JP2005513054A - ２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、および１７８３２を用いて血液障害を処置するための方法および組成物 - Google Patents

２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、および１７８３２を用いて血液障害を処置するための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、血液障害の診断および処置のための方法に関する。特に、本発明は、血液障害疾患状態に関連する組織において、および／または種々の血液障害の評価および診断に関連する操作に応答して、そしてそのような状態に対する素因を示す被験体の同定のために、２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子、または１７８３２遺伝子の差示的な発現を同定する。本発明はまた、血液障害を調節し得る化合物を同定するための方法を提供する。本発明はまた、血液障害の処置としての化合物の同定および治療用途のための方法を提供する。

Description

本出願は、米国仮特許出願番号６０／３４，１６０６（２００１年１２月１７日に出願）に対する優先権を主張し、この全体の内容は、本明細書中で参考として援用される。
骨髄発達の調節に関与する標的は、第１に、骨髄不全および骨髄機能不全、第２に毒性障害（ｔｏｘｉｃ ｉｎｓｕｌｔ）（最も化学治療誘導性血球減少症）の処置のための新規の治療アプローチを提供する。重篤なまだ対処されていないこの領域において必要な医療が存在し、現在利用可能なわずかな治療は組換えタンパク質であり、この組換えタンパク質は、系統分化の比較的後期で作用する。
造血（ｈｅｍａｔｏｐｏｅｔｉｃ）幹細胞が富化されたヒト起源およびマウス起源の骨髄集団ならびに骨髄ストローマ細胞集団は、前駆体集団の増殖および成熟に関与する遺伝子発見および標的に注釈のための物質の有用な供給源を提供する。種々の境遇下で培養され、インビボでヒトからか、またはインビボで動物モデルから単離された造血細胞は、血液障害に有用な新規な治療剤の同定をもたらす遺伝子発現分析のための原料物質の豊富な供給源を提供する。
（発明の詳細な説明）
本発明は、血液障害を有する患者の診断および処置のための方法および組成物を提供する。
本明細書中で使用される場合、「処置」は、疾患または障害、１つの疾患または障害の症状あるいは疾患または障害に向かう素因を治癒（ｃｕｒｉｎｇ）する、治癒（ｈｅａｌｉｎｇ）する、緩和する、軽減する、変化させる、軽減する、回復する、改善するまたは影響する目的で、患者への治療剤の適用または投与、あるいは患者から単離された組織または細胞株への治療剤の適用または投与として規定され、患者は、疾患または障害、疾患または障害の症状あるいは疾患または障害に向かう素因を有する。治療剤としては、低分子、ペプチド、抗体、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な分子は、本明細書中に記載される。
本明細書中で使用される場合、血液障害としては、赤血球関連障害が挙げられるが、これに限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「赤血球関連障害」は、異常な（増大したかまたは欠損した）赤芽球増殖（例えば、赤白血病）および異常な（増大したかまたは欠損した）赤芽球分化（例えば、貧血）を含む障害を含む。赤血球関連障害としては、以下が挙げられる：貧血（例えば、薬物（化学療法）誘導性貧血、遺伝的な細胞膜異常に起因する溶血性貧血（例えば、遺伝性球状赤血球症、遺伝性楕円赤血球症および遺伝性熱変形赤血球症）；後天的な細胞膜欠損に起因する溶血性貧血（例えば、発作性夜間血色素尿症および有棘細胞貧血）；抗体反応によって引き起こされる溶血性貧血（例えば、ＲＢＣ抗原に対する抗体、またはＡＢＯ系、Ｌｅｗｉｓ系、Ｉｉ系、Ｒｈ系、Ｋｉｄｄ系、Ｄｕｆｆｙ系およびＫｅｌｌ系の抗原に対する抗体）；メトヘモグロビン血症；赤血球生成の不全（例えば、再生不良性貧血、赤芽球ろう、骨髄異形成症候群、鉄芽球性貧血および先天性異常赤血球生成貧血の結果としてのもの）；非溶血性障害における二次的貧血（例えば、化学療法、アルコール中毒症または肝臓疾患の結果としてのもの）；慢性疾患の貧血（例えば、慢性腎不全）；ならびに内分泌欠損疾患。
本発明のポリペプチドまたは核酸の活性または発現を調節する薬剤を使用して、貧血、特に、薬物誘導性貧血または癌治療、慢性腎不全、悪性疾患、成人性または若年性の慢性関節リウマチ、ヘモグロビン合成の障害、早熟およびＨＩＶ感染のジドブジン処置に関連する貧血を処置し得る。処置を受ける被験体は、さらに二次薬剤（例えば、エリスロポイエチン）でさらなる少なくとも１つの状態の症状まで処置される。処置のオーダーは、逆にされ得る。この２つの処置は、同時に投与され得る。処置の間のタイミングは、変化され得る。
本明細書中で使用される場合、用語「エリスロポイエチン」または「ＥＰＯ」は、腎臓において生産される糖タンパク質をいい、これは、赤血球生成（赤血球生成：ｅｒｙｔｈｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）を刺激するのに責任がある主要なホルモンである。ＥＰＯは、骨髄における拘束された（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）赤血球先祖の分裂および分化を刺激する。正常な血漿エリスロポイエチンレベルは、０．０１〜０．０３単位／ｍＬの範囲であり、そして低酸素症または貧血の間、１００〜１，０００倍まで上昇し得る。ＧｒａｂｅｒおよびＫｒａｎｔｚ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．２９：５１（１９７８）；ＥｓｃｈｂａｃｈおよびＡｄａｍｓｏｎ，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ．２８：１（１９８５）。組換えヒトエリスロポイエチン（ｒＨｕＥｐｏまたはエポエチン（ｅｐｏｉｅｔｉｎ）α）は、ＥＰＯＧＥＮ．ＲＴＭ．（エポエチンα、組換えヒトエリスロポイエチン）（Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，Ｃａｌｉｆ．）およびＰＲＯＣＲＩＴ．ＲＴＭ．（エポエチンα、組換えヒトエリスロポイエチン）（Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎ．Ｊ．）として市販される。
赤血球関連障害の別の例は、赤血球増加症である。赤血球造血症（過剰および／または異所性のエリスロポイエチン生成によって引き起こされる赤血球過剰生産の障害）は、癌（例えば、腎細胞癌、悪性肝細胞癌および中枢神経系癌）によって引き起こされ得る。赤血球増加症（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｏｓｉｓ）に関連する疾患としては、赤血球増加症（ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ）（例えば、真性赤血球増加症、二次赤血球増加症および相対的赤血球増加症）が挙げられる。
本明細書中で使用される場合、血液障害は、Ｂ細胞に関与する障害を含み、これらとしては、前駆体Ｂ細胞新生物（例えば、リンパ芽球性白血病／リンパ芽球性リンパ腫）が挙げられるが、これに限定されない。末梢Ｂ細胞新生物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ種、濾胞性リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ｄｉｆｆｕｓｅ ｌａｒｇｅ Ｂ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、バーキットリンパ腫、プラスマ細胞新生物、多発性骨髄腫および関連要素、リンパプラスマ細胞リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｐｌａｓｍａｃｙｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｍａ）（ヴァルデンストレームマクログロブリン血症）、成熟細胞性リンパ腫、辺縁層リンパ腫（ＭＡＬＴｏｍａ）ならびにヘアリーセル白血病。
本明細書中で使用される場合、血液障害は、骨髄の障害を含み、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：造血性（ｈｅｍａｔｏｐｏｅｉｔｉｃ）幹細胞に関与する疾患；拘束されたリンパ先祖細胞；Ｂ細胞およびＴ細胞を含むリンパ細胞；拘束された骨髄様先祖（単球、顆粒球および巨核球を含む）；および拘束された赤血球先祖。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：白血病（Ｂ−リンパ性白血病、Ｔ−リンパ性白血病、未分化型白血病を含む）；赤白血病、巨核芽球白血病、単球；［白血病は、分化状態であるか分化状態でない］；慢性および急性リンパ芽球性白血病、慢性および急性リンパ性白血病、慢性および急性骨髄性白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群、慢性および急性骨髄性白血病、骨髄単球性白血病；慢性および急性骨髄芽球性白血病、慢性および急性骨髄性白血病、慢性および急性の前骨髄性白血病、慢性および急性の骨髄球白血病、単球マクロファージ直系の血液悪性疾患（例えば、若年性慢性骨髄性白血病）；二次ＡＭＬ、前駆体血液障害；不応性貧血；再生不良性貧血；反応性皮膚（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ）血管内皮細胞腫症；樹状細胞における改変された発現に関与する線維性障害、全身性硬化症、Ｅ−Ｍ症候群、流行性毒性油症候群（ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｔｏｘｉｃ ｏｉｌｓｙｎｄｒｏｍｅ）、強皮症の好酸球性筋膜炎の限局性形態、ケロイドおよび線維性大腸症を含む障害；血管腫様悪性線維性組織球腫；癌（原発性の頭部および頚部の扁平上皮細胞癌を含む）；肉腫（カポージ肉腫を含む）；線維腺腫および葉状腫瘍（乳房線維腺腫を含む）；間質腫瘍；葉状腫瘍（組織球腫を含む）；赤芽球症；神経線維腫症；血管内皮の疾患；古い外傷における粒状の脱髄；神経膠症、血管原性水腫、脈管性疾患、アルツハイマー病およびパーキンソン病；Ｔ細胞リンパ腫；Ｂ細胞リンパ腫。
本明細書中で使用される場合、血液障害は、血小板障害を含み得、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：減少した血小板の数に関する障害、血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病（急性特発性血小板減少性紫斑病を含む）、薬物誘導性血小板減少症、ＨＩＶ関連血小板減少症および血栓性細小血管症を含む）；血栓性血小板減少性紫斑病および溶血性尿毒症症候群。
血液障害はまた、血栓症を含み得る。血栓症は、血小板機能不全を生じ得る（例えば、心筋梗塞において見られる）、アンギナ、高血圧、脂質障害；真性糖尿病；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性症候群（真性赤血球増加症および血小板血症（ｔｈｏｍｂｏｃｙｔｈｅｍｉａ）を含む）；血栓性血小板減少性紫斑病；ＨＩＶ誘導性血小板障害（ＡＩＤＳ血小板減少症）；ヘパリン誘導性血小板減少症；血小板凝集／脱顆粒をもたらす壁細胞の改変／相互作用、血管内皮細胞活性化／損傷、単球／マクロファージの溢血および平滑筋細胞の増殖；自己免疫疾患（例えば、これらに限定されないが、脈管炎、抗リン脂質症候群、全身性エリテマトーデス）；炎症性疾患（例えば、これらに限定されないが、免疫活性化）；対宿主性移植片病；放射線誘導性過剰凝固（ｈｙｐｅｒｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）；遺伝性（常染色体優性または劣性）（例えば、限定されないが、タンパク質Ｃ／Ｓ、抗トロンビンＩＩＩ欠損およびＬｅｉｄｅｎ変異第Ｖ因子を含む凝固因子の経路）または後天性（例えば、限定されないが、凝固因子の自己免疫、癌関連異常調節（ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）および薬物誘導性異常調節）のいずれかの凝固因子の異常調節。
本明細書中で使用される場合、血液障害は、赤血球障害を含み得、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：貧血（例えば、溶血性貧血（遺伝性球状赤血球症、赤血球酵素欠損：グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ欠損に起因する溶血性疾患を含む））、鎌状赤血球疾患、セラサミア症候群、発作性夜間血色素尿症、免疫溶血性貧血、および外傷から赤血球を生じる溶血性貧血；ならびに減少した赤血球生成の貧血（巨赤芽球性貧血を含む）（例えば、ビタミンＢ１２欠損の貧血）：悪性貧血および葉酸欠損の貧血、鉄欠損貧血、慢性疾患の貧血、再生不良性貧血、赤芽球ろうおよび骨髄不全の他の形態。
本明細書中で使用される場合、血液学的障害としては、Ｔ細胞の障害が挙げられ得、これには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：細胞媒介性過敏症（例えば、遅延型過敏症およびＴ細胞媒介性細胞傷害性）および移植拒絶；自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、全身性硬化症、炎症性ミオパシー、混合型結合組織疾患および結節性多発性動脈炎）および他の脈管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｄｅｓ）；免疫欠損症候群（原発性免疫欠損（例えば、胸腺発育不全、重症複合型免疫不全疾患およびＡＩＤＳ）が挙げられるが、これらに限定されない）；白血球減少症；白血球の反応性（炎症性）増殖（白血球増加症、急性非特異的リンパ節炎および慢性非特異的リンパ節炎が挙げられるが、これらに限定されない）；白血球の腫瘍性増殖（リンパ新生物（例えば、前駆体Ｔ細胞新生物（例えば、急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫、末梢Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞の新生物）（これには、末梢Ｔ細胞リンパ腫、不特定の成体成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、菌状息肉腫およびセザリー症候群が挙げられる））ならびにホジキン病が挙げられるが、これらに限定されない）。
本発明の１つの局面は、例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２媒介性障害または２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２関連障害（例えば、造血障害（例えば、赤血球関連障害））を処置および診断するために適用可能なアッセイにおける試薬または標的として有用である２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のポリペプチドおよびその生物学的に活性なフラグメントまたは抗原性フラグメントを特徴とする。別の実施形態において、本発明は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性を有する２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２ポリペプチドを提供する。好ましいポリペプチドは、少なくとも１つの二重特異的ホスファターゼ触媒ドメインを含む、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質であり、好ましくは、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性（例えば、本明細書中に記載されるような２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性）を有する２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質である。
関連する局面において、本発明は、融合タンパク質を形成するために非２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のポリペプチドに作動可能に連結される２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のポリペプチドまたはフラグメントを提供する。
別の局面において、本発明は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のポリペプチドと反応する、より好ましくはそれらを特異的に結合する、抗体およびそれらの抗原結合フラグメントを特徴とする。
別の局面において、本発明は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。
さらに別の局面において、本発明は、例えば、スクリーニングされた化合物を用いて、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するためのプロセスを提供する。特定の実施形態において、本方法は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２のポリペプチドまたは核酸の減少した活性または発現に関連する状態（例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２を発現する細胞（例えば、造血細胞（例えば、骨髄（好中球）細胞、単球、赤血球、骨髄細胞、ＣＤ３４発現細胞、巨核球））の異常な増殖の処置を含む。状態としては、白血病（例えば、赤白血病）の場合のような造血細胞の活性または増殖の増加；または例えば、貧血の場合のような、造血細胞の分化の減少が挙げられ得る。
さらに別の局面において、本発明は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２を発現する細胞（例えば、造血細胞（例えば、骨髄（好中球）細胞、単球、赤血球、骨髄細胞、ＣＤ３４発現細胞、巨核球））の増殖、生存および／または分化を調節（例えば、増強または阻害）するための方法を提供する。本方法は、その細胞を、細胞の増殖および／または分化を調節するのに有効な量の薬剤（例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２のポリペプチドまたは核酸の活性または発現を調節する）と接触させる工程を包含する。
好ましい実施形態において、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２のポリペプチドは、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、または２１と同一または実質的に同一なアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２のポリペプチドは、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、または２１の、少なくとも１５、２０、５０、１００、１５０、１８０、２００またはそれ以上連続するアミノ酸のフラグメントである。
好ましい実施形態において、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２の核酸は、配列番号１、４、７、１０、１３、１６または１９と同一または実質的に同一なヌクレオチド配列を有する。他の実施形態において、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２の核酸は、配列番号１、４、７、１０、１３、１６または１９の、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００またはそれ以上連続するヌクレオチドのフラグメントである。
好ましい実施形態において、薬剤は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２の核酸の発現を、例えば、転写、ｍＲＮＡ安定性などを調節することによって、調節（例えば、増大または減少）する。
好ましい実施形態において、この薬剤は、ペプチド、ホスホペプチド、低分子（例えば、コンビナトリアルライブラリーのメンバー）または抗体、あるいはこれらの任意の組み合わせである。この抗体は、細胞毒、細胞傷害性剤および反応性金属イオンからなる群より選択される治療部分に結合体化され得る。
さらなる好ましい実施形態において、この薬剤は、アンチセンス、リボザイムまたは三重らせん分子、あるいは、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２の核酸、あるいはこれらの任意の組み合わせである。
好ましい実施形態において、この薬剤は、細胞傷害性剤と合わせて投与される。
好ましい実施形態において、細胞（例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２を発現する細胞）は、造血細胞（例えば、骨髄細胞、リンパ細胞または赤血球細胞、あるいはその前駆細胞）である。このような細胞の例としては、骨髄細胞（多形核細胞）、赤血球細胞、リンパ球、単球、細網細胞、プラスマ細胞および巨核球、ならびに異なる系統への幹細胞、そして約束された先祖細胞への前駆体（例えば、赤血球細胞の前駆体（赤芽球）、マクロファージの前駆体（単芽球）、血小板の前駆体（巨核球）、多形核白血球の前駆体（骨髄芽球）およびリンパ球の前駆体（リンパ芽球））が挙げられる。
好ましい実施形態において、細胞（例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２を発現する細胞）は、骨髄細胞（例えば、骨髄ＣＤ３４発現細胞）である。ＣＤ３４発現細胞の例としては、未成熟造血前駆細胞、骨髄中の造血コロニー形成細胞（単能性（ＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−Ｅ）および多能性祖先細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、ＣＦＵ−ＭｉｘおよびＣＦＵ−芽細胞））；ならびに間質細胞前駆体、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）発現Ｂリンパ前駆体およびＴリンパ前駆体、初期骨髄細胞および初期赤血球細胞、が挙げられる。
好ましい実施形態において、細胞（例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２を発現する細胞）は、骨髄赤血球系細胞（例えば、赤血球祖先細胞（例えば、ＧＰＡ（低）ＣＤ７１＋細胞）または分化した細胞（例えば、赤血球または巨核球））である。
好ましい実施形態において、細胞（例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２を発現する細胞）は、タンパク質（例えば、サイトカイン）と、さらに接触される。好ましくは、このタンパク質は、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、幹細胞因子および好ましくはエリトロポイエチンからなる群より選択される。このタンパク質接触工程は、薬剤が接触される前か、それと同時か、またはその後で、生じ得る。例えば、細胞（例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２を発現する細胞）は、被験体（例えば、患者）から獲得され、そしてタンパク質とエキソビボで接触される。処理された細胞は、被験体に戻し導入され得る。あるいは、このタンパク質接触工程は、インビボで生じ得る。
好ましい実施形態において、この薬剤と、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２のポリペプチドまたは核酸とは、インビトロまたはエキソビボで接触される。
好ましい実施形態において、この接触工程は、例えば、治療プロトコルまたは予防プロトコルの一部として、被験体においてインビボでもたらされる。好ましくは、被験体は、ヒト（例えば、造血障害（例えば、白血病または赤血球関連障害）を有する患者）である。例えば、この被験体は、貧血（例えば、溶血性貧血、異常な赤血球生成、非造血障害における二次的貧血、慢性疾患（例えば、慢性腎不全）の貧血）；内分泌欠損疾患；および／または赤血球増加症（例えば、多血症）を有する患者であり得る。あるいは、被験体は、癌患者（例えば、白血病性の癌（例えば、赤血球白血病）または癌腫（例えば、腎臓癌腫）を有する患者）であり得る。他の実施形態において、この被験体は、非ヒト動物（例えば、実験動物）である。
接触工程は、反復され得る。
好ましい実施形態において、この薬剤は、細胞（例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２を発現する細胞（例えば、造血細胞（例えば、骨髄（好中球）細胞、単球、赤血球系細胞、骨髄細胞、ＣＤ３４発現細胞、巨核球）））の増殖を減少し、そして／またはこれらの分化を増強する。このような薬剤は、癌（例えば、白血病性癌）を処置または予防するために使用され得る。
好ましい実施形態において、この薬剤は、造血細胞（例えば、骨髄（好中球）細胞、単球、赤血球系細胞、骨髄細胞、ＣＤ３４発現細胞、巨核球）の数を、祖先細胞の増殖、生存を増大すること、そして／またはその分化を刺激することによって、増大させる。このような薬剤は、造血障害（例えば、貧血（例えば、溶血性貧血、異常な赤血球生成、非造血障害における二次的貧血、慢性疾患（例えば、慢性腎不全）の貧血）；内分泌欠損疾患；および／または赤血球増加症（例えば、多血症））を処置または予防するために使用され得る。
別の局面において、本発明は、造血（例えば、赤血球生成）を調節する方法を特徴とし、この方法は、２３２発現細胞、２５２発現細胞、３０４発現細胞、１９８０発現細胞、１４７１７発現細胞、９９４１発現細胞、１９３１０発現細胞、または１７８３２発現細胞（例えば、造血細胞（例えば、骨髄性（好中球）細胞、単球、赤血球、骨髄細胞、ＣＤ３４発現細胞、巨核球）と、２５２ポリペプチド、３０４ポリペプチド、１９８０ポリペプチド、１４７１７ポリペプチド、９９４１ポリペプチド、１９３１０ポリペプチド、もしくは１７８３２ポリペプチド、または２５２核酸、３０４核酸、１９８０核酸、１４７１７核酸、９９４１核酸、１９３１０核酸、もしくは１７８３２核酸の活性または発現を増大または減少させる薬剤とを接触させ、それにより、造血細胞の分化を調節する工程を包含する。
なお別の局面において、本発明は、被験体における造血障害（例えば、赤血球関連障害）を処置または予防する方法を特徴とする。この方法は、２５２ポリペプチド、３０４ポリペプチド、１９８０ポリペプチド、１４７１７ポリペプチド、９９４１ポリペプチド、１９３１０ポリペプチド、もしくは１７８３２ポリペプチド、または２５２核酸、３０４核酸、１９８０核酸、１４７１７核酸、９９４１核酸、１９３１０核酸、もしくは１７８３２核酸の活性または発現を調節する薬剤の有効量を、その被験体に投与し、その結果、この造血障害が緩和されるか、または血液学的障害の少なくとも１つの症状を低減させる工程を包含する。
（本発明の分子）
（遺伝子ＩＤ ２５２）
非翻訳領域を含む、約１７９０ヌクレオチド長のヒト２５２配列（配列番号１）、（ＧＩ：１４８６２３４、プロスタグランチンＥレセプター（ＥＰ４）としても公知）は、終止コドンを含む約１４６７ヌクレオチドの推定メチオニン開始コード配列（配列番号１のコードとして示されるヌクレオチド、配列番号２）を含む。このコード配列は、４８８アミノ酸のタンパク質（配列番号３）（ＧＩ：１４８６２３５）をコードする。
ＴａｑＭａｎ分析により評価した場合に、２５２ ｍＲＮＡは、種々のヒト組織において低レベルで広範に発現したが、骨髄のＣＤ３４＋前駆細胞において高レベルで発現した。高レベルの発現はまた、インビボにおいて、ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ１５＋好中球集団において見出され、そして２５２ｍＲＮＡのレべルは、骨髄造血の間、恒常的であった。２５２はプロスタグランチンＥについてのレセプターであり、種々の前駆体細胞およびコロニー形成単位（ＣＦＵ）混合物に関して刺激性の効果を有することが公知である。この経路のアゴナイズは、ＣＤ３４＋細胞の増殖を刺激し全ての系統における細胞数を増大させる。発現パターンに起因して２５２活性を調節する薬剤は、本明細書中で開示されるような造血障害に有用な治療剤である。
（遺伝子ＩＤ ３０４）
非翻訳領域を含む約１８２４ヌクレオチド長のヒト３０４配列（配列番号４）（ＧＩ：５６３９８１、バソプレシンＶ１ｂレセプターとしても公知）は、終止コドンを含む約１２７５ヌクレオチドの推定メチオニン開始コード配列（配列番号４のコードとして示されるヌクレオチド、配列番号５）を含む。このコード配列は、４２４アミノ酸のタンパク質（配列番号６）（ＧＩ：５６３９８２）をコードする。
ＴａｑＭａｎ分析により評価した場合に、３０４ ｍＲＮＡの発見は、非常にわずかな組織において発現し、骨髄細胞のＣＤ３４＋前駆細胞が最も顕著であった。発現はまた、腎臓および単一肺腫瘍において見出された。３０４ ｍＲＮＡの発現は、骨髄の分化系統において観察されなかった。
３０４は、バソプレシンＶ３レセプターである。このレセプターを会するシグナル伝達は、内皮細胞に影響することが知られている。このレセプターをアゴナイズすることによって、本発明者らは前駆体細胞増殖を刺激し、そして全ての系統の細胞数を増加することができる。従って、３０４活性を調節する薬剤は、本明細書中で開示されるような血液疾患に有用な治療剤である。
（遺伝子ＩＤ １９８０）
非翻訳領域を含む約２９４３ヌクレオチド長のヒト１９８０配列（配列番号７）（ＧＩ：２５１８３９、グルタミンレセプターサブユニットとしても公知）は、終止コドンを含む約２９４３ヌクレオチドの推定メチオニン開始コード配列（配列番号７のコードとして示されるヌクレオチド、配列番号８）を含む。このコード配列は、９８０アミノ酸のタンパク質（配列番号９）（ＧＩ：２５１８４０）をコードする。
Ｔａｑｍａｎ発現分析は、ＣＤ３４＋前駆体細胞において高レベルの１９８０ ｍＲＮＡ発現を示す。インビトロおよびインビボで、他の全ての細胞の系統において発現はなかった。発現はまた、正常なヒトの脳および腎臓ならびにヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）においても見られた。１９８０は、グルタミンレセプターのサブユニットの１つである。その十分記載された、シナプスシグナル経路に関する効果とは別に、異なる細胞型において種々の役割を果たすことが公知である。多くの細胞型において増殖および生存を促進することが公知であり、そしてその阻害は細胞の分化を誘導し得る。このレセプターをアゴナイズすることによって、本発明者らは前駆体細胞増殖を刺激し、そして全ての系統の細胞数を増加することができる。従って、１９８０活性を調節する薬剤は、本明細書中で記載されるような血液疾患に有用な治療剤である。
（遺伝子ＩＤ １４７１７）
非翻訳領域を含む約２０４２ヌクレオチド長のヒト１４７１７配列（配列番号１０）（ＧＩ：２２０４３４６、ヒト躁病縞前駆体としても公知）は、終止コドンを含む約９６６ヌクレオチドの推定メチオニン開始コード配列（配列番号１０のコードとして示されるヌクレオチド、配列番号１１）を含む。このコード配列は、３２１アミノ酸のタンパク質（配列番号１２）（ＧＩ：２２０４３４７）をコードする。
ＴａｑＭａｎ分析により評価した場合、１４７１７ｍＲＮＡは、ＣＤ３４＋前駆体細胞およびインビトロの赤血球培養において高発現し、１４７１７ｍＲＮＡレベルは、分化の間、増加した。高レベルでの１４７１７ｍＲＮＡ発現はまた、ＧＰＡ−ｌｏ細胞においても見出され、赤血球新生において有する役割と一致する。さらなるＴａｑＭａｎ分析により、１４７１７ｍＲＮＡは、試験した全ての正常ヒト組織においては低いことを示したが、ＨＵＶＥＣ細胞における高レベルの発現が注目された。
１４７１７または躁病縞は、Ｎｏｔｃｈのプロセシングに関与するグルコシルトランスフェラーゼである。１４７１７は、Ｎｏｔｃｈの細胞表面への移動に必要である。１４７１７は、Ｎｏｔｃｈを通じたシグナル伝達に必要であることが知られている。１４７１７の活性の調節は、Ｎｏｔｃｈの機能を阻害することによって赤血球新生を刺激する。Ｎｏｔｃｈは、細胞をコミットされていない状態に維持することによって、分化を阻害することが知られている。Ｎｏｔｃｈを介したシグナル伝達の減少は、赤血球のコミットおよび分化の破壊を生じる。従って、１４７１７活性のモジュレーターは、本明細書中で開示されるような血液疾患治療剤として有用である。
（遺伝子ＩＤ ９９４１）
非翻訳領域を含む約１７４０ヌクレオチド長のヒト９９４１配列（配列番号１３）（ＧＩ：４０７００５、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼとしても公知）は、終止コドンを含む約１４２２ヌクレオチドの推定メチオニン開始コード配列（配列番号１３のコードとして示されるヌクレオチド、配列番号１４）を含む。このコード配列は、４７３アミノ酸のタンパク質（配列番号１５）（ＧＩ：４０７００６）をコードする。
ＴａｑＭａｎ分析により、９９４１ｍＲＮＡは正常なヒトの脳、Ｔ細胞（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）、ＣＤ６１＋骨髄巨核球において、および血小板ＲＮＡにおいて見出され、そして心臓虚血および不安定性狭心症の患者からの血小板において上昇したレベルで見出された。
ジーンターゲティングにより決定された、小脳の発達および機能に必須の９９４１カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＶ［Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０００ Ｎｏｖ １５；２０（２２）：ＲＣ１０７］。カルシウム移動は、血小板活性化および脱顆粒の重要な要素である。カルシウム依存性シグナル伝達は、血小板活性化の間のシグナル伝達酵素の細胞骨格転位に関連した。９９４１活性をアンタゴナイズすることにより、血小板の反応性が阻害される。従って、９９４１活性のモジュレーターは、本明細書中に開示されるような血液障害（血栓症を含むがこれらに限定されない）の有用な治療剤である。
（遺伝子ＩＤ １９３１０）
非翻訳領域を含む約２２９１ヌクレオチド長のヒト１９３１０配列（配列番号１６）（ＧＩ：７０２１０３６、オキシダーゼとしても公知）は、終止コドンを含む約１６６８ヌクレオチドの推定メチオニン開始コード配列（配列番号１６のコードとして示されるヌクレオチド、配列番号１７）を含む。このコード配列は、５５５アミノ酸のタンパク質（配列番号１８）（ＧＩ：７０２１０３７）をコードする。
ＴａｑＭａｎ分析により評価されるように、１９３１０ｍＲＮＡは正常なヒトの脳、巨核球前駆体、骨髄巨核球（ＣＤ６１＋）、および血小板において発現することが見出された。正常なボランティアの血小板と比較して、わずかに上昇したレベルの１９３１０ｍＲＮＡが、心筋梗塞後の患者由来の血小板において検出された。
ポリアミンは、血小板の凝集を阻害する。ポリアミンオキシダーゼは、ポリアミンの異化を媒介する２つの酵素うちの２番目のものである。さらに、ポリアミンは、ポリアミンオキシダーゼの合成を刺激し得る。１９３１０酵素活性を阻害することにより、ポリアミンの酵素分解が防止され、それによって抗血小板活性が促進され、止血が維持される。従って、１９３１０活性のモジュレーターは、本明細書中に開示されるような血液障害（血栓症を含むがこれらに限定されない）の有用な治療剤である。
（遺伝子ＩＤ １７８３２）
非翻訳領域を含む約２６４９ヌクレオチド長のヒト１７８３２配列（配列番号１９）（ＧＩ：１３３２５１０７、カリウムチャネル、スーパーファミリーＫ（ＴＷＩＫ−２）としても公知）は、終止コドンを含む約９４２ヌクレオチドの推定メチオニン開始コード配列（配列番号１９のコードとして示されるヌクレオチド、配列番号２０）を含む。このコード配列は、３１３アミノ酸のタンパク質（配列番号２１）（ＧＩ：１３３２５１０８）をコードする。
ＴａｑＭａｎ分析により評価される場合、１７８３２ ｍＲＮＡの発現は、培養巨核球において高レベルで見出され、骨髄巨核球（ＣＤ６１＋細胞）においてそれより中程度で見出され、そして正常なボランティアの血小板と比較して心筋梗塞および真性赤血球増加症患者由来の血小板において増大したレベルで見出された。
１７８３２またはＴＷＩＫ−２は、潜在的なＰＫＣリン酸化部位（Ｓｅｒ１５８）を含み、そしてプロテインキナーゼＣアクチベーターＰＭＡによって刺激され得る［ＪＢＣ １９９９；２７４（１２）：７８８７−９２］。病理的な剪断応力およびトロンビンは、ＰＫＣを活性化し、そして血小板の凝集を刺激する［ＪＢＣ １９９３；２６８（５）：３５２０−４］。巨核球および血小板における１７８３２機能は、高い剪断応力および／またはトロンビン活性化部位での血小板凝集の補償的機構またはフィードバック阻害であり得る。従って、１７８３２のモジュレーターは、本明細書中に開示されるような血液障害（血栓症を含むがこれらに限定されない）の有用な治療剤である。
本発明の種々の局面は、以下の小節においてさらに詳細に記載される。
（Ｉ．スクリーニングアッセイ）
本発明は、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質に結合するか、例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の発現あるいは２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性に対して刺激効果または阻害効果を有するか、あるいは例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の基質の発現または活性に対して刺激効果または阻害効果を有する、モジュレーター（すなわち、候補化合物もしくは試験化合物または候補薬剤もしくは試験薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子（有機または無機）または他の薬物））を同定するための方法（これは、本明細書中で「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる）を提供する。本明細書中に記載のアッセイを使用して同定される化合物は、血液学的障害を処置するのに有用であり得る。
これらのアッセイは、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質に結合する化合物、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質と相互作用する他の細胞内タンパク質または細胞外タンパク質に結合する化合物、および他の細胞内タンパク質または細胞外タンパク質と２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質との相互作用を妨害する化合物を同定するように設計されている。例えば、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質（これは、膜貫通レセプター型タンパク質である）の場合、このような技術は、このようなレセプターのためのリガンドを同定し得る。２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質のリガンドまたは基質は、例えば、血液学的障害の少なくとも１つの症状に対して使用され得る。このような化合物としては、ペプチド、抗体、または有機低分子化合物もしくは無機低分子化合物が挙げられ得るがこれらに限定されない。このような化合物はまた、他の細胞性タンパク質を含み得る。
アッセイによって同定される化合物（例えば、本明細書に記載の化合物）は、例えば、血液学的障害を処置するのに有用であり得る。血液学的障害状態が、細胞または組織における、全体的に低いレベルの２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の遺伝子発現および／あるいは２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質により生じる場合、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質と相互作用する化合物は、結合した２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質の活性を強調するかまたは増幅する化合物を含み得る。このような化合物は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質活性のレベルの効果的な増大を引き起し、したがって、症状を改善する。
他の例において、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の遺伝子における変異は、血液学的障害にいたる有害な効果を有する、異常型または過剰量の、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質を生じさせ得る。同様に、生理学的状態は、血液学的障害に至る、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の遺伝子発現の過剰な増大を引き起こし得る。このような場合、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質に結合する化合物は、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質の活性を阻害するタンパク質として同定され得る。本節で記載されるような技術によって同定される化合物の有効性を試験するためのアッセイは、本明細書中に議論されている。
１つの実施形態において、本発明は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質またはポリペプチドあるいはそれらの生物学的に活性な部分の基質である候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。別の実施形態において、本発明は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質またはポリペプチドまたはその生物学的活性な部分に結合するかまたはその活性を調節する候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、以下に挙げられる当該分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのうちの任意のものを使用して得られ得る：生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な並列固相ライブラリーまたは液相ライブラリー；デコンボルーション処理を必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティクロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、化合物の、ペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリー、または低分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）。
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、例えば、以下において、当該分野で見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３。
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２〜４２１）、またはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５〜５５６）、細菌上（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２２３，４０９号）、芽胞上（Ｌａｄｎｅｒ、ＵＳＰ’４０９号）、プラスミド上（Ｃｕｌｌら（１９９２）ＰｒｏｃＮａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６〜３９０）；（Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４〜４０６）；（Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８〜６３８２）；（Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１〜３１０）；（Ｌａｄｎｅｒ 前出）に提示され得る。
１つの実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、ここで２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質もしくは１７８３２タンパク質またはその生物学的に活性な部分を発現する細胞を、試験化合物と接触させ、そして試験化合物が２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性を調節する能力を決定する。試験化合物が２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性を調節する能力の決定を、例えば、細胞内カルシウム、ＩＰ３、ｃＡＭＰ、またはジアシルグリセロール濃度、細胞内タンパク質のリン酸化プロフィール、細胞増殖および／または移動、例えば、細胞表面接着分子もしくは造血に関連する遺伝子の遺伝子発現、あるいは２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２により調節される転写因子の活性をモニタリングすることによって達成し得る。この細胞は、哺乳動物由来（例えば、神経細胞由来）であり得る。１つの実施形態において、レセプタードメインと相互作用する化合物が、リガンドとして（すなわち、レセプターに結合し、シグナル伝達経路を調節するよう）機能するそれらの能力についてスクリーニングされ得る。リガンドの同定、およびリガンド−レセプター複合体の活性の測定は、この相互作用のモジュレーター（例えば、アンタゴニスト）の同定を導く。このようなモジュレーターは、血液学的障害の処置に有用であり得る。
基質への２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の結合を調節する試験化合物の能力、あるいは２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２に結合する試験化合物の能力もまた、決定され得る。基質への２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の結合を調節する試験化合物の能力の決定は、例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の基質を、放射性同位体または酵素標識とカップリングさせることによって達成され得、その結果、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２への、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の基質の結合は、複合体中の標識された２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の基質を検出することによって、決定され得る。２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２はまた、放射性同位体または酵素標識とカップリングされて、複合体中の２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の基質への２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の結合を調節する試験化合物の能力をモニタリングし得る。２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２と結合する試験化合物の能力の決定は、例えば、その化合物と、放射性同位体または酵素標識とをカップリングさせることによって達成され、その結果、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２へのこの化合物の結合は、複合体中の標識された２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の化合物を検出することによって決定され得る。例えば、化合物（例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のリガンドまたは基質）を、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで、直接的または間接的のいずれかで標識し得、そしてこの放射性同位体が、放射線の直接的な計数によってか、またはシンチレーション計数によってかで検出され得る。化合物はさらに、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素標識され得、そして適切な基質の産物への変換を測定することによって、この酵素標識を検出し得る。
相互作用するもののいずれも標識することなく、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２と相互作用する化合物（例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のリガンドまたは基質）の能力を決定することもまた、本発明の範囲内である。例えば、微視的生理機能測定器を使用して、化合物も２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のいずれも標識することなく、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２との化合物の相互作用を検出し得る（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍ．ら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：１９０６−１９１２）。本明細書中で使用される場合、「微視的生理機能測定器（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）」（例えば、細胞センサー（Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ））は、光アドレス可能な電位差計センサー（ＬＡＰＳ）を使用して、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化を、化合物と２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２との間の相互作用の指標として使用し得る。
別の実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、これは、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の標的分子（例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の基質）を発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物が、この２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の標的分子の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物が、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の標的分子の活性を調節する能力の決定は、例えば、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質が、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の標的分子と結合または相互作用する能力を決定することによって、達成され得る。
２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質あるいはこれらの生物学的に活性なフラグメントが、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の標的分子と結合または相互作用する能力の決定は、直接結合の決定に関して上記の方法の１つによって、達成され得る。好ましい実施形態において、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質が２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の標的分子と結合または相互作用する能力の決定は、その標的分子の活性を決定することによって、達成され得る。例えば、この標的分子の活性は、その標的の細胞セカンドメッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３、ｃＡＭＰ）の誘導を検出すること、適切な基質への標的の触媒活性／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動可能に連結された標的応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出すること、または標的で調節された細胞応答（例えば、遺伝子発現）を検出することにより、決定され得る。
なお別の実施形態において、本発明のアッセイは無細胞アッセイであり、ここで、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質もしくは１７８３２タンパク質またはこれらの生物学的に活性な部分は、試験化合物と接触され、そして試験化合物が、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質もしくは１７８３２タンパク質またはこれらの生物学的に活性な部分に結合する能力が決定される。本発明のアッセイにおいて使用される２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質の好ましい生物学的に活性な部分は、非２５２分子、非３０４分子、非１９８０分子、非１４７１７分子、非９９４１分子、非１９３１０分子または非１７８３２分子との相互作用に関与するフラグメント（例えば、高い表面確立スコアを有するフラグメント）を含む。試験化合物の、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質への結合は、上記のように直接的にかまたは間接的にかのいずれかで測定され得る。好ましい実施形態において、このアッセイは、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質もしくは１７８３２タンパク質またはこれらの生物学的に活性な部分を、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２に結合する既知の化合物と接触させ、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、および試験化合物が２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、試験化合物が２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、試験化合物が、既知の化合物と比較して優先的に２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２あるいはこれらの生物学的に活性な部分に結合する能力を決定する工程を含む。２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の、既知の標的タンパク質との相互作用を調節する化合物は、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質（特に、変異体２５２タンパク質、変異体３０４タンパク質、変異体１９８０タンパク質、変異体１４７１７タンパク質、変異体９９４１タンパク質、変異体１９３１０タンパク質または変異体１７８３２タンパク質）の活性を調節するのに有用であり得る。
別の実施形態において、アッセイは、無細胞アッセイであり、ここで、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質、またはその生物学的に活性な部分が試験化合物と接触され、そしてその試験化合物が２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパクまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力が決定される。この試験化合物が２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質の活性を調節する能力の決定は、例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質が、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２の標的分子に結合する能力を、直接的結合の決定のための上記方法の１つによって決定することにより、達成され得る。２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質が２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２の標的分子に結合する能力を決定することはまた、リアルタイムのＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）のような技術を用いて達成され得る（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．およびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８〜２３４５およびＳｚａｂｏら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９〜７０５）。本明細書において用いる場合、「ＢＩＡ」は、いずれの相互作用物（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）も標識することなく、リアルタイムで生体特異的相互作用を研究するための技術である。表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｒｎａｎｃｅ）（ＳＰＲ）の光学的現象（ｏｐｔｉｃａｌ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）における変化は、生物学的分子の間のリアルタイム反応の指標として用いられ得る。
別の実施形態において、この試験化合物が２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質の活性を調節する能力の決定は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質が、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２の標的分子の下流エフェクター活性をさらに調節する能力を決定することにより、達成され得る。例えば、このエフェクター分子の適切な標的に対する活性が決定され得るかまたはこのエフェクターの適切な標的に対する結合が、上に記載のように決定され得る。
なお別の実施形態において、無細胞アッセイは、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質またはその生物学的に活性な部分に、この２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質に結合する既知の化合物を接触させてアッセイ混合物を形成させる工程、このアッセイ混合物を、試験化合物と接触させる工程、およびこの試験化合物が２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物が２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のと相互作用する能力を決定する工程は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質が、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２の標的分子と優先的に結合するか、またはその２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２の標的分子の活性を優先的に調節する能力を決定する工程を包含する。
本発明の上記アッセイ方法の１つより多い実施形態において、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２またはその標的分子のいずれかを固定して、そのタンパク質の一方または両方の非複合体化形態からの複合体化形態の分離を促進し、そしてそのアッセイの自動化に適用させることが、望ましくあり得る。試験化合物の２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質への結合、または候補化合物の存在下および非存在下での２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質の標的分子との相互作用は、これらの反応物を収容するために適切な任意の容器内で、達成され得る。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。１つの実施形態において、そのタンパク質の一方または両方がマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質が、提供され得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２の融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いで、これらは、試験化合物と合わせられるか、あるいは試験化合物および非吸着の標的タンパク質または２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質のいずれかと合わせられ、そしてこの混合物が、複合体形成に貢献する条件下（例えば、塩およびｐＨに関して生理学的条件）でインキュベートされる。インキュベーションに続いて、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、結合していないあらゆる成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定し、例えば、上記のように、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体がマトリックスから解離され得、そして２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２の結合レベルまたは活性レベルを、標準的な技術を使用して決定し得る。
タンパク質をマトリックス上に固定するための他の技術もまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質または２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２の標的分子のいずれかが、ビオチンとストレプトアビジンとの結合体化を利用して固定され得る。ビオチン化された２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質または標的分子は、当該分野において公知の技術を使用して、ビオチンＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製され得（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、そしてストレプトアビジン被覆した９６ウェルのプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定され得る。あるいは、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質または標的分子と反応性であるが、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質の標的分子への結合を妨害しない抗体が、そのプレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない標的またはタンパク質が、抗体の結合体化によってウェル内にトラップされ得る。このような複合体を検出するための方法には、ＧＳＴ固定複合体に関しての上記のものに加えて、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質または標的分子と反応性の抗体を使用する複合体の免疫検出、ならびに２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質または標的分子に関する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
別の実施形態において、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２の発現のモジュレーターは、細胞が候補化合物と接触され、そして細胞中での２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が決定される方法において同定される。候補化合物の存在下での２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルは、候補化合物の非存在下での２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルと比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づき、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２の発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下よりも存在下で多い（統計的に有意に多い）場合、候補化合物は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激物質として同定される。あるいは、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下よりも存在下でより低い（統計学的に有意に低い）場合、候補化合物は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のｍＲＮＡまたはタンパク質発現のインヒビターとして同定される。細胞中での２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のｍＲＮＡ発現またはタンパク質発現のレベルは、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のｍＲＮＡまたはタンパク質の検出について本明細書中に記載される方法により決定され得る。
本発明のなお別の局面において、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイ（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら、（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：２２３〜２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６〜１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０〜９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）において「ベイト（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用されて、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２（「２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２の結合タンパク質」または「２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２−ｂｐ」）と結合または相互作用し、そして２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２の活性に関与する他のタンパク質を同定し得る。このような２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２の結合タンパク質はまた、例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２の媒介性シグナル伝達経路の下流エレメントとして、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質または２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２の標的によるシグナル伝達に関与する可能性がある。あるいは、このような２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２の結合タンパク質は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のインヒビターである可能性がある。
ツーハイブリッドシステムは、別個のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる大半の転写因子のモジュラー性質に基づく。手短には、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物において、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質をコードする遺伝子は、公知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。もう一方の構築物において、同定されていないタンパク質（「プレイ（ｐｒｅｙ）」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列のライブラリー由来のＤＮＡ配列は、公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイト」タンパク質および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用して２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２に依存性の複合体を形成し得る場合、転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、近接する。このように近接することにより、転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結したレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写が可能になる。レポーター遺伝子の発現が、検出され得、そして機能的転写因子を含む細胞コロニーは、単離され得、そして２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得るために使用され得る。
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるアッセイの２つ以上の組み合わせに関する。例えば、調節剤は、細胞ベースのアッセイまたは無細胞アッセイを用いて同定され得、そして２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質の活性を調節する因子の能力は、例えば、動物（例えば、本明細書中に記載される、血液学的障害の動物モデル）においてインビボで確認され得る。
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイによって同定される新規薬剤に関する。従って、適切な動物モデルにおいて、本明細書中で記載されるように同定された薬剤をさらに使用することは本発明の範囲内である。例えば、本明細書中に記載されるように同定された薬剤（例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２の調節剤、アンチセンスの２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２の核酸分子、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２に特異的な抗体、または２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２の結合パートナー）は、このような薬剤を用いる処置の効果、毒性、または副作用を決定するために、動物モデルにおいて使用され得る。あるいは、本明細書中に記載されるように同定される薬剤は、このような薬剤の作用の機構を決定するために、動物モデルにおいて使用され得る。さらに、本発明は、本明細書中に記載されるような処置についての上記スクリーニングアッセイによって同定された新規薬剤の使用に関する。
任意の化合物（上記アッセイ系において同定されるような化合物が挙げられるがこれらに限定されない）が、血液学的障害を処置する能力について試験され得る。血液学的障害の少なくとも１つの症状に対するこのような能力を示す化合物の同定のための細胞ベースのアッセイおよび動物モデルベースのアッセイは、本明細書中に記載される。
さらに、血液学的障害の動物ベースのモデル（例えば、本明細書中に記載されるようなモデル）は、血液学的障害を処置し得る化合物を同定するために使用され得る。このような動物モデルは、血液学的障害を処置する上で有効であり得る薬物、医薬品、治療、および介入の同定のための試験基質として使用され得る。例えば、動物モデルは、血液学的障害を処置する能力を示すことが予測される化合物に対して、曝露された動物における血液学的障害のこのような改善を導くのに十分な濃度および十分な時間、曝露され得る。この曝露に対する動物の応答は、処置の前および後の血液学的障害の症状の逆転を評価することによりモニタリングされ得る。
介入に関して、血液学的障害の任意の局面を逆転する任意の処置が、ヒト血液学的障害治療介入の候補として考慮されるべきである。試験薬剤の投薬量は、用量応答曲線を得ることによって決定され得る。
さらに、遺伝子発現パターンは、血液学的障害の少なくとも１つの徴候に対する化合物の能力を評価するために使用され得る。例えば、１つ以上の遺伝子の発現パターンは、「遺伝子発現プロフィール」または「転写プロフィール」の一部を形成し得、次いで、このような評価において使用され得る。本明細書中で使用される場合、「遺伝子発現プロフィール」または「転写プロフィール」は、所定のセットの条件下で、所定の組織または細胞型について獲得されるｍＲＮＡ発現のパターンを含む。遺伝子発現プロフィールは、例えば、ディファレンシャルディスプレイ手順、ノーザン分析、および／またはＲＴ−ＰＣＲを使用することによって、作製され得る。１つの実施形態において、２５２遺伝子配列、３０４遺伝子配列、１９８０遺伝子配列、１４７１７遺伝子配列、９９４１遺伝子配列、１９３１０遺伝子配列または１７８３２遺伝子配列は、このような遺伝子発現プロフィールの作製および確証のためのプローブおよび／またはＰＣＲプライマーとして使用され得る。
遺伝子発現プロフィールは、細胞および／または動物ベースのモデル系における、既知の状態（心臓血管疾患または正常のいずれか）について特徴付けられ得る。その後、これらの既知の遺伝子発現プロフィールは、効果を確認するために比較され得、試験化合物は、このような遺伝子発現プロフィールを改変する必要があり、そしてそのプロフィールをより望ましいプロフィールの化合物とより緊密に類似させる必要がある。
例えば、化合物の投与は、血液学的障害疾患モデル系の遺伝子発現プロフィールを、コントロール系とより緊密に類似させ得る。あるいは、化合物の投与は、コントロール系の遺伝子発現プロフィールに、血液学的障害または血液学的障害疾患状態を模倣させ始め得る。このような化合物は、例えば、目的の化合物のさらなる特徴付けにおいて使用され得るか、または、さらなる動物モデルの作製において使用され得る。
（ＩＩ．細胞ベースおよび動物ベースのモデル系）
血液学的障害のためのモデルとしての役割を果たす、細胞ベースおよび動物ベースの系が、本明細書中に記載される。これらの系は、種々の適用において使用され得る。例えば、細胞ベースおよび動物ベースのモデル系を使用して、心臓血管疾患に関連する、差次的に発現される遺伝子（例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２）をさらに特徴付けし得る。さらに動物ベースおよび細胞ベースのアッセイは、以下に記載されるような血液学的障害を回復させ得る化合物を同定するように設計された、スクリーニングストラテジーの一部として使用され得る。従って、動物ベースおよび細胞ベースのモデルを使用して、血液学的障害を処置する際に有効であり得る薬物、医薬品、治療および介入を同定し得る。さらに、このような動物モデルを使用して、動物被験体におけるＬＤ５０およびＥＤ５０を決定し得、そしてこのようなデータを使用して、潜在的な血液学的障害処置のインビボでの効力を決定し得る。
（Ａ．動物ベースの系）
血液学的障害の動物ベースのモデル系としては、非組換え動物および操作されたトランスジェニック動物が挙げられ得るがこれらに限定されない。
血液学的障害についての非組換え動物モデルとしては、例えば、遺伝的モデルが挙げられ得る。
さらに、血液学的障害を示す動物モデルは、例えば、当業者に周知であるトランスジェニック動物を作製するための技術とともに、上記の２５２遺伝子配列、３０４遺伝子配列、１９８０遺伝子配列、１４７１７遺伝子配列、９９４１遺伝子配列、１９３１０遺伝子配列または１７８３２遺伝子配列を使用することによって、操作され得る。例えば、２５２遺伝子配列、３０４遺伝子配列、１９８０遺伝子配列、１４７１７遺伝子配列、９９４１遺伝子配列、１９３１０遺伝子配列または１７８３２遺伝子配列が、目的の動物のゲノムに導入され得、そしてこの目的の動物のゲノムにおいて過剰発現され得るか、あるいは内因性の２５２遺伝子配列、３０４遺伝子配列、１９８０遺伝子配列、１４７１７遺伝子配列、９９４１遺伝子配列、１９３１０遺伝子配列または１７８３２遺伝子配列が存在する場合、これらは、過剰発現され得るか、また、あるいは、２５２遺伝子発現、３０４遺伝子発現、１９８０遺伝子発現、１４７１７遺伝子発現、９９４１遺伝子発現、１９３１０遺伝子発現または１７８３２遺伝子発現を過少発現させるかまたはこれらの遺伝子発現を不活化させるために破壊され得るかのいずれかであり得る。
本発明の宿主細胞をまた使用して、非ヒトトランスジェニック動物を作製し得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、受精卵または胚性幹細胞であり、この細胞に、２５２コード配列、３０４コード配列、１９８０コード配列、１４７１７コード配列、９９４１コード配列、１９３１０コード配列もしくは１７８３２コード配列が導入されている。次いで、このような宿主細胞を使用して、非ヒトトランスジェニック動物を作製し得、ここにおいて、外因性の２５２配列、３０４配列、１９８０配列、１４７１７配列、９９４１配列、１９３１０配列もしくは１７８３２配列が、それらのゲノムまたは相同組換え動物に導入され、ここで、内因性の２５２配列、３０４配列、１９８０配列、１４７１７配列、９９４１配列、１９３１０配列もしくは１７８３２配列が、変更されている。このような動物は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２の機能および／または活性を研究するため、ならびに２５２活性、３０４活性、１９８０活性、１４７１７活性、９９４１活性、１９３１０活性もしくは１７８３２活性のモジュレーターを同定および／または評価するために、有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」は、非ヒト動物であり、好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくは、ラットまたはマウスのようなげっ歯類であり、ここで、これらの動物の１つ以上の細胞が、導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。導入遺伝子は、外因性ＤＮＡであり、この外因性ＤＮＡは、トランスジェニック動物が成長する細胞のゲノムに取り込まれ、かつ成熟動物のゲノムにおいて維持され、それによってこのトランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織における、コードされた遺伝子産物の発現を指向する。本明細書中で使用される場合、「相同組換え動物」は、非ヒト動物であり、好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくは、マウスであり、ここで、内因性の２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子は、この内因性遺伝子と、その動物の成長前にこの動物の細胞（例えば、動物の胎児性細胞）に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって変更されている。
本発明の方法において使用されるトランスジェニック動物は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のコード核酸を、受精卵の雄前核に、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって導入し、そして卵母細胞を偽妊娠雌養母動物において成長させることによって作製され得る。２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のｃＤＮＡ配列は、導入遺伝子として、非ヒト動物のゲノムに導入され得る。あるいは、ヒトの２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、マウスまたはラットの２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子）が、導入遺伝子として使用され得る。あるいは、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の遺伝子ホモログ（例えば、別の２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のファミリーメンバー）は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のｃＤＮＡ配列へのハイブリダイゼーションに基づいて単離され得、そして導入遺伝子として使用され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、導入遺伝子の発現の効力を増加させるように、この導入遺伝子に含まれ得る。組織特異的調節配列は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の導入遺伝子に作動可能に連結されて、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質の発現を特定の細胞に指向し得る。胚操作およびマイクロインジェクションを介して、トランスジェニック動物（特に、マウスのような動物）を作製するための方法は、当該分野において慣習的であり、例えば、以下に記載されている：米国特許第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号（両方が、Ｌｅｄｅｒらによる）、米国特許第４，８７３，１９１号（Ｗａｇｎｅｒらによる）、ならびにＨｏｇａｎ，Ｂ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）。類似の方法が、他のトランスジェニック動物の作製のために使用される。トランスジェニック始原（ｆｏｕｎｄｅｒ）動物は、そのゲノムにおける２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の導入遺伝子の存在、および／あるいは動物の組織または細胞における２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のｍＲＮＡの発現に基づいて、同定され得る。次いで、トランスジェニック始原動物を使用して、導入遺伝子を保有するさらなる動物を育種し得る。さらに、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質をコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物はさらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物を産出し得る。
相同組換え動物を作製するために、２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子の少なくとも一部を含むベクターが調製され、このベクターに、欠失、付加または置換が導入されて、それによって、２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子が変更される（例えば、機能的に破壊される）。この２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子は、ヒト遺伝子であり得るが、より好ましくは、ヒトの２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子の非ヒトホモログである。例えば、ラットの２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子を使用して、マウスゲノムにおいて内因性の２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子を変更するのに適切な、相同組換え核酸分子（例えば、ベクター）を構築し得る。好ましい実施形態において、相同組換え核酸分子は、相同組換えの際に、内因性の２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子が機能的に破壊される（すなわち、もはや機能的タンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる）ように、設計される。あるいは、相同組換え核酸分子は、相同組換えの際に、内因性の２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子が変異されるか、さもなければ変更されるが依然として機能的タンパク質をコードする（例えば、上流の調節領域が変更され、それによって内因性の２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質の発現を変更し得る）ように、設計され得る。相同組換え核酸分子において、２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子の変更された部分は、２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子のさらなる核酸配列によって、その５’末端および３’末端に隣接され、相同組換え核酸分子によって保有される外因性の２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子と、細胞（例えば、胚性幹細胞）における内因性２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子との間に、相同組換えが生じることを可能にする。隣接するさらなる２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の核酸配列は、内因性遺伝子との首尾よい相同組換えに十分な長さの核酸配列である。代表的には、隣接したＤＮＡ（５’末端と３’末端との両方）の数キロベースが、この相同組換え核酸分子に含まれる（例えば、相同組換えベクターの記載については、Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．およびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：５０３を参照のこと）。相同組換え核酸分子は、細胞（例えば、胚性幹細胞株）に（例えば、エレクトロポレーションによって）導入され、そして導入された２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子が内因性の２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子と相同に組み換わる細胞が、選択される（例えば、Ｌｉ，Ｅ．ら（１９９２）Ｃｅｌｌ ６９：９１５を参照のこと）。次いで、これらの選択された細胞は、動物（例えば、マウス）の胚盤胞に注射され、凝集キメラを形成し得る。（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７）１１３−１５２頁）を参照のこと）。次いで、キメラ胚は、適切な偽妊娠雌養母動物に移植され得、そしてこの胚は、生殖（ｔｅｒｍ）され得る。生殖細胞において相同組換えされたＤＮＡを含む子孫を使用して、動物を繁殖させ得、ここで、この動物の全ての細胞は、導入遺伝子の生殖系列伝達によって相同組換えされたＤＮＡを含む。相同組換え核酸分子（例えば、ベクター）または相同組換え動物を構築するための方法は、以下にさらに記載される：Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２：８２３−８２９、およびＬｅ Ｍｏｕｅｌｌｅｃらによる、ＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ ９０／１１３５４；Ｓｍｉｔｈｉｅｓらによる、ＷＯ ９１／０１１４０；Ｚｉｊｌｓｔｒａらによる、ＷＯ ９２／０９６８；およびＢｅｒｎｓらによる、ＷＯ ９３／０４１６９。
別の実施形態において、本発明の方法において使用するためのトランスジェニック非ヒト動物が作製され得、この動物は、導入遺伝子の調節された発現を可能にする、選択された系を含む。このような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の記載については、例えば、Ｌａｋｓｏら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を使用して導入遺伝子の発現を調節する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が、必要とされる。このような動物は、「二重」トランスジェニック動物の構築によって（例えば、２種のトランスジェニック動物（一方は、選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方は、リコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む）を交配させることによって）提供され得る。
本明細書中に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、以下に記載される方法に従って作製され得る：Ｗｉｌｍｕｔ，Ｉ．ら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３およびＰＣＴ国際公開番号ＷＯ ９７／０７６６８およびＷＯ ９７／０７６６９。簡潔には、トランスジェニック動物由来の細胞（例えば、体細胞）が単離され得、そして増殖周期を出てＧｏ期に入るように誘導され得る。次いで、休止細胞が、例えば、電気パルスの使用を介して、この休止細胞が単離される同じ種の動物由来の除核された卵母細胞に融合され得る。次いで、この再構築された卵母細胞は、桑実胚または未分化胚芽細胞が成長するように培養され、次いで、偽妊娠雌養母動物に移される。この雌養母動物に由来する子孫は、細胞（例えば、体細胞）が単離される動物のクローンである。
次いで、容易に検出可能なレベルの２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のｍＲＮＡあるいは２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のペプチド（２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のエピトープに対する抗体を使用して、免疫細胞化学的に検出される）を発現する、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のトランスジェニック動物は、特徴的な血液学的障害を表示する動物を同定するために、さらに評価されるべきである。
（Ｂ．細胞ベースの系）
２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２タンパク質をコードする、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２遺伝子配列を含み、かつこれらを発現し、そしてさらに例えば、造血（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ）に関連する細胞表現型を示す細胞を使用して、効果を示す化合物を同定し得る。このような細胞としては、以下が挙げられ得る：非組換え単球細胞株（例えば、Ｕ９３７（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５９３）、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−２０２）、およびＰ３８８Ｄ１（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−６３））；内皮細胞（例えば、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）、およびウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ））；ならびに、一般的な哺乳動物細胞株（例えば、ＨｅＬａ細胞およびＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５１）、血液学に関連する細胞を構成する上記の細胞））。さらに、このような細胞としては、組換え細胞株、トランスジェニック細胞株が挙げられ得る。例えば、上で議論される、本発明の血液学的障害の動物モデルを使用して、この障害に対する細胞培養モデルとして使用され得る細胞株（これは、例えば、造血に関与する１種以上の細胞型を含む）を作製し得る。本発明の血液学的障害モデルのトランスジェニック動物由来の一次培養物が利用され得るが、連続した細胞株の作製が、好ましい。トランスジェニック動物から連続した細胞株を誘導するために使用され得る技術の例については、Ｓｍａｌｌら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：６４２−６４８を参照のこと。
あるいは、例えば、造血に関与することが知られている細胞型の細胞は、細胞内での２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２遺伝子発現の量を増加または低下させ得る配列でトランスフェクトされ得る。例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２遺伝子配列は、目的の細胞のゲノムに導入され得、そしてこの目的の細胞のゲノムにおいて過剰発現され得るか、あるいは内因性の２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２遺伝子配列が存在する場合、これらは、過剰発現され得るか、またはあるいは、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２遺伝子を過少発現させるかまたはこれらの遺伝子発現を不活化させるために破壊され得るかのいずれかであり得る。
２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２遺伝子を過剰発現させるために、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２遺伝子のコード部分は、目的の細胞型（例えば、内皮細胞）において遺伝子発現を駆動し得る調節配列に連結され得る。このような調節領域は、当業者に周知であり、そして過度な実験を行うことなく利用され得る。標的遺伝子を発現させるための組換え方法は、上に記載されている。
内因性の２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の遺伝子配列の過少発現のために、このような配列は、単離され得、そして目的の細胞型のゲノムに再導入された場合、内因性の２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の対立遺伝子が不活性化されるように、操作され得る。好ましくは、この操作された２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の配列は、遺伝子ターゲティングを介して導入され、その結果、内因性の２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の配列は、操作された２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の配列を、細胞のゲノムに組み込む際に破壊される。２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２遺伝子を用いた、宿主細胞のトランスフェクションは、上に記載されている。
化合物で処置されたかあるいは２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２遺伝子を用いてトランスフェクトされた細胞は、例えば、造血に関連する表現型について試験され得る。
２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の核酸のトランスフェクションは、標準的な技術（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８９）前出、に記載される）を使用することによって、達成され得る。トランスフェクトされた細胞は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の組換え遺伝子配列の存在について、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のｍＲＮＡの発現および蓄積について、ならびに２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の組換えタンパク質産物の存在について、評価されるべきである。２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の遺伝子発現の減少が望ましい例において、標準的な技術を使用して、内因性の２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の遺伝子発現および／あるいは２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質産生の低下が達成されるか否かを、実証し得る。
（ＩＩＩ．予測医学）
本発明はまた、予測医学の分野に関し、ここにおいて、診断アッセイ、予後アッセイ、モニタリング臨床試験が、診断（予測）目的のために使用され、それによって個体を予防的に処置する。従って、本発明の１つの局面は、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞（例えば、内皮細胞）、または組織（例えば、血管組織））の状況において、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質および／または核酸の発現、ならびに２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性を決定し、それによって、個体が、血液学的障害の素因に罹患しているかまたは血液学的障害を被っているか否かを決定するための診断アッセイに関する。本発明はまた、個体が血液学的障害を発病する危険性があるか否かを決定するための、診断（または予測）アッセイを提供する。例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２遺伝子における変異が、生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このようなアッセイは、診断目的または予測目的のために使用され得、それによって個体は、血液学的障害の発症前に、予防的に（ｐｈｏｐｈｙｌａｃｔｉｃａｌｌｙ）処置される。
本発明の別の局面は、臨床試験における、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の発現または活性に対する、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のモジュレーター（例えば、抗２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２抗体、あるいは２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のリボザイム）の影響のモニタリングに関する。
これらの因子および他の因子は、以下の節で、さらに詳細に記載される。
（Ａ．診断アッセイ）
被験体が疾患に罹患しているか否かを決定するために、生物学的サンプルが被験体から得られ得、そしてこの生物学的サンプルは、この生物学的サンプル中で、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質、あるいは２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を検出することができる、化合物または因子と接触され得る。２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するために好ましい因子は、標識核酸プローブであり、このプローブは、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る。この核酸プローブは、例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、もしくは配列番号１９に示される２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の核酸またはそれらの一部（例えば、少なくとも１５ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、４５ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、２５０ヌクレオチド長または５００ヌクレオチド長であり、かつストリンジェントな条件下で、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするに十分であるオリゴヌクレオチド）であり得る。本発明の診断アッセイにおいて使用するのに適切な他のプローブが、本明細書中に記載されている。
サンプル中で、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質を検出するのに好ましい因子は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質に結合し得る抗体であり、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体であり得るかまたは、より好ましくは、モノクローナル抗体であり得る。インタクトな抗体、またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が、使用され得る。プローブまたは抗体に関して、用語「標識（された）」は、検出可能な物質をそのプローブまたは抗体にカップリング（すなわち、物理的に連結する）し、そして直接的に標識される別の試薬との反応性によってこのプローブまたは抗体を間接的に標識することによる、プローブまたは抗体の直接的な標識を含むことが意図される。間接的な標識の例は、蛍光標識された二次抗体を使用し、そして蛍光標識されたストレプトアビジンで検出され得るように、ビオチンでＤＮＡプローブを末端標識する、一次抗体の検出を含む。
用語「生物学的サンプル」は、被験体から単離された組織、細胞、および生物学的流体、ならびに被験体内に存在する組織、細胞、および流体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法を使用して、インビトロおよびインビボで、生物学的サンプル中の２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡを検出し得る。例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のｍＲＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質を検出するためのインビトロ技術としては、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光検査法が挙げられる。２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質を検出するためのインビボ技術は、被験体に、標識された抗２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２抗体を導入することを含む。例えば、抗体は、被験体における存在および位置が、標準的な画像化技術によって検出され得る放射標識マーカーで、標識され得る。
別の実施形態において、本方法はさらに、以下の工程を包含する：コントロール被験体から、コントロールの生物学的サンプルを得る工程；このコントロールサンプルを、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出することができる化合物または因子と接触させる工程であって、その結果、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在が、生物学的サンプル中で検出される、工程；ならびに、コントロールサンプルにおける２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を、試験サンプルにおける２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と比較する工程。
（Ｂ．予後アッセイ）
本発明はさらに、異常な２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の発現または活性に関連する疾患を有するかまたはそのような疾患を発症する危険性のある被験体を同定するための方法に関する。
本明細書中で使用される場合、用語「異常な」は、野生型の２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の発現または活性から逸脱した、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の発現または活性を含む。異常な発現または活性は、発現または活性の増加または減少、ならびに野生型の発生的な発現のパターンまたは亜細胞の発現パターンに従わない、発現または活性を含む。例えば、異常な２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の発現または活性は、２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子における変異により、２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子が、過少発現または過剰発現される場合、ならびにこのような変異によって、非機能的な２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質または野生型様式で機能しないタンパク質（例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の基質と相互作用しないタンパク質、または非２５２基質、非３０４基質、非１９８０基質、非１４７１７基質、非９９４１基質、非１９３１０基質または非１７８３２基質と相互作用するタンパク質）が生じる状況、を含むことが意図される。
本明細書中に記載されるアッセイ（例えば、前述の診断アッセイまたは以下のアッセイ）を使用して、疾患を有する被験体または疾患が発症する危険性のある被験体を同定し得る。生物学的サンプルを、被験体より取得し得、そして遺伝的変更の存在または非存在について試験し得る。例えば、このような遺伝的変更は、以下の少なくとも１つの存在を確認することにより検出され得る：１）２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子由来の１つ以上のヌクレオチドの検出、２）２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの付加、３）２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、４）２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子の染色体再構築、５）２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける変更、６）ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのような、２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子の異常な改変、７）２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、８）２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質の非野生型レベル、９）２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子対立遺伝子喪失、および１０）２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質の不適切な翻訳後修飾。
本明細書中で記載されるように、２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子における遺伝的変更を検出するために使用され得る当該分野において公知の多くのアッセイが、存在する。例えば、２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子における遺伝的変更は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）（例えば、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲ）あるいは、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３６０−３６４を参照のこと）においてプローブ／プライマーを使用して検出され得、これらのうちの後者は、２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子における点変異を検出するために特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２を参照のこと）。この方法は、被験体から生物学的サンプルを収集する工程、このサンプルから核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはこれらの両方）を単離する工程、（存在するならば）２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で、この核酸サンプルを、２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーと接触させる工程；ならびに増幅産物の存在または非存在を検出するかまたは増幅産物のサイズを検出しそしてコントロールサンプルと長さを比較する工程。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲが、本明細書中に記載される変異を検出するために使用される任意の技術と組合わせて予備的増幅工程として使用するに好ましくあり得ることは、明白である。
代替の増幅法としては以下が挙げられる：持続的配列増幅（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ら（１９８８）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、または他の核酸増幅法のいずれか、その後の当業者に周知の技術を使用する増幅分子の検出。これらの検出スキームは、このような分子が非常に少数で存在する場合に、核酸分子の検出に特に有用である。
代替の実施形態において、生物学的サンプル由来の２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子における変異は、制限酵素切断パターンにおける変更によって同定され得る。例えば、サンプルおよびコントロールＤＮＡが、単離され、（必要に応じて）増幅され、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化され、そしてフラグメント長サイズが、ゲル電気泳動によって決定され、そして比較される。サンプルとコントロールＤＮＡとの間のフラグメント長サイズの差異は、サンプルＤＮＡ中の変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム（例えば、米国特許第５，４９８，５３１号）の使用は、リボザイム切断部位の発生または喪失によって、特異的変異の存在についてスコア付けられ得る。
他の実施形態において、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２における遺伝的変異は、生物学的サンプル由来の核酸およびコントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、何百個または何千個のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイにハイブリダイズさせることによって同定され得る（Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｔ．ら（１９９６）Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌ，Ｍ．Ｊ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：７５３−７５９）。例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２における遺伝的変異は、Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｔ．ら（１９９６）（上述）に記載されるような光生成ＤＮＡプローブを含む２次元アレイにおいて同定され得る。簡単には、プローブの第１のハイブリダイゼーションアレイを使用して、連続的で重複するプローブの線状アレイを作製することによって、サンプルおよびコントロールにおけるＤＮＡの長鎖を通して走査して配列間の塩基変化を同定し得る。この工程は、点変異の同定を可能とする。この工程の後、検出される全ての改変体または変異に相補的なより小さな特定化されたプローブアレイを使用することによって、特異的変異の特徴付けを可能にする第２のハイブリダイゼーションアレイが続く。各変異アレイは、パラレルプローブセット、野生型遺伝子に対するある相補体および変異遺伝子に対する他の相補体から構成される。
なお別の実施形態において、当該分野において公知の種々の配列決定反応のいずれかを使用して、生物学的サンプル中の２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子を直接的に配列決定し得、そして生物学的サンプル中の２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の配列を、対応する野生型（コントロール）配列と比較することによって変異を検出し得る。配列決定反応の例としては、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５６０またはＳａｎｇｅｒ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３によって開発された技術に基く反応が挙げられる。種々の自動化配列決定手順が、質量分析法による配列決定（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９を参照のこと）を含む診断アッセイ（Ｎａｅｖｅ，Ｃ．Ｗ．（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４８−５３）を行う場合に利用され得ることもまた、企図される。
２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、切断剤からの保護がＲＮＡ／ＲＮＡ異種二重鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ異種二重鎖中でミスマッチした塩基を検出するために使用される方法が挙げられる（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２）。一般に、「ミスマッチ切断」の分野の技術は、野生型２５２配列、野生型３０４配列、野生型１９８０配列、野生型１４７１７配列、野生型９９４１配列、野生型１９３１０配列または野生型１７８３２配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織サンプルより得られた潜在的変異ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成される異種二重鎖を提供することによって開始する。二本鎖二重鎖は、コントロール鎖とサンプル鎖との間の塩基対ミスマッチに起因して存在するような二本鎖の一本鎖領域を切断する因子で処理される。例えば、ミスマッチ領域を酵素的に消化するために、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖はＲＮａｓｅで処理され得、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処理され得る。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のいずれかが、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムで処理され、そして、ミスマッチ領域を消化するためにピペリジンで処理される。ミスマッチ領域の消化後、次いで、生じた物質が、変異部位を決定するために変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズで分けられる。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：４３９７およびＳａｌｅｅｂａら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５を参照のこと。好ましい実施形態において、コントロールＤＮＡまたはＲＮＡが、検出のために標識され得る。
さらに別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、細胞のサンプルより得られた２５２ ｃＤＮＡ、３０４ ｃＤＮＡ、１９８０ ｃＤＮＡ、１４７１７ ｃＤＮＡ、９９４１ ｃＤＮＡ、１９３１０ ｃＤＮＡまたは１７８３２ ｃＤＮＡ中の点変異を検出およびマッピングするために規定された系において二本鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素と呼ばれる）を使用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞由来のチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する（Ｈｓｕら（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １５：１６５７−１６６２）。例示的実施形態に従って、２５２配列、３０４配列、１９８０配列、１４７１７配列、９９４１配列、１９３１０配列または１７８３２配列（例えば、野生型の２５２配列、３０４配列、１９８０配列、１４７１７配列、９９４１配列、１９３１０配列または１７８３２配列）に基くプローブは、試験細胞からのｃＤＮＡ産物または他のＤＮＡ産物にハイブリダイズされる。二重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理され、そして存在する場合、切断産物は、電気泳動的プロトコルなどから検出され得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
他の実施形態において、電気泳動的移動度の変更を使用して、２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子における変異を同定する。例えば、一本鎖コンフォーメーション多型（ＳＳＣＰ）を使用して、変異体核酸と野生型核酸との間の電気泳動的移動度の差異を検出し得る（Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：８６：２７６６；Ｃｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４およびＨａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３−７９もまた参照のこと）。サンプルおよびコントロールの２５２核酸、３０４核酸、１９８０核酸、１４７１７核酸、９９４１核酸、１９３１０核酸または１７８３２核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは変性され、そして再生される。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、電気泳動的移動度において生じた変更は、単一の塩基変化の検出さえ可能にする。ＤＮＡフラグメントは、標識されたプローブで標識されても検出されてもよい。このアッセイの感度は、（ＤＮＡではなく）ＲＮＡを用いることにより増強され、ここで二次構造は、配列の変化により感受性である。好ましい実施形態において、目的の方法は、電気泳動的移動度の変化に基いて二本鎖へテロ二重鎖分子を分離するためにヘテロ二重鎖分析を利用する（Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ ７：５）。
なお別の実施形態において、変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドにおける変異体または野生型フラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイされる（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５）。ＤＧＧＥが分析の方法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲによって約４０ｂｐの高融解ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加することによって、完全には変性しないことを保証するために改変される。さらなる実施形態において、温度勾配は、コントロールＤＮＡおよびサンプルＤＮＡの移動度における差異を同定するために、変性勾配の代わりに使用される（ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ ２６５：１２７５３）。
点変異を検出するための他の技術の例としては、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸張が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーが調製され得、ここで、公知の変異が中心的におきかえられ、次いで完全な一致が見出される場合のみハイブリダイゼーションが可能となる条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズされる（Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３；Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６２３０）。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする膜に結合され、標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズされる場合に、ＰＣＲ増幅した標的ＤＮＡまたは多数の異なる変異にハイブリダイズされる。
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅｃ）特異的増幅技術は、本発明と組み合わせて使用され得る。特異的増幅のためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心において（Ｇｉｂｂｓら、（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２４３７−２４４８）、または適切な条件下でミスマッチがポリメラーゼ伸張を防ぐかまたは減少し得る１つのプライマーの最も３’末端にて（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ １１：２３８）目的の変異をもたらし得る（その結果、増幅は差次的ハイブリダイゼーションに依存する）。さらに、変異の領域に新規な制限部位を導入して、切断に基づく検出をおこすことが望ましくあり得る（Ｇａｓｐａｒｉｎｉら、（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ６：１）。特定の実施形態において、増幅はまた、増幅のためのＴａｑリガーゼを使用して行われ得ることが予期される（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９）。このような場合において、連結は、増幅の存在または非存在について探索することによって特定の部位での公知の変異の存在を検出し得る５’配列の３’末端にて、完全な一致が存在する場合にのみ生じる。
さらに、本明細書中に記載される予後アッセイは、被験体が疾患を有効に処置するために２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のモジュレーター（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、または低分子）を投与され得るか否かを決定するために使用され得る。
（Ｃ．臨床試験の間の効果のモニタリング）
本発明はさらに、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のモジュレーター（例えば、本明細書中において同定された２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のモジュレーター）の、疾患の処置に対する有効性を決定するための方法を提供する。例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の遺伝子の発現増加、タンパク質レベル増加、または２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性のアップレギュレートにおける、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のモジュレーターの有効性は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の遺伝子の発現減少、タンパク質レベル減少、または２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性のダウンレギュレートを示す被験体の臨床試験においてモニタリングされ得る。あるいは、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の遺伝子の発現減少、タンパク質レベル減少、あるいは２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性のダウンレギュレートにおける２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のモジュレーターの有効性は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の発現増加、タンパク質レベル増加、あるいは２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性の増加を示す被験体の臨床試験においてモニタリングされ得る。このような臨床試験において、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の遺伝子、および好ましくは、例えば、造血に関与する他の遺伝子の発現または活性が、「読み出し」すなわち特定の細胞の表現型のマーカーとして使用され得る。
例えば（限定のためではなく）、（例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイにおいて同定される）２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性を調節する因子での処置によって細胞において調節される、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２を含む遺伝子が、同定され得る。従って、血液障害を罹患する被験体に対する２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性を調節する因子の効果を（例えば、臨床試験において）研究するために、細胞が単離され得、そしてＲＮＡが調製され得、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２、および血液障害に関連する他の遺伝子の発現レベルについて分析され得る。遺伝子発現レベル（例えば、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるようなノザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲによって、あるいは本明細書中に記載される方法の１つによって生成されるタンパク質の量を測定することによって、または２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２、または他の遺伝子の活性レベルを測定することによって、定量され得る。この方法において、遺伝子発現パターンは、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性を調節する因子に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとして作用し得る。この応答状態は、個体を２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性を調節する因子で処置する前、およびその間の種々の時点で決定され得る。
好ましい実施形態において、本発明は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性を調節する因子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される低分子）での被験体の処置の有効性をモニタリングするための方法を提供し、以下の工程を包含する：（ｉ）この因子の投与前に予め投与するサンプルを被験体から得る工程；（ｉｉ）この投与前サンプル中の２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出する工程；（ｉｉｉ）投与後の１つ以上のするサンプルを被験体から得る工程；（ｉｖ）これらの投与後のサンプル中の２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性レベルを検出する工程；（ｖ）投与前サンプル中の２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性レベルを、投与後サンプル中の２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性レベルと比較する工程；ならびに（ｖｉ）被験体に対する因子の投与を適宜変更する工程。例えば、因子の投与増加は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の発現または活性を、検出された（すなわち、因子の有効性を増加させる）レベルよりも高いレベルに増加することが、好ましくあり得る。あるいは、因子の投与減少は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の発現または活性を、検出された（すなわち、因子の有効性を減少させる）レベルよりも低いレベルに減少することが、望ましくあり得る。このような実施形態に従って、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の発現または活性は、観察可能な表現型応答の非存在下ですら、因子の有効性の指標として使用され得る。
（ＩＶ．処置方法）
本発明は、被験体（例えば、疾患の危険性のある（または疾患に罹患している疑いのある）ヒト）を処置する予防法および治療法の両方を提供する。処置の予防法および治療法の両方の観点で、このような処置は、薬理ゲノム学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）の分野から得られる知識に基づいて、特異的に仕立てられ（ｔａｉｌｏｒｅ）得るかまたは改変され得る。「薬理ゲノム学」は、本明細書中で使用される場合、遺伝子配列決定、統計的遺伝学および遺伝子発現分析のようなゲノム技術の、臨床開発および市場での薬物に対する適用をいう。より詳細には、この用語は、患者の遺伝子がどのように薬物に対する患者の応答（例えば、患者の「薬物応答表現型」または「薬物応答遺伝子型」）を決定するのかについての研究をいう。
従って、本発明の別の局面は、個々の薬物応答遺伝子型に従って、本発明の２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の分子、または、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のモジュレーターのいずれかを用いる被験体の予防処置または治療処置を仕立てるための方法を提供する。薬理ゲノム学によって、臨床医（ｃｌｉｎｉｃｉａｎ）または内科医（ｐｈｙｓｉｃｉａｎ）は、この処置から最も利益を得る患者に対して予防処置または治療処置を標的化することが可能になり、そして毒性薬物関連副作用を被る患者の処置を避けることが可能になる。
（Ａ．予防方法）
一局面において、本発明は２５２発現、３０４発現、１９８０発現、１４７１７発現、９９４１発現、１９３１０発現または１７８３２発現あるいは２５２活性、３０４活性、１９８０活性、１４７１７活性、９９４１活性、１９３１０活性または１７８３２活性を調節する薬剤を患者に投与することによって、患者における疾患を防ぐ方法を提供する。血液学的な障害に対する危険性のある患者は、例えば、本明細書中に記載の任意の診断的または予後的なアッセイまたはそれらの組み合わせによって同定され得る。予防薬の投与は、異常な２５２発現、３０４発現、１９８０発現、１４７１７発現、９９４１発現、１９３１０発現または１７８３２発現あるいは異常な２５２活性、３０４活性、１９８０活性、１４７１７活性、９９４１活性、１９３１０活性または１７８３２活性の特徴的症状の発生に先立って生じ得、これのよって疾患が予防されるか、あるいは、その進行が遅延される。２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の起始異常の型に依存して、例えば、２５２アゴニスト、３０４アゴニスト、１９８０アゴニスト、１４７１７アゴニスト、９９４１アゴニスト、１９３１０アゴニストまたは１７８３２アゴニストあるいは２５２アンタゴニスト薬剤、３０４アンタゴニスト薬剤、１９８０アンタゴニスト薬剤、１４７１７アンタゴニスト薬剤、９９４１アンタゴニスト薬剤、１９３１０アンタゴニスト薬剤または１７８３２アンタゴニスト薬剤が、患者の処置に関して使用され得る。適切な薬剤は、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。
（Ｂ．治療的方法）
本明細書中に記載したのは、血液学的障害を回復し得る方法および組成物である。特定の血液学的障害は、少なくとも部分的に遺伝子産物の過度のレベルによって、あるいは異常または過剰な活性を示す遺伝子産物の存在によってもたらされる。このように、このような遺伝子産物のレベルおよび／または活性の減少は、血液学的障害の回復をもたらす。遺伝子発現のレベルまたはタンパク質の活性の減少に関する技術は、以下に議論される。
あるいは、特定の他の血液学的障害は、少なくとも一部、遺伝子発現のレベルの欠損または減少、もしくはタンパク質の活性のレベルの減少によってもたらされる。このように、遺伝子の発現および／またはこのようなタンパク質の活性のレベルの増加は、血液学的障害の回復をもたらす。
いくつかの場合において、疾患状態における遺伝子のアップレギュレーションは、疾患状態に対しての応答において、その遺伝子産物に対する保護的な役割を反映する。このような遺伝子発現または遺伝子産物の活性の促進は、それが影響する保護的な効果を強固にする。いくつかの血液学的障害の状態は、このような保護的遺伝子の活性のレベルの異常に低い値に起因し得る。これらの場合において、また、遺伝発現のレベルおよび／またはこのような遺伝子産物の活性の増加は、血液学的障害の回復をもたらす。標的遺伝子発現レベルまたは標的遺伝子産物活性レベルを増加させるための技術は本明細書中に議論される。
従って、本発明の別の側面は、処置目的のための２５２発現、３０４発現、１９８０発現、１４７１７発現、９９４１発現、１９３１０発現または１７８３２発現または、２５２活性、３０４活性、１９８０活性、１４７１７活性、９９４１活性、１９３１０活性または１７８３２活性を修飾する方法に関係する。従って、例示的な実施例において、本発明の修飾方法は、細胞と２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２との結合、もしくは、その細胞（例えば、内皮細胞または卵巣細胞）に関連した、２５２タンパク質活性、３０４タンパク質活性、１９８０タンパク質活性、１４７１７タンパク質活性、９９４１タンパク質活性、１９３１０タンパク質活性または１７８３２タンパク質活性の１つ以上の活性化を修飾する試薬との結合を含む。２５２タンパク質活性、３０４タンパク質活性、１９８０タンパク質活性、１４７１７タンパク質活性、９９４１タンパク質活性、１９３１０タンパク質活性または１７８３２タンパク質活性を修飾する試薬は、本明細書で記載されるように、（例えば、核酸またはタンパク質、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質の自発的標的分子（例えば、２５２リガンド、３０４リガンド、１９８０リガンド、１４７１７リガンド、９９４１リガンド、１９３１０リガンドまたは１７８３２リガンドもしくは２５２基質、３０４基質、１９８０基質、１４７１７基質、９９４１基質、１９３１０基質または１７８３２基質）、２５２抗体、３０４抗体、１９８０抗体、１４７１７抗体、９９４１抗体、１９３１０抗体または１７８３２抗体、２５２アゴニスト、３０４アゴニスト、１９８０アゴニスト、１４７１７アゴニスト、９９４１アゴニスト、１９３１０アゴニストまたは１７８３２アゴニスト、もしくは２５２アンタゴニスト、３０４アンタゴニスト、１９８０アンタゴニスト、１４７１７アンタゴニスト、９９４１アンタゴニスト、１９３１０アンタゴニストまたは１７８３２アンタゴニスト、２５２アゴニストのペプチド模放物、、３０４アゴニストのペプチド模放物、１９８０アゴニストのペプチド模放物、１４７１７アゴニストのペプチド模放物、９９４１アゴニストのペプチド模放物、１９３１０アゴニストのペプチド模放物または１７８３２アゴニストのペプチド模放物もしくは２５２アンタゴニストのペプチド模放物、３０４アンタゴニストのペプチド模放物、１９８０アンタゴニストのペプチド模放物、１４７１７アンタゴニストのペプチド模放物、９９４１アンタゴニストのペプチド模放物、１９３１０アンタゴニストのペプチド模放物または１７８３２アンタゴニストのペプチド模放物、あるいは他の小さな分子のような試薬であり得る。１つの実施形態において、試薬は、１つ以上の２５２活性、３０４活性、１９８０活性、１４７１７活性、９９４１活性、１９３１０活性または１７８３２活性を刺激する。そのような刺激試薬の実施例は、活性化２５２タンパク質、活性化３０４タンパク質、活性化１９８０タンパク質、活性化１４７１７タンパク質、活性化９９４１タンパク質、活性化１９３１０タンパク質または活性化１７８３２タンパク質および細胞に導入される２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２をコードする核酸分子を含む。別の実施形態において、試薬は１つ以上の２５２活性、３０４活性、１９８０活性、１４７１７活性、９９４１活性、１９３１０活性または１７８３２活性を抑制する。そのような抑制剤の実施例は、アンチセンス２５２核酸分子、アンチセンス３０４核酸分子、アンチセンス１９８０核酸分子、アンチセンス１４７１７核酸分子、アンチセンス９９４１核酸分子、アンチセンス１９３１０核酸分子またはアンチセンス１７８３２核酸分子、抗２５２抗体、抗３０４抗体、抗１９８０抗体、抗１４７１７抗体、抗９９４１抗体、抗１９３１０抗体または抗１７８３２抗体、および２５２インヒビター、３０４インヒビター、１９８０インヒビター、１４７１７インヒビター、９９４１インヒビター、１９３１０インヒビターまたは１７８３２インヒビターを含む。これらの修飾方法は、インビトロで（例えば、試薬と一緒の細胞培養によって）、あるいは、インビボで（例えば、試薬を被験体に投与することによって）行われ得る。このように、本発明は、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質、もしくは２５２核酸分子、３０４核酸分子、１９８０核酸分子、１４７１７核酸分子、９９４１核酸分子、１９３１０核酸分子または１７８３２核酸分子の異所性のまたは望まない発現または活性によって特徴付けられた疾患または異常に罹患した個体の処置方法を提供する。１つの実施形態において、方法は、試薬（例えば、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定された試薬）、または２５２発現、３０４発現、１９８０発現、１４７１７発現、９９４１発現、１９３１０発現または１７８３２発現もしくは２５２活性、３０４活性、１９８０活性、１４７１７活性、９９４１活性、１９３１０活性または１７８３２活性を修飾する（例えば、アップレギュレートするかまたはダウンレギュレートする）試薬の組合せの投与を包含する。別の実施形態において、方法は、減少した、異所性の、または望まない２５２発現、３０４発現、１９８０発現、１４７１７発現、９９４１発現、１９３１０発現または１７８３２発現または、２５２活性、３０４活性、１９８０活性、１４７１７活性、９９４１活性、１９３１０活性または１７８３２活性を補うための処置として、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質、もしくは２５２核酸分子、３０４核酸分子、１９８０核酸分子、１４７１７核酸分子、９９４１核酸分子、１９３１０核酸分子または１７８３２核酸分子の投与を包含する。
２５２活性、３０４活性、１９８０活性、１４７１７活性、９９４１活性、１９３１０活性または１７８３２活性の刺激は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２が、異常にダウンレギュレートするおよび／または増加２５２活性、増加３０４活性、増加１９８０活性、増加１４７１７活性、増加９９４１活性、増加１９３１０活性または増加１７８３２活性が、有用な効果を有する状況において所望である。同様に、２５２活性、３０４活性、１９８０活性、１４７１７活性、９９４１活性、１９３１０活性または１７８３２活性の抑制は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２が、異常にアップレギュレートされるおよび／または減少２５２活性、減少３０４活性、減少１９８０活性、減少１４７１７活性、減少９９４１活性、減少１９３１０活性または減少１７８３２活性が、有用な効果を有する状況において所望である。
（（ｉ）標的遺伝子の発現、合成、または活性を抑制する方法）
上記で述べたように、循環器疾患に関係する遺伝子は、遺伝子活性の増加レベルを介して、このような異常を引き起こし得る。いくつかのケースでは、そのようなアップレギュレーションは、疾患状態における原因効果または増悪効果を有し得る。種々の技術が、そのような遺伝子および／またはタンパク質の発現、合成、または活性を抑制するために使用され得る。
例えば、化合物（例えば、上記に記載したアッセイで同定された化合物）は、抑制活性を示し、血液疾患の少なくとも１つの徴候に対する発明に従って使用され得る。このような分子は、小さな有機分子、ペプチド、抗体などを含むが、それらに制限されない。
例えば、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質に対する内因性リガンドに結合した化合物が投与され得る。リガンドに結合した２５２タンパク質、リガンドに結合した３０４タンパク質、リガンドに結合した１９８０タンパク質、リガンドに結合した１４７１７タンパク質、リガンドに結合した９９４１タンパク質、リガンドに結合した１９３１０タンパク質またはリガンドに結合した１７８３２タンパク質の得られた量の減少は、内皮細胞の生理学を修飾する。この目的で特異的に使用され得る化合物は、例えば、可溶性タンパク質またはペプチド（例えば、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質の１つ以上の細胞外ドメイン、または細胞外部分および／またはそのアナログ（例えば、Ｉｇ標識融合タンパク質のような可溶性融合タンパク質）を含む。（Ｉｇ標識融合タンパク質の産生の説明については、例えば、米国特許第５，１１６，９６４号を参照のこと）。あるいは、２５２レセプター部位、３０４レセプター部位、１９８０レセプター部位、１４７１７レセプター部位、９９４１レセプター部位、１９３１０レセプター部位または１７８３２レセプター部位と結合するが、タンパク質を活性化しない（例えば、レセプター−リガンドアンタゴニスト）化合物は（例えば、リガンドアナログまたは抗体）、２５２タンパク質活性、３０４タンパク質活性、１９８０タンパク質活性、１４７１７タンパク質活性、９９４１タンパク質活性、１９３１０タンパク質活性または１７８３２タンパク質活性の抑制において効果的であり得る。
さらに、２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子の発現を抑制するアンチセンス分子およびリボザイム分子はまた、異所性の２５２遺伝子活性、３０４遺伝子活性、１９８０遺伝子活性、１４７１７遺伝子活性、９９４１遺伝子活性、１９３１０遺伝子活性または１７８３２遺伝子活性を抑制するための発明に従って使用され得る。さらに、三重らせん分子が、異所性の２５２遺伝子活性、３０４遺伝子活性、１９８０遺伝子活性、１４７１７遺伝子活性、９９４１遺伝子活性、１９３１０遺伝子活性または１７８３２遺伝子活性を抑制するために使用され得る。
本発明の方法で使用されるアンチセンス核酸分子は、被験体に代表的に投与されるかインサイチュで生成され、その結果、それらの分子は、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質をコードする細胞内ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか結合し、それによって（例えば、転写および／または翻訳を抑制することによって）、タンパク質の発現を抑制する。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成するための従来のヌクレオチド相補性によって、または、例えば、二重らせんの主要な溝における特異的な相互作用を介して、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合に行われ得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例は、組織部位における直接投与を包含する。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的にするために修飾され得、次に体系的に投与され得る。例えば、体系的投与では、アンチセンス分子が修飾され得、その結果、その分子は、例えば、アンチセンス核酸分子を、細胞表面レセプターまたは細胞表面抗原と結合するペプチドまたは抗体を結合することによって、選択された細胞表面に発現するレセプターまたは抗原と、特異的に結合する。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書中で記載されるベクターを用いて、細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を獲得するために、アンチセンス核酸分子が、強力なｐｏｌ ＩＩプロモーターまたは強力なｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれるベクター構築物が好ましい。
さらなる別の実施形態において、本発明の方法で使用されるアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二重鎖ハイブリッドを形成し、ここで、通常のβ−ユニットとは対照的に、二本鎖ハイブリッドは、互いに平行に並ぶ（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ． １５：６６２５〜６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含む（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５：６１３１〜６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７〜３３０）。
さらに別の実施形態において、本発明の方法で使用されるアンチセンス核酸は、リボザイムである。リボザイムは、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子であり、それらは相補的領域を有する。このように、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３４：５８５〜５９１））は、２５２ｍＲＮＡ転写産物、３０４ｍＲＮＡ転写産物、１９８０ｍＲＮＡ転写産物、１４７１７ｍＲＮＡ転写産物、９９４１ｍＲＮＡ転写産物、１９３１０ｍＲＮＡ転写産物または１７８３２ｍＲＮＡ転写産物を触媒的に切断するために使用され得、それによって、２５２ｍＲＮＡ、３０４ｍＲＮＡ、１９８０ｍＲＮＡ、１４７１７ｍＲＮＡ、９９４１ｍＲＮＡ、１９３１０ｍＲＮＡまたは１７８３２ｍＲＮＡの翻訳を抑制する。５７７をコードする核酸、２０７３９をコードする核酸、５７１１４５をコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書中で公開する２５２ｃＤＮＡ、３０４ＤＮＡ、１９８０ＤＮＡ、１４７１７ＤＮＡ、９９４１ＤＮＡ、１９３１０ＤＮＡまたは１７８３２ＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１または配列番号３）に基づいて設計され得る。例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ Ｌ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡ誘導体が構築され、ここで、活性部位のヌクレオチド配列は、５７７，２０７３９をコードするｍＲＮＡまたは５７１４５をコードするｍＲＮＡ（例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと）において切断されるヌクレオチド配列に相補的である。あるいは、２５２ｍＲＮＡ、３０４ｍＲＮＡ、１９８０ｍＲＮＡ、１４７１７ｍＲＮＡ、９９４１ｍＲＮＡ、１９３１０ｍＲＮＡまたは１７８３２ｍＲＮＡはまた、ＲＮＡ分子プールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択するために使用され得る（例えば、Ｂａｒｔｅｌ，ＤおよびＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと）。
２５２遺伝子発現、３０４遺伝子発現、１９８０遺伝子発現、１４７１７遺伝子発現、９９４１遺伝子発現、１９３１０遺伝子発現または１７８３２遺伝子発現はまた、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の制御領域と相補的なヌクレオチド配列（例えば、２５２、３０プロモーターおよび／またはエンハンサー４、１９８０プロモーターおよび／またはエンハンサー、１４７１７プロモーターおよび／またはエンハンサー、９９４１プロモーターおよび／またはエンハンサー、１９３１０プロモーターおよび／またはエンハンサーまたは１７８３２プロモーターおよび／またはエンハンサー）を標的することによって抑制され得、標的細胞中で２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子の転写を防ぐ三重らせん構造を形成する（例えば、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． ６（６）：５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃら（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７〜３６；およびＭａｈｅｒ，Ｌ．Ｊ．（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙ１４（１２）：８０７〜１５を参照のこと）。２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質に特異的であり、その活性を干渉する抗体はまた、２５２タンパク質機能、３０４タンパク質機能、１９８０タンパク質機能、１４７１７タンパク質機能、９９４１タンパク質機能、１９３１０タンパク質機能または１７８３２タンパク質機能を修飾するかまたは抑制するために使用され得る。そのような抗体は、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質自体に対して、またはそのタンパク質の部分に対応するペプチドに対して、本明細書中に記載される標準的技術を用いて生成され得る。そのような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、Ｆａｂフラグメント、単一鎖抗体、またはキメラ抗体を包含するが、それらに制限されない。
標的遺伝子タンパク質が細胞内であり、そして全抗体が使用される場合において、内在化抗体が好ましい。リポフェクチンリポソームが、抗体または標的エピトープを細胞に結合させるＦａｂ領域のフラグメントを送達するために使用され得る。抗体のフラグメントが使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインと結合する最小の抑制フラグメントが好ましい。例えば、標的遺伝子タンパク質抗体の可変領域のドメインに対応するアミノ酸配列を有するペプチドが使用され得る。そのようなペプチドは、化学合成され得るかまたは当業者に周知の方法を用いる組み換えＤＮＡ技術を介して産生され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８３）、前出；およびＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）前出に記載されている）。細胞内標的遺伝子エピトープと結合する単一鎖中和抗体がまた、投与され得る。そのような単一鎖抗体は、例えば、Ｍａｒａｓｃｏら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：７８８９〜７８９３）に記載されるような技術を用いて、標的細胞集団内の単一鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を発現することによって投与され得る。
いくつかの例では、標的遺伝子タンパク質は、細胞外であり、膜貫通タンパク質（例えば、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパ２ク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質）である。例えば、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパ２ク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質の１つ以上の細胞外ドメインに特異的であり、そしてその活性に干渉する抗体は、血液疾患または血液異常の治療に特に有益である。そのような抗体は、その抗体が血流ｋら標的ドメインに直接アクセスできるので、特に有用である。ペプチド投与に適切な下記に記載ある任意の投与技術は、抑制的標的遺伝子抗体を、それらの活性部位に効果的に投与するために使用され得る。
（（ｉｉ）標的遺伝子活性を再生または増大させる方法）
血液学的障害を生じる遺伝子は、疾患状況内で過小発現され得る。あるいは、このような遺伝子のタンパク質産物の活性は、低下され得、血液学的障害の発症を導く。このような遺伝子発現のダウンレギュレートまたはタンパク質活性の低下は、疾患状態に対する原因的影響または悪化させる影響を有し得る。
いくつかの場合、疾患状態においてアップレギュレートされる遺伝子は、予防効果を発揮し得る。種々の技術が、血液学的障害状態に対する予防効果を発揮する、遺伝子および／またはタンパク質の発現、合成、または活性を増大させるために用いられ得る。
この節に記載されるものは、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性のレベルを血液学的障害が改善されるレベルまで、増大させ得る方法である。２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性のレベルは、例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の遺伝子発現のレベルを増加させるか、または存在する活性な２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質のレベルを増加させることのいずれかによって、増加され得る。
例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質は、血液学的障害の少なくとも１つの症状に対して十分なレベルで、このような症状を示す患者に投与され得る。以下で議論される技術のいずれかが、このような投与のために用いられ得る。当業者は、以下に記載されるような技術を利用して、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質の有効な、非毒性用量の濃度を決定する方法を容易に知る。
さらに、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質をコードするＲＮＡ配列は、血液学的障害を示す患者に、血液学的障害が改善される２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質のレベルを生じるのに十分な濃度で、直接投与され得る。化合物の細胞内投与を達成する以下に記載される技術（例えば、リポソーム投与）のいずれかは、このようなＲＮＡ分子の投与のために用いられ得る。ＲＮＡ分子は、例えば、本明細書中に記載されるような組換え技術により作製され得る。
さらに、被験体は、遺伝子置換治療により処置され得る。２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の機能を有する、正常な２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質の産生を指向する、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の遺伝子、あるいはその部分の１以上のコピーは、ＤＮＡを細胞へと導入する他の粒子（例えば、リポソーム）に加えて、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターを含むが、これらに限定されない、ベクターを用いて細胞へと挿入され得る。さらに、上記のような技術は、ヒト細胞への、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の遺伝子配列の導入のために用いられ得る。
次いで、細胞、好ましくは、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２発現遺伝子配列を含む自系の細胞は、血液学的障害の改善を可能にする位置で被験体へと導入または再導入され得る。このような細胞置換技術は、例えば、遺伝子産物が、分泌された、細胞外遺伝子産物である場合、好ましくあり得る。
（Ｃ．薬学的組成物）
本発明の別の局面は、疾患に罹患した被験体を処置するための方法に関する。これらの方法は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の発現または活性を調節する因子（例えば、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイにより同定される因子）、またはこのような因子の組み合わせを、被験体に投与することを包含する。別の実施形態では、この方法は、低下した、異常な、または望ましくない、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の発現または活性を補償するための治療として、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質または核酸分子を、被験体に投与することを包含する。
２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性の刺激は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２が異常にダウンレギュレートされる、そして／あるいは上昇した２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性が、有益な効果を有すると考えられる状況において望ましい。同様に、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性の阻害は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２が、異常にアップレギュレートされる、そして／あるいは減少した２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性が、有益な効果を有すると考えられる状況において望ましい。
２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性を調節する因子は、このような投与に適切な薬学的組成物を用いて、被験体に投与され得る。このような組成物は、代表的には、因子（例えば、核酸分子、タンパク質、または抗体）および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、語「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的投与に適合性の、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌性および抗真菌性の薬剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。このような媒体および薬剤の、薬学的に活性な物質のための使用は、当該分野で周知である。この活性な化合物と非適合性である任意の従来の媒体または薬剤の範囲を除いて、組成物におけるそれらの使用が企図される。補助的な活性化合物もまた、この組成物に組み込まれ得る。
本発明の治療方法において使用される薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性となるように処方される。投与経路の例としては、非経口的（例えば、静脈内、皮内、皮下）、経口（例えば、吸入）、経皮（局所的）、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈剤（例えば、注射のための水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート試薬（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝液（例えば、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩）、および張性を調整するための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはブドウ糖）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）を用いて調整され得る。非経口的調製物は、ガラスまたはプラスチックから作製されるアンプル、使い捨てシリンジ、または複数用量のバイアルに封入され得る。
注入用途のために適切な薬学的組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散体、および滅菌注射可能な溶液または分散体の即席調製のための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与のために適切なキャリアとしては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、この組成物は、無菌でなければならず、そして容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性であるべきである。この組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保護されなければならない。このキャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散体の場合において要求される粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤（例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注入可能組成物の長期の吸収は、この組成物中に吸収を遅延する薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含むことによってもたらされ得る。
滅菌の注入可能な溶液は、上記に列挙された成分のうちの１つまたは組み合わせと共に、必要とされる量の２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性を調節する因子（例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２のタンパク質のフラグメントまたは抗２５２抗体、抗３０４抗体、抗１９８０抗体、抗１４７１７抗体、抗９９４１抗体、抗１９３１０抗体もしくは抗１７８３２抗体）を適切な溶媒に取り込み、続いて、必要に応じて滅菌濾過することによって調製され得る。一般に、分散体は、基礎分散媒体および上記に列挙される成分のうちの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルに、この活性化合物を取り込むことによって調製される。滅菌の注入可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉末および以前に滅菌濾過されたその溶液からの任意のさらなる所望の成分を得る、真空乾燥および凍結乾燥である。
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤に加圧され得る。経口治療投与の目的で、この活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれ、そして錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用される。経口組成物はまた、うがい薬としての使用のための流体キャリアを使用して調製され得、ここで、流体キャリア中の化合物は、経口的に適用され、そしてスウィッシュ（ｓｗｉｓｈ）され、そして吐き出されるかまたは飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料が、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などが、以下の成分のいずれかまたは同様の性質を有する化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、ガムトラガントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；グライダント（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは矯味矯臭剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー）。
吸入による投与について、この化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む圧縮容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エアロゾルスプレーの形態で送達される。
全身的投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または経皮投与について、浸透されるバリアに対して適切な浸透剤が、処方物中で使用される。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与については、この活性化合物は、当該分野で一般的に公知である軟膏剤、軟膏、ゲル、またはクリーム剤へ処方される。
２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性を調節する薬剤はまた、直腸送達のための坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤ベースと共に）または保持浣腸の形態で調製され得る。
１つの実施形態において、この２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性を調節する薬剤は、身体からの迅速な排出に対してこの化合物を保護するキャリアを用いて調製され（例えば、制御放出処方物）、これには、移植片およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当業者には明らかである。これらの材料はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能である。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて、感染させた細胞へ標的化されるリポソームを含む）がまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で、経口組成物または非経口組成物を処方することが、特に有益である。本明細書で使用される場合、投薬単位形態は、処置される被験体のための単位投薬量として適切な、物理的に個々の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと関連して、所望の治療的効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての詳細は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の活性を調節する薬剤の固有の特性、および達成される特定の治療効果、ならびに被験体の処置のためのこのような薬剤を調合する当該分野に固有の制限によって影響を受け、これらに直接依存する。
そのような薬剤の毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死性である用量）およびＥＤ５０（集団のうちの５０％において治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的薬学的手順によって決定され得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、そしてそれは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表され得る。大きな治療指数を示す薬剤が、好ましい。毒性副作用を示す薬剤が使用され得るが、非感染細胞に対して生じ得る損傷を最小にして副作用を低減するために、罹患した組織部位にそのような薬剤を標的化する送達システムを設計するために注意が払われるべきである。
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータは、ヒトにおける使用のために一定範囲の投与量を処方する際に使用され得る。そのような２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２調節剤の投薬量は、好ましくは、毒性をほとんど伴わないかまたは全く伴わない、ＥＤ５０を含む一定範囲の循環濃度内に入る。その投薬量は、使用される投薬形態および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変動し得る。本発明の治療方法において使用されるどの薬剤についても、治療上有効な用量は、細胞培養アッセイからまず推定され得る。細胞培養において決定されるようなＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害半分を達成する試験化合物濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するための用量が、動物モデルにおいて処方され得る。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために、使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
本明細書中で規定される場合、タンパク質またはポリペプチドの治療上有効な量（すなわち、有効投薬量）は、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、およびなおより好ましくは、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、２〜９ｍｇ／ｋｇ体重、３〜８ｍｇ／ｋｇ体重、４〜７ｍｇ／ｋｇ体重、または５〜６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。特定の要因が、被験体を有効に処置するために必要な投薬量に影響し得ることを当業者は認識し、そのような要因としては、疾患もしくは障害の重篤度、以前の処置、被験体の全身の健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、治療上有効な量のタンパク質、ポリペプチド、または抗体を用いる被験体の処置は、単回処置を包含し得るか、または好ましくは、一連の処置を包含し得る。
好ましい例において、被験体は、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の間の範囲にある抗体、タンパク質、またはポリペプチドを用いて、１週間に１回、約１〜１０週間の間、好ましくは２〜８週間の間、より好ましくは約３〜７週間の間、そしてなおより好ましくは約４週間、５週間、または６週間の間、処置される。処置に使用される抗体、タンパク質、またはポリペプチドの有効投薬量は、特定の処置経過にわたって増加または減少し得ることもまた、認識される。投薬量の変化は、本明細書中に記載される診断アッセイの結果から生じ得、そしてその結果から明らかになり得る。
本発明は、発現または活性を調節する薬剤を包含する。薬剤は、例えば、低分子であり得る。例えば、そのような低分子としては、ペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、約１０，０００グラム／モル未満の分子量を有する有機化合物もしくは無機化合物（すなわち、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物を含む）、約５，０００グラム／モル未満の分子量を有する有機化合物もしくは無機化合物、約１，０００グラム／モル未満の分子量を有する有機化合物もしくは無機化合物、約５００グラム／モル未満の分子量を有する有機化合物もしくは無機化合物、ならびにそのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に受容可能な形態が挙げられるが、これらに限定されない。低分子薬剤の適切な用量は、当業者である医師、獣医師、または研究者の知識内にある多数の要因に依存することが理解される。この低分子の用量は、例えば、処置される被験体またはサンプルの身元、サイズおよび状態に依存して変化し、さらに、該当する場合は、その組成物が投与される経路、ならびに本発明の核酸もしくはポリペプチドに対してその低分子が有することを実施者が望む効果に依存して変化する。
例示的な用量としては、被験体またはサンプルの重量１ｋｇあたり、ミリグラム量またはマイクログラム量の低分子（例えば、約１μｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約１μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇ）が挙げられる。低分子の適切な用量は、調節されるべき発現または活性に関するその低分子の能力に依存することが、さらに理解される。そのような適切な用量は、本明細書中に記載されるアッセイを使用して決定され得る。これらの低分子のうちの１つ以上が、本発明のポリペプチドまたは核酸の発現もしくは活性を調節するために動物（例えば、ヒト）に投与される場合、医師、獣医師、または研究者は、例えば、最初に比較的低用量を処方し、その後、適切な応答が得られるまでその用量を増加させ得る。さらに、特定の任意の動物被験体についての特定の用量レベルは、種々の要因（使用される特定の化合物の活性、被験体の年齢、被験体の体重、被験体の全身の健康、被験体の性別、および被験体の食餌、投与時期、投与経路、排出速度、任意の薬物組み合わせ、ならびに調節されるべき発現または活性の程度を含む）に依存することが、理解される。
さらに、抗体（またはそのフラグメント）は、治療部分（例えば、細胞毒）、治療剤、または放射性金属イオンに結合体化され得る。細胞毒または細胞傷害性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を包む。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロパロノール、およびピューロマイシン、ならびにそれらのアナログまたはホモログが挙げられる。治療剤としては、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（前名ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（前名アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂薬（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の結合体は、所定の生物学的応答を改変するために使用され得、その薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定するように解釈されるべきではない。例えば、その薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質としては、例えば、トキシン（例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリアトキシン）；タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲン活性化因子）；または生物学的応答改変因子（例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、あるいは他の増殖因子が挙げられ得る。
そのような治療部分を抗体に結合体化するための技術は、周知である。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄら編（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）、ｐｐ．２４３〜５６のＡｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８７）ｐｐ．６２３〜５３のＨｅｌｌｓｔｒｏｍら「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａら編，ｐｐ．４７５〜５０６（１９８５）のＴｈｏｒｐｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎら編（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）ｐｐ．３０３〜１６の「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」；ならびにＴｈｏｒｐｅら「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９〜５８（１９８２）を参照のこと。あるいは、抗体は、Ｓｅｇａｌによって米国特許第４，６７６，９８０号中に記載されるように、抗体へテロ結合体を形成するために二次抗体と結合され得る。
本発明の方法において使用される核酸分子は、ベクター中に挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４〜３０５７を参照のこと）によって、被験体に送達され得る。その遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが組み込まれた徐放マトリクスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクター（例えば、レトロウイルスベクター）が組換え細胞からインタクトで産生され得る場合、その薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含み得る。
（Ｄ．薬理ゲノム学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ））
本発明の治療法と組み合わせて、薬理ゲノム学（すなわち、被験体の遺伝子型と、外来化合物または外来薬物に対するその被験体の応答との間の関連性の研究）が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血液濃度との間の関係を変更することによって、重篤な毒性または治療の失敗をもたらし得る。従って、医師または臨床医は、２５２活性、３０４活性、１９８０活性、１４７１７活性、９９４１活性、１９３１０活性または１７８３２活性を調節する薬剤を投与するか否か、ならびに２５２活性、３０４活性、１９８０活性、１４７１７活性、９９４１活性、１９３１０活性または１７８３２活性を調節する薬剤を用いる処置の投薬量および／もしくは治療レジメンを調整するか否かを決定する際に、適切な薬理ゲノム学研究において得られる知識を適用することを考慮し得る。
薬理ゲノム学は、罹患した個人における変化した薬物の性質および異常な作用に起因する、薬物に対する応答における臨床学的に有意な遺伝的変動を取り扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ，Ｍ．ら、（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３（１０〜１１）：９８３〜９８５およびＬｉｎｄｅｒ，Ｍ．Ｗ．ら、（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３（２）：２５４〜２６６を参照のこと。一般に、２つの型の薬理ゲノム学的条件は、区別され得る。遺伝的条件は、薬物が身体に作用する様式を変更する（変化した薬物作用）単一因子として伝達したか、または遺伝的条件は、身体が薬物に作用する様式を変更する（変化した薬物代謝）単一因子として伝達した。これらの薬理ゲノム学的条件は、稀な遺伝子欠損または天然に存在する多型のいずれかとして、存在し得る。例えば、グルコース−６−リン酸アミノペプチダーゼ欠損（Ｇ６ＰＤ）は、一般的な遺伝性酵素病であり、ここで、主な臨床学的合併症は、酸化剤薬物（抗マラリア薬、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの消費後の溶血である。
「ゲノムワイド相関解析（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」として知られている、薬物応答を予測する遺伝子を同定するための１つの薬理ゲノム学的アプローチは、すでに知られている遺伝子関連マーカー（例えば、「二座対立遺伝子」マーカーマップ（これは、ヒトゲノム上の６０，０００〜１００，０００の多型部位または変動部位からなり、その部位の各々は、２つの改変体を有する））からなるヒトゲノムの高分解能マップに、主に依存する。このような高分解能ゲノムマップは、特定の観察された薬物応答または副作用に関連したマーカーを同定するために、フェーズＩＩ／フェーズＩＩＩの薬物試験に参加した統計学的に有意な数の患者の各々のゲノムのマップと比較され得る。あるいは、このような高分解能マップは、ヒトゲノムにおいて、数千万個の公知の一塩基多型（ＳＮＰ）の組み合わせから生じ得る。本明細書中で使用される場合、「ＳＮＰ」とは、ＤＮＡストレッチにおいて、単一のヌクレオチド塩基において生じる共通の変化である。例えば、ＳＮＰは、１０００塩基のＤＮＡごとに１回生じ得る。ＳＮＰは、疾患プロセスに関与し得るが、大部分は、疾患に関連していないかもしれない。このようなＳＮＰの発生に基づく遺伝マップを考慮すると、個体は、個々のゲノムにおける特定のＳＮＰパターンに依存して、複数の遺伝カテゴリーへと分類され得る。このような様式において、処置レジメンは、遺伝的に類似する個体の間で共通であり得る特性を考慮して、そのような遺伝的に類似する個体の群に合わせて変更され得る。
あるいは、「候補遺伝子アプローチ」と呼ばれる方法が、薬物応答を予測する遺伝子を同定するために用いられ得る。この方法に従って、薬物標的をコードする遺伝子が既知である場合（例えば、本発明の方法において使用される２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２タンパク質）、その遺伝子の共通のすべての改変体は、その集団においてかなり容易に同定され得、そして別の遺伝子バージョンに対する１つの遺伝子バージョンを有することが特定の薬物応答に関連するか否かが決定され得る。
例示的実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続時間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロムＰ４５０酵素であるＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝子多型の発見は、標準的かつ安全な用量の薬物を摂取した後に、患者が予測される薬物効果を得ることも過大な薬物応答および重篤な毒性を示すこともない理由に関する説明を提供した。これらの多型は、その集団中で２つの表現型（代謝が速い者（ＥＭ）および代謝が遅い者（ＰＭ））の状態で発現される。ＰＭの普及率は、種々の集団間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は、非常に多型性であり、いくつかの変異が、ＰＭにおいて同定されており、そのすべてが、機能的ＣＹＰ２Ｄ６の不在をもたらす。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の代謝速度が遅い者は、標準的用量を受けたときに、過大な薬物応答および副作用を非常に頻繁に経験する。代謝物が活性な治療部分である場合、ＰＭは、ＣＹＰ２Ｄ６が形成した代謝物であるモルヒネにより媒介されるコデインの鎮痛効果について示されるような、治療応答を示さない。その他の極端な者は、標準的用量に対して応答しない、いわゆる代謝が著しく速い者である。最近、著しく速い代謝の分子的基礎が、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因することが同定された。
あるいは、「遺伝子発現プロファイリング」と呼ばれる方法が、薬物応答を予測する遺伝子を同定するために用いられ得る。例えば、薬物（例えば、本発明の方法において使用される２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０もしくは１７８３２分子または２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２モジュレーター）を投薬された動物の遺伝子発現は、毒性に関連する遺伝子経路が作動するかの指標を与え得る。
上記薬理ゲノム学的アプローチのうちの１つより多くから得られる情報が、被験体の予防的処置または治療的処置のための、適切な投薬量および処置レジメンを決定するために使用され得る。この知識は、投薬または薬物選択に適用される場合、有害な反応または治療の失敗を回避し得、それによって、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２活性を調節する薬剤で、心血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症）に罹患している被験体を処置する場合、治療効果または予防効果を増強し得る。
（Ｖ．本発明の方法において使用される、組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の方法（例えば、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイ）は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２タンパク質（またはその一部）をコードする核酸を含むベクター（好ましくは発現ベクター）の使用を包含する。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」とは、これが連結された別の核酸を輸送可能である、核酸分子を指す。１つの型のベクターは、「プラスミド」であり、「プラスミド」とは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る、環状の二本鎖ＤＮＡの輪を指す。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、そのベクターにおいて、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクターは、これらが導入される宿主細胞中で自律複製可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中に導入された際に、宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって、その宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、これらが作動可能に連結された遺伝子の発現を指向可能である。そのようなベクターは、本明細書中で「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」と「ベクター」とは、互換可能に使用され得る。なぜなら、プラスミドは、ベクターの最も一般的に使用される形態であるからである。しかし、本発明は、等価な機能を提供する、そのような他の形態の発現ベクター（例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス））を包含することが意図される。
本発明の方法において使用される組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に適切な形態にある本発明の核酸を含む。このことは、その組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節配列（発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択される）を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロでの転写／翻訳系において、またはそのベクターが宿主細胞中に導入される場合は、その宿主細胞において）そのヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節配列に連結されていることを意味することが意図される。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：３〜７に記載される。調節配列とは、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列、および特定の宿主細胞においてのみそのヌクレオチド配列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的調節配列）を包含する。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質発現レベルなどのような因子に依存し得ることが、当業者により認識される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞内に導入され得、それにより本明細書中に記載されるような核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質または融合ペプチドを含む）（例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２タンパク質、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２タンパク質の変異体形態、融合タンパク質など）を産生し得る。
本発明の方法において使用される組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２タンパク質の発現のために設計され得る。例えば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞、または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）前出においてさらに記載される。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写および翻訳され得る。
原核生物におけるタンパク質の発現は、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて最も頻繁に行われる。融合ベクターは、ベクター中にコードされるタンパク質に、通常は、組換えタンパク質のアミノ末端に、多くのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には、３つの目的を果たす：１）組換えタンパク質の発現を増大させること；２）組換えタンパク質の可溶性を増大させること；および３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより、組換えタンパク質の精製を補助すること。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解性切断部位は、融合部分と組換えタンパク質の接合部に導入され、融合タンパク質の精製に続いて、組換えタンパク質を融合部分から分離することが可能になる。このような酵素、およびそれらのコグネイト認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを、標的組換えタンパク質に融合させる、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。
精製融合タンパク質は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２活性アッセイ（例えば、以下に詳細に記載される直接的アッセイまたは競合アッセイ）において、または２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２タンパク質に特異的な抗体を生成するために利用され得る。好ましい実施形態において、本発明のレトロウイルス発現ベクターにおいて発現される２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２融合タンパク質は、骨髄細胞に感染させるために利用され得る。続いて、この骨髄細胞は、照射されたレシピエントに移植される。次いで、被験体レシピエントの病態は、十分な時間（例えば、６週間）が経過した後に試験される。
別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞において使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルス調節エレメントにより提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞両方について適切な他の発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型においてこの核酸の発現を優先的に指向し得る（例えば、組織特異的調節エレメントがこの核酸を発現させるために使用される）。
本発明の方法は、本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクター（このＤＮＡ分子は、この発現ベクターにアンチセンス方向にてクローニングされる）をさらに使用し得る。すなわち、このＤＮＡ分子は、（このＤＮＡ分子の転写による）２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現を可能にする様式にて、調節配列に作動可能に連結される。種々の細胞型（例えば、ウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサー）におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指向する、アンチセンス方向にクローニングされる核酸に作動可能に連結される調節配列が選択され得るか、またはアンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現、または細胞型特異的発現を指向する調節配列が、選択され得る。このアンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化ウイルスの形態にあり得、この中でアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で生成され、その活性は、ベクターが導入される細胞型により決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の議論については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）１９８６を参照のこと。
本発明の別の局面は、本発明の２５２核酸分子、３０４核酸分子、１９８０核酸分子、１４７１７核酸分子、９９４１核酸分子、１９３１０核酸分子または１７８３２核酸分子（例えば、組換え発現ベクター内の２５２核酸分子、３０４核酸分子、１９８０核酸分子、１４７１７核酸分子、９９４１核酸分子、１９３１０核酸分子または１７８３２核酸分子、あるいは宿主細胞ゲノムの特定の部位への相同組換えを可能にする配列を含む、２５２核酸分子、３０４核酸分子、１９８０核酸分子、１４７１７核酸分子、９９４１核酸分子、１９３１０核酸分子または１７８３２核酸分子）が導入される宿主細胞の使用に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で交換可能に使用される。このような用語は、特定の被験体細胞のみならず、このような細胞の子孫または潜在的子孫もまた言及することが理解される。特定の改変が、変異または環境的影響のいずれかに起因して、次の世代に生じ得るので、このような子孫は、実際に、親細胞と同一でなくてもよいが、本明細書中で使用される用語の範囲内になお含まれる。
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術を介して、原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞中に導入するための当該分野で認識される種々の技術をいうことを意図し、これらとしては、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムの共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが挙げられる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）および他の実験室マニュアルに見出され得る。
本発明の方法において使用される宿主細胞（例えば、培養物中の原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞）を使用して、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質を生成（すなわち、発現）し得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質を生成するための方法を提供する。１つの実施形態において、本方法は、本発明の宿主細胞（この細胞中に２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を適切な培地中で培養する工程、その結果２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質を生成する工程を、包含する。別の実施形態において、本方法はさらに、培地または宿主細胞から２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質を単離する工程を包含する。
（ＶＩ．本発明の方法において使用される、単離された核酸分子）
本発明の方法は、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質もしくは１７８３２タンパク質、またはその生物学的に活性な部分をコードする、単離された核酸分子、ならびに、２５２をコードする核酸分子、３０４をコードする核酸分子、１９８０をコードする核酸分子、１４７１７をコードする核酸分子、９９４１をコードする核酸分子、１９３１０をコードする核酸分子もしくは１７８３２をコードする核酸分子（例えば、２５２ ｍＲＮＡ、３０４ ｍＲＮＡ、１９８０ ｍＲＮＡ、１４７１７ ｍＲＮＡ、９９４１ ｍＲＮＡ、１９３１０ ｍＲＮＡまたは１７８３２ ｍＲＮＡ）を同定するための、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用に足りる核酸フラグメント、および２５２核酸分子、３０４核酸分子、１９８０核酸分子、１４７１７核酸分子、９９４１核酸分子、１９３１０核酸分子または１７８３２核酸分子を増幅または変異誘発するためのＰＣＲプライマーとしての使用のためのフラグメントの使用を、包含する。本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ならびにヌクレオチドアナログを使用して作製されたＤＮＡアナログまたはＲＮＡアナログを含むことを意図される。この核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
本発明の方法において使用される核酸分子（例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、もしくは配列番号１９、またはその部分のヌクレオチド配列を有する核酸分子）を、標準的な分子生物学的技術および本明細書中に提供される配列情報を使用して単離し得る。ハイブリダイゼーションプローブとして、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、もしくは配列番号１９の核酸配列の全部または一部を使用して、２５２核酸分子、３０４核酸分子、１９８０核酸分子、１４７１７核酸分子、９９４１核酸分子、１９３１０核酸分子または１７８３２核酸分子を、（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されるような）標準的なハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術を使用して単離し得る。
さらに、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、もしくは配列番号１９の全部または一部を含有する核酸分子を、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、または配列番号１９の配列に基づいて設計した合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、単離し得る。
本発明の方法において使用される核酸を、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、テンプレートとしてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡ、および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、増幅し得る。さらに、２５２ヌクレオチド配列、３０４ヌクレオチド配列、１９８０ヌクレオチド配列、１４７１７ヌクレオチド配列、９９４１ヌクレオチド配列、１９３１０ヌクレオチド配列または１７８３２ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、標準的な合成技術（例えば、自動ＤＮＡ合成機を使用すること）によって、調製し得る。
好ましい実施形態において、本発明の方法において使用される単離された核酸分子は、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、もしくは配列番号１９に示されるヌクレオチド配列、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、もしくは配列番号１９に示されるヌクレオチド配列の相補体、またはこれらのヌクレオチド配列の任意の部分を含む。配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６または配列番号１９に示されるヌクレオチド配列に相補的である核酸分子とは、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６または配列番号１９に示されるヌクレオチド配列に十分に相補的である核酸分子であり、その結果、この核酸分子は配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６または配列番号１９に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得、それによって安定な二重鎖を形成する。
なお別の好ましい実施形態において、本発明の方法において使用される単離された核酸分子は、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、もしくは配列番号１９に示されるヌクレオチド配列の全長、またはこのヌクレオチド配列の任意の部分に、少なくとも約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上同一であるヌクレオチド配列を含有する。
さらに、本発明の方法において使用される核酸分子は、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６または配列番号１９の核酸配列の部分（例えば、プローブもしくはプライマーとして使用され得るフラグメント）、または２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質の部分（例えば、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質の生物学的に活性な部分）をコードするフラグメント）のみを含み得る。代表的に、プローブ／プライマーは、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。代表的に、オリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６または配列番号１９のセンス配列、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６または配列番号１９のアンチセンス配列、あるいは配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６または配列番号１９の天然に存在する対立遺伝子の改変体または変異体の少なくとも約１２または１５、好ましくは約２０または２５、より好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５または７５個連続したヌクレオチドにストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。１つの実施形態において、本発明の方法において使用される核酸分子は、１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、８００〜９００、９００〜１０００、１０００〜１１００、１１００〜１２００、１２００〜１３００以上のヌクレオチド長よりも長く、かつストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６または配列番号１９の核酸分子にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、お互いに有意に同一または相同であるヌクレオチ配列が、お互いにハイブリダイズされたままである状態でハイブリダイゼーションおよび洗浄するための条件を記載することを意図する。好ましくは、この条件は、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、なおより好ましくは少なくとも約８５％または９０％で、互いに同一な配列が、互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。このようなストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、そしてＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９５），２節，４節および６節に見出され得る。さらなストリンジェントな条件は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９），７節、９節および１１節に見出され得る。好ましい、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例としては、約６５〜７０℃での、４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でハイブリダイゼーション（または約４２〜５０℃での、４×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中でハイブリダイゼーション）、次いで約６５〜７０℃での、１×ＳＳＣで１回以上の洗浄が挙げられる。好ましい、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例としては、約６５〜７０℃での、１×ＳＳＣ中でハイブリダイゼーション（または約４２〜５０℃での、１×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中でハイブリダイゼーション）、次いで約６５〜７０℃での、０．３×ＳＳＣで１回以上の洗浄が挙げられる。好ましい、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の非限定的な例としては、約５０〜６０℃での、４×ＳＳＣ中でハイブリダイゼーション（または約４０〜４５℃での、６×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中でハイブリダイゼーション）、次いで約５０〜６０℃での、２×ＳＳＣで１回以上の洗浄が挙げられる。上記の値の中間の範囲（例えば、６５〜７０℃または４２〜５０℃）もまた、本発明に含まれることが意図される。ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４である）は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液中でＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）に置き換わり得る；洗浄は、各ハイブリダイゼーションが終了した後で、１５分間実行される。５０塩基対長未満であることが予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５〜１０℃低くあるべきであり、ここでＴｍが以下の式に従って決定される。１８塩基対長未満であるハイブリッドについて、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ塩基＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ塩基＋Ｃ塩基の数）。１８塩基対長と４９塩基対長の間のであるハイブリッドについて、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基の数であり、そして［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣに対する［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。膜（例えば、ニトロセルロース膜、またはナイロン膜）への核酸分子の非特異的ハイブリダイゼーションを減少させるために、さらなる試薬が、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄緩衝液に添加され得ることが当業者によってまた認識され、この試薬としては、限定されないが以下が挙げられる：ブロッキング剤（例えば、ＢＳＡ、もしくはサケまたはニシンの精子キャリアＤＮＡ）、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、Ｆｉｃｏｌｌ、ＰＶＰなど。ナイロン膜が使用される場合、特にさらなる好ましい、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例としては、約６５℃での、０．２５〜０．５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、７％ ＳＤＳ中でハイブリダイゼーション、次いで６５℃での、０．０２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、１％ ＳＤＳで１回以上の洗浄である（例えば、ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１９９１−１９９５，（または代替的に０．２×ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ）。
好ましい実施形態において、プローブは、プローブに結合した標識基をさらに含む（例えば、標識基は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であり得る）。このようなプローブは、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質を誤発現する（ｍｉｓｅｘｐｒｅｓｓ）細胞または組織を同定するための診断的試験キットの一部として使用され得る（例えば、被験体由来の細胞サンプル中の２５２コード核酸、３０４コード核酸、１９８０コード核酸、１４７１７コード核酸、９９４１コード核酸、１９３１０コード核酸または１７８３２コード核酸のレベルを測定すること、例えば、２５２ ｍＲＮＡレベル、３０４ ｍＲＮＡレベル、１９８０ ｍＲＮＡレベル、１４７１７ ｍＲＮＡレベル、９９４１ ｍＲＮＡレベル、１９３１０ ｍＲＮＡレベルまたは１７８３２ ｍＲＮＡレベルを検出するか、またはゲノムの２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子が変異されているか除去されているかを測定することによって）。
本発明の方法は、遺伝暗号の縮重に起因して、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、または配列番号１９に示されるヌクレオチド配列とは異なり、従って、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、または配列番号１９に示されるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と同じ２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質をコードする核酸分子の使用をさらに含む。別の実施形態において、本発明の方法に含まれる単離された核酸分子は、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、または配列番号２１に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
本発明の方法は、ヒト２５２、ヒト３０４、ヒト１９８０、ヒト１４７１７、ヒト９９４１、ヒト１９３１０、またはヒト１７８３２の対立遺伝子改変体（例えば、機能的対立遺伝子改変体および非機能的対立遺伝子改変体）の使用をさらに含む。機能的対立遺伝子改変体は、ヒト２５２タンパク質、ヒト３０４タンパク質、ヒト１９８０タンパク質、ヒト１４７１７タンパク質、ヒト９９４１タンパク質、ヒト１９３１０タンパク質、またはヒト１７８３２タンパク質の天然に存在するアミノ酸配列改変体であって、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２の活性を維持するアミノ酸配列改変体である。機能的対立遺伝子改変体は、代表的に、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、または配列番号２１の１つ以上のアミノ酸の保存的置換、またはそのタンパク質の非必須領域における非必須残基の置換、欠失、もしくは挿入のみを含む。
非機能的対立遺伝子改変体は、ヒト２５２タンパク質、ヒト３０４タンパク質、ヒト１９８０タンパク質、ヒト１４７１７タンパク質、ヒト９９４１タンパク質、ヒト１９３１０タンパク質、またはヒト１７８３２タンパク質の天然に存在するアミノ酸配列改変体であって、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２の活性を有さないアミノ酸配列改変体である。非機能的対立遺伝子改変体は、代表的には、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、または配列番号２１のアミノ酸配列の非保存的な置換、欠失、もしくは挿入または未成熟短縮化（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、あるいはこのタンパク質の必須残基または必須領域の置換、挿入、または欠失を含む。
本発明の方法は、ヒト２５２タンパク質、ヒト３０４タンパク質、ヒト１９８０タンパク質、ヒト１４７１７タンパク質、ヒト９９４１タンパク質、ヒト１９３１０タンパク質、またはヒト１７８３２タンパク質の非ヒトオルソログをさらに使用し得る。ヒト２５２タンパク質、ヒト３０４タンパク質、ヒト１９８０タンパク質、ヒト１４７１７タンパク質、ヒト９９４１タンパク質、ヒト１９３１０タンパク質、またはヒト１７８３２タンパク質のオルソログは、非ヒト生物から単離され、そして同じ２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２の活性を有するタンパク質である。
本発明の方法は、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、もしくは配列番号１９のヌクレオチド配列またはそれらの一部を含む核酸分子であって、変異が導入されている核酸分子の使用をさらに包含する。変異は、「非必須」アミノ酸残基または「必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換を導き得る。「非必須」アミノ酸残基とは、その生物学的活性を変化することなく２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２の野生型配列（例えば、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、または配列番号２１の配列）から変化され得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性のために必要とされる。例えば、本発明の２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質の間で保存されたアミノ酸残基は、変化を受容する可能性は低い。
変異は、標準技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）により配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、または配列番号１９に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１つ以上の予想される非必須アミノ酸残基でなされる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当該分野において規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無荷電の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。従って、好ましくは、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質において予想される非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖のファミリーからの別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態において、変異は、例えば、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２のコード配列の全てまたは一部に沿って、ランダムに導入され得、そして得られた変異体は、活性を保持する変異体を同定するために、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２の生物学的活性についてスクリーニングされ得る。配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、または配列番号１９の変異誘発の後、コードされたタンパク質が、組換え発現され得、そしてそのタンパク質の活性が、本明細書中に記載されたアッセイを用いて決定され得る。
本発明の別の局面は、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、または配列番号１９のヌクレオチド配列に対するアンチセンスである単離された核酸分子の使用に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるかまたはｍＲＮＡ配列に相補的である）ヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合し得る。アンチセンス核酸は、全長２５２コード鎖、全長３０４コード鎖、全長１９８０コード鎖、全長１４７１７コード鎖、全長９９４１コード鎖、全長１９３１０コード鎖、または全長１７８３２コード鎖または、それらの一部のみに相補的であり得る。１実施形態において、アンチセンス核酸分子は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対するアンチセンスである。用語「コード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域をいう。別の実施形態において、このアンチセンス核酸分子は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対するアンチセンスである。用語「非コード領域」とは、コード領域に隣接する５’配列および３’配列であって、アミノ酸に翻訳されない配列をいう（５’および３’の非翻訳領域ともいう）。
本明細書中に開示される２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２をコードするコード鎖配列を考慮して、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋの塩基対形成の法則に従って、設計され得る。アンチセンス核酸分子は、２５２ｍＲＮＡ、３０４ｍＲＮＡ、１９８０ｍＲＮＡ、１４７１７ｍＲＮＡ、９９４１ｍＲＮＡ、１９３１０ｍＲＮＡ、または１７８３２ｍＲＮＡの全コード領域に相補的であり得るが、より好ましくは、２５２ｍＲＮＡ、３０４ｍＲＮＡ、１９８０ｍＲＮＡ、１４７１７ｍＲＮＡ、９９４１ｍＲＮＡ、１９３１０ｍＲＮＡ、または１７８３２ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２５２ｍＲＮＡ、３０４ｍＲＮＡ、１９８０ｍＲＮＡ、１４７１７ｍＲＮＡ、９９４１ｍＲＮＡ、１９３１０ｍＲＮＡ、または１７８３２ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周辺領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を使用して、化学的合成および酵素的連結反応を使用して構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、あるいは分子の生物学的安定性を増大するように、またはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二重鎖の物理的安定性を増大するように設計された、種々に改変されたヌクレオチドを使用して、化学的に合成され得る。例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る。アンチセンス核酸を生成するために使用され得る改変ヌクレオチドの例としては、以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）および２，６−ジアミノプリン。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを使用して、生物学的に生成され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡは、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向のＲＮＡである）。本発明の方法において使用されるアンチセンス核酸分子は、さらに、上記の第ＩＶ節において記載される。
なお別の実施形態において、本発明の方法において使用される２５２核酸分子、３０４核酸分子、１９８０核酸分子、１４７１７核酸分子、９９４１核酸分子、１９３１０核酸分子、または１７８３２核酸分子は、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格において改変されて、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは可溶性を改善し得る。例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸骨格は、ペプチド核酸を生成するために改変され得る（Ｈｙｒｕｐ Ｂ．ら、（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４（１）：５−２３を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」すなわち「ＰＮＡ」は、核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいい、ここで、デオキシリボースリン酸骨格は、偽ペプチド骨格によって置換され、そして４種の天然の核酸塩基だけが維持される。ＰＮＡの中性の骨格は、低イオン強度の条件下で、ＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、標準的な固相ペプチド合成プロトコルを使用して、Ｈｙｒｕｐ Ｂ．ら、（１９９６）前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１４６７０−６７５に記載されるように実施され得る。
２５２核酸分子、３０４核酸分子、１９８０核酸分子、１４７１７核酸分子、９９４１核酸分子、１９３１０核酸分子、または１７８３２核酸分子のＰＮＡは、本明細書中に記載される治療適用および診断適用において使用され得る。例えば、ＰＮＡは、例えば、転写もしくは翻訳の停止を誘導するか、または複製を阻害することによって、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンス因子またはアンチ遺伝子（ａｎｔｉｇｅｎｅ）因子として使用され得る。２５２核酸分子、３０４核酸分子、１９８０核酸分子、１４７１７核酸分子、９９４１核酸分子、１９３１０核酸分子、または１７８３２核酸分子のＰＮＡはまた、遺伝子中の単一塩基対の変異の分析において（例えば、ＰＮＡ指向性のＰＣＲクランピングによって）；他の酵素と組み合わせて使用する場合には、「人工制限酵素」として（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ（Ｈｙｒｕｐ Ｂ．ら、（１９９６）前出））；またはＤＮＡ配列決定もしくはハイブリダイゼーションのためのプローブもしくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐ Ｂ．ら、（１９９６）前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、（１９９６）前出）、使用され得る。
別の実施形態において、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２のＰＮＡは、（例えば、ＰＮＡの安定性または細胞取り込みを増強するために）、ＰＮＡに親油性もしくは他のヘルパー基を結合させることによってか、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によってか、またはリポソームもしくは当該分野で公知の他の薬物送達技術の使用によって、改変され得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組み合わせ得る２５２核酸分子、３０４核酸分子、１９８０核酸分子、１４７１７核酸分子、９９４１核酸分子、１９３１０核酸分子、または１７８３２核酸分子のＰＮＡ−ＤＮＡキメラが、生成され得る。このようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮＡｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）に、ＤＮＡ部分と相互作用させ、一方、ＰＮＡ部分は、高い結合親和性および結合特異性を提供する。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、核酸塩基間の結合の数および方向に関して選択される、適切な長さのリンカーを使用して、連結され得る（Ｈｙｒｕｐ Ｂ．ら、（１９９６）前出）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ Ｂ．ら、（１９９６）前出およびＦｉｎｎ Ｐ．Ｊ．ら、（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（１７）：３３５７−６３に記載されるように実施され得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホロアミダイトカップリング化学および改変ヌクレオシドアナログを使用して、固体支持体上で合成され得る。例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホラミダイトが、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間として使用され得る（Ｍａｇ、Ｍ．ら、（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７：５９７３−８８）。次いで、ＰＮＡモノマーは、段階的な様式でカップリングされて、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（Ｆｉｎｎ Ｐ．Ｊ．ら、（１９９６）前出）。あるいは、キメラ分子は、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いて合成され得る（Ｐｅｔｅｒｓｅｒ、Ｋ．Ｈ．ら、（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９−１１１２４）。
他の実施形態において、本発明の方法において使用されるオリゴヌクレオチドは、他の付随的な基（例えば、（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するための）ペプチド、または細胞膜を通る輸送を促進するための因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）もしくは血液脳関門を通る輸送を促進するための因子（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）を含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発性切断因子（例えば、Ｋｒｏｌら、（１９８８）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６を参照のこと）またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏｎ（１９８８）Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照のこと）を用いて改変され得る。この目的で、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチドハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送因子またはハイブリダイゼーション誘発性切断因子）に結合体化され得る。
（ＶＩＩ．本発明の方法において使用される、単離された２５２タンパク質、単離された３０４タンパク質、単離された１９８０タンパク質、単離された１４７１７タンパク質、単離された９９４１タンパク質、単離された１９３１０タンパク質、または単離された１７８３２タンパク質、および抗２５２抗体、抗３０４抗体、抗１９８０抗体、抗１４７１７抗体、抗９９４１抗体、抗１９３１０抗体、または抗１７８３２抗体）
本発明の方法は、単離された２５２タンパク質、単離された３０４タンパク質、単離された１９８０タンパク質、単離された１４７１７タンパク質、単離された９９４１タンパク質、単離された１９３１０タンパク質、または単離された１７８３２タンパク質およびこれらの生物学的に活性な部分、ならびに抗２５２抗体、抗３０４抗体、抗１９８０抗体、抗１４７１７抗体、抗９９４１抗体、抗１９３１０抗体、または抗１７８３２抗体を惹起するための免疫原として使用されるのに適切なポリペプチドフラグメントの使用を包含する。１つの実施形態において、ネイティブの２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を使用する、適切な精製スキームによって、細胞供給源または組織供給源から単離され得る。別の実施形態において、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって生成される。組換え発現と代替的に、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質、あるいは２５２ポリペプチド、３０４ポリペプチド、１９８０ポリペプチド、１４７１７ポリペプチド、９９４１ポリペプチド、１９３１０ポリペプチド、または１７８３２ポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を使用して、化学的に合成され得る。
本明細書中で使用する場合、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質の「生物学的に活性な部分」は、２５２活性、３０４活性、１９８０活性、１４７１７活性、９９４１活性、１９３１０活性、または１７８３２活性を有する、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質のフラグメントを含む。２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質の生物学的に活性な部分は、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質のアミノ酸配列に十分に同一であるかまたはこれらに由来する、アミノ酸配列（例えば、全長の２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質より少ないアミノ酸を含み、かつ２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質の少なくとも１つの活性を示す、配列番号３、６、９に示されるアミノ酸配列）を含むペプチドを含む。代表的には、生物学的に活性な部分は、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフ（例えば、アポトーシス活性の調節に関与すると考えられている、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質のＮ末端領域）を含む。２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００アミノ酸長以上である、ポリペプチドであり得る。２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質の生物学的に活性な部分は、２５２活性、３０４活性、１９８０活性、１４７１７活性、９９４１活性、１９３１０活性、または１７８３２活性を調節する薬剤を開発するための標的として使用され得る。
好ましい実施形態において、本発明の方法において使用される２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質は、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、または２１に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質は、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、または２１に対して実質的に同一であり、そして配列番号３、６、９、１２、１５、１８、または２１のタンパク質の機能的活性を保持するが、上記第Ｖ節において詳細に記載されるように、天然の対立遺伝子変化または変異誘発に起因して、アミノ酸配列が異なる。従って、別の実施形態において、本発明の方法において使用される２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質は、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、または２１に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一なアミノ酸配列を含むタンパク質である。
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、これらの配列は、最適比較目的で整列される（例えば、ギャップが、最適な整列のために、第１および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方に導入され得、そして非同一配列は、比較目的で無視され得る）。好ましい実施形態において、比較目的で整列される参照配列の長さは、参照配列の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも６０％、およびさらにより好ましくは、少なくとも７０％、８０％または９０％の長さである（例えば、５００アミノ酸残基を有する、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、または２１の２５２アミノ酸配列、３０４アミノ酸配列、１９８０アミノ酸配列、１４７１７アミノ酸配列、９９４１アミノ酸配列、１９３１０アミノ酸配列、または１７８３２アミノ酸配列に、第二の配列を整列させる場合、少なくとも７５、好ましくは少なくとも１５０、より好ましくは少なくとも２２５、なおより好ましくは少なくとも３００およびなおより好ましくは少なくとも４００またはそれ以上のアミノ酸残基が整列される）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが、比較される。第１の配列における位置が、第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められる場合、これらの分子は、その位置で同一である（本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と等しい）。２つの配列間の同一性パーセントは、それらの配列により共有される同一の位置の数の関数である（２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要のある、ギャップの数、および、各ギャップの長さが考慮される）。
配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、ならびにギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６、または４およびレングスウェイト（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）１、２、３、４、５、または６を用いて決定される。さらに別の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）中のＧＡＰプログラムを用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスならびにギャップウェイト４０、５０、６０、７０、または８０およびレングスウェイト１、２、３、４、５、または６を用いて決定される。別の実施形態において、２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０または２．０Ｕ）に組みこまれたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０ウェイトレジデューテーブル（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｄｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップレングスペナルティー１２、およびギャップペナルティー４を用いて決定され得る。
本発明の方法はまた、２５２キメラタンパク質、３０４キメラタンパク質、１９８０キメラタンパク質、１４７１７キメラタンパク質、９９４１キメラタンパク質、１９３１０キメラタンパク質、または１７８３２キメラタンパク質、あるいは２５２融合タンパク質、３０４融合タンパク質、１９８０融合タンパク質、１４７１７融合タンパク質、９９４１融合タンパク質、１９３１０融合タンパク質、または１７８３２融合タンパク質を使用し得る。本明細書中で使用される場合、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、もしくは１７８３２の「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非２５２ポリペプチド、非３０４ポリペプチド、非１９８０ポリペプチド、非１４７１７ポリペプチド、非９９４１ポリペプチド、非１９３１０ポリペプチド、または非１７８３２ポリペプチドに作動可能に連結された、２５２ポリペプチド、３０４ポリペプチド、１９８０ポリペプチド、１４７１７ポリペプチド、９９４１ポリペプチド、１９３１０ポリペプチド、または１７８３２ポリペプチドを含む。「２５２ポリペプチド、３０４ポリペプチド、１９８０ポリペプチド、１４７１７ポリペプチド、９９４１ポリペプチド、１９３１０ポリペプチド、または１７８３２ポリペプチド」は、２５２分子、３０４分子、１９８０分子、１４７１７分子、９９４１分子、１９３１０分子、または１７８３２分子に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうが、一方、「非２５２ポリペプチド、非３０４ポリペプチド、非１９８０ポリペプチド、非１４７１７ポリペプチド、非９９４１ポリペプチド、非１９３１０ポリペプチド、または非１７８３２ポリペプチド」は、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質に実質的に相同でないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド（例えば、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質とは異なり、かつ同じ生物または異なる生物由来のタンパク質）をいう。２５２融合タンパク質、３０４融合タンパク質、１９８０融合タンパク質、１４７１７融合タンパク質、９９４１融合タンパク質、１９３１０融合タンパク質または１７８３２融合タンパク質において、２５２ポリペプチド、３０４ポリペプチド、１９８０ポリペプチド、１４７１７ポリペプチド、９９４１ポリペプチド、１９３１０ポリペプチド、または１７８３２ポリペプチドは、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質の全てまたは一部に対応し得る。好ましい実施形態において、２５２融合タンパク質、３０４融合タンパク質、１９８０融合タンパク質、１４７１７融合タンパク質、９９４１融合タンパク質、１９３１０融合タンパク質または１７８３２融合タンパク質は、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の好ましい実施形態において、２５２融合タンパク質、３０４融合タンパク質、１９８０融合タンパク質、１４７１７融合タンパク質、９９４１融合タンパク質、１９３１０融合タンパク質または１７８３２融合タンパク質は、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結した」は、２５２ポリペプチド、３０４ポリペプチド、１９８０ポリペプチド、１４７１７ポリペプチド、９９４１ポリペプチド、１９３１０ポリペプチド、または１７８３２ポリペプチドおよび非２５２ポリペプチド、非３０４ポリペプチド、非１９８０ポリペプチド、非１４７１７ポリペプチド、非９９４１ポリペプチド、非１９３１０ポリペプチド、または非１７８３２ポリペプチドは、互いにインフレームで融合されることを示すことが意図される。非２５２ポリペプチド、非３０４ポリペプチド、非１９８０ポリペプチド、非１４７１７ポリペプチド、非９９４１ポリペプチド、非１９３１０ポリペプチド、または非１７８３２ポリペプチドは、２５２ポリペプチド、３０４ポリペプチド、１９８０ポリペプチド、１４７１７ポリペプチド、９９４１ポリペプチド、１９３１０ポリペプチド、または１７８３２ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
例えば、１つの実施形態において、融合タンパク質は、ＧＳＴ−２５２融合タンパク質、ＧＳＴ−３０４融合タンパク質、ＧＳＴ−１９８０融合タンパク質、ＧＳＴ−１４７１７融合タンパク質、ＧＳＴ−９９４１融合タンパク質、ＧＳＴ−１９３１０融合タンパク質またはＧＳＴ−１７８３２融合タンパク質であり、ここで、２５２配列、３０４配列、１９８０配列、１４７１７配列、９９４１配列１９３１０配列、または１７８３２配列が、ＧＳＴ配列のＣ末端に融合されている。このような融合タンパク質は、組換え２５２、組換え３０４、組換え１９８０、組換え１４７１７、組換え９９４１、組換え１９３１０、または組換え１７８３２の精製を容易にし得る。
別の実施形態において、この融合タンパク質は、そのＮ末端において異種シグナル配列を含む２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質である。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０の発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用によって増大され得る。
本発明の方法において使用される２５２融合タンパク質、３０４融合タンパク質、１９８０融合タンパク質、１４７１７融合タンパク質、９９４１融合タンパク質、１９３１０融合タンパク質または１７８３２融合タンパク質は、薬学的組成物中に組み込まれ得、そして被験体にインビボで投与され得る。２５２融合タンパク質、３０４融合タンパク質、１９８０融合タンパク質、１４７１７融合タンパク質、９９４１融合タンパク質、１９３１０融合タンパク質または１７８３２融合タンパク質は、２５２基質、３０４基質、１９８０基質、１４７１７基質、９９４１基質、１９３１０基質または１７８３２基質のバイオアベイラビリティーに影響を与えるために使用され得る。２５２融合タンパク質、３０４融合タンパク質、１９８０融合タンパク質、１４７１７融合タンパク質、９９４１融合タンパク質、１９３１０融合タンパク質または１７８３２融合タンパク質の使用は、例えば、以下によって引き起こされる障害の処置のために治療的に有用であり得る：（ｉ）２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質をコードする遺伝子の異常な改変または変異；（ｉｉ）２５２遺伝子、３０４遺伝子、１９８０遺伝子、１４７１７遺伝子、９９４１遺伝子、１９３１０遺伝子または１７８３２遺伝子の誤調節；ならびに（ｉｉｉ）２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質の異常な翻訳後修飾。
さらに、本発明の方法において使用される２５２融合タンパク質、３０４融合タンパク質、１９８０融合タンパク質、１４７１７融合タンパク質、９９４１融合タンパク質、１９３１０融合タンパク質または１７８３２融合タンパク質は、被験体において抗２５２抗体、抗３０４抗体、抗１９８０抗体、抗１４７１７抗体、抗９９４１抗体、抗１９３１０抗体または抗１７８３２抗体を産生するための免疫原として、２５２リガンド、３０４リガンド、１９８０リガンド、１４７１７リガンド、９９４１リガンド、１９３１０リガンドまたは１７８３２リガンドを精製するために、そして２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０、または１７８３２と、２５２基質、３０４基質、１９８０基質、１４７１７基質、９９４１基質、１９３１０基質または１７８３２基質との相互作用を阻害する分子を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて、使用され得る。
好ましくは、本発明の方法において使用される２５２キメラタンパク質、３０４キメラタンパク質、１９８０キメラタンパク質、１４７１７キメラタンパク質、９９４１キメラタンパク質、１９３１０キメラタンパク質、もしくは１７８３２キメラタンパク質または２５２融合タンパク質、３０４融合タンパク質、１９８０融合タンパク質、１４７１７融合タンパク質、９９４１融合タンパク質、１９３１０融合タンパク質、または１７８３２融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって産生される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、従来技術に従って、例えば、連結のために平滑末端または付着末端を使用し、適切な末端を提供するための制限酵素消化を使用し、適切な場合粘着末端をフィルイン（ｆｉｌｌ−ｉｎ）し、所望でない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理を使用し、そして酵素的連結を使用することによって一緒にインフレームで連結される。別の実施形態において、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、引き続いてアニーリングおよび再増幅されてキメラ遺伝子配列を生成し得る２つの連続遺伝子フラグメント間の相補的突出を生じるアンカープライマーを使用して実施され得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：１９９２を参照のこと）。さらに、すでに融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をコードしている多くの発現ベクターが市販されている。２５２コード核酸、３０４コード核酸、１９８０コード核酸、１４７１７コード核酸、９９４１コード核酸、１９３１０コード核酸、または１７８３２コード核酸は、この融合部分が、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質にインフレームで連結されるように、このような発現ベクター中にクローニングされ得る。
本発明はまた、２５２アゴニスト、３０４アゴニスト、１９８０アゴニスト、１４７１７アゴニスト、９９４１アゴニスト、１９３１０アゴニストまたは１７８３２アゴニスト（模倣物）、あるいは２５２アンタゴニスト、３０４アンタゴニスト、１９８０アンタゴニスト、１４７１７アンタゴニスト、９９４１アンタゴニスト、１９３１０アンタゴニストまたは１７８３２アンタゴニストのいずれかとして機能する、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質の改変体の使用に関する。２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質の改変体は、変異誘発（例えば、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質の別個の点変異または短縮）によって生成され得る。２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質のアゴニストは、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性と実質的に同じ生物学的活性またはそのサブセットを保持し得る。２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質のアンタゴニストは、例えば、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質の、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２媒介性の活性を拮抗的に調節することによって、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質の天然に存在する形態の活性の１以上を阻害し得る。従って、特定の生物学的効果は、機能が限定された改変体を用いる処置によって誘発され得る。１つの実施形態において、タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを有する改変体を用いる被験体の処置は、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質の天然に存在する形態を用いた処置と比較して、被験体における副作用がより小さい。
１つの実施形態において、２５２アゴニスト、３０４アゴニスト、１９８０アゴニスト、１４７１７アゴニスト、９９４１アゴニスト、１９３１０アゴニストまたは１７８３２アゴニスト（模倣物）、あるいは２５２アンタゴニスト、３０４アンタゴニスト、１９８０アンタゴニスト、１４７１７アンタゴニスト、９９４１アンタゴニスト、１９３１０アンタゴニストまたは１７８３２アンタゴニストのいずれかとして機能する、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質の改変体は、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質のアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性について、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質の変異体（例えば、短縮変異体）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって、同定され得る。１つの実施形態において、２５２改変体、３０４改変体、１９８０改変体、１４７１７改変体、９９４１改変体、１９３１０改変体または１７８３２改変体の多様なライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発によって生成され、そして多様な遺伝子ライブラリーによってコードされる。２５２改変体、３０４改変体、１９８０改変体、１４７１７改変体、９９４１改変体、１９３１０改変体または１７８３２改変体の多様なライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することによって生成され得、その結果、潜在的な２５２配列、３０４配列、１９８０配列、１４７１７配列、９９４１配列、１９３１０配列または１７８３２配列の縮重セットは、個々のポリペプチドとしてか、あるいはその中に２５２配列、３０４配列、１９８０配列、１４７１７配列、９９４１配列、１９３１０配列または１７８３２配列のセットを含むより大きい融合タンパク質のセットとして（例えば、ファージディスプレイについて）発現可能である。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的な２５２改変体、３０４改変体、１９８０改変体、１４７１７改変体、９９４１改変体、１９３１０改変体または１７８３２改変体のライブラリーを生成するために使用され得る、種々の方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡ合成機において実施され得、次いで、この合成遺伝子は、適切な発現ベクター中に連結され得る。遺伝子の縮重セットの使用は、潜在的な２５２配列、３０４配列、１９８０配列、１４７１７配列、９９４１配列、１９３１０配列または１７８３２配列の所望のセットをコードする全ての配列を１つの混合物中で提供することを可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ、Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅら、（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。
さらに、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーは、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のために、２５２フラグメント、３０４フラグメント、１９８０フラグメント、１４７１７フラグメント、９９４１フラグメント、１９３１０フラグメントまたは１７８３２フラグメントの多様な集団を生成するために使用され得る。１つの実施形態において、コード配列フラグメントのライブラリーは、２５２コード配列、３０４コード配列、１９８０コード配列、１４７１７コード配列、９９４１コード配列、１９３１０コード配列または１７８３２コード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、ニック形成が１分子当たりほぼ１回だけ生じるような条件下でヌクレアーゼで処理し、二重鎖ＤＮＡを変性し、異なるニック形成産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成するためにＤＮＡを再生し、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理によって、再形成された二重鎖から一本鎖部分を除去し、そして得られたフラグメントライブラリーを発現ベクター中に連結することによって、生成され得る。この方法によって、種々のサイズの２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質のＮ末端フラグメント、Ｃ末端フラグメントおよび内部フラグメントをコードする、発現ライブラリーが誘導され得る。
点変異または短縮によって作成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするためのいくつかの技術、および選択された特性を有する遺伝子産物についてのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が、当該分野で公知である。このような技術は、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質のコンビナトリアル変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングのために適合可能である。大きい遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための高スループットの分析に使用されやすい、最も広く使用される技術は、代表的に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローニングする工程、ベクターの得られたライブラリーで適切な細胞を形質転換する工程、および所望の活性の検出が、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現する工程を包含する。再帰的アンサンブル変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ （ＲＥＭ））（これは、ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増強する新たな技術である）は、２５２改変体、３０４改変体、１９８０改変体、１４７１７改変体、９９４１改変体、１９３１０改変体または１７８３２改変体を同定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて使用され得る（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら、（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（３）：３２７−３３１）。
本発明の方法はさらに、抗２５２抗体、抗３０４抗体、抗１９８０抗体、抗１４７１７抗体、抗９９４１抗体、抗１９３１０抗体または抗１７８３２抗体の使用を包含する。単離された２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質、またはその部分もしくはそのフラグメントは、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体調製のための標準的技術を用いて、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２と結合する抗体を生成するための免疫原として使用され得る。全長２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質が使用され得るか、または、代わりに２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の抗原性ペプチドフラグメントが、免疫原として使用され得る。２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の抗原性ペプチドは、配列番号３，６，９に示されるアミノ酸配列の少なくとも８つのアミノ酸残基を含み、そしてそのペプチドに対して励起される抗体が、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質と特異的免疫複合体を形成するように２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のエピトープを含む。好ましくは、その抗原ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基を含み、より好ましくは、少なくとも１５個のアミノ酸残基を含み、よりさらに好ましくは、少なくとも２０個のアミノ酸残基を含み、そして、最も好ましくは、少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。
抗原性ペプチドによって含まれる好ましいエピトープは、タンパク質の表面（例えば、親水性領域、および高い抗原性を有する領域）に位置する２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の領域である。
２５２免疫原、３０４免疫原、１９８０免疫原、１４７１７免疫原、９９４１免疫原、１９３１０免疫原または１７８３２免疫原は、代表的には、適切な被験体（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳動物）をその免疫原で免疫することによって抗体を調製するために使用される。適切な免疫原性製調製物は、例えば、組み換え法で発現される２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質または化学合成２５２ポリペプチド、３０４ポリペプチド、１９８０ポリペプチド、１４７１７ポリペプチド、９９４１ポリペプチド、１９３１０ポリペプチドまたは１７８３２ポリペプチドを含み得る。調製物はさらに、フロインドの完全アジュバントまたは不完全アジュバント、または同様な免疫刺激性試薬のようなアジュバントを含み得る。適切な被験体を、免疫原性２５２調製物、３０４調製物、１９８０調製物、１４７１７調製物、９９４１調製物、１９３１０調製物または１７８３２調製物で免疫することによって、ポリクローナル抗２５２抗体反応、ポリクローナル抗３０４抗体反応、ポリクローナル抗１９８０抗体反応、ポリクローナル抗１４７１７抗体反応、ポリクローナル抗９９４１抗体反応、ポリクローナル抗１９３１０抗体反応またはポリクローナル抗１７８３２抗体反応が誘導される。
本明細書中で使用される用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫的に活性部位（すなわち、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のような抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子）をいう。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部位の例は、（例えば、ペプシンのような）酵素で、抗体を処理することによって生成され得るＦ（ａｂ）フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントを包含する。本発明は、２５２分子、３０４分子、１９８０分子、１４７１７分子、９９４１分子、１９３１０分子または１７８３２分子と結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２の特定エピトープと免疫反応することができる抗原結合部位の１つの種のみを含む抗体分子の集団をいう。従って、モノクローナル抗体組成物は、代表的には、それが免疫反応する特定の２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質または１７８３２タンパク質に対して単一結合親和性を示す。
ポリクローナル抗２５２抗体、ポリクローナル抗３０４抗体、ポリクローナル抗１９８０抗体、ポリクローナル抗１４７１７抗体、ポリクローナル抗９９４１抗体、ポリクローナル抗１９３１０抗体またはポリクローナル抗１７８３２抗体は、上記に記載のように、適切な被験体を、２５２免疫原、３０４免疫原、１９８０免疫原、１４７１７免疫原、９９４１免疫原、１９３１０免疫原または１７８３２免疫原で免疫することによって、調製され得る。免疫される被験体中における抗２５２抗体力価、抗３０４抗体力価、抗１９８０抗体力価、抗１４７１７抗体力価、抗９９４１抗体力価、抗１９３１０抗体力価または抗１７８３２抗体力価は、標準的技術（例えば、免疫化２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２を用いる、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））のような）によって経時的にモニターされ得る。所望であれば、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２に対して指向された抗体分子は、（例えば、血液から）哺乳動物から単離され得、さらに、ＩｇＧ画分を得るための、プロテインＡクロマトグラフィーのような、周知の技術によって精製され得る。免疫後の適切な時間で、例えば、抗２５２抗体力価、抗３０４抗体力価、抗１９８０抗体力価、抗１４７１７抗体力価、抗９９４１抗体力価、抗１９３１０抗体力価または抗１７８３２抗体力価が最高のときに、抗体産生細胞は、被験体から得られ得、そして例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６；４９５−４９７に初めに記載されるハイブリドーマ技術のような標準的技術によって、モノクローナル抗体を調製するために使用され得る（Ｂｒｏｗｎら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７；５３９−４６；Ｂｒｏｗｎら（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈら（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：２９２７−３１；およびＹｅｈら（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２９：２６９−７５），より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２），ＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）またはトリオーマ技術もまた参照のこと）。モノクローナル抗体ハイブリドーマを産生するための技術は周知である（一般的に、Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ｒ．Ｈ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｌｅｒｎｅｒ，Ｅ．Ａ．（１９８１）Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．５４：３８７−４０２；Ｇｅｆｔｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｔ．３：２３１−３６を参照のこと）。要するに、不死化細胞株（代表的には骨髄腫細胞）が、上記に記載のように、２５２免疫原、３０４免疫原、１９８０免疫原、１４７１７免疫原、９９４１免疫原、１９３１０免疫原または１７８３２免疫原で免疫される哺乳動物からのリンパ球（代表的には脾臓細胞）と融合され、そして得られるハイブリドーマ細胞の培養上清は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２と結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定するために、スクリーニングされる。
リンパ球と不死化細胞株とを融合するために使用される任意の多くの周知のプロトコルが、抗２５２モノクローナル抗体、抗３０４モノクローナル抗体、抗１９８０モノクローナル抗体、抗１４７１７モノクローナル抗体、抗９９４１モノクローナル抗体、抗１９３１０モノクローナル抗体、または抗１７８３２モノクローナル抗体を生成する目的で使用され得る（例えば、Ｇ．Ｇａｌｆｒｅら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ ２６６：５５０５２；Ｇｅｆｔｅｒら（１９７７）前述；Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）前述；およびＫｅｎｎｅｔｈ（１９８０）前述を参照のこと）。さらに、当業者は、これもまた有用であるような方法の多くのバリエーションがあることを認識する。代表的には、不死化細胞株（例えば、骨髄腫細胞）は、リンパ求と同じ哺乳動物種に由来する。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物で免疫されたマウスからのリンパ球と、不死化マウス細胞株とを融合することによって作製され得る。好ましい不死化細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（を含む培養培地「ＨＡＴ培地」）に感受性であるマウス骨髄細胞株である。任意の多くの骨髄細胞株（例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１，Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄細胞株）は、標準的技術（に従って、融合パートナーとして使用され得る。このような骨髄細部株は、ＡＴＣＣから入手可能である。代表的に、ＨＡＴ感受性マウス骨髄細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いて、マウス脾臓細胞と融合される。その融合から生じるハイブリドーマ細胞は、次にＨＡＴ培地を用いて選択され、その培地は、融合されない骨髄腫細胞および非増殖的に融合した骨髄細胞を殺す（融合しなかった脾臓細胞は、形質転換されていないので、数日後に死ぬ）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、（例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて）２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２と結合する抗体のハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって、検出される。
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製する代わりに、抗２５２モノクローナル抗体、抗３０４モノクローナル抗体、抗１９８０モノクローナル抗体、抗１４７１７モノクローナル抗体、抗９９４１モノクローナル抗体、抗１９３１０モノクローナル抗体、または抗１７８３２モノクローナル抗体は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２を用いて組み換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングすることによって、同定および単離され得、それによって２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２と結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離する。ファージディスプレイライブラリーを生成およびスクリーニングするためのキットは、市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ，カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰ（登録商標）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｋｉｔ，カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレイライブラリーを生成およびスクリーニングする使用のために特に適した方法および試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇら、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／１８６１９；ＤｏｗｅｒらＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９１／１７２７１；ＷｎｔｅｒらＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／２０７９１；ＭａｒｋｌａｎｄらＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／１５６７９；ＢｒｅｉｔｌｉｎｇらＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／０１０４７；ＧａｒｒａｒｄらＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／０９６９０；ＬａｄｎｅｒらＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｒｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７９７８−７９８２；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４）において見られ得る。
さらに、キメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体のような、ヒト部分および非ヒト部分の両方を包含し、標準的な組み換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る、組み換え抗２５２抗体、抗３０４抗体、抗１９８０抗体、抗１４７１７抗体、抗９９４１抗体、抗１９３１０抗体、または抗１７８３２抗体は、本発明の方法の範囲内である。そのようなキメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知の組み換えＤＮＡ技術、例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Ａｋｉｒａら、欧州特許出願第１８４，１８７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，欧州特許出願第１７１，４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，欧州特許出願第１７３，４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙら，米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら，欧州特許出願第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９；Ｓｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：２１４；Ｗｉｎｔｅｒ米国特許第５，２２５，３３９号；Ｊｏｈｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に記載される方法を用いて産生され得る。
抗２５２抗体、抗３０４抗体、抗１９８０抗体、抗１４７１７抗体、抗９９４１抗体、抗１９３１０抗体、または抗１７８３２抗体は、２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質の存在量および発現パターンを評価するために、（例えば、細胞溶解物または細胞上清中の）２５２タンパク質、３０４タンパク質、１９８０タンパク質、１４７１７タンパク質、９９４１タンパク質、１９３１０タンパク質、または１７８３２タンパク質を検出するために使用され得る。抗２５２抗体、抗３０４抗体、抗１９８０抗体、抗１４７１７抗体、抗９９４１抗体、抗１９３１０抗体、または抗１７８３２抗体は、臨床試験手順（例えば、所定の処置レジメンの効率を決定するために）の一部として、組織におけるタンパク質のレベルをモニタリングするために診断的に使用され得る。検出は、検出可能な物質に抗体を結合させる（すなわち、物理的連結）ことによって促進され得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、□−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；そして適切な放射活物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
本発明はさらに、限定と解釈されるべきではない以下の実施例によって例示される。本願、ならびに図面および配列表を通して引用される全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、本明細書中に参考として援用される。
（実施例１）ＴＡＱＭＡＮＴＭ分析を使用しての組織配置
この実施例は、ＴａｑＭａｎＴＭの方法を記載する。ＴａｑＭａｎＴＭの方法は、定量的であり、ｍＲＮＡ検出に関して逆転写ＰＣＲに基づく研究方法である。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、ＰＣＲの間、ＴａｑＭａｎＴＭのプローブを切断するために、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄＴＭ ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレア−ゼ活性を活用する。簡単にいうと、ｃＤＮＡを、目的のサンプル（例えば、心臓、腎臓、肝臓、骨格筋および種々の血管）から生成し、そしてＰＣＲ増幅反応の開始材料として使用した。５’および３’の遺伝子特異的プライマーに加えて、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ（増幅した領域に相補的）を反応に加えた（すなわち、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ）。ＴａｑＭａｎＴＭプローブは、プローブの５’末端に共有結合した蛍光レポーター色素（例えば、ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、ＴＥＴ（６−カルボキシ−４，７，２’，７−テトラクロロフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４，５−ジクロロ−２，７−ジメトキシフルオレセイン）、またはＶＩＣ）、およびプローブの３’末端に失活色素（ＴＡＭＡＲＡ（６−カルボキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルローダミン））を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＰＣＲ反応の間、プローブの切断は、レポーター色素および失活色素を分離し、レポーターの蛍光の増加が生じる。ＰＣＲ産物の蓄積は、レポーター色素の蛍光の増加をモニタリングすることによって検出する。プローブが未処理の場合、レポーター色素が失活色素の近傍にあるのでレポーターの蛍光の制御が生じる。ＰＣＲの間、目的の標的が存在する場合、このプローブは、順方向プライマー部位と、逆方向プライマー部位との間に特異的にアニールする。ＡｍｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄＴＭ ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’核酸分解活性は、プローブが標的にハイブリダイズする場合のみ、レポーターと失活剤との間のプローブを切断する。プローブ断片は、その後、標的からはがれ、そして鎖の重合が続く。プローブの３’末端は、ＰＣＲの間のプローブの伸長を防止するようブロックされる。この工程は、各サイクルで起こり、そして産物の指数関数的な蓄積を妨げない。ＲＮＡをトリゾール法を使用して調整し、そしてゲノムＤＮＡの混入を除くためにＤＮａｓｅで処置した。ｃＤＮＡを、標準的な技術を使用して合成した。逆転写酵素の非存在下でのモックｃＤＮＡ合成で、サンプル中にコントロール遺伝子のＰＣＲ増幅が検出されないことから、ゲノムＤＮＡの混入の除去が効果的であることを確認する。
（等価物）
当業者は、過剰な実験を行うことなく、本発明の明細書中に記載の特定の実施例に対する多くの等価物を認識し、確認することができる。添付の特許請求の範囲は、このような等価物を包含する。
【配列表】
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Claims (13)

  1. 血液障害を治療することができる化合物を同定する方法であって、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２核酸発現または２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２ポリペプチド活性を調節する化合物の能力を評価する工程を包含し、それによって、血液障害の処置することが可能な化合物を同定する、方法。
  2. 造血を調節することが可能な化合物を同定する方法であって、以下の工程：
    ａ）２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２を発現する細胞を試験化合物と接触させる工程：
    ｂ）２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２核酸発現または２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２ポリペプチド活性を調節する試験化合物の能力を評価し、それによって、造血を調節することが可能な化合物を同定する工程、
    を包含する、方法。
  3. 細胞における造血を調節する方法であって、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２調節因子と細胞とを接触する工程を包含し、それによって、該細胞において造血を調節する、方法。
  4. 請求項２に記載の方法であって、ここで、前記細胞が造血細胞である、方法。
  5. 請求項３に記載の方法であって、ここで前記２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２調節因子が有機低分子、ペプチド、抗体またはアンチセンス核酸分子である、方法。
  6. 請求項３に記載の方法であって、ここで前記２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２調節因子は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２ペプチド活性を調節することが可能である、方法
  7. 請求項６に記載の方法であって、ここで前記２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２調節因子は、有機低分子、ペプチド、抗体またはアンチセンス核酸分子である、方法。
  8. 請求項６に記載の方法であって、ここで前記２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２調節因子は、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２核酸発現を調節することが可能である、方法
  9. 異常な２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２ポリペプチド活性または異常な２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２核酸発現によって特徴付けられる血液障害を有する患者を処置する方法であって、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２調節因子を患者に投与する工程を包含し、それによって、血液障害を有する患者を処置する、方法。
  10. 請求項９に記載の方法であって、ここで前記血液障害は、癌に対する骨髄照射または化学的療法処置の結果生じる障害、悪性貧血、出血性貧血、溶血性貧血、再生不良性貧血、鎌状赤血球性貧血、鉄芽球性貧血、マラリアトリパソーマ症、ＨＩＶ、肝炎ウイルスまたは他のウイルスのような慢性感染に関連する貧血、骨髄不全によって引き起こされる骨髄障害性貧血、貧血の結果生じる腎不全、貧血、赤血球増加症、伝染性単核球症（ＩＭ）、急性非リンパ性白血病（ＡＮＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性前骨髄性白血病（ＡＰＬ）、急性骨髄単球性白血病（ＡＭＭｏＬ）、真性赤血球増加症、リンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病、ウィルムス腫、ユーイング肉腫、網膜芽細胞腫、血友病、血栓症の増加した危険に関連する障害、疱疹、サラセミア、輸血反応および赤芽球症のような抗体媒介障害、細血管異常性溶血性貧血のような赤血球に対する機械的外傷、血栓性血小板減少性紫斑病および汎発性血管内凝固症候群、プラスモディウム属のような寄生虫による感染、化学的損傷（例えば、鉛中毒からの化学的損傷）、および脾機能亢進からなる群から選択される、方法。
  11. 請求項９に記載の方法であって、ここで、前記２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２調節因子が、薬学的に受容可能な処方物において投与される、方法。
  12. 請求項９に記載の方法であって、ここで前記２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２調節因子が、有機低分子、ペプチド、抗体またはアンチセンス核酸分子である、方法。
  13. 請求項９に記載の方法であって、ここで前記２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２調節因子が、２５２、３０４、１９８０、１４７１７、９９４１、１９３１０または１７８３２のポリペプチド活性を調節することが可能である、方法。
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