KR20220130158A - 인간 만능 줄기 세포로부터의 무-간질 t 세포 분화 - Google Patents

Abstract

본 명세서에 설명된 기술은 무-간질 T 세포 분화 방법에 관한 것이다. 또한 본 명세서에는 무-간질 방법을 이용하여 분화된 면역 세포 및 이러한 면역 세포를 포함하는 조성물이 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 유전적으로 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포 또는 상기 면역 세포를 포함하는 조성물은 병태를 치료하기 위한 세포 대체 요법으로서 환자에게 투여될 수 있다.

Description

인간 만능 줄기 세포로부터의 무-간질 T 세포 분화

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2020년 1월 23일에 출원된 미국 가출원 제62/964,857호 및 2020년 5월 15일에 출원된 미국 가출원 제63/025,412호에 대해 35 U.S.C.§119(e)에 따른 이익을 주장하며, 상기 가출원 각각의 내용은 그 전문이 본 명세서에 참조로 통합된다.

정부 지원

본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 기금번호 2U01DK104218에 따른 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가지고 있다.

서열 목록

본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 형식으로 제출된 서열목록을 포함하고, 그 전문이 본 명세서에 참조로 통합된다. 2021년 1월 22일에 생성된 ASCII 사본의 이름은 701039-096580WOPT_SL.txt이며, 크기는 108,672바이트이다.

기술 분야

본 명세서에 기술된 기술은 면역 세포 분화 방법에 관한 것이다.

배경

생체내(in vivo) 세포 대체 요법, 숙주의 질병, 장애 및 병태에 대한 요법, 및 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 혈액 질환의 시험관내(in vitro) 연구를 위한 기능적 면역 세포의 공급이 부족하다. T 세포는 인간 적응 면역 시스템의 핵심 구성요소이며 큰 치료 잠재력을 가지고 있다. 그러나, 현재의 T 세포-매개 요법은 자가(autologous) T 세포에 의존하고 있으며, 이는 광범위한 적용을 방해한다. 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)는 세포 요법을 위한 기성(off-the-shelf) 제품의 확장가능한 제조를 위한 이상적인 공급원이다. 그러나, iPSC로부터 성숙하고 기능적인 T 세포의 생성은 어려운 것으로 밝혀졌다. 또한, iPSC의 분화는 iPSC-유래 T 세포의 번역 잠재력을 제한하는, 마우스 간질 세포와의 공동-배양(co-culture)을 필요로 한다. 그에 따라 고수율의 임상적으로 적용가능한 T 세포 분화 방법이 필요하다.

요약

본 명세서에 기술된 기술은 T 세포 분화 방법에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 명세서에 기술된 방법은 무-간질(stroma-free) T 세포 분화 방법, 즉 간질 세포 또는 임의의 다른 유형의 지지 세포와의 공동-배양을 포함하지 않는 방법이다. 마우스 간질 세포와 같은 간질 세포와의 공동-배양은 iPSC 유래 T 세포의 번역 잠재력(potential)을 제한한다. 예를 들어, 간질 세포의 존재로 인한 이식 거부에 대한 우려가 있을 수 있다. 또한, 간질 세포를 사용하여 분화된 T 세포는 선천적-유사(innate-like) 표현형을 나타낸다(예를 들어, 감마 델타 T 세포에 대한 마커인, TCRgd 발현으로 측정됨). T 세포는, 예를 들어, TCR α 및 β의 발현을 특징으로 하는 적응성 표현형을 나타내는 것이 바람직하다. 추가로, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 무-간질 T 세포 분화 방법은 간질 공동-배양을 포함하는 분화 방법과 비교하여 증가된 수의 CD3⁺ T 세포(예를 들어, CD4⁺CD8⁺ 세포)를 초래한다.

따라서, 무-간질 방법을 이용하여, 그리고, 한 실시형태에서, 후성유전 조절인자(epigenetic regulator)(예를 들어, 히스톤 메틸 트랜스퍼라제(HMT); 예를 들어, EZH1, G9a/GLP)의 억제와 조합하여, 분화된 T 세포는 간질 공동-배양 방법과 비교하여 적어도 다음과 같은 예상치 못한 이점을 나타낸다: (1) 인간에서의 이식 잠재력 증가; (2) 선천적-유사 T 세포 수의 감소; (3) 생성된 T 세포(예를 들어, CD5⁺CD7⁺ Pro-T 세포; CD3⁺ T 세포; CD4⁺CD8⁺ T 세포; CD4⁺ T 세포; CD8⁺ T 세포; 알파-베타 T 세포)의 수 및/또는 백분율 증가; (4) 알파 베타 T 세포와 가장 유사한 유전자 발현 프로파일; (5) 보다 다양한 TCR 레퍼토리; 및/또는 (6) TCR CDR 길이 증가(예를 들어, 실시예 1, 도 1c-1d, 도 3a-3b, 도 4, 도 5a-5d, 도 6-16 참조).

한 양태에서, 본 명세서에는, (a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포(hemogenic endothelium)의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지(aggregation media)에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계; (b) 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단에서 히스톤 메틸트랜스퍼라제를 억제하는 단계; 및 (c) CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 노치(Notch) 리간드의 존재 하에 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서, 상기 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계를 포함하는 방법이 기술된다.

또 다른 양태에서, 본 명세서에는, (a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계; (b) 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단에서 후성유전 조절인자를 억제하는 단계; 및 (c) CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 노치 리간드의 존재 하에 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서, 상기 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계를 포함하는 방법이 기술된다.

또 다른 양태에서, 본 명세서에는, (a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계; (b) 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단에서 G9a 및/또는 GLP를 억제하는 단계; 및 (c) CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 노치 리간드의 존재 하에 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계를 포함하는 방법이 기술된다.

또 다른 양태에서, 본 명세서에는, (a) CD34+ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계; 및 (b) CD3+ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 노치 리간드의 존재 하에 CD3⁺-T-세포-분화 배지에서 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계를 포함하는 방법이 기술된다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 노치 리간드는 고체 기재(substrate)에 부착된다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 노치 리간드는 세포 배양 접시에 부착된다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 노치 리간드는 간질 세포로부터 유래되지 않는다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 노치 리간드의 존재 하에 혈액생성 내피세포를 분화시키는 것은 노치 리간드를 발현하는 간질 세포와의 공동-배양을 포함하지 않는다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 노치 리간드의 존재 하에 혈액생성 내피세포를 분화시키는 것은 OP9-DL1 세포 또는 OP9-DL4 세포와의 공동-배양을 포함하지 않는다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 노치 리간드는 델타-유사-1(DLL1), 델타-유사-4(DLL4), 고정화된 델타1^ext-IgG, 및 고정화된 델타4^ext-IgG로 이루어진 군으로부터 선택된다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 고정화된 델타1^ext-IgG는 인간 IgG1의 Fc 도메인에 융합된 인간 델타-유사-1의 세포외 도메인으로 이루어진다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간은 적어도 4주이다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, CD3⁺-T-세포 분화 배지는 무혈청이다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, CD3⁺-T-세포-분화 배지는 FLT3 및 IL7을 포함한다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, CD3⁺-T-세포-분화 배지는 15 ng/㎖ FLT3 및 25 ng/㎖ IL7을 포함한다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, CD3⁺-T-세포-분화 배지는 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서의 적어도 처음 2주의 분화 동안 5 ng/㎖ 트롬보포이에틴(TPO) 및/또는 30 ng/㎖ SCF를 추가로 포함한다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, TPO를 포함하는 CD3⁺-T-세포-분화 배지는 CD5⁺ CD7⁺ ProT 세포의 집단으로의 분화를 촉진한다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, CD3⁺ T 세포의 집단은 CD4⁺CD8⁺ T 세포의 집단을 포함한다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 방법은 CD4⁺ 세포의 집단 및 CD8⁺ 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 단일-양성-T-세포-분화 배지에서 CD4⁺CD8⁺ T 세포의 집단을 분화시키는 것을 추가로 포함한다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, CD4⁺CD8⁺ T 세포의 집단으로부터 CD4⁺ T 세포의 집단 및 CD8⁺ 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간은 적어도 1주이다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로부터 CD4⁺ T 세포의 집단 및 CD8⁺ 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간은 적어도 5주이다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 단일-양성-T-세포-분화 배지는 10 ng/㎖ IL-15 및 T 세포 활성화인자(activator)를 포함한다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, T 세포 활성화인자는 10 ㎕/㎖ CD3/CD28 T 세포 활성화인자를 포함한다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, T 세포 활성화인자는 세포당 한(one) 비드의 CD3/CD28 T 세포 활성화인자 다이나비드(dynabeads) 포함한다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 방법은 적어도 1주 후, CD4⁺ 세포 농축 및/또는 CD8⁺ 세포 농축 단계를 추가로 포함한다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포의 집단은 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포) 또는 배아 줄기 세포(ESC)를 포함한다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 유도된 만능 줄기 세포는 재프로그래밍 인자 OCT4, SOX2, KLF4 및 임의로 c-MYC 또는 nanog 및 LIN28만을 성숙한 세포에 도입함으로써 생성된다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 유도 만능 줄기 세포는 재프로그래밍 인자를 2회 이상 성숙 세포에 도입함으로써 생성된다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포의 집단은 배상체(embryoid bodies) 또는 2D 부착 배양물을 사용하여 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로 분화된다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간은 적어도 8일이다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 응집 배지는 BMP4, SB-431542, CHIR99021, bFGF, VEGF, IL-6, IL-11, IGF-1, SCF, 및 EPO를 포함한다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 응집 배지는 10 ng/㎖ BMP4, 6 mM SB-431542, 3 mM CHIR99021, 5 ng/㎖ bFGF, 15 ng/㎖ VEGF, 10 ng/㎖ IL- 6, 5 ng/㎖ IL-11, 25 ng/㎖ IGF-1, 50 ng/㎖ SCF, 및 2 U/㎖ EPO를 포함한다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 방법은 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단에 대한 표면 마커의 발현을 이용하여 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 선택 또는 단리하는 단계를 추가로 포함한다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단은 CD45 음성/낮음인 것이다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단은 CD38 음성/낮음인 것이다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 방법은 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단 또는 CD3⁺ T 세포의 생성된 집단을 유전적으로 변형시키는 단계를 추가로 포함한다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 유전자 변형은 내인성(endogenous) HLA를 편집하는 것, 내인성 TCR을 제거하는 것, 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 것이다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제는 히스톤 3 라이신 잔기 9(H3K9) 및/또는 히스톤 3 라이신 잔기 27(H3K27)에 대한 메틸 기의 부가를 촉매화한다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 H3K9 및/또는 H3K27은 소분자 억제제 또는 핵산 억제제에 의해 억제된다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 H3K9 및/또는 H3K27 소분자 억제제는 이종유기(heterorganic) 화합물 또는 유기금속(organometallic) 화합물이다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 H3K9 및/또는 H3K27 소분자 억제제는 BIX-01294, UNC0638, E72, BRD4770, A-366, 케토신(chaetocin), UNC0224, UNC0631, UNC0646, EPZ005687, EPZ-6438(E7438), 3-데아잔플라노신 A(DZNep), EI1, GSK343, GSK126, 및 UNC1999로 이루어진 군에서 선택된다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 핵산 억제제는 히스톤 메틸트랜스퍼라제의 발현을 표적화하는 핵산이다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 핵산 억제제는 RNA 간섭 억제제 또는 작용제이다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 핵산 억제제는 EZH1에 결합하는 압타머, EZH1 특이적 RNA 간섭제(interference agent), 및 EZH1 특이적 RNA 간섭제를 코딩하는 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 EZH1 특이적 핵산이며, 여기서 RNA 간섭제는 서열번호: 11 내지 19로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상을 포함하는 것이다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 후성유전 조절인자는 DNA-메틸트랜스퍼라제(DNMT); 메틸-CpG-결합 도메인(MBD) 단백질; DNA 데메틸라제; 히스톤 메틸 트랜스퍼라제(HMT); 메틸-히스톤 결합 단백질; 히스톤 데메틸라제; 히스톤 아세틸 트랜스퍼라제(HAT); 아세틸 결합 단백질; 또는 히스톤 데아세틸라제(HDAC)이다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 후성유전 조절인자의 억제제는, UNC0224; MC1568; 및 CAY10591로 이루어진 군에서 선택된다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 후성유전 조절인자의 억제제는 적어도 500 nM의 농도로 제공된다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, CD34⁺ 세포의 집단으로부터 CD5⁺CD7⁺ proT 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간은 약 14일이다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, G9a 및/또는 GLP 억제제는 UNC0224; UNC0638; A366; BRD4770; BIX01294; UNC0642; UNC0631; UNC0646; UNC0321; E72; BIX-01338; BRD9539; 케토신; 및 DCG066으로 이루어진 군에서 선택된다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, G9a 및/또는 GLP 억제제는 UNC0224이다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, G9a 및/또는 GLP 억제제는 300nM 내지 5μM의 농도로 제공된다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, CD34⁺ 세포의 집단으로부터 CD5⁺CD7⁺ proT 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간은 약 14일이다.

한 양태에서, 본 명세서에는, (a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계; 및 (b) CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화 촉진하기 위해 적어도 4주 동안 10 ㎍/㎖ 노치 리간드의 존재 하에 15 ng/㎖ FLT3 및 25 ng/㎖ IL7을 포함하는 CD3+-T-세포 분화 배지에서 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계로서, 여기서 상기 CD3⁺-T-세포 분화 배지는 적어도 처음 2주 동안 5 ng/㎖ TPO 및 30 ng/㎖ SCF를 추가로 포함하는 것인, 단계를 포함하는 방법이 기술된다.

한 양태에서, 본 명세서에는, (a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계; 및 (b) CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화 촉진하기 위해 적어도 4주 동안 10 ㎍/㎖ 노치 리간드의 존재 하에 15 ng/㎖ FLT3 및 25 ng/㎖ IL7을 포함하는 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계로서, 여기서 상기 CD3⁺-T-세포 분화 배지는 적어도 처음 2주 동안 5 ng/㎖ TPO, 30 ng/㎖ SCF, 및 G9a/GLP 억제제를 추가로 포함하는 것인, 단계를 포함하는 방법이 기술된다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, CD3⁺ T 세포의 집단은 알파 베타 T 세포와 가장 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타낸다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, CD3⁺ T 세포의 집단은 알파 베타 T 세포와 적어도 10%, 20%, 30%, 40% 또는 그 이상 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타낸다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, CD3⁺ T 세포의 집단은 말초혈 알파 베타 T 세포와 비교하여 적어도 0.85인 피어슨 상관 계수를 갖는 유전자 발현 프로파일을 나타낸다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, CD3⁺ T 세포의 집단은 약 0.025의 생산적 심슨 클론형성능(Productive Simpson Clonality) 값을 나타낸다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, CD3⁺ T 세포의 집단은 메틸트랜스퍼라제의 억제 없이 또는 간질 세포를 이용하여 분화된 면역 세포에 비해 적어도 3개의 뉴클레오티드가 더 긴 T 세포 수용체(TCR) 상보성 결정 영역(CDR)을 나타낸다.

한 양태에서 본 명세서에는, 본 명세서에 기술된 것과 같은 방법에 의해 생성된 면역 세포가 기술된다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 면역 세포는 알파 베타 T 세포와 가장 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타낸다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 면역 세포는 알파 베타 T 세포와 적어도 10%, 20%, 30%, 40% 또는 그 이상 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타낸다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 면역 세포는 말초혈 알파 베타 T 세포와 비교하여 적어도 0.85인 피어슨 상관 계수를 갖는 유전자 발현 프로파일을 나타낸다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 면역 세포는 약 0.025의 생산적 심슨 클론형성능 값을 나타낸다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 면역 세포는 간질 세포를 이용하여 메틸트랜스퍼라제의 억제 없이 분화된 면역 세포에 비해 적어도 3개의 뉴클레오티드가더 긴 T 세포 수용체(TCR) 상보성 결정 영역(CDR)을 나타낸다.

본 명세서에 기술된 또 다른 양태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 면역 세포 또는 이의 집단을 포함하는 조성물이 제공된다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다.

한 양태에서, 본 명세서에는, 본 명세서에 기술된 것과 같은 면역 세포 또는 이의 집단, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 기술된다.

또 다른 양태에서, 본 명세서에는 대상체에서 세포 대체 요법에 사용하기 위한 본 명세서에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물이 제공된다.

한 양태에서 본 명세서에는, 본 명세서에 기술된 것과 같은 면역 세포 또는 이의 집단, 또는 본 명세서에 기술된 것과 같은 조성물, 또는 본 명세서에 기술된 것과 같은 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 수혜 대상체(recipient subject)에게 투여하는 것을 포함하는 세포 대체 요법의 방법이 기술된다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 수혜 대상체는 화학요법 및/또는 방사선조사(irradiation)를 받은 적이 있다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 수혜 대상체는 면역 기능 및/또는 림프구 재구성에 결함이 있다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 이식 전에, 면역 세포 또는 이의 집단은 수혜 대상체에서의 후속 생착을 촉진하기 위해 생체외에서(ex vivo) 프로스타글란딘 E2 및/또는 항산화제 N-아세틸-L-시스테인 (NAC)으로 처리된다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 면역 세포 또는 이의 집단은 수혜 대상체에 대해 자가의 것이다.

임의의 양태의 일부 실시형태에서, 면역 세포 또는 이의 집단은 수혜 대상체와 매칭되는 HLA 타입의 것이다.

도 1A-1D는 인간 만능 줄기 세포로부터 T 세포의 무-간질 분화를 보여주는 일련의 개략도 및 그래프이다. 도 1A는 무-간질 방법을 이용한 CD3⁺ T 세포의 분화를 보여주는 개략도이다. 요약하면, 비-조직 배양물로 처치된 플레이트를 재조합 인간 DL1/DL4-Fc 단백질로 코팅한다(PBS 중 10 ㎍/㎖, 실온에서 3시간). 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 조혈 줄기 세포 및 전구체 세포(HSPC; 예를 들어, CD34⁺ 조혈 내피세포)를 IL-7, 줄기 세포 인자(SCF), Flit3, 및 트롬보포이에틴(TPO)을 포함하는 배지 중의 노치 리간드(예를 들어, 델타 유사 표준 노치 리간드4(DLL4)) 코팅된 플레이트에서 배양한다. 2주 후, CD5⁺CD7⁺ T 세포 전구체(ProT)가 분화한다. ProT 세포는 IL-7 및 Flit3를 포함하는 배지 중의 DLL4-코팅된 플레이트에서 분화를 지속하고; 대략 3주가 더 지나면, CD3⁺ T 세포가 분화한다. 도 1B는 분화 2주 후(좌측 상단, 28.1% CD5⁺CD7⁺) 또는 분화 5주 후(우측 상단, 59.2% CD5⁺CD7⁺) CD5 및 CD7(예를 들어, T 세포 전구체에 대한 마커로서)의 발현과, 분화 2주 후(좌측 하단, 4.70% CD3⁺) 또는 분화 5주 후(우측 하단, 58.8% CD3⁺) CD3의 발현(예를 들어, T 세포에 대한 마커로서)을 보여주는 일련의 유세포 분석 플롯이다. 2주와 5주에 CD5⁺CD7⁺ T 세포 전구체의 높은 비율과 5주에 CD3⁺ T 세포의 높은 비율에 주목할 필요가 있다. 도 1C는 CD3/CD28 항체로 CD3⁺ 세포를 자극하기 전(좌측 플롯) 및 후(우측 플롯) CD4 및 CD8의 발현을 보여주는 일련의 유세포 분석 플롯이다. 자극 전과 비교하여 자극 후 CD4 및 CD8 단일-양성 세포의 비율이 더 높음에 주목할 필요가 있다. 도 1D는 OP9-DL1 간질 세포(좌측 플롯, 55.4% TCRgd⁺) 또는 본 명세서에 설명된 무-간질 방법(우측 플롯, 5.71% TCRgd⁺)를 사용하여 분화된 T 세포에 대한 TCRgd(예를 들어, 선천-유사 T 세포 또는 감마 델타 T 세포에 대한 마커로서)의 발현을 보여주는 일련의 유세포 분석 플롯이다. OP9-DL1 간질 세포 방법에 비해 무-간질 방법을 이용하면 TCRgd⁺ 선천적 유사 T 세포의 비율이 더 낮음에 주목할 필요가 있다.
도 2A-2D는 iPSC-유래 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포의 생성을 보여주는 일련의 개략도 및 플롯이다. 도 2a는 항-CD19 CAR의 iPSC HSPC 내로의 도입을 보여주는 개략도이고; T 세포 분화는 CAR iPS-T 세포의 집단을 생성한다. 도 2B는 다음 세포에서의 (예를 들어, CD19 CAR에 대한 마커로서) mCherry의 발현을 보여주는 일련의 유세포 분석 플롯이다: T 세포 분화를 거치지 않은 비형질도입된(UTD; untransduced) 대조군 세포(좌측 플롯, 0.95% mCherry⁺); T 세포 분화를 거치지 않은 CD19 CAR 형질도입된 세포(중간 플롯, 64.3% mCherry⁺); 및 T 세포 분화 후 CD19 CAR 형질도입된 세포(우측 플롯, 80.9% mCherry+). mCherry의 발현(예를 들어, CD19 CAR에 대한 마커로서)은 분화 동안 유지되었음에 주목할 필요가 있다. 도 2C는 배양 1주 동안의 UTD 대조군 및 CAR 형질도입된 세포의 T 세포 확대을 보여주는 선 그래프이다. 도 2D는 다음 세포에서의 CD8 및 CD107a의 발현을 보여주는 일련의 유세포 분석 플롯(예를 들어, 면역 세포 활성화 및 세포독성 탈과립화의 마커로서 CD107a 사용): 자극되지 않은 CAR-iPSC T 세포(좌측 플롯; 32.0% CD8^- CD107a^-, 55.0% CD8⁺ CD107a^-, 7.14% CD8^- CD107a⁺, 5.39% CD8⁺ CD107a⁺); CD19-K562 세포로 자극된 UTD-iPSC T 세포(중간 플롯; 28.0% CD8^- CD107a^-, 50.2% CD8⁺ CD107a^-, 11.7% CD8^- CD107a⁺, 10.1% CD8⁺ CD107a⁺); 및 CD19-K562 세포로 자극된 CAR-iPSC T 세포(우측 플롯; 29.1% CD8^- CD107a^-, 10.7 % CD8⁺ CD107a^-, 29.8% CD8^- CD107a⁺, 30.4% CD8⁺ CD107a⁺). 자극되지 않은 CAR-iPSC T 세포 및 자극된 UTD-iPSC T 세포와 비교하여 자극된 CAR-iPSC T 세포에서 CD107a의 증가된 발현에 주목할 필요가 있다.
도 3A-3B는 TCR 기능 및 활성에 관여하는 T 세포 시그니처 유전자(도 3A), 및 γδ T 세포로부터 αβ T 세포를 구별시키는 유전자(도 3B)의 발현 수준을 보여주는 일련의 히트맵이다. abT, 말초혈액 αβ T 세포; gdT, 말초 혈액 γδ T 세포; NK, 말초혈액 NK 세포; conT_OP9, OP9-DL4 공동-배양 시스템을 사용하는 ipsc-유래 T 세포; conT_SF, 무-간질 ipsc-T 세포; CB_T, 본 명세서에 기술된 무-간질 방법을 이용하여 제대혈 CD34+ HSPC로부터 분화된 T 세포; EZ_T, EZH1 녹다운이 있는 무-간질 ipsc-T 세포. 도 3A와 3B 모두에서, EZ_T 세포는 공여자의 말초혈액의 알파 베타 T 세포(abT; 각 히트맵의 마지막 6개 열 참조)와 가장 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타내는 반면, 다른 iPSC 유래 T 세포는 선천적-유사 세포(예를 들어, 감마 델타 T 또는 NK 세포)와 더 유사함에 주목할 필요가 있다. 도 3A-3B의 데이타에 기초하여, 피어슨의 상관 계수는 EZ-T와 abT 사이에서 0.8886의 값으로 계산되었다. 값의 범위는 -1에서 1까지일 수 있으며, 1은 완전한 양의 상관관계이다. 이 결과는 EZ-T 세포가 PBMC 알파 베타 T 세포와 매우 유사함을 나타낸다.
도 4는 EZ-T 세포가 다양한 TCR 레퍼토리를 나타낸다는 것을 보여주는 일련의 개략도이다. EZ-T 세포는 본 명세서에 기술된 바와 같은 EZH1 억제 및 무-간질 T 세포 분화를 포함하여 CD34+ HE로부터 분화된 T 세포를 지칭한다. EZ-T 세포에 대해 TCR 베타 사슬 시퀀싱을 수행했으며, T 세포 분화 중 무작위 TCR 유전자 재조합의 결과로 수만 개의 고유한 TCR 재배열이 확인되었다. 파이 차트(왼쪽)는 EZ-T 세포에서 T-세포 수용체 베타 사슬 가변(TCRBV) 유전자 패밀리의 사용을 보여준다. 각 음영은 하나의 TCRBV 패밀리를 나타낸다. 생산적인 심슨 클론형성능(Simpson Clonality) 값은 0.0233이었으며, 이는 TCR 레퍼토리가 매우 다양함을 나타낸다.
도 5A-5D는 EZ-T 세포가 대조군 PSC-T 세포보다 더 긴 CDR3 분절(segments)을 가짐을 보여주는 일련의 개략도 및 그래프이다. CDR3는 TCR의 가장 가변적인 영역이며, 그 길이는 TCR 재배열 동안 뉴클레오티드를 무작위로 추가하는, TdT 효소의 활성에 의해 결정될 수 있다. 도 5A는 TdT의 활성을 보여주는 개략도이다(예를 들어, 서열번호: 49-50 참조). CDR3는 성숙한 PBMC T 세포에 비해 미성숙 T 세포 및 iPSC 유래 T 세포에서 더 짧은 것으로 보고되었다. 도 5B-5E는 특정 길이의 생산적 TCR 재배열(예를 들어, 각 생산적 TCR 재배열이 고유한 TCR 사슬로 번역될 수 있음)의 백분율을 보여주는 일련의 막대 차트이다(도 5B는 6 내지 27개 뉴클레오티드(nt)의 CDR 길이를 나타내고; 도 5C는 30 내지 54개 nt의 CDR 길이를 나타내고; 도 5D는 57 내지 78개 nt의 CDR 길이를 나타냄). 도 5B-5E는 EZ-T 세포(어두운 회색, 각 그룹의 왼쪽 막대)가 대조군 iPSC-유래 T 세포(밝은 회색, 각 그룹의 오른쪽 막대; 대조군 iPSC-T 세포는 EZH1 녹다운 없이 무-간질 분화 방법을 이용하여 분화되었음)에 비해 증가된 CDR3 길이를 나타냄을 보여주며, PBMC T 세포와 더 유사했음(각 그룹에서 중간 회색, 중간 막대)을 입증한다.
도 6은 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 T 세포 분화 방법을 이용하여, T 세포 특성화(specification)를 촉진하는 후성유전 인자의 소분자 억제제에 대한 1차 스크린을 보여주는 개략도이다. "5F 세포"는 5개의 전사 인자(HOXA9, ERG, RORA, SOX4, 및 MYB)를 발현하는 세포를 의미한다. Cayman 후성유전학 라이브러리에는 다양한 후성유전 '작성자(writers) 및 제거자(erasers)' 및 '판독자(readers)' 단백질의 활성을 조절하는 것으로 알려진 140개 이상의 소분자가 포함되어 있다. 이에는 메틸트랜스퍼라제, 데메틸라제, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라제, 및 아세틸화된 히스톤 결합 단백질의 활성을 조절하는 화합물이 포함될 수 있으며; 예를 들어, caymanchem.com/product/11076/epigenetics-screening-library-(96-well) 참조.
도 7은 도 6에 기재된 스크린으로부터의 1차 히트(hits)의 식별을 보여주는 산점도이다. Z 스코어를 처치 후 T 전구체의 수에 기초하여 모든 소분자에 대해 계산했다. Z 스코어가 3보다 큰 임의의 소분자를 1차 히트로 간주했다. 예를 들어, 표 2를 참조.
도 8은 도 7에서 확인된 1차 히트로 처리한 후 5F HSPC로부터 생성된 proT 세포의 배수 변화를 보여주는 막대 차트이다(예를 들어, 표 2 참조). UNC0224, MC1568, 및 CAY10591의 3개의 소분자가 T 세포 특성화(specification)를 촉진하는 것을 확인했다.
도 9는 T 세포 분화 촉진을 위한 후성유전 인자의 소분자 억제제를 테스트하기 위해, 야생형 iPSC 유래 CD34+ 혈액생성 내피(HE) 세포(5F HSPC가 아닌, 예를 들어, 도 6-9 및 표 2에 사용된 바와 같음)를 사용하는 제2 스크린을 보여주는 개략도이다.
도 10A-10B는 도 9로부터의 스크린의 결과를 보여주는 일련의 그래프이다. 도 10A는 Z 스코어의 산점도이며, 처치 이후 T 전구체의 수에 기초하여 모든 소분자에 대해 계산했다. Z 스코어가 3보다 큰 모든 소분자를 1차 히트로 간주했다. 도 10b는 1차 히트의 검증을 나타내는 막대 그래프이다. 1차 히트를 3회 테스트했다. UNC0224 처치는 CD34⁺ HE 세포에서 생성된 proT 세포의 상당한 증가를 초래했다.
도 11은 2개의 독립적인 스크린으로 UNC0224가 T 세포 특성화를 향상시키기는 것으로 식별되었음을 보여주는 개략도이다. 예를 들어, 도 6-10, 표 2를 참조.
도 12A-12B는 UNC0224가 용량-의존적 방식으로 T 세포 특성화를 촉진함을 보여주는 일련의 개략도 및 그래프이다. 도 12A는 실험을 요약한 개략도이다(예를 들어, 도 6-11, 표 2 참조). 도 12B는 상이한 용량에서 UNC0224로 처리된 후 CD34+ HE 세포로부터 생성된 proT 세포의 배수 변화를 보여주는 막대 차트이다.
도 13A-13F는 G9 억제제가 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 분화 방법을 이용하여 T 세포 분화를 촉진한다는 것을 보여주는 일련의 개략도 및 그래프이다. 도 13A는 실험을 요약한 개략도이다(예를 들어, 도 6-12, 표 2 참조). 도 13B-13E는 상이한 용량에서 다른 G9a 억제제로 처리한 후 CD34+ HE 세포로부터 생성된 proT 세포의 배수 변화를 보여주는 막대 차트이다. 도 13B는 UNC0638에 대한 T 세포 분화 용량 반응을 보여준다. 도 13C는 A366에 대한 T 세포 분화 용량 반응을 나타낸다. 도 13D는 BRD4770에 대한 T 세포 분화 용량 반응을 나타낸다. 도 13E는 BIX01294에 대한 T 세포 분화 용량 반응을 나타낸다. 도 13F는 UNC0642에 대한 T 세포 분화 용량 반응을 나타낸다. UNC0224 외에, 적어도 4개의 소분자가 T 세포 분화를 촉진할 수 있으며: UNC0638; BRD4770; BIX01294; 및 UNC0642; 예를 들어, 표 3 참조.
도 14A-14C는 UNC0224가 적혈구/골수성 잠재력을 소비하면서 T 세포 순응(commitment)을 향상시킴을 보여주는 일련의 개략도 및 그래프이다. 도 14A는 UNC0224가 T 세포 분화에 특이적으로 영향을 미치는지 여부를 테스트한 개략도이다. iPSC 유래 CD34⁺ HE 세포를 UNC0224로 처리하고 CD34⁺CD45⁺ 조혈 줄기 세포 및 전구체 세포(HSPC)로 분화시켰다. 이들 HSPC를 사용하여 T 세포, 적혈구계 세포, 및 골수 세포를 생성하여 다분화능을 결정했다. 도 14B는 UNC0224(500nM) 처리 후 CD34⁺CD45⁺ HSPC 세포로부터 생성된 proT 세포의 배수 변화를 보여주는 막대 차트이다. UNC0224 처리는 CD5⁺CD7⁺ ProT 세포의 상당한 증가를 초래함에 주목할 필요가 있다. 도 14C는 콜로니-형성 단위(CFU) 분석에서 CD34⁺CD45⁺ HSPC로부터 생성된 콜로니의 상이한 유형의 수를 보여주는 막대 차트이다. E, 적혈구계; M, 대식세포; G, 과립구; GM, 과립구/대식세포; GEMM, 과립구/적혈구/대식세포/거핵구. UNC0224 처리는 적혈구계 또는 골수계 계통 세포의 상당한 감소를 초래함에 주목할 필요가 있다.
도 15A-15C는 UNC0224가 세포 증식보다 T 세포 특성화를 촉진한다는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 도 14B는 UNC0224(500nM) 처리 후 CD34⁺CD45⁺ HSPC 세포로부터 생성된 proT 세포의 배수 변화를 보여주는 막대 차트이다. UNC0224 처리는 CD5⁺CD7⁺ ProT 세포의 상당한 증가를 초래함에 주목할 필요가 있다. 도 14B는 DMSO 또는 UNC0224로 처리된 CD34⁺CD45⁺ HSPC의 T 세포 분화 14일 후 총 세포 수의 배수 변화를 보여주는 막대 차트이다. UNC0224 처리는 총 세포의 상당한 감소를 초래함에 주목할 필요가 있다. 도 14C는 DMSO 또는 UNC0224로 처리된 CD34⁺CD45⁺ HSPC로부터 생성된 proT 세포의 백분율을 보여주는 막대 차트이다. UNC0224 처리는 CD5⁺CD7⁺ ProT 세포의 백분율의 유의한 증가를 초래함에 주목할 필요가 있다. N=3, **** P≤0.0001.
도 16은 H3K9 메틸화 및 T 세포 분화에 관한 예시적인 가설을 보여주는 개략도이다. 이론에 구속되는 것을 원치 않으면서, H3K9 메틸화는 림프구계 유전자의 억제를 매개하는 것으로 예상된다. 이와 같이, H3K9 메틸화의 억제제를 사용한 처리(예를 들어, 도 6-15, 표 2-3 참조)는, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 T 세포 분화 방법을 이용할 때 T 세포 분화를 촉진한다.
도 17은 무-간질 방법을 이용한 CD3⁺ T 세포의 분화를 나타내는 개략도이다. 요약하면, 비-조직 배양 처리된 플레이트를 재조합 인간 DL1/DL4-Fc 단백질로 코팅한다(PBS 중 10 ㎍/㎖, 실온에서 3시간). 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 조혈 줄기 및 전구체 세포(HSPC; 예를 들어, CD34⁺ 조혈 내피세포)를 IL-7, 줄기 세포 인자(SCF), Flit3 및 트롬보포이에틴(TPO)가 포함된 배지 중의 노치 리간드(예를 들어, 델타 유사 표준 노치 리간드 4(DLL4)) 코팅된 플레이트에서 배양한다. 2주 후, CD5⁺CD7⁺ T 세포 전구체(ProT)가 분화한다. ProT 세포는 IL-7, SCF 및 Flit3를 포함하는 배지 중의 DLL4 코팅된 플레이트에서 분화를 지속하고; 대략 3주가 더 지나면, CD3⁺ T 세포가 분화한다.

상세한 설명

본 명세서에 기술된 기술의 실시형태는 T 세포를 분화시키는 방법을 포함한다. 한 양태에서, 본 명세서에 기술된 방법은 무-간질 T 세포 분화 방법, 즉 간질 세포 또는 임의의 다른 유형의 지지 세포와의 공동-배양을 포함하지 않는 방법이다. 마우스 간질 세포와 같은 간질 세포와의 공동 배양은 iPSC 유래 T 세포의 번역 잠재력을 제한하며; 예를 들어, 간질 세포의 존재로 인한 이식 거부의 우려가 있을 수 있다. 또한, 간질 세포를 사용하여 분화된 T 세포는 선천적-유사 표현형(예를 들어, 감마 델타 T 세포에 대한 마커인, TCRgd 발현에 의해 측정됨)을 나타낸다. T 세포는, 예를 들어, TCR α 및 β의 발현을 특징으로 하는 적응성 표현형을 나타내는 것이 바람직하다.

추가로, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 무-간질 T 세포 분화 방법은 간질 공동-배양을 포함하는 분화 방법과 비교하여 증가된 수의 CD3+ T 세포(예를 들어, CD4⁺CD8⁺ 세포)를 초래한다. 따라서, 간질 세포 방법 없이 분화된 T 세포는, 한 실시형태에서, 후성유전 조절인자(예를 들어, HMT; 예를 들어, EZH1, G9a/GLP)의 억제와 조합하여, 간질 공동-배양 방법과 비교하여 적어도 다음과 같은 예상치 못한 이점을 나타낸다: (1) 인간에서의 이식 잠재력 증가; (2) 선천적-유사 T 세포 수의 감소; (3) 생성된 T 세포(예를 들어, CD5⁺CD7⁺ Pro-T 세포; CD3⁺ T 세포; CD4⁺CD8⁺ T 세포; CD4⁺ T 세포; CD8⁺ T 세포; 알파-베타 T 세포)의 수 및/또는 백분율 증가; (4) 알파 베타 T 세포와 가장 유사한 유전자 발현 프로파일; (5) 보다 다양한 TCR 레퍼토리; 및/또는 (6) 증가된 TCR CDR 길이(예를 들어, 실시예 1, 도 1C-1D, 도 3A-3B, 도 4, 도 5A-5D, 도 6-16 참조).

분화 방법

한 양태에서, 본 명세서에는 (a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계; 및 (b) CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 노치 리간드의 존재 하에 CD3⁺ T-세포 분화 배지에서 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계를 포함하는 방법이 기술된다.

일부 실시형태에서, 방법은 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단에서 히스톤 메틸트랜스퍼라제를 억제하는 것을 추가로 포함한다. 이러한 억제는 T 세포로의 분화 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 한 양태에서, 본 명세서에는 (a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계; (b) 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단에서 히스톤 메틸트랜스퍼라제를 억제하는 단계; 및 (c) CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 노치 리간드의 존재 하에 CD3⁺ T-세포 분화 배지에서 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계를 포함하는 방법이 기술된다.

한 실시형태에서, CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단은 CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기 위해 적어도 4주 동안 10 ㎍/㎖ 노치 리간드의 존재 하에 100 ng/㎖ SCF, 100 ng/㎖ FLT3, 및 50 ng/㎖ IL7을 포함하는 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서 배양한다.

한 실시형태에서, CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단은 CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기 위해 적어도 4주 동안 10 μg/㎖ 노치 리간드의 존재 하에 100 ng/㎖ FLT3 및 50 ng/㎖ IL7을 포함하는 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서 배양한다.

한 실시형태에서, CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단은 CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기 위해 적어도 4주 동안 10 ㎍/㎖ 노치 리간드의 존재 하에 30 ng/㎖ SCF, 15 ng/㎖ FLT3, 및 25 ng/㎖ IL7을 포함하는 CD3⁺-T-세포 분화 배지 내에서 배양한다.

한 실시형태에서, CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단은 CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기 위해 적어도 4주 동안 10 ㎍/㎖ 노치 리간드의 존재 하에 15 ng/㎖ FLT3 및 25 ng/㎖ IL7을 포함하는 CD3⁺-T-세포 분화 배지 내에서 배양한다.

한 양태에서, 본 명세서에는 (a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계; 및 (b) CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화 촉진하기 위해 적어도 4주 동안 10 ㎍/㎖ 노치 리간드의 존재하에 15 ng/㎖ FLT3 및 25 ng/㎖ IL7을 포함하는 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서, 상기 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계를 포함하는 방법이 기술되며; 여기서 CD3⁺-T-세포 분화 배지는 적어도 처음 2주 동안 5 ng/㎖ TPO 및 30 ng/㎖ SCF를 추가로 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 명세서에는 (a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계; 및 (b) CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화 촉진하기 위해 적어도 4주 동안 10 ㎍/㎖ 노치 리간드의 존재하에 15 ng/㎖ FLT3 및 25 ng/㎖ IL7을 포함하는 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서, 상기 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계를 포함하는 방법이 기술되며; 여기서 CD3⁺-T-세포 분화 배지는 적어도 처음 2주 동안 5 ng/㎖ TPO, 30 ng/㎖ SCF, 및 G9a 억제제를 추가로 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 명세서에는 (a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계; 및 (b) CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화 촉진하기 위해 적어도 4주 동안 10 ㎍/㎖ 노치 리간드의 존재하에 100 ng/㎖ SCF, 100 ng/㎖ FLT3, 및 50 ng/㎖ IL7을 포함하는 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서, 상기 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계를 포함하는 방법이 기술되며; 여기서 CD3⁺-T-세포 분화 배지는 적어도 처음 2주 동안 TPO(50 ng/㎖)를 추가로 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 명세서에는 (a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계; 및 (b) CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화 촉진하기 위해 적어도 4주 동안 10 ㎍/㎖ 노치 리간드의 존재하에 100 ng/㎖ SCF, 100 ng/㎖ FLT3, 및 50 ng/㎖ IL7을 포함하는 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서, 상기 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계를 포함하는 방법이 기술되며; 여기서 CD3⁺-T-세포 분화 배지는 적어도 처음 2주 동안 TPO(50 ng/㎖) 및 G9a/GLP 억제제를 추가로 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 명세서에는 (a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계; 및 (b) CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화 촉진하기 위해 적어도 4주 동안 10 ㎍/㎖ 노치 리간드의 존재하에 100 ng/㎖ FLT3 및 50 ng/㎖ IL7을 포함하는 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서, 상기 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계를 포함하는 방법이 기술되며; 여기서 CD3⁺-T-세포 분화 배지는 적어도 처음 2주 동안 50 ng/㎖ TPO 및 100 ng/㎖ SCF를 추가로 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 명세서에는 (a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계; 및 (b) CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화 촉진하기 위해 적어도 4주 동안 10 ㎍/㎖ 노치 리간드의 존재하에 100 ng/㎖ FLT3 및 50 ng/㎖ IL7을 포함하는 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서, 상기 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계를 포함하는 방법이 기술되며; 여기서 CD3⁺-T-세포 분화 배지는 적어도 처음 2주 동안 50 ng/㎖ TPO, 100 ng/㎖ SCF, 및 G9a 억제제를 추가로 포함한다.

만능 줄기 세포

일부 실시형태에서, 무-간질 T 세포 분화 방법은 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 것을 포함한다. 만능 줄기 세포(PSC)는 모든 체세포 조직을 생성하는 잠재력을 갖는다. 본 명세서에 기술된 임의의 방법, 세포 또는 조성물의 한 실시형태에서, 만능 줄기 세포의 집단은 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 또는 배아 줄기 세포(ESC)이다. IPSC 및 ESC는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포의 집단은 배아 줄기 세포(ESC)를 포함한다. 배아 줄기 세포(ESC)는 인간 배아의 미분화 내부 덩어리 세포에서 유래한 줄기 세포이다.

PSC의 유도된(directed) 분화는 3개의 배엽층(germ layers)을 특성화함으로써 배아 발달을 재점검하여 환자-맞춤 조직을 생성하는 것을 목표로 한다. 모든 생식층에 걸친 유도된 분화에서의 공통된 주제는 PSC가 배아- 및 태아-유사 세포 유형을 생성하는 경향이며, 이는 성인 수혜자에서의 통합 및 기능에 문제를 야기한다. 이러한 구별은 개체발생 동안에 시간적으로 그리고 공간적으로 분리된 파동으로 나타나는, 조혈 시스템에서 특히 두드러진다. 가장 초기의 "원시성(primitive)" 전구체는 8.5 dpc의 난황낭에서 나타나며 제한된 레퍼토리의 대식세포, 거핵구 및 유핵 적혈구를 생성한다. 이러한 초기 배아-유사 전구체는 일반적으로 골수계-기반(myeloid-based)이며 기능적으로 성인 수혜자의 골수를 다시 채울 수 없다. 대조적으로, 조혈 줄기 세포(HSC) 잠재력을 가진 "확정성(definitive)" 세포는 나중에 대동맥-생식샘-중심콩팥(AGM; aorta-gonad-mesonephros) 및 기타 해부학적 부위 내의 동맥 내피세포에서 나타난다. PSC의 유도된 분화는, 초기 배아의 난황낭에서 발견되는 것과 유사한, 조혈 전구체 세포를 생성한다. 이들은 기능적 재구성 잠재력이 결여되어 있고, 골수 계통에 편향되어 있으며, 배아 글로빈을 발현한다. 따라서, 원시성 또는 확정성 계통의 발달을 촉진하는 주요 운명 결정 메커니즘을 이해하는 것은 PSC로부터 HSC, 및 기타 성인-유사 세포 유형(예를 들어, 적혈구)을 특정정하는 데 중요하다.

일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포(PSC)의 집단은 유도된 만능 줄기 세포(iPS 세포)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유도된 만능 줄기 세포는 재프로그래밍 인자 OCT4, SOX2, KLF4 및 임의로 c-MYC 또는 nanog 및 LIN28만을 성숙한 세포에 도입함으로써 생성된다. 일부 실시형태에서, 유도된 만능 줄기 세포는 재프로그래밍 인자를 성숙한 세포에 2회 이상 도입함으로써 생산된다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 만능 줄기 세포(PSC)는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)이다. iPSC를 사용하는 이점은 최종(eventual) 면역 세포가 재도입될 동일 대상체에서 세포로부터 유래될 수 있다는 것이다. 즉, 체세포를 대상체로부터 획득하여, 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하고, 그런 다음 형질감염시키고 변형된 면역세포(예를 들어, 자가 세포)로 분화시켜 대상체에게 투여할 수 있다. 전구세포는 본질적으로 자가 기원에서 유래하기 때문에, 다른 대상체 또는 대상체 그룹의 세포를 사용하는 것과 비교하여 생착 거부 또는 알레르기 반응의 위험이 감소된다. 일부 실시형태에서, iPSC를 생성하기 위한 세포는 비-자가 유래 공급원으로부터 유래된다. 또한, iPSC를 사용하면 배아 공급원에서 얻은 세포가 필요하지 않다. 따라서, 한 실시형태에서, 개시된 방법에 사용된 PSC는 배아 줄기 세포가 아니다.

분화는 생리학적 맥락에서 일반적으로 비가역적이지만, 체세포를 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하기 위한 여러 방법이 최근에 개발되었다. 예시적인 방법은 당업자에게 공지되어 있고 아래에 간략하게 설명되어 있다.

본 명세서에 사용된, 용어 "재프로그래밍"은 분화된 세포(예를 들어, 체세포)의 분화 상태를 변경하거나 역전시키는 과정을 지칭한다. 다시 말하면, 재프로그래밍은 세포의 분화를 역으로 미분화 또는 보다 원시적인 유형의 세포로 유도하는 과정을 의미한다. 많은 1차 세포를 배양에 배치하면 완전히 분화된 특성의 일부 손실이 야기될 수 있음에 주목하여야 한다. 따라서, 분화된 세포라는 용어에 포함된 이러한 세포를 단순히 배양하는 것은 이들 세포를 분화되지 않은 세포(예를 들어, 미분화 세포) 또는 만능 세포로 만들지 못한다. 분화된 세포의 만능성으로의 전환은 배양에서 분화된 특성의 부분적 손실로 이어지는 자극을 넘어서는 재프로그래밍 자극을 필요로 한다. 재프로그래밍된 세포는 또한 일반적으로 배양에서 오직 제한된 수의 분열에 대한 능력을 갖는, 1차 세포 부모에 비해, 성장 잠재력의 손실 없이 연장된 계대 능력의 특성을 갖는다.

재프로그래밍될 세포는 재프로그래밍 전에 부분적으로 또는 최종적으로 분화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍은 분화된 세포(예를 들어, 체세포)의 분화 상태를 만능 상태 또는 다능 상태로 완전히 복귀시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍은 분화된 세포(예를 들어, 체세포)의 분화 상태를 미분화된 세포(예를 들어, 배아-유사 세포)로 완전히 또는 부분적으로 복귀시키는 것을 포함한다. 재프로그래밍은 세포에 의한 특정 유전자의 발현을 초래할 수 있으며, 그 발현은 재프로그래밍에 추가로 기여한다. 본 명세서에 기술된 특정 실시형태에서, 분화된 세포(예를 들어, 체세포)의 재프로그래밍은 분화된 세포가 미분화된 상태(예를 들어, 미분화된 세포임)가 되도록 유발한다. 생성된 세포는 "재프로그래밍된 세포" 또는 "유도 만능 줄기 세포(iPSC 또는 iPS 세포)"로 지칭된다.

재프로그래밍은 세포 분화 동안 발생하는 핵산 변형(예를 들어, 메틸화), 염색질 응축, 후성유전 변화(epigenetic changes), 게놈 각인 등의 유전 가능한 패턴 중 적어도 일부의 변경, 예를 들어, 역전을 포함할 수 있다. 재프로그래밍은 이미 만능성인 세포의 기존의 미분화 상태를 단순히 유지하거나, 이미 다능성 세포인 세포(예를 들어, 일반 골수 줄기 세포)의 기존의 완전히 분화되지 않은 상태를 유지하는 것과는 구별된다. 재프로그래밍은 또한 이미 만능성 또는 다능성인 세포의 자가 재생 또는 증식을 촉진하는 것과 구별되지만, 일부 실시형태에서는 본 명세서에 기술된 조성물 및 방법이 이러한 목적을 위해 사용될 수도 있다.

체세포로부터 만능 줄기 세포를 생성하는 데 사용되는 특정 접근 방식 또는 방법(광범위하게 "재프로그래밍"으로 지칭됨)이 설명된 본 방법에 반드시 중요한 것은 아니다. 따라서, 체세포를 만능 표현형으로 재프로그래밍하는 임의의 방법은 본 명세서에 기술된 방법에 사용하기에 적절할 수 있다.

전사 인자의 정의된 조합을 사용하여 만능 세포를 생성하기 위한 재프로그래밍 방법론은 체세포로부터 만능 줄기 세포를 유도하기 위해 설명되었다. Yamanaka와 Takahashi는 Oct4, Sox2, Klf4, 및 선택적으로 c-Myc의 직접 형질도입에 의해 마우스 체세포를 발달 잠재력이 확대된 ES 세포 유사 세포로 전환시켰다. Yamanaka 및 Takahashi의 미국 특허 제8058065 및 9045738를 참조. iPSC는 만능성 관련 전사 회로와 많은 후성유전 랜드스케이프를 복원하기 때문에 ES 세포와 유사하다. 또한, 마우스 iPSC는 다능성에 대한 다음의 모든 표준 분석을 충족한다: 구체적으로, 3가지 배엽층의 세포 유형으로의 시험관내(in vitro) 분화, 기형종(teratoma) 형성, 키메라에 대한 기여, 생식선 전이(germline transmission), 및 4배체 보완(tetraploid complementation).

후속 연구는 인간 iPS 세포가 유사한 형질도입 방법을 이용하여 얻어질 수 있고, 전사 인자 트리오, OCT4, SOX2 및 NANOG가 만능성을 지배하는 전사 인자의 핵심 세트로서 확립되었음을 보여주었다. iPS 세포의 생산은 바이러스 벡터를 사용하여, 줄기 세포-관련 유전자를 코딩하는 핵산 서열을 성체 체세포에 도입함으로써 달성할 수 있다.

OCT4, SOX2, KLF4 및 c-MYC는 마우스 섬유아세포를 iPSC로 재프로그래밍하기 위해 확인된 원래의 4가지 전사 인자이다. 이 동일한 4가지 인자는 또한 인간 iPSC를 생성하기에 충분했다. OCT3/4 및 SOX2는 만능성 관련 유전자의 발현을 조절함으로써 만능성 네트워크의 핵심 전사 인자로서 기능한다. 크류펠-유사 인자 4(KLF4)는 마우스 ES 세포에서 LIF-STAT3 신호전달의 하류 표적이며 자가 재생을 조절한다. 인간 iPSC는 또한 4가지 대체 인자를 사용하여 생성할 수 있으며; OCT4와 SOX2가 필요하지만 KLF4와 c-MYC는 ES 세포와 초기 배아 모두에서 만능성 유지에 중요한 호메오박스 단백질인 NANOG와, RNA 결합 단백질인 LIN28로 대체될 수 있다. OCT4, SOX2, NANOG 및 LIN28 재프로그래밍 인자의 조합은 인간 iPSC를 생성하기에 충분한 것으로도 보고되었다.

본 명세서에 기술된 임의의 방법, 세포, 또는 조성물의 한 실시형태에서, iPSC는, 예를 들어, 오직 3개의 재프로그래밍 인자 OCT4, SOX2 및 KLF4의 외인성 카피를 성숙 또는 체세포에 도입함으로써 생성된다. 본 명세서에 기술된 임의의 방법, 세포, 또는 조성물의 한 실시형태에서, c-MYC, 또는 nanog 및/또는 LIN28은 성숙 또는 체세포로 분화하기 위해 OCT4, SOX2 및 KLF4의 외인성 유전자 코딩 카피를 갖는 iPSC에 추가로 도입된다. 본 명세서에 기술된 임의의 방법, 세포, 또는 조성물의 한 실시형태에서, iPSC는 재프로그래밍 인자 OCT4, SOX2, 및 KLF4의 외인성 카피를, 임의로 c-MYC 또는 nanog 및/또는 LIN28와 함께 도입하여 성숙 또는 체세포로 분화시킴으로써 생성된다.

본 명세서에 기술된 임의의 방법, 세포, 또는 조성물의 한 실시형태에서, iPSC는 성숙 세포를 적어도 하나의 벡터와 접촉시킴으로써 생성되며, 여기서 적어도 하나의 벡터는 재프로그래밍 인자 OCT4, SOX2, 및 KLF4의 외인성 유전자 코딩 카피, 및 임의로 c-MYC, 또는 nanog 및/또는 LIN28과 함께 성숙 또는 체세포로 분화되고, 여기서 재프로그래밍 인자는 접촉된 성숙 또는 체세포에서 생체내에서(in vivo) 발현된다. 접촉은 시험관내(in vitro) 또는 생체외에서(in vivo) 이루어진다. 분화에 필요한 재프로그래밍 인자는 모두 하나의 벡터(예를 들어, OCT4, SOX2, KLF4, 및 c-MYC의 외인성 유전자 코딩 카피를 운반하는 벡터)에 의해 발현될 수 있다. 대안적으로, 재프로그래밍 인자는 각각 iPSC에 접촉하는 데 사용되는 하나 이상의 벡터로 발현될 수 있다. 예를 들어, iPSC는 OCT4, SOX2의 외인성 유전자 코딩 카피를 운반하는 첫 번째 벡터와 KLF4 및 c-MYC를 코딩하는 외인성 유전자를 운반하는 두 번째 벡터에 의해 접촉될 수 있다.

임의의 개시된 방법의 한 실시형태에서, iPS 세포는 유전자 Oct4(Pou5f1), Sox2, cMyc, Klf4, Nanog, Lin 28 및 Glis1로 이루어진 군에서 선택되는 재프로그래밍 인자를 코딩하는 핵산 서열의 적어도 하나의 외인성 카피를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍 인자의 조합이 사용된다. 예를 들어, Oct4, Sox2, cMyc 및 Klf4로 이루어진 4개의 재프로그래밍 인자의 조합, 또는 Oct4, Sox2, Nanog 및 Lin 28로 이루어진 4개의 재프로그래밍 인자의 조합.

본 명세서에 기술된 임의의 방법, 세포, 또는 조성물의 한 실시형태에서, iPSC는 개시된 재프로그래밍 인자, 또는 재프로그래밍 인자의 임의의 조합을 성숙 또는 체세포에 2회 이상 도입함으로써 생성된다. 한 실시형태에서, 재프로그래밍 인자의 조합은 조합이 1회 이상 iPSC에 도입될 때 상이하며, 예를 들어, Oct4(Pou5f1), Sox2, cMyc, Klf4, Nanog의 조합이 먼저 iPSC에 도입되고, Oct4(Pou5f1), Sox2, cMyc의 조합은 이후에 iPSC에 도입된다. 본 명세서에 기술된 임의의 방법, 세포, 또는 조성물의 한 실시형태에서, iPSC는 성숙한 세포를 성숙한/체세포 내로 2회 이상 개시된 벡터(들) 인자와 접촉시킴으로써 생산된다.

일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포(예를 들어, iPSC)의 집단은 노치 리간드의 존재 하에 분화되지 않는다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포(예를 들어, iPSC) 집단의 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기 위해 사용되는 응집 배지는 노치 리간드를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포(예를 들어, iPSC) 집단을 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로 분화시키는 동안 사용되는 세포 배양 용기는 노치 리간드를 포함하지 않는다.

iPS 세포는 최종 분화된 체세포 뿐만 아니라, 성체 줄기 세포, 또는 체세포 줄기 세포로부터 생성되거나 유래될 수 있다. 즉, 비-만능성 전구체 세포는 재프로그래밍에 의해 만능성 또는 다능성이 될 수 있다. 그러한 경우에, 최종 분화 세포를 재프로그래밍하는 데 필요한 만큼의 재프로그래밍 인자를 포함할 필요가 없을 수 있다. 또한, 재프로그래밍은 재프로그래밍 인자의 비-바이러스성 도입에 의해, 예를 들어, 단백질 자체를 도입함으로써, 또는 재프로그래밍 인자를 코딩하는 핵산을 도입함으로써, 또는 번역 시에 재프로그래밍 인자를 생성하는 메신저 RNA를 도입함으로써 유도될 수 있다(예를 들어, 문헌[Warren et al., Cell Stem Cell, 2010 Nov 5;7(5):618-30] 참조, 이 참고문헌은 그 전문이 참조로 본 명세서에 통합된다). 재프로그래밍은, 예를 들어, Oct-4(Oct-3/4 또는 Pouf51로도 알려짐), Sox1, Sox2, Sox3, Sox 15, Sox 18, NANOG, Klf1, Klf2, Klf4, Klf5, NR5A2, c-Myc, l-Myc, n-Myc, Rem2, Tert, 및 LIN28를 포함하는 줄기 세포-관련 유전자를 코딩하는 핵산 조합을 도입함으로써 달성될 수 있다. 한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물을 사용한 재프로그래밍은 Oct-3/4, Sox 패밀리의 구성원, Klf 패밀리의 구성원, 및 Myc 패밀리의 구성원 중 하나 이상을 체세포에 도입하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물은 재프로그래밍을 위해 Oct 4, Sox2, Nanog, c-MYC 및 Klf4 각각 중 하나 이상을 도입하는 것을 추가로 포함한다. 위에서 언급한 바와 같이, 재프로그래밍에 사용된 정확한 방법은 본 명세서에 설명된 방법 및 조성물에 반드시 중요한 것은 아니다. 그러나, 재프로그래밍된 세포로부터 분화된 세포가, 예를 들어, 인간 요법에 사용되는 경우, 한 실시형태에서, 재프로그래밍은 게놈을 변경하는 방법에 의해 영향을 받지 않는다. 따라서, 이러한 실시형태에서, 예를 들어, 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 사용하지 않고 재프로그래밍이 달성된다.

출발 세포의 집단으로부터 유래된 재프로그래밍의 효율(즉, 재프로그래밍된 세포의 수)은, 각 문헌의 내용이 그 전문으로 본 명세서에 참조로 통합되는, 문헌[Shi, Y., et al (2008) Cell-Stem Cell 2:525-528, Huangfu, D., et al(2008) Nature Biotechnology 26(7):795-797 및 Marson, A., et al(2008) Cell-Stem Cell 3:132-135]에 나타난 바와 같이 다양한 소분자의 첨가에 의해 향상될 수 있다. 따라서, 유도 만능 줄기 세포 생산의 효율 또는 속도를 향상시키는 작용제 또는 작용제의 조합은 환자-특이적 또는 질병-특이적 iPSC의 생산에 사용될 수 있다. 재프로그래밍 효율을 향상시키는 작용제의 일부 비제한적 예에는 가용성 Wnt, Wnt 조절 배지, BIX-01294(G9a 히스톤 메틸트랜스퍼라제), PD0325901(MEK 억제제), DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제, 발프로산, 5'-아자시티딘, 덱사메타손, 수베로일아닐리드 하이드록삼산(SAHA), 비타민 C, 트리코스타틴(TSA) 등을 포함한다.

재프로그래밍 향상제의 다른 비제한적 예는 수베로일아닐리드 히드록삼산(SAHA(예를 들어, MK0683, 보리노스타트) 및 기타 히드록삼산), BML-210, 데푸데신(예를 들어, (-)-데푸데신), HC 독소, 널스크립트(Nullscript)(4-(1,3-디옥소-1H,3H-벤조[de]이소퀴놀린-2-일)-N-하이드록시부탄아미드), 페닐부티레이트(예를 들어, 소듐 페닐부티레이트) 및 발프로산((VPA) 및 기타 단쇄 지방 산), 스트립타이드(Scriptaid), 수라민 소듐, 트리코스타틴 A(TSA), APHA 화합물 8, 아피시딘, 소듐 부티레이트, 피발로일옥시메틸 부티레이트(Pivanex, AN-9), 트라폭신 B, 클라미도신, 뎁시펩티드(FR901228 또는 FK228로도 알려짐), 벤즈아미드(예를 들어, CI-994(예를 들어, N-아세틸 디날린) 및 MS-27?275), MGCD0103, NVP-LAQ-824, CBHA(m-카르복시신남산 비스히드록삼산), JNJ16241199, 투바신, A-161906, 프록사미드, 옥삼플라틴, 3-Cl-UCHA(예를 들어, 6-(3-클로로페닐우레이도)카프로산 하이드록삼산), AOE(2-아미노-8-옥소-9,10-에폭시데칸산), CHAP31 및 CHAP 50를 포함한다. 기타 재프로그래밍 향상제는, 예를 들어, HDAC의 우성 음성 형태(예를 들어, 촉매 불활성 형태), HDAC의 siRNA 억제제, 및 HDAC에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 이러한 억제제는, 예를 들어, BIOMOL International, Fukasawa, Merck Biosciences, Novartis, Gloucester Pharmaceuticals, Aton Pharma, Titan Pharmaceuticals, Schering AG, Pharmion, MethylGene, 및 Sigma Aldrich로부터 입수가능하다.

본 명세서에 기술된 방법과 함께 사용하기 위한 만능 줄기 세포의 유도를 확인하기 위해, 줄기 세포 마커의 발현에 대해 단리된 클론을 시험할 수 있다. 체세포에서 유래된 세포에서의 이러한 발현은 세포를 유도 만능 줄기 세포로 식별한다. 줄기 세포 마커는 SSEA3, SSEA4, CD9, Nanog, Fbx15, Ecat1, Esg1, Eras, Gdf3, Fgf4, Cripto, Dax1, Zpf296, Slc2a3, Rex1, Utf1, 및 Nat1을 포함하는 비제한적인 군으로부터 선택될 수 있다. 한 실시형태에서, Oct4 또는 Nanog를 발현하는 세포는 만능으로서 확인된다. 이러한 마커의 발현을 검출하는 방법은, 예를 들어, RT-PCR 및 코딩된 폴리펩티드의 존재를 검출하는 면역학적 방법, 예컨대 웨스턴 블롯 또는 유세포 분석을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출은 RT-PCR 뿐만 아니라 단백질 마커의 검출도 포함한다. 세포내 마커는 RT-PCR을 통해 가장 잘 식별될 수 있는 반면, 세포 표면 마커는, 예를 들어, 면역세포화학에 의해 쉽게 식별된다.

단리된 세포의 만능 줄기 세포 특성은 3개의 배엽층 각각의 세포로 분화하는 iPSC의 활성을 평가하는 테스트에 의해 확인될 수 있다. 한 예로서, 누드 마우스에서 기형종 형성을 사용하여 분리된 클론의 만능 특성을 평가할 수 있다. 세포를 누드 마우스에 도입하고, 세포에서 발생하는 종양에 대해 조직학 및/또는 면역조직화학을 수행한다. 예를 들어, 3개의 모든 배엽층의 세포를 포함하는 종양의 성장은 세포가 만능 줄기 세포임을 추가로 나타낸다.

많은 미국 특허 및 특허 출원 공개는 iPSC를 생성하는 방법 및 관련 발명주제에 대해 가르치고 기술한다. 예를 들어, 미국 특허 제8058065호, 제9347044호, 제9347042호, 제9347045호, 제9340775호, 제9341625호, 제9340772호, 제9250230호, 제9132152호, 제9045738호, 제9005975호, 제9005976호, 제8927277호, 제8993329호, 제8900871호, 제8852941호, 제8802438호, 제8691574호, 제8735150호, 제8765470호, 제8058065호, 제8048675호, 및 미국 공개특허 제20090227032호, 제20100210014호, 제20110250692호, 제20110201110호, 제20110200568호, 제20110223669호, 제20110306516호, 제20100021437호, 제20110256626호, 제20110044961호, 제20120276070호, 제20120214243호, 제20120263689호, 제20120128655호, 제20120100568호, 제20130295064호, 제20130029866호, 제20130059386호, 제20130183759호, 제20130189786호, 제20130295579호, 제20130130387호, 제20130157365호, 제20140234973호, 제20140227736호, 제20140093486호, 제20140301988호, 제20140170746호, 제20140178989호, 제20140349401호, 제20140065227호, 및 제20150140662호가 있으며, 상기 특허문헌 모두는 이들 전문이 본 명세서에 참조로 통합된다.

일부 실시형태에서, iPSC는 체세포로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에 사용된 체세포는 생식계열 세포를 제외한 유기체의 신체를 형성하는 임의의 세포를 지칭한다. 포유동물 신체의 모든 세포 유형-정자와 난자, 이것들이 만들어지는 세포(배우자 세포) 및 미분화 줄기 세포를 제외함-은 분화된 체세포이다. 예를 들어, 내장, 피부, 뼈, 혈액, 및 결합 조직은 모두 분화된 체세포로 구성된다. 본 명세서에 기술된 임의의 방법, 세포, 또는 조성물의 한 실시형태에서, iPS 세포가 만들어지는 성숙한 세포는 B 림프구(B-세포), T 림프구(T-세포), 및 섬유아세포 및 각질세포와 같은 임의의 체세포를 포함한다.

본 명세서에 기술된 조성물 및 방법과 함께 사용하기 위한 추가의 체세포 유형은 다음을 포함한다: 섬유아세포(예를 들어, 1차 섬유아세포), 근육 세포(예를 들어, 근세포), 난구 세포, 신경 세포, 유선 세포, 간세포 및 췌장 섬 세포. 일부 실시형태에서, 체세포는 1차 세포주이거나 또는 1차 또는 2차 세포주의 자손이다. 일부 실시형태에서, 체세포는 인간 샘플, 예를 들어, 모낭, 혈액 샘플, 생검(예를 들어, 피부 생검 또는 지방 생검), 면봉 샘플(예를 들어, 구강 면봉 샘플), 따라서 인간의 체세포이다.

분화된 체세포의 일부 비제한적인 예에는 상피, 내피, 신경 세포, 지방 세포, 심장, 골격근, 피부, 면역 세포, 간, 비장, 폐, 말초 순환 혈액 세포, 위장관, 신장, 골수, 및 췌장 세포가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 체세포는 뇌, 간, 장(gut), 위, 내장(intestine), 지방, 근육, 자궁, 피부, 비장, 내분비 기관, 뼈 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 체세포로부터 단리된 1차 세포일 수 있다. 또한, 체세포는 뮤린, 소, 유인원, 돼지, 말, 양, 또는 인간 세포를 포함하는 비제한적인 예와 함께, 임의의 포유동물 종으로부터 유래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 체세포는 인간 체세포이다.

재프로그래밍된 세포가 질병의 치료적 치료에 사용되는 전구체 세포의 생성에 사용되는 경우, 치료되는 환자로부터 분리된 체세포를 사용하는 것이 바람직하지만 필수적인 것은 아니다. 예를 들면, 질병에 관여하는 체세포, 질병의 치료에 관여하는 체세포 등을 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍된 세포 및 이들이 유도되거나 생성된 체세포를 포함하는 이종 집단으로부터 재프로그래밍된 세포를 선택하는 방법은 임의의 공지된 수단에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 선택 마커 유전자와 같은 약물 내성 유전자 등은 선택 마커를 지표로 사용하여 재프로그래밍된 세포를 분리하는데 사용될 수 있다.

본 명세서에 개시된 재프로그래밍된 체세포는, 알칼리성 포스파타제(AP); ABCG2; 단계 특이적 배아 항원-1(SSEA-1); SSEA-3; SSEA-4; TRA-1-60; TRA-1-81; Tra-2-49/6E; ERAs/ECAT5, E-카드헤린; 베타-III-튜불린; 알파 평활근 액틴(α-SMA); 섬유아세포 성장 인자 4(Fgf4), Cripto, Dax1; 징크 핑거 단백질 296(Zfp296); N-아세틸트랜스퍼라제-1(Nat1); (ES 세포 관련 전사체 1(ECAT1); ESG1/DPPA5/ECAT2; ECAT3; ECAT6; ECAT7; ECAT8; ECAT9; ECAT10; ECAT15-1; ECAT15-2; Fthl17; Sal14; 미분화 배아 세포 전사 인자(Utf1); Rex1; p53; G3PDH; TERT를 포함하는, 텔로머라제; 침묵 X 염색체 유전자; Dnmt3a; Dnmt3b; TRIM28; F-박스 포함 단백질 15(Fbx15); Nanog/ECAT4; Oct3/4; Sox2; Klf4; c-Myc; Esrrb; TDGF1; GABRB3; Zfp42, FoxD3; GDF3; CYP25A1; 발달 다능성 관련 2(DPPA2); T-세포 림프종 중단점 1(Tcl1); DPPA3/Stella; DPPA4; 다능성에 대한 기타 일반 마커 등을 포함하는, 임의의 수의 만능 세포 마커를 발현할 수 있다. 기타 마커로는 Dnmt3L; Sox15; Stat3; Grb2; β-카테닌, 및 Bmi1을 포함할 수 있다. 이러한 세포는 또한 유도 만능 줄기 세포가 유래된 체세포의 특징적인 마커의 하향-조절을 특징으로 할 수 있다. 한 실시형태에서, iPSC는 성숙하고 분화된 체세포로부터 유래된다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 분화 방법에 사용된 만능 줄기 세포의 집단은 환자 샘플로부터 정제된 CD34⁺ HSPC 또는 다능성 림프구계 전구체(MLP)를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포의 집단은 제대혈 또는 골수 샘플로부터 정제되거나 단리된 줄기 세포를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포의 집단은 환자 샘플(예를 들어, 제대혈 또는 골수)로부터 단리된 줄기 세포로부터 유래되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 만능 줄기 세포의 집단은 환자의 체세포 샘플로부터 유래된 것과 같은 iPSC를 포함한다. 예를 들어, 다음 문헌 참조: Tabatabaei-Zavareh et al., J Immunol May 1, 2017, 198(1 Supplement) 202.9.

혈액생성 내피세포

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법은 만능 줄기 세포(예를 들어, iPSC)의 집단을 조혈 잠재력을 갖는 세포의 집단으로 분화시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조혈 잠재력을 갖는 세포의 집단은 조혈 내피 및/또는 조혈 줄기 세포(HSC)를 포함한다. 조혈 잠재력을 갖는 세포(예를 들어, 조혈 내피세포, HSC)는 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 생성될 수 있다.

hPSC로부터 HSC를 생성하기 위한 하나의 예시적인 접근법은 개체유전적(ontogenetic) 전구체로부터 HSC를 특성화하는 것이다. 현재 HSC는 대동맥-생식샘-중신콩팥(AGM) 중의 혈액생성 내피세포(HE)와 다른 해부학적 부위 중의 동맥 내피세포에서 기원한다는 것이 널리 받아들여지고 있다. hPSC에서 HE의 직접적인 분화에 대한 최근 연구는 원시성 또는 확정성 집단의 출현을 제어하는 일부 신호 전달 경로에 대한 귀중한 통찰력을 제공했으며; 그러나, 내피세포에서 조혈세포로의 전환(예를 들어, HE에서 HSC로)은 인간 조혈 발달에서 불완전하게 이해된 상태로 남아 있다.

본 명세서에 사용된, 용어 "혈액생성 내피세포(hemogenic endothelium)"는 조혈 세포로 분화할 수 있는 혈관 내에 흩어져 있는 내피 세포의 독특한 서브세트를 지칭한다. 발달 중인 마우스에서, HSC는 대동맥-생식선-중신 영역 내에 위치한 혈액생성 잠재력이 있는 작은 집단의 내피 세포(혈액생성 내피세포)에서 배아 발생 10.5일째부터 발생한다. 내피에서 조혈로의 전이(EHT)로 알려진 과정에서, 대동맥 바닥의 내피 세포는 둥글게 모여서 혈관외 공간으로 발아한 다음 이어서 하부 정맥(underlying vein)을 통해 순환계로 재진입한다. 일부 실시형태에서, 혈액생성 내피세포의 특성을 포함하는 세포의 집단은 만능 줄기 세포(예를 들어, iPSC)의 집단으로부터 시험관내에서(in vitro) 분화된다. 상기 "혈액생성 내피세포의 특성을 포함하는 세포"는 또한 본 명세서에서 혈액생성 내피세포로 지칭될 수 있다.

만능 줄기 세포(PSC)로부터 HSC를 유도하려는 노력은 배아 조혈(embryonic hematopoiesis)은 원시성 및 확정성의 두 가지 프로그램으로 구성되지만, 확정성 조혈만이 조혈모세포를 생성하고 따라서 림프 계통을 생성한다는 사실로 인해 복잡하다. T-림프 잠재력에 의해 측정되는 바와 같이, 확정성 조혈은 원시성 조혈 프로그램의 확립 후에 나타나며, 조혈 내피세포의 특성을 나타내는 선조 집단에서 발달한다.

일부 실시형태에서, 무-간질 T 세포 분화 방법은 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포는 확정성 조혈을 겪을 수 있고/있거나 림프 잠재력을 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 혈액생성 내피세포는 분화하거나 조혈 줄기 세포(HSC)로 분화된다.

일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포(예를 들어, iPSC)의 집단은 배상체(EB) 또는 2D 부착 배양물을 사용하여 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로 분화된다; 예를 들어, 본 명세서에 참조로 통합되는, 문헌[Pineda et al., Differentiation patterns of embryonic stem cells in two versus three dimensional culture, Cells Tissues Organs. 2013; 197(5): 399-410] 참조. EB는 혈청 존재하에 시험관 내에서(in vitro) 생산 및 배양된 만능성 줄기 세포의 3차원 집합체이다. EB는 원시성 및 확정성 조혈 전구체 세포 유형의 혼합물을 생성할 수 있다. 원시성 선조는 배아 발달의 초기 단계에서 생체내에서(in vivo) 자연적으로 발생하는 것과 동일하지만, 성숙의 후기 단계에서 배아 집단은 성체 조혈의 전형적인 세포와 유사하게 행동하는 확정성 선조 세포를 발생시킨다.

일부 실시형태에서, CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간은 적어도 8일(예를 들어, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10일, 또는 그 이상)이다. 일부 실시형태에서, CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간은 최대 8일, 최대 9일, 최대 10일 또는 그 이상이다.

일부 실시형태에서, 응집 배지는 BMP4, SB-431542, CHIR99021, bFGF, VEGF, IL-6, IL-11, IGF-1, SCF, 및 EPO 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 응집 배지는 10 ng/㎖ BMP4, 6 mM SB-431542, 3 mM CHIR99021, 5 ng/㎖ bFGF, 15 ng/㎖ VEGF, 10 ng/㎖ IL-6, 5 ng/㎖ IL-11, 25 ng/㎖ IGF-1, 50 ng/㎖ SCF, 및 2 U/㎖ EPO을 포함하며; 예를 들어, 본 명세서에 제시된 실시예 2 및 표 1 참조.

일부 실시형태에서, 응집 배지의 성분은 만능 줄기 세포가 혈액생성 내피세포로 분화되는 동안 변화된다. 비제한적 예로서, 배상체는 BMP4의 존재 하에, 이어서 단계-특이적인 bFGF, VEGF, 및 조혈 사이토카인(예를 들어, IL-6, IL-11, IGF-1, SCF 및 EPO) 첨가에 의해 분화된다. 액티빈-결절(Activin-nodal) 신호전달은 2일과 3일 사이에 (예를 들어, SB-431542 및 CHIR99021 사용하여) 조작될 수 있다. 예를 들어, 하기 실시예 2 참조; 및 본 명세서에 참조로 통합되는, 문헌[Sturgeon et al., Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells, Nat Biotechnol. 2014 Jun; 32(6): 554-561] 참조.

일부 실시형태에서, 응집 배지는 분화 0, 1 및/또는 2일 동안 BMP(예를 들어, 10 ug/㎖ BMP)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 응집 배지는 분화 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일 동안 BMP를 포함하지 않는다.

일부 실시형태에서, 응집 배지는 분화 2일 동안 SB-431542(예를 들어, 6mM SB-431542) 및/또는 CHIR99021(예를 들어, 3mM CHIR99021)을 포함한다. SB-431542는 액티빈-결절 신호전달의 소분자 길항제(antagonist)이다. CHIR99021은 GSK-3 억제제이자 Wnt 효능제(agonist)이다. 액티빈-결절 신호전달의 억제 및 Wnt 신호전달의 활성화는 PSC 분화를 림프구 잠재력을 갖는 확정성 전구세포(KDR⁺CD235a^-)로 유도하는 것으로 나타났다(예를 들어, 본 명세서에 참조로 통합되는, Sturgeon 2014, 전게서 참조). 일부 실시형태에서, 응집 배지는 분화 0, 1, 3, 4, 5, 6, 7 및/또는 8일 동안 SB-431542 및/또는 CHIR99021을 포함하지 않는다.

일부 실시형태에서, 응집 배지는 분화 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 및/또는 8일 동안 bFGF(예를 들어, 5 ng/㎖ bFGF)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 응집 배지는 분화 0일 동안 bFGF를 포함하지 않는다.

일부 실시형태에서, 응집 배지는 분화 3, 4, 5, 6, 7, 및/또는 8일 동안 VEGF(예를 들어, 15 ng/㎖ VEGF)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 응집 배지는 분화 0, 1, 또는 2일 동안 VEGF를 포함하지 않는다.

일부 실시형태에서, 응집 배지는 분화 6, 7, 및/또는 8일 동안 조혈 사이토카인(들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 응집 배지는 분화 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5일 동안 조혈 사이토카인(들)을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 조혈 사이토카인은 IL-6(예를 들어, 10 ng/㎖ IL-6), IL-11(예를 들어, 5 ng/㎖ IL-11), IGF-1(예를 들어, 25 ng/㎖ IGF-1), SCF(예를 들어, 50 ng/㎖ SCF), 및 EPO(예를 들어, 2 U/㎖ EPO)로 이루어진 군에서 선택된다.

일부 실시형태에서, 분화 방법은 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단에 대한 표면 마커의 발현을 이용하여 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 선택하거나 단리하는 것을 추가로 포함한다. 혈액생성 내피세포를 선택하거나 분리하는 방법의 비제한적 예는 자기 활성화 세포 분류(MACS) 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혈액생성 내피세포에 대한 표면 마커는 CD34(예를 들어, 높은 CD34 표면 발현)이다.

일부 실시형태에서, 혈액생성 내피세포에 대한 추가의 양성 또는 음성 마커는 CD45, CD38, KDR, CD235, 및 CD43을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단은 CD45 음성/낮음이다. 일부 실시형태에서, CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단은 CD38 음성/낮음이다. 일부 실시형태에서, CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단은 KDR⁺이다. 일부 실시형태에서, CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단은 CD235 음성/낮음이다. 일부 실시형태에서, CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단은 CD43 음성/낮음이다.

일부 실시형태에서, 혈액생성 내피세포 및/또는 HSC는 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 생성된다. 비제한적 예로서, PSC를 혈액생성 내피세포로 분화시키는 방법은 ERG, HOXA5, HOXA9, HOXA10, LCOR, RUNX1, 및/또는 SPI1과 같은 전사 인자의 도입을 포함할 수 있다; 예를 들어, 각각의 내용이 그 전문으로 본 명세서에 참조로 통합되는, 다음 문헌 참조: 국제 출원 WO 2018/048828, 미국 특허출원 2019/0225940, Doulatov et al., Cell Stem Cell. 2013 October 3, 13(4); Vo et al., Nature 2018, 553(7689): 506-510.

일부 실시형태에서, 혈액생성 내피세포는 PSC로부터 유래되지 않고 오히려 내피 세포로부터 직접 유래된다. 예를 들어, 내피 세포(예를 들어, 폐, 뇌 및 기타 조직으로부터의 것)는 전사 인자(예를 들어, Fosb, Gfi1, Runx1, 및 Spi1)의 형질도입 및 불멸화 내피 세포주와의 공동 배양에 의해 혈액생성 내피세포로 직접 재프로그래밍될 수 있으며; 내피 세포는 세포-외부(cell-extrinsic) 인자(예를 들어, 혈청, SB-431542, 및/또는 내피 유사분열원)에 추가로 노출될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참조로 통합되는 다음 문헌 참조: Lis et al., Nature. 2017 May 25, 545(7655):439-445; Blaser and Zon, Blood. 2018 Sep 27; 132(13): 1372-1378.

후성유전 조절인자의 억제

일부 양태에서, 본 명세서에는 적어도 하나의 후성유전 조절인자를 억제하는 단계를 포함하는 T-세포 분화 방법이 기술된다. 본 명세서에 사용된, 용어 "후성유전 조절인자(epigenetic regulator)"는 DNA 메틸화 및/또는 히스톤 변형(예를 들어, 히스톤 아세틸화, 히스톤 메틸화)에 영향을 미치고, 그 자체로 게놈의 뉴클레오티드 서열을 변경(예를 들어, 치환 또는 결실)하지 않고 유전자의 전사 수준에 영향을 미치는 인자, 예를 들어, 폴리펩티드, 예를 들어, 효소를 지칭한다. 후성유전 조절인자의 비제한적 예는 다음을 포함한다: DNA-메틸트랜스퍼라제(DNMT; 예를 들어, DNMT1; DNMT3a; DNMT3b); 메틸-CpG-결합 도메인(MBD) 단백질(예를 들어, MeCP2; MBD1; MBD2; MCD4; KAISO; ZBTB4; ZBTB38; UHRF2); DNA 데메틸라제(예를 들어, 5'-메틸사이토카인 하이드록실라제; TET1; TET2; TET3); 히스톤 메틸 트랜스퍼라제(HMT; 예를 들어, SUV39s; SET1s; EZH1; EZH2; Set2s; PRDMs; SMYDs; DOT1L; PRMTs; G9a; GLP); 메틸-히스톤 결합 단백질(예를 들어, HP1; Chd1; BPTF; L3MBTL1; ING2; BHC80; JMJD2A); 히스톤 데메틸라제(예를 들어, KDM; 예를 들어, LSD; JHDM; JMJD; JARID; Uts; PHF); 히스톤 아세틸 트랜스퍼라제(HAT; 예를 들어, HAT1; GCN5; PCAF; MYSTs; p300; CBP; SRC/p160); 아세틸-결합 단백질(예를 들어, BROMO-도메인, DPF-도메인, 또는 YEATS-도메인-함유 단백질); 히스톤 데아세틸라제(HDAC; 예를 들어, HDAC1; HDAC2; HDAC3; HDAC4; HDAC5; HDAC6; HDAC7; HDAC8; HDAC9; HDAC10; HDAC11; Sirt1; Sirt2; Sirt3; Sirt4; Sirt5; Sirt6; Sirt7). 예를 들어, 문헌의 내용이 그 전문으로 본 명세서에 참조로 통합되는 다음 문헌 참조: Cheng et al., Signal Transduction and Targeted Therapy volμMe 4, Article nμMber: 62 (2019).

일부 실시형태에서, 상기 방법은 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계 후에, 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단에서 후성유전 조절인자를 억제하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은, CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 노치 리간드의 존재 하에 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서, 상기 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계 전에, CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단에서 후성유전 조절인자를 억제하는 단계를 포함한다.

따라서, 한 양태에서, 본 명세서에는 (a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계; (b) 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단에서 후성유전 조절인자를 억제하는 단계; 및 (c) CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 노치 리간드의 존재 하에 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서, 상기 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계를 포함하는 방법이 기술된다.

일부 실시형태에서, CD34⁺ 혈액생성 내피세포는 후성유전 조절인자의 억제제로 처치된다. 후성유전 조절인자의 예시적인 억제제는 다음 중 적어도 하나의 억제제를 포함한다: DNMT; MBD; DNA 데메틸라제; HMT; 메틸-히스톤 결합 단백질; 히스톤 데메틸라제; HAT; 아세틸-결합 단백질; 또는 HDAC. 일부 실시형태에서, 후성유전 조절인자는 H3K9 메틸트랜스퍼라제이다. 인간에서 H3K9의 메틸화는 주로 Suv39 계열의 구성원, 즉 EHMT1/GLP, EHMT2/G9a, SUV39H1, SUV39H2, SETDB1 및 SETDB2뿐 아니라, 비-Suv39 효소 PRDM2 및 ASH1L에 의존한다.

DNMT 억제제의 비제한적인 예는 아자시티딘; 데시타빈; 구아데시타빈; 히드랄라진을 포함한다. HMT 억제제의 비제한적 예는 피노메토스타트(pinometostat); 타제메토스타트; GSK2816126; CPI-1205; TCP; ORY-2001; GSK2879552; 4SC-202를 포함한다. HDAC 억제제의 비제한적 예는 발프로산, 페닐부티레이트; 보리노스타트; 트리코스타틴 A; 벨리노스타트; 엔티노스타트; 파노비노스타트; 모세티노스타트; CI-994; 로미뎁신; 니코틴아미드; 수라민; PRI-724; GSK525762; CPI-0610; RO6870810; MK-8628를 포함한다.

일부 실시형태에서, 후성유전 조절인자의 억제제는 표 2로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 후성유전 조절인자의 억제제는 SB939(프라시노스타트); 4-요오도-SAHA; 스크립트에이드; 옥사플라틴(즉, 옥삼플라틴); s-HDAC-42; UNC0224; 피록사미드; MC1568; CAY10398; CAY10591; SAHA(Vorinostat)(SIH-359); SGI-1027; 및 루카파립(Rubraca™)으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 후성유전 조절인자의 억제제는 SB939(프라시노스타트); 4-요오도-SAHA; 스크립트에이드; 옥사플라틴(즉, 옥삼플라틴); s-HDAC-42; UNC0224; 피록사미드; MC1568; CAY10398; CAY10591; 및 SAHA(보리노스타트)(SIH-359)로 이루어진 군에서 선택되며; 예를 들어, 도 7 및 표 2를 참조.

표 2: T 세포 분화를 촉진할 수 있는 소분자 억제제(예를 들어, 500 nM에서, Z 스코어가 3보다 큰 소분자는 굵은 글씨로 표시됨, 예를 들어, 도 6-7 참조).

웰 위치	CD5 + CD7 + %	Z 스코어	소분자	소분자의 기능	소분자의 구조
1A4	39.4 %	5.042400516	SB939 (프라시노스타트)	팬(Pan)-HDAC 억제제(예를 들어, HDAC6을 제외하고 IC50이 40-140nM임). 이것은 클래스 III 이소효소 SIRT1에 대한 활성이 없다.
1A6	25.3 %	5.894930088	4-아이오도-SAHA	4-아이오도-SAHA는 클래스 I 및 클래스 II HDAC(예를 들어, HDAC1 또는 HDAC6) 억제제 SAHA의 소수성 유도체이다.
1B3	19.7 %	3.857176477	스크립트에이드	HDAC 억제제(예를 들어, 미국 특허 제6,544,957호 참조).
1H7	12.4 %	6.539525618	옥사플라틴(즉, 옥삼플라틴)	HDAC 억제제
1H11	43.2 %	4.262647859	s-HDAC-42	HDAC 억제제
2A8	15.0 %	3.475075737	UNC0224	G9a 및 GLP 억제제(H3K9 메틸트랜스퍼라제)
2B2	11.6 %	3.121963203	피록사미드	HDAC (예를 들어, HDAC1) 억제제
2E5	14.0 %	5.829159302	MC1568	클래스 II HDAC(예를 들어, HDAC4 및 HDAC5) 억제제. 클래스 I HDAC 활동의 억제를 나타내지 않음(예를 들어, HDAC1, HDAC2, HDAC3).
2F10	36.9 %	4.181300807	CAY10398	HDAC (예를 들어, HDAC1) 억제제
2G4	25.9 %	8.575590126	CAY10591	SIRT1 활성화제. 시르투인(SIRT)은 트리코스타틴 A-불감성 리실-탈아세틸라제(클래스 III HDAC)의 별개의 클래스를 나타낸다.
2G6	34.7 %	7.987069235	SAHA (보리노스타트) (SIH-359)	클래스 I 및 클래스 II HDAC를 모두 포함하는 강력한 가역적 팬-히스톤 데아세틸라제 HDAC 억제제.
1D11	19.9 %	0.093570319	SGI-1027	DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT, 예를 들어, DNMT1, DNMT3A 또는 DNMT3B) 억제제
1E 8	37.2 %	0.467851594	루카파립(루브라카™)	폴리(ADP-리보스) 폴리머라제(PARP; 예를 들어, PARP1, PARP2, PARP3) 억제제
대조군 세포	11.60%

일부 실시형태에서, 후성유전 조절인자의 억제제는 UNC0224; MC1568; 및 CAY10591(예를 들어, 도 8 참조)로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 후성유전 조절인자의 억제제는 UNC0224이다. 일부 실시형태에서, 후성유전 조절인자의 억제제는 MC1568이다. 일부 실시형태에서, 후성유전 조절인자의 억제제는 CAY10591이다.

일부 실시형태에서, 후성유전 조절인자의 억제제는 UNC0224 또는 5-메틸-2'-데옥시시티딘이다(예를 들어, 도 10B 및 하기 화학식 I의 구조 참조). 일부 실시형태에서, 후성유전 조절인자의 억제제는 5-메틸-2'-데옥시시티딘이다. 5-메틸-2'-데옥시시티딘은, 단일 가닥 DNA에 도입될 때, 시스(cis)에서 작용하여 새로운(de nov) DNA 메틸화를 신호할 수 있는 피리미딘 뉴클레오시드이다. 예를 들어, 다음 문헌 참조: Christman et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92(16), 7347-7351(1995).

I: 5-메틸-2'-데옥시시티딘

일부 실시형태에서, 후성유전 조절인자의 억제제는 500 nM 이상의 농도로 제공된다. 일부 실시형태에서, 후성 조절인자의 억제제는 적어도 1 nM, 적어도 2 nM, 적어도 3 nM, 적어도 4 nM, 적어도 5 nM, 적어도 6 nM, 적어도 7 nM, 적어도 8 nM, 적어도 9 nM, 적어도 10 nM, 적어도 20 nM, 적어도 30 nM, 적어도 40 nM, 적어도 50 nM, 적어도 60 nM, 적어도 70 nM, 적어도 80 nM , 적어도 90 nM, 적어도 100 nM, 적어도 150 nM, 적어도 200 nM, 적어도 300 nM, 적어도 400 nM, 적어도 500 nM, 적어도 600 nM, 적어도 700 nM, 적어도 800 nM, 적어도 900 nM, 적어도 1.0 μM, 적어도 1.25 μM, 적어도 1.5 μM, 적어도 1.75 μM, 적어도 2.0 μM, 적어도 2.5 μM, 적어도 3 μM, 적어도 4 μM, 적어도 5 μM , 적어도 6 μM, 적어도 7 μM, 적어도 8 μM, 적어도 9 μM, 또는 적어도 10 μM의 농도로 제공된다. 일부 실시형태에서, 후성유전 조절인자의 억제제는 1nM-10nM, 10nM-50nM, 50nM-100nM, 100nM-500nM, 500nM-1μM, 1μM-5μM, 또는 5μM-10μM의 농도로 제공된다.

일부 실시형태에서, 세포(예를 들어, CD34⁺ 혈액생성 내피세포)는 CD5⁺CD7⁺ proT 세포가 발달할 때까지 후성유전 조절인자의 억제제에 노출되어 배양된다. 일부 실시형태에서, 세포(예를 들어, CD34⁺ 혈액생성 내피세포)는 약 14일 동안 후성유전 조절인자의 억제제에 노출된 상태로 배양된다. 일부 실시형태에서, 세포(예를 들어, CD34⁺ 혈액생성 내피세포)는 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일, 적어도 21일, 적어도 22일, 적어도 23일, 적어도 24일, 적어도 25일, 적어도 26일, 적어도 27일, 적어도 28일, 적어도 29일, 적어도 30일, 적어도 31일, 적어도 32일, 적어도 33일, 적어도 34일, 적어도 적어도 35일, 적어도 36일, 적어도 37일, 적어도 38일, 적어도 39일, 적어도 40일, 적어도 41일, 적어도 42일, 적어도 43일, 적어도 44일, 적어도 45일, 적어도 46일, 적어도 47일, 적어도 48일, 적어도 49일, 적어도 50일, 또는 그 이상 동안 후성유전 조절인자의 억제제에 노출된 채로 배양된다.

G9a 및/또는 GLP의 억제

일부 양태에서 본 명세서에는 G9a 및/또는 GLP를 억제하는 단계를 포함하는 T-세포 분화 방법이 기술된다. 일부 양태에서 본 명세서에는 G9a를 억제하는 단계를 포함하는 T-세포 분화 방법이 기재된다. G9a는 또한 진정염색질 히스톤 라이신 메틸트랜스퍼라제 2(EHMT2); 히스톤 H3-K9 메틸트랜스퍼라제 3; KMT1C; 라이신 N-메틸트랜스퍼라제 1C; BAT8; 또는 NG36로 상호교환 가능하게 언급될 수 있다. G9a는 히스톤 H3의 라이신 잔기를 메틸화하는 메틸트랜스퍼라제이다(예를 들어, NCBI 유전자 ID: 10919; 서열번호: 45-46 또는 적어도 95% 동일하고 동일한 기능을 유지하는 서열, 또는 이의 기능적 단편 참조). 일부 양태에서 본 명세서에는 G9a-유사 단백질(GLP)을 억제하는 단계를 포함하는 T-세포 분화 방법이 기술된다. GLP는 또한 진정염색질 히스톤 라이신 메틸트랜스퍼라제 1(EHMT1); KMT1D; Eu-HMTase1; 또는 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제, H3 라이신-9 특이적 5(예를 들어, NCBI 유전자 ID: 79813; 서열번호: 47-48 또는 적어도 95% 동일하고 동일한 기능을 유지하는 서열, 또는 이의 기능적 단편 참조)로 상호교환 가능하게 지칭된다.

G9a 및 GLP는 주로 G9a-GLP 이형체성(heteromeric) 복합체로서 존재한다. G9a 및 GLP는 진정염색질에서 히스톤 H3(H3K9me1 및 H3K9me2)의 Lys 9에서 모노- 및 디메틸화를 위한 주요 효소이다. H3K9me는 HP1 단백질을 메틸화된 히스톤에 모집함으로써 후성유전 전사 억제를 위한 특정 태그를 나타낸다. G9a/GLP는 또한 히스톤 H3(H3K27me)의 'Lys-27'을 약하게 메틸화한다. G9a/GLP는 DNA 메틸화에도 필요하다. G9a/GLP의 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성은 DNA 메틸화에 필요하지 않으며, 이는 이 두 활성이 독립적으로 기능함을 시사한다. G9a/GLP는 아마도 상이한 DNA-결합 단백질, 예를 들어, E2F6, MGA, MAX 및/또는 DP1에 의해 히스톤 H3를 표적으로 할 것이다. 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성 외에도, G9a/GLP는 비-히스톤 단백질을 메틸화한다(예를 들어, p53/TP53의 'Lys-373'의 디메틸화).

G9a는 또한 G1 단계에서 히스톤 H3(H3K56me1)의 'Lys-56'의 모노메틸화를 매개하며, 이는 히스톤 H3과 PCNA 간의 상호작용을 촉진을 야기하고 DNA 복제를 조절한다. G9a는 또한 히스톤 H1을 메틸화한다. G9a는 또한 CDYL, WIZ, ACIN1, DNMT1, HDAC1, ERCC6, KLF12, 및 그 자체를 메틸화한다. G0 단계에서 GLP는 MYC 및 E2F 반응성 유전자의 침묵에 기여할 수 있으며, 이는 세포 주기에서 G0/G1 전환에서의 이의 역할을 시사한다. 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성 외에도, GLP는 비-히스톤 단백질을 메틸화하며: 이는 p53/TP53의 'Lys-373'의 디메틸화를 매개한다.

서열번호: 45, 호모 사피엔스(Homo sapiens) 진정염색질 히스톤 라이신 메틸트랜스퍼라제 2(EHMT2), 전사체 변이체 1, mRNA, NCBI 참조 서열: NM_001289413.1(영역 5-3706), 3702 bp

서열번호: 46, 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 EHMT2 이소형 c(호모 사피엔스), NCBI 참조 서열: NP_001276342.1, 1233 aa

서열번호: 47, 호모 사피엔스 진정염색질 히스톤 라이신 메틸트랜스퍼라제 1(EHMT1), 전사체 변이체 2, mRNA, NCBI 참조 서열: NM_001145527.2(영역 25-2451), 2427 bp

서열번호: 48, 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 EHMT1 이소형 2(호모 사피엔스), NCBI 참조 서열: NP_001138999.1, 808 aa

일부 실시형태에서, 상기 방법은 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계 후에, 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단에서 G9a 및/또는 GLP를 억제하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은, CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 노치 리간드의 존재 하에 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계 전에, CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단에서 G9a 및/또는 GLP를 억제하는 단계를 포함한다.

따라서, 한 양태에서 본 명세서에는 (a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계; (b) 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단에서 G9a 및/또는 GLP를 억제하는 단계; 및 (c) CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 노치 리간드의 존재 하에 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계를 포함하는 방법이 기술된다.

한 실시형태에서, 억제제는 G9a/GLP 억제제이다. 한 실시형태에서, G9a/GLP 억제제는 표 3에 열거된 화합물, 또는 이의 유도체 또는 유사체로부터 선택된다. 한 실시형태에서, G9a/GLP 억제제는 UNC0224; UNC0638; A366; BRD4770; BIX01294; UNC0642; UNC0631; UNC0646; UNC0321; E72; BIX-01338; BRD9539; 케토신; 및 DCG066으로 이루어진 군에서 선택된다. 한 실시형태에서, G9a/GLP 억제제는 UNC0224; UNC0638; A366; BRD4770; BIX01294; 및 UNC0642로 이루어진 군에서 선택된다(예를 들어, 도 8, 10B, 12B, 13B-13F 참조). 일부 실시형태에서, G9a/GLP 억제제는 UNC0224; UNC0638; BRD4770; BIX01294; 및 UNC0642로 이루어진 군에서 선택된다(예를 들어, 도 8, 10B, 12B, 13B, 13D-13F 참조).

일부 실시형태에서, G9a/GLP 억제제는 UNC0224; UNC0638; A366; BIX01294; UNC0642; UNC0631; UNC0646; UNC0321; 및 E72로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시형태에서, G9a/GLP 억제제는 BRD4770; BIX-01338; 및 BRD9539로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시형태에서, G9a/GLP 억제제는 유형 III G9a/GLP 억제제, 예컨대 케토신이다. 일부 실시형태에서, G9a/GLP 억제제는 DCG066으로 이루어진 군으로부터 선택된 IV형 G9a/GLP 억제제이다.

표 3: T 세포 분화를 촉진할 수 있는 G9a/GLP 억제제(예를 들어, 도 13A-13F 참조). 표 3에 인용된 모든 참고 문헌은 이들 전문이 구체적으로 본 명세서에 참조로 통합된다.

G9a/GLP 억제제	예시적인 결과	예시적인 유효 용량(들)		소분자 구조
UNC0224 (예를 들어, I형 G9a 억제제, BIX-01294 유도체)	예를 들어, 도 8, 10B, 12B 참조	312 nM, 625 nM, 1.25 μM, 2.5 μM, 5 μM
UNC0638 (예를 들어, I형 G9a 억제제, BIX-01294 유도체)	예를 들어, 도 13B 참조	8 nM
A366 (예를 들어, I형 G9a 억제제, BIX-01294 유도체)	예를 들어, 도 13C 참조	N/A
BRD4770 (예를 들어, II형 G9a 억제제, BIX-01338 유도체)	예를 들어, 도 13D 참조; 예를 들어, Yuan et al., ACS Chem Biol. 2012 Jul 20; 7(7): 1152-1157 참조.	200 nM
BIX01294 (예를 들어, I형 G9a 억제제)	예를 들어, 도 13E	200 nM
UNC0642 (예를 들어, I형 G9a 억제제, BIX-01294 유도체)	예를 들어, 도 13F	40 nM
UNC0631 (예를 들어, I형 G9a 억제제, BIX-01294 유도체)	예를 들어, Liu et al. Journal of Medicinal Chemistry 54(17), 6139-6150 (2011) 참조.	예를 들어, MDA-MB-231 세포에서, IC50 = 25 nM
UNC0646 (예를 들어, I형 G9a 억제제, BIX-01294 유도체)	예를 들어, Liu et al. Journal of Medicinal Chemistry 54(17), 6139-6150 (2011) 참조.	예를 들어, MDA-MB-231 세포에서, IC50 = 26 nM
UNC0321 (예를 들어, I형 G9a 억제제, BIX-01294 유도체)	예를 들어, Liu et al. J Med Chem. 2010 Aug 12; 53(15): 5844-5857; Liu et al. J Med Chem. 2009 Dec 24; 52(24): 7950-7953 참조. PKMT G9a를 강력하고 선택적으로 억제하는 세포-투과성 퀴나졸린 유사체(CLOT 및 ECSD에 대한 두 가지 생화학적 분석에서, 각각, IC50 = 6 nM 및 9 nM, 모리슨(Morrison) Ki = 63 pM, 이는 밀접하게 관련된 아날로그, BIX01294에 비해 대략 250배 더 강력한 것임. 이것은 감소된 효능(예를 들어, 15 nM)으로 GLP를 억제하고, ECSD 효소 분석에서 다른 단백질 라이신 및 아르기닌 트랜스퍼라제, 예컨대 SET7/9(aH3K4 PKMT), SET8/PreSET7(aH4K20 PKMT), 및 PRMT3뿐만 아니라, JMJD2E(> 1000배 선택성)에 대해 비활성(IC50 > 40 μM)인 것으로 확인된다.		예를 들어, G9a (IC50 = 6 nM 및 9 nM, 그리고 모리슨 Ki = 63 pM; GLP (예를 들어, 15 nM)
E72 (예를 들어, I형 G9a 억제제, BIX-01294 유도체)	예를 들어, Chang et al. J Mol Biol. 2010 Jul 2; 400(1): 1-7 참조.		예를 들어, G9a EC50 100 nM
BIX-01338 (예를 들어, II형 G9a 억제제)	예를 들어, Greiner et al. Nature Chemical Biology 1(3), 143-145 (2005) 참조. SAM-경쟁 방식에서 PRMT1 H4R3 me2 활성, SET7/9 H3K4 me 활성, G9a H3K9 me2 활성뿐만 아니라, SUV39H1의 H3K9 me3 활성(야생형 및 H320R 과활성 돌연변이체)을 포함하는, 광범위한 히스톤 메틸트랜스퍼라제 및 GLP(유효 농도 = 15 μM)를 억제하는 것으로 나타난 세포 투과성 아미노-벤즈이미다졸로 화합물.		G9a/GLP 유효 농도= 15 μM
BRD9539 (예를 들어, II형 G9a 억제제, BIX-01338 유도체)	예를 들어, Yuan et al., ACS Chem Biol. 2012 Jul 20; 7(7): 1152-1157 참조. BRD9539는 IC50 값이 6.3μM인 G9a의 억제제이다. 10μM의 농도로 사용했을 때, G9a 및 PRC2에 대해 각각 54% 및 43% 활성이 남아 있는 폴리콤 억제 복합체 2(PRC2)를 유사한 정도로 억제한다. SU39H1 및 NDMT1에 비해 G9a 및 PRC2의 경우 최대 40μM 농도까지 선택적이다. 이것은 효소 분석에서 BRD4770보다 더 강력하지만, 세포-기반 분석의 경우 더 높은 농도가 필요할 수 있다.		예를 들어, G9a, 6.3 μM의 IC50 값
Chaetocin (예를 들어, (+)-Chaetocin; I형II G9a 억제제)	예를 들어, Greiner et al. Nature Chemical Biology 1(3), 143-145 (2005) 참조. 케토신은 HMT SU(VAR)3-9(IC50 = 0.8μM)를 억제하는 진균 마이코독소이다.1 G9a(IC50 = 2.5μM) 및 DIM5(IC50 = 3μM)를 비롯한, 다른 Lys9-특이적 HMT를 억제한다.1 Lys9-HMT에 대한 선택성은 Lys20-특이적 PRSET7, Lys27-특이적 EZH2, 및 Lys4-특이적 SET7/9에 대해 더 높은 IC50 값(>90 μM)으로 나타난다.		예를 들어, G9a IC50 = 2.5μM
DCG066 (예를 들어, I형V G9a 억제제)	예를 들어, Kondengaden et al., Eur J Med Chem. 2016 Oct 21;122:382-393 참조.		예를 들어, G9a EC50 6.5 μM

일부 실시형태에서, G9a/GLP 억제제는 적어도 500 nM의 농도로 제공된다. 일부 실시형태에서, G9a/GLP 억제제는 적어도 1 nM, 적어도 2 nM, 적어도 3 nM, 적어도 4 nM, 적어도 5 nM, 적어도 6 nM, 적어도 7 nM, 적어도 8 nM, 적어도 9 nM, 적어도 10 nM, 적어도 20 nM, 적어도 30 nM, 적어도 40 nM, 적어도 50 nM, 적어도 60 nM, 적어도 70 nM, 적어도 80 nM, 적어도 90 nM, 적어도 100 nM, 적어도 150 nM, 적어도 200 nM, 적어도 300 nM, 적어도 400 nM, 적어도 500 nM, 적어도 600 nM, 적어도 700 nM, 적어도 800 n 적어도 900 nM, 적어도 1.0 μM, 적어도 1.25 μM, 적어도 1.5 μM, 적어도 1.75 μM, 적어도 2.0 μM, 적어도 2.5 μM, 적어도 3 μM, 적어도 4 μM, 적어도 5 μM, 적어도 6 μM, 적어도 7 μM, 적어도 8 μM, 적어도 9 μM, 또는 적어도 10 μM의 농도로 제공된다. 일부 실시형태에서, G9a/GLP 억제제는 1nM-10nM, 10nM-50nM, 50nM-100nM, 100nM-500nM, 500nM-1μM, 1μM-5μM, 또는 5μM-10μM의 농도로 제공된다.

일부 실시형태에서, G9a/GLP 억제제(예를 들어, UNC0224; 예를 들어, 도 8, 10B, 12B 참조)는 적어도 312 nM, 적어도 625 nM, 적어도 1.25 μM, 적어도 2.5 μM, 또는 적어도 5 μM의 농도로 제공된다. 일부 실시형태에서, G9a/GLP 억제제(예를 들어, UNC0638; 예를 들어, 도 13B 참조)는 적어도 8 nM의 농도로 제공된다. 일부 실시형태에서, G9a/GLP 억제제(예를 들어, BRD4770; 예를 들어, 도 13D 참조)는 적어도 200 nM의 농도로 제공된다. 일부 실시형태에서, G9a/GLP 억제제(예를 들어, BIX01294; 예를 들어, 도 13E 참조)는 적어도 200 nM의 농도로 제공된다. 일부 실시형태에서, G9a/GLP 억제제(예를 들어, UNC0642; 예를 들어, 도 13F 참조)는 적어도 40 nM의 농도로 제공된다.

일부 실시형태에서, 세포(예를 들어, CD34⁺ 혈액생성 내피세포)는 CD5⁺CD7⁺ proT 세포가 발달할 때까지 G9a/GLP 억제제에 노출된 상태에서 배양된다. 일부 실시형태에서, 세포(예를 들어, CD34⁺ 혈액생성 내피세포)는 약 14일 동안 G9a/GLP 억제제에 노출된 상태로 배양된다. 일부 실시형태에서, 세포(예를 들어, CD34⁺ 혈액생성 내피세포)는 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일, 적어도 21일, 적어도 22일, 적어도 23일, 적어도 24일, 적어도 적어도 25일, 적어도 26일, 적어도 27일, 적어도 28일, 적어도 29일, 적어도 30일, 적어도 31일, 적어도 32일, 적어도 33일, 적어도 34일, 적어도 적어도 35일, 적어도 36일, 적어도 37일, 적어도 38일, 적어도 39일, 적어도 40일, 적어도 41일, 적어도 42일, 적어도 43일, 적어도 44일, 적어도 45일, 적어도 46일, 적어도 47일, 적어도 48일, 적어도 49일, 적어도 50일, 또는 그 이상 동안 G9a/GLP 억제제에 노출된 상태로 배양된다.

일부 실시형태에서, G9a/GLP 억제제의 존재 하에 세포(예를 들어, CD34⁺ 혈액생성 내피)를 배양하면 G9a/GLP 억제제의 존재 하에 배양되지 않은 세포와 비교하여 생성된 세포(예를 들어, CD5⁺CD7⁺ Pro-T 세포; CD3⁺ T 세포; CD4⁺CD8⁺ T 세포; CD4⁺ T 세포; CD8⁺ T 세포; 알파-베타 T 세포)의 수가 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7 %, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45 %, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95 %, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 250%, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 적어도 450%, 적어도 500%, 적어도 600%, 적어도 700%, 적어도 800%, 적어도 900%, 또는 그 이상, 또는 적어도 10배(x), 20배(x), 30배(x), 40배(x), 50배(x), 60배(x), 70배(x), 80배(x), 90배(x), 100배(x), 500배(x), 1,000배(x), 또는 그 이상 더 높게 증가한다; 예를 들어, 도 8, 도 10B, 도 12B, 도 13B-13F, 도 14B, 도 15A 참조.

일부 실시형태에서, G9a/GLP 억제제의 존재 하에 세포(예를 들어, CD34⁺ 혈액생성 내피세포)를 배양하면 G9a/GLP 억제제의 존재 하에 배양되지 않은 세포와 비교하여 적혈구계 또는 골수계 계통 세포(예를 들어, 적혈구 세포; 대식세포; 과립구; 거핵구)의 수가 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 15 %, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65 %, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 250 %, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 적어도 450%, 적어도 500%, 적어도 600%, 적어도 700%, 적어도 800%, 적어도 900%, 또는 그 이상, 또는 적어도 10배(x), 20배(x), 30배(x), 40배(x), 50배(x), 60배(x), 70배(x), 80배(x), 90배(x), 100배(x), 500배(x), 1,000배(x) 또는 그 이상 더 높게 감소한다; 예를 들어, 도 14C 참조.

일부 실시형태에서, G9a/GLP 억제제의 존재 하에 세포(예를 들어, CD34⁺ 혈액생성 내피)를 배양하면 G9a/GLP 억제제의 존재 하에 배양되지 않은 세포에 비해 분화된 세포의 총 수가 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 250%, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 적어도 450%, 적어도 500%, 적어도 600%, 적어도 700%, 적어도 800%, 적어도 900%, 또는 그 이상, 또는 적어도 10배(x), 20배(x), 30배(x), 40배(x), 50배(x), 60x , 70배(x), 80배(x), 90배(x), 100배(x), 500배(x), 1,000배(x), 또는 그 이상 더 높게 감소한다; 예를 들어, 도 15B 참조.

일부 실시형태에서, G9a/GLP 억제제의 존재 하에 세포(예를 들어, CD34⁺ 혈액생성 내피)를 배양하면 G9a/GLP 억제제의 존재 하에 배양되지 않은 세포와 비교하여 분화된 세포의 총 수 중의 생성된 관심 세포(예를 들어, CD5⁺CD7⁺ Pro-T 세포; CD3⁺ T 세포; CD4⁺CD8⁺ T 세포; CD4⁺ T 세포; CD8⁺ T 세포; 알파-베타 T 세포)의 백분율이 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 250%, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 적어도 450%, 적어도 500%, 적어도 600%, 적어도 700%, 적어도 800%, 적어도 900%, 또는 그 이상, 또는 적어도 10배(x), 20배(x), 30배(x), 40배(x), 50배(x), 60배(x), 70배(x), 80배(x), 90배(x), 100배(x), 500배(x), 1,000배(x) 또는 그 이상 더 높게 증가한다; 예를 들어, 도 15C 참조.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 T 세포를 분화시키는 방법(예를 들어, G9a/GLP 억제 및 무-간질 T 세포 분화)은 관심 세포(예를 들어, CD5⁺CD7⁺ Pro-T 세포; CD3⁺ T 세포; CD4⁺CD8⁺ T 세포; CD4⁺ T 세포; CD8⁺ T 세포; 알파-베타 T 세포)의 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%를 포함하는 집단을 생성한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 T 세포를 분화시키는 방법(예를 들어, G9a/GLP 억제 및 무-간질 T 세포 분화)은 CD5⁺CD7⁺ ProT 세포를 적어도 15% 포함하는 집단을 생성한다.

예를 들어, 각각의 내용이 전문으로 본 명세서에 참조로 통합되는 다음 문헌 참조: Greiner et al. Nature Chemical Biology 1(3), 143-145 (2005); Liu et al. Journal of Medicinal Chemistry 54(17), 6139-6150 (2011); Liu et al. J Med Chem. 2010 Aug 12; 53(15): 5844-5857; Liu et al., J Med Chem. 2009 Dec 24; 52(24): 7950-7953; Kondengaden et al., Eur J Med Chem. 2016 Oct 21, 122:382-393; Yuan et al. ACS Chem Biol. 2012 Jul 20; 7(7): 1152-1157; Chang et al. J Mol Biol. 2010 Jul 2; 400(1): 1-7; Christman et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92(16), 7347-7351 (1995); Cheng et al., Signal Transduction and Targeted Therapy volume 4, Article number: 62 (2019).

히스톤 메틸트랜스퍼라제의 억제

일부 실시형태에서, 분화 방법은 히스톤 메틸트랜스퍼라제를 억제하는 것을 포함할 수 있다. 히스톤 메틸트랜스퍼라제(예를 들어, EZH1 녹다운)를 억제하는 단계는 (예를 들어, T 세포의) 분화 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 분화 방법은, 예를 들어, 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단에서 히스톤 메틸트랜스퍼라제를 억제하는 것을 포함한다. 히스톤 메틸트랜스퍼라제를 억제하는 방법은 당업계에 공지되어 있다; 예를 들어, 각각의 내용이 이들 전문으로 본 명세서에 참조로 통합되는 다음 문헌 참조: 국제 출원 제WO 2018/048828호, 미국 출원 제2019/0225940호, Doulatov et al., Cell Stem Cell. 2013 October 3, 13(4); Vo et al., Nature 2018, 553(7689): 506-510.

그러나, 히스톤 메틸트랜스퍼라제(예를 들어, EZH1 녹다운)를 억제하는 단계는 필요하지 않다. 따라서, 일부 실시형태에서, 분화 방법은, 예를 들어, 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단에서 히스톤 메틸트랜스퍼라제를 억제하는 것을 포함하지 않는다.

이들 실험 과정에서, 본 발명자들은 H3K9 및 H3K27을 표적으로 하는 특정 히스톤 변형 효소의 억제가 만능 줄기 세포로부터 유래된 조혈 전구체 세포의 림프 잠재력을 촉진한다는 것을 발견하였다. 히스톤 변형 효소는 히스톤 라이신 메틸트랜스퍼라제이다. 히스톤 단백질의 번역 후 변형은 염색질 응축을 조절하고, 전사의 후성유전적 조절을 매개하며, 건강과 질병에서 세포 분화를 조절한다. 히스톤 꼬리의 메틸화는 후성유전 신호전달의 근본적인 사건 중 하나이다. 히스톤 H3(H3K9)의 라이신 9의 트리메틸화는 HP1의 염색질 모집, 이질염색질 응축 및 유전자 침묵을 매개한다. 유사하게, H3K27 및 H4K20의 메틸화는 염색질의 억제된 상태와 연관되는 반면, 발현된 유전자는 H3K4, H3K36 및 H3K79에서 메틸화된다. 인간에서 H3K9의 메틸화는 대부분 Suv39 패밀리의 구성원, 즉 EHMT1/GLP, EHMT2/G9a, SUV39H1, SUV39H2, SETDB1 및 SETDB2뿐만 아니라, 이후 비-Suv39 효소인 PRDM2 및 ASH1L에 의존한다(예를 들어, 본 명세서에 참조로 통합되는, 문헌[Hong Wu et al., Structural Biology of Human H3K9 Methyltransferases, 2010, PLoS ONE, 5(2): e8570] 참조). 대조적으로, H3K27의 메틸화는 폴리콤 억제 복합체 2(PRC2)에 의해 수행된다.

H3K9의 디/트리메틸화는 주로 보존된 SUV39H1/2 히스톤 메틸트랜스퍼라제에 의해 촉매되는 반면, 폴리콤 억제 복합체 2(PRC2)는 H3K27의 디/트리메틸화를 보장한다(예를 들어, 문헌[Rea S, 2000. Nature 406:593-599; Margueron R, and Reinberg D. 2011. Nature 469:343-349] 참조). PRC2는 EZH1/2 촉매 서브유닛, SUZ12, EED 및 RBBP7/4를 포함한다(예를 들어, Margueron R 및 Reinberg D, 2011 참조).

본 명세서에서는 H3K9 및 H3K27을 표적으로 하는 히스톤 라이신 메틸트랜스퍼라제를 억제하는 것이 히스톤 H3의 메틸화로 인한 전사 억제를 완화하고, 이에 의해 세포 분화, 특히 T 세포 특성화를 촉진하는 유전자 발현을 촉진함을 구체적으로 고려한다.

한 실시형태에서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제는 히스톤 H3 라이신 잔기 9(H3K9) 및/또는 히스톤 H3 라이신 잔기 27(H3K27)에 대한 메틸 기의 부가를 촉매한다.

한 실시형태에서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 억제제는 G9a/GLP 이형체성(heteromeric) 복합체를 억제한다.

G9a(EC 2.1.1.43)(UniProtKB: Q96KQ7)는 EHMT2(진성염색질 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 2), G9A 히스톤 메틸트랜스퍼라제 및 단백질 G9a로도 알려져 있다.

GLP(EC 2.1.1.43)(UniProtKB: Q9H9B1)는 EHMT1(진성염색질 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 1), G9a-유사 단백질 1 및 GLP1로도 알려져 있다.

한 실시형태에서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 억제제는 EZH1(제스트(Zeste) 1 폴리콤 억제 복합체 2 서브유닛의 인핸서)을 억제한다.

한 실시형태에서, H3K27 히스톤 메틸트랜스퍼라제는 EZH1(EC:2.1.1.43)(UniproKB Q92800-1)이다.

한 실시형태에서, H3K27 히스톤 메틸트랜스퍼라제는 EZH2(EC:2.1.1.43)(Unipro Q15910-1)가 아니다.

한 실시형태에서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제의 억제제는 히스톤 메틸트랜스퍼라제의 유전자 발현 또는 단백질 촉매 활성을 억제한다.

한 실시형태에서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 H3K9 및/또는 H3K27은 소분자 또는 핵산 또는 CRISPR-매개 표적 유전적 간섭에 의해 억제된다.

일부 실시형태에서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 H3K9 및/또는 H3K27은 소분자 억제제 또는 핵산 억제제에 의해 억제된다. 기재된 임의의 방법, 세포, 또는 조성물의 한 실시형태에서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 소분자 억제제는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 펩티드, 펩티드모방체, 아미노산, 아미노산 유사체, 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 유사체, 압타머, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 몰당 약 10,000g 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물(즉, 헤테로유기 및 유기금속 화합물 포함), 몰당 약 5,000g 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 몰당 약 1,000g 미만의 분자량, 몰당 약 500g 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 및 이러한 화합물의 염, 에스테르, 및 기타 약제학적으로 허용가능한 형태을 포함하는 화학 작용제이다. 일부 실시형태에서, 소분자는 이종유기 화합물 또는 유기금속 화합물이다.

한 실시형태에서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 소분자 억제제는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, AMI-1, A-366, BIX-01294, BIX01338, BRD4770, 케토신, E72, UNC0224, UNC0631, UNC0638, UNC0642, UNC0646, EPZ5676, EPZ005687, GSK343, EPZ-6438(E7438), 3-데아잔플라노신 A(DZNeP) HCl, UNC1999, MM-102, SGC 0946, 엔타카폰, EPZ015666, UNC0379, EI1, MI-2(메닌-MLL 억제제), MI-3(메닌-MLL 억제제), PFI-2, GSK126, 또는 EPZ004777을 포함한다.

한 실시형태에서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 소분자 억제제는 UNC0631, BRD4770, UNC1999, CPI-360, 및 BIX01294로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 실시형태에서, 핵산 억제제는 히스톤 메틸트랜스퍼라제의 발현을 표적화하는 핵산이다. 예를 들어, 히스톤 메틸트랜스퍼라제, EZH1의 mRNA 또는 1차 전사체를 표적화하여, 이 효소의 단백질 발현을 억제함. 제스트 1 폴리콤 억제 복합체 2 서브유닛(EZH1)의 인핸서 또는 EC 2.1.1.43이라고도 하는 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제는 히스톤 H3(MIM 602812 참조) lys27(H3K27)의 메틸화를 매개하고 배아줄기세포의 만능성 및 가소성(plasticity) 유지에 기능하는 비표준 폴리콤 억제 복합체-2(PRC2)의 구성요소이다. 인간 EZH1 유전자에 대한 외부 식별은 다음과 같다: HGNC: 3526; 엔트레즈 유전자(Entrez Gene): 2145; 앙상블(Ensembl): ENSG00000108799; OMIM: 601674; UniProtKB: Q92800; EMBL: AB002386 mRNA 및 상응하는 mRNA 번역: BAA20842.2; 진뱅크(GENBANK): BT009782 mRNA 및 상응하는 mRNA 번역: AAP88784.1.

한 실시형태에서, 핵산 억제제는 인간 EZH1 mRNA를 표적화한다.

한 실시형태에서, 핵산 억제제는 RNA 간섭 억제제 또는 CRISPR-매개 유전 간섭 억제제이다. RNA 간섭 억제제는 표적으로서 EZH1의 mRNA를 사용하여 Whitehead Institute, MIT, siRNA 웹사이트에서 찾을 수 있는 예측기 RNAi 소프트웨어, Invitrogen/ThermoFisher의 BLOCK-iT™ RNAi Designer, 및 The RNAi Web의 기타 온라인 siRNA 설계 도구를 이용하여 설계할 수 있다.

유사하게, 크리스퍼 가이드 RNA는 EZH1의 mRNA 또는 게놈 유전자를 표적으로 사용하여 Broad Institute(MIT) CRISPR 소프트웨어(예를 들어, portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design에서 월드와이드 웹 상에서 이용가능함), dna20, Clontech, AddGene, e-crisp, 및 Innovative Genomic을 이용하여 설계할 수 있다.

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) Cas9-매개 유전자 파괴는 포유동물을 비롯한 다양한 유기체에서 기능상실(loss-of-function) 돌연변이를 생성하는 데 널리 사용되었다(Cong et al., 2013, Science, 339(6121):819-23; Hsu et al., 2014, Cell, 157(6):1262-78에서 리뷰됨). Cas9-기반 녹아웃 스크린은 다양한 세포주에서 약물 내성과 관련된 필수 유전자 및 유전자를 식별하는 데 적용되었다. CRISPR-Cas 시스템, 이의 구성요소, 및 방법, 재료, 전달 비히클, 벡터, 입자, AAV를 포함하는 이러한 구성요소의 전달, 및 양 및 제형을 포함하는 이의 제조 및 사용에 관한 일반 정보와 관련하여, 본 발명의 실시에 유용한 모든 사항은, 다음을 참조하여 이루어진다: 미국 특허 제8,999,641호, 제8,993,233호, 제8,945,839호, 제8,932,814호, 제8,906,616호, 제8,895,308호, 제8,889,418호, 제8,889,356호, 제8,871,445호, 제8,865,406호, 제8,795,965호, 제8,771,945호 및 제8,697,359호; 미국 공개특허 US 2014-0310830, US 2014-0287938, US 2014-0273234, US2014-0273232, US 2014-0273231, US 2014-0256046, US 2014-0248702, US 2014-0242700, US 2014-0242699, US 2014-0242664, US 2014-0234972, US 2014-0227787, US 2014-0189896, US 2014-0186958, US 2014-0186919, US 2014-0186843, US 2014-0179770 및 US 2014-0179006, US 2014-0170753; 유럽 특허 EP 2 784 162 B1 및 EP 2 771 468 B1; 유럽 특허출원 EP 2 771 468(EP13818570.7), EP 2 764 103(EP13824232.6), 및 EP 2 784 162(EP14170383.5); 및 국제출원 WO 2014/093661; 상기 문헌 모두는 그 전문이 본 명세서에 참조로 통합된다.

본 발명의 맥락에서 사용하기 위해 구상된 CRISPR/Cas 시스템은 임의의 적합한 CRISPR 효소를 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR 효소는 타입 II CRISPR 시스템 효소이다. 일부 실시형태에서, CRISPR 효소는 Cas9 효소이다. 일부 실시형태에서, Cas9 효소는 S. 뉴모니애(S. pneumoniae), S. 피오게네스(S. pyogenes), 또는 S. 써모필러스(S. thermophilus) Cas9이고, 이들 유기체로부터 유래된 돌연변이된 Cas9를 포함할 수 있다. 효소는 Cas9 상동체(homolog) 또는 이종상동체(ortholog)일 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR 효소는 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다.

본 명세서에 기술된 바와 같이, CRISPR/Cas 시스템은 관심 있는 연속적인 게놈 영역 내의 다수의 서열을 특이적으로 표적화하는 데 사용된다. 표적화는 전형적으로 적어도 하나의 Cas 단백질, 및 본 명세서에 기술된 가이드 RNA 라이브러리의 하나 이상의 가이드 RNA를 포함하는, 조작된 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 포함하는 하나 이상의 벡터의 벡터 시스템을 세포 집단의 각 세포에 도입하는 것을 포함한다.

이러한 방법에서, Cas 단백질 및 하나 이상의 가이드 RNA는 시스템의 동일하거나 상이한 벡터 상에 있을 수 있고 각 세포에 통합되며, 이로써 각각의 가이드 서열은 세포 집단의 각 세포의 연속 게놈 영역 내의 서열을 표적화한다. Cas 단백질은 상기 세포에서의 발현을 보장하기 위해 조절 요소, 더 특별하게는 세포 집단의 세포에서의 발현에 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 독시사이클린 유도성 프로모터와 같은 유도성 프로모터이다. 세포 집단의 세포 내에서 전사될 때, 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA는 연속 게놈 영역의 표적 서열에 대한 CRISPR-Cas 시스템의 서열-특이적 결합을 유도한다. 일반적으로 CRISPR-Cas 시스템의 결합은 Cas 단백질에 의한 연속 게놈 영역의 절단을 유도한다.

짧은 간섭 RNA(siRNA) 또는 마이크로RNA(miRNA)에 의해 매개되는 RNA 간섭(RNAi)은 유전자 발현의 전사후 조절을 위한 강력한 방법이다. RNAi는 포유동물 세포의 생물학적 과정 연구에 광범위하게 사용되어 왔으며, 유전자 발현의 선택적 조절이 요망될 수 있는 인간 질병에 대한 치료적 접근을 구성할 수 있다. miRNA와 표적 mRNA 서열 사이의 상보성 정도에 따라, 동족(cognate) mRNA의 분해를 유도하거나 번역 감쇠에 의해 유전자 발현의 손실이 발생한다. 내인성 miRNA는 1차 전사체로 전사되고 이어서 RNAse III 효소 드로샤(Drosha)에 의해 가공되어 스템 루프 구조를 생성한다. 다이서(dicer)에 의한 핵 외수송(export) 및 절단은 가이드 가닥과 패신저 가닥으로 분리되는 성숙한 짧은 이중 가닥 분자(siRNA)를 생성한다. 가이드 가닥은, 패신저 가닥이 분해되는 동안 RISC 단백질에 결합하는 기능적 가이드 가닥으로 표적 mRNA의 절단을 매개하는 이펙터 복합체인, RNA 유도 침묵 복합체(RISC)에 로딩된다. 가이드 대 패신저 가닥을 RISC로 로딩하는 것은 siRNA의 5' 말단 안정성에 크게 의존하며, 포유류 세포에서의 정확한 조절은 불완전하게 이해되어 있지만, 덜 안정적인 가닥이 RISC에 우선적으로 도입된다. 가이드 가닥의 5' 말단에는 표적 식별에 중요한 "시드 영역(seed region)"이 포함되어 있다. 드로샤 및 다이서에 의한 정확한 절단은 적절한 표적 mRNA에 대한 효율적인 결합을 매개하는 정의된 시드 영역이 있는 가이드 RNA의 생성에 중요하다. 부정확한 가공은 표적-이탈(off-target) 분자에 결합하는 결과를 초래하지만 절단 부위에서의 이동은 또한 듀플렉스(duplex) 말단의 뉴클레오티드 조성을 변경하여, RISC로의 가닥 로딩에 중대한 영향을 미칠 수 있다.

선택된 표적 폴리펩티드의 발현을 억제하는 것은 RNA 간섭제의 사용을 통해 이루어진다. RNA 간섭(RNAi)은 선택적 분해를 위해 표적 폴리펩티드를 코딩하는 메신저 RNA를 표적으로 하는 작은 간섭 RNA(siRNA) 듀플렉스를 사용한다. 유전자 발현의 siRNA-의존성 전사 후 침묵은 siRNA에 의해 가이드되는 부위에서 표적 전령 RNA 분자를 절단하는 것을 포함한다. RNAi는 표적 유전자와 동일하거나 매우 유사한 서열의 RNA의 발현 또는 도입이 해당 표적 유전자로부터 전사된 메신저 RNA(mRNA)의 서열 특이적 분해 또는 특이적 전사후 유전자 침묵(PTGS)을 초래하는 진화적으로 보존된 과정이며(예를 들어, 문헌[Coburn, G. and Cullen, B. (2002) J. Virology 76(18):9225] 참조), 이로 인해 표적 유전자의 발현이 억제된다. 한 실시형태에서, RNA는 이중 가닥 RNA(dsRNA)이다. 이 과정은 식물, 무척추동물, 및 포유류 세포에서 설명되었다. 천연에서, RNAi는 dsRNA-특이적 엔도뉴클레아제 다이서에 의해 시작되며, 이는 긴 dsRNA를 siRNA라고 하는 이중-가닥 단편으로의 진행적(processive) 절단을 촉진한다. siRNA는 표적 mRNA를 인식하고 절단하는 단백질 복합체("RNA 유도 침묵 복합체" 또는 "RISC"라고 함)에 도입된다. RNAi는 또한 표적 유전자의 발현을 억제하거나 침묵시키기 위해 핵산 분자, 예를 들어, 합성 siRNA 또는 RNA 간섭제를 도입함으로써 개시될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "표적 유전자 발현의 억제"는 RNA 간섭이 유도되지 않은 상황과 비교하여 표적 유전자 또는 표적 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 또는 단백질 활성 또는 수준의 임의의 감소를 포함한다. 감소는 표적 유전자의 발현 또는 RNA 간섭제에 의해 표적화되지 않은 표적 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 수준과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 그 이상이 될 것이다.

본 명세서에 사용된, 용어 "RNA 간섭제" 및 "RNA 간섭"은 RNA 간섭제가 siRNA, miRNA, shRNA 또는 다른 이중 가닥 RNA 분자를 포함하는지 여부에 관계없이, 이중 가닥 RNA에 의해 매개되는 유전자 침묵의 형태를 포괄하도록 의도된다. siRNA는, 예를 들어, RNAi에 의해 표적 유전자의 발현을 억제하는 기능을 하는 RNA 작용제로 정의된다. siRNA는 화학적으로 합성될 수 있거나, 시험관내(in vitro) 전사에 의해 생성될 수 있거나, 숙주 세포 내에서 생성될 수 있다. 한 실시형태에서, siRNA는 길이가 약 15 내지 약 40개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 15 내지 약 28개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 19 내지 약 25개의 뉴클레오티드 길이, 더욱 바람직하게는 약 19, 20, 21, 22, 또는 23개의 뉴클레오티드 길이의 이중 가닥 RNA(dsRNA) 분자이고, 각 가닥에 약 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 3' 및/또는 5' 돌출부(overhang)를 함유할 수 있다. 돌출부의 길이는 두 가닥 사이에 독립적이며, 즉, 한 가닥 상의 돌출부의 길이는 제2 가닥 상의 돌출부의 길이에 의존하지 않는다. 바람직하게는 siRNA는 표적 메신저 RNA(mRNA)의 분해 또는 특이적 전사후 유전자 침묵(PTGS)을 통해 RNA 간섭을 촉진할 수 있다.

siRNA는 또한 작은 헤어핀(스템 루프라고도 함) RNA(shRNA)를 포함한다. 한 실시형태에서, 이들 shRNA는 짧은(예를 들어, 약 19 내지 약 25개 뉴클레오티드) 안티센스 가닥, 이어서 약 5 내지 약 9개 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 루프, 및 유사한 센스 가닥으로 구성된다. 대안적으로, 센스 가닥은 뉴클레오티드 루프 구조에 선행할 수 있고 안티센스 가닥은 뒤따를 수 있다. 이러한 shRNA는 플라스미드, 레트로바이러스, 및 렌티바이러스에 포함될 수 있으며, 예를 들어, pol III U6 프로모터, 또는 다른 프로모터로부터 발현될 수 있다(예를 들어, 그 전문이 본 명세서에 참조로 통합되는 다음 문헌 참조: Stewart, et al. (2003) RNA April; 9(4):493-501). RNA 간섭제의 표적 유전자 또는 서열은 세포 유전자 또는 게놈 서열, 예를 들어, G9a/GLP 또는 EZH1 서열일 수 있다. siRNA는 표적 유전자 또는 게놈 서열, 또는 이의 단편과 실질적으로 상동일 수 있다. 이러한 맥락에서 사용되는, 용어 "상동성(homologous)"은 표적의 RNA 간섭에 영향을 미치기 위해 표적 mRNA 또는 이의 단편과 실질적으로 동일하거나, 충분히 상보적이거나 유사한 것으로 정의된다. 천연 RNA 분자 외에, 표적 서열의 발현을 억제 또는 간섭하기에 적합한 RNA는 RNA 유도체 및 유사체를 포함한다. 바람직하게는, siRNA는 이의 표적과 동일하다. siRNA는 바람직하게는 오직 하나의 서열만을 표적으로 한다. siRNA와 같은 각각의 RNA 간섭제는, 예를 들어, 발현 프로파일링에 의해 잠재적인 표적-이탈 효과에 대해 스크리닝될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Jackson et al. Nature Biotechnology 6:635-637, 2003]에 기술되어 있다. 발현 프로파일링에 추가하여, 표적-이탈 효과를 나타낼 수 있는 잠재적 서열을 확인하기 위해 서열 데이터베이스에서 유사한 서열에 대한 잠재적 표적 서열을 스크리닝할 수도 있다. 예를 들어, 서열 동일성의 15개 또는 아마도 11개 정도로 적은 수의 연접(contiguous) 뉴클레오티드는 비-표적 전사체의 침묵을 유도하기에 충분하다. 따라서, BLAST와 같은 알려진 서열 비교 방법에 의한 서열 동일성 분석을 이용하여 잠재적인 표적-이탈 침묵을 피하기 위해 제안된 siRNA를 처음에 스크리닝할 수 있다. siRNA 서열은 siRNA의 안티센스(가이드) 가닥의 RISC로의 흡수를 최대화하고 이에 의해 분해를 위해 G9a/GLP 또는 EZH1 mRNA를 표적화하는 RISC의 활성을 최대화하도록 선택된다. 이것은 안티센스 가닥의 5'-말단에서 결합의 가장 낮은 자유 에너지를 갖는 서열을 스캐닝함으로써 달성될 수 있다. 더 낮은 자유 에너지는 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5'-말단의 풀림을 향상시키며, 이로 인해 안티센스 가닥이 RISC에 의해 점유되고 인간 G9a/GLP 또는 EZH1 mRNA의 서열-특이적 절단을 유도하도록 하는 것을 보장한다. siRNA 분자는 RNA만을 포함하는 분자에 한정될 필요는 없지만, 예를 들어, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 및 비-뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 리보스 당 분자가 다른 당 분자 또는 유사한 기능을 수행하는 분자로 치환된 분자도 포함한다. 또한, 포스포로티오에이트 연결과 같은 뉴클레오티드 잔기 간의 비-천연 연결이 사용될 수 있다. RNA 가닥은 형광단과 같은 리포터 그룹의 반응성 작용기로 유도체화될 수 있다. 특히 유용한 유도체는 RNA 가닥의 말단 또는 말단, 일반적으로 센스 가닥의 3' 말단에서 변형된다. 예를 들어, 3' 말단의 2'-히드록실은 다양한 기로 쉽게 선택적으로 유도체화될 수 있다. 다른 유용한 RNA 유도체는 2'O-알킬화된 잔기 또는 2'-O-메틸 리보실 유도체 및 2'-O-플루오로 리보실 유도체와 같은 변형된 탄수화물 모이어티를 갖는 뉴클레오티드를 포함한다. RNA 염기도 변형될 수 있다. 표적 서열의 발현을 억제하거나 간섭하는데 유용한 임의의 변형된 염기가 사용될 수 있다. 예를 들어, 5-브로모우라실 및 5-요오도우라실과 같은 할로겐화 염기가 포함될 수 있다. 염기는 또한 알킬화될 수 있으며, 예를 들어, 7-메틸구아노신이 구아노신 잔기 대신에 혼입될 수 있다. 성공적인 억제를 생성하는 비-천연 염기도 포함될 수 있다. 바람직한 siRNA 변형은 2'-데옥시-2'-플루오로우리딘 또는 잠금 핵산(LAN) 뉴클레오티드 및 포스포디에스테르 또는 다양한 수의 포스포로티오에이트 연결을 함유하는 RNA 듀플렉스를 포함한다. 이러한 변형은 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Braasch et al., Biochemistry, 42: 7967-7975, 2003]에 기술되어 있다. siRNA 분자에 대한 유용한 변형의 대부분은 안티센스 올리고뉴클레오티드 기술에 대해 확립된 화학을 이용하여 도입될 수 있다. 바람직하게는, 변형은 최소한의 2'-O-메틸 변형을 포함하고, 바람직하게는 이러한 변형을 배제한다. 변형은 또한 바람직하게는 siRNA의 유리 5'-히드록실 기의 변형을 배제한다. 본 명세서의 실시예는 mRNA를 효과적으로 표적화하는 shRNA 분자와 같은 RNA 간섭제의 특정 예를 제공한다.

한 실시형태에서, 핵산은 G9a/GLP 또는 EZH1 특이적 RNA 간섭제 또는 RNA 간섭제를 코딩하는 벡터이다. 한 실시형태에서, RNA 간섭제는 CTATCTGGCAGTGCGAGAATG(서열번호: 11), AGACGTGCAAGCAGGTCTTTC(서열번호: 12), TGGATGACTTATGCGTGATTT(서열번호: 13), CAACAGAACTTTATGGTAGAA(서열번호: 14), CCGCCGTGGTTTGTATTCATT(서열번호: 15), GCTTCCTCTTCAACCTCAATA(서열번호: 16), CCGCCGTGGTTTGTATTCATT(서열번호: 17), GCTCTTCTTTGATTACAGGTA(서열번호: 18), 및 GCTACTCGGAAAGGAAACAAA(서열번호: 19)로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상을 포함한다.

일부 실시형태에서, 핵산 억제제는 EZH1에 결합하는 압타머, EZH1 특이적 RNA 간섭제, 및 EZH1 특이적 RNA 간섭제를 코딩하는 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 EZH1 특이적 핵산이고, 여기서 RNA 간섭제는 서열번호: 11-19로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

한 실시형태에서, 다계통 조혈 전구체 세포는 서열번호: 11-19로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 운반하는 바이러스 벡터 또는 벡터와 접촉된다.

한 실시형태에서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 억제제와의 접촉은 1회 이상 발생한다. 예를 들어, 서열번호: 11-19로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 운반하는 바이러스 또는 벡터와 다계통 조혈 전구체 세포의 최초 접촉 후, 또는 본 명세서에 기술된 소분자 억제제와 접촉 후, 접촉된 세포를 세척하여 해당 바이러스 또는 벡터를 제거하고, 그런 다음 세척된 세포를 첫 번째 접촉에서 사용된 동일한 바이러스 또는 벡터와 두 번째로 접촉시킨다.

게놈 편집의 Cas9/CRISPR 시스템이 본 명세서에 기술된 방법, 세포 및 조성물과 함께 사용되는 것이 본 명세서에서 고려된다. 클러스터링된 규칙적으로 배치된 짧은 회문 반복체(CRISPR)/CRISPR-연관(Cas) 시스템은 RNA-프로그래밍 가능한 게놈 편집에 유용하다(예를 들어, Jinek, M. et al. Science(2012) 337(6096):816-821 참조).

트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)는 작은 트랜스-코딩된 RNA이다. 그것은 인간 병원체 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)에서 처음 발견되었다. (Deltcheva E, et al.(2011). Nature 471(7340): 602-7 참조). 박테리아와 고세균에서, CRISPR/Cas(클러스터링된, 규칙적으로 배치된 짧은 회문 반복체/CRISPR 관련 단백질)는 바이러스 및 플라스미드로부터 보호하는 RNA-매개 방어 시스템을 구성한다. 이 방어 경로에는 세 단계가 있다. 먼저 침입하는 핵산의 카피가 CRISPR 유전자좌에 통합된다. 다음으로, 이 CRISPR 유전자좌에서 CRISPR RNA(crRNA)가 전사된다. 그런 다음 crRNA는 이펙터 복합체에 통합되며, 여기서 crRNA는 복합체를 침입 핵산으로 가이드하고 Cas 단백질은 이 핵산을 분해한다. (예를 들어, Terns MP and Terns RM (2011). Curr Opin Microbiol 14 (3): 321-7 참조). CRISPR 활성화의 여러 경로가 있으며, 그 중 하나는 crRNA의 성숙에 역할을 하는 tracrRNA를 필요로 한다. TracrRNA는 RNA 듀플렉스를 형성하는 pre-crRNA에 상보적이고 염기쌍을 형성한다. 이것은 RNA-특이적 리보뉴클레아제인 RNase III에 의해 절단되어 crRNA/tracrRNA 하이브리드를 형성한다. 이 하이브리드는 침입 핵산을 절단하는 엔도뉴클레아제 Cas9을 위한 가이드로서 역할한다. (예를 들어, Deltcheva E, et al. 전게서; Jinek M, et al. (2012), Science 337 (6096): 816-21; 및 Brouns SJ (2012), Science 337 (6096): 808-9 참조).

일부 실시형태에서, Cas9/CRISPR 시스템 가이드 RNA는 알려진 EZH1의 모든 전사체에 존재하는 EZH1 유전자의 엑손 3을 표적화하도록 설계된다. 엑손 3 서열은, ATTACAGCAAGATGGAAATACCAAATCCCCCTACCTCCAAATGTATCACTTACTGGAAAAGAAAAGTGAAATCTGAATACATGCGACTTCGACAACTTAAACGGCTTCAGGCAAATATGGGTGCAAAG (서열번호: 20)이다.

엑손 3을 표적으로 하는 비제한적인 예시적인 gRNA는, TCGACAACTTAAACGGCTTC(서열번호: 21), TGCGACTTCGACAACTTAAA(서열번호: 22), CCTCCAAATGTATCACTTAC(서열번호: 23), TAAACGGCTTCAGGCAAATA(서열번호: 24) AAACGGCTTCAGGCAAATAT(서열번호: 25), CATTTGGAGGTAGGGGGATT(서열번호: 26), CCAGTAAGTGATACATTTGG(서열번호: 27), GTGATACATTTGGAGGTAGG(서열번호: 28), AAGTGATACATTTGGAGGTA(서열번호: 29), AGTGATACATTTGGAGGTAG(서열번호: 30), TTTCCAGTAAGTGATACATT(서열번호: 31), 및 TAAGTGATACATTTGGAGGT(서열번호: 32)이다.

다른 실시형태에서, Cas9/CRISPR 시스템 가이드 RNA는 알려진 EZH1의 모든 전사체에도 존재하는 EZH1 유전자의 엑손 4를 표적화하도록 설계된다. 엑손 4 서열은, GCTTTGTATGTGGCAAATTTTGCAAAGGTTCAAGAAAAAACCCAGATCCTCAATGAAGAATGGAAGAAGCTTCGTGTCCAACCTGTTCAGTCAATGAAGCCTGTGAGTGGACACCCTTTTCTCAAAAAG(서열번호: 33)이다.

엑손 4를 표적으로 하는 비제한적인 예시적인 gRNA는, GCTTCATTGACTGAACAGGT(서열번호: 34), ACAGGCTTCATTGACTGAAC(서열번호: 35), AGAAAAGGGTGTCCACTCAC(서열번호: 36), TCCATTCTTCATTGAGGATC(서열번호: 37), CCATTCTTCATTGAGGATCT(서열번호: 38), CCCAGATCCTCAATGAAGAA(서열번호: 39), GTATGTGGCAAATTTTGCAA(서열번호: 40), 및 CAGTCAATGAAGCCTGTGAG(서열번호: 41)이다.

한 실시형태에서, 벡터는 히스톤 메틸트랜스퍼라제의 핵산 억제제 중 임의의 것을 본 명세서에 기술된 바와 같은 세포 집단으로부터 선택된 표적 세포(예를 들어, ESC; PSC; iPSC; 혈액생성 내피세포; HSC)로 도입하기 위한 수송 비히클로서 사용된다. 한 실시형태에서, 벡터는 히스톤 메틸트랜스퍼라제의 기재된 핵산 억제제를 포함하는 본 명세서에 기술된 임의의 핵산을 본 명세서에 기술된 바와 같은 세포 집단으로부터 선택된 표적 세포(예를 들어, ESC; PSC; iPSC; 혈액생성 내피세포; HSC)로 도입하기 위한 수송 비히클로서 사용된다. 핵산 억제제의 생체내(in vivo) 발현은 G9a/GLP 또는 EZH1과 같은 표적 히스톤 메틸트랜스퍼라제의 mRNA를 분해하여 각각의 히스톤 메틸트랜스퍼라제의 발현을 감소 및 억제하기 위한 것이며, 이는 형질감염된 세포에서 히스톤 H3의 메틸화를 감소시키고 그 안의 유전자 발현 억제를 완화하는 것을 목표로 한다.

한 실시형태에서, 숙주 세포는 배아 줄기 세포, 체세포 줄기 세포, 전구체 세포, 골수 세포, 조혈 줄기 세포, 조혈 전구체 세포, T 세포 또는 B와 같은 면역 세포, 적혈구, 섬유아세포, 각질세포, 또는 골수계 전구체 세포이다. 한 실시형태에서, 숙주 세포는 대상체로부터 단리된다. 한 실시형태에서, 숙주 세포는 혈액 질환으로 진단된 대상체로부터 단리된다.

한 실시형태에서, 벡터는 비장 초점-형성 바이러스 프로모터, 테트라사이클린-유도성 프로모터, 독시사이클린(Dox)-유도성, 또는 β-글로빈 유전자좌 제어 영역 및 β-글로빈 프로모터를 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, 프로모터는 그 안의 핵산 분자의 표적화된 발현을 제공한다. 프로모터의 다른 예는 다양한 이식유전자에 대한 CMV 프로모터 및 EF1-알파 프로모터, 및 EZH1을 표적으로 하는 shRNA에 대한 U6 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

한 실시형태에서, 벡터는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터이다. 세포에서 유전자 전달 및 발현을 위한 바이러스 벡터의 비제한적인 예는 레트로바이러스, 아데노바이러스(유형 2 및 5), 아데노 관련 바이러스(AAV), 헬퍼-의존성 아데노바이러스 벡터(HdAd), 하이브리드 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스, 폭스 바이러스, 인간 포미 바이러스(HFV), 및 렌티바이러스이다. 본 명세서에 기술된 본 발명에 유용한 예시적인 벡터는 에피솜 벡터, 통합 벡터, 비-통합 벡터, 및 절제가능한 벡터를 포함한다.

무-간질 T 세포 분화

일부 실시형태에서, 분화 방법은 CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 노치 리간드의 존재 하에 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 것을 포함한다. 본 명세서에 기술된 방법은 무-간질 T 세포 분화 방법이다. 노치 리간드를 발현하는 간질 세포와의 분화와 비교하여, 무-간질 분화는 예기치 않게 분화된 T 세포의 증가된 수를 초래하며, 이러한 T 세포의 더 작은 부분은 선천적-유사 세포이다(예를 들어, 실시예 1, 도 1D 참조). 예상치못하게, 본 발명자들은 본 명세서에 기술된 무-간질 프로토콜이, iPSC 또는 HE-유래 전구세포(예를 들어, 림프구 전구세포)가 아닌, 혈액생성 내피세포(HE)로 시작하는 것을 필요로 한다는 것을 발견했다.

천연에서, 골수의 조혈 줄기 세포(HSC)는 공통 골수계 전구체(CMP; common myeloid progenitors) 및 공통 림프구계 전구체(CLP; common lymphoid progenitors)로 분화되기 전에 다능성 전구체(MPP)를 생성한다. CLP는 골수에서 흉선으로 이동하며, 여기서 델타-유사 리간드 4(DLL4)를 발현하는 흉선 상피 세포는 초기 흉선 전구체(ETP)에서 표준 노치 1 신호를 유발한다. 이 노치 1 신호는 T 세포 계통 순응(commitment)에 필수적이며 이중-음성 3(DN3) 단계까지 흉선 세포 분화의 초기 단계에서 추가로 필요하다. T 세포 발달의 이러한 초기 단계 동안 활성 노치 신호는 B 세포 및 골수계 세포(수지상 세포(DC) 포함) 잠재력과 같은 다른 계통 잠재력을 억제한다. β-선택 동안, 노치 신호전달은 pre-T 세포 수용체 신호전달의 결과로 꺼진다. 따라서, T 세포 발달의 후속 단계는 매우 낮은 수준의 노치 신호전달을 나타낸다. 노치는 또한 조절 T(T_Reg) 세포(특히, 흉선 T_Reg 세포)의 발달에 영향을 미치는 것으로 제안되었다. 노치 신호는 노치 2 수용체에 의해 매개된다. 노치 신호 전달 경로는 척추동물과 무척추동물 종 모두에서 고도로 보존되어 있으며 다양한 세포 운명 결정을 조절한다. 신경발생, 혈관신생 또는 근육신생과 같은 발달 중 패턴 형성에 중요하며 T 세포 발달 및 줄기 세포 유지를 조절한다. 노치 신호는 또한 성인기 전반에 걸친 세포 과정에 관여한다. 노치를 통한 신호 전달은 이웃 세포 사이에서 발생하며 수용체와 이의 리간드 둘 다 막횡단 단백질이다. 예를 들어, 본 명세서에 참조로 통합되는 다음 문헌 참조: Schmitt T.M.,

J.C. (2002) Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by 델타-like-1 in vitro. Immunity 17:749-756; Mohtashami M. (2010) Direct Comparison of Dll1- and Dll4-Mediated Notch Activation Levels Shows Differential Lymphomyeloid Lineage Commitment Outcomes. J Immunol. 185(2):867-76; Ohishi K et al. 델타-1은 인간 CD34(⁺) CD38(^-) 제대혈 세포의 골수 및 흉선 재증식(repopulating) 활성을 향상시킨다. 예를 들어, 본 명세서에 참조로 통합되는 다음 문헌 참조: J Clin Invest. 2002 Oct;110(8):1165-74; 및 Dallas MH et al. Density of the Notch ligand Delta1 determines generation of B and T cell 전구체s from hematopoietic stem cells J Exp Med. 2005 May 2; 201(9): 1361-1366.

노치 리간드

따라서, 림프구계 계통 및 T 세포 계통 순응(commitment)에서의 분화를 개시하기 위해, 혈액생성 내피세포는 노치 리간드에 노출되어 그 안의 노치 신호전달 경로를 활성화시킨다. 예상치못하게, 본 발명자들은 노치 리간드에 대한 노출을 포함하는 본 명세서에 기술된 무-간질 프로토콜이 iPSC 또는 HE-유래 전구체(예를 들어, 림프구 전구체)가 아닌 혈액생성 내피세포(HE)로 시작하는 것을 필요로 한다는 것을 발견했다. 따라서, 일부 실시형태에서, iPSC 또는 HE-유래 전구체는 노치 리간드의 존재 하에 T 세포로 분화되는 초기의 집단이 아니다.

노치 리간드는 DSL(델타, 서레이트, LAG-2)-도메인 및 다양한 수의 EGF-유사 반복부를 갖는 단일-통과 막관통 단백질이다. 표준 노치 리간드에는 델타/델타-유사 및 서레이트/재그드(Jagged) 클래스의 두 가지 클래스가 있다. 후자는 막관통 도메인에 가까운 시스테인이 풍부한 반복부의 추가 도메인을 가지고 있다. 포유류에는 5개의 표준 노치 리간드가 있다: 재그드-1, 재그드-2, DLL1, DLL3 및 DLL4. 이들은 4개의 노치 수용체, 노치 1-4에 결합할 수 있다. 노치 델타 리간드, 델타-유사 1로도 알려진 DLL1은 노치2 수용체와 상호작용하는 단백질이다. 예를 들어, 다음 문헌 참조: Shimizu K, et al., 2001, J. Biol. Chem. 276 (28): 25753-8; Blaumueller CM, et al., 1997, Cell 90 (2): 281-91; Shimizu K, et al., 2000, Mol. Cell. Biol. 20 (18): 6913-22. DLL1은 인간에서 DLL1 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다. DLL1은 노치 델타 리간드의 인간 상동체이다.

일부 실시형태에서, 노치 리간드는 델타 유사-1(DLL1, DL1이라고도 함), 델타 유사-4(DLL4, DL4라고도 함), 고정화된 델타1ext-IgG, 및 고정화된 델타4ext-IgG로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 고정화된 델타1ext-IgG는 인간 IgG1의 Fc 도메인에 융합된 인간 델타-유사-1의 세포외 도메인으로 이루어진다. "고정화된 델타1ext-IgG"는 델타-유사 1의 세포외 도메인을 인간 IgG1의 Fc 도메인에 융합함으로써 제조된 재조합 노치 리간드를 지칭한다(예를 들어, 서열번호: 42 참조). 이것은 적정가능한(titratable) 용량의 노치 리간드를 제공하는 합성 방법이다. 예를 들어, 그 전문이 본 명세서에 참조로 통합되는 다음 문헌 참조: Varnum-Finney et al., J Cell Sci. 2000 Dec;113 Pt 23:4313-8. 재조합 노치 리간드 및 Fc-융합은 AdipoGen™에서 상업적으로 이용가능하다. "고정화된 델타4ext-IgG"는 델타-유사 4의 세포외 도메인을 인간 IgG1의 Fc 도메인에 융합함으로써 제조된 재조합 노치 리간드를 지칭한다(예를 들어, 서열번호: 43 참조).

일부 실시형태에서, 델타1ext-IgG 또는 델타4ext-IgG의 IgG 도메인은 당업계에 공지된 임의의 IgG 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 델타1ext-IgG 또는 델타4ext-IgG는, 항-인간 IgG 항체, 단백질 G, 또는 단백질 A를 포함하나 이에 제한되지는 않는 IgG Fc에 결합하는 조성물로 고체 기재(substrate)를 코팅함으로써 고체 기재(예를 들어, 조직 배양 플레이트)에 고정될 수 있다.

일부 실시형태에서, 노치 리간드(예를 들어, DLL1)의 핵산 서열은 서열번호: 1-3 또는 서열번호: 1-3과 동일한 기능(예를 들어, 노치 수용체에 결합 및/또는 활성화)을 유지하는 서열번호: 1-3의 서열과 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 90%, 적어도 SEQ의 서열과 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.

서열번호: 1, DLL1 델타 유사 표준 노치 리간드 1[호모 사피엔스(인간)], 유전자 ID: 28514, NCBI 참조 서열: NG_027940.1, 8873 bp

서열번호: 2 호모 사피엔스(Homo sapiens) 델타 유사 표준 노치 1 리간드 1(DLL1), mRNA, NCBI 참조 서열: NM_005618.4, 3779 bp

서열번호: 3 호모 사피엔스(Homo sapiens) 델타 유사 표준 노치 리간드 1 (DLL1), CDS mRNA, NCBI 참조 서열: NM_005618.4, 2172 bp

일부 실시형태에서, 노치 리간드(예를 들어, DLL1)의 아미노산 서열은 서열 4 또는 서열번호: 4와 동일한 기능(예를 들어, 노치 수용체에 결합 및/또는 활성화)을 유지하는 서열번호: 4의 서열과 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

서열번호: 4 델타-유사 단백질 1 전구체 [Homo sapiens], NCBI 참조 서열: NP_005609.3, 723 aa

일부 실시형태에서, 노치 리간드(예를 들어, 델타1ext-IgG)는 대략적으로 DLL1의 아미노산 1-536, 또는 아미노산 22-544, 또는 아미노산 22-537에 상응하는 인간 DLL1의 세포외 도메인을 포함한다(예를 들어, DLL1의 전체 길이 서열에 대해서는 서열번호: 4 참조). 일부 실시형태에서, 인간 DLL1의 세포외 도메인은 서열번호: 5, 또는 서열번호: 5의 서열과 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호: 5와 동일한 기능(예를 들어, 노치 수용체에 결합 및/또는 활성화)을 유지하는 아미노산 서열을 포함한다.

서열번호: 5, 인간 DLL1 세포외 도메인, 536 아미노산

일부 실시형태에서, 노치 리간드(예를 들어, DLL4)의 핵산 서열은 서열번호: 6-9, 또는 서열번호: 6-9의 서열과 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호: 6-9와 동일한 기능(예를 들어, 노치 수용체에 결합 및/또는 활성화)을 유지하는 서열을 포함한다.

서열번호: 6, DLL4 델타 유사 표준 노치 리간드 4 [호모 사피엔스(인간)], 유전자 ID: 54567, NCBI 참조 서열: NG_046974.1, 9734 bp

서열번호: 7, 호모 사피엔스(Homo sapiens) 델타 유사 표준 노치 리간드 4 (DLL4), mRNA, NCBI 참조 서열: NM_019074.4, 3426 bp

서열번호: 8, 호모 사피엔스(Homo sapiens) 델타 유사 표준 노치 리간드 4 (DLL4), CDS mRNA, NCBI 참조 서열: NM_019074.4, 2058 bp

일부 실시형태에서, 노치 리간드(예를 들어, DLL4)의 아미노산 서열은 서열 4, 또는 서열번호: 4의 서열과 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호: 4와 동일한 기능(예를 들어, 노치 수용체에 결합 및/또는 활성화)을 유지하는 아미노산 서열을 포함한다.

서열번호: 9, 델타-유사 단백질 4 전구체 [Homo sapiens], NCBI 참조 서열: NP_061947.1, 685 아미노산

일부 실시형태에서, 노치 리간드는 DLL4의 아미노산 1-526, 또는 DLL4의 아미노산 1-524, 또는 DLL4의 아미노산 27-524에 상응하는 인간 DLL4의 세포외 도메인을 포함한다(예를 들어, DLL4의 전체 길이 서열의 경우 서열번호: 9 참조). 일부 실시형태에서, 인간 DLL4의 세포외 도메인은 서열번호: 10, 또는 서열번호: 10의 서열과 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호: 10과 동일한 기능(예를 들어, 노치 수용체에 결합 및/또는 활성화)을 유지하는 아미노산 서열을 포함한다.

서열번호: 10, 인간 DLL4 세포외 도메인, 526 아미노산

일부 실시형태에서, 노치 리간드(예를 들어, 델타1ext-IgG)는 서열번호: 42 또는 서열번호: 42의 서열과 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호: 42와 동일한 기능(예를 들어, 노치 수용체에 결합 및/또는 활성화)을 유지하는 아미노산 서열을 포함한다.

서열번호: 42, 재조합 인간 DLL1 Fc 키메라 단백질, R&D SYSTEMS 10184-DL: 인간 DLL1 (Ser22-Glu537) 접근 # O00548 + IEGRMDP + 인간 IgG1 Fc (Pro100-Lys330)

일부 실시형태에서, 노치 리간드(예를 들어, 델타4ext-IgG)는 서열번호: 43 또는 서열번호: 43의 서열과 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호: 43과 동일한 기능(예를 들어, 노치 수용체에 결합 및/또는 활성화)을 유지하는 아미노산 서열을 포함한다.

서열번호: 43, 인간 DLL4 단백질 Fc Tag, ACRO BIOSYSTEMS DL4-H5259: 인간 DLL4 (Ser27-Pro524) + 인간 IgG1 Fc (Pro100-Lys330)

일부 실시형태에서, 노치 리간드는 (예를 들어, 선택적 링커 서열을 통해) 인간 IgG1의 Fc 도메인에 연결된 본 명세서에 기술된 바와 같은 노치 리간드의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 IgG1 Fc 도메인은 서열번호: 44 또는 서열번호: 44의 서열과 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호: 44와 동일한 기능을 유지하는 아미노산 서열을 포함한다.

서열번호: 44, P01857(IGHG1_인간)의 Pro100-Lys330

노치 리간드를 제공하는 몇 가지 방법이 있으며, 예를 들어, 노치 리간드 또는 노치 수용체-결합 단편의 정제된 재조합 형태를 제공하고, 수용체-결합 단편은 접촉 시 생체내에서(in vivo) 세포 신호전달 이벤트를 유도하기에 충분하고 이들 세포의 세포외 노치 수용체와 결합한다. 일부 실시형태에서, 노치 리간드는, 예를 들어, 공유 또는 비공유 결합 또는 연결을 사용하여 고체 기재에 부착된다. 일부 실시형태에서, 노치 리간드는 세포 배양 접시에 부착된다.

일부 실시형태에서, 노치 리간드는 노치 리간드를 고체 기재에 고정시키기 위한 도메인을 추가로 포함한다. 비제한적 예로서, 노치 리간드는 친화성 쌍의 제1 구성원을 포함하고, 고체 기재는 친화성 쌍의 제2 구성원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 친화성 쌍의 제1 및 제2 구성원은, 상응하는 항체 또는 이의 결합 부분 또는 단편(예를 들어, FLAG 및 항-FLAG 모노클로날 항체, 이들의 서열은 당업계에 공지되어 있음)과 조합된 합텐 또는 항원 화합물; 디곡시제닌 및 항-디곡시제닌; 마우스 면역글로불린 및 염소 항-마우스 면역글로불린; 비-면역학적 결합 쌍; 비오틴 및 아비딘; 비오틴 및 스트렙타비딘; 호르몬 및 호르몬-결합 단백질; 티록신 및 코르티솔-호르몬 결합 단백질; 수용체 및 수용체 효능제; 수용체 및 수용체 길항제; 아세틸콜린 수용체 및 아세틸콜린 또는 이의 유사체; IgG 및 단백질 A; 렉틴 및 탄수화물; 효소 및 효소 보조인자; 효소 및 효소 억제제; 핵산 듀플렉스를 형성할 수 있는 상보적 올리고뉴클레오티드 쌍; 및 음으로 하전된 제1 분자 및 양으로 하전된 제2 분자로 이루어진 군에서 선택된다.

일부 실시형태에서, 혈액생성 내피세포의 집단은 비-조직 배양 처리된 배양 용기에서 배양함으로써 CD3⁺ T 세포의 집단으로 분화되고; 달리 말하면, 배양 용기는 소수성 플라스틱 표면을 개질하여 이를 더 친수성으로 만들기 위해 플라즈마 가스에 노출되지 아니한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "배양 용기(culture vessel)"는 접시, 플라스크, 플레이트, 멀티-웰 플레이트 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양 용기는 재조합 인간 DL1-Fc 단백질(예를 들어, R&D SYSTEMS를 통해 상업적으로 입수가능, 항목 번호 10184-DL), 재조합 인간 DL4-Fc 단백질(예를 들어, ACRO BIOSYSTEMS를 통해 상업적으로 입수가능, 항목 번호 DL4-H5259), 또는 두 노치 리간드의 혼합물, 또는 본 명세서에 기술된 임의의 노치 리간드로 코팅된다. 일부 실시형태예에서, 배양 용기는 적어도 0.5시간, 적어도 1.0시간, 적어도 1.5시간, 적어도 2.0시간, 적어도 2.5시간, 적어도 3.0시간, 적어도 3.5시간, 적어도 3.5시간, 적어도 4.0시간, 적어도 4.5시간, 또는 적어도 5.0시간 동안 노치 리간드로 코팅된다. 일부 실시형태에서, 배양 용기는 실온에서 노치 리간드로 코팅된다.

일부 실시형태에서, 비-간질 유래 노치 리간드(예를 들어, 조직 배양 플레이트 상에 고정화된 노치 리간드)는 1 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖의 농도 또는 5 ㎍/㎖ 내지 15 ㎍/㎖의 농도로 제공된다. 비-간질 유래 노치 리간드는 적어도 1 ㎍/㎖, 적어도 2 ㎍/㎖, 적어도 3 ㎍/㎖, 적어도 4 ㎍/㎖, 적어도 5 ㎍/㎖, 적어도 6 ㎍/㎖, 적어도 7 ㎍/㎖, 적어도 8 ㎍/㎖, 적어도 9 ㎍/㎖, 적어도 10 ㎍/㎖, 적어도 11 ㎍/㎖, 적어도 12 ㎍/㎖, 적어도 13 ㎍/㎖, 적어도 14 ㎍/㎖, 적어도 15 ㎍/㎖, 적어도 16 ㎍/㎖, 적어도 17 ㎍/㎖, 적어도 18 ㎍/㎖, 적어도 19 ㎍/㎖, 적어도 20 ㎍/㎖, 적어도 25 ㎍/㎖, 적어도 30 ㎍/㎖, 적어도 35 ㎍/㎖, 적어도 40 ㎍/㎖, 적어도 45 ㎍/㎖, 적어도 50 ㎍/㎖, 적어도 55 ㎍/㎖, 적어도 60 ㎍/㎖, 적어도 65 ㎍/㎖, 적어도 70 ㎍/㎖, 적어도 75 ㎍/㎖, 적어도 80 ㎍/㎖, 적어도 85 ㎍/㎖, 적어도 90 ㎍/㎖, 적어도 95 ㎍/㎖, 또는 적어도 100 ㎍/㎖의 농도로 제공된다. 바람직한 실시형태에서, 비-간질 유래 노치 리간드는 10 ㎍/㎖의 농도로 제공된다.

일부 실시형태에서, 세포는 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일, 적어도 21일, 적어도 22일, 적어도 23일, 적어도 24일, 적어도 25일, 적어도 26일, 적어도 27일, 적어도 28일, 적어도 29일, 적어도 30일, 적어도 31일, 적어도 32일, 적어도 33일, 적어도 34일, 적어도 35일, 적어도 36일, 적어도 37일, 적어도 38일, 적어도 39일, 적어도 40일, 적어도 41일, 적어도 42일, 적어도 43일, 적어도 44일, 적어도 45일, 적어도 46일, 적어도 47일, 적어도 48일, 적어도 49일, 적어도 50일, 또는 그 이상 동안 비-간질 유래 노치 리간드(예를 들어, 조직 배양 플레이트에 고정화된 노치 리간드)에 노출되어 배양된다.

무-간질 분화

본 명세서에 기술된 방법은 무-간질 T 세포 분화 방법, 즉 간질 세포 또는 임의의 다른 유형의 지지 세포와의 공동-배양을 포함하지 않는 방법이다. 마우스 간질 세포와 같은 간질 세포와의 공동-배양은 iPSC 유래 T 세포의 번역 잠재력을 제한하며; 예를 들어, 간질 세포의 존재로 인한 이식 거부의 우려가 있을 수 있다. 또한, 간질 세포를 사용하여 분화된 T 세포는 (예를 들어, 감마 델타 T 세포에 대한 마커인, TCRgd 발현에 의해 측정되는 것과 같은) 선천적-유사 표현형을 나타낸다. T 세포는, 예를 들어, TCR α 및 β의 발현을 특징으로 하는 적응 표현형을 나타내는 것이 바람직하다. 추가로, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 무-간질 T 세포 분화 방법은 간질 공동-배양을 포함하는 분화 방법과 비교하여 증가된 수의 CD3⁺ T 세포(예를 들어, CD4⁺CD8⁺ 세포)를 초래한다.

따라서, 무-간질 방법을 이용하여 분화된 T 세포는, 한 실시형태에서, 후성유전 조절인자(예를 들어, HMT; 예를 들어, EZH1, G9a/GLP)의 억제와 함께 간질 공동-배양 방법과 비교하여 적어도 다음의 예기치 못한 이점을 나타낸다: (1) 인간 이식 잠재력의 증가; (2) 선천적-유사 T 세포 수의 감소; (3) 생성된 T 세포(예를 들어, CD5⁺CD7⁺ Pro-T 세포; CD3⁺ T 세포; CD4⁺CD8⁺ T 세포; CD4⁺ T 세포; CD8⁺ T 세포; 알파-베타 T 세포)의 수 및/또는 백분율 증가; (4) 알파 베타 T 세포와 가장 유사한 유전자 발현 프로파일; (5) 보다 다양한 TCR 레퍼토리; 및/또는 (6) TCR CDR 길이 증가(예를 들어, 실시예 1, 도 1C-1D, 도 3A-3B, 도 4, 도 5A-5D, 도 6-16 참조).

본 명세서에 사용된 바와 같이, 세포 분화의 맥락에서 사용될 때 용어 "지지 세포 또는 간질 세포"는 다능성 조혈 전구체 세포 또는 T 세포 또는 B 세포의 성장, 증식, 분화 또는 확대를 위한 미세환경을 생성, 촉진 또는 지원할 수 있는 임의의 세포를 지칭한다. 본 명세서에 기술된 분화 방법에 포함되지 않는 지지 세포의 비제한적 예는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 간질 세포 및 섬유아세포를 포함한다.

세포 분화 목적을 위한 공동-배양에서 이전에 사용된 지지 세포는 일반적으로 간질 세포이다. 그러나, 본 명세서에 기술된 방법은 간질 세포를 포함하는 공동-배양을 포함하지 않는다. 본 명세서에 기술된 분화 방법에 포함되지 않는 간질 세포주의 예에는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 뮤린 MS5 간질 세포주; 뮤린 골수-유래 간질 세포주, 예컨대, S10, S17, OP9(예를 들어, OP9-DL1 세포 또는 OP9-DL4 세포) 및 BMS2 세포주; 전문이 본 명세서에 참조로 통합되는 미국 특허 제5,879,940호에 기술된 것과 같은 인간 골수 간질 세포주; 또는 노치 리간드를 발현하고 세포외로 제시하거나 또는 분비하는 기타 유사한 세포를 포함한다. OP9-DL1 세포는 노치 리간드인 델타-유사 1(DLL1)을 이소성으로(ectopically) 발현하는 골수 유래 간질 세포주이다. OP9-노치 리간드 발현 세포를 이용하여 만능 줄기 세포를 T-세포로 분화시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제7575925호, 제8772028호, 제8871510호, 및 제9206394호 및 US 특허 공개 제20090217403호, 제20110123502호, 제20110052554호, 제20110027881호, 제2011023363호, 제20102449100호, 제20130281304호, 제20140322808호, 제20140248248호, 및 제20140037599호 참조. 이들 참조문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 통합된다.

본 명세서에서는 T 세포를 만능 줄기 세포로부터 분화시키는 방법을 기술하며, 이 방법은 세포를 지지 세포 또는 간질 세포와 공동-배양하는 단계를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 사용된 노치 리간드는 간질 세포로부터 유래되지 않는다. 일부 실시형태에서, 노치 리간드의 존재 하에 혈액생성 내피세포를 분화시키는 것은 노치 리간드를 발현하는 간질 세포와의 공동-배양을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 노치 리간드의 존재 하에 혈액생성 내피세포를 분화시키는 것은 OP9-DL1 세포 또는 OP9-DL4 세포와의 공동-배양을 포함하지 않는다.

T 세포 분화 배지

일부 실시형태에서, 분화 방법은 CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간은 적어도 3주, 적어도 3.5주, 적어도 4주, 적어도 4.5주, 적어도 5주, 적어도 5.5주, 적어도 6주 또는 그 이상이다. 일부 실시형태에서, CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간은 최대 6주이다.

일부 실시형태에서, 지지 세포 또는 간질 세포에 의해 발현될 수 있는 폴리펩티드(예를 들어, 성장 또는 분화 인자)는 세포 배양 배지에 제공될 수 있다. 세포 배양 배지에 포함될 수 있는 T 세포의 분화를 지원하는 폴리펩티드의 비제한적인 예는 IL-7, SCF, Flt3 및 TPO를 포함한다. 인터루킨-7(IL-7)은 골수와 흉선의 간질 세포에서 분비되는 조혈성장인자이며, B세포와 T세포 발달에 관여한다. 줄기 세포 인자(SCF, KIT-리간드, KL, 또는 스틸(steel) 인자라고도 함)는 c-KIT 수용체(CD117)에 결합하고 T 세포 분화에 관여하는 사이토카인이다. FLT3(Flit3 또는 Fms-유사 티로신 키나제 3이라고도 함)은 조혈을 조절하는 클래스 III 수용체 티로신 키나제이다. 트롬보포이에틴(TPO 또는 THPO)은 주로 거핵구 생산을 담당하지만 조혈 줄기 세포(HSC)를 유지하는 역할도 하는 사이토카인이다. 예를 들어, 다음 문헌 참조: Wang et al., Distinct roles of IL-7 and stem cell factor in the OP9-DL1 T cell differentiation culture system. Exp Hematol. 2006 Dec;34(12):1730-40.

일부 실시형태에서, CD3⁺-T-세포 분화 배지는 무혈청(serum-free)이다. 일부 실시형태에서, CD3⁺-T-세포-분화 배지는 SCF, FLT3, 및/또는 IL7 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3⁺-T-세포-분화 배지는 SCF, FLT3, 및 IL7을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3⁺-T-세포 분화 배지는 30 ng/㎖ SCF, 15 ng/㎖ FLT3, 및 25 ng/㎖ IL7을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3⁺-T-세포-분화 배지는 100 ng/㎖ SCF, 100 ng/㎖ FLT3, 및 50 ng/㎖ IL7을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3⁺-T-세포-분화 배지는 FLT3 및 IL7을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3⁺-T-세포 분화 배지는 15 ng/㎖ FLT3 및 25 ng/㎖ IL7을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3⁺-T-세포-분화 배지는 100 ng/㎖ FLT3 및 50 ng/㎖ IL7을 포함한다.

SCF, FLT3, 및/또는 IL7의 농도는 이들이 CD3⁺ T 세포의 집단으로 혈액생성 내피세포의 분화를 촉진하도록 사용되어야 한다. SCF의 농도 범위는 1 ng/㎖에서 200 ng/㎖이다. 일부 실시형태에서, SCF의 농도(예를 들어, CD3⁺-T-세포-분화 배지에서)은 30 ng/㎖이다. 일부 실시형태에서, SCF의 농도(예를 들어, CD3⁺-T-세포-분화 배지에서)는 100 ng/㎖이다. FLT3의 농도 범위는 1 ng/㎖에서 200 ng/㎖이다. 일부 실시형태에서, FLT3의 농도(예를 들어, CD3⁺-T-세포-분화 배지에서)는 15 ng/㎖이다. 일부 실시형태에서, FLT3의 농도(예를 들어, CD3⁺-T-세포-분화 배지에서)는 100 ng/㎖이다. IL7의 농도는 1 ng/㎖에서 200 ng/㎖ 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, IL7의 농도(예를 들어, CD3⁺-T-세포-분화 배지에서)는 25 ng/㎖이다. 일부 실시형태에서, IL7의 농도(예를 들어, CD3⁺-T-세포-분화 배지에서)는 50 ng/㎖이다.

일부 실시형태에서, CD3⁺-T-세포-분화 배지는 CD3⁺-T-세포-분화 배지에서 분화의 적어도 처음 2주 동안 트롬보포이에틴(TPO)을 추가로 포함한다. 비제한적인 예로서, CD3⁺-T-세포 분화 배지는 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서의 분화의 적어도 처음 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일 또는 21일 동안 트롬보포이에틴(TPO)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, TPO를 포함하는 CD3⁺-T-세포-분화 배지는 CD5⁺CD7⁺ ProT 세포의 집단으로의 분화를 촉진한다. 이러한 CD5⁺CD7⁺ ProT 세포는 CD3₊-T-세포 분화 배지에서 분화의 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일 후에 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, CD5⁺ CD7⁺ ProT 세포는 CD3⁺-T-세포-분화 배지에서 분화의 적어도 2주 후에 검출될 수 있다.

일부 실시형태에서, TPO의 농도는 혈액생성 내피세포의 CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하도록 사용되어야 한다. 일부 실시형태에서, TPO의 농도는 1 ng/㎖ 내지 200 ng/㎖의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, TPO의 농도(예를 들어, CD3⁺-T-세포-분화 배지에서)는 5 ng/㎖이다. 일부 실시형태에서, TPO의 농도(예를 들어, CD3⁺-T-세포-분화 배지에서)는 50 ng/㎖이다.

일부 실시형태에서, CD3⁺-T-세포-분화 배지(예를 들어, IL-7 및/또는 FLT3 포함)는 CD3⁺-T-세포-분화 배지에서 분화의 적어도 처음 2주 동안 SCF를 추가로 포함한다. 비제한적 예로서, CD3⁺-T-세포 분화 배지는 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서의 분화의 적어도 처음 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 또는 21일 동안 SCF를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, SCF를 포함하는 CD3⁺-T-세포 분화 배지는 CD5⁺CD7⁺ ProT 세포의 집단으로의 분화를 촉진한다.

일부 실시형태에서, SCF, FLT3, IL7 및/또는 TPO는 CD3⁺-T-세포-분화 배지에 적어도 1 ng/㎖, 적어도 2 ng/㎖, 적어도 3 ng/㎖, 적어도 4 ng/㎖, 적어도 5 ng/㎖, 적어도 6 ng/㎖, 적어도 7 ng/㎖, 적어도 8 ng/㎖, 적어도 9 ng/㎖, 적어도 10ng /㎖, 적어도 11 ng/㎖, 적어도 12 ng/㎖, 적어도 13 ng/㎖, 적어도 14 ng/㎖, 적어도 15 ng/㎖, 적어도 16 ng/㎖, 적어도 17 ng/㎖, 적어도 18 ng/㎖, 적어도 19 ng/㎖, 적어도 20 ng/㎖, 적어도 25 ng/㎖, 적어도 30 ng/㎖, 적어도 35 ng/㎖, 적어도 40 ng/㎖, 적어도 45 ng/㎖, 적어도 50 ng/㎖, 적어도 55 ng/㎖, 적어도 60 ng/㎖, 적어도 65 ng/㎖, 적어도 70 ng/㎖, 적어도 75 ng/㎖, 적어도 80 ng/㎖, 적어도 85 ng/㎖, 적어도 90 ng/㎖, 적어도 95 ng/㎖, 적어도 100 ng/㎖, 적어도 105 ng/㎖, 적어도 110 ng/㎖, 적어도 115 ng/㎖, 적어도 120 ng/㎖, 적어도 125 ng/㎖, 적어도 130 ng/㎖, 적어도 135 ng/㎖, 적어도 140 ng/㎖, 적어도 145 ng/㎖, 적어도 150 ng/㎖, 적어도 155 ng/㎖, 적어도 160 ng/㎖, 적어도 165 ng/㎖, 적어도 170 ng/㎖, 적어도 175 ng/㎖, 적어도 180 ng/㎖, 적어도 185ng /㎖, 적어도 190 ng/㎖, 적어도 195 ng/㎖, 또는 적어도 200 ng/㎖의 농도로 제공된다. SCF, FLT3, IL7 및/또는 TPO의 농도는 같거나 다를 수 있다.

일부 실시형태에서, CD3⁺ T 세포는 CD3⁺-T-세포-분화 배지에서 분화의 적어도 5.0주 후에 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, CD3⁺ T 세포는 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서 적어도 1.5주, 2주, 2.5주, 3.0주, 3.5주, 4.0주, 4.5주, 또는 5.0주의 분화 후에 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, CD3⁺ T 세포의 집단은 본 명세서에서 이중-양성 또는 DP T 세포로도 지칭되는 CD4⁺CD8⁺ T 세포의 집단을 포함한다. 이러한 CD4⁺CD8⁺ CD3⁺ T 세포는 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서 적어도 1.5주, 2주, 2.5주, 3.0주, 3.5주, 4.0주, 4.5주 또는 5.0주의 분화 후에 검출될 수 있다.

일부 실시형태에서, 방법은 CD4⁺ 세포 및 CD8⁺ 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 단일-양성 T 세포 분화 배지에서 CD4⁺CD8⁺ T 세포의 집단을 분화시키는 것을 추가로 포함한다 세포. 일부 실시형태에서, CD4⁺CD8⁺ T 세포의 집단으로부터 CD4⁺ T 세포의 집단 및 CD8⁺ 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간은 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 또는 적어도 10일이다. 일부 실시형태에서, CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로부터 CD4⁺ T 세포의 집단 및 CD8⁺ 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간은 적어도 4.0주, 4.5주, 5.0주, 5.5주, 또는 6.0주이다.

일부 실시형태에서, 단일-양성-T-세포-분화 배지는 10 ng/㎖ IL-15 및 T 세포 활성화인자를 포함한다. 인터루킨-15(IL-15)는 IL-7과 마찬가지로 인터루킨 2(IL-2) 슈퍼패밀리의 구성원이며 림프구를 자극하는 활성을 포함하여 IL-2와 많은 활성을 공유한다. 일부 실시형태에서, CD4⁺CD8+ T 세포의 단일 양성 CD4⁺ 세포 및 CD8⁺ 세포로의 분화를 여전히 촉진하는 한 다양한 농도의 IL-15가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, IL15의 농도는 1 ng/㎖ 내지 200 ng/㎖의 범위일 수 있고, 바람직한 농도는 10 ng/㎖이다.

일부 실시형태에서, T 세포 활성화인자는 CD3 및 CD28(및 임의로 CD2) 세포 표면 리간드에 결합하는 성분(예를 들어, 가용성 사량체성 항체 복합체)을 포함한다. T 세포 활성화인자의 결합은 CD3 및 CD28(및 선택적으로 CD2) 세포 표면 리간드의 가교를 초래하여, T 세포 활성화에 필요한 1차 및 공동-자극 신호를 제공한다.

일부 실시형태에서, T 세포 활성화인자는 CD3/CD28 T 세포 활성화인자를 포함한다(예를 들어, 10 ㎕/㎖의 농도로). 그러한 CD3/CD28 T 세포 활성화인자는 상업적으로 입수가능하다(예를 들어, StemCell Technology™를 통해, 항목 #10970). 일부 실시형태에서, CD3/CD28 T 세포 활성화인자의 농도는 이것이 CD4⁺CD8⁺ T 세포의 단일 양성 CD4⁺ 세포 및 CD8⁺ 세포로의 분화를 촉진하도록 사용되어야 한다. 일부 실시형태에서, 농도는 1 ㎕/㎖ 내지 200 ㎕/㎖의 범위일 수 있으며, 바람직한 농도는 10 ㎕/㎖이다.

일부 실시형태에서, T 세포 활성화인자는 CD3/CD28 T 세포 활성화인자 Dynabeads(예를 들어, 세포당 하나의 비드로 사용됨)를 포함한다. 이러한 CD3/CD28 T 세포 활성화인자 Dynabeads는 (예를 들어, ThermoFisher™ #11132D를 통해) 상업적으로 이용가능하다. 일부 실시형태에서, CD3/CD28 T 세포 활성화인자 Dynabeads의 농도는 CD4⁺CD8⁺ T 세포의 단일 양성 CD4⁺ 세포 및 CD8⁺ 세포로의 분화를 촉진하도록 사용되어야 한다. 일부 실시형태에서, 농도는 1 비드/세포 내지 20 비드/세포의 범위일 수 있고, 바람직한 농도는 1 비드/세포이다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 적어도 1주 후(예를 들어, 단일-양성-T-세포-분화 배지에서), CD4⁺ 세포 농축 및/또는 CD8⁺ 세포 농축 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CD4⁺ 세포 농축 및/또는 CD8⁺ 세포 농축 단계는 단일-양성-T-세포 분화 배지에서의 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 또는 적어도 14일의 배양으로 일어날 수 있다.

CD4⁺ 또는 CD8⁺ 세포를 농축하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 비제한적 예로서, CD4⁺ 또는 CD8⁺ 세포는 그에 따라 항-CD4 또는 항-CD8 항체와 함께 자기-활성화 세포 분류(MACS; magnetic-activated cell sorting) 및 형광-활성화 세포 분류(FACS; fluorescence-activated cell sorting)를 이용하여 농축될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 전체 T 세포 분화 프로토콜은 무-간질 환경에서 발생하며, 예를 들어, 세포는 비-간질-유래(non-stromal-derived) 노치 리간드(예를 들어, 조직 배양 플레이트 상에 고정화된 노치 리간드)에 노출된 세포를 배양한다. 일부 실시형태에서, T 세포 분화 프로토콜의 적어도 일부(예를 들어, CD3⁺-T-세포-분화 배지 및 단일-양성-T-세포-분화 배지에서 배양하는 것을 포함함)는 무-간질 환경에서 발생하며, 예를 들어, 세포는 비-간질-유래 노치 리간드(예를 들어, 조직 배양 플레이트에 고정화된 노치 리간드)에 노출되어 배양된다.

유래된 T 세포 집단

본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법을 이용하여, 그리고 한 실시형태에서 후성유전 조절인자(예를 들어, HMT; 예를 들어, EZH1, G9a/GLP)의 억제와 조합하여 유도된 T 세포의 집단은, 간질 공동-배양 방법과 비교하여 적어도 다음의 예상치 못한 이점을 나타낸다: (1) 인간 이식 잠재력의 증가; (2) 선천적-유사 T 세포 수의 감소; (3) 생성된 T 세포(예를 들어, CD5⁺CD7⁺ Pro-T 세포; CD3⁺ T 세포; CD4⁺CD8⁺ T 세포; CD4⁺ T 세포; CD8⁺ T 세포; 알파-베타 T 세포)의 수 및/또는 백분율의 증가; (4) 알파 베타 T 세포와 가장 유사한 유전자 발현 프로파일; (5) 보다 다양한 TCR 레퍼토리; 및/또는 (6) TCR CDR 길이의 증가(예를 들어, 실시예 1, 도 1C-1D, 도 3A-3B, 도 4, 도 5A-5D, 도 6-16 참조).

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법 및/또는 후성유전 조절인자(예를 들어, HMT, 예를 들어, EZH1, G9a/GLP)의 억제를 이용하여 유래된 T 세포(예를 들어, CD3⁺ T 세포; CD4⁺CD8⁺ T 세포; CD4⁺ T 세포; CD8⁺ T 세포)의 집단은 간질 방법을 이용하여 유래된 T 세포의 집단에 비해 적어도 10% 더 높은 이식 또는 생착률을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법 및/또는 후성적 조절인자의 억제를 이용하여 유래된 T 세포의 집단은 간질 방법을 이용하거나 후성 유전적 조절인자의 억제 없이 유래된 T 세포의 집단에 비해 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85 %, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 250%, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500% 또는 그 이상, 또는 적어도 10배(x), 20배(x), 30배(x), 40배(x), 50배(x), 60배(x), 70배(x), 80배(x), 90배(x), 100배(x), 500배(x), 1,000배(x), 또는 그 이상 더 높은 이식 또는 생착률을 나타낸다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법 및/또는 후성유전 조절인자의 억제를 이용하여 유래된 T 세포(예를 들어, CD3+ T 세포; CD4+CD8+ T 세포; CD4+ T 세포; CD8+ T 세포)의 집단 중 소수는 TCRgd⁺(즉, 선천적-유사 감마 델타 T 세포)이다. 감마 델타 T 세포(γδ T 세포)는 이들의 표면 상에 독특한 T 세포 수용체(TCR)를 갖는 T 세포이다. 대부분의 T 세포는 α(알파) 및 β(베타) TCR 사슬이라고 하는 2개의 당단백질 사슬로 구성된 TCR이 있는 αβ(알파 베타) T 세포이다. 대조적으로, 감마 델타(γδ) T 세포는 하나의 γ(감마) 쇄와 하나의 δ(델타) 사슬로 구성된 TCR을 가지고 있다. CD1d-제한된 자연 살해 T 세포와 같이, 불변 TCR을 보유하는 다른 '독특한(unconventional)' T 세포 서브세트와 마찬가지로, 감마 델타 T 세포는 다양한 외부 인자에 대한 신속한 유익한 반응을 허용하는 보다 원시적인 선천 면역계와 적응 면역계 사이의 경계에 위치하는 몇 가지 특성을 나타나며, 여기서 B 및 T 세포는 느리지만 고도로 항원 특이적 면역 반응을 조정하여 동일한 항원에 의한 후속 도전에 대해 오래 지속되는 기억을 유도한다. 감마 델타 T 세포는 TCR 유전자를 재배열하여 접합 다양성을 생성하고 기억 표현형을 발달시킬 수 있다는 점에서 적응 면역의 구성요소로 간주될 수 있다. 그러나, 다양한 서브세트는 특정 TCR이 패턴 인식 수용체로 기능할 수 있는 선천 면역의 일부로 간주될 수도 있다. 예를 들어, 다음 문헌 참조: Born WK, Reardon CL, O'Brien RL (February 2006). "The function of gammadelta T cells in innate immunity". Current Opinion in Immunology. 18 (1): 31-8.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법 및/또는 후성유전 조절인자의 억제를 이용하여 유래된 T 세포(예를 들어, CD3⁺ T 세포, CD4⁺CD8⁺ T 세포, CD4⁺ T 세포, CD8⁺ T 세포)의 집단의 최대(at most) 10%가 TCRgd⁺이다. 일부 실시형태에서, 최대 1%, 최대 2%, 최대 3%, 최대 4%, 최대 5%, 최대 6%, 최대 7%, 최대 8%, 최대 9%, 최대 10%, 최대 11%, 최대 12%, 최대 13%, 최대 14%, 최대 15%, 최대 16%, 최대 17%, 최대 18%, 최대 19%, 최대 20%, 최대 21%, 최대 22%, 최대 23%, 최대 24%, 최대 25%, 최대 26%, 최대 27%, 최대 28%, 최대 29%, 최대 30%, 최대 31%, 최대 32%, 최대 33%, 최대 34%, 최대 35%, 최대 36%, 최대 37%, 최대 38%, 최대 39%, 최대 40%, 최대 41%, 최대 42%, 최대 43%, 최대 44%, 최대 45%, 최대 46%, 최대 47%, 최대 48% 또는 최대 49%의 T 세포(예를 들어, CD3⁺ T 세포, CD4⁺CD8⁺ T 세포, CD4⁺ T 세포, CD8⁺ T 세포)의 집단은 TCRgd⁺이다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법 및/또는 후성유전 조절인자의 억제를 이용하여 유래된 T 세포(예를 들어, CD3⁺ T 세포; CD4⁺CD8⁺ T 세포; CD4⁺ T 세포; CD8⁺ T 세포)의 집단은 간질 방법을 이용하거나 후성 유전적 조절인자의 억제 없이 유래된 T 세포의 집단에 비해 적어도 10% 더 많은 T 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법 및/또는 후성유전 조절인자의 억제를 이용하여 유래된 T 세포의 집단은 간질 방법 또는 후성유전 조절인자의 억제 없이 유래된 T 세포의 집단에 비해 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35 %, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 250%, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500% 또는 그 이상, 또는 적어도 10배(x), 20배(x), 30배(x), 40배(x), 50배(x), 60배(x), 70배(x), 80배(x), 90배(x), 100배(x), 500배(x), 1,000배(x), 또는 그 이상 더 많은 T 세포를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법 및/또는 후성유전 조절인자의 억제를 이용하여 유래된 T 세포(예를 들어, CD3⁺ T 세포; CD4⁺CD8⁺ T 세포; CD4⁺ T 세포; CD8⁺ T 세포)의 집단은, 다른 세포(예를 들어, γδ T 세포; NK 세포; OP9-DL4 공동-배양 시스템을 이용하는 iPSC 유래 T 세포; 제대혈 CD34⁺ HSPC에서 분화된 T 세포)에 비해, αβ T 세포와 더 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타내며, 예를 들어, 유래된 T 세포의 유전자 프로파일은 다른 세포 유형과 비교하여 αβ T 세포와 적어도 0.5% 더 유사하다. 한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법 및/또는 후성유전 조절인자의 억제를 사용하여 유래된 T 세포의 집단은 αβ T 세포의 유전자 발현 프로파일과 최대 10% 차이나는 T 세포 시그니처 유전자 및/또는 αβ T 세포 시그니처 유전자의 유전자 발현 프로파일을 나타낸다. 한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법 및/또는 후성적 조절인자의 억제를 사용하여 유래된 T 세포의 집단은, αβ T 세포의 유전자 발현 프로파일과 최대 20%(예를 들어, 최대 1%, 최대 2%, 최대 3%, 최대 4%, 최대 5%, 최대 6%, 최대 7%, 최대 8%, 최대 9%, 최대 10%, 최대 11%, 최대 12%, 최대 13%, 최대 14%, 최대 15%, 최대 16%, 최대 17%, 최대 18%, 최대 19%, 또는 그 이상) 차이나는 T 세포 시그니처 유전자 및/또는 αβ T 세포 시그니처 유전자의 유전자 발현 프로파일을 나타낸다. 한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법 및/또는 후성유전 조절인자의 억제를 사용하여 유래된 T 세포의 집단은, αβ T 세포의 유전자 발현 프로파일과 1% 내지 5%, 2% 내지 6%, 3% 내지 7%, 4% 내지 8%, 5% 내지 9%, 5% 내지 10%, 5% 내지 15%, 10% 내지 15% 또는 15% 내지 20% 차이나는 T 세포 시그니처 유전자 및/또는 αβ T 세포 시그니처 유전자의 유전자 발현 프로파일을 나타낸다.

한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법 및/또는 후성유전 조절인자의 억제를 사용하여 유래된 T 세포의 집단은, 간질 방법을 이용하거나 또는 후성유전 조절인자의 억제 없이 유래된 T 세포의 집단에 비해 αβ T 세포의 유전자 발현 프로필과 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38 %, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 더 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타낸다. 한 실시형태에서, 유래된 T 세포는 다른 세포 유형의 유전자 프로파일보다 αβ T 세포의 유전자 발현 프로파일에 대해 더 큰 백분율의 유사성을 나타낸다. 당업자는 표준 방법, 예를 들어, 특정 세포 유형의 전사체(transcriptome) 시퀀싱(FACS-분류된 세포)을 사용하여 본 명세서에 기술된 무-간질 방법으로부터 유래된 T 세포 및 αβ T 세포에서 유전자 발현의 유사성을 결정할 수 있다.

한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법 및/또는 후성유전 조절인자의 억제를 이용하여 유래된 T 세포의 집단은, 말초 혈액 알파 베타 T 세포와 비교하여 적어도 0.75, 0.755, 0.76, 0.765, 0.77, 0.775, 0.78, 0.785, 0.79, 0.795, 0.8, 0.805, 0.81, 0.815, 0.82, 0.825, 0.83, 0.835, 0.84, 0.845, 0.85, 0.855, 0.86, 0.865, 0.87, 0.875, 0.88, 0.885, 0.89, 0.895, 0.9, 0.905, 0.91, 0.915, 0.92, 0.925, 0.93, 0.935, 0.94, 0.945, 0.95, 0.955, 0.96, 0.965, 0.97, 0.975, 0.98, 0.985, 0.99, 0.995, 또는 1.0의 피어슨(Pearson) 상관계수를 갖는 유전자 발현 프로파일을 나타낸다.

일부 실시형태에서, CD3⁺ T 세포의 집단은 알파 베타 T 세포와 가장 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타낸다. 일부 실시형태에서, CD3⁺ T 세포의 집단은 알파 베타 T 세포와 유사하거나 실질적으로 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타낸다. 일부 실시형태에서, CD3⁺ T 세포의 집단은 알파 베타 T 세포와 적어도 10%, 20%, 30%, 40% 또는 그 이상 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타낸다. 일부 실시형태에서, CD3⁺ T 세포의 집단은 말초혈 알파 베타 T 세포와 비교하여 적어도 0.85의 피어슨 상관계수를 갖는 유전자 발현 프로파일을 나타낸다.

일부 실시형태에서, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 및/또는 후성유전 조절인자의 억제를 사용하여 유래된 면역 세포는 알파 베타 T 세포와 가장 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 알파 베타 T 세포와 유사하거나 실질적으로 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 알파 베타 T 세포와 적어도 10%, 20%, 30%, 40% 또는 그 이상 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는, 말초 혈액 알파 베타 T 세포와 비교하여 적어도 0.85의 피어슨 상관계수를 갖는 유전자 발현 프로파일을 나타낸다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법 및/또는 후성유전 조절인자의 억제를 사용하여 유래된 T 세포의 집단은, αβ T 세포로부터의 시그니처 유전자를 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개, 적어도 25개, 적어도 26개, 적어도 27개, 적어도 28개, 적어도 29개, 적어도 30개, 적어도 31개, 적어도 32개, 적어도 33개, 적어도 34개, 적어도 35개, 적어도 36개, 적어도 37개, 적어도 38개, 적어도 39개, 적어도 40개, 적어도 41개, 적어도 42개, 적어도 43개, 적어도 44개, 적어도 45개, 적어도 46개, 적어도 47개, 적어도 48개, 적어도 49개, 적어도 50개, 적어도 51개, 적어도 52개, 적어도 53개, 적어도 54개, 적어도 55개, 적어도 56개, 적어도 57개, 적어도 58개, 적어도 59개, 적어도 60개, 적어도 61개, 적어도 62개, 적어도 63개, 적어도 64개, 적어도 65개, 적어도 66개, 적어도 67개, 적어도 68개, 적어도 69개, 적어도 70개, 적어도 71개, 적어도 72개, 적어도 73개, 적어도 74개, 적어도 75개, 적어도 76개, 적어도 77개, 적어도 78개, 적어도 79개, 적어도 80개, 적어도 81개, 적어도 82개, 적어도 83개, 적어도 84개, 적어도 85개, 적어도 86개, 적어도 87개, 적어도 88개, 적어도 89개, 적어도 90개, 적어도 91개, 적어도 92개, 적어도 93개, 적어도 94개, 적어도 95개, 적어도 96개, 적어도 97개, 적어도 98개, 적어도 99개, 적어도 100개, 적어도 125개, 적어도 150개 또는 그 이상으로 발현한다. 한 실시형태에서, 유래된 T 세포는 다른 세포 유형으로부터의 시그니처 유전자보다 αβ T 세포로부터의 시그니처 유전자를 더 많은 수로 발현한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "시그니처 유전자"는 특정 세포 유형(예를 들어, T 세포, αβ T 세포)에서 특징적인 발현 패턴을 나타내는 유전자를 지칭하고; 시그니처 유전자는 특정 세포 유형의 기능에 필요할 수 있다. T 세포 시그니처 유전자 및 αβ T 세포 시그니처 유전자의 비제한적인 예는 본 명세서에 추가로 기재되어 있다. 특정 세포 유형(예를 들어, T 세포, αβ T 세포)은, 고유한 특징적인 유전자 발현 패턴(즉, 시그니처 유전자)을 가진 세포에서 단일 또는 조합된 유전자 그룹을 포함하는, 유전자 시그니처 또는 유전자 발현 시그니처를 나타낸다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법 및/또는 후성적 조절인자의 억제를 사용하여 유래된 T 세포의 집단은, αβ T 세포로부터의 유전자를 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개, 적어도 25개, 적어도 26개, 적어도 27개, 적어도 28개, 적어도 29개, 적어도 30개, 적어도 31개, 적어도 32개, 적어도 33개, 적어도 34개, 적어도 35개, 적어도 36개, 적어도 37개, 적어도 38개, 적어도 39개, 적어도 40개, 적어도 41개, 적어도 42개, 적어도 43개, 적어도 44개, 적어도 45개, 적어도 46개, 적어도 47개, 적어도 48개, 적어도 49개, 적어도 50개, 적어도 51개, 적어도 52개, 적어도 53개, 적어도 54개, 적어도 55개, 적어도 56개, 적어도 57개, 적어도 58개, 적어도 59개, 적어도 60개, 적어도 61개, 적어도 62개, 적어도 63개, 적어도 64개, 적어도 65개, 적어도 66개, 적어도 67개, 적어도 68개, 적어도 69개, 적어도 70개, 적어도 71개, 적어도 72개, 적어도 73개, 적어도 74개, 적어도 75개, 적어도 76개, 적어도 77개, 적어도 78개, 적어도 79개, 적어도 80개, 적어도 81개, 적어도 82개, 적어도 83개, 적어도 84개, 적어도 85개, 적어도 86개, 적어도 87개, 적어도 88개, 적어도 89개, 적어도 90개, 적어도 91개, 적어도 92개, 적어도 93개, 적어도 94개, 적어도 95개, 적어도 96개, 적어도 97개, 적어도 98개, 적어도 99개, 적어도 100개, 적어도 125개, 적어도 150개 또는 그 이상으로 발현한다. 한 실시형태에서, 유래된 T 세포는 다른 세포 유형으로부터의 시그니처 유전자보다 αβ T 세포로부터의 유전자를 훨씬 더 많은 수로 발현한다.

T 세포 시그니처 유전자의 비제한적인 예는, GRB2 (성장 인자 수용체 결합 단백질 2); NFATC3 (활성화된 T 세포의 핵 인자 3); ZAP70 (T 세포 수용체의 제타 사슬 연관 단백질 키나제 70); RAF1 (Raf-1 원발암유전자, 세린/트레오닌 키나제); PIK3CG (포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나제 촉매 서브유닛 감마); PIK3R1 (포스포이노시티드-3-키나제 조절 서브유닛 1); CALM3 (칼모듈린 3); PTPN7 (단백질 티로신 포스파타제 비-수용체 타입 7); LAT (T 세포의 활성화 링커); NFKBIA (NFKB 억제제 알파); VAV1 (Vav 구아닌 뉴클레오티드 교체 인자 1); SHC1 (SHC (Src 상동체 2 도메인 함유) 어댑터 단백질 1); PRKCB (단백질 키나제 C 베타); MAP2K4 (미토겐-활성화 단백질 키나제 키나제 4); MAP2K1 (미토겐-활성화 단백질 키나제 키나제 1); RAC1 (Rac 패밀리 소 GTPase 1); FYN (Fyn 원발암유전자, Src 패밀리 티로신 키나제); RELA (RELA 원발암유전자, NF-KB 서브유닛, v-rel 조류 세망내피증 바이러스 종양유전자 상동체 A); LCK (Lck 원발암유전자, Src 패밀리 티로신 키나제); CALM2 (칼모듈린 2); CD3D (CD3 Antigen, Delta 서브유닛); CALM1 (칼모듈린 1); CD247 (T-세포 표면 당단백질 CD3 제타 쇄); CD3E (T-세포 표면 당단백질 CD3 엡실론 쇄); CD3G (T-세포 표면 당단백질 CD3 감마 쇄); FOS (Fos 원발암유전자, AP-1 전사 인자 서브유닛); PIK3CA (포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나제 촉매 서브유닛 알파); PLCG1 (포스포리파제 C 감마 1); SOS1 (소스(Son Of Sevenless) 상동체 1, SOS Ras/Rac 구아닌 뉴클레오티드 교체 인자 1); ELK1 (ETS 전사 인자 ELK1); PPP3CC (단백질 포스파타제 3 촉매 서브유닛 감마); MAP3K1 (미토겐-활성화 단백질 키나제 키나제 키나제 1); PPP3CA (단백질 포스파타제 3 촉매 서브유닛 알파); NFKB1 (핵 인자 카파 B 서브유닛 1); NFATC2 (활성화된 T 세포의 핵 인자 2); NFATC1 (활성화된 T 세포의 핵 인자 1, AP-1 전사 인자 서브유닛); JUN (Jun 원발암유전자; MAPK8 (미토겐-활성화 단백질 키나제 8); RASA1 (RAS P21 단백질 활성화인자 1); PPP3CB (단백질 포스파타제 3 촉매 서브유닛 베타); PRKCA (단백질 키나제 C 알파); MAPK3 (미토겐-활성화 단백질 키나제 3); 및 NFATC4 (활성화된 T 세포의 핵 인자 4)를 포함한다(예를 들어, 도 3A 참조).

αβ T 세포 시그니처 유전자의 비제한적 예는, ATP11B (ATPase 포스포리피드 운송 11B); PPP4R3A (단백질 포스파타제 4 조절 서브유닛 3A); CAB39 (칼슘 결합 단백질 39); GLS (글루타미나제); UBE2Z (유비퀴틴 결찰 효소 E2 Z); INPP4A (이노시톨 폴리포스페이트-4-포스파타제 타입 I A); RAB22A (Ras-관련 단백질 Rab-22A, Ras 원발암유전자 패밀리 구성원); SMARCD2 (염색질 서브패밀리 D 구성원의 SWI/SNF(SWItch/Sucrose Non-Fermentable) 관련, 매트릭스 연관, 액틴 의존성 조절인자 2); VPS26B (VPS26, 레트로머 복합체 구성성분 B, 공포(Vacuolar) 단백질 분류-연관 단백질 26B); CERK (세라마이드 키나제); ESYT2 (신장된 스냅토태그민 2); RAC1 (Rac 패밀리 소 GTPase 1); EIF3B (진핵 번역 개시 인자 3 서브유닛 B); NEK7 (NIMA(Never In Mitosis Gene A)-관련 키나제 7); MDFIC (MyoD (근원세포 결정 단백질 1) 패밀리 억제자 도메인 함유); YWHAH (티로신 3-모노옥시게나제/트립토판 5-모노옥시게나제 활성화 단백질 Eta); MCMBP (미니염색체 유지 복합체 결합 단백질); GOLPH3 (골지 포스포단백질 3); PTGER4 (프로스타글란딘 E 수용체 4); B3GNT2 (UDP-GlcNAc:BetaGal 베타-1,3-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 2, 갈락토실트랜스퍼라제 7); PITPNC1 (포스파티딜이노시톨 전달 단백질 세포질 1); ARAP2 (RhoGAP 도메인, 안키린(Ankyrin) 반복부 및 PH 도메인이 있는 ArfGAP 2; Arf 및 Rho GAP 어댑터 단백질 2); ZFP36L2 (징크 핑거 단백질 36, C3H1 타입-유사 2); EFHD2 (EF-Hand 도메인 패밀리 구성원 D2, 스위프로신(Swiprosin)-1); CPD (카복시펩티다제 D); KLRB1 (킬러 세포 렉틴 유사 수용체 B1); DUSP1 (이중 특이성 포스파타제 1); CMPK1 (시티딘/우리딘 모노포스페이트 키나제 1); RASGRP1 (Ras 구아닐 배출 단백질 1); TM9SF3 (막통과 9 수퍼패밀리 구성원 3); MAPK1 (미토겐-활성화 단백질 키나제 1); GSPT1 (G1 내지 S 시기 전이 1); PNRC1 (프롤린 풍부 핵 수용체 공동활성화인자 1); TMEM248 (막통과 단백질 248); STT3B (STT3(ST아우로스포린 및 온도 감작) 올리고사카릴트랜스퍼라제 복합체 촉매 서브유닛 B); KHDRBS1 (KH(K 상동성) RNA 결합 도메인 함유, 신호 전달 관련 1); GNPTAB (N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 트랜스퍼라제 서브유닛 알파 및 베타); GRSF1 (G-풍부 RNA 서열 결합 인자 1); TARP (TCR 감마 대체 판독 틀 단백질, T-Cell 수용체 감마-쇄); ZBTB16 (징크 핑거 및 BTB(BR-C, ttk 및 bab의 경우) 도메인 함유 16, 징크 핑거 단백질 145(전골수구성 백혈병에서 발현되는, 크루펠-유사)); TGFBR1 (변형 성장 인자 베타 수용체 1); LGALS3BP (갈렉틴 3 결합 단백질); CD5 (T-세포 표면 당단백질 CD5); CD4 (T-세포 표면 당단백질 CD4); LRRN3 (류신 풍부 반복부 뉴런 3); SLC40A1 (용질 운반체 패밀리 40 구성원 1); CYSLTR1 (시스테닐 류코트리엔 수용체 1); H4C3 (H4 클러스터화된 히스톤 3); CISH (사이토카인 유도성 SH2 (Src Homology 2) 함유 단백질); CD8B (T-세포 표면 당단백질 CD8 베타 쇄); MAL (Mal, T 세포 분화 단백질, 미엘린 및 림프구 단백질); SUN2 (Sad1 및 Unc84 도메인 함유 2, Rab5-상호작용 단백질); CCR7 (C-C 모티프 케모카인 수용체 7); GNLY (그래뉼라이신); ANKLE2 (안키린 반복부 및 LEM(LAP2, 에머린, MAN1) 도메인 함유 2); PSIP1 (PC4(양성 보조인자 4) 및 SFRS1(세린 및 아르기닌 풍부 스플라이싱 인자 1) 상호작용 단백질 1, 수정체 상피-유래 성장 인자); PITPNA (포스파티딜이노시톨 전달 단백질 알파); RBM15B (RNA 결합 모티프 단백질 15B); PTPRA (단백질 티로신 포스파타제 수용체 타입 A); MARK2 (미세소관 친화도 조절 키나제 2); BLOC1S4 (리소좀 세포소기관 복합체 1의 생합성 서브유닛 4); SIAH2 (시아 E3 유비퀴틴 단백질 리가제 2); MXD4 (최대 이량체화 단백질 4); SRM (스페미딘 합성효소); SESN1 (세스트린 1); SSBP4 (단일 가닥 DNA 결합 단백질 4); TAF10 (TATA-박스 결합 단백질 관련 인자 10); DUSP2 (이중 특이성포스파타제 2); LPCAT1 (리소포스파티딜콜린 아실트랜스퍼라제 1); RASAL3 (Ras 단백질 활성화인자 유사 3); TRIM65 (3성분(Tripartite) 모티프 함유 65); FAM50A (서열 유사성 50이 있는 패밀리 구성원 A); PIM3 (Pim-3 원발암유전자, 세린/트레오닌 키나제); SIPA1 (신호-유도된 증식-관련 1); FAM89B (서열 유사성이 있는 패밀리 89 구성원 B); ZBTB7A (징크 핑거 및 BTB(BR-C, ttk 및 bab의 경우) 도메인 함유 7A, 짧은 전사체 단백빌 1의 유도인자에 결합하는 인자); NIN (나인인); NR1D2 (핵 수용체 수퍼패밀리 1 그룹 D 구성원 2); SIK3 (Salt-유도성 키나제 3); ARHGAP26 (Rho GTPase 활성화 단백질 26); IL18RAP (인터루킨 18 수용체 보조 단백질); CNR2 (칸나비노이드 수용체 2); EOMES (에오메소데르민); KLRC1 (킬러 세포 렉틴 유사 수용체 C1); SEL1L3 (린(Lin)-12-유사 단백질의 억제인자 3); IL12RB2 (인터루킨 12 수용체 서브유닛 베타 2); COTL1 (코액토신 유사 F-액틴 결합 단백질 1); PIK3AP1 (포스포이노시티드-3-키나제 어댑터 단백질 1); TBX21 (T-박스 전사 인자 21); FAM43A (서열 유사성 43이 있는 패밀리 구성원 A); KLRD1 (킬러 세포 렉틴 유사 수용체 D1); SLAMF7 (신호전달 림프구 활성화 분자 (SLAM) family 구성원 7); S1PR5 (스핑고신-1-포스페이트 수용체 5); LAG3 (림프구 활성화 3); ABCG1 (ATP 결합 카세트 수퍼패밀리 G 구성원 1); S100B (S100 칼슘-결합 단백질, 베타); CCL22 (C-C 모티프 케모카인 리간드 22); CEBPD (CCAAT 박스 인핸서 결합 단백질 델타); IL17F (인터루킨 17F); 및 CEACAM1 (CEA 세포 접착 분자 1)를 포함한다(예를 들어, 도 3B 참조).

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법 및/또는 후성유전 조절인자의 억제를 이용하여 유래된 T 세포의 집단은, 이러한 무-간질 방법 또는 후성유전 조절인자의 억제를 이용하여 유래되지 않은 T 세포와 비교하여, 더 다양한 TCR 레퍼토리를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법 및/또는 후생적 조절인자의 억제를 사용하여 유래된 T 세포의 집단은 약 0.000-0.025의 생산적 심슨 클론형성능(Productive Simpson Clonality) 값을 나타낸다. 0에 가까울수록 클론성에 비해 다양성이 더 높음을 나타낸다. 값이 1에 가까울수록 다양성에 비해 클론성이 더 높음을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법 및/또는 후성유전 조절인자의 억제를 이용하여 유래된 T 세포의 집단은 최대 0.01, 최대 0.015, 최대 0.02, 최대 0.025, 최대 0.03, 최대 0.035, 최대 0.04, 최대 0.045, 최대 0.05, 최대 0.055, 최대 0.06, 최대 0.065, 최대 0.07, 최대 0.075, 최대 0.08, 최대 0.08, 최대 0.085, 최대 0.9, 최대 0.095, 또는 최대 0.1의 생산적 심슨 클론형성능 값을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법 및/또는 후성적 조절인자의 억제를 사용하여 유래된 T 세포의 집단은 약 0.025의 생산적 심슨 클론형성능 값을 나타낸다(예를 들어, 도 4 참조).

T-세포 수용체(TCR) α-쇄 및 β-쇄 모두의 가변 도메인은 각각 3개의 초가변 또는 상보성 결정 영역(CDR; 예를 들어, CDR1, CDR2, CDR3)을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법 및/또는 후성유전 조절인자의 억제를 사용하여 유래된 T 세포의 집단은, 간질 방법을 이용하거나 후성유전 조절인자의 억제 없이 유래된 T 세포와 비교하여 증가된 CDR(예를 들어, CDR1, CDR2, CDR3) 길이를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법 및/또는 후성유전 조절인자의 억제를 사용하여 유래된 T 세포의 집단은, 간질 방법을 이용하거나 후성유전 조절인자의 억제 없이 유래된 T 세포의 CDR에 비해, 평균적으로, 약 3개의 뉴클레오티드(nt), 6 nt, 9 nt, 또는 12 nt 또는 그 이상 더 긴 CDR(예를 들어, CDR1, CDR2, CDR3) 길이를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법 및/또는 후성유전 조절인자의 억제를 사용하여 유래된 T 세포의 집단은, 평균적으로 약 27 nt, 30 nt, 33nt, 36nt, 39nt, 42nt, 45nt, 48nt, 51nt, 54nt, 57nt, 또는 60nt 또는 그 이상 더 긴 인 CDR(예를 들어, CDR1, CDR2, CDR3) 길이를 나타낸다(예를 들어, 도 5A-5D 참조). 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법 및/또는 후성유전 조절인자의 억제를 사용하여 유래된 T 세포의 집단은 대조군 iPSC-유래 T 세포의 경우 평균 39 nt, 또는 말초혈액 단핵 세포(PBMC)-유래 T 세포의 경우 평균 45개와 비교하여, 평균 약 42 nt 긴 CDR3 길이를 나타낸다(예를 들어, 도 5C 참조).

T 세포의 유전적 변형

일부 실시형태에서, 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 또 다른 집단(예를 들어, ESC; iPSC; HSC; CD5⁺CD7⁺ ProT 세포; CD3⁺ T 세포; CD4⁺CD8⁺ T 세포; CD4⁺ T 세포; CD8⁺ T 세포)은 유전적으로 변형된다. 일부 실시형태에서, 천연 T 세포 수용체 유전자좌는 표적화된 특이성을 향상시키기 위해 제거 및/또는 대체될 수 있다. 일부 실시형태에서, 내인성(endogenous) HLA(예를 들어, 클래스 I 및/또는 클래스 II 주요 조직적합성 복합체)는 편집되거나 제거될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전적 변형은 NK 세포-매개 용해를 방지하기 위한 비-표준 HLA-G 및 HLA-E의 도입 및 발현을 포함할 수 있으며(예를 들어, Riolobos L et al. 2013 참조), 이는 면역요법, 예를 들어, 암 면역 요범을 위한 범용성 T 세포의 공급원을 제공할 수 있다.

일부 실시형태에서, 유전적 변형은 키메라 항원 수용체(CAR) 발현을 포함한다. 키메라 항원 수용체(CAR, 키메라 면역수용체, 키메라 T 세포 수용체 또는 인공 T 세포 수용체로도 알려짐)는 T 세포에 특정 단백질을 표적으로 하는 새로운 활성을 부여하도록 조작된 수용체 단백질이다. 수용체는 키메라인데, 이들은 항원-결합 기능과 T-세포 활성화 기능 둘 다를 단일 수용체로 조합한 것이기 때문이다. 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR T 세포로도 알려짐)를 조작하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 각각의 내용이 그 전문이 본 명세서에 참조로 통합되는 다음 문헌 참조: 미국 특허공보 US7446190, US8399645, US8822647, US9212229, US9273283, US9447194, US9587020, US9932405, US10125193, US10221245, US10273300, US10287354; 미국 공개특허공보 US20160152723; PCT 공개공보 WO2009091826, WO2012079000, WO2014165707, WO2015164740, WO2016168595A1, WO2017040945, WO2017100428, WO2017117112, WO2017149515, WO2018067992, WO2018102787, WO2018102786, WO2018165228, WO2019084288 참조.

일부 실시형태에서, CAR을 발현하도록 세포를 유전적으로 변형시키는 방법은, 이로만 제한되는 것은 아니지만, CAR을 코딩하는 벡터를 사용한 세포의 형질감염 또는 전기천공; CAR을 코딩하는 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스)를 사용한 형질도입; 진 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화인자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 메가뉴클레아제-TALEN 또는 CRISPR-Cas를 사용한 유전자 편집; 또는 CAR을 발현하도록 세포를 유전적으로 변형시키는 당업계에 공지된 임의의 다른 방법을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 분화의 초기 단계에 있는 세포의 집단(예를 들어, ESC; PSC; iPSC; 혈액생성 내피세포; HSC)은 CAR로 유전적으로 변형된다.

일부 실시형태에서, CAR의 항원-결합 영역은, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 암, 자가면역 질환 또는 심장 질환(예를 들어, 심장 섬유증)과 같은 질환 또는 장애에 관련된 항원에 대해 지시된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "암"은 일반적으로 비정상적인 세포가 통제 없이 분열하고 주변 조직을 침범할 수 있는 질병 또는 상태의 부류에 관한 것이다. 암세포는 또한 혈액과 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 퍼질 수 있다. 암에는 몇 가지 주요 유형이 있다. 암종(carcinoma)은 피부 또는 내부 장기를 덮고 있는 조직에서 시작되는 암이다. 육종(sarcoma)은 뼈, 연골, 지방, 근육, 혈관 또는 기타 결합 또는 지지 조직에서 시작되는 암이다. 백혈병은 골수와 같은 혈액-형성 조직에서 시작하여 많은 수의 비정상 혈액 세포가 생성되어 혈액으로 들어가는 암이다. 림프종과 다발성 골수종은 면역 체계의 세포에서 시작되는 암이다. 중추신경계 암은 뇌와 척수의 조직에서 시작되는 암이다.

일부 실시형태에서, 암은 원발성 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 악성 암이다. 본 명세서에 사용된, 용어 "악성(malignant)"은 종양 세포의 그룹이 제어되지 않는 성장(즉, 정상 한계를 넘어서는 분열), 침습(즉, 인접 조직에 대한 침입 및 파괴), 및 전이(즉, 림프 또는 혈액을 통해 신체의 다른 위치로 퍼짐) 중 하나 이상을 나타내는 암을 지칭한다. 본 명세서에 사용된, 용어 "전이하다(metastasize)"는 신체의 한 부분에서 다른 부분으로 암의 확산을 지칭한다. 전이된 세포에 의해 형성된 종양을 "전이성 종양" 또는 "전이"라고 한다. 전이성 종양은 원래(원발성) 종양에 있는 것과 유사한 세포를 포함한다. 본 명세서에 사용된, 용어 "양성" 또는 "비-악성"은 더 커질 수 있지만 신체의 다른 부분으로 퍼지지 않는 종양을 지칭한다. 양성 종양은 자가-제한적이며 일반적으로 침습하거나 전이하지 아니한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "신생물"은 조직의 임의의 신규 및 비정상 성장, 예를 들어, 조직의 비정상 덩어리를 지칭하며, 그 성장은 정상 조직의 성장을 초과하고 이에 상응하지 않는다. 따라서 신생물은 양성 신생물, 전악성 신생물, 또는 악성 신생물일 수 있다.

암 또는 종양이 있는 대상체는 대상체의 신체에 객관적으로 측정가능한 암세포가 존재하는 대상체이다. 이 정의에는 잠재적으로 잠복하는 종양 또는 미세전이뿐만 아니라 악성, 활발하게 증식하는 암이 포함된다. 원래 위치에서 이동하여 다른 중요한 장기에 씨를 뿌린 암은 결국 영향을 받은 장기의 기능 저하를 통해 대상의 사망을 야기할 수 있다.

암의 예에는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 백혈병, 기저 세포 암종, 담도암; 방광암; 골암; 뇌 및 CNS 암; 유방암; 복막의 암; 자궁 경부암; 융모막암종; 결장 및 직장암; 결합 조직 암; 소화계의 암; 자궁내막암; 식도암; 안암; 두경부의 암; 위암(위장관(gastrointestinal)암 포함); 교모세포종(GBM; glioblastoma); 간세포 암(hepatic carcinoma); 간암(hepatoma); 상피내 신생물; 신장 또는 신장암; 후두암; 백혈병; 간암(liver cancer); 폐암(예를 들어, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평상피암); 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종을 포함하는 림프종; 흑색종; 골수종; 신경 모세포종; 구강암(예를 들어, 입술, 혀, 입, 및 인두); 난소 암; 췌장암; 전립선암; 망막모세포종; 횡문근육종; 직장암; 호흡계의 암; 침샘 암종; 육종; 피부암; 편평세포암; 위암; 고환암; 갑상선 암; 자궁 또는 자궁내막암; 비뇨계의 암; 외음부암; 뿐만 아니라 다른 암종 및 육종; 뿐만 아니라 B-세포 림프종(저 등급/여포성 비호지킨 림프종(NHL); 소림프구(SL) NHL; 중간 등급/여포성 NHL; 중간 등급 확산 NHL; 고 등급 면역모세포 NHL; 고 등급 림프모구 NHL; 고 등급 소형 비절단 세포 NHL 포함; 벌키 질병 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS 관련 림프종; 및 발덴스트롬(Waldenstrom)의 거대글로불린혈증 포함); 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프구성 백혈병(ALL); 털세포백혈병(Hairy cell leukemia); 만성 골수성 백혈병; 이식 후 림프증식성 장애(PTLD)뿐만 아니라, 모반증(phakomatoses)과 관련된 비정상적인 혈관 증식, 부종(예컨대 뇌종양과 관련된 것), 및 메이그 증후군을 포함한다. 바람직하게는, CAR T 요법의 경우, 암은 백혈병 또는 림프종과 같은 혈액암이다.

키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 사용한 면역요법은 암 환자의 치료율을 개선하고 이환율을 감소시키는 유망한 방법을 제공한다. 이와 관련하여 CD19-특이적 CAR T 세포 요법은 CD19-양성 백혈병 또는 림프종이 있는 높은 비율의 환자에 대해 극적인 객관적 반응을 달성했다. 따라서, 일부 실시형태에서, CAR의 항원-결합 영역은 CD19에 대해 유도되며; 예를 들어, 각각의 내용이 그 전문으로 본 명세서에 참조로 통합되는 다음 문헌 참조: 미국 특허공보 US10221245, US10357514; 미국 특허 공개공보 US20160152723; PCT 공개공보 WO2016033570.

종양 항원은 면역 반응, 특히 T-세포 매개 면역 반응을 유발하는 종양 세포에 의해 생성되는 단백질이다. 본 발명의 항원 결합 도메인의 선택은 치료될 암의 특정 유형에 따라 달라질 것이다. 종양 항원은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 신경교종-연관 항원, 암배아 항원(CEA), EGFRvIII, IL-11Ra, IL-13Ra, EGFR, B7H3, Kit, CA-IX, CS-1, MUC1, BCMA, bcr-abl, HER2, β-인간 융모막 성선 자극 호르몬, 알파태아단백(AFP), ALK, CD19, CD123, 사이클린 B1, 렉틴-반응성 AFP, Fos-관련 항원 1, ADRB3, 티로글로불린, EphA2, RAGE- 1, RU1, RU2, SSX2, AKAP-4, LCK, OY-TES1, PAX5, SART3, CLL-1, 푸코실 GM1, GloboH, MN-CA IX, EPCAM, EVT6-AML, TGS5, 인간 텔로머라제 역전사효소, 플라이시알 산(plysialic acid), PLAC1, RU1, RU2(AS), 장 카복실 에스테라제, 르위스(lewis)Y, sLe, LY6K, mut hsp70-2, M-CSF, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, 전립선, 전립선-특이 항원(PSA), PAX3, PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, LMP2, NCAM, p53, p53 돌연변이, Ras 돌연변이, gp100, 프로스테인, OR51E2, PANX3, PSMA, PSCA, Her2/neu, hTERT, HMWMAA, HAVCR1, VEGFR2, PDGFR-베타, 레구마인, HPV E6, E7, 서바이빈 및 텔로머라제, 정자 단백질 17, SSEA-4, 티로시나제, TARP, WT1, 전립선-암종 종양 항원-1(PCTA-1), ML-IAP, MAGE, MAGE-A1, MAD-CT-1, MAD-CT-2, MelanA/MART1, XAGE1, ELF2M, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, 호중구 엘라스타제, 육종 전위 중단점, NY-BR-1, 에프린(ephrin)B2, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44v6, CD97, CD171, CD179a, 안드로겐 수용체, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II , IGF-1 수용체, GD2, o-아세틸-GD2, GD3, GM3, GPRC5D, GPR20, CXORF61, 엽산 수용체(FRa), 엽산 수용체 베타, ROR1, Flt3, TAG72, TN Ag, Tie 2, TEM1, TEM7R, CLDN6, TSHR, UPK2 및 메조텔린을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 종양 항원은 엽산 수용체(FRa), 메조텔린, EGFRvIII, IL-13Ra, CD123, CD19, CD33, BCMA, GD2, CLL-1, CA-IX, MUC1, HER2, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다; 예를 들어, 각각의 내용은 그 전문이 본 명세서에 참조로 통합되는 다음 문헌 참조: 미국 특허 공개공보 20170209492 및 20180022795.

세포 대체 요법

한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법에 의해 생성된 조작된 면역 세포의 집단이 제공되고, 여기서 T 세포의 집단은 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 분화 방법을 이용하여 생성된다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포의 집단은, 이로만 제한되는 것은 아니지만, PSC; iPSC; 혈액생성 내피세포; HSC; CD5⁺CD7⁺ ProT 세포; CD3⁺ T 세포; CD4⁺CD8⁺ T 세포; CD4⁺ T 세포; CD8⁺ T 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 알파 베타 T 세포와 가장 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타낸다.

한 실시형태에서, 세포 집단은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다. 이러한 조작된 면역 세포는 배양을 확대하여 사용할 세포 수를 증가시킬 수 있다.

본 명세서에 기술된 조작된 면역 세포는 생물학적 연구를 위한 실험실에서 유용하다. 예를 들어, 이러한 세포는 유전 질환 또는 결함이 있는 개인으로부터 유래할 수 있으며, 실험실에서 질병 또는 결함의 생물학적 측면을 연구하고, 해당 질병 또는 결함에 대한 잠재적 치료법을 선별 및 테스트하는 데 사용할 수 있다.

대안적으로, 본 명세서에 기술된 조작된 면역 세포는 세포 대체 요법 및 필요로 하는 대상체의 기타 의학적 치료에 유용하다. 예를 들어, 화학요법이나 방사선조사 또는 둘 모두를 받았고, 면역 기능 및/또는 림프구 재구성, 또는 암 면역 요법에서 명백한 결함이 있는 환자.

다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조작된 면역 세포는 세포 대체 요법을 필요로 하는 대상체에게 투여(즉, 이식 또는 이식)된다.

한 실시형태에서, 본 명세서에는 세포 대체 요법의 방법, 또는 대상체에서 암, 자가면역 장애, 혈액 질환, 또는 기타 유전 질환 및 장애의 치료를 위한 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 공여자 대상체로부터 체세포를 제공하는 단계, (b) 상기 단락 중 임의 단락에 기재된 바와 같이 체세포로부터 유래된 만능 줄기 세포로부터 다계통 조혈 전구체 세포(예를 들어, 조혈 내피세포, HSPC)를 생성하는 단계; (c) 상기 단락 중 임의 단락에 기재된 바와 같이 생성된 다계통 조혈 전구체 세포 집단에서 히스톤 메틸트랜스퍼라제를 억제하는 단계; (d) 노치 리간드의 존재 하에 생성된 다계통 조혈 전구체 세포 집단을 분화시켜 상기 단락 중 임의 단락에 기재된 바와 같이 림프계 계통(예를 들어, T 세포)으로의 분화를 촉진하는 단계, 및 (e) 생성된 분화된 림프계 세포를 수혜 대상체로 이식하거나 투여하는 단계를 포함한다.

일 실시예에서, 호스트 대상체와 수혜 대상체는 동일한 개체이다. 또는 호스트 대상체와 수혜 대상체는 동일한 개체가 아니지만 적어도 HLA는 호환가능하다.

혈액 질환은 주로 혈액에 영향을 미치는 장애이다. 이러한 질병 또는 장애는 골수계 유래 장애, 예컨대 혈색소병증(헤모글로빈 분자 또는 헤모글로빈 합성 속도의 선천적 이상), 예를 들어, 겸상적혈구병, 지중해빈혈 및 메트헤모글로빈혈증; 빈혈(적혈구 또는 헤모글로빈 결핍), 악성 빈혈; 세포 수 감소를 초래하는 장애, 예컨대 골수이형성 증후군, 호중구감소증(호중구 수 감소), 및 혈전성 혈소판감소성 자반병(TTP), 혈소판 증가증, 혈액 악성 종양, 예컨대 림프종, 골수종 및 백혈병; 림프종, 예컨대 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 역형성 대세포 림프종, 비장 변연부 림프종, 간비장 T-세포 림프종, 및 혈관면역모세포 T-세포 림프종(AILT); 골수종, 예컨대 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 형질세포종; 결함 WBC를 증가시키는 백혈병, 예컨대 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 특발성 골수섬유증(MF), 만성 골수성 백혈병(CML), T-세포 전림프구성 백혈병(T-PLL), B-세포 전림프구성 백혈병(B-PLL), 만성 호중구 백혈병(CNL), 털세포백혈병(HCL), T 세포 거대 과립 림프구 백혈병(T-LGL), 및 공격적 NK 세포 백혈병을 포함한다.

본 명세서에는 자가면역 질환의 치료가 필요한 환자에게 유효량의 면역 세포 또는 이의 집단, 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 조성물, 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 자가면역 질환의 치료 방법이 제공된다. "자가면역 질환"은 대상체 자신의 항체가 숙주 조직과 반응하거나 면역 이펙터 T 세포가 내인성 자가-펩티드에 자가반응하여 조직 파괴를 유발하는 질환의 부류를 지칭한다. 따라서, 면역 반응이 자가 항원이라고 하는 대상체 자신의 항원에 대해 일어난다. 본 명세서에서 "자가-항원"은 정상 숙주 조직의 항원을 의미한다. 정상적인 숙주 조직은 신생물 세포를 포함하지 않는다.

치료될 수 있는 자가면역 질환의 비제한적 예는 천포창(심상성천포창(pemphigus vulgaris), 낙엽성천포창(pemphigus foliaceus) 또는 부종양성천포창(paraneoplastic pemphigus)), 크론병, 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), 헤파린 유도성 혈소판감소증(HIT), 혈전성 혈소판감소성 자반병(TTP), 중증 근무력증(MG), 및 만성 염증성 탈수초 다발신경병증(CIDP)을 포함한다. 추가의 비제한적인 자가면역 질환은 자가면역 혈소판감소증, 면역호중구감소증, 항혈우병 FVIII 억제제, 항인지질 증후군, 가와사키 증후군, ANCA-연관 질환, 다발성근염, 수포성 천포창, 다발성 경화증(MS), 길랭-바레 증후군, 만성 다발성신경병증, 궤양성 대장염, 당뇨병(diabetes mellitus), 자가면역 갑상선염, 그레이브스 안과질환, 류마티스관절염, 궤양성 대장염, 원발성 경화성 담관염, 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 자가면역 뇌척수염, 하시모토 갑상선염, 굿파스처 증후군, 자가면역 용혈성 빈혈, 항콜라겐 항체가 있는 경피증, 혼합 결합 조직 질환, 악성 빈혈(pernicious anemia), 특발성 면역 질환(예를 들어, 초승달 모양의 사구체신염, 증식성 사구체신염), 인슐린 저항성, 자가면역 당뇨병(타입 1 당뇨병; 인슐린 의존성 당뇨병)을 포함한다. 자가면역 질환은 또한 죽상동맥경화증 및 알츠하이머병을 포괄하는 것으로 인식되어 왔다. 또 다른 실시형태에서, 자가면역 질환은, 간염, 자가면역 혈우병, 자가면역 림프증식 증후군(ALPS), 자가면역 포도막염, 사구체신염, 무감마글로불린혈증, 원형 탈모증, 아밀로이드증, 강직성 척추염, 자가면역 혈관부종, 자가면역 재생불량성 빈혈, 자가면역 자율신경실조증, 자가면역 고지혈증, 자가면역면역결핍증, 자가면역 내이 질환(AIED), 자가면역 심근염, 자가면역 췌장염, 자가면역 망막병증, 자가면역 두드러기, 자가면역 두드러기 신경병증, 자가면역 축삭 신경병증, 발로병, 베체트병, 캐슬만병, 체강병, 샤가스병, 만성 재발성 다초점 골수염(CRMO), 처그-스트라우스 증후군, 반흔 천포창, 양성 점막 천포창, 코간 증후군, 한랭응집소질환, 콕사키 심근염, CREST병, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 포진성 피부염, 피부근염, 데빅병(시신경척수염), 확장성 심근병증, 원판상 루푸스, 드레슬러 증후군, 자궁내막증, 호산구성 혈관심성 섬유증, 호산구성 근막염, 결절 홍반, 에반스 증후군, 섬유화 폐포염, 거대 세포 동맥염(측두 동맥염), 하시모토 뇌염, 헤노흐-쇤라인(Henoch-Schonlein) 자반병, 임신성 포진(Herpes gestationis), 특발성 저보체성 세뇨관장관 신염, 다발성 골수종, 다초점 운동 신경병증, NMDA 수용체 항체 뇌염, IgG4-관련 질환, IgG4-관련 경화성 질환, 염증성 대동맥류, 염증성 가성종양, 봉입체 근염, 간질성 방광염, 소아 관절염, 커트너 종양, 램버트-이튼 증후군, 백혈구 세포성 혈관염, 편평 태선(lichen planus), 경화 태선(lichen sclerosus), 목질결막염(Ligneous conjunctivitis), 선형 IgA병(LAD), 라임병, 만성, 종격동 섬유증, 메니에르병, 현미경적 다발혈관염, 미쿨리츠 증후군, 무렌 궤양, 무하-하버만병, 선상 IgA병(LAD), 라임병, 만성, 종격동 섬유증, 메니에르병, 현미경적 다발혈관염, 미쿨리츠 증후군, 무렌 궤양, 무하-하버만병, 다초점 섬유경화증, 기면증, 시신경염, 오르몬드병(후복막섬유증(retroperitoneal fibrosis)), 회문형 류머티즘, PANDAS(연쇄구균과 연관된 소아 자가면역 신경정신병), 부종양 소뇌 변성, 방종양성 소뇌 퇴화(paraproteinemic polyneuropathies), 파라단백질성 다발신경병증(paraproteinemic polyneuropathies), 발작성 야간 혈색소뇨증(PNH), 패리 롬버그 증후군, 파소니지-터너 증후군, 대동맥 주위염, 동맥 주위염, 말초 신경병증, 정맥주위성 뇌척수막염(Perivenous encephalomyelitis), POEMS 증후군, 결절다발동맥염(polyarteritis nodosa), 타입 I, II 및 III 자가면역 다선 증후군, 류마티스성 다발성 근육통, 심낭절제술 증후군(postpericardiotomy syndrome), 프로게스테론 피부염, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 건선 관절염, 특발성 폐섬유증, 괴저 농피증, 순수 적혈구 무형성증, 레이노 증상(Raynaud's phenomenon), 반사 교감 이영양증, 라이터 증후군, 재발성 다발연골염, 하지불안 증후군, 류마티스열, 리데 갑상선염(Riede's thyroiditis), 유육종증, 슈미트 증후군, 공막염, 쇼그렌 증후군, 정자 및 고환 자가면역, 경직된 사람 증후군, 아급성 세균성 심내막염(SBE), 수삭 증후군(Susac's syndrome), 교감성 안염, 타카야스 동맥염(Takayasu's arteritis), 톨로사-헌트 증후군(Tolosa-Hunt syndrome), 횡단 척수염, 미분화 결합 조직 질환(UCTD), 수포성 피부병, 백반증, 라스무센 뇌염(Rasmussen's encephalitis), 발덴스트롬 거대글로불린혈증을 포함한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "투여하는(administering)", "도입하는(introducing)" 및 "이식하는(transplanting)"은, 원하는 효과(들)가 생성되도록, 손상 또는 복구 부위와 같은 원하는 부위에서 도입된 세포의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의해, 대상체 내로의 기술된 세포, 예를 들어, 조혈 전구체 세포의 배치와 관련하여 상호교환적으로 사용된다. 세포, 예를 들어, 조혈 전구체 세포, 또는 이들의 분화된 자손(예를 들어, T 세포)은 이식된 세포 또는 세포의 성분의 적어도 일부가 생존가능한 상태로 유지되는 대상체의 원하는 위치로의 전달을 초래하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다.

다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조작된 면역 세포는 대상체에 투여하기 전에 임의로 생체외에서(ex vivo) 확대된다. 다른 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 선택적으로 일정 기간 동안 동결보존된 다음, 대상체에 투여하기 전에 해동된다.

세포 대체 요법에 사용되는 조작된 면역 세포는 세포의 수혜자와 관련하여 자가(autologous)/자가(autogenic)("자가(self)") 또는 비-자가(non-autologous)("비-자가(non-self)", 예를 들어, 동종이계(allogeneic), 동계(syngeneic) 또는 이종(xenogeneic))일 수 있다. 본 명세서에 사용된 "자가(autologous)"는 동일한 대상체로부터의 세포를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 "동종이계(allogeneic)"은 비교에 있어서 세포와 유전적으로 상이한 동일한 종의 세포를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 "동계(syngeneic)"는 비교 시 세포와 유전적으로 동일한 상이한 대상체의 세포를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 "이종(xenogeneic)"은 비교하여 세포에 대해 상이한 종의 세포를 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 세포는 동종이계이다.

다양한 실시형태에서, 이를 필요로 하는 대상체에 이식될 본 명세서에 기술된 조작된 면역 세포는 대상체에 대해 자가 또는 동종이계이다.

다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조작된 면역 세포는 하나 이상의 공여자로부터 유래될 수 있거나, 자가 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 전에 배양물에서 확대된다.

다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조작된 면역 세포는 하나 이상의 공여자로부터 유래될 수 있거나, 자가 공급원으로부터 수득될 수 있다.

다양한 실시형태에서, 이식 전에 수혜자 대상체는 화학요법 및/또는 방사선으로 치료된다.

한 실시형태에서, 화학요법 및/또는 방사선은 내인성 줄기 세포를 감소시켜 이식된 세포의 생착을 촉진한다.

다양한 실시형태에서, 이식 전에, 조작된 면역 세포 또는 히스톤 메틸트랜스퍼라제 억제된, 다계통 조혈 전구체 세포 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법을 이용하여 분화된 T 세포를 생체외에서(ex vivo) 프로스타글란딘 E2 및/또는 항산화제 N-아세틸-L-시스테인(NAC)으로 처리하여 수혜 대상체에서 후속 생착을 촉진한다.

다양한 실시형태에서, 수혜 대상체는 인간이다.

다양한 실시형태에서, 대상체는 이전에 HIV 또는 다른 바이러스 질환, 혈액 질환으로 진단받았거나, 또는 암 치료를 받은 적이 있다.

한 실시형태에서, 대상체는 본 명세서에 기술된 조작된 면역 세포 및 iPSC를 생산하는 데 사용될 체세포를 공여(donation)하도록 선택된다. 한 실시형태에서, 선택된 대상체는 유전 질환 또는 결함을 갖는다.

다양한 실시형태에서, 공여자 대상체는 인간, 비-인간 동물, 설치류 또는 비-설치류이다. 예를 들어, 대상체는 임의의 포유동물, 예를 들어, 인간, 다른 영장류, 돼지, 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트, 토끼, 기니피그, 햄스터, 소, 말, 고양이, 개, 양 또는 염소, 또는 비-포유동물, 예컨대 새일 수 있다.

다양한 실시형태에서, 공여자는 이전에 HIV, 혈액 질환 또는 암으로 진단받은 적이 있다.

한 실시형태에서, 생물학적 샘플, 배아 줄기 세포, 체세포 줄기 세포, 전구체 세포, 골수 세포, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구체 세포의 집단이 공여자 대상체로부터 수득된다.

다양한 실시형태에서, 생물학적 샘플, 본 명세서에 기술된 배아 줄기 세포, 체세포 줄기 세포, 전구체 세포, 골수 세포, 조혈 줄기 세포, 또는 조혈 전구체 세포의 집단은 하나 이상의 공여자로부터 유래될 수 있거나, 또는 자가 공급원에서 수득될 수 있다.

한 실시형태에서, 배아 줄기 세포, 체세포 줄기 세포, 전구체 세포, 골수 세포, 조혈 줄기 세포, 조혈 전구체 세포는 공여자 대상체로부터 단리되고, 형질감염되고, 배양되고(선택적), 동일한 대상체로 다시 이식, 즉 자가 세포 이식된다. 여기서 공여 대상체와 수혜 대상체는 동일인이다. 또 다른 실시형태에서, 배아 줄기 세포, 체세포 줄기 세포, 전구체 세포, 골수 세포, 조혈 줄기 세포, 또는 조혈 전구체 세포는 대상체(수혜자)와 HLA 유형이 일치하는 공여자로부터 단리된다. 공여자-수혜자 항원 유형 매칭은 당업계에 잘 알려져 있다. HLA 유형에는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 및 HLA-D가 포함된다. 이들은 이식에 필요한 최소 수의 세포 표면 항원 일치를 나타낸다. 즉, 형질감염된 세포가 상이한 대상체, 즉 수혜 숙주 대상체와 동종이계로 이식된다. 공여자 또는 대상체의 배아 줄기 세포, 체세포 줄기 세포, 전구체 세포, 골수 세포, 조혈 줄기 세포, 또는 조혈 전구체 세포는 본 명세서에 기술된 핵산 분자(들)를 포함하는 벡터 또는 핵산으로 형질감염될 수 있고, 형질감염된 세포는 개시된 바와 같이 배양, 억제 및 분화되고, 선택적으로 확대되고, 그런 다음 수혜 대상체에 이식된다. 한 실시형태에서, 이식된 조작된 면역 세포는 수혜 대상체에서 생착된다. 한 실시형태에서, 이식된 조작된 면역 세포는 수혜 대상체에서 면역계를 재구성한다. 형질감염된 세포는 또한 형질감염 및 저장 후 동결보존되거나, 또는 세포 확대 및 저장 후 동결보존될 수 있다.

조작된 면역 세포 또는 히스톤 메틸트랜스퍼라제가 억제된, 다계통 조혈 전구체 세포 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법을 이용하여 분화된 T 세포는 골수 절제 요법(bone marrow ablative therapy)을 받았거나 받지 않은 개체에게 골수 또는 제대혈 이식의 일부로 투여할 수 있다. 한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 유전적으로 변형된 세포는 화학절제 또는 방사선절제 골수 요법을 받은 개체에게 골수 이식으로 투여된다.

한 실시형태에서, 세포의 용량은 정맥내로 대상체에게 전달된다. 한 실시형태에서, 세포는 대상체에게 정맥내 투여된다.

특정 실시형태에서, 환자는 본 명세서에 기술된 변형된 세포, 예를 들어, 조작된 면역 세포 또는 히스톤 메틸트랜스퍼라제 억제된, 다계통 조혈 전구체 세포 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법을 이용하여 분화된 T 세포를, 1회 정맥내 투여로 약 1 x 10⁵개 세포/㎏, 약 5 x 10⁵개 세포/㎏, 약 1 x 10⁶개 세포/㎏, 약 2 x 10⁶개 세포/㎏, 약 3 x 10⁶개 세포/㎏, 약 4 x 10⁶개 세포/㎏, 약 5 x 10⁶개 세포/㎏, 약 6 x 10⁶개 세포/㎏, 약 7 x 10⁶개 세포/㎏, 약 8 x 10⁶개 세포/㎏, 약 9 x 10⁶개 세포/㎏, 약 1 x 10⁷개 세포/㎏, 약 5 x 10⁷개 세포/㎏, 약 1 x 10⁸개 세포/㎏ 또는 그 이상 제공받는다.

특정 실시형태에서, 환자는 본 명세서에 기술된 변형된 세포, 예를 들어, 조작된 면역 세포 또는 히스톤 메틸트랜스퍼라제 억제된, 다계통 조혈 전구체 세포 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법을 이용하여 분화된 T 세포의 용량을, 1회 단일 정맥내 투여로 적어도 1 x 10⁵개 세포/㎏, 적어도 5 x 10⁵개 세포/㎏, 적어도 1 x 10⁶개 세포/㎏, 적어도 2 x 10⁶개 세포/㎏, 적어도 3 x 10⁶개 세포/㎏, 적어도 4 x 10⁶개 세포/㎏, 적어도 5 x 10⁶개 세포/㎏, 적어도 6 x 10⁶ 개 세포/㎏, 적어도 7 x 10⁶개 세포/㎏, 적어도 8 x 10⁶개 세포/㎏, 적어도 9 x 10⁶개 세포/㎏, 적어도 1 x 10⁷개 세포/㎏, 적어도 5 x 10⁷개 세포/㎏, 적어도 1 x 10⁸개 세포/㎏, 또는 그 이상 제공받는다.

추가 실시형태에서, 환자는 본 명세서에 기술된 변형된 세포, 예를 들어, 조작된 면역 세포 또는 히스톤 메틸트랜스퍼라제 억제된, 다계통 조혈 전구체 세포 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법을 이용하여 분화된 T 세포의 용량을, 약 1 x 10⁵개 세포/㎏ 내지 약 1 x 10⁸개 세포/㎏, 약 1 x 10⁶개 세포/㎏ 내지 약 1 x 10⁸개 세포/㎏, 약 1 x 10⁶개 세포/㎏ 내지 약 9 x 10⁶개 세포/㎏, 약 2 x 10⁶개 세포/㎏ 내지 약 8 x 10⁶개 세포/㎏, 약 2 x 10⁶개 세포/㎏ 내지 약 8 x 10⁶개 세포/㎏, 약 2 x 10⁶개 세포/㎏ 내지 약 5 x 10⁶개 세포/㎏, 약 3 x 10⁶개 세포/㎏ 내지 약 5 x 10⁶개 세포/㎏, 약 3 x 10⁶개 세포/㎏ 내지 약 4 x 10⁸개 세포/㎏, 또는 세포/㎏ 단위의 임의의 중간 용량(intervening dose)으로 제공받는다.

일반적으로, 본 명세서에 기술된 조작된 면역 세포 또는 히스톤 메틸트랜스퍼라제 억제된, 다계통 조혈 전구체 세포 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법을 이용하여 분화된 T 세포는 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 현탁액으로서 투여된다. 예를 들어, 치료 조성물로서. 치료 조성물은 생리학적으로 용인가능한 담체(physiologically tolerable carrier)와 함께 세포 조성물 및 임의로 활성 성분으로서 그 안에 용해되거나 분산된 본 명세서에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 생물활성제를 함유한다. 바람직한 실시형태에서, 치료 조성물은, 원하는 경우가 아니면, 치료 목적으로 포유동물 또는 인간 환자에게 투여될 때 실질적으로 면역원성이 아니다. 당업자는 세포 조성물에 사용되는 약제학적으로 허용가능한 담체가 대상체에 전달될 세포의 생존력을 실질적으로 방해하는 양으로 완충제, 화합물, 동결보존제, 보존제, 또는 기타 작용제를 포함하지 않을 것임을 인식할 것이다. 세포를 포함하는 제형은, 예를 들어, 세포막 완전성이 유지되도록 허용하는 삼투성 완충제, 및 임의로, 투여시 세포 생존력을 유지하거나 생착을 향상시키기 위한 영양소를 포함할 수 있다. 이러한 제형 및 현탁액은 당업자에게 공지되어 있고/있거나 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에 기술된 바와 같은 세포와 함께 사용하기 위해 변경될 수 있다.

본 명세서에 사용된, 용어 "약제학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)", "생리학적으로 용인가능한(physiologically tolerable)" 및 이들의 문법적 변형은 조성물, 담체, 희석제 및 시약을 지칭할 때 상호교환적으로 사용되며, 물질은 메스꺼움, 현기증, 위장 장애 등과 같은 바람직하지 않은 생리학적 효과의 생성 없이 포유동물에게 또는 포유동물에 투여될 수 있다는 것을 의미한다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 원하는 경우가 아니면 혼합되는 작용제에 대한 면역 반응의 상승을 촉진하지 않을 것이다. 활성 성분이 용해 또는 분산된 약리학적 조성물의 제조는 당업계에 잘 알려져 있으며 제형에 따라 제한될 필요는 없다. 전형적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사가능한 것으로 제조되지만, 사용 전에 액체 또는 현탁액 중에서 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 제제는 또한 유화되거나 리포솜 조성물로 제공될 수 있다. 활성 성분은 약제학적으로 허용가능하고 활성 성분과 상용성인 부형제와 본 명세서에 기술된 치료 방법에 사용하기에 적합한 양으로 혼합될 수 있다. 적합한 부형제는, 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합을 포함한다. 또한, 원하는 경우, 조성물은 활성 성분의 유효성을 향상시키는 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 등과 같은 보조 물질을 소량 함유할 수 있다. 본 발명의 치료학적 조성물은 그 안에 성분들의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염은, 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산으로 형성된 산부가염(폴리펩티드의 유리 아미노기로 형성됨)을 포함한다. 유리 카복실기로 형성된 염은 또한, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 제2철 수산화물과 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래될 수 있다. 생리학적으로 용인가능한 담체는 당업계에 잘 알려져 있다. 예시적인 액체 담체는 활성 성분 및 물 외에 어떠한 물질도 함유하지 않거나, 생리학적 pH 값에서 인산나트륨과 같은 완충제, 생리학적 식염수 또는 둘 다, 예컨대, 인산염-완충 식염수를 함유하는 멸균 수용액이다. 또한, 수성 담체는 염화나트륨 및 염화칼륨, 덱스트로스, 폴리에틸렌 글리콜 및 기타 용질과 같은 염뿐만 아니라 하나 이상의 완충염을 추가로 함유할 수 있다. 액체 조성물은 또한 물 이외에 액체 상을 포함할 수 있고 물을 제외할 수 있다. 그러한 추가 액체상의 예로는 글리세린, 면실유와 같은 식물성 오일, 및 물-오일 에멀젼이 있다. 특정 장애 또는 상태의 치료에 효과적일 본 명세서에 기술된 방법에 사용되는 활성제의 양은 장애 또는 상태의 성질에 의존할 것이고, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 적합한 약제학적 담체는 이 분야의 표준 참조 텍스트인 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol]에 기술되어 있다. 예를 들어, 주사 투여에 적합한 비경구 조성물은 1.5중량%의 활성 성분을 0.9% 염화나트륨 용액에 용해시켜 제조한다.

한 실시형태에서, "약제학적으로 허용가능한" 담체는 시험관내(in vitro) 세포 배양 배지를 포함하지 않는다.

일부 실시형태에서, 기재된 조작된 면역 세포의 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다.

다양한 실시형태에서, 적어도 제2 또는 후속 용량의 세포가 수혜 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 제2 투여는 이전 투여로부터 약 1일 내지 30주 사이에 제공될 수 있다. 제2, 제3, 제4 또는 그 이상의 총 후속 투여는, 필요에 따라, 예를 들어 숙련된 임상의에 의해 결정될 때 개체에게 전달될 수 있다.

세포 조성물은 대상체에서 효과적인 세포 대체 치료를 초래하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있으며, 즉 투여는 조성물의 적어도 일부가 전달되는 대상체의 원하는 위치로 전달을 초래하며, 즉 적어도 1 x 10⁴ 세포가 일정 기간 동안 원하는 부위에 전달된다. 투여 방식은 주사, 주입, 또는 점적(instillation)을 포함하고, "주사"는 정맥내, 동맥내, 심실내, 심장내 주사 및 주입을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 세포 전달의 경우, 주사 또는 주입에 의한 투여가 일반적으로 바람직하다.

효능 테스트는 본 명세서에 기술된 방법을 이용하여 치료 과정 동안 수행할 수 있다. 특정 질병(ailment)과 관련된 여러 증상의 중증도 측정은 치료 시작 전, 그리고 치료 시작 후 특정 시간 후에 기록된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 면역 또는 이의 집단을 포함하는 약제학적 조성물은 대상체에서 세포 대체 요법을 위해 사용될 수 있다.

따라서, 본 개시의 목적은 또한 생체내(in vivo) 세포 대체 요법, 암 면역 요법과 같은 의학적 요법, 및 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 혈액 질환의 시험관내(in vitro) 연구용으로 사용하기 위한 변형된(조작된) 세포의 조성물을 제공하는 것이다.

본 개시 프로토콜의 이점은, 모두가 환자의 몸에서 쉽게 수집될 수 있는, 줄기 세포, 조혈 전구체 세포, 및 성숙 및 분화된 체세포로부터, 다양한 유형의 세포 공급원으로부터 원하는 면역 세포 또는 다른 유형의 조혈 세포(즉, 다능성 HSC에서 분화된 세포)의 반-영구적 대량 생산을 허용하는 방법이다.

생산된 조작된 면역 세포 또는 조작된 히스톤 메틸트랜스퍼라제-억제된 CD34⁺/CD 38^lo/- 조혈 전구체 세포(예를 들어, 조혈 내피세포) 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법을 이용하여 분화된 T 세포를 면역 시스템 재건 요법(예를 들어, 골수 절제 후의 요법) 또는 면역 요법(예를 들어, 암 요법 또는 자가면역 질환에서의 요법)과 같은 다양한 의학적 치료를 위해 환자에게 이식할 수 있다. 한 가지 추가된 이점은 소스 세포의 공여자와 조작된 면역 세포의 수혜자가 동일한 사람인 경우, 생산된 조작된 면역 세포가 수혜자와 동일한 HLA를 갖고 이것이 이식 후 숙주-이식 면역 거부를 방지한다는 것이다. 소스 세포의 공여자와 HLA가 동종이계인 수혜 환자의 경우, 숙주-이식 면역 거부 반응이 크게 감소된다.

생산된 조작된 면역 세포 또는 조작된 히스톤 메틸트랜스퍼라제-억제된 CD34⁺/CD38-조혈 전구체 세포 또는 본 명세서에 기술된 바와 같이 무-간질 방법을 이용하여 분화된 T 세포는 또한 장래에 필요할 때까지 동결보존될 수 있다.

현재, 골수 이식은 다양한 혈액학적 장애에 대해 가장 확립된 세포 대체 요법이다. 골수 이식의 기능적 단위는 조혈 줄기 세포(HSC)로, 복잡한 세포 계층 구조의 정점에 있으며 일생 동안 혈액 발달을 보충한다. HLA-일치 HSC의 부족은 이식, 질병 모델링 및 약물 스크리닝을 수행하는 능력을 심각하게 제한한다. 그에 따라, 많은 연구에서 대체 소스로부터 HSC를 생성하는 것을 목표로 하였다. 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로의 재프로그래밍의 진전은 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 세포 요법의 유망한 소스인, 광범위한 환자 특이적 만능 세포에 대한 액세스를 제공하였다. 그러나, 인간 만능 줄기 세포(hPSC)에서 이식가능한 조혈 줄기 및 전구체 세포를 유도할 수 없기 때문에 혈액 질환의 특성화는 시험관내(in vitro) 분석으로 제한되었다. 유도된 분화에 의한 HSC의 생성은 여전히 난해하며, 이 문제에 대한 새로운 접근 방식이 필요하다.

따라서, 한 양태에서 본 명세서에는 세포 대체 용법의 방법이 기술되며, 이 방법은 본 명세서에 기술된 면역 세포 또는 이의 집단, 또는 상기 면역 세포 또는 이의 집단을 포함하는 조성물, 또는 상기 면역 세포 또는 이의 집단을 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 수혜 대상체에 투여하는 것을 포함한다.

일부 실시형태에서, 수혜 대상체는 화학요법 및/또는 방사선조사를 받은 적이 있다. 일부 실시형태에서, 수혜 대상체는 면역 기능 및/또는 림프구 재구성에 결함이 있다. 일부 실시형태에서, 이식 전에, 면역 세포 또는 이의 집단은 프로스타글란딘 E2 및/또는 항산화제 N-아세틸-L-시스테인(NAC)으로 생체외(ex vivo) 처치되어 수혜 대상체에서 후속 생착을 촉진한다.

키트

본 명세서에 기술된 기술의 또 다른 양태은 무엇보다도 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법을 이용하여 T 세포를 분화시키기 위한 키트에 관한 것이다. 본 명세서에 기술된 하나 이상의 키트에 포함될 수 있는 키트 성분이 본 명세서에 기술된다.

일부 실시형태에서, 키트는 유효량의 CD3⁺ T-세포 분화 인자(예를 들어, IL-7, SCF, FLT3, 및/또는 TPO); 또는 유효량의 iPSC 분화 인자(예를 들어, OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, nanog 및/또는 LIN28); 또는 유효량의 혈액생성 내피세포 분화 인자(예를 들어, BMP4, SB-431542, CHIR99021, bFGF, VEGF, IL-6, IL-11, IGF-1, SCF 및 EPO); 또는 유효량의 단일-양성 T-세포 분화 인자(예를 들어, IL-15 및/또는 CD3/CD28 T 세포 활성화인자와 같은 T 세포 활성화인자); 또는 유효량의 후성유전 조절인자의 억제제(예를 들어, MC1568; CAY10591; UNC0224; UNC0638; A366; BRD4770; BIX01294; UNC0642; UNC0631; UNC0646; UNC0321; E72; BIX-01338; BRD9539; 케토신; 또는 EZH1 RNA 간섭제)를 포함한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 이러한 세포 분화 인자는 동결건조된 형태 또는 배양된 세포와 함께 사용하기 전에 희석될 수 있는 농축된 형태로 공급될 수 있다. 바람직한 제형은 세포에 무독성 및/또는 성장률 또는 생존력 등에 영향을 미치지 않는 제형을 포함한다. T-세포 분화 인자는 분취량(aliquots) 또는 단위 용량으로 공급될 수 있다.

일부 실시형태에서, 키트는 고정화된 노치 리간드를 포함하는 세포 배양 용기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 세포 배양 용기 및 본 명세서에 제공된 시약 및/또는 설명서를 사용하여 세포 배양 용기에 고정될 수 있는 노치 리간드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기술된 바와 같은 간질 세포를 포함하지 않는다.

일부 실시형태에서, 키트는 CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 성분은 단독으로 또는 임의의 조합으로 키트로 제공될 수 있다. 키트는 본 명세서에 기술된 성분, 예를 들어, 간질 세포를 포함하지 않는 노치 리간드를 포함하는 조성물, 분화 인자(들)를 포함하는 조성물, 예를 들어, 본 명세서 전체에 걸쳐 기재된 바와 같은 CAR을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물(들)을 포함한다. 이러한 키트는 선택적으로 T 세포 성숙에 대한 마커(예를 들어, CD5, CD7, CD3, CD4, CD8, TCRgd, TCR 알파 또는 베타 등) 또는 이들의 세트의 검출을 허용하는 하나 이상의 작용제를 포함할 수 있다. 이러한 키트는 선택적으로 T 세포 활성화에 대한 마커(예를 들어, CD107a, CD69, CD25, HLA-DR, IFNg, TNFa 등) 또는 이들의 세트의 검출을 허용하는 하나 이상의 작용제를 포함할 수 있다. 이러한 키트는 선택적으로 혈액생성 내피세포에 대한 마커(예를 들어, CD34, CD38, CD45, KDR, CD235, CD43 등)의 검출을 허용하는 하나 이상의 작용제를 포함할 수 있다. 또한, 키트는 선택적으로 정보 자료를 포함한다. 키트는 또한 라미닌, 피브로넥틴, 폴리-L-라이신, 또는 메틸셀룰로오스와 같은 배양 접시를 코팅하기 위한 기질(substrate)을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 키트의 조성물은 일부 실시형태에서 키트의 다른 성분이 실질적으로 없는 방수 또는 기밀 용기에 제공될 수 있다. 예를 들어, 세포 분화 시약은 하나 이상의 용기에 공급될 수 있으며, 예를 들어, 미리결정된 수, 예를 들어 1, 2, 3 또는 그 이상의 분화 분석을 위한 충분한 시약이 있는 용기에 공급될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 성분은 임의의 형태, 예를 들어, 액체, 건조 또는 동결건조 형태로 제공될 수 있다. 본 명세서에 기술된 성분은 실질적으로 순수하고/거나 멸균된 것이 바람직하다. 본 명세서에 기술된 성분이 액체 용액으로 제공되는 경우, 액체 용액은 바람직하게는 수용액이고, 멸균 수용액이 바람직하다.

정보 자료는 설명, 교육, 마케팅 또는 본 명세서에 설명된 방법과 관련된 기타 자료일 수 있다. 키트의 정보 자료는 형식에 제한이 없다. 한 실시형태에서, 정보 자료는 고정화된 노치 리간드를 포함하는 세포 배양 용기의 생산에 대한 정보; 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 무-간질 방법을 이용하여 분화된 T 세포의 생산; 또는 세포 분화 인자와 같은 본 명세서에서 사용되는 시약의 농도, 만료 일자, 배치 또는 생산 장소 정보 등을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, 정보 자료는 키트의 성분을 사용하거나 투여하는 방법에 관한 것이다.

키트는 세포 분화용 마커의 검출을 위한 구성요소를 포함할 수 있다. 또한, 키트는 세포 마커에 결합하는 하나 이상의 항체, 또는 RT-PCR 또는 PCR 반응, 예를 들어, 반-정량적 또는 정량적 RT-PCR 또는 PCR 반응을 위한 프라이머를 포함할 수 있다. 이러한 구성요소는 세포 성숙 마커의 활성화 또는 미분화 또는 미성숙 세포 마커의 손실을 평가하는 데 사용할 수 있다. 검출 시약이 항체인 경우, 동결건조와 같은 건조 제제 또는 용액으로 제공될 수 있다. 항체 또는 다른 검출 시약은 검출에 사용하기 위한 표지, 예를 들어, 방사선학적, 형광성(예를 들어, GFP) 또는 비색성 표지에 연결될 수 있다. 검출 시약이 프라이머인 경우 동결건조와 같은 건조 제제 또는 용액으로 제공될 수 있다.

키트는 일반적으로 하나의 패키지, 섬유-계, 예를 들어, 판지, 또는 폴리머성, 예를 들어, 스티로폼 상자에 포함된 다양한 요소와 함께 제공된다. 인클로저(enclosure)는 내부와 외부 사이의 온도 차이를 유지하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 미리선택된 시간 동안 미리선택된 온도에서 시약을 유지하기 위한 단열(insulating) 특성을 제공할 수 있다.

정의

편의를 위해, 명세서, 실시예 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 일부 용어 및 구문의 의미가 아래에 제공된다. 달리 명시되지 않거나 문맥에서 암시되지 않는 한, 다음 용어 및 구문에는 아래 제공된 의미가 포함된다. 정의는 특정 실시형태를 설명하는 데 도움을 주기 위해 제공되며, 본 발명의 범위가 청구범위에 의해서만 제한되기 때문에 이는 청구된 발명을 제한하려는 의도는 없다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 해당 기술 분야에서 용어의 사용과 여기에 제공된 정의 사이에 명백한 불일치가 있는 경우 명세서에 제공된 정의가 우선한다.

편의를 위해, 본 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에서, 사용된 특정 용어가 여기에 모여 있다.

본 명세서에 사용된, 용어 "세포"는 단일 세포 뿐만 아니라 (즉, 하나 초과) 세포의 집단을 지칭한다. 집단은 만능 줄기 세포의 집단 또는 분화된 T 세포의 집단과 같은 하나의 세포 유형을 포함하는 순수한 집단일 수 있다. 본 명세서에 사용된, 용어 "집단"은 순수한 집단 또는 한 세포 유형의 다수(예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%)를 차지하는 집단을 지칭한다. 대안적으로, 집단은 하나 이상의 세포 유형, 예를 들어, 혼합된 세포 집단을 포함할 수 있다. 이것은 집단의 세포 수를 제한하려는 것은 아니며; 예를 들어, 혼합된 세포 집단은 적어도 하나의 분화된 세포를 포함할 수 있다. 본 발명에서, 혼합 세포 집단이 포함할 수 있는 세포 유형의 수에는 제한이 없다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 한 실시형태에서, 용어 "조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell)" 또는 "HSC"는 자가-재생 능력을 갖고 또한 3개의 조혈 계통, 적혈구계, 림프구계, 및 골수계의 모든 혈액 세포 타입을 발생시키는 줄기 세포를 지칭한다. 이러한 세포 타입은 골수계 계통(단핵구 및 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 거핵구/혈소판, 수지상 세포) 및 림프계 계통(T 세포, B 세포, NK 세포)을 포함한다. 인간 HSC는 CD34⁺, CD59⁺, CD90/Thy1⁺, CD38^low/-, c-kit/CD117^-/low, 및 Lin^-로 결정된다. 마우스 HSC^-는 CD34^low/-, SCA-1⁺, CD90/Thy1^+/low, CD38⁺, c-Kit/CD117⁺, 및 Lin^-로 간주된다. 이러한 마커 패널의 발현을 검출하면 형광-활성화 세포 분류(FACS)와 같은 기술을 통해 특정 세포 집단을 분리할 수 있다. 한 실시형태에서, 용어 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 자가-재생 능력을 갖고 하기 세포 표면 마커를 갖는 줄기 세포를 지칭한다: CD34+, CD59+, Thy1/CD90⁺, CD38^lo/-, CD133+, c-Kit/CD117^-/lo, 및 Lin^-. 한 실시형태에서, 용어 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 적어도 CD34⁺인 줄기 세포를 지칭한다. 한 실시형태에서, 용어 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 자가 재생 능력을 갖고 적어도 CD34⁺ 및 c-kit/CD117^lo/-인 줄기 세포를 지칭한다. 한 실시형태에서, 용어 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 자가 재생 능력을 갖고 적어도 CD38^low/-, c-kit/CD117^-/low인 줄기 세포를 지칭한다. HSC라는 용어는 "조혈 줄기 및 전구체 세포"(HSPC)라는 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본 명세서에 사용된, 용어 "iPS 세포", "iPSC" 및 "유도 만능 줄기 세포"는 상호교환적으로 사용되며 다음 재프로그래밍 인자 OCT4, SOX2, KLF4, 및 임의로, 분화된 세포, 예를 들어, 체세포로부터의 c-MYC 또는 nanog 및 LIN28의 형질감염에 의해 인위적으로 유도된 만능 세포를 지칭한다. 재프로그래밍 인자의 대체 조합은 OCT4, SOX2, NANOG, 및 LIN28을 포함한다. hPSC라는 용어는 인간 만능 줄기 세포를 지칭한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "계통(lineage)"은 줄기 및 전구체 세포 분화 및 발달의 맥락에서 사용될 때, 세포가 완전히 분화된 세포가 되기 위해 취할 수 있는 세포 분화 및 발달 경로를 지칭한다. 예를 들어, HSC에는 적혈구계, 림프구계 및 골수계의 세 가지 조혈 계통이 있으며; HSC는 잠재력, 즉 이 세 계통 모두에 대해 알려진 최종적으로 분화된 세포 타입으로 분화하고 발달할 수 있는 능력을 가지고 있다. "다계통(multilineage)"이라는 용어가 사용될 때, 이는 세포가 미래에 하나 이상의 계통으로 알려진 최종적으로 분화된 세포 유형으로 분화 및 발달할 수 있음을 지칭한다. 예를 들어, HSC는 다중 혈통 잠재력을 가지고 있다. "제한된 혈통"이라는 용어가 사용되는 경우, 세포가 한 혈통으로 알려진 최종 분화 세포 타입으로 분화 및 발달할 수 있음을 지칭한다. 예를 들어, 일반 골수계 전구체 세포(CMP) 또는 거핵구-적혈구계 전구체 세포(MEP)는, 세포가 림프구계 계통이 아닌 골수계 계통의 말단 분화된 세포 타입으로만 분화 및 발달할 수 있기 때문에 제한된 계통을 가지고 있다. 골수계 계통의 말단 분화 세포는 적혈구, 단핵구, 대식세포, 거핵구, 골수아세포, 수지상 세포, 및 과립구(호염기구, 호중구, 호산구, 및 비만 세포)를 포함하며; 림프구계 계통의 최종 분화 세포는 T 림프구/T 세포, B 림프구/B 세포, 수지상 세포 및 자연 살해 세포를 포함한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "전구체 세포(progenitor cell)"는 나중에 특정 세포 타입(완전 분화 또는 최종 분화 세포), 예를 들어, 혈액 세포, 피부 세포, 뼈 세포, 또는 모발 세포로 성숙(분화)할 잠재력이 있는 미성숙 또는 미분화 세포를 지칭한다. 전구체 세포는 분화에 의해 야기될 수 있는 세포에 비해 더 원시적인(예를 들어, 완전히 분화된 세포보다 발달 경로 또는 진행을 따라 더 이른 단계에 있는) 세포 표현형을 갖는다. 종종, 전구체 세포는 또한 현저하거나 매우 높은 증식 잠재력을 갖는다. 전구체 세포는 발달 경로 및 세포가 발달하고 분화하는 환경에 따라 여러 개의 구별되는 분화된 세포 유형 또는 단일 분화된 세포 유형을 생성할 수 있다. 전구체 세포는 또한 유사하게 미성숙하거나 미분화된 전구체 세포를 더 많이 만들기 위해 증식할 수 있다.

용어 "분화된 세포"는 본 명세서에 정의된 용어와 같이 천연 형태에서 만능이 아닌 임의의 1차 세포를 의미한다. "분화된 세포"라는 용어는 또한 다능성 세포(예를 들어, 성체 체세포 줄기 세포)와 같이 부분적으로 분화된 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용어 "분화된 세포"는 또한, 세포가 세포 분화 과정을 겪은 덜 특수화된 세포 타입(예를 들어, 미분화 세포 또는 재프로그래밍된 세포)의 세포로부터 유래된 보다 특수화된 세포 타입의 세포를 지칭한다.

세포 개체발생(ontogeny)의 맥락에서, 용어 "분화하다(differentiate)" 또는 "분화하는(differentiating)"은 "분화된 세포"가 이의 전구체 세포에 비해 발달 경로의 아래로 더 진행된 세포를 의미하는 상대적 용어이다. 따라서 일부 실시형태에서, 이 용어가 본 명세서에 정의된 바와 같은 재프로그래밍된 세포는, 계통-제한된 전구체 세포(예컨대, 중배엽 줄기 세포 또는 내배엽 줄기 세포)로 분화할 수 있고, 이는 차례로 경로의 더 아래쪽으로 나아가 다른 타입의 전구체 세포(예컨대, 조직 특이적 전구체, 예를 들어, 심근세포 전구체, 또는 췌장 전구체)로 분화한 다음, 특정 조직 타입에서 특징적인 역할을 하는 최종-단계(end-stage) 분화 세포로 분화할 수 있으며, 더 증식할 수 있는 능력을 보유하거나 보유하지 않을 수 있다.

"다능성 세포(multipotent cell)"와 관련하여 사용될 때 "다능성(multipotent)"이라는 용어는 3개의 모든 배엽층에서 유래된 세포의 전부는 아니지만 일부로 분화할 수 있는 세포를 지칭한다. 따라서 다능성 세포는 부분적으로 분화된 세포이다. 다능성 세포는 당업계에 잘 알려져 있으며, 다능성 세포의 예로는 조혈 줄기 세포 및 신경 줄기 세포와 같은 성체 체세포 줄기 세포, 모낭 줄기 세포, 간 줄기 세포 등이 있다. 다능성은 줄기 세포가 주어진 계통에서 많은 타입의 세포를 형성할 수 있지만, 다른 계통의 세포는 형성하지 않을 수 있음을 지칭한다. 예를 들어, 다능성 혈액 줄기 세포는 다양한 타입의 혈액 세포(적혈구, 백혈구, 혈소판 등)를 형성할 수 있지만 뉴런 형성; 심혈관 전구체 세포(MICP)의 특정 성숙한 심장, 페이스메이커, 평활근, 및 내피 세포 타입으로의 분화; 췌장-유래 다능성 전구체 세포(PMP) 콜로니는 췌장 계통(인슐린, 글루카곤, 아밀라아제 또는 소마토스타틴을 생산하는 세포) 및 신경 계통(형태학적으로 뉴런-유사 세포, 성상교세포-유사 세포 또는 희돌기아교세포-유사 세포)의 세포 타입을 생성한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "재프로그래밍 유전자"는 이의 발현이 분화된 세포, 예를 들어, 체세포의 미분화 세포(예를 들어, 만능 상태 또는 부분 만능 상태, 다능 상태의 세포)로의 재프로그래밍에 기여하는 유전자를 지칭한다. 재프로그래밍 유전자는, 예를 들어, 마스터 전사 인자 Sox2, Oct3/4, Klf4, Nanog, Lin-28, c-myc 등을 코딩하는 유전자일 수 있다. "재프로그래밍 인자"라는 용어는 재프로그래밍 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 의미한다.

"외인성(exogenous)"이라는 용어는 세포의 천연 공급원 이외의 세포에 존재하는 물질을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "외인성"은 인간의 손을 포함하는 과정에 의해, 일반적으로 발견되지 않거나 적은 양으로 발견되는, 세포나 유기체와 같은 생물학적 시스템에 도입된, 핵산(예를 들어, 재프로그래밍 전사 인자를 코딩하는 핵산, 예를 들어, Sox2, Oct3/4, Klf4, Nanog, Lin-28, c-myc 등) 또는 단백질(예를 들어, 전사 인자 폴리펩티드)을 지칭한다. 물질(예를 들어, sox2 전사 인자를 코딩하는 핵산 또는 단백질, 예를 들어, SOX2 폴리펩티드)은 해당 물질을 물려 받은 세포 또는 조상에 도입되는 경우 외인성으로 간주된다.

본 명세서에 사용된, 용어 "분리된"은 세포가 천연 환경 이외의 조건에 놓이는 것을 의미한다. "분리된"이라는 용어는 이후에 이들 세포를 다른 세포와의 조합 또는 혼합물로 사용하는 것을 배제하지 않는다.

본 명세서에 사용된, 용어 "확대하는(expanding)"은 세포 분열(유사분열)을 통해 유사 세포의 수를 증가시키는 것을 지칭한다. "증식하는(proliferating)"과 "확대하는(expanding)"이라는 용어는 같은 의미로 사용된다.

본 명세서에 사용된 "세포 표면 마커"는 세포 표면에서 발현되는 임의의 분자를 지칭한다. 세포 표면 발현은 일반적으로 분자가 막통과 도메인을 소유할 것을 요구한다. 일반적으로 세포 표면에서 발견되지 않는 일부 분자는 재조합 기술로 조작되어 세포 표면에서 발현될 수 있다. 많은 자연적으로 생성되는 세포 표면 마커를 "CD" 또는 "분화 클러스터" 분자로 지칭된다. 세포 표면 마커는 종종 항체가 결합할 수 있는 항원 결정기를 제공한다. 본 명세서에 기술된 방법과 특히 관련된 세포 표면 마커는 CD34이다. 본 개시에 따른 유용한 조혈 전구체 세포(예를 들어, 조혈 내피)는 바람직하게는 CD34를 발현하거나 또는 달리 말해서, CD34 양성이다.

세포는 임의의 세포 표면 마커에 대해 "양성" 또는 "음성"으로 지정될 수 있으며, 이러한 지정은 모두 본 명세서에 기술된 방법의 실행에 유용하다. 세포를 해당 마커에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키고, 후속적으로 이러한 접촉된 세포의 유세포 분석을 수행하여 항체가 세포에 결합되었는지 여부를 결정하는 것과 같은 당업자에게 알려진 방법을 이용하여 검출하기에 충분한 양으로 세포가 세포 표면에 마커를 발현하는 경우, 세포는 세포 표면 마커에 대해 "양성"으로 간주된다. 세포가 세포 표면 마커에 대한 전령 RNA를 발현할 수 있지만, 본 명세서에 기술된 방법에 대해 양성인 것으로 간주되기 위해서, 세포가 세포 표면에서 이것을 발현해야 함을 이해해야 한다. 유사하게, 세포를 해당 마커에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키고, 후속적으로 이러한 접촉된 세포의 유세포 분석을 수행하여 항체가 세포에 결합되었는지 여부를 결정하는 것과 같은, 당업자에게 알려진 방법을 이용하여 검출하기에 충분한 양으로 세포가 세포 표면에 마커를 발현하지 않는 경우, 세포는 세포 표면 마커에 대해 "음성" 또는 "음성/낮음"(약어로 "-/lo" 또는 "lo/-")으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 계통 마커에 특이적인 작용제가 사용되는 경우, 작용제는 모두 형광 태그와 같은 동일한 표지 또는 태그를 포함할 수 있으며, 따라서 해당 표지 또는 태그에 대해 양성인 모든 세포는 제외되거나 제거되어, 본 명세서에 기술된 방법에 사용하기 위해 비접촉된 조혈 줄기 또는 전구체 세포가 남게 될 수 있다.

본 명세서에 사용된, 용어 "히스톤 메틸트랜스퍼라제 억제제" 또는 "억제제"는 히스톤 메틸트랜스퍼라제(예를 들어, G9a, GLP, EZH1)의 발현을 억제하거나, 또는 기질(substrate) 히스톤 단백질에 존재하는 라이신 잔기를 메틸화하는 효소의 촉매 활성을 억제하는 임의의 분자이다. 라이신은 기질 히스톤 단백질에 존재한다. 예를 들어, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 억제제는, 억제된 세포에서 G9a, GLP, 또는 EZH1의 발현을 억제하는 siRNA 또는 dsRNA, 또는 억제된 세포에서 G9a, GLP, 또는 EZH1의 mRNA의 분해를 촉진하는 gRNA일 수 있다. 예를 들어, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 억제제는 효소 활성을 길항하는 작은 분자이다. 예로는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 본 명세서에 기술된 것과 같은 소분자 AMI-1, A-366, BIX-01294, BIX01338, BRD4770, 케토신, UNC0224, UNC0631, UNC0638, UNC0642, UNC0646, EPZ5676, EPZ005687, GSK343, EPZ-6438, 3-데아자네플라노신 A(DZNeP) HCl, UNC1999, MM-102, SGC 0946, 엔타카폰(Entacapone), EPZ015666, UNC0379, EI1, MI-2(메닌-MLL 억제제), MI-3(메닌-MLL 억제제), PFI-2, GSK126, EPZ004777, BRD4770, 및 EPZ-6438을 포함한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "소분자"는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 펩티드, 펩티드모방체, 아미노산, 아미노산 유사체, 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 유사체, 압타머, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 몰당 약 10,000g 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 몰당 약 5,000g 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 몰당 약 1,000g 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 몰당 약 500g 미만의 분자량을 갖는 무기 또는 유기 화합물(즉, 헤테로유기 및 유기금속 화합물 포함), 및 이러한 화합물의 염, 에스테르 및 기타 약제학적으로 허용가능한 형태를 포함하는 화학 작용제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 소분자는 이종유기 화합물 또는 유기금속 화합물이다.

용어 "억제 RNA"는 표적 핵산의 수준 또는 활성의 감소를 매개하는 표적 핵산(예를 들어, 표적 마이크로RNA)에 상보적인 서열을 함유하는 핵산 분자를 포함하는 것을 의미한다. 억제 RNA의 비제한적인 예는 간섭 RNA, shRNA, siRNA, 리보자임, 안타고미르(antagomirs), 및 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 억제 RNA의 제조 방법이 본 명세서에 기재되어 있다. 억제성 RNA를 제조하는 추가 방법은 당업계에 공지되어 있다. 한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 G9a/GLP 또는 EZH1 마이크로RNA는 G9a/GLP 또는 EZH1 mRNA의 활성 감소를 유발하는 억제 RNA이다.

본 명세서에 사용된 "간섭 RNA"는 RNA 간섭을 매개함으로써 유전자 발현을 직접적으로 또는 간접적으로(즉, 전환 시) 억제하거나 하향 조절할 수 있는 임의의 이중 가닥 또는 단일 가닥 RNA 서열을 지칭한다. 간섭 RNA는 소형 간섭 RNA("siRNA") 및 소형 헤어핀 RNA("shRNA")를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. "RNA 간섭"은 서열-호환성(sequence-compatible) 메신저 RNA 전사체의 선택적 분해를 지칭한다.

본 명세서에 사용된 "shRNA"(작은 헤어핀 RNA)는 안티센스 영역, 루프 부분 및 센스 영역을 포함하는 RNA 분자를 지칭하며, 여기서 센스 영역은 안티센스 영역과 염기쌍을 형성하여 듀플렉스 스템을 형성하는 상보적 뉴클레오티드를 가지고 있다. 전사후 가공(post-transcriptional processing) 이후, 작은 헤어핀 RNA는 RNase III 계열의 구성원인 효소 다이서(Dicer)에 의해 매개되는 절단 사건에 의해 작은 간섭 RNA로 전환된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "전사후 가공"이라는 문구는 전사 후에 발생하고, 예를 들어, 효소 다이서 및/또는 드로샤(Drosha)에 의해 매개되는 mRNA 가공을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 "소형 간섭 RNA" 또는 "siRNA"는 서열 특이적 방식으로 RNA 간섭을 매개함으로써 유전자 발현을 억제하거나 하향 조절할 수 있는 임의의 소형 RNA 분자를 지칭한다. 작은 RNA는, 예를 들어, 약 18개 내지 21개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 각 siRNA 듀플레스는 가이드 가닥과 패신저 가닥으로 구성된다. 엔도뉴클레아제 아그로너트(Argonaute) 2(Ago 2)는 siRNA 이중체의 풀림을 촉매한다. 풀림이 이뤄지면, 가이드 가닥은 RNA 간접 특이성 복합체(RISC)에 통합되는 한편, 패신저 가닥은 해제된다. RISC는 가이드 가닥을 사용하여 표적 mRNA의 핵산내부분해방식 절단(endonucleolytic cleavage)을 유도하는 상보적 서열을 가진 mRNA를 찾는다.

레트로바이러스는 복제 주기 동안 역전사효소를 이용하는 RNA 바이러스이다. "레트로바이러스"라는 용어는 알려진 레트로바이러스(예를 들어, 몰로니 뮤린 육종 바이러스(MoMSV), 하비 뮤린 육종 바이러스(HaMuSV), 뮤린 유방 종양 바이러스(MuMTV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 고양이 백혈병 바이러스(FLV), 스푸마바이러스와 같은 타입 c 레트로바이러스)를 지칭한다.

레트로바이러스 게놈 RNA는 역전사효소에 의해 이중-가닥 DNA로 전환된다. 이 이중-가닥 DNA 형태의 바이러스는 감염된 세포의 염색체에 통합될 수 있으며; 일단 통합되면 "프로바이러스"라고 지칭된다. 프로바이러스는 RNA 중합효소 II의 주형 역할을 하며, 새로운 바이러스 입자를 생성하는 데 필요한 구조 단백질과 효소를 코딩하는, RNA 분자의 발현을 유도한다.

프로바이러스의 각 말단에는 "긴 말단 반복부(long terminal repeats)" 또는 "LTR"로 불리는 구조가 있다. "긴 말단 반복부(LTR)"라는 용어는, 레트로바이러스 DNA의 말단에 위치한 염기쌍의 도메인을 지칭하며, 이것은, 이들의 천연 서열 맥락에서, 직접 반복부이고 U3, R 및 U5 영역을 포함한다. LTR은 일반적으로 레트로바이러스 유전자의 발현(예를 들어, 유전자 전사체의 촉진, 개시 및 폴리아데닐화) 및 바이러스 복제에 기본적인 기능을 제공한다. LTR은 전사 제어 요소, 폴리아데닐화 신호 및 바이러스 게놈의 복제 및 통합에 필요한 서열을 비롯한 수많은 조절 신호를 포함한다. 바이러스 LTR은 U3, R 및 U5라는 세 영역으로 나뉜다. U3 영역에는 인핸서 및 프로모터 요소가 포함되어 있다. U5 영역은 프라이머 결합 부위와 R 영역 사이의 서열이며 폴리아데닐화 서열을 포함한다. R(반복) 영역은 U3 및 U5 영역에 의해 측접(flanking)되어 있다. U3, R 및 U5 영역으로 구성된 LTR은 바이러스 게놈의 5' 및 3' 말단 모두에 나타난다. 본 발명의 한 실시형태에서, 5' LTR을 포함하는 LTR 내의 프로모터는, 이종성(heterologous) 프로모터로 대체된다. 사용될 수 있는 이종성 프로모터의 예는, 예를 들어, 비장 초점-형성 바이러스(SFFV) 프로모터, 테트라사이클린-유도성(TET) 프로모터, β-글로빈 유전자좌 조절 영역 및 β-글로빈 프로모터(LCR), 및 거대세포바이러스(CMV) 프로모터를 포함한다.

"렌티바이러스"라는 용어는 천천히 발병하는 질병을 일으키는 레트로바이러스의 그룹(또는 속)을 지칭한다. 이 그룹에 포함된 바이러스는, 인간 후천성 면역결핍 증후군(AIDS)의 원인 인자인, HIV(인간 면역결핍 바이러스, HIV 타입 1 및 HIV 타입 2 포함); 양에서 뇌염(visna) 또는 폐렴(maedi)을 유발하는 비스나-매디(visna-maedi), 염소에서 면역 결핍, 관절염, 및 뇌병증을 유발하는, 염소 관절염-뇌염 바이러스; 자가면역 용혈성 빈혈, 및 말에서 뇌병증을 유발하는, 말 감염성 빈혈 바이러스; 고양이의 면역 결핍을 유발하는, 고양이 면역 결핍 바이러스(FIV); 소의 림프절병증, 림프구증가증, 및 가능한 중추신경계 감염을 유발하는, 소 면역 결핍 바이러스(BIV); 및 아-인간(sub-human) 영장류에서 면역 결핍 및 뇌병증을 유발하는, 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함한다. 이들 바이러스로 인한 질병은 긴 잠복기와 장기간의 경과가 특징이다. 일반적으로 바이러스는 단핵구와 대식세포를 잠복 감염시키며, 이들 세포로부터 다른 세포로 퍼진다. HIV, FIV, 및 SIV는 또한 T 림프구, 즉 T 세포에 쉽게 감염한다.

용어 "R 영역"은 캡핑 그룹의 시작(즉, 전사의 시작)에서 시작하여 폴리 A 트랙의 시작의 직전에 끝나는 레트로바이러스 LTR 내의 영역을 지칭한다. R 영역은 또한 U3 및 U5 영역이 측접되어 있는 것으로 정의된다. R 영역은 게놈의 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝으로 초기(nascent) DNA의 전달을 허용하는 역전사 동안 중요한 역할을 한다.

"프로모터/인핸서"라는 용어는 프로모터 및 인핸서 기능을 모두 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA 단편을 지칭한다. 예를 들어, 레트로바이러스의 긴 말단 반복부는 프로모터와 인핸서 기능을 모두 포함한다. 인핸서/프로모터는 "내인성(endogenous), "외인성(exogenous)", 또는 "이종성(heterologous)"일 수 있다. "내인성" 인핸서/프로모터는 게놈에서 주어진 유전자와 자연적으로 연결된 것이다. "외인성" 또는 "이종성" 인핸서/프로모터는 유전자의 전사가 연결된 인핸서/프로모터에 의해 유도되도록 유전자 조작(즉, 분자 생물학적 기술)에 의해 유전자에 병치(juxtaposition)로 배치되는 것이다.

본 명세서에 사용된, 용어 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 리보핵산, 데옥시리보핵산, 또는 이들의 유사체의 단위를 포함하는, 임의의 분자, 바람직하게는 중합체 분자를 지칭한다. 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 단일-가닥 핵산은 변성된 이중-가닥 DNA의 한 핵산 가닥일 수 있다. 대안적으로, 이것은 이중-가닥 DNA로부터 유래되지 않은 단일-가닥 핵산일 수 있다. 한 양태에서, 핵산은 DNA일 수 있다. 또 다른 양태에서, 핵산은 RNA일 수 있다. 적합한 DNA는, 예를 들어, 게놈 DNA 또는 cDNA를 포함할 수 있다. 적합한 RNA는, 예를 들어 mRNA, iRNA, miRNA, siRNA 등을 포함할 수 있다.

핵산은, 예를 들어, 관심 단백질을 코딩하는 핵산, 올리고뉴클레오티드, 핵산 유사체, 예를 들어, 펩티드-핵산(PNA), 슈도-상보성 PNA(pc-PNA), 및 잠금 핵산(LNA)을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 이러한 핵산 서열은, 예를 들어, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 전사 억제인자, 안티센스 분자, 리보자임, 작은 억제 핵산 서열로 작용하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 예를 들어, 이로만 제한되는 것은 아니지만, RNAi, shRNAi, siRNA, 마이크로RNAi(miRNA), 및 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 수혜 숙주와 관련하여 용어 "생착(engraftment)"은, 새로운 혈액-형성 세포가 성장하기 시작하고 이식 후 최소 10일 후에 이식된 세포로부터 유래되어 수혜자의 혈액에 나타나는 건강한 혈액 줄기 세포를 만드는 시기이다. 생착은 이식 후 빠르면 10일째에 발생할 수 있지만 대략 14 내지 20일 정도가 더 일반적이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 수용 숙주의 면역계 또는 혈액계와 관련하여 용어 "재구성(reconstitution)"은 수혜 숙주의 체내에서 선천적 저장소 또는 작업 시스템(working system), 또는 이의 일부를 자연적 또는 기능적으로 상태로 재구축하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 화학요법 후의 골수는 골수 줄기 세포가 소멸(obliteration)되었다.

용어 "저하(decrease)", "감소된(reduced)", "감소(reduction)" 또는 "억제되다(inhibit)"는 모두 통계적으로 유의한 양만큼 감소를 의미하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 일부 실시형태에서, "감소하다(reduce)", "감소(reduction)" 또는 "저하(decrease)" 또는 "억제되다(inhibit)"는 일반적으로 참조 수준(예를 들어, 주어진 치료제 또는 작용제의 부재)과 비교하여 적어도 10% 저하를 의미하고, 예를 들어, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된, "감소" 또는 "억제"는 참조 수준과 비교하여 완전한 억제 또는 감소를 포함하지 않는다. "완전한 억제"는 참조 수준과 비교하여 100% 억제다. 저하는 바람직하게는 주어진 장애가 없는 개인에 대해 정상 범위 내로 허용되는 수준까지 낮을 수 있다.

용어 "증가된(increased)", "증가(increase)", "향상시키다(enhance)" 또는 "활성화하다(activate)"는 모두 정적으로 유의한 양만큼 증가를 의미하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 일부 실시형태에서, 용어 "증가된(increased)", "증가(increase)", "향상하다(enhance)", 또는 "활성화하다(activate)"는 참조 수준과 비교하여 적어도 10%의 증가, 예를 들어, 참조 수준과 비교하여 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 100%를 포함하여 최대 100% 증가 또는 10 내지 100% 사이의 임의의 증가, 또는 참조 수준과 비교하여 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 이상 증가, 또는 2배 내지 10배 이상의 임의의 증가 또는 그 이상을 의미할 수 있다. 마커 또는 증상의 맥락에서 "증가"는 그러한 수준의 통계적으로 유의한 증가이다.

본 명세서에 사용된 "대상체(subject)"는 인간 또는 동물을 의미한다. 일반적으로 동물은 영장류, 설치류, 가축 또는 사냥감 동물과 같은 척추동물이다. 영장류는 침팬지, 사이노몰구스 원숭이, 거미 원숭이, 붉은털 원숭이와 같은 마카크를 포함한다. 설치류는 마우스, 래트, 우드척, 흰 족제비, 토끼 및 햄스터를 포함한다. 가축 및 사냥감 동물은 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이과(feline) 종, 예를 들어, 집 고양이, 개과(canine) 종, 예를 들어, 개, 여우, 늑대, 조류(avian) 종, 예를 들어, 닭, 에뮤, 타조, 및 어류(fish), 예를 들어, 송어, 메기, 연어을 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어, 영장류, 예를 들어 인간이다. "개체(individual)", "환자(patient)" 및 "대상체(subject)"라는 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.

바람직하게는, 대상체는 포유동물이다. 포유동물은 인간, 비-인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있지만, 이들 예에 제한되는 것은 아니다. 인간 이외의 포유류는 세포 대체 요법의 동물 모델을 나타내는 대상체로 유리하게 이용될 수 있다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있다.

대상체는 치료를 필요로 하는 상태(예를 들어, 혈액 질환, 암 등) 또는 이러한 상태와 관련된 하나 이상의 합병증을 앓고 있거나 또는 이를 갖는 것으로 이전에 진단되거나 확인된 대상체일 수 있으며, 선택적으로, 혈액 질환 또는 혈액 질환과 관련된 하나 이상의 합병증에 대한 치료를 이미 받은 적이 있을 수 있다. 대안적으로, 대상체는 또한 이전에 혈액 질환 또는 혈액 질환과 관련된 하나 이상의 합병증을 갖는 것으로 진단된 적이 없는 대상체일 수 있다. 예를 들어, 대상체는 혈액 질환에 대한 하나 이상의 위험 인자 또는 혈액 질환과 관련된 하나 이상의 합병증을 나타내는 대상체 또는 위험 인자를 나타내지 않는 대상체일 수 있다.

특정 상태에 대한 치료를 "필요로 하는 대상체"는 해당 상태를 갖고 있거나, 해당 상태를 갖는 것으로 진단되거나, 해당 상태가 발생할 위험이 있는 대상체일 수 있다.

변이체 아미노산 또는 DNA 서열은 천연 또는 참조 서열과 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 이상 동일할 수 있다. 천연 서열과 돌연변이 서열 사이의 상동성(동일성 백분율)의 정도는, 예를 들어, 월드 와이드 웹에서 이 목적을 위해 일반적으로 사용되는 무료로 이용가능한 컴퓨터 프로그램(예를 들어, 디폴트 설정이 있는 BLASTp 또는 BLASTn)을 이용하여 두 서열을 비교함으로써 결정될 수 있다.

천연 아미노산 서열의 변경은 당업자에게 공지된 다수의 기술 중 임의의 것에 의해 달성될 수 있다. 돌연변이는, 예를 들어, 천연 서열의 단편에 결찰할 수 있는 제한 부위가 측접된, 돌연변이 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성함으로써 특정 유전자좌에 도입될 수 있다. 결찰 후, 생성된 재구성된 서열은 원하는 아미노산 삽입, 치환, 또는 결실을 갖는 유사체를 코딩한다. 대안적으로, 올리고뉴클레오티드-지정 부위-특이적 돌연변이유발 절차를 이용하여 요구되는 치환, 결실 또는 삽입에 따라 변경된 특정 코돈을 갖는 변경된 뉴클레오티드 서열을 제공할 수 있다. 그러한 변경을 위한 기술은 매우 잘 확립되어 있으며, 예를 들어, 그 전문이 본 명세서에 참조로 통합되는 다음 문헌에 개시된 것들을 포함한다: Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); 및 미국 특허 제4,518,584호 및 제4,737,462호. 폴리펩티드의 적절한 형태를 유지하는 데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기는 또한 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 개선하고 비정상적인 가교를 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)은 폴리펩티드에 부가되어 안정성을 개선하거나 올리고머화를 촉진할 수 있다.

용어 "발현"은, 예를 들어, 전사, 전사체 처리, 번역 및 단백질 폴딩, 변형 및 가공을 포함하지만 이에 제한되지 않는, RNA 및 단백질 생성 및, 적절한 경우, 단백질 분비에 관여하는 세포 과정을 지칭한다. 발현은 본 발명의 핵산 단편 또는 단편들로부터 유래된 센스(mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정적인 축적 및/또는 mRNA의 폴리펩티드로의 번역을 지칭할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바이오마커(들), 표적(들), 또는 유전자/폴리펩티드의 발현은 조직 특이적이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바이오마커(들), 표적(들), 또는 유전자/폴리펩티드의 발현은 전체적이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바이오마커(들), 표적(들), 또는 유전자/폴리펩티드의 발현은 전신적이다.

"발현 생성물"은 유전자로부터 전사된 RNA, 및 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역에 의해 수득된 폴리펩티드를 포함한다. "유전자"라는 용어는 적절한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 경우 시험관내(in vitro) 또는 생체내에서(in vivo) RNA로 전사되는(DNA) 핵산 서열을 의미한다. 유전자는 코딩 영역의 앞 및 뒤에 있는 영역, 예를 들어, 5' 비번역(5'UTR) 또는 "리더" 서열 및 3' UTR 또는 "트레일러" 서열 뿐만 아니라, 개별 코딩 세그먼트(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리펩티드, 핵산, 또는 세포가 조작될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "조작된"은 사람의 손에 의해 조작된 양태를 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩티드의 적어도 하나의 양태, 예를 들어, 그 서열이 자연에 존재하는 양태와 다르게 사람의 손에 의해 조작되었다면, "조작된" 것으로 간주된다. 일반적인 관행이고 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 조작된 세포의 자손은 비록 실제 조작이 이전 엔티티에서 수행되었음에도 불구하고 일반적으로 여전히 "조작된" 것으로 지칭된다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 분화 및/또는 조작된 T 세포는 외인성이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 분화 및/또는 조작된 T 세포는 이소성(ectopic)이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 분화 및/또는 조작된 T 세포는 내인성이 아니다.

"외인성"이라는 용어는 세포의 천연 공급원 이외의 세포에 존재하는 물질을 지칭한다. 본 명세서에 사용된, 용어 "외인성"은 핵산(예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산) 또는 인간의 손을 포함하는 과정에 의해, 일반적으로 발견되지 않고, 핵산 또는 폴리펩티드를 그러한 세포 또는 유기체에 도입하기를 원하는, 세포 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템 내로 도입된 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 대안적으로, "외인성"은 인간의 손을 포함하는 과정에 의해, 상대적으로 적은 양으로 이것이 발견되고, 예를 들어, 이소성 발현 또는 수준을 생성하기 위해, 핵산 또는 폴리펩티드의 양을 그러한 세포 또는 유기체에서 증가시키길 원하는 세포 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템 내로 도입된 핵산 또는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 대조적으로, "내인성"이라는 용어는 생물학적 시스템 또는 세포에 고유한 물질을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "이소성"은 비정상적인 위치 및/또는 양에서 발견되는 물질을 지칭한다. 이소성 물질은 일반적으로 주어진 세포에서 발견되지만, 훨씬 더 적은 양 및/또는 다른 시기에 발견되는 것일 수 있다. 이소성은 또한 자연 환경에서 주어진 세포에서 자연적으로 발견되거나 발현되지 않는 폴리펩티드 또는 핵산과 같은 물질을 포함한다.

본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리펩티드(예를 들어, CAR 폴리펩티드)를 코딩하는 핵산은 벡터에 포함될 수 있다. 본 명세서에 사용된, 용어 "벡터"는 숙주 세포로의 전달 또는 상이한 숙주 세포 사이의 전달을 위해 설계된 핵산 구축물을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 벡터는 바이러스성 또는 비-바이러스성일 수 있다. 용어 "벡터"는 적절한 제어 요소와 연관될 때 복제할 수 있고 유전자 서열을 세포로 전달할 수 있는 임의의 유전 요소를 포함한다. 벡터는 클로닝 벡터, 발현 벡터, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 염색체, 바이러스, 비리온 등을 포함할 수 있지만 이로만 제한되는 것은 아니다.

벡터는 재조합일 수 있으며, 예를 들어, 이는 적어도 2개의 상이한 공급원으로부터 유래하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 적어도 2개의 상이한 종으로부터 기원하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 적어도 2개의 상이한 유전자로부터 유래하는 서열을 포함하고, 예를 들어, 융합 단백질 또는 적어도 1개의 비-천연(예를 들어, 이종성) 유전자 제어 요소(예를 들어, 프로모터, 억제인자, 활성화인자, 인핸서, 반응 요소 등)에 작동가능하게 연결된 발현 생성물을 코딩하는 핵산을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 벡터 또는 핵산은 코돈 최적화되고, 예를 들어, 변형되거나 조작된 핵산이 천연/야생형 서열과 동일한 폴리펩티드 발현 생성물을 코딩하지만, 원하는 발현 시스템에서 개선된 효율로 전사 및/또는 번역될 수 있도록 핵산 서열의 천연 또는 야생형 서열이 대체 코돈을 포함하도록 변경되거나 조작된다. 일부 실시형태에서, 발현 시스템은 천연/야생형 서열의 공급원 이외의 유기체(또는 이러한 유기체로부터 수득된 세포)이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 벡터 및/또는 핵산 서열은 포유동물 또는 포유동물 세포, 예를 들어, 마우스, 뮤린 세포 또는 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 벡터 및/또는 핵산 서열은 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 벡터 및/또는 핵산 서열은 효모 또는 효모 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 벡터 및/또는 핵산 서열은 박테리아 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 벡터 및/또는 핵산 서열은 대장균(E. coli) 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.

본 명세서에 사용된, 용어 "발현 벡터"는 벡터 상의 전사 조절 서열에 연결된 서열로부터 RNA 또는 폴리펩티드의 발현을 지시하는 벡터를 지칭한다. 발현된 서열은 종종 세포에 대해 이종성일 것이지만, 반드시 그런 것은 아니다. 발현 벡터는 추가 요소를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 발현 벡터는 2개의 복제 시스템을 가질 수 있으며, 그에 따라 이것이 2개의 유기체, 예를 들어, 발현을 위한 인간 세포 및 클로닝 및 증폭을 위한 원핵 숙주에서 유지되도록 할 수 있다.

본 명세서에 사용된, 용어 "바이러스 벡터"는 바이러스 기원의 적어도 하나의 요소를 포함하고 바이러스 벡터 입자에 패키징될 수 있는 능력을 갖는 핵산 벡터 작제물을 지칭한다. 바이러스 벡터는 비필수 바이러스 유전자 대신에 본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 함유할 수 있다. 벡터 및/또는 입자는 시험관내(in vitro) 또는 생체내에서(in vivo) 임의의 핵산을 세포 내로 전달하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 바이러스 벡터의 다양한 형태가 공지되어 있다. 본 발명의 바이러스 벡터의 비제한적인 예는 AAV 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 및 키메라 바이러스 벡터를 포함한다.

본 명세서에 기재된 벡터는 일부 실시형태에서 다른 적합한 조성물 및 요법과 조합될 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 적절한 에피솜 벡터의 사용은 높은 카피 수의 여분의 염색체 DNA로 대상체에서 관심 뉴클레오티드를 유지함으로써 염색체 통합의 잠재적 효과를 제거하는 수단을 제공한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "치료하다(treat)", "치료(treatment)", "치료하는(treating)" 또는 "개선(amelioration)"은 치료적 치료를 지칭하며, 여기서 목적(object)은 질병 또는 장애와 관련된 상태, 예를 들어, 혈액 질환 또는 암의 진행 또는 중증도를 역전, 경감, 개선, 억제, 감속(slow down) 또는 중단시키는 것이다. "치료하는"이라는 용어는 혈액 질환 또는 암과 관련된 상태, 질병 또는 장애의 적어도 하나의 부작용 또는 증상을 감소 또는 완화시키는 것을 포함한다. 치료는 일반적으로 하나 이상의 증상 또는 임상 마커가 감소되는 경우 "효과적"이다. 대안적으로, 치료는 질병의 진행이 감소되거나 중단되는 경우 "효과적"이다. 즉, "치료"에는 증상 또는 마커의 개선 뿐만 아니라, 치료가 없을 때 예상되는 것과 비교하여 증상의 진행 또는 악화의 중지, 또는 적어도 감속도 포함한다. 유익하거나 원하는 임상 결과에는, 검출 가능 여부에 관계없이, 하나 이상의 증상(들)의 완화, 질병 정도의 감소, 질병의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질병 진행의 지연 또는 감속, 질병 상태의 개선 또는 일시완화(palliation), 관해(부분적이든 전체적이든) 및/또는 사망률 감소를 포함하지만, 이로만 제한되는 것은 아니다. 질병의 "치료"라는 용어는 또한 질병의 증상 또는 부작용으로부터의 위안(relief)(일시완화적 치료 포함)을 제공하는 것을 포함한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "투여(administering)"는 원하는 부위에서 작용제의 적어도 부분적 전달을 초래하는 방법 또는 경로에 의해 본 명세서에 개시된 바와 같은 화합물을 대상체로 배치하는 것을 지칭한다. 본 명세서에 개시된 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 대상체에서 효과적인 치료를 초래하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 물리적 인간 활동, 예를 들어, 주사, 섭취 행위, 적용 행위, 및/또는 전달 장치 또는 기계의 조작을 포함한다. 이러한 활동은, 예를 들어, 의료 전문가 및/또는 치료를 받는 대상체에 의해 수행될 수 있다.

본 명세서에 사용된 "접촉(contacting)"은 적어도 하나의 세포에 작용제를 전달하거나 노출시키기 위한 임의의 적합한 수단을 지징한다. 예시적인 전달 방법은 세포 배양 배지로의 직접 전달, 관류, 주사 또는 당업자에게 잘 알려진 다른 전달 방법가 포함하지만, 이로만 제한되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 접촉은 물리적 인간 활동, 예를 들어, 주사, 분배, 혼합, 및/또는 따라내기(decanting); 및/또는 전달 장치 또는 기계의 조작을 포함한다.

"통계적으로 유의한" 또는 "유의하게"라는 용어는 통계적 유의성을 나타내며 일반적으로 2 표준 편차(2SD) 이상의 차이를 의미한다.

작동 예에서, 또는 달리 지시된 경우를 제외하고, 본 명세서에서 사용된 성분 또는 반응 조건의 양을 나타내는 모든 숫자는, 모든 경우에 "약"이라는 용어에 의해 변경된 것으로 이해되어야 한다. 백분율과 관련하여 사용될 때 용어 "약"은 ±1%를 의미할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "포함하는(comprising)"이라는 용어는 제시된 정의된 요소에 더하여 다른 요소가 또한 존재할 수 있음을 의미한다. "포함하는"의 사용은 제한이 아니라 포함을 나타낸다.

용어 "구성되는(consisting of)"은 실시형태의 해당 설명에서 언급되지 않은 임의의 요소가 배제된, 본 명세서에 기술된 바와 같은 조성물, 방법, 및 이들 각각의 구성성분을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"은 주어진 실시형태에 요구되는 요소를 지칭한다. 이 용어는 본 발명의 해당 실시형태의 기본적이고 신규한 또는 기능적 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가 요소의 존재를 허용한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "~에 상응하는(corresponding to)"은 제2 폴리펩티드 또는 핵산의 열거된 아미노산 또는 뉴클레오티드와 등가인 제1 폴리펩티드 또는 핵산의 열거된 위치에 있는 아미노산 또는 뉴클레오티드을 지칭한다. 등가의 열거된 아미노산 또는 뉴클레오티드는 당업계에 공지된 상동성 프로그램, 예를 들어, BLAST를 이용하여 후보 서열의 정렬에 의해 결정될 수 있다.

단수 용어 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다. 유사하게, "또는"이라는 단어는 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한 "및"을 포함하도록 의도된다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 재료가 본 개시의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 아래에 기재되어 있다. 약어, "예를 들어(e.g.)"는 라틴어 exempli gratia에서 파생되었으며 비제한적인 예를 나타내기 위해 본 명세서에서 사용된다. 따라서 약어 "예를 들어(e.g.)" "예를 들어(for example)"라는 용어와 동의어이다.

본 명세서에 개시된 본 발명의 대안적 요소 또는 실시형태의 그룹화는 제한으로 해석되어서는 안 된다. 각 그룹 구성원은 개별적으로 또는 그룹의 다른 구성원 또는 본 명세서에서 발견되는 다른 요소와 임의의 조합으로 참조 및 청구될 수 있다. 그룹의 1개 이상의 구성원은 편의 및/또는 특허성을 이유로 그룹에 포함되거나, 그룹에서 삭제될 수 있다. 임의의 그러한 포함 또는 삭제가 발생하면, 본 명세서는 수정된 그룹을 포함하고, 그에 따라 첨부된 청구범위에 사용된 모든 마쿠쉬(Markush) 그룹에 대한 서면 설명을 충족하는 것으로 간주된다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 본 발명은 본 명세서에 기술된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않으며, 그 자체가 다양할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용된, 용어는 단지 특정한 실시형태를 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 의도로 사용된 것은 아니며, 본 발명의 범위는 오직 청구범위에 의해 정의된다. 면역학 및 분자 생물학에서 일반적인 용어의 정의는, 그 내용이 전문으로 본 명세서에 참조로 통합되는, 다음 문헌에서 찾을 수 있다: The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 20th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2018 (ISBN 0911910190, 978-0911910421); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); 및 Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), W. W. Norton & Company, 2016 (ISBN 0815345054, 978-0815345053); Lewin's Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; 및 Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737).

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 개시는 인간을 클로닝하는 방법, 인간의 생식계열 유전적 정체성을 변경하는 방법, 산업적 또는 상업적 목적을 위한 인간 배아의 사용 또는 사람이나 동물에게 임의의 실질적인 의학적 이익 없이 고통을 유발할 가능성이 있는 동물의 유전적 동일성(identity)을 변경하는 방법, 및 그러한 방법으로 초래된 동물과 관련이 없다.

본 발명의 다양한 양태에 대한 설명 내에서 다른 용어는 여기에 정의된다.

본 출원 전반에 걸쳐 인용된, 문헌 참조, 공고된 특허, 공개된 특허 출원, 및 동시 계류 중인 특허 출원을 포함하는 모든 특허 및 기타 간행물은, 설명 및 개시, 예를 들어, 본 명세서에 설명된 기술과 연계하여 사용될 수 있는 그러한 간행물에 설명된 방법론을 설명 및 개시하기 위한 목적으로 본 명세서에 명시적으로 참조로 통합된다. 이러한 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 공개를 위해서만 제공된다. 이와 관련하여 어떠한 것도 발명자가 선행 발명으로 인해 또는 다른 이유로 그러한 개시보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 아니된다. 이들 문헌의 내용에 대한 날짜 또는 표현에 대한 모든 진술은 출원인이 사용할 수 있는 정보를 기반으로 한 것이며, 이들 문헌의 날짜 또는 내용의 정확성에 대한 어떠한 인정도 구성하지 않는다.

본 개시의 실시형태에 대한 설명은 완전한 형태로 개시되거나 개시된 정확한 형태로 개시내용을 제한하도록 의도되지 않는다. 본 개시의 특정 실시형태, 및 실시예는 예시의 목적으로 본 명세서에 기술되어 있지만, 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 인식하는 바와 같이 본 발명의 범위 내에서 다양한 등가 변형이 가능하다. 예를 들어, 방법 단계 또는 기능이 주어진 순서로 제시되지만, 대안적인 실시형태는 다른 순서로 기능을 수행할 수 있거나, 기능은 실질적으로 동시에 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공된 개시의 교시는 적절하게 다른 절차 또는 방법에 적용될 수 있다. 본 명세서에 설명된 다양한 실시형태는 추가 실시형태를 제공하기 위해 조합될 수 있다. 본 개시의 양태는, 필요하다면, 본 개시의 또 다른 실시형태를 제공하기 위해 상기 참조 및 적용의 구성, 기능 및 개념을 이용하도록 변경될 수 있다. 이러한 변화 및 기타 변화는 상세한 설명에 비추어 본 개시에 대해 이루어질 수 있다. 이러한 모든 변경은 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되도록 의도된다.

전술한 실시형태 중 임의의 것의 특정 요소는 다른 실시형태의 요소로 결합되거나 대체될 수 있다. 또한, 본 발명의 특정 실시형태와 관련된 이점이 이러한 실시형태의 맥락에서 설명되었지만, 다른 실시예도 이러한 이점을 나타낼 수 있으며, 모든 실시형태가 본 개시의 범위 내에 포함되기 위해 반드시 그러한 이점을 나타낼 필요는 없다.

본 명세서에 설명된 기술의 일부 실시형태는는 아래 번호매겨진 단락 중 하나에 따라 정의될 수 있다:

1. a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계;

b) 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단에서 히스톤 메틸트랜스퍼라제를 억제하는 단계; 및

c) CD3⁺-T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 노치(Notch) 리간드의 존재 하에 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서, 상기 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계,

를 포함하는, 방법.

2. a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계;

b) 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단에서 후성유전 조절인자를 억제시키는 단계; 및

c) CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 노치 리간드의 존재 하에 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서, 상기 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계,

를 포함하는, 방법.

3. a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계;

b) 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단에서 G9a 및/또는 GLP를 억제시키는 단계; 및

c) CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 노치 리간드의 존재 하에 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서, 상기 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계,

를 포함하는, 방법.

4. a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계; 및

b) CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 노치 리간드의 존재 하에 CD3⁺-T-세포-분화 배지에서, 상기 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계,

를 포함하는, 방법.

5. 단락 1 내지 단락 4 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 노치 리간드가 고체 기재에 부착되어 있는, 방법.

6. 단락 1 내지 단락 5 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 노치 리간드가 세포 배양 접시에 부착되어 있는, 방법.

7. 단락 1 내지 단락 6 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 노치 리간드가 간질 세포로부터 유래되지 않은 것인, 방법.

8. 단락 1 내지 단락 7 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 노치 리간드의 존재 하에 혈액생성 내피세포를 분화시키는 단계가 노치 리간드를 발현하는 간질 세포와의 공동-배양을 포함하지 않는 것인, 방법.

9. 단락 1 내지 단락 8 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 노치 리간드의 존재 하에 혈액생성 내피세포를 분화시키는 단계가 OP9-DL1 세포 또는 OP9-DL4 세포와의 공동-배양을 포함하지 않는 것인, 방법.

10. 단락 1 내지 단락 9 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 노치 리간드가 델타-유사-1(DLL1), 델타-유사-4(DLL4), 고정화된 델타1^ext-IgG, 및 고정화된 델타4^ext-IgG로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.

11. 단락 10에 있어서, 상기 고정화된 델타1^ext-IgG가 인간 IgG1의 Fc 도메인에 융합된 인간 델타-유사-1의 세포외 도메인으로 구성되는 것인, 방법.

12. 단락 1 내지 단락 11 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간이 적어도 4주인, 방법.

13. 단락 1 내지 단락 12 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CD3⁺-T-세포 분화 배지가 무혈청인, 방법.

14. 단락 1 내지 단락 13 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CD3⁺-T-세포-분화 배지가 FLT3 및 IL7을 포함하는 것인, 방법.

15. 단락 1 내지 단락 14 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CD3⁺-T-세포-분화 배지가 15 ng/㎖ FLT3 및 25 ng/㎖ IL7을 포함하는 것인, 방법.

16. 단락 1 내지 단락 15 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CD3⁺-T-세포-분화 배지가 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서의 적어도 처음 2주의 분화 동안 5 ng/㎖ 트롬보포이에틴(TPO) 및/또는 30 ng/㎖ SCF를 추가로 포함하는 것인, 방법.

17. 단락 1 내지 단락 16 중 어느 한 단락에 있어서, TPO를 포함하는 CD3⁺-T-세포-분화 배지가 CD5⁺ CD7⁺ ProT 세포의 집단으로의 분화를 촉진하는 것인, 방법.

18. 단락 1 내지 단락 4 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CD3⁺ T 세포의 집단이 CD4⁺CD8⁺ T 세포의 집단을 포함하는 것인, 방법.

19. 단락 18에 있어서, 상기 CD4⁺ 세포의 집단 및 CD8⁺ 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 단일-양성-T-세포-분화 배지에서 CD4⁺CD8⁺ T 세포의 집단을 분화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

20. 단락 19에 있어서, 상기 CD4⁺CD8⁺ T 세포의 집단으로부터 CD4⁺ T 세포의 집단 및 CD8⁺ 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간이 적어도 1주인, 방법.

21. 단락 19에 있어서, 상기 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로부터 CD4⁺ T 세포의 집단 및 CD8⁺ 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간이 적어도 5주인, 방법.

22. 단락 19에 있어서, 상기 단일-양성-T-세포-분화 배지가 10 ng/㎖ IL-15 및 T 세포 활성화인자를 포함하는 것인, 방법.

23. 단락 22에 있어서, 상기 T 세포 활성화인자가 10 ㎕/㎖ CD3/CD28 T 세포 활성화인자를 포함하는 것인, 방법.

24. 단락 22에 있어서, 상기 T 세포 활성화인자가 세포당 1개 비드의 CD3/CD28 T 세포 활성화인자 다이나비드를 포함하는 것인, 방법.

25. 단락 18 내지 단락 24 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 1주 후에 CD4⁺ 세포 농축 및/또는 CD8⁺ 세포 농축 단계를 추가로 포함하는, 방법.

26. 단락 1 내지 단락 4 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 만능 줄기 세포의 집단이 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포) 또는 배아 줄기 세포(ESC)를 포함하는 것인, 방법.

27. 단락 26에 있어서, 상기 유도 만능 줄기 세포가 단지 재프로그래밍 인자 OCT4, SOX2, KLF4 및 임의로 c-MYC 또는 nanog 및 LIN28을 성숙한 세포에 도입함으로써 생산되는 것인, 방법.

28. 단락 26에 있어서, 상기 유도 만능 줄기 세포가 재프로그래밍 인자를 2회 이상 성숙세포에 도입함으로써 생산되는 것인, 방법.

29. 단락 1 내지 단락 4 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 만능 줄기 세포의 집단이 배상체(embryoid bodies) 또는 2D 부착 배양물을 사용하여 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로 분화되는 것인, 방법.

30. 단락 1 내지 단락 4 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간이 적어도 8일인, 방법.

31. 단락 1 내지 단락 4 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 응집 배지가 BMP4, SB-431542, CHIR99021, bFGF, VEGF, IL-6, IL-11, IGF-1, SCF, 및 EPO를 포함하는 것인, 방법.

32. 단락 29 내지 단락 31 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 응집 배지가 10 ng/㎖ BMP4, 6 mM SB-431542, 3 mM CHIR99021, 5 ng/㎖ bFGF, 15 ng/㎖ VEGF, 10 ng/㎖ IL-6, 5 ng/㎖ IL-11, 25 ng/㎖ IGF-1, 50 ng/㎖ SCF, 및 2 U/㎖ EPO를 포함하는 것인, 방법.

33. 단락 29 내지 단락 32 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단에 대한 표면 마커의 발현을 이용하여 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 선택 또는 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

34. 단락 29 내지 제33항 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단이 CD45 음성/낮음인 것인, 방법.

35. 단락 29 내지 단락 34 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단이 CD38 음성/낮음인 것인, 방법.

36. 단락 1 내지 단락 4 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단 또는 CD3⁺ T 세포의 생성된 집단을 유전적으로 변형시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

37. 제36항에 있어서, 상기 유전적 변형이 내인성 HLA를 편집하는 것, 내인성 TCR을 제거하는 것, 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 것인, 방법.

38. 단락 1에 있어서, 상기 히스톤 메틸트랜스퍼라제가 히스톤 3 라이신 잔기 9(H3K9) 및/또는 히스톤 3 라이신 잔기 27(H3K27)에 대한 메틸기의 부가를 촉매하는 것인, 방법.

39. 단락 1에 있어서, 상기 히스톤 메틸트랜스퍼라제 H3K9 및/또는 H3K27이 소분자 억제제 또는 핵산 억제제에 의해 억제되는 것인, 방법.

40. 단락 39에 있어서, 상기 히스톤 메틸트랜스퍼라제 H3K9 및/또는 H3K27 소분자 억제제가 이종유기(heterorganic) 화합물 또는 유기금속(organometallic) 화합물인, 방법.

41. 단락 39에 있어서, 상기 히스톤 메틸트랜스퍼라제 H3K9 및/또는 H3K27 소분자 억제제가 BIX-01294, UNC0638, E72, BRD4770, A-366, 케토신(chaetocin), UNC0224, UNC0631, UNC0646, EPZ005687, EPZ-6438(E7438), 3-데아잔플라노신 A(DZNep), EI1, GSK343, GSK126, 및 UNC1999로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.

42. 단락 39에 있어서, 상기 핵산 억제제가 히스톤 메틸트랜스퍼라제의 발현을 표적화하는 핵산인, 방법.

43. 단락 39에 있어서, 상기 핵산 억제제가 RNA 간섭 억제제 또는 작용제인, 방법.

44. 단락 39에 있어서, 상기 핵산 억제제가 EZH1에 결합하는 압타머, EZH1 특이적 RNA 간섭제, 및 EZH1 특이적 RNA 간섭제를 코딩하는 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 EZH1 특이적 핵산이고, 여기서 상기 RNA 간섭제는 서열번호: 11 내지 19로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상을 포함하는 것인, 방법.

45. 단락 2에 있어서, 상기 후성유전 조절인자가 DNA-메틸트랜스퍼라제(DNMT); 메틸-CpG-결합 도메인(MBD) 단백질; DNA 데메틸라제; 히스톤 메틸 트랜스퍼라제(HMT); 메틸-히스톤 결합 단백질; 히스톤 데메틸라제; 히스톤 아세틸 트랜스퍼라제(HAT); 아세틸-결합 단백질; 또는 히스톤 데아세틸라제(HDAC)인, 방법.

46. 단락 45에 있어서, 상기 후성유전 조절인자의 억제제가 UNC0224; MC1568; 및 CAY10591로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.

47. 단락 45 내지 단락 46 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 후성유전 조절인자의 억제제가 500 nM 이상의 농도로 제공되는 것인, 방법.

48. 단락 45 내지 단락 46 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CD34⁺ 세포의 집단으로부터 CD5⁺CD7⁺ proT 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간이 약 14일인, 방법.

49. 단락 3에 있어서, 상기 G9a 및/또는 GLP 억제제가 UNC0224; UNC0638; A366; BRD4770; BIX01294; UNC0642; UNC0631; UNC0646; UNC0321; E72; BIX-01338; BRD9539; 키토신; 및 DCG066으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.

50. 단락 49에 있어서, 상기 G9a 및/또는 GLP 억제제가 UNC0224인, 방법.

51. 단락 49 내지 단락 50 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 G9a 및/또는 GLP 억제제가 300 nM 내지 5 μM의 농도로 제공되는 것인, 방법.

52. 단락 49 내지 제51항 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CD34⁺ 세포의 집단으로부터 CD5⁺CD7⁺ proT 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간이 약 14일인, 방법.

53. a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계; 및

b) CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기 위해 10 ㎍/㎖ 노치 리간드의 존재 하에 적어도 4주 동안 15 ng/㎖ FLT3 및 25 ng/㎖ IL7을 포함하는 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서, 상기 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계로서, 상기 CD3⁺-T-세포 분화 배지는 적어도 처음 2주 동안 5 ng/㎖ TPO 및 30 ng/㎖ SCF를 추가로 포함하는, 단계,

를 포함하는, 방법.

54. a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계; 및

b) CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기 위해 적어도 4주 동안 10㎍/㎖ 노치 리간드의 존재 하에 15 ng/㎖ FLT3 및 25 ng/㎖ IL7을 포함하는 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서, 상기 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계로서, 상기 CD3⁺-T-세포 분화 배지는 적어도 처음 2주 동안 5 ng/㎖ TPO, 30 ng/㎖ SCF, 및 G9a/GLP 억제제를 추가로 포함하는 것인, 단계,

를 포함하는, 방법.

55. 단락 1 내지 단락 54 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CD3⁺ T 세포의 집단이 알파 베타 T 세포와 가장 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타내는 것인, 방법.

56. 단락 1 내지 단락 55 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CD3⁺ T 세포의 집단이 알파 베타 T 세포와 적어도 10%, 20%, 30%, 40% 또는 그 이상 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타내는 것인, 방법.

57. 단락 1 내지 단락 56 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CD3⁺ T 세포의 집단이 말초혈 알파 베타 T 세포와 비교하여 적어도 0.85인 피어슨 상관 계수를 갖는 유전자 발현 프로파일을 나타내는 것인, 방법.

58. 단락 1 내지 단락 57 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CD3⁺ T 세포의 집단이 약 0.025의 생산적 심슨 클론형성능 값을 나타내는 것인, 방법.

59. 단락 1 내지 단락 58 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CD3+ T 세포의 집단이 메틸트랜스퍼라제의 억제 또는 간질 세포 이용없이 분화된 면역 세포에 비해 적어도 3개 뉴클레오티드가 더 긴 T 세포 수용체(TCR) 상보성 결정 영역(CDR)을 나타내는 것인, 방법.

60. 단락 1 내지 단락 59 중 어느 한 단락의 방법에 의해 생성된 면역 세포.

61. 단락 60에 있어서, 상기 면역 세포가 알파 베타 T 세포와 가장 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타내는 것인, 면역 세포.

62. 단락 60 내지 단락 61 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 면역 세포가 알파 베타 T 세포와 적어도 10%, 20%, 30%, 40% 또는 그 이상 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타내는 것인, 면역 세포.

63. 단락 60 내지 단락 62 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 면역 세포가 말초혈 알파 베타 T 세포와 비교하여 적어도 0.85인 피어슨 상관 계수를 갖는 유전자 발현 프로파일을 나타내는 것인, 면역 세포.

64. 단락 60 내지 단락 63 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 면역 세포가 약 0.025의 생산적 심슨 클론형성능 값을 나타내는 것인, 면역 세포.

65. 단락 60 내지 단락 64 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 면역 세포가, 간질 세포를 사용하여, 메틸트랜스퍼라제의 억제 없이 분화된 면역 세포에 비해 적어도 3개 뉴클레오티드가 더 긴 T 세포 수용체(TCR) 상보성 결정 영역(CDR)을 나타내는 것인, 면역 세포.

66. 단락 60 내지 단락 65 중 어느 한 단락의 면역 세포 또는 이의 집단을 포함하는 조성물.

67. 단락 66에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 조성물.

68. 단락 60 내지 단락 65 중 어느 한 단락의 면역 세포 또는 이의 집단, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.

69. 단락 68에 있어서, 대상체에서 세포 대체 요법에 사용하기 위한 것인, 약제학적 조성물.

70. 세포 대체 요법의 방법으로서, 상기 방법은 단락 60 내지 단락 65 중 어느 한 단락의 면역 세포 또는 이의 집단, 또는 단락 66 내지 단락 67의 조성물, 또는 단락 68 내지 단락 69의 약제학적 조성물을 필요로 하는 수혜 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.

71. 단락 70에 있어서, 상기 수혜 대상체가 화학요법 및/또는 방사선조사(irradiation)를 받은 적이 있는, 세포 대체 요법의 방법.

72. 단락 70에 있어서, 상기 수혜 대상체가 면역 기능 및/또는 림프구 재구성에 결함이 있는, 세포 대체 요법의 방법.

73. 단락 70 내지 단락 72 중 어느 한 단락에 있어서, 이식 전에, 상기 면역 세포 또는 이의 집단이 수혜 대상체에서 후속 생착을 촉진하기 위해 프로스타글란딘 E2 및/또는 항산화제 N-아세틸-L-시스테인(NAC)으로 생체외에서(ex vivo) 처리되는, 방법.

74. 단락 70 내지 단락 73 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 면역 세포 또는 이의 집단이 수혜 대상체에 대해 자가의 것인, 세포 대체 요법의 방법.

75. 단락 70 내지 단락 74 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 면역 세포 또는 이의 집단이 수혜 대상체와 매칭되는 HLA 타입의 것인, 세포 대체 요법의 방법.

실시예

실시예 1: 인간 만능 줄기 세포로부터의 무-간질 T 세포 분화

T 세포는 인간 적응 면역계의 핵심 구성요소이며 큰 치료 잠재력을 가지고 있다. 그러나, 현재의 T 세포-매개 요법은 자가 T 세포에 의존하며, 이는 광범위한 적용을 막는다. 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)는 세포 치료를 위한 기성(off-the-shelf) 제품의 확장 가능한 제조를 위한 이상적인 소스이다. 그러나, iPSC에서 성숙하고 기능적인 T 세포의 생성은 어려운 것으로 입증되었다. 또한, iPSC의 분화는 iPSC-유래 T 세포의 번역 잠재력을 제한하는 마우스 간질 세포와의 공동-배양을 필요로 한다.

T 세포 분화를 위한 무-혈청, 무-간질 분화 프로토콜이 본 명세서에 기술되어 있다. 혈액생성 CD34⁺ 내피 세포는 먼저 iPS로부터 유래되었다(예를 들어, 실시예 2 참조). 비-조직 배양 처리된 플레이트를 재조합 인간 DL1/DL4-Fc 단백질(PBS 중 10 ㎍/㎖, 실온에서 3시간)으로 코팅했다. iPSC-유래 혈액생성 내피 세포를 노치 리간드가 코팅된 조직 배양 플레이트에서 배양하고 T 세포 발달에 필수적인 성장 인자(Flt3, SCF, Il7, TPO)를 배지에 순차적으로 첨가했다(예를 들어, 도 1A 또는 도 17 참조). 이 프로토콜을 사용하여, CD5⁺CD7⁺ T 세포 전구체를 분화 2주 후에 생성시킬 수 있고 CD3⁺ T 세포는 분화 5주 후에 관찰된다(예를 들어, 도 1B 참조). 이러한 CD3⁺는 CD3/CD28 항체에 의해 추가로 자극될 수 있으며, 이는 CD4 또는 CD8 단일 양성 T 세포의 증식 및 유도를 증가시킨다(예를 들어, 도 1C 참조). 또한, OP9-DL4 세포를 이용하는 전통적인 T 세포 분화 프로토콜은 감마 델타 TCR을 발현하는 선천적-유사 T 세포를 생성한다. 본 명세서에 설명된 무-간질 프로토콜은 증가된 수의 T 세포를 생성하고 이러한 세포의 작은 부분만이 선천적-유사 세포(예를 들어, 도 1D 참조)이며, 이는 이 방법이 더 성숙한 표현형을 나타내는 T 세포를 생성한다는 것을 시사한다. 요약하면, 본 명세서는 더 임상적으로 관련된 iPSC-유래 T 세포의 생성을 위한 새로운 플랫폼을 기술한다.

무-간질 T 세포 분화 방법의 한 가지 적용은 CAR iPSC-T 세포의 생성이다. 항-CD19 키메라 항원 수용체(CAR)를 iPSC HSPC에 도입하고, 세포를 본 명세서에 기재된 무-간질 T 세포 분화 방법을 이용하여 T 세포로 분화시켰다(예를 들어, 도 2A 참조). CAR의 발현은 분화 동안 유지되었다(예를 들어, 도 2B 참조). CAR T 세포는 비형질도입된(UTD; untransduced) 대조군과 유사하게 확대되었다(예를 들어, 도 2C 참조). CD19-K562 세포를 사용한 자극은 CAR-iPSC T 세포의 활성화를 초래했지만 비형질도입된(UTD) 대조군 또는 비자극된 CAR-iPSC T 세포는 활성화시키지 않았다(예를 들어, 도 2D 참조).

RNA-seq 분석을 1차 T 세포 및 iPSC-유래 T 세포에서 수행했다. PBMC αβT, γδT, 및 NK 세포에 대한 iPSC-T 세포의 유사성을 비교하기 위해 T 세포 시그니처 유전자의 발현을 조사했다(예를 들어, 도 3A 참조). 알파 베타 T 세포와 감마 델타 T 세포를 구별하는 유전자의 발현을 조사하여 iPSC-T 세포와 TCRαβ 및 TCRγδ T 세포의 유사성을 비교했다(도 3B 참조). 결과는 본 명세서에 기술된 분화 방법이 공여자의 말초 혈액(abT)으로부터의 알파 베타 T 세포와 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타내는 iPSC-T 세포(EZ-T)의 생성을 허용한다는 것을 보여준다. 대조적으로, 전통적인 iPSC-T 세포(conT_OP9)는 선천적-유사 T 세포의 표현형을 나타냈다. 따라서, 본 명세서에 기술된 방법(예를 들어, 무-간질 및 EZH1 녹다운)은 간질 방법과 비교하여 천연 T 세포와 가장 유사한 발현 프로파일을 갖는 T 세포를 생성한다.

EZ-T 세포는 또한 다양한 TCR 레퍼토리를 나타낸다. EZ-T 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 EZH1 억제 및 무-간질 T 세포 분화를 포함하는 CD34⁺ HE로부터 분화된 T 세포를 지칭한다. EZ-T 세포에 대해 TCR 베타 쇄 시퀀싱을 수행했으며 T 세포 분화 중 무작위 TCR 유전자 재조합의 결과로 수만 개의 고유한 TCR 재배열이 확인되었다. EZ-T 세포에서 TCRBV 유전자 패밀리의 사용을 조사했다. 각 음영은 하나의 TCRBV 패밀리를 나타낸다. 생산적인 심슨 클론형성능 값은 0.0233이었으며, 이는 매우 다양한 TCR 레퍼토리를 시사한다. 예를 들어, 도 4를 참조.

EZ-T 세포는 또한 대조군 PSC-T 세포보다 더 긴 CDR3 분절을 갖는다. CDR3는 TCR의 가장 가변적인 영역이며, 이것의 길이는 TCR 재배열 동안 뉴클레오티드를 무작위로 추가하는 TdT 효소의 활성에 의해 결정될 수 있다. CDR3는 성숙한 PBMC T 세포에 비해 미성숙 T 세포 및 iPSC-유래 T 세포에서 더 짧은 것으로 보고되었다. EZ-T 세포는 대조군 iPSC-유래 T 세포에 비해 증가된 CDR3 길이를 나타내었고, PBMC T 세포와 더 유사하였다(예를 들어, 도 5A-5D 참조). EZ-T 세포가 TdT에 의해 추가된 더 긴 영역을 나타내므로, 이러한 CDR은 더 많은 서열 가변성과, 그에 따라 더 다양한 TCR 레퍼토리를 나타낸다.

실시예 2: 혈액생성 내피세포의 제조 방법

유도 만능 줄기(iPS) 세포로부터 혈액생성(CD34⁺) 내피세포를 생산하기 위한 8-일 프로토콜이 본 명세서에 기술되어 있다; 예를 들어, 그 내용이 전문으로 본 명세서에 참조로 통합되는 다음 문헌을 참조: Sturgeon et al., Wnt Signaling Controls the Specification of Definitive and Primitive Hematopoiesis From Human Pluripotent Stem Cells, Nat Biotechnol. 2014 Jun; 32(6): 554-561.

0일차: MEF상에서 iPSC로부터 EB의 형성

일반적으로, 뮤린 배아 섬유아세포(MEF)에서 배양 3일 내지 1주 후에, iPS 세포는 배상체(EB)를 만들 준비가 된다. D0에 대해 다음 프로토콜을 따른다.

1. MEF상에서 성장한 iPS 세포를 5 ㎖의 DMEM/F12 배지로 세척한다.

2. 각 접시에서 배지를 흡인한다. 0.22 μM 필터링된 DMEM/F12에 희석된 1X 콜라게나제 IV 5 ㎖로 교체한다.

3. 37℃에서 5-10분 동안 인큐베이션하고 iPS 콜로니가 분리(detaching)되고 있는지 현미경으로 주기적으로 확인한다.

4. 콜라게나제 IV를 흡인하고 5 ㎖의 여과된 DMEM/F12로 교체한다.

5. 멸균 세포 스크래퍼를 사용하여, 먼저 접시의 가장자리 주위에서 콜로니를 긁어낸 다음, 왼쪽에서 오른쪽으로, 그 다음 위에서 아래로 긁어 낸다.

6. 10 ㎖ 혈청학적 피펫을 이용하여 세포를 코니칼 튜브로 조심스럽게 천천히 옮긴다. 잔류 콜로니가 있는 경우, 추가 5 ㎖로 플레이트를 세척하고, 동일한 튜브에 추가한다.

7. 1분 동안 1100 rpm으로 원심분리(spin down)한다

8. 세포가 원심분리되는 동안, BMP4가 있는 응집 배지(예를 들어, 표 1 참조) 9 ㎖를 Corning Ultra Low Adherent 10 cm 접시에 첨가한다.

9. 펠릿화된 iPS 콜로니에서 배지를 흡인하고 BMP4가 있는 응집 배지 1 ㎖에 재현탁시킨다.

10. 1 ㎖의 세포를 응집 배지를 함유하는 각 Ultra Low Adherent 10cm에 조심스럽게 옮긴다. 동일한 피펫을 이용하여 세포가 없는 플레이트 영역에서 최대 1 ㎖를 피펫팅하고 코니칼 튜브를 세척한다. 코니칼 튜브에 1 ㎖를 다시 첨가하고; 이제 iPS 세포의 3-4개 시작 플레이트를 포함하는 각 플레이트의 최종 부피는 10 ㎖이다.

11. 37℃에서 저산소 인큐베이터(5% O₂)로 옮긴다. 4-5개의 플레이트를 서로의 상부에 겹쳐 쌓을 수 있으며, 이때 1개의 플레이트는 증발을 방지하기 위해 스택 하단부에서 PBS로 채워진다. 이것이 EB 배양의 0일차이다.

1일차: bFGF 첨가

1일차에 다음 프로토콜을 따른다: 1. 5 ng/㎖의 최종 농도를 위해 각 10 cm의 EB 접시에 bFGF를 직접 첨가한다. 플레이트를 진탕시켜 배지를 분산시킨다.

2일차: D2 배지로의 교체 완료

2일차에 D2 배지를 도입한다. D2에 대해 다음 프로토콜을 따른다.

1. D2 응집 배지는 다음을 포함한다(예를 들어, 표 1 참조): BMP4, bFGF, CHIR99021(StemCell Technologies Inc. # 72054), 및 SB431542(StemCell Technologies Inc. # 72234). SB와 CHIR이 해동되면, 재동결하는 것은 권장하지 않는다.

2. 10 ㎖ 혈청학적 피펫을 사용하여 EB를 수집하고 코니칼 튜브에 넣는다.

3. EB를 ~15분 동안 안정화시킨다.

4. 배지를 흡인하고 D2 배지(10 ㎖/10cm 접시)에 재현탁한 다음, 조심스럽게 Ultra-Low Adherent 접시로 다시 옮긴다.

3일차: D3 배지로 배지 교체 완료

3일차에 D3 배지를 도입한다. D3에 대해 다음 프로토콜을 따른다.

1. D3 응집 배지는 다음을 포함한다(예를 들어, 표 1 참조): VEGF 및 bFGF.

2. 10 ㎖ 혈청학적 피펫을 이용하여 EB를 수집하고 코니칼 튜브에 넣는다

3. EB를 ~15분 동안 안정화시킨다

4. 배지를 흡인하고 D2 배지(10 ㎖/10cm 접시)에 재현탁한 다음, 조심스럽게 Ultra-Low Adherent 접시로 다시 옮긴다.

4-5일차: 배지 교체 없음

4-5일차에는 배지 교체를 하지 않는다.

6일차: D6 배지로 배지 교체 완료

6일차에, D6 배지를 도입한다. D6에 대해 다음 프로토콜을 따른다.

1. D6 응집 배지는 다음을 포함한다(예를 들어, 표 1 참조): VEGF 재조합 인간 VEGF 165(VEGF-A)(R&D Systems(R&D) #293-VE-500), bFGF, SCF, EPO, IL-6 재조합 인간 IL-6(20ug)(Peprotech™ # 200-06), IL-11 및 IGF-1.

2. 10 ㎖ 혈청학적 피펫을 사용하여 EB를 수집하고 코니칼 튜브에 넣는다

3. EB를 ~15분 동안 안정화시킨다

4. 배지를 흡인하고 D6 배지(10 ㎖/10cm 접시)에 재현탁한 다음, 조심스럽게 Ultra-Low Adherent 접시로 다시 옮긴다

7일차: 배지 교체 없음

7일차에는 배지 교체를 하지 않는다.

8일차: CD34 ⁺ 세포에 대한 MAC 분류에 의한 혈액생성 내피세포의 단리

8일차에, CD34⁺ 세포에 대한 자기-활성화 세포 분류(MACS)를 이용하여 혈액생성 내피세포를 단리했다. CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 이어서 본 명세서에 기재된 바와 같은 무-간질 T 세포 분화 방법을 이용하여 T 세포를 분화시키는 데 사용할 수 있다(예를 들어, 실시예 1 참조).

실시예 3: 후성유전 조절인자의 억제(예를 들어, G9a/GLP)

T 세포 분화를 촉진하는 능력에 대해 후성유전 조절인자의 그룹을 테스트했다. 5F 세포의 첫 번째 스크린에서, UNC0224, MC1568, 또는 CAY10591은 생성된 proT 세포의 수를 크게 증가시켰다(예를 들어, 도 6-8 참조). 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같이 무-간질 T 세포 분화 방법을 이용하여, EB-유래 CD34⁺ 세포(예를 들어, CD34⁺ 혈액생성 내피세포)의 두 번째 스크린에서, UNC0224는 생성된 proT 세포의 수를 상당히 증가시켰다(예를 들어, 도 9-11 참조). 용량 반응은 312 nM 내지 5 μM의 UNC0224 농도가 T 세포 분화를 촉진하는 데 가장 잘 작용함을 보여주었다(예를 들어, 도 12A-12B 참조). UNC0224는 G9a/GLP의 억제제이므로, 다른 다양한 G9a/GLP 억제제를 테스트했다. UNC0638, BRD4770, BIX01294, 및 UNC0642는 각각 생성된 proT 세포의 수를 상당히 증가시켰다(예를 들어, 도 13B, 13D-13F 참조).

UNC0224는 적혈구계/골수계 잠재력을 희생시키면서 T 세포 순응(commitment)을 향상시켰다. UNC0224 처리는 CD5⁺CD7⁺ ProT 세포의 상당한 증가를 초래했지만, 이는 또한 적혈구계 또는 골수계 계통 세포의 상당한 감소를 초래했다(예를 들어, 도 14A-14C 참조). UNC0224는 또한 세포 증식보다는 T 세포 특성화(specification)를 촉진했다. UNC0224 처리는 CD5⁺CD7⁺ ProT 세포의 수 또는 백분율의 상당한 증가를 초래했지만, 이는 또한 전체 세포의 상당한 감소를 초래했다(예를 들어, 도 15A-15C 참조). 이론에 구속되는 것을 원치 않지만, H3K9 메틸화는 림프계 유전자의 억제를 매개하는 것으로 예상된다. 이와 같이, H3K9 메틸화의 억제제로의 처리(예를 들어, 도 6-16, 표 2-3 참조)는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 무-간질 T 세포 분화 방법을 이용할 때 T 세포 분화를 촉진한다. 이러한 H3K9 메틸화 억제제는 히스톤 메틸트랜스퍼라제(예를 들어, EZH1 녹다운)의 억제 대신에, 또는 이와 함께 사용될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> THE CHILDREN'S MEDICAL CENTER CORPORATION <120> STROMA-FREE T CELL DIFFERENTIATION FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS <130> 701039-096580WOPT <150> 62/964,857 <151> 2020-01-23 <150> 63/025,412 <151> 2020-05-15 <160> 50 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8873 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 actgaccatt tggcgatcca ttgagaggag ggtttggaaa agtggctcct ttgtgacagc 60 tctcgccaga ttggggggct gctgatttgc atctcattag ccatgcgggc ggccggctga 120 atataagggc ggcaggcgcc ggcgagagcc agatcctctg cgcgcacccg cggagacccg 180 acccggccga gggcagagcg caggggaacc cgggcagccg cggcgcagag cctcctccca 240 cggcccggcc cctccggtcc tgcgcgtgtg tactggatgg cattggctgg attcatcgga 300 aagacgcgga tctttgctgt gacaccggag atcggagccc ggagtgctcc cggaacgacc 360 gccgccgccg agtgacaccg ggccgcgatc cgcaggggcc gccgcgcaca cccgccgccg 420 ccgaccgtcc cctcagcgcg cgccgctggc cccggattat cgccttgccc gtgggatttc 480 cagaccgcgg ctttctaatc ggctcgggag gaagctctgc agctctcttg ggaattaagc 540 tcaatctctg gactctctct ctttctcttt ctccccctcc ctctcctgcg aagaagctca 600 agacaaaacc aggaagccgg cgaccctcac ctcctcgggg gctgggagga aggaggaaaa 660 cgaaagtcgc cgccgccgcg ctgtcccccg agagctgcct ttcctcgggc atccctgggg 720 ctgccgcggg acctcgcagg gcggatataa agaaccgcgg ccttgggaag aggcggagac 780 cggcttttaa agaaagaagt cctgggtcct gcggtctggg gcgaggcaag ggcgcttttc 840 tgcccacgct ccccgtggcc catcgatccc ccgcgcgtcc gccgctgttc taaggagaga 900 agtgggggcc ccccaggctc gcgcgtggag cgaagcagca tgggcagtcg gtgcgcgctg 960 gccctggcgg tgctctcggc cttgctgtgt caggtaggcg ggcaggtggg ggcgccgcgg 1020 ccccgcgggg tctcacgggt agccggggcg cggggcagga gcgcgcgggg aggggcggac 1080 agcggcacgg gccgcgccag ccacggcccg gaagatgaat cccgggggcg acgaccccag 1140 cgccggccgt gcagcgagcg cgctcggccc ctgagccctt ccaggctctc cgcacacccc 1200 ccacccaggc ctcacgcccc ctagctcggg cgggacccgc gtcctcacgc ccccgccctc 1260 ccccgtgcag gtctggagct ctggggtgtt cgaactgaag ctgcaggagt tcgtcaacaa 1320 gaaggggctg ctggggaacc gcaactgctg ccgcgggggc gcggggccac cgccgtgcgc 1380 ctgccggacc ttcttccgcg tgtgcctcaa gcactaccag gccagcgtgt cccccgagcc 1440 gccctgcacc tacggcagcg ccgtcacccc cgtgctgggc gtcgactcct tcagtctgcc 1500 cgacggcggg ggcgccgact ccgcgttcag caaccccatc cgcttcccct tcggcttcac 1560 ctggccggtg agtgccgcac ctgcgcgcgc cgggccggcc ctgaagctgg gcgggctgca 1620 ggacgcgctg ggatcccgcc ttgggcgctc ggtggcggga cctcggggac cccgcgaggc 1680 gcaggtgggc gctgcgatct gcctagcggc ggccccagga ctccagccca gcagcgcgga 1740 cacctcgccc cggggccccg cggcctgcag gaggggaccg cgctggggcg aggaggagag 1800 gccgagcgcg cccgggagat ttccgtatcc ggcctctgtg ccaggtctcc agtcagaggc 1860 gccccttcac gtgggaaggt tctggtttcc cgactcctag acgcgttggt ggcgcgatta 1920 cccgcgcagc gcgaccgcta ccacccggag cgtgcccatc ccccaagaaa aatgacaagg 1980 gccctcgggc ctcttccacc ccatcctgcc tgcattctct ctctctctct aattaaaaaa 2040 acaacgtaat atcctgtagt acaggctgaa aaaacacgtc aggaaaccac tctttaaaaa 2100 gttcttccat ttccttaggg aaggtgagag caggcaggag gtgcgtggag accctctcca 2160 gacacgctgc cccagacctg cagccttcag gcctctgttg ctgacctggc tgttaggaat 2220 gactgctttt tgccgttttc ttttcgttac ctttctgggt tgtctaacgt cttctcccct 2280 ctctcccagg gcaccttctc tctgattatt gaagctctcc acacagattc tcctgatgac 2340 ctcgcaacag gtaaaaacaa aacccaaacc ccaaaactgc tttccccagt taatagcatt 2400 ggactttgcc cacccatccc ccagccaaac ccggacagct ttcattctgc acgtgcccca 2460 gaaagttcag ggtggagcag cttgggcctc cttcccgtgc tgaatgtctc ggcccacccc 2520 cgctctgtcc cgagtcacag ggttctcgtt cagaaccaac caggagcatc ttctccccgt 2580 agaaaaccca gaaagactca tcagccgcct ggccacccag aggcacctga cggtgggcga 2640 ggagtggtcc caggacctgc acagcagcgg ccgcacggac ctcaagtact cctaccgctt 2700 cgtgtgtgac gaacactact acggagaggg ctgctccgtt ttctgccgtc cccgggacga 2760 tgccttcggc cacttcacct gtggggagcg tggggagaaa gtgtgcaacc ctggctggaa 2820 agggccctac tgcacagagc gtgagtctct gggaaggcac cgctggctca ctcgtccacg 2880 aacacggacc gcgcgcaggg acggggcttc ctgagccacg gggggcttgg gactgtagag 2940 atgttctggt ggggaaactg aggcccagag gacagaagtg gattgctata agtcacagct 3000 cgtcagtggg ggggttgggg tcaacgcaga cattttaaca tcccaggctg tgtttatcca 3060 ctatcggaac tgcctttctt aatcagggag gattttagag acagggccag gggtcaggaa 3120 gtaaagccag tgctaccccc agggtgtgtg tattagagag ggagaggagg aaggaaggga 3180 ggaacacaga gagagcttgt gtgtcagggg caccatttca acccgagttc ccagtgctgg 3240 aacagcatca cactgggaaa cgttccattt tctctctgga gctggtgtgc ttgacctctc 3300 tggagcaaac gcctttccgg atactccctg tgacacgcac tgtctatgct ggccagagag 3360 caggctttca ctcctgtggg ctgctgaggc caggtctcca aggcctgtgt gggcgagggg 3420 tgcacagccc cgtctggctt gaatgctcag gcagcacctt gtctggagaa gcaatgtctt 3480 cccaatagtg acagaggctc tacctgcctc ttattaggta ttgatgtgtc aatgtcatgg 3540 caggcaggtg actagggcag ggttggggcc gtgctggctc ctggttctgg ctcatgggga 3600 cctcaggagc cctctctcca gctgactgag gcctcgcctg cacgcctggc cgtcccagcc 3660 cattggtacc ggatttctct acagctgggg attgggtagg tcctggagct gcccagaaac 3720 tccagggaac tgtcattctc cttccttgga actggacaac cttggagagg ggctctggga 3780 ggcccagaac ctctggcagg agctgggtag tgcctggggt tgagggtggg tcttcccatt 3840 cactgagtgc cttgatgtcc ttgctcctta gcttcccaaa ttccctccgg aacttactga 3900 gctccttcta agctttgcct tggcctgaac tggttctggg gaaaaacaaa aaaacaaaaa 3960 acaacttgtg gagctgcttg ttaatgagtt tcataaccag gcagcaagag ccagctccaa 4020 gcctcaagcc cactgtctac tccctgccct gcgggagcct ctggccagtc tgctgcctcc 4080 cacccttcct ccctgcctct cttcaccaca gggtagccag aaacttaaac ttttttcttc 4140 aaacactgaa gtctctcccc gcccccagct cgcgcgtgcc atagattaga tctctccggg 4200 gataggcgca gggacacccg ccggctccca ttggcggaag gggtgcgtgt gcgtgtgtgt 4260 gtgtgtgtgt gtgtgtacac gcgaggggtg tgtgtgagga ggtggggccg ggggcgcggg 4320 ggaggccggc attgttgcgc tggggcagct gccgtggagg acagacaatg gagcagctgt 4380 cctgccctgg caccctgcat accagctgtc cactcttatc tgcacacaca ctttctggga 4440 tattaagagg tggagctttg tgcacagaat tgggaagtgg gggaggagga gggggaagac 4500 ttctgaccct ctcttagaag aaaaggggat agggtggggg tgggggcttc cgagagccct 4560 tttgtccttg agcccctgtg ttaagaagaa tgctcatccc cagggctgag tcaagtccca 4620 ggctactagg caggggggtc agtcctccac aacctgggaa gattaactca gctgggattt 4680 gctgactgaa gccggcgagt tgtgtcctgg ccccaagggc ggcagccctg ttgggacgta 4740 cttggcgtgg ggcttgaccc tgtttttcct ttgcttgtag cgatctgcct gcctggatgt 4800 gatgagcagc atggattttg tgacaaacca ggggaatgca agtaagtctg cacaaggtgg 4860 tgttttgttt tgttgccttt tcttgttatc ttttcacagc tggtgtattt gtaaaaacag 4920 ccctaggtga tcattcgaaa aactccagta agattgattg aacagggggc cgttttctca 4980 tgtttctact taatcaatgt ttggcagcat gtaaggtcat ggagttgtca ttcgtctaag 5040 ccccttaacg gctatgagaa tttacagata gtagtttaaa aagagttggc acaggaaatg 5100 atagtatagt tcaatggttc tcaaatgttg cctcatccta gaatcactca gggagtgatt 5160 tttgagatgc tgacactggt gctgccctaa cacccaagaa gccagaacct ctggtggggc 5220 ccaggcccag gctgcagctc ccaaggtgac ccagtgttct gctaatctgg agaaccagag 5280 gctcactggt gctgcgggaa gatggtttct agggtgagaa tgtccactgc aaagccagca 5340 acagtcaacg tccatctgag tcttctgctt ttctccaagg tgcagagtgg gctggcaggg 5400 ccggtactgt gacgagtgta tccgctatcc aggctgtctc catggcacct gccagcagcc 5460 ctggcagtgc aactgccagg aaggctgggg gggccttttc tgcaaccagg gtaagccttc 5520 tctccctgag gcagcctgct ccctccagag cagccctgga cttccctggc tgtttgatca 5580 ctggaaaaat aaagtcttcc tgcatttgat gtcgagcttc ctatctccta cttttcctgt 5640 ccccaccctt cacagacctg aactactgca cacaccataa gccctgcaag aatggagcca 5700 cctgcaccaa cacgggccag gggagctaca cttgctcttg ccggcctggg tacacaggtg 5760 ccacctgcga gctggggatt gacgagtgtg accccagccc ttgtaagaac ggagggagct 5820 gcacggtgag tcggaggctc catggcatct cacccggaag ctggggtgcc ctggtgttga 5880 atggagtgtg tgggctcctt ggagcaactt tggaaagcct tttctgacct ctccatcgtg 5940 taggatctcg agaacagcta ctcctgtacc tgcccacccg gcttctacgg caaaatctgt 6000 gaattgagtg ccatgacctg tgcggacggc ccttgcttta acgggggtcg gtgctcagac 6060 agccccgatg gagggtacag ctgccgctgc cccgtgggct actccggctt caactgtgag 6120 aagaaaattg actactgcag ctcttcaccc tgttctaatg gtaagggggc agctggtgat 6180 tgctcagaga ctcgggcgag cggtcaatac tgaggtggca ttaaaaacaa gcatttgtga 6240 gtgacctcga gtttatgaat cacttttatc cagaccgcca ggaattctcg atggaaactc 6300 tatctttgag tctggaaagg cctggggaat gagagaggcc agggcatttg ttatgaagtt 6360 ctctgtggaa acctagacca agcagtgaat gacttgctca gggccacaag gtgcttcggg 6420 cacctgcggc cgcctgaggt tcagtaagtg atgcccacag gtgccggcca ctccagcttg 6480 ggaggatggc ccagctgtgt ggccacccag cacagtagtt gggggtgtcc ctgagtgagg 6540 acagagagcc tcctgctagc agcgaggggc tggctgccca aaggagacac acagcaagga 6600 gagctgggcc ccagatgtgc cggagcattc cggaatggtc atccttcccc tccctccctc 6660 ccctgttgtc agtgcctgct cctctcactt gctgtgtaac tgtgggcaag gacaccctcg 6720 ttaagcctca gtttccccat ctgaaacctg ggtcgagtgg cacatgctct tgcccggctg 6780 ttgtggcgac taatgcagcc accagagtgt tctgcacagc gcctgtccag atgctggccg 6840 tgtggtttct gacttgtaga gctagacctg gacacctctc gtatttgagg tcctaaacca 6900 tgtcaccttg cgctgtggac tcattcaggc cacagactgt ctttggtttg tctggtttct 6960 acagtgtcag acagatagat gcttcagagt gactttttgg tgaacaaacc tacgaggaga 7020 cacgtgatgt tcatgtccct gtgttccagg tgccaagtgt gtggacctcg gtgatgccta 7080 cctgtgccgc tgccaggccg gcttctcggg gaggcactgt gacgacaacg tggacgactg 7140 cgcctcctcc ccgtgcgcca acgggggcac ctgccgggat ggcgtgaacg acttctcctg 7200 cacctgcccg cctggctaca cgggcaggaa ctgcagtgcc cccgtcagca ggtgcgagca 7260 cgcaccctgc cacaatgggg ccacctgcca cgagaggggc caccgctatg tgtgcgagtg 7320 tgcccgaggc tacgggggtc ccaactgcca gttcctgctc cccgagctgc ccccgggccc 7380 agcggtggtg gacctcactg agaagctaga gggccagggc gggccattcc cctgggtggc 7440 cgtgtgcgcc ggggtcatcc ttgtcctcat gctgctgctg ggctgtgccg ctgtggtggt 7500 ctgcgtccgg ctgaggctgc agaagcaccg gcccccagcc gacccctgcc ggggggagac 7560 ggagaccatg aacaacctgg ccaactgcca gcgtgagaag gacatctcag tcagcatcat 7620 cggggccacg cagatcaaga acaccaacaa gaaggcggac ttccacgggg accacagcgc 7680 cgacaagaat ggcttcaagg cccgctaccc agcggtggac tataacctcg tgcaggacct 7740 caagggtgac gacaccgccg tcagggacgc gcacagcaag cgtgacacca agtgccagcc 7800 ccagggctcc tcaggggagg agaaggggac cccgaccaca ctcagggggt gcgtgctgcg 7860 ggccgggcat caggaggggg tacctggggg gtgtcttcct ggaaccactg ctccgtttct 7920 cttcccaaat gttctcatgc attcattgtg gattttctct attttccttt tagtggagaa 7980 gcatctgaaa gaaaaaggcc ggactcgggc tgttcaactt caaaagacac caagtaccag 8040 tcggtgtacg tcatatccga ggagaaggat gagtgcgtca tagcaactga ggtcagtgca 8100 ggcagcagcc gctccctcct cctcggcatg ggagcacctg aagctggagc acgggaatcg 8160 gtctcaggct aacttcccat ttgtcttgtg gccccccagg tgtaaaatgg aagtgagatg 8220 gcaagactcc cgtttctctt aaaataagta aaattccaag gatatatgcc ccaacgaatg 8280 ctgctgaaga ggagggaggc ctcgtggact gctgctgaga aaccgagttc agaccgagca 8340 ggttctcctc ctgaggtcct cgacgcctgc cgacagcctg tcgcggcccg gccgcctgcg 8400 gcactgcctt ccgtgacgtc gccgttgcac tatggacagt tgctcttaag agaatatata 8460 tttaaatggg tgaactgaat tacgcataag aagcatgcac tgcctgagtg tatattttgg 8520 attcttatga gccagtcttt tcttgaatta gaaacacaaa cactgccttt attgtccttt 8580 ttgatacgaa gatgtgcttt ttctagatgg aaaagatgtg tgttattttt tggatttgta 8640 aaaatatttt tcatgatatc tgtaaagctt gagtattttg tgatgttcgt tttttataat 8700 ttaaattttg gtaaatatgt acaaaggcac ttcgggtcta tgtgactata tttttttgta 8760 tataaatgta tttatggaat attgtgcaaa tgttatttga gttttttact gttttgttaa 8820 tgaagaaatt cctttttaaa atatttttcc aaaataaatt ttatgaatga caa 8873 <210> 2 <211> 3779 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 actgaccatt tggcgatcca ttgagaggag ggtttggaaa agtggctcct ttgtgacagc 60 tctcgccaga ttggggggct gctgatttgc atctcattag ccatgcgggc ggccggctga 120 atataagggc ggcaggcgcc ggcgagagcc agatcctctg cgcgcacccg cggagacccg 180 acccggccga gggcagagcg caggggaacc cgggcagccg cggcgcagag cctcctccca 240 cggcccggcc cctccggtcc tgcgcgtgtg tactggatgg cattggctgg attcatcgga 300 aagacgcgga tctttgctgt gacaccggag atcggagccc ggagtgctcc cggaacgacc 360 gccgccgccg agtgacaccg ggccgcgatc cgcaggggcc gccgcgcaca cccgccgccg 420 ccgaccgtcc cctcagcgcg cgccgctggc cccggattat cgccttgccc gtgggatttc 480 cagaccgcgg ctttctaatc ggctcgggag gaagctctgc agctctcttg ggaattaagc 540 tcaatctctg gactctctct ctttctcttt ctccccctcc ctctcctgcg aagaagctca 600 agacaaaacc aggaagccgg cgaccctcac ctcctcgggg gctgggagga aggaggaaaa 660 cgaaagtcgc cgccgccgcg ctgtcccccg agagctgcct ttcctcgggc atccctgggg 720 ctgccgcggg acctcgcagg gcggatataa agaaccgcgg ccttgggaag aggcggagac 780 cggcttttaa agaaagaagt cctgggtcct gcggtctggg gcgaggcaag ggcgcttttc 840 tgcccacgct ccccgtggcc catcgatccc ccgcgcgtcc gccgctgttc taaggagaga 900 agtgggggcc ccccaggctc gcgcgtggag cgaagcagca tgggcagtcg gtgcgcgctg 960 gccctggcgg tgctctcggc cttgctgtgt caggtctgga gctctggggt gttcgaactg 1020 aagctgcagg agttcgtcaa caagaagggg ctgctgggga accgcaactg ctgccgcggg 1080 ggcgcggggc caccgccgtg cgcctgccgg accttcttcc gcgtgtgcct caagcactac 1140 caggccagcg tgtcccccga gccgccctgc acctacggca gcgccgtcac ccccgtgctg 1200 ggcgtcgact ccttcagtct gcccgacggc gggggcgccg actccgcgtt cagcaacccc 1260 atccgcttcc ccttcggctt cacctggccg ggcaccttct ctctgattat tgaagctctc 1320 cacacagatt ctcctgatga cctcgcaaca gaaaacccag aaagactcat cagccgcctg 1380 gccacccaga ggcacctgac ggtgggcgag gagtggtccc aggacctgca cagcagcggc 1440 cgcacggacc tcaagtactc ctaccgcttc gtgtgtgacg aacactacta cggagagggc 1500 tgctccgttt tctgccgtcc ccgggacgat gccttcggcc acttcacctg tggggagcgt 1560 ggggagaaag tgtgcaaccc tggctggaaa gggccctact gcacagagcc gatctgcctg 1620 cctggatgtg atgagcagca tggattttgt gacaaaccag gggaatgcaa gtgcagagtg 1680 ggctggcagg gccggtactg tgacgagtgt atccgctatc caggctgtct ccatggcacc 1740 tgccagcagc cctggcagtg caactgccag gaaggctggg ggggcctttt ctgcaaccag 1800 gacctgaact actgcacaca ccataagccc tgcaagaatg gagccacctg caccaacacg 1860 ggccagggga gctacacttg ctcttgccgg cctgggtaca caggtgccac ctgcgagctg 1920 gggattgacg agtgtgaccc cagcccttgt aagaacggag ggagctgcac ggatctcgag 1980 aacagctact cctgtacctg cccacccggc ttctacggca aaatctgtga attgagtgcc 2040 atgacctgtg cggacggccc ttgctttaac gggggtcggt gctcagacag ccccgatgga 2100 gggtacagct gccgctgccc cgtgggctac tccggcttca actgtgagaa gaaaattgac 2160 tactgcagct cttcaccctg ttctaatggt gccaagtgtg tggacctcgg tgatgcctac 2220 ctgtgccgct gccaggccgg cttctcgggg aggcactgtg acgacaacgt ggacgactgc 2280 gcctcctccc cgtgcgccaa cgggggcacc tgccgggatg gcgtgaacga cttctcctgc 2340 acctgcccgc ctggctacac gggcaggaac tgcagtgccc ccgtcagcag gtgcgagcac 2400 gcaccctgcc acaatggggc cacctgccac gagaggggcc accgctatgt gtgcgagtgt 2460 gcccgaggct acgggggtcc caactgccag ttcctgctcc ccgagctgcc cccgggccca 2520 gcggtggtgg acctcactga gaagctagag ggccagggcg ggccattccc ctgggtggcc 2580 gtgtgcgccg gggtcatcct tgtcctcatg ctgctgctgg gctgtgccgc tgtggtggtc 2640 tgcgtccggc tgaggctgca gaagcaccgg cccccagccg acccctgccg gggggagacg 2700 gagaccatga acaacctggc caactgccag cgtgagaagg acatctcagt cagcatcatc 2760 ggggccacgc agatcaagaa caccaacaag aaggcggact tccacgggga ccacagcgcc 2820 gacaagaatg gcttcaaggc ccgctaccca gcggtggact ataacctcgt gcaggacctc 2880 aagggtgacg acaccgccgt cagggacgcg cacagcaagc gtgacaccaa gtgccagccc 2940 cagggctcct caggggagga gaaggggacc ccgaccacac tcaggggtgg agaagcatct 3000 gaaagaaaaa ggccggactc gggctgttca acttcaaaag acaccaagta ccagtcggtg 3060 tacgtcatat ccgaggagaa ggatgagtgc gtcatagcaa ctgaggtgta aaatggaagt 3120 gagatggcaa gactcccgtt tctcttaaaa taagtaaaat tccaaggata tatgccccaa 3180 cgaatgctgc tgaagaggag ggaggcctcg tggactgctg ctgagaaacc gagttcagac 3240 cgagcaggtt ctcctcctga ggtcctcgac gcctgccgac agcctgtcgc ggcccggccg 3300 cctgcggcac tgccttccgt gacgtcgccg ttgcactatg gacagttgct cttaagagaa 3360 tatatattta aatgggtgaa ctgaattacg cataagaagc atgcactgcc tgagtgtata 3420 ttttggattc ttatgagcca gtcttttctt gaattagaaa cacaaacact gcctttattg 3480 tcctttttga tacgaagatg tgctttttct agatggaaaa gatgtgtgtt attttttgga 3540 tttgtaaaaa tatttttcat gatatctgta aagcttgagt attttgtgat gttcgttttt 3600 tataatttaa attttggtaa atatgtacaa aggcacttcg ggtctatgtg actatatttt 3660 tttgtatata aatgtattta tggaatattg tgcaaatgtt atttgagttt tttactgttt 3720 tgttaatgaa gaaattcctt tttaaaatat ttttccaaaa taaattttat gaatgacaa 3779 <210> 3 <211> 2172 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgggcagtc ggtgcgcgct ggccctggcg gtgctctcgg ccttgctgtg tcaggtctgg 60 agctctgggg tgttcgaact gaagctgcag gagttcgtca acaagaaggg gctgctgggg 120 aaccgcaact gctgccgcgg gggcgcgggg ccaccgccgt gcgcctgccg gaccttcttc 180 cgcgtgtgcc tcaagcacta ccaggccagc gtgtcccccg agccgccctg cacctacggc 240 agcgccgtca cccccgtgct gggcgtcgac tccttcagtc tgcccgacgg cgggggcgcc 300 gactccgcgt tcagcaaccc catccgcttc cccttcggct tcacctggcc gggcaccttc 360 tctctgatta ttgaagctct ccacacagat tctcctgatg acctcgcaac agaaaaccca 420 gaaagactca tcagccgcct ggccacccag aggcacctga cggtgggcga ggagtggtcc 480 caggacctgc acagcagcgg ccgcacggac ctcaagtact cctaccgctt cgtgtgtgac 540 gaacactact acggagaggg ctgctccgtt ttctgccgtc cccgggacga tgccttcggc 600 cacttcacct gtggggagcg tggggagaaa gtgtgcaacc ctggctggaa agggccctac 660 tgcacagagc cgatctgcct gcctggatgt gatgagcagc atggattttg tgacaaacca 720 ggggaatgca agtgcagagt gggctggcag ggccggtact gtgacgagtg tatccgctat 780 ccaggctgtc tccatggcac ctgccagcag ccctggcagt gcaactgcca ggaaggctgg 840 gggggccttt tctgcaacca ggacctgaac tactgcacac accataagcc ctgcaagaat 900 ggagccacct gcaccaacac gggccagggg agctacactt gctcttgccg gcctgggtac 960 acaggtgcca cctgcgagct ggggattgac gagtgtgacc ccagcccttg taagaacgga 1020 gggagctgca cggatctcga gaacagctac tcctgtacct gcccacccgg cttctacggc 1080 aaaatctgtg aattgagtgc catgacctgt gcggacggcc cttgctttaa cgggggtcgg 1140 tgctcagaca gccccgatgg agggtacagc tgccgctgcc ccgtgggcta ctccggcttc 1200 aactgtgaga agaaaattga ctactgcagc tcttcaccct gttctaatgg tgccaagtgt 1260 gtggacctcg gtgatgccta cctgtgccgc tgccaggccg gcttctcggg gaggcactgt 1320 gacgacaacg tggacgactg cgcctcctcc ccgtgcgcca acgggggcac ctgccgggat 1380 ggcgtgaacg acttctcctg cacctgcccg cctggctaca cgggcaggaa ctgcagtgcc 1440 cccgtcagca ggtgcgagca cgcaccctgc cacaatgggg ccacctgcca cgagaggggc 1500 caccgctatg tgtgcgagtg tgcccgaggc tacgggggtc ccaactgcca gttcctgctc 1560 cccgagctgc ccccgggccc agcggtggtg gacctcactg agaagctaga gggccagggc 1620 gggccattcc cctgggtggc cgtgtgcgcc ggggtcatcc ttgtcctcat gctgctgctg 1680 ggctgtgccg ctgtggtggt ctgcgtccgg ctgaggctgc agaagcaccg gcccccagcc 1740 gacccctgcc ggggggagac ggagaccatg aacaacctgg ccaactgcca gcgtgagaag 1800 gacatctcag tcagcatcat cggggccacg cagatcaaga acaccaacaa gaaggcggac 1860 ttccacgggg accacagcgc cgacaagaat ggcttcaagg cccgctaccc agcggtggac 1920 tataacctcg tgcaggacct caagggtgac gacaccgccg tcagggacgc gcacagcaag 1980 cgtgacacca agtgccagcc ccagggctcc tcaggggagg agaaggggac cccgaccaca 2040 ctcaggggtg gagaagcatc tgaaagaaaa aggccggact cgggctgttc aacttcaaaa 2100 gacaccaagt accagtcggt gtacgtcata tccgaggaga aggatgagtg cgtcatagca 2160 actgaggtgt aa 2172 <210> 4 <211> 723 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Gly Ser Arg Cys Ala Leu Ala Leu Ala Val Leu Ser Ala Leu Leu 1 5 10 15 Cys Gln Val Trp Ser Ser Gly Val Phe Glu Leu Lys Leu Gln Glu Phe 20 25 30 Val Asn Lys Lys Gly Leu Leu Gly Asn Arg Asn Cys Cys Arg Gly Gly 35 40 45 Ala Gly Pro Pro Pro Cys Ala Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu 50 55 60 Lys His Tyr Gln Ala Ser Val Ser Pro Glu Pro Pro Cys Thr Tyr Gly 65 70 75 80 Ser Ala Val Thr Pro Val Leu Gly Val Asp Ser Phe Ser Leu Pro Asp 85 90 95 Gly Gly Gly Ala Asp Ser Ala Phe Ser Asn Pro Ile Arg Phe Pro Phe 100 105 110 Gly Phe Thr Trp Pro Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Leu His 115 120 125 Thr Asp Ser Pro Asp Asp Leu Ala Thr Glu Asn Pro Glu Arg Leu Ile 130 135 140 Ser Arg Leu Ala Thr Gln Arg His Leu Thr Val Gly Glu Glu Trp Ser 145 150 155 160 Gln Asp Leu His Ser Ser Gly Arg Thr Asp Leu Lys Tyr Ser Tyr Arg 165 170 175 Phe Val Cys Asp Glu His Tyr Tyr Gly Glu Gly Cys Ser Val Phe Cys 180 185 190 Arg Pro Arg Asp Asp Ala Phe Gly His Phe Thr Cys Gly Glu Arg Gly 195 200 205 Glu Lys Val Cys Asn Pro Gly Trp Lys Gly Pro Tyr Cys Thr Glu Pro 210 215 220 Ile Cys Leu Pro Gly Cys Asp Glu Gln His Gly Phe Cys Asp Lys Pro 225 230 235 240 Gly Glu Cys Lys Cys Arg Val Gly Trp Gln Gly Arg Tyr Cys Asp Glu 245 250 255 Cys Ile Arg Tyr Pro Gly Cys Leu His Gly Thr Cys Gln Gln Pro Trp 260 265 270 Gln Cys Asn Cys Gln Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asn Gln Asp 275 280 285 Leu Asn Tyr Cys Thr His His Lys Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys 290 295 300 Thr Asn Thr Gly Gln Gly Ser Tyr Thr Cys Ser Cys Arg Pro Gly Tyr 305 310 315 320 Thr Gly Ala Thr Cys Glu Leu Gly Ile Asp Glu Cys Asp Pro Ser Pro 325 330 335 Cys Lys Asn Gly Gly Ser Cys Thr Asp Leu Glu Asn Ser Tyr Ser Cys 340 345 350 Thr Cys Pro Pro Gly Phe Tyr Gly Lys Ile Cys Glu Leu Ser Ala Met 355 360 365 Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly Arg Cys Ser Asp Ser 370 375 380 Pro Asp Gly Gly Tyr Ser Cys Arg Cys Pro Val Gly Tyr Ser Gly Phe 385 390 395 400 Asn Cys Glu Lys Lys Ile Asp Tyr Cys Ser Ser Ser Pro Cys Ser Asn 405 410 415 Gly Ala Lys Cys Val Asp Leu Gly Asp Ala Tyr Leu Cys Arg Cys Gln 420 425 430 Ala Gly Phe Ser Gly Arg His Cys Asp Asp Asn Val Asp Asp Cys Ala 435 440 445 Ser Ser Pro Cys Ala Asn Gly Gly Thr Cys Arg Asp Gly Val Asn Asp 450 455 460 Phe Ser Cys Thr Cys Pro Pro Gly Tyr Thr Gly Arg Asn Cys Ser Ala 465 470 475 480 Pro Val Ser Arg Cys Glu His Ala Pro Cys His Asn Gly Ala Thr Cys 485 490 495 His Glu Arg Gly His Arg Tyr Val Cys Glu Cys Ala Arg Gly Tyr Gly 500 505 510 Gly Pro Asn Cys Gln Phe Leu Leu Pro Glu Leu Pro Pro Gly Pro Ala 515 520 525 Val Val Asp Leu Thr Glu Lys Leu Glu Gly Gln Gly Gly Pro Phe Pro 530 535 540 Trp Val Ala Val Cys Ala Gly Val Ile Leu Val Leu Met Leu Leu Leu 545 550 555 560 Gly Cys Ala Ala Val Val Val Cys Val Arg Leu Arg Leu Gln Lys His 565 570 575 Arg Pro Pro Ala Asp Pro Cys Arg Gly Glu Thr Glu Thr Met Asn Asn 580 585 590 Leu Ala Asn Cys Gln Arg Glu Lys Asp Ile Ser Val Ser Ile Ile Gly 595 600 605 Ala Thr Gln Ile Lys Asn Thr Asn Lys Lys Ala Asp Phe His Gly Asp 610 615 620 His Ser Ala Asp Lys Asn Gly Phe Lys Ala Arg Tyr Pro Ala Val Asp 625 630 635 640 Tyr Asn Leu Val Gln Asp Leu Lys Gly Asp Asp Thr Ala Val Arg Asp 645 650 655 Ala His Ser Lys Arg Asp Thr Lys Cys Gln Pro Gln Gly Ser Ser Gly 660 665 670 Glu Glu Lys Gly Thr Pro Thr Thr Leu Arg Gly Gly Glu Ala Ser Glu 675 680 685 Arg Lys Arg Pro Asp Ser Gly Cys Ser Thr Ser Lys Asp Thr Lys Tyr 690 695 700 Gln Ser Val Tyr Val Ile Ser Glu Glu Lys Asp Glu Cys Val Ile Ala 705 710 715 720 Thr Glu Val <210> 5 <211> 536 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Gly Ser Arg Cys Ala Leu Ala Leu Ala Val Leu Ser Ala Leu Leu 1 5 10 15 Cys Gln Val Trp Ser Ser Gly Val Phe Glu Leu Lys Leu Gln Glu Phe 20 25 30 Val Asn Lys Lys Gly Leu Leu Gly Asn Arg Asn Cys Cys Arg Gly Gly 35 40 45 Ala Gly Pro Pro Pro Cys Ala Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu 50 55 60 Lys His Tyr Gln Ala Ser Val Ser Pro Glu Pro Pro Cys Thr Tyr Gly 65 70 75 80 Ser Ala Val Thr Pro Val Leu Gly Val Asp Ser Phe Ser Leu Pro Asp 85 90 95 Gly Gly Gly Ala Asp Ser Ala Phe Ser Asn Pro Ile Arg Phe Pro Phe 100 105 110 Gly Phe Thr Trp Pro Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Leu His 115 120 125 Thr Asp Ser Pro Asp Asp Leu Ala Thr Glu Asn Pro Glu Arg Leu Ile 130 135 140 Ser Arg Leu Ala Thr Gln Arg His Leu Thr Val Gly Glu Glu Trp Ser 145 150 155 160 Gln Asp Leu His Ser Ser Gly Arg Thr Asp Leu Lys Tyr Ser Tyr Arg 165 170 175 Phe Val Cys Asp Glu His Tyr Tyr Gly Glu Gly Cys Ser Val Phe Cys 180 185 190 Arg Pro Arg Asp Asp Ala Phe Gly His Phe Thr Cys Gly Glu Arg Gly 195 200 205 Glu Lys Val Cys Asn Pro Gly Trp Lys Gly Pro Tyr Cys Thr Glu Pro 210 215 220 Ile Cys Leu Pro Gly Cys Asp Glu Gln His Gly Phe Cys Asp Lys Pro 225 230 235 240 Gly Glu Cys Lys Cys Arg Val Gly Trp Gln Gly Arg Tyr Cys Asp Glu 245 250 255 Cys Ile Arg Tyr Pro Gly Cys Leu His Gly Thr Cys Gln Gln Pro Trp 260 265 270 Gln Cys Asn Cys Gln Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asn Gln Asp 275 280 285 Leu Asn Tyr Cys Thr His His Lys Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys 290 295 300 Thr Asn Thr Gly Gln Gly Ser Tyr Thr Cys Ser Cys Arg Pro Gly Tyr 305 310 315 320 Thr Gly Ala Thr Cys Glu Leu Gly Ile Asp Glu Cys Asp Pro Ser Pro 325 330 335 Cys Lys Asn Gly Gly Ser Cys Thr Asp Leu Glu Asn Ser Tyr Ser Cys 340 345 350 Thr Cys Pro Pro Gly Phe Tyr Gly Lys Ile Cys Glu Leu Ser Ala Met 355 360 365 Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly Arg Cys Ser Asp Ser 370 375 380 Pro Asp Gly Gly Tyr Ser Cys Arg Cys Pro Val Gly Tyr Ser Gly Phe 385 390 395 400 Asn Cys Glu Lys Lys Ile Asp Tyr Cys Ser Ser Ser Pro Cys Ser Asn 405 410 415 Gly Ala Lys Cys Val Asp Leu Gly Asp Ala Tyr Leu Cys Arg Cys Gln 420 425 430 Ala Gly Phe Ser Gly Arg His Cys Asp Asp Asn Val Asp Asp Cys Ala 435 440 445 Ser Ser Pro Cys Ala Asn Gly Gly Thr Cys Arg Asp Gly Val Asn Asp 450 455 460 Phe Ser Cys Thr Cys Pro Pro Gly Tyr Thr Gly Arg Asn Cys Ser Ala 465 470 475 480 Pro Val Ser Arg Cys Glu His Ala Pro Cys His Asn Gly Ala Thr Cys 485 490 495 His Glu Arg Gly His Arg Tyr Val Cys Glu Cys Ala Arg Gly Tyr Gly 500 505 510 Gly Pro Asn Cys Gln Phe Leu Leu Pro Glu Leu Pro Pro Gly Pro Ala 515 520 525 Val Val Asp Leu Thr Glu Lys Leu 530 535 <210> 6 <211> 9734 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 agtagcggcg ctgcgcgcag gccgggaaca cgaggccaag agccgcagcc ccagccgcct 60 tggtgcagcg tacaccggca ctagcccgct tgcagcccca ggattagaca gaagacgcgt 120 cctcggcgcg gtcgccgccc agccgtagtc acctggatta cctacagcgg cagctgcagc 180 ggagccagcg agaaggccaa aggggagcag cgtcccgaga ggagcgcctc ttttcaggga 240 ccccgccggc tggcggacgc gcgggaaagc ggcgtcgcga acagagccag attgagggcc 300 cgcgggtgga gagagcgacg cccgagggga tggcggcagc gtcccggagc gcctctggct 360 gggcgctact gctgctggtg gcactttggc agcaggtaac acgtcccgcg ccctctccgt 420 cccctctgcc gcgctctggg cctcagcccc gggcaccagc tgagctgacc ggtcccctcc 480 ctccttccct cggtccctgt gcaatagcgc gcggccggct ccggcgtctt ccagctgcag 540 ctgcaggagt tcatcaacga gcgcggcgta ctggccagtg ggcggccttg cgagcccggc 600 tgccggactt tcttccgcgt ctgccttaag cacttccagg cggtcgtctc gcccggaccc 660 tgcaccttcg ggaccgtctc cacgccggta ttgggcacca actccttcgc tgtccgggac 720 gacagtagcg gcggggggcg caaccctctc caactgccct tcaatttcac ctggccggtg 780 agcacagcct gggcgcactg ggaggtcgca gaagccgaga gaggaggcgc cctgggacca 840 aagccccctc cccagatttc cttgtacaca cacccccacc cccaaaaagc ccaggatgca 900 ttctttcctg gctcttcccg actctctcct gagactgatc ccagaaaagg ctctcaccag 960 tctccgtctt cccagtttat gtcctcccgt ccccagctct tgggacacga ttttcattac 1020 ctaccactct ggggcggtac cctaccaccc cctcctccag tggctctccc ttacactctc 1080 ccgtctctca accctccctc taccgggggt tctcctctcg ccttccctgc tcaagcgcta 1140 cactgtgcac agccccgtta tgttgacccg ggcgcagtaa ctgaatcctg caattagatt 1200 aattaaacag gctgccgcaa ggcaccccca cctctccccg cttgctcatc tcgccatctc 1260 tccgtccccc cacccccttt cccagggtac cttctcgctc atcatcgaag cttggcacgc 1320 gccaggagac gacctgcggc caggtgagta gctcgctccg ccaccacagg ggggcgacac 1380 ggcgcagcgc cgaaagagtt aatctgttct aggcggggga agtgcgggct tgggggtggg 1440 aggcaggacg cttagcttgg cctggagctg cgccccgcgc tggacgctcg gattccgctc 1500 gctgcctgga ctcagagcac aattgcgttt cctgcgggtt atttttggcg tgggaacgcg 1560 gggagtacgg cggtgagaaa ggctgaagct gccagcgccg ctgacgggcc ccttcctgta 1620 ttttacacct ttcgcgaatt ccgctccttt ggaaagggaa taatggcttt gggatgttgt 1680 tctgacacag aggaaaagga tatttcagca gcacaacaat tctcactttg aaaaggaaaa 1740 aagaaaacca ttacccacct ctggaggcag aacccctgaa tgggcaccaa aggaccccct 1800 gctcccaggg tcctctctag cctggggagc ttttctttct ttttctcttt tttccatttt 1860 gacctctttt cctctttccc ctccctatct gcctccaaga ccctgggata tcttaacatc 1920 cttctattgt cccctttttg aatactatca ggccccctgc acatgcacac acgtagggca 1980 gctacgtagc ggggctttgg gtccctctgg cctgttcttg ctggcaggcg ggggtcatct 2040 ggataactgg gctgattggt tggctgatca ccatcatcac agccaagaag gacattggcc 2100 agccgtcact ggcacccttg gggactggcg acccttccct gacccgaccc tctgccccct 2160 cagaggcctt gccaccagat gcactcatca gcaagatcgc catccagggc tccctagctg 2220 tgggtcagaa ctggttattg gatgagcaaa ccagcaccct cacaaggctg cgctactctt 2280 accgggtcat ctgcagtgac aactactatg gagacaactg ctcccgcctg tgcaagaagc 2340 gcaatgacca cttcggccac tatgtgtgcc agccagatgg caacttgtcc tgcctgcccg 2400 gttggactgg ggaatattgc caacagcgta agcagtcaag ctcccacctg tgtggaaggg 2460 gagggtcccc tgaggaaaca cagtggagct tcttggtcac agcttgcctc ccttgaagag 2520 tgggtctggg cctcctacta gctgggcctc agggatgctg agggtgggct tgacctcaga 2580 cctcctgtct cttcccagtg ctcctcccat catgccaaag cccacaagaa ccccatcatg 2640 acattccatc cagtttggct tctccttccc tgtgccatta tttcacttta agacactcgg 2700 ggctcctctg ggaggccagg agtaggaaga gggcccagga gagctagggg atccccaggg 2760 ccagcaggtg agaatggggc ttaagagtcc ttggtatccc agcctcaccc agctctgtgt 2820 tcttccctta gctatctgtc tttcgggctg tcatgaacag aatggctact gcagcaagcc 2880 agcagagtgc ctgtgagtag gggacaggaa gtggtgagtg ggagccctcc cttggccaag 2940 gcctctcacc tcactctgcc tctctcttgt tccccagctg ccgcccaggc tggcagggcc 3000 ggctgtgtaa cgaatgcatc ccccacaatg gctgtcgcca cggcacctgc agcactccct 3060 ggcaatgtac ttgtgatgag ggctggggag gcctgttttg tgaccaaggt gagtcagggt 3120 gaagagaggg tgcagagggt gcaagagata tggggctggg gggtggaaat ccgattcgtc 3180 acctggatcc ttcttacttg gtgactgcag acttggcttt cccatgatct tccaaggatc 3240 ttgggtcttt taaggatctt tacaactggc ccagaatgag gcggtgggtc cttctccagg 3300 tgcggcggca gggggtggtg gagccagggt ggctgaaaaa cccagggggg tgacaaggtc 3360 ggcagcctgg aggttgcact cataaatcct agcaaagcca aagagagagg gatggcaggc 3420 tcagttcctc tttcaacccc gtagttacct attaaccccc tgagtgtttg cttaccttcc 3480 agggctgttt gagcagctct cccctaaaca gctgtccggt ggggtgtgcc caccggccac 3540 ctgaggctgt gggtgagctg ggcctctggg cggagtggca tctaaccgac ttttcggtgt 3600 gggcacaaac ggcctcccct gctcttacct agttaccacc tgcctgaacc catgcggtct 3660 ctacctggtg tttaggggta gtcactctct ggctatacag gggcctttca gccccaacct 3720 tgggggagga ggaagccttt tttcttgcat cctgctagcc agctgcagcc agctgcagct 3780 cccattttca ggatcaaatg ggtgcacctg ctgcccagag acaccggcgc aggcctgggt 3840 agggtgggca gagagcttgc cagggtggaa agaaattgcc taggccctga cttgctgtca 3900 acaaggggct tgggattcag tccctgtgtt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 3960 ctgtcccttt actaccatcc ccaccccaac actcacacac ctggttcctg ctcattctct 4020 tccctctcca ccatatttgc tcccaggtga cacagtcata tactcatcat atgcaaacac 4080 agcacttgca ggccatatat ttactctgtc tggttctccc tccctgtcct tcccaaataa 4140 aaaaacaaat acttatattt caaaataccc ttgtaacacc tcttccttta aaaaatgccc 4200 gattactgcc tatggtggct ctcatctctc ctctaccatt tctacctgtt gaaattttat 4260 ccctccttcc aggcttatct cagctgcccc tcctccatga agccttttct gacttcctcc 4320 ccgacatgtg gccttgccct ctgctcttct tccttatctt catcctactt gggttggcag 4380 tttgtgagtt tccctggcag gacgtcttcc agttccagtt gtgttgtttc acttttggtt 4440 gactgcactg gtcatatgtg attcaaggtg ctttaagaaa catgattttc atcctggcta 4500 acacagtgaa accctgtctg tattaaaaat acaaaagtta gccaggtgtg gtggcaggca 4560 cctgtagccc cagctgctgg gaaggctgag gcaggagaat ggcgaagtag agcttgcagt 4620 gagccgaggt cgtgccactg cactccagcc tgagtgacag agcaagactc cgtctcaaaa 4680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagaaacatg attttaggct gggtgcgatg gcctgtaatc 4740 ccagcacttt gggaggccga ggtaggtgga tcacttgaag tcaggagttc gagaccatcc 4800 tggccatcct ggtgaaaccc ctgtaaaaat acaaatatta atcgggcaca gtggcgcatg 4860 cctgtaatcc cagctactta gaaggttgag gtatgagaat cgcttgaacc cggaaggcga 4920 aggttgtagt gagcctatat cacatcactg cactccagcc tgggcgacag agtgagactc 4980 tgttaaaaaa aaaaaaaaaa gaaggaaaga aagagaaaga gagagaaaga aagaaagaaa 5040 gagaaagaaa aaagatttta ttggtggtgg aggaaggatg tttgggcctg ggagactttg 5100 agttgaggtg tctttgagcc aaacatgggg gcaaacatgg actgcaagga gcctggaggt 5160 gagtgcattc cctggccctg ctcagctgct tggttcctgt ttctgcagat ctcaactact 5220 gcacccacca ctccccatgc aagaatgggg caacgtgctc caacagtggg cagcgaagct 5280 acacctgcac ctgtcgccca ggctacactg gtgtggactg tgagctggag ctcagcgagt 5340 gtgacagcaa cccctgtcgc aatggaggca gctgtaaggt gaggcccaga ccagcgcagg 5400 aagacagagg tgtcaggtgg tgtctgggca tccctaacct aggcagttag tggatgtaca 5460 gccatggaca ggcattgtgg gcaggtggag cccagccttc agtcacacat ccctgccccc 5520 cagggtctga ctttggcccc tttatggtct ctctccagga ccaggaggat ggctaccact 5580 gcctgtgtcc tccgggctac tatggcctgc attgtgaaca cagcaccttg agctgcgccg 5640 actccccctg cttcaatggg ggctcctgcc gggagcgcaa ccagggggcc aactatgctt 5700 gtgaatgtcc ccccaacttc accggctcca actgcgagaa gaaagtggac aggtgcacca 5760 gcaacccctg tgccaacggt gcgtgctgct gccctgctaa cctggtggac tggccctggg 5820 gctgagagag acttctggtg agggagggtc aggagaggag cgaggcattg tctgccactc 5880 tggcccccca tctgctctgg agggcgaaga gcttgcttga tcagctgggg ggctgtggaa 5940 gcggagctgg ttagttgcac gcaggcctta ggagcagggg tggtatgcac cctgcatagc 6000 ttccattcct attcccatgt cagaaccccg tcctggctgg ggtggcctct gaccctcccc 6060 aggaagtcct gagctggaga gagggatgtt ggaggcttca tgtttctcct caaaggaggc 6120 agtgattcag tcagagccct gctcctggag gcctcatctt gccccgtgcc caggtagagc 6180 atgaggtagc atgaggcatc ttgaatgttt gcaccttttg aggcacaaag cctgttggta 6240 atccttgtct atctggctcc caggtgaccc tctgtgaggc aggcaggcag gcagcgctca 6300 ggagctggag aggggtggga agggctgaga gggagtctgc tctctcactg aagcctctgg 6360 cactgccatt tcttcatcac tgaatgggaa actataatac ctgtcctctg tccttcatgt 6420 ggttgtgaag atgaagtaaa acagtcatga ttgtacttat ccgagcatta actatatacc 6480 aaacatgggc tcttgccttc atgtaccttc ccggctatcc tatgaagggg ctagcattct 6540 actccagtct aacaaatggg gaaactgagg cttagagaca cggttaagca gcaagtgcca 6600 gatctcaggc cacagagtga cagctgaggt cccaactcaa gcctatctgt ctgattctac 6660 gttaaagttc tgtaagatgc tagtcatttt tatacatgag cccactgagg ccgagagaat 6720 caaggtcatg ctaaactcca ggtctcctga ctctgtgcag ttctctttgt agtgggctct 6780 gcaggtggag gtagaagggc ccgaacgtgt tcctggaatg gggctcccac cccctgcccc 6840 agggagctcc caggctatca ctgacttgtg tctcatgcgt cctcacaggg ggacagtgcc 6900 tgaaccgagg tccaagccgc atgtgccgct gccgtcctgg attcacgggc acctactgtg 6960 aactccacgt cagcgactgt gcccgtaacc cttgcgccca cggtggcact tgccatgacc 7020 tggagaatgg gctcatgtgc acctgccctg ccggcttctc tggccgacgc tgtgaggtgc 7080 ggacatccat cgatgcctgt gcctcgagtc cctgcttcaa cagggccacc tgctacaccg 7140 acctctccac agacaccttt gtgtgcaact gcccttatgg ctttgtgggc agccgctgcg 7200 agttccccgt gggcttgccg cccagcttcc cctgggtggc cgtctcgctg ggtgtggggc 7260 tggcagtgct gctggtactg ctgggcatgg tggcagtggc tgtgcggcag ctgcggcttc 7320 gacggccgga cgacggcagc agggaagcca tgaacaactt gtcggacttc cagaaggaca 7380 acctgattcc tgccgcccag cttaaaaaca caaaccagaa gaaggagctg gaagtggact 7440 gtggcctgga caagtccaac tgtggcaaac agcaaaacca cacattggac tataatctgg 7500 ccccagggcc cctggggcgg gggaccatgc caggaaagtt tccccacagt gacaagagct 7560 taggagagaa ggcgccactg cggttacaca ggtgagtggc acccagaagc ccagggcctg 7620 gccaccggcc ccgacatggt tctgcctagg ctcctcttag gccaggcggg aagcagttaa 7680 gcagctgagg ttttgttact gacaggaaga tcctccagta ggatttctgt caggggtcct 7740 ttgtccttcc ctcccattca ttcatttgtt cattcacaca tgtcaagtgt ccctagggtg 7800 tctcttgtga cttccgtctt tccacagtgt ggcttgcctc tagtggcagc actggcttta 7860 tgcagggctc agacccttct ggtgaggttg ggaggcctgt gactctctta ggggcctttt 7920 cctaagtgcc cccctgcagc agcccagcac tgggcacgtc cagcccctgt gtcttcccca 7980 agaaccaccc tgcagatgcc ctttggctct ccagggtcct ccctcccccc aagcctctcc 8040 ccgtccctcc cttacacgcc tgtcttgtgt tccctcagtg aaaagccaga gtgtcggata 8100 tcagcgatat gctcccccag ggactccatg taccagtctg tgtgtttgat atcagaggag 8160 aggaatgaat gtgtcattgc cacggaggtg agtgctgggc tcgcctttcc ttctgccttt 8220 tgtgggaggg aaagtggcct ggtcactctt gacccatggg ccattcctga agggtaggtc 8280 agaaccctgc cttggcaggc caagttcagt ggactcttgg gtccctgctg gcctcattgc 8340 cactaagggt gtgaaacagg aaccatggcg gcaagcctgg tctggtcctt tcctgctgta 8400 ttggtgctgg gttgggcagc cacggcactg ctggccagcc tctgatgggt gagggggccc 8460 ctcacccctt gtgcccttcc tgccccttcc cactggcttc ctccattgac ctcatgagcg 8520 caagctccca ggcccgtgtg tgtgttgggc cgaagactgg ggaggactgc cccacctgcc 8580 cttagcccct gcctgcccca tcgccttctc ccagggaggc ccagggaggg cctggaggga 8640 gtgcgcatgc ccagggtaac ctgtttccct gccttccgct tgctcccagg tataaggcag 8700 gagcctacct ggacatccct gctcagcccc gcggctggac cttccttctg cattgtttac 8760 attgcatcct ggatgggacg tttttcatat gcaacgtgct gctctcagga ggaggaggga 8820 atggcaggaa ccggacagac tgtgaacttg ccaagagatg caataccctt ccacaccttt 8880 gggtgtctgt ctggcatcag attggcagct gcaccaacca gaggaacaga agagaagaga 8940 gatgccactg ggcactgccc tgccagtagt ggccttcagg gggctccttc cggggctccg 9000 gcctgttttc cagagagagt ggcagtagcc ccatggggcc cggagctgct gtggcctcca 9060 ctggcatccg tgtttccaaa agtgcctttg gcccaggctc cacggcgaca gttgggccca 9120 aatcagaaag gagagagggg gccaatgagg gcagggcctc ctgtgggctg gaaaaccact 9180 gggtgcgtct cttgctgggg tttgccctgg aggtgaggtg agtgctcgag ggaggggagt 9240 gctttctgcc ccatgcctcc aactactgta tgcaggcctg gctctctggt ctaggccctt 9300 tgggcaagaa tgtccgtcta cccggcttcc accaccctct ggccctgggc ttctgtaagc 9360 agacaggcag agggcctgcc cctcccacca gccaagggtg ccaggcctaa ctggggcact 9420 cagggcagtg tgttggaaat tccactgagg gggaaatcag gtgctgcggc cgcctgggcc 9480 ctttcctccc tcaagcccat ctccacaacc tcgagcctgg gctctggtcc actactgccc 9540 cagaccaccc tcaaagctgg tcttcagaaa tcaataatat gagtttttat tttgtttttt 9600 tttttttttt tgtagtttat tttggagtct agtatttcaa taatttaaga atcagaagca 9660 ctgacctttc tacattttat aacattattt tgtatataat gtgtatttat aatatgaaac 9720 agatgtgtac agga 9734 <210> 7 <211> 3426 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 agtagcggcg ctgcgcgcag gccgggaaca cgaggccaag agccgcagcc ccagccgcct 60 tggtgcagcg tacaccggca ctagcccgct tgcagcccca ggattagaca gaagacgcgt 120 cctcggcgcg gtcgccgccc agccgtagtc acctggatta cctacagcgg cagctgcagc 180 ggagccagcg agaaggccaa aggggagcag cgtcccgaga ggagcgcctc ttttcaggga 240 ccccgccggc tggcggacgc gcgggaaagc ggcgtcgcga acagagccag attgagggcc 300 cgcgggtgga gagagcgacg cccgagggga tggcggcagc gtcccggagc gcctctggct 360 gggcgctact gctgctggtg gcactttggc agcagcgcgc ggccggctcc ggcgtcttcc 420 agctgcagct gcaggagttc atcaacgagc gcggcgtact ggccagtggg cggccttgcg 480 agcccggctg ccggactttc ttccgcgtct gccttaagca cttccaggcg gtcgtctcgc 540 ccggaccctg caccttcggg accgtctcca cgccggtatt gggcaccaac tccttcgctg 600 tccgggacga cagtagcggc ggggggcgca accctctcca actgcccttc aatttcacct 660 ggccgggtac cttctcgctc atcatcgaag cttggcacgc gccaggagac gacctgcggc 720 cagaggcctt gccaccagat gcactcatca gcaagatcgc catccagggc tccctagctg 780 tgggtcagaa ctggttattg gatgagcaaa ccagcaccct cacaaggctg cgctactctt 840 accgggtcat ctgcagtgac aactactatg gagacaactg ctcccgcctg tgcaagaagc 900 gcaatgacca cttcggccac tatgtgtgcc agccagatgg caacttgtcc tgcctgcccg 960 gttggactgg ggaatattgc caacagccta tctgtctttc gggctgtcat gaacagaatg 1020 gctactgcag caagccagca gagtgcctct gccgcccagg ctggcagggc cggctgtgta 1080 acgaatgcat cccccacaat ggctgtcgcc acggcacctg cagcactccc tggcaatgta 1140 cttgtgatga gggctgggga ggcctgtttt gtgaccaaga tctcaactac tgcacccacc 1200 actccccatg caagaatggg gcaacgtgct ccaacagtgg gcagcgaagc tacacctgca 1260 cctgtcgccc aggctacact ggtgtggact gtgagctgga gctcagcgag tgtgacagca 1320 acccctgtcg caatggaggc agctgtaagg accaggagga tggctaccac tgcctgtgtc 1380 ctccgggcta ctatggcctg cattgtgaac acagcacctt gagctgcgcc gactccccct 1440 gcttcaatgg gggctcctgc cgggagcgca accagggggc caactatgct tgtgaatgtc 1500 cccccaactt caccggctcc aactgcgaga agaaagtgga caggtgcacc agcaacccct 1560 gtgccaacgg gggacagtgc ctgaaccgag gtccaagccg catgtgccgc tgccgtcctg 1620 gattcacggg cacctactgt gaactccacg tcagcgactg tgcccgtaac ccttgcgccc 1680 acggtggcac ttgccatgac ctggagaatg ggctcatgtg cacctgccct gccggcttct 1740 ctggccgacg ctgtgaggtg cggacatcca tcgatgcctg tgcctcgagt ccctgcttca 1800 acagggccac ctgctacacc gacctctcca cagacacctt tgtgtgcaac tgcccttatg 1860 gctttgtggg cagccgctgc gagttccccg tgggcttgcc gcccagcttc ccctgggtgg 1920 ccgtctcgct gggtgtgggg ctggcagtgc tgctggtact gctgggcatg gtggcagtgg 1980 ctgtgcggca gctgcggctt cgacggccgg acgacggcag cagggaagcc atgaacaact 2040 tgtcggactt ccagaaggac aacctgattc ctgccgccca gcttaaaaac acaaaccaga 2100 agaaggagct ggaagtggac tgtggcctgg acaagtccaa ctgtggcaaa cagcaaaacc 2160 acacattgga ctataatctg gccccagggc ccctggggcg ggggaccatg ccaggaaagt 2220 ttccccacag tgacaagagc ttaggagaga aggcgccact gcggttacac agtgaaaagc 2280 cagagtgtcg gatatcagcg atatgctccc ccagggactc catgtaccag tctgtgtgtt 2340 tgatatcaga ggagaggaat gaatgtgtca ttgccacgga ggtataaggc aggagcctac 2400 ctggacatcc ctgctcagcc ccgcggctgg accttccttc tgcattgttt acattgcatc 2460 ctggatggga cgtttttcat atgcaacgtg ctgctctcag gaggaggagg gaatggcagg 2520 aaccggacag actgtgaact tgccaagaga tgcaataccc ttccacacct ttgggtgtct 2580 gtctggcatc agattggcag ctgcaccaac cagaggaaca gaagagaaga gagatgccac 2640 tgggcactgc cctgccagta gtggccttca gggggctcct tccggggctc cggcctgttt 2700 tccagagaga gtggcagtag ccccatgggg cccggagctg ctgtggcctc cactggcatc 2760 cgtgtttcca aaagtgcctt tggcccaggc tccacggcga cagttgggcc caaatcagaa 2820 aggagagagg gggccaatga gggcagggcc tcctgtgggc tggaaaacca ctgggtgcgt 2880 ctcttgctgg ggtttgccct ggaggtgagg tgagtgctcg agggagggga gtgctttctg 2940 ccccatgcct ccaactactg tatgcaggcc tggctctctg gtctaggccc tttgggcaag 3000 aatgtccgtc tacccggctt ccaccaccct ctggccctgg gcttctgtaa gcagacaggc 3060 agagggcctg cccctcccac cagccaaggg tgccaggcct aactggggca ctcagggcag 3120 tgtgttggaa attccactga gggggaaatc aggtgctgcg gccgcctggg ccctttcctc 3180 cctcaagccc atctccacaa cctcgagcct gggctctggt ccactactgc cccagaccac 3240 cctcaaagct ggtcttcaga aatcaataat atgagttttt attttgtttt tttttttttt 3300 tttgtagttt attttggagt ctagtatttc aataatttaa gaatcagaag cactgacctt 3360 tctacatttt ataacattat tttgtatata atgtgtattt ataatatgaa acagatgtgt 3420 acagga 3426 <210> 8 <211> 2058 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 atggcggcag cgtcccggag cgcctctggc tgggcgctac tgctgctggt ggcactttgg 60 cagcagcgcg cggccggctc cggcgtcttc cagctgcagc tgcaggagtt catcaacgag 120 cgcggcgtac tggccagtgg gcggccttgc gagcccggct gccggacttt cttccgcgtc 180 tgccttaagc acttccaggc ggtcgtctcg cccggaccct gcaccttcgg gaccgtctcc 240 acgccggtat tgggcaccaa ctccttcgct gtccgggacg acagtagcgg cggggggcgc 300 aaccctctcc aactgccctt caatttcacc tggccgggta ccttctcgct catcatcgaa 360 gcttggcacg cgccaggaga cgacctgcgg ccagaggcct tgccaccaga tgcactcatc 420 agcaagatcg ccatccaggg ctccctagct gtgggtcaga actggttatt ggatgagcaa 480 accagcaccc tcacaaggct gcgctactct taccgggtca tctgcagtga caactactat 540 ggagacaact gctcccgcct gtgcaagaag cgcaatgacc acttcggcca ctatgtgtgc 600 cagccagatg gcaacttgtc ctgcctgccc ggttggactg gggaatattg ccaacagcct 660 atctgtcttt cgggctgtca tgaacagaat ggctactgca gcaagccagc agagtgcctc 720 tgccgcccag gctggcaggg ccggctgtgt aacgaatgca tcccccacaa tggctgtcgc 780 cacggcacct gcagcactcc ctggcaatgt acttgtgatg agggctgggg aggcctgttt 840 tgtgaccaag atctcaacta ctgcacccac cactccccat gcaagaatgg ggcaacgtgc 900 tccaacagtg ggcagcgaag ctacacctgc acctgtcgcc caggctacac tggtgtggac 960 tgtgagctgg agctcagcga gtgtgacagc aacccctgtc gcaatggagg cagctgtaag 1020 gaccaggagg atggctacca ctgcctgtgt cctccgggct actatggcct gcattgtgaa 1080 cacagcacct tgagctgcgc cgactccccc tgcttcaatg ggggctcctg ccgggagcgc 1140 aaccaggggg ccaactatgc ttgtgaatgt ccccccaact tcaccggctc caactgcgag 1200 aagaaagtgg acaggtgcac cagcaacccc tgtgccaacg ggggacagtg cctgaaccga 1260 ggtccaagcc gcatgtgccg ctgccgtcct ggattcacgg gcacctactg tgaactccac 1320 gtcagcgact gtgcccgtaa cccttgcgcc cacggtggca cttgccatga cctggagaat 1380 gggctcatgt gcacctgccc tgccggcttc tctggccgac gctgtgaggt gcggacatcc 1440 atcgatgcct gtgcctcgag tccctgcttc aacagggcca cctgctacac cgacctctcc 1500 acagacacct ttgtgtgcaa ctgcccttat ggctttgtgg gcagccgctg cgagttcccc 1560 gtgggcttgc cgcccagctt cccctgggtg gccgtctcgc tgggtgtggg gctggcagtg 1620 ctgctggtac tgctgggcat ggtggcagtg gctgtgcggc agctgcggct tcgacggccg 1680 gacgacggca gcagggaagc catgaacaac ttgtcggact tccagaagga caacctgatt 1740 cctgccgccc agcttaaaaa cacaaaccag aagaaggagc tggaagtgga ctgtggcctg 1800 gacaagtcca actgtggcaa acagcaaaac cacacattgg actataatct ggccccaggg 1860 cccctggggc gggggaccat gccaggaaag tttccccaca gtgacaagag cttaggagag 1920 aaggcgccac tgcggttaca cagtgaaaag ccagagtgtc ggatatcagc gatatgctcc 1980 cccagggact ccatgtacca gtctgtgtgt ttgatatcag aggagaggaa tgaatgtgtc 2040 attgccacgg aggtataa 2058 <210> 9 <211> 685 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Ala Ala Ala Ser Arg Ser Ala Ser Gly Trp Ala Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Val Ala Leu Trp Gln Gln Arg Ala Ala Gly Ser Gly Val Phe Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Gln Glu Phe Ile Asn Glu Arg Gly Val Leu Ala Ser Gly Arg 35 40 45 Pro Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys His 50 55 60 Phe Gln Ala Val Val Ser Pro Gly Pro Cys Thr Phe Gly Thr Val Ser 65 70 75 80 Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Ala Val Arg Asp Asp Ser Ser 85 90 95 Gly Gly Gly Arg Asn Pro Leu Gln Leu Pro Phe Asn Phe Thr Trp Pro 100 105 110 Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Trp His Ala Pro Gly Asp Asp 115 120 125 Leu Arg Pro Glu Ala Leu Pro Pro Asp Ala Leu Ile Ser Lys Ile Ala 130 135 140 Ile Gln Gly Ser Leu Ala Val Gly Gln Asn Trp Leu Leu Asp Glu Gln 145 150 155 160 Thr Ser Thr Leu Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Tyr Arg Val Ile Cys Ser 165 170 175 Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn Cys Ser Arg Leu Cys Lys Lys Arg Asn 180 185 190 Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gln Pro Asp Gly Asn Leu Ser Cys 195 200 205 Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr Cys Gln Gln Pro Ile Cys Leu Ser 210 215 220 Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser Lys Pro Ala Glu Cys Leu 225 230 235 240 Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg Leu Cys Asn Glu Cys Ile Pro His 245 250 255 Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Ser Thr Pro Trp Gln Cys Thr Cys 260 265 270 Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp Gln Asp Leu Asn Tyr Cys 275 280 285 Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys Ser Asn Ser Gly 290 295 300 Gln Arg Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Val Asp 305 310 315 320 Cys Glu Leu Glu Leu Ser Glu Cys Asp Ser Asn Pro Cys Arg Asn Gly 325 330 335 Gly Ser Cys Lys Asp Gln Glu Asp Gly Tyr His Cys Leu Cys Pro Pro 340 345 350 Gly Tyr Tyr Gly Leu His Cys Glu His Ser Thr Leu Ser Cys Ala Asp 355 360 365 Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg Glu Arg Asn Gln Gly Ala 370 375 380 Asn Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe Thr Gly Ser Asn Cys Glu 385 390 395 400 Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Gln 405 410 415 Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser Arg Met Cys Arg Cys Arg Pro Gly Phe 420 425 430 Thr Gly Thr Tyr Cys Glu Leu His Val Ser Asp Cys Ala Arg Asn Pro 435 440 445 Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp Leu Glu Asn Gly Leu Met Cys 450 455 460 Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg Cys Glu Val Arg Thr Ser 465 470 475 480 Ile Asp Ala Cys Ala Ser Ser Pro Cys Phe Asn Arg Ala Thr Cys Tyr 485 490 495 Thr Asp Leu Ser Thr Asp Thr Phe Val Cys Asn Cys Pro Tyr Gly Phe 500 505 510 Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly Leu Pro Pro Ser Phe Pro 515 520 525 Trp Val Ala Val Ser Leu Gly Val Gly Leu Ala Val Leu Leu Val Leu 530 535 540 Leu Gly Met Val Ala Val Ala Val Arg Gln Leu Arg Leu Arg Arg Pro 545 550 555 560 Asp Asp Gly Ser Arg Glu Ala Met Asn Asn Leu Ser Asp Phe Gln Lys 565 570 575 Asp Asn Leu Ile Pro Ala Ala Gln Leu Lys Asn Thr Asn Gln Lys Lys 580 585 590 Glu Leu Glu Val Asp Cys Gly Leu Asp Lys Ser Asn Cys Gly Lys Gln 595 600 605 Gln Asn His Thr Leu Asp Tyr Asn Leu Ala Pro Gly Pro Leu Gly Arg 610 615 620 Gly Thr Met Pro Gly Lys Phe Pro His Ser Asp Lys Ser Leu Gly Glu 625 630 635 640 Lys Ala Pro Leu Arg Leu His Ser Glu Lys Pro Glu Cys Arg Ile Ser 645 650 655 Ala Ile Cys Ser Pro Arg Asp Ser Met Tyr Gln Ser Val Cys Leu Ile 660 665 670 Ser Glu Glu Arg Asn Glu Cys Val Ile Ala Thr Glu Val 675 680 685 <210> 10 <211> 526 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Ala Ala Ala Ser Arg Ser Ala Ser Gly Trp Ala Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Val Ala Leu Trp Gln Gln Arg Ala Ala Gly Ser Gly Val Phe Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Gln Glu Phe Ile Asn Glu Arg Gly Val Leu Ala Ser Gly Arg 35 40 45 Pro Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys His 50 55 60 Phe Gln Ala Val Val Ser Pro Gly Pro Cys Thr Phe Gly Thr Val Ser 65 70 75 80 Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Ala Val Arg Asp Asp Ser Ser 85 90 95 Gly Gly Gly Arg Asn Pro Leu Gln Leu Pro Phe Asn Phe Thr Trp Pro 100 105 110 Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Trp His Ala Pro Gly Asp Asp 115 120 125 Leu Arg Pro Glu Ala Leu Pro Pro Asp Ala Leu Ile Ser Lys Ile Ala 130 135 140 Ile Gln Gly Ser Leu Ala Val Gly Gln Asn Trp Leu Leu Asp Glu Gln 145 150 155 160 Thr Ser Thr Leu Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Tyr Arg Val Ile Cys Ser 165 170 175 Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn Cys Ser Arg Leu Cys Lys Lys Arg Asn 180 185 190 Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gln Pro Asp Gly Asn Leu Ser Cys 195 200 205 Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr Cys Gln Gln Pro Ile Cys Leu Ser 210 215 220 Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser Lys Pro Ala Glu Cys Leu 225 230 235 240 Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg Leu Cys Asn Glu Cys Ile Pro His 245 250 255 Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Ser Thr Pro Trp Gln Cys Thr Cys 260 265 270 Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp Gln Asp Leu Asn Tyr Cys 275 280 285 Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys Ser Asn Ser Gly 290 295 300 Gln Arg Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Val Asp 305 310 315 320 Cys Glu Leu Glu Leu Ser Glu Cys Asp Ser Asn Pro Cys Arg Asn Gly 325 330 335 Gly Ser Cys Lys Asp Gln Glu Asp Gly Tyr His Cys Leu Cys Pro Pro 340 345 350 Gly Tyr Tyr Gly Leu His Cys Glu His Ser Thr Leu Ser Cys Ala Asp 355 360 365 Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg Glu Arg Asn Gln Gly Ala 370 375 380 Asn Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe Thr Gly Ser Asn Cys Glu 385 390 395 400 Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Gln 405 410 415 Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser Arg Met Cys Arg Cys Arg Pro Gly Phe 420 425 430 Thr Gly Thr Tyr Cys Glu Leu His Val Ser Asp Cys Ala Arg Asn Pro 435 440 445 Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp Leu Glu Asn Gly Leu Met Cys 450 455 460 Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg Cys Glu Val Arg Thr Ser 465 470 475 480 Ile Asp Ala Cys Ala Ser Ser Pro Cys Phe Asn Arg Ala Thr Cys Tyr 485 490 495 Thr Asp Leu Ser Thr Asp Thr Phe Val Cys Asn Cys Pro Tyr Gly Phe 500 505 510 Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly Leu Pro Pro Ser 515 520 525 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 11 ctatctggca gtgcgagaat g 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 12 agacgtgcaa gcaggtcttt c 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 13 tggatgactt atgcgtgatt t 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 14 caacagaact ttatggtaga a 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 15 ccgccgtggt ttgtattcat t 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 16 gcttcctctt caacctcaat a 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 17 ccgccgtggt ttgtattcat t 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 18 gctcttcttt gattacaggt a 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 19 gctactcgga aaggaaacaa a 21 <210> 20 <211> 128 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 attacagcaa gatggaaata ccaaatcccc ctacctccaa atgtatcact tactggaaaa 60 gaaaagtgaa atctgaatac atgcgacttc gacaacttaa acggcttcag gcaaatatgg 120 gtgcaaag 128 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 21 tcgacaactt aaacggcttc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 22 tgcgacttcg acaacttaaa 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 23 cctccaaatg tatcacttac 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 24 taaacggctt caggcaaata 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 25 aaacggcttc aggcaaatat 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 26 catttggagg tagggggatt 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 27 ccagtaagtg atacatttgg 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 28 gtgatacatt tggaggtagg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 29 aagtgataca tttggaggta 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 30 agtgatacat ttggaggtag 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 31 tttccagtaa gtgatacatt 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 32 taagtgatac atttggaggt 20 <210> 33 <211> 129 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 gctttgtatg tggcaaattt tgcaaaggtt caagaaaaaa cccagatcct caatgaagaa 60 tggaagaagc ttcgtgtcca acctgttcag tcaatgaagc ctgtgagtgg acaccctttt 120 ctcaaaaag 129 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 34 gcttcattga ctgaacaggt 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 35 acaggcttca ttgactgaac 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 36 agaaaagggt gtccactcac 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 37 tccattcttc attgaggatc 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 38 ccattcttca ttgaggatct 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 39 cccagatcct caatgaagaa 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 40 gtatgtggca aattttgcaa 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 41 cagtcaatga agcctgtgag 20 <210> 42 <211> 754 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 42 Ser Gly Val Phe Glu Leu Lys Leu Gln Glu Phe Val Asn Lys Lys Gly 1 5 10 15 Leu Leu Gly Asn Arg Asn Cys Cys Arg Gly Gly Ala Gly Pro Pro Pro 20 25 30 Cys Ala Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys His Tyr Gln Ala 35 40 45 Ser Val Ser Pro Glu Pro Pro Cys Thr Tyr Gly Ser Ala Val Thr Pro 50 55 60 Val Leu Gly Val Asp Ser Phe Ser Leu Pro Asp Gly Gly Gly Ala Asp 65 70 75 80 Ser Ala Phe Ser Asn Pro Ile Arg Phe Pro Phe Gly Phe Thr Trp Pro 85 90 95 Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Leu His Thr Asp Ser Pro Asp 100 105 110 Asp Leu Ala Thr Glu Asn Pro Glu Arg Leu Ile Ser Arg Leu Ala Thr 115 120 125 Gln Arg His Leu Thr Val Gly Glu Glu Trp Ser Gln Asp Leu His Ser 130 135 140 Ser Gly Arg Thr Asp Leu Lys Tyr Ser Tyr Arg Phe Val Cys Asp Glu 145 150 155 160 His Tyr Tyr Gly Glu Gly Cys Ser Val Phe Cys Arg Pro Arg Asp Asp 165 170 175 Ala Phe Gly His Phe Thr Cys Gly Glu Arg Gly Glu Lys Val Cys Asn 180 185 190 Pro Gly Trp Lys Gly Pro Tyr Cys Thr Glu Pro Ile Cys Leu Pro Gly 195 200 205 Cys Asp Glu Gln His Gly Phe Cys Asp Lys Pro Gly Glu Cys Lys Cys 210 215 220 Arg Val Gly Trp Gln Gly Arg Tyr Cys Asp Glu Cys Ile Arg Tyr Pro 225 230 235 240 Gly Cys Leu His Gly Thr Cys Gln Gln Pro Trp Gln Cys Asn Cys Gln 245 250 255 Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asn Gln Asp Leu Asn Tyr Cys Thr 260 265 270 His His Lys Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys Thr Asn Thr Gly Gln 275 280 285 Gly Ser Tyr Thr Cys Ser Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Ala Thr Cys 290 295 300 Glu Leu Gly Ile Asp Glu Cys Asp Pro Ser Pro Cys Lys Asn Gly Gly 305 310 315 320 Ser Cys Thr Asp Leu Glu Asn Ser Tyr Ser Cys Thr Cys Pro Pro Gly 325 330 335 Phe Tyr Gly Lys Ile Cys Glu Leu Ser Ala Met Thr Cys Ala Asp Gly 340 345 350 Pro Cys Phe Asn Gly Gly Arg Cys Ser Asp Ser Pro Asp Gly Gly Tyr 355 360 365 Ser Cys Arg Cys Pro Val Gly Tyr Ser Gly Phe Asn Cys Glu Lys Lys 370 375 380 Ile Asp Tyr Cys Ser Ser Ser Pro Cys Ser Asn Gly Ala Lys Cys Val 385 390 395 400 Asp Leu Gly Asp Ala Tyr Leu Cys Arg Cys Gln Ala Gly Phe Ser Gly 405 410 415 Arg His Cys Asp Asp Asn Val Asp Asp Cys Ala Ser Ser Pro Cys Ala 420 425 430 Asn Gly Gly Thr Cys Arg Asp Gly Val Asn Asp Phe Ser Cys Thr Cys 435 440 445 Pro Pro Gly Tyr Thr Gly Arg Asn Cys Ser Ala Pro Val Ser Arg Cys 450 455 460 Glu His Ala Pro Cys His Asn Gly Ala Thr Cys His Glu Arg Gly His 465 470 475 480 Arg Tyr Val Cys Glu Cys Ala Arg Gly Tyr Gly Gly Pro Asn Cys Gln 485 490 495 Phe Leu Leu Pro Glu Leu Pro Pro Gly Pro Ala Val Val Asp Leu Thr 500 505 510 Glu Lys Leu Glu Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Pro Lys Ser Cys Asp 515 520 525 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 530 535 540 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 545 550 555 560 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 565 570 575 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 580 585 590 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 595 600 605 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 610 615 620 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 625 630 635 640 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 645 650 655 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 660 665 670 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 675 680 685 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 690 695 700 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 705 710 715 720 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 725 730 735 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 740 745 750 Gly Lys <210> 43 <211> 729 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 43 Ser Gly Val Phe Gln Leu Gln Leu Gln Glu Phe Ile Asn Glu Arg Gly 1 5 10 15 Val Leu Ala Ser Gly Arg Pro Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr Phe Phe 20 25 30 Arg Val Cys Leu Lys His Phe Gln Ala Val Val Ser Pro Gly Pro Cys 35 40 45 Thr Phe Gly Thr Val Ser Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Ala 50 55 60 Val Arg Asp Asp Ser Ser Gly Gly Gly Arg Asn Pro Leu Gln Leu Pro 65 70 75 80 Phe Asn Phe Thr Trp Pro Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Trp 85 90 95 His Ala Pro Gly Asp Asp Leu Arg Pro Glu Ala Leu Pro Pro Asp Ala 100 105 110 Leu Ile Ser Lys Ile Ala Ile Gln Gly Ser Leu Ala Val Gly Gln Asn 115 120 125 Trp Leu Leu Asp Glu Gln Thr Ser Thr Leu Thr Arg Leu Arg Tyr Ser 130 135 140 Tyr Arg Val Ile Cys Ser Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn Cys Ser Arg 145 150 155 160 Leu Cys Lys Lys Arg Asn Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gln Pro 165 170 175 Asp Gly Asn Leu Ser Cys Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr Cys Gln 180 185 190 Gln Pro Ile Cys Leu Ser Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser 195 200 205 Lys Pro Ala Glu Cys Leu Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg Leu Cys 210 215 220 Asn Glu Cys Ile Pro His Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Ser Thr 225 230 235 240 Pro Trp Gln Cys Thr Cys Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp 245 250 255 Gln Asp Leu Asn Tyr Cys Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly Ala 260 265 270 Thr Cys Ser Asn Ser Gly Gln Arg Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Arg Pro 275 280 285 Gly Tyr Thr Gly Val Asp Cys Glu Leu Glu Leu Ser Glu Cys Asp Ser 290 295 300 Asn Pro Cys Arg Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Glu Asp Gly Tyr 305 310 315 320 His Cys Leu Cys Pro Pro Gly Tyr Tyr Gly Leu His Cys Glu His Ser 325 330 335 Thr Leu Ser Cys Ala Asp Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg 340 345 350 Glu Arg Asn Gln Gly Ala Asn Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe 355 360 365 Thr Gly Ser Asn Cys Glu Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser Asn Pro 370 375 380 Cys Ala Asn Gly Gly Gln Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser Arg Met Cys 385 390 395 400 Arg Cys Arg Pro Gly Phe Thr Gly Thr Tyr Cys Glu Leu His Val Ser 405 410 415 Asp Cys Ala Arg Asn Pro Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp Leu 420 425 430 Glu Asn Gly Leu Met Cys Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg 435 440 445 Cys Glu Val Arg Thr Ser Ile Asp Ala Cys Ala Ser Ser Pro Cys Phe 450 455 460 Asn Arg Ala Thr Cys Tyr Thr Asp Leu Ser Thr Asp Thr Phe Val Cys 465 470 475 480 Asn Cys Pro Tyr Gly Phe Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly 485 490 495 Leu Pro Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 500 505 510 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 515 520 525 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 530 535 540 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 545 550 555 560 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 565 570 575 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 580 585 590 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 595 600 605 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 610 615 620 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 625 630 635 640 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 645 650 655 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 660 665 670 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 675 680 685 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 690 695 700 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 705 710 715 720 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 725 <210> 44 <211> 231 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 1 5 10 15 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 65 70 75 80 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 100 105 110 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 130 135 140 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180 185 190 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 45 <211> 3702 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 atgcggggtc taccgagagg gagggggttg atgcgggccc gggggagggg tcgtgcggcc 60 cctccgggca gccgaggccg cggaaggggg gggccccaca gaggaagagg taggccccgg 120 agcctactct ctcttcccag ggcccaggca tcctggaccc cccaactctc tactgggctg 180 accagccctc ctgtcccttg tctcccctcc cagggggagg cccccgctga gatgggggcg 240 ctgctgctgg agaaggaaac cagaggagcc accgagagag ttcatggctc tttgggggac 300 acccctcgta gtgaagaaac cctgcccaag gccacccccg actccctgga gcctgctggc 360 ccctcatctc cagcctctgt cactgtcact gttggtgatg agggggctga cacccctgta 420 ggggctacac cactcattgg ggatgaatct gagaatcttg agggagatgg ggacctccgt 480 gggggccgga tcctgctggg ccatgccaca aagtcattcc cctcttcccc cagcaagggg 540 ggttcctgtc ctagccgggc caagatgtca atgacagggg cgggaaaatc acctccatct 600 gtccagagtt tggctatgag gctactgagt atgccaggag cccagggagc tgcagcagca 660 gggtctgaac cccctccagc caccacgagc ccagagggac agcccaaggt ccaccgagcc 720 cgcaaaacca tgtccaaacc aggaaatgga cagcccccgg tccctgagaa gcggccccct 780 gaaatacagc atttccgcat gagtgatgat gtccactcac tgggaaaggt gacctcagat 840 ctggccaaaa ggaggaagct gaactcagga ggtggcctgt cagaggagtt aggttctgcc 900 cggcgttcag gagaagtgac cctgacgaaa ggggaccccg ggtccctgga ggagtgggag 960 acggtggtgg gtgatgactt cagtctctac tatgattcct actctgtgga tgagcgcgtg 1020 gactccgaca gcaagtctga agttgaagct ctaactgaac aactaagtga agaggaggag 1080 gaggaagagg aggaagaaga agaagaggaa gaggaggagg aagaggaaga agaagaggaa 1140 gatgaggagt cagggaatca gtcagatagg agtggttcca gtggccggcg caaggccaag 1200 aagaaatggc gaaaagacag cccatgggtg aagccgtctc ggaaacggcg caagcgggag 1260 cctccgcggg ccaaggagcc acgaggggtg tccaatgaca catcttcgct ggagacagag 1320 cgagggtttg aggagttgcc cctgtgcagc tgccgcatgg aggcacccaa gattgaccgc 1380 atcagcgaga gggcggggca caagtgcatg gccactgaga gtgtggacgg agagctgtca 1440 ggctgcaatg ccgccatcct caagcgggag accatgaggc catccagccg tgtggccctg 1500 atggtgctct gtgagaccca ccgcgcccgc atggtcaaac accactgctg cccgggctgc 1560 ggctacttct gcacggcggg caccttcctg gagtgccacc ctgacttccg tgtggcccac 1620 cgcttccaca aggcctgtgt gtctcagctg aatgggatgg tcttctgtcc ccactgtggg 1680 gaggatgctt ctgaagctca agaggtgacc atcccccggg gtgacggggt gaccccaccg 1740 gccggcactg cagctcctgc acccccaccc ctgtcccagg atgtccccgg gagagcagac 1800 acttctcagc ccagtgcccg gatgcgaggg catggggaac cccggcgccc gccctgcgat 1860 cccctggctg acaccattga cagctcaggg ccctccctga ccctgcccaa tgggggctgc 1920 ctttcagccg tggggctgcc actggggcca ggccgggagg ccctggaaaa ggccctggtc 1980 atccaggagt cagagaggcg gaagaagctc cgtttccacc ctcggcagtt gtacctgtcc 2040 gtgaagcagg gcgagctgca gaaggtgatc ctgatgctgt tggacaacct ggaccccaac 2100 ttccagagcg accagcagag caagcgcacg cccctgcatg cagccgccca gaagggctcc 2160 gtggagatct gccatgtgct gctgcaggct ggagccaaca taaatgcagt ggacaaacag 2220 cagcggacgc cactgatgga ggccgtggtg aacaaccacc tggaggtagc ccgttacatg 2280 gtgcagcgtg gtggctgtgt ctatagcaag gaggaggacg gttccacctg cctccaccac 2340 gcagccaaaa tcgggaactt ggagatggtc agcctgctgc tgagcacagg acaggtggac 2400 gtcaacgccc aggacagtgg ggggtggacg cccatcatct gggctgcaga gcacaagcac 2460 atcgaggtga tccgcatgct actgacgcgg ggcgccgacg tcaccctcac tgacaacgag 2520 gagaacatct gcctgcactg ggcctccttc acgggcagcg ccgccatcgc cgaagtcctt 2580 ctgaatgcgc gctgtgacct ccatgctgtc aactaccatg gggacacccc cctgcacatc 2640 gcagctcggg agagctacca tgactgcgtg ctgttattcc tgtcacgtgg ggccaaccct 2700 gagctgcgga acaaagaggg ggacacagca tgggacctga ctcccgagcg ctccgacgtg 2760 tggtttgcgc ttcaactcaa ccgcaagctc cgacttgggg tgggaaatcg ggccatccgc 2820 acagagaaga tcatctgccg ggacgtggct cggggctatg agaacgtgcc cattccctgt 2880 gtcaacggtg tggatgggga gccctgccct gaggattaca agtacatctc agagaactgc 2940 gagacgtcca ccatgaacat cgatcgcaac atcacccacc tgcagcactg cacgtgtgtg 3000 gacgactgct ctagctccaa ctgcctgtgc ggccagctca gcatccggtg ctggtatgac 3060 aaggatgggc gattgctcca ggaatttaac aagattgagc ctccgctgat tttcgagtgt 3120 aaccaggcgt gctcatgctg gagaaactgc aagaaccggg tcgtacagag tggcatcaag 3180 gtgcggctac agctctaccg aacagccaag atgggctggg gggtccgcgc cctgcagacc 3240 atcccacagg ggaccttcat ctgcgagtat gtcggggagc tgatctctga tgctgaggct 3300 gatgtgagag aggatgattc ttacctcttc gacttagaca acaaggatgg agaggtgtac 3360 tgcatagatg cccgttacta tggcaacatc agccgcttca tcaaccacct gtgtgacccc 3420 aacatcattc ccgtccgggt cttcatgctg caccaagacc tgcgatttcc acgcatcgcc 3480 ttcttcagtt cccgagacat ccggactggg gaggagctag ggtttgacta tggcgaccgc 3540 ttctgggaca tcaaaagcaa atatttcacc tgccaatgtg gctctgagaa gtgcaagcac 3600 tcagccgaag ccattgccct ggagcagagc cgtctggccc gcctggaccc acaccctgag 3660 ctgctgcccg agctcggctc cctgccccct gtcaacacat ga 3702 <210> 46 <211> 1233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Met Arg Gly Leu Pro Arg Gly Arg Gly Leu Met Arg Ala Arg Gly Arg 1 5 10 15 Gly Arg Ala Ala Pro Pro Gly Ser Arg Gly Arg Gly Arg Gly Gly Pro 20 25 30 His Arg Gly Arg Gly Arg Pro Arg Ser Leu Leu Ser Leu Pro Arg Ala 35 40 45 Gln Ala Ser Trp Thr Pro Gln Leu Ser Thr Gly Leu Thr Ser Pro Pro 50 55 60 Val Pro Cys Leu Pro Ser Gln Gly Glu Ala Pro Ala Glu Met Gly Ala 65 70 75 80 Leu Leu Leu Glu Lys Glu Thr Arg Gly Ala Thr Glu Arg Val His Gly 85 90 95 Ser Leu Gly Asp Thr Pro Arg Ser Glu Glu Thr Leu Pro Lys Ala Thr 100 105 110 Pro Asp Ser Leu Glu Pro Ala Gly Pro Ser Ser Pro Ala Ser Val Thr 115 120 125 Val Thr Val Gly Asp Glu Gly Ala Asp Thr Pro Val Gly Ala Thr Pro 130 135 140 Leu Ile Gly Asp Glu Ser Glu Asn Leu Glu Gly Asp Gly Asp Leu Arg 145 150 155 160 Gly Gly Arg Ile Leu Leu Gly His Ala Thr Lys Ser Phe Pro Ser Ser 165 170 175 Pro Ser Lys Gly Gly Ser Cys Pro Ser Arg Ala Lys Met Ser Met Thr 180 185 190 Gly Ala Gly Lys Ser Pro Pro Ser Val Gln Ser Leu Ala Met Arg Leu 195 200 205 Leu Ser Met Pro Gly Ala Gln Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ser Glu Pro 210 215 220 Pro Pro Ala Thr Thr Ser Pro Glu Gly Gln Pro Lys Val His Arg Ala 225 230 235 240 Arg Lys Thr Met Ser Lys Pro Gly Asn Gly Gln Pro Pro Val Pro Glu 245 250 255 Lys Arg Pro Pro Glu Ile Gln His Phe Arg Met Ser Asp Asp Val His 260 265 270 Ser Leu Gly Lys Val Thr Ser Asp Leu Ala Lys Arg Arg Lys Leu Asn 275 280 285 Ser Gly Gly Gly Leu Ser Glu Glu Leu Gly Ser Ala Arg Arg Ser Gly 290 295 300 Glu Val Thr Leu Thr Lys Gly Asp Pro Gly Ser Leu Glu Glu Trp Glu 305 310 315 320 Thr Val Val Gly Asp Asp Phe Ser Leu Tyr Tyr Asp Ser Tyr Ser Val 325 330 335 Asp Glu Arg Val Asp Ser Asp Ser Lys Ser Glu Val Glu Ala Leu Thr 340 345 350 Glu Gln Leu Ser Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Ser 370 375 380 Gly Asn Gln Ser Asp Arg Ser Gly Ser Ser Gly Arg Arg Lys Ala Lys 385 390 395 400 Lys Lys Trp Arg Lys Asp Ser Pro Trp Val Lys Pro Ser Arg Lys Arg 405 410 415 Arg Lys Arg Glu Pro Pro Arg Ala Lys Glu Pro Arg Gly Val Ser Asn 420 425 430 Asp Thr Ser Ser Leu Glu Thr Glu Arg Gly Phe Glu Glu Leu Pro Leu 435 440 445 Cys Ser Cys Arg Met Glu Ala Pro Lys Ile Asp Arg Ile Ser Glu Arg 450 455 460 Ala Gly His Lys Cys Met Ala Thr Glu Ser Val Asp Gly Glu Leu Ser 465 470 475 480 Gly Cys Asn Ala Ala Ile Leu Lys Arg Glu Thr Met Arg Pro Ser Ser 485 490 495 Arg Val Ala Leu Met Val Leu Cys Glu Thr His Arg Ala Arg Met Val 500 505 510 Lys His His Cys Cys Pro Gly Cys Gly Tyr Phe Cys Thr Ala Gly Thr 515 520 525 Phe Leu Glu Cys His Pro Asp Phe Arg Val Ala His Arg Phe His Lys 530 535 540 Ala Cys Val Ser Gln Leu Asn Gly Met Val Phe Cys Pro His Cys Gly 545 550 555 560 Glu Asp Ala Ser Glu Ala Gln Glu Val Thr Ile Pro Arg Gly Asp Gly 565 570 575 Val Thr Pro Pro Ala Gly Thr Ala Ala Pro Ala Pro Pro Pro Leu Ser 580 585 590 Gln Asp Val Pro Gly Arg Ala Asp Thr Ser Gln Pro Ser Ala Arg Met 595 600 605 Arg Gly His Gly Glu Pro Arg Arg Pro Pro Cys Asp Pro Leu Ala Asp 610 615 620 Thr Ile Asp Ser Ser Gly Pro Ser Leu Thr Leu Pro Asn Gly Gly Cys 625 630 635 640 Leu Ser Ala Val Gly Leu Pro Leu Gly Pro Gly Arg Glu Ala Leu Glu 645 650 655 Lys Ala Leu Val Ile Gln Glu Ser Glu Arg Arg Lys Lys Leu Arg Phe 660 665 670 His Pro Arg Gln Leu Tyr Leu Ser Val Lys Gln Gly Glu Leu Gln Lys 675 680 685 Val Ile Leu Met Leu Leu Asp Asn Leu Asp Pro Asn Phe Gln Ser Asp 690 695 700 Gln Gln Ser Lys Arg Thr Pro Leu His Ala Ala Ala Gln Lys Gly Ser 705 710 715 720 Val Glu Ile Cys His Val Leu Leu Gln Ala Gly Ala Asn Ile Asn Ala 725 730 735 Val Asp Lys Gln Gln Arg Thr Pro Leu Met Glu Ala Val Val Asn Asn 740 745 750 His Leu Glu Val Ala Arg Tyr Met Val Gln Arg Gly Gly Cys Val Tyr 755 760 765 Ser Lys Glu Glu Asp Gly Ser Thr Cys Leu His His Ala Ala Lys Ile 770 775 780 Gly Asn Leu Glu Met Val Ser Leu Leu Leu Ser Thr Gly Gln Val Asp 785 790 795 800 Val Asn Ala Gln Asp Ser Gly Gly Trp Thr Pro Ile Ile Trp Ala Ala 805 810 815 Glu His Lys His Ile Glu Val Ile Arg Met Leu Leu Thr Arg Gly Ala 820 825 830 Asp Val Thr Leu Thr Asp Asn Glu Glu Asn Ile Cys Leu His Trp Ala 835 840 845 Ser Phe Thr Gly Ser Ala Ala Ile Ala Glu Val Leu Leu Asn Ala Arg 850 855 860 Cys Asp Leu His Ala Val Asn Tyr His Gly Asp Thr Pro Leu His Ile 865 870 875 880 Ala Ala Arg Glu Ser Tyr His Asp Cys Val Leu Leu Phe Leu Ser Arg 885 890 895 Gly Ala Asn Pro Glu Leu Arg Asn Lys Glu Gly Asp Thr Ala Trp Asp 900 905 910 Leu Thr Pro Glu Arg Ser Asp Val Trp Phe Ala Leu Gln Leu Asn Arg 915 920 925 Lys Leu Arg Leu Gly Val Gly Asn Arg Ala Ile Arg Thr Glu Lys Ile 930 935 940 Ile Cys Arg Asp Val Ala Arg Gly Tyr Glu Asn Val Pro Ile Pro Cys 945 950 955 960 Val Asn Gly Val Asp Gly Glu Pro Cys Pro Glu Asp Tyr Lys Tyr Ile 965 970 975 Ser Glu Asn Cys Glu Thr Ser Thr Met Asn Ile Asp Arg Asn Ile Thr 980 985 990 His Leu Gln His Cys Thr Cys Val Asp Asp Cys Ser Ser Ser Asn Cys 995 1000 1005 Leu Cys Gly Gln Leu Ser Ile Arg Cys Trp Tyr Asp Lys Asp Gly 1010 1015 1020 Arg Leu Leu Gln Glu Phe Asn Lys Ile Glu Pro Pro Leu Ile Phe 1025 1030 1035 Glu Cys Asn Gln Ala Cys Ser Cys Trp Arg Asn Cys Lys Asn Arg 1040 1045 1050 Val Val Gln Ser Gly Ile Lys Val Arg Leu Gln Leu Tyr Arg Thr 1055 1060 1065 Ala Lys Met Gly Trp Gly Val Arg Ala Leu Gln Thr Ile Pro Gln 1070 1075 1080 Gly Thr Phe Ile Cys Glu Tyr Val Gly Glu Leu Ile Ser Asp Ala 1085 1090 1095 Glu Ala Asp Val Arg Glu Asp Asp Ser Tyr Leu Phe Asp Leu Asp 1100 1105 1110 Asn Lys Asp Gly Glu Val Tyr Cys Ile Asp Ala Arg Tyr Tyr Gly 1115 1120 1125 Asn Ile Ser Arg Phe Ile Asn His Leu Cys Asp Pro Asn Ile Ile 1130 1135 1140 Pro Val Arg Val Phe Met Leu His Gln Asp Leu Arg Phe Pro Arg 1145 1150 1155 Ile Ala Phe Phe Ser Ser Arg Asp Ile Arg Thr Gly Glu Glu Leu 1160 1165 1170 Gly Phe Asp Tyr Gly Asp Arg Phe Trp Asp Ile Lys Ser Lys Tyr 1175 1180 1185 Phe Thr Cys Gln Cys Gly Ser Glu Lys Cys Lys His Ser Ala Glu 1190 1195 1200 Ala Ile Ala Leu Glu Gln Ser Arg Leu Ala Arg Leu Asp Pro His 1205 1210 1215 Pro Glu Leu Leu Pro Glu Leu Gly Ser Leu Pro Pro Val Asn Thr 1220 1225 1230 <210> 47 <211> 2427 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 atggccgccg ccgatgccga ggcagttccg gcgagggggg agcctcagca ggattgctgt 60 gtgaaaaccg agctgctggg agaagagaca cctatggctg ccgatgaagg ctcagcagag 120 aaacaggcag gagaggccca catggctgcg gacggtgaga ccaatgggtc ttgtgaaaac 180 agcgatgcca gcagtcatgc aaatgctgca aagcacactc aggacagcgc aagggtcaac 240 ccccaggatg gcaccaacac actaactcgg atagcggaaa atggggtttc agaaagagac 300 tcagaagcgg cgaagcaaaa ccacgtcact gccgacgact ttgtgcagac ttctgtcatc 360 ggcagcaacg gatacatctt aaataagccg gccctacagg cacagccctt gaggactacc 420 agcactctgg cctcttcgct gcctggccat gctgcaaaaa cccttcctgg aggggctggc 480 aaaggcagga ctccaagcgc ttttccccag acgccagccg ccccaccagc cacccttggg 540 gaggggagtg ctgacacaga ggacaggaag ctcccggccc ctggcgccga cgtcaaggtc 600 cacagggcac gcaagaccat gccgaagtcc gtcgtgggcc tgcatgcagc cagtaaagat 660 cccagagaag ttcgagaagc tagagatcat aaggaaccaa aagaggagat caacaaaaac 720 atttctgact ttggacgaca gcagctttta ccccccttcc catcccttca tcagtcgcta 780 cctcagaacc agtgctacat ggccaccaca aaatcacaga cagcttgctt gccttttgtt 840 ttagcagctg cagtatctcg gaagaaaaaa cgaagaatgg gaacctatag cctggttcct 900 aagaaaaaga ccaaagtatt aaaacagagg acggtgattg agatgtttaa gagcataact 960 cattccactg tgggttccaa gggggagaag gacctgggcg ccagcagcct gcacgtgaat 1020 ggggagagcc tggagatgga ctcggatgag gacgactcag aggagctcga ggaggacgac 1080 ggccatggtg cagagcaggc ggccgcgttc cccacagagg acagcaggac ttccaaggag 1140 agcatgtcgg aggctgatcg cgcccagaag atggacgggg agtccgagga ggagcaggag 1200 tccgtggaca ccggggagga ggaggaaggc ggtgacgagt ctgacctgag ttcggaatcc 1260 agcattaaga agaaatttct caagaggaaa ggaaagaccg acagtccctg gatcaagcca 1320 gccaggaaaa ggaggcggag aagtagaaag aagcccagcg gtgccctcgg ttctgagtcg 1380 tataagtcat ctgcaggaag cgctgagcag acggcaccag gagacagcac agggtacatg 1440 gaagtttctc tggactccct ggatctccga gtcaaaggaa ttctgtcttc acaagcagaa 1500 gggttggcca acggtccaga tgtgctggag acagacggcc tccaggaagt gcctctctgc 1560 agctgccgga tggaaacacc gaagagtcga gagatcacca cactggccaa caaccagtgc 1620 atggctacag agagcgtgga ccatgaattg ggccggtgca caaacagcgt ggtcaagtat 1680 gagctgatgc gcccctccaa caaggccccg ctcctcgtgc tgtgtgaaga ccaccggggc 1740 cgcatggtga agcaccagtg ctgtcctggc tgtggctact tctgcacagc gggtaatttt 1800 atggagtgtc agcccgagag cagcatctct caccgtttcc acaaagactg tgcctctcga 1860 gtcaataacg ccagctattg tccccactgt ggggaggaga gctccaaggc caaagaggtg 1920 acgatagcta aagcagacac cacctcgacc gtgacaccag tccccgggca ggagaagggc 1980 tcggccctgg agggcagggc cgacaccaca acgggcagtg ctgccgggcc accactctcg 2040 gaggacgaca agctgcaggg tgcagcctcc cacgtgcccg agggctttga tccaacggga 2100 cctgctgggc ttgggaggcc aactcccggc ctttcccagg gaccagggaa ggaaaccttg 2160 gagagcgctc tcatcgccct cgactcggaa aaacccaaga agcttcgctt ccacccaaag 2220 cagctgtact tctccgccag gcaaggggag cttcagaagg tgctcctcat gctggtggac 2280 ggaattgacc ccaacttcaa aatggagcac cagaataagc gctctccact gcacgccgcg 2340 gcagaggctg gacacgtgga catctgccac atgctggttc agttctgcag gctgggaagc 2400 ccaaggtcga ggggctgcct ttggtga 2427 <210> 48 <211> 808 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Met Ala Ala Ala Asp Ala Glu Ala Val Pro Ala Arg Gly Glu Pro Gln 1 5 10 15 Gln Asp Cys Cys Val Lys Thr Glu Leu Leu Gly Glu Glu Thr Pro Met 20 25 30 Ala Ala Asp Glu Gly Ser Ala Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ala His Met 35 40 45 Ala Ala Asp Gly Glu Thr Asn Gly Ser Cys Glu Asn Ser Asp Ala Ser 50 55 60 Ser His Ala Asn Ala Ala Lys His Thr Gln Asp Ser Ala Arg Val Asn 65 70 75 80 Pro Gln Asp Gly Thr Asn Thr Leu Thr Arg Ile Ala Glu Asn Gly Val 85 90 95 Ser Glu Arg Asp Ser Glu Ala Ala Lys Gln Asn His Val Thr Ala Asp 100 105 110 Asp Phe Val Gln Thr Ser Val Ile Gly Ser Asn Gly Tyr Ile Leu Asn 115 120 125 Lys Pro Ala Leu Gln Ala Gln Pro Leu Arg Thr Thr Ser Thr Leu Ala 130 135 140 Ser Ser Leu Pro Gly His Ala Ala Lys Thr Leu Pro Gly Gly Ala Gly 145 150 155 160 Lys Gly Arg Thr Pro Ser Ala Phe Pro Gln Thr Pro Ala Ala Pro Pro 165 170 175 Ala Thr Leu Gly Glu Gly Ser Ala Asp Thr Glu Asp Arg Lys Leu Pro 180 185 190 Ala Pro Gly Ala Asp Val Lys Val His Arg Ala Arg Lys Thr Met Pro 195 200 205 Lys Ser Val Val Gly Leu His Ala Ala Ser Lys Asp Pro Arg Glu Val 210 215 220 Arg Glu Ala Arg Asp His Lys Glu Pro Lys Glu Glu Ile Asn Lys Asn 225 230 235 240 Ile Ser Asp Phe Gly Arg Gln Gln Leu Leu Pro Pro Phe Pro Ser Leu 245 250 255 His Gln Ser Leu Pro Gln Asn Gln Cys Tyr Met Ala Thr Thr Lys Ser 260 265 270 Gln Thr Ala Cys Leu Pro Phe Val Leu Ala Ala Ala Val Ser Arg Lys 275 280 285 Lys Lys Arg Arg Met Gly Thr Tyr Ser Leu Val Pro Lys Lys Lys Thr 290 295 300 Lys Val Leu Lys Gln Arg Thr Val Ile Glu Met Phe Lys Ser Ile Thr 305 310 315 320 His Ser Thr Val Gly Ser Lys Gly Glu Lys Asp Leu Gly Ala Ser Ser 325 330 335 Leu His Val Asn Gly Glu Ser Leu Glu Met Asp Ser Asp Glu Asp Asp 340 345 350 Ser Glu Glu Leu Glu Glu Asp Asp Gly His Gly Ala Glu Gln Ala Ala 355 360 365 Ala Phe Pro Thr Glu Asp Ser Arg Thr Ser Lys Glu Ser Met Ser Glu 370 375 380 Ala Asp Arg Ala Gln Lys Met Asp Gly Glu Ser Glu Glu Glu Gln Glu 385 390 395 400 Ser Val Asp Thr Gly Glu Glu Glu Glu Gly Gly Asp Glu Ser Asp Leu 405 410 415 Ser Ser Glu Ser Ser Ile Lys Lys Lys Phe Leu Lys Arg Lys Gly Lys 420 425 430 Thr Asp Ser Pro Trp Ile Lys Pro Ala Arg Lys Arg Arg Arg Arg Ser 435 440 445 Arg Lys Lys Pro Ser Gly Ala Leu Gly Ser Glu Ser Tyr Lys Ser Ser 450 455 460 Ala Gly Ser Ala Glu Gln Thr Ala Pro Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Met 465 470 475 480 Glu Val Ser Leu Asp Ser Leu Asp Leu Arg Val Lys Gly Ile Leu Ser 485 490 495 Ser Gln Ala Glu Gly Leu Ala Asn Gly Pro Asp Val Leu Glu Thr Asp 500 505 510 Gly Leu Gln Glu Val Pro Leu Cys Ser Cys Arg Met Glu Thr Pro Lys 515 520 525 Ser Arg Glu Ile Thr Thr Leu Ala Asn Asn Gln Cys Met Ala Thr Glu 530 535 540 Ser Val Asp His Glu Leu Gly Arg Cys Thr Asn Ser Val Val Lys Tyr 545 550 555 560 Glu Leu Met Arg Pro Ser Asn Lys Ala Pro Leu Leu Val Leu Cys Glu 565 570 575 Asp His Arg Gly Arg Met Val Lys His Gln Cys Cys Pro Gly Cys Gly 580 585 590 Tyr Phe Cys Thr Ala Gly Asn Phe Met Glu Cys Gln Pro Glu Ser Ser 595 600 605 Ile Ser His Arg Phe His Lys Asp Cys Ala Ser Arg Val Asn Asn Ala 610 615 620 Ser Tyr Cys Pro His Cys Gly Glu Glu Ser Ser Lys Ala Lys Glu Val 625 630 635 640 Thr Ile Ala Lys Ala Asp Thr Thr Ser Thr Val Thr Pro Val Pro Gly 645 650 655 Gln Glu Lys Gly Ser Ala Leu Glu Gly Arg Ala Asp Thr Thr Thr Gly 660 665 670 Ser Ala Ala Gly Pro Pro Leu Ser Glu Asp Asp Lys Leu Gln Gly Ala 675 680 685 Ala Ser His Val Pro Glu Gly Phe Asp Pro Thr Gly Pro Ala Gly Leu 690 695 700 Gly Arg Pro Thr Pro Gly Leu Ser Gln Gly Pro Gly Lys Glu Thr Leu 705 710 715 720 Glu Ser Ala Leu Ile Ala Leu Asp Ser Glu Lys Pro Lys Lys Leu Arg 725 730 735 Phe His Pro Lys Gln Leu Tyr Phe Ser Ala Arg Gln Gly Glu Leu Gln 740 745 750 Lys Val Leu Leu Met Leu Val Asp Gly Ile Asp Pro Asn Phe Lys Met 755 760 765 Glu His Gln Asn Lys Arg Ser Pro Leu His Ala Ala Ala Glu Ala Gly 770 775 780 His Val Asp Ile Cys His Met Leu Val Gln Phe Cys Arg Leu Gly Ser 785 790 795 800 Pro Arg Ser Arg Gly Cys Leu Trp 805 <210> 49 <211> 13 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 tcgacactcc tta 13 <210> 50 <211> 13 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 atataacgtt ctt 13

Claims (75)

1. a) CD34⁺ 혈액생성(hemogenic) 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계;
   b) 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단에서 히스톤 메틸트랜스퍼라제를 억제하는 단계; 및
   c) CD3⁺-T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 노치(Notch) 리간드의 존재 하에 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서, 상기 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계,
   를 포함하는, 방법.
2. a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계;
   b) 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단에서 후성유전 조절인자를 억제시키는 단계; 및
   c) CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 노치 리간드의 존재 하에 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서, 상기 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계,
   를 포함하는, 방법.
3. a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계;
   b) 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단에서 G9a 및/또는 GLP를 억제시키는 단계; 및
   c) CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 노치 리간드의 존재 하에 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서, 상기 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계,
   를 포함하는, 방법.
4. a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계; 및
   b) CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 노치 리간드의 존재 하에 CD3⁺-T-세포-분화 배지에서 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계,
   를 포함하는, 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 노치 리간드가 고체 기재에 부착되어 있는, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 노치 리간드가 세포 배양 접시에 부착되어 있는, 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 노치 리간드가 간질 세포로부터 유래되지 않은 것인, 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 노치 리간드의 존재 하에 혈액생성 내피세포를 분화시키는 단계가 노치 리간드를 발현하는 간질 세포와의 공동-배양을 포함하지 않는 것인, 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 노치 리간드의 존재 하에 혈액생성 내피세포를 분화시키는 단계가 OP9-DL1 세포 또는 OP9-DL4 세포와의 공동-배양을 포함하지 않는 것인, 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 노치 리간드가 델타-유사-1(DLL1), 델타-유사-4(DLL4), 고정화된 델타1^ext-IgG, 및 고정화된 델타4^ext-IgG로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
11. 제10항에 있어서,
    상기 고정화된 델타1^ext-IgG가 인간 IgG1의 Fc 도메인에 융합된 인간 델타-유사-1의 세포외 도메인으로 구성되는 것인, 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간이 적어도 4주인, 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD3⁺-T-세포 분화 배지가 무혈청인, 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD3⁺-T-세포-분화 배지가 FLT3 및 IL7을 포함하는 것인, 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD3⁺-T-세포-분화 배지가 15 ng/㎖ FLT3 및 25 ng/㎖ IL7을 포함하는 것인, 방법.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD3⁺-T-세포-분화 배지가 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서의 적어도 처음 2주의 분화 동안 5 ng/㎖ 트롬보포이에틴(TPO) 및/또는 30 ng/㎖ SCF를 추가로 포함하는 것인, 방법.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TPO를 포함하는 CD3⁺-T-세포-분화 배지가 CD5⁺CD7⁺ ProT 세포의 집단으로의 분화를 촉진하는 것인, 방법.
18. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD3⁺ T 세포의 집단이 CD4⁺CD8⁺ T 세포의 집단을 포함하는 것인, 방법.
19. 제18항에 있어서,
    상기 CD4⁺ 세포의 집단 및 CD8⁺ 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 단일-양성-T-세포-분화 배지에서 CD4⁺CD8⁺ T 세포의 집단을 분화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
20. 제19항에 있어서,
    상기 CD4⁺CD8⁺ T 세포의 집단으로부터 CD4⁺ T 세포의 집단 및 CD8⁺ 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간이 적어도 1주인, 방법.
21. 제19항에 있어서,
    상기 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로부터 CD4⁺ T 세포의 집단 및 CD8⁺ 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간이 적어도 5주인, 방법.
22. 제19항에 있어서,
    상기 단일-양성-T-세포-분화 배지가 10 ng/㎖ IL-15 및 T 세포 활성화인자를 포함하는 것인, 방법.
23. 제22항에 있어서,
    상기 T 세포 활성화인자가 10 ㎕/㎖ CD3/CD28 T 세포 활성화인자를 포함하는 것인, 방법.
24. 제22항에 있어서,
    상기 T 세포 활성화인자가 세포당 1개 비드의 CD3/CD28 T 세포 활성화인자 다이나비드를 포함하는 것인, 방법.
25. 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 1주 후에 CD4⁺ 세포 농축 및/또는 CD8⁺ 세포 농축 단계를 추가로 포함하는, 방법.
26. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 만능 줄기 세포의 집단이 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포) 또는 배아 줄기 세포(ESC)를 포함하는 것인, 방법.
27. 제26항에 있어서,
    상기 유도 만능 줄기 세포가 단지 재프로그래밍 인자 OCT4, SOX2, KLF4 및 임의로 c-MYC 또는 nanog 및 LIN28을 성숙한 세포에 도입함으로써 생산되는 것인, 방법.
28. 제 26항에 있어서,
    상기 유도 만능 줄기 세포가 재프로그래밍 인자를 2회 이상 성숙세포에 도입함으로써 생산되는 것인, 방법.
29. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 만능 줄기 세포의 집단이 배상체 또는 2D 부착 배양물을 사용하여 CD34+ 혈액생성 내피세포의 집단으로 분화되는 것인, 방법.
30. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간이 적어도 8일인, 방법.
31. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 응집 배지가 BMP4, SB-431542, CHIR99021, bFGF, VEGF, IL-6, IL-11, IGF-1, SCF, 및 EPO를 포함하는 것인, 방법.
32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 응집 배지가 10 ng/㎖ BMP4, 6 mM SB-431542, 3 mM CHIR99021, 5 ng/㎖ bFGF, 15 ng/㎖ VEGF, 10 ng/㎖ IL-6, 5 ng/㎖ IL-11, 25 ng/㎖ IGF-1, 50 ng/㎖ SCF, 및 2 U/㎖ EPO를 포함하는 것인, 방법.
33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단에 대한 표면 마커의 발현을 이용하여 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 선택 또는 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단이 CD45 음성/낮음인 것인, 방법.
35. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단이 CD38 음성/낮음인 것인, 방법.
36. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단 또는 CD3⁺ T 세포의 생성된 집단을 유전적으로 변형시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
37. 제36항에 있어서,
    상기 유전적 변형이 내인성 HLA를 편집하는 것, 내인성 TCR을 제거하는 것, 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 것인, 방법.
38. 제1항에 있어서,
    상기 히스톤 메틸트랜스퍼라제가 히스톤 3 라이신 잔기 9(H3K9) 및/또는 히스톤 3 라이신 잔기 27(H3K27)에 대한 메틸기의 부가를 촉매하는 것인, 방법.
39. 제1항에 있어서,
    상기 히스톤 메틸트랜스퍼라제 H3K9 및/또는 H3K27이 소분자 억제제 또는 핵산 억제제에 의해 억제되는 것인, 방법.
40. 제39항에 있어서,
    상기 히스톤 메틸트랜스퍼라제 H3K9 및/또는 H3K27 소분자 억제제가 이종유기 화합물 또는 유기금속 화합물인, 방법.
41. 제39항에 있어서, 상기 히스톤 메틸트랜스퍼라제 H3K9 및/또는 H3K27 소분자 억제제가 BIX-01294, UNC0638, E72, BRD4770, A-366, 케토신(chaetocin), UNC0224, UNC0631, UNC0646, EPZ005687, EPZ-6438(E7438), 3-데아잔플라노신 A(DZNep), EI1, GSK343, GSK126, 및 UNC1999로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
42. 제39항에 있어서,
    상기 핵산 억제제가 히스톤 메틸트랜스퍼라제의 발현을 표적화하는 핵산인, 방법.
43. 제39항에 있어서,
    상기 핵산 억제제가 RNA 간섭 억제제 또는 작용제인, 방법.
44. 제39항에 있어서,
    상기 핵산 억제제가 EZH1에 결합하는 압타머, EZH1 특이적 RNA 간섭제, 및 EZH1 특이적 RNA 간섭제를 코딩하는 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 EZH1 특이적 핵산이고, 여기서 상기 RNA 간섭제는 서열번호: 11 내지 19로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상을 포함하는 것인, 방법.
45. 제2항에 있어서,
    상기 후성유전 조절인자가 DNA-메틸트랜스퍼라제(DNMT); 메틸-CpG-결합 도메인(MBD) 단백질; DNA 데메틸라제; 히스톤 메틸 트랜스퍼라제(HMT); 메틸-히스톤 결합 단백질; 히스톤 데메틸라제; 히스톤 아세틸 트랜스퍼라제(HAT); 아세틸-결합 단백질; 또는 히스톤 데아세틸라제(HDAC)인, 방법.
46. 제45항에 있어서,
    상기 후성유전 조절인자의 억제제가 UNC0224; MC1568; 및 CAY10591로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
47. 제45항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 후성유전 조절인자의 억제제가 500 nM 이상의 농도로 제공되는 것인, 방법.
48. 제45항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD34⁺ 세포의 집단으로부터 CD5⁺CD7⁺ proT 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간이 약 14일인, 방법.
49. 제3항에 있어서,
    상기 G9a 및/또는 GLP 억제제가 UNC0224; UNC0638; A366; BRD4770; BIX01294; UNC0642; UNC0631; UNC0646; UNC0321; E72; BIX-01338; BRD9539; 키토신; 및 DCG066으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
50. 제49항에 있어서,
    상기 G9a 및/또는 GLP 억제제가 UNC0224인, 방법.
51. 제49항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 G9a 및/또는 GLP 억제제가 300 nM 내지 5 μM의 농도로 제공되는 것인, 방법.
52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD34⁺ 세포의 집단으로부터 CD5⁺CD7⁺ proT 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간이 약 14일인, 방법.
53. a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계; 및
    b) CD3⁺ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기 위해 10 ㎍/㎖ 노치 리간드의 존재 하에 적어도 4주 동안 15 ng/㎖ FLT3 및 25 ng/㎖ IL7을 포함하는 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서, 상기 생성된 CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계로서, 상기 CD3⁺-T-세포 분화 배지는 적어도 처음 2주 동안 5 ng/㎖ TPO 및 30 ng/㎖ SCF를 추가로 포함하는, 단계,
    를 포함하는, 방법.
54. a) CD34⁺ 혈액생성 내피세포의 집단으로의 분화를 촉진하기에 충분한 시간 동안 응집 배지에서 만능 줄기 세포의 집단을 분화시키는 단계; 및
    b) CD3+ T 세포의 집단으로의 분화를 촉진하기 위해 적어도 4주 동안 10㎍/㎖ 노치 리간드의 존재 하에 15 ng/㎖ FLT3 및 25 ng/㎖ IL7을 포함하는 CD3⁺-T-세포 분화 배지에서 생성된 CD34+ 혈액생성 내피세포의 집단을 분화시키는 단계로서, 상기 CD3⁺-T-세포 분화 배지는 적어도 처음 2주 동안 5 ng/㎖ TPO, 30 ng/㎖ SCF, 및 G9a/GLP 억제제를 추가로 포함하는 것인, 단계,
    를 포함하는, 방법.
55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD3⁺ T 세포의 집단이 알파 베타 T 세포와 가장 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타내는 것인, 방법.
56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD3⁺ T 세포의 집단이 알파 베타 T 세포와 적어도 10%, 20%, 30%, 40% 또는 그 이상 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타내는 것인, 방법.
57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD3⁺ T 세포의 집단이 말초혈 알파 베타 T 세포와 비교하여 적어도 0.85인 피어슨 상관 계수를 갖는 유전자 발현 프로파일을 나타내는 것인, 방법.
58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD3⁺ T 세포의 집단이 약 0.025의 생산적 심슨 클론형성능 값을 나타내는 것인, 방법.
59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD3⁺ T 세포의 집단이 메틸트랜스퍼라제의 억제 또는 간질 세포 이용없이 분화된 면역 세포에 비해 적어도 3개 뉴클레오티드가 더 긴 T 세포 수용체(TCR) 상보성 결정 영역(CDR)을 나타내는 것인, 방법.
60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 면역 세포.
61. 제60항에 있어서,
    상기 면역 세포가 알파 베타 T 세포와 가장 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타내는 것인, 면역 세포.
62. 제60항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포가 알파 베타 T 세포와 적어도 10%, 20%, 30%, 40% 또는 그 이상 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타내는 것인, 면역 세포.
63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포가 말초혈 알파 베타 T 세포와 비교하여 적어도 0.85인 피어슨 상관 계수를 갖는 유전자 발현 프로파일을 나타내는 것인, 면역 세포.
64. 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포가 약 0.025의 생산적 심슨 클론형성능 값을 나타내는 것인, 면역 세포.
65. 제60항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포가, 간질 세포를 사용하여, 메틸트랜스퍼라제의 억제 없이 분화된 면역 세포에 비해 적어도 3개 뉴클레오티드가 더 긴 T 세포 수용체(TCR) 상보성 결정 영역(CDR)을 나타내는 것인, 면역 세포.
66. 제60항 내지 제65항 중 어느 한 항의 면역 세포 또는 이의 집단을 포함하는 조성물.
67. 제66항에 있어서,
    약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 조성물.
68. 제60항 내지 제65항 중 어느 한 항의 면역 세포 또는 이의 집단, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
69. 제68항에 있어서,
    대상체에서 세포 대체 요법에 사용하기 위한 것인, 약제학적 조성물.
70. 세포 대체 요법의 방법으로서,
    상기 방법은 제60항 내지 제65항 중 어느 한 항의 면역 세포 또는 이의 집단, 또는 제66항 내지 제67항의 조성물, 또는 제68항 내지 제69항의 약제학적 조성물을 필요로 하는 수혜 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
71. 제70항에 있어서,
    상기 수혜 대상체가 화학요법 및/또는 방사선조사를 받은 적이 있는, 세포 대체 요법의 방법.
72. 제70항에 있어서,
    상기 수혜 대상체가 면역 기능 및/또는 림프구 재구성에 결함이 있는, 세포 대체 요법의 방법.
73. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서,
    이식 전에, 상기 면역 세포 또는 이의 집단이 수혜 대상체에서 후속 생착을 촉진하기 위해 프로스타글란딘 E2 및/또는 항산화제 N-아세틸-L-시스테인(NAC)으로 생체외에서(ex vivo) 처리되는, 방법.
74. 제70항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포 또는 이의 집단이 수혜 대상체에 대해 자가의 것인, 세포 대체 요법의 방법.
75. 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포 또는 이의 집단이 수혜 대상체와 매칭되는 HLA 타입의 것인, 세포 대체 요법의 방법.
    

Images