JP2005532786A - 新規蛋白およびそれらをコードする核酸 - Google Patents

新規蛋白およびそれらをコードする核酸 Download PDF

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Abstract

本発明は、新規単離ポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドによりコードされる小型分子標的ポリペプチドを提供する。新規小型分子標的ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、または該ポリペプチド、ポリヌクレオチドもしくは抗体の誘導体、変種、変異体もしくはフラグメントが開示され、該小型分子標的ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体が広範な病理学的状態の検出および処置に使用される方法も開示される。より詳細には、本発明は、疾病に関連した治療抗体および治療小型分子の同定を目的とする種々のスクリーニング法における、組み換え法により発現された蛋白および／または内因的に発現された蛋白の使用方法が開示される。さらに本発明は、これらの新規ヒト核酸および蛋白のいずれかが関与する疾病の診断、治療および予防のための治療的、診断的および研究的方法を開示する。

Description

発明の詳細な説明
（技術分野）
本発明は、小分子薬物の標的であるかつ細胞、組織、器官または生物の生化学的または生理学的応答の刺激に関する特性を有する新規ポリペプチドに関する。より具体的には、新規ポリペプチドは、新規遺伝子の遺伝子産物であり、またはその特異的生物学的活性フラグメントまたは誘導体である。使用の方法は、診断および予後アッセイ手法並びに広範な病理学的状態を処置する方法を包含する。
（背景技術）
真核細胞は、通常の条件下では細胞の維持および増殖を達成するために精妙にバランスを受けている、生化学的および生理学的方法を特色とする。そのような細胞が脊椎動物のような多細胞生物、またはさらに特別には哺乳動物のような生物の構成要素であるとき、生化学的および生理学的方法の調節には精緻な情報伝達経路を伴う。しばしば、そのような情報伝達経路は、細胞外の情報伝達タンパク質、情報伝達タンパク質に結合する細胞性受容体、および細胞内に局在する情報伝達構成要素に関与する。
情報伝達タンパク質は、内分泌性エフェクター、パラクリンエフェクターまたはオートクリンエフェクターに分類され得る。内分泌性エフェクターは特定の器官により循環系中に分泌される情報伝達分子であり、これは次いで遠隔の標的器官または標的組織へと輸送される。標的細胞は内分泌性エフェクターの受容体を含み、内分泌性エフェクターが結合すると情報伝達カスケードが誘導される。パラクリンエフェクターには、互いに近傍にある分泌細胞と受容細胞、例えば同じ組織または器官内の２つの異なるクラスの細胞が関与する。あるクラスの細胞がパラクリンエフェクターを分泌し、これが次いで、例えば細胞外液を介する拡散により、第２のクラスの細胞に到達する。第２のクラスの細胞はパラクリンエフェクターに対する受容体を含有しており、エフェクターの結合は情報伝達カスケードを誘導し、これが対応する生化学的または生理学的作用を誘起する。オートクリンエフェクターは、オートクリンエフェクターを分泌する同じタイプの細胞が受容体をも含有していること以外は、パラクリンエフェクターと高度の類似性を有している。かくして、オートクリンエフェクターは、同じ細胞上でまた同じ近接する細胞上で受容体に結合する。次いで、結合過程は特色的な生化学的または生理学的作用をひき起こす。
情報伝達過程は細胞および組織に対し、これらに限定されない例として、細胞または組織の増殖の誘導、成長または増殖の抑制、細胞または組織の分化または成熟の誘導、および細胞または組織の分化または成熟の抑制を含む多様な影響をひき起こし得る。
多くの病理学的状態には、重要なエフェクタータンパク質の発現の調節不全が関与している。特定のクラスの病態においては、調節不全は、タンパク質エフェクターの合成および分泌の縮減または抑制レベルとして現れる。病理の他の種類では、非調節は、タンパク質エフェクターの合成および分泌の増加または上方調節レベルとして明示される。臨床現場において、対象が興味のあるタンパク質エフェクターレベルの増加または過多によりもたらされる異常に罹患していることを疑うことがある。
それ故に、そのような対象由来の生物学的試料中の興味のあるタンパク質エフェクターのレベルをアッセイし、そしてそのレベルを非病態的状態に特色的なものと比較する必要がある。また、製造の産物としてタンパク質エフェクターを提供する必要性がある。その必要のある対象にエフェクターを投与することは、病理学的状態の処置に有用である。よって、興味あるタンパク質エフェクターの縮減または抑制レベルによってもたらされる病理学的状態の処置の方法のための必要性がある。加えて、興味のタンパク質エフェクターの増加または上方調節レベルによってもたらされる病理学的状態の処置の方法の必要性がある。
小分子標的は、種々の疾患状態または病理において関与してきた。これらの標的は、タンパク質、特に酵素的タンパク質でありえ、それは標的機能を変更するおよび所望の結果を達成する目的で、小分子薬物によって作用される。細胞性、動物および臨床研究を実施し、状態の病因諭および病原性への遺伝的貢献を解明し得、ここに小分子標的は、種々の生理学的、薬理学的または天然状態で関与する。これらの研究は、Curagen Corporationのコア技術を利用し、異なる遺伝子発現、タンパク質−タンパク質相互作用、発現される遺伝子の大規模配列決定および遺伝子的変異の連関、例えば限定しないが、実験および対照群からの生物学的試料中および間の単一ヌクレオチド多型性（SNP)またはスプライス変異体を見る。そのような研究の目的は、疾病の結果を予防、処置または状態を治療するため、治療的介入の潜在的経路を同定することである。
疾患、病理および他の異常状態または状態であって、ここに哺乳動物が正常状態以外のもであると、あるいはそのようなリスクがあると診断されたものを処置するために、新しい治療剤を同定するのが重要である。そのような手法は、少なくとも、罹患した組織または器官内の標的構成要素を同定する、および標的の機能的属性を調節する候補治療剤を同定する工程を含む。標的構成要素は、疾患または病理に関与する任意の生物学的巨大分子であり得る。一般に標的は特異的機能属性を有するポリペプチドまたはタンパク質である。巨大分子の他のクラスは、核酸、多糖類、脂質、例えば複合脂質または糖脂質であり得る；加えて標的は、細胞下位構造または細胞外構造であり得、それはこれらのクラスの巨大分子のより多くを含む。ひとたびそのような標的が同定されると、スクリーニングアッセイで使用し、大集団の物質または化合物間からの好ましい治療的治療剤を同定しうる。
多くの場合、そのようなスクリーニングアッセイの目的は、小分子候補を同定することである；これは一般に、試験すべき物質の集団を開発するコンビナトリアルな方法論の使用によって接近される。高処理量スクリーニング方法論の実施化は、化合物の大きい、コンビナトリアルライブラリーで作業するとき、有利である。
(発明の要約)
本発明は新規ポリペプチドをコード化する核酸配列の発見に部分的に基づく。新規核酸およびポリペプチドは、本明細書においては、ＮＯＶＸまたはＮＯＶ１、ＮＯＶ２、ＮＯＶ３等、核酸およびポリペプチドと呼ばれる。これらの核酸およびポリペプチド、ならびにその誘導体、ホモログ、アナログおよびフラグメントは以後総称して「ＮＯＶＸ」核酸またはポリペプチド配列と呼ばれ、それらは配列番号２ｎ−１からなる群より選択されるヌクレオチド配列を示し、ここにｎは１ないし６６の整数であり、またはポリペプチド配列であってそれは配列番号２ｎからなる群を示し、ここにｎは１ないし６６の整数である。
一つの態様では、本発明はＮＯＶＸアミノ酸の成熟型を含む単離ペプチドを提供する。ポリペプチドは、例えば、ＮＯＶＸアミノ酸配列、または選択された配列に特定される任意のアミノ酸が、配列中においてアミノ酸残基の１５％未満が変更されるという条件で、異なるアミノ酸に変更されているＮＯＶＸアミノ酸配列の変異体であってもよい。アミノ酸は例えば、ＮＯＶＸアミノ酸配列またはＮＯＶＸアミノ酸配列の変異体であり得、ここに選択された配列に特定される任意のアミノ酸は、配列中の１５％を超えないアミノ酸残基がそのように変化している条件で、異なるアミノ酸に変化している。本発明はまた、任意のＮＯＶＸポリペプチドのフラグメントを含む。もう一つの態様では、本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチドをコード化する単離核酸、またはそのフラグメント、ホモログ、アナログまたは誘導体を含む。
本発明にはまた、ＮＯＶＸ配列の天然に存在する変異体であるＮＯＶＸポリペプチドが含まれる。一つの実施形態では、対立遺伝子変異体は、ＮＯＶＸ核酸配列から１個のヌクレオチドだけ異なる核酸配列の翻訳物であるアミノ酸配列を含む。もう一つの実施形態では、ＮＯＶＸポリペプチドはそこに記載される変異体ポリペプチドであり、そこでは選択された配列で特定される任意のアミノ酸が保存的置換を生じるように変更されている。もう一つの態様では、本発明は、試料を提供すること；ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体に試料を導入すること；そしてＮＯＶＸポリペプチドに結合した抗体の存在または量を測定し、それにより試料中のＮＯＶＸポリペプチドの存在または量を測定すること；により、試料中のＮＯＶＸポリペプチドの存在または量を測定する方法を提供する。さらにもう一つの態様では、本発明は、哺乳動物の対象中のＮＯＶＸポリペプチドの変化したレベルと関連した疾患の存在または素因を測定する方法を含む。該方法は第１の哺乳動物の対象由来の試料中のポリペプチドの発現レベルを測定し；第１ステップの試料中のポリペプチドの量を、疾患または素因を有しないことが知られている第２の哺乳動物の対象由来の対照試料中に存在するポリペプチドの量と比較する工程を含み、第１の対象中のポリペプチドの発現レベルの対照試料に比較する変化は、疾患の存在または素因を示す。
さらなる実施形態では、発明は、ＮＯＶＸポリペプチドに結合する剤を同定する方法を含む。この方法は、剤へポリペプチドを導入する；および該剤がポリペプチドに結合するか決定する工程を含む。種々の実施形態では、該剤は、細胞性レセプターまたは下流エフェクターであり得る。
さらなる態様では、発明は、病理の職地における使用のための潜在治療剤を同定する方法を提供し、ここに該病理は、ＮＯＶＸポリペプチドの異常発現または異常生理学的相互作用に関する。該方法は、ＮＯＶＸポリペプチドを発現するかつポリペプチドへ帰すべき特性または機能を有する細胞を提供する；細胞を、候補物質を含む組成物と接触する；および物質がポリペプチドに帰すべき特性または機能を変化させるか否か決定する工程を含み、それによってもし物質の存在下で観察される変化が細胞が物質のない組成物と接触されるときに観察されないならば、物質は潜在的治療剤として同定される。さらなる態様では、発明は、ＮＯＶＸポリペプチドと連関する病理への活性または潜在性または素因のモジュレーターをスクリーニングする方法を開示する。該方法は、以下の工程を含み、ＮＯＶＸポリペプチドと連関する病理の増加リスクにある試験動物に試験化合物を投与し、ここで試験動物は、組み換え的にＮＯＶＸポリペプチドを位発現する。この方法は、工程の化合物を投与する後に試験動物中のＮＯＶＸポリペプチドの活性を測定する；およびポリペプチドを投与されていない対照動物におけるＮＯＶＸポリペプチドの活性と、試験動物におけるタンパク質の活性を比較することを含み、ここに対象動物についての試験動物におけるＮＯＶＸポリペプチドの活性の変化は、試験化合物がＮＰＶＸポリペプチドと連関する病理の潜在または素因のモジュレーターであることを指摘する。ある実施形態では、試験動物は、野生型試験動物について、試験タンパク質トランスジーンを発現する、または増加レベルのプロモーターの制御下のトランスジーンを発現する組み換え体試験動物であり、ここにプロモーターは、トランスジーンの本来の遺伝子プロモーターではない。さらなる態様では、発明は、ＮＯＶＸポリペプチドの活性を調節する方法を含み、該方法は、ＮＯＶＸポリペプチドを発現する細胞試料を、ポリペプチドの活性を調節するのに十分量のポリペプチドに結合する化合物ととともに導入することを含む。
本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチド、またはそのフラグメント、相同体、類似体、または誘導体をコードする単離核酸を含む。好ましい実施形態では、核酸分子は、天然に存在する対立遺伝子核酸変異体のヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、核酸は、変異体ポリペプチドをコードし、ここで変異体ポリペプチドは、天然存在ポリペプチド変異体のポリペプチド配列を有する。さらなる実施形態では、核酸分子は、ＮＯＶＸ核酸配列と単一ヌクレオチドによって異なる。１実施形態では、ＮＯＶＸ核酸分子は、厳密（ストリンジェント）な条件下で、配列番号２ｎ−１からなる群より選ばれるヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズし、ここでｎは１ないし６６である。さらなる態様では、発明は、ＮＯＶＸヌクレオチド配列を発現するベクターまたは細胞を提供する。
１実施形態では、発明は、ＮＯＶＸポリペプチドの活性を調節する方法を開示する。方法は、ＮＯＶＸポリペプチドを発現する細胞試料を、ポリペプチドの活性を調節するのに十分量でポリペプチドに結合する化合物とともに導入する工程を含む。さらなる実施形態では、発明は、ＮＯＶＸアミノ酸配列またはＮＯＶＸアミノ酸配列の成熟型の変異体を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離ＮＯＶＸアミノ酸配列を含み、ここで選択される配列の成熟型の任意のアミノ酸は、異なるアミノ酸に変化していてもよい。ただし成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％を超えないものがそのように変化することを条件とする。更なる実施形態では、発明は、ＮＯＶＸアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列を含み、ここで選択配列で特定される任意のアミノ酸が異なるアミノ酸に変化していてもよい。ただし、配列中のアミノ酸残基の１５％を超えないものがそのように変化することを条件とする。
１実施形態では、発明は、ＮＯＶＸポリペプチドまたは任意の変異体ポリペプチドの少なくとも１部分をコードするＮＯＶＸ核酸フラグメントを開示し、ここで選択配列の任意のアミノ酸は異なるアミノ酸に変化していてもよく、ただし、配列中のアミノ酸残基の１０％を超えないものがそのように変化することを条件とする。さらなる実施形態では、発明は、任意のＮＯＶＸ核酸分子または天然存在対立遺伝子核酸変異体相補物を含む。さらなる実施形態では、発明は、変異体ポリペプチドをコードするＮＯＶＸ核酸分子を開示し、ここで変異体ポリペプチドは、天然存在ポリペプチド変異体のポリペプチド配列を有する。さらなる実施形態では、発明は、ＮＯＶＸ核酸を開示し、ここで核酸分子は、ＮＯＶＸ核酸配列から単一ヌクレオチドによって異なる。
さらなる態様では、発明は、ＮＯＶＸ核酸を含み、ここでＮＯＶＸヌクレオチド配列中の１または２以上のヌクレオチドが、異なるヌクレオチドに変化してもよく、ただしヌクレオチドの１５％を超えないものがそのように変化することを条件とする。１実施形態では、発明は、ＮＯＶＸヌクレオチド配列の核酸フラグメントおよび核酸フラグメントであって、ここでＮＯＶＸヌクレオチド配列中の１または２以上のヌクレオチドが、選択配列からなる群より選択されるものから異なるヌクレオチドに変化しているものを開示し、ただし、１５％を超えないヌクレオチドがそのように変化することを条件とする。さらなる実施形態では、発明は、核酸分子を含み、ここで核酸分子は、ストリンジェント条件でＮＯＶＸヌクレオチド配列またはＮＯＶＸヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする。１実施形態では、発明は核酸分子を含みここで配列は変化し、その結果コーディング配列中の１５％を超えないヌクレオチドが、ＮＯＶＸヌクレオチド配列またはそのフラグメントと異なる。
さらなる態様では、発明は、試料中のＮＯＶＸ核酸の存在または量を決定する方法を含む。該方法は、試料を提供する；核酸分子に結合するプローブへ試料を導入する；およびＮＯＶＸ核酸分子に結合したプローブの存在または量を決定する工程を含み、それによって試料中のＮＯＶＸ核酸分子の存在または量を決定する。１実施形態では、核酸分子の存在または量を、細胞または組織型のマーカーとして使用する。
さらなる態様では、発明は、第一の哺乳動物対象のＮＯＶＸ核酸分子の変更レベルに連関する疾患の存在または素因を決定する方法を開示する。方法は、第一の哺乳動物対象からの試料中のＮＯＶＸ核酸の量を測定する；および工程（ａ）の試料中の核酸の量を、疾患を有しないまたは素因がないと知られる第二の哺乳動物対象からの対照試料中に存在するＮＯＶＸ核酸の量と比較する、工程を含み、ここで対象試料と比較した場合の第一対象中の核酸のレベルの変更が、疾患の存在または素因を指摘する。
１態様において、本発明は、疾病と特異的な関係を有する標的物を用いて、疾患、病理または異常な状態もしくはコンディションを治療するための治療薬剤の候補を同定する方法を提供する。この方法は、以下の工程：
（１） 疾病、病理、または異常な状態もしくはコンディションと関連した標的バイオポリマーの同定；
（２） 該バイオポリマーを、少なくとも１つの化合物と接触させること；および
（３） 該バイオポリマーと結合する化合物を、治療薬剤の候補として同定すること
を含む。
この方法の１実施形態において、該化合物は、化合物のコンビナトリアルライブラリーのメンバーであって；工程（ｂ）における接触は、バイオポリマーの１つもしくはそれ以上の複製サンプルに対して行われるものであって；該複製サンプルは、少なくとも１つのコンビナトリアルライブラリーのメンバーと接触させられる。この方法のさらなる実施形態において、バイオポリマーは、細胞内に含まれ、そこで機能的に発現する。さらなる有利な実施形態において、化合物の結合は、バイオポリマーの機能を調節するものであって、調節によって、化合物が潜在的な治療薬剤であることが同定できる。この方法のさらなる重要な実施形態において、標的バイオポリマーはポリペプチドである。
本発明の第２の態様において、疾病、病理、または異常な状態もしくはコンディションを治療するための医薬品を同定するための方法が提供される。第２の方法は、以下の工程：
（１） 前段落に記載の方法によって、前記疾病、病理、または異常な状態もしくはコンディションの治療のための候補治療薬剤を同定する工程；
（２） 疾病、病理、または異常な状態もしくはコンディションと関連した生物サンプルを、該候補治療薬剤と接触させる工程；
（３） 該候補が、そこで治療応答と関連した生物サンプルに効果を誘導するか決定する工程；および
（４） 医薬品としての効果を示す候補を同定する工程
を含む。
第２の方法のいくつかの実施形態において、生物サンプルは、細胞、組織もしくは臓器を含むものであって、またはヒトでない哺乳類である。
本発明は、多様な疾患もしくは病理と、タンパク質およびポリペプチドおよびそれらをコードする核酸の新規の関連を開示する。該タンパク質およびそれらに類似した関連タンパク質は、ｃＤＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡによってコードされる。タンパク質、ポリペプチドおよびそれらと同種の核酸は、ある場合において、CuraGen Corporationによって同定された。CG154077およびそのあらゆる変種によってコードされるヒトスルホニル尿素２Ａタンパク質は、診断マーカー、抗体治療のための標的、小分子薬剤の標的として適当である。本発明の実施形態のように、組み換え技術によって発現した、および／または内在的に発現したタンパク質は、かかる治療薬剤および／または抗体および／または治療小分子の同定のための、様々な選別において使用される。
特に指摘しない場合、ここに使用する技術および具体的用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味である。本明細書で説明されるものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適当な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許申請、特許、および他の参考文献は全体的な出典明示により本明細書の一部とする。抵触がある場合には本明細書が、定義を含め優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示的なものであって限定することを意図しない。
本発明の他の特性および利点は以下の発明の開示および請求項より明らかであろう。
（発明の開示）
本発明は、新規ヌクレオチドおよびそれによりコードされたポリペプチドを提供する。本発明は、新規核酸配列、それらのコードされたポリペプチド、抗体、および他の関連化合物を含む。本明細書において、配列を「ＮＯＶＸ核酸」または「ＮＯＶＸポリヌクレオチド」と総称し、対応するコードされたポリペプチドを「ＮＯＶＸポリペプチド」または「ＮＯＶＸタンパク質」と称する。別段の記述がない限り、「ＮＯＶＸ」は本明細書に開示される任意の新規配列を指すことを意味する。表ＡにＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドの要約を示す。
表Ａ：配列および対応する配列番号
Figure 2005532786
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表ＡはＮＯＶＸポリペプチドの既知のタンパク質ファミリーとの相同性を示す。従って、表１の第１欄で特定されるＮＯＶＸに対応する本発明に従う核酸およりポリヌクレオチド、抗体および関連化合物は、例えば、表Ａの第５欄に特定される既知タンパク質ファミリーに関連する病変および疾患に関係する治療的応用および診断的応用において有用である。
ＮＯＶＸ配列と連関する病理、疾患、障害および状態などは、限定しないが、例えば以下のものを含む：心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心疾患、大動脈弁狭窄、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、血管石灰化、線維症、房室（Ａ−Ｖ）管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満、肥満に連関する代謝妨害、移植、副腎白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、前立腺癌、糖尿病、代謝障害、新生物；腺癌、リンパ腫、子宮癌、受胎能、血友病、凝固性亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫不全、移植片対宿主疾患、ＡＩＤＳ、気管支喘息、クローン病；多発性硬化症、Albright遺伝性骨ジストロフィー（Ostoeodystrophy）、感染性疾患、食欲不振、癌連関悪液質、癌、神経変性性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、および種々の異常脂血症、代謝症候群Ｘおよび慢性疾患および種々の癌、並びに状態例えば移植及び不妊と連関する消耗性障害。
ＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドは種々の応用および状況において有用である。本発明に従う種々のＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドは、前記タンパク質とのドメインおよび配列関連性の存在に従うタンパク質ファミリーの新規メンバーとして有用である。加えて、ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを用いて、ＮＯＶＸポリペプチドが属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定し得る。
表Ａの第５欄で特定されるタンパク質ファミリーの他の既知のメンバーと一致して、本発明のＮＯＶＸポリペプチドは、そのようなタンパク質ファミリーの他のメンバーに相同性を示し、そしてそれらを特徴とするドメインを含有する。それぞれのＮＯＶＸについての配列関連性分析およびドメイン分析の詳細を実施例Ａに示す。
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを、ＮＯＶＸの活性または機能を阻害または促進する分子をスクリーニングするのに使用し得る。特に、本発明に従う核酸およびポリペプチドは、表Ａに掲げたタンパク質ファミリーと関連する疾患を調整または阻害する低分子の同定用の標的として使用され得る。
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドはまた、特定の細胞タイプを検出にも有用である。ＮＯＶＸそれぞれに対する発現分析の詳細を実施例Ｃに示す。従って、本発明に従うＮＯＶＸ核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、正常組織対疾患組織、例えば、種々のがん、において異なる発現を有する種々の疾患の検出における診断的応用および治療的応用を有する。それぞれのＮＯＶＸに関するＳＮＰ分析は、該当する場合、実施例Ｄに示される。
本発明に従うＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドのさらに別の利用法が本明細書に開示される。
ＮＯＶＸクローン
ＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドは、種々の応用および状況において有用である。本発明に従う種々のＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドは、上記該タンパク質と関連するドメインおよび配列の存在に従うタンパク質ファミリーの新規メンバーとして有用である。加えて、ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを、ＮＯＶＸポリペプチドが所属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定するために使用し得る。
ＮＯＶＸ遺伝子およびそれらの対応するコードされたタンパク質は、例えば、タンパク質治療または遺伝子治療により、医学的状態を予防、処置または緩和するのに有用である。病態を、試料中の新規タンパク質の量を測定または新規遺伝子中の変異の存在を測定することにより診断し得る。ＮＯＶＸ遺伝子が最も高発現する組織に基づいて、それぞれのＮＯＶＸ遺伝子に対する特異的な使用を説明する。使用は、種々の疾患および障害を診断または処置するための産物を開発することを含む。
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は、潜在的な診断応用および治療応用、および研究ツールとして有用である。これらは、特異的または選択的核酸、またはタンパク質、診断マーカーおよび／または予後マーカーとして役立つことを含む。ここで核酸またはタンパク質の存在または量、ならびに以下のような潜在的な治療応用を評価する：（ｉ）タンパク質治療薬、（ｉｉ）低分子薬の標的、（ｉｉｉ）抗体の標的（治療的、診断的、薬のターゲティング／細胞毒性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療（遺伝子デリバリー／遺伝子手術）に有用な核酸、および（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物、（ｖｉ）生物学的防衛兵器。
一つの特定の実施形態では、本発明は、(ａ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜６６の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型；(ｂ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜６６の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型の変異体、但し、成熟型中の任意のアミノ酸は、成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている；(ｃ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜６６の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列；(ｄ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜６６の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ変異体、但し、選択された配列で特定される任意のアミノ酸は、配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている；およびｅ）ａ）ないしｄ）のいずれかのフラグメント、からなる群から選択したアミノ酸配列を含有する単離ポリペプチドを含む。
もう一つの特別な実施形態では、本発明は、(ａ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜６６の整数である）を与えられたアミノ酸配列を持つ成熟型；(ｂ)配列番号２ｎ（ｎは１〜６６の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型の変異体であり、選択された配列の成熟型中の任意のアミノ酸が、成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている、変異体；(ｃ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜６６の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列；(ｄ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜６６の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列の変異体であり、選択された配列中の特定されるアミノ酸が、配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている、変異体；および(ｅ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜６６の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも一部分、または選択された配列の任意のアミノ酸が、配列においてアミノ酸残基の１０％未満が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている、ポリペプチドの任意の変異体をコードする核酸のフラグメント；および(ｆ) 核酸分子のいずれかの相補的分子、からなる群より選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子を含む。
なおもう一つの特別な実施形態では、本発明は単離核酸分子を含む。ここで該核酸分子は、(ａ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列；(ｂ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列中で一つまたはそれ以上のヌクレオチドが、選択された配列からなる群から選択されるものから、ヌクレオチドの１５％以下が変更を受けるという条件で異なるヌクレオチドに変更されているヌクレオチド配列；(ｃ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）からなる群から選択される配列を持つ核酸フラグメント；および(ｄ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列中で一つまたはそれ以上のヌクレオチドが、選択された配列からなる群から選択されるものから、ヌクレオチドの１５％以下が変更を受けるという条件で異なるヌクレオチドに変更されている核酸フラグメント、からなる群より選択したヌクレオチド配列を含む。
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド
本発明の一つの態様は、ＮＯＶＸポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性な部分をコードする単離核酸分子に関する。また、本発明は、ＮＯＶＸをコードする核酸(例えば、ＮＯＶＸのｍＲＮＡ)を同定するためのハイブリダーゼーションプローブとしての使用に十分な核酸フラグメント、およびＮＯＶＸ核酸分子の増幅および／または変異用のＰＣＲプライマーとしての使用のためのフラグメントを含む。本明細書において使用する用語「核酸分子」とは、ＤＮＡ分子(例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ)、ＲＮＡ分子(例えば、ｍＲＮＡ)、ヌクレオチド類似体を用いて生成されたＤＮＡ類似体またはＲＮＡ類似体、およびそれらの誘導体、フラグメントおよび相同体を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖でも二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
ＮＯＶＸ核酸は成熟ＮＯＶＸポリペプチドをコードし得る。本明細書において使用するように、本発明に開示するポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型とは、天然に存在するポリペプチド、または前駆体、またはプロタンパク質の産物である。天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質は、限定されない例として、対応する遺伝子によりコードされる全長遺伝子産物を含む。これに代えて、本明細書に説明するＯＲＦによりコードするポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質として定義し得る。産物の「成熟」型は、限定されない例として、遺伝子産物を生じる細胞(例えば、宿主細胞)内で起こり得る一つまたはそれ以上の天然に存在するプロセシングステップの結果として生じる。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型を導くそのようなプロセシングステップの例として、ＯＲＦの開始コドンによりコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドまたはリーダー配列のタンパク質分解的切断を挙げる。従って、残基１がＮ末端メチオニンである１〜Ｎの残基を有する前駆ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟型は、Ｎ末端メチオニン除去後に残存する残基２〜Ｎを有する。これに代えて、残基１〜残基ＭからＮ末端シグナル配列を切断する、残基１〜Ｎを有する前駆ポリペプチドまたはタンパク質より生じる成熟型は、残存する残基Ｍ＋１〜残基Ｎからの残基を有する。さらに本明細書において使用するように、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型はタンパク質分解による切断事象以外の翻訳後の工程により生じ得る。そのようなさらに別な方法は、限定されない例として、グリコシル化、ミリストイル化、またはリン酸化を含む。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質を、これらの方法のただ一つ、またはそれらのいずれかの組合せの操作によりもたらし得る。
本明細書において使用する用語「プローブ」は、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド(ｎｔ)から約１００ｎｔの間、または特定の使用によっては約、例えば６０００ｎｔもの長さである可変的長さの核酸配列を指す。プローブを、同一、類似、または相補的な核酸配列の検出に使用し得る。より長いプローブを天然または組換え供給源から一般的に得る。より長いプローブは、特異性が高くより短い長さのオリゴマーのプローブよりハイブリダイズするのが遅い。プローブは、一本鎖または二本鎖でもよく、そしてＰＣＲ、メンブレン−ベースのハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様技術において特異性を有するようにデザインされ得る。
本明細書において使用する用語「単離」核酸分子は、核酸の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離された核酸である。好ましくは、「単離」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中で核酸に天然に隣接する配列(即ち核酸の５'末端および３'末端に位置する配列)を有しない。例えば、種々の実施形態において、単離ＮＯＶＸ核酸分子は、核酸が由来する細胞／組織(例えば、脳、心臓、肝臓、脾臓等)のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０.５ｋｂ、０.１ｋｂ以下、またはそれ未満のヌクレオチド配列を含有し得る。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は、他の細胞性物質、培地、または化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まなくてもよい。
本発明の核酸分子、例えば、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはこのヌクレオチド配列の相補物を、標準的分子生物学の技術および本明細書に示す配列情報を用いて単離し得る。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）の核酸配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、標準的ハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術(例えば、Sambrook, et al., (eds.), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; および Ausubel, et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993に記載されるように)を用いてＮＯＶＸ分子を単離し得る。
本発明の核酸は、鋳型としてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはこれに代えてゲノムＤＮＡを使用して標準的ＰＣＲ増幅技術にしたがって適切なオリゴヌクレオチドプライマーで増幅し得る。そのように増幅した核酸を、適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析により特徴づけ得る。さらに、ＮＯＶＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、標準合成技術、例えば自動ＤＮＡ合成装置の使用、により調製し得る。
本明細書において使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結するヌクレオチド残基を指す。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列に基づき得るし、またはそれらからデザインし得る。そして短いオリゴヌクレオチド配列を使用して、特定の細胞または組織の同一、類似、または相補的ＤＮＡまたはＲＮＡの存在を増幅し、確認し、または明らかにする。オリゴヌクレオチドは、長さ約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔ、好ましくは長さ約１５ｎｔ〜３０ｎｔの核酸配列を含む。本発明の一つの実施形態では、長さ１００ｎｔ未満の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）の少なくとも６個の連続したヌクレオチド、またはそれらの相補物をさらに含む。オリゴヌクレオチドを、化学的に合成し、プローブとして使用し得る。
もう一つの実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）に示すヌクレオチド配列、またはこのヌクレオチド配列の一部(例えば、ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするプローブ、プライマー、またはフラグメントとして使用し得るフラグメント)の相補物である核酸分子を含む。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）を示すヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）を示すヌクレオチド配列に十分に相補的であるものであり、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）を示すヌクレオチド配列と殆どミスマッチなしでまたは全くミスマッチ無しで水素結合し得る。そのため核酸分子は安定な二本鎖を形成する。
本明細書において使用する用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のWatson-CrickまたはHoogsteen塩基対形成を指し、用語「結合」は、２個のポリペプチドまたは化合物、または関連するポリペプチドまたは化合物またはそれらの組合せ間の物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン、非イオン、ファン・デル・ワールス、疎水性相互作用等を含む。物理的相互作用は直接的または間接的であり得る。間接的相互作用は、他のポリペプチドまたは化合物の作用を介したまたはこれに因るものであり得る。直接的結合は、他のポリペプチドまたは化合物の作用を介したまたはこれに因り起こるのではなく、代わりに他の実質的な化学的仲介物無しで起こる相互作用を指す。
本明細書で提供する「フラグメント」は、核酸の場合特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さ、アミノ酸の場合にはエピトープの特異的認識に十分な長さである、少なくとも６個の(連続した)核酸または少なくとも４個の(連続した)アミノ酸の配列として定義され、そして全長より短いほとんどの或る一部である。フラグメントは、選択した核酸またはアミノ酸配列の任意の連続した部分から由来するものであり得る。
全長ＮＯＶＸのクローンを、ＡＴＧ翻訳開始コドンおよびインフレームの停止コドンを含有するとして同定する。ＡＴＧ開始コドンを欠く任意の開示するＮＯＶＸヌクレオチド配列は、それ故にれぞれのＮＯＶＸポリペプチドの切断（truncated）型Ｃ末端フラグメントをコードし、対応する全長ｃＤＮＡが開示する配列の５'方向へ伸長することを要求する。インフレームの停止コドンを欠く任意の開示するＮＯＶＸヌクレオチド配列は、同様にそれぞれのＮＯＶＸポリペプチドの切断型Ｎ末端フラグメントをコードし、対応する全長ｃＤＮＡが開示する配列の３'方向へ伸長することを要求する。
「誘導体」は、もとの化合物から直接、修飾によりまたは部分的置換によるいずれかで生成した核酸配列またはアミノ酸配列である。類似体は、もとの化合物に類似しているが同一ではない構造を有する核酸配列またはアミノ酸配列であり、例えば、それらは特定の成分または側鎖に関して天然化合物と異なっている。類似体は、合成であり得るし異なる進化起源を由来とし得るし、野生型と比較して類似または反対の代謝活性を有し得る。相同体は、異なる種を由来とする特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
誘導体および類似体は全長または全長以外であり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体または類似体は、同一サイズの核酸またはアミノ酸配列に亘って、または当該分野において公知のコンピューター相同性プログラムによりアラインメントしたアラインメント配列と比較した際、種々の実施形態において、少なくとも約７０％、８０％、または９５％の同一性(好ましくは、８０〜９５％の同一性)で本発明の核酸またはタンパク質に実質的に相同である領域を含む分子、またはそれらのコードする核酸が本発明のタンパク質をコードする配列の相補物に厳密、中等度に厳密、または低い厳密度の条件下でハイブリダイズ可能である分子を含むが、これらに限定されない。例えば、Ausubel, et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993および以下を参照されたい。
「相同な核酸配列」または「相同なアミノ酸配列」またはそれらの変異体は、上述のようにヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの相同性を特徴とする配列を指す。相同なヌクレオチド配列は、ＮＯＶＸポリペプチドのアイソフォームをコードするこれらの配列を含む。アイソフォームを、例えばＲＮＡの選択的スプライシングの結果として同じ生物の異なる組織において発現し得る。これに代えて、アイソフォームを、異なる遺伝子によりコードし得る。本発明では、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種のＮＯＶＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、脊椎動物を含むが脊椎動物に限定されない。よって例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、および他の生物を含む。相同なヌクレオチド配列はまた、本明細書に示すヌクレオチド配列の天然に存在する対立遺伝子変異体および突然変異体を含むが、これらに限定しない。しかしながら、相同なヌクレオチド配列は、ヒトＮＯＶＸタンパク質をコードする正確なヌクレオチド配列を含まない。相同な核酸配列は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）の保存的アミノ酸置換(下記参照)をコードする核酸配列ならびにＮＯＶＸの生物活性を有するポリペプチドを含む。ＮＯＶＸタンパク質の種々の生物学的活性を、以下に説明する。
ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸ核酸のオープンリーディングフレーム(「ＯＲＦ」)によりコードされる。ＯＲＦは、ポリペプチドに潜在的に翻訳し得るヌクレオチドに対応する。ＯＲＦを含む一連の核酸を、停止コドンにより中断しない。全長タンパク質をコードする配列を表すＯＲＦは、ＡＴＧ「開始」コドンで始まり、３種の「停止」コドン即ちＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡの一つで終わる。本発明の目的のため、ＯＲＦは、開始コドン、停止コドン、またはその両方があってもなくてもよい、コード化配列の任意の部分であり得る。ＯＲＦを真正の細胞性タンパク質をコードする良好な候補として考えるために、最小限の要件、例えば、５０個のアミノ酸またはそれ以上をコードする一連のＤＮＡ、がしばしば定められる。
ヒトＮＯＶＸ遺伝子のクローニングから決定するヌクレオチド配列は、他の細胞タイプ、例えば他の組織由来のＮＯＶＸ相同体、ならびに他の脊椎動物由来のＮＯＶＸ相同体を同定および／またはクローニングする際の使用のためにデザインするプローブおよびプライマーの作成を可能にする。プローブ／プライマーは、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを典型的に含む。オリゴヌクレオチドは、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）の少なくとも約１２、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００個の連続したセンス鎖のヌクレオチド配列；または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）の天然に存在する変異体に厳密な条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を典型的に含む。
ヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に基づくプローブを、同じタンパク質または相同タンパク質をコードする転写体またはゲノム配列を検出するのに使用し得る。種々の実施形態において、プローブは検出可能な標識がつけられており、例えば、標識は放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素のコファクターであり得る。かかるプローブは、対象由来の細胞試料中のあるＮＯＶＸコード化核酸のレベルを測定することによるように、あるＮＯＶＸタンパク質を誤って発現している細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として使用し得る、例えば、ＮＯＶＸのｍＲＮＡを検出するかまたはゲノムＮＯＶＸ遺伝子が変異または欠失をしたか否かを測定する。
「ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」は、特定の生物学的分析において測定するような成熟型を含み、本発明のポリペプチドの活性に類似な、しかし必ずしも同一ではない活性を用量依存性の有無を問わず発揮するポリペプチドを指す。「ＮＯＶＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントを、あるＮＯＶＸの生物活性(ＮＯＶＸタンパク質の生物活性を以下に説明する)を有するポリペプチドをコードする配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）の一部を単離し、ＮＯＶＸタンパク質のコードする部分を発現し(例えば、インビトロ組換え発現により)、ＮＯＶＸのコードする部分の活性を評価するすることにより調製し得る。
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド変異体
本発明はさらに、遺伝子コードの縮重により配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）に示すヌクレオチド配列と異なっており、従って配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）に示すヌクレオチド配列によりコードするのと同じＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子を包含する。もう一つの実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列番号２ｎ（ｎは１〜６６の整数である）に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）に示すヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に加えて、ＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列の多型が、集団(例えばヒトの集団)中に存在し得ることを当業者は理解する。ＮＯＶＸ遺伝子のかかる遺伝子多型は、天然の対立遺伝子変異に因り集団の中の個体間に存在し得る。本明細書において使用する用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＮＯＶＸタンパク質、好ましくは脊椎動物のＮＯＶＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む核酸分子を指す。かかる天然の対立遺伝子変異は、ＮＯＶＸ遺伝子のヌクレオチド配列中に１〜５％の変異を典型的にもたらす。天然の対立遺伝子変異の結果でありＮＯＶＸポリペプチドの機能活性を変化しない任意のおよび全てのかかるヌクレオチド変異およびそこで得られるＮＯＶＸポリペプチド中のアミノ酸多型は、本発明の範囲内にあるものとする。
さらに、他の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子、および従ってヒト配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあるものとする。本発明のＮＯＶＸｃＤＮＡの天然の対立遺伝子変異体および相同体に対応する核酸分子は、厳密なハイブリダイゼーション条件下で標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて、本明細書に開示するヒトＮＯＶＸ核酸との相同性に基づいて単離し得る。
従って、もう一つの実施形態では、本発明の単離核酸分子は少なくとも６ヌクレオチド長であり、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子に厳密な条件下でハイブリダイズする。もう一つの実施形態では、核酸は少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００またはそれ以上のヌクレオチド長である。なおもう一つの実施形態では、本発明の単離核酸分子はコード化領域にハイブリダイズする。本明細書において用いる用語「厳密な条件下でハイブリダイズする」は、お互いに少なくとも約６５％相同なヌクレオチド配列がお互いに典型的にハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーション条件および洗滌条件を記載することを意図する。
相同体(即ち、ヒト以外の生物種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸)または他の関連配列(例えばパラログ)を、核酸のハイブリダイゼーションおよびクローニングの当該分野において周知の方法を用いて特定のヒト配列の全部または一部をプローブとし、低度、中度、または高度に厳密なハイブリダイゼーションにより得られる。
本明細書において使用する用語「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。厳密な条件は配列依存性であり、異なる環境で差がある。より長い配列は、より短い配列よりもより高温で特異的にハイブリダイズする。一般的に、厳密な条件を、一定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列の融解温度(Ｔｍ)より約５℃低いように選択する。Ｔｍは、標的配列と相補的なプローブの５０％が平衡時に標的配列にハイブリダイズする温度(規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で)である。標的配列はＴｍにおいて一般的に過剰に存在するので、プローブの５０％を平衡時に占める。典型的に、厳密な条件はｐＨ７.０〜８.３で塩濃度が約１.０Ｍナトリウムイオン未満、典型的には約０.０１〜１.０Ｍナトリウムイオン(または他の塩)であり、温度は短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド(例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ)に対して少なくとも約３０℃であり、より長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドに対して少なくとも約６０℃である。厳密な条件を、フォルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成し得る。
厳密な条件は当業者に公知であり、Ausubel, et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.に見出すことができる。好ましくは、条件は、互いに少なくとも６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同な配列が互いに典型的にハイブリダイズしたままであるようなものである。厳密なハイブリダイゼーションの限定されない例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％ＰＶＰ、０.０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０.０２％ＢＳＡおよび５００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中６５℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで０.２×ＳＳＣ、０.０１％ＢＳＡ中５０℃で１回またはそれ以上洗滌する。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜５２の整数である）の配列に厳密な条件下でハイブリダイズする本発明の単離核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書において使用する用語「天然に存在する」核酸分子は、天然に(例えば、天然のタンパク質をコードする)存在する核酸配列を有するＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を指す。
第２の実施形態では、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、類似体または誘導体と中度に厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列を提供する。中度に厳密なハイブリダイゼーション条件の限定されない例は、６×ＳＳＣ、５×Reinhardtの溶液、０.５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中５５℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中３７℃で１回またはそれ以上洗滌することである。使用され得る他の中度に厳密な条件は当該分野内で周知である。例えば、Ausubel, et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, および Krieger, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.を参照されたい。
第３の実施形態では、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、類似体または誘導体と低度に厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列を提供する。低度に厳密なハイブリダイゼーション条件の限定されない例は、３５％フォルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％ＰＶＰ、０.０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０.２％ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％(ｗｔ／ｖｏｌ)硫酸デキストラン中４０℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０.１％ＳＤＳ中５０℃で１回またはそれ以上洗滌することである。使用し得る他の低度に厳密な条件(例えば種間ハイブリダイゼーションに使用する)は当該分野において周知である。例えば、Ausubel, et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, および Kriegler, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.；Shilo and Weinberg, 1981. Proc Natl Acad Sci USA 78: 6789-6792を参照されたい。
保存的変異
集団中に存在し得るＮＯＶＸ配列の天然に存在する対立遺伝子変異に加えて、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）のヌクレオチド配列中に変異により変換を導入することができ、それによってＮＯＶＸタンパク質の機能活性を変えること無しに、コードするＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列の変化を導くことができることを当業者はさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸置換に導くヌクレオチド置換を、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）の配列中で行い得る。「非必須」アミノ酸残基は、ＮＯＶＸタンパク質の野生型の配列をそれらの生物活性を変化させることなく変えることのできる残基であるが、一方で「必須」アミノ酸残基をそのような生物活性に必要とする。例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質中で保存するアミノ酸残基は、特に変換に耐えられない。保存的置換が行われ得るアミノ酸は当該分野内で周知である。
本発明のもう一つの態様は、活性に必須でないアミノ酸残基中に変化を含有するＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。かかるＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）とアミノ酸配列において異なっているが、生物活性を依然保持している。一つの実施形態では、単離核酸分子はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここでタンパク質は、配列番号２ｎ（ｎは１〜６６の整数である）のアミノ酸配列と少なくとも約５０％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、核酸分子によりコードするタンパク質は、配列番号２ｎ（ｎは１〜６６の整数である）に少なくとも約６０％相同であり；より好ましくは、核酸分子によりコードするタンパク質は、配列番号２ｎ（ｎは１〜６６の整数である）に少なくとも約７０％相同であり；さらに好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜６６の整数である）に少なくとも約８０％相同であり；それよりさらにより好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜６６の整数である）に少なくとも約９０％相同であり；最も好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜６６の整数である）に少なくとも約９５％相同である。
配列番号２ｎ（ｎは１〜６６の整数である）のタンパク質に相同なあるＮＯＶＸタンパク質をコードする単離核酸分子を、１個またはそれ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失をコードするタンパク質内に導入するように配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）のヌクレオチド配列の中に１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより創成し得る。
突然変異を、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）の中に、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ仲介性突然変異誘発のような、標準的技術により導入し得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換を、１個またはそれ以上の非必須アミノ酸残基において行う。「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えるアミノ酸残基中の一つである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野内で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖をもつアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖をもつアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、電荷のない側鎖をもつアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、無極性側鎖をもつアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ位側鎖をもつアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、ならびに芳香族側鎖をもつアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。従って、ＮＯＶＸタンパク質中の非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換する。これに代えて、もう一つの実施形態では、突然変異を、飽和突然変異誘発のように、あるＮＯＶＸコード化配列の全部または一部に沿って無作為に導入し得るし、得られた突然変異体をＮＯＶＸの生物学的活性についてスクリーニングして活性を保持する変異体を同定し得る。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）の突然変異誘発に引き続いて、コードされたタンパク質を当該分野において公知の任意の組換え技術で発現し、タンパク質の活性を測定し得る。
アミノ酸ファミリーの関連性を、側鎖の相互作用に基づいても決定し得る。置換したアミノ酸は、十分に保存された「強い」残基または十分に保存された「弱い」残基であり得る。保存したアミノ酸残基の「強い」群は、次の群のいずれか一つであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷであり、ここでアミノ酸の一文字表記は、互いに置換し得るアミノ酸でグル−プ分けする。同様に、保存した残基の「弱い」群は、次のいずれか一つであり得る：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＨＦＹであり、ここでそれぞれの群の文字はアミノ酸の一文字表記を表す。
一つの実施形態では、変異ＮＯＶＸタンパク質を、(i)他のＮＯＶＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質またはそれらの生物学的活性部位と相互作用するタンパク質：タンパク質を形成する活性、(ii)変異ＮＯＶＸタンパク質とあるＮＯＶＸリガンド間の複合体形成、または(iii)細胞内標的タンパク質またはそれらの生物学的活性部位に結合する変異ＮＯＶＸタンパク質の活性についてアッセイし得る；(例えば、アビジンタンパク質)。
なおもう一つの実施形態では、変異ＮＯＶＸタンパク質を、特定の生物学的機能を調節する活性(例えば、インスリン分泌の調節)についてアッセイし得る。
妨害性ＲＮＡ
本発明の１の態様において、ＮＯＶＸ遺伝子発現をＲＮＡ妨害により弱めることができる。当該分野においてよく知られた１のアプローチは、短い妨害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される遺伝子サイレント化であり、該アプローチにおいて、ＮＯＶＸ遺伝子転写物の少なくとも１９ないし２５ヌクレオチドの長さのセグメントに対して相補的であり、５’非翻訳（ＵＴ）領域、ＯＲＦ、または３’ＵＴ領域を含む、特異的な２本鎖ＮＯＶＸ由来のｓｉＲＮＡヌクレオチド配列により、ＮＯＶＸ遺伝子発現産物が標的とされる。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ００／４４８９５、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ０１／７５１６４、ＷＯ０１／９２５１３、ＷＯ０１／２９０５８、ＷＯ０１／８９３０４、ＷＯ０２／１６６２０、およびＷＯ０２／２９８５８参照（それぞれを参照により本明細書に一体化させる）。標的化される遺伝子はＮＯＶＸ遺伝子であってもよく、あるいはＮＯＶＸ遺伝子の上流または下流モジュレーターであってもよい。ＮＯＶＸ遺伝子の上流または下流モジュレーターの非限定的な例は、例えば、ＮＯＶＸ遺伝子プロモーターに結合する転写因子ＮＯＶＸポリペプチドと相互作用するキナーゼまたはホスファターゼ、ならびにＮＯＶＸ調節経路に含まれるポリペプチドである。
本発明の方法によれば、妨害性ＲＮＡを用いてＮＯＶＸ遺伝子発現がサイレント化される。本発明のＮＯＶＸポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを包含する。ＮＯＶＸポリヌクレオチド配列を用いて、例えば、ショウジョウバエ抽出物（これに限らない）のごとき無細胞系でＮＯＶＸポリヌクレオチド配列をプロセッシングすることにより、あるいは組み換え型２本鎖ＮＯＶＸ ＲＮＡの転写により、あるいはＮＯＶＡ配列に相同的なヌクレオチド配列を合成することにより、かかるＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡを得ることができる。例えば、Tuschul, Zamire, Lehmann, Bartel and Sharp (1999), Genes & Dev. 13: 3191-3197参照（参照により本発明系に一体化させる）。合成する場合、典型的な０．２マイクロモラースケールのＲＮＡ合成により約１ミリグラムのｓｉＲＮＡが得られ、それは２４ウェルの組織培養プレートフォーマットを用いる１０００回のトランスフェクション実験に十分なものである。
最も効率的なサイレント化は、一般的には、２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有するように対合された２１ヌクレオチドのセンス鎖および２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ２本鎖を用いて観察される。２ヌクレオチドの３’オーバーハングの配列は、ｓｉＲＮＡの標的認識の特異性にさらなる小さな貢献をする。特異性に対する貢献は最初に対合した塩基に隣接した未対合ヌクレオチドに局在化される。１の実施形態において、３’オーバーハング中のヌクレオチドはリブヌクレオチドである。別の実施形態において、３’オーバーハング中のヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。３’オーバーハング中の２’−デオキシリボヌクレオチドを用いることはリボヌクレオチドの使用として有効であるが、デオキシリボヌクレオチドはしばしば合成費用が安く、よりヌクレアーゼ耐性である可能性が最も高い。
本発明の企図される組み換え型発現ベクターは、両方の鎖の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にするような様式でＮＯＶＸ配列に作動可能に連結された近接調節配列を含む発現ベクター中に組み込まれたＮＯＶＸ ＤＮＡ分子を含む。ＮＯＶＸ ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子は第１のプロモーター（例えば、クローン化ＤＮＡの３’プロモーター配列）により転写され、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡに対してセンス鎖であるＲＮＡ分子が第２のプロモーター（クローン化ＤＮＡの５’プロモーター配列）により転写される。センスおよびアンチセンス鎖はインビボでハイブリダイゼーションして、ＮＯＶＸ遺伝子のサイレント化のためのｓｉＲＮＡ構築物を生じる。別法として、２つの構築物を用いて、ｓｉＲＮＡ構築物のセンスおよびアンチセンス鎖を作成することもできる。結局、クローン化ＤＮＡは第２の構造を有する構築物をコードするものであり得、単一の転写物は、標的遺伝子（複数も可）由来のセンスおよび相補的アンチセンス配列を有するものである。この実施形態の一例において、ヘアピンＲＮＡｉ産物は標的遺伝子のすべてまたは一部に対して相同的である。もう１つの例において、ヘアピンＲＮＡｉ産物はｓｉＲＮＡである。ＮＯＶＸ配列に近接した調節配列は、それらの発現が独立してモジュレーションされ、あるいは時間的または位置的にモジュレーションされうるならば、同一であってもよく、異なっていてもよい。
特別な実施形態において、例えば、より小型の核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６またはヒトＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡ Ｈ１に由来するＲＮＡｐｏｌ ＩＩＩ転写ユニットを含むベクター中にＮＯＶＸ遺伝子鋳型を組み込むことにより、ｓｉＲＮＡは細胞内で転写される。ベクター系の１例はGeneSuppressorTM RNA Interference kit （Imgenexから市販されている）である。Ｕ６およびＨ１プロモーターはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターのタイプＩＩＩクラスのメンバーである。Ｕ６様プロモーターの＋１ヌクレオチドは常にグアノシンであるが、Ｈ１プロモーターの＋１はアデノシンである。これらのプロモーターのターミネーションシグナルは５個の連続したチミジンにより定義される。典型的には、転写物を２つ目のウリジンの後ろで開裂させる。この位置での開裂は、発現されたｓｉＲＮＡ中に３’ＵＵオーバーハングを生じさせ、それは合成ｓｉＲＮＡの３’オーバーハングと類似である。長さ４００ヌクレオチド未満の配列をこれらのプロモーターにより転写させることができ、それゆえ、それらは約２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡを例えば約５０ヌクレオチドのＲＮＡステムループ転写物中に発現させることに理想的に適したものである。
長時間の発現ノックダウンが必要な場合に、ｓｉＲＮＡベクターは合成ｓｉＲＮＡよりも有利であると考えられる。ｓｉＲＮＡ発現ベクターでトランスフェクションされた細胞は安定で、長時間のｍＲＮＡ阻害をこうむるであろう。対照的に、外来性合成ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞は、典型的には７日以内あるいは１０ラウンドの細胞分裂の間にｍＲＮＡサプレッションから回復する。ｓｉＲＮＡ発現ベクターの長時間の遺伝子サイレント化能は遺伝子治療への適用を可能にしうる。
一般的には、ｓｉＲＮＡは、ＤＩＣＥＲと呼ばれるＡＴＰ依存性リボヌクレアーゼにより、より長いｄｓＲＮＡから切断される。ＤＩＣＥＲは２本鎖ＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼのＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのメンバーである。ｓｉＲＮＡは細胞蛋白とともに集合してエンドヌクレアーゼ複合体となる。ショウジョウバエにおけるインビトロでの研究は、ｓｉＲＮＡ／蛋白複合体（ｓｉＲＮＰ）がその後ＤＩＥＣＲとは異なるエンドリボヌクレアーゼを含むＲＮＡ誘導サイレンス化複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる第２の酵素複合体に転移されることを示唆している。ＲＩＳＣはｓｉＲＮＡ鎖によりコードされる配列を用いて相補的配列のｍＲＮＡを見つけて破壊する。かくしてｓｉＲＮＡはガイドとして作用し、２本のｓｉＲＮＡ鎖の一方に相補的なｍＲＮＡのみを開裂するようにリボヌクレアーゼを制限する。
ｓｉＲＮＡにより標的化されるべきＮＯＶＸ ｍＲＮＡ領域は、一般的には、スタートコドンの５０ないし１００ヌクレオチド下流から開始する所望ＮＯＶＸ配列から選択される。別法として、５’または３’ＵＴＲおよびスタートコドン付近の領域を用いることができるが、一般的には避けられる。なぜならこれらは調節蛋白結合部位において豊富だからである。ＵＴＲ結合蛋白および／または翻訳開始複合体はｓｉＲＮＰまたはＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害しうる。選択されたｓｉＲＮＡ配列に関する最初のＢＬＡＳＴ相同性サーチを利用可能なヌクレオチド配列ライブラリーに対して行って、ただ１つの遺伝子が標的化されることを確実にする。ｓｉＲＮＡ２本鎖による標的認識特異性は、ｓｉＲＮＡの対合領域に存在する単一の点突然変異が標的ｍＲＮＡの分解を妨げるに十分であることを示す。Elbashir et al. 2001 EMBO J. 20(23):6877-88参照。それゆえ、所望遺伝子を標的化する場合、ＳＮＰ、多型、対立遺伝子変種または種特異的変化をうまく考慮すべきである。
１の実施形態において、完全なＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ実験は正しい負の対照を用いるものである。一般的には、負の対照ｓｉＲＮＡはＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を有するが、ゲノムに対して有意な配列相同性を欠いている。典型的には、ＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列をスクランブルし、相同性検索を行って、それが他のいすれの遺伝子とも相同性を欠いていることを確認する。
２つの独立したＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ２本鎖を用いて標的ＮＯＶＸ遺伝子をノックダウンすることができる。このことはサイレント化効果の特異性を制御することを助ける。さらに、等しい濃度の異なるＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ２本鎖、例えば、ＮＯＶＸ遺伝子またはポリペプチドのレギュレーターに関するＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを用いることにより、２つの独立した遺伝子の発現を同時にノックダウンすることができる。ｓｉＲＮＡ結合蛋白の利用可能性は標的ｍＲＮＡアクセス可能性よりも限定的であると考えられる。
典型的には、標的化されたＮＯＶＸ領域は、１９個（Ｎ１９）の残基のスペーサー領域により分けられた２個のアデニン（ＡＡ）および２個のチミジン（ＴＴ）である（例えば、ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴ）。望ましいスペーサー領域は約３０〜７０％、より好ましくは約５０％のＧ／Ｃ−含量を有する。配列ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴが標的配列中に存在しない場合、別の標的領域はＡＡ（Ｎ２１）であろう。ＮＯＶＸセンスｓｉＲＮＡの配列は（Ｎ１９）ＴＴまたはＮ２１にそれぞれ対応する。後者の場合、かかる配列が本質的にＮＯＶＸポリヌクレオチド中に存在しないならば、センスｓｉＲＮＡの３’末端のＴＴへの変換を行うことができる。この配列変換の論理的解釈は、センスおよびアンチセンス３’オーバーハングの配列組成に関して対称な２本鎖を生じさせることである。対称な３’オーバーハングは、センスおよびアンチセンス標的ＲＮＡ−開裂ｓｉＲＮＰの適切な等しい割合でｓｉＲＮＰが形成されることを確実ならしめることを助けることができる。例えば、Elbashir, Lendeckel and Tuschl (2001). Genes & Dev. 15: 188-200参照（参照により本明細書に一体化させる）。ｓｉＲＮＡ２本鎖のセンス配列のオーバーハングの修飾が標的化されたｍＲＮＡの認識に影響するとは考えられない。なぜならアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖は標的認識をガイドするからである。
別法として、ＮＯＶＸ標的ｍＲＮＡが適当なＡＡ（Ｎ２１）配列を含まない場合、配列ＮＡ（Ｎ２１）をサーチしてもよい。さらに、センス鎖およびアンチセンス鎖の配列を５’（Ｎ１９）ＴＴとして合成してもよい。なぜならアンチセンスｓｉＲＮＡの３’側の大部分のヌクレオチドの配列は特異性に貢献しないからである。アンチセンスまたはリボザイム法とは違って、標的ｍＲＮＡの２次構造はサイレンス化に強く影響するとは考えられない。Harborth, et al. (2001) J. Cell Science 114: 4557-4565参照（参照により本明細書に一体化させる）。
標準的な核酸トランスフェクション法、例えば、OLIGOFECTAMINE Reagent（Invitrogenから市販されている）を用いてＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ２本鎖のトランスフェクションを行うことができる。一般的には、ＮＯＶＸ遺伝子サイレンシングに関するアッセイをトランスフェクションから約２日後に行う。トランスフェクション試薬の不存在下においてはＮＯＶＸ遺伝子サイレント化は観察されず、野生型およびサイレント化ＮＯＶＸ表現型の比較分析が可能であった。特別な実施形態において、２４ウェルプレートの１つのウェルには通常約０．８４μｇのｓｉＲＮＡ２本鎖で十分である。典型的には、細胞を前日に撒き、約５０％集密になったところでトランスフェクションする。細胞培地および培養条件の選択は等業者が通常行うことであり、細胞タイプの選択により変更されるであろう。トランスフェクションの効率は細胞タイプのみならず細胞の継代数および集密度に依存する。ｓｉＲＮＡ−リポソーム複合体の形成時間および方法（例えば、倒置かボルテックスか）も重要である。低いトランスフェクション効率はＮＯＶＸサイレント化の不成功の最大の原因である。使用する新たな細胞系に関してトランスフェクション効率を注意深く調べることが必要である。好ましい細胞は哺乳動物由来であり、より好ましくはラットまたはマウスのごときげっ歯類由来であり、最も好ましくはヒト由来である。治療的処置に使用する場合、好ましくは細胞は自己由来のものであるが、非−自己由来の細胞ソースも本発明の範囲内とされる。
対照実験に関し、０．８４μｇの１本鎖センスＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションはＮＯＶＸサイレント化に影響せず、０．８４μｇのアンチセンス ｓｉＲＮＡは、０．８４μｇの２本鎖ｓｉＲＮＡと比較すると弱いサイレント化効果を有する。対照実験はさらに野生型およびサイレント化ＮＯＶＸ表現型の比較分析を可能にする。トランスフェクション効率を制御するために、典型的には通常蛋白の標的化を行う。例えば、ラミンＡ／Ｃの標的化あるいはＣＭＶにより駆動されるＥＧＦＰ発現プラスミド（例えば、Clontechから市販されている）のトランスフェクションを行う。上例において、イムノフルオレッセンス、ウェスタンブロット、ノーザンブロットあるいは蛋白発現または遺伝子発現に関する他の類似のアッセイのごとき方法により、細胞中のラミンＡ／Ｃノックダウンのフラグメントを翌日に行う。ラミンＡ／Ｃモノクローナル抗体をSanta Cruz Biotechnologyから得た。
細胞中の標的化ＮＯＶＸポリヌクレオチドの豊富さおよび半減期（またはターンオーバー）にもよるが、１〜３日後あるいはその後にノックダウン表現型が明らかにされうる。ＮＯＶＸノックダウン表現型が観察されない場合には、トランスフェクションされたｓｉＲＮＡ２本鎖により標的ｍＲＮＡ（ＮＯＶＸまたはＮＯＶＸ上流または下流遺伝子）が効果的に破壊されたかどうかを分析することが望ましいかもしれない。トランスフェクションから２日後、全ＲＮＡを調製し、標的特異的プライマーを用いて逆転写し、少なくとも１つのエキソン−エキソンジャンクションを変換するプライマーペアーを用いてＰＣＲ増幅を行ってプレ−ｍＲＮＡの増幅を制御する。非標的化ｍＲＮＡのＲＴ／ＰＣＲも対照として必要である。ｍＲＮＡの効果的な枯渇であるが検出できない標的蛋白の減少は、安定なＮＯＶＸ蛋白の大きなリザーバーが細胞中に存在することを示しうる。標的蛋白が最終的に枯渇して表現型が明らかにされうるに至るには、十分に長いインターバルでの複数回のトランスフェクションが必要であるかもしれない。複数回のトランスフェクション工程が必要な場合、トランスフェクションから２〜３日後に細胞を分ける。分けた直後に細胞をトランスフェクションしてもよい。
本発明の治療方法は、増加あるいは逸脱したＮＯＶＸ発現または活性を補正するための治療としてＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ構築物を投与することを企図する。上記のごとく、ＮＯＶＸリボポリヌクレオチドを得て、ｓｉＲＮＡフラグメントにプロセッシングするか、あるいはＮＩＶＸ ｓｉＲＮＡを合成する。上記のごとく、既知の核酸トランスフェクション法を用いてＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡを細胞または組織に投与する。ＮＯＶＸ遺伝子に特異的なＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡはＮＯＶＸ転写産物を減少またはノックダウンし、そのことはＮＯＶＸポリペプチド生成を減少させ、細胞または組織中のＮＯＶＸポリペプチド活性を低下させる。
また本発明は、個体におけるＮＯＶＸ蛋白の存在に関連する疾病または症状の治療方法を包含し、該方法は、分解されるべき蛋白のｍＲＮＡ（該蛋白をコードするｍＲＮＡ）を標的化するＲＮＡｉ構築物を個体に投与することを特徴とする。特別なＲＮＡｉ構築物はｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡにプロセッシングされる２本鎖遺伝子転写物を含む。治療により、標的蛋白が産生されなくなるか、あるいは治療を行わない場合よりも産生の程度が低下する。
ＮＯＶＸ遺伝子機能が既知表現型と相関関係を有しない場合、健康個体由来の細胞または組織の対照試料により、ＮＯＶＸ発現レベルを決定するためのリファレンス標準が提供される。説明したアッセイ、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等を用いて発現レベルを検出する。疾病状態にある哺乳動物、好ましくはヒト対象から細胞または組織の試料を採取する。細胞または組織中への核酸のトランスフェクションに関して説明した方法によりＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡを細胞または組織に投与することによってこれらの細胞または組織を処理し、説明したアッセイを用いて対象試料中のＮＯＶＸポリペプチドまたはポリヌクレオチド発現の変化を観察し、対照試料のものと比較する。このＮＯＶＸ遺伝子ノックダウン法は、治療対象試料中のＮＯＶＸマイナス（ＮＯＶＸ−）表現型を決定するための迅速法を提供する。かくして、治療対象試料中において観察されたＮＯＶＸ−表現型は、治療中の疾病状態の経過観察のためのマーカーとして役立つ。
特別な実施形態において、ＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡを治療に用いる。ＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡの生成および使用方法は等業者に知られている。方法の例を以下に示す。
ＲＮＡの生成
ＲＮＡ発現ベクターにおける転写のごとき既知方法を用いてＮＯＶＸのセンスＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）およびアンチセンス（ａｓＲＮＡ）を得る。最初の実験において、センスおよびアンチセンスＲＮＡはそれぞれ約５００塩基の長さである。得られたｓｓＲＮＡおよびａｓＲＮＡ（０．５μＭ）を２０ｍＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で９５℃にて１分間加熱し、次いで、冷却し、室温で１２ないし１６時間アニーリングさせる。ＲＮＡを沈殿させ、溶解バッファー（下記）中に再懸濁させる。アニーリングをモニターするために、ＴＢＥバッファー中の２％アガロースゲル中でＲＮＡを電気泳動させ、臭化エチジウムで染色する。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.(1989)参照。
溶解物の調製
製造者（Ambion）の指示に従って未処理ウサギ網状赤血球溶解物を集める。ｄｓＲＮＡを溶解物中３０℃で１０分間インキュベーションし、次いで、ｍＲＮＡを添加する。その後、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡを添加し、さらに６０分インキュベーションを続ける。２本鎖ＲＮＡとｍＲＮＡとのモル比は約２００：１である。ＮＯＶＸ ｍＲＮＡを放射性標識し（既知方法を用いて）、その安定性をゲル電気泳動によりモニターする。
同じ条件で平行して行う実験において、３２Ｐ−ＡＴＰを用いて２本鎖ＲＮＡを内部で放射性標識する。２ＸプロテイナーゼＫバッファーにより反応を停止させ、すでに記載されているようにして（Tuschl et al., Genes Dev., 13: 3191-3197）脱蛋白する。適当なＲＮＡ標準を用いて１５％または１８％ポリアクリルアミド配列決定用ゲル中での電気泳動により生成物を分析する。ゲルを放射活性についてモニターすることにより、２本鎖ＲＮＡからの１０ないし２５ヌクレオチドのＲＮＡの自然な生成を調べることができる。
約２１〜２３ｂｐの２本鎖ＲＮＡのバンドを溶出する。これらの２１〜２３量体ＮＯＶＸ転写抑制の有効性を、各アッセイにつき５０ナノモラーの２本鎖２１〜２３量体を用いて上記と同じウサギ網状赤血球を用いてインビトロにてアッセイする。次いで、これらの２１〜２３量体の配列を標準的な核酸配列決定法を用いて決定する。
ＲＮＡの調製
上で決定された配列に基づいて、Expedite RNA phosphoramidites および thymidine phosphoramidite（Proligo, Germany）２１を用いてヌクレオチドのＲＮＡを化学合成する。合成オリゴヌクレオチドを脱保護し、ゲル精製（Elbashir, Lendeckel, & Tuschl, Genes & Dev. 15, 188-200 (2001)）し、次いで、Sep-Pak C18 cartridge（Waters, Milford, Mass., USA）で精製（Tuschl, et al., Biochemistry, 32:11658-11668 (1993)）する。
これらのＲＮＡ（２０μＭ）１本鎖をアニーリングバッファー中、９０℃で１分間インキュベーションし、次いで、３７℃で１時間インキュベーションする。
細胞培養
ＮＯＶＸを規則的に発現させるための当該分野において知られた細胞培養を、標準的条件を用いて行う。トランスフェクションの２４時間前に、約８０％集密において、細胞をトリプシン処理し、抗生物質不含の新鮮培地で１：５に希釈（１〜３ｘ１０５個／ｍｌ）し、２４ウェルプレートに移す（５００ｍｌ／ウェル）。市販リポフェクションキットを用いてトランスフェクションを行い、陽性および陰性対照を付して標準的方法を用いてＮＯＶＸ発現をモニターする。陽性対照は本来的にＮＯＶＸを発現する細胞であり、陰性対照はＮＯＶＸを発現しない細胞である。オーバーハング３’を有する塩基対合した２１および２２ヌクレオチドのｓｉＲＮＡは、溶解物および細胞培養において、効果的な配列特異的ｍＲＮＡ分解を媒介する。異なる濃度のｓｉＲＮＡを用いる。哺乳動物細胞培養の場合のインビトロでのサプレッションに効果的な濃度は２５ｎＭないし１００ｎＭの最終濃度である。このことは、慣用的なアンチセンスまたはリボザイム遺伝子標的化実験に用いる濃度よりも数オーダー低い濃度のｓｉＲＮＡが有効であることを示す。
上記方法は、ＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ配列の推論およびかかるｓｉＲＮＡのイオンビトロサプレッションへの使用の両方のための方法を提供する。よく知られたインビボトランスフェクションまたは遺伝子治療トランスフェクション法を用い、同じｓｉＲＮＡを用いてインビボサプレッションを行ってもよい。
アンチセンス核酸
本発明のもう一つの態様は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、相同体または誘導体、とハイブリダイズ可能なまたは相補的な単離アンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的な(例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード化鎖に相補的な、またはｍＲＮＡ配列に相補的な)ヌクレオチド配列を含む。特別な態様では、少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０、または５００のヌクレオチドまたは全ＮＯＶＸコード化鎖に相補的な配列、またはそれらの一部のみにを含むアンチセンス核酸分子を提供する。配列番号２ｎ（ｎは１〜６６の整数である）のあるＮＯＶＸタンパク質のフラグメント、相同体、誘導体および類似体をコードする核酸分子、または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）のあるＮＯＶＸ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸を加えて提供する。
一つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、あるＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード化鎖の「コード化領域」に対するアンチセンスである。用語「コード化領域」は、アミノ酸残基に翻訳するコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す。もう一つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード化鎖の「非コード化領域」に対するアンチセンスである。用語「非コード化領域」は、アミノ酸に翻訳しないコード化領域に隣接する５'配列および３'配列を指す(即ち、５'非翻訳領域および３'非翻訳領域とも呼ぶ)。
本明細書に開示するＮＯＶＸタンパク質をコードするコード化鎖の配列を与えると、本発明のアンチセンス核酸をWatsonとCrickまたはHoogsteenの塩基対の規則にしたがってデザインし得る。アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの全コード化領域と相補的であり得るが、さらに好ましくは、ＮＯＶＸのｍＲＮＡのコード化または非コード化領域の一部のみに対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さ約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸を、当該分野において公知の手順を用いる化学合成または酵素ライゲーション反応を用いて構築し得る。例えば、アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加またはアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成する二本鎖の物理的安定性を増加するようデザインした様々に修飾したヌクレオチドを用いて、化学合成し得る(例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジンで置換したヌクレオチドを使用しうる)。
アンチセンス核酸を作成に使用し得る修飾ヌクレオチドの例として以下のものを挙げる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２,２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、５−メトキシウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、５−メチル−２−チオウラシル、３−(３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル)ウラシル、(ａｃｐ３)ｗ、および２、６−ジアミノプリン。これに代えて、アンチセンス核酸を、核酸がアンチセンスの配向(即ち、挿入した核酸から転写したＲＮＡが、興味ある標的核酸に対するアンチセンスの配向であり、以下の小節でさらに説明する)においてサブクローニングする発現ベクターを使用して生物学的に生産し得る。
本発明のアンチセンス核酸分子を、それらがあるＮＯＶＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズまたは結合し、それにより(例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより)タンパク質発現を阻害するように典型的に対象に投与するか、または組織で作成する。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成する従来のヌクレオチドの相補性によるものでもあり得る。または、例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸の場合には、二本鎖の大溝での特異的相互作用を介するものであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例として、組織部位への直接の注射を挙げる。これに代えて、アンチセンス核酸分子を、選択した細胞標的へ修飾しそこで全身性に投与し得る。例えば、全身性投与のために、アンチセンス分子を、選択した細胞表面上に発現する受容体または抗原に特異的に結合するように(例えば、ペプチドにアンチセンス核酸分子を連結させることまたは細胞表面受容体または抗原に結合する抗体により)修飾し得る。アンチセンス核酸分子をまた、本明細書に説明するベクターを用いて細胞に送達し得る。十分な核酸分子を送達するために、アンチセンス核酸分子を強力なｐｏｌＩＩプロモーターまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの調節下に置くベクター構造が好ましい。
なおもう一つの実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、これは通常のβユニットとは反対で鎖が互いに並行に走行する。例えば、Gaultier, et al., 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641を参照されたい。アンチセンス核酸分子はまた、２'−ｏ−メチルリボヌクレオチド(例えば、Inoue, et al. 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148を参照)またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体(例えば、Inoue, et al., 1987. FEBS Lett. 215: 327-330を参照)を含み得る。
リボザイムおよびＰＮＡ部分
核酸の修飾は、非限定的な例として、修飾した塩基、および糖リン酸主鎖を修飾または誘導した核酸を挙げる。これらの修飾を少なくとも部分的に行い、例えば対象への治療応用において核酸へ結合するアンチセンスとして使用し得るように修飾した核酸の化学的安定性を増強する。
１の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらが相補的領域を有するｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断する能力のあるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒活性ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム(例えば、Haselhoff and Gerlach 1988. Nature 334: 585-591に記載されているようなハンマーヘッドリボザイム)を使用して、ＮＯＶＸのｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによりＮＯＶＸのｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＮＯＶＸをコードする核酸に対する特異性を有するリボゾームは、本明細書に開示するあるＮＯＶＸｃＤＮＡのヌクレオチド配列(即ち、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６６の整数である）)に基づいてデザインし得る。例えば、その中で活性部位のヌクレオチド配列がＮＯＶＸをコードするｍＲＮＡ中で切断し得るヌクレオチド配列に相補的であるTetrahymenaＬ−１９ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築し得る。例えば、Cech, et al.の米国特許第４,９８７,０７１号およびCech, et al.の米国特許第５,１１６,７４２号を参照されたい。ＮＯＶＸ ｍＲＮＡをまた、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択するのに使用し得る。例えば、Bartel et al., (1993) Science 261:1411-1418を参照されたい。
一方、ＮＯＶＸ遺伝子発現は、ＮＯＶＸ核酸の調節領域(例えば、ＮＯＶＸプロモーターおよび／またはエンハンサー)に相補的なヌクレオチド配列を標的とすることで阻害し、標的細胞中のＮＯＶＸ遺伝子の転写を阻止するトリプルヘリカル構造を形成し得る。例えば、Helene, 1991. Anticancer Drug Des. 6: 569-84; Helene, et al. 1992. Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27-36; Maher, 1992. Bioassays 14: 807-15を参照されたい。
種々の実施形態において、ＮＯＶＸ核酸を塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格部分において修飾し、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解度を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸を生成し得る。例えば、Hyrup, et al., 1996. Bioorg Med Chem 4: 5-23を参照されたい。本明細書において使用する用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格を擬似ペプチド骨格で置換し、４個の核酸塩基のみを保持する核酸模倣体(例えばＤＮＡ模倣体)を指す。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることを示す。ＰＮＡオリゴマーの合成を、Hyrup, et al., 1996. supra; Perry-O'Keefe, et al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-14675に記載されているように、標準固相ペプチド合成プロトコールを用いて実施し得る。
ＮＯＶＸのＰＮＡを治療的応用および診断的応用に使用し得る。例えば、ＰＮＡを、例えば転写または翻訳停止を誘導することまたは複製を阻害することにより、遺伝子発現の配列特異的調整のためのアンチセンスまたは抗原薬剤として使用し得る。ＮＯＶＸのＰＮＡはまた、例えば、遺伝子中の単塩基対変異の分析(例えば、ＰＣＲ固定を指示するＰＮＡ；他の酵素、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、との組合せで使用し得る人工的制限酵素として(Hyrup, et al., 1996.supraを参照)；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマーとして(Hyrup, et al., 1996, supra; Perry-O'Keefe, et al., 1996. supraを参照))にも使用し得る。
もう一つの実施形態では、ＮＯＶＸのＰＮＡを修飾して、例えば、ＰＮＡに親油性なまたは他の補助的な基をＰＮＡに結合することにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの生成により、またはリポソームまたは当該分野において公知の他の薬剤送達技術の使用によりそれらの安定性または細胞への取り込みを増強し得る。例えば、ＰＮＡとＤＮＡの有益な性質を結合し得るＮＯＶＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成し得る。かかるキメラは、ＤＮＡ認識酵素(例えば、ＲＮａｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ)がＤＮＡ部分と相互作用し、一方でＰＮＡ部分が結合高親和性および結合高特異性を提供することを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基結合、ヌクレオチド塩基間の結合数および配向について選択した適当な長さのリンカーを使用して結合し得る(Hyrup, et al., 1996. supraを参照)。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成を、Hyrup, et al., 1996. supra および Finn, et al., 1996. Nucl Acids Res 24: 3357-3363に記載のように実施し得る。例えば、ＤＮＡ鎖を、標準ホスホラミダイトカップリング化学反応を使用して固相支持体上で合成し得る。そして修飾したヌクレオシド類似体、例えば、5'-(4-メトキシトリチル)アミノ-5'-デオキシチミジンホスホラミダイトをＰＮＡとＤＮＡの５'末端間で使用し得る。例えば、Mag, et al., 1989. Nucl Acid Res 17: 5973-5988を参照されたい。次いで、ＰＮＡモノマーを段階的にカップリングし、５'ＰＮＡセグメントおよび３'ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する。例えば、Finn, et al., 1996. supraを参照されたい。これに代えて、キメラ分子を５'ＤＮＡセグメントおよび３'ＰＮＡセグメントで合成することもできる。例えば、Petersen, et al., 1975. Bioorg. Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124を参照されたい。
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような添付群(例えば、インビボにおいて宿主細胞レセプターを標的とするため)、または細胞膜(例えば、Letsinger, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556; Lemaitre, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652; ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照)または血液脳関門(例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照)を横切る輸送を促進する薬剤を含み得る。加えて、オリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤(例えば、Krol, et al., 1988. BioTechniques 6:958-976を参照)または挿入剤(例えば、Zon, 1988. Pharm. Res. 5: 539-549を参照)で修飾し得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドを、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤等と複合し得る。
ＮＯＶＸポリペプチド
本発明に従うポリペプチドは、配列が配列番号２ｎ（ｎは１〜６６の整数である）において提供するＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含む。本発明はまた、その任意の残基が、配列番号２ｎ（ｎは１〜６６の整数である）に示す対応する残基から変換し得る一方で、そのＮＯＶＸ活性および生理機能を保持するタンパク質、またはそれらの機能的フラグメントを依然コードする変異タンパク質または変種タンパク質を含む。
一般に、ＮＯＶＸ様機能を保持するあるＮＯＶＸ変異体は、配列中の特定部位の残基を他のアミノ酸で置換する任意の変異体を含み、親タンパク質の２個の残基間にもう一残基または複数残基を挿入する可能性ならびに親配列から１個またはそれ以上の残基を欠失する可能性をさらに含む。任意のアミノ酸の置換、挿入または欠失を本発明に包含する。好ましい状況では、置換は上で定義した保存的置換である。
本発明の一つの態様は、単離ＮＯＶＸタンパク質およびそれらの生物活性部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、類似体、または相同体に関する。また、抗ＮＯＶＸ抗体産生用の免疫源としての使用に適当なポリペプチドフラグメントも提供し得る。一つの実施形態では、細胞または組織供給源から標準タンパク質精製技術を使用する適当な精製スキームにより天然のＮＯＶＸタンパク質を単離し得る。もう一つの実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質を、組換えＤＮＡ技術により生産する。組換え発現に代えて、あるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドを、標準ペプチド合成技術を使用して化学的に合成し得る。
「単離」または「精製」ポリペプチドまたはタンパク質またはそれらの生物活性部分は、ＮＯＶＸタンパク質の由来する細胞供給源または組織供給源の細胞性物質または他の混入タンパク質を実質的に含まず、または化学的に合成したと際化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞性物質が実質的に含まれていない」という用語は、タンパク質を単離または組換え的に生産した元の細胞の細胞成分からタンパク質を分離したＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。一つの実施形態では、「細胞原料が実質的に含まれていない」という用語は、約３０％(乾燥重量比)未満の非ＮＯＶＸタンパク質(ここでは「混入タンパク質」とも言う)、さらに好ましくは約２０％未満の非ＮＯＶＸタンパク質、なおさらに好ましくは約１０％未満の非ＮＯＶＸタンパク質、そして最も好ましくは約５％未満の非ＮＯＶＸタンパク質を有するＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。ＮＯＶＸタンパク質またはそれらの生物活性部分を組換え的に生産する際には、それはまた、好ましくは培地を実質的に含まず、即ち、培地はＮＯＶＸタンパク質標本の容積の約２０％未満、さらに好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは５％未満を表す。
「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、ＮＯＶＸタンパク質の標本を含み、ここでタンパク質を、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離する。一つの実施形態では、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、約３０％未満(乾燥重量比)の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、さらに好ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、なおさらに好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、および最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を有するＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。
ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＮＯＶＸタンパク質より少ないアミノ酸を含有しＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの活性を示すＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列(例えば、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜６６の整数である)に十分相同なアミノ酸配列またはＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列)に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。典型的に、生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。あるＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば１０、２５、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸残基の長さのポリペプチドであり得る。
さらに、タンパク質の他の領域が欠失した他の生物学的に活性な部分を、組換え技術で調製しそして天然のＮＯＶＸタンパク質の機能活性の一つまたはそれ以上について評価し得る。
一つの実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜６６の整数である)に示すアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜６６の整数である)に実質的に相同であり、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜６６の整数である)のタンパク質の機能活性を保持するが、なお以下に詳述するように天然の対立遺伝子の変異体または変異に因りアミノ酸配列を異にする。従って、もう一つの実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜６６の整数である)のアミノ酸配列と少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含み、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜６６の整数である)のＮＯＶＸタンパク質の機能活性を保持するタンパク質である。
２個またはそれ以上の配列間の相同性の測定
２個のアミノ酸配列または２個の核酸の相同性の割合を測定するために、配列を至適な比較目的でアラインメント(例えば、ギャップを、２番目のアミノ酸または核酸配列と至適なアラインメントになるように第１のアミノ酸配列または核酸配列の中に入れ得る)。対応するアミノ酸部位または核酸部位におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを次いで比較する。第１の配列の部位を、第２の配列の対応する部位と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占めると、両分子はその部位において相同である(即ち、本明細書において使用するように、アミノ酸または核酸の「相同性」はアミノ酸または核酸の「同一性」と同等である)。
核酸配列の相同性を、２個の配列間の同一性の程度として測定し得る。相同性は、ＧＣＧプログラムパッケージに提供されるＧＡＰソフトウエアのような、当該分野において公知のコンピュータープログラムを使用して測定し得る。Needleman and Wunsch, 1970. J Mol Biol 48: 443-453を参照されたい。以下のセッティング：ＧＡＰ生成ペナルティー５．０またはＧＡＰ伸長ペナルティー０．３で、ＧＣＧ ＧＡＰソフトウエアを使用して、上述の類似核酸配列のコード化領域は、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜６６の整数である)に示すＤＮＡ配列のＣＤＳ(コード化)部分と好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性の程度を示す。
用語「配列同一性」は、２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列が比較の特定領域に亘って残基毎に同一である程度を指す。用語「配列同一性の百分率」を、比較の領域に亘って至適にアラインメントした２個の配列を比較し、一致部位の数を求め同一の核酸塩基(例えば、核酸の場合には、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列中に存在する部位数を測定して、一致部位の数を比較領域の部位の総数(即ち、ウインドウサイズ)で除し、商を１００倍して、配列同一性の百分率を得ることにより計算しうる。本明細書において使用する用語「実質的同一性」は、ポリヌクレオチド配列の特性を意味する。ここでポリヌクレオチドは、比較領域に亘って標準配列と比較して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、およびしばしば９０〜９５％の配列同一性、さらに通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
キメラタンパク質または融合タンパク質
本発明はまた、ＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書において使用するように、あるＮＯＶＸ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＮＯＶＸポリペプチドに作動し得るように連結したあるＮＯＶＸポリペプチドを含む。「ＮＯＶＸポリペプチド」は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜６６の整数である)のあるＮＯＶＸタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す一方で、「非ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質と実質的に相同でないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えば、ＮＯＶＸタンパク質と異なり同一または異なる生物由来であるタンパク質を指す。あるＮＯＶＸ融合タンパク質内では、ＮＯＶＸポリペプチドはあるＮＯＶＸタンパク質の全部または一部に対応し得る。一つの実施形態では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質はあるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの生物学的に活性な部分を含む。もう一つの実施形態では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質は、あるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも二つの生物学的に活性な部分を含む。なおもう一つの実施形態では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質は、あるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも三つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質内では、用語「作動し得るように連結した」は、ＮＯＶＸポリペプチドおよび非ＮＯＶＸポリペプチドがお互いにインフレームで融合していることを示すものとする。非ＮＯＶＸポリペプチドを、ＮＯＶＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合し得る。
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質である。ここでＮＯＶＸ配列がＧＳＴ(グルタチオンＳ転移酵素)のＣ末端に融合する。そのような融合タンパク質は、組換えＮＯＶＸポリペプチドの精製を容易にし得る。
もう一つの実施形態では、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種のシグナル配列を含有するあるＮＯＶＸタンパク質である。特定の宿主細胞(例えば、哺乳動物の宿主細胞)において、ＮＯＶＸの発現および／または分泌を異種シグナル配列の使用を介して増強し得る。
なおもう一つの実施形態では、融合タンパク質は、ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質である。ここでＮＯＶＸ配列は、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバー由来の配列と融合している。本発明のＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を、医薬組成物中に組み入れ、対象に投与し、細胞上でのＮＯＶＸリガンドとあるＮＯＶＸタンパク質との相互作用を阻害し、それによりインビボでのＮＯＶＸ仲介性の情報伝達を抑制し得る。ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を使用して、あるＮＯＶＸと同種のリガンドの生物学的利用性に影響を及ぼし得る。ＮＯＶＸリガンド／ＮＯＶＸ相互作用の阻害は、増殖および分化障害の処置ならびに細胞生存を調整(例えば増強または阻害)のために治療上有用であり得る。さらに、本発明のＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を使用して、対象中で抗ＮＯＶＸ抗体を生産し、ＮＯＶＸリガンドを精製し、そしてスクリーニングアッセイにおいて、ＮＯＶＸのあるＮＯＶＸリガンドとの相互作用を阻害する分子を同定し得る。
本発明のＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を、標準組換えＤＮＡ技術により生産し得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、例えば、連結のための平滑末端化または互い違い末端を用いること、適切な末端を提供するための制限酵素による切断、適切に粘着末端の充填、望ましくない結合を防止するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的結合などの従来の方法にしたがってインフレームで一緒に連結する。もう一つの実施形態では、融合遺伝子を、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術により合成し得る。これに代えて、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２個の連続する遺伝子フラグメント間で相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて行い、それらを引き続いてアニールし、再増幅して、キメラ遺伝子配列を生成し得る(例えば、Ausubel, et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992を参照)。さらに、融合部分を既にコードする多くの発現ベクター(例えば、ＧＳＴポリペプチド)が市販されている。ＮＯＶＸをコードする核酸を、融合部分がＮＯＶＸタンパク質にインフレームで結合するように、そのような発現ベクターの中にクローン化することができる。
ＮＯＶＸアゴニストおよびアンタゴニスト
本発明はまた、ＮＯＶＸアゴニスト(即ち、ミメティクス)またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の変異体を含む。ＮＯＶＸタンパク質の変異体は、突然変異(例えば、ＮＯＶＸタンパク質の点突然変異または切断)により生成し得る。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質と実質的に同一な生物学的諸活性またはそのサブセットを保持する。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質を含む、細胞の情報伝達カスケードの下流または上流メンバーに拮抗的に結合することにより、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質の一つまたはそれ以上の活性を阻害し得る。従って、特異的な生物学的作用を、限定された機能を有する変異体での処置により発揮することができる。一つの実施形態では、天然に存在する形のタンパク質の生物学的活性のサブセットを有する変異体による対象の処置は、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質による処置と比べて対象における副作用がより少ない。
ＮＯＶＸアゴニスト(即ちミメティック)またはＮＯＶＸアンタゴニストのどちらかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の変異体は、ＮＯＶＸタンパク質の突然変異体(例えば切断突然変異体)の組換えライブラリーをＮＯＶＸタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることにより同定し得る。一つの実施形態では、ＮＯＶＸ変異体の変化に富むライブラリーを、核酸レベルでの組換え（コンビナトリアル）変異誘発によって生成し、そして変化に富む遺伝子ライブラリーによりコードする。ＮＯＶＸ変異体の変化に富むライブラリーは、例えば、潜在的ＮＯＶＸ配列の縮重したセットが個別のポリペプチドとして発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することにより、またはこれに代えて、その中にＮＯＶＸ配列のセットを含有するさらに大きい融合タンパク質(例えば、ファージディスプレー用に)のセットとして、生成し得る。縮重したオリゴヌクレオチド配列から潜在的ＮＯＶＸ変異体のライブラリーを使用して生成し得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成機により行い、次いで、合成遺伝子を適切な発現ベクター内に連結し得る。遺伝子の縮重セットの使用は、潜在的ＮＯＶＸ配列の所望のセットをコードする配列の全ての、一つの混合物の提供を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当該分野内において周知である。例えば、Narang, 1983. Tetrahedron 39: 3; Itakura, et al., 1984. Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura, et al., 1984. Science 198: 1056; Ike, et al., 1983. Nucl. Acids Res. 11: 477を参照されたい。
ポリペプチドライブラリー
加えて、ＮＯＶＸタンパク質コード化配列のフラグメントライブラリーを用いて、ＮＯＶＸタンパク質の変異体のスクリーニングおよびそれに続く選択のためにＮＯＶＸフラグメントの変化に富む集団を生成し得る。一つの実施形態では、コード化配列フラグメントのライブラリーを、あるＮＯＶＸコード化配列の二本鎖ＰＣＲ断片を、ニッキングが分子あたりたった約１回生じる条件でヌクレアーゼ処置し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを異なるニッキング産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼの処理で再生成した二重らせんから単鎖部分を除去し、そして得られたフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することにより、生成し得る。この方法によって、ＮＯＶＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端または内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導し得る。
点突然変異または切断により作成した組換え（コンビナトリアル）ライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする、および選択した性質を有する遺伝子産物のためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする種々の技術は、当該分野において公知である。かかる技術は、ＮＯＶＸタンパク質の組換え（コンビナトリアル）突然変異誘発により生成した遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするハイスループット分析に適用可能な最も広く使用する技術は、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、そして、所望の活性の検出がその生産物を検出する遺伝子をコードするベクターの単離を容易する条件で、組換え（コンビナトリアル）遺伝子を発現することを典型的に含む。ライブラリー中の機能的変異の頻度を増大する新しい技術である繰り返しアンサンブル変異誘発(ＲＥＭ)をスクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、ＮＯＶＸ変異体を同定し得る。例えば、Arkin and Yourvan, 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave, et al., 1993. 蛋白 Engineering 6:327-331を参照されたい。
抗ＮＯＶＸ抗体
ＮＯＶＸタンパク質、またはＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに対する抗体は本発明に含まれる。本明細書において使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン(Ｉｇ)分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原に特異的に結合する(と免疫学的に反応する)抗原結合部位を含有する分子を指す。かかる抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ' およびＦ(ａｂ')2フラグメントならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げるが、これらに限定しない。一般に、ヒトから得る抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのクラスのいずれかに関し、これらは分子中に存在するＨ鎖の性質によりお互いに異なる。特定のクラスは、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2およびその他のような、サブクラスを同様に有する。さらに、ヒトにおいて、Ｌ鎖は、ｋ鎖またはλ鎖であり得る。本明細書における抗体への参照は、ヒト抗体種の全てのそのようなクラス、サブクラスおよびタイプへの参照を含む。
抗原として使用することを意図した本発明の単離タンパク質、またはその部分またはフラグメントを免疫源として使用しポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製の標準的技術を使用し、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成し得る。全長のタンパク質を使用し得るが、またはこれに代えて、本発明は、免疫源として使用するための抗原の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜６６の整数である)に示すアミノ酸配列のような全長タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも６個のアミノ酸残基を含み、そしてペプチドに対して育成した抗体が、エピトープを含有する全長タンパク質または任意のフラグメントと特異的な免疫複合体を形成するようそのエピトープを包含する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、または少なくとも１５個のアミノ酸残基、または少なくとも２０個のアミノ酸残基、または少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドにより包含する好ましいエピトープは、表面に局在するタンパク質領域であり；これらは通常親水性領域である。
本発明の特定の実施形態において、抗原性ペプチドにより包含される少なくとも一つのエピトープは、タンパク質の表面に局在するＮＯＶＸ領域、例えば、親水性領域である。ヒトＮＯＶＸタンパク質配列の疎水性分析は、ＮＯＶＸポリペプチドのどの領域が特に親水性であり、したがって抗体生産を目標とするために有用な表面残基をコードする可能性が高いかを示す。抗体生産を目標とするための手段として、親水性および疎水性領域を示すハイドロパシープロットを、例えば、どちらもフーリエ変換を用いるかまたは用いないで、Kyte DoolittleまたはHopp Woods方法を含む当該分野において周知の任意の方法で生成し得る。例えば、Hopp and Woods, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828; Kyte and Doolittle 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-142(いずれも全体的な出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体内の一つまたはそれ以上のドメインに特異的である、抗体はまた、本明細書において提供する。
用語「エピトープ」には、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合し得る全てのタンパク質決定基(部位）が含まれる。エピトープ様決定基（部位）は、通常、化学的に活性な分子（例えば、アミノ酸もしくは糖側鎖など）表面群を含み、通常、特定の三次元的構造特性、に加えて特定電荷特性を示す。あるＮＯＶＸポリペプチドまたはそれらのフラグメントは、少なくとも１つの抗原エピトープを持つ。アッセイ（例えば、当業者には既知のラジオリガンド結合アッセイまたは類似のアッセイ）によって測定されるような、平衡結合定数ＫＤが、＜１μＭ、好ましくは＜１００ｎＭ、より好ましくは＜１０ｎＭ、もっとも好ましくは＜１００ｐＭ〜約１ｐＭである場合、本発明の抗ＮＯＶＸ抗体は、抗原ＮＯＶＸに特異的に結合するという。
本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、類似体、相同体、またはオーソログを、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の生成において免疫源として利用することができる。
当該分野内において公知の種々の方法を、本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、類似体、相同体、またはオーソログ、に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の生産に使用し得る(例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。これらの抗体の幾つかについて以下に考察する。
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体の生産には、種々の適当な宿主動物(例えばウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳動物)を、天然タンパク質、その合成変異体、または前述の誘導体を1回またはそれ以上注射して免疫を行い得る。適切な免疫原性製剤としては、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を代表する化学的に合成したポリペプチド、または組換え的に発現した免疫原性タンパク質を挙げ得る。さらに、タンパク質を、免疫する哺乳動物において免疫原性であることが知られている第２のタンパク質と複合体を形成してもよい。かかる免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンおよび大豆トリプシン阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。製剤はさらにアジュバントを含有し得る。免疫応答を増大するために使用する種々のアジュバントとしては、フロイントの(完全および不完全)アジュバント、鉱物ゲル(例えば水酸化アルミニウム)、界面活性剤(例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノール等)、カルメット-ゲラン杆菌およびコリネバクテリウム-パルヴムのようなヒトに使用可能なアジュバント、または類似の免疫促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用し得るアジュバントのさらに別な例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント(モノホスホリルリピドＡ、合成ジコリノミコール酸トレハロース)を挙げ得る。
免疫原性タンパク質に対するポリクローナル抗体を、哺乳動物から(例えば、血液から)単離して、免疫血清中の主としてＩｇＧ画分を提供するプロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーのような、公知の技術を用いてさらに精製し得る。引き続いて、またはこれに代えて、求める免疫グロブリンの標的である特異的抗原、またはそのエピトープ、をカラム上に固相化して、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製を、例えば、D. Wilkinson (The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28)により考察する。
モノクローナル抗体
本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」(ＭＡｂ)または「モノクローナル抗体組成物」は、特徴的なＬ鎖遺伝子産物および特徴的なＨ鎖遺伝子産物より成る抗体分子の１分子種のみを含有する抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域(ＣＤＲ)は、集団の全ての分子において同一である。従って、ＭＡｂは、それに対する特徴的な結合活性を特徴とする抗原の特定のエピトープと免疫反応する能力がある抗原結合部位を含有する。
モノクローナル抗体を、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)により記載するような、ハイブリドーマ方法を用いて調製し得る。ハイブリドーマ方法では、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を典型的に免疫化剤で免疫することにより、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生産するかまたは生産する能力のあるリンパ球を誘発する。これに代えて、リンパ球をインビトロで免疫することができる。
免疫化剤としては典型的に、タンパク質抗原、それらのフラグメントまたはその融合タンパク質が挙げられる。一般的に、ヒト由来の細胞を所望するならば、末梢血リンパ球を使用し、またはヒト以外の哺乳動物源を所望するならば、脾臓細胞またはリンパ節細胞を使用するかのいずれかである。次いで、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて不死化細胞株と融合し、ハイブリドーマ細胞を生成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103）。不死化細胞株は通常、形質転換した哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシまたはヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株を使用し得る。ハイブリドーマ細胞を、融合していない不死化細胞の増殖または生存を阻害する一つまたはそれ以上の物質を好ましくは含有する適切な培地中で培養し得る。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ)を欠くならば、ハイブリドーマ用の培地は典型的に、その物質がＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を阻止する、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む(“ＨＡＴ培地”)。
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択した抗体生産細胞による抗体の高レベル発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性のあるものである。さらに好ましい不死化細胞株は、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Californiaおよびthe American Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから入手し得るマウス骨髄腫細胞株である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の生産用に記載する（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63）。
ハイブリドーマが培養する培地を次いで、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイし得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産したモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降によりまたはラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)または酵素結合免疫吸着検査法(ＥＬＩＳＡ)のような、インビトロ結合アッセイによって測定する。そのような技術またはアッセイは当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性を、例えば、Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のScatchard分析により測定し得る。標的抗原に対して高度の特異性および高い結合親和性を有する抗体を同定することは、モノクローナル抗体の治療的応用において特に重要な目的である。
所望のハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈法でサブクローン化して、標準方法で増殖し得る(Goding,1986)。この目的のための適当な培地としては、例えば、Dulbecco's 修飾後 Eagle's Medium培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地を挙げ得る。これに代えて、ハイブリドーマ細胞を哺乳動物中で腹水としてインビボで増殖し得る。
サブクローンにより分泌したモノクローナル抗体を、培地または腹水から、例えば、プロテイン−Ａセファローズ、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手順により単離または精製し得る。
モノクローナル抗体をまた、米国特許第４,８１６,５６７号に記載するような組換えＤＮＡ方法により作り得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を使用して(例えば、マウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力のある、オリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)容易に単離し配列決定し得る。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離すれば、ＤＮＡを発現ベクター中に配置し、それを次いでサルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、またはそうしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入して、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を取得し得る。ＤＮＡをまた、例えば相同なマウスの配列の代わりにヒトのＨ鎖およびＬ鎖の通常ドメインに対するコード化配列を置換することにより(米国特許第４,８１６,５６７号; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994))、または非免疫グロブリンペプチドに対するコード化配列の全部または一部を免疫グロブリンのコード化配列に共有結合することにより、修飾し得る。そのような非免疫グロブリンポリペプチドを、本発明の抗体の通常ドメインに対して置換することができるか、または本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに対して置換して、キメラ２価抗体を創成することができる。
ヒト化抗体
本発明のタンパク質抗原に対する抗体はさらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含む。これらの抗体は、投与した免疫グロブリンに対してヒトによる免疫応答を惹き起こすことなくヒトに投与するのに適している。抗体のヒト化型は、主としてヒト免疫グロブリンの配列より成って、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント(Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２または抗体の他の抗原結合サブ配列)である。ヒト化は、Winterまたは共同研究者(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))の方法にしたがって、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列で置換することにより、実施し得る。(また、米国特許第５,２２５,５３９号を参照)場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレーム枠の残基を対応する非ヒト残基により置換し得る。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体またはＣＤＲまたはフレーム枠配列にも見出さない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は少なくとも一つ、また典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ここでＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そしてフレーム枠領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は至適にはまた、免疫グロブリンの通常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含む(Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; および Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992))。
ヒト抗体
完全なヒト抗体は、ＣＤＲを含むＬ鎖およびＨ鎖の全配列がヒトの遺伝子より生じる、抗体分子に本質的に関する。かかる抗体は本明細書では、「ヒト抗体」または「完全なヒト抗体」と呼称する。ヒトモノクローナル抗体を、トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72を参照)およびＥＢＶハイブリドーマ技術により調製し、ヒトモノクローナル抗体を生産し得る(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照)。ヒト化モノクローナル抗体を、本発明の実施に利用し得て、そしてヒトハイブリドーマを用いて(Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030を参照)またはヒトＢ細胞をインビトロでEpstein Barrウイルスにより形質転換することによって(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照)生産し得る。
加えて、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991))を含むさらに別な技術を用いて生産し得る。同様に、ヒト抗体を、ヒト免疫グロブリンの遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、マウスに導入することによって作り得る。ここで内在性免疫グロブリン遺伝子を部分的にまたは完全に不活化する。チャレンジによって、遺伝子再配列、アセンブリー、および抗体レパトリ−を含む全ての面でヒトにおいて見られるのと非常に良く似たヒト抗体生産を観察する。このアプローチは、例えば、米国特許第５,５４５,８０７号; ５,５４５,８０６号; ５,５６９,８２５号; ５,６２５,１２６号; ５,６３３,４２５号; ５,６６１,０１６号、ならびに Marks et al. (Bio/Technology 10, 779-783 (1992))、Lonberg et al. (Nature 368 856-859 (1994))、Morrison ( Nature 368, 812-13 (1994))、Fishwild et al,( Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996))、Neuberger (Nature Biotechnology 14, 826 (1996))、 Lonberg and Huszar (Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995))に記載されている。
ヒト抗体を、抗原によるチャレンジに応答して動物の内在性抗体ではなく完全なヒト抗体を生産するように修飾したトランスジェニック非ヒト動物を用いて、付加的に生産し得る(ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０２６０２を参照)。非ヒト宿主中の免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖をコードする内在性遺伝子を無能にし、そしてヒト免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖をコードする活性遺伝子座を宿主のゲノムの中に挿入する。ヒトの遺伝子を、例えば、必要なヒトＤＮＡセグメントを含有する酵母の人工染色体を用いて組み入れ得る。全ての所望の修飾を提供する動物は次いで、修飾の全相補物より少ない相補物を含有する中間トランスジェニック動物を交雑育種することにより子孫として得られる。そのような非ヒト動物の好ましい実施形態はマウスであり、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６号に開示されているようにXenomouse[登録商標]と呼称する。この動物は、完全なヒト免疫グロブリンを分泌する、Ｂ細胞を生産する。抗体は、興味のある免疫原で免疫後、動物から、例えば、ポリクローナル抗体の標本として、直接得ることも、またはこれに代えて、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマのような、動物由来の不死化Ｂ細胞から得ることもできる。これに加えて、ヒトの可変領域を持つ免疫グロブリンをコードする遺伝子を回収し、発現して、抗体を直接得ることもでき、またはさらに修飾して、例えば、単鎖Ｆｖ分子のような抗体の類似体を得ることができる。
内在性免疫グロブリンのＨ鎖の発現を欠失する、マウスとして例証した、非ヒト宿主を生産する方法の実施例は、米国特許第５,９３９,５９８号、に開示されている。それは、遺伝子座の再配列を阻止するためにそして再配列した免疫グロブリンＨ鎖の遺伝子座の転写物生成を阻止するために、胚性幹細胞中の少なくとも一つの内在性Ｈ鎖の遺伝子座からＪセグメントを欠失させ、この欠失は選択マーカーをコードする遺伝子を含有するターゲティングベクターによりもたらされ、そして体細胞または胚細胞が選択マーカーをコードする遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを胚性幹細胞から生産することを含む方法により得られる。
ヒト抗体のような興味のある抗体を生産する方法は、米国特許第５,９１６,７７１号、に開示されている。それは、Ｈ鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを一つの培養哺乳動物宿主細胞に導入すること、Ｌ鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターをさらに別な哺乳動物宿主細胞に導入すること、および２個の細胞を融合してハイブリッド細胞を生成することを含む。ハイブリッド細胞は、Ｈ鎖およびＬ鎖を含有する抗体を発現する。
この手順のさらなる改良において、免疫原上の臨床的に関係のあるエピトープを同定する方法、および関係のあるエピトープに高親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択する相関的方法が、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５３０４９に開示されている。
Ｆａｂフラグメントおよび単鎖抗体
本発明にしたがって、技術を、本発明の抗原タンパク質に特異的な単鎖抗体の生産に適合することができる(例えば米国特許第４,９４６,７７８号を参照)。加えて、方法を、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に適合し(例えば、Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281、を参照)、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能し得る。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含有する抗体フラグメントを、当該分野において公知の技術により生産し得て、それは、(i)抗体分子のペプシン消化により生産するＦ(ａｂ')２フラグメント；(ii)Ｆ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド架橋を還元して得られるＦａｂフラグメント；(iii)抗体分子をパパインおよび還元剤で処置して生成するＦａｂフラグメント；ならびに(iv)Ｆｖフラグメントを含むが、これらに限定されない。
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトのまたはヒト化の抗体である。本明細書においては、結合特異性の一つは本発明の抗原タンパク質に対するものである。２番目の結合標的は、任意の他の抗原であって、有利に細胞表面タンパク質または受容体または受容体サブユニットである。
二重特異性抗体の作成方法は当該分野において公知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え生産は、２個のＨ鎖が異なる特異性を有する２個の免疫グロブリンＨ鎖／Ｌ鎖対の共発現に基づく(Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖のランダムな組合せのため、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生産し、そのうちの一つだけが正しい２重特異性構造を有する。正しい分子の精製は通常、アフィニティークロマトグラフィーにより行う。類似の方法が、１９９３年５月に公開されたＷＯ９３／０８８２９およびTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性を持つ抗体の可変ドメイン(抗体−抗原結合部位)を、免疫グロブリンの通常ドメイン配列に融合し得る。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリンＨ鎖の通常ドメインと共にある。少なくとも融合の一つの中に存在するＬ鎖結合に必要な部位を含有する第１のＨ鎖通常領域(ＣＨ１)を有することが好ましい。免疫グロブリンＨ鎖の融合をコードするＤＮＡ、および所望ならば、免疫グロブリンＬ鎖を別々の発現ベクター中に挿入し適当な宿主生物中に形質移入する。二重特異性抗体のさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
ＷＯ９６／２７０１１に記載されたもう一つのアプローチによれば、一対の抗体分子間の境界面を改変して、組換え細胞培地から回収するヘテロダイマーの百分率を最大にし得る。好ましい境界面は、抗体の通常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の境界面の一つまたはそれ以上の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖(例えばチロシンまたはトリプトファン)で置換する。大きな側鎖(複数を含む)と同一または類似のサイズの代償的な「空隙」を、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの(例えばアラニンまたはスレオニン)で置換することにより第２の抗体分子の境界面に生成する。これは、ホモダイマーのような他の望ましくない最終産物以上にヘテロダイマーの収量を増加する機構を提供する。
二重特異性抗体を、抗体の全長または抗体フラグメント(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成する技術は文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体フラグメントを、化学的結合を用いて調製することができる。Brennan et al., Science 229:81 (1985)は、完全な抗体をタンパク質分解酵素で切断してＦ(ａｂ')２フラグメントを生成する手順を記載する。これらのフラグメントをジチオール錯化剤の亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接するジチオールを安定化させて、分子間ジスルフィド形成を阻止する。次いで、生成したＦａｂ'フラグメントをチオニトロ安息香酸(ＴＮＢ)誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ'−ＴＮＢの一つをメルカプトエチルアミンとの還元によりＦａｂ'−チオールに再変換し、そして等量の他のＦａｂ'−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を生成する。生成した二重特異性抗体を酵素の選択的固定化剤として使用し得る。
これに加えて、Ｆａｂ'フラグメントを大腸菌から直接回収して、化学的にカップリングして、二重特異性抗体を生成し得る。Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)は、完全にヒト化した二重特異性抗体のＦ(ａｂ')２分子の生産を記載している。それぞれのＦａｂ'フラグメントを大腸菌から別々に分泌し、インビトロで指向性化学カップリングに供して、二重特異性抗体を形成した。従って形成した二重特異性抗体を、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞に結合することができ、ならびにヒト乳腺腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。
組換え細胞培地から直接二重特異性抗体を作成し単離する種々の技術をまた記載する。例えば、二重特異性抗体をロイシンジッパーを用いて生産する。Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーを遺伝子融合により二つの異なる抗体のＦａｂ'部分に結合した。抗体のホモダイマーをヒンジ領域において還元して、モノマーを形成し、次いで再酸化して、抗体のヘテロダイマーを形成した。この方法をまた、抗体のホモダイマーの生産に利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)により記載されている「diabody」技術は、二重特異性抗体フラグメント作成のさらに別の機構を提供する。フラグメントは、リンカーによりＬ鎖可変領域(ＶＬ)に連結したＨ鎖可変領域(ＶＨ)を含むが、リンカーが短いため同じ鎖の上の２個のドメイン間での対形成を可能にしない。したがって、一つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは強制的にもう一つのフラグメントの相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対を形成し、それにより二つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)のダイマーの使用による二重特異性抗体フラグメント作成のもう一つの戦略がまた報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
３価以上の結合価をもつ抗体も考得る。例えば、３重特異性抗体を調製し得る。例えば、Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)。
典型的な二重特異性抗体は、少なくとも一つが本発明のタンパク質抗原に由来する二つの異なるエピトープに結合し得る。これに代えて、免疫グロブリン分子の抗−抗原アームを、白血球上でＴ細胞受容体分子(例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８またはＢ７)またはＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)およびＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)のような、ＩｇＧに対するＦｃ受容体(Ｆｃγ)のような誘発性分子に結合するアームと組み合わせて、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞性防御機構に焦点を当て得る。二重特異性抗体をまた使用して、特定の抗原を発現している細胞に細胞障害性物質を指向し得る。これらの抗体は、抗原結合アームおよび細胞障害性薬剤またはＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡまたはＴＥＴＡのような放射性核種キレート化剤と結合するアームを所有する。興味のあるもう一つの二重特異性抗体は、本明細書に説明するタンパク質抗原と結合して、さらに組織因子(ＴＦ)と結合する。
ヘテロ複合抗体
ヘテロ複合抗体はまた本発明の範囲内にある。ヘテロ複合抗体は、共有結合で結合した二つの抗体より成る。そのような抗体は、例えば、好ましくない細胞に免疫系の細胞を標的化するため(米国特許第４,６７６,９８０号)、およびＨＩＶ感染の処置のため(ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９)に提案されている。これらの抗体を、架橋剤を伴うものを含むタンパク質合成化学の既知の方法を用いてインビトロで調製し得ると考えられている。例えば、ジスルフィド交換反応を使用してまたはチオエーテル結合を形成することより、イムノトキシンを構築することができる。この目的のために適当な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートならびに、例えば、米国特許第４,６７６,９８０号に開示されているものを挙げ得る。
エフェクター機能工学
例えば、がんの処置における抗体の有効性を増強するために、本発明の抗体をエフェクター機能に関して修飾することが望ましい。例えば、システイン残基(複数を含む)をＦｃ領域に導入し、それによりこの領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にし得る。かくして生成したホモダイマーの抗体は、改善した内部移行能および／または増強した補体仲介性細胞殺害ならびに抗体依存性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)を有し得る。Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) および Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照されたい。増強した抗腫瘍活性を持つホモダイマー抗体はまた、Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)に記載されているように、ヘテロ２機能性架橋剤を用いて調製し得る。これに代えて、２重のＦｃ領域を有して、それにより増強した補体依存性細胞溶解およびＡＤＣＣ能を有する抗体を工学操作することができる。Stevenson et al., Anti-癌 Drug Design, 3: 219-230 (1989)を参照されたい。
免疫複合体
本発明はまた、化学療法剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらのフラグメント)または放射性同位体(即ち、放射性複合体)のような細胞毒性物質と複合した抗体を含む免疫複合体に関する。
そのような免疫複合体の生成に有用な化学療法剤を上述する。使用できる酵素的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、内毒素Ａ鎖(Pseudomonas aeruginosa由来)、リシンＡ鎖、アビリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、Aleurites fordii(シナアブラギリ)タンパク質、ディアンティンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ)、momoridica char抗a(ツルレイシ)阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalisc阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。種々の放射性核種を放射性複合抗体の生産に利用できる。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅを挙げ得る。
抗体と細胞障害性薬剤との複合体を、Ｎ−サクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオール)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの２機能性誘導体(ジメチルアジピイミデートＨＣＬのような)、活性エステル(ジサクシンイミジルスベレートのような)、アルデヒド(グルタルアルデヒドのような)、ビスアジド誘導体(ビス−(ｐ−アジドベンゾイル)−ヘキサンジアミンのような)、ビスジアゾニウム誘導体(ビス−(ｐ−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミンのような)、ジイソシアネート(トリエン２、６−ジイソシアネートのような)、およびビス活性フッ素化合物(１,５−ジフルオロ２,４−ジニトロベンゼンのような)のような種々の２機能性タンパク質カップリング剤を用いて作る。例えば、リシン免疫毒素を、Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)に記載のように調製することができる。炭素１４で標識した１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸(ＭＸ−ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドを抗体に結合するための典型的なキレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。
もう一つの実施形態では、抗体を、腫瘍をプレターゲティンブのための「受容体」(ストレプトアビジンのような)に結合することができて、そこでは抗体−受容体複合体を患者に投与し、引き続いて未結合の複合体を除去剤を用いて血液循環から除去し、次いで今度は細胞障害性薬剤に複合した「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
イムノリポソーム
本明細書で開示される抗体をまた、イムノリポソームとして処方することができる。抗体を含有するリポソームリポソームは、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); ならびに米国特許第４,４８５,０４５号および第４,５４４,５４５号に記載されているような、当該分野において公知の方法で調製する。増大した循環時間を持つリポソームリポソームは、米国特許第５,０１３,５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームリポソームを、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ−ＰＥ)を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法により生成し得る。リポソームリポソームを定められた孔径のフィルターを通して押し出して、所望の直径のリポソームリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ'フラグメントを、Martin et al ., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)に記載されるように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームリポソームに結合し得る。化学療法剤(ドキソルビシンのような)を任意にリポソーム内に含有する。Gabizon et al., J. National cancer Inst., 81(19): 1484 (1989)を参照されたい。
本発明のタンパク質に対して指向した抗体の診断応用
１実施形態では、所望の特異性を保有する抗体のスクリーニングのための方法は限定しないが、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）および他の当業者既知免疫学的介在技法を含む。具体的実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質の特定のドメインに特異的である抗体の選択は、そのようなドメインを保有するＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに結合するハイブリドーマの生成によって容易化される。かくして、ＮＯＶＸタンパク質内の所望のドメイン、その誘導体、フラグメント、類似体、または相同物に特異的で合える抗体をまたここに提供する。
本発明のＮＯＶＸタンパク質に対して指向化された抗体を、ＮＯＶＸタンパク質の局在化及び／または定量に関する当業界内既知方法で使用し得る（例えば適当な生理学的サンプル内のＮＯＶＸタンパク質のレベルの測定における使用のため、診断方法における使用のため、タンパク質の画像化における使用のためなど）。所定の実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質、その誘導体、フラグメント、類似体または相同物に特異的な抗体であって、抗体由来抗原結合ドメインを含むものは、薬理学的活性化合物として利用する（以後「治療剤」と称する）。
本発明のＮＯＶＸタンパク質に対して特異的な抗体を（例えばモノクローナルまたはポリクローナル抗体）、イムノアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的な技術により、ＮＯＶＸポリペプチドを単離するために使用し得る。ＮＯＶＸポリペプチドへの抗体を、細胞由来の天然タンパク質および宿主細胞で発現する組換え的に生産したＮＯＶＸ抗原の精製を容易にし得る。さらに、そのような抗ＮＯＶＸ抗体を使用して、抗原性ＮＯＶＸタンパク質の存在量または発現パターンを評価するために抗原性ＮＯＶＸタンパク質(例えば、細胞溶解物または細胞上清中の)を検出することができる。ＮＯＶＸタンパク質に対して指向した抗体を診断的に使用して、例えば、与えられた処置法の有効性を測定するために臨床検査の手順の一環として組織中のタンパク質レベルをモニターすることができる。抗体を検出可能な物質にカップリング(即ち物理的に連結)することにより、検出を促進し得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、配合群、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質を挙げる。適当な酵素の例としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを挙げ得る；適当な配合群の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを挙げ得る；適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレッセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンを挙げ得る；発光物質の例としては、ルミノールを挙げ得る；生物発光物質の例としてはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを挙うるし、適当な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを挙げ得る。
抗体治療法
ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化および完全なヒト抗体を含む本発明の抗体を治療薬として使用し得る。そのような薬剤を一般的に、対象の疾患または病変の治療または予防に使用する。抗体製剤、好ましくはその標的抗原に対して高い特異性および高い親和性を有するものを対象に投与して、一般的に標的への結合に因る効果を有する。そのような効果は、与えた抗体分子と問題とする標的抗原との間の相互作用の特異的性質に依存する２種類のうちの一つである。第１の場合では、抗体の投与は、標的の本来結合する内在性リガンドとの結合を阻止または阻害し得る。この場合には、抗体は標的に結合して、リガンドがエフェクター分子として作用する、天然に存在するリガンドの結合部位をマスクする。かくして、受容体はリガンドが役割を担う情報伝達経路を仲介する。
これに代えて、作用は、抗体が標的分子上のエフェクター結合部位への結合により生理的結果を誘発するものであり得る。この場合には、疾患または病変においては存在しないかまたは欠陥のあり得る内在性リガンドを有する受容体である標的を、代替のエフェクターリガンドとしての抗体と結合して、受容体に基づく情報伝達事象を受容体により開始する。
本発明の抗体の治療的に有効な量は一般的に、治療目的を達成するのに必要とされる量に関する。上述のように、これは、特定の場合には標的の機能を阻害し、そして他の場合には生理的応答を促進する抗体およびその標的抗原との間の結合相互作用であり得る。投与に必要な量はさらに、特定の抗原に対する抗体の結合親和性に依存するし、そしてまた投与した抗体が投与した対象の自由体積から除去し得る速度に依存する。本発明の抗体または抗体フラグメントの治療的に有効な投与量の通常の範囲は、限定されない例として、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。通常の投与回数は、例えば、１日２回から１週１回の範囲であり得る。
抗体の医薬組成物
本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体、ならびに本明細書に開示するスクリーニングアッセイにより同定する他の分子を、医薬組成物の形で種々の障害の処置のために投与し得る。そのような組成物の調製に関与する原理および考慮事項、ならびに成分の選択の指針は、例えば、The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa. : 1995、Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994、および Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New Yorkに提供されている。
抗原タンパク質が細胞内にあり、完全な抗体を阻害剤として使用するならば、内部移行性抗体が好ましい。しかしながら、リポソームを使用して、抗体または抗体フラグメントを細胞内に送達し得る。抗体フラグメントを使用する場合には、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さな阻害フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域の配列に基づいて、標的タンパク質の配列に結合する能力を保持するペプチド分子をデザインし得る。そのようなペプチドを、化学的および／または組換えＤＮＡ技術により合成し得る。例えば、Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照されたい。本明細書における処方はまた、処置する特定の適応のために必要なニつ以上の活性化合物、好ましくはお互いに悪影響を及ぼし合わない相補的活性を持つものを含有し得る。これに代えて、またはこれに加えて、組成物は、その機能を増強する薬剤、例えば、細胞障害性薬剤、サイトカイン、化学療法剤、または増殖阻害剤を含有していてもよい。そのような分子は好都合には、意図する目的にとって効果的な量で組み合わされて存在する。
活性成分を、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により調製したマイクロカプセル中で、例えば、ハイドロキシメチルセルローズまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中で、それぞれ、コロイド状薬送達システム(例えば、リポソーム、アルブミン小球体、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)中に、またはマクロエマルジョン中に閉じ込め得る。
インビボ投与に使用する製剤は無菌でなければならない。このことを、無菌ろ過膜によるろ過により容易に達成する。
徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適当な例としては、抗体を含有する固相の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルのような造形品の形をしている。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ハイドロゲル(例えば、ポリ(２−ヒドロキシエチル−メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第３,７７３,９１９号)、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌグルタミン酸エステルの共重合体、非分解性エチレン−ビニルアセテート、LUPRON DEPOT[登録商標](乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸リュープロリドより成る注射用マイクロスフェア)のような分解性乳酸−グリコール酸共重合体が挙げられる。酢酸エチレンビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日間に亘って分子を放出することができるが一方、特定のヒドロゲルはより短期間でタンパク質を放出する。
ＥＬＩＳＡアッセイ
アナライトのタンパク質を検出する薬剤は、アナライトのタンパク質に結合する能力のある抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナルでもよく、またはさらに好ましくはモノクローナルであり得る。完全な抗体またはそのフラグメント(例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ)２)を使うことができる。用語「標識」とは、プローブまたは抗体に関して、プローブまたは抗体に検出可能な物質をカップリングする(即ち、物理的に連結する)ことによるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接に標識するもう一つの薬剤との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を包含するものとする。間接標識の例としては、蛍光標識した第２抗体を用いた第１抗体の検出および蛍光標識ストレプトアビジンで検出できるようにＤＮＡプローブをビオチンで末端標識することが挙げられる。用語「生物学的試料」とは、対象から単離した組織、細胞および生物学的流体、ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含むものとする。それ故に、用語「生物学的試料」の範囲には血液および血清、血漿、またはリンパ液を含む血液のフラクションまたは成分を含み得る。即ち、本発明の検出法を使用して、生物学的試料中のアナライトのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡをインビトロならびにインビボで検出することができる。例えば、アナライトのｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイツハイブリダイゼーションを挙げ得る。アナライトのタンパク質のインビトロ検出技術としては、酵素結合免疫吸着検査法(ＥＬＩＳＡ)、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を挙げ得る。アナライトのＤＮＡのインビトロ検出技術としては、サザンハイブリダイゼーションを挙げ得る。イムノアッセイを実施する手順は、例えば、「ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology」, Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995、「Immunoassay」, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996、および「Practice and Thory of Enzyme Immunoassays」, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985に記載されている。さらに、アナライトのタンパク質のインビボ検出のための技術は、標識化した抗アナライトタンパク質抗体を対象に導入することを含む。例えば、対象中での存在または局在が標準的な造影技法で検出できる放射性マーカーで、抗体を標識し得る。
ＮＯＶＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明のもう一つの態様は、ＮＯＶＸタンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書において使用する用語「ベクター」とは、それに結合しているもう一つの核酸を運搬する能力のある核酸分子を指す。ベクターの一つのタイプは「プラスミド」であり、これは、さらに別なＤＮＡセグメントが結合した環状の二重鎖ＤＮＡループを指す。ベクターのもう一つのタイプはウイルスベクターであり、ここではさらに別なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムの中に結合し得る。特定のベクターは、それらを導入した宿主細胞中で自律増幅することができる(例えば、細菌の複製起点を持つ細菌のベクターおよび哺乳動物のエピゾームベクター)。他のベクター(例えば、哺乳動物の非エピゾームベクター)は、宿主細胞中への導入に際し宿主細胞のゲノム中に組み込まれて、それにより宿主ゲノムと一緒に複製し得る。さらに、特定のベクターは、それらが作動し得るように連結した遺伝子の発現を指示する能力がある。そのようなベクターを、本明細書において「発現ベクター」と呼称する。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をしている。プラスミドはベクターの最も通常に使用する形態であるので、本明細書においては、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用し得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を有するウイルスベクター(例えば、複製能を欠いたレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)のような他の形の発現ベクターを含むこととする。
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中における核酸の発現に適した形での本発明の核酸を含み、これは組換え発現ウイルスを、発現に使用する宿主細胞に基づいて選択した発現すべき核酸配列に作動し得るように連結した一つまたはそれ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内において、「作動し得るように連結した」とは、興味のある核酸配列が核酸配列の発現を可能にする様式で(例えばインビトロ転写／翻訳システムでまたはベクターを宿主細胞に導入する場合には宿主細胞中で)調節配列に結合していることを意味するものとする。
用語「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むものとする。そのような調節配列は、例えば、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するものおよび特定の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの(例えば、組織特異的調節配列)を挙げ得る。発現ベクターのデザインが、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等のような要因に依存し得ることを当業者は理解する。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入して、それにより本明細書に説明するように核酸によりコードする融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチド(例えば、ＮＯＶＸタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の突然変異型、融合タンパク質等)を生産し得る。
本発明の組換え発現ベクターを、原核のまたは真核の細胞中におけるＮＯＶＸタンパク質発現用にデザインし得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質を、Escherichia coliのような細菌細胞、昆虫細胞(バキュロウイルス発現ベクターを使用して)、酵母細胞または哺乳動物細胞中で発現し得る。適当な宿主細胞は、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)においてさらに考察されている。これに代えて、組換え発現ベクターを、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写して、翻訳し得る。
真核細胞中におけるタンパク質の発現は最もしばしば、Escherichia coli中で融合タンパク質または非融合タンパク質のどちらかの発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて行われる。融合ベクターは、その中にコードしたタンパク質に多数のアミノ酸を、通常には組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。そのような融合ベクターは典型的に三つの目的に役立つ：(i)組換えタンパク質の発現を増大するため；(ii)組換えタンパク質の溶解性を増加するため；および(iii)アフィニティークロマトグラフィーにおけるリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を助けるため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解による切断部位を融合部分および組換えタンパク質の接合部に導入して、融合部分から組換えタンパク質の分離に引き続いて融合タンパク質の精製を可能にする。そのような酵素、およびそれらと同種の認識配列としては、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼを挙げ得る。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ標的組換えタンパク質に融合させるｐＧＥＸ(Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40)、ｐＭＡＬ (New England Biolabs, Beverly, Mass.)およびｐＲＩＴ５ (Pharmacia, Piscataway, N.J.) を挙げ得る。
適当な誘導性非融合E. coli発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ(Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315)およびｐＥＴ１１ｄ (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89)を挙げ得る。
E. coliにおけるタンパク質発現を最大にする一つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を障害した宿主細胞中でタンパク質を発現することである。Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128を参照されたい。もう一つの戦略は、それぞれのアミノ酸に対する個別のコドンをE. coliで優先的に使用するものとなるように、発現ベクターに挿入する核酸の核酸配列を変更することである(例えば、Wada, et al., 1992. Nucl. Acids Res. 20: 2111-2118を参照)。本発明の核酸配列のそのような変更は標準的ＤＮＡ合成技法により行い得る。
もう一つの実施形態では、ＮＯＶＸ発現ベクターは酵母の発現ベクターである。酵母のSaccharomyces cerivisae中の発現ベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１ (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234)、ｐＭＦａ(Kurjan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943)、ｐＪＲＹ８８ (Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123)、ｐＹＥＳ２(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)、およびｐｉｃＺ(InVitrogen Corp, San Diego, Calif.)を挙げ得る。
これに代えて、ＮＯＶＸをバキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中で発現し得る。培養昆虫細胞(例えば、ＳＦ９細胞)中でのタンパク質発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ(Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) およびｐＶＬシリーズ(Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39)を挙げ得る。
なおもう一つの実施形態では、本発明の核酸を、哺乳動物の発現ベクターを用いて哺乳動物細胞中で発現し得る。哺乳動物の発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８(Seed, 1987. Nature 329: 840)およびｐＭＴ２ＰＣ(Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195)を挙げ得る。哺乳動物細胞中で使用するときには、発現ベクターの制御機能はしばしば、ウイルスの調節要素により提供される。例えば、普通に使用するプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。原核のおよび真核の細胞両方にとって適当な他の発現系については、例えば、Chapters 16 and 17 of Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989を参照されたい。
もう一つの実施形態では、組換え哺乳動物表現ベクターは、特定の細胞タイプ中で優先的に核酸の発現を指示する能力がある(例えば、組織特異的調節要素を核酸を発現するために使用する)。組織特異的調節要素は当該分野において公知である。適当な組織特異的プロモータの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター(肝臓特異的；Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277)、リンパ系特異的プロモーター(Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275)、特にT細胞受容体(Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733)および免疫グロブリン (Banerji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748)のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター(例えば、ニューロフィラメントプロモーター; Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916)、ならびに乳腺特異的プロモーター(例えば、乳漿；米国特許第４,８７３,３１６号及びヨーロッパ出願公開第２６４,１６６号)を挙得る。例えば、マウスのｈｏｘプロモーター(Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379)およびα−フェトプロテインプロモーター(Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546)の発生的に調節されるプロモーターも包含する。
本発明はさらに、発現ベクターの中にアンチセンスの配向でクローン化した本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。即ち、ＤＮＡ分子は、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現(ＤＮＡ分子の転写による)を可能にするような様式で、調節配列に機能し得るように結合する。種々の細胞タイプ中のアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指示するアンチセンスの配向にクローン化した核酸に機能し得るように結合した調節配列、例えば、ウイルスのプロモーターおよび／またはエンハンサーを選択することができるか、またはアンチセンスＲＮＡの組織特異的または細胞タイプ特異的な構成的発現を指示する調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、ベクターを導入した細胞タイプにより活性を決定する高効率調節領域の制御下で、アンチセンス核酸を生産する組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形であり得る。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の考察については、例えば、Weintraub, et al., 「Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis」 Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986を参照されたい。
本発明のもう一つの態様は、本発明の組換え発現ベクターを導入する宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」を、本明細書においては互換的に使用する。そのような用語は、特定の対象の細胞のみならずそのような細胞の子孫または潜在的子孫をまた指すことを理解する。突然変異または環境の影響により後の世代に特定の修飾が生じるかもしれないため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書において使用する用語の範囲内になお含まれる。
宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質を、E. coliのような細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)またはＣＯＳ細胞)のような細菌の細胞中で発現することができる。他の適当な宿主細胞は当業者に周知である。
ベクターＤＮＡを、従来の形質転換または形質移入技術により原核細胞または真核の細胞の中に導入することができる。本明細書において使用する用語「形質転換」および「形質移入」とは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介性形質移入、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む外来の核酸(例えばＤＮＡ)を宿主細胞に導入するために当該分野で認める種々の技術を指すものとする。宿主細胞を形質転換しまたは形質移入するための適当な方法は、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)および他の実験室マニュアルに見出すことができる。
哺乳動物細胞の安定的な形質移入については、使用される発現ベクターおよび形質移入の技法に依存して、細胞のごく小数のフラクションが外来性ＤＮＡをそのゲノムの中に組み込み得る。これらの組み込み体を同定し選択するために、選択可能なマーカー(例えば、抗生物質に対する抵抗性)が一般的に、興味のある遺伝子と一緒に宿主細胞に導入される。種々の選択可能なマーカーとしては、Ｇ４１８,ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬剤に抵抗性を与えるものが挙げられる。選択可能なマーカーをコードする核酸を、ＮＯＶＸをコードするものと同一のベクター上で宿主細胞に導入することができか、または別のベクター上で導入することもできる。導入された核酸で安定に形質移入された細胞は、薬剤選択により同定されることができる(例えば、選択可能なマーカーを組み込んでいる細胞は生き残る一方で、他の細胞は死ぬ)。
培地中の原核細胞または真核細胞のような本発明の宿主細胞を用いて、ＮＯＶＸタンパク質を生産する(即ち、発現する)ことができる。したがって、本発明は、本発明の宿主細胞を用いるＮＯＶＸタンパク質の生産方法をさらに提供する。一つの実施形態では、その方法は、本発明の宿主細胞(その中にＮＯＶＸタンパク質をコードする組換え発現ベクターを導入する)を、ＮＯＶＸタンパク質を生産するような適当な培地中で培養することを含む。もう一つの実施形態では、その方法は、培地または宿主細胞からＮＯＶＸタンパク質を単離することをさらに含む。
トランスジェニックＮＯＶＸ動物
本発明の宿主細胞をまた使用して、非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。例えば、一つの実施形態では、本発明の宿主細胞は、その中にＮＯＶＸタンパク質コード化配列を導入する受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、そのような宿主細胞を使用して、その中で外来性のＮＯＶＸ配列をゲノムの中に導入する非ヒトトランスジェニック動物、またはその中で内在性のＮＯＶＸ配列を変更する相同な組換え動物を創成することができる。そのような動物は、ＮＯＶＸタンパク質の機能および／または活性の研究にならびにＮＯＶＸタンパク質活性のモジュレーターの同定および／または評価に有用である。本明細書において使用する「トランスジェニック動物」とは、その中で動物の一つまたはそれ以上の細胞が導入遺伝子を含む非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはラットまたはマウスのようなげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両棲類等を挙げ得る。導入遺伝子は、それからトランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムの中に取り込まれ、そして成熟動物のゲノム内に残存して、それによりトランスジェニック動物の一つまたはそれ以上の細胞タイプまたは組織中におけるコード化遺伝子産物の発現を指令する外来性ＤＮＡである。本明細書において使用する「相同の組換え動物」とは、その中で内在性ＮＯＶＸ遺伝子が内在性遺伝子および、動物の細胞、例えば、動物の胚細胞の中に動物の発生前に導入された外来性ＤＮＡ分子との間で相同組換えにより変更した非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスである。
本発明のトランスジェニック動物は、ＮＯＶＸをコードする核酸を受精卵母細胞の雄性前核の中に(例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染により)導入して、卵母細胞を偽妊娠雌性仮親動物の体内で発生することを可能にすることにより、創成することができる。配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜６６の整数である)のヒトＮＯＶＸｃＤＮＡ配列を、非ヒト動物のゲノム内に導入遺伝子として導入することができる。これに代えて、マウスＮＯＶＸ遺伝子のようなヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒト相同体を、ヒトＮＯＶＸのｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション(上にさらに詳述)に基づいて単離して、導入遺伝子として使用し得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、導入遺伝子の発現効率を増加するために導入遺伝子中に含み得る。組織特異的調節配列をＮＯＶＸ導入遺伝子に機能し得るように結合して、特定の細胞にＮＯＶＸタンパク質の発現を指示し得る。胚の操作およびマイクロインジェクションによる、トランスジェニック動物、特にマウスのような動物の作成方法は当該分野において従来的となってきており、例えば、米国特許第４,７３６,８６６号; ４,８７０,００９号; および４,８７３,１９１号;ならびにHogan, 1986. In: MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されている。類似の方法を他のトランスジェニック動物の生産に用い得る。初代トランスジェニック動物を、ゲノム内のＮＯＶＸ導入遺伝子の存在および／または動物の組織または細胞中におけるＮＯＶＸ ｍＲＮＡの発現に基づいて、同定し得る。次いで、初代トランスジェニック動物を、導入遺伝子を保持する追加的動物の繁殖に使用し得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする導入遺伝子を保持するトランスジェニック動物を使用して、他の導入遺伝子を保持するさらに別なトランスジェニック動物を繁殖し得る。
相同の組換え動物を創成するために、その中に欠失、付加または置換を導入していて、それによりＮＯＶＸ遺伝子を変化させる例えば機能的に破壊するあるＮＯＶＸ遺伝子の少なくとも一部を含有するベクターを調製する。ＮＯＶＸ遺伝子は、ヒト遺伝子(例えば配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜６６の整数である)のｃＤＮＡ)であり得るが、さらに好ましくはヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒト相同体である。例えば、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜６６の整数である)のヒトＮＯＶＸ遺伝子のマウス相同体を使用して、マウスゲノム中の内在性ＮＯＶＸ遺伝子を変更するのに適する相同組換えベクターを構築することができる。一つの実施形態では、ベクターを、相同組換えにより、内在性遺伝子を機能的に破壊する(即ち、もはや機能的なタンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼称する)ようにデザインする。
これに代えて、ベクターは、相同組換えにより内在性ＮＯＶＸ遺伝子を変異するかまたは他のように変更するが、依然機能性タンパク質をコードする(例えば、上流の調節領域を変更してそれにより内在性ＮＯＶＸタンパク質の発現を変更する)ようにデザインし得る。相同組換えベクターでは、ＮＯＶＸ遺伝子の変更したタンパク質は、ＮＯＶＸ遺伝子のさらに別な核酸により５'末端または３'末端に隣接して、ベクターにより保持する外来性ＮＯＶＸ遺伝子および胚性幹細胞中の内在性ＮＯＶＸ遺伝子の間で相同組換えが起こることを可能にする。さらに別な隣接ＮＯＶＸ核酸は、内在性遺伝子と成功裏に相同組換えが起きるように十分な長さを持つ。典型的には、数キロ塩基の隣接ＤＮＡ(５'末端および３'末端の両方とも)をベクターに含み得る。相同組換えベクターの記載については、例えば、Thomas, et al., 1987. Cell 51: 503を参照されたい。次いで、ベクターを胚性幹細胞株に(例えば、エレクトロポレーションにより)導入し、そしてその中で導入したＮＯＶＸ遺伝子を内在性ＮＯＶＸ遺伝子と相同的に組み換えた細胞を選択する。例えば、Li, et al., 1992. Cell 69: 915を参照されたい。
次いで、選択した細胞を動物(例えば、マウス)の胚盤胞の中に注入して、凝集キメラを形成する。例えば、Bradley, 1987. In: TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEM CELLS: A PRACTICAL APPROACH, Robertson, ed. IRL, Oxford, pp. 113-152を参照されたい。次いで、キメラ胚を適当な偽妊娠雌性仮親動物に植え込んで、胚を満期出産する。生殖細胞内に相同組換えしたＤＮＡを保持している子孫を用いて、その中で動物の全ての細胞が、導入遺伝子の生殖系列を介した伝達により相同組換えＤＮＡを含有する動物を繁殖させることができる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築する方法は、Bradley, 1991. Curr. Opin. Biotechnol. 2: 823-829; ＰＣＴ国際公開第: ＷＯ９０／１１３５４号；ＷＯ９１／０１１４０号；ＷＯ９２／０９６８号;およびＷＯ９３／０４１６９号にさらに記載される。
もう一つの実施形態では、導入遺伝子の調節発現を可能にする選択したシステムを含有する非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。そのようなシステムの一つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムの記載については、例えば、Lakso, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236を参照されたい。リコンビナーゼシステムのもう一つの例は、Saccharomyces cerevisiaeのＦＬＰリコンビナーゼシステムである。O'Gorman, et al., 1991. Science 251:1351-1355を参照されたい。もしｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムを用いて導入遺伝子の発現を調節するならば、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択したタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含有する動物が必要となる。そのような動物は、例えば、一つは選択したタンパク質をコードする導入遺伝子を含有し、他はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含有する二つのトランスジェニック動物を交配させることによる「ダブル」トランスジェニック動物の構築により提供し得る。
本明細書に説明した非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Wilmut, et al., 1997. Nature 385: 810-813に記載された方法にしたがって生産することができる。略述すれば、トランスジェニック動物から細胞(例えば体細胞)を単離し、誘導して、増殖サイクルから抜け出てＧ０期に入ることができる。次いで、静止細胞を、例えば、電気パルスの使用により静止細胞を単離したのと同じ種類の動物由来の脱核した卵母細胞と融合することができる。次いで、再構成した卵母細胞を、それを桑実胚または胚盤胞にまで発生させて、次いで擬妊娠雌性仮親動物に導入するように培養する。この雌性仮親動物から生まれた子孫は、細胞(例えば体細胞)を単離する動物のクローンである。
医薬組成物
本発明のＮＯＶＸ核酸分子、ＮＯＶＸタンパク質、抗−ＮＯＶＸ抗体(本明細書では「活性化合物」ともいう)、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、類似体および相同体を投与に適する医薬組成物の中に組込み得る。典型的に、そのような組成物は核酸分子、タンパク質または抗体およびおよび医薬的に許容され得る担体を含む。本明細書において使用する「医薬的に許容され得る担体」とは、医薬品投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗かび剤、等張および吸収遅延剤等を含むことを意図する。適当な担体は、この分野で標準的な参照テキストであるRemingtonの薬剤学の最新版(出典明示により本明細書の一部とする)に記載されている。そのような担体または賦形剤の好ましい例としては、水、食塩水、フィンガー溶液、ブドウ糖溶液および５％ヒト血清アルブミンを挙げるが、それらに限定しない。リポソームおよび油脂のような非水溶性ビークルもまた使用する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤は当該分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物に適合しない限りでなければ、組成物内のそれらの使用を意図する。補助的な活性化合物をまた、組成物の中に組込み得る。
本発明の医薬組成物を、その意図する投与経路に適合するように処方する。投与経路の例としては、非経口の、例えば、静脈の、皮内の、皮下の、経口の(例えば、吸入)、経皮の(即ち局所の)、経粘膜のおよび直腸の投与を挙げ得る。非経口の、皮内のまたは皮下の応用に使用する溶液または懸濁液としては、以下の成分を挙げることができる：注射用水のような無菌賦形剤、食塩水溶液、油脂、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)のようなキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、ならびに塩化ナトリウムまたはブドウ糖のような等張性を調整する薬剤。塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基を用いてｐＨを調整することができる。非経口性製剤を、ガラスまたはプラスチックで作るアンプル、使い捨て注射器、または多回使用バイアルの中に封入し得る。
注射用に適する医薬組成物としては、無菌水溶液(水溶性である場合)または分散液および無菌注射用の溶液または分散液の必要に応じて調合する製剤用の無菌粉末を挙げ得る。静脈投与のためには、適当な担体としては、生理食塩水、静菌性水、Cremophor EL[登録商標] (BASF, Parsippany, N.J.)またはリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)を挙げ得る。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性であるべきである。それは製造および保管の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液性ポリエチレングリコール等)ならびにそれらの適当な混合液を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により、保持し得る。微生物作用の保護は、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等、により達成される。多くの場合に、組成物中に、等張性薬剤、例えば、砂糖、マニトールのようなポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成剤の吸収の延長は、組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによりもたらせ得る。
無菌注射用溶液を、適切な溶媒の中に一つまたは上で列挙した成分の組合せと共に必要な量で活性化合物(例えば、あるＮＯＶＸタンパク質または抗ＮＯＶＸ抗体)を組み込み、ついでろ過滅菌を行なうことにより調製することができる。一般的に、分散液は、基本的な分散媒体および上で列挙したものから必要な他の成分を含有する無菌ビークルの中に活性化合物を組み込むことにより調製することができる。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合には、調製方法は、活性成分の粉末プラス前もって無菌ろ過されたその溶液からの任意のさらに別の望ましい成分の粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥である。
一般的に、経口の組成物は、不活性賦形剤または食用の担体を含む。それらをゼラチンカプセル中に封入するかまたは錠剤に打錠することができる。経口治療投与の目的には、活性化合物を添加物と共に組込んで錠剤、トローチまたはカプセルの形状で使用することができる。経口の組成物をまた、うがい薬としての使用のために液体担体を用いて調製し得るが、そこでは液体担体中の化合物を経口的に塗布し、さっと取り除いて、吐き出すか飲み込む。薬学的に適合する結合剤、おおび／またはアジュバント材料を組成物の一部として含み得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は任意の以下の成分または同様な性質を持つ化合物を含有し得る：微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンのような結合剤；デンプンまたは乳糖のような添加剤、アルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロートのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような滑り剤；ショ糖またはサッカリンのような甘味剤；またはハッカ、サルチル酸メチル、オレンジ香料のような着香剤。
吸入による投与のためには、化合物を、適当な噴射剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含有する加圧容器またはディスペンザー、またはネブライザーからエアゾールスプレイの形式で送達し得る。
全身的投与はまた、経粘液または経皮手段により得る。経粘液または経皮投与のためには、透過すべきバリアーに適切な浸透剤を処方に使用する。そのような浸透剤は当該分野において一般的に公知であり、そして、例えば、経粘液投与のためには、洗剤、胆汁酸塩、フシジン酸誘導体を挙げ得る。経粘液投与は鼻腔スプレーまたは坐剤の使用により達成され得る。経皮投与のためには、活性化合物は、当該分野において一般的に公知であるように、軟膏、軟膏剤、ゲルまたはクリームの中に処方される。
化合物をまた、直腸送達のために坐薬(例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤用基材と共に)または保持浣腸剤の形式で調製し得る。
一つの実施形態において、活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤のように、化合物を身体からの迅速な排泄から防止する担体と共に調製する。酢酸エチレンビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ酢酸のような、生物分解性で生体適合性のポリマーを使用し得る。そのような製剤を調製する方法は当業者に明らかである。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から市販で入手可能である。リポソームの懸濁液(モノクローナル抗体を持つ感染した細胞からウイルス抗体に至って標的化したリポソームを含む)をまた、医薬的に許容され得る担体として使用することができる。これらを、例えば米国特許第４,５２２,８１１号に記載のように、当業者に公知の方法に従い調製し得る。
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、経口性または非経口性の組成物を単位投与剤型で処方することが特に有益である。本明細書で使用する単位投与剤型とは、処置する対象に対して単一の投与量として適する物理学的に分離した単位を指し；それぞれの単位は、必要な薬学的な担体と一緒に望ましい治療効果を生じるように計算した予め決められた量の活性化合物を含有する。本発明の単位投与剤型の規格は、活性化合物の特異な特色および達成するべき特別な治療効果、ならびにそのような活性化合物を個体の処置のために配合する当該分野に固有の制限により指示されかつ直接に依存する。
本発明の核酸分子をベクターの中に挿入して遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターを、例えば、静脈注射、局所投与により(例えば、米国特許第５,３２８,４７０号を参照)または走触性注射(例えば、Chen, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057を参照)により送達し得る。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容される賦形剤の中に遺伝子治療ベクターを含むか、またはその中に遺伝子治療ベクターを埋め込んだ持続性マトリックスを含み得る。これに代えて、完全な遺伝子治療ベクターを組換え細胞、例えばレテロウイルスベクターから無傷で生産し得る場合には、医薬製剤は遺伝子送達システムを生産する一つまたはそれ以上の細胞を含み得る。
医薬製剤を、投与指示書と共に、容器、パックまたはディスペンサーの中に含み得る。
スクリーニングおよび検出の方法
以下に詳述するように、本発明の単離核酸分子を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を発現し(例えば、遺伝子治療応用において宿主細胞中で組換え発現ベクターを介して)、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡ(例えば、生物学的試料中の)またはＮＯＶＸ遺伝子中の遺伝的欠損を検出し、そしてＮＯＶＸ活性を調整することができる。加えて、ＮＯＶＸタンパク質を用いて、ＮＯＶＸタンパク質の活性または発現を調整する薬または化合物をスクリーニングし、ならびにＮＯＶＸタンパク質の不十分なまたは過剰な生産、またはＮＯＶＸの野生型タンパク質と比較して低下または異常な活性を有するＮＯＶＸタンパク質型の生産を特徴とする疾患(例えば；糖尿病(インスリン放出を調節する)；肥満(脂質に結合し輸送する)；肥満に関連した代謝障害、代謝的シンドロームＸならびに慢性障害および種々のがんに随伴する食欲不振および消耗性障害、ならびに感染性疾患(抗微生物活性を有する)および種々の異脂肪血症を処置し得る。加えて、本発明の抗ＮＯＶＸ抗体を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を検出しかつ単離し、そしてＮＯＶＸ活性を調整し得る。なおさらなる態様では、本発明を方法で使用して、食欲、栄養の吸収および代謝基質の処分を正および負の両方の様式で影響させることができる。
本発明はさらに、本明細書に説明するスクリーニングアッセイで同定する新規な薬剤および上述の処置のためのそれらの使用に関する。
スクリーニングアッセイ
本発明は、モジュレーター、即ち、ＮＯＶＸタンパク質に結合するか、または、例えばＮＯＶＸタンパク質の発現またはＮＯＶＸタンパク質の活性に促進的または阻害的作用を有する候補または試験化合物または薬剤(例えば、ペプチド、ペプチドミメティクス、低分子または他の薬)を同定する方法(本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも呼称する)を提供する。本発明はまた、本明細書に説明するスクリーニングアッセイにおいて同定した化合物を含む。
一つの実施形態では、本発明は、膜結合型のあるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合するかまたは活性を調整する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物を、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス参照可能な並列の固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成的ライブラリー方法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー方法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー方法：を含む、当該分野において周知のコンビナトリアルライブラリーにおける数多くのアプローチのいずれを用いても得られる。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに限定される一方で、他の４種のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である。例えば、Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145を参照されたい。
本明細書において使用する「低分子」とは、約５ｋＤ未満の、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物を指す。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティクス、炭水化物、脂質または他の有機のまたは無機の分子であり得る。化学的および／または、真菌、細菌、または藻類の抽出物のような、生物学的混合物は当該分野において公知であり、本発明の任意のアッセイを用いてスクリーニングすることができる。
分子ライブラリー合成方法の例を、例えば、DeWitt, et al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909、Erb, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 11422、Zuckermann, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 2678、Cho, et al., 1993. Science 261: 1303; Carrell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059、Carell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061、およびGallop, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 1233における当該分野に見出し得る。
化合物のライブラリーを、溶液中で(例えば、Houghten, 1992. Biotechniques 13: 412-421)、またはビーズ上で(Lam, 1991. Nature 354: 82-84)、チップ上で(Fodor, 1993. Nature 364: 555-556)、バクテリア(Ladner, 米国特許第５,２２３,４０９号)、胞子 (Ladner, 米国特許第５,２３３,４０９号)、プラスミド (Cull, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869)上でまたはファージ上で(Scott and Smith, 1990. Science 249: 386-390; Devlin, 1990. Science 249: 404-406、Cwirla, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 6378-6382、Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222: 301-310、Ladner, 米国特許第５,２３３,４０９号)で提供し得る。
ある実施形態では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、そこでは膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触させ、そして試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質に結合する能力を測定する。細胞は、例えば、哺乳動物由来または酵母細胞であり得る。試験化合物がＮＯＶＸタンパク質に結合する能力を測定することは、例えば、試験化合物を放射性同位元素または酵素標識とカップリングして、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分への試験化合物の結合を、複合物中の標識化合物を検出することにより測定できるようにする。例えば、試験化合物を、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで直接的にまたは間接的に標識し、そして放射性同位元素を放射線放射の直接計数またはシンチレーション計数により検出する。これに代えて、試験化合物を、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼにより酵素的に標識し、そして適切な基質の生産物への変換の測定により酵素標識を検出する。ある実施形態では、アッセイは、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を、ＮＯＶＸに結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成して、アッセイ混合物を試験化合物と接触し、そして試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に、既知化合物と比較して優先的に結合する能力を測定することを含む。
もう一つの実施形態では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調整する(例えば促進または阻害する)能力を測定することを含む。試験化合物がＮＯＶＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調整する活性を測定することは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子と結合するかまたは相互作用をする能力を測定することにより達成し得る。本明細書において使用する「標的分子」とは、自然界であるＮＯＶＸタンパク質が結合または相互作用する分子、例えば、あるＮＯＶＸと相互作用するタンパク質を発現する細胞表面の分子、２番目の細胞表面の分子、細胞外の環境中の分子、細胞膜の内側表面と会合している分子または細胞質の分子である。ＮＯＶＸの標的分子は、非ＮＯＶＸ分子または本発明のあるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。一つの実施形態では、あるＮＯＶＸの標的分子は、細胞外のシグナル(例えば、膜結合ＮＯＶＸ分子への化合物の結合により発生するシグナル)を細胞膜を通してかつ細胞内への伝達を促進する情報伝達経路の成分である。標的は、例えば、触媒活性を有する２番目の細胞内タンパク質または下流のシグナル分子とＮＯＶＸとの会合を促進するタンパク質であり得る。
ＮＯＶＸタンパク質をあるＮＯＶＸの標的分子と結合するかまたは相互作用をする能力を測定することは、直接的な結合を測定する上述の方法の一つにより達成し得る。一つの実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子と結合または相互作用する能力を測定することは、標的分子の活性を測定することにより達成することができる。例えば、標的分子の活性を、標的の細胞性第二のメッセンジャー(即ち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３等)の誘導を検出すること、適切な基質に対する標的の触媒／酵素活性を検出すること、受容体遺伝子(検出可能なマーカー、例えば、ルシフェラーゼ、をコードする核酸に機能し得るように結合したＮＯＶＸ応答性調節要素を含む)の誘導を検出すること、または細胞応答、例えば、細胞の生存、細胞の分化、または細胞の増殖、を検出することにより測定し得る。
なおもう一つの実施形態では、本発明のアッセイは無細胞アッセイであって、あるＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を測定することを含む。ＮＯＶＸタンパク質への試験化合物の結合を、上述のように、直接的または間接的のどちらかで測定することができる。一つのそのような実施形態では、アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分をＮＯＶＸと結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触すること、および試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に既知化合物と比較して優先的に結合する能力を測定することを含む。
なおもう一つの実施形態では、アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質の活性を調整する(例えば促進または阻害する)能力を測定することを含む無細胞アッセイである。ＮＯＶＸの活性を調整する試験化合物の能力を測定することは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子に結合する活性を直接な結合を測定するために上述した方法の一つにより達成することができる。さらに別の実施形態では、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質の活性を調節する能力を測定することは、ＮＯＶＸタンパク質がさらにあるＮＯＶＸの標的分子を調整する能力を測定することにより達成することができる。例えば、適切な基質に対する標的分子の触媒／酵素活性を上述のように測定することができる。
なおもう一つの実施形態では、無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分をＮＯＶＸタンパク質と結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触すること、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子に優先的に結合するかまたはその活性を調整する能力を測定することを含む。
本発明の無細胞アッセイは、可溶性型または膜結合型のＮＯＶＸタンパク質の両方に使用することができる。膜結合型のＮＯＶＸタンパク質を含む無細胞アッセイの場合には、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質を溶液中に維持するように、可溶化剤を利用するのが望ましい。そのような可溶化剤の例としては、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ[登録商標]Ｘ-１００、Ｔｒｉｔｏｎ[登録商標]Ｘ-１１４、Ｔｈｅｓｉｔ[登録商標]、イソトリデシポリ(エチレングリコールエーテル)ｎのような非イオン性界面活性剤、Ｎ−ドデシル−Ｎ,Ｎ−ジメチル−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−(３−クロルアミドプロピル)ジメチルアミニオール−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳ)、または３−(３−クロルアミドプロピル)ジメチルアミニオール−２ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳＯ)を挙げ得る。
本発明の上記のアッセイ法の二つ以上の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子を固相化して、一つまたは両方のタンパク質の非複合型から複合型の分離を容易にし、ならびにアッセイの自動化に適合することができる。試験化合物のＮＯＶＸタンパク質への結合、または候補化合物存在下および非存在下でのＮＯＶＸタンパク質と標的分子との相互作用は、反応物質を含有するのに適する任意の容器において達成することができる。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心チューブを挙げ得る。一つの実施形態では、一つまたは両方のタンパク質をマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供し得る。例えば、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質またはＧＳＴ−標的融合タンパク質をグルタチオンセファローズビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)またはグルタチオンで誘導体化したマイクロタイタープレート上に吸着し、これを次いで試験化合物、または試験化合物および非吸着標的タンパク質またはＮＯＶＸタンパク質のどちらかと結合し、そして混合物を複合体形成を促進する条件下で(例えば、塩およびｐＨに関して生理的な条件で)インキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレート穴を洗滌して、非結合成分を全て除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定化し、複合体を例えば上述のように、直接的にまたは間接的に測定する。これに代えて、複合体をマトリックスから解離し、そしてＮＯＶＸタンパク質の結合または活性レベルを標準的技術を用いて測定することもできる。
マトリックス上にタンパク質を固定化する他の技術をまた、本発明のスクリーニングアッセイに使用し得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子のいずれかをビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。ビオチニル化ＮＯＶＸタンパク質または標的分子をビオチン−ＮＨＳ(Ｎ−ヒドロキシ−サクシンイミド)から当該分野内で周知の技術(例えば、ビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill.)を用いて調製して、ストレプトアビジンをコーティングした９６穴プレート(Pierce Chemical)の穴に固定化することができる。これに代えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応性であるが、ＮＯＶＸタンパク質のその標的タンパク質への結合を妨害しない抗体をプレートの穴に誘導体化して、非結合標的またはＮＯＶＸタンパク質を抗体との結合により穴に捕捉することができる。そのような複合体を検出する方法としては、ＧＳＴ−固定化複合体について上述したものに加えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応する抗体を用いる複合体の免疫検出、ならびにＮＯＶＸタンパク質または標的分子に関連した酵素活性を検出することに依存する酵素結合アッセイを挙げ得る。
もう一つの実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質発現のモジュレータを、細胞を候補化合物と接触し、細胞中のＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定する方法で同定する。候補化合物の存在下でのＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを、候補化合物の非存在下でのＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較する。次いで、候補化合物を、この比較に基づいてＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質のモジュレータとして同定し得る。例えば、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を候補化合物の存在下での方がその非存在下でよりも多い(即ち統計的に有意に多い)ときには、候補化合物を、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の促進剤として同定する。これに代えて、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の存在下での方がその非存在下でよりも少ない(即ち統計的に有意に少ない)ときには、候補化合物を、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤として同定する。細胞中のＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルを、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書で説明する方法により測定することができる。
本発明のなおもう一つの態様では、ＮＯＶＸタンパク質は２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイ(例えば米国特許第5,283,317号、Zervos, et al., 1993. Cell 72: 223-232、Madura, et al., 1993. J. Biol. Chem. 268: 12046-12054、Bartel, et al., 1993. Biotechniques 14: 920-924、Iwabuchi, et al., 1993. Oncogene 8: 1693-1696、および Brent 第ＷＯ９４／１０３００号を参照)おける「ベイトタンパク質」として使用して、ＮＯＶＸと結合または相互作用をしてＮＯＶＸ活性を調整する他のタンパク質(「ＮＯＶＸ結合タンパク質」または「ＮＯＶＸ−ｂｐ」)を同定し得る。そのようなＮＯＶＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＮＯＶＸ経路の上流または下流の要素としてＮＯＶＸタンパク質によるシグナルの増幅に関与する可能性が高い。
２ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインより成る殆どの転写因子のモジュール構成的性質に基づく。略述すれば、アッセイには２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物においては、ＮＯＶＸをコードする遺伝子を既知の転写因子(例えば、ＧＡＬ−４)のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。他の構築物においては、未同定のタンパク質(「プレイ」または「試料」)をコードするＤＮＡ配列ライブラリー由来のＤＮＡを、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。もし「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用してＮＯＶＸ依存性複合体を形成することができれば、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインを近くに引き寄せ得る。この近接は、転写因子に応答性の転写調節部位に機能し得るように結合したレポーター遺伝子(例えば、ＬａｃＺ)の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現を検出し、機能的転写因子を含有する細胞コロニーを単離し、そしてこれを用いてＮＯＶＸと相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得ることができる。
本発明はさらに前述のスクリーニングアッセイにより同定する新規薬剤および本明細書に説明する処置へのその使用に関する。
検出アッセイ
本明細書で同定するｃＤＮＡの一部またはフラグメント(および対応する完全な遺伝子配列)をポリヌクレオチド試薬として種々の方式で使用することができる。例として、限定は無しに、これらの配列を：(i)染色体上にそれぞれの遺伝子をマップし；かくして遺伝的疾患に関連した遺伝子領域を位置決定する；(ii)微量の生物学的試料から個体を同定する(組織タイピング)；および(iii)生物学的試料の法医学的同定を助けるために用い得る。これらの応用の幾つかを以下のサブセクションで説明する。
染色体マッピング
一旦遺伝子の配列(または配列の一部)を単離すれば、この配列を用いて、染色体上の遺伝子の位置をマップすることができる。この方法を染色体マッピングと呼ぶ。したがって、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜６６の整数である)であるＮＯＶＸ配列の一部またはフラグメント、またはそれらのフラグメントまたは誘導体を用いて、染色体上のＮＯＶＸ遺伝子の位置をそれぞれマップし得る。染色体へのＮＯＶＸ配列のマッピングは、これらの配列を疾患に関連する遺伝子と相関づける重要な第一歩である。
略述すれば、ＮＯＶＸ遺伝子を、ＮＯＶＸ配列からＰＣＲプライマー(好ましくは１５−２５ｂｐ長)を調製することにより染色体にマップし得る。ＮＯＶＸ配列のコンピューター分析を使用して、そのため増幅プロセスを複雑にする、ゲノムＤＮＡ中の二つ以上のエキソンに亘らないプライマーを迅速に選択し得る。次いで、これらのプライマーを、個別のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用し得る。ＮＯＶＸ配列に対応するヒト遺伝子を含有するそれらのハイブリッドのが、増幅したフラグメントを生成する。
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物由来の体細胞(例えば、ヒトおよびマウスの細胞)を融合することにより調製する。ヒトおよびマウスの細胞のハイブリッドが増殖し、分裂するうちに、それらはヒト染色体をランダムな順序で徐々に欠失するが、マウスの染色体を保持する。特定の酵素を欠くためマウス細胞は増殖できないが、ヒト細胞は増殖できる培地を用いることにより、必要とする酵素をコードする遺伝子を含有する一つのヒト染色体を保持する。種々の培地を使用することにより、ハイブリッド細胞株のパネルを樹立し得る。パネル中のそれぞれの細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体、および完全なセットのマウス染色体を含有し、個別の遺伝子を特定のヒト染色体に容易にマップすることを可能にする。例えば、D'Eustachio, et al., 1983. Science 220: 919-924を参照されたい。ヒト染色体のフラグメントのみを含有する体細胞ハイブリッドをまた、転座および欠失を持つヒト染色体を用いることにより生産し得る。
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の配列を特定の染色体に対応付ける迅速な手順である。単一のサーマルサイクラーを用いて、１日に３個以上の配列を対応付けることが可能である。ＮＯＶＸ配列を用いてオリゴヌクレオチドプライマーをデザインすることにより、特定の染色体由来のフラグメントのパネルを用いて細かな局在部位の特定化を達成し得る。
分裂中期の染色体スプレッドへのＤＮＡ配列の蛍光インシツハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)をさらに用いて、正確な染色体上の位置を１ステップで提供し得る。染色体スプレッドを、コルセミドのような紡錘体を破壊する化学物質により細胞分裂を分裂中期でブロックされている細胞を用いて作成し得る。染色体を短時間トリプシンで処理し、次いでギムザ染色し得る。明暗のバンドのパターンがそれぞれの染色体上に出現し、それにより染色体を個別に同定し得る。ＦＩＳＨ技術を５００または６００塩基と短いＤＮＡ配列で使用し得る。しかしながら、１０００塩基より大きなクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度で特定の染色体上の位置に結合する可能性がより高い。好ましくは１０００塩基、そしてさらに好ましくは２０００塩基が合理的な時間に良好な結果を得るのに十分である。この技術の総説については、Verma, et al., HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES (Pergamon Press, New York 1988を参照されたい。
染色体マッピング用の試薬を個別に使用して、単一の染色体またはその染色体上の単一の部位を標識すること、または試薬のパネルを複数の部位および／または複数の染色体を標識するために使用し得る。遺伝子の非コード化領域に対応する試薬が実際には、マッピングの目的には好ましい。コード化領域を遺伝子ファミリー内で保存する可能性がより高く、かくして染色体マッピングの間に交叉ハイブリダイゼーションのチャンスが増大する。
一旦配列を正確な染色体上の位置にマッピングすると、染色体上の配列の物理的な位置を遺伝子マップのデータと関連づけ得る。そのようなデータを、例えば、in McKusick, Mendelian Inheritance in Man (Hopkins University Welch Medical Libraryを通してオンラインで入手可能)に見出す。同じ染色体部位にマッピングした遺伝子と疾患との間の関係を、次いで、例えば、Egelおよび, et al., 1987. Nature, 325: 783-787に記載する関連分析(物理的に隣接している遺伝子の同時遺伝)により同定し得る。
さらに、ＮＯＶＸ遺伝子に関連した疾患に罹患している個体と罹患していない個体の間のＤＮＡ配列の差を測定し得る。もし変異を罹患している個体のいくらかまたは全部で観察するが、罹患していない個体のいずれでも観察しないならば、変異は特定の疾患の原因剤である可能性が高い。罹患した個体と罹患していない個体の比較は一般的に、まず染色体スプレッドから視認可能な欠失または転座のような染色体の目に見える構造変化、またはそのＤＮＡ配列に基づくＰＣＲの使用で検出可能な構造変化の探索を伴う。最後に、数人の個体由来の遺伝子の完全なシークエンシングを行って、変異の存在を確認し、そして変異を多型性と区別し得る。
組織タイピング
本発明のＮＯＶＸ配列をまた使用して、微量な生物学的試料から個体を同定し得る。この技術では、個体のゲノムＤＮＡを一つまたはそれ以上の制限酵素で消化して、サザンブロット上でプローブ結合し、同定用のユニークなバンドを生成する。本発明の配列は、ＲＦＬＰ(制限断片長多型、米国特許第５,２７２,０５７号に記載)のさらに別なＤＮＡマーカーとして有用である。
さらに、本発明の配列を使用して、個体のゲノムの選択した部分の実際の塩基ごとのＤＮＡ配列を測定するさらに別な技術を提供し得る。かくして、本明細書に説明したＮＯＶＸ配列を用いて、配列の５'末端および３'末端から二つののＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを用いて、個体のＤＮＡを増幅し、引き続いてこれをシークエンシングし得る。
それぞれの個体は、対立遺伝子の違いによるそのようなＤＮＡの特徴的セットを有するため、この様式で調製した個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、特徴的個体の同定を提供し得る。本発明の配列を使用して、個体および組織由来のそのような同定配列を得ることができる。本発明のＮＯＶＸ配列は、ヒトゲノムの部分を特徴的に表現する。対立遺伝子の変異は、これらの配列のコード化領域中にある程度起こり、そして非コード化領域中にはより大きな程度で起こる。個別のヒト間の対立遺伝子の変異は、５００塩基に約１個の頻度で起こるとみつもられる。対立遺伝子変異の多くは、制限断片長多型(ＲＦＬＰ)を含む単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に因る。
本明細書に説明する配列のそれぞれを、個体由来のＤＮＡを同定の目的で比較し得る標準として、ある程度、使用し得る。非コード化領域にはより多くの遺伝子多型が起こるため、個体を識別するにはより少ない配列が必要である。非コード化配列は、それぞれが１００塩基の非コード化増幅配列を生じる多分１０〜１０００個のプライマーのパネルにより個体の明白な同定を無理なく提供し得る。もし配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜６６の整数である)の配列のような予想するコード化配列を使用すれば、明白な個体の同定のためのさらに適切なプライマーの数は５００〜２０００である。
予測医学
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミクス、および臨床試験のモニタリングを予後的(予測的)目的で使用し、それにより個体を予防的に処置する、予測医学の分野に関する。したがって、本発明の１つの態様は、ＮＯＶＸタンパク質および／または核酸の発現ならびにＮＯＶＸ活性を生物学的試料(例えば、血液、血清、細胞、組織)との関連で測定して、それにより個体が異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害に罹患しているか、または障害を発症するリスクを有しているか否かを測定するための診断アッセイに関する。障害としては、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、がん関連悪液質、がん、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異脂肪血症、肥満に伴う代謝障害、代謝性シンドロームＸならびに慢性疾患および種々のがんに関連した消耗性疾患を挙げ得る。本発明はまた、個体がＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または活性に関連した障害を発症するリスクを有しているか否かを測定するための予後的(予測的)アッセイを提供する。例えば、あるＮＯＶＸ遺伝子の突然変異を生物学的試料中でアッセイし得る。そのようなアッセイを、予後的または予測的目的に使用し、それによりＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または生物学的活性を特徴とするかまたはこれと関連する障害の発生に先立って個体を予防的に処置し得る。
本発明のもう一つの態様は、個体におけるＮＯＶＸタンパク質、核酸発現または活性を測定し、それによりその個体にとって適切な治療的または予防的な薬剤を選択する方法(本明細書では「薬理ゲノミクス」と呼称する)を提供する。薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型に基づいた個体の治療的または予防的処置のための薬剤(例えば薬)の選択を可能にする(例えば、個体の遺伝子型を検査して、個体が特定の薬剤に応答する能力を測定する)。
本発明のなおもう一つの態様は、薬剤(例えば、薬、化合物)が臨床試験においてＮＯＶＸの発現または活性に与える影響をモニタリングすることに関する。
これらおよび他の薬剤については以下のセクションで詳細に説明する。
診断的アッセイ
生物学的試料中におけるＮＯＶＸの存在または非存在を検出する例示的な方法は、被験対象から生物学的試料を得ること、および生物学的試料をＮＯＶＸタンパク質またはＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)を検出する能力のある化合物または薬剤と接触し、ＮＯＶＸの存在が生物学的試料中で検出できるようにすることを伴う。ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの検出用の薬剤は、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとハイブリダイズする能力のある標識核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜６６の整数である)の核酸のような全長ＮＯＶＸ核酸、または少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長でそして厳密な条件下でＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドの一部である。本発明の診断的アッセイにおいて使用するための他の適当なプローブを本明細書で説明する。
ＮＯＶＸタンパク質検出用の薬剤は、ＮＯＶＸタンパク質に結合する能力のある抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはさらに好ましくはモノクローナルであり得る。インタクトな抗体、またはそのフラグメント(例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ')２)を使用し得る。プローブまたは抗体に関する用語「標識」とは、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングする(即ち物理的に連結する)ことによりプローブまたは抗体を直接的に標識すること、ならびに直接標識したもう一つの試薬との反応性によりプローブまたは抗体を間接的に標識することを包含する。間接的な標識の例としては、蛍光標識した第２抗体を用いた第１抗体の検出、および蛍光標識したストレブトアビジンで検出し得るように、ビオチンでＤＮＡプローブを末端標識することを挙げ得る。用語「生物学的試料」とは、対象から単離した組織、細胞および生物学的流体、ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含む。即ち、本発明の検出法を使用して、インビトロおよびインビボで生物学的試料中のＮＯＶＸ ｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡを検出し得る。例えば、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインシツハイブリダイゼーションを挙げ得る。ＮＯＶＸタンパク質を検出するためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)、ウエスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光を挙げ得る。ＮＯＶＸゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションを挙げ得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質を検出するためのインビボ技術は、対象中へ標識抗ＮＯＶＸ抗体を導入することを含む。例えば、抗体を、対象中のその存在および位置を標準的な造影技術で検出し得る放射活性マーカーで標識することができる。
一つの実施形態では、生物学的試料は被験対象由来のタンパク質分子を含有する。これ代えて、生物学的試料は、被験対象由来のｍＲＮＡ分子または被験対象由来のゲノムＤＮＡ分子を含有し得る。好ましい生物学的試料は、対象より従来の手段で単離した末梢血白血球試料である。
もう一つの実施形態では、方法は、対照対象から対照の生物学的試料を得ること、対照試料をＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出する能力のある化合物または薬剤と、ＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を生物学的試料中で検出するように接触すること、および対照試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を試験試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと比較することをさらに伴う。
本発明はまた、生物学的試料中のＮＯＶＸの存在を検出するキットを包含する。例えば、キットは：生物学的試料中のＮＯＶＸタンパク質またはｍＲＮＡを検出する能力のある標識化合物または薬剤；試料中のＮＯＶＸの量を測定する手段；および試料中のＮＯＶＸの量を標準と比較する手段を含み得る。化合物および薬剤を適当な容器中に包装し得る。キットは、ＮＯＶＸタンパク質または核酸を検出するキットの使用のための使用説明書をさらに含み得る。
予後アッセイ
さらに、本明細書に説明する診断方法を利用して、異常ＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。例えば、先行の診断アッセイおよび以下のアッセイのような、本明細書で説明するアッセイを利用して、ＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または活性に関連した障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。これに代えて、予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。かくして、本発明は、試験試料を対象から得て、そして異常なＮＯＶＸタンパク質または核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)を検出する異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を同定する方法を提供し、そこではＮＯＶＸタンパク質または核酸の存在は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象に対する診断になる。本明細書において使用する「試験試料」とは、興味のある対象から得られる生物学的試料を指す。例えば、試験試料は生物学的流体(例えば血清)、細胞試料、または組織であり得る。
さらに、本明細書に説明する予後アッセイを使用して、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を処置するために、対象に薬剤(例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の医薬候補物)を投与することができるか否かを決定し得る。例えば、そのような方法を使用して、対象の疾患を薬剤により有効に処置するか否かを決定し得る。かくして、本発明は、試験試料を得て、ＮＯＶＸタンパク質または核酸を検出する異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した障害を薬剤により対象を有効に処置し得るか否かを決定する方法を提供する(例えば、そこではＮＯＶＸタンパク質または核酸の存在は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した障害を処置するために薬剤を投与され得る対象に対する診断になる)。
本発明の方法をまた使用してあるＮＯＶＸ遺伝子中の遺伝的損傷を検出し、それにより損傷のある遺伝子を有する対象が異常な細胞増殖および／または分化を特徴とする障害のリスクにあるか否かを決定し得る。種々の実施形態において、これらの方法は、対象由来の細胞試料中において、あるＮＯＶＸタンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を及ぼす少なくとも一つの変更、またはＮＯＶＸ遺伝子の誤発現を特徴とする遺伝的損傷の存在または不在の検出を含む。例えば、そのような遺伝的損傷を、(i)あるＮＯＶＸ遺伝子からの一つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失；(ii)あるＮＯＶＸ遺伝子への一つまたはそれ以上のヌクレオチドの付加；(iii)あるＮＯＶＸ遺伝子の一つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、(iv)あるＮＯＶＸ遺伝子の染色体上の移動、(v)あるＮＯＶＸ遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベルの変化、(vi)ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのようなあるＮＯＶＸ遺伝子の異常修飾、(vii)あるＮＯＶＸ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、(viii)あるＮＯＶＸタンパク質の非野生型レベル、(ix)あるＮＯＶＸ遺伝子の対立遺伝子欠失、および(ｘ)あるＮＯＶＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾の少なくとも一つの存在の確認により検出し得る。本明細書に説明するあるＮＯＶＸ遺伝子の損傷を検出するために使用し得る当該分野において公知の多数のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的試料は、対象から従来の手段で単離した末梢血白血球試料である。しかしながら、例えば、頬粘膜細胞を含む有核細胞を含有する任意の生物学的試料を使用し得る。
特定の実施形態では、損傷の検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)(例えば米国特許第４,６８３,１９５号および第４,６８３,２０２号を参照)におけるかまたはこれに代えて、連結連鎖反応(ＬＣＲ)(例えば、Lおよびegran, et al., 1988. Science 241: 1077-1080、およびNakazawa, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 360-364を参照)におけるプローブ／プライマーの使用を伴うが、後者はＮＯＶＸ遺伝子中の点突然変異検出に特に有用であり得る(Abravaya, et al., 1995. Nucl. Acids Res. 23: 675-682を参照)。この方法は、患者から細胞試料を集め、試料の細胞から核酸(例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方)を単離し、ＮＯＶＸ遺伝子(もし存在するならば)のハイブリダイゼーションおよび増幅が起きるような条件下で、あるＮＯＶＸ遺伝子と特異的にハイブリダイズする一つまたはそれ以上のプライマーと核酸試料を接触し、そして増幅産物の存在または不在を検出し、または増幅産物のサイズを検出し、そして対照試料と長さを比較するステップを含み得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に説明する変異の検出に使用する任意の技術と一緒に予備的増幅ステップとして使用するのが望ましい。
さらに別な増幅法としては：自己保持配列複製(Guatelli, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878を参照)、転写増幅システム(Kwoh, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177を参照); Ｑβレプリカーゼ(Lizardi, et al, 1988. BioTechnology 6: 1197を参照)、または任意の他の核酸増幅法に引き続いて当業者に周知の技術を用いる増幅分子の検出を挙げ得る。これらの検出スキームは、核酸分子がごく少数で存在するならば、そのような分子の検出に特に有用である。
さらに別の実施形態では、試料細胞由来のあるＮＯＶＸ遺伝子中の変異を、制限酵素切断パターンの変化により同定し得る。例えば、試料および対照のＤＮＡを単離し、増幅し(任意に)、一つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで処理し、そしてフラグメントのサイズをゲル電気泳動で測定して比較する。試料と対照のＤＮＡ間のフラグメントサイズの差は試料ＤＮＡ中の変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム(例えば、米国特許第５,４９３,５３１号を参照)を使用して、リボザイム切断部位の発生または消失により特異的な変異の存在を評価し得る。
他の実施形態では、ＮＯＶＸ中の遺伝的突然変異は、試料および対照の核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを数百または数千個のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイにハイブリダイズすることにより同定することができる。例えば、Cronin, et al., 1996. Human Mutation 7: 244-255、Kozal, et al., 1996. Nat. Med. 2: 753-759を参照されたい。例えば、ＮＯＶＸ中の遺伝的変異を、上述のCronin, et al.に記載するように光を発生するＤＮＡプローブを含有する２次元アレイ中で同定し得る。略述すれば、プローブの１番目のハイブリダイゼーションアレイを用いて、試料と対照中の長い一続きのＤＮＡをスキャンして、一連の重なり合うプローブの線形アレイを作成することにより配列間の塩基変化を同定し得る。このステップは点突然変異の同定を可能にする。これに、検出した全ての変異体または突然変異に相補的なさらに小さな特別のプローブアレイを用いることにより特定の変異の特徴化を可能にする２番目のハイブリダイゼーションを行う。それぞれの変異アレイは、一つは野生型遺伝子に相補的で、他は突然変異遺伝子に相補的な並行なプローブのセットから成る。
なおもう一つの実施形態において、当該分野において公知の種々のシークエンシング反応のいずれかを使用してＮＯＶＸ遺伝子を直接にシークエンシングして、試料のＮＯＶＸの配列を対応する野生型(対照)配列と比較することにより変異を検出し得る。シークエンシング反応の例としては、Maxim and Gilbert, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560またはSanger, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463により開発された技術に基づくものを挙げ得る。質量分析によるシークエンシング(例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４／１６１０１号; Cohen, et al., 1996. Adv. Chromatography 36: 127-162およびGriffin, et al., 1993. Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159を参照)を含む種々の自動化シークエンシング方法のいずれも診断アッセイの実施に際して利用され得ることをまた考え得る(例えば、Naeve, et al., 1995. Biotechniques 19: 448を参照)。
ＮＯＶＸ遺伝子中の変異を検出する他の方法としては、切断剤からの保護を用いてＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖中のミスマッチ塩基を検出する方法を挙げ得る。例えば、Myers, et al., 1985. Science 230: 1242を参照されたい。一般に、「ミスマッチ切断」の当該分野の技術は、野生型ＮＯＶＸ配列を含有する(標識した)ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織試料より得る潜在的突然変異体のＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズすることにより形成したヘテロ二重鎖を提供することから始まる。二重鎖を、対照および試料の鎖の間の塩基のミスマッチのために存在する二重鎖の単鎖領域を切断する薬剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖をＲＮａｓｅで処理し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処置し、ミスマッチ領域を酵素的に処理し得る。他の実施形態では、ミスマッチ領域を消化するために、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡの二重鎖のどちらかをヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理し得る。ミスマッチ領域の処理の後、得られた材料を次いで変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズにより分離して変異の部位を決定する。例えば、Cotton, et al., 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397、Saleeba, et al., 1992. Methods Enzymol. 217: 286-295を参照されたい。一つの実施形態では、対照のＤＮＡまたはＲＮＡを検出用に標識し得る。
なおもう一つの実施形態では、ミスマッチ切断反応は、細胞の試料より得られたＮＯＶＸｃＤＮＡ中で点突然変異を検出しマッピングするために、規定したシステム中で二重鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する一つまたはそれ以上のタンパク質(いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素)を使用する。例えば、E. coliのｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチのＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシダーゼはＧ／ＴミスマッチのＴを切断する。例えば、Hsu, et al., 1994. Carcinogenesis 15: 1657-1662を参照されたい。例示的な実施形態によれば、あるＮＯＶＸ配列、例えば、野生型ＮＯＶＸ配列に基づくプローブを、試験細胞(複数を含む)由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物とハイブリダイズする。この二重鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理して、切断生産物をもしあれば電気泳動のプロトコール等から検出し得る。例えば、米国特許第５,４５９,０３９号を参照されたい。
他の実施形態では、電気泳動上の移動度の変化を用いて、ＮＯＶＸ遺伝子の突然変異を同定する。例えば、単鎖コンフォーメーション多型(ＳＳＣＰ)を使用して、突然変異体および野生型核酸の間の電気泳動移動度の差を検出し得る。例えば、Orita, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 86: 2766、Cotton, 1993. Mutat. Res. 285: 125-144、Hayashi, 1992. Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79を参照されたい。試料および対照のＮＯＶＸ核酸の単鎖ＤＮＡフラグメントを変性し、復元することを可能にする。単鎖核酸の二次構造は配列により異なり、電気泳動上の移動度のそこで得る変化はたとえ１個の塩基変化の検出をも可能にする。ＤＮＡフラグメントを標識プローブで標識または検出し得る。アッセイの感度を、２次構造が配列変化により感受性であるＲＮＡ(ＤＮＡよりもむしろ)を使用することにより増大し得る。一つの実施形態では、主題の方法は、ヘテロ二重らせん分析を利用して、電気泳動の移動度の変化に基づいて二重らせんへテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Keen, et al., 1991. Trends Genet. 7: 5を参照されたい。
なおもう一つの実施形態では、ある勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲル中での突然変異体または野生型フラグメントの移動を、変性濃度勾配ゲル電気泳動(ＤＧＧＥ)を用いてアッセイする。例えば、Myers, et al., 1985. Nature 313: 495を参照されたい。ＤＧＧＥを分析法として使用する際、ＤＮＡを修飾し、例えば、凡そ４０ｂｐの高融点ＧＣ富化ＤＮＡのＧＣクランプをＰＣＲで付加することにより、それが完全に変性しないことを保証する。さらなる実施形態では、変性勾配に代えて温度勾配を使用して、対照および試料のＤＮＡの移動度の差を同定する。例えば、Rosenbaum and Reissner, 1987. Biophys. Chem. 265: 12753を参照されたい。
点突然変異を検出するための他の技術の例として、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長を挙げ得るが、これらに限定しない。例えば、既知の変異を中央に置いたオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで完全なマッチが見られる場合にのみハイブリダイゼーションを認める条件下で、標的ＤＮＡとハイブリダイズする。例えば、Saiki, et al., 1986. Nature 324: 163、Saiki, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230を参照されたい。オリゴヌクレオチドをハイブリダイズ用膜に付着して、標識した標的ＤＮＡとハイブリダイズする際、そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅した標的ＤＮＡまたはある数の異なる突然変異体とハイブリダイズする。
これに代えて、選択的ＰＣＲ増幅に基づく対立遺伝子特異的増幅技術を本発明と一緒に使用し得る。特異的増幅のためのプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドは、興味のある変異を分子の中央で(増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存するように；例えば、Gibbs, et al., 1989. Nucl. Acids Res. 17: 2437-2448を参照)または適切な条件下で、ミスマッチがポリメラーゼ伸長を阻止または低減できる(例えば、Prossner, 1993. Tibtech. 11: 238を参照)一つのプライマーの３'最末端において保持していてもよい。加えて、切断に基づく検出を創成するために、変異の領域に新規制限部位を導入するのが望ましい。例えば、Gasparini, et al., 1992. Mol. Cell プローブs 6: 1を参照されたい。特定の実施形態では、増幅はまた、増幅のためのＴａｑリガーゼを使用して実施され得ることを予想する。例えば、Barany, 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189を参照されたい。このような場合には、５'末端配列の３'末端に完全なマッチがある場合にのみ連結が起こり、増幅の存在または不在を調べることにより特定の部位における既知の変異の存在を検出することを可能にする。
本明細書に説明する方法を、例えば、本明細書に説明する少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含むプレパック診断キットを利用することにより実施し得る。これを、例えば、臨床の場においてＮＯＶＸ遺伝子の関与する疾患または疾病の症状を示すかまたは家族歴のある患者を診断するのに簡便に使用し得る。
さらに、ＮＯＶＸを発現する任意の細胞タイプまたは組織、好ましくは末梢血白血球を本明細書に説明した予後アッセイに利用し得る。しかしながら、例えば、頬粘膜細胞の有核細胞を含む任意の生物学的試料を使用し得る。
薬理ゲノミクス
本明細書に説明したスクリーニングアッセイにより同定するようなＮＯＶＸ活性(例えば、ＮＯＶＸ遺伝子発現)に促進的または阻害的効果を有する薬剤またはモジュレータを個体に投与し、障害を(予防的にまたは治療的に)処置することができる。障害としては、限定しないが、例えば、前記の疾病、障害および状態を含み、特に、表Ａに要約するようなＮＯＶＸタンパク質の相同物と関連した疾病、障害および状態を含む。そのような処置と一緒に、個体の薬理ゲノミクス(即ち、個体の遺伝子型および外来性化合物または薬に対するその個体の応答との間の関係の研究)を考慮し得る。治療薬の代謝の差は、薬理学的に活性な薬の用量と血中濃度の関係を変えることにより、重症の毒性または治療の失敗をもたらし得る。かくして、個体の薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型の考慮に基づく予防的または治療的処置ための有効な薬剤(例えば薬)の選択を許容する。そのような薬理ゲノミクスをさらに用いて、適切な投与量および治療方法を決定し得る。したがって、個体のＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、またはＮＯＶＸ遺伝子の変異の含量を測定し、それにより個体の治療的処置または予防的処置に適切な薬剤(複数を含む)を選択し得る。
薬理ゲノミクスは、罹患した人における変化した薬剤分布および異常な作用に因る薬への応答における臨床的に有意な遺伝的変異を取り扱う。例えば、Eichelbaum, 1996. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 23: 983-985; Linder, 1997. Clin. Chem., 43: 254-266を参照されたい。一般に、二つのタイプの薬理遺伝学的異常を区別し得る。薬が身体に作用する方式を変える単一の因子として伝達する遺伝的異常(変化した薬剤作用)または身体が薬に作用する方式を変える単一因子として伝達する遺伝的異常(変化した薬物代謝)がある。これらの薬理遺伝学的異常は、稀な欠陥または多型性のどちらかとして生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素(Ｇ６ＰＤ)欠乏症は、よくみられる遺伝性酵素異常症であり、そこでは主な臨床的合併症は、酸化剤の薬(抗マラリア剤、スルホンアミド剤、鎮痛剤、ニトロフラン類)摂取後またはソラマメ摂食後の溶血である。
例示的実施形態として、薬の代謝酵素の活性は、薬の作用の強度および持続の両者の主たる決定因子である。薬の代謝酵素の遺伝的多型性(例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２(ＮＡＴ２)ならびにチトクローム妊娠帯前駆タンパク質酵素のＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９)の発見は、なぜ或る患者は標準かつ安全用量の薬物摂取後に期待した薬の効果を得られないかまたは過大な薬の応答および重篤な毒性を示すのかについての説明を提供する。これらの多型性を、人口集団で高代謝群(ＥＭ)および低代謝群(ＰＭ)の２つの表現型で表現する。ＰＭの存在比率は異なる集団間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型性で、そして幾つかの変異が、機能的なＣＹＰ２Ｄ６の不在をもたらすＰＭを同定する。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低代謝群は、標準的な用量の投与を受けた際、極めて頻繁に過剰な薬の応答および副作用を経験する。代謝物が活性な治療成分であるならば、ＣＹＰ２Ｄ６が生成する代謝物モルヒネにより仲介するコデインの鎮痛作用について実証するように、ＰＭは治療応答を示さない。それと全く正反対なのが、標準の用量に応答しないいわゆる超高速代謝群である。最近、超高速代謝群の分子的根拠をＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に因ると確認する。
従って、個体のＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、またはＮＯＶＸ遺伝子の変異含量を測定し、それにより個体の治療的処置または予防的処置のために適切な薬剤(複数を含む)を選択し得る。加えて、薬理遺伝学的研究を用いて、薬の代謝酵素をコードする遺伝子多型の対立遺伝子の遺伝子型決定を、個体の薬の応答性の表現型の同定に応用し得る。この知識を投与量および薬の選択に応用する際、本明細書で説明する例示的スクリーニングアッセイの一つにより同定したモジュレータのようなＮＯＶＸモジュレータで対象を処置する際に、有害作用または治療失敗を避け、かくして治療的または予防的効率を増強し得る。
臨床試験の作用モニタリング
ＮＯＶＸの発現または活性(例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調整する活性)に対する薬剤(例えば、薬、化合物)の影響をモニタリングすることは、基礎的な薬のスクリーニングに応用できるだけでなく、また臨床試験にも応用できる。例えば、本明細書に説明したようにスクリーニングアッセイにより、ＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを増加し、またはＮＯＶＸ活性を上方調節すると決定した薬剤の有効性を、低下したＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、または下方制御されたＮＯＶＸ活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。これに代えて、ＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを減少し、またはＮＯＶＸ活性を下方調節すると決定した薬剤の有効性を、増加したＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、または上方制御したＮＯＶＸ活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。そのような臨床試験において、ＮＯＶＸ、および、好ましくは、例えば、細胞増殖または免疫障害に関係する他の遺伝子の発現または活性を、特定の細胞の免疫応答性の「読み出し」またはマーカーとして使用し得る。
限定しない例として、ＮＯＶＸ活性(例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定する)を調整する薬剤(例えば、化合物、薬または低分子)を用いた処置により細胞中で調整するＮＯＶＸを含む遺伝子を同定し得る。従って、細胞増殖障害に対する薬剤の効果を、例えば、臨床試験において検討するために、細胞を単離してＲＮＡを調製し、そして障害に関連すると思うＮＯＶＸおよび他の遺伝子の発現レベルを分析し得る。遺伝子発現レベル(即ち、遺伝子発現パターン)を、本明細書に説明するようにノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲにより、またはこれに代えて本明細書で説明する方法の一つにより生産したタンパク質の量を測定することにより、またはＮＯＶＸまたは他の遺伝子の活性レベルを測定することにより、定量することができる。この様式においては、遺伝子発現パターンは、薬剤に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとしての役割を果たす。したがって、薬剤による個体の処置の前および処置中の種々の時点で、この応答状態を測定し得る。
一つの実施形態において、本発明は、薬剤(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、核酸、低分子、または本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した他の薬候補物)で対象を処置することの有効性をモニターする方法を提供し、その方法は、(i)薬剤投与前に対象から投与前試料を得て、(ii)投与前試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出し、(iii)対象から一つまたはそれ以上の投与後の試料を得て、(iv)投与後の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを検出し、(v)投与前の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを投与後のひとつまたは複数の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡと比較し、そして(vi)それにしたがって対象への薬剤の投与を変更するステップを含む。例えば、ＮＯＶＸの発現または活性を検出したより高レベルに増加するためには、即ち、薬剤の有効性を増加するためには、薬剤の増加した投与が望ましい。これに代えて、ＮＯＶＸの発現または活性を検出したより低レベルに減少する、即ち、薬剤の有効性を減少するためには、薬剤の減少した投与が望ましい。
処置方法
本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患のリスクにある(感受性)かまたは疾患を有する対象を処置する予防的方法および治療的方法の両方を提供する。障害としては、限定しないが、例えば、前記の疾病、障害および状態を含み、特に、表Ａに要約するようなＮＯＶＸタンパク質の相同物と関連した疾病、障害および状態を含む。
これらの処置法を以下にさらに詳細に考察する。
疾患および障害
増加したレベル(疾患または障害に罹患していない対象と比べて)または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性に拮抗する(即ち、低下するかまたは阻害する)治療薬で処置し得る。活性に拮抗する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、(i)前述のペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメントまたは相同体；(ii)前述のペプチドに対する抗体；(iii)前述のペプチドをコードする核酸；(iv)アンチセンス核酸および前述のペプチドの内在的機能を相同組換えにより「ノックアウト」するのに使用する「機能障害性」である核酸(即ち、前述のペプチドに対するコード化配列のコード化配列内への異種挿入に因る)の投与(例えば、Capecchi, 1989. Science 244: 1288-1292を参照)；または(v)前述のペプチドおよびその結合相手との相互作用を変化するモジュレータ(即ち、本発明のさらに別なペプチドのミメティックまたは本発明のペプチドに特異的な抗体を含む阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト)を挙げ得るが、これらに限定しない。
減少したレベル(疾患または障害に罹患していない対象と比べて)または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性を増加する(即ち、アゴニストである)治療薬で処置し得る。活性を上方制御する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、前述のペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメント、または相同体；またはバイオアベイラビリティーを増加するアゴニストを挙げ得るが、これらに限定しない。
増加または減少したレベルを、患者の組織試料(例えば、生検組織から)を得て、インビトロでＲＮＡまたはペプチドのレベル、発現したペプチド(または前述のペプチドのｍＲＮＡ)の構造および／または活性をアッセイすることにより、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することにより容易に検出し得る。当該分野内で周知の方法としては、イムノアッセイ(例えば、ウエスタンブロット分析、免疫沈降とそれに引き続くドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学、等)および／またはｍＲＮＡ発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インシツハイブリダイゼーション、等)を挙げ得るが、これらに限定しない。
予防的方法
一つの態様では、異常なＮＯＶＸ発現または少なくともあるＮＯＶＸ活性を調整する薬剤を対象に投与することにより、本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または異常を、対象において予防する方法を提供する。異常なＮＯＶＸの発現または活性が原因または一因となって生じる疾患のリスクを有する対象を、例えば、本明細書で説明するように診断的アッセイまたは予後的アッセイのいずれかまたはそれらの組合せによって同定し得る。疾患または障害を予防し、または、これに代えて、その進行を遅らせるようにＮＯＶＸ異常に特徴的な症状の出現に先立って予防的薬剤の投与を行い得る。ＮＯＶＸ異常のタイプに依存して、例えば、あるＮＯＶＸアゴニストまたはＮＯＶＸアンタゴニストである薬剤を対象の処置に使用し得る。適切な薬剤を、本明細書で説明するスクリーニング法に基づいて決定することができる。本発明の予防的方法をさらに以下のサブセクションで考察する。
治療的方法
本発明のもう一つの態様は、治療目的のためにＮＯＶＸの発現または活性を調整する方法に関する。本発明の調整方法は、細胞を細胞に関連するＮＯＶＸタンパク質活性の一つまたはそれ以上の活性を調整する薬剤と接触することを含む。ＮＯＶＸタンパク質活性を調整する薬剤は、核酸またはタンパク質、あるＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する同属のリガンド、ペプチド、あるＮＯＶＸペプチドミメティック、または低分子のような本明細書に説明する薬剤であり得る。一つの実施形態では、薬剤は一つまたはそれ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を促進する。そのような促進的薬剤の例としては、活性なＮＯＶＸタンパク質および細胞中に導入したＮＯＶＸをコードする核酸分子を挙げ得る。もう一つの実施形態では、薬剤は一つまたはそれ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を阻害する。そのような阻害的薬剤の例としては、アンチセンスＮＯＶＸ核酸分子および抗−ＮＯＶＸ抗体を挙げ得る。これらの調整方法は、インビトロで(例えば、細胞を薬剤と共に培養することにより)または、これに代えて、インビボで(例えば、薬剤を対象に投与することにより)実施し得る。このように、本発明はあるＮＯＶＸタンパク質または核酸分子の異常な発現または活性を特徴とする疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。一つの実施形態では、その方法は、薬剤(例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した薬剤)またはＮＯＶＸの発現または活性を調整する(例えば、上方制御または下方制御する)薬剤の組合せを投与することを伴う。もう一つの実施形態では、その方法は減少または異常なＮＯＶＸの発現または活性を補償するための治療としてあるＮＯＶＸタンパク質または核酸分子を投与することを伴う。
ＮＯＶＸが異常に下方制御されているかおよび／または増加したＮＯＶＸ活性が有益な効果を有すると思われる状況では、ＮＯＶＸ活性を促進することが望ましい。そのような状況の一つの例は、対象が異常な細胞増殖および／または分化(例えば、がんまたは免疫関連疾患)を特徴とする障害を有する場合である。そのような状況のもう一つの例は、対象が妊娠性疾患(例えば、子癇前症)を有する場合である。
治療薬の生物学的効果の測定
本発明の種々の実施形態において、適切なインビトロまたはインビボアッセイを実施して、特定の治療薬の効果およびその投与を罹患している組織の処置に適応があるか否かを決定する。
種々の特定の実施形態において、患者の障害に関与する代表的なタイプ(複数を含む)の細胞についてインビトロアッセイを実施して、投与した治療薬が細胞タイプに所望の効果を発揮するかどうかを測定し得る。治療に使用する化合物を、ヒト対象での試験に先立って、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ等を限定することなく含む適切な動物モデルシステムで試験し得る。同様に、インビボ試験でも、ヒト対象への投与に先立って、当該分野において公知の動物モデルシステムのいずれかを使用し得る。
本発明の組成物の予防的使用および治療的使用
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は、種々の障害に関連する潜在的で予防的応用および治療的応用に有用である。障害としては、限定しないが、例えば、前記の疾病、障害および状態を含み、特に、表Ａに要約するようなＮＯＶＸタンパク質の相同物と関連した疾病、障害および状態を含む。
例として、本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、そしてタンパク質は、それを必要とする対象に投与する際に有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、本明細書に挙げられたものを含むが、それらに限定されない疾病、障害、状態およびそれに類似するものに罹患する対象の処置のための効験を有するであろう。
ＮＯＶＸタンパク質をコードする新規核酸、および本発明のＮＯＶＸタンパク質の両方、またはそれらのフラグメントはまた、核酸またはタンパク質の存在または量を評価する診断的応用にも有用であり得る。さらなる使用は、抗細菌分子(即ち、或るペプチドは抗細菌的性質を有することが見出されている)としてであるかもしれない。これらの物質は、治療的または診断的方法に使用するための本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の作成にさらに有用である。
本発明を、以下の実施例でさらに記載し、これらはクレームに記載の発明の範囲を限定しない。
（実施例A):ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列、および相同性データ
(実施例1)
NOV1クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表1Aに示す。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
前述のタンパク質配列の配列比較により、表1Bに示す以下の配列関係が得られる。
Figure 2005532786
NOV1aタンパク質のさらなる解析により、表1Cに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV1aタンパク質の検索によって、表1Dに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV1aタンパク質は表1EのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV1aタンパク質は表1Fに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
 (実施例2)
NOV2クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表2Aに示す。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
前述のタンパク質配列の配列比較により、表2Bに示す以下の配列関係が得られる。
Figure 2005532786
NOV2aタンパク質のさらなる解析により、表2Cに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOVa2タンパク質の検索によって、表2Dに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV2aタンパク質は表2EのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した。
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV2aタンパク質は表2Fに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
 (実施例3)
NOV3クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表3Aに示す。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
前述のタンパク質配列の配列比較により、表3Bに示す以下の配列関係が得られる。
Figure 2005532786
NOV3aタンパク質のさらなる解析により、表3Cに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV3aタンパク質の検索によって、表3Dに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV3aタンパク質は表3EのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した。
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV3aタンパク質は表3Fに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
 (実施例4)
NOV4クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表4Aに示す。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
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Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
前述のタンパク質配列の配列比較により、表4Bに示す以下の配列関係が得られる。
Figure 2005532786
NOV4aタンパク質のさらなる解析により、表4Cに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
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Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV4aタンパク質の検索によって、表4Dに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV4aタンパク質は表4EのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した。
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV4aタンパク質は表4Fに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
 (実施例5)
NOV5クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表5Aに示す。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
NOV5aタンパク質のさらなる解析により、表5Bに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV5aタンパク質の検索によって、表5Cに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV5aタンパク質は表5DのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した。
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV5aタンパク質は表5Eに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
 (実施例6)
NOV6クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表6Aに示す。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
NOV6aタンパク質のさらなる解析により、表6Bに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV6aタンパク質の検索によって、表6Cに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV6aタンパク質は表6DのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した。
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV6aタンパク質は表6Eに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
 (実施例7)
NOV7クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表7Aに示す。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786

Figure 2005532786
前述のタンパク質配列の配列比較により、表7Bに示す以下の配列関係が得られる。
Figure 2005532786
NOV7aタンパク質のさらなる解析により、表7Cに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV7aタンパク質の検索によって、表7Dに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV7aタンパク質は表7EのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した。
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV7aタンパク質は表7Fに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
 (実施例8)
NOV8クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表8Aに示す。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
前述のタンパク質配列の配列比較により、表8Bに示す以下の配列関係が得られる。
Figure 2005532786
NOV8aタンパク質のさらなる解析により、表8Cに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV8aタンパク質の検索によって、表8Dに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV8aタンパク質は表8EのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した。
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV8aタンパク質は表8Fに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
 (実施例9)
NOV9クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表9Aに示す。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
NOV9aタンパク質のさらなる解析により、表9Bに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV9aタンパク質の検索によって、表9Cに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV9aタンパク質は表9DのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した。
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV9aタンパク質は表9Eに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
 (実施例10)
NOV10クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表10Aに示す。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
前述のタンパク質配列の配列比較により、表10Bに示す以下の配列関係が得られる。
Figure 2005532786
NOV10aタンパク質のさらなる解析により、表10Cに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV10aタンパク質の検索によって、表10Dに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV10aタンパク質は表10EのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した。
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV10aタンパク質は表10Fに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
 (実施例11)
NOV11クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表11Aに示す。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
NOV11aタンパク質のさらなる解析により、表11Bに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV11aタンパク質の検索によって、表11Cに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV11aタンパク質は表11DのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した。
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV11aタンパク質は表11Eに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
 (実施例12)
NOV12クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表12Aに示す。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
前述のタンパク質配列の配列比較により、表12Bに示す以下の配列関係が得られる。
Figure 2005532786
NOV12aタンパク質のさらなる解析により、表12Cに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV12aタンパク質の検索によって、表12Dに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV12aタンパク質は表12EのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した。
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV12aタンパク質は表12Fに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
 (実施例13)
NOV13クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表13Aに示す。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
NOV13aタンパク質のさらなる解析により、表13Bに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV13aタンパク質の検索によって、表13Cに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV13aタンパク質は表13DのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した。
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV13タンパク質は表13Eに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
 (実施例14)
NOV14クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表14Aに示す。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
前述のタンパク質配列の配列比較により、表14Bに示す以下の配列関係が得られる。
Figure 2005532786
NOV14aタンパク質のさらなる解析により、表14Cに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV14aタンパク質の検索によって、表14Dに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV14aタンパク質は表14EのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した。
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV14aタンパク質は表14Fに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
 (実施例15)
NOV15クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表15Aに示す。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
NOV15aタンパク質のさらなる解析により、表15Bに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV15aタンパク質の検索によって、表15Cに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV15aタンパク質は表15DのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した。
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV15aタンパク質は表15Eに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
 (実施例16)
NOV16クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表16Aに示す。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
NOV16aタンパク質のさらなる解析により、表16Bに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV16aタンパク質の検索によって、表16Cに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV16aタンパク質は表16DのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した。
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV16aタンパク質は表16Eに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
 (実施例17)
NOV17クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表17Aに示す。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
NOV17aタンパク質のさらなる解析により、表17Bに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV17aタンパク質の検索によって、表17Cに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV17aタンパク質は表17DのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した。
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV17aタンパク質は表17Eに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
 (実施例18)
NOV18クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表18Aに示す。
Figure 2005532786
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Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
前述のタンパク質配列の配列比較により、表18Bに示す以下の配列関係が得られる。
Figure 2005532786
NOV18aタンパク質のさらなる解析により、表18Cに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV18aタンパク質の検索によって、表18Dに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV18aタンパク質は表18EのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した。
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV18aタンパク質は表18Fに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
 (実施例19)
NOV19クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表19Aに示す。
Figure 2005532786
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Figure 2005532786
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Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
前述のタンパク質配列の配列比較により、表19Bに示す以下の配列関係が得られる。
Figure 2005532786
NOV19aタンパク質のさらなる解析により、表19Cに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV19aタンパク質の検索によって、表19Dに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV19aタンパク質は表19EのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した。
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV19aタンパク質は表19Fに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
 (実施例20)
NOV20クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表20Aに示す。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
前述のタンパク質配列の配列比較により、表20Bに示す以下の配列関係が得られる。
Figure 2005532786
NOV20aタンパク質のさらなる解析により、表20Cに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV20aタンパク質の検索によって、表20Dに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV20aタンパク質は表20EのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した。
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV20aタンパク質は表20Fに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
 (実施例21)
NOV21クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表21Aに示す。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
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Figure 2005532786
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Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
前述のタンパク質配列の配列比較により、表21Bに示す以下の配列関係が得られる。
Figure 2005532786
NOV21aタンパク質のさらなる解析により、表21Cに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV21aタンパク質の検索によって、表21Dに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV21aタンパク質は表21EのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した。
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV21aタンパク質は表21Fに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
 (実施例22)
NOV22クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表22Aに示す。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
前述のタンパク質配列の配列比較により、表22Bに示す以下の配列関係が得られる。
Figure 2005532786
NOV22aタンパク質のさらなる解析により、表22Cに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV22aタンパク質の検索によって、表22Dに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV22aタンパク質は表22EのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した。
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV22aタンパク質は表22Fに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
 (実施例23)
NOV23クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表23Aに示す。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
前述のタンパク質配列の配列比較により、表23Bに示す以下の配列関係が得られる。
Figure 2005532786
NOV23aタンパク質のさらなる解析により、表23Cに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV23aタンパク質の検索によって、表23Dに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV23aタンパク質は表23EのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した。
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV23aタンパク質は表23Fに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
 (実施例24)
NOV24クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表24Aに示す。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
前述のタンパク質配列の配列比較により、表24Bに示す以下の配列関係が得られる。
Figure 2005532786
NOV24aタンパク質のさらなる解析により、表24Cに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV24aタンパク質の検索によって、表24Dに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV24aタンパク質は表24EのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した。
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV24aタンパク質は表24Fに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
 (実施例25)
NOV25クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表25Aに示す。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
前述のタンパク質配列の配列比較により、表25Bに示す以下の配列関係が得られる。
Figure 2005532786
NOV25aタンパク質のさらなる解析により、表25Cに示す以下の特性が得られる。
Figure 2005532786
Figure 2005532786
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV25aタンパク質の検索によって、表25Dに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
Figure 2005532786
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV25aタンパク質は表25EのBLASTPデータに示されるタンパク質と相同性を有することが判明した。
Figure 2005532786
PFam解析によって、NOV25aタンパク質は表25Fに示すドメインを含むことが予測される。
Figure 2005532786
（実施例B）:NOVXクローンの配列決定法および同定
1.GeneCalling(商標)技術:これはCuraGenで開発され、Shimketsら「Gene expression analysis by transcript profiling coupled to a gene database query」Nature Biotechnology 17: 198-803 (1999)」に記載された、2以上のサンプル間の遺伝子発現の差のプロファイリングを実施する特許方法である。cDNAは種々のドナー由来の複数の組織種、正常状態および病的状態、生理的状態、ならびに発達段階に相当する種々のヒトサンプルから得た。サンプルは、全組織、一次細胞または組織培養した一次細胞または細胞株として得た。細胞および細胞株は、遺伝子発現を調節する生物因子または化学薬品、例えば、成長因子、ケモカインまたはステロイドで処理しておいてもよい。次いで、このような由来のcDNAを最大120対までの制限酵素で消化し、各対の制限酵素に特異的なリンカー-アダプター対を適当な末端に連結した。制限消化による特有のcDNA遺伝子断片の混合物が生じる。限定PCR増幅を、一方のプライマーがビオチン化され、他方が蛍光標識されている、リンカー・アダプター配列と相同なプライマーで実施する。二重標識された物質を単離し、蛍光標識された一本鎖をキャピラリーゲル電気泳動によって分離する。コンピューターアルゴリズムで、各制限消化について実験群および対照群から得た電気泳動図を比較する。これとさらなる配列由来情報を用い、種々の遺伝子データベースを用いて発現に差のある各遺伝子断片の同一性を予測する。遺伝子断片の同一性は、さらなる、遺伝子特異的競合PCRによって、またはこの遺伝子断片の単離および配列決定によって確認する。
2.SeqCalling(商標)技術:cDNAは種々のドナー由来の複数の組織種、正常状態および病的状態、生理的状態、ならびに発達段階に相当する種々のヒトサンプルから得た。サンプルは、全組織、一次細胞または組織培養した一次細胞または細胞株として得た。細胞および細胞株は、遺伝子発現を調節する生物因子または化学薬品、例えば、成長因子、ケモカインまたはステロイドで処理しておいてもよい。次いで、このような由来のcDNAをCuraGenの特許SeqCalling技術を用いて配列決定した。配列トレースは手作業で評価し、必要に応じて修正のために編集した。すべてのサンプルからのcDNA配列を、時々は公開ヒト配列を含めてともにアセンブルし、バイオインフォマティックプログラムを用いて各アセンブリーの共通配列を得た。各アセンブリーはCuraGen社のデータベースに含まれている。配列は別の構成要素との同一性の程度が50bpにわたって少なくとも95%である場合、アセンブリーの構成要素として含めた。各アセンブリーは、遺伝子またはその一部に相当し、スプライシング型単一ヌクレオチド多型(SNP)、挿入、欠失およびその他の配列変異体などの変異体に関する情報を含む。
3.PathCalling(商標)技術:
NOVX核酸配列はツーハイブリッド・アプローチによるcDNAライブラリーの実験室スクリーニングから導かれる。全長DNA配列、または配列の一部のいずれか、あるいはその双方をカバーするcDNA断片が配列決定される。インシリコ予測はCuraGen社の特許配列データベースまたは公開されているヒト配列データベースで入手可能な配列に基づいたものであり、全長DNA配列またはそのある一部のいずれかが提供される。
実験室スクリーニングは以下に要約した方法を用いて実施した:
cDNAライブラリーは、種々のドナー由来の複数の組織種、正常状態および病的状態、生理的状態、ならびに発達段階に相当する種々のヒトサンプルから得た。サンプルは、全組織、一次細胞または組織培養した一次細胞または細胞株として得た。細胞および細胞株は、遺伝子発現を調節する生物因子または化学薬品、例えば、成長因子、ケモカインまたはステロイドで処理しておいてもよい。次いで、このような由来のcDNAを適当なツーハイブリッド・ベクター(Gal4活性化ドメイン(Gal4-AD)融合物)へ一定方向にクローニングした。次いで、かかるcDNAライブラリーならびにClontech(Palo Alto, CA)より市販されているcDNAライブラリーを、イー・コリ(E.coli)からCuraGen社特許酵母株(その全文を参考文献として本明細書に組み込む、米国特許第6,057,101号および6,083,693号に開示)へ移した。
CuraGen社特許ヒト配列ライブラリーのGal4結合ドメイン(Gal4-BD)融合物を用いて複数のGal4-AD融合物cDNAライブラリーをスクリーニングし、その結果、その各々でGal4-AD融合物が個々のcDNAを含む酵母ハイブリッド二倍体を選択した。各サンプルをcDNA挿入境界で非特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて増幅した。かかるPCR産物を配列決定し、配列トレースは手作業で評価し、必要に応じて修正のために編集した。すべてのサンプルからのcDNA配列を、時々は公開ヒト配列を含めて、ともにアセンブルし、バイオインフォマティックプログラムを用いて各アセンブリーの共通配列を得た。各アセンブリーはCuraGen社のデータベースに含まれている。配列は別の構成要素との同一性の程度が50bpにわたって少なくとも95%である場合、アセンブリーの構成要素として含めた。各アセンブリーは遺伝子またはその一部に相当し、スプライシング型単一ヌクレオチド多型(SNP)、挿入、欠失およびその他の配列変異体などの変異体に関する情報を含む。
物理的クローン:全オープンリーディングフレームをカバーする、スクリーニング手順により得たcDNA断片を、cDNAライブラリーの作製に用いたpACT2プラスミド(Clontech)に組み換えDNAとしてクローニングする。この組換えプラスミドを宿主へ挿入し、CuraGen社特許酵母株N106'およびYULH(米国特許第6,057,101号および第6,083,693号)の双方の接合によってスクリーニング手順の間に生じた酵母ハイブリッド二倍体によって選択する。
4.RACE:cDNA末端の迅速増幅(RACE)などのポリメラーゼ連鎖反応に基づく技術を用いて、本発明のcDNA配列を単離または完成した。通常、1以上のヒトサンプルから複数のクローンを配列決定して断片の配列を導いた。種々のドナー由来の種々のヒト組織サンプルをRACE反応に用いた。これらの手順から得られた配列を、前節に記載したSeqCallingアセンブリープロセスに含めた。
5.エクソン結合:本発明で同定されたNOVX 標的配列を、エクソン結合プロセスに付して配列を確認した。PCRプライマーは正方向プライマーについては入手可能な最も上流の配列で、逆方向プライマーについては入手可能な最も下流の配列で開始することによって設計した。いずれの場合にも、特有かまたは選択性が高く適した配列に出会うまで、あるいは、逆方向プライマーの場合には、停止コドンに達するまで、それぞれの末端からコード配列に向かって内へ進んで配列を調べた。かかるプライマーは全長cDNAのインシリコ予測、標的配列のDNAまたはタンパク質配列の一部(1以上のエクソン)に基づいて、あるいはエクソンの、他の種由来の密接に関連したヒト配列との翻訳後相同性によって設計した。次いで、これらのプライマーを、ヒトcDNAの以下のプール:副腎、骨髄、脳-扁桃体、脳-小脳、脳-海馬、脳-黒質、脳-視床、脳-全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫-Raji、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮を基にしたPCR増幅に用いた。通常、得られたアンプリコンをゲル精製し、クローニングして重複性が高くなるまで配列決定する。エクソン結合から得られたPCR産物を、Invitrogen製のpCR2.1ベクターにクローニングした。得られた細菌クローンはpCR2.1ベクターにクローニングされた全オープンリーディングフレームをカバーする挿入部分を有する。全クローンから得られた配列は、それら自身を用いて、CuraGen社のデータベースにあるその他の断片を用いて、および公開されているESTを用いてアセンブルした。断片およびESTは、そのアセンブリーの別の構成要素との同一性の程度が50bpにわたって少なくとも95%である場合、アセンブリーの構成要素として含めた。さらに、配列トレースを手作業で評価し、必要に応じて修正のために編集した。これらの手順により本明細書で報告される配列が提供される。
6.物理的クローン:相同性によってエクソンを予測し、標準的な遺伝子規則を用いてイントロン/エクソンの境界を決定した。エクソンをさらに選択し、複数のBLAST(例えば、tBlastN、BlastX、およびBlastN)検索、また、場合によっては、GeneScanおよびGrailを用いる類似性測定によって正確なものにした。遺伝子配列をさらに規定し、かつ、完成するために、利用可能な場合には、公開データベースおよび特許データベース双方由来の発現配列も加えた。次いで、明らかな不整合に関してDNA配列を手作業で修正した結果、全長タンパク質をコードする配列が得られた。
全オープンリーディングフレームをカバーする、エクソン結合によって得られたPCR産物をInvitrogen製のpCR2.1ベクターにクローニングして発現およびスクリーニング目的に用いるクローンを準備した。
(実施例C):種々の細胞および組織におけるクローンの量的発現解析
種々のクローンの量的発現を、リアルタイム定量PCR(RTQ PCR)を用い、種々の正常および病理由来細胞、細胞株および組織由来のRNAサンプルを含むマイクロタイタープレートを用いて評価した。RTQ PCRはApplied Biosystems ABI PRISMO(登録商標)7700またはABI PRISM(登録商標)7900 HT 配列 Detection Systemで実施した。サンプルの種々の収集物をプレート上でアセンブルし、パネル1(正常組織および癌細胞株を含む)、パネル2(正常および癌供給源組織に由来するサンプルを含む)、パネル3(癌細胞株を含む)、パネル4(正常組織由来の細胞および細胞株ならびに炎症症状と関連している細胞を含む)、パネル5D/5I(代謝病(metabolic disease)に重点をおいたヒト組織および細胞株を含む)、AI 包括的 パネル(正常組織および自己炎症性疾患(autoinflammatory diseases)由来のサンプルを含む)、パネルCNSD.01(正常脳および患部脳由来のサンプルを含む)およびCNS 神経変性 パネル(正常脳およびアルツハイマー病(Alzheimer's disease)の脳由来のサンプルを含む)と称した。
全サンプル由来のRNAの完全性は、28Sおよび18SリボソームRNA染色強度比をガイド(2:1〜2.5:1 28s:18s)として用いるアガロースゲル電気泳動図の視覚的評価によって質に関して、および分解産物を示唆するであろう低分子量RNAの不在に関して制御する。サンプルは単一エクソンの長さにわたって増幅するよう設計したプローブおよびプライマーセットを用いる、逆転写酵素の不在下でのRTQ PCR反応実施によってゲノムDNA混入に対して制御する。
最初に、このRNAサンプルを常時発現遺伝子(例えば、β-アクチンおよびGAPDH)などの参照核酸に対して標準化した。標準化したRNA(5μl)をcDNAへ変換し、ワンステップRT-PCR Master Mix試薬(Applied Biosystems;カタログ番号4309169)および遺伝子特異的プライマーを、製造者の使用説明書に従って用いるRTQ-PCRにより解析した。
他の場合には、標準化していないRNAサンプルを、Superscript II(Invitrogen社;カタログ番号18064-147)およびランダム・ヘキサマーを、製造者の使用説明書に従って用いて一本鎖cDNA(sscDNA)へ変換した。全RNAを最大10ug含む反応を20μlの容量で実施し、42℃で60分間インキュベートした。この反応は最終容量100μlにおいて50μgの全RNAまでスケールアップすることができる。次いで、sscDNAサンプルを1×TaqMan(登録商標)Universal Master mix (Applied Biosystems;カタログ番号4324020)を、製造者の使用説明書に従って用いて先に記載した参照核酸に対して標準化した。
プローブおよびプライマーはApplied BiosystemsのPrimer Expressソフトウェアパッケージ(アップルコンピューターのマッキントッシュパワーPCのバージョン1)または標的配列をインプットとして用いる類似のアルゴリズムに従って各アッセイ用に設計した。デフォルト設定を反応条件に用い、以下のパラメーターを設定し、その後、プライマーを選択した:プライマー濃度=250nM、プライマー融解温度(Tm)範囲=58〜60℃、プライマーの最適Tm=59℃、最大プライマー差=2℃、プローブは5'Gを含まない、プローブTmはプライマーTmより10℃高くなくてはならない、アンプリコンサイズは75bp〜100bp。選択したプローブおよびプライマー(以下参照)をSynthegen(Houston, TX, USA)によって合成した。プローブをHPLCで2回精製して、結合していない色素を除去し、質量分析によって評価して、レポーターおよびクエンチャー色素のプローブの5'および3'末端それぞれとの結合を確認した。最終濃度は、正方向および逆方向プライマーは各900nM、プローブは200nMとした
PCR条件:RNAサンプルを扱う場合には、各組織および各細胞株由来の標準化RNAを96ウェルまたは384ウェルPCRプレート(Applied Biosystems)のいずれかの各ウェルにスポットした。PCRカクテルは単一の遺伝子特異的プローブおよびプライマーセット、または2つのマルチプレックス化したプローブおよびプライマーセット(標的クローンに特異的なセットおよび標的プローブについてマルチプレックス化した別の遺伝子特異的セット)のいずれかを含んでいた。PCR反応は、TaqMan(登録商標)ワンステップRT-PCR Master Mix (Applied Biosystems、カタログ番号4313803)を、製造者の使用説明書に従って用いて設定した。48℃で30分間の逆転写、次いで、以下の増幅/PCRサイクル:95℃10分間、その後95℃15秒を40サイクル、60℃で1分間を実施した。結果は、所与のサンプルとΔCT力について2で表される最低のCT値を持つサンプル間のRNA濃度に差に関して、ログスケールを用いてCT値(所与のサンプルが蛍光の閾値を通過するサイクル)として記録した。次いで、相対発現パーセントがこのRNA差異の逆数をとり、100を掛けることによって得られる。
sscDNAサンプルを扱う場合には、標準化したsscDNAを、RNAサンプルについて先に記載した通りに用いた。1または2セットのプローブおよびプライマーを含むPCR反応を、1×TaqMan(登録商標)Universal Master mix(Applied Biosystems;カタログ番号4324020)を、製造者の使用説明書に従って用いて、前述の通り設定した。PCR増幅は以下のように実施した:95℃で10分、次いで95℃で15秒、60℃で1分の40サイクル。結果は前述のように解析し、処理した。
パネル1、1.1、1.2、および1.3D
パネル1、1.1、1.2および1.3Dのプレートには、2つの対照ウェル(ゲノムDNA対照および化学対照)および種々のサンプル由来のcDNAを含む94のウェルが含まれる。これらのパネルのサンプルは、2つのクラス:培養細胞株由来のサンプルおよび一次正常組織由来のサンプルに分類される。細胞株は以下の種類の癌:肺癌(lung cancer)、乳癌(breast cancer)、メラノーマ(melanoma)、結腸癌(colon cancer)、前立腺癌(prostate cancer)、CNS癌(CNS cancer)、扁平上皮癌(squamous cell carcinoma)、卵巣癌(ovarian cancer)、肝臓癌(liver cancer)、腎臓癌(renal cancer)、胃癌(gastric cancer)および膵臓癌(pancreatic cancer)に由来する。これらのパネルで用いた細胞株は、培養細胞株の宝庫であるAmerican Type Culture Collection(ATCC) を通じて広く入手可能であり、ATCCの推奨する条件を用いて培養した。これらのパネルに見られる正常組織は、単一の成人個体または胎児のすべての主要器官系に由来するサンプルからなる。これらのサンプルは以下の器官:成人骨格筋、胎児骨格筋、成人心臓、胎児心臓、成人腎臓、胎児腎臓、成人肝臓、胎児肝臓、成人肺、胎児肺、脳の種々の領域、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、結腸、膀胱、気管、乳房、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪に由来する。
パネル1、1.1、1.2および1.3Dの結果では、以下の略語が用いられる:
ca.=癌腫、
*=転移により確立されたもの、
met=転移、
s cell var=小細胞変異体、
non-s=non-sm=非小、
squam=扁平上皮の、
pl. eff= pl effusion=胸水、
glio=神経膠腫、
astro=アストロサイト腫、および
neuro=神経芽細胞腫。
一般 スクリーニング パネル v1.4、v1.5、v1.6およびv1.7
パネル1.4、1.5、1.6および1.7のプレートには、2つの対照ウェル(ゲノムDNA対照および化学対照)および種々のサンプル由来のcDNAを含む88〜94のウェルが含まれる。パネル1.4、1.5、1.6および1.7のサンプルは、2つのクラス:培養細胞株由来のサンプルおよび一次正常組織由来のサンプルに分類される。細胞株は以下の種類の癌:肺癌、乳癌、メラノーマ、結腸癌、前立腺癌、CNS癌、扁平上皮癌、卵巣癌、肝臓癌、腎臓癌、胃癌および膵臓癌に由来する。パネル1.4、1.5、1.6および1.7で用いる細胞株は、培養細胞株の宝庫であるAmerican Type Culture Collection (ATCC) を通じて広く入手可能であり、ATCCの推奨する条件を用いて培養した。パネル1.4、1.5、1.6および1.7に見られる正常組織は、2〜5の異なる成人個体または胎児のすべての主要器官系に由来するサンプルのプールからなる。これらのサンプルは以下の器官:成人骨格筋、胎児骨格筋、成人心臓、胎児心臓、成人腎臓、胎児腎臓、成人肝臓、胎児肝臓、成人肺、胎児肺、脳の種々の領域、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、結腸、膀胱、気管、乳房、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪に由来する。略語はパネル1、1.1、1.2、および1.3Dについて記載した通りである。
パネル2D、2.2、2.3および2.4
パネル2D、2.2、2.3および2.4のプレートには、概ね2つの対照ウェルおよび米国国立癌研究所(the National Cancer Institute)のCooperative Human Tissue Network (CHTN)またはNational Disease Research Initiative (NDRI)と密接な協力関係を持つ医師により入手したか、あるいはArdaisまたはClinomicsから得たヒト組織から単離した、RNAまたはcDNAからなる94の試験サンプルが含まれる。これらの組織はヒト悪性腫瘍に由来し、示される場合には、多くの悪性組織が腫瘍とまさに隣接した非癌性組織から得られた「対応縁部」を含む。これらを正常な隣接組織と称し、下記の結果では「NAT」と示す。腫瘍組織および「対応縁部」は2人の独立した病理学者によって(外科病理学者およびさらにNDRI/CHTN/Ardais/Clinomicsの病理学者によって)評価されている。悪性腫瘍のない組織(正常組織)由来の非対応RNAサンプルもArdaisまたはClinomicsより入手した。この分析により腫瘍の分化の程度に関する全体的な組織病理学的評価が提供される。さらに、ほとんどのサンプルが患者の臨床段階に関する情報を提供する最初の外科病理学報告書を包含する。これら対応縁部は外科手術域を取り囲む(すなわち、最も近くに隣接する)組織(表RRでは正常隣接細胞という語から「NAT」と表す)から採取されている。さらに、RNAおよびcDNAサンプルを高齢者または急死した被害者(事故など)に行なわれた検死解剖より得た種々のヒト組織から得た。これらの組織は病気にかかっていないと確認され、Clontech(Palo Alto, CA)、Research Genetics、およびInvitrogenなどの種々の商業ソースから購入した。
HASSパネルv 1.0
HASSパネルv 1.0プレートは93のcDNAサンプルおよび2つの対照からなる。詳しくは、これらのサンプルのうち81が、血清飢餓、アシドーシスおよび無酸素に異なる期間付された培養ヒト癌細胞株、ならびにこれらの処置の対照に由来し、3サンプルがヒト一次細胞、9サンプルが悪性脳癌(malignant brain cancer)(4の髄芽細胞腫(medulloblastomas)および5の膠芽細胞腫(glioblastomas))、ならびに2が対照である。ヒト癌細胞株はATCC(American Type Culture Collection)より入手し、以下の組織群:乳癌、前立腺癌、膀胱癌腫(bladder carcinoma)、膵臓癌およびCNS癌細胞株に分類される。これらの癌細胞はすべて標準の推奨される条件下で培養する。用いた処置(血清飢餓、アシドーシスおよび無酸素)はこれまでに科学論文で公開されている。ヒト一次細胞はClonetics(Walkersville, MD)より入手し、Cloneticsの推奨する培地および条件で増殖させた。悪性脳癌サンプルは共同研究(Henry Ford Cancer Center)の一環として入手し、CuraGenがサンプルを受け取る前に病理学者によって評価されている。標準的な手順を用いてRNAをこれらのサンプルから調製した。ゲノム対照および化学対照ウェルについては既に記載した。
ARDAISパネルv1.0
ARDAISパネルv1.0のプレートには、概ね2つの対照ウェルおよびArdais社と密接な協力関係を持つ医師により入手したヒト組織から単離したRNAからなる22の試験サンプルが含まれる。組織はヒト肺悪性腫瘍(human lung malignacies)(肺腺癌(lung adenocarcinoma)または肺扁平上皮癌(lung squamous cell carcinoma))に由来し、示される場合には、多くの悪性サンプルは腫瘍とまさに隣接した非癌性肺組織から得られる「対応縁部」を含む。これら対応縁部は以下の結果では外科手術域を取り囲む(すなわち、最も近くに隣接する)組織(正常隣接細胞という語から「NAT」と呼ばれる)から採取されている。腫瘍組織および「対応縁部」は独立した病理学者によって(外科病理学者およびさらにArdaisの病理学者によって)評価されている。肺由来の非対応悪性および非悪性のRNAサンプルもArdaisより入手した。Ardaisからのさらなる情報により腫瘍分化の程度および段階に関する全体的な組織病理学的評価が提供される。さらに、ほとんどのサンプルが患者の臨床段階に関する情報を提供する最初の外科病理学報告書を包含する。
パネル 3D、3.1および3.2
パネル3D、3.1、および 3.2のプレートは、94のcDNAサンプルおよび2つの対照サンプルからなる。詳しくは、これらのサンプルのうち92が培養ヒト癌細胞株に由来し、2サンプルがヒト一次小脳組織に由来し2が対照である。ヒト細胞株は概ねATCC(American Type Culture Collection)、NCIまたはドイツ腫瘍細胞バンク(German tumor cell bank)より入手し、以下の組織群:舌の扁平上皮癌、乳癌、前立腺癌、メラノーマ、類表皮癌腫(epidermoid carcinoma)、肉腫(sarcomas)、膀胱癌腫、膵臓癌、腎臓癌、白血病(leukemias)/リンパ腫(lymphomas)、卵巣/子宮(uterine)/子宮頸癌(cervical cancer)、胃癌、結腸癌、肺癌およびCNS癌細胞株に分けられる。さらに、2つの独立した小脳のサンプルがある。これらの細胞はすべて標準の推奨された条件下で培養し、標準的な手順を用いてRNAを抽出した。パネル3D、3.1、3.2、1、1.1、1.2、1.3D、1.4、1.5および1.6の細胞株は科学文献で用いられる最も一般的な細胞株である。
パネル4D、4R、および4.1D
パネル4は96ウェルプレート(対照ウェル2、試験サンプル94)に、炎症症状に関連する種々のヒト細胞株または組織から単離したRNA(パネル4R)またはcDNA(パネル4D/4.1D)からなるサンプルを含む。結腸および肺(Stratagene, La Jolla, CA)ならびに胸腺および腎臓(Clontech)などの対照正常組織由来の全RNAを用いた。肝硬変(cirrhosis)患者より得た肝臓組織および狼瘡(lupus)患者より得た腎臓由来の全RNAは、BioChain(Biochain Institute, Inc. , Hayward, CA)より入手した。クローン病(Crohn's disease)および潰瘍性大腸炎(ulcerative colitis)であると診断された患者由来のRNA調製用の腸組織はNational Disease Research Interchange (NDRI) (Philadelphia, PA)より入手した。
アストロサイト、肺繊維芽細胞、皮膚繊維芽細胞、冠状動脈平滑筋細胞、細気管支上皮、気管支上皮、皮膚微小血管内皮細胞、肺微小血管内皮細胞、ヒト肺大動脈内皮細胞、ヒト臍静脈内皮細胞はすべてClonetics(Walkersville, MD)より購入し、これらの細胞種用にCloneticsが提供する培地で増殖させた。これらの一次細胞種は示したように、種々のサイトカインまたはサイトカインの組み合わせを用いて6および/または12〜14時間活性化した。以下のサイトカインを用いた;約1〜5ng/mlのIL-1β、約5〜10ng/mlのTNFα、約20〜50ng/mlのIFNγ、約5〜10ng/mlのIL-4、約5〜10ng/mlのIL-9、約5〜10ng/mlのIL-13。内皮細胞は0.1%血清を含むCloneticsの基本培地での培養によって種々の期間飢餓とすることもあった。
単核球を、Ficollを用いてCuraGen社の社員の血液から調製した。LAK細胞を、これらの細胞からDMEM 5%FCS(Hyclone)、100μM非必須アミノ酸 (Gibco/Life Technologies, Rockville, MD)、1mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール5.5×10-5M(Gibco)、および10mM Hepes(Gibco)およびインターロイキン2で4〜6日培養することによって調製した。次いで、細胞を、10〜20ng/ml PMAおよび1〜2μg/ml イオノマイシン、5〜10ng/mlのIL-12、20〜50ng/mlのIFNγおよび5〜10ng/mlのIL-18で6時間活性化させた。場合によっては、単核球をDMEM 5% FCS (Hyclone)、100μM非必須アミノ酸(Gibco)、1mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール5.5×10-5M(Gibco)、および約5μg/mlのPHA(フィトヘムアグルチニン)またはPWM(ポークウィードマイトジェン)を含む10mM Hepes(Gibco)で4〜5日間培養した。サンプルはRNA調製用に24、48および72時間で採取した。MLR(混合リンパ球反応)サンプルは二人のドナーより血液を採取し、Ficollを用いて単核球を単離し、単離した単核球をDMEM 5% FCS (Hyclone)、100μM非必須アミノ酸(Gibco)、1mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール(5.5×10-5M)(Gibco)、および10mM Hepes (Gibco)に約2×106細胞/mlの最終濃度で1:1混合することで得た。MLRを培養し、サンプルをRNA調製用に1〜7日間の範囲の種々の時点で採取した。
単球は、CD 14 Miltenyiビーズ、ポジティブVS選択カラムおよびVario Magnetを、製造者の使用説明書に従って用いて単核球から単離した。単球はDMEM 5%ウシ胎児血清(FCS)(Hyclone, Logan, UT)、100μM非必須アミノ酸(Gibco)、1mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール5.5×10-5M(Gibco)、および10mM Hepes(Gibco)、50ng/ml GMCSFおよび5ng/ml IL-4で5〜7日間培養することによって樹状細胞へ分化した。マクロファージはDMEM 5%FCS(Hyclone)、100μM非必須アミノ酸(Gibco)、1mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール5.5×10-5M(Gibco)、10mM Hepes(Gibco)および10%AB型ヒト血清または約50ng/mlのMCSFで単球を5〜7日間培養することによって調製した。単球、マクロファージおよび樹状細胞はまた、100ng/mlのリポ多糖(LPS)で6および12〜14時間刺激した。樹状細胞はまた10μg/mlの抗CD40モノクローナル抗体(Pharmingen)で6および12〜14時間刺激した。
CD4リンパ球、CD8リンパ球およびNK細胞も、CD4、CD8およびCD56 Miltenyiビーズ、ポジティブVS選択カラムならびにVario Magnetを、製造者の使用説明書に従って用いて単核球から単離した。CD45RAおよびCD45RO CD4リンパ球はCD8、CD56、CD14およびCD19 Miltenyiビーズおよびポジティブ選抜を用いてCD8、CD56、CD14およびCD19細胞の単核球を枯渇させることによって単離した。次いでCD45ROビーズを用いてCD45RO CD4リンパ球を、CD45RA CD4リンパ球である残存する細胞とともに単離した。CD45RA CD4、CD45RO CD4およびCD8リンパ球を、DMEM 5%FCS(Hyclone)、100μM非必須アミノ酸(Gibco)、1mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール5.5x10-5(Gibco)、および10mM Hepes(Gibco)に入れ、PBS中0.5μg/ml抗CD28(Pharmingen)および3ug/ml抗CD3(OKT3, ATCC)で一晩コーティングしておいたFalcon6ウェル組織培養プレートの上に106個細胞/mlでプレーティングした。6時間後及び24時間後に、RNA調製のためこの細胞を回収した。慢性的に活性化したCD8リンパ球を調製するため、本発明者らは単離したCD8リンパ球を4日間、抗CD28および抗CD3コーティングプレート上で活性化し、次いで細胞を回収し、これらをDMEM 5%FCS(Hyclone)、100μM非必須アミノ酸(Gibco)、1mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール5.5×10-5M(Gibco)、および10mM Hepes(Gibco)、およびIL-2で拡大した。次いで、拡大したCD8細胞を再び、抗CD3および抗CD28が結合したプレートで4日間活性化させ、前と同様に拡大した。第2の活性化の6および24時間後に、ならびに第2の拡大培養の4日後にRNAを単離した。単離したNK細胞はDMEM 5%FCS(Hyclone)、100μM非必須アミノ酸(Gibco)、1mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール5.5×10-5M(Gibco)、および10mM Hepes(Gibco)およびIL-2で4〜6日間培養し、その後RNAを調製した。
B細胞を得るために、扁桃をNDRIより入手した。扁桃を滅菌した解剖用鋏で細かく切断した後、篩にかけた。次いで扁桃細胞を沈降させ、DMEM 5%FCS(Hyclone)、100μM非必須アミノ酸(Gibco)、1mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール5.5×10-5M(Gibco)、および10mM Hepes(Gibco)で、106個細胞/mlに再懸濁した。細胞を活性化させるため、本発明者らは5μg/mlのPWMまたは約10μg/mlの抗CD40(Pharmingen)ならびに5〜10ng/mlのIL-4を用いた。RNA調製用に24、48および72時間で細胞を回収した。
一次および二次Th1/Th2およびTr1細胞を調製するため、6ウェルFalconプレートを10μg/ml 抗CD28(Pharmingen)および2μg/ml OKT3(ATCC)で一晩コーティングし、次いでPBSで2回洗浄した。臍帯血CD4リンパ球(Poietic Systems, German Town, MD)をDMEM 5%FCS(Hyclone)、100μM非必須アミノ酸(Gibco)、1mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール5.5×10-5M(Gibco)、10mM Hepes(Gibco)およびIL-2(4ng/ml)で105〜106個細胞/mlで培養した。IL-12(5ng/ml)および抗IL4(1μg/ml)をTh1向けるために用い、他方IL-4(5ng/ml)および抗IFNγ(1μg/ml)をTh2へ向けるために用い、5ng/mlのIL-10をTr1へ向けるために用いた。4〜5日後、活性化したTh1、Th2およびTr1リンパ球をDMEMで一度洗浄し、DMEM 5%FCS(Hyclone)、100μM非必須アミノ酸(Gibco)、1mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール5.5×10-5M(Gibco)、10mM Hepes(Gibco)およびIL-2 (1ng/ml)で4〜7日間拡大した。この後、活性化したTh1、Th2およびTr1リンパ球を前述の通りではあるが、アポトーシスを防ぐため抗CD95L(1μg/ml)を添加して抗CD28/OKT3およびサイトカインで5日間再刺激した。4〜5日後、Th1、Th2およびTr1リンパ球を洗浄し、次いで再びIL-2 で4〜7日間拡大した。活性化したTh1およびTh2リンパ球をこのように最大3サイクル間維持した。抗CD3および抗CD28 mAbsが結合したプレートでの第2および第3の活性化、ならびにインターロイキン2での第2および第3の拡大培養への4日間の6および24時間後、RNAを一次および二次Th1、Th2およびTr1より調製した。
以下の白血球細胞株:Ramos、EOL-1、KU-812はATCCより入手した。EOL細胞は、さらに0.1mM dbcAMPで5×105個細胞/mlにて、3日毎に培地を交換し、細胞濃度を5×105個細胞/mlに調整しながら、8日間培養して分化させた。これらの細胞の培養には、本発明者らはDMEMまたはRPMI(ATCCの推奨するもの)を5% FCS(Hyclone)、100μM非必須アミノ酸(Gibco)、1mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール5.5×10-5M(Gibco)、10mM Hepes(Gibco)を添加して用いた。RNAは休止細胞または10ng/mlのPMAおよび1μg/mlのイオノマイシンで6および14時間活性化させた細胞のいずれかから調製した。ケラチノサイト株CCD106および気道上皮腫瘍(airway epithelial tumor)株NCI-H292もATCCより入手した。双方ともDMEM 5%FCS(Hyclone)、100μM非必須アミノ酸(Gibco)、1mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール5.5×10-5M(Gibco)、および10mM Hepes(Gibco)で培養した。CCD1106細胞は約5ng/ml TNFαおよび1ng/ml IL-1βで6および14時間活性化させ、NCI-H292細胞は以下のサイトカイン:5ng/ml IL-4、5ng/ml IL-9、5ng/ml IL-13および25ng/ml IFNγで6および14時間活性化させた。
これらの細胞株および血液細胞については、RNAはトリゾール(Gibco BRL)を用いて約107個細胞/mlに溶解させることによって調製した。便宜には、1/10容量のブロモクロロプロパン(Molecular Research Corporation)をRNAサンプルへ加え、ボルテックス処理をして室温にて10分後、チューブをSorvall SS34 ローターで14,000rpmで回転させた。水相を回収し、15ml Falcon Tubeの中に入れた。等量のイソプロパノールを加え、-20℃で一晩静置した。沈殿したRNAをSorvall SS34ローターで9,000rpmで15分間沈降させ、70%エタノールで洗浄した。ペレットを300μlのRNアーゼを含まない水に再び溶解し、35μlのバッファー(Promega)、5μl DTT、7μl RNAsinおよび8μlのDNアーゼを加えた。このチューブを37℃で30分間インキュベートして混入しているゲノムDNAを除去し、フェノールクロロホルムで1回抽出し、1/10容量の3M酢酸ナトリウムおよび2容量の100%エタノールで再び沈殿させた。RNAを沈降させ、RNアーゼを含まない水に入れた。RNAは-80℃で保存した。
AI 包括的 パネル v1.0
AI 包括的 パネル v1.0のプレートには2つの対照ウェルならびに、Backus HospitalおよびClinomics(Frederick, MD)より入手した外科および検死解剖ヒト組織から単離したcDNAからなる89の試験サンプルが含まれる。全RNAはCuraGenの施設内のBackus Hospitalより得た組織サンプルから抽出した。他の組織由来の全RNAはClinomicsより入手した。
滑液、滑膜、骨および軟骨をはじめとする関節組織は、Backus Hospitalで人工膝関節または人工股関節置換術を受けている患者より得た。単離したRNAが確実に最適な品質のものであり、かつ、退化しないように組織サンプルは液体窒素中で直ちに急速凍結させた。骨関節症(osteoarthritis)および慢性関節リウマチ(rheumatoid arthritis)の関節組織のさらなるサンプルをClinomicsより入手した。正常な対照組織はClinomicsより提供されたもので、外傷被害者の検死解剖の際に入手した。
乾癬(psoriatic)組織および隣接した対応組織の外科試料はClinomicsより全RNAとして提供された。 25〜47歳の間の2名の男性および2名の女性患者を選択した。サンプルを単離する時に処方薬を服用していた患者はいなかった。
潰瘍性大腸炎およびクローン病の患者より得た患部結腸の外科試料および隣接する対応組織をClinomicsより入手した。41〜69歳の間の3名の女性および3名の男性クローン病患者より得た腸管組織を用いた。2名の患者は薬を処方されていなかったが、他の者はデキサメタゾン、フェノバルビタール、またはタイレノールを服用していた。潰瘍性大腸炎組織は3名の男性および4名の女性患者より得た。患者のうち4名はレヴィッド(lebvid)を、そして2名はフェノバルビタールを服用していた。
疾病のない、または肺気腫(emphysema)、喘息(asthma)またはCOPDを患う外傷被害者より得た検死解剖肺組織由来の全RNAをClinomicsより購入した。40〜70歳の範囲の肺気腫患者は全員が喫煙者であり、この年齢範囲はタバコが関連している肺気腫の患者に主眼を置き、かつ、α-1抗トリプシン欠乏症の患者を避けるよう選択した。喘息患者は36〜75歳にわたり、COPDも有するおそれのある患者を避けるため喫煙者を除外した。COPD患者は35〜80歳にわたり、喫煙者と非喫煙者の双方が含まれていた。ほとんどの患者がコルチコステロイドおよび気管支拡張薬を服用していた。
AI 包括的 パネル v1.0パネルで組織の同定に用いた標識では、以下の略語が用いられている:
AI=自己免疫
Syn=滑液の
Normal=明白な疾病なし
Rep22/Rep20=個々の患者
RA=慢性関節リウマチ
Backus=Backus病院提供
OA=骨関節症
(SS) (BA) (MF)=個々の患者
Adj=隣接組織
Match control=隣接組織
- M=男性
- F=女性
COPD=慢性閉塞性肺疾患(chronic obstructive pulmonary disease)
AI.05軟骨肉腫
AI.05軟骨肉腫プレートは、血清飢餓およびMMP(1、3および13)合成を誘導することが知られているサイトカイン(例えば、IL1β)での処理に付されたSW1353細胞からなる。これらの処理としては以下が挙げられる：IL-1β(10ng/ml)、IL-1β+TNF-α(50ng/ml)、IL-1β+オンコスタチン(50ng/ml)およびPMA(100ng/ml)。SW1353細胞はATCC(American Type Culture Collection)から入手し、すべて、標準的な推奨条件下で培養した。SW1353細胞は、６ウェルプレートに3×105個細胞/ml(DMEM培地-10%FBS)でプレーティングした。処理は3連で、6時間および18時間行った。MMP1、3および13産生の解析のため、およびRNA抽出のために上清を回収した。RNAはこれらのサンプルから標準的な手順を用いて調製した。
パネル5Dおよび5I
パネル5Dおよび5Iのプレートには2つの対照ウェルならびに代謝病に重点を置いてヒト組織および細胞株から単離した種々のcDNAが含まれる。代謝組織は妊娠糖尿病(Gestational Diabetes)研究に加わっている患者より得た。細胞はヒト間葉幹細胞由来の脂肪細胞の分化における様々の段階の間で得た。ヒト膵島も得た。
妊娠糖尿病研究では、被検者は慣例の(選択性の)帝王切開をうけている妊娠糖尿病であるか、そうでない、若い(18〜40歳)かまたは健常な女性である。乳児出産後の外科的切開が修復される/閉じられる際、各外科レベルの終了処理中に産科医が露出した代謝組織の小サンプル(<1cc)を摘出した。生検材料を摘出の時間から5分以内に滅菌した生理食塩水ですすぎ、水分を吸い取って急速凍結した。次いで組織を液体窒素で瞬間凍結し、滅菌したネジ蓋式のチューブに個別に保存し、発送用またはCuraGen社が回収するようにドライアイス上で維持した。注目する代謝組織としては、子宮壁(平滑筋)、内臓脂肪、骨格筋(直筋)および皮下脂肪が挙げられる。患者の概要は以下の通り:
患者2:糖尿病のラテンアメリカ人、過体重、インスリンを常用していない
患者7-9:糖尿病でない白人で肥満(BMI>30)
患者10:糖尿病のラテンアメリカ人、過体重、インスリンを常用
患者11:糖尿病でないアフリカ系アメリカ人で過体重
患者12:糖尿病のラテンアメリカ人、インスリンを常用
脂肪細胞の分化を、2つの複製しかないドナー3Uを除き、3連でOsirus(Clonetics/BioWhittakerの一部門)から得たドナー前駆細胞内で誘導した。Cloneticsの科学者らはCuraGenのためにMark F. Pittengerら、Multilineage Potential of Adult Human mesenchymal Stem 細胞 Science Apr 2 1999: 143-147に見られる公開プロトコールに基づいて、ヒト間葉幹細胞(HuMSC)を単離し、増殖させ、分化させた。CloneticsはmRNA単離および二本鎖cDNA生成に好適なトリゾール溶解物または凍結ペレットを提供した。各ドナーの概要は以下の通り:
ドナー2および3U: 間葉幹細胞、未分化の脂肪
ドナー2および3AM:脂肪、分化途中の脂肪
ドナー2および3AD:脂肪、分化した脂肪
ヒト細胞株は概ねATCC(American Type Culture Collection)、NCIまたはドイツ腫瘍細胞バンク(German tumor cell bank)より入手し、以下の組織群:腎臓近位尿細管、子宮平滑筋細胞、小腸、肝臓HepG2癌細胞、心臓一次間質細胞、および副腎皮質腺腫細胞に分類される。これらの細胞はすべて標準の推奨された条件下で培養し、標準的な手順を用いてRNAを抽出した。すべてのサンプルはCuraGenで処理して一本鎖cDNAを得た。
パネル5Iはこれまでに記載したすべてのサンプルを含み、マイアミ医科大学(University of Miami School of Medicine)の糖尿病研究所(Diabetes Research Institute)から得た58歳の女性患者の膵島をさらに加えた。島組織は外部ソースで全RNAに処理され、パネル51に加えるためCuraGenに届けられた。
5Dおよび51パネルで組織の同定に用いた標識では、以下の略語が用いられている:
GO Adipose=大網脂肪
SK=骨格筋
UT=子宮
PL=胎盤
AD=分化した脂肪
AM=分化途中の脂肪
U=未分化の幹細胞
パネル CNSD 01
パネル CNSD 01のプレートは2つの対照ウェルおよびハーバード脳組織資源センター(Harvard Brain Tissue Resource Center)より得た検死解剖ヒト脳組織から単離したcDNAからなる94の試験サンプルが含まれる。脳は死後4〜24時間にドナーの頭蓋冠から摘出され、神経解剖学者によって区分化され、液体窒素蒸気中で-80℃にて凍結されている。すべての脳は神経病理学者によって区分化されて調べられ、明確に関連している神経病理学について診断が確認されている。
疾病診断は患者の記録から取られている。パネルには以下の診断:アルツハイマー病、パーキンソン病(Parkinson's diseas)、ハンチントン舞踏病(Huntington's disease)、進行性核上麻痺(Progressive Supernuclear Palsy)、鬱病(Depression）の各々からの2つの脳、および「正常対照」が含まれる。これらの脳の各々の中には、以下の領域が示されている:帯状回、側頭極、淡蒼球、黒質、ブロードマン領野4(一次運動帯)、ブロードマン領野7(頭頂皮質)、ブロードマン領野9(前前頭皮質)、およびブロードマン領野17(後頭皮質)。すべての患者ですべての脳の領域が示されるわけではなく、例えば、ハンチントン舞踏病は一つには淡蒼球での神経変性を特徴とするので、ハンチントン舞踏病と確認された患者からこの領域を得ることは不可能である。同様にパーキンソン病は黒質の変性を特徴とし、この領域を得るのが一層困難となる。正常な対照脳は神経病理学に関して調べられ、神経変性に一致する病理がないと判明したものである。
CNSパネルで組織の同定に用いた標識では、以下の略語が用いられている:
PSP=進行性核上麻痺
Sub Nigra=黒質
Glob Palladus=淡蒼球
Temp Pole=側頭極
Cing Gyr=帯状回
BA 4= ブロードマン領野4
パネル CNS 神経変性 V1.0
パネルCNS 神経変性 V1. 0のプレートには、2つの対照ウェルならびにハーバード脳組織資源センター(Harvard Brain Tissue Resource Center)(McLean Hospital)およびヒト脳・脊髄液資源センター(Human Brain and Spinal Fluid Resource Center)(VA Greater Los Angeles Healthcare System)から入手した検死解剖ヒト脳組織から単離したcDNAからなる47の試験サンプルが含まれる。脳は死後4〜24時間にドナーの頭蓋冠から摘出され、神経解剖学者によって区分化され、液体窒素蒸気中で-80℃で凍結されている。すべての脳は神経病理学者によって区分化され、調べられ、明確に関連する神経病理学について診断が確認されている。
疾病診断は患者の記録から取られている。このパネルには6のアルツハイマー病(AD)患者由来の脳、および8の死亡前に痴呆の徴候を示さなかった「正常対照」由来の脳が含まれる。8の正常対照脳は2種類:痴呆およびアルツハイマー病のような病理のない対照(対照)および痴呆はないが重篤なアルツハイマー病のような病理の徴候のある対照、(詳しくは、0〜3段階のレベル3と評価される老人斑量;0=斑の徴候なし、3=重篤なAD老人斑量)に分けられる。これらの脳の各々の中には、以下の領域が示されている:海馬、側頭皮質(ブロードマン領野21)、頭頂皮質(ブロードマン領野7)、および後頭皮質(ブロードマン領野17)。これらの領域はADにおけるすべての段階の神経変性を包含するよう選択した。海馬はADにおいて初期ならびに重篤な神経損失領域である;側頭皮質はADにおいて海馬の後に神経変性を示すと知られている;頭頂皮質はこの疾病の最終段階で中程度の神経細胞死を示す;後頭皮質はADで残される、従ってAD患者内で「対照」領域として役割を果たす。すべての患者ですべての脳領域が示されているわけではない。
CNS 神経変性 V1.0パネルで組織の同定に用いた標識では、以下の略語が用いられている:
AD=アルツハイマー病脳;検死解剖に際し患者は痴呆であり、ADのような病理を示した
Control=対照脳;神経病理学を示さない痴呆でない患者
Control(path)=対照脳;痴呆でないが重篤なADのような病理を示す患者
Sup Temporal Ctx=上側頭皮質
Inf Temporal Ctx=下側頭皮質
A. CG125312-01 (NOV6a):ミオシンIF(ミオシンIE)と類似
遺伝子CG125312-01の発現を、プライマー-プローブセットAg7882を使用して評価し、表AAに記載した。RTQ-PCR実施の結果を、表AB、ACおよびADに示す。
表AA プローブ名Ag7882
Figure 2005532786
表AB CNS 神経変性 v1.0
Figure 2005532786
表AC 一般 スクリーニング パネル v1.7
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表AD パネル 4.1D
Figure 2005532786
Figure 2005532786
CNS 神経変性 v1.0まとめ:Ag7882 この遺伝子の低度発現が、アルツハイマー病患者の側頭皮質で見られる。したがって、この遺伝子またはタンパク質産物の治療的調節は、アルツハイマー病の処置で有用であり得る。
一般 スクリーニング パネル v1.7まとめ:Ag7882 この遺伝子の高度発現が、メラノーマSK-MEL-5細胞株でのみ見られる(CT=26)。したがって、この遺伝子の発現は、メラノーマの存在を検出するための診断マーカーとして使用でき、この遺伝子またはタンパク質産物の治療的調節は、メラノーマの処置で有用であり得る。
パネル4.1Dまとめ:Ag7882 この遺伝子の最高発現が、休止好中球において検出される(CT=29.7)。この遺伝子の有意ではあるが低下した発現がまた、活性化好中球で見られる。加えて、この遺伝子の中〜低度発現がまた、二次極性化T細胞、記憶T細胞、LAK細胞、休止IL-2処理NK細胞、休止PBMC細胞、好酸球、樹状細胞、単球および活性化真皮線維芽細胞で見られる。したがって、この遺伝子産物は、これらの炎症性細胞の活性化を減少させ、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、肺気腫、関節リウマチ、エリテマトーデスまたは乾癬の患者において症候を減少またはなくさせるタンパク質治療薬として有用であり得る。さらに、この遺伝子産物の、小分子または抗体アンタゴニストは、AIDSまたはその他の免疫不全症の患者において免疫応答を増加させるのに有効であり得る。
B. CG134632-01: dUTPアーゼ(ミトコンドリア型)
遺伝子CG134632-01の発現を、プライマー-プローブセットAg6505を使用して評価し、表BAに記載した。RTQ-PCR実施の結果を、表BB、BCおよびBDに示す。
表BA プローブ名Ag6505
Figure 2005532786
表BB 一般 スクリーニング パネルv1.6
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表BC パネル4.1D
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表BD パネルCNS 1.1
Figure 2005532786
Figure 2005532786
一般 スクリーニング パネル v1.6まとめ:Ag6505 この遺伝子の最高発現が、卵巣癌OVCAR-8細胞株において検出される(CT=29.7)。この遺伝子の中〜低レベルの発現がまた、膵臓癌、胃癌、結腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、メラノーマおよび脳癌由来細胞株のクラスターで見られる。したがって、この遺伝子の発現は、これらの癌の存在を検出するためのマーカーとして使用できる可能性がある。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、膵臓癌、胃癌、結腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、メラノーマおよび脳癌の処置で有効であり得る。
代謝または内分泌機能を有する組織の中では、この遺伝子は、膵臓、副腎、甲状腺、下垂体、胎児骨格筋、心臓、胎児肝臓および消化管において中〜低レベルで発現される。したがって、この遺伝子の活性の治療的調節は、内分泌/代謝関連疾病、例えば、肥満症および糖尿病の処置で有用であると分かり得る。
さらに、この遺伝子は、扁桃体、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質および脊髄をはじめとする調べた中枢神経系のすべての領域において中レベルで発現される。したがって、この遺伝子産物の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症、総合失調症および鬱病などの中枢神経系の疾患の処置で有用であり得る。
パネル4.1Dまとめ:Ag6505 CG134632-01遺伝子の最高発現が、肺微小血管内皮細胞およびIL-9処理NCI-H292細胞において検出される(CTs=33.6)。さらに、この遺伝子の低レベルの発現がまた、活性化一次及び二次Th1およびTh2細胞、活性化CD4リンパ球、IL2処理NK細胞、TNFα+Il-1β処理末梢気道上皮およびHPAEC細胞、冠動脈SMC、好塩基球、RNFα+IL-1β処理肺繊維芽細胞および真皮線維芽細胞で見られる。したがって、この遺伝子産物の治療的調節は、喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、関節リウマチおよび骨関節炎などの自己免疫および炎症性疾患の処置で有用であり得る。
この遺伝子の低レベルの発現がまた、腎臓で見られる。したがって、この遺伝子によってコードされるタンパク質を用いて設計した小分子治療は、腎機能を調節でき、狼瘡および糸球体腎炎をはじめとする、腎臓に影響を及ぼす、炎症性または自己免疫疾患の処置において重要である可能性がある。
パネルCNS 1.1まとめ:Ag6505 このパネルでは、CG134632-01遺伝子の発現が、独立した個体群の脳において低レベルで確認される。したがって、この遺伝子の治療的調節は、神経疾患の処置で有用であり得る。
C. CG154077-01:SUR2
遺伝子CG154077-01の発現を、プライマー-プローブセットAg5693を使用して評価し、表CAに記載した。RTQ-PCR実施の結果を、表CB、CC、CDおよびCEに示す。
表CA プローブ名Ag5693
Figure 2005532786
表CB 一般 スクリーニング パネル v1.5
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表CC 一般 スクリーニング パネル v1.6
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表CD パネル4.1D
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表CE パネル5膵島
Figure 2005532786
一般 スクリーニング パネル v1.5まとめ:Ag5693 この遺伝子の最高発現が、骨格筋において検出される(CT=29.6)。この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、骨格筋、心臓、肝臓および消化管をはじめとする代謝または内分泌機能を有する組織において中〜低レベルで発現される。この遺伝子はスルホニル尿素受容体2(SUR2)をコードする。SUR2はATP結合カセット(ABC)輸送体のスーパーファミリーのメンバーである。ATP感受性カリウムチャンネルに特異的な、筋肉の薬物結合性調節サブユニットとして機能する。最近のデータにより、SUR2の破壊は、骨格筋におけるインスリン刺激性グルコース取り込みの増加をもたらすことが示された。Curagenで、GeneCalling研究を用いて、SUR2が高脂肪食を与えたマウスおよび糖病病マウスにおいて遅筋に対して速筋でアッププレギュレートされていることがわかった。グルコース取り込みは、遅筋と比べ速筋では減少していることは公知である。SUR2の阻害は、遅筋表現型に好都合であるためにグルコース取り込みが増加し、インスリン感受性が改善される可能性がある。したがって、SUR2のアンタゴニストは、インスリン耐性および糖尿病に対する有効な治療薬であり得る。
さらに、この遺伝子の低度発現がまた、胎児脳、大脳皮質、黒質および脊髄で見られる。したがって、この遺伝子産物の治療的調節は、パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症および癲癇発作などの中枢神経系の疾患の処置で有用であり得る。
この遺伝子の低度発現がまた、メラノーマ結腸癌および脳癌由来のいくつかの癌細胞株で見られる。したがって、小分子薬の使用によるこの遺伝子またはそのタンパク質産物の治療的調節は、メラノーマ、結腸癌および脳癌の処置で有用であり得る。
Chutkow WA, Samuel V, Hansen PA, Pu J, Valdivia CR, Makielski JC, Burant CF. Disruption of Sur2-containing K(ATP) channels enhances insulin-stimulated glucose uptake in skeltal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U SA 2001. 98,11760-4. PMID: 11562480、Chutkow WA, Simon MC, Le Beau MM, Burant CF. Cloning, tissue expression, and chromosomal localization of SUR2, the putative drug-binding subunit of cardiac, skeltal muscle, and vascular KATP channels. Diabetes 1996. 45,1439-45. PMID: 8826984、Halseth AE, Bracy DP, Wasserman DH. Functional limitations to glucose uptake in muscles comprised of different fiber types. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2001. 280, E994-9. PMID: 11350781、Shindo T, Yamada M, Isomoto S, Horio Y, Kurachi Y. SUR2 subtype (A and B)-dependent differential activation of the cloned ATP-sensitive K+ channels by pinacidil and nicorandil. Br. J. Pharmacol. 1998. 124, 985-91. PMID: 9692785、Reimann F, Ashcroft FM, Gribble FM. Structural basis for the interference between nicorandil and sulfonylurea action. Diabetes 2001. 50, 2253-9. PMID: 11574406 and Moreau C, Jacquet H, Prost AL, D'hahan N, Vivaudou M. The molecular basis of the specificity of action of K(ATP) channel openers. EMBO J. 2000.19, 6644-51. PMID: 11118199参照。
一般 スクリーニング パネル v1.6まとめ:Ag5693 この遺伝子の最高発現が、腎臓プールにおいて検出される(CT=28.3)。このパネルでのこの遺伝子の発現は、パネル1.5で見られるものと一致しており、この遺伝子のさらなる考察についてはパネル1.5参照。
パネル4.1Dまとめ:Ag5693 の遺伝子の最高発現が、肝硬変において検出される(CT=33.6)。したがって、この遺伝子またはタンパク質産物の治療的調節は、肝硬変の処置で有用であり得る。
この遺伝子の低度発現がまた、休止および活性化肺および真皮線維芽細胞、腎臓および肺で見られる。したがって、小分子薬の使用によるこの遺伝子またはそのタンパク質産物の治療的調節は、乾癬、エリテマトーデス、慢性閉塞性肺疾患、喘息、アレルギーおよび肺気腫をはじめとする自己免疫および炎症性疾患 の処置で有用であり得る。
パネル5膵島まとめ:Ag5693 この遺伝子の最高発現が、インスリンを服用している糖尿病患者の骨格筋において検出される(CT=31)。この遺伝子は、非糖尿病および糖尿病患者の脂肪および骨格筋において低レベルで発現される。SUR2の発現レベルは、非糖尿病の個体と比べて糖尿病の脂肪／骨格筋(患者12)では大幅に上がっている。これらのデータは、SUR2のアップレギュレーションには病原性の影響があり、SUR2の阻害は糖尿病の処置で有益であり得るということをさらに支持する。
D. CG155759-02:嗅覚受容体
遺伝子CG155759-02の発現を、プライマー-プローブセットAg2298を使用して評価し、表DAに記載した。CG155759-02は全長物理的クローンに相当することに注意。
表DA プローブ名Ag2298
Figure 2005532786
CNS 神経変性 v1.0まとめ:Ag2298 この遺伝子の発現が、このパネルのすべてのサンプルにおいて低/検出不能である(CT>35)。
パネル1.3Dまとめ:Ag2298 この遺伝子の発現が、このパネルのすべてのサンプルにおいて低/検出不能である(CT>35)。
パネル2.2まとめ:Ag2298 この遺伝子の発現が、このパネルのすべてのサンプルにおいて低/検出不能である(CT>35)。
パネル4.1Dまとめ:Ag2298 この遺伝子の発現が、このパネルのすべてのサンプルにおいて低/検出不能である(CT>35)。
パネル5膵島まとめ:Ag2298 この遺伝子の発現が、このパネルのすべてのサンプルにおいて低/検出不能である(CT>35)。
E. CG155882-01:嗅覚受容体
遺伝子CG155882-01の発現を、プライマー-プローブセットAg2192を使用して評価し、表EAに記載した。RTQ-PCR実施の結果を、表EB、EC、EDおよびEEに示す。
表EA プローブ名Ag2192
Figure 2005532786
表EB パネル1.3D
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表EC パネル2D
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表ED パネル3D
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表EE パネル4D
Figure 2005532786
Figure 2005532786
AI 包括的パネル v1.0まとめ:Ag2192 この遺伝子の発現が、このパネルのサンプルのすべてにわたり低/検出不能である(CT>35)。
パネル1.3Dまとめ:Ag2192 CG155882-01遺伝子の発現は腎臓癌細胞株(ACHN)由来のサンプルで最高である(CT=33.3)。加えて、別の腎臓癌細胞株、2種のメラノーマ細胞株および神経膠腫細胞株でも発現される。したがって、この遺伝子の発現は、このパネルでこれらのサンプルと他のものを区別するために使用できる可能性がある。さらに、この受容体のシグナル伝達の阻害をもたらす、ヒトモノクローナル抗体を用いるCG155882-01のターゲッティングは、これらの腫瘍に対して、好ましくは、腎臓細胞癌腫に対して治療的作用を有し、細胞成長及び増殖の低下をもたらす。
パネル2Dまとめ:Ag2192 CG155882-01遺伝子の発現は、腎臓癌由来サンプルで最高であると思われる(CT=33.3)。加えて、いくつかの他の腎臓癌サンプルでもかなり発現されると思われる。この結果は、パネル1.3Dで見られると一致している。注目すべきは、腎臓癌サンプルとそれぞれの正常隣接組織間の発現の相違である。したがって、この遺伝子の発現は、このパネルの腎臓癌サンプルを残りのサンプルと区別するために使用できる可能性がある。さらに、このデータは、GPCRは、腎臓細胞癌腫進行において、およびおそらくは、このファミリーの他のメンバーに関して先に示されているのと同様、細胞成長および増殖において役割を有することを示す。したがって、小分子薬、抗体またはタンパク質治療薬の使用によるこの遺伝子の治療的調節は、腎臓癌、好ましくは、腎臓細胞癌腫の処置で有用である可能性がある。
パネル3Dまとめ:Ag2192 CG155882-01遺伝子の発現は、腎臓癌細胞株由来のサンプルで最高であると思われる(CT=32.6)。腎臓癌とのこの関係はパネル1.3Dおよび2Dでも見られる。加えて、1種の脳癌細胞株、1種の繊維肉腫細胞株、1種のメラノーマ細胞株および1種の平滑筋肉腫細胞株でかなりの発現が見られる。したがって、この遺伝子の発現は、このパネルのこれらのサンプルと他のサンプルを区別するために使用できる可能性がある。さらに、小分子薬、抗体またはタンパク質治療薬の使用によるこの遺伝子の治療的調節は、腎臓癌、メラノーマ、線維肉腫、脳癌または平滑筋肉腫の処置で有益である可能性がある。
パネル4Dまとめ:Ag2192 CG155882-01遺伝子の発現は、IL-4サイトカインによってではなく、強力な炎症性サイトカインTNF-aおよびIFN-gサイトカインによって処理された線維芽細胞において、未処理の繊維芽細胞よりも高い。IL-4は抗炎症性と関連している。RNF-aおよびIFNｇは、線維芽細胞における細胞外マトリックスのタンパク質分解による分解の活性化、肺気腫と関係している現象をもたらすことがわかっている。IFNgはまた、肺の肉芽腫性炎症に向けることがわかっている。したがって、小分子薬、または抗体の使用によるこの遺伝子産物の治療的調節は、これらの疾病の処置にとって有益である可能性がある。
F. CG167853-01: 細胞質アセチルCOA加水分解酵素
遺伝子CG167853-01の発現を、プライマー-プローブセットAg6104を使用して評価し、表FAに記載した。RTQ-PCR実施の結果を、表FBおよびFCに示す。
表FA プローブ名Ag6104
Figure 2005532786
表FB 一般 スクリーニング パネル v1.5
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表FC パネル4.1D
Figure 2005532786
Figure 2005532786
CNS 神経変性 v1.0まとめ:Ag6104 この遺伝子の発現が、このパネルのサンプルのすべてにわたり低/検出不能である(CT>35)。
一般 スクリーニング パネル v1.5まとめ:Ag6104 この遺伝子の最高発現が、主に胎児肝臓で見られる(CT=29.9)。この遺伝子の低度発現がまた、成人肝臓で見られる。興味深いことに、この遺伝子は、成人肝臓(CT=34.1)と比較すると胎児においてかなり高いレベルで発現される(CT=29.9)。この知見は、この遺伝子の発現は、胎児肝臓と成人肝臓を区別するために使用できるということを示唆する。さらに、胎児組織におけるこの遺伝子の相対的過剰発現は、このタンパク質産物は、胎児では肝臓成長または発達を増強する可能性があり、したがって、成人においても再生能において作用する可能性があることを示唆する。したがって、この遺伝子によってコードされるタンパク質の治療的調節は、肝臓関連疾病の処置で有用である可能性がある。
この遺伝子の中〜低度発現がまた、メラノーマ、結腸癌および脳癌由来のいくつかの細胞株で見られる。したがって、この遺伝子の治療的調節は、メラノーマ、結腸癌および脳癌の処置で有用であり得る。
パネル4.1Dまとめ:Ag6104 この遺伝子の低度発現が、主に腎臓で見られる(CT=33.4)。したがって、この遺伝子によってコードされるタンパク質を用いて設計した抗体または小分子治療は、腎機能を調節でき、狼瘡および糸球体腎炎をはじめとする、腎臓に影響を及ぼす炎症性または自己免疫疾患の処置において重要である可能性がある。
パネル5膵島まとめ:Ag6104 この遺伝子の発現が、おそらくは、プローブまたは化学反応失敗のために、このパネルのサンプルのすべてにわたり低/検出不能である(CT>35)。
G. CG167873-01:P2Xプリン受容体5
遺伝子CG167873-01の発現を、プライマー-プローブセットAg6266を使用して評価し、表GAに記載した。RTQ-PCR実施の結果を、表GBおよびGCに示す。
表GA プローブ名Ag6266
Figure 2005532786
表GB 一般 スクリーニング パネル v1.5
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表GC パネル4.1D
Figure 2005532786
Figure 2005532786
CNS 神経変性 v1.0まとめ:Ag6266 この遺伝子の発現が、このパネルのサンプルのすべてにわたり低/検出不能である(CT>35)。
一般 スクリーニング パネル v1.5まとめ:Ag6266 この遺伝子の低度発現が、主に、腎臓癌UO-31細胞株において検出される(CT=33.9)。したがって、この遺伝子の発現は、腎臓癌の診断マーカーとして使用できる。さらに、小分子薬の使用によるこの遺伝子またはそのタンパク質産物の治療的調節は、腎臓癌を処置するために使用できる。
この遺伝子の低度発現がまた、脊髄サンプルで見られる。したがって、この遺伝子またはタンパク質産物の治療的調節は、脊髄に影響を及ぼす神経疾患の処置で有用であり得る。
パネル4.1Dまとめ:Ag6266 この遺伝子の最高発現が、活性化された二次Th1細胞において検出される(CT=31.9)。加えて、この遺伝子の低度発現がまた、活性化された一次Tr1、Th2および活性化された二次Th2、ナイーブT細胞および記憶T細胞においてある。したがって、T細胞におけるこの遺伝子の発現パターンは、T細胞極性化において重要であり得るということを示唆する。したがって、転写物または転写物によってコードされるタンパク質の治療的調節は、免疫調節において、および喘息、関節炎、乾癬、クローン病および潰瘍性大腸炎をはじめとするIBD、および狼瘡などのT細胞媒介性疾病の処置において重要である可能性がある。
H. CG167873-02:P2Xプリン受容体5
遺伝子CG167873-02の発現を、プライマー-プローブセットAg6267を使用して評価し、表HAに記載した。RTQ-PCR実施の結果を、表HBおよびHCに示す。
表HA プローブ名Ag6267
Figure 2005532786
表HB 一般 スクリーニング パネル v1.5
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表HC パネル4.1D
Figure 2005532786
Figure 2005532786
CNS 神経変性 v1.0まとめ:Ag6267 この遺伝子の発現が、このパネルのサンプルのすべてにわたり低/検出不能である(CT>35)。
一般 スクリーニング パネル v1.5まとめ:Ag6267 この遺伝子の最高発現が、主に肺癌NCI-H23細胞株で見られる(CT=29.2)。したがって、この遺伝子の発現は、肺癌の存在を検出するための診断マーカーとして使用でき、また、この遺伝子の治療的調節は、肺癌の処置で有用であり得る。
さらに、この遺伝子の中度発現がまた、骨格筋および胸腺で見られる。したがって、小分子薬の使用によるこの遺伝子の治療的調節は、筋肉関連疾病および喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデスまたは関節リウマチをはじめとするT細胞媒介性自己免疫または炎症性疾患の処置で有用であり得る。
パネル4.1Dまとめ:Ag6267 この遺伝子の最高発現が、IL-13活性化NCI-H292細胞で見られる(CT=31.3)。この遺伝子の中度発現は、休止および活性化NCI-H292細胞に限定されている。気道上皮のモデルとして用いられることの多い、この粘膜表皮性細胞株(NCI-H292細胞)におけるこの遺伝子の発現は、この遺伝子が、気道上皮の増殖または活性化において重要であり得ることを示唆する。したがって、この遺伝子によってコードされるタンパク質を用いて設計した治療薬は、慢性閉塞性肺疾患、喘息、アレルギーおよび肺気腫において肺上皮の炎症によって起きる症候を減少させるか、または消失させることができる。
I. CG108945-02:カチオン輸送ATPアーゼ1
遺伝子CG108945-02の発現を、プライマー-プローブセットAg6263を使用して評価し、表IAに記載した。RTQ-PCR実施の結果を、表IBおよびICに示す。
表IA プローブ名Ag6263
Figure 2005532786
表IB CNS 神経変性 v1.0
Figure 2005532786
表IC 一般 スクリーニング パネル v1.5
Figure 2005532786
Figure 2005532786
CNS 神経変性 v1.0まとめ:Ag6263 このパネルでは、この遺伝子の発現が、独立した個体群の脳において低レベルで確認される。この遺伝子は、アルツハイマー病患者の側頭皮質においてわずかにダウンレギュレートされていることがわかる。したがって、この遺伝子もしくはそのタンパク質産物のアップレギュレーション、またはこの受容体に特異的なアゴニストを用いた処置は、この疾病に伴われる痴呆/記憶喪失およびニューロン死を逆転させるのに有用であり得る。
一般 スクリーニング パネル v1.5まとめ:Ag6263 この遺伝子の最高発現が、胎児脳および扁桃体、海馬、黒質、視床、小脳および大脳皮質をはじめとするすべての成人脳領域において検出される(CT=30)。この遺伝子の中度発現がまた、脊髄で見られる。したがって、この遺伝子産物の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症、総合失調症および鬱病などの中枢神経系の疾患の処置で有用であり得る。
この遺伝子の中〜低レベルの発現がまた、膵臓癌、胃癌、結腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、メラノーマおよび脳癌由来細胞株のクラスターで見られる。したがって、この遺伝子の発現は、これらの癌の存在を検出するためのマーカーとして使用できる可能性がある。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、膵臓癌、胃癌、結腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、メラノーマおよび脳癌の処置で有効であり得る。
代謝または内分泌機能を有する組織の中では、この遺伝子は、膵臓、甲状腺、骨格筋および胎児肝臓において低レベルで発現される。したがって、この遺伝子の活性の治療的調節は、内分泌/代謝関連疾病、例えば、肥満症および糖尿病の処置で有用であると分かり得る。
興味深いことに、この遺伝子は、成人肺および肝臓(CT=38)と比較すると、胎児においてかなり高レベルで発現される(CT=34〜34.8)。この知見は、この遺伝子の発現は、胎児肝臓と成人肝臓を区別するために使用できることを示唆する。さらに、胎児組織におけるこの遺伝子の相対的過剰発現は、このタンパク質産物は、胎児では肝臓成長または発達を増強する可能性があり、したがって、成人においても再生能力において作用する可能性があるということを示唆する。したがって、この遺伝子によってコードされるタンパク質の治療的調節は、肝臓関連疾病の処置で有用である可能性がある。
パネル4.1Dまとめ:Ag6263 この遺伝子の発現が、このパネルのサンプルのすべてにわたり低/検出不能である(CT>35)。
J. CG167893−01:P450
遺伝子CG167893-01の発現を、プライマー-プローブセットAg6107を使用して評価し、表JAに記載した。
表JA プローブ名Ag6107
Figure 2005532786
CNS 神経変性 v1.0まとめ:Ag6107 この遺伝子の発現が、このパネルのすべてのサンプルにおいて低/検出不能である(CT>35)。
一般 スクリーニング パネル v1.5まとめ:Ag6107 この遺伝子の発現が、このパネルのすべてのサンプルにおいて低/検出不能である(CT>35)。
K. CG169088-01:細胞膜カルシウム輸送ATPアーゼ3
遺伝子CG169088-01の発現を、プライマー-プローブセットAg6111を使用して評価し、表KAに記載した。
表KA プローブ名Ag6111
Figure 2005532786
CNS 神経変性 v1.0まとめ:Ag6111 この遺伝子の発現が、このパネルのすべてのサンプルにおいて低/検出不能である(CT>35)。
一般 スクリーニング パネル v1.5まとめ:Ag6111 この遺伝子の発現が、このパネルのすべてのサンプルにおいて低/検出不能である(CT>35)。
パネル4.1Dまとめ:Ag6111 この遺伝子の発現が、このパネルのすべてのサンプルにおいて低/検出不能である(CT>35)。
L. CG169201-01:可能性あるリン脂質輸送ATPアーゼIH
遺伝子CG169201-01の発現を、プライマー-プローブセットAg6123、Ag7799およびAg7814を使用して評価し、表LA、LBおよびLCに記載した。RTQ-PCR実施の結果を、表LD、LEおよびLFに示す。
表LA プローブ名Ag6123
Figure 2005532786
表LB プローブ名Ag7799
Figure 2005532786
表LC プローブ名Ag7814
Figure 2005532786
表LD CNS 神経変性 v1.0
Figure 2005532786
表LE 一般 スクリーニング パネル v1.5
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表LF パネル5膵島
Figure 2005532786
CNS 神経変性 v1.0まとめ:Ag7799 このパネルは、アルツハイマー病においてこの遺伝子の発現の差を示さない。しかしながら、このプロフィールにより、この遺伝子の発現が、脳において中レベルで確認される。中枢神経系におけるこの遺伝子の考察については、パネル1.5参照。
一般 スクリーニング パネル v1.5まとめ:Ag6123 この遺伝子の最高発現が、乳癌細胞株で見られる(CT=27.9)。この遺伝子はこのパネルでは広く発現され、中度発現が脳癌、結腸癌、胃癌、肺癌、乳癌、卵巣癌およびメラノーマ癌細胞株で見られる。この発現プロフィールは、細胞生存および増殖におけるこの遺伝子産物の役割を示唆する。この遺伝子産物の調節は、癌の処置で有用であり得る。
代謝機能を有する組織の中では、この遺伝子は、下垂体、脂肪、副腎、膵臓、甲状腺ならびに成人および胎児骨格筋、心臓および肝臓において中〜低レベルで発現される。これら組織の中でのこの広範な発現は、この遺伝子産物が、正常神経内分泌および代謝機能において役割を果たしている可能性があること、および、この遺伝子の調節されていない発現は、肥満症および糖尿病などの神経内分泌疾患または代謝疾患の原因となる可能性があることを示唆する。
さらに、この遺伝子は、成人対応物(CT=30〜32)と比較すると、胎児肺、肝臓および骨格筋組織においてかなり高レベルで発現される(CT=27〜29)。したがって、この遺伝子の発現は、これら組織の胎児および成人供給源間を区別するために使用できる。
興味深いことに、この遺伝子は、成人対応物における発現レベル(CT=33.8)と比較すると、胎児肝臓組織においてかなり高レベルで発現される(CT=30.5)。この知見は、この遺伝子の発現は、この組織の胎児および成人供給源間を区別するために使用できることを示唆する。さらに、胎児肝臓におけるこの遺伝子の相対的過剰発現は、このタンパク質産物が、胎児では、この器官の成長または発達を増強する可能性があり、したがって、成人でも再生能において作用する可能性があることを示唆する。したがって、この遺伝子によってコードされるタンパク質の治療的調節は、肝臓関連疾病の処置で有用である可能性がある。
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃体、小脳および大脳皮質をはじめとするCNSにおいて、低度ではあるが有意なレベルで発現される。したがって、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、神経疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、総合失調症、多発性硬化症、脳卒中および癲癇の処置で有用であり得る。
パネル5膵島まとめ:Ag6123 この遺伝子の最高発現が、脂肪で見られる(CT=31.1)。中〜低レベルの発現が、胎盤及び骨格筋をはじめとするその他の代謝組織で見られる。代謝病におけるこの遺伝子の考察については、パネル1.5参照。
M. CG50303-03:嗅覚受容体
遺伝子CG50303-03の発現を、プライマー-プローブセットAg1501、Ag1585、Ag2377、Ag2607およびAg2610を使用して評価し、表MA、MB、MC、MDおよびMEに記載した。RTQ-PCR実施の結果を、表MF、MG、MH、MI、MJ、MKおよびMLに示す。
表MA プローブ名Ag1501
Figure 2005532786
表MB プローブAg1585
Figure 2005532786
表MC プローブ名Ag2377
Figure 2005532786
表MD プローブ名Ag2607
Figure 2005532786
表ME プローブ名Ag2610
Figure 2005532786
表MF CNS 神経変性 v1.0
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表MG パネル1.2
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表MH パネル1.3D
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表MI パネル2.2
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表MJ パネル4D
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表MK パネルCNS 1
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表ML パネルCNS 1.1
Figure 2005532786
Figure 2005532786
CNS 神経変性 v1.0まとめ:Ag2610/Ag2607/Ag2377 CG50303-03遺伝子は、アルツハイマー病の脳の側頭皮質において、アルツハイマー病に特徴的であり、その原因である可能性のあるアミロイドプラークのない対照脳よりも高度に発現される。CG50303-03遺伝子は、GPCRと相同性を有するタンパク質をコードする。GPCRは、薬物を用いて容易にターゲッティングすることができ、シグナル伝達プロセスをはじめ、多数の特定の脳プロセスを制御し、これは現在、アルツハイマー病を治療するFDA認可薬剤、例えば、コリン作動性の系の標的である。AβP誘導性細胞傷害性について提唱されている主要な機序は、Ca2+恒常性の喪失および反応性酸素腫(ROS)の生成を含む。Ca2+恒常性の変化は、二次メッセンジャーのGタンパク質駆動性放出の変化の結果である可能性がある。したがって、このクラスの分子をターゲッティングすることは、アルツハイマー病治療において治療的可能性があり得る。詳しくは、アルツハイマー病に冒された脳におけるCG50303-03遺伝子発現の増加は、GPCRを標的とする薬物の治療的価値の可能性を示す。
Perrine K, Dogali M, Fazzini E, Sterio D, Kolodny E, Eidelberg D, Devinsky O, Beric A.Cognitive functioning after pallidotomy for refractory Parkinson's disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1998 Aug;65(2):150-4. PMID: 9703163 and Kourie JI.Mechanisms of amyloid β protein-induced modification in ion transport systems: implications for neurodegenerative diseases. Cell Mol Neurobiol 2001 Jun; 21(3):173-213 PMID: 11569534参照。
パネル1.2まとめ:Ag1501 CG50303-03遺伝子は、このパネルでは多数のサンプル中で中レベルで発現される。最高発現は卵巣癌細胞株において検出される(CT=30.7)。加えて、この遺伝子は、正常卵巣における発現と比較すると、このパネルに存在する6種の卵巣癌細胞株のすべてで過剰発現されている。CG50303-03遺伝子はまた、メラノーマ、乳癌および肺癌由来細胞株において中度に発現される。したがって、この遺伝子の発現は、これらの細胞株を他の組織サンプルと区別するために使用できる可能性がある。さらに、小分子薬または抗体の使用による、CG50303-03遺伝子またはそのタンパク質産物の治療的調節は、卵巣癌、乳癌、肺癌またはメラノーマの処置で有用であり得る。
代謝機能に関与する組織の中では、CG50303-03遺伝子は、副腎、心臓、骨格筋および成人肝臓において中程度に発現される。興味深いことに、CG50303-03遺伝子発現は、胎児肝臓および心臓組織において、対応する成人組織におけるよりもかなり低い。したがって、CG50303-03遺伝子の発現は、心臓および肝臓由来の成人および胎児組織間を区別するために使用できる可能性がある。さらに、この遺伝子またはそのタンパク質産物は、前記で列挙した組織のいずれかまたはすべてにおける疾病の原因および/または処置において重要であり得る。
CG50303-03遺伝子は、扁桃体、小脳、海馬、視床、大脳皮質および脊髄をはじめとするCNS由来サンプルの多くにわたって広範に中度発現する。CNS疾患の処置におけるこの遺伝子の役割の可能性の説明については、CNS 神経変性 パネル v1.0まとめ参照。
パネル1.3Dまとめ:Ag2610/Ag2607/Ag1585/Ag2377 CG50303-03遺伝子の発現は、このパネルでは中枢神経系機能に関与する組織に限定されていると思われる。詳しくは、低度ではあるが有意な発現が、視床、黒質、脊髄および胎児脳において検出される。
パネル2.2まとめ:Ag2377/Ag2607 CG50303-03遺伝子の発現は、乳癌サンプル由来サンプルにおいて最高である(CT=34〜34.7)。したがって、この遺伝子の発現は、乳癌サンプルと他のサンプルを区別するために、および、乳癌の存在についての診断マーカーとして使用できる可能性がある。さらに、小分子薬または抗体の使用によるCG50303-03遺伝子またはそのタンパク質産物の活性の治療的調節は、乳癌の処置で有効である可能性がある。Ag2610/Ag1585 CG50303-03遺伝子の発現は、このパネルのすべてのサンプルにおいて低/検出不能である(Ct値>35)。
パネル4Dまとめ:Ag2607/Ag2377 2種の異なるプローブおよびプライマーセットを用いる2つの実験は、CG50303-03遺伝子が、LPS刺激された単球においてアップレギュレートされていることを示す(CTw=32〜34)。したがって、この遺伝子によってコードされる推定GPCRは、その抗原提示細胞としての機能において単球の活性化に関与している可能性がある。このことは、この膜タンパク質の機能をブロックする抗体または小分子治療薬は、自己免疫および炎症性疾患を処置するための抗炎症性治療薬として有用であり得るということを示唆する。さらに、このFPCRの機能を刺激する抗体または小分子治療薬は、免疫抑制された個体を処置するための有用な治療薬であり得る。プローブおよびプライマーセットAg2610を用いた一実験のデータは、このパネルのすべてのサンプルにおいて低/検出不能な発現を示したことに注意。
パネルCNS 1まとめ:Ag2377 同一のプローブおよびプライマーセットを用いる2つの実験により、極めて良好に一致する結果が得られている。CG50303-03遺伝子の発現は、ハンチントン病患者の黒質において最高であり、このことは、この遺伝子は神経変性に伴う遺伝的調節不全に関与している可能性があることを示唆する。黒質はまた、パーキンソン病神経変性の進行にとっても重要である。したがって、CG50303-03によってコードされるGPCRの薬理学的ターゲッティングは、ハンチントン病ならびにおそらくはパーキンソン病患者において、この遺伝的調節不全に対応するのに役立ち、正常機能の回復に寄与し得る。GPCRシグナル伝達系の薬理学的調節は、SSRIなどの強力な鬱病治療薬がその作用を発揮する機構である。プローブおよびプライマーセットAg1585を用いた第3の実験は、このパネルではすべてのサンプルにおいて低/検出不能な発現を示したことに注意(CT>35)。
パネルCNS 1.1まとめ:Ag2377 同一のプローブおよびプライマーを用いた2つの実験では、CG50303-03遺伝子の最高発現が、パラ核上性麻痺PSPおよび鬱病の患者の帯状回 で見られる(CT=32)。この知見は、このGPCRをターゲッティングすることは、これらの疾病の処置において治療的価値がある可能性があるということを示唆する。
N. CG54092-01:タンデムアシッド(TANDEM ACID)感受性カリウムチャンネルTASK5
遺伝子CG54092-01の発現を、プライマー-プローブセットAg241およびAg3074を使用して評価し、表NAおよびNBに記載した。RTQ-PCR実施の結果を、表NC、ND、NE、NF、NG、NHおよびNIに示す。
表NA プローブ名Ag241
Figure 2005532786
表NB プローブ名Ag3074
Figure 2005532786
表NC AI.05軟骨肉腫
Figure 2005532786
表ND AI 包括的パネル v1.0
Figure 2005532786
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表NE パネル1.3D
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表NF パネル2D
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表NG パネル3D
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表NH パネル4.1D
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表NI パネル4D
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AI.05軟骨肉腫まとめ:Ag3074 この遺伝子の最高発現が、IL-1b/オンコスタチン処理軟骨肉腫細胞株(SW1353)において検出される。興味深いことに、この遺伝子の発現は、IL-1処理で幾分かアップレギュレートされていると思われ、炎症誘発性サイトカインの強力なアクチベーターおよびマトリックスメタロプロテイナーゼは、骨関節炎(OA)において認められる軟骨の破壊に関与している。小分子またはアンチセンスのいずれかによる軟骨細胞におけるこの転写物の発現調節は、OAおよび関節リウマチにおいて認められる軟骨の分解を防ぐのに重要である可能性がある。
AI 包括的パネル v1.0まとめ:Ag3074 この遺伝子の低度ではあるが有意なレベルの発現が、OA骨および隣接骨ならびにOA軟骨、OA滑膜およびOA滑液サンプルをはじめとする骨関節炎(OA)患者由来の関節組織において検出される。この遺伝子は、対応する正常組織では有意なレベルでは発現されない。この遺伝子は、タンデムアシッド感受性カリウムチャンネルTASK5をコードする。このファミリーのK+チャンネルは、細胞外pHの小さな変化に対して極めて感受性があり、このことは、TASKは細胞外pHの変化に対する細胞応答において役割を有するということを示唆する(OMIN603220)。したがって、この遺伝子によってコードされるタンパク質をベースとした小分子治療薬および抗体治療薬は、骨関節炎および関節リウマチの発症および進行と関連している炎症および組織破壊を減少または抑制する可能性がある。
この遺伝子の低レベル発現がまた、正常肺サンプル、CORD肺、肺気腫、アトピー性喘息、喘息、アレルギー、クローン病(正常対応対照および患部)、潰瘍性大腸炎(正常対応対照および患部)および乾癬(正常対応対照および患部)由来のサンプルにおいて検出される。したがって、この遺伝子産物の治療的調節は、乾癬、アレルギー、喘息および炎症性腸疾患をはじめとする自己免疫および炎症性疾患と関連している症候/状態を寛解し得る。
パネル1.3Dまとめ:Ag241/Ag3074 2種の異なるプローブおよびプライマーセットを用いた3実験により、極めて良好に一致する結果が得られている。このパネルにおけるこの遺伝子の発現は、癌細胞株で最も顕著であり、胃癌細胞株で最高に発現される(CT=28)。有意なレベルも発現がまた、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、肺癌および腎臓癌由来の細胞株で見られる。したがって、小分子薬または抗体の使用によるこの遺伝子活性の治療的阻害は、前記で列挙した癌種の処置で有用である可能性がある。さらに、この遺伝子の発現は、癌の診断マーカーとして使用できる可能性がある。
代謝組織の中では、この遺伝子は、副腎、下垂体、心臓および脂肪において低レベルで発現される。したがって、この遺伝子産物は、副腎疾患、肥満症および2型糖尿病をはじめとする代謝および内分泌疾患を処置するための小分子標的であり得る。
Ag241を用いた一実験の結果(実施165628181)の結果は、このパネルではすべてのサンプルにおいて低/検出不能レベルの発現を示す(CT>35)。
Maingret F, Patel AJ, Lesage F, Lazdunski M, Honore E. Lysophospholipids open the two-pore domain mechano-gated K(+) channels TREK-1 and TRAAK. J Biol Chem. 2000 Apr 7;275(14):10128-33. PMID: 10744694 and Ouadid-Ahidouch H, Chaussade F, Roudbaraki M, Slomianny C, Dewailly E, Delcourt P, Prevarskaya N. KV1.1 K(+) channels identification in human breast cancer cell: involvement in cell proliferation. Biochem Biophys Res Commun 2000 Nov 19;278(2):272-7参照。(Ouadid-Ahidouchらの報告は、カリウムの流れが、乳癌細胞増殖にとってどのように重要であるかを示し、このことは、CG54092-01、カリウムチャンネルが腫瘍細胞成長および増殖において役割を果たすことを示唆する)。
パネル2Dまとめ:Ag241/Ag3041 この遺伝子の発現は、3回の独立した実施で評価し、実施間は良好に一致していた。この遺伝子は、結腸癌、甲状腺癌、乳癌および膀胱癌サンプルにおいて、正常隣接組織と比べてより高レベルで発現される。さらに、相当なレベルの発現が卵巣癌サンプルで見られる。この発現は、パネル1.3Dおよび3Dで見られる細胞株発現と一致している。したがって、この遺伝子は、これらの癌の診断マーカーとして使用できる。さらに、関連チャンネルの活性の阻害をもたらす、ヒトモノクローナル抗体を用いる、この遺伝子によってコードされるTASK5のターゲッティングは、腫瘍、好ましくは乳房、卵巣および結腸細胞癌腫に対して治療的作用を有し、また細胞成長および増殖の低下をもたらす。
パネル3Dまとめ:Ag241 この遺伝子の発現は1回の実施で評価した。この遺伝子は、メラノーマ、胃癌、腎臓癌、子宮頸癌および肺癌細胞株をはじめとするいくつかの細胞株において発現される。したがって、小分子薬または抗体の使用によるこの遺伝子活性の治療的阻害は、前記で列挙した癌種の処置において有用である可能性がある。
パネル4.1Dまとめ:Ag3074 最高発現が、IFN-γ処理真皮線維芽細胞で見られる(CT33.3)。自己免疫疾患におけるこの遺伝子の考察については、パネル4D参照。
パネル4Dまとめ:Ag241/Ag3074 2種の異なるプローブおよびプライマーセットを用いる2つの実験は、IFN-γ処理した真皮線維芽細胞におけるこの遺伝子の最高発現を示す(CT=30〜33)。相当な発現が、IL-4で処理した真皮線維芽細胞で見られる。この発現は、この遺伝子によってコードされるタンパク質は皮膚疾患、例えば、乾癬に関与している可能性があることを示唆する。相当なレベルの発現がまた、粘膜表皮性肺細胞株NCI-H292、アストロサイトおよびいくつかの活性化T細胞集団由来の処理および未処理サンプルの双方で見られる。この発現プロフィールは、この遺伝子産物がまた、肺に影響を及ぼす炎症性プロセスに関与している可能性があることを示唆する。したがって、この遺伝子によってコードされるタンパク質の発現または機能の治療的調節は、喘息、アレルギー、肺気腫およびCORDの処置で有効であり得る。
O. CG55798-02:嗅覚受容体
遺伝子CG55798-02の発現を、プライマー-プローブセットAg1500、Ag2609およびAg2611を使用して評価し、表OA、OBおよびOCに記載した。RTQ-PCR実施の結果を、表OD、OE、OF、OG、OHおよびOIに示す。CG55798-02は全長物理的クローンに相当することに注意。
表OA プローブ名Ag1500
Figure 2005532786
表OB プローブ名Ag2609
Figure 2005532786
表OC プローブ名Ag2611
Figure 2005532786
表OD CNS 神経変性 v1.0
Figure 2005532786
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表OE パネル1.2
Figure 2005532786
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表OF パネル1.3D
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表OG パネル2.2
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表OH パネル4D
Figure 2005532786
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表OI パネルCNS 1
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CNS 神経変性 v1.0まとめ:Ag2611/Ag2609 この遺伝子は、アルツハイマー病の脳の側頭皮質において、アルツハイマー病に特徴的であり、その原因である可能性のあるアミロイドプラークのない対照脳よりも高度に発現される。この遺伝子は、GPCRと相同性を有するタンパク質をコードする。GPCRは、薬物を用いて容易にターゲッティングすることができ、シグナル伝達プロセスをはじめ、多数の特定の脳プロセスを制御し、これは現在、アルツハイマー病を治療するFDA認可薬、例えば、コリン作動性の系の標的である。AβP誘導性細胞傷害性について提唱されている主要な機序は、Ca2+恒常性の喪失および反応性酸素腫(ROS)の生成を含む。Ca2+恒常性の変化は、二次メッセンジャーのGタンパク質駆動性放出の変化の結果である可能性がある。したがって、このクラスの分子をターゲッティングすることは、アルツハイマー病治療において治療的可能性があり得る。詳しくは、アルツハイマー病に冒された脳におけるこの遺伝子発現の増加は、GPCRを標的とする薬物の治療的価値の可能性を示す。
Kourie JI.Mechanisms of amyloid β protein-induced modification in ion transport systems: implications for neurodegenerative diseases. Cell Mol Neurobiol 2001 Jun;21(3):173-213参照。
パネル1.2まとめ:Ag1500 この遺伝子の最高発現が、大脳皮質で見られる。(CT=30.4)。中枢神経系中の活性組織の中では、この遺伝子はまた、小脳、海馬、視床および脊髄において中度に発現される。CNS疾患の処置におけるこの遺伝子の潜在的に可能な役割の説明については、CNS 神経変性 パネル v1.0まとめ参照。
代謝機能を有する組織の中では、この遺伝子は、副腎、心臓および骨格筋由来サンプルにおいて、低度ではあるが有意なレベルで発現される。したがって、この遺伝子によってコードされるタンパク質は、前記で列挙した組織のいずれかまたはすべてにおける疾病の原因および/または処置で重要であり得る。
この遺伝子はまた、癌細胞株との関連を示し、乳癌、卵巣癌、メラノーマおよび肺癌細胞株由来サンプルのクラスターにおいて発現される。したがって、この遺伝子の発現は、組織と比較した場合に、細胞株由来サンプルを区別するために使用できる可能性がある。さらに、小分子薬または抗体の使用によるこの遺伝子またはそのタンパク質産物の治療的調節は、卵巣癌、乳癌、肺癌またはメラノーマの処置で有益である可能性がある。
パネル1.3Dまとめ:Ag2611/Ag2609 2種の異なるプローブ/プライマーセットを用いた2つの実験は双方とも、この遺伝子の、中枢神経系由来の組織における優先的発現を示し、発現が脊髄(CT=33.1)および視床(CT=34.1)で見られる。CNS疾患の処置におけるこの遺伝子の潜在的に可能な役割の説明については、CNS 神経変性 パネル v1.0まとめ参照。
パネル2.2まとめ:Ag2611/Ag2609 2種の異なるプローブおよびプライマーセットを用いた2つの実験では、この遺伝子の発現は、乳癌由来のサンプルに限定されており(CT=33.2)、正常隣接組織と比べ、乳癌では過剰発現されていると思われる。このことは、この遺伝子は、乳癌サンプルを他のサンプルと区別するために、および乳癌を検出するために使用できる可能性があることを示唆する。さらに、小分子薬または抗体の使用によるこの遺伝子の治療的阻害は、乳癌の処置で有用である可能性がある。
パネル4Dまとめ:Ag2611/Ag2609 この遺伝子は、LPS-活性化単球において中レベルで発現されるが、休止単球では発現されない。逆に、この遺伝子は、休止マクロファージにおいて中レベルで発現されるが、活性化マクロファージでは低レベルである。この配列に対応する2種の異なるプローブおよびプライマーセットを用いた実験でこのパターンが明らかである。循環単球および組織マクロファージは双方とも発達的に関連のある細胞種であるので、この遺伝子は、小分子薬ならびに治療用抗体の開発のための有用な標的として使用できる可能性がある。この遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を遮断する治療用抗体および小分子阻害剤は、クローン病、炎症性腸疾患、喘息、乾癬および関節リウマチの患者において炎症および自己免疫疾患症候を減少するのに有用であり得る。
パネルCNS 1まとめ:Ag2609 この遺伝子の発現は、ハンチントン病患者の黒質で最高であり、このことは、この遺伝子がこの脳領域に起きる神経変性に伴う遺伝的調節不全に関与している可能性があることを示唆する。黒質はまた、パーキンソン病神経変性の進行にとっても重要である。したがって、この遺伝子によってコードされるGPCRの薬理学的ターゲッティングは、ハンチントン病ならびにおそらくはパーキンソン病患者において、この遺伝的調節不全に対応するのに役立ち、正常機能の回復に寄与し得る。GPCRシグナル伝達系の薬理学的調節は、SSRIなどの強力な鬱病治療薬がその作用を発揮する機構である。
P. CG55838-02およびCG55838-03:二重特異性マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ2
CG55838-02およびCG55838-03遺伝子の発現を、プライマー-プローブセットAg2022およびAg7706を使用して評価し、表PAおよびPBに記載した。RTQ-PCR実施の結果を、表PC、PD、PE、PF、PGおよびPHに示す。プライマープローブAg7706はCG55838-03に特異的であることに注意。また、CG55838-03は全長物理的クローンに相当することにも注意。
表PA プローブ名Ag2022
Figure 2005532786
表PB プローブ名Ag7706
Figure 2005532786
表PC 一般 スクリーニング パネル v1.7
Figure 2005532786
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表PD パネル1.3D
Figure 2005532786
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表PE パネル2.2
Figure 2005532786
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表PF パネル4.1D
Figure 2005532786
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T表PG パネル4D
Figure 2005532786
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表PH パネル5膵島
Figure 2005532786
一般 スクリーニング パネル v1.7まとめ:Ag7706 この遺伝子の最高発現が、卵巣癌IGROV-1細胞株において検出される(CT=26.2)。この遺伝子の中〜高レベルの発現がまた、膵臓癌、胃癌、結腸癌、肺癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、メラノーマおよび脳癌由来細胞株のクラスターで見られる。したがって、この遺伝子の発現は、これらの癌の存在を検出するためのマーカーとして使用できる可能性がある。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、膵臓癌、胃癌、結腸癌、肺癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、メラノーマおよび脳癌の処置で有効であり得る。
代謝または内分泌機能を有する組織の中では、この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および消化管において中レベルで発現される。したがって、この遺伝子の活性の治療的調節は、内分泌/代謝関連疾病、例えば、肥満症および糖尿病の処置で有用であると分かり得る。
さらに、この遺伝子は、扁桃体、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質および脊髄をはじめとする調べた中枢神経系のすべての領域において高〜中レベルで発現される。したがって、この遺伝子産物の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症、総合失調症および鬱病などの中枢神経系の疾患の処置で有用であり得る。
パネル1.3Dまとめ:Ag2022 同一のプローブおよびプライマーセットを用いた2つの結果は、極めて一致している結果を示し、この遺伝子は成人骨格筋において最高発現される(CT=27)。この遺伝子はまた、脂肪、成人および胎児心臓および肝臓、成人骨格筋、膵臓および副腎、甲状腺および下垂体をはじめとする代謝機能を有するその他の組織において中度発現を示す。発現は、胎児骨格筋では(CT=30)、成人組織(CT=27)と比べてかなり低く、このことにより、この遺伝子の発現は骨格筋の分化に関係していると考えられ、したがって、この遺伝子の発現は、この組織の成人および胎児表現型間を区別するために使用できる可能性があることを示唆する。MAPキナーゼキナーゼ(MAPKK)によって媒介される経路は筋芽細胞増殖に影響を及ぼすことがわかっており(参照文献3)、骨格筋ではインスリンと運動の双方が、この経路によるシグナル伝達を刺激する(参照文献4)。肥満症および糖尿病患者におけるインスリン耐性は、幾分かは、その作用がインスリンによるMAPKKの正常な活性化による干渉によって媒介される腫瘍壊死因子αによるものであり得る(参照文献5)。さらに、運動トレーニングは、肥満Zuckerラットにおいてインスリン誘導性MAPKK活性を大きく改善する(参照文献6)。このことは、このキナーゼのアクチベーターは、糖尿病の処置において有効な薬剤であり得るということを示唆する。さらに、MAPKK経路の活性化は、アンドロゲン不全症における前脂肪細胞からの脂肪分化に関与している(参照文献7)。したがって、MAPKKアンタゴニストは、いくつかの症例では、肥満症の治療において適した薬剤であり得る。
この遺伝子は、メラノーマおよび腎臓癌および肺癌由来の発細胞株において、正常組織と比べて高レベルで発現され、これらの組織の癌において役割を果たし得る。したがって、この遺伝子の発現は、肺癌および腎臓癌ならびにメラノーマのマーカーとして、または治療薬として有用である可能性がある。さらに、ペプチド、キメラ分子または小分子薬の使用によるこの遺伝子産物の活性の治療的調節は、これらの癌の治療で有用であり得る。
この遺伝子、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼの相同体は、脳中で高〜中レベルで発現され、中枢神経中の最高発現は視床で見られる(CT=28.4)。マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼは、バルプロ酸、発作性疾患および二極性鬱病双方を治療するために使用される薬剤によって活性化される。バルプロ酸は、GABA、脳における主要な抑制性神経伝達物質のニューロン産生を増加させることによって働くと考えられている。したがって、このキナーゼの選択的活性化は、発作性疾患、二極性疾患の処置において、またはGABA不足によって起こると考えられる他の神経学的/精神医学的状態(総合失調症)において治療的効果があり得る。
Yuan PX, Huang LD, Jiang YM, Gutkind JS, Manji HK, Chen G. (2001) The mood stabilizer valproic acid activates mitogen-activated protein kinases and promotes neurite growth. J Biol Chem. 276:31674-83. PMID: 11418608、Bulleit RF, Hsieh T. (2000) MEK inhibitors block BDNF-dependent and -independent expression of GABA(A) receptor subunit mRNAs in cultured mouse cerebellar granule neurons. Brain Res Dev Brain Res. 119:1-10. PMID: 10648867、Jones NC, Fedorov YV, Rosenthal RS, Olwin BB. (2001) ERK1/2 is required for myoblast proliferation but is dispensable for muscle gene expression and cell fusion. J Cell Physiol. 186:104-15. PMID: 11147804、Wojtaszewski JF, Lynge J, Jakobsen AB, Goodyear LJ, Richter EA. (1999) Differential regulation of MAP kinase by contraction and insulin in skeltal muscle: metabolic implications. Am J Physiol. 277(4 Pt 1):E724-32. PMID: 10516133、Begum N, Ragolia L, Srinivasan M. (1996) Effect of tumor necrosis factor-α on insulin-stimulated mitogen-activated protein kinase cascade in cultured rat skeltal muscle cell. Eur J. Biochem. 238:214-20. PMID: 8665940、Osman AA, Hancock J, Hunt DG, Ivy JL, Mandarino LJ. (2001) Exercise training increases ERK2 activity in skeltal muscle of obese Zucker rats. J Appl Physiol. 90:454-60. PMID: 11160042 and Lacasa D, Garcia E, Henriot D, Agli B, Giudicelli Y. (1997) Site-related specificities of the control by androgenic status of adipogenesis and mitogen-activated protein kinase cascade/c-fos signaling pathways in rat preadipocytes. Endocrinology 138:3181-6. PMID: 9231766参照。
パネル2.2まとめ:Ag2022 このパネルでは、この遺伝子の最高発現が、乳癌サンプルで見られる(CT=29.0)。この遺伝子の発現は、対応正常組織と比べ、乳癌および腎臓癌由来のサンプルとの関連を示す。したがって、AC011005_da2遺伝子の発現は、乳癌および腎臓癌のマーカーとして有用である可能性がある。さらに、ペプチド、キメラ分子または小分子薬の使用によるこの遺伝子の産物の治療的活性は、乳癌および腎臓癌の処置で有用であり得る。
パネル4.1Dまとめ:Ag7706 この遺伝子の最高発現が、休止肺微小血管細胞において検出される(CT=33.6)。この遺伝子の低度発現がまた、休止および活性化真皮および肺線維芽細胞、休止ケラチノサイト、冠動脈SMC、活性化末梢気道上皮、休止樹状細胞および好酸球、休止および活性化HUVEC細胞、活性化Bリンパ球およびRamos B細胞、休止IL-2処理NK細胞、活性化ナイーブおよび記憶T細胞、活性化一次および二次極性化T細胞で見られる。したがって、この遺伝子産物の治療的調節は、乾癬、アレルギー、喘息、炎症性腸疾患、関節リウマチおよび骨関節炎をはじめとする自己免疫および炎症性疾患と関係している症候/状態を寛解し得る。
パネル4Dまとめ:Ag2022 この遺伝子の発現は、このパネル中で広範である。この遺伝子の最高発現は、非活性化細胞と比べ、PMA/イオノマイシンで活性化された、好塩基球細胞株、KU-812で見られる(CT=26.2)。この遺伝子の高度発現がまた、活性化B細胞、B細胞株および真皮繊維芽細胞で見られる。この遺伝子は、増殖および分化に影響を及ぼすシグナル伝達経路のRafの下流で機能するマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ2(MAPKK2)、セリンスレオニンキナーゼと相同である。好塩基球でのこのキナーゼの高度発現は、肥満細胞/好塩基球シグナル伝達におけるこのキナーゼの役割を示唆する。活性化肥満/好塩基球細胞は、喘息、アトピー性接触皮膚炎、アレルギーおよび鼻炎をはじめとする多数のアトピー性疾患と関連している。したがって、小分子薬の使用によるこの遺伝子産物の発現または機能の治療的調節は、これらの疾病の処置で有益である可能性がある。さらに、活性化B細胞におけるこのキナーゼの高度発現は、この遺伝子産物に対して設計された小分子薬の使用は、自己免疫疾患およびリンパ腫などのB細胞過剰増殖性疾患を防ぐ可能性があるということを示唆する。
パネル5膵島まとめ:Ag2022 この遺伝子は、広範な発現を示し、最高発現が間葉幹細胞で見られる(CT=28.7)。この遺伝子の発現は未分化および分化した脂肪組織でより高い。この遺伝子の発現は、骨格筋、脂肪組織、子宮、胎盤、腎臓および小腸において検出される。TNFαは、肥満関連インスリン耐性に関与している重要な因子の1つであり、MEK1/2を活性化すると知られている。最近、MEK1/2の阻害により、TNFαによって誘導されたインスリン感受性が回復することが示された(Mol. Endocrinology, 2000, 14, 1557; J. Cell Physiol., 1999, 179,58)。したがって、MEK2のアンタゴニストは、インスリン耐性/糖尿病の処置にとって有益であるはずである。
Q. CG55838-04:二重特異性マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ2
遺伝子CG55838-04の発現を、プライマー-プローブセットAg2022およびAg7822を使用して評価し、表 QAおよびQBに記載した。RTQ-PCR実施の結果を、表QC、QD、QE、QFおよびQGに示す。CG55838-04は全長物理的クローンに相当することに注意。
表QA プローブ名Ag2022
Figure 2005532786
表QB プローブ名Ag7822
Figure 2005532786
表QC 一般 スクリーニング パネル v1.7
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表QD パネル1.3D
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表QE パネル2.2
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表QF パネル4D
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表QG パネル5膵島
Figure 2005532786
Figure 2005532786
一般 スクリーニング パネル v1.7まとめ:Ag7822 この遺伝子の最高発現が、肺癌HOP-62細胞株において検出される(CT=29.5)。この遺伝子の中度発現がまた、膵臓癌、胃癌、結腸癌、肺癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、メラノーマおよび脳癌由来細胞株のクラスターで見られる。したがって、この遺伝子の発現は、これらの癌の存在を検出するためのマーカーとして使用できる可能性がある。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、膵臓癌、胃癌、結腸癌、肺癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、メラノーマおよび脳癌の処置で有効であり得る。
代謝または内分泌機能を有する組織の中では、この遺伝子は、膵臓、脂肪、甲状腺、下垂体、骨格筋および胎児肝臓において中〜低レベルで発現される。したがって、この遺伝子の活性の治療的調節は、内分泌/代謝関連疾病、例えば、肥満症および糖尿病の処置で有用であると分かり得る。
さらに、この遺伝子は、扁桃体、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質および脊髄をはじめとする調べた中枢神経系のすべての領域において中レベルで発現される。したがって、この遺伝子産物の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症、総合失調症および鬱病などの中枢神経系の疾患の処置で有用であり得る。
パネル1.3Dまとめ:Ag2022 Two results 同一のプローブおよびプライマーセットを用いた2つの結果は、極めて一致している結果を示し、この遺伝子は成人骨格筋で最高に発現される(CT=27)。この遺伝子はまた、脂肪、成人および胎児心臓および肝臓、成人骨格筋、膵臓および副腎、甲状腺および下垂体をはじめとする代謝機能を有する他の組織では中度発現示す。発現は、胎児骨格筋(CT=30)では、成人組織(CT=27)と比べてかなり低く、このことにより、この遺伝子の発現は骨格筋の分化に関係していると考えられ、したがって、この遺伝子の発現は、この組織の成人および胎児表現型間を区別するために使用できる可能性があることを示唆する。MAPキナーゼキナーゼ(MAPKK)によって媒介される経路は筋芽細胞増殖に影響を及ぼすことがわかっており(参照文献3)、骨格筋ではインスリンと運動の双方が、この経路によるシグナル伝達を刺激する(参照文献4)。肥満症および糖尿病患者におけるインスリン耐性は、幾分かは、その作用がインスリンによるMAPKKの正常な活性化による干渉によって媒介される腫瘍壊死因子αによるものであり得る(参照文献5)。さらに、運動トレーニングは、肥満Zuckerラットにおいてインスリン誘導性MAPKK活性を大きく改善する(参照文献6)。このことは、このキナーゼのアクチベーターは、糖尿病の処置において有効な薬剤であり得るということを示唆する。さらに、MAPKK経路の活性化は、アンドロゲン不全症における前脂肪細胞からの脂肪分化に関与している(参照文献7)。したがって、MAPKKアンタゴニストは、いくつかの症例では、肥満症の治療において適した薬剤であり得る。
この遺伝子は、メラノーマおよび腎臓癌および肺癌由来細胞株において、正常組織と比べて高レベルで発現され、これらの組織の癌において役割を果たしている可能性がある。したがって、この遺伝子の発現は、肺癌および腎臓癌ならびにメラノーマのマーカーとして、または治療薬として有用である可能性がある。さらに、ペプチド、キメラ分子または小分子薬の使用によるこの遺伝子産物の活性の治療的調節は、これらの癌の治療で有用であり得る。
この遺伝子、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼの相同体は、脳中で高〜中レベルで発現され、中枢神経中の最高発現は視床で見られる(CT=28.4)。マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼは、バルプロ酸、発作性疾患および二極性鬱病双方を治療するために使用される薬剤によって活性化される。バルプロ酸は、GABA、脳における主要な抑制性神経伝達物質のニューロン産生を増加させることによって働くと考えられている。したがって、このキナーゼの選択的活性化は、発作性疾患、二極性疾患の処置において、またはGABA不足によって起こると考えられる他の神経学的/精神医学的状態(総合失調症)において治療的効果があり得る。
Yuan PX, Huang LD, Jiang YM, Gutkind JS, Manji HK, Chen G. (2001) The mood stabilizer valproic acid activates mitogen-activated protein kinases and promotes neurite growth. J Biol Chem. 276:31674-83. PMID: 11418608、Bulleit RF, Hsieh T. (2000) MEK inhibitors block BDNF-dependent and -independent expression of GABA(A) receptor subunit mRNAs in cultured mouse cerebellar granule neurons. Brain Res Dev Brain Res. 119:1-10. PMID: 10648867、Jones NC, Fedorov YV, Rosenthal RS, Olwin BB. (2001) ERK1/2 is required for myoblast proliferation but is dispensable for muscle gene expression and cell fusion. J Cell Physiol. 186:104-15. PMID: 11147804、Wojtaszewski JF, Lynge J, Jakobsen AB, Goodyear LJ, Richter EA. (1999) Differential regulation of MAP kinase by contraction and insulin in muscle: metabolic implications. Am J Physiol. 277(4 Pt 1):E724-32. PMID: 10516133、Begum N, Ragolia L, Srinivasan M. (1996) Effect of tumor necrosis factor-α on insulin-stimulated mitogen-activated protein kinase cascade in cultured rat skeltal muscle cells. Eur J. Biochem. 238:214-20. PMID: 8665940、Osman AA, Hancock J, Hunt DG, Ivy JL, Mandarino LJ. (2001) Exercise training increases ERK2 activity in skeltal muscle of obese Zucker rats. J Appl Physiol. 90:454-60. PMID: 11160042およびLacasa D, Garcia E, Henriot D, Agli B, Giudicelli Y. (1997) Site-related specificities of the control by androgenic status of adipogenesis and mitogen-activated protein kinase cascade/c-fos signaling pathways in rat preadipocytes. Endocrinology 138:3181-6. PMID: 9231766参照。
パネル2.2まとめ:Ag2022 このパネルでは、この遺伝子の最高発現が乳癌サンプルで見られる(CT=29.0)。この遺伝子の発現は、対応正常組織と比べ、乳癌および腎臓癌由来のサンプルとの関連を示す。したがって、AC011005_da2遺伝子の発現は、乳癌および腎臓癌のマーカーとして有用である可能性がある。さらに、ペプチド、キメラ分子または小分子薬の使用によるこの遺伝子の産物の治療的活性は、乳癌および腎臓癌の処置で有用であり得る。
パネル4Dまとめ:Ag2022 この遺伝子の発現は、このパネル中で広範である。この遺伝子の最高発現は、非活性化細胞と比べ、PMA/イオノマイシンで活性化された、好塩基球細胞株、KU-812で見られる(CT=26.2)。この遺伝子の高度発現がまた、活性化B細胞、B細胞株および真皮繊維芽細胞で見られる。この遺伝子は、増殖および分化に影響を及ぼすシグナル伝達経路のRafの下流で機能するマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ2(MAPKK2)、セリンスレオニンキナーゼと相同である。好塩基球でのこのキナーゼの高度発現は、肥満細胞/好塩基球シグナル伝達におけるこのキナーゼの役割を示唆する。活性化肥満/好塩基球細胞は、喘息、アトピー性接触皮膚炎、アレルギーおよび鼻炎をはじめとする多数のアトピー性疾患と関連している。したがって、小分子薬の使用によるこの遺伝子産物の発現または機能の治療的調節は、これらの疾病の処置で有益である可能性がある。さらに、活性化B細胞におけるこのキナーゼの高度発現は、この遺伝子産物に対して設計された小分子薬の使用は、自己免疫疾患およびリンパ腫などのB細胞過剰増殖性疾患を防ぐ可能性があるということを示唆する。
パネル5膵島まとめ:Ag2022 この遺伝子は広範な発現を示し、最高発現が間葉幹細胞で見られる(CT=28.7)。この遺伝子の発現は、未分化および分化した脂肪組織でより高い。この遺伝子の発現は、骨格筋、脂肪組織、子宮、胎盤、腎臓および小腸において検出される。TNFαは、肥満関連インスリン耐性に関与している重要な因子の1つであり、MEK1/2を活性化すると知られている。最近、MEK1/2の阻害により、TNFαによって誘導されたインスリン感受性が回復することが示された(Mol. Endocrinology, 2000, 14, 1557; J. Cell Physiol., 1999, 179,58)。したがって、MEK2のアンタゴニストは、インスリン耐性/糖尿病の処置にとって有益であるはずである。
Ag7822 この遺伝子の最高発現が、分化した脂肪組織において検出される(CT=33.9)。この遺伝子の低度発現がまた、分化途中の脂肪組織で見られる。
R. CG56618-04:熱ショックタンパク質HSP90
遺伝子CG56618-04の発現を、プライマー-プローブセットAg4548を使用して評価し、表RAに記載した。RTQ-PCR実施の結果を、表RB、RCおよびRDに示す。
表RA プローブ名Ag4548
Figure 2005532786
表RB CNS 神経変性 v1.0
Figure 2005532786
表RC 一般 スクリーニング パネル v1.4
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表RD パネル4.1D
Figure 2005532786
Figure 2005532786
CNS 神経変性 v1.0まとめ:Ag4548 このパネルでは、この遺伝子の発現が、独立した個体群の脳において低レベルで確認される。しかしながら、この実験では、アルツハイマー病の検死解剖脳と痴呆でない対照のものの間で、この遺伝子の発現の差は検出されなかった。中枢神経系の疾患の処置におけるこの遺伝子の潜在的に可能な役割の考察については、パネル1.4参照。
一般 スクリーニング パネル v1.4まとめ:Ag4548 この遺伝子の最高発現が、結腸癌HCT-116細胞株において検出される(CT=23.2)。この遺伝子の高レベルの発現がまた、膵臓癌、胃癌、結腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、メラノーマおよび脳癌由来細胞株のクラスターで見られる。したがって、この遺伝子の発現は、これらの癌の存在を検出するためのマーカーとして使用できる可能性がある。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、膵臓癌、胃癌、結腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、メラノーマおよび脳癌の処置で有効であり得る。
代謝または内分泌機能を有する組織の中では、この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および消化管において中〜高レベルで発現される。したがって、この遺伝子の活性の治療的調節は、内分泌/代謝関連疾病、例えば、肥満症および糖尿病の処置で有用であると分かり得る。
さらに、この遺伝子は、扁桃体、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質および脊髄をはじめとする調べた中枢神経系のすべての領域において高レベルで発現される。したがって、この遺伝子産物の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症、総合失調症および鬱病などの中枢神経系の疾患の処置で有用であり得る。
興味深いことに、この遺伝子は、成人肺および肝臓(CT=26〜27)と比較すると、胎児においてかなり高レベルで発現される(CT=30)。この知見は、この遺伝子の発現は、胎児肺および肝臓と成人肺および肝臓を区別するために使用できるということを示唆する。さらに、胎児組織におけるこの遺伝子の相対的過剰発現は、このタンパク質産物は、胎児では、肺および肝臓成長または発達を増強する可能性があり、したがって、成人でも再生能において作用する可能性があることを示唆する。したがって、この遺伝子によってコードされるタンパク質の治療的調節は、肺および肝臓関連疾病の処置で有用である可能性がある。
パネル4.1Dまとめ:Ag4548 この遺伝子の最高発現が、活性化された一次Tr1細胞において検出される(CT=27.3)。この遺伝子は、健常および疾病における免疫応答において重要な広範な細胞種において、高〜中レベルで発現される。これらの細胞としては、T細胞、B細胞、内皮細胞、マクロファージ/単球および末梢血単核細胞ファミリーのメンバー、ならびに、肺および皮膚由来の上皮および線維芽細胞種、および大腸、肺、胸腺および腎臓に相当する正常組織が挙げられる。発現のこの広範なパターンは、この遺伝子産物がこれらおよびその他の細胞種ならびに組織の恒常性プロセスに関与している可能性があるということを示唆する。このパターンは、一般 スクリーニング パネルv1.4における発現プロフィールと一致し、また細胞生存および増殖におけるこの遺伝子産物の役割を示唆する。したがって、機能的治療薬でのこの遺伝子産物の調節は、これらの細胞種と関連している機能の変更をもたらし、また、喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、関節リウマチおよび骨関節炎などの自己免疫および炎症性疾患を患う患者の症候の改善をもたらす可能性がある。
S. CG57509-01:カルパイン3.
遺伝子CG57509-01の発現を、プライマー-プローブセットAg2073を使用して評価し、表SAに記載した。RTQ-PCR実施の結果を、表SBおよびSCに示す。
表SA プローブ名Ag2073
Figure 2005532786
表SB パネル1.3D
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表SC パネル5D
Figure 2005532786
パネル1.3Dまとめ:Ag2073 CG57909-01遺伝子、カルパイン相同体は、甲状腺、下垂体、心臓、副腎および肝臓において低レベルで発現する。カルパイン10は、最近、2型糖尿病の感受性遺伝子として同定された。したがって、この遺伝子産物は、タイロイドパシー(thyroidopathies)、1型および2型糖尿病をはじめとする内分泌および代謝疾患を治療するための小分子標的であり得る。加えて、この遺伝子は、骨格筋で高度に発現される。カルパイン3遺伝子の突然変異は、肢帯型筋ジストロフィー(LGMD)2A型の原因となることが証明されている。したがって、この遺伝子産物の治療的調節はLGMD2A型の処置であり得る。
Chae J, Minami N, Jin Y, Nakagawa M, Murayama K, Igarashi F, Nonaka I. Calpain 3 gene mutations: genetic and clinico-pathologic findings in limb-girdle muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 2001 Sep;11(6-7):547-55. PMID: 11525884 and Huang Y, Wang KK. The calpain family および human disease. Trends Mol Med. 2001 Aug;7(8):355-62。総説。PMID: 11516996参照。
パネル4Dまとめ:Ag2073 CG56003-01遺伝子を用いた一実験の結果は含まれていない。ampプロットは、この実施に実験上の問題があったことを示す。
パネル5Dまとめ:Ag2073 CG57509-01遺伝子の発現は、骨格筋に限定されており、これにより、パネル1.3Dの結果が確認される。代謝病におけるこの遺伝子の考察については、パネル1.3D参照。
T. CG90474-02:ミトコンドリア脱共役タンパク質2
遺伝子CG90474-02の発現を、プライマー-プローブセットAg1693を使用して評価し、表TAに記載した。RTQ-PCR実施の結果を、表TBおよびTCに示す。CG90474-02は全長物理的クローンに相当することに注意。
表TA プローブ名Ag1693
Figure 2005532786
表TB パネル1.3D
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表TC パネル5D
Figure 2005532786
パネル1.3Dまとめ:Ag1693 この遺伝子の最高発現が、骨格筋で見られる(CT=26.2)。この遺伝子はまた、下垂体、脂肪、副腎、膵臓、甲状腺ならびに成人および胎児骨格筋、心臓および肝臓において、低度ではあるが有意なレベルで発現される。これら組織の中でのこの広範な発現は、この遺伝子産物が、正常神経内分泌および代謝機能において役割を果たしている可能性があること、および、この遺伝子の調節されていない発現は、肥満症および糖尿病などの神経内分泌疾患または代謝疾患の原因となる可能性があることということを示唆する。
さらに、この遺伝子は、成人対応物(CT=30〜32)と比較すると、胎児心臓、肝臓および骨格筋組織においてかなり高レベルで発現される(CT=26〜28)。したがって、この遺伝子の発現は、これらの組織の胎児および成人供給源間を区別するために使用できる。さらに、胎児心臓、肝臓および骨格筋におけるこの遺伝子の相対的過剰発現は、このタンパク質産物が、胎児では、これら器官の成長または発達を増強する可能性があり、したがって、成人でも再生能において作用する可能性があることを示唆する。したがって、この遺伝子によってコードされるタンパク質の治療的調節は、肝臓、心臓および筋肉関連疾病の処置で有用である可能性がある。
この遺伝子は、このパネルでは広範に発現し、脳癌、結腸癌、胃癌、肺癌、乳癌、卵巣癌およびメラノーマ細胞株において中レベルの発現が見られる。この発現プロフィールは、細胞生存および増殖におけるこの遺伝子産物の役割を示唆する。この遺伝子産物の調節は、癌の処置で有用であり得る。
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃体、小脳および大脳皮質をはじめとするCNSにおいて中レベルで発現される。したがって、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、神経疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、総合失調症、多発性硬化症、脳卒中および癲癇の処置で有用であり得る。
パネル5Dまとめ:Ag1693 最高発現が、腎臓細胞株で見られる(CT=28.7)。中レベルの発現がまた、脂肪、胎盤および骨格筋などの代謝組織で見られる。代謝病におけるこの遺伝子の考察については、パネル1.3D参照。
U. CG159399-01:CRAL/TRIO含有タンパク質
遺伝子CG159399-01の発現を、プライマー-プローブセットAg2893を使用して評価し、表UAに記載した。RTQ-PCR実施の結果を、表UB、UC、UD、UEおよびUFに示す。
表UA プローブ名Ag2893
Figure 2005532786
表UB CNS 神経変性 v1.0
Figure 2005532786
表UC パネル1.3D
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表UD パネル2D
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表UE パネル3D
Figure 2005532786
Figure 2005532786
表UF パネル4D
Figure 2005532786
Figure 2005532786
CNS 神経変性 v1.0まとめ:Ag2893 このパネルは、アルツハイマー病においてこの遺伝子の発現の差を示さない。しかしながら、このプロフィールによって、脳におけるこの遺伝子の低レベルの発現が確認される。中神経系におけるこの遺伝子の考察については、パネル1.3D参照。
パネル1.3Dまとめ:Ag2893 同一のプローブおよびプライマーセットを用いる2つの実験により、極めて一致する結果が得られ、この遺伝子は、腎臓癌細胞株において最高に発現される(CT=28〜30)。相当な発現がまた、腎臓癌細胞株のクラスターで見られる。したがって、この遺伝子の発現は、このパネルでこのサンプルと他のサンプル間を区別するために、また腎臓癌の存在を検出するためのマーカーとして使用できる可能性がある。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、腎臓癌の処置で有効であり得る。
この遺伝子はまた、脳において低度ではあるが有意なレベルで発現される。大脳皮質におけるこの遺伝子の発現は、CNS特異的プロセスにおける役割を示唆する。トコフェロール関連タンパク質(TAP)転写因子との相同性は、トコフェロール媒介性遺伝子転写におけるこの遺伝子の役割を示唆する。トコフェロールは、抗酸化性とこの遺伝子によって遺伝子転写を調節する能力の双方によって媒介され得る、多数のCNSプロセスに関与する必須ビタミンである。トコフェロールプロセシングの遺伝的混乱は、トコフェロール欠乏および運動失調および神経変性などのCNS疾患をもたらす。したがって、この遺伝子またはそのタンパク質産物を調節する薬剤は、運動失調および神経変性疾患の処置で有用であり得る。
Yamauchi J, Iwamoto T, Kida S, Masushige S, Yamada K, Esashi T. Tocopherol-associated protein is a ligand-dependent transcriptional activator. Biochem Biophys Res Commun 2001 Jul 13;285(2):295-9およびYokota T, Igarashi K, Uchihara T, Jishage K, Tomita H, Inaba A, Li Y, Arita M, Suzuki H, Mizusawa H, Arai H. Delayed-onset ataxia in mice lackingα-tocopherol transfer protein: model for neuronal degeneration caused by chronic oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A 2001 Dec 18;98(26):15185-90参照。
パネル2Dまとめ:Ag2893 この遺伝子の最高発現が、腎臓癌細胞株由来サンプルで見られる(CT=29.5)。さらに、このサンプルは、腎臓癌において、隣接する正常組織よりも高度に発現される。したがって、この遺伝子の発現は、このパネルでこのサンプルと他のサンプル間を区別するために、また腎臓癌の存在を検出するためのマーカーとして使用できる可能性がある。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、腎臓癌の処置で有効であり得る。
パネル3Dまとめ:Ag2893 この遺伝子の発現は、主に、腎臓癌細胞株由来サンプルにおいて検出される(CT=30)。したがって、この遺伝子の発現は、このパネルでこれらのサンプルと他のサンプル間を区別するために、また腎臓癌の存在を検出するためのマーカーとして使用できる可能性がある。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、腎臓癌の処置で有効であり得る。
パネル4Dまとめ:Ag2893 この遺伝子は、肺および胸腺においておよび狼瘡腎臓および硬変肝において、低度ではあるが有意なレベルで発現される。したがって、転写物またはそれがコードするタンパク質はこれら組織を検出するために使用できる可能性がある。この遺伝子の発現は、この転写物によってコードされるタンパク質が、胸腺および肺組織の正常な恒常性において重要な役割を果たしている可能性があることを示唆する。したがって、この転写物によってコードされるタンパク質を用いて設計した治療薬は、喘息および肺気腫などの疾病による炎症の際の、胸腺におけるT細胞発達の調節にとって、またこれらの肺の正常な機能の維持または回復にとって重要である可能性がある。さらに、腎臓および肝臓などの他の組織におけるこの転写物の誘導は有害である場合があり、この転写物によってコードされるタンパク質を用いて設計されるアンタゴニスト療法は、これら組織の疾病の処置において重要である可能性がある。
(実施例D)：NOVX核酸配列における単一ヌクレオチド多型の同定
変異体配列も本願に含まれる。変異体配列は、単一ヌクレオチド多型(SNP)を含むこともある。SNPは、SNPを含むヌクレオチド配列がcDNAとして起こることを示すために「cSNP」と呼ばれる場合もある。SNPはいくつかの方法で生じ得る。例えば、SNPは多型部位での、1つのヌクレオチドの別のものとの置換によるものであり得る。かかる置換はトランジションまたはトランスバーションのいずれかであり得る。SNPはまた、参照対立遺伝子と比べた、ヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入からも生じ得る。この場合、多型部位とは、一対立遺伝子が別の対立遺伝子の特定のヌクレオチドに対してギャップを有する部位である。遺伝子内に生じるSNPは、SNPの位置の遺伝子によってコードされるアミノ酸の変更をもたらし得る。遺伝子内SNPはまた、SNPを含むコドンが同一のアミノ酸をコードする場合には、遺伝暗号の縮重性の結果としてサイレントであることもある。遺伝子領域の外側に生じる、または遺伝子内のイントロン中のSNPは、タンパク質のどのアミノ酸配列にも変化をもたらさないが、発現パターンの調節の変更をもたらすことがある。例としては、時間的発現、生理学的応答調節、細胞種発現調節、発現強度、および転写されたメッセージの安定性の変更が挙げられる。
エクソン結合プロセスによって得られたSeqCallingアセンブリーを、以下の基準を用いて選択し、伸長させた。最初の配列または伸長させた配列の全てまたは部分に対し98%の同一性を持つ領域を有するゲノムクローンを、ヒトゲノムデータベースをクエリーするのに適切な配列を用いてBLASTN検索によって同定した。この同一性がこれらのクローンがこれらSeqCallingアセンブリーのゲノム座位を含むことを示すことから、得られたゲノムクローンをさらなる解析のために選択した。これらの配列は推定コード領域ならびに既知DNAおよびタンパク質配列との類似性に関して解析した。これらの解析に用いたプログラムとしては、Grail、Genscan、BLAST、HMMER、FASTA、Hybridおよびその他の適切なプログラムが挙げられる。
さらなるゲノム領域を、選択したSeqCallingアセンブリーがそれらの領域にマッピングするということでいくつか同定しておいてもよい。かかるSeqCalling配列は相同性またはエクソン予測により規定される領域と重複していてもよい。また、断片の位置が、類似性または当初の予測配列に含まれていたエクソン予測により同定されるゲノム領域の近傍にあったという理由でこれらを含めてもよい。このように同定された配列を手作業でアセンブルし、次いでCuraGen社のヒトSeqCallingデータベースから得られる1以上のさらなる配列を用いて伸長しておいてもよい。含めるのに適したSeqCalling断片を、CuraTools(商標)プログラムSeqExtendにより、または解析したゲノムクローンの適当な領域へマッピングするSeqCalling断片の同定により同定した。
次いで、本明細書に開示された最終配列を導くため、前記手順により規定される領域を手作業で統合し、例えば、元の断片中でミスコールされた塩基から、または予測されるエクソン結合部、EST位置と配列類似性領域との間の矛盾から生じ得た明らかな不一致を訂正した。必要であれば、SeqCallingアセンブリーおよびゲノムクローンを同定および解析するプロセスを繰り返して全長配列を導いた(Alderborn et al., Determination of Single Nucleotide Polymorphisms by Real-time Pyrophosphate DNA Sequencing. Genome Research. 10(8) 1249-1265,2000)。
変異体は個々に報告されるが、変異体の全てまたは選択サブセットのいずれの組み合わせも本発明の考慮されるNOVXの実施形態として含まれる。
NOV2b SNPデータ(CG112559-02)
NOV2bの2種の多型変異体を同定し、表SNP1に示す。
表SNP1 NOV2bの変異体
Figure 2005532786
NOV3b SNPデータ(CG115757-02)
NOV3bの1種の多型変異体を同定し、表SNP2に示す。
表SNP2 NOV3bの変異体
Figure 2005532786
NOV7a SNPデータ(CG134632-01)
NOV7aの１種の多型変異体を同定し、表SNP3に示す。
表SNP3 NOV7aの変異体
Figure 2005532786
NOV8a SNPデータ(CG148411-01)
NOV8aの4種の多型変異体を同定し、表SNP4に示す。
表SNP4 NOV8aの変異体
Figure 2005532786
NOV19b SNPデータ(CG54092-01)
NOV19b3の種の多型変異体を同定し、表SNP5に示す。
表SNP5 NOV19bの変異体
Figure 2005532786
NOV22c SNPデータ(CG56618-04)
NOV22cの8種の多型変異体を同定し、表SNP6に示す。.
表SNP6 NOV22cの変異体
Figure 2005532786
NOV24a SNPデータ(CG59522-02)
NOV22cの8種の多型変異体を同定し、表SNP7に示す。
表SNP7 NOV24aの変異体
Figure 2005532786
(実施例E):使用方法
(実施例E1):CG154077-01、NOV9a(ヒトスルホニル尿素受容体2A)の使用方法
本発明は、タンパク質およびポリペプチドおよびそれらをコードする核酸と、疾病または病態との新規関係を開示する。タンパク質およびそれらと類似の関連タンパク質は、cDNAおよび/またはゲノムDNAによってコードされる。スルホニル尿素受容体2A(CG154077)がコードするタンパク質およびその変異体はいずれも、診断マーカー、抗体治療薬の標的および小分子薬の標的として適している。そのようなものとして本発明は、詳しくは、肥満症または糖尿病の処置に用いるための、かかる治療用抗体および/または治療用小分子を同定するための種々のスクリーニングにおける、組換えによって発現されたおよび/または内因的に発現されたタンパク質の使用を実施する。
肥満症および糖尿病は、先進国世界においても発展途上国世界においても主要な公衆衛生の懸念事項である。成人米国人口の半数を超える人々が、肥満度指数(BMI)が正常の上限より大きい過体重であると推定されている(ここで、BMIは、体重(Kg)/[身長(m)]2と定義される)。過体重であることのよくある結末は、高脂血症およびインスリン耐性の発生である。これには、高血糖、II型糖尿病の特徴が続く。治療しないままでおくと、高血糖は微小血管の疾病および網膜症、腎疾患、心疾患、末梢神経障害および末梢血管障害をはじめとする終末器官損傷を引き起こす。現在、米国では1600万人を超える成人がII型糖尿病に冒されており、症状は今では、学齢期の子供の間にも、その年齢群で肥満が広まった結果として広がるようになった。
種々の生理学的状態、薬理学的状態または自然の状態における、これらの症状の病因および病原に対する遺伝的寄与を解明するために、いくつかの細胞での研究、動物での研究および臨床研究が実施された。これらの研究では、実験群および対照群の生体サンプルにおける、およびそれらの間での、遺伝子発現の差、タンパク質-タンパク質相互作用、発現された遺伝子の大規模配列決定および限定されるものではないが、単一ヌクレオチド多型(SNP)またはスプライシング変異体などの遺伝的変異体の関連を調べるためにCureGen社のコア技術が用いられた。かかる研究の目標は、肥満症および糖尿病の結果を予防、治療する、またはそれらの症状を治療するための治療的介入のための可能性ある手段を特定することである。
疾病、病態および哺乳類生物が正常な状態および状況ではないと、またはそうなる危険にあると診断された他の異常な状態または症状を治療するためには、新規治療薬を同定することが重要である。かかる手順は、少なくとも、患部組織または器官内の標的成分を同定するステップおよびその標的の機能的特性を調節する候補治療薬を同定するステップを含む。標的成分は、疾病または病態に関与している何らかの生物学的高分子であり得る。通常、標的は、特定の機能的特性を有するポリペプチドまたはタンパク質である。他の種類の高分子としては、核酸、多糖、複合資質または糖脂質などの脂質があり得る。さらに、標的は、2種以上のこれらの種類の高分子からなる細胞成分構造でも、細胞外成分構造でもあり得る。かかる標的を同定すると、物質または化合物の大集団の中から好都合な候補治療薬を同定するためのスクリーニングアッセイに使用できる。
多くの場合、かかるスクリーニングアッセイの目的は、小分子候補を同定することであり、これは、通常、コンビナトリアル方法論を用いて調べられる物質集団を開発することによって取り組まれる。化合物の大きなコンビナトリアルライブラリーを用いて作業する場合には、ハイスループットスクリーニング方法論の実施が有利である。
本発明の目的は、候補薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて高分子成分として働くよう意図される少なくとも1種の標的生体高分子を提供することである。
本発明のもう1つの目的は、低分子量物質または化合物のコンビナトリアルライブラリーの中から候補薬剤を陽性に同定するスクリーニングアッセイを提供することである。
本発明のさらなる目的は、哺乳類の疾病、病態、または異常な状態もしくは状況の処置において、有利な治療用途を有する薬剤を同定するための種々のin vitro、ex vivoおよびin vivoアッセイのいずれかで候補薬剤を使用することである。
スルホニル尿素受容体2(SUR2)は、ATP結合カセット(ABC)輸送体のスーパーファミリーのメンバーである。筋特異的ATP感受性カリウムチャンネルの薬物結合性調節サブユニットとして機能する。最近のデータにより、SUR2の破壊は、骨格筋におけるインスリン刺激性グルコース取り込みの増加をもたらす示された(Chutkow WA, Samuel V, Hansen PA, Pu J, Valdivia CR, Makielski JC, Burant CF. Disruption of Sur2-containing K(ATP) channels enhances insulin-stimulated glucose uptake in skeltal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U SA 2001. 98,11760-4. PMID: 11562480、Chutkow WA, Simon MC, Le Beau MM, Burant CF. Cloning, tissue expression, and chromosomal localization of SUR2, the putative drug-binding subunit of cardiac, skeltal muscle, and vascular KATP channels. Diabetes 1996. 45,1439-45. PMID: 8826984、Halseth AE, Bracy DP, Wasserman DH. Functional limitations to glucose uptake in muscles comprised of different fiber types. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2001. 280, E994-9. PMID: 11350781、Shindo T, Yamada M, Isomoto S, Horio Y, Kurachi Y. SUR2 subtype (A and B)-dependent differential activation of the cloned ATP-sensitive K+ channels by pinacidil and nicorandil. Br. J. Pharmacol. 1998. 124, 985-91. PMID: 9692785、Reimann F, Ashcroft FM, Gribble FM. Structural basis for the interference between nicorandil and sulfonylurea action. Diabetes 2001. 50, 2253-9. PMID: 11574406、Moreau C, Jacquet H, Prost AL, D'hahan N, Vivaudou M. The molecular basis of the specificity of action of K(ATP) channel openers. EMBO J. 2000.19, 6644-51. PMID: 11118199)。
本発明は、病態、疾病、あるいは異常な状況または状態において調節に差のある生物学的高分子の同定に基づいている。ここで注目する病態または疾病の中には、内分泌学的疾患、癌、種々の腫瘍および腫瘍形成、炎症性疾患、中枢神経系疾患、および類似の異常状況または状態に関するものをはじめとする代謝病が含まれる。生物学的高分子が関与する重要な代謝疾患としては、肥満症および糖尿病、特に肥満症およびII型糖尿病が挙げられる。肥満症は患者をII型糖尿病にかかりやすくすると考えられている。本発明の極めて重要な実施形態では、これらの病態および状況に関係している生物学的高分子は、タンパク質およびポリペプチドであり、このような場合、本発明は同様にそれらをコードする核酸にも関与する。関係のある生物学的高分子を同定するために用いることができる方法としては、疾患に関連するタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸の発現の差を検出するいずれかの手順、ならびにそれぞれのタンパク質およびポリペプチド自体を検出する手順が挙げられる。本発明者らの用いた有意な方法としては、各々それぞれ全文を引用することにより本明細書の一部とされる、米国特許第5,871,697号および1999年10月13日出願の米国特許出願第09/417,386号にそれぞれ開示される、GeneCalling(登録商標)技術およびSeqCalling(商標)技術が挙げられる。GeneCalling(登録商標)はShimkets et al., Nature Biotechnology, 17:198-803 (1999)にも記載されている。
本発明は、哺乳類において、疾病または病態、または異常な状態または状況と新規の関連を有すると同定されたポリペプチドおよびそれによってコードされるヌクレオチドを提供する。本発明には核酸配列およびそれらにコードされるポリペプチドが含まれる。この配列を総じて「肥満症および/または糖尿病核酸」または「肥満症および/または糖尿病ポリヌクレオチド」と呼び、対応するコードされるポリペプチドは「肥満症および/または糖尿病ポリペプチド」または「肥満症および/または糖尿病タンパク質」と呼ぶ。例えば、本発明の肥満症および/または糖尿病核酸は、肥満症および/または糖尿病核酸を含む核酸であり、本発明の肥満症および/または糖尿病ポリペプチドは、肥満症および/または糖尿病ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドである。特に断りのない限り、「肥満症および/または糖尿病」とは本明細書に開示の新規の関連を有するいずれの配列も指すものとする。
本発明は、種々の疾病、病態、異常な状態および状況の処置における治療薬の標的として関与する、天然ポリペプチド、このポリペプチドまたはタンパク質の前駆体型またはプロタンパク質または成熟型をはじめとする一連のタンパク質およびポリペプチドを同定する。標的は、標的と相互作用し、そうすることによって所望のまたは好ましい効果を発揮する候補治療薬を同定するための種々のスクリーニング方法論のいずれでも用いることができる。本発明の重要な実施形態では、候補治療薬は物質または化合物の大きな収集物をスクリーニングすることによって同定する。かかる収集物は、物質または化合物の少なくとも1つのサブセットにおいて、個々のメンバーが特定の基準または基本的な化学構造をベースとした簡単な構造上の変化によって互いに関与している、物質または化合物のコンビナトリアル・ライブラリーを含み得る。この変化には、例を限定するものではないが、結合している原子の基礎構造の長さまたは同一性における変化;環状構造、架橋構造、脂環式環、および芳香環の数、構成および配置における変化;ならびに特定の位置で、結合している原子の基礎構造または環状構造、架橋構造、脂環式構造、あるいは芳香族構造と結合しているペンダントまたは置換原子もしくは基における変化が挙げられる。
本明細書に記載され、かつ、スクリーニング手順で標的として役立つポリペプチドまたはタンパク質としては、天然のポリペプチドまたは前駆体型またはプロタンパク質の産物が挙げられる。天然のポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質としては、例えば、対応する遺伝子にコードされる全長遺伝子産物が挙げられる。天然のポリペプチドとしてはまた、本明細書に記載されるオープンリーディングフレームによってコードされるポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質も挙げられる。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型は、宿主細胞をはじめとする細胞内で生じ得る1以上の天然のプロセシングステップの結果として生じる。このプロセシングステップは、遺伝子産物が生じる時に、例えば、オープンリーディングフレームの開始コドンによってコードされるアミノ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドもしくはリーダー配列のタンパク質加水分解切断により起こる。したがって、1からNまでの残基を有し、残基1がN末端メチオニンである前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟型には、残基2からNが残存する。あるいは、残基1〜Nを有し、残基1から残基Mまでのアミノ末端シグナル配列が切断される前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟型は、残基M+1から残基Nまでの残存する残基を含む。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型は、非タンパク質加水分解翻訳後修飾からも生じ得る。かかる非タンパク質加水分解プロセスとしては、例えば、グリコシル化、ミリスチル化またはリン酸化が挙げられる。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質は、これらのプロセスのただ１つの働き、またはそれらのうちのいずれかの組み合わせから生じ得る。
スルホニル尿素受容体(SUR2、CG154077-01)は、高脂肪食を与えたマウスにおいておよび高血糖性/糖尿病マウスにおいて、遅筋骨格筋に対して速筋でアップレギュレートされていることがわかった。グルコース取り込みは、遅筋と比べ速筋では減少していることは公知である。SUR2の阻害は、遅筋表現型を支持し、そのためにグルコース取り込みが増加し、インスリン感受性が改善される可能性がある。
本明細書において「同一な」残基とは、2つの配列間の比較において、2つの配列のアラインメントで対応するヌクレオチド塩基またはアミノ酸残基が同一残基である残基にあたる。あるいは、アラインメントでの2つの配列間の比較が、比較上対応する位置にある残基が同じアミノ酸か以下に定義する保存アミノ酸のいずれかであると示す場合に、残基は「類似の」または「ポジティブ」と記載される。
本明細書において「化学組成物」とは、天然の供給源より合成されたか抽出されたかどちらかの少なくとも1種の化合物を含む組成物に関する。化学化合物は指定の合成手順の産物であり得る。かかる合成化合物は本明細書では分子式、結合した原子の相互の会合に関する分子構造、電気泳動図または分光学的特性その他などの物理的特性に関して指定の特性を有するものと理解される。天然の供給源より抽出された化合物は、分子式、結合した分子の相互の会合に関する分子構造、電気泳動図または分光学的特性その他などの物理的特性をはじめとするその指定の特性の説明を提供するため、化学的および物理的方法で分析されていることが有利である。
本明細書において「候補治療薬」とは、標的生体高分子と結合すると示される少なくとも１種の物質を含む化学化合物である。本発明の重要な実施形態では、標的生体高分子はタンパク質またはポリペプチド、核酸、多糖またはプロテオグリカン、あるいは複合脂質などの脂質である。標的と結合する化合物の同定方法により、結合親和性をほとんどまたは全く持たない化合物を効果的に除去され、それによって同定された化学化合物が有益な治療用途を持つ可能性が高まる。「候補治療薬」が2種以上の化学化合物の混合物である場合には、次いでスクリーニング手順を実施して、混合物中の、結合性化合物であって候補治療薬として同定されるべき特定の物質を同定することができる。
本明細書において「薬剤」は、疾病または病態に関して所望のまたは有益な治療効果を発揮する候補を同定するための、その病状または病態モデルを用いる候補治療薬のスクリーニングにより提供される。首尾よくかかる効果をもたらすかかる候補を本明細書では薬剤と呼ぶ。限定するものではないが、かかるスクリーニングに使用できるモデル系の例としては、特定の細胞株、培養細胞、組織調製物、全組織、器官調製物、完全な器官、および非ヒト哺乳類が挙げられる。薬剤を同定するためには少なくとも１つの系、好ましくは2以上の系を用いるスクリーニングを用いればよい。このように同定された薬剤はいずれもヒト被験者を用いるさらなる研究で取り組むことができる。
ヒトスルホニル尿素受容体2A遺伝子の、診断薬ならびに/または小分子薬および抗体治療薬の標的としての使用
以下のアルゴリズムによるCG154077-01の解析により、遺伝子産物が、特徴的な機能的タンパク質ドメインを含む細胞膜関連ABC輸送体であることが示される。
機能的相同性:クエリー:CG154077-01
ptnr:SWISSPROT-ACC:O60706スルホニル尿素受容体2-ホモサピエンス(ヒト)、1549
アミノ酸長=1549
スコア(score)= 7961 (2802.4ビット)、エクスペクト(Expect) = 0.0, P = 0.0
同一性= 1549/1549 (100%)、ポジティブ = 1549/1549 (100%)
BLAST解析により、CG154077-01のタンパク質翻訳が、SwissProtデータベースにおいてスルホニル尿素受容体2配列O60706と同一であることが示された。
PSORT結果:クエリー:CG154077-01
細胞膜---確実性=0.8000(肯定) < succ>
ゴルジ体---確実性=0.4000(肯定) < succ>
小胞体(膜)---確実性=0.3000(肯定) < succ>
微小体(ペルオキシソーム)---確実性=0.3000(肯定) < succ>

PSORT解析により、CG154077-01は細胞膜に局在することが推定される。
マウス食事誘導性肥満研究(BP24.02)
臨床集団で肥満の主な原因は過剰なカロリー摂取である。このいわゆる食餌誘導性肥満症(DIO)を、脂肪含有量が40%より多いの高脂肪食を与えることにより動物モデルで模倣する。このDIO研究は、食餌誘導性肥満症の発症および進行の一因となる遺伝子発現の変化を同定するために確立した。さらに、研究デザインは、特定の個体に高脂肪食の影響に抵抗する能力をもたらす要因を特定し、それによって肥満症を防ぐことを追求する。この研究のためのサンプル群はC57BL/6Jマウスから選択し、体重+1S.D.、+4S.D.および+7S.D.という固形試料食事制限とした(下記)。さらに、+7S.D.マウスの生化学プロフィールから、肥満にかかわらず正常な血糖プロフィールを保持したマウス(ngsd7)と高血糖を実証したマウス(hgsd7)へのこれらの動物のさらなる層別化が明らかになった。調べる組織には、視床下部、脳幹、肝臓、後腹膜白色脂肪組織(WAT)、副睾丸WAT、褐色脂肪組織(BAT)、腓腹筋(速筋骨格筋)およびヒラメ筋(遅筋骨格筋)を含めた。これらの組織の遺伝子発現プロフィールの差は、肥満症の治療標的として使用できる遺伝子および経路を明らかにするはずである。
GeneCalling研究BP24.02の結果
差示的遺伝子発現についてのCureGenのGeneCalling(商標)法を用いて、マウススルホニル尿素受容体2Aの遺伝子断片は、高脂肪食を与えたマウス(sd1)では、腓腹筋においてヒラメ筋に対して2倍にアップレギュレートされていることがわかった。高血糖の肥満症マウス(hgsd7)では、腓腹筋においてヒラメ骨格筋に対して3倍にアップレギュレートされていることもわかった。約97ヌクレオチド長に移動する発現に差のあるマウス遺伝子断片(表E1-縦の実線)を、マウススルホニル尿素受容体2AcDNAとして断定的に同定した(グラフでは、横軸はヌクレオチド長で測られ、縦軸はシグナル応答として測られている)。遺伝子の高次構造評価には競合PCRという方法を用いた。PCR増幅の際に遺伝子特異的プライマー(以下参照)がリンカー-アダプター中のプライマーと競合する場合に、マウススルホニル尿素受容体2Aの遺伝子断片に相当するエレクトロフェログラムのピークを切り出す。妊娠性糖尿病の雌および正常な妊娠中の雌双方由来のサンプルで、97nt長のピーク(点線または破線のトレース)が切り出される。
97ヌクレオチド長遺伝子断片および競合PCRに用いた遺伝子特異的プライマーの直接配列を、スルホニル尿素受容体2AのcDNA配列で示し、以下に太字で示す。断片の5'および3'末端の遺伝子特異的プライマーはイタリック体である。
マウススルホニル尿素受容体2Aの競合PCRプライマー(NOV9a、CG154077-01の前記で列挙された配列配列番号37の3054から3150の断片、バンドの大きさ:97)を、表E１に示す。
表E１ GeneCalling実験結果
Figure 2005532786
CG154077のPfam解析により、このタンパク質では4個の有意なドメインが同定される。
Pfamドメイン:クエリー:CG154077-01

Figure 2005532786
CG154077-01のPfam解析からのABC輸送体ドメインのE値は高度に有意であり、これは活性のあるABC膜輸送体を示唆する。
CG154077-01の解析と、それに続くアルゴリズムにより、遺伝子産物が、特徴的な機能的タンパク質ドメインを含む細胞膜関連ABC輸送体であることが示される。
SeqCalling
ライブラリー:
Figure 2005532786
SeqCallingにより、心臓、脳およびいくつかの無関係な組織におけるCG154077-01の発現が示される。
ヒトスルホニル尿素受容体2Aの変異体を、直接クローニングおよび/または公開データベースから得た。実験研究において発現に差のあるものとして同定されたヒト型の遺伝子に加え、他の変異体を、多数の種々のヒト組織由来のcDNAの直接配列決定によって、および公開データベース中の配列から同定した。
ヒトでは少なくとも3種の代替スプライシングイソ型が同定されている(SUR2A、SUR2Aδ、SUR2B)。SUR2Aδは、SUR2A(CG154077-01)と同一であるが、エクソン14を欠く。SUR2Bは、異なるエクソン利用に由来する、SUR2Aとは異なる独特のC末端を含む(SUR2Aはエクソン39を用いる、SUR2B-エクソン40)。
RTQPCR解析
パネル1.5は、CG154077が脂肪、腎臓、心臓および膵臓をはじめとするいくつかの代謝組織で発現され、SUR2の最高レベルの発現は骨格筋においてであることを示す。
パネル5Iは、CG154077がヒト脂肪および骨格筋で発現されることを示す。CG154077の発現レベルは、糖尿病の脂肪/骨格筋では、糖尿病でない個体と比べて大幅に上がっている(患者12)。これらのデータは、ヒトスルホニル尿素受容体A2のアップレギュレーションが病原性の結果をもたらし、この遺伝子またはこの遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の阻害は、糖尿病の処置にとって有益であるということをさらに支持する。
生化学、細胞株発現およびスクリーニングアッセイ構築
スルホニル尿素受容体2A(SUR2)は、カリウムチャンネルの調節サブユニットである。チャンネルの活性をアッセイするための通常の方法は、トランスフェクトした哺乳類細胞株において、またはアフリカツメガエル卵母細胞によって発現される組換えタンパク質において、パス-クランプ(path-clamp)法によって流れを測定することである。既知のアクチベーター、例えば、臨床血管弛緩薬(ペナシジル)がある。スルホン尿素化合物は、SUR2を、SUR1に対しての100〜1000倍効果が少ないが、阻害することができるということがわかっている。
スルホニル尿素受容体2Aを発現する細胞株は、前記で示したRTQ-PCRの結果から得ることができる。これらおよびその他のスルホニル尿素受容体2Aを発現する細胞株はスクリーニング目的で使用できる可能性がある。
理論に拘束されようとは思わないが、本発明者らは、カリウムチャンネルを含むスルホニル尿素受容体2の破壊は、骨格筋におけるインスリン刺激性グルコース取り込みを増強すること、およびスルホニル尿素受容体2は、高脂肪食を与えた動物モデルでは、および高血糖の動物モデルでは、速筋において、遅筋に対してアップレギュレートされていることを提案する。グルコース取り込みは、遅筋と比べ速筋では減少していることは公知である。したがって、スルホニル尿素受容体2の阻害は、インスリン刺激性グルコース取り込みを増加させ、遅筋にとって好都合であり、このようにしてインスリン感受性を改善する可能性がある。ヒトスルホニル尿素受容体2Aの阻害剤/アンタゴニストは肥満症の処置で有益である可能性がある。
(実施例E2):ヒトタンパク質キナーゼMEK2様タンパク質、これをコードする核酸およびその使用方法
疾病、病態および哺乳類生物が、正常な状態および状況ではないと、またはそうなる危険にあると診断された他の異常な状態または症状を治療するためには、新規治療薬を同定することが重要である。
MEK2は、MAPK/ERKシグナル伝達カスケードに関与する二重特異性タンパク質キナーゼである(Lewis TS, Shapiro PS, Ahn NG., 1998, Signal transduction through MAP kinase cascades. Adv Cancer Res;74:49-139; PMID: 9561267)。このカスケードは、受容体チロシンキナーゼ、インテグリンおよびイオンチャンネルを含む成長および分化に関与する広範な受容体によって活性化される。異なる刺激間でカスケードの特異的成分は大きく変わるが、経路の構造は、通常、受容体を、シグナルを小GTP結合タンパク質に伝達するグアニンヌクレオチド交換因子(Ras、Rap1)と結合させる一連のアダプターを誘導し、これが、次いで、MAPKKK(Raf)、MAPKK(MEK1/2)およびMAPK(EPK)からなるカスケードのコアユニットを活性化する。活性化されたERK二量体は、サイトゾルにおいて標的を調節し、また遺伝子発現を調節する種々の転写因子を、リン酸化が行われる核へ輸送することができる。
MEK1およびMEK2は、MAPキナーゼキナーゼファミリーに属しており、複数の生化学シグナルの統合点として作用し、増殖、分化、転写調節および発達などの広範な細胞プロセスに関与するERK活性化に直接的に寄与する。両MEKとも、TNFα処理に応じて活性化されることが知られている(Jain RG, Phelps KD, Pekala PH.,1999)。腫瘍壊死因子αは、3T3-L1脂肪細胞でシグナル伝達を開始する(J Cell Physiol. 179: 58-66; PMID: 10082133、Zhang HH, Halbleib M, Ahmad F, Manganiello VC, Greenberg AS)。腫瘍壊死因子αは、細胞外シグナル関連キナーゼの活性化および細胞内cAMPの増加によって分化したヒト脂肪細胞において脂肪分解を刺激する(Diabetes 51(10): 2929-35; 2002; PMID: 12351429)。最近、脂肪細胞を両MEKのアンタゴニストで処理すると、インスリン感受性が回復するということがわかった(Engelman JA, Berg AH, Lewis RY, Lisanti MP, Scherer PE. (2000) Tumor necrosis factor α-mediated insulin resistance, but not dedifferentiation, is abrogated by MEK1/2 inhibitors in 3T3-L1 adipocytes. Mol. Endocrinology 14, 1557; PMID: 11043572)。
種々の生理学的状態、薬理学的状態または自然の状態における、これらの症状の病因および病原に対する遺伝的寄与を解明するために、いくつかの細胞での研究、動物での研究および臨床研究が実施された。これらの研究では、実験群および対照群の生体サンプルにおける、およびそれらの間での、遺伝子発現の差、タンパク質-タンパク質相互作用、発現された遺伝子の大規模配列決定および限定されるものではないが、単一ヌクレオチド多型(SNP)またはスプライシング変異体などの遺伝的変異体の関連を調べるためにCureGen社のコア技術が用いられた。かかる研究の目標は、肥満症および糖尿病の結果を予防、治療する、またはそれらの症状を治療するための治療的介入のための可能性ある手段を特定することである。
本発明は、タンパク質およびポリペプチドおよびそれらをコードする核酸と、疾病または病態との新規関係を開示する。タンパク質およびそれらと類似の関連タンパク質は、cDNAおよび/またはゲノムDNAによってコードされる。詳しくは、CG55838-02によってコードされるタンパク質キナーゼMEK2タンパク質およびその変異体はいずれも、診断マーカー、抗体治療薬の標的および小分子薬の標的として適している。本発明者らは、タンパク質キナーゼMEK2の発現が、食事誘導性肥満症に耐性のあるマウスでは骨格筋でダウンレギュレートされていることを見出したが、このことは、MEK2の特異的阻害は痩せ表現型を支持することを示唆する。本発明者らはまた、遺伝的に肥満症のマウスでは、タンパク質キナーゼMEK2が調節されていないことを見出した。本発明者らは、タンパク質キナーゼMEK2が肥満症患者の肝臓において上昇していることをさらに開示した。総合すれば、これらの知見は、MEK2はインスリン応答性組織における肥満症の陽性マーカーであるということを示唆する。本発明者らは、MEK2は肥満症に伴うインスリン耐性の媒介物質であり、したがって、MEK2のアンタゴニストは糖尿病および/または肥満症の処置にとって有益であるはずであるということを提案する。本発明の好ましい方法は、肥満症および/または糖尿病の処置で有益である可能性があるアゴニストを同定するための、タンパク質キナーゼMEK2の使用である。そのようなものとして本発明は、かかる治療用抗体および/または治療用小分子を同定するための種々のスクリーニングにおける、組換えによって発現されたおよび/または内因的に発現されたタンパク質の使用を実施する。
本発明は、病態、疾病、あるいは異常な状況または状態において調節に差のある生物学的高分子の同定に基づいている。ここで注目する病態または疾病の中には、内分泌学的疾患、癌、種々の腫瘍および腫瘍形成、炎症性疾患、中枢神経系疾患、および類似の異常状況または状態に関するものをはじめとする代謝病が含まれる。生物学的高分子が関与する重要な代謝疾患としては、肥満症および糖尿病、特に肥満症およびII型糖尿病が挙げられる。肥満症は患者をII型糖尿病にかかりやすくすると考えられている。本発明の極めて重要な実施形態では、これらの病態および状況に関係している生物学的高分子は、タンパク質およびポリペプチドであり、このような場合、本発明は同様にそれらをコードする核酸にも関与する。関係のある生物学的高分子を同定するために用いることができる方法としては、疾患に関連するタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸の発現の差を検出するいずれかの手順、ならびにそれぞれのタンパク質およびポリペプチド自体を検出する手順が挙げられる。本発明者らの用いた有意な方法としては、各々それぞれ全文を引用することにより本明細書の一部とされる、米国特許第5,871,697号および1999年10月13日出願の米国特許出願第09/417,386号にそれぞれ開示される、GeneCalling(登録商標)技術およびSeqCalling(商標)技術が挙げられる。GeneCalling(登録商標)はShimkets et al., Nature Biotechnology, 17:198-803 (1999)にも記載されている。
本発明は、哺乳類において、疾病または病態、または異常な状態または状況と新規の関連を有すると同定されたポリペプチドおよびそれによってコードされるヌクレオチドを提供する。本発明には核酸配列およびそれらにコードされるポリペプチドが含まれる。この配列を総じて「肥満症および/または糖尿病核酸」または「肥満症および/または糖尿病ポリヌクレオチド」と呼び、対応するコードされるポリペプチドは「肥満症および/または糖尿病ポリペプチド」または「肥満症および/または糖尿病タンパク質」と呼ぶ。例えば、本発明の肥満症および/または糖尿病核酸は、肥満症および/または糖尿病核酸を含む核酸であり、本発明の肥満症および/または糖尿病ポリペプチドは、肥満症および/または糖尿病ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドである。特に断りのない限り、「肥満症および/または糖尿病」とは本明細書に開示の新規の関連を有するいずれの配列も指すものとする。
本発明は、種々の疾病、病態、異常な状態および状況の処置における治療薬の標的として関与する、天然ポリペプチド、このポリペプチドまたはタンパク質の前駆体型またはプロタンパク質または成熟型をはじめとする一連のタンパク質およびポリペプチドを同定する。標的は、標的と相互作用し、そうすることによって所望のまたは好ましい効果を発揮する候補治療薬を同定するための種々のスクリーニング方法論のいずれで用いてもよい。本発明の重要な実施形態では、候補治療薬は物質または化合物の大きな収集物をスクリーニングすることによって同定する。かかる収集物は、物質または化合物の少なくとも1つのサブセットにおいて、個々のメンバーが特定の基準または基本的な化学構造をベースとした簡単な構造上の変化によって互いに関与している、物質または化合物のコンビナトリアル・ライブラリーを含み得る。この変化には、例を限定するものではないが、結合している原子の基礎構造の長さまたは同一性における変化;環状構造、架橋構造、脂環式環、および芳香環の数、構成および配置における変化;ならびに特定の位置で、結合している原子の基礎構造または環状構造、架橋構造、脂環式構造、あるいは芳香族構造と結合しているペンダントまたは置換原子もしくは基における変化が挙げられる。
本明細書に記載され、かつ、スクリーニング手順で標的として役立つポリペプチドまたはタンパク質としては、天然のポリペプチドまたは前駆体型またはプロタンパク質の産物が挙げられる。天然のポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質としては、例えば、対応する遺伝子にコードされる全長遺伝子産物が挙げられる。天然のポリペプチドとしてはまた、本明細書に記載されるオープンリーディングフレームによってコードされるポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質も挙げられる。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型は、宿主細胞をはじめとする細胞内で生じ得る1以上の天然のプロセシングステップの結果として生じる。このプロセシングステップは、遺伝子産物が生じる時に、例えば、オープンリーディングフレームの開始コドンによってコードされるアミノ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドもしくはリーダー配列のタンパク質加水分解切断により起こる。したがって、1からNまでの残基を有し、残基1がN末端メチオニンである前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟型には、残基2からNが残存する。あるいは、残基1〜Nを有し、残基1から残基Mまでのアミノ末端シグナル配列が切断される前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟型は、残基M+1から残基Nまでの残存する残基を含む。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型は、非タンパク質加水分解翻訳後修飾からも生じ得る。かかる非タンパク質加水分解プロセスとしては、例えば、グリコシル化、ミリスチル化またはリン酸化が挙げられる。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質は、これらのプロセスのただ１つの働き、またはそれらのうちのいずれかの組み合わせから生じ得る。
本明細書において「同一な」残基とは、2つの配列間の比較において、2つの配列のアラインメントで対応するヌクレオチド塩基またはアミノ酸残基が同一残基である残基にあたる。あるいは、アラインメントでの2つの配列間の比較が、比較上対応する位置にある残基が同じアミノ酸か以下に定義する保存アミノ酸のいずれかであると示す場合に、残基は「類似の」または「ポジティブ」と記載される。
本明細書において「化学組成物」とは、天然の供給源より合成されたか抽出されたかどちらかの少なくとも1種の化合物を含む組成物に関する。化学化合物は指定の合成手順の産物であり得る。かかる合成化合物は本明細書では分子式、結合した原子の相互の会合に関する分子構造、電気泳動図または分光学的特性その他などの物理的特性に関して指定の特性を有するものと理解される。天然の供給源より抽出された化合物は、分子式、結合した分子の相互の会合に関する分子構造、電気泳動図または分光学的特性その他などの物理的特性をはじめとするその指定の特性の説明を提供するため、化学的および物理的方法で分析されていることが有利である。
本明細書において「候補治療薬」とは、標的生体高分子と結合すると示される少なくとも１種の物質を含む化学化合物である。本発明の重要な実施形態では、標的生体高分子はタンパク質またはポリペプチド、核酸、多糖またはプロテオグリカン、あるいは複合脂質などの脂質である。標的と結合する化合物の同定方法により、結合親和性をほとんどまたは全く持たない化合物を効果的に除去され、それによって同定された化学化合物が有益な治療用途を持つ可能性が高まる。「候補治療薬」が2種以上の化学化合物の混合物である場合には、次いでスクリーニング手順を実施して、混合物中の、結合性化合物であって候補治療薬として同定されるべき特定の物質を同定することができる。
本明細書において「薬剤」は、疾病または病態に関して所望のまたは有益な治療効果を発揮する候補を同定するための、その病状または病態モデルを用いる候補治療薬のスクリーニングにより提供される。首尾よくかかる効果をもたらすかかる候補を本明細書では薬剤と呼ぶ。限定するものではないが、かかるスクリーニングに使用できるモデル系の例としては、特定の細胞株、培養細胞、組織調製物、全組織、器官調製物、完全な器官、および非ヒト哺乳類が挙げられる。薬剤を同定するためには少なくとも１つの系、好ましくは2以上の系を用いるスクリーニングを用いればよい。このように同定された薬剤はいずれもヒト被験者を用いるさらなる研究で取り組むことができる。
詳しくは、本発明は、診断薬および/または小分子薬および抗体治療薬の標的としての、タンパク質キナーゼMEK2タンパク質の使用に関する。
本発明者らは、タンパク質キナーゼMEK2は、食事誘導性肥満症に耐性のあるマウスでは骨格筋でダウンレギュレートされていることを見出したが、このことは、MEK2の阻害は、痩せ表現型を支持するということを示唆する。本発明者らはまた、遺伝的に肥満症のマウスでは、タンパク質キナーゼMEK2が調節されていないことを見出した。本発明者らは、タンパク質キナーゼMEK2が肥満症患者の肝臓において上昇していることをさらに開示した。総合すれば、これらの知見は、MEK2はインスリン応答性組織における肥満症の陽性マーカーであるということを示唆する。本発明者らは、MEK2は、骨格筋および肝臓、すなわち、2つの主要なインスリン感受性組織において発現される最も大量にあるイソ型であることを示す。特定の作用機序に限定されようとは思わないが、本発明者らは、それにもかかわらず、MEK2は、インスリン耐性および/または肥満と関連している糖尿病の媒介物質であるということを提案する。本発明の特定の実施形態では、タンパク質キナーゼMEK2はスクリーニングの標的である。そのようなものとして本発明は、肥満症および/または糖尿病の処置で有益である、タンパク質キナーゼMEK2アンタゴニスト、治療用抗体および/または治療用小分子を同定するための種々のスクリーニングにおける、組換えによって発現されたおよび/または内因的に発現されたタンパク質の使用を実施する。
GeneCalling(登録商標)実験の結果
材料および方法
次節に、肥満症および糖尿病についての、診断マーカー、抗体治療薬の標的および小分子薬の標的として好適であるような、タンパク質キナーゼMEL2がコードするタンパク質およびそのいずれかの変異体を同定するために用いた研究デザインを記載する。
マウス食事誘導性肥満症研究(BP24.02)
臨床集団で肥満の主な原因は過剰なカロリー摂取である。このいわゆる食餌誘導性肥満症(DIO)を、脂肪含有量が40%より多いの高脂肪食を与えることにより動物モデルで模倣する。このマウスDIO研究は、食餌誘導性肥満症の発症および進行の一因となる遺伝子発現の変化を同定するために確立した。さらに、研究デザインは、特定の個体に高脂肪食の影響に抵抗する能力をもたらす要因を特定し、それによって肥満症を防ぐことを追求する。この研究のためのサンプル群はC57BL/6Jマウスから選択し、体重+1S.D.、+4S.D.および+7S.D.という固形試料食事制限とした(下記)。さらに、+7S.D.マウスの生化学プロフィールから、肥満にかかわらず正常な血糖プロフィールを保持したマウス(ngsd7)と高血糖を実証したマウス(hgsd7)へのこれらの動物のさらなる層別化が明らかになった。調べる組織には、視床下部、脳幹、肝臓、後腹膜白色脂肪組織(WAT)、副睾丸WAT、褐色脂肪組織(BAT)、腓腹筋(速筋骨格筋)およびヒラメ筋(遅筋骨格筋)を含めた。これらの組織の遺伝子発現プロフィールの差は、肥満症の治療標的として使用できる遺伝子および経路を明らかにするはずである。
マウス肥満症研究(MB.04)
体重および組成の異なる多数のマウス系統が同定されている。AKRおよびNZB系は肥満であり、SWR、C57LおよびC57BL/6系は平均的な体重であるのに対してSM/JおよびCast/Ei系は痩せている。これらの系統由来の主要代謝組織での遺伝子発現の違いを理解することで肥満症の病態生理学的機序が解明されるであろう。体重および関連形質の量的形質座位(QTL)が公開された遺伝学研究で報告されているので、これら特定の系統のラットを差示的遺伝子発現解析のために選択した。組織には全脳、骨格筋、内臓脂肪、および肝臓を含めた。
マウス食事誘導性肥満症研究の結果(BP24.02)
差示的遺伝子発現についてのCureGenのGeneCalling(商標)法を用いて、まず、マウスタンパク質キナーゼMEK2遺伝子(249〜301の断片;バンドの大きさ53nt)は、食事誘導性肥満症耐性(sd1)マウスの腓腹筋(解糖)骨格筋では、ヒラメ筋(酸化)骨格筋に対して1.6倍にダウンレギュレートされていることがわかった。。約51.7ヌクレオチド長に移動する発現に差のあるマウス遺伝子断片(表E2-縦の実線)を、マウスタンパク質キナーゼMEK2cDNAとして断定的に同定した(グラフでは、横軸はヌクレオチド長で測られ、縦軸はシグナル応答として測られている)。遺伝子の高次構造評価には競合PCRという方法を用いた。PCR増幅の際に遺伝子特異的プライマーがリンカー-アダプター中のプライマー配列と競合する場合に(表E2参照)、マウスタンパク質キナーゼMEK2の遺伝子断片に相当するエレクトロフェログラムのピークを切り出す。肥満耐性(sd1)マウスのヒラメ筋(酸化)骨格筋由来サンプルで、51.7nt長のピーク(点線または破線のトレース)が切り出される(表E2参照)。要するに、sd1マウスにおいて認められるMEK2ダウンレギュレーションは、タンパク質キナーゼMEK2の阻害が好都合な肥満耐性状態を促進する可能性があることを示唆し、MEK2のアンタゴニストは肥満症および/または糖尿病の処置にとって有益である可能性があるという仮説を支持する。
表E2. このエレクトロフェログラムのピークは、発見研究Bp24.02において発現に差のある遺伝子断片がマウスタンパク質キナーゼMEK2由来のものであるということを表す。断片内の51.7ntに移動するピーク(赤色トレース)を、MEK2遺伝子由来の競合PCRプライマーを用いて(緑色トレース)切り出すことができる。
Figure 2005532786
マウス肥満症研究(MB.04)の結果
差示的遺伝子発現についてのCureGenのGeneCalling(商標)法を用いて、まず、マウスタンパク質キナーゼMEK2遺伝子(1168〜1304の断片;バンドの大きさ136nt)は、正常C57L/Jマウスの骨格筋では、遺伝的に痩せたCast/Eiマウスと比べて1.7倍にダウンレギュレートされていることがわかった。同一断片は、正常SERマウスの骨格筋では、遺伝的に痩せたCast/Eiマウスと比べて2.6倍アップレギュレートされていた。約137ヌクレオチド長に移動する発現に差のあるマウス遺伝子断片(表E3-縦の実線)を、マウスタンパク質キナーゼMEK2cDNAとして断定的に同定した(グラフでは、横軸はヌクレオチド長で測られ、縦軸はシグナル応答として測られている)。遺伝子の高次構造評価には競合PCRという方法を用いた。PCR増幅の際に遺伝子特異的プライマーがリンカー-アダプター中のプライマーと競合する場合に(表E3参照)、マウスタンパク質キナーゼMEK2の遺伝子断片に相当するエレクトロフェログラムのピークを切り出す。Cast/Eiマウス由来のサンプルで、136nt長のピーク(点線または破線のトレース)が切り出される(表E3参照)。種々の体重の動物で、MEK2が調節されていないという知見は、肥満と関係のある病状におけるMEK2の役割を示唆する。
表E3 発見研究MB.04におけるこの発現に差のある遺伝子断片はマウスタンパク質キナーゼMEK２由来のものである。
Figure 2005532786
ヒトCG55838-02配列同定
材料および方法
SeqCalling断片を、CuraTools(商標)プログラムSeqExtendにより、または解析したゲノムクローンの適当な領域へマッピングするSeqCalling断片の同定により同定した。かかる配列は、オーバーラップ領域の1種以上のSeqCallingアセンブリーとの同一性度が高い場合のみ、受託番号CG55838-02の誘導体に含めた。同一性度は、例えば、約90%以上、好ましくは約95%以上およびより好ましくはほとんどまたは100%に等しいものであり得る。必要であれば、SeqCalling断片およびゲノムクローンを同定し、解析するプロセスを繰り返して全長配列を導いた。次いで、本明細書に開示された最終配列を導くため、前記手順により規定される領域を手作業で統合し、例えば、元の断片中でミスコールされた塩基から、または予測されるエクソン結合部、EST位置と配列類似性領域との間の矛盾から生じ得た明らかな不一致を訂正した。必要であれば、SeqCallingアセンブリーおよびゲノムクローンを同定および解析するプロセスを繰り返して全長配列を導いた。したがって、インシリコ予測に用いた公開タンパク質は本発明に含めた。本発明のタンパク質(CG55838−02)の全長配列を、Curatools(登録商標)プログラム、GeneAnglerを用いて予測した。
CG55838-02のPfam解析により、このタンパク質では1個のタンパク質キナーゼドメインが同定される。このドメインに対応するE値は(4e-72)は高度に有意であり、この遺伝子によってコードされるタンパク質が、タンパク質キナーゼMEK2タンパク質ファミリーのメンバーの触媒的に活性なドメイン特性を含むということを示唆する。ヒトタンパク質キナーゼMEK2は400個のアミノ酸長であり、ヒト染色体7q32にマッピングされ、サイトゾルに局在する。
ヒトタンパク質キナーゼMEK2遺伝子変異体およびSNP
1種のスプライシング型変異体を同定した。この新規イソ型は、キナーゼドメインに欠失を含み、ATPおよびリン酸化部位は保存されている。CureGenでは、いくつかのアミノ酸変更性および非アミノ酸変更性cSNPが同定され、以下の表E1に示す。UCP=非荷電極性、NP=非極性、A＝酸性およびB=塩基性。ID「cgsp」をつけたcSNPはCuraGen特許SNPを指し、他方「hsnp」を表示したものは公開データベース由来のものである。同定されたすべてのもののうち、スクリーニング目的で用いるのに好ましい変異体は、CG55838-02である。
表E4. CG55838-02 SNPs
Figure 2005532786
ヒトタンパク質キナーゼMEK2遺伝子(CG55838-02)の発現プロフィール(RTQPCRの節ではCG55838-02について先に記載した)
CuraChipを用いる遺伝子発現解析
CuraGenは、生物学的に重要なマーカーまたは疾病もしくは病態および治療的介入の標的を同定するための遺伝子マイクロアレイ(CuraChip1.2)を開発した。それは、製薬上扱いやすいゲノム(PTG)に相当するCuraGenのcDNA配列コレクションの、包括的mRNA発現解析のハイスループット手段を提供する。この配列セットは、タンパク質治療薬へ発展させることのできる、または抗体もしくは小分子治療薬の開発に使用できる遺伝子を含む。CuraChip1.2は、(限定されるものではないが)、キナーゼ、イオンチャンネル、Gタンパク質共役受容体(GPCR)、核ホルモン受容体、プロテアーゼ、トランスポーター、代謝酵素、ホルモン、増殖因子、ケモカイン、サイトカイン、補体および凝固因子、ならびに細胞表面レセプターをはじめとする約8,500の遺伝子座に相当する約11,000個のオリゴを含む。
CuraChipのｃDNAは、ガラス製マイクロチップ上の30量体オリゴデオキシリボヌクレオチド(オリゴ)として表した。25量体オリゴを使用する方法と比較すると、より長いCuraChipオリゴを使用するハイブリダイゼーション法は特異性が高い。CuraChipオリゴをリンカーを用いて合成し、精製して末端切断されたオリゴ(ハイブリダイゼーションの強度および特異性に影響し得る)を除去し、ガラススライド上に滴下した。オリゴdTプライマーを用いて注目するサンプルからハイブリダイゼーション用cRNAプローブを作製した。ビオチン-アビジンコンジュゲーション系を用いてフルオロフォアー標識二次抗体でハイブリダイズされたプローブを検出した。遺伝子発現は、クラスタリングおよびSpotfire(登録商標) (Spotfire, Inc., 212 Elm Street, Somerville, MA 02144)などの関連バイオインフォマティックツール、ならびに多変量解析(MVA)のような統計学的ツールを用いて解析した。
CuraChip解析を用いる、糖尿病および肥満症における差示的遺伝子発現の解析
4つの人種の各々に属する、62歳未満の、正常(20〜25)、過体重(25〜30)および肥満(>30)表現型に相当する肥満度指数(BMI)に広がる、12人の健常および12人の糖尿病の男性患者から、RNA抽出用に集めた剖検組織から遺伝子発現プロフィールを作製した。
代謝組織には、腰筋(骨格筋)および横隔膜(骨格筋)、内蔵脂肪、皮下脂肪、象徴、肝臓、膵臓および視床下部を含めた。患者の説明は表E2に示した通りである。
表E5:
Figure 2005532786
各組織から総RNAを単離し、cRNAを作製するために用い、これを標識し、特許マイクロアレイ(CuraCHip1.2)とハイブリダイズさせた。スキャンした画像の蛍光強度を定量化し、標準化した。
患者をその疾病状態をもとに:糖尿病と非糖尿病、またはそのBMIをもとに:BMIの低い患者(BMIが25未満である)、BMIが中程度である患者(BMIが２５を超え30未満である)およびBMIが高い患者(BMIが３０を超える)群に分けた。
RTQ-PCR解析
タンパク質キナーゼMEK2、CG55838-02遺伝子の発現を、プライマー-プローブセットAg2022を使用して評価し、表PAに記載した。RTQ-PCR実施の結果を、表PD、PE、PGおよびPHに示す。
一般 スクリーニング パネルv1.3(MEK2)および1.6(MEK1)まとめ:タンパク質キナーゼMEK2遺伝子は広範に発現される遺伝子であり、最高レベルの発現は骨格筋においてである(CT=27.4)。主要なインスリン応答性組織のちの一方における高度発現は、GeneCalling研究の結果と一致し、MEK2は骨格筋における病原性インスリン耐性状況の一因であるという仮説を強める。対照的に、MEK1は、骨格筋では発現されないが、癌組織において広範な発現を示す。正常組織の中では、MEK1は、脳において高度発現を示す。総合すると、データは、MEK2は骨格筋および肝臓で発現される主な遺伝子であり、したがって、肥満症および/または糖尿病におけるインスリン耐性の処置にとって好ましい標的であるということを示す。
パネル5膵島まとめ(MEK2):パネル5Iは、培養脂肪細胞、腎臓および骨格筋におけるタンパク質キナーゼMEK2遺伝子の高度発現を示す(CT=28〜29)。特に、NEK2は、妊娠性糖尿病の患者(患者12)の骨格筋において、正常患者(患者11および9)の骨格筋と比べて有意にアップレギュレートされており、このことにより、MEK2は糖尿病および/または肥満症の一因であるという仮説がさらに強められる。
CuraChip結果:
タンパク質キナーゼMEK2、CG55838-02の発現を、MEK2遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて評価した。各患者群のタンパク質キナーゼMEK2の蛍光強度の平均値および標準偏差を算出した:糖尿病患者、非糖尿病患者、低BMI患者、中程度のBMI患者、高BMI患者。
膵臓、内臓脂肪および小腸では、群間でMEK2発現の変化は検出されなかった。骨格筋(腰筋)では、BMI値が高いとタンパク質キナーゼMEK2の発現は高まっていたが、群の患者数が不十分であったためにデータは統計的に有意ではなかった(データは示していない)。肝臓では、タンパク質キナーゼMEK2の発現は、肥満患者で大幅にアップレギュレートされていた(図E4)。特に、肥満肝臓におけるMEK2アップレギュレーションは、非糖尿病患者と比べて糖尿病患者でより激しく、このことは、肥満症および糖尿病双方におけるMEK2の役割を示唆する。要するに、CuraChip解析は、MEK2アップレギュレーションは、ヒト肝臓では肥満症、インスリン耐性および糖尿病と正の相関があることを示す。この知見は、MEK2の阻害は、肥満症および/または糖尿病の処置にとって有益であり得るという仮説を強めるものである。
表E6 ヒト肝臓における、タンパク質キナーゼMEK2遺伝子の遺伝子発現のCuraChip解析:種々のBMIの、糖尿病および非糖尿病患者における、MEK2に特異的なオリゴヌクレオチドの強度の平均値および標準偏差
Figure 2005532786
生化学/細胞株発現/スクリーニングアッセイ構築
ヒトタンパク質キナーゼMEK2を標的とする抗体治療薬または小分子薬をスクリーニングするためのアッセイを、細胞株(先に示したRTQ-PCR結果からのそれらの網羅するものではないリスト)において発現される、組換えタンパク質または内生MEK2を利用して構築することができる。
タンパク質キナーゼMEK2のセリン/スレオニンキナーゼ活性をアッセイするには、一般的な/特異的ペプチド基質[s]と32P-ATPを用いるリン酸化反応と、それに続く放射性リン酸の基質への組み込みの測定を利用することができる。タンパク質キナーゼMEK2の全活性を評価するには、活性なリン酸化型のMEK2をスクリーニングに用いなくてはならない。内因的にリン酸化されたMEK2は、活性化された細胞から免疫沈降によって、またはスクリーニングにMEK2の常時活性型の突然変異体(S222E/S226D)を用いることによって得ることができる。化合物の選択性を確実にするために、組換えERK1/2などの内生基質を使用することもできる。化合物の効力を評価するには、インスリン応答性細胞におけるインスリン刺激性グルコース取り込みまたは脂肪細胞におけるインスリン刺激性脂肪分解などのいくつかの細胞アッセイを使用できる。
発現およびスクリーニング目的に利用可能な物理的cDNAクローン
材料および方法
エクソン結合:CG55838-02配列をコードするcDNAを、既知のcDNA配列または本発明のcDNA/タンパク質配列の全長またはある部分(1個以上のエクソン)のインシリコ予測をベースとして設計したプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってクローニングした。これらのプライマーを用いてｃDNAを、以下の組織由来の発現されたヒト配列を含有するプールから増幅した:副腎、骨髄、脳-扁桃体、脳-小脳、脳-海馬、脳-黒質、脳-視床、脳-全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫-Raji、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管および子宮。
物理的クローン:全オープンリーディングフレームをカバーする、エクソン結合によって得られたPCR産物を、Invitrogen製のpCR2.1ベクターにクローニングして発現およびスクリーニング目的に用いるクローンを準備した。
インフレームクローニング:インフレームクローニングは、DNA配列を発現ベクターに挿入し、その結果コードされたタンパク質が産生され得るように設計された方法である。発現されたタンパク質は、全長または注目する特定のドメインに相当するもののいずれかとした。PCR鋳型は、入手可能である場合には先に同定されたプラスミド(全オープンリーディングフレームをカバーする、エクソン結合によって得られたPCR産物)を、またはヒトcDNAをベースとした。ヒトcDNAプールは、各5マイクログラムの以下のヒト組織CDNAからなるものとした:副腎、全脳、扁桃体、小脳、視床、骨髄、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、肝臓、リンパ腫、バーキットRaji細胞株、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脾臓、胃、甲状腺、子宮。下流クローニング目的には、正および逆プライマーにインフレーム制限部位を含めた。増幅産物はアガロースゲル電気泳動によって検出した。断片は、製造業者の推奨にしたがって、ゲル精製し、pCR2.1ベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA)に連結した。形質転換当たり24クローンを選び、質制御ステップを実施して、これらのクローンが予想された大きさのインサートを含むことを確認した。次いで、これらのクローンのうち8個を配列決定し、SeqCalling法と同様の様式でアセンブリーした。8個の配列アセンブリーの解析の他に、配列トレースを手作業で評価した。
ヒトタンパク質キナーゼMEK2をコードする前記CG55838-02遺伝子は、全長物理的クローンに相当し、発現およびスクリーニング目的に直接使用できる。この配列が好ましいイソ型ではあるが、その他のイソ型もいずれも同様の目的で使用できる。さらに、変動するアッセイ条件下で、どのイソ型が記載されたイソ型に取って代わることができるかが決定され得る。
(実施例F):病理Calling相互作用
実施例F1:カルパイン-3経路におけるCG57509-02の相互作用
カルパイン3経路における新規相互作用の解析
本発明は、cDNAライブラリーまたは1つ１つのマトリック反応を用いて酵母2ハイブリッドスクリーニングにおいて同定されるような、タンパク質およびポリペプチドおよびそれらをコードする核酸の新規関連性を開示する。タンパク質およびそれらと類似の関連タンパク質は、cDNAおよび/またはゲノムDNAによってコードされ、一部の例ではCuraGen社によって同定された。。
本発明では、タンパク質相互作用としては、タンパク質断片と全長タンパク質との、タンパク質断片と別のタンパク質断片との、または全長タンパク質相互の相互作用が挙げられる。本発明で開示されるタンパク質相互作用はまた、新規タンパク質が既知経路の構成要素であるとわかる、既知タンパク質が新規経路の構成要素であるとわかる、または新規タンパク質が新規経路の構成要素であるとわかる、特定の疾病または病状に対して機能上重要である重大な発見を示す可能性がある。
カルパインタンパク質およびタンパク質ファミリー、その相互作用およびその変異体はいずれも、抗体治療薬、タンパク質薬の標的および/または小分子薬の標的として適している。そのようなものとして、これらの複合体および経路およびその調節不全の存在は、特定の病的状態を同定するためのマーカーとして、または診断薬として、治療的介入の標的として、小分子化合物および/または薬剤のスクリーニングにおいて、または細胞モデルもしくは動物モデルにおいて使用するために使用できる。したがって、本開示は、本発明の実施形態として、クローニングされた核酸配列、ベクター、トランスフェクトされたおよび/または形質転換された細胞株、動物モデル、組換えによって発現されたおよび／または内因的に発現されたタンパク質を含む。
本発明の化合物は、癌、クローン病、IBD、アレルギー、リウマトイドおよび骨関節炎、炎症性皮膚疾患、アレルギー、血液疾患をはじめとする炎症および自己免疫疾患、結腸癌、白血病、AIDS、糖尿病および肥満症をはじめとする代謝性疾患、膵臓機能不全をはじめとする膵臓疾患および癌、および前立腺癌をはじめとする前立腺疾患およびその他の疾病、疾患および状態などを患う患者の処置にとって効力を有する。
一態様では、本発明は、疾病と特異的関連性を有する実体をターゲッティングすることによって、疾病、病態、異常の状態または状況の処置において、治療的介入の候補である、新規タンパク質、タンパク質相互作用、複合体および/または経路を同定する方法を提供する。本発見の使用としては、以下が挙げられる:
1)疾病または病的状態のための診断的または治療的介入の機序としての、タンパク質相互作用対、複合体、相互作用の収集物またはタンパク質のこれまでは価値を認められていなかった機能または生物学的前後関係を解明する経路の使用。
2)精製の手段としてのまたは相互作用する別のタンパク質成分の存在を同定するための、親和性試薬(例えば、免疫強沈降またはアフィニティークロマトグラフィーにおけるような)としての、タンパク質またはタンパク質複合体の使用。
3)特定の細胞状況または状態を同定するための、化合物のライブラリーのスクリーニングにおけるような、薬剤の作用の指標として相互作用対または複合体の形成をモニターするための使用。
4)下流相互作用物質または遺伝子の活性または発現の変化を誘発し、特定の表現型の変更をもたらすための、経路のある成分を調節するための使用。
5)タンパク質相互作用自体を混乱させるかまたは促進するための、ハイスループットスクリーニングにおいて同定されたものなどの化合物の使用。
6)酵素/基質相互作用の場合には、酵素活性および/または改変された基質の生成の変化を、例えば、化合物のハイスループットスクリーニングにおける指標としてモニターするための使用。
本発明は新規タンパク質複合体を含む。本発明の一態様は、タンパク質複合体を検出する方法および組換えタンパク質を生産する方法である。この態様は、タンパク質-タンパク質相互作用をアッセイする、細胞ベースの(酵母2-ハイブリッド、免疫共沈降)のアッセイにおいておよびin vitro(アフィニティークロマトグラフィー)アッセイにおいて相互作用する全長タンパク質ならびにタンパク質断片を含み得る方法を含む。もう1つの態様では、同定されたタンパク質複合体を、特定の疾病または病的状態または状況の決定における、ならびに疾病または病的状態の素因を検出するための診断薬として使用できる。この態様には、標識した、または融合タンパク質を検出に用いる方法および/または個々のタンパク質またはタンパク質複合体に特異的な抗体を用いる方法が含まれる。この方法により、タンパク質の複合体を形成する能力が測定され、タンパク質の複合体を形成する能力または正常に機能する能力に影響を及ぼし得る、突然変異または単一ヌクレオチド多型(SNP)の同定が含まれる。この態様の別の部分には、複合体を、疾病の処置または治療的介入の標的として使用し、その結果、複合体形成の促進または消失がその生物学的機能および表現型全体に影響を及ぼすことが含まれる。実施形態として、タンパク質のヌクレオチド配列、いずれかのベクター構築物、組換えタンパク質、モノクローナル及びポリクローナル抗体、改変された細胞株および動物モデルが含まれる。
本発明は、親和性試薬としての、複合体におけるタンパク質相互作用の使用を含む。本発明の一態様は、免疫沈降実験において、複合体形成量をモニターするための、ならびに複合体の他の成分の有無を調べるための、複合体のタンパク質成分の使用を含む。複合体の個々の成分に特異的な抗体は、複合体中の会合されたタンパク質を引き剥がすために使用でき、次いで、これを二次抗体によって同定できる。基本的には、複合体は、注目するタンパク質を発現する天然組織または人工的に作り出された細胞株から、抗体またはアフィニティーカラムに特異的なアフィニティータグによって単離することができる。特定の複合体、または他の会合されたタンパク質の存在は、電気泳動されたタンパク質の染色、質量分析、または二次抗体によって調べることができる。この態様の一実施形態は、注目するタンパク質またはタンパク質断片を発現する改変された細胞株、ならびにこのタンパク質および複合体に特異的な抗体の使用である。
本発明は、タンパク質相互作用またはタンパク質複合体の形成を、薬物または薬剤での処置に応じた特定の状態または状況の指標としてモニターする方法を含む。本発明の一態様は、タンパク質複合体に特異的な抗体の、種々の条件下または特定の組織における複合体の相対存在量を調べる方法における試薬としての使用を含む。一実施形態は、その発現および相互作用を容易にモニターするための、「エピトープ」タグとともに発現され得る組換えタンパク質の使用である。
本発明は、本明細書に記載した関連経路で生じる、タンパク質成分または複合体を調節することによって特定の表現型を調節する方法を含む。これは、薬物または抗体またはアンチセンスオリゴを用いて、タンパク質または複合体の活性、タンパク質または複合体の、その生物学的パートナーと相互作用する能力を調節すること、またはタンパク質を経路または複合体から除去することによって達成できる。かかる変化は、標的遺伝子の遺伝子発現の調節、または表現型特異的マーカーの有無をモニターすることによって観察することができる。この態様の実施形態としては、ベクター、抗体、化合物のライブラリー、遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび細胞株が含まれる。
本発明は、タンパク質複合体と相互作用し、タンパク質-タンパク質相互作用自体に影響を及ぼす化学物質を同定するための、化合物、薬物および/または薬剤のスクリーニングにおけるタンパク質複合体の使用を含む。そのようなものとして、同定される化合物を、複合体の形成に影響を及ぼすその能力に基づいて選択することができる。複合体に特異的な抗体の使用は、あれば、未処理対照に対する、化合物での処理後に形成された複合体量の変化を調べるために使用できる。
本発明は、複合体の活性に影響を及ぼし得る化合物をスクリーニングする方法を含む。複合体の活性を、薬物作用の指標としてモニターする方法がこの態様と関連している。これは、生物化学の標準的な方法を用いて実施でき、触媒活性(VMax)および/または基質の親和性(KM)の速度の変化によって測定できる。改変された基質に対する抗体は、処理対対照における、注目する複合体の活性の変化をアッセイするために使用できる。この態様の実施形態として、化合物のライブラリー、薬物および/または薬剤を、特定のタンパク質複合体を調節する薬剤を選択するために使用できる。
カルパイン3とWNK1間の相互作用(表F1)
表F1に示される相互作用は、カルパイン3と、WNK1および電位依存性カリウムチャンネル調節性サブユニットとの相互作用を示す。カルパイン3は、心臓組織において高度に発現される、十分に特性決定されたシステインプロテアーゼである。カルパイン3は、PKAおよびPKCによるリン酸化にとっていくつかの可能性ある部位を含むが、WNKキナーゼ、特に、WNK1によるリン酸化はまだ示されていない。カルパイン3タンパク質分解活性のカルシウム依存性は十分に実証されており、カルパインの既知の標的としては一次構造タンパク質が挙げられる。電位依存性カリウムチャンネル調節性サブユニットタンパク質はまた、カルシウム結合を媒介すると思われるいくつかのEFハンドモチーフ含み、これはカルシウム調節性機能と一致し、これらの相互作用は、カルシウムおよびカリウム依存性細胞事象において重要な機能を媒介するということを示唆する。本発明は、前立腺由来STE20様キナーゼ(PSKまたはWNK1)シグナル伝達に関与する、これまでは未知であったタンパク質相互作用を報告する。WNK1は、タンパク質キナーゼの新規ファミリーのメンバーであり、活性部位に、一般的なリジンの代わりにシステイン残基を含む。WNK1は、多数の組織で発現されるが、腎臓、心筋および骨格筋において特に高レベルで見られる。JNK-MAPKシグナル伝達経路を活性化することもわかっており、このことは、遺伝子発現の調節ならびに細胞生存において役割があり得ることを示唆する。最近の連鎖解析によって、WNK1の突然変異はいくつかの型の高血圧において役割を有するということが示唆されている。本明細書において同定された相互作用は、適切な心機能および腎機能におけるWNK1の役割と一致する。最近、WNK1は細胞質性であり、そのために、WNK1活性がカルパイン3タンパク質分解によって調節される可能性が存在することが示された。カルパイン3の、WNK1を切断する能力およびその関連作用はまだ示されていない。しかしながら、これは、高血圧および心機能、骨格筋機能および腎機能と関連した、カルシウム依存性シグナル伝達事象における重要なステップに相当する可能性がある。さらに、電位依存性カリウムチャンネル調節性サブユニットのカルパイン3媒介性タンパク質分解もまた示されていないが、高血圧性ストレスに応じた心臓興奮性および機能の調節に関する興味深い可能性を提供する。
表F1 カルパイン3経路における新規相互作用(青色線は、陽性酵母2-ハイブリッド相互作用を示し、灰色の結節はその他の相互作用するタンパク質を表す)
Figure 2005532786
カルパイン3の配列はNOV23b、配列番号123および124である。カルパイン3はまた、AF127765として知られることもある。WNK1のヌクレオチドおよびアミノ酸配列(配列番号229および230)は以下の通りである:
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Figure 2005532786
Y-2-Hスクリーニングに用いた各タンパク質のセグメント(表F2)
表F2 PRKWNK1、カルパイン3および心臓カリウムチャンネル調節性タンパク質のタンパク質配列およびドメイン情報。(緑色のバーは、相互作用に関与するタンパク質の領域、関与するタンパク質が「ベイト」か「プレイ」であるかを示し正確なアミノ酸数を緑色のバーの上に示す)。

電位依存性カリウムチャンネル調節性サブユニット(aa26〜227)
カルパイン3(aa1〜821)
WNK1(aa2082〜2382)
Figure 2005532786

カルパイン3のWNK1との相互作用は、カルボキシ末端の数百のアミノ酸によって媒介される。この領域は、WNK1の触媒部位とは異なっており(少なくとも一次構造の点では)、ゆえに、その後のカルパイン3のWNK1依存性リン酸化、WNK1のカルパイン3依存性タンパク質分解に必要な相互作用事象、またはおそらくはそのそれぞれの触媒活性とは独立しているが適切なシグナル伝達事象または局在化には重要である相互作用事象のいずれかに相当し得る。本発明者らは、カルパイン3の電位依存性カリウムチャンネル調節性サブユニットとの相互作用は、カリウムチャンネル機能の機能変更をもたらす可能性があるタンパク質分解事象に相当する可能性があると仮定することができる。カルパイン3の、タンパク質と相互作用する部位の正確な決定は、依然、同定されるべきものである。カルパイン3に関するさらなる情報として、CuraGen社による新規スプライシング型の同定があり、これはシステインプロテアーゼドメイン内に48個のアミノ酸(aa268〜315)の欠失を含む。心臓組織における既知の発現に加え、カルパイン3のRTQ解析によって、骨格筋、腎臓およびRNFαに対する曝露によって活性化された肺上皮において発現が認められることが示唆される。本明細書に開示されたタンパク質および相互作用は、高血圧、心臓病、偽低アルドステロン症II型、高カリウム血症、肺気腫、喘息ならびにその他の処置の、説得力のある治療標的に相当する。
本発明の相互作用を構成する、核酸およびタンパク質を同定する方法
病理Calling(商標)
PRKWNK1、カルパイン3および電位依存性カリウムチャンネル調節性サブユニットの配列を、cDNA断片の実験室クローニングによって、配列のインシリコ予測によって導いた。DNA配列の全長かその配列の一部または双方をカバーするcDNA断片をクローニングした。インシリコ予測はCuraGen社の特許配列データベースまたは公開されているヒト配列データベースで入手可能な配列を基にし、全長DNA配列またはそのある一部のいずれかが提供された。
実験室スクリーニングは1種以上の以下に要約した方法を用いて実施した:
cDNAライブラリーは、種々のドナー由来の複数の組織種、正常状態および病的状態、生理的状態、ならびに発達段階に相当する種々のヒトサンプルから得た。サンプルは、全組織、一次細胞または組織培養した一次細胞または細胞株として得た。細胞および細胞株は、遺伝子発現を調節する生物因子または化学薬品、例えば、成長因子、ケモカインまたはステロイドで処理しておいてもよい。次いで、このような由来のcDNAを適当なツーハイブリッド・ベクター(Gal4活性化ドメイン(Gal4-AD)融合物)へ一定方向にクローニングした。次いで、かかるcDNAライブラリーならびにClontech(Palo Alto, CA)より市販されているcDNAライブラリーを、大腸菌からCuraGen社特許酵母株(その全文を出典明示により本明細書の一部とする、米国特許第6,057,101号および6,083,693号に開示)へ移した。
CuraGen社特許ヒト配列ライブラリーのGal4結合ドメイン(Gal4-BD)融合物を用いて複数のGal4-AD融合物cDNAライブラリーをスクリーニングし、その結果、その各々でGal4-AD融合物が個々のcDNAを含む酵母ハイブリッド二倍体を選択した。各サンプルをcDNA挿入境界で非特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて増幅した。かかるPCR産物を配列決定し、配列トレースは手作業で評価し、必要に応じて修正のために編集した。すべてのサンプルからのcDNA配列を、時には公開ヒト配列を含めて、ともにアセンブルし、バイオインフォマティックプログラムを用いて各アセンブリーの共通配列を得た。各アセンブリーはCuraGen社のデータベースに含まれている。配列は別の構成要素との同一性の程度が50bpにわたって少なくとも95%である場合、アセンブリーの構成要素として含めた。各アセンブリーは遺伝子またはその一部に相当し、スプライシング型単一ヌクレオチド多型(SNP)、挿入、欠失およびその他の配列変異体などの変異体に関する情報を含む。
物理的クローン:全オープンリーディングフレームをカバーする、スクリーニング手順により得たcDNA断片を、cDNAライブラリーの作製に用いたpACT2プラスミド(Clontech)に組み換えDNAとしてクローニングする。この組換えプラスミドを宿主へ挿入し、CuraGen社特許酵母株N106'およびYULH(米国特許第6,057,101号および第6,083,693号)の双方の接合によってスクリーニング手順の間に生じた酵母ハイブリッド二倍体によって選択してクローンを準備する。
タンパク質対の相互作用を、CuraGenの病理Calling(商標)タンパク質相互作用データベースに加える。このデータベースにより、それらの相互作用および/または病理学的に関連のあるシグナル伝達経路における存在に基づいて新規薬剤標的の発見が可能となる。次いで、バイナリータンパク質相互作用、タンパク質複合体形成、ならびに完全細胞性シグナル伝達経路を可視化する手段を提供する、GeneScape(商標)内のバイオインフォマティックツールを用いてタンパク質相互作用を解析する。詳しくは、PRKWNK1、カルパイン3および電位依存性カリウムチャンネル調節性サブユニットタンパク質をコードする配列は相互作用するとわかり、タンパク質複合体の形成もたらす可能性があり、または細胞性シグナルを伝播するために形成する、疾病病理と生理学的に関連のある、一連の複合体を構成する可能性がある。特定の複合体を構成する特定の相互作用はまた、組換えタンパク質または抗体療法、小分子薬または遺伝子治療アプローチの使用による治療滴介入にとって有用であり得る。病理Calling(商標)データベースを掘り起こすことによって同定されるタンパク質相互作用を、in vitroおよびin vivoでスクリーニングして発現情報、機能的情報、生化学的情報および表現型情報を提供することができる。アッセイは単独で用いても、以下の技術に限定されるものではないが、RTQ-PCR、組換えタンパク質のトランスフェクション、免疫共沈降および質量分析、FRET、アフィニティークロマトグラフィー、免疫組織化学または免疫細胞化学、遺伝子CHIPハイブリダイゼーション、アンチセンス(すなわち、ノックダウン、ノックアップ)、GeneCalling実験、および/または生化学アッセイ(リン酸化、脱リン酸化、プロテアーゼ等)をはじめとするものと組合せて用いてもよい。
SeqCalling(商標)技術
cDNAライブラリーは、種々のドナー由来の複数の組織種、正常状態および病的状態、生理的状態、ならびに発達段階に相当する種々のヒトサンプルから得た。サンプルは、全組織、一次細胞または組織培養した一次細胞または細胞株として得た。細胞および細胞株は、遺伝子発現を調節する生物因子または化学薬品、例えば、成長因子、ケモカインまたはステロイドで処理しておいてもよい。次いで、このように得たcDNAを、CuraGenの特許SeqCalling技術を用いて配列決定した。配列トレースは手作業で評価し、必要に応じて修正のために編集した。すべてのサンプルからのcDNA配列を、時には公開ヒト配列を含めてともにアセンブルし、バイオインフォマティックプログラムを用いて各アセンブリーの共通配列を得た。各アセンブリーはCuraGen社のデータベースに含まれている。配列は別の構成要素との同一性の程度が50bpにわたって少なくとも95%である場合、アセンブリーの構成要素として含めた。各アセンブリーは、遺伝子またはその一部に相当し、スプライシング型単一ヌクレオチド多型(SNP)、挿入、欠失およびその他の配列変異体などの変異体に関する情報を含む。
本発明の組成物の使用
カルパイン3の相互作用複合体ならびにそのWNK1との、および一般に、カルパイン3およびWNK1シグナル伝達との関連性により、カルパイン3およびWNK1タンパク質ならびにカルパイン3とWNK1タンパク質複合体によるシグナル伝達が関与している種々の病的状況に対するツールを開発する機会が提供される。したがって、本発明の核酸およびタンパク質は、可能性ある診断および治療用途で、および研究ツールとして有用である。これらとしては、核酸またはタンパク質の存在または量が評価される、特異的または選択的核酸またはタンパク質診断マーカーおよび予後マーカーとして働くこと、相互作用性パートナーによって単離する手段、ならびに以下に挙げるような可能性ある治療用途:(i)タンパク質治療薬、(ii)小分子薬標的、(iii)抗体標的(治療用、診断用、薬物ターゲッティング/細胞傷害性抗体)、(iv)遺伝子治療において有用な核酸(遺伝子送達/遺伝子消失)および(v)in vitroおよびin vivoで組織再生を促進する組成物(vi)生体防御手段が挙げられる。
酵母2-ハイブリッド系を用いて本発明で開示される相互作用タンパク質を同定した。これらの相互作用に関与するタンパク質は、同一の生理学的経路に加わっている可能性がある。これらの経路の重要性のために、本発明は、これらのタンパク質および/またはこれらのタンパク質をコードするDNAを、治療および診断ツールを開発するための基礎として用いるリストを提供する。このリストには、限定されるものではないが、以下の実施例がが含まれる。
質量分析(MS)
質量分析法についての詳細な説明には、Bonkand Humeny, Neuroscientist, 2001、Gygi and Aebersold, Curr Opinion in Chem Biol, 2000 or Gygi et al., Nature Biotechnology, 1999参照。以下は、タンパク質相互作用、修飾およびタンパク質組成物のアッセイに使用できる可能性があるいくつかのMSアプローチの簡単な説明である。
質量分析は、ガス相イオンの質量対荷電(m/z)比の測定に基づいている。タンパク質またはペプチドにとっては、これは、m/z比を測定するためには、まずイオン化し、次いで、気化しなくてはならないことを意味する。質量分析は自動化しやすく、少量のタンパク質、大型タンパク質、ペプチドの同定(ピコ〜ゼプトモル範囲)、およびタンパク質修飾の同定には有用である。MSはまた、タンパク質相互作用およびミリ秒のオーダーで脱離が起こるために動力学が比較的速い場合でさえも、複合体の同定にも有用である。
一方法として、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)併用飛行時間型(TOF)MS解析、いわゆるMALDI-TOFがある。この方法は、光吸収性マトリックスの使用を含み、これによって、サンプル分子の気化および脱離時間の関数としての質量の解析がもたらされる。関連技術としては、表面増強レーザー脱離イオン化(SELDI)−TOFがあり、これには、化学的クロマトグラフィー特性が規定された表面(例えば、疎水性、親水性、陽イオン性、陰イオン性)またはタンパク質、受容体、抗体またはDNAオリゴヌクレオチドなどの生化学的リガンドを用いることによってタンパク質の精製を必要としないという利点がある。もう1つの変法としては、タンデム質量分析、例えば、ナノエレクトロスプレー(ES)MS/MSがあり、これは広範な分子をイオン化/気化するのに最適な方法である。種々のMS法の利点を最大にするために、最良のアプローチは、例えば、リフレクトロンTOF(MS2)を直交配置した、四重極TOFと併用するMALDIイオン化またはESのタンデムアレイ(MS1)(マイクロマスQ-TOF)を用いるハイブリッドであると思われる(詳しい方法については、Fおよびrich et al., 2000参照)。プロテアーゼ消化を組合せた、同位元素でコードしたアフィニティータグ(ICAT)で修飾したタンパク質、マイクロキャピラリー液体クロマトグラフィーおよびES MS/MSによって、比較的少量で存在する場合であっても、複合体混合物中の個々のタンパク質の定量化および同時配列同定が可能となる。MSにおける最も最近の進歩は、エレクトロスプレーイオン化-フーリエ変換サイクロトロン共鳴質量分析法(ESI-FTIRMS)であり、これによって、単一システイン含有ペプチドの正確な質量測定によるタンパク質同定が可能となり、1ppmのオーダーで存在するタンパク質を検出するのに十分な感度があることが示されている(Goodlett et al., 2000)。
機能アッセイ
酵素活性を有するタンパク質が関与する興味深いツーハイブリッド相互作用は、細胞アッセイによって確認することができる。リン酸化、脱リン酸化、タンパク質分解、ユビキチン化、スモイル化およびアセチル化などの修飾は、特異的抗体を用いるウェスタンブロッティングによって解析することができる。
前記の修飾の中には、酵母系で解析できるものもある。活性化ドメイン(AD)またはDNA結合ドメイン(BD)融合タンパク質として2種の相互作用タンパク質を発現する酵母細胞を増殖させ、細胞を適切に溶解することによって細胞抽出物を調製する。修飾されると予想される基質タンパク質を、ADまたはBDドメインに特異的な抗体を用いて免疫沈降させる。免疫沈降物をSDS-PAGEで分離し、特異的抗体を用いてウェスタンブロッティングする。リン酸化されたタンパク質を同定するには、ホスホチロシン、またはホスホセリン/スレオニンに特異的な抗体を用いる。同様に、ユビキチン化またはスモイル化による修飾を検出するためには、これらのタンパク質に特異的な抗体を用いることができる。タンパク質分解には、標的タンパク質の移動度の変化(分子量の変化)を、確かな相互作用の陽性指標として捉えることができる。各アッセイにつき、相互作用酵素がない場合には、基質タンパク質が何ら修飾を受けないことを示すために、一方のタンパク質のみを発現する対照酵母株を処理する。
酵母溶解物を得るために、酵母培養物から1〜1.5mlのサンプルを採取し、サンプルをドライアイス上で凍結する。氷上で、細胞ペレットに低塩溶解バッファーを加える。ガラスビーズを加え、細胞を短時間ボルテックス処理することによって再懸濁する。細胞を、90秒間ビーズを攪拌することによって溶解させる。溶解物を氷上に5分間おき、ビーズを再度90秒間攪拌する。サンプルを氷上に戻す。溶解物からビーズを除いた後、溶解物を4℃で微量遠心機で最大速度で3〜5分間遠心分離し、サンプルを氷上におく。25〜50μｌの上清を採取し、等量の2×タンパク質サンプルバッファーと混合し、ウェスタン解析用に保存する。
酵母からの免疫沈降:溶解物サンプルを解凍し、所望の容量を新しい微量遠沈管に入れる。新しい低塩溶解バッファーを加えてすべてのサンプルを同容量にする。低塩溶解バッファーで希釈した抗体(サンプル当たり10μｌ)を加え、ボルテックス処理することによって混合する。氷上で30分間インキュベートする。
タンパク質A-セファロース/抗体結合:タンパク質A-セファロースビーズを、ビーズを低塩バッファーに懸濁し、短時間遠心分離してビーズを沈殿させ、上清を除去することによって低塩溶解バッファーで平衡化する。この平衡化洗浄ステップを2または3回反復する。バッファーで平衡化したビーズを、確実にすべての管に等量のビーズが入るようにしながら、新しい0.5mlの微量遠沈管に入れてアリコートとする。抗体/抽出物混合物を、微量遠心機で4℃で全速で1分間遠心分離する。上清を回収し、タンパク質A-セファロースに加える。4℃で、逆さまにひっくり返るローテータ中で1〜2時間混合する。微量遠心機で短時間遠心分離し(遠心を全速までもっていき、その後戻す)、上清を除去する。サンプルはできるだけ氷中で維持し、400μｌのビーズバッファーを加えることによってビーズを洗浄する。ビーズを再懸濁し、再度遠心分離する。上清を除去する。ビーズをビーズバッファーに再懸濁し、混合物を新しい管に移し、古い管をさらなるビーズバッファーですすいで残っているビーズを新しい管に回収する。ビーズを遠心分離し、上清を除去し、ビーズをビーズバッファーで再度洗浄する。免疫沈降物が、結合している放射標識したタンパク質の解析用のみである場合には、ビーズをタンパク質サンプルバッファーに単に再懸濁し、90秒間煮沸し、電気泳動することもできる。いくつかの種類の酵素活性が関与している場合には、ビーズを反応バッファーで1または2回洗浄しなくてはならない。
酵母系では相互作用が確認できない場合には、相互作用タンパク質に異なるエピトープでNまたはC末端にタグをつけ、一過性トランスフェクションによって適当な哺乳類細胞株で発現させる。細胞を48〜72時間増殖させ、溶解し、エピトープに特異的な抗体を用いて基質タンパク質を免疫沈降させ、酵母系について記載したのと同様にウェスタンブロッティングによって解析する。
蛍光共鳴エネルギーの移動
蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)顕微鏡観察は、生理学的条件下でのタンパク質相互作用、およびタンパク質の局在を研究するのは好都合な方法である。FRETには、その励起/発光スペクトルにいくらかの重複を示す、2種のフルオロフォア(ドナーおよびアクセプター)を用いることが必要である。フルオロフォアの空間的分離が10nmを超えない場合に、ドナーの励起がアクセプターの光発光をもたらし、同時にドナーからの発光が減少する。FRETは、タンパク質相互作用を測定するための非破壊性分光学的方法であるために、生細胞、一次培養細胞または固定化細胞株のいずれかで実施することができる。この蛍光寿命法により、タンパク質相互作用の瞬間のFRETシグナルを、ナノ秒以下のオーダーの分解能でモニターすることが可能となり、高い時間的ならびに空間的分解能が得られる。分子の相互作用を検出する一方法は、注目するタンパク質を含む融合タンパク質として発現される2種のGFP(シアンFPと黄色FP)間またはGFPと第2のフルオロフォア間の蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を含む。CFP-YFPの場合には、ドナー、CFPの励起は440nm、発光は490nmで起こり、アクセプター、YFPについては、励起は450で、発光は535nmである。FRETは440nmでのドナーの励起光の曝露によって起こり、その後、アクセプターの発光を535nmで測定する。これらの内因的に蛍光のタンパク質は極めて安定であるので、注目する融合されたドメインまたはタンパク質による干渉をあまり考えることなく、タンパク質相互作用をモニターするための融合タンパク質構築物に使用できる。FRETは535/485nmでの発光の比として定義され、YFPがCFPによる励起のために発光している光の程度を示す。
その他の実施形態
特定の実施形態が本明細書中で詳細に開示されているが、これは単に例示目的のための例としてなされたものであり、以下に添付の特許請求の範囲について限定しようとするものではない。詳しくは、特許請求の範囲で定義される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明に種々の置換、変更、改変がなされ得ることを発明者らは考慮している。核酸出発物質、注目するクローン、またはライブラリーの種類の選択は、本明細書に記載の実施形態の知識を有する当業者にとっては通常の問題であると考えられる。その他の態様、利点、改変は以下の特許請求の範囲内にあると考えられる。示した特許請求の範囲は、本明細書で開示された発明を代表するものである。別の、特許請求されていない発明も考慮される。出願人らは、後の特許請求の範囲においてかかる発明を追求する権利を留保する。

Claims (45)

  1. 配列番号２ｎからなる群より選択される配列決定された成熟型のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、ｎが１ないし６６の整数であるポリペプチド。
  2. 配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、ｎが１ないし６６の整数であるポリペプチド。
  3. 配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、ｎが１ないし６６の整数であるポリペプチド。
  4. 配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列における１またはそれ以上の保存的置換を含むアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、ｎが１ないし６６の整数である、ポリペプチド。
  5. 天然に存在する、請求項１のポリペプチド。
  6. 請求項１のポリペプチドおよび担体を含む組成物。
  7. １またはそれ以上の容器中に請求項６の組成物を含むキット。
  8. ヒト疾患に付随する症候群を処置するための医薬の製造における治療剤の使用であって、該疾患が請求項１のポリペプチドと連関する病理から選択され、該治療剤が請求項１のポリペプチドを含むものである使用。
  9. 試料中の請求項１のポリペプチドの存在または量を決定する方法であって、
    （ａ）当該試料を提供し、
    （ｂ）当該試料を、該ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体に導入し、次いで
    （ｃ）当該ポリペプチドに結合した抗体の存在または量を決定し、それによって当該試料中のポリペプチドの存在または量を決定する、
    ことを含む方法。
  10. 第一の哺乳動物対象中の請求項１のポリペプチドの発現の変更レベルと連関する疾患の存在または素因を決定する方法であって、
    ａ）第一の哺乳動物対象からの試料中のポリペプチドの発現のレベルを測定し、次いで
    ｂ）工程（ａ）の試料中の当該ポリペプチドの発現を、当該疾患を有しない、または素因がないと知られる第二の哺乳動物対象からの対照試料中に存在するポリペプチドの発現と比較する、
    ことを含み、対照試料と比較したときの第一の対象におけるポリペプチドの発現のレベルの変化が当該疾患の存在または素因を指摘するものである方法。
  11. 請求項１のポリペプチドに結合する剤を同定する方法であって、
    （ａ）当該剤に当該ポリペプチドを導入し、次いで
    （ｂ）当該剤が当該ポリペプチドに結合するか否か決定する
    ことを含む方法。
  12. 該剤が細胞性レセプターまたは下流エフェクターである請求項１１の方法。
  13. 病理の処置における潜在的治療剤を同定する方法であって、該病理が請求項１のポリペプチドの異常発現または異常生理学的相互作用に関連するものであり、
    （ａ）請求項１のポリペプチドを発現する、かつ該ポリペプチドに帰すべき特性または機能を有する細胞を提供し、
    （ｂ）該細胞を、候補物質を含む組成物と接触させ、次いで
    （ｃ）該物質が該ポリペプチドに帰すべき特性または機能を変更するか否か決定することを含み、
    上記工程を行うことにより、細胞が該物質不存在の組成物と接触させられた場合に、該物質の存在下で観察される変化が観察されないならば、該物質が潜在的な治療剤として同定されるものである方法。
  14. 請求項１のポリペプチドに連関する病理の活性または潜在または素因のモジュレーターをスクリーニングする方法であって、下記工程を含むものであり：
    （ａ）試験化合物を、請求項１のポリペプチドと連関する病理の増加リスクにある、試験動物に投与し、ここで当該試験動物は請求項１のポリペプチドを組み換え的に発現するものであり、
    （ｂ）工程（ａ）の化合物の投与後、当該試験動物における当該ポリペプチドの活性を測定し、次いで
    （ｃ）当該試験動物における当該ポリペプチドの活性を、当該ポリペプチドを投与されていない対照動物における当該ポリペプチドの活性と比較し、当該対照動物について当該試験動物における当該ポリペプチドの活性の変化が、試験化合物が請求項１のポリペプチドと連関する病理の活性または潜在または素因のモジュレーターであることを指摘するものである方法。
  15. 当該試験動物が、試験タンパク質トランスジーンを発現するものであるか、あるいは野生型試験動物についての増加レベルにあるプロモーターの制御下の当該トランスジーンを発現するものであり、かつ、当該プロモーターが当該トランスジーンの本来の遺伝子プロモーターではない、請求項１４の方法。
  16. 請求項１のポリペプチドの活性を調節する方法であって、請求項１のポリペプチドを発現する細胞試料を、該ポリペプチドの活性を調節するに十分量の、当該ポリペプチドに結合する化合物と接触させることを含む方法。
  17. 請求項１のポリペプチドと連関する病理を処置または予防する方法であって、そのような処置または予防が望まれる対象に、対象における病理を処置または予防するのに十分量の請求項１のポリペプチドを投与することを含む方法。
  18. 該対象がヒトである請求項１７の方法。
  19. 哺乳動物の病理学的状態を処置する方法であって、病理学的状態を緩和するのに十分である量のポリペプチドを哺乳動物に投与することを含み、該ポリペプチドが配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列またはその生物学的活性フラグメントを有するポリペプチドであり、ここでｎが１ないし６６の整数である方法。
  20. 配列番号２ｎ−１からなる群より選択される核酸配列を含む単離核酸分子であって、ｎが１ないし６６の整数である分子。
  21. 請求項２０の核酸分子であって、天然に存在する分子。
  22. 核酸分子であって、配列番号２ｎ−１からなる群より選択される核酸配列とは単一ヌクレオチドによって異なっており、ｎが１ないし６６の整数である分子。
  23. 配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの成熟型をコードする単離核酸分子であって、ｎが１ないし６６の整数である分子。
  24. 配列番号２ｎ−１からなる群より選択される核酸を含む単離核酸分子であって、ｎが１ないし６６の整数である、分子。
  25. 請求項２０の核酸分子であって、配列番号２ｎ−１からなる群より選択されるヌクレオチド配列または当該ヌクレオチド配列の相補物にストリンジェント条件下でハイブリダイズするものであり、ｎが１ないし６６の整数である分子。
  26. 請求項２０の核酸分子を含むベクター。
  27. 該核酸分子に作動可能に連結されるプロモーターを含む請求項２６の方法。
  28. 請求項２６のベクターを含む細胞。
  29. 請求項１のポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体。
  30. モノクローナル抗体である請求項２９の抗体。
  31. ヒト化抗体である請求項２９の抗体。
  32. 試料中の請求項２０の核酸分子の存在または量を決定する方法であって、
    （ａ）該試料を提供し
    （ｂ）該試料を、当該核酸分子に結合するプローブに導入し、次いで
    （ｃ）該核酸分子に結合する当該プローブの存在または量を決定する
    ことを含み、当該試料中の核酸の存在または量が決定される方法。
  33. 核酸分子の存在または量が細胞または組織型についてのマーカーとして使用される請求項３２の方法。
  34. 該細胞または組織型が癌性である請求項３３の方法。
  35. 第一の哺乳動物対象における請求項２０の核酸分子の発現の変更レベルと連関する疾患の存在または素因を決定する方法であって、
    ａ）該第一の哺乳動物対象からの試料中の核酸の発現のレベルを測定し、次いで
    ｂ）工程（ａ）の試料中の当該核酸の発現のレベルを、該疾患を有しないまたは素因がないと知られる第二の哺乳動物対象からの対照試料に存在する核酸の発現のレベルと比較する
    ことを含み、ここで該対照試料と比較した場合の第一の対象における核酸の発現のレベルの変化が該疾患の存在または素因を指摘するものである方法。
  36. 請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、該ポリペプチドの発現につながる条件下で細胞を培養することを含み、ここで当該細胞が配列番号２ｎ−１からなる群より選択される核酸配列を含む単離核酸分子を含むベクターを含むものであり、ｎが１ないし６６の整数である方法。
  37. 該細胞が細菌細胞である請求項３６の方法。
  38. 該細胞が昆虫細胞である請求項３６の方法。
  39. 該細胞が酵母細胞である請求項３６の方法。
  40. 該細胞が哺乳動物細胞である請求項３６の方法。
  41. 請求項２のポリペプチドの生産方法であって、ポリペプチドの発現につながる条件下で細胞を培養することを含み、当該細胞が配列番号２ｎ−１からなる群より選択される核酸配列を含む単離核酸分子を含むベクターを含むものであり、ｎが１ないし６６の整数である方法。
  42. 該細胞が細菌細胞である請求項４１の方法。
  43. 該細胞が昆虫細胞である請求項４１の方法。
  44. 該細胞が酵母細胞である請求項４１の方法。
  45. 該細胞が哺乳動物細胞である請求項４１の方法。

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