JP2024517607A - Ｒｕｖｃドメインを有する酵素 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本開示は、際立ったドメイン特性を有するエンドヌクレアーゼ酵素、ならびにかかる酵素またはそのバリアントを使用する方法を提供する。【選択図】図４
Description
相互参照
本出願は、２０２１年４月３０日に出願された「ＥＮＺＹＭＥＳ ＷＩＴＨ ＲＵＶＣ ＤＯＭＡＩＮＳ」と題される米国仮特許出願第６３／１８２，４３８号の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年４月３０日に出願された「ＥＮＺＹＭＥＳ ＷＩＴＨ ＲＵＶＣ ＤＯＭＡＩＮＳ」と題される米国仮特許出願第６３／１８２，４３８号の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ｃａｓ酵素は、それらの関連するクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ガイドリボ核酸（ＲＮＡ）と共に、原核生物の免疫システムの広範（細菌の約４５％、古細菌の約８４％）な成分であるようであり、ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡガイド核酸切断による感染性ウイルスおよびプラスミドなどの非自己核酸からこうした微生物を保護するのに役立つ。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡエレメントをコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エレメントは、構造及び長さが比較的保存され得るが、それらのＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質は、高度に多様であり、非常に様々な核酸相互作用ドメインを含有する。ＣＲＩＳＰＲ ＤＮＡエレメントは、早くも１９８７年に観察されているが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体のプログラム可能なエンドヌクレアーゼ切断能力は、比較的最近でしか認識されておらず、多様なＤＮＡ操作および遺伝子編集用途における組換えＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用につながっている。
一部の態様では、本開示は、（ａ）配列番号５５０～５６７を含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するよう構成されたエンドヌクレアーゼ、当該エンドヌクレアーゼは、クラス２タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼである；および（ｂ）（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするよう構成されたガイドリボ核酸配列；および（ｉｉ）当該エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む当該エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成された操作されたガイドリボ核酸構造を含む、操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。一部の実施形態では、当該エンドヌクレアーゼは、培養されていない微生物に由来する。一部の実施形態では、当該エンドヌクレアーゼは、異なるＰＡＭ配列に結合するよう操作されていない。一部の実施形態では、当該エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｄエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｃエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓ１３ｄエンドヌクレアーゼではない。一部の実施形態では、当該エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと８０％未満の同一性を有する。一部の実施形態では、当該エンドヌクレアーゼは、ＨＮＨドメインをさらに含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドリボ核酸構造は、少なくとも二つのリボ核酸ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、当該操作されたガイドリボ核酸構造は、当該ガイドリボ核酸配列および当該ｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む一つのリボ核酸ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、当該ガイドリボ核酸配列は、原核生物、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳類、またはヒトゲノム配列に相補的である。一部の実施形態では、当該ガイドリボ核酸配列は、１５～２４ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、当該エンドヌクレアーゼは、当該エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端の近位に一つまたは複数の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。一部の実施形態では、当該ＮＬＳは、配列番号５８６～６０１から選択される配列を含む。一部の実施形態では、操作されたヌクレアーゼシステムは、５’から３’の方向に、当該標的デオキシリボ核酸配列に対して５’の、少なくとも２０個のヌクレオチドの配列を含む第一の相同アーム、少なくとも１０個のヌクレオチドの合成ＤＮＡ配列、および当該標的配列に対して３’の、少なくとも２０個のヌクレオチドの配列を含む第二の相同アームを含む一本鎖または二本鎖のＤＮＡ修復鋳型をさらに含む。一部の実施形態では、当該第一または第二の相同アームは、少なくとも４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１，０００ヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、当該システムは、Ｍｇ２＋の供給源をさらに含む。一部の実施形態では、当該エンドヌクレアーゼおよび当該ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、同じ門内の別個の細菌種に由来する。一部の実施形態では、当該エンドヌクレアーゼは、配列番号１～５４９もしくは６０２～１２７６、またはそれと少なくとも５５％の同一性を有するそのバリアントを含む。
一態様では、本開示は、（ａ）配列番号５５０～５６７のいずれか一つを含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列についての選択性を有するよう構成されたエンドヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼシステムを提供し、エンドヌクレアーゼは、クラス２タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、システムは、（ｂ）（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするよう構成された標的化核酸配列；および（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む、エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成された操作されたガイド核酸構造をさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、培養されていない微生物に由来する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼの天然のＰＡＭ配列とは異なるＰＡＭ配列に結合するよう操作されていない。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｄエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｃエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓ１３ｄエンドヌクレアーゼではない。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと８０％未満の同一性を有する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１２７７～１６４１もしくは１６８３のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１～５４９または６０２～１２７６のいずれか一つのＰＩドメインと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＲｕｖＣドメインは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つのＲｕｖＣドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＲｕｖＣドメインは、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つのＲｕｖＣドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＨＮＨドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＨＮＨドメインは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つのＨＮＨドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＨＮＨドメインは、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つのＨＮＨドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号５５３、５５５、もしくは５６６のいずれか一つを含むＰＡＭ配列、またはそのバリアントについての選択性を有するよう構成されている。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、少なくとも二つのリボ核酸ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、ガイドリボ核酸配列およびｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む一つのリボ核酸ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６４５～１６６２のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または操作されたガイド核酸構造は、配列番号５６８～５８５もしくは１６４３～１６４４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６４８、１６５０、もしくは１６６１のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または操作されたガイド核酸構造は、配列番号５７１、５７３、もしくは５８４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、標的化核酸配列は、原核生物、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳類、またはヒトゲノム配列と相補的である。一部の実施形態では、標的化核酸配列は、１５～２４ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端の近位に一つまたは複数の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。ＮＬＳは、配列番号５８６～６０１のいずれか一つ、またはそのバリアントを含む配列を含む。一部の実施形態では、システムは、５’から３’の方向に、標的デオキシリボ核酸配列に対して５’の、少なくとも２０個のヌクレオチドの配列を含む第一の相同アーム、少なくとも１０個のヌクレオチドの合成ＤＮＡ配列、および標的配列に対して３’の、少なくとも２０個のヌクレオチドの配列を含む第二の相同アームを含む一本鎖または二本鎖のＤＮＡ修復鋳型をさらに含む。一部の実施形態では、第一または第二の相同アームは、少なくとも４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１，０００ヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、システムは、Ｍｇ２＋の供給源をさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼおよびｔｒａｃｒリボ核酸配列は、同じ門内の別個の細菌種に由来する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つ、またはそれと少なくとも５５％の同一性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴアルゴリズム、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムパラメーターを用いたＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズムによって決定される。一部の実施形態では、配列同一性は、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）のパラメーター、および１１の存在、１の延長でギャップコストを設定しているＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用し、条件付き組成スコアマトリックス調整を使用した、ＢＬＡＳＴＰ相同性検索アルゴリズムによって決定される。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、標的デオキシリボ核酸配列の３’にある。
一部の態様では、本開示は、生物における発現のため最適化された操作された核酸配列を含む核酸を提供し、核酸は、配列番号５５０～５６７のいずれか一つを含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）について選択的であるよう構成されたクラス２タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１２７７～１６４１もしくは１６８３のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含むか、あるいはエンドヌクレアーゼは、配列番号１～５４９または６０２～１２７６のいずれか一つのＰＩドメインと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＲｕｖＣドメインは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つのＲｕｖＣドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＲｕｖＣドメインは、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つのＲｕｖＣドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＨＮＨドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＨＮＨドメインは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つのＨＮＨドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＨＮＨドメインは、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つのＨＮＨドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つ、またはそれと少なくとも５５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、生物は、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳類、またはヒト生物である。
一部の態様では、本開示は、（ａ）配列番号１～５４９、６０２～１２７６のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼ、またはそのバリアント；および（ｂ）操作されたガイド核酸構造を含む操作されたヌクレアーゼシステムを提供し、操作されたガイドＲＮＡは、エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、操作されたガイドＲＮＡは、標的核酸配列にハイブリダイズするよう構成された標的化核酸配列を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つ、またはそれと少なくとも５５％の同一性、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＲｕｖＣドメインは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つのＲｕｖＣドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＲｕｖＣドメインは、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つのＲｕｖＣドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＨＮＨドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＨＮＨドメインは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つのＨＮＨドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＨＮＨドメインは、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つのＨＮＨドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６４５～１６６２のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または操作されたガイド核酸構造は、配列番号５６８～５８５もしくは１６４３～１６４４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６４８、１６５０、もしくは１６６１のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または操作されたガイド核酸構造は、配列番号５７１、５７３、もしくは５８４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするよう構成された標的化核酸配列；および（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む。一部の実施形態では、標的化核酸配列は、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳類、またはヒトゲノム配列と相補的である。一部の実施形態では、標的化核酸配列は、１５～２４ヌクレオチド長である。
一部の態様では、本開示は、（ａ）（ｉ）配列番号１６４５～１６６２のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するｔｒａｃｒ配列；または（ｉｉ）配列番号５６８～５８５もしくは１６４３～１６４４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む操作されたガイド核酸構造、および（ｂ）操作されたガイド核酸構造に結合するよう構成されたクラス２タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６４８、１６５０、もしくは１６６１のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または操作されたガイド核酸構造は、配列番号５７１、５７３、もしくは５８４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするよう構成された標的化核酸配列；および（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む。一部の実施形態では、標的化核酸配列は、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳類、またはヒトゲノム配列と相補的である。一部の実施形態では、標的化核酸配列は、１５～２４ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１～５４９、６０２～１２７６のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つに記載の配列、またはそれと少なくとも５５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一部の態様では、本開示は、（ａ）標的ＤＮＡ分子における標的配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む標的化核酸配列；および（ｂ）ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）デュプレックスを形成するヌクレオチドの二つの相補的区画を含むタンパク質結合セグメント、その一つが、ｔｒａｃｒ配列を含み、ヌクレオチドの二つの相補的区画が、介在するヌクレオチドと互いに共有結合している、を含む操作されたガイド核酸構造を提供し、操作されたガイドリボ核酸ポリヌクレオチドは、配列番号１～５４９、６０２～１２７６のいずれか一つ、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼと複合体を形成し、複合体を標的ＤＮＡ分子の標的配列に標的化する能力がある。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つ、またはそれと少なくとも５５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、標的化核酸配列は、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳類、またはヒトゲノム配列と相補的である。一部の実施形態では、標的化核酸配列は、１５～２４ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６４５～１６６２のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または操作されたガイド核酸構造は、配列番号５６８～５８５もしくは１６４３～１６４４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６４８、１６５０、もしくは１６６１のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または操作されたガイド核酸構造は、配列番号５７１、５７３、もしくは５８４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される核酸のいずれかを含む操作されたベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミド、ミニサークル、ＣＥＬｉＤ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来ビリオン、レンチウイルス、またはアデノウイルスである。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるベクターのいずれかまたは本明細書に記載される核酸のいずれかを含む細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳類、またはヒト細胞である。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される細胞のいずれかを培養することを含む、エンドヌクレアーゼを製造する方法を提供する。
一部の態様では、本開示は、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを、エンドヌクレアーゼおよび二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドに結合するよう構成された操作されたガイド核酸構造との複合体におけるクラス２タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼと接触させることを含む、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを結合するか、切断するか、印付けするか、または修飾する方法を提供し、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含み、ＰＡＭは、配列番号５５０～５６７のいずれか一つに記載の配列を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１２７７～１６４１もしくは１６８３のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含むか、あるいはエンドヌクレアーゼは、配列番号１～５４９または６０２～１２７６のいずれか一つのＰＩドメインと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＲｕｖＣドメインは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つのＲｕｖＣドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＲｕｖＣドメインは、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つのＲｕｖＣドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＨＮＨドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＨＮＨドメインは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つのＨＮＨドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＨＮＨドメインは、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つのＨＮＨドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つ、またはそれと少なくとも５５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６４５～１６６２のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または操作されたガイド核酸構造は、配列番号５６８～５８５もしくは１６４３～１６４４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６４８、１６５０、もしくは１６６１のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または操作されたガイド核酸構造は、配列番号５７１、５７３、もしくは５８４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするよう構成された標的化核酸配列；および（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む。一部の実施形態では、標的化核酸配列は、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳類、またはヒトゲノム配列と相補的である。一部の実施形態では、標的化核酸配列は、１５～２４ヌクレオチド長である。
一部の態様では、本開示は、細胞に、（ａ）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ；および（ｂ）操作されたガイド核酸構造を接触させることを含む、細胞におけるＡＡＶＳ１遺伝子座を編集する方法を提供し、操作されたガイド核酸構造は、エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、操作されたガイド核酸構造は、ＡＡＶＳ１遺伝子座の領域にハイブリダイズするよう構成されたスペーサー配列を含み、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６６５～１６６６のいずれか一つの少なくとも１８個の連続ヌクレオチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する標的化配列またはその逆相補鎖を含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６６３または１６６４のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、ＭＧ７１－２－ＡＡＶＳ１－ｓｇＲＮＡ－Ｃ３またはＭＧ７１－２－ＡＡＶＳ１－ｓｇＲＮＡ－Ｅ２である。
一部の態様では、本開示は、細胞に、（ａ）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ；および（ｂ）操作されたガイド核酸構造を接触させることを含む、細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子座を編集する方法を提供し、操作されたガイド核酸構造は、エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、操作されたガイド核酸構造は、ＴＲＡＣ遺伝子座の領域にハイブリダイズするよう構成されたスペーサー配列を含み、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６６８もしくは１６７６～１６８２のいずれか一つの少なくとも１８個の連続ヌクレオチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する標的化配列またはその逆相補鎖を含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６６７または１６６９～１６７５のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、ＭＧ７３－１－ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ－Ｇ３、ＭＧ８９－２－ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ－Ｆ１、ＭＧ８９－２－ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ－Ｇ５、ＭＧ８９－２－ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ－Ｅ５、ＭＧ８９－２－ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ－Ｆ５、ＭＧ８９－２－ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ－Ｇ１、ＭＧ８９－２－ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ－Ｅ１、ＭＧ８９－２－ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ－Ｂ１である。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするよう構成された標的化核酸配列；および（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む。一部の実施形態では、標的化核酸配列は、１５～２４ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６４５～１６６２のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または操作されたガイド核酸構造は、配列番号５６８～５８５もしくは１６４３～１６４４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６４８、１６５０、もしくは１６６１のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または操作されたガイド核酸構造は、配列番号５７１、５７３、もしくは５８４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号５５０～５６７のいずれか一つを含むＰＡＭ配列についての選択性を有するよう構成されている。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１２７７～１６４１もしくは１６８３のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含むか、あるいはエンドヌクレアーゼは、配列番号１～５４９または６０２～１２７６のいずれか一つのＰＩドメインと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つ、またはそれと少なくとも５５％の同一性、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
本開示の更なる態様及び利点は、以下の詳細な説明から、当業者に容易に明らかになり、ここで、本開示の例示的な実施形態のみが示され、記載される。理解されるように、本開示は、他の異なる実施形態をすることができ、そのいくつかの詳細は、全て本開示から逸脱することなく、様々な明白な点において改変することができる。したがって、図面および説明は、本質的に例示とみなされるべきであり、制限としみなされるべきではない。
参照による組み込み
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれるべきことが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれるべきことが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に特記して記載される。本発明の特徴および利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および添付の図面（また、本明細書において「図」および「図」）を参照することによって得られるだろう。
図１は、異なるクラスおよびタイプのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座の典型的な機構を示す。
図２は、両方が結合されるハイブリッドｓｇＲＮＡと比較した、天然のクラスＩＩ／タイプＩＩ ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ対の構造を示す。
図３（例えば、図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、および３Ｅ）は、本明細書に記載される（例えば、実施例３に記載される）ＮＧＳを介して誘導されるＰＡＭ配列のｓｅｑＬｏｇｏ表示を示す。
図３（例えば、図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、および３Ｅ）は、本明細書に記載される（例えば、実施例３に記載される）ＮＧＳを介して誘導されるＰＡＭ配列のｓｅｑＬｏｇｏ表示を示す。
図３（例えば、図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、および３Ｅ）は、本明細書に記載される（例えば、実施例３に記載される）ＮＧＳを介して誘導されるＰＡＭ配列のｓｅｑＬｏｇｏ表示を示す。
図３（例えば、図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、および３Ｅ）は、本明細書に記載される（例えば、実施例３に記載される）ＮＧＳを介して誘導されるＰＡＭ配列のｓｅｑＬｏｇｏ表示を示す。
図３（例えば、図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、および３Ｅ）は、本明細書に記載される（例えば、実施例３に記載される）ＮＧＳを介して誘導されるＰＡＭ配列のｓｅｑＬｏｇｏ表示を示す。
図４は、実施例７におけるＫ５６２細胞中のＴＲＡＣおよびＡＡＶＳ１についてのＤＮＡレベルでの遺伝子編集結果を示す。
配列表の簡単な説明
本明細書と共に提出された配列表は、本開示による方法、組成物、およびシステムで使用するためのポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の例を提供する。以下は、その中の配列の説明例である。
本明細書と共に提出された配列表は、本開示による方法、組成物、およびシステムで使用するためのポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の例を提供する。以下は、その中の配列の説明例である。
ＭＧ４４
配列番号１～２１６および６０２～９３８は、ＭＧ４４ヌクレアーゼの全長ペプチド配列を示す。
配列番号５５０は、ＭＧ４４ヌクレアーゼと適合するＰＡＭ配列を示す。
配列番号５６８は、ＭＧ４４ヌクレアーゼと機能するように操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示し、Ｎｓは、標的化配列のヌクレオチドを示す。
配列番号１２７７～１４１９は、ＭＧ４４ヌクレアーゼのＰＡＭ相互作用ドメインのペプチド配列を示す。
配列番号１６４５は、上記のＭＧ４４ヌクレアーゼと同じ遺伝子座に由来するＭＧ４４ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
ＭＧ４６
配列番号２１７～２５７および９３９～１１０４は、ＭＧ４６ヌクレアーゼの全長ペプチド配列を示す。
配列番号５５１は、ＭＧ４６ヌクレアーゼと適合するＰＡＭ配列を示す。
配列番号５６９は、ＭＧ４６ヌクレアーゼと機能するように操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示し、Ｎｓは、標的化配列のヌクレオチドを示す。
配列番号１４２０～１４９７は、ＭＧ４６ヌクレアーゼのＰＡＭ相互作用ドメインのペプチド配列を示す。
配列番号１６４６は、上記のＭＧ４６ヌクレアーゼと同じ遺伝子座に由来するＭＧ４６ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
ＭＧ７１
配列番号２５８～２８３および１１０５は、ＭＧ７１ヌクレアーゼの全長ペプチド配列を示す。
配列番号５５２～５５３は、ＭＧ７１ヌクレアーゼと適合するＰＡＭ配列を示す。
配列番号５７０～５７１は、ＭＧ７１ヌクレアーゼと機能するように操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示し、Ｎｓは、標的化配列のヌクレオチドを示す。
配列番号１４９８～１４９９は、ＭＧ７１ヌクレアーゼのＰＡＭ相互作用ドメインのペプチド配列を示す。
配列番号１６４３～１６４４は、ＭＧ７１ヌクレアーゼで機能するよう操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１６４７～１６４８は、上記のＭＧ７１ヌクレアーゼと同じ遺伝子座に由来するＭＧ７１ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
ＭＧ７２
配列番号２８４～２９５および１１０６～１１１５は、ＭＧ７２ヌクレアーゼの全長ペプチド配列を示す。
配列番号５５４は、ＭＧ７２ヌクレアーゼと適合するＰＡＭ配列を示す。
配列番号５７２は、ＭＧ７２ヌクレアーゼと機能するように操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示し、Ｎｓは、標的化配列のヌクレオチドを示す。
配列番号１６４９は、上記のＭＧ７２ヌクレアーゼと同じ遺伝子座に由来するＭＧ７２ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
ＭＧ７３
配列番号２９６～３０５および１１１６～１１１８は、ＭＧ７３ヌクレアーゼの全長ペプチド配列を示す。
配列番号５５５は、ＭＧ７３ヌクレアーゼと適合するＰＡＭ配列を示す。
配列番号５７３～５７４は、ＭＧ７３ヌクレアーゼと機能するように操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示し、Ｎｓは、標的化配列のヌクレオチドを示す。
配列番号１５００～１５０５は、ＭＧ７３ヌクレアーゼのＰＡＭ相互作用ドメインのペプチド配列を示す。
配列番号１６５０～１６５１は、上記のＭＧ７３ヌクレアーゼと同じ遺伝子座に由来するＭＧ７３ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
ＭＧ７４
配列番号３０６～３５５および１１１９～１１６０は、ＭＧ７４ヌクレアーゼの全長ペプチド配列を示す。
配列番号５５６は、ＭＧ７４ヌクレアーゼと適合するＰＡＭ配列を示す。
配列番号５７５は、ＭＧ７４ヌクレアーゼと機能するように操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示し、Ｎｓは、標的化配列のヌクレオチドを示す。
配列番号１５０６～１５１９は、ＭＧ７４ヌクレアーゼのＰＡＭ相互作用ドメインのペプチド配列を示す。
配列番号１６５２は、上記のＭＧ７４ヌクレアーゼと同じ遺伝子座に由来するＭＧ７４ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
ＭＧ８６
配列番号３５６～４０２および１１６１～１２０６は、ＭＧ８６ヌクレアーゼの全長ペプチド配列を示す。
配列番号５５７～５５９は、ＭＧ８６ヌクレアーゼと適合するＰＡＭ配列を示す。
配列番号５７６～５７７は、ＭＧ８６ヌクレアーゼと機能するように操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示し、Ｎｓは、標的化配列のヌクレオチドを示す。
配列番号１５２０～１５７８は、ＭＧ８６ヌクレアーゼのＰＡＭ相互作用ドメインのペプチド配列を示す。
配列番号１６４２は、ＭＧ８６ヌクレアーゼの単一ガイドＰＡＭのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１６５３～１６５４は、上記のＭＧ８６ヌクレアーゼと同じ遺伝子座に由来するＭＧ８６ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
ＭＧ８７
配列番号４０３～４６２および１２０７～１２４７は、ＭＧ８７ヌクレアーゼの全長ペプチド配列を示す。
配列番号５６０～５６２は、ＭＧ８７ヌクレアーゼと適合するＰＡＭ配列を示す。
配列番号５７８～５８０は、ＭＧ８７ヌクレアーゼと機能するように操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示し、Ｎｓは、標的化配列のヌクレオチドを示す。
配列番号１５７９～１６１５は、ＭＧ８７ヌクレアーゼのＰＡＭ相互作用ドメインのペプチド配列を示す。
配列番号１６５５～１６５７は、上記のＭＧ８７ヌクレアーゼと同じ遺伝子座に由来するＭＧ８７ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
ＭＧ８８
配列番号４６３～４８２および１２４８～１２５８は、ＭＧ８８ヌクレアーゼの全長ペプチド配列を示す。
配列番号５６３～５６５は、ＭＧ８８ヌクレアーゼと適合するＰＡＭ配列を示す。
配列番号５８１～５８３は、ＭＧ８８ヌクレアーゼと機能するように操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示し、Ｎｓは、標的化配列のヌクレオチドを示す。
配列番号１６１６～１６２８は、ＭＧ８８ヌクレアーゼのＰＡＭ相互作用ドメインのペプチド配列を示す。
配列番号１６５８～１６６０は、上記のＭＧ８８ヌクレアーゼと同じ遺伝子座に由来するＭＧ８８ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
ＭＧ８９
配列番号４８３～５４９および１２５９～１２７６は、ＭＧ８９ヌクレアーゼの全長ペプチド配列を示す。
配列番号５６６～５６７は、ＭＧ８９ヌクレアーゼと適合するＰＡＭ配列を示す。
配列番号５８４～５８５は、ＭＧ８９ヌクレアーゼと機能するように操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示し、Ｎｓは、標的化配列のヌクレオチドを示す。
配列番号１６２９～１６４１は、ＭＧ８９ヌクレアーゼのＰＡＭ相互作用ドメインのペプチド配列を示す。
配列番号１６６１～１６６２は、上記のＭＧ８８ヌクレアーゼと同じ遺伝子座に由来するＭＧ８８ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
ＭＧ７１－２ ＡＡＶＳ１標的化
配列番号１６６３～１６６４は、ＡＡＶＳ１を標的化するために、ＭＧ７１－２ヌクレアーゼで機能するよう操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１６６３～１６６４は、ＡＡＶＳ１を標的化するために、ＭＧ７１－２ヌクレアーゼで機能するよう操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１６６５～１６６６は、ＡＡＶＳ１標的部位のＤＮＡ配列を示す。
ＭＧ７３－１ ＴＲＡＣ標的化
配列番号１６６７は、ＴＲＡＣを標的化するために、ＭＧ７３－１ヌクレアーゼで機能するよう操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１６６７は、ＴＲＡＣを標的化するために、ＭＧ７３－１ヌクレアーゼで機能するよう操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１６６８は、ＴＲＡＣ標的部位のＤＮＡ配列を示す。
ＭＧ８９－２ ＴＲＡＣ標的化
配列番号１６６９～１６７５は、ＴＲＡＣを標的化するために、ＭＧ８９－２ヌクレアーゼで機能するよう操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１６６９～１６７５は、ＴＲＡＣを標的化するために、ＭＧ８９－２ヌクレアーゼで機能するよう操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１６７６～１６８２は、ＴＲＡＣ標的部位のＤＮＡ配列を示す。
本発明の様々な実施形態は本明細書に示され、記載されるが、このような実施形態が、例示の目的でのみ提供されることは、当業者には明らかであろう。多数の変形、変更、及び置換は、本発明から逸脱することなく、当業者にとって生じ得る。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替が用いられ得ることは、理解されるべきである。
本明細書に開示されるいくつかの方法の実践は、別段の示唆がない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、および組換えＤＮＡの技術を用いる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．），ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（２０１０））（参照により本明細書に完全に組み込まれる）を参照のこと。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に示さない限り、複数形も含むことが意図される。更に、用語「含むこと」、「含む」、「有すること」、「有する」、「有する」、又はそのバリアントが、詳細な説明及び／又は特許請求の範囲のいずれかで使用される限りにおいて、かかる用語は、用語「含むこと」と類似した様式で包含的であることが意図される。
用語「約」又は「およそ」は、当業者によって決定される特定の値についての許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定又は決定されるか、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当該技術分野の慣行によると、一つ以上の標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、最大１５％、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味し得る。
本明細書で使用される場合、「細胞」は概して生物学的細胞を指す。細胞は、生きている生物の基本的な構造、機能、及び／又は生物学的単位であり得る。細胞は、一つ以上の細胞を有する任意の生物を起源とし得る。いくつかの非限定的な例としては、原核細胞、真核生物の細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単一細胞の真核生物の細胞、原虫細胞、植物由来の細胞（例えば、植物作物、果実、野菜、穀物、大豆、トウモロコシ、トウモロコシ、小麦、種子、トマト、米、キャッサバ、サトウキビ、カボチャ、乾草、ジャガイモ、綿、大麻、タバコ、開花している植物、針葉樹、ジムノスパーム、シダ、ヒカゲノカズラ、ツノゴケ、コケ植物、コケ由来の細胞）、藻類の細胞（例えば、ボトリオコッカス・ブラウニイ（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ）、クラミドモナス・ラインハートティ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ナンノクロロプシス・ガジタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）、クロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、サルガッスム・パテンスＣ．アガード（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ Ｃ．Ａｇａｒｄｈ）など）、海藻（例えば、ケルプ）、真菌細胞（例えば、酵母細胞、キノコ由来の細胞）、動物細胞、脊椎動物（例えば、フルーツフライ、クニダリアン、エキノデルム、線虫など）由来の細胞、脊椎動物（例えば、魚、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）由来の細胞、哺乳類（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒトなど）由来の細胞などが挙げられる。場合によっては、細胞は、天然の生物に由来するものではない（例えば、細胞は、合成的に作製されてもよく、時には人工細胞と呼ばれることがある）。
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、概して、塩基－糖－リン酸の組み合わせを指す。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドアナログを含んでもよい。ヌクレオチドは、核酸配列（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ））の単量体単位であってもよい。ヌクレオチドという用語は、リボヌクレオシド三リン酸アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シトシン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、又はその誘導体を含み得る。かかる誘導体としては、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７－デアザ－ｄＧＴＰ及び７－デアザ－ｄＡＴＰ、並びにそれらを含有する核酸分子にヌクレアーゼ耐性を付与するヌクレオチド誘導体を挙げることができる。本明細書で使用される場合、ヌクレオチドという用語は、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）及びその誘導体を指す場合がある。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の例としては、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、及びｄｄＴＴＰが挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、光学的に検出可能な部分（例えば、フルオロフォア）を含む部分を使用するなど、非標識又は検出可能に標識されてもよい。標識はまた、量子ドットを用いて行われてもよい。検出可能な標識としては、例えば、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、及び酵素標識を挙げることができる。ヌクレオチドの蛍光標識は、フルオレセイン、５－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２′７′－ジメトキシ－４′５－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６－カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、４－（４′ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、カスケードブルー、オレゴングリーン、テキサスレット、シアニンおよび５－（２′－アミノエチル）アミノナフタレン－１－スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）を含むが、これらに限定されない。蛍光標識されたヌクレオチドの具体的な例としては、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆから入手可能な［Ｒ６Ｇ］ｄＵＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＵＴＰ、［Ｒ１１０］ｄＣＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＣＴＰ、［ＪＯＥ］ｄｄＡＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ＦＡＭ］ｄｄＣＴＰ、［Ｒ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、［ＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ、［ｄＲ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ｄＲ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ｄＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、および［ｄＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ；Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｉｌｌ．から入手可能なフルオロ結合デオキシヌクレオチド、フルオロ結合Ｃｙ３－ｄＣＴＰ、フルオロ結合Ｃｙ５－ｄＣＴＰ、フルオロ結合フルオロＸ－ｄＣＴＰ、フルオロ結合Ｃｙ３－ｄＵＴＰ、およびフルオロ結合Ｃｙ５－ｄＵＴＰ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．から入手可能なフルオレセイン－１５－ｄＡＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄＵＴＰ、テトラメチル－ローダミン－６－ｄＵＴＰ、ＩＲ７７０－９－ｄＡＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄｄＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ＵＴＰ、およびフルオレセイン－１５－２′－ｄＡＴＰ；ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇから入手可能な染色体標識ヌクレオチド、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ－４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ－１４－ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ－１４－ｄＵＴＰ、カスケードブルー－７－ＵＴＰ、カスケードブルー－７－ｄＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄＵＴＰ、オレゴングリーン４８８－５－ｄＵＴＰ、ローダミングリーン－５－ＵＴＰ、ローダミングリーン－５－ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン－６－ＵＴＰ、テトラメチルローダミン－６－ｄＵＴＰ、テキサスレッド－５－ＵＴＰ、テキサスレッド－５－ｄＵＴＰ、およびテキサスレッド－１２－ｄＵＴＰを挙げることができる。ヌクレオチドはまた、化学修飾によって標識または印付けられてもよい。化学修飾された単一ヌクレオチドは、ビオチン－ｄＮＴＰであり得る。ビオチン化ｄＮＴＰのいくつかの非限定的な例としては、ビオチン－ｄＡＴＰ（例えば、ビオ－Ｎ６－ｄｄＡＴＰ、ビオチン－１４－ｄＡＴＰ）、ビオチン－ｄＣＴＰ（例えば、ビオチン－１１－ｄＣＴＰ、ビオチン－１４－ｄＣＴＰ）、およびビオチン－ｄＵＴＰ（例えば、ビオチン－１１－ｄＵＴＰ、ビオチン－１６－ｄＵＴＰ、ビオチン－２０－ｄＵＴＰ）が挙げられる。
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」は、概して、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそのアナログのいずれかを、一本鎖、二本鎖、または多本鎖の形態で、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すように互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、細胞にとって外因性又は内因性であってもよい。ポリヌクレオチドは、無細胞環境に存在してもよい。ポリヌクレオチドは、遺伝子又はその断片であってもよい。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもよい。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであってもよい。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有してもよく、任意の機能を発揮してもよい。ポリヌクレオチドは、一つ以上のアナログ（例えば、改変された骨格、糖、又は核酸塩基）を含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリの前又は後に付与されてもよい。アナログのいくつかの非限定的な例としては、５－ブロモウラシル、ペプチド核酸、異種核酸、モルホリノ、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コーディセピン、７－デアザ－ＧＴＰ、フルオロフォア（例えば、糖に結合したローダミンまたはフルオレセイン）、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン結合ヌクレオチド、蛍光塩基アナログ、ＣｐＧアイランド、メチル－７－グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、クエオシン、およびワイオシンが挙げられる。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子又は遺伝子断片のコード又は非コード領域、結合解析から定義した遺伝子座（遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロ－ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、細胞を含まないＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）及び細胞を含まないＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）を含む細胞を含まないポリヌクレオチド、核酸プローブ、並びにプライマーが挙げられる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。
用語「トランスフェクション」または「トランスフェクトされた」は、概して、非ウイルスまたはウイルスベースの方法による細胞内への核酸の導入を指す。核酸分子は、完全なタンパク質又はその機能的部分をコードする遺伝子配列であってもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１８．１－１８．８８を参照のこと。
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、概して、ペプチド結合（複数可）によって結合された少なくとも二つのアミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、ポリマーの特定の長さを意味しておらず、ペプチドが組換え技術、化学若しくは酵素合成を使用して産生されるか、又は天然に存在するかを暗示又は区別することを意図するものではない。この用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマー並びに少なくとも一つの修飾アミノ酸を含むアミノ酸ポリマーに適用する。場合によっては、ポリマーは、非アミノ酸によって中断されてもよい。用語は、全長タンパク質、及び二次及び／又は三次構造を有するか又は有さないタンパク質（例えば、ドメイン）を含む、任意の長さのアミノ酸鎖を含む。用語はまた、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質形成、アセチル化、リン酸化、酸化、及び標識成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」及び「複数のアミノ酸」という用語は、概して、修飾アミノ酸及びアミノ酸アナログを含むが、これに限定されない天然及び非天然アミノ酸を指す。修飾アミノ酸は、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸を含んでもよく、これは、アミノ酸上に天然に存在しない基又は化学的部分を含むように化学的に修飾されている。アミノ酸アナログは、アミノ酸誘導体を指す場合がある。用語「アミノ酸」は、Ｄ－アミノ酸とＬ－アミノ酸の両方を含む。
本明細書において使用される場合、「非天然」は、概して、天然の核酸またはタンパク質に存在しない核酸またはポリペプチド配列を指すことができる。非天然は、親和性タグを指してもよい。非天然は、融合物を指してもよい。非天然は、変異、挿入、及び／又は欠失を含む、天然に存在する核酸又はポリペプチド配列を指してもよい。非天然配列は、非天然配列が融合される核酸配列及び／又はポリペプチド配列によっても呈され得る活性（例えば、酵素活性、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性など）を示し得、かつ／又はコードし得る。非天然核酸又はポリペプチド配列を、遺伝子操作によって天然に生じる核酸及び／又はポリペプチド配列（若しくはそのバリアント）に連結して、キメラ核酸又はポリペプチドをコードするキメラ核酸及び／又はポリペプチド配列を生成してもよい。
本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」は、概して、遺伝子の転写又は発現を制御し、ＲＮＡ転写が開始されるヌクレオチドのヌクレオチド又はヌクレオチドの領域に隣接するか、又は重複して位置し得る調節ＤＮＡ領域を指す。プロモーターは、しばしば転写因子と呼ばれるタンパク質因子に結合する特定のＤＮＡ配列を含有してもよく、これは、ＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡへの結合を促進し、これにより、遺伝子転写をもたらす。「コアプロモーター」とも呼ばれる「基礎プロモーター」は、概して、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写発現を促進するための全ての塩基性必須要素を含有するプロモーターを指してもよい。真核生物の基礎プロモーターは、必ずしもではないが典型的には、ＴＡＴＡ－ボックス及び／又はＣＡＡＴボックスを含む。
本明細書で使用される場合、用語「発現」は、概して、核酸配列若しくはポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡ若しくは他のＲＮＡ転写物に）転写されるプロセス、及び／又は転写ｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、「遺伝子産物」と総称され得る。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核生物の細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含む。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」、「作動可能な連結」、「作動可能に連結された」、又はその文法的な均等物は、概して、遺伝子エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列などの並列化を指し、ここで、エレメントは、それらが予期される様式で作動することを可能にする関係にある。例えば、プロモーター配列及び／又はエンハンサー配列を含み得る、調節エレメントは、調節エレメントが、コード配列の転写を開始するのを助ける場合、コード領域に作動可能に連結される。この機能的関係が維持される限り、制御エレメントとコード領域との間に介在する残基があってもよい。
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、概して、ポリヌクレオチドを含むか、またはポリヌクレオチドと会合し、ポリヌクレオチドの細胞への送達を媒介するために使用され得る高分子または高分子の会合を指す。ベクターの例としては、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム、及び他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。ベクターは、概して、標的中の遺伝子の発現を促進するために遺伝子に作動可能に連結された、遺伝子エレメント、例えば、制御エレメントを含む。
本明細書において使用される場合、「発現カセット」および「核酸カセット」は、または発現のために作動可能に連結される核酸配列またはエレメントの組み合わせを指すために概して互換的に使用される。ある場合では、発現カセットは、発現のために作動可能に連結されている制御エレメントと遺伝子または複数の遺伝子との組み合わせを指す。
ＤＮＡまたはタンパク質配列の「機能的断片」は、概して、全長ＤＮＡまたはタンパク質配列の生物学的活性と実質的に類似した生物学的活性（機能的または構造的のいずれか）を保持する断片を指す。ＤＮＡ配列の生物学的活性は、全長配列に起因することが公知の様式で発現に影響を与える能力であってもよい。
本明細書で使用される場合、「操作された」対象は、概して、対象がヒトの介入によって修飾されたことを示す。非限定的な実施例によれば、核酸は、その配列を、天然では生じない配列に改変することによって修飾されてもよく、核酸は、ライゲーションされた産物が、オリジナルの核酸に存在しない機能を有するように、天然では関連しない核酸にライゲーションすることによって修飾されてもよく、操作された核酸は、天然では存在しない配列を用いてインビトロで合成されてもよく、タンパク質は、天然では存在しない配列にそのアミノ酸配列を変更することによって修飾されてもよく、操作されたタンパク質は、新しい機能又は特性を獲得してもよい。「操作された」システムは、少なくとも一つの操作された構成要素を含む。
本明細書において使用される場合、「合成」および「人工」は、天然に存在するヒトタンパク質と低い配列同一性（例えば、５０％未満の配列同一性、２５％未満の配列同一性、１０％未満の配列同一性、５％未満の配列同一性、１％未満の配列同一性）を有するタンパク質またはそのドメインを指すために互換的に使用される。例えば、ＶＰＲドメインおよびＶＰ６４ドメインは、合成トランス活性化ドメインである。
本明細書で使用される場合、用語「ｔｒａｃｒＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒ配列」は、概して、野生型の例となるｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス、黄色ブドウ球菌由来のｔｒａｃｒＲＮＡなど）と少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは１００％の配列同一性および／または配列類似性を有する核酸を指すことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、野生型の例となるｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス、黄色ブドウ球菌由来のｔｒａｃｒＲＮＡなど）に対し最大約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％の配列同一性及び／または配列類似性を有する核酸を指すことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、欠失、挿入、もしくは置換、バリアント、変異、またはキメラなどのヌクレオチド変更を含み得るｔｒａｃｒＲＮＡの修飾形態を指す。ｔｒａｃｒＲＮＡは、少なくとも６つの連続ヌクレオチドの区間にわたって、野生型の例となるｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス、黄色ブドウ球菌由来のｔｒａｃｒＲＮＡ）配列と少なくとも約６０％同一であり得る核酸を指してもよい。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６つの連続するヌクレオチドの区画にわたって野生型の例となるｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、トレプトコッカス・ピオゲネス、黄色ブドウ球菌由来のｔｒａｃｒＲＮＡなど）配列と少なくとも約６０％同一、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一であり得る。タイプＩＩ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、隣接するＣＲＩＳＰＲアレイ中のリピート配列の一部に対して相補性を有する領域を特定することによって、ゲノム配列上で予測することができる。
本明細書において使用される場合、「ガイド核酸」は、概して、別の核酸にハイブリダイズし得る核酸を指すことができる。ガイド核酸は、ＲＮＡであってもよい。ガイド核酸は、ＤＮＡであってもよい。ガイド核酸は、部位特異的に核酸の配列に結合するようにプログラムされてもよい。標的化されるべき核酸、又は標的核酸は、ヌクレオチドを含んでもよい。ガイド核酸は、ヌクレオチドを含んでもよい。標的核酸の一部は、ガイド核酸の一部に対して相補的であってもよい。ガイド核酸に相補的であり、ガイド核酸とハイブリダイズする二本鎖標的ポリヌクレオチドの鎖を、相補鎖と呼ぶことができる。相補鎖に相補的であり、それゆえ、ガイド核酸に相補的ではない二本鎖標的ポリヌクレオチドの鎖は、非相補鎖と呼ばれてもよい。ガイド核酸は、ポリヌクレオチド鎖を含んでもよく、また「単一ガイド核酸」と呼ばれ得る。ガイド核酸は、二つのポリヌクレオチド鎖を含んでもよく、また「ダブルガイド核酸」と呼ばれ得る。そうでない場合、用語「ガイド核酸」は、単一ガイド核酸とダブルガイド核酸の両方を指す、包括的であってもよい。ガイド核酸は、「核酸標的化セグメント」または「核酸標的化配列」と称され得るセグメントを含み得る。核酸標的化セグメントは、「タンパク質結合セグメント」または「タンパク質結合配列」または「Ｃａｓタンパク質結合セグメント」と称され得るサブセグメントを含んでもよい。
二つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における用語「配列同一性」または「パーセント同一性」は、概して、配列比較アルゴリズムを使用して測定された場合、局所比較ウィンドウまたはグローバル比較ウィンドウにわたって最大対応のために比較および整列されたとき、同一であるか、または特定のパーセンテージの、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する、二つ（例えば、ペアワイズアラインメントで）またはそれ以上（例えば、複数の配列アラインメントにおける）の配列を指す。ポリペプチド配列に好適な配列比較アルゴリズムとしては、例えば、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、および１１の存在のパラメーター、１の延長でギャップコストを設定しているＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用し、かつ３０残基より長いポリペプチド配列についての条件付き組成スコアマトリックス調整を使用したＢＬＡＳＴＰ；２のワード長（Ｗ）、１００００００の期待値（Ｅ）のパラメーター、およびオープンギャップに対して９および３０残基より短い配列についての拡張ギャップに対して１でのＰＡＭ３０スコアリング設定ギャップコストを使用したＢＬＡＳＴＰ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで入手可能なＢＬＡＳＴにおいてＢＬＡＳＴＰについてのデフォルトのパラメーターが存在する）；２の一致、－１のミスマッチ、および－１のギャップのパラメーターを用いたＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを用いたＣＬＵＳＴＡＬＷ；デフォルトパラメーターを用いたＭＵＳＣＬＥ；２のパラメーターリツリーおよび１０００の最大反復を用いたＭＡＦＦＴ；デフォルトパラメーターを用いたＮｏｖａｆｏｌｄ；デフォルトパラメーターを用いたＨＭＭＥＲ ｈｍｍａｌｉｇｎが挙げられる。
本明細書において使用される場合、用語「ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメイン」は、概して、ＲｕｖＣエンドヌクレアーゼドメインの第三の不連続セグメントを指す（ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインは、三つの不連続セグメントであるＲｕｖＣ＿Ｉ、ＲｕｖＣ＿ＩＩ、およびＲｕｖＣ＿ＩＩＩから構成される）。ＲｕｖＣドメインまたはそのセグメントは、概して、公知のドメイン配列へのアライメント、注釈付きドメインを有するタンパク質への構造的アライメント、または公知のドメイン配列（例えば、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩのＰｆａｍ ＨＭＭ ＰＦ１８５４１）に基づいて構築されたＨｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌｓ（ＨＭＭ）との比較によって識別することができる。
本明細書において使用される場合、用語「ＨＮＨドメイン」は、概して、特徴的なヒスチジン残基およびアスパラギン残基を有するエンドヌクレアーゼドメインを指す。ＨＮＨドメインは、概して、公知のドメイン配列へのアライメント、注釈付きドメインを有するタンパク質への構造的アライメント、または公知のドメイン配列（例えば、ドメインＨＮＨのＰｆａｍ ＨＭＭ ＰＦ０１８４４）に基づいて構築されたＨｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌｓ（ＨＭＭ）との比較によって識別することができる。
本明細書において使用される場合、用語「ウェッジ」（ＷＥＤ）ドメインは、概して、主にｓｇＲＮＡおよびＰＡＭ二重の反復：抗反復二重と相互作用するドメイン（例えば、Ｃａｓタンパク質に存在する）を指す。
本明細書において使用される場合、用語「ＰＡＭ相互作用ドメイン」は、概して、Ｃａｓタンパク質によって標的化される領域内のシード配列の外部のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と相互作用するドメインを指す。ＰＡＭ相互作用ドメインの例としては、Ｃａｓタンパク質に存在するトポイソメラーゼ相同性（ＴＯＰＯ）ドメインおよびＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）が挙げられるが、これらに限定されない。
一つ以上の保存的アミノ酸置換を有する本明細書に記載される酵素のうちのいずれかのバリアントが、本開示に含まれる。こうした保存的置換は、ポリペプチドの三次元構造又は機能を破壊することなく、ポリペプチドのアミノ酸配列においてなされ得る。保存的置換は、アミノ酸を、互いに同様の疎水性、極性、及びＲ鎖長で置換することによって達成することができる。加えて、又は代わりに、異なる種由来の相同なタンパク質のアラインされた配列を比較することによって、保存的置換は、コードされたタンパク質の基本的な機能を変化させることなく、種間で変異したアミノ酸残基（例えば、非保存残基）を見つけることによって特定され得る。このような保存的置換されたバリアントは、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼタンパク質配列（例えば、本明細書に記載されるＭＧ４４、ＭＧ４６、ＭＧ７１、ＭＧ７２、ＭＧ７３、ＭＧ７４、ＭＧ８６、ＭＧ８７、ＭＧ８８、もしくはＭＧ８９ファミリーエンドヌクレアーゼ、または本明細書に記載される任意のファミリーヌクレアーゼ）のうちのいずれか一つに対して少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有するバリアントを含んでもよい。一部の実施形態では、このような保存的に置換されたバリアントは、機能的バリアントである。こうした機能的バリアントは、エンドヌクレアーゼの一つ以上の重要な活性部位残基又はガイドＲＮＡ結合残基の活性が破壊されないように、置換を有する配列を包含することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質のうちのいずれかの機能的バリアントは、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼのＲｕｖＣまたはＨＮＨドメインの保存された残基または機能的残基のうちの少なくとも一つの置換を欠く。一部の実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質のうちのいずれかの機能的バリアントは、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼのＲｕｖＣまたはＨＮＨドメインの保存された残基または機能的残基のうちの全ての置換を欠く。
機能的に類似したアミノ酸をもたらす保存的置換表は、様々な参考文献から入手可能である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．；２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ１９９３）を参照のこと））。以下の八つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。
概要
固有の機能性及び構造を有する新しいＣａｓ酵素の発見は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）編集テクノロジーを更に破壊し、速度、特異性、機能性、及び使いやすさを改善する可能性を付与する可能性がある。微生物におけるクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムの予測される保有率及び微生物種の純多様性と比較して、比較的少数の機能的に特徴付けられたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が、文献に存在する。これは、一部、実験室条件下では、膨大な数の微生物種が容易には培養されないためである。多数の微生物種を表す天然の環境ニッチからのメタゲノムシークエンシングは、公知の新しいＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの数を劇的に増加させ、新しいオリゴヌクレオチド編集機能の発見を早める可能性を付与する可能性がある。このようなアプローチの実りのある最近の例は、天然微生物群集のメタゲノム解析からのＣａｓＸ／ＣａｓＹ ＣＲＩＳＰＲシステムの２０１６年の発見によって示される。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、微生物における適応免疫システムとして機能すると記載されているＲＮＡ指向ヌクレアーゼ複合体である。それらの自然な状況では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）オペロン又は遺伝子座において生じ、これは概して、二つの部分：（ｉ）ＲＮＡベースの標的化エレメントをコードする、同等に短いスペーサー配列によって分けられた短い反復配列（３０～４０ｂｐ）のアレイ；及び（ｉｉ）アクセサリータンパク質／酵素と並んだＲＮＡベースの標的化エレメントによって指示されるヌクレアーゼポリペプチドをコードするＣａｓをコードするＯＲＦを含む。特定の標的核酸配列の効率的なヌクレアーゼ標的化は、概して、（ｉ）標的（標的シード）の最初の６～８個の核酸とｃｒＲＮＡガイドとの間の相補的なハイブリダイゼーション；および（ｉｉ）標的シードの画定された近傍内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の存在の両方を必要とする（ＰＡＭは、通常、宿主ゲノム内に一般的に表されない配列である）。システムの正確な機能および構成に応じて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、共有された機能的特徴および進化的類似性に基づき、２つのクラス、５つのタイプ、および１６のサブタイプに一般的に構成されている。
クラスＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、大型の複数サブユニットエフェクター複合体を有し、タイプＩ、ＩＩＩ、およびＩＶを含む。
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、構成要素の面で中程度の複雑さとみなされる。タイプＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムでは、ＲＮＡ標的化エレメントのアレイは、リピートエレメントで処理される長い前駆ｃｒＲＮＡ（プレｃｒＲＮＡ）として転写されて、ヌクレアーゼ複合体を核酸標的に配向させる短い成熟ｃｒＲＮＡが、その後、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる適切な短いコンセンサス配列に引き続いて放出される。このプロセシングは、カスケードと呼ばれる大きなエンドヌクレアーゼ複合体のエンドリボヌクレアーゼサブユニット（Ｃａｓ６）を介して生じ、これは、ｃｒＲＮＡ指向性ヌクレアーゼ複合体のヌクレアーゼ（Ｃａｓ３）タンパク質成分も含む。Ｃａｓ Ｉヌクレアーゼは、主にＤＮＡヌクレアーゼとして機能する。
タイプＩＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣｓｍまたはＣｍｒタンパク質サブユニットを含む反復関連ミステリアスタンパク質（ＲＡＭＰ）と共に、Ｃａｓ１０として知られる中心ヌクレアーゼの存在によって特徴付けられ得る。タイプＩシステムと同様、成熟ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ６様酵素を使用してプレｃｒＲＮＡから処理される。タイプＩおよびＩＩシステムとは異なり、タイプＩＩＩシステムは、ＤＮＡ－ＲＮＡ二本鎖（ＲＮＡポリメラーゼの鋳型として使用されるＤＮＡ鎖など）を標的化し、開裂するようである。
タイプＩＶ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、高度に還元された大きなサブユニットヌクレアーゼ（ｃｓｆ１）、Ｃａｓ５（ｃｓｆ３）およびＣａｓ７（ｃｓｆ２）群のＲＡＭＰタンパク質の二つの遺伝子、ならびにある場合では、予測される小さいサブユニットの遺伝子からなるエフェクター複合体を有し、そのようなシステムは、内因性プラスミドに一般的に存在する。
クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、概して、単一ポリペプチド複数ドメインヌクレアーゼエフェクターを有し、タイプＩＩ、ＶおよびＶＩを含む。
タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、構成要素の点で最も単純なものとみなされる。タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムでは、ＣＲＩＳＰＲアレイを成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングすることは、特別なエンドヌクレアーゼサブユニットの存在を必要としないが、むしろ、アレイリピート配列に相補的な領域を有する小さなトランスコードｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）であり、ｔｒａｃｒＲＮＡは、その対応するエフェクターヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）およびリピート配列の両方と相互作用して、前駆ｄｓＲＮＡ構造を形成し、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの両方を負荷した成熟エフェクター酵素を生成するために、内因性ＲＮＡｓｅ ＩＩＩによって切断される。Ｃａｓ ＩＩヌクレアーゼは、ＤＮＡヌクレアーゼとして知られている。タイプ２エフェクターは、概して、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインのフォールドに挿入された無関係なＨＮＨヌクレアーゼドメインを有するＲＮａｓｅ Ｈフォールドに適合するＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインからなる構造を呈する。ＲｕｖＣ様ドメインは、標的（例えば、ｃｒＲＮＡ相補的）ＤＮＡ鎖の切断に関与し、一方、ＨＮＨドメインは、置換ＤＮＡ鎖の切断に関与する。タイプＩＩエフェクターはまた、ｃｒＲＮＡ標的ＤＮＡ領域の近傍のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位の認識に寄与するＴＯＰＯ領域およびＣＴＤ領域を含むＰＡＭ相互作用ドメインまたはＰＩドメインを含むことができる。
タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＲｕｖＣ様ドメインを含む、タイプＩＩエフェクターの構造と類似したヌクレアーゼエフェクター（例えば、Ｃａｓ１２）構造によって特徴付けられる。タイプＩＩと同様に、ほとんどの（すべてではない）タイプＶ ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｔｒａｃｒＲＮＡを使用して、プレｃｒＲＮＡを成熟ｃｒＲＮＡに処理するが、プレｃｒＲＮＡを複数のｃｒＲＮＡに切断するためのＲＮＡｓｅ ＩＩＩを必要とするタイプＩＩ型システムとは異なり、タイプＶシステムは、エフェクターヌクレアーゼ自体を使用してプレｃｒＲＮＡを切断することができる。タイプＩＩ ＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと同様に、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＤＮＡヌクレアーゼとして知られている。タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとは異なり、一部のタイプＶ酵素（例えば、Ｃａｓ１２ａ）は、二本鎖標的配列の第一のｃｒＲＮＡ指向切断によって活性化される、強固な一本鎖非特異的デオキシリボヌクレアーゼ活性を有するようである。
タイプＶＩ ＣＲＩＰＳＲ－Ｃａｓシステムは、ＲＮＡガイドＲＮＡエンドヌクレアーゼを有する。ＲｕｖＣ様ドメインの代わりに、タイプＶＩシステム（例えば、Ｃａｓ１３）の単一ポリペプチドエフェクターは、二つのＨＥＰＮリボヌクレアーゼドメインを含む。タイプＩＩとＶシステムの両方とは異なり、タイプＶＩシステムもまた、プレｃｒＲＮＡをｃｒＲＮＡに処理するためｔｒａｃｒＲＮＡを必要としないと思われる。しかしながら、タイプＶシステムと同様に、一部のタイプＶＩシステム（例えば、Ｃ２Ｃ２）は、標的ＲＮＡの第一のｃｒＲＮＡ指向切断によって活性化される、頑強な一本鎖非特異的ヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼ）活性を有するようである。
クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、より単純な構築物であるため、設計ヌクレアーゼ／ゲノム編集適用としての操作および開発に最も広く適用されてきた。
インビトロ使用のためのこのようなシステムの早期適用のうちの一つは、Ｊｉｎｅｋら （Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ａｕｇ １７；３３７（６０９６）：８１６－２１、参照により本明細書に完全に組み込まれる）において見ることができる。Ｊｉｎｅｋ試験では、最初に（ｉ）ストレプトコッカス・ピオゲネスＳＦ３７０から単離した、組換え発現した、精製された全長Ｃａｓ９（例えば、クラスＩＩ、タイプＩＩ Ｃａｓ酵素）、（ｉｉ）切断されることが望まれる標的ＤＮＡ配列に相補的な約２０ｎｔの５’配列、続いて３’ｔｒａｃｒ結合配列を生じる、精製された成熟約４２ｎｔのｃｒＲＮＡ（Ｔ７プロモーター配列を担持する合成ＤＮＡ鋳型からインビトロで転写された全ｃｒＲＮＡ）、（ｉｉｉ）Ｔ７プロモーター配列を担持する合成ＤＮＡ鋳型からインビトロで転写された精製ｔｒａｃｒＲＮＡ、および（ｉｖ）Ｍｇ２＋を含むシステムを記載した。Ｊｉｎｅｋは、後に、（ｉｉ）のｃｒＲＮＡが、（ｉｉｉ）の５’末端にリンカー（例えば、ＧＡＡＡ）によって結合されて、それ自体で標的にＣａｓ９を誘導することができる単一の融合合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成する、改良された操作されたシステムを記載した（図２の上部パネルと下部パネルを比較する）。
参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｍａｌｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８２３－８２６．）は、後に、（ｉ）Ｃ末端核局在化配列（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ）および適当なポリアデニル化シグナル（例えば、ＴＫ ｐＡシグナル）を有する適当な哺乳類プロモーター下でコドン最適化Ｃａｓ９（例えば、クラスＩＩ、タイプＩＩ Ｃａｓ酵素）をコードするＯＲＦ；ならびに（ｉｉ）適当なポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター）下にｓｇＲＮＡ（Ｇで始まる５′配列、続いて３′ｔｒａｃｒ結合配列に結合した２０ｎｔの相補的標的化核酸配列、リンカー、およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を有する）をコードするＯＲＦをコードするＤＮＡベクターをもたらすことによって、哺乳類細胞での使用にこのシステムを適合した。
ＭＧ酵素
一態様では、本開示は、（ａ）エンドヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。ある場合には、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。ある場合には、エンドヌクレアーゼは、タイプＩＩクラスＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣドメインまたはその部分（例えば、ＲｕｖＣ＿Ｉ、ＲｕｖＣ＿ＩＩ、もしくはＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメイン）を含んでもよい。エンドヌクレアーゼは、ＨＮＨドメインを含んでもよい。エンドヌクレアーゼは、ＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを含んでもよい。
ある場合には、エンドヌクレアーゼは、配列番号１～５４９または６０２～１２７６のいずれか一つと少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するバリアントを含んでもよい。ある場合には、エンドヌクレアーゼは、配列番号１～５４９または６０２～１２７６のいずれか一つと実質的に同一であってもよい。
一部の実施形態では、本開示によるエンドヌクレアーゼシステムは、表１に記載する成分のいずれかを含み得る。
ある場合には、エンドヌクレアーゼは、一つまたは複数の核局在化配列（ＮＬＳ）を有するバリアントを含んでもよい。ＮＬＳは、当該エンドヌクレアーゼのＮ末端又はＣ末端の近位にあってもよい。ＮＬＳは、配列番号１～５４９もしくは６０２～１２７６のうちのいずれか一つ、又は配列番号１～５４９もしくは６０２～１２７６のうちのいずれか一つに対して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するバリアントに対してＮ末端又はＣ末端に付加されてもよい。ＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳは、ｃ－ｍｙｃ ＮＬＳであってもよい。ＮＬＳは、配列番号５８６～６０１のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＮＬＳは、配列番号５８６～６０１のいずれか一つと実質的に同一の配列を含み得る。ＮＬＳは、以下の表２中の配列のいずれか、またはその組み合わせを含み得る。
一態様では、本開示は、（ａ）配列番号５５０～５６７のいずれか一つを含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列についての選択性を有するよう構成されたエンドヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼシステムを提供し、エンドヌクレアーゼは、クラス２タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、システムは、（ｂ）（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするよう構成された標的化核酸配列；および（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む、エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成された操作されたガイド核酸構造をさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、培養されていない微生物に由来する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼの天然のＰＡＭ配列とは異なるＰＡＭ配列に結合するよう操作されていない。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ １２ｃエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｄエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｃエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓ１３ｄエンドヌクレアーゼではない。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと８０％未満の同一性を有する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１２７７～１６４１もしくは１６８３のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１～５４９または６０２～１２７６のいずれか一つのＰＩドメインと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＲｕｖＣドメインは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つのＲｕｖＣドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＲｕｖＣドメインは、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つのＲｕｖＣドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＨＮＨドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＨＮＨドメインは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つのＨＮＨドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＨＮＨドメインは、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つのＨＮＨドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号５５３、５５５、もしくは５６６のいずれか一つを含むＰＡＭ配列、またはそのバリアントについての選択性を有するよう構成されている。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、少なくとも二つのリボ核酸ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、ガイドリボ核酸配列およびｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む一つのリボ核酸ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６４５～１６６２のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または操作されたガイド核酸構造は、配列番号５６８～５８５もしくは１６４３～１６４４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６４８、１６５０、もしくは１６６１のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または操作されたガイド核酸構造は、配列番号５７１、５７３、もしくは５８４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、標的化核酸配列は、原核生物、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳類、またはヒトゲノム配列と相補的である。一部の実施形態では、標的化核酸配列は、１５～２４ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端の近位に一つまたは複数の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。ＮＬＳは、配列番号５８６～６０１のいずれか一つ、またはそのバリアントを含む配列を含む。一部の実施形態では、システムは、５’から３’の方向に、標的デオキシリボ核酸配列に対して５’の、少なくとも２０個のヌクレオチドの配列を含む第一の相同アーム、少なくとも１０個のヌクレオチドの合成ＤＮＡ配列、および標的配列に対して３’の、少なくとも２０個のヌクレオチドの配列を含む第二の相同アームを含む一本鎖または二本鎖のＤＮＡ修復鋳型をさらに含む。一部の実施形態では、第一または第二の相同アームは、少なくとも４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１，０００ヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、システムは、Ｍｇ２＋の供給源をさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼおよびｔｒａｃｒリボ核酸配列は、同じ門内の別個の細菌種に由来する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つ、またはそれと少なくとも５５％の同一性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴアルゴリズム、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムパラメーターを用いたＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズムによって決定される。一部の実施形態では、配列同一性は、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）のパラメーター、および１１の存在、１の延長でギャップコストを設定しているＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用し、条件付き組成スコアマトリックス調整を使用した、ＢＬＡＳＴＰ相同性検索アルゴリズムによって決定される。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、標的デオキシリボ核酸配列の３’にある。
一部の態様では、本開示は、生物における発現のため最適化された操作された核酸配列を含む核酸を提供し、核酸は、配列番号５５０～５６７のいずれか一つを含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）について選択的であるよう構成されたクラス２タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１２７７～１６４１もしくは１６８３のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含むか、あるいはエンドヌクレアーゼは、配列番号１～５４９または６０２～１２７６のいずれか一つのＰＩドメインと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＲｕｖＣドメインは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つのＲｕｖＣドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＲｕｖＣドメインは、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つのＲｕｖＣドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＨＮＨドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＨＮＨドメインは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つのＨＮＨドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＨＮＨドメインは、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つのＨＮＨドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つ、またはそれと少なくとも５５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、生物は、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳類、またはヒト生物である。
一部の態様では、本開示は、（ａ）配列番号１～５４９、６０２～１２７６のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼ、またはそのバリアント；および（ｂ）操作されたガイド核酸構造を含む操作されたヌクレアーゼシステムを提供し、操作されたガイドＲＮＡは、エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、操作されたガイドＲＮＡは、標的核酸配列にハイブリダイズするよう構成された標的化核酸配列を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つ、またはそれと少なくとも５５％の同一性、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＲｕｖＣドメインは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つのＲｕｖＣドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＲｕｖＣドメインは、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つのＲｕｖＣドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＨＮＨドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＨＮＨドメインは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つのＨＮＨドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＨＮＨドメインは、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つのＨＮＨドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６４５～１６６２のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または操作されたガイド核酸構造は、配列番号５６８～５８５もしくは１６４３～１６４４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６４８、１６５０、もしくは１６６１のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または操作されたガイド核酸構造は、配列番号５７１、５７３、もしくは５８４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするよう構成された標的化核酸配列；および（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む。一部の実施形態では、標的化核酸配列は、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳類、またはヒトゲノム配列と相補的である。一部の実施形態では、標的化核酸配列は、１５～２４ヌクレオチド長である。
一部の態様では、本開示は、（ａ）（ｉ）配列番号１６４５～１６６２のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するｔｒａｃｒ配列；または（ｉｉ）配列番号５６８～５８５もしくは１６４３～１６４４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む操作されたガイド核酸構造、および（ｂ）操作されたガイド核酸構造に結合するよう構成されたクラス２タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６４８、１６５０、もしくは１６６１のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または操作されたガイド核酸構造は、配列番号５７１、５７３、もしくは５８４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするよう構成された標的化核酸配列；および（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む。一部の実施形態では、標的化核酸配列は、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳類、またはヒトゲノム配列と相補的である。一部の実施形態では、標的化核酸配列は、１５～２４ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１～５４９、６０２～１２７６のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つに記載の配列、またはそれと少なくとも５５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一部の態様では、本開示は、（ａ）標的ＤＮＡ分子における標的配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む標的化核酸配列；および（ｂ）ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）デュプレックスを形成するヌクレオチドの二つの相補的区画を含むタンパク質結合セグメント、その一つが、ｔｒａｃｒ配列を含み、ヌクレオチドの二つの相補的区画が、介在するヌクレオチドと互いに共有結合している、を含む操作されたガイド核酸構造を提供し、操作されたガイドリボ核酸ポリヌクレオチドは、配列番号１～５４９、６０２～１２７６のいずれか一つ、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼと複合体を形成し、複合体を標的ＤＮＡ分子の標的配列に標的化する能力がある。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つ、またはそれと少なくとも５５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、標的化核酸配列は、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳類、またはヒトゲノム配列と相補的である。一部の実施形態では、標的化核酸配列は、１５～２４ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６４５～１６６２のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または操作されたガイド核酸構造は、配列番号５６８～５８５もしくは１６４３～１６４４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６４８、１６５０、もしくは１６６１のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または操作されたガイド核酸構造は、配列番号５７１、５７３、もしくは５８４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される核酸のいずれかを含む操作されたベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミド、ミニサークル、ＣＥＬｉＤ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来ビリオン、レンチウイルス、またはアデノウイルスである。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるベクターのいずれかまたは本明細書に記載される核酸のいずれかを含む細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳類、またはヒト細胞である。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される細胞のいずれかを培養することを含む、エンドヌクレアーゼを製造する方法を提供する。
一部の態様では、本開示は、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを、エンドヌクレアーゼおよび二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドに結合するよう構成された操作されたガイド核酸構造との複合体におけるクラス２タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼと接触させることを含む、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを結合するか、切断するか、印付けするか、または修飾する方法を提供し、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含み、ＰＡＭは、配列番号５５０～５６７のいずれか一つに記載の配列を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１２７７～１６４１もしくは１６８３のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含むか、あるいはエンドヌクレアーゼは、配列番号１～５４９または６０２～１２７６のいずれか一つのＰＩドメインと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＲｕｖＣドメインは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つのＲｕｖＣドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＲｕｖＣドメインは、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つのＲｕｖＣドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＨＮＨドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＨＮＨドメインは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つのＨＮＨドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＨＮＨドメインは、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つのＨＮＨドメイン、またはそのバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つ、またはそれと少なくとも５５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６４５～１６６２のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または操作されたガイド核酸構造は、配列番号５６８～５８５もしくは１６４３～１６４４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６４８、１６５０、もしくは１６６１のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または操作されたガイド核酸構造は、配列番号５７１、５７３、もしくは５８４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするよう構成された標的化核酸配列；および（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む。一部の実施形態では、標的化核酸配列は、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳類、またはヒトゲノム配列と相補的である。一部の実施形態では、標的化核酸配列は、１５～２４ヌクレオチド長である。
一部の態様では、本開示は、細胞に、（ａ）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ；および（ｂ）操作されたガイド核酸構造を接触させることを含む、細胞におけるＡＡＶＳ１遺伝子座を編集する方法を提供し、操作されたガイド核酸構造は、エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、操作されたガイド核酸構造は、ＡＡＶＳ１遺伝子座の領域にハイブリダイズするよう構成されたスペーサー配列を含み、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６６５～１６６６のいずれか一つの少なくとも１８個の連続ヌクレオチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する標的化配列またはその逆相補鎖を含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６６３または１６６４のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、ＭＧ７１－２－ＡＡＶＳ１－ｓｇＲＮＡ－Ｃ３またはＭＧ７１－２－ＡＡＶＳ１－ｓｇＲＮＡ－Ｅ２である。
一部の態様では、本開示は、細胞に、（ａ）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ；および（ｂ）操作されたガイド核酸構造を接触させることを含む、細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子座を編集する方法を提供し、操作されたガイド核酸構造は、エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、操作されたガイド核酸構造は、ＴＲＡＣ遺伝子座の領域にハイブリダイズするよう構成されたスペーサー配列を含み、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６６８もしくは１６７６～１６８２のいずれか一つの少なくとも１８個の連続ヌクレオチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する標的化配列またはその逆相補鎖を含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６６７または１６６９～１６７５のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、ＭＧ７３－１－ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ－Ｇ３、ＭＧ８９－２－ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ－Ｆ１、ＭＧ８９－２－ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ－Ｇ５、ＭＧ８９－２－ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ－Ｅ５、ＭＧ８９－２－ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ－Ｆ５、ＭＧ８９－２－ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ－Ｇ１、ＭＧ８９－２－ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ－Ｅ１、ＭＧ８９－２－ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ－Ｂ１である。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするよう構成された標的化核酸配列；および（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む。一部の実施形態では、標的化核酸配列は、１５～２４ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６４５～１６６２のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または操作されたガイド核酸構造は、配列番号５６８～５８５もしくは１６４３～１６４４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、操作されたガイド核酸構造は、配列番号１６４８、１６５０、もしくは１６６１のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または操作されたガイド核酸構造は、配列番号５７１、５７３、もしくは５８４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号５５０～５６７のいずれか一つを含むＰＡＭ配列についての選択性を有するよう構成されている。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１２７７～１６４１もしくは１６８３のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含むか、あるいはエンドヌクレアーゼは、配列番号１～５４９または６０２～１２７６のいずれか一つのＰＩドメインと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つ、またはそれと少なくとも５５％の同一性、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
本開示のシステムは、例えば、核酸分子に結合する（例えば、配列特異的結合）、核酸編集（例えば、遺伝子編集）などの様々な用途に使用され得る。このようなシステムは、例えば、対象において疾患を引き起こす可能性のある遺伝的に受け継がれた突然変異に対処する（例えば、除去または置換する）ため、細胞におけるその機能を確認するために遺伝子を不活性化するため、疾患を引き起こす遺伝子エレメントを検出する診断ツールとして（例えば、逆転写されたウイルスＲＮＡもしくは疾患を引き起こす突然変異をコードする増幅されたＤＮＡ配列の切断を介して）、特定のヌクレオチド配列（例えば、細菌内の抗生物質耐性をコードする配列）を標的化するためのプローブと組み合わせた不活性化した酵素として、ウイルスゲノムを標的化することによってウイルスを不活性化するか、もしくは宿主細胞に感染できないようにするため、価値ある低分子、高分子、もしくは二次代謝産物を生じるように生物を操作するための遺伝子を加えるか、もしくは代謝経路を修正するため、進化的選択のための遺伝子駆動エレメントを確立するため、バイオセンサーとして外来低分子およびヌクレオチドによる細胞の摂動を検出するため使用され得る。
実施例１－新規タンパク質のメタゲノミクス分析
メタゲノミクス試料を、沈殿物、土壌および動物から採取した。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を、Ｚｙｍｏｂｉｏｍｉｃｓ ＤＮＡミニプレップキットを用いて抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ（登録商標）２５００で配列決定した。試料を、所有者の同意を得て収集した。公的ソースからのさらなる生配列データには、動物マイクロバイオーム、沈降、土壌、温泉、熱水通気孔、海洋、泥炭、パーマフロスト、および下水の配列が含まれていた。ＩＩ型Ｃａｓエフェクタータンパク質を含む公知のＣａｓタンパク質配列に基づいて生成された隠れマルコフモデルを使用して、メタゲノミクス配列データを検索した。検索によって特定した新規エフェクタータンパク質を、既知のタンパク質に対して整列させて、可能性のある活性部位を特定した。このメタゲノミクスワークフローは、本明細書に記載するＭＧ４４、ＭＧ４６、ＭＧ７１、ＭＧ７２、ＭＧ７３、ＭＧ７４、ＭＧ８７、ＭＧ８８およびＭＧ８９ファミリーのクラスＩＩ、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの詳細をもたらした。
メタゲノミクス試料を、沈殿物、土壌および動物から採取した。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を、Ｚｙｍｏｂｉｏｍｉｃｓ ＤＮＡミニプレップキットを用いて抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ（登録商標）２５００で配列決定した。試料を、所有者の同意を得て収集した。公的ソースからのさらなる生配列データには、動物マイクロバイオーム、沈降、土壌、温泉、熱水通気孔、海洋、泥炭、パーマフロスト、および下水の配列が含まれていた。ＩＩ型Ｃａｓエフェクタータンパク質を含む公知のＣａｓタンパク質配列に基づいて生成された隠れマルコフモデルを使用して、メタゲノミクス配列データを検索した。検索によって特定した新規エフェクタータンパク質を、既知のタンパク質に対して整列させて、可能性のある活性部位を特定した。このメタゲノミクスワークフローは、本明細書に記載するＭＧ４４、ＭＧ４６、ＭＧ７１、ＭＧ７２、ＭＧ７３、ＭＧ７４、ＭＧ８７、ＭＧ８８およびＭＧ８９ファミリーのクラスＩＩ、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの詳細をもたらした。
実施例２－ＣＲＩＳＰＲシステムのＭＧ４４、ＭＧ４６、ＭＧ７１、ＭＧ７２、ＭＧ７３、ＭＧ７４、ＭＧ８７、ＭＧ８８およびＭＧ８９ファミリーの発見
実施例１のメタゲノミクス解析のデータの解析により、以前に記述されていない、９つのファミリー（ＭＧ４４、ＭＧ４６、ＭＧ７１、ＭＧ７２、ＭＧ７３、ＭＧ７４、ＭＧ８７、ＭＧ８８およびＭＧ８９）を含む推定ＣＲＩＳＰＲシステムの新しいクラスターが明らかになった。これらの新規酵素およびそれらの例示的なサブドメインの対応するタンパク質配列および核酸配列を、配列番号１～５４９または６０２～１２７６として提示する。
実施例１のメタゲノミクス解析のデータの解析により、以前に記述されていない、９つのファミリー（ＭＧ４４、ＭＧ４６、ＭＧ７１、ＭＧ７２、ＭＧ７３、ＭＧ７４、ＭＧ８７、ＭＧ８８およびＭＧ８９）を含む推定ＣＲＩＳＰＲシステムの新しいクラスターが明らかになった。これらの新規酵素およびそれらの例示的なサブドメインの対応するタンパク質配列および核酸配列を、配列番号１～５４９または６０２～１２７６として提示する。
実施例３－プロトスペーサー－隣接モチーフの決定
ＰＡＭ配列を、大腸菌溶解物ベースの発現系（ｍｙＴＸＴＬ、Ａｒｂｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で発現させた推定エンドヌクレアーゼによって切断され得るランダムに生成したＰＡＭ配列を含有するプラスミドを配列決定することによって決定した。このシステムにおいて、大腸菌コドン最適化ヌクレオチド配列を、Ｔ７プロモーターの制御下でＰＣＲ断片から転写し、翻訳した。Ｔ７プロモーター下のｔｒａｃｒ配列を有する第二のＰＣＲ断片及びＴ７プロモーターとそれに続く反復スペーサー反復配列から構成される最小ＣＲＩＳＰＲアレイを、同じ反応で転写した。ＴＸＴＬシステムにおけるエンドヌクレアーゼ配列およびｔｒａｃｒ配列の発現に成功し、続いてＣＲＩＳＰＲアレイ処理により、活性なインビトロＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体を得た。
ＰＡＭ配列を、大腸菌溶解物ベースの発現系（ｍｙＴＸＴＬ、Ａｒｂｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で発現させた推定エンドヌクレアーゼによって切断され得るランダムに生成したＰＡＭ配列を含有するプラスミドを配列決定することによって決定した。このシステムにおいて、大腸菌コドン最適化ヌクレオチド配列を、Ｔ７プロモーターの制御下でＰＣＲ断片から転写し、翻訳した。Ｔ７プロモーター下のｔｒａｃｒ配列を有する第二のＰＣＲ断片及びＴ７プロモーターとそれに続く反復スペーサー反復配列から構成される最小ＣＲＩＳＰＲアレイを、同じ反応で転写した。ＴＸＴＬシステムにおけるエンドヌクレアーゼ配列およびｔｒａｃｒ配列の発現に成功し、続いてＣＲＩＳＰＲアレイ処理により、活性なインビトロＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体を得た。
最小アレイ中のそれと一致するスペーサー配列、続いて８Ｎ混合塩基（推定ＰＡＭ配列）を含有する標的プラスミドのライブラリーを、ＴＸＴＬ反応の生成物とともにインキュベートした。１～３時間後、反応を停止し、ＤＮＡクリーンアップキット、例えば、Ｚｙｍｏ ＤＣＣ、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ、ＱｉａＱｕｉｃｋなどを介してＤＮＡを回収した。アダプター配列を、エンドヌクレアーゼによって切断された活性なＰＡＭ配列を有するＤＮＡに平滑末端ライゲーションしたが、切断されなかったＤＮＡは、ライゲーションにはアクセスできなかった。次いで、活性ＰＡＭ配列を含むＤＮＡセグメントを、ライブラリーおよびアダプター配列に特異的なプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増幅産物をゲル上で分解して、切断事象に対応するアンプリコンを同定した。切断反応の増幅したセグメントも、ＮＧＳライブラリーの調製のための鋳型として使用した。開始８Ｎライブラリーのサブセットであるこの得られたライブラリーを配列決定することにより、活性ＣＲＩＳＰＲ複合体についての正しいＰＡＭを含む配列を明らかにした。単一のＲＮＡ構築物を用いたＰＡＭ試験については、インビトロ転写ＲＮＡをプラスミドライブラリーと共に加え、ｔｒａｃｒ／最小ＣＲＩＳＰＲアレイ鋳型を省略したことを除いて、同じ手順を繰り返した。ＮＧＳライブラリーを調製したエンドヌクレアーゼについては、ｓｅｑＬｏｇｏ（例えば、Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１５ Ｆｅｂ；１２（２）：１１５－２１）表示を構築し、図３に示した。これらの表示を構築するために使用したｓｅｑＬｏｇｏモジュールは、ＤＮＡ配列モチーフ（例えば、ＰＡＭ配列）の位置重み行列を取り、ＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＳｔｅｐｈｅｎｓ（例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０ Ｏｃｔ ２５；１８（２０）：６０９７－１００を参照）が導入した通り、対応する配列ロゴをプロットする。ｓｅｑＬｏｇｏ表示の配列を表す文字を、整列した配列（例えば、ＰＡＭ配列）の各位置について互いの上に重ねた。各文字の高さはその頻度に比例し、最も一般的な文字が一番上にあるように、文字を並べ替えている。
実施例４－ＭＧ ＣＲＩＳＰＲ複合体の（予測）インビトロ切断効率
エンドヌクレアーゼは、タンパク質分解酵素欠損大腸菌Ｂ株における誘導性Ｔ７プロモーターからのＨｉｓタグ付き融合タンパク質として発現される。Ｈｉｓタグ付きタンパク質を発現している細胞を超音波処理によって溶解し、Ｈｉｓタグ付きタンパク質を、ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ ＦＰＬＣ（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）上のＨｉｓＴｒａｐ ＦＦカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）上のＮｉ－ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーによって精製する。溶離液をアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上のＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ Ｕｌｔｒａｆａｓｔ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色する。純度を、ＩｍａｇｅＬａｂソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いたタンパク質バンドの濃度測定法を使用して決定する。精製したエンドヌクレアーゼを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール、ｐＨ７．５からなる保存緩衝液に透析し、－８０℃で保存する。
エンドヌクレアーゼは、タンパク質分解酵素欠損大腸菌Ｂ株における誘導性Ｔ７プロモーターからのＨｉｓタグ付き融合タンパク質として発現される。Ｈｉｓタグ付きタンパク質を発現している細胞を超音波処理によって溶解し、Ｈｉｓタグ付きタンパク質を、ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ ＦＰＬＣ（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）上のＨｉｓＴｒａｐ ＦＦカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）上のＮｉ－ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーによって精製する。溶離液をアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上のＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ Ｕｌｔｒａｆａｓｔ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色する。純度を、ＩｍａｇｅＬａｂソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いたタンパク質バンドの濃度測定法を使用して決定する。精製したエンドヌクレアーゼを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール、ｐＨ７．５からなる保存緩衝液に透析し、－８０℃で保存する。
スペーサー配列およびＰＡＭ配列を含有する標的ＤＮＡ（例えば、実施例３で決定した）を、ＤＮＡ合成によって構築する。ＰＡＭが縮重塩基を有する場合の試験のため、単一の代表的なＰＡＭを選択する。標的ＤＮＡは、ＰＡＭおよび一端から７００ｂｐに位置するスペーサーを用いたＰＣＲ増幅を介してプラスミドに由来する２２００ｂｐの直鎖ＤＮＡからなる。切断の成功は、７００および１５００ｂｐの断片をもたらす。標的ＤＮＡ、インビトロ転写単一ＲＮＡ、および精製した組換えタンパク質を、過剰なタンパク質およびＲＮＡを含む切断緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で組み合わせ、５分～３時間、通常は１時間インキュベートする。反応を、ＲＮＡｓｅ Ａの添加および６０分のインキュベーションを介して停止させる。次いで、反応物を１．２％ＴＡＥアガロースゲル上で分解し、切断した標的ＤＮＡの画分をＩｍａｇｅＬａｂソフトウェアで定量化する。
実施例５－大腸菌におけるＭＧ ＣＲＩＳＰＲ複合体のゲノム切断活性の（予測）試験
大腸菌は、二本鎖ＤＮＡ切断を効率的に修復する能力を欠く。したがって、ゲノムＤＮＡの切断は、致命的な事象であり得る。この現象を利用して、エンドヌクレアーゼ活性を、そのゲノムＤＮＡに組み込まれるスペーサー／標的配列およびＰＡＭ配列を有する標的株においてエンドヌクレアーゼおよびｔｒａｃｒＲＮＡを組換え発現させることによって、大腸菌で試験する。
大腸菌は、二本鎖ＤＮＡ切断を効率的に修復する能力を欠く。したがって、ゲノムＤＮＡの切断は、致命的な事象であり得る。この現象を利用して、エンドヌクレアーゼ活性を、そのゲノムＤＮＡに組み込まれるスペーサー／標的配列およびＰＡＭ配列を有する標的株においてエンドヌクレアーゼおよびｔｒａｃｒＲＮＡを組換え発現させることによって、大腸菌で試験する。
このアッセイでは、ＰＡＭ配列は、実施例３に記載した方法によって決定した試験しているエンドヌクレアーゼに特異的である。ｓｇＲＮＡ配列を、ｔｒａｃｒＲＮＡの配列および予測構造に基づいて決定する。反復の５’末端から開始する、８～１２ｂｐ（一般に１０ｂｐ）の反復抗反復対を選択する。反復の残りの３’末端およびｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端を、テトラループで置換する。概して、テトラループはＧＡＡＡであるが、特に、ＧＡＡＡ配列がフォールディングに干渉すると予測する場合、他のテトラループを使用することができる。これらの場合、ＴＴＣＧテトラループを使用した。
ゲノムＤＮＡに組み込まれたＰＡＭ配列を有する操作した株を、エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡで形質転換する。次いで、形質転換体を、化学能力を有し、標的配列に特異的（「オンターゲット」）、または標的に非特異的（「非標的」）かのいずれかの５０ｎｇの単一ガイドＲＮＡで形質転換する。ヒートショック後、形質転換を、ＳＯＣ中、３７℃で２時間回収する。次いで、ヌクレアーゼ効率を、誘導培地上で成長させた５倍希釈液によって決定する。コロニーを、トリプリケートで希釈系列から定量化する。
実施例６－哺乳類細胞におけるＭＧ ＣＲＩＳＰＲ複合体のゲノム切断活性の（予測）試験
哺乳類細胞における標的化および切断活性を示すために、ＭＧ Ｃａｓエフェクタータンパク質配列を、二つの哺乳類発現ベクター、（ａ）一つは、Ｃ末端のＳＶ４０ ＮＬＳおよび２Ａ－ＧＦＰタグを有し、（ｂ）一つは、ＧＦＰタグを有さず、二つのＳＶ４０ ＮＬＳ配列を有し、一つはＮ末端上にあり、一つはＣ末端上にある、で試験する。ある場合では、エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を、哺乳類細胞における発現のためにコドン最適化する。
哺乳類細胞における標的化および切断活性を示すために、ＭＧ Ｃａｓエフェクタータンパク質配列を、二つの哺乳類発現ベクター、（ａ）一つは、Ｃ末端のＳＶ４０ ＮＬＳおよび２Ａ－ＧＦＰタグを有し、（ｂ）一つは、ＧＦＰタグを有さず、二つのＳＶ４０ ＮＬＳ配列を有し、一つはＮ末端上にあり、一つはＣ末端上にある、で試験する。ある場合では、エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を、哺乳類細胞における発現のためにコドン最適化する。
標的化配列を付加した対応する単一ガイドＲＮＡ配列（ｓｇＲＮＡ）を、第二の哺乳動物発現ベクターにクローニングする。二つのプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトする。発現プラスミドとｓｇＲＮＡ標的化プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクションしてから７２時間後、ＤＮＡを抽出し、ＮＧＳライブラリーの調製に使用する。ＮＨＥＪの割合を標的部位の配列決定におけるインデルを介して測定して、哺乳類細胞における酵素の標的化効率を示す。各タンパク質の活性を試験するために、少なくとも１０個の異なる標的部位を選択した。
実施例７－Ｋ５６２細胞におけるＴＲＡＣおよびＡＡＶＳ１のＤＮＡレベルでの遺伝子編集結果
ＭＧ７１－２、ＭＧ７３－１、およびＭＧ８９－２ ｍＲＮＡの核酸感染を、以下の表４からの一致するガイドＲＮＡ（５００ｎｇのｍＲＮＡ／１５０ｐｍｏｌガイド）と共に、Ｌｏｎｚａ ４Ｄエレクトロポレーターを使用してＫ５６２細胞（２００，０００）に行った。細胞を回収し、トランスフェクションの３日後にゲノムＤＮＡを調製した。ＮＧＳベースのＤＮＡシーケンシングでの使用に適したＰＣＲプライマーを作製し、最適化し、各ガイドＲＮＡの個々の標的配列を増幅するために使用した。アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑマシン上で配列決定し、独自のＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いて解析して、遺伝子編集を測定した（図４）。
ＭＧ７１－２、ＭＧ７３－１、およびＭＧ８９－２ ｍＲＮＡの核酸感染を、以下の表４からの一致するガイドＲＮＡ（５００ｎｇのｍＲＮＡ／１５０ｐｍｏｌガイド）と共に、Ｌｏｎｚａ ４Ｄエレクトロポレーターを使用してＫ５６２細胞（２００，０００）に行った。細胞を回収し、トランスフェクションの３日後にゲノムＤＮＡを調製した。ＮＧＳベースのＤＮＡシーケンシングでの使用に適したＰＣＲプライマーを作製し、最適化し、各ガイドＲＮＡの個々の標的配列を増幅するために使用した。アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑマシン上で配列決定し、独自のＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いて解析して、遺伝子編集を測定した（図４）。
本開示のシステムは、例えば、核酸分子に結合する（例えば、配列特異的結合）、核酸編集（例えば、遺伝子編集）などの様々な用途に使用され得る。このようなシステムは、例えば、対象において疾患を引き起こす可能性のある遺伝的に受け継がれた突然変異に対処する（例えば、除去または置換する）ため、細胞におけるその機能を確認するために遺伝子を不活性化するため、疾患を引き起こす遺伝子エレメントを検出する診断ツールとして（例えば、逆転写されたウイルスＲＮＡもしくは疾患を引き起こす突然変異をコードする増幅されたＤＮＡ配列の切断を介して）、特定のヌクレオチド配列（例えば、細菌内の抗生物質耐性をコードする配列）を標的化するためのプローブと組み合わせた不活性化した酵素として、ウイルスゲノムを標的化することによってウイルスを不活性化するか、もしくは宿主細胞に感染できないようにするため、価値ある低分子、高分子、もしくは二次代謝産物を生じるように生物を操作するための遺伝子を加えるか、もしくは代謝経路を修正するため、進化的選択のための遺伝子駆動エレメントを確立するため、バイオセンサーとして外来低分子およびヌクレオチドによる細胞の摂動を検出するため使用され得る。
本発明の好ましい実施形態は本明細書に示され、記載されるが、このような実施形態が、例示の目的でのみ提供されることは、当業者には明らかであろう。本発明は、本明細書内で提供される特定の実施例によって限定されることは意図されていない。本発明は前述の説明を参照して記載されているが、本明細書の実施形態の記載及び説明は、限定された意味で解釈されることを意図していない。多数の変形、変更、及び置換は、ここで、本発明から逸脱することなく、当業者にとって生じるであろう。更に、本発明の全ての態様は、様々な条件及び変数に依存する、本明細書に記載される特定の描写、構成又は相対的割合に限定されないことが理解されよう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替が、本発明の実施に用いられ得ることは、理解されるべきである。したがって、本発明は、こうした任意の代替、修正、変形、又は均等物も包含することが企図される。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲、及びそれによって包含されるこれらの請求の範囲及びそれらの均等物内のその方法及び構造を定義することが意図される。
Claims (105)
- 操作されたヌクレアーゼシステムであって、
（ａ）配列番号５５０～５６７のいずれか一つを含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列についての選択性を有するよう構成されたエンドヌクレアーゼであって、クラス２タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、エンドヌクレアーゼと、
（ｂ）前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成された操作されたガイド核酸構造であって、
（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするよう構成された標的化核酸配列；および
（ｉｉ）前記エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む、操作されたガイド核酸構造と、を含む、操作されたヌクレアーゼシステム。 - 前記エンドヌクレアーゼが、培養されていない微生物に由来する、請求項１に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記エンドヌクレアーゼが、前記エンドヌクレアーゼの天然のＰＡＭ配列と異なるＰＡＭ配列に結合するよう操作されていない、請求項１または２に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｄエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｃエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓ１３ｄエンドヌクレアーゼではない、請求項３に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと８０％未満の同一性を有する、請求項３に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記エンドヌクレアーゼが、配列番号１２７７～１６４１もしくは１６８３のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含むか、あるいは前記エンドヌクレアーゼが、配列番号１～５４９または６０２～１２７６のいずれか一つのＰＩドメインと少なくとも８０％の同一性を有するＰＩドメインをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記エンドヌクレアーゼが、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む、請求項６に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記エンドヌクレアーゼが、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む、請求項６に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記エンドヌクレアーゼが、ＲｕｖＣドメインをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記ＲｕｖＣドメインが、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つのＲｕｖＣドメイン、またはそのバリアントと少なくとも８０％の同一性を有する、請求項９に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記ＲｕｖＣドメインが、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つのＲｕｖＣドメイン、またはそのバリアントと少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１０に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記エンドヌクレアーゼが、ＨＮＨドメインをさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記ＨＮＨドメインが、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つのＨＮＨドメイン、またはそのバリアントと少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１２に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記ＨＮＨドメインが、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つのＨＮＨドメイン、またはそのバリアントと少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１２に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記エンドヌクレアーゼが、配列番号５５３、５５５、もしくは５６６のいずれか一つを含むＰＡＭ配列、またはそのバリアントについての選択性を有するよう構成されている、請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記操作されたガイド核酸構造が、少なくとも二つのリボ核酸ポリヌクレオチドを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記操作されたガイド核酸構造が、前記ガイドリボ核酸配列および前記ｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む一つのリボ核酸ポリヌクレオチドを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号１６４５～１６６２のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号５６８～５８５もしくは１６４３～１６４４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号１６４８、１６５０、もしくは１６６１のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号５７１、５７３、もしくは５８４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記標的化核酸配列が、原核生物、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳類、またはヒトゲノム配列と相補的である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記標的化核酸配列が、１５～２４ヌクレオチド長である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記エンドヌクレアーゼが、前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端の近位に一つまたは複数の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記ＮＬＳが、配列番号５８６～６０１のいずれか一つ、またはそのバリアントを含む配列を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- ５’から３’の方向に、前記標的デオキシリボ核酸配列に対して５’の、少なくとも２０個のヌクレオチドの配列を含む第一の相同アーム、少なくとも１０個のヌクレオチドの合成ＤＮＡ配列、および前記標的配列に対して３’の、少なくとも２０個のヌクレオチドの配列を含む第二の相同アームを含む、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ修復鋳型をさらに含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記第一または第二の相同アームが、少なくとも４０、８０、１２０、１５０、２００、３００、５００、または１，０００個のヌクレオチドの配列を含む、請求項２４に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記システムが、Ｍｇ２＋の供給源をさらに含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記エンドヌクレアーゼおよび前記ｔｒａｃｒリボ核酸配列が、同じ門内の別個の細菌種に由来する、請求項１～２６のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記エンドヌクレアーゼが、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つ、またはそれと少なくとも５５％の同一性を有するそのバリアントを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記配列同一性が、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴアルゴリズム、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムパラメーターを用いたＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズムによって決定される、請求項１～２８のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記配列同一性が、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）のパラメーター、および１１の存在、１の延長でギャップコストを設定しているＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用し、条件付き組成スコアマトリックス調整を使用した、前記ＢＬＡＳＴＰ相同性検索アルゴリズムによって決定される、請求項２９に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記ＰＡＭ配列が、前記標的デオキシリボ核酸配列の３’に位置する、請求項１～３０のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 生物における発現のため最適化された操作された核酸配列を含む核酸であって、配列番号５５０～５６７のいずれか一つを含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）について選択的であるよう構成されたクラス２タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする、核酸。
- 前記エンドヌクレアーゼが、配列番号１２７７～１６４１もしくは１６８３のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含むか、あるいは前記エンドヌクレアーゼが、配列番号１～５４９もしくは６０２～１２７６のいずれか一つのＰＩドメインと少なくとも８０％の同一性を有するＰＩドメインをさらに含む、請求項３２に記載の核酸。
- 前記エンドヌクレアーゼが、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む、請求項３２に記載の核酸。
- 前記エンドヌクレアーゼが、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む、請求項３２に記載の核酸。
- 前記エンドヌクレアーゼが、ＲｕｖＣドメインをさらに含む、請求項３２～３５のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記ＲｕｖＣドメインが、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つのＲｕｖＣドメイン、またはそのバリアントと少なくとも８０％の同一性を有する、請求項３６に記載の核酸。
- 前記ＲｕｖＣドメインが、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つのＲｕｖＣドメイン、またはそのバリアントと少なくとも８０％の同一性を有する、請求項３６に記載の核酸。
- 前記エンドヌクレアーゼが、ＨＮＨドメインをさらに含む、請求項３２～３８のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記ＨＮＨドメインが、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つのＨＮＨドメイン、またはそのバリアントと少なくとも８０％の同一性を有する、請求項３９に記載の核酸。
- 前記ＨＮＨドメインが、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つのＨＮＨドメイン、またはそのバリアントと少なくとも８０％の同一性を有する、請求項３９に記載の核酸。
- 前記エンドヌクレアーゼが、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つ、またはそれと少なくとも５５％の同一性を有するそのバリアントを含む、請求項３２～４１のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記生物が、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳類、またはヒト生物である、請求項３２～４２のいずれか一項に記載の核酸。
- 操作されたヌクレアーゼシステムであって、
（ａ）配列番号１～５４９、６０２～１２７６のいずれか一つ、またはそのバリアントと少なくとも８０％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼと、
（ｂ）操作されたガイド核酸構造であって、前記操作されたガイド核酸構造が、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、前記操作されたガイド核酸構造が、標的核酸配列にハイブリダイズするよう構成された標的化核酸配列を含む、操作されたガイド核酸構造と、を含む、操作されたヌクレアーゼシステム。 - 前記エンドヌクレアーゼが、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つ、またはそれと少なくとも５５％の同一性を有するそのバリアントを含む、請求項４４に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記エンドヌクレアーゼが、ＲｕｖＣドメインをさらに含む、請求項４４または４５に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記ＲｕｖＣドメインが、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つのＲｕｖＣドメイン、またはそのバリアントと少なくとも８０％の同一性を有する、請求項４６に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記ＲｕｖＣドメインが、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つのＲｕｖＣドメイン、またはそのバリアントと少なくとも８０％の同一性を有する、請求項４６に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記エンドヌクレアーゼが、ＨＮＨドメインをさらに含む、請求項４４～４８のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記ＨＮＨドメインが、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つのＨＮＨドメイン、またはそのバリアントと少なくとも８０％の同一性を有する、請求項４４～４９のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記ＨＮＨドメインが、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つのＨＮＨドメイン、またはそのバリアントと少なくとも８０％の同一性を有する、請求項４４～４９のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号１６４５～１６６２のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号５６８～５８５または１６４３～１６４４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項４４～５１のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号１６４８、１６５０、もしくは１６６１のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号５７１、５７３、もしくは５８４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項４４～５１のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記操作されたガイド核酸構造が、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするよう構成された標的化核酸配列；および（ｉｉ）前記エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む、請求項４４～５３のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記標的化核酸配列が、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳類、またはヒトゲノム配列と相補的である、請求項５４に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記標的化核酸配列が、１５～２４ヌクレオチド長である、請求項５４または５５に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 操作されたヌクレアーゼシステムであって、
（ａ）（ｉ）配列番号１６４５～１６６２のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有するｔｒａｃｒ配列；または（ｉｉ）配列番号５６８～５８５もしくは１６４３～１６４４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、操作されたガイド核酸構造、および
（ｂ）前記操作されたガイド核酸構造に結合するよう構成されたクラス２タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む、操作されたヌクレアーゼシステム。 - 前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号１６４８、１６５０、もしくは１６６１のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号５７１、５７３、もしくは５８４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項５７に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記操作されたガイド核酸構造が、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするよう構成された標的化核酸配列；および（ｉｉ）前記エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む、請求項５７または５８に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記標的化核酸配列が、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳類、またはヒトゲノム配列と相補的である、請求項５９に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記標的化核酸配列が、１５～２４ヌクレオチド長である、請求項５９または６０に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記エンドヌクレアーゼが、配列番号１～５４９、６０２～１２７６のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、またはそのバリアントを含む、請求項５７～６１のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 前記エンドヌクレアーゼが、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つに記載の配列、またはそれと少なくとも５５％の同一性を有するそのバリアントを含む、請求項５７～６１のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
- 操作されたガイド核酸構造であって、
（ａ）標的ＤＮＡ分子中の標的配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む標的化核酸配列と、
（ｂ）そのうちの一つがｔｒａｃｒ配列を含む、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）デュプレックスを形成するようハイブリダイズするヌクレオチドの二つの相補的区画を含む、タンパク質結合セグメントと、を含み、
ヌクレオチドの前記二つの相補的区画が、介在するヌクレオチドと互いに共有結合し、
前記操作されたガイドリボ核酸ポリヌクレオチドが、配列番号１～５４９、６０２～１２７６のいずれか一つ、またはそのバリアントと少なくとも８０％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼと複合体を形成し、前記複合体を前記標的ＤＮＡ分子の前記標的配列に標的化する能力がある、操作されたガイド核酸構造。 - 前記エンドヌクレアーゼが、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つ、またはそれと少なくとも５５％の同一性を有するそのバリアントを含む、請求項６４に記載の操作されたガイド核酸構造。
- 前記標的化核酸配列が、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳類、またはヒトゲノム配列と相補的である、請求項６４または６５に記載の操作されたガイド核酸構造。
- 前記標的化核酸配列が、１５～２４ヌクレオチド長である、請求項６４～６６のいずれか一項に記載の操作されたガイド核酸構造。
- 前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号１６４５～１６６２のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号５６８～５８５もしくは１６４３～１６４４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項６４～６７のいずれか一項に記載の操作されたガイド核酸構造。
- 前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号１６４８、１６５０、もしくは１６６１のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号５７１、５７３、もしくは５８４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項６４～６８のいずれか一項に記載の操作されたガイド核酸構造。
- 請求項３２～４３のいずれか一項に記載の核酸を含む、操作されたベクター。
- 前記ベクターが、プラスミド、ミニサークル、ＣＥＬｉＤ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来ビリオン、レンチウイルス、またはアデノウイルスである、請求項７０に記載の操作されたベクター。
- 請求項７０もしくは７１に記載のベクターまたは請求項３２～４３のいずれか一項に記載の核酸を含む、細胞。
- 請求項７２に記載の細胞を培養することを含む、エンドヌクレアーゼを製造する方法。
- 二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを結合するか、切断するか、印付けするか、または修飾する方法であって、
前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを、前記エンドヌクレアーゼおよび前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドに結合するよう構成された操作されたガイド核酸構造との複合体におけるクラス２タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼと接触させることを含み、
前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドが、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含み、前記ＰＡＭが、配列番号５５０～５６７のいずれか一つに記載の配列を含む、方法。 - 前記エンドヌクレアーゼが、配列番号１２７７～１６４１もしくは１６８３のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含むか、あるいは前記エンドヌクレアーゼが、配列番号１～５４９または６０２～１２７６のいずれか一つのＰＩドメインと少なくとも８０％の同一性を有するＰＩドメインをさらに含む、請求項７４に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼが、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む、請求項７４に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼが、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む、請求項７４に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼが、ＲｕｖＣドメインをさらに含む、請求項７４～７７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＲｕｖＣドメインが、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つのＲｕｖＣドメイン、またはそのバリアントと少なくとも８０％の同一性を有する、請求項７８に記載の方法。
- 前記ＲｕｖＣドメインが、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つのＲｕｖＣドメイン、またはそのバリアントと少なくとも８０％の同一性を有する、請求項７８に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼが、ＨＮＨドメインをさらに含む、請求項７４～８０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＨＮＨドメインが、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つのＨＮＨドメイン、またはそのバリアントと少なくとも８０％の同一性を有する、請求項８１に記載の方法。
- 前記ＨＮＨドメインが、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つのＨＮＨドメイン、またはそのバリアントと少なくとも８０％の同一性を有する、請求項８１に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼが、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つ、またはそれと少なくとも５５％の同一性を有するそのバリアントを含む、請求項７４～８３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号１６４５～１６６２のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号５６８～５８５もしくは１６４３～１６４４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項７４～８４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号１６４８、１６５０、もしくは１６６１のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号５７１、５７３、もしくは５８４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項７４～８４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作されたガイド核酸構造が、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするよう構成された標的化核酸配列；および（ｉｉ）前記エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む、請求項７４～８６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的化核酸配列が、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳類、またはヒトゲノム配列と相補的である、請求項８７に記載の方法。
- 前記標的化核酸配列が、１５～２４ヌクレオチド長である、請求項８７または８８に記載の方法。
- 細胞内のＡＡＶＳ１遺伝子座を編集する方法であって、前記細胞に、
（ａ）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、および
（ｂ）操作されたガイド核酸構造であって、前記操作されたガイド核酸構造が、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、前記操作されたガイド核酸構造が、前記ＡＡＶＳ１遺伝子座の領域にハイブリダイズするよう構成されたスペーサー配列を含む、操作されたガイド核酸構造、を接触させることを含み、
前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号１６６５～１６６６のいずれか一つの少なくとも１８個の連続ヌクレオチドと少なくとも８５％の同一性を有する標的化配列またはその逆相補鎖を含む、方法。 - 前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号１６６３または１６６４のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する、請求項９０に記載の方法。
- 前記操作されたガイド核酸構造が、ＭＧ７１－２－ＡＡＶＳ１－ｓｇＲＮＡ－Ｃ３またはＭＧ７１－２－ＡＡＶＳ１－ｓｇＲＮＡ－Ｅ２である、請求項９０に記載の方法。
- 細胞内のＴＲＡＣ遺伝子座を編集する方法であって、前記細胞に、
（ａ）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、および
（ｂ）操作されたガイド核酸構造であって、前記操作されたガイド核酸構造が、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、前記操作されたガイド核酸構造が、前記ＴＲＡＣ遺伝子座の領域にハイブリダイズするよう構成されたスペーサー配列を含む、操作されたガイド核酸構造、を接触させることを含み、
前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号１６６８もしくは１６７６～１６８２のいずれか一つの少なくとも１８個の連続ヌクレオチドと少なくとも８５％の同一性を有する標的化配列またはその逆相補鎖を含む、方法。 - 前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号１６６７もしくは１６６９～１６７５のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する、請求項９３に記載の方法。
- 前記操作されたガイド核酸構造が、ＭＧ７３－１－ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ－Ｇ３、ＭＧ８９－２－ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ－Ｆ１、ＭＧ８９－２－ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ－Ｇ５、ＭＧ８９－２－ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ－Ｅ５、ＭＧ８９－２－ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ－Ｆ５、ＭＧ８９－２－ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ－Ｇ１、ＭＧ８９－２－ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ－Ｅ１、ＭＧ８９－２－ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ－Ｂ１である、請求項９３に記載の方法。
- 前記操作されたガイド核酸構造が、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するよう構成され、（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするよう構成された標的化核酸配列；および（ｉｉ）前記エンドヌクレアーゼに結合するよう構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む、請求項９０～９５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的化核酸配列が、１５～２４ヌクレオチド長である、請求項９６に記載の方法。
- 前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号１６４５～１６６２のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号５６８～５８５もしくは１６４３～１６４４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項９０～９７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号１６４８、１６５０、もしくは１６６１のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含むか、または前記操作されたガイド核酸構造が、配列番号５７１、５７３、もしくは５８４のいずれか一つの非縮重ヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項９０～９７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼが、クラス２タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、請求項９０～９９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼが、配列番号５５０～５６７のいずれか一つを含むＰＡＭ配列について選択性を有するよう構成されている、請求項１００に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼが、配列番号１２７７～１６４１もしくは１６８３のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含むか、あるいは前記エンドヌクレアーゼが、配列番号１～５４９または６０２～１２７６のいずれか一つのＰＩドメインと少なくとも８０％の同一性を有するＰＩドメインをさらに含む、請求項１００または１０１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼが、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む、請求項１００または１０１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼが、配列番号２５９、２９６、もしくは４８４のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列、またはそのバリアントを含むＰＩドメインをさらに含む、請求項１００または１０１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼが、配列番号１、２１７、２５８、２５９、２８４、２９６、２９７、３０６、３５７、４０３、４０４、４０５、４６３、４６４、４６５、３５６、もしくは４８４のいずれか一つ、またはそれと少なくとも５５％の同一性を有するそのバリアントを含む、請求項９０～１０４のいずれか一項に記載の方法。
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