BRPI0611583A2 - polimorfismos no gene da proteìna de ligação de ácido graxo 4 (fabp4) e suas associações com medidas de gordura intramuscular e espessura de gordura subcutánea em gado de corte - Google Patents

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BRPI0611583A2 BRPI0611583-7A BRPI0611583A BRPI0611583A2 BR PI0611583 A2 BRPI0611583 A2 BR PI0611583A2 BR PI0611583 A BRPI0611583 A BR PI0611583A BR PI0611583 A2 BRPI0611583 A2 BR PI0611583A2
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Abstract

POLIMORFISMOS NO GENE DA PROTEìNA DE LIGAçãO DE áCIDO GRAXO 4 (FABP4) E SUAS ASSOCIAçõES COM MEDIDAS DE GORDURA INTRAMUSCULAR E ESPESSURA DE GORDURA SUBCUTáNEA EM GADO DE CORTE. A presente invenção refere-se à regulação fisiológica de absorção, crescimento e partição de energia em animais, que está sob o controle de vários genes, que podem ser candidatos importantes para desvendar a variação genética em características economicamente relevantes na produção de carne bovina. A presente invenção refere-se à identificação de polimorfismos de nucleotideo único (SNPs) dentro de genes bovinos que codificam proteínas de ligação de ácido graxo e suas associações com características economicamente relevantes na produção de carne bovina. A invenção ainda abrange métodos e sistemas, incluindo processos baseados em rede de computadores, para gerenciar os dados de SNP e outros dados relacionados a animais e rebanhos de animais específicos, cuidado veterinário, dados de controle de qualidade e diagnóstico, e manejo de criação de gado que, com base na genotipagem, tem características de qualidade de carne previsíveis, condições de criação, bem-estar do animal, informação de segurança alimentar, verificação de processos existentes e dados de localidades de campo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLIMOR-FISMOS NO GENE DA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE ÁCIDO GRAXO 4(FABP4) E SUAS ASSOCIAÇÕES COM MEDIDAS DE GORDURA IN-TRAMUSCULAR E ESPESSURA DE GORDURA SUBCUTÂNEA EM GADO DE CORTE".
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
Esse pedido reivindica o benefício do pedido de patente provisó-rio U.S. N- de Série 60/690.408 depositado em 13 de junho de 2005.
Os pedidos precedentes, e todos os documentos citados nele oudurante seu processo ("documentos citados no pedido") e todos os docu-mentos citados ou referidos nos documentos citados no pedido, e todos osdocumentos citados ou referidos aqui ("documentos aqui citados") e todos osdocumentos citados ou referidos nos documentos aqui citados, junto comquaisquer instruções do fabricante, descrições, especificações do produto einformações técnicas para qualquer um dos produtos aqui mencionados ouem qualquer documento incorporado aqui por referência estão por meio des-se incorporados aqui por referência e podem ser empregados na prática dainvenção.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se à identificação de polimorfismosde nucleotídeo único (SNPs) dentro de genes de bovinos que codificam aproteína de ligação de ácido graxo 4 ("FABP4") e suas associações com ca-racterísticas economicamente relevantes na produção de carne bovina. Ainvenção ainda refere-se a métodos e sistemas, incluindo processos basea-dos em rede de computadores, para gerenciar os dados de SNP e outrosdados que se referem a animais e rebanhos de animais específicos, cuidadoveterinário, dados de controle de qualidade e diagnóstico e manejo da cria-ção que, com base na genotipagem, tem características de qualidade decarne previsíveis, condições de criação, bem-estar do animal, informação desegurança alimentar, verificação de processos existentes e dados de locali-dades de campo.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃOMelhorias significativas no desempenho, eficiência e carcaça doanimal e na qualidade da carne têm sido feitas ao longo dos anos através daaplicação de técnicas comuns de reprodução e seleção de animais. Entre-tanto, tais técnicas de reprodução animal clássicas requerem vários anos deavaliação genética de registros de desempenho de animais individuais eseus parentes e são, portanto muito dispendiosas. Outros esforços têm sidofeitos para melhorar a produtividade e a qualidade através de tais práticas demanejo como o uso de aditivos de ração, implantes hormonais animais equimioterápicos. Entretanto, há uma resistência política e reguladora signifi-cativa à introdução e uso de tais metodologias. Tais metodologias tambémsão não-hereditárias e precisam ser aplicadas diferentemente em cada sis-tema de produção.
Há uma necessidade por métodos que permitam a seleção ereprodução relativamente fácil e mais eficiente de animais de criação comuma vantagem por uma característica hereditária de níveis de Ieptina circu-lante, ingestão de alimento, taxa de crescimento, peso corporal, valor dacarcaça e composição da carcaça. O significado econômico do uso de rótu-los genéticos que estão associados com características economicamenteimportantes (especialmente características com baixa hereditariedade) emanimais de criação através da seleção auxiliada por rótulos, não pode, por-tanto ser superenfatizada.
A regulação fisiológica da ingestão, crescimento e partição deenergia em animais está sob o controle de múltiplos genes, que podem sercandidatos importantes para explicar a variação genética em característicaseconomicamente relevantes (ERT) na produção de carne bovina. Polimor-fismos nesses genes candidatos que mostram associação com ERT especí-fica são nucleotídeos de características quantitativas úteis para seleção auxi-liada por rótulo. No presente estudo, foram encontradas associações entrepolimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) no gene da proteína de ligaçãode ácido graxo 4 ("FABP4") com gordura intramuscular e espessura de gor-dura subcutânea.
Proteínas de ligação de ácido graxo é uma família de proteínascitoplasmáticas pequenas, altamente conservadas que se ligam a ácidosgraxos de cadeia longa e outros Iigantes hidrofóbicos (Kaikaus et al. 1990.Experientia1 46: 617-630). Suas principais funções incluem a absorção,transporte e metabolismo de ácido graxo. Até agora, nove membros distintosforam identificados nessa família de genes (Damcott et al. 2004. Metabolism,53:303-309), incluindo a proteína de ligação de ácido graxo de adipócito ouproteína de ligação de ácido graxo 4 ("FABP4"). FABP4 desempenha umpapel importante na regulação da homeostase de lipídio e glicose através desua interação com os receptores ativados por proliferador de peroxissomo(PPARs), localizados no núcleo da célula. Especificamente, o complexoFABP4/ác\6o graxo ativa a isoforma PPAR-γ, que por sua vez, regula atranscrição de FABP4 (Damcott et al. 2004. Metabolism, 53:303-309). Alémdisso, FABP4 parece estar envolvida na hidrólise de lipídio e trânsito intrace-lular de ácido graxo através de interação direta e ligação à Iipase sensível ahormônio (Shen et al 1999. Proc Natl Acad Sci USA, 96:5528-5532), que éuma enzima primária envolvida no catabolismo de lipídio (Tansey et ai 2003.J. Biol. Chem. 278:8401-8406). Recentemente, FABP4 e FABP5 foram pro-postos como genes candidatos em potencial para obesidade já que eles es-tão localizados dentro dé uma região de lócus de características quantitati-vas (QTL) para níveis séricos de Ieptina em camundongos (Ogino et al.2003. Mamm. Genome, 14:839-844). Leptina, uma proteína de 16 kDa se-cretada por adipócitos brancos, está envolvida na regulação da ingestão ali-mentar, gasto de energia e balanço de energia corporal total (Jiang & Gibson1999. Mamm. Genome, 10:191-193). Todos esses fatores indicam queFABP4 pode desempenhar um papel importante no metabolismo lipídico ehomeostase nos adipócitos.
Permanece vantajoso fornecer SNPs adicionais que podem pre-ver mais exatamente o fenótipo de qualidade da carne de um animal e tam-bém um método de trabalho que fornece eficiência de produção aumentadaem gado de criação, assim como fornece acesso a vários registros dos ani-mais e permite comparações com metas esperadas ou desejadas com rela-ção à qualidade e quantidade de animais produzidos.A citação ou identificação de qualquer documento nesse pedidonão é uma admissão de que tal documento está disponível como técnicaanterior a presente invenção.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se à identificação de polimorfismosde nucleotídeo único (SNPs) dentro de genes de bovinos que codificam aproteína de ligação de ácido graxo 4 ("FABP4') e suas associações com ca-racterísticas economicamente relevantes na produção de carne bovina.
A invenção abrange um método para subagrupar animais de a-cordo com o genótipo em que os animais de cada subgrupo têm um polimor-fismo similar em um gene FABP4 que pode compreender determinar o genó-tipo de cada animal a ser subagrupado pela determinação da presença deum polimorfismo de nucleotídeo único no gene FABP4, e segregar animaisindividuais em subgrupos em que cada animal em um subgrupo tem um po-limorfismo similar no gene FABP4.
A invenção também abrange um método para subagrupar ani-mais de acordo com o genótipo em que os animais de cada subgrupo têmum genótipo similar no gene FABP4 que pode compreender a determinaçãodo genótipo de cada animal a ser subagrupado pela determinação-da-pre^sença de polimorfismo(s) de nucleotídeo único de interesse no gene FABP4e segregar animais individuais em subgrupos dependendo se o animal temou não tem o(s) polimorfismo(s) de nucleotídeo único de interesse no geneFABP4.
0(s) polimorfismo(s) de nucleotídeo único de interesse pode(m)ser selecionado(s) a partir do grupo que consiste em substituição de G por Cna posição de nucleotídeo 7516 do gene FABP4 e uma substituição de Gpor C na posição 7713 do gene FABP4.
A invenção ainda refere-se a um método para subagrupar ani-mais de acordo com o genótipo em que os animais de cada subgrupo têmum genótipo similar no gene FABP4 que pode compreender determinar ogenótipo de cada animal a ser subagrupado pela determinação da presençade qualquer um dos SNPs acima, e segregar animais individuais em subgru-pos dependendo se o animal tem, ou não tem, qualquer um dos SNPs acimano gene FABP4.
A invenção também refere-se a um método para identificar umanimal que tem um fenótipo desejável quando comparado à população geralde animais daquela espécie, que pode compreender determinar a presençade um polimorfismo de nucleotídeo único no gene de FABP do animal, emque a presença do SNP é indicativa de um fenótipo desejável.
Em uma modalidade vantajosa, o animal pode ser um bovino.Em outra modalidade vantajosa, o gene FABP4 pode ser um gene de FABPbovina.
A invenção também abrange métodos e sistemas auxiliados porcomputador para melhorar a eficiência de produção de animais de criaçãoque têm carne macia comercializável usando múltiplos dados e em particu-lar, o genótipo dos animais já que ele se relaciona com SNPs de FABP4. Osmétodos da invenção abrangem obter uma amostra genética de cada animalem um rebanho de animais de criação, determinar o genótipo de cada ani-mal com relação a características de qualidade específicas como definidopor um grupo de pelo menos dois polimorfismos de nucleotídeo único(SNPs), agrupar os animais com genótipos semelhantes e, opcionalmente,ainda subagrupar os animais com base em fenótipos semelhantes. Métodosda invenção também podem abrangir obter e manter dados relativos aosanimais ou aos rebanhos, suas condições de criação, saúde e cuidado econdição veterinária, história genética ou parentesco e fornecer esses dadosa outros através de sistemas que estão baseados na web, contidos em umabase de dados ou acoplados ao próprio animal como por um microchip im-plantável. Um aspecto vantajoso da presente invenção, portanto, está dirigi-do para um sistema de computador e métodos auxiliados por computadorpara rastrear caracteres de qualidade para animais de criação que possuempredisposições genéticas específicas.
A presente invenção vantajosamente abrange métodos e siste-mas auxiliados por computador para aquisição de dados genéticos, particu-larmente de dados genéticos como definidos pela ausência ou presença deum SNP dentro do gene FABP4 relacionado a características de qualidadeda carne da raça do animal e associar esses dados com outros dados sobreo animal ou seu rebanho, e manter esses dados de maneiras que eles sejamacessíveis. Outro aspecto da invenção abrange um método auxiliado porcomputador para prever quais animais de criação possuem uma diferençabiológica na qualidade da carne, e que pode incluir as etapas de usar umsistema computacional, por exemplo, um computador programado compre-endendo um processador, um sistema de armazenamento de dados, umdispositivo de entrada e um dispositivo de saída, as etapas de: (a) inserir nocomputador programado através do dispositivo de entrada, dados que inclu-em o genótipo de um animal conforme ele se relaciona a qualquer um dosSNPs de FABP descritos aqui, (b) correlacionar a qualidade prevista da car-ne pelo genótipo de FABP4 usando o processador e o sistema de armaze-namento de dados e (c) emitir pelo dispositivo de saída a qualidade da carnecorrelacionada ao genótipo de FABP4, assim maneira prevendo quais ani-mais de criação possuem uma qualidade de carne particular.
Ainda outro aspecto da invenção refere-se a um método de fazernegócios para gerenciamento de animais de criação que compreende forne-cer a um usuário um sistema computacional para gerenciamento de animaisde criação que compreende as características físicas e genótipos que cor-respondem a um ou mais animais ou um meio de leitura em computador pa-ra gerenciamento de animais de criação que compreende característicasfísicas e genótipos que correspondem a um ou mais animais ou característi-cas físicas e genótipos correspondentes a um ou mais animais, em que umacaracterística física é absorção, crescimento e valor de carcaça em gado decorte e o genótipo é um genótipo de FABP4.
É observado que nessa descrição e particularmente nas reivindi-cações e/ou parágrafos, termos tais como "compreende", "compreendido","compreendendo" e similares podem ter o significado atribuído a eles na leidé Patente U.S.; por exemplo, eles podem significar "inclui", "incluído", "in-cluindo" e similares; e que termos como "consistindo essencialmente de" e"consiste essencialmente de" têm o significado atribuído a eles na lei de Pa-tente U.S, por exemplo, eles permitem elementos não citados explicitamen-te, mas excluem elementos que são encontrados na técnica anterior ou queafetam uma característica básica ou nova da invenção.
Essas e outras modalidades estão descritas ou são óbvias e a-brangidas pela seguinte Descrição Detalhada.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A seguinte descrição detalhada, dada como forma de exemplo,mas não pretendida para limitar a invenção unicamente às modalidades es-pecíficas descritas, pode ser melhor compreendida em conjunto com os de-senhos anexos, nos quais:
FIGURA 1 descreve o alinhamento de seqüência entre cDNA eDNA genômico para determinar a organização genômica do gene FABP4bovino.
FIGURA 2 descreve duas substituições G/C detectadas nas po-sições 7516 e 7713 no gene FABP4 bovino.
FIGURA 3 descreve a genotipagem por PCR-RFLP da substitui-ção C/G na posição 7516 do gene FABP4 bovino. Raia 1: rótulo de 100 pb.Raias 2 - 7: um amplicon de 452 pb foi digerido com a enzima de restriçãoMspAI I. Raias 2-4, animais CG mostram 3 bandas após digestãO~compíe-ta, 452, 352 e 100 pb; Raia 5, animais CC não têm um sítio de MspAII e oamplicon de 452 pb não é digerido; Raias 6 e 7, animais GG têm um sítio deMspAI I e revelam duas bandas após digestão completa: 352 pb e 100 pb.
FIGURA 4 descreve o Ne de Acesso do GenBank A-AFC01136716, Bos taurus Contl 36721, seqüência de "shotgun" do genomainteiro.
FIGURA 5. ilustra um fluxograma da entrada de dados e saídade resultados a partir da análise e correlação de dados pertencentes à re-produção, históricos veterinários e requisitos de desempenho de um grupode animais tais como um rebanho de vacas e o fluxo de dados interativo apartir de um dispositivo auxiliado por computador a um grupo de estudantesaprendendo o uso do método da invenção.
FIGURA 6. ilustra os relacionamentos potenciais entre os ele-mentos dos dados a serem introduzidos no sistema. As setas unidirecionaisindicam, por exemplo, que um celeiro é tipicamente de propriedade de ape-nas uma fazenda, enquanto que uma fazenda pode ter vários celeiros. Simi-larmente, uma prescrição pode incluir produtos veterinários.
FIGURA 7A ilustra o fluxo de eventos no uso do sistema basea-do em computador portátil para registro de dados sobre a reprodução e pro-dução animal de um rebanho de vacas.
FIGURA 7B ilustra o fluxo de eventos através de sub-rotinas re-lacionadas ao registro de dados referentes ao gerenciamento de fazenda.
FIGURA 7C ilustra o fluxo de eventos através de sub-rotinas re-lacionadas ao registro de dados referentes a dados específicos para umaempresa.
FIGURA 8 ilustra um fluxograma da entrada de dados e da saídade resultados a partir da análise e correlação dos dados pertinentes a repro-dução, históricos veterinários e requisitos de desempenho de um grupo deanimais.
DESCRIÇÃO DETALHADA
A prática da presente invenção empregará, a menos que indica-do de outra maneira, técnicas convencionais de biologia molecularrmicrobio—logia, tecnologia de DNA recombinante e imunologia, que estão dentro doconhecimento da técnica. Tais técnicas são totalmente explicadas na litera-tura. Veja, por exemplo, Sambrook et aí. (2001) Molecular Cloning: A Labo-ratory Manual, 3- ed., Cold Spring Harbor Press; DNA Cloning, Vols. I e Il (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); NucleicAcid Hybridization (B. D. Hames &S. J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Cul-ture (R. K. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRI, press,1986); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); a série Me-thods In Enzymology (S. Colowick & N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.);e Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir & C. C.Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications).
Antes de descrever a presente invenção em detalhes, deve sercompreendido que essa invenção não está limitada a DNA, seqüências depolipeptídeos ou parâmetros de processo particulares que como tais podem,é claro, variar. Também deve ser compreendido que a terminologia usadaaqui tem o propósito de descrever apenas modalidades particulares da in-venção e não pretende ser limitante.
A menos que definido de outra maneira, todos os termos técni-cos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que o comumentecompreendido pelo versado na técnica a qual a invenção pertence. Emboravários métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritospossam ser usados na prática da presente invenção, os materiais e métodospreferidos estão descritos aqui.
Ao descrever da presente invenção, os seguintes termos serãoempregados e são pretendidos por ser definidos como indicado abaixo.
O termo "vaca" ou "gado" é usado geralmente para se referir aum animal de origem bovina de qualquer idade. Termos intercambiáveis in-cluem "bovino", "bezerro", "novilho", "touro", "vitela" e similares. Ele tambéminclui um animal individual em todos os estágios de desenvolvimento, inclu-indo estágios embrionário e fetal. Os animais como referidos aqui tambémpodem incluir indivíduos ou grupos de indivíduos que são criados para ou-tras produções além da produção de alimento, tais comormasnão-limitadosa animais transgênicos para a produção de biofármacos incluindo anticorpose outras proteínas ou produtos de proteína.
Pelo termo "complementaridade" ou "complementar" entende-se,para os propósitos da descrição ou reivindicações, um número suficiente emoligonucleotídeo de pares de bases complementares em sua seqüência parainteragir especificamente (hibridizar) com uma seqüência de ácido nucléicoalvo do polimorfismo do gene a ser amplificado ou detectado. Como conhe-cido pelos versados na técnica, um grau de complementaridade muito ele-vado é necessário para a especificidade e sensibilidade que envolve a hibri-dização, embora não necessite ser 100%. Assim, por exemplo, um oligonu-cleotídeo que é idêntico em seqüência de nucleotídeos a um oligonucleotí-deo descrito aqui, exceto por uma alteração ou substituição de base, podefuncionar equivalentemente aos oligonucleotídeos descritos. Um gene de"DNA complementar" ou "cDNA" inclui genes recombinantes sintetizados portranscrição reversa de RNA mensageiro ("mRNA").
Uma "reação mediada por polimerase cíclica" refere-se a umareação bioquímica na qual uma molécula de molde ou uma população demoléculas de molde é periodicamente e repetidamente copiada para criaruma molécula de molde complementar ou moléculas de molde complemen-tares, dessa maneira aumentando o número de moléculas de molde ao lon-go do tempo.
Pelo termo "porção detectável" entende-se, para os propósitosda especificação ou reivindicações, uma molécula marcadora (isotópica ounão isotópica) que está incorporada indiretamente ou diretamente em umoligonucleotídeo, em que a molécula marcadora facilita a detecção do oligo-nucleotídeo no qual ela está incorporada, por exemplo quando o oligonucleo-tídeo é hibridizado a seqüências polimórficas de gene amplificadas. Assim,"porção detectável" é usado como sinônimo de "molécula marcadora". A sín-tese de oligonucleotídeos pode ser obtida por qualquer um de vários méto-dos conhecidos por aqueles versados na técnica. Moléculas marcadoras,conhecidas por aqueles versados na técnica como sendo úteis para detec-ção, incluem moléculas quimioluminescentes, fluorescentes~ou~luminescen---tes. Várias moléculas fluorescentes são conhecidas na técnica que são ade-quadas para uso como rótulo de um ácido nucléico para o método da pre-sente invenção. O protocolo para tal incorporação pode variar dependendoda molécula fluorescente usada. Tais protocolos são conhecidos na técnicapara a respectiva molécula fluorescente.
"Amplificação de DNA" como usado aqui se refere a qualquerprocesso que aumenta o número de cópias de uma seqüência de DNA es-pecífica por amplificar enzimaticamente a seqüência de ácido nucléico. Vá-rios processos são conhecidos. Um dos mais comumente usados é o pro-cesso da reação em cadeia da polimerase (PCR) de Mullis como descritonas Patentes U.S. NQs 4.683.195 e 4.683.202. Métodos, equipamentos ereagentes como descritos nas Patentes U.S. Nes 6.951.726; 6.927.024;6.924.127; 6.893.863; 6.887.664; 6.881.559; 6.855.522; '6.855.521;6.849.4306.818.4026.770.4406.703.236RE38.3526.632.6536.586.2336.558.9296.518.0206.492.1146.465.6386.426.2156.391.5596.358.6806.316.1926.300.0726.268.1536.258.5376.225.0936.183.963
6.143.4966.068.9746.031.9606.001.5725.955.2745.883.9245.863.7315.853.9915.827.6575.811.296
5.774.4975.716.784;
6.849.4046.794.1776.767.7246.699.7136.650.7196.617.1076.569.6786.558.9096.514.7506.485.9076.465.6376.423.4996.383.7556.355.4226.312.9306.287.7816.268.1436.258.5296.221.5956.180.372;6.140.6136.063.5636.017.6995.985.6195.952.2005.876.9785.861.2515.849.4975.824.5165.804.3835.766.8895.712.125
6.846.6316.794.1336.750.0226.696.2776.645.7586.613.5606.569.6276.551.7836.514.7066.485.9036.465.1716.410.2236.379.9326.348.3366.309.8406.284.455D445.9076.251.607D441.0916.180.3496.140.1106.048.6886.015.6645.976.8425.936.9685.876.9775.861.2455.837.4685.824.4795.800.9975.759.8225.712.090
6.844.158;6.790.9526.744.7896.664.0806.645.7206.610.4876.566.1036.544.7826.503.7506.482.5886.448.0146.403.3416.372.4846.346.3846.309.8376.277.6056.261.4316.248.5676.218τ1536.174.670;6.103.4686.046.0396.015.5345.972.6025.909.4685.874.2215.858.7255.830.6635.817.7975.780.2715.750.3475.710.381
6.844.1556.783.9406.733.9996.664.0646.642.0006.596.4926.566.0676.537.7526.503.705
6.475.7296.432.6466.399.3206.368.8346.319.6736.303.3436.270.9776.258.5706.235;4686:207.4256.153.4126.087.0976.037.1296.004.747
5.968.7305.905.7325.869.3185.858.7185.827.6955.814.4895.780.2225.747.2515.705.627
6.818.437;6.773.901;6.733.972;6.664.044;6.638.716;6.586.250;6.566.052;6.524.830;6.493.640;6.468.743;6.428.987;6.395.518;6.365.375;6.316.195;6.300.073;6.270.966;6.258.567;6.232.079;6:183.999;6.146.834;6.072.369;6.033.854;6.001.612;5.958.686;5.888.740;5.863.772;5.856.086;5.827.661;5.814.453;5.776.686;5.741.656;5.702.884;5.693.4675.656.4935.639.8715.618.7035.589.3335.556.7735.512.4625.484.6995.426.0265.364.7585.232.8295.198.337
5.691.1465.656.4615.639.6115.618.7025.585.2385.538.8715.501.9475.476.7745.420.0095.340.7285.231.0155.187.060
5.681.7415.654.1445.639.6065.614.3885.576.1975.527.8985.494.7955.475.6105.411.8765.283.1715.229.2975.142.033
5.674.717; 5.665.572
5.652.1025.631.1285.610.0175.565.3405.527.5105.491.2255.447.8395.393.6575.279.9525.224.7785.091.310
5.650.2685.629.1785.602.7565.565.3395.514.5685.487.9935.437.9755.389.5125.254.4695.219.7275.082.780
5.665.539;
5.643.765
5.627.054
5.599.674
5.556.774
5.512.463
5.487.985
5.436.144
5.364.790
5.241.363
5.213.961
5.066.584
5.023.171 e 5.008.182 também podem ser empregados na prática da pre-sente invenção. PCR envolve o uso de uma DNA polimerase termoestável,seqüências conhecidas como iniciadores e ciclos de aquecimento, que sepa-ram as filamentos do ácido desoxirribonucléico replicante (DNA) e amplificaexponencialmente um gene de interesse. Qualquer tipo de PCR1 tal comoPCR quantitativo, RT-PCR, PCR hot start, LAPCR, PCR multiplex, PCR tou-chdown, etc. pode ser usado. VantajosamenterPCR em tempo real-é-tisadorEm geral, o processo de amplificação por PCR envolve uma reação em ca-deia enzimática cíclica para preparar quantidades exponenciais de uma se-qüência de ácido nucléico específica. Ele requer uma pequena quantidadede uma seqüência para iniciar a reação em cadeia e iniciadores de oligonu-cleotídeo que hibridizarão à seqüência. No PCR os iniciadores são aneladospara desnaturar o ácido nucléico seguido pela extensão com um agente in-dutor (enzima) e nucleotídeos. Isso resulta em produtos de extensão sinteti-zados recentemente. Já que essas seqüências recentemente sintetizadas setornam moldes para os iniciadores, ciclos repetidos de desnaturação, ane-lamento do iniciador e extensão resultam em acúmulo exponencial da se-qüência específica sendo amplificada. O produto da extensão da reação emcadeia será um dúplex de ácido nucléico distinto com uma terminação quecorresponde às extremidades dos iniciadores específicos empregados.Pelos termos "amplificar enzimaticamente" ou "amplificar" enten-de-se, para os propósitos do relatório ou reivindicações, amplificação deDNA, isto é, um processo pelo qual seqüências de ácido nucléico são ampli-ficadas em número. Existem vários meios de amplificar enzimaticamenteseqüências de ácido nucléico. Atualmente, o método mais comumente usa-do é a reação em cadeia da polimerase (PCR). Outros métodos de amplifi-cação incluem LCR (reação em cadeia de ligase) que utiliza DNA Iigase euma sonda que consiste em duas metades de um segmento de DNA que écomplementar à seqüência de DNA a ser amplificada, enzima QB replicase eum molde de seqüência de um ácido ribonucléico (RNA) ligado a uma sondacomplementar ao DNA a ser copiado que é usado para fazer um molde deDNA para produção exponencial de RNA complementar; amplificação portransferência de filamento (SDA); amplificação por replicase Οβ (QpRA); re-plicação auto-sustentada (3SR); e NASBA (amplificação baseada em se-qüência de ácido nucléico), que pode ser realizada em RNA ou DNA comoseqüência de ácido nucléico a ser amplificada.
Um "fragmento" de uma molécula tal como uma proteína ou áci-do nucléico significa referir-se a qualquer porção da seqüência genética deaminoácido ou nucleotídeo. .
Como usado aqui, o termo "genoma" refere-se a todo o materialgenético nos cromossomos de um organismo em particular. Seu tamanho édado geralmente como seu número total de pares de base. Dentro do geno-ma, o termo "gene" refere-se a uma seqüência ordenada de nucleotídeoslocalizada em uma posição particular em um cromossomo particular que co-difica um produto funcional específico (por exemplo, uma proteína ou molé-cula de RNA). Em geral, as características genéticas de um animal, comodefinidas pela seqüência de nucleotídeos de seu genoma, são conhecidascomo seu "genótipo", enquanto que as características físicas do animal sãodescritas como seu "fenótipo".
Por "heterozigoto" ou "polimorfismo heterozigoto" entende-seque os dois alelos de um organismo ou célula diplóide em um dado lócussão diferentes, ou seja, que eles têm um nucleotídeo diferente trocado pelomesmo nucleotídeo no mesmo local em suas seqüências.
Por "homozigoto" ou "polimorfismo homozigoto" entende-se queos dois alelos de um organismo ou célula diplóide em um dado lócus sãoidênticos, ou seja, que eles têm o mesmo nucleotídeo para troca de nucleo-tídeo no mesmo local em suas seqüências.
Por "hibridização" ou "hibridizar" como usado aqui, entende-se aformação de pares de bases A-T e C-G entre a seqüência de nucleotídeosde um fragmento de um segmento de um polinucleotídeo e uma seqüênciade nucleotídeos complementar de um oligonucleotídeo. Por complementarentende-se que no lócus de cada A, C, G ou T (ou U em um ribonucleotídeo)na seqüência do fragmento, o oligonucleotídeo seqüenciado tem um T, G, Cou A respectivamente. O fragmento/oligonucleotídeo hibridizado é chamadode um "dúplex".
Um "complexo de hibridização", tal como em um ensaio sanduí-che, significa um complexo de moléculas de ácido nucléico que inclui pelomenos o ácido nucléico alvo e uma sonda de sensor. Também pode incluiruma sonda âncora.
Como usado aqui, o termo "lócus" ou "loci" refere-se ao local deum gene em um cromossomo. Pares de"genesr conhecidos como "alelos"controlam a característica hereditária produzida por lócus de gene. Cadacombinação de alelos particular do animal é referida como seu "genótipo".Onde ambos os alelos são idênticos, o indivíduo é dito ser homozigoto paraa característica controlada por aquele par de genes; onde os alelos são dife-rentes, o indivíduo é dito ser heterozigoto para a característica.
Uma "temperatura de fusão" significa a temperatura na qual osdúplices hibridizados se desibridizam e retornam ao seu estado de filamentoúnico. Da mesma maneira, a hibridização não ocorrerá no primeiro lugar en-tre dois oligonucleotídeos ou, aqui, um oligonucleotídeo e um fragmento, emtemperaturas acima da temperatura de fusão do dúplex resultante. É vanta-joso que a diferença nas temperaturas dos pontos de fusão dos dúplices oli-gonucleotídeo-fragmento dessa invenção seja entre cerca de 10C a cerca de10°C a fim de que seja facilmente detectável.Como usado aqui, o termo "molécula de ácido nucléico" preten-de incluir moléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômico), molé-culas de RNA (por exemplo, mRNA), análogos de DNA ou RNA gerados u-sando análogos de nucleotídeos e derivados, fragmentos e homólogos des-ses. A molécula de ácido nucléico pode ser de filamento único ou filamentoduplo, mas vantajosamente é DNA de filamento duplo. "DNA" refere-se àforma polimérica de desoxirribonucleotídeos (adenina, guanina, timina oucitosina) tanto em sua forma de filamento único quanto de hélice de filamen-to duplo. Esse termo refere-se à estrutura primária e secundária da molécu-la, e não-limita a quaisquer formas terciárias em particular. Assim, esse ter-mo inclui DNA de filamento duplo encontrado, inter alia, em moléculas deDNA lineares (por exemplo, fragmentos de restrição), vírus, plasmídeos ecromossomos. A discutir a estrutura de moléculas de DNA de filamento du-plo em particular, as seqüências podem ser descritas aqui de acordo com aconvenção normal de dar a seqüência apenas na direção 5' para 3' juntocom o filamento de DNA não transcrito (isto é, o filamento que tem uma se-qüência homóloga ao mRNA). Uma molécula de ácido nucléico "isolada" éuma que é separada de outras moléculas de ácido nucléico que estão pre-sentes na fonte natural doácido nucléico.
Um "nucleosídeo" refere-se a uma base ligada a um açúcar. Abase pode ser adenina (A), guanina (G) (ou sua substituta, inosina (I)), cito-sina (C), ou timina (T) (ou sua substituta uracila (U)). O açúcar pode ser ri-bose (o açúcar de um nucleotídeo natural no RNA) ou 2-desoxirribose (oaçúcar de um nucleotídeo natural no DNA). Um "nucleotídeo" refere-se a umnucleosídeo ligado a um único grupo fosfato.
Como usado aqui, o termo "oligonucleotídeo" refere-se a umasérie de resíduos de nucleotídeo ligados, cujo oligonucleotídeo tem um nú-mero de bases de nucleotídeo suficiente para ser usado em uma reação dePCR. Uma seqüência de oligonucleotídeo curta pode ser baseada, ou dese-nhada a partir de, uma seqüência genômica ou de cDNA e é usada paraamplificar, confirmar ou revelar a presença de um RNA ou DNA idêntico, si-milar ou complementar em uma célula ou tecido em particular. Oligonucleo-tídeos podem ser sintetizados quimicamente e podem ser usados como ini-ciadores ou sondas. Oligonucleotídeo significa qualquer nucleotídeo de maisde 3 bases de extensão usado para facilitar a detecção ou identificação deum ácido nucléico alvo, incluindo sondas e iniciadores.
Uma "polimerase" é uma enzima que catalisa a adição seqüen-cial de unidades monoméricas a uma cadeia polimérica, ou liga duas oumais unidades monoméricas para iniciar uma cadeia polimérica. A "polime-rase" trabalhará pela adição de unidades monoméricas cuja identidade édeterminada por e que é complementar a uma molécula molde de uma se-qüência específica. Por exemplo, DNA polimerases tais como DNA pol 1 eTaq polimerase adicionam desoxirribonucleotídeos à extremidade 3' de umacadeia de polinucleotídeo de uma maneira dependente do molde, dessaforma sintetizando um ácido nucléico que é complementar à molécula molde.Polimerases podem ser usadas tanto para estender um iniciador uma vez ourepetidamente ou para amplificar um polinucleotídeo por iniciação repetidade dois filamentos complementares usando dois iniciadores. Uma "polimera-se termoestável" refere-se a uma enzima DNA ou RNA polimerase que podesuportar temperaturas extremamente altas, tais como aquelas que se apro-ximam de 100°C. Freqüentemente, polimerases termoestáveis são derivadasde organismos que vivem em temperaturas extremas, tal como Thermus a-quaticus. Exemplos de polimerases termoestáveis incluem Taq, Tth, Pfu1Vent, deep vent, UITma e variações e derivados dessas.
Um "polinucleotídeo" refere-se a uma cadeia linear de nucleotí-deos conectados por uma ligação fosfodiéster entre o grupo 3'-hidroxila deum nucleosídeo e o grupo 5'-hidroxila de um segundo nucleosídeo que porsua vez está ligado através de seu grupo 3'-hidroxila ao grupo 5'-hidroxila deum terceiro nucleosídeo e assim sucessivamente para formar um polímerocompreendido por nucleosídeos ligados por um esqueleto de fosfodiéster.Um "polinucleotídeo modificado" refere-se a um polinucleotídeo no qual umou mais nucleotídeos naturais foram parcialmente, substancialmente oucompletamente substituídos por nucleotídeos modificados.
Um "iniciador" é um oligonucleotídeo, a seqüência de pelo me-nos porção do qual é complementar a um segmento de um DNA molde queestá para ser amplificado ou replicado. Tipicamente, iniciadores são usadosna realização da reação em cadeia da polimerase (PCR). Um iniciador hibri-diza com (ou "anela" ao) DNA molde e é usado pela enzima polimerase co-mo ponto de partida para o processo de replicação/amplificação. Os iniciado-res são selecionados aqui para serem "substancialmente" complementares adiferentes filamentos de uma seqüência de DNA alvo em particular. Isso sig-nifica que os iniciadores devem ser suficientemente complementares parahibridizar com suas respectivas filamentos. Portanto, a seqüência do inicia-dor não precisa refletir a seqüência exata do molde. Por exemplo, um frag-mento de nucleotídeo não-complementar pode ser ligado à extremidade 5'do iniciador com o restante da seqüência do iniciador sendo complementarao filamento. Alternativamente, bases não-complementares ou seqüênciasmais longas podem ser intercaladas no iniciador, contanto que a seqüênciado iniciador tenha complementaridade suficiente com a seqüência do fila-mento para hibridizar com ela e dessa maneira formar o molde para a sínte-se do produto de extensão.
"Sondas" referem-se a seqüências de ácido nucléico de oligonu-cleotídeos de extensão variável, usadas na detecção de seqüências de áci-do nucléico idênticas, similares ou complementares por hibridização. Umaseqüência de oligonucleotídeo usada como sonda de detecção pode ser ro-tulada com uma porção detectável.
A seguir estão exemplos não-limitantes de polinucleotídeos: umgene ou fragmento de gene, éxons, íntrons, mRNA, tRNA, rRNA, ribozimas,cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plas-mídeos, vetores, DNA isolado de qualquer seqüência, RNA isolado de qual-quer seqüência, sondas de ácido nucléico e iniciadores. Um polinucleotídeopode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metila-dos e análogos de nucleotídeo, uracila, outros açúcares e grupos Iigantestais como fluororribose e tiolato, e ramificações de nucleotídeo. A seqüênciade nucleotídeos pode ser ainda modificada após a polimerização, tal comopor conjugação, com um componente rótulo. Outros tipos de modificaçõesincluídas nessa definição são "caps", substituição de um ou mais dos nu-cleotídeos de ocorrência natural por um análogo e introdução de meios paraligação do polinucleotídeo a proteínas, íons de metal, componentes rótulos,outros polinucleotídeos ou suporte sólido.
Um polinucleotídeo ou polipeptídeo "isolado" é aquele que ésubstancialmente puro de materiais com os quais está associado no seuambiente nativo. Por substancialmente livre, entende-se pelo menos 50%,pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, vantajosamente pelomenos 70%, pelo menos 75%, mais vantajosamente pelo menos 80%, pelomenos 85%, ainda mais vantajosamente pelo menos 90%, pelo menos 91%,pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelomenos 96%, pelo menos 97%, o mais vantajosamente pelo menos 98%, pe-lo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,9% livre desses materiais.
Uma molécula de ácido nucléico "isolada" é uma molécula deácido nucléico separada e distinta do organismo completo com o qual a mo-lécula é encontrada na natureza; ou uma molécula de ácido nucléico des-provida, no todo ou em parte, de seqüências normalmente associadas comela na natureza; ou uma seqüência, como ela existe na natureza, mas quetem seqüências heterólogas (como definido abaixo) em associação com ela.
O termo "polinucleotídeo que codifica uma proteína" como usadoaqui se refere a um fragmento de DNA ou molécula de DNA isolada que co-difica uma proteína, ou o filamento complementar a ela; mas, RNA não éexcluído, como é entendido na técnica que timidina (T) em uma seqüênciade DNA é considerada igual a uracila (U) em uma seqüência de RNA. Assim,seqüências de RNA para uso na invenção, por exemplo, para uso em veto-res de RNA, podem ser derivadas de seqüências de DNA, por causa da ti-midina (T) na seqüência de DNA ser considerada igual a uracila (U) em se-qüências de RNA.
Uma "seqüência codificante" de DNA ou uma "seqüência de nu-cleotídeo que codifica" uma proteína particular, é uma seqüência de DNAque é transcrita e traduzida em um polipeptídeo in vitro ou in vivo quandocolocada sob o controle de elementos regulatórios apropriados. Os limites daseqüência codificante são determinados por um códon de início na termina-ção 5' (amino) e um códon de parada de tradução na terminação 3' (carboxi).Uma seqüência codificante pode incluir, mas não é limitada a seqüênciasprocarióticas, cDNA de mRNA eucariótico, seqüências de DNA genômico deDNA eucariótico (por exemplo, mamíferos) e ainda seqüências de DNA sin-tético. Uma seqüência de terminação de transcrição estará geralmente loca-lizada a 3" da seqüência codificante.
"Homologia" refere-se ao percentual de identidade entre doispolinucleotídeos ou duas porções de polipeptídeo. Dois DNAs ou duas se-qüências de polipeptídeo são "substancialmente homólogas" uma a outraquando as seqüências exibem pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%,84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, preferivelmente pelo menos cerca de90%, 91%, 92%, 93%, 94% e o mais preferivelmente pelo menos cerca de95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% de identidade de seqüência poruma extensão definida das moléculas. Como usado aqui, substancialmentehomólogo também se refere a seqüências que mostram identidade completa(100% de identidade de seqüência) com um DNA especificado ou seqüênciade polipeptídeo.
Homologia pode ser determinada pela hibridização de -pol.inucl.e--..otídeos sob condições que formam dúplices estáveis entre regiões homólo-gas, seguida pela digestão com nucleases específicas de filamento único edeterminação de tamanho dos fragmentos digeridos. Seqüências de DNAque são substancialmente homólogas podem ser identificadas em um expe-rimento de hibridização Southern sob, por exemplo, condições estringentes,como definidas para aquele sistema particular. Definir condições de hibridi-zação apropriadas está dentro do conhecimento da técnica. Veja, por exem-plo, Sambrook et ai, supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization,supra.
Dois fragmentos de ácido nucléico são considerados sendo "hi-bridizáveis seletivamente" a um polinucleotídeo se eles forem capazes dehibridizar especificamente a um ácido nucléico ou uma variante desse ouiniciar especificamente uma reação em cadeia da polimerase: (i) sob condi-ções de hibridização e lavagem típicas, como descrito, por exemplo, emSambrook et ai, supra e Nucleic Acid Hybridization, supra; (ii) usar condi-ções de lavagem de estringência reduzida que permitem no máximo cercade 25-30% de não-pareamento de pares de bases, por exemplo: SSC 2x,SDS 0,1%, temperatura ambiente duas vezes, 30 minutos cada; então SSC2x, SDS 0,1%, 37°C uma vez, 30 minutos; então SSC 2x temperatura ambi-ente duas vezes, 10 minutos cada, ou (iii) selecionar iniciadores para uso emreações em cadeia da polimerase típicas (PCR) sob condições padrão (des-critas por exemplo em Saiki et ai (1988) Science 239:487-491).
O termo "capaz de se hibridizar sob condições estringentes" co-mo usado aqui refere-se ao anelamento de um primeiro ácido nucléico a umsegundo ácido nucléico sob condições estringentes como definidas abaixo.Condições estringentes de hibridização permitem tipicamente a hibridizaçãode moléculas de ácido nucléico que tem pelo menos 70% de identidade deseqüência com a molécula de ácido nucléico sendo usada como uma sondana reação de hibridização. Por exemplo, o primeiro ácido nucléico pode seruma amostra ou sonda de teste e o segundo ácido nucléico pode ser umfilamento senso ou anti-senso de um ácido nucléico ou fragmento desse.Hibridização do primeiro e segundo ácidos nucléicos pode ser conduzida sobcondições estringentes, por exemplo, alta temperatura e/ou conteúdo baixode sal que tendem a desfavorecer a hibridização de seqüências de nucleotí-deos não-similares. Alternativamente, a hibridização do primeiro e segundoácidos nucléicos pode ser conduzida sob condições de estringência reduzi-das, por exemplo, baixa temperatura e/ou conteúdo alto de sal que tendem afavorecer a hibridização de seqüências de nucleotídeos não similares. Con-dições de hibridização de baixa estringência podem ser seguidas por condi-ções de alta estringência ou condições de estringência intermediária ou mé-dia para aumentar a seletividade da ligação do primeiro e segundo ácidosnucléicos. As condições de hibridização podem ainda incluir reagentes taiscomo, mas não-limitados a, dimetil sulfóxido (DMSO) ou formamida paradesfavorecer ainda mais a hibridização de seqüências de nucleotídeos nãosimilares. Um protocolo de hibridização adequado pode, por exemplo, envol-ver hibridização em SSC 6x (em que SSC 1x compreende citrato de sódio0,015 M e cloreto de sódio 0,15 M), a 65°C em uma solução aquosa, segui-da por lavagem com SSC 1x a 65°C. Fórmulas para calcular condições dehibridização e lavagem apropriadas para se obter hibridização que permite30% ou menos de não-pareamento entre duas moléculas de ácido nucléicoestão descritas, por exemplo, em Meinkoth et al. (1984) Anal. Biochem.138:267-284; cujo conteúdo está incorporado aqui por referência em suatotalidade. Protocolos para técnicas de hibridização são bem conhecidos poraqueles versados na técnica e manuais padronizados de biologia molecularpodem ser consultados para selecionar um protocolo de hibridização ade-quado sem experimentação indevida. Veja, por exemplo, Sambrook et al.(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 35 Ed., Cold Spring HarborPress, cujo conteúdo está incorporado aqui por referência em sua totalidade.
Tipicamente, condições estringentes serão aquelas nas quais aconcentração de sal é menor do que cerca de 1,5 M de íon de sódio, con-centração de íon de Na (ou outros sais) de tipicamente cerca de 0,01 a 1,0M, de cerca de pH 7.0 a cerca de pH 8,3 e a temperatura é de pelo menoscerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) epelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, maiores doque 50 nucleotídeos). Condições estringentes também podem ser obtidascom a adição de agentes desestabilizantes tal como formamida. Condiçõesexemplares de baixa estringência incluem hibridização com uma soluçãotampão de 30 a 35% de formamida, NaCI 1M, SDS 1% (dodecil sulfato desódio) a 37°C e uma lavagem em SSC 1 -2x a 50-55°C. Condições exempla-res de estringência moderada incluem hibridização em 40 a 45% de forma-mida, NaCI 1M, SDS 1% a 37°C e uma lavagem em SSC 0,5-1 χ em 55° a60°C. Condições exemplares de alta estringência incluem hibridização em50% de formamida, NaCI 1M, SDS 1% a 37°C e uma lavagem em SSC 0,1xa 60-65°C.
Métodos e materiais da invenção podem ser usados mais geral-mente para avaliar uma amostra de DNA de um animal, classificar geneti-camente um animal individual e detectar diferenças genéticas em animais.Em particular, uma amostra de DNA genômico de um animal pode ser avali-ada por referência com um ou mais controles para determinar se um SNP1ou um grupo de SNPs, está presente em um gene. Qualquer método paradeterminação de genótipo pode ser usado para determinar o genótipo dapresente invenção. Tais métodos incluem, mas não são limitados a seqüen-ciamento de amplimer, seqüenciamento de DNA1 espectroscopia de fluores-cência, análise de hibridização baseada em transferência de energia de res-sonância de fluorescência (ou "FRET"), seleção de alto rendimento, espec-troscopia de massa, análise de microssatélite, hibridização de ácido nucléi-co, reação em cadeia da polimerase (PCR), análise RFLP e cromatografiade tamanho (por exemplo, cromatografia capilar ou em gel), todos os quaissão bem conhecidos por aquele versado na técnica. Em particular, métodospara determinar polimorfismos de nucleotídeo, particularmente polimorfismosde nucleotídeo único, estão descritos nas Patentes U.S Nos. 6.514.700;6.503.710; 6.468.742; 6.410.231; 6.383.756; 6.358.679; 6.322.980;6.316.230 e 6.287.766 e revisados por Chen & Sullivan, PharmacogenomicsJ 2003; 3(2):77-96, cujas descrições estão incorporadas por referência emsuas totalidades. Dados genotípicos úteis nos métodos da invenção e méto-dos para identificação e seleção de características animais são baseados napresença de SNPs.
Um "fragmento de restrição" refere-se a um fragmento de umpolinucleotídeo gerado por uma endonuclease de restrição (uma enzima quediva ligações fosfodiéster dentro de uma cadeia de polinucleotídeo) que di-va o DNA em resposta a um sítio de reconhecimento no DNA. O sítio de re-conhecimento (sítio de restrição) consiste em uma seqüência específica denucleotídeos tipicamente com cerca de 4-8 nucleotídeos de extensão.
Um "polimorfismo de nucleotídeo único" ou "SNP" refere-se auma variação na seqüência de nucleotídeo de um polinucleotídeo que diferede outro polinucleotídeo por uma única diferença de nucleotídeo. Por exem-pio, sem limitação, trocar um A por um C, G ou T na seqüência completa depolinucleotídeo constitui um SNP. É possível ter mais do que um SNP emum nucleotídeo particular. Por exemplo, em uma posição em um nucleotí-deo, um C pode ser trocado por um T1 em outra posição um G pode ser tro-cado por um A e assim sucessivamente. Quando se referir a SNPs1 o polinu-cleotídeo é o mais freqüentemente DNA.
Como usado aqui, um "molde" refere-se a um filamento de poli-nucleotídeo alvo, por exemplo, sem limitação, um filamento de DNA de ocor-rência natural não-modificada, que uma polimerase usa como um meio dereconhecer qual nucleotídeo deve ser o próximo a ser incorporado em umfilamento em crescimento para polimerizar o complemento do filamento deocorrência natural. Tal filamento de DNA pode ser um filamento único oupode ser parte de um molde de DNA de filamento duplo. Nas aplicações dapresente invenção que requerem ciclos repetidos de polimerização, por e-xemplo, a reação em cadeia da polimerase (PCR), o filamento molde por sisó pode se tornar modificada pela incorporação de nucleotídeos modifica-dos, mas ainda servir como um molde para uma polimerase sintetizar poli-nucleotídeos adicionais.
Uma "reação termocíclica" é uma reação multi-etapas em quepelo menos duas etapas são realizadas pela alteração da temperatura dareação.
Uma "variância" é uma diferença na seqüência de nucleotídeoentre polinucleotídeos relacionados. A diferença pode ser a deleção de umou mais nucleotídeos da seqüência de um polinucleotídeo em comparaçãocom a seqüência de um polinucleotídeo relacionado, a adição de um ou maisnucleotídeos ou a substituição de um nucleotídeo por outro. Os termos "mu-tação", "polimorfismo" e "variância" são usados aqui intercambiavelmente.Como usado aqui, o termo "variância" no singular é para ser entendido porincluir variâncias múltiplas; isto é, duas ou mais adições, deleções e/ousubstituições de nucleotídeos no mesmo polinucleotídeo. Uma "mutaçãopontual" refere-se a uma substituição única de um nucleotídeo por outro.
Como usados aqui, os termos "características", "característicasde qualidade" ou "características físicas" ou "fenótipos" referem-se a propri-edades vantajosas do animal que resultam da genética. Características dequalidade incluem, mas não são limitadas a, habilidade genética do animalde metabolizar eficientemente a energia, produzir carne ou leite, adquirirgordura intramuscular. Características físicas incluem, mas não são limita-das a, carnes com marmoreio, macias ou magras. Os termos podem ser u-sados intercambiavelmente.
Um "sistema computacional" refere-se a ferramentas, programase meios de armazenamento de dados usados para compilar os dados dapresente invenção. As ferramentas mínimas de sistemas baseados em com-putador da invenção podem compreender uma unidade central de proces-samento (CPU), meios de entrada, meios de saída e meios de armazena-mento de dados. Desejavelmente, um monitor é fornecido para visualizar aestrutura dos dados. O meio de armazenamento de dados pode ser RAM ououtro meio para acessar a mídia de leitura por computador da invenção. E-xemplos de tais sistemas são estações de trabalho de microcomputadoresdisponibilizadas por Silicon Graphics Incorporated e Sun Microsystems querodam sistemas operacionais baseados em Unix, Linux, Windows NT, XP ouIBM OS/2.
"Mídia de leitura por computador" refere-se a qualquer mídia quepode ser lida e acessada diretamente por um computador e inclui, mas nãoestá limitada a: mídia de armazenamento magnético-tal· como discos flexí-veis, meio de armazenamento rígido e filamento magnético; mídia de arma-zenamento óptico tais como discos ópticos ou CD-ROM; mídia de armaze-namento elétrico tais como RAM e ROM; e híbridos dessas categorias, taiscomo mídia magnética/óptica. Pelo fornecimento de tal mídia legível porcomputador, os dados compilados sobre um animal em particular podem seracessados rotineiramente por um usuário, por exemplo, um operador de a-nimais confinados.
O termo "módulo de análise de dados" é definido aqui por incluirqualquer pessoa ou máquina, individualmente ou trabalhando juntos, queanalisa a amostra e determina a informação genética nela contida. O termopode incluir uma pessoa ou máquina dentro de um ambiente de laboratório.
Como usado aqui, o termo "módulo de coleta de dados" refere-se a qualquer pessoa, objeto ou sistema que obtém uma amostra de tecidode um animal ou embrião. Como exemplo e sem limitação, o termo podedefinir, individualmente ou coletivamente, a pessoa ou máquina em contatofísico com o animal enquanto a amostra é retirada, os recipientes que guar-dam as amostras de tecido, a embalagem usada para transportar as amos-tras e similares. Vantajosamente, o coletor de dados é uma pessoa. Maisvantajosamente, o coletor de dados é um criador de animais, um procriadorou um veterinário.
O termo "interface de trabalho" é definido aqui por incluir qual-quer pessoa ou sistema computacional capaz de acessar dados, registrardados, combinar dados, analisar dados, buscar dados, transmitir dados ouarmazenar dados. O termo é amplamente definido como sendo uma pessoaque analisa dados, os sistemas eletrônicos de ferramentas e programas u-sados na análise, as bases de dados que armazenam a análise de dados equalquer mídia de armazenamento capaz de armazenar dados. Exemplosnão-limitantes de interfaces de trabalho incluem pessoas, equipamento delaboratório automatizado, computadores e redes de computador, equipa-mentos de armazenamento de dados tais como, mas não-limitados a discos,discos rígidos ou chips de memória.
O termo "histórico de procriação" como usado aqui refere a umregistro da vida de um animal ou grupo de animais incluindo, mas não selimitado a, localização, procriação, período de alojamento, assim como umahistórico genético dos animais, incluindo ascendência e descendência, genó-tipo, fenótipo, histórico transgênico se relevante e similares.
O termo "condições de criação" como usado aqui refere-se aparâmetros relacionados à manutenção de animais incluindo, mas não selimitados a, temperatura do galpão ou alojamento, mortalidade semanal deum rebanho, consumo de água, consumo de ração, qualidade e taxa de ven-tilação, condição do feno e similares.
O termo "histórico veterinário" como usado aqui refere-se a da-dos de vacinação de um animal ou grupo de animais, incluindo, mas não-limitado a, tipo(s) de vacina, número(s) de série da batelada da vacina, doseadministrada, antígeno alvo, método de administração da vacina ao(s) ani-mal(is) receptor(es), idade dos animais e o vacinador. Dados relativos à res-posta sorológica ou imunológica induzida pela vacina também podem serincluídos. "Histórico veterinário" como usado aqui também pretende incluiros históricos de medicação do(s) animal(is) alvo incluindo, mas não-limitadoa, fármacos e/ou antibióticos administrados aos animais incluindo o tipo demedicação administrada, quantidade e taxas de dose, por quem e quandoadministradas, por qual via, por exemplo, oral, subcutânea e similares, e aresposta à medicação incluindo efeitos desejáveis e indesejáveis dessa.
O termo "dados de diagnóstico" como usado aqui refere-se aosdados relacionados à saúde do(s) animal(is) além dos dados que detalham ohistórico de vacinação ou medicação do animal. Por exemplo, os dados dediagnóstico podem ser um registro das infecções sofridas pelo(s) animal(is)e a resposta desse a medicações fornecidas para tratar tais infecções. Da-dos sorológicos incluindo composição de anticorpo e proteína do soro e ou-tros biofluidos também podem ser dados de diagnóstico úteis para entradanos métodos da invenção. Dados cirúrgicos pertinentes ao(s) animal(is) po-dem ser incluídos, tais como o tipo de manipulação cirúrgica, o resultado dacirurgia e complicações que surgiram do procedimento cirúrgico. "Dados dediagnóstico" também podem incluir medidas de parâmetros tais como peso,morbidade e outras características observadas por um serviço veterináriotais como condições da pele, pés, etc.
O termo "dados de bem-estar" como usado aqui refere-se aoacúmulo coletivo de dados pertinentes a um animal ou grupo de animais in-cluindo, mas não-limitado a, um histórico de procriação, um histórico veteri-nário, perfil de bem-estar, dados diagnósticos, dados de controle de qualida-de ou qualquer combinação desses.
O termo "perfil de bem-estar" como usado aqui refere-se a pa-râmetros tais como peso, densidade da carne, níveis de agrupamento naprocriação ou confinamentos para criação, comportamento psicológico doanimal, taxa e qualidade de crescimento e similares.
O termo "controle de qualidade" como usado aqui refere-se àscaracterísticas desejadas do(s) animal(is). Para animais que não são aves,tais como gado e carneiro, por exemplo, tais parâmetros incluem quantidadee densidade do músculo, conteúdo de gordura, maciez da carne, rendimentoe qualidade do leite, habilidade de procriação e similares.
O termo "parâmetros de desempenho" como usado aqui refere-se a fatores tais como rendimento da carne, rendimento da procriação, pro-dução leiteira, rendimento e qualidade da carne, vida produtiva e similaresque podem ser as metas desejáveis da procriação e criação dos animais. Osparâmetros de desempenho podem tanto ser gerados a partir dos própriosanimais, quanto àqueles parâmetros desejados por um consumidor ou pelomercado.
O termo "dados nutricionais" como usado aqui refere-se à com-posição, quantidade e freqüência da oferta de alimento, incluindo água, for-necida ao(s) animal(is).
O termo "segurança alimentar" como usado aqui refere-se àqualidade da carne de um animal de criação, incluindo mas não-limitado aotempo, local e maneira de preparação, armazenamento do produto alimentí-cio, via de transporte, registros de inspeção, textura, cor, gosto, odor, conte-údo bacteriano, conteúdo de parasitas e similares.
Ficará claro para aqueles versados na técnica" que os dados re-lativos à saúde e manutenção de animais podem ser agrupados de diversasmaneiras dependendo da fonte ou intenção do coletor de dados e, portantoqualquer agrupamento aqui não pretende ser limitante.
A menos que definido de outra maneira, todos os termos técni-cos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que o comumentecompreendido pelo versado na arte da biologia molecular. Embora métodose materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser u-sados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais ade-quados são descritos aqui.
Em uma modalidade em que o gene de interesse é FABP bovi-no, a seqüência de nucleotídeo de FABP bovino pode ser selecionada a par-tir de, mas não-limitada a, seqüência correspondente ao número de acessodo GenBank AAFC01136716 (FIGURA 4, SEQ ID NO: 1) ou um fragmentodessa ou uma região do genoma bovino que compreenda essa seqüência.
A presente invenção, portanto, fornece ácidos nucléicos isoladosque podem hibridizar especificamente à seqüência de nucleotídeos corres-pondente ao No. de Acesso do GenBank AAFC01136716 (FIGURA 4, SEQID NO: 1) ou o complemento dessa e que compreende o sítio polimórficoque corresponde a uma substituição de um G por C na posição de nucleotí-deo 7516 do gene FABP4 e uma substituição de G por C na posição 7713do gene FABP4.
O SNP vantajoso na presente invenção está associado com cer-tas características hereditárias e economicamente valiosas em relação aqualidade da carne de bovinos. Portanto, é um objetivo da presente inven-ção determinar o genótipo de um dado animal de interesse como definidopelo SNP do lócus de FABP de acordo com a presente invenção. Também écontemplado que o genótipo do(s) animal(is) pode ser definido por SNPsadicionais dentro do gene FABP ou dentro de outros genes identificadoscom características desejáveis ou outras características e em particular porum painel ou painéis de SNPs.
Há vários métodos conhecidos na técnica para determinar a se-qüência de DNA em uma amostra, e para identificar se uma dada amostrade DNA contém um SNP particular. Qualquer uma de tais técnicas conheci-das pode ser usada no desempenho dos métodos da presente invenção.
Os métodos da presente invenção permitem que animais comcertas características hereditárias economicamente valiosas sejam identifi-cados com base na presença de SNPs ém seus genomas e particularmentecom um SNP localizado dentro do gene FABP. Os métodos ainda permitem,pelos métodos auxiliados por computador da invenção, correlacionar as ca-racterísticas associadas ao SNP com outros dados pertinentes ao bem-estare capacidade produtiva dos animais ou grupo de animais.
Para determinar o genótipo de um dado animal de acordo comos métodos da presente invenção, é necessário obter uma amostra de DNAgenômico daquele animal. Tipicamente, esta amostra de DNA genômico se-rá obtida a partir de uma amostra de tecido ou células retiradas daquele a-nimal. Uma amostra de tecido ou célula pode ser retirada de um animal emqualquer momento do período de vida de um animal, mas antes que a iden-tidade da carcaça seja perdida. A amostra de tecido pode compreender pêlo,incluindo raízes, pele, osso, esfregaços bucais, sangue, saliva, leite, sêmen,embriões, músculo ou quaisquer órgãos internos. Nos métodos da presenteinvenção, a fonte da amostra de tecido e assim também a fonte da amostrade ácido nucléico de teste, não é crítica. Por exemplo, o ácido nucléico deteste pode ser obtido de células de dentro de um fluido corporal do animal,ou de células que constituem um tecido corporal do animal. O fluido corporalparticular a partir do qual as células são obtidas também não é crítico para apresente invenção. Por exemplo, o fluido corporal pode ser selecionado dogrupo que consiste em sangue, ascite, fluido pleural e fluido espinhal. Alémdisso, o tecido corporal particular a partir do qual as células são obtidas tam-bém não é crítico para a presente invenção. Por exemplo, um tecido corporalpode ser selecionado do grupo que consiste em pele, tecido endometrial,uterino e cervical. Tanto tecidos normais como tumorais podem ser usados.
Tipicamente, a amostra de tecido é rotulada com um número deidentificação ou outro indicador que relacione a amostra ao animal individualdo qual a amostra foi retirada. A identidade da amostra vantajosamentepermanece constante através dos métodos e sistemas da invenção garan-tindo dessa maneira a integridade e a continuidade da amostra durante aextração e análise. Alternativamente, os indicadores podem ser alterados deuma maneira regular que assegure que os dados, e qualquer outro dado as-sociado, possam ser relacionados de volta ao animal a partir do qual o dadofoi obtido.
A quantidade/tamanho da amostra necessária é conhecida poraqueles versados na técnica e, por exemplo, pode ser determinada pelasetapas subseqüentes usadas no método e sistema da invenção e nos méto-dos específicos de análise usados. Idealmente, o tamanho/volume da amos-tra de tecido coletado deve ser tão consistente quanto possível dentro dotipo de amostra e a espécie do animal. Por exemplo, para gado, exemplosnão-limitantes de tamanhos de amostra/métodos incluem carne não-gordurosa: 0,0002 gm-10,0 gm; pele: 0,0004 gm-10,0 gm; raízes de pêlo:pelo menos uma e vantajosamente mais do cinco; esfregaços bucais: 15 a20 segundos de raspagem com pressão moderada na área entre o lábio ex-terno e gengiva usando, por exemplo, uma escova citológica; osso: 0,0002gm-10,0 gm; sangue: 30 μΙ a 50 ml.
Geralmente, a amostra de tecido é colocada em um recipienteque é rotulado usando um sistema de numeração que fornece um códigoque corresponde ao animal, por exemplo ao selo da orelha do animal. Con-seqüentemente, o genótipo de um animal particular é facilmente rastreável aqualquer momento. O equipamento e/ou recipiente de amostragem pode serfornecido ao fazendeiro, ao àbatedouro ou ao revendedor. O equipamentode amostragem vantajosamente retira uma amostra consistente e reprodutí-vel dos animais individuais enquanto evita simultaneamente qualquer con-taminação cruzada de tecido. Conseqüentemente, o tamanho e volume deamostras de tecido derivadas de animais individuais deverão ser consistentes.
DNA pode ser isolado a partir de tecidos/células por técnicasconhecidas por aqueles versados na técnica (veja, por exemplo, PatentesU.S Nos. 6.548.256 e 5.989.431; Hirota et ai (1989) Jinrui Idengaku Zasshir34:217-23 e John et aí. (1991) Nucleic Acids Res. 19:408, cujas descriçõesestão incorporadas por referência em suas totalidades). Por exemplo, DNAde alto peso molecular pode ser purificado a partir de células ou tecidos u-sando extração com proteinase K e precipitação com etanol. Entretanto,DNA pode ser extraído de um espécime de animal usando qualquer outrométodo adequado conhecido na técnica.
Em uma modalidade, ã presença ou ausência do SNP de qual-quer um dos genes da presente invenção pode ser determinada pelo se-qüenciamento da região da amostra de DNA genômico que abrange o lócuspolimórfico. Vários métodos de seqüenciamento de DNA genômico são co-nhecidos na técnica e qualquer um de tais métodos pode ser usado, veja,por exemplo, Sambrook et al (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manu-al, 3ã Ed. Cold Spring Harbor Press. Por exemplo, como descrito abaixo, umfragmento de DNA que abrange a localização do SNP de interesse pode seramplificado usando a reação em cadeia da polimerase. A região amplificadade forma de DNA pode então ser seqüenciada usando qualquer método co-nhecido na técnica, por exemplo, usando um seqüenciador automático deácido nucléico. A detecção de um dado SNP pode então ser realizada usan-do a hibridização de sondas ou usando métodos de amplificação baseadosem PCR. Tais métodos são descritos em mais detalhes abaixo.
Os métodos da presente invenção podem usar oligonucleotídeosúteis como iniciadores para amplificar seqüências específicas de ácidos nu-cléicos do gene FABP4, vantajosamente da região que abrange um SNP deFABP4. Tais fragmentos devem ser longos o suficiente para permitir o ane-lamento específico ou hibridização à amostra de ácido nucléico. As seqüên-cias tipicamente terão cerca de 8 a cerca de 44 nucleotídeos de extensão.Seqüências mais longas, por exemplo, de cerca de 14 a cerca de 50, podemser vantajosas para certas modalidades. O desenho de iniciadores é bemconhecido pelo versado na técnica.
Moléculas de ácido nucléico inventivas incluem moléculas deácido nucléico que têm pelo menos 70% de identidade ou homologia ou si-milaridade com um gene FABP4 ou sondas ou iniciadores derivados-desse,-tal como pelo menos 75% de identidade ou homologia ou similaridade, prefe-rivelmente pelo menos 80% de identidade ou homologia ou similaridade,mais preferivelmente pelo menos 85% de identidade ou homologia ou simila-ridade, tal como pelo menos 90% de identidade ou homologia ou similarida-de, mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade ou homologia ousimilaridade, tal como pelo menos 97% de identidade ou homologia ou simi-laridade. A similaridade, homologia ou identidade da seqüência de nucleotí-deos pode ser determinada usando o programa "Align" de Myers & Miller("Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS 4, 11-17, 1988) e disponívelem NCBI. Alternativamente ou adicionalmente, os termos "similaridade" ou"identidade" ou "homologia", por exemplo, com relação a uma seqüência denucleotídeo, pretende indicar a medida quantitativa de homologia entre duasseqüências. O percentual de homologia de seqüência pode ser calculadocomo (Νref - NdifTlOO/Nref, em que Ndif é o número total de resíduos não i-dênticos nas duas seqüências quando alinhadas e em que Nre^ é o númerode resíduos em uma das seqüências. Então, a seqüência de DNA AGT-CAGTC terá uma similaridade de seqüência de 75% com a seqüência AAT-CAATC (Nref = 8; Ndif = 2). Alternativamente ou adicionalmente, "similarida-de" com relação a seqüências refere-se ao número de posições com nucleo-tídeos idênticos dividido pelo número de nucleotídeos na mais curta das du-as seqüências em que o alinhamento das duas seqüências pode ser deter-minado de acordo com o algoritmo de Wilbur e Lipman (Wilbur & Lipman,1983 PNAS USA 80:726), por exemplo, usando tamanho de janela de 20nucleotídeos, tamanho da palavra de 4 nucleotídeos e penalidade por inter-valo de 4 e análise e interpretação auxiliadas por computador dos dados daseqüência incluindo o alinhamento pode ser realizada convenientementeusando programas comercialmente disponíveis (por exemplo, Intelligene-tics™ Suite, Intelligenetics Inc. CA). Quando seqüências de RNA são ditassimilares ou têm um grau de identidade de seqüência com seqüências deDNA, a timidina (T) na seqüência de DNA é considerada igual a uracila (U)na seqüência de RNA.
Uma sonda ou iniciador pode ter uma fita de pelo menos 8, pre-ferivelmente pelo menos 10, mais preferivelmente pelo menos 12, 13, 14 ou15, tal como pelo menos 20, por exemplo, pelo menos 23 ou 25, por exem-plo, pelo menos 27 ou 30 nucleotídeos em um gene de FABP que são úni-cos para um gene de FABP. Tal como para iniciadores ou sondas para PCRou hibridização e extensões ótimas para esses, também é feita referência aKajimura et ai., GATA 7(4):71 -79 (1990).
Seqüências de RNA dentro do escopo da invenção são deriva-das de seqüências de DNA, com timidina (T) na seqüência de DNA sendoconsiderada igual a uracila (U) nas seqüências de RNA.
Os oligonucleotídeos podem ser produzidos por um processo deprodução convencional para oligonucleotídeos em geral. Eles podem serproduzidos, por exemplo, por um processo de síntese química ou por umprocesso microbiano que faz uso de um vetor de plasmídeo, um vetor defago ou semelhantes. Além disso, é adequado usar um sintetizador de ácidonucléico.
Para marcar um nucleotídeo com o corante fluorescente, um dosmétodos de marcação convencionalmente conhecidos pode ser usado.(Tyagi & Kramer (1996) Nature Biotechnology 14: 303-308; Schofield etal. (1997) Appl. and Environ. Microbiol. 63 : 1 143-1 147; Proudnikov & Mirzabe-kov (1996) Nucl. Acids Res. 24: 4532-4535). Alternativamente, o oligonucleo-tídeo pode ser rotulado com um rótulo radioativo por exemplo, 3H, 125I, 35S,14C, 32P, etc. Métodos de marcação bem conhecidos estão descritos por e-xemplo em Sambrook et ai (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3ã ed., Cold Spring Harbor Press. O rótulo é acoplado diretamente ou indire-tamente a um componente do oligonucleotídeo de acordo com métodos bemconhecidos na técnica. Cromatografia de fase reversa ou semelhante usadapara fornecer uma sonda de ácido nucléico para uso na presente invençãopode purificar o oligonucleotídeo sintetizado rotulado com um rótulo. Umaforma vantajosa de sonda é aquela rotulada com um corante fluorescente naterminação 3' ou 5' e que contém G ou C como a base na terminação rotula-da. Se a terminação 5' está rotulada e a terminação 3' não está rotulada, ogrupo OH no átomo de C na posição 3' da ribose ou desoxirribose da termi-nação 3' pode ser modificado com um grupo fosfato ou semelhante emboranenhuma limitação seja imposta a esse respeito.
Durante a hibridização do ácido nucléico alvo com as sondas,condições estringentes podem ser utilizadas, vantajosamente junto com ou-tras condições que afetam a estringência, para auxiliar na hibridização. Adetecção por ruptura diferencial é particularmente vantajosa para reduzir oueliminar erros de hibridização entre sondas e alvo e para promover hibridiza-ção mais eficaz. Em outro aspecto ainda, condições de estringência podemser variadas durante a determinação da estabilidade do complexo de hibridi-zação a fim de determinar mais precisamente ou rapidamente se um SNPestá presente na seqüência alvo.
Um método para determinar o genótipo no lócus do gene poli-mórfico abrange obter uma amostra de ácido nucléico, hibridizar a amostrade ácido nucléico com uma sonda e romper a hibridização para determinar onível de energia de ruptura necessário em que a sonda tem uma energia deruptura diferente para um alelo quando comparado com outro alelo. Em umexemplo, pode haver uma energia de ruptura menor, por exemplo, tempera-tura de fusão, para um alelo que têm um resíduo de citosina em um lócuspolimórfico, e uma energia necessária maior para um alelo com um resíduodiferente naquele lócus polimórfico. Isso pode ser obtido onde a sonda tem100% de homologia com um alelo (uma sonda que pareia perfeitamente),mas tem um único não pareamento com o alelo alternativo. Já que a sondaque pareia perfeitamente está ligada mais fortemente ao DNA alvo do que ásonda não-pareada, ele necessita de mais energia para causar a dissocia-ção da sonda hibridizada.
Em uma etapa adicional do método acima, uma segunda sonda("âncora") pode ser usada. Geralmente a sonda âncora não é específica pa-ra nenhum alelo, mas hibridiza independentemente de qual nucleotídeo estápresente no lócus polimórfico. A sonda âncora não afeta a energia de ruptu-ra necessária para dissociar o complexo de hibridização mas, ao contrário,contém um rótulo complementar para usar com a primeira sonda ("sensor").
A estabilidade da hibridização pode ser influenciada por váriosfatores, incluindo termorregulação, regulação química assim como controleeletrônico de estringência, tanto sozinhos quanto em combinação com ou-tros fatores listados. Através do uso de condições de estringência, em am-bas ou qualquer uma das etapas de hibridização ao alvo ou de estringênciado oligonucleotídeo sensor, a finalização rápida do processo pode ser obti-da. É desejável obter hibridização apropriadamente indexada do DNA alvopara se atingir o número máximo de moléculas em um sítio de teste com umcomplexo de hibridização preciso. Como forma de exemplo, com o uso deestringência, a etapa inicial de hibridização pode ser completada em 10 mi-nutos ou menos, mais vantajosamente em cinco minutos ou menos e o maisvantajosamente em dois minutos ou menos. De modo geral, o processo ana-lítico pode ser completado em menos de meia hora.
Em uma maneira, o complexo de hibridização é rotulado e a eta-pa de determinação da quantidade de hibridização inclui detectar as quanti-dades de complexo de hibridização rotulado nos sítios de teste. O método eequipamento de detecção podem incluir, mas não estão limitados a, imagemóptica, imagem eletrônica, imagem com uma câmera CCD1 imagem ópticaintegrada e espectrometria de massa. Além disso, a quantidade de sondarotulada ou não-rotulada ligada ao alvo pode ser quantificada. Tal quantifica-ção pode incluir análise estatística. A porção rotulada do complexo pode sero alvo, o estabilizador, a sonda ou o complexo de hibridização como um to-do. A marcação pode ser por uma marcação fluorescente selecionada dogrupo, mas não-limitada a, Cy3, Cy5, Bodipy Texas Red, Bodipy Far Red,Lucifer Yellow1 Bodipy 6301650-X, Bodipy R6G-X e 5-CR 6G. Marcação co-lorimétrica, marcação bioluminescente e/ou marcação quimioluminescentepodem ainda realizar a marcação. A marcação ainda pode incluir transferên-cia de energia entre moléculas no complexo de hibridização por análise deperturbação, extinção, transporte de elétron entre moléculas doadoras e a-ceptoras, o último dos quais pode ser facilitado por complexos de hibridiza-ção combinada de filamento duplo. Opcionalmente, se o complexo de hibri-dização não está rotulado, a detecção pode ser obtida pela medida de con-dutância diferencial entre DNA de filamento duplo e DNA não-filamento du-pio. Além disso, a detecção direta pode ser obtida por interferometria ópticabaseada em silicone poroso ou por espectrometria de massa. Usando es-pectrometria de massa não é necessário um rótulo fluorescente ou outro ró-tulo. A detecção é obtida por níveis extremamente altos de resolução demassa obtidos por medida direta, por exemplo, pelo tempo de vôo (TOF) oupor ionizaçâo por spray de elétrons (ESI). Onde a espectrometria de massaé contemplada, as sondas que tem seqüência de ácido nucléico de 50 basesou menos são vantajosas.
O rótulo pode ser amplificado e pode incluir, por exemplo, DNAramificado ou dendrítico. Se o DNA alvo está purificado, ele pode ser não-amplificado ou amplificado. Além disso, se o alvo purificado é amplificado e aamplificação é um método exponencial, ele pode ser, por exemplo, DNAamplificado por PCR ou DNA amplificado por amplificação por transferênciade filamento (SDA). Métodos lineares de amplificação de DNA tais como cír-culo rolante ou "runoff" transcricional também podem ser usados.
Onde for desejável amplificar um fragmento de DNA que com-preende um SNP de acordo com a presente invenção, os iniciadores de sen-tido direto e de sentido reverso podem ter filamentos contíguas de cerca de8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,29, 30 ou qualquer outra extensão até e incluindo cerca de 50 nucleotídeosde extensão. As seqüências às quais os iniciadores de sentido direto e desentido reverso anelam estão localizadas vantajosamente em cada lado daposição do nucleotídeo particular que é substituído no SNP a ser amplificado.
Um rótulo detectável pode ser incorporado em um ácido nucléicodurante pelo menos um ciclo de uma reação de amplificação. Meios espec-troscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, elétricos, ópticos ouquímicos podem detectar tais rótulos. Rótulos úteis na presente invençãoincluem corantes fluorescentes (por exemplo, isotiocianato de fluoresceína,Texas red, rodamina, e similares), radiorótulos (por exemplo, 3H, 125I1 35S,14C, 32P, et.), enzimas (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, fosfata-se alcalina, etc.), rótulos colorimétricos tais como ourocoloidalouesferas-devidro ou plástico colorido (por exemplo, poliestireno, polipropileno, látex,etc.). O rótulo é acoplado diretamente ou indiretamente a um componente doensaio de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Como indicadoacima, uma grande variedade de rótulos é usada, com a escolha do rótulodependendo da sensibilidade necessária, facilidade de conjugação com ocomposto, requisitos de estabilidade, instrumentação disponível e disponibi-lidade de estoque. Rótulos não radioativos são freqüentemente acopladospor meios indiretos. Polimerases também podem incorporar nucleotídeosfluorescentes durante a síntese de ácidos nucléicos.
Reagentes que permitem o seqüenciamento de produtos de rea-ção podem ser utilizados aqui. Por exemplo, nucleotídeos de terminação decadeia serão freqüentemente incorporados em um produto de reação duran-te um ou mais ciclos de uma reação. Kits comerciais que contêm reagentesmais tipicamente usados para esses métodos de seqüenciamento de DNAestão disponíveis e são amplamente usados. Métodos de digestão com exo-nuclease por PCR para seqüenciamento de DNA também podem ser usa-dos. Vários métodos de seqüenciamento de DNA genômico são conhecidosna técnica e qualquer um de tais métodos pode ser usado, veja por exemplo,Sambrook et ai (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3- ed., ColdSpring Harbor Press. Por exemplo, como descrito abaixo, um fragmento deDNA que ocupa a localização do SNP de interesse pode ser amplificado u-sando a reação em cadeia da polimerase ou alguma outra reação de amplifi-cação cíclica mediada por polimerase. A região amplificada de DNA podeentão ser seqüenciada usando qualquer método conhecido na técnica. Van-tajosamente, o seqüenciamento do ácido nucléico é por métodos automati-zados (revisado por Meldrum, (2000) Genome Res. 10: 1288-303, cuja des-crição está incorporada por referência em sua totalidade), por exemplo u-sando um Beckman CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman CoulterInstruments, Inc.). Métodos para seqüenciamento de ácidos nucléicos inclu-em, mas não são limitados a, seqüenciamento automático de DNA fluores-cente (veja, por exemplo, Watts & MacBeath, (2001) Methods Mol Biol. 167:153-70 e MacBeath et ai. (2001) Methods Mol Biol. 167: 119-52)T-eletro-forese capilar (veja, por exemplo, Bosserhoff et al. (2000) Comb Chem HighThroughput Screen. 3: 455-66), chips de seqüenciamento de DNA (veja, porexemplo, Jain, (2000) Pharmacogenomics. 1: 289-307), espectrometria demassa (veja, por exemplo, Yates, (2000) Trends Genet. 16: 5-8), pirosse-qüenciamento (veja, por exemplo, Ronaghi, (2001) Genome Res. 11 : 3-1 I),e eletroforese em gel de camada ultra-fina (veja, por exemplo, Guttman &Ronai, (2000) Electrophoresis. 21 : 3952-64), cujas descrições estão incor-poradas por referência em suas totalidades. O seqüenciamento também po-de ser feito por uma empresa comercial. Exemplos de tais empresas inclu-em, mas não são limitadas a, University of Geórgia Molecular Genetics Ins-trumentation Facility (Athens, Geórgia) ou SeqWright DNA TechnologiesServices (Houston, Texas).
Uma sonda específica para SNP também pode ser usada nadetecção do SNP em seqüências específicas de ácido nucléico amplificadodo gene alvo, tais como os produtos amplificados por PCR gerados usandoos iniciadores descritos acima. Em certas modalidades, essas sondas espe-cíficas para SNP consistem em fragmentos de oligonucleotídeos. Vantajo-samente, os fragmentos são extensos o suficiente para fornecer hibridizaçãoespecífica com a amostra de ácido nucléico. O uso de uma sonda de hibridi-zação de extensão entre 10 e 50 nucleotídeos permite a formação de umamolécula dúplex que tanto é estável quanto seletiva. Moléculas que têm se-qüências complementares por extensões maiores do que 12 bases de com-primento são geralmente vantajosas, a fim de aumentar a estabilidade e se-Ietividade do híbrido, e dessa maneira melhorar a qualidade e o grau dasmoléculas híbridas particulares obtidas. Geralmente será preferido desenharmoléculas de ácido nucléico que tem extensões de 16 a 24 nucleotídeos ouaté mais longas onde desejado. Uma região de nucleotídeo sinalizador (tag)pode ser incluída, como na extremidade 5' do iniciador que pode fornecerum sítio para o qual um iniciador de seqüenciamento de nucleotídeo podehibridizar para facilitar o seqüenciamento de múltiplas amostras de PCR.
A seqüência da sonda deve ocupar a posição particular do nu-cleotídeo que pode ser substituído-no SNP particular a ser detectado.Vanta-josamente, duas ou mais "sondas alelo-específicas" diferentes podem serusadas para análise de um SNP, uma primeira sonda alelo-específica paradetecção de um alelo e uma segunda sonda alelo-específica para detecçãodo alelo alternativo.
Será compreendido que essa invenção não é limitada aos inicia-dores e sondas particulares descritos aqui e pretende abranger pelo menosseqüências de ácido nucléico que são hibridizáveis com a seqüência de nu-cleotídeos descrita aqui, o complemento ou fragmento dessa, oü são análo-gos de seqüência funcionais dessas seqüências. Também é contempladoque uma característica particular de um animal pode ser determinada pelouso de um painel de SNPs associados com aquela característica. Várias ca-racterísticas economicamente relevantes podem ser caracterizadas pelapresença ou ausência de um ou mais SNPs e por uma pluralidade de SNPsem genes diferentes. Um ou mais painéis de SNPs podem ser usados nosmétodos da invenção para definir o perfil fenotípico do indivíduo animal.
Seqüências homólogas (isto é, ácidos nucléicos derivados deoutras espécies) ou outras seqüências relacionadas (por exemplo, parólo-gas) podem ser obtidas sob condições de hibridização padrão ou estringentecom toda ou uma porção da seqüência em particular como uma sonda u-sando métodos bem conhecidos na técnica para hibridização e clonagem deácido nucléico.
Os rótulos genéticos, sondas desses, métodos e kits da inven-ção também são úteis em um programa de procriação para selecionar paraprocriação aqueles animais que tem fenótipos desejáveis para várias carac-terísticas economicamente importantes, tais como rendimento e qualidademelhoradas da carne, em particular a maciez da carne. A seleção contínua eprocriação de animais, tais como animais de criação, que são pelo menosheterozigotos e vantajosamente homozigotos para os alelos desejáveis dossítios polimórficos do gene FABP associados com características economi-camente relevantes de crescimento, consumo de alimento, eficiência e valorda carcaça, poderia levar a uma raça, linhagem ou população que tem nú-meros maiores de descendentes com as características economicamenterelevantes de crescimento, ingestão de alimento, eficiência e valor da carca-ça. Assim, os SNPs de FABP da presente invenção podem ser usados comouma ferramenta de seleção.
Fenótipos desejáveis incluem, mas não são limitados a consumode alimento, taxa de crescimento, peso corporal, composição e valor da car-caça e produção de leite. Características específicas da carcaça com fenóti-pos desejáveis incluem, mas não são limitados a, valor adicional da carcaça(valor adicional carc, $), ganho médio diário (ADG, Ib/d), espessura da gor-dura dorsal (BFAT, in), peso vivo calculado (peso vivo calc, Ib), grau de ren-dimento calculado (cYG), dias de alimentação (DOF, d), rendimento da car-caça (DP, %), consumo de matéria seca (DMI, Ib), consumo de matéria secapor dia de alimentação (DMI por DOF, Ib/d), peso da carcaça quente (HCW,Ib), valor do peso da carcaça quente (valor HCV, $), conteúdo de gorduraintramuscular (IMF, %), escore de marmoreio (MBS, de 10 a 99), escore demarmoreio dividido pelos dias de alimentação (MBS/DOF), grau de qualida-de, menor ou igual ao selecionado versus maior ou igual ao escolhido (QG,< Se vs, >Ch), área de olho de lombo (REA, in2), área de olho de lombo porcem HCW de peso (REA/cwt HCW, in2/100 Ib), peso da carcaça quente(HCW) e profundidade da gordura subcutânea (SFD).
Um aspecto da presente invenção fornece um grupo de animaise métodos para gerenciar a produção de animais de criação que compreen-de um grupo de animais de criação tais como gado de acordo com o genóti-po como definido por painéis de SNPs, cada painel compreendendo pelomenos um SNP, um ou mais dos quais estão no gene FABP da presenteinvenção. Outros SNPs que podem ser incluídos nos painéis de SNPs inclu-em, mas não são limitados a, SNPs encontrados no gene da calpastatina,gene GHR, gene da grelina, gene da leptina, gene NPY, gene ob, geneTFAM, gene UASMS1, gene UASMS2, gene UASMS3 e/ou gene UCP2. Aseleção genética e os métodos de agrupamento da presente invenção po-dem ser usados em conjunto com outros métodos convencionais de agru-pamento fenotípico tais como agrupar animais por características visíveistais como peso, tamanho esquelético, características da raça e similares. Osmétodos da presente invenção fornecem gado produtor que tem característi-cas hereditárias melhoradas, e que pode ser usado para otimizar o desem-penho de rebanhos de animais de criação em áreas tais como procriação,consumo de alimento, qualidade da carcaça/carne e produção de leite. Apresente invenção fornece métodos de rastrear animais de criação para de-terminar aqueles que mais provavelmente desenvolverão uma condição cor-poral desejada pela identificação da presença ou ausência de um ou maispolimorfismos de gene correlacionados com a qualidade da carne.
Como descrito acima, e nos Exemplos, há várias característicasfenotípicas com as quais os SNPs da presente invenção podem estar asso-ciados. Cada uma das características fenotípicas e genéticas podem ser tes-tadas usando os métodos descritos nos Exemplos ou usando quaisquer mé-todos adequados conhecidos na técnica. Usando os métodos da invenção,um fazendeiro ou um operador de animais confinados, ou semelhante, podeagrupar o gado de acordo com a tendência genética de cada animal parauma característica desejável tais como taxa de crescimento, consumo dealimento ou comportamento alimentar, como determinado pelo genótipo deSNP. O gado é testado para determinar homozigosidade ou heterozigozida-de com relação aos alelos de SNP de um ou mais genes de maneira queeles possam ser agrupados tal que cada curral contenha gado com genóti-pos semelhantes. Cada curral de animais é então alimentado e mantidonormalmente de uma maneira e por um tempo determinado pelo operadorde confinamento e então abatido.
Os dados genotípicos individuais derivados de um painel ou depainéis de SNP para cada animal ou um rebanho de animais podem ser re-gistrados e associados com vários outros dados do animal, por exemplo,informação sobre saúde, linhagem, condições de criação, histórico de vaci-nação, registros do rebanho, dados de segurança alimentar subseqüentes esimilares. Tais informações podem ser transferidas para uma agência gover-namental para fornecer a rastreabilidade de um animal ou produto de carne,ou pode servir como a base para informação de procriação, alimentação emercado. Uma vez quê os dados tenharrrou não teηham s ido~assocrados—com outros dados, os dados são armazenados em uma base de dados a-cessível, tal como, mas não-limitada a base de dados de computador ou ummicrochip implantado no animal. Os métodos da invenção podem forneceruma análise dos dados de entrada que podem ser comparados com os pa-râmetros desejados pelo operador. Esses parâmetros incluem, mas não sãolimitados a, metas de procriação, alvos de oviposição, níveis de vacinaçãode um rebanho. Se o desempenho ou propriedades dos animais se desviamdas metas desejadas, os métodos baseados em computador podem desen-cadear um alerta para permitir ao operador ajustar as doses de vacinação,medicações, alimentação, etc de acordo.
Os resultados da análise fornecem dados que são associadoscom o animal individual ou com o rebanho, em todo ou em parte, a partir doqual uma amostra foi retirada. Os dados são mantidos então em uma basede dados acessível, e podem ou não ser associados com outros dados da-quele animal em particular ou de outros animais.
Os dados obtidos a partir de animais individuais podem ser ar-mazenados em uma base de dados que pode ser integrada ou associadacom e/ou cruzada com outras bases de dados. A base de dados junto comos dados associados fornece informações sobre o animal individual a seremconhecidas através de cada estágio da vida do animal, isto é, da concepçãoaté o consumo do produto do animal.
Os dados acumulados e a combinação dos dados genéticos comoutros tipos de dados do animal fornecem acesso a informação sobre a li-nhagem, identificação do rebanho, informações de saúde incluindo vacina-ções, exposição a doenças, localização do confinamento, dieta e alteraçõesde propriedade. Informações tais como datas e resultados de testes de diag-nóstico e de rotina são facilmente armazenadas e alcançadas. Tal informa-ção seria especialmente valiosa para empresas, particularmente aquelasque procuram linhagens de procriação superiores.
Cada animal pode ser fornecido com um identificador único. Oanimal pode ser rotulado, como em programas de rastreamento tradicionaisou ter chips de computador implantados que fornecem dados armazenadose legíveis ou provido com qualquer outro método de identificação que asso-cie o animal com seu identificador único.
A base de dados que contém os resultados de genótipo baseadoem SNP para cada animal ou os dados de cada animal pode ser associadaou ligada a outra bases de dados contendo dados, por exemplo, que podemser úteis na seleção de características para agrupamento ou sub-grupamento de um animal. Por exemplo, e não para limitação, dados perti-nentes a animais que têm protocolos de vacinação ou medicação particula-res podem opcionalmente ainda ser ligados com dados pertencentes a ani-mais que têm alimentação a partir de certas fontes alimentícias. A habilidadede refinar um grupo de animais é limitada apenas pelas características pro-curadas e as bases de dados que contêm informação relacionada àquelascaracterísticas.Bases de dados que podem ser utilmente associadas com osmétodos da invenção incluem, mas não se limitam a, dados específicos oucientíficos em geral. Dados específicos incluem, mas não se limitam a, li-nhagens de procriação, ancestrais, parceiros de cruzamento (dames), e si-milares, genótipos de outros animais, incluindo se outros animais específicospossuem ou não genes específicos, incluindo elementos genéticos transgê-nicos, localização de animais que partilham características genéticas idênti-cas ou similares e similares. Dados gerais incluem, mas não são limitados a,dados científicos tais como quais genes codificam características de quali-dade específicas, dados associados à raça, dados de alimentação, tendên-cias de procriação e similares.
Um método da presente invenção inclui fornecer ao proprietárioou comprador do animal um equipamento de coleta de amostra, tal como"swabs" e adesivos úteis para coletar amostras a partir das quais dados ge-néticos podem ser obtidos. Vantajosamente, a embalagem é codificada comum selo de código de barras. Os adesivos são codificados com os mesmossímbolos de identificação, vantajosamente com um selo de código de barrascoincidente. Opcionalmente, a embalagem contém meios para enviar os a-desivos para um laboratório para análise. A embalagem opcional também écodificada com símbolos de identificação, vantajosamente com um selo decódigo de barras.
O método opcionalmente inclui um sistema em que uma contade base de dados é estabelecida mediante pedido do equipamento de amos-tragem. O identificador da conta da base de dados corresponde aos símbo-los de identificação dos adesivos e da embalagem. Na remessa do equipa-mento de amostragem em cumprimento ao pedido, os símbolos de identifi-cação são registrados em uma base de dados.
Vantajosamente, o identificador é um selo de código de barrasque é escaneado quando os adesivos são enviados. Quando os adesivossão devolvidos para o estabelecimento de teste, o identificador é registradonovamente e comparado com a informação previamente registrada na basede dados na remessa do frasco para o comprador. Uma vez que a genotipa-gem é terminada, a informação é registrada na base de dados e codificadacom um identificador único. Os resultados do teste também são fornecidosao comprador ou proprietário do animal.
Os dados armazenados na base de dados de genótipos podemser integrados ou comparados com outros dados ou bases de dados com opropósito de identificar animais com base em tendências genéticas. Outrosdados ou bases de dados incluem, mas não se limitam àqueles que contêminformação relacionada a teste de DNA baseado em SNP1 vacinação, pro-grama de pré-condicionamento Sure Health, resultados de gravidez e cio,níveis hormonais, segurança/contaminação de alimento, contagem de célu-las somáticas, ocorrência de mastite, resultados de teste de diagnóstico, ní-veis de proteína no leite, gordura do leite, estado de vacinação, registros desaúde, níveis de minerais, níveis de minerais traço, desempenho do rebanhoe similares.
A presente invenção, portanto abrange métodos auxiliados porcomputador para rastrear os históricos de procriação e veterinário de ani-mais de criação que abrange o uso de um sistema baseado em computadorque compreende um computador programado que compreende um proces-sador, um sistema de armazenamento de dados, um dispositivo de entrada eum dispositivo de saída, e que compreende as etapas de gerar um perfil deum animal de criação pela inserção no computador programado, através dodispositivo de entrada, dados do genótipo do animal, em que o genótipo po-de ser definido por um painel de pelo menos dois polimorfismos de nucleotí-deo único que predizem pelo menos uma característica física do animal, in-serir no computador programado, através do dispositivo de entrada, dadossobre o bem-estar do animal, correlacionar os dados de bem-estar inseridoscom o perfil fenotípico do animal usando o processador e o sistema de ar-mazenamento de dados, e emitir um perfil do animal ou grupo de animaispara o dispositivo de saída.
As bases de dados e a análise desses serão acessíveis paraaqueles a quem o acesso foi fornecido. O acesso também pode ser forneci-do através de direitos de acesso ou por subscrição para partes específicasdos dados. Por exemplo, a base de dados pode ser acessada pelos proprie-tários do animal, o local de teste, a entidade que fornece a amostra para olocal de teste, funcionários do local de confinamento e veterinários. Os da-dos podem ser fornecidos em qualquer forma tal como por acesso a umwebsite, fax, email, correspondência por carta, atendimento eletrônico portelefone, ou outros métodos de comunicação. Esses dados também podemser codificados em um dispositivo de armazenamento portátil, tal como ummicrochip que pode ser implantado no animal. Vantajosamente, a informa-ção pode ser lida e nova informação adicionada sem remover o microchip doanimal.
A presente invenção compreende sistemas para realização dosmétodos aqui descritos. Tais sistemas compreendem dispositivos, tais comocomputadores, conexões de internet, servidores, e dispositivos de armaze-namento para dados. A presente invenção também fornece um método detransmitir os dados que compreendem a transmissão da informação a partirde tais métodos discutidos aqui ou etapas desses, por exemplo, através detelecomunicação, telefone, vídeo conferência, comunicação em massa, porexemplo, apresentação tal como uma apresentação por computador (porexemplo, POWERPOINT), internet, email, comunicação documentada talcomo programas de computador (por exemplo, WORD) e similares.
Sistemas da presente invenção podem compreender um módulocoletor de dados, que inclui um coletor de dados para coletar dados de umanimal ou embrião e transmitir os dados a um módulo de análise de dados,uma interface de rede para receber os dados do módulo de análise de da-dos, e opcionalmente ainda adaptada para combinar múltiplos dados de umou mais animais individuais e transmitir os dados através de rede para ou-tros locais, ou para um dispositivo de armazenamento.
Mais particularmente, os sistemas da presente invenção com-preendem um módulo coletor de dados, um módulo de análise de dados,uma interface de rede para receber dados do módulo de análise de dados, eopcionalmente ainda adaptados para combinar múltiplos dados de um oumais animais individuais, e transmitir os dados através de uma rede paraoutros locais, e/ou para um dispositivo de armazenamento. Por exemplo, osdados coletados pelo módulo coletor de dados leva a uma determinação daausência ou presença de um SNP de um gene do animal ou embrião e, porexemplo, tal dado é transmitido quando o regime alimentar do animal é pla-nejado.
Em uma modalidade onde os dados são implantados em um mi-crochip em um animal particular, o fazendeiro pode otimizar a eficiência domanuseio do rebanho por que o fazendeiro está apto a identificar a predis-posição genética de um animal individual assim como os tratamentos dopassado, presente e futuro (por exemplo, vacinações e visitas do veteriná-rios). A invenção, portanto, também fornece acesso a outras bases de da-dos, por exemplo, dados do rebanho que se relacionam a testes genéticos edados realizados por outros, pela conexão de dados a outros locais. Portan-to, dados de outras bases de dados podem ser transmitidos para a base dedados central da presente invenção através de uma interface de rede parareceber dados a partir do módulo de análise de dados do outras bases dedados.
A invenção refere-se a um sistema computacional e uma mídiade leitura por computador para compilar dados sobre um animal, o sistemacontendo dados inseridos sobre aquele animal, tais como, mas não-limitadosa, históricos de vacinação e medicação, teste de DNA, teste de tireoglobuli-na, leptina, MMI (Meta Morphyx Inc.), diagnóstico de encefalopatia espongi-forme bovina (BSE), vacinação contra brucelose, vacinação contra FMD (fe-bre aftosa), vacinação contra BVD (diarréia viral bovina), programa de pré-condicionamento Sure Health, resultados de gravidez e cio, tuberculose, ní-veis hormonais, segurança/contaminação alimentar, contagem de célulassomáticas, ocorrência de mastite, resultados de testes diagnósticos, níveisde proteína no leite, gordura do leite, estado de vacina, registros de saúde,níveis de minerais, níveis de minerais traço, desempenho do rebanho, e si-milares. Os dados do animal também podem incluir tratamentos anterioresassim como tratamento personalizado sugerido dependendo da predisposi-ção genética do animal em relação a uma doença particular.A invenção também fornece um método auxiliado por computa-dor para melhorar a produção animal usando um sistema computacional, porexemplo, um computador programado que compreende um processador, umsistema de armazenamento de dados, um dispositivo de entrada e um dis-positivo de saída, e as etapas de inserir no computador programado, atravésdo dispositivo de entrada, dados que compreendem dados de procriação,veterinários, de medicação, diagnóstico e similares de um animal, correla-cionar a característica física prevista pelo genótipo usando o processador eo sistema de armazenamento de dados, enviar para o dispositivo de saída acaracterística física correlacionada ao genótipo e alimentar o animal comuma dieta baseada na característica física, melhorando dessa maneira aprodução de animais de criação.
A invenção ainda fornece um método auxiliado por computadorpara otimizar a eficiência de confinamentos para animais de criação quecompreende usar um sistema computacional, por exemplo, um computadorprogramado que compreende um processador, um sistema de armazena-mento de dados, um dispositivo de entrada e um dispositivo de saída e asetapas de inserir no computador programado, através do dispositivo de en-trada, dados compreendendo histórico de procriação, veterinário de um ani-mal, correlacionar os históricos de procriação e veterinário usando o proces-sador e o sistema de armazenamento de dados, enviar para o dispositivo desaída a característica física correlacionada ao genótipo, e alimentar o animalcom uma dieta baseada na característica física, melhorando dessa maneiraa eficiência de confínamento para animais de criação.
A invenção ainda abrange métodos de realizar serviços pelo for-necimento de acesso a tal mídia de leitura por computador e/ou sistemas decomputador e/ou dados coletados de animais para usuários; por exemplo,dados da mídia e/ou seqüência podem ser acessíveis a um usuário, por e-xemplo com base em uma subscrição, através da Internet ou uma rede glo-bal de comunicação/computador; ou o sistema computacional pode ser dis-ponibilizado para um usuário com base em uma subscrição.
Em uma modalidade, a invenção fornece um sistema computa-cional para gerenciar animais de criação que compreende característicasfísicas e bancos de dados que correspondem a um ou mais animais. Emoutra modalidade, a invenção fornece uma mídia de leitura por computadorpara gerenciar animais de criação que compreende características físicas ehistóricos veterinários correspondentes a um ou mais animais. A invençãoainda fornece métodos para realizar serviços para gerenciamento de animaisde criação que compreende fornecer ao usuário o sistema de computador ea mídia descrita acima ou as características físicas e históricos veterináriosque correspondem a um ou mais animais. A invenção ainda abrange méto-dos de transmissão de informação obtida em qualquer método ou etapadesse aqui descrita ou qualquer informação aqui descrita, por exemplo, atra-vés de telecomunicações, telefone, comunicação em massa mídia de mas-sa, apresentações, internet, email, etc.
A invenção ainda abrange kits úteis para o rastreamento de áci-do nucléico isolado de um ou mais indivíduos bovinos quanto à variação alé-Iica de um ou mais genes de FABP e em particular, para qualquer um dosSNPs descritos aqui, em que os kits podem compreender pelo menos umoligonucleotídeo que hibridiza seletivamente a um ácido nucléico que com-preende qualquer uma ou mais das seqüências de FABP descritas aqui einstruções para uso do oligonucleotídeo para detectar a variação no nucleo-tídeo correspondente ao SNP do ácido nucléico isolado.
Uma modalidade desse aspecto da invenção fornece um oligo-nucleotídeo que hibridiza especificamente à molécula de ácido nucléico iso-lada desse aspecto da invenção, e em que o oligonucleotídeo hibridiza auma porção da molécula de ácido nucléico isolado que compreende qual-quer um dos sítios polimórficos nas seqüências de FABP aqui descritas.
Outra modalidade da invenção é um oligonucleotídeo que hibri-diza especificamente sob condições de alta estringência a qualquer um dossítios polimórficos dos genes de FABP1 em que o oligonucleotídeo tem entrecerca de 18 nucleotídeos e cerca de 50 nucleotídeos.
Em outra modalidade da invenção, o oligonucleotídeo compre-ende um nucleotídeo central que hibridiza especificamente com o sítio poli-mórfico do gene FABP4 da porção da molécula de ácido nucléico.
Outro aspecto da invenção é um método de identificação de umpolimorfismo de FABP4 em uma amostra de ácido nucléico que compreendeisolar a molécula de ácido nucléico que codifica FABP ou um fragmento des-sa e determinar o nucleotídeo no sítio polimórfico.
Outro aspecto da invenção é um método de rastreamento degado para determinar aqueles bovinos que mais provavelmente exibirão umadiferença biológica na qualidade da carne que compreende as etapas deobter uma amostra de material genético do bovino; e analisar para a presen-ça de um genótipo no bovino que está associado com qualidade de carne, ogenótipo caracterizado por um polimorfismo em qualquer um dos genes deFABP.
Em outras modalidades desse aspecto da invenção, a etapa deanálise é selecionada do grupo que consiste em análise de polimorfismo decomprimento de fragmento de restrição (RFLP), minisseqüenciamento,MALD-TOF, SINE, análise de heterodúplex, polimorfismo conformacional defilamento único (SSCP), eletroforese em gel com gradiente desnaturante(DGGE) e eletroforese em gel com gradiente de temperatura (TGGE).
Em várias modalidades da invenção, o método ainda pode eom-----preender a etapa de amplificar uma região do gene de FABP ou uma porçãodessa que contém o polimorfismo. Em outras modalidades da invenção, aamplificação pode incluir a etapa de selecionar um iniciador de seqüênciadireta e um de seqüência reversa capaz de amplificar a região do gene deFABP.
Outro aspecto da invenção é um método auxiliado por computa-dor para predizer quais dos animais de criação possuem uma diferença bio-lógica na qualidade da carne que compreende: usar um sistema computa-cional, por exemplo, um computador programado que compreende um pro-cessador, um sistema de armazenamento de dados, um dispositivo de en-trada e um dispositivo de saída, as etapas de: (a) inserir no computador pro-gramado através do dispositivo de entrada dados que compreendem um ge-nótipo de FABP de um animal, (b) correlacionar o crescimento, consumo dealimento, qualidade do rendimento e valor da carcaça previstos pelo genóti-po de FABP usando o processador e o sistema de armazenamento de dadose (c) enviar para o dispositivo de saída a qualidade da carne correlacionadaao genótipo de FABP, predizendo dessa maneira quais animais de criaçãopossuem crescimento, consumo de alimento, qualidade do rendimento ouvalor da carcaça particulares.
Outro aspecto da invenção é um método realizar serviços paragerenciamento de animais de criação compreendendo fornecer ao usuárioum sistema computacional para gerenciamento de animais de criação com-preendendo características físicas e genótipos que correspondem a um oumais animais ou uma mídia de leitura por computador para gerenciar ani-mais de criação que compreende características físicas e genótipos que cor-respondem a um ou mais animais.
A invenção será descrita adicionalmente por meio dos seguintesexemplos não-limitantes.
EXEMPLOS
Exemplo 1:
Esse Exemplo demonstra que o gene bovino da proteína de li-gação de ácido graxo 4 (FABP4) está significativamente associado commarmoreio e profundidade de gordura subcutânea em cruzamentos de Wag-yu χ Limousin Fz.
Evidências mostraram que a proteína de ligação de ácido graxo4 (FABP4), expressa em tecido adiposo interage com os receptores ativadospor proliferador de peroxissomo e se liga a uma Iipase sensível a hormônio,desempenhando assim um papel importante no metabolismo lipídico e nahomeostase em adipócitos. O objetivo desse estudo foi, portanto, investigarassociações do gene de FABP4 bovino com a deposição de gordura em cru-zamentos de Wagyu χ Limousin F2. Ambas ás seqüências de cDNA (625 pb)e DNA genômico (8031 pb) do gene FABP4 bovino foram encontradas embases de dados públicas e alinhadas para determinar sua organização ge-nômica. Dois pares de iniciadores foram desenhados, que atingiram duasregiões do gene, um entre as bases 5433 a 6106 e uma entre as bases 7417- 7868 (AAFC01136716). O seqüenciamento direto de produtos de PCR dedois grupos de DNA de animais com muito/pouco marmoreio revelou duassubstituições G/C nas posições 7516 e 7713, respectivamente. A primeirasubstituição G/C pode ser revelada por PCR-RFLP usando a enzima de res-trição MspA1\ e foi genotipada em 246 animais F2 na população de referên-cia. A análise estatística mostrou que o genótipo do gene FABP4 bovino afe-tou significativamente a deposição de gordura intramuscular e subcutânea,como indicado pelo escore de marmoreio (P=0,0321) e profundidade de gor-dura subcutânea (P=0,0246), respectivamente. O gene FABP4 cai em umintervalo de QTL sugestivo/significativo para o marmoreio de carne relatadopreviamente no cromossomo 14 bovino em três outras populações, que po-de ser implementado imediatamente em programas de seleção de carne.
Proteínas de ligação de ácido graxo são de uma família de pro-teínas citoplasmáticas, pequenas, altamente conservadas, que se ligam aácidos graxos de cadeia longa e outros Iigantes hidrofóbicos (Kaikaus et al.1990). Suas principais funções incluem a absorção, transporte e metabolis-mo de ácido graxo. Até agora, nove membros distintos foram identificadosnessa família de genes (Damcott et ai 2004), incluindo a proteína de ligaçãode ácido graxo de adipócito ou proteína de ligação-de ácido-graxo 4(FABP4). FABP4 desempenha um papel importante na regulação da home-ostase de lipídio e glicose através de sua interação com os receptores ativa-dos por proliferador de peroxissomo (PPARs), localizados no núcleo da célu-la. Especificamente, o complexo FABP4/ácido graxo ativa a isoforma PPAR-γ, que por sua vez, regula a transcrição de FABP4 (Damcott et al. 2004). A-lém disso, FABP4 parece estar envolvida na hidrólise de lipídio e trânsitointracelular de ácido graxo através de interação direta e ligação a Iipase sen-sível a hormônio (Shen et al 1999), que é uma enzima primária envolvida nocatabolismo lipídico (Tansey et al. 2003). Recentemente, FABP4 e FABP5foram propostos como genes candidatos potenciais para obesidade já queeles estão localizados dentro de uma região de lócus de característicasquantitativas (QTL) para níveis séricos de Ieptina em camundongos (Oginoet al. 2003). Leptina, uma proteína de 16 kDa secretada por adipócitos bran-cos, está envolvida na regulação da ingestão alimentar, gasto de energia ebalanço energético corporal total (Jiang et ai 1999). Todos esses fatoresindicam que FABP4 desempenha um papel importante no metabolismo lipí-dico e homeostase nos adipócitos. Aqui, o desenvolvimento de rótulos gené-ticos no gene FABP4 bovino e a associação significativa do gene com mar-moreio e profundidade de gordura subcutânea (SFD) em cruzamentos deWagyu χ Limousin F2 são relatados.
A seqüência genômica do gene FABP4 bovino não foi descrita.Entretanto, a seqüência de cDNA do gene FABP4 bovino (X89244), derivadada glândula mamária bovina, foi descrita anteriormente (Specht et aí. 1996).Portanto uma busca com BLAST foi realizada usando essa seqüência decDNA como uma pesquisa para buscar sua seqüência de DNA genômicocontra seqüências de genoma bovino 3X que foram liberadas para o domíniopúblico (http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/projects/bovine/). O processo encon-trou Bos taurus contigl36721 (Número de acesso do GenBank A-AFC01136716) que contém a seqüência de gene FABP4 bovino de 8031 pb.A estrutura geral do gene FABP4 bovino foi então determinada pela compa-ração da seqüência de DNA genômico com a seqüência de cDNA completa(FIGURAI). A organização genômica do gene-F/4£P4-bovino-consiste em-quatro éxons e três íntrons (FIGURA 1), o que é comparável com a estruturado gene em outros membros da família de proteína de ligação de ácido gra-xo e é idêntica a mesma estrutura gênica em ser humano (NC-000008), por-co (Y 16039), camundongo (NC-000069), rato (NC-005 10 1) e galinha (NC-006089). O alinhamento de cDNA - DNA genômico do gene FABP4 bovinomostrou 99% de identidade de seqüência em um bloco alinhado (Exon 3,FIGURA 1) e 100% de identidade de seqüência em três blocos. Esses qua-tro blocos alinhados representam 5'UTR (região não traduzida), 4 éxons e3'UTR. Portanto, essa seqüência genômica de 8031 pb do gene FABP4 bo-vino pode ser dividida experimentalmente nas seguintes partes organizacio-nais: 1819 pb para o promotor proximal, 67 pb para 5'UTR, 66 pb para éxon1, 2709 pb para íntron 1, 173 pb para éxon 2, 594 pb para íntron 2, 102 pbpara éxon 3, 463 pb para íntron 3, 51 pb para éxon 4, 100 pb para 3' UTR e1887 pb para seqüência 3' não transcrita, respectivamente (FIGURA 1).
População de referência Wagyu χ Limousin foi desenvolvidaconjuntamente pela Washington State University e Fort Keogh Livestock andRange Research Laboratory, ARS, USDA. Os cruzamentos F-i, incluindo 6touros Fi e 113 fêmeas, foram gerados na Washington State Universityetransferidos para a estação de pesquisa da USDA no outono de 1998. O a-casalamento entre si desses animais F1 produziu uma progênie de 71 F2 em2000, 90 em 2001 e 109 em 2002, respectivamente. A taxa de crescimento,os dados de qualidade da carcaça e da carne, incluindo escores de marmo-reio e SFD, foram coletados em todos os bezerros de F2. O escore de mar-moreio é um medida subjetiva da quantidade de gordura intramuscular domúsculo Iongissimus com base em padrões da USDA(http://www.ams.usda.gov/). SFD foi medido na interface da 12-13ã costelaperpendicular a superfície externa em um ponto três quartos da extensão domúsculo Iongissimus a partir da sua extremidade do osso da coluna verte-bral. Escores de marmoreio variaram de 4 = Discreto0 a 9,5 = Moderada-mente abundante50 (SD = 1,00) e as medidas de SFD variaram de 0,1 a 1,3polegadas (2,54 a 33,02 mm) (SD = 0,18) nessa população F2. O DNA foiextraído de amostras de sangue. Com base-na-disponibilidade-de-ambos os -dados e amostras de DNA, 246 observações foram usadas no presente es-tudo. Dois grupos de DNA foram formados a partir da população de referên-cia, um de 20 indivíduos com os maiores escores de marmoreio (grupoHMS) e um de 20 indivíduos com os menores escores de marmoreio (grupoLMS), para um rastreamento inicial de associação de rótulos com as carac-terísticas.
Dois pares de iniciadores foram desenhados para detectar poli-morfismos genéticos no gene FABP4 bovino, com base na seqüência genô-mica contigl36721 (Número de acesso GenBank AAFC01136716. Toda anumeração desse documento é baseada nessa seqüência). O primeiro parde iniciadores (seqüência direta, 5' TCG TAA ACT TAG ATG AAG GTG CTCTGG 3' (SEQ ID NO: 2) e a seqüência reversa 5' ACG TAT CCA GCA GAAAGT CAT GGA G 3' (SEQ ID NO: 3) tem como alvo uma região entre as ba-ses 5433 a 6106. Essa região inclui éxon 3, íntron 3 e éxon 4, e uma supostasubstituição G/A foi encontrada no éxon 3 com base no alinhamento de se-qüência entre cDNA e DNA genômico do gene FABP4 bovino. O segundopar de iniciadores (seqüência direta, 5' ATA TAG TCC ATA GGG TGG CAAAGA 3' (SEQ ID NO: 4) e seqüência reversa, 5'C CTC TCT TTG AAT TCTCCA TTC T 3' (SEQ ID NO: 5) amplifica uma região de 7417 - 7868 pb, quecontém uma repetição curta em tandem de "CA". Aproximadamente 50 ngde DNA genômico dos grupos HMS e LMS foram amplificados em um volu-me final de 10μΙ_ que continham 12,5 ng de cada iniciador, 150 μΜ dedNTPs, 1,5 mM de MgCI2, 50 mM de KCI, 20 mM de Tris-HCI e 0,25 U deTaq polimerase Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA). As condições de PCRforam realizadas como se segue: 94°C por 2 min, 32 ciclos de 94°C por 30 s,63°C (para o primeiro par de iniciadores) ou 56°C (para o segundo par deiniciadores) por 30 s e 72°C por 30 seg seguido por uma extensão adicionalde 5 min a 72°C. Produtos de PCR foram examinados por eletroforese atra-vés de um gel de agarose 1,5% com tampão TBE 1X para determinar a qua-lidade e quantidade de DNA para seqüenciamento.
O seqüenciamento direto de produtos de PCR dos dois gruposde DNA foi realizado em um seqüenciador AB\373QnoLaboratory-forBiote—chnology and Bloanalysis (Washington State University) usando um protoco-lo padronizado. Entretanto, o seqüenciamento de DNA não confirmou a exis-tência de uma substituição G/A no éxon 3 ou uma variação no número derepetições de CA na região 3' não transcrita do gene FABP4 bovino entre osgrupos HMS e LMS. Ao invés disso, dois polimorfismos de nucleotídeo único(SNPs) foram detectados nos produtos amplificados com o segundo par deiniciadores, incluindo uma substituição G/C localizada na posição 7516 (FI-GURA 2A) e uma substituição G/C em 7713 pb dentro da região de repeti-ção de CA (FIGURA 2B). Análise do mapa de restrição indicou que a substi-tuição G/C em 7516 pb poderia ser genotipada por PCR-RFLP usando a en-zima de restrição MspAI I. Esse SNP G/C no gene FABP4 bovino foi entãogenotipado individualmente no DNA de animais Wagyu X Limousin F2 comescores de marmoreio e medidas de SFD registradas. Após amplificação porPCR, os amplicons foram digeridos a 37°C por três horas com 2U de MspAII(New England Biolabs, Beverly, MA) seguido pela análise em géis de agaro-se 1,5%. O amplicon de 452 pb com a substituição G/C em 7516 pb contémum único sítio polimórfico para a enzima de restrição MspAII. Portanto, ani-mais homozigotos para GG tem um sítio de MspAII e mostram após a diges-tão completa duas bandas: 100 pb e 352 pb. Em comparação, animais ho-mozigotos com alelo C perderam o sítio de reconhecimento de MspAII nessaposição e mostram apenas a banda de 452 pb. Animais heterozigotos sãoidentificados pela presença de três bandas após a digestão com MspAII (Fl-GURA 3). Dos 232 animais genotipados, 139 eram homozigotos com aleloC, 21 eram homozigotos com alelo G e os 72 restantes eram heterozigotoscom ambos os alelos CeG (Tabela 1). A distribuição do genótipo estava emequilíbrio de Hardy-Weinberg (x2 = 2,82, P > 0,05).
Tabela 1. Associações de SNP G/C de FABP4 bovino na posição 7516 commarmoreio e SFD em cruzamentos Waygu X Limousin F2.
<table>table see original document page 56</column></row><table>
ab Médias dentro de uma série sem sobrescritos comuns são significativa-mente diferentes (P<0,05).
Os dados fenotípicos para escores de marmoreio e medidas deSFD foram analisados usando o procedimento GLM (modelo linear geral) deSAS v9.1 (SAS Institute Inc., Gary, NC). Os efeitos fixos do modelo incluíramano de nascimento, gênero, idade na coleta (linear) e o genótipo para umasubstituição G/C em 7516 pb do gene FABP4. Comparações aos pares dasmédias dos quadrados mínimos foram realizadas usando um teste-t protegi-do. Genótipo afetou significativamente a deposição de gordura intramusculare subcutânea (Tabela 1), como indicado pelo escore de marmoreio(P=0,0321) e SFD (P=0,0246), respectivamente. Como o número de animaiscom o genótipo GG era relativamente baixo na população, diferenças signifi-cativas em SFD ou escores de marmoreio não foram detectadas. Entretanto,numericamente, animais homozigotos com o alelo G tiveram SFD maior eescores de marmoreio maiores do que animais homozigotos com o alelo C.Animais com o genótipo heterozigoto tiveram escores de marmoreio e SFDsignificativamente maiores (P<0,05) do que animais com o genótipo CC. En-quanto esses resultados são o primeiro relato conhecido de uma associaçãoentre o genótipo de FABP4 e escore de marmoreio e SFD em gado, outrospesquisadores relataram polimorfismos significativos no gene FABP4 porci-no que estavam relacionados a aumento de lipídiosT Gerbens et ai (1998)detectou um róturonje_microssatélite~nO-gene_F^fíP4^porcino-que-era^oti^mórfico em seis raças de porco. Genótipos para esse microssatélite estavamassociados significativamente com o conteúdo de gordura intramuscular debiópsias de músculo Iongissimus dorsi de porcos Duroc (Gerbens et ai1998) e Iongissimus Iumborum de porcos castrados cruzados (Gerbens et ai2001). Além disso, Ye e outros (2002) indicaram que um lócus de Bsml nogene FABP4 porcino próximo do rótulo de microssatélite descrito por Ger-bens et ai (1998) estava significativamente associado com o conteúdo degordura intramuscular.
Vários relatos demonstraram que o cromossomo 14 bovino(BTA14) abriga QTL significante ou sugestivo para marmoreio (conteúdo degordura intramuscular) e SFD em gado de corte. Casas e outros (2003) rela-taram um QTL sugerido para marmoreio em uma família Bos indicus χ Bostaurus localizado a 47 cM e um QTL sugerido para SFD a 16 cM em BTA14.Taylor e Schnabel (2004) (http://animalgenomics.missouri.edu/) desenvolve-ram recentemente um depósito de DNA do sêmen de 1600 touros registra-dos representando 14 gerações do American Angus Association para o pro-jeto Angus Genome e confirmaram a existência de um QTL de marmoreiocom uma localização similar ao QTL identificado por Casas e outros (2003).No gado Japonês negro de raça pura, um QTL para marmoreio foi encontra-do Nas regiões centroméricas de BTA14 (Imai et al. 2004). A padronizaçãodas localizações desses rótulos com base na mais nova versão do mapa deligação bovino (lhara et al. 2004) demonstrou que esses QTLs ocupam umintervalo entre 59 cM e 70 cM em BTA14. Integração do mapa genético (lha-ra et al. 2004) e do mapa RH (Itoh et al. 2005) de BTA14 previu que o geneFABP4 poderia estar localizado em algum lugar entre 63.156 e 63.859 cM nomapa de ligação do cromossomo bovino. Esses dados indicam que o geneFABP4 cai em um intervalo de QTL de marmoreio relatado em três popula-ções diferentes como descrito acima.
Referências:
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Exemplo 2
Esse Exemplo fornece associações entre rótulos TFAM-1,
TFAM-2 e FABP4 e características da carcaça em confinamentos comerciaisde novilhos e novilhas.
Os seguintes rótulos foram avaliados: (1) uma substituição de Cpor A na posição de nucleotídeo 1220 no promotor do gene do fator detranscrição mitocondrial A (TFAM-1), (2) uma substituição de C por T na po-sição de nucleotídeo 1212 no promotor de TFAM-2 e (3) uma substituição deG por C na posição de nucleotídeo 7516 do gene da proteína de ligação deácido graxo 4 (FABP4). Resultados anteriores indicam que os rótulos afetammarmoreio e gordura dorsal.
Inicialmente, havia 1589 registros de novilhos e novilhas. A me-ta-alvo era 12,2 mm de gordura dorsal. Dados coletados foram previstoscomo uma meta econômica ótima por animal. Grupos contemporâneos inclu-íram fonte e sexo. Foi admitido que o tipo de raça se confundiu com a fonte.O grupo de dados finais incluiu~o número de registros baseados-nos-fenóti--pos e genótipos disponíveis para cada característica.
As características testadas são: peso da caraça quente (HCW,Ib), área do olho do lombo (REA, in2), área do olho do lombo por cem librasde HCW (REA/cwt HCW, in2/100 Ib do peso da carcaça quente (HCW)), va-lor do peso da carcaça quente (valor de HCW, $), peso vivo calculado (pesovivo calc, Ib), consumo de matéria seca (DMI, Ib), dias de alimentação (DOF,d), consumo de matéria seca por dia de alimentação (DMI por DOF, Ib/d),ganho médio diário (ADG, Ib/d), rendimento da carcaça (DP, %), espessurada gordura dorsal (BFAT, in), grau de rendimento calculado (cYG), grau dequalidade, menor ou igual ao selecionado versus maior ou igual ao escolhido(QG, < Se vs, >Ch) (ADG, kg/d), conteúdo de gordura intramuscular (IMF,%), escore de marmoreio (MBS, 10 a 99), escore de marmoreio dividido pe-los dias de alimentação (MBS/DOF), valor adicional da carcaça (valor adi-cional carc, $), retorno líquido ajustado-todos os custos retirados (retornolíq. ajust.--todos custos retirados, R$) e retorno líquido ajustado-valor inicialdo animal não retirado (retorno líq. ajust.-- valor inicial do animal não retira-do, $).
Os modelos da análise foram genótipo, em que os genótiposforam ajustados como efeitos fixos e aditivos ou substituição alélica, quemostraram regressão no número de alelos (O, 1, 2). Ambos os modelos seajustam com combinações de 2 rótulos. Outro modelo de análise é de hapló-tipo, que mostra regressão no haplótipo (esperado) quando se ajusta múlti-pios rótulos de TFAM. Associações de rótulo único significativas estão apre-sentadas na Tabela 2 e combinações de 2 rótulos significativas estão apre-sentadas na Tabela 3.<table>table see original document page 61</column></row><table><table>table see original document page 62</column></row><table><table>table see original document page 63</column></row><table>Exemplo 3.
FIGURA 5. mostra um fluxograma da entrada de dados e saídade resultados a partir da análise e correlação dos dados relacionados a pro-criação, históricos veterinários e requisitos de desempenho de um grupo deanimais tais como de bovinos. O fluxograma ilustrado na FIGURA 5 aindaindica o fluxo de dados interativos a partir de um equipamento auxiliado porcomputador a um grupo de estudantes aprendendo o uso do método da in-venção e a correlação de tais dados interativos para apresentar um resulta-do como um gráfico de torta indicando o progresso da classe. O fluxogramaindica ainda modificações do método da invenção de acordo com a informa-ção recebida dos estudantes para avançar o processo de ensino ou otimizaro método para satisfazer as necessidades dos estudantes.
FIGURA 6. ilustra as relações potenciais entre os elementos dosdados a serem introduzidos no sistema. As setas unidirecionais indicam, porexemplo, que um celeiro é tipicamente de propriedade de apenas uma fa-zenda, enquanto que uma fazenda pode ter vários celeiros. Similarmente,uma prescrição pode incluir produtos veterinários.
FIGURA 7A ilustra o fluxo de eventos no uso do sistema basea-do em computador portátil para entrada de dados sobre a procriação e cria-ção de um rebanho de vacas. FIGURA 7B ilustra o fluxo de eventos atravésde sub-rotinas relacionadas à entrada de dados referentes ao gerenciamentode fazenda. FIGURA 7C ilustra o fluxo de eventos através de sub-rotinasrelacionadas à entrada de dados referentes a dados específicos para umaempresa.
FIGURA 8 ilustra um fluxograma da entrada de dados e saída deresultados a partir da análise e correlação dos dados relacionados com aprocriação, históricos veterinários e requisitos de desempenho de um grupode animais.
A invenção ainda é descrita pelos seguintes parágrafos numerados:
1. Um método para subagrupar animais de acordo com o genóti-po em que os animais de cada subgrupo tem um polimorfismo similar no ge-ne da proteína de ligação de ácido graxo 4 ("FABP4") compreendendo:
(a) determinar o genótipo de cada animal a ser subagrupado pe-la determinação da presença de um polimorfismo de nucleotídeo único nogene FABP4 e
(b) segregar animais individuais em subgrupos em que cada a-nimal em um subgrupo tem um polimorfismo similar no gene FABP4.
2. Um método para subagrupar animais de acordo com o genóti-po em que os animais de cada subgrupo têm um genótipo similar no geneFABP4compreendendo:
(a) determinar o genótipo de cada animal a ser subagrupado pe-la determinação da presença de polimorfismo(s) de nucleotídeo único deinteresse no gene FABP4,
(b) segregar animais individuais em subgrupos dependendo seos animais têm, ou não têm, o(s) polimorfismo(s) de nucleotídeo único deinteresse no gene FABP4.
3. O método dos parágrafos 1 ou 2, em que o(s) polimorfismo(s)de nucleotídeo único de interesse é(são) selecionado(s) do grupo que con-siste em uma substituição de G por C na posição de nucleotídeo 7516 dogene de FABP4 e uma substituição de G por C na posição 7713 do geneFABP4.
4. Um método para subagrupar animais de acordo com o genóti-po em que os animais de cada subgrupo têm um genótipo similar no geneFABP4 compreendendo:
(a) determinar o genótipo de cada animal a ser subagrupado pe-la determinação da presença de uma substituição de G por C na posição denucleotídeo 7516 do gene FABP4 e uma substituição de G por C na posição 7713 do gene FABP4, e
(b) segregar animais individuais em subgrupos dependendo seos animais têm, ou não têm, substituição de G por C na posição de nucleotí-deo 7516 do gene FABP4 e uma substituição de G por C na posição 7713do gene FABP4.
5. Um método para identificar um animal que tem um fenótipodesejável quando comparado a população geral de animais daquela espé-cie, compreendendo determinar a presença de um polimorfismo de nucleotí-deo único no gene FABP4 do animal, em que o polimorfismo é selecionado apartir do grupo que consiste em uma substituição de G por C na posição denucleotídeo 7516 do gene FABP4 e uma substituição de G por C na posição 7713 do gene FABP4. Polimorfismo de nucleotídeo único é indicativo de fe-nótipo desejável.
6. O método do parágrafo 5, em que o fenótipo desejável é con-sumo de alimento, taxa de crescimento, peso corporal, composição e valorda carcaça, produção de leite ou qualquer combinação desses.
7. Os métodos do parágrafo 5 ou 6, em que o fenótipo desejávelé o valor adicional da carcaça (valor adicional carc, $), ganho médio diário(ADG, Ib/d), espessura da gordura dorsal (BFAT, in), peso vivo calculado(peso vivo calc, Ib), grau de rendimento calculado (cYG), dias de alimenta-ção (DOF, d), rendimento da carcaça (DP, %), consumo de matéria seca(DMI, Ib), consumo de matéria seca por dia de alimentação (DMI por DOF,Ib/d), peso da carcaça quente (HCW, Ib), valor do peso da carcaça quente(valor HCW, $), conteúdo de gordura intramuscular (IMF, %), escore demarmoreio (MBS, 10 a 99)7escore de marmoreio dividido pelos dias de ali-mentação (MBS/DOF), grau de qualidade, menor ou igual ao selecionadoversus maior ou igual ao escolhido (QG1 < Se vs, >Ch), área de olho de lom-bo (REA, in2), área de olho de lombo por cem libras HCW (REA/cwt HCW,in2/100 Ib de peso da carcaça quente (HCW)) e profundidade da gordurasubcutânea (SFD) ou qualquer combinação desses.
8. O método de qualquer um dos parágrafos de 1 a 7 em que oanimal é um bovino.
9. O método de qualquer um dos parágrafos 1 a 8 em que o ge-ne FABP4 é um gene de FABP bovino.
10. Um método interativo auxiliado por computador para rastreara criação de bovinos compreendendo, usando um sistema computacionalcompreendendo um computador programado que compreende um proces-sador, um sistema de armazenamento de dados, um dispositivo de entrada eum dispositivo de saída e um dispositivo interativo, as etapas de: (a) inserirno computador programado através do dispositivo de entrada, dados quecompreendem o histórico de procriação de um bovino ou rebanho de bovi-nos, (b) inserir no computador programado através do dispositivo de entrada,dados que compreendem o histórico veterinário de um bovino ou rebanho debovinos, (c) correlacionar os dados veterinários com o histórico de procria-ção do bovino ou rebanho de bovinos usando o processador e o sistema dearmazenamento de dados e (d) emitir para o dispositivo de saída o históricoreprodutivo e o histórico veterinário do bovino ou rebanho de bovinos.
11.0 método de acordo com o parágrafo 10, em que o sistemacomputacional é um sistema interativo através do qual, modificações na saí-da do método auxiliado por computador podem ser correlacionadas de acor-do com a entrada a partir do dispositivo interativo.
12. O método de acordo com o parágrafo 10 ou 11, ainda com-preendendo as etapas de inserir no computador programado dados diagnós-ticos relacionados a saúde de uma vaca ou rebanho de vacas; e correlacio-nar os dados de diagnóstico com os históricos de procriação e veterináriosde uma vaca ou rebanho de vacas.
13. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a 12, em que os dados veterinários compreendem um registro de vacinaçãode uma vaca ou rebanho de vacas.
14. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a 13 em que os dados de saúde são selecionados a partir do grupo que con-siste em dados de condição de criação, histórico do rebanho e dados de se-gurança alimentar.
15. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a 14, ainda compreendendo pelo menos uma etapa adicional selecionada apartir do grupo que consiste em inserir no computador programado dadosrelacionados ao controle de qualidade do bovino ou rebanho de bovinos ecorrelacionar os dados de controle de qualidade com os históricos de procri-ação e veterinário de uma vaca ou rebanho de vacas, inserir no computadorprogramado parâmetros de desempenho de uma vaca ou rebanho de vacas;e correlacionar os parâmetros de desempenho requeridos do bovino ou re-banho de bovinos a uma necessidade de desempenho específica de umcomprador, correlacionando dados de vacina aos parâmetros de desempe-nho do bovino ou rebanho de bovinos, correlacionar o rebanho aos parâme-tros de desempenho do bovino ou rebanho de bovinos, correlacionar os da-dos de segurança alimentar aos parâmetros de desempenho do bovino ourebanho de bovinos, correlacionar os dados de condição de criação aos pa-râmetros de desempenho do bovino ou rebanho de bovinos, inserir no com-putador programado dados relativos aos dados nutricionais do bovino ourebanho de bovinos e correlacionar os dados nutricionais aos parâmetros dedesempenho do bovino ou rebanho de bovinos e; alertar para alteraçõesindesejáveis nos parâmetros de desempenho do bovino ou rebanho de bovinos.
16. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a 15, ainda compreendendo as etapas de inserir no computador programadoatravés do dispositivo de entrada, dados que compreendem um genótipo deum bovino; correlacionar uma característica física prevista pelo genótipo u-sando o processador e o sistema de armazenamento de dados; e enviar pa-ra o dispositivo de saída a característica física-correlaeionada-ao-genótipo-para um bovino ou população de bovinos e alimentar o(s) animal(is) comuma dieta baseada na característica física, melhorando dessa maneira aprodução bovina.
17. O método auxiliado por computador de acordo com qualquerum dos parágrafos 10 a 16 para otimizar a eficiência de confinamentos paraanimais de criação que compreende enviar para o dispositivo de saída o his-tóricos de procriação e veterinário do bovino ou rebanho de bovinos e ali-mentar o(s) animal(is) com uma dieta baseada em seus históricos reproduti-vo e veterinário, otimizando dessa maneira a eficiência de confinamentospara bovinos ou rebanhos de bovinos.
18. Um método de transmissão de dados que compreendetransmitir a informação a partir de tais métodos de acordo com qualquer umdos parágrafos 10 a 16, selecionado a partir do grupo que consiste em tele-comunicação, telefone, vídeo conferência, comunicação em massa, umaapresentação, uma apresentação por computador, uma apresentação dePOWERPOINT™, internet, email, comunicação documentada.
19. Um sistema interativo de computador de acordo com qual-quer um dos parágrafos 10 a 16 para rastreamento de históricos de procria-ção e de bem-estar de vacas que compreende dados de procriação e veteri-nários que correspondem a um bovino ou rebanho de bovinos, e em que osistema de computador está configurado para permitir ao operador dessetrocar dados com o dispositivo ou base de dados remota.
20. O sistema interativo de computador de acordo com o pará-grafo 19, em que os dispositivos de entrada e saída são um assistente digitalpessoal ou computador de bolso.
21. Um método de realizar serviços para rastrear históricos deprocriação e de bem-estar de animais de criação compreendendo dados deprocriação e veterinários que correspondem a um ou mais animais de cria-ção que compreende fornecer a um usuário o sistema de computador doparágrafo 19.
22. Um método de realizar serviços para rastrear históricos deprocriação e de bem-estar de animais de criação compreendendo dados deprocriação e veterinários que correspondem a um ou mais animais de cria-ção compreendendo fornecer a um usuário o sistema de computador do pa-rágrafo 20.
23. O método de realizar serviços de acordo com o parágrafo 21,ainda compreendendo fornecer ao proprietário ou comprador do animal umequipamento de coleta de amostra, tais como "swabs" e adesivos úteis paracoletar amostras a partir das quais os dados genéticos podem ser obtidos, eem que os adesivos estão opcionalmente embalados em um recipiente queé codificado com símbolos identificadores.
24. O método de realizar serviços de acordo com os parágrafos 10 a 16, em que o sistema computacional ainda compreende uma pluralida-de de dispositivos interativos e em que o método ainda compreende as eta-pas de receber dados de dispositivos interativos, compilar os dados, enviaros dados para indicar a resposta de um estudante ou classe de estudantesde uma questão relacionada com a operação do método auxiliado por com-putador e opcionalmente modificar a operação do método auxiliado porcomputador de acordo com a indicação da resposta.
25. O método de qualquer um dos parágrafos 10 a 24 em que osdados compreendem a presença ou ausência de um ou mais polimorfismo(s)de nucleotídeo único de interesse no gene FABP.
26. O método do parágrafo 25 em que o(s) polimorfismo(s) denucleotídeo único de interesse é(são) selecionado(s) a partir do grupo queconsiste em uma substituição de G por C na posição de nucleotídeo 7516 dogene de FABP4 e uma substituição de G por C na posição 7713 do geneFABP4.
Tendo assim descrito em detalhe as modalidades preferidas dapresente invenção, deve ser entendido que a invenção definida pelos pará-grafos acima não é limitada aos detalhes particulares descritos na descriçãoacima já que diversas variações aparentes desses são possíveis sem des-considerar o espírito ou escopo da presente invenção.

Claims (19)

1. Método para identificar um animal que tem gordura intramus-cular e espessura de gordura subcutânea desejáveis ou uma combinaçãodesses, quando comparado com a população geral de animais daquela es-pécie, que compreende determinar a presença de um polimorfismo de nu-cleotídeo único em um gene da proteína de ligação de ácido graxo 4("FABP4") a presença de um polimorfismo de nucleotídeo único no gene deFABP 4 do animal, em que o polimorfismo de nucleotídeo único é indicativode "marbling" e espessura de gordura subcutânea desejáveis, ou uma com-binação desses.
2. Método de acordo com a reivindicação 1 ainda compreenden-do subagrupar os animais de acordo com o genótipo, em que os animais decada subgrupo têm um polimorfismo similar no gene de FABP 4, o dito mé-todo compreendendo:(a) determinar o genótipo de cada animal a ser subagrupado pe-la determinação da presença de um polimorfismo de nucleotídeo único nogene de FABP 4, e(b) separar animais individuais em subgrupos dependendo de seos animais têm, ou não têm o polimorfismo dè nucleõtídéõ úríico delntêres"se do gene de FABP 4.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o(s) polimor-fismo(s) de nucleotídeo único de interesse é(são) selecionado(s) a partir deum grupo que consiste em uma substituição de G para C na posição de nu-cleotídeo 7516 do gene de FABP 4 e uma substituição de G para C na posi-ção 7713 do gene de FABP 4.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o animal éum bovino.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o gene deFABP 4 é um gene de FABP 4 de bovino.
6. Método interativo auxiliado por computador para rastrear arecria de bovinos de criação compreendendo, usar um sistema computacio-nal que compreende um computador programado que compreende um pro-cessador, um sistema de armazenamento de dados, um dispositivo de en-trada, um dispositivo de saída, e um dispositivo interativo, as etapas de: (a)inserir no computador programado através do dispositivo de entrada dadosque compreendem um histórico da procriação de um bovino ou rebanho debovinos e um genótipo de um bovino; correlacionar uma característica físicaprevista pelo genótipo usando o processador e o sistema de armazenamentode dados, (b) inserir no computador programado através do dispositivo deentrada compreendendo um histórico veterinário de um bovino ou rebanhode bovinos, (c) correlacionar os dados veterinários com o histórico de procri-ação do bovino ou rebanho de bovinos usando o processador e o sistema dearmazenamento de dados, e (d) emitir para o dispositivo de saída o históricode procriação, o histórico veterinário do bovino ou rebanho de bovinos, e acaracterística física correlacionada ao genótipo para um bovino ou uma po-pulação de bovinos,em que a característica física é "marbling" e espessura de gor-dura subcutânea desejáveis, ou uma combinação desses, quando compara-do com a população geral de bovinos, e o genótipo é um polimorfismo denucleotídeo único em um gene de FABP 4.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o sistemacomputacional é um sistema interativo pelo qual modificações à saída dométodo auxiliado por computador podem ser correlacionadas de acordo coma entrada a partir do dispositivo interativo.
8. Método de acordo com a reivindicação 6, ainda compreen-dendo as etapas de inserir no computador programado dados de diagnósticorelacionados com a saúde da vaca ou rebanho de vacas; e correlacionar osdados de diagnóstico com os históricos de procriação e veterinário da vacaou rebanho de vacas.
9. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o dado vete-rinário compreende um registro de vacinação para uma vaca ou rebanho devacas.
10. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o dado desaúde é selecionado a partir do grupo que consiste em dados de condiçãoda criação de gado, histórico do rebanho, e dados de segurança alimentar.
11. Método de acordo com a reivindicação 6, ainda compreen-dendo pelo menos uma etapa adicional selecionada a partir do grupo queconsiste em inserir no computador programado dados relacionados com ocontrole de qualidade do bovino ou rebanho de bovinos e correlacionar osdados de controle de qualidade com os históricos de procriação e veterinárioda vaca ou rebanho de vacas, inserir no computador programado parâme-tros de desempenho da vaca ou rebanho de vacas; e correlacionar os parâ-metros de desempenho requeridos do bovino ou rebanho de bovinos a umanecessidade de desempenho específica de um comprador, correlacionar osdados de vacina aos parâmetros de desempenho do bovino ou rebanho debovinos, correlacionar o rebanho aos parâmetros de desempenho do bovinoou rebanho de bovinos, correlacionar dados de segurança alimentar aos pa-râmetros de desempenho do bovino ou rebanho de bovinos, correlacionar osdados da condição da criação de gado aos parâmetros de desempenho dobovino ou rebanho de bovinos, inserir no computador programado dadosrelacionados aos dados nutricionais do bovino ou rebanho de bovinos; e cor-relacionar os dados nutricionais aos parâmetros de desempenho do bovinoou rebanho de bovinos, e ficar alerta para alterações indesejáveis nos parâ"metros de desempenho do bovino ou rebanho de bovinos.
12. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o(s) poli-morfismo(s) de nucleotídeo único de interesse é(são) selecionado(s) a partirdo grupo que consiste em uma substituição de G para C na posição de nu-cleotídeo 7516 do gene de FABP 4 e uma substituição de G para C na posi-ção 7713 do gene de FABP 4.
13. Método de transmitir dados compreendendo transmissão deinformação a partir de tais métodos de acordo com a reivindicação 6, sele-cionado a partir do grupo que consiste em telecomunicação, telefone, vídeoconferência, comunicação de massa, uma apresentação, uma apresentaçãopor computador, uma apresentação em POWERPOINT™, internet, e-mail, ecomunicação documentária.
14. Sistema computacional interativo de acordo com a reivindi-cação 6, para rastrear os históricos de procriação e bem-estar de vacascompreendendo dados de procriação e veterinários correspondentes a umbovino ou rebanho de bovinos, e em que o sistema computacional está con-figurado para permitir que o operador desse troque dados com o dispositivoou com uma base de dados remota.
15. Sistema computacional interativo de acordo com a reivindi-cação 14, em que os dispositivos de entrada e de saída são um assistentedigital pessoal ou um computador de bolso.
16. Método de realizar serviço para rastrear históricos de procri-ação e bem-estar de criações compreendendo dados de procriação e veteri-nários correspondentes a um ou mais animais de criação compreendendofornecer a um usuário o sistema computacional como definido na reivindica-ção 14.
17. Método de realizar serviço para rastrear históricos de procri-ação e bem-estar de criações compreendendo dados de procriação e veteri-nários que correspondem a um ou mais animais de criação compreendendofornecer a um usuário o sistema computacional como definido na reivindica-ção 14.
18. Método de realizar serviço de acordo com a reivindicação 16^—ainda compreendendo fornecer ao dono ou comprador do animal equipa-mento de coleta de amostra, tais como coletores e adesivos úteis para cole-tar amostras a partir das quais dados genéticos podem ser obtidos, e emque os adesivos são opcionalmente embalados em um recipiente que é codi-ficado com símbolos identificadores.
19. Método de realizar serviço de acordo com a reivindicação 16,em que o sistema computacional ainda compreende uma variedade de dis-positivos interativos e em que o método ainda compreende as etapas de re-ceber dados a partir de dispositivos interativos, compilar os dados, emitir osdados para indicar a resposta de um estudante ou turma de estudantes auma questão relacionada com a operação do método auxiliado por compu-tador, e opcionalmente modificar a operação do método auxiliado por com-putador de acordo com a indicação da resposta.
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