ES2576126T3 - Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones enzimáticas mejorados para la manipulación de secuencias - Google Patents

Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones enzimáticas mejorados para la manipulación de secuencias Download PDF

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cas9
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Harvard College
Massachusetts Institute of Technology
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Abstract

Una composición que comprende: componentes del complejo de CRISPR, que comprenden: I. una o más secuencias de polinucleótidos del sistema de CRISPR-Cas, que comprende(n): (a) una secuencia guía modificada por ingeniería genética constituida por ARN y capaz de hibridarse a una secuencia diana en un locus del polinucleótido, (b) una secuencia de emparejamiento tracr constituida por ARN, y (c) una secuencia de tracRNA constituida por ARN, y en donde (a), (b) y (c) están dispuestas en una orientación 5' a 3', II. una proteína Cas9 de Tipo II, en donde la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida a la secuencia tracRNA y la secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un complejo de CRISPR a una secuencia diana, en donde el complejo de CRISPR comprende la proteína Cas9 de Tipo II formando complejo con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida la secuencia de tracrRNA, y en donde la proteína Cas9 de Tipo II es o comprende una Cas9 de Staphylococcus aureus (SaCas9).

Description

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(ii) una primera secuencia de emparejamiento tracr, y
(iii) una primera secuencia de tracr, y
II. un segundo elemento regulador enlazado operativamente a una segunda secuencia de polinucelótidos de ARN quimérico (chiRNA) de un sistema de CRISPR-Cas, en donde la segunda secuencia de polinucleótidos comprende
(i)
una segunda secuencia guía capaz de hibridarse con una segunda secuencia diana en un segundo locus genómico en la célula del organismo,
(ii)
una segunda secuencia de emparejamiento tracr, y
(iii) una segunda secuencia de tracr, y
III. un tercer elemento regulador enlazado operativamente a una secuencia codificadora de enzima que codifica una primera enzima de CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de localización nuclear y está enlazada operativamente a un primer dominio funcional,
IV. un cuarto elemento regulador enlazado operativamente a una secuencia codificadora de enzima que codifica una segunda enzima de CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de localización nuclear y está enlazada operativamente a un segundo dominio funcional, en donde (i), (ii) y (iii) en I y II están dispuestos en una orientación 5' a 3', en donde los componentes I, II, III y IV se encuentran en los mismos o en diferentes vectores del sistema, en donde, cuando se transcriben, cada una de las secuencias de emparejamiento tracr se hibrida con su secuencia tracr correspondiente y la primera y segunda secuencias guía dirigen la unión específica para la secuencia del primer y segundo complejos de CRISPR a la primera y segunda secuencia diana, en donde el complejo de CRISPR comprende la enzima de CRISPR formando complejo con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida con la secuencia de tracr, y en donde la expresión de la enzima de CRISPR proporciona la manipulación de la secuencia diana, en donde la primera y segunda enzimas de CRISPR comprenden cada una dos o más mutaciones, en donde la primera y segunda enzima de CRISPR es un ortólogo Cas9 de un género que pertenece al grupo que consiste en
Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor , Mycoplasma y Campylobacter, y en donde el primer locus genómico es modulado por la actividad del primer dominio funcional y el segundo locus genómico es modulado por la actividad del segundo dominio funcional. En una realización adicional, el primer dominio funcional se selecciona del grupo que consiste en un activador transcripcional, represor transcripcional, una recombinasa, una transposasa, una remodelador de histona, una ADN metiltransferasa, un criptocromo y un dominio inducible/contro!able por la luz o un dominio inducible/contro!able químicamente. En una realización adicional, el segundo dominio funcional se selecciona del grupo que consiste en un activador transcripcional, represor transcripcional, una recombinasa, una transposasa, un remodelador de histona, una ADN metiltransferasa, un criptocromo y un dominio inducible/contro!able por la luz o un dominio inducible/contro!able químicamente. En realizaciones preferidas, la primera o segunda enzima de CRISPR es una Cas9 de Sutterella wadsworthensis, una Cas9 de Filifactor alocis, una Cas9 de Lactobacillus johnsonii, una Cas9 de Campylobacter lari, una Cas9 de Corynebacter diptheriae, una Cas9 de Parvibaculum lavamentivorans, una Cas9 de Mycoplasma gailisepticum, una Cas9 de Staphylococcus aureus subsubespecie Aureus Cas9, una Cas9 de Legionella pneumophila Paris, una Cas9 de Treponema denticola, una Cas9 de Staphylococcus pseudintermedius, una Cas9 de Neisseria cinerea.
En algunas realizaciones, la enzima de CRISPR es una enzima de CRISPR de tipo I, II o III, preferentemente una enzima CRISPR de tipo II. Esta enzima de CRISPR de tipo II puede ser cualquier enzima Cas. Una enzima Cas puede ser identificada como Cas9, ya que esto puede referirse a la clase general de enzimas que comparten homología con el mayor nucleasa con múltiples dominios nucleasa del sistema de CRISPR tipo II. Lo más preferiblemente, la enzima Cas9 es, o se deriva de SpCas9 o Staphylococcus aureus subsubespecie Aureus SaCas9. Por se deriva se entiende que la enzima derivada se basa en gran medida, en el sentido de tener un alto grado de homología de secuencia con, una enzima de tipo salvaje, pero que ha sido mutada (modificada) de alguna manera tal como se describe en esta memoria.
Se apreciará que las expresiones enzima Cas y CRISPR se utilizan en general en esta memoria de forma indistinta, a menos que de otro modo resulte evidente. Tal como se mencionó anteriormente, muchas de las numeraciones de residuos utilizadas en esta memoria se refieren a la enzima Cas9 del locus CRISPR de tipo II en Streptotoccus pyogenes. Sin embargo, se apreciará que esta invención incluye muchas más Cas9s de otras especies de microbios tales como los pertenecientes al género Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma o Campylobacter, tal como SpCas9, SaCas9, St1Cas9, St3Cas9 y así sucesivamente, en donde St es Streptococcus thermophilus.
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Un ejemplo de una secuencia optimizada en codones, en este caso optimizada para seres humanos (es decir, optimizada para la expresión en seres humanos) se proporciona en esta memoria, ver la secuencia optimizada en codones humana SaCas9. Si bien esto se prefiere, se apreciará que son posibles otros ejemplos y se conoce la optimización de codones para una especie huésped.
Aspectos adicionales de la invención se refieren a la especificidad de escisión mejorada, la secuencia tracr optimizada, el ARN guía quimérico optimizado, la estructura co-plegada de tracrRNA y la secuencia de emparejamiento tracr, la estabilización de estructuras secundarias de tracRNA, tracrRNA con una región acortada de apareamiento de bases, tracrRNA con elementos de ARN fusionados, la clonación y el suministro simplificados, sistemas de toxicidad reducida y/o inducibles. Otro aspecto de la invención se refiere a la estabilización de ARN quimérico, y/o secuencia guía y/o una parte del mismo de complejos de CRISPR, en donde la enzima de CRISPR es un ortólogo de CRISPR, en donde el ARN quimérico y/o la secuencia guía y/o una parte del mismo se estabiliza mediante nucleótidos sintéticos o modificados químicamente (p. ej., LNA/BNA; modificación de tiol, modificación de reticulación 2’/3’-OH), se modifica para ser resistentes a la degradación/hidrólisis y al que se han añadido elementos de estabilidad estructural.
La invención comprende, además, en determinadas realizaciones un método de modificar un organismo o un organismo no humano mediante la manipulación de una secuencia diana en un locus genómico de interés, que comprende suministrar una composición que se produce de forma no natural o que se produce mediante ingeniería genética que comprende un sistema de vectores que comprende uno o más vectores que codifican operativamente una composición comentada en esta memoria para la expresión de los mismos. Preferiblemente, el vector es un vector viral, tal como vectores virales lenti-o baculo-o preferiblemente adeno-asociados, pero se conocen y se proporcionan otros medios de suministro (tales como sistemas de levadura, microvesículas, pistolas de genes/medios de fijación de vectores a nanopartículas de oro).
En esta memoria se describe diversos medios de suministro y se comentan en esta sección.
Suministro Viral: La enzima de CRISPR, por ejemplo una Cas9, y/o cualquiera de los presentes ARN, por ejemplo, un ARN guía, puede ser suministrada utilizando virus adeno-asociado (AAV), lentivirus, adenovirus u otros tipos de vectores virales, o combinaciones de los mismos. Cas9 y uno o más ARN guía pueden ser empaquetados en uno o más vectores virales. En algunas realizaciones, el vector viral es suministrado al tejido de interés, por ejemplo, mediante inyección intramuscular, mientras que otras veces el suministro viral es a través de la vía intravenosa, transdérmica, intranasal, oral, mucosal, u otros métodos de suministro. Una administración de este tipo puede ser o bien a través de una sola dosis o de múltiples dosis. Un experto en la técnica entiende que la dosis real a suministrar en esta memoria pueden variar en gran medida dependiendo de una diversidad de factores tales como el vector elegido, la célula, organismo o tejido diana, el estado general del sujeto a tratar, el grado de transformación/modificación buscado, la vía de administración, el modo de administración, el tipo de de transformación/modificación buscado, etc.
Una dosificación de este tipo puede contener, además, por ejemplo, un soporte (agua, solución salina, etanol, glicerol, lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, gelatina, dextrano, agar, pectina, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, etc.), un diluyente, un soporte farmacéuticamente aceptable (p. ej., solución salina tamponada con fosfato), un excipiente farmacéuticamente aceptable, un adyuvante para potenciar la antigenicidad, un compuesto o molécula inmunoestimulador y/u otros compuestos conocidos en la técnica. El adyuvante en esta memoria puede contener una suspensión de minerales (alumbre, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio) sobre los que se adsorbe el antígeno, o una emulsión de agua-en-aceite en la que la disolución de antígeno se emulsiona en aceite (MF-59, adyuvante incompleto de Freund), a veces con la inclusión de micobacterias muertas (adyuvante completo de Freund) para mejorar adicionalmente la antigenicidad (inhibe la degradación del antígeno y/o provoca la afluencia de macrófagos). Los adyuvantes también incluyen moléculas inmunoestimulantes tales como citoquinas, moléculas coestimulantes y, por ejemplo, moléculas de ADN o de ARN inmunoestimulantes tales como oligonucleótidos CpG. Una formulación de dosificación de este tipo es fácilmente determinable por un experto en la técnica. La dosificación puede contener, además, una o más sales farmacéuticamente aceptables tales como, por ejemplo, una sal de ácido mineral tal como un hidrocloruro, un hidrobromuro, un fosfato, un sulfato, etc.; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, etc. Adicionalmente, también pueden estar presentes sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponadoras del pH, geles o materiales gelificantes, aromas, colorantes, microesferas, polímeros, agentes de suspensión, etc. Además, también pueden estar presentes uno o más de otros ingredientes farmacéuticos convencionales tales como conservantes, humectantes, agentes de suspensión, tensioactivos, antioxidantes, agentes antiapelmazantes, cargas, agentes quelantes, agentes de revestimiento, estabilizadores químicos, etc., especialmente si la forma de dosificación es una forma reconstituible. Ingredientes a modo de ejemplo adecuados incluyen celulosa microcristalina,
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la transcripción in vitro. Por ejemplo, ARNm de Cas9 se puede sintetizar utilizando una casete de PCR que contiene los siguientes elementos: secuencia T7_promotor-kozak (GCCACC)-Cas9-3' UTR de la cola beta globina-poliA (una cadena de 120 o más adeninas). La casete se puede utilizar para la transcripción por la T7polimerasa. ARNs guía también se pueden transcribir utilizando la transcripción in vitro a partir de una casete que contiene la secuencia T7_promotor-GG-ARN guía.
Para potenciar la expresión y reducir la toxicidad, la enzima CRISPR y/o el ARN guía se pueden modificar utilizando pseudo-U o 5-Metil-C.
ARNm de la enzima de CRISPR y ARN guía se pueden administrar simultáneamente utilizando nanopartículas o envueltas lipídicas.
Por ejemplo, Su X, Fricke I, Kavanagh DG, Irvine DJ ( "In vitro and in vivo mRNA delivey using lipid-enveloped pHresponsive polymer nanoparticles” Mol Pharm 6 de junio de 2011; 8(3):774-87 doi:10.1021/mp100390w Epub 1 de abril de 2011) describe nanopartículas de núcleo y envoltura estructuradas biodegradables con un núcleo poli (βamino éster) (PBAE) envuelto por una envoltura bicapa de fosfolípidos. Estos fueron desarrollados para el suministro in vivo de ARNm. El componente PBAE sensible al pH fue escogido para fomentar la interrupción del endosoma, mientras que la capa de la superficie de lípidos se seleccionó para minimizar la toxicidad del núcleo de policationes. Por lo tanto, éstos se prefieren para el suministro de ARN de la presente invención.
Además de ello, Michael S.D. Kormann et al. ("Expression of therapeutic proteins after delivey of chemically modified mRNA in mice: Nature Biotechnology, Volumen: 29, páginas: 154-157 (2011) publicado en línea el 9 de enero de 2011) describen el uso de envolturas de lípidos para suministrar ARN. El uso de envolturas de lípidos también se prefiere en la presente invención.
Métodos de suministro de ARNm son especialmente prometedores para suministrar actualmente al hígado.
ARNm de la enzima de CRISPR ARNguía también podrían ser suministrados por separado. ARNm de la enzima de CRISPR puede ser suministrado antes del ARN guía para dar tiempo a que la enzima de CRISPR se exprese. ARNm de la enzima de CRISPR puede ser administrada 1-12 horas (preferiblemente alrededor de 2-6 horas) antes de la administración de ARNguía.
Alternativamente, ARNm de la enzima de CRISPR y ARN guía se pueden administrar juntos. Ventajosamente, una segunda dosis de refuerzo de ARN guía se puede administrar 1 -12 horas (preferiblemente alrededor de 2-6 horas) después de la administración inicial de ARNm de la enzima de CRISPR + ARNguía.
Administraciones adicionales de ARNm de la enzima de CRISPR y/o ARN guía podrían ser útiles para alcanzar los niveles más eficientes de modificación del genoma.
Para la minimización de la toxicidad y los efectos fuera de objetivo, será importante controlar la concentración de ARNm de la enzima de CRISPR y el ARN guía suministrado. Concentraciones óptimas del ARNm de la enzima de CRISPR y ARN guía se pueden determinar mediante el ensayo de diferentes concentraciones en un modelo celular
o animal y se puede utilizar la secuenciación profunda para analizar el grado de modificación en potenciales loci genómicos fuera de objetivo. Por ejemplo, para la secuencia guía que fija como objetivo 5'-GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA-3' en el gen EMX1 del genoma humano, la secuenciación profunda se puede utilizar para evaluar el nivel de modificación en los dos loci siguientes fuera de objetivo, 1: 5'-GAGTCCTAGCAGGAGAAGAA-3' y 2: 5'-GAGTCTAAGCAGAAGAAGAA-3'. La concentración que da el mayor nivel de modificación en objetivo al tiempo que minimiza el nivel de modificación fuera de objetivo debe ser elegido para el suministro in vivo.
Alternativamente, para minimizar el nivel de toxicidad y los efectos fuera de objetivo, la enzima de CRISPR nickase ARNm (por ejemplo Cas9 de S pyogenes con la mutación D10A) puede ser suministrada con un par de ARNs guía que fijan como objetivo un sitio de interés. Los dos ARN guías tienen que estar separados de la siguiente manera. Secuencias guía en rojo (subrayado sencillo) y azul (subrayado doble), respectivamente (estos ejemplos se basan en el requisito del PAM para Cas9 de Streptococcus pyogenes).
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Zhang Y, Schlachetzki F, Pardridge WM. ("Global non-viral gene transfer to the primate brain following intravenous administration" Mol Ther. enero de 2003; 7(1):11-8.) describen cómo la expresión de plásmidos que codifican informadores tales como luciferasa fueron encapsulados en el interior de un "virus artificial" constituido por inmunoliposoma 85 nm pegilado, que fue fijado como objetivo al cerebro de mono rhesus in vivo con un anticuerpo monoclonal (MAb) al receptor de la insulina huma (HIR). El HlRMAb permite que el liposoma que porta el gen exógeno se someta a transcitosis a través de la barrera sangre-cerebro y la endocitosis a través de la membrana plasmática neuronal después de la inyección intravenosa. El nivel de expresión del gen de luciferasa en el cerebro era 50 veces más alto en el mono rhesus en comparación con la rata. La expresión neuronal general del gen betagalactosidasa en el cerebro de los primates fue demostrada tanto por histoquímica como por microscopía confocal. Los autores indican que este enfoque hace factibles transgénicos adultos reversibles en 24 horas. Por consiguiente,se prefiere el uso de inmunoliposoma. Éste se puede utilizar en unión con anticuerpos para fijar como objetivo tejidos diana específicos o proteínas de la superficie celular.
También se prefieren otros medios de suministro o de ARN tales como a través de nanopartículas (Clio, S., Goldberg, M., Son, S., Xu, Q., Yang, F., Mei, Y., Bogatyrev, S., Langer, R, y Anderson, D., Lipid-like nanoparticles for small interfering RNA delivey to endotelial cells, Advanced Functional Materials, 19:3112-31 18, 2010) o exosomas (Schroeder, A., Levins, C., Cortez, C., Langer, R. y Anderson, D., Lipid-based nanotherapeutics fro siRNA delivery, Journal of Internal Medicine, 267: 9-21, 2010, PMID: 20059641). De hecho, los exozomas han demostrado ser particularmente útiles en el suministro de siRNA, un sistema con algunos paralelismos con el sistema de CRISPR. Por ejemplo, El-Andaloussi S, et al. ("Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo" Nat Protoc. diciembre de 2012;7(12):2112-26 doi: 10.1038/nprot.2012.131 Epub 15 de noviembre de 2012) describen cómo los exosomas son herramientas prometedoras para el suministro de fármacos a través de diferentes barreras biológicas y pueden ser aprovechados para el suministro de siRNA in vitro e in vivo. Su enfoque es generar exosomas fijados como objetivo a través de transfección de un vector de expresión, que comprende una proteína exosomai fusionada con un ligando de péptido. Los exosomas son entonces purificados y caracterizados a partir del sobrenadante de células transfectadas y, a continuación, el siRNA se carga en los exosomas.
Un aspecto de la manipulación de una secuencia diana también se refiere a la manipulación epigenética de una secuencia diana. Esto puede ser del estado de cromatina de una secuencia diana tal como por modificación del estado de metilación de la secuencia diana (es decir, adición o eliminación de metilación o patrones de metilación o islas CpG), modificación de histona, el aumento o la reducción de la accesibilidad a la secuencia diana, o mediante la promoción o la reducción de plegado 3D.
Un vector puede significar no sólo un sistema viral o de levadura (por ejemplo, en los casos en los que los ácidos nucleicos de interés pueden estar operativamente enlazados a y bajo el control de (en términos de expresión, tal como para proporcionar en última instancia un ARN procesado) un promotor, sino que también un suministro directo de ácidos nucleicos a una célula huésped.
La invención comprende también, en determinadas realizaciones, un método para tratar o inhibir una afección provocada por un defecto en una secuencia diana en un locus genómico de interés en un sujeto o un sujeto no humano en necesidad del mismo, que comprende la modificación del sujeto o del sujeto no humano mediante la manipulación de la secuencia diana y en el que la afección es susceptible de tratamiento o la inhibición por manipulación de la secuencia diana que comprende proporcionar un tratamiento que comprende: suministrar una composición que se produce de forma no natural o modificada por ingeniería genética que comprende un sistema de vectores que comprende uno o más vectores que comprende codificar de manera operativa una composición de la presente memoria comentada para la expresión de los mismos, en el que la secuencia diana es manipulada por la composición cuando se expresa.
En determinadas realizaciones de los métodos de esta memoria, los métodos pueden incluir la expresión de la inducción, que puede ser inducir la expresión de la enzima de CRISPR y/o inducir la expresión de las secuencias guía, tracr o de emparejamiento tracr. En determinadas realizaciones de los métodos en esta memoria, el organismo
o sujeto es un eucariota o un eucariota no humano. En determinadas realizaciones de los métodos en esta memoria, el organismo o sujeto es una planta. En determinadas realizaciones de los métodos en esta memoria, el organismo o sujeto es un mamífero o un mamífero no humano. En determinadas realizaciones de los métodos en esta memoria, el organismo o sujeto son algas.
Mientras que en los métodos de esta memoria el vector puede ser un vector viral y éste es ventajosamente un AAV, se pueden emplear otros vectores virales tal como se describen en esta memoria. Por ejemplo, se pueden utilizar baculovirus para la expresión en células de insectos. Estas células de insectos pueden, a su vez, ser útiles para
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producir grandes cantidades de otros vectores, tales como vectores de AAV adaptados para el suministro de la presente invención.
Asimismo, se prevé un método para suministrar la presente enzima de CRISPR, que comprende suministrar a la célula un ARNm que codifican la enzima de CRISPR. Se apreciará que la enzima de CRISPR está truncada, es de un tamaño específico según se describe en esta memoria, es una nucleasa o nickase o una proteína de unión a ADN genérico, está optimizada en codones, comprende una o más mutaciones y/o comprende una enzima de CRISPR quimérica, o las otras opciones como se discuten en esta memoria.
Asimismo, se prevé un método para preparar un vector para el suministro de las composiciones o las presentes enzimas de CRISPR de la invención y para su uso en los presentes métodos.
Se prefieren los vectores virales AAV. Por lo tanto, en un aspecto adicional, se proporciona un método de preparar un vector viral AAV, que comprende transfectar un plásmido o plásmidos que contienen o que consisten esencialmente en una molécula o moléculas de ácido nucleico que codifican el AAV en células de infectadas con AAV, y suministrar AAV rep y/o cap obligatorio para la replicación y el empaquetamiento del AAV. A este respecto, se apreciará que la enzima de CRISPR está truncada, está compuesto por menos de mil aminoácidos o menos de cuatro mil aminoácidos, es una nucleasa o nickase, está optimizada en codones, comprende una o más mutaciones y/o comprende una enzima de CRISPR quimérica tal como se comenta en esta memoria. En algunas realizaciones, el AAV rep y/o cap obligatorio para la replicación y el empaquetamiento del AAV se suministra mediante la transfección de las células con plásmido o plásmidos helper (cooperadores). En algunas realizaciones, el virus helper es un virus de la viruela, adenovirus, virus herpes o baculovirus. En algunas realizaciones, el virus de la viruela es un virus vacuna. En algunas realizaciones las células son células de mamíferos. Y en algunas realizaciones las células son células de insectos y el virus helper es baculovirus.
La invención comprende además en determinadas realizaciones una enzima de CRISPR modificada. Diferencias con la enzima de CRISPR de tipo salvaje pueden comprender: la enzima de CRISPR modificada está truncada en comparación con una enzima de CRISPR de tipo salvaje, o la enzima de CRISPR es de un tamaño específico, p. ej., de al menos 500 aminoácidos, al menos 800-899 aminoácidos, al menos 900-999 aminoácidos, al menos 1000-1099 aminoácidos, al menos 1100-1199 aminoácidos, al menos 1200-1299 aminoácidos, al menos 1300-1399 aminoácidos, al menos 1400-1499 aminoácidos, al menos 1500-1599 aminoácidos, al menos 1600-1699 aminoácidos o al menos 2000 aminoácidos; y/o la enzima de CRISPR es una nucleasa que dirige la escisión de ambas cadenas en la ubicación de la secuencia diana, o la enzima de CRISPR es una nickase que dirige la escisión de una cadena en el lugar de la secuencia diana, o la enzima de CRISPR es un mutante catalítico nulo que funciona como una proteína de unión de ADN; y/o la enzima de CRISPR está optimizada en codones o está optimizada en codones para la expresión en una célula eucariota, y/o la enzima de CRISPR comprende una o más mutaciones y/o la enzima de CRISPR comprende una enzima de CRISPR quimérica y/o la enzima de CRISPR tiene uno o más de otros atributos comentados en la presente memoria. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, la enzima de CRISPR comprende una o más mutaciones en residuos catalíticos tales como spCa9 D10A, E762A, H840A, N854A, N863A o D986A o los correspondientes a ellos en otras enzimas Cas (tal como se describe en esta memoria) con referencia a la numeración de la posición de SpCas9, y/o tiene una o más mutaciones se encuentra en un dominio RuvC I, RuvC II, RuvC III, HNH u otro dominio descrito en esta memoria de la enzima de CRISPR y/o la enzima de CRISPR tiene una o más mutaciones en un dominio catalítico, en el que, cuando se transcribe, una secuencia de emparejamiento tracr se hibrida con una secuencia tracr y una secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un complejo de CRISPR a una secuencia diana, y en donde la enzima comprende, además, un dominio funcional. El dominio funcional puede incluir, pero no se limita a activador transcripcional, represor transcripcional, una recombinasa, una transposasa, un remodelador de histona, una ADN metiltransferasa, un criptocromo, un dominio inducible/controlable por la luz o un dominio inducible/controlable químicamente. La enzima de CRISPR en determinadas realizaciones puede tener el dominio funcional que sea un dominio activador transcripcional, p. ej., VP64. En algunas realizaciones, un dominio represor transcripcional es KRAB. En algunas realizaciones, un dominio represor de la transcripción es SID, o concatámeros de SID (es decir SID4X). En algunas realizaciones, se proporciona una enzima modificadora epigenética.
En realizaciones preferidas, la enzima de CRISPR es una enzima Cas, p. ej., un ortólogo Cas9.
Aspectos de la invención también comprenden identificar nuevos ortólogos de enzimas de CRISPR. Los métodos para identificar nuevos ortólogos de enzimas CRISPR pueden implicar identificar secuencias tracr en los genomas de interés. La identificación de secuencias tracr puede estar relacionada con los siguientes pasos: Búsqueda de las repeticiones directas o secuencias de emparejamiento tracr en una base de datos para identificar una región
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% de homología cuando se realiza un alineamiento global. En consecuencia, la mayoría de los métodos de comparación de secuencias se diseñan para producir alineamientos óptimos que tienen en cuenta posibles inserciones y deleciones sin penalizar indebidamente la puntuación de homología o identidad global. Esto se consigue insertando "huecos" en el alineamiento de secuencias para intentar maximizar la homología o identidad local.
Sin embargo, estos métodos más complejos asignan "penalizaciones por hueco" a cada uno de los huecos que se produce en el alineamiento, de modo que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, un alineamiento de la secuencia con tan pocos huecos como sea posible -lo que refleja una mayor relatividad entre las dos secuencias comparadas -puede alcanzar una puntuación más alta que con muchos huecos. Se utilizan típicamente “costos de huecos de afinidad" que cargan un coste relativamente alto para la existencia de un hueco y una penalización más pequeña para cada uno de los residuos posteriores en el hueco. Este es el sistema de puntuación de huecos más comúnmente utilizado. Penalizaciones de huecos elevadas pueden producir, por supuesto, alineamientos optimizados con menos huecos. La mayoría de los programas de alineamiento permiten modificar las penalizaciones por hueco. Sin embargo, se prefiere utilizar los valores por defecto cuando se utiliza un software de este tipo para las comparaciones de secuencias. Por ejemplo, al utilizar el paquete GCG Wisconsin Bestfit la penalización por hueco por defecto para secuencias de aminoácidos es -12 para un hueco y -4 para cada extensión,
El cálculo del % máximo de homología, por tanto, requiere primero la producción de una alineación óptima, teniendo en consideración las penalizaciones por hueco. Un programa informático adecuado para llevar a cabo dicho alineamiento es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al., 1984 Nuc. Acids Research 12 p 387). Ejemplos de otros software que pueden realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete BLAST (véase Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4ª Ed. -Capítulo 18), FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 403-410) y el conjunto GENEWORKS de herramientas de comparación. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para la búsqueda en línea y fuera de línea (véase Ausubel et al., 1999, Short Protocols in Molecular Biology, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones, se prefiere utilizar el programa GCG Bestfit. Una nueva herramienta, denominada BLAST 2 Sequences, está también disponible para la comparación de secuencias de proteínas y nucleótidos (véase FEMS Microbiol Lett. 1999 174(2):247-50; FEMS Microbiol Lett. 1999 177(1):187-8 y el sitio web del Centro Nacional de información sobre Biotecnología en la página web de National Institutes for Health).
Aunque el % de homología final puede medirse en términos de identidad, el proceso de alineamiento en sí no se basa típicamente en una comparación de pares de todo o nada. En su lugar, se utiliza generalmente una matriz de puntuación de similitud a escala que asigna puntuaciones a cada comparación por pares basada en la similitud química o la distancia evolutiva. Un ejemplo de una matriz de este tipo comúnmente utilizada es la matriz BLOSUM62 -la matriz por defecto para el conjunto de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin generalmente utilizan cualquiera de los valores por defecto públicos o una tabla de comparación de símbolos personalizada, si se suministra (véase el manual del usuario para más detalles). Para algunas aplicaciones, se prefiere utilizar los valores por defecto públicos para el paquete GCG, o en el caso de otro software, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.
Alternativamente, las homologías porcentuales pueden calcularse utilizando la característica de alineamiento múltiple en DNASIS™ (Hitachi Software), basado en un algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG y Sharp PM (1988), Gene 73 (1), 237-244). Una vez que el software ha producido un alineamiento óptimo, es posible calcular el % de homología, preferentemente el % de identidad de secuencia. El software hace normalmente esto como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.
Las secuencias también pueden tener deleciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que producen un cambio silencioso y resultan en una sustancia funcionalmente equivalente. Sustituciones de aminoácidos deliberadas pueden realizarse sobre la base de la similitud en las propiedades de aminoácidos (tales como polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos) y, por lo tanto, es útil para agrupar juntos aminoácidos en grupos funcionales. Los aminoácidos pueden agruparse basándose en las propiedades de sus cadenas laterales solas. Sin embargo, es más útil incluir los datos de mutación también. Los conjuntos de aminoácidos así obtenidos es probable que se conserven por razones estructurales. Estos conjuntos pueden describirse en forma de un diagrama de Venn (Livingstone CD y Barton GJ (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput. Appl. Biosci. 9: 745756) (Taylor W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J. Theor. Biol. 119; 205-218). Sustituciones conservadoras se pueden hacer, por ejemplo, de acuerdo con la tabla que figura a continuación que describe un diagrama de Venn generalmente aceptado de agrupación de aminoácidos.
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F W Y H K M I L V A G C Aromático F W Y H
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Polar
W Y H K R E D C S T N Q Cargado H K R E D
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Pequeño
V C A G S P T N D Minúsculo A G S
Realizaciones de la invención incluyen secuencias (tanto de polinucleótidos o polipéptidos) que puede comprender la sustitución homóloga (sustitución y reemplazo se utilizan ambos en esta memoria para dar a entender el intercambio de un residuo de aminoácido o nucleótido existente, con un residuo o nucleótido alternativo) que puede producirse, es decir, una sustitución comparable en el caso de aminoácidos tal como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. También puede producirse una sustitución no homóloga, es decir, de una clase de residuo a otro o, alternativamente, que implica la inclusión de aminoácidos no naturales tales como ornitina (a la que se alude en lo sucesivo como Z), ornitina del ácido diaminobutírico (a la que se alude en lo sucesivo como B), ornitina norleucina (a la que se alude en lo sucesivo como O), pirilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina.
Secuencias de aminoácidos variantes pueden incluir grupos espaciadores adecuados que pueden insertarse entre cualesquiera dos residuos de aminoácidos de la secuencia, incluyendo grupos alquilo tales como grupos metilo, etilo
o propilo, además de espaciadores de aminoácidos tales como residuos glicina o β-alanina. Una forma adicional de variación, que implica la presencia de uno o más residuos aminoácidos en forma peptoide, pueda ser bien comprendida por los expertos en la técnica. Para evitar dudas, "la forma peptoide" se utiliza para referirse a residuos aminoácidos variantes, en donde el grupo de sustituyentes carbono α está en átomo de nitrógeno del residuo en lugar del carbono α. Procedimientos para preparar péptidos en forma peptoide son conocidos en la técnica, por ejemplo Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 y Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134.
La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de inmunología, bioquímica, química, biología molecular, microbiología, biología celular, genómica y ADN recombinante, que están dentro de la experiencia de la técnica. Véase Sambrook, Fritsch y Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª edición (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.
M. Ausubel, et al. comps., (1987)); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames y G.R. Taylor comps. (1995)), Harlow y Lane, comps. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, y ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, comp. (1987)).
En un aspecto, la invención proporciona vectores que se utilizan en la ingeniería y optimización de los sistemas CRISPR/Cas.
Tal como se utiliza en esta memoria, un "vector" es una herramienta que permite o facilita la transferencia de una entidad de un entorno a otro. Es un replicón, tal como un plásmido, fago, o cósmido, en el que se puede insertar otro segmento de ADN con el fin de llevar a cabo la replicación del segmento insertado. Generalmente, un vector es capaz de replicarse cuando se asocia con los elementos de control apropiados. En general, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Vectores incluyen, pero no se limitan a, moléculas de ácido nucleico que son de cadena sencilla, de cadena doble, o parcialmente de doble cadena; moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más extremos libres, sin extremos libres (p. ej., circulares); moléculas de ácido nucleico que comprenden ADN, ARN, o ambos; y otras variedades de polinucleótidos conocidos en la técnica. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble cadena circular en el que se pueden insertar segmentos de ADN adicionales tal como por técnicas de clonación molecular estándares. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que las secuencias de ADN o ARN derivadas de virus están presentes en el vector para el empaquetamiento en un virus (p. ej., retrovirus, retrovirus defectuosos en la replicación, adenovirus, adenovirus defectuosos en la replicación, y virus adeno-asociados). Los vectores virales también incluyen polinucleótidos portados por un virus para la transfección en una célula huésped. Determinados vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamífero). Otros vectores (p. ej., vectores no episomales de mamífero) se integran en el genoma de una célula huésped tras la
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introducción en la célula huésped y, con ello, se replican junto con el genoma del huésped. Además, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están enlazados operativamente. Tales vectores se denominan en esta memoria "vectores de expresión". Vectores de expresión comunes de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos. En esta memoria se proporciona una discusión adicional de vectores.
Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen uno o más elementos reguladores, que pueden seleccionarse sobre la base de las células huésped a utilizar para la expresión, que están operativamente enlazadas a la secuencia de ácido nucleico a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, "enlazada operativamente" pretende significar que la secuencia de nucleótidos de interés está enlazada al o a los elementos reguladores de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (p. ej., en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector se introduce en la célula huésped). Con respecto a métodos de recombinación y de clonación, se hace mención a la solicitud de patente de EE.UU. 10/815.730, publicada el 2 de septiembre de 2004 como US 2004-0171156 A1.
Aspectos y realizaciones de la invención se refieren a vectores bicistrónicos para ARN quimérico y Cas9 o un ortólogo Cas9. En algunas realizaciones, la Cas9 es impulsada por el promotor promotor CBh. En algunas realizaciones, el ARN quimérico es impulsado por un promotor U6. Preferiblemente, el CBh y U6 se utilizan juntos, en el sentido de que Cas9 es impulsada por el promotor CBh y el ARN quimérico es impulsado por un promotor U6. En algunas realizaciones, el ARN guía quimérico consiste en una secuencia guía de 20 pb (Ns) unidos a la secuencia tracr (que va desde la primera "U" de la cadena inferior al extremo del transcrito), que está truncada en diversas posiciones tal como se indica. Las secuencias guía y tracr están separadas preferiblemente por la secuencia de emparejamiento tracr. Un ejemplo preferido de una secuencia de emparejamiento tracr es GUUUUAGAGCUA. Esto es seguido preferiblemente por una secuencia de bucle. El bucle es preferiblemente GAAA, pero no se limita a esta secuencia o, de hecho, sólo es de 4 pb de longitud. De hecho, secuencias formadoras de bucle preferidas para su uso en estructuras de horquilla son de cuatro nucleótidos de longitud, y lo más preferiblemente tienen la secuencia GAAA. Sin embargo, se pueden utilizar secuencias de bucle más largas o más cortas, al igual que secuencias alternativas. Las secuencias incluyen preferiblemente un triplete de nucleótidos (por ejemplo, AAA), y un nucleótido adicional (por ejemplo C o G). Ejemplos de secuencias formadoras de bucle incluyen CAAA y AAAG. A lo largo de esta solicitud, ARN quimérico también se puede denominar ARN guía sencillo
o guía sintético (sgRNA).
Por ejemplo, tal como se describe en detalle específico en el Ejemplo 2, ARNs guía quiméricos pueden ser diseñados tal como se muestra en la Figura 8. Los loci de CRISPR en algunas de estas familias se representan en la Figura 11. Las correspondientes secuencias de ARN guía se muestran en la Figura 12. Los autores de la invención analizaron la secuencia de ADN genómico dentro ~ 2kb de las proteínas Cas9 e identificaron repeticiones directas que van desde 35 pb a 50 pb, con separadores intermedios que van desde 29 pb a 35 pb. Sobre la base de la secuencia de repetición directa, realizaron búsquedas de secuencias candidatas de tracrRNA con los siguientes criterios: fuera de la matriz de crRNA, pero que contienen un alto grado de homología con repeticiones directas (tal como se requiere para el apareamiento de bases repetición directa:tracRNA; el análisis personalizado de cálculo), fuera de las regiones codificantes de los componentes de la proteína, que contienen señales de terminación de la transcripción de ~ 60 pb-120 pb aguas abajo de la región de homología con repeticiones directas y el co-plegamiento con repetición directa para formar un dúplex, seguido de dos o más estructuras de horquilla en el extremo distal de la secuencia de tracrRNA. Sobre la base de estos criterios de predicción, los autores de la invención seleccionaron un conjunto inicial de 18 proteínas Cas9 y sus repeticiones y tracrRNAs directos asociados de forma única distribuidos a través de las cinco familias Cas9. La solicitante generó, además, un conjunto de 18 estructuras de ARN quiméricas que conservaron la secuencia y las estructuras secundarias del dúplex repetición directa:tracRNA nativo, al tiempo que acortan la región de apareamiento de bases y fusionan los dos elementos de ARN a través de un bucle artificial (Figuras 6 A-J).
La expresión "elemento regulador" pretende incluir promotores, potenciadores, sitios de entrada al ribosoma interno (IRES), y otros elementos de control de la expresión (p. ej., señales de terminación de la transcripción tales como señales de poliadenilación y secuencias poli-U). Se describen estos elementos reguladores, por ejemplo, en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Elementos reguladores incluyen los que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huéspedes y los que dirigen la expresión directa de la secuencia de nucleótidos sólo en determinadas células huéspedes (p. ej., secuencias reguladoras específicas para el tejido). Un promotor específico para el tejido puede dirigir la expresión principalmente en un tejido deseado de interés tal como
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En algunas realizaciones, un vector impulsa la expresión de proteínas en células de insecto utilizando vectores de expresión de baculovirus. Vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (p. ej., células SF9) incluyen la serie pAc (Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers, 1989. Virology 170:31-39).
En algunas realizaciones, un vector es capaz de impulsar la expresión de una o más secuencias en células de mamífero utilizando un vector de expresión de mamífero. Ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6:187-195). Cuando se utiliza en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión son proporcionadas típicamente por uno o más elementos reguladores. Por ejemplo, promotores comúnmente utilizados se derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus, virus de simio 40, y otros descritos en esta memoria y conocidos en la técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como eucariotas véanse, p ej., los Capítulos 16 y 17 de Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING:. A LABORATORY MANUAL. 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989.
En algunas realizaciones, el vector de expresión de mamífero recombinante es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de célula particular (p. ej., elementos reguladores específicos para tejidos se utilizan para expresar el ácido nucleico). Elementos reguladores específicos para tejidos son conocidos en la técnica. Ejemplos no limitantes de promotores específicos para tejidos, adecuados, incluyen el promotor de albúmina (específico para el hígado; Pinkert, et al., 1987, Genes Dev. 1: 268-277), promotores linfoide-específicos (Calame y Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43:235-275), en particular promotores de receptores de células T (Winoto y Baltimore, 1989. EMBO J. 8:729-733) e inmunoglobulinas (Baneiji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen y Baltimore, 1983 Cell
33: 741-748), promotores específicos para neuronas (p. ej., el promotor para neurofilamentos; Byrne y Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477), promotores específicos para páncreas (Edlund, et al., 1985. Science 230:912-916) y promotores específicos para glándulas mamarias (p. ej., promotor de suero lácteo; patente de EE.UU. Nº. 4.873.316 y la Publicación de Solicitud Europea Nº 264.166.). Promotores regulados en el desarrollo también están comprendidos, p. ej., los promotores hox murinos (Kessel y Gruss, 1990. Science 249:374-379) y el promotor de α-fetoproteína (Campes y Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546). Con respecto a estos vectores procarióticos y eucarióticos, se hace mención a la patente de EE.UU. 6.750.059. Otras realizaciones de la invención pueden estar relacionadas con el uso de vectores virales, en lo que respecta a los que se hace mención en la solicitud de patente de EE.UU. 13/092.085. Elementos reguladores específicos para tejidos son conocidos en la técnica y, en este sentido, se hace mención a la patente de EE.UU. 7.776.321.
En algunas realizaciones, un elemento regulador está enlazado operativamente a uno o más elementos de un sistema de CRISPR con el fin de impulsar la expresión de los uno o más elementos del sistema de CRISPR. En general, las CISPRs (Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas), también conocidas como SPIDRs (Repeticiones Directas Intercaladas Separadas), constituyen una familia de loci de ADN que habitualmente son específicos para una especie bacteriana particular. El locus de CRISPR puede comprender una clase distinta de Repeticiones de Secuencia Corta Intercaladas (SSRs) que fueron reconocidas en E. coli (Ishino et al, J. Bacteriol., 169:5429-5433 [1987]; y Nakata et al, J. Bacteriol., 171: 3553-3556 [1989]), y genes asociados. SSRs intercaladas similares han sido identificadas en Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena y Mycobacterium tuberculosis (Véase, Groenen et al, Mol. Microbiol., 10:1057-1065 [1993]; Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5:254-263 [1999]; Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30 [1996]; y Mojica et al., Mol. Microbiol., 17:85-93 [1995]). Los loci CRISPR difieren típicamente de otros SSRs por la estructura de las repeticiones, que se han denominado repeticiones cortas regularmente espaciadas (SRSRs) (Janssen et al., OMICS J. Integ. Biol., 6:2333 [2002]; y Mojica et. al., Mol Microbiol, 36:244-246 [2000]). En general, las repeticiones son elementos cortos que se producen en grupos que están espaciados regularmente por secuencias intermedias únicas con una longitud sustancialmente constante (Mojica et al., [2000], supra). Aunque las secuencias de repetición están altamente conservadas entre las cepas, el número de repeticiones intercaladas y las secuencias de las regiones del espaciador difieren típicamente de una cepa a otra (van Embden et al., J. Bacteriol., 182:2393-2401 [2000]). Loci CRISPR han sido identificados en más de 40 procariotas (Véase, p. ej., Jansen et al, Mol. Microbiol., 43:1565-1575 [2002]; y Mojica et al., [2005]), incluyendo, pero no limitado a Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus, Halocarcula, Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobacterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Myxococcus, Campylobacter, Wolinella, Acinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pasteurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthomonas, Yersinia, Treponema y Thermotoga.
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En general, "sistema de CRISPR" se refiere colectivamente a transcritos y otros elementos implicados en la expresión de o dirigir la actividad de genes CRISPR-asociados ("Cas"), incluyendo secuencias que codifican un gen Cas, una secuencia tracr (CRISPR trans-activante) (p. ej., tracrRNA o un tracrRNA parcial activo), una secuencia de emparejamiento tracr (que abarca una "repetición directa" y una repetición directa parcial procesada por tracrRNA en el contexto de un sistema de CRISPR endógeno), una secuencia guía (a la que también se alude como un "espaciador" en el contexto de un sistema de CRISPR endógeno), u otras secuencias y transcritos de un locus CRISPR. En algunas realizaciones, uno o más elementos de un sistema de CRISPR se derivan de un sistema de CRISPR de tipo I, tipo II o de tipo III. En algunas realizaciones, uno o más elementos de un sistema de CRISPR se derivan de un organismo particular que puede comprender un sistema de CRISPR endógeno tal como Streptococcus pyogenes. En general, un sistema de CRISPR se caracteriza por elementos que fomentan la formación de un complejo de CRISPR en el sitio de una secuencia diana (al que también se alude como un protoespaciador en el contexto de un sistema de CRISPR endógeno). En el contexto de la formación de un complejo de CRISPR, "secuencia diana" se refiere a una secuencia a la que una secuencia guía está diseñada para que tenga complementariedad, en donde la hibridación entre una secuencia diana y una secuencia guía fomenta la formación de un complejo de CRISPR. Una secuencia diana puede comprender cualquier polinucleótido tal como polinucleótidos de ADN o ARN. En algunas realizaciones, una secuencia diana se encuentra en el núcleo o citoplasma de una célula.
En realizaciones preferidas de la invención, el sistema de CRISPR es un sistema de CRISPR de tipo II y la enzima Cas es Cas9, que cataliza la escisión de ADN. La acción enzimática por Cas9 derivada de Streptococcus pyogenes
o cualquier Cas9 estrechamente relacionada genera roturas de doble cadena en las secuencias del sitio diana que se hibridan a 20 nucleótidos de la secuencia guía y que tienen una secuencia del motivo adyacente al protoespaciador (PAM) NGG/NRG (por ejemplo, tal como se discute en otra parte, un PAM adecuado es 5’-NRG o 5’-NNGRR para SpCas9 o enzimas (o enzimas derivadas) SaCas9, respectivamente) después de los 20 nucleótidos de la secuencia diana. La actividad de CRISPR a través de Cas9 para el reconocimiento de ADN específico para el sitio y la escisión se definen por la secuencia guía, la secuencia tracr que se hibrida en parte a la secuencia guía y la secuencia de PAM. Se describen más aspectos del sistema de CRISPR en Karginov y Hannon. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea, Mole Cell 2010, 15 de enero; 37(1): 7.
El locus de CRISPR de tipo II de Streptococcus pyogenes SF370 contiene un racimo de cuatro genes Cas9, Cas1, Cas2 y Csn1, así como dos elementos de ARN no codificantes, tracrRNA y una matriz característica de secuencias repetitivas (repeticiones directas) interespaciadas por tramos cortos de secuencias no repetitivas (espaciadores, aproximadamente de 30 pb cada uno). En este sistema, la rotura de doble cadena de ADN (DSB) fijada como objetivo se genera en cuatro etapas secuenciales (Figura 2A). En primer lugar, dos ARN no codificantes, la matriz pre-crRNA y tracrRNA se transcriben a partir del locus de CRISPR. En segundo lugar, tracrRNA se hibrida a las repeticiones directas de pre-crRNA, que se procesa luego en crRNA maduros que contienen secuencias de espaciador individuales. En tercer lugar, el complejo crRNA:tracrRNA maduro dirige Cas9 a la diana de ADN que consiste en el protoespaciador y el PAM correspondiente a través de la formación de heteroduplex entre la región del espaciador del crRNA y el ADN del protoespaciador. Por último, Cas9 media en la escisión del ADN diana aguas arriba del PAM para crear una DSB dentro del protoespaciador (Figura 2A). La Figura 2B muestra la ubicación nuclear de Cas9 optimizado en codones. Para fomentar la iniciación de la transcripción precisa, se seleccionó el promotor U6 basado en ARN polimerasa III para impulsar la expresión de tracrRNA (Figura 2C). De manera similar, se desarrolló una construcción basada en el promotor U6 para expresar una matriz de pre-crRNA que consiste en un único espaciador flanqueado por dos repeticiones directas (DRs, también abarcados por la expresión "secuencias de emparejamiento de tracr”; Figura 2C). El espaciador inicial se diseñó para fijar como objetivo un sitio diana de 33 pares de bases (pb) (protoespaciador de 30 pb más una secuencia del motivo de CRISPR (PAM) de 3 pb que satisface el motivo de reconocimiento de NGG de Cas9) en el locus EMX1 humano (Figura 2C), un gen clave en el desarrollo de la corteza cerebral.
La Figura 16 muestra ortólogos Cas9 y respectivos sgRNAs se utilizan para escindir dos dianas candidatas presentes en un banco basado en pUC19. La diana 1 es seguida por un PAM aleatorio que contiene 7 bases degeneradas (5’-NNNNNNN -3’), y la diana 1’, que contiene la misma secuencia diana que la diana 1, es seguida por un PAM fijo (5'-TGGAGAAT-3). El sgRNA de cada uno de los ortólogos Cas9 contiene la secuencia guía contra la diana 1 o diana 1’. Imágenes en gel muestran la escisión con éxito por 20 ortólogos Cas9, lo que indica que estos diseños de sgRNA son funcionales con sus respectivas enzimas Cas9.
En algunas realizaciones, repeticiones directas o secuencias de emparejamiento tracr se descargan de la base de datos CRISPRs o se identifican in silico mediante el rastreo de motivos repetitivos que 1. se encuentran en una ventana de 2 kb de secuencia genómica flanqueante del locus CRISPR de tipo II, 2. abarcan de 20 a 50 pb, y 3.
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puede ser visualizada la ubicación dentro de una célula, tal como en combinación con medios para detectar la ubicación del núcleo (p. ej., un colorante específico para el núcleo, tal como DAPI). Los núcleos de las células también pueden aislarse de las células, cuyos contenidos pueden luego ser analizados mediante cualquier procedimiento adecuado para la detección de proteínas, tal como inmunohistoquímica, transferencia Western o un ensayo de actividad enzimática. La acumulación en el núcleo también puede determinarse indirectamente tal como mediante un ensayo para el efecto de la formación de complejos CRISPR (p. ej., ensayo para la escisión o mutación de ADN en la secuencia diana, o ensayo para la actividad de la expresión génica alterada, afectada por la formación de complejos de CRISPR y/o actividad de la enzima de CRISPR), en comparación con un control no expuesto a la enzima o complejo CRISPR, o expuesto a una enzima de CRISPR que carece de la una o más NLSs.
En general, una secuencia guía es cualquier secuencia de polinucleótidos que tiene suficiente complementariedad con una secuencia de polinucleótidos diana para hibridarse con la secuencia diana y dirigir la unión específica para la secuencia de un complejo de CRISPR a la secuencia diana. En algunas realizaciones, el grado de complementariedad entre una secuencia guía y su secuencia diana correspondiente, cuando se alinean óptimamente utilizando un algoritmo de alineación adecuado, se trata de o más de aproximadamente 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99%, o más. Un alineamiento óptimo puede ser determinado con el uso de cualquier algoritmo adecuado para el alineamiento de secuencias, ejemplos no limitativos de los cuales incluyen el algoritmo de Smith-Waterman, el algoritmo de Needleman-Wunsch, algoritmos basados en la Transformada de Burrows-Wheeler (p. ej., el Alineador de Burrows Wheeler), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies; disponible en www.novocmft.com), ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (disponible en soap.genomics.org.cn) y Maq (disponible en maq.sourceforge.net). En algunas realizaciones, una secuencia guía está relacionada en aproximadamente o más de aproximadamente 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, una secuencia guía es menor que aproximadamente 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, o menos nucleótidos de longitud. La capacidad de una secuencia de guía para dirigir unión específica para la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia diana se puede determinar mediante cualquier ensayo adecuado. Por ejemplo, los componentes de un sistema de CRISPR, suficientes para formar un complejo de CRISPR, incluyendo la secuencia guía a ensayar, se pueden proporcionar a una célula huésped que tiene la secuencia diana correspondiente, tal como por transfección con vectores que codifican los componentes de la secuencia CRISPR, seguido de un estudio de escisión preferencial dentro de la secuencia diana tal como el ensayo Surveyor como se describe en esta memoria. De manera similar, la escisión de una secuencia de polinucleótido diana puede ser evaluada en un tubo de ensayo proporcionando la secuencia diana, componentes de un complejo de CRISPR, que incluye la secuencia guía a ensayar y una secuencia guía de control diferente de la secuencia guía de ensayo, y comparando la unión o la tasa de escisión en la secuencia diana entre las reacciones de ensayo y de la secuencia guía de control. Son posibles otros ensayos, y se les ocurrirán a los expertos en la técnica.
Nickase multiplezda: Aspectos de optimización y las enseñanzas de Cas9 detallada en esta solicitud también se pueden utilizar para generar nickases Cas9. Nickases Cas9 se pueden utilizar ventajosamente en combinación con pares de ARNs guía para generar roturas de la doble cadena de ADN con colgantes definidos. Cuando se utilizan dos pares de ARNs guía, es posible escindir un fragmento de ADN intermedio. Si un trozo exógeno de ADN es escindido por los dos pares de ARNs guía para generar colgantes compatibles con el ADN genómico, entonces el fragmento de ADN exógeno se puede ligar en el ADN genómico para reemplazar el fragmento escindido. Por ejemplo, esto se puede utilizar para eliminar la expansión de repetición de trinucleótidos en el gen huntingtina (HIT para el tratamiento de la enfermedad de Huntington.
Cas9 y su ARN guía quimérico, o combinación de tracrRNA y crRNA, se pueden suministrar como ADN o ARN. El suministro de Cas9 y ARN guía ambos como moléculas de ARN (normal o con un contenido de bases o modificaciones de la cadena principal) se puede utilizar para reducir la cantidad de tiempo que la proteína Cas9 persiste en la célula. Esto puede reducir el nivel de la actividad de escisión fuera de objetivo en la célula diana. Dado que el suministro de Cas9 como ARNm requiere tiempo para ser traducido en proteína, podría ser ventajoso suministrar el ARN guía varias horas después del suministro de ARNm de Cas9, para maximizar el nivel de ARN guía disponible para la interacción con la proteína Cas9.
En situaciones en las que la cantidad de ARN guía es limitante, puede ser deseable introducir Cas9 como ARNm y ARN guía en forma de una casete de expresión de ADN con un promotor que impulsa la expresión del ARN guía. De esta manera la cantidad de ARN guía disponible será amplificada a través de la transcripción.
Se puede introducir una diversidad de sistemas de suministro para introducir Cas9 (ADN o ARN) y ARN guía (ADN oARN) en la célula huésped. Éstos incluyen el uso de liposomas, vectores virales, electroporación, nanopartículas, nanohilos (Shalek et al., Nano Letters, 2012), exosomas. Liposomas de caballos de Troya moleculares (Pardridge et
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realizaciones, un molde de recombinación está diseñado para servir como un molde en la recombinación homóloga tal como dentro o cerca de una secuencia diana mellada o escindida por una enzima de CRISPR como parte de un complejo de CRISPR. Un polinucleótido molde puede ser de cualquier longitud adecuada, tal como aproximadamente o más de aproximadamente 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000, o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el polinucleótido molde es complementario a una parte de un polinucleótido que puede comprender la secuencia diana. Cuando se alinean óptimamente, un polinucleótido molde podría solaparse con uno o más nucleótidos de una secuencia diana (p. ej., aproximadamente o más de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, o más nucleótidos). En algunas realizaciones, cuando una secuencia de un molde y un polinucleótido, que comprende una secuencia diana, se alinean de manera óptima, el nucleótido más próximo del polinucleótido del molde está dentro de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000, o más nucleótidos de la secuencia diana.
En algunas realizaciones, la enzima de CRISPR es parte de una proteína de fusión que comprende uno o más dominios de proteínas heterólogos (p. ej., aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más dominios, además de la enzima de CRISPR). Una proteína de fusión enzima de CRISPR puede comprender cualquier secuencia de la proteína adicional, y opcionalmente una secuencia de unión entre cualquiera de dos dominios. Ejemplos de dominios de proteínas que pueden fusionarse con una enzima de CRISPR incluyen, sin limitación, macadores de epítopos, secuencias de gen indicador y dominios de proteínas que tienen una o más de las siguientes actividades: actividad metilasa, actividad desmetilasa, actividad de activación de la transcripción, actividad de represión de la transcripción, actividad del factor de liberación de la transcripción, actividad de la modificación de histonas, actividad de escisión del ARN y actividad de unión a ácido nucleico. Ejemplos no limitantes de marcadores de epítopos incluyen marcadores de histidina (His), marcadores V5, marcadores FLAG, marcadores de hemaglutinina de la gripe (HA), marcadores Myc, marcadores VSV-G y marcadores de tiorredoxina (Trx). Ejemplos de genes informadores incluyen, pero no se limitan a, glutatión-S-transferasa (GST), peroxidasa de rábano picante (HRP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), beta-galactosidasa, beta-glucuronidasa, luciferasa, proteína fluorescente verde (GFP), HcRed, DsRed, proteína fluorescente cian (CFP), proteína amarilla fluorescente (YFP) y proteínas autofluorescentes incluyendo la proteína fluorescente azul (BFP). Una enzima de CRISPR puede fusionarse a una secuencia de gen que codifica una proteína o un fragmento de una proteína que une moléculas de ADN o une otras moléculas celulares, incluyendo pero no limitada a la proteína de unión a maltosa (MBP), S-tag, fusiones del dominio de unión a ADN (DBD) de Lex A, fusiones del dominio de unión a ADN de GAL4 y fusiones de la proteína BP16 del virus herpes simplex (HSV). Dominios adicionales que pueden formar parte de una proteína de fusión que puede comprender una enzima de CRISPR se describen en el documento US20110059502. En algunas realizaciones, se utiliza una enzima de CRISPR marcada para identificar la ubicación de una secuencia diana.
En algunas realizaciones, una enzima de CRISPR puede formar un componente de un sistema inducible. La naturaleza inducible del sistema permitiría un control de espacio-temporal de la edición gen o la expresión génica utilizando una forma de energía. La forma de energía puede incluir, pero no se limita a la radiación electromagnética, energía sonora, energía química y energía térmica. Ejemplos de sistema inducible incluyen promotores de tetraciclina inducibles (Tet-On o Tet-Off), sistemas de activaciones de transcripción de dos híbridos de moléculas pequeñas (FKBP, ABA, etc.), o sistemas inducibles por la luz (fitocromo, dominios LOV, o criptocromo). En una realización, la enzima CRISPR puede ser una parte de un Efector Transcripcional Inducible por la Luz (LITE) para dirigir cambios en la actividad transcripcional de una manera específica para la secuencia. Los componentes de una luz pueden incluir una enzima de CRISPR, un heterodímero citocromo sensible a la luz (p. ej., de Arabidopsis thaliana), y un dominio de activación/represión transcripcional.
En algunos aspectos, la invención proporciona métodos que comprenden suministrar uno o más polinucleótidos, tales como o uno o más vectores tal como se describen en esta memoria, uno o más transcritos de los mismos, y/o una o más proteínas transcritas de los mismos, a una célula huésped. En algunos aspectos, la invención proporciona, además, células producidas por tales métodos, y animales que comprenden o son producidos a partir de tales células. En algunas realizaciones, una enzima de CRISPR en combinación con (y opcionalmente formando complejo con) una secuencia guía se suministra a una célula. Métodos de transferencia génica basados en virus y no virales convencionales pueden utilizarse para introducir ácidos nucleicos en células de mamífero o tejidos diana. Tales métodos se pueden utilizar para administrar ácidos nucleicos que codifican componentes de un sistema de CRISPR para células en cultivo, o en un organismo huésped. Sistemas de suministro de vectores no virales incluyen plásmidos de ADN, ARN (p. ej., un transcrito de un vector descrito en esta memoria), ácido nucleico desnudo y ácido nucleico formando complejo con un vehículo de suministro, tal como un liposoma. Sistemas de suministro de vectores virales incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas episomales o integrados después dl suministro a la célula. Para una revisión de procedimientos de terapia génica, véase Anderson, Science 256: 808-813 (1992); Nabel y Felgner, TIBTECH 11: 211-217 (1993); Mitani y Caskey, TIBTECH 11;162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357: 455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne,
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de una línea celular que empaqueta un vector de ácido nucleico en una partícula viral. Los vectores contienen típicamente las secuencias virales mínimas requeridas para el empaquetamiento y la posterior integración en un huésped, siendo reemplazadas otras secuencias virales por una casete de expresión para el o los polinucleótidos a expresar. Las funciones virales que faltan se suministran normalmente en trans por la línea celular de empaquetamiento. Por ejemplo, los vectores AAV utilizados en terapia génica poseen típicamente sólo secuencias ITR del genoma de AAV que se requieren para el empaquetamiento y la integración en el genoma huésped. El ADN viral se empaqueta en una línea celular, que contiene un plásmido auxiliar que codifica los otros genes AAV, a saber rep y cap, pero que carece de secuencias ITR. La línea celular también puede estar infectada con adenovirus como un helper (cooperador). El virus helper fomenta la replicación del vector AAV y la expresión de genes AAV a partir del plásmido helper. El plásmido helper no está empaquetado en cantidades significativas debido a una carencia de secuencias ITR. La contaminación con adenovirus puede reducirse mediante, p. ej., tratamiento térmico al que el adenovirus es más sensible que AAV. Métodos adicionales para el suministro de ácidos nucleicos a las células son conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, el documento US20030087817.
Por consiguiente, el AAV se considera un candidato ideal para su uso como un vector de transducción. Tales vectores de transducción AAV pueden comprender suficientes funciones que actúan en cis para replicar en presencia de adenovirus o virus herpes o virus de la viruela (p. ej., virus vacuna) funciones helper proporcionadas en trans. AAV recombinante (rAAV) puede utilizarse para transportar genes exógenos a células de una diversidad de linajes. En estos vectores, los genes cap y/o rep de AAV se eliminan del genoma viral y se reemplazan por un segmento de ADN de elección. Vectores AAV actuales pueden alojar hasta 4300 bases de ADN insertado.
Existe un cierto número de maneras de producir rAAV, y la invención proporciona rAAV y métodos para preparar rAAV. Por ejemplo, un plásmido o plásmidos que contienen o consisten esencialmente en la construcción viral deseada se transfectan en células infectadas con AAV. Además, un segundo o adicional plásmido helper se cotransfecta en estas células para proporcionar los genes cap y/o rep de AAV que son obligatorias para replicación y el empaquetamiento de la construcción viral recombinante. Bajo estas condiciones, las proteínas rep y/o cap de AAV actúan en trans para estimular la replicación y el empaquetamiento de la construcción de rAAV. Dos a tres días después de la transfección, se recoge el rAAV. Tradicionalmente el rAAV se recoge de las células junto con adenovirus. El adenovirus contaminante se inactiva luego por tratamiento térmico. En la presente invención, el rAAV se recoge ventajosamente no de las propias células, sino a partir de sobrenadante celular. Por consiguiente, en un aspecto inicial, la invención proporciona preparar rAAV, y además de lo anterior, rAAV se puede preparar por un método que comprende o consiste esencialmente en: infectar células susceptibles con un ADN exógeno que contiene rAAV, incluyendo ADN para la expresión, y virus helper (p. ej., adenovirus, virus herpes, virus de la viruela tales como el virus vacuna) en el que el rAAV carece de cap y/o rep funcionales (y el virus helper (p. ej., adenovirus, virus herpes, virus de la viruela tales como el virus vacuna) proporciona la función cap y/o rep de la que carece el rAAV); o infectar células susceptibles con un rAAV que contiene ADN exógeno incluyendo ADN para la expresión, en donde el recombinante carece de cap y/o rep funcional, y transfectar dichas células con un plásmido que suministra la función cap y/o rep de la que carece el rAAV; o infectar células susceptibles con un rAAV que contiene ADN exógeno incluyendo ADN para la expresión, en donde el recombinante carece de cap y/o rep funcional, en donde dichas células suministran la función cap y/o rep de la que carece el recombinante carece; o transfectar las células susceptibles con un AAV que carecen de cap y/o rep funcional y plásmidos para la inserción de ADN exógeno en el recombinante, de modo que el ADN exógeno se expresa por el recombinante y para suministrar las funciones rep y/o cap, con lo que la transfección resulta en un rAAV que contiene el ADN exógeno incluyendo ADN para la expresión que carece de cap y/o rep funcional.
El rAAV puede ser de un AAV tal como se describe en esta memoria, y ventajosamente puede ser un rAAV1, rAAV2, AAV5 o rAAV que tiene un híbrido o una cápside que puede comprender AAV1, AAV2, AAV5 o cualquier combinación de los mismos. Se puede seleccionar el AAV del rAAV con respecto a las células a ser fijadas como objetivo por el rAAV; p. ej., se puede seleccionar AAV serotipos 1, 2, 5 o un híbrido o la cápside de AAV 1, AAV2, AAV5 o cualquier combinación de los mismos para fijar como objetivo células del cerebro o neuronales; y se puede seleccionar AAV4 para fijar como objetivo tejido cardíaco, AAV8 para fijar como objetivo tejido del hígado.
Además de las células 293, en la práctica de la invención se pueden utilizar otras células y la infectividad relativa de determinados serotipos de AAV in vitro en cuanto a estas células (véase Grimm, D. et al, J. Virol 82.: 5887-5911 (2008)) es la siguiente:
Línea Celular
AAV-1 AAV-2 AAV-3 AAV-4 AAV-5 AAV-6 AAV-8 AAV-9
Huh-7
13 100 2,5 0,0 0,1 10 0,7 0,0
HEK293
25 100 2,5 0,1 0,1 5 0,7 0,1
HeLa
3 100 2,0 0,1 6,7 1 0,2 0,1
HepG2
3 100 16,7 0,3 1,7 5 0,3 ND
Hep1A
20 100 0,2 1,0 0,1 1 0,2 0,0
911
17 100 11 0,2 0,1 17 0,1 ND
CHO
100 100 14 1,4 333 50 10 1,0
COS
33 100 33 3,3 5,0 14 2,0 0,5
MeWo
10 100 20 0,3 6,7 10 1,0 0,2
NIH3T3
10 100 2,9 2,9 0,3 10 0,3 ND
A549
14 100 20 ND 0,5 10 0,5 0,1
HT1180
20 100 10 0,1 0,3 33 0,5 0,1
Monocitos
1111 100 ND ND 125 1429 ND ND
DC inmadura
2500 100 ND ND 222 2857 ND ND
DC madura
2222 100 ND ND 333 3333 ND ND
La invención proporciona rAAV que contiene o consiste esencialmente en una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica un sistema de CRISPR (Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente 5 Interespaciadas), p. ej., una pluralidad de casetes que comprenden o consisten en una primera casete que comprende o consiste esencialmente en un promotor, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína CRISPR-asociada (Cas) (proteínas nucleasa o helicasa putativas), p. ej., Cas9 y un terminador, y dos, o más, de manera ventajosa hasta el límite de tamaño de empaquetamiento del vector, p. ej., en total (incluyendo la primera casete) de cinco casetes que comprenden o consisten esencialmente en un promotor, una molécula de ácido 10 nucleico que codifica ARN guía (gRNA) y un terminador (p. ej., cada una de las casetes representada esquemáticamente como Promotor-gRNA1-terminador, Promotor-gRNA2-terminador…. Promotor-gRNA(N)terminador (en donde N es un número que puede ser insertado que se encuentra en un límite superior del límite de tamaño de empaquetamiento del vector), o dos o más rAAVs individuales, cada uno de los cuales contiene una o más de una casete de un sistema de CRISPR, p. ej., un primer rAAV que contiene la primera casete que comprende 15 o que consiste esencialmente en un promotor, una molécula de ácido nucleico que codifica Cas, p. ej., Cas9 y un terminador y un segundo rAAV que contiene una pluralidad, cuatro, casetes que comprende o consiste
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específicamente las proteínas tirosina-fosforiladas están disponibles de un número de proveedores, incluyendo Invitrogen y Perkin Elmer. Anticuerpos anti-fosfotirosina son particularmente útiles en la detección de proteínas que son fosforiladas diferencialmente en sus residuos de tirosina en respuesta a un estrés ER. Tales proteínas incluyen, pero no se limitan al factor 2 alfa de iniciación de la traducción eucariótica (eIF-2α). Alternativamente, estos anticuerpos pueden generarse utilizando tecnologías de anticuerpos policlonales o monoclonales convencionales mediante la inmunización de un animal huésped o una célula productora de anticuerpos con una proteína diana que exhibe la modificación post-traduccional deseada.
En la práctica del método en cuestión, puede ser deseable discernir el patrón de expresión de una proteína asociada con una vía de señalización bioquímica en diferentes tejidos corporales, en diferentes tipos de células y/o en diferentes estructuras subcelulares. Estos estudios se pueden realizar con el uso de anticuerpos específicos para el tejido, específicos para la célula o específicos para la estructura subcelular, capaces de unirse a marcadores de proteínas que se expresan preferentemente en determinados tejidos, tipos de célula o estructuras subcelulares.
Una expresión alterada de un gen asociado con una vía de señalización bioquímica también se puede determinar examinando un cambio en la actividad del producto génico con relación a una célula de control. El ensayo para un cambio inducido por agente en la actividad de una proteína asociada con una vía de señalización bioquímica dependerá de la actividad biológica y/o la vía de transducción de señales que está bajo investigación. Por ejemplo, en los casos en los que la proteína es una quinasa, un cambio en su capacidad para fosforilar el o los sustratos aguas abajo puede ser determinado por una diversidad de ensayos conocidos en la técnica. Ensayos representativos incluyen, pero no se limitan a inmunotransferencia e inmunoprecipitación con anticuerpos tales como anticuerpos anti-fosfotirosina que reconocen las proteínas fosforiladas. Además, la actividad quinasa se puede detectar por ensayos quimioluminiscentes de alto rendimiento tales como los ensayos AlphaScrea™ (disponible de Perkin Elmer) y eTag™ (Chan-Hui, et al. (2003) Clinical Immunology 111:162-174).
En los casos en los que la proteína asociada con una vía de señalización bioquímica es parte de una cascada de señalización que conduce a una fluctuación de la condición de pH intracelular, moléculas sensibles al pH tales como colorantes de pH fluorescentes se pueden utilizar como moléculas informadoras. En otro ejemplo en el que la proteína asociada a una vía de señalización bioquímica es un canal de iones, se pueden vigilar las fluctuaciones en el potencial de membrana y/o en la concentración intracelular de iones. Un cierto número de kits comerciales y dispositivos de alto rendimiento son particularmente adecuados para un rastreo rápido y robusto para moduladores de canales de iones. Instrumentos representativos incluyen FLIPRTM (Molecular Devices, Inc.) y VIPR (Aurora Biosciences). Estos instrumentos son capaces de detectar reacciones en pocillos de más de 1000 muestras de una microplaca de forma simultánea, y proporcionan una medición en tiempo real y datos funcionales en el espacio de un segundo o incluso un milisegundo.
En la práctica de cualquiera de los métodos descritos en esta memoria, un vector adecuado se puede introducir en una célula o un embrión a través de uno o más métodos conocidos en la técnica, incluyendo, sin limitación, microinyección, eiectroporación, sonoporación, biolística, transfección mediada por fosfato de calcio, transfección catiónica, transfección de liposomas, transfección de dendrímeros, transfección de choque térmico, transfección por nucleofección, magnetofección, lipofección, impalefección, transfección óptica, captación de propiedad reforzada por el agente de ácidos nucleicos y el suministro a través de liposomas, inmunoliposomas, virosomas o viriones artificiales. En algunos métodos, el vector se introduce en un embrión mediante microinyección. El vector o los vectores se pueden microinyectar en el núcleo o en el citoplasma del embrión. En algunos métodos, el vector o los vectores se pueden introducir en una célula por nucleofección.
El polinucleótido diana de un complejo de CRISPR puede ser cualquier polinucleótido endógeno o exógeno a la célula eucariota. Por ejemplo, el polinucleótido diana puede ser un polinucleótido que reside en el núcleo de la célula eucariota. El polinucleótido diana puede ser una secuencia codificadora un producto génico (p. ej., una proteína) o una secuencia no codificadora (p. ej., un polinucleótido regulador o un ADN basura).
Ejemplos de polinucleótidos diana incluyen una secuencia asociada con una vía de señalización bioquímica, p. ej., un gen o polinucleótido asociado a la vía de señalización bioquímica. Ejemplos de polinucleótidos diana incluyen un gen o polinucleótido asociado a la enfermedad. Un gen o polinucleótido "asociado a la enfermedad" se refiere a cualquier gen o polinucleótido que está proporcionando productos de transcripción o traducción en un nivel anormal
o en una forma anormal en células derivadas de tejidos afectados por la enfermedad en comparación con los tejidos
o células de un control no enfermo . Puede ser un gen que se expresa a un nivel anormalmente alto; puede ser un gen que se expresa a un nivel anormalmente bajo, en donde la expresión alterada se correlaciona con la aparición y/o el progreso de la enfermedad. Un gen asociado a la enfermedad también se refiere a un gen que posee
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ENFERMEDAD/TRASTORNOS
GENE(S)
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(Receptor de Andrógeno); TSG101; IGF; Receptor de IGF1; Igf1 (4
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variantes); Igf2 (3 variantes); Receptor de Igf1; Receptor de Igf2;
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Bax; Bcl2; familia de caspasas (9 miembros:
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1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12); Kras; Apc
Macular relacionada con la edad
Abcr; Ccl2; Cc2; cp (ceruloplasmina); Timp3; catepsinaD;
Degeneración
Vldlr; Ccr2
Esquizofrenia
Neuregulina1 (Nrg1); Erb4 (receptor para Neuregulina);
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Complexina1 (Cplx1); Tph1 Triptofanohidroxilasa; Tph2
Triptófano
hidroxilasa 2; Neurexina 1; GSK3; GSK3a;
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GSK3b
Trastornos
5-HTT (Slc6a4); COMT; DRD (Drd1a); SLC6A3; DAOA;
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DTNBP1; Dao (Dao1)
Repetición de Trinucleótidos
HTT (Enfermedad de Huntington); SBMA/SMAX1/AR (Enfermedad de Kennedy);
Trastornos
FXN/X25 (Ataxia de Friedrich); ATX3 (Enfermedad de Machado-
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Joseph); ATXN1 and ATXN2 (ataxias espinocerebelares);
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DMPK (distrofia miotónica); Atrofins-1 y Atnl
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(Enfermedad DRPLA); CBP (Creb-BP – inestabilidad global); VLDLR
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(Alzheimer); Atxn7; Atxn10
Síndrome X Frágil
FMR2; FXR1; FXR2; mGLUR5
Relacionado con Secretasa
APH-1 (alfa y beta); Presenilina (Psen1); nicastrina
Trastornos
(Ncstn); PEN-2
ENFERMEDAD/TRASTORNOS
GENE(S)
Otros
Nos1; Parp1; Nat1; Nat2
Trastornos relacionados con Priones
Prp
ALS
SOD1; ALS2; STEX; FUS; TARDBP; VEGF (VEGF-a;
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VEGF-b; VEGF-c)
Adicción a fármacos
Prkce (alcohol); Drd2; Drd4; ABAT (alcohol); GRIA2;
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Grm5; Grin1; Htr1b; Grin2a; Drd3; Pdyn; Gria1 (alcohol)
Autismo
Mecp2; BZRAP1; MDGA2; Sema5A; Neurexina 1; Frágil X
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(FMR2 (AFF2); FXR1; FXR2; Mglur5)
Enfermedad de Alzheimer
E1; CHIP; UCH; UBB; Tau; LRP; PICALM; Clusterina; PS1;
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SORL1; CR1; Vldlr; Uba1; Uba3; CHIP28 (Aqp1,
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Aquaporina 1); Uchl1; Uchl3; APP
Inflamación
IL-10; IL-1 (IL-1a; IL-1b); IL-13; IL-17 (IL-17a(CTLA8); IL
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17b; IL-17c; IL,-17d; IL-17f); II-23; Cx3cr1; ptpn22; TNFa;
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OD2/CARD15 for IBD; IL-6; IL-12 (IL-12a; IL-12b);
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CTLA4; Cx3c11
Enfermedad de Parkinson
x-Sinucleína; DJ-1; LRRK2; Parkin; PINK1
Tabla B:
Enfermedades y trastornos de la sangre y coagulación
Anemia (CDAN1, CDA1, RPS19, DBA, PKLR, PK1, NT5C3, UMPH1, PSN1, RHAG, RH50A, NRAMP2, SPTB, ALAS2, ANH1, ASB, ABCB7, ABC7, ASAT); síndrome de linfocito desnudo (TAPBP, TPSN, TAP2, ABCB3, PSF2, RING11, MHC2TA, C2TA, RFX5, RFXAP, RFX5), Trastornos de hemorragia (TBXA2R, P2RX1, P2X1); Factor H y tipo factor H 1 (HF 1, CFH, HUS); Factor V y factor VIII (MCFD2); Deficiencia de factor VII (F7); Deficiencia de factor X (F10); Deficiencia de factor XI (F11); Deficiencia de factor XII (F 12, HAF); Deficiencia de factor XIIIA (F13A1, F13A); Deficiencia de factor XIIIB (F13B); anemia de Fanconi (FANCA, FACA, FA1, FA, FAA, FAAP95, FAAP90, FLJ34064, FANCB, FANCC, FACC, BRCA2, FANCD1, FANCD2, FANCD, FACD, FAD, FANCE, FACE, FANCF, XRCC9, FANCG, BRIP1, BACH1, FANCJ, PHF9, FANCL, FANCM, KIAA1596); Trastornos de linfohistiocitosis hemofagocítica (PRF1, HPLH2,
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UNC13D, MUNC13-4, HPLH3, HLH3, FHL3); Hemofilia A (F8, F8C, HEMA); Hemofilia B (F9, HEMB), Trastornos hemorrágicos (PI, ATT, F5); Deficiencias y trastornos de leucocitos (ITGB2, CD18, LCAMB, LAD, EIF2B1, EIF2BA, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B5, LVWM, CACH, CLE, EIF2B4); anemia de células de Sickle (HBB); Talasemia (HBA2, HBB, HBD, LCRB, HBA1).
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Enfermedades y trastornos de disregulación celular y oncología
Linfoma no-Hodgkin B-cel1 (BCL7A, BCL7); Leucemia (TAL1, TCL5, SCL, TAL2, FLT3, NBS1, NBS, ZNFN1A1, IK1, LYF1, HOXD4, HOX4B, BCR, CML, PHL, ALL, ARNT, KRAS2, RASK2, GMPS, AF10, ARHGEF12, LARG, KIAA0382, CALM, CLTH, CEBPA, CEBP, CHIC2, BTL, FLT3, KIT, PBT, LPP, NPM1, NUP214, D9S46E, CAN, CAIN, RUNX1, CBFA2, AML1, WHSC1L1, NSD3, FLT3, AF1Q, NPM1, NUMA1, ZNF145, PLZF, PML, MYL, STAT5B, AF10, CALM, CLTH, ARL 11, ARLTS 1, P2RX7, P2X7, BCR, CML, PHL, ALL, GRAF, NF1, VRNF, WSS, NFNS, PTPN11, PTP2C, SHP2, NS1, BCL2, CCND1, PRAD1, BCL1, TCRA, GATA1, GF1, ERYF1, NFE1, ABL1, NQO1, DIA4, NMOR1, NUP214, D9S46E, CAN, CAIN).
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Enfermedades y trastornos relacionados con la inflamación y el sistema inmune
AIDS (KIR3DL1, NKAT3, NKB1, AMB11, KIR3DS1, IFNG, CXCL12, SDF1); Síndrome linfoproliferativo autoinmune (TNFRSF6, APT1, FAS, CD95, ALPS1A); Inmunodeficiencia combinada, (IL2RG, SCIDX1, SCIDX, IMD4); HIV-1 (CCL5, SCYA5, D17S136E, TCP228), Susceptibilidad o infección por VIH (IL10, CSIF, CMKBR2, CCR2, CMKBR5, CCCKR5 (CCR5)); Inmunodeficiencias (CD3E, CD3G, AICDA, AID, HIGM2, TNFRSF5, CD40, UNG, DGU, HIGM4, TNFSF5, CD40LG, HIGM1, IGM, FOXP3, IPEX, AIID, XPID, PIDX, TNFRSF14B, TACI); Inflamación (IL-10, IL-1 (IL-1a, IL-1b), IL-13, IL-17 (IL-17a (CTLA8), IL-17b, IL-17c, II,-17d, IL-17f), II-23, Cx3crl, ptpn22, TNFa, NOD2/CARD15 for IBD, IL-6, IL-12 (IL-12a, IL-12b), CTLA4, Cx3cl1); Inmunodeficiencias combinadas graves (SCIDs)(JAK3, JAKL, DCLRE1C, ARTEMIS, SCIDA, RAG1, RAG2, ADA, PTPRC, CD45, LCA, IL7R, CD3D, T3D, IL2RG, SCIDX1, SCIDX, IMD4).
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Enfermedades y trastornos metabólicos, del hígado, riñon y proteínas
Neuropatía amiloide (TTR, PALB); Amiloidosis (APOA1, APP, AAA, CVAP, AD1, GSN, FGA, LYZ, TTR, PALB); Cirrosis (KRT18, KRT8, CIRH1A, NAIC, TEX292, KIAA1988); Fibrosis quística (CFTR, ABCC7, CF, MRP7); Enfermedades de almacenamiento de glucógeno (SLC2A2, GLUT2, G6PC, G6PT, G6PT1, GAA, LAMP2, LAMPB, AGL, GDE, GBE1, GYS2, PYGL, PFKM); Adenoma hepático, 142330 (TCF1, HNF1A, MODY3), Insuficiencia hepática, brote temprano y trastorno neurológico (SCOD1, SCO1), Deficiencia de lipasa hepática (LIPC), Hepatoblastoma, cáncer y carcinomas (CTNNB1, PDGFRL, PDGRL, PRLTS, AXIN1, AXIN, CTNNB1, TP53, P53, LFS1, IGF2R, MPRI, MET, CASP8, MCH5; Enfermedad de riñón quístico medular (UMOD, HNFJ, FJHN, MCKD2, ADMCKD2); fenilcetonuria (PAH, PKU1, QDPR, DHPR, PTS); Riñón poliquístico y enfermedad hepática (FCYT, PKHD 1, ARPKD, PKD 1, PKD2, PKD4, PKDTS, PRKCSH, G19P1, PCLD, SEC63).
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Enfermedades y trastornos Musculares/ del Esqueleto
Distrofia muscular de Becker (DMD, BMD, MYF6), Distrofia muscular de Duchenne (DMD, BMD); Distrofia muscular de Emery-Dreifuss (LMNA, LMN1, EMD2, FPLD, CMD1A, HGPS, LGMD1B, LMNA, LMN1, EMD2, FPLD, CMD1A); Distrofia muscular facioescapulohumeral (FSHMD1A, FSHD1A); Distrofia muscular (FKRP, MDC1C, LGMD2I, LAMA2, LAMM, LARGE, KIAA0609, MDC1D, FCMD, TTID, MYOT, CAPN3, CANP3, DYSF, LGMD2B, SGCG, LGMD2C, DMDA1, SCG3, SGCA, ADL, DAG2, LGMD2D, DMDA2, SGCB, LGMD2E, SGCD, SGD, LGMD2F, CMD1L, TCAP, LGMD2G,
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CMD1N, TRIM32, HT2A, LGMD2H, FKRP, MDC1C, LGMD2I, TTN, CMD1G, TMD, LGMD2J, POMT 1, CAV3, LGMD1C, SEPN 1, SELN, RSMD1, PLEC1, PLTN, EBS1); Osteopetrosis (LRP5, BMND1, LRP7, LR3, OPPG, VBCH2, CLCN7, CLC7, OPTA2, OSTM1, GL, TCIRG1, TIRC7, OC116, OPTB1); Atrofia muscular (VAPB, VAPC, ALS8, SMN1, SMA1, SMA2, SMA3, SMA4, BSCL2, SPG17, GARS, SMAD1, CMT2D, HEXB, IGHMBP2, SMUBP2, CATF1, SMARD1).
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Enfermedades y trastornos neurológicos y neuronales
ALS (SOD1, ALS2, STEX, FUS, TARDBP, VEGF (VEGF-a, VEGF-b, VEGF-c); enfermedad de Alzheimer (APP, AAA, CVAP, AD1, APOE, AD2, PSEN2, AD4, STM2, APBB2, FE65L1, NOS3, PLAU, URK, ACE, DCP 1, ACE 1, MPO, PACIP 1, PAXIP1L, PTIP, A2M, BLMH, BMH, PSEN1, AD3); Autismo (Mecp2, BZRAP1, MDGA2, Sema5A, Neurexina 1, GLO1, MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, NLGN3, NLGN4, KIAA1260, AUTSX2); Síndrome X frágil (FMR2, FXR1, FXR2, mGLUR55); Enfermedad y trastornos tipo enfermedad de Huntington (HD, IT 15, PRNP, PRIP, JPH3, JP3, HDL2, TBP, SCA17); Enfermedad de Parkinson (NR4A2, NURR1, NOT, TINUR, SNCAIP, TBP, SCA17, SNCA, NACP, PARK1, PARK4, DJ1, PARK7, LRRK2, PARK8, PINK1, PARK6, UCHL1, PARK5, SNCA, NACP, PARK1, PARK4, PRKN, PARK2, PDJ, DBH, NDUFV2); Síndrome de Rett (MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, CDKL5, STK9, MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, x-Sinucleína, DJ-1); Esquizofrenia (Neuregulina1 (Nrg1), Erb4 (receptor para Neuregulina), Complexina1 (Cplx1), Tph1 Triptófano hidroxilasa, Tph2, Triptófano hidroxilasa 2, Neurexina 1, GSK3, GSK3a, GSK3b, 5-HTT (Slc6a4), COMT, DRD (Drd1a), SLC6A3, DAOA, DTNBP1, Dao (Dao1)); Trastornos relacionados con secretasa (APH-1 (alfa y beta), Presenilina (Psen1), nicastrina, (Ncstn), PEN-2, Nos1, Parp1, Nat1, Nat2); Trastornos de la repetición de trinucleótidos (HTT (Enfermedad de Huntington), SBMA/SMAX1/AR (Enfermedad de Kennedy), FXN/X25 (Ataxia de Friedrich), ATX3 (Enfermedad de Machado-Joseph), ATXN1 y ATXN2 (ataxias espinocerebelares), DMPK (distrofia miotónica), Atrofina-1 y Atn1 (DRPLA Dx), CBP (Creb-BP – inestabilidad global), VLDLR (Alzheimer), Atxn7, Atxn10).
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Enfermedades y trastornos oculares
Degeneración macular relacionada con la edad (Abcr, Cc12, Cc2, cp (ceruloplasmina), Timp3, catepsinaD, Vldlr, Ccr2); Cataratas (CRYAA, CRYA1, CRYBB2, CRYB2, PITX3, BFSP2, CP49, CP47, CRYAA, CRYA1, PAX6, AN2, MGDA, CRYBA1, CRYB1, CRYGC, CRYG3, CCL, LIM2, MP19, CRYGD, CRYG4, BFSP2, CP49, CP47, HSF4, CTM, HSF4, CTM, MIP, AQP0, CRYAB, CRYA2, CTPP2, CRYBB1, CRYGD, CRYG4, CRYBB2, CRYB2, CRYGC, CRYG3, CCL, CRYAA, CRYA1, GJA8, CX50, CAE1, GJA3, CX46, CZP3, CAE3, CCM1, CAM, KRIT1); Opacidad y distrofia de la córnea (APOA1, TGFBI, CSD2, CDGG1, CSD, BIGH3, CDG2, TACSTD2, TROP2, M1S1, VSX1, RINX, PPCD, PPD, KTCN, COL8A2, FECD, PPCD2, PIP5K3, CFD); Córnea plana congénita (KERA, CNA2); Glaucoma (MYOC, TIGR, GLC1A, JOAG, GPOA, OPTN, GLC1E, FIP2, HYPL, NRP, CYP1B1, GLC3A, OPA1, NTG, NPG, CYP1B1, GLC3A); Amaurosis congénita del hígado (CRB1, RP 12, CRX, CORD2, CRD, RPGRIP 1, LCA6, CORD9, RPE65, RP20, AIPL1, LCA4, GUCY2D, GUC2D, LCA1, CORD6, RDH12, LCA3); Distrofia macular (ELOVL4, ADMD, STGD2, STGD3, RDS, RP7, PRPH2, PRPH, AVMD, AOFMD, VMD2).
Tabla C:
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Señalización PI3K/AKT
PRKCE; ITGAM; ITGA5; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2;
imagen151
PTEN; EIF4E; PRKCZ; GRK6; MAPK1; TSC1; PLK1;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen152
AKT2; IKBKB; PIK3CA; CDK8; CDKN1B; NFKB2; BCL2;
imagen153
PIK3CB; FPP2R1A; MAPK8; BCL2L1; MAPK3; TSC2;
imagen154
ITGA1; KRAS; EIF4EBP1; RELA; PRKCD; NOS3;
imagen155
IPRKAA1; MAPK9; CDK2; PPP2CA; PIM1; ITGB7;
imagen156
YWHAZ; ILK; TP53; RAF1; IKBKG; RELB; DYRK1A;
imagen157
CDKN1A; ITGB1; MAP2K2; JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1;
imagen158
CHUK; PDPK1; PPP2R5C; CTNNB1; MAP2K1; NFKB1;
imagen159
PAK3; ITGB3; CCND1; GSK3A; FRAP1; SFN; ITGA2;
imagen160
TTK; CSNK1A1; BRAF; GSK3B; AKT3; FOXO1; SGK;
imagen161
HSP90AA1; RPS6KB1
Señalización ERK/MAPK
PRKCE; ITGAM; ITGA5; HSPB1; IRAK1; PRKAA2;
imagen162
EIF2AK2; RAC1; RAP1A; TLN1; EIF4E; ELK1; GRK6;
imagen163
MAPK1; RAC2; PLK1; AKT2; PIK3CA; CDK8; CREB1;
imagen164
PRKCI; PTK2; FOS; RPS6KA4; PIK3CB; PPP2R1A;
imagen165
PIK3C3; MAPK8; MAPK3; ITGA1; ETS1; KRAS; MYCN;
imagen166
EIF4EBP1; PPARG; PRKCD; PRKAA1; MAPK9; SRC;
imagen167
CDK2; PPP2CA; PIM1; PIK3C2A; ITGB7; YWHAZ;
imagen168
PPP1CC; KSR1; PXN; RAF1; FYN; DYRK1A; ITGB1;
imagen169
MAP2K2; PAK4; PIK3R1; STAT3; PPP2R5C; MAP2K1;
imagen170
PAK3; ITGB3; ESR1; ITGA2; MYC; TTK; CSNK1A1;
imagen171
CRKL; BRAF; ATF4; PRKCA; SRF; STAT1; SGK
Señalización del Receptor de Glucocorticoides
RAC1; TAF4B; EP300; SMAD2; TRAF6; PCAF; ELK1;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen172
MAPK1; SMAD3; AKT2; IKBKB; NCOR2; UBE2I;
imagen173
PIK3CA; CREB1; FOS; HSPA5; NFKB2; BCL2;
imagen174
MAP3K14; STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; BCL2L1;
imagen175
MAPK3; TSC22D3; MAPK10; NRIP1; KRAS; MAPK13;
imagen176
RELA; STAT5A; MAPK9; NOS2A; PBX1; NR3C1;
imagen177
PIK3C2A; CDKN1C; TRAF2; SERPINA1; NCOA3;
imagen178
MAPK14; TNF; RAF1; IKBKG; MAP3K7; CREBBP;
imagen179
CDKN1A; MAP2K2; JAK1; IL8; NCOA2; AKT1; JAK2;
imagen180
PIK3R1; CHUK; STAT3; MAP2K1; NFKB1; TGFBR1;
imagen181
ESR1; SMAD4; CEBPB; JUN; AR; AKT3; CCL2; MMP1;
imagen182
STAT1; IL6; HSP90AA1
Señalización de Guía Axonal
PRKCE; ITGAM; ROCK1; ITGA5; CXCR4; ADAM12;
imagen183
IGF 1; RAC 1; RAP1A; EIF4E; PRKCZ; NRP 1; NTRK2;
imagen184
ARHGEF7; SMO; ROCK2; MAPK1; PGF; RAC2;
imagen185
PTPN11; GNAS; AKT2; PIK3CA; ERBB2; PRKCI; PTK2;
imagen186
CFL1; GNAQ; PIK3CB; CXCL12; PIK3C3; WNT11;
imagen187
PRKD1; GNB2L1; ABL1; MAPK3; ITGA1; KRAS; RHOA;
imagen188
PRKCD; PIK3C2A; ITGB7; GLI2; PXN; VASP; RAF1;
imagen189
FYN; ITGB1; MAP2K2; PAK4; ADAM17; AKT1; PIK3R1;
imagen190
GLI1; WNT5A; ADAM10; MAP2K1; PAK3; ITGB3;
imagen191
CDC42; VEGFA; ITGA2; EPHA8; CRKL; RND1; GSK3B;
imagen192
AKT3; PRKCA
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Señalización del Receptor Efrina
PRKCE; ITGAM; ROCK1; ITGA5; CXCR4; IRAK1;
imagen193
PRKAA2; EIF2AK2; RAC1; RAP1A; GRK6; ROCK2;
imagen194
MAPK1; PGF; RAC2; PTPN11; GNAS; PLK1; AKT2;
imagen195
DOK1; CDK8; CREB1; PTK2; CFL1; GNAQ; MAP3K14;
imagen196
CXCL12; MAPK8; GNB2L1; ABL1; MAPK3; ITGA1;
imagen197
KRAS; RHOA; PRKCD; PRKAA1; MAPK9; SRC; CDK2;
imagen198
PIM1; ITGB7; PXN; RAF1; FYN; DYRK1A; ITGB1;
imagen199
MAP2K2; PAK4; AKT1; JAK2; STAT3; ADAM10;
imagen200
MAP2K1; PAK3; ITGB3; CDC42; VEGFA; ITGA2;
imagen201
EPHA8; TTK; CSNK1A1; CRKL; BRAF; PTPN13; ATF4;
imagen202
AKT3; SGK
Señalización del Citoesqueleto de Actina
ACTN4; PRKCE; ITGAM; ROCK1; ITGA5; IRAK1;
imagen203
IPRKAA2; FIF2AK2; RAC1; INS; ARHGEF7; GRK6;
imagen204
ROCK2; MAPK1; RAC2; PLK1; AKT2; PIK3CA; CDK8;
imagen205
PTK2; CFL1; PIK3CB; MYH9; DIAPH1; PIK3C3; MAPK8;
imagen206
F2R; MAPK3; SLC9A1; 1TGA1; KRAS; RHOA; PRKCD;
imagen207
PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; PIK3C2A; ITGB7;
imagen208
PPP1CC; PXN; VIL2; RAF 1; GSN; DYRK1A; ITGB 1;
imagen209
MAP2K2; PAK4; PIP5K1A; PIK3R1; MAP2K1; PAK3;
imagen210
ITGB3; CDC42; APC; ITGA2; TTK; CSNK1A1; CRKL;
imagen211
BRAF; VAV3; SGK
Señalización de la Enfermedad de Huntington
PRKCE; IGF1; EP300; RCOR1; PRKCZ; HDAC4; TGM2;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen212
MAPK1; CAPNS1; AKT2; EGFR; NCOR2; SP1; CAPN2;
imagen213
PIK3CA; HDAC5; CREB1; PRKCI; HSPA5; REST;
imagen214
GNAQ; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; IGF1R; PRKD1;
imagen215
GNB2L1; BCL2L1; CAPN1; MAPK3; CLASP8; HDAC2;
imagen216
HDAC7A; PRKCD; HDAC11; MAPK9; HDAC9; PIK3C2A;
imagen217
HDAC3; TP53; CASP9; CREBBP; AKT1; PIK3R1;
imagen218
PDPK1; CASP1; APAF1; FRAP1; CASP2; JUN; BAX;
imagen219
ATF4; AKT3; PRKCA; CLTC; SGK; HDAC6; CASP3
Señalización de la Apoptosis
PRKCE; ROCK1; BID; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; BAK1;
imagen220
BIRC4; GRK6; MAPK1; CAPNS1; PLK1; AKT2; IKBKB;
imagen221
CAPN2; CDK8; FAS; NFKB2; BCL2; MAP3K14; MAPK8;
imagen222
BCL2L1; CAPN1; MAPK3; CASP8; KRAS; RELA;
imagen223
PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; TP53; TNF;
imagen224
RAF1; IKBKG; RELB; CASP9; DYRK1A; MAP2K2;
imagen225
CHUK; APAF1; MAP2K1; NFKB1; PAK3; LMNA; CASP2;
imagen226
BIRC2; TTK; CSNK1A1; BRAF; BAX; PRKCA; SGK;
imagen227
CASP3; BIRC3; CARP1
Señalización del Receptor de Células B
RAC1; PTEN; LYN; ELK1; MAPK1; RAC2; PTPN11;
imagen228
AKT2; IKBKB; PIK3CA; CREB1; SYK; NFKB2; CAMK2A;
imagen229
IMAP3K14; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; BCL2L1; ABL1;
imagen230
MAPK3; ETS1; KRAS; MAPK13; RELA; PTPN6; MAPK9;
imagen231
EGR1; PIK3C2A; BTK; MAPK14; RAF1; IKBKG; RELB;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen232
MAP3K7; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; CHUK; MAP2K1;
imagen233
NFKB1; CDC42; GSK3A; FRAP1; BCL6; BCL10; JUN;
imagen234
GSK3B; ATF4; AKT3; VAV3; RPS6KB1
Señalización de la Extravasación de Leucocitos
ACTN4; CD44; PRKCE; ITGAM; ROCK1; CXCR4; CYBA;
imagen235
RAC1; RAP1A; PRKCZ; ROCK2; RAC2; PTPN11;
imagen236
MMP14; PIK3CA; PRKCI; PTK2; PIK3CB; CXCL12;
imagen237
P1K3C3; MAPK; PRKD1; ABL1; MAPK10; CYBB;
imagen238
MAPK13; RHOA; PRKCD; MAPK9; SRC; PIK3C2A; BTK;
imagen239
MAPK14; NOX1; PXN; VIL2; VASP; ITGB1; MAP2K2;
imagen240
CTNND1; PIK3R1; CTNNB1; CLDN1; CDC42; F11R; ITK;
imagen241
CRKL; VAV3; CTTN; PRKCA; MMP1; MUMP9
Señalización de Integrina
ACTN4; ITGAM; ROCK1; ITGA5; RAC1; PTEN; RAP1A;
imagen242
IRLN1; ARHGEF7; MAPK1; RAC2; CAPNS1; AKT2;
imagen243
CAPN2; PIK3CA; PTK2; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
imagen244
CAV1; CAPN1; ABL1; MAPK3; ITGA1; KRAS; RHOA;
imagen245
SRC; PIK3C2A; ITGB7; PPP1CC; ILK; PXN; VASP;
imagen246
RAF1; FYN; ITGB1; MAP2K2; PAK4; AKT1; PIK3R1;
imagen247
TNK2; MAP2K1; PAK3; ITGB3; CDC42; RND3; ITGA2;
imagen248
CRKL; BRAF; GSK3B; AKT3
Señalización de la Respuesta de Fase Aguda
IRAK1; SOD2; MYD88; TRAF6; ELK1; MAPK1; PTPN11;
imagen249
AKT2; IKBKB; PIK3GA; FOS; NFKB2; MAP3K14;
imagen250
PIK3CB; MAPK8; RIPK1; MAPK3; IL6ST; KRAS;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen251
MAPK13; IL6R; RELA; SOCS1; MAPK9; FTL; NR3C1;
imagen252
TRAF2; SERPINE1; MAPK14; TNF; RAF1; PDK1;
imagen253
IKBKG; RELB; MAP3K7; MAP2K2; AKT1; JAK2; PIK3R1;
imagen254
CHUK; STAT3; MAP2K1; NFKB1; FRAP1; CEBPB; JUN;
imagen255
AKT3; IL 1R1; IL6
Señalización de PTEN
ITGAM; ITGA5; RAC1; PTEN; PRKCZ; BCL2L11;
imagen256
MAPK1; RAC2; AKT2; EGFR; IKBKB; CBL; PIK3CA;
imagen257
CDKN1B; PTK2; NFKB2; BCL2; PIK3CB; BCL2L1;
imagen258
MAPK3; ITGA1; KRAS; ITGB7; ILK; PDGFRB; INSR;
imagen259
RAF1; IKBKG; CASP9; CDKN1A; ITGB1; MAP2K2;
imagen260
AKT1; PIK3R1; CHUK; PDGFRA; PDPK1; MAP2K1;
imagen261
NFKB1; ITGB3; CDC42; CCND1; GSK3A; ITGA2;
imagen262
GSK3B; AKT3; FOXO1; CLASP3; RPS6KB1
Señalización de p53
PTEN; EP300; BBC3; PCAF; FASN; BRCA1; GADD45A;
imagen263
BIRC5; AKT2; PIK3CA; CHEK1; TP53INP1; BCL2;
imagen264
PIK3CB; PIQC3C3; MAPK8; THBS1; ATR; BCL2L1; E2F1;
imagen265
PMAIP 1; CHEK2; TNFRSF10B; TP73; RB1; HDAC9;
imagen266
CDK2; PIK3C2A; MAPK14; TP53; LRDD; CDKN1A;
imagen267
HIPK2; AKT1; PIK3R1; RRM2B; APAF1; CTNNB1;
imagen268
SIRT1; CCND1; PRKDC; ATM; SFN; CDKN2A; JUN;
imagen269
SNAI2; GSK3B; BAX; AKT3
Señalización del Receptor de Aril Hidrocarbono
HSPB1; EP300; FASN; TGM2; RXRA; MAPK1; NQO1;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen270
NCOR2; SP1; ARNT; CDKN1B; FOS; CHEK1;
imagen271
SMARCA4; NFKB2; MAPK8; ALDH1A1; ATR; E2F1;
imagen272
MAPK3; NRIP1; CHEK2; RELA; TP73; GSTP1; RB1;
imagen273
SRC; CDK2; AHR; NFE2L2; NCOA3; TP53; TNF;
imagen274
CDKN1A; NCOA2; APAF1; NFKB1; CCND1; ATM; ESR1;
imagen275
CDKN2A; MYC; JUN; ESR2; BAX; IL6; CYP1B1;
imagen276
HSP90AA1
Señalización del Metabolismo Xenobiótico
PRKCE; EP300; PRKCZ; RXRA; MAPK1; NQO1;
imagen277
NCOR2; PIK3CA; ARNT; PRKCI; NFKB2; CAMK2A;
imagen278
PIK3CB; PPP2R1A; PIK3C3; MAPK8; PRKD1;
imagen279
ALDH1A1; MAPK3; NRIP1; KRAS; MAPK13; PRKCD;
imagen280
GSTP1; MAPK9; NOS2A; ABCB1; AHR; PPP2CA; FTL;
imagen281
NFE2L2; PIK3C2A; PPARGC1A; MAPK14; TNF; RAF1;
imagen282
CREBBP; MAP2K2; PIK3R1; PPP2R5C; MAP2K1;
imagen283
NFKB 1; KEAP 1; PRKCA; EIF2AK3; IL6; CYP1B1;
imagen284
HSP94AA1
Señalización de SAPK/JNK
PRKCE; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; RAC1; ELK1;
imagen285
GRK6; MAPK1; GADD45A; RAC2; PLK1; AKT2; PIK3CA;
imagen286
FADD; CDK8; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; RIPS1;
imagen287
GNB2L1; IRS1; MAPK3; MAPK10; DAXX; KRAS;
imagen288
PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; PIK3C2A;
imagen289
TRAF2; TP53; LCK; MAP3K7; DYRK1A; MAP2K2;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen290
PIK3R1; MAP2K1; PAK3; CDC42; JUN; TTK; CSNK1A1;
imagen291
CRKL; BRAF; SGK
Señalización de PPAr/RXR
PRKAA2; EP300; INS; SMAD2; TRAF6; PPARA; FASN;
imagen292
RXRA; MAPK1; SAD3; GNAS; IKBKB; NCOR2;
imagen293
ABCA1; GNAQ; NFKB2; MAP3K14; STAT5B; MAPK8;
imagen294
IRS1; MAPK3; KRAS; RELA; PRKAA1; PPARGC1A;
imagen295
NCOA3; MAPK14; INSR; RAF1; IKBKG; RELB; MAP3K7;
imagen296
CREBBP; MAP2K2; JAK2; CHUK; MAP2K1; NFKB1;
imagen297
TGFBR1; SMAD4; JUN; IL1R1; PRKCA; IL6; HSP90AA1;
imagen298
ADIPOQ
Señalización de NF-KB
IRAK1; EIF2AK2; EP300; INS; MYD88; PRKCZ; TRAY6;
imagen299
TBKL1; AKT2; EGFR; IKBKB; PIK3CA; BTRC; NFKB2;
imagen300
MAP3K14; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; RIPK1; HDAC2;
imagen301
KRAS; RELA; PIK3C2A; TRAF2; TLR4; PDGFRB; TNF;
imagen302
INSR; LCK; IKBKG; RELB; MAP3K7; CREBBP; AKT1;
imagen303
PIK3R1; CHUK; PDGFRA; NFKB1; TLR2; BCL10;
imagen304
GSK3B; AKT3; TNFAIP3; IL 1R1
Señalización de Neuregulina
ERBB4; PRKCE; ITGAM; ITGA5; PTEN; PRKCZ; ELK1;
imagen305
MAPK1; PTPN11; AKT2; EGFR; ERBB2; PRKCI;
imagen306
CDKN1B; STAT5B; PRKD1; MAPK3; ITGA1; KRAS;
imagen307
PRKCD; STAT5A; SRC; ITGB7; RAF1; ITGB1; MAP2K2;
imagen308
ADAM17; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1; ITGB3;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen309
EREG; FRAP1; PSEN1; ITGA2; MYC; NRG1; CRKL;
imagen310
AKT3; PRKCA; HSP90AA1; RPS6KB1
Señalización de Wnt y Beta catenina
CD44; EP300; LRP6; DVL3; CSNK1E; GJA1; SMO;
imagen311
AKT2; PIN1; CDH1; BTRC; GNAQ; MARK2; PPP2R1A;
imagen312
WNT11; SRC; DKK1; PPP2CA; SOX6; SFRP2; ILK;
imagen313
LEF1; SOX9; TP53; MAP3K7; CREBBP; TCF7L2; AKT1;
imagen314
PPP2R5C; WNT5A; LRP5; CTNNB1; TGFBR1; CCND1;
imagen315
GSK3A; DVL1; APC; CDKN2A; MYC; CSNK1A1; GSK3B;
imagen316
AKT3; SOX2
Señalización del Receptor de Insulina
PTEN; INS; EIF4E; PTPN1; PRKCZ; MAPK1; TSC1;
imagen317
PTPN11; AKT2; CBL; PIK3CA; PRKCI; PIK3CB; PIK3C3;
imagen318
MAPK8; IRS1; MAPK3; TSC2; KRAS; EIF4EBP1;
imagen319
SLC2A4; PIK3C2A; PPP1CC; INSR; RAF1; FYN;
imagen320
AP2K2; JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1;
imagen321
GSK3A; FRAP1; CRKL; GSK3B; AKT3; FOXO1; SGK;
imagen322
RPS6KB1
Señalización de IL-6
HSPB1; TRAF6; MAPKAPK2; ELK1; MAPK1; PTPN11;
imagen323
IKBKB; FOS; NFKB2; MAP3K14; MAPK8; MAPK3;
imagen324
MAPK10; IL6ST; KRAS; MAPK13; IL6R; RELA; SOCS1;
imagen325
MAPK9; ABCB1; TRAF2; MAPK14; TNF; RAF1; IKBKG;
imagen326
RELB; MAP3K7; MAP2K2; IL8; JAK2; CHUK; STAT3;
imagen327
MAP2K1; NFKB1; CEBPB; JUN; IL1R1; SRF; IL6
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Colestasis Hepática
PRKCE; IRAK1; INS; MYD88; PRKCZ; TRAF6; PPARA;
imagen328
RXRA; IKBKB; PRKCI; NFKB2; MAP3K14; MAPK8;
imagen329
PRKD1; MAPK10; RELA; PRKCD; MAPK9; ABC1;
imagen330
TRAF2; TLR4; TNF; INSR; IKBKG; RELB; MAP3K7; IL8;
imagen331
CHUK; NR1H2; TJP2; NFKB1; ESR1; SREBF1; FGFR4;
imagen332
JUN; IL1R1; PRKCA; IL6
Señalización de IGF-1
IGF1; PRKCZ; ELK1; MAPK1; PTPN11; NEDD4; AKT2;
imagen333
PIK3CA; PRKCI; PTK2; FOS; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
imagen334
IGF1R; IRS1; MAPK3; IGFBP7; KRAS; PIK3C2A;
imagen335
YWHAZ; PXN; RAF1; CASP9; MAP2K2; AKT1; PIK3R1;
imagen336
PDPK1; MAP2K1; IGFBP2; SFN; JUN; CYR61; AKT3;
imagen337
FOXO1; SRF; CTGF; RPS6KB1
Respuesta de Estrés Oxidativo mediada por NRF2
PRKCE; EP300; SOD2; PRKCZ; MAPK1; SQSTM1;
imagen338
NQO1; PIK3CA; PRKCI; FOS; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
imagen339
PRKD1; MAPK3; KRAS; PRKCD; GSTP1; MAPK9; FTL;
imagen340
NFE2L2; PIK3C2A; MAPK14; RAF1; MAP3K7; CREBBP;
imagen341
MAP2K2; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; PPIB; JUN; KEAP1;
imagen342
GSK3B; ATF4; PRKCA; EIF2AK3; HSP90AA1
Fibrosis Hepática/Activación de Células Estelares
EDN1; IGF1; KDR; FLT1; SMAD2; FGFR1; MET; PGF;
imagen343
SMAD3; EGFR; FAS; CSF1; NFKB2; BCL2; MYH9;
imagen344
IGF1R; IL6R; RELA; TLR4; PDGFRB; TNF; RELB; IL8;
imagen345
PDGFRA; NFKB1; TGFBR1; SMAD4; VEGFA; BAX;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen346
IL1R1; CCL2; HGF; MMP1; STAT1; IL6; CTGF; MMP9
Señalización de PPAR
EP300; INS; TRAF6; PPARA; RXRA; MAPK1; IKBKB;
imagen347
NCOR2; FOS; NFKB2; MAP3K14; STAT5B; MAPK3;
imagen348
NRIP1; KRAS; PPARG; RELA; STAT5A; TRAF2;
imagen349
PPARGC1A; PDGFRB; TNF; INSR; RAF1; IKBKG;
imagen350
RELB; MAP3K7; CREBBP; MAP2K2; CHUK; PDGFRA;
imagen351
MAP2K1; NFKB1; JUN; IL1R1; HSP90AA1
Señalización de Fc Epsilon RI
PRKCE; RAC1; PRKCZ; LYN; MAPK1; RAC2; PTPN11;
imagen352
AKT2; PIK3CA; SYK; PRKCI; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
imagen353
PRKD1; MAPK3; MAPK10; KRAS; MAPK13; PRKCD;
imagen354
MAPK9; PIK3C2A; BTK; MAPK14; TNF; RAF1; FYN;
imagen355
MAP2K2; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1; AKT3;
imagen356
VAV3; PRKCA
Señalización del Receptor Acoplado a Proteína G
PRKCE; RAP1A; RGS16; MAPK1; GNAS; AKT2; IKBKB;
imagen357
PIK3CA; CREB1; GNAQ; NFKB2; CAMK2A; PIK3CB;
imagen358
PIK3C3; MAPK3; KRAS; RELA; SRC; PIK3C2A; RAF1;
imagen359
IKBKG; REB; FYN; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; CHUK;
imagen360
PDPK1; STAT3; MAP2K1; NFKB1; BRAF; ATF4; AKT3;
imagen361
PRKCA
Metabolismo de Inositol Fosfato
PRKCE; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; PTEN; GRK6;
imagen362
MAPK8; PLK1; AKT2; PIK3CA; CDK8; PIK3CB; PIK3C3;
MAPK8
MAPK8; MAPK3; PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen363
PIM1; PIK3G2A; DYRK1A; MAP2K2; PIP5KlA; PIK3R1;
imagen364
MAP2K1; PAK3; ATM; TTK; CSNK1A1; BRAF; SGK
Señalización de PDGF
EIF2AK2; ELK1; ABL2; MAPK1; PIK3CA; FOS; PIK3CB;
imagen365
PIK3C3; MAPK8; CAV1; ABL1; MAPK3; KRAS; SRC;
imagen366
PIK3C2A; PDGFRB; RAF1; MAP2K2; JAK1; JAK2;
imagen367
PIK3R1; PDGFRA; STAT3; SPHK1; MAP2K1; MYC;
imagen368
JUN; CRKL; PRKCA; SRF; STAT1; SPHK2
Señalización de VEGF
ACTN4; ROCK1; KDR; FLT1; ROCK2; MAPK1; PGF;
imagen369
AKT2; PIK3CA; ARNT; PTK2; BCL2; PIK3CB; PIK3C3;
imagen370
BCL2L1; MAPK3; KRAS; HIF1A; NOS3; PIK3C2A; PXN;
imagen371
RAF1; MAP2K2; ELAVL1; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; SFN;
imagen372
VEGFA; AKT3; FOXO1; PRKCA
Señalización de Células Asesinas Naturales
PRKCE; RAC1; PRKCZ; MAPK1; RAC2; PTPN11;
imagen373
KIR2DL3; AKT2; PIK3CA; SYK; PRKCI; PIK3CB;
imagen374
PIK3C3; PRKD1; MAPK3; KRAS; PRKCD; PTPN6;
imagen375
P1K3C2A; LCK; RAF1; FYN; MAP2K2; PAK4; AKT1;
imagen376
PIK3R1; MAP2K1; PAK3; AKT3; VAV3; PRKCA
Ciclo Celular: GI/S
HDAC4; SMAD3; SUV39H1; HDAC5; CDKN1B; BTRC;
Regulación del punto de verificación
ATR; ABL1; E2F1; HDAC2; HDAC7A; RB1; HDAC11;
imagen377
HDAC9; CDK2; E2F2; HDAC3; TP53; CDKN1A; CCND1;
imagen378
E2F4; ATM; RBL2; SMAD4; CDKN2A; MYC; NRG1;
imagen379
IGSK3B; RBL1; HDAC6
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Señalización del Receptor de Células T
RAC1; ELK1; MAPK1; IKBKB; CBL; PIK3CA; FOS;
imagen380
NFKB2; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; KRAS;
imagen381
RELA; PIK3C2A; BTK; LCK; RAF1; IKBKG; RELB; FYN;
imagen382
MAP2K2; PIK3R1; CHUK; MAP2K1; NFKB1; ITK; BCL10;
imagen383
JUN; VAV3
Señalización del Receptor de Muerte
CRADD; HSPB1; BID; BIRC4; TBK1; IKBKB; FADD;
imagen384
FAS; NFKB2; BCL2; MAP3K14; MAPK8; RIPS1; CASP8;
imagen385
DAXX; TNFRSF10B; RELA; TRAF2; TNF; IKBKG; RELB;
imagen386
CASP9; CHUK; APAF1; NFKB1; CASP2; BIRC2; CASP3;
imagen387
BIRC3
Señalización de FGF
RAC1; FGFR1; MET; MAPKAPK2; MAPK1; PTPN11;
imagen388
AKT2; PIK3CA; CREB1; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
imagen389
MAPK3; MAPK13; PTPN6; PIK3C2A; MAPK14; RAF1;
imagen390
AKT1; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; FGFR4; CRKL; ATF4;
imagen391
AKT3; PRKCA; HGF
Señalización de GM-GSF
LYN; ELK1; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA; CAMK2A;
imagen392
STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; GNB2L1; BCL2L1; MAPK3;
imagen393
ETS1; KRAS; RUNX1; PIM1; PIK3C2A; RAF1; MAP2K2;
imagen394
AKT1; JAK2; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; CCND1; AKT3;
imagen395
STAT1
Señalización de la Esclerosis Lateral Amiotrófica
BID; IGF1; RAC1; BIRC4; PGF; CAPNS1; CAPN2;
imagen396
PIK3CA; BCL2; PIK3CB; PIK3C3; BCL2L1; CAPN1;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen397
PIK3C2A; TP53; CASP9; PIK3R1; RAB5A; CASP1;
imagen398
APAF1; VEGF; BIRC2; BAX; AKT3; CASP3; BIRC3
Señalización de JAK/Stat
PTPN1; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA; STAT5B;
imagen399
PIK3CB; PIK3C3; MAPK3; KRAS; SOCS1; STAT5A;
imagen400
PTPN6; PIK3C2A; RAF1; CDKN1A; MAP2K2; JAK1;
imagen401
AKT1; JAK2; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; FRAP1; AKT3;
imagen402
STAT1
Metabolismo de Nicotinato y Nicotinamida
PRKCE; IRAK; PRKAA2; EIF2AK2; GRK6; MAPK1;
imagen403
PLK1; AKT2; CDK8; MAPK8; MAPK3; PRKCD; PRKAA1;
imagen404
PBEF1; MAPK9; CDK2; PIM1; DYRK1A; MAP2K2;
imagen405
MAF2K1; PAK3; NT5E; TTK; CSNK1A1; BRAF; SGK
Señalización de Quimioquinas
CXCR4; ROCK2; MAPS1; PTK2; FOS; CFL1; GNAQ;
imagen406
CAMK2A; CXCL12; MAPK8; MAPK3; KRAS; MAPK13;
imagen407
RHOA; CCR3; SRC; PPP1CC; MAPK14; NOX1; RAF1;
imagen408
MAP2K2; MAP2K1; JUN; CCL2; PRKCA
Señalización de IL-2
ELK1; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA; SYK; FOS;
imagen409
STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; KRAS;
imagen410
SOCS1; STAT5A; PIK3C2A; LCK; RAF1; MAP2K2;
imagen411
JAK1; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; JUN; AKT3
Depresión Sináptica a Largo Plazo
PRKCE; IGF1; PRKCZ; PRDX6; LYN; MAPK1; GNAS;
imagen412
PRKCI; GNAQ; PPP2R1A; IGF1R; PRKD1; MAPK3;
imagen413
KRAS; GRN; PRKCD; NOS3; NOS2A; PPP2CA;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen414
YWHAZ; RAF1; MAP2K2; PPP2R5C; MAP2K1; PRKCA
Señalización del Receptor de Estrógenos
TAF4B; EP300; CARM1; PCAF; MAPK1; NCOR2;
imagen415
SMARCA4; MAPK3; NRIP1; KRAS; SRC; NR3C1;
imagen416
HDAC3; PPARGC1A; RBM9; NCOA3; RAF1; CREBBP;
imagen417
MAP2K2; NCOA2; MAP2K1; PRKDC; ESR1; ESR2
Vía de la Ubiquitinación de Proteínas
TRAF6; SMURF1; BIRC4; BRCA1; UCHL1; NEDD4;
imagen418
CBL; UBE2I; BTRC; HSPA5; USP7; USP10; FBXW7;
imagen419
USP9X; STUB1; USP22; B2M; BIRC2; PARK2; USP8;
imagen420
USP1; VHL; HSP90AA1; BIRC3
Señalización de IL-10
TRAF6; CCR1; ELK1; IKBKB; SP1; FOS; NFKB2;
imagen421
MAP3K14; MAPK8; MAPK13; RELA; MAPK14; TNF;
imagen422
IKBKG; RELB; MAP3K7; JAK1; CHUK; STAT3; NFKB1;
imagen423
JUN; IL1R1; IL6
Activación de VDR/RXR
PRKCE; EP300; PRKCZ; RXRA; GADD45A; HES1;
imagen424
NCOR2; SP1; PRKCI; CDKN1B; PRKD1; PRKCD;
imagen425
RUNX2; KLF4; YY1; NCOA3; CDKN1A; NCOA2; SPP1;
imagen426
LRP5; CEBPB; FOXO1; PRKCA
Señalización de TGF-beta
EP300; SMAD2; SMURF1; MAPK1; SMAD3; SMAD1;
imagen427
FOS; MAPK8; MAPK3; KRAS; MAPK9; RUNX2;
imagen428
SERPINE1; RAF1; MAP3K7; CREBBP; MAP2K2;
imagen429
MAP2K1; TGEBR1; SMAD4; JUN; SMAD5
Señalización del Receptor de tipo Toll
IRAK1; EIF2AK2; MYD88; TRAF6; PPARA; ELK1;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen430
IKBKB; FOS; NFKB2; MAP3K14; MAPK8; MAPK13;
imagen431
RELA; TLR4; MAPK14; IKBKG; RELB; MAP3K7; CHUK;
imagen432
NFKB1; TLR2; JUN
Señalización de p38 MAPK
HSPB1; IRAK1; TRAF6; MAPKAPK2; ELK1; FADD; FAS;
imagen433
CREB1; DDIT3; RPS6KA4; DAXX; MAPK13; TRAF2;
imagen434
MAPK14; TNF; MAP3K.7; TGFBR1; MYC; ATF4; IL 1R1;
imagen435
SRF; STAT1
Señalización de Neurotrofina/TRK
NTRK2; MAPK1; PTPN11; PIK3CA; CREB1; FOS;
imagen436
PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; KRAS; PIK3C2A;
imagen437
RAF1; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1;
imagen438
CDC42; JUN; ATF4
Activación de FXR/RXR
INS; PPARA; FASN; RXRA; AKT2; SDC1; MAPK8;
imagen439
APOB; MAPK10; PPARG; MTTP; MAPK9; PPARGC1A;
imagen440
TNF; CREBBP; AKT1; SREBF1; FGFR4; AKT3; FOXO1
Potenciación Sináptica a Largo Plazo
PRKCE; RAP1A; EP300; PRKCZ; MAPK1; CREB1;
imagen441
PRKCI; GNAQ; CAMK2A; PRKD1; MAPK3; KRAS;
imagen442
PRKCD; PPP1CC; RAF1; CREBBP; MAP2K2; MAP2K1;
imagen443
ATF4; PRKCA
Señalización de Calcio
RAP1A; EP300; HDAC4; MAPK1; HDAC5; CREB1;
imagen444
CAMK2A; MYH9; MAPK3; HDAC2; HDAC7A; HDAC11;
imagen445
HDAC9; HDAC3; CREBBP; CALR; CAMKK2; ATF4;
imagen446
HDAC6
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Señalización de EGF
ELK1; MAPK1; EGFR; PIK3CA; FOS; PIK3CB; PIK3C3;
imagen447
MAPK8; MAPK3; PIK3C2A; RAF1; JAK1; PIK3R1;
imagen448
STAT3; MAP2K1; JUN; PRKCA; SRF; STAT1
Señalización de Hipoxia en el
EDN1; PTEN; EP300; NQO1; UBE2I; CREB1; ARNT;
Sistema Cardiovascular
HIF1A; SLC2A4; NOS3; TP53; LDHA; AKT1; ATM;
imagen449
VEGFA; JUN; ATF4; VHL; HSP90AA1
Inhibición Mediada por LPS/IL-1
IRAK1; MYD88; TRAF6; PPARA; RXRA; ABCA1;
de la Función RXR
MAPK8; ALDH1A1; GSTP1; MAPK9; ABCB1; TRAF2;
imagen450
TLR4; TNF; MAP3K7; NR1H2; SREBF1; JUN; IL1R1
Activación de LXR/RXR
FASN; RXRA; NCOR2; ABCA1; NFKB2; IRF3; RELA;
imagen451
NOS2A; TLR4; TNF; RELB; LDLR; NR1H2; NFKB1;
imagen452
SREBF1; IL1R1; CCL2; IL6; MMP9
Procesamiento Amiloide
PRKCE; CSNK1E; MAPK1; CAPNS1; AKT2; CAPN2;
imagen453
CAPN1; MAPK3; MAPK13; MAPT; MAPK14; AKT1;
imagen454
PSEN1; CSNK1A1; GSK3B; AKT3; APP
Señalización de IL-4
AKT2; PIK3CA; PIK3CB; PIK3C3; IRS1; KRAS; SOCS1;
imagen455
PTPN6; NR3C1; PIK3C2A; JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1;
imagen456
FRAP1; AKT3; RPS6KB1
Ciclo Celular: G2/M Regulación del Punto
EP300; PCAF; BRCA1; GADD45A; PLK1; BTRC;
de Verificación de Daño a ADN
CHEK1; ATR; CHEK2; YWHAZ; TP53; CDKN1A;
imagen457
PRKDC; ATM; SFN; CDKN2A
Señalización de Óxido Nítrico en el
KDR; FLT1; PGF; AKT2; PIK3CA; PIK3CB; PIK3C3;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Sistema Cardiovascular
CAV1; PRKCD; NOS3; PIK3C2A; AKT1; PIK3R1;
imagen458
VEGFA; AKT3; HSP90AA1
Metabolismo de Purina
NME2; SMARCA4; MYH9; RRM2; ADAR; EIF2AK4;
imagen459
PKM2; ENTPD 1; RAD51; RRM2B; TJP2; RAD51C;
imagen460
NT5E; POLD1; NME1
Señalización mediada por cAMP
RAP1A; MAPK1; GNAS; CREB1; CAMK2A; MAPK3;
imagen461
SRC; RAF1; MAP2K2; STAT3; MAP2K1; BRAF; ATF4
Disfunción Mitocondrial
SOD2; MAPK8; CASP8; MAPK10; MAPK9; CASP9;
imagen462
PARK7; PSEN1; PARK2; APP; CASP3
Señalización de Notch
HES1; JAG1; NUMB; NOTCH4; ADAM17; NOTCH2;
imagen463
PSEN1; NOTCH3; NOTCH1; DLL4
Vía del Estrés del Retículo Endoplásmico
HSPA5; MAPK8; XBP1; TRAF2; ATF6; CASP9; ATF4;
imagen464
EIF2AK3; CASP3
Metabolismo de Pirimidina
NME2; AICDA; RRM2; EIF2AK4; ENTPD1; RRM2B;
imagen465
NT5E; POLD1; NME1
Señalización de Parkinson
UCHL1; MAPK8; MAPK13; MAPK14; CASP9; PARK7;
imagen466
PARK2; CASP3
Señalización Cardiaca y Beta Adrenérgica
GNAS; GNAQ; PPP2R1A; GNB2L1; PPP2CA; PPP1CC;
imagen467
PPP2R5C
Glicolisis/Gluconeogénesis
HK2; GCK; GPI; ALDH1A1; PKM2; LDHA; HK1
Señalización de Interferón
IRF1; SOCS1; JAK1; JAK2; IFITM1; STAT1; IFIT3
Señalización Sonic Hedgehog
ARRB2; SMO; GL12; DYRK1A; GLI1; GSK3B; DYRK1B
FUNCIÓN CELULAR
imagen468 GENES
Metabolismo de Glicerofosfolípidos
imagen469 PLD1; GRN; GPAM; YWHAZ; SPHK1; SPHK2
imagen470
imagen471 imagen472
Degradación de Fosfolípidos
imagen473 PRDX6; PLD1; GRN; YWHAZ; SPHK1; SPHK2
Metabolismo de triptófano
imagen474 SIAH2; PRMT5; NEDD4; ALDH1A1; CYP1B1; SIAH1
Degradación de Lisina
imagen475 SUV39H1; EHMT2; NSD1; SETD7; PPP2R5C
Vía de la Reparación de la Escisión Nucleótidos
de ERCC5; ERCC4; XPA; XPC; ERCC1
imagen476
imagen477 imagen478
Metabolismo de Almidón y Sacarosa
imagen479 UCHL1; HK2; GCK; GPI; HK1
imagen480
imagen481 imagen482
Metabolismo de Aminoazúcares
imagen483 NQO1; HK2; GCK; HK1
Metabolismo del Ácido Araquidónico
imagen484 PRDX6; GRN; YWHAZ; CYP1B1
imagen485
imagen486 imagen487
Señalización del Ritmo Circadiano
imagen488 CSNK1E; CREB1; ATF4; NR1D1
Sistema de Coagulación
imagen489 BDKRB1; F2R; SERPINE1; F3
Señalización del Receptor de Dopamina
imagen490 PPP2R1A; PPP2CA; PPP1CC; PPP2R5C
imagen491
imagen492 imagen493
Metabolismo de Glutation
imagen494 IDH2; GSTP1; ANPEP; IDH1
Metabolismo de Glicerolípidos
imagen495 ALDH1A1; GPAM; SPHK1; SPHK2
Metabolismo del Ácido Linoleico
imagen496 PRDX6; GRN; YWHAZ; CYP1B1
Metabolismo de Metionina
imagen497 DNMT1; DNMT3B; AHCY; DNMT3A
Metabolismo de Piruvato
imagen498 GLO1; ALDH1A1; PKM2; LDHA
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Metabolismo de Arginina y Prolina
ALDH1A1; NOS3; NOS2A
imagen499
imagen500
Señalización de Eicosanoides
PRDX6; GRN; YWHAZ
Metabolismo de Fructosa y Manosa
HK2; GCK; HK1
imagen501
imagen502
Metabolismo de Galactosa
HK2; GCK; HK1
Biosíntesis de Estilbeno, Coumarina y
PRDX6; PRDX1; TYR
Lignina
imagen503
Vía de la Presentación de Antígenos
CALR; B2M
imagen504
imagen505
Biosíntesis de Esteroides
NQO1; DHCR7
Metabolismo de Butanoato
ALDH1A1; NLGN1
Ciclo del Citrato
IDH2; IDH1
Metabolismo de Ácidos Grasos
ALDH1A1; CYP1B1
Metabolismo de Glicerofosfolípidos
PRDX6; CHKA
imagen506
imagen507
Metabolismo de Histidina
PRMT5; ALDH1A1
Metabolismo de Inositol
ERO1L; APEX1
Metabolismo de Xenobióticos
GSTP1; CYP1B1
por el Citocromo p450
imagen508
Metabolismo del Metano
PRDX6; PRDX1
Metabolismo de Fenilalanina
PRDX6; PRDX1
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Metabolismo de Propanoato
LDH1A1; LDHA
Metabolismo de Selenoaminoácido
PRMT5; AHCY
imagen509
imagen510
Metabolismo de Esfingolípidos
SPHK1; SPHK2
Metabolismo de Aminofosfonato
PRMT5
imagen511
imagen512
Metabolismo de Andrógenos y Estrógenos
PRMT5
imagen513
imagen514
Metabolismo de Ascorbato y Aldarato
ALDH1A1
imagen515
imagen516
Biosíntesis de Ácidos Biliares
ALDH1A1
Metabolismo de Cisteína
LDHA
Biosíntesis de Ácidos Grasos
FASN
Señalización del Receptor de Glutamato
GNB2L1
imagen517
imagen518
Respuesta al Estrés Oxidativo medida por NRF2
PRDX1
imagen519
imagen520
Vía del Fosfato de Pentosa
GPI
imagen521
imagen522
Interconversiones de Pentosa y Glucuronato
UCHL1
imagen523
imagen524
Metabolism de Retinol
ALDH1A1
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Metabolismo de Riboflavina
TYR
Metabolismo de Tirosina
PRMT5, TYR
Biosíntesis de Ubiquinona
PRMT5
Degradación de Valina, Leucina e
ALDH1A1
Isoleucina
imagen525
Metabolismo de Glicina, Serina y
CHKA
Treonina
imagen526
Degradación de Lisina
ALDH1A1
Dolor/Sabor
TRPM5; TRPA1
Dolor
TRPM7; TRPC5; TRPC6; TRPC1; Cnr1; cnr2; Grk2;
imagen527
Trpa1; Pomc; Cgrp; Crf; Pka; Era; Nr2b; TRPM5; Prkaca;
imagen528
Prkacb; Prkar1a; Prkar2a
Función Mitocondrial
AIF; CytC; SMAC (Diablo); Aifm-1; Aifm-2
Neurología del desarrollo
BMP-4; Cordina (Chrd); Nogina (Nog); WNT (Wnt2;
imagen529
Wnt2b; Wnt3a; Wnt4; Wnt5a; Wnt6; Wnt7b; Wnt8b;
imagen530
Wnt9a; Wnt9b; Wnt10a; Wnt10b; Wnt16); beta-catenina;
imagen531
Dkk-1; Proteínas relacionadas con Frizzled; Otx-2; Gbx2; FGF8;
imagen532
Reelina; Dab1; unc-86 (Pou4f1 o Brn3a); Numb; Reln
Realizaciones de la invención también se refieren a métodos y composiciones relacionados con la inactivación de genes, la amplificación de genes y la reparación de mutaciones particulares asociadas con la inestabilidad en la repetición de ADN y trastornos neurológicos (Robert D. Wells, Tetsuo Ashizawa, Genetic Instabilities and Neurological Diseases, Segunda Edición, Academic Press 13 de oct. de 2011 -Medical). Se ha encontrado que 5 aspectos específicos de secuencias repetidas en tándem son los responsables de más de una veintena de enfermedades humanas (New insights into repeat instability: role of RNA•DNA hybrids. McIvor EI, Polak U, Napierala
M. RNA Biol. 2010 Sep.-Oct.;7(5):551-8). El sistema de CRISPR-Cas puede ser aprovechado para corregir estos defectos de la inestabilidad genómica.
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Ejemplos adicionales de afecciones preferidas tratables con el presente sistema se pueden seleccionar de: Síndrome de Aicardi-Goutieres; Enfermedad de Alexander; Síndrome de Allan-Herndon-Dudley; Trastornos Relacionados con POLG; Alfa-Manosidosis (Tipos I y III); Síndrome de Alström; Síndrome de Angelman; Ataxia-Telangiectasia; Lipofuscinosis Ceroide Neuronal; Beta-Talasemia; Atrofia Óptica Bilateral y Atrofia Óptica (Infantil) 5 Tipo 1; Retinoblastoma (bilateral); Enfermedad de Canavan; Síndrome Cerebro-oculofacioesquelético 1 [COFS1]; Xantomatosis Cerebrotendinosa: Síndrome de Cornelia de Lange; Trastornos Relacionados con MAPT; Enfermedades Priónicas Genéticas; Síndrome de Dravet; Enfermedad de Alzheimer Familiar de Aparición Temprana; Ataxia de Friedreich [FRDA]; Síndrome de Fryns; Fucosidosis; Distrofia Muscular Congénita de Fukuyama; Galactosialidosis; Enfermedad de Gaucher; Acidemias Orgánicas; Linfohistiocitosis Hemofagocítica; 10 Síndrome de Progeria de Hutchinson-Gilford; Mucolipidosis II; Enfermedad de Almacenamiento de Ácido Siálico Libre Infantil; Neurodegeneración Asociada a PLA2G6; Síndrome de Jervell y Lange-Nielsen; Epidermolisis Bullosa de la Unión; Enfermedad de Huntington; Enfermedad de Krabbe (Infantil); Síndrome de Leigh y NARP asociado a ADN mitocondrial; Síndrome de Lesch-Nyhan; Lisencefalia Asociada a LIS1; Síndrome de Lowe; Enfermedad de la Orina de Jarabe de Arce; Síndrome de Duplicación de MECP2; Trastornos de Transporte de Cobre Relacionados 15 con ATP7A; Distrofia Muscular Relacionada con LAMA2; Deficiencia de Arilsulfatasa A; Mucopolisacaridosis Tipos I, II o III; Trastornos de la Biogénesis de Peroxisomas, Espectro del Síndrome de Zellweger; Neurodegeneración con Trastornos de Acumulación de Hierro en el Cerebro; Deficiencia de Esfingomielinasa Ácida; Enfermedad de Niemann-Pick Tipo C; Encefalopatía de Glicina; Trastornos Relacionados con ARX; Trastornos del Ciclo de la Urea; Osteogénesis Imperfecta Relacionada con COL1A1/2; Síndromes Mitocondriales de Deleción de ADN; Trastornos 20 relacionados con PLP1; Síndrome de Perry; Síndrome de Phelan-McDermid; Enfermedad del Almacenamiento de Glucógeno Tipo II (Enfermedad de Pompe) (Infantil); Trastornos Relacionados con MAPT; Trastornos Relacionados con MECP2; Condrodisplasia Punctata Rizomélica Tipo 1; Síndrome de Roberts; Enfermedad de Sandhoff; Enfermedad de Schindler -Tipo 1; Deficiencia de Adenosina Desaminasa; Síndrome de Smith-Lemli-Opitz; Atrofia Muscular Espinal; Ataxia Espinocerebelosa de Brote Infantil; Deficiencia de Hexosaminidasa A; Displasia
25 Tanatofórica Tipo 1; Trastornos Relacionados con Colágeno Tipo VI; Síndrome de Usher Tipo I; Distrofia Muscular Congénita; Síndrome de Wolf-Hirschhorn; Deficiencia Lisosomal de Lipasa Ácida; y Xenoderma Pigmentosum.
Como resultará evidente, se prevé que el presente sistema se pueda utilizar para fijar como objetivo a cualquier secuencia de polinucleótidos de interés. Algunos ejemplos de afecciones o enfermedades que podrían ser tratadas útilmente utilizando el presente sistema se incluyen en las Tablas anteriores y también se proporcionan allí ejemplos
30 de genes asociados actualmente con esas afecciones. Sin embargo, los genes ejemplificados no son exhaustivos.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se dan con el propósito de ilustrar diversas realizaciones de la invención.
Ejemplo 1: Mejora del sistema Cas9 para la aplicación in vivo
Las solicitantes llevarón a cabo una búsqueda metagenómica para una Cas9 con pequeño peso molecular. La
35 mayoría de los homólogos de Cas9 son bastante grandes. Muchos homólogos de Cas9 conocidos son grandes y contienen más de 1300 amino ácidos. Por ejemplo, la SpCas9 es de alrededor de 1368aa de larga, que es demasiado grande para ser empaquetada fácilmente en vectores virales para el suministro. En la Figura 6 se muestra un gráfico que representa la distribución de longitud de homólogos de Cas9: El gráfico se genera a partir de secuencias depositadas en GenBank. Algunas de las secuencias pueden haber sido anotadas erróneamente y, por
40 lo tanto, la frecuencia exacta para cada uno de los tramos no tiene que ser necesariamente fiable. No obstante, proporciona un esbozo de la distribución de proteínas Cas9 y sugiere que existen homólogos de Cas9 más cortos.
A través de análisis computacional, la solicitante encontró que en la cepa bacteriana Campylobacter existen dos proteínas Cas9 con menos de 1000 aminoácidos. La secuencia para una Cas9 de Campylobacter jejuni se presenta a continuación. En esta longitud, CjCas9 puede empaquetarse fácilmente en AAV, lentivirus, adenovirus y otros
45 vectores virales para el suministro sólido en células primarias y en modelos animales in vivo. En una realización preferida de la invención, se utiliza la proteína Cas9 de S. aureus.
Cas9 de Campylobacter jejuni (CjCas9)
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En algunas realizaciones, las secuencias de emparejamiento tracr o las repeticiones directas se descargan ya sea desde la base de datos CRISPRs o se identifican in silico mediante el rastreo de motivos repetitivos que 1. se encuentran en una ventana de 2 kb de secuencia genómica flanqueante del locus de CRISPR de tipo II, 2. abarcan de 20 a 50 pb, y 3. están separados por 20 a 50 pb. En algunas realizaciones, se pueden utilizar 2 de estos criterios, 5 por ejemplo, 1 y 2, 2 y 3, ó 1 y 3. En algunas realizaciones, se pueden utilizar los 3 criterios. En algunas realizaciones tracrRNA candidatas son predichas posteriormente predichas por 1. homología de la secuencia con repeticiones directas (rastreo de motivos en Geneious con hasta apareamientos erróneos de hasta 18 pb), 2. presencia de un terminador transcripcional independiente de Rho predicho en la dirección de la transcripción y 3. la estructura secundaria de horquilla estable entre tracrRNA y la repetición directa. En algunas realizaciones, se
10 pueden utilizar 2 de estos criterios, por ejemplo 1 y 2, 2 y 3, ó 1 y 3. En algunas realizaciones, se pueden utilizar los 3 criterios. En algunas realizaciones, diseños de ARNs quiméricos guía sintéticos (sgRNAs) incorporan al menos 12 pb de la estructura dúplex entre la repetición directa y tracrRNA.
La lista de las secuencias de ortólogos Cas9 humanas, optimizadas en codones, a emparejarse con los ARNs quiméricos proporcionados en las Figuras 8 A-J se proporciona en las Figuras 9 A-O. La solicitante también ha 15 demostrado que los ortólogos Cas9 pueden escindir sus dianas en ensayos de escisión in vitro (Figura 16). Los loci de CRISPR en algunas de estas familias se representa en la Figura 11. Las secuencias de ARN guía correspondientes se muestran en la Figura 12. La solicitante analizó sistemáticamente la secuencia de ADN genómico dentro de ~ 2 kb de las proteínas Cas9 utilizando el código de análisis computacional habitual e identificó repeticiones directas que oscilaban entre 35 pb y 50 pb, con espaciadores intermedios que oscilaban entre 29 pb y 20 35 pb. Sobre la base de la secuencia de repetición directa, la solicitante rastreó de forma computacional secuencias candidatas tracrRNA con los siguientes criterios: fuera de la matriz de crRNA, pero que contienen un alto grado de homología con repeticiones directas (tal como se requiere para el apareamiento de bases repetición directa:tracRNA; análisis computacional habitual), fuera de las regiones codificadoras de los componentes de proteínas, que contienen señales de terminación de la transcripción Rho-independientes, ~ 60 pb-120 pb aguas 25 abajo de la región de homología de repeticiones directas, y co-plegamiento con repeticiones directas para formar un dúplex, seguido por dos o más estructuras de horquilla en el extremo distal de la secuencia de tracrRNA. Sobre la base de estos criterios de predicción, la solicitante seleccionó un conjunto inicial de 18 proteínas Cas9 y sus repeticiones directas asociadas de forma única y tracrRNAs distribuidos en todas las cinco familias Cas9. La solicitante generó, además, un conjunto de 18 estructuras de ARN quimérico que conservaron la secuencia y
30 estructuras secundarias del dúplex repetición directa nativa:tracrRNA al tiempo que acortaron la región de apareamiento de bases y fusionaron los dos elementos de ARN a través de un bucle artificial (Figuras 8A-J).
Ejemplo 3: Ortólogos Cas9
La solicitante ha generado ortólogos Cas9 optimizados en codones para progresar en la expresión en células eucariotas.
35 Un ejemplo de una secuencia humana optimizada en codones (es decir, optimizada para la expresión en seres humanos.) : SaCas9: se proporciona a continuación
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recombinación homóloga. Además de ello, SpCas9 con estas mutaciones reduce (individualmente) el nivel de ruptura de la doble cadena. Ortólogos Cas9 comparten todos la organización general de los dominios 3-4 RuvC y un dominio HNH (Figura 19). El dominio RuvC más próximo a 5’ escinde la cadena no complementaria y el dominio HNH escinde la cadena complementaria. Todas las notaciones son en referencia a la secuencia guía.
5 El residuo catalítico en el dominio 5' RuvC se identifica a través de la comparación de homología de la Cas9 de interés con otros ortólogos Cas9 (de locus de CRISPR tipo 11 de S. pyogenes, locus 1 de CRISPR de S. thermophilus, locus 3 de CRISPR de S. thermophilus y el locus de CRISPR tipo II de Franciscilla novicida), y el residuo Asp conservado está mutado a alanina para convertir Cas9 en una enzima que produce mella de la cadena complementaria. DE manera similar, los residuos His y Asn conservados en los dominios HNH están mutados a
10 alanina para convertir Cas9 en una enzima que produce mella de cadena no complementaria.
Ejemplo 5: Optimización funcional de Cas9
Para la función mejorada o para desarrollar nuevas funciones, la solicitante genera proteínas quiméricas Cas9 mediante la combinación de fragmentos de diferentes ortólogos Cas9.
Por ejemplo, la solicitante fusiona el extremo N de St1Cas9 (el fragmento de esta proteína está en negrita) con 15 extremo C de SpCas9 (el fragmento de esta proteína está subrayado).
> Sti(N)Sp(C)Cas9
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> Sp(N)St1(C)Cas9
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Mientras que determinados vectores AAV actuales pueden alojar hasta 4300 bases de ADN insertado, como un límite superior o un límite de empaquetamiento, el AAV puede tener ADN insertado de 4,5 o 4,75 KB. Esto significa que el ADN que codifica una enzima Cas9 así como un promotor y terminador de la transcripción tiene que encajar todos en el mismo vector viral. Construcciones mayores que 4,5 o 4,75 KB conducirá a una producción de virus
5 significativamente reducida. SpCas9 es bastante grande, el gen por sí es de más de 4,1 kb, lo que hace que sea difícil de empaquetar en un AAV. Por lo tanto, realizaciones de la invención incluyen utilizar ortólogos de Cas9 que sean más cortos. Por ejemplo:
Especie Tamaño de Cas9 Corynebacter diphtheria 3252 Fubacterium ventriosum 3321 Streptococcus pasteurianus 3390 Lactobacillus farciminis 3378 Sphaerochaeta globus 3537 Azospirillum B510 3504 Gluconacetobacter diazotrophicus 3150 Neisseria cinerea 3246 Roseburia intestinalis 3420 Parvibaculum lavamentivorans 3111 Staphylococcus aureus 3159 Nitratifractor salsuginis DSM 16511 3396 Campylobacter lari CF89-12 3009 Streptococcus thermophilus LMD-9 3396
La Figura 3 proporciona representaciones esquemáticas de vectores de AAV que se pueden utilizar en los métodos y composiciones de la invención. El empaquetamiento se comentó anteriormente.
10 Ejemplo 7: Modificación por Ingeniería Genética de Microalgas utilizando Cas9
Métodos de suministrar Cas9
Método 1: La solicitante suministra Cas9 y ARN guía utilizando un vector que expresa Cas9 bajo el control de un promotor constitutivo tal como Hsp70A-Rbc S2 o beta2-tubulina.
Método 2: La solicitante proporciona Cas9 y T7 polimerasa utilizando vectores que expresan Cas9 y T7 polimerasa
15 bajo el control de un promotor constitutivo tal como Hsp70A-Rbc S2 o beta2-tubulina. ARN guía será suministrada utilizando un promotor T7 que contiene vector que impulsa el ARN guía.
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Secuencia de un casete que impulsa la expresión de T7 polimerasa bajo el control del promotor beta-2 tubulina, seguido por la 3' UTR de Cop1:
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Sumario de la Eficiencia de Escisión del Genoma y otras Estadísticas en Todas las Dianas Testadas
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Los resultados del ensayo de PAM se muestran en las Figs. 22-27. Un ensayo completo de más de 100 dianas 5 identificó que el PAM para SaCas9 podría describirse como NNGRR (pero no NNGRRT como se indicó anteriormente).
Sumario del Ensayo de PAM: (1) NNGRR para SaCas9 PAM general – de ayuda para el diseño de nuevas dianas,
(2) Testado de doble nickase con nuevas dianas, (3) NNGRG puede ser un PAM más potente. Referencias:
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en donde, en (A) o (B), la enzima CRISPR es un ortólogo Cas9 de un género que pertenece al grupo que consiste en Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Fiaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma y Campylobacter.
Cláusula 2. Una enzima de CRISPR modificada, en donde la enzima es un ortólogo Cas9 de un género perteneciente al grupo que consiste en Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Fiaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma y Campylobacter, y en donde diferencias de la correspondiente enzima de CRISPR de tipo salvaje comprenden:
la enzima de CRISPR modificada está truncada en comparación con una enzima de CRISPR de tipo salvaje, o
la enzima de CRISPR tiene una longitud de al menos 500 aminoácidos, al menos 800-899 aminoácidos, al menos 900-999 aminoácidos, al menos 1000-1099 aminoácidos, al menos 1100-1199 aminoácidos, al menos 12001299 aminoácidos, al menos 1300-1399 aminoácidos, al menos 1400-1499 aminoácidos, al menos 1500-1599 aminoácidos, al menos 1600-1699 aminoácidos o al menos 2000 aminoácidos, y/o
la enzima de CRISPR es una nucleasa que dirige la escisión de las dos cadenas en la localización de la secuencia diana, o la enzima de CRISPR es una nickase que dirige la escisión de una cadena en la localización de la secuencia diana, y/o
la enzima de CRISPR está optimizada en codones o está optimizada en codones para la expresión en una célula eucariota, y/o
la enzima de CRISPR comprende una o más mutaciones, y/o
la enzima de CRISPR comprende una enzima CRISPR quimérica.
Cláusula 3. La composición de acuerdo con la cláusula 1, o la enzima de acuerdo con la cláusula 2, en donde la enzima de CRISPR tiene una o más mutaciones en cualquier dominio de la enzima.
Cláusula 4. La composición o enzima de acuerdo con cualquier cláusula precedente, en donde la enzima de CRISPR tiene una o más mutaciones en un dominio catalítico.
Cláusula 5. La composición o enzima de acuerdo con la cláusula 3 ó 4, en donde la una o más mutaciones es en un dominio RuvC I, RuvC II, RuvC III o HNH de la enzima de CRISPR.
Cláusula 6. La composición o enzima de acuerdo con la cláusula 4 ó 5, en donde la enzima de CRISPR comprende una o más mutaciones correspondientes a la numeración de posición de SpCas9 en las posiciones D10A, E762A, H840A, N854A, N863A o D986A.
Cláusula 7. La composición o enzima de acuerdo con cualquier cláusula precedente, en donde la enzima comprende, además, un dominio funcional.
Cláusula 8. La composición o enzima de acuerdo con la cláusula 7, en donde el dominio funcional es un dominio activador transcripcional.
Cláusula 9. La composición o enzima de acuerdo con la cláusula 8, en donde el dominio activador transcripcional es VP64.
Cláusula 10. La composición o enzima de acuerdo con las cláusulas 7 a 9, en donde el dominio funcional es un dominio represor transcripcional.
Cláusula 11. La composición o enzima de acuerdo con la cláusula 10, en donde el dominio represor transcripcional es KRAB, SID o SID4X.
Cláusula 12. Un método para modificar un organismo o un organismo no humano mediante la manipulación de una secuencia diana en un locus genómico de interés, que comprende
suministrar una composición que se produce de forma no natural o modificada por ingeniería genética que comprende un sistema de vectores que codifica operativamente una composición de cualquier cláusula precedente para la expresión de la misma.
Cláusula 13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el suministro es a través de uno o más vectores virales.
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IV. un cuarto elemento regulador enlazado operativamente a una secuencia codificadora de enzima que codifica una segunda enzima de CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de localización nuclear y está enlazada operativamente a un segundo dominio funcional,
en donde (i), (ii) y (iii) en I y II están dispuestos en una orientación 5' a 3',
en donde los componentes I, II, III y IV se encuentran en el mismo o en diferentes vectores del sistema,
en donde, cuando se transcriben, cada una de las secuencias de emparejamiento tracr se hibrida con su secuencia tracr correspondiente y la primera y segunda secuencias guía dirigen la unión específica para la secuencia del primer y segundo complejos de CRISPR a la primera y segunda secuencia diana,
en donde el complejo de CRISPR comprende la enzima de CRISPR formando complejo con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida con la secuencia de tracr, y en donde la expresión de la enzima de CRISPR proporciona la manipulación de la secuencia diana,
en donde la primera y segunda enzimas de CRISPR comprenden cada una dos o más mutaciones,
en donde la primera y segunda enzima de CRISPR es un ortólogo Cas9 de un género que pertenece al grupo que consiste en Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor , Mycoplasma y Campylobacter, y
en donde el primer locus genómico es modulado por la actividad del primer dominio funcional y el segundo locus genómico es modulado por la actividad del segundo dominio funcional.
Cláusula 16. La composición de acuerdo con la cláusula 14, o el método de acuerdo con la cláusula 15, en donde el primer dominio funcional se selecciona del grupo que consiste en un activador transcripcional, un represor transcripcional, una recombinasa, una transposasa, un remodelador de histona, una ADN metiltransferasa, un criptocromo y un dominio inducible/controlable por la luz o un dominio inducible y/o controlable químicamente.
Cláusula 17. La composición de acuerdo con la cláusula 14 ó 16, o el método de acuerdo con la cláusula 15 ó 16, en donde el segundo dominio funcional se selecciona del grupo que consiste en un activador transcripcional, un represor transcripcional, una recombinasa, una transposasa, un remodelador de histona, una ADN metiltransferasa, un criptocromo y un dominio inducible/controlable por la luz o un dominio inducible y/o controlable químicamente.
Cláusula 18. La composición o el método de acuerdo con la cláusula 16 ó 17, en donde el primer o segundo dominio funcional es un dominio activador transcripcional.
Cláusula 19. La composición o el método de acuerdo con la cláusula 47, en donde el dominio activador transcripcional es VP64.
Cláusula 20. La composición o el método de acuerdo con la cláusula 16 ó 17, en donde el primer o segundo dominio funcional es un dominio represor transcripcional.
Cláusula 21. La composición o el método de acuerdo con la cláusula 20, en donde el dominio represor transcripcional es KRAB, SID o SID4X.
Cláusula 22. La composición o el método de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 14 a 21, en donde la primera o segunda enzima de CRISPR es una Cas9 de Sutterella wadsworthensis.
Cláusula 23. La composición o el método de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 14 a 21, en donde la primera o segunda enzima de CRISPR es una Cas9 de Filifactor alocis.
Cláusula 24. La composición o el método de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 14 a 21, en donde la primera o segunda enzima de CRISPR es una Cas9 de Lactobacillus johnsonii.
Cláusula 25. La composición o el método de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 14 a 21, en donde la primera o segunda enzima de CRISPR es una Cas9 de Campylobacter lari.
Cláusula 26. La composición o el método de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 14 a 21, en donde la primera o segunda enzima de CRISPR es una Cas9 de Corynebacter diptheriae.
Cláusula 27. La composición o el método de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 14 a 21, en donde la primera o segunda enzima de CRISPR es una Cas9 de Parvibaculum lavamentivorans.
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A) -I. una secuencia de polinucleótidos de ARN quimérico (chiRNA) de un sistema de CRISPR-Cas, en donde la secuencia de polinucleótidos comprende:
(a)
una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula eucariota,
(b)
una secuencia de emparejamiento de tracr, y
(c)
una secuencia de tracr, y
II. una secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima de CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de localización nuclear,
en donde (a), (b) y (c) están dispuestas en una orientación 5' a 3',
en donde, cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un complejo de CRISPR a la secuencia diana, y
en donde el complejo de CRISPR comprende la enzima de CRISPR formando complejo con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida con la secuencia de tracr, y la secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima de CRISPR es ADN o ARN,
o
(B) I. polinucleótidos que comprenden:
(a)
una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula procariota, y
(b)
al menos una o más secuencias de emparejamiento tracr,
II. una secuencia de polinucleótido que codifica una enzima de CRISPR, y
III. una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia tracr, en donde cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un complejo de CRISPR a la secuencia diana, y
en donde el complejo de CRISPR comprende la enzima CRISPR formando complejo con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida con la secuencia tracr, y la secuencia de polinucleótido que codifica una enzima de CRISPR es ADN o ARN, y
en donde la enzima de CRISPR es un ortólogo Cas9 de un género que pertenece al grupo que consiste en Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Fiaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma y Campylobacter.
Cláusula 63. Un método de modificar un organismo o un organismo no humano mediante manipulación de una secuencia diana en un locus genómico de interés, que comprende suministrar una composición que se produce de forma no natural o modificada por ingeniería genética, que comprende:
A) -I. una secuencia de polinucleótidos de ARN quimérico (chiRNA) de un sistema de CRISPR-Cas, en donde la secuencia de polinucleótidos comprende:
(a)
una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula eucariota,
(b)
una secuencia de emparejamiento de tracr, y
(c)
una secuencia de tracr, y
II. una secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima de CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de localización nuclear,
en donde (a), (b) y (c) están dispuestas en una orientación 5' a 3',
en donde, cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un complejo de CRISPR a la secuencia diana, y
en donde el complejo de CRISPR comprende la enzima de CRISPR formando complejo con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida con la secuencia de tracr, y la secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima de CRISPR es ADN o ARN,
o
(B) I. polinucleótidos que comprenden:
(a)
una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula procariota, y
(b)
al menos una o más secuencias de emparejamiento tracr,
II. una secuencia de polinucleótido que codifica una enzima de CRISPR, y
III. una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia tracr, en donde cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un complejo de CRISPR a la secuencia diana, y
en donde el complejo de CRISPR comprende la enzima CRISPR formando complejo con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida con la secuencia tracr, y la secuencia de polinucleótido que codifica una enzima de CRISPR es ADN o ARN, y
en donde la enzima de CRISPR es un ortólogo Cas9 de un género que pertenece al grupo que consiste en Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Fiaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma y Campylobacter.
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