JP2020099333A - 配列操作のための改善された系、方法および酵素組成物のエンジニアリングおよび最適化 - Google Patents

配列操作のための改善された系、方法および酵素組成物のエンジニアリングおよび最適化 Download PDF

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Abstract

【課題】多彩な用途の配列ターゲティングのための代替的で堅牢な系および技術の提供。【解決手段】（Ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡポリヌクレオチド配列に作動可能に結合している第１の調節エレメント、および、少なくとも１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメント、または、（Ｂ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、および少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒメイト配列に作動可能に結合している第１の調節エレメント、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列に作動可能に結合している第２の調節エレメント、およびｔｒａｃｒ配列に作動可能に結合している第３の調節エレメントを含み、各エレメントは同一または異なるベクター上にあり、ＣＲＩＳＰＲ酵素は特定の属の微生物由来である、天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物。【選択図】なし

Description

関連出願および参照による組み込み
本出願は、２０１３年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／８３６，１０１号明細書、標題ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＯＰＴＩＭＩＺＡＴＩＯＮ ＯＦ ＩＭＰＲＯＶＥＤ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＥＮＺＹＭＥ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮの優先権を主張する。本出願は、米国仮特許出願第６１／７５８，４６８号明細書；同第６１／７６９，０４６号明細書；同第６１／８０２，１７４号明細書；同第６１／８０６，３７５号明細書；同第６１／８１４，２６３号明細書；同第６１／８１９，８０３号明細書および同第６１／８２８，１３０号明細書の優先権も主張し、それぞれ標題ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＯＰＴＩＭＩＺＡＴＩＯＮ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮであり、それぞれ２０１３年１月３０日；２０１３年２月２５日、２０１３年３月１５日；２０１３年３月２８日、２０１３年４月２０日；２０１３年５月６日および２０１３年５月２８日に出願されたものである。本出願は、米国仮特許出願第６１／７３６，５２７号明細書および同第６１／７４８，４２７号明細書の優先権も主張し、両方とも標題ＳＹＳＴＥＭＳ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮであり、それぞれ２０１２年１２月１２日および２０１３年１月２日に出願されたものである。それぞれ２０１３年３月１５日および２０１３年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／７９１，４０９号明細書および同第６１／８３５，９３１号明細書の優先権も主張される。
それぞれ２０１３年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／８３６，１２７号明細書、同第６１／８３５，９３６号明細書、同第６１／８３６，０８０号明細書、同第６１／８３６，１２３号明細書、および同第６１／８３５，９７３号明細書が参照される。
上記の出願、ならびにそれらの出願においてまたはそれらの審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）およびその出願引用文献において引用または参照される全ての文献、ならびに本明細書において引用または参照される全ての文献（「本明細書引用文献」）、および本明細書引用文献において引用または参照される全ての文献は、本明細書においてまたは本明細書に参照により組み込まれる任意の文献において挙げられる任意の製品に関する任意の製造業者の指示書、説明書、製品仕様書、および製品シートと一緒に、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施において用いることができる。より具体的には、全ての参照文献は、それぞれの個々の文献が個別具体的に参照により組み込まれることが示されるような程度で参照により組み込まれる。
本発明は、一般に、クラスター化等間隔短鎖回分リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）およびその成分に関する配列ターゲティング、例えば、ゲノム摂動または遺伝子編集を含む遺伝子発現の制御に使用される系、方法および組成物のエンジニアリングおよび最適化に関する。
連邦政府により資金提供された研究に関する記述
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）により助成されたＮＩＨパイオニアアワード（１ＤＰ１ＭＨ１００７０６）のもと政府支援によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
ゲノムシーケンシング技術および分析法の近年の進歩により、多様な範囲の生物学的機能および疾患に関連する遺伝因子を分類およびマッピングする技能が顕著に加速されている。正確なゲノムターゲティング技術は、個々の遺伝子エレメントの選択的摂動を可能とすることにより因果的遺伝子変異の体系的なリバースエンジニアリングを可能とするため、ならびに合成生物学、バイオテクノロジーおよび医薬用途を進歩させるために必要とされる。ゲノム編集技術、例えば、デザイナー亜鉛フィンガー、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）、またはホーミングメガヌクレアーゼがターゲティングされるゲノム摂動の産生に利用可能であるが、安価で、設定が容易で、スケーラブルで、真核ゲノム内の複数位置をターゲティングしやすい新たなゲノムエンジニアリング技術が依然として必要とされている。
国際公開第９７／０３２１１号パンフレット
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系（両方の用語は、本出願全体にわたり互換的に使用される）は特異的配列をターゲティングするためにカスタムタンパク質の生成を要求するのではなく、単一Ｃａｓ酵素を短鎖ＲＮＡ分子によりプログラミングして特異的ＤＮＡ標的を認識させることができ、換言すると、Ｃａｓ酵素は、前記短鎖ＲＮＡ分子を使用して特異的ＤＮＡ標的にリクルートすることができる。ゲノムシーケンシング技術および分析法のレパートリーへのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の付加により方法論が顕著に簡易化され、多様な範囲の生物学的機能および疾患に関連する遺伝因子を分類およびマッピングする技能が加速される。有害効果を有さずにゲノム編集にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を有効に利用するため、特許請求される本発明の態様であるそれらのゲノムエンジニアリングツールのエンジニアリングおよび最適化の態様を理解することが重要である。
したがって、多彩な用途の配列ターゲティングのための代替的で堅牢な系および技術が差し迫って必要とされている。本発明の態様は、この必要性に対処し、関連する利点を提供する。例示的なＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、限定されるものではないが、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）が挙げられる属のＣａｓオルソログ、例えば、Ｃａｓ９オルソログである。ガイド配列は、次いでｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。
一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントを使用する方法を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチドを改変するための有効な手段を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、広範な有用性、例として、非常に多数の細胞タイプ中の標的ポリヌクレオチドの改変（例えば、欠失、挿入、転座、不活性化、活性化、抑制、メチル化の変更、規定部分の移動）を有する。したがって、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、例えば、遺伝子またはゲノム編集、遺伝子調節、遺伝子療法、薬物送達、薬物スクリーニング、疾患診断、および予後における幅広い用途範囲を有する。本発明の好ましい態様において、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、限定されるものではないが、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）が挙げられる属のＣａｓ酵素、好ましくは、Ｃａｓ９オルソログを含む。
本発明の態様は、最適化機能を有するＣＲＩＳＰＲ酵素に関する。Ｃａｓ酵素であるＣＲＩＳＰＲ酵素に関して、本発明の好ましい実施形態は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系における改善された標的特異性を有するＣａｓ９オルソログに関する。このことは、限定されるものではないが、最適な活性を有するガイドＲＮＡの設計および調製、規定の長さのＣａｓ９酵素の選択、Ｃａｓ９酵素のトランケーション（Ｃａｓ９をコードする核酸分子をトランケートすることにより、対応する野生型Ｃａｓ９酵素よりもＣａｓ９の長さを短くする）、ならびにキメラＣａｓ９酵素（調整された特異性を有するキメラ酵素を得るために酵素の異なる部分が異なるオルソログ間でスワップまたは交換されている）の生成が挙げられるアプローチにより達成することができる。本発明の態様はまた、Ｃａｓ９オルソログ酵素の標的特異性を改善する方法またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を設計する方法であって、最適な活性を有するガイドＲＮＡを設計もしくは調製することおよび／または対応する野生型Ｃａｓ９よりも小さいサイズもしくは長さを有するＣａｓ９オルソログ酵素を選択もしくは調製すること（それにより、対応する野生型Ｃａｓ９よりも送達ベクター中のそのコード配列が短いため、それをコードする核酸の送達ベクター中へのパッケージングが向上する）、および／またはキメラＣａｓ９酵素を生成することを含む方法に関する。
医療における本発明の配列、ベクター、酵素または系の使用も提供される。遺伝子またはゲノム編集において使用される本発明の配列、ベクター、酵素または系も提供される。遺伝子またはゲノム編集、例えば、遺伝子またはゲノム編集による治療のための医薬品の製造における本発明の配列、ベクター、酵素または系の使用も提供される。治療において使用される本発明の配列、ベクター、酵素または系も提供される。
本発明の追加の態様において、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９酵素は、１つ以上の突然変異を含み得、機能ドメインとの融合を有し、もしくは有さず、またはそれに作動可能に結合している包括的ＤＮＡ結合タンパク質として使用することができる。突然変異は人工的に導入された突然変異であり得、それとしては、限定されるものではないが、触媒ドメイン中の１つ以上の突然変異を挙げることができる。Ｃａｓ９酵素に関する触媒ドメインの例としては、限定されるものではないが、ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、ＲｕｖＣＩＩＩおよびＨＮＨドメインを挙げることができる。好適な突然変異の好ましい例は、Ｃａｓ９のＮ末端ＲｕｖＣＩドメイン中の触媒残基または内部ＨＮＨドメイン中の触媒残基である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）である（またはそれに由来する）。このような実施形態において、好ましい突然変異は、ＳｐＣａｓ９の１０、７６２、８４０、８５４、８６３および／または９８６位またはＳｐＣａｓ９の位置ナンバリングに関して他のＣａｓ９オルソログ中の対応する位置（例えば、標準的な配列比較ツール、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷまたはＬａｓｅｒｇｅｎｅ １０ ｓｕｉｔｅによるＭｅｇＡｌｉｇｎにより確認することができる）のいずれかまたは全てにおけるものである。特に、ＳｐＣａｓ９中の以下の突然変異：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａおよび／またはＤ９８６Ａのいずれかまたは全てが好ましく；置換アミノ酸のいずれかについての保存的置換も想定される。他のＣａｓ９オルソログ中のＳｐＣａｓ９の位置ナンバリングに関して対応する位置における同一の突然変異（またはそれらの突然変異の保存的置換）も、好ましい。ＳｐＣａｓ９中のＤ１０およびＨ８４０が特に好ましい。しかしながら、他のＣａｓ９において、ＳｐＣａｓ９Ｄ１０およびＨ８４０に対応する残基も好ましい。これらは、単独で突然変異される場合、それらがニッカーゼ活性を提供するため、および両方の突然変異が存在する場合、Ｃａｓ９が包括的ＤＮＡ結合に有用な触媒的に無効な突然変異体に変換されるため有利である。さらなる突然変異が同定および特性決定された。本発明の他の態様は、限定されるものではないが、転写アクチベーター、転写リプレッサー、リコンビナーゼ、トランスポーゼース、ヒストンリモデラー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、クリプトクロム、光誘導性／制御性ドメインまたは化学誘導性／制御性ドメインが挙げられるドメインに融合しており、または作動可能に結合している突然変異Ｃａｓ９酵素に関する。
本発明のさらなる態様は、キメラＣａｓ９タンパク質およびキメラＣａｓ９タンパク質を生成する方法を提供する。キメラＣａｓ９タンパク質は、異なるＣａｓ９オルソログが起源である断片を含むタンパク質である。例えば、第１のＣａｓ９オルソログのＮ末端を、第２のＣａｓ９オルソログのＣ末端と融合させて得られるＣａｓ９キメラタンパク質を生成することができる。これらのキメラＣａｓ９タンパク質は、キメラタンパク質が生成される個々のＣａｓ９酵素のいずれかの元の特異性または効率よりも高い特異性または高い効率を有し得る。これらのキメラタンパク質は、１つ以上の突然変異も含み得、または１つ以上の機能ドメインに結合させることができる。したがって、本発明の態様は、第１のＣａｓオルソログからの１つ以上の断片および第２のＣａｓオルソログからの１つ以上の断片を含むキメラＣａｓ酵素に関する。本発明の一実施形態において、第１または第２のＣａｓオルソログの１つ以上の断片は、第１または第２のＣａｓオルソログのＣまたはＮ末端からのものである。さらなる実施形態において、第１または第２のＣａｓオルソログは、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群に属する属から選択される。
さらなる実施形態において、本発明は、Ｃａｓ酵素、例えば、Ｃａｓ９オルソログを含むＣＲＩＳＰＲ複合体の突然変異体成分を生成する方法を提供する。突然変異体成分としては、限定されるものではないが、突然変異体ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒメイト配列または細胞中のそれらのＲＮＡの性能の向上を可能とする突然変異体キメラガイド配列を挙げることができる。標的配列の改変のための医薬品の調製における本組成物または酵素の使用も提供される。
本発明は、いっそうさらなる態様において、
Ａ）−Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列であって、
（ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列
（ｂ）ｔｒａｃｒメイト配列、および
（ｃ）ｔｒａｃｒ配列
を含むポリヌクレオチド配列、および
ＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列
を含み、
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、５’から３’配向で配置されており、
転写されるとｔｒａｃｒメイト配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつガイド配列が標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、
ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡである
天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物
または
（Ｂ）Ｉ．ポリヌクレオチドであって、
（ａ）原核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、および
（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒメイト配列
を含むポリヌクレオチド、
ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、および
ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列を含むポリヌクレオチド配列
を含み、
転写されるとｔｒａｃｒメイト配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつガイド配列が標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異標的結合を指向し、
ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群に属する属のＣａｓ９オルソログである
天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物に関する組成物および方法を提供する。
本発明は、いっそうさらなる態様において、（Ａ）Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列に作動可能に結合している第１の調節エレメント（ポリヌクレオチド配列は、（ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、（ｂ）ｔｒａｃｒメイト配列、および（ｃ）ｔｒａｃｒ配列を含む）、およびＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメントを含み、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、５’から３’配向で配置されており、成分ＩおよびＩＩは、系の同一または異なるベクター上にあり、転写されるとｔｒａｃｒメイト配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつガイド配列が標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群に属する属のＣａｓ９オルソログである１つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物または（Ｂ）Ｉ．（ａ）原核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、および（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒメイト配列に作動可能に結合している第１の調節エレメント、ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメント、およびＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列に作動可能に結合している第３の調節エレメントを含み、成分Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩは、系の同一または異なるベクター上にあり、転写されるとｔｒａｃｒメイト配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつガイド配列が標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群に属する属のＣａｓ９オルソログであり、以下の基準の少なくとも１つが当てはまる１つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を提供する。
基準は以下のとおりであり、それらの任意数が当てはまり得、好ましくは、１つ以上、好ましくは、２つ以上、好ましくは、３つ以上、４つ以上、または５つ以上、または全てが当てはまり得ることが認識される：
−規定のサイズを有するＣＲＩＳＰＲ酵素が選択され、少なくとも５００アミノ酸、少なくとも８００〜８９９アミノ酸、少なくとも９００〜９９９アミノ酸、少なくとも１０００〜１０９９アミノ酸、少なくとも１１００〜１１９９アミノ酸、少なくとも１２００〜１２９９アミノ酸、少なくとも１３００〜１３９９アミノ酸、少なくとも１４００〜１４９９アミノ酸、少なくとも１５００〜１５９９アミノ酸、少なくとも１６００〜１６９９アミノ酸または少なくとも２０００アミノ酸の長さを有し；
−および／またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、対応する野生型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較してトランケートされており；
−および／またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における両方の鎖の開裂を指向するヌクレアーゼであり、もしくはＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における一方の鎖の開裂を指向するニッカーゼであり；
−および／またはガイド配列は、少なくとも１０、少なくとも１５または少なくとも２０ヌクレオチドを含み；
−および／またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、コドン最適化されており、もしくは真核細胞中の発現のためにコドン最適化されており；
−および／またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の突然変異を含み；
−および／またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、キメラＣＲＩＳＰＲ酵素を含み；
−および／またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、本明細書において考察される１つ以上の他の特質を有する。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、野生型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較してトランケートされており、またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、少なくとも５００アミノ酸、少なくとも８００〜８９９アミノ酸、少なくとも９００〜９９９アミノ酸、少なくとも１０００〜１０９９アミノ酸、少なくとも１１００〜１１９９アミノ酸、少なくとも１２００〜１２９９アミノ酸、少なくとも１３００〜１３９９アミノ酸、少なくとも１４００〜１４９９アミノ酸、少なくとも１５００〜１５９９アミノ酸、少なくとも１６００〜１６９９アミノ酸または少なくとも２０００アミノ酸を含む。好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ酵素、例えば、Ｃａｓ９オルソログである。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における両方の鎖の開裂を指向するヌクレアーゼであり、またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における一方の鎖の開裂を指向するニッカーゼである。さらなる実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、包括的ＤＮＡ結合タンパク質である触媒的に無効な突然変異体である。好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ酵素、例えば、Ｃａｓ９オルソログである。
一部の実施形態において、ガイド配列は、少なくとも１５ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、コドン最適化されており、または真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の突然変異を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、キメラＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、本明細書において考察される１つ以上の他の特質を有する。好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ酵素、例えば、Ｃａｓ９オルソログである。
ある実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の突然変異を含む。１つ以上の突然変異は、酵素の特定のドメイン中に存在し得る。好ましい実施形態において、１つ以上の突然変異は、触媒ドメイン中に存在し得る。さらに好ましい実施形態において、触媒ドメインは、ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、ＲｕｖＣＩＩＩまたはＨＮＨドメインである。より好ましい実施形態において、１つ以上の突然変異は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣ１またはＨＮＨドメイン中に存在する。さらに好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ酵素、例えば、Ｃａｓ９オルソログであり、突然変異は、限定されるものではないが、ＳｐＣａｓ９の位置ナンバリングに関してＤ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３ＡまたはＤ９８６Ａに対応する位置が挙げられる１つまたは位置におけるものであり得、および／または本明細書において他に考察される突然変異である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、酵素の特定のドメイン中の１つ以上の突然変異を有し、転写されるとｔｒａｃｒメイト配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつガイド配列が標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、酵素は、機能ドメインをさらに含む。機能ドメインとしては、限定されるものではないが、転写アクチベーター、転写リプレッサー、リコンビナーゼ、トランスポーゼース、ヒストンリモデラー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、クリプトクロム、光誘導性／制御性ドメインまたは化学誘導性／制御性ドメインを挙げることができる。
一部の実施形態において、機能ドメインは、転写アクチベータードメインＶＰ６４である。一部の実施形態において、機能ドメインは、転写リプレッサードメインＫＲＡＢである。一部の実施形態において、転写リプレッサードメインは、ＳＩＤであり、またはＳＩＤのコンカテマー（すなわち、ＳＩＤ４Ｘ）である。一部の実施形態において、エピジェネティック修飾酵素、例えば、ヒストン修飾タンパク質またはエピジェネティッククロマチン修飾タンパク質が提供される。一部の実施形態において、Ｐ６５アクチベータードメインであり得るアクチベータードメインが提供される。
本発明のさらなる態様は、２つ以上の目的ゲノム遺伝子座を改変する方法を包含する。本発明の好ましい実施形態において、２つ以上のゲノム遺伝子座を、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、２つ以上のＣａｓ９オルソログを利用することにより別個にモジュレートし、それぞれのオルソログは、１つ以上の機能ドメインに作動可能に結合している。一態様において、本発明は、真核細胞中の２つ以上のゲノム遺伝子座を改変する方法を提供する。したがって、本発明の態様は、生物中の２つ以上の目的ゲノム遺伝子座の発現をモジュレートする方法であって、
Ｉ．第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列に作動可能に結合している第１の調節エレメント（第１のポリヌクレオチド配列は、
（ｉ）生物の細胞中の第１のゲノム遺伝子座における第１の標的配列にハイブリダイズし得る第１のガイド配列
（ｉｉ）第１のｔｒａｃｒメイト配列、および
（ｉｉｉ）第１のｔｒａｃｒ配列
を含む）、および
ＩＩ．第２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列に作動可能に結合している第２の調節エレメント（第２のポリヌクレオチド配列は、
（ｉ）生物の細胞中の第２のゲノム遺伝子座における第２の標的配列にハイブリダイズし得る第２のガイド配列、
（ｉｉ）第２のｔｒａｃｒメイト配列、および
（ｉｉｉ）第２のｔｒａｃｒ配列
を含む）、および
ＩＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み、第１の機能ドメインに作動可能に結合している第１のＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第３の調節エレメント、
ＩＶ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み、第２の機能ドメインに作動可能に結合している第２のＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第４の調節エレメント
を含み、ＩおよびＩＩの（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、５’から３’配向で配置されており、成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶは、系の同一または異なるベクター上にあり、転写されるとそれぞれのｔｒａｃｒメイト配列ｇあｇｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ第１および第２のガイド配列が第１および第２の標的配列への第１および第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素の発現は、標的配列の操作を提供し、第１および第２のＣＲＩＳＰＲ酵素は、２つ以上の突然変異をそれぞれ含み、第１および第２のＣＲＩＳＰＲ酵素は、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群に属する属のＣａｓ９オルソログである１つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を送達することを含み、第１のゲノム遺伝子座を、第１の機能ドメインの活性によりモジュレートし、第２のゲノム遺伝子座を、第２の機能ドメインの活性によりモジュレートする方法を提供する。さらなる実施形態において、第１の機能ドメインは、転写アクチベーター、転写リプレッサー、リコンビナーゼ、トランスポーゼース、ヒストンリモデラー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、クリプトクロムおよび光誘導性／制御性ドメインまたは化学誘導性／制御性ドメインからなる群から選択される。さらなる実施形態において、第２の機能ドメインは、転写アクチベーター、転写リプレッサー、リコンビナーゼ、トランスポーゼース、ヒストンリモデラー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、クリプトクロムおよび光誘導性／制御性ドメインまたは化学誘導性／制御性ドメインからなる群から選択される。好ましい実施形態において、第１または第２のＣＲＩＳＰＲ酵素は、ステレラ・ウォズワーセンシス（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）Ｃａｓ９、フィリファクター・アロシス（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ）Ｃａｓ９、ラクトバシラス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）Ｃａｓ９、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）Ｃａｓ９、コリネバクター・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）Ｃａｓ９、パービバキュラム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）Ｃａｓ９、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）Ｃａｓ９、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ Ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）Ｐａｒｉｓ Ｃａｓ９、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９、スタフィロコッカス・シュードインターメディアス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）Ｃａｓ９、ネイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）Ｃａｓ９である。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素、好ましくは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素である。このＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、任意のＣａｓ酵素であり得る。Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ９として識別することができる。それというのも、これは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系からの複数のヌクレアーゼドメインを有する最大のヌクレアーゼとの相同性を共有する酵素の一般クラスを指し得るためである。最も好ましくは、Ｃａｓ９酵素は、ＳｐＣａｓ９または黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ Ａｕｒｅｕｓ）ＳａＣａｓ９からのものであり、またはそれらに由来する。由来するとは、由来酵素の大部分が、野生型酵素との高程度の配列相同性を有するという意味において、野生型酵素をベースとするが、それが本明細書に記載の一部の手法で突然変異（改変）されたことを意味する。
用語ＣａｓおよびＣＲＩＳＰＲ酵素は、特に明らかでない限り、本明細書において互換的に一般に使用されることが認識される。上記のとおり、本明細書において使用される残基ナンバリングの多くは、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｔｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）中のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのＣａｓ９酵素を指す。しかしながら、本発明は、他の微生物種、例えば、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）またはカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）の属に属するものからのさらに多くのＣａｓ９、例えば、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９、Ｓｔ３Ｃａｓ９などを含むことが認識され、Ｓｔは、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）である。
この場合にはヒトに最適化された（すなわちヒトでの発現に最適化されている）コドン最適化配列の例が本明細書に提供される（ＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照のこと）。これが好ましいが、他の例が可能であることが理解されるであろうとともに、宿主種に対するコドン最適化は公知である。
本発明のさらなる態様は、改善された開裂特異性、最適化されたｔｒａｃｒ配列、最適化されたキメラガイドＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒメイト配列の同時フォールド（ｃｏ−ｆｏｌｄ）構造、ｔｒａｃｒＲＮＡの二次構造の安定化、短縮された塩基対形成の領域を有するｔｒａｃｒＲＮＡ、融合ＲＮＡエレメントを有するｔｒａｃｒＲＮＡ、簡略化されたクローニングおよび送達、低減された毒性および／または誘導性系に関する。本発明の別の態様は、キメラＲＮＡ、および／またはガイド配列およびまたはＣＲＩＳＰＲ複合体のそれらの一部の安定化に関し、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲオルソログであり、キメラＲＮＡ、および／またはガイド配列およびまたはそれらの一部は、合成または化学修飾ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡ／ＢＮＡ：チオール修飾、２’／３’−ＯＨ架橋修飾）により安定化され、分解／加水分解耐性になるように改変され、それに構造安定性のエレメントが添加された。
本発明は、ある実施形態において、目的ゲノム遺伝子座中の標的配列の操作により生物または非ヒト生物を改変する方法であって、本明細書において考察される組成物をその発現のために作動可能にコードする１つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を送達することを含む方法をさらに包含する。好ましくは、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスまたはバキュロウイルス、または好ましくは、アデノウイルス／アデノ随伴ウイルスベクターであるが、他の送達手段が公知であり（例えば、酵母系、マイクロベシクル、遺伝子銃／ベクターを金ナノ粒子に付着させる手段）、提供される。
種々の送達手段が本明細書に記載され、本節でさらに考察される。
ウイルス性送達：ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えばＣａｓ９および／または本ＲＮＡのいずれか、例えばガイドＲＮＡは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルスまたは他のウイルスベクター型、またはそれらの組み合わせを使用して送達することができる。Ｃａｓ９および１つ以上のガイドＲＮＡは１つ以上のウイルスベクターにパッケージングすることができる。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、例えば筋肉内注射によって目的の組織に送達されるが、他の場合にはウイルス性送達は静脈内、経皮的、鼻腔内、経口、粘膜、または他の送達方法による。かかる送達は単回用量によっても、あるいは複数回用量によってもよい。当業者は、本明細書における送達される実際の投薬量が、ベクターの選択、標的細胞、生物、または組織、治療対象の全身状態、求められる形質転換／改変の程度、投与経路、投与方法、求められる形質転換／改変のタイプ等の種々の要因に応じて大幅に異なり得ることを理解する。
かかる投薬量は、例えば、担体（水、生理食塩水、エタノール、グリセロール、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油等）、希釈剤、薬学的に許容可能な担体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、薬学的に許容可能な賦形剤、抗原性を増強するアジュバント、免疫賦活性化合物または分子、および／または当該技術分野において公知の他の化合物をさらに含有し得る。本明細書におけるアジュバントは、抗原が吸着するミネラル（ミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）の懸濁液；または抗原溶液が油中に乳化される油中水型エマルション（ＭＦ−５９、フロイントの不完全アジュバント）（時に死滅マイコバクテリアを含む（フロイントの完全アジュバント））を含有して抗原性をさらに増強し得る（抗原の分解を阻害しおよび／またはマクロファージの流入を生じさせる）。アジュバントにはまた、免疫賦活性分子、例えばサイトカイン、副刺激分子、および例えば、免疫賦活性ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、例えばＣｐＧオリゴヌクレオチドも含まれる。かかる投薬量配合は当業者により容易に確かめられる。投薬量は、１つ以上の薬学的に許容可能な塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等の有機酸塩をさらに含有し得る。加えて、補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、ゲルまたはゲル化材料、香味料、着色料、マイクロスフェア、ポリマー、懸濁剤等もまた本明細書において存在し得る。加えて、１つ以上の他の従来の医薬品成分、例えば保存剤、保湿剤、懸濁剤、界面活性剤、抗酸化剤、固化防止剤、充填剤、キレート剤、コーティング剤、化学的安定剤等もまた、特に剤形が再構成可能な形態である場合に存在し得る。好適な例示的成分としては、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート８０、フェニルエチルアルコール、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノール、ゼラチン、アルブミンおよびそれらの組み合わせが挙げられる。薬学的に許容可能な賦形剤の詳細な考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照することができる。
本明細書のある実施形態では、送達はアデノウイルスを介し、これは、少なくとも１×１０５粒子（粒子単位、ｐｕとも称される）のアデノウイルスベクターを含有する単回ブースター用量であり得る。本明細書のある実施形態では、用量は好ましくは、少なくとも約１×１０６粒子（例えば、約１×１０６〜１×１０１２粒子）、より好ましくは少なくとも約１×１０７粒子、より好ましくは少なくとも約１×１０８粒子（例えば、約１×１０８〜１×１０１１粒子または約１×１０８〜１×１０１２粒子）、および最も好ましくは少なくとも約１×１００粒子（例えば、約１＊×１０９〜１×１０１０粒子または約１×１０９〜１×１０１２粒子）、またはさらには少なくとも約１×１０１０粒子（例えば、約１×１０１０〜１×１０１２粒子）のアデノウイルスベクターである。あるいは、用量は、約１×１０１４粒子以下、好ましくは約１×１０１３粒子以下、さらにより好ましくは約１×１０１２粒子以下、さらにより好ましくは約１×１０１１粒子以下、および最も好ましくは約１×１０１０粒子以下（例えば、約１×１０９粒子（ａｒｔｉｃｌｅｓ）以下）を含む。従って、用量は、例えば、約１×１０６粒子単位（ｐｕ）、約２×１０６ｐｕ、約４×１０６ｐｕ、約１×１０７ｐｕ、約２×１０７ｐｕ、約４×１０７ｐｕ、約１×１０８ｐｕ、約２×１０８ｐｕ、約４×１０８ｐｕ、約１×１０９ｐｕ、約２×１０９ｐｕ、約４×１０９ｐｕ、約１×１０１０ｐｕ、約２×１０１０ｐｕ、約４×１０１０ｐｕ、約１×１０１１ｐｕ、約２×１０１１ｐｕ、約４×１０１１ｐｕ、約１×１０１２ｐｕ、約２×１０１２ｐｕ、または約４×１０１２ｐｕのアデノウイルスベクターを含む単回用量のアデノウイルスベクターを含有し得る。例えば、２０１３年６月４日に付与されたＮａｂｅｌ，ｅｔ．ａｌ．に対する米国特許第８，４５４，９７２ Ｂ２号明細書（参照によって本明細書に組み込まれる）のアデノウイルスベクター、およびその第２９欄第３６〜５８行にある投薬量を参照のこと。本明細書のある実施形態では、アデノウイルスは複数回用量で送達される。
本明細書のある実施形態では、送達はＡＡＶを介する。ヒトに対するＡＡＶのインビボ送達についての治療上有効な投薬量は、約１×１０１０〜約１×１０１０の機能性ＡＡＶ／ｍｌ溶液を含有する生理食塩水約２０〜約５０ｍｌの範囲であると考えられる。投薬量は、治療利益と、それに対する任意の副作用との均衡をとるように調整され得る。本明細書のある実施形態では、ＡＡＶ用量は、概して、約１×１０５〜１×１０５０ゲノムのＡＡＶ、約１×１０８〜１×１０２０ゲノムのＡＡＶ、約１×１０１０〜約１×１０１６ゲノム、または約１×１０１１〜約１×１０１６ゲノムのＡＡＶの濃度範囲である。ヒト投薬量は約１×１０１３ゲノムのＡＡＶであってもよい。かかる濃度は、約０．００１ｍｌ〜約１００ｍｌ、約０．０５〜約５０ｍｌ、または約１０〜約２５ｍｌの担体溶液で送達され得る。他の効果的な投薬量が、当業者により、用量反応曲線を作成する常法の試験を介して容易に確立され得る。例えば、２０１３年３月２６日に付与されたＨａｊｊａｒ，ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第８，４０４，６５８ Ｂ２号明細書、第２７欄第４５〜６０行を参照のこと。
本明細書のある実施形態では、送達はプラスミドを介する。かかるプラスミド組成物では、投薬量は、反応を誘発するのに十分な量のプラスミドでなければならない。例えば、プラスミド組成物中のプラスミドＤＮＡの好適な分量は、約０．１〜約２ｍｇ、または約１μｇ〜約１０μｇであり得る。
本明細書の用量は平均７０ｋｇの個体に基づく。投与頻度は医学または獣医学の実務者（例えば、医師、獣医師）、または当業の科学者の裁量の範囲内にある。
ウイルスベクターは、目的組織中にインジェクトすることができる。細胞タイプ特異的ゲノム改変のため、Ｃａｓ９の発現を細胞タイプ特異的プロモーターによりドライブすることができる。例えば、肝臓特異的発現は、アルブミンプロモーターを使用し得、神経細胞特異的発現は、シナプシンＩプロモーターを使用し得る。
ＲＮＡ送達：ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えばＣａｓ９、および／または本ＲＮＡのいずれか、例えばガイドＲＮＡはまた、ＲＮＡの形態でも送達することができる。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡはインビトロ転写を用いて作成することができる。例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、βグロビン−ポリＡテール（１２０個以上の一連のアデニン）から以下のエレメント：Ｔ７＿プロモーター−コザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）−Ｃａｓ９−３’ＵＴＲを含むＰＣＲカセットを使用して合成することができる。このカセットは、Ｔ７ポリメラーゼによる転写に使用することができる。ガイドＲＮＡもまた、Ｔ７＿プロモーター−ＧＧ−ガイドＲＮＡ配列を含むカセットからのインビトロ転写を用いて転写させることができる。
発現を増強しかつ毒性を低下させるため、ＣＲＩＳＰＲ酵素および／またはガイドＲＮＡを、プソイドＵまたは５−メチル−Ｃを使用して改変することができる。
ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡは、ナノ粒子または脂質エンベロープを使用して同時に送達されてもよい。
例えば、Ｓｕ Ｘ，Ｆｒｉｃｋｅ Ｊ，Ｋａｖａｎａｇｈ ＤＧ，Ｉｒｖｉｎｅ ＤＪ（「脂質エンベロープを有するｐＨ応答性ポリマーナノ粒子を使用したインビトロおよびインビボｍＲＮＡ送達（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｌｉｐｉｄ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｐＨ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２０１１ Ｊｕｎ ６；８（３）：７７４−８７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ１００３９０ｗ．電子出版２０１１年４月１日）は、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）コアがリン脂質二重層シェルに包まれている被覆されている生分解性のコア−シェル構造を有するナノ粒子について記載する。これらはインビボｍＲＮＡ送達のために開発された。ｐＨ応答性ＰＢＡＥ成分がエンドソーム破壊を促進するように選択された一方、脂質表面層はポリカチオンコアの毒性を最小限に抑えるように選択された。従って、これは本発明のＲＮＡを送達に好ましい。
さらに、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ Ｄ Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（「マウスにおける化学改変ｍＲＮＡ送達後の治療用タンパク質の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｆｔｅｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ ｉｎ ｍｉｃｅ）：Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ：２９，Ｐａｇｅｓ：１５４−１５７（２０１１）、オンライン発行２０１１年１月９日）は、脂質エンベロープを使用したＲＮＡの送達を記載している。脂質エンベロープの使用もまた本発明において好ましい。
ｍＲＮＡ送達法は目下、肝臓送達に特に有望である。
ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡはまた個別に送達されてもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素が発現する時間を与えるため、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡはガイドＲＮＡより先に送達され得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡはガイドＲＮＡ投与の１〜１２時間前（好ましくは約２〜６時間前）に投与され得る。
あるいは、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡは共に投与することができる。有利には、ガイドＲＮＡの第２のブースター用量を、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ＋ガイドＲＮＡの初回投与の１〜１２時間後（好ましくは約２〜６時間後）に投与することができる。
最も効率的なゲノム改変レベルを達成するために、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡおよび／またはガイドＲＮＡのさらなる投与が有用であり得る。
毒性およびオフターゲット効果を最小限に抑えるためには、送達されるＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡの濃度を制御することが重要となる。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡの最適濃度は、細胞または動物モデルで種々の濃度を試験し、ディープシーケンシングを使用して潜在的なオフターゲットゲノム遺伝子座における改変の程度を分析することにより決定し得る。例えば、ヒトゲノムのＥＭＸ１遺伝子の５’−ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’を標的化するガイド配列について、ディープシーケンシングを使用して以下の２つのオフターゲット遺伝子座、すなわち１：５’−ＧＡＧＴＣＣＴＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡ−３’および２：５’−ＧＡＧＴＣＴＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’における改変レベルを評価することができる。オフターゲット改変レベルを最小限に抑えながら最も高いオンターゲット改変レベルが得られる濃度をインビボ送達に選択するべきである。
あるいは、毒性レベルおよびオフターゲット効果を最小限に抑えるため、ＣＲＩＳＰＲ 酵素ニッカーゼｍＲＮＡ（例えばＤ１０Ａ突然変異を有する化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）を目的の部位を標的化するガイドＲＮＡのペアと共に送達することができる。２つのガイドＲＮＡは以下のとおり隔てられていなければならない。それぞれ赤色（一重下線）および青色（二重下線）のガイド配列（これらの例は化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のＰＡＭ要件に基づく）。
この系をさらに調べることにより、出願人らは５’オーバーハングのエビデンスを得ている（例えば、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｓｅｐ １２；１５４（６）：１３８０−９および２０１３年８月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／８７１，３０１号明細書を参照のこと）。出願人らは、２つのガイドＲＮＡと組み合わせたときのＣａｓ９ニッカーゼ突然変異体による効率的な開裂に関連するパラメータをさらに同定しており、それらのパラメータには、限定はされないが５’オーバーハングの長さが含まれる。本発明の実施形態において５’オーバーハングは高々２００塩基対、好ましくは高々１００塩基対、またはより好ましくは高々５０塩基対である。本発明の実施形態において５’オーバーハングは少なくとも２６塩基対、好ましくは少なくとも３０塩基対またはより好ましくは３４〜５０塩基対または１〜３４塩基対である。本発明の他の好ましい方法では、第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍でＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の開裂を指向し、かつ第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍で他方の鎖の開裂を指向することにより、平滑末端または３’オーバーハングが生じる。本発明の実施形態において３’オーバーハングは高々１５０、１００または２５塩基対または少なくとも１５、１０または１塩基対である。好ましい実施形態において３’オーバーハングは１〜１００塩基対である。
本発明の態様は、遺伝子産物の発現を低下させること、または遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子にテンプレートポリヌクレオチドがさらに導入されること、または２つの５’オーバーハングをリアニーリングおよびライゲートさせることにより介在配列が正確に切り出されること、または遺伝子産物の活性または機能を変化させること、または遺伝子産物の発現を増加させることに関する。本発明のある実施形態において、遺伝子産物はタンパク質である。
ガイド配列間に８ｂｐ未満のオーバーラップ（−８ｂｐより大きいオフセット）を有する５’オーバーハングを作り出すｓｇＲＮＡペアのみが、検出可能なインデル形成を媒介することが可能であった。重要なことには、これらのアッセイで使用される各ガイドは、野生型Ｃａｓ９とペアになるとインデルを効率的に誘導することが可能であり、二重ニッキング活性を予測する際にガイドペアの相対位置が最も重要なパラメータであることが示される。
Ｃａｓ９ｎとＣａｓ９Ｈ８４０ＡとはＤＮＡの逆の鎖にニックを入れるため、所与のｓｇＲＮＡペアを有するＣａｓ９Ｈ８４０ＡによるＣａｓ９ｎの置換によってオーバーハング型の逆位が生じるはずである。例えば、Ｃａｓ９ｎで５’オーバーハングを生成し得るｓｇＲＮＡのペアは、原則的には代わりに対応する３’オーバーハングを生成するはずである。従って、Ｃａｓ９ｎで３’オーバーハングの生成を生じさせるｓｇＲＮＡペアを、Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａで５’オーバーハングを生成するために使用し得る。予想外にも、本出願人らは、５’および３’オーバーハングの両方（オフセット範囲−２７８〜＋５８ｂｐ）を生成するように設計された一組のｓｇＲＮＡペアでＣａｓ９Ｈ８４０Ａを試験したが、インデル形成を観察することはできなかった。Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａによる二重ニッキングが可能となるようにｓｇＲＮＡペアを組み合わせるのに必要な設計基準を特定するには、さらなる研究が必要であり得る。
脳に関する追加の送達の選択肢としては、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの形態のＣＲＩＳＰＲ酵素およびガイドＲＮＡをリポソームに封入し、分子トロイの木馬にコンジュゲートして血液脳関門（ＢＢＢ）を通過させて送達することが含まれる。分子トロイの木馬は、Ｂ−ｇａｌ発現ベクターを非ヒト霊長類の脳に送達するのに有効であることが示されている。同じ手法を用いて、ＣＲＩＳＰＲ酵素とガイドＲＮＡとを含有するベクターを送達することができる。例えば、Ｘｉａ ＣＦ ａｎｄ Ｂｏａｄｏ ＲＪ，Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ＷＭ（「アビジン−ビオチン技術を用いたヒトインスリン受容体を介するｓｉＲＮＡの抗体媒介性ターゲティング（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｖｉａ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｕｓｉｎｇ ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２００９ Ｍａｙ−Ｊｕｎ；６（３）：７４７−５１．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ８００１９４）は、受容体特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびアビジン−ビオチン技術の併用によって、培養下、およびインビボでの細胞に対する低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達がどのように可能になるかを記載している。この著者らはまた、標的化するｍＡｂとｓｉＲＮＡとの間の結合がアビジン−ビオチン技術で安定しており、標的化ｓｉＲＮＡの静脈内投与後にインビボで脳などの遠隔部位でのＲＮＡｉ効果が観察されることも報告する。
Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｓｃｈｌａｃｈｅｔｚｋｉ Ｆ，Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ＷＭ．（“Ｇｌｏｂａｌ ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｔｅ ｂｒａｉｎ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．”Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００３ Ｊａｎ；７（１）：１１−８．）は、レポーター、例えば、ルシフェラーゼをコードする発現プラスミドを、ヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）によりインビボでアカゲザル脳にターゲティングされる８５ｎｍのペグ化イムノリポソームを含む「人工ウイルス」の内部にいかに封入したかを記載している。ＨＩＲＭＡｂは、静脈注射後に、外来性遺伝子を担持するリポソームが血液脳関門にわたるトランスサイトーシスおよび神経細胞膜にわたるエンドサイトーシスを受けることを可能にする。脳におけるルシフェラーゼ遺伝子発現のレベルはラットと比較してアカゲザルにおいて５０倍高かった。霊長類脳におけるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の広範なニューロン発現が、組織化学および共焦点顕微鏡法の両方によって実証された。この著者らは、この手法によって２４時間で可逆的な成体トランスジェニックが実現可能になることを示している。従って、免疫リポソームの使用が好ましい。それらが抗体と併せて用いられることにより、特定の組織または細胞表面タンパク質が標的化される。
ナノ粒子（Ｃｈｏ，Ｓ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｓｏｎ，Ｓ．，Ｘｕ，Ｑ．，Ｙａｎｇ，Ｆ．，Ｍｅｉ，Ｙ．，Ｂｏｇａｔｙｒｅｖ，Ｓ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，「低分子干渉ＲＮＡを内皮細胞に送達するための脂質様ナノ粒子（Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）」，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９：３１１２−３１１８，２０１０）またはエキソソーム（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ａ．，Ｌｅｖｉｎｓ，Ｃ．，Ｃｏｒｔｅｚ，Ｃ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，「ｓｉＲＮＡ送達用の脂質ベースのナノ治療薬（Ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２６７：９−２１，２０１０，ＰＭＩＤ：２００５９６４１）を介するなど、他の送達手段またはＲＮＡもまた好ましい。実際、エキソソームは、いくらかＣＲＩＳＰＲ系と似たところがある系であるｓｉＲＮＡの送達において特に有用であることが示されている。例えば、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（「インビトロおよびインビボでのｓｉＲＮＡのエキソソーム媒介性送達（Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ）」Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２ Ｄｅｃ；７（１２）：２１１２−２６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．１３１．電子出版２０１２年１１月１５日）は、如何にエキソソームが種々の生物学的関門を越える薬物送達に有望なツールであるか、およびそれをインビトロおよびインビボでのｓｉＲＮＡの送達に利用することができるかについて記載している。この著者らの手法は、発現ベクターの形質移入によって標的化エキソソームを生成することであり、ペプチドリガンドと融合したエキソソームタンパク質が含まれる。次にエキソソームが形質移入細胞上清から精製されて特徴付けられ、次にそのエキソソームにｓｉＲＮＡが負荷される。
標的配列の操作の一態様はまた、標的配列のエピジェネティック操作に関する。これは、例えば、標的配列のメチル化状態の改変（すなわち、メチル化またはメチル化パターンまたはＣｐＧアイランドの付加または除去）、ヒストン修飾、標的配列への接近可能性の増加もしくは低減、または３Ｄフォールディングの促進もしくは低減による標的配列のクロマチン状態のものであり得る。
ベクターは、ウイルスまたは酵母系（例えば、目的核酸をプロモーターに作動可能に結合させることができ、プロモーターの制御下（発現に関して、例えば、最終的にプロセシングされたＲＮＡを提供するために）である場合だけでなく、宿主細胞中への核酸の直接送達も意味し得る。
本発明はまた、ある実施形態において、目的ゲノム遺伝子座中の標的配列の異常により引き起こされる病態の治療または阻害が必要とされる対象または非ヒト対象における目的ゲノム遺伝子座中の標的配列の異常により引き起こされる病態を治療または阻害する方法であって、本明細書において考察される組成物をその発現のために作動可能にコードすることを含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を送達することを含む治療を提供することを含む標的配列の操作により対象または非ヒト対象を改変することを含み、病態は、標的配列の操作による治療または阻害に感受性であり、組成物を発現させた場合に組成物により標的配列を操作する方法を包含する。
本明細書における方法のある実施形態において、方法は、ＣＲＩＳＰＲ酵素の発現を誘導すること、および／またはガイド、ｔｒａｃｒもしくはｔｒａｃｒメイト配列の発現を誘導することであり得る発現を誘導することを含み得る。本明細書における方法のある実施形態において、生物または対象は、真核生物または非ヒト真核生物である。本明細書における方法のある実施形態において、生物または対象は、植物である。本明細書における方法のある実施形態において、生物または対象は、哺乳動物または非ヒト哺乳動物である。本明細書における方法のある実施形態において、生物または対象は、藻類である。
本明細書における方法において、ベクターはウイルスベクターであり得、これは有利にはＡＡＶである一方、本明細書において考察される他のウイルスベクターを用いることができる。例えば、バキュロウイルスを昆虫細胞中の発現に使用することができる。これらの昆虫細胞は、次いで、大量のさらなるベクター、例えば、本発明の送達のために適合されたＡＡＶベクターの産生に有用であり得る。
本ＣＲＩＳＰＲ酵素を送達する方法であって、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする細胞ｍＲＮＡに送達することを含む方法も想定される。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、トランケートされており、本明細書に記載の規定のサイズのものであり、ヌクレアーゼもしくはニッカーゼもしくは包括的ＤＮＡ結合タンパク質であり、コドン最適化されており、１つ以上の突然変異を含み、および／またはキメラＣＲＩＳＰＲ酵素、または本明細書において考察される他の任意選択を含むことが認識される。
本発明の組成物または本ＣＲＩＳＰＲ酵素を送達するための、および本方法において使用されるベクターを調製する方法も想定される。
ＡＡＶウイルスベクターが好ましい。したがって、さらなる態様において、ＡＡＶウイルスベクターを調製する方法であって、ＡＡＶをコードする核酸分子を含有し、または本質的にそれからなるプラスミドをＡＡＶ感染細胞中に形質移入すること、ならびにＡＡＶの複製およびパッケージングに必須のＡＡＶｒｅｐおよび／またはｃａｐを供給することを含む方法が提供される。これに関して、ＣＲＩＳＰＲ酵素がトランケートされており、１０００未満のアミノ酸または４０００未満のアミノ酸を含み、ヌクレアーゼもしくはニッカーゼであり、コドン最適化されており、１つ以上の突然変異を含み、および／または本明細書において考察されるキメラＣＲＩＳＰＲ酵素を含むことが認識される。一部の実施形態において、細胞をヘルパープラスミドまたはヘルパーウイルスにより形質移入することにより、ＡＡＶの複製およびパッケージングに必須のＡＡＶｒｅｐおよび／またはｃａｐを供給する。一部の実施形態において、ヘルパーウイルスは、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである。一部の実施形態において、ポックスウイルスは、牛痘ウイルスである。一部の実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態において、細胞は、昆虫細胞であり、ヘルパーウイルスは、バキュロウイルスである。
本発明は、ある実施形態において、改変ＣＲＩＳＰＲ酵素をさらに包含する。野生型ＣＲＩＳＰＲ酵素との差異は、以下を含み得る：改変ＣＲＩＳＰＲ酵素は、野生型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較してトランケートされており、またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、規定のサイズ、例えば、少なくとも５００アミノ酸、少なくとも８００〜８９９アミノ酸、少なくとも９００〜９９９アミノ酸、少なくとも１０００〜１０９９アミノ酸、少なくとも１１００〜１１９９アミノ酸、少なくとも１２００〜１２９９アミノ酸、少なくとも１３００〜１３９９アミノ酸、少なくとも１４００〜１４９９アミノ酸、少なくとも１５００〜１５９９アミノ酸、少なくとも１６００〜１６９９アミノ酸もしくは少なくとも２０００アミノ酸のものであり；および／またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における両方の鎖の開裂を指向するヌクレアーゼであり、またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における一方の鎖の開裂を指向するニッカーゼであり、またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ結合タンパク質として機能する触媒的に無効な突然変異体であり；および／またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、コドン最適化されており、もしくは真核細胞中の発現のためにコドン最適化されており、および／またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の突然変異を含み、および／またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、キメラＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、および／またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、本明細書において考察される１つ以上の他の特質を有する。したがって、ある実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、触媒残基中の１つ以上の突然変異、例えば、ｓｐＣａ９Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３ＡもしくはＤ９８６ＡまたはＳｐＣａｓ９の位置ナンバリングに関して他のＣａｓ酵素（本明細書に記載）中のそれらに対応するものを含み、および／またはＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、ＲｕｖＣＩＩＩ、ＨＮＨもしくは本明細書に記載の他のドメイン中の１つ以上の突然変異を有し、および／またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、触媒ドメイン中の１つ以上の突然変異を有し、転写されるとｔｒａｃｒメイト配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつガイド配列が標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、酵素は、機能ドメインをさらに含む。機能ドメインとしては、限定されるものではないが、転写アクチベーター、転写リプレッサー、リコンビナーゼ、トランスポーゼース、ヒストンリモデラー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、クリプトクロム、光誘導性／制御性ドメインまたは化学誘導性／制御性ドメインを挙げることができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ある実施形態において、転写アクチベータードメイン、例えば、ＶＰ６４である機能ドメインを有し得る。一部の実施形態において、転写リプレッサードメインは、ＫＲＡＢである。一部の実施形態において、転写リプレッサードメインは、ＳＩＤ、またはＳＩＤのコンカテマー（すなわち、ＳＩＤ４Ｘ）である。一部の実施形態において、エピジェネティック修飾酵素が提供される。
好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ酵素、例えば、Ｃａｓ９オルソログである。
本発明の態様はまた、ＣＲＩＳＰＲ酵素の新規オルソログを同定することを包含する。ＣＲＩＳＰＲ酵素の新規オルソログを同定する方法は、目的ゲノム中のｔｒａｃｒ配列を同定することを含み得る。ｔｒａｃｒ配列の同定は、以下のステップに関し得る：ＣＲＩＳＰＲ酵素を含むＣＲＩＳＰＲ領域を同定するためのデータベース中のダイレクトリピートまたはｔｒａｃｒメイト配列の検索、例えば、図１８。センスおよびアンチセンス方向の両方におけるＣＲＩＳＰＲ酵素をフランキングするＣＲＩＳＰＲ領域中の相同配列の検索。転写ターミネーターおよび二次構造の探索。ダイレクトリピートでもｔｒａｃｒメイト配列でもないが、潜在的なｔｒａｃｒ配列としてのダイレクトリピートまたはｔｒａｃｒメイト配列と５０％を超える同一性を有する任意の配列の同定。潜在的ｔｒａｃｒ配列の抽出およびそれに関連する転写ターミネーター配列の分析。
本発明は、ある実施形態において、医療における本明細書に記載の組成物またはＣＲＩＳＰＲ酵素の使用を包含する。本発明は、ある実施形態において、本発明の方法において使用される本発明の組成物またはＣＲＩＳＰＲ酵素をさらに包含する。本発明はまた、ある実施形態において、好ましくは、エクスビボ遺伝子もしくはゲノム編集、または好ましくは、エクスビボ遺伝子もしくはゲノム編集法における本発明の組成物またはＣＲＩＳＰＲ酵素の使用を包含する。したがって、本発明はまた、ある実施形態において、エクスビボ遺伝子もしくはゲノム編集のための、または本明細書において考察される方法において使用される医薬品の製造における本発明の組成物またはＣＲＩＳＰＲ酵素の使用を包含する。
さらに、本発明は、ある実施形態において、標的配列がＣＲＩＳＰＲ酵素、典型的にはＣａｓ、特にＣａｓ９に好適なＰＡＭによりフランキングされており、または標的配列にその３’末端においてそのＰＡＭが続く本発明の組成物またはＣＲＩＳＰＲ酵素を包含する。このＰＡＭ配列はそれぞれのＣａｓ９に特異的であるが、本明細書に記載の方法により容易に決定することができる。
例えば、好適なＰＡＭは、ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９酵素（または由来酵素）についてそれぞれ５’−ＮＲＧまたは５’−ＮＮＧＲＲである。本明細書において、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、好ましくは、例として、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ Ａｕｒｅｕｓ）が参照されることが認識される。
したがって、本発明の目的は、任意の既に公知の生成物、その生成物の作製方法、またはその生成物の使用方法を本発明に包含することではなく、その結果、本出願人らは、その権利を保有し、任意の既に公知の生成物、作製方法、または使用方法の放棄を本明細書に開示する。本発明は、ＵＳＰＴＯ（米国特許法第１１２条、第１段落）またはＥＰＯ（欧州特許条約第８３条）の記載要件および実施可能要件を満たさない任意の生成物、方法、または生成物の作製または生成物の使用方法を、本発明の範囲に包含しないものとし、その結果、本出願人らは、その権利を保有し、任意の既に記載の生成物、その生成物の作製方法、またはその生成物の使用方法の放棄を本明細書に開示することがさらに留意される。
本開示、特に特許請求の範囲および／または段落において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのような用語は、米国特許法に帰属する意味を有し得；例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得；「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」のような用語は、米国特許法に帰属する意味を有し、例えば、それらは、明示的に記述されないエレメントを許容するが、先行技術に見出され、または本発明の基本もしくは新規特徴に影響するエレメントを排除することが留意される。
これらおよび他の実施形態は開示され、または以下の詳細な説明から明らかであり、それにより包含される。
本発明の新規特徴を、特に添付の特許請求の範囲を用いて記載する。本発明の特徴および利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用される説明的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および付属の図面を参照することにより得られる。
ＲＮＡによりガイドされるＣａｓ９ヌクレアーゼの模式図を示す。化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９ヌクレアーゼを、２０ｎｔガイド配列および足場からなる合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によりゲノムＤＮＡにターゲティングする。ガイド配列は、必要な５’−ＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）のすぐ上流のＤＮＡ標的と塩基対形成し、Ｃａｓ９は、ＰＡＭの約３ｂｐ上流の二本鎖切断（ＤＳＢ）（三角形により示す）を媒介する。 例示的ＣＲＩＳＰＲ系および考えられる作用機序（Ａ）、真核細胞中の発現のための例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果（Ｂ〜Ｆ）を示す。 例示的ＣＲＩＳＰＲ系および考えられる作用機序（Ａ）、真核細胞中の発現のための例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果（Ｂ〜Ｆ）を示す。 例示的ＣＲＩＳＰＲ系および考えられる作用機序（Ａ）、真核細胞中の発現のための例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果（Ｂ〜Ｆ）を示す。 例示的ＣＲＩＳＰＲ系および考えられる作用機序（Ａ）、真核細胞中の発現のための例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果（Ｂ〜Ｆ）を示す。 例示的ＣＲＩＳＰＲ系および考えられる作用機序（Ａ）、真核細胞中の発現のための例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果（Ｂ〜Ｆ）を示す。 例示的ＣＲＩＳＰＲ系および考えられる作用機序（Ａ）、真核細胞中の発現のための例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果（Ｂ〜Ｆ）を示す。 ＡＡＶまたはＡＡＶ関連系による送達を好ましく支援するための逆位末端リピート（ＩＴＲ）配列およびガイドキメラＲＮＡを利用するＡＡＶインビボ送達プラスミドの模式的表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つのファミリーを明らかにする系統発生分析の円形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つのファミリーを明らかにする系統発生分析の円形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つのファミリーを明らかにする系統発生分析の円形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つのファミリーを明らかにする系統発生分析の円形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つのファミリーを明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つのファミリーを明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つのファミリーを明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つのファミリーを明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つのファミリーを明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つのファミリーを明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。 Ｃａｓ９オルソログの長さ分布を表すグラフを示す。 逆相補鎖としてのＣａｓ９オルソログのＰＡＭの配列ロゴの表示を示す。 ｔｒａｃｒメイト：ｔｒａｃｒ配列二本鎖の配列および二次構造を保存した一方、人工ループを通して２つのＲＮＡエレメントを塩基対形成および融合する領域を短縮した１８個のキメラＲＮＡ構造を示す。 ｔｒａｃｒメイト：ｔｒａｃｒ配列二本鎖の配列および二次構造を保存した一方、人工ループを通して２つのＲＮＡエレメントを塩基対形成および融合する領域を短縮した１８個のキメラＲＮＡ構造を示す。 ｔｒａｃｒメイト：ｔｒａｃｒ配列二本鎖の配列および二次構造を保存した一方、人工ループを通して２つのＲＮＡエレメントを塩基対形成および融合する領域を短縮した１８個のキメラＲＮＡ構造を示す。 ｔｒａｃｒメイト：ｔｒａｃｒ配列二本鎖の配列および二次構造を保存した一方、人工ループを通して２つのＲＮＡエレメントを塩基対形成および融合する領域を短縮した１８個のキメラＲＮＡ構造を示す。 ｔｒａｃｒメイト：ｔｒａｃｒ配列二本鎖の配列および二次構造を保存した一方、人工ループを通して２つのＲＮＡエレメントを塩基対形成および融合する領域を短縮した１８個のキメラＲＮＡ構造を示す。 ｔｒａｃｒメイト：ｔｒａｃｒ配列二本鎖の配列および二次構造を保存した一方、人工ループを通して２つのＲＮＡエレメントを塩基対形成および融合する領域を短縮した１８個のキメラＲＮＡ構造を示す。 ｔｒａｃｒメイト：ｔｒａｃｒ配列二本鎖の配列および二次構造を保存した一方、人工ループを通して２つのＲＮＡエレメントを塩基対形成および融合する領域を短縮した１８個のキメラＲＮＡ構造を示す。 ｔｒａｃｒメイト：ｔｒａｃｒ配列二本鎖の配列および二次構造を保存した一方、人工ループを通して２つのＲＮＡエレメントを塩基対形成および融合する領域を短縮した１８個のキメラＲＮＡ構造を示す。 ｔｒａｃｒメイト：ｔｒａｃｒ配列二本鎖の配列および二次構造を保存した一方、人工ループを通して２つのＲＮＡエレメントを塩基対形成および融合する領域を短縮した１８個のキメラＲＮＡ構造を示す。 ｔｒａｃｒメイト：ｔｒａｃｒ配列二本鎖の配列および二次構造を保存した一方、人工ループを通して２つのＲＮＡエレメントを塩基対形成および融合する領域を短縮した１８個のキメラＲＮＡ構造を示す。 図８Ａ〜Ｊに提供されるキメラガイドＲＮＡと対形成するためのヒトコドン最適化Ｃａｓ９配列のリストを示す。 図８Ａ〜Ｊに提供されるキメラガイドＲＮＡと対形成するためのヒトコドン最適化Ｃａｓ９配列のリストを示す。 図８Ａ〜Ｊに提供されるキメラガイドＲＮＡと対形成するためのヒトコドン最適化Ｃａｓ９配列のリストを示す。 図８Ａ〜Ｊに提供されるキメラガイドＲＮＡと対形成するためのヒトコドン最適化Ｃａｓ９配列のリストを示す。 図８Ａ〜Ｊに提供されるキメラガイドＲＮＡと対形成するためのヒトコドン最適化Ｃａｓ９配列のリストを示す。 図８Ａ〜Ｊに提供されるキメラガイドＲＮＡと対形成するためのヒトコドン最適化Ｃａｓ９配列のリストを示す。 図８Ａ〜Ｊに提供されるキメラガイドＲＮＡと対形成するためのヒトコドン最適化Ｃａｓ９配列のリストを示す。 図８Ａ〜Ｊに提供されるキメラガイドＲＮＡと対形成するためのヒトコドン最適化Ｃａｓ９配列のリストを示す。 図８Ａ〜Ｊに提供されるキメラガイドＲＮＡと対形成するためのヒトコドン最適化Ｃａｓ９配列のリストを示す。 図８Ａ〜Ｊに提供されるキメラガイドＲＮＡと対形成するためのヒトコドン最適化Ｃａｓ９配列のリストを示す。 図８Ａ〜Ｊに提供されるキメラガイドＲＮＡと対形成するためのヒトコドン最適化Ｃａｓ９配列のリストを示す。 図８Ａ〜Ｊに提供されるキメラガイドＲＮＡと対形成するためのヒトコドン最適化Ｃａｓ９配列のリストを示す。 図８Ａ〜Ｊに提供されるキメラガイドＲＮＡと対形成するためのヒトコドン最適化Ｃａｓ９配列のリストを示す。 図８Ａ〜Ｊに提供されるキメラガイドＲＮＡと対形成するためのヒトコドン最適化Ｃａｓ９配列のリストを示す。 図８Ａ〜Ｊに提供されるキメラガイドＲＮＡと対形成するためのヒトコドン最適化Ｃａｓ９配列のリストを示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 異なる生物中のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を示す。 異なる生物中のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に対応するガイドＲＮＡ配列を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 Ｃａｓ９オルソログおよびそれらの対応するＰＡＭ配列を列挙する表を示す。 黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ Ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９についてのＰＡＭがＮＮＧＲＲであることを示す。 ＳａＣａｓ９のための単一および複数のベクター設計を示す。 ｐＵＣ１９ベースライブラリー中に存在する２つの候補標的を開裂するために使用されているＣａｓ９オルソログおよびそれぞれのｓｇＲＮＡについてのベクター設計およびゲル画像を示す。 ＳｐＣａｓ９、Ｓｔ３Ｃａｓ９、Ｓｐ＿Ｓｔ３キメラおよびＳｔ３＿Ｓｐキメラによるインビトロ開裂を示す。Ｓｔ３Ｃａｓ９およびＳｔ３＿ＳｐキメラＣａｓ９についてのＰＡＭは、ＮＧＧである。 ＣＲＩＳＰＲウェブサーバーの画像を示す。 １２個のＣａｓ９オルソログについての多重配列アラインメントを示す。２つの触媒残基を強調する。第１の強調残基は、ＲｕｖＣＩドメイン中の触媒Ａｓｐ残基であり、第２の強調残基は、ＨＮＨドメイン中の触媒Ｈｉｓ残基である。１つまたは他の残基のＡｌａへの突然変異は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換し得る。両方の残基の突然変異は、Ｃａｓ９を、包括的ＤＮＡ結合に有用な触媒的に無効な突然変異体に変換する。 １２個のＣａｓ９オルソログについての多重配列アラインメントを示す。２つの触媒残基を強調する。第１の強調残基は、ＲｕｖＣＩドメイン中の触媒Ａｓｐ残基であり、第２の強調残基は、ＨＮＨドメイン中の触媒Ｈｉｓ残基である。１つまたは他の残基のＡｌａへの突然変異は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換し得る。両方の残基の突然変異は、Ｃａｓ９を、包括的ＤＮＡ結合に有用な触媒的に無効な突然変異体に変換する。 １２個のＣａｓ９オルソログについての多重配列アラインメントを示す。２つの触媒残基を強調する。第１の強調残基は、ＲｕｖＣＩドメイン中の触媒Ａｓｐ残基であり、第２の強調残基は、ＨＮＨドメイン中の触媒Ｈｉｓ残基である。１つまたは他の残基のＡｌａへの突然変異は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換し得る。両方の残基の突然変異は、Ｃａｓ９を、包括的ＤＮＡ結合に有用な触媒的に無効な突然変異体に変換する。 １２個のＣａｓ９オルソログについての多重配列アラインメントを示す。２つの触媒残基を強調する。第１の強調残基は、ＲｕｖＣＩドメイン中の触媒Ａｓｐ残基であり、第２の強調残基は、ＨＮＨドメイン中の触媒Ｈｉｓ残基である。１つまたは他の残基のＡｌａへの突然変異は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換し得る。両方の残基の突然変異は、Ｃａｓ９を、包括的ＤＮＡ結合に有用な触媒的に無効な突然変異体に変換する。 １２個のＣａｓ９オルソログについての多重配列アラインメントを示す。２つの触媒残基を強調する。第１の強調残基は、ＲｕｖＣＩドメイン中の触媒Ａｓｐ残基であり、第２の強調残基は、ＨＮＨドメイン中の触媒Ｈｉｓ残基である。１つまたは他の残基のＡｌａへの突然変異は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換し得る。両方の残基の突然変異は、Ｃａｓ９を、包括的ＤＮＡ結合に有用な触媒的に無効な突然変異体に変換する。 １２個のＣａｓ９オルソログについての多重配列アラインメントを示す。２つの触媒残基を強調する。第１の強調残基は、ＲｕｖＣＩドメイン中の触媒Ａｓｐ残基であり、第２の強調残基は、ＨＮＨドメイン中の触媒Ｈｉｓ残基である。１つまたは他の残基のＡｌａへの突然変異は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換し得る。両方の残基の突然変異は、Ｃａｓ９を、包括的ＤＮＡ結合に有用な触媒的に無効な突然変異体に変換する。 １２個のＣａｓ９オルソログについての多重配列アラインメントを示す。２つの触媒残基を強調する。第１の強調残基は、ＲｕｖＣＩドメイン中の触媒Ａｓｐ残基であり、第２の強調残基は、ＨＮＨドメイン中の触媒Ｈｉｓ残基である。１つまたは他の残基のＡｌａへの突然変異は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換し得る。両方の残基の突然変異は、Ｃａｓ９を、包括的ＤＮＡ結合に有用な触媒的に無効な突然変異体に変換する。 １２個のＣａｓ９オルソログについての多重配列アラインメントを示す。２つの触媒残基を強調する。第１の強調残基は、ＲｕｖＣＩドメイン中の触媒Ａｓｐ残基であり、第２の強調残基は、ＨＮＨドメイン中の触媒Ｈｉｓ残基である。１つまたは他の残基のＡｌａへの突然変異は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換し得る。両方の残基の突然変異は、Ｃａｓ９を、包括的ＤＮＡ結合に有用な触媒的に無効な突然変異体に変換する。 １２個のＣａｓ９オルソログについての多重配列アラインメントを示す。２つの触媒残基を強調する。第１の強調残基は、ＲｕｖＣＩドメイン中の触媒Ａｓｐ残基であり、第２の強調残基は、ＨＮＨドメイン中の触媒Ｈｉｓ残基である。１つまたは他の残基のＡｌａへの突然変異は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換し得る。両方の残基の突然変異は、Ｃａｓ９を、包括的ＤＮＡ結合に有用な触媒的に無効な突然変異体に変換する。 １２個のＣａｓ９オルソログについての多重配列アラインメントを示す。２つの触媒残基を強調する。第１の強調残基は、ＲｕｖＣＩドメイン中の触媒Ａｓｐ残基であり、第２の強調残基は、ＨＮＨドメイン中の触媒Ｈｉｓ残基である。１つまたは他の残基のＡｌａへの突然変異は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換し得る。両方の残基の突然変異は、Ｃａｓ９を、包括的ＤＮＡ結合に有用な触媒的に無効な突然変異体に変換する。 １２個のＣａｓ９オルソログについての多重配列アラインメントを示す。２つの触媒残基を強調する。第１の強調残基は、ＲｕｖＣＩドメイン中の触媒Ａｓｐ残基であり、第２の強調残基は、ＨＮＨドメイン中の触媒Ｈｉｓ残基である。１つまたは他の残基のＡｌａへの突然変異は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換し得る。両方の残基の突然変異は、Ｃａｓ９を、包括的ＤＮＡ結合に有用な触媒的に無効な突然変異体に変換する。 １２個のＣａｓ９オルソログについての多重配列アラインメントを示す。２つの触媒残基を強調する。第１の強調残基は、ＲｕｖＣＩドメイン中の触媒Ａｓｐ残基であり、第２の強調残基は、ＨＮＨドメイン中の触媒Ｈｉｓ残基である。１つまたは他の残基のＡｌａへの突然変異は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換し得る。両方の残基の突然変異は、Ｃａｓ９を、包括的ＤＮＡ結合に有用な触媒的に無効な突然変異体に変換する。 Ｃａｓ９オルソログがＨＥＫ２９３ＦＴ細胞中で発現されることを示すウェスタンブロットを示し；Ｃａｓ９オルソログをコードするＤＮＡプラスミドをＨＥＫ２９３ＦＴ細胞中に形質移入し、細胞溶解物をウェスタンブロットのために回収した。Ｃａｓ９オルソログ＃８についてはＤＮＡを形質移入しない。 １０個のＣａｓ９オルソログによるｐＵＣ１９プラスミド上の候補標的のインビトロ開裂を示す。コンセンサスＰＡＭを配列ロゴにより予測し（図７）、それに基づきｐＵＣ１９上の候補標的を選択する。試験された９つの新たなＣａｓ９オルソログのうち７つが、少なくとも１つのｐＵＣ１９標的を良好に開裂した。ＳｐＣａｓ９は、インビトロでＮＧＡも開裂し得る。 ＳａＣａｓ９によるゲノム開裂を示す代表的なＳｕｒｖｅｙｏｒゲルを示す。 ＰＡＭ配列（全標的）のゲノム開裂効率を示す。 ＰＡＭ配列（開裂標的）ゲノム開裂効率を示す。 ＰＡＭ配列（全標的、低効率およびオーファン標的を破棄）のゲノム開裂効率を示す。 ＰＡＭ配列（開裂標的、低効率およびオーファン標的を破棄）のゲノム開裂効率を示す。 機能開裂スペーサーおよびＰＡＭについての配列ロゴ（Ｔが要求されないことを示す新たな内因性ゲノム試験）を示す。
本明細書における図面は、説明目的のためのものにすぎず、必ずしも一定の縮尺で描画されるものではない。
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系およびその成分に関する配列ターゲティング、例えば、ゲノム摂動または遺伝子編集を含む遺伝子発現の制御に使用される系、方法および組成物のエンジニアリングおよび最適化に関する。有利な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ酵素、例えば、Ｃａｓ９オルソログである。
本発明は核酸を使用して標的ＤＮＡ配列を結合する。核酸は、例えばペプチドと比べて作製がはるかに容易で安価であり、かつ相同性が求められるストレッチの長さに応じて特異性を変化させることができるため、これは有利である。例えば、複数のフィンガーの複雑な三次元の配置は不要である。
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用される。これらは、任意の長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらのアナログのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、既知または未知の任意の機能を遂行し得る。以下のものは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖分析から定義される遺伝子座（遺伝子座）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意配列の単離ＤＮＡ、任意配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。この用語はまた、合成骨格を有する核酸様構造も包含し、例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９１；Ｂａｓｅｒｇａ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｍｉｌｌｉｇａｎ，１９９３；国際公開第９７／０３２１１号パンフレット；国際公開第９６／３９１５４号パンフレット；Ｍａｔａ，１９９７；Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ，１９９７；およびＳａｍｓｔａｇ，１９９６を参照のこと。ポリヌクレオチドは、１つ以上の改変ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。ヌクレオチド構造の改変は、存在する場合、ポリマーの集合前または後に与えることができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断することができる。ポリヌクレオチドは、重合後に例えば標識成分とのコンジュゲーションによりさらに改変することができる。
本発明の態様において、用語「キメラＲＮＡ」、「キメラガイドＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」および「合成ガイドＲＮＡ」は、互換的に使用され、ガイド配列、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒメイト配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。用語「ガイド配列」は、標的部位を規定するガイドＲＮＡ内の約２０ｂｐ配列を指し、用語「ガイド」または「スペーサー」と互換的に使用することができる。用語「ｔｒａｃｒメイト配列」も、用語「ダイレクトリピート」と互換的に使用することができる。
本明細書において使用される用語「野生型」は、当業者により理解される当技術分野の用語であり、突然変異体またはバリアント形態から区別される天然状態で生じるままの生物、株、遺伝子または特徴の典型的な形態を意味する。
本明細書において使用される用語「バリアント」は、天然状態で生じるものから逸脱するパターンを有する品質の提示を意味すると解釈すべきである。
用語「天然に存在しない」または「エンジニアリングされた」は、互換的に使用され、人工の関与を示す。この用語は、核酸分子またはポリペプチドを指す場合、核酸分子またはポリペプチドが、それらが天然状態で天然に会合し、または天然状態で見出される少なくとも１つの他の成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。
「相補性」は、古典的ワトソン−クリック塩基対形成または他の非古典的タイプのいずれかによる別の核酸配列との水素結合を形成する核酸の能力を指す。相補性パーセントは、第２の核酸配列との水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対形成）を形成し得る核酸分子中の残基の割合を示す（例えば、１０のうち５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％の相補性である）。「完全に相補的」は、核酸配列の全ての連続残基が第２の核酸配列中の同一数の連続残基と水素結合することを意味する。本明細書において使用される「実質的に相補的」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれよりも多いヌクレオチドの領域に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％である相補性の程度を指し、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。
本明細書において使用されるハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」は、標的配列に対する相補性を有する核酸が、標的配列と優位にハイブリダイズし、非標的配列と実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、一般に、配列依存的であり、多数の因子に応じて変動する。一般に、配列が長ければ、配列がその標的配列と特異的にハイブリダイズする温度が高い。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に詳述されている。ポリヌクレオチド配列に言及がなされる場合、相補的なまたは部分的に相補的な配列もまた想定される。それらは好ましくは、高度にストリンジェントな条件下で参照配列にハイブリダイズし得る。概して、ハイブリダイゼーション速度を最大化するためには、比較的低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が選択される：熱的融点（Ｔｍ）より約２０〜２５℃低い。Ｔｍは、特定の標的配列の５０％が規定のイオン強度およびｐＨの溶液中で完全に相補的なプローブとハイブリダイズする温度である。概して、ハイブリダイズされる配列の少なくとも約８５％のヌクレオチド相補性を求めるためには、Ｔｍより約５〜１５℃低い高度にストリンジェントな洗浄条件が選択される。ハイブリダイズされる配列の少なくとも約７０％のヌクレオチド相補性を求めるためには、Ｔｍより約１５〜３０℃低い中程度にストリンジェントな洗浄条件が選択される。高度に許容的な（極めて低いストリンジェンシーの）洗浄条件は、Ｔｍより５０℃も低いものであってよく、ハイブリダイズされる配列間における高度のミスマッチを許容する。当業者は、標的配列とプローブ配列との間の具体的な相同性レベルによる検出可能なハイブリダイゼーションシグナルの結果に影響が及ぶように、ハイブリダイゼーション工程および洗浄工程における他の物理的および化学的パラメータもまた変更し得ることを認識するであろう。好ましい高度にストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、または５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベーションと、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、６５℃での洗浄を含む。
「ハイブリダイゼーション」は、１つ以上のポリヌクレオチドが反応してヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対形成、フーグスティーン結合により、または任意の他の配列特異的様式で生じ得る。複合体は、二本鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３つ以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズする鎖、またはそれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より広範なプロセス、例えば、ＰＣＲの開始、または酵素によるポリヌクレオチドの開裂におけるステップを構成し得る。所与の配列とハイブリダイズし得る配列は、所与の配列の「相補鎖」と称される。
本明細書で使用されるとき、用語「ゲノム遺伝子座（ｇｅｎｏｍｉｃ ｌｏｃｕｓ）」または「遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）」（複数形では遺伝子座（ｌｏｃｉ））は、染色体上の遺伝子またはＤＮＡ配列の特定の位置である。「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするひと続きのＤＮＡもしくはＲＮＡ、または生物において機能的な役割を担い、ひいては生体における遺伝の分子単位であるＲＮＡ鎖を指す。本発明の目的上、遺伝子は遺伝子産物の産生を調節する領域（かかる調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接するか否かに関わらず）を含むと見なされ得る。従って、遺伝子には、必ずしも限定されるわけではないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位および配列内リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位および遺伝子座制御領域が含まれる。
本明細書で使用されるとき、「ゲノム遺伝子座の発現」または「遺伝子発現」は、機能性遺伝子産物の合成において遺伝子からの情報が用いられるプロセスである。遺伝子発現の産物は多くの場合にタンパク質であるが、ｒＲＮＡ遺伝子またはｔＲＮＡ遺伝子などの非タンパク質コード遺伝子では、産物は機能性ＲＮＡである。遺伝子発現プロセスは、知られている全ての生命−真核生物（多細胞生物を含む）、原核生物（細菌および古細菌）およびウイルスによって、生存のための機能性産物の生成に用いられる。本明細書で使用されるとき、遺伝子または核酸の「発現」には、細胞遺伝子発現のみならず、クローニングシステムおよび任意の他のコンテクストにおける核酸の転写および翻訳もまた包含される。本明細書で使用されるとき、「発現」はまた、ポリヌクレオチドがＤＮＡテンプレートから（例えばｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物に）転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスも指す。転写物およびコードされたポリペプチドは、まとめて「遺伝子産物」と称され得る。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために互換的に使用される。ポリマーは、直鎖または分枝鎖であり得、それは、改変アミノ酸を含み得、それは、非アミノ酸により中断されていてよい。この用語は、改変、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作、例えば、標識成分とのコンジュゲーションを受けたアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書において使用される用語「アミノ酸」は、グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の両方を含む天然および／または非天然または合成アミノ酸、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣体を含む。
本明細書で使用されるとき、用語「ドメイン」または「タンパク質ドメイン」は、タンパク質鎖の残りの部分と独立して存在しおよび機能し得るタンパク質配列の一部を指す。
本発明の態様に記載されるとおり、配列同一性は配列相同性と関係がある。相同性比較は目測で行われてもよく、またはより通例では、容易に利用可能な配列比較プログラムの助けを借りて行われてもよい。これらの市販のコンピュータプログラムは２つ以上の配列間のパーセント（％）相同性を計算し得るとともに、２つ以上のアミノ酸または核酸配列が共有する配列同一性も計算し得る。配列相同性は、当該技術分野において公知の多くのコンピュータプログラムのいずれか、例えばＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡ等により生成し得る。かかるアラインメントの実行に好適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージである（ウィスコンシン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、米国；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）。配列比較を実施し得る他のソフトウェアの例としては、限定はされないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ 前掲書−Ｃｈａｐｔｅｒ １８を参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３−４１０）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートの比較ツールが挙げられる。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡは両方とも、オフラインおよびオンライン検索に利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ 前掲書，７−５８〜７−６０頁を参照）。しかしながら、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。
％配列相同性は連続する配列にわたり計算することができ、すなわち１つの配列が他の配列と整列され、一方の配列の各アミノ酸またはヌクレオチドが他方の配列の対応するアミノ酸またはヌクレオチドと一度に１個の残基ずつ直接比較される。これは「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。典型的には、かかるギャップなしアラインメントは比較的少ない数の残基にわたってのみ実施される。
これは極めて単純かつ一貫した方法であるが、例えば、本来同一である配列ペアにおいて、１つの挿入または欠失によって続くアミノ酸残基のアラインメントにずれが生じ、ひいては大域的アラインメントの実行時に％相同性が大幅に低下する可能性がある点を考慮に入れることができない。結果的に、多くの配列比較方法が、全体的な相同性または同一性スコアを過度に不利にすることなく可能性のある挿入および欠失を考慮に入れる最適アラインメントを作製するように設計される。これは配列アラインメントに「ギャップ」を挿入して局所的な相同性または同一性を最大化しようとすることにより達成される。
しかしながら、これらのより複雑な方法では、アラインメントに現れる各ギャップに「ギャップペナルティー」が割り当てられ、従って、同じ数の同一アミノ酸について、可能な限り少ないギャップ−２つの比較される配列間のより高い関連性を反映する−を有する配列アラインメント程、多くのギャップを有するものより高いスコアを達成し得る。ギャップの存在に比較的高いコストを課し、ギャップにおける後続の各残基により小さいペナルティーを課す「アフィニティーギャップコスト」が典型的に使用される。これは最も一般的に用いられるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、当然ながらギャップがより少ない最適化されたアラインメントを生じ得る。多くのアラインメントプログラムでギャップペナルティーを変更することが可能である。しかしながら、配列比較にかかるソフトウェアを使用する際にはデフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列に関するデフォルトのギャップペナルティーは、ギャップが−１２、および各伸長が−４である。
従って最大％相同性の計算は、初めにギャップペナルティーを考慮して最適アラインメントを作成することが必要である。かかるアラインメントの実行に好適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２ ｐ３８７）である。配列比較を実施し得る他のソフトウェアの例としては、限定はされないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．−Ｃｈａｐｔｅｒ １８を参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートの比較ツールが挙げられる。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡは両方とも、オフラインおよびオンライン検索に利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７−５８〜７−６０頁を参照）。しかしながら、用途によってはＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新規ツールもまたタンパク質およびヌクレオチド配列の比較に利用可能である（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１９９９ １７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１９９９ １７７（１）：１８７−８および米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ）のウェブサイトにある国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイトを参照）。
最終的な％相同性は同一性の点で測定され得るが、アラインメントプロセスそれ自体は典型的にはオール・オア・ナッシングのペア比較に基づくものではない。代わりに、化学的類似性または進化距離に基づき各ペアワイズ比較にスコアを割り当てるスケール付き類似性スコア行列が概して使用される。一般的に用いられるかかる行列の例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列−ＢＬＡＳＴプログラムスイートのデフォルト行列である。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、概して公開されているデフォルト値か、あるいは供給がある場合にはカスタムの記号比較表を使用する（さらなる詳細についてはユーザーマニュアルを参照のこと）。用途によっては、ＧＣＧパッケージの公開されているデフォルト値か、または他のソフトウェアの場合にはＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルト行列を使用することが好ましい。
あるいは、パーセンテージ相同性は、ＤＮＡＳＩＳ（商標）（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）の多重アラインメント機能を使用して、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ＆Ｓｈａｒｐ ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ ７３（１），２３７−２４４）と類似したアルゴリズムに基づき計算することができる。ソフトウェアが最適アラインメントを作成し終えると、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することが可能になる。ソフトウェアは典型的にはこれを配列比較の一部として行い、数値結果を生成する。
配列はまた、サイレントな変化を生じさせて機能的に等価な物質をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入または置換も有し得る。アミノ酸特性（残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質など）の類似性に基づき計画的なアミノ酸置換が作製されてもよく、従ってアミノ酸を官能基で一つにまとめることが有用である。アミノ酸は、その側鎖の特性のみに基づき一つにまとめられてもよい。しかしながら、突然変異データも同様に含めることがより有用である。このように得られたアミノ酸セットは、構造上の理由から保存されているものと見られる。これらのセットはベン図の形式で記述することができる（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｃ．Ｄ．ａｎｄ Ｂａｒｔｏｎ Ｇ．Ｊ．（１９９３）「タンパク質配列アラインメント：残基保存の階層分析戦略（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕｅ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）」Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．９：７４５−７５６）（Ｔａｙｌｏｒ Ｗ．Ｒ．（１９８６）「アミノ酸保存の分類（Ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）」Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９；２０５−２１８）。保存的置換は、例えば、一般に受け入れられているベン図によるアミノ酸分類を記載する下記の表に従い作製し得る。
本発明の実施形態は、起こり得る相同置換（置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）および置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）は、本明細書では既存のアミノ酸残基またはヌクレオチドと代替の残基またはヌクレオチドとの相互交換を意味して用いられる）、すなわち、アミノ酸の場合に塩基性同士、酸性同士、極性同士等、同種のもの同士の置換を含み得る配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの両方）を含む。非相同置換、すなわち、あるクラスから別のクラスの残基への置換、あるいは、オルニチン（以下、Ｚと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂと称する）、ノルロイシンオルニチン（以下、Ｏと称する）、ピリジルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニンおよびフェニルグリシンなどの非天然アミノ酸の取り込みが関わる置換もまた起こり得る。
変異体アミノ酸配列は、グリシンまたはβ−アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加え、メチル基、エチル基またはプロピル基などのアルキル基を含む配列の任意の２つのアミノ酸残基の間に挿入され得る好適なスペーサー基を含み得る。別形態の変化（これにはペプトイド形態の１つ以上のアミノ酸残基の存在が関わる）については、当業者は十分に理解し得る。誤解を避けるため、「ペプトイド形態」は、α−炭素置換基がα−炭素上ではなく、むしろ残基の窒素原子上にある変異体アミノ酸残基を指して使用される。ペプトイド形態のペプチドの調製方法は当該技術分野において公知である（例えばＳｉｍｏｎ ＲＪ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０），９３６７−９３７１およびＨｏｒｗｅｌｌ ＤＣ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４），１３２−１３４）。
本発明の実施は、特に記載のない限り、当業者の技能の範囲内である免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの慣用の技術を用いる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（１９８７））；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、およびＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））参照。
一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のエンジニアリングおよび最適化において使用されるベクターを提供する。
本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、ある環境から別の環境に実体を移すことを可能にし、またはそれを促進するツールである。ベクターはレプリコン、例えばプラスミド、ファージ、またはコスミドであり、そこに別のＤＮＡセグメントが挿入されることで、挿入されたセグメントの複製がもたらされ得る。概してベクターは、適切な制御エレメントと関連付けられたときに複製能を有する。一般に、用語「ベクター」は、核酸分子であって、それが結合している別の核酸の輸送能を有する核酸分子を指す。ベクターとしては、限定はされないが、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖の核酸分子；１つ以上の遊離末端を含む、遊離末端を含まない（例えば環状の）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方を含む核酸分子；および当該技術分野において公知の他のポリヌクレオチド変種が挙げられる。ある種のベクターは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術によるなどしてさらなるＤＮＡセグメントを中に挿入することのできる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここではウイルス（例えばレトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）にパッケージングするためのウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列がベクター中に存在する。ウイルスベクターはまた、宿主細胞への形質移入のためウイルスによって担持されるポリヌクレオチドも含む。特定のベクターは、それが導入される宿主細胞中で自己複製する能力を有する（例えば細菌性複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムにインテグレートされ、従って宿主ゲノムと共に複製する。さらに、特定のベクターは、作動可能に結合している遺伝子の発現を指向させる能力を有する。かかるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。組換えＤＮＡ技法において有用な一般的な発現ベクターは、多くの場合にプラスミドの形態である。ベクターのさらなる考察が本明細書において提供される。
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含んでもよく、これは、その組換え発現ベクターが、発現させる核酸配列に作動可能に結合した１つ以上の調節エレメントを含むことを意味し、調節エレメントは、発現に使用される宿主細胞に基づき選択され得る。組換え発現ベクター内で「作動可能に結合している」とは、目的のヌクレオチド配列が調節エレメントに、そのヌクレオチド配列の（例えばインビトロ転写／翻訳系における、またはベクターが宿主細胞に導入される場合には宿主細胞における）発現を可能にする形で結合していることを意味するように意図される。組換えおよびクローニング方法に関しては、２００４年９月２日に米国特許出願公開第２００４−０１７１１５６ Ａ１号明細書として公開された米国特許出願第１０／８１５，７３０号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる）が参照される。
本発明の態様および実施形態は、キメラＲＮＡおよびＣａｓ９またはＣａｓ９オルソログのためのバイシストロニックベクターに関する。一部の実施形態において、Ｃａｓ９は、ＣＢｈプロモーターによりドライブされる。一部の実施形態において、キメラＲＮＡは、Ｕ６プロモーターによりドライブされる。好ましくは、ＣＢｈおよびＵ６は、Ｃａｓ９がＣＢｈプロモーターによりドライブされ、キメラＲＮＡがＵ６プロモーターによりドライブという意味で一緒に使用される。一部の実施形態において、キメラガイドＲＮＡは、示される種々の位置においてトランケートされたｔｒａｃｒ配列（下方の鎖の最初の「Ｕ」から転写物の末端に及ぶ）に結合している２０ｂｐのガイド配列（Ｎ）からなる。ガイドおよびｔｒａｃｒ配列は、好ましくは、ｔｒａｃｒメイト配列により離隔している。ｔｒａｃｒメイト配列の好ましい例は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡである。これに、好ましくは、ループ配列が続く。ループは、好ましくは、ＧＡＡＡであるが、この配列に限定されるものではなく、または実際には４ｂｐ長のみである。実際、ヘアピン構造において使用される好ましいループ形成配列は４ヌクレオチド長であり、最も好ましくは、配列ＧＡＡＡを有する。しかしながら、代替配列であり得るようにより長いまたは短いループ配列を使用することができる。配列は、好ましくは、ヌクレオチドトリプレット（例えば、ＡＡＡ）、および追加のヌクレオチド（例えば、ＣまたはＧ）を含む。ループ形成配列の例としては、ＣＡＡＡおよびＡＡＡＧが挙げられる。本出願全体にわたり、キメラＲＮＡは、単一ガイド、または合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と称することもできる。
例えば、実施例２に具体的に詳述されるとおり、キメラガイドＲＮＡは図８に示されるとおり設計することができる。これらのファミリーの一部におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を図１１に示す。対応するガイドＲＮＡ配列を図１２に示す。本出願人らは、Ｃａｓ９タンパク質の約２ｋｂ内のゲノムＤＮＡ配列を分析し、２９ｂｐから３５ｂｐに及ぶ介在スペーサーを有する３５ｂｐから５０ｂｐに及ぶダイレクトリピートを同定した。ダイレクトリピート配列に基づき、本出願人らは、以下の基準を有するｔｒａｃｒＲＮＡ候補配列を検索した：ｃｒＲＮＡアレイの外側であるが、ダイレクトリピートとの高程度の相同性を含有し（ダイレクトリピート：ｔｒａｃｒＲＮＡ塩基対形成に要求されるもの；カスタム計算分析）、タンパク質成分のコード領域の外側であり、ダイレクトリピートとの相同性の領域から約６０ｂｐ〜１２０ｂｐ下流のＲｈｏ非依存性転写終結シグナルを含有し、ダイレクトリピートと同時フォールディングして二本鎖を形成し、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の遠位末端における２つ以上のヘアピン構造が続くこと。これらの予測基準に基づき、本出願人らは、１８個のＣａｓ９タンパク質およびそれらのユニークに関連するダイレクトリピートならびに５つ全てのＣａｓ９ファミリーにわたり分布するｔｒａｃｒＲＮＡの初期セットを選択した。本出願人らは、天然ダイレクトリピート：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖の配列および二次構造を保存した一方、人工ループを通して２つのＲＮＡエレメントを塩基対形成および融合する領域を短縮した１８個のキメラＲＮＡ構造のセットをさらに生成した（図６Ａ〜Ｊ）。
用語「調節エレメント」は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナルおよびポリＵ配列などの転写終結シグナル）を含むことが意図される。かかる調節エレメントは、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載される。調節エレメントには、多くのタイプの宿主細胞でヌクレオチド配列の構成的発現を指図するもの、および特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指図するもの（例えば組織特異的調節配列）が含まれる。組織特異的プロモーターは、主として所望される目的の組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば肝臓、膵臓）など、または特定の細胞型（例えばリンパ球）における発現を指図し得る。調節エレメントはまた、細胞周期依存的または発生段階依存的様式など、時間依存的様式での発現も指図することができ、これは同時に組織または細胞型特異的であっても、またはそうでなくてもよい。一部の実施形態では、ベクターは、１つ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば１、２、３、４、５つ、またはそれ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば１、２、３、４、５つ、またはそれ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター（例えば１、２、３、４、５つ、またはそれ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター）、またはそれらの組み合わせを含む。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例としては、限定はされないが、Ｕ６およびＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例としては、限定はされないが、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によりＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によりＣＭＶエンハンサーを伴う）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターが挙げられる。また、エンハンサーエレメント、例えばＷＰＲＥ；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲにおけるＲ−Ｕ５’セグメント（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６−４７２，１９８８）；ＳＶ４０エンハンサー；およびウサギβ−グロビンのエクソン２と３との間のイントロン配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８（３），ｐ．１５２７−３１，１９８１）も用語「調節エレメント」に包含される。発現ベクターの設計が、形質転換する宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどの要因に依存し得ることは、当業者によって理解されるであろう。ベクターを宿主細胞に導入し、それにより本明細書に記載されるとおり核酸によってコードされる転写物、タンパク質、またはペプチド、例えば融合タンパク質またはペプチド（例えば、クラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、それらの突然変異形態、それらの融合タンパク質等）を産生させることができる。調節配列に関しては、米国特許出願第１０／４９１，０２６号明細書が参照される（その内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる）。プロモーターに関しては、国際公開第２０１１／０２８９２９号パンフレットおよび米国特許出願第１２／５１１，９４０号明細書が参照される（その内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる）。
ベクターは、原核または真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質、または酵素）の発現のために設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、または哺乳動物細胞中で発現させることができる。好適な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）にさらに考察されている。あるいは、組換え発現ベクターをインビトロで、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して転写および翻訳させることができる。
ベクターは、原核生物または原核細胞中に導入し、その中で増殖させることができる。一部の実施形態において、原核生物を使用して真核細胞中に導入すべきベクターのコピーを増幅し、または真核細胞中に導入すべきベクターの産生における中間ベクターとして使用される（例えば、ウイルスベクターパッケージング系の一部としてプラスミドを増幅）。一部の実施形態において、原核生物を使用してベクターのコピーを増幅し、１つ以上の核酸を発現させ、例えば、宿主細胞または宿主生物への送達のための１つ以上のタンパク質の資源を提供する。原核生物中のタンパク質の発現は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中で、融合または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的または誘導的プロモーターを含有するベクターを用いて実施されることが最も多い。融合ベクターは、多数のアミノ酸をそれにコードされるタンパク質に、例えば、組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。このような融合ベクターは、１つ以上の目的、例えば、（ｉ）組換えタンパク質の発現の増加；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度の増加；および（ｉｉｉ）親和性精製におけるリガンドとして作用することによる組換えタンパク質の精製の支援を果たし得る。融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解開裂部位を融合部分および組換えタンパク質の接合部に導入して融合タンパク質の精製後に融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能とすることが多い。このような酵素、およびそのコグネート認識配列としては、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。例示的融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合する。
好適な誘導的非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。
一部の実施形態において、ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母の出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）中の発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｉｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
一部の実施形態において、ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞中のタンパク質発現をドライブする。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中のタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）が挙げられる。
一部の実施形態において、ベクターは、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞中の１つ以上の配列の発現をドライブし得る。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクター制御機能は、典型的には、１つ以上の調節エレメントにより提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２型、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス４０、ならびに本明細書に開示の他のものおよび当技術分野において公知のものに由来する。原核および真核細胞の両方のために他の好適な発現系については、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒｓ １６ ａｎｄ １７ ｏｆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９参照。
一部の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞タイプ中の核酸の発現を優先的に指向し得る（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現させる）。組織特異的調節エレメントは、当技術分野において公知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｉｊｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）、神経細胞特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号明細書および欧州特許出願公開第２６４，１６６号明細書）が挙げられる。発生制御プロモーター、例えば、ネズミｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトタンパク質プロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）も包含される。これらの原核生物および真核生物ベクターに関しては、米国特許第６，７５０，０５９号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる）が参照される。本発明の他の実施形態はウイルスベクターの使用に関するものであってよく、これに関しては米国特許出願第１３／０９２，０８５号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる）が参照される。組織特異的調節エレメントは当該技術分野において公知であり、これに関しては米国特許第７，７７６，３２１号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる）が参照される。
一部の実施形態において、調節エレメントは、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現をドライブするようにＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントに作動可能に結合している。一般に、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化等間隔短鎖回分リピート）は、ＳＰＩＤＲ（スペーサー散在型ダイレクトリピート（ＳＰａｃｅｒ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｐｅａｔ））としても公知であり、通常、特定の細菌種に特異的であるＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で認識された区別されるクラスの散在型短鎖配列リピート（ＳＳＲ）（Ｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：５４２９−５４３３［１９８７］；およびＮａｋａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１：３５５３−３５５６［１９８９］）および関連遺伝子を含む。類似の散在型ＳＳＲが、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、および結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）中で同定されている（Ｇｒｏｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０：１０５７−１０６５［１９９３］；Ｈｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，５：２５４−２６３［１９９９］；Ｍａｓｅｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３０７：２６−３０［１９９６］；およびＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７：８５−９３［１９９５］参照）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、典型的には他のＳＳＲとリピートの構造が異なり、それは短鎖等間隔リピート（ＳＲＳＲ）と称されている（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＯＭＩＣＳ Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．，６：２３−３３［２００２］；およびＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６：２４４−２４６［２０００］）。一般に、リピートは、実質的に一定の長さを有するユニーク介入配列により等間隔とされているクラスターで生じる短いエレメントである（Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２０００］、前掲）。リピート配列は株間で高度に保存されているが、散在型リピートの数およびスペーサー領域の配列は、典型的には、株ごとに異なる（ｖａｎ Ｅｍｂｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２：２３９３−２４０１［２０００］）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、４０を超える原核生物中で同定されており（例えば、Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：１５６５−１５７５［２００２］；およびＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２００５］参照）、例として、限定されるものではないが、アエロパイラム属（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、パイロバキュラム属（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、スルフォロバス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アーケオグロバス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロカーキュラ属（Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルシナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノパイラス属（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィラス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アキフェックス属（Ａｑｕｉｆｅｘ）、ポーフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、クロロビウム属（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アザーカス属（Ａｚａｒｃｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、デスルフォビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、ミクソコッカス属（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、およびサーモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）である。
一般に、「ＣＲＩＳＰＲ系」は、集合的に、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現またはその活性の指向に関与する転写物および他のエレメント、例として、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関して「ダイレクトリピート」およびｔｒａｃｒＲＮＡによりプロセシングされる部分ダイレクトリピートを包含）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関して「スペーサー」とも称される）、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列および転写物を指す。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に由来する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントは、内因性ＣＲＩＳＰＲ系を含む特定の生物、例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関してプロトスペーサーとも称される）におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントを特徴とする。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関して、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、標的配列は、細胞の核または細胞質中に局在している。
本発明の好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系であり、Ｃａｓ酵素は、ＤＮＡ開裂を触媒するＣａｓ９である。化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９または任意の近縁Ｃａｓ９による酵素作用は、２０ヌクレオチドのガイド配列にハイブリダイズし、２０ヌクレオチドの標的配列に続くプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列ＮＧＧ／ＮＲＧ（例えば、他箇所に考察されるとおり、好適なＰＡＭは、ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９酵素（または由来酵素）についてそれぞれ５’−ＮＲＧまたは５’−ＮＮＧＲＲである）を有する標的部位配列における二本鎖切断を生成する。部位特異的ＤＮＡ認識および開裂についてＣａｓ９を通したＣＲＩＳＰＲ活性は、ガイド配列、ガイド配列に部分的にハイブリダイズするｔｒａｃｒ配列およびＰＡＭ配列により定義される。ＣＲＩＳＰＲ系のより多くの態様は、Ｋａｒｇｉｎｏｖ ａｎｄ Ｈａｎｎｏｎ，Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍ：ｓｍａｌｌ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｄｅｆｅｎｓｅ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ａｒｃｈａｅ，Ｍｏｌｅ Ｃｅｌｌ ２０１０，Ｊａｎｕａｒｙ １５；３７（１）：７に記載されている。
化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０由来のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、４つの遺伝子Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、およびＣｓｎ１のクラスター、ならびに２つの非コードＲＮＡエレメント、ｔｒａｃｒＲＮＡおよび短い一続きの非反復配列（スペーサー、各約３０ｂｐ）が間に置かれた反復配列（ダイレクトリピート）の特徴的アレイを含む。この系では、標的化されたＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）が４段階の逐次的なステップで作成される（図２Ａ）。第一に、２つの非コードＲＮＡ、プレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第二に、ｔｒａｃｒＲＮＡがプレｃｒＲＮＡのダイレクトリピートにハイブリダイズし、次にはこれがプロセシングされて、個々のスペーサー配列を含む成熟ｃｒＲＮＡとなる。第三に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、ｃｒＲＮＡのスペーサー領域とプロトスペーサーＤＮＡとの間のヘテロ二重鎖形成によって、プロトスペーサーおよび対応するＰＡＭからなるＤＮＡ標的にＣａｓ９を仕向ける。最後に、Ｃａｓ９がＰＡＭの上流で標的ＤＮＡの開裂を媒介することにより、プロトスペーサー内にＤＳＢが作り出される（図２Ａ）。図２Ｂは、コドン最適化Ｃａｓ９の核局在を実証する。正確な転写開始を促進するため、ｔｒａｃｒＲＮＡの発現の駆動にＲＮＡポリメラーゼＩＩＩベースのＵ６プロモーターが選択された（図２Ｃ）。同様に、単一のスペーサーと、それに隣接する２つのダイレクトリピート（ＤＲ、用語「ｔｒａｃｒメイト配列」にも包含される；図２Ｃ）からなるプレｃｒＲＮＡアレイを発現させるため、Ｕ６プロモーターベースの構築物が開発された。初期のスペーサーは、大脳皮質の発生に重要な遺伝子であるヒトＥＭＸ１遺伝子座における３３塩基対（ｂｐ）の標的部位（３０ｂｐプロトスペーサー＋Ｃａｓ９のＮＧＧ認識モチーフを満たす３ｂｐ ＣＲＩＳＰＲモチーフ（ＰＡＭ）配列）をターゲティングするように設計された、（図２Ｃ）。
図１６は、Ｃａｓ９オルソログおよびそれぞれのｓｇＲＮＡを使用してｐＵＣ１９ベースライブラリー中に存在する２つの候補標的を開裂することを示す。標的１に、７つの縮重塩基（５’−ＮＮＮＮＮＮＮ−３’）を含有するランダム化ＰＡＭが続き、標的１と同一の標的配列を含有する標的１’に、固定ＰＡＭ（５’−ＴＧＧＡＧＡＡＴ−３’）が続く。それぞれのＣａｓ９オルソログのｓｇＲＮＡは、標的１または標的１’に対するガイド配列を含有する。ゲル画像は、２０個のＣａｓ９オルソログによる良好な開裂を示し、このことは、それらのｓｇＲＮＡ設計がそれらのそれぞれのＣａｓ９酵素について機能的であることを示す。
一部の実施形態において、ダイレクトリピートまたはｔｒａｃｒメイト配列は、ＣＲＩＳＰＲデータベースからダウンロードし、または１．ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座をフランキングするゲノム配列の２ｋｂウインドウに見出され、２．２０から５０ｂｐに及び、３．２０から５０ｂｐごとの間隔の反復モチーフを検索することによりインシリコで同定する。一部の実施形態において、これらの基準の２つ、例えば、１および２、２および３、または１および３を使用することができる。一部の実施形態において、３つ全ての基準を使用することができる。
一部の実施形態において、続いて、候補ｔｒａｃｒＲＮＡを、１．ダイレクトリピートとの配列相同性（最大１８ｂｐミスマッチでのＧｅｎｅｉｏｕｓにおけるモチーフ検索）、２．転写の方向における予測Ｒｈｏ非依存性転写ターミネーターの存在、および３．ｔｒａｃｒＲＮＡとダイレクトリピートとの間の安定ヘアピン二次構造により予測する。一部の実施形態において、これらの基準の２つ、例えば、１および２、２および３、または１および３を使用することができる。一部の実施形態において、３つ全ての基準を使用することができる。一部の実施形態において、キメラ合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）設計は、ダイレクトリピートとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の少なくとも８ｂｐの二本鎖構造を取り込む。
ＣＲＩＳＰＲ系のいくつかの態様は、ＣＲＩＳＰＲターゲティングの効率および多用途性を増加させるようにさらに改善することができる。最適なＣａｓ９活性は、哺乳動物核中に存在するものよりも高いレベルにおけるフリーＭｇ２＋の利用可能性に依存し得（例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６参照）、プロトスペーサーに隣接する下流のＮＧＧ／ＮＲＧモチーフについての優先性は、ヒトゲノム中で平均１２ｂｐごとでターゲティング能を制限する。
典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関して、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（標的配列にハイブリダイズされ、１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体形成しているガイド配列を含む）は、標的配列中または付近（例えば、それから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれよりも多い塩基対内）の一方または両方の鎖の開裂をもたらす。理論により拘束されるものではないが、ｔｒａｃｒ配列は、野生型ｔｒａｃｒ配列の全部または一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約または約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５、またはそれよりも多い数を超えるヌクレオチド）を含み得、またはそれからなっていてよく、例えば、ガイド配列に作動可能に結合しているｔｒａｃｒメイト配列の全部または一部とのｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿うハイブリダイゼーションによりＣＲＩＳＰＲ複合体の一部も形成し得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現をドライブする１つ以上のベクターを宿主細胞中に導入し、その結果、ＣＲＩＳＰＲ系のエレメントの発現が１つ以上の標的部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を指向する。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に結合しているガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列は、それぞれ別個のベクター上の別個の調節エレメントに作動可能に結合させることができる。あるいは、同一または異なる調節エレメントから発現されるエレメントの２つ以上を単一ベクター中で合わせることができ、ＣＲＩＳＰＲ系の任意の成分を提供する１つ以上の追加のベクターは第１のベクター中に含まれない。単一ベクター中で合わせるＣＲＩＳＰＲ系エレメントは、任意の好適な配向で配置することができ、例えば、あるエレメントを第２のエレメントに対して５’側（の上流）にまたは３’側（の下流）に局在化することができる。あるエレメントのコード配列は、第２のエレメントのコード配列の同一または逆鎖上で局在化し、同一または逆向きで配向させることができる。一部の実施形態において、単一のプロモーターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする転写物、ならびに１つ以上のイントロン配列内に埋め込まれているガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列（場合により、ガイド配列に作動可能に結合している）、およびｔｒａｃｒ配列（例えば、それぞれが異なるイントロン中に、２つ以上が少なくとも１つのイントロン中に、または全部が単一のイントロン中に存在する）の１つ以上の発現をドライブする。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列、およびｔｒａｃｒ配列は、同一のプロモーターに作動可能に結合しており、それから発現される。
一部の実施形態において、ベクターは、１つ以上の挿入部位、例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニング部位」とも称される）を含む。一部の実施形態において、１つ以上の挿入部位（例えば、約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い数を超える挿入部位）は、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流および／または下流に局在している。一部の実施形態において、ベクターは、ｔｒａｃｒメイト配列の上流、および場合によりｔｒａｃｒメイト配列に作動可能に結合している調節エレメントの下流の挿入部位を含み、その結果、挿入部位中へのガイド配列の挿入後および発現時にガイド配列が真核細胞中の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する。一部の実施形態において、ベクターは、２つ以上の挿入部位を含み、それぞれの挿入部位は、それぞれの部位におけるガイド配列の挿入を可能とするために２つのｔｒａｃｒメイト配列間に局在している。このような配置において、２つ以上のガイド配列は、単一ガイド配列の２つ以上のコピー、２つ以上の異なるガイド配列、またはそれらの組合せを含み得る。複数の異なるガイド配列を使用する場合、単一発現構築物を使用して細胞内の複数の異なる対応する標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ活性をターゲティングすることができる。例えば、単一ベクターは、約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれよりも多い数を超えるガイド配列を含み得る。一部の実施形態において、約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い数を超えるそのようなガイド配列含有ベクターを提供し、場合により細胞に送達することができる。
一部の実施形態において、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している調節エレメントを含む。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、またはそれらの改変バージョンが挙げられる。一部の実施形態において、非改変ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ開裂活性を有し、例えば、Ｃａｓ９である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における、例えば、標的配列内および／または標的配列の相補鎖内の一方または両方の鎖の開裂を指向する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドからの約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、またはそれよりも多い塩基対内の一方または両方の鎖の開裂を指向する。一部の実施形態において、ベクターは、対応する野生型酵素に対して突然変異しているＣＲＩＳＰＲ酵素をコードし、その結果、突然変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を開裂する能力を欠く。例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン中のアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を両方の鎖を開裂するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を開裂する）に変換する。Ｃａｓ９をニッカーゼにする突然変異の他の例としては、限定されるものではないが、ＳｐＣａｓ９中のＨ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、およびＮ８６３Ａが挙げられる。本明細書において考察されるとおり、対応する位置は、ＳｐＣａｓ９の位置ナンバリングに関して他の細菌種からの、またはそれに由来する他のＣａｓ９中で、すなわち、Ｃａｓ９オルソログ中で保存され得る。（図１９）は、１２個のＣａｓ９オルソログの多重配列アラインメントを示し、ＲｕｖＣＩドメイン中の保存触媒Ａｓｐ残基およびＨＮＨドメイン中の保存触媒Ｈｉｓ残基を示す。１つまたは他の残基のＡｌａへの突然変異は、Ｃａｓ９オルソログをニッカーゼに変換し得る。両方の残基の突然変異は、Ｃａｓ９オルソログを、包括的ＤＮＡ結合に有用な触媒的に無効な突然変異体に変換し得る。さらなる例として、Ｃａｓ９の２つ以上の触媒ドメイン（ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、およびＲｕｖＣ ＩＩＩまたはＨＮＨドメイン）を突然変異させて全てのＤＮＡ開裂活性を実質的に欠く突然変異Ｃａｓ９オルソログを産生することができる。一部の実施形態において、Ｄ１０Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８６３Ａ突然変異の１つ以上と組み合わせて全てのＤＮＡ開裂活性を実質的に欠くＣａｓ９酵素を産生する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、突然変異酵素のＤＮＡ開裂活性がその非突然変異形態に対して約２５％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％、またはそれよりも小さい数未満である場合、全てのＤＮＡ開裂活性を実質的に欠くとみなす。
ＳｐＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）をエンジニアリングしてヌクレアーゼをニッカーゼに変換し（例えば、Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９：９２７５；Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０９：Ｅ２５７９を参照）、ニックの入ったゲノムＤＮＡが高フィデリティ相同性組換え修復（ＨＤＲ）を起こすようにした。本出願人は、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより、ＳｐＣａｓ９ｎがＥＭＸ１プロトスペーサー標的にインデルを生成しないことを確認した。ＥＭＸ１ターゲティングキメラｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ成分も同様に有する）をＳｐＣａｓ９と同時発現させると標的部位にインデルが生じたが、ＳｐＣａｓ９ｎとの同時発現では生じなかった（ｎ＝３）。さらに、３２７個のアンプリコンのシーケンシングでは、ＳｐＣａｓ９ｎによって誘導されたインデルは検出されなかった。同じ遺伝子座を選択して、ＥＭＸ１を標的とするキメラＲＮＡ、ｈＳｐＣａｓ９またはｈＳｐＣａｓ９ｎ、ならびに一対の制限部位（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ）をプロトスペーサー近傍に導入するためのＨＲテンプレートをＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に同時形質移入することにより、ＣＲＩＳＰＲ媒介性ＨＲを試験した。ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９ｎは、実際、ＥＭＸ１遺伝子座中へのＨＲテンプレートのインテグレーションを触媒した。標的領域のＰＣＲ増幅とそれに続くＨｉｎｄＩＩＩによる制限消化により、予測断片サイズに対応する開裂産物が明らかになり、ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９ｎは類似レベルのＨＲ効率を媒介した。本出願人らは、ゲノムアンプリコンのサンガーシーケンシングを使用してＨＲをさらに確認し、哺乳動物ゲノム中のターゲティングされる遺伝子挿入を促進するためのＣＲＩＳＰＲの有用性を実証した。野生型ＳｐＣａｓ９の１４ｂｐ（スペーサーからの１２ｂｐおよびＰＡＭからの２ｂｐ）の標的特異性を考慮すると、ニッカーゼの利用可能性は、一本鎖切断物がエラープローンＮＨＥＪ経路のための基質でないため、オフターゲット改変の可能性を顕著に低減させ得る。図１０Ａ〜Ｍは、ＳｐＣａｓ９中の突然変異の位置を示す模式図を提供し、Ｃａｓ９オルソログは、典型的には、３〜４つのＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインの一般的な組織化を共有する。５’のほとんどのＲｕｖＣドメインは、非相補鎖を開裂し、ＨＮＨドメインは相補鎖を開裂する。
５’ＲｕｖＣドメイン中の触媒残基は、目的Ｃａｓ９と他のＣａｓ９オルソログ（化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座１、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座３、およびフランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｉｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から）との相同性比較を通して同定し、保存Ａｓｐ残基をアラニンに突然変異させてＣａｓ９を相補鎖ニック形成酵素に変換する。同様に、ＨＮＨドメイン中の保存ＨｉｓおよびＡｓｎ残基をアラニンに突然変異させてＣａｓ９を非相補鎖ニック形成酵素に変換する。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、特に細胞、例えば真核細胞での発現にコドンが最適化される。真核細胞は特定の生物、例えば哺乳動物、例えば限定はされないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、または非ヒト霊長類を含む非ヒト哺乳動物のものであるかまたはそれに由来し得る。一部の実施形態では、ヒトの生殖系列の遺伝的アイデンティティを改変する方法および／または動物の遺伝的アイデンティティを改変する方法であって、人または動物に対するいかなる実質的な医学的利益もなしにそれらに苦痛を生じさせる可能性がある方法、およびかかる方法から得られる動物もまた、除外され得る。
一般に、コドン最適化は、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約または約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、またはそれよりも多い数を超えるコドン）を、その宿主細胞の遺伝子中で使用されるより高頻度または最も高頻度のコドンにより置き換える一方、天然アミノ酸配列を維持することにより目的宿主細胞中の発現の向上のために核酸配列を改変するプロセスを指す。種々の種は、特定のアミノ酸のあるコドンについて特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の差）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関することが多く、このことは、次いで、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存的であると考えられる。細胞中で選択されるｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成において最も高頻度で使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づき所与の生物中の最適な遺伝子発現のために調整することができる。コドン使用頻度表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（２００２年７月９日にアクセス）で入手可能な「コドン使用頻度データベース」において容易に入手可能であり、これらの表は、多数の手法で適応させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）参照。特定の宿主細胞中の発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも入手可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）も入手可能である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列中の１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、またはそれよりも多い、または全てのコドン）は、特定のアミノ酸について最も高頻度で使用されるコドンに対応する。
一部の実施形態において、ベクターは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）、例えば、約また約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い数を超えるＮＬＳを含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、アミノ末端またはその付近における約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い数を超えるＮＬＳ、カルボキシ末端またはその付近における約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い数を超えるＮＬＳ、またはそれらの組合せ（例えば、アミノ末端における１つ以上のＮＬＳおよびカルボキシ末端における１つ以上のＮＬＳ）を含む。２つ以上のＮＬＳが存在する場合、それぞれは、単一のＮＬＳが２つ以上のコピーで存在し得るように他のものから独立して、および／または１つ以上のコピーで存在する１つ以上の他のＮＬＳとの組合せで選択することができる。本発明の好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、多くとも６つのＮＬＳを含む。一部の実施形態において、ＮＬＳは、ＮＬＳの最近傍アミノ酸が、ＮまたはＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、またはそれよりも多いアミノ酸内である場合、ＮまたはＣ末端付近に存在するとみなす。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンからのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有するヌクレオプラスミン二分（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤまたはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ−ｍｙｃＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチンアルファからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰおよびＰＰＫＫＡＲＥＤ；ヒトｐ５３の配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ；マウスｃ−ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲおよびＰＫＱＫＫＲＫ；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ；ならびにステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫに由来するＮＬＳ配列が挙げられる。
一般に、１つ以上のＮＬＳは、真核細胞の核中の検出可能な量のＣＲＩＳＰＲ酵素の蓄積をドライブするために十分な強度である。一般に、核局在化活性の強度は、ＣＲＩＳＰＲ酵素中のＮＬＳの数、使用される特定のＮＬＳ、またはそれらの因子の組合せに由来し得る。核中の蓄積の検出は、任意の好適な技術により実施することができる。例えば、検出可能なマーカーをＣＲＩＳＰＲ酵素に融合させることができ、その結果、細胞内の局在を、例えば、核の局在を検出する手段（例えば、核に特異的な染色、例えば、ＤＡＰＩ）との組合せで可視化することができる。細胞核を細胞から単離することもでき、次いでその含有物を、タンパク質を検出する任意の好適なプロセス、例えば、免疫組織学的分析、ウエスタンブロット、または酵素活性アッセイにより分析することができる。核中の蓄積は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の効果についてのアッセイ（例えば、標的配列におけるＤＮＡ開裂もしくは突然変異についてのアッセイ、またはＣＲＩＳＰＲ複合体形成および／もしくはＣＲＩＳＰＲ酵素活性により影響される遺伝子発現活性の変化についてのアッセイ）により、ＣＲＩＳＰＲ酵素にも複合体にも曝露されず、または１つ以上のＮＬＳを欠くＣＲＩＳＰＲ酵素に曝露される対照と比較して間接的に測定することもできる。
一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向するために標的ポリヌクレオチド配列との十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインされた場合、約または約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれよりも大きい数を超える。最適なアラインメントは、配列をアラインするための任意の好適なアルゴリズムを使用して決定することができ、その非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍをベースとするアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍにおいて入手可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて入手可能）、およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて入手可能）が挙げられる。一部の実施形態において、ガイド配列は、約または約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、またはそれよりも大きい数を超えるヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２、またはそれよりも小さい数未満のヌクレオチド長である。標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向するガイド配列の能力は、任意の好適なアッセイにより評価することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するために十分なＣＲＩＳＰＲ系の成分、例として、試験すべきガイド配列は、対応する標的配列を有する宿主細胞に、例えば、ＣＲＩＳＰＲ配列の成分をコードするベクターによる形質移入により提供することができ、次いで標的配列内の優先的開裂を例えば本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより評価する。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の開裂は、試験管中で標的配列、ＣＲＩＳＰＲ複合体の成分、例として、試験すべきガイド配列および試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を提供し、試験および対照ガイド配列反応間の標的配列における結合または開裂の比率を比較することにより評価することができる。他のアッセイが考えられ、当業者はそれを認識する。
多重化ニッカーゼ：本出願において詳述されるＣａｓ９の最適化の態様および教示を使用してＣａｓ９ニッカーゼを生成することもできる。Ｃａｓ９ニッカーゼは、有利には、ガイドＲＮＡのペアとの組合せで使用して定義されるオーバーハングを有するＤＮＡ二本鎖切断物を生成することができる。ガイドＲＮＡの２つのペアを使用する場合、介在ＤＮＡ断片を切り出すことが可能である。外因性ＤＮＡ片をガイドＲＮＡの２つのペアにより開裂してゲノムＤＮＡと適合性のオーバーハングを生成する場合、外因性ＤＮＡ断片をゲノムＤＮＡ中にライゲートして切り出された断片を置き換えることができる。例えば、これを使用してハンチントン（ＨＴＴ）遺伝子中のトリヌクレオチドリピート伸長を除去してハンチントン病を治療することができる。
Ｃａｓ９およびそのキメラガイドＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの組合せは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとして送達することができる。Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡの両方のＲＮＡ（通常または塩基もしくは骨格改変を含有）分子としての送達を使用してＣａｓ９タンパク質が細胞中で持続する時間の量を低減させることができる。このことは、標的細胞中のオフターゲット開裂活性のレベルを低減させ得る。ｍＲＮＡとしてのＣａｓ９の送達は、タンパク質に翻訳される時間を要するため、Ｃａｓ９ｍＲＮＡの送達から数時間後にガイドＲＮＡを送達してＣａｓ９タンパク質との相互作用に利用可能なガイドＲＮＡのレベルを最大化することが有利であり得る。
ガイドＲＮＡ量が限定される状況において、ｍＲＮＡとしてのＣａｓ９およびＤＮＡガイドＲＮＡの発現をドライブするプロモーターを有するＤＮＡ発現カセットの形態のガイドＲＮＡを導入することが望ましいことがある。こうして、利用可能なガイドＲＮＡの量を転写を介して増幅する。
種々の送達系を導入してＣａｓ９（ＤＮＡまたはＲＮＡ）およびガイドＲＮＡ（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を宿主細胞中に導入することができる。これらとしては、リポソーム、ウイルスベクター、エレクトロポレーション、ナノ粒子、ナノワイヤ（Ｓｈａｌｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１２）、エキソソームの使用が挙げられる。分子トロイの木馬リポソーム（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ；２０１０；ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４０７）を使用してＣａｓ９およびガイドＲＮＡを血液脳関門に通して送達することができる。
オルソログについてのガイドＲＮＡの考察：一部の実施形態において、ガイド配列は、ガイドＲＮＡ内の二次構造の程度を低減させるように選択される。一部の実施形態において、約または約７５％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％、またはそれより少ない数未満のヌクレオチドのガイドＲＮＡが、最適にフォールディングされた場合に自己相補的塩基対形成に関与する。最適なフォールディングは、任意の好適なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムにより決定することができる。一部のプログラムは、最小ギブス自由エネルギーの算出をベースとする。１つのこのようなアルゴリズムの例は、ｍＦｏｌｄであり、Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３−１４８）により記載されている。別の例示的フォールディングアルゴリズムは、セントロイド構造予測アルゴリズムを使用するＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａにおいて開発されたオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３−２４；およびＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１−６２参照）。Ｃａｓ９オルソログのガイドＲＮＡを最適化する方法は、ガイドＲＮＡ中のポリＵトラクトを破壊することを含む。破壊することができるポリＵトラクトは、一連の４、５、６、７、８、９または１０個のＵを含み得る。
一般に、ｔｒａｃｒメイト配列は、（１）対応するｔｒａｃｒ配列を含有する細胞中でｔｒａｃｒメイト配列によりフランキングされているガイド配列の切り出し；および（２）標的配列におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列を含む）の１つ以上を促進するためにｔｒａｃｒ配列との十分な相補性を有する任意の配列を含む。一般に、相補性の程度は、２つの配列の短い方の長さに沿うｔｒａｃｒメイト配列およびｔｒａｃｒ配列の最適なアラインメントに準拠する。最適なアラインメントは、任意の好適なアラインメントアルゴリズムにより決定することができ、二次構造、例えばｔｒａｃｒ配列またはｔｒａｃｒメイト配列内の自己相補性をさらに説明し得る。一部の実施形態において、２つの短い方の長さに沿ったｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒメイト配列との間の相補性の程度は、最適にアラインされた場合、約または約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれよりも大きい数を超える。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、約または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、またはそれよりも大きい数を超えるヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｔメイト配列は、単一転写物内に含有され、その結果、２つの間のハイブリダイゼーションが二次構造、例えば、ヘアピンを有する転写物を産生する。本発明の一実施形態において、転写物または転写されたポリヌクレオチド配列は、少なくとも２つ以上のヘアピンを有する。好ましい実施形態において、転写物は、２、３、４または５つのヘアピンを有する。本発明のさらなる実施形態において、転写物は、多くとも５つのヘアピンを有する。ヘアピン構造において、最後の「Ｎ」およびループの上流の５’側の配列の部分は、ｔｒａｃｒメイト配列に対応し、ループの３’側の配列の部分は、ｔｒａｃｒ配列に対応する。ガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列、およびｔｒａｃｒ配列を含む単一ポリヌクレオチドのさらなる非限定的な例は、以下のとおりであり（５’から３’に列記）、「Ｎ」は、ガイド配列の塩基を表し、第１の小文字のブロックは、ｔｒａｃｒメイト配列を表し、第２の小文字のブロックは、ｔｒａｃｒ配列を表し、最後のポリＴ配列は、転写ターミネーターを表す：
一部の実施形態において、配列（１）から（３）は、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１からのＣａｓ９との組合せで使用される。一部の実施形態において、配列（４）から（６）は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９との組合せで使用される。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒメイト配列を含む転写物と別個の転写物である。
オルソログについてのｔｒａｃｒメイト配列の考察：一部の実施形態において、組換えテンプレートも提供される。組換えテンプレートは、本明細書に記載の別のベクターの成分であり得、別個のベクター中で含有させ、または別個のポリヌクレオチドとして提供することができる。一部の実施形態において、組換えテンプレートは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部としてのＣＲＩＳＰＲ酵素によりニック形成または開裂される標的配列内またはその付近での相同組換えにおけるテンプレートとして機能するように設計される。テンプレートポリヌクレオチドは、任意の好適な長さ、例えば、約または約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、１０００、またはそれよりも大きい数を超えるヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態において、テンプレートポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部に相補的である。最適にアラインされた場合、テンプレートポリヌクレオチドは、標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば、約または約１、５、１０、１５、２０、またはそれよりも多い数を超えるヌクレオチド）と重複し得る。一部の実施形態において、テンプレート配列および標的配列を含むポリヌクレオチドが最適にアラインされた場合、テンプレートポリヌクレオチドの最近傍ヌクレオチドは、標的配列から約１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、１００００、またはそれよりも多いヌクレオチド内に存在する。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素の他の約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い数を超えるドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列、および場合により任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合させることができるタンパク質ドメインの例としては、限定されるものではないが、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、ならびに以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ開裂活性および核酸結合活性の１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、限定されるものではないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および自己蛍光タンパク質、例として、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ分子に結合し、または他の細胞分子に結合するタンパク質またはタンパク質の断片、例として、限定されるものではないが、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物をコードする遺伝子配列に融合させることができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得る追加のドメインは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１００５９５０２号明細書に記載されている。一部の実施形態において、タグ化ＣＲＩＳＰＲ酵素を使用して標的配列の局在を同定する。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、誘導性系の成分を形成し得る。系の誘導性質により、エネルギー形態を使用する遺伝子編集または遺伝子発現の時空間制御が可能となる。エネルギー形態としては、限定されるものではないが、電磁放射、音響エネルギー、化学エネルギーおよび熱エネルギーを挙げることができる。誘導性系の例としては、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔ−ＯｎまたはＴｅｔ−Ｏｆｆ）、小分子２ハイブリッド転写活性化系（ＦＫＢＰ、ＡＢＡなど）、または光誘導性系（フィトクロム、ＬＯＶドメイン、またはクリプトクロム）が挙げられる。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、配列特異的様式での転写活性の変化を指向するための光誘導性転写エフェクター（Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ）（ＬＩＴＥ）の一部であり得る。光の成分は、ＣＲＩＳＰＲ酵素、光応答性チトクロムヘテロダイマー（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）から）、および転写活性化／抑制ドメインを含み得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質およびその使用方法のさらなる例は、参照により全体して本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６１／７３６４６５号明細書および米国仮特許出願第６１／７２１，２８３号明細書に提供される。
一部の態様において、本発明は、１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、または本明細書に記載の１つ以上のベクター、１つ以上のその転写物、および／またはそれから転写された１つまたはタンパク質を宿主細胞に送達することを含む方法を提供する。一部の態様において、本発明は、そのような細胞により産生された細胞、およびそのような細胞を含み、またはそれから産生された動物をさらに提供する。一部の実施形態において、ガイド配列との組合せの（および場合によりそれと複合体形成している）ＣＲＩＳＰＲ酵素を細胞に送達する。慣用のウイルスおよび非ウイルスベース遺伝子移入法を使用して核酸を哺乳動物細胞または標的組織中に導入することができる。このような方法を使用してＣＲＩＳＰＲ系の成分をコードする核酸を培養物中の細胞に、または宿主生物中に投与することができる。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のベクターの転写物）、ネイキッド核酸、および送達ビヒクル、例えば、リポソームと複合体形成している核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞への送達後にエピソーム性またはインテグレートされるゲノムを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。遺伝子療法手順の概要については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ＆Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ＆Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ＆Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｅｈｍ（ｅｄｓ）（１９９５）；およびＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６（１９９４）参照。
核酸の非ウイルス送達の方法としては、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤により向上されるＤＮＡの取り込みが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号明細書、同第４，９４６，７８７号明細書；および同第４，８９７，３５５号明細書）に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオンおよび中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレットのものが挙げられる。送達は、細胞（例えば、インビトロまたはエクスビボ投与）または標的組織（例えば、インビボ投与）に対するものであり得る。
脂質：核酸複合体、例として、ターゲティングされるリポソーム、例えば、免疫脂質複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号明細書、同第４，２１７，３４４号明細書、同第４，２３５，８７１号明細書、同第４，２６１，９７５号明細書、同第４，４８５，０５４号明細書、同第４，５０１，７２８号明細書、同第４，７７４，０８５号明細書、同第４，８３７，０２８号明細書、および同第４，９４６，７８７号明細書参照）。
核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベース系の使用は、ウイルスを体内の規定の細胞にターゲティングし、ウイルスペイロードを核に輸送する高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与することができ（インビボ）、またはそれらを使用してインビトロで細胞を治療することができ、場合により、改変された細胞を患者に投与することができる（エクスビボ）。慣用のウイルスベース系としては、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴および単純ヘルペスウイルスベクターを挙げることができる。宿主ゲノム中のインテグレーションは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入法について考えられ、挿入されたトランス遺伝子の長期発現をもたらすことが多い。さらに、高い形質導入効率が多くの異なる細胞タイプおよび標的組織において観察されている。
レトロウイルスの向性は、外来エンベロープタンパク質を取り込むことにより変え、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染し、典型的には、高ウイルス力価を産生し得るレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、６〜１０ｋｂまでの外来配列のためのパッケージング能を有するシス作用長鎖末端リピートを含む。最小シス作用ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、次いでそれを使用して治療遺伝子を標的細胞中にインテグレートして恒久的なトランス遺伝子発現を提供する。広く使用されるレトロウイルスベクターとしては、ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）をベースとするもの、またはそれらの組合せが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００号明細書参照）。
一過的発現が好ましい用途においては、アデノウイルスベース系を使用することができる。アデノウイルスベースベクターは、多くの細胞タイプにおいて極めて高い形質導入効率を示し得、細胞分裂を要求しない。このようなベクターについて、高い力価および発現のレベルが得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。
例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生において、ならびにインビボおよびエクスビボ遺伝子療法手順のためにアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを使用して細胞に標的核酸を形質導入することもできる（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号明細書；国際公開第９３／２４６４１号パンフレット；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）参照。組換えＡＡＶベクターの構築は、多数の刊行物、例として、米国特許第５，１７３，４１４号明細書；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；およびＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）に記載されている。
典型的には、パッケージング細胞を使用して宿主細胞に感染し得るウイルス粒子を形成する。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法において使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする細胞系を産生することにより生成する。ベクターは、典型的には、パッケージングおよび後続の宿主中へのインテグレーションに要求される最小ウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現させるべきポリヌクレオチドのための発現カセットにより置き換えられている。欠損ウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞系によりトランスで供給する。例えば、遺伝子療法において使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノム中へのパッケージングおよびインテグレーションに要求されるＡＡＶゲノムからのＩＴＲ配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞系中にパッケージングされる。細胞系は、ヘルパーとしてのアデノウイルスにより感染させることもできる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して顕著な量でパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性である熱処理により低減させることができる。核酸を細胞に送達する追加の方法は、当業者に公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３００８７８１７号明細書参照。
従って、ＡＡＶは形質導入ベクターとして使用するのに理想的な候補と考えられる。かかるＡＡＶ形質導入ベクターは、トランスに提供されるアデノウイルスまたはヘルペスウイルスまたはポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）ヘルパー機能の存在下で複製するのに十分なシス作用性機能を含み得る。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を使用して種々の系統の細胞に外来性遺伝子を運び込むことができる。これらのベクターでは、ＡＡＶ ｃａｐおよび／またはｒｅｐ遺伝子をウイルスゲノムから欠失させ、選択のＤＮＡセグメントに置き換える。現在のＡＡＶベクターは、最大４３００塩基の挿入ＤＮＡを収容し得る。
ｒＡＡＶの作製方法は数多くあり、本発明はｒＡＡＶおよびｒＡＡＶの調製方法を提供する。例えば、所望のウイルス構築物を含むまたはそれから本質的になる１つまたは複数のプラスミドが、ＡＡＶ感染細胞に形質移入される。加えて、第２のまたは追加のヘルパープラスミドがこれらの細胞に同時形質移入され、組換えウイルス構築物の複製およびパッケージングに必須のＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子が提供される。これらの条件下で、ＡＡＶのｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質はトランスに作用してｒＡＡＶ構築物の複製およびパッケージングを刺激する。形質移入後２〜３日でｒＡＡＶは回収される。従来、ｒＡＡＶはアデノウイルスと共に細胞から回収される。次に汚染アデノウイルスが熱処理によって不活性化される。本発明では、ｒＡＡＶは有利には、細胞それ自体からではなく、細胞上清から回収される。従って、最初の態様では本発明はｒＡＡＶを調製することを提供し、および前述に加えて、以下を含むまたはそれから本質的になる方法によりｒＡＡＶを調製することができる：発現用ＤＮＡを含む外来性ＤＮＡと、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスなどのポックスウイルス）とを含有するｒＡＡＶを感受性細胞に感染させるステップであって、ｒＡＡＶが機能性ｃａｐおよび／またはｒｅｐを欠損している（およびヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスなどのポックスウイルス）はｒＡＡＶに欠損しているｃａｐおよび／またはｒｅｖ機能を提供する）ステップ；または発現用ＤＮＡを含む外来性ＤＮＡを含有するｒＡＡＶを感受性細胞に感染させるステップであって、組換え体が機能性ｃａｐおよび／またはｒｅｐを欠損しているステップと、ｒＡＡＶに欠損しているｃａｐおよび／またはｒｅｐ機能を提供するプラスミドを前記細胞に形質移入すること；または発現用ＤＮＡを含む外来性ＤＮＡを含有するｒＡＡＶを感受性細胞に感染させるステップであって、組換え体が機能性ｃａｐおよび／またはｒｅｐを欠損しており、前記細胞が、組換え体に欠損しているｃａｐおよび／またはｒｅｐ機能を提供すること；または機能性ｃａｐおよび／またはｒｅｐを欠損しているＡＡＶと、外来性ＤＮＡが組換え体によって発現されるように外来性ＤＮＡを組換え体に挿入するための、かつｒｅｐおよび／またはｃａｐ機能を提供するためのプラスミドとを感受性細胞に形質移入することであって、従って形質移入により、機能性ｃａｐおよび／またはｒｅｐが欠損した、発現用ＤＮＡを含む外来性ＤＮＡを含有するｒＡＡＶがもたらされること。
ｒＡＡＶは、本明細書に記載されるとおりＡＡＶ由来であってもよく、有利には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５またはそれらの任意の組み合わせを含み得るハイブリッドまたはカプシドを有するｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ＡＡＶ５またはｒＡＡＶであり得る。ｒＡＡＶのＡＡＶは、ｒＡＡＶが標的とする細胞に関連して選択することができる；例えば、脳または神経細胞のターゲティングには、ＡＡＶ血清型１、２、５またはハイブリッドもしくはカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５またはそれらの任意の組み合わせを選択することができ；および心臓組織のターゲティングにはＡＡＶ４を、肝臓組織のターゲティングにはＡＡＶ８を選択することができる。
２９３細胞に加えて、本発明の実施に用いることのできる他の細胞およびそれらの細胞に関するインビトロでの特定のＡＡＶ血清型の相対的感染力（Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７−５９１１（２００８）を参照）は以下のとおりである。
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化等間隔短鎖回分リピート）系をコードする外来性核酸分子、例えば、プロモーターと、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質（推定ヌクレアーゼまたはヘリカーゼタンパク質）、例えばＣａｓ９をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含むまたはそれから本質的になる第１のカセット、およびプロモーターと、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含むまたはそれから本質的になる２つ、またはそれ以上の、有利にはベクターのパッケージングサイズ限界に至るまでの、例えば合計で（第１のカセットを含めて）５つのカセット（例えば、各カセットは概略的に、プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター、プロモーター−ｇＲＮＡ２−ターミネーター．．．プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター（式中、Ｎは、ベクターのパッケージングサイズ限界の上限である挿入可能な数である）と表される）を含むまたはそれからなる複数のカセットを含むまたはそれから本質的になるｒＡＡＶ、または２つ以上の個々のｒＡＡＶであって、各々がＣＲＩＳＰＲ系の１つまたは２つ以上のカセットを含み、例えば、第１のｒＡＡＶが、プロモーターと、Ｃａｓ、例えばＣａｓ９をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含むまたはそれから本質的になる第１のカセットを含み、および第２のｒＡＡＶが、プロモーターと、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含むまたはそれから本質的になる複数の４つのカセット（例えば、各カセットは概略的に、プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター、プロモーター−ｇＲＮＡ２−ターミネーター．．．プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター（式中、Ｎは、ベクターのパッケージングサイズ限界の上限である挿入可能な数である）と表される）を含むｒＡＡＶを提供する。ｒＡＡＶはＤＮＡウイルスであるため、ＡＡＶまたはｒＡＡＶに関する本明細書の考察における核酸分子は、有利にはＤＮＡである。プロモーターは、一部の実施形態では有利にはヒトシナプシンＩプロモーター（ｈＳｙｎ）である。
Ｃａｓ９コード核酸分子、例えば、ＤＮＡをウイルスベクター中にパッケージングしてインビボでゲノム改変を媒介する２つの手法が好ましい：
ＮＨＥＪ媒介遺伝子ノックアウトを達成するため：
単一ウイルスベクター：
２つ以上の発現カセットを含有するベクター：
プロモーター−Ｃａｓ９コード核酸分子−ターミネーター
プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター
プロモーター−ｇＲＮＡ２−ターミネーター
プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター（ベクターのサイズ限界まで）
二重ウイルスベクター：
Ｃａｓ９の発現をドライブするための１つの発現カセットを含有するベクター１
プロモーター−Ｃａｓ９コード核酸分子−ターミネーター
１つ以上のガイドＲＮＡの発現をドライブするためのもう１つの発現カセットを含有するベクター２
プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター
プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター（ベクターのサイズ限界まで）
相同性組換え修復を媒介するため。上記の単一および二重ウイルスベクターアプローチに加え、追加のベクターを使用して相同性組換え修復テンプレートを送達する。
Ｃａｓ９コード核酸分子の発現をドライブするために使用されるプロモーターは、以下を含み得る：
ＡＡＶ ＩＴＲは、プロモーターとして機能し得：これは、追加のプロモーターエレメント（ベクター中のスペースを占め得る）の必要性の排除に有利である。追加スペースの制限解放を使用して追加のエレメント（ｇＲＮＡなど）の発現をドライブすることができる。また、ＩＴＲ活性は相対的に弱く、したがってそれを使用してＣａｓ９の過剰発現に起因する毒性を低減させることができる。
ユビキタス発現のため、プロモーター：ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＰＧＫ、ＳＶ４０、フェリチン重鎖または軽鎖などを使用することができる。
脳発現のため、プロモーター：全ての神経細胞のためにシナプシンＩ、興奮性神経細胞のためにＣａＭＫＩＩアルファ、ＧＡＢＡ性神経細胞のためにＧＡＤ６７またはＧＡＤ６５またはＶＧＡＴなどを使用することができる。
肝臓発現のため、アルブミンプロモーターを使用することができる。
肺発現のため、ＳＰ−Ｂを使用することができる。
内皮細胞のため、ＩＣＡＭを使用することができる。
造血細胞のため、ＩＦＮベータまたはＣＤ４５を使用することができる。
骨芽細胞のため、ＯＧ−２を使用することができる。
ガイドＲＮＡをドライブするために使用されるプロモーターは、以下を含み得る：
ＰｏｌＩＩＩプロモーター、例えば、Ｕ６またはＨ１
ｇＲＮＡを発現させるためのＰｏｌＩＩプロモーターおよびイントロン性カセットの使用
ＡＡＶに関して、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５またはそれらの任意の組合せであり得る。ターゲティングすべき細胞に関するＡＡＶのＡＡＶを選択することができ；例えば、脳または神経細胞のターゲティングのためにＡＡＶ血清型１、２、５またはハイブリッドまたはカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５またはそれらの任意の組合せを選択することができ；心臓組織のターゲティングのためにＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は、肝臓への送達に有用である。上記プロモーターおよびベクターが個々に好ましい。
核酸を細胞に送達する追加の方法は、当業者に公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３００８７８１７号明細書参照。
一部の実施形態において、宿主細胞を、本明細書に記載の１つ以上のベクターにより一過的にまたは非一過的に形質移入する。一部の実施形態において、細胞を、それが対象中で天然に生じるままで形質移入する。一部の実施形態において、形質移入される細胞を対象から採取する。一部の実施形態において、細胞は、対象から採取された細胞、例えば、細胞系に由来する。組織培養のための広範な細胞系は、当技術分野において公知である。細胞系の例としては、限定されるものではないが、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ−３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ−Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｃ１、ＰＣ−３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ−２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ−７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ−ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ−Ｋ２、ＷＥＨＩ−２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ−１、ＢＣ−３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ−５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨｅＬａ Ｂ、ＨｅＬａ Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−６、ＣＯＳ−Ｍ６Ａ、ＢＳ−Ｃ−１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３−Ｌ１、１３２−ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３−Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ−５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ−１細胞、ＢＥＡＳ−２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ−２１、ＢＲ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ−２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ−７、ＣＨＯ−ＩＲ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ２、ＣＨＯ−Ｔ、ＣＨＯ Ｄｈｆｒ−／−、ＣＯＲ−Ｌ２３、ＣＯＲ−Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ−Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ−７、ＣＯＶ−４３４、ＣＭＬ Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ−６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ−２９、Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ−Ｍｅｌ１−４８、ＭＣ−３８、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ６、ＭＴＤ−１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＮＡＬＭ−１、ＮＷ−１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞系、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ−１Ａ／ＰＮＴ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ−５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｓｆ−９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ−４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞系、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ−４９、Ｘ６３、ＹＡＣ−１、ＹＡＲ、およびそれらのトランスジェニック変種が挙げられる。細胞系は、当業者に公知の種々の資源から入手可能である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓｕｓ，Ｖａ．）参照）。一部の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のベクターにより形質移入された細胞を使用して１つ以上のベクター由来配列を含む新たな細胞系を樹立する。一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ系の成分により一過的に形質移入され（例えば、１つ以上のベクターの一過的形質移入、またはＲＮＡによる形質移入により）、ＣＲＩＳＰＲ複合体の活性を通して改変された細胞を使用して改変を含有するがあらゆる他の外因性配列を欠く細胞を含む新たな細胞系を樹立する。一部の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のベクターにより一過的にまたは非一過的に形質移入された細胞、またはそのような細胞に由来する細胞系を、１つ以上の試験化合物の評価において使用する。
一部の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のベクターを使用して非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物を産生する。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、またはウサギである。トランスジェニック植物および動物を産生する方法は、当技術分野において公知であり、一般に、例えば、本明細書に記載の細胞形質移入の方法から出発する。
作物ゲノミクスの近年の進歩とともに、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用して効率的でコスト効率の良い遺伝子編集および操作を実施する技能により、産生の改善および形質の向上のためにそのようなゲノムを形質転換するための単一および多重化遺伝子操作の迅速な選択および比較が可能となる。これに関して、米国特許および刊行物：米国特許第６，６０３，０６１号明細書−Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ；米国特許第７，８６８，１４９号明細書−Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆおよび米国特許出願公開第２００９／０１００５３６号明細書−Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｇｒｏｎｏｍｉｃ Ｔｒａｉｔｓが参照され、これらのそれぞれの全ての内容および開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。本発明の実施において、Ｍｏｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ“Ｃｒｏｐ ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ｄｅｃ ２９；１３（２）：８５−９６の内容および開示も参照により全体として本明細書に組み込まれる。本発明の有利な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して微細藻類をエンジニアリングする（実施例７）。したがって、本明細書における動物細胞への言及は、必要な変更を加え、特に明らかでない限り植物細胞にも当てはまり得る。
一態様において、本発明は、インビボ、エクスビボまたはインビトロであり得る真核細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ヒトまたは非ヒト動物または植物（微細藻類を含む）から細胞または細胞の集団をサンプリングし、１つまたは複数の細胞を改変することを含む。培養は、任意の段階においてエクスビボで行うことができる。１つまたは複数の細胞は、非ヒト動物または植物（微細藻類を含む）中に再導入することもできる。再導入される細胞については、細胞が幹細胞であることが特に好ましい。
一部の実施形態において、方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記標的ポリヌクレオチドの開裂を生じさせ、それにより、標的ポリヌクレオチドを改変することを含み、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、次いでｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。
一態様において、本発明は、真核細胞中のポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体をポリヌクレオチドに結合させ、その結果、前記結合が前記ポリヌクレオチドの発現の増加または減少をもたらすことを含み；ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、次いでｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。類似の考察は、上記のとおり標的ポリヌクレオチドを改変する方法に当てはまる。実際、これらのサンプリング、培養および再導入の任意選択は、本発明の態様にわたり当てはまる。
一態様において、本発明は、上記方法および組成物に開示のエレメントのいずれか１つ以上を含有するキットを提供する。エレメントは、個々にまたは組合せで提供することができ、任意の好適な容器、例えば、バイアル、ボトル、またはチューブ中で提供することができる。一部の実施形態において、キットは、１つ以上の言語の、例えば、２つ以上の言語の指示書を含む。
一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載のエレメントの１つ以上を利用するプロセスにおいて使用される１つ以上の試薬を含む。試薬は、任意の好適な容器中で提供することができる。例えば、キットは、１つ以上の反応または貯蔵緩衝液を提供し得る。試薬は、特定のアッセイにおいて使用可能な形態で、または使用前に１つ以上の他の成分の添加を要求する形態（例えば、濃縮物または凍結乾燥形態）で提供することができる。緩衝液は、任意の緩衝液、例として、限定されるものではないが、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、およびそれらの組合せであり得る。一部の実施形態において、緩衝液はアルカリ性である。一部の実施形態において、緩衝液は、約７から約１０のｐＨを有する。一部の実施形態において、キットは、ガイド配列および調節エレメントを作動可能に結合させるためのベクター中への挿入のためのガイド配列に対応する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、キットは、相同組換えテンプレートポリヌクレオチドを含む。
一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントを使用する方法を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチドを改変する有効な手段を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、広範な有用性、例として、非常に多数の細胞タイプ中の標的ポリヌクレオチドの改変（例えば、欠失、挿入、転座、不活性化、活性化）を有する。したがって、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、例えば、遺伝子療法、薬物スクリーニング、疾患診断、および予後における幅広い用途範囲を有する。例示的ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。ガイド配列は、次いでｔｒａｃｔ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。
一実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチドを開裂する方法を提供する。本方法は、標的ポリヌクレオチドに結合して前記標的ポリヌクレオチドの開裂を生じさせるＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的ポリヌクレオチドを改変することを含む。典型的には、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、細胞に導入されると、ゲノム配列に切断（例えば、一本鎖または二本鎖切断）を作り出す。例えば、本方法を用いて細胞中の疾患遺伝子を開裂させることができる。
ＣＲＩＳＰＲ複合体によって作り出された切断は、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路または高フィデリティ相同性組換え修復（ＨＤＲ）などの修復プロセスによって修復され得る。これらの修復プロセスの間、ゲノム配列に外来性ポリヌクレオチドテンプレートを導入することができる。一部の方法では、ＨＤＲプロセスを用いてゲノム配列が改変される。例えば、上流配列および下流配列が隣接するインテグレートしようとする配列を含む外来性ポリヌクレオチドテンプレートが細胞に導入される。上流および下流配列は、染色体におけるインテグレーション部位の両側と配列類似性を共有する。
望ましい場合、ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、例えばＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、線状ＤＮＡ片、ＰＣＲ断片、ネイキッド核酸、またはリポソームまたはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体化した核酸であってもよい。
外来性ポリヌクレオチドテンプレートは、インテグレートされる配列（例えば変異遺伝子）を含む。インテグレートする配列は、細胞にとって内因性または外来性の配列であってもよい。インテグレートされる配列の例としては、タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは非コードＲＮＡ（例えばマイクロＲＮＡ）が挙げられる。従って、インテグレートする配列は、１つまたは複数の適切な制御配列に作動可能に結合され得る。あるいは、インテグレートされる配列が調節機能を提供し得る。
外来性ポリヌクレオチドテンプレート中の上流および下流配列は、目的の染色体配列とドナーポリヌクレオチドとの間の組換えを促進するように選択される。上流配列は、標的インテグレーション部位の上流のゲノム配列と配列類似性を共有する核酸配列である。同様に、下流配列は、標的インテグレーション部位の下流の染色体配列と配列類似性を共有する核酸配列である。外来性ポリヌクレオチドテンプレート中の上流および下流配列は、標的ゲノム配列と７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有し得る。好ましくは、外来性ポリヌクレオチドテンプレート中の上流および下流配列は、標的ゲノム配列と約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。一部の方法では、外来性ポリヌクレオチドテンプレート中の上流および下流配列は、標的ゲノム配列と約９９％または１００％の配列同一性を有する。
上流または下流配列は、約２０ｂｐ〜約２５００ｂｐ、例えば、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、または２５００ｂｐを含み得る。一部の方法では、例示的上流または下流配列は、約２００ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、またはより詳細には約７００ｂｐ〜約１０００ｂｐを有する。
一部の方法では、外来性ポリヌクレオチドテンプレートはマーカーをさらに含み得る。かかるマーカーは標的インテグレーションのスクリーニングを容易にし得る。好適なマーカーの例としては、制限部位、蛍光タンパク質、または選択可能なマーカーが挙げられる。本発明の外来性ポリヌクレオチドテンプレートは組換え技術を用いて構築することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６を参照）。
外来性ポリヌクレオチドテンプレートをインテグレートすることにより標的ポリヌクレオチドを改変する例示的方法においては、ＣＲＩＳＰＲ複合体によってゲノム配列に二本鎖切断が導入され、その切断が、外来性ポリヌクレオチドテンプレートによる相同組換えでテンプレートがゲノムにインテグレートされることにより修復される。二本鎖切断の存在がテンプレートのインテグレーションを促進する。
他の実施形態では、この発明は、真核細胞におけるポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。本方法は、そのポリヌクレオチドに結合するＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的ポリヌクレオチドの発現を増加または低下させることを含む。
一部の方法では、細胞における発現の改変を達成するため標的ポリヌクレオチドを不活性化させることができる。例えば、細胞中の標的配列にＣＲＩＳＰＲ複合体が結合すると、配列が転写されないか、コードされたタンパク質が産生されないか、または野生型配列が機能するとおりには配列が機能しないように、標的ポリヌクレオチドが不活性化される。例えば、タンパク質が産生されないようにタンパク質またはマイクロＲＮＡコード配列が不活性化されてもよい。
一部の方法では、それ以上制御配列として機能しないように制御配列を不活性化することができる。本明細書で使用されるとき、「制御配列」は、核酸配列の転写、翻訳、または接触可能性を実現する任意の核酸配列を指す。制御配列の例としては、プロモーター、転写ターミネーターが挙げられ、およびエンハンサーが制御配列である。
不活性化された標的配列は、欠失突然変異（すなわち、１つ以上のヌクレオチドの欠失）、挿入突然変異（すなわち、１つ以上のヌクレオチドの挿入）、またはナンセンス突然変異（すなわち、終止コドンが導入されるような単一のヌクレオチドによる別のヌクレオチドとの置換）を含み得る。一部の方法では、標的配列の不活性化は標的配列の「ノックアウト」をもたらす。
生化学的シグナル伝達経路に関連する１つ以上のゲノム配列の発現の変化は、候補薬剤に接触させたときの試験モデル細胞と対照細胞との間における対応する遺伝子のｍＲＮＡレベルの差をアッセイすることにより決定され得る。あるいは、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列の発現の差は、コードされたポリペプチドまたは遺伝子産物のレベルの差を検出することにより決定される。
ｍＲＮＡ転写物または対応するポリヌクレオチドのレベルの薬剤により引き起こされた変化をアッセイするため、初めに試料中に含まれる核酸が当該技術分野の標準方法に従い抽出される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）に示される手順に従い種々の溶菌酵素または化学溶液を使用してｍＲＮＡを単離することができ、または製造者により提供される付属の説明書に従い核酸結合樹脂で抽出することができる。抽出した核酸試料に含まれるｍＲＮＡは、次に当該技術分野において広く知られている方法に従うかまたは本明細書に例示する方法に基づき、増幅手順または従来のハイブリダイゼーションアッセイ（例えばノーザンブロット解析）により検出される。
本発明の目的上、増幅は、妥当なフィデリティで標的配列を複製する能力を有するプライマーおよびポリメラーゼを用いる任意の方法を意味する。増幅は、天然または組換えＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＴａｑＧｏｌｄ（商標）、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、および逆転写酵素によって行われ得る。好ましい増幅方法はＰＣＲである。詳細には、単離されたＲＮＡが、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列の発現レベルを定量化するため定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）と組み合わされた逆転写アッセイに供され得る。
遺伝子発現レベルの検出は、増幅アッセイ中にリアルタイムで行うことができる。一態様では、増幅産物が、蛍光ＤＮＡ結合剤、例えば限定はされないがＤＮＡインターカレート剤およびＤＮＡ溝結合剤で直接可視化され得る。二本鎖ＤＮＡ分子に組み込まれるインターカレート剤の量は、典型的には増幅されたＤＮＡ産物の量に比例するため、好都合には、当該技術分野における従来の光学的システムを使用してインターカレート色素の蛍光を定量化することにより、増幅産物の量を決定することができる。この適用に好適なＤＮＡ結合色素としては、ＳＹＢＲグリーン、ＳＹＢＲブルー、ＤＡＰＩ、プロピジウムヨウ素、Ｈｏｅｓｔｅ、ＳＹＢＲゴールド、臭化エチジウム、アクリジン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、蛍光クマリン（ｆｌｕｏｒｃｏｕｍａｎｉｎ）、エリプチシン、ダウノマイシン、クロロキン、ジスタマイシンＤ、クロモマイシン、ホミジウム、ミトラマイシン、ルテニウムポリピリジル、アントラマイシンなどが挙げられる。
別の態様では、配列特異的プローブなどの他の蛍光標識を増幅反応に用いて増幅産物の検出および定量化を促進し得る。プローブベースの定量的増幅は、所望の増幅産物の配列特異的検出に頼る。この増幅は、特異性および感度の増加をもたらす蛍光性の標的特異的プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）を利用する。プローブベースの定量的増幅を実施する方法は当該技術分野で十分に確立されており、米国特許第５，２１０，０１５号明細書に教示される。
さらに別の態様では、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列と配列相同性を共有するハイブリダイゼーションプローブを使用して従来のハイブリダイゼーションアッセイを実施し得る。典型的には、プローブは、被験対象から得られた生体試料内に含まれる生化学的シグナル伝達経路に関連する配列と安定した複合体をハイブリダイゼーション反応で形成することが可能である。アンチセンスがプローブ核酸として使用される場合、試料中に提供される標的ポリヌクレオチドがアンチセンス核酸の配列と相補的であるように選択されることは、当業者に理解されるであろう。逆に、ヌクレオチドプローブがセンス核酸である場合、標的ポリヌクレオチドはセンス核酸の配列と相補的であるように選択される。
ハイブリダイゼーションは、例えば本明細書に記載されるような種々のストリンジェンシーの条件下で実施することができる。本発明の実施に好適なハイブリダイゼーション条件は、プローブと生化学的シグナル伝達経路に関連する配列との間の認識相互作用が十分に特異的であるとともに十分に安定しているものである。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーが増加する条件は当該技術分野で広く知られており、発表されている。例えば、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）；Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照のこと。ハイブリダイゼーションアッセイは、限定はされないが、ニトロセルロース、ガラス、ケイ素、および種々の遺伝子アレイを含めた任意の固体支持体上に固定化されたプローブを使用して形成され得る。好ましいハイブリダイゼーションアッセイは、米国特許第５，４４５，９３４号明細書に記載されるとおりの高密度遺伝子チップで実施される。
ハイブリダイゼーションアッセイ中に形成されるプローブ−標的複合体を好都合に検出するため、ヌクレオチドプローブが検出可能標識にコンジュゲートされる。本発明における使用に好適な検出可能標識には、光化学的、生化学的、分光学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段で検出可能な任意の組成物が含まれる。幅広い種類の適切な検出可能標識が当該技術分野において公知であり、それには、蛍光または化学発光標識、放射性同位元素標識、酵素または他のリガンドが含まれる。好ましい実施形態では、ジゴキシゲニン、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼ、アビジン／ビオチン複合体など、蛍光標識または酵素タグを用いることが所望されるものと思われる。
ハイブリダイゼーション強度の検出または定量化に用いられる検出方法は、典型的には上記で選択される標識に依存することになる。例えば、放射標識は、写真フィルムまたはホスフォイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）を使用して検出し得る。蛍光マーカーは、放出される光を検出するため光検出器を使用して検出および定量化し得る。酵素標識は、典型的には酵素に基質を提供し、基質に対する酵素の作用によって産生された反応産物を計測することにより検出される；および最後に、比色標識は、単純に、着色した標識を可視化することにより検出される。
薬剤により引き起こされる、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列の発現の変化はまた、対応する遺伝子産物を調べることによっても決定し得る。タンパク質レベルの決定には、典型的には、ａ）生体試料中に含まれるタンパク質を、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質に特異的に結合する薬剤と接触させること；および（ｂ）そのようにして形成された任意の薬剤：タンパク質複合体を同定することが関わる。この実施形態の一態様において、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質に特異的に結合する薬剤は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。
反応は、薬剤と生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質との間で複合体が形成されることを可能にする条件下で、被験試料から得られた生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質の試料に薬剤を接触させることにより実施される。複合体の形成は、当該技術分野の標準的手順に従い直接的または間接的に検出することができる。直接的な検出方法では、薬剤に検出可能標識が提供され、複合体から未反応薬剤が除去され得る；従って残る標識の量が、形成された複合体の量を示す。かかる方法には、ストリンジェントな洗浄条件の中にあっても薬剤に結合したまま留まる標識を選択することが好ましい。標識は結合反応を妨げないことが好ましい。代替として、間接的な検出手順では、化学的に、あるいは酵素的に導入された標識を含む薬剤を使用し得る。望ましい標識は、概して得られる薬剤：ポリペプチド複合体の結合または安定性を妨げない。しかしながら、標識は典型的には、有効な結合、ひいては検出可能なシグナルの生成のため抗体に接触可能であるように設計される。
タンパク質レベルの検出に好適な幅広い種類の標識が当該技術分野において公知である。非限定的な例としては、放射性同位元素、酵素、コロイド金属、蛍光化合物、生物発光化合物、および化学発光化合物が挙げられる。
結合反応中に形成された薬剤：ポリペプチド複合体の量は、標準的な定量アッセイにより定量化することができる。上記に説明したとおり、薬剤：ポリペプチド複合体の形成は、結合部位に残る標識の量によって直接計測することができる。代替例では、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質が、特定の薬剤上の結合部位に関して標識類似体と競合するその能力に関して試験される。この競合アッセイでは、捕捉される標識の量は、被験試料中に存在する生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質配列の量に反比例する。
上記に概説した一般的原理に基づく多くのタンパク質分析技術は、当該技術分野において利用可能である。これには、限定はされないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノラジオメトリックアッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、インサイチューイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位元素標識を使用する）、ウエスタンブロット分析、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光アッセイ、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥが含まれる。
前述のタンパク質分析の実施には、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質を特異的に認識しまたは結合する抗体が好ましい。望ましい場合、特定のタイプの翻訳後改変（例えば、生化学的シグナル伝達経路誘導性改変）を認識する抗体を使用することができる。翻訳後改変としては、限定はされないが、グリコシル化、脂質化、アセチル化、およびリン酸化が挙げられる。これらの抗体は、商業的な供給業者から購入してもよい。例えば、チロシンリン酸化タンパク質を特異的に認識する抗ホスホチロシン抗体が、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒを含む多くの供給業者から入手可能である。抗ホスホチロシン抗体は、ＥＲストレスに応答してそのチロシン残基で別様にリン酸化されるタンパク質の検出において特に有用である。かかるタンパク質としては、限定はされないが、真核生物翻訳開始因子２α（ｅＩＦ−２α）が挙げられる。あるいは、これらの抗体は、従来のポリクローナルまたはモノクローナル抗体技術を用いて、所望の翻訳後改変を呈する標的タンパク質で宿主動物または抗体産生細胞を免疫することにより作成し得る。
主題の方法を実施するにおいて、異なる体組織、異なる細胞型、および／または異なる細胞内構造における生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質の発現パターンを識別することが望ましいこともある。こうした試験は、特定の組織、細胞型、または細胞内構造で優先的に発現するタンパク質マーカーと結合する能力を有する組織特異的、細胞特異的または細胞内構造特異抗体を使用して実施することができる。
生化学的シグナル伝達経路に関連する遺伝子の発現の変化はまた、対照細胞と比べた遺伝子産物の活性の変化を調べることにより決定し得る。薬剤により引き起こされる、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質の活性の変化に関するアッセイは、調べている生物学的活性および／またはシグナル伝達経路に依存し得る。例えば、タンパク質がキナーゼである場合、下流の１つまたは複数の基質をリン酸化するその能力の変化を当該技術分野において公知の種々のアッセイにより決定することができる。代表的なアッセイとしては、限定はされないが、リン酸化タンパク質を認識する抗ホスホチロシン抗体などの抗体による免疫ブロットおよび免疫沈降が挙げられる。加えて、キナーゼ活性は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから入手可能）およびｅＴａｇ（商標）アッセイ（Ｃｈａｎ−Ｈｕｉ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１１：１６２−１７４）などのハイスループット化学発光アッセイにより検出することができる。
生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質が細胞内ｐＨ条件の変動をもたらすシグナル伝達カスケードの一部である場合、蛍光ｐＨ色素などのｐＨ感受性分子をレポーター分子として使用することができる。生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質がイオンチャネルである別の例では、膜電位および／または細胞内イオン濃度の変動をモニタすることができる。多くの市販キットおよびハイスループット装置が、イオンチャネルの調節因子に関する迅速かつロバストなスクリーニングに特に適している。代表的な機器としては、ＦＬＩＰＲ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．）およびＶＩＰＲ（Ａｕｒｏｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられる。これらの機器は、マイクロプレートの１０００個を超えるサンプルウェルで同時に反応を検出し、かつ１秒またはさらには１ミリ秒以内にリアルタイムの計測値および機能データを提供する能力を有する。
本明細書に開示される任意の方法の実施においては、限定なしに、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ソノポレーション、微粒子銃、リン酸カルシウム媒介性形質移入、カチオン性形質移入、リポソーム形質移入、デンドリマー形質移入、熱ショック形質移入、ヌクレオフェクション形質移入、マグネトフェクション、リポフェクション、インペイルフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、光学的形質移入、有標の薬剤により増強される核酸取り込み、およびリポソーム、免疫リポソーム、ビロソーム、または人工ビリオンを介した送達を含めた当該技術分野で公知の１つ以上の方法によって細胞または胚に好適なベクターを導入することができる。一部の方法では、ベクターはマイクロインジェクションにより胚に導入される。１つまたは複数のベクターが胚の核または細胞質に微量注入され得る。一部の方法では、１つまたは複数のベクターはヌクレオフェクションにより細胞に導入され得る。
ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞に対して内因性または外因性である任意のポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核中に残留するポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列または非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチドまたはジャンクＤＮＡ）であり得る。
標的ポリヌクレオチドの例としては、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列、例えば、生化学的シグナル伝達経路関連遺伝子またはポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例としては、疾患関連遺伝子またはポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連」遺伝子またはポリヌクレオチドとは、罹患組織に由来する細胞において非疾患対照の組織または細胞と比較して異常なレベルでまたは異常な形態で転写または翻訳産物を産生している任意の遺伝子またはポリヌクレオチドを指す。それは異常に高いレベルで発現するようになる遺伝子であってもよく；異常に低いレベルで発現するようになる遺伝子であってもよく、ここで発現の変化は疾患の発生および／または進行と相関する。疾患関連遺伝子はまた、疾患の原因に直接関与するかまたはそれに関与する１つまたは複数の遺伝子との連鎖不平衡がある１つまたは複数の突然変異または遺伝的変異を有する遺伝子も指す。転写または翻訳された産物は既知であってもまたは未知であってもよく、および正常レベルであってもまたは異常レベルであってもよい。
ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞にとって内因性または外来性の任意のポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核に存在するポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えばタンパク質）をコードする配列または非コード配列（例えば調節ポリヌクレオチドまたはジャンクＤＮＡ）であり得る。理論により拘束されるものではないが、標的配列がＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）；すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体により認識される短い配列と会合するはずであることが考えられる。ＰＡＭについての正確な配列および長さの条件は、使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素に応じて異なるが、ＰＡＭは、典型的には、プロトスペーサー（すなわち、標的配列）に隣接する２〜５塩基対配列である。ＰＡＭ配列の例を以下の実施例セクションに挙げ、当業者は、所与のＣＲＩＳＰＲ酵素について使用されるさらなるＰＡＭ配列を同定することができる。
ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドとしては、それぞれＢｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１１／００８／ＷＳＧＲ整理番号４４０６３−７０１．１０１およびＢＩ−２０１１／００８／ＷＳＧＲ整理番号４４０６３−７０１．１０２を有する米国仮特許出願第６１／７３６，５２７号明細書および同第６１／７４８，４２７号明細書（両方とも、標題ＳＹＳＴＥＭＳ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ、それぞれ２０１２年１２月１２日および２０１３年１月２日に出願、これらの全ての内容は参照により全体として本明細書に組み込まれる）に列記の多数の疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチドならびにシグナリング生化学経路関連遺伝子およびポリヌクレオチドを挙げることができる。
標的ポリヌクレオチドの例としては、シグナリング生化学経路に関連する配列、例えば、シグナリング生化学経路関連遺伝子またはポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例としては、疾患関連遺伝子またはポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連」遺伝子またはポリヌクレオチドは、非疾患対照の組織または細胞と比較して患部組織に由来する細胞中で異常なレベルにおいてまたは異常な形態で転写または翻訳産物を生じさせている任意の遺伝子またはポリヌクレオチドを指す。これは、異常に高いレベルにおいて発現されるようになる遺伝子であり得；これは、異常に低いレベルにおいて発現されるようになる遺伝子であり得、発現の変化は、疾患の発生および／または進行と相関する。疾患関連遺伝子は、疾患の病因を直接担い、または疾患の病因を担う遺伝子と連鎖不平衡をなす突然変異または遺伝子変異を有する遺伝子も指す。転写または翻訳される産物は、既知または未知のものであり得、正常または異常レベルにおけるものであり得る。
疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチドの例は、ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎａｔｈａｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ （Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）から入手可能であり、ワールドワイドウェブから入手可能である。
疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチドの例を表ＡおよびＢに列記する。疾患特異的情報は、ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎａｔｈａｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ （Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）から入手可能であり、ワールドワイドウェブから入手可能である。シグナリング生化学経路関連遺伝子およびポリヌクレオチドの例を表Ｃに列記する。
これらの遺伝子および経路中の突然変異は、機能に影響する不適切な量の不適切な１つまたは複数のタンパク質の産生をもたらし得る。遺伝子、疾患およびタンパク質のさらなる例は、２０１２年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／７３６，５２７号明細書および２０１３年１月２日に出願された同第６１／７４８，４２７号明細書から参照により本明細書に組み込まれる。このような遺伝子、タンパク質および経路は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドであり得る。
本発明の実施形態は、遺伝子のノックアウト、遺伝子の増幅ならびにＤＮＡリピート不安定性および神経学的疾患に関連する特定の突然変異の修復に関連する方法および組成物にも関する（Ｒｏｂｅｒｔ Ｄ．Ｗｅｌｌｓ，Ｔｅｔｓｕｏ Ａｓｈｉｚａｗａ，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｃｔ １３，２０１１−Ｍｅｄｉｃａｌ）。規定の態様のタンデムリピート配列が２０を超えるヒト疾患を担うことが見出されている（Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｒｅｐｅａｔ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ：ｒｏｌｅ ｏｆ ＲＮＡ・ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｓ．ＭｃＩｖｏｒ ＥＩ，Ｐｏｌａｋ Ｕ，Ｎａｐｉｅｒａｌａ Ｍ．ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；７（５）：５５１−８）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を利用してゲノム不安定性のこれらの異常を補正することができる。
本発明のさらなる態様は、ラフォラ病に関連することが同定されているＥＭＰ２ＡおよびＥＭＰ２Ｂ遺伝子の異常の補正のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の利用に関する。ラフォラ病は、青年期において癲癇性発作として始まり得る進行性ミオクローヌス癲癇を特徴とする常染色体劣性病態である。この疾患の数例は、未だ同定されていない遺伝子の突然変異により引き起こされ得る。この疾患は、発作、筋痙攣、歩行困難、認知症、および最終的に死亡を引き起こす。現在、疾患進行に対して有効であることが証明されている治療は存在しない。癲癇に関連する他の遺伝子異常を、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系によりターゲティングすることもでき、基礎となる遺伝学は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｐｉｌｅｐｓｉｅｓ，Ｇｉｕｌｉａｎｏ Ａｖａｎｚｉｎｉ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｌ．Ｎｏｅｂｅｌｓにより編集，Ｍａｒｉａｎｉ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ：２０；２００９）にさらに記載されている。
本発明のさらに別の態様において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用し、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｙｅ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｅｌｉａｓ Ｉ．Ｔｒａｂｏｕｌｓｉ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１２にさらに記載されているいくつかの遺伝子突然変異から生じる眼の異常を補正することができる。
本発明のいくつかのさらなる態様は、米国国立衛生研究所のウェブサイト（ｈｅａｌｔｈ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｐｉｃ／ＧｅｎｅｔｉｃＤｉｓｏｒｄｅｒｓにおけるウェブサイト）上にトピックサブセクションＧｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓのもとでさらに記載されている広範な遺伝子疾患に関連する異常の補正に関する。遺伝子脳疾患としては、限定されるものではないが、副腎白質ジストロフィー、脳梁欠損症、アイカルディ症候群、アルパース病、アルツハイマー病、バース症候群、バッテン病、ＣＡＤＡＳＩＬ、小脳変性症、ファブリー病、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病、ハンチントン病および他のトリプレットリピート病、リー病、レッシュ−ナイハン症候群、メンケス病、ミトコンドリアミオパチーならびにＮＩＮＤＳコルポセファリーが挙げられる。これらの疾患は、米国国立衛生研究所のウェブサイト上にサブセクションＧｅｎｅｔｉｃ Ｂｒａｉｎ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓのもとでさらに記載されている。
一部の実施形態において、病態は、新形成である。病態が新形成であり得る一部の実施形態において、ターゲティングすべき遺伝子は、表Ａに列記のもののいずれかであり得る（この場合、ＰＴＥＮなど）。一部の実施形態において、病態は、加齢黄斑変性症であり得る。一部の実施形態において、病態は、統合失調症であり得る。一部の実施形態において、病態は、トリヌクレオチドリピート障害であり得る。一部の実施形態において、病態は、脆弱性Ｘ症候群であり得る。一部の実施形態において、病態は、セクレターゼ関連障害であり得る。一部の実施形態において、病態は、プリオン関連障害であり得る。一部の実施形態において、病態は、ＡＬＳであり得る。一部の実施形態において、病態は、薬物嗜好であり得る。一部の実施形態において、病態は、自閉症であり得る。一部の実施形態において、病態は、アルツハイマー病であり得る。一部の実施形態において、病態は、炎症であり得る。一部の実施形態において、病態は、パーキンソン病であり得る。
パーキンソン病に関連するタンパク質の例としては、限定されるものではないが、α−シヌクレイン、ＤＪ−１、ＬＲＲＫ２、ＰＩＮＫ１、パーキン、ＵＣＨＬ１、シンフィリン−１、およびＮＵＲＲ１が挙げられる。
嗜好関連タンパク質の例としては、例えば、ＡＢＡＴを挙げることができる。
炎症関連タンパク質の例としては、例えば、Ｃｃｒ２遺伝子によりコードされる単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ１）、Ｃｃｒ５遺伝子によりコードされるＣ−Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５）、Ｆｃｇｒ２ｂ遺伝子によりコードされるＩｇＧ受容体ＩＩＢ（ＦＣＧＲ２ｂ、ＣＤ３２とも称される）、またはＦｃｅｒ１ｇ遺伝子によりコードされるＦｃイプシロンＲ１ｇ（ＦＣＥＲ１ｇ）タンパク質を挙げることができる。
心血管疾患関連タンパク質の例としては、例えば、ＩＬ１Ｂ（インターロイキン１、ベータ）、ＸＤＨ（キサンチンデヒドロゲナーゼ）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＰＴＧＩＳ（プロスタグランジンＩ２（プロスタサイクリン）シンターゼ）、ＭＢ（ミオグロビン）、ＩＬ４（インターロイキン４）、ＡＮＧＰＴ１（アンジオポエチン１）、ＡＢＣＧ８（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）、メンバー８）、またはＣＴＳＫ（カテプシンＫ）を挙げることができる。
アルツハイマー病関連タンパク質の例としては、例えば、ＶＬＤＬＲ遺伝子によりコードされる超低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）、ＵＢＡ１遺伝子によりコードされるユビキチン様修飾因子活性化酵素１（ＵＢＡ１）、またはＵＢＡ３遺伝子によりコードされるＮＥＤＤ８活性化酵素Ｅ１触媒サブユニットタンパク質（ＵＢＥ１Ｃ）を挙げることができる。
自閉症スペクトラム障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＢＺＲＡＰ１遺伝子によりコードされるベンゾジアゼピン受容体（末梢性）関連タンパク質１（ＢＺＲＡＰ１）、ＡＦＦ２遺伝子（ＭＦＲ２とも称される）によりコードされるＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２タンパク質（ＡＦＦ２）、ＦＸＲ１遺伝子によりコードされる脆弱性Ｘ精神遅滞常染色体ホモログ１タンパク質（ＦＸＲ１）、またはＦＸＲ２遺伝子によりコードされる脆弱性Ｘ精神遅滞常染色体ホモログ２タンパク質（ＦＸＲ２）を挙げることができる。
黄斑変性症に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＡＢＣＲ遺伝子によりコードされるＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー４タンパク質（ＡＢＣＡ４）、ＡＰＯＥ遺伝子によりコードされるアポリポタンパク質Ｅタンパク質（ＡＰＯＥ）、またはＣＣＬ２遺伝子によりコードされるケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２タンパク質（ＣＣＬ２）を挙げることができる。
統合失調症に関連するタンパク質の例としては、ＮＲＧ１、ＥｒｂＢ４、ＣＰＬＸ１、ＴＰＨ１、ＴＰＨ２、ＮＲＸＮ１、ＧＳＫ３Ａ、ＢＤＮＦ、ＤＩＳＣ１、ＧＳＫ３Ｂ、およびそれらの組合せを挙げることができる。
腫瘍抑制に関与するタンパク質の例としては、例えば、ＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調症変異）、ＡＴＲ（毛細血管拡張性運動失調症およびＲａｄ３関連）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＥＲＢＢ２（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ２）、ＥＲＢＢ３（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３）、ＥＲＢＢ４（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４）、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、またはＮｏｔｃｈ４を挙げることができる。
セクレターゼ障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＰＳＥＮＥＮ（プレセニリンエンハンサー２ホモログ（線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＰＳＥＮ１（プレセニリン１）、ＡＰＰ（アミロイドベータ（Ａ４）前駆体タンパク質）、ＡＰＨ１Ｂ（咽頭前部欠損１ホモログＢ（線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＰＳＥＮ２（プレセニリン２（アルツハイマー病４））、またはＢＡＣＥ１（ベータ部位ＡＰＰ開裂酵素１）を挙げることができる。
筋萎縮性側索硬化症に関連するタンパク質の例としては、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）、ＡＬＳ２（筋萎縮性側索硬化症２）、ＦＵＳ（ｆｕｓｅｄ ｉｎ ｓａｒｃｏｍａ）、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質）、ＶＡＧＦＡ（血管内皮成長因子Ａ）、ＶＡＧＦＢ（血管内皮成長因子Ｂ）、およびＶＡＧＦＣ（血管内皮成長因子Ｃ）、およびそれらの任意の組合せを挙げることができる。
プリオン疾患に関連するタンパク質の例としては、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）、ＡＬＳ２（筋萎縮性側索硬化症２）、ＦＵＳ（ｆｕｓｅｄ ｉｎ ｓａｒｃｏｍａ）、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質）、ＶＡＧＦＡ（血管内皮成長因子Ａ）、ＶＡＧＦＢ（血管内皮成長因子Ｂ）、およびＶＡＧＦＣ（血管内皮成長因子Ｃ）、およびそれらの任意の組合せを挙げることができる。
プリオン障害における神経変性病態に関連するタンパク質の例としては、例えば、Ａ２Ｍ（アルファ−２−マクログロブリン）、ＡＡＴＦ（アポトーシス拮抗転写因子）、ＡＣＰＰ（前立腺酸性ホスファターゼ）、ＡＣＴＡ２（大動脈平滑筋アクチンアルファ２）、ＡＤＡＭ２２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン）、ＡＤＯＲＡ３（アデノシンＡ３受容体）、またはＡＤＲＡ１Ｄ（アルファ−１Ｄアドレナリン受容体についてのアルファ−１Ｄアドレナリン作動性受容体）を挙げることができる。
免疫不全症に関連するタンパク質の例としては、例えば、Ａ２Ｍ［アルファ−２−マクログロブリン］；ＡＡＮＡＴ［アリールアルキルアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ］；ＡＢＣＡ１［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー１］；ＡＢＣＡ２［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー２］；またはＡＢＣＡ３［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー３］を挙げることができる。
トリヌクレオチドリピート障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＡＲ（アンドロゲン受容体）、ＦＭＲ１（脆弱性Ｘ精神遅滞１）、ＨＴＴ（ハンチントン）、またはＤＭＰＫ（筋緊張性異栄養症タンパク質キナーゼ）、ＦＸＮ（フラタキシン）、ＡＴＸＮ２（アタキシン２）が挙げられる。
神経伝達障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＳＳＴ（ソマトスタチン）、ＮＯＳ１（一酸化窒素シンターゼ１（神経型））、ＡＤＲＡ２Ａ（アドレナリン作動性アルファ−２Ａ受容体）、ＡＤＲＡ２Ｃ（アドレナリン作動性アルファ−２Ｃ受容体）、ＴＡＣＲ１（タキキニン受容体１）、またはＨＴＲ２ｃ（５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体２Ｃ）が挙げられる。
神経発達関連配列の例としては、例えば、Ａ２ＢＰ１［アタキシン２結合タンパク質１］、ＡＡＤＡＴ［アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ］、ＡＡＮＡＴ［アリールアルキルアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ］、ＡＢＡＴ［４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ］、ＡＢＣＡ１［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１］、またはＡＢＣＡ１３［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１３］が挙げられる。
本発明の系により治療可能な好ましい病態のさらなる例は、以下のものから選択することができる：アルカルディ−グティエール症候群；アレキサンダー病；アラン−ハーンドン−ダッドリー症候群；ＰＯＬＧ関連障害；アルファ−マンノシドーシス（ＩＩおよびＩＩＩ型）；アルストレム症候群；アンジェルマン症候群；毛細血管拡張性運動失調症；神経セロイドリポフスチン症；ベータ−セラサミア；両側性視神経委縮症および（幼児型）視神経委縮症１型；網膜芽腫（両側性）；カナバン病；脳・眼・顔・骨格症候群１［ＣＯＦＳ１］；脳腱黄色腫症；コルネリア・デ・ラング症候群；ＭＡＰＴ関連障害；遺伝性プリオン病；ドラベ症候群；早期発症型家族性アルツハイマー病；フリードライヒ運動失調症［ＦＲＤＡ］；フリンス症候群；フコシドーシス；福山型先天性筋ジストロフィー；ガラクトシアリドーシス；ゴーシェ病；有機酸血症；血球貪食性リンパ組織球症；ハッチンソン−ギルフォード早老症候群；ムコリピドーシスＩＩ型；幼児遊離シアル酸蓄積症；ＰＬＡ２Ｇ６関連神経変性症；ジャーベル・ランゲ−ニールセン症候群；接合型表皮水疱症；ハンチントン病；クラッベ病（幼児型）；ミトコンドリアＤＮＡ関連リー症候群およびＮＡＲＰ；レッシュ−ナイハン症候群；ＬＩＳ１関連滑脳症；ロウ症候群；メープルシロップ尿症；ＭＥＣＰ２重複症候群；ＡＴＰ７Ａ関連銅輸送障害；ＬＡＭＡ２関連筋ジストロフィー；アリールスルファターゼＡ欠損症；ムコ多糖症Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ型；ペルオキシソーム形成異常症、ツェルウェーガー症候群スペクトラム；脳の鉄蓄積症を伴う神経変性症；酸性スフィンゴミエリナーゼ欠損症；ニーマン−ピック病Ｃ型；グリシン脳症；ＡＲＸ関連障害；尿素サイクル異常症；ＣＯＬ１Ａ１／２関連骨形成不全症；ミトコンドリアＤＮＡ欠失症候群；ＰＬＰ１関連障害；ペリー症候群；フェラン−マクダーモット症候群；グリコーゲン蓄積症ＩＩ型（ポンペ病）（幼児型）；ＭＡＰＴ関連障害；ＭＥＣＰ２関連障害；肢根型点状軟骨異形成症１型；ロバーツ症候群；サンドホフ病；シンドラー病１型；アデノシンデアミナーゼ欠損症；スミス−レムリ−オピッツ症候群；脊髄性筋萎縮症；幼児期発症型脊髄小脳失調症；ヘキソサミニダーゼＡ欠損症；致死性異形成１型；コラーゲンＶＩ型関連障害；アッシャー症候群Ｉ型；先天性筋ジストロフィー；ウォルフ−ヒルシュホーン症候群；リソソーム酸リパーゼ欠損症；ならびに色素性乾皮症。
明らかなとおり、本発明の系を使用して任意の目的ポリヌクレオチド配列をターゲティングすることができることが想定される。本発明の系を使用して有用に治療することができる病態または疾患の一部の例を上記表に含め、それらの病態に現在関連する遺伝子の例もその表に提供する。しかしながら、例示される遺伝子は排他的なものではない。
以下の実施例を、本発明の種々の実施形態を説明する目的のために挙げ、それらは本発明をいかなる様式にも限定することを意味しない。本実施例は、本明細書に記載の方法とともに、目下好ましい実施形態の代表例であり、例示であり、本発明の範囲に対する限定を意図するものではない。特許請求の範囲の範囲により定義される本発明の趣旨に包含されるその変更および他の使用は、当業者が行う。
実施例１：インビボ用途のためのＣａｓ９系の改善
本出願人らは、小分子量を有するＣａｓ９についてメタゲノム検索を実施した。ほとんどのＣａｓ９オルソログはかなり大きい。多くの公知のＣａｓ９オルソログは、巨大であり、１３００を超えるアミノ酸を含有する。例えばＳｐＣａｓ９は約１３６８アミノ酸長であり、これは大き過ぎるため送達用のウイルスベクターへのパッケージングが容易でない。Ｃａｓ９ホモログの長さ分布を表すグラフが図６に示される。グラフは、ＧｅｎＢａｎｋに寄託されている配列から作成される。配列の中には誤って注釈されているものもあり、従って各長さについての正確な度数は必ずしも正しいとは限らない。それでもなお、これによりＣａｓ９タンパク質の分布の概観が得られ、より短いＣａｓ９ホモログの存在が示唆される。
本出願人らは、コンピュータ解析により、細菌株カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）に１０００アミノ酸未満のＣａｓ９タンパク質が２つあることを見出した。カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来の１つのＣａｓ９の配列を以下に提供する。この長さでは、ＣｊＣａｓ９は、初代細胞へのおよび動物モデルにおけるインビボでのロバストな送達のためＡＡＶ、レンチウイルス、アデノウイルス、および他のウイルスベクターに容易にパッケージングすることができる。本発明の好ましい実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質が使用される。
カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）
このＣｊＣａｓ９のための推定ｔｒａｃｒＲＮＡエレメントは、以下である：
ダイレクトリピート配列は、以下である：
ＣｊＣａｓ９のためのキメラガイドＲＮＡの一例は、以下である：
実施例２：Ｃａｓ９多様性およびキメラＲＮＡ
野生型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、細菌および古細菌にわたる多様な種により用いられる侵入外因性ＤＮＡに対する適応免疫機序である。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座中への外来ＤＮＡの「獲得」を担うタンパク質をコードする遺伝子のセット、およびＤＮＡ開裂機序の「実行」をコードする遺伝子のセットからなり；これらは、ＤＮＡヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）、非コードトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、およびダイレクトリピートによりフランキングされている外来ＤＮＡ由来スペーサーのアレイ（ｃｒＲＮＡ）を含む。Ｃａｓ９による成熟時、ｔｒａｃＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ二本鎖は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをスペーサーガイド配列により規定される標的ＤＮＡ配列にガイドし、開裂に要求され、それぞれのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に特異的な標的ＤＮＡ中の短鎖配列モチーフ付近のＤＮＡの二本鎖切断を媒介する。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、細菌界全体にわたり見出されており、Ｃａｓ９タンパク質配列およびサイズ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡダイレクトリピート配列、それらのエレメントのゲノム構成、ならびに標的開裂のためのモチーフ要件は高度に多様である。ある種は、複数の区別されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を有し得る。
本出願人らは、公知のＣａｓ９との配列相同性および公知のサブドメイン、例として、ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインおよびＲｕｖＣエンドヌクレアーゼドメイン［Ｅｕｇｅｎｅ Ｋｏｏｎｉｎ氏およびＫｉｒａ Ｍａｋａｒｏｖａ氏からの情報］とオルソロガスな構造に基づき同定された細菌種から２０７個の推定Ｃａｓ９を評価した。このセットのタンパク質配列保存に基づく系統発生分析により、大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つのファミリーが明らかになった（図４および５Ａ〜Ｆ）。
一部の実施形態において、ｔｒａｃｒメイト配列またはダイレクトリピートは、ＣＲＩＳＰＲデータベースからダウンロードし、または１．ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座をフランキングするゲノム配列の２ｋｂウインドウに見出され、２．２０から５０ｂｐに及び、３．２０から５０ｂｐごとの間隔の反復モチーフを検索することによりインシリコで同定する。一部の実施形態において、これらの基準の２つ、例えば、１および２、２および３、または１および３を使用することができる。一部の実施形態において、３つ全ての基準を使用することができる。一部の実施形態において、続いて、候補ｔｒａｃｒＲＮＡを、１．ダイレクトリピートとの配列相同性（最大１８ｂｐミスマッチでのＧｅｎｅｉｏｕｓにおけるモチーフ検索）、２．転写の方向における予測Ｒｈｏ非依存性転写ターミネーターの存在、および３．ｔｒａｃｒＲＮＡとダイレクトリピートとの間の安定ヘアピン二次構造により予測する。一部の実施形態において、これらの基準の２つ、例えば、１および２、２および３、または１および３を使用することができる。一部の実施形態において、３つ全ての基準を使用することができる。一部の実施形態において、キメラ合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）設計は、ダイレクトリピートとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の少なくとも１２ｂｐの二本鎖構造を取り込む。
図８Ａ〜Ｊに提供されるキメラＲＮＡと対形成するためのヒトコドン最適化Ｃａｓ９オルソログ配列のリストを、図９Ａ〜Ｏに提供する。本出願人らは、Ｃａｓ９オルソログがそれらの標的をインビトロ開裂アッセイにおいて開裂し得ることも示した（図１６）。これらのファミリーの一部におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を図１１に示す。対応するガイドＲＮＡ配列を図１２に示す。本出願人らは、カスタム計算分析コードを使用してＣａｓ９タンパク質の約２ｋｂ内のゲノムＤＮＡ配列を体系的に分析し、２９ｂｐから３５ｂｐに及ぶ介在スペーサーを有する３５ｂｐから５０ｂｐに及ぶダイレクトリピートを同定した。ダイレクトリピート配列に基づき、本出願人らは、以下の基準を有するｔｒａｃｒＲＮＡ候補配列を計算により検索した：ｃｒＲＮＡアレイの外側であるが、ダイレクトリピートとの高程度の相同性を含有し（ダイレクトリピート：ｔｒａｃｒＲＮＡ塩基対形成に要求されるもの；カスタム計算分析）、タンパク質成分のコード領域の外側であり、ダイレクトリピートからの相同性の領域から約６０ｂｐ〜１２０ｂｐ下流のＲｈｏ非依存性転写終結シグナルを含有し、ダイレクトリピートと同時フォールディングして二本鎖を形成し、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の遠位末端における２つ以上のヘアピン構造が続くこと。これらの予測基準に基づき、本出願人らは、１８個のＣａｓ９タンパク質およびそれらのユニークに関連するダイレクトリピートならびに５つ全てのＣａｓ９ファミリーにわたり分布するｔｒａｃｒＲＮＡの初期セットを選択した。本出願人らは、天然ダイレクトリピート：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖の配列および二次構造を保存した一方、人工ループを通して２つのＲＮＡエレメントを塩基対形成および融合する領域を短縮した１８個のキメラＲＮＡ構造のセットをさらに生成した（図８Ａ〜Ｊ）。
実施例３：Ｃａｓ９オルソログ
本出願人らは、真核細胞中の発現を向上させるためのコドン最適化Ｃａｓ９オルソログを生成した。
ヒトコドン最適化配列（すなわち、ヒトにおける発現のために最適化されている）配列：ＳａＣａｓ９の例を以下に提供する。
本出願人らは、Ｃａｓ９オルソログを分析して図１３Ａ〜ＩＩに示されるとおり関連ＰＡＭ配列および対応するキメラガイドＲＮＡを同定した。このＰＡＭの拡大セットは、ゲノムにわたるより広いターゲティングを提供し、ユニーク標的部位の数も顕著に増加させ、ゲノム中の特異性の増加レベルを有する新規Ｃａｓ９を同定する潜在性を提供する。本出願人らは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ Ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９についてのＰＡＭが、ＮＮＧＲＲであることを決定した（図１４）。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ Ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９は、ＳａＣａｓ９としても公知である。図１５ａ〜ｄは、ＳａＣａｓ９の単一または複数のベクター設計を提供する。
図７は、逆相補鎖により示される推定ＰＡＭについての配列ロゴを示す。Ｃａｓ９オルソログおよびそれらのそれぞれのｓｇＲＮＡを使用してランダム化ＰＡＭ（標的配列の３’側に隣接する７ｂｐ配列）を担持する標的のライブラリーを開裂した。開裂産物を単離し、ディープシーケンシングしてそれぞれのＣａｓ９オルソログについての開裂を許容する７ｂｐ候補配列を生じさせた。それぞれのＣａｓ９オルソログについて、全ての７ｂｐ候補配列をアラインすることによりコンセンサスＰＡＭを決定した（図７および２１）。
ｓｇＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の熱力学およびインビボ安定性を試験するさらなる実験は、オフターゲット活性についての追加の予測力を生じさせる可能性が高い一方、ＳｐＣａｓ９突然変異体およびオルソログの開発は、改善された特異性を有する新規バリアントを生じさせ得る。Ｃａｓ９オルソログの特異性は、ガイドＲＮＡとそのＤＮＡ標的との間のミスマッチを許容するそれぞれのＣａｓ９の能力を試験することによりさらに評価することができる。
実施例４：Ｃａｓ９突然変異
本実施例において、本出願人らは、以下の突然変異がＳｐＣａｓ９をニック形成酵素に変換し得ることを示す：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｄ９８６Ａ。
本出願人らは、突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内のどこに局在するかを示す配列を提供する（図１０Ａ〜Ｍ）。本出願人らは、ニッカーゼが相同組換えを依然として媒介し得ることも示す。さらに、これらの突然変異を有するＳｐＣａｓ９が（個々に）二本鎖切断のレベルを低減することを示す。Ｃａｓ９オルソログは全て、３〜４個のＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインの一般的構成を共有する（図１９）。最も５’側のＲｕｖＣドメインが非相補鎖を開裂し、ＨＮＨドメインが相補鎖を開裂する。表記は全てガイド配列を参照する。
５’ＲｕｖＣドメインの触媒残基は、目的のＣａｓ９を他のＣａｓ９オルソログ（化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座１、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座３、およびフランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｉｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来）と相同性比較することによって同定され、保存されたＡｓｐ残基をアラニンに突然変異させることにより、Ｃａｓ９が相補鎖ニッキング酵素に変換される。同様に、ＨＮＨドメインの保存されたＨｉｓおよびＡｓｎ残基をアラニンに突然変異させることにより、Ｃａｓ９が非相補鎖ニッキング酵素に変換される。
実施例５：Ｃａｓ９機能最適化
機能向上または新たな機能の開発のため、本出願人らは、異なるＣａｓ９オルソログからの断片を組み合わせることによりキメラＣａｓ９タンパク質を生成した。
例えば、本出願人らは、Ｓｔ１Ｃａｓ９（このタンパク質からの断片を太字で示す）のＮ末端を、ＳｐＣａｓ９（このタンパク質からの断片を下線で示す）のＣ末端と融合させた。
＞Ｓｔ１（Ｎ）Ｓｐ（Ｃ）Ｃａｓ９
＞Ｓｐ（Ｎ）Ｓｔ１（Ｃ）Ｃａｓ９
本出願人らは、Ｓｐ＿Ｓｔ３キメラタンパク質も生成し、ＳｐＣａｓ９、Ｓｔ３Ｃａｓ９、Ｓｐ＿Ｓｔ３キメラおよびＳｔ３＿Ｓｐキメラによるインビトロ開裂を示した（図１７）。
キメラＣａｓ９を作製する利益としては、以下が挙げられる：
ａ．毒性の低減
ｂ．真核細胞中の発現の改善
ｃ．特異性の向上
ｄ．タンパク質の分子量の低減、異なるＣａｓ９ホモログからの最小ドメインを組み合わせることによるより小さいタンパク質の作製。
ｅ．ＰＡＭ配列要件の変更
実施例６：ＡＡＶ粒子またはベクターを使用するインビボＣａｓ９送達
インビボ送達−ＡＡＶ法
ＡＡＶは、数個の理由について他のウイルスベクターと比べて有利である：
・毒性が低い（これは、免疫応答を活性化し得る細胞粒子の超遠心を要求しない精製法に起因し得る）
・それが宿主ゲノム中にインテグレートしないため、挿入突然変異導入を引き起こす確率が低い。
ある現行のＡＡＶベクターは、上限またはパッケージング限界として最大４３００塩基の挿入ＤＮＡを収容し得る一方、ＡＡＶは、４．５または４．７５ＫＢの挿入ＤＮＡを有し得る。このことは、Ｃａｓ９酵素をコードするＤＮＡならびにプロモーターおよび転写ターミネーターが同一のウイルスベクターに全て適合しなければならないことを意味する。４．５または４．７５ＫＢよりも大きい構築物は、顕著に低減したウイルス産生をもたらす。ＳｐＣａｓ９は、完全に大きく、遺伝子自体が４．１ｋｂを上回り、このことによりＡＡＶ中へのパッキングが困難となる。したがって、本発明の実施形態は、より短いＣａｓ９のオルソログを利用することを含む。例えば：
図３は、本発明の方法および組成物において使用することができるＡＡＶベクターの模式的表示を提供する。パッケージングは上記に考察される。
実施例７：Ｃａｓ９を使用する微細藻類のエンジニアリング
Ｃａｓ９を送達する方法
方法１：本出願人らは、構成的プロモーター、例えば、Ｈｓｐ７０Ａ−Ｒｂｃ Ｓ２またはベータ２−チューブリンの制御下でＣａｓ９を発現するベクターを使用してＣａｓ９およびガイドＲＮＡを送達する。
方法２：本出願人らは、構成的プロモーター、例えば、Ｈｓｐ７０Ａ−Ｒｂｃ Ｓ２またはベータ２−チューブリンの制御下でＣａｓ９およびＴ７ポリメラーゼを発現するベクターを使用してＣａｓ９およびＴ７ポリメラーゼを送達する。ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡをドライブするＴ７プロモーターを含有するベクターを使用して送達する。
方法３：本出願人らは、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびインビトロで転写されたガイドＲＮＡを藻類細胞に送達する。ＲＮＡは、インビトロで転写させることができる。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、Ｃａｓ９についてのコード領域およびＣａｓ９ｍＲＮＡの安定化を確保するためのＣｏｐ１からの３’ＵＴＲからなる。
相同組換えのため、本出願人らは、追加の相同組換え修復テンプレートを提供する。
ベータ−２チューブリンプロモーターの制御下でＣａｓ９の発現をドライブするカセットと、それに続くＣｏｐ１の３’ＵＴＲについての配列。
ベータ−２チューブリンプロモーターの制御下でＴ７ポリメラーゼの発現をドライブするカセットと、それに続くＣｏｐ１の３’ＵＴＲについての配列：
Ｔ７プロモーターによりドライブされるガイドＲＮＡの配列（Ｔ７プロモーター、Ｎは、標的配列を表す）：
遺伝子送達：
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒからのコナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）株ＣＣ−１２４およびＣＣ−１２５を、エレクトロポレーションに使用する。エレクトロポレーションプロトコルは、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇキット（ｔｏｏｌｓ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｇｅｎｅａｒｔ＿ｃｈｌａｍｙ＿ｋｉｔｓ＿ｍａｎ．ｐｄｆにおけるウェブサイト情報）からの標準的な推奨プロトコルに従う。
また、本出願人らは、Ｃａｓ９を構成的に発現するコナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）の系統を生成する。このことは、ｐＣｈｌａｍｙ１（ＰｖｕＩを使用して線形化）を使用し、ハイグロマイシン耐性コロニーを選択することにより行うことができる。Ｃａｓ９を含有するｐＣｈｌａｍｙ１についての配列を以下に示す。遺伝子ノックアウトを達成するためのこの手法において、ガイドＲＮＡのためのＲＮＡを送達することが必要なだけである。相同組換えのため、本出願人らは、ガイドＲＮＡおよび線形化相同組換えテンプレートを送達する。
ｐＣｈｌａｍｙ１−Ｃａｓ９：
全ての改変コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）細胞について、本出願人らは、ＰＣＲ、ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイ、およびＤＮＡシーケンシングを使用して良好な改変を確認した。
実施例８：インビボ用途のためのＳａＣａｓ９およびＰＡＭ認識
哺乳動物細胞中の機能ゲノムエンジニアリングツールとしての化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓｐ）およびストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）（Ｓｔ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の同定後に本出願人らがＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を多様性のさらなる利用を求めるため、このプロジェクトを開始した。
哺乳動物細胞における用途のために新たな機能ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を定義することにより、本出願人らは、以下を潜在的に見出すことができる：
（１）より高い効率および／または特異性を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系
（２）より広い範囲のゲノム遺伝子座のターゲティングを可能とする異なるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系
（３）より小さいサイズを有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（したがって、本出願人らは、それらをインビボで単一ベクター中で、パッケージングサイズ限界（現行のＳｐまたはＳｔ系は、４．７ｋｂのこの限界を超過する）を有する哺乳動物ウイルス送達系、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにより送達することができる）
および他の所望の形質。
インビボ用途のためのＳａ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の同定および設計。本出願人らは、ｄｓＤＮＡ開裂アッセイにおいてインビトロで機能する黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（Ｓａ）において新たなＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を試験し、ＮＮＧＲＲＴの推定ＰＡＭを同定した。この系の成分は、ＳａからのＣａｓ９タンパク質、ＳａからのｔｒａｃｒＲＮＡとの機能ガイドＲＮＡ複合体を形成するＳａからのダイレクトリピート（ＤＲ）を有するガイドＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡである。この３成分系は、全ての他のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と類似する。したがって、本出願人らは、２成分系を設計し、本出願人らは、本出願人らが化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓｐ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系について行ったとおり、短鎖ステム−ループを介してＳａ ｔｒａｃｒＲＮＡをＳａガイドＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡに融合させてキメラガイドＲＮＡを形成した。このキメラガイドＲＮＡは、インビトロでｄｓＤＮＡの開裂を支持し得た。したがって、本出願人らは、完全２成分系：ｃａｓ９およびキメラガイドＲＮＡをＡＡＶベクター中にクローニングして生存生物中のその機能性を試験することを決定した。
本出願人らはＡＡＶ系を選択した。それというのも、これは、インビボ用途に安全であることが示されている血清型に応じて異なる組織／器官における幅広い向性を有し、生存生物中のトランス遺伝子の長期発現も支持する、インテグレートしないｓｓＤＮＡベースの非免疫原性哺乳動物ウイルスであるためである。
初期ＡＡＶベクターの設計は、（１）単一ＮＬＳおよびＨＡエピトープタグを有するＳａＣａｓ９タンパク質をドライブするＣＭＶプロモーター、（２）キメラＲＮＡをドライブするヒトＵ６プロモーターを有する。これらを、ウイルスパッケージングシグナルとして機能する最も十分に研究されたＡＡＶ血清型２からの２つの逆位末端リピート（ＩＴＲ）間に配置する。
内因性哺乳動物ゲノムに対するＰＡＭ配列試験は、以下のとおりである：ＳａＣａｓ９標的スペーサーを複数の遺伝子にわたり選択して異なる潜在的なＰＡＭ配列をカバーした。異なるスペーサーをＵ６−ｓｇＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡ）発現ｄｓＤＮＡカセット中にクローニングし、Ｕ６−ｓｇＲＮＡ発現ｄｓＤＮＡカセットを哺乳動物細胞系（ヒト標的については２９３ＦＴ、マウス標的についてはＮ２ａおよびＨｅｐａ）中に同時形質移入した。形質移入から７２時間後、全てのゲノムＤＮＡを抽出し、ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイに供した。ＴＢＥ Ｐａｇｅゲルに通して流してゲノム開裂を検出する。ゲノムＤＮＡ開裂効率を定量し、プロットする。
全ての試験標的に対するゲノム開裂効率および他の統計値のまとめ
全ての試験標的に対するゲノム開裂効率および他の統計値のまとめ（クリーンアップ版）
ＰＡＭ試験からの結果を図２２〜２７に示す。１００を超える標的の包括試験により、ＳａＣａｓ９についてのＰＡＭは、ＮＮＧＲＲ（上記のＮＮＧＲＲＴでない）と記載することができることが同定された。
ＰＡＭ試験まとめ：（１）新たな標的の設計に有用な一般的なＳａＣａｓ９ＰＡＭについてのＮＮＧＲＲ、（２）新たな標的を用いる二重ニッカーゼの試験、（３）ＮＮＧＲＧは、より強力なＰＡＭであり得る。
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１４．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａ ＴＡＬＥ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９，１４３−１４８（２０１１）．
１５．Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ，Ｃ． ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ＴＡＬＥ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｅｎａｂｌｅｓ ｈｉｇｈ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３９，９２８３−９２９３（２０１１）．
１６．Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．＆Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ｎｅｕｒａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ＡＣＳ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ３，６０３−６１０（２０１２）．
１７．Ｓａｎｊａｎａ，Ｎ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｔｏｏｌｂｏｘ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７，１７１−１９２（２０１２）．
１８．Ｐｏｒｔｅｕｓ，Ｍ．Ｈ．＆Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｄ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３００，７６３（２００３）．
１９．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５，７７８−７８５（２００７）．
２０．Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ−ｎｕｃｌｅａｓｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｃｏｎｔｅｘｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＣｏＤＡ）．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８，６７−６９（２０１１）．
２１．Ｗｏｏｄ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｃｒｏｓｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ＺＦＮｓ ａｎｄ ＴＡＬＥＮｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３，３０７（２０１１）．
２２．Ｂｏｂｉｓ−Ｗｏｚｏｗｉｃｚ，Ｓ．，Ｏｓｉａｋ，Ａ．，Ｒａｈｍａｎ，Ｓ．Ｈ．＆Ｃａｔｈｏｍｅｎ，Ｔ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ５３，３３９−３４６（２０１１）．
２３．Ｊｉａｎｇ，Ｗ．，Ｂｉｋａｒｄ，Ｄ．，Ｃｏｘ，Ｄ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．＆Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，２３３−２３９（２０１３）．
２４．Ｑｉ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ａｓ ａｎ ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ １５２，１１７３−１１８３（２０１３）．
２５．Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ，Ｌ．Ｍ．，Ｍａｕｄ“Ｄｉｅ ｋｉｎｅｔｉｋ ｄｅｒ ｉｎｖｅｒｔｉｎｗｉｒｋｕｎｇ．”．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｚ（１９１３）．
２６．Ｍａｈｆｏｕｚ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅ ｎｏｖｏ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ （ＴＡＬＥ）ｈｙｂｒｉｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｗｉｔｈ ｎｏｖｅｌ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｃｒｅａｔｅｓ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８，２６２３−２６２８（２０１１）．
２７．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｂ．Ｐｒｏｂａｂｌｅ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ，ｔｈｅ ｌａｗ ｏｆ ｓｕｃｃｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ．Ｊ Ａｍ Ｓｔａｔ Ａｓｓｏｃ ２２， ２０９−２１２（１９２７）．
２８．Ｄｉｎｇ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．Ａ ＴＡＬＥＮ ｇｅｎｏｍｅ−ｅｄｉｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｄｅｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １２，２３８−２５１（２０１３）．
２９．Ｓｏｌｄｎｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｇｅｎｉｃ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ ａｔ ｔｗｏ ｅａｒｌｙ ｏｎｓｅｔ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｃｅｌｌ １４６，３１８−３３１（２０１１）．
３０．Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＴＡＬＥＮ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｉｎ ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０９，１７３８２−１７３８７（２０１２）．
３１．Ｇｅｕｒｔｓ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｒａｔｓ ｖｉａ Ｅｍｂｒｙｏ Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｚｉｎｃ−Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２５，４３３−４３３（２００９）．
３２．Ｔａｋａｓｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉｌｋｗｏｒｍ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｕｓｉｎｇ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｍＲＮＡ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌｅｃ ４０，７５９−７６５（２０１０）．
３３．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｈｅｍｉｍｅｔａｂｏｌｏｕｓ ｉｎｓｅｃｔ ｕｓｉｎｇ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ａｎｄ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ３（２０１２）．
３４．Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＦＬＡＳＨ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＴＡＬＥＮｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３０，４６０−４６５（２０１２）．
３５．Ｂｏｃｈ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｂｒｅａｋｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｄｅ ｏｆ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＴＡＬ−ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６，１５０９−１５１２（２００９）．
３６．Ｍｏｓｃｏｕ，Ｍ．Ｊ．＆Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，Ａ．Ｊ．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｃｉｐｈｅｒ ｇｏｖｅｒｎｓ ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６，１５０１（２００９）．
３７．Ｄｅｖｅａｕ，Ｈ．，Ｇａｒｎｅａｕ，Ｊ．Ｅ．＆Ｍｏｉｎｅａｕ，Ｓ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐｈａｇｅ−ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６４，４７５−４９３（２０１０）．
３８．Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｐ．＆Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｒ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ，ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７，１６７−１７０ （２０１０）．
３９．Ｍａｋａｒｏｖａ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ９，４６７−４７７（２０１１）．
４０．Ｂｈａｙａ，Ｄ．，Ｄａｖｉｓｏｎ，Ｍ．＆Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｒ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａ：ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓ ｆｏｒ ａｄａｐｔｉｖｅ ｄｅｆｅｎｓｅ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ４５，２７３−２９７（２０１１）．
４１．Ｇａｒｎｅａｕ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｃｌｅａｖｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ ４６８，６７−７１（２０１０）．
４２．Ｇａｓｉｕｎａｓ，Ｇ．，Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｒ．，Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｐ．＆Ｓｉｋｓｎｙｓ，Ｖ．Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ ｆｏｒ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０９，Ｅ２５７９−２５８６ （２０１２）．
４３．Ｕｒｎｏｖ，Ｆ．Ｄ．，Ｒｅｂａｒ，Ｅ．Ｊ．，Ｈｏｌｍｅｓ，Ｍ．Ｃ．， Ｚｈａｎｇ， Ｈ．Ｓ．＆Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｐ．Ｄ．Ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １１，６３６−６４６（２０１０）．
４４．Ｐｅｒｅｚ，Ｅ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ＨＩＶ−１ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ＣＤ４（＋）Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６，８０８−８１６（２００８）．
４５．Ｃｈｅｎ，Ｆ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｓｓＤＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８，７５３−Ｕ７９６（２０１１）．
４６．Ｂｅｄｅｌｌ，Ｖ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ａ ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＴＡＬＥＮ ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ ４９１，１１４−Ｕ１３３（２０１２）．
４７．Ｓａｌｅｈ−Ｇｏｈａｒｉ，Ｎ．＆Ｈｅｌｌｅｄａｙ，Ｔ．Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｐａｉｒｓ ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓ ｐｈａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３２，３６８３−３６８８（２００４）．
４８．Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３９，９２７５−９２８２ （２０１１）．
４９．Ｓｈｅｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｉｃｅ ｖｉａ Ｃａｓ９／ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２３， ７２０−７２３ （２０１３）．
５０．Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０，４４６−４４８（２００２）．
５１．Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，Ｏ．，Ｇｒｅｇｇ，Ｒ．Ｇ．，Ｂｏｇｇｓ，Ｓ．Ｓ．，Ｋｏｒａｌｅｗｓｋｉ，Ｍ．Ａ．＆Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，Ｒ．Ｓ．Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ ｌｏｃｕｓ ｂｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ３１７，２３０−２３４（１９８５）．
５２．Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．，Ｆｏｌｇｅｒ，Ｋ．Ｒ．＆Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｍ．Ｒ． Ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｏｍｅ．Ｃｅｌｌ ４４，４１９−４２８（１９８６）．
５３．Ｈａｓｔｙ，Ｐ．，Ｒｉｖｅｒａ−Ｐｅｒｅｚ，Ｊ．＆Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．Ｔｈｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１，５５８６−５５９１（１９９１）．
５４．Ｗｕ，Ｓ．，Ｙｉｎｇ，Ｇ．Ｘ．，Ｗｕ，Ｑ．＆Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．Ａ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ ｆａｍｉｌｙ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ３，１０５６−１０７６（２００８）．
５５．Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｔ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｃａｐｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ： ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３７５，１７６−１８１ （２０１２）．
５６．Ｔｒｅｍｂｌａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｉｎｄｕｃｅ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｒａｔａｘｉｎ Ｇｅｎｅ；Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｕｇｕｓｔ ２０１２，２３（８）：８８３−８９０．
５７．Ｓｈａｌｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｗｉｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｅｎａｂｌｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１２，Ｄｅｃ １２；１２（１２）：６４９８−５０４．
５８．Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｏｊａｎ ｈｏｒｓｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（ＴＨＬｓ）ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ；２０１０；Ａｐｒ；２０１０（４）
５９．Ｐｌｏｓｋｅｒ ＧＬ ｅｔ ａｌ．Ｆｌｕｖａｓｔａｔｉｎ：ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｉｔｓ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌａｅｍｉａ；Ｄｒｕｇｓ １９９６，５１（３）：４３３−４５９）．
６０．Ｔｒａｐａｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｎｏｎｓｔａｔｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｌｏｗｅｒｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ；ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ，Ｖｏｌｕｍｅ ６３，Ｉｓｓｕｅ １１，ｐａｇｅｓ ９６４−９７１，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１１
６１．Ｂｉｒｃｈ ＡＭ ｅｔ ａｌ．ＤＧＡＴ１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｓ ａｎｔｉ−ｏｂｅｓｉｔｙ ａｎｄ ａｎｔｉ−ｄｉａｂｅｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１０，１３（４）：４８９−４９６
６２．Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．Ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａ ＢＣＲ／ＡＢＬ ｆｕｓｉｏｎ ｇｅｎｅ ｂｙ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００２，２１（３７）：５７１６−５７２４．
６３． ＭｃＭａｎａｍａｎ ＪＬ ｅｔ ａｌ． Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ−２ Ｎｕｌｌ Ｍｉｃｅ ａｒｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｉｅｔ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｏｂｅｓｉｔｙ，Ａｄｉｐｏｓｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆａｔｔｙ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｊｌｒ．Ｍ０３５０６３．Ｆｉｒｓｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １２，２０１３．
６４．Ｔａｎｇ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＳＲＥＢＰ ｂｙ ａ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｂｅｔｕｌｉｎ，Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ ａｎｄ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ Ｒｅｄｕｃｅｓ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ Ｐｌａｑｕｅｓ；Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｖｏｌｕｍｅ １３，Ｉｓｓｕｅ １，４４−５６，５ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１１．
６５．Ｄｕｍｉｔｒａｃｈｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｘ２ ｅｎａｂｌｅｓ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｓｉｓｔｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｉｄ ｅｘｃｈａｎｇｅｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｒｅｐａｉｒ；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１１ Ａｕｇｕｓｔ；１８８（４）：７８７−７９７
本発明の好ましい実施形態を本明細書において示し、記載したが、そのような実施形態が例として提供されるにすぎないことは当業者に明らかである。当業者は目下、多数のバリエーション、変更、および置換を本発明から逸脱せずに行う。本明細書に記載の本発明の実施形態の種々の代替例を本発明の実施において用いることができることを理解されるべきである。

Claims (69)

  1. 天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物であって、
    （Ａ）Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列に作動可能に結合している第１の調節エレメントであって、前記ポリヌクレオチド配列は、
    （ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、
    （ｂ）ｔｒａｃｒメイト配列、および
    （ｃ）ｔｒａｃｒ配列
    を含む第１の調節エレメント、および
    ＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメント
    を含み、
    （ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、５’から３’配向で配置されており、
    成分ＩおよびＩＩは、系の同一または異なるベクター上にあり、
    転写されると前記ｔｒａｃｒメイト配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列が前記標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的配列にハイブリダイズされる前記ガイド配列、および（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされる前記ｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成している前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物
    または
    （Ｂ）Ｉ．第１の調節エレメントであって、
    （ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、および
    （ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒメイト配列
    に作動可能に結合している第１の調節エレメント、
    ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメント、および
    ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列に作動可能に結合している第３の調節エレメント
    を含み、
    成分Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩは、系の同一または異なるベクター上にあり、
    転写されると前記ｔｒａｃｒメイト配列は前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列が前記標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的配列にハイブリダイズされる前記ガイド配列、および（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされる前記ｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成している前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、
    （Ａ）または（Ｂ）において、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群に属する属のＣａｓ９オルソログである１つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物。
  2. 改変ＣＲＩＳＰＲ酵素であって、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群に属する属のＣａｓ９オルソログであり、対応する野生型ＣＲＩＳＰＲ酵素との差異は、以下：
    前記改変ＣＲＩＳＰＲ酵素は、野生型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較してトランケートされており、または
    前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、少なくとも５００アミノ酸、少なくとも８００〜８９９アミノ酸、少なくとも９００〜９９９アミノ酸、少なくとも１０００〜１０９９アミノ酸、少なくとも１１００〜１１９９アミノ酸、少なくとも１２００〜１２９９アミノ酸、少なくとも１３００〜１３９９アミノ酸、少なくとも１４００〜１４９９アミノ酸、少なくとも１５００〜１５９９アミノ酸、少なくとも１６００〜１６９９アミノ酸または少なくとも２０００アミノ酸の長さを有し、および／または
    前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、前記標的配列の局在における両方の鎖の開裂を指向するヌクレアーゼであり、または前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、前記標的配列の局在における一方の鎖の開裂を指向するニッカーゼであり、および／または
    前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、コドン最適化されているか、または真核細胞中の発現のためにコドン最適化されており、および／または
    前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の突然変異を含み、および／または
    前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、キメラＣＲＩＳＰＲ酵素を含む、
    を含む、改変ＣＲＩＳＰＲ酵素。
  3. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、前記酵素の任意のドメイン中の１つ以上の突然変異を有する、請求項１に記載の組成物、または請求項２に記載の酵素。
  4. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、触媒ドメイン中の１つ以上の突然変異を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物または酵素。
  5. 前記１つ以上の突然変異が、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、ＲｕｖＣＩＩＩまたはＨＮＨドメイン中に存在する、請求項３または４に記載の組成物または酵素。
  6. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、位置Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３ＡまたはＤ９８６ＡにおけるＳｐＣａｓ９の位置ナンバリングに対応する１つ以上の突然変異を含む、請求項４または５に記載の組成物または酵素。
  7. 前記酵素が、機能ドメインをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物または酵素。
  8. 前記機能ドメインが、転写アクチベータードメインである、請求項７に記載の組成物または酵素。
  9. 前記転写アクチベータードメインが、ＶＰ６４である、請求項８に記載の組成物または酵素。
  10. 前記機能ドメインが、転写リプレッサードメインである、請求項７〜９のいずれか一項に記載の組成物または酵素。
  11. 前記転写リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ、ＳＩＤまたはＳＩＤ４Ｘである、請求項１０に記載の組成物または酵素。
  12. 目的ゲノム遺伝子座中の標的配列の操作により生物または非ヒト生物を改変する方法であって、
    請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物をその発現のために作動可能にコードするベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を送達すること
    を含む方法。
  13. 送達が、１つ以上のウイルスベクターを介する、請求項１２に記載の方法。
  14. Ｉ．第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列に作動可能に結合している第１の調節エレメントであって、前記第１のポリヌクレオチド配列は、
    （ｉ）生物の細胞中の第１のゲノム遺伝子座における第１の標的配列にハイブリダイズし得る第１のガイド配列
    （ｉｉ）第１のｔｒａｃｒメイト配列、および
    （ｉｉｉ）第１のｔｒａｃｒ配列
    を含む第１の調節エレメント、および
    ＩＩ．第２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列に作動可能に結合している第２の調節エレメントであって、前記第２のポリヌクレオチド配列は、
    （ｉ）前記生物の前記細胞中の第２のゲノム遺伝子座における第２の標的配列にハイブリダイズし得る第２のガイド配列、
    （ｉｉ）第２のｔｒａｃｒメイト配列、および
    （ｉｉｉ）第２のｔｒａｃｒ配列
    を含む第２の調節エレメント、および
    ＩＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み、第１の機能ドメインに作動可能に結合している第１のＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第３の調節エレメント、
    ＩＶ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み、第２の機能ドメインに作動可能に結合している第２のＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第４の調節エレメント
    を含み、
    ＩおよびＩＩの（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、５’から３’配向で配置されており、
    成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶは、系の同一または異なるベクター上にあり、
    転写されるとそれぞれのｔｒａｃｒメイト配列がその対応するｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記第１および第２のガイド配列が前記第１および第２の標的配列への前記第１および第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的配列にハイブリダイズされる前記ガイド配列、および（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされる前記ｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成している前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の発現は、前記標的配列の操作を提供し、
    前記第１および第２のＣＲＩＳＰＲ酵素は、２つ以上の突然変異をそれぞれ含み、
    前記第１および第２のＣＲＩＳＰＲ酵素は、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群に属する属のＣａｓ９オルソログである１つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物。
  15. 生物中の２つ以上の目的ゲノム遺伝子座の発現をモジュレートする方法であって、
    Ｉ．第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列に作動可能に結合している第１の調節エレメントであって、前記第１のポリヌクレオチド配列は、
    （ｉ）生物の細胞中の第１のゲノム遺伝子座における第１の標的配列にハイブリダイズし得る第１のガイド配列
    （ｉｉ）第１のｔｒａｃｒメイト配列、および
    （ｉｉｉ）第１のｔｒａｃｒ配列
    を含む第１の調節エレメント、および
    ＩＩ．第２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列に作動可能に結合している第２の調節エレメントであって、前記第２のポリヌクレオチド配列は、
    （ｉ）前記生物の前記細胞中の第２のゲノム遺伝子座における第２の標的配列にハイブリダイズし得る第２のガイド配列、
    （ｉｉ）第２のｔｒａｃｒメイト配列、および
    （ｉｉｉ）第２のｔｒａｃｒ配列
    を含む第２の調節エレメント、および
    ＩＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み、第１の機能ドメインに作動可能に結合している第１のＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第３の調節エレメント、
    ＩＶ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み、第２の機能ドメインに作動可能に結合している第２のＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第４の調節エレメント
    を含み、
    ＩおよびＩＩの（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、５’から３’配向で配置されており、
    成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶは、系の同一または異なるベクター上にあり、
    転写されるとそれぞれのｔｒａｃｒメイト配列はがその対応するｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記第１および第２のガイド配列が前記第１および第２の標的配列への前記第１および第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的配列にハイブリダイズされる前記ガイド配列、および（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされる前記ｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成している前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の発現は、前記標的配列の操作を提供し、
    前記第１および第２のＣＲＩＳＰＲ酵素は、２つ以上の突然変異をそれぞれ含み、
    前記第１および第２のＣＲＩＳＰＲ酵素は、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群に属する属のＣａｓ９オルソログである１つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を送達することを含み、
    前記第１のゲノム遺伝子座を、前記第１の機能ドメインの活性によりモジュレートし、前記第２のゲノム遺伝子座を、前記第２の機能ドメインの活性によりモジュレートする方法。
  16. 前記第１の機能ドメインが、転写アクチベーター、転写リプレッサー、リコンビナーゼ、トランスポーゼース、ヒストンリモデラー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、クリプトクロムおよび光誘導性／制御性ドメインまたは化学誘導性／制御性ドメインからなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物、または請求項１５に記載の方法。
  17. 前記第２の機能ドメインが、転写アクチベーター、転写リプレッサー、リコンビナーゼ、トランスポーゼース、ヒストンリモデラー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、クリプトクロムおよび光誘導性／制御性ドメインまたは化学誘導性／制御性ドメインからなる群から選択される、請求項１４もしくは１６に記載の組成物、または請求項１５もしくは１６に記載の方法。
  18. 前記第１または第２の機能ドメインが、転写アクチベータードメインである、請求項１６または１７に記載の組成物または方法。
  19. 前記転写アクチベータードメインが、ＶＰ６４である、請求項４７に記載の組成物または方法。
  20. 前記第１または第２の機能ドメインが、転写リプレッサードメインである、請求項１６または１７に記載の組成物または方法。
  21. 前記転写リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ、ＳＩＤまたはＳＩＤ４Ｘである、請求項２０に記載の組成物または方法。
  22. 前記第１または第２のＣＲＩＳＰＲ酵素が、ステレラ・ウォズワーセンシス（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）Ｃａｓ９である、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の組成物または方法。
  23. 前記第１または第２のＣＲＩＳＰＲ酵素が、フィリファクター・アロシス（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ）Ｃａｓ９である、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の組成物または方法。
  24. 前記第１または第２のＣＲＩＳＰＲ酵素が、ラクトバシラス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）Ｃａｓ９である、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の組成物または方法。
  25. 前記第１または第２のＣＲＩＳＰＲ酵素が、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）Ｃａｓ９である、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の組成物または方法。
  26. 前記第１または第２のＣＲＩＳＰＲ酵素が、コリネバクター・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）Ｃａｓ９である、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の組成物または方法。
  27. 前記第１または第２のＣＲＩＳＰＲ酵素が、パービバキュタム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）Ｃａｓ９である、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の組成物または方法。
  28. 前記第１または第２のＣＲＩＳＰＲ酵素が、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）Ｃａｓ９である、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の組成物または方法。
  29. 前記第１または第２のＣＲＩＳＰＲ酵素が、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ Ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９である、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の組成物または方法。
  30. 前記第１または第２のＣＲＩＳＰＲ酵素が、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）Ｐａｒｉｓ Ｃａｓ９である、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の組成物または方法。
  31. 前記第１または第２のＣＲＩＳＰＲ酵素が、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）Ｃａｓ９である、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の組成物または方法。
  32. 前記第１または第２のＣＲＩＳＰＲ酵素が、スタフィロコッカス・シュードインターメディアス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）Ｃａｓ９である、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の組成物または方法。
  33. 前記第１または第２のＣＲＩＳＰＲ酵素が、ネイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）Ｃａｓ９である、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の組成物または方法。
  34. 目的のゲノム遺伝子座中の標的配列の異常により引き起こされる病態の治療または阻害が必要とされる対象または非ヒト対象における目的のゲノム遺伝子座中の標的配列の異常により引き起こされる病態を治療または阻害する方法であって、前記標的配列の操作により前記対象または非ヒト対象を改変することを含み、前記病態は、
    請求項１または３〜１１のいずれか一項に記載の組成物をその発現のために作動可能にコードする１つ以上のＡＡＶベクターを含むＡＡＶベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を送達すること
    を含む治療を提供することを含む標的配列の操作による治療または阻害に感受性であり、前記組成物を発現させた場合に前記組成物により前記標的配列を操作する方法。
  35. 発現を誘導することを含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記生物または対象が、真核生物または非ヒト真核生物である、請求項３４または３５に記載の方法。
  37. 前記生物または対象が、植物である、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記生物または対象が、哺乳動物または非ヒト哺乳動物である、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記生物または対象が、藻類である、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記ウイルスベクターが、ＡＡＶである、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 医療において使用され、または治療において使用される、請求項１〜１１、１４、または１６〜３３のいずれか一項に記載の組成物または酵素。
  42. 請求項１２、１３、または１５〜４０のいずれか一項に記載の方法において使用される、請求項１〜１１、１４、または１６〜３３のいずれか一項に記載の組成物または酵素。
  43. エクスビボ遺伝子またはゲノム編集における、請求項１〜１１、１４、または１６〜３３のいずれか一項に記載の組成物または酵素の使用。
  44. エクスビボ遺伝子もしくはゲノム編集のための、または請求項１２、１３、もしくは１５〜４０のいずれか一項に記載の方法において使用される医薬品の製造における、請求項１〜１１、１４、または１６〜３３のいずれか一項に記載の組成物または酵素の使用。
  45. 特に前記Ｃａｓ９が化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９である（またはそれに由来する）場合、前記標的配列が、その３’末端において５’−ＮＲＧ（Ｎは、任意のヌクレオチドである）によりフランキングされている、請求項１〜１１、１４、または１６〜３３のいずれか一項に記載の組成物または酵素。
  46. 請求項１〜１１、１４、または１６〜３３のいずれか一項に記載の組成物または酵素を送達のためのＡＡＶを調製する方法であって、ＡＡＶをコードする核酸分子を含有し、または本質的にそれからなるプラスミドをＡＡＶ感染細胞中に形質移入すること、ならびに前記ＡＡＶの複製およびパッケージングに必須のＡＡＶｒｅｐおよび／またはｃａｐを供給することを含む方法。
  47. 前記細胞をヘルパープラスミドまたはヘルパーウイルスにより形質移入することにより、前記ＡＡＶの複製およびパッケージングに必須の前記ＡＡＶｒｅｐおよび／またはｃａｐを供給する、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記ヘルパーウイルスは、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記ポックスウイルスが、牛痘ウイルスである、請求項４８に記載の方法。
  50. − 前記細胞が、哺乳動物細胞であり；または
    − 前記細胞が、昆虫細胞であり、前記ヘルパーウイルスが、バキュロウイルスである、
    請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 請求項２〜１１のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ酵素を送達する方法であって、細胞に前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡを送達することを含む方法。
  52. 第１のＣａｓオルソログからの１つ以上の断片および第２のＣａｓオルソログからの１つ以上の断片を含むキメラＣａｓ酵素。
  53. 前記第１または第２のＣａｓオルソログの前記１つ以上の断片が、前記第１または第２のＣａｓオルソログのＣまたはＮ末端からのものである、請求項５２に記載の酵素。
  54. 前記第１または第２のＣａｓオルソログが、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群に属する属から選択される、請求項５２または５３に記載の酵素。
  55. 標的配列の改変のための医薬品の調製における、請求項１〜１１、１４、１６〜３３、または５２〜５４のいずれか一項に記載の組成物または酵素の使用。
  56. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、野生型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較してトランケートされており、または前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、５００〜２０００アミノ酸を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
  57. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、前記標的配列の局在における両方の鎖の開裂を指向するヌクレアーゼであり、または前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、前記標的配列の局在における一方の鎖の開裂を指向するニッカーゼである、請求項１〜１１または５６のいずれか一項に記載の組成物。
  58. 前記ガイド配列が、少なくとも１５ヌクレオチドを含む、請求項１〜１１または５６〜５７のいずれか一項に記載の組成物。
  59. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、コドン最適化されており、または真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている、請求項１〜１１または５６〜５８のいずれか一項に記載の組成物。
  60. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、１つ以上の突然変異を含む、請求項１〜１１または５６〜５９のいずれか一項に記載の組成物。
  61. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、キメラＣＲＩＳＰＲ酵素を含む、請求項１〜１１または５６〜６０のいずれか一項に記載の組成物。
  62. 天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物であって、
    Ａ）−Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列であって、
    （ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列
    （ｂ）ｔｒａｃｒメイト配列、および
    （ｃ）ｔｒａｃｒ配列
    を含むポリヌクレオチド配列、および
    ＩＩ．少なくとも１つの核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列
    を含み、
    （ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、５’から３’配向で配置されており、
    転写されると前記ｔｒａｃｒメイト配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列が前記標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的配列にハイブリダイズされる前記ガイド配列、および（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされる前記ｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成している前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする前記ポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡである
    天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物
    または
    （Ｂ）Ｉ．ポリヌクレオチドであって、
    （ａ）原核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、および
    （ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒメイト配列
    を含むポリヌクレオチド、
    ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、および
    ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列を含むポリヌクレオチド配列
    を含み、
    転写されると前記ｔｒａｃｒメイト配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列が前記標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異標的結合を指向し、
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的配列にハイブリダイズされる前記ガイド配列、および（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされる前記ｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成している前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする前記ポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、
    前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群に属する属のＣａｓ９オルソログである
    天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物。
  63. 目的ゲノム遺伝子座中の標的配列の操作により生物または非ヒト生物を改変する方法であって、
    Ａ）−Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列であって、
    （ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列
    （ｂ）ｔｒａｃｒメイト配列、および
    （ｃ）ｔｒａｃｒ配列
    を含むポリヌクレオチド配列、および
    ＩＩ．少なくとも１つの核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列
    を含み、
    （ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、５’から３’配向で配置されており、
    転写されると前記ｔｒａｃｒメイト配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列が前記標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的配列にハイブリダイズされる前記ガイド配列、および（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされる前記ｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成している前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする前記ポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡである
    天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物
    または
    （Ｂ）Ｉ．ポリヌクレオチドであって、
    （ａ）原核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、および
    （ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒメイト配列
    を含むポリヌクレオチド、
    ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、および
    ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列を含むポリヌクレオチド配列
    を含み、
    転写されると前記ｔｒａｃｒメイト配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列が前記標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異標的結合を指向し、
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的配列にハイブリダイズされる前記ガイド配列、および（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされる前記ｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成している前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする前記ポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、
    前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群に属する属のＣａｓ９オルソログである
    天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を送達することを含む方法。
  64. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、野生型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較してトランケートされており、または前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、５００〜２０００アミノ酸を含む、請求項６２に記載の組成物、または請求項６３に記載の方法。
  65. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、前記標的配列の局在における両方の鎖の開裂を指向するヌクレアーゼであり、または前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、前記標的配列の局在における一方の鎖の開裂を指向するニッカーゼである、請求項６２〜６４のいずれか一項に記載の組成物または方法。
  66. 前記ガイド配列が、少なくとも１５ヌクレオチドを含む、請求項６２〜６５のいずれか一項に記載の組成物または方法。
  67. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、コドン最適化されており、または真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている、請求項６２〜６６のいずれか一項に記載の組成物または方法。
  68. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、１つ以上の突然変異を含む、請求項６２〜６７のいずれか一項に記載の組成物または方法。
  69. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、キメラＣＲＩＳＰＲ酵素を含む、請求項６２〜６８のいずれか一項に記載の組成物または方法。
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