JP7399955B2 - インビトロで肝細胞を増殖・培養する方法及び応用 - Google Patents

Description

本発明は、バイオテクノロジーの分野に属し、より具体的には、インビトロで肝細胞を増殖・培養する方法、ならびに代謝分析および細胞移植における増殖した肝細胞の用途に関する。

肝臓は、体内で最も機能的で複雑な実質臓器の一つとして、その主な機能には、炭水化物と脂質のバランスを調節することと、外因性物質の代謝と生体内変化、胆汁の生成と排泄、ビタミンの貯蔵、分泌タンパク質の合成、凝固物質の生成と除去に関与することを含み、特異性および非特異性の免疫において重要な役割を果たしている。ヒトの代謝の中心として、肝臓は、さまざまな生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしているので、多くの疾患も肝臓に影響を与える。現在、末期肝臓疾患に対して、最も効果的な治療法は肝移植であるが、ドナーの肝源が不足し、治療費が高いため、その臨床応用は大きく制限されている。近年、研究者らは肝細胞移植を使用して全肝移植を置き換えることを試みており、その有効性は臨床および動物モデルで検証されている。しかし、肝細胞移植の治療は、肝統合能力を備えたヒト肝細胞の欠如によって依然として制限されている。また、ヒト肝臓指向性病原体の宿主特異性および種間の肝臓代謝酵素の大きな違いのために、ヒト肝細胞を免疫不全動物に移植して得られたヒト化肝臓の動物は、肝感染症の研究および薬剤開発の分野で広く使用されている。したがって、高効率の肝臓再生（再増殖）能力を有するヒト肝細胞は、肝臓疾患の治療および肝臓ヒト化動物の構築において大きな需要および応用価値を有する。

細胞の不死化とは、インビトロで培養された細胞が、自発的または外部要因の影響を受けて、増殖と老化の危機から脱出し、無期限に増殖する能力を有する過程を指す。肝細胞の自発的な不死化の可能性は非常に低く、肝細胞の不死化は通常、遺伝子トランスフェクションなどの技術によって達成される。しかし、インビトロで不死化した肝細胞株の肝機能は初代肝細胞よりもはるかに低く、肝臓で大量に再生（再増殖）できることを証明する実験がない。さらに、一部の不死化細胞が、体内で腫瘍形成のリスクもある。

当業者はまた、少量のヒト肝細胞の増殖を促進するために小分子化合物と組み合わせた共培養の技術を採用して、このような培養技術の利点は、肝細胞機能の維持にあるが、増殖の倍数は小さいことと、増殖したヒト肝細胞が肝臓に統合する能力を持っていることを証明する移植実験もないことは、細胞移植療法における当該技術の適用を制限しています。

当業者はまた、ヒト肝胆管由来の前駆細胞を培養するためにオルガノイド法を採用しているが、このような培養で得られた持続可能的に増殖する肝オルガノイドの肝機能は、誘導後でも、ヒト初代肝細胞の肝機能よりはるかに劣っており、インビボで移植統合の効率は非常に低い。

当業者はまた、マウス肝細胞の肝前駆細胞へのインビトロ脱分化を行っており、このような培養技術の利点は、インビトロでの肝細胞の大規模な増殖することができ、かつ移植後に、肝臓を効率的に再生する能力が達成できる。しかしながら、この技術はインビトロでヒト肝細胞の増殖を促進することはできない。
つまり、研究者が、ヒト肝細胞培養と肝臓再生の新しいメカニズムに多くの進歩を遂げたが、現在、ヒト肝細胞を遺伝子編集なしに増殖させ続け、体内で効率的に再増殖の能力を持たせることは不可能だ。

本発明の目的としては、インビトロで肝細胞を増殖・培養する方法と応用を提供することである。

本発明の第一の態様には、インビトロで肝細胞（初代肝細胞を含む）を増殖する方法を提供し、肝細胞を、Ｗｎｔシグナル経路アクティベーターを含有する細胞培地で培養し、インビトロで増殖することを含む。

一つの好ましい例では、上記の細胞培地は、さらに、以下から選べられる組分を含む：Ｎ－アセチル－システイン、ニコチンアミド、ＦＧＦ１０、ＥＧＦ、ＨＧＦ、［Ｌｅｕ１５］－ｇａｓｔｒｉｎ Ｉ、Ａ ８３－０１、Ｙ－２７６３２の細胞培地。
もう一つの好ましい例では、上記のＷｎｔシグナル経路アクティベーターは、以下から選べられるアクティベーターを含む：Ｗｎｔ３ａ タンパク質、Ｗｎｔ３ａ馴化培地、ＣＨＩＲ、又はそれらの組み合わせ。

もう一つの好ましい例では、上記の細胞培地には、さらに、以下から選べられる細胞成長添加剤を含む：Ｎ２添加物、Ｂ２７添加物；又は、血清も含む。
もう一つの好ましい例では、上記の細胞培地には、以下から選べられる培地を基礎培地とする：ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ（例えばＲＰＭＩ１６４０）、Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｂａｓａｌ又はＦｉｓｃｈｅｒｓ；好ましくに、上記のＤＭＥＭは、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２から選べられる。

もう一つの好ましい例では、上記の方法は、さらに以下の内容を含む：増殖された肝細胞を成熟肝細胞に誘導する；上記の細胞培地にフォルスコリン、デキサメタゾン、オンコスタチンＭを添加する。

もう一つの好ましい例では、細胞培地における上記の組分の濃度は：
[組１]

もう一つの好ましい例では、上記のＷｎｔ３ａタンパク質、Ｗｎｔ３ａ馴化培地、ＣＨＩＲからの一つを選べられてもよく、或いはそれらの組み合わせを選べられてもよい。
もう一つの好ましい例では、上記のＮ２添加物の使用量は、１Ｘである。
もう一つの好ましい例では、上記のＢ２７添加物の使用量は、１Ｘである。

もう一つの好ましい例では、上記の方法は、以下の内容も含む：増殖した肝細胞を継代培養する；好ましくに、低酸素状態で継代培養を行い、上記の低酸素とは、体積比で、０～１５％の酸素含有量を指す；好ましくに、酸素含有量は、１０％より低いであり、より好ましくに、酸素含有量は、６％より低いであり、例えば１％、２％、３％、４％である；好ましくに、上記の培養は、三次元の条件での培養である。

もう一つの好ましい例では、上記の肝細胞は、ヒト肝細胞であり、ヒト初代肝細胞を含む。

本発明のもう一つには、前記のいずれか一つの方法で得られた肝細胞培養物又は当該肝細胞培養物から単離・精製された肝細胞を提供する。
一つの好ましい例では、上記の肝細胞は、成熟肝細胞および肝前駆細胞との間にある中間状態細胞である。

もう一つの好ましい例では、上記の肝細胞は、成熟肝細胞である；好ましくに、それが、成熟肝細胞に特有の典型的な多角形と二重の核を有し、その肝前駆体遺伝子（例えばＳＯＸ９、ＣＫ１９或ＣＫ７）は、低いレベルに発現し、薬物と尿素の代謝に関与するキー遺伝子は、高いレベルに発現し、ＣＹＰ２Ｂ６と尿素の代謝能力が増加する。

本発明のもう一つには、上記の肝細胞培養物または単離・精製された肝細胞の用途を提供し、当該用途は：肝臓の再生を促進する薬物の調製における用途；肝臓疾患（肝臓の損傷、肝臓がん、肝硬変などを含む）を予防、緩和又は治療する薬物組成物又はキットの調製における用途；インビトロモデルとして、肝臓に関連する疾患又は薬物に対する研究における用途；生体内の細胞移植の組成物の調製における用途；或いはＡｌｂｕｍｉｎタンパク質の産生における用途。

一つの好ましい例では、上記の肝臓に関連する疾患又は薬物的研究は、薬物の送達、薬物の代謝、肝臓の形成、肝臓の再生に対する研究；或いは肝毒性試験、肝細胞毒性物質のスクリーニング、肝細胞機能を調節する物質のスクリーニングである。
本発明のもう一つには、薬物組成物を提供し、ただし、上記の肝細胞培養物又は単離・精製された肝細胞；及び薬学的に許容される担体を含む。

本発明のもう一つには、キットを提供し、ただし、上記の肝細胞培養物又は単離・精製された肝細胞を含む；或いは上記の薬物組成物を含む。

本発明のもう一つには、インビトロで肝細胞を増殖するための培地を提供し、Ｗｎｔシグナル経路アクティベーター、Ｎ－アセチル－システイン、ニコチンアミド、ＦＧＦ１０、ＥＧＦ、ＨＧＦ、［Ｌｅｕ１５］－ガストリン Ｉ、Ａ ８３－０１、Ｙ－２７６３２の細胞培地を含む；ただし、上記のＷｎｔシグナル経路アクティベーターは、Ｗｎｔ３ａタンパク質、Ｗｎｔ３ａ馴化培地、ＣＨＩＲ、又はそれらの組み合わせから選べられる。

一つの好ましい例では、上記の培地は、さらに以下の組分を含む：Ｎ２添加物、Ｂ２７添加物、血清。

本発明のもう一つには、インビトロで肝細胞を増殖すると肝細胞の成熟を誘導するための培地を提供し、上記のインビトロで肝細胞を増殖する培地、及びフォルスコリン、デキサメタゾン、オンコスタチンＭを含む。

一つの好ましい例では、上記のＷｎｔシグナル経路アクティベーター、Ｎ－アセチル－システイン、ニコチンアミド、ＦＧＦ１０、ＥＧＦ、ＨＧＦ、［Ｌｅｕ１５］－ガストリン Ｉ、Ａ ８３－０１、Ｙ－２７６３２の細胞培地。

もう一つの好ましい例では、上記のＷｎｔシグナル経路アクティベーターは、Ｗｎｔ３ａタンパク質、Ｗｎｔ３ａ馴化培地、ＣＨＩＲ、又はそれらの組み合わせから選べられる。

もう一つの好ましい例では、上記の培地には、さらにＮ２添加物、Ｂ２７添加物、血清、フォルスコリン、デキサメタゾン、オンコスタチンＭを含む。

もう一つの好ましい例では、各組分は、有効量のものである。

もう一つの好ましい例では、上記の細胞培地には、上記の組分は、基礎培地に存在し、上記の基礎培地は、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ（如ＲＰＭＩ１６４０）、Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｂａｓａｌ又はＦｉｓｃｈｅｒｓから選べられる；好ましくに、上記のＤＭＥＭは、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２から選べられる。

本発明のもう一つには、前記のいずれか一つの培地の用途を提供し、インビトロで肝細胞を増殖すると肝細胞の成熟に誘導することにおける用途である。
本発明のもう一つには、インビトロで肝細胞を増殖すると肝細胞の成熟を誘導するためのキットを提供し、ただし、前記のいずれか一つの培地を含む。
本文に開示された内容に基づき、当業者にとって、本発明の他の面は自明なものである。

ＨＭ培地と低酸素の組み合わせでの培養が、インビトロで、長期間にわたってヒト肝細胞の増殖を促進できる。 Ａ、ＨＭ培地に、インビトロでヒト肝細胞を５日培養の定期的な写真記録。スケールバー、２００ｕｍ。 Ｂ、ＨＭ培地に、インビトロでヒト肝細胞を５日培養し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＦＬＲで定期的な細胞融合分析を行った。 Ｃ、インビトロでヒト肝細胞を培養する３日目に、Ｂｒｄｕ及びＫｉ６７細胞免疫蛍光染色で、細胞の増殖を分析した。マウス肝細胞培地ＹＡＣを、陰性コントロールとする。スケールバー、１００ｕｍ。 Ｄ、インビトロでヒト肝細胞を通常の酸素で培養する２世代目と５世代目である場合と、低酸素（１世代目から低酸素である）で培養する６世代目である場合に、ＳＡ－β－ｇａｌ染色で細胞老化の状況を分析した。 Ｅ、低酸素（１世代目から低酸素である）と通常の酸素の状況で、インビトロで異なる代数の肝細胞を増殖する細胞の数を統計した。 Ｆ、低酸素（１世代目から低酸素である）の培養で、インビトロで異なるドナー（ドナーコード名：ＪＦＣ、ＴＶＲ、ＤＶＡ、ＥＹＰ、ＱＩＥ、ＸＪＬ、ＴＬＹ）由来の肝細胞を増殖する細胞の数を統計した。 ＨＭ培地の組分として、Ｗｎｔ３ａは、肝細胞の増殖を促進するために必要なものである。 Ａ、Ｗｎｔ３ａ馴化培地を含むＨＭ培地、Ｗｎｔ３ａ馴化培地を去除したＨＭ培地、Ｗｎｔ３ａ馴化培地の代わりにＷｎｔ３ａ精製タンパク質を使用して配置したＨＭ培地と、Ｗｎｔ３ａ馴化培地の代わりにＣＨＩＲを使用して配置したＨＭ培地で、ヒト肝細胞を培養した６日後の細胞状態写真。 Ｂ、Ｗｎｔ３ａ馴化培地を含むＨＭ培地、Ｗｎｔ３ａ馴化培地を去除したＨＭ培地、Ｗｎｔ３ａ馴化培地の代わりにＷｎｔ３ａ精製タンパク質を使用して配置したＨＭ培地と、Ｗｎｔ３ａ馴化培地の代わりにＣＨＩＲを使用して配置したＨＭ培地で、ヒト肝細胞を培養した６日後の増殖倍数。 増殖したヒト肝細胞が、一部の成熟肝細胞の機能を維持している。 Ａ、異なる代数に増殖したヒト肝細胞（ＰｒｏｌｉＨＨ）における肝細胞遺伝子発現。データは、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の発現量を１とし、正規化された。Ｐ１～Ｐ４は、１世代目～４世代目を表す。 Ｂ、ＰｒｏｌｉＨＨに対して、ＡＬＢとＡＡＴ免疫蛍光共局在染色を行った。スケールバー、１００ｕｍ。 Ｃ、ＰｒｏｌｉＨＨ、ＰＨＨ、ｈｉＨｅｐとｈｉＰＳＣ－Ｈｅｐの全ゲノム遺伝子発現プロファイルに対して、主成分及びクラスター分析を行った。 Ｄ、遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）より、ＰＨＨに対してＰｒｏｌｉＨＨが濃縮している遺伝子経路を特定した。 Ｅ、ＥＬＩＳＡ法より、異なる世代のＰｒｏｌｉＨＨのヒトアルブミンの分泌量を分析した。 Ｆ、過ヨウ素酸シッフ染色とオイルレッド染色を使用して、４世代目ＰｒｏｌｉＨＨのグリコーゲン貯蔵能と脂肪滴蓄積能を特定した。 増殖したヒト肝細胞は、成熟肝細胞と肝前駆細胞この両者の中間状態にある。 Ａ、ＲＮＡシーケンス結果に基づき、ＰｒｏｌｉＨＨ及びＰＨＨにおける肝前駆細胞の特徴遺伝子の発現を分析した。 Ｂ、ＰｒｏｌｉＨＨに対して、ＡＬＢ、ＣＫ１９、ＣＫ７とＳＯＸ９免疫蛍光共局在染色を行った。スケールバー、１００ｕｍ。 Ｃ．ベン図で、ＰＨＨに対して、ＰｒｏｌｉＨＨとＬＰＣの発現がアップレギュレートされている（アップレギュレーション倍数＞＝３）遺伝子の数と共通部分を分析した。 Ｄ、クラスターで、ＰＨＨ、ＰｒｏｌｉＨＨとＬＰＣにおけるＬＰＣが濃縮している遺伝子の発現を分析した。 Ｅ、遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）より、ＬＰＣ濃縮遺伝子セットＩとＩＩにおける濃縮したシグナル経路を特定した。 Ｆ、ＰｒｏｌｉＨＨ、ＰＨＨ、ｈｉＨｅｐとｈｉＰＳＣ－Ｈｅｐの全ゲノム遺伝子発現プロファイルに対して、主成分及びクラスター分析を行った。 インビトロで、増殖したヒト肝細胞は、成熟肝細胞に誘導することができる。 Ａ、インビトロでＰｒｏｌｉＨＨの成熟誘導のフローチャート。ＰｒｏｌｉＨＨを、まずＨＭで増殖・培養し、そしてＨＩＭと３Ｄ培養条件との組み合わせで、インビトロで、肝向け成熟を誘導した。 Ｂ、インビトロで成熟誘導されないＰｒｏｌｉＨＨと、インビトロで３Ｄ成熟誘導されたＰｒｏｌｉＨＨの肝臓オルガノイドの代表的な図。黒い矢印は二核細胞を示す。スケールバー、１００ｕｍ。 Ｃ、インビトロで肝向け成熟誘導１０日後に、ＰｒｏｌｉＨＨの肝細胞遺伝子発現。データは、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の発現量を１とし、正規化された。 Ｄ、インビトロで肝向け成熟誘導１０日後に、ＰｒｏｌｉＨＨの肝前駆体細胞遺伝子発現。データは、ＨＭで培養されたＰｒｏｌｉＨＨの発現量を１とし、正規化処理された。 Ｅ、インビトロで誘導成熟したＰｒｏｌｉＨＨのＣＹＰ２Ｂ６代謝活性に対して、液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析によって、ヒドロキシブプロピオン（ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｐｒｏｐｉｏｎ）代謝産物を検測した。ＰＨＨを、陽性コントロールにする。 Ｆ、インビトロで成熟誘導した後に、ＰｒｏｌｉＨＨの尿素代謝能を検測した。 ＨＩＭが肝細胞の成熟を促進する要因の特定。増殖した肝細胞ＰｒｏｌｉＨＨを、３Ｄ培養条件において肝臓オルガノイドを形成し、それぞれに、ＨＭとＨＩＭで培養した。定量ＰＣＲで肝細胞のキー代謝遺伝子ＣＹＰ３Ａ４及び肝前体遺伝子ＳＯＸ９、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＫ１９、ＣＫ７の発現を検測した。 インビトロで、増殖したヒト肝細胞は、成熟肝細胞に誘導することができる。 Ａ、移植されない細胞と移植したＰｒｏｌｉＨＨとＰＨＨのＦＲＧマウスのＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線。 Ｂ、ＰｒｏｌｉＨＨ（ｎ＝４）とＰＨＨ（ｎ＝６）を移植したＦＲＧマウスの体重変化曲線。 Ｃ、細胞を移植せずに死にかけている（ｎ＝３）、ＰｒｏｌｉＨＨ（ｎ＝３）及びＰＨＨ（ｎ＝４）を移植して生き残るＦＲＧマウス血清におけるＡＬＴ、ＡＳＴとＴＢＩＬレベル。 Ｄ、ＥＬＩＳＡで、ＰｒｏｌｉＨＨ（ｎ＝４）及びＰＨＨ（ｎ＝５）を移植したＦＲＧ血清におけるヒトアルブミン分泌量の動的変化を検測した。 Ｅ、ＰｒｏｌｉＨＨ（ｎ＝４）及びＰＨＨ（ｎ＝５）を移植して４ヶ月生き残るマウス血清におけるヒトアルブミンの分泌量。 Ｆ、ＰｒｏｌｉＨＨ及びＰＨＨを移植して４ヶ月生き残るマウスの肝臓Ｆａｈ免疫組織化学染色。 Ｇ、Ｆａｈ免疫組織化学染色で、ＰｒｏｌｉＨＨ及びＰＨＨの、ＦＲＧ肝臓における再増殖効率を定量的に分析した。 増殖したヒト肝細胞を体内に移植し、肝機能が完全に成熟した。 Ａ、体内で再増殖したＰｒｏｌｉＨＨに対して、Ｆａｈ、ＡＬＢ、ＨＮＦ４ａ、ＣＫ１９とＣＫ７免疫蛍光共局在染色を行った。 Ｂ、Ｆａｈ、ＣＹＰ３Ａ４とＧＳ免疫蛍光共局在染色で、肝臓代謝遺伝子の局所的な発現を分析した。 Ｃ、成熟の肝細胞機能遺伝子、例えばＩ、ＩＩフェーズ代謝酵素と、トランスポーターが、インビトロのＰＨＨ、ＰｒｏｌｉＨＨと、体内で再増殖したＰＨＨ、ＰｒｏｌｉＨＨにおける発現を比較した。 Ｄ、インビトロのＰＨＨ、ＰｒｏｌｉＨＨと、体内で再増殖したＰＨＨ、ＰｒｏｌｉＨＨとの全ゲノム発現プロファイルの類似性分析。 Ｅ、ＰｒｏｌｉＨＨを移植したＦＲＧマウスに対して、ヒト特異性ＣＹＰ２Ｄ６の薬物代謝能を分析した。コントロールとするＦＲＧマウス（ｎ＝３）と、ＰｒｏｌｉＨＨ（ｎ＝３）を移植したＦＲＧマウスに対して、２ｍｇ／ｋｇ ＤＥＢ注射の０－２時間後に、血清におけるＤＥＢと４－ＯＨ ＤＥＢ濃度を検測した。 増殖されたヒト肝細胞には、体内で腫瘍形成リスクがない。２ｘ１０^６のＰｒｏｌｉＨＨ（ｎ＝８）と肝臓がん細胞株Ｓｎｕ－３９８（ｎ＝６）を、重症免疫不全症のＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの皮下鼠径部に注射し、２ヶ月後に腫瘍形成を観察した。

本発明者らは、再生におけるヒト肝細胞の可塑性に基づいて、ヒト肝細胞を成熟肝細胞と肝前駆細胞との間の増殖性中間状態細胞に再プログラミングするための培養システムを確立し、そして、動物におけるその肝臓再生能を検証し、遂に、肝臓再生能を持つヒト肝細胞の欠如の問題を解決した。本発明の方法は、外来遺伝子を肝細胞に導入する必要がなく、従来の培養で肝細胞の増殖を実現でき、得られた肝細胞を継代することができる上に、それはまた、機能的なヒト肝成熟細胞を得るために成熟・培養し続けることができる。さらに、この方法は、簡単な培養条件、低コスト、安全性および安定性を備える。

本発明に使用されるように、用語「含む」または「有する」は、「含む」、「主に～構成する」、「基本的に～からなる」および「からなる」を含む。
特に明記しない限り、本発明に培養されるものは、肝細胞、特に初代肝細胞、より特にヒト肝細胞、ヒト初代肝細胞である。

培養方法
本発明は、インビトロで肝細胞を増殖する方法を開示する：肝細胞を、本発明の「肝細胞培地（インビトロ増殖培地）」に培養し、多量の成熟肝細胞と肝前駆細胞の間にある中間状態細胞を得る。本発明の一部の実施形態において、それが、肝前駆細胞に関連するマーカーとするタンパク質ＳＯＸ９、ＣＫ１９とＣＫ７を発現することは見られ、そのＡＬＢ、ＨＮＦ４Ａ、ＴＴＲ又はＣＹＰ３Ａ４発現レベルは、初代肝細胞より低く、そのＣＹＰ１Ａ２、ＣＡＲ、Ｃ３又はＵＧＴ１Ａ１発現レベルは、初代肝細胞に近い或いはこれより高い。これらの細胞を、さらに肝成熟細胞に誘導することができる。

上記のインビトロで肝細胞を増殖する方法が、肝細胞を、Ｗｎｔシグナル経路アクティベーターを含有する細胞培地で培養し、インビトロで増殖することを含む。上記のＷｎｔシグナル経路アクティベーターは、以下から選べられるアクティベーターを含む：Ｗｎｔ３ａ タンパク質、Ｗｎｔ３ａ馴化培地、ＣＨＩＲ、又はそれらの組み合わせ。上記のＷｎｔシグナル経路アクティベーターは、本発明の方法における肝心な要因である。本発明者の実験結果によって、培地にＷｎｔシグナル経路アクティベーターを含まないと、優れた増殖を得られない。

本発明の好ましい方式として、上記の細胞培地は、さらに、以下から選べられる組分を含む：Ｎ－アセチル－システイン、ニコチンアミド、ＦＧＦ１０、ＥＧＦ、ＨＧＦ、［Ｌｅｕ１５］－ｇａｓｔｒｉｎ Ｉ、Ａ ８３－０１、Ｙ－２７６３２の細胞培地、Ｎ２添加物、Ｂ２７添加物、血清。最も好ましい方式において、上記の細胞培地は、すべての上記の組分を含む。

本発明の好ましい方式として、上記の方法は、さらに以下の内容を含む：増殖された肝細胞を成熟肝細胞に誘導し、本発明の「肝細胞誘導培地（肝向け成熟培地）」で培養することを含む；上記のインビトロ増殖培地と比較して、上記の肝向け成熟培地にＦｏｒｓｋｏｌｉｎ、デキサメタゾン、オンコスタチンＭを添加する。本発明の一部の実施形態において、上記の肝細胞が、成熟肝細胞に特有の典型的な多角形と二重の核を有し、その肝前駆体遺伝子（例えばＳＯＸ９、ＣＫ１９或ＣＫ７）は、低いレベルに発現し、薬物と尿素の代謝に関与するキー遺伝子は、高いレベルに発現し、ＣＹＰ２Ｂ６と尿素の代謝能力が増加することは見られる。

本発明者らは、研究において、低酸素処理が、本発明で培養された肝細胞の継代回数を増加させるのに有益であることを予期せず発見した。したがって、本発明の好ましい方式において、低酸素状態で継代培養を行い、上記の低酸素とは、体積比で、０～１５％の酸素含有量を指す；好ましくに、酸素含有量は、１０％未満であり、より好ましくに、酸素含有量は、６％未満である。

本発明の培養方法及び培地を採用する際に、二次元又は三次元培養システムで培養しても良い。本発明の好ましい方式として、上記の培養は、三次元での培養である。

本発明の方法で得られた成熟肝細胞は、凍結され、蘇生され、継代され、そして培養において長期間維持され得る。さらに、本発明において、出発株として使用される肝細胞（初代肝細胞）は、確立された初代肝細胞であり得るか、または生物から単離され得ることも理解されるべきである。

培地
本発明者が、インビトロで肝細胞を増殖する培地を提供する。上記の培地は、「インビトロ増殖培地」と「肝向け成熟培地」を含む。

上記のインビトロ増殖培地は、Ｗｎｔシグナル経路アクティベーターを含む上に、さらに以下から選べられる組分も含む：Ｎ－アセチル－システイン、ニコチンアミド、ＦＧＦ１０、ＥＧＦ、ＨＧＦ、［Ｌｅｕ１５］－ガストリン Ｉ、Ａ ８３－０１、Ｙ－２７６３２、Ｎ２添加物、Ｂ２７添加物、血清。これにより、肝細胞が十分に増殖する。

上記の肝向け成熟培地は、上記のインビトロ増殖培地を基礎とする上に、フォルスコリン、デキサメタゾン、オンコスタチンＭを添加してなるものである。

本発明の実施例に挙げられた具体的なＷｎｔシグナル経路アクティベーターを除き、他の活性化できるＷｎｔシグナル経路のアクティベーターも同じ技術効果を達成できるので、本発明に含まれることを理解されるべきである。好ましくは、上記のＷｎｔシグナル経路アクティベーターは、以下から選べられるアクティベーターを含む：Ｗｎｔ３ａ タンパク質、Ｗｎｔ３ａ馴化培地、ＣＨＩＲ、又はそれらの組み合わせである。

同様に、上記に具体的に挙げられた組分の類似体、同種機能性タンパク質（例えば、成長因子の同種機能性タンパク質）または化合物、同じ標的を誘導する同等化合物、類似体、誘導体、および／またはそれらの塩、水和物または前駆体は、上記の組分を置き換えることに用いられ、同じ技術的効果を達成することもできる。これらの類似体、同種機能性タンパク質または化合物も、本発明に含まれる。化合物の類似物は、化合物の異性体、ラセミートを含むが、それらに限定されない。化合物は、一つと以上の非対称センターを有する。したがって、これらの化合物は、ラセミート混合物、単独のエナンチオマー、単独のジアステレオマー、ジアステレオマー混合物、シスまたはトランス異性体として存在してもよい。上記の「塩」は、（１）塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などのような無機酸と形成した塩；（２）酢酸、蓚酸、コハク酸、酒石酸、メタンスルホン酸、マレイン酸、アルギニンなどのような有機酸と形成した塩を含むが、これらに限定されない。他の塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属（例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、又はマグネシウム）と形成した塩などを含む。「化合物の前駆体」とは、適切な方法によって投与または処理されたあとに、当該化合物の前駆体が、培地において、上記のいずれ一つの化合物に転換できる化合物の一つであり、又は上記の化合物のいずれ一つの化合物が組成する塩又は溶液を指す。

本発明の好ましい方式として、上記の培地には、細胞培養の細菌汚染、特にグラム陽性菌と陰性菌の汚染を予防するために使用される組分も添加される。好ましくに、ペニシリン（例えば１％；ただし、百分含有量は、プラスマイナス５０％の差を有しても良い；好ましくに、プラスマイナス３０％の差を有しても良い；より好ましくに、プラスマイナス２０％、例えば１０％、５％の差を有しても良い）を添加する。

上記の基礎細胞培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｂａｓａｌ又はＦｉｓｃｈｅｒｓなどであっても良くが、これらに限定されない。理解すべきことは、当業者は、上記の基礎細胞培地の調製又は購入方式を熟知するから、基礎細胞培地は、本発明に挙げられたものに限定されない。

本発明は、さらに、キットを提供し、その中に、本発明に記載された「インビトロ増殖培地」又は「肝向け成熟培地」を含む。好ましくに、上記のキットには、ユーザーマニュアルを含み、そして、当業者は研究または臨床で使用するのに便利である。

培養された肝細胞及び組成物
本発明の新しい発見によって、本発明に記載された方法で得られる肝細胞培養物、又は当該肝細胞培養物から単離・精製された肝細胞（成熟肝細胞と肝前駆細胞の間にある中間状態細胞を含む）、或さらに誘導してなる成熟肝細胞を提供する。

細胞培養物から細胞を濃縮又は単離・精製する方法は、当業者に熟知され、例えば、肝細胞の類上皮形態に基づき濃縮しても良い；或いは、肝細胞において発現された特別なタンパク質（例えばＡｌｂｕｍｉｎなど）又は分子マーカーに基づき、選択、収集しても良い（例えば、特異性抗体又は配体を使用する）。なお、非上皮形態の他の細胞を除去（例えば、消化、溶解）することで肝細胞を濃縮するでも可能な方法である。代替の実施形態として、フローサイトメトリーを使用して、肝細胞の表面上の分子マーカーを介して細胞を単離・精製することができる。

本発明で培養された肝細胞は多くの用途を有する。例えば：肝臓の再生を促進する組成物（薬物組成物）の調製における用途；肝臓の損傷（末期肝疾患、肝硬変、アルコール性肝、糖尿病、肥満、急性肝不全、肝炎、肝線維症、肝がん、肝代謝性疾患または肝不全による肝障害を含むが、これらに限定されない）を治療する組成物（薬物組成物）の調製における用途；インビトロモデルとして、肝臓に関連する疾患又は薬物に対する研究（例えば薬物の送達、薬物の代謝、肝臓の形成、肝臓の再生に対する研究、或いは肝毒性試験、肝細胞毒性物質のスクリーニング、肝細胞機能を調節する物質のスクリーニング）における用途；或いはＡｌｂｕｍｉｎタンパク質の産生における用途、を含むが、これらに限定されない。

本発明で培養された肝細胞は、肝毒物学研究に使用することができ、肝疾患を治療するための細胞移植、バイオ人工肝構築、新薬肝毒性検出、薬効評価、薬標的同定にも使用することができる；生物学、医学および薬局の基礎研究および臨床応用に、十分な肝細胞源または肝細胞モデルを提供することができる；その誘導・分化プロセスはまた、ヒト肝細胞の発育・分化プロセスのための最良の研究プラットフォームを提供することができ、その応用の見通しは非常に広い。

必要があれば、本発明で培養された肝細胞は、さらに遺伝子工学組換えに応用し、組換え細胞を形成してもよく、例えば、細胞にさらなる機能や特徴を与えるために、外来遺伝子発現カセットを細胞に導入しても良く、或いは、細胞のゲノムに対して遺伝子ノックアウトや遺伝子編集を行っても良い。

本発明は、さらに組成物（薬物）を提供し、上記の組成物は、有効量の上記の肝細胞（例えば１×１０^４－１×１０^１２個；好ましくに１×１０^５－１×１０^１０個）；及び薬学的に許容される担体を含有する。それが、有効量の上記の肝細胞及び薬学的に許容される担体を含有する。上記の組成物は、動物に対する目に見える毒性および副作用を有さない。

上記の「有効量」とは、人及び／又は動物に、機能できる又は活性を有する、かつ人及び／又は動物に許容される量である。上記の「薬学的に許容される担体」とは、治療剤の投薬に用いられる担体を指し、各種な賦形剤と希釈剤を含む。当該用語が、それ自体が必須の有効成分ではないが、投与後に過度に毒性がないいくつかの医薬品担体を指す。適当な担体は、当業者に熟知される。組成物には、薬学的に許容される担体が、液体、例えば水、塩水、バッファを含んでも良い。さらに、これらの担体はまた、補助物質、例えば充填剤、潤滑剤、流動促進剤、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などを含んでも良い。上記の担体には、さらに細胞トランスフェクション剤を含んでも良い。

本発明は、さらに肝臓の再生を促進する方法を提供し、上記の方法は、治療が必要な対象に、有効量の本発明で培養された肝細胞を投与することを含む。
上記の組成物を投薬に使用される場合、通常に、１×１０^２－１×１０^１０個細胞／ｋｇ体重、好ましくは１×１０^３－１×１０^８個細胞／ｋｇ体重は適切であり、臨床医の診断および患者の症状の重症度に依存する。

本発明は、さらにキットを提供し、その中に、本発明で培養された肝細胞を含有し、或いは当該肝細胞の組成物を含有する。好ましくは、上記のキットには、ユーザーマニュアルを含み、そして、当業者は研究または臨床で使用するのに便利である。

以下、具体的な実施例を参照して、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の単なる例示であることが理解されるべく。以下の実施例における特定の条件を特定しない実験方法は、通常に、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ、２００２に記載された通常条件に従って実施され、或いはメーカーが推奨する条件に従って実施される。

材料と方法
１、実験材料
１．１ 肝細胞培地
肝細胞培地（インビトロ増殖培地、ＨＭ）の配合及び来源は、表１に示された。ただし、各配合の作業濃度は、培地中の最終濃度である。

＊当該組分は、３０％ Ｗｎｔ３ａ馴化培地又は０．１ｕＭ ＣＨＩＲに代わられても良い。ただし、Ｗｎｔ３ａ馴化培地は、２日間の培養後のＬ－Ｗｎｔ３ａ細胞株（ＨｕｂｒｅｃｈｔＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＨａｎｓＣｌｅｖｅｒｓ研究室から入手）によって生成された細胞上清から採取された。

１．２肝細胞誘導培地
肝細胞誘導培地（肝向け成熟培地、ＨＩＭ）の配合及び来源は、表２に示された。ただし、各配合の作業濃度は、培地中の最終濃度である。

＊当該組分は、３０％ Ｗｎｔ３ａ馴化培地又は０．１ｕＭ ＣＨＩＲ（ＣＨＩＲ９９０２１）に代わられても良い。ただし、Ｗｎｔ３ａ馴化培地は、２日間の培養後のＬ－Ｗｎｔ３ａ細胞株（ＨａｎｓＣｌｅｖｅｒｓ研究室から入手）によって生成された細胞上清から採取された。

１．３ コントロール培地：培地ＹＡＣ
[組２]

１．４ 細胞
異なるロット番号のヒト肝細胞は、米国のＣｅｌｓｉｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｌａｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）から購入した。Ｌ－Ｗｎｔ３ａ細胞株は、Ｈａｎｓ Ｃｌｅｖｅｒｓ研究室から入手した。Ｓｎｕ－３９８細胞株は、米国のＡＴＣＣセルバンクから購入した。

１．５動物
Ｆａｈ^－／－ Ｒａｇ２^－／－ＩＬ２ｒｇ^－／－（ＦＲＧ）マウス：フマリルアセトアセターゼ（ＦＡＨ）ノックアウトマウス（略語：Ｆａｈ^－／－マウス）は、１９９３年に確立された。Ｆａｈ－／－マウスは、完全なチロシン代謝をできないので、肝臓にスクシニルを蓄積し、肝臓実質細胞の死をもたらす。ＮＴＢＣを添加した飲料水で飼育されたＦａｈ^－／－マウスは、野生型マウスと表現型に明らかな違いはなく、正常な肝機能を有し、正常に発育および繁殖できるが、ＮＴＢＣの給餌を停止してから４～６週間以内に肝不全で死亡する。Ｆａｈ^－／－マウスは広範囲かつ継続的な肝障害があり、その肝臓微小環境は移植細胞の増殖に特に適し、野生型肝細胞（正常なＦＡＨ遺伝子発現を有する）は、脾臓移植を経った後にＦａｈ^－／－マウスの脾臓をほぼ完全（９０％以上）に再構築でき、アクセプターとするマウスは正常な肝機能に戻った。Ｆａｈ^－／－マウスとＲａｇ２^－／－ＩＬ２ｒｇ^－／－免疫不全マウスとを交配した後、３つの遺伝子ノックアウトを有するＦａｈ^－／－Ｒａｇ２^－／－ＩＬ２ｒｇ^－／－マウス（ＦＲＧマウス）が得られた。ＦＲＧマウスは、成熟したＴ、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞を欠いて、ヒト肝細胞の移植後、ヒト肝細胞を高度（＞９０％）に再増殖することができる。

２．実験方法
２．１ヒト肝細胞培養
冷凍ヒト肝細胞は、米国のＣｅｌｓｉｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｌａｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）から購入した。凍結したヒト肝細胞を１０％血清を含むＤＭＥＭ培地で蘇生し、２×１０^４細胞／ｃｍ^２の密度でＩ型コラーゲンでコーティングされた培養プレートに植え、培養プレートを３７℃、５％ＣＯ_２、５％Ｏ_２のインキュベーターで培養し、１日培養後に肝細胞培養培地に交換し、３日ごとに細胞培養培地を交換した。細胞培養の６日後、生い茂った細胞をトリプシン処理し、Ｉ型コラーゲンでコーティングされた培養プレート上に３×１０^４細胞／ｃｍ^２の密度で再び植え、培養プレートを３７℃、５％ＣＯ_２、５％Ｏ_２のインキュベーターで培養した。

２．２増殖肝細胞の肝向け誘導実験
増殖されたヒト肝細胞を培養し、いっぱいになった後、細胞をトリプシン処理し、細胞を肝細胞培養培地に再懸濁し、５×１０^５細胞／ウェルの密度で日本のＥｌｐｌａｓｉａ会社の非付着２４ウェルプレートに植え、１日後、細胞培養培地を肝細胞の肝向け誘導培地に交換し、細胞はゆっくりと凝集して細胞球になった。培地を２日ごとに交換し、細胞誘導の１０日後に誘導された細胞を収集した。

２．３細胞培養、写真を撮る
凍結したヒト肝細胞を１０％血清を含むＤＭＥＭ培地で蘇生し、２×１０^４細胞／ｃｍ^２の密度でＩ型コラーゲンをコーティングした６ウェルプレートに植えった。細胞が壁に付着した後、培地を肝細胞培養に変更し、細胞プレートをｉｎｃｕＣｙｔｅ ＦＬＲ装置の３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで培養し、細胞を３日間連続して培養し、同じ視野の細胞を３０分ごとに写真を撮った。細胞培養・増殖のビデオはソフトウェアによって生成される。

２．４ 遺伝子発現の検測
１）Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＲＮｅａｓｙ ＦＦＰＥ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）試薬を使用して、細胞ＲＮＡを抽出した。
２）Ｔｒｉｚｏｌで抽出されたＲＮＡから１ ｕｇを取って、ＲＮｅａｓｙＦＦＰＥキットで抽出されたＲＮＡから、１ｕｇの特定の値またはすべてを取って、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）キットでｃＤＮＡを得た。
３）リアルタイム定量ＰＣＲにはＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）キットを使用し、遺伝子発現の検出にはＡＢＩ ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。すべてのＱ－ＰＣＲデータには少なくとも２回の繰り返しがあり、プライマー配列は表３に示された。

２．５ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ検測
検出にはＡＬＢＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。

２．６ 尿素検測実験
培養された細胞の尿素分泌能を検出するために、細胞の２４時間の細胞培養上清を採取し、Ａｂｎｏｖａ会社製の尿素検出キットを用いて、実験操作過程に従って実験を行った。

２．７ ＰＡＳ染色とオイルレッド染色
細胞のＰＡＳ（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ Ａｃｉｄ－Ｓｃｈｉｆｆ ｓｔａｉｎ、過ヨウ素酸シッフ染色）染色は、Ｓｉｇｍａ会社の実験キットに従って使用された。細胞をオイルレッド染色し、細胞から細胞培養液を吸引し、ＰＢＳで洗浄した。４％パラホルムアルデヒドを加え、細胞を３０分間固定し、パラホルムアルデヒドを除去し、ＰＢＳで３回洗浄した。オイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で１０分間染色し、７０％エタノール溶液で２回洗浄し、顕微鏡で観察して写真を撮った。

２．８ 老化に関連するβ－ガラクトシダーゼ染色
細胞老化に関連するβ－ガラクトシダーゼ染色し、細胞プレート内の細胞から細胞培養培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した。４％パラホルムアルデヒドを加え、細胞を５分間固定し、パラホルムアルデヒドを除去し、ＰＢＳで３回洗浄した。β－ガラクトシダーゼ染色キット（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ）の指示に従い、顕微鏡で観察して写真を撮った。

２．９ ＣＹＰ２Ｂ６ 代謝実験
増殖されたヒト肝細胞のＣＹＰ２Ｂ６代謝能を検出するために、１０日間の肝向け誘導後、細胞と新たに蘇生されたヒト肝細胞を、それぞれに１００μｍのブプロピオンを含む培地にインキュベートし、インキュベーションの異なる時点での培養上清を採取した。細胞上清をＲｕｉｄｅＬｉｖｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ会社に送って、質量分析を使用してＣＹＰ２Ｂ６代謝物の生成を検出した。産物は、市販の標準を使用して標準曲線を描いた。

２．１０ ＲＮＡシーケンスプロセス
実験手順に従って、細胞ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）試薬で抽出した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｔｒａｓｅｑ ＲＮＡサンプル前処理キットを使用して、１マイクログラムの総ＲＮＡからシーケンスライブラリーを調製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨＩＳＥＱ２０００シーケンサーで、シングルエンドリード長１００ｂｐで実行した。Ｔｏｐｈａｔを使用して、読み取り数をヒトリファレンスゲノム（ＨＧ１９）にマッピングした。Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓを使用して、デフォルトのパラメーターを使用し、ＵＣＳＣ遺伝子のＦＰＫＭを計算した（１００万分の１のフラグメントの１００万分の１のエクソンフラグメントのマッピング）。ＦＰＫＭは、下流の遺伝子分析のためにＬｏｇ２に変換された。遺伝子発現については、一元配置分散分析を実行し、差異発現遺伝子（ＤＥＧＳ）を特定した。各分析では、Ｐ値と変化の倍数を計算する必要がある。Ｐａｒｔｅｋ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｕｉｔｅ ６．６に基づく選択されたプローブセットの平均リンケージクラスターのユークリッド距離を使用して、分類または遺伝子全体の無差別クラスタリングとヒートマップ生成を行った。

２．１１シグナル経路の濃縮分析
遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）は、ＤＥＧ経路の濃縮に使用された。ＤＥＧｓリストには、オンラインＭＳＩＧＤＢツールが使用された（ｈｔｔｐ：／／Ｓｔｕｄｉｏ．Ｏｒｇ／ｇＳｅ／ＭＳｉｇＤｂ／ ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）。ＧＳＥＡ Ｖ２デスクトップソフトウェアは、ＲＮＡＳＥＱの結果から大幅に濃縮された経路を特定することに使用された。

２．１２ 細胞移植Ｆａｈ^－／－Ｒａｇ２^－／－ＩＬ２ｒｇ^－／－マウス
１）細胞移植の６日前に、飲料水中のＮＴＢＣの濃度を除去することにより、マウスの肝障害が引き起こされた。
２）マウスの脾臓側を上に向けて、肋骨の１～２ｃｍ下の表皮と筋層を切り取った。脾臓に付着している褐色脂肪を見つけ、それを引き出して脾臓を引き出した。脾臓の前端を糸で軽く結紮した。
３）５×１０^５のｐｒｏｌｉＨＨまたはヒト初代肝細胞（約１００ｕｌ）をインスリン針で採取し、結紮位置を超えて脾臓に針を挿入した。注入が完了したら、３０～６０秒間一時停止し、針を抜いて糸をしっかりと結び、液体が逆流しないようにした。
４）脾臓を腹腔に入れ、筋肉と表皮を縫合し、傷口をアルコール綿で消毒し、ケージに入れた。移植後、体重と死亡状態を毎週記録した。移植細胞がなく、体重が３０％減少したマウスを陰性コントロールとして使用した。
５）１２週間生存したマウスを処理し、その後の分析のために肝臓と血液のサンプルを収集した。

２．１３ 皮下腫瘍形成実験
１）ＰｒｏｌｉＨＨと肝癌細胞株Ｓｎｕ３９８を消化し、２×１０^６個の細胞を採取し、免疫不全ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの鼠径部に直接注入した。
２）２か月後、マウスの腫瘍形成を観察し、記録のために写真を撮った。

２．１４統計分析
全文統計分析にはＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５ソフトウェアを使用した。両側ログランク検定を使用して、初代肝細胞移植後のラットの生存曲線を計算した。サンプルの血清学的データ統計は、対応のないスチューデントのＴ検定を採用した。図に示されているデータは、平均±標準誤差である。＊ Ｐ ＜０．０５を示すものは、著しい違いである。

ＨＭ培地と低酸素の組み合わせでの培養が、インビトロで、長期間にわたってヒト肝細胞の増殖を促進できる

培地配合のスクリーニング及び最適化より、本発明者が、ヒト肝細胞のインビトロ増殖を促進できる培地を得、ＨＭ培地と名付けられた。ヒト肝細胞を１×１０^５細胞／ウェルで、６ウェルプレートにプレーティングし、ＨＭ培地を添加して培養した。 生細胞ワークステーションでのリアルタイム観察をすると、ヒト肝細胞が２日目に細胞形態で上皮細胞から間葉への形質転換を経て、２日目から３日目まで細胞が大量に増殖することを示している（図１ＡおよびＢ）。３日目に、ｋｉ６７染色で、細胞の８０％が増殖状態にあることを示し、さらに３時間のＢｒｄｕインキュベーションで、肝細胞の２０％が細胞複製を持っていることを示した（図１Ｃ）。マウス肝細胞の増殖を誘導できる以前に報告された培地ＹＡＣでは、ヒト肝細胞が増殖および複製することはめったにない（図１Ｃ）。

増殖されたヒト肝細胞を、継続的に継代すると、通常の酸素（２０％）培養条件下で、肝細胞は５回目の継代で増殖を停止し、細胞の７２％がＳＡ－β－ｇａｌに陽性であり、これは、細胞老化によりヒト肝細胞の増殖が停止することを示している（図１ＤおよびＥ）。本発明者らは、肝細胞を低酸素状態（５％（ｖ／ｖ））に置くことにより、肝細胞の老化が著しく阻害され、継代回数が延長されることを予期せず発見した（図１ＤおよびＥ）。さらに、７つの異なるドナー肝細胞を低酸素と組み合わせたＨＭ培地に継続的に増殖させることができ、この培養法の普遍性がさらに確認された（図１Ｆ）。

上記の結果は、ＨＭ培地がインビトロでヒト肝細胞の継続的な増殖を促進でき、さらに低酸素治療と組み合わせると、インビトロでこの継続的な増殖を促進することができることを証明している。

ＨＭ培地の組分として、Ｗｎｔ３ａは、肝細胞の増殖を促進するために必要なものである

ＨＭ培地には、さまざまな成長因子と小分子化合物が含まれ、本発明者らは、Ｗｎｔ３ａ馴化培地を除去すると、ヒト肝細胞を増殖できないことを発見した（図２ＡおよびＢ）。

Ｗｎｔ３ａ馴化培地の代わりに、５０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ精製タンパク質またはＷｎｔシグナル経路アクティベーターＣＨＩＲ（０．１ｕＭ）を使用すると、ヒト肝細胞も増殖でき、細胞形態と増殖倍数は類似している（図２Ａ）。

上記の結果は、ＨＭ培地中のＷｎｔシグナル経路アクティベーターは、肝細胞の増殖に必要であるものを証明し、Ｗｎｔシグナル経路アクティベーターはＷｎｔ３ａ馴化培地、Ｗｎｔシグナル経路の活性化タンパク質または小分子であっても良いと証明している。

増殖したヒト肝細胞が、一部の成熟肝細胞の機能を維持している

ＨＭ培地で培養されたヒト肝細胞は、成熟肝細胞遺伝子の発現を維持しており、その発現レベルは、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ；新たに蘇生した未培養のヒト初代肝細胞）とは異なり、例えば、ＡＬＢ、ＨＮＦ４Ａ、ＴＴＲとＣＹＰ３Ａ４の発現レベルはＰＨＨよりも低かったが、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＡＲ、Ｃ３とＵＧＴ１Ａ１の発現レベルはＰＨＨに近いか、それよりも高かった（図３Ａ）。免疫蛍光染色は、さらに、９７％より多い増殖されたヒト肝細胞（ＰｒｏｌｉＨＨ）が成熟肝細胞マーカータンパク質ＡＬＢとＡＡＴを発現していることを示した（図３Ｂ）。ＰｒｏｌｉＨＨの肝細胞遺伝子の維持レベルを分析するために、本発明者らは、トランスクリプトームレベルで、ＰＨＨ、ＰｒｏｌｉＨＨ、および、胚性幹細胞の分化と線維芽細胞の分化転換に由来する肝細胞様細胞（ＨＬＣ；胚性幹細胞の分化および線維芽細胞の分化転換に由来する肝細胞）の間の差異を比較した。主成分分析とクラスター分析によって、ＰｒｏｌｉＨＨがＰＨＨに近く、ＨＬＣから遠いことを示した（図３Ｃ）。これは、ＨＬＣと比較し、ＰｒｏｌｉＨＨが肝細胞遺伝子発現において成熟していることを示している。遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）によって、ＨＬＣと比較し、ＰｒｏｌｉＨＨが薬物、胆汁酸、脂肪酸、および尿素代謝シグナル伝達経路の遺伝子の発現に富んでいることを示した（図３Ｄ）。肝臓の遺伝子発現と一致し、ＰｒｏｌｉＨＨが、高レベルのＡＬＢタンパク質分泌、グリコーゲン蓄積、および脂肪滴合成を維持している（図３ＥおよびＦ）。

上記の結果は、増殖されたヒト肝細胞が、一部の成熟肝細胞の機能を維持していることを証明した。

増殖したヒト肝細胞は、成熟肝細胞と肝前駆細胞この両者の中間状態にある

ＨＭ培地で培養されたヒト肝細胞が、ＳＯＸ９、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＣＫ１９、ＣＫ７などの肝前駆細胞関連遺伝子の発現を得た（図４Ａ）。免疫蛍光染色は、さらに、９７％より多いＰｒｏｌｉＨＨが、肝前駆細胞関連遺伝子、例えば、ＳＯＸ９、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＣＫ１９とＣＫ７を発現していることを示した（図４Ｂ）。ＰｒｏｌｉＨＨと肝前駆細胞（ＬＰＣ；ヒト胚性幹細胞のインビトロ分化に由来する肝前駆細胞）との間の類似性を分析するために、本発明者らは、トランスクリプトームレベルで、ＰＨＨ、ＰｒｏｌｉＨＨおよび胚性幹細胞分化に由来するＬＰＣの間の差異を比較した。ＰＨＨと比較して、３４８２個の遺伝子がＬＰＣで高度に発現した（図４Ｃ）。それらの中で、１６５２（４７．４％）の遺伝子もＰｒｏｌｉＨＨでアップレギュレートされた（図４Ｃ）。これは、培養プロセス中に、全トランスクリプトームレベルで、ＰｒｏｌｉＨＨが多数の肝前駆細胞濃縮遺伝子の発現を得たことを示唆した。ＰＨＨ、ＰｒｏｌｉＨＨ、とＬＰＣの差異遺伝子発現プロファイルの分析により、ＬＰＣ濃縮遺伝子は３セットに分割できることがわかられた（図４Ｄ）。セット１と２の遺伝子にはＰＨＨ低発現で、ＬＰＣ高発現であるが、培養過程で、ＰｒｏｌｉＨＨの発現を徐々に増加する。遺伝子セット濃縮分析は、セット１および２の遺伝子が主に幹細胞および細胞周期関連経路で濃縮されていることを示した（図４Ｅ）。セット３の遺伝子には、ＰＨＨ低発現で、ＬＰＣ高発現であるが、ＰｒｏｌｉＨＨは、ＤＬＫ１、ＫＩＴ、ＦＯＸＪ１などの以前に報告された肝前駆体遺伝子のように、培養プロセスで有意にアップレギュレートされない（図４Ｄ）。しかし、全トランスクリプトームの分析から、ＰｒｏｌｉＨＨ発現プロファイルはＰＨＨ発現プロファイルに近いが、ＬＰＣとは異なることがわかった（図４Ｆ）。これらの結果は、ＰｒｏｌｉＨＨが培養の過程で多数の肝前駆細胞関連遺伝子を取得したが、肝前駆細胞の完全な発現プロファイルが完全に確立されていないことを示している。

したがって、ＰｒｏｌｉＨＨは、成熟肝細胞と肝前駆細胞の間の二重表現型（ｂｉ－ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ）の中間状態にある。

インビトロで、増殖したヒト肝細胞は、成熟肝細胞に誘導することができる
インビトロの増殖には、増殖されたヒト肝細胞は、一部の成熟肝臓遺伝子の発現をダウンレギュレートし、肝前駆体関連遺伝子の発現をアップレギュレートした。それがインビトロで成熟肝細胞に誘導され得るかどうかを試験するために、本発明者らは、ＰｒｏｌｉＨＨを三次元培養システムに置き、肝向け成熟培地（ＨＩＭ）を添加し、１０日間培養した（図５Ａ）（通常の酸素）。成熟まで誘導した後、ＰｒｏｌｉＨＨは成熟肝細胞に特有の典型的な多角形と二重の核を有する（図５Ｂ）。細胞形態の変化に加えて、ＡＬＢ、ＴＴＲ、ＨＮＦ４Ａ、ＡＡＴなどの肝細胞遺伝子も大幅にアップレギュレートされ、ＳＯＸ９、ＣＫ１９、ＣＫ７などの肝前駆体遺伝子は大幅にダウンレギュレートされた（図５Ｃ）。さらに重要なことは、薬物と尿素の代謝に関与する重要な遺伝子も、成熟まで誘導された後に有意にアップレギュレートされ、それに応じて、ＣＹＰ２Ｂ６と尿素の代謝能も有意に増加した（図５Ｄ－Ｆ）。

上記の結果は、増殖されたヒト肝細胞が、インビトロで肝向け誘導成熟システムにおいて、成熟肝細胞に誘導され得ることを示している。

代謝の成熟を促進し、前駆体遺伝子の発現を阻害する重要な要因

増殖された肝細胞を、３Ｄ培養条件において、肝臓オルガノイドを形成し、それぞれに、ＨＭとＨＩＭで培養した。定量ＰＣＲで肝細胞のキー代謝遺伝子ＣＹＰ３Ａ４及び肝前体遺伝子ＳＯＸ９、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＫ１９、ＣＫ７の発現を検測した。

肝向け成熟培地（ＨＩＭ）は、フォルスコリン、ＤＥＸとＯＳＭをＨＭ培地に添加してなるものである。増殖された肝細胞を３Ｄボールで培養した後、ＨＭおよびＨＩＭで培養した。遺伝子発現分析により、図６に示すように、ＨＩＭで培養された肝オルガノイドにおけるＣＹＰ３Ａ４は、ＨＭで培養された肝オルガノイドよりも有意に高く、ＣＤ１３３、ＣＫ１９などの肝前駆遺伝子のＨＩＭで培養された肝オルガノイドにおける発現は、より低いことがわかりった。

上記の結果は、肝向け成熟培地には、フォルスコリン、ＤＥＸ、とＯＳＭは、肝細胞の代謝成熟を促進し、前駆体遺伝子の発現を阻害する重要な要因であることを証明した。

増殖されたヒト肝細胞は、細胞の移植で肝臓疾患を治療することができる

増殖されたヒト肝細胞は、細胞の移植で肝臓疾患を治療することができることを証明するために、本発明者らが、それをＦａｈ^－／－Ｒａｇ２^－／－ＩＬ２ｒｇ^－／－（ＦＲＧ）マウスに移植した。ＦＲＧマウスは、ヒトＩ型高チロシン血症を模倣した免疫不全マウスモデルである。ＦＲＧマウスが生き残るためには、飲料水に２－（２－ニトロ－４－トリフルオロメチルベンジルアルコール）－１，３－シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）を加える必要がある。ＮＴＢＣを除去すると、マウスは、４～６週間以内に肝不全で死亡するが、ヒト初代肝細胞はＦＲＧの肝臓に効率的に再増殖し、ＦＲＧマウスを肝不全から救うことができる。したがって、ＦＲＧマウスは、体内でヒト肝細胞の機能を検証するための優れたモデルである。

ＰｒｏｌｉＨＨを移植する方法：細胞移植の６日前に、飲料水中のＮＴＢＣの濃度を除去することにより、ＦＲＧマウスの肝障害が引き起こされた。５ｘ１０^５のヒト初代肝細胞ＰＨＨと増殖された肝細胞ＰｒｏｌｉＨＨを、脾臓を介してＦＲＧマウスに移植した。

細胞を移植されない６匹のＦＲＧマウスの中、５匹は、ＮＴＢＣ水を除去してから７週間後に死亡したが、初代ヒト肝細胞を移植した７匹のマウスの中、５匹は生存でき、マウスの生存率が大幅に向上した（図７Ａ）。さらに重要なことに、ＰｒｏｌｉＨＨを移植された１４匹のマウスの中、１１匹は４ヶ月以上生き残ることができる。ＰｒｏｌｉＨＨを移植されたマウスは、移植後最初の４週間で体重が減少したが、その後増加し、安定したまま（図７Ｂ）。これは、ＰｒｏｌｉＨＨの移植が、ＦＲＧマウスの損傷した肝臓の肝機能を回復できることを示している。血清学的検査により、肝機能の回復がさらに確認された。移植されなく、死亡したＦＲＧマウスと比較して、ＰｒｏｌｉＨＨの移植後に、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＴＢＩＬなどの肝機能指標は有意にダウンレギュレートされ、移植されたＰＨＨマウスと同等のレベルに戻った（図７Ｃ）。マウス血清中のヒトアルブミンの分泌も、ＰｒｏｌｉＨＨ移植後に徐々に増加し、移植後４か月で５．８±４．５ｍｇ／ｍｌに達した（図７ＤとＥ）。当該ヒトアルブミン分泌レベルは、ヒト初代肝細胞を移植されたＦＲＧマウスのレベル（７．３±６．１ｍｇ／ｍｌ）に達した（図７ＤおよびＥ）。４ヶ月生存したマウスの肝臓のＦａｈ免疫組織化学的染色は、肝臓におけるＰｒｏｌｉＨＨの組み込み比が６４±２１．８％に達したことを示した（図７ＦとＧ）。同時期のＰＨＨ移植の組み込み率は７０．４±２１．５％であり、体内でのＰｒｏｌｉＨＨの移植の組み込む能は、ＰＨＨと同等であることを示している（図７ＦとＧ）。

上記の結果は、ＰｒｏｌｉＨＨがＦＲＧマウスの肝臓を効率的に再増殖でき、肝障害の治療効果があることを示している。

増殖したヒト肝細胞を体内に移植し、肝機能が完全に成熟した
増殖されたヒト肝細胞ＰｒｏｌｉＨＨは、インビトロでの増殖中に、肝前駆体関連遺伝子の発現をアップレギュレートした。それが体内で成熟肝細胞に誘導され得るかどうかを試験するために、本発明者らは、ＦＲＧマウスの肝臓に組み込まれたＰｒｏｌｉＨＨを分析・同定した。免疫蛍光染色は、ＰｒｏｌｉＨＨが体内で成熟肝細胞マーカータンパク質ＡＬＢ、ＦＡＨ、ＨＮＦ４ＡとＣＹＰ３Ａ４を発現したが、肝前駆細胞関連遺伝子ＣＫ１９およびＣＫ７を発現しなかったことを示した（図８ＡとＢ）。ｑＰＣＲ検出にヒト特異的肝臓遺伝子プライマーを使用すると、体内で、フェーズＩとフェーズＩＩ代謝酵素及びトランスポータータンパク質などの成熟肝細胞遺伝子のＰｒｏｌｉＨＨでの発現が、インビトロで培養されたＰｒｏｌｉＨＨよりも有意に高かったことが示された（図８Ｃ）。全トランスクリプトーム分析によって、体内でのＰｒｏｌｉＨＨが、ＰＨＨと非常に高い類似性を持っていることを示し（ｒ^２＝０．９４）、これは、体内での肝細胞には、ＰｒｏｌｉＨＨの遺伝子発現がＰＨＨの遺伝子発現に近いことを示している（図８Ｄ）。

体内に移植されたＰｒｏｌｉＨＨが、成熟した肝細胞代謝機能を有することを証明するために、本発明者らは、移植されたマウスにおけるヒトＣＹＰ２Ｄ６の特定の薬物代謝を試験した。ヒトＣＹＰ２Ｄ６の代謝基質として、イソキノリン（ＤＥＢ）はマウス肝細胞では代謝できなく、ヒト肝細胞のみで代謝され、４－ヒドロキシイソキノリン（４－ＯＨ－ＤＥＢ）になる。ＤＥＢ薬の胃内投与後に、ＰｒｏｌｉＨＨを移植されたＦＲＧマウスでは、代謝産物とする４－ＯＨ－ＤＥＢが血清中で上昇していることが検出される（図８Ｅ）。コントロール群とする移植されないＦＲＧマウスの４－ＯＨ－ＤＥＢは、常にバックグラウンドレベルだった（図８Ｅ）。これは、ＰｒｏｌｉＨＨが体内で完全に成熟しており、ヒト特有の薬物代謝能を持つことを示している。

上記の結果は、増殖されたヒト肝細胞が、肝臓で多量に再増殖後に、成熟肝細胞に誘導され得ることを示している。

増殖されたヒト肝細胞には、体内で腫瘍形成リスクがない

増殖されたヒト肝細胞は、インビトロで培養された後も継続的に増殖する能を持つ。増殖されたＰｒｏｌｉＨＨが、体内で腫瘍形成のリスクを有するかどうかを検出するために、本発明者らは、２ｘ１０^６ＰｒｏｌｉＨＨと肝癌細胞株Ｓｎｕ－３９８を重症免疫不全症のＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの皮下に注射した。２か月後、Ｓｎｕ－３９８を注射した６匹のマウスはすべて腫瘍になったが、ＰｒｏｌｉＨＨを注射した８匹のマウスは、いずれも腫瘍を形成していない（図９）。

上記の結果は、増殖されたヒト肝細胞が、体内で腫瘍形成のリスクがないことを示している。

ＨＭ２～３とＨＩＭ２～３によるインビトロでの増殖

ＨＭ培地の効果を検証するために、本発明者らは、表４と表５に示すように、インビトロ増殖培地ＨＭ２～３と肝向け成熟培地ＨＩＭ２～３を調製した。

ヒト初代肝細胞を出発細胞とし、実施例１のＨＭ培地をＨＭ２に置き換えたことを除いて、実施例１と同じように、通常の酸素培養を行った。その結果、通常の酸素状態では、細胞形態には、ヒト肝細胞は、２日目に上皮細胞間葉移行を起こし、２日目から３日目に細胞が大量に増殖した；かつ、増殖されたヒト肝細胞は、成熟肝細胞と肝前駆細胞の中間状態にある。

ヒト初代肝細胞を出発細胞とし、実施例１のＨＭ培地をＨＭ２に置き換えたことと、低酸素状態を７％に置き換えたことを除いて、実施例１と同じように、通常の酸素培養を行った。結果は、低酸素状態下で、ヒト肝細胞が大量に増殖し、増殖されたヒト肝細胞が、成熟肝細胞と肝前駆細胞の中間状態にあり、継代回数が６倍を超える可能性があることを示した。

ＰｒｏｌｉＨＨを出発細胞とし、実施例５のＨＩＭ培地をＨＩＭ２に置き換えたことを除いて、実施例５と同じように、培養を行った。結果は、成熟まで誘導された後、ＰｒｏｌｉＨＨは、成熟肝細胞に特有の典型的な多角形と二核を持っていることを示した；ＡＬＢ、ＴＴＲ、ＨＮＦ４ＡとＡＡＴなどの肝細胞遺伝子も大幅にアップレギュレートされたが、ＳＯＸ９、ＣＫ１９とＣＫ７などの肝前駆遺伝子は大幅にダウンレギュレートされた。

ＰｒｏｌｉＨＨを出発細胞とし、実施例５のＨＩＭ培地をＨＩＭ３に置き換えたことを除いて、実施例５と同じように、培養を行った。結果は、成熟まで誘導された後、ＰｒｏｌｉＨＨは、成熟肝細胞に特有の典型的な多角形と二核を持っていることを示した；ＡＬＢ、ＴＴＲ、ＨＮＦ４ＡとＡＡＴなどの肝細胞遺伝子も大幅にアップレギュレートされたが、ＳＯＸ９、ＣＫ１９とＣＫ７などの肝前駆遺伝子は大幅にダウンレギュレートされた。

本出願に言及されている全ての参考文献は、参照として単独に引用されるように、本出願に引用されて、参照になる。理解すべきことは、本発明の上記の開示に基づき、当業者は、本発明を様々な変更または修正を行っても良い、これらの同等の形態も本出願に添付された請求の範囲に規定される範囲内に含まれる。

Claims (24)

1. 肝細胞を、Ｗｎｔシグナル経路アクティベーターを含有する細胞培養培地で培養し、インビトロで増殖することを含むことを特徴とするインビトロで肝細胞を増殖する方法であって、
   前記細胞培養培地は、成分として、Ｗｎｔシグナル経路アクティベーター、Ｎ－アセチル－システイン、ニコチンアミド、ＦＧＦ１０、ＥＧＦ、ＨＧＦ、［Ｌｅｕ^１５］－ガストリンＩ、Ａ ８３－０１、Ｙ－２７６３２、および血清を含有し、
   前記Ｗｎｔシグナル経路アクティベーターは、Ｗｎｔ３ａ タンパク質またはＣＨＩＲであり、
   前記成分の濃度は、
   Ｗｎｔ３ａ タンパク質 ３０～７０ ｎｇ／ｍｌ、
   ＣＨＩＲ ０．０５～２ μＭ、
   Ｎ－アセチル－システイン ０．５～２ ｍＭ、
   ニコチンアミド ５～２０ ｍＭ、
   ＦＧＦ１０ １～４ ｎｇ／ｍｌ、
   ＥＧＦ ３０～７０ ｎｇ／ｍｌ、
   ＨＧＦ １５～４０ ｎｇ／ｍｌ、
   ［Ｌｅｕ^１５］－ガストリンＩ ５～２０ ｍＭ、
   Ａ ８３－０１ ３～７ μＭ、
   Ｙ－２７６３２ ５～２０ μＭ、
   血清 ０．５～２ ％、
   であることを特徴とする、インビトロで肝細胞を増殖する方法。
2. 前記細胞培養培地は、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、又はＲＰＭＩから選ばれる培地を基礎培地とする、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記ＤＭＥＭは、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２およびＤＭＥＭ／Ｆ１２から選ばれることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
4. 請求項１で増殖された肝細胞を成熟肝細胞に誘導する方法であって、
   前記細胞培養培地にフォルスコリン、デキサメタゾン、オンコスタチンＭを
   フォルスコリン ３～７ μＭ、
   デキサメタゾン ５～２０ μＭ、
   オンコスタチンＭ １０～３０ ｎｇ／ｍｌ、
   の濃度で添加することを特徴とする方法。
5. 前記細胞培養培地においてフォルスコリン、デキサメタゾン、オンコスタチンＭは、
   フォルスコリン ４～６ μＭ、
   デキサメタゾン ７～１５ μＭ、
   オンコスタチンＭ １５～２５ ｎｇ／ｍｌ、
   の濃度であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. 前記成分の濃度が、
   Ｗｎｔ３ａ タンパク質 ４０～６０ ｎｇ／ｍｌ、
   ＣＨＩＲ ０．０７～１．５ μＭ、
   Ｎ－アセチル－システイン ０．７～１．５ ｍＭ、
   ニコチンアミド ７～１５ ｍＭ、
   ＦＧＦ１０ ２～３ ｎｇ／ｍｌ、
   ＥＧＦ ４０～６０ ｎｇ／ｍｌ、
   ＨＧＦ ２０～３０ ｎｇ／ｍｌ、
   ［Ｌｅｕ^１５］－ガストリンＩ ７～１５ ｍＭ、
   Ａ ８３－０１ ４～６ μＭ、
   Ｙ－２７６３２ ７～１５ μＭ、
   血清 ０．７～１．５ ％、
   であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 前記方法は、増殖した肝細胞を継代培養する請求項１に記載の方法。
8. 前記継代培養は低酸素状態で行われ、前記低酸素状態は、体積比で０～１５％の酸素を含む、ことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
9. 前記低酸素状態は、体積比で１０％未満の酸素を含む、ことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
10. 前記低酸素状態は、体積比で６％未満の酸素を含む、ことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
11. 前記培養は、３次元培養である、ことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
12. 上記の肝細胞は、ヒト肝細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
13. 請求項１～３および６～１２のいずれか一つの方法で得られた肝細胞培養物、又は、当該肝細胞培養物から単離・精製された成熟肝細胞と肝前駆細胞の間にある中間状態細胞である肝細胞。
14. 請求項１３に記載の、肝細胞培養物、又は、単離・精製された成熟肝細胞と肝前駆細胞の間にある中間状態細胞である肝細胞、の使用であって、
    肝臓の再生を促進する薬物の調製における使用；または、
    肝臓疾患を予防、緩和又は治療する薬物組成物又はキットの調製における使用；または、
    インビトロモデルとして、肝臓に関連する疾患又は薬物に対する研究における使用；または、
    生体内の細胞移植の組成物の調製における使用；または、
    Ａｌｂｕｍｉｎタンパク質の産生における使用。
15. 前記肝臓に関連する疾患又は薬物的研究は、薬物の送達、薬物の代謝、肝臓の形成、肝臓の再生に対する研究；或いは肝毒性試験、肝細胞毒性物質のスクリーニング、肝細胞機能を調節する物質のスクリーニングであることを特徴とする請求項1４に記載の使用。
16. 請求項１３に記載の肝細胞培養物又は単離・精製された肝細胞；及び薬学的に許容される担体；を含むことを特徴とする薬物組成物。
17. 請求項１３に記載の肝細胞培養物又は単離・精製された肝細胞を含む；又は請求項１６に記載された薬物組成物を含む；ことを特徴とするキット。
18. 培養培地が、成分として、Ｗｎｔシグナル経路アクティベーター、Ｎ－アセチル－システイン、ニコチンアミド、ＦＧＦ１０、ＥＧＦ、ＨＧＦ、［Ｌｅｕ^１５］－ガストリンＩ、Ａ ８３－０１、Ｙ－２７６３２、および血清を含有し、
    前記Ｗｎｔシグナル経路アクティベーターは、Ｗｎｔ３ａ タンパク質またはＣＨＩＲであり、前記成分の濃度は、
    Ｗｎｔ３ａ タンパク質 ３０～７０ ｎｇ／ｍｌ、
    ＣＨＩＲ ０．０５～２ μＭ、
    Ｎ－アセチル－システイン ０．５～２ ｍＭ、
    ニコチンアミド ５～２０ ｍＭ、
    ＦＧＦ１０ １～４ ｎｇ／ｍｌ、
    ＥＧＦ ３０～７０ ｎｇ／ｍｌ、
    ＨＧＦ １５～４０ ｎｇ／ｍｌ、
    ［Ｌｅｕ^１５］－ガストリンＩ ５～２０ ｍＭ、
    Ａ ８３－０１ ３～７ μＭ、
    Ｙ－２７６３２ ５～２０ μＭ、
    血清 ０．５～２ ％、
    であることを特徴とする、インビトロで肝細胞を増殖するための培養培地。
19. 請求項１８に記載のインビトロで肝細胞を増殖する培養培地、及び、フォルスコリン、デキサメタゾン、オンコスタチンＭを含む、インビトロでの肝細胞の増殖、および、肝細胞の成熟を誘導する培養培地であって、前記フォルスコリン、デキサメタゾン、オンコスタチンＭは、
    フォルスコリン ３～７ μＭ、
    デキサメタゾン ５～２０ μＭ、
    オンコスタチンＭ １０～３０ ｎｇ／ｍｌ、
    の濃度であることを特徴とする、インビトロで肝細胞を増殖、および、肝細胞の成熟を誘導する培養培地。
20. 前記培養培地が含む成分が、基礎培地に存在し、前記基礎培地は、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、又は、ＲＰＭＩから選ばれることを特徴とする請求項１８に記載の培養培地。
21. 前記ＤＭＥＭは、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２およびＤＭＥＭ／Ｆ１２から選ばれることを特徴とする、請求項２０に記載の培養培地。
22. 前記培養培地における成分の濃度は、
    Ｗｎｔ３ａ タンパク質 ４０～６０ ｎｇ／ｍｌ、
    ＣＨＩＲ ０．０７～１．５ μＭ、
    Ｎ－アセチル－システイン ０．７～１．５ ｍＭ、
    ニコチンアミド ７～１５ ｍＭ、
    ＦＧＦ１０ ２～３ ｎｇ／ｍｌ、
    ＥＧＦ ４０～６０ ｎｇ／ｍｌ、
    ＨＧＦ ２０～３０ ｎｇ／ｍｌ、
    ［Ｌｅｕ^１５］－ガストリンＩ ７～１５ ｍＭ、
    Ａ ８３－０１ ４～６ μＭ、
    Ｙ－２７６３２ ７～１５ μＭ、
    血清 ０．７～１．５ ％
    であることを特徴とする請求項１８に記載された培養培地。
23. インビトロで肝細胞を増殖するとともに、肝細胞の成熟を誘導することを特徴とする請求項１８～２２のいずれか一つの培養培地の使用。
24. 請求項１８～２２のいずれか一つの培養培地を含むことを特徴とするインビトロで肝細胞を増殖するとともに肝細胞の成熟を誘導するキット。