JP2005511013A - 核酸、ポリペプチド、一塩基多型、およびそれらの使用方法 - Google Patents

核酸、ポリペプチド、一塩基多型、およびそれらの使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明において、新規ポリペプチドをコード化する核酸配列を開示する。核酸配列によりコード化されるポリペプチド、およびポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、ならびに誘導体、変異体、突然変異体、または上述のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体のフラグメントもまた開示する。本発明は、治療方法、診断方法、およびこの新規ヒト核酸およびタンパク質と関与する疾患の診断、処置、および予防の研究方法をさらに開示する。本発明はまた、転写されたヒト配列について同定された一塩基多型を含有する核酸、ならびに核酸の使用方法を提供する。

Description

発明の詳細な説明
（発明の技術分野）
本発明は、様々な遺伝子の一塩基多型に関する。本発明はまた、遺伝子の対立遺伝子変異を解析する方法および物質に関し、かつ疾患または病態の診断および処置での多型配列の使用に関する。
（発明の背景技術）
核酸配列の配列多型性に基づく解析は、個々の同一性および関連性を測定するすでに既知の方法を増強させるか、または取って代わり得る。アプローチは、関連する個体間の核酸配列の変化に一般に基づく。この解析は、様々な遺伝的用途、診断的用途、および法医学的用途で広く用いられてきた。例えば、多型性解析は、同一性および親子解析、および遺伝子マッピング研究で用いられる。
かかるタイプの１つの変異は、制限断片長多型（ＲＥＬＰ）である。ＲＦＬＰは、第２の核酸と比べて第１の核酸の制限酵素エンドヌクレアーゼの認識配列を生成または欠損しうる。変異の結果は、２つの核酸の制限酵素生成ＤＮＡフラグメントの長さの相対的な変化である。
他の多型性は、タンデム反復数（ＶＮＴＲ）配列としても言及される短いタンデム反復（ＳＴＲ）配列の形をとる。ＳＴＲ配列は、第１の個体由来の核酸には存在するが、対応する遺伝子座の第２の関連個体由来の核酸には存在しない２、３または４ヌクレオチド配列のタンデム反復を典型的に含む。
他の多型性は、個体間の一塩基多型（ＳＮＰ）と呼ばれる、一塩基変異の形をとる。ＳＮＰはある場合「ｃＳＮＰ」として言及され、ＳＮＰを含有するヌクレオチド配列がｃＤＮＡに源を発することを表すことができる。
ＳＮＰは、様々な方法で生じ得る。一塩基多型は、多型部位でのあるヌクレオチドから別のものへの置換により生じ得る。置換は、トランジションおよびトランスバージョンであり得る。トランジションは、別のヌクレオチドによるあるプリンヌクレオチド、または別のピリミジンによるあるピリミジンの置換である。トランスバージョンは、ピリミジンによるプリンの置換またはその逆である。
一塩基多型はまた、参考対立遺伝子と比べてヌクレオチドの欠損またはヌクレオチドの挿入から生じ得る。従って、多型部位は、ある対立遺伝子が別の対立遺伝子の一塩基に関するギャップを生じる部位である。あるＳＮＰは遺伝子内または遺伝子の近くで生じる。かかるクラスの１つは、ポリペプチド産物をコード化する遺伝子領域で起こるＳＮＰを含む。該ＳＮＰは、ポリペプチド産物のアミノ酸配列の変化を生じ得るし、かつ欠損変異体タンパク質または他の変異体タンパク質の発現を生じ得る。かかる変異体産物はある場合、病態、例えば遺伝性疾病を生じ得る。コード配列内の多型性が遺伝性疾病を生じる遺伝子の実施例は、鎌状赤血球貧血および嚢胞性線維症を含む。他のＳＮＰはポリペプチド産物の変化を生じない。もちろん、ＳＮＰはまた遺伝子の非コード領域で生じ得る。
ＳＮＰは、高頻度で生じる傾向があり、かつゲノムを通じて均一に間隔を空けられる。ＳＮＰの頻度および均一性は、かかる多型性が該遺伝子座の非常に近くで見つけられるより高い確率を意味する。
ＳＮＰを用いて、特定の医薬品での治療に最も適した患者を同定し得る（これはしばしば「薬理遺伝学」として言及される）。薬理遺伝学はまた、薬の選択方法をアシストするための医薬研究において用いられ得る。多型性はまた、ヒト遺伝子のマッピングにおいて用いられ、かつ疾病の遺伝的成分を解明するために用いられ得る。
（発明の要約）
本発明は、新規ポリペプチドをコード化する核酸配列の発見に一部基づく。新規核酸およびポリペプチド、ならびに誘導体、相同体、類似体、およびそれらのフラグメントは、ＮＯＶ１またはＳＮＰＸ（ＳＮＰＸは、ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、ＳＮＰ３、ＳＮＰ４、ＳＮＰ５、ＳＮＰ６またはＳＮＰ７のいずれかに言及する）核酸またはポリペプチド配列として以下で名付けられる。
ある態様において、本発明は、配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、または１７で開示される核酸に同一性を有する核酸配列を含むＮＯＶ１またはＳＮＰＸポリペプチドをコード化する単離ＮＯＶ１核酸分子またはＳＮＰＸ核酸分子を提供する。ある実施態様において、ＮＯＶ１核酸分子またはＳＮＰＸ核酸分子は、ＮＯＶ１核酸配列またはＳＮＰＸ核酸配列のタンパク質コード配列を含む核酸分子に相補的な核酸配列に厳密な条件下でハイブリダイズする。本発明はまた、ＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチド、またはフラグメント、相同体、類似体またはそれらの誘導体をコード化する単離核酸を含む。例えば、核酸は配列番号：２、４、８、１０、１２、１４、１６、または１８のアミノ酸配列を含むポリペプチドに少なくとも９５％同一なポリペプチドをコード化し得る。例えば、核酸は、配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、または１７のいずれかの核酸配列を含むゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡ分子であり得る。ある実施態様において、核酸およびポリペプチドは天然に存在する。
本発明においてまた、例えば、ＮＯＶ１核酸またはＳＮＰＸ核酸（例えば、配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、または１７）の少なくとも６連続ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、または該オリゴヌクレオチドの相補体を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。ある実施態様において、ＮＯＶ１ポリペプチドおよびＳＮＰＸポリペプチドは、ヒトＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドのアミノ酸配列に実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、ＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチド、またはフラグメント、相同体、類似体またはそれらの誘導体に免疫選択的に結合する抗体を特色とする。抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体であり得る。ある実施態様において、抗体に対するポリペプチドの結合の解離定数は、１×１０−９Ｍ未満である。別の実施態様において、抗体はポリペプチドの活性を中和し得る。
別の態様において、本発明は治療的または予防的に効果のある量の治療および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を含む。治療は、例えば、ＮＯＶ１核酸またはＳＮＰＸ核酸、ＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチド、またはＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドに特異的抗体であり得る。さらなる態様において、本発明は１またはそれ以上の容器内の治療的または予防的に効果のある量の該医薬組成物を含む。
さらなる態様において、本発明は、ＤＮＡによりコード化されるＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドの発現を可能とする条件下でのＮＯＶ１核酸またはＳＮＰＸ核酸を含む細胞の培養によるポリペプチド産生方法を含む。必要なら、ＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドは、次いで回収される。本発明はまた、ポリペプチドを含むキットを含む。
別の態様において、本発明は、試料中のＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドの存在を検出する方法を含む。該方法において、試料を、ポリペプチドと化合物との複合体の形成を可能とする条件下でポリペプチドに選択的に結合する化合物と接触させる。複合体はもし存在するなら検出され、それにより試料内のＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドを同定する。
本発明はまた、ＮＯＶ１またはＳＮＰＸの発現に基付く特異的細胞タイプまたは組織タイプを同定するための方法を含む。好ましい実施態様において、細胞は細菌、哺乳類、昆虫または酵母細胞である。本発明はまた、ＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドを産生する方法を含み、該方法はポリペプチドの発現を導く条件下での細胞培養を含み、ここで該細胞は単離ＮＯＶ１またはＳＮＰＸ核酸分子を有するベクターを含む。
本発明においてまた、ＮＯＶ１核酸プローブまたはプライマーを有する試料との接触、および核酸プローブまたはプライマーが試料中のＮＯＶ１核酸分子またはＳＮＰＸ核酸分子に結合するか否かの検出による試料中のＮＯＶ１核酸分子またはＳＮＰＸ核酸分子の存在を検出する方法が含まれる。
さらなる態様において、本発明は、該ポリペプチドの活性を調節するのに十分な量でＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドに結合する化合物とＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドを含む細胞試料を接触させることにより、ＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドの活性を調節する方法を提供する。化合物は、本明細書においてさらに開示される様に、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、模倣ペプチド分子、糖分子、脂質分子または他の有機分子（炭素含有）または無機分子のような低分子であり得る。
また、発明の範囲内には、例えば、発生疾病、ＭＨＣ ＩＩおよびＩＩＩ疾病（免疫疾病）；味覚および嗅覚検出能疾患；シグナル伝達経路の疾患；光受容に関するものを含む網膜疾病；細胞成長速度の疾患；細胞形の疾患；感染性疾病；細菌、真菌、原生動物およびウイルス感染（特に、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２により引き起こされる感染）；癌（新生物；腺腫；リンパ腫；前立腺癌；子宮癌を含むがこれに制限されない）；癌関連悪液質；過食症；喘息；パーキンソン病；急性心不全；狭心症；心筋梗塞；免疫疾患；自己免疫疾病；免疫不全；移植；移植；全身性エリテマトーデス；強皮症；ＩｇＡ腎症；心筋症；アテローム性動脈硬化症；動脈硬化症；先天性心臓欠陥；虚血；大動脈弁狭窄；心房中隔欠損症（ＡＳＤ）；房室管（Ａ−Ｖ）型欠損；動脈管；肺動脈弁狭窄；大動脈弁下部狭窄；心房中隔欠損（ＶＳＤ）；弁疾患；強皮症；不妊症；成長および生殖性疾患；炎症性腸疾患；移植片対宿主病；甲状腺機能亢進症；慢性炎症；感染性ショック；単球性白血病；大腸炎；敗血症；悪液質；関節リウマチ；慢性骨髄性白血病；喘息；乾癬；造血性疾患および／または同様の病態および疾患を含む疾病または症候群の処置または予防のための薬物の製造における治療法の使用である。
治療法は、例えば、ＮＯＶ１核酸またはＳＮＰＸ核酸、ＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチド、またはＮＯＶ１特異的抗体またはＳＮＰＸ特異的抗体、または生物学的に活性な誘導体またはそららのフラグメントであり得る。ポリペプチドは、本発明に特異的な抗体を産生する免疫原、およびワクチンとして用いられ得る。それらを用いて、潜在的作用化合物および拮抗化合物をスクリーニングし得る。例えば、ＮＯＶ１またはＳＮＰＸをコード化するｃＤＮＡは遺伝子療法で有用であり、かつＮＯＶ１またはＳＮＰＸは、それらを必要とする対象に投与される場合有用であり得る。実施例を制限することなく、本発明の組成物は、上で開示された疾病および疾病および／または他の病態および類似の疾患に罹患する患者の処置で有効である。
本発明はまた、ＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドの存在または量を測定する方法を含み、該方法は：（ａ）該試料を用意すること；（ｂ）該試料をポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体に導入すること；および（ｃ）該ポリペプチドに結合する抗体の存在または量を測定すること、それにより該試料中のポリペプチドの存在または量を測定することを含む。本発明はまた、第１の哺乳類対象中のＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドの発現の変化レベルと関連する疾患の存在または素因を測定する方法を提供し、該方法は：（ａ）第１の哺乳類対象由来の試料中のポリペプチドの発現レベルを測定すること；および（ｂ）ステップ（ａ）の試料中の該ポリペプチドの発現を、該疾患を有さないまたは素因がないと知られた第２の哺乳類対象由来の対照試料中に存在するポリペプチドの発現と比較することを含み、ここで対照試料と比較して第１の対象中のポリペプチドの発現のレベルの変化は該疾病の存在または素因を示す。
本発明は、例えば、上で開示された疾病および疾患および／または他の病態および類似の疾患を含む疾患または症候群のモジュレーターをスクリーニングする方法をさらに含む。方法は、試験化合物をＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドと接触させること、および試験化合物がＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドに結合するか否かを決定することを含む。ＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドへの試験化合物の結合は、試験化合物が上述の疾患または症候群に対する活性、または潜在活性または素因のモジュレーターであることを示す。
また、本発明の範囲内には、上で開示された疾病および疾患および／または他の病態および類似の疾患を含む疾患または症候群に対する活性、または潜在活性または素因のモジュレーターを、上述の疾患または症候群に対して増加リスクのある被検動物への試験化合物の投与によりスクリーニングする方法がある。被検動物は、ＮＯＶ１核酸またはＳＮＰＸ核酸によりコード化される組換えポリペプチドを発現する。ＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドの発現または活性は、ＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドを組変え発現するが、疾患または症候群に対して増加リスクのない対照動物中のタンパク質の発現または活性であるとして被検動物で続いて測定される。次に、被検動物および対象動物の両方のＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドの発現を比較する。対照動物と比べて被検動物中のＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドの活性の変化は、試験化合物が疾患または症候群の潜在活性のモジュレーターであることを示す。
別の態様において、本発明はまた、第１の哺乳類対象中のＮＯＶ１核酸分子またはＳＮＰＸ核酸分子の発現の変化レベルと関連する疾病の存在または素因を測定する方法を含み、該方法は：（ａ）第１の哺乳類対象由来の試料中の核酸の発現レベルを測定すること；および（ｂ）ステップ（ａ）の試料中の該核酸の発現のレベルを、疾病を有さないまたは素因のないことが知られている第２の哺乳類対象由来の対照試料に存在する核酸の発現のレベルと比較すること；ここで、対照試料と比較して第１の対象中の核酸の発現のレベルの変化は、疾病の存在または素因を示す。
本発明はまた、ＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドの活性を調節する方法を提供し、該方法は、ＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドを発現する細胞試料を、ポリペプチドの活性を調節するのに十分な量で該ポリペプチドに結合する化合物と接触させることを含む。
別の態様において、本発明は、ＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドと関連する病態を処置または予防する方法を提供し、該方法は、ＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドを、かかる処置または予防が望まれる対象に対象の病態を処置または予防するのに十分な量で投与することを含む。本発明はまた、哺乳類の病態を処置する方法を含み、該方法は、哺乳類に病態を改善するのに十分な量でポリペプチドまたは該ポリペプチドに対する抗体を投与することを含む。ここで、該ポリペプチドは配列番号：２、４、８、１０、１２、１４、１６、または１８のアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチドに少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
本発明はまた、ＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドに結合する物資を同定する方法を提供し、該方法は：（ａ）該ポリペプチドを該物質に導入すること；および（ｂ）該物質が該ポリペプチドに結合するか否かを決定することを含む。さらに別の態様において、本発明は、対象（例えば、ヒト対象）中のＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチド、ＮＯＶ１核酸またはＳＮＰＸ核酸、または両方の変化レベルと関連する疾病の存在または素因を測定する方法を含む。方法は、対象由来の試験試料中のＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドの量を測定すること、および試験試料中のポリペプチドの量を対照試料中に存在するＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドの量と比較することを含む。対照試料と比較したときの試験試料中のＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドのレベルの変化は、対象中の疾患の存在または素因を示す。好ましくは、素因は例えば、上で開示された疾病および疾患、および／または他の病態および類似の疾患を含む。また、本発明の新たなポリペプチドの発現レベルを方法で用いて、様々な癌をスクリーニングし得るし、ならびに癌のステージも決定し得る。
さらなる態様において、本発明は、対象にＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチド、ＮＯＶ１核酸またはＳＮＰＸ核酸、または対象（例えば、ヒト対象）に対するＮＯＶ１特異的またはＳＮＰＸ特異的抗体を、病状を改善または予防するのに十分な量で投与することにより哺乳類中の疾病と関連する病状を予防する方法を含む。好ましい実施態様において、疾患は、例えば、上で開示された疾病および疾患、および／または他の病態および類似の疾患を含む。
さらに別の態様において、本発明は、当分野の通常に用いられる多くの技術のいずれか１つにより本発明の細胞受容体または下流エフェクターを同定するための方法において用いられ得る。これらは、ツーハイブリッドシステム、アフィニティー精製、抗体または他の特異的相互作用分子との共沈を含むが、これらに制限されない。ＮＯＶ１核酸またはＳＮＰＸ核酸、またはＮＯＶ１ポリペプチドまたはＳＮＰＸポリペプチドは、治療法または診断方法の使用のため、ＮＯＶ１物質またはＳＮＰＸ物質に免疫特異的に結合する抗体の生成でさらに有用である。該ＮＯＶ１抗体またはＳＮＰＸ抗体は、当分野で既知の方法により疎水性チャート由来の予測を用いて生成され得る。開示されたＮＯＶ１タンパク質またはＳＮＰＸタンパク質は、それぞれが免疫原として用いられ得る多数の親水性領域を有する。該ＮＯＶ１タンパク質またはＳＮＰＸタンパク質は、疾病の病態の理解および様々な疾患の新たな薬剤標的の発生で手助けとなる、様々なヒト疾患の機能的解析のアッセイシステムで用いられ得る。
本明細書において同定されたＮＯＶ１核酸またはＳＮＰＸ核酸、およびＮＯＶ１タンパク質またはＳＮＰＸタンパク質は、上で示された様に様々な病態および疾患に関係するがこれらに制限されない、潜在的治療法の応用で有用であり得る。本発明の潜在的治療法の応用は：タンパク質療法、低分子薬剤の標的、抗体標的（治療、診断、薬剤標的／細胞毒性抗体）、診断マーカーおよび／または予後マーカー、遺伝子療法（遺伝子輸送／遺伝子切除）、研究ツール、本明細書において定義されたものを含むがこれらに制限されない全組織タイプおよび全細胞タイプのインビボおよびインビトロでの組織再生を含むが、これらに制限されない。本発明はまた、ＮＯＶ１核酸分子またはＳＮＰＸ核酸分子を含むベクターを含む。好ましい実施態様において、ベクターは該核酸分子に作用可能に結合するプロモーターをさらに含む。
本発明はまた、ヒトＤＮＡの領域中の新規一塩基多型（ＳＮＰ）の発見に一部基づく。または、ある態様において、本発明は、本明細書において記載された１またはそれ以上のＳＮＰを含む単離ポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、例えば、表４〜１０（配列番号：３、７、９、１１、１３、１５、または１７）で示される１またはそれ以上の多型配列および多型配列を含むヌクレオチド、または多型部位を含みさえすれば多型配列のフラグメントであり得る。ポリヌクレオチドは、１またはそれ以上の配列に相補的な配列を含むヌクレオチド配列、またはフラグメントが多型配列中の多型部位を含むという条件で相補的ヌクレオチド配列のフラグメントを代わりに含有し得る。ＳＮＰ１は配列番号：３（ここで、１２６位置のヌクレオチドはＡ、ＧまたはＴである。）により与えられる。ＳＮＰ２は配列番号：７（ここで、４８３位置のヌクレオチドはＡ、ＣまたはＴである。）により与えられる。ＳＮＰ３は配列番号：９（ここで、３７４位置のヌクレオチドはＡ、ＣまたはＧである。）により与えられる。ＳＮＰ４は配列番号：１１（ここで、３６７位置のヌクレオチドはＡ、ＣまたはＧである。）により与えられる。ＳＮＰ５は配列番号：１３（ここで、２８１位置のヌクレオチドはＡ、ＣまたはＴである。）により与えられる。ＳＮＰ６は配列番号：１５（ここで、１５５位置のヌクレオチドはＣ、ＧまたはＴである。）により与えられる。ＳＮＰ７は配列番号：１７（ここで、１３０位置のヌクレオチドはＣ、ＧまたはＴである。）により与えられる。
本発明はまた、参考配列（配列番号：１または５）の多型部位でのヌクレオチドを測定することにより少なくとも１つのＳＮＰの非存在または存在を検出する方法を提供する。
本発明はまた、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、または１７の５’非翻訳領域を含む単離核酸を提供する。ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得るし、かつ約１０〜約１００ヌクレオチドの間、例えば、長さ１０〜９０、１５〜７５、２０〜６０、または２５〜５０ヌクレオチドであり得る。
ある実施態様において、多型配列中の多型部位は、多型配列の表４〜１０で記載されるヌクレオチド（例えば、塩基変更）以外のヌクレオチドを含む。
他の実施態様において、多型部位の相補体は、多型配列の相補体の表４〜１０で記載されるヌクレオチドの相補体、例えば、多型配列の表４〜１０で記載されるヌクレオチドの相補体以外のヌクレオチドを含む。ある実施態様において、多型配列は、本明細書において開示されるタンパク質ファミリーの１つと関係するポリペプチドと関連する。
別の態様において、本発明は、多型部位を含有する第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離された対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを提供する。第１のポリヌクレオチドは、例えば、１またはそれ以上の多型配列を含むヌクレオチド配列であり得る。または、第１のポリヌクレオチドは、フラグメントが多型配列に多型部位を含むという条件で多型配列のフラグメントであるヌクレオチド配列、または１またはそれ以上の多型配列に相補的な配列を含む相補的ヌクレオチド配列であり得る。加えて、第１のポリヌクレオチドは、フラグメントが多型配列中の多型部位を含むという条件で相補的配列のフラグメントであるヌクレオチド配列を含む。
ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは厳密な条件下で第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズしない。第２のポリヌクレオチドは、例えば、（ａ）多型配列が多型配列の表４〜１０に記載されるヌクレオチドを含む、１またはそれ以上の多型配列を含むヌクレオチド配列；（ｂ）多型配列のいずれかのフラグメントであるヌクレオチド配列；（ｃ）多型配列が表４〜１０に記載されるヌクレオチドの相補体を含む、１またはそれ以上の多型配列に相補的な配列を含む相補的ヌクレオチド配列；および（ｄ）フラグメントが多型配列中の多型部位を含むという条件で、相補的配列のフラグメントであるヌクレオチド配列、であり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、長さ約１０〜約１００塩基の間であり得る。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは長さ約１０〜９０塩基、１５から７５塩基、２０〜６０塩基、または約２５〜５０塩基の間である。
本発明はまた、核酸中の多型部位を検出する方法を提供する。方法は、配列番号：３、７、９、１１、１３、１５、および１７からなる群から選択される多型配列、または該相補体にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと核酸を接触させることを含む。方法はまた、核酸およびオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするか否かを決定することを含む。核酸配列へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、核酸中の多型部位の存在を示す。
他の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、多型配列が多型配列の表４〜１０に列挙されるヌクレオチドを含む場合、または多型配列の相補体が多型配列の表４〜１０に列挙されるヌクレオチドの相補体を含む場合、多型配列にハイブリダイズしない。オリゴヌクレオチドは、例えば、長さ約１０〜約１００塩基の間であり得る。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、長さ約１０〜９０塩基、１５〜７５塩基、２０〜６０塩基、または約２５〜５０塩基の間である。
ある実施態様において、オリゴヌクレオチドにより同定された多型配列は、本明細書において開示されるタンパク質ファミリーの１つに関係するポリペプチドと関連する。例えば、核酸は、ＧＰＣＲまたはＩＬ１ＲＮタンパクに関係する関連ポリペプチドであり得る。
別の態様において、方法は、配列多型性がヒトのような対象に存在するかを決定することを含む。方法は、対象由来の核酸を用意すること、および配列番号：３、７、９、１１、１３、１５、および１７からなる群から選択される多型配列、または該相補体にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと核酸を接触させることを含む。核酸とオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは続いて測定される。核酸配列に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、該対象中の多型性の存在を示す。
さらなる態様において、本発明は第１の核酸と第２の核酸との関係を測定する方法を提供する。方法は、第１の核酸および第２の核酸を用意すること、および第１の核酸および第２の核酸を、配列番号：３、７、９、１１、１３、１５、および１７からなる群から選択される多型配列、または該相補体にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはプライマーと接触させることを含む。好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは約１７〜３５ヌクレオチドである。方法はまた、第１の核酸および第２の核酸がオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするか否かを測定すること、およびオリゴヌクレオチドへの第１の核酸と第２の核酸のハイブリダイゼーションを比較することを含む。核酸に対する第１の核酸および第２の核酸のハイブリダイゼーションは、第１の対象と第２の対象が関係することを示す。
ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、多型配列が多型配列の表４〜１０で列挙されるヌクレオチドを含む場合、または多型配列の相補体が多型配列の表４〜１０に列挙されるヌクレオチドの相補体を含む場合、多型配列にハイブリダイズしない。オリゴヌクレオチドは、例えば、長さ約１０〜約１００塩基の間である。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは長さ約１０〜９０塩基、１５〜７５塩基、２０〜６０塩基、または約２５〜５０塩基の間である。
方法は、様々な応用で用いられ得る。例えば、第１の核酸は事件現場で集められた身体的証拠から単離され得るし、かつ第２の核酸は犯罪を行ったことを疑われる人から得られ得る。該方法を用いた２つの核酸の一致は、身体的証拠が該人由来であるか否かを確証し得る。別の実施例において、第１の試料は、子供の父親であることが疑われるヒト男性由来であり得るし、かつ第２の試料は子供由来であり得る。記載の方法を用いた一致の確証は、男性が子供の父親であるか否かを確証し得る。
別の態様において、本発明は、１またはそれ以上のアミノ酸残基で多型部位を含む単離ポリペプチドを提供し、ここでタンパク質は、配列番号：３、７、９、１１、１３、１５、および１７の多型配列または該相補体のうちの１つを含むポリヌクレオチドによりコード化される。
ある実施態様において、ポリペプチドは、アミノ酸配列が多型性部位を除いて多型タンパク質のアミノ酸配列に同一である野生型タンパク質であるとしてオープンリーディングフレームで翻訳される。
ある実施態様において、多型配列または該相補体によりコード化されるポリペプチドは、多型配列の表４〜１０に記載されるヌクレオチドを含むし、または相補体は表４〜１０に記載されるヌクレオチドの相補体を含む。
本発明はまた、配列番号３、７、９、１１、１３、１５、および１７の多型配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド、または該相補体によりコード化されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコード化されるポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。多型配列は多型配列の表４〜１０に列挙されるヌクレオチド以外のヌクレオチドを含み、あるいは相補体は表４〜１０に列挙されるヌクレオチドの相補体以外のヌクレオチドを含む。
ある実施態様において、抗体は、多型配列の表４〜１０に記載されるヌクレオチドを含む多型配列によりコード化されるポリペプチドに特異的に結合する。
他の実施態様において、抗体は、多型配列の表４〜１０に記載されるヌクレオチドを含む多型配列によりコード化されるポリペプチドに特異的に結合しない。
本発明は、対象中の１またはそれ以上のアミノ酸残基多型性を有するポリペプチドの存在を検出する方法をさらに提供する。方法は、対象由来のタンパク質試料を用意すること、および抗体と抗原との複合体の形成を可能とする条件下で上述の抗体と試料を接触させることを含む。抗体と抗原との複合体は続いて検出される。複合体の存在は、アミノ酸多型性を有するポリペプチドの存在を示す。
本発明はまた、対象、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ウシ、ブタ、ヤギ、またはウサギの配列多型性の存在だとされる病態に罹患する対象、リスクのある対象、または疑われる対象を処置する方法を提供する。方法は、配列番号：３、７、９、１１、１３、１５、および１７からなる群から選択される多型配列、または該相補体を含む第１の核酸の異常発現と関連する病態に罹患する対象を用意すること、および効果的量の治療物質を対象に投与することにより処置することを含む。異常発現は、遺伝子の発現、例えば、野生型の対照物に関して変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化する遺伝子の発現の質的変化を含み得る。質的に異なるポリペプチドは、野生型ポリペプチドのアミノ酸配列と比べてより短いポリペプチド、より長いポリペプチド、または変化ポリペプチドを含み得る。異常発現はまた、遺伝子の発現の質的変化を含む。遺伝子の発現の質的変化の実施例は、野生型対照物と比べてより低いレベルまたはより高いレベルの遺伝子発現、または時間的または組織特異的な遺伝子発現パターンの変化を含む。最終的に、異常発現はまた、遺伝子発現の質的変化と量的変化の組合せを含む。
治療物質は、例えば、第２の核酸が野生型対立遺伝子に存在するヌクレオチドを含むという条件で多型配列を含む第２の核酸を、含み得る。ある実施態様において、第２の核酸配列は、多型配列の表４〜１０に記載されるヌクレオチドを含む多型配列を含む。
または、治療物質は、配列番号：３、７、９、１１、１３、１５、および１７からなる群から選択される多型配列を含むポリヌクレオチドにより、または多型配列が多型配列の表４〜１０に記載されるヌクレオチドを含むという条件で配列番号３、７、９、１１、１３、１５、および１７の多型配列のいずれか１つに相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドにより、コード化されるポリペプチドであり得る。
治療物質は、本明細書で記載される様に抗体、または配列番号：３、７、９、１１、１３、１５、および１７からなる群から選択される多型配列を含むオリゴヌクレオチド、または多型配列が多型配列についての表４〜１０に記載されるヌクレオチドを含むという条件で配列番号：３、７、９、１１、１３、１５、および１７の多型配列のいずれか１つに相補的であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む。
別の態様において、本発明は、内部に包含された多型部位で第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズする１またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を提供する。第１のポリヌクレオチドは、例えば、１またはそれ以上の多型配列（配列番号：３、７、９、１１、１３、１５、および１７）を含むヌクレオチド配列；フラグメントが多型配列中の多型部位を含むという条件の任意のヌクレオチド配列のフラグメントであるヌクレオチド配列；１またはそれ以上の多型配列（配列番号：３、７、９、１１、１３、１５、および１７）に相補的な配列を含む相補的ヌクレオチド配列；またはフラグメントが多型配列中の多型部位を含むという条件の相補的配列のフラグメントであるヌクレオチド配列であり得る。
好ましい実施態様において、配列は１０；１００；１，０００；１０，０００；１００，０００、またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含む。
本発明はまた、本明細書において記載される１またはそれ以上の核酸を含むキットを提供する。キットは、例えば、本明細書において記載される１またはそれ以上のＳＮＰを含むポリヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドは、例えば、表４〜１０（配列番号：３、７、９、１１、１３、１５、および１７）に示される１またはそれ以上の多型配列を含み、かつ多型配列、または多型部位を含みさえすれば多型配列のフラグメントを含むヌクレオチド配列であり得る。代わりにポリヌクレオチドは、１またはそれ以上の配列（配列番号：３、７、９、１１、１３、１５、および１７）に相補的な配列を含むヌクレオチド配列、またはフラグメントが多型配列中に多型部位を含むという条件で相補的ヌクレオチド配列のフラグメントを含有し得る。
本発明は、多型部位を含有する第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、単離された対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを提供する。第１のポリヌクレオチドは、例えば、１またはそれ以上の多型配列（配列番号：３、７、９、１１、１３、１５、および１７）を含むヌクレオチド配列であり得る。代わりに、第１のポリヌクレオチドは、フラグメントが多型配列中の多型部位を含むという条件で多型配列のフラグメントであるヌクレオチド配列、または１またはそれ以上の多型配列（配列番号：３、７、９、１１、１３、１５、および１７）に相補的な配列を含む相補的ヌクレオチド配列であり得る。加えて第１のポリヌクレオチドは、フラグメントが多型配列中の多型部位を含むという条件で、相補的配列のフラグメントであるヌクレオチド配列を含み得る。
さらなる態様において、本発明は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、または１７の多型性と関連する疾病または病態の存在または素因を測定する方法を含み、該方法は：（ａ）多型性の存在について哺乳類対象由来の生物学的試料を試験すること；および（ｂ）多型対立遺伝子のコピー数を測定すること、ここで、多型性の対立遺伝子のコピー数が該疾病または病態の存在または素因を示す、ことを含む。
本明細書において用いられるように、コピー数は変異体対立遺伝子の数に言及する。それは、ＳＮＰ変異を生じる対立遺伝子の数である。例えば、対象は、２つの同一野生型対立遺伝子（ホモ接合体）、１つの野生型対立遺伝子および１つの変異体ＳＮＰ対立遺伝子（ヘテロ接合体）、または２つの変異体ＳＮＰ対立遺伝子（ホモ接合体）を有し得る。
本発明はまた、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、または１７の多型性と関連する遺伝的リスクの変化因子の輸送状態を同定する方法を含み、該方法は：（ａ）多型性の存在について哺乳類対象由来の生物学的試料を試験すること；および（ｂ）多型対立遺伝子のコピー数を測定すること、ここで多型対立遺伝子のコピー数は輸送状態を示すこと、を含む。
好ましい実施態様において、多型対立遺伝子は、心電図ＳＴセグメントの上昇または心電図ＳＴセグメントの増加リスクの表示である。別の実施態様において、疾病または病態は、急性疾患および慢性疾患を含む心臓疾病である。本発明のさらなる態様において、心臓疾患は、心筋梗塞、狭心症、うっ血性心不全、心筋症、虚血、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、および心臓血管および他の器官系で生じる合併症を含む。
さらなる実施態様において、遺伝的リスク因子は心電図ＳＴセグメントの上昇または心電図ＳＴセグメントの増加リスクからなる。
別の態様において、本発明は、対象中の配列多型性の存在に起因する病態に罹患する対象、リスクのある対象、または疑われる対象を処置する方法を提供し、該方法は：ａ）配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、および１７からなる群から選択される多型配列または該相補体を含む第１の核酸の異常発現と関連する病態に罹患する対象を用意すること；およびｂ）第２の核酸が野生型対立遺伝子に存在するヌクレオチドを含むという条件で、多型配列を含む第１の核酸の効果的な薬用量を対象に投与すること、それにより該対象を処置することを含む。
本発明はまた、対象中の配列多型性の存在に起因する病態に罹患する、リスクのある対象、または疑われる対象を処置する方法を含み、該方法は：ａ）配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、および１７からなる群から選択される多型配列または該相補体を含む核酸の異常発現と関連する病態に罹患する対象、リスクのある対象、または疑われる対象を用意すること、およびｂ）配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、および１７からなる群から選択される多型配列を含むオリゴヌクレオチドの効果的な量、または配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、および１７の多型配列のいずれか１つに相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを対象に投与すること、それにより該対象を処置することを含む。
本発明はまた、該核酸の対応多型配列または相補体と比較して、参考配列（すなわち、野生型配列）により選択的にハイブリダイズする長さ１０〜１００ヌクレオチドの単離核酸分子を提供する。別の実施態様において、本発明は対応参考配列（すなわち、野生型配列）または該相補体と比較して、多型配列により選択的にハイブリダイズする長さ１０〜１００ヌクレオチドの単離核酸分子を提供する。上述された核酸対は、表２において与えられ、かつ配列番号：１および３、配列番号：５および７、配列番号：５および９、配列番号：５および１１、配列番号：５および１３、配列番号：５および１５、および配列番号：５および１７、またはその相補体から成る。
本発明のさらなる態様において、参考（野生型）配列または本発明の多型配列のいずれかに選択的にハイブリダイズする長さ１０〜１００ヌクレオチドの核酸分子は、多型部位ヌクレオチドを含む５連続ヌクレオチド、および多型部位の少なくとも２ヌクレオチド上流および多型部位の少なくとも２ヌクレオチド下流を含む。
本発明の別の実施態様は、ポリメラーゼと１ペアーのオリゴヌクレオチドプライマーを含む増幅システムを含む。増幅システムの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、および１７からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＳＮＰXを増幅することができる。ある実施態様において、増幅はポリメラーゼ連鎖反応法（「ＰＣＲ」）で生じる。
さらなる実施態様は、少なくとも１ペアーのオリゴヌクレオチドプライマーを含むキットを含む。少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、および１７からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズする。キットはまた、ポリヌクレオチドの増幅、合成、またはハイブリダイゼーションに用いるバッファーおよびポリメラーゼのような酵素を含む。
本発明のある実施態様は、試料中のＳＮＰＸ核酸分子を検出する方法を提供する。方法は、核酸分子の試料を用意すること、および試料中の相同性標的核酸分子への第１のプライマー対および第２のプライマー対のアニーリングを可能とする条件下で、試料を第１のプライマー対および第２のプライマー対の少なくとも１つのメンバーと接触させること、それにより第１および第２のアニーリングしたプライマーと標的核酸分子との複合体を形成することを含む。第１および第２のアニーリング標的核酸分子との複合体はポリメラーゼで伸長され、第１および第２の伸長プライマー配列を形成し、かつ第１および第２の伸長プライマー配列が同定され、それによりＳＮＰＸ核酸分子が同定される。
別の実施態様は、対象中のＳＮＰＸと関連する疾病または状態と関連する存在または感受性を診断する方法を提供する。方法は、対象由来の核酸である試料を用意すること、相同性標的核酸分子に対するプライマー対メンバーのアニーリングを可能とする条件下で、試料を少なくとも１メンバーのプライマー対と接触させること、それにより第１のアニーリングしたプライマーと標的核酸分子との複合体を形成すること、ポリメラーゼで第１のアニーリング標的核酸分子との複合体を伸長させて第１の伸長プライマー配列を形成させること、および伸長プライマー配列を同定すること、ここで伸長プライマー配列の同定は、対象がＳＮＰＸと関連する疾病または状態を有すること、または感受性があることを示すことを含む。
特に定義されてなければ、本明細書において用いられる全技術的用語および科学的用語は、本発明が属する当業者により普通に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において記載されたものと類似または同等の方法および物質は、本発明の実施または試験で用いられ得るが、適当な方法および材料は以下に記載する。本明細書において記載される全刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、全体として参考により取り込まれる。不一致の場合、定義を含む本明細書が支配する。加えて、物質、方法、および実施例は、説明のためのみであり、制限されることを意図しない。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求項から明らかである。
（発明の詳細な説明）
本発明は、新規ヌクレオチドおよびそれによりコード化されるポリペプチドを提供する。本発明において、新規核酸配列および該コード化ポリペプチドが含まれる。配列は集団的に「ＮＯＶ１核酸」または「ＮＯＶ１ポリヌクレオチド」として本明細書において言及され、かつ対応するコード化ポリペプチドは「ＮＯＶ１ポリペプチド」または「ＮＯＶ１タンパク質」として言及される。特に示されてなければ、「ＮＯＶ１」は、本明細書において開示される任意の新規配列に言及することを意味する。表１は、ＮＯＶ１核酸および該コード化ポリペプチドの概要を提供する。
表１：ＮＯＶポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列および対応する配列番号
Figure 2005511013
本発明はまた、転写された配列中のヒトＳＮＰ、すなわちｃＳＮＰを提供する。多くのＳＮＰは、既知の機能のポリペプチドと関係する遺伝子で同定された。必要なら、様々なポリペプチドと関連するＳＮＰが共に用いられ得る。例えば、ＳＮＰは、特定のタンパク質ファミリーに関係するか、または特定の機能に関与するポリペプチドをコード化する核酸からもたらされるか否かによりグループ化され得る。同様に、ＳＮＰは該遺伝子産物により働く機能により、グループ化され得る。かかる機能は、構造タンパク質、脂肪酸代謝、解糖、中間代謝、カルシウム代謝、プロテアーゼ、およびアミノ酸代謝等の代謝経路と関連するもの由来のタンパク質を含む。表２は、本発明のＳＮＰの概要を提供する。
表２．ＳＮＰポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列および対応する配列番号
Figure 2005511013
表２は、対立遺伝子配列に関する情報を提供する。配列の１つは参考配列を称し、かつ対応する第２の配列は多型部位で変異体ＳＮＰを含む。配列番号はまた、表２において相互参照される。翻訳アミノ酸配列に対応する配列番号の参考も与えられる。表２はまた、それぞれのｃＳＮＰについての説明情報を含む。ＳＮＰ核酸およびＳＮＰタンパク質のそれぞれについての配列データは、対応する参考配列と共に実施例２で示される。
本発明において開示されるＳＮＰは、公的に入手可能なｍＲＮＡライブラリー（Clontech）である遺伝的多種多様な供給源由来の多数の配列を整列させることにより検出した。一致配列と異なる変異塩基の様々な実施例を探すために特異的にデザインされたソフトウエアが製作され、配備された。高質の配列解読での一致と異なる２つの発生配列の最小基準を用いて、ＳＮＰを同定した。
本明細書に記載されるＳＮＰは、チップのＤＮＡ配列およびＳＮＰのハイブリダイゼーションを含む他の使用のための診断キットにおいて有用であり得る。特異的ＳＮＰは、該遺伝子と関連する疾患を診断および処置を決定するのに有用である。
Ａ）ＮＯＶ１およびＳＮＰ１
本発明は、ＧＰＣＲ様タンパク質をコード化する単離核酸分子である、ＣＧ５０３０３−０３（ＮＯＶ１）を提供する。Ｇタンパク質共役受容体（「ＧＰＣＲ」）は、多くの神経伝達物質およびホルモン受容体を有する７つの膜貫通型ドメイン構造を共有する受容体の大きなファミリーである。本発明はまた、Ｔ対立遺伝子が心電図ＳＴセグメントの増加リスク、そしてそれゆえ心臓血管および他の器官系での心筋梗塞および結果として生じる合併症の増加リスクの表示であるヌクレオチド多型性ＳＮＰ１３３７３９４６（ＳＮＰ１）を有するＣＧ５０３０３−０３の単離核酸を提供する。本発明はまた、遺伝的リスクの変化因子の担体であるか、または特定の疾病過程または関係する過程の変化リスクを有する個体、特に白人の民族性を同定する方法を提供する。方法は、個体由来の生物学的試料を得ること、およびヌクレオチド多型性について個体を試験すること、ここで、疾病のリスクはＴ対立遺伝子の量と共に増加し得ることを含む。
心筋梗塞は、疾病の罹患率および進行が環境と遺伝子相互作用の産物である、通常の遺伝的な複合体の形質である。ＳＴセグメントの増加リスクである心電図の所見は、心臓エリアへの動脈をブロックし、かつ心筋の全層が傷害されていることを示す。冠動脈は、アテローム性動脈硬化症の慢性過程においてプラークによる部分的梗塞を徐々に形成する。この状態は心筋の血液供給が仕事負荷を休止させると十分であるが虚血を生じ、仕事負荷が情緒ストレスまたは身体的ストレスのいずれかにより増加すると、不十分となる。部分的梗塞アテローム性動脈硬化症の冠動脈は、完全梗塞に突然なり得る。虚血は、傷害心筋細胞の休止の代謝要求が任意の側枝血流により満たされなければ、直ちに発生する。梗塞が傷害細胞の貯蔵グリコーゲンが大幅に使い尽くされる前に軽減されると、細胞は収縮を直ちに再開する。しかしながら、急性の場合、完全梗塞は心筋細胞のグリコーゲンが大幅に使い尽くされるまで続き、仮死状態になる。血流が回復した後でさえ、該細胞は貯蔵グリコーゲンを使い尽くすまで収縮を再開できない。完全梗塞が、心筋細胞のグリコーゲンが完全に使い尽くされるまでさらに持続すると、細胞はそれ自体を維持できなくなり、不可逆的に損傷され、そして壊死する。この臨床的な過程は、心発作または心筋梗塞（ＭＩ）と称される。
冠血流での潜在的な可逆的減少により引き起こされるＥＣＧ変化は、ＳＴセグメントのベースラインレベルがＴＰセグメントおよびＰＲセグメントのベースラインレベルから逸脱していると、「傷害」と典型的に称される。ＳＴセグメントのベースラインのシフトは、不十分な灌流が心筋細胞膜の透過性イオン流動を非正常にすると生じる。生じる傷害心筋と非傷害心筋間の心電図の潜在的な差は、傷害電流の定常流動を生じる。患者が本格的な心発作を患い続ける多くの場合、Ｑ波心筋梗塞として臨床的には言及される。ＳＴ上昇は、血管を再開させるための積極的処置（血栓溶解剤または血管形成）の良い指標である。しかしながらある場合、患者の状態は、重篤な状態が多少ある非Ｑ波心筋梗塞に陥る。非上昇ＳＴセグメントは、正常な心拍を示す。
Ｂ）ＳＮＰ２〜７
本発明は、ＩＬ１ＲＮタンパク質（GenBank受託番号Ｍ６３０９９）の多型配列（すなわち、新規変異体）である単離核酸分子に関する。ＩＬ−１受容体拮抗物質（短縮されたＩＬ−１ｒａまたはｓＩＬ−１ｒａ）である、ＩＬ１ＲＮは、ＩＬ−１の潜在的に有害なエフェクターの伸展を制限するＩＬ−１の天然に存在する阻害剤である（Dinarello, C.A. and R.C. Thompson (1991) Immunol. Today 12:404; Dinareool, C.A. and S.M. Wolff (1993) New Eng. J. Med. 328:106）。ＩＬ−１は、炎症および全体的免疫応答の臨床的に初期のメディエーターであり、慢性感染症、敗血症、および造血性欠陥となる病態の発生で重要な働きをする（Dinarello, C.A. (1991) Blood 77:1627)）。
ＩＬ１ＲＮは、単球性白血病の患者の尿において最初に同定された強力な炎症阻害剤である（Seckinger, P. et al. (1987) J. Immunol. 139:1546; Mazzei, G.J. et al. (1990) Eur. J. Immunol. 20:683）。ＩＬ−１ＲＮは、実験的に誘導された炎症および多くの疾病の自然経過においてインビボにおいて放出される（Fischer, E. et al. (1992) Blood 79:2196）。被検動物において、ＩＬ−１ＲＮでの事前処置は、リポ多糖誘導敗血症（Ohlsson, K. et al. (1990) Nature 348:550）またはＴＮＦα／ＩＬ−１組合せ注入（Everaerdt, B. et al. (1994) J. Immunol. 152:5041）から生じる死を予防し、かつ免疫複合体誘導大腸炎の発生を予防（Ferretti, M. et al. (1994) J. Clin. Invest. 94:449）するとわかっていた。ＩＬ−１ＲＮの相対的被存在はまた、ヒト炎症性腸疾病で関係してきた（Casini-Raggi, V. et al. (1995) J. Immunol. 154:2434）。ラットのＣＮＳにおいて、Ｌ−１βの脳室内注入は胃酸分泌を潜在的に阻害する。この阻害は、ＩＬ−１ＲＮの事前の脳室内注入により完全に逆になる（Saperas, E. and Y. Tache (1993) Life Sci. 52:785）。しかしながら、ヒトボランティアがグラム陰性内毒素を静脈内に投与されるある研究において、全身のＩＬ−１ＲＮは注入に対する血行性応答、免疫性応答、または代謝性応答に全く作用しない。しかしながら、それはボランティアにより経験された症状の重症度を軽減した（Van Zee, K.J. et al. (1995) J. Immunol. 154:1499）。臨床前の試験および臨床試験は、敗血症、悪質液、関節リウマチ、慢性骨髄性白血病、喘息、乾癬、炎症性大腸炎、および移植片対宿主病の処置でのＩＬ−１ＲＮの治療的使用を示した（Antin, J.H. et al. (1994) Blood 84:1342）。加えてマウスにおいて、ＩＬ−１ＲＮの注入でのタイプＩ ＩＬ−１Ｒのブロックは、発生、フィブロネクチン結合、または胚盤胞の遊走に逆に作用することなく、インビボにおいて母性子宮内膜へのマウス胚盤胞の結合と干渉した（Simon, C. et al. (1994) Endocrinology 134:521）。
一塩基多型配列（ＳＮＰ）
本発明のＳＮＰは、実施例２において示される。実施例２の表４〜１０は、本明細書において開示される多型配列の概要を提供する。表４〜１０のそれぞれにおいて、「ＳＮＰ」は、多型配列に組み込まれた多型部位である。多型部位は、野生型と多型対立遺伝子配列との間のヌクレオチド変異の位置である、一塩基により占められる。部位は普通は、対立遺伝子の相対的な高保存配列により前に置かれ、かつ後に続く（例えば、集団の１／１００または１／１０００メンバー未満が変化する配列）。従って、多型配列は１またはそれ以上の以下の配列を含み得る：（１）対応表において表されるヌクレオチドを多型配列中の多型部位で有する配列；または（２）表において表されるヌクレオチド以外のヌクレオチドを多型配列中の多型部位で有する配列。
参考多型対についてのヌクレオチド配列は実施例２において示される。それぞれのｃＳＮＰ記入事項は、野生型ヌクレオチド配列ならびに多型部位でＳＮＰを含む対応配列に関する情報を提供する。配列番号はまた、表２において相互参照される。配列番号に対する参考：翻訳アミノ酸配列の提供はまた、必要なら与えられる。
本発明はまた、該多型性を有する核酸配列を含むか、または検出することが可能な組成物、ならびにＳＮＰ１〜７を用いる方法を提供する。
ＳＮＰを有する個体の同定
本発明の多型対立遺伝子を有する個体は、当分野において良く知られている様々な技術を用いてＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質レベルのいずれかで検出され得る。同定および検出のストラテジーは、例えば、ＥＰ７３０，６６３、ＥＰ７１７，１１３、およびＰＣＴ ＵＳ９７／０２１０２において記載される。当該方法は、事前に特徴付けられた多型性を普通に利用する。それは、既に測定された部位に存在する多型型の位置および性質を遺伝子型同定することである。この情報の利用性は、プローブのセットが既知の多型型の特異的同定についてデザインされるのを可能とする。
以下に記載される多くの方法は、標的試料由来のＤＮＡの増幅を必要とする。このことは、例えばＰＣＲにより成し遂げられる。ＰＣＲ技術：Principles and Applications for DNA Amplification (ed. H.A. Erlich, Freeman Press, NY, NY, 1992)、ＰＣＲプロトコール：A Guide to Methods and Applications (eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, CA, 1990); Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19, 4967 (1991); Eckert et al., PCR Methods and Applications 1, 17 (1991); PCR (eds. McPherson et al., IRL Press, Oxford)；および米国特許番号４，６８３，２０２を一般に参照されたい。
用語「組換えタンパク質」または「組換え産生タンパク質」は、タンパク質を発現できるＤＮＡの内在性コピーを有さない天然でない細胞を用いて産生されるペプチドまたはタンパク質に言及する。特に、本明細書において用いられる様に、組換え産生タンパク質は、多型対立遺伝子の遺伝子産物、例えば、ヌクレオチド多型性の翻訳部位で変化するアミノ酸を含有する「多型タンパク質」に言及する。細胞は、それらが適当な核酸配列の導入により一般に変化されたため、該タンパク質を産生する。組換えタンパク質は、タンパク質とタンパク質を産生する細胞と正常に関連する他の細胞成分との関連においては見られない。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書においてほとんど同じ意味で用いられる。
核酸、ペプチドまたはタンパク質に言及する場合の用語「実質的に精製」または「単離」は、天然に関連するものを有する他の細胞成分のより少ない成分、または好ましくは本質的に全くない成分を含有する環境にある化学組成物を意味する。したがって、用語「単離」または「実質的純粋」は、宿主細胞の核酸と正常に関連する少なくとも１つのタンパク質または核酸を欠く核酸の調製に言及する。乾燥または水性溶液のいずれかにあり得るが、好ましくは均一状態においてである。純度および均一性は、ゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーのような解析的な化学技術を用いて典型的に測定される。一般に、実質的に精製または単離核酸またはタンパク質は、標本に存在する８０％より多くの全巨大分子種を含むであろう。好ましくは、核酸またはタンパク質を精製し、９０％より多くの当該巨大分子種を表す。より好ましくは、核酸またはタンパク質を精製して９０％より多く、および最も好ましくは、核酸またはタンパク質を本質的な均一性に対して精製し、ここで、他の巨大分子種は通常の解析方法により検出されない。
診断に用いられるゲノムＤＮＡは、末梢血、尿、唾液、口腔内試料、外科標本、および剖検標本のような、任意の真核体細胞から得られる。ＤＮＡは直接用いられ得るし、または変異解析に先だって、ＰＣＲ（Saiki et al. Science 239:487-491 (1988)）、またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Wu and Wallace Genomics 4:560-569 (1989)）、鎖置換増幅（strand displacement amplification）（ＳＤＡ）（Walker et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 89:392-396 (1992)）、自己維持的配列複製（self-sustained sequence replication）（３ＳＲ）（Fahy et al. PCR Methods P&J& 1:25-33 (1992)）の様な他のインビトロの増幅方法の使用を介してインビトロで酵素的に増幅され得る。
変異検出に適した形の核酸の調製方法は、当分野においてよく知られている。「核酸」は、別段に示されていなければ天然のヌクレオチドの既知の類似体を含む、１本鎖型または２本鎖型のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーである。本明細書において用いられる用語「核酸」は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかに言及する。「核酸配列」または「ポリヌクレオチド配列」は、５’末端から３’末端へ解読されたデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の１本鎖配列に言及する。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’付加の方向は、転写方向として言及される；ＲＮＡと同一配列を有するＤＮＡ鎖の配列領域および５’方向のＲＮＡ転写の５’末端に及ぶ配列領域は、「上流配列」として言及される；ＲＮＡと同一配列を有するＤＮＡ鎖の配列領域および３’方向のＲＮＡ転写物の３’末端に及ぶ配列領域は、「下流配列」として言及される。用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの感染性ポリマーである自己複製プラスミドおよび非機能性ＤＮＡまたはＲＮＡの両方を含む。本発明の任意の核酸配列の相補体は、該配列の定義に含まれることは理解される。「核酸プローブ」は、ＤＮＡフラグメントまたはＲＮＡフラグメントであり得る。
特異的ＤＮＡ配列の多型性の検出は、対立遺伝子特異的制限酵素エンドヌクレアーゼ切断に基づく制限断片長多型検出（Kan and Dozy Lancet ii:910-912 (1978)）、固定化オリゴヌクレオチド（Saiki et al. Proc. Natl. Acad. SCI. USA, 86:6230-6234 (1969)）またはオリゴヌクレオチド配列（Maskos and Southern Nucl. Acids Res 21:2269-2270 (1993)）を含む対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション（Wallace et al. Nucl. Acids Res. 6:3543-3557 (1978)）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（Newton et al. Nucl Acids Res 17:2503- 2516 (1989)）、ミスマッチ修復検出（ＭＲＤ）（Faham and Cox Genome Res 5:474-482 (1995)）、ＭｕｔＳタンパク質の結合（Wagner et al. Nucl Acids Res 23:3944-3948 (1995)）、勾配ゲル電気泳動での変性（ＤＧＧＥ）（Fisher and Lerman et al. Proc. NatI. Acad. Sci. U.S.A. 80:1579-l 583 (1983)）、１本鎖構造多型性検出（Orita et al. Genomics 5:874-879 (1983)）、ミスマッチ塩基対でのＲＮＡｓｅ切断（Myers et al. Science 230:1242 (1985)）、ヘテロ２本鎖ＤＮＡの化学的切断（Cotton et al. Proc. Natl. w Sci. U.S.A, 8Z4397-4401 (1988)）または酵素的切断（Youil et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:87-91 (1995)）、対立遺伝子特異的プライマー伸長に基づく方法（Syvanen et al. Genomics 8:684-692 (1990)）、遺伝子少量解析（ＧＢＡ）（Nikiforov et al. &&I Acids 22:4167-4175 (1994)）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）（Landegren et al. Science 241:1077 (1988)）、対立遺伝子特異的ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（Barrany Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:189-l 93 (1991)）、ゲルＬＣＲ（Abravaya et al. Nucl Acids Res 23:675-682 (1995)）、当分野において既知の標準的方法を用いる放射性および／または蛍光ＤＮＡ配列決定、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）アッセイ（Orum et al., Nucl. Acids Res, 21:5332-5356 (1993); Thiede et al., Nucl. Acids Res. 24:983-984 (1996)）を含む様々な方法により成し遂げら得るが、これらに制限されない。
「特異的ハイブリダイゼーション」または「選択的ハイブリダイゼーション」は、配列が複合体混合物（例えば、全細胞ＤＮＡまたはＲＮＡ）に存在する場合の適当な厳密条件下で、核酸が相補性である第２の特定ヌクレオチド配列のみへの核酸分子の結合または２本鎖形成に言及する。「厳密な条件」は、プローブがその標的配列にはハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件のことである。厳密な条件は、配列依存性であり、かつ異なる環境で異なる。より長い配列は、短いものより高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、厳密な条件は、温度がハイブリダイゼーションが定義されたイオン強度およびｐＨで生じることを意図されるものへの特異的配列の融解温度点（Ｔｍ）より約５度低いように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が平衡状態で相補的なプローブにハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下）である。典型的に厳密な条件は、ｐＨ７．０〜８．３で少なくとも約０．０１〜約１．０ＭのＮａイオン（または他の塩）の塩濃度を含む。温度は、より短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に対して少なくとも約３０度である。厳密な条件はまた、ホルムアルデヒドの様な不安定化試薬の添加で成し遂げられ得る。例えば、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｎａリン酸塩、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）および２５〜３０℃の温度の条件が、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションに適当である。
「相補的」または「標的」核酸配列は、核酸プローブに選択的にハイブリダイズする該核酸配列に言及する。適したアニーリング条件は、例えば、プローブの長さ、塩基組成、およびミスマッチの数およびプローブの位置に依存し、かつしばしば経験的に決定されなければならない。核酸プローブのデザインおよびアニーリング条件の考察のため、例えば、Sambrook et al., or Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., ed., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987)を参照されたい。
完全に一致するプローブは、特定の標的配列に完全に相補的な配列を有する。試験プローブは典型的には、標的配列の一部に完全に相補的である。「多型」マーカーまたは部位は、参考配列に関して配列差が生じる遺伝子座である。多型マーカーは、制限断片長多型、可変タンデム反復数（ＶＮＴＲ）、高頻度可変性領域、ミニサテライト、ジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、単純配列リピート、およびＡｌｕのような挿入エレメントを含む。参考対立遺伝子型は、例えば、個体群の最も大量の型または同定されるべき第１の対立遺伝子型であり得て、かつ他の対立遺伝子型は代わりとなるもの、変異体または多型対立遺伝子となづけられる。選択される個体群において最も高頻度で生じる対立遺伝子型は、時として「野生」型として言及され、および本明細書において「参考」型としても言及される。二倍体生物は、対立遺伝子型に対するホモ接合体またはヘテロ接合体であり得る。２対立遺伝子多型性は２つの区別可能な型（例えば、塩基配列）を有し、そして３対立遺伝子多型性は３つのかかる型を有する。
本明細書において用いられる「オリゴヌクレオチド」は、長さ２〜約６０塩基の一本鎖核酸である。オリゴヌクレオチドはまた、しばしば合成であるが天然に存在するポリヌクレオチドから産生され得る。プローブは、１またはそれ以上のタイプの化学結合、普通は水素結合形成を経由した相補的塩基対形成を介する相補的配列の標的核酸に結合可能なオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドプローブはしばしば長さ５〜６０塩基の間であり、特定の実施態様において１０〜４０、または１５〜３０塩基の間であり得る。オリゴヌクレオチドプローブは、天然の塩基（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）または修飾塩基（7-deazaguanosine、イノシン等）を含み得る。加えて、オリゴヌクレオチドプローブの塩基は、ホスホラミタイド結合またはホスホロチオネート結合のようなリン酸ジエステル結合以外の結合により結合され得るか、またはハイブリダイゼーションと干渉しない限り、ホスホラミタイド結合によるよりむしろペプチド結合により結合される成分塩基のペプチド核酸であり得る。
本明細書において用いられる様に、用語「プライマー」は、適当な条件下（例えば、４つの異なるヌクレオシド３リン酸塩、およびＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素のような重合物質の存在下）で、適当なバッファーおよび適当な温度で鋳型に従うＤＮＡ合成の開始点として振舞う１本鎖オリゴヌクレオチドに言及する。プライマーの適当な長さは、プライマーの意図される使用に依存するが、典型的には１５〜３０ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は一般に、鋳型との十分に安定的な混成複合体を形成するためのより低い温度を必要とする。プライマーは、鋳型の正確な配列に完全に相補的である必要はないが、それとハイブリダイズするのに十分相補的であるべきである。用語「プライマー部位」は、プライマーがハイブリダイズするものに対する標的ＤＮＡの存在に言及する。用語「プライマー対」は、増幅されるべきＤＮＡ配列の５’末端でハイブリダイズする５’（上流）プライマー、および増幅されるべき配列の３’末端の相補体でハイブリダイズする３’（下流）プライマーを含むプライマーのセットに言及する。
ＤＮＡフラグメントは、例えば、プラスミドＤＮＡの切断またはＰＣＲの使用により調製され得る。プライマーまたはプローブとして使用するオリゴヌクレオチドは、参考により両方が本明細書に取り込まれるBeaucage and Carruthers, Tetrahedron Lett 22:1859-l 862 (1981)に記載されるホスホラミタイド法およびMatteucci, et al., J. Am. Chem. Soc., 103:3185 (1981)により記載されるトリエステル法を含むがこれらに制限されないポリヌクレオチドの化学合成の分野において既知の方法により化学的に合成される。これらの合成は、Needham-VanDevanter, D.R., et al., Nucleic Acids Res. 12:61596168 (1984)において記載されるように自動合成機を用いうる。オリゴヌクレオチドの精製は、未変性アクリルアミドゲル電気泳動またはPearson, J.D. and Regnier, F.E., J. Chrom,, 255:137-149 (1983)に記載の様に陰イオン交換ＨＰＬＣのいずれかにより実行され得る。２本鎖フラグメントは、必要なら適当な条件下での適当な相補的１本鎖と一緒のアニーリングにより、または適当なプライマー配列でのＤＮＡポリメラーゼを用いる相補鎖の合成により続いて得られる。核酸プローブに特異的な配列が与えられると、相補鎖はまた同定および含まれることは理解される。相補鎖は、標的が２本鎖核酸である状況で同様によく機能する。
合成オリゴヌクレオチドの配列または任意の核酸フラグメントの配列は、ジデオキシ鎖末端法またはマキサムギルバート（Maxam-Gilbert）法のいずれかを用いて得られる（参考により本明細書において取り込まれるSambrook et al. Molecular Cloning - a Laboratory Manual (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989)を参照されたい。該マニュアルは”Sambrook et al.” ; Zyskind et al., (1988)として以下で言及される。）。Recombinant DNA Laboratory Manual, (Acad. Press, New York)を参照。診断アッセイで有用なオリゴヌクレオチドは典型的には、少なくとも長さ８連続ヌクレオチドであり、かつ１００またはそれ以上の連続ヌクレオチドより長い長さの１８ヌクレオチドの上向きの範囲であり得る。
本発明の別の態様は、本発明のヌクレオチド配列、またはフラグメント、類似体、またはそれらの誘導体を含有するＳＮＰを含む核酸分子にハイブリダイズ可能であるか、または相補的である単離アンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコード化する「センス」核酸に相補的、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるか、またはｍＲＮＡ配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。特定の態様において、アンチセンス核酸分子は、少なくとも約１０、約２５、約５０、または約６０ヌクレオチドまたは全ＳＮＰコード鎖、またはそれらの部分にのみ相補的な配列を含むものを提供する。
ある実施態様において、アンチセンス核酸分子は、本発明の多型ヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対するアンチセンスである。用語「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域に言及する。別の実施態様において、アンチセンス核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対するアンチセンスである。用語「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されないコード領域に隣接する５’配列および３’配列（すなわち、５’および３’非翻訳領域としても言及される）に言及する。
本明細書において開示されるコード鎖配列を与えられると、本発明のアンチセンス核酸は、Watson and Crick型塩基対またはHoogsteen型塩基対の規則によりデザインされ得る。例えば、アンチセンス核酸分子は、ｍＲＮＡの全コード領域に一般的に相補的であり得るが、本明細書の実施態様のようにさらに好ましくは、ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部のみに対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約５〜約６０ヌクレオチドの間の長さの範囲であることができ、好ましくは約１０〜約４５ヌクレオチドであり、より好ましくは約１５〜４０ヌクレオチドの間であり、さらにより好ましくは長さ約１５〜３０の間である。本発明のアンチセンス核酸は、当分野において既知の方法を用いて、化学合成または酵素結合反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加またはアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成される二本鎖の物理的安定性を増加させるために様々に修飾されたヌクレオチドを用いて化学的に合成され得る。例えば、ホスホロチオネート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが用いられ得る。
アンチセンス核酸を生成するために用いられ得る修飾ヌクレオチドの実施例は以下を含む：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシ水酸化メチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキヨシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。または、アンチセンス核酸は、アンチセンスの向きでサブクローンされた核酸の発現ベクターを用いて生物学的に生成され得る（すなわち、挿入核酸から転写されるＲＮＡは、該標的核酸に対してアンチセンス向きのものであり、以下のセクションにおいてさらに記載される）。
本発明のアンチセンス核酸分子は、対象に典型的に投与されるか、または多型タンパク質をコード化する細胞のｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、または結合するようにインサイツで生成されて、それにより、例えば
転写および／または翻訳を阻害することにより、タンパク質の発現を阻害する。ハイブリダイゼーションは、安定二本鎖を形成するために従来のヌクレオチド相補的配列によるものであり得るか、または例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二本鎖ヘリックスの大溝での特異的相互作用を介するものであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の実施例は、組織部位での直接注入を含む。または、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的とするために修飾され、続いて全身に投与され得る。例えば全身投与のため、アンチセンス分子は、例えば、細胞表面の受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に対するアンチセンス核酸分子を結合することにより、選択された細胞表面上で発現する受容体または抗原に特異的に結合するように修飾され得る。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記載するベクターを用いて細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、強力なｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれるアンチセンス核酸分子のベクター構築物が好ましい。
さらに別の実施態様において、本発明のアンチセンス核酸は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、普通のβ−ユニットと反対で、鎖が互いに平行に走る相補的ＲＮＡとハイブリッドする特異的な二本鎖を形成する（Gaultier et al.（1987）Nucleic Acids Res 15：6625−6641）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res 15： 6131−6148）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Inoue et al. (1987) FEBS Lett 215： 327−330)を含み得る。
以下の用語を用いて、２またはそれ以上の核酸またはポリヌクレオチド間の配列関係を記載する：「参考配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、および「実質的同一性」。「参考配列」は、配列比較のための基礎として用いられる定義配列であり；参考配列は、例えば、全長ｃＤＮＡのセグメントまたは配列表で与えられた遺伝子配列のようなより長い配列のサブセットであり得るか、または完全ｃＤＮＡまたは遺伝子配列を含み得る。比較ウインドウを整列させる配列の最適化アラインメントは、例えば、Smith and Waterman Adv. AppI. Math, 2482 (1981)の局所相同性アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 852444 (1988)の検索の類似の方法により、または該アルゴリズムのコンピューター化実行（例えば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびWisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＴＦＡＳＴＡ）により指揮されうる。
ポリペプチドを発現ベクターにコード化する核酸配列のサブクローニング、プローブの標識、ＤＮＡハイブリダイゼーションなどのような、本発明のｃＳＮＰを宿す核酸配列の核酸操作技術は、Sambrook et alにおいて一般的に記載される。用語「コード化核酸配列」は、特異的タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸配列の発現を指示する核酸に言及する。核酸配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖配およびタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸配列に翻訳されるＲＮＡ配列の両方を含む。核酸配列は、本明細書において開示される全長核酸配列ならびに全長タンパク質由来の非全長配列の両方を含む。配列が未変性配列の変性コドン、または導入されて特定の宿主細胞においてコドン優先を提供し得る配列を含むことはさらに理解される。結果的に、プローブの選択および配列デザインの原理を容易に拡大して、より複雑な多型性を解析し得る（ＥＰ７３０，６６３を参照）。例えば、３対立遺伝子ＳＮＰ多型性を特徴づけるために、３つのグループのプローブが、上述された様に３つの多型型のタイル張りをデザインされ得る。さらなる実施例のように、ヌクレオチドの欠損に関する２対立遺伝子多型性を解析するために、参考配列のような非欠損多型型に基づく第１のグループのプローブ、および参考配列のような欠損形に基づく第２のグループのプローブをタイル張りすることができる。
ゲノムＤＮＡの解析のため、任意の生物学的に好都合の組織試料が実質的に用いられ得る。適当な試料は、全血、精液、唾液、涙、尿、糞便材料、汗、口腔内、皮膚および髪を含む。ゲノムＤＮＡは解析の前に典型的に増幅される。増幅は、例えば解析されるべき多型性の遺伝子座を含有する５０〜５００ヌクレオチドの適当なフラグメントに隣接するプライマーを用いるＰＣＲにより普通に作用する。標的は、増幅過程で普通に標識される。増幅産物は、ＲＮＡまたはＤＮＡ、１本鎖または２本鎖であり得る。２本鎖なら、増幅産物はアレイの適用の前に典型的に変性される。ゲノムＤＮＡが増幅なしで解析されると、アレイの適用の前に試料からＲＮＡを除去することが望ましい。この様なことはＤＮＡｓｅのないＲＮａｓｅでの切断により成し遂げら得る。
核酸試料の多型性の検出
本明細書において開示されるＳＮＰを用いて、特徴付けられた多型性の型が解析下の個体に存在するか否かを決定し得る。
多型性を解析する対立遺伝子特異的プローブのデザインおよび使用は、例えば、Saiki et al., Nature 324, 163-166 (1986)；Dattagupta,ＥＰ２３５，７２６、Saiki, ＷＯ８９／１１５４８に記載される。対立遺伝子特異的プローブは、ある個体由来の標的ＤＮＡセグメントにはハイブリダイズするが、２個体由来のそれぞれのセグメントの異なる多型型の存在に起因する別の個体由来の対応するセグメントにはハイブリダイズしないようにデザインされ得る。ハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子間のハイブリダイゼーション感度において有意差の存在する、十分に厳密なものであり、そして好ましくは、対立遺伝子の１つのみにハイブリダイズするプローブによる本質的に双対の応答である。あるプローブは、多型部位がプローブの中心位置で整列するように（例えば、１５ｍｅｒの７位置；１６ｍｅｒの７、８または９位置のいずれか）標的ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズするようにデザインされる。プローブの該デザインは、異なる対立遺伝子形の間のハイブリダイゼーションにおいて良い識別を成し遂げる。
対立遺伝子特異的プローブはしばしば、ペアーの一方のメンバーが標的配列の参考型に完全な一致を示し、かつ他のメンバーが変異体型に完全な一致を示すペアーで用いられる。プローブのいくつかのペアーは、同一標的配列内の複数の多型性の同時解析のため、同一サポート上に続いて固定化される。
多型性はまた、公開ＰＣＴ出願ＷＯ９５／１１９９５に記載される実施例のいくつかである、核酸アレイへのハイブリダイゼーションにより同定されうる。ＷＯ９５／１１９９５はまた、特徴付けられる前の多型性の変異体型の検出について最適化されるサブアレイを記載する。かかるサブアレイは、第１の参考配列の対立遺伝子変異体である、第２の参考配列に相補的であるようにデザインされるプローブを含有する。第２のグループのプローブは、プローブが第２の参考配列に対する相補性をあらわすことを除き、同一の原理によりデザインされる。第２のグループ（または、さらなるグループ）の含有物は、プローブの長さと釣り合う短い距離内で生じることを期待される複数変異（例えば、９〜２１塩基内の２またはそれ以上の変異）にある、第１の参考配列の短いサブシーケンスの解析に特に有用であり得る。
対立遺伝子特異的プライマーは、多型性を覆う標的ＤＮＡ上の部位にハイブリダイズし、完全な相補性を表すプライマーに対する対立遺伝子型の増幅をただ開始する。Gibbs, Nucleic Acid Res. 17 2427-2448 (1989)を参照されたい。該プライマーは、末端部位でハイブリダイズする第２のプライマーとの結合で用いられる。特定の対立遺伝子型を示す検出可能な産物を生じる、２プライマー由来の増幅進行が存在する。対照は、一方が多型部位での一塩基ミスマッチを示し、かつ他方が末端部位に対する完全な相補性を表す、第２のペアーのプライマーで普通に行われる。一塩基ミスマッチは増幅を妨げ、そして検出可能な産物は形成されない。ミスマッチが多型性で整列させたオリゴヌクレオチドの最も３’の位置で含まれる場合、該位置がプライマーからの伸長を最も不安定化するため、方法は最もよく機能する（ＷＯ９３／２２４５６を参照）。
ポリメラーゼ連鎖反応法を用いて生成された増幅産物は、勾配ゲル電気泳動の変性の使用により解析され得る。異なる対立遺伝子は、異なる配列依存性融解特性および溶液中のＤＮＡの電気泳動に基づいて同定され得る。Erlich, ed., PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification, (W.H. Freeman and Co New York, 1992, Chapter 7).を参照されたい。
標的配列の対立遺伝子は、Orita et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 2766-2770 (1989)に記載されるように１本鎖ＰＣＲ産物の電気泳動での変化により塩基差を同定する、１本鎖構造多型性解析を用いて同定され得る。増幅ＰＣＲ産物を生成し、そして加熱またはそうでなければ変性して、１本鎖増幅産物を形成し得る。１本鎖核酸は、塩基配列に部分的に依存する第２の構造をリフォールディングするか、または形成し得る。１本鎖増幅産物の異なる電気泳動特性は、標的配列の対立遺伝子間の塩基配列差に関係し得る。
遺伝子多型性により生じることが疑われる病態に関して、個体の遺伝子型は関連解析により評価され得る。関連解析に適当な遺伝子型形質は、遺伝的要素を今までにマッピングしていないが既知である疾病（例えば、無γグロブリン血症、尿崩症、レッシュ・ナイハン症候群、筋ジストロフィー、ウィスコット・アルドリッチ症候群、ファブリー病、家族性高コレステロール血症、多発性嚢胞腎、遺伝性球状赤血球症、フォン・ヴィレブランド病、結節硬化症、遺伝性出血性毛細管拡張症、家族性大腸ポリープ症、エーラー・ダンロス症候群、骨形成不全症、および急性間欠性ポルフィリン症）を含む。
遺伝子型形成はまた、自己免疫疾患、高血圧、炎症、癌、神経系の疾病、および病原微生物による感染のような遺伝的であるか、またはあり得る要素の多因子遺伝病の症状、または感受性を含む。自己免疫疾患のいくつかの実施例は、関節リウマチ、多発性硬化症、糖尿病（インスリン依存性および非依存性）、全身性エリテマトーデスおよび グレーブス病を含む。癌のいくつかの実施例は、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、大腸癌、食道癌、腎臓癌、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、白血病、肝臓癌、肺癌、および子宮癌を含む。遺伝子型形質はまた、長寿、外見（例えば、はげ、肥満）、強さ、速さ、持久力、受精能、および特定の薬物または治療的処置に対する感受性または受容性のような特徴を含む。
個体の多型部位のセットを占める多型型の測定は、個々を区別する多型型のセットを同定する。一般に、National Research Council, The Evaluation of Forensic DNA Evidence (Eds. Pollard et al., National Academy Press, DC, 1996)を参照。多型部位はヒトゲノムの５０，０００ｂｐ領域内であるので、該多型部位間の組換え率は低い。該低確率は、この適用で示すハプロタイプ（全１０多型部位のセット）が少なくとも何世代間で変化なしで遺伝することを意味する。さらなる部位は、１個体の多型型のセットが無関係個体のものと同一であるより低い確率を解析される。好ましくは、複数部位が解析されるなら、部位は非連鎖である。従って本発明の多型性は、末端遺伝子の多型性との結合でしばしば用いられる。法医学で用いられる好ましい多型性は普通、２つの多型型の集団頻度が複数対立遺伝子座での複数の多型型のものより、より高い正確さで測定されるため、２対立遺伝子である。
個体の法医学的マーカーの顕著なセットまたは特徴的セットを同定する能力は、法医学的解析に有用である。例えば、選択された多型部位を占める多型型のセットが容疑者および試料で同一であるか否かを決定することにより、容疑者由来の血液試料が事件現場由来の血液試料または他の組織試料と一致するか否かを決定し得る。多型マーカーのセットが容疑者と試料との間で一致しないなら、容疑者は試料の供給源ではないと結論付けられる（実験誤差がなければ）。マーカーのセットが一致するなら、容疑者由来のＤＮＡが事件現場で見つかったものと一致すると結論できる。試験された遺伝子座の多型型の頻度が測定されると（例えば、個体の適当な群の解析により）、容疑者試料と事件現場の試料との一致が偶然生じる確率を決定するための統計分析を行う。
ｐ（ＩＤ）は、２つの無作為な個体が与えられた多型部位で同一の多型または対立遺伝子型を有する確率である。対立遺伝子座において、４つの遺伝子型は：ＡＡ、ＡＢ、ＢＡ、およびＢＢが可能である。対立遺伝子ＡおよびＢが頻度ｘおよび頻度ｙを有する生物の１倍体ゲノムで生じると、二倍体生物のそれぞれの遺伝子型の確率（ＷＯ９５／１２６０７を参照）は：
ホモ接合体：ｐ（ＡＡ）＝ｘ２
ホモ接合体：ｐ（ＢＢ）＝ｙ２＝（１−ｘ）２
単一へテロ接合体：ｐ（ＡＢ）＝ｐ（ＢＡ）＝ｘｙ＝ｘ（１−ｘ）
両ヘテロ接合体：ｐ（ＡＢ＋ＢＡ）＝２ｘｙ＝２ｘ（１−ｘ）
である。
ある遺伝子座での同一性の確率（すなわち、個体群から無作為に選ばれた２つの個体が与えられた遺伝子座で同一多型型を有する確率）は、方程式：
ｐ（ＩＤ）＝（ｘ２）２＋（２ｘｙ）２＋（ｙ２）２
により与えられる。
これらの計算は、与えられた遺伝子座での多型型の任意の数について拡張され得る。例えば、対立遺伝子がそれぞれｘ、ｙおよびｚの個体群の頻度を有する３対立遺伝子システムの同一性ｐ（ＩＤ）の確率は、遺伝子型頻度の二乗の和：
ｐ（ＩＤ）＝ｘ４＋（２ｘｙ）２＋（２ｙｚ）２＋（２ｘｚ）２＋ｚ４＋ｙ４
と同じである。
ｎ対立遺伝子の遺伝子座において、適当な２項式を用いてｐ（ＩＤ）およびｐ（ｅｘｃ）を計算する。
複数の未連鎖遺伝子座のそれぞれの同一性の累積確率（ｃｕｍ ｐ（ＩＤ））は、それぞれの遺伝子座により与えられる確率の乗：
ｃｕｍ ｐ（ＩＤ）＝ｐ（ＩＤ１）ｐ（ＩＤ２）ｐ（ＩＤ３）．．．ｐ（ＩＤｎ）
により決定される。
ｎ遺伝子座の非同一の累積確率（すなわち、２つの無作為な個体が１またはそれ以上の遺伝子座で異なる確率）は、方程式：
ｃｕｍ ｐ（ｎｏｎＩＤ）＝１−ｃｕｍ ｐ（ＩＤ）
により与えられる。
いくつかの多型遺伝子座が試験されると、無作為の個体の非同一性の累積確率は非常に高くなる（例えば、１から１０億）。かかる確率は、容疑者の有罪または無罪を決定する他の証拠とともに考慮され得る。
親子鑑定の対象は普通、男性が子供の父親であるか否かを決定をすることである。多くの場合、子供の母親はわかっており、従って子供の遺伝子型に対する母親の寄与をさかのぼることができる。親子鑑定は、母親に寄与しない子供の遺伝子型の部分が推定の父親のものと一致するか否かを調べる。親子鑑定は、推定の父親および子供の多型性のセットを解析することにより行われる。
父親に起因する子供の多型性のセットが推定の父親と一致しないと、実験誤差がなければ、推定の父親は本当の父親でないと結論付けられる。父親に起因する子供の多型性のセットが推定の父親の多型性のセットと一致しないと、統計計算を行い、偶然一致の確率を決定することができる。
除外パーセンテージの確率（無作為の男性が、彼を父親として矛盾させる、与えられた多型部位で多型型を有する確率を表す）は、方程式（ＷＯ９５／１２６０７を参照）：
ｐ（ｅｘｃ）＝ｘｙ（１−ｘｙ）
により与えられる。
ｘおよびｙが対立遺伝子多型部位の対立遺伝子ＡおよびＢの個体群の頻度である（３対立遺伝子部位でｐ（ｅｘｃ）＝ｘｙ（１−ｘｙ）＋ｙｚ（１−ｙｚ）＋ｘｚ（１−ｘｚ）＋３ｘｙｚ（１−ｘｙｚ））であり、ここでｘ、ｙおよびｚはそれぞれ対立遺伝子Ａ、ＢおよびＣの個体群の頻度である）。非除外の確率は：
ｐ（ｎｏｎ−ｅｘｃ）＝１−ｐ（ｅｘｃ）
である。
非除外の累積確率（ｎ遺伝子座が用いられた場合の値を表す）は従って：
ｃｕｍ ｐ（ｎｏｎ−ｅｘｃ）＝ｐ（ｎｏｎ−ｅｘｃ１）ｐ（ｎｏｎ−ｅｘｃ２）ｐ（ｎｏｎ−ｅｘｃ３）．．．ｐ（ｎｏｎ−ｅｘｃｎ）
である。
ｎ遺伝子座についての除外の累積確率（無作為の男性が除外されない確率を表す）は：
ｃｕｍ ｐ（ｅｘｃ）＝１−ｃｕｍ ｐ（ｎｏｎ−ｅｘｃ）
である。
いくつかの多型遺伝子座が解析に含まれると、無作為の男性の除外の累積確率は
非常に高い。この確率は、多型マーカーセットが彼／彼女の父親に起因する子供の多型マーカーセットと一致する、推定の父親の責任を評価する際考慮され得る。
本発明の多型性は、異なる方法で生物のフェノタイプに起因しうる。いくつかの多型性が、配列をコードするタンパク質内で生じ、かつタンパク質構造への作用によりフェノタイプに起因する。作用は、環境に依存する中立、有益または有害、または有益でもあり有害でもあるものであり得る。例えば、ヘテロ接合体鎌状細胞変異はマラリアに対する抵抗性を与えるが、ホモ接合体鎌状細胞変異は普通は致死性である。他の多型性は非コード領域で生じるが、複製、転写、および翻訳への作用を経由してフェノタイプ作用を直接的に発揮し得る。単一多型性は、１以上のフェノタイプ形質に作用し得る。同様に、単一のフェノタイプ特性は異なる遺伝子中の多型性により作用され得る。さらにいくつかの多型性は、個体を原因としてあるフェノタイプと関係する明らかな変異となりやすくする。
フェノタイプ形質は、今までに遺伝的要素をマッピングいていないが既知である疾病を含む。フェノタイプ形質はまた、自己免疫疾患、炎症、癌、神経系疾病、および病原性微生物による感染のような遺伝的であるかあり得る要素の多因子遺伝病の症状または感受性を含む。自己免疫疾患のいくつかの実施例は、関節リウマチ、多発性硬化症、糖尿病（インスリン依存性および非依存性）、全身性エリテマトーデスおよびグレーブス病を含む。癌のいくつかの実施例は、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、大腸癌、食道癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、および子宮癌を含む。フェノタイプ形質はまた、長寿、外見（例えば、はげ、肥満）、強さ、速さ、持久力、受精能、および特定の薬物または治療的処置の感受性または受容性のような特徴を含む。
対比は、該フェノタイプ形質の存在または非存在について、および多型マーカーセットについて試験された個体の群について行われた。かかる解析を行うため、多型性（すなわち、多型セット）のセットの存在または非存在は、個体のあるものが特定形質を表しかつあるものが該形質を欠くことを表す、個体のセットについて測定される。該セットのそれぞれの多型性である対立遺伝子は続いて見直されて、特定の対立遺伝子の存在または非存在が該形質と関連するか否かを測定される。対比は、標準的統計法により行われ、多型型とフェノタイプ特徴との間の統計的に有意な関連が示される。例えば、多型性Ａでの対立遺伝子Ａ１の存在は心臓疾病と相互に関連することがわかる。さらなる実施例のように、多型性Ａでの対立遺伝子Ａ１と多型性Ｂでの対立遺伝子Ｂ１との共存は、家畜のミルク産生の増加と相互に関連することがわかる。
かかる相関は、いくつかの方法で生かすことができる。１またはそれ以上の多型型のセットと処置が利用可能である疾病との間の強力な相関の場合、ヒト患者または動物患畜の多型型セットの検出が、処置である迅速投与、または少なくとも患者の標準モニタリング制度を正しいとし得る。夫婦が考えている家族の重篤な疾病と相関する多型型の検出はまた、生殖の決心で夫婦にとって価値があり得る。例えば、女性のパートナーはインビトロでの受精を決心して、彼女の夫から彼女の子孫へのかかる多型性の伝達の可能性を避け得る。多型セットとヒト疾病との間の統計的に有意な相関だが弱い場合、迅速な治療行為またはモニタリングは正しいとされない。患者は、患者にとってほとんどコストなしで成し遂げられる単純なライフスタイルの変更（例えば、食事、運動）であることに意欲的であり得るにも関わらず、変異体対立遺伝子の長所により感受性を増加された患者に対してリスク条件を減少する際に潜在的有益性をおくる。疾病のためのいくつかの治療計画のうちの１つに対して増強された受容性と相関する、患者の多型セットの同定は、該治療計画が従われるべきものであることを示す。
動物および植物にとって、特徴とフェノタイプとの間の相関は望まれる特徴を繁殖させるのに有用である。例えば、Beitz et alの米国特許番号５，２９２，６３９は、ウシのミルク産生を改善するための繁殖プログラムにおけるウシミトコンドリア多型性の使用を考察する。ｍｔＤＮＡのＤループ配列多型性のミルク産生への作用を確かめるため、それぞれのウシは、よく考えられた１７遺伝子座のそれぞれでの遺伝子型ミトコンドリアＤＮＡ配列に関して、変異体なら１の価値、または野生型なら０の価値を割り当てられた。
上のセクションは、該形質に直接的または非直接的に起因するフェノタイプ形質と多型性との間の相関を同定することに関する。本セクションは、形質と関連する遺伝子座と、形質と関連しないが形質の原因である遺伝子座と物理的に近接する多型マーカーとの間の物理的結合の同定について記載し、それで同時分離する。かかる解析は、フェノタイプ形質と関連する遺伝子座を染色体位置に対してマッピングするのに有用であり、かつそれにより形質の原因である遺伝子をクローニングする。Lander et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83, 7353-7357 (1986); Lander et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84, 2363-2367 (1987); Donis-Keller et al., Cell 51, 319-337 (1987); Lander et al., Genetics 121, 185-199 (1989))を参照されたい。連鎖により局在化された遺伝子は、方向クローニングとして知られる方法によりクローン化され得る。Wainwright, Med. J. Australia 159, 170-174 (1993); Collins, Nature Genetics 1, 3-6 (1992)（それぞれが、全目的のため全体として参考により取り込まれる）を参照されたい。
連鎖研究はファミリーのメンバーで典型的に行われる。ファミリーの利用可能なメンバーは、フェノタイプ形質の存在または非存在および多型マーカーのセットについて特徴付けられる。情報価値のある減数分裂における多型マーカーの分布は続いて分析されて、多型マーカーが多型型質と同時分裂するか否かを決定する。例えば、Kerem et al., Science 245, 1073-1080 (1989); Monaco et al., Nature 316, 842 (1985); Yamoka et al., Neurology 40, 222-226 (1990); Rossiter et al., FASEB Journal 5, 21-27 (1991)を参照されたい。
連鎖は、ＬＯＤ（余りの対数）値の計算により分析される。ｌｏｄ値は、２つが連鎖せず、独立して分離する状況に対して、２つが組換え分画フラクションＲＦに位置する場合、マーカーと遺伝子座の観察される分離データを得る、相関的可能性である（Thompson & Thompson, Genetics in Medicine (5th ed, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1991); Strachan, ”Mapping the human genome”in The Human Genome (BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford), Chapter 4）。一連の可能性の率は、ＲＦ＝０．０（偶然の遺伝子座）〜ＲＦ＝０．５０（非連鎖）の範囲にある、様々な組換え分画（ＲＦ）で計算される。したがって、与えられたＲＦ値での可能性は、遺伝子座がＲＦで非連鎖のデータ確率から非連鎖遺伝子座のデータ確率である。コンピューター処理した可能性は普通、この率のｌｏｇ１０（すなわち、ｌｏｄスコア）として表す。例えば、ｌｏｄスコア３は、明らかに観察される連鎖の一致に対する１０００：１のオッズを示す。対数の使用は、異なる家族から集められたデータが、単純な付加により組み合わされることを可能とする。コンピュータープログラムは、異なるＲＦ値のｌｏｄスコアの計算に利用可能である（例えば、LIPED, MLINK (Lathrop, Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 81, 3443-3446 (1984))。特定のｌｏｄスコアのいずれかのため、組合せ分画は数表から決定され得る。Smith et al., Mathematical tables for research workers in human genetics (Churchill, London, 1961); Smith, Ann. Hum. Genet. 32, 127-150 (1968)を参照されたい。ｌｏｄスコアが最高であるＲＦ値は、熟考されて組換え分画のベストな評価となる。
ポジティブｌｏｄスコア値は、ネガティブ値が連鎖は２つの遺伝子座が非連鎖である確率より小さそうな（そのＲＦ値で）ことを示すのに対して、２つの遺伝子座は連鎖することを示す。慣例により、＋３またはより大きな（連鎖の恩恵での１０００：１オッズより大きいものと等しい）組合せｌｏｄスコアは、２つの遺伝子座が連鎖されるという最も確実な証拠を考慮する。同様に慣例により、−２またはそれ未満のネガティブｌｏｄスコアは、比較された２つの遺伝子座の連鎖に対する最も確実な証拠として取り上げられる。ネガティブ連鎖データは、熟考より染色体またはそれらのセグメントの除外で有用である。研究は、未除外染色体遺伝子座の残存に焦点を置く。
本発明は、外来性変異体遺伝子を発現および／または不活性化外来性変異体遺伝子の対立遺伝子の一方または両方を有する能力のあるトランスジェニック非ヒト動物をさらに提供する。外来性変異体遺伝子の発現は、プロモーターおよび任意でエンハンサーへの作用可能な結合、および接合体への構造物の微量注入により普通に成し遂げられる。Hogan et al., "Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory (1989)を参照されたい。外来性変異体遺伝子の不活性化は、ポジティブセレクションマーカーの挿入により不活性化されるクローン化変異体遺伝子の導入遺伝子の形成により成し遂げられることができる。Capecchi, Science 244, 1288-1292を参照。導入遺伝子は続いて、外来性変異体遺伝子とのホモ接合体組み換えを行う胚性幹細胞に導入される。マウスおよび他のげっ歯類は好ましい動物である。かかる動物は有用な薬のスクリーニングシステムを提供する。
本発明は、特定の医薬組成物またはかかる組成物のクラスに対する一塩基多型を宿す対象の薬理ゲノミクス感受性を評価する方法をさらに提供する。薬物代謝酵素、薬物輸送体、医薬組成物の受容体、および他の薬剤標的の遺伝子多型性は、対象に投与される医薬組成物の効果および毒性の特徴に基づく個体差と相関した。薬に対する対象の感受性である薬理ゲノミクスの特徴は、対象の特定の遺伝子構造物に投与計画を合わせる能力を増強させ、それにより治療の治療的効果を増強および最適化する。
ｃＳＮＰが病態の原因であることが記載される多型タンパク質を導く場合、かかる状態の処置方法は多型タンパク質の病態野生型同族源を経験する対象に投与することを含む。効果的な投与計画で投与されると、野生型同族源は多型タンパク質に起因する欠陥の相補性または治療を提供する。対象の状態はタンパク質療法により回復する。
ｃＳＮＰから生じる多型タンパク質に原因のある病態に罹患することが疑われる対象は、核酸のｃＳＮＰの存在、または対象から取り上げられた適当な臨床試料の同族多型タンパク質の存在を同定することが可能な様々な診断方法のいずれかを用いて診断されるべきである。ｃＳＮＰの存在が確かめられ、かつ病態が正常遺伝子または野生型遺伝子の投与により治療可能であると、対象は治療野生型遺伝子、または野生型遺伝子の治療配列を含有するフラグメントを宿す核酸を含む医薬組成物で処置される。かかる核酸が投与される方法の非制限の実施例は、アデノウイルスまたはアデノ関連ウイルスのようなウイルスベクターでの野生型遺伝子の取り込み、および投与された核酸の細胞内取り込みを促進する医薬組成物のネーキッドＤＮＡの投与を含む。多型性の野生型対立遺伝子をコードする遺伝子を含む核酸が対象の細胞内に取り込まれると、野生型遺伝子産物の新規生合成を開始する。核酸が対象のゲノムにさらに取り込まれると、持続時間の間、野生型タンパク質の新規生合成という条件で処理は長期間作用する。対象の細胞の野生型タンパク質の生合成は対象の臨床的状態の治療的増強に寄与する。
ＳＮＰに起因する病態に罹患する対象は、遺伝子欠損を治療するために処置され得る（Kren et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:10349-10354 (1999)を参照）。かかる対象は対象由来の試料の多型性を検出できる任意の方法により同定される。かかる遺伝子欠損は、ＳＮＰの位置で野生型ヌクレオチドを供給する修復配列を取り込む核酸フラグメントをかかる対象に投与することにより恒常的に修復され得る。該部位特異的修復配列は、対象のゲノムＤＮＡの内在性修復を促進するために作用するＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドを包含する。ポリエチレンイミンとの複合体または陰イオンリポゾーム内へのカプセル化のような、適当な媒体での投与で、先天的病態を導く遺伝子欠損はキメラオリゴヌクレオチドが対象のゲノムに野生型配列の取り込みを誘導するように、乗り越え得る。取り込みで、野生型遺伝子産物は発現し、そして置換が伝播され、それにより恒常的修復を行う。
本発明は、上述のような少なくとも１つの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを含むキットをさらに提供する。しばしば、キットは、多型性の異なる型にハイブリダイズする１またはそれ以上のペアーの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを含有する。あるキットにおいて、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、基質に固定化されている。例えば、同一基質は、表４〜１０に示される多型性の少なくとも１０、１００、１０００、または全てを検出する対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを含み得る。キットの任意の付加要素は、例えば、制限酵素、逆転写酵素またはポリメラーゼ、基質ヌクレオチド３リン酸塩、標識のために用いられる材料（例えば、標識がビオチンなら、アビジン酵素結合体、酵素基質および色素原）、および逆転写、ＰＣＲ、またはハイブリダイゼーション反応の適当なバッファーを含む。普通は、キットはまたハイブリダイゼーション法を実施する指示を含有する。
本発明はいくつかの態様は、本発明のＳＮＰを含む核酸によりコード化される利用可能な多型タンパク質を有することによる。該核酸配列を単離する様々な方法が存在する。例えば、ＤＮＡは本明細書に開示される配列に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから単離される。かかるプローブは、ハイブリダイゼーションアッセイで直接的に用いられ得る。または、プローブは、ＰＣＲのような増幅技術での使用のためデザインされ得る。
ｃＤＮＡライブラリーを調製するため、ｍＲＮＡは心臓または膵臓のような組織から単離され、好ましくは、遺伝子または遺伝子ファミリーの発現が生じるような組織である。ｃＤＮＡはｍＲＮＡから調製され、そして組換えベクターに結合される。ベクターは、増殖、スクリーニングおよびクローニングのための組換え宿主に形質移入される。ｃＤＮＡライブラリーを作成およびスクリーニングする方法はよく知られている。Gubler, U. and Hoffman, B.J. Gene 25:263-269 (1983) and Sambrook et alを参照。
ゲノムライブラリーのため、例えば、ＤＮＡは組織から抽出され、そして機械的に切断または酵素的切断のいずれかを行い、約１２〜２０ｋｂのフラグメントを生じる。フラグメントは、続いて勾配遠心法により不必要なサイズから分離され、バクテリオファージのλベクター内に構築される。これらのベクターおよびファージは、Sambrook, et aに記載される様にインビトロでパッケージされる。組換えファージは、Benton and Davis, Science 196:180-l 82 (1977)に記載される様にプラークハイブリッド形成法により解析される。コロニーハイブリダイゼーションは、M. Grunstein et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3961-3965 (1975に一般に記載される様に実行される。該ＤＮＡは、例えば、サザンブロットで核酸プローブとハイブリダイズする能力によりｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーのいずれかにおいて同定され、そしてこれらのＤＮＡ領域は当業者にとって通常の標準的方法により単離される。Sambrook, et al.を参照。
ＰＣＲ技術において、増幅されるべきＤＮＡ領域の２つの３’境界に対して相補的なオリゴヌクレオチドプライマーが合成される。ポリメラーゼ連鎖反応法は、２つのプライマーを用いて続いて実行される。ＰＣＲプロトコール；a Guide to Methods and Applications (Innis, M, Gelfand, D., Sninsky, J. and White, T., eds.), Academic Press, San Diego (1990)を参照されたい。プライマーは選択されて、該全長配列をコード化する全体領域を増幅することができるか、または必要ならより小さいＤＮＡフラグメントを増幅することができる。ＰＣＲは様々なプロトコールで用いられて、該配列をコード化するＤＮＡを単離し得る。これらのプロトコールにおいて、該配列をコード化するＤＮＡを増幅する適当なプライマーおよびプローブが、本明細書に記載されるＤＮＡ配列の解析から生成される。かかる領域がＰＣＲ増幅であると、それらは配列決定され、かつオリゴヌクレオチドプローブは配列から調整され得る。
ｃＳＮＰを含む配列をコード化するＤＮＡが単離およびクローン化されると、様々な組換え操作された細胞においてコード化多型タンパク質を発現させることができる。当業者が該配列をコード化するＤＮＡの発現に利用可能な多くの発現システムにおいて博識であることは予測される。原核細胞または真核細胞のタンパク質の発現について機知の様々な方法を詳細に記載する試みは、本明細書においてなされていない。
簡単な概要において、該配列をコード化する天然核酸または合成核酸の発現は、プロモーターへのＤＮＡまたはｃＤＮＡの作用可能な結合（構成的または誘導可能のいずれかである）により成し遂げられ、発現ベクターへの取り込みが続く。ベクターは、原核細胞または真核細胞のいずれかでの複製および組込みに適し得る。典型的な発現ベクターは、開始配列、転写および翻訳終結、および該ポリヌクレオチド配列の発現の制御に有用なプロモーターを含有する。クローン化遺伝子の高レベル発現を得るため、転写、翻訳開始のためのリボゾーム結合部位、および転写／翻訳終結に向くための強力なプロモーターを最小値で含有する発現プラスミドを構築することが望まれる。発現ベクターはまた、少なくとも１つの独立性終結配列、真核細胞および原核細胞の両方でのプラスミドの複製を許可する配列、すなわちシャトルベクター、および原核細胞発現システムおよび真核細胞発現システムに対するセレクションマーカーを含有する一般的な発現カセットを含む。Sambrook et alを参照されたい。
様々な原核細胞発現システムを用いて、本発明の多型タンパク質を発現できる。実施例は、E. coli、Bacillus、Streptomyces等を含む。
転写、翻訳開始のためのリボゾーム結合部位、および転写／翻訳終結に向くための強力なプロモーターを最小値で含有する発現プラスミドを構築することが好ましい。E. coliにおいてこの目的に適した制御領域の実施例は、Yanofsky, C., J. Bacterial 158:1018-1024 (1984)により記載される様にE. coliトリプトファン生合成経路のプロモーターおよびオペレーター領域、およびA , I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet. 14:399-445 (1980)により記載される様にλファージの左方向のプロモーターである。E. coliに形質転換されたＤＮＡベクターのセレクションマーカーの含有はまた有用である。かかるマーカーの実施例は、アンピシリン、テトラサイクリン、またはクロラムフェニコールに対する耐性を示す遺伝子を含む。E. coliで用いるセレクションマーカーに関する詳細のため、Sambrook et al.を参照されたい。
発現組換えタンパク質の正確なフォールディングを増強するために、E. coliからの精製の間、発現タンパク質はまず変性され、続いて修復され得る。このことは、グアニジンＨＣＩのようなカオトロピック物質で細菌性に産生されたタンパク質を可容化すること、およびβ−メルカプトエタノールのような還元剤で全システイン残基を還元することにより成し遂げられ得る。タンパク質は、時間をかけた透析またはゲルフィルトレーションのいずれかにより続いて修復される。米国特許番号４，５１１，５０３を参照されたい。発現抗原の検出は、ラジオイムノアッセイまたはウエスタンブロッティング技術または免疫沈降のような当分野において既知の方法により成し遂げられる。E. coliからの精製は、米国特許番号４，５１１，５０３に記載されるもののような以下の方法で成し遂げられ得る。
酵母、昆虫細胞株、トリ細胞、サカナ細胞および哺乳類細胞のような、様々な真核細胞発現システムのいずれかを用いて、本発明の多型タンパク質を発現し得る。以下で簡単に説明するように、ｃＳＮＰを宿すヌクレオチド配列は、これらの真核細胞システムで発現しうる。酵母でのヘテロ接合体の合成は良く知られている。Methods in Yeast Genetics, Sherman, F., et al., Cold Spring Harbor Laboratory, (1982) は、酵母におけるタンパク質産生を可能とする様々な方法を記載する公認の研究である。適当なベクターは普通、３−ホスホグリセンリン酸キナーゼまたは解糖酵素を含むプロモーターのような制御配列、および複製の開始、終結配列および要望どおりのものを有する。例えば、適当なベクターは文献（Botstein, et al., Gene 8:17-24 (1979); Broach, et al., Gene 8:121-133 (1979))に記載される。
２方法が酵母細胞の形質転換に用いられる。１つの場合、酵母細胞はまず、ザイモリエース、リティカーゼ（lyticase）またはグルスラーゼ（glusulase）を用いてプロトプラストに変えられ、ＤＮＡおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加により続けられる。ＰＥＧ処理プロトプラストは、選択的条件下で３％アガー培養液で続いて再生成される。この方法の詳細は、J.D. Beggs, Nature (London) 275:104-109 (1978); and Hinnen, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:1929-1933 (1978)による文献で与えられる。２つめの方法は、細胞壁の除去に関しない。代わりに、細胞は、リチウムクロライドまたはアセテートおよびＰＥＧで処理され、そして選択プレートに細胞を置き（Ito, H., et al., J. Bact, 153163-168 (1983))、標準タンパク質単離技術を可溶化液に適用する。
精製方法は、ウエスタンブロット技術またはラジオイムノアッセイまたは他の標準技術の使用により観察され得る。本発明のタンパク質をコード化する配列はまた、例えば、哺乳類起源、昆虫起源、トリ起源、サカナ起源の形質導入細胞培養で使用するため、様々な免疫アッセイ発現ベクターに結合される。ポリペプチドの産生に有用な細胞培養の実例は、哺乳類細胞である。哺乳類細胞懸濁液が用いられるが、哺乳類細胞システムはしばしば細胞の単層型である。完全タンパク質の発現が可能な多くの適当な宿主細胞株が当分野において発達し、そしてＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、およびＣＨＯ細胞株、およびＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、ジャーカット細胞などのような様々なヒト細胞を含む。これらの細胞の発現ベクターは、複製起点、プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶｔｋプロモーターまたはｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター）、エンハンサー（Queen et al. Immunol. Rev, 89:49 (1986))、およびリボゾーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニレーション部位（例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原付加部位）、および転写終結配列のような必要なプロセッシング情報部位を含むことができる。
他の動物細胞は、例えば、American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (7th edition, (1992))から入手できる。昆虫細胞での本発明のタンパク質の発現に適したベクターは普通、バキュロウイルス由来である。昆虫細胞株は、Schneider細胞株（Schneider J., Embryol. Exp. Morphol., 27:353-365 (1987)を参照）のようなカの幼虫、カイコ、アワヨトウの幼虫、ガおよびショウジョウバエ細胞株を含む。上で示した様に、ベクター、例えば、宿主細胞を形質導入するために用いられるプラスミドは、好ましくは転写を開始するためのＤＮＡ配列、およびタンパク質の翻訳を制御する配列を含有する。これらの配列は、発現制御配列として言及される。酵母と同様に、より高等動物宿主細胞を利用すると、既知の哺乳類遺伝子由来のポリアデニル化または転写終結配列が、ベクターに取り込まれることを必要とする。終結配列の実施例は、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化配列である。転写物の正確なスプライシング配列がまた含まれる。スプライシング配列の実施例は、ＳＶ４０由来のＶＰ１イントロンである（Sprague, J. et al., J. Virol. 45: 773-781 (1983)）。加えて、宿主細胞で複製を制御する遺伝子配列は、Saveria-Campo, M., 1985, ”Bovine Papilloma virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector” in DNA Cloning Vol. II a Practical Approach Ed. D.M. Glover, IRL Press, Arlington, Virginia pp. 213-238であり得る。宿主細胞は、様々な方法による形質導入の要素または与えられた要素である。動物細胞内にＤＮＡを導入するよく知られた、いくつかの方法がある。これらは、カルシウムリン酸塩沈殿、ＤＮＡを含有する細菌性プロトプラストとの受け入れ細胞の融合、ＤＮＡを含有するレポソームでの受け入れ細胞の処理、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーションおよび細胞内へのＤＮＡ直接微量注入を含む。
形質導入細胞は、当分野においれ既知の方法により培養される（”Biochemical Methods in Cell Culture and Virology”, Kuchler, R.J., Dowden, Hutchinson and Ross, Inc., (1977)）。発現ポリペプチドは、懸濁または単層培養として育てられた細胞から単離される。後になって、よく知られた機会的方法、化学的方法または酵素的方法により回復させる。
組換えタンパク質を発現させる一般的方法はまた、既知であり、およびR. Kaufman, ”Methods in Enzymology”185, 537-566 (1990)に例示されている。本明細書において定義されるように、「作用可能に結合」は、プロモーターがＤＮＡ配列の転写を仲介するようにＤＮＡ配列より上流のプロモーターの連鎖に言及する。特に、「作用可能に結合」は、本発明の単離ポリヌクレオチドおよび発現制御配列がタンパク質をコード化する遺伝子が連鎖したポリヌクレオチド／発現配列で形質導入（形質移入）された宿主細胞により発現される方法で、ベクターまたは細胞内に位置することを意味する。用語「ベクター」は、ウイルス発現システム、自己増殖複製環状ＤＮＡ（プラスミド）に言及し、かつ両発現および非発現プラスミドを含む。
本明細書において用いられる用語「遺伝子」は、ポリペプチドをコード化する核酸配列に言及することを意図する。この定義は、様々な配列多型性、変異、および／またはかかる変化が遺伝子産物の機能に作用しない配列変異体を含む。用語「遺伝子」は、コード配列だけでなく、プロモーター、エンハンサー、終結領域、および類似の非翻訳ヌクレオチド配列も含むことを意図する。用語は、全イントロンおよび選択的スプライス部位から生じる変異体と一緒にｍＲＮＡからスプライスした他のＤＮＡ配列をさらに含む。
多くのタイプの細胞は、タンパク質発現のため適当な宿主細胞として働き得る。哺乳類宿主細胞は、例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト上皮Ａ４３ １細胞、ヒトＣｏ１０２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、他の形質導入された霊長類細胞、正常二倍体細胞、プライマリー組織のインビトロでの培養由来の細胞株、一次の移植片、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはジャーカット細胞を含む。または、酵母のようなより下等な真核細胞または細菌のような原核細胞でのタンパク質を産生する可能性であり得る。潜在的に適当な酵母菌株は、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces 菌株、Candidaまたは異種性タンパク質を発現可能な任意の酵母菌株を含む。潜在的に適当な細菌株は、Escherichia coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、または異種性タンパク質を発現可能な任意の細菌株を含む。該タンパク質が酵母または細菌で作られると、例えば、適当な部位のリン酸化またはグリコシル化により、機能的タンパク質を得るためにそれらの中で産生されたタンパク質を修飾する必要がありうる。
タンパク質はまた、１またはそれ以上の昆虫発現ベクターの適当な制御配列に本発明の単離ポリヌクレオチドを作用可能に結合させることにより、および昆虫発現システムを利用することにより産生され得る。バキュロウィルス発現システム／昆虫細胞発現システムの材料および方法は、例えば、Invitrogen, San Diego, California, U.S.A. （MaxBac［登録商標］キット）のキット型で市販され、かつかかる方法は、参考により本明細書に取り込まれる、Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)に記載される様に当分野においてよく知られている。本明細書において用いられるように、本発明のポリヌクレオチドを発現可能な昆虫細胞が「形質導入」される。本発明のタンパク質は、組換えタンパク質を発現するのに適した培養条件下で形質導入宿主細胞を培養することにより調製され得る。
本発明の多型タンパク質はまた、例えば、タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含有する体細胞または精細胞により特徴付けられるトランスジェニックウシ、ヤギ、ブタ、またはヒツジのミルクの成分のようなトランスジェニック動物の産物として発現される。タンパク質はまた、既知の従来の化学合成により産生され得る。合成方法により本発明のタンパク質を構築する方法は、当業者に知られている。
組換えＤＮＡ技術により産生された多型タンパク質は、組換えタンパク質を単離または精製するために普通に使用される技術により精製され得る。組換え的に産生されたタンパク質は、直接的に発現または融合タンパク質として発現され得る。タンパク質は、続いて細胞溶解（例えば、超音波処理）とアフィニティークロマトグラフィーとの組み合わせにより精製される。融合産物のため、適当なタンパク質分解酵素での融合タンパク質の引き続いての切断が、必要なポリペプチドを放出する。本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムのような物質との選択的沈殿、カラムクロマトグラフィー、免疫精製法などを含む、当分野において良く知られた標準的技術により実質的純度となるよう精製されうる。例えば、参考により全体として本明細書に取り込まれる、R. Scopes, ”Protein Purification: Principles and Practice”, Springer-Verlag: New York (1982)を参照されたい。例えば、実施態様において、抗体は本明細書において記載される様に本発明のタンパク質に対して生じ得る。細胞膜は、組換えタンパク質を発現する細胞株から単離され、該タンパク質は膜から抽出されて免疫沈降される。タンパク質は、続いて上述のように標準タンパク質化学技術によりさらに精製され得る。
生じた発現タンパク質は、ゲルフィルトレージョンおよびイオン交換クロマトグラフィーのような既知の精製方法を用いてかかる培養（すなわち、培養液または細胞抽出物）から続いて精製され得る。タンパク質の精製はまた、タンパク質に結合する物質を含有するアフィニティーカラムを含む；コンカナバリンＡアガロース、ヘパリン−トヨパール＠またはチバクロンブルー３ＧＡセファロースＢのようなアフィニティー樹脂にわたる１またはそれ以上のカラムステップ；フェニルエーテル、ブチルエーテル、またはプロピルエーテルのような樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィー、または免疫親和性クロマトグラフィーを含む１またはそれ以上のステップ。または、本発明のタンパク質はまた、精製を促進する型で発現され得る。例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシン（ＴＲＸ）のもののような融合タンパク質として発現され得る。かかる融合タンパク質の発現および精製のキットは、New England BioLab (Beverly, MA)、Pharmacia (Piscataway, NJ)およびInVitrogenからそれぞれ市販されている。タンパク質はまた、エピトープで標識され、かつ続いてかかるエピトープに向く特異的抗体を用いて精製され得る。かかるエピトープ（「Ｆｌａｇ」）は、Kodak (New Haven, CT)から市販されている。最終的に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えば、ペンダントメチルまたは他の脂肪族残基を有するシリカゲルを利用する１またはそれ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ステップを利用して、タンパク質をさらに精製することができる。様々な組合せの上述の精製ステップのいくつかまたは全てを利用して、実質的に均一な単離組換えタンパク質も供給し得る。従って、精製されたタンパク質は、他の哺乳類タンパク質が実質的になく、かつ本発明に基づき「単離タンパク質」として定義される。
本明細書において用いられる様に用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫的に活性な部分、すなわち、多型の様な抗原に特異的に結合する（免疫作用する）抗原結合部位を含有する分子に言及する。かかる抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、１本鎖、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーを含むが、これらに制限されない。特定の実施態様において、ヒト多型タンパク質に対する抗体が開示される。
タンパク質またはペプチドに言及する際の用語、抗体に「特異的に結合」、「免疫特異的に結合」または「特異的に免疫反応する」は、タンパク質および他の生物学的物質の異種性個体群の存在下でのタンパク質の存在の決定である結合反応に言及する。従って例えば、指定された免疫アッセイ条件下で、特異化抗体は特定のタンパク質に結合するが、試料中に存在する他のタンパク質には十分な量でも結合しない。 かかる条件下での抗体への特異的結合は、特定タンパク質の特異性について選択される抗体を必要とし得る。本発明の該特定の抗体は、多型タンパク質に免疫特異的に結合するが同族野生型対立遺伝子タンパク質には結合しない、またはその逆の抗体である。様々な免疫アッセイフォーマットを用いて、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択し得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイを日常的に用いて、タンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体が選択される。特異的免疫反応を測定するために用いられうる免疫アッセイフォーマットおよび条件の考察のため、Harlow and Lane （1988） ”Antibodies, a Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Publications, New Yorkを参照されたい。
多型遺伝子産物には免疫特異的に結合するが、対応遺伝子型または「野生型」遺伝子産物には結合しないポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体も提供される。抗体は、変異体遺伝子産物または合成ペプチドでのマウスまたは他の動物への注入により作成され得る。モノクローナル抗体は、例えば、Harlow & Lane, ”Antibodies, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press, New York (1988); Goding, ”Monoclonal Antibodies, Principles and Practice” (2d ed.) Academic Press, New York (1986)に記載される様にスクリーニングされる。モノクローナル抗体は、変異体遺伝子産物との特異的免疫活性および対応する原型遺伝子産物に対する免疫活性の欠如について試験される。
単離多型タンパク質、またはそれらの一部またはフラグメントは、免疫原として用いられて、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体調製の標準技術を用いて多型タンパク質を結合する抗体を生成し得る。全長多型タンパク質が用いられるか、または本発明は免疫原としての使用のため多型抗原ペプチドフラグメントを提供する。本発明の多型タンパク質の抗原ペプチドは、多型アミノ酸を包含するアミノ酸配列の少なくとも８アミノ酸残基を含み、かつペプチドに対して生じる抗体が多型タンパク質との特異的免疫複合体を形成するような多型タンパク質のエピトープを包含する。好ましくは、抗原ペプチドは少なくとも１０アミノ酸残基を含み、さらに好ましくは少なくとも１５アミノ酸残基、なおさらに好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基、そして最も好ましくは少なくとも３０アミノ酸残基を含む。抗原ペプチドにより包含される好ましいエピトープは、タンパク質の表面、例えば、親水性領域に位置する多型領域である。
ポリクローナル抗体の産生のため、様々な適当な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の動物）が、多型タンパク質での注入により免疫され得る。適当な免疫性標本は、例えば、組換え発現多型タンパク質または化学合成多型ポリペプチドを含有しうる。標本はアジュバントをさらに含み得る。様々なアジュバントを用いて、フロイント（完全および不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、表面活性化物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノール等）、Bacille CalmetteGuerinおよびCorynebacterium parvumのようなヒトアジュバント、または同様の免疫刺激性物質を含むがこれらに制限されない免疫反応を増加する。必要なら、多型タンパク質に対して向く抗体分子が哺乳類から（例えば、血液から）単離され、そしてＩｇＧフラクションを得るためのタンパク質Ａクロマトグラフィーのような良く知られた技術によりさらに精製される。
本明細書において用いられるように、用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単一のハイブリドーマ細胞クローンから起こり、かつ多型タンパク質の特定のエピトープと免疫反応が可能な抗原結合部位の１タイプのみを含有する抗体分子群に言及する。従って、モノクローナル抗体組成物は典型的に、それが免疫反応するものを有する特定の多型タンパク質に対する単一結合アフィニティーを表す。特定の多型タンパク質、または誘導体、フラグメント、類似体またはそれらの相同体に向くモノクローナル抗体の調製のため、連続的な細胞株培養により抗体分子の調製を提供する任意の技術が利用されうる。かかる技術は、ハイブリドーマ技術（Kohler & Milstein, 1975 Nature 256: 495497を参照）；トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72を参照）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole, et al., 1985 In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 7796を参照）を含むが、こららに制限されない。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施で用いられうるし、かつヒトハイブリドーマを用いることにより（Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 20262030を参照）またはインビトロでEpstein Barr VirusでのヒトＢ細胞を形質導入することにより（Cole, et al., 1985 In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 7796を参照）産生され得る。
本発明により、技術は多型タンパク質に特異的な１本鎖抗体の産生に適応し得る（例えば、米国特許番号４，９４６，７７８を参照）。加えて、方法がＦａｂ発現ライブラリー（例えば、Huse, et al., 1989 Science 246: 12751281を参照）の構築に適応され、多型タンパク質または誘導体、フラグメント、類似体またはそれらの相同体に必要な特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速な同定および効果的な同定を可能とし得る。非ヒト抗体は、当分野において良く知られた技術により「ヒト化」されることができる。例えば、米国特許番号５，２２５，５３９を参照されたい。多型タンパク質のイディオタイプを含有する抗体フラグメントは、：（ｉ）抗体分子のペプシン切断により産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ii）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋の還元により生成されるＦａｂフラグメント；（iii）パパインでの抗体分子の処理および物質の還元により生成されるＦａｂフラグメントおよび（iv）Ｆｖフラグメントを含むがこれらに制限されない、当分野において既知の技術により産生され得る。
加えて、標準的組換えＤＮＡ技術を用いて作られる、ヒトおとび非ヒト部分を両方含むキメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体のような組換え抗多型タンパク質抗体は、本発明の範囲内である。かかるキメラ抗体およびヒトモノクローナル抗体は、当分野で既知の組換えＤＮＡ技術、例えば、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；ヨーロッパ特許出願番号１８４，１８７；ヨーロッパ特許出願番号１７１，４９６；ヨーロッパ特許出願番号１７３，４９４；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ８６／０１５３３；米国特許番号４，８１６，５６７；ヨーロッパ特許出願番号１２５，０２３； Better et al. (1988) Science 240:10411043；Liu et al. (1987) PNAS 84:34393443；Liu et al. (1987) J Immunol. 139:35213526；Sun et al. (1987) PNAS 84:214218；Nishimura et al. (1987) Cancer Res 47:9991005；Wood et al. (1985) Nature 314:446449；Shaw et al. (1988) J Natl Cancer Inst 80:15531559)；Morrison(1985) Science 229:12021207；Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214；米国特許番号５，２２５，５３９；Jones et al. (1986) Nature 321:552525；Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534；およびBeidler et al. (1988) J Immunol 141:40534060に記載される方法を用いて産生され得る。
ある実施態様において、望まれる特異性を有する抗体のスクリーニングの方法は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）および当分野において既知の他の免疫学的に仲介される技術を含むが、これらに制限されない。
抗多型タンパク質抗体は、検出、定量および／または多型タンパク質の細胞局在性または組織局在性に関する分野内で知られる方法で用いられ得る（例えば、適当な生理学試料内の多型タンパク質レベルの測定での使用、診断方法での使用、タンパク質のイメージ化での使用等）。与えられる実施態様において、抗体由来のＣＤＲを含有する、多型タンパク質、または誘導体、フラグメント、類似体またはそれらの相同体に対する抗体は、対象のｃＳＮＰ対立遺伝子の存在から生じる対象の病態を処置することを意図される治療応用において薬理学的に活性な化合物として利用される。
抗多型タンパク質抗体（例えば、モノクローナル抗体）を用いて、免疫親和性クロマトグラフィーまたは免疫沈降のような様々な免疫化学技術により多型タンパク質を単離し得る。抗多型タンパク質抗体は細胞由来の天然の多型タンパク質および宿主細胞内で発現する組み換え生成された多型タンパク質の精製を促進し得る。さらに、抗多型タンパク質抗体を用いて、多型タンパク質の発現の異常またはパターンを評価するために多型タンパク質（例えば、細胞可溶化物または細胞上清）を検出し得る。抗多型抗体を診断的に用いて、例えば、与えられた処置計画の効果を測定するため、臨床試験方法の一部として組織中のタンパク質のレベルをモニターできる。検出は、検出可能基質への抗体の結合（すなわち、物理的に結合）により促進され得る。検出可能な基質の例は、様々な酵素、接合団、蛍光物質、生物発光物質、および放射性物質を含む。適当な酵素の例としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを挙げ得る；適当な接合団の実施例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを挙げ得る；適当な蛍光物質の実施例としては、ウンベリフェロン、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレッセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンを挙げ得る；発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを挙げ得るし、適当な放射性物質の例しては１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを挙げ得る。
核酸およびポリペプチド
本発明のある態様は、ＮＯＶ１ポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性な部分をコード化する単離核酸分子に関する。ＮＯＶ１コード化核酸（例えば、ＮＯＶ１ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いるのに十分な核酸フラグメント、およびＮＯＶ１核酸分子の増幅および／または変異のためのＰＣＲプライマーとして用いられるフラグメントも本発明に含まれる。本明細書において用いられる用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体を用いて生成されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体、およびそれらの誘導体、フラグメントおよび相同体を含むことを意図する。核酸分子は１本鎖または２本鎖であり得るが、好ましくは２本鎖ＤＮＡを含む。
ＮＯＶ１核酸は成熟型ＮＯＶ１ペプチドをコード化し得る。本明細書において用いられる様に、本明細書において開示されるポリペプチドまたはタンパク質の成熟型は天然に存在するポリペプチドまたは前駆体型またはプロタンパク質の産物である。天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質は、対応する遺伝子によりコード化される全長遺伝子産物を含むが、これに制限されない。または、それは本明細書において記載されるＯＲＦによりコード化されるポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質として定義され得る。産物「成熟型」は遺伝子産物が生じる細胞、または宿主細胞内で起こり得る様な１またはそれ以上の天然に存在するプロセッシングステップの結果として生じるが、これらに制限されない。ポリペプチドまたはタンパク質の成熟型を導くかかるプロセッシングステップの実施例は、ＯＲＦの開始コドンによりコード化されるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドまたはリーダー配列のタンパク質分解性の切断を含む。従って、残基１〜Ｎ（ここで、残基１はＮ末端メチオニンである）を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟型は、Ｎ末端メチオニンの除去後残存ずる残基Ｎを介して残基２を有する。または、残基１〜Ｎ（ここで、残基１〜ＭのＮ末端シグナル配列は切断されている）を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟型は残存する残基Ｎに対する残基Ｍ＋１由来の残基を有す。さらに本明細書において用いられる様に、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型は、タンパク質分解性切断現象以外の翻訳後修飾のステップから生じ得る。かかる別のステップは、グリコシル化、ミリストイル化またはリン酸化を含むが、これらの実施例に制限されない。一般的に、成熟型ポリペプチドまたはタンパク質は、これらのプロセスの１つのみ、またはそれらのいずれかの組合せの操作から生じ得る。
本明細書において利用される様に用語「プローブ」は、可変長の核酸配列、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、１００ｎｔ、または例えば、特異的な使用に依存する約６，０００ｎｔと同数の核酸配列について言及する。プローブは、同一、類似、または相補的核酸配列の検出において使用される。天然供給源または組換え供給源から普通に得られるより長いプローブは、より短い長さのオリゴマーより非常に特異的にハイブリダイズし、ずっとゆっくりハイブリダイズする。プローブは、一本鎖または二本鎖であることができ、ＰＣＲ、膜ベースのハイブリダイゼーションテクノロジー、またはＥＬＩＳＡ様テクノロジーにおいて特異性を有するようにデザインされ得る。
本明細書において用いられる様に用語「単離」核酸分子は、核酸の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。単離核酸分子の実施例は、制限されることなく、ベクターに含有される組換えＤＮＡ分子、異種性宿主細胞中で維持される組換えＤＮＡ分子、部分的または実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含む。好ましくは、「単離」核酸は、核酸がもたらされる生物のゲノムＤＮＡ中の天然の隣接核酸（すなわち、核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）である配列がないものである。例えば、様々な実施態様において、単離ＮＯＶ１核酸分子は、核酸がもたらされるもの由来の細胞／組織のゲノムＤＮＡ中の天然の隣接核酸分子である約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有できる。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は、組換え技術により生成された場合、他の細胞の物質または培養上清、または化学的に合成された場合、化学物質前駆体または他の化学物質が実質的にないものであり得る。
本発明の核酸分子、例えば、配列番号：１のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはこの上述のヌクレオチド配列の相補的配列は、標準分子生物学的技術および本明細書において提供される配列情報を用いて単離され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして配列番号：１の核酸配列の全てまたは一部を用いて、ＮＯＶ１分子は、標準ハイブリダイゼーションおよびクローニング技術を使用して単離され得る（例えば、Sambrook et al., (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989;および Ausubel, et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993に記載される）。
本発明の核酸は、鋳型および適切なオリゴヌクレオチドプライマーとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、代わりにゲノムＤＮＡを用いて、標準ＰＣＲ増幅技術により増幅され得る。増幅された核酸は、適切なベクターにクローン化され、ＤＮＡ配列解析により特徴付けられることができる。さらに、ＮＯＶ１ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準合成技術、例えば、自動ＤＮＡ合成機により準備されることができる。
本明細書において用いる様に、用語「オリゴヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドがＰＣＲ反応に用いられるために十分な数のヌクレオチド塩基を有する連鎖ヌクレオチドのシリーズに言及する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列に基づくか、またはそれからデザインされ、特定の細胞または組織中の同一、類似または相補的ＤＮＡまたはＲＮＡの存在を増幅、確認、または明らかにするために用いられる。オリゴヌクレオチドは、長さ約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔ、好ましくは長さ約１５ｎｔから３０ｎｔを有する核酸配列の一部を含む。本発明のある実施態様において、長さ１００ｎｔ未満の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、配列番号：１の少なくとも６連続ヌクレオチド、またはそれらの相補的配列をさらに含む。オリゴヌクレオチドは化学的に合成され得るしかつプローブとして用いられ得る。
別の実施態様において、本発明の単離核酸分子は、配列番号：１において示されるヌクレオチド配列の相補体、またはこのヌクレオチド配列の部分（例えば、プローブまたはプライマーとして用いられ得るフラグメント、またはＮＯＶ１ポリペプチドの生物学的に活性な部分をコード化するフラグメント）である核酸分子を含む。番号：１に
おいて示されるヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号：１において示されるヌクレオチド配列にほとんどミスマッチなしで、または全くミスマッチなしで水素結合し、それにより安定的な２本鎖を形成する配列番号：１において示されるヌクレオチド配列に十分に相補的なものである。
本明細書において使用する、用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のWatson-Crick型塩基対またはHoogsteen型塩基対に言及し、用語「結合」は、２つのポリペプチドまたは化合物または関連ポリペプチドまたは化合物、またはそれらの組合せの物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン結合、非イオン結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用等を含む。物理的相互作用は、直接的または非直接的のいずれかであり得る。非直接的相互作用は、別のポリペプチドまたは化合物の作用を介したものであるか、またはそれに起因したものである。直接的結合は、別のポリペプチドまたは化合物の作用を介しては生じないか、またはそれに起因しない相互作用に言及するが、それよりむしろ他の実質的な化学中間体なしである。
本明細書において提供されるフラグメントは、核酸の少なくとも６（隣接）核酸または少なくとも４（隣接）アミノ酸の配列として、それぞれ核酸の場合の特異的ハイブリダイゼーション、またはアミノ酸の場合のエピトープの特異的認識を可能とするのに十分な長さを定義し、多くても全長配列より短い部分である。フラグメントは、核酸またはアミノ酸配列の任意の隣接部分の選択に由来する。誘導体は、直接的、修飾、部分的な置換のいずれかにより天然の化合物から形成された核酸配列またはアミノ酸配列である。類似体は、天然の化合物に類似だが同一でない構造を有するが、ある成分または側鎖に関してそれと異なる核酸配列またはアミノ酸配列である。類似体は、合成であるか、または異なる進化起源由来であり得るし、かつ野生型と比較し類似または逆の代謝活性を有し得る。相同体は、異なる種由来の特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
誘導体および類似体は、誘導体または類似体が以下に記載する様に修飾核酸またはアミノ酸を含有する場合、全長または全長以外であり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体または類似体は、限定されることなく、様々な実施態様において、同一サイズの核酸またはアミノ酸の少なくとも約７０％、８０％、または９５％と同一性（好ましくは８０〜９５％の同一性を有する）により、またはアラインメントが当分野において既知のコンピューター相同プログラムによりなされる整列配列に比較した場合、本発明の核酸またはタンパク質に実質的に相同な領域を含む分子、または厳密、中厳密、または低厳密条件下で上述のタンパク質をコード化する配列の相補的配列にハイブリダイズする能力があるそのコード化核酸を含む。例えば、Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993、および以下を参照されたい。
「相同核酸配列」または「相同アミノ酸配列」、またはそれらの誘導体は、上述した様にヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの相同性により特徴付けられる配列に言及する。相同ヌクレオチド配列は、ＮＯＶ１ポリペプチドのアイソフォームをコードするこれらの配列をコード化する。アイソフォームは、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果として同一生物の異なる組織において発現し得る。または、アイソフォームは、異なる遺伝子によりコード化され得る。本発明において、相同ヌクレオチド配列は、限定されることなく、脊椎動物、従って例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、および他の生物を含む得るヒト以外の種のＮＯＶ１ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む。相同ヌクレオチド配列はまた、制限されることなく、本明細書において設定されるヌクレオチド配列の天然に存在する対立遺伝子バリエーションおよび変異を含む。しかしながら、相同ヌクレオチド配列は、ヒトＮＯＶ１タンパク質をコード化する正確なヌクレオチド配列を含まない。相同核酸配列は、配列番号：１の保存的アミノ酸置換（以下を参照）、ならびにＮＯＶ１の生物学的活性を有するポリペプチドをコード化するそれらの核酸配列を含む。ＮＯＶ１タンパク質の様々な生物学的活性は、以下に記載される。
ＮＯＶ１ポリペプチドは、ＮＯＶ１核酸のオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）によりコード化される。ＯＲＦは、ポリペプチドに潜在的に翻訳され得るヌクレオチド配列に対応する。ＯＲＦを含む核酸の伸長は、停止コドンによっては中断されない。全長タンパク質のコード配列を表すＯＲＦはＡＴＧ「開始」コドンで開始され、かつＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡと名づけられる３つの「停止」コドンの１つで終結する。本発明の目的のため、ＯＲＦは開始コドン、停止固コドン、または両方を有するまたは有さないコード配列の任意の部分であり得る。本物の細胞タンパク質をコードする良い候補物質として考えられるべきＯＲＦのため、最小サイズの要求はしばしば、例えば、５０アミノ酸またはそれ以上のタンパク質をコード化するＤＮＡの伸長をセットする。
ヒトＮＯＶ１遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列は、他の細胞タイプ、例えば、他の組織由来のＮＯＶ１相同体、ならびに他の脊椎動物由来のＮＯＶ１相同体の同定および／またはクローニングにおいて使用するためにデザインされるプローブおよびプライマーの生成を可能とする。プローブ／プライマーは、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを典型的に含む。オリゴヌクレオチドは、配列番号：１の少なくとも約１２、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００の連続センス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号：１のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号：１の天然に存在する突然変異体に厳密な条件下でハイブリダイズするヌクレオチドの領域を典型的に含む。
ヒトＮＯＶ１ヌクレオチド配列に基づくプローブを用いて、転写物、または同一タンパク質または相同タンパク質をコード化するゲノム配列を検出できる。様々な実施態様において、プローブは、それらに結合する標識群、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素補助因子であり得るラベル群をさらに含む。かかるプローブを、対象由来の細胞試料中のＮＯＶ１コード化核酸のレベルを測定すること、例えば、ＮＯＶ１ｍＲＮＡレベルを測定すること、またはゲノムＮＯＶ１遺伝子を突然変異したか、または欠損するか否かを決定することにより、ＮＯＶ１タンパク質を異所性発現する細胞または組織の同定のための診断試験キットの一部として用いることができる。
「ＮＯＶ１ポリペプチドの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」は、用量依存性であるまたは依存性でない特定の生物学的アッセイにおいて測定される様に、成熟型を含む本発明のポリペプチドの活性に類似だが同一である必要のない活性を表すポリペプチドに言及する。「ＮＯＶ１の生物学的に活性な部分」をコード化する核酸フラグメントを、ＮＯＶ１の生物学的活性（ＮＯＶ１タンパク質の生物学的な活性は、以下に記載する）を有する、ＮＯＶ１タンパク質のコード化部分を発現する（例えば、インビトロでの組換え発現により）、およびＮＯＶ１のコード化部分の活性を評価するポリペプチドをコード化する配列番号：１の部分を単離することにより調製され得る。
核酸およびポリペプチド変異体
本発明は、遺伝子コードの縮重に起因する配列番号：１において示されるヌクレオチド配列と異なり、かつ配列番号：１において示されるヌクレオチド配列によりコード化ｓれるものと同一のＮＯＶ１タンパク質をコード化する核酸分子をさらに包含する。別の実施態様において、本発明の単離核酸分子は、配列番号：２において示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化するヌクレオチド配列を有する。
配列番号：１において示されるヒトＮＯＶ１ヌクレオチド配列に加えて、ＮＯＶ１ポリペプチドのアミノ酸配列の変化を導くＤＮＡ配列多型は、集団内（例えば、ヒト集団）に存在し得ることは、当業者により認識されるであろう。ＮＯＶ１遺伝子のかかる遺伝子多型は、天然の対立遺伝子のバリエーションに起因して集団内の個体間で存在し得る。本明細書において使用する、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＮＯＶ１タンパク質、好ましくは脊髄動物ＮＯＶ１タンパク質をコード化するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子に言及する。かかる天然の対立遺伝子のバリエーションは、典型的に、ＮＯＶ１遺伝子のヌクレオチド配列の１〜５％バリエーションとなり得る。かかるヌクレオチドバリエーションのいずれかおよび全ては、天然の対立遺伝子バリエーションの結果物であり、かつＮＯＶ１ポリペプチドの機能活性を変化させないＮＯＶ１ポリペプチド中の結果として生じるアミノ酸多型性は、本発明の範囲内にあることを意図される。
さらに、他の種由来のＮＯＶ１タンパク質をコード化する核酸分子、およびゆえにヒト配列番号：１と異なるヌクレオチド配列を有する核酸は、本発明の範囲内であることを意図される。天然の対立遺伝子変異体に対応する核酸分子および本発明のＮＯＶ１ｃＤＮＡの相同体は、本明細書において開示されるヒトＮＯＶ１核酸に対する相同性に基づき、厳密なハイブリダイゼーション条件下の標準ハイブリダイゼーション技術によるハイブリダイゼーションプローブとして、ヒトｃＤＮＡ、またはそれらの一部を用いて単離され得る。
または、別の実施態様において、本発明の単離核酸分子は、少なくとも長さ６ヌクレオチドであり、配列番号：１のヌクレオチド配列を含む核酸分子に厳密な条件下でハイブリダイズする。別の実施態様において、核酸は、少なくとも長さ１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、または２０００またはそれ以上のヌクレオチドである。なお別の実施態様において、本発明の単離核酸分子は、コード領域にハイブリダイズする。本明細書において用いられる様に、用語「厳密な条件下でハイブリダイズする」は、互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が、典型的に互いにハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記載することを意図される。
相同体（すなわち、ヒト以外の種由来のＮＯＶ１タンパク質をコード化する核酸）または他の関連配列（例えば、パラログ）は、核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングの当分野においてよく知られた方法を用いるプローブとして、特定のヒト配列の全部または一部との低厳密、中程度厳密、または高厳密なハイブリダイゼーションにより得られることができる。
本明細書において用いられる様に、語句「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドがその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件に言及する。厳密な条件は、配列依存性であり、違った状況で異なるものである。長い配列は、短い配列より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般的に、厳密な条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで特異的な配列の温熱性融解温度（Ｔｍ）より約５度低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である（定義されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度の下）。標的配列は、一般に過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、プローブの５０％が平衡状態で占められる。典型的に、厳密な条件は、塩濃度が約１．０Ｍのナトリウムイオン未満であり、典型的にはｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）、および温度は短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）のために少なくとも約３０℃であり、より長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドのために少なくとも約６０℃である。厳密な条件は、ホルムアミドの様な不安定試薬の添加でも成し遂げられ得る。
厳密な条件は、当業者にとって既知であり、Ausubel, et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.16.3.6において見られる。好ましくは、条件は、互いに少なくとも約６５％、７０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％相同である配列が、典型的に互いに結合したままである様な条件である。厳密な条件の非制限の実施例は、６５℃で６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩バッファー中でのハイブリダイゼーションであり、５０℃で０．２×ＳＳＣ、０．０１％ＢＳＡ中での１回またはそれ以上の洗浄が続く。配列番号：１の配列に厳密な条件下でハイブリダイズする本発明の単離核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書において用いられる様に、「天然に存在する」核酸分子は、天然において生じるヌクレオチド配列（例えば、天然のタンパク質をコード化する）を有するＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子に言及する。
第２の実施態様において、配列番号：１のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはフラグメント、それらの類似体または誘導体に中程度厳密な条件下でハイブリダイズすることが可能である核酸配列が提供される。中程度厳密なハイブリダイゼーション条件の非制限の実施例は、５５℃で６×ＳＳＣ、５×デンハート液、０．５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリダイゼーションであり、３７℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回またはそれ以上の洗浄が続く。用いられ得る中程度厳密な他の条件は、当分野においてよく知られている。例えば、Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, and Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYを参照されたい。
第３の実施態様において、配列番号：１のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはフラグメント、それらの類似体または誘導体に低厳密な条件下でハイブリダイゼーションする核酸が提供される。低厳密なハイブリダイゼーション条件の非制限の実施例は、４０℃で３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（wt/vol）デキストラン硫酸中でのハイブリダイゼーション、５０℃で２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳ中での１回またはそれ以上の洗浄が続く。用いられ得る低厳密な他の条件は、当分野においてよく知られている（例えば、異種間ハイブリダイゼーションに用いられる様に）。例えば、Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY、およびKriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; Shilo and Weinberg, 1981, Proc Natl Acad Sci USA 78: 67896792を参照されたい。
保存的変異
集団中に存在し得るＮＯＶ１配列の天然に生じる対立遺伝子変異体に加えて、当業者は、変更が配列番号：１のヌクレオチド内への変異により誘導され得ること、それにより該ＮＯＶ１タンパク質の機能的能力を変えることなくコード化ＮＯＶ１タンパク質のアミノ酸配列の変更を導き得ることをさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換を導くヌクレオチド置換は、配列番号：２の配列において起こり得る。「非必須」アミノ酸残基は、「必須」アミノ酸残基は、かかる生物学的活性を必要とするのに、生物学的活性を変えることなくＮＯＶ１タンパク質の野生型配列から変更され得る残基である。例えば、本発明のＮＯＶ１タンパク質間で保存されるアミノ酸残基は、変更に特に従わないものであると予測される。保存的置換がなされ得るアミノ酸は当分野において良く知られている。
本発明の別の態様は、活性に必須でないアミノ酸残基での変化を含有するＮＯＶ１タンパク質をコード化する核酸分子に関する。かかるＮＯＶ１タンパク質は、配列番号：１由来のアミノ酸配列において異なり、生物学的活性は依然保持している。１つの実施態様において、単離核酸分子は、タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含み、該タンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列に対して少なくとも約４５％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、核酸分子によりコード化されるタンパク質は、配列番号：２に少なくとも約６０％相同であり、より好ましくは、配列番号：２に少なくとも約７０％相同であり：なおより好ましくは、配列番号：２に少なくとも約８０％相同であり；なおより好ましくは、配列番号：２に少なくとも約９０％相同であり；そして最も好ましくは、配列番号：２に少なくとも約９５％相同である。
配列番号：２のタンパク質に対するＮＯＶ１タンパク質相同体をコード化する単離核酸分子は、１またはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠損がコード化タンパク質に誘導される様な１またはそれ以上のヌクレオチド置換、配列番号：１のヌクレオチド配列への付加または欠損を導入することにより生成され得る。
変異は、部位指向変異誘発およびＰＣＲ仲介変異誘発のような標準技術により配列番号：１に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１またはそれ以上の予測非必須アミノ酸残基でもたらされる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で取って代わられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野において定義されてきた。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷の極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。従って、ＮＯＶ１タンパク質中の予測非必須アミノ酸残基は、同一の側鎖ファミリーから別のアミノ酸残基で取って代わる。または、別の実施態様において、変異は、飽和変異誘発によるようなＮＯＶ１コード化配列の全部または一部に沿って、ランダムに導入され、結果として生じる変異は、ＮＯＶ１の生物学的活性をスクリーニングして、活性を保持する変異を同定することができる。配列番号：１の変異誘発に続くコード化タンパク質を、当分野において既知の任意の組換え技術により発現させることができ、かつタンパク質の活性は決定され得る。
アミノ酸ファミリーの関係はまた、側鎖の相互作用に基づき決定され得る。置換されたアミノ酸は、完全に保存された「強い」残基または完全に保存された「弱い」残基であり得る。保存されたアミノ酸残基の「強い」群は、以下の群：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷのいずれか１つであり得、ここで一文字のアミノ酸コードは互いに置換され得るアミノ酸によりグループ化され得る。同様に、保存された残基の「弱い」群は、以下の：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＶＬＩＭ、ＨＩＦＹのいずれか１つであり得、ここで、それぞれの群の文字は一文字アミノ酸コードを表す。
ある実施態様において、変異ＮＯＶ１タンパク質は、（i）タンパク質を形成する能力：タンパク質が他のＮＯＶ１タンパク質、他の細胞表面タンパク質、またはそれらの生物学的に活性な部分と相互作用する（ii）変異体ＮＯＶ１タンパク質とＮＯＶ１リガンドとの複合体形成；または（iii）変異体ＮＯＶ１タンパク質が細胞内標的タンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分に結合する能力；（例えば、アビジンタンパク質）についてアッセイされ得る。
なお別の実施態様において、変異体ＮＯＶ１タンパク質は、特異的生物学的機能（例えば、インスリン放出の制御）を制御する能力についてアッセイされ得る。
アンチセンス核酸
本発明の別の態様は、配列番号：１のヌクレオチドを含む核酸分子、またはフラグメント、それらの類似体または誘導体にハイブリダイズ可能であるか、または相補的配列である単離アンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコード化する「センス」核酸に相補的配列（例えば、二本鎖ｃＤＮＡのコード鎖に相補的配列、またはｍＲＮＡに相補的な配列）であるヌクレオチド配列を含む。特定の態様において、アンチセンス核酸分子は、少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドまたは全ＮＯＶ１コード鎖、またはそれら部分のみに対する相補的配列を含むものを提供する。配列番号：２のＮＯＶ１タンパク質のフラグメント、相同体、誘導体および類似体をコード化する核酸分子、または配列番号：１のＮＯＶ１核酸配列に相補的なアンチセンス核酸は、さらに提供される。
１つの実施態様において、アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶ１をコード化するヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対するアンチセンスである。用語「コード領域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域に言及する。別の実施態様において、アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶ１タンパク質をコード化するヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対するアンチセンスである。用語「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されないコード領域に隣接する５’および３’配列（すなわち、５’および３’非翻訳領域にも言及する）に言及する。
本明細書において開示されるＮＯＶ１タンパク質をコード化するコード鎖配列を与えられ、本発明のアンチセンス核酸は、Watson and Crick型塩基対またはHoogsteen型塩基対のルールによりデザインされ得る。アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶ１ｍＲＮＡの全コード領域に相補的であり得るが、さらに好ましくは、ＮＯＶ１ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部のみに対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＶ１ｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に対して相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さ約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当分野において既知の方法を用いる化学合成または酵素ライゲーションを使用して構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に生じるオリゴヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増大するためにデザインされたまたはアンチセンスとセンス核酸間で形成される二本鎖の物理的安定性を増大するために様々に修飾されたヌクレオチドを用いて化学的に合成され得る（例えば、ホスホロチオネート誘導体およびヌクレオチドを置換されたアクリジンが用いられ得る）。
アンチセンス核酸を生成するために用いられ得る修飾ヌクレオチドの実施例は以下を含む：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシ水酸化メチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルエクノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルエクオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキヨシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。または、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンスの向きでサブクローンされた発現ベクターを用いて生物学的に生成され得る（すなわち、挿入核酸から転写されたＲＮＡは、該標的核酸に対するアンチセンス向きのものであり、以下の節においてさらに記載される）。
本発明のアンチセンス核酸分子は典型的には、対象に投与されるか、または細胞のｍＲＮＡおよび／またはＮＯＶ１タンパク質をコード化するゲノムＤＮＡと共にハイブリダイズするかまたは結合して、それにより（例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより）タンパク質の発現を阻害するように組織内で生成される。ハイブリダイゼーションは、安定二本鎖を形成するための通常のヌクレオチド相補的配列によるものであり、または、例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合において、二本鎖ヘリックスの大溝での特異的相互作用を介するものであり得る。本発明のアンチセンス核酸の投与経路の実施例は、組織部位での直接注入を含む。または、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的とするために修飾され、次に全身性に投与され得る。例えば、全身性投与のため、アンチセンス分子は、選択された細胞表面上で発現する受容体または抗原に特異的に結合するように（例えば、細胞表面の受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に対するアンチセンス核酸分子に結合することにより）修飾され得る。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記載するベクターを用いる細胞に送達され得る。十分な核酸分子を達成するために、アンチセンス核酸分子は強力なｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれるベクター構築物が好ましい。
さらに別の実施態様において、本発明のアンチセンス核酸は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、普通のβ−ユニットと反対で、鎖が互いに平行に走る相補的ＲＮＡとハイブリダイズする特異的な二本鎖を形成する。例えば、Gaultier et al. 1987 Nucleic Acids Res 15: 66256641を参照されたい。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド （例えば、Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res 15: 61316148を参照）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（例えば、Inoue et al. 1987 FEBS Lett 215: 327330を参照）を含み得る。
リボザイムおよびＰＮＡ部分
核酸の修飾は、実施例に限定されることなく、修飾塩基、および糖リン酸主鎖が修飾されるかまたは誘導される核酸を含む。これらの修飾は、例えば、対象での治療応用において核酸に結合するアンチセンスとして用いられ得るように、修飾された核酸の化学的安定性を増大するために少なくとも一部実行される。
ある実施態様において、本発明のアンチセンス核酸は、リボザイムである。リボザイムは、相補的領域を有するｍＲＮＡの様な一本鎖核酸を切断する能力のあるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子である。従って、リボザイムは（例えば、Haselhoff and Gerlach 1988 Nature 334:585591において記載されるハンマーヘッドリボザイム）を用いて、ＮＯＶ１ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによりＮＯＶ１ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。ＮＯＶ１コード化核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書において開示されるＮＯＶ１ｃＤＮＡ（すなわち、配列番号：１）のヌクレオチド配列に基づいてデザインされ得る。例えば、テトラヒメナＬ−１９ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体は、活性化部位のヌクレオチド配列が、ＮＯＶ１コード化ｍＲＮＡにおいて切断されるべきヌクレオチド配列に相補的配列であものに構築され得る。例えば、Cech等の米国特許番号４，９８７，０７１；およびCech等の米国特許番号５，１１６，７４２を参照されたい。または、ＮＯＶ１ｍＲＮＡを用いて、ＲＮＡ分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼを有する触媒性ＲＮＡを選択することができる。Bartel et al., (1993) Science 261:14111418を参照されたい。
代わりに、ＮＯＶ１遺伝子発現は、ＮＯＶ１核酸の制御領域（例えば、ＮＯＶ１プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的とすることにより阻害されて、標的細胞中のＮＯＶ１遺伝子の転写を妨げる３重ヘリックス構造を形成し得る。例えば、Helene. 1991 Anticancer Drug Des. 6: 56984; Helene. et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:2736；Maher 1992 Bioassays 14: 80715を一般に参照。
様々な実施態様において、ＮＯＶ１核酸は、塩基部分、糖部分またはリン酸主鎖で修飾され、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または可溶性を改善され得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸主鎖は、修飾されて、ペプチド核酸を生成し得る。例えば、Hyrup et al. 1996 Bioorg Med Chem 4: 523を参照されたい。本明細書において用いられる様に、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸主鎖が擬ペプチド主鎖により取って代わられ、４つの元々の核酸塩基のみ保持する核酸ミメティクス（例えば、ＤＮＡミメティクス）に言及する。ＰＮＡの天然の主鎖は、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的なハイブリダイゼーションを可能とすると見られてきた。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Hyrup et al.1996 ; PerryO'Keefe et al. 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1467014675に記載される様に、標準固相ペプチド合成プロトコールを用いて実行され得る。
ＮＯＶ１のＰＮＡは、治療応用および診断応用において用いられ得る。例えば、ＰＮＡは、遺伝子発現の配列特異的調節のためアンチセンスまたは抗原物質として、転写または翻訳の抑止を誘導、または複製を阻害することにより、用いられ得る。ＮＯＶ１のＰＮＡは、例えば、遺伝子の単一塩基対変異の解析において（例えば、ＰＮＡ指向性ＰＣＲｃｌａｍｐｉｎｇ法より；他の酵素との組合せにおいて用いられる場合の人工制限酵素、例えば、ＳＩヌクレアーゼ（上述のHyrup, et al., 1996を参照）として；またはＤＮＡ配列決定およびハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマー（上述のHyrup et al. (1996)；上述のPerry−O'Keefe (1996)を参照）としても用いられ得る。
別の実施態様において、ＮＯＶ１のＰＮＡは、親油性またはＰＮＡに対する他のヘルパー群と関連することにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成により、または当分野において既知の薬輸送のリボソームまたは他の技術の使用により例えば、安定性または細胞の取り込みを増強するために修飾され得る。例えば、ＮＯＶ１のＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組合せ得るものを生成され得る。かかるキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用することを可能とする一方で、ＰＮＡ部分は高結合親和性および特異性を提供する。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、核酸塩基間の多くの結合、および向きの点で選択される適当な長さのリンカーを用いて結びつき得る（上述のHyrup, et al., 1996を参照）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、上述のHyrup, et al., 1996およびFinn et al. 1996 Nucl Acids Res 24: 33573363に記載される様に実行されることができる。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準ホスホラミダイトカップリング化学反応、およびモディファイされたヌクレオシド類似体、例えば、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間で用いられ得る５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホラミダイトを用いて固体支持上で合成され得る。Mag et al. 1989 Nucl Acid Res 17: 597388を参照されたい。ＰＮＡモノマーは次に、段階的な方法でカップリングされ、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を産生する。上述のFinn et al. 1996を参照されたい。または、キメラ分子は、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントと共に合成され得る。例えば、Petersen et al. 1975 Bioorg Med Chem Lett 5: 111911124を参照されたい。
他の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、ペプチドの様な他の添加群（例えば、インビボにおいて宿主細胞受容体を標的とする）、または細胞膜を介する輸送を促進する物質（例えば、Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:65536556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648652; ＰＣＴ公開番号Ｗ０８８／０９８１０を参照）、または血管脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号Ｗ０８９／１０１３４を参照）を含み得る。加えて、オリゴヌクレオチドは、切断を引き起こすハイブリダイゼーション試薬（例えば、Krol et al., 1988, BioTechniques 6:958976を参照）または介在試薬（例えば、Zon, 1988, Pharm. Res. 5: 539549を参照）でモディファイされ得る。最後に、オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えば、ペプチド、クロスリンクを引き起こすハイブリダイゼーション試薬、輸送物質、切断を引き起こすハイブリダイゼーション試薬等と共役し得る。
ポリペプチド
本発明によるポリペプチドは、配列番号：２において提供される配列のＮＯＶ１ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明はまた、いずれかの残基が配列番号：２において示される対応する残基から変更されうるが、一方で依然としてＮＯＶ１活性および生理学的機能を維持するタンパク質またはそれらの機能的なフラグメントをコード化する変異体または変異体タンパク質を含む。
一般に、ＮＯＶ１様機能を維持するＮＯＶ１変異体は、配列の特定の位置の残基が、他のアミノ酸により置換された任意の変異体を含み、および別の残基または該タンパク質の２残基間の残基を挿入する可能性、ならびに該配列由来の１またはそれ以上の残基を欠く可能性をさらに含む。任意のアミノ酸置換、挿入、または欠損が本発明により包含される。好ましい場合において、置換は上で定義されたように保存的置換である。
本発明の１つの態様は、単離ＮＯＶ１タンパク質、およびそれらの生物学的に活性な部分、または誘導体、フラグメント、それらの類似体または相同体に関する。抗ＮＯＶ１抗体を生じる免疫原としての使用に適したポリペプチドフラグメントもさらに提供される。１つの実施態様において、天然のＮＯＶ１タンパク質は、標準タンパク質精製技術を用いる適当な精製スキームにより細胞または組織供給源から単離されることができる。別の実施態様において、ＮＯＶ１タンパク質は、組換えＤＮＡ技術により産生される。組換え発現の代わりに、ＮＯＶ１タンパク質またはポリペプチドは、標準ペプチド合成技術を用いて化学的に合成され得る。
「単離」または「精製」ポリペプチドまたはタンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分は、細胞の物質またはＮＯＶ１タンパク質がもたらされる細胞または組織供給源由来のタンパク質の混入が実質的にない、または化学的前駆体または化学的に合成される場合の他の化学物質が実質的にない。用語「細胞の物質が実質的にない」は、ＮＯＶ１タンパク質の標本を含み、ここでタンパク質はそれが単離されるものまたは組み換え的に生成されるもの由来の細胞の細胞成分から分離される。ある実施態様において、用語「細胞の物質が実質的にない」は、非ＮＯＶ１タンパク質（「混入するタンパク質」として本明細書においても言及される）の約３０％（乾燥重量による）未満、より好ましくは、非ＮＯＶ１タンパク質の約２０％未満、なおより好ましくは、非ＮＯＶ１タンパク質の約１０％未満、そして最も好ましくは、非ＮＯＶ１タンパク質の約５％未満を有するＮＯＶ１タンパク質の標本を含む。ＮＯＶ１タンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分が組変え的に生成されると、好ましくは培養上清が実質的にない、すなわち、培養液が約２０％未満、さらに好ましくは、約１０％未満、そして最も好ましくはタンパク質標本の用量の約５％未満を意味する。
用語「化学的前駆体または他の化学物質が実質的にない」は、タンパク質が化学的前駆体またはタンパク質の合成において関与する他の化学物質から分離されるＮＯＶ１タンパク質の標本を含む。１つの実施態様において、用語「化学的前駆体または他の化学物質が実質的にない」は、化学的前駆体または非ＮＯＶ１化学物質の約３０％（乾燥重量による）未満、さらに好ましくは、化学的前駆体または非ＮＯＶ１化学物質の約２０％未満、なおさらに好ましくは、化学的前駆体または非ＮＯＶ１化学物質の約１０％未満、そして最も好ましくは、化学的前駆体または非ＮＯＶ１化学物質の約５％未満を有するＮＯＶ１タンパク質の標本を含む。
ＮＯＶ１タンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＮＯＶ１タンパク質より短いアミノ酸を含み、かつＮＯＶ１タンパク質の少なくとも１つの活性を表すＮＯＶ１タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号：２において示されるアミノ酸配列）に十分に相同なアミノ酸配列、またはまたは由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。典型的には、生物学的に活性な部分は、ＮＯＶ１タンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。ＮＯＶ１タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さ１０、２５、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸残基であるポリペプチドであり得る。さらに、タンパク質の他の領域が欠損する他の生物学的に活性な部分は組み換え技術により生成され得るし、かつ天然のＮＯＶ１タンパク質の１またはそれ以上の機能的な活性について評価し得る。
実施態様において、ＮＯＶ１タンパク質は、配列番号：２において示されるアミノ酸配列を有する。他の実施態様において、ＮＯＶ１タンパク質は、配列番号：２に実質的に相同であり、かつ配列番号：２のタンパク質の機能的な活性を維持し、依然以下に詳細に記載される様に天然の対立遺伝子のバリエーションまたは変異誘発に起因するアミノ酸配列おいて異なる。または、別の実施態様において、ＮＯＶ１タンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含み、かつ配列番号：２のＮＯＶ１タンパク質の機能的な活性を維持するタンパク質である。
２またはそれ以上の配列間の相同性の測定
２つのアミノ酸または２つの核酸のパーセント相同性を測定するために、配列を最適な比較目的のため整列させる（例えば、ギャップが最適なアラインメントのため第１のアミノ酸または核酸配列に第２のアミノ酸または核酸配列と共に導入され得る。）対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドは、次に比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置の同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められている場合、分子はその位置で相同である（すなわち、本明細書において用いられる様に、アミノ酸または核酸「相同性」は、アミノ酸または核酸「同一」と等しい。）
核酸配列相同性は、２配列間の同一性の程度として測定され得る。相同性は、ＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェアのような、当分野において既知のコンピュータープログラムを用いて測定され得る。Needleman and Wunsch 1970 J Mol Biol 48: 443-453を参照されたい。核酸配列比較の以下の設定：５．０のＧＡＰ生成ペナルティーおよび０．３のＧＡＰ伸長ペナルティーを伴なうＧＣＧ ＧＡＰソフトウエアを用いて、上で言及された類似核酸配列のコード領域は、配列番号：１において示されるＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード化）部分と好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性の程度を表す。
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、比較の特定領域にわたって残基毎に同一である程度に言及する。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、比較の領域にわたって、２つの最適整列配列を比較すること、一致位置の数をもたらすために両配列において生じる同一核酸塩基（例えば、核酸の場合、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）のある位置の数を測定すること、比較の領域中の位置の合計数（すなわち、ウィンドウサイズ）により一致位置の数を割ること、および配列同一性のパーセンテージをもたらすために、結果を１００倍することにより測定される。本明細書において用いられる様に、用語「実質的同一性」は、ポリヌクレオチド配列の特徴を示す。ここで、該ポリヌクレオチドは、比較領域にわたって参考配列と比較して、少なくとも８０％配列同一性、好ましくは、少なくとも８５％同一性、およびしばしば９０〜９５％配列同一性、さらに一般的には少なくても９９％配列同一性を有する配列を含む。
キメラタンパク質および融合タンパク質
本発明はまた、ＮＯＶ１キメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書において用いられる様に、ＮＯＶ１「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＮＯＶ１ポリペプチドに作用可能に結合したＮＯＶ１ポリペプチドを含む。「ＮＯＶ１ポリペプチド」は、配列番号：２のＮＯＶ１タンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドに言及し、「非ＮＯＶ１ポリペプチド」は、ＮＯＶ１タンパク質に実質的に相同でないタンパク質、例えば、ＮＯＶ１タンパク質と異なり、かつ同一生物または異なる生物からもたらされるタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドに言及する。ＮＯＶ１融合タンパク質内で、ＮＯＶ１ポリペプチドは、ＮＯＶ１タンパク質の全部または一部に対応し得る。１つの実施態様において、ＮＯＶ１融合タンパク質は、少なくとも１つのＮＯＶ１タンパク質の生物学的に活性な部分を含む。別の実施態様において、ＮＯＶ１融合タンパク質は、少なくとも２つのＮＯＶ１タンパク質の生物学的に活性な部分を含む。なお別の実施態様において、ＮＯＶ１融合タンパク質はＮＯＶ１タンパク質の少なくとも３つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質内で、用語「作用可能に結合する」は、ＮＯＶ１ポリペプチドおよび非ＮＯＶ１ポリペプチドが互いにインフレームで融合されることを示すことを意図する。非ＮＯＶ１ポリペプチドは、ＮＯＶ１ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合し得る。
ある実施態様において、融合タンパク質はＧＳＴ−ＮＯＶ１融合タンパク質である、ここでＮＯＶ１配列はＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）のＣ末端に融合される。かかる融合タンパク質は組み換えＮＯＶ１ポリペプチドの精製を促進することができる。
別の実施態様において、融合タンパク質は、Ｎ末端にある異種性シグナル配列を含有するＮＯＶ１タンパク質である。ある宿主細胞（例えば、哺乳類宿主細胞）において、ＮＯＶ１の発現および／または分泌は、異種性シグナル配列の使用を介して増加され得る。
なお別の実施態様において、融合タンパク質は、１またはそれ以上のドメインを含むＮＯＶ１配列が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーからもたらされる配列に融合されるＮＯＶ１免疫グロブリン融合タンパク質である。本発明のＮＯＶ１免疫グロブリン融合タンパク質は、医薬組成物に取り込まれ、対象に投与され、細胞表面上のＮＯＶ１リガンドとＮＯＶ１タンパク質との相互作用を阻害し、それによりインビボでのＮＯＶ１仲介シグナル伝達を抑制できる。ＮＯＶ１免疫グロブリン融合タンパク質を用いて、ＮＯＶ１同族リガンドの生物学的利用能に作用させることができる。ＮＯＶ１リガンド／ＮＯＶ１相互作用の阻害は、増殖性疾患および分化性疾患の両方の処置、ならびに細胞生存の調節（例えば、促進または阻害）のために治療的に有用であり得る。さらに、本発明のＮＯＶ１免疫グロブリン融合タンパク質を免疫原として用いて、対象において抗ＮＯＶ１抗体を産生し、ＮＯＶ１リガンドを精製し、ＮＯＶ１リガンドとのＮＯＶ１の相互作用を阻害する分子を同定するためのスクリーニングにおいて用いられ得る。
本発明のＮＯＶ１キメラタンパク質または融合タンパク質は、標準組換えＤＮＡ技術により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、例えば、ライゲーションのための平滑末端またはねじれ（stagger）末端、適当な末端を提供するための制限酵素切断、適当な粘着末端の充填、望まない結合を避けるためのアルカリフォスファターゼ処理、および酵素ライゲーションを用いることにより、従来技術に従いインフレームで互いに結合する。別の実施態様において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来技術により合成され得る。または、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、引き続いてアニーリングし、再増幅され、キメラ遺伝子配列を精製し得る２つの連続遺伝子フラグメント間の相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて実行されうる（例えば、 Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1992を参照）。さらに、多くの発現ベクターは、融合部分を既にコード化する市販されるもの（例えば、ＧＳＴポリペプチド）である。ＮＯＶ１コード化核酸は、融合部分がＮＯＶ１タンパク質にインフレームで結合するように発現ベクターにクローン化され得る。
拮抗物質および作用物質
本発明はまた、ＮＯＶ１作用物質（すなわち、ミメティクス）またはＮＯＶ１拮抗物質のいずれかとして機能するＮＯＶ１タンパク質の変異体に関する。ＮＯＶ１タンパク質の変異体は、変異誘発（例えば、ＮＯＶ１タンパク質の別々の点変異または切断）により生成され得る。ＮＯＶ１の作用物質は、ＮＯＶ１タンパク質の天然に存在する型の生物学的に活性な同一物またはサブセットを実質的に保持し得る。ＮＯＶ１タンパク質の拮抗物質は、例えば、ＮＯＶ１タンパク質を含む細胞のシグナルカスケイドの下流または上流のメンバーに競合的に結合することにより、１またはそれ以上のＮＯＶ１タンパク質の天然に生じる形の活性化を阻害し得る。従って、特異的な生物学的作用は、機能を制限された変異体との処理により誘発され得る。１つの実施態様において、タンパク質の天然に生じる形の生物学的に活性なサブセットを有する変異体との対象の処理は、ＮＯＶ１タンパク質の天然に生じる形との処置と関係する対象においてより少ない副作用を有する。
ＮＯＶ１作用物質（すなわち、ミメティクス）としてまたはＮＯＶ１拮抗物質のいずれかとして機能するＮＯＶ１タンパク質の変異体は、ＮＯＶ１タンパク質の変異体（例えば、切断変異体）の組み換えライブラリーをＮＯＶ１タンパク質の作用物質または拮抗物質の活性についてスクリーニングすることにより同定され得る。１つの実施態様において、ＮＯＶ１変異体の多彩アなライブラリーは、核酸レベルの組合せ変異誘発により生成され、多彩な遺伝子ライブラリーによりコード化される。ＮＯＶ１変異体の多彩なライブラリーは、例えば、潜在的なＮＯＶ１配列の変性セットが、個々のポリペプチドとして、または代わりにＮＯＶ１配列のセットを含有するより大きな融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレイ）として発現可能である様な遺伝子配列に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的にライゲーションすることにより産生され得る。変性オリゴヌクレオチド配列由来の潜在的ＮＯＶ１変異体のライブラリーを産生するために用いられ得る様々な方法がある。変性遺伝子配列の化学的合成を、自動ＤＮＡ合成機において実行することができ、合成遺伝子は次に、適当な発現ベクターに結合させられる。遺伝子の変性セットの使用は、潜在的ＮＯＶ１配列の望まれるセットをコード化する配列の全部である混合物の１つにおいて供給を可能とする。変性オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当分野において既知である。例えば、Narang 1983 Tetrahedron 39:3; Itakura et al. 1984 Annu Rev Biochem 53:323; Itakura et al. 1984 Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucl Acid Res 11:477を参照されたい。
ポリペプチドライブラリー
加えて、ＮＯＶ１コード配列のフラグメントのライブラリーを用いて、ＮＯＶ１タンパク質の変異体のスクリーニングおよび続く選択のためのＮＯＶ１の多彩な群を産生し得る。１つの実施態様において、コード配列フラグメントのライブラリーは、ニッキングが１分子あたり約１回のみ生じる条件下でヌクレアーゼを有するＮＯＶ１コード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントの処理、ニ本鎖ＤＮＡの変性、異なるニック産物由来のセンス／アンチセンスプライマーを含み得る二本鎖ＤＮＡを形成するためのＤＮＡの再生、Ｓ１ヌクレアーゼとの処理によりニ本鎖の再形成から一本鎖部分を取り除くこと、および結果として生じるフラグメントライブラリーの発現ベクターへのライゲーションにより生成されうる。この方法により、発現ライブラリーは、Ｎ末端およびＮＯＶ１タンパク質の様々なサイズの内部フラグメントをコード化するものがもたらされ得る。
点変異または切断により作られた組合せライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングすること、および選択された性質を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするいくつかの技術は、当分野において既知である。かかる技術は、ＮＯＶ１タンパク質の組合せ変異誘発により生成される遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適している。複製可能な発現ベクターへの遺伝子ライブラリーのクローン化、結果として生じるベクターライブラリーとの適当な細胞の形質移入、および望まれる活性の検出が産物が検出される遺伝子をコード化するベクターの単離を促進する条件下での組合せ遺伝子の発現を典型的に含む大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングする高処理量分析に従った技術が、最も広く用いられる。ライブラリーの機能的変異の頻度を増大する新たな技術である再帰全変異誘発（ＲＥＭ）が、ＮＯＶ１変異体を同定するためのスクリーニングアッセイとの組合せにおいて用いられ得る。例えば、Arkin and Yourvan 1992 Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:78117815; Delgrave et al. 1993 Protein Engineering 6:327331を参照されたい。
抗体
本発明において、ＮＯＶ１タンパク質、またはＮＯＶ１タンパク質のフラグメントに対する抗体もまた含まれる。本明細書において用いられる用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子に言及する。かかる抗体は、限定されることなく、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーを含む。一般に、ヒトから得られる抗体分子は、分子に存在する天然の重鎖により別のものと異なる任意のクラスのＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤに関する。あるクラスは、同様に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ等のサブクラスを有する。さらに、ヒトにおいて、軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であり得る。抗体に対する本明細書における参考文献は、ヒト抗体種のかかるクラス、サブクラスおよびタイプの全てに対する参考文献を含む。
抗原、またはそれらの一部またはフラグメントとして機能することを意図され得る単離ＮＯＶ１関連タンパク質は、ポリクローナル抗体標本およびモノクローナル抗体標本の標準技術を用いられ、および加えて抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成するための免疫原として用いられ得る。全長タンパク質を用いることができるか、または、本発明は免疫原としての使用のため抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、全長タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも６アミノ酸残を含み、全長タンパク質またはエピトープを含有する任意のフラグメントとの特異的免疫複合体を形成するペプチドに対して生じる抗体のエピトープを包含する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、または少なくとも１５アミノ酸残基、または少なくとも２０アミノ酸残基、または少なくとも３０アミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドにより包含される好ましいエピトープは、その表面に位置するタンパク質の領域；普通は、親水性領域である。
本発明のある実施態様において、抗原性ペプチドにより包含される少なくとも１つのエピトープが、タンパク質の表面に位置するＮＯＶ１関連タンパク質の領域、例えば親水性領域である。ヒトＮＯＶ１関連タンパク質配列の疎水性分析は、ＮＯＶ１関連タンパク質の領域が特定の親水性領域であり、それゆえ、抗体産物の標的化に有用である表面残基をコード化することを示す。抗体産物の標的化を意味する様に、親水性領域および親水性を示す疎水性親水性指標プロットは、例えば、フーリエ形質転換ありでまたはなしのいずれかでのKyte Doolittle法またはHopp Woods法を含む、当分野においてよく知られた任意の方法により生成され得る。例えば、Hopp and Woods, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828；Kyte and Doolittle 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-142を参照されたい。それぞれ、全体として参考文献により本明細書において取り込まれる。抗原性タンパク質、または誘導体、フラグメント、それらの類似体または相同体内の１またはそれ以上のドメインに特異的な抗体も、本明細書において提供される。
本発明のタンパク質、または誘導体、フラグメント、類似体、それらの相同体またはオルソログは、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の生成での、免疫原として利用され得る。
当分野内において既知の様々な方法は、本発明のタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、類似体、またはそれらの相同体またはオルソログに対して指示されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の産生に用いられ得る（例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照。参考文献により本明細書に組み込まれる）。これらの抗体のいくつかを、以下に論じる。
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体の産生のために、様々な適当な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳類）が、天然タンパク質、それらの合成変異体、または上述の誘導体を伴う１回またはそれ以上の注入により免疫され得る。適当な免疫原性標本は、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を表す化学的に合成されたポリペプチド、または組換え的に発現させた免疫原性タンパク質を含有することができる。さらに、タンパク質は、免疫された哺乳類での免疫原であると知られた第２のタンパク質に複合され得る。かかる免疫原性タンパク質の実施例は、制限されることなく、キーホールカサガイヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、および大豆トリプシンインヒビターを含む。標本は、アジュバントをさらに含むことができる。免疫学的反応を増大させるために用いられる様々なアジュバントは、制限されることなく、フロイント（完全および不完全）、ミネラルジェル（例えば、水酸化アルミニウム）、表面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノール等）、Bacille Calmette-GuerinおよびCorynebacterium parvumのようなヒトに使用可能なアジュバント、または類似の免疫促進剤が挙げられる。使用し得るアジュバントのさらに別な例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成ジコリノミコール酸トレハロース）を挙げ得る。
免疫原性タンパク質に対して指示されるポリクローナル抗体分子は、哺乳類（例えば、血液から）単離され、免疫血清のＩｇＧ分画を第１に提供するタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇを用いるアフィニティークロマトグラフィーのようなよく知られた技術によりさらに精製され得る。引き続いて、または代わりに、探された免疫グロブリンの標的である特異的抗原、またはそれらのエピトープは、免疫親和性クロマトグラフィーにより免疫特異的抗体を精製するためのカラム上に固定され得る。免疫グロブリンの精製は、例えば、D. Wilkinson (The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28)により考察される。
モノクローナル抗体
本明細書において用いる用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」は、特徴のある軽鎖遺伝子産物および特徴のある重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の１分子種のみを含有する抗体分子群に言及する。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、全ての分子群において同一である。従って、ＭＡｂは、それらに特徴のある結合親和性により特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応が可能な抗原結合部位を含有する。
モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)により記載される様に、ハイブリドーマ法を用いて調製され得る。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター、または他の適当な宿主動物は、免疫試薬で典型的に免疫され、免疫試薬に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生可能であるリンパ球を促進する。または、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。
免疫試薬は、タンパク質抗原、それらのフラグメントまたはそれらの融合タンパク質を典型的に含む。ヒト起源の細胞が望まれるなら用いられ一般に、末梢血液リンパ球が用いられ、非ヒト哺乳類起源が望まれるなら、脾細胞またはリンパ節が用いられる。リンパ球は、そこでポリエチレングリコールのような適当な融合試薬を用いた不死化細胞株と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103を参照）。不死化細胞株は、普通は、哺乳類細胞特定の場合げっ歯類、ウシおよびヒト機嫌の骨髄腫に形質移入される。普通は、ラットまたはマウス骨髄腫細胞株が用いられる。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、非融合細胞不死化細胞の成長または生存を阻害する１またはそれ以上の物質を含有する適当な培養液において培養され得る。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマの培養液は、物質がＨＧＰＲＴ欠乏細胞の成長を妨げるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を典型的に含む。
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高発現レベルをサポートするものであり、ＨＡＴ培地のような培地に感受性がる。さらに好ましくい不死化細胞株は、例えば、the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California and the American Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから得られる、マウス骨髄腫細胞株である。ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、ヒトモノクローナル抗体の産物についても記載される（Kozbor: J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al.: Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63を参照）。
ハイブリドーマ細胞が培養される培養液は、そのとき抗原に対して指示するモノクローナル抗体の存在をアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）のようなインビトロ結合アッセイにより測定される。かかる技術およびアッセイは、当分野において既知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のScatchard analysisにより測定され得る。好ましくは、標的抗原に高特異的および高結合親和性を有する抗体が単離される。
望ましいハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは、限界希釈法によりサブクローン化され、標準方法により成長する。この目的に適当な培地は、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地およびＲＰＭＩ培地を含む。または、ハイブリドーマ細胞は、哺乳類の腹水の様にインビボにおいて成長し得る。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、単離されるか、または例えば、タンパク質Ａセファロース、ヒドロキシルアバタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳道、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような通常の免疫グロブリン精製により、培地または腹水液から精製される。
モノクローナル抗体はまた、米国特許番号４，８１６，５６７において記載される様な組換えＤＮＡ方法により作られることがきる。本発明のモノクローナル抗体をコード化するＤＮＡは、迅速に単離され、通常の方法（例えば、マウス抗体の重鎖おとび軽鎖をコード化する遺伝子に免疫特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブ用いることにより）を用いて配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい供給源として働く。一旦単離されると、ＤＮＡは、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンタンパク質を別に産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞に形質移入される発現ベクター内に位置し、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得られる。ＤＮＡは、例えば、相同マウス配列の場所にあるヒト重鎖および軽鎖定常ドメインの配列をコードする置換（米国特許番号４，８１６，５６７；Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)）により、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部の免疫グロブリンコード配列に共有結合性結合することによりモディファイされ得る。かかる非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインのために置換され得るし、またはキメラ二価抗体を生成するための本発明の抗体の抗原結合部位の可変ドメインのために置換され得る。
ヒト化抗体
本発明のタンパク質抗原に対して指示する抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体を含む。これらの抗体は、投与された免疫グロブリンに対するヒトによる免疫応答を生じさせることなくヒトへの投与に適している。抗体のヒト化型は、ヒト免疫グロブリンの配列を主に含み、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または他の抗体の抗原結合配列）である。ヒト化は、Winter and co-workers (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))の方法に従い、ヒト交代の対応する配列のげっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を置換することにより実行され得る（米国特許番号５，２２５，５３９も参照）。時には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基により置きかえられる。ヒト化抗体は、レシピエント抗体において、または移動されたＣＤＲまたはフレームワーク配列のどちらにおいても見られない残基も含む。一般に、ヒト化抗体は、可変ドメインの少なくとも１つの全体、および典型的な２つの可変ドメインを実質的に含む。ここで、非ヒト免疫グロブリンの対応するＣＤＲ領域の全て、または実質的に全て、およびフレームワーク領域の全て、または実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン共通配列の領域である。ヒト化抗体は、好ましくは、少なくとも免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部、ヒト免疫グロブリンの一部を典型的に含む(Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992))。
ヒト抗体
完全にヒト抗体は、ヒト遺伝子から生じるＣＤＲを含む軽鎖および重鎖の両方の全配列の抗体分子に基本的に関与する。かかる抗体は、本明細書において「ヒト抗体」または「完全にヒト抗体」と名付けられる。ヒトモノクローナル抗体は、trioma技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72を参照）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole, et al., 1985 In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 7796を参照）により調製され得る。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施において利用され得るし、ヒトハイブリドーマを用いることにより、またはインビトロでのＥＢウイルスとのヒトＢ細胞の形質移入により産生され得る（Cole, et al., 1985 In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 7796を参照）。
加えて、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーを含む別の技術を用いて産生され得る（Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)）。同様に、ヒト抗体は、トランスジェニック動物、例えば部分的に不活性化されたまたは完全に不活性化された内在性免疫グロブリン遺伝子であるマウスにヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することにより作られることができる。挑戦により、ヒト抗体産物は、遺伝子再配列、構築、抗体レパートリーを含む全観点においてヒトにおいて見られるものはよく似ていることを観察される。このアプローチは、例えば、米国特許番号５，５４５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，６６１，０１６、およびMarks et al. (Bio/Technology 10, 779-783 (1992))；Lonberg et al. (Nature 368 856-859 (1994))；Morrison ( Nature 368, 812-13 (1994))；Fishwild et al,( Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996))；Neuberger (Nature Biotechnology 14, 826 (1996))；およびLonberg and Huszar (Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995))において記載される。
ヒト抗体は、抗原により、挑戦に対する応答での動物の内在性抗体よりむしろ完全にヒト抗体を産生するためにモディファイされるトランスジェニック非ヒト動物を用いて別に産生され得る（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０２６０２参照）。非ヒト宿主での重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンをコード化する内在性遺伝子は、能力を奪われ、宿主のゲノムに挿入されるヒト重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンをコード化する遺伝子座を活性化する。ヒト遺伝子は、例えば、要求されるヒトＤＮＡセグメントを含有する酵母人工染色体を用いて組み込まれる。全ての望まれる修飾を提供する動物は、修飾の全相補的配列より少ない相補的配列を含有するトランスジェニック動物が仲介する交配により子孫として得られる。かかる非ヒト動物の好ましい実施態様は、マウスおよびＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６において開示される様にXenomouseTMと名付けられる。この動物は、完全にヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体の標本、またはモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのような動物由来の不死化Ｂ細胞由来の標本として該免疫原での免疫の後の動物から直接的に得られることができる。加えて、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコード化する遺伝子は、回復させ、直接的に抗体を得るために発現させるか、または例えば、一本鎖Ｆｖ分子のような抗体の類似体を得るためにさらにモディファイされ得る。
マウスとして例示され、内在性免疫グロブリン重鎖の発現を欠く非ヒト宿主を産生する方法の実施例は、米国特許番号５，９３９，５９８において開示される。それは、遺伝子座の転座および転座免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写物の形成を防ぐために胚性幹細胞での少なくとも１つの内在性重鎖遺伝子座由来のＪセグメントを欠くことを含む方法により得られることができ、欠損は、選択可能なマーカーをコード化する遺伝子を含有するベクターを標的とすること；および体細胞および生殖細胞が胚性幹細胞から選択可能なマーカーをコード化する遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを賛成することにより作用される。
ヒト抗体のような、該抗体を産生する方法は、米国特許番号５，９１６，７７１において開示される。それは、重鎖をコード化するヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを培養での１つの哺乳類宿主細胞内へ導入すること、軽鎖をコード化するヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを別の哺乳類宿主細胞へ導入すること、およびハイブリドーマ細胞を形成するために２つの細胞を融合させることを含む。ハイブリドーマ細胞は、重鎖および軽鎖を含有する交代を発現する。
この産物のさらなる改良において、免疫原の臨床的に関連するエピトープを同定する方法、および高親和性で関連するエピトープに免疫特異的に結合する抗体を選択する相関連する方法は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５３０４９において開示される。
Ｆａｂフラグメントおよび一本鎖抗体
本発明によると、技術は、本発明の抗原性タンパク質に対して特異的な一本鎖抗体の産物に適応させ得る（例えば、米国特許番号４，９４６，７７８を参照）。加えて、方法は、タンパク質または誘導体、フラグメント、類似体またはそれらの相同体にたいする望まれる特別性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速で効果的な同定を可能とするＦａｂ発現ライブラリー（例えば、Huse, et al., 1989 Science 246: 12751281を参照）の構造に適応され得る。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含有する抗体フラグメントは、制限されることなく、：（i）抗体分子のペプシン切断により産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ii）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィドブリッジを還元することにより生成されるＦａｂフラグメント；（iii）パパインでの抗体分子の処理により生成されるＦａｂフラグメントおよび還元剤および（iv）Ｆｖフラグメントを含む当分野において既知の技術により産生され得る。
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、モノクローナルであり、好ましくは少なくとも２つの異なる抗原への結合特異性を有するヒトまたはヒト化抗体である。当該場合において、結合特異性の１つは、本発明の抗原性タンパク質によるものである。第２の結合標的は、別の抗原であり、有利には細胞表面タンパク質または受容体または受容体サブユニットである。
二重特異性抗体を作る方法は、当分野において既知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え産物は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖ペアーの共発現に基づき、２つの重鎖は、異なる特異性を有する(Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983))。
免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな分類のため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１つのみが正しい二重特異性構造の１０の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生する。正しい分子の精製は普通、アフィにティークロマトグラフィーステップにより成し遂げられる。類似の方法が、１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ９３／０８８２９、およびTraunecker et al., 1991 EMBO J., 10:3655-3659において開示される。
望まれる結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体抗原結合部位）は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合され得る。好ましくは、融合は、少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインと共にある。好ましくは、少なくとも融合の１つにおいて存在する軽鎖結合を必要とする部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有する。免疫グロブリン重鎖融合をコード化するＤＮＡは、望まれるなら、免疫グロブリン軽鎖は、別の発現ベクターに挿入され、適当な宿主生物に同時形質移入される。二重特異性抗体の生成のさらんる詳細のため、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
ＷＯ９６／２７０１１において記載される別のアプローチによると、抗体分子ペアー間の干渉は、組換え細胞培養から回復させるヘテロダイマーの最大パーセンテージに設計され得る。好ましい干渉は、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。最後に、第１の抗体分子の干渉由来の１またはそれ以上の小さなアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）でとって代わられる。大きな側鎖と同一または類似の側鎖の代償性「穴」は、より小さなものでの大きなアミノ酸側鎖を取って代わることにより第２の抗体分子の干渉で生成される。このことは、ホモダイマーのような他の望まれていない末端産物のヘテロダイマー分野を増大するメカニズムを提供する。
二重特異性抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製され得る。抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成する技術は、文献において記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学的な連鎖を用いて調製され得る。Brennan et al., Science 229:81 (1985)は、無処理抗体が、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成するためにタンパク質分解性に切断され得る方法を記載する。これらのフラグメントは、ジチオール複合体試薬ナトリウム亜ヒ酸塩存在下において近接ジチオールを安定化、分子間ジスルフィド形成を防ぐために置換される。生成されたＦａｂ’フラグメントは、チオニトロベンゾエイト（thionitrobenzoate）（ＴＮＢ）誘導体にそこのとき変換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つは、そのときＦａｂ’−チオールにメルカプトエチルアミンとの置換により再変換され、二重特異性抗体を形成するために他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合される。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための試薬として用いられ得る。
加えて、Ｆａｂ’フラグメントは、E.coliから直接的に回復され、二重特異性抗体を形成するために化学的にカップリングされ得る。Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217225 (1992)は、完全にヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子産物を記載する。それぞれのＦａｂ’フラグメントは、E.coliから別々に分泌され、二重特異性抗体を形成するためにインビトロでの直接化学カップリングの対象とされた。従って、形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞、および正常ヒトＴ細胞、ならびにヒト乳癌標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解性活性のトリガーに結合可能であった。
組換え細胞培養に直接由来する二重特異性抗体フラグメントを作り、単離するための様々な技術は、また記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて産生され得る。Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):15471553 (1992)を参照。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合させた。抗体ホモダイマーを、モノマーを形成するためにヒンジ領域で還元し、抗体へテロダイマーを形成するために再び酸化した。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:64446448 (1993)により記載される「ダイアボーイ」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作る選択的メカニズムを提供した。フラグメントは、同一鎖の２つのドメイン間の対形成を可能とするには短いリンカーにより軽鎖可変領域（ＶＬ）に結合する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。代わりに、
１つのフラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインを有する対に強制され、それにより、２つの後援結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用による二重特異性抗体フラグメントを作る別のストラテジーも、報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
２より多い結合価を有する抗体が熟慮される。例えば、三重特異性抗体が、調製され得る。Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)を参照。
例示的に二重特異性抗体は、少なくとも１つが本発明のタンパク質抗原に起源を有する、２つの異なるエピトープに結合することができる。また、免疫グロブリン分子の抗−抗原性アームは、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＢ７）、ＦｃｙＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃｙＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃｙＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のような特定の抗原を発現する細胞にたいする細胞の防御メカニズムに力をおくために白血球上の引き金を引く分子に結合するアームと結合されることができる。二重特異性抗体を用いて、細胞障害性試薬を特定の抗原を発現する細胞に直接作用させることができる。これらの抗体は、抗原結合アームおよび細胞障害性試薬またはＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡまたはＴＥＴＡのような放射性核種キレート剤を結合するアームを有する。当該別の二重特異性抗体は、本明細所において記載されるタンパク質抗原に結合し、組織因子（ＴＦ）にさらに結合する。
ヘテロ結合抗体
ヘテロ結合抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロ結合抗体は、２つの共有結合性に結合した抗体から構成される。かかる抗体は、例えば、望まれる細胞に対して免疫系細胞を標的するため（米国特許番号４，６７６，９８０）、およびＨＩＶ感染の処置のために（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）提案される。抗体が、クロスリンクする試薬を含むそれらを含む、合成タンパク質化学反応において既知の方法を用いて調製され得る。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、チオエーテル結合の形成により構築され得る。この目的のための適切な試薬の実施例は、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチリミデイトおよび例えば、米国特許番号４，６７６，９８０に開示されるものを含む。
エフェクター機能操作
例えば、癌処置における抗体の有効性を増強するために、エフェクター機能に関する本発明の抗体をモディファイことは望ましい。例えば、システイン残基（ｓ）は、Ｆｃ領域に挿入され、それにより、この領域での内部鎖のジスルフィド結合形成を可能とする。従って、生成されたホモダイマー抗体は、改善したインターナリゼーション能力および／または増大した相補的配列仲介の細胞死滅および抗体依存の細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有することができる。Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992)およびShopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照されたい。増強抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体はまた、Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)において記載される様にヘテロ二重特異性クロスリンカーを用いて調製され得る。または、抗体は、二重Ｆｃ領域を有するものを操作され、それにより、増強した相補的な分解およびＡＤＣＣ能力を有することができる。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)を参照されたい。
免疫複合体
本発明は、化学療法物質、毒（例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒、またはそれらのフラグメント）、または放射性同位元素（すなわち、放射性複合体）の様な細胞傷害性物質に結合したＮＯＶ１抗体を含む免疫複合体に関する。
そのような免疫複合体の生成に有用な化学療法物質を上述した。使用できる酵素的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、内毒素Ａ鎖（Pseudomonas aeruginosa由来）、リシンＡ鎖、アビリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、Aleurites fordiiタンパク質、ディアンティンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、momoridica charantia阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalisc阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。種々の放射性核種を放射性複合抗体の生産に利用できる。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅを挙げ得る。
抗体と細胞障害性薬剤との複合体を、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２機能性誘導体（ジメチルアジピイミデートＨＣＬのような）、活性エステル（ジサクシンイミジルスベレートのような）、アルデヒド（グルタルアルデヒドのような）、ビスアジド誘導体（ビス−（ｐ−アジドベンゾイル）−ヘキサンジアミンのような）、ビスジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンのような）、ジイソシアネート（トリエン２、６−ジイソシアネートのような）、およびビス活性フッ素化合物（１,５−ジフルオロ２,４−ジニトロベンゼンのような）のような種々の２機能性タンパク質カップリング剤を用いて作る。例えば、リシン免疫毒素を、Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)に記載のように調製することができる。炭素１４で標識した１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸(ＭＸ−ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドを抗体に結合するための典型的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。
もう一つの実施態様では、抗体を、腫瘍をプレターゲティンブのための「受容体」（ストレプトアビジンのような）に結合することができて、そこでは抗体−受容体複合体を患者に投与し、引き続いて未結合の複合体を除去剤を用いて血液循環から除去し、次いで今度は細胞障害性薬剤に複合した「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
ある実施態様において、必要な特異性を有する抗体のスクリーニング方法は、酵素結合免疫測定（ＥＬＩＳＡ）および当分野において既知の他の免疫学的に仲介される技術を含むが、これらに制限されない。特定の実施態様において、ＮＯＶ１タンパク質の特定のドメインに特異的である抗体の選択は、かかるドメインを有するＮＯＶ１タンパク質のフラグメントに結合するハイブリドーマの生成により促進される。従って、ＮＯＶ１タンパク質、または誘導体、フラグメント、類似体またはそれらの相同体内の必要なドメインに特異的である抗体もまた、本明細書において提供される。
抗ＮＯＶ１抗体は、ＮＯＶ１タンパク質の局在または／および定量に関する分野において既知の方法において用いられう得る（例えば、適当な生理的試料内のＮＯＶ１タンパク質のレベルの測定での使用、診断方法での使用、タンパク質のイメージ化での使用など）。与えられた実施態様において、抗体由来の結合ドメインを含有するＮＯＶ１タンパク質、または誘導体、フラグメント、類似体またはそれらの相同体に対する抗体は、薬理学的に活性名化合物（以下「治療薬」）として利用される。
抗ＮＯＶ１抗体（例えば、モノクローナル抗体）を用いて、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的な技術によりＮＯＶ１ポリペプチドを単離する。抗ＮＯＶ１抗体は細胞由来の天然のＮＯＶ１ポリペプチドおよび宿主細胞内で発現される組み換え生成ＮＯＶ１ポリペプチドの精製を促進できる。さらに、抗ＮＯＶ１抗体を用いて、多量のＮＯＶ１発現およびＮＯＶ１発現パターンを評価するためにＮＯＶ１タンパク質（例えば、細胞の可溶化物または培養上清）を検出することができる。抗ＮＯＶ１抗体を診断的に用いて、化学的な試験物質の一部として組織中のタンパク質レベルをモニターすること、例えば、与えられた、処置法の有効性を決定することができる。検出は抗体を検出可能な物質に結合させること（すなわち、物理的結合）により促進され得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、配合群、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質を挙げる。適当な酵素の例としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを挙げ得る；適当な配合群の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを挙げ得る；適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレッセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンを挙げ得る；発光物質の例としては、ルミノールを挙げ得る；生物発光物質の例としてはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを挙うるし、適当な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを挙げ得る。
組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明に別の態様は、ベクター、好ましくは、ＮＯＶ１タンパク質、誘導体、フラグメント、類似体、またはそれらの相同体をコード化する核酸を含有する発現ベクターに関する。本明細書において使用する、用語「ベクター」は、それが結合した別の核酸を輸送する能力のある核酸分子に言及する。ベクターの１つのタイプは、別のＤＮＡセグメントが結合され得る環状二本鎖ＤＮＡループに言及する「プラスミド」である。ベクターの別のタイプは、ウイルスベクターであり、別のＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノムに結合され得る。あるベクター（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピゾームの哺乳類ベクター）は、そららが導入される宿主細胞において自立増殖できる。他のベクター（例えば、非エピゾーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入において宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、あるベクターは、作用可能に結合するゲノムの発現に指示することができる。かかるベクターは、本明細書において「発現ベクター」として言及される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形である。本発明の明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドはベクターの最も普通に用いられる形であるので、交互に用いられることができる。しかしながら、本発明は、等しい機能を有するウイルスベクター（例えば、複製能を欠いたレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような、発現ベクターの他の形を含むことを意図する。
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸発現に適当な形で本発明の核酸を含み、このことは、組換え発現ベクターが、発現のために用いられる宿主細胞に基づき選択される１またはそれ以上の制御配列、発現されるべき核酸配列に作用可能に結合することを意味する。組換え発現ベクター内で、「作用可能に結合する」は、該ヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能とする哺乳類において（例えば、インビトロの転写システム／翻訳システムにおいて、またはベクターが宿主細胞に導入される宿主細胞において）制御配列に結合することを意味することを意図する。
用語「制御配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。かかる制御配列は、例えば、Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)において記載される。制御配列は、宿主細胞の多くのタイプでのヌクレオチド配列の構成的発現に指示するもの、およびある宿主細胞でのヌクレオチドの発現に指示するもの（例えば、組織特異的制御配列）を含む。発現ベクターのデザインが形質転換されるべき宿主細胞の選択、望まれるタンパク質の発現のレベル等のような因子に依存し得ることは、当業者により理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それにより、本明細書において記載される核酸によりコード化される融合タンパク質または融合ペプチドを含む、タンパク質またはペプチド（例えば、ＮＯＶ１タンパク質、ＮＯＶ１の成熟型、融合タンパク質等）を産生することができる。
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞におけるＮＯＶ１タンパク質の発現のためにデザインされる得る。例えば、ＮＯＶ１タンパク質は、Escherichia.coliのような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞、または哺乳類細胞において発現され得る。適当な宿主細胞は、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)においてさらに記載される。または、組換え発現ベクターは、インビトロにおいて、例えば、Ｔ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、転写および翻訳され得る。
真核細胞でのタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質のいずれかの発現に指示する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを有するEscherichia.coliにおいて、しばしば実行される。融合ベクターは、多くのアミノ酸を、それらにコード化されるタンパク質、普通は組換えタンパク質のアミノ末端に加える。かかる融合ベクターは、３つの目的：（i）組換えタンパク質の発現を増加するため；（ii）組換えタンパク質の溶解性を増加するため；および（iii）アフィニティー精製でのリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の溶解性を増加するために、典型的に役立つ。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解性の切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との結合で導入され、融合部分からの組換えタンパク質の分離、引き続いて、融合タンパク質の精製を可能とする。かかる酵素、およびそれらの同族認識配列は、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターは、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａをそれぞれ標的組換えタンパク質に融合するｐＧＥＣ（Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson 1988 Gene 67:3140）、ｐＭＡＬ（New England Biolabs, Beverly, Mass.）およびｐＲＩＴ５（Pharmacia, Piscataway, N.J.）を含む。
適当な誘導性非融合E.coli発現ベクターの実施例は、ｐＴｒｃ（Amrann et al., (1988) Gene 69:301315）およびｐＥＴ１１ｄ（Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 6089）を含む。
E.coliでの組換えタンパク質発現を最大にする１つのストラテジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解性に切断する障害性能力を有する宿主細菌でのタンパク質を発現することである。例えば、Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119128を参照されたい。別のストラテジーは、それそれのアミノ酸の個々のコドンがE.coliで優先的に利用されるものであるように、発現ベクターに挿入されるべき核酸の核酸配列を変えることである（例えば、Wada et al., 1992 Nucl. Acids Res. 20:21112118を参照）。本発明の核酸配列のかかる変化は、標準ＤＮＡ合成技術により実行されることができる。
別の実施態様において、ＮＯＶ１発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母Saccharomyces cerivisaeでの発現のためのベクターの実施例は、pYepSec1（Baldari, et al., 1987 EMBO J 6:229234）、ｐＭＦａ（Kurjan and Herskowitz, 1982 Cell 30:933943）、ｐＪＲＹ８８（Schultz et al., 1987 Gene 54:113123）、ｐＹＥＳ２（Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.）、およびｐｉｃＺ（InVitrogen Corp, San Diego, Calif.）を含む。
代わりに、ＮＯＶ１は、バキュロウイルス発現ベクターを用いる昆虫細胞において発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）でのタンパク質発現に利用可能なバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃシリーズ（Smith et al. 1983 Mol Cell Biol 3:21562165）およびｐＶＬシリーズ（Lucklow and Summers 1989 Virology 170:3139）を含む。
なお別の実施態様において、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを用いる哺乳類細胞において発現する。哺乳類発現ベクターの実施例は、ｐＣＤＭ８（1987 Nature 329:840を参照）およびｐＭＴ２ＰＣ（Kaufman et al. 1987 EMBO J 6: 187 195）を含む。哺乳類細胞において用いられると、発現ベクターの調節機能は、ウイルス制御エレメントによりしばしば提供される。例えば、普通に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０由来である。原核細胞および真核細胞の両方に適当な他の発現システムについては、例えば、Chapters 16 and 17 of Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989を参照されたい。
別の実施態様において、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞タイプにおいて核酸の発現を優先的に指示する能力がある（例えば、組織特異的制御エレメントを用いて、核酸を発現する）。組織特異的制御エレメントは、当分野において既知である。適当な組織特異的プロモーターの制限されない実施例は、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkert et al. 1987 Genes Dev 1:268277）、リンパ系特異的プロモーター（Calame and Eaton 1988 Adv Immunol 43:235275）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（Winoto and Baltimore 1989 EMBO J 8:729733）および免疫グロブリンのプロモーター（Banerji et al. 1983 Cell 33:729740; Queen and Baltimore 1983 Cell 33:741748）、神経細胞特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター; Byrne and Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:54735477）、膵臓特異的プロモーター（Edlund et al. 1985 Science 230:912916）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許番号４，８７３，３１６およびヨーロッパ出願公開番号２６４，１６６）を含む。発生的に制御されるプロモーターは、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Kessel and Gruss (1990) Science 249:374379）およびα−フェトタンパク質プロモーター（Campes and Tilghman (1989) Genes Dev 3:537546）を包含する。
本発明はさらに、発現ベクターの中にアンチセンスの配向でクローン化した本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。即ち、ＤＮＡ分子は、ＮＯＶ１ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にするような様式で、調節配列に機能し得るように結合する。種々の細胞タイプ中のアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指示するアンチセンスの配向にクローン化した核酸に機能し得るように結合した調節配列、例えば、ウイルスのプロモーターおよび／またはエンハンサーを選択することができるか、またはアンチセンスＲＮＡの組織特異的または細胞タイプ特異的な構成的発現を指示する調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、ベクターを導入した細胞タイプにより活性を決定する高効率調節領域の制御下で、アンチセンス核酸を生産する組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形であり得る。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の考察については、例えば、Weintraub, et al., 「Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis」 Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986を参照されたい。
本発明のもう一つの態様は、本発明の組換え発現ベクターを導入する宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」を、本明細書においては互換的に使用する。そのような用語は、特定の対象の細胞のみならずそのような細胞の子孫または潜在的子孫をまた指すことを理解する。突然変異または環境の影響により後の世代に特定の修飾が生じるかもしれないため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書において使用する用語の範囲内になお含まれる。
宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、ＮＯＶ１タンパク質を、E. coliのような細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳類細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）のような細菌の細胞中で発現することができる。他の適当な宿主細胞は当業者に周知である。
ベクターＤＮＡを、従来の形質転換または形質移入技術により原核細胞または真核の細胞の中に導入することができる。本明細書において使用する用語「形質転換」および「形質移入」とは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介性形質移入、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む外来の核酸(例えばＤＮＡ)を宿主細胞に導入するために当分野で認める種々の技術を指すものとする。宿主細胞を形質転換しまたは形質移入するための適当な方法は、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)および他の実験室マニュアルに見出すことができる。
哺乳類細胞の安定的な形質移入については、使用される発現ベクターおよび形質移入の技法に依存して、細胞のごく小数のフラクションが外来性ＤＮＡをそのゲノムの中に組み込み得る。これらの組み込み体を同定し選択するために、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質に対する抵抗性）が一般的に、興味のある遺伝子と一緒に宿主細胞に導入される。種々の選択可能なマーカーとしては、Ｇ４１８,ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬剤に抵抗性を与えるものが挙げられる。選択可能なマーカーをコードする核酸を、ＮＯＶ１をコードするものと同一のベクター上で宿主細胞に導入することができか、または別のベクター上で導入することもできる。導入された核酸で安定に形質移入された細胞は、薬剤選択により同定されることができる（例えば、選択可能なマーカーを組み込んでいる細胞は生き残る一方で、他の細胞は死ぬ）。
培地中の原核細胞または真核細胞のような本発明の宿主細胞を用いて、ＮＯＶ１タンパク質を生産する（即ち、発現する）ことができる。したがって、本発明は、本発明の宿主細胞を用いるＮＯＶ１タンパク質の生産方法をさらに提供する。一つの実施態様では、その方法は、本発明の宿主細胞(その中にＮＯＶ１タンパク質をコードする組換え発現ベクターを導入する)を、ＮＯＶ１タンパク質を生産するような適当な培地中で培養することを含む。もう一つの実施態様では、その方法は、培地または宿主細胞からＮＯＶ１タンパク質を単離することをさらに含む。
トランスジェニック動物
本発明の宿主細胞をまた使用して、非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。例えば、一つの実施態様では、本発明の宿主細胞は、その中にＮＯＶ１タンパク質コード化配列を導入する受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、そのような宿主細胞を使用して、その中で外来性のＮＯＶ１配列をゲノムの中に導入する非ヒトトランスジェニック動物、またはその中で内在性のＮＯＶ１配列を変更する相同な組換え動物を創成することができる。そのような動物は、ＮＯＶ１タンパク質の機能および／または活性の研究にならびにＮＯＶ１タンパク質活性のモジュレーターの同定および／または評価に有用である。本明細書において使用する「トランスジェニック動物」とは、その中で動物の一つまたはそれ以上の細胞が導入遺伝子を含む非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはラットまたはマウスのようなげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両棲類等を挙げ得る。導入遺伝子は、それからトランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムの中に取り込まれ、そして成熟動物のゲノム内に残存して、それによりトランスジェニック動物の一つまたはそれ以上の細胞タイプまたは組織中におけるコード化遺伝子産物の発現を指令する外来性ＤＮＡである。本明細書において使用する「相同の組換え動物」とは、その中で内在性ＮＯＶ１遺伝子が内在性遺伝子および、動物の細胞、例えば、動物の胚細胞の中に動物の発生前に導入された外来性ＤＮＡ分子との間で相同組換えにより変更した非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスである。
本発明のトランスジェニック動物は、ＮＯＶ１をコードする核酸を受精卵母細胞の雄性前核の中に（例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染により）導入して、卵母細胞を偽妊娠雌性仮親動物の体内で発生することを可能にすることにより、創成することができる。配列番号：１のヒトＮＯＶ１ｃＤＮＡ配列を、非ヒト動物のゲノム内に導入遺伝子として導入することができる。これに代えて、マウスＮＯＶ１遺伝子のようなヒトＮＯＶ１遺伝子の非ヒト相同体を、ヒトＮＯＶ１のｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション（上にさらに詳述）に基づいて単離して、導入遺伝子として使用し得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、導入遺伝子の発現効率を増加するために導入遺伝子中に含み得る。組織特異的調節配列をＮＯＶ１導入遺伝子に機能し得るように結合して、特定の細胞にＮＯＶ１タンパク質の発現を指示し得る。胚の操作およびマイクロインジェクションによる、トランスジェニック動物、特にマウスのような動物の作成方法は当分野において従来的となってきており、例えば、米国特許番号４,７３６,８６６; ４,８７０,００９; および４,８７３,１９１;ならびにHogan, 1986. In: MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されている。類似の方法を他のトランスジェニック動物の生産に用い得る。初代トランスジェニック動物を、ゲノム内のＮＯＶ１導入遺伝子の存在および／または動物の組織または細胞中におけるＮＯＶ１ｍＲＮＡの発現に基づいて、同定し得る。次いで、初代トランスジェニック動物を、導入遺伝子を保持する追加的動物の繁殖に使用し得る。さらに、ＮＯＶ１タンパク質をコードする導入遺伝子を保持するトランスジェニック動物を使用して、他の導入遺伝子を保持するさらに別なトランスジェニック動物を繁殖し得る。
相同の組換え動物を創成するために、その中に欠失、付加または置換を導入していて、それによりＮＯＶ１遺伝子を変化させる例えば機能的に破壊するあるＮＯＶ１遺伝子の少なくとも一部を含有するベクターを調製する。ＮＯＶ１遺伝子は、ヒト遺伝子（例えば配列番号：１のｃＤＮＡ）であり得るが、さらに好ましくはヒトＮＯＶ１遺伝子の非ヒト相同体である。例えば、配列番号：１のヒトＮＯＶ１遺伝子のマウス相同体を使用して、マウスゲノム中の内在性ＮＯＶ１遺伝子を変更するのに適する相同組換えベクターを構築することができる。一つの実施態様では、ベクターを、相同組換えにより、内在性遺伝子を機能的に破壊する（即ち、もはや機能的なタンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼称する）ようにデザインする。
これに代えて、ベクターは、相同組換えにより内在性ＮＯＶ１遺伝子を変異するかまたは他のように変更するが、依然機能性タンパク質をコードする（例えば、上流の調節領域を変更してそれにより内在性ＮＯＶ１タンパク質の発現を変更する）ようにデザインし得る。相同組換えベクターでは、ＮＯＶ１遺伝子の変更したタンパク質は、ＮＯＶ１遺伝子のさらに別な核酸により５'末端または３'末端に隣接して、ベクターにより保持する外来性ＮＯＶ１遺伝子および胚性幹細胞中の内在性ＮＯＶ１遺伝子の間で相同組換えが起こることを可能にする。さらに別な隣接ＮＯＶ１核酸は、内在性遺伝子と成功裏に相同組換えが起きるように十分な長さを持つ。典型的には、数キロ塩基の隣接ＤＮＡ（５'末端および３'末端の両方とも）をベクターに含み得る。相同組換えベクターの記載については、例えば、Thomas, et al., (1987). Cell 51: 503を参照されたい。次いで、ベクターを胚性幹細胞株に（例えば、エレクトロポレーションにより）導入し、そしてその中で導入したＮＯＶ１遺伝子を内在性ＮＯＶ１遺伝子と相同的に組み換えた細胞を選択する（例えば、Li, et al., (1992). Cell 69: 915を参照）。
次いで、選択した細胞を動物(例えば、マウス)の胚盤胞の中に注入して、凝集キメラを形成する。例えば、Bradley, 1987. In: TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEM CELLS: A PRACTICAL APPROACH, Robertson, ed. IRL, Oxford, pp. 113-152を参照されたい。次いで、キメラ胚を適当な偽妊娠雌性仮親動物に植え込んで、胚を満期出産する。生殖細胞内に相同組換えしたＤＮＡを保持している子孫を用いて、その中で動物の全ての細胞が、導入遺伝子の生殖系列を介した伝達により相同組換えＤＮＡを含有する動物を繁殖させることができる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築する方法は、Bradley, 1991. Curr. Opin. Biotechnol. 2: 823-829; ＰＣＴ国際公開第: ＷＯ９０／１１３５４号；ＷＯ９１／０１１４０号；ＷＯ９２／０９６８号；およびＷＯ９３／０４１６９号にさらに記載される。
もう一つの実施態様では、導入遺伝子の調節発現を可能にする選択したシステムを含有する非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。そのようなシステムの一つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムの記載については、例えば、Lakso, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236を参照されたい。リコンビナーゼシステムのもう一つの例は、Saccharomyces cerevisiaeのＦＬＰリコンビナーゼシステムである。O'Gorman, et al., 1991. Science 251:1351-1355を参照されたい。もしｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムを用いて導入遺伝子の発現を調節するならば、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択したタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含有する動物が必要となる。そのような動物は、例えば、一つは選択したタンパク質をコードする導入遺伝子を含有し、他はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含有する二つのトランスジェニック動物を交配させることによる「ダブル」トランスジェニック動物の構築により提供し得る。
本明細書に説明した非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Wilmut, et al., 1997. Nature 385: 810-813. In brief, a cell, e.g., a somatic cellに記載された方法にしたがって生産することができる。略述すれば、トランスジェニック動物から細胞（例えば体細胞）を単離し、誘導して、増殖サイクルから抜け出てＧ０期に入ることができる。次いで、静止細胞を、例えば、電気パルスの使用により静止細胞を単離したのと同じ種類の動物由来の脱核した卵母細胞と融合することができる。次いで、再構成した卵母細胞を、それを桑実胚または胚盤胞にまで発生させて、次いで擬妊娠雌性仮親動物に導入するように培養する。この雌性仮親動物から生まれた子孫は、細胞（例えば、体細胞）を単離する動物のクローンである。
医薬組成物
本発明のＮＯＶ１核酸分子、ＮＯＶ１タンパク質、抗−ＮＯＶ１抗体（本明細書では「活性化合物」ともいう）、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、類似体および相同体を投与に適する医薬組成物の中に組込み得る。典型的に、そのような組成物は核酸分子、タンパク質または抗体およびおよび医薬的に許容され得る担体を含む。本明細書において使用する「医薬的に許容され得る担体」とは、医薬品投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗かび剤、等張および吸収遅延剤等を含むことを意図する。適当な担体は、この分野で標準的な参照テキストであるRemingtonの薬剤学の最新版（出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている。そのような担体または賦形剤の好ましい例としては、水、食塩水、ビンガー溶液、ブドウ糖溶液および５％ヒト血清アルブミンを挙げるが、それらに限定しない。リポソームおよび脂肪油のような非水溶性ビークルもまた使用する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤は当分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物に適合しない限りでなければ、組成物内のそれらの使用を意図する。補助的な活性化合物をまた、組成物の中に組込み得る。
本発明の医薬組成物を、その意図する投与経路に適合するように処方する。投与経路の例としては、非経口の、例えば、静脈の、皮内の、皮下の、経口の（吸入）、経皮の（局所）、経粘膜のおよび直腸の投与を挙げ得る。非経口の、皮内のまたは皮下の応用に使用する溶液または懸濁液としては、以下の成分を挙げることができる：注射用水のような無菌賦形剤、食塩水溶液、脂肪油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のようなキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、ならびに塩化ナトリウムまたはブドウ糖のような等張性を調整する薬剤。塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基を用いてｐＨを調整することができる。非経口性製剤を、ガラスまたはプラスチックで作るアンプル、使い捨て注射器、または多回使用バイアルの中に封入し得る。
注射用に適する医薬組成物としては、無菌水溶液（水溶性である場合）または分散液および無菌注射用の溶液または分散液の必要に応じて調合する製剤用の無菌粉末を挙げ得る。静脈投与のためには、適当な担体としては、生理食塩水、静菌性水、Cremophor EL[登録商標] （BASF, Parsippany, N.J.）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を挙げ得る。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性であるべきである。それは製造および保管の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液性ポリエチレングリコール等）ならびにそれらの適当な混合液を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により、保持し得る。微生物作用の保護は、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等、により達成される。多くの場合に、組成物中に、等張性薬剤、例えば、砂糖、マニトールのようなポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成剤の吸収の延長は、組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによりもたらせ得る。
無菌注射用溶液を、適切な溶媒の中に一つまたは上で列挙した成分の組合せと共に必要な量で活性化合物（例えば、あるＮＯＶ１タンパク質または抗ＮＯＶ１抗体）を組み込み、ついでろ過滅菌を行なうことにより調製することができる。一般的に、分散液は、基本的な分散媒体および上で列挙したものから必要な他の成分を含有する無菌ビークルの中に活性化合物を組み込むことにより調製することができる。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合には、調製方法は、活性成分の粉末プラス前もって無菌ろ過されたその溶液からの任意のさらに別の望ましい成分の粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥である。
一般的に、経口の組成物は、不活性賦形剤または食用の担体を含む。それらをゼラチンカプセル中に封入するかまたは錠剤に打錠することができる。経口治療投与の目的には、活性化合物を添加物と共に組込んで錠剤、トローチまたはカプセルの形状で使用することができる。経口の組成物をまた、うがい薬としての使用のために液体担体を用いて調製し得るが、そこでは液体担体中の化合物を経口的に塗布し、さっと取り除いて、吐き出すか飲み込む。薬学的に適合する結合剤、おおび／またはアジュバント材料を組成物の一部として含み得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は任意の以下の成分または同様な性質を持つ化合物を含有し得る：微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンのような結合剤；デンプンまたは乳糖のような添加剤、アルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロートのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような滑り剤；ショ糖またはサッカリンのような甘味剤；またはハッカ、サルチル酸メチル、オレンジ香料のような着香剤。
吸入による投与のためには、化合物を、適当な噴射剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含有する加圧容器またはディスペンザー、またはネブライザーからエアゾールスプレイの形式で送達し得る。
全身的投与はまた、経粘液または経皮手段により得る。経粘液または経皮投与のためには、透過すべきバリアーに適切な浸透剤を処方に使用する。そのような浸透剤は当分野において一般的に公知であり、そして、例えば、経粘液投与のためには、洗剤、胆汁酸塩、フシジン酸誘導体を挙げ得る。経粘液投与は鼻腔スプレーまたは坐剤の使用により達成され得る。経皮投与のためには、活性化合物は、当分野において一般的に公知であるように、軟膏、軟膏剤、ゲルまたはクリームの中に処方される。
化合物をまた、直腸送達のために坐薬（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤用基材と共に）または保持浣腸剤の形式で調製し得る。
一つの実施態様において、活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤のように、化合物を身体からの迅速な排泄から防止する担体と共に調製する。酢酸エチレンビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ酢酸のような、生物分解性で生体適合性のポリマーを使用し得る。そのような製剤を調製する方法は当業者に明らかである。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から市販で入手可能である。リポソームの懸濁液(モノクローナル抗体を持つ感染した細胞からウイルス抗体に至って標的化したリポソームを含む)をまた、医薬的に許容され得る担体として使用することができる。これらを、例えば米国特許番号４,５２２,８１１に記載のように、当業者に公知の方法に従い調製し得る。
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、経口性または非経口性の組成物を単位投与剤型で処方することが特に有益である。本明細書で使用する単位投与剤型とは、処置する対象に対して単一の投与量として適する物理学的に分離した単位を指し；それぞれの単位は、必要な薬学的な担体と一緒に望ましい治療効果を生じるように計算した予め決められた量の活性化合物を含有する。本発明の単位投与剤型の規格は、活性化合物の特異な特色および達成するべき特別な治療効果、およびかつ個人の処置に活性な化合物のような配合分野において固有の制限により指示されかつ直接に依存する。
本発明の核酸分子をベクターの中に挿入して遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与（例えば、米国特許番号５，３２８，４７０）または定位的注射（例えば、Chen, et al., 1994. Proc Narl Acad Sci USA 91: 3054-3057を参照）による対象に運ばれる。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容される賦形剤の中に遺伝子治療ベクターを含むか、またはその中に遺伝子治療ベクターを埋め込んだ持続性マトリックスを含み得る。これに代えて、完全な遺伝子治療ベクターを組換え細胞、例えばレテロウイルスベクターから無傷で生産し得る場合には、医薬製剤は遺伝子送達システムを生産する一つまたはそれ以上の細胞を含み得る。
医薬製剤を、投与指示書と共に、容器、パックまたはディスペンサーの中に含み得る。
スクリーニングアッセイ
本発明は、モジュレーター、即ち、ＮＯＶ１タンパク質に結合するか、または、例えばＮＯＶ１の発現またはＮＯＶ１の活性に促進的または阻害的作用を有する候補または試験化合物または薬剤(例えば、ペプチド、ペプチドミメティクス、低分子または他の薬)を同定する方法（本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも呼称する）を提供する。一つの実施態様では、本発明は、膜結合型のＮＯＶ１タンパク質またはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分の活性を調整する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物を、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス参照可能な並列の固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成的ライブラリー方法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー方法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー方法：を含む、当分野において周知のコンビナトリアルライブラリーにおける数多くのアプローチのいずれを用いても得られる。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに限定される一方で、他の４種のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である。例えば、Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145を参照されたい。
本明細書において用いられる「小分子」は、約５ｋＤ未満、最も好ましくは約４ｋＤの分子量を有する組成物に言及することを意味する。小分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質または他の有機または無機分子であり得る。真菌、細菌、または藻類抽出物のような化学的および／または生物学的混合物のライブラリーは、当分野において既知であり、かつ本発明のいずれかのアッセイでスクリーニングできる。
分子ライブラリー合成方法の例を、例えば、DeWitt, et al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909、Erb, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 11422、Zuckermann, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 2678、Cho, et al., 1993. Science 261: 1303; Carrell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059、Carell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061、およびGallop, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 1233における当分野に見出し得る。
化合物のライブラリーを、溶液中で(例えば、Houghten, 1992. Biotechniques 13: 412-421)、またはビーズ上で(Lam, 1991. Nature 354: 82-84)、チップ上で(Fodor, 1993. Nature 364: 555-556)、バクテリア(Ladner, 米国特許番号５,２２３,４０９)、胞子 (Ladner, 米国特許番号５,２３３,４０９)、プラスミド (Cull, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869)上でまたはファージ上で(Scott and Smith, 1990. Science 249: 386-390; Devlin, 1990. Science 249: 404-406、Cwirla, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 6378-6382、Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222: 301-310、Ladner, 米国特許番号５,２２３,４０９)で提供し得る。
ある実施態様では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、そこでは膜結合型のＮＯＶ１タンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触させ、そして試験化合物があるＮＯＶ１タンパク質に結合する能力を測定する。細胞は、例えば、哺乳類由来または酵母細胞であり得る。試験化合物がＮＯＶ１タンパク質に結合する能力を測定することは、例えば、試験化合物を放射性同位元素または酵素標識とカップリングして、ＮＯＶ１タンパク質またはその生物学的に活性な部分への試験化合物の結合を、複合物中の標識化合物を検出することにより測定できるようにする。例えば、試験化合物を、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで直接的にまたは間接的に標識し、そして放射性同位元素を放射線放射の直接計数またはシンチレーション計数により検出する。これに代えて、試験化合物を、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼにより酵素的に標識し、そして適切な基質の生産物への変換の測定により酵素標識を検出する。ある実施態様では、アッセイは、膜結合型のＮＯＶ１タンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を、ＮＯＶ１に結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成して、アッセイ混合物を試験化合物と接触し、そして試験化合物があるＮＯＶ１と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶ１タンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物がＮＯＶ１タンパク質またはその生物学的に活性な部分に、既知化合物と比較して優先的に結合する能力を測定することを含む。
もう一つの実施態様では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、膜結合型のＮＯＶ１タンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶ１タンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調整する（例えば促進または阻害する）能力を測定することを含む。試験化合物がＮＯＶ１またはその生物学的に活性な部分の活性を調整する活性を測定することは、例えば、ＮＯＶ１タンパク質があるＮＯＶ１の標的分子と結合するかまたは相互作用をする能力を測定することにより達成し得る。本明細書において使用する「標的分子」とは、自然界にあるＮＯＶ１タンパク質が結合または相互作用する分子、例えば、あるＮＯＶ１と相互作用するタンパク質を発現する細胞表面の分子、２番目の細胞表面の分子、細胞外の環境中の分子、細胞膜の内側表面と会合している分子または細胞質の分子である。ＮＯＶ１の標的分子は、非ＮＯＶ１分子または本発明のあるＮＯＶ１タンパク質またはポリペプチドであり得る。一つの実施態様では、あるＮＯＶ１の標的分子は、細胞外のシグナル（例えば、膜結合ＮＯＶ１分子への化合物の結合により発生するシグナル）を細胞膜を通してかつ細胞内への伝達を促進する情報伝達経路の成分である。標的は、例えば、触媒活性を有する２番目の細胞内タンパク質または下流のシグナル分子とＮＯＶ１との会合を促進するタンパク質であり得る。
ＮＯＶ１タンパク質を、あるＮＯＶ１の標的分子と結合するかまたは相互作用をする能力を測定することは、直接的な結合を測定する上述の方法の一つにより達成し得る。一つの実施態様では、ＮＯＶ１タンパク質があるＮＯＶ１の標的分子と結合または相互作用する能力を測定することは、標的分子の活性を測定することにより達成することができる。例えば、標的分子の活性を、標的の細胞性第二のメッセンジャー(即ち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３等)の誘導を検出すること、適切な基質に対する標的の触媒／酵素活性を検出すること、受容体遺伝子(検出可能なマーカー、例えば、ルシフェラーゼ、をコードする核酸に機能し得るように結合したＮＯＶ１応答性調節要素を含む)の誘導を検出すること、または細胞応答、例えば、細胞の生存、細胞の分化、または細胞の増殖、を検出することにより測定し得る。
なおもう一つの実施態様では、本発明のアッセイは無細胞アッセイであって、あるＮＯＶ１タンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶ１タンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を測定することを含む。ＮＯＶ１タンパク質への試験化合物の結合を、上述のように、直接的または間接的のどちらかで測定することができる。一つのそのような実施態様では、アッセイは、ＮＯＶ１タンパク質またはその生物学的に活性な部分をＮＯＶ１と結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触すること、および試験化合物があるＮＯＶ１タンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶ１タンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物がＮＯＶ１タンパク質またはその生物学的に活性な部分に既知化合物と比較して優先的に結合する能力を測定することを含む。
なおもう一つの実施態様では、アッセイは、ＮＯＶ１タンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶ１タンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質の活性を調整する（例えば促進または阻害する）能力を測定することを含む無細胞アッセイである。ＮＯＶ１の活性を調整する試験化合物の能力を測定することは、例えば、ＮＯＶ１タンパク質があるＮＯＶ１の標的分子に結合する活性を直接な結合を測定するために上述した方法の一つにより達成することができる。さらに別の実施態様では、試験化合物がＮＯＶ１タンパク質の活性を調節する能力を測定することは、ＮＯＶ１タンパク質がさらにあるＮＯＶ１の標的分子を調整する能力を測定することにより達成することができる。例えば、適切な基質に対する標的分子の触媒／酵素活性を上述のように測定することができる。
なおもう一つの実施態様では、無細胞アッセイは、ＮＯＶ１タンパク質またはその生物学的に活性な部分をＮＯＶ１タンパク質と結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触すること、そして試験化合物がＮＯＶ１タンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶ１タンパク質と相互作用する能力を測定することは、ＮＯＶ１タンパク質があるＮＯＶ１の標的分子に優先的に結合するかまたはその活性を調整する能力を測定することを含む。
本発明の無細胞アッセイは、可溶性型または膜結合型のＮＯＶ１タンパク質の両方に使用することができる。膜結合型のＮＯＶ１タンパク質を含む無細胞アッセイの場合には、膜結合型のＮＯＶ１タンパク質を溶液中に維持するように、可溶化剤を利用するのが望ましい。そのような可溶化剤の例としては、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ［登録商標］Ｘ-１００、Ｔｒｉｔｏｎ［登録商標］Ｘ-１１４、Ｔｈｅｓｉｔ［登録商標］、イソトリデシポリ(エチレングリコールエーテル)ｎのような非イオン性界面活性剤、Ｎ−ドデシル−Ｎ,Ｎ−ジメチル−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−(３−クロルアミドプロピル)ジメチルアミニオール−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳ)、または３−(３−クロルアミドプロピル)ジメチルアミニオール−２ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳＯ)を挙げ得る。
本発明の上記のアッセイ法の二つ以上の実施態様において、ＮＯＶ１タンパク質またはその標的分子を固相化して、一つまたは両方のタンパク質の非複合型から複合型の分離を容易にし、ならびにアッセイの自動化に適合することができる。試験化合物のＮＯＶ１タンパク質への結合、または候補化合物存在下および非存在下でのＮＯＶ１タンパク質と標的分子との相互作用は、反応物質を含有するのに適する任意の容器において達成することができる。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心チューブを挙げ得る。一つの実施態様では、一つまたは両方のタンパク質をマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供し得る。例えば、ＧＳＴＮＯＶ１融合タンパク質またはＧＳＴ−標的融合タンパク質をグルタチオンセファローズビーズ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）またはグルタチオンで誘導体化したマイクロタイタープレート上に吸着し、これを次いで試験化合物、または試験化合物および非吸着標的タンパク質またはＮＯＶ１タンパク質のどちらかと結合し、そして混合物を複合体形成を促進する条件下で（例えば、塩およびｐＨに関して生理的な条件で）インキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレート穴を洗滌して、非結合成分を全て除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定化し、複合体を例えば上述のように、直接的にまたは間接的に測定する。これに代えて、複合体をマトリックスから解離し、そしてＮＯＶ１タンパク質の結合または活性レベルを標準的技術を用いて測定することもできる。
マトリックス上にタンパク質を固定化する他の技術をまた、本発明のスクリーニングアッセイに使用し得る。例えば、ＮＯＶ１タンパク質またはその標的分子のいずれかをビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。ビオチニル化ＮＯＶ１タンパク質または標的分子をビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−サクシンイミド)から当分野内で周知の技術（例えば、ビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill.）を用いて調製して、ストレプトアビジンをコーティングした９６穴プレート（Pierce Chemical）の穴に固定化することができる。これに代えて、ＮＯＶ１タンパク質または標的分子と反応性であるが、ＮＯＶ１タンパク質のその標的タンパク質への結合を妨害しない抗体をプレートの穴に誘導体化して、非結合標的またはＮＯＶ１タンパク質を抗体との結合により穴に捕捉することができる。そのような複合体を検出する方法としては、ＧＳＴ−固定化複合体について上述したものに加えて、ＮＯＶ１タンパク質または標的分子と反応する抗体を用いる複合体の免疫検出、ならびにＮＯＶ１タンパク質または標的分子に関連した酵素活性を検出することに依存する酵素結合アッセイを挙げ得る。
もう一つの実施態様では、ＮＯＶ１タンパク質発現のモジュレータを、細胞を候補化合物と接触し、細胞中のＮＯＶ１ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定する方法で同定する。候補化合物の存在下でのＮＯＶ１ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを、候補化合物の非存在下でのＮＯＶ１ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較する。次いで、候補化合物を、この比較に基づいてＮＯＶ１ｍＲＮＡまたはタンパク質のモジュレータとして同定し得る。例えば、ＮＯＶ１ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を候補化合物の存在下での方がその非存在下でよりも多い（即ち統計的に有意に多い）ときには、候補化合物を、ＮＯＶ１ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の促進剤として同定する。これに代えて、ＮＯＶ１ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の存在下での方がその非存在下でよりも少ない（即ち統計的に有意に少ない）ときには、候補化合物を、ＮＯＶ１ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤として同定する。細胞中のＮＯＶ１ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルを、ＮＯＶ１ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書で説明する方法により測定することができる。
本発明のなおもう一つの態様では、ＮＯＶ１タンパク質は２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイ（例えば米国特許番号5,283,317、Zervos, et al., 1993. Cell 72: 223-232、Madura, et al., 1993. J. Biol. Chem. 268: 12046-12054、Bartel, et al., 1993. Biotechniques 14: 920-924、Iwabuchi, et al., 1993. Oncogene 8: 1693-1696、および Brent 第ＷＯ９４／１０３００号を参照)おける「ベイトタンパク質」として使用して、ＮＯＶ１と結合または相互作用をしてＮＯＶ１活性を調整する他のタンパク質(「ＮＯＶ１結合タンパク質」または「ＮＯＶ１−ｂｐ」)を同定し得る。そのようなＮＯＶ１結合タンパク質はまた、例えば、ＮＯＶ１経路の上流または下流の要素としてＮＯＶ１タンパク質によるシグナルの増幅に関与する。
２ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインより成る殆どの転写因子のモジュール構成的性質に基づく。略述すれば、アッセイには２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物においては、ＮＯＶ１をコードする遺伝子を既知の転写因子(例えば、ＧＡＬ−４)のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。他の構築物においては、未同定のタンパク質（「プレイ」または「試料」）をコードするＤＮＡ配列ライブラリー由来のＤＮＡを、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。もし「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用してＮＯＶ１依存性複合体を形成することができれば、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインを近くに引き寄せ得る。この近接は、転写因子に応答性の転写調節部位に機能し得るように結合したレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現を検出し、機能的転写因子を含有する細胞コロニーを単離し、そしてこれを用いてＮＯＶ１と相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得ることができる。
本発明はさらに前述のスクリーニングアッセイにより同定する新規薬剤および本明細書に説明する処置へのその使用に関する。
検出アッセイ
本明細書で同定するｃＤＮＡの一部またはフラグメント（および対応する完全な遺伝子配列）をポリヌクレオチド試薬として種々の方式で使用することができる。制限されるこのない例により、これらの配列を：（i）染色体上にそれぞれの遺伝子をマップし；かくして遺伝的疾患に関連した遺伝子領域を位置決定する；（ii）微量の生物学的試料から個体を同定する（組織タイピング）；および（iii）生物学的試料の法医学的同定を助けるために用い得る。これらの応用のいくつかは、以下のセクションにおいて記載される。
染色体マッピング
遺伝子の配列（または配列の一部）が単離されると、この配列を用いて染色体上の遺伝子の位置をマッピングする。このプロセスは染色体マッピングと呼ばれ。または、ＮＯＶ１配列の部分またはフラグメント、配列番号：１、またはそれらのフラグメントまたは誘導体を用いて、染色体上のＮＯＶ１遺伝子の位置をそれぞれマッピングできる。染色体に対するＮＯＶ１配列のマッピングは、疾病と関連する遺伝子を有するこれらの配列の相互作用において重要なステップである。
要約すると、ＮＯＶ１遺伝子は、ＮＯＶ１配列由来のＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５ｂｐ長）を用意することにより染色体にマッピングされ得る。ＮＯＶ１配列のコンピューター解析を用いて、ゲノムＤＮＡ中の１より多いエクソンにわたらないプライマーを迅速に選択でき、ゆえいに増幅過程は複雑化する。これらのプライマーは次に個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに用いられ得る。ＮＯＶ１配列に対応するヒト遺伝子を含有するこれらのハイブリッドは増幅フラグメントを生じる。
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳類（例えば、ヒト細胞およびマウス細胞）由来の体細胞を融合させることにより調整される。ヒトおよびマウス細胞のハイブリッドが成長および分割するにつれて、それらはランダムな順序でヒト染色体を徐々に欠くが、マウス染色体を保持する。特定の酵素を欠くためマウス細胞が成長できないが、ヒト細胞は成長できる培地を用いることにより、必要な酵素をコード化する遺伝子を含有するヒト染色体が保持さるだろう。様々な培地を用いることにより、ハイブリッド細胞株のパネルが確立され得る。パネルのそれぞれの細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体のいずれか、およびマウス染色体の全セットを含有し、特定のヒト染色体に対する個々の遺伝子のマッピングを容易にする。例えば、D'Eustachio, et al., 1983. Science 220: 919924を参照されたい。ヒト染色体のフラグメントのみを含有する体細胞ハイブリッドはまた、転座または欠損を有するヒト染色体を用いて産生され得る。
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に対する特定の配列
を決定する迅速な方法である。一日当てリ３またはそれ以上の配列が、シングルサーマルサイクラーを用いて決定され得る。デザインオリゴヌクレオチドプライマーに対するＮＯＶ１配列を用いて、半局在化は特定の染色体由来のフラグメントのパネルで達成され得る。
拡散する中期の染色体に対するＤＮＡ配列の蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）をさらに用いて、あるステップでの正確な染色体局在化を提供できる。染色体の拡散は、紡錘体を破壊するコルセミドのような化学物質により中期で分割がブロックされた細胞を用いて作られ得る。染色体はトリプシンで短時間処理され、次にギムザ染色される。明るいバンドおよび暗いバンドのパターンがそれぞれの染色体に依存し、染色体はそれぞれ同定され得る。ＦＩＳＨ技術は、５００塩基または６００塩基の短さのＤＮＡ配列と共に用いられ得る。しかしながら、１，０００塩基より長いクローンは、単一欠損についての十分な感度で特徴的染色体座に結合するより長いものを有する。好ましくは、１，０００塩基、そしてより好ましくは２，０００塩基が、妥当な時間でよい結果を生じるのに十分である。この技術の再考察のため、Verma, et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques (Pergamon Press, New York 1988)を参照されたい。
染色体マッピングの試薬を個別に用いて、単一染色体または該染色体の単一部位、または多型部位および／または多型染色体をマーキングできる。遺伝子の非コード領域に対応する試薬は実際にマッピング目的に好ましい。コード配列は遺伝子ファミリー内でより保存され、従って染色体マッピング間で、クロスハイブリダイゼーションの機会を増加させる。
配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上での配列の物理的位置は、遺伝子マップデータと相関しうる。かかるデータは、例えば、Johns Hopkins University Welch Medical Libraryを介して利用可能なオンラインであるin McKusick, Mendelian Inheritance in Manにおいて見られる。同一染色体領域にマッピングされる遺伝子と疾病との間の関連は、次に例えば、Egeland, et al., 1987. Nature, 325: 783787において記載される連鎖解析（物的な隣接遺伝子の共遺伝）を介して同定され得る。
さらに、ＮＯＶ１遺伝子と関連する疾病の影響を受けた個体と受けない個体間のＤＮＡ配列の差が測定され得る。変異が影響を受けた個体のいくつかまたは全てで見られるが、影響を受けていない個体で見られないと、変異が特定の疾病の原因物質でありうる。影響を受けた個体と影響を受けていない個体との比較は一般に、染色体拡散から目に見えるまたはＤＮＡ配列に基づくＰＣＲを用いて検出可能な欠損または転座のような染色体中の構造変化をまず探すことに関与する。結局、いくつかの個体由来の遺伝子の完全な配列決定を成し遂げて、変異の存在を確認できるか、または多型性由来の変異を区別できる。
組織タイピング
本発明のＮＯＶ１配列をまた用いて、微小な生物学的試料から個体を同定し得る。この技術において、個体のゲノムＤＮＡは、１またはそれ以上の制限酵素で切断され、サザンブロットで探索され同定のための特徴的なバンドを生じる。本発明の配列は、ＲＥＬＰ（米国特許番号５，２７２，０５７に記載される「制限断片長多型」）のためのＤＮＡマーカーとてして有用である。
さらに、本発明の配列を用いて、個体のゲノムの選択された部分の実際の塩基ごとのＤＮＡ配列を測定する代わりの技術を提供することができる。従って、本明細書において記載されるＮＯＶ１配列を用いて、配列の５’末端および３’末端由来の２つのＰＣＲプライマーを調製できる。これらのプライマーを次に用いて、個々のＤＮＡを増幅して続いてそれを配列決定できる。
この方法で調製される個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、それぞれの個体が対立遺伝子の差に起因するＤＮＡ配列のような特徴的なセットを有するような、特徴的な個体同定を提供する。本発明の配列を用いて、個体および組織由来のかかる同定配列を得ることができる。本発明のＮＯＶ１配列は、ヒトゲノムの一部を特徴的に表す。対立遺伝子のバリエーションは、これらの配列のコード領域である程度、非コード領域でより高い程度で生じる。個々のヒト間の対立遺伝子バリエーションが５００塩基ごとに約１度の頻度で生じることが確かめられる。多くの対立遺伝子バリエーションは、制限酵素断片長多型（ＲＥＬＰ）を含む一塩多型（ＳＮＰ）に起因する。
本明細書において記載される配列のそれぞれは、個体由来のＤＮＡが同定目的のため比較されるものに対する基準としてある程度用いられ得る。より多くの多型性非コード領域で生じるため、より短い配列は個体を区別するのに必要である。非コード配列は十分に、それぞれが１００塩基の非コード増幅配列を生む、おそらく１０〜１，０００プライマーのパネルと共に陽性個体の同定を提供し得る。配列番号：１のもののような予測コード配列が用いられると、陽性個体の同定により適当な数のプライマーは５００〜２，０００である。
予測医学
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミクス、および臨床試験のモニタリングを予後的（予測的）目的で使用し、それにより個体を予防的に処置する、予測医学の分野に関する。したがって、本発明の１つの態様は、ＮＯＶ１タンパク質および／または核酸の発現ならびにＮＯＶ１活性を生物学的試料（例えば、血液、血清、細胞、組織）との関連で測定して、それにより個体が異常なＮＯＶ１の発現または活性に関連した疾患または障害に罹患しているか、または障害を発症するリスクを有しているか否かを測定するための診断アッセイに関する。本発明はまた、個体がＮＯＶ１タンパク質、核酸の発現または活性に関連した障害を発症するリスクを有しているか否かを測定するための予後的（予測的）アッセイを提供する。例えば、あるＮＯＶ１遺伝子の突然変異を生物学的試料中でアッセイし得る。そのようなアッセイを、予後的または予測的目的に使用し、それによりＮＯＶ１タンパク質、核酸の発現または活性を特徴とするかまたはこれと関連する障害の発生に先立って個体を予防的に処置し得る。
本発明のもう一つの態様は、個体におけるＮＯＶ１タンパク質、核酸発現または活性を測定し、それによりその個体にとって適切な治療的または予防的な薬剤を選択する方法（本明細書では「薬理ゲノミクス」と呼称する）を提供する。薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型に基づいた個体の治療的または予防的処置のための薬剤（例えば薬）の選択を可能にする（例えば、個体の遺伝子型を検査して、個体が特定の薬剤に応答する能力を測定する）。
本発明のなおもう一つの態様は、薬剤（例えば、薬、化合物）が臨床試験においてＮＯＶ１の発現または活性に与える影響をモニタリングすることに関する。
これらおよび他の薬剤については以下のセクションで詳細に説明する。
診断アッセイ
生物学的試料中におけるＮＯＶ１の存在または非存在を検出する例示的な方法は、被験対象から生物学的試料を得ること、および生物学的試料をＮＯＶ１タンパク質またはＮＯＶ１タンパク質をコードする核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)を検出する能力のある化合物または薬剤と接触し、ＮＯＶ１の存在が生物学的試料中で検出できるようにすることを伴う。ＮＯＶ１ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの検出用の薬剤は、ＮＯＶ１ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとハイブリダイズする能力のある標識核酸プローブである。核酸プローブは、上述のように、例えば、配列番号：１の核酸のような全長ＮＯＶ１核酸、または少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長でそして厳密な条件下でＮＯＶ１ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドの一部である。本発明の診断的アッセイにおいて使用するための他の適当なプローブを本明細書で説明する。
ＮＯＶ１タンパク質検出用の薬剤は、ＮＯＶ１タンパク質に結合する能力のある抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはさらに好ましくはモノクローナルであり得る。インタクトな抗体、またはそのフラグメント(例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ')２)を使用し得る。プローブまたは抗体に関する用語「標識」とは、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングする（即ち物理的に連結する）ことによりプローブまたは抗体を直接的に標識すること、ならびに直接標識したもう一つの試薬との反応性によりプローブまたは抗体を間接的に標識することを包含する。間接的な標識の例としては、蛍光標識した第２抗体を用いた第１抗体の検出、および蛍光標識したストレブトアビジンで検出し得るように、ビオチンでＤＮＡプローブを末端標識することを挙げ得る。用語「生物学的試料」とは、対象から単離した組織、細胞および生物学的流体、ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含む。即ち、本発明の検出法を使用して、インビトロおよびインビボで生物学的試料中のＮＯＶ１ｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡを検出し得る。例えば、ＮＯＶ１ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインシツハイブリダイゼーションを挙げ得る。ＮＯＶ１タンパク質を検出するためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)、ウエスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光を挙げ得る。ＮＯＶ１ゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションを挙げ得る。さらに、ＮＯＶ１タンパク質を検出するためのインビボ技術は、対象中へ標識抗ＮＯＶ１抗体を導入することを含む。例えば、抗体を、対象中のその存在および位置を標準造影技術で検出し得る放射活性マーカーで標識することができる。
一つの実施態様では、生物学的試料は被験対象由来のタンパク質分子を含有する。これ代えて、生物学的試料は、被験対象由来のｍＲＮＡ分子または被験対象由来のゲノムＤＮＡ分子を含有し得る。好ましい生物学的試料は、対象より従来の手段で単離した末梢血白血球試料である。
もう一つの実施態様では、方法は、対照対象から対照の生物学的試料を得ること、対照試料をＮＯＶ１タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出する能力のある化合物または薬剤と、ＮＯＶ１タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を生物学的試料中で検出するように接触すること、および対照試料中のＮＯＶ１タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を試験試料中のＮＯＶ１タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと比較することをさらに伴う。
本発明はまた、生物学的試料中のＮＯＶ１の存在を検出するキットを包含する。例えば、キットは：生物学的試料中のＮＯＶ１タンパク質またはｍＲＮＡを検出する能力のある標識化合物または薬剤；試料中のＮＯＶ１の量を測定する手段；および試料中のＮＯＶ１の量を標準と比較する手段を含み得る。化合物および薬剤を適当な容器中に包装し得る。キットは、ＮＯＶ１タンパク質または核酸を検出するキットの使用のための使用説明書をさらに含み得る。
予後アッセイ
さらに、本明細書に説明する診断方法を利用して、異常ＮＯＶ１の発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。例えば、先行の診断アッセイおよび以下のアッセイのような、本明細書で説明するアッセイを利用して、ＮＯＶ１タンパク質、核酸の発現または活性に関連した障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。これに代えて、予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。かくして、本発明は、試験試料を対象から得て、そして異常なＮＯＶ１タンパク質または核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)を検出する異常なＮＯＶ１の発現または活性に関連した疾患または障害を同定する方法を提供し、そこではＮＯＶ１タンパク質または核酸の存在は、異常なＮＯＶ１の発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象に対する診断になる。本明細書において使用する「試験試料」とは、興味のある対象から得られる生物学的試料を指す。例えば、試験試料は生物学的流体（例えば血清）、細胞試料、または組織であり得る。
さらに、本明細書に説明する予後アッセイを使用して、異常なＮＯＶ１の発現または活性に関連した疾患または障害を処置するために、対象に薬剤（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の医薬候補物）を投与することができるか否かを決定し得る。例えば、そのような方法を使用して、疾患を薬剤により有効に処置するか否かを決定し得る。かくして、本発明は、試験試料を得て、ＮＯＶ１タンパク質または核酸を検出する異常なＮＯＶ１の発現または活性に関連した障害を薬剤により対象を有効に処置し得るか否かを決定する方法を提供する（例えば、そこではＮＯＶ１タンパク質または核酸の存在は、異常なＮＯＶ１の発現または活性に関連した障害を処置するために薬剤を投与され得る対象に対する診断になる）。
本発明の方法をまた使用してあるＮＯＶ１遺伝子中の遺伝的損傷を検出し、それにより損傷のある遺伝子を有する対象が異常な細胞増殖および／または分化により特徴付けられる疾病に対するリスクであるかを測定する。種々の実施態様において、これらの方法は、対象由来の細胞試料中において、あるＮＯＶ１タンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を及ぼす少なくとも一つの変更、またはＮＯＶ１遺伝子の誤発現を特徴とする遺伝的損傷の存在または不在の検出を含む。例えば、そのような遺伝的損傷を、（i）あるＮＯＶ１遺伝子からの一つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失；（ii）あるＮＯＶ１遺伝子への一つまたはそれ以上のヌクレオチドの付加；（iii）あるＮＯＶ１遺伝子の一つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、（iv）あるＮＯＶ１遺伝子の染色体再編成、（v）あるＮＯＶ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベルの変化、（vi）ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのようなあるＮＯＶ１遺伝子の異常修飾、（vii）あるＮＯＶ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、（viii）あるＮＯＶ１タンパク質の非野生型レベル、（ix）あるＮＯＶ１遺伝子の対立遺伝子欠失、および（x）あるＮＯＶ１タンパク質の不適切な翻訳後修飾の少なくとも一つの存在の確認により検出し得る。本明細書に説明するあるＮＯＶ１遺伝子の損傷を検出するために使用し得る当分野において公知の多数のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的試料は、対象から従来の手段で単離した末梢血白血球試料である。しかしながら、例えば、頬粘膜細胞を含む有核細胞を含有する任意の生物学的試料を使用し得る。
特定の実施態様では、損傷の検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば米国特許番号４,６８３,１９５および４,６８３,２０２を参照）におけるかまたはこれに代えて、連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Landegran, et al., 1988. Science 241: 1077-1080、およびNakazawa, et al., 1994. Proc. Natl. Acad Sci. USA 91: 360-364を参照）におけるプローブ／プライマーの使用を伴うが、後者はＮＯＶ１遺伝子中の点突然変異検出に特に有用であり得る（Abravaya, et al., 1995. Nucl. Acids Res. 23: 675-682を参照）。この方法は、患者から細胞試料を集め、試料の細胞から核酸(例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方)を単離し、ＮＯＶ１遺伝子（もし存在するならば）のハイブリダイゼーションおよび増幅が起きるような条件下で、あるＮＯＶ１遺伝子と特異的にハイブリダイズする一つまたはそれ以上のプライマーと核酸試料を接触し、そして増幅産物の存在または不在を検出し、または増幅産物のサイズを検出し、そして対照試料と長さを比較するステップを含み得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に説明する変異の検出に使用する任意の技術と一緒に予備的増幅ステップとして使用するのが望ましい。
さらに別な増幅法としては：自己保持配列複製（Guatelli, et al., (1990). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878を参照）、転写増幅システム（Kwoh, et al., (1989). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177を参照）；Ｑβレプリカーゼ（Lizardi, et al, (1988). BioTechnology 6: 1197を参照）、または任意の他の核酸増幅法に引き続いて当業者に周知の技術を用いる増幅分子の検出を挙げ得る。これらの検出スキームは、核酸分子がごく少数で存在するならば、そのような分子の検出に特に有用である。
さらに別の実施態様では、試料細胞由来のあるＮＯＶ１遺伝子中の変異を、制限酵素切断パターンの変化により同定し得る。例えば、試料および対照のＤＮＡを単離し、増幅し（任意に）、一つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで処理し、そしてフラグメントのサイズをゲル電気泳動で測定して比較する。試料と対照のＤＮＡ間のフラグメントサイズの差は試料ＤＮＡ中の変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム（例えば、米国特許番号５,４９３,５３１を参照）を使用して、リボザイム切断部位の発生または消失により特異的な変異の存在を評価し得る。
他の実施態様では、ＮＯＶ１中の遺伝的突然変異は、試料および対照の核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを数百または数千個のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイにハイブリダイズすることにより同定することができる。例えば、Cronin, et al., 1996. Human Mutation 7: 244-255、Kozal, et al., 1996. Nat. Med. 2: 753-759を参照されたい。例えば、ＮＯＶ１中の遺伝的変異を、上述のCronin, et al.に記載するように光を発生するＤＮＡプローブを含有する２次元アレイ中で同定し得る。略述すれば、プローブの１番目のハイブリダイゼーションアレイを用いて、試料と対照中の長い一続きのＤＮＡをスキャンして、一連の重なり合うプローブの線形アレイを作成することにより配列間の塩基変化を同定し得る。このことは点突然変異の同定を可能にする。これに、検出した全ての変異体または突然変異に相補的なさらに小さな特別のプローブアレイを用いることにより特定の変異の特徴化を可能にする２番目のハイブリダイゼーションを行う。それぞれの変異アレイは、一つは野生型遺伝子に相補的で、他は突然変異遺伝子に相補的な並行なプローブのセットから成る。
なおもう一つの実施態様において、当分野において公知の種々のシークエンシング反応のいずれかを使用してＮＯＶ１遺伝子を直接にシークエンシングして、試料のＮＯＶ１の配列を対応する野生型（対照）配列と比較することにより変異を検出し得る。シークエンシング反応の例としては、Maxim and Gilbert, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560またはSanger, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463により開発された技術に基づくものを挙げ得る。質量分析によるシークエンシング（例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４／１６１０１号; Cohen, et al., 1996. Adv. Chromatography 36: 127-162およびGriffin, et al., 1993. Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159を参照）を含む種々の自動化シークエンシング方法のいずれも診断アッセイの実施に際して利用され得ることをまた考え得る（例えば、Naeve, et al., 1995. Biotechniques 19: 448を参照）。
ＮＯＶ１遺伝子中の変異を検出する他の方法としては、切断剤からの保護を用いてＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖中のミスマッチ塩基を検出する方法を挙げ得る。例えば、Myers, et al., 1985. Science 230: 1242を参照されたい。一般に、「ミスマッチ切断」の当分野の技術は、野生型ＮＯＶ１配列を含有する（標識した）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織試料より得た潜在的突然変異体のＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズすることにより形成したヘテロ二重鎖を提供することから始まる。二重鎖を、対照および試料の鎖の間の塩基のミスマッチのために存在する二重鎖の単鎖領域を切断する薬剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖をＲＮａｓｅで処理し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処置し、ミスマッチ領域を酵素的に処理し得る。他の実施態様では、ミスマッチ領域を消化するために、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡの二重鎖のどちらかをヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理し得る。ミスマッチ領域の処理の後、得られた材料を次いで変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズにより分離して変異の部位を決定する。例えば、Cotton, et al., 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397、Saleeba, et al., 1992. Methods Enzymol. 217: 286-295を参照されたい。一つの実施態様では、対照のＤＮＡまたはＲＮＡを検出用に標識し得る。
なおもう一つの実施態様では、ミスマッチ切断反応は、細胞の試料より得られたＮＯＶ１ｃＤＮＡ中で点突然変異を検出しマッピングするために、規定したシステム中で二重鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する一つまたはそれ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を使用する。例えば、E. coliのｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチのＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシダーゼはＧ／ＴミスマッチのＴを切断する。例えば、Hsu, et al., 1994. Carcinogenesis 15: 1657-1662を参照されたい。例示的な実施態様によれば、あるＮＯＶ１配列、例えば、野生型ＮＯＶ１配列に基づくプローブを、試験細胞（複数を含む）由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物とハイブリダイズする。この二重鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理して、切断生産物をもしあれば電気泳動のプロトコール等から検出し得る。例えば、米国特許番号５,４５９,０３９を参照されたい。
他の実施態様では、電気泳動上の移動度の変化を用いて、ＮＯＶ１遺伝子の突然変異を同定する。例えば、単鎖コンフォーメーション多型（ＳＳＣＰ）を使用して、突然変異体および野生型核酸の間の電気泳動移動度の差を検出し得る。例えば、Orita, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 86: 2766、Cotton, 1993. Mutat. Res. 285: 125-144、Hayashi, 1992. Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79を参照されたい。試料および対照のＮＯＶ１核酸の単鎖ＤＮＡフラグメントを変性し、復元することを可能にする。単鎖核酸の二次構造は配列により異なり、電気泳動上の移動度のそこで得た変化はたとえ１個の塩基変化の検出をも可能にする。ＤＮＡフラグメントを標識プローブで標識または検出し得る。アッセイの感度を、２次構造が配列変化により感受性であるＲＮＡ（ＤＮＡよりもむしろ）を使用することにより増大し得る。一つの実施態様では、主題の方法は、ヘテロ二重らせん分析を利用して、電気泳動の移動度の変化に基づいて二重らせんへテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Keen, et al., 1991. Trends Genet. 7: 5を参照されたい。
なおもう一つの実施態様では、ある勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲル中での突然変異体または野生型フラグメントの移動を、変性濃度勾配ゲル電気泳動(ＤＧＧＥ)を用いてアッセイする。例えば、Myers, et al., 1985. Nature 313: 495を参照されたい。ＤＧＧＥを分析法として使用する際、ＤＮＡを修飾し、例えば、凡そ４０ｂｐの高融点ＧＣ富化ＤＮＡのＧＣクランプをＰＣＲで付加することにより、それが完全に変性しないことを保証する。さらなる実施態様では、変性勾配に代えて温度勾配を使用して、対照および試料のＤＮＡの移動度の差を同定する。例えば、Rosenbaum and Reissner, 1987. Biophys. Chem. 265: 12753を参照されたい。
点突然変異を検出するための他の技術の例として、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長を挙げ得るが、これらに限定しない。例えば、既知の変異を中央に置いたオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで完全なマッチが見られる場合にのみハイブリダイゼーションを認める条件下で、標的ＤＮＡとハイブリダイズする。例えば、Saiki, et al., 1986. Nature 324: 163、Saiki, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230を参照されたい。オリゴヌクレオチドをハイブリダイズ用膜に付着して、標識した標的ＤＮＡとハイブリダイズする際、そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅した標的ＤＮＡまたはある数の異なる突然変異体とハイブリダイズする。
これに代えて、選択的ＰＣＲ増幅に基づく対立遺伝子特異的増幅技術を本発明と一緒に使用し得る。特異的増幅のためのプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドは、興味のある変異を分子の中央で（増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存するように；例えば、Gibbs, et al., 1989. Nucl. Acids Res. 17: 2437-2448を参照）または適切な条件下で、ミスマッチがポリメラーゼ伸長を阻止または低減できる（例えば、Prossner, 1993. Tibtech. 11: 238を参照）一つのプライマーの３'最末端において保持していてもよい。加えて、切断に基づく検出を創成するために、変異の領域に新規制限部位を導入するのが望ましい。例えば、Gasparini, et al., 1992. Mol. Cell Probes 6: 1を参照されたい。特定の実施態様では、増幅はまた、増幅のためのＴａｑリガーゼを使用して実施され得ることを予想する。例えば、Barany, 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189を参照されたい。このような場合には、５'末端配列の３'末端に完全なマッチがある場合にのみ連結が起こり、増幅の存在または不在を調べることにより特定の部位における既知の変異の存在を検出することを可能にする。
本明細書に説明する方法を、例えば、本明細書に説明する少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含むプレパック診断キットを利用することにより実施し得る。これを、例えば、臨床の場においてＮＯＶ１遺伝子の関与する疾患または疾病の症状を示すかまたは家族歴のある患者を診断するのに簡便に使用し得る。
さらに、ＮＯＶ１を発現する任意の細胞タイプまたは組織、好ましくは末梢血白血球を本明細書に説明した予後アッセイに利用し得る。しかしながら、例えば、頬粘膜細胞の有核細胞を含む任意の生物学的試料を使用し得る。
薬理ゲノミクス
本明細書に説明したスクリーニングアッセイにより同定するようなＮＯＶ１活性(例えば、ＮＯＶ１遺伝子発現)に促進的または阻害的効果を有する薬剤またはモジュレータを個体に投与し、心臓疾患を（予防的にまたは治療的に）処置することができる。そのような処置と一緒に、個体の薬理ゲノミクス(即ち、個体の遺伝子型および外来性化合物または薬に対するその個体の応答との間の関係の研究)を考慮し得る。治療薬の代謝の差は、薬理学的に活性な薬の用量と血中濃度の関係を変えることにより、重症の毒性または治療の失敗をもたらし得る。かくして、個体の薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型の考慮に基く予防的または治療的処置ための有効な薬剤(例えば薬)の選択を許容する。そのような薬理ゲノミクスをさらに用いて、適切な投与量および治療方法を決定し得る。したがって、個体のＮＯＶ１タンパク質の活性、ＮＯＶ１核酸の発現、またはＮＯＶ１遺伝子の変異の含量を測定し、それにより個体の治療的処置または予防的処置に適切な薬剤（複数を含む）を選択し得る。
薬理ゲノミクスは、罹患した人における変化した薬剤分布および異常な作用に因る薬への応答における臨床的に有意な遺伝的変異を取り扱う。例えば、Eichelbaum, 1996. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 23: 983-985; Linder, 1997. Clin. Chem., 43: 254-266を参照されたい。一般に、二つのタイプの薬理遺伝学的異常を区別し得る。薬が身体に作用する方式を変える単一の因子として伝達する遺伝的異常（変化した薬剤作用）または身体が薬に作用する方式を変える単一因子として伝達する遺伝的異常（変化した薬物代謝）がある。これらの薬理遺伝学的異常は、稀な欠陥または多型性のどちらかとして生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤ）欠乏症は、よくみられる遺伝性酵素異常症であり、そこでは主な臨床的合併症は、酸化剤の薬（抗マラリア剤、スルホンアミド剤、鎮痛剤、ニトロフラン類）摂取後またはソラマメ摂食後の溶血である。
例示的実施態様として、薬の代謝酵素の活性は、薬の作用の強度および持続の両者の主たる決定因子である。薬の代謝酵素の遺伝的多型性（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）ならびにチトクロームＰ４５０酵素のＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の発見は、なぜ或る患者は標準かつ安全用量の薬物摂取後に期待した薬の効果を得られないかまたは過大な薬の応答および重篤な毒性を示すのかについての説明を提供する。これらの多型性を、人口集団で高代謝群（ＥＭ）および低代謝群（ＰＭ）の２つの表現型で表現する。ＰＭの存在比率は異なる集団間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型性で、そして幾つかの変異が、機能的なＣＹＰ２Ｄ６の不在をもたらすＰＭを同定する。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低代謝群は、標準的な用量の投与を受けた際、極めて頻繁に過剰な薬の応答および副作用を経験する。代謝物が活性な治療成分であるならば、ＣＹＰ２Ｄ６が生成する代謝物モルヒネにより仲介するコデインの鎮痛作用について実証するように、ＰＭは治療応答を示さない。それと全く正反対なのが、標準の用量に応答しないいわゆる超高速代謝群である。最近、超高速代謝群の分子的根拠をＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に因ると確認した。
従って、個体のＮＯＶ１タンパク質の活性、ＮＯＶ１核酸の発現、またはＮＯＶ１遺伝子の変異含量を測定し、それにより個体の治療的処置または予防的処置のために適切な薬剤（複数を含む）を選択し得る。加えて、薬理遺伝学的研究を用いて、薬の代謝酵素をコードする遺伝子多型の対立遺伝子の遺伝子型決定を、個体の薬の応答性の表現型の同定に応用し得る。この知識を投与量および薬の選択に応用する際、本明細書で説明する例示的スクリーニングアッセイの一つにより同定したモジュレータのようなＮＯＶ１モジュレータで対象を処置する際に、有害作用または治療失敗を避け、かくして治療的または予防的効率を増強し得る。
臨床試験での作用のモニタリング
ＮＯＶ１の発現または活性（例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調整する活性）に対する薬剤（例えば、薬、化合物）の影響をモニタリングすることは、基礎的な薬のスクリーニングに応用できるだけでなく、また臨床試験にも応用できる。例えば、本明細書に説明したようにスクリーニングアッセイにより、ＮＯＶ１遺伝子発現、タンパク質レベルを増加し、またはＮＯＶ１活性を上方調節すると決定した薬剤の有効性を、低下したＮＯＶ１遺伝子発現、タンパク質レベル、または下方制御されたＮＯＶ１活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。これに代えて、ＮＯＶ１遺伝子発現、タンパク質レベルを減少し、またはＮＯＶ１活性を下方調節すると決定した薬剤の有効性を、増加したＮＯＶ１遺伝子発現、タンパク質レベル、または上方制御したＮＯＶ１活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。そのような臨床試験において、ＮＯＶ１、および好ましくは例えばシ細胞増殖性疾患または免疫疾患に関係する他の遺伝子の発現または活性は、特定の細胞の免疫応答の「読み出し」またはマーカーとして用いられうる。
限定されない例により、ＮＯＶ１活性（例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定する）を調整する薬剤（例えば、化合物、薬または低分子）を用いた処置により細胞中で調整するＮＯＶ１を含む遺伝子を同定し得る。従って、細胞増殖障害に対する薬剤の効果を、例えば、臨床試験において検討するために、細胞を単離してＲＮＡを調製し、そして障害に関連すると思うＮＯＶ１および他の遺伝子の発現レベルを分析し得る。遺伝子発現レベル（即ち、遺伝子発現パターン）を、本明細書に説明するようにノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲにより、またはこれに代えて本明細書で説明する方法の一つにより生産したタンパク質の量を測定することにより、またはＮＯＶ１または他の遺伝子の活性レベルを測定することにより、定量することができる。この様式においては、遺伝子発現パターンは、薬剤に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとしての役割を果たす。したがって、薬剤による個体の処置の前および処置中の種々の時点で、この応答状態を測定し得る。
一つの実施態様において、本発明は、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、核酸、低分子、または本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した他の薬候補物）で対象を処置することの有効性をモニターする方法を提供し、その方法は、(i)薬剤投与前に対象から投与前試料を得て、(ii)投与前試料中のＮＯＶ１タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出し、(iii)対象から一つまたはそれ以上の投与後の試料を得て、(iv)投与後の試料中のＮＯＶ１タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを検出し、(v)投与前の試料中のＮＯＶ１タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを投与後のひとつまたは複数の試料中のＮＯＶ１タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡと比較し、そして(vi)それにしたがって対象への薬剤の投与を変更するステップを含む。例えば、ＮＯＶ１の発現または活性を検出したより高レベルに増加するためには、即ち、薬剤の有効性を増加するためには、薬剤の増加した投与が望ましい。これに代えて、ＮＯＶ１の発現または活性を検出したより低レベルに減少する、即ち、薬剤の有効性を減少するためには、薬剤の減少した投与が望ましい。
処置方法
本発明は、疾患のリスクのある、または異常なＮＯＶ１発現または活性と関連する疾患を有する対象を処置する予防方法および治療方法の両方を提供する。疾患は、
心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、先天性心臓欠陥、大動脈弁狭窄、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）チャネル欠損症、動脈管開存症、肺動脈弁狭窄、大動脈弁下部狭窄、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節性硬化症、強皮症、糖尿病、移植、副腎白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、前立腺癌、新生物、腺癌、リンパ腫、子宮癌、不妊、血友病、過凝固、特発性血小板減少性紫斑病、免疫不全症、移植片対宿主病、ＡＩＤＳ、気管支喘息、クローン病、多発性硬化症、アルブライト遺伝性骨形成異常（Albright Hereditary Ostoeodystrophy）の処置、および他の疾病、亜一環および状態を含む。これらの処置方法は、以下により完全に考察される。
疾患および疾病
増加したレベル（疾患または障害に罹患していない対象と比べて）または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性に拮抗する（即ち、低下するかまたは阻害する）治療薬で処置し得る。活性に拮抗する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、(i)上述のポリペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメントまたは相同体；(ii)上述のペプチドに対する抗体；(iii) 上述のペプチドをコードする核酸；(iv)アンチセンス核酸および上述のペプチドの内在的機能を相同組換えにより「ノックアウト」するのに使用する「機能障害性」である核酸（即ち、上述のペプチドに対するコード化配列のコード化配列内への異種挿入に因る）の投与（例えば、Capecchi, 1989. Science 244: 1288-1292を参照）；または(v)上述のペプチドおよびその結合相手との相互作用を変化するモジュレータ（即ち、本発明のさらに別なペプチドのミメティックまたは本発明のペプチドに特異的な抗体を含む阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト）を挙げ得るが、これらに限定しない。
減少したレベル（疾患または障害に罹患していない対象と比べて）または生物学的活性を特徴とする疾患および疾病を、活性を増加する（即ち、アゴニストである）治療薬で処置し得る。活性を上方制御する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、上述のペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメント、または相同体；またはバイオアベイラビリティーを増加するアゴニストを挙げ得るが、これらに限定しない。
増加または減少したレベルを、患者の組織試料（例えば、生検組織から）を得て、インビトロでＲＮＡまたはペプチドのレベル、発現したペプチド（または上述のペプチドのｍＲＮＡ）の構造および／または活性をアッセイすることにより、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することにより容易に検出し得る。当分野内で周知の方法としては、イムノアッセイ（例えば、ウエスタンブロット分析、免疫沈降とそれに引き続くドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学、等）および／またはｍＲＮＡ発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インシツハイブリダイゼーション、等）を挙げ得るが、これらに限定しない。
予防方法
一つの態様では、異常なＮＯＶ１発現または少なくともあるＮＯＶ１活性を調整する薬剤を対象に投与することにより、本発明は、異常なＮＯＶ１の発現または活性に関連した疾患または異常を、対象において予防する方法を提供する。異常なＮＯＶ１の発現または活性が原因または一因となって生じる疾患のリスクを有する対象を、例えば、本明細書で説明するように診断的アッセイまたは予後的アッセイのいずれかまたはそれらの組合せによって同定し得る。疾患または疾病を予防し、または、これに代えて、その進行を遅らせるようにＮＯＶ１異常に特徴的な症状の出現に先立って予防的薬剤の投与を行い得る。ＮＯＶ１異常のタイプに依存して、例えば、あるＮＯＶ１アゴニストまたはＮＯＶ１アンタゴニストである薬剤を対象の処置に使用し得る。適切な薬剤を、本明細書で説明するスクリーニング法に基づいて決定することができる。本発明の予防的方法をさらに以下のサブセクションで考察する。
治療的方法
本発明のもう一つの態様は、治療目的のためにＮＯＶ１の発現または活性を調整する方法に関する。本発明の調整方法は、細胞を細胞に関連するＮＯＶ１タンパク質活性の一つまたはそれ以上の活性を調整する薬剤と接触することを含む。ＮＯＶ１タンパク質活性を調整する薬剤は、核酸またはタンパク質、あるＮＯＶ１タンパク質の天然に存在する同属のリガンド、ペプチド、あるＮＯＶ１ペプチドミメティック、または低分子のような本明細書に説明する薬剤であり得る。一つの実施態様では、薬剤は一つまたはそれ以上のＮＯＶ１タンパク質活性を促進する。そのような促進的薬剤の例としては、活性なＮＯＶ１タンパク質および細胞中に導入したＮＯＶ１をコードする核酸分子を挙げ得る。もう一つの実施態様では、薬剤は一つまたはそれ以上のＮＯＶ１タンパク質活性を阻害する。そのような阻害的薬剤の例としては、アンチセンスＮＯＶ１核酸分子および抗ＮＯＶ１抗体を挙げ得る。これらの調整方法は、インビトロで（例えば、細胞を薬剤と共に培養することにより）または、これに代えて、インビボで（例えば、薬剤を対象に投与することにより）実施し得る。このように、本発明はあるＮＯＶ１タンパク質または核酸分子の異常な発現または活性を特徴とする疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。一つの実施態様では、その方法は、薬剤（例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した薬剤）またはＮＯＶ１の発現または活性を調整する（例えば、上方制御または下方制御する）薬剤の組合せを投与することを伴う。もう一つの実施態様では、その方法は減少または異常なＮＯＶ１の発現または活性を補償するための治療としてあるＮＯＶ１タンパク質または核酸分子を投与することを伴う。
ＮＯＶ１活性の刺激は、ＮＯＶ１が異常に下方制御される場合、および／または増加ＮＯＶ１活性が有益な効果を有するように思われる場合で望まれる。かかる状況の１実施例は、対象が異常細胞増殖および／または分化により特徴付けられる疾病（例えば、癌または免疫関連疾患）を有する場合である。かかる状況の別の実施例は対象が胃（例えば、子癇前症）疾病を有する場合である。
治療の生物学的な作用の測定
本発明の様々な実施態様において、適当なインビトロアッセイまたはインビボアッセイを実行して、特異的治療の作用およびその投与が影響を受けた組織の処置について示されているか否かを測定する。
様々な実施態様において、インビトロアッセイは、患者疾患に関与する典型的な細胞タイプで実行され、与えられた治療が細胞タイプに必要な作用を発揮するかを測定し得る。治療で使用する化合物は、ヒト対象でに試験に先立ち、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなどを含むがこれらに制限されない適当な動物モデルシステムで試験され得る。同様に、インビボでの試験のため、当分野で既知の動物モデルシステムのいずれかを、ヒト対象への投与に先立ち用いうる。
本発明の組成物の予防的使用および治療的使用
本発明のＮＯＶ１核酸およびタンパク質は、代謝性疾患、糖尿病、肥満、感染症、摂食障害、癌関連癌、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫疾患、血液疾患、および様々な異脂肪血症、肥満と関連する代謝性障害、代謝性症候群Ｘおよび慢性疾病および様々な癌と関連する萎縮病を含むがこれらに制限されない様々な疾患に関与する潜在的な予防的応用および治療的応用で有用である。
実施例として、本発明のＮＯＶ１タンパク質をコード化するｃＤＮＡは遺伝子療法において有用であり得るし、かつタンパク質はそれらを必要とする対象に投与される場合に有用であり得る。制限されない実施例により、本発明の組成物は、心筋梗塞に罹患する患者の効果的である。
ＮＯＶ１タンパク質をコード化する新規核酸、および本発明のＮＯＶ１タンパク質の両方、またはそれらのフラグメントはまた診断応用において有用であり得、ここで、核酸またはタンパク質の存在または量は評価される得る。さらなる使用は、抗細菌分子（すなわち、抗細菌分子を有することがわかっているあるペプチド）である。これらの物質は、治療方法および診断方法で使用する本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の生成においてさらに有用である。
実施例１：ＮＯＶ１配列解析
Figure 2005511013
実施例２：ＳＮＰ配列解析
Figure 2005511013
表４の続き
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実施例３：ＳＮＰ同定方法
Seq Calling［登録商標］技術：ｃＤＮＡを、複数の組織タイプ、正常および病態、生理的状態、および異なるドナー由来の発生状態を表す様々なヒト試料から得た。試料を全体組織、細胞株、プライマリー細胞を培養したプライマリー細胞または組織および細胞株として得た。細胞および細胞株を、例えば、成長因子、ケモカイン、ステロイドの遺伝子発現を制御する生物学的薬剤または化学的薬剤で処理した。従って、もたらされたｃＤＮＡを次にCuraGen専売特許のSeq Calling技術を用いて配列決定した。配列形質はを手動で評価し、適当なら収集に編集した。全試料由来のｃＤＮＡ配列を、それ自体および公開ＥＳＴで、CuraGenのヒトSeq CallingアセンブリーのヒトSeq Callingデータベースを生成するためのバイオインフォマティックプログラムを用いてアセンブリーした。それぞれアセンブリーは、１またはそれ以上のヒト試料由来の１またはそれ以上の重複ｃＤＮＡを含有する。ＥＳＴを、アセンブリーの別の成分との同一性の伸長が少なくとも９５％、５０ｂｐを超える場合、アセンブリーの成分として含んだ。それぞれのアセンブリーは、スプライスフォームおよび／または一塩基多型（ＳＮＰ）およびそれらの組合せのような遺伝子および／またはその変異体を表すことができる。
変異体配列はこの応用で含まれる。変異体配列は一塩基多型（ＳＮＰ）を含むことができる。ＳＮＰをある場合に、ＳＮＰを含有するヌクレオチド配列がｃＤＮＡとして生じることを意味するために「ｃＳＮＰ」として言及する。ＳＮＰは様々な方法で生じ得る。例えば、ＳＮＰは、多型部位で別のヌクレオチドへの置換に起因し得る。かかる置換は、トランジションまたはトランスバージョンのいずれかであり得る。ＳＮＰはまた、参考対立遺伝子と比べてヌクレオチドの欠損またはヌクレオチドの挿入から生じ得る。この場合、多型部位は、ある対立遺伝子が別の対立遺伝子の特定のヌクレオチドに関するギャップを生む部位である。遺伝子内で生じるＳＮＰは、ＳＮＰの位置の遺伝子によりコード化されるアミノ酸の変化を結果として生じうる。しかしながら、遺伝子内のＳＮＰはまた、ＳＮＰを含むコドンが遺伝子コードの重複の結果として同一アミノ酸をコード化する場合、サイレントである。遺伝子領域の外側、または遺伝子内のイントロンで生じるＳＮＰは、タンパク質のいずれかのアミノ酸配列での変化を結果として生じないが、例えば、時間的発現、生理的応答制御、細胞タイプ発現制御、発現の強度、転写メッセージの安定性での変化のような発現パターンの変化した制御を結果とする。
新規ＳＮＰ同定方法：ＳＮＰは、CuraGenの専売特許SNPToolアルゴリズムを用いる配列アセンブリー解析により同定される。SNPToolは、以下の基準でのアセンブリーにおいてバリエーションを同定する：ＳＮＰをアラインメントの両末端上の１０塩基対内で解析しない；ウインドウサイズ（可視塩基数）は１０である；ウインドウでのミスマッチの可能な数は２である；最初のＳＮＰ塩基クオリティー（ＰＨＲＥＤスコア）は２３である；ＳＮＰをスコア決定するための変更の最小数は２／アセンブリー位置である。SNPToolはアセンブリーを解析し、かつアセンブリーの個々の変異体配列と関連するＳＮＰ位置、与えられた位置でのアセンブリーの深さ、推定アセンブリー対立遺伝子頻度、およびＳＮＰ配列バリエーションを表す。配列形質は次に選択され、そして最小の確認につての見識をもたらす。一致アセンブリー配列は、変異体配列の変化と共にCuraToolに持ち込まれ、ＳＮＰ配列のバリエーションから生じる潜在的なアミノ酸変化を同定する。包括的なＳＮＰデータ解析は次に、SNP Callingデータベースに持ち出される。
新規ＳＮＰ確認方法：ＳＮＰをPyrosequencingとして既知の有効な方法を利用して確認する。Pyrosequencingについての詳細なプロトコールを以下に示す：
Alderborn et al. Determination of Single Nucleotide Polymorphisms by Real-time Pyrophosphate DNA Sequencing, Genome Research, 10, Issue 8, (August 2000) 1249-1265。簡単に言うと、Pyrosequencingは、ジェノタイピングのリアルタイム伸長方法である。このプロトコールは、ゲノムＤＮＡ試料から2本鎖ビオチン化ＰＣＲ産物を取り、それらをストレプトアビジンビーズに結合させる。これらのビーズは次に1本鎖結合ＤＮＡ生成を変性する。ＳＮＰを、ＤＮＡ鎖伸長の上のそれぞれのｄＮＴＰから放出されるピロリン酸（ＰＰｉ）の非直接的なバイオルミノメトリックアッセイに基づく技術を利用して特徴付ける。クレノーポリメラーゼ介在の塩基取り込みに従って、ＰＰｉを放出し、そして、ＡＴＰの形成を結果として生じるＡＴＰスルフィラーゼ（sulfurylase）のためのアデノシン５’ホスホ硫酸と共に基質として用いる。続いて、ＡＴＰはルシフェラーゼの動きによりそのオキシ系へのルシフェリンの変換を成し遂げる。後に続く光のアウトプットは、約４塩基におよぶ追加塩基の数に対して比例する。方法の進歩を可能とするために、ｄＮＴＰのみを配列決定の間に鋳型に加えるて、過剰のｄＮＴＰを開始反応混合物に存在するアピラーゼにより減少させる。このプロセスを完全に自動化し、大きなＳＮＰパネルの迅速なスクリーニングを可能とする９６穴フォーマットに適応させる。
フェノタイプ形質と関連する新規ＳＮＰの方法：定義されたフェノタイプ形質とのＳＮＰの関連を、ヒトの群試料におけるＳＮＰの統計的解析を介して発見し、ここでフェノタイプは調査下で特徴付けられたものである。かかる群は、無関係個体、または兄弟（二卵性双生児または一卵性双生児を含む）、子孫と親、または遺伝的に関連する個体からなる他の家族構造体のような関係個体からなり得る。これらの群は、それぞれの家族内の１またはそれ以上の疾病の影響を受けた個人の存在に基づき確認され得るか、または群全体を表す疫学的試料として確認され得る。フェノタイプ形質は、生化学的アッセイ、生理的機能または実行、および肥満度指数のような成長および発達の臨床的測定を含むがこれらに制限されない、ヒトの観察可能な特徴および測定可能な特徴のいずれかであり得る。用いられる特異的な解析方法は、兄弟についてのＱＴＤＴ（参考文献：Abecasis et al., A General Test of Association for Quantitative Traits in Nuclear Families, Am J Hum Genet (2000) 66:279-292）のような、特異的な家族構成体依存する。
実施例４：群、臨床的測定および遺伝子型
遺伝的変異体と疾病との関連の証拠を提供する群は、循環器疾患のリスク因子を同定または予防処置のために高リスクの個体を選択するための長期的調査に参加した中年の白人男性からなっていた。ウプサラの地方自治体に住む１９７０から１９７３の間の５０歳の男性を、冠動脈心疾患（ULSAM, http://www.pubcare.uu.se/ULSAM/）に対するリスク因子の健康調査への参加のため招待した。遺伝子型同定を、７０歳での追加調査に利用可能な８２５対象で実施した。
臨床的な測定を、仰臥位心臓収縮および拡張期圧、空腹時血糖、血液グルコース付加試験（経口および静脈内試験）、グルコース取り込み（抗インシュリン性クランプ）、肥満度指数、空腹時血清脂質、喫煙、身長、身体活動、血清βカロテン、αトコフェロール、セレン、コレステロールエステル中の血清脂肪酸、血清インスリン、血清クレアチニン、完全２Ｄおよびドップラー心エコー研究、および１２誘導心電図研究、尿アルブミン、薬歴、および社会的地位を含むが、これらに制限されない範囲の形質について行った。
定量値を伴う形質のため、それぞれの形質を１変量の標準正常分布に近づけるため、標準化した。多くの形質のため、これは形質平均および標準偏差を測定すること、次にそれぞれの形質スコアから平均を引き、そして標準偏差で割って、０平均および一群の相違を有する形質を生じることに関与する。ある形質のため、広く正常であることが明らかな分布、および長い形質転換を標準化に先立ち適用した。
遺伝子型を、４％またはそれ未満の矛盾率の少なくとも７０％の個体についてのそれぞれのマーカーについて測定した。矛盾の遺伝子同定は、試験の偽陽性を増加させないが、偽陰性率を増加する。
遺伝子同定をＳＮＰ１（１３３７３９４６）について行った。結果を以下に示す。
ＳＮＰ１の遺伝子型結果：
ホモ接合体主要対立遺伝子 Ｃ／Ｃ ６２０
ヘテロ接合体 Ｃ／Ｔ ２５
ホモ接合体少数対立遺伝子 Ｔ／Ｔ ０
それぞれのマーカー／形質の組合せの統計的解析
データ収集
個体を、形質の値および遺伝子型の両方が利用可能なら、情報価値があるとして定義した。群全体を次に３つのグループに分けた：兄弟姉妹両方の情報価値を伴うＭＺペアー、兄弟姉妹の両方の情報価値を有するＤＺペアー、および兄弟姉妹の一方のみが情報価値のあるＭＺペアーおよびＤＺペアー両方とは無関係。
用語ｎＵｎｒｅｌ、ｎＭＸ、およびｎＤＺは、それぞれ無関係の数、ＭＺペアーの数、およびＤＺペアーの数に言及し、情報価値のある個体の全数はｎＵｒｅｌ＋２ｎＭＺ＋２ｎＤＺである。
少数対立遺伝子（０から０．５の間の数）の対立遺伝子頻度を、加重平均として測定し、ここで無関連個体は１の重さを有し、ＭＺ個体は０．５の重さを有し、およびＤＺ個体は０．７５の重さを有していた。これらの重さは、兄弟姉妹ペアー内の遺伝子型相関を説明する。我々が試験したマーカーは２対立遺伝子であった。少数対立遺伝子の頻度をｐで示し、対立遺伝子Ｂと呼ばれる主要対立遺伝子の頻度をｑおよび同等の１−ｐで示す。
ハーディワインベルグ試験
ハーディワインベルグ平衡（ＨＷＥ）は、一般的な仮説である平衡群下での対立遺伝子頻度に対する遺伝子型の頻度に言及する。ＨＷＥの妨害は、少数対立遺伝子および群の層別化に対する選択を示す。小数対立遺伝子に対する選択は小数対立遺伝子の進化の適性を損なう場合生じ、そして偶然に予測したものよりより少ないホモ接合性を生じる結果となり得る。
群の層別化は、研究する群が実際に異なる頻度の対立遺伝子Ａとの小群の混合である場合、生じる。層別化は、偶然に予測したものよりホモ接合性を有する結果となる。層別化は、家族試験間の偽陽性および偽陰性の率を増加し得るが、家族試験内で作用しない（以下を参照）。従って、層別化を示すと、家族試験内でのみ実行されることが好ましい。
ハーディワインベルグ試験を実施するために、１個体をＭＺペアーおよびＤＺペアーのそれぞれからランダムに選択し、合計Ｎ＝ｎＵｎｒｅｌ＋ｎＭＺ＋ｎＤＺの無関連個体を生じる。この群のＡＡ、ＡＢ、およびＢＢ遺伝子型での個体のカウントを、それぞれＮ（ＡＡ）、Ｎ（ＡＢ）、およびＮ（ＢＢ）と呼び、そして対立遺伝子の頻度ｐを
ｐ＝［Ｎ（ＡＡ）＋０．５Ｎ（ＢＢ）］／Ｎ
として測定した。
次に、ＨＷＥの帰無仮説下でのそれぞれの遺伝子型について予測した個体のカウントを
ｎ（ＡＡ）＝ｐ２Ｎ
ｎ（ＡＢ）＝２ｐｑＮ
ｎ（ＢＢ）＝ｑ２Ｎ
として測定した。
最終的に、２試験統計値を測定した：
ＨＷ１＝［Ｎ（ＡＡ）−ｎ（ＡＡ）］２／ｎ（ＡＡ）＋［Ｎ（ＡＢ）−ｎ（ＡＢ）］２／ｎ（ＡＢ）＋［Ｎ（ＢＢ）−ｎ（ＢＢ）］２／ｎ（ＢＢ）
ＨＷ２＝｛［Ｎ（ＡＡ）＋Ｎ（ＢＢ）］−［ｎ（ＡＡ）＋ｎ（ＢＢ）］｝２／｛ｎ（ＡＡ）＋ｎ（ＢＢ））｝＋［Ｎ（ＡＢ）−ｎ（ＡＢ）］２／ｎ（ＡＢ）
帰無仮説下で、ＨＷ１およびＨＷ２の両方は、自由１度でのｘ２分布に続く。０．０５および０．０１のｐ値に対するｘ２の分類値はそれぞれ、３．８４および６．６３である。これらより大きなｘ２値は、５％偶然または１％偶然の満たされたＨＷの仮定を示す。
ＨＷ１試験は標準的な試験であるが、典型的にはＮ（ＡＡ）である、最小範囲が５個体より少ないと正確でない。ＨＷ２試験はより強固であるが、まれな対立遺伝子に対してより低い感度であり得る。ＨＷＥとの有意な分割があると、［Ｎ（ＡＡ）＋Ｎ（ＢＢ）］−［ｎ（ＡＡ）＋ｎ（ＢＢ）］のサインは、理由を示す：陽性値は層別化かつ陰性値は少数対立遺伝子に対する選択を示す。
関連試験
関連試験は、量的形質座位（ＱＴＬ）として、マーカーの遺伝子モデルに基づき、
Ｘｆｉ＝Ｙｆ＋Ｙｆｉ＋ｍ（Ｇｆｉ）
式中、Ｘｆｉは家族ｆの個体ｉのフェノタイプ値であり、ＹｆはＱＴＬ由来の作用を含む共有遺伝的作用および環境作用由来のＸｆｉの貢献を表し、ＹｆｉはＱＴＬを含む非共有の貢献を表し、そしてｍ（Ｇｆｉ）はＱＴＬ由来の平均作用を表し、かつ遺伝子型Ｇｆｉにのみ、
ｍ（ＡＡ）＝ａ−ｃ
ｍ（ＡＢ）＝ｄ−ｃ
ｍ（ＢＢ）＝−ａ−ｃ、
と依存し、
ここで定数ｃは、（ｐ−ｑ）＋２ｐｄとして定義される。
ａおよびｄの両方の意味について試験する代わりに、モデル中の回帰係数の意味を試験することにより、フェノタイプに対する対立遺伝子の追加の貢献に焦点を置いた、
Ｘｉ＝Ｙｉ＋ａ＋ｂｐｉ
式中、Ｘｉは試料ｉのフェノタイプ値であり、Ｙｉは試料１についてのＱＴＬを含むフェノタイプへの貢献を表し、そしてｐｉは試料１に対する対立遺伝子頻度である。
ｐｉは別の数の値をとるので、試験は、それぞれのｐｉ値についてＸｉの平均および標準エラーを測定し、次にｂを得るために結合値の回帰試験を実施しかつ標準偏差を試料収集することにより実施した。無関連の帰無仮説下で、ｂ／ｓは標準正常分布に続く。有意な関連のｐ値を、ｂ／ｓの２側面試験から測定した。
この性質の合計６試験を実施した：
無関連 Ｘｉおよびｐｉは無関連個体およびＭＺペアー由来である。無関連のため、それぞれの個体はＸｉおよびｐｉの単一試料を生じる。ＭＺペアーのため、Ｘｉおよびｐｉを、２個体の平均として求める。この試験の一部として、ＭＺ兄弟姉妹間のフェノタイプの相関を明らかにすることは好ましい。
平均 それぞれのＤＺペアーは、フェノタイプ値の意味およびペアーｉの対立遺伝子頻度に等しいＸｉおよびｐｉを有する単一試料を生じる。
差 それぞれのＤＺペアーは、フェノタイプ値での差および第１および第２の兄弟姉妹間の対立遺伝子頻度と等しいＸｉおよびｐｉを有する単一試料を生じる。この試験は、層別化に強い。
非パラメーター差 それぞれのＤＺペアーは、第１の兄弟姉妹のフェノタイプ値が第２の兄弟姉妹のものより大きい、等しい、または小さいなら、第１および第２の兄弟姉妹間の対立遺伝子頻度の差と等しいｐｉ、および１、０、−１に等しいＸｉを有する単一試料を生じる。この試験は伝達平衡試験（ＴＤＴ）のようである。差試験のように、層別化に強い；それはまた、非正常および異常値に強いが、差試験より小さな作用に対する感度が低い。
合計 全試験は、統計的に依存しない無関連、意味、および差試験由来のｂの推定を組み合わせる。ｂの最小相違の推定を相違の試料収集の逆で３つの形質のそれぞれに付加をかけることにより構築し、そして組み合わされた推定の相違は非依存性の推定の逆相違の和の逆である。この形質は層別化の非存在下の３つの非依存形質のいずれかより高感度だが、層別化の存在下の差または非パラメーター差試験と同じくらい強くない。
層別化 層別化試験についての試験統計は、自由度１でのｘ２分布に従う２つの推定の相違の和により標準化された平均および差試験由来のｂの推定の差の２乗である。試験統計の大きな値は、群層別化を示し、かつ差試験および非パラメーラー差試験は強力であり得る。
平均、差、および合計試験のため、用語ｂは遺伝子モデルのパラメーラーに
ｂ＝２［ａ−（ｐ−ｑ）ｄ］
として関連する。
作用サイズを別の承継（ｄ＝０）を仮定し、次に形質値の標準偏差に対する率ａをとる量ａとして報告する。
相関の複数の試験をまた、有意な形質に対する約１０−３未満のｐ値を必要とすることにより応用した。おおよそ１００フェノタイプ試験は、フェノタイプの多くが相関するので、約２０の非依存形質に対応する；この閾値は、試験されたマーカー当たり約２％の偽陽性率に対応する。
実施例７：ＳＮＰの出力解析
ＳＮＰ：Ｚ７３２を有する１３３７９４６（ＳＴセグメント上昇）
分割表：
遺伝子型 Ｃ／Ｃ Ｃ／Ｔ
ＳＴ上昇なし： ６１８ ２３
ＳＴ上昇： ２ ２
連続性についての訂正を用いるカイ２乗：
６４５（１１９０−３２２．５）＾２／６４１×４×６２０×２５＝１２．２
連続性について訂正された２面のカイ２乗由来のＰ値：０．０００４８
２面のフィッシャー抽出試験由来のＰ値：０．００１７
同等の発明
本発明の特定の実施態様の上述の詳細な記載から、特徴的な組成物および既知の遺伝子中のＳＮＰのにおけるそれらの使用方法が記載されたことは明らかである。特定の実施態様は本明細書において詳細に開示されたが、これは例示のみの目的のための実施例によりなされるが、以下の細くの請求の範囲について制限することを意図するものではない。特に、様々な置換、変化、および修飾が請求項により定義されるように本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明に対してなされることは、本発明者により予測される。

Claims (104)

  1. 配列番号：２、４、８、１０、１２、１４、１６、および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列の成熟型を含む、単離ポリペプチド。
  2. 配列番号：２、４、８、１０、１２、１４、１６、および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
  3. 配列番号：２および４からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
  4. ポリペプチドが配列番号：２および４からなる群から選択されるアミノ酸配列において１またはそれ以上の保存的置換を含むアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
  5. 該ポリペプチドが天然に存在する、請求項１に記載のポリペプチド。
  6. 請求項１に記載のポリペプチドおよび担体を含む組成物。
  7. １またはそれ以上の容器に請求項６に記載の組成物を含むキット。
  8. ヒト疾病と関連する症候群を処置するための薬物の製造における療法剤の使用であって、疾病が請求項１に記載のポリペプチドと関連する病態から選択され、療法剤が請求項１に記載のポリペプチドを含むものである使用。
  9. 第１の哺乳類対象における請求項１に記載のポリペプチドの発現の変化レベルと関連する疾病の存在または素因を測定する方法であって、
    （ａ）第１の哺乳類対象由来の試料中のポリペプチドの発現のレベルを測定すること；および
    （ｂ）ステップ（ａ）の試料中の該ペプチドの発現を、該疾患を有さないことまたは素因のないことが知られている第２の哺乳類対象由来の対照試料中に存在するポリペプチドの発現と比較すること；
    ここで、対照試料と比較して第１の対象中のポリペプチドの発現のレベルの変化は、該疾患の存在または素因を示すものである、
    を含む方法。
  10. 請求項１に記載のポリペプチドと関連する病態を処置または予防する方法であって、かかる処置または予防が望まれる対象に、対象の病態を処置または予防するのに十分な量で請求項１に記載のポリペプチドを投与することを含む方法。
  11. 配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、および１７からなる群から選択される核酸配列を含む、単離核酸分子。
  12. 核酸分子が天然に存在する、請求項１９に記載の核酸分子。
  13. 配列番号：２、４、８、１０、１２、１４、１６、および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの成熟型をコード化する、単離核酸分子。
  14. 請求項１１に記載の核酸分子を含むベクター。
  15. 該核酸分子に作用可能に結合するプロモーターをさらに含む、請求項１４に記載のベクター。
  16. 請求項１４に記載のベクターを含む細胞。
  17. 請求項１に記載のポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体。
  18. 第１の哺乳類対象中の請求項１１に記載の核酸分子の発現の変化レベルと関連する疾病の存在または素因を測定する方法であって、
    （ａ）第１の哺乳類対象由来の試料中の核酸の発現のレベルを測定すること；および
    （ｂ）ステップ（ａ）の試料中の該核酸の発現のレベルを、疾患を有さないまたは素因のないことが知られている第２の哺乳類対象由来の対照試料に存在する核酸の発現のレベルと比較すること；
    ここで、対照試料と比較して第１の対象中の核酸の発現のレベルでの変化は、疾患の存在または素因を示すものである、
    を含む方法。
  19. ポリヌクレオチドにその中に包含される多型部位でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、ここで該ポリペプチドは配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、および１７からなる群から選択される、単離対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド。
  20. 配列番号：３（ここで、１２６位置に対応するヌクレオチドはＡ、Ｇ、またはＴである）を含む単離核核酸。
  21. 配列番号：７（ここで、４８３位置に対応するヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、またはＴである）を含む単離核酸。
  22. 配列番号：９（ここで、３７４位置に対応するヌクレオチドがＡ、Ｃ、またはＧである）を含む単離核酸。
  23. 配列番号：１１（ここで、３６７位置に対応するヌクレオチドがＡ、Ｃ、またはＧである）を含む単離核酸。
  24. 配列番号：１３（ここで、２８１位置に対応するヌクレオチドがＡ、Ｃ、またはＴである）を含む単離核酸。
  25. 配列番号：１５（ここで、１５５位置に対応するヌクレオチドがＣ、Ｇ、またはＴである）を含む単離核酸。
  26. 配列番号：１７（ここで、１３０位置に対応するヌクレオチドがＣ、Ｇ、またはＴである）を含む単離核酸。
  27. ヒトＧＰＣＲ様遺伝子中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の検出方法であって、
    配列番号：１の位置により定義される様に１２６位置でヌクレオチド（ここで１２６位置のヌクレオチドはＣではない）を測定すること；および
    それにより少なくとも１つのＳＮＰの非存在または存在を検出すること
    を含む方法。
  28. ヒトＩＬ１ＲＮ様遺伝子中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の検出方法であって、
    配列番号：５の位置により定義される様に４８３位置でヌクレオチド（ここで４８３位置のヌクレオチドはＧではない）を測定すること；および
    それにより少なくとも１つのＳＮＰの非存在または存在を検出すること
    を含む方法。
  29. ヒトＩＬ１ＲＮ様遺伝子中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の検出方法であって、
    配列番号：５の位置により定義される様に３７４位置でヌクレオチド（ここで３７４位置のヌクレオチドはＴではない）を測定すること、および
    それにより少なくとも１つのＳＮＰの非存在または存在を検出すること
    を含む方法。
  30. ヒトＩＬ１ＲＮ様遺伝子中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の検出方法であって、
    配列番号：５の位置により定義される様に３６７位置でヌクレオチド（ここで３６７位置のヌクレオチドはＴではない）を測定すること、および
    それにより少なくとも１つのＳＮＰの非存在または存在を検出すること
    を含む方法。
  31. ヒトＩＬ１ＲＮ様遺伝子中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の検出方法であって、
    配列番号：５の位置により定義される様に２８１位置でヌクレオチド（ここで２８１位置のヌクレオチドはＧではない）を測定すること、および
    それにより少なくとも１つのＳＮＰの非存在または存在を検出すること
    を含む方法。
  32. ヒトＩＬ１ＲＮ様遺伝子中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の検出方法であって、
    配列番号：５の位置により定義される様に１５５位置でヌクレオチド（ここで１５５位置のヌクレオチドはＡではない）を測定すること、および
    それにより少なくとも１つのＳＮＰの非存在または存在を検出することを含む方法。
  33. ヒトＩＬ１ＲＮ様遺伝子中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の検出方法であって、
    配列番号：５の位置により定義される様に１３０位置でヌクレオチド（ここで１３０位置のヌクレオチドはＡではない）を測定すること、および
    それにより少なくとも１つのＳＮＰの非存在または存在を検出すること
    を含む方法。
  34. 配列番号：３、７、９、１１、１３、１５、または１７の多型性と関連する疾病または病状の存在または素因を測定する方法であって、
    （ａ）多型性の存在について哺乳類対象由来の生物学的試料を試験すること；および
    （ｂ）多型対立遺伝子のコピー数を測定すること；
    ここで、多型対立遺伝子のコピー数は、該疾病または病状の存在または素因を示すものである、
    を含む方法。
  35. 配列番号：３、７、９、１１、１３、１５、または１７の多型性と関連する遺伝的リスクの変化因子の担体状態を同定する方法であって、
    （ａ）多型性の存在について哺乳類由来の生物学的試料を試験すること；
    （ｂ）多型対立遺伝子のコピー数を測定すること；
    ここで、多型対立遺伝子のコピー数は担体状態を示すものである、
    を含む方法。
  36. Ｔ対立遺伝子が上昇心電図ＳＴセグメントの表示である、請求項２０に記載の核酸配列。
  37. 該疾病または病態が心臓疾病である、請求項３４に記載の方法。
  38. 該心臓疾病が急性または慢性である、請求項３７に記載の方法。
  39. 該心臓疾患が心筋梗塞、狭心症、うっ血性心不全、心筋症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、および虚血からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
  40. 該遺伝的リスク因子が上昇心電図ＳＴセグメントである、請求項３５に記載の方法。
  41. 対象の配列多型性の存在に帰せられる病態に罹患した、リスクのある、または罹患したと疑われる対象を処置する方法であって、
    (ａ）配列番号：３、７、９、１１、１３、１５および１７からなる群から選択される多型配列、またはその相補体を含む第１の核酸の異常発現と関連する病態に罹患する対象を用意すること；および
    (ｂ）第２の核酸が野生型対立遺伝子に存在するヌクレオチドを含むという条件で、多型配列を含む第１の核酸の効果的な薬用量を対象に投与すること；
    （これにより、該対象を処置する）を含む方法。
  42. 対象の配列多型性の存在に帰せられる病態に罹患した、リスクのある、または罹患したと疑われる対象を処置する方法であって、
    （ａ）配列番号：３、７、９、１１、１３、１５および１７からなる群から選択される多型配列、またはその相補体を含む核酸の異常発現と関連する病態に罹患する対象、リスクのある対象、または疑われる対象を用意すること；および
    （ｂ）配列番号：３、７、９、１１、１３、１５および１７からなる群から選択される多型配列を含むオリゴヌクレオチドの効果的用量、または配列番号：３、７、９、１１、１３、１５または１７の多型配列のいずれか１つに相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドにより対象に投与されること；
    （これにより、該対象を処置する）を含む方法。
  43. 第１のポリヌクレオチドにその中に包含される多型部位でハイブリダイズする１またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列であって、ここで第１のポリヌクレオチドが、
    （ａ）配列番号：３、７、９、１１、１３、１５および１７からなる群から選択される１またはそれ以上の多型配列を含むヌクレオチド配列；
    （ｂ）フラグメントが該多型配列中の多型部位を含むという条件で、該ヌクレオチド配列の任意のフラグメントであるヌクレオチド配列；
    （ｃ）配列番号：３、７、９、１１、１３、１５および１７からなる群から選択される１またはそれ以上の多型配列に相補的な配列を含む相補的ヌクレオチド配列；
    （ｄ）フラグメントが該多型配列中の多型部位を含むという条件で、該相補的配列のフラグメントであるヌクレオチド配列；
    からなる群から選択される、オリゴヌクレオチド配列。
  44. 請求項４３に記載の配列であって、該配列が約１０〜１０００オリゴヌクレオチドを含む配列。
  45. 長さ１０〜１００ヌクレオチドの単離核酸分子であって、該核酸は配列番号：３と比較して配列番号：１または該核酸の相補体により選択的にハイブリダイズする、単離核酸分子。
  46. 請求項４５に記載の核酸分子であって、該核酸分子が配列番号：１の１０〜１００ヌクレオチド、またはその相補体を含む、核酸分子。
  47. 請求項４５に記載の核酸分子であって、該核酸分子が５連続ヌクレオチドＧＣＣＣＣまたはＣＧＧＧＧを含む核酸分子。
  48. 長さ１０〜１００ヌクレオチドの単離核酸分子であって、該核酸分子が配列番号：１と比較して配列番号：３または該核酸の相補体に、より選択的にハイブリダイズする、単離核酸分子。
  49. 請求項４８に記載の核酸分子であって、該核酸分子が配列番号：３またはその相補体の１０〜１００ヌクレオチドを含む核酸分子。
  50. 請求項４８に記載の核酸分子であって、該核酸が５連続ヌクレオチドＧＣＴＣＣまたはＣＧＡＧＧを含む核酸分子。
  51. 長さ１０〜１００ヌクレオチドの単離核酸分子であって、該核酸分子が配列番号：７と比較して配列番号：５または該核酸の相補体に、より選択的にハイブリダイズする単離核酸分子。
  52. 請求項５１に記載の核酸分子であって、該核酸分子が配列番号：５またはその相補体の１０〜１００ヌクレオチドを含む核酸分子。
  53. 請求項５１に記載の核酸分子であって、該核酸が５連続ヌクレオチドＡＴＧＣＣまたはＴＡＣＧＧを含む核酸分子。
  54. 長さ１０〜１００ヌクレオチドの単離核酸分子であって、該核酸が配列番号：５と比較して配列番号：７または該核酸の相補体に、より選択的にハイブリダイズする単離核酸分子。
  55. 請求項５４に記載の核酸分子であって、該核酸分子が配列番号：７またはその相補体の１０〜１００ヌクレオチドを含む核酸分子。
  56. 請求項５４に記載の核酸分子であって、該核酸分子が５連続ヌクレオチドＡＴＡＣＣまたはＴＡＴＧＧを含む核酸分子。
  57. 長さ１０〜１００ヌクレオチドの単離核酸分子であって、該核酸が配列番号：９と比較して配列番号：５または該核酸の相補体に、より選択的にハイブリダイズする単離核酸分子。
  58. 請求項５７に記載の核酸分子であって、該核酸分子が配列番号：５またはその相補体の１０〜１００ヌクレオチドを含む核酸分子。
  59. 請求項５７に記載の核酸分子であって、該核酸が５連続ヌクレオチドＣＴＴＣＡまたはＧＡＡＧＴを含む核酸分子。
  60. 長さ１０〜１００ヌクレオチドの単離核酸分子であって、該核酸が配列番号：５と比較して配列番号：９または該核酸の相補体に、より選択的にハイブリダイズする単離核酸分子。
  61. 請求項６０に記載の核酸分子であって、該核酸分子が配列番号：９またはその相補体の１０〜１００ヌクレオチドを含む核酸分子。
  62. 請求項６０に記載の核酸分子であって、該核酸が５連続ヌクレオチドＣＴＣＣＡまたはＧＡＧＧＴを含む核酸分子。
  63. 長さ１０〜１００ヌクレオチドの単離核酸分子であって、配列番号：１１に比較して配列番号：５または該核酸の相補体に、より選択的にハイブリダイズする単離核酸分子。
  64. 請求項６３に記載の核酸分子であって、該核酸分子が配列番号：５またはその相補体の１０〜１００ヌクレオチドを含む核酸分子。
  65. 請求項６３に記載の核酸分子であって、該核酸が５連続ヌクレオチドＧＣＴＴＣまたはＣＧＡＡＧを含む核酸分子。
  66. 長さ１０〜１００ヌクレオチドの単離核酸分子であって、該核酸が配列番号：５に比較して配列番号：１１または該核酸の相補体に、より選択的にハイブリダイズする単離核酸分子。
  67. 請求項６６に記載の核酸分子であって、該核酸分子が配列番号：１１またはその相補体の１０〜１００ヌクレオチドを含む核酸分子。
  68. 請求項６６に記載の核酸分子であって、該核酸が５連続ヌクレオチドＧＣＣＴＣまたはＣＧＧＡＧを含む核酸分子。
  69. 長さ１０〜１００ヌクレオチドの単離核酸分子であって、該核酸が配列番号：１３に比較して配列番号：５または該核酸の相補体に、より選択的にハイブリダイズする単離核酸分子。
  70. 請求項６９に記載の核酸分子であって、該核酸分子が配列番号：５またはその相補体の１０〜１００ヌクレオチドを含む核酸分子。
  71. 請求項６９に記載の核酸分子であって、該核酸が５連続ヌクレオチドＣＴＧＴＧまたはＧＡＣＡＣを含む核酸分子。
  72. 長さ１０〜１００ヌクレオチドの単離核酸分子であって、該核酸が配列番号：５に比較して配列番号：１３または該核酸の相補体に、より選択的にハイブリダイズする単離核酸分子。
  73. 請求項７２に記載の核酸分子であって、該核酸分子が配列番号：１３またはその相補体の１０〜１００ヌクレオチドを含む核酸分子。
  74. 請求項７２に記載の核酸分子であって、該核酸が５連続ＣＴＡＴＧまたはＧＡＴＡＣを含む核酸分子。
  75. 長さ１０〜１００ヌクレオチドの単離核酸分子であって、該核酸が配列番号：１５に比較して配列番号：５または該核酸の相補体に、より選択的にハイブリダイズする単離核酸分子。
  76. 請求項７５に記載の核酸分子であって、該核酸分子が配列番号：５またはその相補体の１０〜１００ヌクレオチドを含む核酸分子。
  77. 請求項７５に記載の核酸分子であって、該核酸が５連続ヌクレオチドＧＡＡＣＡまたはＣＴＴＧＴを含む核酸分子。
  78. 長さ１０〜１００ヌクレオチドの単離核酸分子であって、該核酸が配列番号：５に比較して配列番号：１５または該核酸の相補体に、より選択的にハイブリダイズする単離核酸分子。
  79. 請求項７８に記載の核酸分子であって、該核酸分子が配列番号：１５またはその相補体の１０〜１００ヌクレオチドを含む核酸分子。
  80. 請求項７８に記載の核酸分子であって、該核酸が５連続ヌクレオチドＧＡＧＣＡまたはＣＴＣＧＴを含む核酸分子。
  81. 長さ１０〜１００ヌクレオチドの単離核酸分子であって、該核酸が配列番号：１７に比較して配列番号：５または該核酸の相補体に、より選択的にハイブリダイズする単離核酸分子。
  82. 請求項８１に記載の核酸分子であって、該核酸分子が配列番号：５またはその相補体の１０〜１００ヌクレオチドを含む核酸分子。
  83. 請求項８１に記載の核酸分子であって、該核酸が５連続ヌクレオチドＴＴＡＡＣまたはＡＡＴＴＧを含む核酸分子。
  84. 長さ１０〜１００ヌクレオチドの単離核酸分子であって、該核酸が配列番号：５に比較して配列番号：１７または該核酸の相補体に、より選択的にハイブリダイズする単離核酸分子。
  85. 請求項８４に記載の核酸分子であって、該核酸分子が配列番号：１７またはその相補体の１０〜１００ヌクレオチドを含む核酸分子。
  86. 請求項８４に記載の核酸分子であって、該核酸が５連続ヌクレオチドＴＴＧＡＣまたはＡＡＣＴＧを含む核酸分子。
  87. ポリメラーゼおよび１ペアーのオリゴヌクレオチドプライマーを含む増幅システムであって、該オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つが配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、および１７からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズする、増幅システム。
  88. 少なくとも１ペアーのオリゴヌクレオチドプライマーを含むキットであって、該オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つが配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、および１７からなる群から選択されるポリヌクレオチドおよびバッファーに選択的にハイブリダイズする、キット。
  89. 核酸分子の試料中のＳＮＰＸ核酸分子を検出する方法であって、
    （ａ）核酸分子を含む試料を用意すること；
    （ｂ）該試料を、該試料中の相補的標的核酸分子への該第１および第２のプライマーペアーのメンバーのアニーリングを可能とする条件下で第１のプライマーペアーおよび第２のプライマーペアーの少なくとも１つのメンバーと接触させ、それにより第１および第２のアニーリングされたプライマー標的核酸分子の複合体を形成すること；
    （ｃ）該第１および第２のアニーリングされた標的核酸分子の複合体をポリメラーゼで伸長させて、第１および第２の伸長されたプライマー配列を形成すること；および
    （ｄ）該第１および第２の伸長されたプライマー配列を同定すること；
    （これにより、核酸分子である該試料中のSNP核酸分子を同定する）を含む方法。
  90. 該プライマーペアーが、３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：１の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第１のプライマー、および３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：３の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第２のプライマー（該第２のプライマーは１２６位置で少なくともヌクレオチドを含む）を含む、請求項８９に記載の方法。
  91. 該プライマーペアーが、３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：５の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第１のプライマー、および３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：７の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第２のプライマー（該第２のプライマーは４８３位置で少なくともヌクレオチドを含む）を含む、請求項８９に記載の方法。
  92. 該プライマーペアーが、３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：５の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第１のプライマー、および３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：９の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第２のプライマー（該第２のプライマーは３７４位置で少なくともヌクレオチドを含む）を含む、請求項８９に記載の方法。
  93. 該プライマーペアーが、３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：５の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第１のプライマー、および３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：１１の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第２のプライマー（該第２のプライマーは３６７位置で少なくともヌクレオチドを含む）を含む、請求項８９に記載の方法。
  94. 該プライマーペアーが、３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：５の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第１のプライマー、および３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：１３の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第２のプライマー（該第２のプライマーは２８１位置で少なくともヌクレオチドを含む）を含む、請求項８９に記載の方法。
  95. 該プライマーペアーが、３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：５の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第１のプライマー、および３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：１５の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第２のプライマー（該第２のプライマーは１５５位置で少なくともヌクレオチドを含む）を含む、請求項８９に記載の方法。
  96. 該プライマーペアーが、３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：５の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第１のプライマー、および３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：１７の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第２のプライマー（該第２のプライマーは１３０位置で少なくともヌクレオチドを含む）を含む、請求項８９に記載の方法。
  97. 対象のＳＮＰＸと関連する疾病または状態と関連する存在または感受性を診断する方法であって、
    （ａ）該対象由来の核酸を含む試料を用意すること；
    （ｂ）該試料を、該試料中の相補的標的核酸分子への該プライマーペアーのアニーリングを可能とする条件下でプライマーペアーの少なくとも１メンバーと接触させ、それにより第１のアニーリングされたプライマー標的核酸分子の複合体を形成すること；
    （ｃ）該第１のアニーリングされた標的核酸分子の複合体をポリメラーゼで伸長させて、第１の伸長されたプライマー配列を形成すること；および
    （ｄ）該伸長されたプライマー配列を同定すること（ここで、伸長されたプライマー配列の同定が該対象がＳＮＰＸと関連する疾病または状態を有するか、または感受性のあることを示す）；
    を含む方法。
  98. 該プライマーペアーが、３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：１の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第１のプライマー、および３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：３の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第２のプライマー（該第２のプライマーは１２６位置で少なくともヌクレオチドを含む）を含む、請求項９７に記載の方法。
  99. 該プライマーペアーが、３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：５の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第１のプライマー、および３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：７の少なくとも１５ヌクレオチドの第２のプライマー（該第２のプライマーは４８３位置で少なくともヌクレオチドを含む）を含む、請求項９７に記載の方法。
  100. 該プライマーペアーが、３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：５の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第１のプライマー、および３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：９の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第２のプライマー（該第２のプライマーは３７４位置で少なくともヌクレオチドを含む）を含む、請求項９７に記載の方法。
  101. 該プライマーペアーが、３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：５の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第１のプライマー、および３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：１１の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第２のプライマー（該第２のプライマーは３６７位置で少なくともヌクレオチドを含む）を含む、請求項９７に記載の方法。
  102. 該プライマーペアーが、３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：５の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第１のプライマー、および３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：１３の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第２のプライマー（該第２のプライマーは２８１位置で少なくともヌクレオチドを含む）を含む、請求項９７に記載の方法。
  103. 該プライマーペアーが、３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：５の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第１のプライマー、および３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：１５の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第２のプライマー（該第２のプライマーは１５５位置で少なくともヌクレオチドを含む）を含む、請求項９７に記載の方法。
  104. 該プライマーペアーが、３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：５の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第１のプライマー、および３１ヌクレオチド未満の長さであってかつ配列番号：１７の少なくとも１５ヌクレオチドを含む第２のプライマー（該第２のプライマーは１３０位置で少なくともヌクレオチドを含む）を含む、請求項９７に記載の方法。
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