JP2006515753A - 治療ポリペプチド、それをコードする核酸、および使用方法 - Google Patents

治療ポリペプチド、それをコードする核酸、および使用方法 Download PDF

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Abstract

新規ポリペプチドをコードする核酸配列が本明細書において開示される。該核酸配列によりコードされるポリペプチド、および該ポリペプチドと免疫特異的に結合する抗体、ならびに新規ポリペプチドの誘導体、変異体、突然変異体、またはフラグメント、ポリヌクレオチド、または該ポリペプチドと特異的な抗体も開示される。ベクター、宿主細胞、抗体、およびポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産生する組換え方法、ならびにその使用方法も含まれる。本発明は、該新規ヒト核酸およびタンパク質のいずれか１つと関与する疾患の診断、処置、および予防のための治療方法、診断方法、および研究方法をさらに開示する。

Description

発明の詳細な説明
（技術分野）
本発明は、細胞、組織、器官または生物の生化学的または生理学的応答の刺激に関する特性を有する新規ポリペプチド、およびそれをコードする核酸に関する。より具体的には、新規ポリペプチドは、新規遺伝子の遺伝子産物であり、またはその特異的生物学的活性フラグメントまたは誘導体である。使用の方法は、診断および予後アッセイ手法並びに広範な病理学的状態を処置する方法を包含する。
（背景技術）
真核細胞は、通常の条件下では細胞の維持および増殖を達成するために精妙にバランスを受けている、生化学的および生理学的方法を特色とする。そのような細胞が脊椎動物のような多細胞生物、またはさらに特別には哺乳類のような生物の構成要素であるとき、生化学的および生理学的方法の調節には精緻な情報伝達経路を伴う。しばしば、そのような情報伝達経路は、細胞外の情報伝達タンパク質、情報伝達タンパク質に結合する細胞性受容体、および細胞内に局在する情報伝達構成要素に関与する。
情報伝達タンパク質は、内分泌性エフェクター、パラクリンエフェクターまたはオートクリンエフェクターに分類され得る。内分泌性エフェクターは特定の器官により循環系中に分泌される情報伝達分子であり、これは次いで遠隔の標的器官または標的組織へと輸送される。標的細胞は内分泌性エフェクターの受容体を含み、内分泌性エフェクターが結合すると情報伝達カスケードが誘導される。パラクリンエフェクターには、互いに近傍にある分泌細胞と受容細胞、例えば同じ組織または器官内の２つの異なるクラスの細胞が関与する。あるクラスの細胞がパラクリンエフェクターを分泌し、これが次いで、例えば細胞外液を介する拡散により、第２のクラスの細胞に到達する。第２のクラスの細胞はパラクリンエフェクターに対する受容体を含有しており、エフェクターの結合は情報伝達カスケードを誘導し、これが対応する生化学的または生理学的作用を誘起する。オートクリンエフェクターは、オートクリンエフェクターを分泌する同じタイプの細胞が受容体をも含有していること以外は、パラクリンエフェクターと高度の類似性を有している。かくして、オートクリンエフェクターは、同じ細胞上でまた同じ近接する細胞上で受容体に結合する。次いで、結合過程は特色的な生化学的または生理学的作用をひき起こす。
情報伝達過程は細胞および組織に対し、これらに限定されない例として、細胞または組織の増殖の誘導、成長または増殖の抑制、細胞または組織の分化または成熟の誘導、および細胞または組織の分化または成熟の抑制を含む多様な影響をひき起こし得る。
多くの病理学的状態には、重要なエフェクタータンパク質の発現の調節不全が関与している。特定のクラスの病態においては、調節不全は、タンパク質エフェクターの合成および分泌の縮減または抑制レベルとして現れる。病理の他の種類では、非調節は、タンパク質エフェクターの合成および分泌の増加または上方調節レベルとして明示される。臨床現場において、対象が興味のあるタンパク質エフェクターレベルの増加または過多によりもたらされる異常に罹患していることを疑うことがある。それ故に、そのような対象由来の生物学的試料中の興味のあるタンパク質エフェクターのレベルをアッセイし、そしてそのレベルを非病態的状態に特色的なものと比較する必要がある。また、製造の産物としてタンパク質エフェクターを提供する必要性がある。その必要のある対象にエフェクターを投与することは、病理学的状態の処置に有用である。よって、興味あるタンパク質エフェクターの縮減または抑制レベルによってもたらされる病理学的状態の処置の方法のための必要性がある。さらに、興味の対象となるタンパク質エフェクターの増大または上方調節されたレベルにより引き起こされる病理学的状態の処置方法に対する必要性がある。
抗体は、特異的に特定の抗原に結合し、同種の抗原でない物質にはほとんど結合しないか、あるいは全く結合しない多鎖タンパク質である。抗体は軽鎖とよばれる２本の短い鎖および重鎖とよばれる２本の長い鎖を含む。これらの鎖は免疫グロブリンドメインを構成しており、それらのドメインは、一般的には、２つのクラスがある：それらは１本の鎖あたり１個の可変ドメイン、軽鎖中の１個の不変ドメイン、および重鎖中の３個またはそれ以上の不変ドメインである。免疫グロブリン分子の抗原特異的部分は可変ドメイン中にあり；１本の軽鎖および１本の重鎖の可変ドメインが互いに結合して抗原結合部分を形成する。免疫特異的に同属または標的抗原に結合する抗体は高いアフィニティーで結合する。したがって、試料中の抗原の存在に関して特異的にアッセイすることにおいてそれらは有用である。さらに、それらは抗原の活性を不活性化させる潜在能力を有する。
それゆえ、かかる対象からの生物学的試料中の興味の対象であるタンパク質エフェクターのレベルをアッセイし、このレベルを病理学的状態にないことを特徴とするレベルと比較する必要がある。特に、抗原に免疫特異的に結合する抗体を用いることに基づくかかるアッセイに対する必要性がある。さらに、病理学的状態が上昇したあるいは過剰なエフェクターのレベルから生じる場合において、エフェクターに免疫特異的に結合する抗体の使用に基づいてタンパク質エフェクターの活性を阻害する必要がある。よって、製造結果物としての抗体に対する必要性がある。さらに、抗体を対象に投与することに基づく、興味の対象であるタンパク質の上昇したあるいは過剰なレベルにより生じる病理学的状態の治療方法に対する必要性もある。
(発明の要約)
本発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟型から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドの発見に一部基づき、ここでｎは、１と３８の間の整数である。新規核酸及びポリペプチドは、ＮＯＶ１ａ、ＮＯＶ１ｂ、ＮＯＶ１ｂ、ＮＯＶ１ｃ、ＮＯＶ１ｄ、ＮＯＶ２ａ、ＮＯＶ２ｂ、ＮＯＶ２ｃ、ＮＯＶ２ｄ、ＮＯＶ３ａ、ＮＯＶ３ｂなどとして本明細書中にて言及する。これらの核酸及びポリペプチド並びにその誘導体、相同物、類似体およびフラグメントは、以後集合的に「ＮＯＶＸ」核酸またはポリペプチド配列として命名する。
発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟型の変異体に一部基づき、ここで２ｎは、１と３８の間の整数であり、ここで成熟型の任意のアミノ酸は、異なるアミノ酸に変化している。ただし、成熟型の配列中の１５％を超えないアミノ酸残基はそのように変化している。他の実施形態では、発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ここでｎは、１と３８の間である。他の実施形態では、発明はまた、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列の変異体を含み、ここでｎは、１と３８の間の整数であり、ここで選択された配列中に特定される任意のアミノ酸は、異なるアミノ酸に変化している。ただし、配列中の１５％を超えないアミノ酸残基が、そのように変化している。発明はまた、配列番号２ｎからなる群から選択されるアミノ酸配列の成熟型のいずれかのフラグメント、またはこの群から選択される任意の他のアミノ酸配列に関係し、ここでｎは１と３８の間の整数である。発明は、残基の１５％までが変化しているこれらの群からのフラグメントを含む。
他の実施形態では、発明は、配列番号２ｎからなる群より選択される配列の天然に存在する対立遺伝子変異体であるポリペプチドを含み、ここで、ｎは１と３８の間の整数である。これらの対立遺伝子変異体は、配列番号２ｎ−１からなる群より選択される核酸配列からの単一ヌクレオチドによって異なる核酸配列の翻訳物である、アミノ酸配列を含み、ここでｎは１と３８の間である。変異体ポリペプチドは、選択された配列で任意のアミノ酸が変化している場合、変化して保存置換を提供する。
他の実施形態では、発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ここでｎは１と３８の間の整数であり、および薬学的許容可能担体に関係する医薬組成物を含む。他の実施形態では、発明は、１または２以上の容器中にこの医薬組成物を含む、キットに関係する。
他の実施形態では、発明は、ヒト疾患に随伴する症候群を処置する医薬の製造における治療剤の用途を含み、該疾患は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと連関する病理から選択され、ここでｎは、１と３８の間での整数であり、ここで当該治療剤は、この群から選択されるポリペプチドである。
他の実施形態では、発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの存在または量を決定する方法を含み、ここでｎは１と３８の間の整数であり、該方法は、試料を提供すること；試料を、ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体に導入すること；およびポリペプチドに結合した抗体の存在または量を決定し、それによって試料中のポリペプチドの存在または量を決定することに関係する。
別の実施形態では、発明は、第一の哺乳類対象において、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの変化したレベルと連関する疾患の存在または素因を決定する方法を含み、ここでｎは１と３８の間の整数であり、該方法は、第一の哺乳類対象からの試料中のポリペプチドの発現のレベルを測定すること；およびこの試料中の該ポリペプチドの量を、該疾患を有しない、または素因がないと知られる第二の哺乳類対象からの対照試料中に存在する該ポリペプチドの量と比較することに関係し、ここで該対照試料と比較した場合の、該第一の対象のポリペプチドの発現レベルの変化は、該疾患の存在または素因を指摘する。
他の実施形態では、発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する薬剤を同定する方法に関係し、ここでｎは１と３８の間の整数であり、該方法は、該薬剤へ該ポリペプチドを導入すること；および該薬剤が該ポリペプチドに結合するか否か決定することを含む。該薬剤は、細胞性レセプターまたは下流エフェクターでありうる。
他の実施形態では、発明は、病理の処置における使用のための潜在的な治療剤を同定する方法に関係し、ここで該病理は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの異常発現または異常生理学的相互作用に関し、ここでｎは１と３８の間の整数であり、該方法は、発明のポリペプチドを発現するおよび該ポリペプチドに帰すべき特性または機能を有する細胞を提供する；該細胞を、候補物質を含む組成物と接触させる；および物質がポリペプチドに帰すべき特性または機能を変化させるか決定する；それによってもし物質の存在下観察される変化が、細胞を物質のない組成物と接触させたときに観察されないならば、該物質は、潜在的な治療剤として同定される。
他の実施形態では、発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに連関する病理の活性または潜在性のモジュレーターまたは素因についてのスクリーニング方法に関係し、ここでｎは１と３８の間の整数であり、該方法は、発明のポリペプチドと連関する病理の増加リスクのある被検動物へ試験化合物を投与すること、ここで該被検動物は、発明のポリペプチドを組み換え的に発現し；試験化合物を投与後の、被検動物におけるポリペプチドの活性を測定すること；および被検動物のタンパク質の活性を、ポリペプチドを投与してない対照動物のポリペプチドの活性と比較すること、ここで被検動物におけるポリペプチドの活性の、対照動物に対する変化は、発明のポリペプチドと連関する病理の潜在性のモジュレーターまたは素因であることを指摘する。組み換え体被検動物は、野生型被検動物に対する増加レベルの、タンパク質導入遺伝子またはプロモーターの制御下の導入遺伝子を発現しうる。
他の実施形態では、発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列のポリペプチドの活性を調節する方法に関し、ここでｎは１と３８の間の整数であり、該方法はポリペプチドの活性を調節するために十分な量の、ポリペプチドに結合する化合物と、該ポリペプチドを発現する細胞試料を導入することを含む。
他の実施形態では、発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと連関する病理を処置または予防する方法に関係し、ここでｎは１と３８の間の整数であり、該方法は、そのような処置または予防が、該対象の病理を処置または予防するため十分の量で望まれる対象に、ポリペプチドを投与することを含む。対象はヒトを包含しうる。
他の実施形態では、発明は、哺乳類の病理学的状態を処置する方法に関係し、該方法は、該病理学的状態を緩和するのに十分量のポリペプチドを哺乳類に投与することを含み、ここで該ポリペプチドは、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその生物学的活性フラグメントであり、ここでｎは、１と３８の間の整数である。
他の実施形態では、発明は、配列番号２ｎを与えられるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子、ここでｎは１と３８の間の整数である；配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟型の変異体、ここでｎは１と３８の間の整数であり、ここで選択された配列の成熟型中の任意のアミノ酸は、異なるアミノ酸に変化されている。ただし成熟型の配列中の１５％を超えないアミノ酸残基はそのように変化している；配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列、ここでｎは１と３８の間の整数である；配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列の変異体、ここでｎは１と３８の間の整数であり、ここに選択された配列中に特定される任意のアミノ酸は異なるアミノ酸に変化される。ただし配列中の１５％を超えないアミノ酸残基は、そのように変化している；配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸フラグメント、ここでｎは１と３８の間の整数であり、またはポリペプチドの任意の変異体であり、ここで選択の配列の任意のアミノ酸は、異なるアミノ酸に変化される。ただし、配列中の１０％を超えないアミノ酸残基は、そのように変化される；および核酸分子のいずれかの相補物に関係する。
他の実施形態では、発明は、配列番号２ｎを与えられるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を有する単離核酸分子を含み、ここでｎは１と３８の間の整数であり、ここで核酸分子は、天然に存在する対立遺伝子核酸変異体のヌクレオチド配列を含む。
他の実施形態では、発明は、配列番号２ｎを与えられるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子に関係し、ここでｎは１と３８の間の整数であり、それは変異体ポリペプチドをコードし、ここで該変異体ポリペプチドは、天然存在ポリペプチド変異体のポリペプチド配列を有する。
他の実施形態では、発明は、配列番号２ｎを与えられるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を有する単離核酸分子を含み、ここでｎは１と３８の間の整数であり、ここで核酸分子は、配列番号２ｎ−１からなる群より選択される核酸配列と単一ヌクレオチドによって相違し、ここでｎは１と３８の間の整数である。
他の実施形態では、発明は、配列番号２ｎを与えられるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を有する単離核酸分子を含み、ここでｎは１と３８の間の整数であり、ここで核酸分子は、配列番号２ｎ−１からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、ここでｎは１と３８の間の整数であり；ここでヌクレオチド配列中の１または２以上のヌクレオチドが配列番号２ｎ−１からなる群より選択される、ここでｎは１と３８の間の整数である、ヌクレオチド配列が、選択された配列からなる群より選択されるものから、異なるヌクレオチドに変化している。ただし１５％を超えないヌクレオチドがそのように変化する；配列番号２ｎ−１からなる群より選択される配列の核酸フラグメント、ここでｎは１と３８の間の整数である；およびここでヌクレオチド配列中の１または２以上のヌクレオチドが、配列番号２ｎ−１からなる群より選択される、ここでｎは１と３８の間の整数である、核酸フラグメントが、選択配列からなる群より選択されるものから、異なるヌクレオチドに変化している。ただし１５％を超えないヌクレオチドがそのように変化する。
他の実施形態では、発明は、配列番号２ｎを与えられるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を有する単離核酸分子を含み、ここでｎは１と３８の間の整数であり、ここで該核酸は、配列番号２ｎ−１からなる群より選択されるヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列の相補物に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ここでｎは１と３８の間の整数である。
他の実施形態では、発明は、配列番号２ｎを与えられるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を有する単離核酸分子を含み、ここでｎは１と３８の間の整数であり、ここで核酸分子はヌクレオチド配列を有し、ここに選択されたヌクレオチド配列のコーディング配列中に特定される任意のヌクレオチドは、選択配列からなる群より選択されるものから、異なるヌクレオチド（ただし、選択されたコーディング配列中の、１５％を超えないヌクレオチドは、そのように変化されている）、第一のポリヌクレオチドの相補物である単離された第二のポリヌクレオチド、またはそれらいずれかのフラグメントに変化される。
他の実施形態では、発明は、配列番号２ｎを与えられるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を有する核酸分子を含むベクターを含み、ここでｎは１と３８の間の整数である。このベクターは核酸分子に作動可能に連結されるプロモーターを有することができる。このベクターは、細胞内に位置することができる。
別の実施形態では、発明は、配列番号２ｎを与えられるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を有する核酸分子の存在または量を決定する方法に関係し、ここでｎは１と３８の間の整数であり、該方法は、試料を提供すること；試料を、核酸分子に結合するプローブに導入すること；および核酸分子に結合したプローブの存在または量を決定し、それによって試料中の核酸分子の存在または量を決定することを含む。核酸分子の存在または量を細胞または組織型のためのマーカーとして使用する。細胞型は、癌であってもよい。
別の実施形態では、発明は、第一の哺乳類対象において、配列番号２ｎを与えられるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を有する核酸分子の変化レベルと連関する疾患の存在または素因を決定する方法に関し、ここでｎは１と３８の間の整数であり、該方法は、第一の哺乳類対象由来の試料中の核酸の量を測定すること；および工程（ａ）の試料中の核酸の量を、疾患を有しないまたは素因がないと知られる第二の哺乳類対象由来の対照試料中に存在する核酸の量を比較することを含み；ここで対照試料と比較した場合の、第一の対象中に存在する核酸のレベルの変化は、疾患の存在または素因を指摘する。
本発明は、さらに、ＮＯＶＸポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体を提供する。ＮＯＶＸ抗体は、モノクローナル、ヒト化、もしくは完全なヒト抗体であってよい。好ましくは、抗体は、それに対するＮＯＶＸポリペプチドの結合に関して１ｘ１０−９Ｍ未満の解離定数を有する。より好ましくは、ＮＯＶＸ抗体はＮＯＶＸポリペプチドの活性を中和するものである。
さらなる態様において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドに関連したヒトの疾病に関連した症候群の処置にための医薬の製造における治療薬の使用を提供する。好ましくは、治療薬はＮＯＶＸ抗体である。
よりさらなる態様において、本発明は、対象に、疾患を処置または予防するのに十分な量のＮＯＶＸ抗体を投与することによる、ＮＯＶＸ関連疾患の処置または予防方法、哺乳類における病理状態の処置方法、およびポリペプチドに関連した病理の処置または予防方法を提供する。
特に規定されない限り、本明細書で使用する全ての技術的および科学的用語は本発明が属する技術分野に通常の技能を有する業者により普通に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で説明されるものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適当な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許申請、特許、および他の参考文献は全体的な出典明示により本明細書の一部とする。抵触がある場合には本明細書が、定義を含め優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示的なものであって限定することを意図しない。
本発明の他の特性および利点は以下の発明の詳細な説明および請求項より明らかであろう。
（発明の詳細な記載）
本発明は、新規ヌクレオチドおよびそれによりコードされたポリペプチドを提供する。本発明は、新規核酸配列、それらのコードされたポリペプチド、抗体、および他の関連化合物を含む。本明細書において、配列を「ＮＯＶＸ核酸」または「ＮＯＶＸポリヌクレオチド」と総称し、対応するコードされたポリペプチドを「ＮＯＶＸポリペプチド」または「ＮＯＶＸタンパク質」と称する。別段の記述がない限り、「ＮＯＶＸ」は本明細書に開示される任意の新規配列を指すことを意味する。表ＡにＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドの要約を示す。
表Ａ：配列および対応する配列番号
Figure 2006515753
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表ＡはＮＯＶＸポリペプチドの既知のタンパク質ファミリーとの相同性を示す。従って、表１の第１欄で特定されるＮＯＶＸに対応する本発明に従う核酸およりポリヌクレオチド、抗体および関連化合物は、例えば、表Ａの第５欄に特定される既知タンパク質ファミリーに関連する病変および疾患に関係する治療的応用および診断的応用において有用である。
ＮＯＶＸ配列と連関する病理、疾患、障害および状態などは、限定しないが、例えば以下のものを含む：心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心疾患、大動脈弁狭窄、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、血管石灰化、線維症、房室（Ａ−Ｖ）管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満、肥満に連関する代謝妨害、移植、骨関節症、リウマチ性関節炎、骨軟骨異形成症、副腎白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、前立腺癌、糖尿病、代謝障害、新生物；腺癌、リンパ腫、子宮癌、受胎能、糸球体腎炎、血友病、凝固性亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫不全、乾癬、皮膚疾患、移植片対宿主疾患、ＡＩＤＳ、気管支喘息、狼瘡、クローン病；炎症性腸疾患、潰瘍性疾患、多発性硬化症、Albright遺伝性骨ジストロフィー（Ostoeodystrophy）、感染性疾患、食欲不振、癌連関悪液質、癌、神経変性性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、および種々の異常脂血症、統合失調症、抑鬱、喘息、気腫、アレルギー、代謝症候群Ｘおよび慢性疾患および種々の癌、並びに状態例えば移植、神経保護、受胎能または再生（インビトロおよびインビボ）と連関する消耗性障害。
ＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドは種々の応用および状況において有用である。本発明による種々のＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドは、前記タンパク質とのドメインおよび配列関連性の存在に従うタンパク質ファミリーの新規メンバーとして有用である。加えて、ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを用いて、ＮＯＶＸポリペプチドが属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定し得る。
表Ａの第５欄で特定されるタンパク質ファミリーの他の既知のメンバーと一致して、本発明のＮＯＶＸポリペプチドは、そのようなタンパク質ファミリーの他のメンバーに相同性を示し、そしてそれらを特徴とするドメインを含有する。それぞれのＮＯＶＸについての配列関連性分析およびドメイン分析の詳細を実施例Ａに示す。
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを、ＮＯＶＸの活性または機能を阻害または促進する分子をスクリーニングするのに使用し得る。特に、本発明による核酸およびポリペプチドは、表Ａに掲げたタンパク質ファミリーと関連する疾患を調整または阻害する低分子の同定用の標的として使用され得る。
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドはまた、特定の細胞タイプを検出にも有用である。ＮＯＶＸそれぞれに対する発現分析の詳細を実施例Ｃに示す。従って、本発明に従うＮＯＶＸ核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、正常組織対疾患組織、例えば、種々の癌において異なる発現を有する種々の疾患の検出における診断的応用および治療的応用を有する。
本発明によるＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドのさらに別の利用法が本明細書に開示される。
ＮＯＶＸクローン
ＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドは、種々の応用および状況において有用である。本発明に従う種々のＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドは、上記該タンパク質と関連するドメインおよび配列の存在に従うタンパク質ファミリーの新規メンバーとして有用である。加えて、ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを、ＮＯＶＸポリペプチドが所属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定するために使用し得る。
ＮＯＶＸ遺伝子およびそれらの対応するコードされたタンパク質は、例えば、タンパク質治療または遺伝子治療により、医学的状態を予防、処置または緩和するのに有用である。病態を、試料中の新規タンパク質の量を測定または新規遺伝子中の変異の存在を測定することにより診断し得る。ＮＯＶＸ遺伝子が最も高発現する組織に基づいて、それぞれのＮＯＶＸ遺伝子に対する特異的な使用を説明する。使用は、種々の疾患および障害を診断または処置するための産物を開発することを含む。
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は、潜在的な診断応用および治療応用、および研究ツールとして有用である。これらは、特異的または選択的核酸、またはタンパク質、診断マーカーおよび／または予後マーカーとして役立つことを含む。ここで核酸またはタンパク質の存在または量、ならびに以下のような潜在的な治療応用を評価する：（ｉ）タンパク質治療薬、（ｉｉ）低分子薬の標的、（ｉｉｉ）抗体の標的（治療的、診断的、薬のターゲティング／細胞毒性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療（遺伝子デリバリー／遺伝子手術）に有用な核酸、および（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物、（ｖｉ）生物学的防衛兵器。
一つの特定の実施形態では、本発明は、(ａ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜３８の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型；(ｂ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜３８の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型の変異体、但し、成熟型中の任意のアミノ酸は、成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている；(ｃ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜３８の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列；(ｄ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜３８の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ変異体、但し、選択された配列で特定される任意のアミノ酸は、配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている；および（ｅ）（ａ）ないし（ｄ）のいずれかのフラグメント、からなる群から選択したアミノ酸配列を含有する単離ポリペプチドを含む。
もう一つの特別な実施形態では、本発明は、(ａ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜３８の整数である）を与えられたアミノ酸配列を持つ成熟型；(ｂ)配列番号２ｎ（ｎは１〜３８の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型の変異体であり、選択された配列の成熟型中の任意のアミノ酸が、成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている、変異体；(ｃ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜３８の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列；(ｄ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜３８の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列の変異体であり、選択された配列中の特定されるアミノ酸が、配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている、変異体；および(ｅ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜３８の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも一部分、または選択された配列の任意のアミノ酸が、配列においてアミノ酸残基の１０％未満が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている、ポリペプチドの任意の変異体をコードする核酸のフラグメント；および(ｆ) 核酸分子のいずれかの相補的分子、からなる群より選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子を含む。
なおもう一つの特別な実施形態では、本発明は単離核酸分子を含む。ここで該核酸分子は、(ａ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列；(ｂ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列中で一つまたはそれ以上のヌクレオチドが、選択された配列からなる群から選択されるものから、ヌクレオチドの１５％以下が変更を受けるという条件で異なるヌクレオチドに変更されているヌクレオチド配列；(ｃ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）からなる群から選択される配列を持つ核酸フラグメント；および(ｄ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列中で一つまたはそれ以上のヌクレオチドが、選択された配列からなる群から選択されるものから、ヌクレオチドの１５％以下が変更を受けるという条件で異なるヌクレオチドに変更されている核酸フラグメント、からなる群より選択したヌクレオチド配列を含む。
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド
本発明の一つの態様は、ＮＯＶＸポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性な部分をコードする単離核酸分子に関する。また、本発明は、ＮＯＶＸをコードする核酸(例えば、ＮＯＶＸのｍＲＮＡ)を同定するためのハイブリダーゼーションプローブとしての使用に十分な核酸フラグメント、およびＮＯＶＸ核酸分子の増幅および／または変異用のＰＣＲプライマーとしての使用のためのフラグメントを含む。本明細書において使用する用語「核酸分子」とは、ＤＮＡ分子(例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ)、ＲＮＡ分子(例えば、ｍＲＮＡ)、ヌクレオチド類似体を用いて生成されたＤＮＡ類似体またはＲＮＡ類似体、およびそれらの誘導体、フラグメントおよび相同体を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖でも二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
ＮＯＶＸ核酸は成熟ＮＯＶＸポリペプチドをコードし得る。本明細書において使用するように、本発明に開示するポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型とは、天然に存在するポリペプチド、または前駆体、またはプロタンパク質の産物である。天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質は、限定されない例として、対応する遺伝子によりコードされる全長遺伝子産物を含む。これに代えて、本明細書に説明するＯＲＦによりコードするポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質として定義し得る。産物の「成熟」型は、限定されない例として、遺伝子産物を生じる細胞(例えば、宿主細胞)内で起こり得る一つまたはそれ以上の天然に存在するプロセシングステップの結果として生じる。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型を導くそのようなプロセシングステップの例として、ＯＲＦの開始コドンによりコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドまたはリーダー配列のタンパク質分解的切断を挙げる。従って、残基１がＮ末端メチオニンである１〜Ｎの残基を有する前駆ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟型は、Ｎ末端メチオニン除去後に残存する残基２〜Ｎを有する。これに代えて、残基１〜残基ＭからＮ末端シグナル配列を切断する、残基１〜Ｎを有する前駆ポリペプチドまたはタンパク質より生じる成熟型は、残存する残基Ｍ＋１〜残基Ｎからの残基を有する。さらに本明細書において使用するように、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型はタンパク質分解による切断事象以外の翻訳後の工程により生じ得る。そのようなさらに別な方法は、限定されない例として、グリコシル化、ミリストイル化、またはリン酸化を含む。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質を、これらの方法のただ一つ、またはそれらのいずれかの組合せの操作によりもたらし得る。
本明細書において使用する用語「プローブ」は、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド(ｎｔ)から約１００ｎｔの間、または特定の使用によっては約、例えば６０００ｎｔもの長さである可変的長さの核酸配列を指す。プローブを、同一、類似、または相補的な核酸配列の検出に使用し得る。より長いプローブを天然または組換え供給源から一般的に得る。より長いプローブは、特異性が高くより短い長さのオリゴマーのプローブよりハイブリダイズするのが遅い。プローブは、一本鎖または二本鎖でもよく、そしてＰＣＲ、メンブレン−ベースのハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様技術において特異性を有するようにデザインされ得る。
本明細書において使用する用語「単離」核酸分子は、核酸の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離された核酸である。好ましくは、「単離」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中で核酸に天然に隣接する配列(即ち核酸の５'末端および３'末端に位置する配列)を有しない。例えば、種々の実施形態において、単離ＮＯＶＸ核酸分子は、核酸が由来する細胞／組織(例えば、脳、心臓、肝臓、脾臓等)のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０.５ｋｂ、０.１ｋｂ以下、またはそれ未満のヌクレオチド配列を含有し得る。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は、他の細胞性物質、培地、または化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まなくてもよい。
本発明の核酸分子、例えば、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはこのヌクレオチド配列の相補物を、標準的分子生物学の技術および本明細書に示す配列情報を用いて単離し得る。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）の核酸配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、標準的ハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術(例えば、Sambrook, et al., (eds.), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; および Ausubel, et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993に記載されるように)を用いてＮＯＶＸ分子を単離し得る。
本発明の核酸は、鋳型としてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはこれに代えてゲノムＤＮＡを使用して標準的ＰＣＲ増幅技術にしたがって適切なオリゴヌクレオチドプライマーで増幅し得る。そのように増幅した核酸を、適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析により特徴づけ得る。さらに、ＮＯＶＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、標準合成技術、例えば自動ＤＮＡ合成装置の使用、により調製し得る。
本明細書において使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結するヌクレオチド残基を指す。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列に基づき得るし、またはそれらからデザインし得る。そして短いオリゴヌクレオチド配列を使用して、特定の細胞または組織の同一、類似、または相補的ＤＮＡまたはＲＮＡの存在を増幅し、確認し、または明らかにする。オリゴヌクレオチドは、長さ約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔ、好ましくは長さ約１５ｎｔ〜３０ｎｔの核酸配列を含む。本発明の一つの実施形態では、長さ１００ｎｔ未満の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）の少なくとも６個の連続したヌクレオチド、またはそれらの相補物をさらに含む。オリゴヌクレオチドを、化学的に合成し、プローブとして使用し得る。
もう一つの実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）に示すヌクレオチド配列、またはこのヌクレオチド配列の一部(例えば、ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするプローブ、プライマー、またはフラグメントとして使用し得るフラグメント)の相補物である核酸分子を含む。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）を示すヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）を示すヌクレオチド配列に十分に相補的であるものであり、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）を示すヌクレオチド配列と殆どミスマッチなしでまたは全くミスマッチ無しで水素結合し得る。そのため核酸分子は安定な二本鎖を形成する。
本明細書において使用する用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のWatson-CrickまたはHoogsteen塩基対形成を指し、用語「結合」は、２個のポリペプチドまたは化合物、または関連するポリペプチドまたは化合物またはそれらの組合せ間の物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン、非イオン、ファン・デル・ワールス、疎水性相互作用等を含む。物理的相互作用は直接的または間接的であり得る。間接的相互作用は、他のポリペプチドまたは化合物の作用を介したまたはこれに因るものであり得る。直接的結合は、他のポリペプチドまたは化合物の作用を介したまたはこれに因り起こるのではなく、代わりに他の実質的な化学的仲介物無しで起こる相互作用を指す。
本明細書で提供する「フラグメント」は、核酸の場合特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さ、アミノ酸の場合にはエピトープの特異的認識に十分な長さである、少なくとも６個の(連続した)核酸または少なくとも４個の(連続した)アミノ酸の配列として定義され、そして全長より短いほとんどの或る一部である。フラグメントは、選択した核酸またはアミノ酸配列の任意の連続した部分から由来するものであり得る。
全長ＮＯＶＸのクローンを、ＡＴＧ翻訳開始コドンおよびインフレームの停止コドンを含有するとして同定する。ＡＴＧ開始コドンを欠く任意の開示するＮＯＶＸヌクレオチド配列は、それ故にれぞれのＮＯＶＸポリペプチドの切断（truncated）型Ｃ末端フラグメントをコードし、対応する全長ｃＤＮＡが開示する配列の５'方向へ伸長することを要求する。インフレームの停止コドンを欠く任意の開示するＮＯＶＸヌクレオチド配列は、同様にそれぞれのＮＯＶＸポリペプチドの切断型Ｎ末端フラグメントをコードし、対応する全長ｃＤＮＡが開示する配列の３'方向へ伸長することを要求する。
誘導体は、もとの化合物から直接、修飾によりまたは部分的置換によるいずれかで生成した核酸配列またはアミノ酸配列である。類似体は、もとの化合物に類似しているが同一ではない構造を有する核酸配列またはアミノ酸配列であり、例えば、それらは特定の成分または側鎖に関して天然化合物と異なっている。類似体は、合成であり得るし異なる進化起源を由来とし得るし、野生型と比較して類似または反対の代謝活性を有し得る。相同体は、異なる種を由来とする特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
誘導体および類似体は全長または全長以外であり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体または類似体は、同一サイズの核酸またはアミノ酸配列に亘って、または当該分野において公知のコンピューター相同性プログラムによりアラインメントしたアラインメント配列と比較した際、種々の実施形態において、少なくとも約７０％、８０％、または９５％の同一性(好ましくは、８０〜９５％の同一性)で本発明の核酸またはタンパク質に実質的に相同である領域を含む分子、またはそれらのコードする核酸が本発明のタンパク質をコードする配列の相補物にストリンジェント、中等度にストリンジェント、または低いストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能である分子を含むが、これらに限定されない。例えば、Ausubel, et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993および以下を参照されたい。
「相同な核酸配列」または「相同なアミノ酸配列」またはそれらの変異体は、上述のようにヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの相同性を特徴とする配列を指す。相同なヌクレオチド配列は、ＮＯＶＸポリペプチドのアイソフォームをコードするこれらの配列を含む。アイソフォームを、例えばＲＮＡの選択的スプライシングの結果として同じ生物の異なる組織において発現し得る。これに代えて、アイソフォームを、異なる遺伝子によりコードし得る。本発明では、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種のＮＯＶＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、脊椎動物を含むが脊椎動物に限定されない。よって例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、および他の生物を含む。相同なヌクレオチド配列はまた、本明細書に示すヌクレオチド配列の天然に存在する対立遺伝子変異体および突然変異体を含むが、これらに限定しない。しかしながら、相同なヌクレオチド配列は、ヒトＮＯＶＸタンパク質をコードする正確なヌクレオチド配列を含まない。相同な核酸配列は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）の保存的アミノ酸置換(下記参照)をコードする核酸配列ならびにＮＯＶＸの生物活性を有するポリペプチドを含む。ＮＯＶＸタンパク質の種々の生物学的活性を、以下に説明する。
ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸ核酸のオープンリーディングフレーム(「ＯＲＦ」)によりコードされる。ＯＲＦは、ポリペプチドに潜在的に翻訳し得るヌクレオチドに対応する。ＯＲＦを含む一連の核酸を、停止コドンにより中断しない。全長タンパク質をコードする配列を表すＯＲＦは、ＡＴＧ「開始」コドンで始まり、３種の「停止」コドン即ちＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡの一つで終わる。本発明の目的のため、ＯＲＦは、開始コドン、停止コドン、またはその両方があってもなくてもよい、コード化配列の任意の部分であり得る。ＯＲＦを真正の細胞性タンパク質をコードする良好な候補として考えるために、最小限の要件、例えば、５０個のアミノ酸またはそれ以上をコードする一連のＤＮＡ、がしばしば定められる。
ヒトＮＯＶＸ遺伝子のクローニングから決定するヌクレオチド配列は、他の細胞タイプ、例えば他の組織由来のＮＯＶＸ相同体、ならびに他の脊椎動物由来のＮＯＶＸ相同体を同定および／またはクローニングする際の使用のためにデザインするプローブおよびプライマーの作成を可能にする。プローブ／プライマーは、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを典型的に含む。オリゴヌクレオチドは、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）の少なくとも約１２、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００個の連続したセンス鎖のヌクレオチド配列；または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）の天然に存在する変異体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を典型的に含む。
ヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に基づくプローブを、同じタンパク質または相同タンパク質をコードする転写体またはゲノム配列を検出するのに使用し得る。種々の実施形態において、プローブは検出可能な標識がつけられており、例えば、標識は放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素のコファクターであり得る。かかるプローブは、対象由来の細胞試料中のあるＮＯＶＸコード化核酸のレベルを測定することによるように、あるＮＯＶＸタンパク質を誤って発現している細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として使用し得る、例えば、ＮＯＶＸのｍＲＮＡを検出するかまたはゲノムＮＯＶＸ遺伝子が変異または欠失をしたか否かを測定する。
「ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」は、特定の生物学的分析において測定するような成熟型を含み、本発明のポリペプチドの活性に類似な、しかし必ずしも同一ではない活性を用量依存性の有無を問わず発揮するポリペプチドを指す。「ＮＯＶＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントを、あるＮＯＶＸの生物活性(ＮＯＶＸタンパク質の生物活性を以下に説明する)を有するポリペプチドをコードする配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）の一部を単離し、ＮＯＶＸタンパク質のコードする部分を発現し(例えば、インビトロ組換え発現により)、ＮＯＶＸのコードする部分の活性を評価するすることにより調製し得る。
単一ヌクレオチド多型
変異体配列も本願に含まれる。変異体配列は、単一ヌクレオチド多型(SNP)を含み得る。SNPは、SNPを含むヌクレオチド配列がcDNAとして起こることを示すために「cSNP」と呼ばれる場合もある。SNPはいくつかの方法で生じ得る。例えば、SNPは多型部位での、1つのヌクレオチドの別のものとの置換によるものであり得る。かかる置換はトランジションまたはトランスバーションのいずれかであり得る。SNPはまた、参照対立遺伝子と比べた、ヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入からも生じ得る。この場合、多型部位とは、一対立遺伝子が別の対立遺伝子の特定のヌクレオチドに対してギャップを有する部位である。遺伝子内に生じるSNPは、SNPの位置の遺伝子によってコードされるアミノ酸の変更をもたらし得る。遺伝子内SNPはまた、SNPを含むコドンが同一のアミノ酸をコードする場合には、遺伝暗号の縮重性の結果としてサイレントでもあり得る。遺伝子領域の外側に生じる、または遺伝子内のイントロン中のSNPは、タンパク質のどのアミノ酸配列にも変化をもたらさないが、発現パターンの調節の変更をもたらし得る。例としては、時間的発現、生理学的応答調節、細胞種発現調節、発現強度、および転写されたメッセージの安定性の変更が挙げられる。
エキソン結合プロセスによって得られたSeqCallingアセンブリーを、以下の基準を用いて選択し、伸長させた。最初の配列または伸長させた配列の全てまたは部分に対し98%の同一性を持つ領域を有するゲノムクローンを、ヒトゲノムデータベースをクエリーするのに適切な配列を用いてBLASTN検索によって同定した。この同一性がこれらのクローンがこれらSeqCallingアセンブリーのゲノム座位を含むことを示すことから、得られたゲノムクローンをさらなる解析のために選択した。これらの配列は推定コード領域ならびに既知DNAおよびタンパク質配列との類似性に関して解析した。これらの解析に用いたプログラムとしては、Grail、Genscan、BLAST、HMMER、FASTA、Hybridおよびその他の適切なプログラムが挙げられる。
さらなるゲノム領域を、選択したSeqCallingアセンブリーがそれらの領域にマッピングするということでいくつか同定しておいてもよい。かかるSeqCalling配列は、相同性またはエキソン予測により規定される領域と重複していてもよい。また、断片の位置が、類似性または当初の予測配列に含まれていたエキソン予測により同定されるゲノム領域の近傍にあったという理由でこれらを含めてもよい。このように同定された配列を手作業でアセンブルし、次いでCuraGen社のヒトSeqCallingデータベースから得られる1以上のさらなる配列を用いて伸長しておいてもよい。含めるのに適したSeqCalling断片を、CuraTools(商標)プログラムSeqExtendにより、または解析したゲノムクローンの適当な領域へマッピングするSeqCalling断片の同定により同定した。
次いで、本明細書に開示された最終配列を導くため、前述の手順により規定される領域を手作業で統合し、例えば、元の断片中でミスコールされた塩基から、または予測されるエキソン結合部、EST位置と配列類似性領域との間の矛盾から生じ得た明らかな不一致を訂正した。必要であれば、SeqCallingアセンブリーおよびゲノムクローンを同定および解析するプロセスを繰り返して全長配列を導いた(Alderborn et al., Determination of Single nucleotide Polymorphisms by Real-time Pyrophosphate DNA Sequencing. Genome Research. 10(8) 1249-1265,2000)。
変異体は個々に報告されるが、変異体の全てまたは選択サブセットのいずれの組み合わせも本発明の考慮されるNOVXの実施形態として含まれる。
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド変異体
本発明はさらに、遺伝子コードの縮重により配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）に示すヌクレオチド配列と異なっており、従って配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）に示すヌクレオチド配列によりコードするのと同じＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子を包含する。もう一つの実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列番号２ｎ（ｎは１〜３８の整数である）に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）に示すヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に加えて、ＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列の多型が、集団(例えばヒトの集団)中に存在し得ることを当業者は理解する。ＮＯＶＸ遺伝子のかかる遺伝子多型は、天然の対立遺伝子変異に因り集団の中の個体間に存在し得る。本明細書において使用する用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＮＯＶＸタンパク質、好ましくは脊椎動物のＮＯＶＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む核酸分子を指す。かかる天然の対立遺伝子変異は、ＮＯＶＸ遺伝子のヌクレオチド配列中に１〜５％の変異を典型的にもたらす。天然の対立遺伝子変異の結果でありＮＯＶＸポリペプチドの機能活性を変化しない任意のおよび全てのかかるヌクレオチド変異およびそこで得られるＮＯＶＸポリペプチド中のアミノ酸多型は、本発明の範囲内にあるものとする。
さらに、他の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子、および従ってヒト配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあるものとする。本発明のＮＯＶＸｃＤＮＡの天然の対立遺伝子変異体および相同体に対応する核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて、本明細書に開示するヒトＮＯＶＸ核酸との相同性に基づいて単離し得る。
従って、もう一つの実施形態では、本発明の単離核酸分子は少なくとも６ヌクレオチド長であり、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。もう一つの実施形態では、核酸は少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００またはそれ以上のヌクレオチド長である。なおもう一つの実施形態では、本発明の単離核酸分子はコード化領域にハイブリダイズする。本明細書において用いる用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、お互いに少なくとも約６５％相同なヌクレオチド配列がお互いに典型的にハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーション条件および洗滌条件を記載することを意図する。
相同体(即ち、ヒト以外の生物種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸)または他の関連配列(例えばパラログ)を、核酸のハイブリダイゼーションおよびクローニングの当該分野において周知の方法を用いて特定のヒト配列の全部または一部をプローブとし、低度、中度、または高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションにより得られる。
本明細書において使用する用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる環境で差がある。より長い配列は、より短い配列よりもより高温で特異的にハイブリダイズする。一般的に、ストリンジェントな条件を、一定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列の融解温度(Ｔｍ)より約５℃低いように選択する。Ｔｍは、標的配列と相補的なプローブの５０％が平衡時に標的配列にハイブリダイズする温度(規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で)である。標的配列はＴｍにおいて一般的に過剰に存在するので、プローブの５０％を平衡時に占める。典型的に、ストリンジェントな条件はｐＨ７.０〜８.３で塩濃度が約１.０Ｍナトリウムイオン未満、典型的には約０.０１〜１.０Ｍナトリウムイオン(または他の塩)であり、温度は短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド(例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ)に対して少なくとも約３０℃であり、より長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドに対して少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件を、フォルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成し得る。
ストリンジェントな条件は当業者に公知であり、Ausubel, et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.に見出すことができる。好ましくは、条件は、互いに少なくとも６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同な配列が互いに典型的にハイブリダイズしたままであるようなものである。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの限定されない例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％ＰＶＰ、０.０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０.０２％ＢＳＡおよび５００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中６５℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで０.２×ＳＳＣ、０.０１％ＢＳＡ中５０℃で１回またはそれ以上洗滌する。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）の配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする本発明の単離核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書において使用する用語「天然に存在する」核酸分子は、天然に(例えば、天然のタンパク質をコードする)存在する核酸配列を有するＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を指す。
第２の実施形態では、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、類似体または誘導体と中度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を提供する。中度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の限定されない例は、６×ＳＳＣ、５×Reinhardtの溶液、０.５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中５５℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中３７℃で１回またはそれ以上洗滌することである。使用され得る他の中度にストリンジェントな条件は当該分野内で周知である。例えば、Ausubel, et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, および Krieger, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.を参照されたい。
第３の実施形態では、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、類似体または誘導体と低度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を提供する。低度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の限定されない例は、３５％フォルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％ＰＶＰ、０.０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０.２％ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％(ｗｔ／ｖｏｌ)硫酸デキストラン中４０℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０.１％ＳＤＳ中５０℃で１回またはそれ以上洗滌することである。使用し得る他の低度にストリンジェントな条件(例えば種間ハイブリダイゼーションに使用する)は当該分野において周知である。例えば、Ausubel, et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, and Kriegler, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.；Shilo and Weinberg, 1981. Proc Natl Acad Sci USA 78: 6789-6792を参照されたい。
保存的変異
集団中に存在し得るＮＯＶＸ配列の天然に存在する対立遺伝子変異に加えて、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）のヌクレオチド配列中に変異により変換を導入することができ、それによってＮＯＶＸタンパク質の機能活性を変えること無しに、コードするＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列の変化を導くことができることを当業者はさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸置換に導くヌクレオチド置換を、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）の配列中で行い得る。「非必須」アミノ酸残基は、ＮＯＶＸタンパク質の野生型の配列をそれらの生物活性を変化させることなく変えることのできる残基であるが、一方で「必須」アミノ酸残基をそのような生物活性に必要とする。例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質中で保存するアミノ酸残基を、特に変換に耐えられないと予想する。保存的置換が行われ得るアミノ酸は当該分野内で周知である。
本発明のもう一つの態様は、活性に必須でないアミノ酸残基中に変化を含有するＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。かかるＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）とアミノ酸配列において異なっているが、生物活性を依然保持している。一つの実施形態では、単離核酸分子はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここでタンパク質は、配列番号２ｎ（ｎは１〜３８の整数である）のアミノ酸配列と少なくとも約５０％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、核酸分子によりコードするタンパク質は、配列番号２ｎ（ｎは１〜３８の整数である）に少なくとも約６０％相同であり；より好ましくは、核酸分子によりコードするタンパク質は、配列番号２ｎ（ｎは１〜３８の整数である）に少なくとも約７０％相同であり；さらに好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜３８の整数である）に少なくとも約８０％相同であり；それよりさらにより好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜３８の整数である）に少なくとも約９０％相同であり；最も好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜３８の整数である）に少なくとも約９５％相同である。
配列番号２ｎ（ｎは１〜３８の整数である）のタンパク質に相同なあるＮＯＶＸタンパク質をコードする単離核酸分子を、１個またはそれ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失をコードするタンパク質内に導入するように配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）のヌクレオチド配列の中に１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより創成し得る。
突然変異を、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）の中に、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ仲介性突然変異誘発のような、標準的技術により導入し得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換を、予想する１個またはそれ以上の非必須アミノ酸残基において行う。「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えるアミノ酸残基中の一つである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野内で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖をもつアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖をもつアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、電荷のない側鎖をもつアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、無極性側鎖をもつアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ位側鎖をもつアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、ならびに芳香族側鎖をもつアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。従って、ＮＯＶＸタンパク質中に予想する非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換する。これに代えて、もう一つの実施形態では、突然変異を、飽和突然変異誘発のように、あるＮＯＶＸコード化配列の全部または一部に沿って無作為に導入し得るし、得られた突然変異体をＮＯＶＸの生物学的活性についてスクリーニングして活性を保持する変異体を同定し得る。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）の突然変異誘発に引き続いて、コードされたタンパク質を当該分野において公知の任意の組換え技術で発現し、タンパク質の活性を測定し得る。
アミノ酸ファミリーの関連性を、側鎖の相互作用に基づいても決定し得る。置換したアミノ酸は、十分に保存された「強い」残基または十分に保存された「弱い」残基であり得る。保存したアミノ酸残基の「強い」群は、次の群のいずれか一つであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷであり、ここでアミノ酸の一文字表記は、互いに置換し得るアミノ酸でグル−プ分けする。同様に、保存した残基の「弱い」群は、次のいずれか一つであり得る：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＨＦＹであり、ここでそれぞれの群の文字はアミノ酸の一文字表記を表す。
一つの実施形態では、変異ＮＯＶＸタンパク質を、(i)他のＮＯＶＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質またはそれらの生物学的活性部位と相互作用するタンパク質：タンパク質を形成する活性、(ii)変異ＮＯＶＸタンパク質とあるＮＯＶＸリガンド間の複合体形成、または(iii)細胞内標的タンパク質またはそれらの生物学的活性部位に結合する変異ＮＯＶＸタンパク質の活性についてアッセイし得る；(例えば、アビジンタンパク質)。
なおもう一つの実施形態では、変異ＮＯＶＸタンパク質を、特定の生物学的機能を調節する活性(例えば、インスリン分泌の調節)についてアッセイし得る。
妨害性ＲＮＡ
本発明の１の態様において、ＮＯＶＸ遺伝子発現をＲＮＡ妨害により弱めることができる。当該分野においてよく知られた１のアプローチは、短い妨害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される遺伝子サイレント化であり、該アプローチにおいて、ＮＯＶＸ遺伝子転写物の少なくとも１９ないし２５ヌクレオチドの長さのセグメントに対して相補的であり、５’非翻訳（ＵＴ）領域、ＯＲＦ、または３’ＵＴ領域を含む、特異的な２本鎖ＮＯＶＸ由来のｓｉＲＮＡヌクレオチド配列により、ＮＯＶＸ遺伝子発現産物が標的とされる。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ００／４４８９５、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ０１／７５１６４、ＷＯ０１／９２５１３、ＷＯ０１／２９０５８、ＷＯ０１／８９３０４、ＷＯ０２／１６６２０、およびＷＯ０２／２９８５８参照（それぞれを参照により本明細書に一体化させる）。標的化される遺伝子はＮＯＶＸ遺伝子であってもよく、あるいはＮＯＶＸ遺伝子の上流または下流モジュレーターであってもよい。ＮＯＶＸ遺伝子の上流または下流モジュレーターの非限定的な例は、例えば、ＮＯＶＸ遺伝子プロモーターに結合する転写因子ＮＯＶＸポリペプチドと相互作用するキナーゼまたはホスファターゼ、ならびにＮＯＶＸ調節経路に含まれるポリペプチドである。
本発明の方法によれば、妨害性ＲＮＡを用いてＮＯＶＸ遺伝子発現がサイレント化される。本発明のＮＯＶＸポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを包含する。ＮＯＶＸポリヌクレオチド配列を用いて、例えば、ショウジョウバエ抽出物（これに限らない）のごとき無細胞系でＮＯＶＸポリヌクレオチド配列をプロセッシングすることにより、あるいは組み換え型２本鎖ＮＯＶＸ ＲＮＡの転写により、あるいはＮＯＶＸ配列に相同的なヌクレオチド配列を合成することにより、かかるＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡを得ることができる。例えば、Tuschul, Zamire, Lehmann, Bartel and Sharp (1999), Genes & Dev. 13: 3191-3197参照（参照により本発明系に一体化させる）。合成する場合、典型的な０．２マイクロモラースケールのＲＮＡ合成により約１ミリグラムのｓｉＲＮＡが得られ、それは２４ウェルの組織培養プレートフォーマットを用いる１０００回のトランスフェクション実験に十分なものである。
最も効率的なサイレント化は、一般的には、２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有するように対合された２１ヌクレオチドのセンス鎖および２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ２本鎖を用いて観察される。２ヌクレオチドの３’オーバーハングの配列は、ｓｉＲＮＡの標的認識の特異性にさらなる小さな貢献をする。特異性に対する貢献は最初に対合した塩基に隣接した未対合ヌクレオチドに局在化される。１の実施形態において、３’オーバーハング中のヌクレオチドはリブヌクレオチドである。別の実施形態において、３’オーバーハング中のヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。３’オーバーハング中の２’−デオキシリボヌクレオチドを用いることはリボヌクレオチドの使用として有効であるが、デオキシリボヌクレオチドはしばしば合成費用が安く、よりヌクレアーゼ耐性である可能性が最も高い。
本発明の企図される組み換え型発現ベクターは、両方の鎖の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にするような様式でＮＯＶＸ配列に作動可能に連結された近接調節配列を含む発現ベクター中に組み込まれたＮＯＶＸ ＤＮＡ分子を含む。ＮＯＶＸ ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子は第１のプロモーター（例えば、クローン化ＤＮＡの３’プロモーター配列）により転写され、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡに対してセンス鎖であるＲＮＡ分子が第２のプロモーター（クローン化ＤＮＡの５’プロモーター配列）により転写される。センスおよびアンチセンス鎖はインビボでハイブリダイゼーションして、ＮＯＶＸ遺伝子のサイレント化のためのｓｉＲＮＡ構築物を生じる。別法として、２つの構築物を用いて、ｓｉＲＮＡ構築物のセンスおよびアンチセンス鎖を作成することもできる。結局、クローン化ＤＮＡは第２の構造を有する構築物をコードするものであり得、単一の転写物は、標的遺伝子（複数も可）由来のセンスおよび相補的アンチセンス配列を有するものである。この実施形態の一例において、ヘアピンＲＮＡｉ産物は標的遺伝子のすべてまたは一部に対して相同的である。もう１つの例において、ヘアピンＲＮＡｉ産物はｓｉＲＮＡである。ＮＯＶＸ配列に近接した調節配列は、それらの発現が独立してモジュレーションされ、あるいは時間的または位置的にモジュレーションされうるならば、同一であってもよく、異なっていてもよい。
特別な実施形態において、例えば、より小型の核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６またはヒトＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡ Ｈ１に由来するＲＮＡｐｏｌ ＩＩＩ転写ユニットを含むベクター中にＮＯＶＸ遺伝子鋳型を組み込むことにより、ｓｉＲＮＡは細胞内で転写される。ベクター系の１例はGeneSuppressor(商標)RNA Interference kit （Imgenexから市販されている）である。Ｕ６およびＨ１プロモーターはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターのタイプＩＩＩクラスのメンバーである。Ｕ６様プロモーターの＋１ヌクレオチドは常にグアノシンであるが、Ｈ１プロモーターの＋１はアデノシンである。これらのプロモーターのターミネーションシグナルは５個の連続したチミジンにより定義される。典型的には、転写物を２つ目のウリジンの後ろで開裂させる。この位置での開裂は、発現されたｓｉＲＮＡ中に３’ＵＵオーバーハングを生じさせ、それは合成ｓｉＲＮＡの３’オーバーハングと類似である。長さ４００ヌクレオチド未満の配列をこれらのプロモーターにより転写させることができ、それゆえ、それらは約２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡを例えば約５０ヌクレオチドのＲＮＡステムループ転写物中に発現させることに理想的に適したものである。
長時間の発現ノックダウンが必要な場合に、ｓｉＲＮＡベクターは合成ｓｉＲＮＡよりも有利であると考えられる。ｓｉＲＮＡ発現ベクターでトランスフェクションされた細胞は安定で、長時間のｍＲＮＡ阻害をこうむるであろう。対照的に、外来性合成ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞は、典型的には７日以内あるいは１０ラウンドの細胞分裂の間にｍＲＮＡサプレッションから回復する。ｓｉＲＮＡ発現ベクターの長時間の遺伝子サイレント化能は遺伝子治療への適用を可能にしうる。
一般的には、ｓｉＲＮＡは、ＤＩＣＥＲと呼ばれるＡＴＰ依存性リボヌクレアーゼにより、より長いｄｓＲＮＡから切断される。ＤＩＣＥＲは２本鎖ＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼのＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのメンバーである。ｓｉＲＮＡは細胞タンパク質とともに集合してエンドヌクレアーゼ複合体となる。ショウジョウバエにおけるインビトロでの研究は、ｓｉＲＮＡ／タンパク質複合体（ｓｉＲＮＰ）がその後ＤＩＥＣＲとは異なるエンドリボヌクレアーゼを含むＲＮＡ誘導サイレンス化複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる第２の酵素複合体に転移されることを示唆している。ＲＩＳＣはｓｉＲＮＡ鎖によりコードされる配列を用いて相補的配列のｍＲＮＡを見つけて破壊する。かくしてｓｉＲＮＡはガイドとして作用し、２本のｓｉＲＮＡ鎖の一方に相補的なｍＲＮＡのみを開裂するようにリボヌクレアーゼを制限する。
ｓｉＲＮＡにより標的化されるべきＮＯＶＸ ｍＲＮＡ領域は、一般的には、スタートコドンの５０ないし１００ヌクレオチド下流から開始する所望ＮＯＶＸ配列から選択される。別法として、５’または３’ＵＴＲおよびスタートコドン付近の領域を用いることができるが、一般的には避けられる。なぜならこれらは調節タンパク質結合部位において豊富だからである。ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体はｓｉＲＮＰまたはＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害しうる。選択されたｓｉＲＮＡ配列に関する最初のＢＬＡＳＴ相同性サーチを利用可能なヌクレオチド配列ライブラリーに対して行って、ただ１つの遺伝子が標的化されることを確実にする。ｓｉＲＮＡ２本鎖による標的認識特異性は、ｓｉＲＮＡの対合領域に存在する単一の点突然変異が標的ｍＲＮＡの分解を妨げるに十分であることを示す。Elbashir et al. 2001 EMBO J. 20(23):6877-88参照。それゆえ、所望遺伝子を標的化する場合、ＳＮＰ、多型、対立遺伝子変種または種特異的変化をうまく考慮すべきである。
１の実施形態において、完全なＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ実験は正しい負の対照を用いるものである。一般的には、負の対照ｓｉＲＮＡはＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を有するが、ゲノムに対して有意な配列相同性を欠いている。典型的には、ＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列をスクランブルし、相同性検索を行って、それが他のいすれの遺伝子とも相同性を欠いていることを確認する。
２つの独立したＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ２本鎖を用いて標的ＮＯＶＸ遺伝子をノックダウンすることができる。このことはサイレント化効果の特異性を制御することを助ける。さらに、等しい濃度の異なるＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ２本鎖、例えば、ＮＯＶＸ遺伝子またはポリペプチドのレギュレーターに関するＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを用いることにより、２つの独立した遺伝子の発現を同時にノックダウンすることができる。ｓｉＲＮＡ結合タンパク質の利用可能性は標的ｍＲＮＡアクセス可能性よりも限定的であると考えられる。
典型的には、標的化されたＮＯＶＸ領域は、１９個（Ｎ１９）の残基のスペーサー領域により分けられた２個のアデニン（ＡＡ）および２個のチミジン（ＴＴ）である（例えば、ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴ）。望ましいスペーサー領域は約３０〜７０％、より好ましくは約５０％のＧ／Ｃ−含量を有する。配列ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴが標的配列中に存在しない場合、別の標的領域はＡＡ（Ｎ２１）であろう。ＮＯＶＸセンスｓｉＲＮＡの配列は（Ｎ１９）ＴＴまたはＮ２１にそれぞれ対応する。後者の場合、かかる配列が本質的にＮＯＶＸポリヌクレオチド中に存在しないならば、センスｓｉＲＮＡの３’末端のＴＴへの変換を行うことができる。この配列変換の論理的解釈は、センスおよびアンチセンス３’オーバーハングの配列組成に関して対称な２本鎖を生じさせることである。対称な３’オーバーハングは、センスおよびアンチセンス標的ＲＮＡ−開裂ｓｉＲＮＰの適切な等しい割合でｓｉＲＮＰが形成されることを確実ならしめることを助けることができる。例えば、Elbashir, Lendeckel and Tuschl (2001). Genes & Dev. 15: 188-200参照（参照により本明細書に一体化させる）。ｓｉＲＮＡ２本鎖のセンス配列のオーバーハングの修飾が標的化されたｍＲＮＡの認識に影響するとは考えられない。なぜならアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖は標的認識をガイドするからである。
別法として、ＮＯＶＸ標的ｍＲＮＡが適当なＡＡ（Ｎ２１）配列を含まない場合、配列ＮＡ（Ｎ２１）をサーチしてもよい。さらに、センス鎖およびアンチセンス鎖の配列を５’（Ｎ１９）ＴＴとして合成してもよい。なぜならアンチセンスｓｉＲＮＡの３’側の大部分のヌクレオチドの配列は特異性に貢献しないからである。アンチセンスまたはリボザイム法とは違って、標的ｍＲＮＡの２次構造はサイレンス化に強く影響するとは考えられない。Harborth, et al. (2001) J. Cell Science 114: 4557-4565参照（参照により本明細書に一体化させる）。
標準的な核酸トランスフェクション法、例えば、OLIGOFECTAMINE Reagent（Invitrogenから市販されている）を用いてＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ２本鎖のトランスフェクションを行うことができる。一般的には、ＮＯＶＸ遺伝子サイレンシングに関するアッセイをトランスフェクションから約２日後に行う。トランスフェクション試薬の不存在下において、ＮＯＶＸ遺伝子サイレント化は観察されず、野生型およびサイレント化ＮＯＶＸ表現型の比較分析が可能であった。特別な実施形態において、２４ウェルプレートの１つのウェルには通常約０．８４μｇのｓｉＲＮＡ２本鎖で十分である。典型的には、細胞を前日に撒き、約５０％集密になったところでトランスフェクションする。細胞培地および培養条件の選択は等業者が通常行うことであり、細胞タイプの選択により変更されるであろう。トランスフェクションの効率は細胞タイプのみならず細胞の継代数および集密度に依存する。ｓｉＲＮＡ−リポソーム複合体の形成時間および方法（例えば、倒置かボルテックスか）も重要である。低いトランスフェクション効率はＮＯＶＸサイレント化の不成功の最大の原因である。使用する新たな細胞系に関してトランスフェクション効率を注意深く調べることが必要である。好ましい細胞は哺乳類由来であり、より好ましくはラットまたはマウスのごときげっ歯類由来であり、最も好ましくはヒト由来である。治療的処置に使用する場合、好ましくは細胞は自己由来のものであるが、非−自己由来の細胞ソースも本発明の範囲内とされる。
対照実験に関し、０．８４μｇの１本鎖センスＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションはＮＯＶＸサイレント化に影響せず、０．８４μｇのアンチセンス ｓｉＲＮＡは、０．８４μｇの２本鎖ｓｉＲＮＡと比較すると弱いサイレント化効果を有する。対照実験はさらに野生型およびサイレント化ＮＯＶＸ表現型の比較分析を可能にする。トランスフェクション効率を制御するために、典型的には通常タンパク質の標的化を行う。例えば、ラミンＡ／Ｃの標的化あるいはＣＭＶにより駆動されるＥＧＦＰ発現プラスミド（例えば、Clontechから市販されている）のトランスフェクションを行う。上例において、イムノフルオレッセンス、ウェスタンブロット、ノーザンブロットあるいはタンパク質発現または遺伝子発現に関する他の類似のアッセイのごとき方法により、細胞中のラミンＡ／Ｃノックダウンのフラグメントを翌日に行う。ラミンＡ／Ｃモノクローナル抗体をSanta Cruz Biotechnologyから得た。
細胞中の標的化ＮＯＶＸポリヌクレオチドの豊富さおよび半減期（またはターンオーバー）にもよるが、１〜３日後あるいはその後にノックダウン表現型が明らかにされうる。ＮＯＶＸノックダウン表現型が観察されない場合には、トランスフェクションされたｓｉＲＮＡ２本鎖により標的ｍＲＮＡ（ＮＯＶＸまたはＮＯＶＸ上流または下流遺伝子）が効果的に破壊されたかどうかを分析することが望ましいかもしれない。トランスフェクションから２日後、全ＲＮＡを調製し、標的特異的プライマーを用いて逆転写し、少なくとも１つのエキソン−エキソンジャンクションを変換するプライマーペアーを用いてＰＣＲ増幅を行ってプレ−ｍＲＮＡの増幅を制御する。非標的化ｍＲＮＡのＲＴ／ＰＣＲも対照として必要である。ｍＲＮＡの効果的な枯渇であるが検出できない標的タンパク質の減少は、安定なＮＯＶＸタンパク質の大きなリザーバーが細胞中に存在することを示しうる。標的タンパク質が最終的に枯渇して表現型が明らかにされうるに至るには、十分に長いインターバルでの複数回のトランスフェクションが必要であるかもしれない。複数回のトランスフェクション工程が必要な場合、トランスフェクションから２〜３日後に細胞を分ける。分けた直後に細胞をトランスフェクションしてもよい。
本発明の治療方法は、増加あるいは逸脱したＮＯＶＸ発現または活性を補正するための治療としてＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ構築物を投与することを企図する。上記のごとく、ＮＯＶＸリボポリヌクレオチドを得て、ｓｉＲＮＡフラグメントにプロセッシングするか、あるいはＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡを合成する。上記のごとく、既知の核酸トランスフェクション法を用いてＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡを細胞または組織に投与する。ＮＯＶＸ遺伝子に特異的なＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡはＮＯＶＸ転写産物を減少またはノックダウンし、そのことはＮＯＶＸポリペプチド生成を減少させ、細胞または組織中のＮＯＶＸポリペプチド活性を低下させる。
また本発明は、個体におけるＮＯＶＸタンパク質の存在に関連する疾病または症状の治療方法を包含し、該方法は、分解されるべきタンパク質のｍＲＮＡ（該タンパク質をコードするｍＲＮＡ）を標的化するＲＮＡｉ構築物を個体に投与することを特徴とする。特別なＲＮＡｉ構築物はｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡにプロセッシングされる２本鎖遺伝子転写物を含む。治療により、標的タンパク質が産生されなくなるか、あるいは治療を行わない場合よりも産生の程度が低下する。
ＮＯＶＸ遺伝子機能が既知表現型と相関関係を有しない場合、健康個体由来の細胞または組織の対照試料により、ＮＯＶＸ発現レベルを決定するためのリファレンス標準が提供される。説明したアッセイ、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等を用いて発現レベルを検出する。疾病状態にある哺乳類、好ましくはヒト対象から細胞または組織の試料を採取する。細胞または組織中への核酸のトランスフェクションに関して説明した方法によりＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡを細胞または組織に投与することによってこれらの細胞または組織を処理し、説明したアッセイを用いて対象試料中のＮＯＶＸポリペプチドまたはポリヌクレオチド発現の変化を観察し、対照試料のものと比較する。このＮＯＶＸ遺伝子ノックダウン法は、治療対象試料中のＮＯＶＸマイナス（ＮＯＶＸ−）表現型を決定するための迅速法を提供する。かくして、治療対象試料中において観察されたＮＯＶＸ−表現型は、治療中の疾病状態の経過観察のためのマーカーとして役立つ。
特別な実施形態において、ＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡを治療に用いる。ＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡの生成および使用方法は等業者に知られている。方法の例を以下に示す。
ＲＮＡの生成
ＲＮＡ発現ベクターにおける転写のごとき既知方法を用いてＮＯＶＸのセンスＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）およびアンチセンス（ａｓＲＮＡ）を得る。最初の実験において、センスおよびアンチセンスＲＮＡはそれぞれ約５００塩基の長さである。得られたｓｓＲＮＡおよびａｓＲＮＡ（０．５μＭ）を２０ｍＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で９５℃にて１分間加熱し、次いで、冷却し、室温で１２ないし１６時間アニーリングさせる。ＲＮＡを沈殿させ、溶解バッファー（下記）中に再懸濁させる。アニーリングをモニターするために、ＴＢＥバッファー中の２％アガロースゲル中でＲＮＡを電気泳動させ、臭化エチジウムで染色する。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.(1989)参照。
溶解物の調製
製造者（Ambion）の指示に従って未処理ウサギ網状赤血球溶解物を集める。ｄｓＲＮＡを溶解物中３０℃で１０分間インキュベーションし、次いで、ｍＲＮＡを添加する。その後、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡを添加し、さらに６０分インキュベーションを続ける。２本鎖ＲＮＡとｍＲＮＡとのモル比は約２００：１である。ＮＯＶＸ ｍＲＮＡを放射性標識し（既知方法を用いて）、その安定性をゲル電気泳動によりモニターする。
同じ条件で平行して行う実験において、３２Ｐ−ＡＴＰを用いて２本鎖ＲＮＡを内部で放射性標識する。２ＸプロテアーゼＫバッファーにより反応を停止させ、すでに記載されているようにして（Tuschl et al., Genes Dev., 13: 3191-3197）脱タンパク質する。適当なＲＮＡ標準を用いて１５％または１８％ポリアクリルアミド配列決定用ゲル中での電気泳動により生成物を分析する。ゲルを放射活性についてモニターすることにより、２本鎖ＲＮＡからの１０ないし２５ヌクレオチドのＲＮＡの自然な生成を調べることができる。
約２１〜２３ｂｐの２本鎖ＲＮＡのバンドを溶出する。これらの２１〜２３量体ＮＯＶＸ転写抑制の有効性を、各アッセイにつき５０ナノモラーの２本鎖２１〜２３量体を用いて上記と同じウサギ網状赤血球を用いてインビトロにてアッセイする。次いで、これらの２１〜２３量体の配列を標準的な核酸配列決定法を用いて決定する。
ＲＮＡの調製
上で決定された配列に基づいて、Expedite RNA phosphoramidites and thymidine phosphoramidite（Proligo, Germany）２１を用いてヌクレオチドのＲＮＡを化学合成する。合成オリゴヌクレオチドを脱保護し、ゲル精製（Elbashir, Lendeckel, & Tuschl, Genes & Dev. 15, 188-200 (2001)）し、次いで、Sep-Pak C18 cartridge（Waters, Milford, Mass., USA）で精製（Tuschl, et al., Biochemistry, 32:11658-11668 (1993)）する。
これらのＲＮＡ（２０μＭ）１本鎖をアニーリングバッファー中、９０℃で１分間インキュベーションし、次いで、３７℃で１時間インキュベーションする。
細胞培養
ＮＯＶＸを規則的に発現させるための当該分野において知られた細胞培養を、標準的条件を用いて行う。トランスフェクションの２４時間前に、約８０％集密において、細胞をトリプシン処理し、抗生物質不含の新鮮培地で１：５に希釈（１〜３ｘ１０５個／ｍｌ）し、２４ウェルプレートに移す（５００ｍｌ／ウェル）。市販リポフェクションキットを用いてトランスフェクションを行い、陽性および陰性対照を付して標準的方法を用いてＮＯＶＸ発現をモニターする。陽性対照は本来的にＮＯＶＸを発現する細胞であり、陰性対照はＮＯＶＸを発現しない細胞である。オーバーハング３’を有する塩基対合した２１および２２ヌクレオチドのｓｉＲＮＡは、溶解物および細胞培養において、効果的な配列特異的ｍＲＮＡ分解を媒介する。異なる濃度のｓｉＲＮＡを用いる。哺乳類細胞培養の場合のインビトロでのサプレッションに効果的な濃度は２５ｎＭないし１００ｎＭの最終濃度である。このことは、慣用的なアンチセンスまたはリボザイム遺伝子標的化実験に用いる濃度よりも数オーダー低い濃度のｓｉＲＮＡが有効であることを示す。
上記方法は、ＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ配列の推論およびかかるｓｉＲＮＡのイオンビトロサプレッションへの使用の両方のための方法を提供する。よく知られたインビボトランスフェクションまたは遺伝子治療トランスフェクション法を用い、同じｓｉＲＮＡを用いてインビボサプレッションを行ってもよい。
アンチセンス核酸
本発明のもう一つの態様は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、相同体または誘導体、とハイブリダイズ可能なまたは相補的な単離アンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的な(例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード化鎖に相補的な、またはｍＲＮＡ配列に相補的な)ヌクレオチド配列を含む。特別な態様では、少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０、または５００のヌクレオチドまたは全ＮＯＶＸコード化鎖に相補的な配列、またはそれらの一部のみにを含むアンチセンス核酸分子を提供する。配列番号２ｎ（ｎは１〜３８の整数である）のあるＮＯＶＸタンパク質のフラグメント、相同体、誘導体および類似体をコードする核酸分子、または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）のあるＮＯＶＸ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸を加えて提供する。
一つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、あるＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード化鎖の「コード化領域」に対するアンチセンスである。用語「コード化領域」は、アミノ酸残基に翻訳するコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す。もう一つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード化鎖の「非コード化領域」に対するアンチセンスである。用語「非コード化領域」は、アミノ酸に翻訳しないコード化領域に隣接する５'配列および３'配列を指す(即ち、５'非翻訳領域および３'非翻訳領域とも呼ぶ)。
本明細書に開示するＮＯＶＸタンパク質をコードするコード化鎖の配列を与えると、本発明のアンチセンス核酸をWatsonとCrickまたはHoogsteenの塩基対の規則にしたがってデザインし得る。アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの全コード化領域と相補的であり得るが、さらに好ましくは、ＮＯＶＸのｍＲＮＡのコード化または非コード化領域の一部のみに対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さ約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸を、当該分野において公知の手順を用いる化学合成または酵素ライゲーション反応を用いて構築し得る。例えば、アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加またはアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成する二本鎖の物理的安定性を増加するようデザインした様々に修飾したヌクレオチドを用いて、化学合成し得る(例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジンで置換したヌクレオチドを使用しうる)。
アンチセンス核酸を作成に使用し得る修飾ヌクレオチドの例として以下のものを挙げる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２,２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、５−メトキシウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、５−メチル−２−チオウラシル、３−(３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル)ウラシル、(ａｃｐ３)ｗ、および２、６−ジアミノプリン。これに代えて、アンチセンス核酸を、核酸がアンチセンスの配向(即ち、挿入した核酸から転写したＲＮＡが、興味ある標的核酸に対するアンチセンスの配向であり、以下の小節でさらに説明する)においてサブクローニングする発現ベクターを使用して生物学的に生産し得る。
本発明のアンチセンス核酸分子を、それらがあるＮＯＶＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズまたは結合し、それにより(例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより)タンパク質発現を阻害するように典型的に対象に投与するか、または組織で作成する。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成する従来のヌクレオチドの相補性によるものでもあり得る。または、例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸の場合には、二本鎖の大溝での特異的相互作用を介するものであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例として、組織部位への直接の注射を挙げる。これに代えて、アンチセンス核酸分子を、選択した細胞標的へ修飾しそこで全身性に投与し得る。例えば、全身性投与のために、アンチセンス分子を、選択した細胞表面上に発現する受容体または抗原に特異的に結合するように(例えば、ペプチドにアンチセンス核酸分子を連結させることまたは細胞表面受容体または抗原に結合する抗体により)修飾し得る。アンチセンス核酸分子をまた、本明細書に説明するベクターを用いて細胞に送達し得る。十分な核酸分子を送達するために、アンチセンス核酸分子を強力なｐｏｌＩＩプロモーターまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの調節下に置くベクター構造が好ましい。
なおもう一つの実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、これは通常のβユニットとは反対で鎖が互いに並行に走行する。例えば、Gaultier, et al., 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641を参照されたい。アンチセンス核酸分子はまた、２'−ｏ−メチルリボヌクレオチド(例えば、Inoue, et al. 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148を参照)またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体(例えば、Inoue, et al., 1987. FEBS Lett. 215: 327-330を参照)を含み得る。
リボザイムおよびＰＮＡ部分
核酸の修飾は、非限定的な例として、修飾した塩基、および糖リン酸主鎖を修飾または誘導した核酸を挙げる。これらの修飾を少なくとも部分的に行い、例えば対象への治療応用において核酸へ結合するアンチセンスとして使用し得るように修飾した核酸の化学的安定性を増強する。
１の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらが相補的領域を有するｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断する能力のあるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒活性ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム(例えば、Haselhoff and Gerlach 1988. Nature 334: 585-591に記載されているようなハンマーヘッドリボザイム)を使用して、ＮＯＶＸのｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによりＮＯＶＸのｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＮＯＶＸをコードする核酸に対する特異性を有するリボゾームは、本明細書に開示するあるＮＯＶＸｃＤＮＡのヌクレオチド配列(即ち、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜３８の整数である）)に基づいてデザインし得る。例えば、その中で活性部位のヌクレオチド配列がＮＯＶＸをコードするｍＲＮＡ中で切断し得るヌクレオチド配列に相補的であるTetrahymenaＬ−１９ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築し得る。例えば、Cech, et al.の米国特許第４,９８７,０７１号およびCech, et al.の米国特許第５,１１６,７４２号を参照されたい。ＮＯＶＸ ｍＲＮＡをまた、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択するのに使用し得る。例えば、Bartel et al., (1993) Science 261:1411-1418を参照されたい。
一方、ＮＯＶＸ遺伝子発現は、ＮＯＶＸ核酸の調節領域(例えば、ＮＯＶＸプロモーターおよび／またはエンハンサー)に相補的なヌクレオチド配列を標的とすることで阻害し、標的細胞中のＮＯＶＸ遺伝子の転写を阻止するトリプルヘリカル構造を形成し得る。例えば、Helene, 1991. Anticancer Drug Des. 6: 569-84; Helene, et al. 1992. Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27-36; Maher, 1992. Bioassays 14: 807-15を参照されたい。
種々の実施形態において、ＮＯＶＸ核酸を塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格部分において修飾し、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解度を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸を生成し得る。例えば、Hyrup, et al., 1996. Bioorg Med Chem 4: 5-23を参照されたい。本明細書において使用する用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格を擬似ペプチド骨格で置換し、４個の核酸塩基のみを保持する核酸模倣体(例えばＤＮＡ模倣体)を指す。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることを示す。ＰＮＡオリゴマーの合成を、Hyrup, et al., 1996. supra; Perry-O'Keefe, et al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-14675に記載されているように、標準固相ペプチド合成プロトコールを用いて実施し得る。
ＮＯＶＸのＰＮＡを治療的応用および診断的応用に使用し得る。例えば、ＰＮＡを、例えば転写または翻訳停止を誘導することまたは複製を阻害することにより、遺伝子発現の配列特異的調整のためのアンチセンスまたは抗原薬剤として使用し得る。ＮＯＶＸのＰＮＡはまた、例えば、遺伝子中の単塩基対変異の分析(例えば、ＰＣＲ固定を指示するＰＮＡ；他の酵素、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、との組合せで使用し得る人工的制限酵素として(Hyrup, et al., 1996.supraを参照)；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマーとして(Hyrup, et al., 1996, supra; Perry-O'Keefe, et al., 1996. supraを参照))にも使用し得る。
もう一つの実施形態では、ＮＯＶＸのＰＮＡを修飾して、例えば、ＰＮＡに親油性なまたは他の補助的な基をＰＮＡに結合することにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの生成により、またはリポソームまたは当該分野において公知の他の薬剤送達技術の使用によりそれらの安定性または細胞への取り込みを増強し得る。例えば、ＰＮＡとＤＮＡの有益な性質を結合し得るＮＯＶＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成し得る。かかるキメラは、ＤＮＡ認識酵素(例えば、ＲＮａｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ)がＤＮＡ部分と相互作用し、一方でＰＮＡ部分が結合高親和性および結合高特異性を提供することを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基結合、ヌクレオチド塩基間の結合数および配向について選択した適当な長さのリンカーを使用して結合し得る(Hyrup, et al., 1996. supraを参照)。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成を、Hyrup, et al., 1996. supra および Finn, et al., 1996. Nucl Acids Res 24: 3357-3363に記載のように実施し得る。例えば、ＤＮＡ鎖を、標準ホスホラミダイトカップリング化学反応を使用して固相支持体上で合成し得る。そして修飾したヌクレオシド類似体、例えば、5'-(4-メトキシトリチル)アミノ-5'-デオキシチミジンホスホラミダイトをＰＮＡとＤＮＡの５'末端間で使用し得る。例えば、Mag, et al., 1989. Nucl Acid Res 17: 5973-5988を参照されたい。次いで、ＰＮＡモノマーを段階的にカップリングし、５'ＰＮＡセグメントおよび３'ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する。例えば、Finn, et al., 1996. supraを参照されたい。これに代えて、キメラ分子を５'ＤＮＡセグメントおよび３'ＰＮＡセグメントで合成することもできる。例えば、Petersen, et al., 1975. Bioorg. Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124を参照されたい。
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような添付群(例えば、インビボにおいて宿主細胞レセプターを標的とするため)、または細胞膜(例えば、Letsinger, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556; Lemaitre, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652; ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照)または血液脳関門(例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照)を横切る輸送を促進する薬剤を含み得る。加えて、オリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤(例えば、Krol, et al., 1988. BioTechniques 6:958-976を参照)または挿入剤(例えば、Zon, 1988. Pharm. Res. 5: 539-549を参照)で修飾し得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドを、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤等と複合し得る。
ＮＯＶＸポリペプチド
本発明に従うポリペプチドは、配列が配列番号２ｎ（ｎは１〜３８の整数である）において提供するＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含む。本発明はまた、その任意の残基が、配列番号２ｎ（ｎは１〜３８の整数である）に示す対応する残基から変換し得る一方で、そのＮＯＶＸ活性および生理機能を保持するタンパク質、またはそれらの機能的フラグメントを依然コードする変異タンパク質または変種タンパク質を含む。
一般に、ＮＯＶＸ様機能を保持するあるＮＯＶＸ変異体は、配列中の特定部位の残基を他のアミノ酸で置換する任意の変異体を含み、親タンパク質の２個の残基間にもう一残基または複数残基を挿入する可能性ならびに親配列から１個またはそれ以上の残基を欠失する可能性をさらに含む。任意のアミノ酸の置換、挿入または欠失を本発明に包含する。好ましい状況では、置換は上で定義した保存的置換である。
本発明の一つの態様は、単離ＮＯＶＸタンパク質およびそれらの生物活性部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、類似体、または相同体に関する。また、抗ＮＯＶＸ抗体産生用の免疫源としての使用に適当なポリペプチドフラグメントも提供し得る。一つの実施形態では、細胞または組織供給源から標準タンパク質精製技術を使用する適当な精製スキームにより天然のＮＯＶＸタンパク質を単離し得る。もう一つの実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質を、組換えＤＮＡ技術により生産する。組換え発現に代えて、あるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドを、標準ペプチド合成技術を使用して化学的に合成し得る。
「単離」または「精製」ポリペプチドまたはタンパク質またはそれらの生物活性部分は、ＮＯＶＸタンパク質の由来する細胞供給源または組織供給源の細胞性物質または他の混入タンパク質を実質的に含まず、または化学的に合成したと際化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞性物質が実質的に含まれていない」という用語は、タンパク質を単離または組換え的に生産した元の細胞の細胞成分からタンパク質を分離したＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。一つの実施形態では、「細胞原料が実質的に含まれていない」という用語は、約３０％(乾燥重量比)未満の非ＮＯＶＸタンパク質(ここでは「混入タンパク質」とも言う)、さらに好ましくは約２０％未満の非ＮＯＶＸタンパク質、なおさらに好ましくは約１０％未満の非ＮＯＶＸタンパク質、そして最も好ましくは約５％未満の非ＮＯＶＸタンパク質を有するＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。ＮＯＶＸタンパク質またはそれらの生物活性部分を組換え的に生産する際には、それはまた、好ましくは培地を実質的に含まず、即ち、培地はＮＯＶＸタンパク質標本の容積の約２０％未満、さらに好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは５％未満を表す。
「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、ＮＯＶＸタンパク質の標本を含み、ここでタンパク質を、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離する。一つの実施形態では、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、約３０％未満(乾燥重量比)の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、さらに好ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、なおさらに好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、および最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を有するＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。
ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＮＯＶＸタンパク質より少ないアミノ酸を含有しＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの活性を示すＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列(例えば、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜３８の整数である)に十分相同なアミノ酸配列またはＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列)に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。典型的に、生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。あるＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば１０、２５、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸残基の長さのポリペプチドであり得る。
さらに、タンパク質の他の領域が欠失した他の生物学的に活性な部分を、組換え技術で調製しそして天然のＮＯＶＸタンパク質の機能活性の一つまたはそれ以上について評価し得る。
一つの実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜３８の整数である)に示すアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜３８の整数である)に実質的に相同であり、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜３８の整数である)のタンパク質の機能活性を保持するが、なお以下に詳述するように天然の対立遺伝子の変異体または変異に因りアミノ酸配列を異にする。従って、もう一つの実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜３８の整数である)のアミノ酸配列と少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含み、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜３８の整数である)のＮＯＶＸタンパク質の機能活性を保持するタンパク質である。
２個またはそれ以上の配列間の相同性の測定
２個のアミノ酸配列または２個の核酸の相同性の割合を測定するために、配列を至適な比較目的でアラインメント(例えば、ギャップを、２番目のアミノ酸または核酸配列と至適なアラインメントになるように第１のアミノ酸配列または核酸配列の中に入れ得る)。対応するアミノ酸部位または核酸部位におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを次いで比較する。第１の配列の部位を、第２の配列の対応する部位と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占めると、両分子はその部位において相同である(即ち、本明細書において使用するように、アミノ酸または核酸の「相同性」はアミノ酸または核酸の「同一性」と同等である)。
核酸配列の相同性を、２個の配列間の同一性の程度として測定し得る。相同性は、ＧＣＧプログラムパッケージに提供されるＧＡＰソフトウエアのような、当該分野において公知のコンピュータープログラムを使用して測定し得る。Needleman and Wunsch, 1970. J Mol Biol 48: 443-453を参照されたい。以下のセッティング：ＧＡＰ生成ペナルティー５．０またはＧＡＰ伸長ペナルティー０．３で、ＧＣＧ ＧＡＰソフトウエアを使用して、上述の類似核酸配列のコード化領域は、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜３８の整数である)に示すＤＮＡ配列のＣＤＳ(コード化)部分と好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性の程度を示す。
用語「配列同一性」は、２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列が比較の特定領域に亘って残基毎に同一である程度を指す。用語「配列同一性の百分率」を、比較の領域に亘って至適にアラインメントした２個の配列を比較し、一致部位の数を求め同一の核酸塩基(例えば、核酸の場合には、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列中に存在する部位数を測定して、一致部位の数を比較領域の部位の総数(即ち、ウインドウサイズ)で除し、商を１００倍して、配列同一性の百分率を得ることにより計算しうる。本明細書において使用する用語「実質的同一性」は、ポリヌクレオチド配列の特性を意味する。ここでポリヌクレオチドは、比較領域に亘って標準配列と比較して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、およびしばしば９０〜９５％の配列同一性、さらに通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
キメラタンパク質または融合タンパク質
本発明はまた、ＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書において使用するように、あるＮＯＶＸ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＮＯＶＸポリペプチドに作動し得るように連結したあるＮＯＶＸポリペプチドを含む。「ＮＯＶＸポリペプチド」は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜３８の整数である)のあるＮＯＶＸタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す一方で、「非ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質と実質的に相同でないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えば、ＮＯＶＸタンパク質と異なり同一または異なる生物由来であるタンパク質を指す。あるＮＯＶＸ融合タンパク質内では、ＮＯＶＸポリペプチドはあるＮＯＶＸタンパク質の全部または一部に対応し得る。一つの実施形態では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質はあるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの生物学的に活性な部分を含む。もう一つの実施形態では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質は、あるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも二つの生物学的に活性な部分を含む。なおもう一つの実施形態では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質は、あるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも三つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質内では、用語「作動し得るように連結した」は、ＮＯＶＸポリペプチドおよび非ＮＯＶＸポリペプチドがお互いにインフレームで融合していることを示すものとする。非ＮＯＶＸポリペプチドを、ＮＯＶＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合し得る。
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質である。ここでＮＯＶＸ配列がＧＳＴ(グルタチオンＳ転移酵素)のＣ末端に融合する。そのような融合タンパク質は、組換えＮＯＶＸポリペプチドの精製を容易にし得る。
もう一つの実施形態では、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種のシグナル配列を含有するあるＮＯＶＸタンパク質である。特定の宿主細胞(例えば、哺乳類の宿主細胞)において、ＮＯＶＸの発現および／または分泌を異種シグナル配列の使用を介して増強し得る。
なおもう一つの実施形態では、融合タンパク質は、ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質である。ここでＮＯＶＸ配列は、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバー由来の配列と融合している。本発明のＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を、医薬組成物中に組み入れ、対象に投与し、細胞上でのＮＯＶＸリガンドとあるＮＯＶＸタンパク質との相互作用を阻害し、それによりインビボでのＮＯＶＸ仲介性の情報伝達を抑制し得る。ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を使用して、あるＮＯＶＸと同種のリガンドの生物学的利用性に影響を及ぼし得る。ＮＯＶＸリガンド／ＮＯＶＸ相互作用の阻害は、増殖および分化障害の処置ならびに細胞生存を調整(例えば増強または阻害)のために治療上有用であり得る。さらに、本発明のＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を使用して、対象中で抗ＮＯＶＸ抗体を生産し、ＮＯＶＸリガンドを精製し、そしてスクリーニングアッセイにおいて、ＮＯＶＸのあるＮＯＶＸリガンドとの相互作用を阻害する分子を同定し得る。
本発明のＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を、標準組換えＤＮＡ技術により生産し得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、例えば、連結のための平滑末端化または互い違い末端を用いること、適切な末端を提供するための制限酵素による切断、適切に粘着末端の充填、望ましくない結合を防止するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的結合などの従来の方法にしたがってインフレームで一緒に連結する。もう一つの実施形態では、融合遺伝子を、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術により合成し得る。これに代えて、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２個の連続する遺伝子フラグメント間で相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて行い、それらを引き続いてアニールし、再増幅して、キメラ遺伝子配列を生成し得る(例えば、Ausubel, et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992を参照)。さらに、融合部分を既にコードする多くの発現ベクター(例えば、ＧＳＴポリペプチド)が市販されている。ＮＯＶＸをコードする核酸を、融合部分がＮＯＶＸタンパク質にインフレームで結合するように、そのような発現ベクターの中にクローン化することができる。
ＮＯＶＸアゴニストおよびアンタゴニスト
本発明はまた、ＮＯＶＸアゴニスト(即ち、ミメティクス)またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の変異体を含む。ＮＯＶＸタンパク質の変異体は、突然変異(例えば、ＮＯＶＸタンパク質の点突然変異または切断)により生成し得る。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質と実質的に同一な生物学的諸活性またはそのサブセットを保持する。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質を含む、細胞の情報伝達カスケードの下流または上流メンバーに拮抗的に結合することにより、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質の一つまたはそれ以上の活性を阻害し得る。従って、特異的な生物学的作用を、限定された機能を有する変異体での処置により発揮することができる。一つの実施形態では、天然に存在する形のタンパク質の生物学的活性のサブセットを有する変異体による対象の処置は、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質による処置と比べて対象における副作用がより少ない。
ＮＯＶＸアゴニスト(即ちミメティック)またはＮＯＶＸアンタゴニストのどちらかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の変異体は、ＮＯＶＸタンパク質の突然変異体(例えば切断突然変異体)の組換えライブラリーをＮＯＶＸタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることにより同定し得る。一つの実施形態では、ＮＯＶＸ変異体の変化に富むライブラリーを、核酸レベルでの組換え（コンビナトリアル）変異誘発によって生成し、そして変化に富む遺伝子ライブラリーによりコードする。ＮＯＶＸ変異体の変化に富むライブラリーは、例えば、潜在的ＮＯＶＸ配列の縮重したセットが個別のポリペプチドとして発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することにより、またはこれに代えて、その中にＮＯＶＸ配列のセットを含有するさらに大きい融合タンパク質(例えば、ファージディスプレー用に)のセットとして、生成し得る。縮重したオリゴヌクレオチド配列から潜在的ＮＯＶＸ変異体のライブラリーを使用して生成し得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成機により行い、次いで、合成遺伝子を適切な発現ベクター内に連結し得る。遺伝子の縮重セットの使用は、潜在的ＮＯＶＸ配列の所望のセットをコードする配列の全ての、一つの混合物の提供を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当該分野内において周知である。例えば、Narang, 1983. Tetrahedron 39: 3; Itakura, et al., 1984. Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura, et al., 1984. Science 198: 1056; Ike, et al., 1983. Nucl. Acids Res. 11: 477を参照されたい。
ポリペプチドライブラリー
加えて、ＮＯＶＸタンパク質コード化配列のフラグメントライブラリーを用いて、ＮＯＶＸタンパク質の変異体のスクリーニングおよびそれに続く選択のためにＮＯＶＸフラグメントの変化に富む集団を生成し得る。一つの実施形態では、コード化配列フラグメントのライブラリーを、あるＮＯＶＸコード化配列の二本鎖ＰＣＲ断片を、ニッキングが分子あたりたった約１回生じる条件でヌクレアーゼ処置し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを異なるニッキング産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼの処理で再生成した二重らせんから単鎖部分を除去し、そして得られたフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することにより、生成し得る。この方法によって、ＮＯＶＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端または内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導し得る。
点突然変異または切断により作成した組換え（コンビナトリアル）ライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする、および選択した性質を有する遺伝子産物のためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする種々の技術は、当該分野において公知である。かかる技術は、ＮＯＶＸタンパク質の組換え（コンビナトリアル）突然変異誘発により生成した遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするハイスループット分析に適用可能な最も広く使用する技術は、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、そして、所望の活性の検出がその生産物を検出する遺伝子をコードするベクターの単離を容易する条件で、組換え（コンビナトリアル）遺伝子を発現することを典型的に含む。ライブラリー中の機能的変異の頻度を増大する新しい技術である繰り返しアンサンブル変異誘発(ＲＥＭ)をスクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、ＮＯＶＸ変異体を同定し得る。例えば、Arkin and Yourvan, 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave, et al., 1993. Protein Engineering 6:327-331を参照されたい。
抗ＮＯＶＸ抗体
ＮＯＶＸタンパク質、またはＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに対する抗体は本発明に含まれる。本明細書において使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン(Ｉｇ)分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原に特異的に結合する(と免疫学的に反応する)抗原結合部位を含有する分子を指す。かかる抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ'およびＦ(ａｂ')2フラグメントならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げるが、これらに限定しない。一般に、ヒトから得る抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのクラスのいずれかに関し、これらは分子中に存在するＨ鎖の性質によりお互いに異なる。特定のクラスは、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2およびその他のような、サブクラスを同様に有する。さらに、ヒトにおいて、Ｌ鎖は、ｋ鎖またはλ鎖であり得る。本明細書における抗体への参照は、ヒト抗体種の全てのそのようなクラス、サブクラスおよびタイプへの参照を含む。
抗原として使用することを意図した本発明の単離タンパク質、またはその部分またはフラグメントを免疫源として使用しポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製の標準的技術を使用し、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成し得る。全長のタンパク質を使用し得るが、またはこれに代えて、本発明は、免疫源として使用するための抗原の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜３８の整数である)に示すアミノ酸配列のような全長タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも６個のアミノ酸残基を含み、そしてペプチドに対して育成した抗体が、エピトープを含有する全長タンパク質または任意のフラグメントと特異的な免疫複合体を形成するようそのエピトープを包含する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、または少なくとも１５個のアミノ酸残基、または少なくとも２０個のアミノ酸残基、または少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドにより包含する好ましいエピトープは、表面に局在するタンパク質領域であり；これらは通常親水性領域である。
本発明の特定の実施形態において、抗原性ペプチドにより包含される少なくとも一つのエピトープは、タンパク質の表面に局在するＮＯＶＸ領域、例えば、親水性領域である。ヒトＮＯＶＸタンパク質配列の疎水性分析は、ＮＯＶＸポリペプチドのどの領域が特に親水性であり、したがって抗体生産を目標とするために有用な表面残基をコードする可能性が高いかを示す。抗体生産を目標とするための手段として、親水性および疎水性領域を示すハイドロパシープロットを、例えば、どちらもフーリエ変換を用いるかまたは用いないで、Kyte DoolittleまたはHopp Woods方法を含む当該分野において周知の任意の方法で生成し得る。例えば、Hopp and Woods, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828; Kyte and Doolittle 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-142(いずれも全体的な出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体内の一つまたはそれ以上のドメインに特異的である、抗体はまた、本明細書において提供する。
用語「エピトープ」には、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合し得る全てのタンパク質決定基(部位）が含まれる。エピトープ様決定基（部位）は、通常、化学的に活性な分子（例えば、アミノ酸もしくは糖側鎖など）表面群を含み、通常、特定の三次元的構造特性、に加えて特定電荷特性を示す。あるＮＯＶＸポリペプチドまたはそれらのフラグメントは、少なくとも１つの抗原エピトープを持つ。アッセイ（例えば、当業者には既知のラジオリガンド結合アッセイまたは類似のアッセイ）によって測定されるような、平衡結合定数ＫＤが、＜１μＭ、好ましくは＜１００ｎＭ、より好ましくは＜１０ｎＭ、もっとも好ましくは＜１００ｐＭ〜約１ｐＭである場合、本発明の抗ＮＯＶＸ抗体は、抗原ＮＯＶＸに特異的に結合するという。
本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、類似体、相同体、またはオーソログを、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の生成において免疫源として利用することができる。
当該分野内において公知の種々の方法を、本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、類似体、相同体、またはオーソログ、に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の生産に使用し得る(例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。これらの抗体の幾つかについて以下に考察する。
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体の生産には、種々の適当な宿主動物(例えばウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳類)を、天然タンパク質、その合成変異体、または前述の誘導体を1回またはそれ以上注射して免疫を行い得る。適切な免疫原性製剤としては、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を代表する化学的に合成したポリペプチド、または組換え的に発現した免疫原性タンパク質を挙げ得る。さらに、タンパク質を、免疫する哺乳類において免疫原性であることが知られている第２のタンパク質と複合体を形成してもよい。かかる免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンおよび大豆トリプシン阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。製剤はさらにアジュバントを含有し得る。免疫応答を増大するために使用する種々のアジュバントとしては、フロイントの(完全および不完全)アジュバント、鉱物ゲル(例えば水酸化アルミニウム)、界面活性剤(例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノール等)、カルメット-ゲラン杆菌およびコリネバクテリウム-パルヴムのようなヒトに使用可能なアジュバント、または類似の免疫促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用し得るアジュバントのさらに別な例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント(モノホスホリルリピドＡ、合成ジコリノミコール酸トレハロース)を挙げ得る。
免疫原性タンパク質に対するポリクローナル抗体を、哺乳類から(例えば、血液から)単離して、免疫血清中の主としてＩｇＧ画分を提供するプロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーのような、公知の技術を用いてさらに精製し得る。引き続いて、またはこれに代えて、求める免疫グロブリンの標的である特異的抗原、またはそのエピトープ、をカラム上に固相化して、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製を、例えば、D. Wilkinson (The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28)により考察する。
モノクローナル抗体
本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」(ＭＡｂ)または「モノクローナル抗体組成物」は、特徴的なＬ鎖遺伝子産物および特徴的なＨ鎖遺伝子産物より成る抗体分子の１分子種のみを含有する抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域(ＣＤＲ)は、集団の全ての分子において同一である。従って、ＭＡｂは、それに対する特徴的な結合活性を特徴とする抗原の特定のエピトープと免疫反応する能力がある抗原結合部位を含有する。
モノクローナル抗体を、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)により記載するような、ハイブリドーマ方法を用いて調製し得る。ハイブリドーマ方法では、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を典型的に免疫化剤で免疫することにより、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生産するかまたは生産する能力のあるリンパ球を誘発する。これに代えて、リンパ球をインビトロで免疫することができる。
免疫化剤としては典型的に、タンパク質抗原、それらのフラグメントまたはその融合タンパク質が挙げられる。一般的に、ヒト由来の細胞を所望するならば、末梢血リンパ球を使用し、またはヒト以外の哺乳類源を所望するならば、脾臓細胞またはリンパ節細胞を使用するかのいずれかである。次いで、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて不死化細胞株と融合し、ハイブリドーマ細胞を生成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103）。不死化細胞株は通常、形質転換した哺乳類細胞、特にげっ歯類、ウシまたはヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株を使用し得る。ハイブリドーマ細胞を、融合していない不死化細胞の増殖または生存を阻害する一つまたはそれ以上の物質を好ましくは含有する適切な培地中で培養し得る。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ)を欠くならば、ハイブリドーマ用の培地は典型的に、その物質がＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を阻止する、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む(“ＨＡＴ培地”)。
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択した抗体生産細胞による抗体の高レベル発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性のあるものである。さらに好ましい不死化細胞株は、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Californiaおよびthe American Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから入手し得るマウス骨髄腫細胞株である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の生産用に記載する（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63）。
ハイブリドーマ細胞を培養する培地を次いで、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイし得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産したモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降によりまたはラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)または酵素結合免疫吸着検査法(ＥＬＩＳＡ)のような、インビトロ結合アッセイによって測定する。そのような技術またはアッセイは当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性を、例えば、Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のScatchard分析により測定し得る。標的抗原に対して高度の特異性および高い結合親和性を有する抗体を同定することは、モノクローナル抗体の治療的応用において特に重要な目的である。
所望のハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈法でサブクローン化して、標準方法で増殖し得る(Goding,1986)。この目的のための適当な培地としては、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)およびＲＰＭＩ−１６４０培地を挙げ得る。これに代えて、ハイブリドーマ細胞を哺乳類中で腹水としてインビボで増殖し得る。
サブクローンにより分泌したモノクローナル抗体を、培地または腹水から、例えば、プロテイン−Ａセファローズ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手順により単離または精製し得る。
モノクローナル抗体をまた、米国特許第４,８１６,５６７号に記載するような組換えＤＮＡ方法により作り得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を使用して(例えば、マウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力のある、オリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)容易に単離し配列決定し得る。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離すれば、ＤＮＡを発現ベクター中に配置し、それを次いでサルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、またはそうしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入して、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を取得し得る。ＤＮＡをまた、例えば相同なマウスの配列の代わりにヒトのＨ鎖およびＬ鎖の定常ドメインに対するコード化配列を置換することにより(米国特許第４,８１６,５６７号; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994))、または非免疫グロブリンポリペプチドに対するコード化配列の全部または一部を免疫グロブリンのコード化配列に共有結合することにより、修飾し得る。そのような非免疫グロブリンポリペプチドを、本発明の抗体の定常ドメインに対して置換することができるか、または本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに対して置換して、キメラ２価抗体を創成することができる。
ヒト化抗体
本発明のタンパク質抗原に対する抗体はさらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含む。これらの抗体は、投与した免疫グロブリンに対してヒトによる免疫応答を惹き起こすことなくヒトに投与するのに適している。抗体のヒト化型は、主としてヒト免疫グロブリンの配列より成って、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント(Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２または抗体の他の抗原結合サブ配列)である。ヒト化は、Winterまたは共同研究者(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))の方法にしたがって、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列で置換することにより、実施し得る。(また、米国特許第５,２２５,５３９号を参照)場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレーム枠の残基を対応する非ヒト残基により置換し得る。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体またはＣＤＲまたはフレーム枠配列にも見出さない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は少なくとも一つ、また典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ここでＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そしてフレームワーク領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は至適にはまた、免疫グロブリンの通常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含む(Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; および Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992))。
ヒト抗体
完全なヒト抗体は、ＣＤＲを含むＬ鎖およびＨ鎖の全配列がヒトの遺伝子より生じる、抗体分子に本質的に関する。かかる抗体は本明細書では、「ヒト抗体」または「完全なヒト抗体」と呼称する。ヒトモノクローナル抗体を、トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72を参照)およびＥＢＶハイブリドーマ技術により調製し、ヒトモノクローナル抗体を生産し得る(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照)。ヒト化モノクローナル抗体を、本発明の実施に利用し得て、そしてヒトハイブリドーマを用いて(Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030を参照)またはヒトＢ細胞をインビトロでEpstein Barrウイルスにより形質転換することによって(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照)生産し得る。
加えて、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991))を含むさらに別な技術を用いて生産し得る。同様に、ヒト抗体を、ヒト免疫グロブリンの遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、マウスに導入することによって作り得る。ここで内在性免疫グロブリン遺伝子を部分的にまたは完全に不活化する。チャレンジによって、遺伝子再配列、アセンブリー、および抗体レパトリ−を含む全ての面でヒトにおいて見られるのと非常に良く似たヒト抗体生産を観察する。このアプローチは、例えば、米国特許第５,５４５,８０７号; ５,５４５,８０６号; ５,５６９,８２５号; ５,６２５,１２６号; ５,６３３,４２５号; ５,６６１,０１６号、ならびに Marks et al. (Bio/Technology 10, 779-783 (1992))、Lonberg et al. (Nature 368 856-859 (1994))、Morrison ( Nature 368, 812-13 (1994))、Fishwild et al,( Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996))、Neuberger (Nature Biotechnology 14, 826 (1996))、 Lonberg and Huszar (Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995))に記載されている。
ヒト抗体を、抗原によるチャレンジに応答して動物の内在性抗体ではなく完全なヒト抗体を生産するように修飾したトランスジェニック非ヒト動物を用いて、付加的に生産し得る(ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０２６０２を参照)。非ヒト宿主中の免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖をコードする内在性遺伝子を無能にし、そしてヒト免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖をコードする活性遺伝子座を宿主のゲノムの中に挿入する。ヒトの遺伝子を、例えば、必要なヒトＤＮＡセグメントを含有する酵母の人工染色体を用いて組み入れ得る。全ての所望の修飾を提供する動物は次いで、修飾の全相補物より少ない相補物を含有する中間トランスジェニック動物を交雑育種することにより子孫として得られる。そのような非ヒト動物の好ましい実施形態はマウスであり、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６号に開示されているようにXenomouse[登録商標]と呼称する。この動物は、完全なヒト免疫グロブリンを分泌する、Ｂ細胞を生産する。抗体は、興味のある免疫原で免疫後、動物から、例えば、ポリクローナル抗体の標本として、直接得ることも、またはこれに代えて、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマのような、動物由来の不死化Ｂ細胞から得ることもできる。これに加えて、ヒトの可変領域を持つ免疫グロブリンをコードする遺伝子を回収し、発現して、抗体を直接得ることもでき、またはさらに修飾して、例えば、単鎖Ｆｖ分子のような抗体の類似体を得ることができる。
内在性免疫グロブリンのＨ鎖の発現を欠失する、マウスとして例証した、非ヒト宿主を生産する方法の実施例は、米国特許第５,９３９,５９８号、に開示されている。それは、遺伝子座の再配列を阻止するためにそして再配列した免疫グロブリンＨ鎖の遺伝子座の転写物生成を阻止するために、胚性幹細胞中の少なくとも一つの内在性Ｈ鎖の遺伝子座からＪセグメントを欠失させ、この欠失は選択マーカーをコードする遺伝子を含有するターゲティングベクターによりもたらされ、そして体細胞または胚細胞が選択マーカーをコードする遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを胚性幹細胞から生産することを含む方法により得られる。
ヒト抗体のような興味のある抗体を生産する方法は、米国特許第５,９１６,７７１号、に開示されている。それは、Ｈ鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを一つの培養哺乳類宿主細胞に導入すること、Ｌ鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターをさらに別な哺乳類宿主細胞に導入すること、および２個の細胞を融合してハイブリッド細胞を生成することを含む。ハイブリッド細胞は、Ｈ鎖およびＬ鎖を含有する抗体を発現する。
この手順のさらなる改良において、免疫原上の臨床的に関係のあるエピトープを同定する方法、および関係のあるエピトープに高親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択する相関的方法が、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５３０４９に開示されている。
Ｆａｂフラグメントおよび単鎖抗体
本発明にしたがって、技術を、本発明の抗原タンパク質に特異的な単鎖抗体の生産に適合することができる(例えば米国特許第４,９４６,７７８号を参照)。加えて、方法を、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に適合し(例えば、Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281、を参照)、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能し得る。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含有する抗体フラグメントを、当該分野において公知の技術により生産し得て、それは、(i)抗体分子のペプシン消化により生産するＦ(ａｂ')２フラグメント；(ii)Ｆ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド架橋を還元して得られるＦａｂフラグメント；(iii)抗体分子をパパインおよび還元剤で処置して生成するＦａｂフラグメント；ならびに(iv)Ｆｖフラグメントを含むが、これらに限定されない。
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトのまたはヒト化の抗体である。本明細書においては、結合特異性の一つは本発明の抗原タンパク質に対するものである。２番目の結合標的は、任意の他の抗原であって、有利に細胞表面タンパク質または受容体または受容体サブユニットである。
二重特異性抗体の作成方法は当該分野において公知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え生産は、２個のＨ鎖が異なる特異性を有する２個の免疫グロブリンＨ鎖／Ｌ鎖対の共発現に基づく(Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖のランダムな組合せのため、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生産し、そのうちの一つだけが正しい２重特異性構造を有する。正しい分子の精製は通常、アフィニティークロマトグラフィーにより行う。類似の方法が、１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ９３／０８８２９およびTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性を持つ抗体の可変ドメイン(抗体−抗原結合部位)を、免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合し得る。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリンＨ鎖の定常ドメインと共にある。少なくとも融合の一つの中に存在するＬ鎖結合に必要な部位を含有する第１のＨ鎖通常領域(ＣＨ１)を有することが好ましい。免疫グロブリンＨ鎖の融合をコードするＤＮＡ、および所望ならば、免疫グロブリンＬ鎖を別々の発現ベクター中に挿入し適当な宿主生物中に形質移入する。二重特異性抗体のさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
ＷＯ９６／２７０１１に記載されたもう一つのアプローチによれば、一対の抗体分子間の境界面を改変して、組換え細胞培地から回収するヘテロダイマーの百分率を最大にし得る。好ましい境界面は、抗体の定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の境界面の一つまたはそれ以上の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖(例えばチロシンまたはトリプトファン)で置換する。大きな側鎖(複数を含む)と同一または類似のサイズの代償的な「空隙」を、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの(例えばアラニンまたはスレオニン)で置換することにより第２の抗体分子の境界面に生成する。これは、ホモダイマーのような他の望ましくない最終産物以上にヘテロダイマーの収量を増加する機構を提供する。
二重特異性抗体を、抗体の全長または抗体フラグメント(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成する技術は文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体フラグメントを、化学的結合を用いて調製することができる。Brennan et al., Science 229:81 (1985)は、完全な抗体をタンパク質分解酵素で切断してＦ(ａｂ')２フラグメントを生成する手順を記載する。これらのフラグメントをジチオール錯化剤の亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接するジチオールを安定化させて、分子間ジスルフィド形成を阻止する。次いで、生成したＦａｂ'フラグメントをチオニトロ安息香酸(ＴＮＢ)誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ'−ＴＮＢの一つをメルカプトエチルアミンとの還元によりＦａｂ'−チオールに再変換し、そして等量の他のＦａｂ'−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を生成する。生成した二重特異性抗体を酵素の選択的固定化剤として使用し得る。
これに加えて、Ｆａｂ'フラグメントを大腸菌から直接回収して、化学的にカップリングして、二重特異性抗体を生成し得る。Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)は、完全にヒト化した二重特異性抗体のＦ(ａｂ')２分子の生産を記載している。それぞれのＦａｂ'フラグメントを大腸菌から別々に分泌し、インビトロで指向性化学カップリングに供して、二重特異性抗体を形成した。従って形成した二重特異性抗体を、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞に結合することができ、ならびにヒト乳腺腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。
組換え細胞培地から直接二重特異性抗体を作成し単離する種々の技術をまた記載する。例えば、二重特異性抗体をロイシンジッパーを用いて生産する。Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なる抗体のＦａｂ'部分に結合した。抗体のホモダイマーをヒンジ領域において還元して、モノマーを形成し、次いで再酸化して、抗体のヘテロダイマーを形成した。この方法をまた、抗体のホモダイマーの生産に利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)により記載されている「diabody」技術は、二重特異性抗体フラグメント作成のさらに別の機構を提供する。フラグメントは、リンカーによりＬ鎖可変ドメイン(ＶＬ)に連結したＨ鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含むが、リンカーが短いため同じ鎖の上の２個のドメイン間での対形成を可能にしない。したがって、一つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは強制的にもう一つのフラグメントの相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対を形成し、それにより二つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)のダイマーの使用による二重特異性抗体フラグメント作成のもう一つの戦略がまた報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
３価以上の結合価をもつ抗体も考え得る。例えば、３重特異性抗体を調製し得る。例えば、Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)。
典型的な二重特異性抗体は、少なくとも一つが本発明のタンパク質抗原に由来する二つの異なるエピトープに結合し得る。これに代えて、免疫グロブリン分子の抗−抗原アームを、白血球上でＴ細胞受容体分子(例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８またはＢ７)またはＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)およびＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)のような、ＩｇＧに対するＦｃ受容体(Ｆｃγ)のような誘発性分子に結合するアームと組み合わせて、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞性防御機構に焦点を当て得る。二重特異性抗体をまた使用して、特定の抗原を発現している細胞に細胞障害性物質を指向し得る。これらの抗体は、抗原結合アームおよび細胞障害性薬剤またはＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡまたはＴＥＴＡのような放射性核種キレート化剤と結合するアームを所有する。興味のあるもう一つの二重特異性抗体は、本明細書に説明するタンパク質抗原と結合して、さらに組織因子(ＴＦ)と結合する。
ヘテロ複合抗体
ヘテロ複合抗体はまた本発明の範囲内にある。ヘテロ複合抗体は、共有結合で結合した二つの抗体より成る。そのような抗体は、例えば、好ましくない細胞に免疫系の細胞を標的化するため(米国特許第４,６７６,９８０号)、およびＨＩＶ感染の処置のため(ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９)に提案されている。これらの抗体を、架橋剤を伴うものを含むタンパク質合成化学の既知の方法を用いてインビトロで調製し得ると考えられている。例えば、ジスルフィド交換反応を使用してまたはチオエーテル結合を形成することより、イムノトキシンを構築することができる。この目的のために適当な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートならびに、例えば、米国特許第４,６７６,９８０号に開示されているものを挙げ得る。
エフェクター機能工学
例えば、がんの処置における抗体の有効性を増強するために、本発明の抗体をエフェクター機能に関して修飾することが望ましい。例えば、システイン残基(複数を含む)をＦｃ領域に導入し、それによりこの領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にし得る。かくして生成したホモダイマーの抗体は、改善した内部移行能および／または増強した補体仲介性細胞殺害ならびに抗体依存性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)を有し得る。Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) および Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照されたい。増強した抗腫瘍活性を持つホモダイマー抗体はまた、Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)に記載されているように、ヘテロ２機能性架橋剤を用いて調製し得る。これに代えて、２重のＦｃ領域を有して、それにより増強した補体溶解およびＡＤＣＣ能を有する抗体を工学操作することができる。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)を参照されたい。
免疫複合体
本発明はまた、化学療法剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらのフラグメント)または放射性同位体(即ち、放射性複合体)のような細胞毒性物質と複合した抗体を含む免疫複合体に関する。
そのような免疫複合体の生成に有用な化学療法剤を上述する。使用できる酵素的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素Ａ鎖(Pseudomonas aeruginosa由来)、リシンＡ鎖、アビリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、Aleurites fordii(シナアブラギリ)タンパク質、ディアンティンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ)、momoridica charantia(ツルレイシ)阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。種々の放射性核種を放射性複合抗体の生産に利用できる。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅを挙げ得る。
抗体と細胞障害性薬剤との複合体を、Ｎ−サクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオール)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの２機能性誘導体(ジメチルアジピイミデートＨＣＬのような)、活性エステル(ジサクシンイミジルスベレートのような)、アルデヒド(グルタルアルデヒドのような)、ビスアジド化合物(ビス−(ｐ−アジドベンゾイル)−ヘキサンジアミンのような)、ビスジアゾニウム誘導体(ビス−(ｐ−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミンのような)、ジイソシアネート(トリエン２、６−ジイソシアネートのような)、およびビス活性フッ素化合物(１,５−ジフルオロ２,４−ジニトロベンゼンのような)のような種々の２機能性タンパク質カップリング剤を用いて作る。例えば、リシン免疫毒素を、Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)に記載のように調製することができる。炭素１４で標識した１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸(ＭＸ−ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドを抗体に結合するための典型的なキレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。
もう一つの実施形態では、抗体を、腫瘍をプレターゲティングのための「受容体」(ストレプトアビジンのような)に結合することができて、そこでは抗体−受容体複合体を患者に投与し、引き続いて未結合の複合体を除去剤を用いて血液循環から除去し、次いで今度は細胞障害性薬剤に複合した「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
イムノリポソーム
本明細書で開示される抗体をまた、イムノリポソームとして処方することができる。抗体を含有するリポソームは、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); ならびに米国特許第４,４８５,０４５号および第４,５４４,５４５号に記載されているような、当該分野において公知の方法で調製する。増大した循環時間を持つリポソームは、米国特許第５,０１３,５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームを、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ−ＰＥ)を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法により生成し得る。リポソームを定められた孔径のフィルターを通して押し出して、所望の直径のリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ'フラグメントを、Martin et al ., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)に記載されるように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに結合し得る。化学療法剤(ドキソルビシンのような)を任意にリポソーム内に含有する。Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989)を参照されたい。
本発明のタンパク質に対して指向した抗体の診断応用
１実施形態では、所望の特異性を保有する抗体のスクリーニングのための方法は限定しないが、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）および他の当業者既知免疫学的介在技法を含む。具体的実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質の特定のドメインに特異的である抗体の選択は、そのようなドメインを保有するＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに結合するハイブリドーマの生成によって容易化される。かくして、ＮＯＶＸタンパク質内の所望のドメイン、その誘導体、フラグメント、類似体、または相同物に特異的で合える抗体をまたここに提供する。
本発明のＮＯＶＸタンパク質に対して指向化された抗体を、ＮＯＶＸタンパク質の局在化及び／または定量に関する当業界内既知方法で使用し得る（例えば適当な生理学的サンプル内のＮＯＶＸタンパク質のレベルの測定における使用のため、診断方法における使用のため、タンパク質の画像化における使用のためなど）。所定の実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質、その誘導体、フラグメント、類似体または相同物に特異的な抗体であって、抗体由来抗原結合ドメインを含むものは、薬理学的活性化合物として利用する（以後「治療剤」と称する）。
本発明のＮＯＶＸタンパク質に対して特異的な抗体を（例えばモノクローナルまたはポリクローナル抗体）、イムノアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的な技術により、ＮＯＶＸポリペプチドを単離するために使用し得る。ＮＯＶＸポリペプチドへの抗体を、細胞由来の天然タンパク質および宿主細胞で発現する組換え的に生産したＮＯＶＸ抗原の精製を容易にし得る。さらに、そのような抗ＮＯＶＸ抗体を使用して、抗原性ＮＯＶＸタンパク質の存在量または発現パターンを評価するために抗原性ＮＯＶＸタンパク質(例えば、細胞溶解物または細胞上清中の)を検出することができる。ＮＯＶＸタンパク質に対して指向した抗体を診断的に使用して、例えば、与えられた処置法の有効性を測定するために臨床検査の手順の一環として組織中のタンパク質レベルをモニターすることができる。抗体を検出可能な物質にカップリング(即ち物理的に連結)することにより、検出を促進し得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質を挙げる。適当な酵素の例としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを挙げ得る；適当な配合群の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを挙げ得る；適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレッセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンを挙げ得る；発光物質の例としては、ルミノールを挙げ得る；生物発光物質の例としてはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを挙うるし、適当な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを挙げ得る。
抗体治療法
ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化および完全なヒト抗体を含む本発明の抗体を治療薬として使用し得る。そのような薬剤を一般的に、対象の疾患または病変の治療または予防に使用する。抗体製剤、好ましくはその標的抗原に対して高い特異性および高い親和性を有するものを対象に投与して、一般的に標的への結合に因る効果を有する。そのような効果は、与えた抗体分子と問題とする標的抗原との間の相互作用の特異的性質に依存する２種類のうちの一つである。第１の場合では、抗体の投与は、標的の本来結合する内在性リガンドとの結合を阻止または阻害し得る。この場合には、抗体は標的に結合して、リガンドがエフェクター分子として作用する、天然に存在するリガンドの結合部位をマスクする。かくして、受容体はリガンドが役割を担う情報伝達経路を仲介する。
これに代えて、作用は、抗体が標的分子上のエフェクター結合部位への結合により生理的結果を誘発するものであり得る。この場合には、疾患または病変においては存在しないかまたは欠陥のあり得る内在性リガンドを有する受容体である標的を、代替のエフェクターリガンドとしての抗体と結合して、受容体に基づく情報伝達事象を受容体により開始する。
本発明の抗体の治療的に有効な量は一般的に、治療目的を達成するのに必要とされる量に関する。上述のように、これは、特定の場合には標的の機能を阻害し、そして他の場合には生理的応答を促進する抗体およびその標的抗原との間の結合相互作用であり得る。投与に必要な量はさらに、特定の抗原に対する抗体の結合親和性に依存するし、そしてまた投与した抗体が投与した対象の自由体積から除去し得る速度に依存する。本発明の抗体または抗体フラグメントの治療的に有効な投与量の通常の範囲は、限定されない例として、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。通常の投与回数は、例えば、１日２回から１週１回の範囲であり得る。
抗体の医薬組成物
本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体、ならびに本明細書に開示するスクリーニングアッセイにより同定する他の分子を、医薬組成物の形で種々の障害の処置のために投与し得る。そのような組成物の調製に関与する原理および考慮事項、ならびに成分の選択の指針は、例えば、Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa. : 1995、Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994、および Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New Yorkに提供されている。
抗原タンパク質が細胞内にあり、完全な抗体を阻害剤として使用するならば、内部移行性抗体が好ましい。しかしながら、リポソームを使用して、抗体または抗体フラグメントを細胞内に送達し得る。抗体フラグメントを使用する場合には、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さな阻害フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域の配列に基づいて、標的タンパク質の配列に結合する能力を保持するペプチド分子をデザインし得る。そのようなペプチドを、化学的および／または組換えＤＮＡ技術により合成し得る。例えば、Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照されたい。本明細書における処方はまた、処置する特定の適応のために必要なニつ以上の活性化合物、好ましくはお互いに悪影響を及ぼし合わない相補的活性を持つものを含有し得る。これに代えて、またはこれに加えて、組成物は、その機能を増強する薬剤、例えば、細胞障害性薬剤、サイトカイン、化学療法剤、または増殖阻害剤を含有していてもよい。そのような分子は好都合には、意図する目的にとって効果的な量で組み合わされて存在する。
活性成分を、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により調製したマイクロカプセル中で、例えば、ヒドロキシメチルセルローズまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中で、それぞれ、コロイド状薬送達システム(例えば、リポソーム、アルブミン小球体、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)中に、またはマクロエマルジョン中に閉じ込め得る。
インビボ投与に使用する製剤は無菌でなければならない。このことを、無菌ろ過膜によるろ過により容易に達成する。
徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適当な例としては、抗体を含有する固相の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルのような造形品の形をしている。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ハイドロゲル(例えば、ポリ(２−ヒドロキシエチル−メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第３,７７３,９１９号)、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌグルタミン酸エステルの共重合体、非分解性エチレン−ビニルアセテート、LUPRON DEPOT[登録商標](乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸リュープロリドより成る注射用マイクロスフェア)のような分解性乳酸−グリコール酸共重合体が挙げられる。酢酸エチレンビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日間に亘って分子を放出することができるが一方、特定のヒドロゲルはより短期間でタンパク質を放出する。
ＥＬＩＳＡアッセイ
アナライトのタンパク質を検出する薬剤は、アナライトのタンパク質に結合する能力のある抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナルでもよく、またはさらに好ましくはモノクローナルであり得る。完全な抗体またはそのフラグメント(例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ)２)を使うことができる。用語「標識」とは、プローブまたは抗体に関して、プローブまたは抗体に検出可能な物質をカップリングする(即ち、物理的に連結する)ことによるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接に標識するもう一つの薬剤との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を包含するものとする。間接標識の例としては、蛍光標識した第２抗体を用いた第１抗体の検出および蛍光標識ストレプトアビジンで検出できるようにＤＮＡプローブをビオチンで末端標識することが挙げられる。用語「生物学的試料」とは、対象から単離した組織、細胞および生物学的流体、ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含むものとする。それ故に、用語「生物学的試料」の範囲には血液および血清、血漿、またはリンパ液を含む血液のフラクションまたは成分を含み得る。即ち、本発明の検出法を使用して、生物学的試料中のアナライトのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡをインビトロならびにインビボで検出することができる。例えば、アナライトのｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイツハイブリダイゼーションを挙げ得る。アナライトのタンパク質のインビトロ検出技術としては、酵素結合免疫吸着検査法(ＥＬＩＳＡ)、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を挙げ得る。アナライトのＤＮＡのインビトロ検出技術としては、サザンハイブリダイゼーションを挙げ得る。イムノアッセイを実施する手順は、例えば、「ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology」, Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995、「Immunoassay」, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996、および「Practice and Thory of Enzyme Immunoassays」, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985に記載されている。さらに、アナライトのタンパク質のインビボ検出のための技術は、標識化した抗アナライトタンパク質抗体を対象に導入することを含む。例えば、対象中での存在または局在が標準的な造影技法で検出できる放射性マーカーで、抗体を標識し得る。
ＮＯＶＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明のもう一つの態様は、ＮＯＶＸタンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書において使用する用語「ベクター」とは、それに結合しているもう一つの核酸を運搬する能力のある核酸分子を指す。ベクターの一つのタイプは「プラスミド」であり、これは、さらに別なＤＮＡセグメントが結合した環状の二重鎖ＤＮＡループを指す。ベクターのもう一つのタイプはウイルスベクターであり、ここではさらに別なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムの中に結合し得る。特定のベクターは、それらを導入した宿主細胞中で自律増幅することができる(例えば、細菌の複製起点を持つ細菌のベクターおよび哺乳類のエピゾームベクター)。他のベクター(例えば、哺乳類の非エピゾームベクター)は、宿主細胞中への導入に際し宿主細胞のゲノム中に組み込まれて、それにより宿主ゲノムと一緒に複製し得る。さらに、特定のベクターは、それらが作動し得るように連結した遺伝子の発現を指示する能力がある。そのようなベクターを、本明細書において「発現ベクター」と呼称する。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をしている。プラスミドはベクターの最も通常に使用する形態であるので、本明細書においては、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用し得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を有するウイルスベクター(例えば、複製能を欠いたレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)のような他の形の発現ベクターを含むこととする。
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中における核酸の発現に適した形での本発明の核酸を含み、これは組換え発現ウイルスを、発現に使用する宿主細胞に基づいて選択した発現すべき核酸配列に作動し得るように連結した一つまたはそれ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内において、「作動し得るように連結した」とは、興味のある核酸配列が核酸配列の発現を可能にする様式で(例えばインビトロ転写／翻訳システムでまたはベクターを宿主細胞に導入する場合には宿主細胞中で)調節配列に結合していることを意味するものとする。
用語「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むものとする。そのような調節配列は、例えば、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するものおよび特定の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの(例えば、組織特異的調節配列)を挙げ得る。発現ベクターのデザインが、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等のような要因に依存し得ることを当業者は理解する。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入して、それにより本明細書に説明するように核酸によりコードする融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチド(例えば、ＮＯＶＸタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の突然変異型、融合タンパク質等)を生産し得る。
本発明の組換え発現ベクターを、原核のまたは真核の細胞中におけるＮＯＶＸタンパク質発現用にデザインし得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質を、Escherichia coliのような細菌細胞、昆虫細胞(バキュロウイルス発現ベクターを使用して)、酵母細胞または哺乳類細胞中で発現し得る。適当な宿主細胞は、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)においてさらに考察されている。これに代えて、組換え発現ベクターを、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写して、翻訳し得る。
真核細胞中におけるタンパク質の発現は最もしばしば、Escherichia coli中で融合タンパク質または非融合タンパク質のどちらかの発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて行われる。融合ベクターは、その中にコードしたタンパク質に多数のアミノ酸を、通常には組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。そのような融合ベクターは典型的に三つの目的に役立つ：(i)組換えタンパク質の発現を増大するため；(ii)組換えタンパク質の溶解性を増加するため；および(iii)アフィニティークロマトグラフィーにおけるリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を助けるため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解による切断部位を融合部分および組換えタンパク質の接合部に導入して、融合部分から組換えタンパク質の分離に引き続いて融合タンパク質の精製を可能にする。そのような酵素、およびそれらと同種の認識配列としては、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼを挙げ得る。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ標的組換えタンパク質に融合させるｐＧＥＸ(Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40)、ｐＭＡＬ (New England Biolabs, Beverly, Mass.)およびｐＲＩＴ５ (Pharmacia, Piscataway, N.J.) を挙げ得る。
適当な誘導性非融合E. coli発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ(Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315)およびｐＥＴ１１ｄ (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89)を挙げ得る。
E. coliにおけるタンパク質発現を最大にする一つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を障害した宿主細胞中でタンパク質を発現することである。Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128を参照されたい。もう一つの戦略は、それぞれのアミノ酸に対する個別のコドンをE. coliで優先的に使用するものとなるように、発現ベクターに挿入する核酸の核酸配列を変更することである(例えば、Wada, et al., 1992. Nucl. Acids Res. 20: 2111-2118を参照)。本発明の核酸配列のそのような変更は標準的ＤＮＡ合成技法により行い得る。
もう一つの実施形態では、ＮＯＶＸ発現ベクターは酵母の発現ベクターである。酵母のSaccharomyces cerivisae中の発現ベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１ (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234)、ｐＭＦａ(Kurjan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943)、ｐＪＲＹ８８ (Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123)、ｐＹＥＳ２(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)、およびｐｉｃＺ(InVitrogen Corp, San Diego, Calif.)を挙げ得る。
これに代えて、ＮＯＶＸをバキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中で発現し得る。培養昆虫細胞(例えば、ＳＦ９細胞)中でのタンパク質発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ(Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) およびｐＶＬシリーズ(Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39)を挙げ得る。
なおもう一つの実施形態では、本発明の核酸を、哺乳類の発現ベクターを用いて哺乳類細胞中で発現し得る。哺乳類の発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８(Seed, 1987. Nature 329: 840)およびｐＭＴ２ＰＣ(Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195)を挙げ得る。哺乳類細胞中で使用するときには、発現ベクターの制御機能はしばしば、ウイルスの調節要素により提供される。例えば、普通に使用するプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。原核のおよび真核の細胞両方にとって適当な他の発現系については、例えば、Chapters 16 and 17 of Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989を参照されたい。
もう一つの実施形態では、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞タイプ中で優先的に核酸の発現を指示する能力がある(例えば、組織特異的調節要素を核酸を発現するために使用する)。組織特異的調節要素は当該分野において公知である。適当な組織特異的プロモータの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター(肝臓特異的；Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277)、リンパ系特異的プロモーター(Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275)、特にT細胞受容体(Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733)および免疫グロブリン (Banerji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748)のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター(例えば、ニューロフィラメントプロモーター; Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916)、ならびに乳腺特異的プロモーター(例えば、乳漿；米国特許第４,８７３,３１６号及びヨーロッパ出願公開第２６４,１６６号)を挙得る。例えば、マウスのｈｏｘプロモーター(Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379)およびα−フェトプロテインプロモーター(Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546)の発生的に調節されるプロモーターも包含する。
本発明はさらに、発現ベクターの中にアンチセンスの配向でクローン化した本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。即ち、ＤＮＡ分子は、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現(ＤＮＡ分子の転写による)を可能にするような様式で、調節配列に作動し得るように結合する。種々の細胞タイプ中のアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指示するアンチセンスの配向にクローン化した核酸に作動し得るように結合した調節配列、例えば、ウイルスのプロモーターおよび／またはエンハンサーを選択することができるか、またはアンチセンスＲＮＡの組織特異的または細胞タイプ特異的な構成的発現を指示する調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、ベクターを導入した細胞タイプにより活性を決定する高効率調節領域の制御下で、アンチセンス核酸を生産する組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形であり得る。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の考察については、例えば、Weintraub, et al., 「Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis」 Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986を参照されたい。
本発明のもう一つの態様は、本発明の組換え発現ベクターを導入する宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」を、本明細書においては互換的に使用する。そのような用語は、特定の対象の細胞のみならずそのような細胞の子孫または潜在的子孫をまた指すことを理解する。突然変異または環境の影響により後の世代に特定の修飾が生じるかもしれないため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書において使用する用語の範囲内になお含まれる。
宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質を、E. coliのような細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳類細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)またはＣＯＳ細胞)細胞中で発現することができる。他の適当な宿主細胞は当業者に周知である。
ベクターＤＮＡを、従来の形質転換または形質移入技術により原核細胞または真核の細胞の中に導入することができる。本明細書において使用する用語「形質転換」および「形質移入」とは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介性形質移入、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む外来の核酸(例えばＤＮＡ)を宿主細胞に導入するために当該分野で認める種々の技術を指すものとする。宿主細胞を形質転換しまたは形質移入するための適当な方法は、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)および他の実験室マニュアルに見出すことができる。
哺乳類細胞の安定的な形質移入については、使用される発現ベクターおよび形質移入の技法に依存して、細胞のごく小数のフラクションが外来性ＤＮＡをそのゲノムの中に組み込み得ることが知られている。これらの組み込み体を同定し選択するために、選択可能なマーカー(例えば、抗生物質に対する抵抗性)が一般的に、興味のある遺伝子と一緒に宿主細胞に導入される。種々の選択可能なマーカーとしては、Ｇ４１８,ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬剤に抵抗性を与えるものが挙げられる。選択可能なマーカーをコードする核酸を、ＮＯＶＸをコードするものと同一のベクター上で宿主細胞に導入することができ、または別のベクター上で導入することもできる。導入された核酸で安定に形質移入された細胞は、薬剤選択により同定されることができる(例えば、選択可能なマーカーを組み込んでいる細胞は生き残る一方で、他の細胞は死ぬ)。
培地中の原核細胞または真核細胞のような本発明の宿主細胞を用いて、ＮＯＶＸタンパク質を生産する(即ち、発現する)ことができる。したがって、本発明は、本発明の宿主細胞を用いるＮＯＶＸタンパク質の生産方法をさらに提供する。一つの実施形態では、その方法は、本発明の宿主細胞(その中にＮＯＶＸタンパク質をコードする組換え発現ベクターを導入する)を、ＮＯＶＸタンパク質を生産するような適当な培地中で培養することを含む。もう一つの実施形態では、その方法は、培地または宿主細胞からＮＯＶＸタンパク質を単離することをさらに含む。
トランスジェニックＮＯＶＸ動物
本発明の宿主細胞をまた使用して、非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。例えば、一つの実施形態では、本発明の宿主細胞は、その中にＮＯＶＸタンパク質コード化配列を導入する受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、そのような宿主細胞を使用して、その中で外来性のＮＯＶＸ配列をゲノムの中に導入する非ヒトトランスジェニック動物、またはその中で内在性のＮＯＶＸ配列を変更する相同な組換え動物を創成することができる。そのような動物は、ＮＯＶＸタンパク質の機能および／または活性の研究にならびにＮＯＶＸタンパク質活性のモジュレーターの同定および／または評価に有用である。本明細書において使用する「トランスジェニック動物」とは、その中で動物の一つまたはそれ以上の細胞が導入遺伝子を含む非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはラットまたはマウスのようなげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両棲類等を挙げ得る。導入遺伝子は、それからトランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムの中に取り込まれ、そして成熟動物のゲノム内に残存して、それによりトランスジェニック動物の一つまたはそれ以上の細胞タイプまたは組織中におけるコード化遺伝子産物の発現を指令する外来性ＤＮＡである。本明細書において使用する「相同の組換え動物」とは、その中で内在性ＮＯＶＸ遺伝子が内在性遺伝子および、動物の細胞、例えば、動物の胚細胞の中に動物の発生前に導入された外来性ＤＮＡ分子との間で相同組換えにより変更した非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスである。
本発明のトランスジェニック動物は、ＮＯＶＸをコードする核酸を受精卵母細胞の雄性前核の中に(例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染により)導入して、卵母細胞を偽妊娠雌性仮親動物の体内で発生することを可能にすることにより、創成することができる。配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜３８の整数である)のヒトＮＯＶＸｃＤＮＡ配列を、非ヒト動物のゲノム内に導入遺伝子として導入することができる。これに代えて、マウスＮＯＶＸ遺伝子のようなヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒト相同体を、ヒトＮＯＶＸのｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション(上にさらに詳述)に基づいて単離して、導入遺伝子として使用し得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、導入遺伝子の発現効率を増加するために導入遺伝子中に含み得る。組織特異的調節配列をＮＯＶＸ導入遺伝子に作動し得るように結合して、特定の細胞にＮＯＶＸタンパク質の発現を指示し得る。胚の操作およびマイクロインジェクションによる、トランスジェニック動物、特にマウスのような動物の作成方法は当該分野において従来的となってきており、例えば、米国特許第４,７３６,８６６号; ４,８７０,００９号; および４,８７３,１９１号;ならびにHogan, 1986. In: MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されている。類似の方法を他のトランスジェニック動物の生産に用い得る。初代トランスジェニック動物を、ゲノム内のＮＯＶＸ導入遺伝子の存在および／または動物の組織または細胞中におけるＮＯＶＸ ｍＲＮＡの発現に基づいて、同定し得る。次いで、初代トランスジェニック動物を、導入遺伝子を保持する追加的動物の繁殖に使用し得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする導入遺伝子を保持するトランスジェニック動物を使用して、他の導入遺伝子を保持するさらに別なトランスジェニック動物を繁殖し得る。
相同の組換え動物を創成するために、その中に欠失、付加または置換を導入していて、それによりＮＯＶＸ遺伝子を変化させる例えば機能的に破壊するあるＮＯＶＸ遺伝子の少なくとも一部を含有するベクターを調製する。ＮＯＶＸ遺伝子は、ヒト遺伝子(例えば配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜３８の整数である)のｃＤＮＡ)であり得るが、さらに好ましくはヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒト相同体である。例えば、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜３８の整数である)のヒトＮＯＶＸ遺伝子のマウス相同体を使用して、マウスゲノム中の内在性ＮＯＶＸ遺伝子を変更するのに適する相同組換えベクターを構築することができる。一つの実施形態では、ベクターを、相同組換えにより、内在性遺伝子を機能的に破壊する(即ち、もはや機能的なタンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼称する)ようにデザインする。
これに代えて、ベクターは、相同組換えにより内在性ＮＯＶＸ遺伝子を変異するかまたは他のように変更するが、依然機能性タンパク質をコードする(例えば、上流の調節領域を変更してそれにより内在性ＮＯＶＸタンパク質の発現を変更する)ようにデザインし得る。相同組換えベクターでは、ＮＯＶＸ遺伝子の変更したタンパク質は、ＮＯＶＸ遺伝子のさらに別な核酸により５'末端または３'末端に隣接して、ベクターにより保持する外来性ＮＯＶＸ遺伝子および胚性幹細胞中の内在性ＮＯＶＸ遺伝子の間で相同組換えが起こることを可能にする。さらに別な隣接ＮＯＶＸ核酸は、内在性遺伝子と成功裏に相同組換えが起きるように十分な長さを持つ。典型的には、数キロ塩基の隣接ＤＮＡ(５'末端および３'末端の両方とも)をベクターに含み得る。相同組換えベクターの記載については、例えば、Thomas, et al., 1987. Cell 51: 503を参照されたい。次いで、ベクターを胚性幹細胞株に(例えば、エレクトロポレーションにより)導入し、そしてその中で導入したＮＯＶＸ遺伝子を内在性ＮＯＶＸ遺伝子と相同的に組み換えた細胞を選択する。例えば、Li, et al., 1992. Cell 69: 915を参照されたい。
次いで、選択した細胞を動物(例えば、マウス)の胚盤胞の中に注入して、凝集キメラを形成する。例えば、Bradley, 1987. In: TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEM CELLS: A PRACTICAL APPROACH, Robertson, ed. IRL, Oxford, pp. 113-152を参照されたい。次いで、キメラ胚を適当な偽妊娠雌性仮親動物に植え込んで、胚を満期出産する。生殖細胞内に相同組換えしたＤＮＡを保持している子孫を用いて、その中で動物の全ての細胞が、導入遺伝子の生殖系列を介した伝達により相同組換えＤＮＡを含有する動物を繁殖させることができる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築する方法は、Bradley, 1991. Curr. Opin. Biotechnol. 2: 823-829; ＰＣＴ国際公開第: ＷＯ９０／１１３５４号；ＷＯ９１／０１１４０号；ＷＯ９２／０９６８号;およびＷＯ９３／０４１６９号にさらに記載される。
もう一つの実施形態では、導入遺伝子の調節発現を可能にする選択したシステムを含有する非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。そのようなシステムの一つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムの記載については、例えば、Lakso, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236を参照されたい。リコンビナーゼシステムのもう一つの例は、Saccharomyces cerevisiaeのＦＬＰリコンビナーゼシステムである。O'Gorman, et al., 1991. Science 251:1351-1355を参照されたい。もしｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムを用いて導入遺伝子の発現を調節するならば、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択したタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含有する動物が必要となる。そのような動物は、例えば、一つは選択したタンパク質をコードする導入遺伝子を含有し、他はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含有する二つのトランスジェニック動物を交配させることによる「ダブル」トランスジェニック動物の構築により提供し得る。
本明細書に説明した非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Wilmut, et al., 1997. Nature 385: 810-813に記載された方法にしたがって生産することができる。略述すれば、トランスジェニック動物から細胞(例えば体細胞)を単離し、誘導して、増殖サイクルから抜け出てＧ０期に入ることができる。次いで、静止細胞を、例えば、電気パルスの使用により静止細胞を単離したのと同じ種類の動物由来の脱核した卵母細胞と融合することができる。次いで、再構成した卵母細胞を、それを桑実胚または胚盤胞にまで発生させて、次いで擬妊娠雌性仮親動物に導入するように培養する。この雌性仮親動物から生まれた子孫は、細胞(例えば体細胞)を単離する動物のクローンである。
医薬組成物
本発明のＮＯＶＸ核酸分子、ＮＯＶＸタンパク質、抗−ＮＯＶＸ抗体(本明細書では「活性化合物」ともいう)、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、類似体および相同体を投与に適する医薬組成物の中に組込み得る。典型的に、そのような組成物は核酸分子、タンパク質または抗体およびおよび医薬的に許容され得る担体を含む。本明細書において使用する「医薬的に許容され得る担体」とは、医薬品投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗かび剤、等張および吸収遅延剤等を含むことを意図する。適当な担体は、この分野で標準的な参照テキストであるRemingtonの薬剤学の最新版(出典明示により本明細書の一部とする)に記載されている。そのような担体または賦形剤の好ましい例としては、水、食塩水、フィンガー溶液、ブドウ糖溶液および５％ヒト血清アルブミンを挙げるが、それらに限定しない。リポソームおよび油脂のような非水溶性ビークルもまた使用する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤は当該分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物に適合しない限りでなければ、組成物内のそれらの使用を意図する。補助的な活性化合物をまた、組成物の中に組込み得る。
本発明の医薬組成物を、その意図する投与経路に適合するように処方する。投与経路の例としては、非経口の、例えば、静脈の、皮内の、皮下の、経口の(例えば、吸入)、経皮の(即ち局所の)、経粘膜のおよび直腸の投与を挙げ得る。非経口の、皮内のまたは皮下の応用に使用する溶液または懸濁液としては、以下の成分を挙げることができる：注射用水のような無菌賦形剤、食塩水溶液、油脂、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)のようなキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、ならびに塩化ナトリウムまたはブドウ糖のような等張性を調整する薬剤。塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基を用いてｐＨを調整することができる。非経口性製剤を、ガラスまたはプラスチックで作るアンプル、使い捨て注射器、または多回使用バイアルの中に封入し得る。
注射用に適する医薬組成物としては、無菌水溶液(水溶性である場合)または分散液および無菌注射用の溶液または分散液の必要に応じて調合する製剤用の無菌粉末を挙げ得る。静脈投与のためには、適当な担体としては、生理食塩水、静菌性水、Cremophor EL[登録商標] (BASF, Parsippany, N.J.)またはリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)を挙げ得る。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性であるべきである。それは製造および保管の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液性ポリエチレングリコール等)ならびにそれらの適当な混合液を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により、保持し得る。微生物作用の保護は、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等、により達成される。多くの場合に、組成物中に、等張性薬剤、例えば、砂糖、マニトールのようなポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成剤の吸収の延長は、組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによりもたらせ得る。
無菌注射用溶液を、適切な溶媒の中に一つまたは上で列挙した成分の組合せと共に必要な量で活性化合物(例えば、あるＮＯＶＸタンパク質または抗ＮＯＶＸ抗体)を組み込み、ついでろ過滅菌を行なうことにより調製することができる。一般的に、分散液は、基本的な分散媒体および上で列挙したものから必要な他の成分を含有する無菌ビークルの中に活性化合物を組み込むことにより調製することができる。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合には、調製方法は、活性成分の粉末プラス前もって無菌ろ過されたその溶液からの任意のさらに別の望ましい成分の粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥である。
一般的に、経口の組成物は、不活性賦形剤または食用の担体を含む。それらをゼラチンカプセル中に封入するかまたは錠剤に打錠することができる。経口治療投与の目的には、活性化合物を添加物と共に組込んで錠剤、トローチまたはカプセルの形状で使用することができる。経口の組成物をまた、うがい薬としての使用のために液体担体を用いて調製し得るが、そこでは液体担体中の化合物を経口的に塗布し、さっと取り除いて、吐き出すか飲み込む。薬学的に適合する結合剤、および／またはアジュバント材料を組成物の一部として含み得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は任意の以下の成分または同様な性質を持つ化合物を含有し得る：微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンのような結合剤；デンプンまたは乳糖のような添加剤、アルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロートのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような滑り剤；ショ糖またはサッカリンのような甘味剤；またはハッカ、サルチル酸メチル、オレンジ香料のような着香剤。
吸入による投与のためには、化合物を、適当な噴射剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含有する加圧容器またはディスペンザー、またはネブライザーからエアゾールスプレイの形式で送達し得る。
全身的投与はまた、経粘液または経皮手段により得る。経粘液または経皮投与のためには、透過すべきバリアーに適切な浸透剤を処方に使用する。そのような浸透剤は当該分野において一般的に公知であり、そして、例えば、経粘液投与のためには、洗剤、胆汁酸塩、フシジン酸誘導体を挙げ得る。経粘膜投与は鼻腔スプレーまたは坐剤の使用により達成され得る。経皮投与のためには、活性化合物は、当該分野において一般的に公知であるように、軟膏、軟膏剤、ゲルまたはクリームの中に処方される。
化合物をまた、直腸送達のために坐薬(例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤用基材と共に)または保持浣腸剤の形式で調製し得る。
一つの実施形態において、活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤のように、化合物を身体からの迅速な排泄から防止する担体と共に調製する。酢酸エチレンビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ酢酸のような、生物分解性で生体適合性のポリマーを使用し得る。そのような製剤を調製する方法は当業者に明らかである。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から市販で入手可能である。リポソームの懸濁液(モノクローナル抗体を持つ感染した細胞からウイルス抗体に至って標的化したリポソームを含む)をまた、医薬的に許容され得る担体として使用することができる。これらを、例えば米国特許第４,５２２,８１１号に記載のように、当業者に公知の方法に従い調製し得る。
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、経口性または非経口性の組成物を単位投与剤型で処方することが特に有益である。本明細書で使用する単位投与剤型とは、処置する対象に対して単一の投与量として適する物理学的に分離した単位を指し；それぞれの単位は、必要な薬学的な担体と一緒に望ましい治療効果を生じるように計算した予め決められた量の活性化合物を含有する。本発明の単位投与剤型の規格は、活性化合物の特異な特色および達成するべき特別な治療効果、ならびにそのような活性化合物を個体の処置のために配合する当該分野に固有の制限により指示されかつ直接に依存する。
本発明の核酸分子をベクターの中に挿入して遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターを、例えば、静脈注射、局所投与により(例えば、米国特許第５,３２８,４７０号を参照)または走触性注射(例えば、Chen, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057を参照)により送達し得る。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容される賦形剤の中に遺伝子治療ベクターを含むか、またはその中に遺伝子治療ベクターを埋め込んだ持続性マトリックスを含み得る。これに代えて、完全な遺伝子治療ベクターを組換え細胞、例えばレテロウイルスベクターから無傷で生産し得る場合には、医薬製剤は遺伝子送達システムを生産する一つまたはそれ以上の細胞を含み得る。
医薬製剤を、投与指示書と共に、容器、パックまたはディスペンサーの中に含み得る。
スクリーニングおよび検出の方法
以下に詳述するように、本発明の単離核酸分子を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を発現し(例えば、遺伝子治療応用において宿主細胞中で組換え発現ベクターを介して)、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡ(例えば、生物学的試料中の)またはＮＯＶＸ遺伝子中の遺伝的欠損を検出し、そしてＮＯＶＸ活性を調整することができる。加えて、ＮＯＶＸタンパク質を用いて、ＮＯＶＸタンパク質の活性または発現を調整する薬または化合物をスクリーニングし、ならびにＮＯＶＸタンパク質の不十分なまたは過剰な生産、またはＮＯＶＸの野生型タンパク質と比較して低下または異常な活性を有するＮＯＶＸタンパク質型の生産を特徴とする疾患(例えば；糖尿病(インスリン放出を調節する)；肥満(脂質に結合し輸送する)；肥満に関連した代謝障害、代謝症候群Ｘならびに慢性障害および種々のがんに随伴する食欲不振および消耗性障害、ならびに感染性疾患(抗微生物活性を有する)および種々の異脂肪血症を処置し得る。加えて、本発明の抗ＮＯＶＸ抗体を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を検出しかつ単離し、そしてＮＯＶＸ活性を調整し得る。なおさらなる態様では、本発明を方法で使用して、食欲、栄養の吸収および代謝基質の処分を正および負の両方の様式で影響させることができる。
本発明はさらに、本明細書に説明するスクリーニングアッセイで同定する新規な薬剤および上述の処置のためのそれらの使用に関する。
スクリーニングアッセイ
本発明は、モジュレーター、即ち、ＮＯＶＸタンパク質に結合するか、または、例えばＮＯＶＸタンパク質の発現またはＮＯＶＸタンパク質の活性に促進的または阻害的作用を有する候補または試験化合物または薬剤(例えば、ペプチド、ペプチドミメティクス、低分子または他の薬)を同定する方法(本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも呼称する)を提供する。本発明はまた、本明細書に説明するスクリーニングアッセイにおいて同定した化合物を含む。
一つの実施形態では、本発明は、膜結合型のあるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合するかまたは活性を調整する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物を、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス参照可能な並列の固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成的ライブラリー方法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー方法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー方法：を含む、当該分野において周知のコンビナトリアルライブラリーにおける数多くのアプローチのいずれを用いても得られる。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに限定される一方で、他の４種のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である。例えば、Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145を参照されたい。
本明細書において使用する「低分子」とは、約５ｋＤ未満の、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物を指す。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティクス、炭水化物、脂質または他の有機のまたは無機の分子であり得る。化学的および／または、真菌、細菌、または藻類の抽出物のような、生物学的混合物は当該分野において公知であり、本発明の任意のアッセイを用いてスクリーニングすることができる。
分子ライブラリー合成方法の例を、例えば、DeWitt, et al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909、Erb, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 11422、Zuckermann, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 2678、Cho, et al., 1993. Science 261: 1303; Carrell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059、Carell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061、およびGallop, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 1233における当該分野に見出し得る。
化合物のライブラリーを、溶液中で(例えば、Houghten, 1992. Biotechniques 13: 412-421)、またはビーズ上で(Lam, 1991. Nature 354: 82-84)、チップ上で(Fodor, 1993. Nature 364: 555-556)、バクテリア(Ladner, 米国特許第５,２２３,４０９号)、胞子 (Ladner, 米国特許第５,２３３,４０９号)、プラスミド (Cull, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869)上でまたはファージ上で(Scott and Smith, 1990. Science 249: 386-390; Devlin, 1990. Science 249: 404-406、Cwirla, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 6378-6382、Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222: 301-310、Ladner, 米国特許第５,２３３,４０９号)で提供し得る。
ある実施形態では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、そこでは膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触させ、そして試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質に結合する能力を測定する。細胞は、例えば、哺乳類由来または酵母細胞であり得る。試験化合物がＮＯＶＸタンパク質に結合する能力を測定することは、例えば、試験化合物を放射性同位元素または酵素標識とカップリングして、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分への試験化合物の結合を、複合物中の標識化合物を検出することにより測定できるようにする。例えば、試験化合物を、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで直接的にまたは間接的に標識し、そして放射性同位元素を放射線放射の直接計数またはシンチレーション計数により検出する。これに代えて、試験化合物を、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼにより酵素的に標識し、そして適切な基質の生産物への変換の測定により酵素標識を検出する。ある実施形態では、アッセイは、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を、ＮＯＶＸに結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成して、アッセイ混合物を試験化合物と接触し、そして試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に、既知化合物と比較して優先的に結合する能力を測定することを含む。
もう一つの実施形態では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調整する(例えば促進または阻害する)能力を測定することを含む。試験化合物がＮＯＶＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調整する活性を測定することは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子と結合するかまたは相互作用をする能力を測定することにより達成し得る。本明細書において使用する「標的分子」とは、自然界であるＮＯＶＸタンパク質が結合または相互作用する分子、例えば、あるＮＯＶＸと相互作用するタンパク質を発現する細胞表面の分子、２番目の細胞表面の分子、細胞外の環境中の分子、細胞膜の内側表面と会合している分子または細胞質の分子である。ＮＯＶＸの標的分子は、非ＮＯＶＸ分子または本発明のあるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。一つの実施形態では、あるＮＯＶＸの標的分子は、細胞外のシグナル(例えば、膜結合ＮＯＶＸ分子への化合物の結合により発生するシグナル)を細胞膜を通してかつ細胞内への伝達を促進する情報伝達経路の成分である。標的は、例えば、触媒活性を有する２番目の細胞内タンパク質または下流のシグナル分子とＮＯＶＸとの会合を促進するタンパク質であり得る。
ＮＯＶＸタンパク質をあるＮＯＶＸの標的分子と結合するかまたは相互作用をする能力を測定することは、直接的な結合を測定する上述の方法の一つにより達成し得る。一つの実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子と結合または相互作用する能力を測定することは、標的分子の活性を測定することにより達成することができる。例えば、標的分子の活性を、標的の細胞性第二のメッセンジャー(即ち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３等)の誘導を検出すること、適切な基質に対する標的の触媒／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子(検出可能なマーカー、例えば、ルシフェラーゼ、をコードする核酸に作動し得るように結合したＮＯＶＸ応答性調節要素を含む)の誘導を検出すること、または細胞応答、例えば、細胞の生存、細胞の分化、または細胞の増殖、を検出することにより測定し得る。
なおもう一つの実施形態では、本発明のアッセイは無細胞アッセイであって、あるＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を測定することを含む。ＮＯＶＸタンパク質への試験化合物の結合を、上述のように、直接的または間接的のどちらかで測定することができる。一つのそのような実施形態では、アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分をＮＯＶＸと結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触すること、および試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に既知化合物と比較して優先的に結合する能力を測定することを含む。
なおもう一つの実施形態では、アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質の活性を調整する(例えば促進または阻害する)能力を測定することを含む無細胞アッセイである。ＮＯＶＸの活性を調整する試験化合物の能力を測定することは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子に結合する活性を直接な結合を測定するために上述した方法の一つにより達成することができる。さらに別の実施形態では、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質の活性を調節する能力を測定することは、ＮＯＶＸタンパク質がさらにあるＮＯＶＸの標的分子を調整する能力を測定することにより達成することができる。例えば、適切な基質に対する標的分子の触媒／酵素活性を上述のように測定することができる。
なおもう一つの実施形態では、無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分をＮＯＶＸタンパク質と結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触すること、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子に優先的に結合するかまたはその活性を調整する能力を測定することを含む。
本発明の無細胞アッセイは、可溶性型または膜結合型のＮＯＶＸタンパク質の両方に使用することができる。膜結合型のＮＯＶＸタンパク質を含む無細胞アッセイの場合には、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質を溶液中に維持するように、可溶化剤を利用するのが望ましい。そのような可溶化剤の例としては、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ[登録商標]Ｘ-１００、Ｔｒｉｔｏｎ[登録商標]Ｘ-１１４、Ｔｈｅｓｉｔ[登録商標]、イソトリデシポリ(エチレングリコールエーテル)ｎ、Ｎ−ドデシル−Ｎ,Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−(３−クロルアミドプロピル)ジメチルアミニオール−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳ)、または３−(３−クロルアミドプロピル)ジメチルアミニオール−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳＯ)のような非イオン性界面活性剤を挙げ得る。
本発明の上記のアッセイ法の二つ以上の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子を固定化して、一つまたは両方のタンパク質の非複合型から複合型の分離を容易にし、ならびにアッセイの自動化に適合することができる。試験化合物のＮＯＶＸタンパク質への結合、または候補化合物存在下および非存在下でのＮＯＶＸタンパク質と標的分子との相互作用は、反応物質を含有するのに適する任意の容器において達成することができる。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心チューブを挙げ得る。一つの実施形態では、一つまたは両方のタンパク質をマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供し得る。例えば、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質またはＧＳＴ−標的融合タンパク質をグルタチオンセファローズビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)またはグルタチオンで誘導体化したマイクロタイタープレート上に吸着し、これを次いで試験化合物、または試験化合物および非吸着標的タンパク質またはＮＯＶＸタンパク質のどちらかと結合し、そして混合物を複合体形成を促進する条件下で(例えば、塩およびｐＨに関して生理的な条件で)インキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレート穴を洗滌して、非結合成分を全て除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定化し、複合体を例えば上述のように、直接的にまたは間接的に測定する。これに代えて、複合体をマトリックスから解離し、そしてＮＯＶＸタンパク質の結合または活性レベルを標準的技術を用いて測定することもできる。
マトリックス上にタンパク質を固定化する他の技術をまた、本発明のスクリーニングアッセイに使用し得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子のいずれかをビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。ビオチニル化ＮＯＶＸタンパク質または標的分子をビオチン−ＮＨＳ(Ｎ−ヒドロキシ−サクシンイミド)から当該分野内で周知の技術(例えば、ビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill.)を用いて調製して、ストレプトアビジンをコーティングした９６穴プレート(Pierce Chemical)の穴に固定化することができる。これに代えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応性があるが、ＮＯＶＸタンパク質のその標的タンパク質への結合を妨害しない抗体をプレートの穴に誘導体化して、非結合標的またはＮＯＶＸタンパク質を抗体との結合により穴に捕捉することができる。そのような複合体を検出する方法としては、ＧＳＴ−固定化複合体について上述したものに加えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応する抗体を用いる複合体の免疫検出、ならびにＮＯＶＸタンパク質または標的分子に関連した酵素活性を検出することに依存する酵素結合アッセイを挙げ得る。
もう一つの実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質発現のモジュレータを、細胞を候補化合物と接触し、細胞中のＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定する方法で同定する。候補化合物の存在下でのＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを、候補化合物の非存在下でのＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較する。次いで、候補化合物を、この比較に基づいてＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質のモジュレータとして同定し得る。例えば、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を候補化合物の存在下での方がその非存在下でよりも多い(即ち統計的に有意に多い)ときには、候補化合物を、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の促進剤として同定する。これに代えて、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の存在下での方がその非存在下でよりも少ない(即ち統計的に有意に少ない)ときには、候補化合物を、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤として同定する。細胞中のＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルを、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書で説明する方法により測定することができる。
本発明のなおもう一つの態様では、ＮＯＶＸタンパク質は２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイ(例えば米国特許第5,283,317号、Zervos, et al., 1993. Cell 72: 223-232、Madura, et al., 1993. J. Biol. Chem. 268: 12046-12054、Bartel, et al., 1993. Biotechniques 14: 920-924、Iwabuchi, et al., 1993. Oncogene 8: 1693-1696、および Brent 第ＷＯ９４／１０３００号を参照)おける「ベイトタンパク質」として使用して、ＮＯＶＸと結合または相互作用をしてＮＯＶＸ活性を調整する他のタンパク質(「ＮＯＶＸ結合タンパク質」または「ＮＯＶＸ−ｂｐ」)を同定し得る。そのようなＮＯＶＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＮＯＶＸ経路の上流または下流の要素としてＮＯＶＸタンパク質によるシグナルの増幅にも関与する。
２ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインより成る殆どの転写因子のモジュール構成的性質に基づく。略述すれば、アッセイには２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物においては、ＮＯＶＸをコードする遺伝子を既知の転写因子(例えば、ＧＡＬ−４)のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。他の構築物においては、未同定のタンパク質(「プレイ」または「試料」)をコードするＤＮＡ配列ライブラリー由来のＤＮＡを、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。もし「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用してＮＯＶＸ依存性複合体を形成することができれば、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインを近くに引き寄せ得る。この近接は、転写因子に応答性の転写調節部位に作動し得るように結合したレポーター遺伝子(例えば、ＬａｃＺ)の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現を検出し、機能的転写因子を含有する細胞コロニーを単離し、そしてこれを用いてＮＯＶＸと相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得ることができる。
本発明はさらに前述のスクリーニングアッセイにより同定する新規薬剤および本明細書に説明する処置へのその使用に関する。
検出アッセイ
本明細書で同定するｃＤＮＡの一部またはフラグメント(および対応する完全な遺伝子配列)をポリヌクレオチド試薬として種々の方式で使用することができる。例として、限定は無しに、これらの配列を：(i)染色体上にそれぞれの遺伝子をマップし；かくして遺伝的疾患に関連した遺伝子領域を位置決定する；(ii)微量の生物学的試料から個体を同定する(組織タイピング)；および(iii)生物学的試料の法医学的同定を助けるために用い得る。これらの応用の幾つかを以下のサブセクションで説明する。
染色体マッピング
一旦遺伝子の配列(または配列の一部)を単離すれば、この配列を用いて、染色体上の遺伝子の位置をマップすることができる。この方法を染色体マッピングと呼ぶ。したがって、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜３８の整数である)であるＮＯＶＸ配列の一部またはフラグメント、またはそれらのフラグメントまたは誘導体を用いて、染色体上のＮＯＶＸ遺伝子の位置をそれぞれマップし得る。染色体へのＮＯＶＸ配列のマッピングは、これらの配列を疾患に関連する遺伝子と相関づける重要な第一歩である。
略述すれば、ＮＯＶＸ遺伝子を、ＮＯＶＸ配列からＰＣＲプライマー(好ましくは１５−２５ｂｐ長)を調製することにより染色体にマップし得る。ＮＯＶＸ配列のコンピューター分析を使用して、ゲノムＤＮＡ中の二つ以上のエキソンに亘らず、増幅プロセスを複雑にしないプライマーを迅速に選択し得る。次いで、これらのプライマーを、個別のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用し得る。ＮＯＶＸ配列に対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが、増幅したフラグメントを生成する。
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳類由来の体細胞(例えば、ヒトおよびマウスの細胞)を融合することにより調製する。ヒトおよびマウスの細胞のハイブリッドが増殖し、分裂するうちに、それらはヒト染色体をランダムな順序で徐々に欠失するが、マウスの染色体を保持する。特定の酵素を欠くためマウス細胞は増殖できないが、ヒト細胞は増殖できる培地を用いることにより、必要とする酵素をコードする遺伝子を含有する一つのヒト染色体を保持する。種々の培地を使用することにより、ハイブリッド細胞株のパネルを樹立し得る。パネル中のそれぞれの細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体のいずれか、および完全なセットのマウス染色体を含有し、個別の遺伝子を特定のヒト染色体に容易にマップすることを可能にする。例えば、D'Eustachio, et al., 1983. Science 220: 919-924を参照されたい。ヒト染色体のフラグメントのみを含有する体細胞ハイブリッドをまた、転座および欠失を持つヒト染色体を用いることにより生産し得る。
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の配列を特定の染色体に対応付ける迅速な手順である。単一のサーマルサイクラーを用いて、１日に３個以上の配列を対応付けることが可能である。ＮＯＶＸ配列を用いてオリゴヌクレオチドプライマーをデザインすることにより、特定の染色体由来のフラグメントのパネルを用いて細かな局在部位の特定化を達成し得る。
分裂中期の染色体スプレッドへのＤＮＡ配列の蛍光インシツハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)をさらに用いて、正確な染色体上の位置を１ステップで提供し得る。染色体スプレッドを、コルセミドのような紡錘体を破壊する化学物質により細胞分裂を分裂中期でブロックされている細胞を用いて作成し得る。染色体を短時間トリプシンで処理し、次いでギムザ染色し得る。明暗のバンドのパターンがそれぞれの染色体上に出現し、それにより染色体を個別に同定し得る。ＦＩＳＨ技術を５００または６００塩基と短いＤＮＡ配列で使用し得る。しかしながら、１０００塩基より大きなクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度で特定の染色体上の位置に結合する可能性がより高い。好ましくは１０００塩基、そしてさらに好ましくは２０００塩基が合理的な時間に良好な結果を得るのに十分である。この技術の総説については、Verma, et al., HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES (Pergamon Press, New York 1988を参照されたい。
染色体マッピング用の試薬を個別に使用して、単一の染色体またはその染色体上の単一の部位を標識すること、または試薬のパネルを複数の部位および／または複数の染色体を標識するために使用し得る。遺伝子の非コード化領域に対応する試薬が実際には、マッピングの目的には好ましい。コード化領域を遺伝子ファミリー内で保存する可能性がより高く、かくして染色体マッピングの間に交叉ハイブリダイゼーションのチャンスが増大する。
一旦配列を正確な染色体上の位置にマッピングすると、染色体上の配列の物理的な位置を遺伝子マップのデータと関連づけ得る。そのようなデータを、例えば、McKusick, Mendelian Inheritance in Man (Hopkins University Welch Medical Libraryを通してオンラインで入手可能)に見出す。同じ染色体部位にマッピングした遺伝子と疾患との間の関係を、次いで、例えば、Egel and, et al., 1987. Nature, 325: 783-787に記載する関連分析(物理的に隣接している遺伝子の同時遺伝)により同定し得る。
さらに、ＮＯＶＸ遺伝子に関連した疾患に罹患している個体と罹患していない個体の間のＤＮＡ配列の差を測定し得る。もし変異を罹患している個体のいくらかまたは全部で観察するが、罹患していない個体のいずれでも観察しないならば、変異は特定の疾患の原因剤である可能性が高い。罹患した個体と罹患していない個体の比較は一般的に、まず染色体スプレッドから視認可能な欠失または転座のような染色体の目に見える構造変化、またはそのＤＮＡ配列に基づくＰＣＲの使用で検出可能な構造変化の探索を伴う。最後に、数人の個体由来の遺伝子の完全なシークエンシングを行って、変異の存在を確認し、そして変異を多型性と区別し得る。
組織タイピング
本発明のＮＯＶＸ配列をまた使用して、微量な生物学的試料から個体を同定し得る。この技術では、個体のゲノムＤＮＡを一つまたはそれ以上の制限酵素で消化して、サザンブロット上でプローブ結合し、同定用のユニークなバンドを生成する。本発明の配列は、ＲＦＬＰ(制限断片長多型、米国特許第５,２７２,０５７号に記載)のさらに別なＤＮＡマーカーとして有用である。
さらに、本発明の配列を使用して、個体のゲノムの選択した部分の実際の塩基ごとのＤＮＡ配列を測定するさらに別な技術を提供し得る。かくして、本明細書に説明したＮＯＶＸ配列を用いて、配列の５'末端および３'末端から二つののＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを用いて、個体のＤＮＡを増幅し、引き続いてこれをシークエンシングし得る。
それぞれの個体は、対立遺伝子の違いによるそのようなＤＮＡの特徴的セットを有するため、この様式で調製した個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、特徴的個体の同定を提供し得る。本発明の配列を使用して、個体および組織由来のそのような同定配列を得ることができる。本発明のＮＯＶＸ配列は、ヒトゲノムの部分を特徴的に表現する。対立遺伝子の変異は、これらの配列のコード化領域中にある程度起こり、そして非コード化領域中にはより大きな程度で起こる。個別のヒト間の対立遺伝子の変異は、５００塩基に約１個の頻度で起こるとみつもられる。対立遺伝子変異の多くは、制限断片長多型(ＲＦＬＰ)を含む単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に因る。
本明細書に説明する配列のそれぞれを、個体由来のＤＮＡを同定の目的で比較し得る標準として、ある程度、使用し得る。非コード化領域にはより多くの遺伝子多型が起こるため、個体を識別するにはより少ない配列が必要である。非コード化配列は、それぞれが１００塩基の非コード化増幅配列を生じる多分１０〜１０００個のプライマーのパネルにより個体の明白な同定を無理なく提供し得る。もし配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜３８の整数である)の配列のようなコード化配列を使用すれば、明白な個体の同定のためのさらに適切なプライマーの数は５００〜２０００であろう。
予測医学
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミクス、および臨床試験のモニタリングを予後的(予測的)目的で使用し、それにより個体を予防的に処置する、予測医学の分野に関する。したがって、本発明の１つの態様は、ＮＯＶＸタンパク質および／または核酸の発現ならびにＮＯＶＸ活性を生物学的試料(例えば、血液、血清、細胞、組織)との関連で測定して、それにより個体が異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害に罹患しているか、または障害を発症するリスクを有しているか否かを測定するための診断アッセイに関する。障害としては、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、がん関連悪液質、がん、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異脂肪血症、肥満に伴う代謝障害、代謝症候群Ｘならびに慢性疾患および種々のがんに関連した消耗性疾患を挙げ得る。本発明はまた、個体がＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または活性に関連した障害を発症するリスクを有しているか否かを測定するための予後的(予測的)アッセイを提供する。例えば、あるＮＯＶＸ遺伝子の突然変異を生物学的試料中でアッセイし得る。そのようなアッセイを、予後的または予測的目的に使用し、それによりＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または生物学的活性を特徴とするかまたはこれと関連する障害の発生に先立って個体を予防的に処置し得る。
本発明のもう一つの態様は、個体におけるＮＯＶＸタンパク質、核酸発現または活性を測定し、それによりその個体にとって適切な治療的または予防的な薬剤を選択する方法(本明細書では「薬理ゲノミクス」と呼称する)を提供する。薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型に基づいた個体の治療的または予防的処置のための薬剤(例えば薬)の選択を可能にする(例えば、個体の遺伝子型を検査して、個体が特定の薬剤に応答する能力を測定する)。
本発明のなおもう一つの態様は、薬剤(例えば、薬、化合物)が臨床試験においてＮＯＶＸの発現または活性に与える影響をモニタリングすることに関する。
これらおよび他の薬剤については以下のセクションで詳細に説明する。
診断的アッセイ
生物学的試料中におけるＮＯＶＸの存在または非存在を検出する例示的な方法は、被験対象から生物学的試料を得ること、および生物学的試料をＮＯＶＸタンパク質またはＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)を検出する能力のある化合物または薬剤と接触し、ＮＯＶＸの存在が生物学的試料中で検出できるようにすることを伴う。ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの検出用の薬剤は、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとハイブリダイズする能力のある標識核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜３８の整数である)の核酸のような全長ＮＯＶＸ核酸、またはその一部、例えば、少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長でそしてストリンジェントな条件下でＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドであり得る。本発明の診断的アッセイにおいて使用するための他の適当なプローブを本明細書で説明する。
ＮＯＶＸタンパク質検出用の薬剤は、ＮＯＶＸタンパク質に結合する能力のある抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはさらに好ましくはモノクローナルであり得る。インタクトな抗体、またはそのフラグメント(例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ')２)を使用し得る。プローブまたは抗体に関する用語「標識」とは、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングする(即ち物理的に連結する)ことによりプローブまたは抗体を直接的に標識すること、ならびに直接標識したもう一つの試薬との反応性によりプローブまたは抗体を間接的に標識することを包含する。間接的な標識の例としては、蛍光標識した第２抗体を用いた第１抗体の検出、および蛍光標識したストレブトアビジンで検出し得るように、ビオチンでＤＮＡプローブを末端標識することを挙げ得る。用語「生物学的試料」とは、対象から単離した組織、細胞および体液、ならびに対象内に存在する組織、細胞および体液を含む。即ち、本発明の検出法を使用して、インビトロおよびインビボで生物学的試料中のＮＯＶＸ ｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡを検出し得る。例えば、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインシツハイブリダイゼーションを挙げ得る。ＮＯＶＸタンパク質を検出するためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)、ウエスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光を挙げ得る。ＮＯＶＸゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションを挙げ得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質を検出するためのインビボ技術は、対象中へ標識抗ＮＯＶＸ抗体を導入することを含む。例えば、抗体を、対象中のその存在および位置を標準的な造影技術で検出し得る放射活性マーカーで標識することができる。
一つの実施形態では、生物学的試料は被験対象由来のタンパク質分子を含有する。これ代えて、生物学的試料は、被験対象由来のｍＲＮＡ分子または被験対象由来のゲノムＤＮＡ分子を含有し得る。好ましい生物学的試料は、対象より従来の手段で単離した末梢血白血球試料である。
もう一つの実施形態では、方法は、対照対象から対照の生物学的試料を得ること、対照試料をＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出する能力のある化合物または薬剤と、ＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を生物学的試料中で検出するように接触すること、および対照試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を試験試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと比較することをさらに伴う。
本発明はまた、生物学的試料中のＮＯＶＸの存在を検出するキットを包含する。例えば、キットは：生物学的試料中のＮＯＶＸタンパク質またはｍＲＮＡを検出する能力のある標識化合物または薬剤；試料中のＮＯＶＸの量を測定する手段；および試料中のＮＯＶＸの量を標準と比較する手段を含み得る。化合物および薬剤を適当な容器中に包装し得る。キットは、ＮＯＶＸタンパク質または核酸を検出するキットの使用説明書をさらに含み得る。
予後アッセイ
さらに、本明細書に説明する診断方法を利用して、異常ＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。例えば、先行の診断アッセイおよび以下のアッセイのような、本明細書で説明するアッセイを利用して、ＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または活性に関連した障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。これに代えて、予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。かくして、本発明は、試験試料を対象から得て、そして異常なＮＯＶＸタンパク質または核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)を検出する異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を同定する方法を提供し、そこではＮＯＶＸタンパク質または核酸の存在は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象に対する診断になる。本明細書において使用する「試験試料」とは、興味のある対象から得られる生物学的試料を指す。例えば、試験試料は体液(例えば血清)、細胞試料、または組織であり得る。
さらに、本明細書に説明する予後アッセイを使用して、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を処置するために、対象に薬剤(例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の医薬候補物)を投与することができるか否かを決定し得る。例えば、そのような方法を使用して、対象の疾患を薬剤により有効に処置するか否かを決定し得る。かくして、本発明は、試験試料を得て、ＮＯＶＸタンパク質または核酸を検出する異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した障害を薬剤により対象を有効に処置し得るか否かを決定する方法を提供する(例えば、そこではＮＯＶＸタンパク質または核酸の存在は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した障害を処置するために薬剤を投与され得る対象に対する診断になる)。
本発明の方法をまた使用してあるＮＯＶＸ遺伝子中の遺伝的損傷を検出し、それにより損傷のある遺伝子を有する対象が異常な細胞増殖および／または分化を特徴とする障害のリスクにあるか否かを決定し得る。種々の実施形態において、これらの方法は、対象由来の細胞試料中において、あるＮＯＶＸタンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を及ぼす少なくとも一つの変更、またはＮＯＶＸ遺伝子の誤発現を特徴とする遺伝的損傷の存在または不在の検出を含む。例えば、そのような遺伝的損傷を、(i)あるＮＯＶＸ遺伝子からの一つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失；(ii)あるＮＯＶＸ遺伝子への一つまたはそれ以上のヌクレオチドの付加；(iii)あるＮＯＶＸ遺伝子の一つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、(iv)あるＮＯＶＸ遺伝子の染色体再配列、(v)あるＮＯＶＸ遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベルの変化、(vi)ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのようなあるＮＯＶＸ遺伝子の異常修飾、(vii)あるＮＯＶＸ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、(viii)あるＮＯＶＸタンパク質の非野生型レベル、(ix)あるＮＯＶＸ遺伝子の対立遺伝子欠失、および(ｘ)あるＮＯＶＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾の少なくとも一つの存在の確認により検出し得る。本明細書に説明するあるＮＯＶＸ遺伝子の損傷を検出するために使用し得る当該分野において公知の多数のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的試料は、対象から従来の手段で単離した末梢血白血球試料である。しかしながら、例えば、頬粘膜細胞を含む有核細胞を含有する任意の生物学的試料を使用し得る。
特定の実施形態では、損傷の検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)(例えば米国特許第４,６８３,１９５号および第４,６８３,２０２号を参照)におけるかまたはこれに代えて、連結連鎖反応(ＬＣＲ)(例えば、Landegran, et al., 1988. Science 241: 1077-1080、およびNakazawa, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 360-364を参照)におけるプローブ／プライマーの使用を伴うが、後者はＮＯＶＸ遺伝子中の点突然変異検出に特に有用であり得る(Abravaya, et al., 1995. Nucl. Acids Res. 23: 675-682を参照)。この方法は、患者から細胞試料を集め、試料の細胞から核酸(例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方)を単離し、ＮＯＶＸ遺伝子(もし存在するならば)のハイブリダイゼーションおよび増幅が起きるような条件下で、あるＮＯＶＸ遺伝子と特異的にハイブリダイズする一つまたはそれ以上のプライマーと核酸試料を接触し、そして増幅産物の存在または不在を検出し、または増幅産物のサイズを検出し、そして対照試料と長さを比較するステップを含み得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に説明する変異の検出に使用する任意の技術と一緒に予備的増幅ステップとして使用するのが望ましい。
さらに別な増幅法としては：自己保持配列複製(Guatelli, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878を参照)、転写増幅システム(Kwoh, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177を参照); Ｑβレプリカーゼ(Lizardi, et al, 1988. BioTechnology 6: 1197を参照)、または任意の他の核酸増幅法に引き続いて当業者に周知の技術を用いる増幅分子の検出を挙げ得る。これらの検出スキームは、核酸分子がごく少数で存在するならば、そのような分子の検出に特に有用である。
さらに別の実施形態では、試料細胞由来のあるＮＯＶＸ遺伝子中の変異を、制限酵素切断パターンの変化により同定し得る。例えば、試料および対照のＤＮＡを単離し、増幅し(任意に)、一つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで処理し、そしてフラグメントのサイズをゲル電気泳動で測定して比較する。試料と対照のＤＮＡ間のフラグメントサイズの差は試料ＤＮＡ中の変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム(例えば、米国特許第５,４９３,５３１号を参照)を使用して、リボザイム切断部位の発生または消失により特異的な変異の存在を評価し得る。
他の実施形態では、ＮＯＶＸ中の遺伝的突然変異は、試料および対照の核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを数百または数千個のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイにハイブリダイズすることにより同定することができる。例えば、Cronin, et al., 1996. Human Mutation 7: 244-255、Kozal, et al., 1996. Nat. Med. 2: 753-759を参照されたい。例えば、ＮＯＶＸ中の遺伝的変異を、上述のCronin, et al.に記載するように光を発生するＤＮＡプローブを含有する２次元アレイ中で同定し得る。略述すれば、プローブの１番目のハイブリダイゼーションアレイを用いて、試料と対照中の長い一続きのＤＮＡをスキャンして、一連の重なり合うプローブの線形アレイを作成することにより配列間の塩基変化を同定し得る。このステップは点突然変異の同定を可能にする。これに、検出した全ての変異体または突然変異に相補的なさらに小さな特別のプローブアレイを用いることにより特定の変異の特徴化を可能にする２番目のハイブリダイゼーションを行う。それぞれの変異アレイは、一つは野生型遺伝子に相補的で、他は突然変異遺伝子に相補的な並行なプローブのセットから成る。
なおもう一つの実施形態において、当該分野において公知の種々のシークエンシング反応のいずれかを使用してＮＯＶＸ遺伝子を直接にシークエンシングして、試料のＮＯＶＸの配列を対応する野生型(対照)配列と比較することにより変異を検出し得る。シークエンシング反応の例としては、Maxim and Gilbert, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560またはSanger, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463により開発された技術に基づくものを挙げ得る。質量分析によるシークエンシング(例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４／１６１０１号; Cohen, et al., 1996. Adv. Chromatography 36: 127-162およびGriffin, et al., 1993. Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159を参照)を含む種々の自動化シークエンシング方法のいずれも診断アッセイの実施に際して利用され得ることをまた考え得る(例えば、Naeve, et al., 1995. Biotechniques 19: 448を参照)。
ＮＯＶＸ遺伝子中の変異を検出する他の方法としては、切断剤からの保護を用いてＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖中のミスマッチ塩基を検出する方法を挙げ得る。例えば、Myers, et al., 1985. Science 230: 1242を参照されたい。一般に、「ミスマッチ切断」の当該分野の技術は、野生型ＮＯＶＸ配列を含有する(標識した)ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織試料より得る潜在的突然変異体のＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズすることにより形成したヘテロ二重鎖を提供することから始まる。二重鎖を、対照および試料の鎖の間の塩基のミスマッチのために存在する二重鎖の単鎖領域を切断する薬剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖をＲＮａｓｅで処理し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処置し、ミスマッチ領域を酵素的に処理し得る。他の実施形態では、ミスマッチ領域を消化するために、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡの二重鎖のどちらかをヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理し得る。ミスマッチ領域の消化の後、得られた材料を次いで変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズにより分離して変異の部位を決定する。例えば、Cotton, et al., 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397、Saleeba, et al., 1992. Methods Enzymol. 217: 286-295を参照されたい。一つの実施形態では、対照のＤＮＡまたはＲＮＡを検出用に標識し得る。
なおもう一つの実施形態では、ミスマッチ切断反応は、細胞の試料より得られたＮＯＶＸｃＤＮＡ中で点突然変異を検出しマッピングするために、規定したシステム中で二重鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する一つまたはそれ以上のタンパク質(いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素)を使用する。例えば、E. coliのｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチのＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシダーゼはＧ／ＴミスマッチのＴを切断する。例えば、Hsu, et al., 1994. Carcinogenesis 15: 1657-1662を参照されたい。例示的な実施形態によれば、あるＮＯＶＸ配列、例えば、野生型ＮＯＶＸ配列に基づくプローブを、試験細胞(複数を含む)由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物とハイブリダイズする。この二重鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理して、切断生産物をもしあれば電気泳動のプロトコール等から検出し得る。例えば、米国特許第５,４５９,０３９号を参照されたい。
他の実施形態では、電気泳動上の移動度の変化を用いて、ＮＯＶＸ遺伝子の突然変異を同定する。例えば、単鎖コンフォーメーション多型(ＳＳＣＰ)を使用して、突然変異体および野生型核酸の間の電気泳動移動度の差を検出し得る。例えば、Orita, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 86: 2766、Cotton, 1993. Mutat. Res. 285: 125-144、Hayashi, 1992. Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79を参照されたい。試料および対照のＮＯＶＸ核酸の単鎖ＤＮＡフラグメントを変性し、復元することを可能にする。単鎖核酸の二次構造は配列により異なり、電気泳動上の移動度のそこで得る変化はたとえ１個の塩基変化の検出をも可能にする。ＤＮＡフラグメントを標識プローブで標識または検出し得る。アッセイの感度を、２次構造が配列変化により感受性であるＲＮＡ(ＤＮＡよりもむしろ)を使用することにより増大し得る。一つの実施形態では、主題の方法は、ヘテロ二重らせん分析を利用して、電気泳動の移動度の変化に基づいて二重らせんへテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Keen, et al., 1991. Trends Genet. 7: 5を参照されたい。
なおもう一つの実施形態では、ある勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲル中での突然変異体または野生型フラグメントの移動を、変性濃度勾配ゲル電気泳動(ＤＧＧＥ)を用いてアッセイする。例えば、Myers, et al., 1985. Nature 313: 495を参照されたい。ＤＧＧＥを分析法として使用する際、ＤＮＡを修飾し、例えば、凡そ４０ｂｐの高融点ＧＣ富化ＤＮＡのＧＣクランプをＰＣＲで付加することにより、それが完全に変性しないことを保証する。さらなる実施形態では、変性勾配に代えて温度勾配を使用して、対照および試料のＤＮＡの移動度の差を同定する。例えば、Rosenbaum and Reissner, 1987. Biophys. Chem. 265: 12753を参照されたい。
点突然変異を検出するための他の技術の例として、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長を挙げ得るが、これらに限定しない。例えば、既知の変異を中央に置いたオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで完全なマッチが見られる場合にのみハイブリダイゼーションを認める条件下で、標的ＤＮＡとハイブリダイズする。例えば、Saiki, et al., 1986. Nature 324: 163、Saiki, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230を参照されたい。オリゴヌクレオチドをハイブリダイズ用膜に付着して、標識した標的ＤＮＡとハイブリダイズする際、そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅した標的ＤＮＡまたはある数の異なる突然変異体とハイブリダイズする。
これに代えて、選択的ＰＣＲ増幅に基づく対立遺伝子特異的増幅技術を本発明と一緒に使用し得る。特異的増幅のためのプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドは、興味のある変異を分子の中央で(増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存するように；例えば、Gibbs, et al., 1989. Nucl. Acids Res. 17: 2437-2448を参照)または適切な条件下で、ミスマッチがポリメラーゼ伸長を阻止または低減できる(例えば、Prossner, 1993. Tibtech. 11: 238を参照)一つのプライマーの３'最末端において保持していてもよい。加えて、切断に基づく検出を創成するために、変異の領域に新規制限部位を導入するのが望ましい。例えば、Gasparini, et al., 1992. Mol. Cell Probes 6: 1を参照されたい。特定の実施形態では、増幅はまた、増幅のためのＴａｑリガーゼを使用して実施され得ることを予想する。例えば、Barany, 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189を参照されたい。このような場合には、５'末端配列の３'末端に完全なマッチがある場合にのみ連結が起こり、増幅の存在または不在を調べることにより特定の部位における既知の変異の存在を検出することを可能にする。
本明細書に説明する方法を、例えば、本明細書に説明する少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含むプレパック診断キットを利用することにより実施し得る。これを、例えば、臨床の場においてＮＯＶＸ遺伝子の関与する疾患または疾病の症状を示すかまたは家族歴のある患者を診断するのに簡便に使用し得る。
さらに、ＮＯＶＸを発現する任意の細胞タイプまたは組織、好ましくは末梢血白血球を本明細書に説明した予後アッセイに利用し得る。しかしながら、例えば、頬粘膜細胞の有核細胞を含む任意の生物学的試料を使用し得る。
薬理ゲノミクス
本明細書に説明したスクリーニングアッセイにより同定するようなＮＯＶＸ活性(例えば、ＮＯＶＸ遺伝子発現)に促進的または阻害的効果を有する薬剤またはモジュレータを個体に投与し、障害を(予防的にまたは治療的に)処置することができる。障害としては、限定しないが、例えば、前記の疾病、障害および状態を含み、特に、表Ａに要約するようなＮＯＶＸタンパク質の相同物と関連した疾病、障害および状態を含む。
そのような処置と一緒に、個体の薬理ゲノミクス(即ち、個体の遺伝子型および外来性化合物または薬に対するその個体の応答との間の関係の研究)を考慮し得る。治療薬の代謝の差は、薬理学的に活性な薬の用量と血中濃度の関係を変えることにより、重症の毒性または治療の失敗をもたらし得る。かくして、個体の薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型の考慮に基づく予防的または治療的処置ための有効な薬剤(例えば薬)の選択を許容する。そのような薬理ゲノミクスをさらに用いて、適切な投与量および治療方法を決定し得る。したがって、個体のＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、またはＮＯＶＸ遺伝子の変異の含量を測定し、それにより個体の治療的処置または予防的処置に適切な薬剤(複数を含む)を選択し得る。
薬理ゲノミクスは、罹患した人における変化した薬剤分布および異常な作用に因る薬への応答における臨床的に有意な遺伝的変異を取り扱う。例えば、Eichelbaum, 1996. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 23: 983-985; Linder, 1997. Clin. Chem., 43: 254-266を参照されたい。一般に、二つのタイプの薬理遺伝的状態を区別し得る。薬が身体に作用する方式を変える単一の因子として伝達する遺伝的的状態(変化した薬剤作用)または身体が薬に作用する方式を変える単一因子として伝達する遺伝的状態(変化した薬物代謝)がある。これらの薬理遺伝的状態は、稀な欠陥または多型性のどちらかとして生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素(Ｇ６ＰＤ)欠乏症は、よくみられる遺伝性酵素異常症であり、そこでは主な臨床的合併症は、酸化剤の薬(抗マラリア剤、スルホンアミド剤、鎮痛剤、ニトロフラン類)摂取後またはソラマメ摂食後の溶血である。
例示的実施形態として、薬の代謝酵素の活性は、薬の作用の強度および持続の両者の主たる決定因子である。薬の代謝酵素の遺伝的多型性(例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２(ＮＡＴ２)ならびにチトクローム妊娠帯前駆タンパク質酵素のＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９)の発見は、なぜ或る患者は標準かつ安全用量の薬物摂取後に期待した薬の効果を得られないかまたは過大な薬の応答および重篤な毒性を示すのかについての説明を提供する。これらの多型性を、人口集団で高代謝群(ＥＭ)および低代謝群(ＰＭ)の２つの表現型で表現する。ＰＭの存在比率は異なる集団間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型性で、そして幾つかの変異が、機能的なＣＹＰ２Ｄ６の不在をもたらすＰＭを同定する。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低代謝群は、標準的な用量の投与を受けた際、極めて頻繁に過剰な薬の応答および副作用を経験する。代謝物が活性な治療成分であるならば、ＣＹＰ２Ｄ６が生成する代謝物モルヒネにより仲介するコデインの鎮痛作用について実証するように、ＰＭは治療応答を示さない。それと全く正反対なのが、標準の用量に応答しないいわゆる超高速代謝群である。最近、超高速代謝群の分子的根拠をＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に因ると確認する。
従って、個体のＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、またはＮＯＶＸ遺伝子の変異含量を測定し、それにより個体の治療的処置または予防的処置のために適切な薬剤(複数を含む)を選択し得る。加えて、薬理遺伝学的研究を用いて、薬の代謝酵素をコードする遺伝子多型の対立遺伝子の遺伝子型決定を、個体の薬の応答性の表現型の同定に応用し得る。この知識を投与量および薬の選択に応用する際、本明細書で説明する例示的スクリーニングアッセイの一つにより同定したモジュレータのようなＮＯＶＸモジュレータで対象を処置する際に、有害作用または治療失敗を避け、かくして治療的または予防的効率を増強し得る。
臨床試験の作用モニタリング
ＮＯＶＸの発現または活性(例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調整する活性)に対する薬剤(例えば、薬、化合物)の影響をモニタリングすることは、基礎的な薬のスクリーニングに応用できるだけでなく、また臨床試験にも応用できる。例えば、本明細書に説明したようにスクリーニングアッセイにより、ＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを増加し、またはＮＯＶＸ活性を上方調節すると決定した薬剤の有効性を、低下したＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、または下方制御されたＮＯＶＸ活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。これに代えて、スクリーニングアッセイにより、ＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを減少し、またはＮＯＶＸ活性を下方調節すると決定した薬剤の有効性を、増加したＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、または上方制御したＮＯＶＸ活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。そのような臨床試験において、ＮＯＶＸ、および、好ましくは、例えば、細胞増殖または免疫障害に関係する他の遺伝子の発現または活性を、特定の細胞の免疫応答性の「読み出し」またはマーカーとして使用し得る。
限定しない例として、ＮＯＶＸ活性(例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定する)を調整する薬剤(例えば、化合物、薬または低分子)を用いた処置により細胞中で調整するＮＯＶＸを含む遺伝子を同定し得る。従って、細胞増殖障害に対する薬剤の効果を、例えば、臨床試験において検討するために、細胞を単離してＲＮＡを調製し、そして障害に関連すると思うＮＯＶＸおよび他の遺伝子の発現レベルを分析し得る。遺伝子発現レベル(即ち、遺伝子発現パターン)を、本明細書に説明するようにノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲにより、またはこれに代えて本明細書で説明する方法の一つにより生産したタンパク質の量を測定することにより、またはＮＯＶＸまたは他の遺伝子の活性レベルを測定することにより、定量することができる。この様式においては、遺伝子発現パターンは、薬剤に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとしての役割を果たす。したがって、薬剤による個体の処置の前および処置中の種々の時点で、この応答状態を測定し得る。
一つの実施形態において、本発明は、薬剤(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、核酸、低分子、または本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した他の薬候補物)で対象を処置することの有効性をモニターする方法を提供し、その方法は、(i)薬剤投与前に対象から投与前試料を得て、(ii)投与前試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出し、(iii)対象から一つまたはそれ以上の投与後の試料を得て、(iv)投与後の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを検出し、(v)投与前の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを投与後のひとつまたは複数の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡと比較し、そして(vi)それにしたがって対象への薬剤の投与を変更するステップを含む。例えば、ＮＯＶＸの発現または活性を検出したより高レベルに増加するためには、即ち、薬剤の有効性を増加するためには、薬剤の増加した投与が望ましい。これに代えて、ＮＯＶＸの発現または活性を検出したより低レベルに減少する、即ち、薬剤の有効性を減少するためには、薬剤の減少した投与が望ましい。
処置方法
本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した障害のリスクにある(感受性)かまたは障害を有する対象を処置する予防的方法および治療的方法の両方を提供する。障害としては、限定しないが、例えば、前記の疾病、障害および状態を含み、特に、表Ａに要約するようなＮＯＶＸタンパク質の相同物と関連した疾病、障害および状態を含む。
これらの処置法を以下にさらに詳細に考察する。
疾患および障害
増加したレベル(疾患または障害に罹患していない対象と比べて)または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性に拮抗する(即ち、低下するかまたは阻害する)治療薬で処置し得る。活性に拮抗する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、(i)前述のペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメントまたは相同体；(ii)前述のペプチドに対する抗体；(iii)前述のペプチドをコードする核酸；(iv)アンチセンス核酸および前述のペプチドの内在的機能を相同組換えにより「ノックアウト」するのに使用する「機能障害性」である核酸(即ち、前述のペプチドに対するコード化配列のコード化配列内への異種性挿入に因る)の投与(例えば、Capecchi, 1989. Science 244: 1288-1292を参照)；または(v)前述のペプチドおよびその結合相手との相互作用を変化するモジュレータ(即ち、本発明のさらに別なペプチドのミメティックまたは本発明のペプチドに特異的な抗体を含む阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト)を挙げ得るが、これらに限定しない。
減少したレベル(疾患または障害に罹患していない対象と比べて)または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性を増加する(即ち、アゴニストである)治療薬で処置し得る。活性を上方制御する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、前述のペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメント、または相同体；またはバイオアベイラビリティーを増加するアゴニストを挙げ得るが、これらに限定しない。
増加または減少したレベルを、患者の組織試料(例えば、生検組織から)を得て、インビトロでＲＮＡまたはペプチドのレベル、発現したペプチド(または前述のペプチドのｍＲＮＡ)の構造および／または活性をアッセイすることにより、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することにより容易に検出し得る。当該分野内で周知の方法としては、イムノアッセイ(例えば、ウエスタンブロット分析、免疫沈降とそれに引き続くドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学、等)および／またはｍＲＮＡ発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インシツハイブリダイゼーション、等)を挙げ得るが、これらに限定しない。
予防的方法
一つの態様では、異常なＮＯＶＸ発現または少なくともあるＮＯＶＸ活性を調整する薬剤を対象に投与することにより、本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または異常を、対象において予防する方法を提供する。異常なＮＯＶＸの発現または活性が原因または一因となって生じる疾患のリスクを有する対象を、例えば、本明細書で説明するように診断的アッセイまたは予後的アッセイのいずれかまたはそれらの組合せによって同定し得る。疾患または障害を予防し、または、これに代えて、その進行を遅らせるようにＮＯＶＸ異常に特徴的な症状の出現に先立って予防的薬剤の投与を行い得る。ＮＯＶＸ異常のタイプに依存して、例えば、あるＮＯＶＸアゴニストまたはＮＯＶＸアンタゴニストである薬剤を対象の処置に使用し得る。適切な薬剤を、本明細書で説明するスクリーニング法に基づいて決定することができる。本発明の予防的方法をさらに以下のサブセクションで考察する。
治療的方法
本発明のもう一つの態様は、治療目的のためにＮＯＶＸの発現または活性を調整する方法に関する。本発明の調整方法は、細胞を細胞に関連するＮＯＶＸタンパク質活性の一つまたはそれ以上の活性を調整する薬剤と接触することを含む。ＮＯＶＸタンパク質活性を調整する薬剤は、核酸またはタンパク質、あるＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する同属のリガンド、ペプチド、あるＮＯＶＸペプチドミメティック、または低分子のような本明細書に説明する薬剤であり得る。一つの実施形態では、薬剤は一つまたはそれ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を促進する。そのような促進的薬剤の例としては、活性なＮＯＶＸタンパク質および細胞中に導入したＮＯＶＸをコードする核酸分子を挙げ得る。もう一つの実施形態では、薬剤は一つまたはそれ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を阻害する。そのような阻害的薬剤の例としては、アンチセンスＮＯＶＸ核酸分子および抗−ＮＯＶＸ抗体を挙げ得る。これらの調整方法は、インビトロで(例えば、細胞を薬剤と共に培養することにより)または、これに代えて、インビボで(例えば、薬剤を対象に投与することにより)実施し得る。このように、本発明はあるＮＯＶＸタンパク質または核酸分子の異常な発現または活性を特徴とする疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。一つの実施形態では、その方法は、薬剤(例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した薬剤)またはＮＯＶＸの発現または活性を調整する(例えば、上方制御または下方制御する)薬剤の組合せを投与することを伴う。もう一つの実施形態では、その方法は減少または異常なＮＯＶＸの発現または活性を補償するための治療としてあるＮＯＶＸタンパク質または核酸分子を投与することを伴う。
ＮＯＶＸが異常に下方制御されているかおよび／または増加したＮＯＶＸ活性が有益な効果を有すると思われる状況では、ＮＯＶＸ活性を促進することが望ましい。そのような状況の一つの例は、対象が異常な細胞増殖および／または分化(例えば、がんまたは免疫関連疾患)を特徴とする障害を有する場合である。そのような状況のもう一つの例は、対象が妊娠性疾患(例えば、子癇前症)を有する場合である。
治療薬の生物学的効果の測定
本発明の種々の実施形態において、適切なインビトロまたはインビボアッセイを実施して、特定の治療薬の効果およびその投与を罹患している組織の処置に適応があるか否かを決定する。
種々の特定の実施形態において、患者の障害に関与する代表的なタイプ(複数を含む)の細胞についてインビトロアッセイを実施して、投与した治療薬が細胞タイプに所望の効果を発揮するかどうかを測定し得る。治療に使用する化合物を、ヒト対象での試験に先立って、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ等を限定することなく含む適切な動物モデルシステムで試験し得る。同様に、インビボ試験でも、ヒト対象への投与に先立って、当該分野において公知の動物モデルシステムのいずれかを使用し得る。
本発明の組成物の予防的使用および治療的使用
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は、種々の障害に関連する潜在的で予防的応用および治療的応用に有用である。障害としては、限定しないが、例えば、前記の疾病、障害および状態を含み、特に、表Ａに要約するようなＮＯＶＸタンパク質の相同物と関連した疾病、障害および状態を含む。
例として、本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、そしてタンパク質は、それを必要とする対象に投与する際に有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、本明細書に挙げられたものを含むが、それらに限定されない疾病、障害、状態およびそれに類似するものに罹患する対象の処置のための効験を有するであろう。
ＮＯＶＸタンパク質をコードする新規核酸、および本発明のＮＯＶＸタンパク質の両方、またはそれらのフラグメントはまた、核酸またはタンパク質の存在または量を評価する診断的応用にも有用であり得る。さらなる使用は、抗細菌分子(即ち、或るペプチドは抗細菌的性質を有することが見出されている)としてであるかもしれない。これらの物質は、治療的または診断的方法に使用するための本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の作成にさらに有用である。
本発明を、以下の実施例でさらに記載し、これらはクレームに記載の発明の範囲を限定しない。
実施例
実施例Ａ：ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列、および相同性データ
実施例１．NOV1、CG121992、コーディン
NOV1クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされたポリペプチド配列を表1Aに示す。
Figure 2006515753
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Figure 2006515753
Figure 2006515753
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上記タンパク質配列のClustalW比較により、以下の表1Bに示す配列アラインメントが得られる。
Figure 2006515753
Figure 2006515753
NOV1a、1bは、配列番号2および4のアミノ酸残基１〜２３にそれぞれ対応する分解可能なシグナルペプチドを有する。NOV1a成熟タンパク質は、配列番号2のアミノ酸残基２４〜９８２に対応する。NOV1b成熟タンパク質は、配列番号4のアミノ酸残基２４〜７９０に対応する。NOV1配列は、NOV1b、配列番号4のアミノ酸残基５１〜１２５および７０５〜７６２;NOV1a、配列番号2のアミノ酸残基５１〜１２５、７３２〜７８９、８１１〜８７７および８９９〜９５９;ならびにNOV1c、配列番号6のアミノ酸残基７〜８１および６８８〜７４５に対応するフォン・ウィルブランド因子C型ドメインを含有する。NOV1aおよびNOV1cは、配列番号2のアミノ酸残基３２９〜３５５および配列番号6の残基２８５〜３１１のそれぞれに新規な挿入を有する。
特許および特許公開公報で公開された配列を含有する独自のデータベースであるGeneseqデータベースに対するNOV1aタンパク質のサーチにより、表1Dに示すいくつかの相同なタンパク質が得られた。
Figure 2006515753
公開配列データベースのBLASTサーチでは、NOV1aタンパク質は、表1E中のBLASTPデータに示すタンパク質と相同性を有することが見出された。
Figure 2006515753
コーディンは、骨形成タンパク質(BMP)アンタゴニストである。BMPは、脱灰した骨抽出物が外骨格部位でインビボでの軟骨骨形成を誘発する能力により初めて同定された。これまでに15のBMPが同定されているが、これらは全て分泌されたシグナル伝達分子のトランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーのメンバーであり、組織分化および維持を制御する。それらは特定のセリン／スレオニンキナーゼ受容体と結合することにより胚形成において役割を担い、シグナルを核に変換する。対照的に、BMPに特異的に結合して、それらの特定の受容体への結合またはそれらのシグナル伝達を妨げることによりBMPの機能と拮抗するタンパク質が存在する。
コーディンは、TGF-β様BMPに結合してそれらを潜在的な複合体中に隔離することにより、正常な胚形成と干渉し得る。BMP1およびTLL1はアフリカツメガエルの胚において、過剰発現に対するコーディンの影響を弱めることが示されている(Scott et al. “Mammalian BMP-1/Tolloid-related metalloproteinases, including novel family member mammalian Tolloid-like 2, have differential enzymaticactivities and distributions of expression relevant to patterning and skeletogenesis.”Dev. Biol. 213: 283-300, 1999)。この著者らは、BMP1が初期の哺乳類胚形成ならびに出生前および出生後の骨格形成における主要なコーディンのアンタゴニストであることを示唆した。これはまた、BMP-4およびBMP-2と直接結合し、これらのタンパク質のそれらの受容体への結合と干渉する。
骨転移は、乳癌、前立腺癌、および他の癌を有する患者にしばしば起こる臨床的問題である。これらの病巣の形成は、癌細胞と骨の微小環境との間の多数の細胞および分子相互作用により決定される部位特異的なプロセスである。BMPは、骨腫瘍の予後における重要な因子の１つであることが示されている。BMP2、BMP4およびBMP6の過剰発現は、転移を伴う骨肉腫または前立腺癌のほとんどで見出された(Hamdy, F., Autzen, P., Robinson, MC., Wilson Horne, CH., Neal, DE. and Robson CN. “Immunolocalization and messenger RNA expression of bone morphogenetic protein-6 in human bening and malignant prostatic tissue.”Cancer Research 57: 4427-4431, 1997; Guo, W., Gorlick, R., Ladanyi, M., Meyers, PA., Huvos, AG., Bertino, JR., and Healey, JH)。
“Expression of bone morphogenetic proteins and receptors in sarcomas.”Clinical Orthopaedics および Related Research 365: 175-183, 1999”は、BMPと骨格転移との密接な関連を示唆している。BMP-2、-4、-6は、前立腺癌に続く転移病巣における骨芽細胞の変化に部分的に関連し得る。NOV1は、形態形成および癌の発生の制御において役割を担う。これは関連疾患のための重要な抗体またはタンパク質治療標的である。
NOV1aは、784aaから開始するフレームシフトを引き起こしている、エキソン19が欠失した新規コーディン様スプライスバリアントをコードする3628ヌクレオチドの核酸(CuraGen受託番号CG121992-03が指定された)を有する。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド２４７〜２４９から開始しヌクレオチド３１９３〜３１９５で終了することが同定された。この配列は、27アミノ酸ＫＷＤＧＧＫＴＲＥＫＶＲＥＳＴＣＬＲＫＡＨＭＣＧＬＡＧ(配列番号77)のフレームでの１つのアミノ酸変更L630Mおよび挿入により示されるコーディンのスプライスフォームを表す。982アミノ酸残基を有するコードされたタンパク質は、全長コーディンと比較して、4回繰り返されたフォン・ウィルブランド因子C型ドメインのうち２つを含む。フォン・ウィルブランド因子(VWF)C型ドメインは、ホメオスタシスの維持に関与するマルチドメインタンパク質/多機能タンパク質中に見出される。重複VWFCドメインは、オリゴマー形成に関与するが、最初のダイマー化段階には関与しない。多くの他の複合体形成タンパク質におけるこの領域の存在は、VWFCドメインの複合体形成における関与を指摘する。
本発明で開示されるコーディン様遺伝子は、第３染色体に位置づけられる。コーディン様タンパク質NOV1aについてのPSORT、Signal Pの結果は、この配列がシグナルペプチドを有し、かつ0.5469の確率で細胞外に位置付けられそうであると予想する。シグナルペプチドは、Signal Pにより、26位と27位の間のアミノ酸:ARG-AGで分解されていると予想される。
実施例2．NOV2、CG186275、ADAM 22
NOV2クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされたポリペプチド配列を表2Aに示す。
Figure 2006515753
Figure 2006515753
Figure 2006515753
NOV2aタンパク質のさらなる解析により、以下の特性を得た。NOV2aは、配列番号8のアミノ酸残基１〜２５に対応する分解可能なシグナルペプチドを有する。NOV2aは、アミノ酸残基８１〜９８および８４１〜８７１に新規な挿入を有し、かつ配列番号8の残基７８４〜７８４の間の36アミノ酸が欠失している。
特許および特許公開公報で公開された配列を含有する独自のデータベースであるGeneseqデータベースに対するNOV2aタンパク質のサーチにより、表2Bに示すいくつかの相同なタンパク質が得られた。
Figure 2006515753
公開配列データベースのBLASTサーチでは、NOV2aタンパク質は、表2C中のBLASTPデータに示すタンパク質と相同性を有することが見出された。
Figure 2006515753
PFam解析により、NOV2aタンパク質が表3Fに示すドメインを含有することを予測する。
Figure 2006515753
細胞ディスインテグリンはまた、ADAM(ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ)MDC(メタロプロテアーゼ様、ディスインテグリン様およびシステインリッチ)タンパク質としても知られており、細胞と細胞および細胞と基質相互作用のレギュレータである。これらはプロドメイン、メタロプロテアーゼ様ドメイン、ディスインテグリン様ドメイン、システインリッチドメイン、上皮成長因子様ドメイン、膜貫通型ドメインおよび細胞質ドメインを含む多数の領域を含有する。
NOV 2aは、新規なADAM22様タンパク質をコードする2847ヌクレオチドの核酸(CuraGen受託番号CG186275-03に指定された)を有する。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド４７〜４９から開始しヌクレオチド２７９５〜２７９７で終了すると同定された。コードされたタンパク質は、916アミノ酸残基を有し、18アミノ酸ＲＱＩＱＭＦＬＫＳＥＳＱＫＴＩＹＱＩ(配列番号79)の１つのエキソン挿入を有する、81位に示されるADAM22のスプライスフォームである。本発明で開示されるNOV3遺伝子は、染色体7q21に位置付けられる。
タンパク質中の同定可能なドメインの存在は、Pfam、PROSITE、ProDom、BlocksまたはPrintsのようなドメインデータベースのサーチにより決定され、次いで、Interproドメイン受託番号により同定される。重要なドメインには、レプロリジンドメイン、ディスインテグリンドメインおよびメタロエンドペプチダーゼドメインが挙げられる。
CD156に見出されるレプロリジン(ADAM8(EC3.4.24.-)またはMS2ヒトともいう)は、白血球の血管外遊走に関係する。このファミリーのメンバーは、ペプチドを分解する酵素である。これらのプロテアーゼは、触媒作用に亜鉛を必要とする。このファミリーのメンバーはまた、アダマリジン（adamalysin）としても知られている。このファミリーのメンバーのほとんどはヘビ毒エンドペプチダーゼであるが、P78325のようないくつかの哺乳類タンパク質およびファーティリンQ28472もある。ファーティリンおよび密接に関連するタンパク質は、いくつかの活性部位残基を有しないようであるので、活性酵素ではあり得ない。
メタロエンドペプチダーゼM12Bは、マトリキシン（matrixin）の「システインスイッチ」に類似する配列モチーフを含有する。このドメインを含むタンパク質の多くは、細胞と細胞または細胞と基質相互作用を仲介し得る亜鉛プロテアーゼである。血小板の細胞外基質との接着および血小板と血小板相互作用は、血栓形成および止血に不可欠である。血小板は損傷した血管に接着して、生物学的に活性な化学物質を放出し、凝集するが、これは正常な血液中では阻害される機能である。フィブリノーゲンの活性化血小板の糖タンパク質IIb/IIIa複合体との結合は、血小板凝集に不可欠であり、ADP、コラーゲン、トロンビン、エピネフリンおよびプロスタグランジンエンドペルオキシド類似体を含む多くのアゴニストにより誘導される。ヘビ毒は、複雑な様式で血液凝集および血小板の機能に影響を与える：凝集および放出反応を誘導するものもあれば、それらを阻害するものもある。ディスインテグリンは、いくつかのヘビ毒の成分であるが、放出反応を阻害するのではなく、血小板凝集をブロックし、活性化血小板の受容体・糖タンパク質複合体へのフィブリノーゲンの結合を阻害することにより作用する。それらは血小板表面のインテグリン糖タンパク質IIb-IIIa受容体に結合することにより作用し、ADP、トロンビン、血小板活性化因子およびコラーゲンにより誘導される凝集を阻害する。血液凝集の予防におけるディスインテグリンの役割は、特に抗凝集剤に関する医薬としての対象を提供する。
ディスインテグリンは、多くのシステイン（それらの全てがジスルフィド結合に関与する）を含有する、約70のアミノ酸残基のペプチドである。ディスインテグリンは、多くの接着タンパク質の認識部位であるArg-Gly-Asp(RGD)配列を含有する。ディスインテグリンのRGD配列は、糖タンパク質IIb-IIIa複合体と相互作用する。
実施例3．NOV3 CG50586、β−セクレターゼ
NOV3クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされたポリペプチド配列を表3Aに示す。
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上記タンパク質配列のClustalW比較により、以下の表3Bに示す配列アラインメントが得られる。
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NOV3cタンパク質のさらなる解析により、以下の表3Cに示す特性を得た。
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特許および特許公開公報で公開された配列を含有する独自のデータベースであるGeneseqデータベースに対するNOV3cタンパク質のサーチにより、表3Dに示すいくつかの相同なタンパク質が得られた。
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公開配列データベースのBLASTサーチでは、NOV3aタンパク質は、表3E中のBLASTPデータに示すタンパク質と相同性を有することが見出された。
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PFam解析により、NOV3cタンパク質が表3Fに示すドメインを含有することを予測する。
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実施例4．NOV4、CG50637、Ｔ細胞表面糖タンパク質CD1B前駆体
NOV4クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされたポリペプチド配列を表4Aに示す。
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上記タンパク質配列のClustalW比較により、以下の表4Bに示す配列アラインメントが得られる。
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NOV4aタンパク質のさらなる解析により、以下の表4Cに示す特性を得た。
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特許および特許公開公報で公開された配列を含有する独自のデータベースであるGeneseqデータベースに対するNOV4aタンパク質のサーチにより、表4Dに示すいくつかの相同なタンパク質が得られた。
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公開配列データベースのBLASTサーチでは、NOV4aタンパク質は、表4E中のBLASTPデータに示すタンパク質と相同性を有することが見出された。
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PFam解析により、NOV4aタンパク質が表4Fに示すドメインを含有することを予測する。
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実施例5．NOV5、CG51117-09、ネフロネクチン
NOV5クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされたポリペプチド配列を表5Aに示す。
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NOV5aタンパク質のさらなる解析により、以下の表5Bに示す特性を得た。
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特許および特許公開公報で公開された配列を含有する独自のデータベースであるGeneseqデータベースに対するNOV5eタンパク質のサーチにより、表5Dに示すいくつかの相同なタンパク質が得られた。
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公開配列データベースのBLASTサーチでは、NOV5eタンパク質は、表5D中のBLASTPデータに示すタンパク質と相同性を有することが見出された。
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PFam解析により、NOV5eタンパク質が表5Eに示すドメインを含有することを予測する。
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腎臓の器官形成に必要とされる上皮と間葉系の相互作用は、インテグリンα８β１を欠いたマウスにおいて破壊される。しかしながら、このインテグリンの既知のリガンドのいずれも、この表現型の原因ではないようである。より関連するリガンドを同定するため、Brandenbergerら(2001)は、アルカリホスファターゼ(AP)と融合した可溶性インテグリンα１β１ヘテロダイマーを用いて、ブロットおよびｃＤＮＡライブラリーを探した。新生マウス腎臓抽出物において、α8β1-APは、７０〜９０ｋＤの新規リガンドを検出する。ネフロネクチンと命名されたこのタンパク質は、５つのEGF様反復、RGD配列を含有するムチン領域、およびCOOH-末端MAMドメインを含む細胞外基質タンパク質である。インテグリンα8β1およびいくつかのさらなるRGD結合インテグリンは、ネフロネクチンに結合する。ネフロネクチンmRNAは尿管芽上皮中で発現され、一方、α8β1は後腎間葉で発現される。ネフロネクチンは、α8β1-APによって検出されるリガンドと同じ分布で細胞外基質中に位置し、インビボでα8β1との複合体を形成する。従って、これらの結果は、ネフロネクチンが腎臓内でα8β1機能を仲介する関連リガンドであることを強く示唆する。ネフロネクチンは、腎臓外の多くの部位で発現されるので、これは発生において広範な役割を果たす(Brandenberger et. al., J Cell Biol 2001 Jul 23;154(2):447-58)。
NOV5eは、新規ネフロネクチン様タンパク質をコードする613ヌクレオチドの新規核酸である(CuraGen受託番号CG51117-09に指定された)。この配列は、30アミノ酸である１つのエキソン挿入を有し、かつ24位に１つのアミノ酸S挿入を有する位置で示されるネフロネクチンのスプライスフォームを表し、かつ第６染色体に位置付けられる。
本明細書中に開示されたタンパク質における同定可能なドメインの存在は、Pfam、PROSITE、ProDom、BlocksまたはPrintsのようなメインデータベースに対するサーチにより決定し、次いでInterproドメイン受託番号により同定された。170アミノ酸ドメイン、いわゆるMAMドメインは、機能的に多様なタンパク質の細胞外領域で認識されてきた。これらのタンパク質は、モジュラー、シグナルペプチドを含む受容体様構造、N-末端細胞外ドメイン、１回膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを有する。かかるタンパク質には、メプリン(細胞表面糖タンパク質)；A5抗原(展開的に制御される細胞表面タンパク質)；および受容体様チロシンタンパク質ホスファターゼが挙げられる。MAMドメインは、接着機能を有すると考えられている。これは、４つの保存されたシステイン残基を含有し、おそらくジスルフィド架橋を形成するであろう。
多数の他のほとんどの動物タンパク質において、上皮成長因子(EGF)の配列に見出される約３０〜４０アミノ酸長の残基配列が、より多くまたはより少なく保存された形で存在することが示された。EGF様パターンの１つまたはそれ以上のコピーを含有することが現在知られているタンパク質のリストは膨大で多岐にわたる。非関連のタンパク質であると思われるEGFドメインの機能的重要性はまだ明らかではない。しかしながら、共通の特徴は、これらの繰り返しが膜結合タンパク質の細胞外ドメインまたは分泌されることが知られているタンパク質(例外：プロスタグランジンG／Hシンターゼ)で見出されることである。EGFドメインは、(EGF中で)ジスルフィド結合に関与することが示されている６つのシステイン残基を含む。主な構造は、２本鎖β−シートおよびそれに続くC-末端の短い２本鎖シートへのループである。保存されたシステイン間のサブドメインは、種々の長さを有する。
NOV5a、クローン306433917は、NOV5eと比べて、アミノ酸配列ＧＫＹＱＣＨ、ＥＨＩＰＡＰＬＤＱＧＳＥＱＰＬＦＱＰＬＤＨＱＡＴＳＬＰＳＲ(配列番号79)が欠失し、２９アミノ酸である１つのエキソンの欠損および1つのアミノ酸変更I322Sを有するＰＲＱＰＳＮＤＬＦＥＩＦＥＩＥＲＧＶＳＡＤＤＥＡＫＤＤＰＧ(配列番号80)を有するスプライスフォームである。NOV5b、5c、5d、アセンブリ306447063、306447071、306447075はそれぞれ、NOV5e、CG51117-09の残基１〜６１１の間のオープンリーディングフレームをコードすることが見出された。クローン化された挿入NOV5c、306447071は、NOV5eと比べて、１７アミノ酸である１つのエキソンが欠失したＦＹＶＬＲＱＲＩＡＲＩＲＣＱＬＫＡ(配列番号81)を有し、アミノ酸配列ＥＨＩＰＡＰＬＤＱＧＳＥＱＰＬＦＱＰＬＤＨＱＡＴＳＬＰＳＲ(配列番号82)が欠失し、かつ24位に１つのアミノ酸S欠失を有し、アミノ酸変更Q159Hを有する親（parent）のスプライスフォームである。クローン化された挿入NOV5d、306447075は、NOV5eに比べて、アミノ酸配列ＥＨＩＰＡＰＬＤＱＧＳＥＱＰＬＦＱＰＬＤＨＱＡＴＳＬＰＳＲ(配列番号83)が欠失しており、24位に１つのアミノ酸S欠失を有する。NOV5b、306447063はNOV5eに比べてアミノ酸配列ＥＨＩＰＡＰＬＤＱＧＳＥＱＰＬＦＱＰＬＤＨＱＡＴＳＬＰＳＲ(配列番号84)が欠失している。
実施例6．NOV6、CG51923、プロトカドヘリンFat2前駆体
NOV6クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされたポリペプチド配列を表6Aに示す。
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上記タンパク質配列のClustalW比較は、NOV6配列との間の以下のような関係を示す。NOV6a、CG51923-01との比較では、NOV6nは、以下の配列変化を有する4264アミノ酸残基である：アミノ酸3754〜3759、-ARLSIはGQALTSになる；A3789Vになる；アミノ酸３９００〜３９０７では、ＨＳＳＳＮＶＳＱが欠失する；P4117L；E4160G。NOV6mは、以下の配列変化を有するNOV6aのアミノ酸残基２８０２〜４０２３に対応する：V3033A；L3514S；G3591D；M3631I。NOV6lは、NOV6aのアミノ酸残基１５６１〜２２３３に対応する。NOV6kは、以下の配列変化；Y1181H；Y1287D；N1303Sを有するNOV6aのアミノ酸１１４３〜１７３３に対応する。NOV6bおよびNOV6cの両方は、アミノ酸変更Q2991Hを有するNOV6bを有するNOV6aのアミノ酸２５６１〜３２３３に対応する。NOV6eおよびNOV6fはNOV6aのアミノ酸１〜６５９に対応し、NOV6eはアミノ酸変更R574Cを有する。NOV6gは、R574Cのアミノ酸変更を有するNOV6aのアミノ酸残基１９〜６５９に対応する。NOV6hおよびNOV6iは、NOV6aのアミノ酸１５４〜６５９に対応し、NOV6hはアミノ酸変更R574Cを有する。NOV6dは、アミノ酸変更M3631Iを有するNOV6aのアミノ酸３５５９〜４０４３に対応する。NOV6jは、A1100VおよびY1181Hアミノ酸変更を有するNOV6aアミノ酸５７０〜１２３３に対応する。
NOV6aタンパク質のさらなる解析により、以下の表6Bに示す特性が得られる。
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特許および特許公開公報で公開された配列を含有する独自のデータベースであるGeneseqデータベースに対するNOV6aタンパク質のサーチにより、表6Cに示すいくつかの相同なタンパク質が得られた。
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公開配列データベースのBLASTサーチでは、NOV6aタンパク質は、表6D中のBLASTPデータに示すタンパク質と相同性を有することが見出された。
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PFam解析により、NOV6aタンパク質が表6Eに示すドメインを含有することを予測する。
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CG51923-01の種々のオープンリーディングフレームは、以下のようにクローン化された：アセンブリ317868343および317868367、残基１〜６５９；アセンブリ317871203、残基１９〜６５９；アセンブリ317871219および317871243、残基１５４〜６５９；アセンブリ317871246、残基５７０〜１２３３；アセンブリ317999764、残基１１４３〜１７３３；アセンブリ318176301、残基１５６１〜２２３３；アセンブリ305869563および305869567、残基２５６０〜３２３３。クローン化された挿入は、元の配列と以下の点が異なる：アセンブリ317868343は３つのサイレントSNPおよび１つのR574Cアミノ酸変更を有する；アセンブリ317868367は１つのサイレントSNPを有する；アセンブリ317871203は２つのサイレントSNPと１つのR574Cアミノ酸変更を有する；アセンブリ317871219は３つのサイレントSNPおよび１つのR574Cアミノ酸変更を有する；アセンブリ317871243は１つのサイレントSNPを有する；アセンブリ317871246は２つのアミノ酸変更を有する：A1100VおよびY1181H；ならびにアセンブリ317999764は３つのアミノ酸変更を有する：Y1181H、Y1287DおよびN1303S;ならびにアセンブリ318176301は変更がない；アセンブリ305869563は、元の配列と１つのアミノ酸変更Q2992Hが異なる。一方、アセンブリ305869567のクローン化された挿入は元の配列に100%相同である。
実施例7．NOV7、CG52919、SEZ-6
NOV7クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされたポリペプチド配列を表7Aに示す。
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上記タンパク質配列のClustalW比較により、以下の比較が得られる。NOV7aは、543アミノ酸長のタンパク質配列である。NOV7bは、NOV7aのアミノ酸残基20-543に対応する成熟タンパク質配列である。NOV7cは、NOV7aのアミノ酸残基356-504に対応し、pfamにより予測されるスシドメインおよびCUBドメインを含む（以下を参照されたい）。
NOV7aタンパク質のさらなる解析により、以下の表7Bに示す特性を得た。
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特許および特許公開公報で公開された配列を含有する独自のデータベースであるGeneseqデータベースに対するNOV7aタンパク質のサーチにより、表7Cに示すいくつかの相同なタンパク質が得られた。
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公開配列データベースのBLASTサーチでは、NOV7aタンパク質は、表7D中のBLASTPデータに示すタンパク質と相同性を有することが見出された。
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PFam解析により、NOV7aタンパク質が表7Eに示すドメインを含有することを予測する。
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実施例8．NOV8、CG94946、アグリン前駆体
NOV8クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされたポリペプチド配列を表8Aに示す。
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上記タンパク質配列のClustalW比較により、以下の配列比較が得られる。NOV8bは、以下の変化を有するNOV8aタンパク質配列アミノ酸残基１４０４〜２０５２に対応する：I1658F；A1670V；およびNOV8a配列の1756-1759が欠失し、さらに、以下のpfamにより予測されるように、いくつかのラミニンGおよびEGFドメインを含む。
NOV8aタンパク質のさらなる解析により、以下の表8Bに示す特性を得た。
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特許および特許公開公報で公開された配列を含有する独自のデータベースであるGeneseqデータベースに対するNOV8aタンパク質のサーチにより、表8Cに示すいくつかの相同なタンパク質が得られた。
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公開配列データベースのBLASTサーチでは、NOV8aタンパク質は、表8D中のBLASTPデータに示すタンパク質と相同性を有することが見出された。
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PFam解析により、NOV8aタンパク質が表8Eに示すドメインを含有することを予測する。
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実施例B：NOVXクローンの配列決定法および同定
1．Gene Calling（登録商標）技術：これは、CuraGenで開発され、Shimkets et al., “Gene expression analysis by transcript profiling coupled to a gene database query”Nature Biotechnology 17:198-803 (1999)に記載された、２つまたはそれ以上の試料間で差次的遺伝子発現プロファイリングを行う独自の方法である。ｃDNAは、異なるドナー由来の多数の組織型、正常および疾患状態、生理的状態および発生状態を表す種々のヒト試料からもたらされた。試料は、全組織、初代細胞または組織培養初代細胞もしくは細胞株として得られた。細胞および細胞株は、遺伝子発現を制御する生物学的または化学的因子、例えば、成長因子、ケモカイン、またはステロイドで処理されていてもよい。このようにもたらされたｃＤＮＡを、次に、最大１２０対もの制限酵素で消化し、制限酵素のそれぞれの対に特異的なリンカー・アダプター対を適当な末端にライゲートした。制限酵素の消化により、固有のｃＤＮＡ遺伝子フラグメントの混合物を生じる。限定ＰＣＲ増幅を、一方のプライマーをビオチン化しかつ他方のプライマーを蛍光標識した、リンカー・アダプター配列に相同なプライマーにより行った。二重に標識された材料を単離し、蛍光標識された１本鎖をキャピラリーゲル電気泳動で分離した。コンピューターアルゴリズムにより、実験群および対照群由来の電気泳動図をそれぞれの制限酵素消化について比較する。この配列由来の情報およびさらなる配列由来の情報を用いて、それぞれの差次的発現遺伝子フラグメントの同一性を種々の遺伝子データベースを用いて予測する。遺伝子フラグメントの同一性を、さらなる遺伝子特異的競合的ＰＣＲによりあるいは遺伝子フラグメントの単離そして配列決定により、確認した。
2．SeqCalling（登録商標）テクノロジー：cDNAは、異なるドナー由来の多数の組織型、正常および疾患状態、生理的状態、および発生状態を表す種々のヒト試料からもたらされた。試料を、全組織、初代細胞または組織培養初代細胞、または細胞株として得た。細胞および細胞株は、遺伝子発現を制御する生物学的または化学的因子、例えば、成長因子、ケモカイン、またはステロイドにより処理されていてもよい。このようにもたらされたｃＤＮＡを次に、CuraGen独自のSeqCallingテクノロジーを用いて配列決定した。配列トレースを手作業で評価し、適切な場合は訂正のため編集した。全試料由来のｃＤＮＡ配列を、時には公開ヒト配列を含めて共にアセンブルし、バイオインフォマティックプログラムを用いて、それぞれのアセンブリについて共通配列を得た。それぞれのアセンブリを、CuraGen社のデータベースに含めている。別の構成要素との同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合、配列をアセンブリの構成要素として含めた。それぞれのアセンブリは、遺伝子またはその一部を表し、そしてスプライスフォーム、１塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失、および他の配列変異の様な変異体についての情報を含む。
3．PathCalling（登録商標）技術：NOVX核酸配列は、ツーハイブリッドアプローチによるｃＤＮＡライブラリーの実験室スクリーニングによりもたらされる。DNA配列の全長または当該配列の部分のいずれか、あるいは両方をカバーするcDNAフラグメントを配列決定する。コンピューターでの予測は、CuraGen社の独自の配列データベースまたは公開されたヒト配列データベースで入手可能な配列に基づいており、全長DNA配列またはそのある部分を提供した。
実験室スクリーニングは、以下に要約した方法を用いて行った：
ｃDNAライブラリーは、異なるドナー由来の多数の組織型、正常および疾患状態、生理的状態、および発生状態を表す種々のヒト試料からもたらされた。試料を、全組織、初代細胞または組織培養細胞、または細胞株として得た。細胞および細胞株は、遺伝子発現を制御する生物学的因子または化学的因子、例えば、成長因子、ケモカイン、またはステロイドにより処理されていてもよい。このようにしてもたらされたｃＤＮＡを次に、適当なツーハイブリッドベクター（Gal4活性化ドメイン(Gal4-AD)融合体)に向き指定でクローン化した。次に、かかるｃＤＮＡライブラリーならびにClontech(Palo Alto, CA)から市販されているcDNAライブラリを、大腸菌（E.coli）からCuraGen社独自の酵母株（本明細書において、引用により全体的に取り込まれている米国特許第6,057,101号および同第6,083,693号に開示されている）に移した。
ヒト配列のCuraGen社独自のライブラリーのGal4結合ドメイン(Gal4-BD)融合体を用いて、多数のGal4-AD融合体cDNAライブラリーをスクリーニングし、それぞれがGal4-AD融合体が個々のcDNAを含有している酵母ハイブリッド二倍体を選択した。それぞれの試料を、cDNA挿入境界で非特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて増幅した。かかるPCR産物を配列決定し、配列トレースを手作業で評価し、適切な場合は訂正のために編集した。全試料由来のcDNA配列を、時には公開ヒト配列を含めて共にアセンブルし、バイオインフォマティックプログラムを用いてそれぞれのアセンブリの共通配列を得た。それぞれのアセンブリはCuraGen社のデータベースに含まれている。別の構成要素との同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合、配列をアセンブリの構成要素として含めた。それぞれのアセンブリは、遺伝子またはその部分を表し、スプライスフォーム、１塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失、および他の変異の様な変異体の情報を含んでいる。
物理的クローン：全オープンリーディングフレームをカバーする、スクリーニング手順によりもたらされたcDNAフラグメントを、組み換えDNAとしてcDNAライブラリーの作製に用いたpACT2プラスミド(Clontech)にクローン化した。組み換えプラスミドを宿主に挿入し、CuraGen社独自の酵母株N106'およびYULH(米国特許第6,057,101号および同第6,083,693号)のかけあわせによりスクリーニング手順の間に生じた酵母ハイブリッド二倍体により選択する。
4．RACE:cDNA末端迅速増幅法(RACE)のようなポリメラーゼ鎖反応に基づく技術を用いて、本発明のcDNAの予測配列を単離または完全化した。通常、１つまたはそれ以上のヒト試料から多数のクローンを配列決定し、フラグメントの配列を導いた。異なるドナー由来の種々のヒト組織試料をRACE反応に用いた。この手順によりもたらされた配列は、前節に記載したSeqCallingアセンブリプロセスに含まれている。
5．エキソン結合:本発明で同定されたNOVX標的配列を、エキソン結合プロセスに供して配列を確認した。PCRプライマーは、フォワードプライマーについては入手可能な最も上流の配列、リバースプライマーについては入手可能な最も下流の配列で開始することにより設計した。いずれの場合にも、特有であるかまたは選択性の高い適した配列に出会うまで、あるいはリバースプライマーの場合には停止コドンに達するまで、それぞれの末端からコード配列に向かって内側へ進んで配列を調べた。かかるプライマーを、全長cDNAについてのコンピューター予測、標的配列のDNAまたはタンパク質配列の部分（１つ以上のエキソン）に基づき、あるいは予測エキソンの他の種由来の密接に関連するヒト配列に対する翻訳後相同性により設計した。次いで、これらのプライマーを、ヒトcDNAの以下のプール:副腎、骨髄、脳-扁桃体、脳-小脳、脳-海馬、脳-黒質、脳-視床、脳-全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫-Raji、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮に基づくPCR増幅に用いた。通常、得られたアンプリコンをゲル精製し、高い重複性までクローン化して配列決定した。エキソン結合から得られたPCR産物を、Invitrogen製のpCR2.1ベクターにクローン化した。得た細菌クローンは、pCR2.1ベクターにクローン化された全オープンリーディングフレームをカバーする挿入部分を有する。全クローンから得た配列は、それら自身、CuraGen社のデータベースにある他のフラグメント、および公開ESTによりアセンブルした。アセンブリの別の構成要素との同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合、フラグメントおよびESTを、アセンブリの構成要素として含んだ。さらに、配列トレースを手作業で評価し、適当な場合には訂正のため編集した。この手順により、本明細書に記載の配列が提供される。
6.物理的クローン:相同性によってエキソンを予測し、標準的な遺伝子規則を用いてイントロン/エキソンの境界を決定した。エキソンをさらに選択し、複数のBLAST(例えば、tBlastN、BlastX、およびBlastN)検索、また場合によっては、GeneScanおよびGrailを用いて類似性の決定により正確なものとした。遺伝子配列をさらに規定し、かつ完全化するために利用可能な場合には、公開データベースおよび独自のデータベース双方由来の発現配列も加えた。次いで、明らかな不整合に関してDNA配列を手作業で訂正し、これにより全長タンパク質をコードする配列が得られた。
全オープンリーディングフレームをカバーする、エキソン結合によって得られたPCR産物をInvitrogen製のpCR2.1ベクターにクローン化し、発現およびスクリーニング目的に用いるクローンを準備した。
実施例C:種々の細胞および組織におけるクローンの定量的発現解析
種々のＮＯＶＸ遺伝子の定量的発現を、種々の正常および病変由来細胞、細胞株、および組織由来のＲＮＡ試料を含有するマイクロタイタープレートを用いて、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴＱ−ＰＣＲ）を用いて、Applied Biosystems (Foster City, CA) ABI PRISM（登録商標）7700またはABI PRISM（登録商標）7900HT Sequence Detection System上で評価した。
全試料のRNAの完全性を、28Sおよび18SリボソームRNA染色強度比(2:1〜2.5:1 28s:18s)をガイドとして用い、かつ低分子量RNA(分解産物)が存在しない、アガロースゲル電気泳動図の目視評価により決定した。RTQ-PCR反応に含まれるゲノムDNAのコンタミネーションを検出するため、対照試料は、逆転写酵素の不存下で単一エキソンの範囲にわたり増幅するよう設計したプローブおよびプライマーセットを用いて実施した。
RNA試料を、恒常的発現遺伝子（すなわち、β−アクチンおよびGAPDH）をコードする核酸に対して標準化した。あるいは、標準化していないRNA試料を、Superscript II (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, カタログ番号18064-147)およびランダムな六量体を用い、製造元の指示に従い１本鎖cDNA(sscDNA)に変換した。容量20μl中にトータルRNA最大10μgを含有、または容量100μl中にトータルRNA50μgを含有するようスケールアップした反応液を、42℃で60分インキュベートした。次いで、sscDNA試料を上述の核酸に対して標準化した。
プローブおよびプライマーを、Applied Biosystems Primer Expressソフトウェアパッケージ(Apple ComputerのMacintosh Power PC用バージョンI)に従って、または標的配列をインプットとして用いる類似のアルゴリズムにより設計した。プライマーを選択する前に、初期反応条件設定および以下のパラメータを設定した：プライマー濃度 250nM；プライマー融解温度(Tm)範囲58℃〜60℃；プライマー最適Tm 59℃；最大プライマー差 2℃(プローブが5'Gを有さない場合、プローブのTmはプライマーのTmよりも10℃高くなければならない)；およびアンプリコンサイズ 75bp〜100bp。選択したプローブおよびプライマーは、Synthegen(Houston, TX)によって合成された。プローブをHPLCにより２回精製して、未結合のダイを除去し、質量分析により評価し、レポーターおよびクエンチャーダイのプローブの5'末端および3'末端それぞれへの結合を確認した。最終濃度は、フォワードおよびリバースプライマーが900nM、そしてプローブが200nMであった。
標準化RNAを、96または384ウェルPCRプレート(Applied Biosystems, Foster City, CA)の個々のウェルにスポットした。PCRカクテルは、単一の遺伝子特異的プローブおよびプライマーセットまたは２つの多重化プローブおよびプライマーセットを含んでいた。PCR反応を、TaqMan（登録商標）One-Step RT-PCR Master Mix (Applied Biosystems,カタログ番号4313803)を用いて製造元の指示に従い行った。逆転写を48℃で30分行い、次いで、以下の増幅／PCRサイクルを行った：95℃で10分、次いで95℃で15秒、60℃で１分間を40サイクル。結果をCT値(所定のサンプルが蛍光の閾値レベルとクロスするサイクル）として記録し、所定の試料とΔCT力に対して2として表される最も低いCT値を有する試料との間のRNA濃度の差についてログスケールを用いてプロットした。パーセント相対発現は、RNA差異の逆数に100を掛けて得られた。28未満のCT値は高発現を表し、28と32の間は中程度の発現を示し、32と35の間は低発現を表し、35を超える場合は、発現レベルがあまりに低く信頼可能に測定されていないことを示す。
標準化sscDNAを、1X TaqMan（登録商標）Universal Master mix (Applied Biosystems；カタログ番号4324020)を用い製造元の指示に従い、RTQ-PCRにより解析した。PCR増幅および解析は、上述のように行った。
パネル1、1.1、1.2、および1.3D
パネル1、1.1、1.2および1.3Dには、2つの対照ウェル(ゲノムDNA対照および化学反応対照)、および培養細胞株および初代正常組織由来のcDNA試料を含む94ウェルが含まれる。細胞株は、以下の癌腫(ca)：肺、小細胞(s cell var)、非小細胞(non-sまたはnon-sm)；乳房；黒色腫；大腸；前立腺；神経膠腫(glio)、星細胞腫(astro)および神経芽細胞腫(neuro)；扁平上皮細胞(squam)；卵巣；肝臓；腎臓；胃および脾臓(American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, MD)より)からもたらされた。正常組織は、個々の成人および胎児から得られたものであり、成人および胎児骨格筋、成人および胎児心臓、成人および胎児腎臓、成人および胎児肝臓、成人および胎児肺、脳、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、大腸、膀胱、気管、乳房、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪を含でいた。次の略語：転移(met)；胸膜侵出(pl. effまたはpl effusion)を結果を報告する際用い、そして*は転移から確立されたことを示す。
一般的_スクリーニング_パネル_v1.4、v1.5、v1.6およびv1.7
パネル1.4、1.5、1.6および1.7は、正常組織試料が2〜5人の異なる成人または胎児からプールされたこと以外、パネル1、1.1、1.2および1.3Dについて記載の通りである。
パネル2D、2.2、2.3および2.4
パネル2D、2.2、2.3および2.4は、2つの対照ウェル、およびNational Cancer Institute's Cooperative Human Tissue Network (CHTN)またはNational Disease Research Initiative (NDRI)、Ardais (Lexington, MA)またはClinomics BioSciences (Frederick, MD)から得たヒト外科標本由来のRNAまたはcDNAを含有する94ウェルを含んでいた。組織は、ヒト悪性腫瘍、そしてある場合には対応する隣接正常組織(NAT)を含んでいた。腫瘍異形グレードの組織病理学的評価に関する情報、ならびに試料を得た患者の臨床段階が、概して入手可能であった。正常組織RNAおよびcDNA試料は、Clontech (Palo Alto, CA)、Research GeneticssおよびInvitrogen (Carlsbad, CA)のような種々の販売元から購入した。
HASS パネルv 1.0
HASS パネルv1.0は、種々の長さの時間、確立された手順に従って、血清飢餓、アシドーシスおよび無酸素に供した培養ヒト癌細胞株の81の試料；3つのヒト初代細胞；9つの悪性脳腫瘍（brain cancer)(4つの髄芽細胞腫(medulloblastomas)および5つのグリア芽細胞腫)；および2つの対照を含む、93のcDNA試料および２つの対照を含んでいた。癌細胞株(ATCC)を推奨条件を用いて培養し、そしてこれは乳房、前立腺、膀胱、脾臓およびCNSを含んでいた。初代ヒト細胞は、Clonetics (Walkersville, MD)から得た。悪性の脳試料は、Henry Ford Cancer Centerから寄贈された。
ARDAISパネルv1.0およびv1.1
ARDAISパネルv1.0およびv1.1は、Ardais (Lexington, MA)から得たヒト肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌腫、およびある場合には対応隣接正常組織(NAT)を含む、2つの対照および22の試験試料を含んでいた。腫瘍異形グレードの全体的な組織病変評価を有する肺由来の非対応悪性および非悪性RNA試料、および患者の段階および臨床状態は、Ardaisから得た。
ARDAIS前立腺v1.0
ARDAIS前立腺v1.0パネルは、Ardais (Lexington, MA)から得られた、ヒト前立腺悪性腫瘍、およびある場合には対応隣接正常組織(NAT)を含む、2つの対照および68の試験試料を含んでいた。腫瘍異形のグレードの全体的組織病理学的評価を有する、非対応悪性および非悪性前立腺試料由来のRNA、ならびに患者の段階および臨床状態は、Ardaisから得た。
ARDAIS腎臓v1.0
ARDAIS腎臓v1.0パネルは、Ardais (Lexington, MA)から得られた、ヒト腎臓細胞癌腫、およびある場合には対応隣接正常組織(NAT)を含む、2つの対照および44の試験試料を含ンでいた。腫瘍異形グレードの全体的組織病理学的評価を有する、非対応腎臓細胞癌腫および正常組織由来のRNA、ならびに患者の段階および臨床状態は、Ardaisから得た。
ARDAIS乳房v1.0
ARDAIS乳房v1.0パネルは、Ardais (Lexington, MA)から得られた、ヒト乳房悪性腫瘍、およびある場合には対応隣接正常組織(NAT)を含む、2つの対照および71の試験試料をふくんでいた。腫瘍異形グレードの全体的組織病理学的評価を有する、非対応および非悪性乳房試料由来のRNA、ならびに患者の段階および臨床状態は、Ardaisから得た。
パネル3D、3.1および3.2
パネル3D、3.1および3.2は、２つの対照、培養ヒト癌細胞株cDNAの92の試料、およびヒト初代小脳の2つの試料を含んでいた。細胞株 (ATCC, National Cancer Institute (NCI), German tumor cell bank)を推奨されたように培養した。これらは、舌の扁平上皮細胞癌腫、黒色腫、肉腫、白血病、リンパ腫、および類表皮癌腫、膀胱癌腫、膵臓癌腫、腎臓癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、卵巣癌腫、子宮癌腫、子宮頚部癌腫、胃癌腫、大腸癌腫、肺癌腫およびCNS癌腫を含む。
パネル4D、4Rおよび4.1D
パネル4D、4Rおよび4.1Dは、2つの対照、および炎症状態と関連するヒト細胞株または組織由来のRNA(パネル4R)またはcDNA(パネル4Dおよび4.1D)の94の試験試料を含んでいた。対照は、大腸、肺(Stratagene, La Jolla, CA)、胸腺および腎臓(Clontech, Palo Alto, CA)のような正常組織由来のトータルRNAを含んでいた。硬変(cirrhotic)および狼瘡の腎臓由来のトータルRNAは、BioChain Institute, Inc., (Hayward, CA)から得た。クローン病の腸および潰瘍性大腸炎試料は、National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) から得た。Clonetics(Walkersville, MD)から購入した細胞は、星細胞、肺線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、冠動脈平滑筋細胞、小気道上皮、気管支上皮、皮膚微小血管内皮細胞、肺微小血管内皮細胞、ヒト肺大動脈内皮細胞およびヒト臍静脈内皮細胞を含んでいた。これらの初代細胞型を、種々のサイトカイン(IL-1-β約1〜5 ng/ml、TNFα約5〜10ng/ml、IFNγ約20〜50ng/ml、IL-4約5〜10ng/ml、IL-9約5〜10ng/ml、IL-13約5〜10ng/ml)、または示したサイトカインの組み合わせと共にインキュベートすることにより活性化した。飢餓内皮細胞は、0.1%血清を含む基礎培地(Clonetics, Walkersville, MD)で培養した。
単核細胞を、Ficollを用いて献血から調製した。LAK細胞を、培地[DMEM、5%のFCS(Hyclone, Logan, UT)、100mM 非必須アミノ酸(Gibco/Life Technologies, Rockville, MD)、1mM ピルビン酸ナトリウム(Gibco)、5.5×10-5M メルカプトエタノール(Gibco)、および10mM Hepes(Gibco)]およびインターロイキン2中で4〜6日間培養した。細胞を、10〜20ng/ml PMAおよび1〜2μg/ml イオノマイシン、5〜10ng/ml IL-12、20〜50ng/ml IFNγまたは5〜10ng/ml IL-18により6時間活性化した。ある場合には、単核細胞を、約5mg/ml PHA(フィトヘマグルチニン)またはPWM(ヤマゴボウマイトジェン；Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)を含む培地中で4〜5日間培養した。RNA調製のため、24、48および72時間後に試料を取り出した。MLR(混合リンパ球反応)試料を、2人のドナーから血液を採取し、Ficollを用いて単核細胞を単離し、それらを1:1で、最終濃度約2×106細胞/mlとなるように培地に混合することで得た。RNA調製のため、MLRサンプルを1〜7日の種々の時点で取り出した。
単球を、CD14 Miltenyiビーズ、+ve VS選択カラム、およびVario Magnet(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)を用い、製造元の指示に従い単核細胞から単離した。単球を、50ng/ml GMCSFおよび5ng/ml IL-4を含む培地で5〜7日間培養することにより、樹状細胞に分化させた。マクロファージを、単球を、約50ng/ml 10%AB型ヒト培地(Life technologies, Rockville, MD)またはMCSF(マクロファージコロニー刺激因子；R&D, Minneapolis, MN)を含む培地中で5〜7日間培養することにより調製した。単球、マクロファージおよび樹状細胞を、100ng/ml リポ多糖(LPS)により6時間または12〜14時間刺激した。樹状細胞もまた、10μg/ml 抗CD40モノクローナル抗体(Pharmingen, San Diego, CA)により6時間または12〜14時間刺激した。
CD4+リンパ球、CD8+リンパ球およびNK細胞もまた、CD4、CD8およびCD56 Miltenyiビーズ、ポジティブVS選択カラム、およびVario Magnet(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)を用いて、製造元の指示に従い単核細胞から単離した。CD45+RAおよびCD45+RO CD4+リンパ球を、CD8、CD56、CD14およびCD19 Miltenyiビーズ、およびポジティブ選択を用いてCD8+、CD56+、CD14+およびCD19+細胞の単核細胞を枯渇させることにより単離した。次いで、CD45RO Miltenyiビーズを用いて、CD45+RA CD4+リンパ球からCD45+RO CD4+リンパ球を単離した。CD45+RA CD4+、CD45+RO CD4+およびCD8+リンパ球を、PBS中0.5mg/ml 抗CD28(Pharmingen, San Diego, CA)および3μg/ml 抗CD3(OKT3, ATCC)で一晩事前にコーティングした培養プレートにて106細胞/mlで培地中で培養した。6時間および24時間後、RNA調製のために細胞を回収した。慢性活性化CD8+リンパ球を調製するため、単離したCD8+リンパ球を抗CD28、抗CD3でコーティングしたプレート上で4日間活性化し、次いで回収し、IL-2(1ng/ml)を含む培地中に拡大させた。これらのCD8+細胞を、抗CD3および抗CD28の結合したプレートで再び4日間活性化させ、上述のように拡大させた。２回目の活性化の6時間および24時間後および２回目の拡大培養の４日後にRNAを単離した。単離したNK細胞を、1ng/ml IL-2を含む培地中で4〜6日間培養し、RNAを調製した。
B細胞を、細かく刻んで篩にかけた扁桃組織(NDRI)から調製した。扁桃細胞をペレットにし、培地中106細胞/mlで再懸濁した。細胞を、5μg/ml PWM(Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)または約10μg/ml 抗CD40(Pharmingen, San Diego, CA)、および5〜10ng/ml IL-4細胞を用いて活性化した。24、48および72時間後、RNA調製のため細胞を回収した。
一次および二次Th1/Th2およびTr1細胞を調製するため、臍帯血CD4+リンパ球(Poietic Systems, German Town, MD)を、10μg/ml 抗CD28(Pharmingen)および2μg/ml 抗CD3(OKT3; ATCC)で事前にコーティングし、次いでPBSで２回洗浄した6ウェルFalconプレートにてIL-2(4ng/ml)を含む培地中で105〜106細胞/mlで培養した。
Th1表現型の分化を刺激するため、IL-12(5 ng/ml)および抗IL4(1μg/ml)を用い；Th2表現型の分化のため、IL-4(5ng/ml)および抗IFNγ(1μg/ml)を用い；そしてTr1表現型の分化のため、IL-10(5ng/ml)を用いた。4〜5日後、活性化Th1、Th2およびTr1リンパ球をDMEMで１回洗浄し、IL-2(1ng/ml)を含む培地中で4〜7日間拡大させた。活性化Th1、Th2およびTr1リンパ球を、上記のように抗CD28/CD3およびサイトカインにより、そしてさらにアポトーシスを防ぐために抗CD95L(1μg/ml)により、5日間再刺激した。4〜5日後、Th1、Th2およびTr1リンパ球を洗浄し、IL-2を含む培地中で4〜7日間拡大させた。活性化Th1およびTh2リンパ球を、最大３サイクル維持した。抗CD3および抗CD28mAbが結合したプレートでの2回目および3回目の活性化、ならびにインターロイキン2での2回目および3回目の拡大培養への4日間の6および24時間後、RNAを一次および二次Th1、Th2およびTr1より調製した。
白血球細胞株Ramos、EOL-1、KU-812をATCCから得た。EOL-1細胞を、0.1mM dbcAMPと共に5×105細胞/mlで培地中で8日間培養し、培地を３日毎に交換し、そして細胞密度を5×105細胞/mlに調整して、さらに分化させた。RNAを、休止細胞またはPMA(10ng/ml)およびイオノマイシン(1μg/ml)で6時間および14時間活性化した細胞から調製した。RNAを、休止CCD 1106ケラチノサイト細胞株(ATCC)または約5ng/ml TNFαおよび1ng/ml IL-1-βで活性化した細胞から調製した。RNAを、休止NCI-H292、気道上皮腫瘍細胞株(ATCC)、または5ng/ml IL-4、5ng/ml IL-9、5ng/ml IL-13、および25ng/ml IFNγを含む培地中で6および14時間活性化した細胞から調製した。
RNAを、Trizol(Gibco BRL)を用いて約107細胞/mlで溶解し、次いで1/10容量のブロモクロロプロパン(Molecular Research Corporation, Cincinnati, OH)を添加し、ボルテックスし、室温で10分間インキュベートし、次いでSorvall SS34ローターにて14,000rpmで遠心し、調製した。水相を15mlのFalcon Tubeに入れ、当容量のイソプロパノールを添加し、20℃で一晩放置した。沈殿したRNAを9,000rpmで15分間遠心し、70%エタノールで洗浄した。ペレットをRNAseフリーの水300μl［緩衝液(Promega, Madison, WI)35ml、DTT5μl、RNAsin 7μlおよびDNAse 8μlを含む］に再溶解し、37℃で30分インキュベートして、コンタミしているゲノムDNAを除去し、フェノール−クロロホルムで1回抽出し、1/10容量の3M酢酸ナトリウムおよび2容量の100%エタノールで再び沈殿させた。RNAを遠沈し、RNAseフリーの水に入れ、80℃で保存した。
AI_包括的パネル_v1.0
自己免疫(AI)包括的パネルv1.0は、2つの対照、およびBackus HospitalおよびClinomics(Frederick, MD)から得られた男性(M)および女性(F)の外科手術および検死解剖ヒト組織から単離された89のcDNA試験試料を含んでいた。組織試料は、正常、隣接(Adj)；対応正常隣接(対応対照)；関節組織(滑液(Syn)、滑膜、骨および軟骨、骨関節炎(OA)、関節リウマチ(RA))；乾癬；潰瘍性大腸炎大腸；クローン病の大腸；および気腫、喘息、アレルギー性および慢性閉塞性肺疾患(COPD)の肺を含んでいた。
肺および一般的炎症(PGI)パネルv1.0
肺および一般的炎症(PGI)パネルv1.0は、2つの対照、および外科手術または検死解剖試料として単離された39試験試料を含んでいた。組織試料は、Maryland Brain and Tissue Bank, University of Maryland (Baltimore, MD)、International Bioresource systems, IBS (Tuscon, AZ)、およびAsterand (Detroit, MI)から得られた５つの正常肺試料、Ardais(Lexington, MA)からの５つの正常隣接消化管組織(NAT)、Ardais(Lexington, MA)からの潰瘍性大腸炎試料(UC)；NDRI, National Disease Research Interchange (Philadelphia, PA)からのクローン病の大腸；Ardais(Lexington, MA)およびGenomic Collaborative Inc.(Cambridge, MA)からの気腫組織試料、Maryland Brain and Tissue Bank, University of Maryland (Baltimore, MD)およびGenomic Collaborative Inc (Cambridge, MA)からの喘息組織、ならびにArdais(Lexinton, MA)およびGenomic Collaborative(Cambridge, MA)からの線維組織を含んでいた。
細胞OA/RAパネル
細胞OA.RAパネルは、2つの対照、およびヒト関節およびその炎症状態を代表するヒト細胞株または初代細胞から単離したトータルRNAから作成したcDNAを含む35の試験試料を含んでいる。細胞型は、Clonetics(Cambrex, East Rutherford, NJ)からの正常ヒト骨芽細胞(Nhost)、ATCC(Manossas, VA)からのヒト軟骨肉腫SW1353細胞、Cell Applications, Inc. (San Diego, CA)からのヒト線維芽様滑膜細胞およびRiken Cell bank (Tsukuba Science City, Japan)からのMH7A細胞株(SV40 T抗原で形質転換したリウマチ線維芽細胞様滑膜細胞)を含んでいる。これらの細胞型を、種々のサイトカイン(IL-1-β約1〜10ng/ml、TNFα約5〜50ng/ml、またはNhost細胞についてはプロスタグランジンE2)と共に1時間、6時間、18時間または24時間インキュベートすることにより活性化した。これらの細胞は全て、少なくとも５時間飢餓状態に置き、約0.1〜1% FBSを含む対応する基礎培地で培養した。
ミニ組織OA/RAパネル
OA/RAミニパネルは、2つの対照、およびUniversity of Calgary(Alberta, Canada)、NDRI(Philadelphia, PA)、およびArdais Corporation(Lexington, MA)から得られた外科および検死解剖ヒト組織から単離したトータルRNAから作成したcDNAを含む31の試験試料を含む。関節組織試料は、膝再建手術を受けた骨関節炎および関節リウマチの患者由来の滑膜、骨および軟骨、ならびに正常滑膜試料(RNAおよび組織)を含む。内臓正常組織は、2〜5人の異なる成人からプールし、これは、副腎、心臓、腎臓、脳、大腸、肺、胃、小腸、骨格筋および卵巣を含んでいた。
AI.05軟骨肉腫
AI.05軟骨肉腫プレートは、血清飢餓に供し、そしてMMP (1、3および13)合成を誘導することが知られているサイトカイン(例えば、IL1β)で6時間および18時間処理したSW1353細胞(ATCC)を含んでいた。この処理は、IL-1β(10ng/ml)、IL-1β+TNF-α(50ng/ml)、IL-1β+オンコスタチン(50ng/ml)およびPMA(100ng/ml)を含んでいた。上清を回収し、MMP1、3および13産生について分析した。RNAを、標準的な手順を用いてこれらの試料から調製した。
パネル5Dおよび5I
パネル5Dおよび5Iは、2つの対照、および妊娠期糖尿病の研究(下記)に参加した患者から得た、ヒト組織、ヒト膵島細胞、細胞株、代謝組織、および分化した(AD)、中程度に分化した(AM)、および分化していない(U；ヒト間葉系幹細胞)を含む、異なる段階の分化した脂肪からの細胞から単離したcDNAを含んでいた。
妊娠期糖尿病の研究の対象は、通常の(中絶の)帝王切開を受けた、妊娠期糖尿病を有するかまたは有さない若年(18〜40歳)もしくは他の健常女性であった。子宮壁平滑筋(UT)、内臓(Vis)脂肪、骨格筋(SK)、胎盤(Pl)、大網脂肪(GO Adipose)および皮下(SubQ)脂肪試料(1cc未満)を回収し、無菌生理食塩水ですすぎ、ブロットし、液体窒素中で瞬間冷凍した。患者には、患者2、過体重の糖尿病のヒスパニック、インスリン非依存性；患者7〜9、肥満の非糖尿病、体格指数(BMI)が30より大きい白人；患者10、過体重の糖尿病のヒスパニック、インスリン依存性；患者11、過体重の非糖尿病の黒人；および患者12、糖尿病のヒスパニック、インスリン依存性が含まれていた。
分化した脂肪細胞は、誘導したドナー前駆細胞(Clonetics, Walkersville, MD)から得た。分化したヒト間葉系幹細胞(HuMSC)は、Mark F. Pittenger et al., Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells Science Apr 2 1999: 143-147に記載のように調製した。mRNAを単離し、sscDNAをTrizol溶解物または凍結ペレットから作成した。ヒト細胞株(ATCC、NCIまたはGerman Tumor cell bank)は、腎臓近位尿細管、子宮平滑筋細胞、小腸、肝臓HepG2癌細胞、心臓初代間質細胞および副腎皮質腺腫細胞を含んでいた。細胞を培養し、RNA抽出し、sscDNAを標準的手順を用いて作成した。
パネル5Iはまた、膵島(University of Miami School of MedicineのDiabetes Research Institute)を含んでいる。
ヒト代謝RTQ-PCRパネル
ヒト代謝RTQ-PCRパネルは、2つの対照(ゲノムDNA対照および化学反応対照)、ならびにヒト組織および代謝疾患に関連する細胞株から単離した211のcDNAを含んでいた。このパネルは、肥満および／または糖尿病の病因および病理に役割を担う遺伝子を同定する。胎盤(Pl)、子宮壁平滑筋(Ut)、内臓脂肪、骨格筋(Sk)および皮下(SubQ)脂肪を含む代謝組織は、妊娠期糖尿病の研究(上述)から得た。パネルには、患者7および8、肥満の非糖尿病の白人；患者12、BMI未知の糖尿病の白人、インスリン依存性(治療)；患者13、過体重の糖尿病の白人、インスリン非依存性(未治療)；患者15、肥満の未治療の糖尿病の白人；患者17および25、正常体重の未治療の糖尿病の白人；患者18、肥満の未治療の糖尿病のヒスパニック；患者19、正常体重の非糖尿病の白人；患者20、過体重の治療中の糖尿病の白人；患者21および23、過体重の非糖尿病の白人；患者22、正常体重の治療中の糖尿病の白人；患者23、過体重の非糖尿病の白人；および患者26および27、肥満の治療中の糖尿病の白人が含まれていた。
トータルRNAを、剖検における12人のII型糖尿病(Diab)患者および12人の非糖尿病(Norm)患者由来の視床下部、肝臓、膵臓、膵島、小腸、大腰筋、横隔膜筋、内臓(Vis)脂肪、皮下(SubQ)脂肪および大網(Go)を含む、代謝組織から単離した。対照のの糖尿病および非糖尿病対象は、可能な場合は、年齢；性別（男性(M)；女性(F)）；民族性（白人(CC)；ヒスパニック(HI)；黒人(AA)；アジア人(AS)）およびBMI（20〜25(低BM)、26〜30(中程度BM)またはBMIが30を超える(高BMI)過体重(Overwt)(肥満)）について適合させた。
RNAを抽出し、sscDNAを標準的方法により細胞株(ATCC)から作成した。
CNSパネル
CNSパネルCNSD.01、CNS神経変性V1.0およびCNS神経変性V2.0は、2つの対照、およびHarvard Brain Tissue Resource Center(McLean Hospital)から得た検死解剖ヒト脳組織から単離した46〜94のcDNA試験試料を含んでいた。死後4時間〜24時間の間に、ドナーの頭蓋冠から脳を取り出し、液体窒素気相中-80℃で凍結させた。
パネルCNSD.01
パネルCNSD.01は、それぞれアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、進行性核上性麻痺(PSP)、鬱病由来の2つの標本、および正常対照を含んでいた。集めた組織は、帯状回(Cing Gyr)、側頭極(Temp Pole)、淡蒼球(Glob palladus)、黒質(Sub Nigra)、一次運動野(ブロードマン領域4)、頭頂皮質(ブロードマン領域7)、前前頭皮質(ブロードマン領域9)、および後頭皮質(ブロードマン領域17)を含んでいた。全ての場合において、全脳領域を示しているわけではない。
パネルCNS神経変性V1.0
CNS神経変性V1.0パネルは、６のアルツハイマー病(AD)脳および８の正常脳（痴呆およびアルツハイマー病様病理を含まない対照、または痴呆を有さないが重篤なアルツハイマー病様病理の形跡を示す（対照経路）対照（詳しくは、0〜3の段階のレベル3と評価された老人斑量（0は老人斑の形跡を示さず、3は重篤なAD老人斑量を有する）に分けられる）を含んでいた。集めた組織は、海馬、側頭皮質(ブロードマン領域21)、頭頂皮質(ブロードマン領域7)、後頭皮質(ブロードマン領域17)、上側頭皮質(上側頭皮質)および下側頭皮質(Inf Temproal Ctx)を含んでいた。
全平均値(全ての実施にわたる全ウェルについてのCT平均値)からウェル平均値(特定の組織についてのCT平均値)を減じることにより計算したスケーリング因子を用いて正常化した後、遺伝子発現を分析した。スケーリングしたCT値は、低CT値とスケーリング因子を足したものである。
パネルCNS神経変性V2.0
CNS神経変性V2.0パネルには、16のアルツハイマー病(AD)および29の正常対照(死亡前に痴呆の徴候を示さなかった)が含まれており、これは、痴呆およびアルツハイマー病様病理を有さない14の対照(対照)および痴呆はないが重篤なアルツハイマー病様病理を有する15の対照(AH3)（詳しくは、0〜3の段階のレベル3と評価された老人斑量（0は老人斑の形跡を示さず、3は重篤なAD老人斑量を有する）に分けられる）を含む。側頭皮質(ブロードマン領域21)由来の組織は、所定の個人からプールされた下側頭皮質および上側頭皮質(Inf & Sup Temp Ctx Pool)を含んでいた。
A. NOV1 CG121992: コーディン
NOV1a遺伝子CG121992-03の発現を、表AAに記載のプライマー-プローブセットAg8269を用いて評価した。RTQ-PCR実施の結果を表ABに示す。
表AA. プローブ名Ag8269
Figure 2006515753
表AB. プローブ名Ag7203
Figure 2006515753
表AC. 一般的_スクリーニング_パネル_v1.7
Figure 2006515753
Figure 2006515753
一般的_スクリーニング_パネル_v1.7概要:プローブ-プライマーセット Ag8269およびAg7203を用いた結果は、類似の発現プロファイルを示した。この遺伝子は、脳(CT=25.27)および脂肪(CT=28.57)で高度に発現した。この遺伝子は、ヒトコーディンポリペプチドをコードする。コーディンポリペプチドは、初期胚発生において背側化因子として機能する分泌分子である、アフリカツメガエルコーディンと相同性を有する。コーディンは、形質転換成長因子(TGF)-βスーパーファミリーのメンバーの１つであるBMP-4と結合し、そして拮抗する。この遺伝子の活性の治療的調節は、肥満および糖尿病のような内分泌／代謝関連疾患、ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症、統合失調症および鬱病のような中枢神経系疾患の処置において有用である。
B．NOV2 CG186275：ADAM 22
遺伝子CG121992-03の発現を、表BAおよびBBに記載のプライマー-プローブセットAg7761およびAg8175を用いて評価した。RTQ-PCR実施の結果を表BCに示す。
表BA. プローブ名Ag7761
Figure 2006515753
表BB. プローブ名Ag8175
Figure 2006515753
表 BC. 一般的_スクリーニング_パネル_v1.7
Figure 2006515753
Figure 2006515753
一般的_スクリーニング_パネル_v1.7概要：Ag7761 この遺伝子の最も高い発現は、小脳で検出された(CT=24)。この遺伝子は、概して、中レベルから低レベルで、遍在的に発現した。これは、いくつかの大腸癌および肺癌でアップレギュレートされたので、これらの癌のマーカーとして、およびこれらの器官の癌組織と正常組織とを区別するのに有用である。この遺伝子、発現タンパク質、および／または遺伝子または遺伝子産物を標的とする抗体または低分子薬の使用の治療的調節は、大腸癌および肺癌の処置において有用である。
C．NOV3、CG50586:β-セクレターゼ
遺伝子CG50586-03およびNOV3b、260368280の発現を、表CAに記載のプライマー-プローブセットAg43を用いて評価した。RTQ-PCR実施の結果を表CBに示す。
表CA. プローブ名Ag43
Figure 2006515753
表CB. パネル1
Figure 2006515753
Figure 2006515753
パネル1概要：Ag43 この遺伝子の最も高い発現は、脳組織(CT=21.7)および脊髄(CT=26.68)で検出された。この遺伝子は、ヒトβ-セクレターゼ酵素ポリヌクレオチドをコードする。β-セクレターゼは、β-アミロイド前駆体タンパク質(APP) (AAY33742；スウェーデン変異体APP)を分解し得る。この酵素は、ポリペプチドのヒトβ-セクレターゼ分解の検出およびβ-セクレターゼインヒビターの同定において有用である。この遺伝子の活性の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症、統合失調症および鬱病のような中枢神経系疾患の処置において有用である。
D．NOV4 CG50637：T-細胞表面糖タンパク質CD1B前駆体
遺伝子 NOV4a、CG50637-01；NOV4b 277577082;およびNOV4c 277577094の発現を、表DAに記載のプライマー-プローブセットAg2828を用いて評価した。RTQ-PCR実施の結果を表DB、DCおよびDDに示す。
表DA. プローブ名Ag2828
Figure 2006515753
表 DB. 一般的_スクリーニング_パネル_v1.5
Figure 2006515753
Figure 2006515753
表DC. パネル4D
Figure 2006515753
Figure 2006515753
表DD. パネル5 膵島
Figure 2006515753
一般的_スクリーニング_パネル_v1.5概要：Ag2828 この遺伝子の最も高い発現は、小脳で検出された(CT=26)。この遺伝子は、概して遍在的に発現した。代謝または内分泌機能を有する組織の中でも、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および消化管において、この遺伝子は高レベルから中レベルで発現した。この遺伝子、発現タンパク質および／または遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは低分子薬の使用の治療的調節は、肥満および糖尿病のような内分泌／代謝関連疾患の処置において有用である。
パネル4D概要：Ag2828 この遺伝子の最も高い発現は、休止一次Th1細胞で検出された(CT=30)。この遺伝子は、胸腺、大腸、肺および腎臓で発現した。この遺伝子の発現は、クローン病および大腸炎でダウンレギュレートされた。
未刺激Tリンパ球(Th1、Th2およびTr1)は、この遺伝子を、抗CD28＋抗CD3刺激T細胞よりも高いレベルで発現した。それ故、遺伝子またはタンパク質産物は、活性化T細胞に対する休止T細胞のマーカーとして有用である。従って、この遺伝子は、Tリンパ球機能に関与しているかもしれない。この遺伝子、発現タンパク質および／または遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは低分子薬の使用の治療的調節は、T細胞介在性自己免疫疾患および炎症性疾患の処置において有用である。
パネル5 膵島概要:Ag2828 この遺伝子の最も高い発現は、糖尿病の患者由来の骨格筋で検出された(CT=30)。これはまた、糖尿病および糖尿病でない個体に由来する脂肪、子宮および胎盤でも発現した。この遺伝子、発現タンパク質および／または遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは低分子薬の使用の治療的調節は、肥満および糖尿病のような内分泌/代謝関連疾患の処置において有用である。
E. NOV5、CG51117、ネフロネクチン
遺伝子NOV5aないし5f、CG51117の発現を、表EA、EB、EC、EDおよびEEに記載のプライマー-プローブセットAg2505、Ag2667、Ag2767、Ag2831およびAg7237を用いて評価した。RTQ-PCR実施の結果を表EF、EG、EH、EI、EJ、EK、ELおよびEMに示す。
表EA. プローブ名Ag2505
Figure 2006515753
表EB. プローブ名Ag2667
Figure 2006515753
表EC. プローブ名Ag2767
Figure 2006515753
表ED. プローブ名Ag2831
Figure 2006515753
表EE. プローブ名Ag7237
Figure 2006515753
表EF. AI_包括的パネル_v1.0
Figure 2006515753
Figure 2006515753
表EG. CNS_神経変性_v1.0
Figure 2006515753
Figure 2006515753
表EH. 一般的_スクリーニング_パネル_v1.6
Figure 2006515753
Figure 2006515753
表EI. PGI1.0
Figure 2006515753
表EJ. パネル1.3D
Figure 2006515753
Figure 2006515753
Figure 2006515753
表EK. パネル2.2
Figure 2006515753
Figure 2006515753
表EL. パネル3D
Figure 2006515753
Figure 2006515753
表EM. パネル5 膵島
Figure 2006515753
AI_包括的パネル_v1.0概要：Ag2505/Ag2831 この遺伝子の最も高い発現は、関節リウマチの患者由来の骨で検出された(CT=27-29)。この遺伝子は遍在的な発現を示したが、発現は、OA患者、正常および疾患を有する肺由来の試料における発現と比較して、RA患者由来の骨、滑液、軟骨および滑液で明らかに高かったので、この遺伝子は、これらの疾患状態の区別に有用である。この遺伝子の発現は、対応する対照試料と比較して、クローン病の試料で調節された。この遺伝子は、マウスPOEM(メプリンを有する、前骨芽上皮成長因子様繰り返しタンパク質)またはネフロネクチンに相同な新規な接着分子をコードする。マウスネフロネクチンは、腎臓の発生(Miner JH. J Cell Biol 2001 Jul 23;154(2):257-9, PMID: 11470814)および骨の発生(Morimura N et al., 2001, J. Biol. Chem. 2000 Nov 9;276(45):42172-42181, PMID: 11546798)を含む多数の生物学的プロセスにおいて機能し、肝臓および肺の線維症に関与する(Levine et al., 2000, Am J Pathol 2000 Jun;156(6):1927-35, PMID: 10854216)。この遺伝子、発現タンパク質および／または遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは低分子薬の使用の治療的調節は、リウマチおよび骨関節炎、炎症性腸疾患、COPD、喘息、乾癬、肝臓および肺の線維症のような自己免疫疾患および炎症性疾患の処置において有用である。
CNS_神経変性_v1.0概要：Ag2505/Ag2667/Ag2767/Ag2831/Ag7237 このパネルにより、この遺伝子の発現が、独立した群の個体の脳で低レベルで発現していることを確認する。この遺伝子は、アルツハイマー病患者の側頭皮質でアップレギュレートされることが見出された。この遺伝子は、EGFドメインを有する細胞接着分子であるマウスPOEM(ネフロネクチンの短いアイソフォーム)の相同体をコードする。βセクレターゼに代わる有益なプロセッシングであると概して考えられているαセクレターゼ活性は、神経細胞でEGFにより増加される(Slack BE, Breu J, Muchnicki L, Wurtman RJ, 1997, Biochem J 327 ( Pt 1):245-9)。ここで報告されたこの遺伝子の発現の増加は、アルツハイマー病の機序に立ち向かうための脳の代償的な作用である。この遺伝子、発現タンパク質および／または遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは低分子薬の使用の治療的調節は、アルツハイマー病および他の神経変性疾患の処置において有用である。
EGFはまた、海馬中で長期増強作用(LTP)を促進することが知られており、過程は、学習および記憶の基礎となると考えられている(Abe K, Ishiyama J, Saito H, 1992, Brain Res 593(2):335-8)。この遺伝子、発現タンパク質および／または遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは低分子薬の使用の治療的調節は、単独で、または他の成長因子（例えば、bFGFが挙げられるが、これに限定されない）と組み合わせて用いる場合、神経変性疾患および老化のような記憶の異常の処置において有用である。
さらに、EGFは、ドーパミン作動性ニューロンの成長および分化を支持し(Storch A, Paul G, Csete M, Boehm BO, Carvey PM, Kupsch A, Schwarz J, 2001, Exp Neurol 170(2):317-25)、これは、パーキンソン病において選択的に失われやすい。この遺伝子、発現タンパク質および／または遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは低分子薬のの治療的調節は、パーキンソン病の処置において有用である。
一般的_スクリーニング_パネル_v1.6概要：Ag7237 この遺伝子の最も高い発現は、胎児肺(CT=27)で観察され、胎児では、対応する成人の肺、腎臓、肝臓および骨格筋組織(CT=32-40)と比べて高かった(CT=27-33)。この遺伝子の胎児組織における相対的な過剰発現は、タンパク質産物が、胎児においてこれらの組織の成長または発生を強化し得、従って成人での再生能力においても作用し得ることを示唆している。この遺伝子、発現タンパク質および／または遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは低分子薬の治療的調節は、肺、肝臓、腎臓および筋肉関連疾患の処置において有用である。
この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はまた、扁平上皮癌腫、脳腫瘍、大腸癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、および卵巣癌由来の癌細胞株でも観察された。この遺伝子の発現は、これらの癌の検出のための、または癌組織を正常組織と区別するための診断マーカーとして有用である。この遺伝子、発現タンパク質および／または遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは低分子薬の使用の治療的調節は、癌腫（扁平上皮癌腫、脳腫瘍、大腸癌、腎臓癌、肺癌、乳癌および卵巣癌を含むが、これらに限定されない）の処置において有用である。
この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はまた、代謝／内分泌機能を有する組織および脳の全ての領域で検出された。
PGI1.0概要：Ag2505 この遺伝子の最も高い発現は、肺線維症試料(CT=22)で検出された。この遺伝子は、いくつかの肺線維症および肺気腫試料、ならびに１つの喘息試料においてアップレギュレートされた。この遺伝子、発現タンパク質および／または遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは低分子薬の使用の治療的調節は、線維症、肺気腫および喘息を含む肺疾患の処置において有用である。
パネル1.3D概要：Ag2505/Ag2667/Ag2767/Ag2831 この遺伝子の最も高い発現は、甲状腺および胎児肺で検出された(CT=29-31)。この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はまた、骨格筋、胎児骨格筋、小腸、胃、膵臓、脂肪および胎児心臓を含む代謝／内分泌機能を有する他の組織でもみられた。心臓および胎盤でも非常に低レベルでみられた。ネフロネクチンは、α8β1インテグリンのリガンドである。インテグリンは、発生および器官形成を仲介すると知られている。ネフロネクチンは、α5β3、α5β5、α5β6およびα4β7を含むインテグリンと結合し得るが、α4β1、α3β1、α2β1またはα1β1とは結合しない。ネフロネクチンは、RGD配列を介してインテグリンと相互作用するが、RGD単独では結合するのに十分ではなく、MAMドメインもまた必要とする。この遺伝子、発現タンパク質および／または遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは低分子薬の使用の治療的調節は、炎症性疾患を含むα8β1インテグリンシグナル伝達に関与する疾患の処置において有用である。
肥満もまた、炎症状態に関連しており(Das UN, 2001, Nutrition 17(11-12):953-66, PMID: 11744348)、従って、ヒト化抗体は、この状態およびII型糖尿病のような関連合併症の処置において治療上適切である。
パネル2.2概要：Ag2831 この遺伝子の最も高い発現は、腎臓で検出された(CT=30.3)。この遺伝子の発現は、腎臓癌、肺癌および大腸癌において、正常な隣接組織と比較してダウンレギュレートされていた。反対に、この遺伝子は、乳癌試料において発現が増加していた。従って、この遺伝子の発現は、癌と正常な腎臓、肺、大腸および乳房とを区別するために用いられ得る。この遺伝子、発現タンパク質および／または遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは低分子薬の使用の治療的調節は、腎臓癌、肺癌、大腸癌および乳癌の処置において有用である。
パネル3D概要：Ag2831 この遺伝子の最も高い発現は、小細胞性肺癌NCI-H146細胞株で検出された(CT=29.7)。この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はまた、類表皮癌腫、横紋筋肉腫、胃癌、大腸癌および小細胞性肺癌由来の癌細胞株において観察された。この遺伝子の発現は、これらの癌を検出するため、および癌組織と正常組織とを区別するための診断マーカーとして用いられ得る。この遺伝子、発現タンパク質および／または遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは低分子薬の使用の治療的調節は、類表皮癌腫、横紋筋肉腫、胃癌、大腸癌および小細胞肺癌の処置において有用である。
パネル５ 膵島概要：Ag2505 この遺伝子の最も高い発現は、子宮で検出された(CT=30)。この遺伝子の中レベルの発現はまた、毎日インシュリン注射を必要とする妊娠期間の糖尿病患者、および必要としない妊娠期間の糖尿病患者の脂肪および骨格筋において見出された。この遺伝子はまた、妊娠しており糖尿病ではないが過体重の患者由来の試料においても発現した。さらに、この遺伝子はまた、膵島β細胞(インスリンを産生する細胞)および小腸でも発現した。この遺伝子、発現タンパク質および／または遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは低分子薬の使用の治療的調節は、肥満、I型糖尿病およびＩＩ型糖尿病を含む代謝関連疾患の処置において有用である。
F．NOV6、CG51923：FAT 腫瘍サプレッサー相同体2
遺伝子NOV6a、6m、6n、CG51923の発現を、表FA、FB、FC、FDおよびFEに記載のプライマー-プローブセットAg395、Ag706、Ag888、Ag944およびAg945を用いて評価した。RTQ-PCR実施の結果を、表FFおよびFGに示す。
表FA. プローブ名Ag395
Figure 2006515753
表FB. プローブ名Ag706
Figure 2006515753
表FC. プローブ名Ag888
Figure 2006515753
表FD. プローブ名Ag944
Figure 2006515753
表FE. プローブ名Ag945
Figure 2006515753
表FF. パネル1.1
Figure 2006515753
Figure 2006515753
表FG. パネル2D
Figure 2006515753
Figure 2006515753
パネル1.1概要：Ag395 NOV6の最も高い発現は、小脳で検出された(CT=21)。この遺伝子の高レベルから中レベルの発現はまた、扁桃、海馬、黒質、視床、大脳皮質、および脊髄を含む、検査した中枢神経系の全ての領域において観察された。この遺伝子は、ショウジョウバエ腫瘍サプレッサー遺伝子fatの相同体であるプロトカドヘリンFat2タンパク質をコードする。プロトカドヘリンは、カドヘリンスーパーファミリーの分子に属する膜貫通型糖タンパク質であり、これは、細胞接着、細胞骨格組織化および形態形成のような多くの生物学的過程に関与する。プロトカドヘリンは、概して中程度の接着活性を示すにすぎないが、中枢神経系では高度に発現する。カドヘリンスーパーファミリーの中でも、FAT2は独特である。なぜなら、これは、古典的カドヘリン繰り返しと共にEGFドメインを含有するからである(Nollet et al., 2000, J Mol Biol 299(3):551-72, PMID: 10835267)。カドヘリンは、特に、発生中および損傷に対する応答の際に、軸索誘導および細胞接着タンパク質として作用し得る(Ranscht B., 2000, Int. J. Dev. Neurosci. 18: 643-651, PMID: 10978842)。この遺伝子、発現タンパク質および／または遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは低分子薬の使用の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄小脳失調症、進行性核上麻痺、ＡＬＳ、頭部外傷、発作、または神経細胞の損失と関連する任意の他の疾患／状態における神経細胞の死に対する代償的シナプス形成応答の誘導において有用である。
この遺伝子の中レベルから高レベルの発現はまた、胃、大腸、肺、腎臓、乳房、卵巣、前立腺、黒色腫および脳由来のある種の癌細胞株でも見出された。従って、この遺伝子の発現は、癌細胞と正常な細胞とを区別するのに有用である。この遺伝子、発現タンパク質および／または遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは低分子薬の使用の治療的調節は、胃癌、大腸癌、肺癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、黒色腫および脳腫瘍の処置において有用である。
代謝または内分泌機能を有する組織の中でも、この遺伝子は、膵臓、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および消化管において高レベルから中レベルで発現した。この遺伝子、発現タンパク質および／または遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは低分子薬の使用の治療的調節は、肥満、肥満、糖尿病、高コレステロール血症および高血圧のような内分泌／代謝関連疾患の処置において有用である。
パネル2D概要：Ag395/Ag888 CG51923-01遺伝子の最も高い発現は、2つの肺癌細胞株および対照の乳房試料で検出された(CT=29-32)。この遺伝子の中程度の発現はまた、卵巣癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、肺癌および前立腺癌由来の試料で観察された。この遺伝子の発現は、卵巣癌、膀胱癌および肺癌において、これらの対応する対照試料と比較して高かった。従って、この遺伝子の発現は、これらの癌を対応する正常組織と区別するのに用いられ得る。さらに、この遺伝子、発現タンパク質および／または遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは低分子薬の使用の治療的調節は、卵巣癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、肺癌および前立腺癌の処置において有用である。
G．NOV7 CG52919：分泌されたスシ（sushi）およびCUB sez-6
遺伝子CG52919-06の発現を、表GAに記載のプライマー-プローブセットAg90を用いて評価した。RTQ-PCR実施の結果を表HBに示す。
表GA. プローブ名Ag90
Figure 2006515753
表GB. パネル1
Figure 2006515753
Figure 2006515753
パネル1概要：Ag90 この遺伝子の最も高い発現は、脳の小脳で検出された(CT=25)。この遺伝子の高い発現は、扁桃、海馬、黒質、視床、大脳皮質、および脊髄を含む、脳の全領域で観察された。さらに、この遺伝子の中程度のレベルの発現はまた、2つの肺癌細胞株および神経膠腫細胞株で観察された。差次的なNOV7遺伝子発現は、肺癌および神経膠腫癌の組織または細胞を対応する正常な組織と区別するのに有用である。この遺伝子、発現タンパク質および／または遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは低分子薬の使用の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症、鬱病のような中枢神経系疾患、肺癌および脳腫瘍の処置において有用である。
H. NOV8 CG94946: アグリン前駆体
遺伝子CG94946-01の発現を、表HAおよびHBに記載のプライマー-プローブセットAg3605およびAg3974を用いて評価した。RTQ-PCR実施の結果を表HCおよびHDに示す。
表HA. プローブ名Ag3605
Figure 2006515753
表HB. プローブ名Ag3974
Figure 2006515753
表HC. 一般的_スクリーニング_パネル_v1.4
Figure 2006515753
Figure 2006515753
表HD. パネル4.1D
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一般的_スクリーニング_パネル_v1.4概要：Ag3605/Ag3974 CG94946-01遺伝子の最も高い発現は、乳癌細胞株T47Dで検出された(CT=22.5-25.3)。さらに、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、肺癌、大腸癌および脳腫瘍の細胞株由来の他の試料においても実質的に発現が見られた。従って、この遺伝子の発現は、癌のマーカー、および癌と対応する正常組織または細胞を区別するのに有用である。この遺伝子、発現タンパク質および／または遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは低分子薬の使用の治療的調節は、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、肺癌、大腸癌および脳腫瘍の処置において有用である。この遺伝子は、代謝組織の中でも、副腎、下垂体、成人および胎児の心臓、成人および胎児の肝臓、成人および胎児の骨格筋、ならびに脂肪において低レベルから中レベルの発現を示した。この遺伝子の高い発現は、膵臓および甲状腺で検出された(CT値=27)。アグリンの糸球体での発現の減少は、糖尿病性腎炎において観察された(Yard BA, Exp Nephrol 2001;9(3):214-22 )。従って、この遺伝子産物は、肥満、１型および2型糖尿病、および甲状腺炎（thyroidopathies）を含む代謝および内分泌疾患の区別、診断および処置において有用である。この遺伝子は、扁桃、海馬、黒質、視床、大脳皮質、および脊髄を含む、検査した中枢神経系の全ての領域で中レベルで発現した。この遺伝子、発現タンパク質および／または遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは低分子薬の使用の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症、統合失調症および鬱病のような中枢神経系疾患の処置において有用である。
パネル4.1D概要：Ag3605/Ag3974 NOV9の最も高い発現は、肺微小血管内皮細胞(CT=27.3-28.5)、微小血管皮膚内皮細胞（microvascular dermal endothelial cell）、粘膜表皮細胞株NCI-H292、星細胞およびケラチノサイトで検出された。従って、この遺伝子、発現タンパク質および／または遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは低分子薬の使用の治療的調節は、乾癬、アレルギー、喘息、炎症性腸疾患、関節リウマチおよび骨関節炎を含む、自己免疫疾患および炎症性疾患に関連する症状／状態の処置において有用である。
実施例D：腫瘍および同等の正常組織由来のヒト組織におけるCuraChipを用いた遺伝子発現解析
背景：CuraGenは、標的の同定のための遺伝子マイクロアレイ(CuraChip 1.2)を開発した。これは、Pharmaceutically Tractable Genome(PTG)に代表されるcDNA配列のCuraGenのコレクションの包括的mRNA発現解析のハイスループット手段を提供する。この配列セットは、タンパク質治療に発展され得る、あるいは抗体または低分子治療を開発するために用いられ得る遺伝子を含む。CuraChip 1.2は、キナーゼ、イオンチャネル、Ｇタンパク質共役受容体(GPCR)、核ホルモン受容体、プロテアーゼ、トランスポーター、代謝酵素、ホルモン、成長因子、ケモカイン、サイトカイン、補体および凝集因子、ならびに細胞表面受容体を含む（しかしこれらに限定されない）、約8,500の遺伝子座を表す約11,000のオリゴを含有する。
CuraChip cDNAは、ガラスマイクロチップ上で、30マーのオリゴデオキシリボヌクレオチド(オリゴ)として表される。より長いCuraChipオリゴを用いるハイブリダイゼーション法は、25マーのオリゴを用いる方法と比べてより特異的である。CuraChipのオリゴは、リンカーにより合成され、不完全なオリゴ（これはハイブリダイゼーション長および特異性に影響を与える可能性がある）を取り除くために精製され、スライドガラス上にスポットされる。オリゴdTプライマーを、対象試料からハイブリダイゼーション用のcRNAプローブを作成するために用いた。ビオチン・アビジン複合体系を用いて、蛍光標識した２次抗体によりハイブリダイズしたプローブを検出した。遺伝子発現は、Spotfire（登録商標）(Spotfire, Inc., 212 Elm Street, Somerville, MA 02144)のようなクラスタリングおよび
相関バイオインフォマティクスツール、ならびに多変量解析(MVA)のような統計ツールを用いて解析した。
PTG Chip 1.2を用いたNOV1、CG121992-01の発現解析：外科切除した疾患および非疾患組織から得た組織、および処理および無処理細胞株由来のRNAの234試料を用いて、PTG Chip 1.2にハイブリダイズする標識核酸を生成した。PTG Chip 1.2上のCG121992-01に対応するオリゴ(optg2_1002018,TTGGAGAGATGAGCTGTATCACCTGCAGAT(配列番号143))の発現プロファイルについて解析した。
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CuraChipを用いた遺伝子発現解析により、この遺伝子の発現レベルが、正常隣接組織と比較して乳癌組織で増強され、そして腎臓癌組織で低減されることが明らかになった。従って、この遺伝子は、これらの疾患状態において癌組織と正常組織とを区別するための特異的マーカーとして有用である。この遺伝子、発現タンパク質および／または遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは低分子薬の使用の治療的調節は、乳癌および腎臓癌の処置において有用であろう。
（他の実施態様）
本明細書中では、特定の実施態様を詳細に説明したが、これは実施例による例示のみを目的として行ったものであり、以下に続く添付の特許請求の範囲に基づいて限定することを意図していない。特に、本発明者らは、特許請求の範囲により規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の置換、変更および修正がなされるであろうことを意図する。核酸出発材料、目的のクローンまたはライブラリの種類の選択は、本明細書に記載された実施態様の知識を有する当業者にとって通常のものであると考えられる。他の態様、利点および修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内であると考えられる。提示された特許請求の範囲は、本明細書に開示された発明を代表するものである。特許請求にない他の発明もまた意図される。本出願人は、このような発明を後の特許請求の範囲によって追求する権利を有する。

Claims (20)

  1. 配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形を含む単離ポリペプチドであって、ｎが１から３８の整数であるポリペプチド。
  2. 配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、ｎが１から３８の整数であるポリペプチド。
  3. 請求項１記載のポリペプチドおよび担体を含む組成物。
  4. １またはそれ以上の容器内に請求項４記載の組成物を含むキット。
  5. 試料中の請求項１記載のポリペプチドの存在または量を決定する方法であって、
    （ａ）該試料を用意すること；
    （ｂ）該試料をポリペプチドと免疫特異的に結合する抗体に導入すること；次に
    （ｃ）該ポリペプチドと結合した抗体の存在または量を決定し、これにより該試料中のポリペプチドの存在または量を決定すること、
    を含む方法。
  6. 第１の哺乳類対象における請求項１記載のポリペプチドの発現の変化したレベルと関連する疾患の存在または素因を決定する方法であって、
    ａ）第１の哺乳類対象由来の試料中のポリペプチドの発現のレベルを測定すること；次に
    ｂ）工程（ａ）の試料中の該ポリペプチドの発現を、該疾患を有さないことまたは素因がないと知られている第２の哺乳類対象由来の対照試料中に存在するポリペプチドの発現と比較すること、
    を含み、対照試料と比較したときの第１の哺乳類対象中のポリペプチドの発現のレベルでの変化が該疾患の存在または素因を示す、方法。
  7. 請求項１記載のポリペプチドと結合する剤を同定する方法であって、
    （ａ）該ポリペプチドを該剤に導入すること；次に
    （ｂ）該剤が該ポリペプチドと結合するか否かを決定すること、
    を含む方法。
  8. 剤が細胞受容体または下流エフェクターである、請求項７記載の方法。
  9. 請求項１記載のポリペプチドの異常発現または異常生理的相互作用と関係する病態の処置で使用するための潜在的治療剤を同定する方法であって、
    （ａ）請求項１記載のポリペプチドを発現し、かつ該ポリペプチドに起因する特性または機能を有する細胞を用意すること；
    （ｂ）該細胞を候補物質を含む組成物と接触させること；次に
    （ｃ）該物質が該ポリペプチドに起因する特性または機能を変化させるか否かを決定すること、
    を含み、これにより該物質の存在下で観察される変化が、細胞が該物質の不存下で組成物と接触させられたときに観察されなければ、該物質が潜在的治療剤として同定される、方法。
  10. 請求項１記載のポリペプチドと関連する病態の活性または潜在活性のモジュレーターまたは素因をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）試験化合物を、請求項１記載のポリペプチドを組換え発現する、請求項１記載のポリペプチドと関連する病態のリスクの増加した被検動物に投与すること；
    （ｂ）工程（ａ）の化合物の投与後、該被検動物における該ポリペプチドの活性を測定すること；次に
    （ｃ）該被検動物中の該ポリペプチドの活性を、該ポリペプチドを投与されていない対照動物中の該ポリペプチドの活性と比較すること、ここで該対照動物と比較して該被検動物中の該ポリペプチドの活性の変化が、該試験化合物が請求項１記載のポリペプチドと関連する病態の活性または潜在活性のモジュレーターまたは素因であることを示す、方法。
  11. 該被検動物が、試験タンパク質導入遺伝子を発現するか、あるいは該導入遺伝子をプロモーターの制御下で野生型被検動物と比較して増加したレベルで発現する組換え被検動物であり、かつ該プロモーターが該導入遺伝子の天然の遺伝子プロモーターではない、請求項１０記載の方法。
  12. 哺乳類の病理的状態を処置する方法であって、哺乳類にポリペプチドを病理的状態を緩和するのに十分な量で投与することを含み、該ポリペプチドが、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性なフラグメントを含むアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、ここでｎが１から３８の整数である、方法。
  13. 配列番号２ｎ−１からなる群より選択される核酸配列を含む単離核酸分子であって、ｎが１から３８の整数である核酸分子。
  14. 配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの成熟形をコードする単離核酸分子であって、ｎが１から３８の整数である核酸分子。
  15. 請求項１３記載の核酸分子を含むベクター。
  16. 請求項１５記載のベクターを含む細胞。
  17. 請求項１記載のポリペプチドと免疫特異的に結合する抗体。
  18. ヒト抗体である請求項１７記載の抗体。
  19. 請求項１記載のポリペプチドを産生させる方法であって、細胞を該ポリペプチドの発現を導く条件下で培養することを含み、ここで該細胞が配列番号２ｎ−１からなる群より選択される核酸配列を含む単離核酸分子を含むベクターを含み、ｎが１から３８の整数である方法。
  20. 細胞が細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、および哺乳類細胞からなる群より選択される、請求項１９記載の方法。

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