TW202039828A

TW202039828A - 肝細胞擴增方法

Info

Publication number: TW202039828A
Application number: TW108142919A
Authority: TW
Inventors: 喬漢娜司卡羅勒斯克萊弗斯; 胡慧麗
Original assignee: 荷蘭皇家科學院
Priority date: 2018-11-26
Filing date: 2019-11-26
Publication date: 2020-11-01
Also published as: AU2019390669B2; KR20210096631A; CN113631702A; SG11202105552TA; GB201819224D0; EP3887505A1; AU2019390669A1; JP2022511757A; CA3120932A1; US20220017860A1; IL283363A; WO2020109324A1

Abstract

本發明係關於用於肝細胞、特別是原代肝細胞之活體外擴增之培養方法及培養基；藉由該等方法可獲得及獲得之肝細胞培養物及類器官；以及該等肝細胞培養物及類器官之用途。

Description

肝細胞擴增方法

本發明尤其提供用於肝細胞之活體外擴增之培養方法及培養基、藉由該等方法可獲得及獲得之肝細胞培養物及類器官、以及該等肝細胞培養物及類器官之用途。

哺乳動物肝臟具有顯著再生能力。已闡述兩種損傷反應模式：1)當所有肝細胞皆受慢性肝病影響時，『卵圓細胞』反應來源於膽道系統(biliary tree)。2)在急性肝臟損傷(諸如部分肝切除術(PHx))後發生成熟肝細胞之大規模增殖性反應。雖然卵圓細胞反應已藉由自膽管細胞使類器官生長在活體外捕獲，但肝細胞增殖反應尚未在培養中重現。

肝臟在手術去除其大小之最多達2/3 (部分肝切除術(PHx))後或在全肝化學或感染性損傷後，在質量及功能恢復方面展示出顯著再生能力(Stanger，2015)。對肝臟部分切除之反應特別令人印象深刻，此乃因其涉及剩餘成熟肝細胞之大規模細胞週期進入，而沒有明顯去分化成祖細胞/幹細胞樣狀態(Miyajima等人，2014)。因此，肝臟將在損傷後兩週內恢復生長至其原始大小(Michalopoulos, 2010)。有充分證據表明在活體內穩定狀態條件下直接、緩慢之肝細胞擴增(Wang等人，2015；Font-Burgada等人，2015)。成人功能性肝細胞之增殖代表損失肝臟組織之主要替代機制(Stanger, 2015)。

當有毒劑(毒素、病毒)長期影響所有肝細胞時，肝臟修復之替代機制開始發揮作用。在該等情況下，膽管樹附近之小細胞變成增殖性的(『卵圓細胞』)。盛行學派陳述膽管細胞樣卵圓細胞代表能夠再生肝細胞以及新膽管細胞之經活化肝臟幹細胞(Evarts等人，1987)。已闡述反映活體內卵圓細胞反應之小鼠及人類成體膽管上皮來源之祖細胞之長期3D肝臟擴增系統(Huch等人，2013；Huch等人，2015)。在該等限定之3D類器官培養條件下，最多達三分之一之成熟Epcam+膽管細胞能夠快速去分化成作為囊性結構擴增且可傳代超過6個月之雙潛能祖細胞(Huch等人，2015；Li等人，2017；WO2012/014076；WO2015/173425)。

成體成熟肝細胞亦可因應於慢性肝臟損傷而重新程式化成增殖性雙潛能祖細胞(Tanimizu等人，2014；Tarlow等人，2014；Yimlamai等人，2014；Yanger等人，2013)。實際上，已藉由轉分化成膽管細胞/膽管上皮細胞證實成熟肝細胞展示活體內可塑性(Sekiya及Suzuki, 2014；Tanimizu等人，2014；Yanger等人，2014；Yanger等人，2013)。譜系追蹤已強調了肝細胞來源之祖細胞(hepPD)之存在，但最初在3D培養物中培養該等細胞之嘗試未成功(Malato等人，2011；Tarlow等人，2014)。最近研究已闡述三種小分子之混合物，該混合物可在活體外將大鼠及小鼠肝細胞轉化成小的增殖性雙潛能細胞，稱為呈2D之「化學誘導之肝臟祖細胞」(CLiP)。在長期培養中，CLiP在形態上不類似於肝細胞，但其保持其增殖能力及其肝臟分化能力，且可重建(repopulate)慢性損傷之肝臟(Katsuda等人，2017)。

然而，在培養中維持功能性成熟肝細胞＞1-2週通常仍然具有挑戰性，而況誘導此等肝細胞進入細胞週期並經受活體外長期擴增。已闡述共培養系統或HPV基因之表現支持有限肝細胞擴增(Khetani及Bhatia, 2008；Levy等人，2015)。最近之努力集中於藉由自多能幹細胞(胚胎幹細胞或誘導多能幹細胞(iPSC))分化在活體外產生肝細胞(Li等人，2010a；Liang及Zhang, 2013；Lund等人，2012)。或者，已證明藉由用重新程式化基因轉染來誘導纖維母細胞之轉分化可行(Huang等人，2011；Huang等人，2014；Swenson，2012；Zhu等人，2014)。雖然報導了該等方法令人鼓舞之結果，但活體外產生之肝細胞樣細胞在成熟方面仍不類似於新近分離之原代肝細胞(Si-Tayeb等人，2010)。

因此，仍需要使得能夠在培養中長時期擴增肝細胞之方法，同時擴增之細胞維持肝細胞之形態、功能及生化特徵。

本發明係關於用於活體外擴增肝細胞之新穎方法。根據一些實施例，可使用本發明之方法擴增來自胎兒或成人肝臟之原代肝細胞，視情況其中自藉由使用該方法擴增之細胞治療的個體之胎兒或成人肝臟提取欲擴增之原代肝細胞。

根據一些實施例，使用本發明之方法擴增之肝細胞形成肝細胞類器官(在本文中亦稱為「Hep-org」、「該等肝細胞類器官」或「本發明之肝細胞類器官」)。可在培養中長時期擴增肝細胞類器官，同時維持原代肝細胞之關鍵形態、功能及基因表現特徵。根據一些實施例，肝細胞類器官及/或源自其之細胞(視情況源自其之單細胞)能夠在活體外及移植至個體之肝臟中後重現肝細胞增殖反應(諸如在部分肝切除術之後所見者)。本發明之肝細胞類器官在其形態、基因表現、功能性及/或其在個體之肝臟中植入及增殖之能力方面不同於源自膽管細胞之擴增之類器官(在本文中亦稱為「Chol-org」)。Chol-org先前已闡述於例如Huch等人，2013及Huch等人，2015中。

根據一個態樣，本文提供用於活體外擴增肝細胞之方法(在本文中亦稱為「本發明之方法」)，其中該方法包括在本發明之肝細胞培養基中培養肝細胞。本發明之方法部分地基於本發明之肝細胞培養基之發現，該肝細胞培養基使得能夠最佳擴增原代肝細胞，同時維持其關鍵形態、功能及基因表現性質。如下文(例如，圖12B)中所例示，去除本發明之肝細胞培養基之關鍵組分會降低其使得能夠擴增原代肝細胞之能力。根據一些實施例，本發明之方法係用於產生本發明之肝細胞類器官之方法。

根據一些實施例，當原代肝細胞及/或自其擴增之肝細胞及/或Hep-org與三維細胞外基質(ECM)接觸時，在本發明之肝細胞培養基中培養肝細胞，視情況其中原代肝細胞及/或Hep-org生長在三維細胞外基質上及/或包埋於三維細胞外基質中。因此，根據一些實施例，本發明之方法包括在本發明之肝細胞培養基存在下在三維細胞外基質上及/或三維細胞外基質內培養原代肝細胞，由此擴增原代肝細胞，視情況其中類似地在本發明之肝細胞培養基存在下在三維細胞外基質上及/或三維細胞外基質內培養自原代肝細胞擴增之細胞及/或Hep-org。

根據一些實施例，本文提供本發明之肝細胞培養基。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含： i. 50至500 ng/ml纖維母細胞生長因子(FGF)，其視情況選自由FGF7、FGF10及其組合組成之群； ii. Wnt促效劑，其包含R-脊椎蛋白(spondin)及至少一種肝糖合成酶激酶3 (GSK3)抑制劑； iii. 5至100 ng/ml表皮生長因子(EGF)； iv. 5至100 ng/ml肝細胞生長因子(HGF)；及 v. 轉型生長因子β (TGF-β)抑制劑，其包含活化素受體樣激酶ALK4、ALK5及/或ALK7之抑制劑。

因此，根據一些實施例，本文提供用於活體外擴增肝細胞之方法，其中該方法包括在肝細胞培養基中培養肝細胞，其中該肝細胞培養基包含： i. 50至500 ng/ml纖維母細胞生長因子(FGF)，其視情況選自由FGF7、FGF10及其組合組成之群； ii. Wnt促效劑，其包含R-脊椎蛋白及至少一種肝糖合成酶激酶3 (GSK3)抑制劑； iii. 5至100 ng/ml表皮生長因子(EGF)； iv. 5至100 ng/ml肝細胞生長因子(HGF)；及 v. 轉型生長因子β (TGF-β)抑制劑，其包含活化素受體樣激酶ALK4、ALK5及/或ALK7之抑制劑。

本發明之培養基特別可用於擴增原代肝細胞。因此，根據一些實施例，本文提供用於活體外擴增原代肝細胞之方法，其中該方法包括在肝細胞培養基中培養原代肝細胞，其中該肝細胞培養基包含： i. 50至500 ng/ml纖維母細胞生長因子(FGF)，其視情況選自由FGF7、FGF10及其組合組成之群； ii. Wnt促效劑，其包含R-脊椎蛋白及至少一種肝糖合成酶激酶3 (GSK3)抑制劑； iii. 5至100 ng/ml表皮生長因子(EGF)； iv. 5至100 ng/ml肝細胞生長因子(HGF)；及 v. 轉型生長因子β (TGF-β)抑制劑，其包含活化素受體樣激酶ALK4、ALK5及/或ALK7之抑制劑。

此外，本發明之培養基可用於擴增藉由本發明之擴增方法獲得之肝細胞，包括源自其之肝細胞類器官或細胞。因此，根據一些實施例，本文提供用於活體外擴增肝細胞類器官或源自其之肝細胞之方法，其中該方法包括在肝細胞培養基中培養該肝細胞類器官或源自其之肝細胞，其中該肝細胞培養基包含： i. 50至500 ng/ml纖維母細胞生長因子(FGF)，其視情況選自由FGF7、FGF10及其組合組成之群； ii. Wnt促效劑，其包含R-脊椎蛋白及至少一種肝糖合成酶激酶3 (GSK3)抑制劑； iii. 5至100 ng/ml表皮生長因子(EGF)； iv. 5至100 ng/ml肝細胞生長因子(HGF)；及 v. 轉型生長因子β (TGF-β)抑制劑，其包含活化素受體樣激酶ALK4、ALK5及/或ALK7之抑制劑。

在WO 2015/173425中，本發明者證實向培養基中添加cAMP路徑之活化劑(亦稱為「cAMP路徑活化劑」)與當cAMP路徑活化劑不存在於培養基中時相比，允許將人類上皮幹細胞培養增加之傳代數。然而，根據本發明之較佳實施例，本發明之肝細胞培養基不包含cAMP路徑活化劑。

根據一些實施例，R-脊椎蛋白係選自由以下組成之群：R-脊椎蛋白1 (RSPO1)、R-脊椎蛋白2 (RSPO2)、R-脊椎蛋白3 (RSPO3)、R-脊椎蛋白4 (RSPO4)、其活性片段或變異體及其組合。根據一些實施例，R-脊椎蛋白條件化培養基中之R-脊椎蛋白係R-脊椎蛋白1 (RSPO1)。

根據一些實施例，R-脊椎蛋白係作為條件化培養基提供且在肝細胞培養基內之濃度係5%-50%、5%-40%、5%-35%、10%-30%、10%-20%、12%-17%或較佳約15% (vol/vol)。根據一些實施例，R-脊椎蛋白條件化培養基在肝細胞培養基內之濃度係約15% (vol/vol)。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基中之Wnt促效劑包含約15% (vol/vol)之R-脊椎蛋白。

根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基中之GSK3抑制劑之濃度係1至10 µM、0.5至5 µM、1至5 µM、2至4 µM或較佳約3 µM。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基中之GSK3抑制劑之濃度係約3 µM。

根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基中之GSK3抑制劑係選自由以下組成之群：CHIR99021、SB216763、TWS119、5-溴吲哚、SB415286、BIO、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、BIO-丙酮肟、1-阿紮肯保隆(1-Azakenpaullone)及其組合。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基中之GSK3抑制劑係CHIR99021。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基中之GSK3抑制劑係濃度為約3 µM之CHIR99021。

根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含FGF7。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含濃度為50至400 ng/ml、50至300 ng/ml、75至200 ng/ml、80至150 ng/ml或較佳約100 ng/ml之FGF7。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含濃度為約100 ng/ml之FGF7。

根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含FGF10。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含濃度為50至400 ng/ml、50至300 ng/ml、75至200 ng/ml、80至150 ng/ml或較佳約100 ng/ml之FGF10。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含濃度為約100 ng/ml之FGF10。

根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含FGF7及FGF10。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含濃度各自為約100 ng/ml之FGF7及FGF10。

根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含濃度為10 ng/ml至100 ng/ml、20 ng/ml至100 ng/ml、20 ng/ml至80 ng/ml、40 ng/ml至80 ng/ml或較佳約50 ng/ml之EGF。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含濃度為約50 ng/ml之EGF。

根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含濃度為10 ng/ml至100 ng/ml、20 ng/ml至100 ng/ml、20 ng/ml至80 ng/ml、40 ng/ml至80 ng/ml或較佳約50 ng/ml之HGF。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含濃度為約50 ng/ml之HGF。

根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含濃度為1至10 µM、0.5至5 µM、1至4 µM、1至3 µM或較佳約2 µM之TGF-β 抑制劑。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含濃度為約2 µM之TGF-β 抑制劑。根據一些實施例，TGF-β 抑制劑係活化素受體樣激酶ALK4、ALK5及/或ALK7信號傳導路徑之抑制劑。根據一些實施例，TGF-β 抑制劑係活化素受體樣激酶ALK4、ALK5及/或ALK7之抑制劑。根據一些實施例，TGF-β 抑制劑係活化素受體樣激酶ALK4、ALK5及/或ALK7之抑制劑。根據一些實施例，TGF-β 抑制劑係選自由以下組成之群之活化素受體樣激酶ALK4、ALK5及/或ALK7之抑制劑：A83-01、SB-431542、SB-505124、EW-7197、LY-2157299、GW6604及其組合。根據一些實施例，TGF-β 抑制劑係A83-01，即活化素受體樣激酶ALK4、ALK5及/或ALK7之抑制劑。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基之TGF-β 抑制劑係濃度為約2 µM之A83-01。

根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含菸鹼醯胺。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含濃度為1至100 mM、1至50 mM、1至30 mM、1至20 mM、5至20 mM、5至15 mM或較佳約10 mM之菸鹼醯胺。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含濃度為約10 mM之菸鹼醯胺。

根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含胃泌素。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含濃度為1至100 nM、1至50 nM、1至30 nM、1至20 nM、5至20 nM、5至15 nM或較佳約10 nM之胃泌素。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含濃度為約10 nM之胃泌素。

根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基進一步包含轉型生長因子α (TGF-α) (在本文中亦稱為TGFa)。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含濃度為1至50 ng/ml、5至35 ng/ml、10至30 ng/ml、15至25 ng/ml或較佳約20 ng/ml之TGF-α。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含濃度為約20 ng/ml之TGF-α。

根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基進一步包含Rho相關蛋白質激酶(ROCK)抑制劑。根據一些實施例，ROCK抑制劑係選自由以下組成之群：Y-27632、GSK429286A、法舒地爾(Fasudil)、噻托維汀(Thiazovivin)、Rho激酶抑制劑IV及其組合。根據一些實施例，ROCK抑制劑係Y-27632。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含濃度為1至50 μM、1至30 μM、1至20 μM、5至20 μM、5至15 μM或較佳約10 μM之ROCK抑制劑。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含濃度為約10 μM之ROCK抑制劑。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含濃度為約10 μM之Y-27632。

根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基進一步包含N-乙醯半胱胺酸。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基進一步包含濃度為0.5至5 mM、0.5至4 mM、1至4 mM、1至2 mM、1至1.5 mM或較佳約1.25 mM之N-乙醯半胱胺酸。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含濃度為約1.25 mM之N-乙醯半胱胺酸。

根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基進一步包含B27補充劑。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基進一步包含不含維生素A之B27補充劑。如本文所用，不含維生素A之B27補充劑係指『減去維生素A之B27補充劑』(可得自Invitrogen, Carlsbad, CA；www.invitrogen.com；目前目錄編號12587010；且可得自PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria；www.paa.com；目錄編號F01-002；Brewer等人，J Neurosci Res., 35(5):567-76, 1993)。

根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基進一步包含細胞生長培養基。根據一些實施例，細胞生長培養基包含抗生素、視情況選用之青黴素及鏈黴素。根據一些實施例，細胞生長培養基係AdDMEM/F12 (Invitrogen)，其視情況包含Hepes (例如10 mM)及/或Glutamax補充劑(Gibco)。

根據一些實施例，將根據本發明之方法擴增之肝細胞在本發明之肝細胞培養基存在下與細胞外基質(ECM)接觸培養。細胞外基質較佳為外源性細胞外基質(此意味著其不由正在培養之細胞分泌)。在一些實施例中，細胞外基質係三維細胞外基質。在其他實施例中，細胞外基質處於懸浮液中。根據一些實施例，本發明之方法進一步包括使原代肝細胞與三維細胞外基質(ECM)接觸。根據一些實施例，使細胞與三維細胞外基質(ECM)接觸包含在三維細胞外基質上及/或三維細胞外基質內接種細胞。根據一些實施例，使細胞與三維細胞外基質接觸係指將細胞與非固體三維基質混合，接著使該基質固化，由此將細胞包埋於三維基質之中及/或之上。根據一些實施例，本發明之方法進一步包括使原代肝細胞與三維細胞外基質(ECM)接觸，接著用本發明之肝細胞培養基培養原代肝細胞。根據一些實施例，本發明之方法包括以下步驟：將原代肝細胞包埋於三維細胞外基質(ECM)中，之後在本發明之肝細胞培養基中培養包埋之細胞及三維基質。根據一些實施例，三維細胞外基質包含本發明之肝細胞培養基及/或係使用本發明之肝細胞培養基製備。根據一些實施例，三維細胞外基質係選自由以下組成之群：合成ECM、天然ECM及其組合。根據一些實施例，三維ECM包含Matrigel^TM 。根據一些實施例，三維細胞外基質包含培養基:基質比為1:1、1:2或較佳1:3之本發明之肝細胞培養基。根據一些實施例，三維ECM包含視情況培養基:基質比為1:3之Matrigel^TM 及本發明之肝細胞培養基。

根據一些實施例，自肝臟組織分離藉由本發明之方法擴增之原代肝細胞。根據一些實施例，自肝臟組織分離藉由本發明之方法擴增之原代肝細胞，其中該肝臟組織係外植體或肝臟樣品，視情況來自欲投與擴增之肝細胞之個體。根據一些實施例，本發明之方法進一步包括自肝臟組織分離欲擴增之原代肝細胞。根據一些實施例，分離原代肝細胞包括膠原酶消化。

根據一些實施例，藉由本發明之方法擴增之原代肝細胞係哺乳動物肝細胞，諸如鼠類或人類肝細胞。不希望受任何理論或機制束縛，擴增之鼠類肝細胞及/或Hep-org可用於肝細胞或肝臟研究，或用於測試某些物質(例如治療劑或毒素)對肝臟之潛在作用。擴增之人類肝細胞及/或Hep-org可類似地用於研究中，但亦可移植至需要肝臟再生(例如，部分肝切除術之後)之個體或罹患導致肝臟損傷或與肝臟損傷相關之疾病或病狀之個體中。

根據一些實施例，藉由本發明之方法擴增之肝細胞可為胎兒肝細胞、成體肝細胞及其組合。根據一些實施例，藉由本發明之方法擴增之原代肝細胞可為胎兒原代肝細胞、成人原代肝細胞(在本文中亦稱為「成人原代人類肝細胞」)及其組合，較佳地其中原代肝細胞為人類(「PHH」)。根據一些實施例，藉由本發明之方法擴增之原代肝細胞係表現白蛋白之肝細胞。根據一些實施例，藉由本發明之方法擴增之原代肝細胞係二倍體或四倍體。根據一些實施例，藉由本發明之方法擴增之原代肝細胞並非八倍體。

根據一些實施例，使用本發明之方法擴增肝細胞導致形成一或多個肝細胞類器官(在本文中亦稱為「本發明之肝細胞類器官」或「Hep-org」)。根據一些實施例，使用本發明之方法擴增肝細胞產生肝細胞類器官及/或不為肝細胞類器官之一部分之肝細胞。根據一些實施例，使用本發明之方法擴增胎兒肝細胞產生在本文中亦稱為「胎兒-類器官」或「胎兒-Org」之肝細胞類器官。根據一些實施例，使用本發明之方法擴增成人原代人類肝細胞產生在本文中亦稱為「PHH-org」之肝細胞類器官。根據一些實施例，PHH-org再表現α-胎球蛋白(Afp)。

根據一些實施例，藉由本發明之方法擴增之肝細胞類器官及/或肝細胞能夠在培養中進一步擴增至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50次傳代。根據一些實施例，藉由本發明之方法擴增之肝細胞類器官及/或肝細胞能夠在培養中進一步擴增至少3、4、5、6、10、12、15、18、20或24個月。根據一些實施例，藉由本發明之方法擴增之PHH-org能夠在培養中進一步擴增至少1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5個月。根據一些實施例，藉由本發明之方法擴增之胎兒-org能夠在培養中進一步擴增至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50次傳代。

根據一些實施例，藉由本發明之方法產生之肝細胞類器官以指數方式擴增，視情況其中擴增之比率係每7-10天約1:3。根據一些實施例，藉由本發明之方法產生之肝細胞類器官具有至少0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%或1%之塗鋪效率。

根據另一態樣，本文提供藉由本發明之方法產生之肝細胞類器官。根據一些實施例，本文提供一種肝細胞培養物，其包含藉由本發明之方法產生之肝細胞類器官。根據一些實施例，本文提供自藉由本發明之方法產生之肝細胞類器官製備之單細胞及/或單細胞培養物。

根據一些實施例，藉由本發明之方法產生之肝細胞類器官包含內腔。根據一些實施例，藉由本發明之方法產生之肝細胞類器官包含小內腔及大細胞，而非由膽管細胞產生之類器官之典型大內腔及扁平細胞。

根據一些實施例，藉由本發明之方法產生之肝細胞類器官包含選自由以下組成之群之全肝及原代肝細胞形態及功能之特徵：肝糖累積、低密度脂蛋白(LDL)之功能攝取、包含具有原纖維中心及去凝縮染色質之顯著核仁之細胞核、大量具有少且短之皺褶之粒線體、膽小管、緊密型接合、過氧化體、溶酶體、多胞體、自噬空泡及其組合。

根據一些實施例，藉由本發明之方法產生之肝細胞類器官分泌白蛋白、α-1抗胰蛋白酶(A1AT)、α-胎球蛋白(Afp)及其組合中之至少一種。

根據一些實施例，對於選自由以下組成之群之基因，藉由本發明之方法產生之肝細胞類器官展現出與該等原代肝細胞之基因表現相當之基因表現：白蛋白、脂蛋白元A2 (APOA2)、絲胺酸蛋白酶抑制劑(Serpin)家族成員1 (SERPINA1)及其組合。

根據一些實施例，藉由本發明之方法產生之肝細胞類器官不表現通常在膽管細胞中表現之標記基因。根據一些實施例，藉由本發明之方法產生之肝細胞類器官表現通常在膽管細胞中不表現之基因。根據一些實施例，功能性肝細胞基因(諸如但不限於與細胞色素P450活性、肝糖/脂質代謝及/或尿素循環相關之基因)之表現分別在來自胎兒或成人來源之Hep-org及胎兒肝細胞或成人原代人類肝細胞中相當。根據一些實施例，藉由本發明之方法產生之肝細胞類器官展現祖細胞/膽管細胞標記基因之表現低於源於膽管細胞之類器官所見之表現。此等祖細胞/膽管細胞標記基因之非限制性實例係EPCAM、SOX9、KRT8/18及KRT7/19。

根據另一態樣，本文提供藉由本發明之方法產生之肝細胞類器官及/或源自其之單細胞，其用於醫學或診斷學。

根據一些實施例，本文提供藉由本發明之方法產生之肝細胞類器官，其用於活體內篩選物質對肝細胞之潛在作用，視情況用於篩選治療性或毒性作用。不希望受理論或機制束縛，藉由本發明之方法產生之肝細胞類器官可提供合適之活體外模型，由於其與肝臟組織之高度形態及功能相似性而用於精確篩選及預測物質在活體內對肝臟組織之作用。

根據一些實施例，本文提供藉由本發明之方法產生之肝細胞類器官，其用於治療由個體之肝臟中之受損肝細胞引起及/或與其相關之疾病或病狀。不希望受理論或機制束縛，藉由本發明之方法產生之肝細胞類器官能夠在個體之肝臟中植入及增殖，因此可能夠替代受損肝臟組織並治療肝臟組織(且特別是肝細胞)受損之疾病及病狀。根據一些實施例，由個體之肝臟中之受損肝細胞引起及/或與其相關之疾病或病狀係選自由以下組成之群：肝細胞癌、Alagille症候群、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、自體免疫性肝炎、膽道閉鎖症、慢性肝炎、肝癌、肝硬化、肝囊腫、脂肪肝病、半乳糖血症、捷倍耳氏症候群(Gilbert's Syndrome)、原發性膽汁性肝硬化、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、原發性硬化性膽管炎、雷氏症候群(Reye's Syndrome)、類肉瘤病、酪胺酸血症、I型肝糖貯積病、威爾森氏病(Wilson's Disease)、新生兒肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、紫質症、血色素沈著症、進行性家族性肝內膽汁淤積、III型肝糖貯積病、酪胺酸血症、去氧鳥苷激酶缺乏症、丙酮酸羧化酶缺乏症、先天性紅血球生成不良性貧血、多囊性肝病、多囊性腎病、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、尿素循環缺陷、有機酸血症、溶酶體貯積病、脂肪酸氧化障礙及其組合。

根據一些實施例，本文提供藉由本發明之方法產生之肝細胞類器官，其用於修復經受損傷及/或經受至少部分肝切除術(HPx)之肝臟之方法，該方法包括將肝細胞類器官及/或源自其之單細胞移植至肝臟中。根據一些實施例，本文提供藉由本發明之方法產生之肝細胞類器官，其用於再生有需要之個體之肝臟組織的方法，該方法包括將肝細胞類器官及/或源自其之單細胞移植至肝臟中。根據一些實施例，移植肝細胞類器官及/或源自其之單細胞係經由脾注射。根據一些實施例，使用源自本發明之肝細胞類器官之單細胞實施如本文所揭示之治療、移植及/或再生之方法。熟習此項技術者將能夠端視正在移植之材料(即細胞群體、細胞懸浮液中之單細胞、類器官或類器官片段)選擇適當之投與方法及投與途徑。

不希望受理論或機制束縛，可將本發明之肝細胞類器官植入至受移植個體之肝臟上且在損傷之後重現肝細胞增殖反應，由此使得能夠再生受損及/或去除之肝臟組織。

根據一些實施例，包括將胎兒-org或源自其之細胞(例如單細胞)移植至個體之肝臟中之方法進一步包括使細胞分化之步驟。根據一些實施例，包括使用至個體肝臟中之胎兒-org或源自其之單細胞進行之治療、診斷及/或篩選的方法進一步包括使細胞分化之步驟。根據較佳實施例，實施胎兒-org之細胞或源自其之細胞之分化，接著將該等細胞移植至個體中，使用該等細胞治療個體或使用該等細胞進行活體外篩選及/或診斷。不希望受理論或機制束縛，使源自胎兒肝細胞之類器官分化、接著將其移植至個體中可改良細胞至個體之肝臟中之可移植性及植入，由此潛在地加速及/或改良肝臟再生/治療。根據一些實施例，可受益於在移植至個體中之前分化之胎兒-org及/或源自其之單細胞源自自人類胎兒分離之原代肝細胞，視情況其中該胎兒處於妊娠約第5-30週，視情況處於妊娠約第10-20週。

因此，根據一些實施例，本文提供用於修復經受損傷及/或經受至少部分肝切除術(HPx)之肝臟之方法，該方法包括將肝細胞類器官及/或源自其之單細胞移植至肝臟中，其中自胎兒原代肝細胞擴增該肝細胞類器官且其中該用於修復肝臟之方法進一步包括使該肝細胞類器官及/或該等源自其之單細胞分化，視情況其中分化係在移植該肝細胞類器官及/或該等源自其之單細胞之前。

根據一些實施例，胎兒-org細胞及/或源自其之單細胞之分化係藉由在分化培養基(在本文中亦稱為「DM」)中培養該等細胞來進行。因此，本發明亦提供分化培養基。根據一些實施例，分化培養基增加胎兒-org及/或源自其之細胞之成熟。根據一些實施例，分化培養基包含地塞米松(dexamethasone)及抑癌素M中之至少一種。根據一些實施例，分化培養基包含地塞米松及抑癌素M。根據一些實施例，分化培養基包含本發明之肝細胞培養基以及地塞米松及抑癌素M中之至少一種。根據一些實施例，分化培養基包含補充有地塞米松及抑癌素M之本發明之肝細胞培養基。根據一些實施例，地塞米松之濃度係約1 µM。根據一些實施例，抑癌素M之濃度係約10 ng/ml。根據一些實施例，地塞米松之濃度係約1 µM且抑癌素M之濃度係約10 ng/ml。根據一些實施例，地塞米松之濃度係0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4或5 µM。根據一些實施例，抑癌素M之濃度係約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20 ng/ml。

根據一些實施例，本文提供用於使胎兒肝細胞成熟之分化培養基，其中該分化培養基包含本發明之肝細胞培養基且進一步包含視情況濃度分別為約1 µM及約10 ng/ml之地塞米松及抑癌素M。根據一些實施例，本發明之胎兒肝細胞類器官之分化培養基包含表2中「人類胎兒-Org分化培養基(DM)」下所指示之所有成分。根據一些實施例，本文提供用於使胎兒肝細胞成熟之分化培養基，其中該分化培養基包含表2中「人類胎兒-Org分化培養基(DM)」下所指示之所有成分。

本發明之方法

根據一些實施例，本文提供用於活體外擴增原代肝細胞之方法(在本文中亦稱為「本發明之方法」)，其中該方法包括在本發明之肝細胞培養基中培養原代肝細胞。如對於熟習此項技術者將顯而易見的，用於擴增原代肝細胞之本發明方法可經適當變通後進一步用於擴增藉由本發明之方法產生之細胞及/或肝細胞類器官。

根據一些實施例，本發明之方法係用於活體外擴增原代肝細胞之方法，其中該方法包括在本發明之肝細胞培養基中培養原代肝細胞。

根據一些實施例，本發明之方法係用於活體外擴增原代肝細胞之方法，其中該方法包括在肝細胞培養基中培養原代肝細胞，其中該肝細胞培養基包含： i. 50至500 ng/ml纖維母細胞生長因子(FGF)，其視情況選自由FGF7、FGF10及其組合組成之群； ii. Wnt促效劑，其包含R-脊椎蛋白及至少一種肝糖合成酶激酶3 (GSK3)抑制劑； iii. 5至100 ng/ml表皮生長因子(EGF)； iv. 5至100 ng/ml肝細胞生長因子(HGF)；及 v. 轉型生長因子β (TGF-β)抑制劑，其包含活化素受體樣激酶ALK4、ALK5及/或ALK7信號傳導之抑制劑。

根據一些實施例，本發明之方法進一步包括在肝細胞培養基中培養原代肝細胞之步驟之前，例如使用本文所述之任何分離方法自肝臟分離原代肝細胞之步驟。其他分離方法亦為此項技術中已知。根據其他實施例，無需分離步驟，且在肝細胞培養基中培養來自包含原代肝細胞之胎兒或成人肝臟之組織外植體。

根據一些實施例，本發明之方法進一步包括使原代肝細胞或分離之原代肝細胞與細胞外基質接觸之步驟，如本文所定義。

根據一些實施例，本發明之方法係用於擴增原代肝細胞之三維培養方法。本發明之肝細胞培養基(Hep-培養基)

根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含： i. FGF或其類似物、片段或變異體； ii. Wnt促效劑，其包含R脊椎蛋白或其類似物、片段或變異體以及肝糖合成酶激酶3 (GSK3)抑制劑； iii. 表皮生長因子(EGF)或其類似物、片段或變異體； iv. 肝細胞生長因子(HGF)或其類似物、片段或變異體；以及 v. 轉型生長因子β (TGF-β)抑制劑，其包含ALK4、ALK5及/或ALK7信號傳導之抑制劑。

根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含： i. 50至500 ng/ml FGF，較佳選自FGF7及FGF10； ii. Wnt促效劑，其包含5%至50% (vol/vol) R-脊椎蛋白條件化培養基及至少一種肝糖合成酶激酶3 (GSK3)抑制劑，視情況CHIR99021； iii. 5至100 ng/ml表皮生長因子(EGF)； iv. 5至100 ng/ml肝細胞生長因子(HGF)；及 v. 轉型生長因子β (TGF-β)抑制劑，其包含ALK4、ALK5及/或ALK7信號傳導抑制劑，視情況A83-01。

在一些實施例中，肝細胞培養基進一步包含TGFa。此對人類肝細胞培養特別有利。

在一些實施例中，肝細胞培養基進一步包含胃泌素、菸鹼醯胺、ROCK抑制劑、B27 (視情況無維生素A)及N-乙醯半胱胺酸中之一或多種或全部。

在一些實施例中，肝細胞培養基進一步包含細胞生長培養基，諸如但不限於AdDMEM/F12 (Invitrogen)，視情況進一步包含Hepes (例如10 mM)及/或Glutamax補充劑(Gibco)，視情況包含抗生素，諸如青黴素及鏈黴素。

根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含：約100 ng/ml FGF7；約100 ng/ml FGF10；約20 ng/ml TGFa；約50 ng/ml EGF；約50 ng/ml HGF； B27 (不包含維生素A)；約2 μM A83-01；約10 μM Y-27632；約3 μm CHIR99021；約10 mM菸鹼醯胺；約10 nM胃泌素；約1.25 mM N-乙醯半胱胺酸；及約15% R-脊椎蛋白條件化培養基，視情況其中肝細胞培養基進一步包含細胞生長培養基，諸如但不限於AdDMEM/F12 (Invitrogen)，視情況進一步包含Hepes (例如10 mM)及/或Glutamax補充劑(Gibco)，視情況包含抗生素，諸如青黴素及鏈黴素。

根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基中之組分之濃度使得其能夠根據本發明之方法擴增原代肝細胞，視情況進一步使得能夠在擴增之細胞中維持原代肝細胞之關鍵形態、功能及基因表現性質。

根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基包含表2中所述之Hep-培養基，其中該Hep-培養基(人類)培養基適於擴增人類成體或胎兒肝細胞，而該Hep-培養基(小鼠)培養基適於擴增鼠類肝細胞。表 2- 與用於膽管細胞 ( 及 Chol-org) 之擴增 / 分化之相應培養基相比，根據本發明之一些實施例之用於小鼠 / 人類肝細胞之肝細胞培養基及用於人類胎兒肝細胞之分化培養基

組分	Hep- 培養基 ( 小鼠 )	Hep- 培養基 ( 人類 )	人類胎兒 -Org 分化培養基 (DM)	Chol- 培養基 ( 小鼠 )/Chol-Org 擴增培養基 (EM) (R)	小鼠 Chol-Org 分化培養基 (DM) (R)	Chol- 培養基 ( 人類 )/Chol-Org 擴增培養基 (EM) (R)	人類 Chol-Org 分離培養基 (R)	小鼠 Chol-Org 分化培養基 (DM) (R)
Advanced DMEM/F-12	+	+	+	+	+	+	+	+
1%青黴素/鏈黴素	+	+	+	+	+	+	+	+
1% GlutaMAX	+	+	+	+	+	+	+	+
10 mM HEPES	+	+	+	+	+	+	+	+
B27補充劑(1:50)	(無維生素A)	(無維生素A)	(無維生素A)	兩者中之任一者	兩者中之任一者	兩者中之任一者	兩者中之任一者	有維生素A
N2補充劑 (1:100)	-	-	-	-	-	+	+	+
R-脊椎蛋白1-條件化培養基	15%	15%	15%	5%	-	10%	10%	-
頭蛋白-條件化培養基	-	-	-	-	-	-	5%	-
Wnt3a-條件化培養基	-	-	-	-	-	-	30%	-
ChIR99021	3 μm	3 μm	3 μm	-	-	-	-	-
N-乙醯半胱胺酸	1.25 mM	1.25 mM	1.25 mM	1 mM	1 mM	1 mM	1 mM	1 mM
菸鹼醯胺	10 mM	10 mM	10 mM	10 mM	-	10 mM	10 mM	-
(重組)胃泌素	10 nM	10 nM	10 nM	10 nM	10 nM	10 nM	10 nM	10 nM
(重組) EGF	50 ng/ml	50 ng/ml	50 ng/ml	50 ng/ml	50 ng/ml	50 ng/ml	50 ng/ml	50 ng/ml
(重組) TGFa	-	20 ng/ml	20 ng/ml	-	-	-	-	-
(重組)人類FGF7	50 ng/ml	50 ng/ml	50 ng/ml	-	-	-	-	-
(重組)人類FGF10	50 ng/ml	50 ng/ml	50 ng/ml	100 ng/ml	100 ng/ml	100 ng/ml	100 ng/ml	-
(重組)人類FGF19	-	-	-	-	-	-	-	100 ng/ml
(重組)人類HGF	25 ng/ml	25 ng/ml	25 ng/ml	50 ng/ml	-	25 ng/ml	25 ng/ml	25 ng/ml
氟斯柯林(Forskolin)	-	-	-	-	-	10 µM	10 µM
A83-01	1 μM	2 μM	2 μM	-	50 nM	5 µM	5 µM	0.5 µM
DAPT	-	-	-	-	10 µM	-	-	10 µM
地塞米松	-	-	1 µM	-	3 µM (第13天至第15天)	-	-	3 µM
抑癌素M	-	-	10 ng/ml	-	-	-	-	-
BMP7	-	-	-	-	-	-	-	25 ng/ml
ROCK抑制劑(Y-27632)	10 µM	10 µM	10 µM	-	-	-	10 µM	-

用於本發明之方法中之細胞培養基包含任何受本文提供之限制之合適基礎培養基。用於細胞培養之基礎培養基通常含有大量支持培養細胞之維持所必需之成分。慮及以下揭示內容，成分之合適組合可容易地由熟習此項技術者調配。用於本發明中之基礎培養基通常將包含營養溶液，該營養溶液包含標準細胞培養成分，諸如胺基酸、維生素、脂質補充劑、無機鹽、碳能源及緩衝液，如文獻及下文中更詳細闡述。在一些實施例中，培養基進一步補充有一或多種例如選自以下之標準細胞培養成分：胺基酸、維生素、脂質補充劑、無機鹽、碳能源及緩衝劑。

熟習此項技術者將自公知常識了解可用作本發明之細胞培養基中之基礎培養基的培養基類型。潛在合適之細胞培養基可自市面購得，且包括但不限於杜爾貝科改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Media) (DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Knockout-DMEM (KO-DMEM)、格拉斯哥最低必需培養基(Glasgow Minimal Essential Medium) (G-MEM)、伊格爾基礎培養基(Basal Medium Eagle) (BME)、DMEM/Ham's F12、Advanced DMEM/Ham's F12、伊斯科夫改良杜爾貝科培養基(Iscove' s Modified Dulbecco 's Media)及最低必需培養基(MEM)、Ham' s F-10、Ham's F-12、培養基199及RPMI 1640培養基。較佳地，基礎培養基係advanced-DMEM/F12。

基礎培養基可補充有青黴素/鏈黴素(例如1%)、GlutaMAX (例如1%)、HEPES (例如10 mM)、B27補充劑(1:50，較佳在Hep-培養基中無維生素A)且視情況補充有N2補充劑(1:100)。較佳地，Hep-培養基中不包括N2補充劑。

另外較佳地，該細胞培養基補充有經純化、天然、半合成及/或合成之生長因子，且不包含不明確組分，諸如胎牛血清或小牛血清(fetal calf serum)。各種不同之血清替代物調配物可自市面購得且係熟習此項技術者已知的。在使用血清替代物之情況下，其可根據習用技術以培養基之介於約1體積%與約30體積%之間使用。

如對熟習此項技術之讀者顯而易見的，本發明之較佳培養方法係有利的，此乃因無需飼養細胞。飼養細胞層通常用於支持幹細胞之培養及抑制其分化。飼養細胞層通常係與相關細胞共培養且提供適於相關細胞生長之表面之細胞單層。飼養細胞層提供相關細胞可在其中生長之環境。通常使飼養細胞有絲分裂不活化(例如，藉由輻照或用絲裂黴素C處理)以防止其增殖。飼養細胞之使用係不期望的，此乃因其使細胞傳代複雜化(細胞必須在每次傳代時與飼養細胞分離，且每次傳代皆需要新飼養細胞)。飼養細胞之使用亦可導致期望細胞受到飼養細胞之污染。此對於任何醫療應用而言顯然皆成問題，且即使在研究背景下，亦使對細胞實施之任何實驗之結果的分析複雜化。如本文別處所指出，本發明之培養基特別有利，此乃因其可用於在無飼養細胞接觸之情況下培養細胞，即本發明之方法無需一層飼養細胞來支持促成其生長之細胞。

因此，本發明之組合物可為無飼養細胞組合物。若組合物中之細胞已在不存在飼養細胞層之情況下培養至少一次傳代，則照慣例認為該組合物無飼養細胞。本發明之無飼養細胞組合物通常將含有小於約5%、小於約4%、小於約3%、小於約2%、小於約1%之飼養細胞(表示為組合物中細胞總數之%)或較佳根本不含飼養細胞。

用於本發明中之培養基可包含血清，或可不含血清及/或不含血清替代物，如本文別處所述。培養基及細胞製備較佳係符合FDA對於生物製品之要求之標準且確保產品一致性之GMP製程。

通常將在去離子蒸餾水中調配本發明之培養基。本發明之培養基通常將在使用之前例如藉由紫外光、加熱、輻照或過濾滅菌以防止污染。培養基可經冷凍(例如，在-20℃或-80℃下)以用於儲存或運輸。培養基可含有一或多種抗生素以防止污染。培養基可具有小於0.1內毒素單位/ml之內毒素含量，或可具有小於0.05內毒素單位/ml之內毒素含量。用於確定培養基之內毒素含量之方法係此項技術中已知的。

較佳細胞培養基係用基於碳酸鹽之緩衝液以7.4之pH (較佳以7.2-7.6或至少7.2且不高於7.6之pH)緩衝之明確合成培養基，而在包含介於5%與10%之間之CO₂ 、或至少5%且不高於10% CO₂ 、較佳5% CO₂ 之氛圍中培養細胞。

本發明亦提供一種組合物或細胞培養容器，其包含根據上述本發明之任一態樣之細胞及/或類器官，以及根據上述本發明之任一態樣之培養基。舉例而言，此一組合物或細胞培養容器可包含在如上所述之培養基中根據本發明之方法培養的任何數目之細胞或類器官。

根據本發明之又一態樣，提供含有本發明之培養基之氣密密封容器。在一些實施例中，培養基係擴增培養基。在一些實施例中，培養基係分化培養基。氣密密封容器可較佳用於培養基之運輸或儲存，以防止污染。容器可為任何合適之容器，諸如燒瓶、板、瓶、罐、小瓶或袋。本發明之肝細胞類器官

根據一些實施例，Hep-org係由人類胎兒肝細胞或成人原代人類肝細胞(PHH)產生。根據一些實施例，胎兒肝細胞來自妊娠5-30週之間、視情況妊娠8-25週之間、較佳妊娠11-20週之間之人類肝臟。

根據一些實施例，可將根據本發明之方法擴增之Hep-org擴增至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50次傳代。根據一些實施例，可將根據本發明之方法擴增之Hep-org擴增至少16次傳代。根據一些實施例，可將根據本發明之方法擴增之Hep-org在培養中擴增至少6、12、18、24個月。

根據一些實施例，可將源自根據本發明之方法擴增之胎兒肝細胞的Hep-org擴增至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50次傳代。根據一些實施例，可將根據本發明之方法之Hep-org擴增胎兒肝細胞擴增至少16次傳代。根據一些實施例，可將根據本發明之方法自胎兒肝細胞擴增之Hep-org在培養中擴增至少6、12、18、24個月。根據一些實施例，可將根據本發明之方法自成人原代人類肝細胞擴增之Hep-org在培養中擴增至少2、2.5、3、4、5、6、12、18、24個月。

根據一些實施例，Hep-org包含內腔及肝細胞形態之大細胞。根據一些實施例，Hep-org具有比Chol-org更大之細胞直徑。根據一些實施例，人類Hep-Org之細胞具有比Chol-Org更大之細胞直徑及更低之細胞核/細胞質比。根據一些實施例，對於來自胎兒肝細胞之Hep-Org，細胞直徑/細胞核直徑比為30.08±8.17 μm/14.07±1.59 μm，對於來自PPH之Hep-Org，細胞直徑/細胞核直徑比為7.54±6.50 μm/11.69±1.64 μm，且對於來自Chol-Org之細胞，細胞直徑/細胞核直徑比為10.42±2.78/7.22±1.55 μm。在一些實施例中，Hep-Org具有至少15 μm、至少20 μm或至少25 μm之細胞直徑。在一些實施例中，Hep-Org具有至少5 μm、至少10 μm或至少15 μm之細胞核直徑。

根據一些實施例，源自胎兒肝細胞之人類Hep-org (在本文中亦稱為胎兒-org)表現Alb及HNF4A。根據一些實施例，源自胎兒肝細胞之人類Hep-org表現Alb、HNF4A及CYP2E1。

根據一些實施例，Hep-org包含膽小管。根據一些實施例，Hep-org展現低密度脂蛋白之功能主動攝取。根據一些實施例，Hep-org展現肝糖累積。根據一些實施例，胎兒-org包含膽小管。根據一些實施例，胎兒-org展現低密度脂蛋白之功能主動攝取。根據一些實施例，胎兒-org展現肝糖累積。

根據一些實施例，Hep-org分泌白蛋白。根據一些實施例，Hep-org分泌與原代人類肝細胞相當之量之白蛋白。

根據一些實施例，Hep-org分泌A1AT。根據一些實施例，Hep-org分泌由原代人類肝細胞產生之水準之25%-50%之A1AT。

根據一些實施例，Hep-org分泌Afp。根據一些實施例，藉由Hep-org進行之Afp分泌隨時間而減少。根據一些實施例，PHH-org再表現Afp。

根據一些實施例，胎兒-org展現之CYP3A4活性較原代人類肝細胞之CYP3A4活性低2-8倍。根據其他實施例，源自原代人類肝細胞之Hep-org展現比原代人類肝細胞之CYP3A4活性更高之CYP3A4活性。

根據一些實施例，選自以下群之基因之表現在原代人類肝細胞中及Hep-org中(二者來自胎兒及成人來源)相當：Alb、APOA2、SERPINA1或其組合。

根據一些實施例，功能性肝細胞基因(諸如但不限於與細胞色素P450活性、肝糖/脂質代謝及/或尿素循環相關之基因)之表現分別在來自胎兒或成人來源之Hep-org及胎兒肝細胞或成人原代人類肝細胞中相當。

根據一些實施例，胎兒-org及/或PHH-org包含以下細胞類型中之至少一種：肝細胞，其展現白蛋白、SERPINA1及ASGR1之高表現，可能進一步表現AFP、MT1、APOA、RBP4及FABP1；細胞，其表現間質標記物，諸如COL1A2及FSTL1，可能進一步表現DCN、VIM、FGFR及TGFBI；表現諸如CD24、IL32及MMP7等肝臟祖細胞標記物之細胞，視情況富含粒線體基因mRNA；或其組合。

根據一些實施例，Hep-org能夠植入並重建受損肝臟組織。根據一些實施例，Hep-org展現移植後之顯著移植物擴增。

根據一些實施例，Hep-org表現胎兒肝細胞標記基因Afp、Alb、Hnf4a、Cyp1a2及Cyp3a11。根據一些實施例，Hep-org以顯著高於原代肝細胞之水準表現胎兒肝細胞標記物Cyp3a11 (如例如圖2C中所見)。根據一些實施例，Hep-org以顯著低於原代肝細胞之水準表現胎兒肝細胞標記物Cyp1a2及Alb (如例如圖2C中所見)。根據一些實施例，Hep-org中之細胞色素Cyp1a2活性較原代肝細胞中低至多3倍(如例如圖2H所見)。肝細胞類器官(Hep-org)相對於膽管細胞類器官(Chol-org)

根據一些實施例，本發明之肝細胞類器官與源自膽管細胞之類器官(在本文中亦稱為「Chol-org」)不同之處在於以下特徵中之至少一個：Hep-org不表現通常在膽管細胞中表現之標記基因，Hep-org表現通常在膽管細胞中不表現之基因，Hep-org之緊湊細胞叢(cell clump) (或「葡萄串」)形態不同於Chol-org之大內腔結構，Hep-org之細胞與Chol-org之細胞之膽管細胞形態相比展現出肝細胞樣形態，擴增Chol-org分泌顯著小於Hep-org之白蛋白(小約1000倍)，Hep-org細胞具有比Chol-org細胞更大之細胞直徑，Hep-org細胞具有比Chol-org細胞更低之細胞核/細胞質比，或其組合。

根據一些實施例，Hep-org不展現膽管細胞功能。舉例而言，Hep-org不能主動地將膽管細胞表面糖蛋白MDR1 (多重抗藥性蛋白質1)之受質轉運至其內腔中。

根據一些實施例，本發明之肝細胞類器官與Chol-org不同之處在於至少一個如表1中所揭示之特徵，視情況2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個或全部於表1中所揭示之特徵。表 1– 本發明之 Hep-org 與根據一些實施例之 Chol-org 之間之差異

		Hep-Org	Chol-Org
建立	分離	兩步膠原酶灌注(靜脈內)，消化3-5分鐘，以保持脆弱肝細胞存活，低速離心。	用膠原酶XI+分散酶消化需要＞45分鐘。人類生檢樣本：膠原酶-accutase消化30分鐘。
細胞來源	Alb+鼠類肝細胞。	人類或鼠類Epcam+管細胞
新鮮或冷凍保存之胎兒-肝細胞或冷凍保存之PHH。
純系生成率 (Clonogenicity)	約1%	28.4%±3.2%
基本表徵	形態	緻密之葡萄串樣類器官典型肝細胞形態及結構(穿透式EM)。	囊性類器官，具大內腔且襯有扁平細胞。膽管細胞形態及結構(穿透式EM)。



生長速度	胎兒-Org具有約5-7天之倍增時間，以每7-10天1:3傳代。將PHH-Org保持50-75天，傳代1-2次。	倍增時間為約60小時，傳代比率為每週1:5-7。
表現	與肝細胞類似之諸如ALB、A1AT及HNF4A等肝標記物之高表現	膽管細胞標記物EPCAM、KRT19及KRT7之高表現
功能	活體外分析	類似於正常培養擴增期間之肝細胞之基因表現譜。Hep-Org中之幾乎每個細胞皆顯示LDL攝取、肝糖貯積、脂滴分泌、白蛋白分泌、細胞色素450代謝等。	無肝細胞分化，Chol-Org幾乎未顯示任何肝糖貯積或LDL攝取能力，且具有指示膽功能之高玫瑰紅123攝取。
移植	慢性肝臟損傷模型中來自胎兒肝細胞之胎兒-Org之植入及顯著移植物擴增，3個月後循環中之hAlb為400 ug/ml。PHH-Org在移植後60天內以與PHH相同之速度增殖。	急性肝臟損傷模型中之低水準植入。

本發明之組合物

根據一些實施例，提供包含本發明之培養基及肝臟組織外植體之組合物。根據一些實施例，提供包含本發明之培養基及一或多個原代肝細胞之組合物。根據一些實施例，提供包含本發明之培養基及一或多個經擴增肝細胞之組合物。根據一些實施例，提供包含本發明之培養基及肝細胞類器官之組合物。任何本發明之組合物皆可進一步包含如本文所述之細胞外基質。

亦提供包含本發明之培養基及如本文所述之細胞外基質之組合物。

本發明亦提供可用於產生如本文所揭示之培養基之培養基補充劑。『培養基補充劑』係自身不能支持幹細胞、但當與其他細胞培養成分組合時使得能夠進行幹細胞培養或改良幹細胞培養之成分混合物。因此，補充劑可用於藉由將其與其他細胞培養成分組合以產生適當培養基調配物來產生本發明之功能性細胞培養基。培養基補充劑之使用為此項技術中所熟知。本發明之醫藥組合物

根據一些實施例，本發明提供一種醫藥組合物，其包含如本文所述之任何培養基之組分及醫藥上可接受之稀釋劑及/或賦形劑。

根據一些實施例，本發明提供一種醫藥組合物，其包含一或多個藉由本發明之方法獲得之擴增肝細胞。根據一些實施例，本發明提供一種醫藥組合物，其包含一或多個藉由本發明之方法獲得之肝細胞類器官。根據一些實施例，本發明提供一種醫藥組合物，其包含一或多個來自藉由本發明之方法獲得之類器官的肝細胞。醫藥組合物可調配成使得其合適於向有需要之患者投與。醫藥組合物可進一步包含支架。用於細胞移植療法之合適支架之實例為此項技術中所熟知。支架提供二維或三維網絡。用於此一支架之合適合成材料包含選自以下之聚合物：多孔固體、奈米纖維及水凝膠，例如包括自組裝肽之肽、由聚乙二醇磷酸酯、聚乙二醇富馬酸酯、聚丙烯醯胺、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚乙酸纖維素及/或其共聚物構成之水凝膠(參見，例如Saha等人，2007. Curr Opin Chem Biol. 11(4): 381–387；Saha等人，2008. Biophysical Journal 95: 4426–4438；Little等人，2008. Chem. Rev. 108, 1787–1796)。細胞外基質(ECM)

根據一些實施例，本發明之方法進一步包括使欲擴增之原代肝細胞及/或肝細胞類器官與細胞外基質(在本文中亦稱為「ECM」)接觸。ECM較佳為外源性ECM。在一些實施例中，細胞外基質係三維的(「3D ECM」)。在其他實施例中，預期細胞外基質與培養基呈懸浮態。根據一些實施例，本發明之方法提供在培養中擴增原代肝細胞及/或肝細胞類器官之方法，該方法包括在本發明之肝細胞培養基存在下將原代肝細胞及/或肝細胞類器官與ECM接觸培養。根據一些實施例，使欲藉由本發明之方法擴增之原代肝細胞及/或肝細胞類器官與ECM接觸，之後用本發明之培養基培育。根據一些實施例，ECM包含本發明之肝細胞培養基。

「接觸」意指物理或機械或化學接觸，此意味著為了將該所得類器官或細胞群體與該細胞外基質分離，需要使用力。根據一些實施例，接觸係指將細胞接種於3D ECM之頂部上及/或將細胞包埋於3D ECM中。根據較佳實施例，將欲藉由本發明之方法擴增之原代肝細胞及/或肝細胞類器官包埋於非固體3D ECM內，之後在本發明之肝細胞培養基中培養該等細胞及3D ECM。根據較佳實施例，將原代肝細胞及/或肝細胞類器官包埋於3D ECM中。本發明之肝細胞培養基可擴散至細胞外基質(ECM)中。

任何合適之細胞外基質皆可與本發明之方法一起使用。根據一些實施例，根據本發明使用之ECM可為天然存在之ECM、模擬天然存在之ECM之商業ECM及/或合成ECM。天然存在之ECM由結締組織細胞分泌且可由多種多糖、水、彈性蛋白及糖蛋白構成，其中糖蛋白可包含例如膠原、巢蛋白(entactin, nidogen)、纖網蛋白及層黏連蛋白。不同類型之天然存在之ECM係已知的，包含不同組合物，包括不同類型之糖蛋白及/或糖蛋白之不同組合。該ECM可例如藉由培養產生ECM之細胞來提供。或者，可以商業方式提供模擬天然存在之ECM之ECM。市售細胞外基質之實例係細胞外基質蛋白質(Invitrogen)、來自Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)小鼠肉瘤細胞之基底膜製劑(例如Matrigel^TM (BD Biosciences))及基底膜提取物(例如Cultrex BME^TM , R&D systems)。或者，可使用合成之細胞外基質材料，諸如ProNectin (Sigma Z378666)。

用於本發明方法中之ECM之實例包含至少一種糖蛋白，諸如層黏連蛋白。用於本發明方法中之視情況選用之ECM包含至少兩種不同糖蛋白，諸如兩種不同類型之膠原或膠原及層黏連蛋白。又一視情況選用之ECM包含層黏連蛋白、巢蛋白及膠原IV。又一較佳ECM由Matrigel^TM (BD Biosciences)提供，其包含層黏連蛋白、巢蛋白及膠原IV。在一些實施例中，細胞外基質係含層黏連蛋白之細胞外基質，諸如Matrigel^TM (BD Biosciences)。

在一些實施例中，將肝細胞培養基置於ECM之頂部上。接著可去除培養基且在需要時補充培養基。在一些實施例中，培養基每1、2、3、4、5、6或7天補充一次。若將組分自培養基「添加」或「去除」，則在一些實施例中，此可意指將培養基本身自ECM去除，且接著將含有「添加」組分或具有排除之「去除」組分之新培養基置於ECM上。在一些實施例中，本發明之肝細胞培養基與細胞外基質接觸。

本發明之方法可進一步包括對使用培養方法獲得之類器官進行傳代。在一些實施例中，將一週至10天齡之類器官自細胞外基質移出且機械地解離成小片段，之後轉移至新鮮細胞外基質。熟習此項技術者將知曉如何分裂(split)類器官以對其進行傳代，使得其可在不超過其容器之濃度極限之情況下倍增。在一些實施例中，傳代實施至少2個月，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、20、24個或更多個月。在一些實施例中，每週一次以1:4至1:8分裂比進行傳代，持續至少2個月，例如持續2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、20、24個或更多個月。在一些實施例中，該方法包括將類器官傳代多於6次，例如多於7、8、9、10、12、15、18、20、25、30次。傳代間隔可根據需要進行調整。合適實例係每週兩次、每週一次、每10天一次、每兩週一次，例如每7-10天一次。培養基之分流可根據需要進行調適。合適實例係1:3-1:10稀釋，例如1:3-1:9、1:4-1:8、1:4-1:6稀釋。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基在至少42、50、75、100、125、150、175、200、250、300、365天培養期間誘導或促進細胞之存活及/或增殖。可使用此項技術中已知之技術(諸如BrdU染色、Edu染色、Ki67染色)來評估增殖，且可使用生長曲線分析。原代肝細胞之分離

根據一些實施例，本發明之方法進一步包括分離欲擴增之原代肝細胞。原代肝細胞可藉由任何合適之方法獲得。根據一些實施例，自生檢樣本或組織片段分離原代肝細胞。

在一些實施例中，藉由膠原酶消化來分離原代肝細胞，例如，如實例及Dorell等人，2008 (Hepatology. 2008年10月;48(4):1282-91. Surface markers for the murine oval cell response. Dorrell C, Erker L, Lanxon-Cookson KM, Abraham SL, Victoroff T, Ro S, Canaday PS, Streeter PR, Grompe M)中所述。在一些實施例中，對組織生檢樣本進行膠原酶消化。在一些實施例中，使用膠原酶及accutase消化來獲得用於本發明中之上皮幹細胞。

在一些實施例中，欲擴增之起始原代肝細胞係單細胞。可藉由機械破壞機械地產生包含原代肝細胞之單細胞懸浮液。或者，原代肝細胞群體可用作起點。此項技術中已知之多種物理分離方法中之任一種可用於選擇本發明之細胞且將此等細胞與其他細胞類型區分開。此等物理方法可涉及FACS及基於由本發明之細胞特異性表現之標記物之各種免疫親和方法。

在又一實施例中，提供用於獲得肝細胞類器官之方法，該方法包括在如本文所述之本發明之肝細胞培養基中擴增原代肝細胞。在培養之後，該方法可進一步包括獲得及/或分離一或多個肝細胞類器官或源自其之細胞。額外定義

直接取自活組織之細胞，即新近分離之細胞，亦稱為原代細胞。因此，如本文所用之術語「原代肝細胞」係指已自肝臟組織分離之肝細胞，包括但不限於來自人類成體肝臟之肝細胞、來自人類胎兒之肝細胞或來自鼠類肝臟之肝細胞。根據一些實施例，自妊娠第5-30週、視情況第10-20週之胎兒分離欲用於本發明方法之自人類胎兒分離之原代肝細胞。

可藉由此項技術中已知之任何合適方法來分離欲藉由本發明之方法擴增之原代肝細胞。在一些實施例中，自肝臟生檢樣本分離用於本發明方法中之原代肝細胞。在一些實施例中，藉由膠原酶消化來分離原代肝細胞，例如，如實例及Dorell等人，2008 (Hepatology. 2008年10月;48(4):1282-91. Surface markers for the murine oval cell response. Dorrell C, Erker L, Lanxon-Cookson KM, Abraham SL, Victoroff T, Ro S, Canaday PS, Streeter PR, Grompe M)中所述。在一些實施例中，對肝臟生檢樣本進行膠原酶消化。在一些實施例中，使用膠原酶及accutase消化來獲得用於本發明中之原代肝細胞。根據一些實施例，使用如下文實例中所述之兩步膠原酶灌注來分離用於本發明之方法中之原代肝細胞。

如本文所用，術語「擴增」在其係關於原代肝細胞及本發明之肝細胞類器官時，係指細胞之增殖。根據一些實施例，雖然本發明之方法提供在活體外擴增原代肝細胞及/或所得肝細胞類器官，但本發明之肝細胞類器官在活體內移植至個體之肝臟時能夠進一步擴增。

如本文所用，術語「培養」及「在培養中」係指在活體外培養中維持細胞。如熟習此項技術者已知的，在培養中維持細胞可包括週期性地改變生長培養基(諸如本發明之肝細胞培養基)及/或轉移至不同生長板/燒瓶/基質。

如本文所用之術語「表皮生長因子」及「EGF」可互換使用且係指任何合適之EGF，例如EGF (Peprotech)。EGF亦可包含EGF之活性類似物、片段及變異體。「活性」意指其相對於EGF以相當或改良之活性活化EGF受體。

術語「轉型生長因子α」、「TGF-α」及「TGFa」在本文中可互換使用，且亦可包含TGFa之活性類似物、片段及變異體。「活性」意指其相對於EGF以相當或改良之活性活化TGFa受體。TGFa係EGFR配位體家族之成員且結合EGFR樣EGF，但與EGF相比產生定量及定性不同之細胞反應。本發明者已證明在本發明之肝細胞培養基中包括EGF及TGFa兩者係有利的。

如本文所用之術語「纖維母細胞生長因子」及「FGF」可互換使用且係指任何合適之FGF，例如FGF7 (例如Peprotech)或FGF10 (例如Peptrotech)。FGF亦可包含FGF之活性類似物、片段及變異體。「活性」意指其相對於FGF以相當或改良之活性活化FGF受體。FGF7及FG10結合至FGFR2受體，且更具體地結合至IIIb同功型。結合至該受體且因此可用作FGF7及/或FGF10之替代物之其他FGF包括FGF1、FGF3及FGF22。因此，在一些實施例中，FGF係選自FGF7、FGF10、FGF1、FGF3及FGF22中之一或多種以及其活性類似物、片段或變異體。

如本文所用之術語「肝細胞生長因子」及「HGF」可互換使用且係指任何合適之HGF，例如HGF (Peptrotech)。HGF亦可包含HGF之活性類似物、片段及變異體。「活性」意指其相對於HGF以相當或改良之活性活化HGF受體(c-Met致癌基因之蛋白質產物)。

Wnt信號傳導路徑定義為當包含捲曲(Frizzled)受體LRP及LGR之細胞表面Wnt受體複合物通常由諸如Wnt家族成員等細胞外信號傳導分子活化時發生的一系列事件。此導致分解家族蛋白質之活化，該等分解家族蛋白質抑制包括軸突蛋白、GSK-3及蛋白質APC之蛋白質複合物以降解細胞內β-鏈蛋白。所得富集之核β-鏈蛋白增強藉由TCF/LEF家族轉錄因子之轉錄。如本文所用，術語「Wnt促效劑」係指活化由細胞中之TCF/LEF家族轉錄因子介導之轉錄之劑。Wnt促效劑因此選自結合並活化Wnt受體複合物(包括任何及所有Wnt家族蛋白質)之真實Wnt促效劑、細胞內β-鏈蛋白降解抑制劑、GSK-3抑制劑(諸如CHIR99021)及TCF/LEF活化劑。根據一些實施例，GSK3抑制劑係「CHIR99021」。「CHIR99021」係指6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]胺基]乙基]胺基]-3-吡啶甲腈，CT9902；CAS編號252917-06-9；PubChem物質ID 329825639。

「R脊椎蛋白」結合至Lgr5並增強Wnt信號傳導。因此，R脊椎蛋白是Lgr5促效劑及Wnt促效劑。任何合適之R脊椎蛋白皆可用於本發明之肝細胞培養基中。根據一些實施例，R脊椎蛋白可選自R脊椎蛋白1、R脊椎蛋白2、R脊椎蛋白3及R脊椎蛋白4或其活性類似物、片段或變異體中之一或多種。「活性」意指其相對於R脊椎蛋白1以相當或改良之活性增強經由Lgr5之Wnt信號傳導。根據較佳實施例，R脊椎蛋白係R脊椎蛋白1、R脊椎蛋白2、R脊椎蛋白3或R脊椎蛋白4。在一個特定實施例中，R脊椎蛋白係R脊椎蛋白1。R脊椎蛋白可以R脊椎蛋白條件化培養基之形式提供。例如，約5%至約50%、約10%至約30%或約15%。在一些實施例中，可使用R脊椎蛋白類似物、片段或變異體或Lgr5抗體代替R脊椎蛋白。實例係熟習此項技術者在此項技術中已知的。

如本文所用，「TGF-β抑制劑」 (在本文中亦稱為「轉型生長因子β (TGF-β)抑制劑」之「TGF-β信號傳導抑制劑」)係降低TGF-β路徑之活性之抑制劑。TGF-β超家族配位體包含骨形態發生蛋白質(BMP)、生長及分化因子(GDF)、抗苗勒氏激素(anti-müllerian hormone) (AMH)、活化素、nodal及TGF-β。一般而言，Smad2及Smad3在TGF-β/活化素路徑中被ALK4受體、ALK5受體及ALK7受體磷酸化。相比之下，Smad1、Smad5及Smad8作為骨成形性蛋白質(BMP)路徑之一部分磷酸化。根據本發明之TGF-β抑制劑降低TGF-β信號傳導路徑、較佳經由Smad2及/或Smad3起作用之信號傳導路徑、更佳經由活化素受體樣激酶4、5及/或7 (ALK4、ALK5及/或ALK7)起作用之信號傳導路徑之活性。根據一些實施例，肝細胞培養基中存在不多於一種TGF β抑制劑，其中該一種抑制劑係活化素受體樣激酶4、5及/或7 (ALK4、ALK5及/或ALK7)之抑制劑。在其他實施例中，肝細胞培養基中存在多於一種TGF β抑制劑，例如2、3、4種或更多種。根據一些實施例，本發明之肝細胞培養基內之TGF-β抑制劑包含選自由表3中定義之以下抑制劑組成之群之小分子抑制劑：A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208、SJN 2511及其組合。根據較佳實施例，本發明之肝細胞培養基內之TGF-β抑制劑包含視情況濃度為約2 µM之A83-01。表 3 ：根據一些實施例之小分子 TGF-β 抑制劑

抑制劑	靶標	IC50 (nM)	Mol Wt	名稱	化學式
A83-01	ALK5 (TGF-βR1)	12	421.52	3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲醯胺	C25H19N5S
ALK4	45
ALK7	7.5
SB-431542	ALK5	94	384.39	4-[4-(1,3-苯并二氧呃-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲醯胺	C22H16N4O3
ALK4
ALK7
SB-505124	ALK5	47	335.4	2-(5-苯并[1,3]二氧呃-5-基-2-第三丁基-3H咪唑-4-基)-6-甲基吡啶鹽酸鹽水合物	C20H21N3O2
ALK4	129
SB-525334	ALK5	14.3	343.42	6-[2-(1,1-二甲基乙基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-咪唑-4-基]喹口咢啉	C21H21N5
SD-208	ALK5	49	352.75	2-(5-氯-2-氟苯基)-4-[(4-吡啶基)胺基]喋啶	C17H10ClFN6
LY-36494	TGR-βRI	59	272.31	4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-喹啉	C17H12N4
TGF-βRII	400
MLK-7K	1400
SJN-2511	ALK5	23	287.32	2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶	C17H13N5

根據一些實施例，本發明之方法包括進一步包含N-乙醯半胱胺酸之肝細胞培養基。「N-乙醯半胱胺酸」係指HSCH₂ CH(NHCOCH₃ )CO₂ H (PubChem CID 12035)，且可作為培養基補充劑自市面購得(例如來自Sigma A9165；PubChem物質ID 24891402)。

根據一些實施例，本發明之方法不包含cAMP路徑活化劑。cAMP路徑活化劑係增加細胞中cAMP水準之任何合適活化劑，包括例如腺苷酸環化酶活化劑，諸如氟斯柯林或霍亂毒素。其他實例包括cAMP類似物，例如8-溴-cAMP。cAMP路徑活化劑之又一實例係NKH477 (例如，目錄編號Tocris 1603)。

如本文所用，術語「α-胎蛋白(Alpha-fetoprotein)」、「Afp」、「α-胎蛋白(α-fetoprotein)」、「α-1-胎蛋白」、「α-胎球蛋白」或「α胎兒蛋白」可互換使用且根據上下文係指其基因或蛋白質產物。如熟習此項技術者所已知，Afp通常在發育期間在胎兒肝臟中高度表現。

如本文所用，「肝標記物」包括但不一定限於Alb、Hnf4a、Hpx、Hp、Fgg Afp、Ahsg及Gc。

如本文所用，術語「部分肝切除術」及「PHx」可互換使用且係指一部分肝臟之去除。通則

除非另外指明，否則本發明之實施將採用在所屬領域技能內之習知化學、生物化學、分子生物學、免疫學及藥理學方法。

術語「包含」涵蓋「包括」以及「由......組成」，例如「包含」X之組合物可排他性地由X組成，或可包括其他某物，例如X + Y。

關於數值x 之術語「約」為視情況存在的且意指例如x ±10%。

詞語「實質上」不排除「完全」，例如「實質上不含」Y之組合物可完全不含Y。必要時，本發明之定義中可省略詞語「實質上」。

除非特別陳述，否則包括多個步驟之製程或方法可在方法開始或結束包括其他步驟，或可包括其他插入步驟。此外，適當時步驟可組合，省去或以替代次序進行。

本文中闡述本發明之各個實施例。應瞭解各實施例中說明之特徵均可與其他所說明之特徵組合以提供其他實施例。特定而言，本文中強調為合適、典型或較佳的實施例可彼此組合(除非其互斥時)。實例實例 1– 方法

在本文所提供之全部實例中皆使用以下方法。小鼠

所有動物實驗皆在荷蘭皇家藝術與科學院學院(KNAW)動物倫理委員會機構檢視後實施，項目許可證為AVD8010020151且研究方案為HI16.10.05及HI16.1002。先前(Schuler等人，2004；van Amerongen等人，2012)闡述了白蛋白-CreERT2及軸蛋白2-CreERT2小鼠。將Rosa26-LSL-tdTomato小鼠與白蛋白-CreERT2或軸蛋白2-CreERT2小鼠雜交且將其後代用於譜系追蹤。先前已闡述生成及基因分型方法(Schuler等人，2004；van Amerongen等人，2012)。使攜帶Cre及Rosa對偶基因之8-24週齡小鼠經受每25 g體重0.2 mg他莫昔芬(Sigma, T548)之單次腹膜內注射。在誘導後5-7天后收集小鼠。使用雄性小鼠及雌性小鼠二者。對於PHx，如所述實施手術(Greene及Puder, 2003)。在PHx後2.5-3天處死小鼠(Greene及Puder, 2003；Yokoyama等人，1953)。對於人類細胞移植，在洛克斐勒大學(Rockefeller University)根據IACUC方案15814使用Fah-/- NODRag1-/- Il2rgnull (FNRG)雌性小鼠。細胞株

293t-HA-Rspon1-Fc細胞如先前所述用於產生R-脊椎蛋白1之條件培養基。在加濕之5% CO2氛圍中培養細胞。自Thermo Scientific (HMCS10)獲得商用人類原代肝細胞。患者及臨床樣本

自萊頓大學醫療中心(Leiden University Medical Center)之Susana M. Chuva de Sousa Lopes獲得人類胎兒肝臟。自烏特勒克大學醫學中心醫院(University Medical Centre Utrecht Hospital)及鹿特丹大學醫學中心(Rotterdam and University Medical Center)接受手術之患者獲得人類肝臟生檢樣本。人類冷凍保存之胎兒及原代人類肝細胞來自洛克斐勒大學及Lonza公司。用於研究之樣品之使用得到倫理委員會之批準，且酌情自供體獲得知情同意。原代小鼠肝細胞之分離

藉由兩步膠原酶灌注(Li等人，2010b)自小鼠中分離肝細胞。簡言之，在將導管置於門靜脈中後，切割下腔靜脈且用預熱之灌注培養基以5-7 ml/min將肝臟灌注10分鐘。接著，用預熱之消化培養基(包括IV型膠原酶及Ca2+)以5 ml/min灌注3-5分鐘。在解離之後，藉助70 µm過濾器過濾細胞。如先前(Broutier等人，2016；Huch等人，2013)所述，藉由以低速(50 g, 1-3 min)離心進一步分離並純化肝細胞且最佳地實施Percoll梯度離心。肝細胞之類器官培養

藉由70 µm過濾器將分離之肝細胞過濾，用冷AdDMEM/F12洗滌兩次，計數且在懸浮板(Greiner)中與MatrigelR混合。24孔板之每孔使用20,000-50,000個細胞。在MatrigelR固化之後，添加Hep-培養基。Hep-培養基由以下組成：AdDMEM/F12 (Thermo Scientific，含Hepes、GlutaMax及青黴素-鏈黴素)加上15% RSPO1條件化培養基(自製)、B27 (減去維生素A)、50 ng/ml EGF (Peprotech)、1.25 mM N-乙醯半胱胺酸(Sigma)、10 nM胃泌素(Sigma)、3 µM CHIR99021 (Sigma)、25 ng/ml HGF (Peprotech)、50 ng/ml FGF7 (Peprotech)、50 ng/ml FGF10 (Peprotech)、1 µM A83-01 (Tocris)、10 mM菸鹼醯胺(Sigma)及10 µM Rho抑制劑Y-27632 (Calbiochem)。在接種後14天，將類器官機械地片段化且再接種至新MatrigelR中。在培養期間，至多每三天更換一次培養基。類器官通常係以每7-10天1:3之分裂比傳代。人類Hep-Org培養

藉由兩步膠原酶灌注方法自人類胎兒組織分離胎兒肝細胞，且藉由以100 g離心5 min來分離。去除紅血球。藉由兩步膠原酶消化自人類成體肝臟分離肝細胞，且將細胞藉助70 µm過濾器過濾並且藉由以100 g離心5 min加以收集。用Advanced DMEM/F12洗滌不同級分。將10,000個冷凍保存之胎兒(11-20週)、幼兒(年齡=0.6歲)及成人肝細胞或新近分離之細胞與人類Hep-培養基及MatrigelR (以1:3之比率)混合且經由24個孔接種。在固化後，添加培養基。人類Hep-培養基：AdDMEM/F12 (Thermo Scientific，含Hepes、GlutaMax及青黴素-鏈黴素)加上15% RSPO1條件化培養基(自製)、B27 (減去維生素A)、50 ng/ml EGF (Peprotech)、1.25 mM N-乙醯半胱胺酸(Sigma)、10 nM胃泌素(Sigma)、3 µM CHIR99021 (Sigma)、50 ng/ml HGF (Peprotech)、100 ng/ml FGF7 (Peprotech)、100 ng/ml FGF10 (Peprotech)、2 µM A83-01 (Tocris)、10 mM菸鹼醯胺(Sigma)、10 µM Rho抑制劑Y-27632 (Calbiochem)及20 ng/ml TGFa。對於胎兒-Org分化，用10 ng/ml抑癌素M及1 µM地塞米松補充人類Hep-培養基(分化培養基，DM)。在培養期間，每2-3天更新培養基。類器官通常係以每7-8天1:3之分裂比傳代，直至P10-15，且自P15起，以每14天1:3之分裂比傳代。如先前所述(Broutier等人，2016)對Chol-Org進行培養及傳代。藉由CellTiter- Glo® 3D細胞活力分析，利用由已知數目之原代肝細胞製成之標準曲線來計算類器官生長之細胞數。 RNA分離及qRT-PCR

依照製造商說明書用RNeasy微型套組(Mini Kit) (Qiagen)實施類器官、組織及原代細胞之RNA分離。在TRIzol (Invitrogen)中溶解具有低量RNA之樣品。用M-MLV逆轉錄酶RNase H Minus (Promega)逆轉錄RNA。在96或384 q-PCR機器(Bio-rad Laboratories)中使用SYBR Green Mixture (Bio-rad Laboratories)實施qPCR分析。使用NCBI Primer-BLAST設計用於qPCR之引子。 mRNA測序及分析

基於DESeq2方法(Hashimshony等人，2016；Love等人，2014)製備RNA測序文庫。簡言之，藉由TRIzol或RNeasy微型套組(Qiagen)分離總mRNA且用Ambion套組逆轉錄。使用1-5 ng cDNA作為模板實施活體外轉錄且將RNA逆轉錄至測序文庫中。在Illumina HiSeq 2000儀器上對樣品進行測序。在R環境中使用DESeq2程式包(CIT)實施測序資料分析。接著對配對讀段(read)進行定量及正歸化。藉由主分量分析(PCA)直觀表示樣品變異性。藉由DeSeq2包實施差異基因表現分析且藉由熱圖直觀表示。利用Corrplot包實施相關分析及直觀表示。使用R studio實施所有資料分析及直觀表示。單細胞測序及分析

將類器官胰蛋白酶化且將組織用膠原酶灌注至單細胞中。使用DAPI進行活/死細胞區分。使用Aria II細胞分選儀(BD bioscience)在384孔板中對單一活細胞進行分選。根據CEL-seq2方法(Hashimshony等人，2016)製備測序文庫。簡言之，在分選至384個板中之後，在65℃下將細胞溶解5分鐘，接著將RNA逆轉錄且彙集，之後在活體外轉錄。使用TruSeq小RNA引子(Illumina)製備Illumina測序文庫且在Illumina NextSeq500上以75 bp讀長進行配對末端測序。使用RaceID2算法實施所有資料分析。所有RNA測序資料皆可藉助NCBI Gene Expression Omnibus中之GEO序列號GSE111301存取。免疫組織化學、免疫螢光、全形包埋染色及顯微術

對於切片免疫螢光，自MatrigelR分離類器官，將其在4℃下在2%多聚甲醛中固定隔夜，洗滌且包埋至石蠟塊中。在染色之前將切片切割並水合。用檸檬酸鹽(pH=6.0)將切片煮沸，在補充有0.2% triton X-100 (PBST)之PBS中透化且在RT下用2%正常驢血清(Jackson ImmunoResearch)或Power Block™通用阻斷試劑(BioGenex)阻斷1 h。接著將一級抗體在4℃下培育隔夜。隨後，在用PBS洗滌之後，將切片與二級抗體一起培育，用DAPI染色，接著使用Vertashield (Vector labs)包埋。在Sp8共焦顯微鏡(Leica)上捕獲影像並使用Photoshop CS4或Image J軟體處理。藉由Image J軟體在用成員標記(member-labelling)及DAPI共染色之類器官切片上量測肝臟類器官之細胞大小。

對於免疫組織化學，在製成切片並使之水合後，將其與含H2O2之阻斷緩衝液一起培育15 min且用檸檬酸鹽(pH=6.0)煮沸。在冷卻後，用預阻斷緩衝液處理切片且在4℃下與一級抗體一起培育隔夜。將切片與二級抗體一起培育且進行DAB染色。用Pertex封閉切片且在DM4000顯微鏡(Leica)上拍攝影像。

對於全形包埋染色，使用細胞回收溶液(Corning)收穫類器官且在4℃下將其在4%多聚甲醛中固定30 min。接著將類器官用PBT (PBS, 0.1% Tween)洗滌，在0.5% PBST中透化，在RT下用PBS中之2%正常驢血清或Power Block™通用阻斷劑(BioGenex)阻斷1 h，且與一級抗體一起培育隔夜。次日，將類器官用PBT洗滌且在4℃下與二級抗體、Alexa-fluor-647毒傘素(二者皆來自Thermo Fischer Scientific)及DAPI (Invitrogen)一起培育隔夜。在成像之前在基於甘油之透明溶液中將類器官光學透明化10 min。使用25×油浸物鏡在Sp8共焦顯微鏡(Leica)或Zeiss LSM 880上實施類器官成像。使用Photoshop CS4或Image J軟體處理影像，且使用Imaris成像軟體進行影像之3D渲染。微陣列

自2/3 PHx後3天之肝臟及自未受損肝臟分離總RNA。將RNA擴增、標記且彙集用於在香港大學設施進行微陣列分析。將通用小鼠參考RNA (Agilent)差異標記且與組織雜交。用於微陣列分析之資料以登錄號GSE110292寄存於Gene Expression Omnibus。流式細胞術(FACS)

對於白蛋白+肝細胞或軸蛋白2+肝細胞分選，藉由兩步膠原酶灌注方法分離肝細胞且用DAPI染色。將單一Tomato+活細胞加以分選並收集至15 ml管或384孔板中以供培養、mRNA或單細胞測序。對於肝細胞之倍數性分選，如先前(Duncan等人，2010)所述，將細胞在37℃下用Hoechst 34580 (Invitrogen)染色15分鐘且單獨收集2n、4n或8n細胞。穿透式EM

對於穿透式EM，使類器官在3 mm直徑及200微米深度之標準扁平載體上之MatrigelR中生長用於高壓冷凍且使用Leica EM高壓冷凍器(等效於HPM10)立即冷凍固定，並且在液氮中儲存直至進一步使用。將其在含有2%四氧化鋨及0.1%乙酸鈾醯之無水丙酮中在–90℃下冷凍取代3天在–90℃下冷凍取代72小時，且以每小時5º升溫至室溫(EM AFS-2, Leica, Vienna, Austria)。將樣品在4℃下保持2 h且在室溫下再保持2 h。在數次丙酮沖洗(4 × 15 min)之後，將樣品用Epon樹脂浸潤2天(3:1-3 h；2:2-3 h；3:1-隔夜；純樹脂-6 h+隔夜+6 h+隔夜+3 h)。或者，用1.6%戊二醛進行化學固定。固定之後在丙酮中去水，接著如所解釋包埋於Epon樹脂中。在配備有Eagle CCD照相機之Tecnai Spirit T12電子顯微鏡(Thermo Fisher Scientific，荷蘭)中觀察超薄切片。 Hep-Org及Chol-Org之功能分析

將晚期傳代之Hep-org用於功能分析。為了獲取肝糖貯積，吾人使用過碘酸-希夫(PAS, Sigma)染色。用DiI-Ac-LDL (Biomedical Technologies)偵測LDL攝取。在10-15分鐘培育期間偵測MDR1介導之玫瑰紅123轉運。用Bethyl Elisa套組偵測小鼠及人類白蛋白分泌且藉由Promega套組測試P450活性。藉由來自Assaypro及R&D之Elisa套組偵測人類α1-抗胰蛋白酶及人類α-胎蛋白(AFP)。所有實驗皆依照製造商說明書。移植

在2D膠原塗覆板上於DM中分化5-7天后，使用人類胎兒-Org。在移植之前，收穫類器官且用胰蛋白酶消化以產生單細胞，在70 μm細胞濾器(BD Bioscience)下過濾，洗滌且藉由台盼藍排除來計算活細胞數。將消化後之Hep-Org (胎兒-Org及PHH-Org)細胞在冷Hep-培養基中維持在4℃下直至移植。將每隻小鼠100,000至300,000個細胞脾內注射至用70 mg/kg單劑量之倒千里光鹼(retrorsine)、OSM及1×109個基因體當量之表現人類HGF之腺病毒載體(Agilent)預處理之雌性FNRG小鼠中。藉由ELISA在移植後每1-2週獲得之血清中對ALB及AFP水準進行定量。在移植後不同時間(約30天及90天)處死小鼠且將肝臟切片針對人類標記物(hALB及NuMA)染色。統計分析

使用非配對雙尾學生t檢定(Student’s t-test)比較兩組樣品之間之數據。計算呈現為平均值+/-標準差或SEM之誤差槓及p值。 GSEA分析

使用基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis) (GSEA, Broad Institute)對不同基因集進行分類。根據部分肝切除術後之表現水準(上調或下調至少5倍)對基因進行分級。接著將Hep-Org及原代Hep之大批量mRNA測序資料以預分級模式呈送至GSEA列表。實例 2- 自單一成熟肝細胞產生之鼠類肝細胞類器官 (Hep-Org)

已藉由兩步膠原酶灌注自野生型成體C57BL/6小鼠肝臟分離原代肝細胞且將細胞懸浮於MatrigelR中(圖1A)。測試多種小分子及生物製劑支持生長之能力，包括Wnt促效劑，諸如R-脊椎蛋白1及CHIR99021，EGF，FGF7及FGF10，HGF及TGF-β抑制劑A83-01 (圖8A)。在第一週培養期間，在一些培養條件下，自Matrigel包埋之肝細胞中出現小類器官。此允許細化條件，最終在最佳化之Hep-培養基(表2)中產生穩健之類器官生長(圖8A及圖8B)。與Chol-Org不同，Hep-Org緊湊，具有典型『葡萄串』外觀(圖1B與圖1D相比：表1給出了所有比較之概況)。塗鋪效率為成熟肝細胞之約0.5%-1.0% (圖1C)。此與膽管上皮細胞之高塗鋪效率(最高達經純化膽管細胞之30%)形成對比(Huch等人，2015；Li等人，2017)，但類似於源自胃、結腸或前列腺之類器官之塗鋪效率(Bartfeld等人，2015；Drost等人，2016；Sato等人，2011)。類器官在15-20天內擴增至約400 µm之直徑，且可藉由機械破壞以每7-10天1:3之比率傳代。生長速度在2-3個月後傾向於減慢(圖8C)。亦可自BALB/c及C57BL/6 x BALB/c小鼠獲得類器官(圖8D)。

圖1E給出針對黏附接合標記物β -鏈蛋白(黃色)及增殖標記物mKi67 (紅色)染色之共焦影像切片，揭示了在鼠類Chol-Org中所見之大內腔之缺失(Huch等人，2013及圖2B)。藉由穿透式EM揭示典型肝細胞形態(圖1F)。

為了探測細胞來源(cell-of-origin)，吾人自白蛋白 -CreERT2 ;Rosa26-LSL-tdTomato 小鼠分離肝細胞。在他莫昔芬誘導後，約99%分泌白蛋白之肝細胞被標記，而膽管上皮細胞未顯示重組(圖8E)。單一經分選tomato標記之肝細胞產生完全標記之類器官，意味著Hep-Org來源於表現白蛋白之單一成熟肝細胞(圖1G)。

肝小葉中之肝細胞沿中心周圍(PC)至門靜脈周圍靜脈(PP)軸線差異地表現區帶標記物(zonation marker) (Bahar Halpern等人，2017；Burke等人，2009；Grun等人，2015)。在穩態期間，Wnt靶基因軸蛋白2之表現標記毗鄰PC之肝細胞，該等肝細胞係穩態自我更新之主要來源(Wang等人，2015)。為了研究Hep-Org之區帶來源，吾人在他莫昔芬誘導後一週，藉由FACS自攜帶軸蛋白 2-CreERT2 及Rosa26-LSL-tdTomato 對偶基因之小鼠分離成熟肝細胞。軸蛋白2+肝細胞展示比軸蛋白2-肝細胞高得多之塗鋪效率(圖8F)。對照Epcam+膽管細胞在Hep-培養基中基本上不產生Hep-Org (圖8G)。另外，如所述(Duncan等人，2010)，吾人分選不同倍數性狀態(2n、4n及8n)之肝細胞。在成年小鼠肝臟中常見之四倍體肝細胞令人驚訝地產生與二倍體細胞相當之塗鋪效率，而八倍體細胞未長出(圖8H)。實例 3- 肝細胞類器官 (Hep-Org) 保留肝細胞之關鍵功能及基因表現譜

接著藉由免疫螢光及免疫組織化學染色分析如實例2中產生之Hep-Org。Hep-Org顯示強白蛋白表現，但就膽管標記物Krt19或Krt7而言為陰性(圖2A及圖2B、圖9A及圖9C)。石蠟切片之H&E染色、E-鈣黏蛋白染色及β -鏈蛋白染色揭示了Hep-Org之特徵組織(圖2A及圖9B)。Hep-Org細胞之大小較大(圖2A及圖9B)。針對肝細胞標記物Alb、Hnf4a、Cyp1a2及Cyp3a11、胎兒肝細胞標記物Afp、膽管細胞/祖細胞標記物Krt19以及祖細胞標記物Tbx3及Sox9實施定量PCR (qPCR) (圖2C及圖2D)。該等標記物在Hep-Org中之表現與原代小鼠肝細胞(原代-Hep)非常類似。然而，前者再表現胎兒肝細胞基因Afp，此係半肝切除術之特徵(Engelhardt等人，1976；Sell等人，1974)。

Hep-Org顯示指示肝糖累積之強過碘酸-希夫(PAS)染色(圖2E)。藉由螢光探針容易直觀表示低密度脂蛋白攝取(LDL) (圖2F)。Hep-Org (第1次傳代(P1)及P3)之白蛋白分泌較原代肝細胞低僅2-4倍。值得注意地，擴增之Chol-Org分泌少至少1000倍之白蛋白，且經分化Chol-Org分泌少至少10倍之白蛋白(Huch等人，2013) (圖2G)。細胞色素活性(Cyp1a2)較原代肝細胞亦低僅2-3倍(圖2H)。

對來自三隻不同小鼠之分離物之Hep-Org及Chol-Org實施大批量mRNA測序且與原代肝細胞RNA進行比較。圖2I表示約40個肝細胞基因、10個膽管細胞/祖細胞基因及諸多增殖標記物(圖9K中給出完整基因列表)之表現之熱圖。半肝切除術反應標記物(Afp，細胞週期基因)在Hep-Org中較高，而在原代肝細胞中不高。值得注意地，參與肝細胞功能(諸如細胞色素P450活性、肝糖代謝、脂質代謝、類固醇代謝、尿素循環及補體活化)之基因在Hep-Org與原代肝細胞之間皆展示類似表現譜(圖9D-9J)。Hep-Org以高於表現PP標記物之程度表現PC標記物(圖9L及圖9M)。

該等資料證實Hep-Org展示出原代肝細胞之關鍵功能態樣。與轉分化之膽管細胞相比，本發明之肝細胞類器官具有不同之基因表現譜。實例 4- 肝細胞類器官 (Hep-Org) 在部分肝切除術 (PHx) 後重現肝細胞增殖

藉由針對兩種鼠類Hep-Org培養物(M1及M2)之mRNA測序來隨時間評估基因表現模式。如藉由PCA圖直觀表示且在P1、P3及P7時所評估，該等基因表現模式隨時間而保持顯著相似(圖3A)。諸如Alb、Hnf4a、Hpx等主要肝標記物之熱圖指示其在Hep-Org傳代期間之穩定表現，而Krt7及Epcam並未再表現(圖3B)。

雖然Hep-Org展示出原代肝細胞之關鍵功能態樣，但其與該等肝細胞明顯不同，乃因其處於週期中且表現諸如Afp及Alb等胎兒標記物(圖3B)。PHx驅使肝細胞進入增殖，在損傷後之第三天達到峰值(Michalopoulos, 2010)。為了比較Hep-Org之基因表現譜與增殖肝細胞之活體內轉錄狀態，吾人在PHx後第3天藉由膠原酶消化分離肝細胞以及對照未受損肝細胞並進行mRNA測序。與未受損肝細胞或Chol-Org之聚集相比，Hep-Org與PHx肝細胞更緊密聚集(圖3C)。藉由基因集富集分析(GSEA)將PHx樣品與對照未受損肝細胞之間差異表現之前100個基因的基因集與Hep-Org進行比較。在部分肝切除術後，多個基因在增殖肝細胞中上調，其亦在Hep-Org中活化；在P1、P3及P7之Hep-Org中發現基因富集(圖3D)。此外，吾人藉由微陣列分析獨立地確定PHx與對照未受損肝臟之間之差異基因表現，且自該分析，吾人產生了包括改變至少5倍之基因之基因集列表。藉由GSEA再次觀察到顯著富集。在增殖之PHx後肝細胞中下調之基因在小鼠Hep-Org中受到阻抑。反之，PHx樣品中之上調基因在Hep-Org中富集(圖3D)。

該等資料表明，Hep-Org具有與增殖肝細胞相似之基因表現譜。實例 5- 肝細胞類器官 (Hep-Org) 可經歷轉分化成膽管細胞

據觀察，一些祖細胞標記物如Krt8/18及Spp1在PHx後肝臟再生期間上調。一項活體內研究闡述了損傷後肝細胞向膽管上皮細胞之轉化(Yanger等人，2013)。類似地，膽管癌可源自Notch及AKT活化後之肝細胞(Fan等人，2012；Sekiya及Suzuki，2014)。當培養來自白蛋白CreERT2; Rosa26-LSL-tdTomato小鼠之原代肝細胞時，當去除CHIR時偶爾形成囊性類器官。實際上，當將Tomato陽性類器官在Chol-培養基中培養多於10天時，強烈誘導Krt7/19，而Alb及Hnf4a之表現逐漸降低(圖10A及10C)。反之，將Chol-Org轉移至Hep-培養基中確實降低Krt7/19表現，但不誘導肝細胞譜系標記物之表現。(圖10B及圖10C)。實例 6- 肝細胞類器官之單細胞 mRNA 分析

已對Hep-Org及Chol-Org實施單細胞mRNA測序(圖4A)。各自測序384個細胞且藉由RaceID2 (Grun等人，2015)分析結果。在針對具有＞4000個轉錄本之細胞過濾後，保留總共186個來自Hep-Org之細胞及253個來自Chol-Org之細胞用於分析。對來自Hep-Org及Chol-Org之組合資料集進行分析，且藉由t-SNE直觀表示基因表現(圖4B)。一致地，Alb、Ahsg、Afp、Fgg及Gc僅在Hep-Org群體中高表現，而Epcam及Krt7在Chol-Org中高表現(圖4C-4D以及圖11A及圖11B)。兩種類器官類型皆含有增殖細胞(圖11C)。

接著對僅源自Hep-Org之細胞進行分群分析，以探究其細胞組成(圖4E)。鑒別出五種不同集群。集群1表示非循環成熟肝細胞(圖4F及圖11D顯示高白蛋白及肝標記物表現)。集群2及集群3表現較低水準之白蛋白、高水準之肝細胞祖細胞標記物(諸如Spp1) (Liu等人，2015)且代表循環肝細胞祖細胞(圖4G及圖11E)。集群4表現高水準之循環標記物且缺乏成熟標記物，從而將其鑒別為更原始之循環細胞群體。在一些集群5細胞中，吾人注意到表明轉分化事件之諸如Krt7等膽管細胞譜系標記物之表現(圖4H)。

亦保留藉由單細胞測序得到之197個PHx後肝細胞及291個未受損肝細胞，以供在針對每細胞＞3000個轉錄本過濾之後進行分析。將該等細胞之間之前100個差異表現基因分組在接著用於Hep-Org之GSEA之基因集中(圖11F)。Hep-Org與增殖之PHx後肝細胞之相當性高於與對照肝細胞之相當性(圖4I)。吾人使用小提琴圖來直觀表示未受損肝細胞、PHx肝細胞及來自Hep-Org之細胞中之基因表現。如所預期，細胞週期相關及核糖體合成基因在Hep-Org細胞及PHx後肝細胞兩者中皆顯著增加(圖4J)。部分肝切除術後上調之典型非細胞週期相關基因在Hep-Org中顯示一致之表現。該等基因包括Afp、Lcn2、Actg1、Fabp5、Clu、Ly6d、Mt2、S100a11、Stmn1、Tubb6、Cdkn1a及Dynll1 (圖4J)。實例 7- 自人類肝細胞建立及表徵肝細胞類器官 (Hep-Org)

針對人類肝細胞之純系生成率及擴增最佳化Hep-Org培養基(Hep-培養基) (圖12A及圖12B)。吾人自妊娠11-20週之供體胚胎分離人類胎兒肝細胞。可自8個胎兒供體組織中之7個建立人類胎兒Hep-Org (胎兒-Org)，每個組織皆展示典型葡萄樣結構(圖5A)。該等組織中之五個可擴增＞16次傳代，且在手稿重新呈送時仍以每7-10天1:3之分裂比呈指數生長。最長培養目前係處於第28次傳代(胎兒來源：妊娠後18週，培養11個月)。吾人亦自冷凍保存之兒童及成人原代人類肝細胞(PHH)建立Hep-Org (PHH-Org)。當與具有約1%之塗鋪效率之胎兒培養物相比時，該等培養物似乎在其擴增時間(2-2.5個月)方面更受限，但產生具有非常類似之組成之類器官(圖5A及圖5B)。與Chol-Org不同，人類Hep-Org含有小內腔且由肝細胞形態之大細胞組成(圖5C、圖12C-12E及表1)。人類Hep-Org具有比Chol-Org更大之細胞直徑及更低之細胞核/細胞質比(細胞直徑/細胞核直徑：胎兒-Org為30.08 ± 8.17 µm/14.07 ± 1.59 µm，PHH-Org為27.54 ± 6.50 µm/11.69 ± 1.64 µm且Chol-Org為10.42 ± 2.78/7.22 ± 1.55 µm)。穿透式EM揭示細胞質中之大量肝糖顆粒。典型肝細胞特徵包括具有帶纖維中心及去凝縮染色質之明顯核仁之細胞核、大量具有少且短之皺褶之粒線體以及RER之圍繞其組織之個別扁囊。此外，高基氏體球囊疊層(Golgi apparatus saccule stack)、膽小管、緊密型接合、過氧化體、溶酶體、多胞體及自噬空泡存在於人類Hep-Org中，此與肝細胞之彼等非常類似(圖5D及圖5E)。

胎兒-Org大量表現ALB及HNF4A，而相當一部分細胞表現CYP2E1 (圖5F及圖12F)。藉由MRP2染色揭示膽小管之顯著網絡(圖5G)。胎兒-Org中之DiI-Ac-LDL及強過碘酸-希夫(PAS)染色指示功能性LDL攝取且確認肝糖累積(圖5H及5I)。Hep-Org未展現膽管細胞功能：玫瑰紅123 (膽管細胞表面糖蛋白多重抗藥性蛋白質-1 (MDR1)之螢光受質)主動轉運至Chol-Org而非Hep-Org之內腔中(圖S5G)。值得注意地，藉由Hep-Org (6個胎兒供體，1個PHH供體)進行之白蛋白分泌與PHH之白蛋白分泌相當(圖5J)。由Hep-Org進行之A1AT分泌係由PHH產生之水準之25%-50% (圖12H)。雖然ALB隨胎兒-Org傳代數增加而略有增加(在圖5J中比較胎兒Org2及3與胎兒-Org 2晚期及3晚期)，但AFP分泌隨時間而降低(圖12I)。源自PHH之Hep-Org中之CYP3A4活性高於PHH之CYP3A4活性，而胎兒-Org中之活性較PHH之活性低2-8倍(圖5K)。

實施大批量mRNA測序以比較不同傳代之胎兒-Org及PHH-Org與胎兒-Hep及PHH。熱圖代表經多次傳代保持與PHH相當之胎兒-Org及PHH-Org中之眾多肝細胞基因，諸如ALB、APOA2及SERPINA1 (圖6A)。功能性肝細胞基因(細胞色素P450活性、肝糖/脂質代謝及尿素循環)之表現水準皆顯示在晚期傳代之胎兒-Org及PHH-Org與胎兒-Hep/PHH之間相當之表現水準(圖13A)。該等水準遠高於分化後之Chol-Org中之肝細胞樣細胞的水準。相比之下，當與Hep-Org相比時，祖細胞/膽管細胞標記物如EPCAM、SOX9、KRT8/18及KRT7/19在處於分化培養基(DM)中之Chol-Org中保持更高(圖13B)。PCA圖強調了處於DM中之Chol-Org與Hep-Org之間之差異。應注意，PHH-Org再表現AFP (圖6A)，此使得PCA圖中PHH-Org與胎兒-Hep之接近度高於與PHH之接近度(圖13A及圖13C)。

接著，吾人對384個源自胎兒-Org之細胞及384個來自人類Chol-Org之細胞實施單細胞mRNA測序。在應用至少4000個偵測到之轉錄本/細胞之過濾準則之後，分別保留161個及197個細胞用於分析。藉由RaceID2對組合之胎兒-Org及Chol-Org資料集之分群分析揭示六個如t-SNE圖中直觀表示之主要集群(圖6B及6C)。集群i-iv細胞幾乎完全源自胎兒-Org。標記物表現分析揭示集群i表示例如由高白蛋白、SERPINA1及ASGR標記之肝細胞(圖6D-6E及圖13D)。集群ii由諸如COL1A2及FSTL1等間質標記物界定(圖13E)。集群iii及集群iv表現諸如CD24及IL32等肝臟祖細胞標記物，而一些細胞富含在肝臟再生期間亦高表現之粒線體基因mRNA。大集群v及vi表現諸如KRT19及EPCAM等(早期)膽管細胞標記物(圖6F)。實際上，該兩個集群中之幾乎所有細胞皆源自Chol-Org。胎兒-Org及Chol-Org細胞兩者皆表現增殖標記物(圖6G及圖13F)。實例 8– 來自人類肝細胞之肝細胞類器官 (Hep-Org) 可植入並重建受損肝臟

吾人探究了人類Hep-Org是否能夠植入並重建受損肝臟組織。由於可移植性通常與肝細胞成熟度相關，因此吾人限定了分化培養基(DM，含有地塞米松及抑癌素M)以增加胎兒-Org之成熟度(Kamiya等人，2001) (圖14A)。將胎兒-Org株系2 (第16次傳代)細胞於DM中(7-10天)接種在膠原塗覆板上持續5-7天。隨後，藉由脾注射將類器官作為單細胞移植至免疫缺乏型Fah-/- NOD Rag1-/- Il2rg-/- (FNRG)小鼠中(Aini等人，2014；Billerbeck等人，2016；Grompe，2017)。

對於移植後之前30天，小鼠循環中之人類ALB保持穩定且在所有接受胎兒-Org之小鼠中明顯可偵測到(圖7D)。藉由人類ALB及NuMa染色(Billerbeck等人，2016)確認1-2個細胞之小集群之初始植入(圖7A)。同一供體中作為陽性對照平行移植之胎兒-Hep顯示hAlb在同一時間段持續增加，且在移植後第30天形成更大集群。(圖7D及圖14D)。然而，在第30天后，類器官移植物開始更快地增殖且以與原代細胞相同之速率擴增。在移植後90天，胎兒-Org之血清hALB已平均上升200倍至高於200 ug/ml。如藉由Ki67染色及定量組織學所確認，集群已經顯著生長且展現持續增殖(圖7B及圖14B)。重建移植物(『結核』)就ALB、MRP2及CYP2E1而言染色呈陽性，此表明其功能成熟度。(圖7C)經移植細胞幾乎皆未保留AFP (胎兒肝細胞標記物)之表現，且在移植物內無法偵測到KRT19 (膽管細胞標記物) (圖7C及圖14C)。用自一個幼兒PHH供體生長之類器官培養物實施相同實驗。由於吾人可自同一個供體獲得肝細胞及Hep-Org，因此吾人再次能夠並列比較植入。與胎兒-Org類似，成熟類器官移植物顯示初始遲滯期，接著以與原代肝細胞對照相同之速率增殖(圖7D及圖14D)。成熟原代細胞及類器官在植入水準及移植物增殖方面明顯優於其胎兒對應物，此證實Hep-Org之再生潛力及類器官培養物中基本組織特徵(例如可移植性)之忠實保守性。總之，吾人之資料顯示Hep-Org能夠成功地重建受損肝臟且展現移植後之顯著移植物擴增。參考文獻

圖 1- 鼠類肝細胞類器官之 3D 培養系統之建立。

(A) 繪示原代肝細胞之分離及接種以及Hep-Org之擴增及傳代之示意圖。

(B) 自野生型C57BL/6小鼠之原代肝細胞培養之第0次傳代(P0)第20天之Hep-Org的干涉相位差(DIC)影像。較低放大率(左，黑色比例尺=50 µm)，較高放大率(右，黑色比例尺=12.5 µm)。

(C) 每10,000個肝細胞形成之類器官數目。以一式三份且對獨立之C57BL/6小鼠實施實驗。數據表示為平均值±SEM。

(D) 第2次傳代第3天之Chol-Org之干涉相位差(DIC)影像(左，黑色比例尺=50 μm)；較高放大率(右，黑色比例尺=12.5 µm)。

(E) 針對增殖標記物mKi67 (紅色)、黏附接合標記物β-鏈蛋白(黃色)及DAPI (藍色)共染色之Hep-Org之石蠟切片的共焦影像。比例尺=25 µm。

(F) Hep-Org之穿透式EM (TEM)顯示典型肝細胞結構。(I)細胞形態概況；(II)-(V)典型肝細胞結構(由箭頭指示)。N=細胞核；Mv=微絨毛；Tj=緊密型接合；Bc=膽小管樣結構；Cv=被覆囊泡；Ld=脂滴，Si=竇狀物。比例尺=2 µm。

(G) 自來自他莫昔芬(tamoxifen)誘導之白蛋白-CreERT2; Rosa26-LSL-tdTomato小鼠之單一原代肝細胞(tdTomato⁺ )生長之純系Hep-Org。在如所指示之不同原代培養日拍攝影像。比例尺=25 µm。

圖 2- 小鼠肝細胞類器官之表徵。

(A) Hep-Org之共焦z堆疊(左)及單平面(右)影像。白蛋白(綠色)、E-鈣黏蛋白(紅色，右圖)及DAPI (藍色)。比例尺=20 µm。

(B) 小鼠Chol-Org之共焦z堆疊(左)及單平面(右)影像。Krt7 (藍色)、Krt19 (紅色)及DAPI (白色)。比例尺=20 µm。

(C) + (D) Hep-Org及Chol-Org中相對於原代肝細胞之肝細胞標記物(C)及膽管細胞/祖細胞標記物(D)之基因表現的qRT-PCR分析。圖形呈現來自3隻獨立小鼠之4個重複之平均結果。數據表示為平均值±SEM。**表示p＜0.01，***表示p＜0.001。

(E) 在Hep-Org中藉由過碘酸-希夫(Periodic-Acid Schiff) (PAS)染色(深粉紅色)評價之肝糖累積。用蘇木精(藍色)將細胞核染色。比例尺=20 µm。

(F) 在培養之Hep-Org中藉由Dil-ac-LDL螢光染色(紅色)分析低密度脂蛋白(LDL)攝取。用DAPI (藍色)將細胞核染色。比例尺=20 µm。

(G) 原代肝細胞、第0次傳代(P0)第15天及第3次傳代(P3)之Hep-Org以及處於擴增培養基(EM)或分化培養基(DM)中之Chol-Org培養24 h後量測之白蛋白分泌。結果表示為每個細胞之白蛋白微微克數。數據表示為平均值±SEM。

(H) 培養之原代肝細胞、p0第15天及p3之Hep-Org中細胞色素活性(Cyp1a2)之量測。指示每ml每百萬個細胞之相對光單位(RLU)。數據表示為平均值±SEM。

(I) 藉由mRNA測序確定之肝臟基因表現之熱圖，其比較了三個獨立Hep-Org (p1)與原代肝細胞(n=1)及三個處於擴增培養基(EM)中之獨立Chol-Org (p8-p12) (圖9K中之完整基因列表)。

圖 3-Hep-Org 在部分肝切除術後重現肝細胞增殖。

(A) 顯示不同傳代之Hep-Org之分群(clustering)及其與Chol-Org (將第1次傳代、第3次傳代及第7次傳代標記為P1、P3及P7)之明顯區別之PCA圖。注意PC2之極小變異數(5%)。

(B) 原代肝細胞、Hep-Org及Chol-Org (來自M1及M2，兩個單獨小鼠供體，將第1次傳代、第3次傳代及第7次傳代標記為P1、P3及P7)中之主要肝標記物之熱圖。

(C) 顯示Chol-Org、第1次傳代、第3次傳代及第7次傳代之Hep-Org、PHx以及未受損(Hep)肝細胞之生物學重複之間之皮爾森相關係數(Pearson’s correlation coefficient)之相關圖。顏色強度及圓之大小與相關係數成比例。基於階層式分群(hierarchical clustering)對樣品進行排序，且圖形中之矩形基於階層式分群之結果。相關性基於前1000個最高表現基因。

(D) 藉由mRNA測序(頂部)或微陣列(底部)獲得的，與PHx後三天之小鼠肝臟相較於非受損肝臟之間之差異表現基因列表相比，Hep-Org (第1次傳代、第3次傳代、第7次傳代之生物學重複)相對於原代肝細胞之GSEA富集分析。部分肝切除術3天后上調基因之富集：左圖；部分肝切除術3天后下調基因之富集：右圖。

圖 4-Hep-Org 之單細胞轉錄體分析

(A) Hep-Org及Chol-Org以及自白蛋白 -CreERT2 ;Rosa26-LSL-tdTomato 小鼠分離之肝細胞(「未受損對照」)或2/3部分肝切除術後3天之肝細胞(「再生」)之單細胞測序實驗的概況。

(B) 指示個別細胞之來源之t-SNE圖：Hep-Org細胞(綠色)、Chol-Org細胞(藍色)。

(C) + (D)顯示源自Hep-Org及Chol-Org之單細胞中Alb (C)及Krt7 (D)之表現的t-SNE圖。以正規化log2值給出表現。

(E) 藉由RaceID2算法獲得之所有來自Hep-Org之細胞集群(cluster)之t-SNE圖。

(F) – (H)顯示Hep-Org中Alb (F)、Pcna (G)及Krt7 (H)之表現水準的t-SNE圖。以正規化log2值給出表現。

(I) Hep-Org相對於原代肝細胞中之基因之GSEA。將表現富集與藉由比較在部分肝切除術後3天之小鼠肝臟與對照非受損肝臟產生之差異表現基因之基因集進行比較。PHx後3天上調基因之富集：上圖；PHx後3天下調基因之富集(下圖)。

(J) 比較未受損肝細胞、分離之PHx後肝細胞及Hep-Org中標記物之表現的小提琴圖(Violin plot)。細胞週期/生長相關基因之表現在頂列中給出。標記物針對其在再生肝臟中之特異性表現來選擇，但與細胞週期無關(底部三列)。轉錄本計數以log10標度提供。

圖 5- 自人類肝細胞建立 Hep-Org 。

(A) 來自P0第21天之胎兒肝臟之Hep-Org之DIC影像(胎兒-Org，左圖) (黑色比例尺=40 μm)或來自p0第19天之原代人類肝細胞(PHH)之DIC影像(PHH-Org，右圖) (黑色比例尺=20 µm)。

(B) 每10,000個胎兒-Hep或PHH形成之Hep-Org數目。以一式三份實施實驗。數據表示為平均值±SEM。

(C) 顯示來自人類成體肝臟之p5 Chol-Org之DIC影像(黑色比例尺=200 µm)

(D) 胎兒-Org之穿透式EM (D) I細胞形態概況，比例尺=2 µm；II典型肝細胞結構，比例尺=1 µm；III典型肝細胞結構，比例尺=2 µm。N=細胞核；Nu=核仁，Gly=肝糖，Mit=粒線體，Mv=微絨毛，Tj=緊密型接合，GJ=間隙接合，RER=粗糙內質網，Bc=膽小管樣結構(黑色箭頭)，Av=自噬空泡(白色箭頭)。

(E) PHH-Org及Chol-Org之穿透式EM (右圖)。PHH-Org顯示出典型肝細胞結構。Mvb=多胞體，Po=過氧化體。

(F) 人類胎兒-Org之(z堆疊投影)之共焦影像。ALB (青色)、HNF4A (綠色)、F-肌動蛋白(紅色)及DAPI (白色)，比例尺=20 µm。

(G) 人類胎兒-Org (P26)之MRP2及F-肌動蛋白(3D重建)之全形包埋染色的共焦影像。

(H) 在培養之人類胎兒-Org中藉由Dil-ac-LDL螢光染色(紅色)分析低密度脂蛋白(LDL)攝取。用DAPI (藍色)將細胞核染色。比例尺=20 µm。

(I) 在人類胎兒-Org中藉由PAS染色(深粉紅色)評價之肝糖累積。用蘇木精(藍色)將細胞核染色。比例尺=20 µm。

(J) PHH (白色)、源自相同PHH批次之PHH-Org (白色條紋)、胎兒肝細胞(胎兒-Hep，灰色)、六種獨立胎兒Hep-Org培養物(灰色條紋)及分化之Chol-Org (黑色)之白蛋白分泌。「晚期」指示來自一個孔之P22培養物。結果指示為每百萬個細胞每天之白蛋白微克數。數據表示為平均值±SEM。

(K) PHH-Org (條紋)中與其所來源之PHH (白色)及四種獨立胎兒-Org培養物(編號與圖5J中相同)相比較之CYP3A4細胞色素活性之量測。給出每ml每百萬個細胞之相對光單位(RLU)。數據表示為平均值±SEM。

圖 6- 人類 Hep-Org 之轉錄表徵

(A) 兩個獨立PHH批次、PHH-Org、胎兒-Hep、胎兒-Org及兩種經分化Chol-Org中最高表現之肝基因之熱圖。Hep-Org株系如圖5中所標記。

(B) 將胎兒-Org細胞(紫色)與Chol-Org細胞(灰色)組合之t-SNE圖。

(C) 顯示經組合胎兒-Org/Chol-Org資料集之分群結果之t-SNE圖。指派了六個主要集群：肝細胞(i)、肝間質樣細胞(ii)、祖細胞(iii-iv)及膽管細胞(v-iv)。

(D) – (G)強調肝細胞標記物ALB、SERPINA1 (D)、ASGR1及ASGR2 (E)、膽管細胞標記物EPCAM及KRT7 (F)以及核糖體基因RPS10 (G)之表現水準的t-SNE圖。如圖6B中之資料集。以正規化log2值給出表現。

圖 7- 人類 Hep-Org 在 FNRG 小鼠肝臟中之植入

(A) 移植後30天用人類胎兒-Org細胞移植之FNRG小鼠之代表性肝臟切片之人類ALB及MKI67免疫螢光(頂部)及人類NuMA免疫組織化學(底部)染色。

(B) 移植後90天之人類胎兒-Org移植FNRG小鼠之代表性肝臟切片的人類ALB、MKI67及KRT19免疫螢光染色(頂部)及人類NuMA免疫組織化學染色(底部)。

(C) 移植後90天之人類胎兒Hep-Org移植FNRG小鼠之代表性肝臟切片的人類ALB、MRP2、CYP2E1、MKI67及AFP免疫螢光染色。

(D) 左圖比較經移植PHH (原代人類肝細胞)、經移植PHH-Org (原代人類肝細胞類器官)及經移植胎兒Hep-Org之血清hALB時程，每個點值表示移植組之平均值。右圖：每組中所有小鼠在45天時間點之數據，其中每個圖表示一隻小鼠。

圖 8- 主要源自中央靜脈肝細胞之肝細胞類器官

(A) 具有所示組成之培養基中每孔之Hep-Org數。在接種後第10天對類器官數目計數。數據表示為一式三份孔中之平均值SEM。

(B) Hep-培養基中在第0次傳代(p0)於第8天及第13天(相同區域)生長之Hep-Org之DIC影像。類器官中之脂滴用黑色箭頭指示(黑色比例尺=100 µm)。

(C) 接種後第0天至第100天跟蹤之Hep-Org (源自原代小鼠肝細胞)之生長曲線。請注意在2-3個月期間之平衡。數據表示為三隻相同年齡之成年雄性小鼠之平均值SEM。

(D) 在第14天分析之在Hep-培養基中培養之Hep-Org (源自BALB/c小鼠或C57BL/6 x BALB/c F1後代之原代小鼠肝細胞)之DIC影像(黑色比例尺=25 µm)。

(E) 單劑量他莫昔芬誘導後5天之白蛋白-CreERT2; Rosa26-LSL-tdTomato小鼠之小鼠肝臟組織切片上tdTomato之免疫組織化學染色(黑色比例尺=50 µm)。

(F) 每5,000個經FACS分選為軸蛋白2 (Axin2)陽性(軸蛋白2+)或軸蛋白2陰性(軸蛋白2-)之細胞形成之類器官數目。以一式三份實施實驗。數據表示為平均值±SEM。

(G) 每5,000個Epcam+細胞形成之類器官數目。以一式三份實施實驗。數據表示為平均值±SEM。

(H) 每10,000個細胞(使用Hoechst34580經FACS分選之二倍體、四倍體、八倍體肝細胞以及未分選之肝細胞)形成之類器官數目。數據表示為平均值±SEM。

圖 9- 鼠類 Hep-Org 及 Chol-Org 之比較

(A) Hep-Org及Chol-Org中Krt7及Krt19之膽管上皮細胞標記物之免疫組織化學染色。比例尺=20 µm。

(B) HE染色(頂部)及針對β-鏈蛋白染色(底部)之Hep-Org及Chol-Org之石蠟切片。箭頭指示Hep-Org中之雙核細胞(上圖，比例尺=20µm。底圖，比例尺=25 µm)。

(C) Chol-Org之共焦影像(z堆疊，頂部；單共焦切面，底部)。F-肌動蛋白(藍色)、Epcam (綠色)及DAPI (白色)。比例尺=20 µm。

(D) – (J)比較Hep-Org (n=3)與原代肝細胞(n=1)及Chol-Org (n=3)之熱圖。細胞色素活性(D)、肝糖代謝(E)、葡萄糖代謝(F)、脂質代謝(G)、補體活化(H)、尿素循環(I)及類固醇代謝(J)。基因集基本上來自圖S2 (Katsuda等人，2017)。樣品與圖2I中相同。

(K) 利用用於圖2I中之完整基因名稱列表比較Hep-Org (n=3)與原代-Hep (n=1)及Chol-Org (n=3)之肝臟基因之表現譜的熱圖。

(L) Hep-Org切片之Glt1 (綠色)及DAPI (藍色)之免疫螢光染色。比例尺=20 µm。

(M) 與原代肝細胞相比，Hep-Org中之中心周圍(PC)及門靜脈周圍(PP)標記物表現之比較。數據表示為平均值±SEM。**表示p＜0.01，***表示p＜0.001。

圖 10-Hep-Org 在 Chol-Org 培養基中轉分化為 Chol-Org

(A) 顯示Tomato+ Hep-Org自白蛋白-CreERT2; Rosa26-LSL-tdTomato轉化為Chol-Org之螢光DIC影像。

(B) 顯示Hep-培養基中Chol-Org之典型變化之DIC影像。

(C) 比較有/無Chol-培養基暴露10天之Hep-Org及有/無Hep-培養基暴露10天之Chol-Org之RNA測序之表現譜的熱圖。泳道1及3：Hep-Org 3及Chol-Org 3亦在圖2I中出現。

圖 11- 藉由單細胞測序對 Hep-Org 及 Chol-Org 之基因表現分析

(A-C)對(A)所示肝標記物(Afp、Ahsg、Fgg及Gc)、(B)膽管細胞標記物(Epcam)及(C)細胞週期標記物(mKi67及Mdm2)之表現水準進行顏色編碼之細胞的t-SNE圖。Hep-Org及Chol-Org之組合資料集。以正規化log2值給出表現。(D-E)在Hep-Org資料集中針對肝標記物(Hp及Fgg) (D)、細胞週期(Rps10) (E)之表現水準進行顏色編碼之細胞的t-SNE圖。以正規化log2值給出表現。

(F)顯示PHx後之肝細胞相對於未受損PHH之間差異表現之基因之火山圖(Volcano plot)。每個點表示基因。紅色點突出顯示≥ 2倍或≤ 2倍變化及p值＜0.05之顯著性之基因。

圖 12- 人類 Hep-Org 之建立、維持及表徵

(A) 自胎兒-Hep (頂部)或PHH (底部)起始Hep-Org所需之關鍵組分。自Hep-培養基中取出一種主要組分(EGF、FGF、R-脊椎蛋白CM、CHIR、A83-01、HGF)或使用Chol-培養基進行比較。在不同條件下培養肝細胞。數據表示為平均值SEM。

(B) 用於兩個已建立之處於P24之胎兒-Org之生長之關鍵組分，編碼對應於圖5J。自Hep-培養基中取出Hep-培養基之一種主要組分或將Chol-培養基與Hep-培養基在Hep-Org生長維持方面進行比較。數據表示為平均值SEM。

(C) 自人類胎兒-Hep培養之胎兒-Org之石蠟切片之PAS染色及(D) β-鏈蛋白(膜標記)染色(比例尺=25 µm)。

(E) 人類Chol-Org之F-肌動蛋白染色(單共焦平面)。

(F) 胎兒-Org之CYP2E1染色(單共焦平面)。

(G) 玫瑰紅123染料在Chol-Org而非Hep-Org中之攝取之代表性影像。

(H) 在培養之PHH (白色)、PHH-Org (白色條紋)、胎兒-Hep (灰色)、胎兒-Org (灰色條紋)及經分化Chol-Org (黑色)之上清液中量測之A1AT分泌。結果指示為每百萬個細胞每天之白蛋白微克數。數據表示為平均值±SEM。

(I) 在培養之PHH (白色)、PHH-Org (白色條紋)、胎兒-Hep (灰色)、胎兒-Org (灰色條紋)及經分化Chol-Org (黑色)之上清液中量測之AFP分泌。『晚期』係來自一個孔之P22。所有編碼皆對應於圖5J及圖12H。數據表示為平均值±SEM。

圖 13-Hep-Org 、 Chol-Org 及 PHH 之轉錄比較

(A) PHH、PHH-Org、胎兒-Hep、胎兒-Org及經分化Chol-Org中之關鍵肝基因表現熱圖

(B) PHH、PHH-Org、胎兒-Hep、胎兒-Org及經分化Chol-Org中祖細胞、膽管細胞及細胞週期相關基因表現之熱圖。

(C) 主分量分析(Principal component analysis) (PCA)顯示Hep-Org (PHH-Org及胎兒-Org)與人類肝細胞(PHH及胎兒-Org)之轉錄體譜分群。

(D)-(F) 針對肝細胞標記物AFP、RBP4、APOA2及MT1G (D)、COL1A2及FSTL1 (E)、細胞週期相關基因PCNA及MKI67 (F)之表現水準進行顏色編碼之細胞的t-SNE圖。以正規化log2值給出表現。

圖 14- 與 PHH 相比藉由人類 Hep-Org 之植入及重建

(A) AFP表現在分化之胎兒-Org中降低。在用PHH及PHH-Org分化之前或之後在不同傳代之胎兒-Org之間進行比較。

(B) 移植人類胎兒-Org後90天定量之移植物結核(nodule)橫截面。

(C) 移植後90天之經移植FNRG小鼠之肝臟切片的人類ALB、hKRT、KRT19及DAPI免疫螢光染色。

(D) 移植PHH、源自同一供體之PHH-Org、胎兒-Hep後30天及移植來自同一供體之胎兒-Org後30天及90天之移植物之比較。

Claims

一種用於活體外擴增肝細胞之方法，其中該方法包括在肝細胞培養基中培養肝細胞，其中該肝細胞培養基包含： i. 50至500 ng/ml纖維母細胞生長因子(FGF)，其視情況選自由FGF7、FGF10及其組合組成之群； ii. Wnt促效劑，其包含R-脊椎蛋白(spondin)及至少一種肝糖合成酶激酶3 (GSK3)抑制劑； iii. 5至100 ng/ml表皮生長因子(EGF)； iv. 5至100 ng/ml肝細胞生長因子(HGF)；及 v. 轉型生長因子β (TGF-β)抑制劑，其包含活化素受體樣激酶ALK4、ALK5及/或ALK7信號傳導路徑之抑制劑。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該R-脊椎蛋白係選自由以下組成之群：R-脊椎蛋白1、R-脊椎蛋白2、R-脊椎蛋白3、R-脊椎蛋白4、其活性片段或變異體及其組合。
如申請專利範圍第2項之方法，其中該R-脊椎蛋白係作為條件化培養基提供且在該肝細胞培養基內之濃度係5%-50%、5%-40%、5%-35%、10%-30%、10%-20%、12%-17%或較佳約15% (vol/vol)。
如申請專利範圍第3項之方法，其中該R-脊椎蛋白條件化培養基中之該R-脊椎蛋白係R-脊椎蛋白1，視情況其濃度為約15%。
如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該GSK3抑制劑之濃度係1至10 µM、0.5至5 µM、1至5 µM、2至4 µM或較佳約3 µM。
如申請專利範圍第5項之方法，其中該GSK3抑制劑係選自由以下組成之群：CHIR99021、SB216763、TWS119、5-溴吲哚、SB415286、BIO、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、BIO-丙酮肟、1-阿紮肯保隆(1-Azakenpaullone)及其組合。
如申請專利範圍第6項之方法，其中該GSK3抑制劑係CHIR99021，視情況其濃度為約3 µM。
如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該肝細胞培養基包含濃度為50至400 ng/ml、50至300 ng/ml、75至200 ng/ml、80至150 ng/ml或較佳約100 ng/ml之FGF7。
如申請專利範圍第8項之方法，該肝細胞培養基包含濃度為50至400 ng/ml、50至300 ng/ml、75至200 ng/ml、80至150 ng/ml或較佳約100 ng/ml之FGF10。
如申請專利範圍第8項或第9項中任一項之方法，其中該培養基包含FGF10及FGF7。
如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該EGF之濃度係10 ng/ml至100 ng/ml、20 ng/ml至100 ng/ml、20 ng/ml至80 ng/ml、40 ng/ml至80 ng/ml或較佳約50 ng/ml。
如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該HGF之濃度係10 ng/ml至100 ng/ml、20 ng/ml至100 ng/ml、20 ng/ml至80 ng/ml、40 ng/ml至80 ng/ml或較佳約50 ng/ml。
如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該TGF-β 抑制劑之濃度係1至10 µM、0.5至5 µM、1至4 µM、1至3 µM或較佳約2 µM。
如申請專利範圍第13項之方法，其中該TGF-β 抑制劑係選自由以下組成之群之活化素受體樣激酶ALK4、ALK5及/或ALK7之抑制劑：A83-01、SB-431542、SB-505124、EW-7197、LY-2157299、GW6604及其組合。
如申請專利範圍第14項之方法，其中該活化素受體樣激酶ALK4、ALK5及/或ALK7之抑制劑係A83-01，視情況其濃度為約2 µM。
如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該肝細胞培養基進一步包含菸鹼醯胺，視情況其濃度為1至100 mM。
如申請專利範圍第16項之方法，其中該菸鹼醯胺之濃度係1至50 mM、1至30 mM、1至20 mM、5至20 mM、5至15 mM或較佳約10 mM。
如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該肝細胞培養基進一步包含胃泌素，視情況其濃度為1至100 nM。
如申請專利範圍第18項之方法，其中該胃泌素之濃度係1至50 nM、1至30 nM、1至20 nM、5至20 nM、5至15 nM或較佳約10 nM。
如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該肝細胞培養基進一步包含轉型生長因子α (TGF-α)。
如申請專利範圍第20項之方法，其中該TGF-α之濃度係1至50 ng/ml、5至35 ng/ml、10至30 ng/ml、15至25 ng/ml或較佳約20 ng/ml。
如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該肝細胞培養基進一步包含Rho相關蛋白質激酶(ROCK)抑制劑；視情況其中該ROCK抑制劑係選自由以下組成之群：Y-27632、GSK429286A、法舒地爾(Fasudil)、噻托維汀(Thiazovivin)、Rho激酶抑制劑IV及其組合；視情況其中該ROCK抑制劑係Y-27632。
如申請專利範圍第22項之方法，其中該ROCK抑制劑之濃度係1至50 μM、1至30 μM、1至20 μM、5至20 μM、5至15 μM或較佳約10 μM。
如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該肝細胞培養基進一步包含N-乙醯半胱胺酸。
如申請專利範圍第24項之方法，其中該N-乙醯半胱胺酸之濃度係0.5 mM至5 mM、0.5 mM至4 mM、1 mM至4 mM、1 mM至2 mM、1 mM至1.5 mM或較佳約1.25 mM。
如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該肝細胞培養基進一步包含B27，視情況其中該B27不包含維生素A。
如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該肝細胞培養基進一步包含細胞生長培養基，視情況其中該細胞生長培養基包含抗生素，其視情況為青黴素及鏈黴素；其中該細胞生長培養基視情況為AdDMEM/F12，其視情況包含Hepes及/或Glutamax。
如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該肝細胞培養基不包含cAMP路徑活化劑。
如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該等肝細胞係原代肝細胞，較佳來自肝臟組織之經分離細胞。
如申請專利範圍第29項之方法，其中該方法進一步包括自肝臟組織分離該等原代肝細胞，視情況其中該肝臟組織係來自欲投與該等擴增之肝細胞之個體之外植體或肝臟樣品，及/或其中分離包括膠原酶消化。
如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該等肝細胞係在該肝細胞培養基存在下與三維細胞外基質(ECM)接觸培養。
如申請專利範圍第31項之方法，其中該三維細胞外基質包含該肝細胞培養基，視情況其培養基:基質比為1:1、1:2或較佳1:3。
如申請專利範圍第31項及第32項中任一項之方法，其中該三維細胞外基質係選自由以下組成之群：合成ECM、天然ECM及其組合；視情況其中該三維ECM包含Matrigel^TM 。
如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該等肝細胞包含選自由以下組成之群之細胞：胎兒肝細胞、成體肝細胞及其組合。
如申請專利範圍第34項之方法，其中該等肝細胞係表現白蛋白之肝細胞，視情況其中該等經培養之肝細胞係二倍體或四倍體。
如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該等擴增細胞之至少一部分形成一或多個肝細胞類器官(organoids)。
如申請專利範圍第36項之方法，其中該等肝細胞類器官能夠在培養中進一步擴增至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50次繼代(passages)。
如申請專利範圍第36項之方法，其中該等肝細胞類器官能夠在培養中進一步擴增至少3、4、5、6、10、12、15、18、20或24個月。
如申請專利範圍第36至38項中任一項之方法，其中該等肝細胞類器官包含內腔。
如申請專利範圍第36至39項中任一項之方法，其中該等肝細胞類器官包含選自由以下組成之群之全肝及原代肝細胞之特徵：肝糖累積、低密度脂蛋白(LDL)之功能攝取、包含顯著核仁之細胞核，該核仁具有原纖維中心(fibrilar centre)及去凝縮(de-condensed)染色質、大量具有少且短之皺褶之粒線體、膽小管、緊密型連結、過氧化體、溶酶體、多胞體(multi-vesicular bodies)、自噬空泡及其組合。
如申請專利範圍第36至40項中任一項之方法，其中該等肝細胞類器官分泌白蛋白、α-1抗胰蛋白酶(A1AT)、α-胎球蛋白(Afp)及其組合中之至少一種。
如申請專利範圍第36至41項中任一項之方法，其中對於選自由以下組成之群之基因，肝細胞類器官展現出與該等原代肝細胞之基因表現相當之基因表現：白蛋白、脂蛋白元A2 (APOA2)、絲胺酸蛋白酶抑制劑(Serpin)家族成員1 (SERPINA1)及其組合。
如申請專利範圍第36至42項中任一項之方法，其中該等肝細胞類器官以指數方式擴增，視情況其中該擴增之比率係每7至10天約1:3。
如申請專利範圍第36至43項中任一項之方法，其中該等肝細胞類器官具有至少0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%或1%之貼盤效率(plating efficiency)。
如申請專利範圍第36至44項中任一項之方法，其中該等肝細胞類器官不表現通常在膽管細胞中表現之標記基因及/或其中該等肝細胞類器官表現通常在膽管細胞中不表現之基因。
一種可由申請專利範圍第36至45項中任一項之方法獲得或業經申請專利範圍第36至45項中任一項之方法所獲得之肝細胞類器官及/或源自其之細胞，視情況該細胞為單細胞。
如申請專利範圍第46項之肝細胞類器官及/或源自其之細胞，其用於醫學或診斷學。
如申請專利範圍第46項之肝細胞類器官及/或源自其之細胞，其用於活體內篩選物質對肝細胞之潛在作用，視情況用於篩選治療性或毒性作用。
如申請專利範圍第46項之肝細胞類器官及/或源自其之細胞，其用於治療由個體之肝臟中之受損肝細胞引起及/或與其相關之疾病或病狀。
如申請專利範圍第49項之肝細胞類器官及/或源自其之細胞，其中該疾病或病狀係選自由以下組成之群：肝細胞癌、Alagille症候群、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、自體免疫性肝炎、膽道閉鎖症、慢性肝炎、肝癌、肝硬化、肝囊腫、脂肪肝病、半乳糖血症、捷倍耳氏症候群(Gilbert's Syndrome)、原發性膽汁性肝硬化、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、原發性硬化性膽管炎、雷氏症候群(Reye's Syndrome)、類肉瘤病、酪胺酸血症、I型肝糖貯積病、威爾森氏病(Wilson's Disease)、新生兒肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、紫質症、血色素沈著症、進行性家族性肝內膽汁淤積、III型肝糖貯積病、去氧鳥苷激酶缺乏症、丙酮酸羧化酶缺乏症、先天性紅血球生成不良性貧血、多囊性肝病、多囊性腎病、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、尿素循環缺陷、有機酸血症、溶酶體貯積病、脂肪酸氧化病症及其組合。
如申請專利範圍第46項之肝細胞類器官及/或源自其之細胞，其用於修復受損傷及/或經受至少部分肝切除術(HPx)之肝臟之方法，該方法包括將該肝細胞類器官及/或該等源自其之單細胞移植至該肝臟中。
如申請專利範圍第51項之肝細胞類器官及/或源自其之細胞，其中自胎兒肝細胞擴增該肝細胞類器官，且其中該修復肝臟之方法進一步包括使該肝細胞類器官分化，視情況其中使該肝細胞類器官分化係在移植該肝細胞類器官及/或該等源自其之細胞之前。
如申請專利範圍第52項之肝細胞類器官及/或源自其之細胞，其中使該自胎兒肝細胞擴增之肝細胞類器官分化包括在分化培養基中培養該肝細胞類器官，視情況其中該分化培養基包含地塞米松(dexamethasone)及抑癌素M。
如申請專利範圍第53項之肝細胞類器官及/或源自其之細胞，其中該分化培養基包含如申請專利範圍第1至28項中任一項之肝細胞培養基，該肝細胞培養基補充有地塞米松及抑癌素M，視情況其中該地塞米松之濃度係約1 µM及/或該抑癌素M之濃度係約10 ng/ml。
一種如申請專利範圍第1至28項中任一項之肝細胞培養基。
如申請專利範圍第1至28項及第55項中任一項之肝細胞培養基，其包含：約100 ng/ml FGF7；約100 ng/ml FGF10；約20 ng/ml TGFa；約50 ng/ml EGF；約50 ng/ml HGF； B27 (不包含維生素A)；約2 μM A83-01；約10 μM Y-27632；約3 μm CHIR99021；約10 mM菸鹼醯胺；約10 nM胃泌素；約1.25 mM N-乙醯半胱胺酸；及約15% R-脊椎蛋白條件化培養基。