BRPI0708853A2 - polimorfismos genéticos no gene de hormÈnio de liberação de corticotropina (crh) como marcadores para melhorar o escore de padrão de listras de gordura da carne e/ou profundidade de gordura subcutánea - Google Patents

Abstract

POLIMORFISMOS GENéTICOS NO GENE DE HORMÈNIO DE LIBERAçãO DE CORTICOTROPINA (CRH) COMO MARCADORES PARA MELHORAR O ESCORE DE PADRãO DE LISTRAS DE GORDURA DA CARNE E/OU PROFUNDIDADE DE GORDURA SUBCUTáNEA. Aspectos da presente invenção também proporcionam novas composições e métodos baseados em novos polimorfismos de um único nucleotídeo no CRH selecionados do grupo consistindo de AAFC03076794.1:g.9657C>T, c.10718G>C, c.10841G>A, c10893A>C e c.10936G>C, os quais podem proporcionar novos marcadores para padrão de listras de gordura e/ou profundidade de gordura subcutânea. Aspectos adicionais proporcionam novos métodos os quais podem compreender seleção assistida por marcador ou gerenciamento assistido por marcador para melhorar o padrão de listras de gordura e/ou profundidade de gordura subcutânea em gado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção Para:" POLIMORFISMOS GENÉTICOS NO GENE DE HORMÔNIO DE LIBERAÇÃODE CORTICOTROPINA (CRH) COMO MARCADORES PARA MELHORAR OESCORE DE PADRÃO DE LISTRAS DE GORDURA DA CARNE E/OUPROFUNDIDADE DE GORDURA SUBCUTÂNEA"

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

O presente pedido reivindica o beneficio dos pedidosde patente provisórios dos E.U. Nos. de Série 60/784.360,depositado em 21 de Março de 2006 e 60/884, 684, depositadoem 12 de Janeiro de 2007.

Os pedidos precedentes e todos os documentos citadosaqui ou durante sua ação ("documentos citados aplicados") etodos os documentos citados ou mencionados nos documentoscitados aplicados e todos os documentos citados oumencionados aqui ("documentos aqui citados") e todos osdocumentos citados ou mencionados nos documentos citados,junto com quaisquer instruções de fabricante, descrições,especificações de produto e folhas de produtos paraquaisquer produtos mencionados aqui ou em qualquerdocumento incorporado neste por referência são aquiincorporados por referência e podem ser empregados naprática da invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

Aspectos da presente invenção se referem, de modogeral, ao padrão de listras de gordura e/ou profundidade degordura subcutânea em gado de corte e, maisparticularmente, a novas composições (por exemplo,marcadoras) e métodos para monitoramento ou previsão depadrão de listras de gordura e/ou profundidade de gordurasubcutânea (SFD), por exemplo, em gado de corte. A invençãoainda se refere a métodos e sistemas, incluindo processosbaseados em rede, para gerenciar os dados de SNP e outrosdados referentes a animais e rebanhos de animaisespecíficos, cuidados veterinários, diagnóstico e dados decontrole de qualidade e gerenciamento de gado os quais,baseados em genotipação, têm traços de qualidade de carneprevisíveis, condições de pecuária, bem estar animal,informação sobre segurança de ração, exame de processos existentes e dados de localização de campo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Aperfeiçoamentos significativos no desempenho animal,eficiência e qualidade de carcaça e carne têm sido feitosdurante os anos através da aplicação de técnicas padrões decriação e seleção de animal. Contudo, tais técnicasclássicas de criação de animal requerem vários anos deavaliação genética de registros de desempenho dos animaisindividuais e seus parentes e são, portanto, muito caros.Outros esforços têm sido feitos para melhorar aprodutividade e qualidade através da aplicação de taispráticas de gerenciamento, como o uso de aditivos pararação, implantes hormonais no animal e quimioterapêuticos.Contudo, há resistência política e regulatóriasignificativa à introdução e uso de tais metodologias. Taismetodologias também são não-hereditárias e precisam seraplicadas diferentemente em cada sistema de produção.

Há uma necessidade de métodos que permitam seleção ecriação relativamente fácil e mais eficiente de gado comuma vantagem para traços hereditários, tais como níveis deleptina em circulação, ingestão de ração, taxa decrescimento, peso corporal, valor da carcaça e composiçãoda carcaça. A significância econômica do uso de marcadoresgenéticos que estão associados a traços economicamenteimportantes específicos (especialmente traços com baixahereditariedade) em animais de fazenda através de seleçãomarcador-auxiliada não pode, portanto, ser superenfatizada.

A regulação fisiológica de ingestão, crescimento edivisão de energia em animais está sob o controle demúltiplos genes, os quais podem ser candidatos importantespara solucionar a variação genética em traçoseconomicamente relevantes (ERT) na produção de carne.Polimorfismos nesses genes candidatos que mostramassociação com ERT específicos são nucleotideos de traçoquantitativo úteis para seleção auxiliada por marcador.

O cromossoma bovino 14 (BTAl4) abriga vários loci detraços quantitativos (QTL) que afetam a gorduraintramuscular (padrão de listras de gordura) (veja, porexemplo, Casas e colaboradores, J Anim Sei. Março de 2000;78 (3) : 560-9) e profundidade de gordura subeutânea (SFD)(veja, por exemplo, Moore e colaboradores, J Anim Sei.Agosto de 2003; 81 (8): 1919-25) em gado de corte. Estudosrecentes implicaram em permitir a mobilização de energiapara lidar com o estresse através de estimulação degliconeogênese hepática pelo produto do gene de hormônio deliberação de corticotropina (CRH)r assim, influenciando ometabolismo de gordura. Estudos funcionais do gene CRH emoutras espécies (incluindo em camundongo (veja, porexemplo, Stenzel-Poore e colaboradores, Endocrinology.Junho de 1992; 130 (6): 3378-86) e suíno (veja, porexemplo, Seasholtz e colaboradores, J Endocrinol. Outubrode 2002; 175 (1) : 89-97) têm sugerido que o CRH estáaltamente associado à composição corporal (metabolismo deproteína de lipídio). O gene CRH bovino está localizadosobre o BTA14 (veja, por exemplo, Barendse e colaboradores,Mamm Genome. Janeiro de 1997; 8 (1): 21-8).

O CRH é um inibidor de crescimento que causa aliberação de glicocorticóides que, por sua vez, estimulam aprodução de pró-opiomelancortina (POMC) e leptina, as quaisestão altamente associadas à obesidade em mamíferos.Adicionalmente, o CRH é mais conhecido como um hormônio de estresse. 0 estresse estimula a gliconeogênese hepática queinfluenciará o metabolismo de gordura e proteína em tecidoperiférico de animais. Por exemplo, um estudo recente sobreum gene CRH de suíno mostrou que ele funciona como umprincipal regulador de resposta neuroendócrina ao estresse. Ele mobiliza energia para lidar com o estresse através deestimulação da gliconeogênese hepática e influencia ometabolismo de gordura.

Portanto, o CRH tem um alto impacto na regulação dehomeostase de energia e, conseqüentemente, ele afeta a composição corporal (depósito de gordura) e crescimento(veja, por exemplo, Murani e colaboradores, Biochem BiophysRes Commun. 7 de Abril de 2006; 342 (2): 394-405).

Há uma necessidade considerável na técnica pormarcadores úteis para gordura intramuscular (padrão de listras de gordura) (veja,· por exemplo, Casas ecolaboradores, 2000, J Anim Sei. Março de 2000; 78 (3):560-9) e profundidade de gordura subeutânea (SFD) (veja,por exemplo, Moore e colaboradores, J Anim Sei. Agosto de2003; 81 (8): 1919-25) em gado de corte.Seria vantajoso proporcionar outros SNPs que podemprever mais precisamente o fenótipo de qualidade de carnede um animal e também um método de negócios que proporcionaeficiências de produção aumentadas em criação de gado, bemcomo proporciona acesso a vários registros dos animais epermite comparações com objetivos esperados ou desejadoscom relação à qualidade e quantidade de animais produzidos.

Citação ou identificação de qualquer documento nopresente pedido não é uma admissão de que tal documento está disponível como a técnica anterior à presenteinvenção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Aspectos da presente invenção proporcionam organizaçãogenômica, polimorfismos de um único nucleotídeo eassociados do gene CRH bovino com o escore de padrão delistras de gordura em carne (BMS) e profundidade de gordurasubcutânea (SFD) em cruzamentos F2 de Wagyu χ Limousin.Modalidades particulares proporcionam novos marcadores (porexemplo, o gene CRH) para padrão de listras de gordura e/ou profundidade de gordura subcutânea em gado de corte.Técnica in silico foram usadas para determinar alocalização do gene CRH no genoma bovino, bem comoseqüências de DNAc e genômicas do gene bovino. Dois paresde primers foram, então, projetados para objetivar opromotor, regiões de éxon 1 e éxon 2 do gene.Seqüenciamento de 6 bois Fl Wagyu X Limousin revelou cincopolimorfismos de um único nucleotideo no gene. Genotipaçãodesses marcadores em ~250 proles F2 mostrou associaçõessignificativas do gene CRH bovino com os traços em gado decorte.

A presente invenção se refere à identificação demarcadores genéticos (polimorfismos de um único nucleotideo(SNPs)) dentro do gene bovino que codifica um hormônio deliberação de corticotropina (CRH) e suas associações comtraços economicamente relevantes na produção de gado decorte.

A invenção abrange um método para subgrupamento deanimais de acordo com o genótipo, em que os animais de cadasubgrupo têm polimorfismos similares em um gene CRH o qualpode compreender determinação do genótipo de cada animal aser subgrupado através de determinação da presença de SNPsem um gene CRH e segregação de animais individuais emsubgrupos, em que cada animal em um subgrupo tempolimorfismos similares em um gene CRH.

A invenção também abrange um método para subgrupamentode animais de acordo com o genótipo, em que os animais decada subgrupo têm um genótipo similar no gene CRH o qualpode compreender determinação do genótipo de cada animal aser subgrupado através de determinação da presença de (um)polimorfismo(s) de um único nucleotideo de interesse nogene CRH e segregação de animais individuais em subgrupos,dependendo se o animal tem ou não o(s) polimorf ismo (s) deum único nucleotideo de interesse no gene CRH.

0(s) polimorfismo(s) genético(s) de interesse pode(m)ser selecionado(s) do grupo consistindo deAAFC0307 67 94.1:g.9657C>T, c.W718G>C, c.10841G>A, c.W893A>Ce c. 10936G>C.

A invenção ainda se refere a um método parasubgrupamento de animais de acordo com o genótipo, em queos animais de cada subgrupo têm um genótipo similar em umgene CRH o qual pode compreender determinação do genótipode cada animal a ser subgrupado através de determinação dapresença do SNP acima e segregação de animais individuaisem subgrupos, dependendo se os animais têm ou não o SNPacima em um gene CRH.

A invenção também se refere a um método paraidentificação de um animal tendo um fenótipo desejávelquando comparado com a população geral de animais dessaespécie, o qual pode compreender determinação da presençade um polimorfismo de um único nucleotideo em um gene CRHdo animal, em que a presença do SNP é indicativa de umfenótipo desejável.Em uma modalidade vantajosa, o animal pode ser umbovino. Em outra modalidade vantajosa, um gene CRH pode serum gene CRH bovino.

A invenção também abrange métodos assistidos por computador e sistemas para melhorar a eficiência deprodução para gado tendo padrão de listras de gordura e/ouprofundidade de gordura subcutânea desejável e, emparticular, o genótipo dos animais quando ele se refere aSNPs do CRH. Métodos da invenção abrangem obtenção de uma amostra genética de cada animal em um rebanho de gado,determinação do genótipo de cada animal com relação atraços de qualidade específicos conforme definido por umpainel de pelo menos dois polimorfismos de um únicopolinucleotídeo (SNPs), agrupamento de animais com os mesmos genótipos e, opcionalmente, subgrupamento de animaisbaseado em fenótipos semelhantes. Métodos da invençãotambém podem abranger obtenção e manutenção de dadosreferentes aos animais ou aos rebanhos, suas condições depecuária, saúde e cuidados veterinários e condição,história genética ou descendência e fornecimento dessesdados a outros através de sistemas que são baseados emrede, contidos em um banco de dados ou presos ao animal emsi, tal como através de um microchip implantado. Um aspectovantajoso da presente invenção, portanto, é dirigido a umsistema de computador e métodos auxiliados por computadorpara rastreio de traços de qualidade para gado possuindopré-disposições genéticas especificas.

A presente invenção abrange, vantajosamente, métodosassistidos por computadores e métodos para aquisição dedados genéticos, particularmente dados genéticos conformedefinido pela ausência ou presença de um SNP dentro de umgene CRH relacionado a traços de gordura subcutânea dacriação do animal e associação desses dados com outrosdados sobre o animal ou seu rebanho e manutenção dessesdados em formas que são acessíveis. Outro aspecto dainvenção abrange um método assistido por computador paraprever quais cabeças de gado possuem uma diferençabiológica no padrão de listras de gordura e/ou profundidadede gordura subcutânea e quais podem incluir as etapas deuso de um sistema de computador, por exemplo, um computadorprogramado compreendendo um processador, um sistema dearmazenamento de dados, um dispositivo de entrada e umdispositivo de saída, as etapas de: (a) inserção, nocomputador programado através do dispositivo de entrada, dedados que incluem um genótipo de um animal na medida em queeles se refiram a qualquer um dos SNPs de CRH descritosaqui, (b) correlação do padrão de listras de gordura e/ouprofundidade de gordura subcutânea previsto pelo genótipode CRH usando o processador e o sistema de armazenamento dedados e (c) envio, ao dispositivo de saida, do padrão delistras de gordura e/ou profundidade de gordura subcutâneacorrelacionada ao genótipo de CRH, desse modo, prevendoquais cabeças de gado possuem um padrão de listras degordura e/ou profundidade de gordura subcutânea emparticular.

Ainda outro aspecto da invenção se refere a um métodopara fazer negócios para gerenciamento de gadocompreendendo fornecimento, a um sistema de computador deusuário, para gerenciamento de gado compreendendocaracterísticas físicas e genótipos correspondendo a um oumais animais, um meio legível em computador paragerenciamento de gado compreendendo características físicase genótipos correspondendo a um ou mais animais oucaracterísticas físicas e genótipos correspondendo a um oumais animais, em que uma entrada de característica física,crescimento ou valor de carcaça em gado de corte e ogenótipo é um genótipo de CRH.

Deve ser notado que, na presente divulgação eparticularmente nas reivindicações e/ou parágrafos, termostais como "compreende", "compreendido", "compreendendo" esemelhantes, podem ter o significado atribuído aos mesmosna lei de Patente dos Estados Unidos; por exemplo, elespodem significar "inclui", "incluído", "incluindo" esemelhantes; e que termos tais como "consistindoessencialmente de" e "consiste essencialmente de" têm osignificado atribuído aos mesmos na lei de Patente dosEstados Unidos, por exemplo, eles permitem elementos nãoexplicitamente mencionados, mas excluem elementos que sãoencontrados na técnica anterior ou que afetam umacaracterística nova ou básica da invenção.

Essas e outras modalidades são divulgadas ou sãoóbvias a partir de e abrangidas pela Descrição Detalhada aseguir.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A descrição detalhada a seguir, fornecida à título deexemplo, mas não destinada a limitar a invenção unicamenteàs modalidades específicas descritas, pode ser melhorcompreendida em conjunto com os desenhos em anexo, nosquais:

FIGURA 1 ilustra a organização genômica e análise dehaplotipo do gene CRH bovino. A região promotora e éxons (Ie II) são mostrados como barras e a linha reta representaum íntron. A relação de desequilíbrio de ligação em parespara 5 mutações (AAFC030767 94.1:g.9657C>T, c.10718G>C,cl0841G>A, c.10893A>C e c.l0936G>C) é ilustrada baseado emmedições de r2.FIGURA 2A mostra a seqüência de DNAc do gene CRHbovino (C0895988) (SEQ ID NO: 1). A seqüência decodificação está sublinhada.

FIGURA 2B mostra a seqüência de DNA genômica do geneCRH bovino derivado de AAFC03076794.1 (SEQ ID NO: 2).Seqüências de primer estão sublinhadas. Seqüênciasexpressas são realçadas e SNPs estão em negrito esublinhado.

FIGURA 2C mostra a seqüência de nucleotídeo da regiãopromotora proximal do gene CRH bovino. O sitio de inicio detranscrição putativo é numerado como +1. O sitiopolimórfico está em negrito e o éxon 1 está sombreado.Sitios de ligação regulatória de transcrições potenciaispara NRSF, E2F, CDF-I e CP2 estão associados ao alelo Capenas.

FIGURA 2D mostra o alinhamento de seqüência da regiãopromotora proximal do CRH parcial dentre nove espécies comum sitio de ligação conservado para NRSF (entre caixas). 0sitio polimórfico no promotor de CRH bovino foi detectado(veja seta) com o alelo T, eliminando o sitio de ligaçãoconservado. As seqüências são de cima para baixo, SEQ IDNOS: 3-13.

FIGURAS 3A-3C ilustram a estrutura secundária de RNAmprevista do gene CRH bovino baseado em cinco haplotipos. AFIGURA 3A representa os haplotipos GGAG, CGCG e CGCC, AFIGURA 3B representa CACG e a FIGURA 3C representa GAAG. Aseta mostra a estrutura ligeiramente diferente descobertaentre os haplotipos CACG e GAAG.

FIGURAS 4A-4C mostram a plotagem de associação dehaplotipos com valores de SFD (em polegadas) . FIGURA 4A,haplotipos entre c.10718G>C e c.10936G>C, FIGURA 4B,haplotipos entre g.9657C>Tand c.l0718G>C e FIGURA 4C,haplotipos entre g.9657C>Tand.10936G>C. Diferentessobrescritos mostram diferenças significativas (Valor Pes <0,05) entre os dois haplotipos comparados.

FIGURA 5 ilustra um fluxograma da entrada de dados eda saída de resultados da análise e correlação dos dadosreferentes à criação, histórias veterinárias e requisitosde desempenho de um grupo de animais, tal como de umrebanho de vacas e o fluxo interativo de dados dodispositivo assistido por computador para um corpo deestudantes aprendendo a usar o método da invenção.

FIGURA 6 ilustra relações potenciais entre oselementos de dados a serem inseridos no sistema. Setasunidirecionais indicam, por exemplo, que um estábulo é,tipicamente, possuído por um fazendeiro, enquanto que umfazendeiro pode possuir vários estábulos. Similarmente, umaprescrição pode incluir produtos veterinários.FIGURA 7A ilustra o fluxo de eventos no uso do sistemacomputador-baseado portátil para entrada de dados sobre acriação e produção de um rebanho de vacas.

FIGURA 7B ilustra o fluxo de eventos através das sub-rotinas relacionadas à entrada de dados referentes aogerenciamento de uma fazenda.

FIGURA 8 ilustra um fluxograma da entrada de dados eda saída de resultados da análise e a correlação dos dadosreferentes à criação, histórias veterinárias e requisitosde desempenho de um grupo de animais.

DESCRIÇÃO DETALHADA

O cromossoma bovino 14 (BTAl4) abriga Ioci de traçosquantitativos (QTL) que afetam o percentual de gordura noleite e rendimento em gado leiteiro (veja, por exemplo,Viitala e colaboradores, J Dairy Sei. Maio de 2003; 86 (5) :1828-36) e gordura intramuscular (padrão de listras degordura) (veja, por exemplo, Casas e colaboradores, 2000. JAnim Sei. Março de 2000; 78 (3): 560-9) e profundidade degordura subeutânea (SFD) em gado de corte (veja, porexemplo, Moore e colaboradores, J Anim Sei. Agosto de 2003;81 (8) : 1919-25) . 0 gene CRH bovino foi anteriormentecolocado sobre o BTA14 (veja, por exemplo, Barendse ecolaboradores, Mamm Genome. Janeiro de 1997; 8 (1): 21-8).

O hormônio de liberação de corticotropina (CRH) é uminibidor de crescimento que causa a liberação deglicocorticóides que, por sua vez, estimulam a produção depró-opiomelancortina (POMC) e leptina, as quais estãoaltamente associadas à obesidade em mamíferos.

Adicionalmente, o CRH é mais conhecido como um hormônio doestresse. 0 estresse estimula a gliconeogênese hepática queinfluenciará o metabolismo de gordura e proteína em tecidoperiférico de animais. Por exemplo, um estudo recente sobreum gene de hormônio de liberação de corticotropina suíno(CRH) mostrou que ele funciona como um principal reguladorde resposta neuroendócrina ao estresse. Ele mobilizaenergia para lidar com o estresse através de estimulação degliconeogênese hepática e influencia o metabolismo degordura. Portanto, o CRH tem um alto impacto na regulaçãode homeostase de energia e, conseqüentemente, afeta acomposição corporal (depósito de gordura) e crescimento(veja, por exemplo, Murani e colaboradores, Biochem BiophysRes Commun. 7 de Abril de 2006; 342 (2): 394-405).

A prática da presente invenção empregará, a menos quede outro modo indicado, técnicas convencionais de biologiamolecular, microbiologia, tecnologia de DNA recombinante eimunologia, as quais estão dentro da capacidade da técnica.Tais técnicas são explicadas completamente na literatura.Veja, por exemplo, Sambrook e colaboradores (2001)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold SpringHarbor Press; DNA Cloning, Vols. I e II (D. N. Glover ed.1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984);Nucleic Aeid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higginseds. 1984); Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986);Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal,B., A Praetieal Guide to Molecular Cloning (1984); a sérieMethods In Enzymology (S. Colowick e N. Kaplan eds.,Academic Press, Inc.); e Handbook of ExperimentalImmunology, Vols. I-IV (D. M. Weir e C. C. Blackwell eds.,1986, Blaekwell Seientific Publications).

Antes de descrever a presente invenção em detalhes,deve ser entendido que a presente invenção não estálimitada aos parâmetros de processo, DNA ou seqüências depolipeptidio em particular uma vez que os mesmos podem,naturalmente, variar. Também deve ser entendido que aterminologia usada aqui é para fins de descrição demodalidades particulares da invenção apenas e não sedestina a ser limitativa.

A menos que de outro modo definido, todos os termostécnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significadoconforme comumente compreendido por aqueles habilitados natécnica à qual a invenção pertence. Embora uma série demétodos e materiais similares ou equivalentes àquelesdescritos aqui possam ser usados na prática da presenteinvenção, os materiais e métodos preferidos são descritosaqui.

Na descrição da presente invenção, os termos a seguirserão empregados e se destinam a ser definidos conformeindicado abaixo.

0 termo "vaca" ou "gado" é usado de modo geral para sereferir a um animal de origem bovina de qualquer idade.Termos permutáveis incluem "bovino", "bezerro", "tourojovem", "boi", "novilha" e semelhantes. Ele também incluium animal individual em todos os estágios dedesenvolvimento, incluindo estágio embrionário e fetal. Osanimais, conforme mencionados aqui também podem incluirindivíduos ou grupos de indivíduos que são criados paraoutra finalidade que não produção de alimento tal como, masnão limitado a, animais transgênicos para a produção debiofármacos, incluindo anticorpos e outras proteínas ouprodutos de proteína.

Pelo termo "complementaridade" ou "complementar"entenda-se, para fins da especificação ou reivindicações,um número suficiente no oligonucleotídeo de pares de basecomplementares em sua seqüência para interagirespecificamente (hibridizar) com uma seqüência de ácidonucléico alvo do polimorfismo genético a ser amplificado oudetectado. Conforme conhecido por aqueles habilitados natécnica, um grau muito alto de complementaridade énecessário para especificidade e sensibilidade envolvendohibridização, embora não seja necessário ser de 100%.Assim, por exemplo, um oligonucleotideo que é idêntico,quanto à seqüência de nucleotideo, a um oligonucleotideodivulgado aqui, exceto quanto a uma alteração ousubstituição de base, pode funcionar equivalentemente aosoligonucleotideos divulgados. Um gene de "DNA complementar'ou "DNAc" inclui genes recombinantes sintetizados atravésde transcrição reversa de RNA mensageiro ("RNAm") .

Uma "reação cíclica mediada por polimerase" se referea uma reação bioquímica na qual uma molécula molde ou umapopulação de moléculas molde é periódica e repetidamentecopiada para criar uma molécula molde complementar oumoléculas molde complementares, desse modo, aumentando onúmero das moléculas molde com o tempo.

Pelo termo "porção detectável" entenda-se, para finsda especificação ou reivindicações, uma molécula demarcação (isotópica ou não isotópica) a qual é incorporadaindireta ou diretamente em um oligonucleotideo, em que amolécula de marcação facilita a detecção dooligonucleotideo no qual ela é incorporada, por exemplo,quando oligonucleotideo é hibridizado à seqüênciaspolimórficas genéticas amplificadas. Assim, "porçãodetectável" é usada como um sinônimo para "molécula demarcação". A sintese de oligonucleotideos pode serrealizada através de qualquer um de vários métodosconhecidos por aqueles habilitados na técnica. Moléculas demarcação, conhecidas por aqueles habilitados na técnicacomo sendo úteis para detecção, incluem moléculasquimioluminescentes, fluorescentes ou luminescentes. Váriasmoléculas fluorescentes são conhecidas na técnica as quaissão adequadas para uso para marcar um ácido nucléico para ométodo da presente invenção. O protocolo para talincorporação pode variar, dependendo da moléculafluorescente usada. Tais protocolos são conhecidos natécnica para a respectiva molécula fluorescente.

"Amplificação de DNA", conforme usado aqui, se referea qualquer processo que aumente o número de cópias de umaseqüência de DNA especifica através de amplificaçãoenzimática da seqüência de ácido nucléico. Uma variedade deprocessos é conhecida. Um dos mais comumente usados é oprocesso de reação em cadeia de polimerase (PCR) de Mullis,conforme descrito nas Pats. U.S. Nos. 4.683.195 e4.683.202. Métodos, dispositivos e reagentes, conformedescrito nas Pats. U.S. Nos. 6.951.726; 6.927.024;6.924 . 127; 6.8 93.8 63; 6.887.664; 6.881.559; 6.85 5.52 2;6.855.521; 6.849.430

6.844.155; 6.818.437

6.790.952; 6.783.940

6.750.022; 6.744.789

6.699.713; 6.696.277

6.849.4046.818.4026.773.9016.733.999

6.638.716; 6.632.653

6.596.492; 6.586.250

6.566.103; 6.566.067

6.551.783; 6.544.782

6.514.750; 6.514.706

6.492.114; 6.485.907

6.468.743; 6.465.638

6.432.646; 6.428.987

6.403.341; 6.399.320

6.379.932; 6.372.484

6.355.422;6.316.192;6.300.073;6.270.977;6.261.431;6.251.607;6.221.595;6.183.963;

6.348.336

6.312.930

6.300.072

6.270.966

6.258.570

6.248.567

6.586.233

6.566.052

6.537.752

6.503.750

6.485.903

6.465.637

6.426.215

6.395.518

6.368.834

6.346.384

6.309.840

6.287.781

6.268.153

6.258.567

6.235.468

6.846.6316.794.1776.770.4406.733.972

6.664.080; 6.664.064

RE38.352 ; 6.650.719; 6.645.758; 6.645.720

6.617.107; 6.613.560

6.569.678

6.558.929

β.524.830

6.503.705

6.482 . 588

6.465.171

6.423.499

6.391.559

6.365.375

6.319.673

6.309.837

6.284.455

6.268.143

6.258.537

6.232.079

D441.091; 6.218.153; 6.207.425

6.844.158;6.794.133;6.767.724;6.703.236;6.664.044;6.642.000;6.610.487;6.569.627;6.558.909;6.518.020;6.493.640;6.475.729;6.448.014;6.410.223;6.383.755;6.358.680;6.316.195;6.303.343;6.277.605;6.445. 907;6.258.529;6.225.093;6.183.999;

6.180.372; 6.180.349 ; 6.174.670; 6.153.412;β.146.834; 6.143.496

6.087.097; 6.072.369

6.046.039; 6.037.129

6.015.664; 6.015.534

5.985.619; 5.976.842

5.955.274; 5.952.200

5.888.740; 5.883.924

5.869.318; 5.863.772

5.858.725; 5.858.718

5.837.468; 5.830.663

5.824.516; 5.824.479

6.140.613;6.068.974;6.033.854;6.004 . 747;5.972.602;5.936.968;5.876.978;5.863.731;5.856.086;5.827.695;5.817.797;

6.140.110;6.063.563;6.031.960;6.001.612;5.968.730;5.909.468;5.876.977;5.861.251;5.853.991;5.827.661;5.814.489;

6.103.6.048 .6.017 .6.001.5.958.5.905.5.874 .5.861.5.8495. 8275. 814

4 68;688;699;57 2;.68 6;.7 32;.221;.24 5;.4 97;. 657;.4 53;

5.811.296; 5.804.383; 5.800.997; 5.780.271

5.780.222;

5.776.686; 5.774.497

5.747.251; 5.741.656

15 5.710.381; 5.705.627

5.681.741; 5.674.717

5.656.461; 5.654.144

5.639.871; 5.639.611

5.627.054; 5.618.703

20 5.602.756; 5.599.674

5.565.340; 5.565.339

5.527.898; 5.527.510

5.501.947; 5.494.795

5.484.699; 5.476.774

5.766.889; 5.759.822; 5.750. 347;

5.716.784; 5.712.12 5; 5.712.0 90;

5.702.884; 5.693.467; 5.691.146;

5.665.572; 5.665.539; 5.656.493;

5.652.102; 5.650.268; 5.643.765;

5.639.606; 5.631.128; 5.629.178;

5.618.702; 5.614.388; 5.610.017;

5.58 9.333; 5.585.238; 5. 57 6.197;

5.556.774; 5.556.773;

5.514.568; 5.512.463;

5.491.225; 5.487.993;

5.475.610; 5.447.839;

5.538.871;5.512.462;5.487.985;5.437.975;5. 436. 14 4; 5. 426. 02 6; 5.420 .009 5.411.876; 5.393.657;5. 389. 512; 5. 364 . 7 90; 5. 364 . 758 5.340.728; 5.283.171;5. 279. 952; 5. 254 . 4 69; 5.241 . 363 5.232.829; 5.231.015;5. 229. 2 97; 5. 224 . 778; 5.219 .727 5.213.961; 5.198.337;5. 187. 0 60; 5. 142. 033; 5.091 .310 5.082.780; 5.066.584;5. 023. 171 e 5 . 008 . 182 podem ser empregados na prática da

presente invenção. PCR envolve o uso de uma DNA polimerasetermoestável, seqüências conhecidas como primers e ciclosde aquecimento, os quais separam as fitas de ácidodeoxirribonucléi co (DNA) de replicação e amplificamexponencialmente um gene de interesse. Qualquer tipo dePCR, tal como PCR quantitativa, RT-PCR, PCR hot start,LAPCR, PCR multiplex, PCR touchdown, etc., pode ser usado.Vantajosamente, PCR em tempo real é usada. Em geral, oprocesso de amplificação por PCR envolve uma reação emcadeia enzimática cíclica para o preparo de quantidadesexponenciais de uma seqüência de ácido nucléico específica.Ela requer uma pequena quantidade de uma seqüência parainiciar a reação em cadeia e primers de oligonucleotídeoque se hibridizarão ã seqüência. Em PCR, os primers sãoanelados ao ácido nucléico desnaturado seguido por extensãocom um agente de indução (enzima) e nucleotídeos. Issoresulta em produtos de extensão recentemente sintetizados.Uma vez que essas seqüências recentemente sintetizadas setornam moldes para os primers, ciclos repetidos dedesnaturação, anelamento de primer e extensão resultam emacúmulo exponencial da seqüência especifica que está sendoamplificada. O produto da extensão da reação em cadeia seráuma dupla de ácido nucléico distinta com um términocorrespondendo às extremidades dos primers específicosempregados.

Pelos termos "amplificar enzimaticamente" ou"amplificar" entenda-se, para fins da especificação oureivindicações, amplificação de DNA, isto é, um processopelo qual seqüências de ácido nucléico são amplificadasquanto ao número. Existem vários meios para amplificaçãoenzimática de seqüências de ácido nucléico. Atualmente, ométodo mais comumente usado é a reação em cadeia depolimerase (PCR). Outros métodos de amplificação incluemLCR (reação em cadeia de ligase) , o qual utiliza DNAligase, e uma sonda consistindo de duas metades de umsegmento de DNA que é complementar à seqüência do DNA a seramplificado, a enzima replicase QB e um molde de ácidoribonucléico (RNA) preso a uma sonda complementar ao DNA aser copiado, o qual é usado para fazer um molde de DNA paraprodução exponencial de RNA complementar; amplificação pordeslocamento de fita (SDA); amplificação com replicase QB(QBRA); replicação auto-sustentada (3SR); e NASBA(amplificação baseada em seqüência de ácido nucléico) , aqual pode ser realizada sobre RNA ou DNA como a seqüênciade ácido nucléico a ser amplificada.

Um "fragmento" de uma molécula, tal como uma proteínaou ácido nucléico, se destina a se referir à qualquerporção da seqüência genética de aminoácido ou nucleotídeo.

Conforme usado aqui, o termo "genoma" se refere a todoo material genético nos cromossomas de um organismo emparticular. Seu tamanho é geralmente fornecido como seu número total de pares de base. Dentro do genoma, o termo"gene" se refere a uma seqüência ordenada de nucleotídeoslocalizada em uma posição particular sobre um cromossoma emparticular que codifica um produto funcional específico(por exemplo, uma proteína ou molécula de RNA) . Em geral,as caracter!sticas genéticas de um animal, conformedefinido pela seqüência de nucleotídeo de seu genoma, sãoconhecidas como seu "genótipo", enquanto que os traçosfísicos do animal são descritos como seu "fenótipo".

Por "heterozigótico" ou "polimorfismo heterozigótico"entenda-se que os dois alelos de uma célula diplóide ouorganismo em um determinado locus são diferentes, isto é,que eles têm um nucleotídeo diferente trocado pelo mesmonucleotídeo no mesmo lugar em suas seqüências.

Por "homozigótico" ou "polimorfismo homozigótico"entenda-se que os dois alelos de uma célula diplóide ouorganismo em um determinado locus são idênticos, isto é,que eles têm o mesmo nucleotideo para troca de nucleotideono mesmo lugar em suas seqüências.

Por "hibridização" ou "hibridizar", conforme usadoaqui, entenda-se a formação de pares de base A-T e C-Gentre a seqüência de nucleotideo de um fragmento de umsegmento de um polinucleotideo e uma seqüência denucleotideo complementar de um oligonucleotideo. Porcomplementaridade entenda-se que, no locus de cada A, C, Gou T (ou U em um ribonucleotideo) na seqüência dofragmento, o oligonucleotideo seqüenciado tem uma T, G, Cou A, respectivamente. 0 fragmento/oligonucleotideohibridizado é denominado uma "dupla".

Um "complexo de hibridização", tal como em um ensaioem sanduíche, significa um complexo de moléculas de ácidonucléico incluindo pelo menos um ácido nucléico alvo e umasonda sensor. Ele também pode incluir uma sonda âncora.

Conforme usado aqui, o termo "locus" ou "Ioci" serefere ao local de um gene sobre um cromossoma. Pares degenes, conhecidos como "alelos", controlam o traço dehereditariedade produzido por um locus genético. Cadacombinação de alelos em particular em um animal é referidacomo seu "genótipo". Onde ambos os alelos são idênticos, oindivíduo é dito como sendo homozigótico para o traçocontrolado por aquele par de gene; onde os alelos sãodiferentes, o indivíduo é dito como sendo heterozigóticopara o traço.

Uma "temperatura de fusão" significa a temperatura naqual duplas hibridizadas revertem a hibridização e retornama seu estado fita simples. Da mesma forma, hibridização nãoocorrerá no primeiro local entre dois oligonucleotídeos ou,aqui, um oligonucleotídeo e um fragmento, em temperaturasacima da temperatura de fusão da dupla resultante.Presentemente, é vantajoso que a diferença nas temperaturasde ponto de fusão das duplas de oligonucleotídeo efragmento da presente invenção seja de cerca de 1 0C acerca de 10 °C, de modo a ser prontamente detectáveis.

Conforme usado aqui, o termo "molécula de ácidonucléico" se destina a incluir moléculas de DNA (porexemplo, DNAc ou DNA genômico) , moléculas de RNA (porexemplo, RNAm), análogos do DNA ou RNA gerados usandoanálogos de nucleotídeo e derivados, fragmentos e homólogosdos mesmos. A molécula de ácido nucléico pode ser fitasimples ou fita dupla, mas, vantajosamente, é DNA fitadupla. "DNA" se refere à forma polimérica dedeoxirribonucleotídeos (adenina, guanina, timina oucitosina) em sua forma fita simples ou uma hélice fitadupla. Esse termo se refere apenas à estrutura primária esecundária da molécula e não a limita a quaisquer formasterciárias em particular. Assim, esse termo inclui DNA fitadupla encontrado, inter alia, em moléculas de DNA lineares(por exemplo, fragmentos de restrição) , virus, plasmideos ecromossomas. Na discussão da estrutura de moléculas de DNAfita dupla em particular, seqüências podem ser descritasaqui de acordo com a convenção normal de proporcionar aseqüência apenas na direção 5' para 3' ao longo da fita deDNA não transcrita (isto é, a fita tendo uma seqüênciahomóloga ao RNAm). Uma molécula de ácido nucléico "isolada"é uma que é separada de outras moléculas de ácido nucléicoque estão presentes na fonte natural do ácido nucléico.

Um "nucleosídeo" se refere a uma base ligada a umaçúcar. A base pode ser adenina (A), guanina (G) (ou seusubstituto, inosina (I)), citosina (C) ou timina (T) (ouseu substituto, uracila (U) ) . 0 açúcar pode ser ribose (oaçúcar de um nucleotideo natural em RNA) ou 2-desoxirribose(o açúcar de um nucleotideo natural em DNA) . Um"nucleotideo" se refere a um nucleosideo ligado a um únicogrupo fosfato.

Conforme usado aqui, o termo "oligonucleotídeo" serefere a uma série de resíduos de nucleotideo ligados, ondeo oligonucleotídeo tem um número suficiente de bases denucleotideo para ser usado em uma reação de PCR. Umaseqüência de oligonucleotídeos curta pode ser baseada em ouprojetada a partir de uma seqüência de DNAc ou genômica e éusada para amplificar, confirmar ou revelar a presença de um DNA ou RNA idêntico, similar ou complementar em umacélula ou tecido em particular. Oligonucleotídeos podem serquimicamente sintetizados e podem ser usados como primersou sondas. Oligonucleotideo significa qualquer nucleotideode mais de 3 bases de comprimento usado para facilitar adetecção ou identificação de um ácido nucléico alvo,incluindo sondas e primers.

Uma "polimerase" é uma enzima que catalisa a adiçãoseqüencial de unidades monoméricas a uma cadeia poliméricaou liga duas ou mais unidades monoméricas para iniciar uma cadeia polimérica. A "polimerase" funcionará através daadição de unidades monoméricas cuja identidade édeterminada por e a qual é complementar a uma moléculamolde de uma seqüência específica. Por exemplo, DNApolimerases, tal como DNA pol 1 e Taq polimerase, adicionam deoxirribonucleotídeos à extremidade 3' de uma cadeia depolinucleotídeo de uma maneira dependente de molde, dessemodo, sintetizando um ácido nucléico que é complementar àmolécula molde. Polimerases podem ser usadas para estenderum prímer uma vez ou repetidamente ou amplificar umpolinucleotídeo através de priming repetitivo de duas fitascomplementares usando dois primers. Uma "polimerasetermoestável" se refere uma enzima DNA ou RNA polimeraseque pode suportar temperaturas extremamente altas, taiscomo aquelas se aproximando de 100 0C. Freqüentemente,polimerases termoestáveis são derivadas de organismos quevivem em temperaturas extremas, tal como Thermus aquatícus.Exemplos de polimerases termoestáveis incluem Taq, Tth,Pfu, Vent, deep vent, UlTma e variações e derivados dasmesmas.

Um "polinucleotídeo" se refere a uma cadeia linear denucleotídeos conectada por uma ligação de fosfodiésterentre o grupo 3'-hidroxila de um nucleosídeo e um grupo 5'-hidroxila de um nucleosídeo secundário a qual, por sua vez,está ligada através de seu grupo 3'-hidroxila ao grupo 5'-hidroxila de um terceiro nucleosídeo e assim por diantepara formar um polímero compreendido de nucleosídeosligados por uma parte principal de fosfodiéster. Um"polinucleotídeo modificado" se refere a um polinucleotídeono qual um ou mais nucleotídeos naturais foram parcial,substancial ou completamente substituídos por nucleotídeosmodificados.

Um "primer" é um oligonucleotídeo, a seqüência de pelomenos uma porção do qual é complementar a um segmento de umDNA molde o qual tem de ser amplificado ou replicado.Tipicamente, primers são usados na realização de reação emcadeia de polimerase (PCR). Um primer se hibridiza com (ou"anela" a) o DNA molde e é usado pela enzima polimerasecomo o ponto de partida para o processo dereplicação/amplificação. Os primers aqui são selecionadospara serem "substancialmente" complementares a diferentesfitas de uma seqüência de DNA alvo em particular. Issosignifica que os primers devem ser suficientementecomplementares para se hibridizar às suas respectivasfitas. Portanto, a seqüência do primer não precisa refletira seqüência exata do molde. Por exemplo, um fragmento denucleotideo não complementar pode ser preso à extremidade5' do primer, com o restante da seqüência do primer sendocomplementar à fita. Alternativamente, bases nãocomplementares ou seqüências mais longas podem serinterespaçadas no primer, contanto que a seqüência doprimer tenha complementaridade suficiente com a seqüênciada fita para se hibridizar à mesma e, desse modo, formar omolde para a síntese do produto de extensão.

O termo "Sondas" se refere às seqüências de ácidonucléico de oligonucleotídeo de comprimento variável usadasna detecção de seqüências de ácido nucléico idênticas,similares ou complementares através de hibridização. Umaseqüência de oligonucleotídeo usada como uma sonda dedetecção pode ser marcada com uma porção detectável.

Os seguintes são exemplos não limitativos depolinucleotideos: um gene ou fragmento genético, éxons,introns, RNAmr tRNA, rRNA, ribozimas, DNAcrpolinucleotideos recombinantes, polinucleotideosramificados, plasmideos, vetores, DNA isolado de qualquerseqüência, RNA isolado de qualquer seqüência, sondas eprimers de ácido nucléico. Um polinucleotideo podecompreender nucleotideos modificados, tais comonucleotideos metilados e análogos de nucleotideo, uracila,outros açúcares e grupos de ligação, tais comofluororribose, tiolato e ramificações de nucleotideo. Aseqüência de nucleotideo pode ser ainda modificada apóspolimerização, tal como através de conjugação, com umcomponente de marcação. Outros tipos de modificaçãoincluídas nessa definição são revestimentos ousubstituições de um ou mais dos nucleotideos que ocorremnaturalmente por um análogo e introdução de meios parafixação do polinucleotideo às proteínas, íons de metal,componentes de marcação, outros polinucleotideos ou suportesólido.

Um polinucleotideo ou polipeptídeo "isolado" é um queé substancialmente isento dos materiais com os quais eleestá associado em seu ambiente nativo. Por substancialmenteisento entenda-se pelo menos 50%>, pelo menos 55%, pelomenos 60%, pelo menos 65%, vantajosamente pelo menos 70%,pelo menos 75%, mais vantajosamente pelo menos 80%, pelo menos 85%, ainda mais vantajosamente pelo menos 90%, pelomenos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%,pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, maisvantajosamente pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos99,5%, pelo menos 99,9% isento desses materiais.

Uma molécula de ácido nucléico "isolada" é umamolécula de ácido nucléico separada e distinta do organismotodo com o qual a molécula é encontrada na natureza; ou umamolécula de ácido nucléico desprovida, no todo ou em parte,de seqüências normalmente associadas à mesma na natureza;ou uma seqüência, conforme ela existe na natureza, mastendo seqüências heterólogas (conforme definido abaixo) emassociação com a mesma.

o termo "polinucleotídeo que codifica uma proteína",conforme usado aqui, se refere a um fragmento de DNA ou molécula de DNA isolada que codifica uma proteína ou a fitacomplementar à mesma; mas RNA não está excluído, uma vezque é entendido na técnica que timidina (T) , em umaseqüência de DNA, é considerada igual à uracila (U) em umaseqüência de RNA. Assim, seqüências de RNA para uso nainvenção, por exemplo, para uso em vetores de RNA, podemser derivadas de seqüências de DNA, por timidina (T) naseqüência de DNA sendo considerada igual à uracila (U) emseqüências de RNA.

Uma "seqüência de codificação" de DNA ou uma"seqüência de nucleotideo de codificação" de uma proteínaem particular é uma seqüência de DNA a qual é transcrita etraduzida em um polipeptídeo in vitro ou in vivo quandocolocada sob o controle de elementos regulatóriosapropriados. Os limites da seqüência de codificação sãodeterminados por um códon inicial no término 5' (amino) eum códon de término de tradução no término 3' (carbóxi) .Uma seqüência de codificação pode incluir, mas não estálimitada a, seqüências procariotas, DNAc de RNAm eucariota,seqüências de DNA genômico de DNA eucariota (por exemplo,mamífero) e mesmo seqüências de DNA sintéticas. Umaseqüência de término de transcrição usualmente estarálocalizada 3' à seqüência de codificação.

"Homologia" se refere à identidade percentual entreduas porções de polinucleotídeo ou duas de polipeptídeo.Duas seqüências de DNA ou dois polipeptídeos são"substancialmente homólogos" uns aos outros quando asseqüências exibem pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%,84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, de preferência pelo menoscerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94% e, mais preferivelmente,cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% deidentidade de seqüência sobre um comprimento definido dasmoléculas. Conforme usado aqui, substancialmente homólogotambém se refere à seqüências mostrando identidade completa(100%) de identidade de seqüência à seqüência de DNA oupolipeptidio especificada.

A homologia pode ser determinada através dehibridização de polinucleotideos sob condições que formamduplas estáveis entre regiões homólogas, seguido pordigestão com nuclease(s) fita simples especifica edeterminação de tamanho dos fragmentos digeridos.Seqüências de DNA que são substancialmente homólogas podemser identificadas em um experimento de hibridização deSouthern, por exemplo, sob condições rigorosas, conformedefinido para esse sistema em particular. A definição decondições de hibridização apropriadas está dentro dacapacidade na técnica. Veja, por exemplo, Sambrook ecolaboradores, supra; DNA Cloning, supra; Nucleic AcidHybridization, supra.

Dois fragmentos de ácido nucléico são consideradoscomo sendo "seletivamente hibridizáveis" a umpolinucleotideo se eles são capazes de hibridizaçãoespecifica a um ácido nucléico ou uma variante do mesmo oupriming especifico de uma reação em cadeia de polimerase:

(i) sob condições típicas de hibridização e lavagemconforme descrito, por exemplo, em Sarnbrook ecolaboradores, supra e Nucleic Acid Hybridization, supra,

(ii) usando condições de lavagem em rigor reduzido quepermitem no máximo cerca de 25-30% de combinações errôneasde pares de bases, por exemplo, 2x SSC, SDS a 0,1%,temperatura ambiente duas vezes, 30 minutos cada; então, 2xSSC, SDS a 0,1%, 37 0C uma vez, 30 minutos; então, 2x SSC,temperatura ambiente duas vezes, 10 minutos cada ou (iii)seleção de primers para uso em reações em cadeia depolimerase (PCR) típicas sob condições padrões (descritas,por exemplo, em Saiki e colaboradores (1988) Science 239:487-491).

O termo "capaz de hibridização sob condiçõesdrásticas", conforme usado aqui, se refere a anelamento deum primeiro ácido nucléico a um segundo ácido nucléico sobcondições rigorosas, conforme definido abaixo. Condições dehibridização rigorosas permitem, tipicamente, ahibridização de moléculas de ácido nucléico tendo pelomenos 70% de identidade de seqüência de ácido nucléico coma molécula de ácido nucléico que está sendo usada como umasonda na reação de hibridização. Por exemplo, o primeiroácido nucléico pode ser uma amostra de teste ou sonda e osegundo ácido nucléico pode ser a fita senso ou anti-sensode um ácido nucléico ou um fragmento do mesmo. Hibridizaçãodo primeiro e segundo ácido nucléico pode ser conduzida sobcondições rigorosas, por exemplo, alta temperatura e/ou baixo teor de sal, que tendem a desfavorecer a hibridizaçãode seqüências de nucleotideo dissimilares.

Alternativamente, a hibridização do primeiro e segundoácido nucléico pode ser conduzida sob condições de rigorreduzido, por exemplo, baixa temperatura e/ou alto teor de sal que tendem a favorecer a hibridização de seqüências denucleotideo dissimilares. Condições de hibridização embaixo rigor podem ser seguidas por condições de alto rigorou condições de rigor médio intermediário para aumentar aseletividade da ligação dos primeiro e segundo ácidos nucléicos. As condições de hibridização podem ainda incluirreagentes tais como, mas não limitado a, sulfóxido dedimetila (DMSO) ou formamida para desfavoreceradicionalmente a hibridização de seqüências de nucleotideodissimilares. Um protocolo de hibridização adequado pode,por exemplo, envolver hibridização em 6 χ SSC (em que 1 χSSC compreende citrato de sódio a 0,015 M e cloreto desódio a 0,15 M) a 65° Celsius em uma solução aquosa,seguido por lavagem com 1 χ SCC a 65 0C. Fórmulas paracalcular condições apropriadas de hibridização e lavagempara obter hibridização que permite 30% ou menos decombinação errônea entre duas moléculas de ácido nucléicosão divulgadas, por exemplo, em Meinkoth e colaboradores(1984) Anal. Biochem. 138: 267-284; o conteúdo do qual éaqui incorporado por referência em sua totalidade.Protocolos para métodos de hibridização são bem conhecidospor aqueles habilitados na técnica e manuais de biologiamolecular padrões podem ser consultados para selecionar umprotocolo de hibridização adequado sem experimentaçãoindevida. Veja, por exemplo, Sambrook. e colaboradores(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., ColdSpring Harbor Press, os conteúdos do qual são aquiincorporados por referência em sua totalidade.

Tipicamente, condições rigorosas serão aquelas nasquais a concentração de sal é menos do que cerca de 1,5 Mde ions de sódio, tipicamente uma concentração de ions deNa+ de cerca de 0,01 a 1,0 M (ou outros sais), com um pH decerca de 7,0 a um pH de cerca de 8,3 e a temperatura é pelomenos cerca de 30° Celsius para sondas curtas (por exemplo,10 a 50 nucleotideos) e pelo menos cerca de 60° Celsiuspara sondas longas (por exemplo, mais de 50 nucleotideos).Condições rigorosas podem também ser obtidas com a adiçãode agentes de desestabilização, tal como formamida.Condições de baixo rigor exemplificativas incluemhibridização com uma solução tampão de formamida a 30 a35%, NaCl a 1 M, SDS a 1% (dodecil sulfato de sódio) a 37°Celsius e uma lavagem em 1-2 χ SSC a 50 a 55° Celsius.

Condições de rigor moderado exemplificativas incluemhibridização em formamida a 40 a 45%, NaCl a 1 M, SDS a 1%a 37° Celsius e uma lavagem em 0,5-1 χ SSC a 55 a 60°Celsius. Condições de alto rigor exemplificativas incluemhibridização em formamida a 50%, NaCl a 1 M, SDS a 1% a 31°Celsius e uma lavagem em 0,1 χ SSC a 60 a 65° Celsius.

Métodos e materiais da invenção podem ser usados maisgeralmente para avaliar uma amostra de DNA de um animal,tipificar geneticamente um animal individual e detectardiferenças genéticas em animais. Em particular, uma amostrade DNA genômico de um animal pode ser avaliada através dereferência a um ou mais controles para determinar se um SNPou grupo de SNPs está presente em um gene. Qualquer métodopara determinação do genótipo pode ser usado paradeterminação do genótipo na presente invenção. Tais métodosincluem, mas não estão limitados a, seqüenciamento deamplímero, seqüenciamento de DNA, espectroscopia porfluorescência, análise de hibridização baseada emtransferência de energia por ressonância de fluorescência(ou "FRET"), triagem em elevado rendimento, espectroscopiade massa, análise de micro-satélite, hibridização de ácidonucléico, reação em cadeia de polimerase (PCR), análise porRFLP e cromatografia de tamanho (por exemplo, cromatografiaem capilar ou gel) , todos os quais são bem conhecidos poraqueles habilitados na técnica. Em particular, métodos paradeterminação de polimorfismos de nucleotideo,

particularmente polimorfismos de um único nucleotideo, sãodescritos nas Patentes U.S. Nos. 6.514.700; 6.503.710;6.468.742; 6.448.4 07; 6.410.231; 6.383.756; 6. 358.67 9;6.322.980; 6.316.230; e 6.287.766 e revistos por Chen eSullivan, Pharmacogenomics J 2003; 3 (2): 77-96, asdivulgações dos quais são incorporadas por referência emsuas totalidades. Dados genotipicos úteis nos métodos dainvenção e métodos para a identificação e seleção de traçosem animais são baseados na presença de SNPs.

Um "fragmento de restrição" se refere a um fragmentode um polinucleotideo gerado por uma endonuclease derestrição (uma enzima que cliva ligações de fosfodiésterdentro de uma cadeia de polinucleotideo) que cliva DNA emresposta a um sitio de reconhecimento sobre o DNA. 0 sitiode reconhecimento (sitio de restrição) consiste de umaseqüência especifica de nucleotideos, tipicamente de cercade 4-8 nucleotideos de comprimento.

Um "polimorfismo de um único nucleotideo" ou "SNP" serefere a uma variação na seqüência de nucleotideo de umpolinucleotídeo que difere de outro polinucleotideo por umaúnica diferença de nucleotideo. Por exemplo, sem limitação,troca de uma A por uma C, G ou T na seqüência toda dopolinucleotideo constitui um SNP. É possível ter mais de umSNP em um polinucleotídeo em particular. Por exemplo, emuma posição em um polinucleotídeo, uma C pode ser trocadapor uma T, em outra posição, uma G pode ser trocada por umaA e assim por diante. Quando de referência a SNPs, opolinucleotídeo é, mais freqüentemente, DNA.

Conforme usado aqui, um "molde" se refere a uma fitade polinucleotídeo alvo, por exemplo, sem limitação, umafita de DNA que ocorre naturalmente não modificada a qualuma polimerase usa como um meio de reconhecimento de qualnucleotideo será o próximo a incorporar em uma fita emcrescimento para polimerizar o complemento da fita queocorre naturalmente. Tal fita de DNA pode ser fita simplesou pode ser parte de um molde de DNA fita dupla. Emaplicações da presente invenção requerendo ciclos repetidosde polimerização, por exemplo, a reação em cadeia depolimerase (PCR) , a fita molde em si pode se tornarmodificada através de incorporação de nucleotídeosmodificados, ainda assim servindo como um molde para queuma polimerase sintetize polinucleotídeos adicionais.

Uma "reação termocíclica" é uma reação commúltiplas etapas em que pelo menos duas etapas sãorealizadas alterando a temperatura da reação.

Uma "variância" é uma diferença na seqüência denucleotideo entre polinucleotideos relacionados. Adiferença pode ser a deleção de um ou mais nucleotideos daseqüência de um polinucleotideo comparado com a seqüênciade um polinucleotideo relacionado, a adição de um ou maisnucleotideos ou a substituição de um nucleotideo por outro.

Os termos "mutação", "polimorfismo" e "variância" sãousados permutavelmente aqui. Conforme usado aqui, o termo"variância" no singular deve ser construído como incluindomúltiplas variâncias, isto é, duas ou mais adições,deleções e/ou substituições de nucleotideo no mesmopolinucleotideo. Uma "mutação de ponto" se refere a umaúnica substituição de um nucleotideo por outro.

Conforme usado aqui, os termos "traços", "traços dequalidade" ou "características físicas" ou "fenótipos" sereferem à propriedades vantajosas do animal resultantes degenética. Traços de qualidade incluem, mas não estãolimitados a, capacidade genética do animal de metabolizarenergia eficientemente, produzir carne ou leite, carregargordura intramuscular. Características físicas incluem, masnão estão limitadas a, carne com padrão de listras degordura, mais tenra ou magra. Os termos podem ser usadospermutavelmente.

Um "sistema de computador" se refere ao meio dehardware, meio de software e meio de armazenamento de dadosusados para compilar os dados da presente invenção. 0 meiode hardware mínimo de sistemas baseados em computador dainvenção pode compreender uma unidade de processamentocentral (CPU) , meio de entrada, meio de saída e meio dearmazenamento de dados. Desejavelmente, um monitor éproporcionado para visualizar os dados de estrutura. 0 meiode armazenamento de dados pode ser RAM ou outro meio paraacesso de meios legíveis em computador da invenção.Exemplos de tais sistemas são workstations demicrocomputador disponíveis da Silicon GraphicsIncorporated and Sun Microsystems e operando sob ossistemas operacionais Unix, Linux, Windows NT, XP ou IBMOS/2.

"Meio legível em computador" se refere a qualquer meioo qual pode ser lido e acessado diretamente por umcomputador e inclui, mas não está limitado a: meios dearmazenamento magnético, tais como disquetes, meio dearmazenamento rígido e fita magnética; meios dearmazenamento óptico, tais como discos ópticos ou CD-ROM;meios de armazenamento elétrico, tais como RAM e ROM; ehíbridos dessas categorias, tais como meiosmagnéticos/ópticos. Fornecendo tal meio legível emcomputador, os dados compilados sobre um animal emparticular podem ser rotineiramente acessados por umusuário, por exemplo, um operador de confinamento de gado.

0 termo "módulo de análise de dados" é definido aquicomo incluindo qualquer pessoa ou máquina, individualmenteou trabalhando juntos, o qual analisa a amostra a determinaa informação genética contida na mesma. 0 termo podeincluir uma pessoa ou máquina dentro de um ambiente de laboratório.

Conforme usado aqui, o termo "módulo de coleta dedados" se refere a qualquer pessoa, objeto ou sistema queobtém uma amostra de tecido de um animal ou embrião. Porexemplo, e sem limitação, o termo pode definir, individual ou coletivamente, a pessoa ou máquina em contato físico como animal à medida que a amostra é tomada, os recipientesque contêm as amostras de tecido, a embalagem usada paratransporte das amostras e semelhantes. Vantajosamente, ocoletor de dados é uma pessoa. Mais vantajosamente, o coletor de dados é um fazendeiro, um pecuarista ou umveterinário.

O termo "interface de rede" é definido aqui comoincluindo qualquer pessoa ou sistema de computador capaz deacessar, depositar, combinar, analisar, pesquisar,transmitir ou armazenar dados. O termo é amplamentedefinido como sendo uma pessoa que analisa os dados, ossistemas de hardware eletrônico e software usados naanálise, os bancos de dados que armazenam a análise dedados e qualquer meio de armazenamento capaz de armazenaros dados. Exemplos não limitativos de interfaces de redeincluem pessoas, equipamento automático de laboratório,computadores e redes de computador, dispositivos dearmazenamento de dados tais como, mas não limitado a,discos, discos rigidos ou chips de memória.

O termo "história de criação", conforme usado aqui, serefere a um registro da vida de um animal ou grupo deanimais incluindo, mas não limitado a, o local, criação,período de alojamento, bem como uma história genética dosanimais, incluindo parentes e descentes dos mesmos,genótipo, fenótipo, história transgênica, se relevante, esemelhantes.

O termo "condições de pecuária", conforme usado aqui,se refere a parâmetros relativos à manutenção de animaisincluindo, mas não limitado a, temperatura de abrigo oualojamento, mortalidade semanal de um rebanho, consumo deágua, consumo de alimento, taxa e qualidade de ventilação,condição da ninhada e semelhantes.

O termo "história veterinária", conforme usado aqui,se refere aos dados de vacinação de um animal ou grupo deanimais incluindo, mas não limitado a, tipo(s) de vacina,número (s) de série do lote de vacina, dose administrada,antigeno alvo, método de administração da vacina ao(s) animal(is) recipiente(s), número de animais vacinados,idade dos animais e o vacinador. Dados relativos a umaresposta sorológica ou imunológica induzida pela vacinatambém podem ser incluídos. "História veterinária",conforme usado aqui, também se destina a incluir as histórias de medicação do(s) animal(is) alvo incluindo, masnão limitado a, fármacos e/ou antibióticos administradosaos animais, incluindo tipo de medicação administrada,quantidade e taxas de dose, por quem e quando administrado,por qual via, por exemplo, oral, subcutaneamente e semelhantes e a resposta à medicação, incluindo efeitosdesejados e indesejáveis da mesma.

0 termo "dados diagnósticos", conforme usado aqui, serefere a outros dados referentes à saúde do(s) animal(is)que não dados detalhando a história de vacinação ou medicação do(s) animal(is). Por exemplo, os dadosdiagnósticos podem ser um registro das infecçõesexperimentadas pelo(s) animal(is) e a resposta do(s)mesmo(s) às medicações fornecidas para tratar taisinfecções. Dados sorológicos, incluindo composição deanticorpo ou proteína do soro ou outros biofluidos, tambémpodem ser dados diagnósticos úteis para inserir nos métodosda invenção. Dados cirúrgicos referentes ao(s) animal(is)podem ser incluidos, tais côo o tipo de manipulaçãocirúrgica, resultado da cirurgia e complicações quesurgiram do procedimento cirúrgico. "Dados diagnósticos"também podem incluir medições de parâmetros tais como peso,morbidade e outras características notadas por um serviçoveterinário, tal como a condição da pele, patas, etc.

O termo "dados de bem estar", conforme usado aqui, serefere ao acúmulo coletivo de dados referentes a um animalou grupo de animais incluindo, mas não limitado a, umahistória de criação, uma história veterinária, um perfil debem estar, dados diagnósticos, dados de controle dequalidade ou qualquer combinação dos mesmos. O termo"perfil de bem estar", conforme usado aqui, se refere aparâmetros tais como peso, densidade da carne, níveis deaglomeração nas áreas cercadas de criação ou produção,comportamento psicológico do animal, taxa e qualidade decrescimento e semelhantes.

O termo "controle de qualidade", conforme usado aqui,se refere às características desejadas do(s) animal (is).Para animais que não aves, tais como gado e ovelha, porexemplo, tais parâmetros incluem quantidade e densidade demúsculo, teor de gordura, maciez da carne, rendimento equalidade de leite, capacidade de cruzamento e semelhantes.

0 termo "parâmetros de desempenho", conforme usadoaqui, se refere a fatores tais como padrão de listras degordura da carne, gordura subcutânea, rendimento da carne,rendimento de criação, forma de leite, qualidade erendimento da carne, taxa de gravidez (isto é,fertilidade), vida produtiva (isto é, longevidade) esemelhantes que podem ser os objetivos desejados da criaçãoe produção do(s) animal(is). Parâmetros de desempenho podemser gerados a partir dos animais em si ou aquelesparâmetros desejados por um cliente ou mercado.

0 termo "dados nutricionais", conforme usado aqui, serefere à composição, quantidade e freqüência dedistribuição de alimento, incluindo água, fornecidos ao(s)animal(is) .

0 termo "segurança do alimento", conforme usado aqui,se refere à qualidade da carne de uma cabeça de gadoincluindo, mas não limitado a, tempo de preparo, local emaneira, armazenamento do produto alimentício, via detransporte, registros de inspeção, textura, cor, sabor,odor, teor bacteriano, teor parasítico e semelhantes.

Será apreciado por aqueles habilitados na técnica queos dados referentes à saúde e manutenção dos animais podemser agrupados de forma variada, dependendo da fonte ouintenção do coletor de dados e qualquer agrupamento aqui,portanto, não se destina a ser limitativo.

A menos que de outro modo definido, todos os termostécnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significadoconforme comumente compreendido por aqueles habilitados natécnica de biologia molecular. Embora métodos e materiaissimilares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam serusados na prática ou em testes da presente invenção,métodos e materiais adequados são descritos aqui.

Em uma modalidade em que o gene de interesse é CRHbovino, a seqüência de nucleotídeo de CRH bovino pode serselecionada de, mas não está limitado a, a seqüênciacorrespondendo ao No. de Acesso ao GenBank AAFC03076794.1,cromossoma bovino 14 (BTA14) ou um fragmento do mesmo ouuma região do genoma bovino que compreenda essa seqüência.

A presente invenção, portanto, proporciona ácidosnucléicos isolados que se hibridizam especificamente àseqüência de nucleotídeo que pode ser selecionada de, masnão está limitada a, seqüência correspondendo ao No. deAcesso ao GenBank AAFC03076794.1 ou o complemento da mesmae a qual compreende os sítios polimórficos correspondendoaos SNPs de CRH.

O(s) polimorfismo(s) de um único nucleotídeo deinteresse pode(m) ser selecionado(s) do grupo consistindode AAFC03076794.1:g.9657C>T, c.10718G>C, c.10841G>A,c.W893A.c e c.10936G>C.

O SNP vantajoso na presente invenção está associado adeterminados traços economicamente valiosos e hereditáriosreferentes ao padrão de listras de gordura e/ouprofundidade de gordura subcutânea em bovinos. Portanto, éum objetivo da presente invenção determinar o genótipo deum determinado animal de interesse, conforme definido peloSNP do locus CRH de acordo com a presente invenção.

Também, considera-se que o genótipo do(s) animal(is)pode ser definido por SNPs adicionais dentro do gene CRH oudentro de outros genes identifiçados com traços ou outrascaracterísticas desejáveis e, em particular, por um painelou painéis de SNP.

Existem muitos métodos conhecidos na técnica paradeterminação da seqüência de DNA em uma amostra e paraidentificar se uma determinada amostra de DNA contém um SNPem particular. Qualquer um de tais métodos conhecidos natécnica pode ser usado para realizar os métodos da presenteinvenção.

Os métodos da presente invenção permitem que animaiscom determinados traços hereditários economicamentevaliosos sejam identificados baseados na presença de SNP emseus genomas e, particularmente, SNP do gene CRH. Osmétodos ainda permitem, através de métodos assistido porcomputador da invenção, correlacionar os traços associadosao SNP a outros dados pertinentes ao bem estar e capacidadereprodutiva dos animais ou grupo de animais.

Para determinar o genótipo de um determinado animal deacordo com os métodos da presente invenção, é necessárioobter uma amostra de DNA genômico desse animal.Tipicamente, essa amostra de DNA genômico será obtida deuma amostra de tecido ou células tomada desse animal. Umaamostra de tecido ou célula pode ser tomada de um animal aqualquer momento durante sua vida, mas antes que aidentidade de carcaça seja perdida. A amostra de tecidopode compreender pêlo, incluindo raízes, pele, osso,esfregaços bucais, sangue, saliva, leite, sêmen, embriões,músculo ou quaisquer órgãos internos. Nos métodos dapresente invenção, a fonte da amostra de tecido e, assim,também a fonte da amostra de ácido· nucléico de teste, não écrítica. Por exemplo, o ácido nucléico de teste pode serobtido de células dentro de um fluido corporal do animal oude células que constituem um tecido corporal do animal. 0fluido corporal em particular do qual as células sãoobtidas também não é crítico para a presente invenção. Porexemplo, o fluido corporal pode ser selecionado do grupoconsistindo de sangue, ascites, fluido pleural e fluidoespinhal. Além disso, o tecido corporal em particular doqual as células são obtidas também não é critico para apresente invenção. Por exemplo, o tecido corporal pode serselecionado do grupo consistindo de pele, endométrio,tecido uterino e cervical. Tecidos normais e tumorígenospodem ser usados.

Tipicamente, a amostra de tecido é marcada com umnúmero de identificação ou outro indicio que relacione aamostra ao animal individual do qual a amostra foi tomada.A identidade da amostra permanece, vantajosamente,constante no decorrer dos métodos e sistemas da invenção,desse modo, assegurando a integridade e continuidade daamostra durante extração e análise. Alternativamente, oindicio pode ser trocado de um modo regular para assegurarque os dados e quaisquer outros dados associados possam serrelacionados novamente ao animal do qual os dados foramobtidos.

A quantidade/tamanho de amostra requerida é conhecidapor aqueles habilitados na técnica e, por exemplo, pode serdeterminada através das etapas subseqüentes usadas nométodo e sistema da invenção e nos métodos específicos deanálise usados. Idealmente, o tamanho/volume da amostra detecido recuperada deverá ser consistente, tanto quantopossível, com o tipo de amostra e a espécie de animal. Porexemplo, para gado, exemplos não limitativos de tamanhos deamostra/métodos incluem: carne sem gordura: 0,0002 g-10,0g; pele: 0,0004 g-10,0 g; raízes de pêlo: pelo menos uma e,vantajosamente, mais de cinco; esfregaços bucais: 15 a 20segundos de esfregação com pressão modesta na área entre olábio externo e a gengiva usando, por exemplo, uma escovade citologia; osso: 0,0002 g-10,0 g; sangue: 30 μΐ a 50 ml.

Geralmente, a amostra de tecido é colocada em umrecipiente que é marcado usando um sistema de numeraçãotrazendo um código correspondendo ao animal, por exemplo, àetiqueta na orelha do animal. Conseqüentemente, o genótipode um animal em particular é sempre facilmente rastreável.

O dispositivo e/ou recipiente de amostragem pode serfornecido ao fazendeiro, abatedouro ou varejista. Odispositivo de amostragem, vantajosamente, toma uma amostraconsistente e reproduzível de animais individuais enquanto,ao mesmo tempo, evita qualquer contaminação cruzada detecido. Conseqüentemente, o tamanho e volume de tecidospara amostra de animais individuais seria consistente.

DNA pode ser isolado do tecido/células através demétodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica(veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6.548.256 e5.989.431; Hirota e colaboradores (1989) Jinrui IdengakuZasshi. 34: 217-23 e John e colaboradores (1991) NucleicAcids Res. 19: 408, as divulgações dos quais sãoincorporadas por referência em suas totalidades). Porexemplo, DNA de elevado peso molecular pode ser purificadode células ou tecido usando extração com proteinase K eprecipitação com etanol. DNA, contudo, pode ser extraido deum espécime animal usando quaisquer outros métodosadequados conhecidos na técnica.

Em uma modalidade, a presença ou ausência do SNP dequalquer um dos genes da presente invenção pode serdeterminada através de seqüenciamento da região da amostrade DNA genômico que abrange o locus polimórfico. Muitosmétodos de seqüenciamento de DNA genômico são conhecidos natécnica e qualquer um de tais métodos pode ser usado; veja,por exemplo, Sambrook e colaboradores (2001) MolecularCloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring HarborPress. Por exemplo, conforme descrito abaixo, um fragmentode DNA abrangendo a localização do SNP de interesse podeser amplificado usando a reação em cadeia de polimerase. Aregião de DNA amplificada pode, então, ser seqüenciadausando qualquer método conhecido na técnica, por exemplo,usando um seqüenciador de ácido nucléico automático. Adetecção de um determinado SNP pode, então, ser realizadausando hibridização de sondas ou usando métodos deamplificação baseados em PCR. Tais métodos são descritos emmaiores detalhes abaixo.

Os métodos da presente invenção podem usaroligonucleotideos úteis como primers para amplificarseqüências de ácido nucléico especificas do gene CRHfvantajosamente, da região abrangendo um SNP de CRH. Taisfragmentos deverão ser de comprimento suficiente parapermitir anelamento ou hibridização especifica à amostra deácido nucléico. As seqüências, tipicamente, terão cerca de8 a cerca de 44 nucleotideos de comprimento. Seqüênciasmais longas, por exemplo, de cerca de 14 a cerca de 50,podem ser vantajosas para determinadas modalidades. Odesign de primers é bem conhecido por aqueles habilitadosna técnica.

As moléculas de ácido nucléico da invenção incluemmoléculas de ácido nucléico tendo pelo menos 70% deidentidade ou homologia ou similaridade com um gene CRHfsondas ou primers derivados do mesmo, tal como pelo menos7 5% de identidade ou homologia ou similaridade, depreferência pelo menos 80% de identidade ou homologia ousimilaridade, mais preferivelmente pelo menos 85% deidentidade, homologia ou similaridade, tal como pelo menos90% de identidade, homologia ou similaridade, maispreferivelmente pelo menos 95% de identidade, homologia ousimilaridade, tal como pelo menos 97% de identidade,homologia ou similaridade. A identidade, homologia ousimilaridade de seqüência de nucleotideo pode serdeterminada usando o programa "Align" de Myers e Miller,("Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS 4, 11-17,1988) e disponível no NCBI. Alternativa ou adicionalmente,os termos "similaridade" ou "identidade" ou "homologia",por exemplo, com relação a uma seqüência de nucleotideo, sedestinam a indicar uma medida quantitativa de homologiaentre duas seqüências. A similaridade de seqüênciapercentual pode ser calculada como (Nref - Ndif) * 100/Nref,em que Ndif é o número total de resíduos não idênticos nasduas seqüências quando alinhadas e em que Nref é o número deresíduos em uma das seqüências. Conseqüentemente, a seqüência de DNA AGTCAGTC terá uma similaridade deseqüência de 75% com a seqüência AATCAATC (Nref = 8; Ndif =2). Alternativa ou adicionalmente, "similaridade", comrelação às seqüências, se refere ao número de posições comnucleotídeos idênticos dividido pelo número de nucleotídeosna mais curta das duas seqüências, em que o alinhamento dasduas seqüências pode ser determinado de acordo com oalgoritmo de Wilbur e Lipman (Wilbur e Lipman, 1983 PNASUSA, 80: 726), por exemplo, usando um tamanho de janela de20 nucleotídeos, um comprimento de palavra de 4nucleotídeos e uma penalidade por gap de 4 e análiseassistida por computador e interpretação dos dados deseqüência incluindo alinhamento pode, convenientemente, serrealizada usando programas comercialmente disponíveis (porexemplo, Intelligenetics ™ Suite, Intelligenetics Inc. CA).Quando seqüências de RNA são ditas como sendo similares outendo um grau de identidade de seqüência com seqüências deDNA, timidina (T) na seqüência de DNA é considerada igual àuracila (U) na seqüência de RNA.

Uma sonda ou primer pode ser qualquer trecho de pelomenos 8, de preferência pelo menos 10, mais preferivelmentepelo menos 12, 13, 14 ou 15, tal como pelo menos 20, porexemplo, pelo menos 23 ou 25, por exemplo, pelo menos 27 ou30 nucleotídeos em um gene CRH os quais são únicos a umgene CRH. Como primers ou sondas de PCR ou hibridização ecomprimentos ótimos para os mesmos, referência também éfeita a Kajimura e colaboradores, GATA 7(4): 71-79 (1990).

Seqüências de RNA, dentro do escopo da invenção, sãoderivadas das seqüências de DNA, por timidina (T) naseqüência de DNA sendo considerada igual à uracila (U) emseqüências de RNA.

Os oligonucleotídeos podem ser produzidos através deum processo de produção convencional para oligonucleotídeosem geral. Eles podem ser produzidos, por exemplo, atravésde um processo de síntese química ou através de um processomicrobiano que faz uso de um vetor de plasmídeo, um vetorde fago ou semelhante. Ainda, é adequado usar umsintetizador de ácido nucléico.

Para marcar um oligonucleotídeo com um corantefluorescente, um dos métodos de marcação convencionalmenteconhecidos pode ser usado (Tyagi & Kramer (1996) NatureBiotechnology 14: 303-308; Schofield e colaboradores (1997)Appl. and Environ. Microbiol. 63: 1143-1147; Proudnikov &Mirzabekov (1996) Nucl. Acids Res. 24: 4532-4535).Alternativamente, o oligonucleotídeo pode ser marcado comum marcador radioativo, por exemplo, 3H, 125I, 35S, 14C, 32P,etc. Métodos de marcação bem conhecidos são descritos, porexemplo, em Sambrook e colaboradores (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring HarborPress. 0 marcador é acoplado direta ou indiretamente a umcomponente do oligonucleotídeo de acordo com métodos bemconhecidos na técnica. Cromatografia de fase reversa ousemelhante usada para proporcionar uma sonda de ácido nucléico para uso na presente invenção pode purificar ooligonucleotídeo sintetizado marcado com um marcador. Umaforma de sonda vantajosa é uma marcada com um corantefluorescente na extremidade 3' ou 5' contendo G ou c como abase na extremidade marcada. Se a extremidade 5' é marcadae a extremidade 3' não é marcada, o grupo OH sobre o átomode C na posição 3' da ribose ou desoxirribose naextremidade 3' pode ser modificado com um grupo fosfato ousemelhante, embora nenhuma limitação seja imposta a esserespeito.

Durante a hibridização do alvo de ácido nucléico comas sondas, condições rigorosas podem ser utilizadas,vantajosamente junto com outras condições que afetem origor para auxiliar na hibridização. Detecção através deruptura diferencial é particularmente vantajosa parareduzir ou eliminar hibridização inadvertida entre sondas eo alvo e para promover hibridização mais eficiente. Emainda outro aspecto, as condições rigorosas podem servariadas durante a determinação de estabilidade do complexode hibridização, de modo a determinar mais precisa ourapidamente se um SNP está presente na seqüência alvo.

Um método para determinação do genótipo no locus dogene polimórfico abrange obtenção de uma amostra de ácidonucléico, hibridização da amostra de ácido nucléico com umasonda e ruptura da hibridização para determinar o nivel deenergia de ruptura requerida, em que a sonda tem umaenergia de ruptura diferente para um alelo quando comparadocom outro alelo. Em um exemplo, pode haver uma menorenergia de ruptura, por exemplo, temperatura de fusão, paraum alelo que abriga um resíduo de citosina em um locuspolimórfico e uma maior energia requerida para um alelo comum resíduo diferente nesse locus polimórfico. Isso pode serobtido onde a sonda tem 100% de homologia com um alelo (umasonda perfeitamente combinada) , mas tem uma únicacombinação errônea com o alelo alternativo. Uma vez que asonda perfeitamente combinada é ligada mais hermeticamenteao DNA alvo do que a sonda com combinação errônea, elarequer mais energia para fazer com que a sonda dehibridização se dissocie.

Em outra etapa do método acima, uma segunda sonda("âncora") pode ser usada. Geralmente, a sonda âncora não éespecífica ao alelo, mas se hibridiza a despeito de qualnucleotídeo está presente no locus polimórfico. A sondaâncora não afeta a energia de ruptura requerida paradissociar o complexo de hibridização mas, antes, contém ummarcador complementar para uso com a primeira sonda("sensor").

A estabilidade de hibridização pode ser influenciadapor numerosos fatores, incluindo termo-regulação, regulaçãoquímica, bem como o controle de rigor eletrônico, quersozinhos ou em combinação com os outros fatores listados.Usando as condições rigorosas, em qualquer uma ou ambas asetapas de hibridização do alvo ou da etapa de rigor dooligonucleotídeo sensor, término rápido de processo podeser obtido. Isso é desejável para obter hibridizaçãoapropriadamente indexada do DNA alvo para obter o númeromáximo de moléculas em um local de teste com um complexo dehibridização preciso. A titulo de exemplo, com o uso derigor, a etapa de hibridização inicial pode ser terminadaem dez minutos ou menos, mais vantajosamente cinco minutosou menos e, mais vantajosamente, dois minutos ou menos. Emgeral, o processo analítico pode estar terminado em menosde meia hora.

Em um modo, o complexo de hibridização é marcado e aetapa de determinação da guantidade de hibridização incluidetecção das guantidades de complexo de hibridizaçãomarcado nos locais de teste. 0 dispositivo e método dedetecção podem incluir, mas não estão limitados a, formaçãode imagem óptica, formação de imagem eletrônica, formaçãode imagem com uma câmera de CCD, formação de imagem ópticaintegrada e espectrometria de massa. Ainda, a quantidade desonda marcada ou não marcada ligada ao alvo pode serquantificada. Tal quantificação pode incluir análiseestatística. A porção marcada do complexo pode ser o alvo,o estabilizante, a sonda ou o complexo de hibridização intoto. Marcação pode ser marcação fluorescente selecionadado grupo de, mas não limitado a, Cy3, Cy5, Bodipy TexasRed, Bodipy Far Red, Amarelo Lúcifer, Bodipy 630/650-X,Bodipy R6G-X e 5-CR 6G. Marcação colorimétrica, marcaçãobioluminescente e/ou marcação quimioluminescente podemainda realizar marcação. Marcação pode ainda ser realizadaatravés de medição do diferencial de condutância entre DNAfita dupla e não fita dupla. Ainda, detecção direta podeser obtida através de interferometria óptica baseada emsilício poroso ou através de espectrometria de massa. Aousar espectrometria de massa, nenhum marcador fluorescenteou outro é necessário. Antes, a detecção é obtida atravésde níveis extremamente altos de decomposição de massaobtidos através de medição direta, por exemplo, através detempo de vôo (TOF) ou ionização por pulverização deelétrons (ESI). Onde espectrometria de massa é considerada,sondas tendo uma seqüência de ácido nucléico de 50 bases oumenos são vantajosas.

O marcador pode ser amplificado e pode incluir, porexemplo, DNA dendrítico ou ramificado. Se o DNA alvo épurificado, ele pode ser não amplificado ou amplificado.Ainda, se o alvo purificado é amplificado e a amplificaçãoé um método exponencial, ele pode ser, por exemplo, DNAamplificado por PCR ou DNA amplificado através deamplificação por deslocamento de fita (SDA). Métodoslineares de amplificação de DNA, tal como circulo giratórioou escoamento transcricional também podem ser usados.

Onde é desejado amplificar um fragmento de DNA quecompreende um SNP de acordo com a presente invenção, osprimers avante e reverso podem ter trechos contínuos decerca de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou qualquer outrocomprimento até e incluindo cerca de 50 nucleotídeos decomprimento. As seqüências às quais os primers avante ereverso se anelam estão, vantajosamente, localizadas sobreo lado da posição de nucleotídeo em particular que ésubstituído no SNP a ser amplificado.

Um marcador detectável pode ser incorporado em umácido nucléico durante pelo menos um ciclo de reação deamplificação. Meios espectroscópicos, fotoquímicos,bioquímicos, imunoquímicos, elétricos, ópticos ou químicospodem detectar tais rótulos. Marcadores úteis na presenteinvenção incluem corantes fluorescentes (por exemplo,isotiocianato de fluoresceína, Texas Red, rodamina esemelhantes) radio-marcadores (por exemplo, 3H, 125I, 35S,14C, 32P, etc.), enzimas (por exemplo, peroxidase dearmorácia, fosfatase alcalina, etc.), rótuloscolorimétricos, tais como glóbulos de ouro coloidal ouvidro colorido ou plástico (por exemplo, poliestireno,polipropileno, látex, etc.). 0 marcador é acoplado diretaou indiretamente a um componente do ensaio de acordo commétodos bem conhecidos na técnica. Conforme indicado acima,uma ampla variedade de rótulos é usada, com a escolha domarcador dependendo da sensibilidade requerida, facilidadede conjugação com o composto, requisitos de estabilidade,instrumentação disponível e condições de descarte. Rótulosnão radioativos são freqüentemente presos através de meiosindiretos. Polimerases também podem incorporar nucleotídeosfluorescentes durante síntese de ácidos nucléicos.

Reagentes que permitem o seqüenciamento de produtos dareação podem ser utilizados aqui. Por exemplo, nucleotídeosde término de cadeia freqüentemente serão incorporados emum produto de reação durante um ou mais ciclos de umareação. Kits comerciais contendo os reagentes maistipicamente usados para esses métodos de seqüenciamento deDNA estão disponíveis e são amplamente usados. Métodos dedigestão com exonuclease de PCR para seqüenciamento de DNAtambém podem ser usados. Muitos métodos de seqüenciamentode DNA genômico são conhecidos na técnica e qualquer um detais métodos pode ser usado; veja, por exemplo, Sambrook ecolaboradores (2001) Molecular Cloning: A LaboratoryManual, 3a ed., Cold Spring Harbor Press. Por exemplo,conforme descrito abaixo, um fragmento de DNA abrangendo olocal do SNP de interesse pode ser amplificado usando areação em cadeia de polimerase ou alguma outra reação deamplificação mediada por polimerase cíclica. A região deDNA amplificada pode, então, ser seqüenciada usandoqualquer método conhecido na técnica. Vantajosamente, oseqüenciamento de ácido nucléico é através de métodosautomáticos (revisto por Meldrum, (2000) Genome Res. 10:1288-303, a divulgação do qual é incorporada por referênciaem sua totalidade), por exemplo, usando um Beckman CEQ 8000Genetic Analysis System (Beckman Coulter Instruments,Inc.). Métodos para seqüenciamento de ácidos nucléicosincluem, mas não estão limitados a, seqüenciamento de DNAfluorescente automático (veja, por exemplo, Watts &MacBeath, (2001) Methods Mol Biol. 167: 153-70 e MacBeath ecolaboradores (2001) Methods Mol Biol. 167: 119-52),eletroforese em capilar (veja, por exemplo, Bosserhoff ecolaboradores (2000) Comb Chem High Throughput Screen. 3:455-66), lascas de seqüenciamento de DNA (veja, porexemplo, Jain, (2000) Pharmacogenomics. 1: 289-307),espectrometria de massa (veja, por exemplo, Yates, (2000)Trends Genet. 16: 5-8), piro-seqüenciamento (veja, porexemplo, Ronaghi (2001) Genome Res. 11: 3-11) eeletroforese em gel com camada ultrafina (veja, porexemplo, Guttman & Ronai, (2000) Electrophoresis. 21: 3952-64), as divulgações dos quais são aqui incorporadas porreferência em suas totalidades. O seqüenciamento tambémpode ser feito por uma companhia comercial. Exemplos detais companhias incluem, mas não estão limitados a,University of Geórgia Molecular Genetics InstrumentationFacility (Athens, Geórgia) ou SeqWright DNA TechnologiesServices (Houston, Texas).

Uma sonda especifica de SNP também pode ser usada nadetecção do SNP em seqüências de ácido nucléico especificasamplificadas do gene alvo, tal como os produtos de PCRamplificados gerados usando os primers descritos acima. Emdeterminadas modalidades, essas sondas especificas de SNPconsistem em fragmentos de oligonucleotideo.

Vantajosamente, os fragmentos são de um comprimentosuficiente para proporcionar hibridização especifica àamostra de ácido nucléico. O uso de uma sonda dehibridização de entre 10 e 50 nucleotideos de comprimentopermite a formação de uma molécula dupla que é estável eseletiva. Moléculas tendo seqüências complementares sobretrechos maiores do que 12 bases de comprimento sãogeralmente vantajosas de forma a aumentar a estabilidade eseletividade do híbrido e, desse modo, melhorar a qualidadee grau de moléculas híbridas em particular obtidas.Geralmente, será preferido· projetar moléculas de ácidonucléico tendo trechos de 16 a 24 nucleotideos ou menoslongas onde desejado. Uma região de nucleotídeo tag podeser incluída, conforme na extremidade 5' do primer, quepode proporcionar um sítio ao qual um primer deseqüenciamento de oligonucleotídeo pode se hibridizar parafacilitar o seqüenciamento de múltiplas amostras de PCR.

A seqüência da sonda deve abranger a posição denucleotídeo em particular que pode ser substituída no SNP aser detectado em particular. Vantajosamente, duas ou mais"sondas específicas de alelo" diferentes podem ser usadaspara análise de um SNP, uma primeira sonda específica dealelo para detecção de um alelo e uma segunda sondaespecífica de alelo para a detecção do alelo alternativo.

Será entendido que a presente invenção não estálimitada aos primers e sondas divulgados aqui em particulare pretende abranger pelo menos seqüências de ácido nucléicoque são hibridizáveis à seqüência de nucleotídeo divulgadaaqui, o complemento ou um fragmento da mesma ou sãoanálogos de seqüência funcionais dessas seqüências. Tambémse considera que um traço particular de um animal pode serdeterminado usando um painel de SNPs associados a essetraço. Vários traços economicamente relevantes podem sercaracterizados pela presença ou ausência de um ou mais SNPse por uma pluralidade de SNPs em diferentes genes. Um oumais painéis de SNPs podem ser usados nos métodos dainvenção para definir o perfil fenotipico do animal emquestão.

Homólogos (isto é, ácidos nucléicos derivados de outraespécie) ou outras seqüências relacionadas (por exemplo,parálogos) podem ser obtidos sob condições de hibridizaçãopadrão ou rigorosa com toda ou uma porção da seqüência emparticular como uma sonda usando métodos bem conhecidos natécnica para hibridização e clonagem de ácido nucléico.

Os marcadores genéticos, sondas dos mesmos, métodos ekits da invenção também são úteis em um programa de criaçãopara selecionar criação daqueles animais tendo fenótiposdesejáveis para vários traços economicamente importantes,tais como padrão de listras de gordura e/ou profundidade degordura subcutânea. Seleção e criação continuas de animais,tais como gado, que são pelo menos heterozigóticos e,vantajosamente, homozigóticos para alelos desejáveis dossítios polimórficos do gene CRH associados a traçoseconomicamente relevantes de crescimento, ingestão dealimento, eficiência e/ou valor da carcaça e reprodução elongevidade levarão a uma raça, linhagem ou população tendomaiores números de proles com traços economicamenterelevantes de crescimento, ingestão de alimento, eficiênciae valor da carcaça e reprodução e longevidade. Assim, osSNPs de CRH da presente invenção podem ser usados como umaferramenta de seleção.

Fenótipos desejáveis incluem, mas não estão limitadosa, ingestão de alimento, taxa de crescimento, pesocorporal, valor e composição da carcaça e reprodução,longevidade e rendimento de leite. Traços da carcaçaespecíficos com fenótipos desejáveis incluem, mas não estãolimitados a, valor adicional da carcaça (valor adicional decuidado, $), ganho diário médio (ADG, quilograma/dia),espessura de gordura nas costas (BFAT, centímetros), pesovivo calculado (Cale Lv Wt, quilograma) , grau de rendimentocalculado (cYG), dias sob alimentação (DOF, d), percentualde adorno (DP, %), ingestão de matéria seca (DMI,quilograma) , ingestão de matéria seca por dia sobalimentação (DMI por DOF, quilograma/dia), peso da carcaçaquente (HCW, quilograma), valor de peso da carcaça quente(valor de HCW, $), teor de gordura intramuscular (IMF%, %),escore de padrão de listras de gordura (MBS, 10 a 99) ,escore de padrão de listras de gordura dividido por diassob alimentação (MBS/DOF), grau de qualidade, menor do queou igual a selecionado versus maior do que ou igual àescolha (QG, < Se vs > Ch), área de carne da costela (REA,centímetro2) , área de carne da costela por peso centesimalHCW (REA/cwt HCW, centímetro2/45, 359 quilos de peso dacarcaça quente (HCW) e padrão de listras de gordura e/ouprofundidade de gordura subcutânea (SFD).

Um aspecto da presente invenção proporcionaagrupamento de animais e métodos para gerenciamento deprodução de gado compreendendo agrupamento de cabeças degado, tal como gado, de acordo com o genótipo conformedefinido por painéis de SNPs, cada painel compreendendopelo menos um SNP, um ou mais dos quais estão no gene CRHda presente invenção. Outros SNPs que podem ser incluídosnos painéis de SNPs incluem, mas não estão limitados a,SNPs encontrados no gene CASTr gene de O-aciltransferase dediacilglicerol (DGATl), gene DOPEY2, gene GHRr gene FABP4,gene de grelina, gene KIAA1462, gene de leptina (LEP)1 geneAPFr gene ob, gene TFAM e/ou o gene UCP3. Os métodos deseleção genética e agrupamento da presente invenção podemser usados em conjunto com outros métodos de agrupamentofenotípico convencionais, tais como agrupamentos de animaisatravés de características visíveis, tais como peso,tamanho de compleição corporal, traços de criação esemelhantes. Os métodos da presente invenção proporcionam aprodução de gado tendo traços hereditários aperfeiçoados epodem ser usados para otimizar a qualidade de rebanhos degado em áreas tais como padrão de listras de gordura e/ouprofundidade de gordura subcutânea. A presente invençãoproporciona métodos de seleção de gado para determinaraqueles mais prováveis de desenvolver uma condição corporaldesejada através de identificação da presença ou ausênciade um ou mais polimorfismos genéticos correlacionados aopadrão de listras de gordura e/ou profundidade de gordurasubcutânea.

Conforme descrito acima e nos Exemplos, existem váriostraços fenotipicos com os quais os SNPs da presenteinvenção podem estar associados. Cada um dos traçosfenotipicos e genéticos pode ser testado usando os métodosdescritos nos Exemplos ou usando quaisquer métodosadequados conhecidos na técnica. Usando os métodos dainvenção, um fazendeiro ou operador de confinamento ousemelhante pode agrupar o gado de acordo com a propensãogenética de cada animal para um traço desejado, tal como taxa de crescimento, ingestão de alimento ou comportamentode alimentação, conforme determinado através do genótipo deSNP. O gado é testado para determinar a homozigosidade ouheterozigosidade com relação aos alelos de SNP de um oumais genes, de modo que ele pode ser agrupado de forma que cada curral contenha gado com genótipos semelhantes. Cadacurral de animais é, então, alimentado e de outro modomantido de uma maneira e durante um tempo determinado pelooperador de confinamento e, então, abatido.

Os dados genotípicos individuais derivados de umpainel ou painéis de SNPs para cada animal ou um rebanho deanimais podem ser registrados e associados a vários outrosdados do animal, por exemplo, informação sobre saúde,parentes, condições de pecuária, história de vacinação,registros do rebanho, dados subsegüentes de segurança doalimento e semelhantes. Tal informação pode ser enviada auma agencia governamental para proporcionar capacidade derastreio de um animal ou produto de carne ou pode servircomo a base para informação de criação, alimentação ecomercialização. Uma vez que os dados foram ou nãoassociados a outros dados, os dados são armazenados em umbanco de dados acessível tal como, mas não limitado a, umbanco de dados de computador ou um microchip implantado noanimal. Os métodos da invenção podem proporcionar umaanálise dos dados inseridos gue podem ser comparados comparâmetros desejados pelo operador. Esses parâmetrosincluem, mas não estão limitados a, objetivos de criação,objetivos de postura de ovos, níveis de vacinação de umrebanho. Se o desempenho ou propriedades dos animais sedesviam dos objetivos desejados, os métodos baseados emcomputador podem disparar um alerta para permitir que ooperador ajuste doses de vacinação, medicações,alimentação, etc. conseqüentemente.

Os resultados da análise proporcionam dados que estãoassociados ao animal individual ou ao rebanho, no todo ouem parte, a partir dos quais a amostra foi tomada. Os dadossão, então, mantidos em um banco de dados acessível e podemou não estar associados a outros dados desse indivíduo emparticular ou de outros animais.

Dados obtidos de animais individuais podem serarmazenados em um banco de dados que pode ser integrado ouassociado com e/ou cruzado com outros bancos de dados. Obanco de dados, junto com os dados associados, permite quea informação sobre o animal seja conhecida através de cadaestágio da vida do animal, isto é, da concepção ao consumodo produto animal. Os dados acumulados e a combinação dosdados genéticos com outros tipos de dados do animalproporcionam acesso à informação sobre os parentes,identificação de rebanho, informação de saúde, incluindovacinações, exposição a doenças, localização deconfinamento, dieta e alterações no proprietário.Informação, tais como datas e resultados de testesdiagnósticos ou de rotina, é facilmente armazenada eobtenível. Tal informação será especialmente valiosa paracompanhias, particularmente aquelas que buscam linhagens decruzamento superiores.

A cada animal pode ser proporcionada uma identificaçãoúnica. O animal pode ser etiquetado, conforme programastradicionais de rastreio, ou ter chips de computadorimplantados que fornecem dados armazenados e legíveis oufornecido qualquer outro método de identificação o qualassocia o animal a seu identificador único.

O banco de dados contendo o genótipo baseado em SNPresulta para cada animal ou os dados para cada animal podeestar associados ou ligados a outros bancos de dadoscontendo dados, por exemplo, os quais podem ser úteis naseleção de traços para agrupamento ou subgrupamento de umanimal. Por exemplo, e não para limitação, dados referentesa animais ,tendo protocolos de vacinação ou medicaçãoparticulares podem ser opcionalmente ainda relacionados adados que se referem a animais alimentados com determinadasfontes de alimento. A capacidade de refinar um grupo deanimais está limitada apenas pelos traços considerados ebancos de dados contendo informação referente a essestraços.

Bancos de dados que podem estar associados de modoútil aos métodos da invenção incluem, mas não estãolimitados a, dados específicos ou gerais específicos. Dadosespecíficos incluem, mas não estão limitados a, linhagensde cruzamento, touros, vacas para cruzamento e semelhantes,outros genótipos do animal, incluindo se outros animaisespecíficos possuem genes específicos ou não, incluindoelementos genéticos transgênicos, localização dos animaisos quais compartilham características genéticas idênticasou similares e semelhantes. Dados gerais incluem, mas nãoestão limitados a, dados específicos, tais como quais genescodificam características de qualidade específicas, dadosde associação de cruzamento, dados de alimentação,tendências de criação e semelhantes.

Um método da presente invenção inclui fornecimento, aoproprietário do animal ou cliente, de um equipamento decoleta de amostra, tais como esfregaços e etiquetas úteispara coleta de amostras das quais dados genéticos podem serobtidos. Vantajosamente, a embalagem é codificada com umrótulo de código de barra. As etiquetas são codificadas como mesmo indício de identificação, vantajosamente, com umrótulo de código de barra equivalente. Opcionalmente, aembalagem contém meios para enviar as etiquetas a umlaboratório para análise. A embalagem opcional também écodificada com indícios de identificação, vantajosamentecom um rótulo de código de barra.

O método inclui, opcionalmente, um sistema em que umaconta de banco de dados é estabelecida quando de pedido doequipamento de amostragem. O identificador da conta debanco de dados corresponde ao indício de identificação dasetiquetas e embalagem. Quando de envio do equipamento deamostragem ao preencher o pedido, os indícios deidentificação são registrados em um banco de dados.Vantajosamente, o identificador é um rótulo de código debarra o qual é explorado quando as etiquetas são enviadas.Quando as etiquetas são retornadas para a unidade detestes, o identificador é novamente registrado e combinadocom a informação anteriormente registrada no banco de dadosquando de envio do frasco ao consumidor. Uma vez que agenotipação está completa, a informação é registrada nobanco de dados e codificada com o identificador único.Resultados de teste são também fornecidos ao cliente ouproprietário do animal.

Os dados armazenados no banco de dados de genótipopodem ser integrados com ou comparados com outros dados oubanco de dados para fins de identificação de animaisbaseado nas propensões genéticas. Outros dados ou bancos dedados incluem, mas não estão limitados a, aqueles contendoinformação relacionada à testagem de DNA baseada em SNP,vacinação, programa de pré-condicionamento Sure Health,resultados do cio e gravidez, níveis hormonais,segurança/contaminação de alimento, contagens de célulassomáticas, ocorrência de mastite, resultados de testediagnóstico, níveis de proteína e gordura no leite, estadode vacina, registros de saúde, níveis de mineral, níveis demineral vestigial, desempenho do rebanho e semelhantes.

A presente invenção, portanto, abrange métodosassistidos por computador para rastreio de históriasveterinárias e de criação de cabeças de gado abrangendo usode um sistema baseado em computador, compreendendo umcomputador programado, compreendendo um processador,sistema de armazenamento de dados, dispositivo de entrada edispositivo de saida. Compreendendo ainda as etapas degeração de um perfil de uma cabeça de gado inserindo, nocomputador programado, através do dispositivo de entrada,dados de genótipo do animal, em que o genótipo pode serdefinido por um painel de pelo menos dois polimorfismos deum único nucleotideo que prevêem pelo menos um traço físicodo animal, inserindo, no computador programado, através dodispositivo de entrada, de dados de bem estar do animalusando o processador e o sistema de armazenamento de dadose enviando um perfil do animal ou grupo de animais aodispositivo de saída.

Os bancos de dados e a análise dos mesmos serãoacessíveis para aqueles cujo acesso tenha sido fornecido.Oacesso pode ser fornecido através de direitos de acessar ouatravés de subscrição a porções específicas dos dados. Porexemplo, o banco de dados pode ser acessado porproprietários do animal, o local de teste, a entidade quefornece a amostra ao local de teste, pessoal doconfinamento e veterinários. Os dados podem ser fornecidosem qualquer forma, tal como acessando um sitio eletrônico,fax, email, correspondência postada, telefone automático ououtros métodos para comunicação. Esses dados também podemser codificados sobre um dispositivo de armazenamentoportátil, tal como um microchip, que pode ser implantado noanimal. Vantajosamente, a informação pode ser lida e novainformação adicionada sem remover o microchip do animal.

A presente invenção compreende sistemas pararealização dos métodos divulgados aqui. Tais sistemascompreendem dispositivos, tais como computadores, conexõesde internet, servidores e dispositivos de armazenamentopara dados. A presente invenção também proporciona ummétodo de transmissão de dados compreendendo transmissão deinformação de tais métodos aqui divulgados ou etapas dosmesmos, por exemplo, via telecomunicação, telefone, video-conferência, comunicação em massa, por exemplo,apresentação, tal como uma apresentação de computador (porexemplo, POWERPOINT), internet, email, comunicação emdocumento, tais como programas de computador (por exemplo,WORD) e semelhantes.

Sistemas da presente invenção podem compreender ummódulo de coleta de dados, o qual inclui um coletor dedados para coletar dados de um animal ou embrião etransmitir os dados a um módulo de análise de dados, umainterface de rede para receber dados do módulo de análise eopcionalmente ainda adaptada para combinar múltiplos dadosde um ou mais animais individuais e transmiti-los via redea outros locais ou a um dispositivo de armazenamento.

Mais particularmente, os sistemas da presente invençãocompreendem um módulo de coleta de dados, um módulo deanálise de dados, uma interface de rede para recebimento dedados do módulo de análise de dados e opcionalmente aindaadaptada para combinar múltiplos dados de um ou maisanimais individuais e transmiti-los via rede a outroslocais e/ou um dispositivo de armazenamento. Por exemplo,os dados coletados pelo módulo de coleta de dados levam auma determinação da ausência ou presença de um SNP de umgene no animal ou embrião e, por exemplo, tais dados sãotransmitidos quando o regime de alimentação do animal éplanejado.

Em uma modalidade onde os dados são implantados sobreum microchip em um animal em particular, o fazendeiro podeotimizar a eficiência de gerenciamento do rebanho porque ofazendeiro é capaz de identificar as pré-disposiçõesgenéticas de um animal individual, bem como tratamentospassados, presentes e futuros (por exemplo, vacinações evisitas do veterinário). A invenção, portanto, tambémproporciona acesso a outros bancos de dados, por exemplo,dados do rebanho referentes a testes genéticos e dadosobtidos por outros, tais como links de dados a outrossítios virtuais. Portanto, dados de outros bancos podem sertransmitidos ao banco de dados central da presente invençãovia uma interface de rede para recebimento de dados domódulo de análise de dados dos outros bancos.

A invenção se refere a um sistema de computador e ummeio legível em computador para compilar dados sobre umanimal. O sistema contendo dados inseridos sobre esseanimal tais como, mas não limitado a, histórias devacinação e medicação, testes de DNA, testes detiroglobulina, testes de leptina, diagnóstico deencefalopatia espongiforme bovina (BSE), vacinação contrabrucelose, vacinação FMD (doença do pé e boca), vacinaçãoBVD (diarréia viral bovina), programa pré-condicionamentoSure Health, resultados de cio e gravidez, tuberculose,níveis hormonais, segurança/contaminação de alimento,contagens de células somáticas, ocorrência de mastite,resultados de testes diagnósticos, níveis de proteína egordura no leite, estado de vacina, registros de saúde,níveis de mineral, níveis de mineral vestigial, desempenhodo rebanho e semelhantes. Os dados do animal podem tambémincluir tratamentos anteriores, bem como tratamentosconfigurados sugeridos, dependendo da pré-disposiçãogenética desse animal a uma doença em particular.

A invenção também proporciona um método assistido porcomputador para melhorar a produção animal compreendendouso de um sistema de computador, por exemplo, um computadorprogramado compreendendo um processador, sistema dearmazenamento de dados, dispositivo de saida e umdispositivo de entrada. As etapas de inserção, nocomputador programado através do dispositivo de entrada, dedados compreendendo uma história de criação, veterinária,medicação, dados diagnósticos e semelhantes de um animal,correlação de uma característica física prevista pelogenótipo usando o processador e o sistema de armazenamentode dados, envio, ao dispositivo de saída, dascaracterísticas físicas correlacionadas ao genótipo ealimentação do animal com uma dieta baseado nacaracterística física, desse modo, melhorando a produção dogado.

A invenção ainda proporciona um método assistido porcomputador para otimização da eficiência de confinamentospara gado compreendendo uso de um sistema de computador,por exemplo, um computador programado compreendendo umprocessador, sistema de armazenamento de dados, dispositivode entrada e um dispositivo de saída. As etapas deinserção, no computador programado através do dispositivode entrada, de dados compreendendo uma história de criaçãoveterinária de um animal, correlação das histórias decriação, veterinária usando o processador e o sistema dearmazenamento de dados, envio, ao dispositivo de saída, dacaracterística física correlacionada ao genótipo ealimentação do animal com uma dieta baseada nacaracterística física, desse modo, otimizando a eficiênciade confinamentos de gado.

A invenção ainda compreende métodos para fazernegócios proporcionando acesso a tais meios legíveis emcomputador e/ou sistemas de computador e/ou dados coletadosde animais a usuários; por exemplo, o meio e/ou dados deseqüência podem ser acessíveis por um usuário, por exemplo,baseado em subscrição, via a internet ou uma rede decomunicação/computador global; ou o sistema de computadorpode estar disponível para um usuário, baseado emsubscrição.

Em uma modalidade, a invenção proporciona um sistemade computador para gerenciamento de animais de fazendacompreendendo características físicas e bancos de dadoscorrespondendo a um ou mais animais. Em outra modalidade, ainvenção proporciona meios legíveis em computador paragerenciamento de cabeças de gado compreendendocaracterísticas físicas e histórias veterináriascorrespondendo a um ou mais animais. A invenção aindaproporciona métodos para fazer negócios como gerenciamentode cabeças de gado compreendendo fornecimento, a umusuário, do sistema de computador e meios descritos acimaou características físicas e histórias veterináriascorrespondendo a um ou mais animais. A invenção aindaabrange métodos de transmissão de informação obtida emqualquer método ou etapa da mesma, ou qualquer informaçãodescrita aqui, por exemplo, via telecomunicações, telefone,comunicações em massa, mídia de massa, apresentações,internet, email, etc.

A invenção ainda abrange kits úteis para seleção deácido nucléico isolado de um ou mais bovinos com relação àvariação alélica em qualquer um dos genes de fator detranscrição mitocondriais e, em particular, qualquer um dosSNPs descritos aqui. Os kits podem compreender pelo menosum oligonucleotídeo que se hibridiza seletivamente a umácido nucléico compreendendo qualquer um ou mais dos quaissão seqüências de CRH descritas aqui e instruções para usodo oligonucleotídeo para detectar variação no nucleotídeoque corresponde ao SNP do ácido nucléico isolado.

Uma modalidade desse aspecto da invenção proporcionaum oligonucleotídeo que se hibridiza especificamente àmolécula de ácido nucléico isolada desse aspecto dainvenção e em que o oligonucleotídeo se hibridiza a umaporção da molécula de ácido nucléico isolada compreendendoqualquer um dos sítios polimórficos nas seqüências de CRHdescritas aqui. Outra modalidade da invenção é umoligonucleotídeo que se hibridiza especificamente sobcondições de alto rigor a qualquer um dos sítiospolimórficos do gene de CRHr em que o oligonucleotídeo tementre cerca de 18 nucleotídeos e cerca de 50 nucleotídeos.

Em outra modalidade da invenção, o oligonucleotídeocompreende um nucleotídeo central que se hibridizaespecificamente a um sítio polimórfico de gene CRH daporção da molécula de ácido nucléico.

Outro aspecto da invenção é um método de identificaçãode um polimorfismo de CRH em uma amostra de ácido nucléicocompreendendo isolamento de uma molécula de ácido nucléicoque codifica CRH ou um fragmento da mesma e determinação donucleotídeo no sítio polimórfico.

Outro aspecto da invenção é um método de triagem degado para determinar aqueles bovinos mais prováveis deexibir uma diferença biológica no padrão de listras degordura e/ou profundidade de gordura subcutâneacompreendendo as etapas de obtenção de uma amostra dematerial genético de um bovino; e ensaio com relação àpresença de um genótipo no bovino o qual está associado aopadrão de listras de gordura e/ou profundidade de gordurasubcutânea, o genótipo caracterizado por um polimorfismo nogene CRH bovino.

Em outras modalidades desse aspecto da invenção, aetapa de ensaio é selecionada do grupo consistindo de:análise de polimorfismo por comprimento de fragmento porrestrição (RFLP), mini-seqüenciamento, MALDI-TOF, SINE,análise de heterodupla, polimorfismo conformacional em fitasimples (SSCP), eletroforese em gel com gradiente dedesnaturação (DGGE) e eletroforese em gel com gradiente detemperatura (TGGE).

Em várias modalidades da invenção, o método pode aindacompreender a etapa de amplificação de uma região do geneCRH ou uma porção do mesmo que contém o polimorfismo. Emoutras modalidades da invenção, a amplificação pode incluira etapa de seleção de um primer de seqüência dianteira ereversa capaz de amplificação de uma região do gene CRH.

Outro aspecto da invenção é um método assistido porcomputador para prever quais cabeças de gado possuem umadiferença biológica no padrão de listras de gordura e/ouprofundidade de gordura subcutânea compreendendo: uso de umsistema de computador, por exemplo, um computadorprogramado compreendendo um processador, um sistema dearmazenamento de dados, um dispositivo de entrada e umdispositivo de saída, das etapas de: (a) inserção, nocomputador programado através do dispositivo de entrada, dedados compreendendo um genótipo de CRH de um animal, (b)correlação do padrão de listras de gordura e/ouprofundidade de gordura subcutânea previsto pelo genótipode CRH usando o processador e o sistema de armazenamento dedados e (c) envio, ao dispositivo de saída, do padrão delistras de gordura e/ou profundidade de gordura subcutâneacorrelacionados ao genótipo de CRHr desse modo, prevendoquais cabeças de gado possuem um padrão de listras degordura e/ou profundidade de gordura subcutânea emparticular.

Ainda outro aspecto da invenção é um método para fazernegócios para gerenciamento de cabeças de gadocompreendendo fornecimento, a um usuário, de um sistema decomputador para gerenciamento de cabeças de gadocompreendendo características físicas e genótiposcorrespondendo a um ou mais animais ou um meio legível emcomputador para gerenciamento de cabeças de gadocompreendendo características físicas e genótiposcorrespondendo a um ou mais animais ou característicasfísicas e genótipos correspondendo a um ou mais animais.Δ invenção será agora descrita por meio dos exemplosnão limitativos a seguir.

EXEMPLOS

Exemplo 1

0 gene do hormônio de liberação de corticotropina(CRH) é mapeado no cromossoma 14 bovino (BTA14), onde maisde 30 Ioci de traços quantitativos relacionados à gordura(QTL) foram reportados em gado leiteiro e de corte. 0 generegula a secreção de hormônio adrenocorticotropina, o eixohipotalâmico-pituitária-adrenal e múltiplas funçõeshipotalâmicas, portanto, nós imaginamos que o CRH é umforte gene candidato para escore de padrão de listras degordura na carne (BMS) e profundidade de gordura subcutânea(SFD) em uma população F2 de Wagyu χ Limousin. Dois paresde primers foram projetados e um total de cincopolimorfismos de um único nucleotideo (SNPs) foiidentificado, incluindo AAFC03076794 .1 :g. 9657C>T,

c.W718G>C, c.10841G>A, c.W893A>C e c.10936G>C. Dentre essescSNPs, c.10718G>C, c.W841G>A e c.W936G>C são mutações nosentido errôneo, levando à alterações de aminoácido dearginina para prolina, de serina para asparagina e de ácidoaspártico para histidina, respectivamente. Esses cinco SNPsforam genotipifiçados sobre -250 proles F2, mas quatroforam selecionados como SNPs alvo para análise deassociação devido a não recombinação histórica observadaentre c.10718G>C e c.W893A>C. Análise estatística mostrouque g. 9657C>T, c.10718G>C e c.10936G>C, bem como seushaplotipos, tinham efeitos significativos sobre a SFD, masapenas o c,10936G>C estava significativamente associado aoBMS. 0 promotor de g.9657C>T levou a um ganho/perda de umsitio CpG e quatro sítios de ligação regulatória.

Diferentes haplotipos entre quatro cSNP tinham um impactosignificativo sobre as estruturas secundárias de RNAml masnenhuma associação com fenótipos. Em geral, nossosresultados fornecem evidência adicional de que o CRH é umforte gene candidato para um QLT coincidente relacionado aometabolismo de lipídio em animais.

Seleções amplas do genoma usando marcadores de micro-satélite mostraram que o cromossoma bovino 14 (BTAl4)abriga Ioci de traços quantitativos (QTL) para escore depadrão de listras de gordura (BMS) e profundidade degordura subcutânea (SFD) em gado de corte. Em duas famíliasmeio-irmãs desenvolvidas através de cruzamento de um touroBelgian Blue χ MARC III e uma vaca Piedmontese χ Angus MARCIII, Casas e colaboradores (veja, por exemplo, Casas ecolaboradores, 2000, J Anim Sei. 78: 560-569) observaram umQTL para profundidade de gordura a 38 cm que interagia comgenótipos de miostatina sobre o BTA2. Em uma família meio-89irmã produzida através de cruzamento de um touro Brahman χHereford com vacas Hereford, Angus, Hereford χ Augus eMARCIII, o mesmo grupo identificou um QTL de profundidadede gordura a 16 cm e um QTL de padrão de listras de gorduraa 47 cm sobre o BTA14 (veja, por exemplo, Casas ecolaboradores, 2003, J Anim Sei. 78: 560-569). Um QTL parapadrão de listras de gordura sobre o BTA14 também foidetectado em uma família meio-irmã de 348 touros jovens deraça pura Japanese Wagyu, mas está localizado a 53 cm(veja, por exemplo, Mizoshita e colaboradores, 2004, J AnimSei. 82: 3415-3420).

O-aciltransferase de diacilglicerol 1 (DGATl) etiroglobulina (TG) foram propostos como genes candidatospotenciais para QTLs de padrão de listras de gordura eprofundidade de gordura sobre o BTA14, porque eles afetam ometabolismo de lipídio. A enzima DGATl utilizadiacilglicerol e acil CoA graxo como substratos de forma acatalisar o estágio final da síntese de triacilglicerol,enquanto que a tiroglobulina é o precursor de glicoproteínaaos hormônios da tireóide, onde o metabolismo é importantepara gasto de energia e dissipação de calor em tecidos.Contudo, associações desses dois genes com padrão delistras de gordura e profundidade de gordura foramreportadas de maneira inconsistente entre diferentespopulações. Em uma população de gado de corte Canadense,nem o DGATl nem o TG mostraram uma associação significativa(P > 0,10) com o EBV de gordura nas costas (valor decriação estimado) (veja, por exemplo, Moore e colaboradores, 2003, J Anim Sei. 81: 1919-1925). Em umestudo usando 22 famílias de touros Brahman acasalados comvacas Brahman, Casas e colaboradores (veja, por exemplo,Casas e colaboradores, 2005, J Anim Sei. 83: 13-19)reportaram uma associação significativa do TG com a espessura de gordura (P < 0,05), mas não com o escore depadrão de listras de gordura. Nenhuma associaçãosignificativa do polimorfismo DGATl foi observada parapadrão de listras de gordura ou espessura de gordura.Apenas recentemente, uma meta-análise conduzida sobre uma população de gado de corte Australiano forneceu evidênciasubstancial quanto a uma associação aditiva entre ummarcador de TG e padrão de listras de gordura usando ummodelo hierárquico Bayesiano (veja, por exemplo, Wood ecolaboradores, 2006, Genet Sel Evol. 38: 479-494). Todosesses dados indicam que genes que fundamentam QTLs parapadrão de listras de gordura e profundidade de gordurasobre o BTA14 permanecem inexplicados.

0 hormônio de liberação de corticotropina (CRH) estáenvolvido em muitas ações e funções biológicas efisiológicas. Basicamente, o CRH exerce um papel importantecomo o principal fator de liberação hipotalâmico parasecreção de adrenocorticotropina na pituitária (ACTH)(veja, por exemplo, Seasholtz e colaboradores, 2002, JEndocrinol. 175: 89-97), a qual regula glicocorticóide ecatecolaminas para mediar a resposta ao estresse. Efeitoscomportamentais do CRH incluem atividade locomotoraaumentada e inibição da ingestão de alimento, enquanto suasações sobre o metabolismo são mediadas principalmenteatravés de ativação do sistema nervoso simpático (veja, porexemplo, Rothwell, 1990, Neurosci Biobehav Rev. 14: 263-271) . De modo interessante, há evidência crescentesustentando o envolvimento desse peptideo de CRH naregulação do equilíbrio de energia e peso corporal,influenciando a ingestão de alimento e termogênesesimpaticamente mediada. Por exemplo, a atividade aumentadado eixo hipotalâmico-pituitária-adrenal (HPA) estimuladapor CRH está altamente associada à gordura abdominal (veja,por exemplo, Perusse e colaboradores, 2001, Diabetes, 50:614-621). Além disso, secreção de ACTH sob um ambiente deestresse estimula glicocorticóides, o que ajuda a retornaro sistema de estresse para a homeostase e mediar muitasalterações metabólicas, tais como aumentos na produção deleptina (veja, por exemplo, Seasholtz e colaboradores,2002, J Endocrinol. 175: 89-97; Buchanan e colaboradores,2005, Anim Genet. 36: 127-131). Os inventores decidiramvalidar sua candidatura para padrão de listras de gordura eSFD em um cruzamento F2 de Wagyu χ Limousin.

Animais. Uma população de referência Wagyu χ Limousinfoi gerada conjuntamente pela Washington State University eo Fort Keogh Livestock and Range Research Laboratory, ARS,USDA, conforme anteriormente descrito (veja, por exemplo,Jiang e colaboradores, 2005, Biochem Biophys Res Commnun. 334: 516-523). Contudo, extração de DNA de 6 bois Fi, 113vacas Fi e ~250 proles F2 mais coleta de dados dedesempenho desses animais F2 foi conduzida no laboratórioda USDA. O escore de padrão de listras de gordura na carne(BMS) era uma medida subjetiva da quantidade de gorduraintramuscular no músculo longissimus, baseado nas normas daUSDA. (http://www.ams.usda.gov/) , oscilando de 4 = Ieve0 a9,5 = moderadamente abundante50 (SD = 1,00) nessa populaçãoF2. A profundidade de gordura subcutânea (SFD) foi medidana 12a ou 13a interface da costela perpendicular àsuperfície externa em um ponto de três quartos ocomprimento do músculo longissimus a partir da extremidadede seu osso da coluna vertebral com uma faixa de 0,2 5 a3,30 centímetros (SD = 0,18) nessa população F2.

Seqüências de DNA e projetação de primer. A seqüênciade DNAc (C0895988, SEQ ID NO: 1) e DNA genômico contig(AAFC0307 67 94, SEQ ID NO: 2) do gene CRH bovino foramrecuperadas do banco de dados GenBank e foram usadas paradeterminar a organização genômica através de alinhamento de seqüência. O design de primer foi terminado usando aferramenta de design de oligonucleotideo online Primer3.Dois pares de primers foram projetados: um objetivado aopromotor proximal e éxon 1 (avante -51CCC CTC CCA TTC ACTCTC TTT TCT 3' (SEQ ID NO: 14) e reverso - 5'AGT TCT GTCTAG GCG CTC CCT ACC3 ' (SEQ ID NO: 15)) e o outroamplificado à região do éxon 2 (avante - 5' GGG TCT GTG GGTGTC GTC CT 3' (SEQ ID NO: 16) e reverso - 5' AAA AAT AAACAT GGT ATC AGA GCA ATG 3' (SEQ ID NO: 17)) do gene CRHbovino, respectivamente.

Detecção de mutação e genotipação. Aproximadamente 50ng de DNA genômico de cada um de seis bois Fi Wagyu ?Limousin foram amplificados em um volume final de 10 µ? quecontinha 12,5 ng de cada primer, dNTPs a 150 µ?, MgCl2 a1,5 mM, KCl a 50 mM, Tris-HCl a 20 mM e 0,25U de PlatinumTaq Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA). As condições dePCR foram realizadas como segue: 94 0C durante 2 minutos,35 ciclos de 94 °C durante 30 seg, 60 °C durante 30 seg e72 °C durante 30 seg, seguido por mais 5 min de extensão a72°C. Os produtos de PCR foram, então, seqüenciados sobreum seqüenciador ABI 3730 no Laboratory for Biotechnologyand Bioanalysis (Washington State University) usando umprotocolo padrão e polimorfismos detectados. Umpolimorfismo de um único nucleotideo (SNP) foi detectado noproduto do promotor/éxon 1, o qual pôde ser reveladoatravés de digestão com a enzima de restrição Hhal. QuatroSNPs foram identificados na região do éxon 2 e os genótiposda prole F2 foram obtidos usando seqüenciamento direto doproduto de PCR.

Análise de dados. Os graus de equilíbrio de Hardy-Weinberg dentro de cada marcador e desequilíbrio delinhagem entre diferentes marcadores no gene CRH bovinoforam estimados usando o programa HAPLOVIEW (veja, porexemplo, Barrett e colaboradores, 2005, Bioinformatics, 21:263-265). Os dados fenotípicos para medições de BMS e SFDforam previamente ajustados para o ano de nascimento, sexo,idade (dias), peso vivo (quilogramas) ou profundidade degordura (centímetros), conforme apropriado. Os fenótiposajustados foram, então, usados em uma subseqüente análisede associação usando o procedimento GLM (modelo lineargeral) do SAS v9.1 (SAS institute Inc., Gary, NC).Comparações em pares das médias dos mínimos quadrados foramrealizadas usando um t-teste protegido. Adicionalmente, oteste de desequilíbrio de transmissão quantitativa QTDT)(veja, por exemplo, Abecasis e colaboradores, 2000, Am JHum Genet. 66: 279-292) foi realizado para examinaradicionalmente a associação entre marcadores e dados de fenótipo relacionados à obesidade ajustados, valor P < 0,05foi considerado estatisticamente significativo. O servidorde rede Matlnspector (veja, por exemplo, Quandt ecolaboradores, 1995, Nucleic Acids Res. 3: 4878-48) foiusado para selecionar alterações potenciais no sítio de transcrição de ligação regulatório causadas porpolimorfismos de promotor, enquanto que o servidor de redeMfold (veja, por exemplo, Zuker, 2003, Nucleic Acids Res.31: 3406-3415) foi usado para prever alterações naestrutura secundária de RNAm causadas por polimorfismos decodificação.

Anotação do gene CRH bovino. Uma busca no banco dedados GenBank revelou que o gene CRH bovino não foi bemanotado. Embora uma seqüência (AF340152, veja, por exemplo,Buchanan e colaboradores, Anim Genet. Abril de 2005; 36(2):127-31) com uma seqüência de codificação completa para ogene bovino tenha sido enviada ao GenBank em 2001, elarepresenta a região do éxon 2 apenas. No presente exemplo,portanto, os inventores fizeram uma busca pelo BLAST contrao banco de dados de EST bovina (tags de seqüência expressa)usando a seqüência AF340152 como uma referência erecuperaram uma seqüência de DNAc de comprimento total(C0895988, SEQ ID NO: 1) para o gene CRH bovino. Um contide DNA genômico (AAFC03076794, SEQ ID NO: 2) para o mesmogene foi, então, recuperado do banco de dados de seqüênciade genoma bovino e, assim, alinhamento entre a seqüência deDNAc e a seqüência genômica determinou a organizaçãogenômica do gene CRH bovino (FIGURA 1 e FIGs. 2A e 2B) . Damesma forma que seu ortólogo humano, o gene CRH bovino temdois éxons e um íntron. O éxon 1 é um éxon de nãocodificação, mas o éxon 2 contém 11 bp de seqüência de nãocodificação e 573 bp de seqüência de codificação completa.O tamanho do íntron 1 é de 771 bp (AAFC0307 67 94) . Alémdisso, cinco ESTs (EE338630, DV826091, DV825584, DV822182 eEE339662) mostram que o gene CRH bovino poderia codificaruma nova forma através de excisão-união com um pró-hormôniode 130 aminoácidos, 60 aminoácidos mais curto do que aqueleregular. Até o momento, nenhuma nova forma com splicing dogene CRH tinha sido reportada em outros mamíferos.

SNPs e haplotipos. Um total de cinco polimorfismos denucleotídeo foi identificado, incluindo um SNP(AAFC03076794 .1: g. 9657OT) na região promotora proximal equatro SNPs de codificação (AAFC03076794.1:c.10718G>C,c. 10841G>A, c.W893A>C e C.10936G>C) na região do éxon 2(FIGURA 2B). Dentre esses quatro cSNPs, três (c.10718G>C,c.10841G>A e c.10936G>C) são mutações no sentido errôneo,levando à alterações de aminoácido de arginina paraprolina, de serina para asparagina e de ácido aspárticopara histidina, respectivamente. Os alelos menores entreesses cinco SNPs são C, G, A, A, C, respectivamente, comuma freqüência oscilando de 0,08 a 0,42. Genotipação sobre~ 250 proles F2 indicou que todos os cinco SNPs caem noequilíbrio de Hardy-Weinberg (P > 0,05). Análise HAPLOVIEWindicou que, dentre esses cinco SNPs, dois SNPs, c,10718G>Ce c.10893A>C, não têm recombinação histórica através deformação de dois haplotipos de CC e GA (FIGURA 1) e, assim,oito haplotipos foram identificados na população, incluindoTCGCCr CGGAG, TCGCGf CGAAGr CCGCCr TGGAGr TGAAG e CCACGrcom uma freqüência de 0,368, 0,326, 0,204, 0,070, 0,016,0,012, 0,003 e 0,002, respectivamente.

SNP promotor e sitios de ligação regulatóriapotenciais. Triagem da região promotora proximal usando oprograma do servidor de rede Matlnspector revelou que oalelo g.9657Cr mas não g.9657Tr ganha quatro possíveissítios de ligação de fator de transcrição, incluindo fatorde silenciamento restritivo de neurônio (NRSF), fator detranscrição E2F, fator-1 de ligação a CDE-CHR (CDF-I) efator de transcrição CP2 (FIGURA 2C). Na verdade, a regiãopromotora que flanqueia o sítio polimórfico em gado éaltamente conservada em outros mamíferos, tais como sereshumanos (NT008183.18), chimpanzé (XM_519792.2), macacorhesus (XM001094433.1), camundongo (NW_001030719.1), rato(M54987.1), ovelha (M22853.1), cão (AB162117) e porco(DQ3587 05.1) (FIGURA 2D). Contudo, dentre os quatro sítiosde ligação regulatórios obtidos pelo alelo g.9657C em gado,apenas o NRSF é retido em todas as outras oito espécies(FIGURA 2D).

Codificação de SNPs e estrutura de PNRm secundária.

Análise HAPLOVIEW indicou que quatro SNPs (c.10718G>C,c. 10841G>A, c.10893A>C e C.10936G>C) formam cincohaplotipos: GGAG, CGCG, CGCC, CACG e GAAGf respectivamente.0 programa Mfold (veja, por exemplo, Zuker, 2003, NucleicAcids Res. 31: 3406-3415) foi usado para prever como esseshaplotipos afetam a estrutura secundária de RNAm envolvendouma seqüência de codificação completa de 573 bp para o pré-pró-hormônio do gene CRH bovino. A FIGURA 3A mostra que osprimeiros três haplotipos (GGAG, CGCG e ■ CGCC)proporcionaram as mesmas estruturas secundárias. Asestruturas secundárias dos dois últimos haplotipos sãoilustradas nas FIGs. 3B e 3C, respectivamente, mas elasdiferem ligeiramente apenas uma da outra (veja setas dentrodas caixas). Contudo, havia uma diferença acentuada naestrutura secundária entre os primeiros três haplotipos eos dois últimos haplotipos. Obviamente, sitio polimórficoc.10841G>A exerce um papel critico na determinação daestrutura secundária do RNAm de CRH em gado.

Análise de associação de SNPs com SFD e padrão delistras de gordura. Uma vez que ambos os SNPs c. 10718G>C ec.W893A>C não têm eventos de recombinação históricos napopulação, quatro SNPs unidos - g. 9657C>T, c.10118G>C,c.W841G>A e c.W936G>C - foram usados na análise deassociação. Exceto quanto ao SNP c,10841G>A, todos osoutros três SNPs estavam significativamente associados àSFD (Tabela 1) . A diferença na SFD entre dois homozigotosatingiu 0,30 centímetros em g.9657C>T (P < 0,01), 0,25centímetros em c.W718G>C (P < 0,001) e 0,28 centímetros emc.l0936G>C (P < 0,005), respectivamente, os quais somam umdesvio padrão de 0,56-0,67 do traço na população. Contudo,apenas um SNP, c.l0936G>C, teve um efeito significativosobre o BMS (Tabela 1). Os animais com genótipos CC tinhamescores de padrão de listras de gordura que eram 0,54 9 (P <0,05) e 0,399 (P < 0,05) menores do que os animais com osgenótipos GG e CG, os quais somam desvios padrões de 0,549e 0,399 para o traço, respectivamente.

Análise de associação de haplotipos com SFD. Conformeindicado acima, três SNPs, g.9657C>T, c.l0718G>C, ec.10936G>C, foram associados à SFD na população dereferência. Portanto, os inventores decidiram determinarcomo seus haplotipos afetam o traço, mas qualquer haplotipocom cinco ou menos animais foi excluído da análise. AFIGURA 4 mostra uma plotagem de associação de haplotiposentre c. 10718G>C e c. 10936G>C com medições de SFD emcentímetros. A SFG do haplotipo GGGG era 0,37 centímetro (P< 0,05) maior do que sua contra-parte, CCCC. Para oshaplotipos entre c.9657C>G com c.10718G>C (FIGURA 4B) , osanimais com CCGG tinham uma SFD que era 0,26 centímetro (P< 0,05) maior do que os animais com o haplotipo TTCC. AFIGURA 4C mostra uma plotagem de associação de haplotiposentre g.9657C>T e c.10936G>C. A mesma tendência foiobservada, com uma diferença de 0,45 centímetros entre oshaplotipos CCGG e TTCC.

O hormônio de liberação de corticotropina (CRH)liberado do hipotálamo para a pituitária anterior sobcondição de estresse estimula a secreção de hormônioadrenocorticotrópico (ACTH), o qual super-regula o nível decortisol. Cortisol tem efeitos metabólicos profundos, talcomo estimulação de gliconeogênese (no fígado), inibindo acaptação de glicose (em músculo e tecido adiposo) eestimulando a decomposição de gordura (em tecido adiposo).Conseqüentemente, a pesquisa sobre o CRH tem aumentado nãoapenas para estudos relacionados ao estresse, mas tambémpara quaisquer doenças metabólicas. Camundongostransgênicos que super expressam CRH exibem perda de pêlo,desgaste muscular, crescimento linear diminuído e obesidade(veja, por exemplo, Stenzel-Poore e colaboradores, 1992,Endocrinology, 130: 3378-3386). Essas condições tambémforam observadas no homem e em outros animais com síndromede Cushing, a qual também é causada por um aumento nocortisol endógeno, com aberração metabólica, desgastemuscular e obesidade como alguns dos sintomas clínicos.Além disso, SNPs no gene CRH de suíno estavamsignificativamente associados à espessura de gordura nascostas, comprimento de carcaça, ganho diário médio e áreado músculo longissimus (veja, por exemplo, Murani, ecolaboradores, 2006, Biochem Biophys Res Commun. 342: 394-405). Em uma população de touros jovens cruzados comCharolais, Buchanan e colaboradores (veja, por exemplo,Buchanan e colaboradores, 2005, Anim Genet. 36: 127-131)reportaram que três SNPs no gene CRH bovino estavamaltamente associados a uma área de costela em final-de-teste (P < 0,034) e peso de carcaça quente (P < 0,0015). Nopresente Exemplo, os Inventores demonstraram que o gene CRHbovino estava significativamente associado ao padrão delistras de gordura e SFD em uma população F2 de Wagyu χLimousin. Todos esses dados indicam que o CRH é um fortegene candidato para QTLs coincidentes relacionados àcomposição corporal e metabolismo de energia.

No presente Exemplo, um SNP na região promotora dogene CRH bovino causou uma transição de citosina paratimina (g.9657C>T). Essa mutação está localizada 138 basesdo sitio de inicio de transcrição putativo e forma um sitioCpG quando o alelo G ocorre (FIGURA 2C) . Se esse sitio CpGé metilado, a atividade transcricional poderia sergravemente suprimida através de inibição de uma região deligação a fator de transcrição especifica de seqüência emvirtude da alteração pela citosina metilada nos sítios dereconhecimento, bloqueio por alguma proteína de ligação aCpG (tal como MeCP-I e MeCP2) e alteração de estruturas decromatina (veja, por exemplo, Kudo e Fukuda, 1995, J BiolChem. 270: 132 98-13302). Por outro lado, o programaMatlnspector revelou que o alelo 9657T elimina quatrosítios de ligação regulatórios potenciais: fator desilenciamento restritivo de neurônio (NRSF), fator detranscrição E2F, fator-1 de ligação a CDE-CHR (CDF-I) efator de transcrição CP2 (FIGURA 2C) . Alinhamento entreespécies (FIGURA 2D) indicou que a região promotoraproximal que flanqueia o sítio polimórfico é altamenteconservada em nove espécies de mamífero, sugerindoimportância evolucionária da região nos sítios regulatóriosde transcrição do CRH. Além disso, análise peloMatlnspector revelou que, entre os quatro sítios de ligaçãodescritos acima, apenas o NRSF é conservado entre asespécies. Seth e colaboradores (veja, por exemplo, Seth ecolaboradores, 2001, J Biol Chem. 276: 13917-13923)mostraram que o NRSF era encontrado na primeira regiãointrônica do CRH e reprime a expressão de gene através deum mecanismo HDAC-dependente. Contudo, o NRSF também atuacomo um intensificador de atividade de transcrição. Quandouma região RE-1/NRSE é rompida ou deletada da regiãointrônica do CRHf uma super regulação significativa de 1,2-2,5 vezes na atividade repórter foi observada (veja, porexemplo, Seth e colaboradores, 2001, J Biol Chem. 276:13917-13923) .

Contudo, os inventores não podem excluir oenvolvimento dos três outros elementos regulatórios naregulação de expressão de CRH em gado. E2F é uma proteínaheterodimérica que exerce um papel importante emcrescimento e apoptose celular. Estudo na região promotorametilada de genes que são regulados pela E2F, tais comodhfr, E2F1, cdc2, c-myb e c-myc, mostraram que a metilaçãopode bloquear os elementos E2F (veja, por exemplo,Campanero e colaboradores, 2000, Proc Natl Acad Sci USA.97: 6481-6486). Além disso, um estudo anterior tambémmostrou que metilação do primeiro resíduo de citosina nomotivo GCGC do elemento E2F, o qual é o caso do sítiopolimórfico de CRH bovino (FIGURA 2C) , bloqueia a ligaçãode proteína E2F ao extrato celular e interfere com aatividade de transcrição do gene. CDF-I é um fatorregulatório de transcrição estéreo-específico que reconhecedois sítios de ligação (região CDE e CHR) . Inversão daposição da região CHR e CDE elimina a repressão reguladapelo ciclo celular, sem afetar a transcrição, sugere queCDF-I interage com o domínio de ativação para mediar arepressão (veja, por exemplo, Zwicker e colaboradores,1997, Nucleic Acids Res. 25: 4926-4932). 0 papel funcionaldo fator de transcrição CP-2 ainda não está claro emvirtude de sua capacidade de não apenas atuar como um fatorde transcrição abundante na maioria dos tecidos, mas tambémele pode estar envolvido em transcrição tecido- ou estágio-específica de alguns genes (veja, por exemplo, Kang ecolaboradores, 2005, FEBS J. 272: 1265-1277). Todavia, opolimorfismo do promotor (g.9657C>T) nos deixa muitasquestões fisiológicas e funcionais para responder no futuro.

Quatro SNPs (c.10718G>C, C.10841G>A, c.W893A>C ec.10936G>C) também foram detectados na região decodificação do éxon 2 do gene CRH bovino. Uma mutação(c.10893A>C) resulta em mutação silenciosa, onde asmutações c.10718G>C, c.10841G>A e c.10936G>C restantes sãomutações no sentido errôneo que levam à alterações deaminoácido de arginina para prolina, de serina paraaspargina e de ácido aspártico para histidina,respectivamente. De acordo com Majewski e Ott (veja, porexemplo, Majewski e Ott, 2003, Gene, 305: 167-173),arginina, ácido aspártico e histidina são os aminoácidosmenos mutáveis, com mutabilidade de 0,365, 0,424 e 0,482,respectivamente. A mutação no sentido errôneo c.10841G>A(serina para asparagina) não estava associada ao padrão delistras de gordura nem SFD na população de referência, mastinha um impacto sobre a estrutura secundária do RNAm deCRH bovino significativamente (FIGS. 3A-3C). c.10718G>C(arginina para prolina) estava significativamente associadaà SFD, enquanto que c.10936G>C (ácido aspártico parahistidina) afetou a SFD e padrão de listras de gordura.Portanto, nesse caso, parece que não há conexão entre aestrutura de RNAm secundária e o fenótipo. Além disso, trêsSNPs (g. 965ΊΟΊ , c. 10718G>C e c. 10936G>C) também tinhamefeitos de haplotipo significativos sobre a SFD (FIGS. 4A-4C) . Em geral, o Exemplo confirmou que o CRH é um fortegene candidato que regula o metabolismo de lipidio emmamíferos. Contudo, as localizações centrais de QTLs sobreo BTAl4 detectados em diferentes experimentos variam parapadrão de listras de gordura e SFD (veja, por exemplo,Casas e colaboradores, 2000, J Anim Sei. 78: 560-569, Casase colaboradores, 2003, J Anim Sei. 81: 2976-2983 eMizoshita e colaboradores, 2004, J Anim Sei. 82: 3415-3420). Isso implica que outros possíveis genes candidatossobre o cromossoma poderiam estar envolvidos em lipogênese.

Exemplo 2

A FIGURA 5 mostra um fluxograma da entrada de dados eda saída de resultados da análise e correlação dos dadosreferentes à criação, histórias veterinárias e requisitosde desempenho de um grupo de animais, tal como de bovinos.O fluxograma ilustrado na FIGURA 5 ainda indica o fluxointerativo de dados do dispositivo assistido por computadorpara um corpo de estudantes aprendendo a usar o método dainvenção e a correlação de tais dados interativos paraapresentar uma saída como um pré-fluxograma indicando oprogresso da classe. 0 fluxograma ainda indica modificaçõesno método da invenção de acordo com a informação recebidade estudantes antecipadamente ao processo de ensinamento ouotimizar o método para satisfazer as necessidades dosestudantes.

A FIGURA 6 ilustra relações potenciais entre oselementos de dados a serem inseridos no sistema. Setasunidirecionais indicam, por exemplo, que um estábulo é,tipicamente, possuído por um fazendeiro, enquanto que umfazendeiro pode possuir vários estábulos. Similarmente, umaprescrição pode incluir produtos veterinários.

A FIGURA 7A ilustra o fluxo de eventos no uso dosistema computador-baseado portátil para entrada de dadossobre a criação e produção de um rebanho de vacas.

A FIGURA 7B ilustra o fluxo de eventos através dassub-rotinas relacionadas à entrada de dados referentes aogerenciamento de uma fazenda.

A FIGURA 8 ilustra um fluxograma da entrada de dados eda saida de resultados da análise e a correlação dos dadosreferentes à criação, histórias veterinárias e requisitosde desempenho de um grupo de animais

A invenção é ainda descrita pelos parágrafosenumerados a seguir:

1. Um método para subgrupamento de animais de acordocom o genótipo em que os animais de cada subgrupo têm umpolimorfismo similar em um gene CRH compreendendo:

(a) determinação do genótipo de cada animal a sersubgrupado através de determinação da presença de umpolimorfismo de um único nucleotídeo no gene CRH e

(b) segregação de animais individuais em subgrupos, emque cada animal em um subgrupo tem um polimorfismo similarno gene CRH.

2. Um método para subgrupamento de animais de acordocom o genótipo em que os animais de cada subgrupo têm umgenótipo similar no gene CRH compreendendo:

(a) determinação do genótipo de cada animal a sersubgrupado através de determinação da presença depolimorfismo(s) de um único nucleotideo de interesse nogene CRH e

(b) segregação de animais individuais em subgruposdependendo se os animais têm ou não o(s) polimorfismo(s) deum único nucleotideo no gene CRH.

3. O método, de acordo com os parágrafos 1 ou 2, emque o(s) polimorfismo (s) de um único nucleotideo deinteresse pode(m) ser selecionado(s) do grupo consistindoem AAFC0307 67 94.1:g.9657C>T, c.W718G>C, c.10841G>A,c.W893A>C e c.10936G>C.

4. Um método para subgrupamento de animais de acordocom o genótipo em que os animais de cada subgrupo têm umgenótipo similar no gene CRH compreendendo:

(a) determinação do genótipo de cada animal a sersubgrupado através de determinação da presença depolimorfismo(s) de um único nucleotideo de interesseselecionado do grupo consistindo emAAFCO307 67 94. 1: g. 965 7C>T, c. 10718G>C, c. 10841G>A, c.W893A>Ce c. 109360C e

(b) segregação de animais individuais em subgrupos,dependendo se os animais têm ou não polimorf ismo (s) de umúnico nucleotideo de interesse selecionado do grupoconsistindo de AAFC0307 67 94 .1: g. 965 IOTr c.10718G>C,c.10841G>A, c.W893A>C e c. 109360C.

5. Um método, para identificação de um animal, tendoum fenótipo desejável quando comparado com a populaçãogeral de animais dessa espécie compreendendo determinaçãoda presença de um polimorfismo de um único nucleotideo nogene CRH do animal, em que o polimorfismo é selecionado dogrupo consistindo de AAFC03076794.1:g.9657C>T, c.!0718G>C,c. 10841G>A, c. W893A>C e c. 109360C, em que o polimorfismode um único nucleotideo é indicativo de um fenótipodesej ável.

6. O método, de acordo com o parágrafo 5, em que ofenótipo desejável é padrão de listras de gordura e/ouprofundidade de gordura subcutânea.

7. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 1a 6 em que o animal é um bovino.

8. 0 método de acordo com qualquer um dos parágrafos 1a 7 em que o gene CRH é um gene CRH bovino.

9. Um método assistido por computador interativo pararastrear a produção de gado compreendendo uso de um sistemade computador compreendendo um computador programadocompreendendo um processador, um sistema de armazenamentode dados, um dispositivo de entrada, um dispositivo desaida e um dispositivo interativo, as etapas de: (a)inserção, no computador programado, através do dispositivode entrada, de dados compreendendo uma história de criaçãode um bovino ou rebanho de bovinos, (b) inserção, nocomputador programado, através do dispositivo de entrada,de dados compreendendo uma história veterinária de umbovino ou rebanho de bovinos, (c) correlação dos dadosveterinários com a história de criação do bovino ou rebanhode bovinos usando o processador e o sistema dearmazenamento de dados e (d) envio, ao dispositivo desaida, da história de criação e da história veterinária dobovino ou rebanho de bovinos.

10. O método, de acordo com o parágrafo 9, em que osistema de computador é um sistema interativo, pelo quemodificações na saida do método assistido por computadorpodem ser correlacionadas de acordo com a entrada dodispositivo interativo.

11. O método, de acordo com o parágrafo 9 ou 10, aindacompreendendo as etapas de inserção, no computadorprogramado, de dados diagnósticos referentes à saúde davaca ou rebanho de vacas; e correlação dos dadosdiagnósticos com as histórias de criação ou veterinárias davaca ou rebanho de vacas.

12. O método, de acordo com qualquer um dos parágrafos9 a 11, em que os dados veterinários compreendem umregistro de vacinação para uma vaca ou rebanho de vacas.

13. O método, de acordo com qualquer um dos parágrafos9 a 11, em que os dados de saúde são selecionados do grupoconsistindo de dados de condição de pecuária, história dorebanho e dados de segurança do alimento.

14. O método, de acordo com qualquer um dos parágrafos9 a 13, ainda compreendendo pelo menos mais uma etapaselecionada do grupo consistindo de inserção, no computadorprogramado, de dados relacionados ao controle de qualidadedo bovino ou rebanho de bovinos e correlação dos dados decontrole de qualidade com as histórias de criação eveterinária da vaca ou rebanho de vacas, inserção, nocomputador programado, de parâmetros de desempenho da vacaou rebanho de vacas; e correlação dos parâmetros dedesempenho requeridos do bovino ou rebanho de bovinos comum requisito de desempenho especifico de um cliente,correlação dos dados de vacina com os parâmetros dedesempenho do bovino ou rebanho de bovinos, correlação dorebanho aos parâmetros de desempenho do bovino ou rebanhode bovinos, correlação dos dados de segurança do alimentocom os parâmetros de desempenho do bovino ou rebanho debovinos, inserção, no computador programado, de dadosrelativos aos dados nutricionais do bovino ou rebanho debovinos; e alerta quanto à alterações indesejáveis nosparâmetros de desempenho do bovino ou rebanho de bovinos.

15. O método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 9 a 14, ainda compreendendo as etapas de inserção, nocomputador programado, através do dispositivo de entrada,de dados compreendendo um genótipo de um bovino; correlaçãoa uma característica física prevista pelo genótipo usando oprocessador e o sistema de armazenamento de dados; e envio,ao dispositivo de saída, da característica físicacorrelacionada ao genótipo para um bovino ou população debovinos e alimentação do(s) animal(is) com uma dietabaseado nas características físicas, desse modo, melhorandoa produção do bovino.

16. O método assistido por computador, de acordo comqualquer um dos parágrafos 9 a 15, para otimização daeficiência de confinamentos para gado compreendendo envio,ao dispositivo de saída, da história de criação eveterinária do bovino ou rebanho de bovinos e alimentaçãodo(s) animal(is) com uma dieta baseada em suas histórias decriação e veterinária, desse modo, otimizando a eficiênciade confinamentos para o bovino ou rebanho de bovinos.

17. Um método de transmissão de dados compreendendotransmissão de informação de tais métodos de acordo comqualquer um dos parágrafos 9 a 15 selecionado do grupoconsistindo de telecomunicação, telefone, videoconferencia, comunicação em massa, uma apresentação, umaapresentação em computador, uma apresentação emPOWERPOINT™, internet, email e comunicação em documentário.

18. Um sistema de computador interativo, de acordo comqualquer um dos parágrafos 9 a 15, para rastreio dehistórias de criação e bem estar de vacas compreendendodados de criação e veterinários correspondendo a um bovinoou rebanhos de bovino e em que o sistema de computador éconfigurado para permitir que o operador do mesmo troquedados com o dispositivo ou um banco de dados remoto.

19. O sistema de computador interativo de acordo com oparágrafo 18 em que os dispositivos de entrada e saida sãoum assistente digital pessoal ou um computador portátil.

20. Um método para fazer negócios para rastreio dehistórias de criação e bem estar de gado compreendendodados de criação e veterinários correspondendo a uma oumais cabeças de gado compreendendo fornecimento a umusuário do sistema de computador de acordo com o parágrafo18 .21. Um método para fazer negócios para rastreio dehistórias de criação e bem estar de gado compreendendodados de criação e veterinários correspondendo a uma oumais cabeças de gado compreendendo fornecimento a umusuário do sistema de computador de acordo com o parágrafo19.

22. Um método de fazer negócios, de acordo com oparágrafo 20, ainda compreendendo fornecimento, aoproprietário do animal ou cliente, de um equipamento decoleta de amostra, tal como'esfregaços e etiquetas úteispara coleta de amostras das quais dados genéticos podem serobtidos e em que as etiquetas são opcionalmente embaladasem um recipiente o qual é codificado com indícios deidentificação.

23. 0 método de fazer negócios, de acordo com qualquerum dos parágrafos 9 a 15, em que o sistema de computadorainda compreende uma pluralidade de dispositivosinterativos e em que o método ainda compreende as etapas derecebimento, compilação e envio de dados dos dispositivosinterativos para indicar a resposta de um estudante ouclasse de estudantes sobre uma questão relativa à operaçãodo método assistido por computador e, opcionalmente,modificação da operação do método assistido por computadorde acordo com a indicação da resposta.

24. O método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 9 a 24, em que os dados compreendem a presença ou ausênciade um ou mais de (um) polixiiorfismo (s) de um úniconucleotideo de interesse no gene CRH .

25. O método, de acordo com o parágrafo 24, em queo (s) polimorfismo(s) de um único nucleotideo é (são)selecionado(s) do grupo consistindo deAAFCO30767 94 . 1 ; g. 9657C>T, C.10718G>C, C.10841G>A, c.VJ893A>Ce c.10936G>C.

26. Um método para o diagnóstico ou monitoramento depadrão de listras de gordura e/ou profundidade de gordurasubcutânea em um indivíduo compreendendo a obtenção de umaamostra biológica de um indivíduo; e determinação, usandoum ensaio adequado, da presença ou ausência, na amostra, deum ou mais SNPs de CRH, conforme descrito aqui.

27. O método, de acordo com o parágrafo 26, em que oindivíduo é um bovino.

28. Um método para seleção assistida por marcador paramelhorar o padrão de listras de gordura e/ou profundidadede gordura subcutânea compreendendo triagem, como parte deum esquema de seleção, baseado em um ou mais SNPs de CRHrconforme descrito aqui, para intensificar a seleção depadrão de listras de gordura e/ou profundidade de gordurasubcutânea.

29. O método, de acordo com o parágrafo 28, em queseleção é para e reduz o padrão de listras de gordura e/ouprofundidade de gordura subcutânea.

Tendo assim descrito em detalhes modalidadespreferidas da presente invenção, deve ser entendido que ainvenção definida pelos parágrafos acima não está limitadaaos detalhes particulares apresentados na descrição acima,uma vez que muitas variações evidentes da mesma sãopossíveis sem se desviar da modalidade ou escopo dapresente invenção.<table>table see original document page 118</column></row><table>*Médias dentro de uma coluna com diferentsobrescritos são significativamente diferentes (P < 0,01)

Claims (18)

1. Método para identificação de um animal tendo umaprofundidade de gordura subcutânea e/ou padrão de listrasde gordura, quando comparado com a população geral deanimais dessa espécie compreendendo determinação dapresença de um ou mais polimorf ismos de um úniconucleotideo em um gene CRH do animal, caracterizado pelofato de que o polimorfismo de um único nucleotideo éindicativo da profundidade de gordura subcutânea e/oupadrão de listras de gordura.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, aindacompreendendo divisão de animais em subgrupos de acordo como genótipo, em que os animais de cada subgrupo têm umpolimorfismo similar no gene CRH, o referido métodocaracterizado pelo fato de compreender:(a) determinação do genótipo de cada animal a sersubgrupado determinando a presença de um polimorfismo de umúnico nucleotideo no gene CRHf e(b) segregação de animais individuais em subgruposdependendo se os animais têm ou não o(s) polimorfismo(s) deum único nucleotideo no gene CRH.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o(s) polimorfismo (s) de umúnico nucleotideo é (são) selecionado (s) do grupoconsistindo de AAFC03076794.1:g.9657C>T, c.10718G>C,C.10841G>A, c.10893A>C e c.10936G>C.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o animal é um bovino,

5. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o gene CRH é um gene CRHbovino.

6. Método interativo assistido por computador pararastrear a criação de bovinos criados em fazenda compreendendo uso de um sistema de computador compreendendoum computador programado tendo um processador, um sistemade armazenamento de dados, um dispositivo de entrada, umdispositivo de saida e um dispositivo interativo,caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) inserção, no computador programado através do dispositivode entrada, de dados compreendendo uma história de criaçãode um bovino ou rebanho de bovinos e um genótipo de bovino;correlação de uma característica física prevista pelogenótipo usando o processador e o sistema de armazenamento de dados; (b) inserção no computador programado, através dodispositivo de entrada de dados, compreendendo uma históriaveterinária de um bovino ou um rebanho de bovinos, (c)correlação dos dados veterinários com a história de criaçãodo bovino ou rebanho de bovinos usando o processador e osistema de armazenamento de dados e (d) produção, nodispositivo de saida, da história de criação, da históriaveterinária do bovino ou rebanho de bovinos e dacaracterística física correlacionada ao genótipo para umbovino ou população de bovinos, em que a característicafísica é padrão de listras de gordura desejável na carne,gordura subcutânea ou uma combinação dos mesmos, quandocomparado com a população geral de bovinos e o genótipo éum polimorfismo de um único nucleotídeo em um gene CRH.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que o sistema de computador é umsistema interativo, pelo qual modificações nos resultadosdo método assistido por computador podem sercorrelacionadas de acordo com aquilo que foi inserido nodispositivo interativo.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que o método ainda compreende asetapas de inserção, no computador programado, de dadosdiagnósticos referentes à saúde da vaca ou rebanho devacas; e correlação dos dados diagnósticos às histórias decriação e veterinária da vaca ou rebanho de vacas.

9. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que os dados veterinárioscompreendem um registro de vacinação para uma vaca ourebanho de vacas.

10. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que os dados de saúde sãoselecionados do grupo consistindo de dados da condição dacriação, história do rebanho e dados de segurança da ração.

11. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que o método ainda compreendepelo menos uma outra etapa selecionada do grupo consistindode inserção, no computador programado, de dadosrelacionados ao controle de qualidade do bovino ou rebanhode bovinos e correlação dos dados de controle de qualidadecom as histórias de criação e veterinária da vaca ourebanho de vacas, inserção, no computador programado, deparâmetros de desempenho da vaca ou rebanho de vacas; ecorrelação dos parâmetros de desempenho requeridos dobovino ou rebanho de bovinos com um requisito de desempenhoespecifico de um cliente, correlação dos dados de vacinacom os parâmetros de desempenho do bovino ou rebanho debovinos, correlação do rebanho aos parâmetros de desempenhodo bovino ou rebanho de bovinos, correlação dos dados desegurança da ração com os parâmetros de desempenho dobovino ou rebanho de bovinos, correlação dos dados decondição de produção com os parâmetros de desempenho dobovino ou rebanho de bovinos, inserção, no computadorprogramado, de dados relacionados aos dados nutricionais dobovino ou rebanho de bovinos; e correlação dos dadosnutricionais aos parâmetros de desempenho do bovino ourebanho de bovinos e alerta quanto à alteraçõesindesejáveis nos parâmetros de desempenho do bovino ourebanho de bovinos.

12. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que o(s) polimorfismo (s) de umúnico nucleotideo é (são) selecionado (s) do grupoconsistindo de AAFC03076794.1:g.9657C>T, c.10718G>C,c.10841G>A, c.10893A>C e c.10936G>C.

13. Método de transmissão de dados compreendendotransmissão de informação de tais métodos, de acordo com areivindicação 6, caracterizado pelo fato de ser selecionadodo grupo consistindo de telecomunicação, telefone, videoconferência, comunicação em massa, uma apresentação, umaapresentação em computador, uma apresentação emPOWERPOINT™, internet, email e comunicação em documentário.

14. Sistema de computador interativo, de acordo coma reivindicação 6, caracterizado pelo fato de ser pararastrear histórias de criação e bem-estar de vacascompreendendo dados de criação e veterinárioscorrespondendo a um bovino ou rebanho de bovinos e em que osistema de computador é configurado para permitir que ooperador do mesmo troque dados com o dispositivo ou umbanco de dados remoto.

15. Sistema de computador interativo, de acordo coma reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que osdispositivos de entrada e saida são um computador de bolsoou assistente digital pessoal.

16. Método para fazer negócios para rastrearhistórias de criação e bem-estar de animais criados emfazenda caracterizado pelo fato de compreender dados decriação e veterinários correspondendo a um ou mais animaiscriados em fazenda compreendendo fornecer, a um usuário, osistema de computador de acordo com a reivindicação 14.

17. Método de fazer negócios, de acordo com areivindicação 16, caracterizado pelo fato de aindacompreender fornecimento, ao proprietário do animal oucliente, de um equipamento de coleta de amostra, tais comoesfregaços e etiquetas úteis para coleta de amostras dasquais dados genéticos podem ser obtidos e em que rótulossão opcionalmente embalados em um recipiente o qual écodificado com indicativo de identificação.

18. Método de fazer negócios, de acordo com areivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o sistemade computador ainda compreende uma pluralidade dedispositivos interativos, e em que o método aindacompreende as etapas de recebimento de dados dosdispositivos interativos, compilação dos dados, produçãodos dados para indicar a resposta de um estudante ou classede estudantes sobre uma questão referente à operação dométodo assistido por computador e opcionalmente modificaçãoda operação do método assistido por computador de acordocom a indicação da resposta.