JP2005507673A - １３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４を用いる心血管疾患を治療するための方法および組成物 - Google Patents

１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４を用いる心血管疾患を治療するための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化症、再潅流傷害、高血圧症、再狭窄、動脈炎症、血栓症および内皮細胞障害を含む心血管疾患を診断および治療するための方法に関する。詳細には、本発明は、正常状態または非−心血管疾患状態における発現と比較した、および／または心血管疾患に関連した操作に応答した、心血管疾患状態における１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子の異なった発現を同定する。本発明は、種々の心血管疾患を診断評価および予測するための、およびかかる症状への素因を示す対象を同定するための方法を記載する。また、本発明は、心血管疾患をモジュレートすることができる化合物を同定するための方法も提供する。また、本発明は、心血管疾患の治療剤としての化合物を同定する方法および治療上の使用方法も提供する。

Description

【０００１】
本願は、出典明示して本明細書の一部とみなす、２００１年１１月５日に出願した米国仮特許出願番号６０／３３９，５８２に基づく優先権を主張する。
【０００２】
心血管疾患は先進国全体にわたって存在する主要な健康を脅かす危険因子である。
心血管疾患のうちで最も有力なものであるアテローム性動脈硬化症は、心臓発作、卒中、および重篤な無能力および四肢の損失を生じる末梢血管疾患の主たる原因であり、それによって合衆国における主たる死因となっている。
【０００３】
アテローム性動脈硬化症は脂質代謝および血管炎症の態様を含む複雑な疾患である。その両方がアテローム性動脈硬化症の発病および進行に対して重大な影響を有している。不規則な脂質代謝はアテローム性動脈硬化症に対する非常によく確立された危険因子である。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、トリグリセリドの上昇ならびに低いレベルの高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、すべて独立してアテローム性動脈硬化症の発病および／または進行に寄与する。現在では、これらの危険因子を低下させ、それによってアテローム性動脈硬化疾患に関わる死亡率および罹患率を低下させる、臨床において利用されている多くの有効な療法が存在する。これれらの療法の幾つかとしては、コレステロール低下薬であるスタチン、トリグリセリド低下薬であるフィブラートおよびナイアシン、ならびにトリグリセリドを低下させ／ＨＤＬを上昇させるＰＰＡＲ−アルファアクチベーターが含まれる。新たなアテローム性動脈硬症療法に対する新たな標的を同定する必要がある。
【０００４】
炎症がアテローム性動脈硬化症のプロセスを演じているという役割の理解について重要な進捗があった。アテローム性動脈硬化症には多くの細胞型および分子ファクターが包含される(例えば、Ross (1993) Nature 362: 801-809に記載されている)。正常な環境におけるプロセス、動脈の壁の内皮細胞および平滑筋細胞（ＳＭＣ）への傷害に対する保護応答である該プロセスは、炎症に先んじておよび炎症を伴う、線維脂肪性および線維性の障害または病斑の形成からなる。アテローム性動脈硬化症の発展した病変は関係する動脈を閉塞し得、多数の異なる形態の傷害に対する過剰な炎症−線維増殖応答から生じ得る。血管内皮細胞の傷害または機能不全は、個人をアテローム性動脈硬化性心血管疾患の加速された発達に傾かせる多くの症状の共通の特徴である。高血圧症がアテローム性動脈硬化症に寄与するということを確立することにかなり多くの努力がなされている。血圧および血管弾性を調節する分子を同定すれば、アテローム性動脈硬化症のような心血管疾患を治療するための新たな療法を発見するのに有用であろう。
【０００５】
本発明は、心血管疾患を診断および治療するための方法および組成物を提供する。本明細書中で用いるように、心臓を含む障害、または"心血管疾患"または"心血管障害"には、血管系、例えば心臓、血管および／または血液に影響する疾患または障害が含まれる。心血管障害は、動脈血圧、心臓の機能不全、または例えば血栓による血管の閉塞によって引き起こされ得る。心血管障害には、限定されるものではないが、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、心臓の肥大、虚血後再潅流傷害、再狭窄、動脈炎症、血管壁再構築、心室再構築、急速心室ペーシング（rapid venticular pacing）、冠動脈微小塞栓症、頻脈、徐脈、圧力過負荷、大動脈屈曲（aortic bending）、冠動脈結紮（coronary artery ligation）、血管心臓病、限定されるものではないが石灰化によって引き起こされる心弁閉鎖不全を含む心弁の疾患、リューマチ性心臓疾患、心内膜炎、または人工弁の合併症；心房性細動、ＱＴ延長症候群、うっ血性心不全、洞房結節機能障害、狭心症、心不全、高血圧症、心房性細動、心房粗動、限定されるものではないが、心膜液貯留心膜炎および心外膜炎を含む心膜疾患；例えば拡張型心筋症または特発性心筋症のような心筋症、心筋梗塞、冠動脈疾患、冠攣縮、虚血性疾患、不整脈、心臓突然死、および心血管発達障害（例えば、動静脈奇形、動脈静脈フィステル、レイノー症候群、神経性胸郭出口症候群、灼熱痛／反射自律神経性ジストロフィー、血管腫、動脈瘤、海綿状様血管腫、大動脈弁狭窄症、心房中隔欠損症、房室管型欠損（atrioventicular canal）、大動脈縮窄症、エプシュタイン奇形（ebsteins anomaly）、左心低形成症候群、大動脈弓離断症、僧帽弁逸脱症、動脈管開存症、卵円口開存、部分的肺静脈還流異常、心室中隔欠損症を伴う肺動脈閉鎖症、心室中隔欠損症を伴わない肺動脈閉鎖症、胎児循環の持続（persistance of the fetal circulation）、肺動脈弁狭窄、単心室、総肺静脈還流異常症、大血管転位症、三尖弁閉鎖症、総動脈幹症、心室中隔欠損症）のごとき障害が含まれる。また、心血管疾患または障害には、内皮細胞障害も含まれ得る。
【０００６】
本願明細書中で用いる"内皮細胞障害"には、異常、不規則または望ましくない内皮細胞活性、例えば増殖、移動、血管形成または血管新生；または、細胞表面接着分子または血管形成に関連する遺伝子、例えばＴＩＥ−２、ＦＬＴおよびＦＬＫの異常な発現によって特徴付けられる障害が含まれる。内皮細胞障害には、腫瘍形成、腫瘍転移、乾癬、糖尿病性網膜症、子宮内膜症、グレーブス病、虚血性疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症）および慢性炎症性疾患（例えば、慢性関節リューマチ）が含まれる。
【０００７】
心血管疾患には血栓症も含まれ得る。血栓症は、例えば心筋梗塞、狭心症、高血圧症、脂肪障害、真性糖尿病に見られる血小板機能不全；骨髄増殖性症候群（真性多血症およびトンボシセミア（thombocythemia）を含む）；血栓性血小板減少性紫斑病；ＨＩＶ−誘導性血小板障害（ＡＩＤＳ−血小板減少症）；ヘパリン−誘導性血小板減少症；血小板の凝集／脱顆粒、血管内皮細胞活性化／傷害、単球／マクロファージ管外遊出および平滑筋細胞増殖に通じるムラル細胞（mural cell)の変化／相互作用；限定されるものではないが、脈管炎、抗リン脂質抗体症候群、全身性エリトマトーデス（systemic lupus erythromatosis）のごとき自己免疫疾患；限定されるものではないが、ｉ免疫活性化（iImmune activation）のごとき炎症疾患；移植片対宿主病；限定されるものではないが、プロテインＣ／Ｓを含む凝固因子経路、抗トロンビンＩＩＩ欠損および第Ｖ因子Leiden突然変異のごとき先天的か、または、限定されるものではないが、自己免疫疾患、腫瘍に関連するおよび薬物誘導性の凝固因子の調節障害のごとき後天的かのいずれかの凝固因子調節不全症から生じ得る。
【０００８】
本願明細書中で用いる"治療"とは、疾患または障害を直す、癒す、緩和する、救済する、変化させる、矯正する、改善する、改良するまたは影響する目的で、疾患または障害、疾患もしくは障害の症状または疾患もしくは障害に対する罹りやすさを有する患者に対する治療剤の適用または投与、該患者からの単離組織またはセルラインに対する治療剤の適用または投与として定義する。治療剤には、限定されるものではないが、小分子、ペプチド、抗体、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。代表的な分子を本願明細書中に記載する。
【０００９】
本発明は、少なくとも部分的には、（後記するごとく）核酸およびタンパク質分子が、正常または非心血管疾患状態における発現と比較して心血管疾患状態においては異なって発現されるという発見に基づく。本発明の方法によって同定された本発明の分子のモジュレーターを用いて、限定されるものではないが、動脈硬化症および血栓症を含む心血管疾患をモジュレート（例えば、阻害、治療または予防する）または診断し得る。
【００１０】
本明細書中で用いる"異なる発現"には、遺伝子の一時的および／または組織発現パターンにおける定量的ならびに定性的の両方の差異を含む。したがって、異なって発現される遺伝子は、正常−対−心血管疾患状態において（例えば、アテローム性動脈硬化症の動物モデルにおけるような実験的な心血管疾患系において）活性化されたかまたは不活性化されたその発現を有し得る。正常−対−心血管疾患において、または、対照−対−実験状態において異なる発現の程度は、標準的な特徴付け技術、例えば定量的ＰＣＲ、ノザン分析、サブストラクティブ・ハイブリダイゼーション（substractive hybridization）、を介して視覚化するのに十分に大きければよい。異なって発現される遺伝子の発現パターンは、予想または診断的な心血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症および／または血栓症、評価の一部分として用い得、あるいは、心血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症および／または血栓症の治療に有用な化合物を同定する方法において用い得る。また、心血管疾患に関与する異なって発現される遺伝子は、標的遺伝子発現のレベルまたは標的遺伝子産物の活性のレベルの調節が心血管疾患症状、例えばアテローム性動脈硬化症および／または血栓症を直す、癒す、緩和する、救済する、変化させる、矯正する、改善する、改良するまたは影響するような標的遺伝子を表し得る。標的遺伝子の発現または標的遺伝子産物の活性を調節する化合物は、心血管疾患の治療に用い得る。本明細書中に記載した遺伝子は心血管疾患に関して異なって発現し得、および／またはそれらの産物は心血管疾患に対して重要な遺伝子産物と相互作用し得るが、該遺伝子はさらなる心血管細胞プロセスに対して重要な機構にも関与しているかもしれない。
【００１１】
遺伝子ＩＤ １３９
非翻訳領域を含むほぼ２７５７ヌクレオチド長であるヒト１３９配列（配列番号：１）、（ＧＩ：１８１９４８、内皮分化タンパク質（ＥＤＩ−１）としても知られている）は、終止コドンを含む約１１４３ヌクレオチドの予想されるメチオニン開始コード配列を含む。コード配列は３８１アミノ酸タンパク質（配列番号：２）（ＧＩ：１８１９４９）をコードする。
ＴａｑＭａｎ分析によって決定されるごとく、１３９ｍＲＮＡの発現がヒトの肝臓、皮膚、扁桃、脾臓、骨髄および末梢血液細胞に見られた。マーモセットをスタチン、セリバスタチンで治療した場合、１３９ｍＲＮＡの発現はプラセボと比較して低下した。スタチンはコレステロール、アテローム性動脈硬化症／冠動脈疾患に対する明らな危険因子、の低下に臨床的に使用されている。動物モデルおよび／またはイン・ビトロ（in vitro）モデルにおいてスタチンによって調節される遺伝子は、この剤の治療上の利益に寄与することが予想され、かつ、心血管疾患／アテローム性動脈硬化症／高脂血症／脂質障害を治療するための新たな治療上の標的を表すことが予想される。したがって、１３９は低いコレステロールおよびトリグリセリドレベルにおけるセリバスタチンの治療上の利益に寄与することが予想され、心血管疾患の治療に有用であることが予想される。
【００１２】
遺伝子ＩＤ ２５８
非翻訳領域を含むほぼ１４９２ヌクレオチド長であるアルギニンバソプレシン受容体（ＡＶＰＲ１）としても知られているヒト２５８配列（配列番号：３）は、終止コドンを含む約１２５４ヌクレオチドの予想されるメチオニン開始コード配列を含む。コード領域は４１８アミノ酸タンパク質（配列番号：４）（ＧＩ：６６７０６８）をコードする。
【００１３】
ＴａｑＭａｎ分析によって判定されるごとく、２５８ｍＲＮＡの発現は正常なヒトの肝臓において最も多く、乳房および皮膚衰弱性壊死においては中位の発現であり、正常な皮膚、骨格筋、脂肪組織および心臓においてはより低量で見られる。２５８ｍＲＮＡは高コレステロール食餌を与えたサルの肝臓においては抑制された。コレステロールは、動脈硬化症／冠動脈疾患の発病および進行についてのよく確立された危険因子である。動物モデルおよび／またはイン・ビトロ（in vitro）モデルにおいてコレステロールによって調節される遺伝子は、疾患の進行および／または開始に寄与することが予想され、心血管疾患／アテローム性動脈硬化症／ジスリピデミア（dyslipidemia）／脂質障害の治療の新たな治療上の標的を表すことが予想される。したがって、２５８のアンタゴニストはコレステロールおよびトリグリセリドのレベルを低下することが予想される。
【００１４】
遺伝子ＩＤ １２６１
非翻訳領域を含むほぼ２４８１ヌクレオチド長であるヒト１２６１配列（配列番号：５）（ＧＩ：１８１３８８１、ＮＡＫ−１としても知られている）は、終止コドンを含む約１７９４ヌクレオチドの予想されるメチオニン開始コード配列を含む。コード配列は５９８アミノ酸タンパク質（配列番号：６）（ＧＩ：１８１３８８２）をコードしている。
【００１５】
ＴａｑＭａｎによって決定されるごとく、ヒト１２６１ｍＲＮＡの発現は、プロ血管原性血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）およびインターロイキン１ベータ（ＩＬ−１ベータ）で処理した場合に、心臓からのヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）において昂進された。１２６１ｍＲＮＡは、ＨＭＶＥＣ細胞を血清で処理した場合にも昂進された。これらのデータは、プロ血管原性因子に曝露した場合に１２６１ｍＲＮＡが昂進され、それが血管形成において役割を演じていることを示している。ヒト臍帯血管内皮細胞を層流剪断応力（アテローム性動脈硬化症の形成を促進することが知られている条件）に付した場合、１２６１ｍＲＮＡは剪断応力に曝露していない細胞と比較して増加した。
【００１６】
遺伝子ＩＤ １４８６
非翻訳領域を含むほぼ１３１０ヌクレオチド長であるヒト１４８６配列（配列番号：７）（ＧＩ：７９１１８７、ＪＮＫ活性化キナーゼ（ＪＮＫＫ１）としても知られている）は、終止コドンを含む約１１９７ヌクレオチドの予想されるメチオニン開始コード配列を含む。コード配列は３９９アミノ酸タンパク質（配列番号：８）（ＧＩ：７９１１８８）をコードしている。
【００１７】
ＴａｑＭａｎ分析によって決定されるごとく、１４８６ｍＲＮＡの発現は試験した他の正常な組織と比較してヒト肝臓において高いことが見出された。さらに、１４８６ｍＲＮＡは、マーモセットをプロブコールまたはセリバスタチンおよびフェノフィブレートの組合せで処理した場合にはマーモセットの肝臓において抑制された。プロブコールはアテローム性動脈硬化症／冠動脈疾患の治療に臨床的に使用されている。動物モデルおよび／またはイン・ビトロ（in vitro）モデルにおいてプロブコールによって調節される遺伝子は、この剤の治療上の利益に寄与することが予想され、心血管疾患／アテローム性動脈硬化症／ジスリピデミア／脂質障害を治療するための新たな治療上の標的を表すことが予想される。
【００１８】
フィブレートはトリグリセリドを低下させるために臨床的に使用されており、スタチンはコレステロールを低下させるために臨床的に使用されており、両方はアテローム性動脈硬化症／冠動脈疾患に対するよく明らかにされている危険因子である。動物モデルおよび／またはイン・ビトロ（in vitro）モデルにおいてこの組合せ治療によって調節される遺伝子は、これらの剤の治療上の利益に寄与することが予想され、心血管疾患／アテローム性動脈硬化症／ジスリピデミア／脂質障害を治療するための新たな治療上の標的を表すことが予想される。
【００１９】
１４８６の抑制はコレステロールおよびトリグリセリドのレベルを低下させ、したがって心血管疾患を治療するのに有用であることが予想される。
【００２０】
遺伝子ＩＤ ２３９８
非翻訳領域を含むほぼ１１１３ヌクレオチド長であるヒト２３９８配列（配列番号：９）（ＧＩ：７３６３３４１、１１型Ｃ−Ｃケモカイン受容体（ＣＣ ＣＫＲ−１１）としても知られている）は、終止コドンを含む約１０５０ヌクレオチドの予想されるメチオニン開始コード配列を含む。コード配列は３５０アミノ酸タンパク質（配列番号：１０）（ＧＩ：７３６３３４２）をコードしている。
【００２１】
ＴａｑＭａｎ分析によって決定されるごとく、２３９８ｍＲＮＡの発現は剪断応力によって内皮細胞（ＥＣ）においてダウンレギュレートされ、これはその抗−アテローム活性または抗−増殖効果と相関する。層流剪断応力（ＬＳＳ）パラダイムは、直線上の分岐のない動脈のストレッチ中の血流を刺激するように設計されている（処理は１０ｄｙｎ／ｃｍ２のＬＳＳを２４時間）。イン・ビトロ（in vitro）においてはそれは一酸化酸素産生を増加させ、接着分子の発現および増殖を低下させ、細胞を血清中断（serum withdrawal）に対する正常なアポトーシス応答から細胞を保護することが知られている。これらのイン・ビトロ（in vitro）の効果のため、パラダイムはイン・ビボ(in vivo)で剪断応力を受けた直線状の分岐していない動脈において観察されるアテローム保護された（比較的領域に制限されない）状態を再現していると考えられる。
【００２２】
２３９８は低酸素条件によってＥＣ中で２４時間アップレギュレートされる。ＶＥＧＦは６時間アップレギュレートされる。２３９８はＶＥＧＦによってもアップレギュレートされることが知られていることから、低酸素によるその誘導はＶＥＧＦの下流に存在し得る。２３９８発現のモジュレーターは、限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化症を含む心血管障害を治療するのに有用であろう。
【００２３】
遺伝子ＩＤ ２４１４
非翻訳領域を含むほぼ１６９７ヌクレオチド長であるヒト２４１４配列（配列番号：１１）（ＧＩ：１４５７９３８、ＧＰＲ６８としても知られている）は、終止コドンを含む約１０９５ヌクレオチドの予想されるメチオニン開始コード配列を含む。コード配列は３６５アミノ酸タンパク質（配列番号：１２）（ＧＩ：１４５７９３９）をコードしている。
【００２４】
ＴａｑＭａｎ分析によって調べたごとく、２４１４ｍＲＮＡの発現は単球／マクロファージ脂質負荷プロセスの間にアップレギュレートされる。修飾ＬＤＬで刺激した単球／マクロファージは泡沫細胞形成を模倣する。泡沫細胞はアテローム発生の初期事象であり、したがってこのプロセスにおいてアップレギュレートされる遺伝子はアテローム発生を治療するのに有用な化合物を同定するのに有用性を有する。
【００２５】
ＴａｑＭａｎ分析によって調べたごとく、２４１４ｍＲＮＡの発現は内皮細胞および単球／マクロファージにおける種々のサイトカイン刺激の間にアップレギュレートされる。ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦアルファ、ＩＬ−１およびＩＮＦガンマを用いて、内皮細胞または単球／マクロファージのいずれかを刺激した。これらのサイトカインはアテローム性動脈硬化症病因を開始／支持した。
【００２６】
２４１４ｍＲＮＡの発現は、正常な血管と比較してサルアテローム試料においてアップレギュレートされる。これは、ＴａｑＭａｎ分析によって定量的およびイン−サイチュハイブリダイゼーションによって定性的の両方において観察された。６の異なるサルアテローム試料を、２４１４発現の定量的比較のために正常な血管と比較した。一貫して、正常な血管と比較してアテロームにおいては２４１４ｍＲＮＡ発現の上昇が存在した。
【００２７】
２４１４はアテローム発生を模倣する多くのイン・ビボ(in vivo)およびイン・ビトロ（in vitro）パラダイムの間にアップレギュレーションを示す。したがって、２４１４の阻害は、アテローム性動脈硬化血管における障害形成を低下させ、それによってアテローム発生の進行を和げるであろう。
【００２８】
遺伝子ＩＤ ７６６０
非翻訳領域を含むほぼ１１８１ヌクレオチド長であるヒト７６６０配列（配列番号：１３）（ＧＩ：２２１３８０８、ＪＡ６１としても知られている）は、終止コドンを含む約１１５２ヌクレオチドの予想されるメチオニン開始コード配列を含む。コード配列は３８４アミノ酸タンパク質（配列番号：１４）（ＧＩ：２２１３８０９）をコードしている。
【００２９】
ＴａｑＭａｎ分析によって調べたごとく、７６６０ｍＲＮＡの発現は正常なヒト肝臓まで制限される。また、７６６０ｍＲＮＡはセリバスタチンで処理したマーモセット肝臓において低下した。スタチンは、アテローム性動脈硬化症／冠動脈疾患に対する明らかにされている危険因子であるコレステロールを低下するために臨床的に使用されている。動物モデルおよび／またはイン・ビトロ（in vitro）モデルにおいてスタチンによって調節される遺伝子は、この剤の治療上の利益に寄与することが予想され、心血管疾患／アテローム性動脈硬化症／ジスリピデミア／脂質障害を治療するための新たな治療上の標的を表すことが予想される。
【００３０】
７６６０の調節は、総コレステロールを低下させることが予想され、アテローム性動脈硬化症および高脂質血症に対する有利な効果を有することが予想される。
【００３１】
遺伝子ＩＤ ８５８７
非翻訳領域を含むほぼ１５８０ヌクレオチド長であるヒト８５８７配列（配列番号：１５）（ＧＩ：４１０２１３、ナトリウム／胆汁酸コトランスポーターとしても知られている）は、終止コドンを含む約１０４７ヌクレオチドの予想されるメチオニン開始コード配列を含む。コード配列は３４９アミノ酸タンパク質（配列番号：１６）（ＧＩ：４１０２１４）をコードしている。
【００３２】
ＴａｑＭａｎ分析によって調べたごとく、８５８７ｍＲＮＡの発現はヒト肝臓において高い。また、８５８７ｍＲＮＡはマーモセット肝臓モデルにおいてイン・ビボ(in vivo)でコレスチラミンによってアップレギュレートされ、マーモセット肝臓モデルにおいてイン・ビボ(in vivo)で組合せスタチン／フィブレート療法によってアップレギュレートされる。コレスチラミンは、アテローム性動脈硬化症／冠動脈疾患に対する明らかにされている危険因子であるコレステロールを低下させるために臨床的に使用されている。動物モデルおよび／またはイン・ビトロ（in vitro）モデルにおいてコレスチラミンによって調節される遺伝子は、この剤の治療上の利益に寄与することが予想され、心血管疾患／アテローム性動脈硬化症／ジスリピデミア／脂質障害を治療するための新たな治療上の標的を表すことが予想される。フィブレートはトリグリセリドを低下させるために臨床的に使用されており、スタチンはコレステロールを低下させるために臨床的に使用されており、両方はアテローム性動脈硬化症／冠動脈疾患に対するよく明らかにされている危険因子である。動物モデルおよび／またはイン・ビトロ（in vitro）モデルにおいてこの組合せ治療によって調節される遺伝子はこれらの剤の治療上の利益に寄与することが予想され、心血管疾患／アテローム性動脈硬化症／ジスリピデミア／脂質障害を治療するための新たな治療上の標的を表すことが予想される。
【００３３】
８５８７の抑制は総コレステロールおよびトリグリセリドを低下させ、したがってコレステロール代謝において役割を演じていることが予想される。
【００３４】
遺伝子ＩＤ １０１８３
非翻訳領域を含むほぼ２０１３ヌクレオチド長であるヒト１０１８３配列（配列番号：１７）（ＧＩ：１８９３２８、オルニチン・アミノトランスフェラーゼとしても知られている）は、終止コドンを含む約１３１７ヌクレオチドの予想されるメチオニン開始コード配列を含む。コード配列は４３９アミノ酸タンパク質（配列番号：１８）（ＧＩ：１８９３２９）をコードしている。
【００３５】
ＴａｑＭａｎ分析によって調べたごとく、１０１８３ｍＲＮＡはイン・ビボ(in vivo)マーモセットモデルにおいてプロブコールおよびセリバスタチン／フェノフィブレートによって抑制される。プロブコールは、アテローム性動脈硬化症／冠動脈疾患を治療するために臨床的に使用されている。動物モデルおよび／またはイン・ビトロ（in vitro）モデルにおいてプロブコールによって調節される遺伝子は、この剤の治療上の利益に寄与することが予想され、心血管疾患／アテローム性動脈硬化症／ジスリピデミア／脂質障害を治療するための新たな治療上の標的を表すことが予想される。フィブレートはトリグリセリドを低下させるために臨床的に使用されており、スタチンはコレステロールを低下させるために臨床的に使用されており、その両方はアテローム性動脈硬化症／冠動脈疾患に対するよく明らかにされている危険因子である。動物モデルおよび／またはイン・ビトロ（in vitro）モデルにおいてこの組合せ処理によって調節される遺伝子は、これらの剤の治療上の利益に寄与することが予想され、心血管疾患／アテローム性動脈硬化症／ジスリピデミア／脂質障害を治療するための新たな治療上の標的を表すことが予想される。１０１８３ｍＲＮＡは原発性ヒト肝細胞においてイン・ビトロ（in vitro）でスタチンおよびＰＰＡＲアゴニストによってもダウンレギュレートされる。ＰＰＡＲアルファアゴニストはトリグリセリドを低下させるために臨床的に使用されており、スタチンはコレステロールを低下させるために臨床的に使用されており、それらは両方ともアテローム性動脈硬化症／冠動脈疾患に対するよく明らかにされている危険因子である。動物モデルおよび／またはイン・ビトロ（in vitro）モデルにおいてこの組合せ処理によって調節される遺伝子は、これらの剤の治療上の利益に寄与することが予想され、心血管疾患／アテローム性動脈硬化症／ジスリピデミア／脂質障害を治療するための新たな治療上の標的を表すことが予想される。１０１８３ｍＲＮＡの高い発現はヒト肝臓において見られる。
【００３６】
１０１８３ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの抑制は、総コレステロールおよびトリグリセリドのレベルを低下させ、したがって心血管疾患を治療するのに有用であることが予想される。
【００３７】
遺伝子ＩＤ １０５５０
非翻訳領域を含むほぼ１２２７ヌクレオチド長であるヒト１０５５０配列（配列番号：１９）（ＧＩ：９４０９７９３、スクシニル−ＣｏＡ−シンセターゼとしても知られている）は、終止コドンを含む約９９９ヌクレオチドの予想されるメチオニン開始コード配列を含む。コード配列は３３３アミノ酸タンパク質（配列番号：２０）（ＧＩ：９４０９７９４）をコードしている。
【００３８】
ＴａｑＭａｎ分析によって調べたごとく、１０５５０ｍＲＮＡはイン・ビボ(in vivo)マーモセットモデルにおいてプロブコールおよびセリバスタチン／フェノフィブレートによって抑制される。プロブコールは、アテローム性動脈硬化症／冠動脈疾患を治療するために臨床的に使用されている。動物モデルおよび／またはイン・ビトロ（in vitro）モデルにおいてプロブコールによって調節される遺伝子は、この剤の治療上の利益に寄与することが予想され、心血管疾患／アテローム性動脈硬化症／ジスリピデミア／脂質障害を治療するための新たな治療上の標的を表すことが予想される。フィブレートはトリグリセリドを低下させるために臨床的に使用されており、スタチンはコレステロールを低下させるために臨床的に使用されており、その両方はアテローム性動脈硬化症／冠動脈疾患に対するよく明らかにされている危険因子である。動物モデルおよび／またはイン・ビトロ（in vitro）モデルにおいてこの組合せ処理によって調節される遺伝子は、これらの剤の治療上の利益に寄与することが予想され、心血管疾患／アテローム性動脈硬化症／ジスリピデミア／脂質障害を治療するための新たな治療上の標的を表すことが予想される。高い発現はヒト肝臓において見られた。
【００３９】
１０５５０シンセターゼの抑制は総コレステロールおよびトリグリセリドを低下させることが予想される。
【００４０】
遺伝子ＩＤ １２６８０
非翻訳領域を含むほぼ４０４０ヌクレオチド長であるヒト１２６８０配列（配列番号：２１）（ＧＩ：３００６２０１、プロスタグランジン・トランスポーターとしても知られている）は、終止コドンを含む約１９２９ヌクレオチドの予想されるメチオニン開始コード配列を含む。コード配列は６４３アミノ酸タンパク質（配列番号：２２）（ＧＩ：１６１７５９０）をコードしている。
【００４１】
ＴａｑＭａｎ分析によって調べたごとく、１２６８０ｍＲＮＡはイン・ビボ(in vivo)マーモセットモデルにおいてプロブコールおよびセリバスタチン／フェノフィブレートによって抑制される。プロブコールは、アテローム性動脈硬化症／冠動脈疾患を治療するために臨床的に使用されている。動物モデルおよび／またはイン・ビトロ（in vitro）モデルにおいてプロブコールによって調節される遺伝子は、この剤の治療上の利益に寄与することが予想され、心血管疾患／アテローム性動脈硬化症／ジスリピデミア／脂質障害を治療するための新たな治療上の標的を表すことが予想される。フィブレートはトリグリセリドを低下させるために臨床的に使用されており、スタチンはコレステロールを低下させるために臨床的に使用されており、その両方はアテローム性動脈硬化症／冠動脈疾患に対するよく明らかにされている危険因子である。動物モデルおよび／またはイン・ビトロ（in vitro）モデルにおいてこの組合せ処理によって調節される遺伝子は、これらの剤の治療上の利益に寄与することが予想され、心血管疾患／アテローム性動脈硬化症／ジスリピデミア／脂質障害を治療するための新たな治療上の標的を表すことが予想される。
【００４２】
１２６８０シンセターゼの抑制は、総コレステロールおよびトリグリセリドのレベルを低下させることが予想される。
【００４３】
遺伝子ＩＤ １７９２１
非翻訳領域を含むほぼ４８９７ヌクレオチド長であるヒト１７９２１配列（配列番号：２３）は、終止コドンを含む約１５１８ヌクレオチドの予想されるメチオニン開始コード配列を含む。コード配列は５０６アミノ酸タンパク質（配列番号：２４）をコードしている（ＫＩＡＡ１３８２としても知られている４３１２ヌクレオチドの部分配列はＧＩ：７２４３１４４として開示する）。
【００４４】
１７９２１のラット・オーソログは機能的に特徴付けられており、細胞内側のアミノ酸の正味のレベルを増大させることが示されている。それは最高の親和性でもってアラニンを輸送し、グルタミンも輸送する。細胞内グルタミンは内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の活性を阻害し得る。
【００４５】
アミノ酸トランスポーター１７９２１は内皮細胞において最も多く発現しており、血管平滑筋においても多く発現している。内皮細胞においては、１７９２１の発現は層流剪断応力によって強力かつ一貫してアップレギュレートされる。１７９２１は調べたすべてのヒト血管において多く発現している。
【００４６】
内皮細胞における１７９２１の高い発現レベルを考えると、グルタミンの正味移動は極めて重要であり、一酸化窒素産生を低下する可能性がある。このことは血管形成、アテローム性動脈硬化症および血管緊張に関連する因果関係を有するであろう。一酸化窒素は主要な血管拡張薬である。ｅＮＯＳを欠いているマウスは高い血圧、アテローム性動脈硬化症に対する高い感受性、および不十分な血管形成を有する。アミノ酸トランスポーター１７９２１はタンパク質合成に利用可能なアミノ酸貯蔵に寄与するさらなる機構によって血管形成を行う内皮細胞の能力をモジュレートし得る。
【００４７】
遺伝子ＩＤ ３２２４８
非翻訳領域を含むほぼ２１０６ヌクレオチド長であるヒト３２２４８配列（配列番号：２５）は、終止コドンを含む約２１０３ヌクレオチドの予想されるメチオニン開始コード配列を含む。コード配列は７０１アミノ酸タンパク質（配列番号：２６）をコードしている（ＧＩ：７８４３９６５１）。
【００４８】
ＴａｑＭａｎ分析によって、３２２４８ｍＲＮＡはサル肝臓モデルにおいてｎ−３ポリ不飽和脂肪酸によって抑制された。食餌ポリ不飽和脂肪酸は、アテローム性動脈硬化症／冠動脈疾患の進行に対して保護することが示されている。動物モデルおよび／またはイン・ビトロ（in vitro）モデルにおいてポリ不飽和脂肪酸によって調節される遺伝子は、この剤の治療上の利益に寄与することが予想され、心血管疾患／アテローム性動脈硬化症／ジスリピデミア／脂質障害を治療するための新たな治療上の標的を表すことが予想される。３２２４８ｍＲＮＡはコレスチラミンによって肝臓においてアップレギュレートされ、マーモセット肝臓モデルにおいて組合せスタチン／フィブレート療法によってアップレギュレートされる。コレスチラミンはコレステロールを低下させるために臨床的に使用されており、アテローム性動脈硬化症／冠動脈疾患に対するよく明らかにされている危険因子である。動物モデルおよび／またはイン・ビトロ（in vitro）モデルにおいてコレスチラミンによって調節される遺伝子は、この剤の治療上の利益に寄与することが予想され、心血管疾患／アテローム性動脈硬化症／ジスリピデミア／脂質障害を治療するための新たな治療上の標的を表すことが予想される。フィブレートはトリグリセリドを低下させるために臨床的に使用されており、スタチンはコレステロールを低下させるために臨床的に使用されており、その両方はアテローム性動脈硬化症／冠動脈疾患に対するよく明らかにされている危険因子である。動物モデルおよび／またはイン・ビトロ（in vitro）モデルにおいてこの組合せ処理によって調節される遺伝子は、これらの剤の治療上の利益に寄与することが予想され、心血管疾患／アテローム性動脈硬化症／ジスリピデミア／脂質障害を治療するための新たな治療上の標的を表すことが予想される。３２２４８はヒト肝臓において多く発現していた。
３２２４８の調節は総コレステロールおよびトリグリセリドを低下することが予想される。
【００４９】
遺伝子ＩＤ６０４８９
非翻訳領域を含むほぼ１２５５ヌクレオチド長であるヒト６０４８９配列（配列番号：２７）は、終止コドンを含む約１０２３ヌクレオチドの予想されるメチオニン開始コード配列を含む。コード配列は３４１アミノ酸タンパク質（配列番号：２８）をコードしている。
【００５０】
ＴａｑＭａｎ分析によって調べたごとく、６０４８９ｍＲＮＡの発現はヒトにおける肝臓、大腸、小腸に限定されている。また、６０４８９ｍＲＮＡはスタチンまたはＰＰＡＲアルファのいずれかまたは組み合わせて処理したヒト肝細胞においてアップレギュレートされた。６０４８９はジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの新規なメンバーである。これらの分子はトリグリセリド生合成において極めて重要な役割を演じることが知られている。６０４８９の標的化阻害はトリグリセリドを低下し、したがってアテローム性動脈硬化症および高脂血症に対して保護的であることが予想されるであろう。
【００５１】
遺伝子ＩＤ９３８０４
非翻訳領域を含むほぼ１３６５ヌクレオチド長であるヒト９３８０４配列（配列番号：２９）（ＧＩ：４１５４２８６、ナプシンＡとしても知られている）は、終止コドンを含む約１２６０ヌクレオチドの予想されるメチオニン開始コード配列を含む。コード配列は４２０アミノ酸タンパク質（配列番号：３０）をコードしている（ＧＩ：４１５４２８７）。
【００５２】
ＴａｑＭａｎ分析およびイン・サイチュ（in situ)ハイブリダイゼーションによって調べたごとく、９３８０４はアテローム性動脈硬化症のイン・ビトロ（in vitro）およびイン・ビボ(in vivo)モデルにおいて調節される。９３８０４ｍＲＮＡは単球およびマクロファージにおける脂質負荷の間にアップレギュレートされる。アテローム発生開始の１の顕著な特徴は、脂質負荷マクロファージの形成である。９３８０４は、イン・ビトロ（in vitro）単球／マクロファージ培養系における脂質負荷パラダイムの間に転写のアップレギュレーションを示す。複数の供与者を用いた多重実験を行った。１の供与者実験（供与者１）においては、単球を適度に酸化したＬＤＬ（ｏｘ−ＬＤＬ）で種々の時間；６時間、４８時間および７２時間刺激した。修飾型ｏｘ−ＬＤＬによる刺激は、単球に脂質を負荷する。９３８０４は中度に酸化されたＬＤＬを用いた６時間の刺激の間にわずかなアップレギュレーション、×１.３を示した。修飾ｏｘ−ＬＤＬによる長期刺激の間においては、９３８０４は単球における脂質負荷プロセスの間に適度のアップレギュレーション、７.２×を示した。
【００５３】
他の供与者実験（供与者６）において、単球を種々の修飾ＬＤＬ；温和に酸化されたＬＤＬ、中度に酸化されたＬＤＬ、およびアセチル化されたＬＤＬで刺激した。９３８０４は３のすべての試薬によってアップレギュレートされた。
【００５４】
９３８０４はＡｐｏＥ欠損血管のなりがちな領域である障害においてアップレギュレートされた。ＡｐｏＥ欠損動物は自然にアテローム性動脈硬化症障害を形成する。障害は大動脈弁領域および上行大動脈の弓状部分に形成されるが、下行大動脈には障害はほとんど形成されない。９３８０４はＡｐｏＥ欠損動物においては大動脈の非障害領域と比較してアテローム障害に富む領域においてより多くの発現を示した。このことは、ＴａｑＭａｎ実験によって定量的に観察された。詳細には、９３８０４の発現は、下行大動脈の領域と比較した場合に大動脈の弓領域においてより高かった。
【００５５】
９３８０４はサル・アテロームモデルにおいてアップレギュレートされた。９３８０４は、ＴａｑＭａｎ実験によって、正常な血管と比較してサル・アテローム血管において高い発現が示された。この実験について観察した３の正常なサル血管の中で、９３８０４ｍＲＮＡの発現は検出されなかった。この実験について観察した６のサル・アテロームの中で、９３８０４ｍＲＮＡの発現は４のアテローム試料において検出された。
【００５６】
９３８０４は種々のヒト器官の中で非常に制限された発現を示した。最も高い発現は肺において見出された。低ないし中度の発現は扁桃、リンパ節、脳および腎臓において示された。
【００５７】
アテローム性動脈硬化症は、活性化した単球／マクロファージ、内皮細胞、平滑筋細胞および動脈壁の体液および細胞媒介免疫学的応答の間の相互作用から生じる、慢性の炎症性疾患であると考えられている。この理由から、これらの血管機構に関与している遺伝子の同定はアテローム性動脈硬化症を予防する新規かつ有効な治療上の標的につながり得る。
【００５８】
９３８０４はアスパラギン酸プロテアーゼのファミリーに属する。アスパラギン酸プロテアーゼは、触媒機構に寄与する２のアスパラギン酸残基を有することによって分類される。幾つかのよく明らかにされた酵素が酵素のこのファミリーに属する：ペプシン、ガストリシン、レニン、カテプシンおよびＨＩＶプロテアーゼ。この３０年間に、アスパラギン酸プロテイナーゼのファミリーは生理学／病態生理学におけるその重要な役割に起因してよく実験された。
【００５９】
単球／マクロファージにおける脂質負荷プロセスの間に９３８０４がアップレギュレーションを示したことは、アテローム発生におけるその役割を示唆している。９３８０４遮断はアテローム性動脈硬化症血管における障害形成を低下させ、それによってアテローム発生の進行を和らげ得る。９３８０４は、アテローム発生プロセスを表すイン・ビトロ（in vitro）およびイン・ビボ(in vivo)パラダイムの両方において調節される。９３８０４は、イン・ビトロ（in vitro）実験において単球／マクロファージの脂質負荷プロセスの間にアップレギュレートされる。また、９３８０４は、ＡｐｏＥ欠損動物において、大動脈の非障害領域と比較してアテローム障害に富む領域において高い発現を示した。これらの調節は９３８０４のアテローム発生効果を強く示唆している。したがって、９３８０４の阻害はアテローム発生の低下を生じるであろう。
本発明の種々の態様を以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載する：
【００６０】
Ｉ．スクリーニングアッセイ：
本発明は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質に結合する、例えば１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４の発現または１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４の活性に対して刺激または阻害効果を有する、または例えば１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４基質の発現または活性に対して刺激または阻害効果を有する、モジュレーター、すなわち候補または試験化合物または剤（例えば、ペプチド、ペプチドミメティック、小分子（有機または無機）または他の薬剤）を同定するための方法（本明細書中では"スクリーニングアッセイ"ともいう）を提供する。本明細書中に記載するアッセイを用いて同定した化合物は、心血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症および／または血栓症を治療するのに有用となり得る。
【００６１】
これらのアッセイは、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質に結合する、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質と相互作用する他の細胞内または細胞外のタンパク質に結合する、ならびに１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質と他の細胞内もしくは細胞外のタンパク質との相互作用を妨害する化合物を同定するよう設計する。例えば、貫膜受容体型のタンパク質である１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質の場合、かかる技術はかかる受容体についてのリガンドを同定し得る。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質リガンドまたは基質を用いて、例えば、心血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症、虚血／再潅流、高血圧症、再狭窄、動脈炎症、血栓症および内皮細胞障害を改善し得る。かかる化合物には、限定されるものではないが、ペプチド、抗体、または小さい有機または無機の化合物が含まれ得る。かかる化合物には、他の細胞タンパク質も含まれ得る。
【００６２】
本明細書に記載するようなアッセイを介して同定した化合物は、例えば、心血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症および／または血栓症を改善するのに有用となり得る。それによって、全体的に低いレベルの１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４の遺伝子発現、および／または全体的に低いレベルの細胞もしくは組織中の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質から生じる心血管疾患状態の場合には、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質と相互作用する化合物には、結合した１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質の活性を強調するまたは増幅する化合物が含まれ得る。かかる化合物は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質活性のレベルを有効に上昇させ、したがって症状を改善するであろう。
【００６３】
他の例において、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子内の突然変異は、心血管疾患に通じる有害な効果を有する、異常な型または過剰な量の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質を引き起こし得る。同様にして、生理的条件は、心血管疾患に通じる１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子発現における過剰な上昇を引き起こし得る。かかる場合においては、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質に結合する化合物は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質の活性を阻害する化合物として同定し得る。本セクションにおいて記載したもののごとき技術によって同定した化合物の有効性を試験するためのアッセイをここに論じる。
【００６４】
１の具体例において、本発明は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質またはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分の基質である候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。もう１の具体例において、本発明は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質またはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合するかまたはそれらの活性をモジュレートする候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該技術分野において知られているコンビナトリアル・ライブラリー法における膨大なアプローチ（生物ライブラリー；空間的にアドレス指定可能なパラレル固相または液相ライブラリー；デコンヴォルーション（deconvolution）を要する合成ライブラリー法；’ワンビーズワン化合物（one-bead one-compound）’ライブラリー法；ならびにアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を含む）のうちのいずれかを用いて得ることができる。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用し得る(Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145)。
【００６５】
分子ライブラリーの合成方法の例は、例えば：DeWittら、(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90: 6909；Erbら、(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422；Zuckermannら、(1994) J. Med. Chem. 37: 2678；Choら、(1993) Science 261: 1303；Carrellら、(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059；Carellら、(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061；ならびにGallopら、(1994) J. Med. Chem. 37: 1233に見出し得る。
【００６６】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Houghten (1992) Biotechniques 13: 412-421）、またはビーズ上(Lam (1991) Nature 354: 82-84)、チップ上(Fodor (1993) Nature 364: 555-556)、細菌上 (Ladner USP 5,223,409号)、胞子上 (Ladner USP '409号)、プラスミド上(Cullら、(1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 1865-1869)もしくはファージ上(ScottおよびSmith (1990) Science 249: 386-390)；(Devlin (1990) Science 249: 404-406)；(Cwirlaら、(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382)；(Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-310)；(Ladner前掲)に存在し得る。
【００６７】
１の具体例において、アッセイは、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質またはその生物学的に活性な部分を発現する細胞を試験化合物と接触させ、ついで１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４活性をモジュレートする試験化合物の能力を判定する細胞ベースアッセイである。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４活性をモジュレートする試験化合物の能力を判定することは、例えば、細胞内カルシウム、ＩＰ３、ｃＡＭＰ、またはジアシルグリセロール濃度、細胞内タンパク質のリン酸化プロフィール、細胞増殖および／または細胞移動、例えば細胞表面接着分子もしくは血管形成に関連する遺伝子の遺伝子発現、または１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４−調節される転写因子の活性をモニターするこによって行い得る。細胞は哺乳動物起源のもの、例えば内皮細胞とし得る。１の具体例において、受容体ドメインと相互作用する化合物は、リガンドとして機能する、すなわち受容体に結合し、シグナル伝達経路をモジュレートするその能力についてスクリーニングし得る。リガンドの同定、およびリガンド−受容体複合体の活性の測定は、この相互作用のモジュレーター（例えば、アンタゴニスト）の同定につながる。かかるモジュレーターは、心血管疾患の治療に有用となり得る。
【００６８】
基質に結合する１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４をモジュレートする試験化合物の能力、または１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４に結合する試験化合物の能力も判定し得る。基質に結合する１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４をモジュレートする試験化合物の能力を判定することは、例えば、コンプレックス中の標識した１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４基質を検出することによって１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４基質の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４に対する結合を判定し得るように、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４基質とラジオアイソトープまたは酵素標識とをカップリングすることによって行い得る。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４は、ラジオアイソトープまたは酵素標識とカップリングして、複合体中の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４基質に対して結合する１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４をモジュレートする試験化合物の能力をモニターすることもできた。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４に結合する試験化合物の能力を判定することは、例えば、複合体中の標識した１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４化合物を検出することによって化合物の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４に対する結合を判定し得るように、化合物とラジオアイソトープまたは酵素標識とをカップリングすることによって行い得る。例えば、化合物（例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４リガンドまたは基質）は、直接的または間接的に１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで標識し得、ラジオアイソトープは放射線放出を直接カウントすることによってか、またはシンチレーションをカウントすることによって検出する。化合物は、さらに、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼ、ならびに適当な基質の生成物への変換を判定することによって検出する酵素標識で酵素を用いて標識することもできる。
【００６９】
いずれの相互作用物も標識することなく、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４と相互作用する化合物（例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４リガンドまたは基質）の能力を判定することも本発明の範囲内に入る。例えば、マイクロフィジオメーターを用いて、化合物も１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４も標識することなく、化合物と１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４との相互作用を検出し得る(McConnell, H. M.ら、(1992) Science 257: 1906-1912）。本明細書中で用いる"マイクロフィジオメーター"（例えば、サイトセンサー）は、光アドレス可能な電位差センサー（light-adressable potentiometric sensor、ＬＡＰＳ）を用いて細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度における変化は、化合物と１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４との間の相互作用の指標として用い得る。
【００７０】
もう１の具体例において、アッセイは、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４標的分子（例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４基質）を発現する細胞と試験化合物とを接触させ、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４標的分子の活性をモジュレートする（例えば、刺激または阻害する）試験化合物の能力を判定することを含む細胞ベースアッセイである。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４標的分子の活性をモジュレートする試験化合物の能力を判定することは、例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４標的分子に結合するかまたはそれと相互作用する１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質の能力を判定することによって行い得る。
【００７１】
１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４標的分子に結合するかまたはそれと相互作用する１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質またはその生物学的に活性なフラグメントの能力を判定することは、直接的な結合を判定するための前記した方法のうちの１によって行い得る。好ましい具体例において、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４標的分子に結合するかまたはそれと相互作用する１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質の能力を判定することは、標的分子の活性を判定することによって行い得る。例えば、標的分子の活性は、標的の細胞セカンドメッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３、ｃＡＭＰ）の誘導を検出するか、適当な基質に対する標的の触媒／酵素活性を検出するか、（検出可能なマーカー、例えばルシフェラーゼをコードする核酸に作動可能に連結した標的応答性の調節エレメントを含む）レポーター遺伝子の誘導を検出するか、または標的調節された細胞応答（例えば遺伝子発現）を検出することによって判定し得る。
【００７２】
いまだもう１の具体例において、本発明のアッセイは、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させ、ついで１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する試験化合物の能力を判定する無細胞（cell-free）アッセイである。本発明のアッセイに用いる１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質の好ましい生物学的に活性な部分には、非−１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４分子との相互作用に関与するフラグメント、例えば高い表面存在確率スコア（high surface probability score）を有するフラグメントが含まれる。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質に対する試験化合物の結合は、前記したごとく直接的または間接的のいずれかで判定し得る。好ましい具体例において、アッセイには、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質またはその生物学的に活性な部分と、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４に結合する既知の化合物とを接触させてアッセイ混合物を形成させ、該アッセイ混合物と試験化合物とを接触させ、ついで１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を判定することが含まれ、ここに１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を判定することには、既知の化合物と比較して、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４またはその生物学的に活性な部分に優先的に結合する試験化合物の能力を判定することが含まれる。既知の標的タンパク質と１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４との相互作用をモジュレートする化合物は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質、とりわけ突然変異１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質の活性を調節するのに有用となり得る。
【００７３】
もう１の具体例において、アッセイは、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させ、ついで１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性をモジュレートする（例えば、刺激または阻害する）試験化合物の能力を判定する無細胞アッセイである。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質の活性をモジュレートする試験化合物の能力を判定することは、例えば、直接結合を判定するための前記した方法のうちの１によって、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４標的分子に結合する１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質の能力を判定することによって行い得る。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４標的分子に結合する１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質の能力を判定することは、リアルタイム−バイオモレキュラー・インタラクション・アナライシス（Biomolecular Interaction Analysis 、ＢＩＡ)（Sjolander, S.およびUrbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63: 2338-2345 およびSzaboら、(1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705)のごとき技術を用いても行い得る。本明細書中で用いる"ＢＩＡ"とは、いずれの相互作用物をも標識することなく（例えば、ＢＩＡcore）、リアルタイムで生物特異的相互作用を調べる技術である。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象における変化は、生物分子間のリアルタイム反応の指標として用い得る。
【００７４】
もう１の具体例において、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質の活性をモジュレートする試験化合物の能力を判定することは、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４標的分子の下流エフェクターの活性をさらにモジュレートする１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質の能力を判定することによって行い得る。例えば、適当な標的に対するエフェクター分子の活性を判定し得、あるいは適当な標的に対するエフェクターの結合を以前に記載したごとく判定し得る。
【００７５】
いまだもう１の具体例において、無細胞アッセイには、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質またはその生物学的に活性な部分と、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質に結合する既知の化合物とを接触させてアッセイ混合物を形成させ、該アッセイ混合物と試験化合物とを接触させ、ついで１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を判定することが含まれ、ここに１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を判定することには、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４標的分子に優先的に結合するかまたはその活性を優先的にモジュレートする１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質の能力を判定することが含まれる。
【００７６】
本発明の前記アッセイ方法の１を超える具体例において、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４またはその標的分子のいずれかを固定化して、タンパク質のうちの１または両方の非複合体形成形態から複合体形成形態の分離を促進し、ならびにアッセイの自動化の便宜を図ることが望ましい場合がある。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質に対する試験化合物の結合、または候補化合物の存在下および不存在下の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質と標的分子との相互作用は、反応物を含有するのに好適ないずれの容器中においても行い得る。かかる容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管および卓上遠心チューブが含まれる。１の具体例において、タンパク質の一方または両方をマトリックスに結合させるドメインを付加する融合タンパク質を提供し得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質をグルタチオン・セファロースビーズ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）またはグルタチオン誘導化マイクロタイタープレート上に吸着させ、ついでそれを試験化合物または試験化合物および非吸着標的タンパク質または１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質のいずれかと合し、ついで混合物を複合体形成に資する条件下で（例えば、塩およびｐＨについて生理学的条件にて）インキュベートする。インキュベーションの後に、ビーズまたはマイクロタイタープレートのウェルを洗浄していずれの非結合成分をも除去し、例えば前記したごとく、直接的または間接的のいずれかでビーズの場合においては固定化したマトリックス、複合体を判定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させ、ついで１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４結合または活性のレベルを標準的な技術を用いて判定し得る。
【００７７】
マトリックス上にタンパク質を固定化するための他の技術も、本発明のスクリーニングアッセイに用い得る。例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質または１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４標的分子のいずれかを、ビオチンおよびストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して固定化し得る。ビオチン化した１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質または標的分子は、当該技術分野で知られている技術（例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, IL）を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（Pierce Chemical）のウェルに固定化し得る。あるいは、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質または標的分子と反応するが、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質のその標的分子に対する結合は妨害しない抗体をプレートのウェルに誘導化し、非結合標的または１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質を抗体コンジュゲーションによってウェルにトラップする。ＧＳＴ−固定化複合体について前記したものに加えて、かかる複合体を検出するための方法には、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質または標的分子と反応する抗体を用いる複合体の免疫検出、ならびに１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質または標的分子と関連する酵素活性を検出することに依存する酵素結合アッセイが含まれる。
【００７８】
もう１の具体例において、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物と接触させ、細胞中の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を判定する方法において同定する。候補化合物存在下の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを、候補化合物不存在下の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較する。ついで、この比較に基づいて、候補化合物を１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４発現のモジュレーターとして同定し得る。例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物不存在下よりも存在下において大きい（統計学上有意に大きい）場合には、候補化合物は１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激剤として同定される。あるいは、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物不存在下よりも存在下において小さい（統計学上有意に小さい）場合には、候補化合物は１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤として同定される。細胞中の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出することに関して本明細書に記載した方法によって判定し得る。
【００７９】
本発明のいまだもう１の態様において、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおける"餌（bait）タンパク質"として用いて（例えば、米国特許第5,283,317号；Zervosら、(1993) Cell 72: 223-232；Maduraら、(1993) J. Biol. Chem. 268: 12046-12054；Bartelら、(1993) Biotechniques 14: 920-924；Iwabuchiら、(1993) Oncogene 8: 1693-1696；およびBrent W094/10300を参照されたい)、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４に結合するかまたはそれと相互作用し（"１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４−結合タンパク質"または"１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４−ｂｐ"）、かつ、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４活性に関与する他のタンパク質を同定し得る。かかる１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４−結合タンパク質は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質、または例えば１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４−媒介シグナル伝達経路の下流エレメントとしての１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４標的によるシグナルの伝搬にも関与しているようである。あるいは、かかる１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４−結合タンパク質は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４阻害剤であるようである。
【００８０】
ツーハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ−結合ドメインおよび活性化ドメインからなる大部分の転写因子のモジュール性質に基づく。簡単には、アッセイは、２の異なるＤＮＡ構築物を利用する。１の構築物において、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質をコードする遺伝子を、既知の転写因子（例えばＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。他の構築物において、未同定のタンパク質（"プレイ（prey)"または"試料"）をコードする、ＤＮＡ配列のライブラリーからのＤＮＡ配列を既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。"餌"および"プレイ"タンパク質がイン・ビボ(in vivo)で相互作用して１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４−依存の複合体を形成し得る場合には、転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは近接していることとなる。この近接によって、転写因子に応答性である転写調節サイトに作動可能に連結したレポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写が許容される。レポーター遺伝子の発現は検出し得、機能転写因子を含有する細胞コロニーを単離して、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得るために用い得る。
【００８１】
もう１の態様において、本発明は、本明細書中に記載する２またはそれを超えるアッセイの組合せに関する。例えば、モジュレート剤は細胞ベースアッセイまたは無細胞アッセイを用いて同定し得、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質の活性をモジュレートする剤の能力は、本明細書中に記載する心血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症および／または血栓症の動物モデルのごとき動物においてイン・ビボ(in vivo)で確認し得る。
【００８２】
さらに、本発明は、前記したスクリーニングアッセイによって同定した新規な剤に関する。したがって、適当な動物モデルで本明細書中で記載したごとく同定した剤をさらに使用することも本発明の範囲に入る。例えば、本明細書中に記載したごとく同定した剤（例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４モジュレート剤、アンチセンス１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４核酸分子、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４−特異的抗体、または１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４−結合パートナー）を動物モデルにおいて用いて、かかる剤を用いた治療の効力、毒性または副作用を判定し得る。あるいは、本明細書に記載したごとく同定した剤を動物モデルにおいて用いて、かかる剤の作用機作を判定し得る。さらに、本発明は、本明細書に記載したごとく治療するための前記したスクリーニングアッセイによって同定した新規な剤の使用に関する。
【００８３】
限定されるものではないが、前記のアッセイシステムにおいて同定したもののごとき化合物を含むいずれの化合物も、心血管疾患症状を治療する能力について試験し得る。心血管疾患系を改善するかかる能力を示す化合物を同定するための細胞ベースおよび動物モデルベースのアッセイを本明細書に記載する。
【００８４】
１の態様において、本明細書中に記載する細胞ベースの系を用いて、少なくとも１の心血管疾患症状を治療するように作用し得る化合物を同定し得る。例えば、かかる細胞系は、曝露された細胞において心血管疾患症状のかかる改善を誘起するのに十分な濃度および時間で、心血管疾患症状を治療する能力を示すことが疑われる化合物に曝露し得る。曝露した後に、細胞を調べて１またはそれを超える心血管疾患細胞表現型がより正常またはより野生型の非−心血管疾患表現型に似るように変化したかを判定する。心血管疾患状態関連する細胞表現型には、異常な増殖および移動、血管形成、細胞外マトリックス成分の沈殿、細胞内脂質の蓄積、および成長因子、サイトカインおよび他の炎症メディエーターの発現が含まれる。
【００８５】
また、本明細書中に記載したごとく、動物ベース心血管疾患系を用いて、心血管疾患症状を改善することができる化合物を同定し得る。かかる動物モデルは、心血管疾患を治療するのに有効となり得る薬剤、医薬、治療剤、および仲介剤を同定するための試験基質として用い得る。例えば、動物モデルを、曝露した動物において心血管疾患症状のかかる改善を誘起するのに十分な濃度および十分な時間、心血管疾患症状を改善する能力を示すことが疑われる化合物に曝露し得る。曝露に対する動物の応答は、例えば、アテローム性動脈硬化症病斑の数をカウントし、および／またはそのサイズを治療の前後でカウントすることによって心血管疾患と関連する障害の反転を調べることによってモニターし得る。
【００８６】
仲介に関しては、心血管疾患症状のいずれの態様を反転するいずれの治療も、ヒト心血管疾患治療仲介の候補と考えなければならない。試験剤の投与量は、用量−応答曲線を推定することによって決定し得る。
【００８７】
さらに、遺伝子発現パターンを利用して、心血管疾患症状を改善する化合物の能力を評価し得る。例えば、１またはそれを超える遺伝子の発現パターンは"遺伝子発現プロフィール"または"転写プロフィール"の一部を形成し得、ついでこれをかかる評価に用い得る。本明細書中で用いる"遺伝子発現プロフィール"または"転写プロフィール"には、所定の症状下で所定の組織または細胞型について得られたｍＲＮＡ発現パターンが含まれる。かかる条件には、限定されるものではないが、本明細書中に記載するいずれかの対照または実験的症状、例えばマクロファージのアテローム発生サイトカイン刺激、を含む、アテローム性動脈硬化症、虚血／再潅流、高血圧症、再狭窄および動脈炎症が含まれ得る。遺伝子発現プロフィールは、例えば、ディファレンシャル・ディスプレイ法（differential display procedure）、ノザン分析および／またはＲＴ−ＰＣＲを利用することによって生成し得る。１の具体例において、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４モジュレート剤、アンチセンス１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子配列を、かかる遺伝子発現プロフィールを作成し、確証するためのプローブおよび／またはＰＣＲプライマーとして用い得る。
【００８８】
遺伝子発現プロフィールは、細胞ベースおよび／または動物ベースのモデル系内で心血管疾患または正常人のいずれかの既知の状態について特徴付けし得る。その後に、これらの既知の遺伝子発現プロフィールを比較して、かかる遺伝子発現プロフィールを改善し、より望ましいプロフィールのものにより酷似させる試験化合物が有する効果を確かめ得る。
【００８９】
例えば、化合物の投与は、心血管疾患モデル系の遺伝子発現プロフィールを対照系により酷似させ得る。あるいは、化合物の投与は、対照系の遺伝子発現プロフィールを心血管疾患状態を模倣し始めさせ得る。かかる化合物は、例えば、関心のある化合物をさらに特徴付けるのに使用し得、あるいはさらなる動物モデルの創製に使用し得る。
【００９０】
ＩＩ．細胞ベースおよび動物ベースモデル系
心血管疾患のモデルとして作用する細胞ベースおよび動物ベース系を本明細書に記載する。これらの系は、種々の適用に使用し得る。例えば、細胞ベースおよび動物ベースモデル系は、心血管疾患と関連する異なって発現する遺伝子、例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４をさらに特徴付けるために使用し得る。また、動物ベースおよび細胞ベースアッセイは、下記のごとく、心血管疾患症状を改善することができる化合物を同定するよう設計されたスクリーニング・ストラテジーの一部分として使用し得る。したがって、動物ベースおよび細胞ベースモデルを用いて、心血管疾患を治療するのに有効となり得る薬剤、医薬、治療剤および仲介剤を同定し得る。さらに、かかる動物モデルを用いて、動物対象におけるＬＤ５０およびＥＤ５０を決定し得、かかるデータを用いて潜在的な心血管疾患治療のイン・ビボ(in vivo)効力を判定し得る。
【００９１】
Ａ．動物ベース系
心血管疾患の動物ベースモデル系には、限定されるものではないが、非組換えおよび改変トランスジェニック動物が含まれ得る。
心血管疾患の非組換え動物モデルには、例えば遺伝モデルが含まれ得る。かかる遺伝心血管疾患モデルには、例えばＡｐｏＢまたはＡｐｏＲ欠損ブタ(Rapaczら、1986, Science 234: 1573-1577)ならびにWatanabe遺伝性高脂血症（ＷＨＨＬ）ウサギ（Kitaら、1987, Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 5928-5931)が含まれ得る。心血管疾患および血管形成におけるトランスジェニック・マウスモデルは、Carmeliet, P.およびCollen, D. (2000) J. Pathol. 190: 387-405に概説されている。
【００９２】
アテローム性動脈硬化症の非組換え、非遺伝動物モデルには、例えば、動物をＬＤＬの食餌供給を介した化学的に傷つけたかまたはバルーンカテーテル血管形成術を介して機械的に傷つけたかのいずれかに曝露する、ブタ、ウサギ、またはラットモデルが含まれ得る。心血管疾患の動物モデルには、ラット心筋梗塞モデル（例えば、Schwarz, ERら、(2000) J. Am. Coll. Cardiol. 35: 1323-1330に記載されている）およびウサギにおけるクロム性心臓虚血のモデル（例えば、Operschall, C.ら、(2000) J. Appl. Physiol. 88: 1438-1445に記載されている）も含まれる。
【００９３】
さらに、心血管疾患症状を示す動物モデルは、例えば当業者によく知られているトランスジェニック動物を創製する技術と組み合わせて、前記した１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子配列を用いることによって改変し得る。例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子配列を関心のある動物のゲノムに導入し、そこで過剰発現させ得、あるいは、マウスにおけるＡｐｏＥの破壊について記載されているごとく（Plumpら、1992, Cell 71 : 343-353)１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子発現を発現低下または不活性化するために破壊し得る。
【００９４】
本発明の宿主細胞を用いて、非−ヒトトランスジェニック動物を創製することもできる。例えば、１の具体例において、本発明の宿主細胞は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４コード配列が導入されている受精卵母細胞または胚性幹細胞である。ついで、かかる宿主細胞を用いて、外因性１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４配列がそのゲノムに導入されている非−ヒトトランスジェニック動物または内因性１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４配列が改変されている同一族組換え動物を創製し得る。かかる動物は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４の機能および／活性を調べるのに有用であり、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４活性のモジュレーターを同定および／または評価するのに有用である。本明細書で用いる"トランスジェニック動物"とは、動物の１またはそれを超える細胞がトランス遺伝子を含む、非−ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラットまたはマウスのごとき齧歯類である。トランスジェニック動物の他の例には、非−ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、トリ、両生類などが含まれる。トランス遺伝子とは、それからトランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれた外因性ＤＮＡであり、それは成熟動物のゲノムに残り、それによってトランスジェニック動物の１またはそれを超える細胞型または組織におけるコード遺伝子産物の発現を指示する。本明細書で用いる"同一族組換え動物"とは、内因性１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子が、内因性遺伝子と動物の細胞、例えば動物の胚細胞に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同性組換えによって動物の発生前に改変されている非−ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスである。
【００９５】
本発明の方法で用いるトランスジェニック動物は、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって受精した卵母細胞の雄性前核に１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４コード核酸を導入し、ついで卵母細胞を偽妊娠雌性養動物において発生させることによって創製し得る。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ｃＤＮＡ配列は、非−ヒト動物のゲノムにトランス遺伝子として導入し得る。あるいは、マウスまたはラットの１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子のごとき、ヒト１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子の非ヒトホモログをトランス遺伝子として用い得る。あるいは、もう１の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ファミリーメンバーのごとき、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子ホモログを、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ｃＤＮＡ配列に対するハイブリダイゼーションに基づいて単離してトランス遺伝子として用い得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルをトランス遺伝子に含めて、トランス遺伝子の発現効率を高めることもできる。組織特異的調節配列（群）を１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４トランス遺伝子に作動可能に連結して、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質を特定の細胞の発現を指示させ得る。胚操作およびマイクロインジェクションを介してトランスジェニック動物、詳細にはマウスのごとき動物を創製する方法は、当該技術分野における慣用技術となってきており、例えば両方ともLederらによる米国特許第4,736,866号および第4,870,009号、Wagnerらによる米国特許第4,873,191号ならびにHogan, B. "Manipulating the Mouse Embryo", (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)に記載されている。同様な方法を他のトランスジェニック動物の創製にも用いる。トランスジェニック養動物は、そのゲノム中の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４トランス遺伝子の存在および／または動物の組織または細胞における１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ｍＲＮＡの発現に基づいて同定し得る。ついで、トランスジェニック養動物を用いて、トランス遺伝子を運搬するさらなる動物を繁殖し得る。さらに、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質をコードするトランス遺伝子を運搬するトランスジェニック動物を他のトランス遺伝子を運搬する他のトランスジェニック動物に繁殖させ得る。
【００９６】
同一族組換え動物を創製するためには、欠失、付加または置換が導入され、それによって、例えば１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子が変化する、例えば機能的に分裂する、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子の少なくとも一部分を含むベクターを調製する。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子はヒト遺伝子とし得るが、より好ましくはヒト１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子の非−ヒトホモログである。例えば、ラット１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子を用いて、マウスゲノム中の内因性１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子を変化するのに好適な、相同組換え核酸分子、例えばベクターを構築し得る。好ましい具体例において、相同組換え核酸分子は、相同性組換えの際に、内因性１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子が機能的に分裂する（すなわち、もはや機能性タンパク質をコードしない；または"ノックアウト"ベクターともいう）ように改変する。あるいは、相同組換え核酸分子は、相同性組換えの際に、内因性１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子が突然変異し、さもなければ変化するがなお機能性タンパク質をコードするようにも設計し得る（例えば、上流調節領域を変化させ、それによって、内因性１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質の発現を変化させる）。相同組換え核酸分子においては、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子の変化した部分は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子のさらなる核酸配列によってその５’末端と３’末端において挟まれており、相同性組換え核酸分子によって運搬される内因性１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子と細胞中、例えば胚性幹細胞中の内因性１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子との間で相同性組換えを生じさせる。さらなるフランキング１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４核酸配列は、内因性遺伝子との相同性組換えが首尾よくいく十分な長さのものである。典型的には、数キロベースのフランキングＤＮＡが（５’および３’末端の両方に）相同性組換え核酸分子中に含まれる（例えば、相同性組換えベクターの記載についてはThomas, K. R. およびCapecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503を参照されたい）。相同性組換え核酸分子は（例えば、エレクトロポレーションによって）細胞、例えば胚性幹細胞ラインに導入し、導入した１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子が内因性１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子と相同的に組換わっている細胞を選抜する（例えば、Li, E.ら、(1992) Cell 69: 915を参照されたい）。ついで、選抜した細胞を動物（例えば、マウス）の胚盤胞に注射して、集合（aggregation）キメラを形成し得る（例えば、Bradley, A. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson編 (IRL, Oxford, 1987) pp. 113-152を参照されたい）。ついで、キメラ胚を好適な偽妊娠雌性養動物に移植し、胚を承伏（bring to term）させ得る。相同的組換えＤＮＡを生殖細胞に担っている子孫を用いて、トランス遺伝子の生殖細胞系列の伝達によって動物の全細胞が相同的組換えＤＮＡを含む動物を繁殖させ得る。相同性組換え核酸分子、例えばベクターまたは同一族組換え動物を構築する方法は、さらにBradley, A. (1991) Current Opinion in Biotechnology 2: 823-829およびLe Mouellecらによる国際公開番号WO 90／11354；SmithiesらによるWO 91／01140；ZijlstraらによるWO 92／0968；およびBernsらによるWO 93／04169にも記載されている。
【００９７】
もう１の具体例において、本発明の方法に用いるトランスジェニック非−ヒト動物は、トランス遺伝子の調節された発現を許容する選択した系を含めて創製し得る。かかる系の一例は、バクテリオファージＰ１のcre／loxPリコンビナーゼ系である。cre／loxPリコンビナーゼ系の記載に関しては、例えばLaksoら（1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236を参照されたい。リコンビナーゼ系のもう１の例はSaccharomyces cerevisiaeのＦＬＰリコンビナーゼ系である（O'Gormanら (1991) Science 251: 1351-1355）。cre／loxPリコンビナーゼ系を用いてトランス遺伝子の発現を調節する場合には、Creリコンビナーゼおよび選択したタンパク質の両方をコードするトランス遺伝子を含む動物が必要である。かかる動物は、例えば２のトランスジェニック動物（１は選択したタンパク質をコードするトランス遺伝子を含み、もう１はリコンビナーゼをコードするトランス遺伝子を含む）を交配させることによって、"二重"トランスジェニック動物の構築を通して得ることができる。
【００９８】
本明細書に記載する非−ヒトトランスジェニック動物のクローンは、Wilmut, Iら、(1997) Nature 385: 810-813および国際公開番号WO 97／07668およびWO 97／07669に記載された方法に従っても創製し得る。簡単には、トランスジェニック動物からの細胞、例えば体細胞を単離し、成長サイクルを出てＧ０期に入ることを誘導し得る。ついで、例えば電気パルスの使用を介して、静止状態にある細胞（quiescent cell）をその静止状態にある細胞を単離したのと同じ種の動物からの除核卵母細胞に融合し得る。ついで、復元した卵母細胞を、それが桑実胚または胚盤胞に発生するように培養し、ついで偽妊娠雌性養動物に移す。この雌性養動物の生まれた子孫は、細胞、例えば体細胞を単離した動物のクローンであろう。
【００９９】
ついで、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ｍＲＮＡまたは（１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４エピトープに対して指向された抗体を用いて免疫組織化学的に検出した）１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ペプチドを容易に検出可能なレベルで発現する１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４トランスジェニック動物をさらに評価して、特徴的な心血管疾患症状を呈する動物を同定すべきである。かかる心血管疾患症状には、例えば、大きな発病率およびサイズの脂肪線条および／または心血管疾患病斑が含まれ得る。
【０１００】
さらに、トランスジェニック動物内の特定の細胞型（例えば、内皮細胞）を、心血管疾患に特徴的な細胞表現型について分析およびアッセイし得る。内皮細胞の場合には、かかる表現型には、限定されるものではないが、細胞増殖、移動、血管形成、前炎症成長因子およびサイトカインの産生、ならびに炎症細胞に対する接着が含まれる。単球の場合には、かかる表現型には、限定されるものではないが、ＬＤＬ取り込み速度の上昇、内皮細胞に対する接着、遊走、泡沫細胞形成、脂肪線条形成、および泡沫細胞特異的産物の生成が含まれ得る。細胞表現型には、心血管疾患症状を呈する動物における特定の細胞型の既知の発現プロフィールと比較した心血管疾患と関連する遺伝子の発現の特定の細胞型のパターンが含まれる。
【０１０１】
Ｂ．細胞ベース系
１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質をコードする１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子配列を含み、それを発現し、かつ、さらに心血管疾患と関連する細胞表現型を呈する細胞を用いて、抗−心血管疾患活性を示す化合物を同定し得る。かかる細胞には、Ｕ９３７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５９３）、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−２０２）およびＰ３８８Ｄ１（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−６３）のごとき非組換え単球セルライン；ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）およびウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）のごとき内皮細胞；ならびに、ＨｅＬａ細胞およびＣＯＳ細胞、例えばＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１６５１）のごとき一般的な哺乳動物セルラインが含まれ得る。さらに、かかる細胞には、組換えトランスジェニックセルラインが含まれ得る。例えば、先に論じた本発明の心血管疾患動物モデルを用いて、心血管疾患に関与する１またはそれを超える細胞型を含むセルラインを創製し得、それをこの障害の細胞培養モデルとして用い得る。本発明の心血管疾患トランスジェニック動物に由来する第１世代培養物を利用し得るが、継続するセルラインの世代が好ましい。トランスジェニック動物からの継続するセルラインを誘導するために使用し得る技術の例に関しては、Smallら、(1985) Mol. Cell Biol. 5: 642-648を参照されたい。
【０１０２】
あるいは、心血管疾患に関与することが知られている細胞型の細胞を、細胞内での１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子発現の量を増大または低下させることができる配列でトランスフェクトし得る。例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子配列を関心のある細胞のゲノムに導入し、その中で過剰発現させ得、あるいは、内因性１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子配列が存在する場合には、それを過剰発現させるか、または１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子発現を過小発現または不活性化するために分裂し得る。
【０１０３】
１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子を過剰発現させるためには、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子のコード部分を、関心のある細胞型、例えば内皮細胞中で遺伝子発現を作動することができる調節配列に連結し得る。かかる調節領域は当業者によく知られており、過度な実験なしに利用することができる。標的遺伝子を発現する組換え法は前記したものと同じである。
【０１０４】
内因性１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子配列の過小発現に関しては、関心のある細胞型のゲノムに再導入した場合に、内因性１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４対立遺伝子が不活性化されるようにかかる配列を単離し、設計する。好ましくは、設計した１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４配列は、設計した１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４配列が細胞のゲノムに組み込まれる際に内因性１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４配列が分裂するように、遺伝子ターゲティングを介して導入する。宿主細胞の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子でのトランスフェクションは前記に論じる。
【０１０５】
化合物で処理したかまたは１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子でトランスフェクトした細胞は、心血管疾患と関連する表現型について調べ得る。単球の場合には、かかる表現型には、限定されるものではないが、ＬＤＬ取り込み速度の上昇、内皮細胞への接着、遊走、泡沫細胞形成、脂肪線条形成、ならびに、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＧＦβ、ＴＧＦα、ＴＮＦα、ＨＢ−ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦのごとき成長因子の泡沫細胞による産生が含まれる。例えば、遊走の割合は、内皮単層を横切って内皮下空間のコラーゲン層に遊走する単球の数を定量化することによって、Navabら、(1988) J. Clin. Invest. 82: 1853-1863のイン・ビトロ（in vitro）系を用いて測定し得る。
【０１０６】
同様にして、内皮細胞は、試験化合物で処理し得、あるいは、遺伝子工学的に改変した１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子でトランスフェクトし得る。ついで、内皮細胞を、限定されるものではないが、細胞構造、細胞増殖、細胞移動、および単核細胞接着における変化を含む心血管疾患と関連する表現型について；または接着分子（例えばＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、Ｅ−セレクチン）、成長因子およびサイトカイン（例えば、ＰＤＧＦ、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＭＣＦ）ならびに血管形成に関与するタンパク質（例えば、ＦＬＫ、ＦＬＴ）のごとき心血管疾患に関与する他のタンパク質の生成に対する影響について調べ得る。
【０１０７】
１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４核酸のトランスフェクションは、標準的な技術（例えば、Ausubel(1989)前掲に記載されている）を用いることによって行い得る。トランスフェクト細胞は、組換え１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子配列の存在、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ｍＲＮＡの発現および蓄積、ならびに組換え１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質産生の存在について評価すべきである。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子発現の低下が望まれる場合には、標準的な技術を用いて、内因性１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子発現および／または１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質産生における低下が達成されるかを示し得る。
【０１０８】
心血管疾患および血管形成を実験するための細胞モデルには、マトリゲル上の内皮細胞分化のモデル（Baatout, S. ら、(1996) Rom. J. Intern. Med. 34: 263-269；Benelli, Rら、(1999) Int. J. Biol. Markers 14: 243-246)、血管形態形成の胚性幹細胞モデル(Doetschman, T.ら、(1993) Hypertension 22: 618-629)、生理学的ゲル中の微小血管フラグメントの培養(Hoying, JBら、(1996) In Vitro Cell Dev. Biol. Anina. 32: 409-419；米国特許第5,976,782号)、ならびに成長因子およびサイトカイン（例えば、ＩＬ−１β、ＰＤＧＦ、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ）、ホモシステイン、およびＬＤＬを含むアテローム発生因子および血管形成因子での内皮細胞および平滑筋細胞の処理が含まれる。イン・ビトロ（in vitro）血管形成モデルは、例えばBlack, AFら (1999) Cell Biol. Toxicol. 15: 81-90に記載されている。
【０１０９】
ＩＩＩ．予想医薬
本発明は、診断アッセイ、予知アッセイおよび臨床試験のモニターを、それによって個人を予防的に治療する診断（予想）目的で使用する。したがって、１の態様において、本発明は、生物試料（例えば、血液、血清、細胞、例えば内皮細胞、または組織、例えば血管組織）の関連において、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質および／または核酸発現ならびに１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４活性を判定し、それによって個人が心血管疾患に罹っているかを判定する診断アッセイに関する。本発明は、個人が心血管障害を発病する危険性があるかを判定する予知（または予想）アッセイも提供する。例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子中の突然変異を、生物試料においてアッセイし得る。かかるアッセイは予知または予想目的で使用し得、それによって心血管障害、例えばアテローム性動脈硬化症の開始前に個人を予防的に（phophylactically）治療し得る。
【０１１０】
本発明のもう１の態様は、臨床試験において１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４の発現または活性に対する１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４モジュレーター（例えば、抗−１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４抗体または１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４リボザイム）の影響をモニターすることに関する。
これらおよび他の剤を、以下のセクションにおいてさらに詳細に記載する。
【０１１１】
Ａ．心血管疾患の診断アッセイ
対象が心血管疾患に罹っているかを判定するためには、対象から生物試料を得、生物試料を生物試料中の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質または１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノミックＤＮＡ）を検出することができる化合物または剤と接触させ得る。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ｍＲＮＡまたはゲノミックＤＮＡを検出するための好ましい剤は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ｍＲＮＡまたはゲノミックＤＮＡにハイブリダイズすることができる標識核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９に記載の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４核酸、または少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長であって、ストリンジェントな条件下で１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ｍＲＮＡまたはゲノミックＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドのごときその一部分とし得る。本発明の診断アッセイに用いる他の好適なプローブを本願明細書に記載する。
【０１１２】
試料中の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質を検出するための好ましい剤は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質に結合することができる抗体、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体はポリクローナル抗体とし得、あるいはより好ましくはモノクローナル抗体である。無傷抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）を用い得る。プローブまたは抗体に関する"標識"なる語は、プローブまたは抗体に対する検出可能な物質のカップリング（すなわち、物理学的連結）によるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接標識したもう１の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を包含することを意図する。間接標識の例には、蛍光標識二次抗体を用いた一次抗体の検出、ならびに蛍光標識したストレプトアビジンで検出し得るようにビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識が含まれる。
【０１１３】
"生物試料"なる語は、対象から単離した組織、細胞および生物流体、ならびに、対象の中に存在する組織、細胞および流体を含むことを意図する。すなわち、本発明の検出方法を用いて、生物試料中の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノミックＤＮＡをイン・ビトロ（in vitro）ならびにイン・ビボ(in vivo)で検出し得る。例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ｍＲＮＡを検出するためのイン・ビトロ（in vitro）技術には、ノザン・ハイブリダイゼーションおよびイン・サイチュ（in situ）ハイブリダイゼーションが含まれる。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質を検出するためのイン・ビトロ（in vitro）技術には、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降およびイムノフルオレッセンスが含まれる。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ゲノミックＤＮＡを検出するためのイン・ビトロ（in vitro）技術には、サザンハイブリダイゼーションが含まれる。さらに、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質を検出するためのイン・ビボ(in vivo)技術には、標識した抗−１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４抗体を対象に導入することが含まれる。例えば、抗体は、対象における存在および位置を標準的なイメージング技術によって検出し得る放射性マーカーで標識し得る。
【０１１４】
もう１の具体例において、方法には、さらに対照対象から対照生物試料を得、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノミックＤＮＡの存在を生物試料中で検出するように、対照試料と１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノミックＤＮＡを検出することができる化合物または剤とを接触させ、対照試料中の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノミックＤＮＡの存在と試験試料中の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノミックＤＮＡの存在とを比較することが含まれる。
【０１１５】
Ｂ．心血管疾患の予知アッセイ
さらに、本発明は、異常な１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４発現または活性と関連する心血管疾患に罹っているかまたは発病する危険性がある対象を同定するための方法に関する。
【０１１６】
本明細書で用いる"異常な"なる語には、野生型１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４発現または活性から逸脱した１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４発現または活性が含まれる。異常な発現または活性には、上昇または低下した発現または活性、ならびに、発現の野生型発生パターンまたは発現の細胞内パターンに従わない発現または活性が含まれる。例えば、異常な１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４発現または活性には、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子中の突然変異が１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子の過小発現または過剰発現を引き起こす場合、かかる突然変異が非−機能的１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質または野生型様式で機能しないタンパク質、例えば１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４基質と相互作用しないタンパク質、または非−１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４基質と相互作用するものを生じる場合が含まれること意図する。
【０１１７】
先の診断アッセイまたは以後のアッセイのごとき本明細書に記載するアッセイを用いて、心血管疾患、例えば限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化症、虚血／再潅流傷害、高血圧、再狭窄、動脈炎症および内皮細胞障害を含む心血管疾患に罹っているかまたはそれを発病する危険性がある対象を同定し得る。生物試料は対象から得ることができ、遺伝子変化の存在または不存在について試験し得る。例えば、かかる遺伝子変化は、１）１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子からの１またはそれを超えるヌクレオチドの欠失、２）１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子への１またはそれを超えるヌクレオチドの付加、３）１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子の１またはそれを超えるヌクレオチドの置換、４）１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子の染色体再編成、５）１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物レベルの変化、６）ゲノミックＤＮＡのメチル化パターンのごとき、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子の異常な修飾、７）１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非−野生型スプライシングパターンの存在、８）１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質の非−野生型レベル、９）１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子の対立遺伝子消失、ならびに１０）１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質の不適当な翻訳後修飾、のうちの少なくとも１の存在を確認することによって検出し得る。
【０１１８】
本明細書に記載するごとく、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子中の遺伝子変化を検出するために用い得る当該技術分野で知られている膨大な数のアッセイが存在する。例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子中の遺伝子変化は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲのごときポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において（例えば、米国特許第4,683,195号および第4,683,202号を参照されたい）、あるいは、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）において（例えば、Landegranら、(1988) Science 241: 1077-1080; およびNakazawaら、(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 360-364を参照されたい)プローブ／プライマーを用いて検出し得、これらのうちの後者は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子中の点突然変異を検出するのに特に有用となり得る（Abravayaら、(1995) Nucleic Acids Res. 23: 675-682を参照されたい）。この方法には、対象から生物試料を収集し、試料から核酸（例えば、ゲノミックＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはその両方）を単離し、核酸試料と１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子に特異的にハイブリダイズする１またはそれを超えるプライマーとを、（存在する場合には）１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下で接触させ、ついで、増幅産物の存在または不存在を検出するか、または増幅産物のサイズを検出して、対照試料と長さを比較することが含まれる。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは本明細書に記載する突然変異を検出するための技術のうちのいずれかと組み合わせて予備増幅工程として使用することが望ましい場合があることは予想される。
【０１１９】
別の増幅方法には：self sustained sequence replication（Guatelli, J. C.ら、(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878）、転写増幅系（Kwoh, D. Y.ら、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177）、Ｑ−ベータ・レプリカーゼ（Lizardi, P. M.ら、（1988) Bio-Technology 6: 1197）、またはいずれか他の核酸増幅方法、ならびにその後の当業者によく知られている技術を用いた増幅分子の検出が含まれる。これらの検出スキームは、かかる分子が非常に少数しか存在しない場合の核酸分子の検出に特に有用である。
【０１２０】
別の具体例において、生物試料からの１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子中の突然変異は、制限酵素切断パターンにおける変化によって同定し得る。例えば、試料および対照ＤＮＡを単離し、（所望により）増幅させ、１またはそれを超える制限エンドヌクレアーゼで消化し、フラグメント長サイズをゲル電気泳動によって判定して比較する。試料と対照ＤＮＡとの間のフラグメント長サイズの相違は、試料ＤＮＡ中の突然変異を示している。さらに、配列特異的リボザイム（例えば、米国特許第5,498,531号を参照されたい）を用いて、リボザイム切断部位の発生または消失によって特定の突然変異の存在について評価し得る。
【０１２１】
他の具体例において、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４中の遺伝子突然変異は、誘導化した生物試料および対照核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを数百ないし数千のオリゴヌクレオチド・プローブを含む高密度アレイにハイブリダイズさせることによって同定し得る（Cronin, M. T.ら、(1996) Human Mutation 7: 244-255; Kozal, M. J.ら、(1996) Nature Medicine 2: 753-759）。例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４中の遺伝子突然変異は、Cronin, M. T.ら、(1996)前掲に記載されているごとく光−発生ＤＮＡプローブを含有する二次元アレイ中で同定し得る。簡単には、第１のプローブのハイブリダイゼーションアレイを用いて試料および対照中のＤＮＡの長いストレッチ全体をスキャンして、連続し重複するプローブの線状アレイを作製することによって配列間の塩基変化を同定し得る。この工程により、点突然変異を同定することができる。この工程の後に、検出したすべての変異または突然変異に相補的な小さい特別のプローブアレイを用いることによって具体的な突然変異を特徴付けし得る。各突然変異アレイは、パラレルなプローブセットからなり、１は野生型遺伝子に相補的であり、もう１は突然変異体遺伝子に相補的である。
【０１２２】
いまだもう１の具体例において、当該技術分野で知られている種々の配列決定反応のいずれかを用いて、生物試料中の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子を直接的に配列決定し得、生物試料中の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４の配列と対応する野生型（対照）配列とを比較することによって突然変異を検出し得る。配列決定反応の例には、MaxamおよびGilbert（（1977） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560）またはSanger（(1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463)によって開発された技術に基づくものが含まれる。診断アッセイを行う場合には（Naeve, C. W. (1995) Biotechniques 19: 448-53)、質量分析による配列決定（例えば、国際公開番号WO 94／16101；Cohenら、(1996) Adv. Chromatogr. 36: 127-162；およびGriffinら、(1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159を参照されたい）を含む種々の自動化配列決定法のいずれかを用い得ることも意図する。
【０１２３】
１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子中の突然変異を検出する他の方法には、切断因子からの保護を用いてＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロデュプレックス中のミスマッチ塩基を検出する方法が含まれる(Myersら、(1985) Science 230: 1242）。一般的に、"ミスマッチ切断"の技術は、野生型１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４配列を含む（標識した）ＲＮＡまたはＤＮＡと、組織試料から得た潜在的な突然変異ＲＮＡまたはＤＮＡとをハイブリダイズすることによって形成されるヘテロデュプレックスを得ることによって開始する。二本鎖デュプレックスを、対照鎖と試料鎖との間に塩基対ミスマッチに起因して存在するであろうごときデュプレックスの一本鎖領域を切断する剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスはＲＮアーゼで処理し得、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処理して、ミスマッチ領域を酵素的に消化し得る。もう１の具体例において、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスのいずれかは、ミスマッチ領域を消化するために、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理し得る。ミスマッチ領域を消化した後に、ついで得られた材料を変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズによって分離して、突然変異の部位を決定し得る。例えば、Cottonら、(1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85: 4397およびSaleebaら、(1992) Methods Enzymol. 217: 286-295を参照されたい。好ましい具体例において、対照ＤＮＡまたはＲＮＡは検出用に標識し得る。
【０１２４】
いまだもう１の具体例において、ミスマッチ切断反応では、検出するための所定の系において二本鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する１またはそれを超えるタンパク質（いわゆる"ＤＮＡミスマッチ修復"酵素）を用い、細胞の試料から得た１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ｃＤＮＡ中の点突然変異マッピングを用いる。例えば、E. coliのｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチにおいてＡを切断し、ＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼはＧ／ＴミスマッチにおいてＴを切断する（Hsuら、(1994) Carcinogenesis 15: 1657-1662)。例示的な具体例によれば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４配列、例えば野生型１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４配列に基づくプローブは、試験細胞（群）からのｃＤＮＡまたは他のｃＤＮＡ産物にハイブリダイズする。デュプレックスをＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理し、存在するならば、切断産物を電気泳動プロトコールなどから検出し得る。例えば、米国特許第5,459,039号を参照されたい。
【０１２５】
他の具体例において、電気泳動移動度における変化を用いて、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子中の突然変異を同定し得る。例えば、一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）を用いて、突然変異体および野生型核酸の間の電気泳動移動度における差異を検出し得る（Oritaら、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA: 86: 2766；Cotton (1993) Mutat. Res. 285: 125-144およびHayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79も参照されたい)。試料および対照１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは変性し、復元するであろう。一本鎖核酸の二次構造は配列によって変化し、電気泳動移動度において得られた変化により単一の塩基変化でさえ検出し得る。ＤＮＡフラグメントは標識することができ、または標識プローブで検出し得る。アッセイの感度は（ＤＮＡよりも）ＲＮＡを用いることによって高めることができ、そこでは二次構造が配列中の変化に対してより感受性である。好ましい具体例において、本発明の方法はヘテロデュプレックス分析を用いて、電気泳動移動度における変化に基づいて二本鎖ヘテロデュプレックス分子を分離する(Keenら、(1991) Trends Genet 7: 5)。
【０１２６】
いまだもう１の具体例において、変性剤のグラジエントを含むポリアクリルアミドゲル中の突然変異または野生型フラグメントの移動は、変性グラジエントゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）(Myersら、(1985) Nature 313: 495)を用いてアッセイする。ＤＧＧＥを分析方法として用いる場合には、ＤＮＡを修飾して、例えばＰＣＲによるほぼ４０ｂｐの高−融解ＧＣリッチなＤＮＡのＧＣクランプを添加することによって、それが完全に変性していないことを確認する。さらなる具体例において、変性グラジエントの代わりに温度グラジエントを用いて、対照および試料ＤＮＡの移動度における差異を同定する(RosenbaumおよびReissner (1987) Biophys Chem 265: 12753)。
【０１２７】
点突然変異を検出する他の技術の例には、限定されるものではないが、感受性オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長が含まれる。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーを調製することができ、そこでは既知の突然変異を中央に位置させ、ついで完全なマッチが見出される場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズさせる（Saikiら、(1986) Nature 324: 163)；Saikiら、(1989) Proc. Natl Acad. Sci USA 86: 6230)）。オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ・メンブレンに結合して標識標的ＤＮＡとハイブリダイズする場合、かかる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅した標的ＤＮＡまたは多数の異なる突然変異にハイブリダイズする。
【０１２８】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術を本発明と組み合わせて使用し得る。特異的増幅用のプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、（増幅が異なるハイブリダイゼーションに依存するように）分子の中央に(Gibbsら、(1989) Nucleic Acids Res. 17: 2437-2448)、または適当な条件下でミスマッチを防ぎ、またはポリメラーゼ伸長を低下し得る１のプライマーの一番３’末端に(Prossner (1993) Tibtech 11:238)関心のある突然変異を運搬している。また、突然変異の領域に新規な制限部位を導入して、切断ベースの検出を創製することが望ましい場合もある(Gaspariniら、(1992) Mol. Cell Probes 6: 1)。ある種の具体例においては、増幅にＴａｑリガーゼを用いて増幅を行い得ることが予想される(Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 189)。かかる場合においては、５’配列の３’末端に完全なマッチが存在する場合にのみ接合が生じて、増幅の存在または不存在を探すことによって特定の部位における既知の突然変異の存在を検出し得る。
【０１２９】
さらに、本明細書に記載する予知方法を用いて、対象に１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４モジュレーター（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸または小分子）を投与すべきかを判定して、心血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症を効果的に治療し得る。
【０１３０】
Ｃ．臨床試験間の効果のモニター
本発明は、さらに、対象における心血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症および／または血栓症を治療することにおいて、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４モジュレーター（例えば、本明細書で同定した１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４モジュレーター）の有効性を判定する方法をさらに提供する。例えば、増大する１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子の発現、タンパク質レベルを増大させる、または１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４活性をアップレギュレートすることにおける１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４モジュレーターの有効性は、低い１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子発現、タンパク質レベル、またはダウンレギュレートされた１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。あるいは、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子発現、タンパク質レベルを低下させる、または１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４活性をダウンレギュレートすることにおける１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４モジュレーターの有効性は、高い１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子発現、タンパク質レベル、または１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４活性を示す対象の臨床試験においてモニターし得る。かかる臨床試験においては、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子、および好ましくは例えばアテローム性動脈硬化症および／または血栓症に関連付けられている他の遺伝子の発現または活性は、特定の細胞、例えば動脈内皮細胞の表現型の"リードアウト(read out)"またはマーカーとして使用し得る。
【０１３１】
例えば、限定されるものではないが、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４活性をモジュレートする剤（例えば、前記のごとくスクリーニングアッセイで同定した）で処理することによって細胞中でモジュレートされた１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４を含む遺伝子を同定し得る。したがって、例えば、臨床試験において、心血管疾患に罹った対象において１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４活性をモジュレートする剤の効果を調べるために、細胞を単離し、ＲＮＡを調製し、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ならびに心血管疾患に関連された他の遺伝子の発現のレベルにつき分析し得る。遺伝子発現のレベル（例えば、遺伝子発現パターン）は、本明細書に記載するごとくノザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲによって、あるいは、産生したタンパク質の量を測定することによって、前記した方法のうちの１によって、または１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４または他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって定量化し得る。このようにして、遺伝子発現パターンは、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４活性をモジュレートする剤に対する細胞の生理学的応答の指標であるマーカーとして作用し得る。この応答状態は、個人を１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４活性をモジュレートする剤で処理する前および処理の間の種々の時点に判定し得る。
【０１３２】
好ましい具体例において、本発明は、
（ｉ）剤を投与する前に対象から投与前試料を得；（ｉｉ）投与前試料中の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノミックＤＮＡの発現のレベルを検出し；（ｉｉｉ）対象から１またはそれを超える投与後試料を得；（ｉｖ）投与後試料中の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノミックＤＮＡの発現または活性のレベルを検出し；（ｖ）投与前試料における１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノミックＤＮＡと、投与後試料または試料群における１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノミックＤＮＡとの発現または活性のレベルを比較し；ついで（ｖｉ）それにしたがって対象に対する剤の投与を変化させる工程を含む、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４活性をモジュレートする剤（例えば、本明細書に記載したスクリーニングアッセイによって同定したアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸または小分子）での対象の治療の有効性をモニターする方法を提供する。例えば、検出されたよりも１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４の発現または活性をより高いレベルまで増大させる、すなわち剤の有効性を増大させるためには、剤を増加させて投与することが望ましい場合がある。あるいは、検出されたよりも１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４の発現または活性をより低いレベルまで低下させる、すなわち剤の有効性を低下させるためには、剤を減少させて投与することが望ましい場合がある。かかる具体例により、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４発現または活性を、観察し得る表現型応答が存在しない場合でさえも、剤の有効性の指標として用い得る。
【０１３３】
ＩＶ．心血管疾患に罹っている対象の治療方法：
本発明は、アテローム性動脈硬化症、虚血／再潅流傷害、高血圧症、再狭窄、動脈炎症、血栓症、および内皮細胞障害のごとき心血管疾患を発病する危険性がある（またはそれらに対して感受性である）対象、例えばヒトを処理する予防方法および治療方法の両方を提供する。処理の予防方法および治療方法の両方に関して、かかる処理は薬理ゲノミクスの分野から得た知見に基づいて、特異的に仕立てるまたは修飾し得る。本明細書で用いる"薬理ゲノミクス"とは、遺伝子配列決定、統計遺伝学および遺伝子発現分析のごときゲノミクス技術の、臨床開発および市場における薬剤への適用をいう。より詳細には、当該語は、患者の遺伝子がどのように彼または彼女の薬剤に対する応答（例えば、患者の"薬剤応答表現型"または"薬剤応答遺伝子型"）を決定するかの研究をいう。
【０１３４】
したがって、本発明のもう１の態様は、個人の薬剤応答遺伝子型に従って本発明の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４分子または１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４モジュレーターのいずれかを用いて対象の予防または治療処理を仕立てる方法を提供する。薬理ゲノミクスにより、臨床医または内科医が、処理から最も恩恵を受けるであろう患者に対する予防または治療処理を標的化することが許容され、かつ、毒性の薬剤関連副作用を経験するであろう患者の処理を回避することが許容される。
【０１３５】
Ａ．予防方法
１の態様において、本発明は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４発現または１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４活性をモジュレートする、例えば、カルシウム流入、細胞移動またはアテローム性動脈硬化症病変の形成をモジュレートする剤を対象に投与することによって心血管疾患を対象において予防する方法を提供する。心血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症および／または血栓症を発病する危険性がある対象は、例えば、本明細書に記載した診断または予知アッセイのいずれかまたは組合せによって同定し得る。予防剤の投与は、心血管疾患が予防され、あるいはその進行が遅延されるように、異常な１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４発現または活性に特徴的な症状の発現の前に行い得る。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４異常の型に依存して、例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４アゴニストまたは１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４アンタゴニスト剤を対象を治療するために使用し得る。適当な剤は、本明細書に記載したスクリーニングアッセイに基づいて決定し得る。
【０１３６】
Ｂ．治療方法
それによって心血管疾患の症状を改善し得る方法および組成物を本明細書に記載する。少なくとも一部分、ある種の心血管疾患は、過剰なレベルの遺伝子産物によってか、または異常もしくは過剰な活性を示す遺伝子産物によって引き起こされる。それ自体は、かかる遺伝子産物のレベルおよび／または活性における低下は、心血管症状の改善を引き起こすであろう。遺伝子発現レベルまたはタンパク質の活性を低下させる技術は後に論じる。
【０１３７】
あるいは、少なくとも一部分、遺伝子発現のレベルの不存在または低下、またはタンパク質活性のレベルの低下によって引き起こされる心血管疾患もある。それ自体は、遺伝子発現のレベルおよび／またはかかるタンパク質の活性における増大は心血管症状の改善を引き起こすであろう。
【０１３８】
疾患状態における遺伝子のアップレギュレーションが疾患症状に応答するその遺伝子産物の保護的役割を反映している場合もある。かかる遺伝子発現または遺伝子産物の活性の上昇は、それが発揮する保護的効果を補強するであろう。かかる保護的遺伝子の異常に低いレベルの活性から生じ得る心血管疾患状態も存在する。これらの場合においても、かかる遺伝子産物の遺伝子発現および／または活性のレベルの上昇は、心血管疾患症状の改善を引き起こすであろう。標的遺伝子発現レベルまたは標的遺伝子産物活性レベルを上昇させる技術は後に論じる。
【０１３９】
したがって、本発明のもう１の態様は、治療目的のために１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４発現または活性をモジュレートする方法に関する。したがって、例示的な具体例において、本発明のモジュレート方法には、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４、または細胞（例えば、内皮細胞または卵巣細胞）に関連する１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質活性の１またはそれを超える活性をモジュレートする剤と細胞とを接触させることが含まれる。核酸またはタンパク質、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質の天然発生標的分子（例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４リガンドまたは基質）、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４抗体、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４アゴニストまたはアンタゴニスト、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４アゴニストまたはアンタゴニストのペプチドミメティック、または他の小分子のごとき、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質活性をモジュレートする剤は、本明細書に記載する剤となり得る。１の具体例において、剤は、１またはそれを超える１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４活性を刺激する。かかる刺激剤の例には、活性な１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質および細胞に導入した１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４をコードする核酸分子が含まれる。もう１の具体例において、剤は１またはそれを超える１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４活性を阻害する。かかる阻害剤の例には、アンチセンス１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４核酸分子、抗−１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４抗体、および１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４阻害剤が含まれる。これらのモジュレート法はイン・ビトロ（in vitro）（例えば、細胞と剤とを培養することによって）、あるいはイン・ビボ(in vivo)（例えば、剤を対象に投与することによって）で行い得る。それ自体で、本発明は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質または核酸分子の異常または望ましくない発現または活性によって特徴付けられる疾患または障害に罹った個人を治療する方法を提供する。１の具体例において、当該方法には、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４発現または活性をモジュレートする（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）剤（例えば、本明細書に記載するスクリーニングアッセイによって同定した剤）または剤の組合せを投与することが含まれる。もう１の具体例において、当該方法には、治療剤として１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質または核酸分子を投与して、低下した、異常なまたは望ましくない１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４発現または活性を補うことが含まれる。
【０１４０】
１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４活性の刺激は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４が異常にダウンレギュレートされている状況および／または高い１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４活性が有利な効果を有するようである状況に望ましい。同様にして、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４活性の阻害は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４が異常にアップレギュレートされている状況および／または低い１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４活性が有利な効果を有するようである状況に望ましい。
【０１４１】
（ｉ）標的遺伝子発現、合成または活性を阻害する方法
前記に論じたごとく、心血管疾患に関与する遺伝子は遺伝子活性の高いレベルを介してかかる障害を引き起こし得る。かかるアップレギュレーションが疾患状態に対して原因または悪化効果を有する場合もある。種々の技術を用いて、かかる遺伝子および／またはタンパク質の発現、合成、または活性を阻害し得る。
【０１４２】
例えば、前記したアッセイを介して同定したもののごとき、阻害活性を呈する化合物を本発明に従って用いて心血管疾患症状を改善し得る。かかる分子には、限定されるものではないが、小有機分子、ペプチド、抗体などが含まれ得る。
【０１４３】
例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質に対する内因性リガンドと競合する化合物を投与し得る。リガンド結合した１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質の量の生じる減少は、内皮細胞の生理学をモジュレートするであろう。この目的に特に有用となり得る化合物には、例えば、Ｉｇ−端部結合（Ig-tailed）融合タンパク質のごとき可溶性融合タンパク質を含む、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質の１またはそれを超える細胞外ドメイン、またはその一部分および／またはアナログを含むペプチドのごとき可溶性のタンパク質またはペプチドが含まれる。（Ｉｇ端部結合融合タンパク質の作製の議論に関しては、例えば米国特許第5,116,964号を参照されたい)。あるいは、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４受容体部位に結合するが、タンパク質を活性化しないリガンドアナログまたは抗体のごとき化合物（例えば、受容体−リガンド・アンタゴニスト）は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質活性を阻害するのに有効となり得る。
【０１４４】
さらに、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子の発現を阻害するアンチセンスおよびリボザイム分子を本発明に従って用いても、異常な１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子活性を阻害し得る。いまださらに、異常な１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４遺伝子活性を阻害することに、三重らせん分子を利用し得る。
【０１４５】
本発明の方法に用いるアンチセンス核酸分子は、典型的に、それが１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４タンパク質をコードする細胞質ｍＲＮＡおよび／またはゲノミックＤＮＡとハイブリダイズまたは結合し、それによって、例えば転写および／または翻訳を阻害することによって、タンパク質の発現を阻害するように、対象に投与するかまたはイン・サイチュで生成する。ハイブリダイゼーションは、安定なデュプレックスを形成する慣用的なヌクレオチド相補性、ＤＮＡデュプレックスに結合するアンチセンス核酸分子の場合においては二重らせんの主溝における特異的相互作用を介して、行い得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例には、組織部位の直接注射が含まれる。あるいは、アンチセンス核酸分子を修飾して選択した細胞を標的化し、ついで全身投与し得る。例えば、全身投与に関しては、例えばアンチセンス核酸分子を細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に結合することによって、アンチセンス分子を、それが選択した細胞表面上に発現された受容体または抗原に特異的に結合するように修飾し得る。十分な細胞内濃度のアンチセンス分子を達成するためには、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御下に設置したベクター構築物が好ましい。
【０１４６】
いまだもう１の具体例において、本発明の方法で用いるアンチセンス核酸分子はα−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、そこでは通常のβ−ユニットとは反対に鎖は互いに平行に走っている（Gaultierら、(1987) Nucleic Acids. Res. 15: 6625-6641)。アンチセンス核酸分子は、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド(Inoueら、(1987) Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148)またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ(Inoueら、(1987) FEBS Lett. 215: 327-330)も含み得る。
【０１４７】
いまだもう１の具体例において、本発明の方法で用いるアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それが対応する相補的領域を有するｍＲＮＡのごとき一本鎖核酸を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。したがって、リボザイム（例えば、ハンマーヘッド・リボザイム、HaselhoffおよびGerlach (1988) Nature 334: 585-591に記載されている)を用いて１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによって１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４コード核酸に対して特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示する１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または２９）に基づいて設計し得る。例えば、テトラヒメナ（Tetrahymena）Ｌ−１９ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築し得、その中では活性部位のヌクレオチド配列は１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４コードｍＲＮＡ中の切断すべきヌクレオチド配列に相補的である（例えば、Cechら、米国特許第4,987,071号；およびCechら、米国特許第5,116,742号を参照されたい)。あるいは、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４ｍＲＮＡを用いて、ＲＮＡ分子のプールから特定のリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択し得る（例えば、Bartel, D.およびSzostak, J. W. (1993) Science 261: 1411-1418を参照されたい)。
【０１４８】
１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４遺伝子発現は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４の調節領域（例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化して、標的細胞における１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４遺伝子の転写を妨害する三重らせん構造を形成させることによっても阻害し得る（例えば、Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6 (6): 569-84；Helene, C.ら、(1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660: 27-36；およびMaher, L. J. (1992) Bioassays 14 (12): 807-15を参照されたい)。
【０１４９】
１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質に対して特異的であり、その活性を妨害する抗体を用いても、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質機能をモジュレートまたは阻害し得る。かかる抗体は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質自体に対してまたは該タンパク質の部分に対応するペプチドに対して、本明細書に記載する標準的な技術を用いて作製し得る。かかる抗体には、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、Ｆａｂフラグメント、一本鎖抗体またはキメラ抗体が含まれる。
【０１５０】
標的遺伝子タンパク質が細胞内であって全抗体を用いる場合、内在抗体が好ましい場合がある。リポフェクチン・リポソームを用いて標的エピトープに結合する抗体またはＦａｂ領域のフラグメントを細胞にデリバリーし得る。抗体のフラグメントを用いる場合、標的タンパク質の結合ドメインに結合する最小の阻害フラグメントが好ましい。例えば、標的遺伝子タンパク質に結合する抗体の可変領域のドメインに対応するアミノ酸配列を有するペプチドを用い得る。かかるペプチドは当該技術分野においてよく知られている方法を用いて化学的に合成するかまたは組換えＤＮＡ技術を介して作製し得る（例えば、Creighton (1983)前掲；およびSambrookら、(1989)前掲に記載されている）。細胞内標的遺伝子エピトープに結合する一本鎖中和抗体も投与し得る。かかる一本鎖抗体は、例えば、Marascoら、（(1993) Proc. Natl.Acad.Sci. USA 90: 7889-7893)に記載されているもののごとき技術を利用することによって標的細胞集団内で一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を発現させることによって投与し得る。
【０１５１】
幾つかの例において、標的遺伝子タンパク質は細胞外であり、または１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質のごとき貫膜タンパク質である。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の１またはそれを超える細胞外ドメインに特異的であり、例えば、しかもその活性を妨害する抗体は、心血管疾患を治療するのに特に有用である。かかる抗体は特に有効である。それは血流から標的ドメインに直接アクセスし得るからである。ペプチド投与に適当である以下に記載するいずれかの投与技術を利用して、阻害標的遺伝子抗体をその作用部位に効果的に投与し得る。
【０１５２】
（ｉｉ）標的遺伝子活性を復元または高める方法
心血管疾患を引き起こす遺伝子は、心血管疾患状況下では過小発現させ得る。あるいは、かかる遺伝子のタンパク質産物の活性を低下させ、心血管疾患症状の発病につながり得る。かかる遺伝子発現のダウンレギュレーションまたはタンパク質活性の低下は疾患状態に対する原因または悪化作用を有し得る。
【０１５３】
幾つかの場合において、疾患状態でアップレギュレートされる遺伝子が保護的効果を呈する場合もある。種々の技術を用いて、心血管疾患症状に応答して保護的効果を発揮する遺伝子および／またはタンパク質の発現、合成または活性を増大し得る。
【０１５４】
それによって１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４活性のレベルを心血管疾患症状が改善されたレベルまで上昇し得る方法をこのセクションに記載する。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４活性のレベルは、例えば１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４遺伝子発現のレベルを増大させるか、または存在する活性１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質のレベルを増大させるかのいずれかによって増大させ得る。
【０１５５】
例えば、心血管疾患症状を改善するのに十分なレベルの１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質を、かかる症状を示す患者に投与し得る。下記に論じる技術のいずれかを、かかる投与に用い得る。当業者であれば、下記に記載するもののごとき技術を利用して、如何にして有効濃度の、非毒性用量の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質を決定するかが容易にわかるであろう。
【０１５６】
さらに、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質をコードするＲＮＡ配列を、心血管疾患症状を改善するような１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質のレベルを生成するのに十分な濃度で、心血管疾患症状を示す患者に直接的に投与し得る。例えばリポソーム投与のごとき化合物の細胞内投与を達成する以下に論じる技術のいずれかを、かかるＲＮＡ分子の投与に用い得る。ＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載するもののごとき組換え技術によって作製し得る。
【０１５７】
さらに、対象は、遺伝子置換両方によっても治療し得る。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４機能を有する正常な１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の生成を指示する１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４遺伝子またはその一部分の１またはそれを超えるコピーを、リポソームのごときＤＮＡを細胞に導入する他の粒子に加えて、限定されるものではないが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルス・ベクターを含むベクターを用いて細胞に挿入し得る。さらに、前記したもののごとき技術を、ヒト細胞への１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４遺伝子配列の導入に用い得る。
【０１５８】
ついで、遺伝子配列を発現する１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４を含む細胞、好ましくは自己細胞を、心血管疾患症状の改善を許容する位置で対象に導入または再導入し得る。かかる細胞置換技術は、例えば遺伝子産物が分泌された細胞外遺伝子産物である場合に好ましい。
【０１５９】
Ｃ．医薬組成物
本発明のもう１の態様は、心血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症に罹った対象を治療する方法に関する。これらの方法には、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４発現または活性をモジュレートする剤（例えば、本明細書に記載するスクリーニングアッセイによって同定した剤）またはかかる剤の組合せを対象に投与することが含まれる。もう１の具体例において、当該方法には、治療剤として１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質または核酸分子を投与して、低下した、異常なまたは望ましくない１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４発現または活性を補うことが含まれる。
【０１６０】
１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４活性の刺激は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４が異常にダウンレギュレートされている状況および／または高い１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４活性が有利な効果を有しているようである状況に望ましい。同様にして、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４活性の阻害は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４が異常にアップレギュレートされている状況および／または低い１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４活性が有利な効果、例えばアテローム性動脈硬化症障害形成を有しているようである状況に望ましい。
【０１６１】
１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４活性をモジュレートする剤は、かかる投与に好適な医薬組成物を用いて対象に投与し得る。かかる組成物には、典型的に、剤（例えば、核酸分子、タンパク質、または抗体）および医薬上許容される担体が含まれる。本明細書で用いる"医薬上許容される担体"なる言語は、医薬投与と融和性の溶剤、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤および抗菌類剤、等張剤および吸収遅延剤などのいずれかまたはすべてを包含することを意図する。医薬上有効な物質に対するかかる媒体および剤の使用は当該技術分野でよく知られている。活性化合物と非融合性であるいずれかの慣用的な媒体または剤の範囲を除き、組成物におけるそれらの使用は意図されている。補充的な活性化合物も組成物に取り込ませ得る。
【０１６２】
本発明の治療方法に用いる医薬組成物は、その意図する投与経路と融合するよう処方化し得る。投与経路の例には、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与が含まれる。非経口、皮内または皮下適用に使用する液剤または懸濁剤には以下の成分が含まれ得る：注射用液、塩類溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のごとき無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのごとき抗細菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムのごとき抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のごときキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のごとき緩衝剤；ならびに塩化ナトリウムまたはデキストロースのごとき張度を調節するための剤。ｐＨは塩酸または水酸化ナトリウムのごとき酸または塩基で調節し得る。非経口調製物はガラスまたはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブル注射器またはマルチ用量バイアル（multiple dose vial）に封入し得る。
【０１６３】
注射使用に好適な医薬組成物には、無菌水溶液（水溶性である場合）または分散液および無菌注射溶液または分散液を即席で調製するための無菌粉剤が含まれる。静脈内投与に関して、好適な担体には生理的塩類溶液、静菌水（bacteriostatic water）、クレモフォール（Cremophor ELTM）（BASF, Parsippany, NJ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射し得る範囲で流動的でなければならない。それは、製造および保存条件下で安定であって、細菌および菌類のごとき微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、ポリエチレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散液媒体とし得る。適当な流動性は、例えば、レシチンのごときコーティング剤を使用することによって、分散液の場合には必要な粒子サイズを維持することによって、ならびに界面活性剤を使用することによって維持し得る。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌および抗菌類剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成し得る。多くの場合において、等張剤、例えば砂糖、マンニトール、ソルビトールのごとき多価アルコールおよび塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましいであろう。注射組成物の持続吸収は、組成物に吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのごとき吸収を遅延させる剤を組成物に含めることによって行い得る。
【０１６４】
無菌注射液は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４活性をモジュレートする剤（例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質または抗−１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４抗体のフラグメント）を必要な量で、必要により前記に列挙した成分の１または組合せと一緒に適当な溶媒に入れて、その後に濾過滅菌することによって調製し得る。一般的に、分散液は、活性化合物を、基本分散媒体および前記に列挙したものからの必要な他の成分を含む無菌賦形剤に配合することによって調製する。無菌注射溶液を調製するための無菌粉剤の場合には、調製の好ましい方法は真空乾燥、および有効成分と先に濾過滅菌した溶液からのさらなる望ましい成分との粉剤が得られる凍結乾燥である。
【０１６５】
一般的に、経口組成物には、不活性な希釈剤または食用担体が含まれる。それは、ゼラチンカプセルに封入し得、または錠剤に圧縮し得る。経口治療投与に関しては、有効化合物は賦形剤と一緒に配合し得、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形態で使用し得る。また、経口組成物はマウスウォッシュとして用いるための流体担体を用いて調製することもでき、ここで流体担体中の化合物は経口適用し、振り回し（swish）および吐き出し、または飲み込む。医薬上混合してもそれぞれの作用に影響を及ぼさない結合剤および／または補助剤物質を組成物の一部分として含有し得る。錠剤、丸薬、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分のいずれのものまたは同様な性質の化合物を含有し得る：マイクロクリスタリン・セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン；デンプンまたはラクトースのごとき賦形剤、アルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチのごとき崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステローテのごとき滑剤；コロイド状二酸化珪素のごとき流動促進剤；スクロースまたはサッカリンのごとき甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジフレーバーのごとき香味剤。
【０１６６】
吸入による投与に関しては、化合物を、好適な噴射剤、例えば二酸化炭素のごときガスまたはネブライザーを含む加圧容器またはディスペンサーからエアゾールスプレーの形態でデリバリーされる。
【０１６７】
全身投与は、経粘膜または経皮手段によっても行い得る。経粘膜または経皮投与に関しては、浸透すべきバリアーに好適な浸透剤を処方中に使用する。かかる浸透剤は当該技術分野において一般的に知られており、例えば、経粘膜投与に関しては界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは座剤を用いて行い得る。経皮投与に関しては、活性化合物は、一般的に当該技術分野において知られているごとく軟膏、塗剤、またはクリーム剤に処方化し得る。
【０１６８】
１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４活性をモジュレートする剤は、座剤の形態（例えば、カカオ脂および他のグリセリドのごとき慣用的な座剤基剤を用いて）または直腸デリバリー用の保持浣腸剤に調製することもできる。
【０１６９】
１の具体例において、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４活性をモジュレートする剤は、植込み錠およびマイクロカプセル封入デリバリー系を含む制御放出処方のごとき身体からの迅速な排除に対して化合物を保護する。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水酸、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のごとき生分解性、生体適合性ポリマーを使用し得る。かかる処方の調製方法は、当業者に明らかであろう。材料はAlza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から市販されている。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で細胞に感染することを標的化したリポソームを含む）は、医薬上許容されるキャリアーとしても使用し得る。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号に記載されているごとく、当業者に知られている方法に従って調製し得る。投与量の投与の簡便性および均一性のために、経口または非経口組成物を投与量ユニット形態に処方化するのが特に有利である。本明細書で用いる投与量ユニット形態とは、治療する対象用の単位投与量として好適な生理学上分離した単位をいい；各ユニットには必要な医薬キャリアーと関連して目的の治療効果を奏するように計算された所定量の有効化合物を含有する。本発明の投与量単位形態の詳細は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４活性をモジュレートする剤のユニークな特性および達成すべき特定の治療効果ならびに対象を治療するためのかかる剤を混合する当該技術における固有の制限によって指定され（dictated by）、それらに直接的に依存する。
【０１７０】
かかる剤の毒性および治療効力は、例えばＬＤ５０（５０％の集団に致死的な用量）およびＥＤ５０（５０％の集団に治療上有効な用量）を決定するために、細胞培養または実験動物における標準的な製薬方法によって決定される。毒性および治療効果の間の用量比は治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表し得る。大きな治療指数を示す剤が好ましい。毒性副作用を示す剤は用い得るが、未感染細胞に対する潜在的な損傷を最小限化するために患部組織部位へかかる剤を標的化するデリバリーシステムを設計し、それによって副作用を減少するよう注意をはらうべきである。
【０１７１】
組織培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための投与量の範囲を処方化するのに用い得る。かかる１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４モジュレート剤の投与量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性のないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は用いる投与量形態および利用する投与経路に依存してこの範囲内で変化し得る。本発明の治療方法に用いるいずれの剤に関しても、治療上有効用量は、最初に細胞培養アッセイから概算し得る。用量は動物モデルにおいて処方化して、細胞培養において決定したようにＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成し得る。かかる情報を用いてヒトにおける有用な用量をより正確に決定し得る。血漿レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定し得る。
【０１７２】
本明細書で規定するごとく、タンパク質またはポリペプチドの治療上有効量（すなわち、有効用量）は、約０.００１ないし３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０.０１ないし２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０.１ないし２０ｍｇ／ｋｇ体重、およびなおより好ましくは約１ないし１０ｍｇ／ｋｇ体重、２ないし９ｍｇ／ｋｇ体重、３ないし８ｍｇ／ｋｇ体重、４ないし７ｍｇ／ｋｇ体重、または５ないし６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。ある種の要因が対象を効果的に治療するために必要な投与量に影響し得、それには限定されるものではないが、疾患または障害の重度、従前の治療、対象の一般的健康状態および／または年齢、および存在する他の疾患が含まれることは、当業者であれば認識するであろう。さらに、治療上有効量のタンパク質、ポリペプチドまたは抗体を用いた対象の治療には、単一の治療が含まれ得、あるいは好ましくは一連の治療が含まれ得る。
【０１７３】
好ましい例において、対象は約０.１ないし２０ｍｇ／ｋｇ体重の間の範囲の抗体、タンパク質またはポリペプチドで、約１ないし１０週間、好ましくは２ないし８週間、より好ましくは約３ないし７週間、およびなおより好ましくは約４、５または６週間の間、一週間に１回治療する。また、治療に用いる抗体、タンパク質、またはポリペプチドの有効投与量を特定の治療の過程にわたって増減し得ることも理解されるであろう。投与量の変化を生じ得、それは本明細書に記載する診断アッセイの結果から明らかになり得る。
【０１７４】
本発明は、発現または活性をモジュレートする剤を包含する。剤は、例えば小分子とし得る。例えば、かかる小分子には、限定されるものではないが、１モルあたり約１０，０００グラム未満の分子量ペプチド、ペプチドミメティック、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、有機または無機化合物（すなわち、ヘテロオーガニックおよび有機金属化合物を含む）、１モルあたり約５,０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、１モルあたり約１,０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、１モルあたり約５００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、ならびにかかる化合物の塩、エステルおよび他の医薬上許容される形態が含まれる。小分子剤の適当な用量が通常の熟練度の医師、獣医師または研究者の知力の範囲内にある多数の因子に依存することは理解されるであろう。小分子の用量（群）は、例えば、治療すべき対象または試料の個性、サイズおよび状態に依存して、さらに組成物を投与する経路に依存して、および、適用し得る場合には、開業医が本発明の核酸またはポリペプチドに対して有することを望む効果に依存して変化するであろう。
【０１７５】
例示的な用量には、ｋｇ患者または試料重量あたりの小分子のミリグラムまたはマイクログラム量が含まれる（例えば、約１μｇ／ｋｇないし約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇないし約５ｍｇ／ｋｇ、または約１μｇ／ｋｇないし約５０μｇ／ｋｇ）。さらに、小分子の適当な用量がモジュレートすべき発現または活性に関する小分子の効能に依存することは理解される。かかる適当な用量は、本明細書に記載するアッセイを用いて決定し得る。本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性をモジュレートするために１またはそれを超えるこれらの小分子を動物（例えば、ヒト）に投与すべき場合には、医師、獣医師または研究者は、例えば最初は比較的低い用量を処方し、その後に適当な応答が得られるまで用量を増加させていくことができる。また、いずれかの特定の動物対象の特定の用量レベルが、用いる特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、一般的健康、性別、および食餌、投与の期間、投与の経路、排泄の割合、いずれかの薬剤の組合せ、ならびにモジュレートすべき発現または活性の程度を含む種々の要因に依存するであろうことは理解される。
【０１７６】
さらに、抗体（またはそのフラグメント）は、サイトトキシン、治療剤または放射性金属イオンのごとき治療基にコンジュゲートし得る。サイトトキシンまたは細胞毒性剤には、細胞に有害ないずれの剤も含まれる。その例には、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシ＝アントラシン＝ジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン（mithramycin）、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびプロマイシンならびにそれらのアナログまたはホモログが含まれる。治療剤には、限定されるものではないが、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ・クロラムブシル（thioepa chlorambucil）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンイトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）プラスチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれる。
【０１７７】
本発明のコンジュゲートは、所定の生物応答を修飾するために使用し得、薬剤部分は古典的な化学療法剤に限定されるものではない。例えば、薬剤部分は目的の生物活性を所有するタンパク質またはポリペプチドとし得る。かかるタンパク質には、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経生長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベーターのごときタンパク質；または、例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ―６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または他の増殖因子が含まれ得る。
【０１７８】
かかる治療剤部分を抗体にコンジュゲートする技術はよく知られており、例えば、Arnonら、"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、Reisfeldら(編)、pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstromら、"Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (第２版)、Robinsonら(編)、pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)；Thorpe、"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies'84: Biological And Clinical Applications, Pincheraら(編)、pp. 475-506 (1985)；"Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwinら(編)、pp. 303-16 (Academic Press 1985)、およびThorpeら、"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982)を参照されたい。あるいは、抗体を二次抗体にコンジュゲートして、米国特許第4,676,980号にSegalによって記載されているごとく抗体ヘテロコンジュゲートを形成させ得る。
【０１７９】
本発明の方法で使用する核酸分子はベクターに挿入して、遺伝子療法ベクターとして使用することもできる。遺伝子療法ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（例えば、米国特許第5,328,470号を参照されたい）または定位注射（stereotactic injection）（例えば、Chenら、（1994) Proc. Natl. Acad. Sci USA 91: 3054-3057を参照されたい）によって患者にデリバリーし得る。遺伝子療法ベクターの医薬調製物には、許容し得る希釈剤中の遺伝子療法ベクターが含まれ得、あるいは遺伝子デリバリー賦形剤が吸収された徐放性マトリックスを含み得る。あるいは、完全遺伝子デリバリーベクターは、組換え細胞、例えばレトロウイスルベクターからインタクトに作製し得、医薬調製物には遺伝子デリバリーシステムを産生する１またはそれを超える細胞が含まれ得る。
【０１８０】
Ｄ．薬理ゲノミクス
本発明の治療方法と結合して、薬理ゲノミクス（すなわち、対象の遺伝子型と外来化合物または薬剤に対する対象の応答との間の関係の研究）を考慮し得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に有効な薬剤の用量と血中濃度との間の関係を変化させることによって重篤な毒性または治療の失敗につながり得る。したがって、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４活性をモジュレートする剤を投与するかを決定することに、ならびに１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４活性をモジュレートする剤での治療の投与量および／または治療様式を仕立てることに、医師または臨床医は適当な薬理ダイナミクス研究で得られた知識を当てはめることができる。
【０１８１】
薬理ダイナミクスは、変化した薬剤素因および冒された個人における異常な作用に起因する薬剤に対する応答における臨床的に重要な遺伝的変化を取り扱う。例えば、Eichelbaum, M.ら、(1996) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23 (10-11): 983-985およびLinder, M. W.ら、(1997) Clin. Chem. 43 (2): 254-266を参照されたい。一般的に、２のタイプの薬理遺伝学的状態が区別される。単一因子として伝達される遺伝学的状態が身体に対する薬剤の方法を変化させることがあり（変化した薬剤作用）、あるいは単一因子として伝達される遺伝学的状態が薬剤に対する身体の方法を変化させることがある（変化した薬剤代謝）。これらの薬理遺伝学的症状は、稀な遺伝的欠陥または天然に生じる多型のいずれかとして生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸アミノペプチダーゼ欠乏症（Ｇ６ＰＤ）は、主要な臨床的合併症がオキシダント薬剤（抗マラリア薬、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフランを摂取した後およびソラマメを消費した後の溶血である一般的な遺伝性酵素異常症である。
【０１８２】
"ゲノムワイドな遺伝的相関解析"としての知られている、薬剤応答性を予言する遺伝子を同定するための１の薬理ゲノミクス・アプローチは、すでに知られている遺伝子関連マーカー（例えば、ヒトゲノム上の６０,０００−１００，０００多型または変化する部位からなる"二重対立遺伝子（bi-allelic）"遺伝子マーカーマップ）からなるヒトゲノムの高解像マッピングに主として依存する。かかる高分解遺伝子マップは、フェーズＩＩ／ＩＩＩ薬剤試験に参加している統計学的に顕著な数の患者の各々のゲノムのマップと比較して、特定の観察される薬剤応答または副作用と関連するマーカーを同定し得る。あるいは、かかる高分解能マップは、ヒトゲノム中の数万の公知の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の組合せから作成し得る。本明細書で用いる"ＳＮＰ"は、ＤＮＡのストレッチ中の単一のヌクレオチド塩基に生じる一般的変化である。例えば、ＳＮＰは毎１０００ベースのＤＮＡあたり一回起こり得る。ＳＮＰは疾患プロセスに関与し得るが、圧倒的大部分は疾患関連のものでないであろう。かかるＳＮＰの発生に基づいて遺伝子マップが得られたら、個人をその個々のゲノム中の特定のＳＮＰのパターンに依存して遺伝しカテゴリーにグループ分けし得る。そのようにして、かかる遺伝子的に類似する個人の中で一般的かもしれない特性を考慮しつつ、遺伝的に類似する個人のグループに対して治療様式を仕立てることができる。
【０１８３】
あるいは、"候補遺伝子アプローチ"という方法を利用して、薬剤応答を予言する遺伝子を同定し得る。この方法によると、薬剤標的をコードする遺伝子が知られている場合（例えば、本発明の方法で用いる１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質）、その遺伝子のすべての一般的変異を集団中でかなり簡単に同定し得、１の遺伝子に対して他の１バージョンの遺伝子を有することが特定の薬剤応答と関連するのかを決定し得る。
【０１８４】
例証的具体例において、薬剤代謝酵素の活性は、薬剤作用の強度および期間の両方の主要な決定因子である。薬剤代謝酵素の遺伝子多型の発見（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびサイトクロームＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）により、標準的かつ安全な用量の薬剤を摂取した後に、予想される薬剤効果が得られず、または悪化した薬剤応答および重篤な毒性を示す患者が存在するかの説明が得られた。これらの多型は集団において２の表現型、代謝能が高い群（ＥＭ）および代謝能が低い群（ＰＭ）で発現される。ＰＭの率は集団によって異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高い多型を有史、幾つかの突然変異がＰＭ中で同定されており、それらはすべて機能性ＣＹＰ２Ｄ６の不存在につながる。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の代謝能の低い群では、標準的な用量を受けた場合に、過大な薬剤応答および副作用がきわめて頻繁に経験される。代謝物が有効な治療部分である場合、そのＣＹＰ２Ｄ６形成代謝物モルヒネによって媒介されるコデインの鎮痛効果について示されるごとく、ＰＭは全く治療応答を示さない。他の端的な例は、標準用量に全く応答しないいわゆる超高速代謝群である。最近、超高速代謝群の分子ベースがＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因して同定された。
【０１８５】
あるいは、"遺伝子発現プロファイリング"という方法を利用して、薬剤応答を予言する遺伝子を同定し得る。例えば、薬剤（例えば、本発明の方法に用いる１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４分子または１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４モジュレーター）を投与した動物の遺伝子発現は、毒性に関連する遺伝子経路がオンになっているかの指標を与え得る。
【０１８６】
１を超える上記の薬理ジェネティック・アプローチから生成する情報を用いて、対象の予防または治療処理の適当な投与量および治療様式を決定し得る。この知見は、投薬または薬剤の選択に当てはめた場合、有害な反応または治療上の失敗を回避し、したがって心血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症を１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４活性をモジュレートする剤で対象を治療する場合に治療効力または予防効力を高め得る。
【０１８７】
Ｖ．本発明の方法に用いた組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の方法（例えば、本明細書に記載するスクリーニングアッセイ）には、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質（またはその一部分）をコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターの使用が含まれる。本明細書で用いる"ベクター"とは、それに連結しているもう１の核酸を輸送することができる核酸分子をいう。１のタイプのベクターはプラスミドであり、それはその中にさらなるＤＮＡセグメントを連結し得る環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。もう１のタイプのベクターはウイルスベクターであり、その中ではさらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結し得る。ある種のベクターは、それが導入された宿主細胞（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）中で自律的に複製することができる。また、宿主細胞に導入した際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと一緒に複製されるベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）も存在する。さらに、それに作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができるベクターも存在する。かかるベクターを本明細書では"発現ベクター"という。一般的に、組換えＤＮＡ技術おいて有益な発現ベクターはプラスミドの形態で存在する場合がある。本明細書中においては、"プラスミド"および"ベクター"はプラスミドが最も一般的に使用される形態のベクターとして互換的に使用し得る。しかし、本発明は、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のごとき、等価な機能を供するかかる他の形態の発現ベクターを包含することを意図する。
【０１８８】
本発明の方法に用いるべき組換え発現ベクターには、宿主細胞中の核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸が含まれ、これは組換え発現ベクターが、発現すべき核酸配列に作動可能に連結した、発現に使用すべき宿主細胞に基づいて選択した１またはそれを超える調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、"作動可能に連結した"とは、（例えば、イン・ビトロ（in vitro）転写／翻訳系またはベクターを宿主細胞に導入する場合には宿主細胞における）ヌクレオチド配列の発現を許容するように、関心のあるヌクレオチド配列が調節配列（群）に連結されていることを意味することを意図する。"調節配列"なる語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。かかる調節配列は、例えば、Goeddel (1990) Methods Enzymol. 185: 3-7に記載されている。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、およびある種の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織−特異的調節配列）が含まれる。発現ベクターの設計が形質転換する宿主細胞の選択、目的のタンパク質の発現レベルなどのごとき因子に依存し得ることは当業者によって理解されるであろう。本発明の発現ベクターは宿主細胞に導入し、それによって、本明細書に記載する核酸（例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質、融合タンパク質など）によってコードされる、融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチドを産生し得る。
【０１８９】
本発明の方法に使用する組換え発現ベクターは、原核生物または真核生物の細胞における１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の発現用に設計し得る。例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質は、イー・コリ（E．coli）のごとき細菌細胞、（バキュロウイルス発現ベクターを用いて）昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞において発現させ得る。好適な宿主細胞は、Goeddel (1990) 前掲においてさらに論じられている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、イン・ビトロ（in vitro）で転写および翻訳させ得る。
【０１９０】
原核生物におけるタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質のいずれかを指示する構成的または誘導的プロモーターを含むベクターを用いてイー・コリ（E．coli）において最も頻繁に行われている。融合ベクターは、多数のアミノ酸をその中にコードされているタンパク質に、通常組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。かかる融合ベクターは、典型的に３の目的を供する：１）組換えタンパク質の発現を増大させること；２）組換えタンパク質の溶解性を増大させること；および３）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を支援すること。融合発現ベクターにおいては、タンパク質加水分解切断部位を融合部分および組換えタンパク質の接合点に導入して、融合部分から組換えタンパク質を分離できるようにし、その後に融合タンパク質を精製することができる場合もある。かかる酵素およびその同族の認識配列には、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターには、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合する、各々ｐＧＥＸ（Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B.およびJohnson, K. S. (1988) Gene 67: 31-40）、ｐＭＡＬ（New England Biolabs, Beverly, MA)およびｐＲＩＴ５(Pharmacia, Piscataway, NJ)が含まれる。
【０１９１】
精製した融合タンパク質は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４活性アッセイ（例えば、後に詳細に記載する直接アッセイまたは競合アッセイ）に利用し得、あるいは１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質に特異的な抗体を創製するために用い得る。好ましい具体例において、本発明のレトロウイルス発現ベクターで発現する１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４融合タンパク質を利用して骨髄細胞を感染し、これをその後に放射線照射したレシピエントに移植し得る。ついで、十分な時間（例えば、６週間）が経過した後に、対象レシピエントの病理を調べる。
【０１９２】
もう１の具体例において、本発明の核酸は哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞中で発現する。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８ (Seed, B. (1987) Nature 329: 840)およびｐＭＴ２ＰＣ (Kaufmanら、(1987) EMBO J. 6: 187-195)が含まれる。哺乳動物細胞に用いた場合、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節エレメントによって供される場合がある。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２型、サイトメガロウイルスおよび鳥類ウイルス４０由来ものである。原核生物および真核生物細胞の両方に好適な他の発現系については、Sambrook, J.ら、Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989の第１６および１７章を参照されたい。
【０１９３】
もう１の具体例において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指示することができる（例えば、組織−特異的調節エレメントを用いて核酸を発現させる）。
【０１９４】
さらに、本発明の方法は、アンチセンス方向で発現ベクターにクローン化した本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターも使用し得る。すなわち、ＤＮＡ分子を、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を許容するように、調節配列に作動可能に連結する。種々の細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の連続した発現を指示するアンチセンス方向にクローン化された核酸に作動可能に連結された調節配列、例えば、ウイルス・プロモーターおよび／またはエンハンサーを選抜し得る。あるいは、アンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的または細胞型特異的発現を指示する調節配列を選抜し得る。アンチセンス発現ベクターは、高効率調節領域の制御下でアンチセンス核酸を生成する組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化ウイルスの形態とし得、その活性はベクターを導入した細胞型によって決定し得る。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の議論については、Weintraub, H.ら, Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol.1(1) 1986を参照されたい。
【０１９５】
本発明のもう１の態様は、その中に本発明の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４核酸分子、例えば組換え発現ベクター内の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４核酸分子または宿主細胞のゲノムの特異的部位に相同的組換えを許容する配列を含む１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４核酸分子が導入された宿主細胞の使用に関する。"宿主細胞"および"組換え宿主細胞"なる語は、本明細書において互換的に用いる。かかる語句が特定の対象のみならずかかる細胞の子孫または潜在的な子孫をもいうことは理解される。突然変異または環境的な影響のいずれかに起因してある種の修飾が続く世代においても起こり得るため、実際には、かかる子孫は親細胞と同一ではないが、これも本明細書で用いる語句の範囲内にいまだ包含される。
【０１９６】
宿主細胞はいずれかの原核生物細胞または真核生物細胞とし得る。例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質は、イー・コリ（E．coli）のごとき細菌、昆虫細胞、酵母または（チャイニーズハムスター卵母細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞のごとき）哺乳動物細胞中で発現させ得る。他の好適な宿主細胞は当業者に知られている。
【０１９７】
ベクターＤＮＡは慣用的な形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核細胞または真核細胞に導入し得る。本明細書で用いるごとく、"形質転換"および"トランスフェクション"なる語は、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当該技術分野で認識されている種々の技術をいい、リン酸カルシウム、塩化カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション法、リポフェクション、またはエレクトロポレーション法が含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするのに好適な方法は、Sambrookら、(Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)および他のラボラトリー・マニュアルに見出すことができる。
【０１９８】
培養中の原核または真核宿主細胞のごとき、本発明の方法に用いる宿主細胞を用いて、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質を産生（すなわち、発現）させ得る。したがって、さらに、本発明は、本発明の宿主細胞を用いて１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質を産生する方法を提供する。１の具体例において、当該方法には、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質が産生されるように好適な培地中で本発明の宿主細胞（その中に、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養することが含まれる。もう１の具体例において、さらに、当該方法には、培地または宿主細胞から１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質を単離することが含まれる。
【０１９９】
ＩＶ．本発明の方法に用いる単離された核酸分子
本発明の方法には、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質またはその生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸分子の使用、ならびに１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４をコードする核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーション・プローブとして使用するのに十分な核酸フラグメント（例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４ｍＲＮＡ）および１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４核酸分子の増幅または突然変異用のＰＣＲプライマーとして使用するためのフラグメントの使用が含まれる。本明細書で用いるごとく、"核酸分子"なる用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチドアナログを用いて作製したＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを含むことを意図する。核酸分子は一本鎖または二本鎖となり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【０２００】
本発明の方法で用いる核酸分子、例えば、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９またはそれらの一部分のヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本明細書に記載する標準的な分子生物学的技術および配列情報を用いて単離し得る。ハイブリダイゼーション・プローブとして配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９の核酸配列のすべてまたは一部分を用いることにより、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術（例えば、Sambrook, J.、Fritsh, E. F.およびManiatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されているごとき）を用いて１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４核酸分子を単離し得る。
【０２０１】
さらに、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９のすべてまたは一部分を包含する核酸分子は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９の配列に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離し得る。
【０２０２】
本発明の方法に用いる核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技術による鋳型および適当なオリゴヌクレオチドプライマーとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、あるいはゲノミックＤＮＡを用いて増幅し得る。さらに、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、例えば、自動化ＤＮＡ合成機を用いて、標準的な合成技術によって調製し得る。
【０２０３】
好ましい具体例において、本発明の方法に用いる単離された核酸分子には、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９に示すヌクレオチド配列、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９に示すヌクレオチド配列の相補体、またはいずれかのこれらのヌクレオチド配列の一部分が含まれる。配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９に示すヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、それが配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９に示すヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それによって安定なデュプレックスを形成し得るような配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９に示すヌクレオチド配列に十分に相補的であるものである。
【０２０４】
いまだもう１の好ましい具体例において、本発明の方法に用いる単離された核酸分子には、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９に示すヌクレオチド配列の全長またはこのヌクレオチド配列のいずれかの一部分に対して、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を有するヌクレオチド配列が含まれる。
【０２０５】
さらに、本発明の方法で用いる核酸分子には、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９の核酸配列の一部分のみ、例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質のプローブまたはプライマーとして用い得るフラグメントまたはそれらの一部分をコードするフラグメント、例えば１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の生物学的に活性な部分のみを含み得る。プローブ／プライマーには、典型的に、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチドには、典型的に、ストリンジェントな条件下で、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９のセンス配列の、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９のアンチセンス配列の、または配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９の天然発生対立遺伝子変異または変異体の少なくとも１２または１５、好ましくは約２０または２５、より好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５または７５の連続ヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域が含まれる。１の具体例において、本発明の方法に用いる核酸分子には、１００、１００−２００、２００−３００、３００−４００、４００−５００、５００−６００、６００−７００、７００−８００、８００−９００、９００−１０００、１０００−１１００、１１００−１２００、１２００−１３００よりも長い、またはさらに長いヌクレオチド長であって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９の核酸分子にハイブリダイズするヌクレオチド配列が含まれる。
【０２０６】
本明細書で用いる"ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする"なる語句は、その条件下で、互いに顕著に同一または相同であるヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記載することを意図している。好ましくは、当該条件は、互いに少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、なおより好ましくは少なくとも約８５％または９０％互いに同一である配列が互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。かかるストリンジェントな条件は当業者に知られており、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelら編、John Wiley & Sons, Inc. (1995), セクション２、４および６に見出し得る。さらなるストリンジェントな条件は、Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Sambrookら、Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), 第７、９および１１章に見出し得る。好ましい、非限定的なストリンジェントな条件の例には、約６５−７０℃にて４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーション（または約４２−５０℃にて４×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミド中のハイブリダイゼーション）につづく約６５−７０℃にて１×ＳＳＣ中の１またはそれを超える洗浄が含まれる。非常にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい、非限定的な例には、約６５−７０℃にて１×ＳＳＣ中のハイブリダイゼーション（または約４２−５０℃にて１×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミド中のハイブリダイゼーション）につづく約６５−７０℃にて０.３×ＳＳＣ中の１またはそれを超える洗浄が含まれる。低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の好ましい、非限定的な例には、約５０−６０℃にて４×ＳＳＣ中のハイブリダイゼーション（あるいは、別報として約４０−４５℃にて６×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミド中のハイブリダイゼーション）につづく約５０−６０℃にて２×ＳＳＣ中の１またはそれを超える洗浄が含まれる。前記に列挙した値の中間範囲、例えば６５−７０℃または４２−５０℃も本発明によって包含されることを意図している。ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液においてＳＳＣ（１×ＳＳＣは０.１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸ナトリウム）の代わりにＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは０.１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、および１.２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７.４）を用いることができ；ハイブリダイゼーション後に各々１５分間行う洗浄は完全である。５０塩基対長未満と予想されるハイブリッドに対するハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融点（Ｔｍ）よりも５−１０℃低い温度とすべきであり、ここにＴｍは以下の等式によって決まる。１８塩基対長未満のハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔの数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。１８ないし４９塩基対長のハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝８１.５＋１６.６（ｌｏｇ１０[Ｎａ＋]）＋０.４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）である｛式中のＮはハイブリッドの塩基の数、[Ｎａ＋]はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度であり、１×ＳＳＣについては０．１６５Ｍである｝。さらなる試薬をハイブリダイゼーションおよび／または洗浄緩衝液に添加してメンブレン、例えばニトロセルロースまたはナイロン・メンブレンに対する核酸分子の非特異的なハイブリダイゼーションを減少させることができることも当業者によって認識され、ブロッキング剤（例えば、ＢＳＡまたはサケもしくはニシンのキャリアーＤＮＡ）、洗浄液（例えば、ＳＤＳ）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、Ｆｉｃｏｌｌ、ＰＶＰなどが含まれる。ナイロン・メンブレンを用いる場合、特に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる好ましい、非限定的な例は、約６５℃にて０.２５−０.５ＭのＮａＨ２ＰＯ４、７％のＳＤＳ中のハイブリダイゼーションにつづく６５℃にて０.０２ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１％のＳＤＳの１またはそれを超える洗浄である。例えば、ChurchおよびGilbert (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995を参照されたい（あるいは、０.２×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ）。
【０２０７】
好ましい具体例において、さらに、プローブには、それに結合した標識基が含まれ、例えば、標識基はラジオアイソトープ、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子とし得る。かかるプローブは、対象からの細胞の試料中の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４をコードする核酸のレベルを測定する、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４ｍＲＮＡレベルを検出する、またはゲノミック１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４遺伝子が突然変異しているかまたは欠失していることを判定するなどによって、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４を誤発現する細胞または組織を同定する診断テストキットの一部分として用い得る。
【０２０８】
さらに、本発明の方法には、遺伝コードの縮重に起因し、したがって配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９に示すヌクレオチド配列によってコードされるものと同一の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質をコードする、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９に示すヌクレオチド配列とは異なる核酸分子の使用も包含される。もう１の具体例において、本発明の方法に含まれる単離された核酸分子は、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【０２０９】
さらに、本発明の方法には、ヒト１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４の対立遺伝子バリアント、例えば機能的および非機能的対立遺伝子バリアントの使用も含まれる。機能的対立遺伝子バリアントは、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４活性を維持しているヒト１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の天然に生じるアミノ酸配列バリアントである。機能的対立遺伝子バリアントは、典型的には、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０の１またはそれを超えるアミノ酸の同類置換、またはタンパク質の重要でない領域中の重要でない残基の置換、欠失または挿入のみを含んでいるであろう。
【０２１０】
非機能的対立遺伝子バリアントは、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４活性を有していないヒト１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の天然に生じるアミノ酸配列バリアントである。非機能的対立遺伝子バリアントは、典型的に、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０のアミノ酸配列の非同類置換、欠失もしくは挿入または早期領域切断（truncation）、またはタンパク質の重要な残基または重要な領域における置換、挿入または欠失を含んでいるであろう。
【０２１１】
さらに、本発明の方法はヒト１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の非ヒトオーソログも使用し得る。ヒト１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質のオーソログは、非ヒト生物から単離され、かつ、同一の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４活性を有しているタンパク質である。
【０２１２】
さらに、本発明の方法には、その中に突然変異が導入されている配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９のヌクレオチド配列またはその一部分の使用も含まれる。突然変異は、"非必須"アミノ酸残基または"必須アミノ酸残基"におけるアミノ酸置換に通じ得る。"非必須"アミノ酸残基は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４の野生型配列から生物活性を変化することなく変化し得る残基であり、一方、"必須アミノ酸残基"は生物活性に必要である。例えば、本発明の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質およびファミリーの他のメンバーの中で保存されているアミノ酸残基は、変化に対して敏感でないようである。
【０２１３】
部位特異的突然変異およびＰＣＲ媒介突然変異導入のごとき標準的な技術によって、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９に突然変異を導入し得る。好ましくは、１またはそれを超える予想される非必須アミノ酸残基に同類アミノ酸置換を作成する。"同類アミノ酸置換"は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換わるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において明らかにされている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質中の予想される非必須アミノ酸残基は、好ましくは同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置換される。あるいは、もう１の具体例において、saturation mutagenesisのごときによって１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４コード配列の全部または一部分に沿って突然変異をランダムに導入し、得られた突然変異体を１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４生物活性についてスクリーニングして活性を保持している突然変異体を同定し得る。配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９の突然変異導入後に、コードされたタンパク質を組換え的に発現させ、タンパク質の活性を本明細書に記載するアッセイを用いて判定し得る。
【０２１４】
本発明のもう１の態様は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９のヌクレオチド配列に対してアンチセンスである単離された核酸分子の使用に関する。"アンチセンス"核酸には、タンパク質をコードする"センス"核酸に相補的である、例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるかまたはｍＲＮＡ配列に相補的である、ヌクレオチド配列が含まれる。したがって、アンチセンス核酸はセンス核酸に対して水素結合し得る。アンチセンス核酸は、全体の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４コード鎖に相補的であることも、またはその一部分にのみ相補的であることもある。１の具体例において、アンチセンス核酸分子は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の"コード領域"に対してアンチセンスである。"コード領域"なる語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域をいう。もう１の具体例において、アンチセンス核酸分子は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の"非コード領域"に対してアンチセンスである。"非コード領域"なる語は、アミノ酸に翻訳されないコード領域を挟む５’および３’配列をいう（あるいは、５’および３’非翻訳領域ともいう）。
【０２１５】
本明細書に開示する１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４をコードするコード鎖配列が得られれば、ワトソン−クリック塩基対形成の法則に従って本発明のアンチセンス核酸を設計し得る。アンチセンス核酸分子は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４ｍＲＮＡの全体コード領域に対して相補的であり得るが、より好ましくは１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の部分にのみに対してアンチセンスである。例えば、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４ｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り囲む領域に対して相補的であり得る。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該技術分野で知られている手法を用いた化学合成および酵素連結反応を用いて構築し得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンス・オリゴヌクレオチド）は、天然に発生しているヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増大させるためにまたはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成されたデュプレックスの物理学的安定性を増大させるために設計された種々の修飾ヌクレオチドを用いて（例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換型ヌクレオチドを用い得る）化学的に合成し得る。アンチセンス核酸を作製するために用い得る修飾ヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５'−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２,６−ジアミノプリンが含まれる。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス向きでサブクローンされた発現ベクター（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡは、関心のある標的核酸に対してアンチセンス向きのものであろう）を用いて生物学的に作製し得る。本発明の方法に用いるアンチセンス核酸分子は、セクションＩＶにおいてさらに記載する。
【０２１６】
いまだもう１の具体例において、本発明の方法に用いる１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４核酸分子は、塩基部分、糖部分またはリン酸主鎖で修飾して、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解性を改善し得る。例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸主鎖を修飾してペプチド核酸を作製し得る（Hyrup B.ら、 (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1) : 5-23を参照されたい)。本明細書で用いる"ペプチド核酸"または"ＰＮＡ"なる語は、核酸擬似物、例えば、デオキシリボースリン酸主鎖がプソイドペプチド主鎖で置き換わり、４の天然の核酸塩基のみが保持されているＤＮＡ擬似物をいう。ＰＮＡの中性主鎖は、低イオン強度の条件下で、ＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを許容することが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Hyrup B.ら、 (1996) 前掲；Perry-O'Keefeら、(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 14670-675.に記載されている標準的な固相ペプチド合成プロトコールを用いて行い得る。
【０２１７】
１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４核酸分子のＰＮＡは、本明細書に記載した治療および診断応用に用い得る。例えば、ＰＮＡは、例えば転写または翻訳高速を誘導するかまたは複製を阻害することによって遺伝子発現の配列特異的なモジュレーション用のアンチセンスまたはアンチ遺伝子剤として使用し得る。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４核酸分子のＰＮＡは、例えば、他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ（Hyrup B.ら、(1996)前掲）と組み合わせて用いた場合には"人工制限酵素"として；またはＤＮＡ配列決定またはハイブリダイゼーション用のプローブまたはプライマーとして（Hyrup B.ら、(1996)前掲；Perry-O'Keefeら、(1996)前掲）；ＰＮＡ−指向ＰＣＲクランプによって）遺伝子中の単一塩基対突然変異の分析にも用い得る。
【０２１８】
もう１の具体例において、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４のＰＮＡは、ＰＮＡに脂肪親和性または他のヘルパー基を結合することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラを形成することによって、または当該技術分野で知られているリポソームまたはドラッグデリバリーの他の技術を用いることによって、修飾し得る（例えば、その安定性または細胞取り込みの向上）。例えば、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４核酸分子のＰＮＡ−ＤＮＡキメラは作製することができ、それはＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を結合し得る。かかるキメラにより、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮアーゼＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用することが許容され、一方ＰＮＡ部分は高い結合アフィニティーおよび特性を提供できる。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基素達キング、核酸塩基間の結合数および向きに鑑みて選択した適当な長さのリンカーを用いて結合し得る（Hyrup B.ら、(1996)前掲）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Hyrup B.ら、(1996)前掲およびFinn P. J.ら、(1996) Nucleic Acids Res. 24(17): 3357-63に記載されているごとく行い得る。例えば、ＤＮＡ鎖は標準的なホスホロアミダイト・カップリング法を用いて固相上で合成することができ、修飾ヌクレオシド・アナログ、例えば５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホロアミダイトをＰＮＡおよびＤＮＡの５’末端の間に用い得る（Mag, M.ら、(1989) Nucleic Acids Res. 17: 5973-88）。ついで、ＰＮＡモノマーを逐次的方法でカップリングさせて、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を作製する（Finn P. J.ら、(1996) 前掲）。あるいは、キメラ分子は、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントで合成し得る（Peterser, K. H.ら、（1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124）。
【０２１９】
ほかの具体例において、本発明の方法に用いるオリゴヌクレオチドには、ペプチド（例えば、イン・ビボ(in vivo)で宿主細胞受容体を標的化するための）、または細胞膜（例えば、Letsingerら、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 86: 6553-6556；Lemaitreら、(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648-652; 国際公開番号WO88／09810を参照されたい）または血液脳関門（国際公開番号WO89／10134）を横切る輸送を促進する剤のごとき他の追加基を含み得る。また、オリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーション誘因（triggered）切断剤（例えば、Krolら(1988) Bio−Techniques 6: 958-976)またはインターカーレート剤（例えば、Zon (1988) Pharm. Res. 5: 539-549を参照されたい）。この末端に、オリゴヌクレオチドを他の分子にコンジュゲートし得る（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘因架橋剤、輸送剤、またはハイブリダイゼーション誘因切断剤）。
【０２２０】
ＶＩＩ．本発明の方法に用いる単離された、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質および抗−１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４抗体
本発明の方法には、単離された、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質およびその生物学的に活性な部分、ならびに抗−１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４抗体を生起するための免疫原として使用するのに好適なポリペプチドフラグメントの使用が含まれる。１の具体例において、天然１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いて適当な精製スキームによって細胞または組織原から単離し得る。もう１の具体例において、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって作製する。組換え発現の別法として、、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質またはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用いて化学的に合成し得る。
【０２２１】
本明細書で用いる、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の"生物学的に活性な部分"には、、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４活性を有する、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質のフラグメントが含まれる。、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の生物学的に活性な部分には、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質のアミノ酸配列と十分に同じまたはそれに由来するアミノ酸配列、例えば完全長、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質よりも数個アミノ酸が少なく、かつ、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の少なくとも１の活性を示す配列番号：２に示すアミノ酸を含むペプチドが含まれる。典型的には、生物学的に活性な部分には、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の少なくとも１の活性を有するドメインまたはモチーフ（例えば、アポトーシス活性の調節に関与すると考えられている１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質のＮ−末端領域）が含まれる。、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００またはそれを超えるアミノ酸長であるポリペプチドとし得る。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の生物学的に活性な部分は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４活性をモジュレートする剤を開発するための標的として用い得る。
【０２２２】
好ましい具体例において、本発明の方法に用いる、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する。もう１の具体例において、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質は、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０と実質的に等しく、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０のタンパク質の機能活性を保持するが、前記サブセクションＶに詳細に記載するごとく、天然の変異または突然変異に起因してアミノ酸において異なる。したがって、もう１の具体例において、本発明の方法に用いる１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質は、配列番号：２と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【０２２３】
２のアミノ酸配列または２の核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列を最適比較目的で並べる（例えば、最適アライメントのために第１および第２のアミノ酸または核酸配列の１または両方にギャップを導入し得、比較目的のために非同一配列を無視し得る）。好ましい具体例において、比較目的で並べた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも６０％、およびなおより好ましくは少なくとも７０％、８０％、または９０％である（例えば、第２の配列を５００アミノ酸残基の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４アミノ酸配列に並べら場合、少なくとも７５、好ましくは少なくとも１５０、より好ましくは少なくとも２２５、なおより好ましくは少なくとも３００、およびなおより好ましくは少なくとも４００またはより多くのアミノ酸残基が整列する）。ついで、対応するアミノ酸ポジションまたはヌクレオチドポジションのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１配列中のポジションが第２配列中の対応するポジションと同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合には、分子はそのポジションにおいて同一である（本明細書で用いるアミノ酸または核酸"同一性"はアミノ酸または核酸"ホモロジー"と等しい）。２の配列間のパーセント同一性は、２の配列の最適アライメントのために導入することが必要であるギャップの数および各ギャップの長さを考慮しつつ、配列によって共有される同一ポジションの数の関数である。
【０２２４】
配列の比較および２の配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて行い得る。好ましい具体例において、２のアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、Blosum 62 matrixまたはPAM 250 matrixのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６または４のgap weightおよび１、２、３、４、５または６のlength weightを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）のＧＡＰプログラムに取り込まれているNeedlemanおよびWunsch（J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970)）アルゴリズムを用いて決定する。いまだもう１の好ましい具体例において、２のヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、NWSgapdna.CMP matrixおよび４０、５０、６０、７０または８０のgap weightおよび１、２、３、４、５または６のlength weight を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）のＧＡＰプログラムを用いて決定する。もう１の具体例において、２のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、PAM 120 weight residue table、１２のgap length penaltyおよび４のgap penaltyを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２.０または２.０Ｕ）に取り込まれているE. MeyersおよびW. Millerのアルゴリズム（Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17 (1988)）を用いて決定する。
【０２２５】
本発明の方法は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４キメラまたは融合タンパク質を用い得る。本明細書で用いる１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４"キメラタンパク質"または"融合タンパク質"には、非−１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４ポリペプチドに作動可能に連結した１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４ポリペプチドが含まれる。"１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４ポリペプチド"とは、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４分子に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいい、一方"非−１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４ポリペプチド"とは、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質に実質的に相同でないタンパク質、例えば１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質とは異なり、同一または異なる生物由来であるタンパク質、に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４融合タンパク質内では、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４ポリペプチドは１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質のすべての部分または一部分に対応し得る。好ましい具体例において、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４融合タンパク質には、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の少なくとも１の生物学的に活性な部分が含まれる。もう１の好ましい具体例において、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４融合タンパク質には、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の少なくとも２の生物学的に活性な部分が含まれる。融合タンパク質内で、"作動可能に連結された"なる語句は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４ポリペプチドおよび非−１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４ポリペプチドを互いに枠内で（in-flame）で融合することを示すことを意図している。非−１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４ポリペプチドは、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４ポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に融合し得る。
【０２２６】
例えば、１の具体例において、融合タンパク質は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４配列がＧＳＴのＣ−末端に融合したＧＳＴ−１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４融合タンパク質である。かかる融合タンパク質により、組換え１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４の精製が促進され得る。
【０２２７】
もう１の具体例において、この融合タンパク質はＮ−末端に異種のシグナル配列を含む１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質である。ある種の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）においては、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４の発現および／分泌を、異種のシグナル配列の使用を介して高め得る。
【０２２８】
本発明の方法に用いる１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４融合タンパク質は、医薬組成物に入れて、イン・ビボ(in vivo)で対象に投与し得る。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４融合タンパク質を用いて、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４基質のバイオアベイラビリティーに影響し得る。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４融合タンパク質の使用は、（ｉ）１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質をコードする遺伝子の異常な修飾または突然変異；（ｉｉ）１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４遺伝子の誤調節；および（ｉｉｉ）１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の異常な翻訳後修飾、によって引き起こされる障害の治療に治療上有用となり得る。
【０２２９】
さらに、本発明の方法に用いる１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４−融合タンパク質は、免疫原として用いて、対象中に抗−１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４抗体を生成し、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４リガンドを生成し、およびスクリーニングアッセイにおいては１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４と１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４基質との相互作用を阻害する分子を同定し得る。
【０２３０】
好ましくは、本発明の方法に用いる１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４キメラまたは融合タンパク質は、標準的なＤＮＡ技術によって作製する。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、慣用的な技術に従って、例えばライゲーション用の平滑末端処理または突出末端処理した末端、制限酵素消化を用いて、適当な末端を得、適当に粘着末端を埋め、アルカリホスファターゼ処理して望ましくない結合を回避し、および酵素ライゲーションすることによって、枠内で一緒にライゲートする。もう１の具体例において、融合遺伝子は自動ＤＮＡ合成機を含む慣用的な技術によって合成し得る。あるいは、後にアニーリングし、再増幅してキメラ遺伝子配列を生成し得る２の連続する遺伝子フラグメント間の相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて遺伝子フラグメントのPCR増幅を行い得る（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelら、John Wiley & Sons: 1992を参照されたい）。さらに、融合基をすでにコードしている多くの発現ベクターが市販されている（例えば、ＧＳＴポリペプチド）。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４コード核酸は、融合基が１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質に枠内で連結するようにかかる発現ベクターにクローニングし得る。
【０２３１】
本発明は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４アゴニスト（ミメティック）または１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４アンタゴニストのいずれかとして機能する１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の変異型の使用にも関する。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の変異型は、突然変異導入、例えば１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の分離点突然変異または領域切断、によって作製し得る。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質のアゴニストは、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の天然発生形態の生物活性と実質的に同一のまたはそのサブセットを保持し得る。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質のアンタゴニストは、例えば１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４−媒介活性を完全にモジュレートすることによって、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の天然発生形態の１またはそれを超える活性を阻害し得る。したがって、特定の生物効果を、制限された機能の変異型で処理することによって誘起し得る。１の具体例において、タンパク質の天然発生形態の生物活性のサブセットを有する変異型で対象を処理することは、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の天然発生形態での処理と比較して対象においてより少ない副作用しか有していない。
【０２３２】
１の具体例において、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４アゴニスト（ミメティック）または１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４アンタゴニストのいずれかとして機能する１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の変異型は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニスト活性について、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の変異体、例えば領域切断突然変異体のコンビナトリアル・ライブラリーをスクリーニングすることによって同定し得る。１の具体例において、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４変異型のまだらなライブラリーは、核酸レベルのコンビナトリアル突然変異導入法によって作製し、まだらな遺伝子ライブラリーによってコードされている。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４変異型のまだらなライブラリーは、例えば、潜在的な１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４配列の縮重セットが個々のポリペプチドとして、またはその中に１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４配列のセットを含むより大きな融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレー）として発現可能なように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することによって作製し得る。縮重オリゴヌクレオチド配列からの潜在的な１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４変異型のライブラリーの作製に用い得る種々の方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成機で行い得、ついで合成した遺伝子を適当な発現ベクターに連結し得る。遺伝子の縮重セットの使用により、潜在的な１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４配列の望ましいセットをコードするすべての配列の１の混合物中の準備が許容される。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当該技術分野において知られている（例えば、Narang, S. A. (1983) Tetrahedrorz 39: 3；Itakuraら、 (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323；Itakuraら、 (1984) Science 198: 1056；Ikeら、(1983) Nucleic Acid Res. 11: 477を参照されたい)。
【０２３３】
また、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質コード配列のライブラリーまたはフラグメントを用いて、スクリーニングし、その後に１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の変異型を選抜するための１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４フラグメントまだらな集団を生成し得る。１の具体例において、コード配列フラグメントのライブラリーは、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４コード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを１分子あたり約１回のみのニックが生じる条件下にてヌクレアーゼで処理し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを復元して異なるニック産物からのセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成させ、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理によって再形成されたデュプレックスから一本鎖部分を除去し、得られたフラグメントライブラリーを発現ベクターにライゲートすることによって生成し得る。この方法によって、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質のＮ−末端、Ｃ−末端および種々のサイズの内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導化し得る。
【０２３４】
点突然変異または領域切断によって作製したコンビナトリアル・ライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、および選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための幾つかの技術が当該技術分野において知られている。かかる技術は１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質のコンビナトリアル突然変異導入法によって生成した遺伝子ライブラリーの高速スクリーニングに適合可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、ハイスループット分析に順応可能である最も広く使用されている技術には、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、得られたベクターのライブラリーで適当な細胞を形質転換し、望ましい活性を検出することによりその生成物を検出する遺伝子をコードするベクターの単離が促進される条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることが含まれる。ライブラリー中の機能的突然変異体の頻度を高める新たな技術であるrecursive ensemble mutagenesis（ＲＥＭ）をスクリーニングアッセイと組み合わせて、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４変異型を同定し得る（ArkinおよびYourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815；Delgraveら (1993) Protein Engineering 6 (3): 327-331）。
【０２３５】
さらに、本発明の方法には、抗−１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４抗体の使用が含まれる。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体調製の標準的な技術を用いて、単離された１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質またはその一部分もしくはフラグメントを免疫原として用いて、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４に結合する抗体を作製し得る。完全長１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質、あるいは１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４の免疫原性ペプチドフラグメントを免疫原として使用し得る。１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４の免疫原性ペプチドには、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０に示すアミノ酸配列の少なくとも８アミノ酸残基が含まれ、ペプチドに対して生起された抗体が１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質と特異的な免疫複合体を形成するように、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４のエピトープを包含している。好ましくは、抗原性のペプチドには少なくとも１０のアミノ酸残基が含まれ、より好ましくは少なくとも１５のアミノ酸残基が含まれ、なおより好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基が含まれ、および最も好ましくは少なくとも３０アミノ酸残基が含まれる。
【０２３６】
抗原性ペプチドによって包含される好ましいエピトープは、タンパク質の表面に位置する１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４の領域、例えば親水性領域、ならびに高い抗原性を有する領域である。
【０２３７】
典型的には、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４免疫原を用いて、免疫原で好適な対象（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）を免疫することによって抗体を調製する。適当な免疫原調製には、例えば、組換え発現した１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質または化学合成した１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４ポリペプチドが含まれ得る。さらに、調製には、フロイント完全または不完全アジュバントのごときアジュバント、または同様の免疫刺激剤が含まれ得る。免疫原性１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４調製物で好適な対象を免疫すると、ポリクローナル抗−１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４抗体応答が誘導される。
【０２３８】
本明細書で用いる"抗体"なる語句は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４のごとき抗原に特異的に結合する（それと免疫反応する）抗原結合部位を含む分子をいう。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例には、抗体をペプシンのごとき酵素で処理することによって生成し得るＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２フラグメントが含まれる。本発明は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４分子に結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する。本明細書で用いる"モノクローナル抗体"または"モノクローナル抗体組成物"なる語句は、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を１種のみ含む抗体分子の集団をいう。したがって、モノクローナル抗体組成物は、典型的には、それが免疫反応する特定の１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質に対して単一の結合親和性を示す。
【０２３９】
ポリクローナル抗−１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４抗体は、好適な対象を１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４免疫原で免疫することによって前記のごとく調製し得る。免疫した対象における抗−１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４抗体価は、固定化した１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４を用いる酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いるごとき、標準的な技術によって経時的にモニターし得る。望ましい場合には、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４に対して指向された抗体分子を哺乳動物（例えば血液）から単離し、プロテインＡクロマトグラフィーのごときよく知られている技術によってさらに精製してＩｇＧ画分を得ることができる。免疫後の適当な時間に、例えば、抗−１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４抗体価が最高の時に、対象から抗体産生細胞を得、それを用いてKohlerおよびMilstein (1975) Nature 256: 495-497)によって元々記載されたハイブリドーマ技術(Brownら、(1981) J. Immunol. 127: 539-46；Brownら、 (1980) J. Biol. Cavern. 255: 4980-83；Yehら、(1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:2927-31；およびYehら、(1982) Int. J. Cancer 29: 269-75も参照されたい)、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら、(1983) Immunol Today 4: 72）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Coleら、(1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96）またはトリオーマ技術のごとき標準的な技術によってモノクローナル抗体を調製し得る。モノクローナル抗体ハイブリドーマを生成する技術はよく知られている（一般的に、Kenneth, R. H. in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980)；Lerner, E. A. (1981) Yale J. Biol. Med. 54: 387-402；Gefter,M. L.ら、(1977) Somatic Cell Genet. 3: 231-36を参照されたい)。簡単には、インモータルなセルライン（典型的にはミエローマ）を前記した１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４免疫原で免疫した哺乳動物からのリンパ球（典型的には脾細胞）に融合し、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
【０２４０】
リンパ球および不死化セルラインを融合する多くのよく知られているプロトコールのいずれかを、抗−１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４モノクローナル抗体を生成する目的で適用し得る（例えば、G. Galfreら、(1977) Nature 266: 55052；Gefterら、(1977)前掲；Lerner(1981) 前掲；およびKenneth (1980) 前掲を参照されたい)。さらに、当業者であれば、それもまた有用であるかかる方法の多くの変形も存在することは理解される。典型的には、不死化セルライン（例えば、ミエローマセルライン）はリンパ球として同じ哺乳動物種かに由来する。例えば、齧歯類ハイブリドーマは、本発明の免疫原調製物で免疫したマウスからのリンパ球と不死化マウス・セルラインとを融合することによって作製し得る。好ましい不死化セルラインは、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培養培地（"ＨＡＴ培地"）に感受性であるマウス・ミエローマセルラインである。例えばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８.６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４ミエローマ系統のような多くのミエローマ・セルラインを、標準的技術に従って融合パートナーとして用い得る。典型的には、ＨＡＴ−感受性マウスミエローマ細胞は、ポリエチレングリコール("ＰＥＧ"）を用いてマウス脾細胞に融合する。ついで、融合から得られたハイブリドーマ細胞を、非融合ミエローマ細胞および無効な融合ミエローマ細胞を死滅させるＨＡＴ培地を用いて選択する（非融合脾細胞は、形質転換されていないために数日後に死滅する）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４に結合する抗体につきハイブリドーマ培地の上清をスクリーニングすることによって検出する。
【０２４１】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製する別法として、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４で組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレーライブラリー）をスクリーニングすることによってモノクローナル抗−１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４抗体を同定および単離し、それによって、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４に結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを単離し得る。ファージディスプレーライブラリーを作製およびスクリーニングするためのキットは市販されている（例えば、Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01；およびStratagene SurfZAPTM Phage Display Kit, Catalog No. 240612)。抗体ディスプレーライブラリーを作製およびスクリーニングに使用するのに特に適用可能な方法および試薬の例は、例えばLadnerら、米国特許第5,223,409号；Kangら、国際公開番号WO 92/18619号；Dowerら、国際公開番号WO 91/17271号；Winterら、国際公開番号WO 92/20791号；Marklandら、国際公開番号WO 92/15679号；Breitlingら、国際公開番号WO 93/01288号；McCaffertyら、国際公開番号WO 92/01047号；Garrardら、国際公開番号WO 92/09690号；Ladnerら、国際公開番号WO 90/02809号；Fuchsら、(1991) Bio/Technology 9: 1370-1372；Hayら、(1992) Hum. Antibod. Hybridomes 3: 81-85；Huseら、(1989) Science 246: 1275-1281；Griffithsら、(1993) EMBO J 12: 725-734；Hawkinsら、(1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896；Clarksonら、(1991) Nature 352: 624- 628；Gramら、(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580；Garradら、 (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377；Hoogenboomら、(1991) Nuc. Acid Res. 19: 4133-4137；Barbasら、(1991) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 88: 7978-7982；ならびにMcCaffertyら、(1990) Nature 348: 552-554に見出し得る。
【０２４２】
さらに、ヒトおよび非ヒト部分を含み、標準的な組換えDNA技術を用いて作製し得る、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体のごとき組換え抗−１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４抗体も本発明の方法の範囲内に入る。かかるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、例えばRobinsonら、国際出願番号PCT／US86／02269号；Akiraら、欧州特許出願184,187；Taniguchi, M. , 欧州特許出願171,496；Morrisonら、欧州特許出願173,494 ；Neubergerら、国際公開番号WO 86/01533；Cabillyら、米国特許第4,816, 567号；Cabillyら、欧州特許出願125,023；Betterら、(1988) Science 240: 1041- 1043；Liuら、(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443；Liuら、(1987) J. Immunol. 139: 3521-3526；Sunら、(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218；Nishimuraら、(1987) Canc. Res. 47: 999-1005；Woodら、(1985) Nature 314:446-449；Shawら、(1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559；Morrison, S. L. (1985) Science 229: 1202-1207；Oiら、 (1986) BioTecniques 4: 214；Winter、米国特許第5,225, 539号；Jonesら、(1986) Nature 321: 552-525；Verhoeyanら (1988) Science 239: 1534；ならびにBeidlerら、(1988) J.Immunol. 141: 4053-4060に記載されている方法を用いて、当該技術分野において知られている組換えＤＮＡ技術を用いて作製し得る。
【０２４３】
１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質の豊富性および発現のパターンを評価するためには、抗−１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４抗体を用いて、１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４タンパク質を検出し得る。抗−１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９または９３８０４抗体を診断的に用いて、臨床試験手法の一部分として組織中のタンパク質レベルを診断的にモニターし、例えば所定の治療様式の効力を決定し得る。検出は抗体を検出可能な物質にカップリング（すなわち、物理的結合）することによって促進し得る。検出可能な物質の例には、種々の酵素、置換基、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が含まれる。好適な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが含まれ；好適な置換基複合体の例にはストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれ；好適な好適な蛍光物質の例にはウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオロセリン・イソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン・フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンが含まれ；発光物質の例にはルミノールが含まれ；生物発光物質の例にはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが含まれ、好適な放射性物質の例には１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが含まれる。
【０２４４】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するがこれは限定するものと解釈されてはならない。本願全体を通して引用したすべての参考文献、特許および特許公開公報の内容ならびに図面および配列表を出典明示して本明細書の一部とみなす。
【０２４５】
実施例
実施例１：ＴａｑＭａｎＴＭ分析を用いた組織分布
本実施例ではＴａｑＭａｎＴＭ法を記載する。ＴａｑＭａｎＴＭ法はｍＲＮＡを検出するための定量性の逆転写酵素ＰＣＲベースのアプローチである。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄＴＭＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用して、ＰＣＲの間にＴａｑＭａｎＴＭプローブを切断する。簡単には、関心のある試料、例えば心臓、腎臓、肝臓、骨格筋、および種々の血管からｃＤＮＡを作製し、それをＰＣＲ増幅の出発物質として使用する。５’および３’遺伝子特異的プライマーに加えて、遺伝子特異的オリゴヌクレオチド・プローブ（増幅する領域に相補的である）を反応に含めた（すなわち、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ）。ＴａｑＭａｎＴＭプローブには、プローブの５’末端に共有結合した蛍光レポーター色素（ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、ＴＥＴ（６−カルボキシ−４，７，２’，７−テトラクロロフルオロセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４，５−ジクロロ−２，７−ジメトキシフルオレセイン）またはＶＩＣのごとき）およびクエンチャー色素（ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−Ｎ，Ｎ,Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルローダミン）をプローブの３’末端に有するオリゴヌクレオチドが含まれる。
【０２４６】
ＰＣＲ反応の間に、プローブの切断がレポーター色素およびクエンチャー色素を分離すると、レポーターの増大した蛍光を生じる。ＰＣＲ産物の蓄積は、レポーター色素の蛍光における増大をモニターすることによって直接的に検出する。プローブがインタクトな場合、クエンチャー色素にレポーター遺伝子が近接していることにより、レポーターの蛍光が抑制される。ＰＣＲの間に関心のある標的が存在する場合には、プローブがフォワードプライマーとリバースプライマーの部位の間に特異的にアニールする。プローブが標的にハイブリダイズした場合にのみ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄＴＭＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性により、レポーターおよびクエンチャー間のプローブが切断される。その場合、プローブのフラグメントは標的から離れ、鎖の重合が続く。プローブの３’末端はブロックされて、ＰＣＲの間のプローブの伸長が阻害される。このプロセスはサイクル毎に生じ、産物の指数関数的な蓄積を妨害しない。ＲＮＡはトリゾール法を用いて調製し、ＤＮアーゼで処理してコンタミしているゲノミックＤＮＡを除去した。ｃＤＮＡは標準的な技術を用いて合成した。試料で行った逆転写酵素不存在下でのモックｃＤＮＡ合成が対照遺伝子の検出可能なＰＣＲ増幅を生じない場合には、ゲノミックＤＮＡのコンタミネーションが有効に除去されたことが確認される。
【０２４７】
等価物
当業者であれば日常的な実験方法を超えるものを用いて本明細書に記載した本発明の特異的な具体例の多くの等価物を認識し、または確認することができるであろう。かかる等価物も以下の特許請求の範囲により包含されることが意図されている。

Claims (13)

  1. １３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４核酸発現または１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ポリペプチド活性をモジュレートする化合物の能力をアッセイし、それによって心血管障害を治療することができる化合物を同定することを含む、心血管障害を治療することができる化合物を同定する方法。
  2. ａ）１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４を発現する細胞と試験化合物とを接触させ；ついで
    ｂ）１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４核酸の発現または１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ポリペプチドの活性をモジュレートする試験化合物の能力をアッセイし、それによって脂質産生をモジュレートすることができる化合物を同定することを含む、脂質産生をモジュレートすることができる化合物を同定する方法。
  3. 細胞と１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４モジュレーターとを接触させ、それによって細胞における脂質産生をモジュレートすることを含む、細胞における脂質産生をモジュレートする方法。
  4. 細胞が肝臓細胞である請求項２記載の方法。
  5. １３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４モジュレーターが小有機分子、ペプチド、抗体またはアンチセンス核酸分子である請求項３記載の方法。
  6. １３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４モジュレーターが１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ポリペプチド活性をモジュレートすることができる請求項３記載の方法。
  7. １３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４モジュレーターが小有機分子、ペプチド、抗体またはアンチセンス核酸分子である請求項６記載の方法。
  8. １３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４モジュレーターが１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４核酸発現をモジュレートすることができる請求項６記載の方法。
  9. 対象に１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４モジュレーターを投与し、それによって心血管障害を有する該対象を治療することを含む、異常な１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ポリペプチド活性または異常な１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４核酸発現によって特徴付けられる心血管障害を有する対象を治療する方法。
  10. 該心血管障害が、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、心臓の肥大、虚血後再潅流傷害、再狭窄、動脈炎症、血管壁再構築、心室再構築、急速心室ペーシング（rapid venticular pacing）、冠動脈微小塞栓症、頻脈、徐脈、圧力過負荷、大動脈屈曲（aortic bending）、冠動脈結紮（coronary artery ligation）、血管心臓病、限定されるものではないが石灰化によって引き起こされる心弁閉鎖不全を含む心弁の疾患、リューマチ性心臓疾患、心内膜炎、または人工弁の合併症；心房性細動、ＱＴ延長症候群、うっ血性心不全、洞房結節機能障害、狭心症、心不全、高血圧症、心房性細動、心房粗動、限定されるものではないが、心膜液貯留心膜炎および心外膜炎を含む心膜疾患；例えば拡張型心筋症または特発性心筋症のような心筋症、心筋梗塞、冠動脈疾患、冠攣縮、虚血性疾患、不整脈、心臓突然死、および心血管発達障害よりなる群から選択される請求項９記載の方法。
  11. 該１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４モジュレーターを医薬上許容される処方で投与する請求項９記載の方法。
  12. １３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４モジュレーターが小有機分子、ペプチド、抗体またはアンチセンス核酸分子である請求項９記載の方法。
  13. １３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４モジュレーターが１３９、２５８、１２６１、１４８６、２３９８、２４１４、７６６０、８５８７、１０１８３、１０５５０、１２６８０、１７９２１、３２２４８、６０４８９もしくは９３８０４ポリペプチド活性をモジュレートすることができる請求項９記載の方法。
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