划线并且是粗体的：
Ab2：重链(hc)可变结构域(VH)肽序列：
Figure BDA0004022477880000223
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列：
Figure BDA0004022477880000224
Ab3：重链(hc)可变结构域(VH)肽序列：
Figure BDA0004022477880000225
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列：
Figure BDA0004022477880000226
Ab4：重链(hc)可变结构域(VH)肽序列：
Figure BDA0004022477880000227
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列：
Figure BDA0004022477880000228
具有全序列重链的Ab100的Fc经修饰形式包括：
Ab5：具有提高的体外ADCC/ADCP效力和体内半衰期的重链(hc)全肽序列(轻链与Ab100相同)([重链可变链]在括号中)：
Figure BDA0004022477880000231
Ab100的组合形式包括：
Ab6：重链(hc)可变结构域(VH)肽序列AB1×B04：
Figure BDA0004022477880000232
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列AB1×B04：
Figure BDA0004022477880000233
Ab7：重链(hc)可变结构域(VH)肽序列AB1×G02：
Figure BDA0004022477880000234
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列AB1×G02：
Figure BDA0004022477880000235
Ab8：重链(hc)可变结构域(VH)肽序列AB1×H01：
Figure BDA0004022477880000236
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列AB1×H01：
Figure BDA0004022477880000237
Ab9：重链(hc)全肽序列AB1 HCII.d：
Figure BDA0004022477880000241
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列AB1 HCII.d：
Figure BDA0004022477880000242
Ab10：重链(hc)全肽序列B04 HCII.d：
Figure BDA0004022477880000243
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列B04 HCII.d：
Figure BDA0004022477880000244
Ab11：重链(hc)全肽序列G02 HCII.d：
Figure BDA0004022477880000245
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列G02 HCII.d：
Figure BDA0004022477880000246
Ab12：
Figure BDA0004022477880000247
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列H01 HCII.d：
Figure BDA0004022477880000251
Ab13：重链(hc)全肽序列AB1×B04 HCII.d：
Figure BDA0004022477880000252
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列AB1×B04 HCII.d：
Figure BDA0004022477880000253
Ab14：重链(hc)全肽序列AB1×G02 HCII.d：
Figure BDA0004022477880000254
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列AB1×G02 HCII.d：
Figure BDA0004022477880000255
Ab15：重链(hc)全肽序列AB1×H01 HCII.d：
Figure BDA0004022477880000256
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列AB1×H01 HCII.d：
Figure BDA0004022477880000257
具有多个Fc修饰的Ab100的稳定非糖基化形式包括：Ab16：非糖基化的重链(hc)全肽序列：
Figure BDA0004022477880000261
非糖基化的轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列AB1：
Figure BDA0004022477880000262
Ab17：非糖基化的重链(hc)全肽序列：
Figure BDA0004022477880000263
非糖基化的轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列H01：
Figure BDA0004022477880000264
序列和相对于Ab101的变化在下面的每个序列中突出显示。CDR加下划线并且是粗体的：
Ab101的亲和力成熟形式包括：
Ab42：重链(hc)可变结构域(VH)肽序列：
Figure BDA0004022477880000265
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列：
Figure BDA0004022477880000266
Ab43：重链(hc)可变结构域(VH)肽序列：
Figure BDA0004022477880000267
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列：
Figure BDA0004022477880000268
Ab44：重链(hc)可变结构域(VH)肽序列：
Figure BDA0004022477880000271
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列：
Figure BDA0004022477880000272
Ab45：重链(hc)可变结构域(VH)肽序列：
Figure BDA0004022477880000273
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列：
Figure BDA0004022477880000274
另外，已经设计了具有经修饰形式的数种抗ABCB5抗体。这些包括双特异性抗体形式(与抗CD16 scFv和抗CD3 scFv组合的全人IgG1κ抗ABCB5抗体或scFv)。在产生重组双特异性抗体衍生物(即衍生的抗体形式与两种不同的抗原特异性结合)的许多不同选择中，设计了三种不同的形式，其中第一特异性/结合位点识别ABCB5(肿瘤)抗原，并且所述特异性/结合位点是针对某种免疫效应细胞抗原(即，细胞毒性T细胞淋巴细胞[cytotoxic T celllymphocyte，CTL]上的CD3或针对自然杀伤[natural killer，NK]细胞上的CD16。这些构建体可被称为双特异性[CTL/NK]细胞接合物。
IgG-scFv融合蛋白[IgG-scFv]
在这些实例中，采用具有给定特异性的现有全长IgG(1)抗体分子，并且其通过重组添加针对另一种抗原的充分有效的结合位点(例如，全scFv片段、双抗体、Fab片段或类似物)来增强(->第二新引入的特异性)。添加的位点可以是轻链的、重链的C端末端或抗体多肽的任何其他潜在的合适位点。
Ab18：具有C端融合的抗CD3 scFv的重链(hc)全肽序列AB1：
Figure BDA0004022477880000281
Figure BDA0004022477880000282
Figure BDA0004022477880000283
未进行改变的轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列AB1(->Ab1 LC)：
Figure BDA0004022477880000284
Ab19：具有C端融合的抗CD3 scFv的重链(hc)全肽序列H01：
Figure BDA0004022477880000285
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列H01：
Figure BDA0004022477880000286
Ab20：重链(hc)可变结构域(VH)肽序列AB1(非寻址(not addressed))：
Figure BDA0004022477880000287
具有C端融合的抗CD3 scFv的轻链(lc)全肽序列AB1：
Figure BDA0004022477880000291
Figure BDA0004022477880000292
Figure BDA0004022477880000293
AB21：重链(hc)可变结构域(VH)肽序列H01：
Figure BDA0004022477880000294
具有C端融合的抗CD3 scFv的轻链(lc)全肽序列H01：
Figure BDA0004022477880000295
Ab22：具有C端融合的抗Cd16 scFv的重链(hc)全肽序列AB1：
Figure BDA0004022477880000296
Figure BDA0004022477880000297
Figure BDA0004022477880000298
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列AB1(非寻址)
Figure BDA0004022477880000299
Ab23：具有C端融合的抗Cd16 scFv的重链(hc)全肽序列H01：
Figure BDA0004022477880000301
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列H01(非寻址)：
Figure BDA0004022477880000302
Ab24：重链(hc)可变结构域(VH)肽序列AB1(非寻址)：
Figure BDA0004022477880000303
具有C端融合的抗Cd16 scFv的轻链(lc)全肽序列AB1：
Figure BDA0004022477880000304
Figure BDA0004022477880000305
Figure BDA0004022477880000306
Ab25：重链(hc)可变结构域(VH)肽序列H01(非寻址)：
Figure BDA0004022477880000307
具有C端融合的抗Cd16 scFv的轻链(lc)全肽序列H01：
Figure BDA0004022477880000308
单链双抗体(scDb)
重组抗体片段，其中根据方案(例如VHA-VLB-VHB-VLA)将2组VH和VL结构域(产生功能scFv片段)重组编码/表达为连续的单多肽链。由于这些重组抗体片段是通过仅使用可变结构域而自主组装的，因此所有所得的构建体组合均不包含恒定结构域。因此，所有这些构建体例如不具有Fc区。
Ab26：组合AB1和抗CD3的可变结构域的全肽序列(VHA-VLB-VHB-VLA)：
Figure BDA0004022477880000311
Figure BDA0004022477880000312
Figure BDA0004022477880000313
Figure BDA0004022477880000314
Ab27：组合AB1和抗CD3的可变结构域的全肽序列(VHB-VLA-VHA-VLB)：
Figure BDA0004022477880000315
Ab28：组合H01和抗CD3的可变结构域的全肽序列(VHA-VLB-VHB-VLA)：
Figure BDA0004022477880000316
另外的丝氨酸氨基酸残基(Ser或
Figure BDA0004022477880000317
)
Ab29：组合H01和抗CD3的可变结构域的全肽序列(VHB-VLA-VHA-VLB)：
Figure BDA0004022477880000321
Ab30：组合AB1和抗Cd16的可变结构域的全肽序列(VHA-VLB-VHB-VLA)：
Figure BDA0004022477880000322
Figure BDA0004022477880000323
Figure BDA0004022477880000324
Figure BDA0004022477880000325
Ab31：组合AB1和抗Cd16的可变结构域的全肽序列(VHB-VLA-VHA-VLB)：
Figure BDA0004022477880000326
Ab32：组合H01和抗Cd16的可变结构域的全肽序列(VHA-VLB-VHB-VLA)：
Figure BDA0004022477880000327
Ab33：组合H01和抗Cd16的可变结构域的全肽序列(VHB-VLA-VHA-VLB)：
Figure BDA0004022477880000331
Ab100的串联scFv(TaFv)：
重组抗体片段，其中根据方案(例如VHA-VLB-VHB-VLA)将2组VH和VL结构域(产生功能scFv片段)重组编码/表达为连续的单多肽链并称为串联scFv(TaFv)。由于这些重组抗体片段是通过仅使用可变结构域而自主组装的，因此所有所得的构建体组合均不具有恒定结构域，并因此所有这些构建体例如不具有Fc区。
Ab34：组合AB1和抗CD3的可变结构域的全肽序列(VHA-VLA-VHB-VLB)：
Figure BDA0004022477880000332
Ab35：组合AB1和抗CD3的可变结构域的全肽序列(VHA-VLA-VHB-VLB)：
Figure BDA0004022477880000333
Ab36：组合H01和抗CD3的可变结构域的全肽序列(VHA-VLA-VHB-VLB)：
Figure BDA0004022477880000341
Ab37：组合H01和抗CD3的可变结构域的全肽序列(VHA-VLA-VHB-VLB)：
Figure BDA0004022477880000342
Ab38：组合Ab1和抗Cd16的可变结构域的全肽序列(VHA-VLA-VHB-VLB)：
Figure BDA0004022477880000343
Ab39：组合AB1和抗Cd16的可变结构域的全肽序列(VHA-VLA-VHB-VLB)：
Figure BDA0004022477880000344
Ab40：组合H01和抗Cd16的可变结构域的全肽序列(VHA-VLA-VHB-VLB)：
Figure BDA0004022477880000351
Ab41：组合H01和抗Cd16的可变结构域的全肽序列(VHA-VLA-VHB-VLB)：
Figure BDA0004022477880000352
Ab101的双特异性变体在下文中公开：
Ab46：具有C端融合的抗CD3 scFv的重链(hc)全肽序列AB101：
Figure BDA0004022477880000353
Figure BDA0004022477880000354
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列AB101(非寻址)：
Figure BDA0004022477880000355
Ab47：具有C端融合的抗CD3 scFv的轻链(lc)全肽序列AB101：
Figure BDA0004022477880000361
重链(hc)可变结构域(VH)肽序列AB101(非寻址)：
Figure BDA0004022477880000362
Ab48：具有C端融合的抗CD16 scFv的重链(hc)全肽序列AB101：
Figure BDA0004022477880000363
Figure BDA0004022477880000364
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列AB101：
Figure BDA0004022477880000365
Ab49：具有C端融合的抗CD16 scFv的轻链(lc)全肽序列AB101：
Figure BDA0004022477880000366
重链(hc)可变结构域(VH)肽序列AB101(非寻址)：
Figure BDA0004022477880000367
Ab101的单链双抗体(scDb)
Ab50：组合AB101和抗CD3的可变结构域的全肽序列(VHA-VLB-VHB-VLA)：
Figure BDA0004022477880000371
Ab51：组合AB101和抗CD3的可变结构域的全肽序列(VHB-VLA-VHA-VLB)：
Figure BDA0004022477880000372
Ab52：组合AB101和抗Cd16的可变结构域的全肽序列(VHA-VLB-VHB-VLA)：
Figure BDA0004022477880000373
Ab53：组合AB101和抗Cd16的可变结构域的全肽序列(VHB-VLA-VHA-VLB)
Figure BDA0004022477880000374
Ab101的串联scFv(TaFv):
Ab54：组合(h)AB101和抗CD3的可变结构域的全肽序列(VHA-VLA-VHB-VLB)：
Figure BDA0004022477880000381
Ab55：组合(h)AB101和抗CD3的可变结构域的全肽序列(VHA-VLA-VHB-VLB)：
Figure BDA0004022477880000382
Ab56：组合AB101和抗Cd16的可变结构域的全肽序列(VHA-VLA-VHB-VLB)：
Figure BDA0004022477880000383
Ab57：组合AB101和抗Cd16的可变结构域的全肽序列(VHA-VLA-VHB-VLB)：
Figure BDA0004022477880000384
Ab44的串联scFv(TaFv):
Ab58：具有C端融合的抗CD3 scFv的重链(hc)全肽序列AB44
Figure BDA0004022477880000391
Figure BDA0004022477880000392
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列Ab44(非寻址)：
Figure BDA0004022477880000393
Ab59：具有C端融合的抗CD3 scFv的轻链(lc)全肽序列Ab44：
Figure BDA0004022477880000394
重链(hc)可变结构域(VH)肽序列Ab44：
Figure BDA0004022477880000395
Ab60：具有C端融合的抗Cd16 scFv的重链(hc)全肽序列Ab44：
Figure BDA0004022477880000396
Figure BDA0004022477880000397
轻链(lc)可变结构域(VL)肽序列Ab101(非寻址)：
Figure BDA0004022477880000398
Ab61：具有C端融合的抗Cd16 scFv的轻链(lc)全肽序列Ab44：
Figure BDA0004022477880000401
重链(hc)可变结构域(VH)肽序列Ab101(非寻址)：
Figure BDA0004022477880000402
Ab62：组合Ab101和抗CD3的可变结构域的全肽序列(VHA-VLB-VHB-VLA)：
Figure BDA0004022477880000403
Ab63：组合Ab44和抗CD3的可变结构域的全肽序列(VHB-VLA-VHA-VLB)：
Figure BDA0004022477880000404
Ab64：组合Ab44和抗Cd16的可变结构域的全肽序列(VHA-VLB-VHB-VLA)：
Figure BDA0004022477880000405
Ab65：组合Ab44和抗Cd16的可变结构域的全肽序列(VHB-VLA-VHA-VLB)：
Figure BDA0004022477880000411
Ab66：组合Ab44和抗CD3的可变结构域的全肽序列(VHA-VLA-VHB-VLB)：
Figure BDA0004022477880000412
Ab67：组合Ab44和抗CD3的可变结构域的全肽序列(VHA-VLA-VHB-VLB)：
Figure BDA0004022477880000413
Ab68：组合Ab44和抗Cd16的可变结构域的全肽序列(VHA-VLA-VHB-VLB)：
Figure BDA0004022477880000414
Ab69：组合Ab44和抗Cd16的可变结构域的全肽序列(VHA-VLA-VHB-VLB)：
Figure BDA0004022477880000421
如下文更详细描述的，本发明还涵盖抗体药物缀合物(ADC)，其中抗ABCB5抗体与接头和载荷(细胞毒性剂)组合以用于靶向药物递送。通过接头在抗体分子的任何可行位点用任何可行的技术/化学与任何细胞毒性载荷缀合的本文中所述的任何抗体或其部分是本发明的ADC。
本文中所述的构建体可包含接头。接头可以是例如肽接头。肽接头包括例如长肽接头，例如GSTSGGGSGGGSGGGGSS(SEQ ID NO.84)和短肽接头，例如GGGGSS(SEQ ID NO.86)。许多其他接头在本文中描述。
具有基于小分子或肽的细胞毒性剂的应用于ADC/靶向药物递送目的示例性重组抗体片段包括以下构建体：
与核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein，RIP；例如多花白树毒蛋白(Gelonin))融合的Ab100来源的抗ABCB5 scFv
组合scFv和多花白树毒蛋白的全肽序列
Figure BDA0004022477880000422
Figure BDA0004022477880000423
Figure BDA0004022477880000424
*_*＝ER(内质网)定位/保留信号肽；仅以来自细菌表达的形式存在
标签和ER是任选的并且可以去除。因此，SEQ ID NO 165可任选地不包含标签和ER。
无表位标签的组合scFv和多花白树毒蛋白的全肽序列
Figure BDA0004022477880000431
与核糖体失活蛋白(RIP)(例如，来自多花白树(Gelonium multiflorum)的多花白树毒蛋白)融合的Ab101来源的抗ABCB5 scFv
组合Ab101 scFv和多花白树毒蛋白的全肽序列
Figure BDA0004022477880000432
Figure BDA0004022477880000433
*_*＝ER(内质网)定位/保留信号肽；仅以来自细菌表达的形式存在
标签和ER是任选的并且可以去除。因此，SEQ ID NO 167可任选地不包含标签和ER。
包括在内的另一些形式包含例如抗ABCB5 scFv/TaFv或核糖体失活蛋白类似物，b)外毒素A(Exotoxin A，ETA；来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、c)皂草毒蛋白(Saporin)(来自肥皂草(Saponaria officinalis))、d)丝瓜籽蛋白P1(Luffin P1)(来自丝瓜(Luffa cylindrica))，以及e)白喉毒素(Diphteria toxin，DT；来自白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae))。
与RIP融合的串联scFv(TaFv’s)和抗ABCB5 scFv’s
与多花白树毒蛋白(N端或C端)：
无表位标签的组合Ab101 scFv和多花白树毒蛋白的全肽序列
Figure BDA0004022477880000441
本文中提供了ABCB5抗体-药物缀合物的另外的实例。例如，下文呈现了与另外的肽接头/间隔区和基于多肽的免疫毒素或载荷[RIP＝核糖体抑制剂蛋白或核糖体失活蛋白]，即a)多花白树毒蛋白(来自多花白树)、b)外毒素a(ETA；来自铜绿假单胞菌)、c)皂草毒蛋白(来自肥皂草)、d)丝瓜籽蛋白P1(来自丝瓜)和e)白喉毒素(DT；来自白喉棒状杆菌)组合的作为严格的单价和单特异性scFv’s(VH-VL)或作为单特异性而非二价串联Fv’s(VH-VL-[长的中间接头＝肽间隔区]-VH-VL)的示例性抗ABCB5单链片段(Ab8、Ab101和Ab44)。
[VH]和[[[VL]]]：
Ab70：组合Ab1×H01(Ab8)的scFv的可变结构域和多花白树毒蛋白毒素的全肽序列
Figure BDA0004022477880000442
Figure BDA0004022477880000443
Ab71：组合Ab1×H01(Ab8)的TaFv的可变结构域和多花白树毒蛋白毒素的全肽序列
Figure BDA0004022477880000444
Figure BDA0004022477880000445
Ab72：组合Ab101的scFv的可变结构域和多花白树毒蛋白毒素的全肽序列
Figure BDA0004022477880000451
Figure BDA0004022477880000452
Ab73：组合Ab101的TaFv的可变结构域和多花白树毒蛋白毒素的全肽序列
Figure BDA0004022477880000453
Figure BDA0004022477880000454
Ab74：组合F01(Ab44)的scFv的可变结构域和多花白树毒蛋白毒素的全肽序列
Figure BDA0004022477880000455
Figure BDA0004022477880000456
Ab75：组合F01(Ab44)的TaFv的可变结构域和重组多花白树毒蛋白毒素的全肽序列
Figure BDA0004022477880000457
Figure BDA0004022477880000458
与外毒素A(N端或C端)：
Ab76：组合Ab70的scFv的可变结构域及间隔区部分(
Figure BDA0004022477880000466
和间隔区)和重组外 毒素A载荷(以下；
Figure BDA0004022477880000468
)的全肽序列：
Figure BDA0004022477880000461
Ab77：组合Ab71的TaFv的可变结构域及间隔区部分(
Figure BDA0004022477880000469
和间隔区)和重组外毒素A载荷(以下；
Figure BDA00040224778800004610
)的全肽序列：
Figure BDA0004022477880000462
Ab78：组合Ab72的scFv的可变结构域及间隔区部分(
Figure BDA00040224778800004615
和间隔区)和重组外 毒素A载荷(以下；
Figure BDA00040224778800004611
)的全肽序列：
Figure BDA0004022477880000463
Ab79：组合Ab73的TaFv的可变结构域及间隔区部分(
Figure BDA00040224778800004616
和间隔区)和重组外 毒素A载荷(以下；
Figure BDA00040224778800004612
)的全肽序列：
Figure BDA0004022477880000464
Ab80：组合Ab74的scFv的可变结构域及间隔区部分(
Figure BDA00040224778800004617
和间隔区)和重组外 毒素A载荷(以下；
Figure BDA00040224778800004613
)的全肽序列：
Figure BDA0004022477880000465
Ab81：组合Ab75的TaFv的可变结构域及间隔区部分(
Figure BDA00040224778800004618
和间隔区)和重组外 毒素A载荷(以下；
Figure BDA00040224778800004614
)的全肽序列：
Figure BDA0004022477880000471
与皂草毒蛋白(N端或C端)
Ab82：组合Ab70的scFv的可变结构域及间隔区部分(
Figure BDA00040224778800004711
和间隔区)和重组皂 草毒蛋白载荷(以下；
Figure BDA0004022477880000477
)的全肽序列：
Figure BDA0004022477880000472
Ab83：组合Ab71的TaFv的可变结构域及间隔区部分(
Figure BDA00040224778800004712
和间隔区)和重组皂 草毒蛋白载荷(以下；
Figure BDA0004022477880000478
)的全肽序列：
Figure BDA0004022477880000473
Ab84：组合Ab72的scFv的可变结构域及间隔区部分(
Figure BDA00040224778800004713
和间隔区)和重组皂 草毒蛋白载荷(以下；
Figure BDA00040224778800004714
)的全肽序列：
Figure BDA0004022477880000474
Ab85：组合Ab73的TaFv的可变结构域及间隔区部分(
Figure BDA00040224778800004715
和间隔区)和重组皂 草毒蛋白载荷(以下；
Figure BDA0004022477880000479
)的全肽序列：
Figure BDA0004022477880000475
Ab86：组合Ab74的scFv的可变结构域及间隔区部分(
Figure BDA00040224778800004716
和间隔区)和重组皂 草毒蛋白载荷(以下；
Figure BDA00040224778800004710
)的全肽序列：
Figure BDA0004022477880000476
Ab87：组合Ab75的TaFv的可变结构域及间隔区部分(
Figure BDA00040224778800004814
和间隔区)和重组皂 草毒蛋白载荷(以下；
Figure BDA0004022477880000488
)的全肽序列：
Figure BDA0004022477880000481
与丝瓜籽蛋白P1(N端或C端)：
Ab88：组合Ab70的scFv的可变结构域及间隔区部分(
Figure BDA00040224778800004816
和间隔区)和重组丝 瓜籽蛋白P1载荷(以下；
Figure BDA0004022477880000489
)的全肽序列：
Figure BDA0004022477880000482
Ab89：组合Ab71的TaFv的可变结构域及间隔区部分(
Figure BDA00040224778800004815
和间隔区)和重组丝 瓜籽蛋白P1载荷(以下；
Figure BDA00040224778800004820
)的全肽序列：
Figure BDA0004022477880000483
Ab90：组合Ab72的scFv的可变结构域及间隔区部分(
Figure BDA00040224778800004817
和间隔区)和重组丝 瓜籽蛋白P1载荷(以下；
Figure BDA00040224778800004810
)的全肽序列：
Figure BDA0004022477880000484
Ab91：组合Ab73的TaFv的可变结构域及间隔区部分(
Figure BDA00040224778800004818
和间隔区)和重组丝 瓜籽蛋白P1载荷(以下；
Figure BDA00040224778800004811
)的全肽序列：
Figure BDA0004022477880000485
Ab92：组合Ab74的scFv的可变结构域及间隔区部分(
Figure BDA00040224778800004819
和间隔区)和重组丝 瓜籽蛋白P1载荷(以下；
Figure BDA00040224778800004812
)的全肽序列：
Figure BDA0004022477880000486
Ab93：组合Ab75的TaFv的可变结构域及间隔区部分(
Figure BDA00040224778800004821
和间隔区)和重组丝 瓜籽蛋白P1载荷(以下；
Figure BDA00040224778800004813
)的全肽序列：
Figure BDA0004022477880000487
与白喉毒素(N端或C端)：
Ab94：组合Ab70的scFv的可变结构域及间隔区部分(
Figure BDA00040224778800004822
和间隔区)和重组N 端白喉毒素载荷(以下；
Figure BDA00040224778800004823
)的全肽序列：
Figure BDA0004022477880000491
Ab95：组合Ab71的TaFv的可变结构域及间隔区部分(
Figure BDA00040224778800004911
和间隔区)和重组N端 白喉毒素载荷(以下；
Figure BDA0004022477880000496
)的全肽序列：
Figure BDA0004022477880000492
Ab96：组合Ab72的scFv的可变结构域及间隔区部分(
Figure BDA00040224778800004912
和间隔区)和重组N 端白喉毒素载荷(以下；
Figure BDA0004022477880000497
)的全肽序列：
Figure BDA0004022477880000493
Ab97：组合Ab73的TaFv的可变结构域及间隔区部分(
Figure BDA00040224778800004914
和间隔区)和重组N端 白喉毒素载荷(以下；
Figure BDA0004022477880000498
)的全肽序列：
Figure BDA0004022477880000494
Ab98：组合Ab74的scFv的可变结构域及间隔区部分(
Figure BDA00040224778800004913
和间隔区)和重组N 端白喉毒素载荷(以下；
Figure BDA0004022477880000499
)的全肽序列：
Figure BDA0004022477880000495
Ab99：组合Ab75的TaFv的可变结构域及间隔区部分(
Figure BDA00040224778800004915
和间隔区)和重组N端 白喉毒素载荷(以下；
Figure BDA00040224778800004910
)的全肽序列：
Figure BDA0004022477880000501
在一些实例中，所述抗体与包含本领域已知和/或本文中例示的任何VH链的抗体结合相同的表位，和/或与这样的抗体竞争与抗原结合。这样的抗体可包含与本文中例示的那些相同的重链CDR。与参考抗体具有相同CDR(例如，CDR3)的抗体意指两种抗体在该CDR区具有相同的氨基酸序列，如通过相同方法(例如，Kabat定义、Chothia定义、AbM定义或接触定义)所确定的。
在一些实施方案中，抗ABCB5抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含重链CDR1(HC CDR1)、重链CDR2(HC CDR2)和重链CDR3(HC CDR3)。例如，根据Kabat定义，HC CDR1可包含GFTFSSYX1MN(SEQ ID NO：109)或GYTFTX2YYMH(SEQ ID NO：110)的氨基酸序列，其中X1是S或D或T并且X2是S或N，；HC CDR2可包含YISSSX3X4TIYYADSVKG(SEQ ID NO：111)或IINPSGGSTSYAQKFX5G(SEQ ID NO：112)的氨基酸序列，其中X3是S或G并且X4是S或N；并且X5是K或Q，和/或HC CDR3可包含NYQYGDYGGY(SEQ ID NO：66)或DX6AVTGTAYYYYYGMDV(SEQ IDNO：113)的氨基酸序列，其中X6是Q或L。
在一个实施方案中，根据Kabat定义，HC CDR1可包含X7ASHDISNFLN(SEQ ID NO：114)或RASX8SVNSX9YLA(SEQ ID NO：115)的氨基酸序列，其中X7是Q或H；X8是L或Q；并且X9是N或K；HC CDR2可包含DAYNLQT(SEQ ID NO：77)或GTSSRAT(SEQ ID NO：78)的氨基酸序列；和/或HC CDR3可包含QQYDYFLSIT(SEQ ID NO：79)或QQFGSSPLT(SEQ ID NO：81)的氨基酸序列。
以下提供了数种示例性抗ABCB5抗体ABCB5-Ab1-Ab101，包含其重链和轻链CDR序列(通过Kabat定义)以及重链和轻链全序列和可变区序列。
表1：示例性抗ABCB5抗体的重链可变序列
Figure BDA0004022477880000511
Figure BDA0004022477880000521
Figure BDA0004022477880000531
Figure BDA0004022477880000541
表2：示例性抗ABCB5抗体的轻链可变序列
Figure BDA0004022477880000551
Figure BDA0004022477880000561
Figure BDA0004022477880000571
表3：示例性抗ABCB5抗体的重链序列
Figure BDA0004022477880000581
Figure BDA0004022477880000591
Figure BDA0004022477880000601
表4：示例性抗ABCB5抗体的轻链序列
Figure BDA0004022477880000611
表5：示例性抗ABCB5抗体的重链CDR序列
Figure BDA0004022477880000621
Figure BDA0004022477880000631
Figure BDA0004022477880000641
Figure BDA0004022477880000651
Figure BDA0004022477880000661
表6：示例性抗ABCB5抗体的轻链CDR序列
Figure BDA0004022477880000671
Figure BDA0004022477880000681
Figure BDA0004022477880000691
Figure BDA0004022477880000701
本文中所述的肽序列是根据通常的惯例书来编写的，由此肽的N端区域在左侧，并且C端区域在右侧。尽管已知氨基酸的异构形式，但其所示是氨基酸的L形式，除非另有明确说明。
在另一些实施方案中，抗ABCB5抗体可包含修饰以改善抗体的性质，例如稳定性、氧化、异构化和脱酰胺。在一些实施方案中，本文中公开的抗ABCB5抗体可包含与参考抗体(例如Ab100或Ab101)的重链CDR总共至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)同一性的重链CDR。作为替代或补充，抗体可包含与参考抗体的轻链CDR总共至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)同一性的轻链CDR。在一些实施方案中，抗ABCB5抗体可包含与参考抗体(例如Ab100或Ab101)的重链可变区至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)同一性的重链可变区和/或与参考抗体的轻链可变区至少80％(例如85％、90％、95％或98％)同一性的轻链可变区。
可使用Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990(其修改为Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993)中的算法来确定两个氨基酸序列的“同一性百分比”。这样的算法被并入Altschul,et al.J.Mol.Biol.215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)中。BLAST蛋白质检索可用XBLAST程序(评分＝50，字长＝3)进行，以获得与目的蛋白质分子同源的氨基酸序列。当两个序列之间存在空位时，可使用空位BLAST(Gapped BLAST)，如Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1997中所述。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
在一些实施方案中，如本文中所述的任何抗ABCB5抗体的重链还可包含重链恒定区(CH)或其一部分(例如CH1、CH2、CH3或其组合)。重链恒定区可以是任何合适的来源(例如，人、小鼠、大鼠或兔)的。在一个特定实例中，重链恒定区来自人IgG(γ重链)，例如IgG1、IgG2或IgG4。
本文中所述的任何抗ABCB5抗体的轻链还可包含轻链恒定区(CL)，其可以是本领域已知的任何CL。在一些实例中，CL是κ轻链。在另一些实例中，CL是λ轻链。抗体重链恒定区和轻链恒定区在本领域是公知的，例如，在IMGT数据库(imgt.org)或在vbase2.org/vbstat.php.提供的那些，二者均通过引用并入本文。
当需要时，本文中所述的抗ABCB5抗体可包含经修饰恒定区。例如，其可包含免疫惰性(例如不触发补体介导的裂解，或不刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC))的经修饰恒定区。可使用美国专利No.5,500,362中公开的方法来评估ADCC活性。在另一些实施方案中，恒定区如Eur.J.Immunol.(1999)29:2613-2624；PCT申请No.PCT/GB99/01441；和/或英国专利申请No.9809951.8中所述进行修饰。
下面提供了包含另一些特征、融合构建体等的数种示例性抗ABCB5抗体。
表7：示例性抗ABCB5抗体的另一些特征
Figure BDA0004022477880000711
Figure BDA0004022477880000721
Figure BDA0004022477880000731
Figure BDA0004022477880000741
Figure BDA0004022477880000751
Figure BDA0004022477880000761
Figure BDA0004022477880000771
表8：双特异性形式
Figure BDA0004022477880000772
Figure BDA0004022477880000781
Figure BDA0004022477880000791
在一些实施方案中，本文中所述的抗ABCB5抗体与本文中所公开的参考抗体(例如，ABCB5-Ab100或ABCB5-Ab101)结合ABCB5抗原中的相同表位，或者与参考抗体竞争与ABCB5抗原结合。“参考抗体”是与ABCB5结合并在功能或结构上为本发明的ABCB5抗体提供比较物的抗体。在一些实施方案中，参考抗体是市售抗体。在另一些实施方案中，参考抗体是亲本抗体。本文中使用的“亲本抗体”是指这样的抗体模板，其经修饰以产生维持一些或所有的亲本抗体期望特征的子抗体，所述特征例如亲本抗体的功能、结合亲和力或结合特异性，即，如在生物测定中所评估的。在一些实施方案中，Ab100和Ab101是示例性亲本抗体。
“表位”是指在靶化合物上被抗体(例如Fab或全长抗体)结合的位点。表位可以是线性的，其长度通常为6至15个氨基酸。或者，表位可以是构象的。与本文中所述的参考抗体结合相同表位的抗体可与参考抗体结合完全相同的表位或基本上重叠的表位(例如，包含少于3个非重叠氨基酸残基、少于2个非重叠氨基酸残基或仅1个非重叠氨基酸残基)。两种抗体是否彼此竞争与同源抗原结合可通过本领域公知的竞争测定来确定。这样的抗体可被确定为本领域技术人员已知，例如，具有基本上类似的结构特征(例如，互补决定区)的那些和/或通过本领域已知测定确定的那些。例如，可使用参考抗体之一进行竞争测定，以确定候选抗体是否与参考抗体结合相同的表位或与其竞争与ABCB5抗原结合。
在一些实施方案中，表位是胞外环。例如，本发明的抗体可以以高特异性和/或亲和力与人ABC转运蛋白ABCB5转录物变体2或β同种型[NCBI登录号NM_178559.5]的第一、第二或第三胞外环(extracellular loop，EC环)结合。示例性表位包括例如以下序列或其部分中的任一者：RFGAAYLIQAGRMTPEG(SEQ ID NO：104)、TMFGNNDKTTLKHDAE(SEQ ID NO：105)、VTGMIETAAMTGFANKDKQELKHAGKIATEALENIRTIVSLTREKAFEQMYEEMLQTQHRNTSKKAQI(SEQID NO：106)或QDIKKADEQMESMTYSTERKTNSLPLHSVKSIKSDFIDKAEESTQSKEISLPEVSLLK(SEQ IDNO：107)。或者，抗体可以以高特异性和/或亲和力与胞内环(核苷酸结合结构域；NBD1或2)或胞内结构域/区(NDB除外)结合。
示例性的可溶性部分重组ABCB5标准蛋白具有以下序列：
NBD1-间隔区-EC1-间隔区-ICD2-间隔区-EC3-间隔区-NBD2：
Figure BDA0004022477880000801
NBD1：
Figure BDA0004022477880000802
间隔区1：
Figure BDA0004022477880000803
EC1：
Figure BDA0004022477880000804
间隔区2：
Figure BDA0004022477880000805
ICD2：
Figure BDA0004022477880000806
间隔区3：
Figure BDA0004022477880000811
EC3：
Figure BDA0004022477880000812
间隔区4：
Figure BDA0004022477880000813
NBD2：
Figure BDA0004022477880000814
可在特定间隔区的开始/结束处引入另外的半胱氨酸残基[C]，以模拟如天然ABCB5蛋白中实际存在的相应序列区段的天然胞外环(EC)结构。
在一些实施方案中，本文中公开的抗ABCB5抗体可与参考抗体(例如，Ab100或Ab101)包含相同的负责抗原结合的区域/残基，例如CDR或整个CDR中相同的特异性决定残基。负责抗原结合的区域/残基可通过本领域已知的方法从参考抗体(以上所示)的重链/轻链序列的氨基酸序列中确定。参见例如bioinf.org.uk/abs；Almagro，J.Mol.Recognit.17：132-143(2004)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.227：799-817(1987)，以及本领域已知或本文中公开的其他方法。抗体中CDR区的确定完全在本领域技术范围之内，例如，本文中公开的方法，例如，Kabat方法(Kabat et al.Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，(5th ed.，1991，National Institutes of Health，Bethesda Md.))或Chothia方法(Chothia et al.，1989，Nature 342：877；Al-lazikani et al(1997)J.Molec.Biol.273：927-948))。本文中使用的CDR可以是指由本领域已知的任何方法限定的CDR。具有相同CDR的两种抗体意指两种抗体具有该CDR的相同氨基酸序列，如通过相同方法所确定的。在一些特定实例中，本文中公开的抗ABCB5抗体与参考抗体(例如Ab100或Ab101)具有相同的VM和/或VL。
本文中公开的任何示例性抗ABCB5抗体的功能变体也在本公开内容的范围内。功能变体相对于参考抗体可在VH和/或VL中或在一个或更多个HC CDR和/或一个或更多个LCCDR中包含一个或更多个氨基酸残基变化，同时保留与参考抗体基本类似的结合和生物活性(例如，基本类似的结合亲和力、结合特异性、抑制活性、抗肿瘤活性或其组合)。
在一些实例中，本文中公开的抗ABCB5抗体包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，其与参考抗体(例如Ab100或Ab101)的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3相比总共包含不多于10个氨基酸变化(例如不多于9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化)。“共同/总共”意指所有三个HCCDR中的氨基酸变化的总数在限定的范围内。作为替代或补充，抗ABCB5抗体可包含LCCDR1、LC CDR2和LC CDR3，其与参考抗体的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3相比总共包含不多于10个氨基酸变化(例如，不多于9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化)。
在一些实例中，本文中公开的抗ABCB5抗体可包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，其中至少一个HC CDR作为参考抗体(例如Ab100或Ab101)的对应HC CDR包含不多于5个氨基酸变化(例如不多于4、3、2或1个氨基酸变化)。在一些特定实例中，抗体包含HC CDR3，其作为参考抗体(例如Ab100或Ab101)的HC CDR3包含不多于5个氨基酸变化(例如，不多于4、3、2或1个氨基酸变化)。作为替代或补充，抗ABCB5抗体可包含LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中至少一个LC CDR作为参考抗体的对应LC CDR包含不多于5个氨基酸变化(例如，不多于4、3、2或1个氨基酸变化)。在一些特定实例中，抗体包含LC CDR3，其作为参考抗体的LC CDR3包含不多于5个氨基酸变化(例如，不多于4、3、2或1个氨基酸变化)。
本公开内容提供了基于多核苷酸或多肽的数种类型的组合物，包括变体和衍生物。这些包括例如替换、插入、缺失和共价变体和衍生物。术语“衍生物”与术语“变体”同义使用，但通常是指相对于参考分子或起始分子以任何方式经修饰和/或经改变的分子。
因此，编码相对于参考序列(特别是本文中公开的多肽序列)包含替换、插入和/或添加、缺失和共价修饰的肽或多肽的多核苷酸包括在本公开内容的范围内。例如，序列标签或氨基酸(例如一个或更多个赖氨酸)可添加至肽序列(例如，在N端或C端处)。序列标签可用于肽检测、纯化或定位。赖氨酸可用于提高肽的溶解度或允许生物素化。或者，可任选地使位于肽或蛋白质的氨基酸序列的羧基末端区和氨基末端区的氨基酸残基缺失来提供截短的序列。或者，可根据序列的用途，使某些氨基酸(例如，C端或N端残基)缺失，如例如，将序列表达为更大序列的一部分，所述更大序列为可溶的或与固体支持物连接。
当提及多肽时，“替换性变体”是指将天然或起始序列中的至少一个氨基酸残基去除并且在其相同位置的地方插入不同的氨基酸。替换可以是单个的，其中分子中只有一个氨基酸被替换，或替换可以是多个的，其中同一分子中有两个或更多个氨基酸被替换。
本文中使用的术语“保守氨基酸替换”是指通常存在于序列中的氨基酸被具有类似尺寸、电荷或极性的不同氨基酸替换。保守替换的实例包括一个非极性(疏水性)残基(例如异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸)对另一非极性残基的替换。同样地，保守替换的实例包括一个极性(亲水性)残基对另一个的替换，例如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酰胺与天冬酰胺之间以及甘氨酸与丝氨酸之间。另外，保守替换的另外的实例是一个碱性残基(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)对另一个的替换，或一个酸性残基(例如天冬氨酸或谷氨酸)对另一个酸性残基的替换。非保守替换的实例包括非极性(疏水性)氨基酸残基(例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸)对极性(亲水性)残基(例如半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸)和/或极性残基对非极性残基的替换。
当提及多肽或多核苷酸时，“特征”分别定义为分子的基于氨基酸序列或基于核苷酸的独特组分。多肽的特征包括表面表现、局部构象形状、折叠、环、半环、结构域、半结构域、位点、末端或其任何组合。
当提及多肽时本文中使用的术语“结构域”是指具有一个或更多个可鉴定的结构或功能特征或特性(例如，结合能力，用作蛋白质-蛋白质相互作用的位点)的多肽的基序。
当提及多肽时本文中使用的术语“位点”当涉及基于氨基酸的实施方案时与“氨基酸残基”和“氨基酸侧链”同义使用。当提及多核苷酸时本文中使用的术语“位点”当涉及基于核苷酸的实施方案时与“核苷酸”同义使用。位点表示可在基于多肽或多核苷酸的分子内被修饰、操作、改变、衍生或变化的肽或多肽或多核苷酸内的位置。
当提及多肽或多核苷酸时本文中使用的术语“端”或“末端”分别是指多肽或多核苷酸的末端。这样的末端不仅限于多肽或多核苷酸的第一或最后位点，还可包含末端区域中另外的氨基酸或核苷酸。基于多肽的分子可表征为具有N端(由具有游离氨基(NH2)的氨基酸终止)和C端(由具有游离羧基(COOH)的氨基酸终止)二者。蛋白质在一些情况下由通过二硫键或非共价力而在一起的多条多肽链组成(例如，多聚体、寡聚体)。这些蛋白质具有多个N端和C端。或者，多肽的末端可以是经修饰的，使得其以基于非多肽的部分(例如有机缀合物)开始或结束(视情况而定)。
如本领域技术人员所认识到的，蛋白质片段、功能性蛋白质结构域和同源蛋白质也被认为在目的多肽的范围内。例如，本文中提供了参考蛋白的长度为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或大于100个氨基酸的任何蛋白质片段(意指比参考多肽序列短至少一个氨基酸残基，但在其他方面相同的多肽序列)。在另一个实例中，可根据本公开内容使用包含与本文中所述的任何序列具有40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％同一性的20、30、40、50或100个氨基酸的区段的任何蛋白质。在一些实施方案中，多肽包含2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个突变，如本文中所提供或引用的任何序列中所示的。在另一个实例中，根据本发明可使用包含与本文中所述的任何序列具有大于80％、90％、95％或100％同一性的20、30、40、50或100个氨基酸的区段的任何蛋白质，其中该蛋白质具有与本文中所述的任何序列具有小于80％、75％、70％、65％或60％同一性的5、10、15、20、25或30个氨基酸的区段。
本公开内容的多肽或多核苷酸分子可与参考分子(例如，参考多肽或参考多核苷酸)例如与Ab100或Ab101共有一定程度的序列类似性或同一性(例如，经改造或设计的分子或野生型分子)。
术语“同一性”是指聚合物分子之间例如多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。例如，两个多核苷酸序列的同一性百分比的计算可通过出于最佳比较目的比对两个序列来进行(例如，出于最佳比对可在第一和第二核酸序列中的一者或二者中引入空位而且出于比较目的可忽略不相同的序列)。在某些实施方案中，出于比较目的而比对的序列的长度是参考序列的长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。然后比较相应核苷酸位置的核苷酸。当第一序列中的一个位置被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的。考虑到空位的数目和每个空位的长度(为了两个序列的最佳比对而需要引入)，两个序列之间同一性百分比是由序列共有的相同位置的数目的函数。可使用数学算法完成序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定。例如，两个核酸序列之间的同一性百分比可使用这样的方法来确定，所述方法例如以下中描述的那些：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,NewYork,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Sequence Analysis in Molecular Biology,vonHeinje,G.,Academic Press,1987；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；和SequenceAnalysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991，其各自通过引用并入本文。例如，两个核酸序列之间的百分比同一性可使用Meyers和Miller(CABIOS,1989,4:11-17)的算法来确定，该算法已使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分并入ALIGN程序(版本2.0)。或者，两个核酸序列之间的同一性百分比可使用GCG软件包中的GAP程序使用NWSgapdna.CMP矩阵来确定。通常用于确定序列之间同一性百分比的方法包括但不限于Carillo,H.,and Lipman,D.,SIAM J Applied Math.,48:1073(1988)(通过引用并入本文)中所述的那些。用于确定同一性的技术已编入可公开获得的计算机程序中。用于确定两个序列之间的同源性的示例性计算机软件包括但不限于GCG程序包，Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research,12(1),387(1984))，BLASTP、BLASTN和FASTA Altschul,S.F.et al.,J.Molec.Biol.,215,403(1990))。
本文中使用的术语“同源性”是指聚合物分子之间例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。通过匹配残基的比对确定的共有阈值水平的类似性或同一性的聚合物分子(例如，核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)和/或多肽分子)被称为同源的。同源性是描述分子之间关系的定性术语，并且可基于定量类似性或同一性。类似性或同一性是定义两个比较的序列之间的序列匹配程度的定量术语。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性或类似性，则认为其彼此是“同源的”。术语“同源”必然是指至少两个序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。如果两个多核苷酸序列编码的多肽对于至少20个氨基酸的至少一个区段为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至99％，则认为其是同源的。在一些实施方案中，同源多核苷酸序列的特征在于编码至少4至5个独特指定的氨基酸的区段的能力。对于长度小于60个核苷酸的多核苷酸序列，同源性由编码至少4至5个独特指定的氨基酸的区段的能力来确定。如果两个蛋白质序列对于至少20个氨基酸的至少一个区段为至少50％、60％、70％、80％或90％同一性，则认为该蛋白质是同源的。
同源性意指所比较序列在进化中从共同的起源分化。术语“同源物”是指通过来源于共同祖先序列而与第二氨基酸序列或核酸序列相关的第一氨基酸序列或核酸序列(例如，基因(DNA或RNA)或蛋白质序列)。术语“同源物”可应用于通过物种形成事件而分离的基因和/或蛋白质之间的关系或者通过遗传复制事件而分离的基因和/或蛋白质之间的关系。“直系同源物(ortholog)”是通过物种形成从共同祖先基因(或蛋白质)进化而来的不同物种中的基因(或蛋白质)。通常来说，直系同源物在进化过程中保留相同的功能。“旁系同源物(paralog)”是通过基因组内复制而相关的基因(或蛋白质)。直系同源物在进化过程中保留相同的功能，而旁系同源物进化出新功能，即使这些与原始功能相关。
在一些实施方案中，用于本文中所述的抗ABCB5抗体的重链恒定区可包含突变(例如，氨基酸残基替换)以调节(例如，增强或降低)ADCC活性。在一些实例中，重链恒定区可包含在位置E233、L234、L235、G236、A327、A330、K322、E318、K320和P331(根据EU索引编号)中的一处或更多处的氨基酸残基突变以降低ADCC活性和/或CDC活性。突变可包含E233P、L234V、L235A、δG236、A327G、A330S、P331S、K322A、E318A、K320A、K322A或其组合。在另一些实例中，重链恒定区可包含在位置S298、S239、K334、M252、S254、A330、I332、K326、E335和T256(根据EU索引编号)中的一处或更多处的氨基酸残基突变以增强ADCC活性和/或CDC活性。氨基酸残基突变可包含S298A、K334A、M252Y、S254T、S239D、A330L、I332E、K326W、E335S和T256E或其组合。在一些情况下，本文中所述的抗ABCB5抗体的重链恒定区可来自人IgG1并且在位置K214(EU索引编号)处包含突变，例如，K214R替换。
在一些实施方案中，用于本文中所述抗ABCB5抗体的重链恒定区可包含突变(例如，氨基酸残基替换)以增强抗体期望的特征，例如，提高与新生Fc受体(neonatal Fcreceptor，FcRn)的结合活性，并因此提高抗体的血清半衰期。已知与FcRn结合对于维持抗体稳态和调节抗体的血清半衰期至关重要。可将一个或更多个(例如，1、2、3、4、5或更多个)突变(例如，氨基酸残基替换)在适当位置(例如，在CH2区)引入至恒定区以增强FcRn结合并增强抗体的半衰期。氨基酸残基突变可包含例如M428L、M252Y、S254T、T256E、H433K、N434F或其组合。
本公开内容还提供了本文中公开的任何示例性抗ABCB5抗体的种系变体。种系变体相对于其亲本抗体针对相应种系序列在框架区中包含一个或更多个突变。为了制备种系变体，亲本抗体的重链或轻链可变区序列或其一部分(例如，框架序列)可用作针对抗体种系序列数据库(例如bioinfo.org.uk/abs/、vbase2.org或imgt.org)的查询以鉴定亲本抗体使用的相应种系序列以及种系序列与亲本抗体之间框架区中一者或更多者的氨基酸残基变化。然后可基于种系序列将一个或更多个氨基酸替换引入至亲本抗体中以产生种系变体。如本文中所述，抗ABCB5抗体可以是任何抗体形式，包括但不限于完整(即，全长)抗体、其抗原结合片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链抗体、双特异性抗体或纳米抗体。
在另一个方面中，本发明涉及包含与部分(例如药物活性部分)偶联的本发明的抗体的缀合物。药物活性部分可以是例如稳定抗体的化合物、标记或治疗剂。
本文中使用的术语“偶联”是指两个或更多个物体联合或连接在一起。当提及化学或生物化合物时，偶联可指两个或更多个化学或生物化合物之间的共价连接。通过非限制性实例的方式，本发明的抗体可与化合物(例如肽)偶联以形成抗体偶联的化合物/肽。抗体偶联的肽可通过设计为使抗体与肽缀合的特定化学反应来形成。
在某些实施方案中，药物活性部分可与抗体直接连接，或者在另一些实施方案中，其可通过接头与抗体共价偶联。接头可经化学修饰以允许抗体与药物活性部分的缀合。接头可例如包括但不限于肽接头(例如上述接头)、烃接头、聚乙二醇(PEG)接头、聚丙二醇(PPG)接头、多糖接头、聚酯接头、由PEG和嵌入杂环组成的混合接头以及烃链。PEG接头可例如包含2至24个PEG单元。已发现磺酰胺接头改善接头-缀合物的溶解度，其继而显著改善缀合效率并减少过程和产物聚集二者。本领域已知的另一些接头包括包含由PEG表示的亲水区和缺乏与靶向剂偶联的手性中心的延伸的接头(WO 2008/070291)；以及具有新的亲水性间隔区基团的接头系统(WO 01/88535)。接头的设计很重要，因为其可影响ADC的效力和安全性二者。接头应在体循环期间提供足够的稳定性，但允许药物以活性形式快速且有效地胞内释放。
ADC还可包括间隔区单元。间隔区通过任选的接头和延伸区将抗体与药物连接。间隔区单元通常有两种一般类型：自裂解性和非自裂解性。非自裂解性间隔区单元是其中部分或全部的间隔区单元在酶促切割抗体-药物缀合物之后保持与药物结合的间隔区单元。非自裂解性间隔区单元的实例包括但不限于(甘氨酸-甘氨酸)间隔区单元和甘氨酸间隔区单元。为了释放药物，可在靶细胞内发生独立的水解反应以切割甘氨酸-药物单元键。在一些实施方案中，非自裂解性间隔区是Gly。或者，ADC包含可释放药物而不需要单独的水解步骤的自裂解性间隔区。在这些实施方案中，间隔区可以是经取代和未经取代的4-氨基丁酸酰胺、经合适取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环体系以及2-氨基苯丙酸酰胺。
本文中使用的术语“缀合物”是指与药物活性部分共价偶联的抗体(包括其抗体片段)。术语“与……缀合”是指本发明的抗体或其片段直接地或通过接头间接地与药物活性部分共价联接或共价连接。药物活性部分可以是肽或非肽有机部分(即“小分子”)。
因此，ADC具有Ab-药物作为其最基本的结构。任选地，该结构是Ab-接头-药物；Ab-接头-间隔区-药物；或Ab-接头-间隔区-延伸区-药物。本领域已经描述了用于产生这些构建体的许多方法，并且本发明的构建体不限于任何一种特定方法。示例性生物缀合方法及其组件例如在US20190262466；WO2002088172、US6884869、US7098308、US7256257、WO2004010957、WO2005001038、US 7659241、US 8906376、US 7659241、WO2005081711中描述；其各自均通过引用并入。
在一些实施方案中，药物活性部分是治疗剂。与治疗剂偶联的抗体在本文中被称为抗体药物缀合物(ADC)。本文中使用的ADC是指任选地通过接头和/或间隔区与治疗性载荷(细胞毒性剂)组合的抗ABCB5抗体(抗体的全长抗体或任何变体、片段或其他形式)。例如，Ab101及其数种亲和力成熟的变体已通过经酶修整的糖结构在N297残基处成功地与包括MMAE载荷的药物化学组合。然而，本发明的范围不限于抗ABCB5抗体或抗体片段的特定性质/来源、化合价(用于单价结合的一种scFv或多价抗ABCB5种类如双抗体、[Fab]2片段等)、接头的性质、长度和组成以及活性剂的性质。
用于本发明ADC的示例性治疗剂是抗肿瘤化合物。抗肿瘤化合物具有抗肿瘤作用，并且具有可与抗体直接连接或通过接头与抗体间接连接的取代基或部分结构。在肿瘤细胞中切割部分或全部接头之后，释放抗肿瘤化合物，使得抗肿瘤化合物表现出抗肿瘤作用。可用的抗肿瘤化合物的实例包括多柔比星、加利车霉素(calicheamicin)、多拉司他汀10(dolastatin10)、奥瑞他汀(例如单甲基奥瑞他汀E(monomethyl auristatin E，MMAE)和单甲基奥瑞他汀F(monomethyl auristatin F，MMAF))、美登素类化合物(maytansinoid)(例如DM1和DM4)、吡咯并苯并二氮二聚体SG2000(SJG-136)、喜树碱衍生物SN-38、倍癌霉素(duocarmycin)(例如CC1065)、鹅膏蕈碱(amanitin)、柔红霉素(daunorubicin)、丝裂霉素C(mitomycin C)、博来霉素(bleomycin)、环胞苷、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、甲氨蝶呤、基于铂的抗肿瘤剂(顺铂及其衍生物)、紫杉醇及其衍生物和依喜替康(exatecan)(喜树碱衍生物((1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氢9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉10,13(9H,15H)-二酮)。
奥瑞他汀肽、奥瑞他汀E(AE)和单甲基奥瑞他汀E(MMAE)、多拉司他汀的合成类似物已作为药物部分与多种抗体缀合，并且可用于本发明的ADC。
本发明的ADC也可以是半胱氨酸改造的抗体，其是FAB抗体片段(thioFab)和全长IgG(thioMab)抗体(US 2007/0092940)。ThioFab和ThioMab抗体通过在新引入的半胱氨酸硫醇处的接头与硫醇反应性接头试剂和药物-接头试剂缀合以制备ADC。
多拉司他汀和奥瑞他汀已显示出干扰微管动力学、GTP水解以及核和细胞分裂，并且具有抗癌活性。多种形式的多拉司他汀或奥瑞他汀药物部分可通过肽药物部分的N(氨基)端或C(羧基)端与抗体共价连接。示例性奥瑞他汀实施方案包括公开于WO 2005/081711中的N端连接的单甲基奥瑞他汀药物部分DE和DF，例如MMAE和MMAF。MMAE或MMAF药物部分的N端可通过接头与抗体的改造的半胱氨酸共价连接。
另一些示例性奥瑞他汀药物部分包括在五肽奥瑞他汀药物部分的C端具有苯丙氨酸羧基修饰的单甲基缬氨酸化合物(WO 2007/008848)和在五肽奥瑞他汀药物部分的C端具有苯丙氨酸侧链修饰的单甲基缬氨酸化合物(WO 2007/008603)。
可用于与本发明的抗体组合的另一些治疗剂包括铜绿假单胞菌外毒素A(亦称monatox)、白喉毒素、皂草毒蛋白、丝瓜籽蛋白P1等或它们的重组形式。
在一些实施方案中，ADC具有最小治疗指数。本文中使用的术语“治疗指数”(therapeutic index，TI)是指对50％的群体具有毒性的药物剂量(即在与目标适应证不相容的发生率或严重程度下引起不良作用)(TD50)除以在50％的群体中产生所期望药理作用的剂量(有效剂量或ED50)的比率。因此，TI＝TD50/ED50。治疗指数可通过临床试验或例如通过血浆暴露测试来确定。另参见Muller,et al.Nature Reviews Drug Discovery 2012,11,751-761。在早期开发阶段，候选药物的临床TI通常尚不清楚。然而，尽早了解药物候选物的初步TI至关重要，因为TI是成功开发药物的可行性的重要指标。在动物模型中，TI通常定义为效力(小鼠异种移植物中的最小有效剂量)与安全性(小鼠或大鼠中的最大耐受剂量)之间的定量比。
术语“治疗效力”是指物质实现某种治疗作用(例如减少肿瘤体积)的能力。可测量治疗作用以确定其中物质可实现期望作用的程度，通常是在相同情况下与另一种物质进行比较。用于治疗效力的合适量度是ED50值，其可例如在临床试验期间或通过血浆暴露测试来确定。在临床前治疗效力确定的情况下，ADC的治疗作用可通过在小鼠中患者来源的肿瘤异种移植物来验证，在这种情况下，效力是指ADC提供有益作用的能力。或者，所述ADC在啮齿动物安全性研究中的耐受性也可以是治疗作用的量度。
在抗体-药物缀合物中，每个抗体分子的缀合的药物分子的数量可以是对其效力和安全性具有影响的重要因素。通过指定反应条件(例如用于反应的起始材料和试剂的量)来进行抗体-药物缀合物的产生，以获得恒定数量的缀合的药物分子。与低分子量化合物的化学反应不同，通常会获得包含不同数量的缀合的药物分子的混合物。每个抗体分子的缀合的药物分子的数量被定义并指示为平均值，即，缀合的药物分子的平均数量。除非另有说明，即，除了表示包含在具有不同数量的缀合药物分子的ADC混合物中的具有特定数量的缀合药物分子的ADC的情况，否则根据本发明的缀合药物分子的数量通常意指平均值。控制与抗体分子缀合的治疗分子的数量，并且作为每个抗体的缀合的药物分子的平均数量，可缀合大约1至10个治疗分子。
在一些实施方案中，药物活性部分可以是稳定抗体的化合物，使得抗体偶联的部分与单独抗体相比具有延长/增加的半衰期。例如通过共价键延长抗体半衰期的部分可以是白蛋白、白蛋白变体、白蛋白结合蛋白和/或结构域、转铁蛋白及其片段和类似物。可并入本发明的缀合物中的另外的延长半衰期的部分包括例如聚乙二醇(PEG)分子(例如PEG5000或PEG2000)、具有不同链长度的脂肪酸和脂肪酸酯(例如月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、硬脂酸酯、花生酸酯、山嵛酸酯、油酸酯、花生四烯酸酯、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等)、聚赖氨酸、辛烷、碳水化合物(葡聚糖、纤维素、低聚糖或多糖)以用于期望的特性。这些部分可与蛋白质支架编码序列直接融合，并且可通过标准克隆和表达技术产生。或者，可使用公知的化学偶联方法将部分与本发明的重组和化学产生的缀合物连接。
将本发明的抗体与本发明的药物活性部分缀合的方法在本领域是已知的。简言之，本发明的抗体可用还原剂(例如，TCEP(三(2-羧乙基)膦))还原、纯化(例如通过蛋白A吸附或凝胶过滤)以及与药物活性部分缀合(例如，通过在允许缀合的条件下向还原的抗体提供冻干的肽)。在缀合反应之后，缀合物可通过离子交换色谱或疏水相互作用色谱(hydrophobic interaction chromatography，HIC)来纯化，最终纯化步骤为蛋白A吸附。在某些实施方案中，本发明的抗体可在利用HIC方法还原之前进行纯化。
例如，可通过将半胱氨酸残基并入至分子的C端并使用公知的方法将聚乙二醇基团(pegyl group)与半胱氨酸连接来将聚乙二醇部分添加至本发明的肽分子。
可通过数种公知的测定来比较并入另外的部分的本发明的肽分子的功能。例如，可使用已知的体外或体内测定来测定单独或在根据本发明的缀合物中的目的治疗性肽的生物或药代动力学活性并且对其进行比较。
在一些实施方案中，本公开内容的抗体与载体或靶向基团共价连接，或者包含一起产生融合蛋白(例如，带有靶向基团和治疗性蛋白质或肽)的两个编码区作为肽缀合物。肽缀合物包括天然存在的物质，例如蛋白质(例如，人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白(HDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如，葡聚糖、普鲁兰多糖、几丁质、壳聚糖、菊糖、环糊精或透明质酸)；或脂质。在一些实施方案中，缀合物可包含阳离子聚合物，例如但不限于多胺、聚赖氨酸、聚亚烷基亚胺和聚乙烯亚胺，其可与聚(乙二醇)接枝。
在一些实施方案中，缀合物可以是生物分子-聚合物缀合物，其包含长效连续-释放系统以提供更大的治疗效力。协同的生物分子-聚合物缀合物可以是美国公开No.US2013/0195799中所述的那些。在一些实施方案中，缀合物可以是如国际专利公开No.WO2012/040524中所述的适配体缀合物。在一些实施方案中，缀合物可以是如美国专利No.8,507,653中所述的含胺聚合物缀合物。每篇参考文献均通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，多核苷酸可与SMARTT POLYMER
Figure BDA0004022477880000911
(
Figure BDA0004022477880000912
Inc.Seattle，WA)缀合。
本公开内容的特征还在于靶向ABCB5的嵌合抗原受体和表达ABCB5的细胞。本文中公开的嵌合抗原受体(CAR)是人工细胞表面受体，当其构建到效应细胞例如T细胞或NK细胞中时，使表达ABCB5+的细胞的结合特异性重定向，从而通过例如效应免疫细胞的效应活性消除靶细胞。CAR构建体通常包含与至少胞内信号传导结构域融合的胞外抗原结合结构域。Cartellieri et al.,J Biomed Biotechnol 2010:956304,2010。可以是单链抗体片段(scFv)的胞外抗原结合结构域对ABCB5抗原具有特异性，并且胞内信号传导结构域可介导导致免疫细胞活化的细胞信号传导。因此，表达对ABCB5具有特异性的CAR构建体的免疫细胞可与表达ABCB5的靶细胞结合，导致免疫细胞的活化和靶细胞的消除。这样的免疫细胞可称为CAR-T或CAR-NK细胞。
本文中使用的CAR-T细胞是指其中已经引入嵌合受体以使其特异性重定向针对选择的抗原ABCB5的T细胞。这样的受体包含与胞质信号传导结构域组合的识别不依赖于MHC限制的抗原的胞外结构域。许多不同的肽可作为嵌合抗原受体的胞外结构域引入T细胞中。实例包括纳米抗体、单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体或抗体片段，包括本文中所述的任何抗体构建体。
自然杀伤细胞(NK细胞)是在固有免疫功能中发挥作用的外周血淋巴细胞。NK细胞表达多种活化和抑制性受体，其负责区分健康细胞和病毒感染的细胞或癌细胞。与T细胞不同，NK细胞以抗原非依赖性方式对靶细胞发挥其细胞毒性作用。作为结果，NK细胞不需要抗原致敏并且在不存在特异性抗原的情况下可显示出稳健的细胞毒性。CAR可将某种抗原特异性引入至免疫效应细胞(例如NK细胞)。因此，本发明的组合物包含药物组合物，所述药物组合物包含作为原代细胞和细胞系二者的NK细胞，其已经用至少一个抗原结合结构域(ABCB5)改造并且被称为CAR-NK细胞。
本文中所述的任何抗ABCB5抗体均可用于产生也在本文中描述的CAR构建体。例如，抗ABCB5抗体的VH和VL结构域可与胞内信号传导结构域融合以使用常规重组技术产生CAR构建体。在一些实例中，抗ABCB5的VH和VL结构域通过肽接头连接以形成scFv片段。
本文中公开的CAR构建体可包含一个或更多个胞内信号传导结构域。在一些实例中，CAR包含含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(immunoreceptor tyrosine-basedactivation motif，ITAM)的胞内信号传导结构域。这样的胞内信号传导结构域可来自CD3ζ、CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ζ信号结构域及其任何组合。
本文中公开的CAR构建体还可包含可从合适的细胞表面受体(例如CD28或CD8)获得的跨膜铰链结构域。或者，可使用由人工多肽构成的跨膜结构域。
胞内信号结构域传递发挥T或NK细胞效应功能所必需的信号。更具体地，当胞外结构域与靶ABCB5结合时，胞内信号结构域传递使细胞活化所必需的信号。胞内信号结构域包括用于通过例如TCR复合物传递信号的结构域和用于传递共刺激信号的结构域。共刺激分子的实例包括CD28、4-1BB(CD137)、CD2、CD4、CD5、CD134、OX-40、CD40和ICOS。
前导序列或信号肽也可用于促进CAR分泌。例如，可使用GM-CSF受体的前导序列。另外，该结构优选地由通过间隔区结构域连接在一起的胞外结构域和跨膜结构域构成。更具体地，根据优选实施方案的CAR在胞外结构域与跨膜结构域之间包含间隔区结构域。间隔区结构域用于促进CAR与靶ABCB5之间的连接。
经改造的T细胞或NK细胞可以是双特异性的，即表达双特异性CAR或多价不同的CAR，其中它们的亲和力是针对两个不同的表位或抗原。双特异性CAR-T或NK可用于增加癌细胞上或癌症ECM中的潜在结合位点的数量，或者作为替代，用于将癌细胞定位至表达对T或NK-CAR具有特异性的配体的其他免疫效应细胞。对于用于癌症治疗，双特异性CAR可与靶肿瘤细胞或肿瘤ABCB5以及效应细胞(例如T细胞、NK细胞或巨噬细胞)结合。本公开内容的经改造的T细胞或NK细胞可包含由相同T细胞或NK细胞表达的双特异性CAR或多价CAR。这允许T细胞或NK细胞同时靶向ABCB5或抗原的两个不同表位。
还提供了编码本文中公开的任何抗ABCB5 CAR的分离的核酸分子和载体，以及包含核酸分子或载体的宿主细胞，例如宿主免疫细胞(例如，T细胞和自然杀伤细胞)。表达包含ABCB5特异性抗体结合片段的抗ABCB5 CAR的免疫细胞可用于治疗由ABCB5+细胞介导的疾病。
如本文中所述能够结合ABCB5的抗体可通过本领域已知的任何方法来制备。如果期望的话，可对目的抗体(单克隆或多克隆)(例如，由杂交瘤产生)进行测序，并随后可将多核苷酸序列克隆到载体中以用于表达或增殖。编码目的抗体的序列可保持在宿主细胞中的载体中，并随后可将宿主细胞扩增和冷冻以备将来使用。在一个替代方案中，多核苷酸序列可用于遗传操作以使抗体“人源化”或改善抗体的亲和力(亲和力成熟)或其他特征。例如，如果将抗体用于人的临床试验和治疗，则可将恒定区改造成更类似于人恒定区以避免免疫应答。期望的是对抗体序列遗传操作以获得针对靶抗原的更大亲和力和抑制ABCB5活性的更大效力。对本领域技术人员将明显的是，可对抗体进行一个或更多个多核苷酸改变并且仍然保持其对靶抗原的结合特异性。
所述抗体被称为是合成的或分离的。短语“分离的抗体或抗体片段”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体或抗体片段(例如，特异性结合靶抗原的分离的抗体基本上不含不特异性结合靶抗原的抗体)。此外，分离的抗体或抗体片段可基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。根据本发明实施方案的分离的抗体可以是合成的。合成的抗体是非天然存在的抗体。所述抗体虽然来源于人免疫球蛋白序列，但可使用并入合成CDR和/或合成框架的系统(例如噬菌体展示)来产生，或者可进行体外诱变以改善抗体特性，产生不天然存在于体内人抗体种系库内的抗体。
在另一些实施方案中，可通过常规杂交瘤技术来制备对靶抗原(例如，ABCB5)具有特异性的抗体。任选地与载体蛋白(例如KLH)偶联的全长靶抗原或其片段或表位可用于对宿主动物进行免疫接种以用于产生与该抗原结合的抗体。如本文中进一步描述的，对宿主动物的免疫接种的途径和方案通常按照用于抗体刺激和产生的已建立和常规的技术。用于产生小鼠、人源化和人抗体的一般技术在本领域是已知的，并在本文中进行了描述。考虑了任何哺乳动物对象(包括人)或其中的抗体产生细胞均可被操作以用作产生哺乳动物(包括人)杂交瘤细胞系的基础。通常来说，向宿主动物腹膜内、肌内、经口、皮下、足底内(intraplantar)和/或皮内接种一定量的免疫原，包括如本文中所述的。所述技术可例如在ABCB5敲除动物(例如小鼠)中进行。这可导致ABCB5抗体群更加多样化。敲除动物可例如使用CRISPR cas技术来制备。抗体也可从对ABCB5具有增强的免疫力的人中分离。
杂交瘤可使用Kohler,B.and Milstein,C.(1975)Nature 256:495-497的通用体细胞杂交技术或如Buck,D.W.,et al.,In Vitro,18:377-381(1982)改进的由淋巴细胞和永生化骨髓瘤细胞制备。可获得的骨髓瘤细胞系，包括但不限于X63-Ag8.653和来自SalkInstitute,Cell Distribution Center,San Diego,Calif.,USA的那些可用于杂交。通常，所述技术涉及使用融合剂(fusogen)例如聚乙二醇或通过本领域技术人员公知的电学方式来使骨髓瘤细胞和淋巴细胞融合。在融合之后，将细胞从融合培养基中分离并在选择性生长培养基例如次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(hypoxanthine-aminopterin-thymidine，HAT)培养基中培养，以消除未杂交的亲本细胞。补充有或不含有血清的本文中所述的任何培养基均可用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。作为细胞融合技术的另一个替代方案，EBV永生化B细胞可用于产生本文中所述的抗ABCB5单克隆抗体。如果期望的话，将杂交瘤扩增并亚克隆，并通过常规免疫测定程序(例如，放射免疫测定、酶免疫测定或荧光免疫测定)测定上清液的抗免疫原活性。
可用作抗体来源的杂交瘤涵盖所有衍生物，即产生能够干扰ABCB5活性的单克隆抗体的亲本杂交瘤的后代细胞。产生这样的抗体的杂交瘤可使用已知程序在体外或体内培养。如果期望的话，可通过常规的免疫球蛋白纯化程序(例如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、色谱和超滤)从培养基或体液分离单克隆抗体。不期望的活性(如果存在的话)可例如通过以下去除：使制备物经过附着于固相的由免疫原制成的吸附剂，并从免疫原洗脱或释放期望的抗体。用使用双官能剂或衍生化剂与在待免疫接种物种中具有免疫原性的蛋白质(例如，匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)缀合的包含靶氨基酸序列的片段或靶抗原免疫接种宿主动物可产生抗体(例如，单克隆抗体)群，所述双官能剂或衍生化剂例如马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基。
在另一些实施方案中，可通过使用已被改造以表达特定人免疫球蛋白的市售小鼠来获得完全人抗体。被设计为产生更期望的(例如，完全人抗体)或更稳健的免疫应答的转基因动物也可用于产生人源化抗体或人抗体。这样的技术的一些实例是来自Amgen,Inc.(Fremont,CA)的XenomouseRTM和来自Medarex,Inc.(Princeton,NJ)的HuMAb-MouseRTM和TCMouseTM或来自Harbour Antibodies BV(Holland)的H2L2小鼠。在另一个替代方案中，可通过噬菌体展示或酵母技术重组地制备抗体。参见，例如，美国专利No.5,565,332；5,580,717；5,733,743和6,265,150；以及Winter et al.,(1994)Annu.Rev.Immunol.12:433-455。或者，噬菌体展示技术(McCafferty et al.,(1990)Nature 348:552-553)可用于由来自未经免疫接种供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库体外产生人抗体和抗体片段。
本文中使用的“全长抗体”是指具有两条全长抗体重链和两条全长抗体轻链的抗体。全长抗体重链(HC)由重链可变区(VH)和恒定结构域(CH1、CH2和CH3)组成。全长抗体轻链(LC)由轻链可变区(VL)和恒定结构域(CL)组成。全长抗体可在一条或两条重链中缺少C端赖氨酸(K)。全长抗体可使用任何上述方法或本领域已知的其他方法来制备。
全长双特异性抗体可例如在两种单特异性二价抗体之间使用Fab半分子交换通过在每个半分子中的重链CH3界面处引入替换以有利于两个抗体半分子的异二聚体形成来产生，所述两个抗体半分子在体外无细胞环境中或使用共表达具有不同的特异性。交换反应是CH3结构域的解离-缔合和二硫键异构化反应的结果。亲本单特异性抗体铰链区中的重链二硫键被还原。亲本单特异性抗体之一的所得游离半胱氨酸与第二亲本单特异性抗体分子的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，并且同时亲本抗体的CH3结构域通过解离-缔合被释放和重组。臂的CH3结构域可被改造成相比同二聚化有利于异二聚化。所得产物是具有各自可结合不同表位的两个臂或半分子的双特异性抗体。
对于抗体本文中使用的“同二聚化”是指具有相同CH3氨基酸序列的两条重链的相互作用。对于抗体本文中使用的“同二聚体”是指具有含有相同CH3氨基酸序列的两条重链的抗体。
对于抗体本文中使用的“异二聚化”是指具有不同CH3氨基酸序列的两条重链的相互作用。对于抗体本文中使用的“异二聚体”是指具有含有不同CH3氨基酸序列的两条重链的抗体。
“隆突-入-穴(knob-in-hole)”策略(参见，例如PCT国际公开No.WO2006/028936)可用于产生全长双特异性抗体。简言之，可在影响CH3结构域相互作用的位置处使形成人IgG中CH3结构域界面的选择的氨基酸突变以促进异二聚体形成。将具有小侧链的氨基酸(穴)引入至特异性结合第一抗原的抗体的重链中，并将具有大侧链的氨基酸(隆突)引入至特异性结合第二抗原的抗体的重链中。在两种抗体共表达之后，由于具有“穴”的重链与具有“隆突”的重链的优先相互作用而形成异二聚体。
可如以下中所述使用另一些策略例如，通过在一个CH3表面处替换带正电荷的残基和在第二CH3表面处替换带负电荷的残基来利用静电相互作用促进重链异二聚化：美国专利公开No.US2010/0015133；美国专利公开No.US2009/0182127；美国专利公开No.US2010/028637或美国专利公开No.US2011/0123532。
除上述方法之外，可根据国际专利公开No.WO2011/131746中所述的方法通过在两种单特异性同二聚体抗体的CH3区中引入非对称突变并在允许二硫键异构化的还原条件下由两种亲本单特异性同二聚体抗体形成双特异性异二聚体抗体在体外无细胞环境中产生双特异性抗体。在该方法中，第一单特异性二价抗体和第二单特异性二价抗体被改造成在CH3结构域处具有促进异二聚体稳定性的某些替换；将抗体在足以允许铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下一起孵育；从而产生双特异性抗体。孵育条件可最佳地恢复至非还原状态。可使用的示例性还原剂是2-巯基乙胺(2-mercaptoethylamine，2-MEA)、二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)、二硫赤藓糖醇(dithioerythritol，DTE)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP)、L-半胱氨酸和β-巯基乙醇，优选选自以下的还原剂：2-巯基乙胺、二硫苏糖醇和三(2-羧乙基)膦。例如，可使用在存在至少25mM 2-MEA或存在至少0.5mM二硫苏糖醇的情况下在pH为5至8(例如pH为7.0或pH为7.4)下在至少20℃的温度下孵育至少90分钟。
完整抗体(全长抗体)的抗原结合片段可通过常规方法来制备。例如，F(ab')2片段可通过胃蛋白酶消化抗体分子来产生，并且Fab片段可通过还原F(ab')2片段的二硫桥来产生。
经遗传改造的抗体，例如人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体和双特异性抗体，可通过例如常规重组技术来产生。在一个实例中，编码对靶抗原具有特异性的单克隆抗体的DNA可使用常规程序(例如，通过使用能够与编码单克隆抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。杂交瘤细胞用作这样的DNA的优选来源。一旦分离，DNA即可被置入一种或更多种表达载体中，然后将所述载体转染到宿主细胞(例如以其他方式不产生免疫球蛋白的大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(Chinesehamster ovary，CHO)细胞、人HEK293细胞或骨髓瘤细胞)中，以在重组宿主细胞中获得对单克隆抗体的合成。参见例如PCT公开No.WO 87/04462。然后可对DNA进行修饰，例如，通过替换人重链和轻链恒定结构域的编码序列来代替同源鼠序列，Morrison et al.,(1984)Proc.Nat.Acad.Sci.81:6851，或者通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或一部分与免疫球蛋白编码序列共价连接。以这种方式，可以制备具有对靶抗原之结合特异性的经遗传改造的抗体，例如“嵌合”或“杂交”抗体。
为产生“嵌合抗体”而开发的技术在本领域是公知的。参见，例如Morrison et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,6851；Neuberger et al.(1984)Nature 312,604；和Takeda et al.(1984)Nature 314:452。
用于构建人源化抗体的方法在本领域也是公知的。参见，例如Queen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-10033(1989)。在一个实例中，按照本领域已知的方法对亲本非人抗体的VH和VL的可变区进行三维分子建模分析。接下来，使用相同的分子建模分析来鉴定预测为对形成正确CDR结构很重要的框架氨基酸残基。并行地，使用亲本VH和VL序列作为检索查询，从任何抗体基因数据库中鉴定具有与亲本非人抗体的那些同源的氨基酸序列的人VH和VL链。然后选择人VH和VL接受体基因。
选择的人接受体基因内的CDR区可用来自亲本非人抗体或其功能变体的CDR区代替。必要时，可使用预测为在与CDR区相互作用中重要的亲本链的框架区内的残基来替换人接受体基因中的相应残基。
单链抗体可通过重组技术通过将编码重链可变区的核苷酸序列和编码轻链可变区的核苷酸序列连接来制备。优选地，将柔性接头并入在两个可变区之间。或者，针对产生单链抗体描述的技术可适于产生噬菌体或酵母scFv文库，并且可按照常规程序从文库中鉴定对ABCB5具有特异性的scFv克隆。可对阳性克隆进行进一步筛选以鉴定抑制ABCB5活性的那些。
遵循本领域已知和本文中所述的方法获得的抗体可使用本领域公知的方法来表征。例如，一种方法是鉴定抗原结合的表位，或“表位作图”。本领域已知有许多方法用于对蛋白质上表位的位置进行作图和表征，包括解析抗体-抗原复合体的晶体结构、竞争测定、基因片段表达测定和基于合成肽的测定。在一个实例中，可使用与蛋白水解和质谱偶联的H/D-Ex(氢氘交换)来完成表位作图。在另一个实例中，可使用表位作图来确定与抗体结合的序列。表位可以是线性表位，即包含在单个氨基酸区段中，或者可以是通过氨基酸的三维相互作用形成的构象表位，其可不必包含在单个区段中(一级结构线性序列)。可分离或合成(例如，重组合成)不同长度(例如，至少4至6个氨基酸长)的肽，并将其用于与抗体的结合测定。在另一个实例中，与抗体结合的表位可在系统筛选中通过使用来源于靶抗原序列的重叠肽并确定抗体的结合来确定。根据基因片段表达测定，将编码靶抗原的开放阅读框随机地或通过特定的遗传构建进行片段化，并确定所表达的抗原片段相对于测试抗体的反应性。
例如，基因片段可通过PCR产生，并随后进行转录并在存在放射性氨基酸的情况下在体外翻译成蛋白质。然后通过免疫沉淀和凝胶电泳来确定抗体与经放射性标记的抗原片段的结合。某些表位还可通过使用展示在噬菌体颗粒表面上的大随机肽序列文库(噬菌体文库)来鉴定。或者，可在简单结合测定中测试所限定的重叠肽片段文库与测试抗体的结合。在另一个实例中，可进行抗原结合结构域诱变、结构域交换实验和丙氨酸扫描诱变以鉴定对于表位结合而言所需、足够和/或必需的残基。例如，结构域交换实验可使用靶抗原的突变体进行，其中ABCB5多肽的多种片段已经被来自密切相关但抗原不同的蛋白质的序列替换(交换)。通过评估抗体与突变体ABCB5的结合，可评估特定抗原片段对抗体结合的重要性。
或者，竞争测定可使用已知与相同抗原结合的其他抗体进行，以确定抗体是否与其他抗体结合相同的表位。竞争测定是本领域技术人员公知的。在一些实例中，抗ABCB5抗体通过如下例示重组技术来制备。
可将编码如本文中所述的抗ABCB5抗体的重链和轻链的核酸克隆到一个表达载体中，每个核苷酸序列与合适的启动子可操作地连接。在一个实例中，编码所述重链和轻链的核苷酸序列中的每一个与不同的启动子可操作地连接。或者，编码所述重链和轻链的核苷酸序列可与单一启动子可操作地连接，使得重链和轻链二者均由相同的启动子表达。必要时，可在重链编码序列与轻链编码序列之间插入内部核糖体进入位点(internalribosomal entry site，IRES)。
在一些实例中，将编码抗体的两条链的核苷酸序列克隆到两种载体中，所述两种载体可被引入到相同或不同的细胞中。当两条链在不同细胞中表达时，其各自可从表达它们的宿主细胞分离，并且可将所分离的重链和轻链混合并在允许形成抗体的合适条件下孵育。
一般而言，可使用本领域已知的方法将编码抗体的一条链或所有链的核酸序列克隆到与合适的启动子可操作地连接的合适的表达载体中。例如，可在合适的条件下使核苷酸序列和载体与限制性酶接触，以在每个分子上产生可彼此配对并用连接酶连接在一起的互补末端。或者，可将合成核酸接头与基因的末端连接。这些合成接头包含对应于载体中特定限制性位点的核酸序列。表达载体/启动子的选择将取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。
多种启动子可用于表达本文中所述的抗体，包括但不限于巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)中间早期启动子、病毒LTR(例如，劳斯肉瘤(Rous sarcoma)病毒LTR、HIV-LTR、HTLV-1LTR)、猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)早期启动子、大肠杆菌lacUV启动子和单纯疱疹tk病毒启动子。
还可使用调节型启动子。这样的调节型启动子包括：使用来自大肠杆菌的lac阻遏物作为转录调节物来调节来自带有lac操纵子的哺乳动物细胞启动子的转录的那些(Brown,M.et al.,Cell,49:603-612(1987))，使用四环素阻遏物(tetracyclinerepressor，tetR)的那些(Gossen,M.,and Bujard,H.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551(1992)；Yao,F.et al.,Human Gene Therapy,9:1939-1950(1998)；Shockelt,P.,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:6522-6526(1995))。另一些系统包括：FK506二聚体、使用astradiol的p65或VP16、RU486、二酚米乐甾酮(diphenol murislerone)或雷帕霉素。诱导型系统可从Invitrogen、Clontech和Ariad等获得。
可使用包含具有操纵子的阻遏物的调节型启动子。在一个实施方案中，来自大肠杆菌的lac阻遏物可用作转录调节物来调节来自带有lac操纵子的哺乳动物细胞启动子的转录(M.Brown et al.,Cell,49:603-612(1987))；Gossen and Bujard(1992)；(M.Gossenet al.,Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992))将四环素阻遏物(tetracyclinerepressor，tetR)与转录激活物(VP 16)组合以产生tetR-哺乳动物细胞转录激活物融合蛋白tTa(tetR-VP 16)、与带有tetO的来源于人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，hCMV)主要即早期启动子的最小启动子组合以产生tetR-tet操纵子系统来在哺乳动物细胞中控制基因表达。在一个实施方案中，使用四环素诱导型开关。当四环素操纵子适当地位于CMVIE启动子的TATA元件下游时，单独的四环素阻遏物(tetR)而不是tetR-哺乳动物细胞转录因子融合衍生物可用作强效反式调节物来在哺乳动物细胞中调节基因表达(Yao etal.,Human Gene Therapy)。这种四环素诱导型开关的一个特别的优点是其不需要使用在一些情况下对细胞可能有毒性的四环素阻遏物-哺乳动物细胞反式激活物或阻遏物融合蛋白(Gossen et al.,Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992)；Shockett et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:6522-6526(1995))，以实现其调节型作用。
另外，载体可包含例如以下中的一些或全部：选择标记基因，例如用于在哺乳动物细胞中选择稳定或瞬时转染子的新霉素基因；用于高水平转录的来自人CMV的即早期基因的增强子/启动子序列；用于mRNA稳定性的来自SV40的转录终止和RNA加工信号；用于适当的附加体复制的SV40多瘤复制起点和ColE1；内部核糖体结合位点(IRES)、多功能多克隆位点；以及用于有义和反义RNA的体外转录的T7和SP6 RNA启动子。合适载体和用于产生含有转基因的载体的方法是本领域公知的并且是可获得的。
可用于实践本文中所述方法的多腺苷酸化信号的一些实例包括但不限于人胶原蛋白I多腺苷酸化信号、人胶原蛋白II多腺苷酸化信号和SV40多腺苷酸化信号。
可将包含编码任何抗体的核酸的一种或更多种载体(例如，表达载体)引入到合适的宿主细胞中以用于产生抗体。可在用于表达抗体或其任何多肽链的合适条件下培养宿主细胞。这样的抗体或其多肽链可通过常规方法(例如亲和纯化)通过所培养细胞(例如，从所述细胞或培养上清液)回收。如果必要的话，可在合适的条件下将抗体的多肽链孵育合适的时间段，从而允许产生抗体。
在一些实施方案中，用于制备本文中所述抗体的方法涉及编码抗ABCB5抗体的重链和轻链二者的重组表达载体，其也如本文中所述。可通过常规方法，例如磷酸钙介导的转染，将重组表达载体引入到合适的宿主细胞中。可选择阳性转化体宿主细胞并在合适条件下培养以允许表达形成抗体的两条多肽链，其可从细胞或从培养基中回收。必要时，从宿主细胞回收的两条链可在合适的条件下孵育以允许形成抗体。
在一个实例中，提供了两种重组表达载体，一种编码抗ABCB5抗体的重链，而另一种编码抗ABCB5抗体的轻链。这两种重组表达载体二者均可通过常规方法例如磷酸钙介导的转染引入到合适的宿主细胞中。或者，可将表达载体各自引入到合适的宿主细胞中。可选择阳性转化体并在合适的条件下培养以允许表达抗体的多肽链。当将两种表达载体引入到相同的宿主细胞中时，可从宿主细胞或从培养基回收在其中产生的抗体。如果必要的话，可从宿主细胞或从培养基回收多肽链，并随后在合适的条件下孵育以允许形成抗体。当将两种表达载体引入到不同的宿主细胞中时，其各自可从相应的宿主细胞或从相应的培养基回收。然后可在合适的条件下孵育两条多肽链以形成抗体。
标准分子生物学技术用于制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞以及从培养基回收抗体。例如，可用蛋白A或蛋白G偶联的基质通过亲和色谱来分离一些抗体。
编码如本文中所述的抗ABCB5抗体的重链、轻链或这两者的任何核酸、包含这样的核酸的载体(例如表达载体)；和包含载体的宿主细胞在本公开内容的范围内。
如本文中所述的抗体以及编码核酸或核酸组、包含这样的核酸或核酸组的载体或包含载体的宿主细胞可与可药用载体(赋形剂)混合以形成用于治疗目标疾病的药物组合物。“可接受的”意指载体必须与组合物的活性成分相容(并且优选能够稳定活性成分)，并且对待治疗的对象无害。可药用赋形剂(载体)包括本领域中公知的缓冲剂。
本发明方法中使用的药物组合物可包含以冻干制剂或水溶液形式的可药用载体、赋形剂或稳定剂。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且可包含缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如，Zn蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一些实例中，本文中所述的药物组合物包含含有抗体(或编码核酸)的脂质体，其可通过本领域已知的方法制备，例如Epstein,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985)；Hwang,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4030(1980)；和美国专利No.4,485,045和4,544,545中所述。具有增强的循环时间的脂质体在美国专利No.5,013,556中公开。特别可用的脂质体可通过反相蒸发方法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-derivatized phosphatidylethanolamine，PEG-PE)的脂质组合物产生。脂质体通过限定孔尺寸的过滤器挤出以产生具有期望直径的脂质体。
还可将抗体或编码核酸包封在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊中，例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊；包封在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中；或包封在粗滴乳剂(macroemulsion)中。
在另一些实例中，本文中所述的药物组合物可以以缓慢释放形式来配制。缓慢释放制剂的一些合适实例包括包含抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质是成型制品(例如膜或微胶囊)的形式。
在另一些实施例中，本文中所述的药物组合物可以以持续释放的形式配制，其通过实施某些蛋白酶生物学技术来影响与组织或肿瘤的选择性结合，例如，通过抗体抗原结合位点的肽掩蔽，以允许在肿瘤微环境中通过一种或更多种蛋白酶例如ProbodyTM或Conditionally Active BiologicsTM的选择性蛋白酶切割。在正常微环境中，活化可被表述为是可逆的。
用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这容易通过例如经由无菌过滤膜过滤来完成。通常将治疗性抗体组合物置于到具有无菌进入口的容器中，例如静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的阻塞物的小瓶。
本文中所述的药物组合物可以是用于经口、胃肠外或直肠施用、或通过吸入或吹入施用的单位剂型，例如片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、溶液剂或混悬剂，或栓剂。对于制备固体组合物(例如片剂)，可将主要活性成分与药用载体(例如，常规压片成分例如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶)和其它药用稀释剂(例如水)混合以形成包含本发明化合物或其无毒可药用盐的均匀混合物的固体预配制组合物。当将这些预配制组合物称为均匀时，意指活性成分均匀地分散在整个组合物中，使得组合物可容易地再分为等效单位剂型，例如片剂、丸剂和胶囊剂。然后，将该固体预配制组合物再分成包含0.1至约500mg本发明活性成分的上述类型的单位剂型。新组合物的片剂或丸剂可被包衣或以其他方式复合以提供给予延长作用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可包含内部剂量和外部剂量组分，后者是在前者上方包膜的形式。这两种组分可通过肠溶层分开，所述肠溶层用于抵抗在胃中的崩解并允许内部组分完整地进入十二指肠或延迟释放。多种材料可用于这样的肠溶层或包衣，这样的材料包括多种聚合物酸，以及聚合物酸与例如虫胶、鲸蜡醇和乙酸纤维素之材料的混合物。
合适的表面活性剂包括特别是非离子剂，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇(例如TweenTM 20、40、60、80或85)和其他脱水山梨糖醇(例如SpanTM20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物将方便地包含0.05％至5％的表面活性剂，并且可为0.1％至2.5％。将理解的是，可添加另一些成分，例如甘露糖醇或其他可药用载剂，如果必要的话。
可使用市售脂肪乳剂(例如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM和LipiphysanTM)制备合适的乳剂。活性成分可溶解在预混合的乳剂组合物中，或者作为替代可将其溶解在油(例如，大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)中，并与磷脂(例如，卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合之后形成乳剂。应理解的是，可添加另一些成分，例如甘油或葡萄糖来调节乳剂的张度(tonicity)。合适的乳剂通常将包含多至20％的油，例如5％至20％。脂肪乳剂可包含0.1至1.0.im.，特别是0.1至0.5.im.的脂肪滴，并且pH为5.5至8.0。
乳剂组合物可以是通过将抗体与IntralipidTM或其组分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)混合而制备的那些。
用于吸入或吹入的药物组合物包括在可药用水性或有机溶剂或其混合物中的溶液剂和混悬剂，以及散剂。液体或固体组合物可包含如上所述的合适的可药用赋形剂。在一些实施方案中，组合物通过经口或经鼻呼吸途径施用以用于局部或全身作用。
在优选无菌的可药用溶剂中的组合物可通过使用气体来雾化。雾化溶液可直接从雾化装置中呼吸，或者雾化装置可连接至面罩、帐幕(tent)或间歇式正压呼吸机。溶液剂、混悬剂或散剂组合物可从以合适方式递送制剂的装置施用，优选经口或经鼻施用。
本文中所述的任何抗体以及编码核酸或核酸组、包含这样的核酸或核酸组的载体或包含载体的宿主细胞可用于治疗癌症或其他恶性肿瘤以及任何其他ABCB5介导的病症。
为了实施本文中所公开的方法，可通过合适的途径，例如静脉内施用，例如作为推注(bolus)或通过在一段时间内的连续输注，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、经口、吸入或表面途径，将有效量的本文中所述的药物组合物施用于有治疗需要的对象(例如人)。用于液体制剂的市售雾化器(包括喷射雾化器和超声雾化器)可用于施用。液体制剂可直接雾化，并且冻干粉末可在重构之后雾化。或者，可使用氟碳化合物(fluorocarbon)制剂和计量吸入器来将本文中所述的抗体气雾化，或作为冻干和经研磨粉末吸入。
待通过本文中所述的方法治疗的对象可以是哺乳动物，更优选地是人。哺乳动物包括但不限于农场动物、运动动物、宠物、灵长类、马、狗、猫、小鼠和大鼠。需要治疗的人对象可以是患有癌症、处于患癌症风险或怀疑患有癌症的人患者。患有目标疾病或病症的对象可通过常规医学检查例如实验室测试、器官功能测试、CT扫描或超声来鉴定。怀疑患有任何这样的目标疾病/病症的对象可能表现出该疾病/病症的一种或更多种症状。处于疾病/病症之风险中的对象可以是具有该疾病/病症的一种或更多种风险因素的对象。
本文中所述的方法和组合物可用于治疗癌症。可用本文中所述的方法和组合物治疗的癌症的一些实例包括但不限于：肺癌、黑素瘤、肾癌、肝癌、骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、甲状腺癌、血液癌、淋巴瘤、白血病、皮肤癌、卵巢癌、膀胱癌、尿路上皮癌、头颈癌、癌症的转移性病变以及被诊断为高突变负担的所有类型的癌症。在一个具体实施方案中，癌症具有高突变负担。患有或处于多种癌症之风险中的对象可通过常规医学程序来鉴定。
在一些实例中，人患者具有高微卫星不稳定性(microsatellite instability-high，MSI-H)或错配修复缺陷(mismatch repair deficient，dMMR)，其见于软组织癌、胶质母细胞瘤、食管癌和EGJ癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢表面上皮癌、未知原发性癌、小细胞肺癌、非上皮性卵巢癌、胰腺癌、其他女性生殖道恶性肿瘤、葡萄膜黑素瘤、腹膜后或腹膜肉瘤、甲状腺癌、子宫肉瘤、胆管癌、前列腺腺癌(prostate adenocarcinoma)、肝细胞癌、神经内分泌肿瘤、宫颈癌、结直肠腺癌、小肠恶性肿瘤、胃腺癌和子宫内膜癌。
本文中使用的“有效量”是指单独或与一种或更多种其他活性剂组合来赋予对象治疗作用所需的每种活性剂的量。在一些实施方案中，治疗作用是降低的ABCB5活性和/或增强的肿瘤杀伤。确定一定量的抗体是否实现治疗作用对本领域技术人员而言将是明显的。如本领域技术人员所知，有效量取决于以下而不等：所治疗的具体病症；病症的严重程度；个体患者参数，包括年龄、身体状况、大小、性别、和体重；治疗的持续时间；同步治疗(如果有的话)的性质；具体的施用途径；以及健康从业者知识和专长范围内的类似因素。这些因素对于本领域普通技术人员来说是公知的并且可以用不超出常规实验来解决。通常优选使用最大剂量的单个组分或其组合，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。
经验考虑因素，例如半衰期，通常将有助于剂量的确定。例如，与人免疫系统相容的抗体，例如人源化抗体或全人抗体，可用于延长抗体的半衰期并防止抗体被宿主免疫系统攻击。施用频率可在治疗过程期间确定和调节，并且通常(但并非必须)基于目标疾病/病症的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。或者，抗体的持续连续释放制剂可以是合适的。用于实现持续释放的多种制剂和装置在本领域中是已知的。
在一个实例中，用于本文中所述抗体的剂量可在已经给予该抗体的一次或更多次施用的个体中凭经验确定。个体被给予递增剂量的抗体。为了评估抗体的效力，可以遵循疾病/病症的指标。
通常来说，对于本文中所述任何抗体的施用，初始候选剂量可以为约2mg/kg。出于本公开内容的目的，典型的日剂量、周剂量、每两周剂量或每三周剂量可以为约0.1μg/kg至3μg/kg至30μg/kg至100μg/kg至300μg/kg至0.6mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、至10mg/kg、至30mg/kg至100mg/kg或高多中的任一种，这取决于上述因素。对于在数天、数周、数月或更长时间内的重复施用，根据病症，持续治疗直至出现期望的症状抑制，或直至达到足够的治疗水平以减轻目标疾病或病症或其症状。示例性的给药方案包括每3周施用约3mg/kg的初始剂量，随后在6周内施用一次约1mg/kg的抗体的维持剂量，或者随后每3周施用约1mg/kg的维持剂量。然而，根据从业者希望实现的药代动力学衰减模式，其他剂量方案可以是可用的。例如，考虑每3周给药一次1mg/kg与至少一种另外的抗癌剂的组合治疗。在一些实施方案中，可使用约3μg/mg至约3mg/kg(例如约3μg/mg、约10μg/mg、约30μg/mg、约100μg/mg、约300μg/mg、约1mg/kg和约3mg/kg)的给药。在一些实施方案中，给药频率为每周、每2周、每3周、每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周或每10周一次；或者每月、每2个月或每3个月或更长时间一次。这种治疗的进展通过常规技术和测定容易地监测。给药方案(包括所使用的抗体)可随时间变化。
在一些实施方案中，对于正常体重的成年患者，可施用约0.1至5.0mg/kg的剂量。在一些实例中，本文中所述的抗ABCB5抗体的剂量可以是10mg/kg。特定的剂量方案，即剂量、时机和重复，将取决于特定个体和该个体的病史以及单独药剂的特性(例如药剂的半衰期和本领域公知的其他考虑因素)。
出于本公开内容的目的，本文中所述的抗体的合适剂量将取决于所使用的特定抗体、抗体和/或非抗体肽(或其组合物)、疾病/病症的类型和严重程度、是出于预防目的还是治疗目的施用抗体、先前的治疗、患者的临床病史和对抗体的响应以及主治医师的判断。通常来说，临床医师将施用抗体，直至达到实现期望结果的剂量。在一些实施方案中，所期望的结果是降低肿瘤尺寸、延长无进展存活期和/或提高总体存活。确定剂量是否产生所期望结果的方法对于本领域技术人员而言是明显的。一种或更多种抗体的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况，施用的目的是治疗性的还是预防性的，以及技术从业者已知的其他因素。抗体的施用可在预选时间段内基本上连续，或者可以以一系列间隔剂量进行，例如在发生目标疾病或病症之前、期间或之后。
本文中使用的术语“治疗”是指将包含一种或更多种活性剂的组合物应用或施用于患有目标疾病或病症、具有疾病/病症症状或倾向于疾病/病症的对象，目的是治愈、治疗、减轻、缓解、改变、救治、改良、改善或影响病症、疾病症状或者对疾病或病症的倾向性。减轻目标疾病/病症包括延迟疾病的发生或进展，或者降低疾病严重程度。
减轻疾病并不一定需要有疗效的结果。本文中使用的“延迟”目标疾病或病症的发生意指推迟、阻碍、减慢、阻止、稳定和/或延缓疾病的进展。这种延迟可具有不同的时长，其取决于病史和/或所治疗个体。“延迟”或减轻疾病发生或延迟疾病发作的方法是这样的方法：当与未使用该方法相比时，降低在给定时间范围内发生疾病的一种或更多种症状的可能性和/或降低在给定时间范围内症状的程度。这样的比较通常基于使用足以给出统计学上显著结果的许多对象的临床研究。
疾病的“发生(development)”或“进展(progression)”意指疾病的初始表现和/或随后的进展。疾病的发生可使用本领域中公知的标准临床技术来检测和评估。然而，发生也指可无法检出的进展。出于本公开内容的目的，发生或进展是指症状的生物学过程。“发生”包括发生、复发和发作。如本文中使用的目标疾病或病症的“发作”或“出现”包括初始发作和/或复发。
在一些实施方案中，本文中所述的抗体以足以在体内抑制靶标活性至少20％(例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的量施用于需要治疗的对象。在另一些实施方案中，抗体以有效降低靶标的活性水平至少20％(例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的量施用。
根据待治疗疾病的类型或疾病部位，可使用医学领域普通技术人员已知的常规方法向对象施用药物组合物。该组合物也可通过其它常规途径施用，例如胃肠外、表面、经口、通过吸入喷雾剂、经直肠、经鼻、口含、经阴道或通过植入的储库施用。本文中使用的术语“胃肠外”包括皮下、皮内、静脉内、腹膜内、瘤内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。另外，其可以通过可注射的贮库施用途径例如使用1个月、3个月或6个月贮库可注射或生物可降解的材料和方法施用于对象。在一些实例中，眼内或玻璃体内施用药物组合物。
可注射组合物可包含多种载体，例如植物油、二甲基乳酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、豆蔻酸异丙酯、乙醇以及多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射，水溶性抗体可通过滴注方法施用，通过该方法输注包含抗体和生理学上可接受的赋形剂的药物制剂。生理上可接受的赋形剂可包括，例如5％右旋糖、0.9％盐水、林格液(Ringer’s solution)或其他合适的赋形剂。可将肌内制剂，例如抗体的合适可溶性盐形式的无菌制剂溶解在药用赋形剂例如注射用水、0.9％盐水或5％葡萄糖溶液中并施用。
在一个实施方案中，抗体通过位点特异性或靶向局部递送技术来施用。位点特异性或靶向局部递送技术的一些实例包括抗体的多种可植入贮库源或局部递送导管，例如输注导管、留置导管或针导管、合成移植物、外膜包裹物(adventitial wrap)、分流器(shunt)和支架或其他可植入装置、位点特异性载体、直接注射或直接施加。
包含多核苷酸(例如，编码本文中所述抗体的那些)的治疗性组合物可以以约100ng至约200mg DNA施用以用于在基因治疗方案中的局部施用。在一些实施方案中，在基因治疗方案期间还可使用约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg以及约20μg至约100μg DNA或更高的浓度范围。
在一些实施方案中，可向有治疗需要的对象施用多于一种抗体，或者抗体与另一种合适的治疗剂的组合。抗体还可与用于增强和/或补充药剂有效性的其他药剂联合使用。
当与另外的治疗剂共施用时，每种药剂的合适的治疗有效剂量可由于加成作用或协同作用而降低。
本文中所述方法的效力可通过本领域中已知的任何方法来评估，并且对于熟练的医学专业人员将是明显的。例如，基于抗体的免疫治疗的效力可通过对象的存活或者对象或其组织或样品中的癌症负担来评估。在一些实施方案中，基于治疗在对象中的安全性或毒性，例如通过对象的整体健康和/或不良事件或严重不良事件的存在来评估基于抗体的治疗。
本文中公开的任何抗ABCB5抗体也可用于在体外或体内检测ABCB5(例如，ABCB5+细胞)的存在。从这样的检测方法获得的结果可用于诊断目的(例如，诊断与ABCB5+细胞相关的疾病)或用于科学研究目的(例如，研究ABCB5+细胞的生物活性和/或调节)。
对于例如诊断用途的测定用途，如本文中所述的抗ABCB5抗体可与可检测标记(例如，成像剂例如造影剂)缀合以用于在体内或体外检测ABCB5(例如，ABCB5+细胞)的存在。本文中使用的“缀合”或“连接”意指两个实体优选地以实现两个实体之间缔合的治疗或诊断益处的足够的亲和力缔合。两个实体之间的缔合可以是直接的，或通过接头，例如聚合物接头。缀合或连接可包括共价或非共价键合以及其他形式的缔合，例如，如一个实体包封在另一个实体之上或之内，或者一个实体或两个实体包封在第三实体(例如胶束)之上或之内。
此外，本发明的缀合物可具有一种或更多种多晶型物或无定形结晶形式，并因此旨在包括在本发明的范围内。另外，缀合物可例如与水(即，水合物)或与常见有机溶剂形成溶剂合物。本文中使用的术语“溶剂合物”意指本发明的缀合物与一个或更多个溶剂分子的物理缔合。这种物理缔合涉及不同程度的离子键合和共价键合，包括氢键合。在某些情况下，例如当将一个或更多个溶剂分子并入结晶固体的晶格中时，溶剂合物将能够分离。术语“溶剂合物”旨在涵盖溶液相和可分离的溶剂合物二者。合适的溶剂合物的非限制性实例包括乙醇酸盐、甲醇盐等。
本发明旨在在其范围内包括本发明缀合物的多晶型物和溶剂合物。因此，在本发明的治疗方法中，术语“施用”应涵盖用本发明的缀合物或其多晶型物或溶剂合物治疗、改善或预防本文中所述的综合征、病症或疾病的方式，这明显将被包括在本发明的范围内，尽管没有具体公开。
在另一个实施方案中，本发明涉及用作药物的本发明的缀合物。
在一个实例中，如本文中所述的抗ABCB5抗体可与可检测标记连接，该标记是能够直接或间接释放可检测信号的化合物，使得可在体外或体内检测、测量和/或定量适配体。这样的“可检测标记”的实例旨在包括但不限于荧光标记、化学发光标记、比色标记、酶标记、放射性同位素和亲和标签，例如生物素。这样的标记可通过常规方法直接或间接与适配体缀合。
在一些实施方案中，可检测标记是适合于在体内对ABCB5+细胞进行成像的试剂，其可以是放射性分子、放射性药物或氧化铁颗粒。适合于体内成像的放射性分子包括但不限于122I、123I、124I、125I、131I、18F、75Br、76Br、76Br、77Br、211At、225Ac、177Lu、153Sm、186Re、188Re、67Cu、213Bi、212Bi、212Pb和67Ga。适合于体内成像的示例性放射性药物包括111In羟基喹啉、131I碘化钠、99mTc甲溴菲宁(Mebrofenin)和99mTc红细胞、123I碘化钠、99mTc依沙美肟(Exametazime)、99mTc大聚集体白蛋白、99mTc Medronate、99mTc巯替肽(Mertiatide)、99mTc奥昔膦酸(Oxidronate)、99mTc喷替酸盐(Pentetate)、99mTc高锝酸盐(Pertechnetate)、99mTc司他比锝(Setamibi)、99mTc硫溶胶(Sulfur Colloid)、99mTc替曲膦(Tetrofosmin)、铊-201或氙-133。报道剂也可以是染料(例如荧光团)，其可用于检测组织样品中由ABCB5+细胞介导的疾病。
为了在体外进行诊断测定，可使抗ABCB5抗体与怀疑含有ABCB5(例如，ABCB5+细胞)的样品接触。抗体和样品可在合适的条件下孵育合适的时间，以允许抗体与ABCB5抗原结合。然后这样的相互作用可通过常规方法，例如ELISA组织学染色或FACS进行检测。
为了在体内进行诊断测定，可向需要检查的对象施用适量的与标记(例如，成像剂或造影剂)缀合的抗ABCB5抗体。经标记抗体的存在可通过常规方法基于从标记释放的信号来检测。
本公开内容还提供了用于如本文中公开的治疗或诊断应用的药盒/试剂盒。这样的药盒/试剂盒可包含一个或更多个容器，其包含抗ABCB5抗体，例如本文中所述那些中的任一种。
在一些实施方案中，药盒/试剂盒可包含用于根据本文中所述的任何方法使用的说明书。所包含的说明书可包含施用抗ABCB5抗体以治疗目标疾病(如本文中所述的那些)、延迟其发作或缓解其的描述。药盒/试剂盒还可包含基于鉴定个体是否患有目标疾病来选择适合于治疗的个体的描述。在另一些实施方案中，说明书包含向出于处于目标疾病风险的个体施用抗体的描述。
有关使用抗ABCB5抗体的说明通常包括关于预期治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如多剂量包装)或子单位剂量。本发明的药盒/试剂盒中提供的说明书通常是标记或包装插页(例如，药盒/试剂盒中包含的纸张)上的书面说明，但机器可读说明(例如，磁性或光学存储盘上携带的说明书)也是可接受的。
标记或包装插页表明组合物用于治疗疾病或病症(例如癌症)、延缓疾病或病症(例如癌症)发作和/或缓解疾病或病症(例如癌症)。可提供用于实践本文中所述任何方法的说明书。
本发明的药盒/试剂盒在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐、软包装(例如密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。还考虑了与特定装置(例如吸入器、鼻施用装置(例如，雾化器))或输注装置(例如微型泵)组合使用的包装。药盒/试剂盒可具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。容器还可具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是抗ABCB5抗体，如本文中所述的那些。
药盒/试剂盒可任选地提供另外的组分，例如缓冲剂和解释性信息。通常地，药盒/试剂盒包含容器和在容器上或与容器相连的标签或包装插页。在一些实施方案中，本发明提供了包含上述药盒/试剂盒的内容物的制品。
本文中还提供了用于检测样品中的ABCB5+细胞和/或分离ABCB5+细胞使用的试剂盒。这样的试剂盒可包含本文中所述的任何抗ABCB5抗体。在一些情况下，抗ABCB5抗体可与可检测标记(如本文中所述的那些)缀合。作为替代或补充，试剂盒可包含能够与抗ABCB5抗体结合的二抗。试剂盒还可包含使用抗ABCB5抗体以用于检测ABCB5+细胞的说明书。
实施例
实施例1-抗ABCB5 Ab100原始/第一代抗体
Ab100的初始SDS-PAGE表征(Bio-Rad ProteanTM免染凝胶)
方法：工艺开发(process development)包括稳定细胞系的产生/表达(CHOvolutionTM CHO K1 SEFEX)、补料分批(GlycanTuneTM C+补料)、生物反应器10升、运行01/02以及通过Mabselect(Prot.A亲和色谱)/Sephadex(凝胶过滤至PBS)柱纯化。所得抗体称为AB100。
结果：Ab100(经纯化的抗体)被表征以确定结构。在变性(96℃，5分钟)和还原(100mM DTT)条件下，通过SDS-PAGE对抗体批次纯度、稳定性、降解等进行了基本评估(参见图1)。因此，针对品质控制使用凝胶电泳检测抗体(经纯化的抗体Ab100)显示出完整的抗体。
ELISA结合研究
线性肽ELISA(20μM肽)
Ab100对ABCB5的特异性。对针对用于制备抗体的ABCB5肽运行的ELISA进行检查。线性肽ELISA结合研究是对与ABCB5线性表位肽(第三胞外环)以及同源(ABCB 1、4、11)蛋白和直系同源(鼠ABCB5)蛋白的相应肽区段的定量结合的比较评估——以评估特异性和/或交叉反应性(参见图2)。将在序列上略有不同的三种人同源蛋白质用于表明特异性。Ab100与三种对照中的任一种都没有任何明显程度的结合。该抗体的确显示出与鼠ABCB5(相对于人的一个氨基酸替换)结合，这是毒性研究的期望特性。未对灵长类的序列进行测试，因为其表位序列与人表位相同。将乱序肽用作阴性对照。所有测试肽均是合成产生与胞外环类似的线性肽。X轴是Ab浓度。Y轴是ELISA的光密度(代表结合的信号)。减去了同种型抗体的非特异性信号，这是为什么未显示出非特异性同种型抗体的原因。
ABCB5重组蛋白ELISA
ABCB5重组人蛋白ELISA结合研究是对与重组ABCB5蛋白特异性结合的评价(参见图3)。示出了结合重组完整蛋白，示出了不仅与肽良好结合而且与完整蛋白良好结合。在此包括同种型作为对照。
环状(生物素化)肽ELISA(200nM肽)
从线性肽产生肽表位的环状形式以产生三维结构。环状形式可更类似于环。因此，环状(生物素化)肽ELISA结合研究评价了具有N端生物素修饰以用于固定(固定在链霉亲和素预包被板上)的天然环状ABCB5肽(通过两端处另外的半胱氨酸之间的二硫键环化)的特异性结合和亲和力(参见图4A至4B)。数据也以数字形式在下表中示出：
Figure BDA0004022477880001121
Figure BDA0004022477880001131
流式细胞术(FACS)结合研究-具有ABCB5+亚群的人肿瘤细胞系
使用FACS分析进行在人肿瘤细胞系下与细胞ABCB5的特异性结合的评价。用APC标记的第二抗人抗体进行检测(参见图5A至5D)。图5A至5D示出了在两种不同浓度的抗体(深色条为25μg/mL；浅色条为12.5μg/mL)下癌细胞群内ABCB5+细胞的百分比。图5A示出了梅克尔细胞癌细胞群中的特异性ABCB5+染色的细胞。图5B示出了G361黑素瘤细胞群中的特异性ABCB5+染色的细胞。图5C示出了A375黑素瘤细胞群中的特异性ABCB5+染色的细胞。图5D示出了HT-29结直肠癌细胞群中的特异性ABCB5+染色的细胞。不同细胞系的设门群(％)中的不同水平反映了群内ABCB5+细胞的不同数量。数据表明，所述抗体能够特异性地识别不同细胞群中的细胞表面ABCB5。
免疫荧光(IF)染色-人肿瘤细胞系w/ABCB5+亚群
进行了在人肿瘤细胞系下与细胞ABCB5的特异性结合的评价和可视化。检查了抗ABCB5抗体与5种肿瘤细胞系的结合，并且数据在图6中示出。图6A至6E示出了癌细胞群内ABCB5+细胞的染色(re指示ABCB5)。图6A示出了梅克尔细胞癌细胞群中的特异性ABCB5+染色的细胞。图6B示出了G361黑素瘤细胞群中的特异性ABCB5+染色的细胞。图6C示出了A375黑素瘤细胞群中的特异性ABCB5+染色的细胞。图6D示出了HT-29结直肠癌细胞群中的特异性ABCB5+染色的细胞。图6E示出了A549 NSCLC细胞群中的特异性ABCB5+染色的细胞。
抗体介导的细胞毒性(抗肿瘤)效应功能
进行了抗体依赖性细胞毒性(ADCC)报道子生物测定以确定对肿瘤细胞系的平均效能/效力(参见图7A至7B)。在响应于用Ab100(图7A)或同种型对照(图7B)处理的细胞组中测量ADCC的倍数诱导。
进行了抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)报道子生物测定以确定对肿瘤细胞系的平均效能/效力(参见图8A至8B)。在响应于用Ab100(图8A)或同种型对照(图8B)处理的细胞组中测量ADCP的倍数诱导。
(基于细胞的)pAkt/Akt ELISA–人肿瘤细胞系w/ABCB5+亚群
为了评估Ab100的胞内信号传导能力，测量了用Ab100或同种型对照处理的细胞(G361-图9A或A375-图9B)中pAkt1与Akt1的比率。结果在图9A至9B中示出。观察到的磷酸化变化反映了ABCB5抗体影响胞内信号传导的能力。使用特异性抗体阻断ABCB5抑制了涉及磷酸化的下游反应。因此，比率响应于Ab100处理而降低。Ab相对于对照显著降低了比率。
实施例2-抗ABCB5体内抗肿瘤效力测试(小鼠模型)
实验1–参见图10
该研究中使用的肿瘤模型是A375人细胞来源的肿瘤异种移植物(cell derivedtumor xenograft，CDX)黑素瘤(肿瘤预防模型)。其被称为肿瘤预防模型，因为抗体是在确定的肿瘤形成之前递送的。s.c.施用107个细胞。小鼠品系为NMRI(免疫受损的裸鼠模型)nu/nu(雌性)。测试项目包括mAb：Ab100、Ab2和同种型对照以及抗体-药物缀合物(ADC)。对于mAb遵循以下给药方案：Ab100为6.4&3.2mg/kg–第1至5天/周，4周–i.p.(n＝8)，Ab2为6.4mg/kg–第1至5天/周，4周–i.p.(n＝8)，以及同种型对照为6.4mg/kg–第1至5天/周，4周–i.p.(n＝8)。对于抗体-药物缀合物遵循以下给药方案：同种型对照为2.5mg/kg–1×/周，4周–i.v.(n＝8)和2.5mg/kg–1×/周，4周–i.v.(n＝8)。
DAR测量抗体上药物的量，并且可以是待递送药物的量的可用评估。黑色箭头是指施用Ab的天数，以及红色箭头指示肿瘤接种日。图10中示出的数据表明，Ab100和Ab2(未与药物缀合)相对于未经处理对照和同种型对照显著降低了小鼠的肿瘤体积。所观察到的ADC的肿瘤体积降低最大。Ab-药物缀合物相对于未经处理对照和同种型对照显著降低了小鼠的肿瘤体积。
实验2
本研究使用CT26.wt(CRL-2638)鼠同基因结直肠癌(肿瘤预防模型)。s.c.施用106个细胞。小鼠品系为Balb/c(雌性)。测试项目包括抗体-药物缀合物和同种型对照。对于测试项目遵循以下给药方案：Ab101-药物缀合物为4mg/kg–第1/3/7/10/13/15/17天(n＝7)和2mg/kg–第1/3/7/10/13/15/17天(n＝7)，以及同种型对照为4mg/kg–第1/3/7/10/13/15/17天(n＝7)和2mg/kg–第1/3/7/10/13/15/17天(n＝7)，均为i.v.。数据表明，Ab101-药物缀合物显著降低了结直肠癌的体内小鼠模型的肿瘤体积。2至4mg/kg的抗体观察到显著的剂量差异。
实验3
A375(CRL-1619)人CDX黑素瘤(总存活分析)用于研究抗体和抗体-药物缀合物。s.c.施用107个细胞。小鼠品系为NMRI nu/nu(雌性)。测试项目包括多种抗体-药物缀合物。数据表明，基于Ab101、Ab44和Ab42的多种抗体-药物缀合物相对于未经处理对照和同种型对照显著提高了黑素瘤小鼠的存活时间。
实验4
使用采用s.c.106个细胞的CT26.wt(CRL-2638)鼠同基因结直肠癌(肿瘤预防模型)。小鼠品系为Balb/c(雌性)。测试项目包括具有Ab101、Ab44和同种型ctrl的抗体-药物缀合物。数据表明，Ab101和Ab44(与药物缀合的Ab)相对于未经处理对照和同种型对照显著增加了小鼠的绝对肿瘤体积。
对本文中公开的许多其他抗体进行了另外的实验。一些数据在图11至24中示出。
除非另有说明，否则任何数值(例如本文中所述的浓度或浓度范围)，应理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，数值通常包括所记载值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。除非上下文另有明确指示，否则本文中使用的数字范围的使用明确包括所有可能的子范围，该范围内的所有单独数值，包括这样的范围内的整数和值的分数。
除非另外指出，否则应将一系列要素之前的术语“至少”理解为是指该系列中的每个要素。本领域技术人员将认识到或者仅使用常规实验就能够确定本文中所述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。这样的等同实施旨在被本发明涵盖。
还应理解，当提及优选发明的组件的尺寸或特征时，本文中使用的术语“约”、“大约”、“一般”、“基本上”和类似术语表明所描述的尺寸/特征不是严格的边界或参数，并且不排除功能上相同或类似的其微小变化，如本领域普通技术人员所理解的。最小程度上，包含数字参数的这样的提及将包括使用本领域接受的数学和工业原理的变化(例如，舍入、测量或其他系统误差、制造公差等)，其不会改变最低有效数字。
除非另外指出，否则本发明的实践可使用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其在本领域技术之内。这样的技术在文献中有充分的解释。无需进一步阐述，认为本领域技术人员可基于以上描述以其最大程度地利用本发明。因此，以下具体实施方案应被解释为仅是举例说明性的，而无论如何不以任何方式限制本公开内容的其余部分。本文中引用的所有出版物均出于本文中引用的目的或主题通过引用并入。
虽然本文中已对数个本发明实施方案进行了描述和举例说明，但是本领域普通技术人员将容易想到多种其他方法和/或结构来实现本文中所述功能和/或获得本文中所述结果和/或一个或更多个优点，并且认为这样的变化和/或修改中的每一个均在本文中所述的本发明实施方案的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易认识到，本文中所述的所有参数、尺寸、材料和构型均意在是示例性的，并且实际的参数、尺寸、材料和/或构型将取决于采用发明教导的一种或更多种特定应用。本领域技术人员将认识或者能够仅使用常规实验就能确定针对本文中描述的具体发明实施方案的许多等同方案。因此，应该理解，前述实施方案仅作为示例示出，并且在所附权利要求书及其等同方案的范围内，本发明实施方案可以以不同于具体描述和要求保护的其他方式实践。本公开内容的发明实施方案涉及本文中所述的每一个单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果这样的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法不相互矛盾，则两个或更多个这样的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任意组合均包含在本公开内容的本发明范围内。
如本文中所定义和使用的所有定义应理解为优先于字典定义、通过引用并入的文件中的定义和/或所定义术语的一般含义。
本文中公开的所有参考文献、专利和专利申请均关于其各自被引用的主题通过引用并入，在一些情况下，其可涵盖文件的全部内容。
除非明确相反地指出，否则如本文在说明书和权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词应理解为意指“至少一个/种”。
如本文在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解成意指如此连接的要素中的“之一或两者”，即在一些情况下要素共同存在，而在另一些情况下要素分别存在。用“和/或”列举的多个要素应以相同方式理解，即所连接要素中的“一个或更多个”。除了由“和/或”子句具体地所指明的要素之外，其他要素可任选地存在，不管与具体地所指明的那些要素相关或不相关。因此，作为非限制性实例，当与例如“包含”的开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的引用可以在一个实施方案中仅指代A(任选地包含除B之外的要素)；在另一个实施方案中，仅指代B(任选地包含除A之外的要素)；在又一个实施方案中，指代A和B二者(任选地包含其他要素)；等。
本文说明书和权利要求书中使用的“或/或者”应理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或“和/或”应理解为包含性的，即包括多个要素或要素列表中的至少一个，但也包括其中的多于一个，并且任选地包括另外的未列举项目。仅明确指出相反的术语，例如“仅一个”或“恰好一个”，或当用于权利要求书时“由其组成”将是指包括多个要素或要素列表中的恰好一个要素。一般而言，当前面有排他性术语(例如“任一”、“其一”、“仅其一”或“恰好其一”)时，如本文中使用的术语“或/或者”仅应理解为表示排他性替选方案(即，“一个/种或另一个/种，但并非二者”)。“基本上由其组成”当在权利要求书使用中时其应具有在专利法领域中所使用的一般含义。
如在本文说明书和权利要求中使用的短语“至少一者”在提及一个或更多个要素的列表时应理解为意指从要素列表中的任一个或更多个要素中选择的至少一个要素，但并不一定包括要素列表中具体列举的每个要素中的至少一者，也不排除要素列表中要素的任何组合。该定义还允许可以任选地存在除在短语“至少一个”所提及的要素列表中具体标识的要素之外的要素，无论其与具体指出的那些要素相关或不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一者”(或等同地，“A或B中的至少一者”，或等同地，“A和/或B中的至少一者”)在一个实施方案中可以指至少一个A，任选地包括多于一个A，而不存在B(并且任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，可以指至少一个B，任选地包括多于一个B，而不存在A(并且任选地包括除A之外的要素)；在又一个实施方案中，可以指至少一个A，任选地包括多于一个A，以及至少一个B，任选地包括多于一个B(并且任选地包括其它要素)；等等。
还应当理解，除非明确指出相反，在本文中要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不必限于所记载的方法的步骤或动作的顺序。
在权利要求书以及以上说明书中，所有过渡性短语例如“包含”、“包括”、“携有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由……构成”等都应理解为开放式的，即，意指包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节中所述，仅过渡性短语“由……组成”和“基本上由……组成”应当分别是封闭式或半封闭式的过渡性短语。应当理解，在本文件中使用开放式过渡性短语(例如，“包含/包括”)描述的实施方案也在替代实施方案中考虑为“由该开放式过渡性短语描述的特征组成”和“基本上由该开放式过渡性短语描述的特征组成”。例如，如果本公开内容描述“包含A和B的组合物”，则本公开内容还涵盖替代实施方案“由A和B组成的组合物”和“基本上由A和B组成的组合物”。

Claims (77)

1.与ATP结合盒转运体家族成员B5(ABCB5)结合的抗体，
其中所述抗体包含重链可变结构域(VH)，其包含(i)与SEQ ID NO：49至56中任一者所示的序列具有至少90％序列同一性的重链互补决定区1(HC CDR1)，(ii)与SEQ ID NO：57至65中任一者所示的序列具有至少90％序列同一性的重链互补决定区2(HC CDR2)；以及(iii)与SEQ ID NO：66至72中任一者所示的序列具有至少90％序列同一性的重链互补决定区3(HC CDR3)；和/或
其中所述抗体包含轻链可变结构域(VL)，其包含(i)与SEQ ID NO：51至54、73至76和80中任一者所示的序列具有至少90％序列同一性的轻链互补决定区1(LC CDR1)；(ii)与SEQID NO：60至63和77至78中任一者所示的序列具有至少90％序列同一性的轻链互补决定区2(LC CDR2)；以及(iii)与SEQ ID NO：67、69、70、79、81和103中任一者所示的序列具有至少90％序列同一性的轻链互补决定区3(LC CDR3)，任选地，其中所述抗体不是AB100或Ab101。
2.与ATP结合盒转运体家族成员B5(ABCB5)结合的抗体，
其中所述抗体包含重链可变结构域(VH)，其包含(i)GFTFSSYX1MN(SEQ ID NO：109)或GYTFTX2YYMH(SEQ ID NO：110)所示的重链互补决定区1(HC CDR1)，其中X1是S或D或T，并且X2是S或N，(ii)YISSSX3X4TIYYADSVKG(SEQ ID NO：111)或IINPSGGSTSYAQKFX5G(SEQ ID NO：112)所示的重链互补决定区2(HC CDR2)，其中X3是S或G，并且X4是S或N；并且X5是K或Q，以及(iii)NYQYGDYGGY(SEQ ID NO：66)或DX6AVTGTAYYYYYGMDV(SEQ ID NO：113)所示的重链互补决定区3(HC CDR3)，其中X6是Q或L；和/或
其中所述抗体包含轻链可变结构域(VL)，其包含(i)X7ASHDISNFLN(SEQ ID NO：114)或RASX8SVNSX9YLA(SEQ ID NO：115)所示的轻链互补决定区1(LC CDR1)，其中X7是Q或H；X8是L或Q；并且X9是N或K，(ii)DAYNLQT(SEQ ID NO：77)或GTSSRAT(SEQ ID NO：78)所示的轻链互补决定区2(LC CDR2)，以及(iii)QQYDYFLSIT(SEQ ID NO：79)或QQFGSSPLT(SEQ ID NO：81)所示的轻链互补决定区3(LC CDR3)，任选地，其中所述抗体不是AB100或Ab101。
3.与ATP结合盒转运体家族成员B5(ABCB5)结合的抗体，其中所述抗体与Ab100或Ab101结合相同的表位，或者与Ab100或Ab101竞争与所述ABCB5结合。
4.抗体，其识别人ABCB5中包含SEQ ID NO.104或与SEQ ID NO.104具有至少80％序列同一性的表位。
5.权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述抗体特异性地结合人ABCB5。
6.权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述抗体与人ABCB5和非人ABCB5交叉反应。
7.权利要求1至6中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合在细胞表面上表达的ABCB5。
8.权利要求3或4所述的抗体，其中所述抗体包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，其与Ab100或Ab101的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3相比总共包含不多于10个氨基酸变化；和/或LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其与Ab100或Ab101的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3相比总共包含不多于10个氨基酸变化。
9.权利要求8所述的抗体，其中所述抗体包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，其与Ab100或Ab101的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3相比总共包含不多于8个氨基酸变化。
10.权利要求9所述的抗体，其中所述抗体包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，其与Ab100或Ab101的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3相比总共包含不多于5个氨基酸变化。
11.权利要求8至10中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3，其与Ab100或Ab101的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3相比总共包含不多于8个氨基酸变化。
12.权利要求11所述的抗体，其中所述抗体包含LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其与Ab100或Ab101的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3相比总共包含不多于5个氨基酸变化。
13.权利要求2所述的抗体，其中所述抗体包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，其中至少一个HC CDR作为Ab100或Ab101的对应HC CDR包含不多于5个氨基酸变化；和/或LC CDR1、LCCDR2和LC CDR3，其中至少一个LC CDR作为Ab100或Ab101的对应LC CDR包含不多于5个氨基酸变化。
14.权利要求13所述的抗体，其中所述抗体包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，其中至少一个HC CDR作为Ab100或Ab101的对应HC CDR包含不多于2个氨基酸变化。
15.权利要求13或权利要求14所述的抗体，其中所述至少一个HC CDR是HC CDR3。
16.权利要求13或权利要求14所述的抗体，其中所述抗体包含LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3，其中至少一个LC CDR作为Ab100或Ab101的对应LC CDR包含不多于2个氨基酸变化。
17.权利要求2所述的抗体，其中所述抗体与Ab100或Ab101包含相同的重链互补决定区(HC CDR)和/或相同的轻链互补决定区(LC CDR)。
18.权利要求17所述的抗体，其中所述抗体与Ab100或Ab101包含相同的重链可变结构域和/或与Ab100或Ab101包含相同的轻链可变结构域。
19.权利要求1至17中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含与Ab100或Ab101的重链可变结构域具有至少85％同一性的重链可变结构域，和/或与Ab100或Ab101的轻链可变结构域具有至少85％同一性的轻链可变结构域。
20.权利要求1至19中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。
21.权利要求1至19中任一项所述的抗体，其中所述抗体是全长抗体。
22.权利要求21所述的抗体，其中所述全长抗体是IgG分子。
23.权利要求21或权利要求22所述的抗体，其中所述抗体包含与天然存在的对应物相比发生了改变的Fc片段，或者其中所述抗体包含非岩藻糖基化的Fc片段，或者其中所述抗体的抗原结合位点被掩蔽以允许蛋白酶介导的活化。
24.权利要求22所述的抗体，其中所述抗体包含含有K214R的改变的IgG1 Fc片段。
25.权利要求23所述的抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:1至8和13至17中任一者所示的重链可变序列和与SEQ ID NO:20至23和26至29中任一者所示的轻链可变序列具有至少90％序列同一性的序列。
26.权利要求23所述的抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:31至44中任一者所示的重链序列和与SEQ ID NO:45至47中任一者所示的轻链序列具有至少90％序列同一性的序列。
27.权利要求1至19中任一项所述的抗体，其中所述抗体单链双抗体(scDb)、二价、三价、四价、五价或六价scFv串联重复(TaFv)是抗原结合片段。
28.权利要求27所述的抗体，其中所述抗原结合片段是Fab、Fab'、F(ab')2或Fv。
29.权利要求1至19中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单链抗体、双特异性抗体或纳米抗体。
30.权利要求1至29中任一项所述的抗体，其中所述抗体与可检测标记缀合。
31.抗体-药物缀合物(ADC)，其包含与治疗剂偶联的权利要求1至30中任一项所述的抗体。
32.权利要求31所述的ADC，其中所述抗体是scFv或其二价、三价、四价、五价或六价scFv串联重复(TaFv)二价串联scFv重复(TaFv)。
33.权利要求31或32所述的ADC，其中所述治疗剂是奥瑞他汀肽、奥瑞他汀E(AE)、单甲基奥瑞他汀E(MMAE)，或者多拉司他汀的合成类似物。
34.抗体-药物缀合物(ADC)，其包含通过接头与治疗剂偶联的与ATP结合盒转运体家族成员B5(ABCB5)特异性结合的抗体。
35.权利要求34所述的ADC，其中所述抗体是scFv或其二价、三价、四价、五价或六价scFv串联重复(TaFv)二价串联scFv重复(TaFv)。
36.权利要求34或35所述的ADC，其中所述治疗剂是奥瑞他汀肽、奥瑞他汀E(AE)、单甲基奥瑞他汀E(MMAE)，或者多拉司他汀的合成类似物。
37.权利要求34至36中任一项所述的ADC，其中所述接头是柔性接头。
38.权利要求34至36中任一项所述的ADC，其中所述接头选自肽接头、烃接头、聚乙二醇(PEG)接头、聚丙二醇(PPG)接头、多糖接头、聚酯接头、由PEG和嵌入杂环组成的混合接头以及烃链。
39.权利要求36所述的ADC，其中所述接头是包含2至24个PEG单元的PEG接头。
40.权利要求36所述的ADC，其中所述接头是磺酰胺接头。
41.权利要求36所述的ADC，其中所述接头是包含GSTSGGGSGGGSGGGGSS(SEQ ID NO.84)或GGGGSS(SEQ ID NO.86)的肽接头。
42.双特异性抗体，其中所述抗体具有对ATP结合盒转运体家族成员B5(ABCB5)具有抗原结合特异性的区域和对免疫效应细胞抗原具有抗原结合特异性的区域。
43.权利要求42所述的双特异性抗体，其中所述免疫效应细胞抗原是Cd16或CD3。
44.权利要求42所述的双特异性抗体，其中对免疫效应细胞抗原具有抗原结合特异性的区域是抗Cd16 scFv或抗CD3 scFv。
45.权利要求42所述的双特异性抗体，其中对ABCB5具有抗原结合特异性的区域是抗ABCB5 scFv或抗ABCB5单克隆抗体。
46.权利要求42所述的双特异性抗体，其中抗体包含IgG-scFv融合蛋白[IgG-scFv]。
47.权利要求42所述的双特异性抗体，其中抗体包含单链双抗体(scDb)。
48.权利要求42所述的双特异性抗体，其中抗体包含串联scFv(TaFv)。
49.核酸或核酸组，其共同编码权利要求1至29或41至47中任一项所述的与ABCB5结合的抗体。
50.权利要求49所述的核酸或核酸组，其是载体或载体组。
51.权利要求50所述的核酸或核酸组，其中所述载体是表达载体。
52.宿主细胞，其包含权利要求51所述的载体或载体组。
53.权利要求52所述的宿主细胞，其选自细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞。
54.经遗传改造的免疫细胞，其表达包含胞外结构域和至少一个胞质信号传导结构域的嵌合受体，其中所述胞外结构域是与ATP结合盒转运体家族成员B5(ABCB5)结合的单链抗体。
55.权利要求55所述的经遗传改造的免疫细胞，其中所述单链抗体包含分别在SEQ IDNO：1至8、13至17和20至23、26至29中任一者中所示的重链可变结构域和/或轻链可变结构域。
56.药物组合物，其包含(a)权利要求1至29中任一项所述的与ABCB5结合的抗体以及(b)可药用载体。
57.用于在对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用有效量的权利要求56所述的药物组合物。
58.权利要求57所述的方法，其中所述人患者患有转移性癌症。
59.权利要求57至58中任一项所述的方法，其中所述对象已经历或正在经历对疾病的另外的治疗。
60.权利要求59所述的方法，其中所述疾病是癌症，并且对癌症的所述治疗是手术、化学治疗、免疫治疗、放射治疗或其组合。
61.用于检测ABCB5的存在的方法，所述方法包括使单独的或与特异性结合和/或捕获其他ABCB5表位的其他抗ABCB5抗体组合的权利要求1至22中所述抗ABCB5抗体与怀疑含有ABCB5的生物样品接触，以及测量所述抗ABCB5抗体与所述样品中ABCB5的结合，所述其他ABCB5表位任选地选自
RFGAYLIQAGRMTPEG(SEQ ID NO.104)，
TMFGNNDKTTLKHDAE(SEQ ID NO.105)，
VTGMIETAAMTGFANKDKQELKHAGKIATEALENIRTIVSLTREKAFEQMYEEMLQTQHRNTSKKAQI(SEQID NO.106)，和
QDIKKADEQMESMTYSTERKTNSLPLHSVKSIKSDFIDKAEESTQSKEISLPEVSLLK(SEQ IDNO.107)。
62.权利要求60所述的方法，其中所述治疗包括向所述对象施用免疫检查点拮抗剂。
63.用于检测ABCB5的存在的方法，所述方法包括使权利要求1至29中所述的抗ABCB5抗体与怀疑含有ABCB5的生物样品接触，以及测量所述抗ABCB5抗体与所述样品中ABCB5的结合。
64.权利要求62或权利要求63所述的方法，其中所述生物样品是体内的，并且所述接触步骤通过向所述对象施用有效的所述抗ABCB5抗体来进行。
65.用于在对象中治疗肿瘤的方法，所述方法包括：从患有肿瘤的对象获得免疫白细胞如T细胞、NK细胞单核细胞和/或巨噬细胞或其组合；将所述T细胞用包含编码含有特异性识别ABCB5的scFv的嵌合抗原受体(CAR)的核酸的载体在体外进行转导，由此经转导的T细胞、NK细胞、单核细胞和/或巨噬细胞免疫细胞表达所述CAR；在体外扩增经转导TCAR免疫细胞；以及将扩增的经转导TCAR免疫细胞输注到所述患有肿瘤的对象中，由此产生抗肿瘤免疫T细胞应答，其中所述肿瘤中的细胞表达ABCB5。
66.权利要求63所述的方法，其中所述抗体与可检测标记缀合。
67.权利要求63或权利要求66所述的方法，其中所述生物样品是体内的，并且所述接触步骤通过向所述对象施用有效的所述抗ABCB5抗体来进行。
68.用于在对象中治疗肿瘤的方法，所述方法包括：从患有肿瘤的对象获得T细胞；将所述T细胞用包含编码含有特异性识别ABCB5的scFv的嵌合抗原受体(CAR)的核酸的载体在体外进行转导，由此经转导T细胞表达所述CAR；在体外扩增所述经转导T细胞；以及将扩增的经转导T细胞输注到所述患有肿瘤的对象中，由此产生抗肿瘤T细胞应答，其中所述肿瘤中的细胞表达ABCB5。
69.分离的嵌合抗原受体(CAR)，其包含ABCB5结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中所述ABCB5结合结构域包含人可变重链(VH)结构域。
70.权利要求69所述的CAR，其中所述ABCB5结合结构域包含权利要求1至29中任一项所述的抗体。
71.分离的细胞或细胞群，其包含一种或更多种权利要求69至70中任一项所限定的CAR。
72.根据权利要求71所述的细胞或细胞群，其中所述细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节性T细胞。
73.药物组合物，其包含权利要求71或72中所限定的细胞或细胞群以及可药用的载体、赋形剂或稀释剂。
74.用于治疗癌症的方法，其包括施用根据权利要求62所述的细胞或细胞群或者根据权利要求63所述的药物组合物。
75.根据权利要求72所述的细胞或根据权利要求29所述的药物组合物，其用于治疗。
76.根据权利要求72所述的细胞或根据权利要求73所述的药物组合物，其用于治疗癌症。
77.根据权利要求72所述的细胞或根据权利要求63所述的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
CN202180046044.6A 2020-04-30 2021-04-30 对abcb5具有特异性的抗体及其用途 Pending CN116096753A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063018440P 2020-04-30 2020-04-30
US63/018,440 2020-04-30
PCT/US2021/030342 WO2021222861A1 (en) 2020-04-30 2021-04-30 Antibodies specific to abcb5 and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116096753A true CN116096753A (zh) 2023-05-09

Family

ID=78373989

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180046044.6A Pending CN116096753A (zh) 2020-04-30 2021-04-30 对abcb5具有特异性的抗体及其用途

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230203153A1 (zh)
EP (1) EP4142793A4 (zh)
JP (1) JP2023524102A (zh)
KR (1) KR20230034944A (zh)
CN (1) CN116096753A (zh)
AU (1) AU2021262864A1 (zh)
CA (1) CA3181591A1 (zh)
WO (1) WO2021222861A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7137696B2 (ja) 2019-05-14 2022-09-14 プロヴェンション・バイオ・インコーポレイテッド １型糖尿病を予防するための方法および組成物
AU2021287998A1 (en) 2020-06-11 2023-02-02 Benaroya Research Institute At Virginia Mason Methods and compositions for preventing type 1 diabetes

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1290028B1 (en) * 2000-06-05 2009-12-23 The Brigham And Women's Hospital, Inc. A GENE ENCODING A MULTIDRUG RESISTANCE HUMAN P-GLYCOPROTEIN HOMOLOGUE ON CHROMOSOME 7p15-21 AND USES THEREOF
JP5889527B2 (ja) * 2007-04-12 2016-03-22 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッドＴｈｅ Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｉｎｃ． 癌療法のためのａｂｃｂ５標的化
WO2010065711A1 (en) * 2008-12-04 2010-06-10 Adimab, Inc. An abcb5 epitope and antibodies thereto for the treatment of cancer
WO2016179576A1 (en) * 2015-05-07 2016-11-10 Bioxcel Corporation Novel immunomodulatory therapeutic strategies targeting tumors in cancer
WO2020198611A1 (en) * 2019-03-28 2020-10-01 Children's Medical Center Corporation Highly functional manufactured abcb5+ mesenchymal stem cells

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230034944A (ko) 2023-03-10
EP4142793A1 (en) 2023-03-08
JP2023524102A (ja) 2023-06-08
US20230203153A1 (en) 2023-06-29
AU2021262864A1 (en) 2022-11-17
CA3181591A1 (en) 2021-11-04
WO2021222861A1 (en) 2021-11-04
EP4142793A4 (en) 2024-08-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2021531826A (ja) 栄養膜細胞表面抗原２（ｔｒｏｐ２）に対する特異的な抗体
EP3753951A1 (en) Anti-b7-h4 antibody, antigen-binding fragment thereof and pharmaceutical use thereof
WO2019141268A1 (zh) 抗4-1bb抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN113474362B (zh) 对cd44特异性的抗体
JP7048567B2 (ja) 二重特異性抗原結合ポリペプチド
JP2020509737A (ja) 新規な組換え型二機能性融合タンパク質、その調製方法および用途
JP2022514693A (ja) Ｍｕｃ１８に特異的な抗体
JP2023506667A (ja) 抗ｐｄ－１抗体およびその使用
CA3105415A1 (en) Antibodies specific to folate receptor alpha
KR20220133884A (ko) 항-mdr1 항체 및 이의 용도
US20230203153A1 (en) Antibodies specific to abcb5 and uses thereof
CN114685666A (zh) 抗间皮素纳米抗体及其应用
JP2022514786A (ja) Ｍｕｃ１８に特異的な抗体
CN113045659B (zh) 抗cd73人源化抗体
CA3206835A1 (en) Mesothelin binding molecule and application thereof
AU2022291982A1 (en) Bispecific antibody combination and use thereof
CN115996951A (zh) 抗cd103抗体
CN114729013A (zh) 抗cd22抗体及其用途
WO2018059465A1 (zh) 抗cd27抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN114685655B (zh) Pd-1结合分子及其应用
JP2024119785A (ja) 葉酸受容体アルファに特異的な抗体
WO2023052541A1 (en) Combination of an anti-btn3a activating antibody and an il-2 agonist for use in therapy
CN115873114A (zh) Ctla-4结合分子及其应用
NZ736142B2 (en) Anti-pdl1 antibodies, activatable anti-pdl1 antibodies, and methods of use thereof
NZ736142A (en) Anti-pdl1 antibodies, activatable anti-pdl1 antibodies, and methods of use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination