CN113604551A - 用于与眼科状况有关的等位基因的多重检测的方法 - Google Patents

用于与眼科状况有关的等位基因的多重检测的方法 Download PDF

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Abstract

公开了用于检测来自人受试者的样品中与角膜营养不良有关的至少两种基因组等位基因的系统和方法，其中所述受试者的细胞(例如上皮)附着于基片的尖端。将基片的尖端在裂解溶液中搅动，所述裂解溶液裂解附着于基片的细胞。当该搅动完成时从裂解溶液移出基片。温育所得裂解溶液，然后从裂解溶液分离基因组DNA以形成gDNA溶液。从这之中，使用至少两个寡核苷酸引物对和gDNA溶液鉴定出人TGFpI基因中存在的至少两个核苷酸的身份。这至少两个核苷酸位于TGFpI基因的分别的独立位置，其对应于与角膜营养不良有关的分别的独立的单核苷酸多态性(SNP)。

Description

用于与眼科状况有关的等位基因的多重检测的方法
本申请是申请日为2014年11月17日，申请号201480072417.7，发明名称为“用于与眼科状况有关的等位基因的多重检测的方法”的中国发明专利申请的分案申请。
发明领域
本申请一般涉及用于分离和检测疾病有关的遗传等位基因的方法。具体地，本申请涉及用于检测Avellino角膜营养不良有关的等位基因的改进的方法。
发明背景
实时PCR可用于检测具有基本相同序列的核酸序列之间的差异。通过使用差异标记的荧光核酸探针(例如一种结合野生型序列而一种结合突变体序列)，能快速并可靠地检测人基因组中的单核苷酸变化。这种解析能力已被应用于医学诊断，其中单核苷酸多态性(SNP)，即在蛋白质的编码和/或非编码序列中发现的单碱基变化，与人疾病相关。
然而，实时PCR分析高度依赖于高质量样品的收集和分离。不良样品收集和/或分离需要使用更长的测定条件和更大量的实时PCR试剂，两者都导致增加的成本和降低的生产力。此外，实时PCR单核苷酸多态性检测测定的失败可引起对收集额外的样品的需要，从而导致甚至更大的时间和资源损失。
因此，高度期望产生改进的样品收集和分离的方法，其改进测定的总体成功率，减少测定所需的试剂，且减少在后期收集额外样品的需要。此外，用于以较低样品材料量实施实时PCR SNP检测测定的方法还将降低与高质量样品的收集和分离有关的挑战。
角膜营养不良可以是常染色体显性的遗传疾病，其开始在患者的角膜中间具有模糊的视力。此模糊视力逐渐蔓延至角膜周边，且视力随着患者年龄增加而恶化。有几种类型的已表征过的角膜营养不良，包括阿维利诺(Avellino)角膜营养不良、颗粒状(Granular)角膜营养不良、格子状I型(lattice type I)角膜营养不良、Thiel-Behnke、和Reis-bucklers角膜营养不良。已知角膜营养不良至少在一些情况中是由编码βIG-H3蛋白(也称为TGFβI蛋白，TGFBI蛋白和角膜上皮蛋白)的转化生长因子beta诱导(TGFβI)基因中的突变引起的。
患有阿维利诺角膜营养不良的杂合患者随着年龄具有增加的视力丧失，在生命的晚年变得严重。比较而言，纯合患者到6岁龄呈现出严重到完全的视力丧失。阿维利诺角膜营养不良首先在约1988年被认可为一种独特的角膜营养不良类型。在那时之前，其可能被错误分类为颗粒状角膜营养不良。现今，已知阿维利诺角膜营养不良是世界范围内最常见的间质角膜营养不良形式。在韩国，据信阿维利诺角膜营养不良具有870个人中约1的流行率(参见Lee,J.H.等,Ophthalmic Epidemiol.,17:160,2010；亦参见Holland,E.J.等,Ophthalmology,99:1564,1992；Kennedy,S.M.等,Br.J.Ophthalmol.,80:489,1996；Dolmetsch,A.M.等,Can.J.Ophthalmol.,31:29,1996；Afshari,N.A.等,Arch.Ophthalmol.,119:16,2001；Stewart,H.S.Hum.Mutat.,14:126,1999)。
之前发现杂合个体(例如，具有一个野生型βIG-H3等位基因和一个突变体βIG-H3等位基因)在LASIK手术后高度易于视力丧失加剧。特别地，手术后两年时，在具有增加的攻击性的这些患者中观察到增加的角膜不透明性，最终导致视力的完全丧失(Jun,R.M.等,Opthalmology,111:463,2004)。之前，进行眼手术，预期通过LASIK或Excimer激光手术将使患有角膜营养不良的患者摆脱视力模糊。假定有30万例LASIK手术，则300个人会失去其视力，基于患有阿维利诺角膜营养不良的杂合患者为1/1000的最小估测。经历LASIK手术的患者主要在其进行生产活动的20多岁及30多岁中；因此，他们的视力丧失导致严重的社会和经济问题。
另外，美国2000年批准LASIK手术后，已发现经历LASIK手术的患有阿维利诺角膜营养不良的非洲裔美国患者丧失视力，其推断许多相似的病例可发生在世界各地。
因此，尽管为了预防由LASIK手术所致的阿维利诺角膜营养不良的进展需要对阿维利诺角膜营养不良的准确诊断，但仅通过对角膜不透明度的显微观察(例如裂隙灯(slitlamp)检查)进行对阿维利诺角膜营养不良的诊断，因而医生经常遗漏患者的潜在症状，从而进行LASIK手术，这导致视力丧失。因此，期望快速并准确地对角膜营养不良进行遗传诊断。
已开发了用于检测βIG-H3基因突变的DNA芯片，该突变造成阿维利诺角膜营养不良(韩国专利早期公开号10-2007-0076532)。然而，使用DNA芯片诊断阿维利诺角膜营养不良不利地需要几个步骤，包括扩增样品中DNA的步骤，使扩增的DNA与DNA芯片杂交的步骤，洗涤杂交的DNA芯片的步骤，和检测阳性应答的步骤。
鉴于上述背景，本领域中需要用于检测与角膜营养不良有关的多重突变等位基因的改进的方法。
发明概述
本公开提供用于检测与人疾病有关的一种或多种等位基因的改进方法。下文描述的方法降低实施得到关于受试者的医学信息的测定法相关的时间和成本。例如，在一些实施方案中，所述改进的方法允许以对患者的降低的成本，同日检测与阿维利诺角膜营养不良有关的基因组标志物。
在一些实施方案中，本公开提供用于检测来自受试者的样品中与角膜营养不良有关的至少两种基因组等位基因的方法，所述方法包括：(A)提供受试者的上皮细胞，其附着于基片的尖端；(B)在裂解溶液中搅动该基片的该尖端，所述裂解溶液裂解附着于该基片的细胞；(C)在完成(B)搅动时，从裂解溶液移出该基片；(D)在(C)移出后温育该裂解溶液；(E)从裂解溶液分离基因组DNA以形成gDNA溶液；和(F)使用至少两种寡核苷酸引物对和该gDNA溶液确定TGFβI基因中存在的至少两个核苷酸的身份，其中所述至少两个核苷酸位于TGFβI基因的分别的独立的位置处，所述位置对应于与角膜营养不良有关的分别的独立的单核苷酸多态性(SNP)。
在一些实施方案中，所述TGFβI基因中存在的至少两个核苷酸在人基因组中相隔至少一个核苷酸。
在一些实施方案中，所述至少两种寡核苷酸引物对的至少一对包含正向PCR引物，其具有包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列，和反向PCR引物，其具有包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述至少两种寡核苷酸引物对的至少一对包含正向PCR引物，其具有包含SEQ ID NO:43的核苷酸序列，和反向PCR引物，其具有包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述至少两种寡核苷酸引物对包含第一扩增引物对和第二扩增引物对。所述第一扩增引物对包含正向PCR引物，其具有包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列，和反向PCR引物，其具有包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。所述第二扩增引物对包含正向PCR引物，其具有包含SEQ ID NO:43的核苷酸序列，和反向PCR引物，其具有包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列。
在一些实施方案中，(F)确定进一步包括使用：(i)具有包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列的第一野生型检测探针，和具有包含SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:48,或SEQ ID NO:49的核苷酸序列的第一突变体检测探针；和(ii)具有包含SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47的核苷酸序列的第二野生型检测探针，和具有包含SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:50的核苷酸序列的第二突变体检测探针。
在一些实施方案中，本公开提供一种用于检测角膜营养不良的方法，该方法包括：(A)使用包含至少第一扩增引物对和至少第二扩增引物对的反应混合物从来自人受试者的生物样品扩增至少两种TGFβI基因序列，包括第一TGFβI基因序列和第二TGFβI基因序列，所述第一TGFβI基因序列包含编码氨基酸残基124的核苷酸，所述第二TGFβI基因序列包含编码氨基酸残基555的核苷酸；(B)将第一检测寡核苷酸探针对的第一检测探针杂交于第一TGFβI基因序列；(C)将第二检测寡核苷酸探针对的第二检测探针杂交于第二TGFβI基因序列；和(D)基于至少两种检测探针对的使用检测第一TGFβI基因序列和/或第二TGFβI基因序列中的一个或多个突变，所述至少两种检测探针对包括第一检测寡核苷酸探针对和第二检测寡核苷酸探针对。
在一些实施方案中，检测第一TGFβI基因序列和/或第二TGFβI基因序列中的一个或多个突变包括检测第一TGFβI基因序列和/或第二TGFβI基因序列中的两个或更多个突变，且所述两个或更多个突变在人基因组中相隔至少一个核苷酸。
在一些实施方案中，所述至少第一扩增引物对包含第一扩增引物和第二扩增引物，其中所述第一扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:1且其中所述第二扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:2。
在一些实施方案中，所述至少第二扩增引物对包含第三扩增引物和第四扩增引物，其中所述第三扩增引物由核苷酸序列SEQ ID NO:43所示且其中所述第四扩增引物由核苷酸序列SEQ ID NO:44所示。
在一些实施方案中，所述第一扩增引物对包含第一扩增引物和第二扩增引物，所述第一扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:1，所述第二扩增引物包含核苷酸序列SEQ IDNO:2，所述第二扩增引物对包含第三扩增引物和第四扩增引物，所述第三扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:43，和所述第四扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:44。
在一些实施方案中，所述一个或多个突变之一对应于在编码的TGFBI蛋白中，在氨基酸124处，精氨酸突变为半胱氨酸(R124C)，精氨酸突变为组氨酸(R124H)，和/或精氨酸突变为亮氨酸(R124L)。
在一些实施方案中，所述一个或多个突变之一对应于在编码的TGFBI蛋白中，在氨基酸555处，精氨酸突变为色氨酸(R555W)和/或精氨酸突变为谷氨酰胺(R555Q)。
在一些实施方案中，所述至少两种检测寡核苷酸探针对的每种各自包括第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针包含各自选自下组的核苷酸序列对：SEQ ID NOs:25-26,SEQ ID NOs:25和48,SEQID NOs:25和49,SEQ ID NOs:27-28,SEQ ID NOs:29-30,SEQ ID NOs:31-32,SEQ ID NOs:33-34,SEQ ID NOs:35-36,SEQ ID NOs:37-38,SEQ ID NOs:39-40,SEQ ID NOs:41-42,SEQID NOs:45-46和SEQ ID NOs:46-47,SEQ ID NOs:45和50,和SEQ ID NOs:47和50。
在一些实施方案中，所述第一检测寡核苷酸探针对包含第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26。
在一些实施方案中，所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46。
在一些实施方案中，所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:46。
在一些实施方案中，所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:48。
在一些实施方案中，所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:49。
在一些实施方案中，所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:50。
在一些实施方案中，所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:50。
在一些实施方案中，所述第一检测探针与第一标记物偶联且所述第二检测探针偶联于第二标记物。
在一些实施方案中，所述第一标记物是VIC且所述第二标记物是FAM。
在一些实施方案中，(B)杂交和(C)杂交在相同溶液中同时实施。
在一些实施方案中，所述(B)杂交和(C)杂交在相同溶液或不同溶液中同时或在不同时间实施。
在一些实施方案中，本公开提供用于检测人受试者中的角膜营养不良的反应混合物，所述反应混合物包含：(A)至少第一扩增引物对和第二扩增引物对，其用于扩增和确定(1)来自该受试者的生物样品的至少两种TGFβI基因序列的第一TGFβI基因序列，其包含编码氨基酸残基124的核苷酸，和(2)来自该受试者的生物样品的至少两种TGFβI基因序列的第二TGFβI基因序列，其包含编码氨基酸残基555的核苷酸；和(B)至少两种检测探针对，其中所述至少两种检测探针对的每种中的检测探针与至少两种TGFβI基因序列的至少一种杂交。
在一些实施方案中，所述第一扩增引物对包含第一扩增引物和第二扩增引物，所述第一扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:1，且所述第二扩增引物包含核苷酸序列SEQID NO:2。
在一些实施方案中，所述第二扩增引物对包含第三扩增引物和第四扩增引物，所述第三扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:43，且所述第四扩增引物包含核苷酸序列SEQID NO:44。
在一些实施方案中，所述至少两种检测探针对的至少一种用于检测对应于编码的TGFBI蛋白中的以下突变：在氨基酸124处，精氨酸突变为半胱氨酸(R124C)，精氨酸突变为组氨酸(R124H)，和/或精氨酸突变为亮氨酸(R124L)。
在一些实施方案中，所述至少两种检测探针对的至少一种用于检测对应于编码的TGFBI蛋白中的以下突变：在氨基酸555处，精氨酸突变为色氨酸(R555W)和/或精氨酸突变为谷氨酰胺(R555Q)。
在一些实施方案中，所述至少两种检测探针对的分别的检测探针对各自包括第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针包含各自选自下组的核苷酸序列对：SEQ ID NOs:25-26,SEQ ID NOs:25和48,SEQ ID NOs:25和49,SEQ ID NOs:27-28,SEQ ID NOs:29-30,SEQ ID NOs:31-32,SEQID NOs:33-34,SEQ ID NOs:35-36,SEQ ID NOs:37-38,SEQ ID NOs:39-40,SEQ ID NOs:41-42,SEQ ID NOs:45-46和SEQ ID NOs:46-47,SEQ ID NOs:45和50,和SEQ ID NOs:47和50。
在一些实施方案中，所述至少两种检测探针对之一包含第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26。
在一些实施方案中，所述至少两种检测探针对之一包含第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46。
在一些实施方案中，所述至少两种检测探针对之一包含第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:46。
在一些实施方案中，所述至少两种检测探针对之一包含第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:48。
在一些实施方案中，所述至少两种检测探针对之一包含第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:49。
在一些实施方案中，所述至少两种检测探针对之一包含第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:50。
在一些实施方案中，所述至少两种检测探针对之一包含第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:50。
在一些实施方案中，所述至少两种检测探针的第一检测探针与第一标记物偶联且所述至少两种检测探针的第二检测探针偶联于第二标记物。
在一些实施方案中，所述第一标记物是VIC且所述第二标记物是FAM。
在一些实施方案中，本公开提供用于检测人受试者中的角膜营养不良的反应混合物，所述反应混合物包含：(A)至少第一扩增引物对，其用于扩增和确定来自该受试者的生物样品的TGFβI基因序列；和(B)至少三种检测探针的组，其中所述至少三种检测探针的组的一种检测探针在暴露于TGFβI基因序列时与TGFβI基因序列杂交。
在一些实施方案中，所述TGFβI基因序列包含来自该受试者的生物样品的编码氨基酸残基124的核苷酸。
在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的组包括选自下组的至少一种检测探针：SEQ ID NOs:25-42和48-49。
在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的组包括选自下组的至少两种或更多种检测探针：SEQ ID NOs:25-42和48-49。
在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的组包括选自下组的至少三种或更多种检测探针：SEQ ID NOs:25-42和48-49。
在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的组包括第一检测探针SEQ ID NO:25和第二检测探针SEQ ID NO:26。
在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的组包括选自下组的第三检测探针：SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49。
在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的组包括不同于第三检测探针且选自下组的第四检测探针：SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49。
在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的组包括选自下组的两种或更多种检测探针：SEQ ID NOs:26和48-49。
在一些实施方案中，所述第一扩增引物对包含第一扩增引物和第二扩增引物，所述第一扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:1，且所述第二扩增引物包含核苷酸序列SEQID NO:2。
在一些实施方案中，反应混合物还包含：(C)至少第二扩增引物对，其用于扩增和确定来自所述生物样品的第二TGFβI基因序列；和(D)至少三种检测探针的第二组，其中所述至少三种检测探针的第二组的一种检测探针在暴露于第二TGFβI基因序列时与第二TGFβI基因序列杂交。
在一些实施方案中，所述第二TGFβI基因序列包含来自该受试者的生物样品的编码氨基酸残基555的核苷酸。
在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的第二组包括选自下组的至少一种检测探针：SEQ ID NOs:45-47和50。
在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的第二组包括选自下组的至少两种或更多种检测探针：SEQ ID NOs:45-47和50。
在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的第二组包括选自下组的至少三种或更多种检测探针：SEQ ID NOs:45-47和50。
在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的第二组包括：第一检测探针，其为SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47，第二检测探针，其为SEQ ID NO:46，和第三检测探针，其为SEQ ID NO:50。
在一些实施方案中，所述第二扩增引物对包含第三扩增引物和第四扩增引物，第三扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:43，和第四扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:44。
在一些实施方案中，所述TGFβI基因序列包含来自该受试者的生物样品的编码氨基酸残基555的核苷酸。
在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的组包括选自下组的至少一种检测探针：SEQ ID NOs:45-47和50。
在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的组包括选自下组的至少两种或更多种检测探针：SEQ ID NOs:45-47和50。
在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的组包括选自下组的至少三种或更多种检测探针：SEQ ID NOs:45-47和50。
在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的组包括：第一检测探针，其为SEQ IDNO:45或SEQ ID NO:47，第二检测探针，其为SEQ ID NO:46，和第三检测探针，其为SEQ IDNO:50。
在一些实施方案中，本公开提供用于检测角膜营养不良的方法，包括：(A-1)使用包含至少第一扩增引物对和至少三种检测探针的组的反应混合物，从来自人受试者的生物样品扩增第一TGFβI基因序列；(B-1)将所述至少三种检测探针的组的第一检测探针与第一TGFβI基因序列杂交；并(C-1)基于以下检测第一TGFβI基因序列中的突变：(i)所述至少三种检测探针的组的第一检测探针杂交于第一TGFβI基因序列，和(ii)所述至少三种检测探针的组的第二和第三检测探针与第一TGFβI基因序列杂交的失败。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括：(A-2)使用相同反应混合物从所述生物样品扩增第二TGFβI基因序列，其中所述反应混合物包含至少第二扩增引物对和至少三种检测探针的第二组；(B-2)将所述至少三种检测探针的第二组的第一检测探针与第二TGFβI基因序列杂交；并(C-2)基于以下检测第二TGFβI基因序列中的突变：(i)所述至少三种检测探针的第二组的第一检测探针杂交于第二TGFβI基因序列，和(ii)所述至少三种检测探针的第二组的第二和第三检测探针与第二TGFβI基因序列杂交的失败。
在一些实施方案中，扩增(A-1)，扩增(A-2)，杂交(B-1)，杂交(B-2)，检测(C-1)，和检测(C-2)用生物样品的同一等分试样实施。
在一些实施方案中，扩增第一TGFβI基因序列(A-1)和扩增第二TGFβI基因序列(A-2)同时实施。
在一些实施方案中，杂交(B-1)和杂交(B-2)同时实施。
在一些实施方案中，检测(C-1)和检测(C-2)同时实施。
在一些实施方案中，所述反应混合物具有上文描述的一些特征。为了简洁，本文中不重复这类细节。
在一些实施方案中，本公开提供如上文任意处记载的反应混合物用于预测受试者中在激光眼科手术后的并发症的风险的用途，所述预测经由检测人受试者中的杂合角膜营养不良进行。
在一些实施方案中，所述激光眼科手术包括Lasik和Excimer激光手术之一。
在一些实施方案中，本公开提供用于检测来自人受试者的样品中与角膜营养不良有关的基因组突变的方法，该方法包括：(A)提供人受试者的上皮细胞，其附着于基片的尖端；(B)在裂解溶液中搅动该基片的该尖端，所述裂解溶液裂解附着于该基片的细胞；(C)在完成(B)搅动时，从裂解溶液移出该基片；(D)在(C)移出后温育该裂解溶液；(E)从裂解溶液分离基因组DNA以形成gDNA溶液；和(F)使用至少第一引物对、至少三种检测探针的组和该gDNA溶液，通过将该gDNA溶液同时暴露于所述至少三种检测探针，确定TGFβI基因中存在的至少一个核苷酸的身份，其中：所述至少一个核苷酸位于TGFβI基因的特定的位置处，所述位置对应于与角膜营养不良有关的单核苷酸多态性(SNP)，且所述至少三种检测探针的组的至少两种检测探针的每种配置为检测TGFβI基因的特定位置处的不同突变。
在一些实施方案中，该方法进一步包括：(G)使用至少第二引物对、至少三种检测探针的第二组和该gDNA溶液，通过将该gDNA溶液同时暴露于所述至少三种检测探针的组和所述至少三种检测探针的第二组，确定TGFβI基因中存在的至少第二核苷酸的身份，其中：所述至少第二核苷酸位于TGFβI基因的独立于所述至少一个核苷酸的位置的第二特定位置处，所述第二特定位置对应于与角膜营养不良有关的第二单核苷酸多态性(SNP)，且所述至少三种检测探针的第二组的至少两种检测探针配置为检测TGFβI基因的第二特定位置处的分别的突变。
在一些实施方案中，所述确定(F)和确定(G)同时实施。
在一些实施方案中，所述确定(F)和确定(G)使用同一gDNA溶液实施。
附图简述
图1A-1B例示根据一些实施方案，用于检测与疾病有关的基因组等位基因的改进的方法100。
图2提供了根据一些实施方案，可用于与阿维利诺角膜营养不良有关的单核苷酸多态性的实时PCR检测的正向和反向PCR引物对的序列列表(SEQ ID NOs:1-24)。
图3提供了根据一些实施方案，可用于与阿维利诺角膜营养不良有关的单核苷酸多态性的实时PCR检测的野生型和突变体检测探针对的序列列表(SEQ ID NOs:25-42)。
图4提供了用于图5A至图8中显示的等位基因检测实验中使用的探针序列和引物的列表。
图5A-图5C提供了使用图4中描述的探针，对于R124C,R124H,R124L,R555W和R555Q突变体的检测的实验数据。图5A提供了使用指定的试剂混合物和指定的循环条件(右手小图)的等位区分图运行(左手小图)。图5B提供了相比于正常对照的多种突变体的实时PCR图。图5C提供了相比于纯合对照的多种突变体的实时PCR图。
图6A-图6C提供关于使用图4中描述的探针检测R124C,R124H,R124L,R555W和R555Q突变体的实验数据。图6A提供等位区分图运行(左手小图)，其使用指定的试剂混合物和指定的循环条件(右手小图)。图6B提供相比于正常对照的多种突变体的实时PCR图。图6C提供了相比于纯合对照的多种突变体的实时PCR图。
图7提供关于使用图4中描述的探针检测R124C,R124H,R124L,R555W和R555Q突变体的实验数据。图7提供等位区分图(左手小图)运行，其使用指定的试剂混合物和指定的循环条件(右手小图)。
图8提供关于使用图4中描述的探针检测R124C,R124H,R124L,R555W和R555Q突变体的实验数据。具体地，图8提供等位区分图运行，其使用指定的试剂混合物和指定的循环条件(右手小图)。等位区分图运行(左手小图)中的名称“B”指示样品在实施实时PCR测定之前用裂解缓冲液预处理。等位区分图(左手小图)中的名称“DW-A”指示样品在实施实时PCR测定之前用蒸馏水预处理。围绕不同样片点的圈显示对于检测的每种等位基因的两种匹配的样品，分别为“B”和“DW-A”(见左手小图)；在每个圈内有两个点，一个是样品“B”，一个是样品“DW-A”。
发明详述
I.引言
对疾病相关的SNP的检测是对多种医学状况的诊断和预后的一项越来越重要的工具。例如，在TGFβI基因的外显子4中单核苷酸变化的存在与阿维利诺角膜营养不良强烈相关。发现该SNP杂合的个体在LASIK手术后有视力丧失的高风险。尽管LASIK是一种极大改进许多人的生活质量的医疗规程，但对于携带G/A TGFβI SNP的个体，其通常导致在4至18个月时段内的逐渐视力受损，这可能导致视力丧失。视力受损可能在或长或短的时段内发生。幸运的是，可以实施筛选来鉴定出携带该突变的个体，所述个体应避免有LASIK规程。
本公开至少部分基于改进样品分离、制备和分析的方法的发现。在一些实施方案中，提供允许患者样品再使用的方法，例如当测定失败或需要实施另外的随访测试时。在一些实施方案中，这些改进的方法包括在室温将携带从患者的口腔黏膜脱落的细胞的基片(例如以人造丝为尖端或以棉为尖端的涂药器)温和地涡旋于裂解溶液中达30-45秒(而不是在升高温度的20分钟的延长温育)。然后，将该裂解溶液在45℃温育30分钟来改进裂解并增加基因组样品的产率。有利地，可随后贮存(例如冻存或冷藏)以人造丝为尖端或以棉为尖端的涂药器用于重分离基因组DNA以用于再测试。
在一些实施方案中，本文中提供的改进是经由使用更少量的用于实时PCR检测测定法的基因组DNA样品来提供的。在一些实施方案中，这通过增加实施的实时PCR循环数(例如约40个循环)和/或通过使用在95℃的3秒变性循环时间实现。有利地，由于需要的样品量被这些方法降低，因此对实时PCR试剂的要求也降低。由于用于诊断测定的许多试剂是专卖的，试剂可能较昂贵。降低使用的试剂量也可以显著降低与试剂有关的成本。
涵盖可以使用用于进行这些各个步骤的每一个的特定条件(例如样品处理、温育温度、反应体积、反应循环数、反应循环时间、反应循环温度)的所有组合来实施本文中描述的方法以检测疾病相关的SNP，如见于TGFβI基因的外显子4的阿维利诺角膜营养不良相关的SNP。
II.选择定义
术语“发明”或“本发明”如本文使用的不意图限制为本发明的任一个具体的实施方案，而是一般应用于本发明的任意和所有实施方案，如权利要求和说明书中描述的。
如本文使用的，除非上下文另外清楚地指示，单数形式“一个/一种”和“该”包括复数指代物。如此，例如对“该方法”的提述包括一种或多种方法，和/或本文描述的类型的步骤，其在阅读本公开时对于本领域技术人员将变得明显的。
如本文使用的，术语“多态性”及其变体指不同基因组或个体之间或之中两种或更多种备选基因组序列或等位基因的存在。术语“遗传突变”或“遗传变异”及其变体包括多态性。
如本文使用的，术语“单核苷酸多态性”(“SNP”)及其变体指在等位基因间变化的一个核苷酸的位点。单核苷酸多态性(SNP)是单个碱基变化或点突变，但也包括所谓的“indel”突变(核苷酸的插入或缺失)，导致个体之间的遗传变化。占据所有人遗传变异的约90％的SNP沿着30亿碱基的人基因组每100至300个碱基发生一次。然而，SNP在其他生物体如病毒中频繁地多地发生。SNP可发生在基因组的编码或非编码区。编码区中的SNP可以改变或可以不改变蛋白质产物的氨基酸序列。非编码区中的SNP可以改变启动子或加工位点，且可以影响基因转录和/或加工。对个体在感兴趣的基因组区域中是否具有特定SNP的了解可以提供开发用于多种疾病的诊断、预防和治疗应用的充足信息。在一些实施方案中，本公开涉及检测位于TGFβI基因的外显子4中的与阿维利诺角膜营养不良有关的鸟嘌呤至腺嘌呤SNP。
术语“引物”及其变体指在PCR反应中充当DNA合成启动点的寡核苷酸。引物通常长为约15至约35个核苷酸并与同靶序列互补的区域杂交。
术语“探针”及其变体(例如检测探针)指在PCR反应中与靶核酸杂交的寡核苷酸。靶序列指要分析的且包含感兴趣的多态性位点的核酸区域。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本方面所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文中描述的那些类似或等同的任意方法和材料，但本文中具体地描述了方法和材料的多个实施方案。
III.样品制备
在一些实施方案中，本公开提供用于分离在实时PCR单核苷酸多态性检测测定法中使用的基因组样品的改进的方法。在一些实施方案中，所述改进的方法100使用图1中概述的步骤的组合。
在一些实施方案中，方法包括提供来自受试者的细胞样品。在一些实施方案中，通过使患者的细胞表面与基片接触来收集细胞，所述基片能可逆地将细胞固定化在基片上。
所公开的方法适用于从多种样品获得的多种细胞类型。在一些实施方案中，用于所公开方法的细胞类型包括但不限于，上皮细胞、内皮细胞、结缔组织细胞、骨骼肌细胞、内分泌细胞、心脏细胞、泌尿器细胞、黑色素细胞、角质形成细胞、血细胞、白细胞、血沉棕黄层(buffy coat)、毛细胞(包括例如根毛细胞)和/或唾液细胞。在一些实施方案中，所述细胞是上皮细胞。在一些实施方案中，所述细胞是囊下-血管周(上皮类型1)；白色(pale)(上皮类型2)；中间(上皮类型3)；黑色(上皮类型4)；未分化(上皮类型5)；和大髓质(上皮类型6)。在一些实施方案中，所述细胞是口腔上皮细胞(例如使用口腔拭子(swap)收集的上皮细胞)。在一些实施方案中，所公开的方法中使用的细胞样品包括上文确定的细胞类型的任意组合。
在一些实施方案中，所述方法包括提供(102)来自受试者的细胞样品。在一些实施方案中，提供的细胞是口腔上皮细胞。
细胞样品通过允许受试者细胞可逆结合于基片的多种方法的任一种来收集。在一些实施方案中，使基片与含有受试者细胞的样品呈物理相互作用地采用，以将细胞可逆结合于基片。在一些实施方案中，使基片与受试者身体呈物理相互作用地直接采用，以将细胞可逆结合于基片。在一些实施方案中，样品是口腔细胞样品且通过将受试者的口腔黏膜(例如其面颊内)与基片接触来收集口腔细胞的样品，所述基片能可逆地固定化从黏膜取出的细胞。在这类实施方案中，以等同于刷牙的力度(例如轻量的力或压力)对受试者的颊内擦拭拭子。涵盖将允许受试者的细胞可逆结合于基片的任意方法用于所公开的方法。
在一些实施方案中，有利地，以非侵入性方式收集样品，如此在任何地方且由几乎任何人完成此类样品收集。例如，在一些实施方案中，在内科医师办公室、在受试者家里或在进行或要进行LASIK手术的设施处收集样品。在一些实施方案中，患者、患者的医生、护士或内科医师的助手或其他临床人员收集样品。
在一些实施方案中，基片由细胞可逆结合的多种材料的任一种制备。例示性基片包括由人造丝、棉、二氧化硅、弹性体、虫漆、琥珀、天然或合成橡胶、纤维素、BAKELITE、NYLON、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯腈、或其他材料或其组合制备的那些。在一些实施方案中，基片是具有人造丝尖端或棉尖端的拭子。
然后，将基片的尖端(例如人造丝拭子或棉拭子的尖端)在裂解溶液中搅动约10秒至60秒(1分钟),或约20秒至60秒,约20秒至约45秒,或约20秒至约30秒,约15秒至约60秒,约15秒至约45秒,或约15秒至约30秒,约10秒至约60秒,约10秒至约45秒,或约10秒至约30秒,约10秒至约15秒或约10秒至约20秒。在一些实施方案中，搅动进行约60秒或约1分钟。在一些实施方案中，搅动进行不到1分钟(例如不到60秒)。在一些实施方案中，搅动进行不超过15秒,20秒,30秒,45秒,60秒,90秒,120秒或更多。在一些实施方案中，搅动进行不超过45秒。在一些实施方案中，搅动进行不超过30秒。在一些实施方案中，搅动进行不超过20秒。在一些实施方案中，搅动进行不超过15秒。
在一些实施方案中，搅动包括基片在裂解溶液中的任何移动。在一些实施方案中，将基片的尖端(例如人造丝拭子或棉拭子的尖端)在裂解溶液中温和移动，从而使得多个口腔细胞保持附着于基片以在后面的时间和/或随后时间进行分析。在裂解溶液中的这类移动包括涡旋运动、侧向运动、上下运动和/或浸渍运动，或基片在裂解溶液中的任何其他运动，其导致多个口腔细胞保持附着于尖端同时允许一些口腔细胞分散到裂解溶液中。
在一些实施方案中，在室温进行搅动步骤，例如在约15℃和约30℃,约18℃和约28℃,约18℃和约25℃或约20℃和约25℃之间的温度。
在搅动后，移出基片(例如具有人造丝尖端或棉尖端的拭子)，并在一些实施方案中贮存用于后期使用，如果需要重新测试或进一步(例如不同或额外的)测试的话。在一些实施方案中，将基片(例如具有人造丝尖端或棉尖端的口腔拭子)置于容器中并冷冻贮存。在一些实施方案中，将基片(例如具有人造丝尖端或棉尖端的口腔拭子)冷藏。在一些实施方案中，将基片在多种温度的任一个贮存多种时段的任一个，同时仍保持对再一次或多次提取可用。
在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存0周,1周,2周,3周,4周,5周,6周,7周,8周,9周,10周,11周或12周或更长。在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存和/或能贮存0周至12周,1周至12周,2周至12周,3周至12周,4周至12周,5周至12周,6周至12周,7周至12周,8周至12周,9周,10周至12周,或11周至12周。在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存1,2,3,4,5,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,30,或36个月或更长。在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存1个月至36个月,2个月至36个月,3个月至36个月,4个月至36个月,5个月至36个月,6个月至36个月,7个月至36个月,8个月至36个月,9个月至36个月,10个月至36个月,12个月至36个月,14个月至36个月,16个月至36个月,18个月至36个月。在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存1个月至30个月,2个月至30个月,3个月至30个月,4个月至30个月,5个月至30个月,6个月至30个月,7个月至30个月,8个月至30个月,9个月至30个月,10个月至30个月,12个月至30个月,14个月至30个月,16个月至30个月或18个月至30个月。在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存1个月至24个月,2个月至24个月,3个月至24个月,4个月至24个月,5个月至24个月,6个月至24个月,7个月至24个月,8个月至24个月,9个月至24个月,10个月至24个月,12个月至24个月,14个月至24个月,16个月至24个月,18个月至24个月。在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存1个月至22个月,2个月至22个月,3个月至22个月,4个月至22个月,5个月至22个月,6个月至22个月,7个月至22个月,8个月至22个月,9个月至22个月,10个月至22个月,12个月至22个月,14个月至22个月,16个月至22个月,18个月至22个月。在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存1个月至20个月,2个月至20个月,3个月至20个月,4个月至20个月,5个月至20个月,6个月至20个月,7个月至20个月,8至20个月,9至20个月,10个月至20个月,12个月至20个月,14个月至20个月,16个月至20个月,18个月至20个月。在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存1个月至18个月,2个月至18个月,3个月至18个月,4个月至18个月,5个月至18个月,6个月至18个月,7个月至18个月,8个月至18个月,9个月至18个月,10个月至18个月,12个月至18个月,14个月至18个月,16个月至18个月或17个月至18个月。在一些实施方案中，将含有样品的基片保藏1个月至12个月,2个月至12个月,3个月至12个月,4个月至12个月,5个月至12个月,6个月至12个月,7个月至12个月,8个月至12个月,9个月至12个月,10个月至12个月或11个月至12个月。
在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存在约2℃,约3℃,约4℃,约5℃,约6℃,约7℃,或约8℃。在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存在约2℃至约8℃,约3℃至约8℃,约4℃至约8℃,约5℃至约8℃,约6℃至约8℃或约7℃至约8℃。在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存在约-25℃,约-24℃,约-23℃,约-22℃,约-21℃,约-20℃,约-19℃,约-18℃,约-17℃,约-16℃或约-15℃。在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存在约-25℃至约-15℃,约-22℃至约-17℃,约-20℃至约-15℃或约-25℃至约-20℃。在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存在约-90℃,约-89℃,约-88℃,约-87℃,约-86℃,约-85℃,约-84℃,约-83℃,约-82℃,约-81℃,约-80℃,约-79℃,约-78℃,约-77℃,约-76℃,约-75℃,约-74℃,约-73℃,约-72℃,约-71℃,约-70℃,约-69℃,约-68℃,约-67℃,约-66℃或约-65℃。在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存在约-90℃至约-65℃,约-85℃至约-65℃,约-80℃至约-65℃,约-75℃至约-65℃或约-70℃至约-65℃。在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存在-90℃至-65℃。
在一些实施方案中，将含有样品的基片冻融一次或多次(例如，在冷冻后，将含有样品的基片解冻，依照所述方法使用并再冷冻)和/或用于本方法。在一些实施方案中，将含有样品的基片冻融1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20次或更多次。在一些实施方案中，将含有样品的基片在本方法中使用1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20次或更多次。在一些实施方案中，将含有样品的基片冻融1至20次,2至20次,3至20次,4至30次,5至20次,6至20次,7至20次,8至20次,9至20次,10至20次,11至20次,12至20次,13至20次,14至20次,15至20次,16至20次,17至20次,18至20次,19至20次,5至15次,5至10次,1至10次或1至5次。在一些实施方案中，将含有样品的基片在本方法中使用1至20次,2至20次,3至20次,4至30次,5至20次,6至20次,7至20次,8至20次,9至20次,10至20次,11至20次,12至20次,13至20次,14至20次,15至20次,16至20次,17至20次,18至20次,19至20次,5至15次,5至10次,1至10次,1至5次,1至4次,1至3次或1至2次。
在一些实施方案中，将含有样品的基片在室温或约15℃至约30℃贮存1周。在一些实施方案中，将样品在约2℃至约8℃或约4℃贮存约1,2或3周。在一些实施方案中，将含有样品的基片在约-25℃至约-15℃或约-20℃贮存约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12个月。在一些实施方案中，将含有样品的基片在约-90℃至约-65℃或约-80℃贮存约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12个月。
有利地且令人惊讶地，发现从基片提取的减少的细胞数被从个别细胞的核酸的增加的提取所抵消。在一些实施方案中，增加的提取通过相比于标准实践将细胞温育更长的时间，相比于标准实践在升高的温度温育细胞，或两者的组合来实现。
在一些实施方案中，细胞的增加的核酸提取通过相比于标准实践将提取温育进行增加的或更长的时段来实现。在一些实施方案中，所述提取温育进行约45分钟，例如45±5,45±10,45±15,或45±20分钟。在一些实施方案中，所述提取温育进行约25分钟至约65分钟,约30分钟至约60分钟,约35分钟至约55分钟,约45分钟至约65分钟,约45分钟至约55分钟,或约40分钟至约50分钟。在一些实施方案中，所述提取温育时间为约25分钟,约30分钟,约35分钟,约40分钟,约45分钟,约50分钟,约55分钟,约60分钟或约65分钟。
在一些实施方案中，细胞的增加的核酸提取通过相比于标准实践将提取温育在增加的或更高的温度进行来实现。在一些实施方案中，所述提取温育在约45℃,例如45±2℃,45±5℃,或45±10℃进行。在一些实施方案中，所述提取温育温度为约35℃至约55℃,约40℃至约50℃或约43℃至约47℃。在一些实施方案中，提取温度为约43℃,约44℃,约45℃,约46℃,约47℃,约48℃,约49℃,约50℃,约51℃,约52℃,约53℃,约54℃或约55℃。在一些实施方案中，使用超过一种提取温度。例如，在一些实施方案中，对于提取的一部分使用标准温度而对于提取的另一部分使用升高的温度。
在一些实施方案中，从基片释放实质上少数的细胞用于依照本系统和方法的后续裂解。在一些实施方案中，在搅动期间从基片释放至少1个细胞,至少2个细胞,至少5个细胞,至少10个细胞,至少15个细胞,至少20个细胞,至少50个细胞,至少75个细胞,至少100个细胞,至少125个细胞,至少150个细胞,至少175个细胞,至少200个细胞,至少250个细胞,至少300个细胞,至少350个细胞,至少400个细胞,至少450个细胞,至少500个细胞或更多。
在一些实施方案中，使用所描述的方法从单个受试者采用(获得)纯度为约0.55至2.00,约0.6至约2.00,约0.7至约2.00约0.8至约2.00,约0.9至约2.00,约1.0至约2.00约1.1至约2.00,约1.2至约2.00,约1.3至约2.00,约1.4至约2.00,约1.5至约2.00约1.6至约2.00约1.7至约2.00约1.8至约2.00或约1.9至约2.00的约1ng/μL至约50ng/μL,约1ng/μL至约40ng/μL,约1ng/μL至约30ng/μL,约1ng/μL至约20ng/μL,约1ng/μL至约10ng/μL,约1ng/μL至约5ng/μL,约1ng/μL至约4ng/μL,约1ng/μL至约3ng/μL或约1ng/μL至约2ng/μL的核酸。在一些实施方案中，使用所描述的方法从单个受试者采用(获得)纯度为约0.55至2.00的1ng/μL至50ng/μL核酸。
IV.裂解溶液
已描述且本领域技术人员已知多种裂解溶液。可将这些公知的裂解溶液的任意一种用于所述方法以从样品分离核酸。例示性裂解溶液包括那些商品化的，如由
Figure BDA0003100721440000192
LIFE
Figure BDA0003100721440000191
和其他制造商销售的那些，以及可由实验室背景的技术人员生成的那些。裂解缓冲液也已经得到完善描述，且可将多种裂解缓冲液用于所公开的方法中，包括例如在Molecular Cloning(three volume set,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012)和Current Protocols(Genetics andGenomics；Molecular Biology；2003-2013)中描述的那些，两者均通过提述并入本文用于所有目的。
细胞裂解是用于从细胞内回收核酸的常见实践方法。在许多情况中，使细胞与裂解溶液，通常为包含去污剂的碱性溶液或裂解酶的溶液接触。这类裂解溶液通常含有盐、去污剂和缓冲剂，以及本领域技术人员会理解去使用的其他试剂。在全部和/或部分裂解后，从裂解溶液回收核酸。
在一些实施方案中，细胞重悬于水性缓冲液中，所述水性缓冲液具有范围从约pH4至约10,约5至约9,约6至约8或约7至约9的pH。
在一些实施方案中，缓冲盐浓度为约10mM至约200mM,约10mM至约100mM或约20mM至约80mM。
在一些实施方案中，缓冲液还包含螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇四乙酸(EGTA)。
在一些实施方案中，裂解溶液进一步包含其他化合物以协助核酸从细胞释放，如多元醇，包括例如但不限于蔗糖，以及糖醇如麦芽糖醇、山梨糖醇、木糖醇、赤藻糖醇和/或异麦芽(isomalt)。在一些实施方案中，多元醇在约2％至约15％w/w,或约5％至约15％w/w或约5％至约10％w/w的范围内。
在一些实施方案中，裂解溶液进一步包含表面活性剂，如例如但不限于Triton X-100,SDS,CTAB,X-114,CHAPS,DOC,和/或NP-40。在一些实施方案中，这类表面活性剂在约1％至约5％w/w,约1％至约4％w/w,或约1％至约3％w/w的范围内。
在实施方案中，裂解溶液进一步包含离液剂，如例如但不限于尿素、十二烷基硫酸钠和/或硫脲。在一些实施方案中，以范围为约0.5M至8M,约1M至约6M,约2M至约6M或约1M至3M的浓度使用离液剂。
在一些实施方案中，裂解溶液进一步包含一种或多种别的裂解试剂且这类裂解试剂是本领域公知的。在一些实施方案中，这类裂解试剂包括细胞壁裂解酶，如例如但不限于溶菌酶。在一些实施方案中，裂解试剂包括碱性去污剂溶液，如含有0.5％十二烷基硫酸钠的0.1M氢氧化钠水溶液(aqueous sodium hydroxide)。
在一些实施方案中，裂解溶液进一步包含水性糖溶液，如蔗糖溶液和螯合剂如EDTA，例如STET缓冲液。在某些实施方案中，裂解试剂通过将细胞悬液和等体积的裂解溶液混合来制备，所述裂解溶液具有期望浓度的两倍(例如0.2M氢氧化钠，1.0％十二烷基硫酸钠)。
在一些实施方案中，在实现期望的裂解程度后，使包含裂解溶液和裂解细胞的混合物与中和试剂或猝灭试剂接触以调整条件，使得裂解试剂不会对期望产物有不利影响。在一些实施方案中，将pH调整至约5至约9,约6至约8,约5至约7,约6至约7或约6.5至7.5的pH以最小化和/或防止细胞内含物(包括例如但不限于核酸)的降解。在一些实施方案中，当裂解试剂包含碱性溶液时，中和试剂包含酸性缓冲剂，例如碱金属乙酸盐/乙酸缓冲剂。在一些实施方案中，选择裂解条件，如温度和裂解试剂的组成，使得基本完成裂解，同时最小化期望产物(包括例如但不限于核酸)的降解。
在一些实施方案中，将第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或20种裂解溶液用于所述方法。在一些实施方案中，使用的裂解缓冲液的体积是约10μL,约20μL,约30μL,约40μL,约50μL,约60μL,约70μL,约80μL,约90μL,约100μL,约120μL,约130μL,约140μL,约150μL,160μL,约170μL,约180μL,约190μL,约200μL,约220μL,约230μL,约240μL,约250μL,约260μL,约270μL,约280μL,约290μL,约300μL,约320μL,约330μL,约340μL,约350μL,约360μL,约370μL,约380μL,约390μL,约400μL,约450μL,约500μL,约550μL,约600μL,约650μL,约700μL,约750μL,约800μL,约850μL,900μL,950μL,1000μL,1500μL或2000μL。在一些实施方案中，裂解缓冲液在约10μL和约1000μL,约10μL和约800μL,约10μL和约600μL,约10μL和约400μL,约20μL和约400μL,约50μL和约300μL,约50μL和约200μL,约50μL和约400μL,约100μL和约400μL,约10μL和约300μL或约100μL和约200μL之间。
上述内容的任意组合均可由技术人员采用以及与其他已知且常规的方法组合，且这类组合涵盖在本发明中。
V.从裂解缓冲液纯化核酸
在一些实施方案中，在实施后续分析之前从裂解缓冲液分离核酸，包括例如但不限于基因组DNA。在一些实施方案中，在实施另外的分析，如例如但不限于实时PCR分析之前从裂解缓冲液分离核酸。所公开方法的多个实施方案使用可用于分离少量核酸的多种方法中的任意方法。这些包括但不限于，沉淀、凝胶过滤、密度梯度和固相结合。这类方法也记载于例如Molecular Cloning(三卷集,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012)和Current Protocols(Genetics and Genomics；Molecular Biology；2003-2013)，通过提述并入本文用于所有目的。
核酸沉淀是本领域技术人员已知的用于分离的公知方法。多种固相结合方法也是本领域已知的，包括但不限于使用珠子(例如二氧化硅、磁性)、柱、膜的形式或本领域已知的多种其他物理形式之任一的固相的固相结合方法。在一些实施方案中，用于所公开方法的固相可逆地结合核酸。这类固相的例子包括所谓的“混合床(mixed-bed)”固相，其为至少两种不同固相的混合物，每种具有在不同溶液条件下结合核酸的容量，和在不同条件下释放核酸的能力和/或容量；如在美国专利申请No.2002/0001812中描述的那些，其通过提述完整并入本文用于所有目的。根据所公开方法的对核酸的固相亲和力可经由通常用于将溶质结合于基质的多种手段中的任一种。这类手段的例子包括但不限于，离子相互作用(例如阴离子交换层析)和疏水相互作用(例如反向层析)、pH差异和变化、盐差异和变化(例如浓度变化，使用离液盐/剂)。例示性的基于pH的固相包括但不限于在INVITROGENChargeSwitch Normalized Buccal Kit磁珠中使用的那些，其在低pH(<6.5)结合核酸并在高pH(>8.5)释放核酸，和单氨基-N-氨基乙基(MANAE)，其在低于7.5的pH结合核酸并在大于8的pH释放核酸。例示性的基于离子交换的基质包括但不限于，来自PHARMACIA(Piscataway,N.J.)的DEA-SEPHAROSETM,Q-SEPHAROSETM,和DEAE-SEPHADEXTM，来自DowChemical公司(Midland,Mich.)的
Figure BDA0003100721440000221
I，来自Rohm&Haas(Philadelphia,Pa.)的
Figure BDA0003100721440000222
来自Duolite International,In.(Cleveland,Ohio)的
Figure BDA0003100721440000223
DIALON TI和DIALON TII。
涵盖任何单个方法单独或与其他方法组合使用，且这类可用组合是公知的并被本领域技术人员所领会的。
VI.核酸分析
所公开的方法用于分离核酸，如基因组DNA(gDNA)，以用于多种核酸分析，包括基因组分析。在一些实施方案中，这类分析包括多种遗传突变的检测，其包括但不限于一个或多个缺失、插入、转换和颠换。在一些实施方案中，突变是单核苷酸多态性(SNP)。
用于分析这类分离的核酸，例如但不限于基因组DNA(gDNA)的多种方法是本领域已知的，且包括PCR方法，如实时PCR分析、微阵列分析、杂交分析和核酸序列分析，以及分析核酸组成且本领域技术人员已知的多种其他方法。参见例如，Molecular Cloning(三卷集,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012)和Current Protocols(Genetics andGenomics；Molecular Biology；2003-2013)。
a.实时PCR
为了设计实时PCR测定法，将几个部分协调起来，包括被两个引物侧接且随后扩增的DNA片段(经常称为扩增子)、两个引物和要使用的检测探针(一种或多种)。
实时PCR依赖于与短多核苷酸(称为“检测探针”)缀合的荧光染料的视觉发射，所述短多核苷酸以序列特异性方式与基因组等位基因联合。相差单个核苷酸的实时PCR探针可在实时PCR测定法中区分，其通过以不同波长发荧光的探针的缀合和检测。实时PCR适用于检测应用(诊断应用)、定量应用和基因型分型应用。
用于实施实时PCR的几种相关方法在本领域中披露，包括依赖于以下的测定法：
Figure BDA0003100721440000231
探针(美国专利Nos.5,210,015和5,487,972，和Lee等,Nucleic AcidsRes.21:3761-6,1993)、分子信标探针(美国专利Nos.5,925,517和6,103,476，和Tyagi和Kramer,Nat.Biotechnol.14:303-8,1996)、自探测扩增子(scorpions)(美国专利No.6,326,145，和Whitcombe等,Nat.Biotechnol.17:804-7,1999)、Amplisensor(Chen等,Appl.Environ.Microbiol.64:4210-6,1998)、Amplifluor(美国专利No.6,117,635，和Nazarenko等,Nucleic Acids Res.25:2516-21,1997、置换杂交探针(Li等,Nucleic AcidsRes.30:E5,2002),DzyNA-PCR(Todd等,Clin.Chem.46:625-30,2000)、荧光限制酶检测(Cairns等,Biochem.Biophys.Res.Commun.318:684-90,2004)和邻近杂交探针(美国专利No.6,174,670和Wittwer等,Biotechniques 22:130-1,134-8,1997)。
在一些情况中，实时PCR可实现对多种基因突变(包括例如但不限于SNP)的检测。在一些实施方案中，使用实时PCR进行对特定基因候选物中SNP的检测，其基于通过使用拴系的猝灭模块对荧光分子的分子内猝灭的用途。因此，根据例示性实施方案，实时PCR方法还包括使用分子信标技术。分子信标技术利用具有内部猝灭的荧光团的发夹形分子，其荧光通过结合感兴趣的DNA靶物恢复(参见例如，Kramer,R.等Nat.Biotechnol.14:303-308,1996)。在一些实施方案中，利用分子信标探针对积累的PCR产物的增加的结合来特异性检测基因组DNA中存在的SNP。
许多适宜的基因型分型规程之一是
Figure BDA0003100721440000232
等位区分测定法。在该测定法的一些情况中，利用在探针的5'端用荧光报道物染料标记且在探针的3'端用猝灭剂染料标记的寡核苷酸探针。猝灭剂对完整探针的接近性保持报道物的较小荧光。在PCR反应期间，DNA聚合酶的5'核酸酶活性切割探针，并分离染料与猝灭剂。这导致报道物的荧光增加。通过监测报道物染料的荧光增加来直接检测PCR产物的积累。仅当探针与靶物杂交并在PCR期间扩增时，DNA聚合酶的5'核酸酶活性在报道物和猝灭剂之间切割探针。探针设计为跨过目标SNP位置，并仅当存在特定SNP等位基因时与核酸分子杂交。
举例而言，为了扩增位于TGFβI基因外显子4中的与阿维利诺角膜营养不良有关的SNP，构建正向和反向PCR引物对(图2中的SEQ ID NOs:1至24)，如美国专利公开文本No.2012/0077200中描述的。在一些实施方案中，将其中披露的正向和反向引物对之任一种用于本文公开的改进方法中。在一个优选的实施方案中，将SEQ ID NO:1(正向)和SEQ IDNO:2(反向)的正向和反向引物对用于本文提供的改进方法中。
为了检测TGFβI基因外显子4的鸟嘌呤到腺嘌呤突变，如美国专利公开文本2012/0077200中描述的，构建了荧光标记的实时PCR探针对，用于检测野生型(“G”)和阿维利诺角膜营养不良有关的突变体(“A”)等位基因，其具有根据如图3中显示的SEQ ID NOs:25至42的核苷酸序列。在一些实施方案中，将任意的野生型和突变体探针用于本文公开的改进方法中。在一个优选的实施方案中，将SEQ ID NO:25(野生型)和SEQ ID NO:26(突变体)的野生型和突变体探针对用于本文提供的改进方法中。为了将野生型等位基因与疾病相关的等位基因区分，将野生型探针用VIC标记，突变体探针用FAM标记。小沟结合剂(MGB)附接于探针以促进对互补基因片段的结合。
b.实时PCR循环
实时PCR方法包括多个步骤或循环作为扩增方法的一部分。这些循环包括将双链核酸变性、将正向引物、反向引物和检测探针与靶基因组DNA序列退火，和从退火的正向引物和反向引物合成(即复制)第二链DNA。这种三步骤过程在本文称为循环。
在一些实施方案中，采用约10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,或60个循环。在一些实施方案中，采用约10至约60个循环，约20至约50或约30至约40个循环。在一些实施方案中，采用40个循环。
在一些实施方案中，将双链核酸变性的步骤在约80℃至100℃,约85℃至约99℃,约90℃至约95℃的温度进行约1秒至约5秒,约2秒至约5秒,或约3秒至约4秒。在一些实施方案中，将双链核酸变性的步骤在95℃的温度进行约3秒。
在一些实施方案中，将正向引物、反向引物和检测探针与靶基因组DNA序列退火的步骤在约40℃至约80℃,约50℃至约70℃,约55℃至约65℃进行约15秒至约45秒,约20秒至约40秒,约25秒至约35秒。在一些实施方案中，将正向引物、反向引物和检测探针与靶基因组DNA序列退火的步骤在约60℃进行约30秒。
在一些实施方案中，从退火的正向引物和反向引物合成(即复制)第二链DNA在约40℃至约80℃,约50℃至约70℃,约55℃至约65℃进行约15秒至约45秒,约20秒至约40秒,约25秒至约35秒。在一些实施方案中，将正向引物、反向引物和检测探针与靶基因组DNA序列退火的步骤在约60℃进行约30秒。
在一些实施方案中，发现根据本文描述的方法制备的约1μL,约2μL,约3μL,约4μL或约5μL的基因组DNA样品与仅约0.05μL,约0.10μL约0.15μL,约0.20μL,约0.25μL或约0.25μL的30X,35X,40X,45X,50X或100X实时PCR测定混合物及蒸馏水组合以形成PCR主混合物。在一些实施方案中，所述PCR主混合物具有约5μL,约6μL,约7μL,约8μL,约9μL,约0μL,约11μL,约12μL,约13μL,约14μL,约15μL,约16μL,约17μL,约18μL,约19μL或约20μL或更高的终体积。在一些实施方案中，发现如上文描述制备的2μL基因组DNA样品与仅约0.15μL的40X实时PCR测定混合物和2.85μL蒸馏水组合以形成PCR主混合物。
尽管本文描述了例示性反应，但技术人员理解如何基于探针设计改变温度和时间。而且，所述方法涵盖上述时间和温度的任何组合。
c.PCR引物和引物设计
在一些实施方案中，在实验室设置下测试和设计引物。在一些实施方案中，通过基于计算机的计算机方法(in silico method)来设计引物。引物序列基于要扩增的扩增子或靶核酸序列的序列。较短的扩增子通常比更长的扩增子更有效复制且实现更有效的扩增。
在设计引物时，技术人员会理解需要考虑熔解温度(Tm；一半的引物-靶物双链体解离且变成单链的温度，其是双链体稳定性的指示；增加的Tm指示增加的稳定性)，其基于所设计的引物的GC和AT含量，以及二级结构考虑(增加的GC含量可导致增加的二级结构)。可使用本领域已知的多种方法计算TM且技术人员会容易地理解用于计算TM的这类多种方法；此类方法包括例如但不限于那些可获的在线工具，如可在万维网上promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm处得到的TM计算器。引物特异性由其完整序列与3’端序列(其为被Taq聚合酶延伸的部分)的组合限定。在一些实施方案中，3’端应具有未在靶序列中任何他处发现的至少5至7个独特的核苷酸，以帮助减少错误引发和创造不正确的扩增产物。正向和反向引物通常以相似的效率结合靶物。在一些情况下，采用工具如NCBIBLAST(位于万维网上ncbi.nlm.nih.gov处)来实施比对和辅助引物设计。
本领域技术人员公知针对靶核酸序列的引物设计的基础，且许多参考手册和教科书关于这类方法具有详细的教导，包括例如，Molecular Cloning(three volume set,ColdSpring Harbor Laboratory Press,2012)和Current Protocols(Genetics andGenomics；Molecular Biology；2003-2013)和Real-time PCR in Microbiology:FromDiagnostics to Characterization(Ian M.MacKay,Calster Academic Press；2007)；可在万维网上primerdigital.com/tools/PrimerAnalyser.html处得到的PrimerAnalyserJava工具，和Kalendar R,等(Genomics,98(2):137-144(2011))，其所有完整并入本文用于所有目的。
引物设计的另一个方面是引物复杂性或语言序列复杂性(参见，Kalendar R,等(Genomics,98(2):137-144(2011))。具有更大语言序列复杂性(例如核苷酸排列和组成)的引物通常更有效。在一些实施方案中，使用语言序列复杂性计算方法来寻找比较的序列之间的保守区，以用于检测低复杂性区域，包括简单序列重复、不完美的直接或倒置重复、多嘌呤和多嘧啶三链cDNA结构和四链结构(如G-四链体)。在一些实施方案中，沿全序列长度使用字母表-能力(alphabet-capacity)L-gram方法实施语言复杂性(LC)测量(参见A.Gabrielian,A.Bolshoy,Computer&Chemistry 23:263–274(1999)和Y.L.Orlov,V.N.Potapov,Complexity:an internet resource for analysis of DNA sequencecomplexity,Nucleic Acids Res.32:W628–W633(2004))，并计算为序列中观察范围(xi)从1至L大小字的总和除以该序列长度的预期(E)值的总和。一些富含G(和富含C)的核酸序列折叠成四链DNA结构，其含有G-四重体的堆积(参见万维网上quadruplex.org处)。一些情况中，这些四链体通过两个或四个DNA分子的分子内联合，含有两个G碱基的序列的二聚化，或通过含有4个鸟嘌呤块的单链的分子内折叠形成(参见P.S.Ho,PNAS,91:9549–9553(1994)；I.A.Il'icheva,V.L.Florent'ev,Russian Journal of Molecular Biology 26:512–531(1992)；D.Sen,W.Gilbert,Methods Enzymol.211:191–199(1992)；P.A.Rachwal,K.R.Fox,Methods 43:291–301(2007)；S.Burge,G.N.Parkinson,P.Hazel,A.K.Todd,K.Neidle,Nucleic Acids Res.34:5402–5415(2006)；A.Guédin,J.Gros,P.Alberti,J.Mergny,Nucleic Acids Res.38:7858–7868(2010)；O.Stegle,L.Payet,J.L.Mergny,D.J.MacKay,J.H.Leon,Bioinformatics 25:i374–i382(2009)；在一些情况中，由于其低语言复杂性(对于(TTAGGG)4为LC＝32％)，将这些从引物设计除去。
这些方法包括多种生物信息学工具用于在具有GC偏倚(skew),(G-C)/(G+C),AT偏倚,(A-T)/(A+T),CG-AT偏倚,(S-W)/(S+W)、或嘌呤-嘧啶(R-Y)/(R+Y)偏倚的序列中关于GC含量和熔解温度的模式分析，并提供用于测定语言序列复杂性概况的工具。例如，在n(其中n是正整数)的滑窗中的GC偏倚，碱基用一个碱基一步计算，根据公式(G-C)/(G+C)，其中对于窗口中的所有序列G是鸟嘌呤的总数且C是胞嘧啶的总数(Y.Benita,等,Nucleic AcidsRes.31:e99(2003))。正GC-偏倚值指示G碱基过多，而负GC-偏倚值代表C碱基过多。类似地，在序列中计算其他偏倚。在一些实施方案中，采用这类方法以及其他方法来确定引物复杂性。
根据非限制性实施方案例子，使用外切核酸酶引物实施实时PCR(
Figure BDA0003100721440000271
探针)。在这类实施方案中，引物利用热稳定性聚合酶如Taq的5'外切核酸酶活性来切割扩增反应中存在的双重标记的探针(参见例如，Wittwer,C.等Biotechniques 22:130-138,1997)。尽管与PCR产物互补，该测定中使用的引物探针不同于PCR引物且用能发荧光的分子和能猝灭荧光的分子双重标记。当探针完整时，DNA探针内的荧光信号的分子内猝灭导致极小信号。当荧光分子被扩增期间Taq的外切核酸酶活性释放时，猝灭极大降低，导致增加的荧光信号。荧光探针的非限制性例子包括6-羧基-荧光素模块等。例示性猝灭剂包括BlackHole Quencher 1模块等。
多种PCR引物可以适用于所公开的方法。例示性引物包括但不限于本文中描述的那些。用于所公开方法的引物亦见于美国专利公开文本No.20120077200，其通过提述并入本文用于所有目的。在一些实施方案中，用于本公开方法的PCR引物包括但不限于表1中列出的以下内容，且适用于检测TGFβI基因。表2和3提供每种引物的生物物理参数，如使用万维网上primerdigital.com/tools/PrimerAnalyser.html处计算的。
表1：用于TGFβI基因的例示性引物
Figure BDA0003100721440000281
Figure BDA0003100721440000291
表2：用于正向引物的生物物理参数
Figure BDA0003100721440000292
Figure BDA0003100721440000301
表3：反向引物的生物物理参数
Figure BDA0003100721440000302
Figure BDA0003100721440000311
在一些实施方案中，用于所公开方法的实时PCR引物具有至少70％,至少72％,至少75％,至少77％,至少80％,至少82％,至少85％,至少88％,至少90％,至少92％,至少95％,至少97％或至少99％的语言序列复杂性。
d.检测探针设计和检测探针
多种检测探针可以适用于所公开的方法并用于基因型分型和/或定量。本领域技术人员通常采用的检测探针包括但不限于，水解探针(也称为
Figure BDA0003100721440000312
探针、5’核酸酶探针或双标记探针)，杂交探针，和Scorpion引物(其在一个分子中组合引物和检测探针)。在一些实施方案中，本领域技术人员基于期望的探针靶物决定检测探针设计，使得探针与采用的PCR引物相容(例如，引物和探针不应在实时PCR测定中干扰彼此的功能)。在一些实施方案中，探针设计为具有比引物更高的Tm，以促进有效的信号产生。使用本领域已知的多种方法的任一种来计算Tm且技术人员会容易地理解用于计算Tm的多种这类方法；这类方法包括例如在线可获的那些工具，如可在万维网上promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm处获得的计算器。在一些实施方案中，检测探针的增加的Tm提供了在引物被聚合酶延伸前检测探针已结合。
在一些实施方案中，检测探针含有多种修饰。在一些实施方案中，检测探针包括经修饰的核酸残基，如但不限于2'-O-甲基核糖核苷酸修饰、硫代磷酸酯主链修饰、二硫代磷酸酯主链修饰、氨基磷酸酯(phosphoramidate)主链修饰、甲基膦酸酯(methylphosphonate)主链修饰、3'末端磷酸根修饰和/或3'烃基取代。
在一些实施方案中，所述检测探针由于修饰对于靶序列具有增加的亲和力。这类检测探针包括具有增加的长度的检测探针，以及含有化学修饰的检测探针。这类修饰包括但不限于2'-氟(2'-脱氧-2'-氟-核苷)修饰、LNA(锁核酸)、PNA(肽核酸)、ZNA(zip核酸)、吗啉代、膦酸甲酯、氨基磷酸酯、聚阳离子缀合物和2'-芘(pyrene)修饰。在一些实施方案中，检测探针含有一种或多种修饰，包括2'氟修饰(又称为，2'-脱氧-2'-氟-核苷)、LNA(锁核酸)、PNA(肽核酸)、ZNA(zip核酸)、吗啉代、膦酸甲酯、氨基磷酸酯、和/或聚阳离子缀合物。
在一些实施方案中，所述检测探针含有可检测的模块，如本文中描述的那些，以及本领域技术人员已知的任何可检测模块。这类可检测模块包括例如但不限于荧光标记物和化学发光标记物。这类可检测模块的例子还包括FRET对的成员。在一些实施方案中，所述检测探针含有可检测实体。
荧光标记物的例子包括但不限于AMCA,DEAC(7-二乙基氨基香豆素-3-羧酸)；7-羟基-4-甲基香豆素-3；7-羟基香豆素-3；MCA(7-甲氧基香豆素-4-乙酸)；7-甲氧基香豆素-3；AMF(4'-(氨基甲基)荧光素)；5-DTAF(5-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素)；6-DTAF(6-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素)；6-FAM(6-羧基荧光素；又称为FAM；包括
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FAMTM)；TAQMAN
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5(6)-FAM尸胺；5-FAM尸胺；5(6)-FAM乙二胺；5-FAM乙二胺；5-FITC(FITC异构体I；荧光素-5-异硫氰酸酯)；5-FITC尸胺；荧光素-5-马来酰亚胺；5-IAF(5-碘乙酰氨基荧光素)；6-JOE(6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素)；5-CRl lO(5-羧基罗丹明110)；6-CRl lO(6-羧基罗丹明110)；5-CR6G(5-羧基罗丹明6G)；6-CR6G(6-羧基罗丹明6G)；5(6)-羧基罗丹明6G尸胺(5(6)-Caroxyrhodamin 6G cadaverine)；5(6)-羧基罗丹明6G乙二胺；5-ROX(5-羧基-X-罗丹明)；6-ROX(6-羧基-X-罗丹明)；5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)；6-TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)；5-TAMRA尸胺；6-TAMRA尸胺；5-TAMRA乙二胺；6-TAMRA乙二胺；5-TMR C6马来酰亚胺；6-TMR C6马来酰亚胺；TR C2马来酰亚胺；TR尸胺；5-TRITC；G异构体(四甲基罗丹明-5-异硫氰酸)；6-TRITC；R异构体(四甲基罗丹明-6-异硫氰酸酯)；丹酰尸胺(5-二甲基氨基萘-l-(N-(5-氨基戊基))磺酰胺)；EDANS C2马来酰亚胺；荧光胺；NBD；和吡咯甲川(pyrromethene)及其衍生物。
化学发光标记物的例子包括但不限于用于Southern印迹和Western印迹方案的那些标记物(参见例如Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(3rded.)(2001)；通过提述完整并入本文)。例子包括但不限于-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰基氧)苯基-1,2-二氧杂环丁烷(dioxetane)(AMPPD)；吖啶酯和金刚烷基-稳定化的1,2-二氧杂环丁烷，及其衍生物。
探针的标记是本领域已知的。使用经标记的探针以在扩增期间在经扩增区域内杂交。修饰探针以避免其充当用于扩增的引物。检测探针用两种荧光染料标记，一种能将另一种染料的荧光猝灭。一种染料附接于探针的5'末端而另一种附接于内部位点，从而使得当探针处于非杂交状态时发生猝灭。
实时PCR探针通常由涉及荧光共振能量转移(FRET)的一对染料(报导染料和接受者染料)组成，其中接受者染料猝灭报导染料的发射。一般地，用荧光标记的探针增加扩增子定量的特异性。
在所公开方法的在一些实施方案中使用的实时PCR还包括使用一种或多种杂交探针(即检测探针)，如由本领域技术人员根据本公开确定的。作为非限制性的例子，这类杂交探针包括但不限于所描述方法中提供的那些探针的一种或多种。例示性探针，如HEX通道和/或FAM通道探针，是本领域技术人员了解的。
根据示例实施方案，便利地选择检测探针和引物，例如使用利用引物设计软件的计算机分析和对存储在国家生物技术信息中心(NCBI)的基因和基因组的可获核苷酸数据库进行交叉参照。在一些实施方案中，可以使用一些另外的指导来选择引物和/或探针。例如，在一些实施方案中，选择引物和探针使得其彼此靠近，但不重叠。在一些实施方案中，引物可具有相同(或接近的TM)(例如在约58℃和约60℃之间)。在一些实施方案中，探针的TM比对引物的TM选择的TM高约10℃。在一些实施方案中，选择探针和引物的长度为约17至39个碱基对等。在一些情况中本领域技术人员使用这些和其他指导来选择适宜的引物和/或探针。
用于本发明方法的探针包括但不限于表4中所列的以下例示性探针。
表4：TGFβI基因的例示性探针
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VII.诊断测试
在一些实施方案中，采用诊断测试通过检测多种突变中的任一种来确定一种或多种遗传条件。在一些实施方案中，当基于例如身体表现、迹象和/或症状以及家族史信息怀疑特定疾患时，使用诊断测试来确认诊断。在一些实施方案中，诊断测试的结果有助于医学领域的那些技术人员确定对于给定患者的适宜治疗方案并允许更个体化和更有效的治疗方案。在一些实施方案中，治疗方案包括多种药物治疗、手术治疗、生活方式改变或其组合的任一种，如由本领域技术人员确定的。
通过所公开方法获得的核酸可用于多种诊断测试，包括用于检测突变如缺失、插入、颠换和转换的测试。在一些实施方案中，这类诊断可用于鉴定携带针对某疾病的基因的一个拷贝的未受影响的个体，所述疾病需要表达针对该疾病的两个拷贝，鉴定携带针对某疾病的基因的一个拷贝的未受影响的个体，其中信息可适用于形成治疗方案，植入前(preimplantation)遗传诊断，出生前诊断测试，新生筛选，系谱DNA测试(用于遗传系谱目的)，用于预测成人发作病症如亨廷顿氏病(Huntington's disease)的症状前测试，用于估测形成成人发作的癌症和阿耳滋海默氏病的风险的症状前测试，症状性个体的确认性诊断，和/或法医/身份测试。在一些实施方案中，本方法适用于检测角膜营养不良。在一些实施方案中，经由例如检测阿维利诺角膜营养不良相关的SNP来检测角膜营养不良，如导致TGFβI基因中R124突变的那些(包括例如但不限于TGFβI基因的核苷酸418处由G至A转换导致的R124H突变，也称为C(G/A)C SNP)。在一些实施方案中，经由检测例如颗粒状角膜营养不良相关的SNP来检测角膜营养不良，如导致TGFβI基因中R555突变的那些(包括例如但不限于TGFβI基因的核苷酸1663处由C至T转换导致的R555W突变，也称为(C/T)GG SNP)。在一些实施方案中，经由例如检测格子状营养不良相关的SNP来检测角膜营养不良，如导致TGFβI基因中R124和/或626突变的那些(包括例如但不限于TGFβI基因的核苷酸417处由C至T转换导致的R124C突变，也称为(C/T)GC SNP，或TGFβI基因的核苷酸1924处由A至C转换导致的H626P突变)。在一些实施方案中，经由检测例如Reis-bucklers角膜营养不良相关的SNP来检测角膜营养不良，如导致TGFβI基因中R124突变的那些(包括例如但不限于TGFβI基因的核苷酸418处由G至T转换导致的R124L突变，也称为C(G/T)C SNP)。在一些实施方案中，经由检测例如Thiel-Behnke角膜营养不良相关的SNP来检测角膜营养不良，如导致TGFβI基因中R555突变的那些(包括例如但不限于TGFβI基因的核苷酸1664处由G至A转换导致的R555Q突变，也称为C(G/A)G SNP)。
在一些实施方案中，新生儿筛选包括刚出生后采用的任何遗传筛选以鉴定遗传病症。在一些实施方案中，新生儿筛选适用于鉴定遗传病症，从而在生命早期确定治疗方案。这类测试包括但不限于测试婴儿的苯丙酮尿和先天甲状腺机能减退。
在一些实施方案中，采用携带者测试(carrier testing)来鉴定携带单拷贝的基因突变的人。在一些情况中，当存在两拷贝时，突变可导致遗传病症。在一些情况中，一个拷贝足以导致遗传病症。在一些情况中，两拷贝的存在是禁用特定治疗方案的，如阿维利诺突变的存在和在进行手术规程之前的预筛选以确保对给定的患者进行适宜的治疗方案。在一些实施方案中，这类信息也可用于个体考虑生育和协助个体制定知情的决策，以及协助医学领域的技术人员对个体患者以及患者家属提供重要的建议。
在一些实施方案中，使用预测性和/或症状前测试类型来检测与多种病症有关的基因突变。在一些情况中，这些测试协助有患遗传病症的家族成员但在测试时可以不显示病症特征的人。在一些实施方案中，预测性测试鉴定提高人的形成具有遗传基础的病症的几率的突变，所述病症包括例如但不限于某些癌症类型。在一些实施方案中，症状前测试可用于在出现任何身体迹象或症状之前确定人是否会形成遗传病症。预测性和症状前测试的结果提供了关于人形成特定病症的风险的信息，且帮助制定对于患者以及患者家属的适宜医学治疗方案的决策。在一些实施方案中，还采用预测性测试来检测某些治疗方案禁用的突变，如存在阿维利诺突变则不当实施LASIK手术和/或其他屈光手术(refractiveprocedure)，如但不限于光治疗性角膜切除术(PTK)和/或光折射性角膜切除术(PRK)。例如，展现阿维利诺突变的患者不应进行LASIK手术或其他屈光手术。
在一些实施方案中，诊断测试还包括药物基因组学(pharmacogenomics)，其包括确定遗传变异对药物应答的影响的遗传测试。来自这类药物基因组学分析的信息适用于确定和形成适宜的治疗方案。医学领域的技术人员在设计适宜治疗方案时采用关于遗传变异的存在和/或缺乏的信息。
在一些实施方案中，使用本公开的方法确定遗传概况(profile)的疾病包括但不限于，眼科病症、癌症、糖尿病、高血压、精神分裂症、和最常见的先天畸形，如唇裂、颚裂、神经管缺陷、软骨发育不全、Alpha-1抗胰蛋白酶缺陷、抗磷脂综合征、孤独症、常染色体显性多囊性肾病、Charcot-Marie-Tooth、结肠癌、Cri du chat、克罗恩病、囊性纤维化病(Cystic fibrosis)、德卡姆病(Dercum Disease)、唐氏综合征、杜安综合征(DuaneSyndrome)、迪谢内肌营养不良(Duchenne Muscular Dystrophy)、因子V Leiden血栓形成倾向、家族性血胆脂醇过多、家族性地中海热、脆性X综合征(Fragile X Syndrome)、戈谢病(Gaucher Disease)、血色素沉积症、血友病、前脑无裂畸形(Holoprosencephaly)、亨延顿氏舞蹈病(Huntington's disease)、克兰费尔特综合征(Klinefelter syndrome)、马方综合征(Marfan syndrome)、强直性肌营养不良、神经纤维瘤病、努南综合征(NoonanSyndrome)、成骨不全(Osteogenesis imperfecta)、帕金森病、苯丙酮尿、Poland异常、卟啉症(Porphyria)、早衰症(Progeria)、视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa)、重症联合免疫缺陷(SCID)、镰状细胞病、脊髓性肌萎缩(Spinal Muscular Atrophy)、戴萨克斯症(Tay-Sachs)、地中海贫血(Thalassemia)、三甲基胺尿(Trimethylaminuria)、特纳综合征(Turner Syndrome)、Velocardiofacial综合征、WAGR综合征、威尔逊病(Wilson Disease)、以及具有遗传组分的任何其他疾病。眼科病症和/或包括眼科组分的病症包括但不限于，睑板腺囊肿(chalazion)、麦粒肿(stye)、倒睫(trichiasis)、睑内翻(entropion)、睑外翻(ectropion)、兔眼症(lagophthalmos)、bleharitis、泪囊炎(dacryocystitis)、眶蜂窝织炎(orbital cellulitis)、ptergium、翼状胬肉(pterygium)角膜营养不良、结膜炎(conjuctivitis)、新生儿眼炎(ophtalmia neonatorum)、细菌性角膜溃疡、真菌性角膜溃疡、青光眼、富克斯营养不良(Fuchs Dystrophy)、圆锥角膜(keratoconus)、老年黄斑变性(Advanced Macular Degeneration)、视网膜色素变性(Retinitis pigmentosa)、白内障、retinal disorecers、黄斑变性、糖尿病眼问题(例如糖尿病视网膜病变)、睑裂狭小-下垂-内眦赘皮-倒向综合征(BPES)、眼皮肤白化病(oculocutaneous albinism)、马方综合征、Stickle综合征、和CHARGE(缺损(coloboma)、心异常、后鼻孔闭锁(atresia of thechoanae)、生长和发育迟滞、生殖/泌尿道异常、耳异常或耳聋)综合征。角膜营养不良包括但不限于，阿维利诺角膜营养不良、颗粒状角膜营养不良、格子状I型(lattice type I)角膜营养不良、富克斯营养不良(Fuchs Dystrophy)、Thiel-Behnke和Reis-bucklers角膜营养不良。癌症包括但不限于，癌、肉瘤、母细胞瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞瘤、和未知起源的癌症。在一些实施方案中，癌症包括但不限于，头和颈癌、皮肤癌、结肠癌、口腔癌、成胶质细胞瘤、乳腺癌、喉癌、食道癌、内皮癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肺癌、泌尿生殖器癌、直肠癌、前列腺癌、肾癌、黑素瘤、肾癌、胰腺癌、胃肠癌、血液癌、肝癌、子宫癌和脑癌以及病毒诱导的癌症，如乳头状瘤病毒诱导的癌症。
在一些实施方案中，本方法适用于开发个体化的医学治疗方案，其通过提供用于测定个体的遗传概况的基因组DNA。在一些实施方案中，本领域技术人员采用这类遗传概况信息以决定和/或形成治疗方案。在一些实施方案中，本领域技术人员使用在通过所描述的方法分离的核酸中鉴定的多种遗传变异和突变的存在和/或缺乏作为个体化医学方案或计划的一部分。例如，在一些实施方案中，将使用所公开方法获得的信息与数据库或其他建立的信息比较以确定对指定疾病的诊断和/或确定治疗方案。在一些情况中，将关于特定患者中遗传突变的存在或缺乏的信息与数据库或其他标准信息来源比较以做出关于提出的治疗方案的决定。在一些情况中，遗传突变的存在指示采纳特定治疗方案。在一些情况中，遗传突变的缺乏指示不采纳特定治疗方案。
在一些实施方案中，使用关于特定遗传突变的存在和/或缺乏的信息来确定用治疗实体治疗的治疗功效，以及修改治疗方案以用治疗实体治疗。在一些实施方案中，采用关于遗传突变的存在和/或缺乏的信息来确定是否采纳某个治疗方案。在一些实施方案中，采用关于遗传突变的存在和/或缺乏的信息来确定是否持续治疗方案。在一些实施方案中，采用遗传突变的存在和/或缺乏来确定是否中断治疗方案。在其他实施方案中，利用遗传突变的存在和/或缺乏来确定是否修改治疗方案。在一些实施方案中，利用遗传突变的存在和/或缺乏来确定是否增加或降低作为治疗方案的一部分施用的治疗剂量。在其他实施方案中，利用遗传突变的存在和/或缺乏来确定是否改变作为治疗方案的一部分施用的治疗的给药频率。在一些实施方案中，利用遗传突变的存在和/或缺乏来确定是否改变每日、每周的剂量数，每治疗日的次数。在一些实施方案中，利用遗传突变的存在和/或缺乏来确定是否改变治疗的剂量量。在一些实施方案中，在启动治疗方案之前和/或在开始治疗方案之后确定遗传突变的存在和/或缺乏。在一些实施方案中，确定遗传突变的存在和/或缺乏，并与关于遗传突变的存在或缺乏的预确定的标准信息比较。
在一些实施方案中，使用所公开的方法生成了超过一种遗传突变的存在和/或缺乏的复合(composite)，且这类复合包括关于超过一种遗传突变的存在和/或缺乏的信息的任意集合。在一些实施方案中，检查2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、20种或更多种、30种或更多种、或40种或更多种遗传突变的存在或缺乏，并用于生成复合。在一些实施方案中，例示信息包括核酸或蛋白质信息，或关于核酸和/或蛋白质遗传突变两者的信息的组合。一般地，复合包含关于遗传突变的存在和/或缺乏的信息。在一些实施方案中，这些复合用于与预确定的标准信息比较以采纳、维持或中断某治疗方案。
在一些实施方案中，经由例如检测选自但不限于以下的2,3,4或5种SNP来检测角膜营养不良：阿维利诺角膜营养不良相关的SNP、颗粒状角膜营养不良相关的SNP、格子状营养不良相关的SNP、Reis-Buckler角膜营养不良相关的SNP、和/或Thiel-Behnke角膜营养不良相关的SNP。在一些实施方案中，经由例如检测阿维利诺角膜营养不良相关的SNP与颗粒状角膜营养不良相关的SNP、格子状营养不良相关的SNP、Reis-Buckler角膜营养不良相关的SNP、和/或Thiel-Behnke角膜营养不良相关的SNP的组合来检测角膜营养不良角膜营养不良。在一些实施方案中，经由例如检测颗粒状角膜营养不良相关的SNP与阿维利诺角膜营养不良相关的SNP、格子状营养不良相关的SNP、Reis-Buckler角膜营养不良相关的SNP、和/或Thiel-Behnke角膜营养不良相关的SNP的组合来检测角膜营养不良。在一些实施方案中，经由例如检测格子状营养不良相关的SNP与阿维利诺角膜营养不良相关的SNP、颗粒状角膜营养不良相关的SNP、Reis-Buckler角膜营养不良相关的SNP、和/或Thiel-Behnke角膜营养不良相关的SNP的组合来检测角膜营养不良。在一些实施方案中，经由例如检测Reis-Buckler角膜营养不良相关的SNP与阿维利诺角膜营养不良相关的SNP、颗粒状角膜营养不良相关的SNP、格子状营养不良相关的SNP、和/或Thiel-Behnke角膜营养不良相关的SNP的组合来检测角膜营养不良。在一些实施方案中，经由例如检测Thiel-Behnke角膜营养不良相关的SNP与阿维利诺角膜营养不良相关的SNP、颗粒状角膜营养不良相关的SNP、格子状营养不良相关的SNP、和/或Reis-Buckler角膜营养不良相关的SNP的组合来检测角膜营养不良。
在一些实施方案中，经由例如检测选自阿维利诺角膜营养不良相关的SNP的2,3,4,5和/或6种SNP来检测角膜营养不良。在一些实施方案中，所述SNP包括导致人TGFβI基因编码的多肽的位置124,555和/或626处突变的SNP。这些突变包括导致TGFβI基因中R124突变的那些(包括例如但不限于由TGFβI基因的核苷酸418处的G至A转换导致的R124H突变，也称为C(G/A)C SNP)，颗粒状角膜营养不良相关的SNP，如导致TGFβI基因中R555突变的那些(包括例如但不限于由TGFβI基因的核苷酸1663处的C至T转换导致的R555W突变，也称为(C/T)GG SNP)，格子状营养不良相关的SNP，如导致TGFβI基因中R124突变的那些(包括例如但不限于由TGFβI基因的核苷酸417处的C至T转换导致的R124C突变，也称为(C/T)GC SNP)，Reis-Buckler角膜营养不良相关的SNP，如导致TGFβI基因中R124突变的那些(包括例如但不限于由TGFβI基因的核苷酸418处的G至T转换导致的R124L突变，也称为C(G/T)C SNP)和/或Thiel-Behnke角膜营养不良相关的SNP，如导致TGFβI基因中R555突变的那些(包括例如但不限于由TGFβI基因的核苷酸1664处的G至A转换导致的R555Q突变，也称为C(G/A)GSNP)。在一些实施方案中，经由例如以下的检测来检测角膜营养不良：阿维利诺角膜营养不良相关的SNP，如导致TGFβI基因中R124突变的那些(包括例如但不限于由TGFβI基因的核苷酸418处的G至A转换导致的R124H突变，也称为C(G/A)C SNP)与颗粒状角膜营养不良相关的SNP，如导致TGFβI基因中R555突变的那些(包括例如但不限于由TGFβI基因的核苷酸1663处的C至T转换导致的R555W突变，也称为(C/T)GG SNP)的组合。在一些实施方案中，经由例如以下的检测来检测角膜营养不良：阿维利诺角膜营养不良相关的SNP，如导致TGFβI基因中H626P突变的那些(包括例如但不限于由TGFβI基因的核苷酸1924处的A到C转换导致的H626P突变)。
在一些实施方案中，经由例如R124C,R124H,R124L,R555W,R555Q和/或H626P中2,3,4,5和/或6种的检测来检测角膜营养不良。在一些实施方案中，经由例如R124C,R124H,R124L,R555W和/或R555Q中2,3,4和/或5种的检测来检测角膜营养不良。在一些实施方案中，经由例如检测R124C与R124H,R124L,R555W和/或R555Q中一种或多种的组合来检测角膜营养不良。在一些实施方案中，经由例如检测R124H与R124C,R124L,R555W和/或R555Q中一种或多种的组合来检测角膜营养不良。在一些实施方案中，经由例如检测R555W与R124C,R124H,R124L和/或R555Q中一种或多种的组合来检测角膜营养不良。在一些实施方案中，经由例如检测R555Q与R124C,R124H,R124L和/或R555W中一种或多种的组合来检测角膜营养不良。在一些实施方案中，检测R124H与R555W的组合。在一些实施方案中，经由例如检测H262P与R124C,R124H,R124L,R555W和/或R555Q中一种或多种的组合来检测角膜营养不良。在一些实施方案中，R124C,R124H,R124L,R555W和/或R555Q都检测。在一些实施方案中，R124C,R124H,R124L,R555W,R555Q和/或H626P都检测。
VIII.诊断试剂盒
在一些实施方案中，将上文描述的任何或所有试剂包装到诊断试剂盒中。这类试剂盒包括本文中描述的，以任意组合的任何和/或所有的引物、探针、缓冲剂、和/或其他试剂。在一些实施方案中，该试剂盒包含用于检测R124C,R124H,R124L,R555W,R555Q和/或H626P中的2,3,4,5和/或6种的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R124C,R124H,R124L,R555W和R555Q中的2,3,4,和/或5种的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R124C,R124H和R124L的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R555W和R555Q的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R124C的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R124H的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R124L。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R555W的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R555Q的试剂。
在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R124C,R124H,R124L,R555W,R555Q和/或H626P中2,3,4,5和/或6种的引物和探针。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R124C,R124H,R124L,R555W和R555Q中2,3,4,和/或5种的引物和探针。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R124C,R124H和R124L的引物和探针。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R555W和R555Q的引物和探针。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R124C的引物和探针。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R124H的引物和探针。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R124L的引物和探针。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R555W的引物和探针。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R555Q的引物和探针。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测H626P的引物和探针。
在一些实施方案中，试剂盒中的试剂作为冻干粉末纳入。在一些实施方案中，试剂盒中的试剂作为冻干粉末纳入，并有重建的用法说明。在一些实施方案中，试剂盒中的试剂作为液体纳入。在一些实施方案中，试剂包含在塑料和/或玻璃管形瓶或其他适宜容器中。在一些实施方案中，引物和探针均含有在试剂盒中的各个容器中。在一些实施方案中，将引物一起包装在一个容器中，而将探针一起包装在另一个容器中。在一些实施方案中，将引物和探针一起包装在单个容器中。
在一些实施方案中，试剂盒还包括对照gDNA和/或DNA样品。在一些实施方案中，包含的对照DNA样品是TGFBI R124正常的。在一些实施方案中，包含的对照DNA样品对应于所检测的突变，包括R124C,R124H,R124L,R555W,R555Q和/或H626P。在一些实施方案中，纳入对应于TGFBI R124正常的对照DNA样品，和对应于R124C,R124H,R124L,R555W,R555Q和/或H626P的突变DNA样品。在一些实施方案中，纳入对应于TGFBI R124正常的对照DNA样品，和对应于R124C,R124H,R124L,R555W和/或R555Q的突变DNA样品。在一些实施方案中，纳入对应于TGFBI R124正常的对照DNA样品，和对应于R124C,R124H和/或R124L的突变DNA样品。在一些实施方案中，纳入对应于TGFBI R124正常的对照DNA样品，和对应于R555W和/或R555Q的突变DNA样品。在一些实施方案中，纳入对应于TGFBI R124正常的对照DNA样品，和对应于R124C的突变DNA样品。在一些实施方案中，纳入对应于TGFBI R124正常DNA的对照DNA样品，和对应于R124H的突变DNA样品。在一些实施方案中，纳入对应于TGFBI R124正常的对照DNA样品，和对应于R124L的突变DNA样品。在一些实施方案中，纳入对应于TGFBI R124正常的对照DNA样品，和对应于R555W的突变DNA样品。在一些实施方案中，纳入对应于TGFBI R124正常的对照DNA样品，和对应于R555Q的突变DNA样品。在一些实施方案中，纳入对应于TGFBIR124正常的对照DNA样品，和对应于H626P的突变DNA样品。在一些实施方案中，对照DNA样品的浓度是5ng/μL,10ng/μL,20ng/μL,30ng/μL,40ng/μL,50ng/μL,60ng/μL,70ng/μL,80ng/μL,90ng/μL,100ng/μL,110ng/μL,120ng/μL,130ng/μL,140ng/μL,150ng/μL,160ng/μL,170ng/μL,180ng/μL,190ng/μL或200ng/μL。在一些实施方案中，对照DNA样品的浓度是50ng/μL,100ng/μL,150ng/μL或200ng/μL。在一些实施方案中，对照DNA样品的浓度是100ng/μL。在一些实施方案中，对照DNA样品具有相同的浓度。在一些实施方案中，对照DNA样品具有不同的浓度。
在一些实施方案中，试剂盒可进一步包含缓冲剂，例如GTXpress
Figure BDA0003100721440000431
试剂混合物或任何等同缓冲剂。在一些实施方案中，缓冲剂包括本文描述的任何缓冲剂。
在一些实施方案中，试剂盒可进一步包含用于克隆的试剂，如载体(包括例如M13载体)。
在一些实施方案中，试剂盒进一步包含用于DNA纯化的试剂。
在一些实施方案中，试剂盒进一步包含用于使用试剂盒来检测受试者中角膜营养不良的用法说明书。在一些实施方案中，这些用法说明书包含本文描述的方案的多个方面。
实施例
实施例1：DNA提取(DNA Extract All Reagents,ThermoFisher)
如下文描述的且依照本文提供的公开内容从口腔上皮或发根或全血提取DNA。
对于从口腔上皮或发根的DNA提取，首先将样品在1X PBS 300μL中预处理。接着，向管添加30μL裂解溶液并涡旋振荡混合物。然后将混合物在95℃温育3min。然后，添加30μL的DNA稳定溶液(来自Life Technologies/Thermo Scientific,USA)并涡旋振荡混合物。接着将混合物以13,000RPM离心1min。
对于从全血的DNA提取，以3μL全血开始，首先将样品在1X PBS 300μL中预处理。接着，向管添加30μL裂解溶液并涡旋振荡混合物。然后将混合物在95℃温育3min。然后，添加30μL的DNA稳定溶液(来自Life Technologies/Thermo Scientific,USA)并涡旋振荡混合物。接着将混合物以13,000RPM离心1min。
在完成上述规程后，使用商品化
Figure BDA0003100721440000442
200PRO NanoQuant的读出DNA浓度。为了定量，将100μL的洗脱液移液到透明的96孔板中。接着，向孔H12添加100μL制备的空白溶液。然后使用与NanoQuant提供的制造商指导来读出浓度。
使用下文表5和6种描述的探针和引物来制备反应混合物。
表5：探针序列
Figure BDA0003100721440000441
表6：引物序列
引物 序列
TGFBI 124 F(SEQ ID NO:1) TCC ACC ACC ACT CAG CTG TA
TGFBI 124 R(SEQ ID NO:2) CCA TCT CAG GCC TCA GCT T
TGFBI 555 F(SEQ ID NO:43) ACA CAG TCT TTG CTC CCA CAA A
TGFBI 555 R(SEQ ID NO:44) ACT TAA GTT GGT CTT TAC CCA AGA GTC T
用于例示性反应混合物中的组分和比率显示于下文表7中。
表7：反应混合物
Figure BDA0003100721440000451
例示性PCR循环条件显示于下文表8中。
表8：PCR循环
Figure BDA0003100721440000452
使用上文方案来生成图4-8中提供的实时PCR数据。
参考
所有标题和节段命名仅用于清楚和参考目的且不意图以任何方式限制。例如，本领域技术人员会领会根据本文中描述的发明的精神和范围在适宜时从不同的标题组合多个方面的有用性。
本文中引用的所有参考文献通过提述完整并入本文并用于所有目的，其程度如同每个公开文本或专利或专利申请具体地且分别地通过提述完整并入用于所有目的的。
可以进行对本申请的许多修改和变化而不背离其精神和范围，如对于本领域技术人员将是明显的。本文描述的具体实施方案和实例仅通过例子提供，且本申请仅由所附权利要求的项以及权利要求所赋予的等同物的完整范围限制。
本发明提供了以下内容：
1.用于检测来自受试者的样品中与角膜营养不良有关的至少两种基因组等位基因的方法，所述方法包括：
(A)提供受试者的上皮细胞，其附着于基片的尖端；
(B)在裂解溶液中搅动该基片的该尖端，所述裂解溶液裂解附着于该基片的细胞；
(C)在完成(B)搅动时，从所述裂解溶液移出该基片；
(D)在(C)移出后温育该裂解溶液；
(E)从所述裂解溶液分离基因组DNA以形成gDNA溶液；和
(F)使用至少两种寡核苷酸引物对和该gDNA溶液确定TGFβI基因中存在的至少两个核苷酸的身份，其中所述至少两个核苷酸位于TGFβI基因的分别的独立的位置处，所述位置对应于与角膜营养不良有关的分别的独立的单核苷酸多态性(SNP)。
2.根据项1的方法，其中所述TGFβI基因中存在的至少两个核苷酸在人基因组中相隔至少一个核苷酸。
3.根据前述项中任一项的方法，其中所述至少两种寡核苷酸引物对的至少一对包含正向PCR引物和反向PCR引物，所述正向PCR引物具有包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列，所述反向PCR引物具有包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
4.根据前述项中任一项的方法，其中所述至少两种寡核苷酸引物对的至少一对包含正向PCR引物和反向PCR引物，所述正向PCR引物具有包含SEQ ID NO:43的核苷酸序列，所述反向PCR引物具有包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列。
5.根据前述项中任一项的方法，其中所述至少两种寡核苷酸引物对包含第一扩增引物对和第二扩增引物对，其中:
所述第一扩增引物对包含正向PCR引物和反向PCR引物，所述正向PCR引物具有包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列，所述反向PCR引物具有包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列；和
所述第二扩增引物对包含正向PCR引物和反向PCR引物，所述正向PCR引物具有包含SEQ ID NO:43的核苷酸序列，所述反向PCR引物具有包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列。
6.根据前述项中任一项的方法，其中所述(F)确定进一步包括使用：
(i)具有包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列的第一野生型检测探针，和具有包含SEQID NO:26,SEQ ID NO:48,或SEQ ID NO:49的核苷酸序列的第一突变体检测探针；和
(ii)具有包含SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47的核苷酸序列的第二野生型检测探针，和具有包含SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:50的核苷酸序列的第二突变体检测探针。
7.用于检测角膜营养不良的方法，包括：
(A)使用包含至少第一扩增引物对和至少第二扩增引物对的反应混合物从来自人受试者的生物样品扩增至少两种TGFβI基因序列，包括第一TGFβI基因序列和第二TGFβI基因序列，所述第一TGFβI基因序列包含编码氨基酸残基124的核苷酸，所述第二TGFβI基因序列包含编码氨基酸残基555的核苷酸；(B)将第一检测寡核苷酸探针对的第一检测探针杂交至所述第一TGFβI基因序列；
(C)将第二检测寡核苷酸探针对的第二检测探针杂交至所述第二TGFβI基因序列；和
(D)基于至少两种检测探针对的使用检测第一TGFβI基因序列和/或第二TGFβI基因序列中的一个或多个突变，所述至少两种检测探针对包括第一检测寡核苷酸探针对和第二检测寡核苷酸探针对。
8.根据项7的方法，其中检测第一TGFβI基因序列和/或第二TGFβI基因序列中的一个或多个突变包括检测所述第一TGFβI基因序列和/或所述第二TGFβI基因序列中的两个或更多个突变，且所述两个或更多个突变在人基因组中相隔至少一个核苷酸。
9.根据项7或8的方法，其中所述至少第一扩增引物对包含第一扩增引物和第二扩增引物，其中所述第一扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:1且其中所述第二扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:2。
10.根据项7-9中任一项的方法，其中所述至少第二扩增引物对包含第三扩增引物和第四扩增引物，其中所述第三扩增引物由核苷酸序列SEQ ID NO:43所示且其中所述第四扩增引物由核苷酸序列SEQ ID NO:44所示。
11.根据项7或8的方法，其中：
所述第一扩增引物对包含第一扩增引物和第二扩增引物，
所述第一扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:1，
所述第二扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:2，
所述第二扩增引物对包含第三扩增引物和第四扩增引物，
所述第三扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:43，和
所述第四扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:44。
12.根据项7-11中任一项的方法，其中所述一个或多个突变之一对应于在编码的TGFBI蛋白中，在氨基酸124处，精氨酸突变为半胱氨酸(R124C)，精氨酸突变为组氨酸(R124H)，和/或精氨酸突变为亮氨酸(R124L)。
13.根据项7-12中任一项的方法，其中所述一个或多个突变之一对应于在编码的TGFBI蛋白中，在氨基酸555处，精氨酸突变为色氨酸(R555W)和/或精氨酸突变为谷氨酰胺(R555Q)。
14.根据项7-13中任一项的方法，其中所述至少两种检测寡核苷酸探针对的每种各自包括第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和所述第二检测寡核苷酸探针包含各自选自下组的核苷酸序列对：SEQ ID NOs:25-26，SEQ ID NOs:25和48，SEQ ID NOs:25和49，SEQ ID NOs:27-28，SEQ ID NOs:29-30，SEQ IDNOs:31-32，SEQ ID NOs:33-34，SEQ ID NOs:35-36，SEQ ID NOs:37-38，SEQ ID NOs:39-40，SEQ ID NOs:41-42，SEQ ID NOs:45-46和SEQ ID NOs:46-47，SEQ ID NOs:45和50，和SEQ ID NOs:47和50。
15.根据项7-14中任一项的方法，其中所述第一检测寡核苷酸探针对包含第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和所述第二检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26。
16.根据项7-15中任一项的方法，其中所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和所述第四检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46。
17.根据项7-15中任一项的方法，其中所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和所述第四检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:46。
18.根据项7-15中任一项的方法，其中所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和所述第四检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:48。
19.根据项7-15中任一项的方法，其中所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:49。
20.根据项7-15中任一项的方法，其中所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和所述第四检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:50。
21.根据项7-15中任一项的方法，其中所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和所述第四检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:50。
22.根据项7-21中任一项的方法，其中所述第一检测探针与第一标记物偶联且所述第二检测探针与第二标记物偶联。
23.根据项22的方法，其中所述第一标记物是VIC且所述第二标记物是FAM。
24.项7的方法，其中(B)杂交和(C)杂交在相同溶液中同时实施。
25.项7的方法，其中所述(B)杂交和(C)杂交在相同溶液或不同溶液中同时或在不同时间实施。
26.用于检测人受试者中的角膜营养不良的反应混合物，所述反应混合物包含：
(A)至少第一扩增引物对和第二扩增引物对，其用于扩增和确定(1)来自该受试者的生物样品的至少两种TGFβI基因序列的第一TGFβI基因序列，其包含编码氨基酸残基124的核苷酸，和(2)来自该受试者的生物样品的至少两种TGFβI基因序列的第二TGFβI基因序列，其包含编码氨基酸残基555的核苷酸；和
(B)至少两种检测探针对，其中所述至少两种检测探针对的每种中的检测探针与所述至少两种TGFβI基因序列的至少一种杂交。
27.根据项26的反应混合物，其中所述第一扩增引物对包含第一扩增引物和第二扩增引物，所述第一扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:1，且所述第二扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:2。
28.根据项26或27的反应混合物，其中所述第二扩增引物对包含第三扩增引物和第四扩增引物，所述第三扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:43，且所述第四扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:44。
29.根据项26-28中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针对的至少一种用于检测对应于编码的TGFBI蛋白中的以下突变：在氨基酸124处，精氨酸突变为半胱氨酸(R124C)，精氨酸突变为组氨酸(R124H)，和/或精氨酸突变为亮氨酸(R124L)。
30.根据项26-29中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针对的至少一种用于检测对应于编码的TGFBI蛋白中的以下突变：在氨基酸555处，精氨酸突变为色氨酸(R555W)和/或精氨酸突变为谷氨酰胺(R555Q)。
31.根据项26-30中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针对的分别的检测探针对各自包括第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针包含各自选自下组的核苷酸序列对：SEQ ID NOs:25-26，SEQ ID NOs:25和48，SEQ ID NOs:25和49，SEQ ID NOs:27-28，SEQ ID NOs:29-30，SEQ ID NOs:31-32，SEQ ID NOs:33-34，SEQ ID NOs:35-36，SEQ ID NOs:37-38，SEQ IDNOs:39-40，SEQ ID NOs:41-42，SEQ ID NOs:45-46和SEQ ID NOs:46-47，SEQ ID NOs:45和50，和SEQ ID NOs:47和50。
32.根据项26-31中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针对之一包含第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和所述第二检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26。
33.根据项26-32中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针对之一包含第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46。
34.根据项26-32中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针对之一包含第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和所述第二检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:46。
35.根据项26-34中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针对之一包含第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和所述第二检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:48。
36.根据项26-35中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针对之一包含第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和所述第二检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:49。
37.根据项24-36中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针对之一包含第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和所述第二检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:50。
38.根据项24-36中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针对之一包含第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和所述第二检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:50。
39.根据项26-38中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针的第一检测探针与第一标记物偶联且所述至少两种检测探针的第二检测探针与第二标记物偶联。
40.根据项39的反应混合物，其中所述第一标记物是VIC且所述第二标记物是FAM。
41.用于检测人受试者中的角膜营养不良的反应混合物，所述反应混合物包含：
(A)至少第一扩增引物对，其用于扩增和确定来自该受试者的生物样品的TGFβI基因序列；和
(B)至少三种检测探针的组，其中所述至少三种检测探针的组的一种检测探针在暴露于所述TGFβI基因序列时与所述TGFβI基因序列杂交。
42.根据项41的反应混合物，其中所述TGFβI基因序列包含来自该受试者的生物样品的编码氨基酸残基124的核苷酸。
43.根据项41或42的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的组包括选自下组的至少一种检测探针：SEQ ID NOs:25-42和48-49。
44.根据项41-43中任一项的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的组包括选自下组的至少两种或更多种检测探针：SEQ ID NOs:25-42和48-49。
45.根据项41-44中任一项的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的组包括选自下组的至少三种或更多种检测探针：SEQ ID NOs:25-42和48-49。
46.根据项41-45中任一项的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的组包括第一检测探针SEQ ID NO:25和第二检测探针SEQ ID NO:26。
47.根据项46的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的组包括选自下组的第三检测探针：SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49。
48.根据项47的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的组包括不同于所述第三检测探针且选自下组的第四检测探针：SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49。
49.根据项41-45中任一项的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的组包括选自下组的两种或更多种检测探针：SEQ ID NOs:26和48-49。
50.根据项41-49中任一项的反应混合物，其中所述第一扩增引物对包含第一扩增引物和第二扩增引物，所述第一扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:1，且所述第二扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:2。
51.根据项41-50中任一项的反应混合物，还包含：
(C)至少第二扩增引物对，其用于扩增和确定来自所述生物样品的第二TGFβI基因序列；和
(D)至少三种检测探针的第二组，其中所述至少三种检测探针的第二组的一种检测探针在暴露于所述第二TGFβI基因序列时与所述第二TGFβI基因序列杂交。
52.根据项51的反应混合物，其中所述第二TGFβI基因序列包含来自该受试者的生物样品的编码氨基酸残基555的核苷酸。
53.根据项51或52的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的第二组包括选自下组的至少一种检测探针：SEQ ID NOs:45-47和50。
54.根据项51-53中任一项的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的第二组包括选自下组的至少两种或更多种检测探针：SEQ ID NOs:45-47和50。
55.根据项51-54中任一项的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的第二组包括选自下组的至少三种或更多种检测探针：SEQ ID NOs:45-47和50。
56.根据项51-55中任一项的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的第二组包括：第一检测探针，其为SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47，第二检测探针，其为SEQ ID NO:46，和第三检测探针，其为SEQ ID NO:50。
57.根据项51-56中任一项的反应混合物，其中所述第二扩增引物对包含第三扩增引物和第四扩增引物，所述第三扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:43，和第四扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:44。
58.根据项41的反应混合物，其中所述TGFβI基因序列包含来自该受试者的生物样品的编码氨基酸残基555的核苷酸。
59.根据项41或58的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的组包括选自下组的至少一种检测探针：SEQ ID NOs:45-47和50。
60.根据项41和58-59中任一项的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的组包括选自下组的至少两种或更多种检测探针：SEQ ID NOs:45-47和50。
61.根据项41和58-60中任一项的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的组包括选自下组的至少三种或更多种检测探针：SEQ ID NOs:45-47和50。
62.根据项41和58-61中任一项的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的组包括：第一检测探针，其为SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47，第二检测探针，其为SEQ ID NO:46，和第三检测探针，其为SEQ ID NO:50。
63.用于检测角膜营养不良的方法，包括：
(A-1)使用包含至少第一扩增引物对和至少三种检测探针的组的反应混合物，从来自人受试者的生物样品扩增第一TGFβI基因序列；
(B-1)将所述至少三种检测探针的组的第一检测探针与所述第一TGFβI基因序列杂交；并
(C-1)基于以下检测所述第一TGFβI基因序列中的突变：(i)所述至少三种检测探针的组的第一检测探针杂交于所述第一TGFβI基因序列，和(ii)所述至少三种检测探针的组的第二和第三检测探针与第一TGFβI基因序列杂交的失败。
64.根据项63的方法，其中所述反应混合物包含如项41-50和58-62的任一项中记载的反应混合物。
65.根据项63或64的方法，进一步包括：
(A-2)使用相同反应混合物从所述生物样品扩增第二TGFβI基因序列，其中所述反应混合物包含至少第二扩增引物对和至少三种检测探针的第二组；
(B-2)将所述至少三种检测探针的第二组的第一检测探针与所述第二TGFβI基因序列杂交；并
(C-2)基于以下检测所述第二TGFβI基因序列中的突变：(i)所述至少三种检测探针的第二组的第一检测探针杂交于所述第二TGFβI基因序列，和(ii)所述至少三种检测探针的第二组的第二和第三检测探针与所述第二TGFβI基因序列杂交的失败。
66.根据项65的方法，其中所述反应混合物包含如项51-57的任一项中记载的反应混合物。
67.根据项65或66的方法，其中所述扩增(A-1)，扩增(A-2)，杂交(B-1)，杂交(B-2)，检测(C-1)，和检测(C-2)用生物样品的同一等分试样实施。
68.根据项65-67中任一项的方法，其中所述扩增第一TGFβI基因序列(A-1)和扩增第二TGFβI基因序列(A-2)同时实施。
69.根据项65-68中任一项的方法，其中所述杂交(B-1)和杂交(B-2)同时实施。
70.根据项65-69中任一项的方法，其中所述检测(C-1)和检测(C-2)同时实施。
71.如项7-70的任一项中记载的反应混合物用于预测受试者中在激光眼科手术后的并发症的风险的用途，所述预测经由检测人受试者中的杂合角膜营养不良进行。
72.根据项71的用途，其中所述激光眼科手术包括Lasik和Excimer激光手术之一。
73.用于检测来自人受试者的样品中与角膜营养不良有关的基因组突变的方法，该方法包括：
(A)提供受试者的上皮细胞，其附着于基片的尖端；
(B)在裂解溶液中搅动该基片的该尖端，所述裂解溶液裂解附着于该基片的细胞；
(C)在完成(B)搅动时，从裂解溶液移出该基片；
(D)在(C)移出后温育该裂解溶液；
(E)从裂解溶液分离基因组DNA以形成gDNA溶液；和
(F)使用至少第一引物对、至少三种检测探针的组和该gDNA溶液，通过将该gDNA溶液同时暴露于所述至少三种检测探针，确定所述TGFβI基因中存在的至少一个核苷酸的身份，其中：
所述至少一个核苷酸位于所述TGFβI基因的特定的位置处，所述位置对应于与角膜营养不良有关的单核苷酸多态性(SNP)，且
所述至少三种检测探针的组的至少两种检测探针的每种配置为检测所述TGFβI基因的特定位置处的不同突变。
74.根据项73的方法，进一步包括：
(G)使用至少第二引物对、至少三种检测探针的第二组和该gDNA溶液，通过将该gDNA溶液同时暴露于所述至少三种检测探针的组和所述至少三种检测探针的第二组，确定所述TGFβI基因中存在的至少第二核苷酸的身份，其中：
所述至少第二核苷酸位于所述TGFβI基因的独立于所述至少一个核苷酸的位置的第二特定位置处，所述第二特定位置对应于与角膜营养不良有关的第二单核苷酸多态性(SNP)，且
所述至少三种检测探针的第二组的至少两种检测探针配置为检测所述TGFβI基因的第二特定位置处的分别的突变。
75.根据项75的方法，其中所述确定(F)和确定(G)同时实施。
76.根据项74或75的方法，其中所述确定(F)和确定(G)使用同一gDNA溶液实施。
TGFβI基因序列(NCBI参考号NG_012646.1):
Figure BDA0003100721440000561
Figure BDA0003100721440000571
Figure BDA0003100721440000581
Figure BDA0003100721440000591
Figure BDA0003100721440000601
Figure BDA0003100721440000611
Figure BDA0003100721440000621
Figure BDA0003100721440000631
Figure BDA0003100721440000641
Figure BDA0003100721440000651
TGFβI基因蛋白产物(βIG-H3蛋白序列；NCBI参考号NG_012646.1):
MALFVRLLALALALALGPAATLAGPAKSPYQLVLQHSRLRGRQHGPNVCAVQKVIGTNRKYFTNCKQWYQRKICGKSTVISYECCPGYEKVPGEKGCPAALPLSNLYETLGVVGSTTTQLYTDRTEKLRPEMEGPGSFTIFAPSNEAWASLPAEVLDSLVSNVNIELLNALRYHMVGRRVLTDELKHGMTLTSMYQNSNIQIHHYPNGIVTVNCARLLKADHHATNGVVHLIDKVISTITNNIQQIIEIEDTFETLRAAVAASGLNTMLEGNGQYTLLAPTNEAFEKIPSETLNRILGDPEALRDLLNNHILKSAMCAEAIVAGLSVETLEGTTLEVGCSGDMLTINGKAIISNKDILATNGVIHYIDELLIPDSAKTLFELAAESDVSTAIDLFRQAGLGNHLSGSERLTLLAPLNSVFKDGTPPIDAHTRNLLRNHIIKDQLASKYLYHGQTLETLGGKKLRVFVYRNSLCIENSCIAAHDKRGRYGTLFTMDRVLTPPMGTVMDVLKGDNRFSMLVAAIQSAGLTETLNREGVYTVFAPTNEAFRALPPRERSRLLGDAKELANILKYHIGDEILVSGGIGALVRLKSLQGDKLEVSLKNNVVSVNKEPVAEPDIMATNGVVHVITNVLQPPANRPQERGDELADSALEIFKQASAFSRASQRSVRLAPVYQKLLERMKH
序列表
<110> 阿维利诺美国实验室股份有限公司
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<151> 2013-11-15
<160> 52
<170> Patentin version 3.2
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 1
tccaccacca ctcagctgta20
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 2
ccatctcagg cctcagctt19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 3
tgcagcccta ccactctcaa20
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 4
aggcctcgtt gctagg16
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
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tagtctctta ttctaataga 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 6
gctgcagact ctgtgtttaa 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 7
ccatccctcc ttctgtcttc tg22
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 8
cgggcccctc catctc16
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 9
cagagaaggg agggtgtggt t21
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 10
gggcgaagat ggtgaagct19
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 11
tcctcgtcct ctccacctgt a21
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 12
agctggcaag gaggccc17
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 13
tttgggcttt cccacatgc19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 14
ggcagacgga ggtcatctca20
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 15
gtagtaccgt gctctctg18
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 16
agttccccat aagaatcccc c21
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 17
ggctggaccc ccagagg17
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 18
acccctcggg gaagtaagg19
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 19
aacctttacg agaccctggg a21
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 20
gactcccatc catcatgccc20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 21
agtcgttgga tccaccacca20
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 22
gacgtcattt cctactgttt cagg24
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 23
ccccccagaa acagcctg18
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 24
ttctaagggg ttaaggagaa agctt25
<210> 25
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探针
<400> 25
cacggaccgc acgga15
<210> 26
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探针
<400> 26
cacggaccac acgga15
<210> 27
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探针
<400> 27
acacggaccg cacg14
<210> 28
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探针
<400> 28
acacggacca cacg14
<210> 29
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探针
<400> 29
tacacggacc gca13
<210> 30
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探针
<400> 30
tacacggacc aca13
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探针
<400> 31
ctgtacacgg accgcacg18
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探针
<400> 32
ctgtacacgg accacacg18
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探针
<400> 33
ctgtacacgg accgcacgga g21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探针
<400> 34
ctgtacacgg accacacgga g21
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探针
<400> 35
gctgtacacg gaccgcacgg agaa24
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探针
<400> 36
gctgtacacg gaccacacgg agaa24
<210> 37
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探针
<400> 37
accgcacgga gaagc15
<210> 38
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探针
<400> 38
accacacgga gaagc15
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探针
<400> 39
accgcacgga gaagctgagg c21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探针
<400> 40
accacacgga gaagctgagg c 21
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探针
<400> 41
accgcacgga gaagctgagg cctg 24
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探针
<400> 42
accacacgga gaagctgagg cctg 24
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 43
acacagtctt tgctcccaca aa 22
<210> 44
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
acttaagttg gtctttaccc aagagtct 28
<210> 45
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 正常探针 10
<400> 45
Val Ile Cys Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Cys Gly
1 5 10 15
Gly Ala Asn Phe Gln
20
<210> 46
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变探针10
<400> 46
Phe Ala Met Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Gly Asn Phe Gln
20
<210> 47
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 正常探针 10a
<400> 47
Val Ile Cys Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Cys Gly
1 5 10 15
Gly Ala Gly Asn Phe Gln
20
<210> 48
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #TGFBI R124C
<400> 48
Phe Ala Met Cys Ala Cys Gly Gly Ala Cys Thr Gly Cys Ala Cys Gly
1 5 10 15
Gly Ala Asn Phe Gln
20
<210> 49
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #TGFBI R124L
<400> 49
Phe Ala Met Cys Ala Cys Gly Gly Ala Cys Cys Thr Cys Ala Cys Gly
1 5 10 15
Gly Ala Asn Phe Gln
20
<210> 50
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #TGFBI R555Q-1
<400> 50
Phe Ala Met Ala Cys Cys Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Cys Ala Gly
1 5 10 15
Ala Gly Asn Phe Gln
20
<210> 51
<211> 34810
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因序列
<400> 51
gcttgcccgt cggtcgctag ctcgctcggt gcgcgtcgtc ccgctccatg gcgctcttcg 60
tgcggctgct ggctctcgcc ctggctctgg ccctgggccc cgccgcgacc ctggcgggtc 120
ccgccaagtc gccctaccag ctggtgctgc agcacagcag gctccggggc cgccagcacg 180
ggtaagccga gccgcctggc caggggctgc ggaaggtcag gtagtcgggg ctcggagcgc 240
aagccgctgg gggcattgaa ctgggctggg ggcgcagggg acaaagcccg aactaaaaac 300
cttgcagcat ggagcgctcg gacaccagcc ctgcacgcgg tggaaggaga gagggaggga 360
ggtggaggac catggaggga aagcgggagg ccgccgcttt gtagaaggga gtggggaagt 420
ggaccagaga ctttcgacgc aggccaagag cctgagacgg acagcgcttt cagcttctcc 480
tcccagccac tgcagaaagg gggaaatggc aactctttgg ccataatcac cgtgggaggg 540
tgccaagggc aaagcccacc cagcagtaca cctattccaa cccagccagg cccccggcca 600
gcgactccag acaagaacct gggccacaca cggtggcagc atctaaggtg ccccaggctc 660
ctgtgctcct ggccaggccc tgcactcaga cactgctggc acccgacact gctctctggg 720
tacagcaagg gcaatgtggc acttcttgtc ctgcccgatg aagagcagga gaatgcactg 780
ggccctcaca cacactgttc aaatggggaa actgagtcct gagtggttcc actttcccac 840
agtcctgaag tgtgcactgg agccaggatt ggagtctgtc ttaaagtaat agctgggttt 900
gtaaatgtag gacactatca ttgcaggaat tcctttgaga ccctgaagat gtgttggctt 960
taggagacaa actcaagcag aaggtctggt ctgatagtgg ccctaatact gacccaggca 1020
gaggcaggca acatttctac ctcaaaaacc aggccatacc tgcgtcacaa atacccaggc 1080
tttgctgcag cttccagcct acctggttgc accaacttct ttttcataac taggtaaaac 1140
tatatatgag tagaatcttg tagtgactcc tcagaggaag cctaaatacc atcggggtct 1200
ggcgttcaca cccacaagca atgcccaaac ctccaagaga ctgggcagat ctgtgctcaa 1260
atcaaaactc attgttgggg gtgatagagt tgacttcaca ggccctgaaa gtcttggctc 1320
cttgcactag gagtgctctg ggtacgggta caggctgccc cttgtagggc atagttgctc 1380
ttgtttcctc tacttgtggc tttatggtct aggcctttca ggagtttggg gctctggcgg 1440
agagggcctg ctgggagcac atctggccac cctgcagagt gaaatcaaac caggcctggc 1500
tgcaacctca acaccctcct ggaaagagga gaatactggg gatatcctgg ggtctttctg 1560
gaagtgggag aatcagcttt gacttgggca gtgtgcagaa tagagtgagg ggggatgtca 1620
gaaagatgag agggatatga ggcctcaaca tcaaaatgca agcacctggc atttttatta 1680
tctctgccca cctctccgtt ggtctctctg cctttcctgc caatgaattg tgttatgttt 1740
gggtgcctca atttgcctag gagggttcta tttcttctgt atcttcgcca ctaagtcagg 1800
agaagatcct tatagcatgc cctgcaacag tgtcacctgt aagggcatct ctctgcacag 1860
ccacagtgaa ggatcctcaa aggtattgag ggctttccat caagagccat ctttacagca 1920
aacctctttc ccttcagagc ccagaagagt gctgaccagc tggaaaacag ggtttttttc 1980
ttaaatgcag atgctcttga ttatgagttc cagatattag atcaacttcc ccaccatacc 2040
cctgcaggca aagcctctta attagcttcc tgcagcacag ctggaaaggc ctattgtaat 2100
ctgtgatggg cagagtaatc taagaagtca caggagcacc cctgtcccag tagaatctgg 2160
atgcgcaggc acatgaacca tggcaaaatg gttgcaggca cagttgtatt tactctgatc 2220
taactgtccc tgttaatgcc acagggctgc ctggcctggc acacagggct gtggcgcctt 2280
gtgcaaatgg ataacgttgt tctagctcca gcctttcatt caaagtgaaa actgttagaa 2340
agggaaggaa aactttgcta ttttaaggaa ttgtagcgtg ctgcctgata tgaaggaaga 2400
aataacagct gtgccttgct tgtgcgcagc actcgattgc cgcttttgct ttcgacctca 2460
ccacaacaca gtgagatcta ctgttcatgt tcccatttta caggaggtga aactgcagct 2520
tagtgaggta gagagtgact tagttcagac acagaatgct gttgggagag taataactat 2580
gatatggtct cttgactccc agctatatct gtgttgctat agggaagggg aaaaataata 2640
ctgaaagaga agtaaaaata caatcacact tccaaacatc aaccaccaaa aactgaactg 2700
aatttcctga agcacttggt tttcaaatct aagctgaaca tcaatgctgt tattcttgag 2760
gcccagaagc aacttgctca tttcaattaa gcttcagcat gaacttccta tgtacacagc 2820
ccacccacac tccccgatgt gagaaggaga gggtcacagc cgcccccagc ctctgctgct 2880
gccacaagga cagcagcagt ggaaacattc agcaaaggaa tgttggagcc acatccacaa 2940
gagactcact gaagattcgc caaacgccta cggaaagtgg cagggaattc attgacagta 3000
attgtttcct gcttgatcag attgaagagc ttctgggatt ctgtaacaat aaataggacc 3060
gggggctgga gtatggccag caaggactct tcaggggtta ttcagggact gtctaacctg 3120
tgaatcctag gcagcaaaca gaaaccaggt attcagaaat ctggaggatt tggtcaggcc 3180
cagctaggac tagggaggca tgggcctctg ctggctgtgg tcccttctcc agccttcact 3240
tctcttgtcc ctagatcctt acatggattc attaatgctc attgtccctc ctgggcccac 3300
tcactttcac ctgttgaaca aaaaactggc caagaggtga cagtcatatc accgcagaag 3360
agacagggca gagaaatgaa ggggcagaat ggactcccac ccaaaagcct gactctgaat 3420
atttgagaat tgttcaagtt cctgcagagg aatcatgatg gggacagtag gtgtagtttt 3480
tactgcaata ttggtgtctt cttaacaaat acgctgcaca tcaagtgatg tctgtggatg 3540
gcattcttaa agtaacaggg aaattgatgt taaagaaata cttcatcctt tgggtgatac 3600
ctgaagttct ctgagcttgg aggtcttgtg aaagccctca gtattgtttg ttttatttgc 3660
tttcctctga cttgtgattc agtcagatgc atgcctgcct ctggctcagg aagatcaacc 3720
ctctcctgac tgaccacgcc tctcctgact gaccacgtag cacagcagct tcctttccct 3780
aggggctcct aatgaagctt tcacaatcac ctggcctgag cacagtttgg gtcaggactt 3840
ggtatacttg aaaaaaacat gcaaaaccaa aatcctgtgg ttctggaaaa ggcttcttag 3900
cagaaccccc agacatttac actctgcttt ttcacagggt ccctgaggat tctttggatc 3960
tgggtagttt ggggagcagt attttcaaca agttcatttc gtgctccttc tacaccctgc 4020
ctggatgcta ggccccatct agaatgtgaa caacagaaca aggcagaaca cttgtcctca 4080
aggttctgtt gagtgttaga tgcagagaag agacaccccc cacctccccg catcacttac 4140
aggaattctg tttggaaccc aacatcaaat aaggaccgta tccactgtca gaggatggga 4200
agcagcatgt catctgggac attggagaaa ggctcctggg ggaagtggga cttgagctgt 4260
gatctaagta atgaacaact gagagttaaa tgggagagca tcccctatca gggtcctgag 4320
agcaaccagc catggtttaa accagctata aagcctcggg tttataggat agacagtaac 4380
aatggcttgt ctttgggagc caagcagctg gtccaggcat gcagagcatg tctgtatgga 4440
gagctgcctg agagatgctt ttgtttacac ttatcaattg cccatgtcaa agaaggatat 4500
gtacatgaag ttacatcagt atgtaagaga gattttaaca atttttgcag gggaagcttt 4560
catgggggct gatgggaatc taggtaaaca gaaccaaagt ctaaacccaa gatatcccca 4620
gtaccaagac tgaaatgact ctctcctcta tctctagaaa gttccagtga cccaaggagg 4680
caaacacgat gggagtcatt aaagtggggt ggacgtgctg atcatcttcc taattctgct 4740
gcttttgttt tcagccccaa cgtgtgtgct gtgcagaagg ttattggcac taataggaag 4800
tacttcacca actgcaagca gtggtaccaa aggaaaatct gtggcaaatc aacgtgagta 4860
tctgtaacca gccaggagac caagctgtat gcacgctggc tgcagttccc cagggcctgg 4920
gccagccttc tagaaggtca ggttgcctaa aaagccatga agatgcatgt gcgaacatgt 4980
ctgggacctg cgtgctaggg agtggcattt ttaggaagct ggccaatttt gttttgcatt 5040
tttaaggctg ctgacaagac ttggagacat ttttcagggc tggtttgggt ttgcaagaaa 5100
catgaaacac tgcgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtttctc aatcctcata aaataataca 5160
gatatgcagt ggagaagcca ccagcatgtg actctggaaa agaaagccca ttggtgaatc 5220
tgtactaaag aatgccatcc ctatcttaca gtcctaaggt aaacacccca aaaagactta 5280
gagcactaaa catatgcaga ttatgagaca gcatagcata taatatttgc acagacttcc 5340
tcattcaaac cctagctcta cctgggccag tcgattcatc tttagaaccc tccattgctt 5400
tacctgaaaa gttcgtataa caaaaggacc caccttatgg ggttgttaca aggattgaat 5460
gaaataatgt acataagaga ctgaatatgg tgcccagcat atatcagtgc tcaataaatg 5520
ctagctacta ttattattat caccctagat ttgcaaatct agaccacaca agcagaagta 5580
agagtgccaa cggggtgtgg accagtgtgg ttacaatagg gcttgttgat gtctgtttca 5640
gcaaggaggg aggcagcttt taccccactg cccagctccc tggtggaatc aggtgcatgt 5700
tctaacaatt ctggggaaac ctaatctgtt ttggcactgt caacagatct caaagctggc 5760
tgtctcctat agctaggaag atgtgtatga caaatctcct gagccacttg tgaaggcctg 5820
accttcctcc tgtctccata cataatggga tgattaagaa actctaagcc actctcttaa 5880
gcacttttca atgttaggga tttttaagtt tattgttgtg acattgcttt tgagcagaca 5940
tctcctccaa tttaatagcc aactgaaaga agagaaaatg ctctttcctt aaactgtatg 6000
tggaaataaa tattccaatg tgtgaccctg attatgttag gcaattagca atcctaatat 6060
gaattgaggg aagttgggat tcatggcaca gctggggaga taccagcagt ccctgggagc 6120
ctgtccaggg caggtccatg gcagcttgct ccatgcctga ttgacagccc agcctgcaag 6180
ctaaaagttg agtgagctag gaggacacac tgccaagatt cagctaacag acacccagcg 6240
atattcttgc tgctatgaac aaaaggagac tatgcaaatt atacaccacc cattcttcca 6300
ggatgcctga cttaaaaaat aagaaaaaag atgggccggg cacagtggct cacgcctgta 6360
atcccaacac tttgggaggc cgaggtgggc ggatcacaag gtcaggagac agagaccatc 6420
ctggctaaca tggtgaaacc ccgtctctac taaaaaaata caaaaatatt agcgggcgtg 6480
gtggcgggca cctgtagtcc cagctactcg ggaggctgag gcaggagaat ggcgtgaacc 6540
tgggaggcgg agcttgcagt gagccaagat cgtgccactg cagtccagcc tgggtgacag 6600
agtgagacac cgtctcaaaa aaaaaaaaaa aaaaagaaaa gaaaaccttt agtactgatt 6660
gattttttcc catgtgtgta tattatctac tcaaattaac aattaattac ttaattaaac 6720
acaaagccag gcctcaccta attgcttctt ggaaggtgac cagagtgcta gtgccaagca 6780
aacaactctt ctatatctca agagccctgg gcttcagagg gccatctttt ttgttaattc 6840
aagtttctct gaaaatggag acccgtttat gatgacaagc tggctacagg gtagcatctg 6900
ccacactgtt tcgggggtgc cgctgggctg aagcatttgc ccagctagtt aacaatagct 6960
cgataacatt ccctatcagt gtccaggctg agaatactgt cagtgatgag tcgccttggc 7020
tcttgtacct gtatctttgt gtgccaggac aaggcacaag caacagagct gtgtgttgcc 7080
aaaatgttcc tgatgagcag gtcaacccct cgggggcagg tttggatatg ataatgtggt 7140
gatgtggtgg cgcagctccc ttacccagtg agcacaaggg gagtcctcta ggaaaaggaa 7200
gaaatgtctg gatgaggtgg ggagatgggg ttcagagtgg actcaggcaa agcccgatgc 7260
ccagtcccag ctgttggcct agtctcacaa agccagaagg atatgacatt tacattcaac 7320
tcttgaattt gtggccactg ctttgggcaa cttcaaagag agaaaatgaa gatagaaaaa 7380
tattatttga tataaaactt ctaggacaag agaggccctt cctggaacat tacatgtagt 7440
attaggaagg tggagctgcc ctggaaaaga tccagagaac tcagagagag gaagaggtgg 7500
aacccatctc tgttcttgta gagagctcag taagagtggc ttggcagggc tcctgtgtac 7560
ctgagaccaa gaccagtgag gaggctactg tctgaccacc atacggtcag aattcagtgc 7620
catgggtggt caggtgggaa ggggagagga ctgtgctggc tggagttgat gttatcctgg 7680
ggaaagtagg tccctagatg cctttagttg agtgaggagc agactgggaa atgggagcac 7740
agtagtggtt ggggcaaaaa ggactgtctc tgcatgaggt ccataggcag ttggaatttt 7800
ctcagcaaga ctccagagaa ggaggctgga gcagaggtgt atgttgggat gaaaaggagt 7860
aaagtatcat gggggaggag gcagctcagg ttgtcaaggg tcaagaaacc agaaggagaa 7920
tttcaccttg gaagcagaca acgggtacca agcatacagg ggaatacttt gtggtgagag 7980
gtcacacaga gatacaggag ccgacctggt gagacaggag cctggagcca cctgcctgct 8040
tttgtgaggc cccagactcc actgctatca tcaggtgaag ctctgttgcc tgcacacaaa 8100
agcttttctg catttacaaa gagagaaggg cctgagtttc tggtgcaatg cgtcaagctg 8160
acatatggac tttattacag gaagtggtta ccagtgggtc cctatttagt ggctgttatt 8220
gtgaatttta ttgttcggaa attcacttta gcatttattt cagatcctaa atagcaccgg 8280
agtgatacaa tggctaatca aacaaagagg gctgtgggga gcagacagtc agcatccccc 8340
tctgtgattt caggccctgg tttgattagt agccataaaa ttttttacgt gtggcacttt 8400
gagcaaaggt gcaggaaatt gtggtcagga agcctggctg cctctcgaca ggcttccttt 8460
gtgctagccc cagggagagg aggcctattt aacagccaag tccaagttga catcatggga 8520
ctggaatagt catagcagga gctcagacat cataaacgtg gcatagggag ggctggtgga 8580
ggagctagcg ggtatgggtg gcagctattc attccaaaag tcttgaaatt gtttcacgag 8640
caacacattt cacaagtgcg aagcccttct ctggagccaa gatgagctgg cagagcactc 8700
ctgtttctct agtagcaagt gttcctttgc ccaggggcaa aaatattaat actccttcag 8760
cactgcatta atgcttaaag atttaacttt taaagagatc agctggtgca tggtcgagct 8820
tttccatcag ctggcagggc tttttcagta ggtgtccttc tgggcagggc actggggaca 8880
gctgacgtga aggtgaagaa gagctgtcgt tttcctccct tatatcccac aaccttggtc 8940
ccaagaggaa aaaaaagaag atggtgagaa gtcatccaag cagaccccag acccatacta 9000
gtgcctcctt tcctgtttca tatccctgtg cagccagctg ggatctcttg aataatctgc 9060
tctgggggca ctgagattgg acatacacca aacagcggag atcgaccaaa cgcctctgtt 9120
gggcagtgtt tcctgagggt tctgtcccat tctgtaaact aggaggctga ctagctgaca 9180
aggaatttta ttctgttggg tatttacatg aacctatgtg ccacctgggg taagaccctg 9240
tggtaggtag aaacatgact tcccaaaaat gtccacatcc taatctctaa ttctgtaaat 9300
atattccctt actggaaaaa gagactttgc aggtgtgatt aaattaagga tcataagagg 9360
gagagattat ccaggattat ttgatgagtc taatataatc atcagggtac ttaaaagagg 9420
gaggcaggct gtgcctggtg gttcacgcct ttaatcccag cactttggga gactgaggcg 9480
agcgggtcac gaggacagga gttggagacc agcctgacca acatggtgaa actccccctc 9540
tagtaaaaaa aaaaatacaa aaattagcca ggcatggtgg tacacacctg taatcccagc 9600
tactcaggag gctgaggcgg gagaattgct tgaacccagg aggcagaggt tgtggtgagc 9660
tgagatcgca ccactgccct ccagcctggg caacagagca agactccatc tcaaaaaaaa 9720
aaaaagaggg aggcagtggg atcagagtca gagaaggcaa cgtgatgatg aaagctgaca 9780
tttgagtgat gcaaccacaa gccaaggaat gcaggcagct tctcaaagct ggaaaggacg 9840
agcaatggat tcttccctac agcctctgtg aggaatgcag cctttgattt taaccccata 9900
aggccgattt ctgactctag cctctggaat tgtaagataa tttgcatgat ctcaagccac 9960
taaatttgtg gtaatttgtc acagaaagca atgggaagcc aacacaggcc ttatttgttg 10020
acttatagat gcatttttct ttatttcaat gtacttttat caatggtctc atgtagggta 10080
ttgctttcaa tgaagatatt aacatagttt caactttaag gtttatatct ggagtttctt 10140
tagaagcttc acaactgacc acttagtaaa cagtaagcat ctgttaagtg cttctcatat 10200
gtaagttcat tcaattctca caatcacact ataagataaa tatgattatt agcccattta 10260
cagatgagga gacaggctca aaagactttt atgcaacctg gtcaaagtca ttcactggta 10320
agctgaggag gtctgtccac ttccttttgc tgcccccagg gggtatcaag cctggcagtt 10380
agtgtcagcg acttaggagg tgaacaagtg agcaggcctg taggacctgg ctaaactgcc 10440
ccaggtctct gtctacagcc tcaaacctgt ggctgtgggt cccagagaca aggcctcctc 10500
agcatcagag aaggatgcct ttgtctcagg gtcatcaacc ttctccaggt tgctcacccc 10560
ctgctgtaaa ggggatcccc aagaccgctc atcagacaag gagcttggga actgaggaga 10620
cacagtcagc ctccaggagt gcccaaaatg ccctcacatg ctgcatacag attgccacaa 10680
ataaagtaca tccacattct gaagactctg tcctcatcac caaccaggct ggcccctggt 10740
gagggctgta gtggttgagg cctttgttgg tagacagtag gttaaagcaa gccatgattt 10800
tctattggga ggcttcagaa tcagctcagc tgtgtttcca agaccaggag ggcagaaagc 10860
aaaccatccc aggcaagcag tccatgggcc atgtcagatg tctagacgtt atgggtctgt 10920
gtttgctctg ccattcctct cggaaactat gatgccctgt atggtttacc ttcagtcaca 10980
ggtgactggc ctacagggcc attccttgtt ccaacgactt ctcgagtata attaatcccc 11040
aggcatttac ggccagagca gccggccaaa tccgtgaagt gcagtggttg ttttaaatta 11100
tattaacttc ttggaaactt attttaggga gagaaaactc agtacttctc tctatccaat 11160
cttgagtaaa aatgttagaa gggactggtg gagagcctcc cagacatccc tacacataga 11220
ctttgggttg acattatctc tttgcacctt ccttgaaact ttcttctaaa ttaggtgcct 11280
tccctaattt aggcaccttc ccagtactag tctgtgacct gttaggaacc aggccacaca 11340
gcaggagttg agtggcaggg agtgagcatt attgcctgag ctccgcctcc tgtcagatca 11400
gcagtggcat tagattctca tagcagtccg aatactattg tgaactgtgc gtgtaaggga 11460
tctagcttgt gcattcctta tgagaatcta atgcccgatg gtctgagatg gaagagtttc 11520
ataccaaaac caccccttcc ccctgccacc atctggggaa atattgtcta ccacgaaact 11580
gatccctggt gccaaaaagg ttggggaccg ctgtcctaag ggatctgctt tttctgacct 11640
gaggtttttc tttattagac tgtatctggc tgaggagaag cctgaagcct ttaatcggaa 11700
cagctttggc tgatgagatt agattcagaa accaacagat tggtcttttc tatgcaggga 11760
agcctaggaa ctggggggct atggctggga agccccctat tgtttccatc ctttcctatg 11820
ttcatcctgg aggaatggca tcagacccat gcctctgtga ttgctcccag cccatccaac 11880
cacagcatct atgttctgcc tgggaccagg gccagggagc atggcacact gagctgagta 11940
taaggagagt ggagcaggcc actgccagcc cagaaaattt tggtcaaagt tgcctgaaat 12000
cttctcagcc ttcgattcac agctgctctc tgctgctctg gggccatgca gaccagttca 12060
gaaaagagtt aatttgttgg ggcagttgga ggcaggtgga ctgccagctt tgacaccttc 12120
ccagcccaca ggctgctgca ctggggctga aggcgtggct aacccctgca cacctagaga 12180
gtgacagaga tgccagactg ggcagcagga aggcaagagg attaagagag agcttcctgg 12240
ctgaaagcca cactcggtta accaggaaaa agcccttggc acgagaagac tcagtggcct 12300
gagggactga gccttggttg ttgggcatgt gctgcataag ccatccatgt gtgacagtag 12360
agtgtagtcc agccactgtg ggacatgggt gctgaaagac cacatggaga ggaacagtga 12420
gtgctgacaa gggctagcct tgatcacttt ggagacaccc cctgtgtctt ctagatgtca 12480
gactttccaa atctgtctgc tatcctccaa acgtgcattt tcaagagcaa tggaaaaagg 12540
attggacttg atggaatgca gcaagagtcc taggtctgtt actacctacc tatgacctta 12600
agaaactcct tcacccctca gaacccttac agctttcttt ctgattctat cctgagttac 12660
tctactccaa gctgagactt ttctgcttag atctatccct tcctcctaaa cccccaacct 12720
ccatttctcc tggtgtcttt ctttacacac ccctcagcat acacacacac ctagccacag 12780
gaaccaatga gttaatattt gaggagttgg ttttcttttg tcctcaatga gatcctggtg 12840
aggccacttg agctgttcag ctcccttgcg gtattttggg gatggaactc agaagccaac 12900
aatatagaaa aagagtcttt ggccagcttt cccaggggct ccatgccata gagagtactg 12960
cacccgtgtg cacagggggc cctgacatga ggactttgag gataacacta ttcctccaac 13020
tctgcttcag catctccatg gattttcaca cagacacttt aggaaagaaa ctaagtttgg 13080
ggggacttga cctaatccca catcacagcc ccagtaatac agccctggaa tttatcacag 13140
aaagcctaga atcccatgca tatcccatgc atatgcatcc ctagtcctat gggttcaagg 13200
cttggagctc tccctggatt tagctgggaa aagttggcag acagttcttc tctgtcttct 13260
agaaatatgg actagaatcg tgagtgtgag attgcaagta acttttaaaa tcatctagtt 13320
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gttcaccctg ctagttactg atggatcaca agtcaaatct cctgattcta gcactgtttc 13440
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gactttagtt tctgaagata aaattgtgag tcaatcaaga tgagtcccaa gacaatagcc 13560
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gcaactccct ggccacctga gcatcttagc tgatctgtct ctgaaacacc ccctggagaa 13800
cagatgaatc aggcttcatc ttcgcttaac taagtcttcc ctgagacgac tccatttaaa 13860
tgaacaagag caggatttcc tgggcacact gagagcacct tccagaggcc cctccagagc 13920
cctaaagcct gtatttcttc cagtcggcct gtttctttcc tggtgatgtc attaaacgcc 13980
ctttgagagt cccacagtga gcagttctgc ggtaaaaccc gctgcaatta aagtctgagt 14040
cctttcctgt ctcaaagggc atattcatat agaagaaagg aaaaggaagg actggctgtt 14100
tgcatttggt tccaggcctg ttgagtagag gtcgtgctca ctccaccgaa ggtacagggt 14160
agccttcagc agaacctggg gatttggttt taagcaagtc tttcttaggt gtgggctttc 14220
agaacacttc cttccttgca atattatttg aaattctcag tgttttagcc gtccccagaa 14280
tattggttcg ttaaagctgt gtatttcaga tctccagaca gtggtcactg tttgtatatt 14340
ttcaatttca aaccagaaaa caaaagttct tattgattac tttttttatt taaaaaataa 14400
aaagtaagta tcttcgtaag aggagctttg ttttaatttt aaagtttaaa atttgattgt 14460
gaagacagag aaaaacttga tgattgtaga tatattcccc tctttggcta ttcaatcaga 14520
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gcatttcctg agctgctcct cctggcctcc ttaccacact ggtggagtag actccaactg 15360
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gcactgggcg aaagacagca tggcacctgt gaattttatt agagcttttc ttttagtgct 15720
acacacaagt gactgtacag gggagttagt attttgtttt aattttgaaa tagagtcatc 15780
ttttggtatc tgcgggggat tgattctagg acccattcta ggatgccata tcctcagatg 15840
ttcaagtccc tgatataaag tggtatagta tttgcatgta atctatgcat attcttccat 15900
gtactttaaa tcatctcaag attacttata ataccaaata taatgtaaat cctatgtaag 15960
tagttgttat accctctttt aaatttttgt attatctttt attgtatttc aaaaaatatt 16020
tttggtccat gtttagttga atctgtgggt gaagaaccca cagatacgaa gggccaactg 16080
tattggctat ttttttagtt aagaatgtga gactgaggcc aggcgcagtg gctcatgcct 16140
ttgattccag cactttggga ggccaagagg ggacgatcac ctgagccaag aattcgagac 16200
cagcagcccg tgcaacatag tgagaccttg tctcttaaag attgtgagac tgggctgggc 16260
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ggtcaggagt ttgagatcag cctggctaac atagtgaaac tctgtctcta ctaaaaatac 16380
aaaaaaatta gctgggtgtg gtggtgggcg cctataatcc cagctactca ggaggctgag 16440
gcaggagaat cgcttgtatc caggaggcgg aggttgcagt gagctgagat agggccgttg 16500
cactccagcc tgggcaagaa gagcaaaact ccatctcaaa aataaataaa taaataaata 16560
aataaatcat gagactgaga cataacagga aggagggcaa tttggttggt tccaaggttc 16620
ctagagtatg tgatgggaga ggttggtgcg ggtggggcca tggaggtact gactcaagtg 16680
gagggacagg tggggaaatg ggatgggaaa agaagattga ccttagaagg ggagctcaac 16740
ctctgaaccc taatttcaga cccttcaaaa tgaatattaa gctcattttg gtctaagaaa 16800
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cgtcctctcc acctgtagat gtaccgtgct ctctgtcaga gaagggaggg tgtggttggg 17280
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aaaatatgtc ttaccaggtt gcgtctaatg ccccccgttc cctactgggc agaaagactt 17700
gggtgcttcc tgaggaggga tccttggcag aagagaggcc tgggctcacg agggctgaga 17760
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gacaccctgt ccttcctcct aggaagtgct ggactccctg gtcagcaatg tcaacattga 17880
gctgctcaat gccctccgct accatatggt gggcaggcga gtcctgactg atgagctgaa 17940
acacggcatg accctcacct ctatgtacca gaattccaac atccagatcc accactatcc 18000
taatggggta ggggatcccc agccatactg catggccctt ggtgcataat gaacccattt 18060
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tgccgagcct gacatcatgg ccacaaatgg cgtggtccat gtcatcacca atgttctgca 31920
gcctccaggt aagtgtcgca tccccactga ctctgcagcc agtccttttc ttcatgtggc 31980
agttggtgga gagaagaaaa actgttctaa acaatgatga gaataacatg taattgtgat 32040
agttaaactg tgcctatgtg actgattgca gagtgaattg ggagctgttg gttttgaatg 32100
caccacacta aggaatgtga ggacacattg ctctttgcgg agttgcccag ctatattagc 32160
tcccctcgga cacagcccag ttttctgtat tcgcgtggat gctgtccgcg cgattcccag 32220
cactcctctt acagcatctc acctcagtgt atgttccttg cctccagtgc agttgaacct 32280
cagtcctgcc tctcctcatg tgtgcattca cctttcttgg tgctctctcc ccatgggcca 32340
agttctacca tgagttatga aacattatgg agaaaacatg tctttggaaa tgtgagccag 32400
aaagcccacc agtgcccctc agtcacggtt gttatgaatg acatgctaat ggtttcactc 32460
tggtcaaacc tgccttttct ttcctcttca gccaacagac ctcaggaaag aggggatgaa 32520
cttgcagact ctgcgcttga gatcttcaaa caagcatcag cgttttccag ggtaagatgc 32580
ctgctaggtt tgcgcctagc ctgagcagcc tcaggtcctc tgtttgggcc atagaggagc 32640
ctctccagcc cctgtcttcc ttggctgctc cccagggctc tcttaaaact tctccccact 32700
cccactgagg catcctcagc cccagcctgt gtcaaattca gagtaaagaa ccaaggcaac 32760
tccctggctt tcatgggcca aagcgcaggc tttcacaccg aggcctctga gcctcagatc 32820
atggggaagt cactgctgga gagaacagac atagctctgg aagccatctg cccaagaggg 32880
cagcccatcc caagttcatc ttacagtggc caggcctgcc ctgagccggg gcctctgggt 32940
cactcttctg ctgtccatgg cattgcccat cctgggtgag gctggggctc tcctgggcac 33000
tgtatgtatt ctggatacag ggatactggg ctcgctatgt gtgtggagcc atcccttcct 33060
tgccccagcc ccacctccct ctcaaaccct ctctggctct ttctgagctt cctttcctgc 33120
tccccagctt gcccagtgct cagtgcccca cttggctctt ttgctacttc gggtcaggtg 33180
gagcctcttg ggaatgtgaa gtgccttaca gaaagattgc acttcaagag gagaggctgc 33240
agggagccat cctaaaccca gaggcctgga gcttactgtg tcactttact tttgtacaca 33300
ggggtctcct tagtgccctc gagaaggatt cttggccctg agcttctact cctgaggcca 33360
cctctgtgca gccccagctc cctcaactct aggctgtagt ctcagtggga aagcctggct 33420
tgggggtctc ctaggaatgt ccacctgaag gcacacttga taggggcttg cacaacttat 33480
gtctgccaag gccacctgag gaactccctg gtgcctataa gttccacctt ccccttcctc 33540
ttcctcgccc cagcattttt tctgagtagg ggtggcaatg ggcaaagcca ttgtcataag 33600
cagttgcagg tataactttc actagaaaac ctgacacctt gtgttttctt tcaggcttcc 33660
cagaggtctg tgcgactagg tgagtctggt ctgggtttga agtcattgca gacctgttta 33720
ggccttaccc ccaagcaagc ccaagcctgc catctgctgt atatagataa gaacatcatg 33780
gtgcagtaaa agaagcctgg cctttggagt cagaacagca gggtgacttg gggtcagacc 33840
cagagcaccc catttccttc tctgtaagat gaggataata agagtaacaa ccttttaggg 33900
ttaaggtgag ttttcagctt aggaagtctg ggaatattgc aaagggcttg gcaggaaccc 33960
atggtgagga tctagttcca agttgatagg tacagaaaac cagaacatcg ggccttgagt 34020
aaagagtgaa gtttcacaaa ccacaaagca cctgctatgt gcaggagagc atggcagaag 34080
gaggctgctt ggccctggtc cttgagattc tgacagtgtc ctagacagac atggggagat 34140
ctgcacctat ttgacgttac caacttctct ttttcagccc ctgtctatca aaagttatta 34200
gagaggatga agcattagct tgaagcacta caggaggaat gcaccacggc agctctccgc 34260
caatttctct cagatttcca cagagactgt ttgaatgttt tcaaaaccaa gtatcacact 34320
ttaatgtaca tgggccgcac cataatgaga tgtgagcctt gtgcatgtgg gggaggaggg 34380
agagagatgt actttttaaa tcatgttccc cctaaacatg gctgttaacc cactgcatgc 34440
agaaacttgg atgtcactgc ctgacattca cttccagaga ggacctatcc caaatgtgga 34500
attgactgcc tatgccaagt ccctggaaaa ggagcttcag tattgtgggg ctcataaaac 34560
atgaatcaag caatccagcc tcatgggaag tcctggcaca gtttttgtaa agcccttgca 34620
cagctggaga aatggcatca ttataagcta tgagttgaaa tgttctgtca aatgtgtctc 34680
acatctacac gtggcttgga ggcttttatg gggccctgtc caggtagaaa agaaatggta 34740
tgtagagctt agatttccct attgtgacag agccatggtg tgtttgtaat aataaaacca 34800
aagaaacata 34810
<210> 52
<211> 683
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因 protein product
<400> 52
Met Ala Leu Phe Val Arg Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gly Pro Ala Ala Thr Leu Ala Gly Pro Ala Lys Ser Pro Tyr Gln Leu
20 25 30
Val Leu Gln His Ser Arg Leu Arg Gly Arg Gln His Gly Pro Asn Val
35 40 45
Cys Ala Val Gln Lys Val Ile Gly Thr Asn Arg Lys Tyr Phe Thr Asn
50 55 60
Cys Lys Gln Trp Tyr Gln Arg Lys Ile Cys Gly Lys Ser Thr Val Ile
65 70 75 80
Ser Tyr Glu Cys Cys Pro Gly Tyr Glu Lys Val Pro Gly Glu Lys Gly
85 90 95
Cys Pro Ala Ala Leu Pro Leu Ser Asn Leu Tyr Glu Thr Leu Gly Val
100 105 110
Val Gly Ser Thr Thr Thr Gln Leu Tyr Thr Asp Arg Thr Glu Lys Leu
115 120 125
Arg Pro Glu Met Glu Gly Pro Gly Ser Phe Thr Ile Phe Ala Pro Ser
130 135 140
Asn Glu Ala Trp Ala Ser Leu Pro Ala Glu Val Leu Asp Ser Leu Val
145 150 155 160
Ser Asn Val Asn Ile Glu Leu Leu Asn Ala Leu Arg Tyr His Met Val
165 170 175
Gly Arg Arg Val Leu Thr Asp Glu Leu Lys His Gly Met Thr Leu Thr
180 185 190
Ser Met Tyr Gln Asn Ser Asn Ile Gln Ile His His Tyr Pro Asn Gly
195 200 205
Ile Val Thr Val Asn Cys Ala Arg Leu Leu Lys Ala Asp His His Ala
210 215 220
Thr Asn Gly Val Val His Leu Ile Asp Lys Val Ile Ser Thr Ile Thr
225 230 235 240
Asn Asn Ile Gln Gln Ile Ile Glu Ile Glu Asp Thr Phe Glu Thr Leu
245 250 255
Arg Ala Ala Val Ala Ala Ser Gly Leu Asn Thr Met Leu Glu Gly Asn
260 265 270
Gly Gln Tyr Thr Leu Leu Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Glu Lys Ile
275 280 285
Pro Ser Glu Thr Leu Asn Arg Ile Leu Gly Asp Pro Glu Ala Leu Arg
290 295 300
Asp Leu Leu Asn Asn His Ile Leu Lys Ser Ala Met Cys Ala Glu Ala
305 310 315 320
Ile Val Ala Gly Leu Ser Val Glu Thr Leu Glu Gly Thr Thr Leu Glu
325 330 335
Val Gly Cys Ser Gly Asp Met Leu Thr Ile Asn Gly Lys Ala Ile Ile
340 345 350
Ser Asn Lys Asp Ile Leu Ala Thr Asn Gly Val Ile His Tyr Ile Asp
355 360 365
Glu Leu Leu Ile Pro Asp Ser Ala Lys Thr Leu Phe Glu Leu Ala Ala
370 375 380
Glu Ser Asp Val Ser Thr Ala Ile Asp Leu Phe Arg Gln Ala Gly Leu
385 390 395 400
Gly Asn His Leu Ser Gly Ser Glu Arg Leu Thr Leu Leu Ala Pro Leu
405 410 415
Asn Ser Val Phe Lys Asp Gly Thr Pro Pro Ile Asp Ala His Thr Arg
420 425 430
Asn Leu Leu Arg Asn His Ile Ile Lys Asp Gln Leu Ala Ser Lys Tyr
435 440 445
Leu Tyr His Gly Gln Thr Leu Glu Thr Leu Gly Gly Lys Lys Leu Arg
450 455 460
Val Phe Val Tyr Arg Asn Ser Leu Cys Ile Glu Asn Ser Cys Ile Ala
465 470 475 480
Ala His Asp Lys Arg Gly Arg Tyr Gly Thr Leu Phe Thr Met Asp Arg
485 490 495
Val Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp
500 505 510
Asn Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr
515 520 525
Glu Thr Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn
530 535 540
Glu Ala Phe Arg Ala Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly
545 550 555 560
Asp Ala Lys Glu Leu Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu
565 570 575
Ile Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu
580 585 590
Gln Gly Asp Lys Leu Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val
595 600 605
Asn Lys Glu Pro Val Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val
610 615 620
Val His Val Ile Thr Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn Arg Pro Gln
625 630 635 640
Glu Arg Gly Asp Glu Leu Ala Asp Ser Ala Leu Glu Ile Phe Lys Gln
645 650 655
Ala Ser Ala Phe Ser Arg Ala Ser Gln Arg Ser Val Arg Leu Ala Pro
660 665 670
Val Tyr Gln Lys Leu Leu Glu Arg Met Lys His
675 680

Claims (9)

1.用于检测人受试者中的角膜营养不良的反应混合物，所述反应混合物包含：
(A)至少第一扩增引物对，其用于扩增和确定来自该受试者的生物样品的第一TGFβI基因序列；和
(B)至少三种检测探针的第一组，其包含：包含选自SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:47的序列的第一检测探针、包含SEQ ID NO:46的序列的第二检测探针和包含SEQ ID NO:50的序列的第三检测探针。
2.根据权利要求1的反应混合物，其还包含至少三种检测探针的第二组，其包含：包含SEQ ID NO:25的序列的第四检测探针、包含SEQ ID NO:26的序列的第五检测探针、包含SEQID NO:48的序列的第六检测探针和包含SEQ ID NO:49的序列的第七检测探针和用于扩增和确定来自该受试者的生物样品的第二TGFβI基因序列的至少第二扩增引物对。
3.根据权利要求1-2中任一项的反应混合物，其中所述第一扩增引物对包含第一扩增引物和第二扩增引物，所述第一扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:1，并且所述第二扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:2。
4.根据权利要求1-3中任一项的反应混合物，其中所述第一TGFβI基因序列包含来自所述受试者的生物样品的编码氨基酸残基555的核苷酸并且所述第二TGFβI基因序列包含来自所述受试者的生物样品的编码氨基酸残基124的核苷酸。
5.根据权利要求3-4中任一项的反应混合物，其中所述第一扩增引物对包含第三扩增引物和第四扩增引物，所述第三扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:43，并且所述第四扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:44。
6.反应混合物用于制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测角膜营养不良的方法，其中所述反应混合物至少包含用于扩增TGFβI基因序列的第一扩增引物对和至少三种检测探针的组，其包含：包含SEQ ID NO:45的序列的第一检测探针、包含SEQ ID NO:46的序列的第二检测探针和包含SEQ ID NO:50的序列的第三检测探针，所述方法包括：
(A)使用至少包含用于扩增TGFβI基因序列的第一扩增引物对和至少三种检测探针的组的反应混合物，从来自人受试者的生物样品扩增第一TGFβI基因序列，所述至少三种检测探针的组包含：包含SEQ ID NO:45的序列的第一检测探针、包含SEQ ID NO:46的序列的第二检测探针和包含SEQ ID NO:50的序列的第三检测探针；
(B)使至少三种检测探针的组的一种检测探针与所述第一TGFβI基因序列杂交；并且
(C)基于以下检测所述第一TGFβI基因序列中的突变：(i)已经在步骤(B)中杂交的至少四种检测探针的组的检测探针杂交于所述第一TGFβI基因序列，和(ii)至少三种检测探针的组的其它两种检测探针与所述第一TGFβI基因序列杂交的失败。
7.根据权利要求6的用途，其中所述反应混合物包含如权利要求1-5中任一项所述的反应混合物。
8.反应混合物用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于检测来自人受试者的样品中与角膜营养不良有关的基因组突变的方法，其中所述反应混合物至少包含用于扩增TGFβI基因序列的第一扩增引物对和至少三种检测探针的第一组，其包含：包含SEQ ID NO:45的序列的第一检测探针、包含SEQ ID NO:46的序列的第二检测探针和包含SEQ ID NO:50的序列的第三检测探针，所述方法包括：
(A)使用人受试者的上皮细胞，其附着于基片的尖端；
(B)在裂解溶液中搅动该基片的该尖端，所述裂解溶液裂解附着于该基片的细胞；
(C)在完成(B)搅动时，从该裂解溶液移出该基片；
(D)在(C)移出后温育该裂解溶液；
(E)从该裂解溶液分离基因组DNA以形成gDNA溶液；并且
(F)至少使用用于扩增TGFβI基因序列的第一扩增引物对、至少三种检测探针的第一组和该gDNA溶液，通过将该gDNA溶液同时暴露于所述至少三种检测探针的第一组，确定TGFβI基因中存在的至少一个核苷酸的身份，所述至少三种检测探针的第一组包含：包含SEQ IDNO:45的序列的第一检测探针、包含SEQ ID NO:46的序列的第二检测探针和包含SEQ IDNO:50的序列的第三检测探针，其中：
所述至少一个核苷酸位于TGFβI基因的特定的位置处，所述位置对应于与角膜营养不良有关的单核苷酸多态性(SNP)。
9.根据权利要求8的用途，其中所述反应混合物包含至少四种检测探针，其包含：包含SEQ ID NO:25的序列的第一检测探针、包含SEQ ID NO:26的序列的第二检测探针、包含SEQID NO:48的序列的第三检测探针和包含SEQ ID NO:49的序列的第四检测探针，并且所述方法还包括：
(G)使用至少四种检测探针和gDNA溶液通过将该gDNA溶液同时暴露于至少四种检测探针的第一组确定身份，所述至少四种检测探针包括：包含SEQ ID NO:25的序列的第一检测探针、包含SEQ ID NO:26的序列的第二检测探针、包含SEQ ID NO:48的序列的第三检测探针和包含SEQ ID NO:49的序列的第四检测探针，其中
至少第二核苷酸位于TGFβI基因的独立于所述至少一个核苷酸的位置的第二特定位置处，所述第二特定位置对应于与角膜营养不良有关的第二单核苷酸多态性(SNP)。
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