JP2005508640A - ２型サイトカインレセプターおよびそれをコードする核酸 - Google Patents

２型サイトカインレセプターおよびそれをコードする核酸 Download PDF

Info

Publication number
JP2005508640A
JP2005508640A JP2003542592A JP2003542592A JP2005508640A JP 2005508640 A JP2005508640 A JP 2005508640A JP 2003542592 A JP2003542592 A JP 2003542592A JP 2003542592 A JP2003542592 A JP 2003542592A JP 2005508640 A JP2005508640 A JP 2005508640A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polypeptide
crf2
seq
nucleic acid
polynucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2003542592A
Other languages
English (en)
Inventor
ウェイ リウ，
リネッテ フォウサー，
ビッキー スパウルディング，
Original Assignee
ワイエス
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ワイエス filed Critical ワイエス
Publication of JP2005508640A publication Critical patent/JP2005508640A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7158—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for chemokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本発明は、新規に単離されたＣＲＦ２−１３ポリヌクレオチドおよびＣＲＦ２−１３ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを提供する。ＣＲＦ２−１３ポリペプチドまたはＣＲＦ２−１３ポリペプチドの任意の誘導体（融合誘導体を含む）、改変体、変異体またはフラグメント、ポリヌクレオチドあるいは抗体に免疫学的に結合する抗体もまた提供される。さらに、本発明は、ＣＲＦ２−１３ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体が、病理学的状態の幅広い範囲の検出および処置において利用される方法、ならびに他の用途を提供する。

Description

（発明の分野）
本発明は、一般的に核酸およびポリペプチド、そしてより具体的にはＩＩ型サイトカインレセプターをコードする核酸およびポリペプチド、ならびにそのポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産生するための、ベクター、宿主細胞、抗体および組換え方法に関連する。
（発明の背景）
インターフェロンのようなサイトカインは、多くの細胞型の増殖および分化に影響を与える可溶性タンパク質である。サイトカインは、サイトカインの影響に応答する細胞の表面に位置する、サイトカインレセプターを通してその効果を発揮する。サイトカインレセプターは、サイトカインに高親和性で結合し、そしてこの細胞への結合事象をレセプターサブユニットの細胞質部分を通して変換する、１つ以上の膜内在タンパク質から構成される。
サイトカインレセプターは、その細胞外リガンド結合ドメインの類似性に基づいて、いくつかのクラスに分けられている。例えば、インターフェロンサイトカインに結合し、そして／またはその影響を変換するのを司るレセプター鎖は、特徴的な２００〜２５０残基の細胞外ドメインの存在に基づく、ＩＩ型サイトカインレセプターファミリー（ＣＲＦ２）のメンバーである。
ＣＲＦ２ファミリーのメンバーは、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＩＬ−１０、ＩＬ−２０、およびＩＬ−２２を含む、様々なサイトカインのレセプターとして作用することが報告された。最近同定されたＣＲＦ２ファミリーのメンバーは、ＩＬ−１０様分子ＩＬ−１９、ＡＫ１５５、およびｍｄａ−７の候補リガンドである。
これらインターフェロンの示されたインビボでの活性は、他のサイトカイン、サイトカインアゴニスト、およびサイトカインアンタゴニストの臨床的可能性、およびその必要性を説明する。
（発明の要旨）
本発明は、部分的には、ＣＲＦ２ファミリーの新規メンバーであるＣＲＦ２−１３をコードするポリヌクレオチド配列の知見に基づく。
従って、１つの局面において、本発明は、配列番号１の配列を含む単離された核酸分子、またはそのフラグメント、ホモログ、アナログまたは誘導体を提供する。その核酸は、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに、少なくとも７０％、例えば８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、またはさらに９９％以上同一のポリペプチドをコードする核酸配列を含み得る。その核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡフラグメント、またはｃＤＮＡ分子であり得る。
本発明にはまた、配列番号２のアミノ酸配列２１〜５２０を含むポリペプチドをコードする核酸（例えば、配列番号１の核酸６１〜１５６０）もある。そのような核酸分子の例は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするものである。
本発明にまた含まれるのは、本明細書中で記載した１つ以上の核酸を含むベクター、および本明細書中で記載したベクターまたは核酸を含む細胞である。
本発明はまた、上記で記載した核酸分子のいずれかを含むベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
別の局面において、本発明はＣＲＦ２−１３核酸および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物を含む。
さらなる局面において、本発明は、実質的に精製されたＣＲＦ２−１３ポリペプチド（例えば、ＣＲＦ２−１３核酸によってコードされる任意のＣＲＦ２−１３ポリペプチド）、ならびにそのフラグメント、ホモログ、アナログ、および誘導体を含む。本発明はまた、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物を含む。
またさらなる局面において、本発明は、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。その抗体は、例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、ならびにそのフラグメント、ホモログ、アナログ、および誘導体であり得る。本発明はまた、ＣＲＦ２−１３抗体および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物を含む。本発明はまた、上記で記載した核酸分子のいずれかによってコードされるポリペプチドのエピトープに結合する単離された抗体に関する。
本発明はまた、上記で記載した薬学的組成物のいずれかを含むキットを含む。
本発明はさらに、ＣＲＦ２−１３核酸（例えば、ＣＲＦ２−１３核酸を含むベクター）を含む細胞を提供し、そしてその細胞をその核酸によってコードされるＣＲＦ２−１３ポリペプチドを発現するのに十分な条件下で培養することによって、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドを産生するための方法を提供する。次いで発現されたＣＲＦ２−１３ポリペプチドを細胞から回収する。好ましくは、その細胞は、内因性ＣＲＦ２−１３ポリペプチドをほとんどまたは全く産生しない。その細胞は、例えば、原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。
本発明はまた、サンプルをＣＲＦ２−１３ポリペプチドまたはＣＲＦ２−１３核酸に特異的に結合する化合物と接触させ、そしてもし存在するなら複合体の形成を検出することによって、サンプル中のＣＲＦ２−１３ポリペプチドまたはＣＲＦ２−１３核酸を同定する方法に関する。
本発明はさらに、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドを化合物と接触させ、そしてＣＲＦ２−１３ポリペプチドの活性が改変されるかどうかを決定することによって、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法を提供する。
本発明はまた、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドを化合物と接触させ、そしてその化合物がＣＲＦ２−１３ポリペプチドの活性を改変するか、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドに結合するか、またはＣＲＦ２−１３ポリペプチドをコードする核酸分子に結合するかどうかを決定することによって同定された、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドの活性を調節する化合物に関する。
別の局面において、本発明は、被験体におけるＣＲＦ２−１３関連障害の存在または素因を決定する方法を提供する。その方法は、その被験体由来のサンプルを提供する工程、および被験体のサンプル中のＣＲＦ２−１３ポリペプチドの量を測定する工程を包含する。被験体サンプル中のＣＲＦ２−１３ポリペプチドの量を、次いでコントロールサンプル中のＣＲＦ２−１３ポリペプチドの量と比較する。コントロールタンパク質サンプル中のＣＲＦ２−１３ポリペプチドの量と比較して、被験体タンパク質サンプル中のＣＲＦ２−１３ポリペプチドの量における変化は、その被験体が組織増殖関連状態を有することを示す。コントロールサンプルは、好ましくは、一致する個体、すなわち同様の年齢、性別、または他の一般的な状態を有するが、組織増殖関連状態を有することが疑われない個体から採取される。あるいは、コンロトールサンプルは、被験体が組織増殖関連障害を有することが疑われない時に、その被験体から採取され得る。いくつかの実施態様において、ＣＲＦ２−１３は、ＣＲＦ２−１３抗体を用いて検出される。
さらなる局面において、本発明は、被験体においてＣＲＦ２−１３関連障害の存在または素因を決定する方法を提供する。その方法は、被験体由来の核酸サンプル（例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または両方）を提供する工程、およびその被験体核酸サンプル中のＣＲＦ２−１３核酸の量を測定する工程を包含する。その被験体核酸中のＣＲＦ２−１３核酸サンプルの量は、次いでコントロールサンプル中のＣＲＦ２−１３核酸の量と比較される。コントロールサンプル中のＣＲＦ２−１３の量と比較して、サンプル中のＣＲＦ２−１３核酸の量における変化は、その被験体が組織増殖関連障害を有することを示す。
なおさらなる局面において、本発明は、ＣＲＦ２−１３関連障害を処置する、または予防する、または遅らせる方法を提供する。その方法は、そのような処置または予防または遅延が望ましい被験体に、ＣＲＦ２−１３核酸、ＣＲＦ２−１３ポリペプチド、またはＣＲＦ２−１３抗体を、被験体において組織増殖関連障害を処置、予防、または遅延するのに十分な量投与する工程を包含する。そのような障害の例としては、慢性関節リウマチおよび多発性硬化症が挙げられる。
他に定義しなければ、本明細書中で使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で記載した方法および材料と同様または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用し得るが、適切な方法および材料を下記で記載する。本明細書中で述べた全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法、および実施例は単なる例示であり、そして制限することを意図しない。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
（発明の詳細な説明）
本発明は、部分的には、ＣＲＦ２ポリペプチドに相同性を示すポリペプチドをコードする新規核酸配列の知見に基づく。本発明に含まれるのは、表１に示す１５６３ヌクレオチド配列（配列番号１）である。配列番号１のヌクレオチド１〜１５６０は、５２０アミノ酸のＣＲＦ２様ポリペプチドをコードする。コードされたポリペプチドのアミノ酸配列を、表２に示す（配列番号２）。５’非翻訳領域の一部および表１で示したコード配列の一部を有する核酸が、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーで同定された。
Figure 2005508640
Figure 2005508640
 表１の核酸は、表２に示す５２０アミノ酸配列（配列番号２）をコードする。Ｓｉｇｎａｌ ＰおよびＰｓｏｒｔの結果は、ＣＲＦ２−１３タンパク質がシグナルペプチドを含み、そして０．４６０の確実性で原形質膜に局在する可能性が高いことを予測する。ＣＲＦ２−１３ポリペプチドの最も可能性の高い切断部位は、アミノ酸２４６と２４７との間、ＡＧＧ−ＶＩにおいてである。
ＣＲＦ２−１３アミノ酸配列は、他の以前に記載されたインターロイキン結合タンパク質と関連する。その関連を、図１に図解的に示す。配列番号２のＣＲＦ２−１３アミノ酸配列は、２３１アミノ酸残基のヒトインターロイキン２２結合タンパク質ＣＲＦ２−１０（ｇｉ｜１５２１２８２６｜）に対して、１１１アミノ酸残基のうち４０個（３６％）同一、そして１１１アミノ酸残基のうち５６個（５０％）類似のアミノ酸残基を有する。同様に、ＣＲＦ２−１３アミノ酸配列は、１３０アミノ酸残基のヒトインターロイキン２２結合タンパク質ＣＲＦ２−１０Ｓ（ｇｉ｜１５２１２８３０｜）に対して、８６アミノ酸残基のうち３２個（３７％）同一、そして８６アミノ酸残基のうち４３個（４９％）類似のアミノ酸残基を有する。さらに、ＣＲＦ２−１３アミノ酸配列は、１３０アミノ酸残基のヒトインターロイキン２２結合タンパク質ＣＲＦ２−１０Ｌ（ｇｉ｜１５２１２８２８｜）に対して、１４２アミノ酸残基のうち４１個（２８％）同一、そして１４２アミノ酸残基のうち５８個（３９％）類似のアミノ酸残基を有する。
ＣＲＦ２−１３ポリペプチドはまた、表３Ａに列挙したＢＬＡＳＴＰデータにおいて示したアミノ酸配列に対して相同性を示す。相同性を、Ａｌｔｓｃｈｕｌおよび共同実験者（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、１９９７）の方法によって計算する。
本明細書中における全てのＢＬＡＳＴアラインメントにおいて、「Ｅ値」または「期待」値は、アラインメントした配列が、検索されたデータベース内で、偶然のみによって、ＢＬＡＳＴ問合せ配列に対するその類似性を達成し得る確率の数字の表示である。例えば、ＩＩＴ ＢＬＡＳＴ分析から回収した対象（「Ｓｂｊｃｔ」）が、純粋に偶然によってＱｕｅｒｙ ＩＩＴ配列とマッチする確率が、Ｅ値である。期待値（Ｅ）は、特定の大きさのデータベースを検索する場合に、偶然のみによって見ることを「期待」し得るヒット数を説明するパラメーターである。それは、２つの配列間の一致に割り当てられたスコア（Ｓ）にともなって指数関数的に減少する。本質的に、Ｅ値は、配列間の一致に関して存在する無作為なバックグラウンドノイズを説明する。Ｂｌａｓｔ検索（Ｂｌａｓｔｉｎｇ）を、ＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑ特許データベースのような、公共のヌクレオチドデータベースに対して行なう。例えば、ＢＬＡＳＴＸ検索を、ＧｅｎＢａｎｋデータベース、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＤＢおよびＰＩＲを含む公共のタンパク質データベースに対して行なう。
期待値を、結果を報告するための有意性閾値を作成する簡便な方法として使用する。Ｂｌａｓｔ検索を行うために使用されるデフォルト値は、代表的には０．０００１に設定される。ＢＬＡＳＴ２．０において、期待値をまた、一致の有意性を報告するためのＰ値（確率）の代わりに使用する。例えば、１つのヒットに割り当てられた１のＥ値は、現在のサイズのデータベースにおいて、単純に偶然によって同様のスコアを有する１つの一致を見ることを期待し得ることを意味すると解釈され得る。ゼロのＥ値は、単純に偶然によって同様のスコアを有する一致を見ることを期待しないことを意味する。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／を参照のこと。
Figure 2005508640
 これらの配列の相同性を、表３ＢのＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図表的に示す。
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
本明細書中で開示されたタンパク質における同定可能なドメインの存在を、ＰＲＯＳＩＴＥ、Ｂｌｏｃｋｓ、Ｐｆａｍ、ＰｒｏＤｏｍａｉｎ、Ｐｒｉｎｔｓのようなアルゴリズムを用いて検索し、そして次いでＩｎｔｅｒｐｒｏウェブサイト（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／）またはＰｒｏＤｏｍデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｂｓｍ／ｄｂｂｒｏｗｓｅｒ／ｊｊ／ｐｒｏｄｏｍｓｒｃｈｊｊ．ｈｔｍｌ）のいずれかを用いてドメインマッチ（またはナンバー）を交差することによってＰｒｏＤｏｍまたはＩｎｔｅｒｐｒｏナンバーを決定することよって決定した。表３Ｃ〜表３Ｅは、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドの、Ｐｆａｍ（表３Ｃ）およびＰｒｏＤｏｍａｉｎ（表３Ｄおよび３Ｅ）を用いた、ＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの説明を列挙する。これは、ＣＲＦ２−１３タンパク質配列は、これらのドメインを含むことが公知である他のタンパク質のものと同様の性質を有することを示す。
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
 そのような増殖因子は、細胞増殖および／または分化を活性化する主な結果を伴って、細胞表面のレセプターに結合するタンパク質である。サイトカイン（例えば、リンホカイン；インターロイキンおよびインターフェロン）は、増殖因子の独特なファミリーである。リンホカイン、造血増殖因子および成長ホルモン関連分子の多くのレセプターは、共通のドメインを共有し、そしてファミリーに分類され得る。サイトカインレセプタークラス２ファミリーとしては、インターロイキン１０レセプター；インターフェロンγレセプター；インターフェロンα／βレセプター；および組織因子（Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４１−４６、１９９６）が挙げられる。組織因子および凝固因子ＩＩＩパルミチン酸組織リポタンパク質シグナル糖タンパク質膜貫通前駆体に見出されるドメインと関連する、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドの領域の存在は、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドの原形質膜への局在およびＣＲＦ２−１３ポリペプチドのサイトカインレセプタースーパーファミリーへの割当と一致する。インターフェロン１レセプター膜貫通糖タンパク質前駆体シグナル鎖インターフェロンα／β ＩＦＮ−アルファレセプターに関連する、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドの領域の存在は、この割当を補強する。
表１に示すヌクレオチド配列は、表４に示すゲノムＤＮＡ配列の一部として同定された：
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
表５は、表４に示すゲノム配列と、表１に示すｃＤＮＡ配列の対応する領域の位置との間の関連を示す。
Figure 2005508640
 いくつかの配列多型が、表４で示す配列で同定された。これらを表６でまとめる：
Figure 2005508640
 ＣＲＦ２をコードする核酸は、表７に示すゲノム核酸配列にも存在する：
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
Figure 2005508640
表８は、表７に示すゲノム配列と、表１に示すｃＤＮＡ配列の対応する領域の位置との間の関連を示す。
Figure 2005508640
 いくつかの配列多型が、表７で示す配列で同定された。これらを表９でまとめる：
Figure 2005508640
 本発明のＣＲＦ２様核酸およびＣＲＦ２様ポリペプチド（表１に示すものを含む）を、本明細書中で「ＣＲＦ２−１３」核酸および「ＣＲＦ２−１３」ポリペプチドと呼ぶ。
本発明によるＣＲＦ２−１３核酸およびコードされるポリペプチドは、様々な適用および状況で有用である。例えば、配列比較は、開示されたＣＲＦ２−１３核酸（表１）がＩＩ型サイトカインレセプターをコードすることを明らかにする。１つ以上の分泌されたレセプター鎖が、ＣＲＦ２の別の膜結合メンバー、または別のファミリーの膜結合レセプターと結合し得る、および／またはその活性を調節し得る。あるいは、またはそれに加えて、本明細書中で開示されたレセプター鎖は、単独で、または別の可溶性レセプターと組み合せて作用し得る。実質的に、そのレセプターはまた、リガンドであり得る。
本発明のＣＲＦ２−１３ポリペプチドの可溶性形態（例えば、配列番号２のアミノ酸である、アミノ酸２１−２３０を含むポリペプチド）をさらに、可溶性レセプターアンタゴニストとして使用し得る。特定のサイトカイン（例えば、ＴＮＦ）の活性をブロックする可溶性レセプターアンタゴニストは、当該分野で公知である。本発明の可溶性ＣＲＦ２−１３ポリペプチドは、ＣＲＦ２メンバーを介して作用するサイトカインの活性を同様にブロックし得る。そのようなポリペプチドの例としては、ＩＬ−１０、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２、ＡＫ１５５、ｍｄａ−７、またはインターフェロン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、またはインターフェロンγ）が挙げられる。１つの実施態様において、本発明の可溶性ＣＲＦ２−１３ポリペプチドは、ＩＬ−２２の機能に拮抗するために使用される。ＩＬ−２２は、配列がＩＬ−１０に遠く関連し、そして活性化Ｔ細胞によって産生される。細胞へのＩＬ−２２シグナル伝達は、そのレセプター鎖であり、両方ともＣＲＦ２ファミリーのメンバーであるＩＬ−２２ＲおよびＣＲＦ２−４によって媒介される。ＣＲＦ２−４レセプターは、もとはＩＬ−１０シグナル伝達において２番目の構成成分として作用すると報告された。ＩＬ−２２は、ヒトＴｈ２ Ｔ細胞からのＩＬ−４産生を阻害し、そしてマウスの肝臓において急性期タンパク質を誘導すると報告された。
本発明によるＣＲＦ２−１３核酸およびＣＲＦ２−１３ポリペプチドをさらに、発明物を作製する、または細胞集団において発明物に結合する細胞型を同定するために使用し得る。ＣＲＦ２−１３核酸およびＣＲＦ２−１３ポリペプチドをまた、免疫調節、炎症、免疫抑制、アレルギー、喘息、自己免疫（慢性関節リウマチおよび多発性硬化症を含む）、血管の損傷または疾患後の血管平滑筋細胞の修復、移植およびこの可溶性レセプターと結合するリガンドに基づく癌のために、単独でまたは別のレセプターと組み合せて使用し得、そして上記のメカニズムおよび／または病状に対してこのリガンドが有する影響。
例えば、本発明のＣＲＦ２−１３ポリペプチドおよび／またはＣＲＦ２−１３ポリペプチドの可溶性形態は、活性のうちの１つ以上の以下を示し得る：（１）調節、例えばそれはサイトカイン（例えば、ＩＬ−１０またはＩＬ−２２）によって媒介されるシグナル伝達経路に拮抗し得る；（２）サイトカイン産生および／または分泌の調節（例えば、炎症促進性サイトカインの産生および／または分泌）；（３）リンホカインの産生および／または分泌の調節；（４）核転写因子の発現または活性の調節；（５）サイトカインリガンドに関してサイトカインレセプターと競合；（６）細胞の増殖、発達、または分化の調節（例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０またはＩＬ−２２）刺激性の産生、発達、または分化）；（７）細胞免疫応答の調節；サイトカイン媒介性炎症促進性作用の調節；ならびに／または免疫反応の促進および／または増強。
本発明のＣＲＦ２−１３ポリペプチドは、膜結合レセプターとの結合によって直接的に、または可溶性リガンドとの結合によって間接的に、以下の細胞型のうちの１つ以上に影響を及ぼすまたは変化をもたらし得る：循環細胞または組織結合細胞：Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ、単球、好中球、肥満細胞、好塩基球、好酸球、ならびに気道、膵臓、腎臓、肝臓、小腸および大腸の細胞。本発明のＣＲＦ２−１３ポリペプチドはさらに、体液性免疫応答および細胞性免疫反応のアップレギュレーションを調節し得る；炎症促進性のサイトカインおよびケモカインの合成を調節し得る；そして損傷、敗血症、胃腸疾患および心血管疾患に関連する炎症応答、または手術後の炎症を調節し得る。
タンパク質の効率的な産生のために、ＣＲＦ２−１３配列を、望ましい宿主における発現に最適化した発現制御配列の制御下に置くことが好ましい。例えば、その配列は、最適化転写配列および／または翻訳調節配列（例えば、変更されたＫｏｚａｋ配列）を含み得る。それに加えて、ＣＲＦ２−１３タンパク質の成熟アミノ末端を、このタンパク質の推定のまたは経験的に決定した成熟アミノ末端に基づいて、非ＣＲＦ２−１３シグナル配列に作動可能に連結し得る。
ＣＲＦ２−１３融合タンパク質を、当該分野で公知のアッセイを用いて、結合パートナーを同定および決定するために使用し得る。これらのアッセイは、例えば、組織学的アッセイ、免疫化学的アッセイ、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイ、または細胞生物学に基づくアッセイのいずれかを含む。
本発明のＣＲＦ２−１３タンパク質が、ＣＲＦ２ファミリーの他のメンバーを既に発現する細胞型と結合するかどうか決定するためにも、アッセイを行ない得る。本発明のＣＲＦ２−１３をまた、公知または新規のサイトカインの活性を調節するその能力に関して、（例えば、サイトカインの機能を阻害または他の方法で拮抗することによって）調査し得る。
例えば、いくつかの新規ＩＬ−１０様分子がクローニングされている。ＩＬ−２２はこれらの分子の１つである。この分子が、Ｔｈ２細胞によるＩＬ−４の産生をブロックし（ヒト）、そして急性期反応を開始する（マウス）ことが報告された。ＣＲＦ２−１３がＩＬ−２２（または他のＩＬ−１０様分子）に結合および阻害するという知見は、ＣＲＦ２−１３発明物を、高レベルのＩＬ−２２ポリペプチドと関連する疾患を処置または予防するために使用し得ることを示す。
本発明のＣＲＦ２−１３ポリペプチドが、ＣＲＦ２ファミリー内の他のレセプターおよび／またはその結合するサイトカインと結合することも企図される。例えば、本発明のＣＲＦ２−１３は、ＩＬ−２２Ｒのいずれかの鎖と結合し、そしてそのレセプターまたはＩＬ−２２リガンドの機能に影響を与え得る。
（ＣＲＦ２−１３核酸）
本発明の核酸は、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドまたはタンパク質をコードするものを含む。本明細書中で使用される場合、ポリペプチドおよびタンパク質という用語は交換可能である。
いくつかの実施形態において、ＣＲＦ２−１３核酸は、成熟ＣＲＦ２−１３ポリペプチドをコードする。本明細書中で使用される場合、本明細書中で記載されるポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、天然に存在するポリペプチドまたは前駆体形態またはプロタンパク質の産物と関連する。ＣＲＦ２−１３ポリペプチドの成熟形態をコードするＣＲＦ２−１３核酸の例は、配列番号２のアミノ酸２１−５２０をコードするヌクレオチド配列である（例えば配列番号１のヌクレオチド６１−１５６０）。天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質は、制限しない例として、対応する遺伝子によってコードされた、全長遺伝子産物を含む。あるいは、それは、本明細書中で記載されるオープンリーディングフレームによってコードされるポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質として規定し得る。産物の「成熟」形態は、再び制限しない例として、その遺伝子産物が生じる細胞内で起こり得る、１つ以上の天然に起こる処理工程の結果として生ずる。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態へいたるそのような処理工程の例は、オープンリーディングフレームの開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドまたはリーダー配列のタンパク質分解的切断を含む。従って、残基１がＮ末端メチオニンである、残基１からＮを有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、Ｎ末端メチオニンの除去後残る残基２からＮを有する。あるいは、残基１から残基ＭまでのＮ末端シグナル配列が切断される、残基１からＮを有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、残る残基Ｍ＋１から残基Ｎまでを有する。さらに本明細書中で使用される場合、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形式は、タンパク質分解切断の発生以外の、翻訳後修飾の工程から生じ得る。そのようなさらなる処理は、制限しない例として、糖鎖付加、ミリストイル化、またはリン酸化を含む。一般的に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質は、これらの処理の１つのみ、またはそれらのいずれかの組み合せの作用から生じ得る。
配列番号１のヌクレオチド１−１５６０、配列番号１それ自身、またはこれらの配列の１つのフラグメントにおいてその配列が提供される核酸が、本発明のＣＲＦ２−１３核酸に含まれる。さらに、本発明は、配列番号１の変異または改変体核酸、またはそのフラグメントを含み、その塩基のいずれかが、配列番号１で示す対応する塩基から変化し得るが、依然として少なくとも１つのＣＲＦ２−１３様活性および生理学的機能（すなわち血管新生、神経発達の調節）を維持するタンパク質をコードする。本発明はさらに、そのフラグメント、誘導体、アナログおよびホモログを含む、配列番号１の核酸配列の相補体を含む。本発明はさらに、その構造が化学的修飾を含む核酸または核酸フラグメント、またはそれへの相補体を含む。
本発明の１つの局面は、ＣＲＦ２−１３タンパク質またはその生物学的に活性な部分をコードする単離核酸分子に関係する。ＣＲＦ２−１３をコードする核酸（例えばＣＲＦ２−１３ ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な核酸フラグメント、およびＣＲＦ２−１３核酸分子の増幅または変異のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして使用するフラグメントも含まれる。本明細書中で使用される場合、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを使用して産生したＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ、およびその誘導体、フラグメント、およびホモログを含むよう意図される。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
「プローブ」は、用途に依存して、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、１００ｎｔ、または例えば約６，０００ｎｔの間の、様々な長さの核酸配列を指す。プローブを、同一の、同様の、または相補的な核酸配列を検出するために使用する。より長いプローブは、通常天然または組換え供給源から得られ、高度に特異的であり、そしてオリゴマーよりもハイブリダイズするのが非常に遅い。プローブは一本鎖または二本鎖で有り得、そしてＰＣＲ、膜に基づくハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様技術において特異性を有するよう設計し得る。
「単離」核酸分子は、その核酸の天然供給源において存在する他の核酸分子から分離されたものである。単離核酸分子の例は、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子、異種由来宿主細胞において維持される組換えＤＮＡ分子、部分的にまたは実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含むがこれに限らない。好ましくは、「単離」核酸は、その核酸が得られた有機体のゲノムＤＮＡにおいて天然にその核酸分子をはさむ配列（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、様々な実施形態において、単離ＣＲＦ２−１３核酸分子は、約５０ｋｂ、２５ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂより少ない、その核酸が得られた細胞のゲノムＤＮＡにおいて天然にその核酸分子をはさむヌクレオチド配列を含み得る。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は、組換え技術によって産生される場合には他の細胞物質または培地から、または化学的に合成される場合には化学的前駆体または他の化学物質を、実質的に含むことができない。
本発明の核酸分子、例えば配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはその相補体を、標準的な分子生物学的技術および本明細書中で提供される配列情報を用いて単離し得る。配列番号１の核酸配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、ＣＲＦ２−１３核酸配列を、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３で記載されるような）を用いて単離し得る。
本発明の核酸を、標準的なＰＣＲ増幅技術によって、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはあるいはゲノムＤＮＡを鋳型として、そして適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅し得る。そのように増幅した核酸を、適切なベクターにクローニングし、そしてＤＮＡ配列分析によって特徴付けし得る。さらに、ＣＲＦ２−１３ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、標準的な合成技術によって、例えば自動化ＤＮＡ合成機を用いて調製し得る。
本明細書中で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、一連の連結したヌクレオチド残基を指し、そのオリゴヌクレオチドはＰＣＲ反応において使用されるために十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列に基づき得るか、またはそれから設計し得、そして特定の細胞または組織において同一の、同様の、または相補的なＤＮＡまたはＲＮＡの存在を増幅、確認、または明らかにするために使用される。オリゴヌクレオチドは、約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔの長さ、好ましくは約１５ｎｔから３０ｎｔの長さを有する核酸配列の部分を含む。１つの実施形態において、１００ｎｔより短い長さの核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、さらに配列番号１の少なくとも６つの連続的なヌクレオチド、またはその相補体を含む。オリゴヌクレオチドを、化学的に合成し得、そしてプローブとして使用し得る。
別の実施形態において、本発明の単離核酸分子は、配列番号１で示したヌクレオチド配列、またはこのヌクレオチド配列の一部に相補的な核酸分子を含む。配列番号１で示したヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、配列番号１で示したヌクレオチド配列とほとんどミスマッチなしで、またはミスマッチなしで水素結合し、それによって安定な二本鎖を形成し得るほど十分に配列番号１で示したヌクレオチド配列と相補的なものである。
本明細書中で使用される場合、「相補的」という用語は、核酸分子のヌクレオチドユニット間の、Ｗａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成を指し、そして「結合」という用語は、２つのポリペプチドまたは化合物あるいは関連するポリペプチドまたは化合物あるいはその組み合せ間の、物理的または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン性、非イオン性、ファンデルワールス、疎水性相互作用等を含む。物理的相互作用は、直接的または間接的のいずれかであり得る。間接的相互作用は、別のポリペプチドまたは化合物の効果を介して、または別のポリペプチドまたは化合物に起因し得る。直接的結合は、別のポリペプチドまたは化合物の効果を介して、または別のポリペプチドまたは化合物に起因して起こる相互作用を指すのではなく、その代わりに他の実質的な化学的中間体を有さない。
さらに、本発明の核酸分子は、配列番号１の核酸配列の一部のみ、例えばプローブまたはプライマーとして使用し得るフラグメント、またはＣＲＦ２−１３の生物学的に活性な部分をコードするフラグメントを含み得る。本明細書中で提供されるフラグメントは、少なくとも６つの（連続的な）核酸、または少なくとも４つの（連続的な）アミノ酸、それぞれ核酸の場合には特異的なハイブリダイゼーション、またはアミノ酸の場合にはエピトープの特異的認識を可能にするのに十分な長さの配列として定義され、そして多くても全長配列より短いある部分である。フラグメントは、選択された核酸またはアミノ酸配列のあらゆる連続的な部分由来であり得る。誘導体は、直接的に、または修飾もしくは部分的な置換によってのいずれかで天然の化合物から形成された核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、天然化合物と同様の、しかし同一ではない構造を有するが、ある構成成分または側鎖に関してそれと異なる核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、合成的または異なる進化的起源由来であり得、そして野生型と比較して同様のまたは反対の代謝活性を有し得る。
誘導体またはアナログが、下記のように修飾核酸またはアミノ酸を含む場合、誘導体およびアナログは、全長または全長以外であり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体またはアナログは、様々な実施形態において、同じサイズの核酸またはアミノ酸配列において、または当該分野で公知のコンピューター相同性プログラムによってアラインメントを行なった整列配列と比較した場合に、少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、またはさらに９９％の同一性で（好ましくは８０−９９％の同一性で）、本発明の核酸またはタンパク質に実質的に相同的であるか、またはそのコードする核酸が、ストリンジェントな、中程度にストリンジェントな、または低ストリンジェントな条件下で前述のタンパク質をコードする配列の相補体とハイブリダイズし得る領域を含む分子を含むがこれに限らない。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３、および下記を参照のこと。代表的なプログラムは、デフォルト設定を用いたＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８ ｆｏｒ ＵＮＩＸ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）であり、それはＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、１９８１、２：４８２−４８９、これは本明細書中でその全体が参考として援用される）のアルゴリズムを用いる。
「相同的核酸配列」または「相同的アミノ酸配列」またはそのバリエーションは、上記で記載したようにヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルにおける相同性によって特徴付けられる配列をいう。相同的ヌクレオチド配列は、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドのアイソフォームをコードする配列をコードする。アイソフォームは、例えばＲＮＡの選択的スプライシングの結果として、同じ有機体の異なる組織に発現し得る。あるいは、アイソフォームは異なる遺伝子によってコードされ得る。本発明において、相同的ヌクレオチド配列は、哺乳類を含むがこれに限らない、そして従って例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、および他の生物を含み得る、ヒト以外の種のＣＲＦ２−１３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。相同的ヌクレオチド配列はまた、本明細書中で示したヌクレオチド配列の、天然に存在する対立遺伝子バリエーションおよび変異を含むがこれに限らない。しかし、相同的ヌクレオチド配列は、ヒトＣＲＦ２−１３タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない。相同的核酸配列は、配列番号２において保存的アミノ酸置換（下記を参照のこと）、およびＣＲＦ２−１３活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＣＲＦ２−１３タンパク質の生物学的活性を、下記で記載する。相同的アミノ酸配列は、ヒトＣＲＦ２−１３ポリペプチドのアミノ酸配列をコードしない。
ヒトＣＲＦ２−１３遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列は、例えば他の組織由来の、他の細胞型におけるＣＲＦ２−１３ホモログ、および他の哺乳類由来のＣＲＦ２−１３ホモログの同定および／またはクローニングに使用するために設計されたプローブおよびプライマーの産生を可能にする。プローブ／プライマーは、代表的には実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。そのオリゴヌクレオチドは、代表的には配列番号１の、少なくとも約１２、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００またはそれ以上の連続的なセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号１のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号１の天然に存在する変異体に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
ヒトＣＲＦ２−１３ヌクレオチド配列に基づくプローブを、同じかまたは相同なタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために使用し得る。様々な実施態様において、そのプローブはさらに、それに結合した標識グループを含む、例えばその標識グループは放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補助因子であり得る。そのようなプローブを、被験体由来の細胞のサンプルにおけるＣＲＦ２−１３をコードする核酸のレベルを測定することによるように、例えばＣＲＦ２−１３ ｍＲＮＡレベルを検出すること、またはゲノムＣＲＦ２−１３遺伝子が変異または欠失したかどうかを決定することによって、ＣＲＦ２−１３を異常発現（ｍｉｓｅｘｒｅｓｓ）する細胞または組織を同定するための診断テストキットの一部として使用し得る。
「ＣＲＦ２−１３の生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」は、成熟形態を含む、特定の生物学的アッセイにおいて測定されるような、用量依存性ありまたはなしの、本発明のポリペプチドの活性と同様の、しかし同じである必要はない、活性を示すポリペプチドを指す。「ＣＲＦ２−１３の生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントを、ＣＲＦ２−１３生物学的活性（ＣＲＦ２−１３タンパク質の生物学的活性を下記に記載する）を有するポリペプチドをコードする配列番号１の部分を単離し、ＣＲＦ２−１３タンパク質のコードされた部分を（例えば、インビトロにおける組換え発現によって）発現し、そしてＣＲＦ２−１３のコードされた部分の活性を評価することによって調製し得る。例えば、ＣＲＦ２−１３の生物学的に活性な部分をコードする核酸フラグメントは、任意でサイトカイン結合ドメインを含み得る。別の実施態様において、ＣＲＦ２−１３の生物学的に活性な部分をコードする核酸フラグメントは、１つ以上の領域を含む。
（ＣＲＦ２−１３関連配列における多型）
本発明はまた、ＣＲＦ２−１３核酸配列の多型形態およびＣＲＦ２−１３配列において多型配列を検出する方法も提供する。多型形態は、ＣＲＦ２−１３に関連するエキソンおよび／またはイントロンに対応するゲノム配列を含む。多型は、様々な単離ＣＲＦ２−１３核酸において提供され得る。例えば、多型は、表６に示す多型配列を含む、配列番号３の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドにおいて提供され得る。あるいは、多型は、表９に示す多型配列の代替形態を含む、配列番号２の少なくとも１０個のヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドにおいて提供され得る。
例えば、単離ＣＲＦ２−１３多型配列は、位置３０９６２が「Ａ」または「Ｇ」ならば、配列番号３のヌクレオチド３０９５７からヌクレオチド３０９６７までを含み得る。２つ目の例において、単離ＣＲＦ２−１３多型配列は、位置３０６５５が「Ａ」または「Ｇ」ならば、配列番号３のヌクレオチド３０６５０からヌクレオチド３０６６０までの少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み得る。さらなる例において、単離ＣＲＦ２−１３核酸配列は、位置２８７４４が「Ａ」または「Ｇ」である、配列番号３のヌクレオチド２８７３９からヌクレオチド２８７４９までの少なくとも１０個の連続するヌクレオチド；位置２８４４８が「Ｃ」または「Ｔ」である、配列番号３のヌクレオチド２８４４２から２８４５２までの少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む；さらなる例は、ポリヌクレオチドの位置９４２６が「Ａ」または「Ｇ」である、配列番号３のヌクレオチド９４２１から９４３１までの少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド、あるいはポリヌクレオチドの位置８８１１が「Ｃ」または「Ｔ」である、配列番号３のヌクレオチド８８０６から８８１６までの少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドを含む。
あるいは、単離ＣＲＦ２−１３多型配列は、位置３２９６２が「Ｃ」または「Ａ」ならば、配列番号２２のヌクレオチド３２９５４からヌクレオチド３２９６４までを含み得る。あるいは、多型配列は、位置３１２６６が「Ｃ」または「Ｔ」ならば、配列番号２２のヌクレオチド３１２６２から３１２７２まで；あるいはヌクレオチド３０９６０が「Ｔ」または「Ｃ」ならば、配列番号２２のヌクレオチド３０９５５から２０９６５まで；あるいはヌクレオチド２９０４８が「Ｃ」または「Ｔ」ならば、配列番号２２のヌクレオチド２９０４３から２９０５３まで；あるいはヌクレオチド２８７５３が「Ｇ」または「Ａ」ならば、配列番号２２のヌクレオチド２８７４８から２８７５８まで；あるいはヌクレオチド２３８３０が「Ｇ」または「Ａ」ならば、配列番号２２のヌクレオチド２３８２５から２３８３５までを含み得る。
さらなる実施態様において、多型核酸は、配列番号３からの少なくとも１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２５０、５００、７５０、または１０００またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含む。ある実施態様において、多型ヌクレオチド配列は、１０−１０００ヌクレオチドの長さである。例えば、多型ヌクレオチド配列は、２０−７５０ヌクレオチド、５０−６２５ヌクレオチド、７５−５００ヌクレオチド、１００−２５０ヌクレオチドの長さであり得る。
本発明の多型対立遺伝子を有する個体を、当該分野で周知の様々な技術を用いて、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質のレベルで検出し得る。同定および検出の戦略は、例えばＥＰ７３０，６６３、ＥＰ７１７、１１３、およびＰＣＴ ＵＳ９７／０２１０２に記載される。本方法は通常、前もって特徴付けられた多型を採用する。すなわち、遺伝子型同定位置および部位に存在する多型形態の性質は、既に決定されている。この情報が利用可能であることは、公知の多型形態の特異的同定のためにプローブのセットを設計することを可能にする。
下記で記載する方法の多くは、標的サンプルからＤＮＡの増幅を必要とする。これは、多型を検出するために、例えばＰＣＲ．（１９８９）、Ｂ．によって達成し得る。一般的に、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、ＮＹ、１９９２）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９、４９６７（１９９１）；Ｅｃｋｅｒｔら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １、１７（１９９１）；ＰＣＲ（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）；および米国特許第４，６８３，２０２号を参照のこと。
診断のために使用されるゲノムＤＮＡを、末梢血、尿、唾液、頬サンプル、外科的標本、および剖検標本に存在するもののような、体のあらゆる有核細胞から得ることができる。ＤＮＡを、直接使用し得るか、あるいはＰＣＲ（Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−４９１（１９８８））、またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０−５６９（１９８９））、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９：３９２−３９６（１９９２））、自立的配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（３ＳＲ）（Ｆａｈｙら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐ＆Ｊ＆ １：２５−３３（１９９２））のような他のインビトロ増幅方法の使用によって、変異分析の前に、インビトロで酵素的に増幅し得る。
特定のＤＮＡ配列における多型の検出は、対立遺伝子特異的制限エンドヌクレアーゼ切断に基づく制限フラグメント長多型検出（ＫａｎおよびＤｏｚｙ、Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ：９１０−９１２（１９７８））、固定化オリゴヌクレオチド（Ｓａｉｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ８６：６２３０−６２３４（１９６９））またはオリゴヌクレオチドアレイ（ＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２２６９−２２７０（１９９３））を含む対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション（Ｗａｌｌａｃｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６：３５４３−３５５７（１９７８））、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（Ｎｅｗｔｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２５０３−２５１６（１９８９））、ミスマッチ修復検出（ＭＲＤ）（ＦａｈａｍおよびＣｏｘ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．５：４７４−４８２（１９９５））、ＭｕｔＳタンパク質の結合（Ｗａｇｎｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３９４４−３９４８（１９９５））、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（ＦｉｓｈｅｒおよびＬｅｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：１５７９−ｌ５８３（１９８３））、一本鎖高次構造多型検出（Ｏｒｉｔａら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５：８７４−８７９（１９８３））、ミスマッチ塩基対におけるＲＮアーゼ切断（Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２（１９８５））、ヘテロ二重鎖ＤＮＡの化学的切断（Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ｗ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８Ｚ４３９７−４４０１（１９８８））または酵素的切断（Ｙｏｕｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：８７−９１（１９９５））、対立遺伝子特異的プライマー延長に基づく方法（Ｓｙｖａｎｅｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８：６８４−６９２（１９９０））、遺伝子小片分析（ｇｅｎｅｔｉｃ ｂｉｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＧＢＡ）（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖら、＆＆Ｉ Ａｃｉｄｓ ２２：４１６７−４１７５（１９９４））、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７（１９８８））、対立遺伝子特異的ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｂａｒｒａｎｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：１８９−１９３（１９９１））、ｇａｐ−ＬＣＲ（Ａｂｒａｖａｙａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２（１９９５））、当該分野で周知の標準的な手順を用いた放射活性および／または蛍光ＤＮＡ配列決定、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）アッセイ（Ｏｒｕｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：５３３２−５３５６（１９９３）；Ｔｈｉｅｄｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：９８３−９８４（１９９６））を含むがこれに限らない様々な方法によって達成し得る。
（ＣＲＦ２−１３改変体）
本発明はさらに、遺伝コードの縮重のために、配列番号１に示すヌクレオチド配列とは異なる核酸分子を含む。従ってこれらの核酸は、配列番号１で示すヌクレオチド配列によってコードされるのと同じＣＲＦ２−１３タンパク質、例えば配列番号２のポリペプチドをコードする。別の実施態様において、本発明の単離核酸分子は、配列番号２で示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
配列番号１で示すヒトＣＲＦ２−１３ヌクレオチド配列に加えて、ＣＲＦ２−１３のアミノ酸配列における変化を引き起こすＤＮＡ配列多型が、集団（例えばヒト集団）内に存在し得ることが、当業者によって認識される。ＣＲＦ２−１３遺伝子におけるそのような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子のバリエーションのために集団内の個体に存在し得る。本明細書中で使用される場合、「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、ＣＲＦ２−１３タンパク質、好ましくは哺乳動物ＣＲＦ２−１３タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を指す。そのような天然の対立遺伝子バリエーションは、代表的にはＣＲＦ２−１３遺伝子のヌクレオチド配列において１−５％の変動を引き起こし得る。天然の対立遺伝子バリエーションの結果であり、そしてＣＲＦ２−１３の機能的活性を変化させない、ＣＲＦ２−１３におけるあらゆるおよび全てのそのようなヌクレオチドバリエーションおよび生じたアミノ酸多型は、本発明の範囲内であると意図される。
さらに、他の種由来のＣＲＦ２−１３タンパク質をコードする核酸分子、そして従って配列番号１のヒト配列とは異なるヌクレオチド配列を有するものは、本発明の範囲内であると意図される。本発明のＣＲＦ２−１３ ｃＤＮＡの天然対立遺伝子改変体およびホモログに対応する核酸分子を、本明細書中で開示されたヒトＣＲＦ２−１３核酸に対するその相同性に基づいて、ハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標準的なハイブリダイゼーション技術によって単離し得る。例えば、可溶性ヒトＣＲＦ２−１３ ｃＤＮＡを、ヒト膜結合ＣＲＦ２−１３に対するその相同性に基づいて単離し得る。同様に、膜結合ヒトＣＲＦ２−１３ ｃＤＮＡを、可溶性ヒトＣＲＦ２−１３に対するその相同性に基づいて単離し得る。
よって、別の実施態様において、本発明の単離核酸分子は、少なくとも６ヌクレオチドの長さであり、そしてストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする。別の実施態様において、その核酸は、少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、または７５０ヌクレオチドの長さである。別の実施態様において、本発明の単離核酸分子は、コード領域にハイブリダイズする。本明細書中で使用される場合、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、互いに少なくとも６０％相同性であるヌクレオチド配列が代表的には互いにハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を説明することを意図する。
ホモログ（すなわち、ヒト以外の種由来のＣＲＦ２−１３タンパク質をコードする核酸）または他の関連する配列（例えばパラログ）を、核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングに関して当該分野で周知の方法を用いて、特定のヒト配列の全てまたは一部をプローブとして用いた低、中程度または高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションによって得ることができる。
本明細書中で使用される場合、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という句は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが、その標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、そして種々の状況において異なる。より長い配列は、より短い配列よりも、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列の融解温度（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。Ｔｍは、平衡において、標的配列に相補的なプローブの５０％が（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）その標的配列にハイブリダイズする温度である。一般的に標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、平衡において５０％のプローブが占有される。代表的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０から８．３において、塩濃度が約１．０Ｍのナトリウムイオンより低い、代表的には約０．０１から１．０Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）であり、そして短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば１０ｎｔから５０ｎｔ）については温度が少なくとも約３０℃、そしてより長いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドについては少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る
ストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、そしてＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１−６．３．６において見出され得る。好ましくは、その条件は、代表的には、互いに少なくとも、約６５％、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９％相同的な配列が、互いにハイブリダイズしたままである条件である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のＦｉｃｏｌｌ、０．０２％のＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩濃度緩衝液中、６５℃におけるハイブリダイゼーションである。このハイブリダイゼーションの後に、５０℃で０．２×ＳＳＣ、０．０１％のＢＳＡで１回以上洗浄する。配列番号１の配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在するヌクレオチド配列を有する（例えば、天然タンパク質をコードする）ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をいう。
２番目の実施態様において、配列番号１のヌクレオチド配列、またはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体を含む核酸分子に、中程度のストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズ可能な核酸配列が提供される。中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％のＳＤＳ、および１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中、５５℃におけるハイブリダイゼーション、続いて１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で３７℃における１回以上の洗浄である。使用され得る中程度のストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９３、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹおよびＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｓｎｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照のこと。
３つめの実施態様において、配列番号１のヌクレオチド配列、またはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体を含む核酸分子に、低ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズ可能な核酸が提供される。低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のＦｉｃｏｌｌ、０．２％のＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の硫酸デキストラン中、４０℃でのハイブリダイゼーション、続いて２×ＳＳＣ、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、および０．１％のＳＤＳ中、５０℃での１回以上の洗浄である。使用され得る低ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である（例えば、種間ハイブリダイゼーションで採用されるような）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９３、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹおよびＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：６７８９−６７９２を参照のこと。
（保存的変異）
集団中に存在し得るＣＲＦ２−１３配列の天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、当業者はさらに、配列番号１のヌクレオチド配列への変異によって変化を導入し、それによってＣＲＦ２−１３タンパク質の機能的能力を変化させずに、コードされるＣＲＦ２−１３タンパク質のアミノ酸配列に変化を引き起こし得ることを認識する。例えば、「非必須」アミノ酸残基においてアミノ酸置換を引き起こすヌクレオチド置換を、配列番号１の配列で行ない得る。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変化させずに野生型ＣＲＦ２−１３配列から変化させ得る残基であり、一方「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要である。例えば、本発明のＣＲＦ２−１３タンパク質の間で保存されているアミノ酸残基は、特に容易に変化させられないと予測される。
本発明の別の局面は、活性に必須でないアミノ酸残基において変化を含むＣＲＦ２−１３タンパク質をコードする核酸分子に関連する。そのようなＣＲＦ２−１３タンパク質は、アミノ酸配列において配列番号２と異なるが、生物学的活性を保持する。１つの実施態様において、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここでそのタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも約７５％相同的なアミノ酸配列を含む。好ましくは、その核酸によってコードされるタンパク質は、配列番号２に対して少なくとも約８０％相同であり、より配列番号２に対して、好ましくは少なくとも、約９０％、約９５％、約９８％、そして最も好ましくは少なくとも約９９％相同である。
配列番号２のタンパク質に相同なＣＲＦ２−１３タンパク質をコードする単離された核酸分子は、コードされるタンパク質に１つ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失を導入するように、配列番号１のヌクレオチド配列に１つ以上のヌクレオチドの置換、付加、または欠失を導入することによって作製され得る。
変異は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発のような標準的な技術によって、配列番号１のヌクレオチド配列に導入され得る。好ましくは、１つ以上の予測される非必須アミノ酸残基において保存的アミノ酸置換を行なう。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当該分野で規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、荷電していない極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。従って、ＣＲＦ２−１３における予測される非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施態様において、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によるように、ＣＲＦ２−１３コード配列のすべてまたは一部にわたって変異を無作為に導入し得、そして得られる変異体をＣＲＦ２−１３生物学的活性に関してスクリーニングして活性を保持する変異体を同定し得る。配列番号１の変異誘発に続いて、コードされるタンパク質を当該分野で公知の任意の組換え技術によって発現し得、そしてそのタンパク質の活性を決定し得る。
１つの実施態様において、変異ＣＲＦ２−１３タンパク質は、以下に関してアッセイされ得る：（１）他のＣＲＦ２−１３タンパク質、他の細胞表面タンパク質、もしくはその生物学的に活性な部分と、タンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力、（２）変異ＣＲＦ２−１３タンパク質とＣＲＦ２−１３レセプターとの間の複合体形成、（３）変異ＣＲＦ２−１３タンパク質の、細胞内標的タンパク質もしくはその生物学的に活性な部分（例えば、アビジンタンパク質）に結合する能力、（４）ＣＲＦ２−１３タンパク質に結合する能力、または（５）抗ＣＲＦ２−１３タンパク質抗体に特異的に結合する能力。
（アンチセンスＣＲＦ２−１３核酸）
本発明の別の局面は、配列番号１のヌクレオチド配列、またはそのフラグメント、アナログ、もしくは誘導体を含む核酸分子にハイブリダイズし得る、またはそれに相補的な、単離されたアンチセンス核酸分子に関連する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的な（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的なまたはｍＲＮＡ配列に相補的な）ヌクレオチド配列を含む。特定の局面において、少なくとも、約１０、約２５、約５０、約１００、約２５０、もしくは約５００ヌクレオチド、またはＣＲＦ２−１３コード鎖全体に、またはその一部のみに相補的な配列を含む、アンチセンス核酸分子が提供される。配列番号２のＣＲＦ２−１３タンパク質のフラグメント、ホモログ、誘導体およびアナログをコードする核酸分子、または配列番号１のＣＲＦ２−１３核酸配列に相補的なアンチセンス核酸がさらに提供される。
１つの実施態様において、アンチセンス核酸分子は、ＣＲＦ２−１３をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列領域をいう（例えば、ヒトＣＲＦ２−１３のタンパク質コード領域は、配列番号２に対応する）。別の実施態様において、アンチセンス核酸分子は、ＣＲＦ２−１３をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。用語「非コード領域」とは、アミノ酸に翻訳されない、コード領域に隣接する、５’配列および３’配列をいう（すなわち、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域とも呼ばれる）。
本明細書中で開示されたＣＲＦ２−１３をコードするコード鎖配列（例えば、配列番号１）を考慮して、本発明のアンチセンス核酸を、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対合の法則に従って設計し得る。アンチセンス核酸分子は、ＣＲＦ２−１３ ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であり得るが、より好ましくはＣＲＦ２−１３ ｍＲＮＡのコードまたは非コード領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＲＦ２−１３ ｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドの長さであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学的合成または酵素的連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）を、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加させるために、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるために設計された、様々に改変されたヌクレオチドを使用して化学的に合成し得る（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用し得る）。
アンチセンス核酸を産生するために使用され得る改変ヌクレオチドの例としては、以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む。あるいは、アンチセンス核酸を、核酸がアンチセンスの方向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて、生物学的に産生し得る（すなわち、挿入核酸から転写されるＲＮＡは、以下の小節においてさらに記載する、目的の標的核酸に対してアンチセンスの方向である）。
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には、それらがＣＲＦ２−１３タンパク質をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡにハイブリダイズまたは結合し、それによって例えば転写および／または翻訳を阻害することによってタンパク質の発現を阻害するように、被験体に投与される、またはインサイチュで産生される。ハイブリダイゼーションは、従来のヌクレオチド相補性によって行われて、安定な二重鎖を形成し得るか、または例えば、ＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、２重らせんの主溝における特異的相互作用によって行われ得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例は、組織部位における直接注射を含む。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化するように改変し、そして次いで全身的に投与され得る。例えば、全身的投与のために、アンチセンス分子を、例えばアンチセンス核酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することによって、それらが選択された細胞表面に発現するレセプターまたは抗原に特異的に結合するように改変し得る。アンチセンス核酸分子をまた、本明細書中で記載されるベクターを用いて細胞に伝達し得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの調節下に置かれたベクター構築物が好ましい。
さらに別の実施態様において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的なＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、ここで通常のβ−ユニットと対照的に、鎖は互いに平行に走る（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）を含み得る。
そのような改変は、非限定的な例として、改変塩基、および糖リン酸バックボーンが改変または誘導体化された核酸を含む。これらの改変を、それらを例えば被験体における治療的適用においてアンチセンス結合核酸として使用し得るように、少なくとも部分的には修飾核酸の化学的安定性を増強するために行なう。
（ＣＲＦ２−１３リボザイムおよびＰＮＡ部分）
さらに別の実施態様において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子であり、それはそれらが相補的領域を有するｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断し得る。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１において記載された））を使用して、ＣＲＦ２−１３ ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによってＣＲＦ２−１３ ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＣＲＦ２−１３をコードする核酸に特異性を有するリボザイムを、本明細書中で開示されたＣＲＦ２−１３ ＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１）に基づいて設計し得る。例えば、テトラヒメナＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築し得、ここで活性部位のヌクレオチド配列が、ＣＲＦ２−１３をコードするｍＲＮＡにおいて切断されるヌクレオチド配列に相補的である。例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいは、ＣＲＦ２−１３ ｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択し得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１−１４１８を参照のこと。
あるいは、ＣＲＦ２−１３遺伝子の発現は、ＣＲＦ２−１３の調節領域（例えば、ＣＲＦ２−１３プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化し、標的細胞においてＣＲＦ２−１３遺伝子の転写を妨害する３重らせん構造を形成することによって阻害され得る。一般的に、Ｈｅｌｅｎｅ（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．６：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅら（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；およびＭａｈｅｒ（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４：８０７−１５を参照のこと。
様々な実施態様において、ＣＲＦ２−１３の核酸は、塩基部分、糖部分、またはリン酸バックボーンにおいて改変されて、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または可溶性が改善され得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸バックボーンを改変して、ペプチド核酸を産生し得る（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４：５−２３を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸バックボーンがシュードペプチドバックボーンで置換され、そして４つの天然核塩基のみが保持される核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの中性バックボーンは、低いイオン強度の条件下において、ＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示された。ＰＮＡオリゴマーの合成を、Ｈｙｒｕｐら（１９９６）上記；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）ＰＮＡＳ ９３：１４６７０−６７５において記載されたような、標準的な固相ペプチド合成プロトコールを用いて行い得る。
ＣＲＦ２−１３のＰＮＡを、治療的適用および診断的適用において使用し得る。例えば、ＰＮＡを、例えば転写または翻訳の停止を誘導する、または複製を阻害することによって、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗遺伝子薬剤として使用し得る。ＣＲＦ２−１３のＰＮＡをまた、例えば、ＰＮＡ特異的ＰＣＲクランピングによって、例えば、遺伝子における単一塩基対変異の分析において；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合せて使用した場合に人工制限酵素として（Ｈｙｒｕｐ Ｂ．（１９９６）上記）；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのためのプローブもしくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）、上記；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ（１９９６）、上記）使用し得る。
別の実施態様において、親油性のまたは他のヘルパー基をＰＮＡに結合することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソームまたは当該分野で公知の他の薬物送達技術を用いることによって、例えば、その安定性または細胞取り込みを増強するために、ＣＲＦ２−１３のＰＮＡを改変し得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な性質を組み合せ得る、ＣＲＦ２−１３のＰＮＡ−ＤＮＡキメラを産生し得る。そのようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮアーゼＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）が、ＤＮＡ部分と相互作用することを可能にし、一方ＰＮＡ部分は高い結合親和性および特異性を提供する。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラを、塩基の積み重なり、核塩基間の結合の数、および方向に関して選択された適切な長さのリンカーを用いて連結し得る（Ｈｙｒｕｐ（１９９６）上記）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成を、Ｈｙｒｕｐ（１９９６）上記およびＦｉｎｎら（１９９６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：３３５７−６３において記載されたように行ない得る。例えば、ＤＮＡ鎖を、標準的なホスホロアミダイト結合化学を用いて固体支持体において合成し得、そして改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホロアミダイト）を、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間で使用し得る（Ｍａｇら（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７：５９７３−８８）。ＰＮＡモノマーを次いで段階的様式で結合させ、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を産生する（Ｆｉｎｎら（１９９６）上記）。あるいは、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを有するキメラ分子を合成し得る。Ｐｅｔｅｒｓｅｎら（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９−１１２４を参照のこと。
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、宿主細胞レセプターをインビボで標的するため）、または細胞膜を横断する輸送を容易にする薬剤（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公報第ＷＯ８８／０９８１０号を、参照のこと）もしくは血液脳関門を横断する輸送を容易にする薬剤（例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ８９／１０１３４号を参照のこと）などの、他の付け加えられた基を含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションに誘発される切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６を参照）またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏｎ（１９８８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９）を用いて、改変され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションに誘発される架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションに誘発される切断剤、など）と、結合され得る。
（ＣＲＦ２−１３ポリペプチド）
本発明のＣＲＦ２−１３ポリペプチドは、配列が配列番号２において提供されるＣＲＦ２−１３様タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２１〜５２０、配列番号２のアミノ酸２１〜２３０、配列番号２のアミノ酸２１〜２４６、配列番号２のアミノ酸２３１〜５２０、配列番号２のアミノ酸２４７〜５２０を、含む。本発明は、開示されるＣＲＦ２−１３ポリペプチドの変異体形態もしくは改変体形態、または本明細書中で開示されるＣＲＦ２−１３ポリペプチド配列のフラグメントのうちのいずれかの変異体形態もしくは改変体形態もまた、包含する。
従って、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドは、ＣＲＦ２−１３様の活性および生理学的機能を維持するタンパク質またはその機能的フラグメントをコードしつつ、配列番号２に示される対応残基から任意の残基が変えられ得る、ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、変異体タンパク質または改変体タンパク質において、その残基の２０％までまたはそれ以上が、そのように変えられ得る。いくつかの実施形態において、本発明に従うＣＲＦ２−１３ポリペプチドは、成熟ポリペプチドである。
一般に、ＣＲＦ２−１３様の機能を保存するＣＲＦ２−１３様改変体は、配列中の特定位置の残基が他のアミノ酸で置換されており、そしてさらに、親タンパク質の２つの残基の間にさらなる残基を挿入している可能性、および親配列から１つ以上の残基を欠失している可能性を含む、任意の改変体を含む。任意のアミノ酸の置換、挿入、または欠失が、本発明に包含される。好都合な状況において、この置換は、上で定義される保存的置換である。
本発明の一局面は、単離されたＣＲＦ２−１３タンパク質、およびその生物学的に活性な部分、またはこれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに関する。抗ＣＲＦ２−１３抗体を惹起させる免疫原としての使用に適切なポリペプチドフラグメントもまた、提供される。一実施形態において、ネイティブのＣＲＦ２−１３タンパク質は、標準的タンパク質精製技術を使用する適切な精製スキームによって、細胞供給源または組織供給源から、単離され得る。別の実施形態において、ＣＲＦ２−１３タンパク質は、組換えＤＮＡ技術により、産生される。組換え発現の代わりに、ＣＲＦ２−１３タンパク質またはＣＲＦ２−１３ポリペプチドは、標準的ペプチド合成技術を使用して、化学的に合成され得る。
「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、ＣＲＦ２−１３タンパク質が由来する細胞供給源もしくは組織供給源からの細胞物質も他の夾雑タンパク質も実質的に含まないか、あるいは化学合成された場合は、化学物質前駆物質も他の化学物質も実質的に含まない。用語「細胞物質を実質的に含まない」は、タンパク質が単離または組換え生成された細胞の細胞成分から分離されている、ＣＲＦ２−１３タンパク質の調製物を包含する。一実施形態において、用語「細胞物質を実質的に含まない」は、約３０％（乾燥重量）未満の非ＣＲＦ２−１３タンパク質（本明細書中で「夾雑タンパク質」とも言及される）、より好ましくは約２０％（乾燥重量）未満の非ＣＲＦ２−１３タンパク質、さらにより好ましくは約１０％（乾燥重量）未満の非ＣＲＦ２−１３タンパク質、そして最も好ましくは約５％（乾燥重量）未満の非ＣＲＦ２−１３タンパク質を有する、ＣＲＦ２−１３タンパク質の調製物を包含する。ＣＲＦ２−１３タンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え生成される場合、これは、好ましくは、実質的に培地を含まない（すなわち、培地が、タンパク質調製物の容量の、約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは約５％未満を示す）。
用語「化学的前駆物質も他の化学物質も実質的に含まない」は、ＣＲＦ２−１３タンパク質が、このタンパク質の合成に関与する化学的前駆物質または他の化学物質から分離された、ＣＲＦ２−１３タンパク質の調製物を含む。一実施形態において、用語「化学的前駆物質も他の化学物質も実質的に含まない」は、約３０％未満（乾燥重量）の化学的前駆物質または非ＣＲＦ２−１３化学物質、より好ましくは約２０％未満の化学的前駆物質または非ＣＲＦ２−１３化学物質、さらにより好ましくは約１０％未満の化学的前駆物質または非ＣＲＦ２−１３化学物質、そして最も好ましくは約５％未満の化学的前駆物質または非ＣＲＦ２−１３化学物質を有する、ＣＲＦ２−１３タンパク質の調製物を含む。
ＣＲＦ２−１３タンパク質の生物学的に活性な部分は、ＣＲＦ２−１３タンパク質のアミノ酸配列と十分に相同なアミノ酸配列、またはＣＲＦ２−１３タンパク質由来のアミノ酸配列（例えば、全長ＣＲＦ２−１３タンパク質よりも少ないアミノ酸を含む、配列番号２で示されるアミノ酸配列）を含むペプチドを含み、そしてＣＲＦ２−１３タンパク質の少なくとも１つの活性を示す。代表的には、生物学的に活性な部分は、ＣＲＦ２−１３タンパク質の少なくとも１つの活性を有する、ドメインまたはモチーフを含む。ＣＲＦ２−１３タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、１０、２５、５０、１００以上の長さのアミノ酸の、ポリペプチドであり得る。
本発明のＣＲＦ２−１３タンパク質の生物学的に活性な部分は、上で同定した、ＣＲＦ２−１３タンパク質の間で保存されるドメインの少なくとも１つを含む。さらに、タンパク質の他の領域が欠失されている他の生物学的に活性な部分は、組換え技術により調製され得、そしてネイティブのＣＲＦ２−１３タンパク質の１つ以上の機能活性について評価される。
一実施形態において、ＣＲＦ２−１３タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、ＣＲＦ２−１３タンパク質は、配列番号２と実質的に相同であり、配列番号２のタンパク質の機能的活性を保持し、さらに以下で詳細に記載されるように、天然の対立遺伝子のバリエーションまたは変異誘発に起因して、アミノ酸配列において異なっている。従って、別の実施形態において、ＣＲＦ２−１３タンパク質は、配列番号２のアミノ酸に対し少なくとも約４５％相同であり、そして配列番号２のＣＲＦ２−１３タンパク質の機能的活性を保持するアミノ酸配列を含む、タンパク質である。
（２つ以上の配列の間の相同性の決定）
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の相同性パーセントを決定するため、配列は、最適な比較の目的（例えば、配列間の最適なアラインメントで比較されるいずれかの配列に、ギャップが導入され得る）で、並べられる。対応するアミノ酸位置または対応するヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが、次いで、比較される。第一配列における位置が、第二配列において対応する位置のアミノ酸またはヌクレオチドと、同じアミノ酸またはヌクレオチドで占められる場合、この分子は、その位置において相同である（すなわち、本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と同義である）。
核酸配列相同性は、２つの配列の間の同一性の程度として、決定され得る。相同性は、当該分野に公知のコンピュータープログラム（ＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェアなど）を使用して、決定され得る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８：４４３−４５３を参照のこと。核酸配列比較のために、以下（５．０のＧＡＰ創造ペナルティおよび０．３のＧＡＰ伸長ペナルティ）のように設定されたＧＣＣ ＧＡＰソフトウェアを使用し、上で言及されるアナログ核酸配列のコード領域は、配列番号１に示されるＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード）部分と、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性の程度を示す。
用語「配列同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が、比較の特定の領域に渡って、残基−残基に基づいて同一である程度をいう。用語「配列相同性パーセント」は、比較領域に渡って最適に整列される２つの配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、核酸の場合、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）が両配列において生じる位置数を決定して適合する位置の数を得、適合位置の数を比較領域（すなわち、ウィンドウサイズ）における位置の総数で割り、そして、この結果に１００を掛けて、配列同一性パーセントを得ることによって、計算される。用語「実質的な同一性」は、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドが、比較領域に渡り、参照配列と比較して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、そして多くの場合は９０〜９５％の配列同一性、より多くの場合は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、ポリヌクレオチド配列の特性を、意味する。用語「ポジティブ残基パーセント」は、比較領域に渡って最適に整列された２つの配列を比較し、同一のアミノ酸および保存的アミノ酸置換（上で定義される）が両配列において生じる位置数を決定して適合する位置の数を得、適合位置の数を比較領域（すなわち、ウィンドウサイズ）における位置の総数で割り、そして、この結果に１００を掛けて、正の残基の百分率を得ることによって、計算される。
（キメラタンパク質および融合タンパク質）
本発明はまた、ＣＲＦ２−１３キメラタンパク質またはＣＲＦ２−１３融合タンパク質も、提供する。本明細書中で使用される場合、ＣＲＦ２−１３の「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＣＲＦ２−１３ポリペプチドに作動可能に連結される、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドを含む。「ＣＲＦ２−１３ポリペプチド」とは、ＣＲＦ２−１３に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。従って、「非ＣＲＦ２−１３ポリペプチド」とは、ＣＲＦ２−１３タンパク質に実質的に相同ではないタンパク質（例えば、ＣＲＦ２−１３タンパク質と異なる、同じまたは異なる生物由来のタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ＣＲＦ２−１３融合タンパク質内において、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドは、ＣＲＦ２−１３タンパク質の全体または一部に対応し得る。ＣＲＦ２−１３融合ポリペプチドの例は、配列番号２の２１〜２３０のアミノ酸を含むポリペプチド（例えば、配列番号２の１〜２４６のアミノ酸または２１〜２４６のアミノ酸を含むポリペプチド）である。一実施形態において、ＣＲＦ２−１３融合タンパク質は、ＣＲＦ２−１３タンパク質の、少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態において、ＣＲＦ２−１３融合タンパク質は、ＣＲＦ２−１３タンパク質の、少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結される」は、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドおよび非ＣＲＦ２−１３ポリペプチドが、インフレームで互いに融合されることを示すことを意図する。非ＣＲＦ２−１３ポリペプチドは、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドの、Ｎ末端またはＣ末端に融合され得る。
例えば、一実施形態において、ＣＲＦ２−１３融合タンパク質は、第二のタンパク質（すなわち、非ＣＲＦ２−１３タンパク質）の細胞外ドメイン、または第二のタンパク質（すなわち、非ＣＲＦ２−１３タンパク質）の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインのどちらかに、作動可能に連結される、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドを含む。このような融合タンパク質は、さらに、ＣＲＦ２−１３活性を調節する化合物についてのスクリーニングアッセイ（このようなアッセイは、以下で詳細に記載される）において、利用され得る。
別の実施形態において、融合タンパク質は、ＣＲＦ２−１３配列がＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合されたＧＳＴ−ＣＲＦ２−１３融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、組換えＣＲＦ２−１３の精製を、容易にし得る。
別の実施形態において、融合タンパク質は、ＣＲＦ２−１３免疫グロブリン融合タンパク質であり、このＣＲＦ２−１３免疫グロブリン融合タンパク質において、１つ以上のドメインを含むＣＲＦ２−１３配列が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバー由来の配列に融合される。
本発明のＣＦＲ２−１３融合タンパク質（例えば、ＣＲＦ２−１３免疫グロブリン融合タンパク質）は、薬学組成物の中に組み込まれ得、そして被験体に投与されて、細胞表面レセプターとそのリガンドとの間の相互作用を阻害し得るかまたは増大させ得る。これは、１）レセプターに対して利用可能なリガンドに結合し、そして除去すること（バイオアベイラビリティに影響するリガンドのＦｃ媒介清掃）；２）リガンドに結合し、そしてその細胞レセプターに結合する能力をブロックすること（拮抗化（ａｎｔａｇｏｎｉｚｉｎｇ）または中和）；３）別のＣＲＦメンバーを添加し、それによって下流のシグナル伝達カスケードを調節（例えば、阻害）すること；４）リガンドまたは別のＣＲＦのいずれかと結合させ、そしてリガンドの活性を助長すること、のいずれかによって起こり得る。これらの全てのメカニズムにより、ＣＲＦ２−１３タンパク質は、ＣＲ２レセプターとその同族リガンドとの間の相互作用（例えば、ＩＬ−１０とＩＬ−１０レセプターとの間の相互作用およびＩＬ−２２とＩＬ−２２レセプターとの間の相互作用）を、調節するために使用され得る。
ＣＲＦ２−１３リガンド／ＣＲＦ２−１３相互作用の阻害は、増殖障害および分化障害（例えば、癌、調節（例えば、促進または阻害）細胞生存、ならびに免疫調節障害、自己免疫、移植、ならびにサイトカインカスケードおよびケモカインカスケードのメカニズムの変質による炎症）の両処置のために、治療的に使用され得る。さらに、本発明のＣＲＦ２−１３免疫グロブリン融合タンパク質は、被験体において抗ＣＲＦ２−１３抗体を産生するために、ＣＲＦ２−１３リガンドを精製するため、およびスクリーニングアッセイにおいてＣＲＦ２−１３とＣＲＦ２−１３リガンドとの相互作用を阻害する分子を同定するための免疫原として使用され得る。
本発明のＣＲＦ２−１３キメラタンパク質またはＣＲＦ２−１３融合タンパク質は、標準的組換えＤＮＡ技術により、産生され得る。例えば、異なったポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントが、従来技術に従って（例えば、連結のための平滑末端またはねじれ末端（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ ｔｅｒｍｉｎｉ）、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な場合、粘着末端の適合、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結の使用により）、インフレームで一緒に連結される。別の実施形態において、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成を含む従来技術によって、合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅が、２つの連続する遺伝子フラグメント間の相補的な突出部張り出しを生じるアンカープライマーを使用して行われ得、この相補的な突出部は、実質的にアニールされ、再増幅されて、キメラ遺伝子配列を産生し得る（例えば、Ａｕｓｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９２）を参照のこと）。さらに、既に融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をコードする多くの発現ベクターが、市販されている。ＣＲＦ２−１３をコードする核酸は、このような発現ベクター内に、その融合部分が、ＣＲＦ２−１３タンパク質にインフレームで連結されるようにクローン化され得る。
（ポリペプチドライブラリー）
さらに、ＣＲＦ２−１３タンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーが、スクリーニングおよびその後のＣＲＦ２−１３タンパク質改変体の選択のためのＣＲＦ２−１３フラグメントの多様な集団を産生するために、使用され得る。一実施形態において、コード配列フラグメントのライブラリーは、ＣＲＦ２−１３コード配列の２本鎖ＰＣＲフラグメントを、ニック形成が１分子あたり約１回だけ生じる条件下でヌクレアーゼで処理し、２本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡの脱変性により、異なるニック形成産物からのセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼで処理することによって再形成された二本鎖から一本鎖部分を除去し、そして得られたフラグメントライブラリーを発現ベクター内へ連結させることにより、産生され得る。この方法により、ＣＲＦ２−１３タンパク質の、種々のサイズのＮ末端フラグメントおよび内部フラグメントをコードする発現ライブラリーが、誘導され得る。
点変異または切断によって作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物のスクリーニングのための幾つかの技術、および選択された特性を有する遺伝子産物についてのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのための幾つかの技術が、当該分野で公知である。このような技術は、ＣＲＦ２−１３タンパク質のコンビナトリアル変異誘発により産生される遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適応し得る。大型遺伝子ライブラリーのスクリーニングのために最も広く使用される、高処理能力分析に適う技術は、代表的には、遺伝子ライブラリーの複製可能発現ベクター内へのクローニング、ベクターの生じたライブラリーを用いた適切な細胞の変換、そして、望ましい活性の検出が、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下での、コンビナトリアル遺伝子の発現を含む。ライブラリーにおける機能的変異体の頻度を増大する新技術である、再帰的アンサンブル変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）は、ＣＲＦ２−１３改変体を同定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて使用され得る（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６：３２７−３３１）。
（ＣＲＦ２−１３抗体）
本発明はまた、ＣＲＦ２−１３タンパク質またはＣＲＦ２−１３タンパク質のフラグメントに対する抗体も含む。用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原を特異的に結合する（免疫作用する）抗原結合部位を含む分子）をいう。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げられるが、これらに限定はされない。一般に、ヒトから得られる抗体分子は、分子内に存在する重鎖の性質により互いに異なる、任意のクラスのＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤに関する。特定のクラスは、同様に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２などのような、サブクラスを有する。さらに、ヒトにおいて、軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であり得る。本明細書中における抗体の言及は、ヒト抗体種の全てのこのようなクラス、サブクラス、および型の言及を含む。
本発明の単離されたＣＲＦ２−１３関連タンパク質は、抗原、またはその一部もしくはフラグメントとして働くように意図され得、そしてさらに免疫特異的に抗原を結合する抗体を産生するための免疫原として、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製のための標準的技術を用いて、使用され得る。全長タンパク質が、使用され得るか、あるいは本発明は、免疫原として使用するための抗原の抗原ペプチドフラグメントを提供する。抗原ペプチドフラグメントは、全長タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列）の少なくとも６つのアミノ酸残基を含み、そのエピトープを含む。これにより、ペプチドに対して惹起された抗体が、全長タンパク質またはエピトープを含む任意のフラグメントとの特異的免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原ペプチドは、少なくとも１０のアミノ酸残基、または少なくとも１５のアミノ酸残基、または少なくとも２０のアミノ酸残基、または少なくとも３０のアミノ酸残基を含む。抗原ペプチドに含まれる好ましいエピトープは、表面上に位置するタンパク質の領域であり；通常、これらは親水性領域である。
本発明の特定の実施形態において、抗原ペプチドに含まれる少なくとも１つのエピトープは、タンパク質の表面上に位置するＣＲＦ２−１３関連タンパク質の領域（例えば、親水性領域）である。ヒトＣＲＦ２−１３関連タンパク質配列の疎水性分析は、ＣＲＦ２−１３関連タンパク質が特に親水性であり、従って、抗体産物の標的化に有用な表面残基をコードしやすい領域を示す。抗体産物を標的化する手段として、親水性領域および疎水性領域を示す、ハイドロパシープロット（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ ｐｌｏｔ）が、当該分野に周知の任意の方法により作成され得る。これらの方法としては、例として、フーリエ変換を用いるかまたは用いない、Ｋｙｔｅ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ法またはＨｏｐｐ Ｗｏｏｄ法が、挙げられる。ＨｏｏｐおよびＷｏｏｄ（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２を参照のこと。これらはそれぞれ、本明細書中でその全体が参考として援用される）。抗原タンパク質内の１つ以上のドメイン、またはその誘導体、そのフラグメント、そのアナログもしくはそのホモログに特異的な抗原もまた、本明細書中で提供される。
本発明のタンパク質またはその誘導体、そのフラグメント、そのアナログ、そのホモログもしくはそのオルソログは、免疫特異的にこれらのタンパク質成分を結合する抗体産生における免疫原として利用され得る。
当該分野で公知の種々の手順は、本発明のタンパク質、またはその誘導体、そのフラグメント、そのアナログ、そのホモログもしくはそのオルソログに対して指向されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の産生のために、使用され得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ Ｅ，およびＬａｎｅ Ｄ（１９８８），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照。本明細書中で参考として援用される）。これらの抗体のうちの幾つかは、以下で議論される。
（ポリクローナル抗体）
ポリクローナル抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳類）が、ネイティブタンパク質、その合成改変体、またはこれらの誘導体の１回以上の注射により、免疫され得る。適切な免疫原調製物は、例えば、天然に存在する免疫原タンパク質、免疫原タンパク質を表す化学合成されたポリペプチド、または組換え的に発現される免疫原タンパク質を含み得る。さらに、このタンパク質は、免疫される哺乳類において、免疫原として公知の第二のタンパク質に結合体化され得る。このような免疫原タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、血清アルブミン、ウシのサイログロブリン、および大豆トリプシン阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。この調製物は、アジュバントをさらに含み得る。免疫応答を上昇させるために使用される種々のアジュバントとしては、フロイント（完全または不完全）アジュバント、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｏｌｙｏｌ）、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、ジニトロフェノールなど）、カルメット‐ゲラン杆菌（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）および挫瘡プロピオンバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）のような、ヒトにおいて使用し得るアジュバント、または同様の免疫刺激剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得るアジュバントのさらなる例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。
免疫原タンパク質に対して指向されるポリクローナル抗体分子は、哺乳類から（例えば、血液から）単離され得、さらにプロテインＡまたはプロテインＧを使用するアフィニティクロマトグラフィ（主に免疫血清のＩｇＧ画分を提供する）などの周知の技術によって、さらに精製され得る。その後、またはあるいは、探究された免疫グロブリンの標的である特異的抗原またはそのエピトープが、カラムに固定化され、免疫アフィニティクロマトグラフィによって免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ Ｉｎｃ．発行，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ＰＡ，Ｖｏｌ．１４．Ｎｏ．８（２０００年４月１７日），ｐｐ．２５−２８）により、議論される。
（モノクローナル抗体）
用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」とは、本明細書中で使用される場合、独自の軽鎖遺伝子産物および独自の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の１つの分子種のみを含む、抗体分子の集団をいう。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、この集団内の全ての分子において、同一である。従って、ＭＡｂは、抗原に対する独自の結合親和性により特徴付けられる、抗原の特定のエピトープと免疫応答し得る抗原結合部位を含む。
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））によって記載されるハイブリドーマ方法を使用して、調製され得る。ハイブリドーマ方法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、代表的には、免疫剤により免疫され、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するか、またはこのような抗体を産生し得るリンパ球を誘導する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。
免疫剤としては、代表的に、タンパク質抗原、そのフラグメント、またはこれらの融合タンパク質が挙げられる。一般に、末梢血リンパ球が、ヒト起源の細胞が望ましい場合に使用されるか、または、脾臓細胞もしくはリンパ節細胞が、非ヒト哺乳類供給原が望ましい場合に使用される。リンパ球は、次いで、適切な融合剤（ポリエチレングリコールなど）を用いて、不死化細胞株と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９−１０３）。不死化細胞株は、通常、哺乳類細胞（特にげっ歯類、ウシ、ヒト起源の骨髄腫細胞）に移入される。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が、使用される。ハイブリドーマ細胞は、非融合の不死化細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を好ましくは含む、適切な培養培地において培養され得る。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマのための培養培地は、代表的にヒポキサンチン、アミノプテイン、およびチミジンを含む（「ＨＡＴ培地」）。これは、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻害する物質である。
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞により抗体の安定な高レベル発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性である、細胞である。より好ましい不死化細胞株は、マウス骨髄腫細胞株であり、これは、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａおよびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから得られ得る。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトへテロ骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載される（Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．ｉｍｍｕｎｏｌｏ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８７）ｐｐ．５１−６３）。
ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、次いで、抗原に対して指向されるモノクローナル抗体の存在について、アッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降または放射免疫測定法（ＲＩＡ）もしくは酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって、決定される。このような技術およびアッセイは、当該分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｄ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０））のスキャッチャード分析により、決定され得る。好ましくは、標的抗原に対する高い程度の特異性および高い結合親和性を有する抗体が、単離される。
望ましいハイブリドーマ細胞が同定された後、限界希釈手順および標準的方法による増殖によって、クローンは、サブクローニングされ得る。この目的のための適切な培養培地としては、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、インビボで、哺乳類の腹水として増殖され得る。
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィなどの、従来の免疫グロブリン精製手順により、培養培地または腹水液から、単離または精製され得る。
モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号などにおいて記載されるような組換えＤＮＡ方法によっても、作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、容易に単離され得、配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターの中に配置され得、この発現ベクターは、次いで宿主細胞（例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンタンパク質以外産生しない骨髄腫細胞など）に移入され、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成物が得られる。ＤＮＡもまた、例えば、ヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインのコード配列を、相同なマウス配列の代わりに置換すること（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８，８１２−１３（１９９４））、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることにより、改変され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインと置換され得るか、または本発明の抗体の１抗原結合部位の可変ドメインと置換され、キメラ二価抗体を作製し得る。
（ヒト化抗体）
本発明のタンパク質抗原に対して惹起される抗体は、さらにヒト化抗体またはヒト抗体を、含み得る。これらの抗体は、ヒトへの投与に適切であり、投与する免疫グロブリンに対する、ヒトによる、免疫応答を引き起こさない。抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはこれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合部分配列）であり、これらは主にヒト免疫グロブリンの配列で構成され、そして非ヒト免疫グロブリン由来の配列を最小限含む。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列と置換することにより、行われ得る。（米国特許第５，２２５，５３９号も参照。）いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基と置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても、外来ＣＤＲまたは外来フレームワーク配列においても、見出されない残基を含む。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして代表的には２つの可変ドメインを、実質的に全て含み、ここで、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そして全てまたは実質的に全てのフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部（Ｆｃ）、代表的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も、含む（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
（ヒト抗体）
完全なヒト抗体は、本質的に、軽鎖および重鎖の両方の配列全体（ＣＤＲを含む）がヒト遺伝子から生じる、抗体分子に関する。このような抗体は、本明細書中で、「ヒト抗体」または「完全なヒト抗体」と呼ばれる。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技術（ｔｒｉｏｍａ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２を参照）およびＥＢＶハイブリドーマ技術により調製され、ヒトモノクローナル抗体を産生し得る（Ｃｏｌｅら（１９８５）Ｉｎ：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実践において利用され得、ヒトハイブリドーマを使用すること（Ｃｏｔｅら、１９８３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０）、またはインビトロでヒトＢ細胞をエプスタイン−バーウイルスを用いて形質転換すること（Ｃｏｌｅら（１９８５）Ｉｎ：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）によって、産生され得る。
加えて、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））を含むさらなる技術を使用して、産生され得る。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物（例えば、マウス）に導入することにより作製され得、このトランスジェニック動物において、内在性免疫グロブリン遺伝子は、部分的にまたは完全に、不活性化されている。負荷実験（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）において、ヒトにおいて見られる抗体産生とあらゆる点（遺伝子の配置、アセンブリ、および抗体のレパートリーを含む）で酷似している、ヒト抗体産生が、観察される。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、ならびにＭａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，７７９−７８３（１９９２））；Ｌｏｎｇｂｅｒｇら（Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８５６−８５９（１９９４））；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ ３６８，８１２−１３（１９９４））；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８４５−５１（１９９６））；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８２６（１９９６））ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３ ６５−９３（１９９５）において記載される。
ヒト抗体は、トランスジェニック（抗原による負荷に応答して動物の内在性抗体ではなく完全なヒト抗体を産生するように改変される）非ヒト動物を使用して、さらに産生され得る。（ＰＣＴ公報第ＷＯ９４／０２６０２号を参照）。非ヒト宿主において、重鎖および軽鎖の免疫グロブリンをコードする内在性遺伝子は、無能化されていて、そしてヒトの重鎖および軽鎖の免疫グロブリンをコードする活性な遺伝子座が、宿主のゲノムに挿入される。このヒト遺伝子は、例えば、必要なヒトＤＮＡセグメントを含む酵母人工染色体を使用して、組み込まれる。全ての望ましい改変を提供する動物は、次いで、全量より少ない改変の相補物を含む中間のトランスジェニック動物を、交配させることにより、子孫として得られる。好ましい実施形態において、このような非ヒト動物は、マウスであり、そして、「ＸｅｎｏｍｏｕｓｅＴＭ」と呼ばれる（ＰＣＴ公報ＷＯ９６／３３７３５号および同第ＷＯ９６／３４０９６号において開示されている）。この動物は、完全なヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を、産生する。この抗体は、目的の免疫原で免疫後、動物から直接（例えば、ポリクローナル抗体の調製物として）得られ得るか、または代わりに動物由来の不死化Ｂ細胞（モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマなど）から得られ得る。さらに、免疫グロブリンとヒト可変領域とを共にコードする遺伝子は、回収され得、そして抗体を直接得るために発現され得るか、または、抗体のアナログ（例えば、単鎖Ｆｖ分子）を得るために、さらに改変され得る。
内在性免疫グロブリン重鎖の発現を欠く非ヒト宿主（例えばマウス）を産生する方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号において開示される。これは、胚幹細胞において、少なくとも１つの内在性重鎖遺伝子座からＪセグメント遺伝子を欠失させて、遺伝子座の再配列を防ぎ、そして再配列免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写物の形成を防ぐ工程であって、ここでこの欠失が、選択マーカーをコードする遺伝子を含む標的ベクターによって影響を受ける工程；および体細胞および生殖細胞が、選択マーカーを含むトランスジェニックマウスを胚幹細胞から産生する工程を包含する方法によって、得られる。
目的の抗体（ヒト抗体など）を産生する方法は、米国特許第５，９１６，７７１号において開示される。これは、重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、１つの培養哺乳類宿主細胞に導入する工程、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、別の哺乳類宿主細胞に導入する工程、および２つの細胞を融合させてハイブリッド細胞を形成する工程を、包含する。このハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含む抗体を、発現する。
この手順のさらなる改良において、臨床的に関連する免疫原上のエピトープを同定する方法、および高い効率で関連エピトープに免疫特異的に結合する抗体を選択する相関的な方法は、ＰＣＴ公報第ＷＯ９９／５３０４９号において開示される。
（Ｆａｂフラグメントおよび単鎖抗体）
本発明に従い、技術は、本発明の抗原タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生に、適合され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照）。加えて、方法は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築（例えば、Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１を参照）に適合され、タンパク質またはその誘導体、そのフラグメント、そのアナログ、もしくはそのホモログに対して望ましい特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを、迅速かつ効果的に同定させ得る。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントは、当該分野で公知の技術によって、産生され得る。この技術としては以下が挙げられるが、これらに限定はされない：（ｉ）抗体分子のペプシン処理によって産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２のジスルフィド架橋を還元することによって産生されるＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤を用いた抗体分子の処理によって産生されるＦａｂフラグメントおよび（ｉｖ）Ｆｖフラグメント。
（二種特異性抗体）
二種特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体は、少なくとも２つの異なった抗原に対する結合特異性を有する、モノクローナル抗体（好ましくはヒト抗体またはヒト化抗体）である。本発明の場合において、結合特異性の１つは、本発明の抗原タンパク質に対する結合特異性である。第二の結合標的は、任意の他の抗原であり、そして好都合にも、細胞表面タンパク質またはレセプターもしくはレセプターサブユニットである。
二種特異性抗体を作製する方法は、当該分野で公知である。従来、二種特異性抗体の組換え体産生は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖の対の共発現に基づき、ここで、２つの重鎖は、異なった特異性を有する（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな分類ゆえに、これらのハイブリドーマ（クアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ））は、１０の生じ得る異なった抗体分子の混合を産生し、これらのうちの１つだけが、正しい二種特異的な構造を有する。正しい分子の精製は、通常、アフィニティクロマトグラフィ工程によって達成される。同様の過程が、ＷＯ９３／０８８２９号（１９９３年５月１３日公開）、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５−３６５９において、開示される。
望ましい結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に、融合され得る。この融合は、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常ドメイン（少なくともヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３の部分を含む）との融合である。これは、少なくとも融合の１つにおいて存在する軽鎖結合に必要な部位を含む、第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが、好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体および、もし望ましいなら、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、そして、適切な宿主生物内に、共トランスフェクトされる。二種特異性抗体の産生のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
ＷＯ９６／２７０１１号に記載の別のアプローチに従い、抗体分子の対の間の境界は、組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーの百分率を最大化するために、操作され得る。好ましい境界は、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法において、第一抗体分子の境界由来の１つ以上の低分子アミノ酸側鎖は、より大型の側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）と置き換えられる。大型の側鎖と同一の側鎖または同様の大きさの側鎖の代償の「穴（ｃａｖｉｔｙ）」は、大型のアミノ酸側鎖をより小型の側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）と置き換えることにより、第二抗体分子の境界上に、作製される。これは、他の望まない最終産物（例えば、ホモダイマー）をしのぐヘテロダイマーの産生を、増加させるメカニズムを、提供する。
二種特異性抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二種特異性抗体）として調製され得る。抗体フラグメントから二種特異性抗体を産生する技術は、文献において記載されている。例えば、二種特異性抗体は、化学的連結を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体がタンパク質溶解により開裂され、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生する手順を、記載する。これらのフラグメントは、ジチオール錯体化剤アルセナイトナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｒｓｅｎｉｔｅ）の存在下で還元されて、隣接するジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を妨げる。産生されるＦａｂ’フラグメントは、次いで、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に、変換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つは、次いで、メルカプトエチルアミンでの還元により、Ｆａｂ’−チオールに再変換され、そして等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合され、二種特異的抗体を形成する。産生される二種特異的抗体は、酵素の選択的固定のための薬剤として使用され得る。
さらに、Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され得、化学的に結合されて、二種特異的抗体を形成する。Ｓｈａｌａｂｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全なヒト化二種特異的抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載する。それぞれのＦａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから別々に分泌され、そしてインビトロで指向された化学的結合に供され、二種特異的抗体を形成する。このように形成された二種特異的抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞に結合し得、そしてヒト細胞障害性リンパ球の、ヒト胸部腫瘍標的に対する溶解活性を引き起こす。
二種特異的抗体フラグメントを、組換え細胞培養から直接作製し、単離するための種々の技術もまた、記載されている。例えば、二種特異的抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合により、２つの異なった抗体のＦａｂ’部分に連結される。抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域において還元されてモノマーを形成し、次いで再び酸化され、抗体へテロダイマーを形成する。この方法は、抗体ホモダイマーを産生するためにもまた、利用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）によって記載されるディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）技術は、二種特異的抗体フラグメントを作製するための、代替のメカニズムを提供している。このフラグメントは、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とリンカーによって連結される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、このリンカーは、同じ鎖の２つのドメインの間で対を作らせるには短すぎる。従って、１つのフラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインと対にさせられ、これにより、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用により、二種特異性抗体フラグメントを作製するための別の戦略もまた、報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
２価以上の抗体が、意図される。例えば、３種特異的抗体が、調製され得る。Ｔｕｔｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
典型的な二種特異的抗体は、２つの異なったエピトープに結合し得、そのうち少なくとも１つは、本発明のタンパク質抗原に由来する。あるいは、免疫グロブリン分子の抗抗原アームは、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８もしくはＢ７）、またはＩｇＧのＦｃレセプター（ＦｃγＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６））などの白血球上の標的分子に結合するアームと連結され得、特定抗原を発現する細胞に対する細胞防御メカニズムに焦点を当てる。二種特異的抗体は、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞障害性薬剤を指向するために、使用され得る。これらの抗体は、抗原結合アームおよび細胞障害剤または放射性核種キレーター（ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、もしくはＴＥＴＡ）を結合するアームを、有する。目的の、別の二種特異的抗原は、本明細書中で記載されるタンパク質抗原を結合し、さらに組織因子（ＴＦ）にも結合する。
（異種結合抗体）
異種結合抗体もまた、本発明の範囲内である。異種結合抗体は、２つの共有的に結合される抗体で構成される。このような抗体は、例えば、望まない細胞に対して免疫系細胞を標的化すること（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のために（ＷＯ９１／００３６０号；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）、提唱されている。抗体は、インビトロで、合成タンパク質化学の公知方法（関連の架橋剤を含む）を使用して調製され得ることを、意図する。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用するかまたはチオエーテル結合を形成することにより、構築され得る。この目的のために適切な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートおよび例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されるものが挙げられる。
（エフェクター機能操作）
本発明の抗体を、例えば、この抗体の癌処置における有効性を増大するために、エフェクター機能に関して改変することが、望ましい。例えば、システイン残基は、Ｆｃ領域に導入され得、これにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合が、形成される。このように産生されるホモダイマー抗体は、内在化能を改善し得、かつ／または補体媒介性細胞殺傷および抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を上昇させ得る。Ｃａｒｏｎら，Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．，１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を、参照のこと。増大される抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体もまた、ヘテロ二官能性架橋材（Ｗｏｌｆｆら Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載）を使用して、調製され得る。あるいは、抗体は、二重のＦｃ領域を有し、そしてこれにより増大された補体溶解およびＡＤＣＣ能を有するように、操作され得る。
（免疫結合体）
本発明はまた、免疫結合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）に関し、この免疫結合体としては、化学療法薬剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の、酵素的に活性な毒素、またはこれらのフラグメント）、または放射活性同位体（例えば、放射性共益）などの細胞障害剤に結合体化された抗体が、挙げられる。
このような免疫結合体の産生において有用な化学療法薬剤は、上で記載されている。使用され得る酵素的な活性毒素およびそのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エキソトキシンＡ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、 α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、マイトジェリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が、挙げられる。種々の放射性核種が、放射結合体化抗体の産生のために入手可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅが挙げられる。
抗体および細胞障害剤の結合体は、種々の二機能性タンパク質結合剤（Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオレン（ＩＴ）など）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬなど）、活性エステル（ジスクシンイミジル基質など）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス−（ｐ−アジドベンゾイル）−ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム化合物（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トリレン（ｔｏｌｙｅｎｅ）２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）を使用してなされる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）において記載されるように調製され得る。炭素−１４−標識化１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への共役のための典型的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６号を参照のこと。
別の実施形態において、抗体は、「レセプター」（ストレプトアビジンなど）に結合対化され得、腫瘍事前標的化において利用される。ここで、抗体−レセプター共役は、患者に投与され得、洗浄剤を使用する循環系からの結合していない結合体の除去を続けて行い、そして次に細胞傷害剤に結合体化された「リガンド」（例えば、アビジン）の投与を行う。
（ＣＲＦ２−１３組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の別の局面は、ベクター（好ましくは発現ベクター）に関し、このベクターは、ＣＲＦ２−１３タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログをコードする核酸を含む。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、連結されている別の核酸を輸送し得る核酸分子を言及する。ベクターのひとつの型は「プラスミド」であり、追加のＤＮＡセグメントが連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループを言及する。別の型のベクターはウイルスベクターであり、さらなるＤＮＡセグメントが、このウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、導入される宿主細胞において、自発的に複製し得る（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入において、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主細胞と共に複製される。その上、特定のベクターは、遺伝子の発現を指揮し得、ここで、その遺伝子に対して
ベクターは操作可能に連結される。このようなベクターは、本明細書中で「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミド形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、互いに交換して使用され得る。それは、プラスミドは、最も普通に使用されるベクターの形態だからである。しかし、本発明は、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような、同等の機能を果たす、発現ベクターの他の形態を含むことを意図する。
本発明の組換え体発現ベクターは、宿主細胞における核酸発現に適切な形態の、本発明の核酸を含む。これは、組換え体発現ベクターは、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される、１つ以上の制御配列を含み、この制御配列は、発現される核酸配列に作動可能に連結されることを意味する。組換え発現ベクター内において、「作動可能に連結される」は、ヌクレオチド配列を発現させる手法において、目的のヌクレオチド配列が、制御配列に連結されること（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、または、このベクターが宿主細胞に導入される場合、宿主細胞において）を意味する意図がある。
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニレル化シグナル）を含むことを意図される。このような制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）において記載される。調節配列は、宿主細胞の多くの型におけるヌクレオチド配列の直接的構成的発現および特定の宿主細胞のみにおけるヌクレオチド配列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的制御配列）を含む。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル、などの因子に依存し得ることが、当業者に理解される。
本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され得、これにより、タンパク質またはペプチドを産生し、このタンパク質またはペプチドは、本明細書中で記載される核酸にコードされる、融合タンパク質または融合ペプチドを含む（例えば、ＣＲＦ２−１３タンパク質、ＣＲＦ２−１３タンパク質の変異形態、融合タンパク質など）。本発明の組換え体発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞におけるＣＲＦ２−１３タンパク質の発現のために、設計され得る。例えば、ＣＲＦ２−１３タンパク質は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞、または哺乳類細胞において、発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）においてさらに議論される。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロにおいて転写および翻訳され得る。
原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて、融合タンパク質か非融合タンパク質のどちらかの発現を指向する、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを用いて、行われる。融合ベクターは、コードされるタンパク質に、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に、多くのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的に３つの目的を果たす：（ｉ）組換えタンパク質の発現の上昇；（ｉｉ）組換えタンパク質の可溶性の上昇；および（ｉｉｉ）アフィニティ精製においてリガンドとして作用することによる組換えタンパク質の精製における補助。しばしば、融合発現ベクター中に、融合部分と組換えタンパク質との連結部において、タンパク溶解開裂部位が導入され、融合部分から組換えタンパク質を分離させ得、次いで、融合タンパク質を精製する。このような酵素、およびその同族認識配列としては、Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが挙げられる。代表的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。これらは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａを、それぞれ、標的組換えタンパク質に融合する。
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎら，（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）。
Ｅ．Ｃｏｌｉ中における組み換えタンパク質発現を最大にするための１つのストラテジーは、組み換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が減力した宿主細菌においてタンパク質を発現することである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ（１９９０）１１９〜１２８を参照のこと。別のストラテジーは、核酸の核酸配列を発現ベクターへ挿入されるように変更することであり、その結果、各アミノ酸についての個々のコドンは、Ｅ．Ｃｏｌｉ中で優先的に利用されるものである（例えば、Ｗａｄａ，ら，１９９２．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１〜２１１８を参照のこと）。本発明の核酸配列のそのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実行され得る。
別の実施形態において、ＣＲＦ２−１３発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃａｈｅｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ら，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９〜２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ ３０：９３３〜９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら，１９８７．Ｇｅｎｅ ５４：１１３〜１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）およびｐｉｃＺ（Ｉｎ Ｖｉｔｏｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
あるいは、ＣＲＦ２−１３は、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞において発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）におけるタンパク質発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６〜２１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１〜３９）が挙げられる。
さらに別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７〜１９５）が挙げられる。哺乳動物において使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしばウイルス性調節エレメントによって提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマウイルス、アデノウイルスＺ、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０由来である。原核生物細胞および真核生物細胞の両方のための他の適切な発現系としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧの第１６章および第１７章：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９を参照のこと。
別の実施形態において、組み換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指向し得る（例えば、組織特異的な調節エレメントが、核酸を発現するために使用される）。組織特異的な調節エレメントは、当該分野において公知である。適切な組織特異的プロモーターの例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら，１９８７．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８〜２７７）、リンパ系特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５〜２７５）、Ｔ細胞レセプターの特定のプロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９〜７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７２９〜７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３．Ｃｅｌｌ３３：７４１〜７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３〜５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２〜９１６）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号およびヨーロッパ出願公開第２６４，１６６号）が挙げられるが、これらに限定されない。発達調節プロモーターとしてはまた、例えば、マウスホックスプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４〜３７９）およびα胎児性タンパク質プロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７〜５４６）が含まれる。
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクター内でクローンニングされる本発明のＤＮＡ分子を含む組み換え発現ベクターを提供する。つまり、ＤＮＡ分子は、ＣＲＦ２−１３ ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現を可能にする（ＤＮＡ分子の転写によって）様式で、調節配列に作動可能に連結される。種々の細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の連続発現を指向する、アンチセンス方向でクローンニングされる核酸に作動可能に連結された調節配列（例えば、ウイルス性プロモーターおよび／またはエンハンサー）が選択され得るか、またはアンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現または細胞型特異的発現を指向する調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミドまたはアンチセンス核酸が高効率調節領域の制御下で産生される弱毒化ウイルスの形態であり得、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の議論に関しては、例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１巻（１） １９８６を参照のこと。
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入される宿主細胞に関係する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で交換可能に使用される。そのような用語は、特定の被験体細胞ばかりでなくそのような細胞の子孫または潜在的子孫をいうことが理解される。突然変異または環境の影響のいずれかに起因して、特定の改変が次世代において生じ得るので、そのような子孫は、事実、親細胞と同一ではあり得ないが、本明細書中で使用される用語の範囲内になお含まれる。
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、ＣＲＦ２−１３タンパク質は、Ｅ．Ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、ヒト、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術によって原核生物細胞または真核生物細胞内に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞内へ導入するための種々の当該分野において認識される技術（リン酸カルシウム共沈殿または塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む）をいうことが意図される。宿主細胞を形質転換するまたはトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の実験室マニュアルにおいて見出され得る。
哺乳動物の細胞の適切なトランスフェクションについて、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞の小さなフラクションのみが、ゲノム内へ外来ＤＮＡを統合し得る。これらの構成要素を同定および選択するために、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質に耐性な）をコードする遺伝子は、一般的に目的の遺伝子とともに宿主細胞内へ導入される。種々の選択可能なマーカーとしては、例えば、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートのような薬物に対する耐性を付与するものが挙げられる。選択可能なマーカーをコードする核酸は、ＣＲＦ２−１３をコードする同じベクター上で宿主細胞内へ導入され得るか、または別個のベクター上に導入され得る。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を取り込む細胞が生存する一方で、他の細胞は死ぬ）。
例えば、培養物中の原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞のような本発明の宿主細胞は、ＣＲＦ２−１３タンパク質を産生（すなわち、発現）するために使用され得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用してＣＲＦ２−１３タンパク質を産生するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＣＲＦ２−１３タンパク質が産生されるような適切な培地における本発明の宿主細胞（ＣＲＦ２−１３タンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入される）の培養を包含する。別の実施形態において、この方法は、さらに培地または宿主細胞からのＣＲＦ２−１３タンパク質の単離を包含する。
（トランスジェニックＣＲＦ２−１３動物）
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を生成するために使用され得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＣＲＦ２−１３タンパク質コード配列が、導入される受精卵母細胞または胚幹細胞である。次いで、そのような宿主細胞は、外因性ＣＲＦ２−１３配列がそのゲノム内へ導入される非ヒトトランスジェニック動物、または内因性ＣＲＦ２−１３配列が変更される相同組換え動物を作製するために使用され得る。そのような動物は、ＣＲＦ２−１３タンパク質の機能および／または活性を研究するために、そしてＣＲＦ２−１３タンパク質活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明細書で使用される場合、「トランスジェニック動物」は、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、ラットやマウスのようなげっ歯類であり、この動物の１つ以上の細胞が、導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、雌ウシ、ヤギ、ニワトリ、両性類などが挙げられる。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生した細胞のゲノム内で一体化され、そして成熟動物のゲノム内に残存する外因性ＤＮＡであり、それにより、トランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織においてコード遺伝子産物の発現を指向する。本明細書中で使用される場合、「相同組換え動物」は、非ヒト動物であり、好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくはマウスであり、この動物において、動物の発生前に、内因性ＣＲＦ２−１３遺伝子は、内因性遺伝子と、動物の細胞（例えば、動物の胚細胞）内へ導入される外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって変更される。
本発明のトランスジェニック動物は、ＣＲＦ２−１３コード核酸を受精卵母細胞の雄性前核内に導入することによって（例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって）、そして偽妊娠雌性里親動物においてその卵母細胞を発生させることによって作製され得る。配列番号１を含む配列は、導入遺伝子として非ヒト動物のゲノム内へ導入され得る。あるいは、マウスＣＲＦ２−１３遺伝子のようなヒトＣＲＦ２−１３遺伝子の非ヒトホモログは、ヒトＣＲＦ２−１３ ｃＤＮＡ（前出でさらに記載される）へのハイブリダイゼーションに基づいて単離され得、そして導入遺伝子として使用され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルがまた、導入遺伝子の発現の効率を増加するように、導入遺伝子中に含まれ得る。組織特異的調節配列は、ＣＲＦ２−１３タンパク質の発現を特定の細胞に対して指向するように、ＣＲＦ２−１３導入遺伝子に作動可能に連結され得る。胚マニピュレーションおよびマイクロインジェクションによるトランスジェニック動物（特にマウスのような動物）を作製する方法は、当該分野において一般的であり、そして例えば、米国特許第４，７３６、８６６号；同第４，８７０，００９号；および同第４，８７３，１９１号；ならびにＨｏｇａｎ、１９８６．ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧＴＨＥ ＭＯＵＳＥ ＥＭＢＲＹＯ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．において記載される。同様の方法が、他のトランスジェニックマウスの生成のために使用される。トランスジェニック創始動物は、そのゲノム中のＣＲＦ２−１３導入遺伝子の存在および／あるいはその動物の組織または細胞中でのＣＲＦ２−１３ ｍＲＮＡの発現に基づいて同定され得る。次いで、創始動物を使用して、導入遺伝子を保育するさらなる動物を飼育し得る。さらに、導入遺伝子コードＣＲＦ２−１３タンパク質を有するトランスジェニック動物は、さらに他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物に対して飼育し得る。
相同組換え動物を作製するために、ＣＲＦ２−１３遺伝子（欠失、付加または置換が導入され、それにより、ＣＲＦ２−１３遺伝子を変更する（例えば、機能的に破壊する））の少なくとも一部を含むベクターが、調製される。ＣＲＦ２−１３遺伝子は、ヒト遺伝子（例えば、配列番号１のＤＮＡ）であり得るが、より好ましくは、ヒトＣＲＦ２−１３遺伝子の非ヒトホモログである。例えば、配列番号１のヒトＣＲＦ２−１３遺伝子のマウスホモログを使用して、マウスゲノム内の内因性ＣＲＦ２−１３遺伝子を変更するために適切な相同組換えベクターを構築し得る。１つの実施形態において、ベクターは、相同組換えの際に、内因性ＣＲＦ２−１３遺伝子が機能的に破壊される（すなわち、もはや機能的タンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも称される）ように設計される。
あるいは、ベクターは、相同組換えの際、内因性ＣＲＦ２−１３遺伝子が、突然変異されるかまたはそうでなければ変更されるが、機能性タンパク質はまだコードする（例えば、上流の調節領域は、変更され得、それにより、内因性ＣＲＦ２−１３タンパク質の発現が変化する）ように設計され得る。この相同組換えベクターにおいて、ＣＲＦ２−１３遺伝子の変化した部分は、相同組換えが、ベクターによって運ばれる外因性ＣＲＦ２−１３遺伝子と胚幹細胞中の内因性ＣＲＦ２−１３遺伝子との間に生じることを可能にするＣＲＦ２−１３遺伝子のさらなる添加によって、その５’末端および３’末端に隣接する。さらなる隣接ＣＲＦ２−１３核酸は、内因性遺伝子による首尾よい相同組換えのために十分な長さである。代表的には、隣接するＤＮＡの数キロベース（５’末端および３’末端の両方で）が、ベクター中に含まれる。相同組換えベクターの記載については、例えば、Ｔｈｏｍａｓら、１９８７．Ｃｅｌｌ ５１：５０３を参照のこと。次いで、ベクターは、胚幹細胞株内に導入され（例えば、エレクトロポレーションによって）、そして導入されたＣＲＦ２−１３遺伝子が内因性ＣＲＦ２−１３遺伝子により相同的に組換えされる細胞が選択される。例えば、Ｌｉら、１９９２、Ｃｅｌｌ ６９：９１５を参照のこと。
次いで、選択された細胞は、凝集キメラを形成するために、動物（例えば、マウス）の胚盤胞内に注入される。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ、１９８７、：ＴＥＲＡＴＯＣＡＲＣＩＮＯＭＡＳＡＮＤ ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ、１１３〜１５２頁を参照のこと。次いで、キメラ胚は、適切な偽妊娠雌性里親動物内へ移植され得、そして胚を正期にする。胚芽細胞中に相同的に組み換えられたＤＮＡを有する子孫は、その動物の全細胞が、導入遺伝子の生殖細胞系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）転移によって相同的に組み換えられたＤＮＡを含む動物を飼育するために使用され得る。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築するための方法は、さらに、Ｂｒａｄｌｅｙ、１９９１．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：８２３〜８２９；ＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ ９０／１１３５４；ＷＯ ９１／０１１４０；ＷＯ ９２／０９６８；およびＷＯ ９３／０４１６９に記載される。
別の実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含むトランスジェニック非ヒト動物が生成され得る。そのような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の記載については、例えば、Ｌａｋｓｏら、１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２〜６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である。Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、１９９１．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１〜１３５５を参照のこと。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が、導入遺伝子の発現を調節するために使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が要求される。そのような動物は、「二重」トランスジェニック動物の構築によって（例えば、２頭のトランスジェニック動物（一方は選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む）を交配することによって）提供され得る。
本明細書中で記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Ｗｉｌｍｕｔら、１９９７．Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０〜８１３において記載される方法によって生成され得る。簡単には、トランスジェニック動物由来の細胞（例えば、体細胞）が単離され、そして成長周期を止め、そしてＧ０相に入るように誘導され得る。次いで、休止細胞は、（例えば、電気パルスの使用によって）、休止細胞が単離された同じ種の動物由来の摘出された卵母細胞と融合され得る。次いで、再構築された卵母細胞は、それが桑実胚または胚芽細胞に成長するように培養され、次いで、偽妊娠雌性里親動物に移入される。この雌性里親動物から生まれた子孫は、その細胞（例えば、体細胞）が単離された動物のクローンである。
（薬学的組成物）
本発明のＣＲＦ２−１３核酸分子、ＣＲＦ２−１３タンパク質、および抗ＣＲＦ２−１３抗体（本明細書中では「活性化合物」とも称される）、ならびにその誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログは、投与に適切な薬学的組成物に組み込まれ得る。そのような組成物は、代表的に、核酸分子、タンパク質、または抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的投与に適合する任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。適切なキャリアは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（当該分野において標準的な参考書である（本明細書中で参考として援用される））の最新版において記載される。そのようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、フィンガー溶液、ブドウ糖溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび固定油のような非水性ビヒフルもまた、使用され得る。薬学的活性物質についてそのような培体および薬剤の使用は、当該分野において周知である。任意の従来の培体または薬剤が活性化合物とは不適合である場合を除いて、その組成物のその使用が、企図される。補足的な活性化合物もまた、この組成物中に組み込まれ得る。
本明細書中で開示される抗体はまた、免疫リポソームとして処方され得る。この抗体を含むリポソームは、当該分野で公知の方法によって調製される（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４０３０（１９８０；）ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号において記載される）。増加した循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示される。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる、逆相蒸発方法によって生成され得る。リポソームは、規定された孔サイズのフィルターを通して押し出して、所望の直径を有するリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７：２８６〜２８８（１９８２）において記載されるように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに結合体化され得る。化学治療薬剤（例えば、ドキソルビシン）は、必要に応じてリポソーム内に含まれる。Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、８１（１９）：１４８４（１９８９）を参照のこと。
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路に適合するように処方される。投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）投与、経口（例えば、吸入）投与、経皮（例えば、局所）投与、経粘膜投与、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液としては、以下の組成物が挙げられ得る：注射用水のような無菌の希釈剤、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のようなキレート剤；アセテート、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはブドウ糖のような張度調整のための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックで作られるアンプル、使い捨ての注射器または複数用量バイアルに封入され得る。
注射可能な使用に適切な薬学的組成物としては、無菌水溶液（水溶性）または分散剤および無菌の注射可能な溶液または分散剤の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。静脈投与のために、適切なキャリアは、生理学的食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合において、この組成物は、無菌でならなければならず、そして容易に注射できる範囲で流体であるべきである。この組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散の場合においては要求される粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の保存は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤（例えば、糖、多価アルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）、塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続性吸収は、組成物中に吸収を遅延する薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含むことによって、もたらされ得る。
無菌の注射可能な溶液は、活性化合物（例えば、ＣＲＦ２−１３タンパク質または抗ＣＲＦ２−１３抗体）を要求される量で、適切な溶媒（上で列挙された成分の１つまたは組み合わせを有し、必要である場合、引き続いて濾過滅菌される）に組み込むことによって調製され得る。一般的に、分散剤は、活性化合物を無菌ビヒフル（基本的な分散媒および上で列挙されたものからの要求される他の成分を含む）中に取り込ませることによって調製される。無菌性の注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合において、調製方法は、前もって滅菌濾過された溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。それらは、ゼラチンカプセル中に包まれるか、または錠剤中に圧縮され得る。経口治療投与の目的で、活性化合物は、賦形剤に取り込まれ得、そして錠剤、トローチ、またはカプセル形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬として使用するために、流体キャリアを使用することで調製され得、ここで、流体キャリア中の化合物は、経口的に適用され、そしてうがいされ、そして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合する結合剤、および／またはアジュバント物質が、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の成分、または同様の性質を有する化合物のいずれかを含み得る：微結晶性セルロース、ゴムトラガカントまたはゼラチンのような結合剤；デンプンまたは乳糖のような賦形剤、アルギン酸、プライモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、またはトウモロコシデンプンのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロート（Ｓｔｅｒｏｔｅ）のような潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素のようなグリダント（ｇｌｉｄａｎｔ）；ショ糖またはサッカリンのような甘味剤；あるいはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料のような香味剤。
吸入による投与のために、化合物は、適切な推進剤（例えば、二酸化炭素のようなガス）を含む圧力容器もしくはディスペンサーまたは噴霧器からエアロゾルスプレーの形態で送達される。
全身性投与はまた、経粘膜的手段または経皮的手段であり得る。経粘膜的投与または経皮的投与のために、透過されるべきバリアに適切な浸透剤は、処方物中で使用される。そのような浸透剤は、一般的に当該分野で公知であり、そして例えば、経粘膜的投与のために、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜的投与は、鼻孔スプレーまたは坐剤の使用を通して達成され得る。経皮的投与について、活性化合物は、当該分野で一般的に公知である軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム中で処方される。
化合物はまた、直腸送達のために、坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤基材を有する）または貯留性注腸の形態で調製され得る。
１つの実施形態において、活性化合物は、化合物が体内から迅速に排出されるのを防止するキャリア（例えば、徐放性処方物であり、移植片および微カプセル化された送達系を含む）とともに調製される。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような生分解性の生体適合性ポリマーが使用され得る。そのような処方体を調製するための方法は、当業者に明らかである。この物質はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販品として得られ得る。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体により感染した細胞に標的化されたリポソームを含む）はまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、当業者にとって公知の方法（例えば、米国特許第４，５２２，８１１号において記載される）によって調製され得る。
投与の容易さおよび投薬の均一性のために経口組成物または非経口組成物を投薬単位形態で処方することは、特に有利である。本明細書中で使用される場合、投薬単位形態とは、処置されるべき被験体に対する単位投薬として適切な物理的に別個の単位をいう；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと共同で所望の治療効果を産生するように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態に関する詳細は、活性化合物の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果、そして個体の処置のためにそのような活性化合物を配合する分野に固有な限定に影響され、そして直接これらに依存する。
本発明の核酸分子は、ベクター内に挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、被験体に、例えば静脈注射、局所的投与（例えば、米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎ、ら、１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４〜３０５７を参照のこと）によって送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子送達賦形剤が埋め込まれた徐放マトリクスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞からインタクトに産生され得る場合（例えば、レトロウイルスベクター）、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含み得る。
本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体および本明細書中で開示されるスクリーニングアッセイによって同定される他の分子は、種々の疾患の処置のために薬学的組成物の形態で投与され得る。そのような組成物の調製に関与する原理および考慮事項、ならびに成分の選択における案内は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第１９版（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、ら、編）Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．：１９９５；Ｄｒｕｇ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，Ａｎｄ Ｔｒｅｎｄｓ、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ、Ｐａ、１９９４；およびＰｅｐｔｉｄｅ Ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｉｎ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第４巻）、１９９１、Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにおいて記載される。抗原性タンパク質が細胞内にあり、そして抗体全体がインヒビターとして使用される場合、内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ）抗体が好ましい。しかし、リポソームもまた、抗体または抗体フラグメントを細胞内へ送達するために使用され得る。抗体フラグメントが使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害性フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列と結合する能力を保持するペプチド分子が、設計され得る。そのようなペプチドは、化学的に合成され得、そして／または組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：７８８９〜７８９３を参照のこと。本明細書中の処方物はまた、処置されるべき特定の適応症のために必要とされる１つより多くの活性化合物、好ましくは、互いに不利な影響を及ぼさない補完活性を有する活性化合物を含み得る。あるいは、またはさらに、この組成物は、その機能を高める薬剤（例えば、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、化学治療剤、または増殖阻害剤）を含み得る。そのような分子は、意図される目的のために効果的な量で組み合わせて適切に存在する。活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術または界面重合化によって調製されるミクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースミクロカプセルまたはゼラチンミクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）ミクロカプセル）中に、それぞれ、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）にて、またはマクロエマルジョンにて、捕捉され得る。
インビボ投与のために使用されるべき処方物は、滅菌されていなければならない。これは、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の適切な例としては、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、造形された物品（例えば、フィルム、またはミクロカプセル）の形態である。徐放性マトリクスの適切な例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸とのコポリマー、非分解性エチレンビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸のコポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される、注射可能なミクロスフェア））、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキ酪酸が挙げられる。エチレンビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーが、１００日間にわたって分子の放出を可能にする場合、特定のヒドロゲルは、より短い期間の間にタンパク質を放出する。
薬学的組成物は、投与のための指示書とともに、容器、パック、またはディスペンサー中に含まれ得る。
（スクリーニング方法および検出方法）
本発明の単離された核酸分子は、下記にさらに記載されるように、ＣＲＦ２−１３タンパク質を発現し（例えば、遺伝子治療の適用において宿主細胞中の組換え発現ベクターを介して）、ＣＲＦ２−１３ ｍＲＮＡを検出する（例えば、生物学的サンプルにおいて）か、またはＣＲＦ２−１３遺伝子の遺伝的損傷を検出し、そしてＣＲＦ２−１３活性を調節するために、使用され得る。さらに、ＣＲＦ２−１３タンパク質は、ＣＲＦ２−１３タンパク質活性またはＣＲＦ２−１３タンパク質発現を調節する薬物または化合物をスクリーニングし、そしてＣＲＦ２−１３タンパク質の不十分もしくは過剰な発現またはＣＲＦ２−１３野生型タンパク質と比較して減少した活性もしくは異常な活性を有するＣＲＦ２−１３タンパク質形態の産生によって特徴付けられる障害を処置するために、使用され得る。さらに、本発明の抗ＣＲＦ２−１３抗体は、ＣＲＦ２−１３タンパク質を検出しそして単離するために、そしてＣＲＦ２−１３活性を調節するために、使用され得る。例えば、ＣＲＦ２−１３活性は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の増殖および分化、抗体産生、および腫瘍の増殖を含む。
本発明はさらに、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される新規薬剤に関係し、そして記載されるような（前出）処置のためのその使用に関する。
（スクリーニングアッセイ）
本発明は、ＣＲＦ２−１３タンパク質に結合するか、または例えば、ＣＲＦ２−１３タンパク質発現もしくはＣＲＦ２−１３タンパク質活性に対する刺激効果もしくは阻害効果を有する、調節因子（すなわち、候補化合物もしくは候補薬剤または試験化合物もしくは試験薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または他の薬物））を同定するための方法（本明細書中では「スクリーニングアッセイ」とも称される）を提供する。本発明はまた、本明細書中で記載されるスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物を含む。
１つの実施形態において、本発明は、ＣＲＦ２−１３タンパク質の膜結合形態またはＣＲＦ２−１３ポリペプチドの膜結合形態あるいはその生物学的に活性な部分に結合するかまたはその活性を調節する、候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野で公知のコンビナトリアルライブラリー方法における非常に多くのアプローチのいずれかを使用して得られ得る。そのコンビナトリアルライブラリー方法としては、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な並行固相ライブラリーまたは溶液相ライブラリー；逆重畳（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）を必要とする合成ライブラリー方法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー方法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー方法が挙げられる。生物学的ライブラリーアプローチが、ペプチドライブラリーに限定される一方で、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子ライブラリーに対して適用可能である。例えば、Ｌａｍ、１９９７．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １２：１４５を参照のこと。
本明細書中で使用される場合、「低分子」は、少なくとも５ｋＤ未満そして最も好ましくは、約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物を言及することになっている。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、糖質、脂質または他の有機分子あるいは無機分子であり得る。化学的混合物および／または生物学的混合物（例えば、真菌抽出物、細菌抽出物、または藻類抽出物）のライブラリーは、当該分野において公知であり、そして本発明のアッセイのいずれかでスクリーニングされ得る。
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において見いだされ、例えば：ＤｅＷｉｔｔ、ら、１９９３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂ、ら、１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ、ら、１９９４．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏ、ら、１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ、ら、１９９４．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ、ら、１９９４．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐ、ら、１９９４．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３に見出され得る。
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、１９９２．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２〜４２１）、またはビーズ上（Ｌａｍ、１９９１．Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ、１９９３．Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５〜５５６）、細菌上（Ｌａｎｄｅｒ、米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上（Ｌａｎｄｅｒ、米国特許第５，２３３，４０９号）、プラスミド上（Ｃｕｌｌ、ら、１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ、１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａ、ら、１９９０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ、１９９１．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２３３，４０９号）に提示され得る。
１つの実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、このアッセイにおいて、ＣＲＦ２−１３タンパク質の膜結合形態またはこの生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を、試験化合物と接触させ、この試験化合物がＣＲＦ２−１３タンパク質に結合する能力が決定される。例えば、この細胞は、哺乳動物起源であっても、または酵母細胞であってもよい。試験化合物がＣＲＦ２−１３タンパク質に結合する能力の決定は、例えば、試験化合物のＣＲＦ２−１３タンパク質またはその生物学的に活性な部分への結合が、複合体中の標識化合物の検出によって決定され得るように、試験化合物に放射性同位元素または酵素標識を結合することによって達成され得る。例えば、試験化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで、直接的にかまたは間接的に標識され得、そしてこの放射性同位元素が、放射能放出の直接計測またはシンチレーション計測によって検出される。あるいは、試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識され得、そしてこの酵素標識は、適切な基質から生成物への転換決定によって検出される。１つの実施形態において、このアッセイは、ＣＲＦ２−１３タンパク質の膜結合形態またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上に発現する細胞を、ＣＲＦ２−１３に結合する公知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成する工程、そのアッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、およびその試験化合物がＣＲＦ２−１３タンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含する。ここで、この試験化合物がＣＲＦ２−１３タンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、上記の公知の化合物と比較して、その試験化合物がＣＲＦ２−１３タンパク質またはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
別の実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、このアッセイは、細胞表面上にＣＲＦ２−１３タンパク質の膜結合形態またはその生物学的に活性な部分を発現する細胞と、試験化合物を接触させる工程、ならびにその試験化合物がＣＲＦ２−１３タンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節する（例えば、刺激するか、または阻害する）能力を決定する工程を包含する。その試験化合物が、ＣＲＦ２−１３またはその生物学的に活性な部分の活性を調節する能力の決定は、例えば、ＣＲＦ２−１３タンパク質がＣＲＦ２−１３標的分子に結合する能力またはこれと相互作用する能力の決定によって達成され得る。本明細書中で使用される場合、「標的分子」は、ＣＲＦ２−１３タンパク質が自然に結合するかまたは相互作用する分子であり、例えば、ＣＲＦ２−１３相互作用タンパク質を発現する細胞の表面上にある分子、第２細胞の表面上にある分子、細胞外環境における分子、細胞膜の内面に結合している分子または細胞質分子である。ＣＲＦ２−１３標的分子は、本発明の非ＣＲＦ２−１３分子またはＣＲＦ２−１３タンパク質またはＣＲＦ２−１３ポリペプチドであり得る。１つの実施形態において、ＣＲＦ２−１３標的分子は、細胞膜を通って細胞に到る、細胞外シグナル（例えば、膜結合ＣＲＦ２−１３分子への化合物の結合によって生成されるシグナル）の伝達を促進するシグナル伝達経路の成分である。例えば、標的は、触媒活性を有する第２の細胞内タンパク質であり得るか、または下流のシグナル伝達分子とＣＲＦ２−１３との結合を促進するタンパク質であり得る。
ＣＲＦ２−１３タンパク質がＣＲＦ２−１３標的分子に結合するかまたはこれと相互作用する能力を決定することは、直接結合の決定についての上述の方法のうちの１つによって達成され得る。１つの実施形態において、ＣＲＦ２−１３タンパク質がＣＲＦ２−１３標的分子に結合するかまたはこれと相互作用する能力の決定は、標的分子の活性の決定によって達成され得る。例えば、標的分子の活性は、標的の細胞性第２メッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導の検出、標的（適切な基質）の触媒活性／酵素活性の検出、レセプター遺伝子（検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸と作動可能に連結されるＣＲＦ２−１３応答性調節エレメントを含む）の誘導の検出、または細胞性応答（例えば、細胞生存、細胞分化、または細胞増殖）の検出によって決定され得る。
さらに別の実施形態において、本発明のアッセイは、ＣＲＦ２−１３タンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させる工程、および試験化合物がＣＲＦ２−１３タンパク質またはこの生物学的に活性な部分に結合する能力を決定する工程を包含する無細胞アッセイである。試験化合物のＣＲＦ２−１３タンパク質への結合は、上述されるように直接または間接のいずれかで決定され得る。１つのそのような実施形態において、アッセイは、ＣＲＦ２−１３タンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＣＲＦ２−１３に結合する公知の化合物と接触させ、アッセイ混合物を形成する工程、アッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、および試験化合物がＣＲＦ２−１３タンパク質と相互作用する能力を決定する工程を含み、ここで、試験化合物がＣＲＦ２−１３タンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、公知の化合物と比較して、試験化合物が優先的にＣＲＦ２−１３タンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を決定する工程を包含する。
さらに別の実施形態において、アッセイは、ＣＲＦ２−１３タンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させる工程、および試験化合物がＣＲＦ２−１３タンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節する（例えば、刺激するか、または阻害する）能力を決定する工程を包含する無細胞アッセイである。試験化合物がＣＲＦ２−１３の活性を調節する能力の決定は、例えば、直接結合の決定について上述される方法のうちの１つによって、ＣＲＦ２−１３タンパク質がＣＲＦ２−１３標的分子に結合する能力を決定することによって達成され得る。代替的な実施形態において、試験化合物がＣＲＦ２−１３タンパク質の活性を調節する能力を決定する工程は、ＣＲＦ２−１３タンパク質がさらに、ＣＲＦ２−１３標的分子を調節する能力を決定することによって達成され得る。例えば、適切な基質に対する標的分子の触媒活性／酵素活性は、上述されるように決定され得る。
さらに別の実施形態において、無細胞アッセイは、ＣＲＦ２−１３タンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＣＲＦ２−１３タンパク質に結合する公知の化合物と接触させ、アッセイ混合物を形成する工程、アッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、および試験化合物がＣＲＦ２−１３タンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、試験化合物がＣＲＦ２−１３タンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、ＣＲＦ２−１３タンパク質が優先的にＣＲＦ２−１３標的分子に結合するか、またはその活性を調節する能力を決定する工程を包含する。
本発明の無細胞アッセイは、ＣＲＦ２−１３タンパク質の可溶形態または膜結合形態の両方の使用を受け入れる。ＣＲＦ２−１３タンパク質の膜結合形態を含む無細胞アッセイの場合、ＣＲＦ２−１３タンパク質の膜結合形態が溶液中で維持されるように可溶化剤を使用することが望ましくあり得る。そのような可溶化剤の例としては、非イオン性界面活性剤（例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド（ｎ−ｄｏｄｅｃｙｌｍａｌｔｏｓｉｄｅ）、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ）、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（商標登録）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（商標登録）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（商標登録）、イソトリデシル（ｔｒｉｄｅｃｙ）ポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、Ｎ−ドデシルＮ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ）−１−プロパンスルフォネート（ＣＨＡＰＳ）、または３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルフォネート（ＣＨＡＰＳＯ））が挙げられる。
本発明の上のアッセイ方法のうちの１つを超える実施形態において、タンパク質の１つまたは両方の非複合形態からの複合形態の分離を容易にするためにＣＲＦ２−１３タンパク質またはその標的分子のいずれかを固定化し、そしてアッセイの自動化を融通させることが望ましくあり得る。候補化合物の存在下および非存在下における試験化合物のＣＲＦ２−１３タンパク質への結合、またはＣＲＦ２−１３タンパク質と標的分子との相互作用は、反応物を含むのに適切な容器において達成され得る。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠心分離管が挙げられる。１つの実施形態において、そのタンパク質の１つまたは両方がマトリクスに結合するのを可能にするドメインを付加する融合タンパク質が提供され得る。例えば、ＧＳＴ−ＣＲＦ２−１３融合タンパク質またはＧＳＴ−標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上で吸着され得、次いで、試験化合物または試験化合物および非吸着標的タンパク質またはＣＲＦ２−１３タンパク質のいずれかと組み合わせられ、そしてこの混合物は、複合体形成を誘導する条件下で（例えば、塩およびｐＨについては、生理的条件で）インキュベートされる。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートのウェルは、例えば、記載されるように（前出）、任意の未結合の成分（ビーズの場合は固定化されたマトリクス、直接または間接のいずれかで決定された複合体）を洗浄し、除去する。あるいは、この複合体はマトリクスから分離され得、そしてＣＲＦ２−１３タンパク質の結合または活性レベルは、標準的な技術を使用して決定され得る。
タンパク質をマトリクス上に固定化するための他の技術はまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、ＣＲＦ２−１３タンパク質またはその標的分子のいずれかが、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合を使用して固定化され得る。ビオチン化ＣＲＦ２−１３タンパク質または標的分子は、当該分野において周知の技術（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製され得、そしてストレプトアビジンで被膜した９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルにおいて固定化され得る。あるいは、ＣＲＦ２−１３タンパク質または標的分子と反応するが、ＣＲＦ２−１３タンパク質がその標的分子に結合するのを妨げない抗体は、プレートのウェルに誘導体化され得、そして未結合標的またはＣＲＦ２−１３タンパク質は、抗体結合体化によってウェル内で捕捉され得る。ＧＳＴ固定化複合体について上述されるものに加えて、そのような複合体を検出するための方法としては、ＣＲＦ２−１３タンパク質または標的分子と反応する抗体を使用する複合体の免疫検出、およびＣＲＦ２−１３タンパク質または標的分子と関連する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
別の実施形態において、ＣＲＦ２−１３タンパク質発現の調節因子は、細胞が候補化合物と接触され、そして細胞中でのＣＲＦ２−１３ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が決定される方法において同定される。候補化合物の存在下でのＣＲＦ２−１３ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルは、候補化合物の非存在下でのＣＲＦ２−１３ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルと同じ程度である。従って、候補化合物は、この比較に基づいて、ＣＲＦ２−１３ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の調節因子として同定され得る。例えば、候補化合物の存在下でのＣＲＦ２−１３ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が非存在下での発現より大きい（すなわち、統計学上有意により大きい）場合、この候補化合物は、ＣＲＦ２−１３ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激物質として同定される。あるいは、候補化合物の存在下でのＣＲＦ２−１３ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が非存在下での発現より少ない（統計学上有意により少ない）場合、この候補化合物は、ＣＲＦ２−１３ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のインヒビターとして同定される。細胞中でのＣＲＦ２−１３ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のレベルは、ＣＲＦ２−１３ ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するための本明細書中で記載される方法によって決定され得る。
さらに本発明の別の局面において、ＣＲＦ２−１３タンパク質は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおける「ベイト（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用され、ＣＲＦ２−１３に結合するかまたはこれと相互作用する他のタンパク質（「ＣＲＦ２−１３−結合タンパク質」または「ＣＲＦ２−１３−ｂｐ」を同定し、そしてＣＲＦ２−１３活性を調節し得る（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ、ら、１９９３．Ｃｅｌｌ ７２：２２３〜２３２；Ｍａｄｕｒａら、１９９３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６〜１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら、１９９３．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０〜９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、１９９３．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３〜１６９６；およびＢｒｅｎｔ ＷＯ ９４／１０３００を参照のこと）。そのようなＣＲＦ２−１３−結合タンパク質はまた、ＣＲＦ２−１３タンパク質によるシグナルの伝播（例えば、ＣＲＦ２−１３経路の上流エレメントまたは下流エレメント）に関与しそうである。
ツーハイブリッドシステムは、ほとんどの転写因子のモジュール特性（ｍｏｄｕｌａｒ ｎａｔｕｒｅ）に基づき、これは、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる。簡単には、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物において、ＣＲＦ２−１３をコードする遺伝子は、公知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他の構築物において、ＤＮＡ配列ライブラリーからの未同定タンパク質（「プレイ」（ｐｒｅｙ）または「サンプル」）コードするＤＮＡ配列は、公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイト」タンパク質および「プレイ」タンパク質がインビトロでのＣＲＦ２−１３依存性複合体の形成と相互作用し得る場合、転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、近位にする。この近位は、転写因子と応答する転写調節部位に作動可能に連結されるレセプター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を可能にする。レセプター遺伝子の発現は検出され得、そして機能的転写因子を含む細胞コロニーが単離され得、そしてＣＲＦ２−１３と相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得るために使用され得る。
さらに、本発明は、前述のスクリーニングアッセイによって同定された新規薬剤に関し、そして本明細書中で記載されるような処置のためのその使用に関する。
さらに、本発明は、以下の非限定的な実施例において示される。
（実施例１：開示されたＣＲＦ２−１３ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列改変体）
配列番号２のアミノ酸配列と一つのアミノ酸配列に関して異なるポリペプチド配列は、配列番号４に示される。改変体アミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されたポリペプチド配列において３０位のバリンは、配列番号４においてアラニンに置換される。
Figure 2005508640
 （実施例２：開示されたＣＲＦ２−１３ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列改変体）
配列番号２のアミノ酸配列と一つのアミノ酸配列に関して異なるポリペプチド配列は、配列番号５に示される。改変体アミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されたポリペプチド配列において３９位のロイシンは、配列番号５においてイソロイシンに置換される。
Figure 2005508640
 （実施例３：開示されたＣＲＦ２−１３ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列改変体）
配列番号２のアミノ酸配列と一つのアミノ酸配列に関して異なるポリペプチド配列は、配列番号６に示される。改変体アミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されたポリペプチド配列において４９位のアスパラギンは、配列番号６においてスレオニンに置換される。
Figure 2005508640
 （実施例４：開示されたＣＲＦ２−１３ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列改変体）
配列番号２のアミノ酸配列と一つのアミノ酸配列に関して異なるポリペプチド配列は、配列番号７に示される。改変体アミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されたポリペプチド配列において６５位のアルギニンは、配列番号７においてリジンに置換される。
Figure 2005508640
 （実施例５：開示されたＣＲＦ２−１３ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列改変体）
配列番号２のアミノ酸配列と一つのアミノ酸配列に関して異なるポリペプチド配列は、配列番号８に示される。改変体アミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されたポリペプチド配列において７８位のリジンは、配列番号８においてアルギニンに置換される。
Figure 2005508640
 （実施例６：開示されたＣＲＦ２−１３ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列改変体）
配列番号２のアミノ酸配列と一つのアミノ酸配列に関して異なるポリペプチド配列は、配列番号９に示される。改変体アミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されたポリペプチド配列において９０位のＱ（グルタミン？）は、配列番号９においてアスパラギンに置換される。
Figure 2005508640
 （実施例７：開示されたＣＲＦ２−１３ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列改変体）
配列番号２のアミノ酸配列と一つのアミノ酸配列に関して異なるポリペプチド配列は、配列番号１０に示される。改変体アミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されたポリペプチド配列において９９位のアルギニンは、配列番号１０においてリジンに置換される。
Figure 2005508640
 （実施例８：開示されたＣＲＦ２−１３ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列改変体）
配列番号２のアミノ酸配列と一つのアミノ酸配列に関して異なるポリペプチド配列は、配列番号１１に示される。改変体アミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されたポリペプチド配列において１１２位のバリンは、配列番号１１においてロイシンに置換される。
Figure 2005508640
 （実施例９：開示されたＣＲＦ２−１３ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列改変体）
配列番号２のアミノ酸配列と一つのアミノ酸配列に関して異なるポリペプチド配列は、配列番号１２に示される。改変体アミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されたポリペプチド配列において１１９位のチロシンは、配列番号１２においてフェニルアラニンに置換される。
Figure 2005508640
 （実施例１０：開示されたＣＲＦ２−１３ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列改変体）
配列番号２のアミノ酸配列と一つのアミノ酸配列に関して異なるポリペプチド配列は、配列番号１３に示される。改変体アミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されたポリペプチド配列において１２９位のバリンは、配列番号１３においてイソロイシンに置換される。
Figure 2005508640
 （実施例１１：開示されたＣＲＦ２−１３ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列改変体）
配列番号２のアミノ酸配列と一つのアミノ酸配列に関して異なるポリペプチド配列は、配列番号１４に示される。改変体アミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されたポリペプチド配列において１４４位のスレオニンは、配列番号１４においてアスパラギンに置換される。
Figure 2005508640
 （実施例１２：開示されたＣＲＦ２−１３ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列改変体）
配列番号２のアミノ酸配列と一つのアミノ酸配列に関して異なるポリペプチド配列は、配列番号１５に示される。改変体アミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されたポリペプチド配列において１５４位のロイシンは、配列番号１５においてアラニンに置換される。
Figure 2005508640
 （実施例１３：開示されたＣＲＦ２−１３ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列改変体）
配列番号２のアミノ酸配列と一つのアミノ酸配列に関して異なるポリペプチド配列は、配列番号１６に示される。改変体アミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されたポリペプチド配列において１７０位のリジンは、配列番号１６においてアルギニンに置換される。
Figure 2005508640
 （実施例１４：開示されたＣＲＦ２−１３ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列改変体）
配列番号２のアミノ酸配列と一つのアミノ酸配列に関して異なるポリペプチド配列は、配列番号１７に示される。改変体アミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されたポリペプチド配列において１７５位のバリンは、配列番号１７においてロイシンに置換される。
Figure 2005508640
 （実施例１５：開示されたＣＲＦ２−１３ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列改変体）
配列番号２のアミノ酸配列と一つのアミノ酸配列に関して異なるポリペプチド配列は、配列番号１８に示される。改変体アミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されたポリペプチド配列において１８９位のアラニンは、配列番号１８においてバリンに置換される。
Figure 2005508640
 （実施例１６：開示されたＣＲＦ２−１３ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列改変体）
配列番号２のアミノ酸配列と一つのアミノ酸配列に関して異なるポリペプチド配列は、配列番号１９に示される。改変体アミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されたポリペプチド配列において１９９位のアルギニンは、配列番号１９においてリジンに置換される。
Figure 2005508640
 （実施例１７：開示されたＣＲＦ２−１３ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列改変体）
配列番号２のアミノ酸配列と一つのアミノ酸配列に関して異なるポリペプチド配列は、配列番号２０に示される。改変体アミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されたポリペプチド配列において２１２位のフェニルアラニンは、配列番号２０においてトリプトファンに置換される。
Figure 2005508640
 （実施例１８：開示されたＣＲＦ２−１３ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列改変体）
配列番号２のアミノ酸配列と一つのアミノ酸配列に関して異なるポリペプチド配列は、配列番号２１に示される。改変体アミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されたポリペプチド配列において２３０位のアルギニンは、配列番号２１においてリジンに置換される。
Figure 2005508640
 （実施例１９：ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーにおけるＣＲＦ２−１３配列の同定）
表１のヌクレオチドＸＸ〜ＸＸ（配列番号１の４１〜３５２）に対応する３１０ヌクレオチドフラグメントを、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＩＩ ＰＣＲキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ,Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ,ＣＡ,ＵＳＡ）およびヒトＣＲＦ２−１３の５’領域に特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ,Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ,ＣＡ,ＵＳＡ）で同定した。プライマーは、Ａｘ５−１（ＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＧＧＣＣＣＣＧ；配列番号２３）およびＡｘ３−１（ＣＣＡＧＧＴＡＴＴＣＧＧＡＣＴＣＣＡＣＣＣＡＧＧＧＧＧＡＣ；配列番号２４）を含んだ。プライマーを、ＰＣＲの３８の熱サイクルのために使用した。ＣＲＦ２−１３核酸産物をゲルで精製し、配列決定した。この配列は、表１に開示されたＣＲＦ２−１３配列に対応する配列に相当する。
これらの発見に基づいて、Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｃｅｎｔａ Ｓｕｂ−Ｐｌａｔｅ ２Ｈ（Ｏｒｉｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ.，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）のＲａｐｉｄ−ＳｃｒｅｅｎＴＭ Ａｒｒａｙｅｄ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐａｎｅｌを、成熟タンパク質（配列番号１の１１−１５６３）をコードするＣＦＲ２−１３クローンのスクリーニングおよび単離のために選択した。配列番号１の最初の１０塩基の存在を、ＰＣＲにより確かめた。ライブラリー精度は、異なるサイズ分画の二重鎖ｃＤＮＡをまず単離し、次いで、ベクターにそれらを別々に連結することにより改善した。ｃＤＮＡライブラリーを、９６ウェルプレートでアレイする。
Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｃｅｎｔａ Ｓｕｂ−Ｐｌａｔｅ ２Ｈヒト胎盤ライブラリーのｃＤＮＡは、ＣＭＶ発現ベクターｐＣＭＶ６−ＸＬ４に指向的にクローン化されたので、ベクター由来の５’ＰＣＲプライマーを、ＣＲＦ２−１３クローンを同定するために、遺伝子特異的３’逆プライマーを用いる結合に使用した。本試験において、ｃＤＮＡライブラリーを、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＩＩ ＰＣＲキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＰＣＲプライマーとしてＡｘ５−１（配列番号２３）およびＡｘ３−２（ＴＴＧＧＴＴＣＣＣＧＣＡＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＣＴＴＣＧ；配列番号２６）を用いて、ＰＣＲベースの手順により、スクリーンした。ＰＣＲ分析を、５０クローン／ウェルでアレイされた９６ウェルで実施した。ＰＣＲポジティブウェル（Ｅ２）を同定し、その後そのウェルからのＥ．ｃｏｌｉ細胞を希釈し、プレートを外に出し（ｐｌａｔｅｄ ｏｕｔ）、クローン全長ＣＲＦ２−１３クローンの産生を分析した。次いで、ＣＲＦ２−１３クローンの同定を配列分析により確認した。
（他の実施形態）
本発明は、その詳細な説明に関連して記載されているが、前述の説明は例示を意図し、発明の範囲（添付の特許請求の範囲により規定される）に限定することを意図しない。他の局面、利点、改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
図１は、本発明によるＣＲＦ２−１３ポリペプチドに関連するポリペプチド配列を示す系統樹である。 図１は、本発明によるＣＲＦ２−１３ポリペプチドに関連するポリペプチド配列を示す系統樹である。 図１は、本発明によるＣＲＦ２−１３ポリペプチドに関連するポリペプチド配列を示す系統樹である。

Claims (115)

  1. 配列番号２のアミノ酸２１〜５２０と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
  2. 請求項１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  3. 請求項２に記載のベクターを含む、細胞。
  4. 請求項１に記載の核酸分子および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
  5. 配列番号２のアミノ酸２１〜５２０と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
  6. 配列番号２のアミノ酸２１〜５２０と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
  7. 配列番号２のアミノ酸２１〜５２０と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
  8. 配列番号２のアミノ酸２１〜５２０と少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
  9. 請求項８に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、配列番号２のアミノ酸２１〜５２０のアミノ酸配列に関して１つ以上の置換を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、核酸分子。
  10. 請求項９に記載の核酸分子であって、ここで、該分子が、ストリンジェント条件下で配列番号１を含む核酸分子に相補的な核酸配列とハイブリダイズする、核酸分子。
  11. 請求項９に記載の核酸分子であって、ここで、前記コードされたポリペプチドが、ポリペプチドリガンドに特異的に結合する、核酸分子。
  12. 配列番号２のアミノ酸２１〜５２０を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
  13. 請求項１２に記載の核酸分子であって、ここで、前記コードされたポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸１〜５２０からなる、核酸分子。
  14. 請求項１２に記載の核酸分子であって、ここで、前記単離された核酸分子が、配列番号１のヌクレオチド１〜１５６３を含む、核酸分子。
  15. 請求項１２に記載の核酸分子であって、ここで、前記コードされたポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸１〜５２０を含む、核酸分子。
  16. 請求項１２に記載の核酸分子および薬学的に受容可能なキャリアを含む、ベクター。
  17. 請求項１６に記載のベクターを含む、細胞。
  18. 少なくとも４９９個のアミノ酸のポリペプチドをコードする単離された核酸であって、ここで該核酸が、高ストリンジェンシー条件下で配列番号１とハイブリダイズする、核酸。
  19. 少なくとも４９９個のアミノ酸のポリペプチドをコードする単離された核酸であって、ここで該核酸が、中程度のストリンジェンシー条件下で配列番号１とハイブリダイズする、核酸。
  20. 少なくとも４９９個のアミノ酸のポリペプチドをコードする単離された核酸であって、ここで該核酸が、低ストリンジェンシー条件下で配列番号１とハイブリダイズする、核酸。
  21. 配列番号２のアミノ酸２１〜５２０のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を含む、実質的に精製されたポリペプチド。
  22. 請求項２０に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
  23. 配列番号２のアミノ酸２１〜５２０のアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、実質的に精製されたポリペプチド。
  24. 配列番号２のアミノ酸２１〜５２０のアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含む、実質的に精製されたポリペプチド。
  25. 請求項２４に記載の実質的に精製されたポリペプチドであり、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２１〜５２０とは１つ以上の置換によって異なる、ポリペプチド。
  26. 配列番号２のアミノ酸２１〜５２０を含む、実質的に精製されたポリペプチド。
  27. 請求項２６に記載の実質的に精製されたポリペプチドであり、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  28. 請求項２６に記載の実質的に精製されたポリペプチドであり、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２１〜５２０からなる、ポリペプチド。
  29. 請求項２６に記載の実質的に精製されたポリペプチドであり、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
  30. 配列番号２のアミノ酸２１〜２３０と少なくとも８５％相同な、ポリペプチド。
  31. 請求項３０に記載のポリペプチドであり、ここで該ポリペプチドが、ポリペプチドリガンドに特異的に結合する、ポリペプチド。
  32. 配列番号２のアミノ酸２１〜２３０と少なくとも９５％相同な、ポリペプチド。
  33. 配列番号２のアミノ酸２１〜２３０と少なくとも９８％相同な、ポリペプチド。
  34. 配列番号２のアミノ酸２１〜２３０と少なくとも９９％相同な、ポリペプチド。
  35. 請求項３４に記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２１〜２３０とは１つ以上の置換によって異なる、ポリペプチド。
  36. 配列番号２のアミノ酸２１〜２３０含む、実質的に精製されたポリペプチド。
  37. 請求項２６に記載のポリペプチドであって、ここで前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２１〜２３０からなる、ポリペプチド。
  38. 非ＣＲＦ２−１３ポリペプチドと作動可能に連結された、請求項１８に記載のポリペプチドを含む、融合ペプチド。
  39. 請求項３８に記載の融合ポリペプチドであって、ここで前記非ＣＲＦ２−１３ポリペプチドが、免疫グロブリン分子のＦｃ領域またはＦＬＡＧエピトープ、ＨＩＳタグ、およびＭＹＣタグからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む、融合ポリペプチド。
  40. 請求項２６に記載の融合ポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
  41. 非ＣＲＦ２−１３ポリペプチドと作動可能に連結された、請求項２６に記載のポリペプチドを含む融合ペプチド。
  42. 請求項４１に記載の融合ポリペプチドであって、ここで前記非ＣＲＦ２−１３ポリペプチドが、免疫グロブリン分子のＦｃ領域またはＦＬＡＧエピトープ、ＨＩＳタグ、およびＭＹＣタグからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む、融合ポリペプチド。
  43. 請求項４１に記載の融合ポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
  44. 非ＣＲＦ２−１３ポリペプチドと作動可能に連結された、請求項３０に記載のポリペプチドを含む、融合ペプチド。
  45. 請求項４４に記載の融合ポリペプチドであって、ここで前記非ＣＲＦ２−１３ポリペプチドが、免疫グロブリン分子のＦｃ領域またはＦＬＡＧエピトープ、ＨＩＳタグ、およびＭＹＣタグからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む、融合ポリペプチド。
  46. 請求項４４に記載の融合ポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
  47. 非ＣＲＦ２−１３ポリペプチドと作動可能に連結された、請求項３６に記載のポリペプチドを含む、融合ペプチド。
  48. 請求項４７に記載の融合ポリペプチドであって、ここで前記非ＣＲＦ２−１３ポリペプチドが、免疫グロブリン分子のＦｃ領域またはＦＬＡＧエピトープ、ＨＩＳタグ、およびＭＹＣタグからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む、融合ポリペプチド。
  49. 請求項４７に記載の融合ポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
  50. 請求項１に記載のポリペプチド、請求項２６に記載のポリペプチド、請求項２６に記載のポリペプチド、請求項３０に記載のポリペプチド、請求項３６に記載のポリペプチド、請求項３８に記載の融合ポリペプチド、請求項４１に記載の融合ポリペプチド、請求項４４に記載の融合ポリペプチド、または請求項４７に記載の融合ポリペプチドと選択的に結合する、抗体。
  51. 請求項５０に記載の抗体であって、ここで該抗体が、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドのＣＲＦ２−１３リガンドへの結合を中和する、抗体。
  52. 請求項５０に記載の抗体であって、ここで該抗体がポリクローナル抗体である、抗体。
  53. 請求項５０に記載の抗体であって、ここで該抗体がモノクローナル抗体である、抗体。
  54. 請求項５３に記載のモノクローナル抗体であって、ここで該モノクローナル抗体が、マウスモノクローナル抗体、およびヒト化モノクローナル抗体からなる群から選択される、モノクローナル抗体。
  55. 請求項５４に記載のモノクローナル抗体であって、ここで該モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である、モノクローナル抗体。
  56. １つ以上の容器中にＣＲＦ２−１３核酸、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドおよびＣＲＦ２−１３ポリペプチドに対する抗体からなる群から選択される化合物を含む、キット。
  57. 請求項５６に記載のキットであり、ここで前記化合物が薬学的に受容可能なキャリアとともに存在する、キット。
  58. ＣＲＦ２−１３ポリペプチドを産生する方法であって、該方法が、請求項１に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下で、該核酸分子を含む細胞を培養する工程を包含する、方法。
  59. ＣＲＦ２−１３ポリペプチドを産生する方法であって、該方法が、請求項１２に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下で、該核酸分子を含む細胞を培養する工程を包含する、方法。
  60. 生物学的サンプルにおいてＣＲＦ２−１３核酸分子の存在を検出する方法であって、該方法は、以下：
    該サンプルと核酸プローブとを接触させる工程；および
    存在するならば、結合プローブを同定して、
    それにより、該サンプルにおけるＣＲＦ２−１３核酸分子の存在を検出する工程、
    を包含する、方法。
  61. 請求項６０に記載の方法であって、ここで前記ＣＲＦ２−１３核酸分子が、以下のプライマー：
    Figure 2005508640
     を使用するＰＣＲ反応において検出される、方法。
  62. サンプルにおけるＣＲＦ２−１３ポリペプチドの存在を検出する方法であり、該方法は、以下：
    該ポリペプチドと該化合物との間での複合体形成を可能にする条件下で、該サンプルと該ポリペプチドに特異的に結合する化合物とを接触させる工程；および
    存在するならば、該複合体を検出して、それにより該サンプルにおける該ポリペプチドを同定する工程、
    を包含する、方法。
  63. ＣＲＦ２−１３ポリペプチドの活性を調節する方法であって、該方法は、該ポリペプチドの活性を調節するために十分な量で、該ポリペプチドを含む細胞サンプルと、該ポリペプチドに結合する化合物とを接触させる工程を包含する、方法。
  64. 請求項６３に記載の方法であって、ここで前記化合物が可溶性ＣＲＦ２−１３ポリペプチドインヒビターである、方法。
  65. 請求項６４に記載の方法であって、ここで前記可溶性ＣＲＦ２−１３インヒビターが、配列番号２のアミノ酸２１−２６０と少なくとも８５％相同であるポリペプチドを含む、方法。
  66. サイトカイン媒介性免疫障害に対する活性または潜伏もしくは素因のモジュレーターをスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下：
    試験化合物とＣＲＦ２−１３ポリペプチドとを接触させる工程；および
    該試験化合物が該ＣＲＦ２−１３ポリペプチドに結合するか否かを決定する工程であって、
    ここで該試験化合物の該ポリペプチドへの結合が、該試験化合物がサイトカイン媒介性免疫障害に対する活性または潜伏もしくは素因のモジュレーターであることを示す、工程
    を包含する、方法。
  67. サイトカイン媒介性免疫障害に対する活性または潜伏もしくは素因のモジュレーターをスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下：
    該免疫疾患に罹患するか、またはその危険が増加している試験動物に試験化合物を投与する工程であって、ここで該試験動物がＣＲＦ２−１３を組換え的に発現する、工程；
    該試験動物における該ポリペプチドの活性の発現を測定する工程；
    該ポリペプチドを組換え的に発現し、かつ該免疫疾患の危険性が増加していないコントロール動物における該ポリペプチドの活性を測定する工程；および
    該試験動物における該ポリペプチドの発現と該コントロール動物における該ポリペプチドの発現とを比較する工程、
    を包含し、ここで該コントロール動物に対する該試験動物における該ポリペプチドの活性の変化が、試験化合物が該免疫疾患の潜伏のモジュレーターであることを示し、そして該サイトカイン媒介性免疫障害が、自己免疫障害、Ｔリンパ球関連障害、細胞増殖障害、細胞分化障害、および免疫不全障害からなる群から選択される、方法。
  68. ＣＲＦ２−１３ポリペプチドの変化したレベルに関連する疾患の存在またはそれに対する素因を決定する方法であって、該方法は、以下；
    ａ）前記被験体由来のサンプルにおける該ポリペプチドの量を測定する工程；
    ｂ）工程（ａ）におけるポリペプチドの量とコントロールサンプルに存在するポリペプチドの量とを比較する工程、
    を包含し、ここで、該コントロールサンプルにおける該ポリペプチドのレベルと比較して、工程（ａ）における該ポリペプチドのレベルにおける変化が、該被験体における疾患の存在またはそれに対する素因を示す、方法。
  69. 請求項６８に記載の方法であって、ここで前記被験体がヒトである、方法。
  70. ＣＲＦ２−１３核酸分子の変化したレベルに関連する疾患の存在またはそれに対する素因を決定する方法であって、該方法は、以下；
    ａ）前記被験体由来のサンプルにおける核酸の量を測定する工程；ならびに
    ｂ）工程（ａ）における該核酸の量とコントロールサンプルに存在する該核酸の量とを比較する工程、
    を包含し、ここで、該コントロールサンプルにおける該核酸のレベルと比較して、工程（ａ）における該核酸のレベルにおける変化が、該被験体における疾患の存在またはそれに対する素因を示す、方法。
  71. 請求項７０に記載の方法であって、ここで、前記被験体がヒトである、方法。
  72. サイトカイン媒介性障害と関連する病理学的状態を処置または予防する方法であって、該方法は、該被験体における病理学的状態を軽減または予防するために十分な量で、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドの細胞外アミノ酸配列を含むポリペプチドのレベルを増加させる薬剤を被験体に投与する工程を包含する、方法。
  73. 請求項７２に記載の方法であって、ここで、前記被験体がヒトである、方法。
  74. 請求項７２に記載の方法であって、ここで、前記薬剤が、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドの細胞外アミノ酸配列を含むポリペプチドである、方法。
  75. 請求項７４に記載の方法であって、ここで、前記ポリペプチドが、非ＣＲＦ２−１３ポリペプチドに融合されたＣＲＦ２−１３ポリペプチドの細胞外アミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである、方法。
  76. 請求項７２に記載の方法であって、ここで、前記薬剤が、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドの細胞外アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸である、方法。
  77. 病理学的状態を処置または予防する方法であって、該方法は、該病理学的状態を軽減または予防するために十分な量で、ＣＲＦ２−１３ポリペプチドに特異的に結合する抗体を投与する工程を包含する、方法。
  78. 請求項７７に記載の方法であって、ここで、前記被験体がヒトである、方法。
  79. 被験体における慢性関節リウマチを処置する方法であって、該方法は、該被験体におけるＣＲＦ２−１３ポリペプチドの量を調節する薬剤を被験体に投与する工程を包含する、方法。
  80. 請求項７９に記載の方法であって、ここで、前記被験体がヒトである、方法。
  81. 請求項７９に記載の方法であって、ここで、前記薬剤がＣＲＦ２−１３核酸またはポリペプチドである、方法。
  82. 請求項７９に記載の方法であって、ここで、前記薬剤が、前記被験体における前記ＣＲＦ２−１３ポリペプチドの量を増加させる、方法。
  83. 請求項７９に記載の方法であって、ここで、前記薬剤が、前記被験体における前記ＣＲＦ２−１３ポリペプチドの量を減少させる、方法。
  84. 請求項７９に記載の方法であって、ここで、前記薬剤が抗ＣＲＦ２−１３抗体である、方法。
  85. 被験体における多発性硬化症を処置する方法であって、該被験体におけるＣＲＦ２−１３ポリペプチドの量を調節する薬剤を該被験体に投与する工程を包含する方法。
  86. 脈管平滑筋細胞増殖を調節する方法であって、該方法は、脈管平滑筋細胞と、該細胞におけるＣＲＦ２−１３ポリペプチドの量を調節する薬剤とを接触させる工程を包含する、方法。
  87. 被験体における炎症を処置または予防する方法であって、該方法は、該被験体におけるＣＲＦ２−１３ポリペプチドの量を調節する薬剤を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
  88. 配列番号３のヌクレオチド３０９５７からヌクレオチド３０９６７の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドであって、ただし、該ポリヌクレオチドの３０９６２位が、「Ａ」または「Ｇ」である、ポリヌクレオチド。
  89. 請求項８８に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、前記配列の３０９６２位が「Ａ」である、ポリヌクレオチド。
  90. 請求項８８に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、前記配列の３０９６２位が「Ｇ」である、ポリヌクレオチド。
  91. 請求項８８に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドが、配列番号３の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド。
  92. 請求項８８に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドが、配列番号３の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド。
  93. 請求項８８に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドが、約１０ヌクレオチド長と約１００ヌクレオチド長との間である、ポリヌクレオチド。
  94. 請求項８８に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチド配列が、約１０ヌクレオチド長と約９０ヌクレオチド長との間である、ポリヌクレオチド。
  95. 請求項８８に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドが、約１０ヌクレオチド長と約７５ヌクレオチド長との間である、ポリヌクレオチド。
  96. 請求項８８に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドが、約１０塩基長と約５０塩基長との間である、ポリヌクレオチド。
  97. 請求項８８に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドが、約１０塩基長と約４０塩基長との間である、ポリヌクレオチド。
  98. 配列番号３のヌクレオチド３０６５０からヌクレオチド３０６６０の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドであって、ただし、該ポリヌクレオチドの３０６５５位が、「Ａ」または「Ｇ」である、ポリヌクレオチド。
  99. 請求項９８に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、前記配列の３０６６５位が「Ａ」である、ポリヌクレオチド。
  100. 請求項９８に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、前記配列の３０６６５位が「Ｇ」である、ポリヌクレオチド。
  101. 配列番号３のヌクレオチド２８７３９からヌクレオチド２８７４９の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドの２８７４４位が「Ａ」または「Ｇ」である、ポリヌクレオチド。
  102. 請求項１０１に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、前記配列の２８７４４位が「Ａ」である、ポリヌクレオチド。
  103. 請求項１０１に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、前記配列の２８７４４位が「Ｇ」である、ポリヌクレオチド。
  104. 配列番号３のヌクレオチド２８４４２から２８４５２の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドの２８４４８位が「Ｃ」または「Ｔ」である、ポリヌクレオチド。
  105. 請求項１０４に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドの２８４４８位が「Ｃ」である、ポリヌクレオチド。
  106. 請求項１０４に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドの２８４４８位が「Ｔ」である、ポリヌクレオチド。
  107. 配列番号３のヌクレオチド９４２１から９４３１の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドの９４２６位が「Ａ」または「Ｇ」である、ポリヌクレオチド。
  108. 請求項１０７に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドの９４２６位が「Ａ」である、ポリヌクレオチド。
  109. 請求項１０７に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドの９４２６位が「Ｇ」である、ポリヌクレオチド。
  110. 配列番号３のヌクレオチド９１５７から９１６７の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドの９１６２位が「Ａ」または「Ｇ」である、ポリヌクレオチド。
  111. 請求項１１０に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドの９１６２位が「Ａ」である、ポリヌクレオチド。
  112. 請求項１１０に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドの９１６２位が「Ｔ」である、ポリヌクレオチド。
  113. 配列番号３のヌクレオチド８８０６から８８１６の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドの８８１１位が「Ｃ」または「Ｔ」である、ポリヌクレオチド。
  114. 請求項１１３に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドの８８１１位が「Ｃ」である、ポリヌクレオチド。
  115. 請求項１１３に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドの８８１１位が「Ｔ」である、ポリヌクレオチド。
JP2003542592A 2001-11-09 2002-11-12 ２型サイトカインレセプターおよびそれをコードする核酸 Pending JP2005508640A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33236601P 2001-11-09 2001-11-09
PCT/US2002/036316 WO2003040345A2 (en) 2001-11-09 2002-11-12 Type 2 cytokine receptor and nucleic acids encoding same

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008213346A Division JP2009060899A (ja) 2001-11-09 2008-08-21 ２型サイトカインレセプターおよびそれをコードする核酸

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2005508640A true JP2005508640A (ja) 2005-04-07

Family

ID=23297911

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003542592A Pending JP2005508640A (ja) 2001-11-09 2002-11-12 ２型サイトカインレセプターおよびそれをコードする核酸
JP2008213346A Withdrawn JP2009060899A (ja) 2001-11-09 2008-08-21 ２型サイトカインレセプターおよびそれをコードする核酸

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008213346A Withdrawn JP2009060899A (ja) 2001-11-09 2008-08-21 ２型サイトカインレセプターおよびそれをコードする核酸

Country Status (8)

Country Link
US (2) US20030180752A1 (ja)
EP (1) EP1451307A4 (ja)
JP (2) JP2005508640A (ja)
AU (2) AU2002343671B2 (ja)
CA (1) CA2464765A1 (ja)
TW (1) TW200300170A (ja)
WO (1) WO2003040345A2 (ja)
ZA (1) ZA200403284B (ja)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004532611A (ja) * 2000-11-28 2004-10-28 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド サイトカイン受容体ｚｃｙｔｏｒ１９
US7033787B2 (en) * 2001-12-21 2006-04-25 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated cytokine receptor LICR-2
JP4409962B2 (ja) * 2002-04-19 2010-02-03 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド サイトカイン受容体
CN1910200A (zh) 2003-08-07 2007-02-07 津莫吉尼蒂克斯公司 Il－28和il－29的均一化制剂
EP1793845A2 (en) 2004-07-29 2007-06-13 ZymoGenetics, Inc. Use of il-28 and il-29 to treat cancer

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5080891A (en) * 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5945511A (en) * 1997-02-20 1999-08-31 Zymogenetics, Inc. Class II cytokine receptor
US5965704A (en) * 1997-08-05 1999-10-12 Zymogenetics, Inc. Class two cytokine receptor-11
US6725560B2 (en) * 2000-07-25 2004-04-27 Braden L. Smith Releasable marking attachment for tape measure
JP2004532611A (ja) * 2000-11-28 2004-10-28 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド サイトカイン受容体ｚｃｙｔｏｒ１９
JP4409962B2 (ja) * 2002-04-19 2010-02-03 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド サイトカイン受容体

Also Published As

Publication number Publication date
AU2002343671B2 (en) 2009-02-19
TW200300170A (en) 2003-05-16
EP1451307A4 (en) 2008-07-09
EP1451307A2 (en) 2004-09-01
AU2009200390A1 (en) 2009-02-19
WO2003040345A2 (en) 2003-05-15
US20030180752A1 (en) 2003-09-25
JP2009060899A (ja) 2009-03-26
CA2464765A1 (en) 2003-05-15
WO2003040345A3 (en) 2004-04-22
ZA200403284B (en) 2005-05-27
US20090232809A1 (en) 2009-09-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20070196370A1 (en) Type 2 cytokine receptor and nucleic acids encoding same
US6858427B2 (en) Sphingosine kinases
AU2001238283A1 (en) Sphingosine kinases
AU2002249948A1 (en) Type 2 cytokine receptor and nucleic acids encoding same
WO2001049729A2 (en) Novex polypeptides, nucleic acids encoding same and their diagnostic and therapeutic use
JP2009060899A (ja) ２型サイトカインレセプターおよびそれをコードする核酸
JP2006501813A (ja) 治療ポリペプチド、それをコードする核酸、および使用方法
US20040147003A1 (en) Novel polypeptides and nucleic acids encoding same
WO2001027156A1 (en) Interleukin-2 like protein and nucleic acids encoding same
WO2001032874A2 (en) Polypeptides and nucleic acids encoding same
US20020151692A1 (en) Novel polypeptides and nucleic acids encoding same
JP2005528434A (ja) セマフォリン様タンパク質およびその使用方法
US20030073823A1 (en) Novel transcription factor-like protein and nucleic acids encoding same
US20020132317A1 (en) Novel interferon-induced tetraspan protein and nucleic acids encoding same
US20030017585A1 (en) Novel sodium/solute symporter-like protein and nucleic acids encoding same
WO2001051632A9 (en) Odorant receptor polypeptides and nucleic acids encoding same
WO2002036632A2 (en) Single nucleotide polymorphisms in nucleic acids encoding human olfactory receptor-like polypeptides
AU1616801A (en) Novel polypeptides and nucleic acids encoding same
JP2003525610A (ja) 熱応答に関連する遺伝子ｇ１２ｌ
WO2001018208A2 (en) Interferon induced polynucleotides and proteins encoded thereby
JP2006515753A (ja) 治療ポリペプチド、それをコードする核酸、および使用方法
WO2001057087A2 (en) High affinity immunoglobulin epsilon receptor beta-subunit-like protein and nucleic acids encoding same
EP1586643A2 (en) Polypeptides and nucleic acids encoding same
JP2006511237A (ja) タンパク質の活性を調節する化合物の同定方法

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20051107

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080221

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20080519

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20080526

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20080619

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20080626

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20080718

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20080728

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080821

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20081114

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090212