KR20210096631A - 간세포 확장 방법 - Google Patents

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KR20210096631A
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hepatocyte
hepatocytes
orgs
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KR1020217019628A
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요하네스 카로루스 클레버스
후일리 후
Original Assignee
코닌클리즈케 네덜란드세 아카데미 반 베텐샤펜
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Abstract

본 발명은 간세포, 특히 일차 간세포의 시험관내 확장을 위한 배양 방법 및 배지; 상기 방법에 의해 수득가능한 및 수득된 간세포 배양물 및 오르가노이드; 그리고 상기 간세포 배양물 및 오르가노이드의 용도에 관한 것이다.

Description

간세포 확장 방법
기술분야
본 발명은, 특히, 간세포의 시험관내 확장을 위한 배양 방법 및 배지, 상기 방법에 의해 수득가능한 및 수득된 간세포 배양물 및 오르가노이드, 그리고 상기 간세포 배양물 및 오르가노이드의 용도를 제공한다.
발명의 배경
포유류 간은 현저한 재생적 능력을 소유한다. 2개의 손상 반응의 모드가 기재되어 있다: 1) '난형 세포' 반응은 모든 간세포가 만성 간 질환에 의해 영향받는 담도 트리에서 나온다. 2) 성숙한 간세포의 대규모, 증식성 반응은 급성 간 손상 예컨대 부분적 간절제 (PHx)시 발생한다. 난형 세포 반응이 담관세포로부터 오르가노이드를 성장시킴으로써 시험관내 포획된 반면, 간세포 증식성 반응은 배양중 반복되지 않았다.
간은 부분적 간절제 (PHx)로 이의 크기 최대 2/3의 수술적 제거시, 또는 간 전체의 화학적 또는 감염성 상해 후 질량 및 기능의 회복의 면에서 두드러진 재생적 능력을 표시한다 (Stanger, 2015). 간의 부분적 제거에 대한 반응은 남아있는 성숙한 간세포의 대규모 세포 주기 진입을 전구/줄기 세포-유사 상태로의 명백한 탈-분화 없이 관여시키기 때문에 특히 인상적이다 (Miyajima 등, 2014). 간은 그래서 손상 후 2 주 이내 이의 본래의 크기로 다시 성장할 것이다 (Michalopoulos, 2010). 생체내 정상 상태 조건 하에서 직접, 느린 간세포 확장에 대하여 양호한 증거가 있다 (Wang 등, 2015, Font-Burgada 등, 2015). 성인, 기능적 간세포의 증식은 상실된 간 조직의 대체를 위한 원리 기전을 나타낸다 (Stanger, 2015).
간 복구의 대안적 기전은 유해 제제 (독소, 바이러스)가 만성적으로 모든 간세포에 영향을 미치는 경우 작용한다. 이들 환경 하에서, 담관 트리 근처 작은 세포는 증식한다 ('난형 세포'). 지배적인 학파는 담관세포-유사 난형 세포가, 간세포 뿐만 아니라 새로운 담관세포를 재생할 수 있는, 활성화된 간 줄기 세포를 나타낸다고 말한다 (Evarts 등, 1987). 생체내 난형 세포 반응을 반영하는 마우스 및 인간 성인 담도 상피-유래된 전구 세포의 장기 3D 간 확장 시스템은 기재되어 있다 (Huch 등, 2013; Huch 등, 2015). 이들 정의된 3D 오르가노이드 배양 조건 하에서, 성숙한 Epcam+의 1/3까지 담도 세포는 낭성 구조로서 확장하고 6 개월 이상 동안 계대될 수 있는 이분화성 전구 세포로 신속한 탈분화를 받을 수 있다 (Huch 등, 2015; Li 등, 2017; WO2012/014076; WO2015/173425).
성인의 성숙한 간세포는 또한 만성 간 상해에 반응하는 증식적 이분화성 전구 세포로 재프로그래밍될 수 있다 (Tanimizu 등, 2014; Tarlow 등, 2014; Yimlamai 등, 2014; Yanger 등, 2013). 실제로, 성숙한 간세포는 담관세포/담도 상피 세포로 전환분화시킴으로써 생체내 가소성을 표시하는 것으로 입증되었다 (Sekiya 및 Suzuki, 2014; Tanimizu 등, 2014; Yanger 등, 2014; Yanger 등, 2013). 혈통 추적은 간세포-유래된 전구 세포 (hepPD)의 실존을 강조했지만, 이들을 3D 배양중 배양하려는 시도는 초기에 실패하였다 (Malato 등, 2011; Tarlow 등, 2014). 최근 연구는, 2D로 '화학적으로 유도된 간 전구체' (CLiP)로 명명된, 작은, 증식적 이분화성 세포로 시험관내 랫트 및 마우스 간세포를 전환시킬 수 있는 3개 작은 분자의 칵테일을 기재하였다. 장기 배양에서, CLiP는 간세포를 형태학적으로 닮지 않지만, 이들은 그들의 증식적 능력 그리고 그들의 간 분화 능력을 보유하고, 만성적으로 상해된 간을 재증식할 수 있다 (Katsuda 등, 2017).
하지만, 그러한 간세포가 세포 주기에 진입하고 시험관내 장기 확장되도록 유도하는 것은 말할 것도 없고, > 1-2 주 동안 배양중 기능적, 성숙한 간세포를 유지하는 것은 일반적으로 여전히 도전적이었다. HPV 유전자의 공-배양 시스템 또는 발현은 제한된 간세포 확장을 지원하는 것으로 기재되었다 (Khetani 및 Bhatia, 2008; Levy 등, 2015). 최근 노력은 다능성 줄기 세포 (배아 줄기 세포 또는 유도된 다능성 (iPSC)로부터 분화에 의해 시험관내 간세포를 생산하는데 집중하였다 (Li 등, 2010a; Liang 및 Zhang, 2013; Lund 등, 2012). 대안적으로, 재프로그래밍 유전자로 형질감염에 의해 섬유아세포의 전환-분화를 유도하는 것이 가능한 것으로 입증되었다 (Huang 등, 2011; Huang 등, 2014; Swenson, 2012; Zhu 등, 2014). 고무적인 결과가 이들 접근법에 대하여 보고중이지만, 시험관내-생산된 간세포-유사 세포는 성숙화의 면에서 신선하게 단리된, 일차 간세포를 아직 닮지 않는다 (Si-Tayeb 등, 2010).
그러므로, 확장된 세포가 간세포의 형태학적, 기능적 및 생물학적 특징을 유지하면서, 연장된 시기 동안 배양중 간세포 확장을 가능하게 하는 방법이 여전히 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 시험관내 간세포의 신규 확장 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에 따르면, 태아 또는 성인 간으로부터 일차 간세포는 본 발명의 방법을 사용하여 확장될 수 있고, 임의로 여기서 확장될 상기 일차 간세포는 본 방법을 사용하여 확장된 세포에 의해 치료될 대상체의 태아 또는 성인 간으로부터 추출된다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법을 사용하여 확장된 간세포는 (본원에서 "Hep-orgs", "간세포 오르가노이드" 또는 "본 발명의 간세포 오르가노이드"로서 또한 지칭된) 간세포 오르가노이드를 형성한다. 간세포 오르가노이드는 일차 간세포의 핵심 형태학적, 기능적 및 유전자 발현 특성을 유지하면서 연장된 시기 동안 배양중 확장될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 간세포 오르가노이드 및/또는 그것에서 유래된 세포 (임의로 그것에서 유래된 단일 세포)는 대상체의 간에 시험관내 및 이식시에 둘 모두 간세포 증식적 반응 (예컨대 부분적 간절제 이후 보여진 것)을 반복할 수 있다. 본 발명의 간세포 오르가노이드는 그들의 형태학에서 (본원에서 "Chol-orgs"로서 또한 지칭된) 담관세포의 확장, 유전자-발현, 기능성 및/또는 대상체의 간에서 생착되고 증식하는 그들의 능력에서 일어나는 오르가노이드와 구별된다. Chol-orgs는, 예를 들어 Huch 등, 2013 및 Huch 등, 2015에서 이전에 기재되어 왔다.
일 양태에 따르면, (본원에서 "본 발명의 방법"으로서 또한 지칭된) 시험관내 간세포의 확장 방법이 본원에서 제공되고, 여기서 상기 방법은 본 발명의 간세포 배양 배지에서 간세포를 배양시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법은 그들의 핵심 형태학적, 기능적 및 유전자 발현 속성을 유지하면서 일차 간세포를 임의로 확장시킬 수 있는 본 발명의 간세포 배양 배지의 발견에 부분적으로 기반된다. 아래 본원에서 (예를 들어 도 12b에서) 예시된 바와 같이, 본 발명의 간세포 배양 배지의 핵심 성분을 제거하는 단계는 일차 간세포의 확장을 가능하게 하는 이의 능력을 감소시킨다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 본 발명의 간세포 오르가노이드의 생성 방법이다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지에서 간세포를 배양시키는 단계는 이들로부터 확장된 일차 간세포, 및/또는 간세포 및/또는 Hep-orgs가 3차원 세포외 기질 (ECM)과 접촉하면서 수행되고, 임의로 여기서 상기 일차 간세포 및/또는 Hep-orgs는 3차원 세포외 기질에서 성장되고/거나 내장된다. 그래서, 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 본 발명의 간세포 배양 배지의 존재 하에서 3차원 세포외 기질 상에서 및/또는 기질 내에서 일차 간세포를 배양시키고, 그래서 일차 간세포를 확장시키는 단계를 포함하고, 임의로 여기서 일차 간세포로부터 확장된 세포 및/또는 Hep-orgs는 본 발명의 간세포 배양 배지의 존재 하에서 3차원 세포외 기질 상에서 및/또는 기질 내에서 유사하게 배양된다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는
i. FGF7, FGF10 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 임의로 선택된, 50 내지 500 ng/ml의 섬유아세포 성장 인자 (FGF);
ii. R-스폰딘 및 적어도 하나의 글리코겐 신타제 키나제 3 (GSK3) 억제제를 포함하는 Wnt 작용제;
iii. 5 내지 100 ng/ml의 표피 성장 인자 (EGF);
iv. 5 내지 100 ng/ml의 간세포 성장 인자 (HGF); 및
v. 액티빈 수용체-유사 키나제 ALK4, ALK5 및/또는 ALK7의 억제제를 포함하는, 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 억제제를 포함한다.
그래서, 일부 구현예에 따르면 시험관내 간세포의 확장 방법이 본원에서 제공되고, 여기서 상기 방법은 간세포 배양 배지에서 간세포를 배양시키는 단계를 포함하고, 상기 간세포 배양 배지는
i. FGF7, FGF10 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 임의로 선택된, 50 내지 500 ng/ml의 섬유아세포 성장 인자 (FGF);
ii. R-스폰딘 및 적어도 하나의 글리코겐 신타제 키나제 3 (GSK3) 억제제를 포함하는 Wnt 작용제;
iii. 5 내지 100 ng/ml의 표피 성장 인자 (EGF);
iv. 5 내지 100 ng/ml의 간세포 성장 인자 (HGF); 및
v. 액티빈 수용체-유사 키나제 ALK4, ALK5 및/또는 ALK7의 억제제를 포함하는, 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 억제제를 포함한다.
본 발명의 배양 배지는 일차 간세포를 확장시키는데 특히 유용하다. 그러므로, 일부 구현예에 따르면 시험관내 일차 간세포의 확장 방법이 본원에서 제공되고, 여기서 상기 방법은 간세포 배양 배지에서 일차 간세포를 배양시키는 단계를 포함하고, 간세포 배양 배지는
i. FGF7, FGF10 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 임의로 선택된, 50 내지 500 ng/ml의 섬유아세포 성장 인자 (FGF);
ii. R-스폰딘 및 적어도 하나의 글리코겐 신타제 키나제 3 (GSK3) 억제제를 포함하는 Wnt 작용제;
iii. 5 내지 100 ng/ml의 표피 성장 인자 (EGF);
iv. 5 내지 100 ng/ml의 간세포 성장 인자 (HGF); 및
v. 액티빈 수용체-유사 키나제 ALK4, ALK5 및/또는 ALK7의 억제제를 포함하는, 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 억제제를 포함한다.
이 밖에도, 본 발명의 배양 배지는 간세포 오르가노이드 또는 그것에서 유래된 세포를 포함하는, 본 발명의 확장 방법에 의해 수득된 간세포를 확장시키는데 사용될 수 있다. 그러므로, 일부 구현예에 따르면 시험관내 간세포 오르가노이드 또는 그것에서 유래된 간세포 세포의 확장 방법이 본원에서 제공되고, 여기서 상기 방법은 간세포 배양 배지에서 간세포 오르가노이드 또는 그것에서 유래된 간세포 세포를 배양시키는 단계를 포함하고, 간세포 배양 배지는
i. FGF7, FGF10 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 임의로 선택된, 50 내지 500 ng/ml의 섬유아세포 성장 인자 (FGF);
ii. R-스폰딘 및 적어도 하나의 글리코겐 신타제 키나제 3 (GSK3) 억제제를 포함하는 Wnt 작용제;
iii. 5 내지 100 ng/ml의 표피 성장 인자 (EGF);
iv. 5 내지 100 ng/ml의 간세포 성장 인자 (HGF); 및
v. 액티빈 수용체-유사 키나제 ALK4, ALK5 및/또는 ALK7의 억제제를 포함하는, 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 억제제를 포함한다.
WO 2015/173425에서 본 발명가들은 배양 배지에 ("cAMP 경로 활성화제"로서 또한 지칭된) cAMP 경로의 활성화제를 첨가하는 단계가 cAMP 경로 활성화제가 배지에 부재인 경우와 비교하여 증가된 수의 계대 동안 인간 상피 줄기 세포가 배양되게 한다는 것을 입증하였다. 하지만, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 cAMP 경로 활성화제를 포함하지 않는다.
일부 구현예에 따르면, R-스폰딘은 R-스폰딘 1 (RSPO1), R-스폰딘 2 (RSPO2), R-스폰딘 3 (RSPO3), R-스폰딘 4 (RSPO4), 이들의 활성 단편 또는 변이체, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에 따르면, R-스폰딘 조건화된 배지에서 R-스폰딘은 R-스폰딘 1 (RSPO1)이다.
일부 구현예에 따르면, R-스폰딘은 조건화된 배지로서 제공되고 간세포 배양 배지 내에서 5%-50%, 5%-40%, 5%-35%, 10%-30%, 10%-20%, 12%-17%, 또는 바람직하게는 약 15% (vol/vol)의 농도이다. 일부 구현예에 따르면, R-스폰딘 조건화된 배지는 간세포 배양 배지 내에서 약 15% (vol/vol)의 농도이다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지에서 Wnt 작용제는 약 15% (vol/vol)의 R-스폰딘을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지에서 GSK3 억제제는 1 내지 10 μM, 0.5 내지 5 μM, 1 내지 5 μM, 2 내지 4 μM, 또는 바람직하게는 약 3 μM의 농도이다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지에서 GSK3 억제제는 약 3 μM의 농도이다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지에서 GSK3 억제제는 CHIR99021, SB216763, TWS119, 5-브로모인돌, SB415286, BIO, AZD2858, AZD1080, AR-A014418, TDZD-8, LY2090314, BIO-아세톡심, 1-아자켄파울론(Azakenpaullone) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지에서 GSK3 억제제는 CHIR99021이다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지에서 GSK3 억제제는 약 3 μM의 농도에서 CHIR99021이다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 FGF7을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 50 내지 400 ng/ml, 50 내지 300 ng/ml, 75 내지 200 ng/ml, 80 내지 150 ng/ml 또는 바람직하게는 약 100 ng/ml의 농도로 FGF7을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 약 100 ng/ml의 농도로 FGF7을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 FGF10을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 50 내지 400 ng/ml, 50 내지 300 ng/ml, 75 내지 200 ng/ml, 80 내지 150 ng/ml 또는 바람직하게는 약 100 ng/ml의 농도로 FGF10을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 약 100 ng/ml의 농도로 FGF10을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 FGF7 및 FGF10을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는, 각각 약 100 ng/ml의 농도로, FGF7 및 FGF10을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 10 ng/ml 내지 100 ng/ml, 20 ng/ml 내지 100 ng/ml, 20 ng/ml 내지 80 ng/ml, 40 ng/ml 내지 80 ng/ml, 또는 바람직하게는 약 50 ng/ml의 농도로 EGF를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 약 50 ng/ml의 농도로 EGF를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 10 ng/ml 내지 100 ng/ml, 20 ng/ml 내지 100 ng/ml, 20 ng/ml 내지 80 ng/ml, 40 ng/ml 내지 80 ng/ml, 또는 바람직하게는 약 50 ng/ml의 농도로 HGF를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 약 50 ng/ml의 농도로 HGF를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 1 내지 10 μM, 0.5 내지 5 μM, 1 내지 4 μM, 1 내지 3 μM, 또는 바람직하게는 약 2 μM의 농도로 TGF-β 억제제를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 약 2 μM의 농도로 TGF-β 억제제를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, TGF-β 억제제는 액티빈 수용체-유사 키나제 ALK4, ALK5 및/또는 ALK7 신호전달 경로의 억제제이다. 일부 구현예에 따르면, TGF-β 억제제는 액티빈 수용체-유사 키나제 ALK4, ALK5 및/또는 ALK7의 억제제이다. 일부 구현예에 따르면, TGF-β 억제제는 액티빈 수용체-유사 키나제 ALK4, ALK5 및/또는 ALK7의 억제제이다. 일부 구현예에 따르면, TGF-β 억제제는 A83-01, SB-431542, SB-505124, EW-7197, LY-2157299, GW6604 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 액티빈 수용체-유사 키나제 ALK4, ALK5 및/또는 ALK7의 억제제이다. 일부 구현예에 따르면, TGF-β 억제제는, 액티빈 수용체-유사 키나제 ALK4, ALK5 및/또는 ALK7의 억제제인, A83-01이다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지의 TGF-β 억제제는 약 2 μM의 농도로 A83-01이다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 니코틴아미드를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 1 내지 100 mM, 1 내지 50 mM, 1 내지 30 mM, 1 내지 20 mM, 5 내지 20 mM, 5 내지 15 mM, 또는 바람직하게는 약 10 mM의 농도로 니코틴아미드를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 약 10 mM의 농도로 니코틴아미드를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 가스트린을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 1 내지 100 nM, 1 내지 50 nM, 1 내지 30 nM, 1 내지 20 nM, 5 내지 20 nM, 5 내지 15 nM, 또는 바람직하게는 약 10 nM의 농도로 가스트린을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 약 10 nM의 농도로 가스트린을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 (본원에서 TGFa로서 또한 지칭된) 형질전환 성장 인자 알파 (TGF-α)를 포함한다 추가로 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 1 내지 50 ng/ml, 5 내지 35 ng/ml, 10 내지 30 ng/ml, 15 내지 25 ng/ml, 또는 바람직하게는 약 20 ng/ml의 농도로 TGF-α를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 약 20 ng/ml의 농도로 TGF-α를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 Rho-연관된 단백질 키나제 (ROCK) 억제제를 포함한다 추가로 포함한다. 일부 구현예에 따르면, ROCK 억제제는 Y-27632, GSK429286A, 파수딜(Fasudil), 티아조비빈(Thiazovivin), Rho 키나제 억제제 IV 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에 따르면, ROCK 억제제는 Y-27632이다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 1 내지 50 μM, 1 내지 30 μM, 1 내지 20 μM, 5 내지 20 μM, 5 내지 15 μM, 또는 바람직하게는 약 10 μM의 농도로 ROCK 억제제를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 약 10 μM의 농도인 ROCK 억제제를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 약 10 μM의 농도로 Y-27632를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 N-아세틸시스테인을 포함한다 추가로 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 0.5 내지 5 mM, 0.5 내지 4 mM, 1 내지 4 mM, 1 내지 2 mM, 1 내지 1.5 mM, 또는 바람직하게는 약 1.25mM의 농도로 N-아세틸시스테인을 포함한다 추가로 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 약 1.25mM의 농도로 N-아세틸시스테인을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 B27 보충제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 비타민 A를 함유하지 않는 B27 보충제를 포함한다 추가로 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이 비타민 A를 함유하지 않는 B27 보충제는 '비타민 A 없는 B27 보충제'를 지칭한다 (Invitrogen, Carlsbad, CA; www.invitrogen.com; 현재 카탈로그 번호 12587010로부터; 그리고 PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria; www.paa.com; 카탈로그 번호 F01-002; Brewer 등, J Neurosci Res., 35(5):567-76, 1993으로부터 이용가능).
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 세포 성장 배지를 추가로 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 세포 성장 배지는 항생제, 임의로 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 세포 성장 배지는, 헤페스(Hepes) (예를 들면 10mM) 및/또는 글루타멕스(Glutamax) 보충제 (Gibco)를 임의로 포함하는, AdDMEM/F12 (Invitrogen제)이다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 확장된 간세포는 본 발명의 간세포 배양 배지의 존재 하에서 세포외 기질 (ECM)과 접촉하여 배양된다. 세포외 기질은 바람직하게는 (배양 중인 세포에 의해 분비되지 않는 것을 의미하는) 외인성 세포외 기질이다. 일부 구현예에서 세포외 기질은 3차원 세포외 기질이다. 다른 구현예에서 세포외 기질은 현탁액이다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 추가로 일차 간세포를 3차원 세포외 기질 (ECM)과 접촉하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 세포를 3차원 세포외 기질 (ECM)과 접촉하는 단계는 세포를 3차원 세포외 기질 상에서 및/또는 기질 내에서 씨딩하는 단계를 포함함. 일부 구현예에 따르면, 세포를 3차원 세포외 기질과 접촉하는 단계는 세포를 비-고체 3차원 기질과 혼합하고 그 다음 기질을 고형화시키고, 그래서 세포를 3차원 기질에서 및/또는 기질 상에서 내장하는 단계를 지칭한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 일차 간세포를 본 발명의 간세포 배양 배지와 접촉하는 단계에 앞서 일차 간세포를 3차원 세포외 기질 (ECM)과 접촉하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 일차 간세포를 3차원 세포외 기질 (ECM)에서 내장하는 단계, 이어서 내장된 세포 및 3차원 기질을 본 발명의 간세포 배양 배지에서 배양시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 3차원 세포외 기질은 본 발명의 간세포 배양 배지를 포함하고/거나 상기 배지를 사용하여 제조된다. 일부 구현예에 따르면, 3차원 세포외 기질은 합성 ECM, 천연 ECM 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 3차원 ECM은 MatrigelTM을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 3차원 세포외 기질은 1:1, 1:2, 또는 바람직하게는 1:3의 배지:기질 비로 본 발명의 간세포 배양 배지를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 3차원 ECM은 MatrigelTM 및 본 발명의 간세포 배양 배지를, 임의로 1:3의 배지:기질 비로 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 확장된 일차 간세포는 간 조직으로부터 단리된다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 확장된 일차 간세포는 간 조직으로부터 단리되고, 여기서 상기 간 조직은, 임의로 확장된 간세포와 투여될 대상체로부터, 외식편 또는 간 샘플이다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 간 조직으로부터 확장될 일차 간세포를 단리시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 일차 간세포를 단리시키는 단계는 콜라게나제 소화를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 확장되는 일차 간세포는 포유류 간세포, 예컨대 쥣과 또는 인간 간세포이다. 임의의 이론 또는 기전에 의해 구속됨의 바램 없이, 확장된 쥣과 간세포 및/또는 Hep-orgs는 간세포 또는 간 연구에서, 또는 간에 관해서 특정 서브스턴스 (예를 들면 치료제 또는 독소)의 잠재적 효과를 테스트하는데 사용될 수 있다. 확장된 인간 간세포 및/또는 Hep-orgs는 연구에서 유사하게 사용될 수 있지만 (예를 들면 부분적 간절제 이후) 간 재생이 필요한 대상체 또는 간 손상을 초래하거나 이와 연관되는 질환 또는 병태에 시달린 대상체에 또한 이식될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 확장되는 간세포는 태아 간세포, 성인 간세포 및 이들의 조합일 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 확장되는 일차 간세포는 태아 일차 간세포, (본원에서 "성인 일차 인간 간세포"로서 또한 지칭된) 성인 일차 간세포 및 이들의 조합일 수 있고, 바람직하게는 여기서 상기 일차 간세포는 인간 ("PHHs")이다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 확장되는 일차 간세포는 알부민-발현 간세포이다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 확장되는 일차 간세포는 2배체 또는 4배체이다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 확장되는 일차 간세포는 8배체가 아니다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법을 사용하여 간세포를 확장시키는 단계는 (본원에서 "본 발명의 간세포 오르가노이드" 또는 "Hep-orgs"로서 또한 지칭된) 하나 이상의 간세포 오르가노이드의 형성을 초래한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법을 사용하여 간세포를 확장시키는 단계는 간세포 오르가노이드의 일부가 아닌 간세포 및/또는 간세포 오르가노이드를 초래한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법을 사용하여 태아 간세포를 확장시키는 단계는 본원에서 "태아-오르가노이드" 또는 "태아-Orgs"로서 또한 지칭된 간세포 오르가노이드를 초래한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법을 사용하여 성인 일차 인간 간세포를 확장시키는 단계는 본원에서 "PHH-orgs"로서 또한 지칭된 간세포 오르가노이드를 초래한다. 일부 구현예에 따르면, PHH-orgs는 알파-태아글로불린 (Afp)을 재-발현시킨다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 확장된 간세포 오르가노이드 및/또는 간세포는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 계대 동안 배양중 추가로 확장될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 확장된 간세포 오르가노이드 및/또는 간세포는 적어도 3, 4, 5, 6, 10, 12, 15, 18, 20 또는 24 개월 동안 배양중 추가로 확장될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 확장된 PHH-orgs는 적어도 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 또는 5 개월 동안 배양중 추가로 확장될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 확장된 태아-orgs는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 계대 동안 배양중 추가로 확장될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 생성된 간세포 오르가노이드는 기하급수적으로 확장하고, 임의로 여기서 상기 확장은 7-10 일마다 약 1:3의 비율이다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 생성된 간세포 오르가노이드는 적어도 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%의 평판배양 효율을 갖는다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 생성된 간세포 오르가노이드가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 생성된 간세포 오르가노이드를 포함하는, 간세포의 배양물이 본원에서 제공된다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 생성된 간세포 오르가노이드로부터 제조된 단일 세포 및/또는 단일 세포의 배양물이 본원에서 제공된다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 생성된 간세포 오르가노이드는 내강을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 생성된 간세포 오르가노이드는, 담관세포로부터 생성된 오르가노이드에 전형적인 큰 내강 및 편평 세포와 반대로, 작은 내강 및 큰 세포를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 생성된 간세포 오르가노이드는 글리코겐 축적, 저밀도 리포단백질 (LDL)의 기능적 흡수, 섬유 중심과 탈-응축된 염색질을 갖는 두드러진 핵소체를 포함하는 핵, 크리스타가 적고 짧은 다수의 미토콘드리아, 담 세관, 단단한 연접, 퍼옥시좀, 리소좀, 다포체, 자가포식 공포 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 전체 간 및 일차 간세포 형태학 및 기능의 특징을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 생성된 간세포 오르가노이드는 알부민, 알파-1 안티트립신 (A1AT), 알파-태아글로불린 (Afp) 및 이들의 조합 중 적어도 하나를 분비한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 생성된 간세포 오르가노이드는 알부민, 아포리포단백질 A2 (APOA2), 세르핀 패밀리 구성원 1 (SERPINA1) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자에 대하여 일차 간세포의 것과 비교가능한 유전자 발현을 입증한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 생성된 간세포 오르가노이드는 담관세포에서 전형적으로 발현된 마커 유전자를 발현시키지 않는다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 생성된 간세포 오르가노이드는 담관세포에서 전형적으로 발현되지 않는 유전자를 발현시킨다. 일부 구현예에 따르면, 기능적 간세포 유전자, 예컨대, 비제한적으로, 시토크롬 P450 활성도, 글리코겐/지질 대사 및/또는 요소 회로에 관련된 유전자의 발현은 태아 또는 성인 기원 그리고 태아 간세포 또는 성인 일차 인간 간세포, 각각으로부터 Hep-orgs에서 비교가능하다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 생성된 간세포 오르가노이드는 담관세포에서 기원하는 오르가노이드에서 보여진 것보다 전구/담관세포 마커 유전자의 더 낮은 발현을 입증한다. 그와 같은 전구/담관세포 마커 유전자의 비-제한 예는 EPCAM, SOX9, KRT8/18 및 KRT7/19이다.
또 다른 양태에 따르면, 의학 또는 진단법에서 사용을 위하여 본 발명의 방법에 의해 생성된 간세포 오르가노이드 및/또는 그것에서 유래된 단일 세포가 본원에서 제공된다.
일부 구현예에 따르면, 생체내 간세포에 관해서 서브스턴스의 잠재적 효과 스크리닝에서 사용을 위하여, 임의로 치료적 또는 독성 효과에 대한 스크리닝에서 사용을 위하여 본 발명의 방법에 의해 생성된 간세포 오르가노이드가 본원에서 제공된다. 이론 또는 기전에 의해 구속됨의 바램 없이, 본 발명의 방법에 의해 생성된 간세포 오르가노이드는 간 조직에 대한 이의 높은 형태학적 및 기능적 유사성으로 인해 생체내 간 조직에 관해서 서브스턴스의 효과를 정확하게 스크리닝 및 예측하기 위하여 적당한 시험관내 모델을 제공할 수 있다
일부 구현예에 따르면, 대상체의 간에서 손상된 간세포에 의해 야기되고/거나 이와 연관되는 질환 또는 병태 치료에서 사용을 위하여 본 발명의 방법에 의해 생성된 간세포 오르가노이드가 본원에서 제공된다. 이론 또는 기전에 의해 구속됨의 바램 없이, 본 발명의 방법에 의해 생성된 간세포 오르가노이드는 대상체의 간에서 생착되고 증식할 수 있고, 그래서 간 조직이 손상하는 질환 및 병태 (및 특히 간세포)를 치료하고 손상된 간 조직을 대체할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 대상체의 간에서 손상된 간세포에 의해 야기되고/거나 이와 연관되는 질환 또는 병태는 간세포 암종, 알라길 증후군, 알파- 1- 안티트립신 결핍증, 자가면역 간염, 담도 폐쇄증, 만성 간염, 간암, 간경변, 간 낭종, 지방간 질환, 갈락토스혈증 길버트 증후군, 원발성 담즙성 경화증, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 원발성 경화성 담관염, 라이 증후군, 유육종증, 티로신혈증, I형 글리코겐 축적병, 윌슨병, 신생아 간염, 비-알코올성 지방간염, 포르피린증, 혈색소증, 진행성 가족성 간내 담즙정체증, 글리코겐 축적병 III형, 티로신혈증, 데옥시구아노신 키나제 결핍증, 피루베이트 카복실라아제 결핍증, 선천성 적혈구형성이상 빈혈, 다낭성 간 질환 다낭성 신장 질환, 알파-1 안티트립신 결핍증, 우레움 회로 결함, 유기 산혈증, 리소좀 축적병, 지방산 산화 장애, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에 따르면, 손상을 입었고/거나 적어도 부분적 간절제 (HPx)를 받았던 간을 복구하는 방법으로, 간세포 오르가노이드 및/또는 그것에서 유래된 단일 세포를 간에 이식하는 단계를 포함하는 방법에서 사용을 위하여 본 발명의 방법에 의해 생성된 간세포 오르가노이드가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에 따르면, 치료가 필요한 대상체에서 간 조직의 재생 방법으로, 간세포 오르가노이드 및/또는 그것에서 유래된 단일 세포를 간에 이식하는 단계를 포함하는 방법에서 사용을 위하여 본 발명의 방법에 의해 생성된 간세포 오르가노이드가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에 따르면, 간세포 오르가노이드 및/또는 그것에서 유래된 단일 세포를 이식하는 단계는 비장 주사를 통한다. 일부 구현예에 따르면, 본원에서 개시된 바와 같이 치료, 이식 및/또는 재생의 방법은 본 발명의 간세포 오르가노이드에서 유래된 단일 세포를 사용하여 수행된다. 숙련된 사람은 이식중인 재료 (즉 세포의 모집단, 세포 현탁액내 단일 세포, 오르가노이드 또는 오르가노이드의 단편)에 의존하여 적당한 방법 및 투여의 경로를 선택할 수 있을 것이다.
이론 또는 기전에 의해 구속됨의 바램 없이, 본 발명의 간세포 오르가노이드는 이식된 대상체의 간에 생착할 수 있고 손상 이후 간세포 증식적 반응을 반복할 수 있고, 그래서 손상된 및/또는 제거된 간 조직의 재생을 가능하게 한다.
일부 구현예에 따르면, 대상체의 간에 태아-orgs 또는 그것에서 유래된 세포 (예를 들면 단일 세포)를 이식하는 단계를 포함하는 방법은 세포를 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 대상체의 간에 태아-orgs 또는 그것에서 유래된 단일 세포의 치료, 진단 및/또는 스크리닝을 포함하는 방법은 세포를 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 구현예에 따르면, 태아-orgs의 세포 또는 그것에서 유래된 세포를 분화시키는 단계는, 대상체를 치료하기 위해 세포를 사용하여 또는 스크리닝 및/또는 진단을 위하여 시험관내 세포를 사용하여, 대상체에 또는 세포를 이식하는 단계에 앞서 수행된다. 이론 또는 기전에 의해 구속됨의 바램 없이, 대상체에 이들을 이식하는 단계에 앞서 태아 간세포에서 유래된 오르가노이드를 분화시키는 단계는 대상체의 간에 세포의 이식가능성 및 생착화를 개선할 수 있고, 그래서 간 재생/치료를 잠재적으로 촉진 및/또는 개선할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 대상체에 이식에 앞서 분화로부터 유익할 수 있는 태아-orgs 및/또는 그것에서 유래된 단일 세포는 인간 태아로부터 단리된 일차 간세포에서 유래되고, 임의로 여기서 상기 태아는 임신 약 5-30 주차, 임의로 임신 약 10-20 주차이다.
그래서, 일부 구현예에 따르면, 손상을 입고/거나 적어도 부분적 간절제 (HPx)를 받았던 간의 복구 방법으로, 간세포 오르가노이드 및/또는 그것에서 유래된 단일 세포를 간에 이식하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 제공되고, 여기서 상기 간세포 오르가노이드는 태아 일차 간세포로부터 확장되었고 간의 복구 방법은 간세포 오르가노이드 및/또는 그것에서 유래된 단일 세포를 분화시키는 단계를 추가로 포함하고, 임의로 여기서 분화시키는 단계는 간세포 오르가노이드 및/또는 그것에서 유래된 단일 세포를 이식하는 단계에 앞선다.
일부 구현예에 따르면, 태아-orgs의 세포 및/또는 그것에서 유래된 단일 세포를 분화시키는 단계는 (본원에서 "DM"으로서 또한 지칭된) 분화 배지에서 세포를 배양시킴으로써 수행된다. 그래서 본 발명은 또한 분화 배지를 제공한다. 일부 구현예에 따르면, 분화 배지는 태아-orgs 및/또는 그것에서 유래된 세포의 성숙을 증가시킨다. 일부 구현예에 따르면, 분화 배지는 덱사메타손 및 온코스타틴 M 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 분화 배지는 덱사메타손 및 온코스타틴 M을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 분화 배지는 본 발명의 간세포 배양 배지 그리고 덱사메타손 및 온코스타틴 M 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 분화 배지는 덱사메타손 및 온코스타틴 M에 의해 보충된 본 발명의 간세포 배양 배지를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 덱사메타손은 약 1 μM의 농도이다. 일부 구현예에 따르면, 온코스타틴 M은 약 10 ng/ml의 농도이다. 일부 구현예에 따르면, 덱사메타손은 약 1 μM의 농도이고 온코스타틴 M은 약 10 ng/ml의 농도이다. 일부 구현예에 따르면, 덱사메타손은 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4 또는 5 μM의 농도이다. 일부 구현예에 따르면, 온코스타틴 M은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 ng/ml의 농도이다.
일부 구현예에 따르면, 태아 간세포의 성숙을 위한 분화 배지가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 분화 배지는 본 발명의 간세포 배지를 포함하고 덱사메타손 및 온코스타틴 M을, 임의로 약 1 μM 및 약 10 ng/ml, 각각의 농도로 추가로 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 태아 간세포 오르가노이드의 분화 배지는 "인간 태아-Orgs 분화 배지 (DM)" 하에 표 2에서 지시된 모든 요소를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 태아 간세포의 성숙을 위한 분화 배지가 본원에서 제공되고, 여기서 상기 분화 배지는 "인간 태아-Orgs 분화 배지 (DM)" 하에 표 2에서 지시된 모든 요소를 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1 - 쥣과 간세포 오르가노이드의 3D 배양 시스템의 확립.
(A) 일차 간세포의 단리 및 씨딩, 그리고 Hep-Orgs의 확장 및 계대를 묘사하는 개략도.
(B) 야생형 C57BL/6 마우스의 일차 간세포로부터 배양된 계대 0 (P0) 20 일차에 Hep-Orgs의 차등 간섭 대비 (DIC) 이미지. 저 배율 (좌, 블랙 스케일 바=50μm), 고 배율 (우, 블랙 스케일 바=12.5 μm).
(C) 10,000개 간세포당 형성된 오르가노이드의 수. 실험은 3중으로 그리고 독립적 C57BL/6 마우스에서 수행되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로서 표시된다.
(D) 계대 2 제3 일차에 Chol-Orgs의 차등 간섭 대비 (DIC) 이미지 (좌, 블랙 스케일 바 =50μm); 고 배율 (우, 블랙 스케일 바 =12.5 μm).
(E) 증식 마커 mKi67 (적색), 부착 연접 마커 β-카테닌 (황색) 및 DAPI (청색)에 대하여 공-염색된 Hep-Org의 파라핀 섹션의 공초점 이미지. 스케일 바=25μm.
(F) Hep-Orgs의 투과 EM (TEM)은 전형적 간세포 구조를 보여준다. (I) 세포 형태학의 개관; (II)-(VI) (화살표로 지시된) 전형적 간세포 구조. N=핵; Mv=미세융모; Tj=밀착 연접; Bc=담 세관-유사 구조; Cv= 코팅된 소포; Ld=지질 방울, Si=시누소이드. 스케일 바=2 μm.
(G) 타목시펜- 유도된 알부민-CreERT2; Rosa26-LSL-tdTomato 마우스로부터 단일 일차 간세포 (tdTomato+)로부터 성장된 클론성 Hep-Org. 이미지는, 표시된 바와 같이, 일차 배양의 상이한 날에 찍어졌다. 스케일 바=25 μm.
도 2 - 마우스 간세포 오르가노이드의 특성규명.
(A) Hep-Orgs의 공초점 z-스택 (좌) 및 단일 평면 (우) 이미지. 알부민 (녹색), E- 카드헤린 (적색, 우측 패널), 및 DAPI (청색). 스케일 바=20μm.
(B) 마우스 Chol-Orgs의 공초점 z-스택 (좌) 및 단일 평면 (우) 이미지. Krt7 (청색), Krt19 (적색), 및 DAPI (백색). 스케일 바=20μm.
(C)+(D) 일차 간세포에 비해 Hep-Orgs 및 Chol-Orgs에서 간세포 마커 (C) 및 담관세포/전구 마커 (D)의 유전자 발현의 qRT-PCR 분석. 그래프는 3개 독립적 마우스로부터 4개 복제물로부터 평균 결과를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM으로 표시된다. **는 p<0.01을 나타내고, ***는 p<0.001을 나타낸다.
(E) Hep- Orgs에서 과요오드산-시프 (Periodic-Acid Schiff; PAS) 염색 (진분홍색)에 의해 평가된 글리코겐 축적. 핵은 헤마톡실린 (청색)으로 염색되었다. 스케일 바=20μm.
(F) 저밀도 리포단백질 (LDL) 흡수는 배양된 Hep-Orgs에서 Dil-ac-LDL 형광성 염색 (적색)에 의해 분석되었다. 핵은 DAPI (청색)로 염색되었다. 스케일 바=20μm.
(G) 확장 배지 (EM) 또는 분화 배지 (DM)에서 일차 간세포, 계대 0 (P0) 15 일차 및 계대 3 (P3)의 Hep-Orgs 그리고 Chol-Orgs의 24시간 배양 후 측정된 알부민 분비. 결과는 세포당 알부민의 피코그램으로서 나타난다. 데이터는 평균 ±SEM으로서 표시된다.
(H) 배양된 일차 간세포, p0 15 일차 및 p3의 Hep-Orgs에서 시토크롬 활성도 (Cyp1a2)의 측정. 백만 세포당 ml당 상대 광 단위 (RLU)는 나타난다. 데이터는 평균 ±SEM으로서 표시된다.
(I) 확장 배지 (EM) (도 9k에서 전체 유전자 목록)에서 3개 독립적 Hep-Orgs, 일차 간세포를 가진 (p1) (n=1), 그리고 3개 독립적 Chol-Orgs (p8-p12)를 비교하는 mRNA 시컨싱에 의해 결정된 간 유전자 발현의 히트맵.
도 3 - Hep-Orgs는 부분적 간절제술시 간세포 증식을 반복한다.
(A) 상이한 계대에서 Hep-Orgs의 클러스터링 그리고 Chol-Orgs와 그들의 명확한 구별을 보여주는 PCA 플롯 (계대 1, 3, 및 7은 P1, P3 및 P7로서 라벨링된다). PC2에서 매우 작은 변이도 (5%)를 유의한다.
(B) 일차 간세포, Hep-Orgs 및 Chol-Orgs에서 주요 간 마커의 히트맵 (M1 및 M2, 2개 별도 마우스 공여체로부터, 계대 1, 3, 및 7은 P1, P3 및 P7로서 라벨링된다).
(C) Chol-Orgs, 계대 1, 3, 및 7에서의 Hep-Orgs, PHx 및 손상되지 않은 (Hep) 간세포의 생물학적 복제물 사이 피어슨 상관 계수를 보여주는 상관 플롯. 색상 강도 및 원의 크기는 상관 계수에 비례한다. 샘플은 계층 클러스터링에 기반하여 정돈되고 그래프에서 직사각형은 계층 클러스터링의 결과에 기반된다. 상관은 최상부 1000개-최고 발현된 유전자에 기반된다.
(D) mRNA 시컨싱 (최상부) 또는 마이크로어레이 (최하부)에 의해 수득된 비-손상된 간과 비교하여 PHx 3 일후 마우스 간 사이 차등적으로 발현된 유전자의 목록과 비교해서 Hep-Orgs (계대 1, 3, 7에서 생물학적 복제물) 대 일차 간세포의 GSEA 농축 분석. 부분적 간절제의 3 일 후 상향-조절된 유전자의 농축: 좌측 패널); 부분적 간절제의 3 일 후 하향-조절된 유전자의 농축: 우측 패널.
도 4 - Hep-Orgs의 단일 세포 전사체 분석
(A) Hep-Orgs 및 Chol-Orgs 그리고 알부민-CreERT2; Rosa26-LSL-tdTomato 마우스 ("손상되지 않은 대조군")로부터 또는 2/3 부분적 간절제 3 일 후 ("재생") 단리된 간세포의 단일 세포 시컨싱 실험의 개관.
(B) 개별 세포: Hep-Org 세포 (녹색), Chol-Org 세포 (청색)의 기원을 나타내는 t-SNE 맵.
(C)+(D) Hep-Orgs 및 Chol-Orgs에서 유래된 단일 세포에서 Alb (C) 및 Krt7 (D)의 발현을 보여주는 t-SNE 플롯. 발현은 정상화된 log2 값으로 제공된다.
(E) RaceID2 알고리즘에 의해 수득된 Hep-Orgs로부터 모든 세포 클러스터의 t-SNE 맵.
(F)- (H) Hep-Orgs에서 Alb (F), Pcna (G), 및 Krt7 (H)의 발현 수준을 보여주는 t-SNE 플롯. 발현은 정상화된 log2 값으로 제공된다.
(I) Hep-Orgs 대 일차 간세포에서 유전자의 GSEA. 발현 농축은 대조군 비-손상된 간과 비교된 부분적 간절제 3 일 후 마우스 간을 비교함으로써 생성된 차등적으로 발현된 유전자의 유전자 셋트와 비교되었다. PHx 후 3 일에 상향-조절된 유전자의 농축: 상부 패널; PHx 후 3 일에 하향-조절된 유전자의 농축 (하부 패널).
(J) 손상되지 않은 간세포, 단리된 PHx 후 간세포 및 Hep-Orgs에서 마커의 발현을 비교하는 바이올린 플롯. 세포 주기-/성장-관련된 유전자의 발현은 최상부 열에서 주어진다. 마커는 간 재생에서 그들의 특이적 발현을 위하여 선택되었지만, 세포 주기화와 관련 없었다 (최하부-3개 열). 전사물 카운트는 log10 척도로 제공된다.
도 5 -인간 간세포로부터 Hep-Orgs의 확립.
(A) p0 21일차에 태아 간 (태아-Orgs, 좌측 패널), 블랙 스케일 바=40μm로부터 또는 p0 19일차에 일차 인간 간세포 (PHHs) (PHH-Orgs, 우측 패널), 블랙 스케일 바=20μm로부터 Hep-Orgs의 DIC 이미지.
(B) 10,000개 태아-Heps 또는 PHHs 당 형성된 Hep-Orgs의 숫자. 실험은 3중으로 수행되었다. 데이터는 평균 ±SEM으로 표시된다.
(C) 인간 성인 간, 블랙 스케일 바=200μm로부터 p5 Chol-Orgs를 보여주는 DIC 이미지
(D) 태아-Orgs (D)의 투과 EM I 세포 형태학의 개관, 스케일 바=2 μm; II 전형적 간세포 구조, 스케일 바=1 μm; III 전형적 간세포 구조, 스케일 바=2 μm. N=핵; Nu=핵소체, Gly=글리코겐, Mit=미토콘드리아, Mv=미세융모, Tj=밀착 연접, GJ= 갭 연접, RER=조면 소포체, Bc=담 세관-유사 구조 (흑색 화살표), Av=자가포식 공포 (백색 화살표).
(E) PHH-Orgs 및 Chol-Orgs의 투과 EM (우측 패널). PHH-Orgs는 전형적 간세포 구조를 보여준다. Mvb=다포체, Po=퍼옥시좀.
(F) 인간 태아-Orgs의 (z-스택 돌출부)의 공초점 이미지. ALB (청록색), HNF4A (녹색), F-ACTIN (적색), 및 DAPI (백색), 스케일 베일=20μm.
(G) 인간 태아-Orgs (P26)의 MRP2 및 F-ACTIN (3D 재구성)의 전체 마운트 염색의 공초점 이미지.
(H) 저밀도 리포단백질 (LDL) 흡수는 배양된 인간 태아-Orgs에서 Dil-ac-LDL 형광성 염색 (적색)에 의해 분석되었다. 핵은 DAPI (청색)로 염색되었다. 스케일 베일=20μm.
(I) 인간 태아-Orgs에서 PAS 염색 (진분홍색)에 의해 평가된 글리코겐 축적. 핵은 헤마톡실린 (청색)으로 염색되었다. 스케일 베일=20μm.
(J) PHHs (백색), 동일한 PHH 배치에서 유래된 PHH-Orgs (백색 줄무늬), 태아 간세포 (태아-Heps, 회색), 6개 독립적 태아 Hep-Org 배양물 (회색 줄무늬) 및 차등화된 Chol-Orgs (흑색)에 의한 알부민 분비. "후기"는 1개 웰로부터 P22 배양물을 나타낸다. 결과는 백만 세포당 일당 알부민의 마이크로그램으로서 나타난다. 데이터는 평균 ±SEM으로서 표시된다.
(K) 이들이 유래되는 PHHs (백색)와 그리고 4개 독립적 태아-Org 배양물 (도 5j에서와 동일한 넘버링)과 비교된 PHH-Orgs (줄무늬)에서 시토크롬 활성도 CYP3A4의 측정. 백만 세포당 ml당 상대 광 단위 (RLU)는 제공된다. 데이터는 평균 ±SEM으로서 표시된다.
도 6 - 인간 Hep-Orgs의 전사적 특성규명
(A) 2개 독립적 PHH 배치, PHH-Orgs, 태아-Heps, 태아-Orgs 및 2개 분화된 Chol-Orgs에서 최상 발현된 간 유전자의 히트맵. 도 5에서 처럼 라벨링된 Hep-Org 주.
(B) 태아-Org 세포 (보라색)와 Chol-Org 세포 (회색)를 조합하는 t-SNE 맵.
(C) 조합된 태아-Org/Chol-Org 데이터셋트의 클러스터링 결과를 보여주는 t-SNE 맵. 6개 주요 클러스터는 할당되었다: 간세포 (i), 간 중간엽-유사 세포 (ii), 전구체 (iii-iv), 및 담관세포 (v-iv).
(D)- (G) 간세포 마커 ALB, SERPINA1 (D), ASGR1 및 ASGR2 (E), 담관세포 마커 EPCAM 및 KRT7 (F) 및 리보솜 유전자 RPS10 (G)의 발현 수준을 강조하는 t-SNE 플롯. 도 6b에서 처럼 데이터셋트. 발현은 정상화된 log2 값으로서 제공된다.
도 7 - FNRG 마우스 간내 인간 Hep-Orgs의 생착화
(A) 이식 30 일 후 인간 태아-Org 세포로 이식된 FNRG 마우스의 대표적 간 섹션의 인간 ALB 및 MKI67 면역형광성 (최상부) 및 인간 NuMA 면역조직화학성 (최하부) 염색.
(B) 이식 90 일 후 인간 태아-Org 이식된 FNRG 마우스의 대표적 간 섹션의 인간 ALB, MKI67 및 KRT19 면역형광성 염색 (최상부) 및 인간 NuMA 면역조직화학성 염색 (최하부).
(C) 이식 90 일 후 인간 태아 Hep-Org 이식된 FNRG 마우스의 대표적 간 섹션의 인간 ALB, MRP2, CYP2E1, MKI67 및 AFP 면역형광 염색.
(D) 좌측 패널은, 이식된 그룹의 평균을 나타내는 각 점 값으로, 이식된 PHHs (일차 인간 간세포), 이식된 PHH-Orgs (일차 인간 간세포 오르가노이드) 및 이식된 태아 Hep-Orgs의 혈청 hALB 시간 과정을 비교한다. 우측 패널: 각 그룹에서 모든 마우스에 대하여 45 일 시점부터의 데이터, 여기에서 각 플롯은 1마리 마우스를 나타낸다.
도 8 - 간세포 오르가노이드는 주로 중심 정맥 간세포에서 기원한다
(A) 지시된 조성물의 배지에서 웰당 Hep-Orgs의 숫자. 오르가노이드 숫자는 씨딩 후 10 일차에 계수되었다. 데이터는 3중 웰에서 평균 SEM으로서 표시된다.
(B) 8 일차 및 13 일차 (동일한 현장)에서 계대 0 (p0)에 Hep-배지에서 성장하는 Hep-Orgs의 DIC 이미지. 흑색 화살표로 지시된 오르가노이드에서 지질 방울 (블랙 스케일 바=100 μm).
(C) 씨딩 후 0 일차부터 100 일차까지 (일차 마우스 간세포에서 유래된) Hep-Orgs의 성장 곡선. 2-3 개월 동안 평준화를 유의한다. 데이터는 동일 나이의 3마리 성체 숫컷 마우스에 대하여 평균 SEM으로서 표시된다.
(D) 14 일차에 분석된 Hep-배지에서 배양된 (BALB/c 마우스 또는 C57BL/6 x BALB/c F1 후손의 일차 마우스 간세포에서 유래된) Hep-Orgs의 DIC 이미지 (블랙 스케일 바=25μm).
(E) 타목시펜 유도의 단일 용량 5 일 후 Rosa26-LSL-tdTomato 마우스; 알부민-CreERT2의 마우스 간 조직 섹션 상에서 tdTomato에 대한 면역조직화학성 염색 (블랙 스케일 바=50μm).
(F) Axin2 양성 (Axin2+) 또는 Axin2 음성 (Axin2-)으로서 FACS-분류된 5,000개 세포당 형성된 오르가노이드의 숫자. 실험은 3중으로 수행되었다. 데이터는 평균 ±SEM으로서 표시된다.
(G) 5,000개 Epcam+ 세포당 형성된 오르가노이드의 숫자. 실험은 3중으로 수행되었다. 데이터는 평균 ±SEM으로서 표시된다.
(H) 10,000개 세포 (Hoechst34580을 사용하여 FACS-분류된, 2배체, 4배체, 8배체 간세포, 그리고 비-분류된 간세포)당 형성된 오르가노이드의 숫자. 데이터는 평균 ±SEM으로서 표시된다.
도 9 - 쥣과 Hep-Orgs 및 Chol-Orgs의 비교
(A) Hep- Orgs 및 Chol-Orgs에서 Krt7 및 Krt19의 담도 상피 세포 마커의 면역조직화학성 염색. 스케일 베일=20μm.
(B) HE-염색된 (최상부) 그리고 β-카테닌 (최하부)에 대하여 염색된 Hep-Orgs 및 Chol-Orgs의 파라핀 섹션. 화살표는 Hep-Orgs에서 2핵화된 세포를 나타냈다 (상부 패널, 스케일 바=20μm. 최하부 패널, 스케일 바=25 μm).
(C) Chol-Orgs의 공초점 이미지 (z-스택, 최상부; 단일 공초점 섹션, 최하부). F-액틴 (청색), Epcam (녹색), 및 DAPI (백색). 스케일 베일=20μm.
(D)- (J) Hep-Orgs (n=3)를 일차 간세포 (n=1) 및 Chol-Orgs (n=3)와 비교하는 히트맵. 시토크롬 활성도 (D), 글리코겐 대사 (E), 글루코스 대사 (F), 지질 대사 (G), 완전 활성화 (H), 요소 회로 (I), 및 스테로이드 대사 (J). 유전자 셋트는 도 S2로부터 기본적이었다 (Katsuda 등, 2017). 샘플은 도 2i에서와 동일하다.
(K) 도 2i에서 사용된, 전체 유전자 명칭 목록이 있는 일차-Heps (n=1), 및 Chol-Orgs (n=3)와, Hep-Orgs (n=3)를 비교하는 간 유전자의 발현 프로파일의 히트맵.
(L) Hep-Org 섹션의 Glt1 (녹색) 및 DAPI (청색)의 면역형광 염색. 스케일 바=20μm.
(M) 일차 간세포와 비교된 Hep-Orgs에서 중심주위 (PC) 및 문맥주위 (PP) 마커 발현의 비교. 데이터는 평균 ±SEM으로서 표시된다. **는 p<0.01을 나타내고, ***는 p<0.001을 나타낸다.
도 10 - Hep-Orgs는 Chol-Org 배지에서 Chol-Orgs로 전환분화한다.
(A) 알부민-CreERT2; Rosa26-LSL-tdTomato부터 Chol-Orgs까지 Tomato+ Hep-Orgs의 전환을 보여주는 형광성 DIC 이미지.
(B) Hep-배지에서 Chol-Orgs의 전형적 변화를 보여주는 DIC 이미지.
(C) 10 일 동안 Hep-배지 노출 있는/없는 Chol-Orgs 및 Chol- 배지 노출 있는/없는 Hep-Orgs를 비교하는 RNA 시컨싱의 발현 프로파일의 히트맵. 레인 1 및 3: Hep-Org 3 및 Chol-Org 3은 또한 도 2i에서 나타난다.
도 11 - 단일 세포 시컨싱에 의한 Hep-Orgs 및 Chol-Orgs의 유전자 발현 분석
(A) 지시된 간 마커 (Afp, Ahsg, Fgg 및 Gc)의 발현 수준에 대하여 색상-코딩된 세포의 t-SNE 플롯 (B), 담관세포 마커 (Epcam) (C), 및 세포 주기 마커 (mKi67 및 Mdm2). Hep-Orgs 및 Chol-Orgs의 조합된 데이터셋트. 발현은 정상화된 log2 값으로서 제공된다. (D-E) 간 마커 (Hp 및 Fgg)의 발현 수준에 대하여 색상-코딩된 세포의 t-SNE 플롯 (D), Hep-Org 데이터셋트에서 세포 주기 (Rps10) (E). 발현은 정상화된 log2 값으로서 제공된다. (F) PHx 후 간세포 대 손상되지 않은 PHHs 사이 차등적으로 발현된 유전자를 보여주는 화산 플롯. 모든 점은 유전자를 표시한다. 적색 점은 ≥2 또는 ≤2 배수 변화 그리고 p-값 <0.05를 가진 유의도를 보여주는 유전자를 강조한다.
도 12 - 인간 Hep-Orgs의 확립, 유지 및 특성규명
(A) 태아-Heps (최상부)로부터 또는 PHHs (최하부)로부터 Hep-Org 개시에 필요한 핵심 성분. 주요 성분 (EGF, FGF, R-스폰딘 CM, CHIR, A83-01, HGF) 중 하나는 Hep-배지로부터 취소되었거나 Chol-배지는 비교하는데 사용되었다. 간세포는 상이한 조건에서 배양되었다. 데이터는 평균 SEM으로서 표시된다.
(B) P24에서 2개 확립된 태아-Orgs의 성장을 위한 핵심 성분, 코딩은 도 5j에 상응한다. Hep-배지의 주요 성분 중 하나는 Hep-배지로부터 취소되었거나 Chol-배지는 Hep-Org 성장 유지하다 에서 Hep-배지와 비교되었다. 데이터는 평균 SEM으로서 표시된다.
인간 태아-Heps로부터 배양된 태아-Orgs의 파라핀 섹션의 (C) PAS 염색 및 (D) β-카테닌 (막 라벨링) (스케일 바=25μm).
(E) 인간 Chol-Orgs의 F-액틴 염색 (단일 공초점 평면).
(F) 태아-Orgs의 CYP2E1 염색 (단일 공초점 평면).
(G) Hep-Orgs가 아닌, Chol-Orgs에서 로다민 123 염료의 흡수의 대표적 이미지.
(H) 배양된 PHHs (백색), PHH-Orgs (백색 줄무늬), 태아-Heps (회색), 태아-Org (회색 줄무늬) 및 분화된 Chol-Orgs (흑색)의 상청액에서 측정된 A1AT 분비. 결과는 백만개 세포당 일당 알부민의 마이크로그램으로 표시된다. 데이터는 평균 ±SEM으로 표시된다.
(I) 배양된 PHHs (백색), PHH-Orgs (백색 줄무늬), 태아-Heps (회색), 태아-Org (회색 줄무늬) 및 분화된 Chol-Orgs (흑색)의 상청액에서 측정된 AFP 분비. '후기'는 1개 웰로부터 P22이다. 모든 코딩은 도 5j 및 도 12h에 상응한다. 데이터는 평균 ±SEM으로서 표시된다.
도 13 - Hep-Orgs, Chol-Orgs 및 PHHs의 전사적 비교
(A) PHHs, PHH -Orgs, 태아-Heps, 태아-Orgs 및 분화된 Chol-Orgs에서 핵심 간 유전자 발현의 히트맵.
(B) PHHs, PHH -Orgs, 태아-Heps, 태아-Orgs 및 분화된 Chol-Orgs에서 전구체, 담관세포 및 세포 주기-관련된 유전자의 발현의 히트맵.
(C) 주성분 분석 (PCA) 분석은 인간 간세포 (PHHs 및 태아-Orgs)로 Hep-Orgs (PHH-Orgs 및 태아-Orgs)의 전사체적 프로파일의 클러스터링을 보여준다.
(D) - (F) 간세포 마커 AFP, RBP4, APOA2 및 MT1G (D), COL1A2 및 FSTL1 (E), 세포 주기 관련된 유전자 PCNA 및 MKI67 (F)에 대한 발현 수준으로 색상 코딩된 세포의 t-SNE 플롯. 발현은 정상화된 log2 값으로서 제공된다.
도 14 - PHHs와 비교된 인간 Hep-Orgs에 의한 생착화 및 재증식
(A) AFP 발현은 분화된 태아-Orgs에서 감소되었다. 비교는 PHHs 및 PHH-Orgs로 분화 전 또는 후, 상이한 계대의 태아-Orgs 사이에서 실시되었다.
(B) 인간 태아-Orgs의 이식 90 일 후 정량화된 이식편 결절 횡단면.
(C) 이식 90 일 후 이식된 FNRG 마우스의 간 섹션의 인간 ALB, hKRT, KRT19 및 DAPI 면역형광성 염색.
(D) PHHs, 동일한 공여체에서 유래된 PHH-Orgs, 태아-Heps, 및 동일한 공여체로부터 (30 및 90 일 동안 이후) 태아-Orgs의 이식 30 일 후 이식편의 비교.
발명의 상세한 설명
발명의 방법
일부 구현예에 따르면, (본원에서 "본 발명의 방법"으로서 또한 지칭된) 시험관내 일차 간세포의 확장 방법이 본원에서 제공되고, 여기서 상기 방법은 본 발명의 간세포 배양 배지에서 일차 간세포를 배양하는 단계를 포함한다. 숙련된 사람에 명백할 바와 같이, 일차 간세포를 확장하기 위한 본 발명의 방법은, 필요한 변경을 가하여, 본 발명의 방법에 의해 생성된 간세포 오르가노이드 및/또는 세포를 확장시키는데 추가로 사용될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 시험관내 일차 간세포의 확장 방법이고, 여기서 상기 방법은 본 발명의 간세포 배양 배지에서 일차 간세포를 배양하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 시험관내 일차 간세포의 확장 방법이고, 여기서 상기 방법은 간세포 배양 배지에서 일차 간세포를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 간세포 배양 배지는
i. FGF7, FGF10 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 임의로 선택된, 50 내지 500 ng/ml의 섬유아세포 성장 인자 (FGF);
ii. R-스폰딘 및 적어도 하나의 글리코겐 신타제 키나제 3 (GSK3) 억제제를 포함하는 Wnt 작용제;
iii. 5 내지 100 ng/ml의 표피 성장 인자 (EGF);
iv. 5 내지 100 ng/ml의 간세포 성장 인자 (HGF); 및
v. 액티빈 수용체-유사 키나제 ALK4, ALK5 및/또는 ALK7 신호전달의 억제제를 포함하는, 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 억제제를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은, 예를 들어, 본원에서 기재된 임의의 단리 방법을 사용하여, 간세포 배양 배지에서 일차 간세포를 배양시키는 단계에 앞서, 간으로부터 일차 간세포를 단리시키는 단계를 추가로 포함한다. 기타 단리 방법은 종래 기술에서 또한 공지된다. 다른 구현예에 따르면, 단리 단계는 필요하지 않고, 일차 간세포를 포함하는 태아 또는 성인 간으로부터 조직 외식편은 간세포 배양 배지에서 배양된다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은, 본원에서 정의된 바와 같이, 일차 간세포 또는 단리된 일차 간세포를 세포외 기질과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 일차 간세포를 배양시키기 위한 3차원 배양 방법이다.
본 발명의 간세포 배양 배지 (Hep-배지)
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는
i. FGF 또는 이의 유사체, 단편 또는 변이체;
ii. R스폰딘 또는 이의 유사체, 단편 또는 변이체, 및 글리코겐 신타제 키나제 3 (GSK3) 억제제를 포함하는 Wnt 작용제;
iii. 표피 성장 인자 (EGF) 또는 이의 유사체, 단편 또는 변이체;
iv. 간세포 성장 인자 (HGF) 또는 이의 유사체, 단편 또는 변이체; 및
v. ALK4, ALK5 및/또는 ALK7 신호전달의 억제제를 포함하는, 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 억제제를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는
i. 바람직하게는 FGF7 및 FGF10으로부터 선택된, 50 내지 500 ng/ml의 FGF;
ii. 5-50% (vol/vol) R-스폰딘 조건화된 배지 및 적어도 하나의 글리코겐 신타제 키나제 3 (GSK3) 억제제, 임의로 CHIR99021을 포함하는 Wnt 작용제;
iii. 5 내지 100 ng/ml의 표피 성장 인자 (EGF);
iv. 5 내지 100 ng/ml의 간세포 성장 인자 (HGF); 및
v. ALK4, ALK5 및/또는 ALK7 신호전달의 억제제, 임의로 A83-01를 포함하는, 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 억제제를 포함한다.
일부 구현예에서, 간세포 배양 배지는 TGFa를 추가로 포함한다. 이것은 인간 간세포 배양에 특히 유리하다.
일부 구현예에서, 간세포 배양 배지는 가스트린, 니코틴아미드, ROCK 억제제, B27 (임의로 비타민 A 없음) 및 N-아세틸시스테인 중 하나 이상 또는 모두를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 간세포 배양 배지는, 임의로 헤페스 (예를 들면 10mM) 및/또는 글루타멕스 보충제 (Gibco)를 추가로 포함하는, 임의로 항생제 예컨대 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는, 세포 성장 배지, 예컨대, 비제한적으로, AdDMEM/F12 (Invitrogen제)를 추가로 포함한다 추가로 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는
약 100ng/ml FGF7;
약 100ng/ml FGF10;
약 20ng/ml TGFa;
약 50ng/ml EGF;
약 50ng/ml HGF;
B27 (비타민 A 포함하지 않음);
약 2 μM A83-01;
약 10μM Y-27632;
약 3μm CHIR99021;
약 10 mM 니코틴아미드;
약 10 nM 가스트린;
약 1.25mM N-아세틸시스테인; 및
약 15% R-스폰딘 조건화된 배지를 포함하고, 임의로 여기서 상기 간세포 배양 배지는, 임의로 헤페스 (예를 들면 10mM) 및/또는 글루타멕스 보충제 (Gibco)를 추가로 포함하는, 임의로 항생제 예컨대 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는, 세포 성장 배지, 예컨대, 비제한적으로, AdDMEM/F12 (Invitrogen제)를 추가로 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지에서 성분의 농도는 본 발명의 방법에 따라 일차 간세포의 확장을 가능하게 하고, 임의로 확장된 세포에서 일차 간세포의 핵심 형태학적, 기능적 및 유전자 발현 속성의 유지를 추가로 가능하게 한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 표 2에서 기재된 Hep-배지를 포함하고, 여기서 상기 Hep-배지(인간) 배지는 인간 성인 또는 태아 간세포를 확장시키는데 적당하고, 반면에 Hep-배지(마우스) 배지는 쥣과 간세포를 확장시키는데 적당하다.
표 2 - 담관세포 (및 Chol-orgs)의 확장/분화에 대하여 상응하는 배지와 비교해서, 본 발명의 일부 구현예에 따른 인간 태아 간세포를 위한 분화 배지 그리고 마우스/인간 간세포를 위한 간세포 배양 배지
Figure pct00001
본 발명의 방법에서 사용되는 세포 배양 배지는, 본원에서 제공된 제한을 받는, 임의의 적당한 기초 배지를 포함한다. 세포 배양을 위한 기초 배지는 전형적으로, 다수의 원료를 함유하고, 이들은 배양된 세포의 유지를 지원하는데 필요하다. 원료의 적당한 조합은, 하기 개시내용을 고려하여, 숙련된 사람에 의해 용이하게 제형화될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 기초 배지는, 문헌 및 아래에서 더욱 상세히 기재된 바와 같이, 표준 세포 배양 원료, 예컨대 아미노산, 비타민, 지질 보충물, 무기 염, 탄소 에너지 공급원, 및 완충액을 포함하는 양액을 일반적으로 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 배양 배지는, 예를 들어 아미노산, 비타민, 지질 보충물, 무기 염, 탄소 에너지 공급원, 및 완충액으로부터 선택된 하나 이상의 표준 세포 배양 원료로 추가 보충된다.
숙련된 사람은 본 발명의 세포 배양 배지에서 기초 배지로서 사용될 수 있는 배양 배지의 유형을 일반 상식으로부터 이해할 것이다. 잠재적으로 적당한 세포 배양 배지는 상업적으로 이용가능하고, 비제한적으로, 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 최소 필수 배지 (MEM), 녹아웃-DMEM (KO-DMEM), 글라스고 최소 필수 배지 (G-MEM), 기초 배지 이글 (BME), DMEM/Ham's F12, 고급 DMEM/Ham's F12, 이스코브 변형 둘베코 배지 및 최소 필수 배지 (MEM), Ham's F-10, Ham's F-12, 배지 199, 및 RPMI 1640 배지를 포함한다. 바람직하게는, 기초 배지는 고급-DMEM/F12이다.
기초 배지는 페니실린/스트렙토마이신 (예를 들면 1%), GlutaMAX (예를 들면 1%), HEPES (예를 들면 10 mM), B27 보충제 (1:50, 바람직하게는 Hep-배지에서 비타민 A 없음)로, 그리고 임의로 N2 보충제 (1:100)로 보충될 수 있다. 바람직하게는, N2 보충제는 Hep-배지로부터 배제된다.
상기 세포 배양 배지가 정제된, 천연, 반-합성 및/또는 합성 성장 인자로 보충되고 정의되지 않은 성분 예컨대 태아 소 혈청 또는 태아 송아지 혈청을 포함하지 않는 것이 더욱 바람직하다. 다양한 상이한 혈청 대체 제형은 상업적으로 이용가능하고 숙련된 사람에게 공지된다. 혈청 대체가 사용되는 경우, 종래의 기법에 따라, 배지의 부피 기준으로 약 1% 내지 약 30%에서 사용될 수 있다.
숙련된 독자에게 명백할 바와 같이, 본 발명의 바람직한 배양 방법은 피더 세포가 필요없기 때문에 유리하다. 피더 세포 층은 줄기 세포의 배양을 지원하는데, 그리고 그들의 분화를 억제시키는데 종종 사용된다. 피더 세포 층은 일반적으로, 관심의 세포와, 공-배양되는, 그리고 세포의 성장에 적당한 표면을 제공하는 세포의 단층이다. 피더 세포 층은 관심의 세포가 성장할 수 있는 환경을 제공한다. 피더 세포는 (예를 들면 연구 또는 미토마이신 C를 이용한 처리에 의해) 종종 유사분열로 불활성화되어 그들의 증식을 방지한다. 피더 세포의 사용이 바람직하지 않은 것은, 세포의 계대하기를 복잡하게 만들기 때문이다 (세포는 각 계대에 피더 세포로부터 분리되어야 하고, 새로운 피더 세포는 각 계대에 필요하다). 피더 세포의 사용은 또한 원하는 세포의 피더 세포로의 오염을 초래할 수 있다. 이것은 임의의 의학적 응용에 대하여 명백하게 문제적이고, 심지어 연구 맥락에서, 세포에 관해서 수행된 임의의 실험의 결과의 분석을 복잡하게 만든다. 본원에서 다른 곳에 언급된 바와 같이, 본 발명의 배양 배지가 특히 유리한 것은 이들이 피더 세포 접촉 없이 세포를 배양하는데 사용될 수 있기 때문이다, 즉 본 발명의 방법은 성장이 후원중인 세포를 지원하기 위해 피더 세포의 층이 필요 없다.
따라서, 본 발명의 조성물은 피더 세포 없는 조성물일 수 있다. 조성물에서 세포가 피더 세포 층의 부재 하에서 적어도 하나의 계대 동안 배양되었다면 조성물은 피더 세포 없는 것으로 관례적으로 간주된다. 본 발명의 피더 세포 없는 조성물은 (조성물에서 세포의 총수의 %로서 표현된) 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만 피더 세포를 정상적으로 함유할 것이거나 바람직하게는 피더 세포를 전혀 함유하지 않을 것이다.
본 발명에서 사용된 배양 배지는, 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이, 혈청을 포함할 수 있거나, 무혈청 및/또는 혈청-대체 없음일 수 있다. 배양 배지 및 세포 제조는 생물학 제품을 위하여 FDA에 의해 요구된 표준에 따라 그리고 제품 일관성을 보장하기 위해 바람직하게는 GMP 공정이다.
본 발명의 배양 배지는 탈이온, 증류 수에서 정상적으로 제형화될 것이다. 본 발명의 배양 배지는 전형적으로, 예를 들면 자외선, 가열, 연구 또는 여과에 의해 오염을 방지하기 위한 사용에 앞서 멸균될 것이다. 배양 배지는 저장 또는 수송을 위하여 (예를 들면 -20℃ 또는 -80℃에서) 냉동될 수 있다. 배지는 오염을 방지하기 위해 하나 이상의 항생제를 함유할 수 있다. 배지는 ml당 0.1 미만 내독소 단위의 내독소 함량을 가질 수 있거나, ml당 0.05 미만 내독소 단위의 내독소 함량을 가질 수 있다. 배양 배지의 내독소 함량의 결정 방법은 종래 기술에서 공지된다.
바람직한 세포 배양 배지는 탄산염-기반된 완충액으로 7.4의 pH에서 (바람직하게는 pH 7. 2 - 7.6 또는 적어도 7.2 내지 7.6 이하로) 완충되는 정의된 합성 배지이고, 반면 세포는 5 % 내지 10% CO2, 또는 적어도 5% 10% CO2 이하, 바람직하게는 5 % CO2를 포함하는 대기에서 배양된다.
본 발명은 또한 상기 기재된 본 발명의 양태 중 어느 하나에 따른 세포 및/또는 오르가노이드를 포함하는 조성물 또는 세포 배양 용기, 그리고 상기 기재된 본 발명의 양태 중 어느 한 하나에 따른 배양 배지를 제공한다. 예를 들어, 그와 같은 조성물 또는 세포 배양 용기는, 상기 기재된 바와 같이 배양 배지에서, 본 발명의 방법에 따라 배양된 임의의 수의 세포 또는 오르가노이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 더욱 추가 양태에 따르면, 본 발명의 배양 배지를 함유하는 밀폐된 용기가 제공된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 확장 배지이다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 분화 배지이다. 밀폐된 용기는, 오염을 방지하기 위해, 배양 배지의 수송 또는 저장에 바람직할 수 있다. 용기는 임의의 적당한 용기, 예컨대 플라스크, 병, 단지, 바이알 또는 백일 수 있다.
본 발명의 간세포 오르가노이드
일부 구현예에 따르면, Hep-orgs는 인간 태아 간세포 또는 성인 일차 인간 간세포 (PHHs)로부터 생성된다. 일부 구현예에 따르면, 태아 간세포는 임신 5-30 주, 임의로 임신 8-25 주, 바람직하게는 임신 11-20 주의 인간 간 출신이다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 확장된 Hep-orgs는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 계대 동안 확장될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 확장된 Hep-orgs는 적어도 16 계대 동안 확장될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 확장된 Hep-orgs는 배양중 적어도 6, 12, 18, 24 개월 동안 확장될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 확장된 태아 간 세포에서 기원하는 Hep-orgs는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 계대 동안 확장될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 따른 확장된 태아 간 세포 Hep-orgs는 적어도 16 계대 동안 확장될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 따른 태아 간 세포로부터 확장된 Hep-orgs는 배양중 적어도 6, 12, 18, 24 개월 동안 확장될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 따른 성인 일차 인간 간세포로부터 확장된 Hep-orgs는 배양중 적어도 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 개월 동안 확장될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, Hep-orgs는 간세포 형태학의 내강 및 큰 세포를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, Hep-orgs는 Chol-orgs보다 더 큰 세포 직경을 갖는다. 일부 구현예에 따르면, 인간 Hep-Orgs의 세포는 Chol-Orgs의 것들보다 더 큰 세포 직경, 및 더 적은 핵/세포질 비를 갖는다. 일부 구현예에 따르면, 세포 직경/핵 직경 비는 태아 간 세포로부터 Hep-Orgs에 대하여 30.08±8.17μm/14.07±1.59 μm, PPH로부터 Hep-Orgs에 대하여 7.54±6.50 μm/11.69±1.64μm 그리고 Chol-Orgs의 세포에 대하여 10.42±2.78/7.22±1.55μm이다. 일부 구현예에서, Hep-Orgs는 적어도 15 μm, 적어도 20 μm 또는 적어도 25 μm의 세포 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, Hep-Orgs는 적어도 5 μm, 적어도 10 μm 또는 적어도 15 μm의 핵 직경을 갖는다.
일부 구현예에 따르면, (본원에서 태아-orgs로서 또한 지칭된) 태아 간 세포에서 기원하는 인간 Hep-orgs는 Alb 및 HNF4A를 발현시킨다. 일부 구현예에 따르면, 태아 간 세포에서 기원하는 인간 Hep-orgs는 Alb, HNF4A 및 CYP2E1을 발현시킨다.
일부 구현예에 따르면, Hep-orgs는 담 세관을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, Hep-orgs는 저밀도 리포단백질의 기능적 흡수를 적극적으로 입증한다. 일부 구현예에 따르면, Hep-orgs는 글리코겐 축적을 입증한다. 일부 구현예에 따르면, 태아-orgs는 담 세관을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 태아-orgs는 저밀도 리포단백질의 기능적 흡수를 적극적으로 입증한다. 일부 구현예에 따르면, 태아-orgs는 글리코겐 축적을 입증한다.
일부 구현예에 따르면, Hep-orgs는 알부민을 분비시킨다. 일부 구현예에 따르면, Hep-orgs는 일차 인간 간세포에 비교가능한 양으로 알부민을 분비한다.
일부 구현예에 따르면, Hep-orgs는 A1AT를 분비한다. 일부 구현예에 따르면, Hep-orgs는 일차 인간 간세포에 의해 생산된 수준의 25%-50%에서 A1AT를 분비한다.
일부 구현예에 따르면, Hep-orgs는 Afp를 분비한다. 일부 구현예에 따르면, Hep-orgs에 의한 Afp 분비는 경시적으로 감소한다. 일부 구현예에 따르면, PHH-orgs는 Afp를 재-발현시킨다.
일부 구현예에 따르면, 태아-orgs는 일차 인간 간세포의 것보다 2-8 더 낮은 CYP3A4 활성도를 입증한다. 다른 구현예에 따르면, 일차 인간 간세포에서 유래된 Hep-orgs는 일차 인간 간세포의 것보다 더 높은 CYP3A4 활성도를 입증한다.
일부 구현예에 따르면, 하기 그룹으로부터 선택된 유전자의 발현은 (양쪽 태아 및 성인 기원으로부터) Hep-orgs에서 그리고 일차 인간 간세포에서 비교가능하다: Alb, APOA2, SERPINA1 또는 이들의 조합.
일부 구현예에 따르면, 기능적 간세포 유전자, 예컨대, 비제한적으로, 시토크롬 P450 활성도, 글리코겐/지질 대사 및/또는 요소 회로에 관련된 유전자의 발현은 태아 또는 성인 기원으로부터 Hep-orgs 그리고 태아 간세포 또는 성인 일차 인간 간세포, 각각에서 비교가능하다.
일부 구현예에 따르면, 태아-orgs 및/또는 PHH-orgs는 하기 세포 유형 중 적어도 하나를 포함한다:
알부민, SERPINA1 및 ASGR1의 고 발현을 입증하는, 가능하게는 추가로 AFP, MT1, APOA, RBP4 및 FABP1을 발현시키는 간세포;
중간엽 마커 예컨대 COL1A2 및 FSTL1을 발현시키는, 가능하게는 추가로 DCN, VIM, FGFR 및 TGFBI를 발현시키는 세포;
임의로 미토콘드리아성 유전자 mRNA에서 풍부한, 간 전구 마커 예컨대 CD24, IL32 및 MMP7을 발현시키는 세포;
또는 이들의 조합.
일부 구현예에 따르면, Hep-orgs는 손상된 간 조직을 외식편화 및 재증식할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, Hep-orgs는 이식 후 상당한 이식편 확장을 입증한다.
일부 구현예에 따르면, Hep-orgs는 태아 간세포 마커 유전자 Afp, Alb, Hnf4a, Cyp1a2 및 Cyp3a11을 발현시킨다. 일부 구현예에 따르면, Hep-orgs는 (예를 들어 도 2c에서 보여진 바와 같이) 일차 간세포보다 상당히 더 높은 수준에서 태아 간세포 마커 Cyp3a11을 발현시킨다. 일부 구현예에 따르면, Hep-orgs는 (예를 들어 도 2c에서 보여진 바와 같이) 일차 간세포보다 상당히 더 낮은 수준에서 태아 간세포 마커 Cyp1a2 및 Alb를 발현시킨다. 일부 구현예에 따르면, Hep-orgs에서 시토크롬 Cyp1a2 활성도는 (예를 들어 도 2h 보여진 바와 같이) 일차 간세포에서보다 최고 3-배 더 낮다.
간세포 오르가노이드 (Hep-orgs) 대 담관세포 오르가노이드 (Chol-orgs)
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 오르가노이드는 하기 특성 중 적어도 하나에 의해 (본원에서 "Chol-orgs"로서 또한 지칭된) 담관세포에서 기원하는 오르가노이드와 구분된다: Hep-orgs는 담관세포에서 전형적으로 발현된 마커 유전자를 발현시키지 않고, Hep-orgs는 담관세포에서 전형적으로 발현되지 않는 유전자를 발현시키고, Hep-orgs의 조밀한 세포 덩어리 (또는 "포도 송이") 형태학은 Chol-orgs의 큰 내강 구조와 구분되고, Hep-orgs의 세포는 Chol-orgs의 세포의 담관세포 형태학과 비교해서 간세포 유사 형태학을 입증하고, 확장하는 Chol-orgs는 알부민을 Hep-orgs보다 상당히 더 적게 (약 1000 배 더 적게) 분비하고, Hep-org 세포는 Chol-org 세포보다 더 큰 세포 직경을 갖고, Hep-org 세포는 그 Chol-org 세포, 또는 이들의 조합 더 낮은 핵/세포질 배급을 갖는다.
일부 구현예에 따르면, Hep-orgs는 담관세포 기능을 입증하지 않는다. 예를 들어, Hep-orgs는 담관세포 표면 당단백질 MDR1 (다제 내성 단백질 1)의 기질을 그들의 내강에 적극적으로 수송할 수 없다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 오르가노이드는 표 1에서 개시된 바와 같이 적어도 하나의 특성만큼, 임의로 표 1에서 개시된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 모든 특성만큼 Chol-orgs와 구분된다.
표 1 - 본 발명의 Hep-orgs와 일부 구현예에 따른 Chol-orgs 사이의 차이
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본 발명의 조성물
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 배양 배지 및 간 조직 외식편을 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 배양 배지 및 하나 이상의 일차 간세포를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 배양 배지 및 하나 이상의 확장된 간세포를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 배양 배지 및 간세포 오르가노이드를 포함하는 조성물이 제공된다. 본 발명의 임의의 조성물은 본원에서 기재된 바와 같이 세포외 기질을 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 기재된 바와 같이 본 발명의 배양 배지 및 세포외 기질을 포함하는 조성물이 또한 제공된다.
본 발명은 또한 본원에서 개시된 바와 같이 배양 배지를 생산하는데 사용될 수 있는 배양 배지 보충제를 제공한다. '배양 배지 보충제'는 줄기 세포를 자체 지원할 수 없는, 하지만 기타 세포 배양 원료와 조합된 경우 줄기 세포 배양을 가능하게 하거나 개선하는 원료의 혼합물이다. 보충제는 그러므로 적합한 배지 제형을 생산하기 위해 기타 세포 배양 원료와 그것을 조합함으로써 본 발명의 기능적 세포 배양 배지를 생산하는데 사용될 수 있다. 배양 배지 보충물의 용도는 종래 기술에서 널리 공지된다.
본 발명의 약학적 조성물
일부 구현예에 따르면, 본 발명은 본원에서 기재된 바와 같이 임의의 배양 배지의 성분 및 약학적으로 허용가능한 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득된 하나 이상의 확장된 간세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득된 하나 이상의 간세포 오르가노이드를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득된 오르가노이드로부터 하나 이상의 간세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 치료가 필요한 환자에게 투여에 적당하도록 제형화될 수 있다. 약학적 조성물은 스캐폴드를 추가로 포함할 수 있다. 세포성 이식 요법에 대하여 적당한 스캐폴드의 예는 종래 기술에서 널리 공지된다. 스캐폴드는 2차원 또는 3차원 네트워크를 제공한다. 그와 같은 스캐폴드에 대하여 적당한 합성 재료는 다공성 고체, 나노섬유, 및 하이드로겔로부터 선택된 폴리머 예컨대, 예를 들어, 자가-조립 펩타이드를 포함하는 펩타이드, 폴리에틸렌 글리콜 포스페이트, 폴리에틸렌 글리콜 푸마레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리하이드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리셀룰로스 아세테이트, 및/또는 이들의 공중합체로 구성된 하이드로겔을 포함한다 (예를 들어, Saha 등, 2007. Curr Opin Chem Biol. 11(4): 381-387; Saha 등, 2008. Biophysical Journal 95: 4426-4438; Little 등, 2008. Chem. Rev 108, 1787-1796 참고).
세포외 기질 (ECM)
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 확장될 일차 간세포 및/또는 간세포 오르가노이드를 (본원에서 "ECM"으로도 지칭된) 세포외 기질과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. ECM은 바람직하게는 외인성 ECM이다. 일부 구현예에서 세포외 기질은 3차원 ("3D ECM")이다. 다른 구현예에서, 세포외 기질이 배양 배지와 현탁되는 것으로 고려된다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 배양중 일차 간세포 및/또는 간세포 오르가노이드를 확장시키는 방법으로, 본 발명의 간세포 배양 배지의 존재 하에서 ECM과 접촉하여 일차 간세포 및/또는 간세포 오르가노이드를 배양시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 확장될 일차 간세포 및/또는 간세포 오르가노이드는 본 발명의 배양 배지로 인큐베이션에 앞서 ECM과 접촉된다. 일부 구현예에 따르면, ECM은 본 발명의 간세포 배양 배지를 포함한다.
"접촉중"은 물리적 또는 기계적 또는 화학적 접촉을 의미하고, 이는 상기 생성된 오르가노이드 또는 세포의 모집단을 상기 세포외 기질에서 분리시키기 위해 힘이 사용되어야 하는 것을 의미한다. 일부 구현예에 따르면, 접촉시키는 단계는 3D ECM에서 세포를 내장하는 단계 및/또는 3D ECM의 최상부에 세포를 씨딩하는 단계를 지칭한다. 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 확장될 일차 간세포 및/또는 간세포 오르가노이드는 비-고체 3D ECM 내에서 내장되고, 이어서 본 발명의 간세포 배양 배지에서 3D ECM 및 세포를 배양시킨다. 바람직한 구현예에 따르면, 일차 간세포 및/또는 간세포 오르가노이드는 3D ECM에서 내장된다. 본 발명의 간세포 배양 배지는 세포외 기질 (ECM)에 확산될 수 있다.
임의의 적당한 세포외 기질은 본 발명의 방법으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명에 따라 사용된 ECM은 천연 발생 ECM, 천연 발생 ECM을 모방하는 상업적 ECM 및/또는 합성 ECM일 수 있다. 천연 발생 ECM은 결합 조직 세포에 의해 분비되고 다양한 폴리사카라이드, 물, 엘라스틴, 및 당단백질로 구성될 수 있고, 여기서 당단백질은, 예를 들어, 콜라겐, 엔탁틴 (니도겐), 피브로넥틴, 및 라미닌을 포함할 수 있다. 상이한 유형의 당단백질 및/또는 당단백질의 상이한 조합을 포함하는 상이한 조성물을 포함하는, 상이한 유형의 천연 발생 ECM이 공지된다. 상기 ECM은, 예를 들어, ECM-생산 세포를 배양시킴으로써 제공될 수 있다. 대안적으로, 천연 발생 ECM을 모방하는 ECM은 상업적으로 제공될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 세포외 기질의 예는 세포외 기질 단백질 (Invitrogen), Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 마우스 육종 세포 (예를 들면 MatrigelTM (BD Biosciences)) 및 Basement Membrane Extract (예를 들면 Cultrex BMETM, R&D systems)로부터 기저막 제제이다. 대안적으로, 합성 세포외 기질 재료, 예컨대 ProNectin (Sigma Z378666)은 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 ECM의 예는 적어도 하나의 당단백질, 예컨대 라미닌을 포함한다. 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 임의적 ECM은 적어도 2개의 뚜렷한 당단백질, 예컨대 2개 상이한 유형의 콜라겐 또는 콜라겐 및 라미닌을 포함한다. 추가 임의적 ECM은 라미닌, 엔탁틴, 및 콜라겐 IV를 포함한다. 추가 바람직한 ECM은 MatrigelTM (BD Biosciences)에 의해 제공되며, 이는 라미닌, 엔탁틴, 및 콜라겐 IV를 포함한다. 일부 구현예에서 세포외 기질은 라미닌-함유 세포외 기질 예컨대 MatrigelTM (BD Biosciences)이다.
일부 구현예에서, 간세포 배양 배지는 ECM의 최상부에 배치된다. 배양 배지는 그 다음 필요에 따라 제거 및 보급될 수 있다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 일마다 보급된다. 성분이 배지로부터 "첨가"되거나 "제거"되면, 이것은 일부 구현예에서 배지 자체가 ECM으로부터 제거되고 그 다음 "첨가된" 성분을 함유하는 또는 배제된 "제거된" 성분과 새로운 배지가 ECM상에 배치되는 것을 의미할 수 있다. 일부 구현예에서 본 발명의 간세포 배양 배지는 세포외 기질과 접촉한다.
본 발명의 방법은 배양 방법을 사용하여 수득된 오르가노이드를 계대하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 1 주령 내지 10 일령 오르가노이드는 세포외 기질로부터 제거되고 작은 단편으로 기계적으로 해리되고 그 다음 신선한 세포외 기질로 이동된다. 숙련된 사람은 이들이 그들의 컨테이너에 대하여 농도 한계 초과 없이 증대할 수 있도록 오르가노이드를 계대시키기 위해 오르가노이드를 분할하는 방법을 알 것이다. 일부 구현예에서, 계대하는 단계는 적어도 2 개월, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 24 개월 또는 초과 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 계대하는 단계는 적어도 2 개월 동안, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 24 개월 또는 초과 동안 주당 1회 1:4 내지 1:8 분할 비로 수행된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 오르가노이드를 6 회 초과, 예를 들면 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30 회 초과 계대하는 단계를 포함한다. 계대하는 간격은 필요시 적응될 수 있다. 적당한 예는 주당 2회, 주당 1회, 10 일마다 1회, 2 주마다 1회, 예를 들어 7-10 일마다 1회이다. 배양 배지의 분할은 필요시 적응될 수 있다. 적당한 예는 1:3-1:10 희석, 예를 들면 1:3-1:9, 1:4-1:8, 1:4-1:6 희석이다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지는 적어도 42, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 365 일의 배양 동안 세포의 생존 및/또는 증식을 유도 또는 촉진시킨다. 증식은 종래 기술에서 공지된 기법 예컨대 BrdU 염색, Edu 염색, Ki67 염색을 사용하여 사정될 수 있고 성장 곡선 검정의 사용은 실시될 수 있다.
일차 간세포의 단리
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 확장될 일차 간세포를 단리시키는 단계를 포함한다. 일차 간세포 세포는 임의의 적당한 방법에 의해 수득될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 일차 간세포는 생검으로부터 또는 조직 단편으로부터 단리된다.
일부 구현예에서, 일차 간세포는, 예를 들어, 실시예에서 그리고 Dorell 등, 2008 (Hepatology. 2008 Oct;48(4):1282-91. 쥣과 난형 세포 반응을 위한 표면 마커. Dorrell C, Erker L, Lanxon-Cookson KM, Abraham SL, Victoroff T, Ro S, Canaday PS, Streeter PR, Grompe M)에서 기재된 바와 같이 콜라게나제 소화에 의해 단리된다. 일부 구현예에서, 콜라게나제 소화는 조직 생검으로 수행된다. 일부 구현예에서, 콜라게나제 및 아큐타제 소화는 본 발명에서 사용을 위하여 상피 줄기 세포를 수득하는데 사용된다.
일부 구현예에서, 확장될 출발하는 일차 간세포는 단일 세포이다. 일차 간세포를 포함하는 단일 세포 현탁액은 기계적 파괴에 의해 기계적으로 생성될 수 있다. 대안적으로, 일차 간세포의 모집단은 출발점으로서 사용될 수 있다. 종래 기술에서 공지된 다수의 물리적 분리 방법 중 어느 하나는 본 발명의 세포를 선택하고 이들을 기타 세포 유형과 식별하는데 사용될 수 있다. 그러한 물리적 방법은 본 발명의 세포에 의해 특이적으로 발현된 메이커에 기반된 다양한 면역-친화성 방법 및 FACS를 관여시킬 수 있다.
추가 구현예에서, 본원에서 기재된 바와 같이 본 발명의 간세포 배양 배지에서 일차 간세포를 확장시키는 단계를 포함하는 간세포 오르가노이드의 수득 방법이 제공된다. 배양시키는 단계 이후, 본 방법은 하나 이상의 간세포 오르가노이드 또는 그것에서 유래된 세포를 수득 및/또는 단리시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
추가의 정의
살아있는 조직으로부터 직접적으로 채집된 세포, 즉 신선하게 단리된 세포는 일차 세포로서 또한 지칭된다. 따라서, 용어 "일차 간세포"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 비제한적으로, 인간 성인 간으로부터 간세포, 인간 태아로부터 간세포 또는 쥣과 간으로부터 간세포를 포함하는, 간 조직으로부터 단리된 간세포를 지칭한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법으로 사용될 인간 태아로부터 단리된 일차 간세포는 임신 5-30, 임의로 10-20 주차에 태아로부터 단리된다.
본 발명의 방법에 의해 확장될 일차 간세포는 종래 기술에서 공지된 임의의 적당한 방법에 의해 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용을 위하여 일차 간세포는 간 생검으로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 일차 간세포는, 예를 들어, 실시예에서 그리고 Dorell 등, 2008 (Hepatology. 2008 Oct;48(4):1282-91. 쥣과 난형 세포 반응을 위한 표면 마커. Dorrell C, Erker L, Lanxon-Cookson KM, Abraham SL, Victoroff T, Ro S, Canaday PS, Streeter PR, Grompe M)에서 기재된 바와 같이 콜라게나제 소화에 의해 단리된다. 일부 구현예에서, 콜라게나제 소화는 간 생검에서 수행된다. 일부 구현예에서, 콜라게나제 및 아큐타제 소화는 본 발명에서 사용을 위하여 일차 간세포를 수득하는데 사용된다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에서 사용을 위하여 일차 간세포는, 아래 본원에 실시예에서 기재된 바와 같이, 2단계 콜라게나제 관류를 사용하여 단리된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 일차 간세포 및 간세포 오르가노이드에 관련함에 따라 용어 "확장"은 세포의 증식을 지칭한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법이 시험관내 일차 간세포 및/또는 생성된 간세포 오르가노이드의 확장을 제공하는 반면, 본 발명의 간세포 오르가노이드는 생체내 대상체의 간에 이식된 경우 추가로 확장할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "배양" 및 "배양중"은 시험관내 배양에서 세포의 유지를 지칭한다. 숙련된 사람에게 공지된 바와 같이, 배양중 세포의 유지는 주기적으로 변화하는 성장 배지 (예컨대 본 발명의 간세포 배양 배지) 및/또는 상이한 성장 플레이트/플라스크/기질로의 이동을 포함할 수 있다.
용어 "표피 성장 인자" 및 "EGF"는 본원에서 사용된 바와 같이 호환적으로 사용되고 임의의 적당한 EGF, 예를 들어, EGF (Peprotech)를 지칭한다. EGF는 EGF의 활성 유사체, 단편 및 변이체를 또한 포함할 수 있다. "활성"은 EGF에 비해 비교가능한 또는 개선된 활성도로 EGF 수용체를 활성화시키는 것을 의미한다.
용어 "형질전환 성장 인자 알파", "TGF-알파" 및 TGFa"는 본원에서 호환적으로 사용되고, TGFa의 활성 유사체, 단편 및 변이체를 또한 포함할 수 있다. "활성"은 TGFa에 비해 비교가능한 또는 개선된 활성도로 EGF 수용체를 활성화시키는 것을 의미한다. TGFa는 EGFR 리간드 패밀리의 구성원이고 EGF 같이 EGFR을 결합시키지만, EGF와 비교하여 양적으로 및 질적으로 뚜렷한 세포성 반응을 생산한다. 본 발명가들은 본 발명의 간세포 배지에서 양쪽 EGF 및 TGFa를 포함하는 것이 유리하다는 것을 보여주었다.
용어 "섬유아세포 성장 인자" 및 "FGF"는 본원에서 사용된 바와 같이 호환적으로 사용되고 임의의 적당한 FGF, 예를 들어, FGF7 (예를 들면 Peprotech) 또는 FGF10 (예를 들면 Peptrotech)을 지칭한다. FGF는 FGF의 활성 유사체, 단편 및 변이체를 또한 포함할 수 있다. "활성"은 FGF에 비해 비교가능한 또는 개선된 활성도로 FGF 수용체를 활성화시키는 것을 의미한다. FGF7 및 FG10은 FGFR2 수용체에, 더욱 구체적으로, IIIb 아이소폼에 결합한다. 이러한 수용체에 결합하고 그러므로 FGF7 및/또는 FGF10에 대한 대안으로서 사용될 수 있는 기타 FGF는 FGF1, FGF3, 및 FGF22를 포함한다. 그러므로 일부 구현예에서, FGF는 FGF7, FGF10, FGF1, FGF3 및 FGF22, 및 이들의 활성 유사체, 단편 또는 변이체 중 하나 이상으로부터 선택된다.
용어 "간세포 성장 인자" 및 "HGF"는 본원에서 사용된 바와 같이 호환적으로 사용되고 임의의 적당한 HGF, 예를 들어, HGF (Peptrotech)를 지칭한다. HGF는 HGF의 활성 유사체, 단편 및 변이체를 또한 포함할 수 있다. "활성"은 HGF에 비해 비교가능한 또는 개선된 활성도로 HGF 수용체 (c-Met 종양유전자의 단백질 산물)를 활성화시키는 것을 의미한다.
Wnt 신호전달 경로는, 프리즐드(Frizzled) 수용체, LRP 및 LGR을 포함하는, 세포-표면 Wnt 수용체 복합체가 활성화되는 경우 발생하는 일련의 이벤트에 의해, 일반적으로 세포외 신호전달 분자, 예컨대 Wnt 패밀리의 구성원에 의해 정의된다. 이것은 세포내 β-카테닌을 분해하기 위해 악신(axin), GSK-3, 및 단백질 APC를 포함하는 단백질의 복합체를 억제시키는 흩어진 패밀리 단백질의 활성화를 초래한다. 생성된 농축 핵 β-카테닌은 TCF/LEF 패밀리 전사 인자에 의해 전사를 향상시킨다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Wnt 작용제"는 세포에서 전사 인자의 TCF/LEF 패밀리에 의해 매개된 전사를 활성화시키는 제제를 지칭한다. Wnt 작용제는 그러므로 (임의의 및 모든 Wnt 패밀리 단백질을 포함하는) Wnt 수용체 복합체, 세포내 β-카테닌 분해의 억제제, GSK-3 억제제 (예컨대 CHIR99021) 및 TCF/LEF의 활성화제를 결합 및 활성화시키는 진정한 Wnt 작용제로부터 선택된다. 일부 구현예에 따르면, GSK3 억제제는 "CHIR99021"이다. "CHIR99021"은 6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카보니트릴, CT9902; CAS Number 252917-06-9; PubChem 서브스턴스 ID 329825639.를 지칭한다
"R스폰딘"은 Lgr5에 결합하고 Wnt 신호전달을 향상시킨다. R스폰딘은 그러므로 Lgr5 작용제 및 Wnt 작용제이다. 임의의 적당한 R스폰딘은 본 발명의 간세포 배양 배지에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에 따르면 R스폰딘은 R스폰딘 1, R스폰딘 2, R스폰딘 3 및 R스폰딘 4 또는 이들의 활성 유사체, 단편 또는 변이체 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. "활성"은 R스폰딘 1에 비해 비교가능한 또는 개선된 활성도로 Lgr5를 통해 Wnt 신호전달을 향상시키는 것을 의미한다. 바람직한 구현예에 따르면, R스폰딘은 R스폰딘 1, R스폰딘 2, R스폰딘 3 또는 R스폰딘 4이다. 하나의 특정한 구현예에서, R스폰딘은 R스폰딘 1이다. R스폰딘은 R스폰딘 조건화된 배지의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 약 5% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 30% 또는 약 15%. 일부 구현예에서, R스폰딘 유사체, 단편 또는 변이체, 또는 Lgr5 항체는 R스폰딘 대신 사용될 수 있다. 예시는 그 분야에서 숙련된 사람에 의해 종래 기술에서 공지된다.
본원에서 사용된 바와 같이, (본원에서 "형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 억제제"의 "TGF-베타 신호전달의 억제제"로서 또한 지칭된) "TGF-베타 억제제"는 TGF-베타 경로의 활성도를 감소시키는 억제제이다. TGF-베타 수퍼패밀리 리간드는 뼈 형태형성 단백질 (BMP), 성장 및 분화 인자 (GDF), 항뮬러관 호르몬 (AMH), 액티빈, 결절 및 TGF-베타를 포함한다. 일반적으로, Smad2 및 Smad3은 TGF-베타/액티빈 경로에서 ALK4, 5 및 7 수용체에 의해 인산화된다. 대조로, Smad1, Smad5 및 Smad8은 뼈 형태형성 단백질 (BMP) 경로의 일부로서 인산화된다. 본 발명에 따른 TGF-베타 억제제는 TGF-베타 신호전달 경로, 바람직하게는 Smad2 및/또는 Smad3을 통해 작용하는 신호전달 경로, 더욱 바람직하게는 키나제 4, 5 및/또는 7 (ALK4, ALK5 및/또는 ALK7) 같은 액티빈 수용체를 통해 작용하는 신호전달 경로의 활성도를 감소시킨다. 일부 구현예에 따르면, 불과 1개의 TGF 베타 억제제가 간세포 배양 배지에서 존재하고, 여기서 1개의 억제제는 키나제 4, 5 및/또는 7 (ALK4, ALK5 및/또는 ALK7) 같은 액티빈 수용체의 억제제이다. 다른 구현예에서, 1개 초과, 예를 들면 2, 3, 4 또는 초과의 TGF 베타 억제제가 간세포 배양 배지에서 존재한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지 내에서 TGF-베타 억제제는 표 3에서 정의되는 하기 억제제로 이루어지는 군으로부터 선택된 소분자 억제제를 포함한다: A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, LY 364947, SD-208, SJN 2511 및 이들의 조합. 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 간세포 배양 배지 내에서 TGF-베타 억제제는 A83-01을, 임의로 약 2μM의 농도로 포함한다.
표 3: 일부 구현예에 따른 소분자 TGF-베타 억제제
Figure pct00003
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 N-아세틸시스테인을 추가로 포함하는 간세포 배지를 포함한다. "N-아세틸시스테인"은 HSCH2CH(NHCOCH3)CO2H (PubChem CID 12035)를 지칭하고, (예를 들면 Sigma A9165; PubChem Substance ID 24891402로부터) 배양 배지 보충제로서 상업적으로 이용가능하다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 cAMP 경로 활성화제를 포함하지 않는다. cAMP 경로 활성화제는, 예를 들어, 아데닐릴 시클라제 활성화제, 예컨대 포스콜린 또는 콜레라 독소를 포함하는, 세포에서 cAMP의 수준을 증가시키는 임의의 적당한 활성화제이다. 기타 예는 cAMP 유사체, 예를 들어 8-브로모-cAMP를 포함한다. cAMP 경로 활성화제의 추가 예는 NKH477 (예를 들면 카탈로그 번호 Tocris 1603)이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "알파-태아단백질", "Afp", "α-태아단백질", "알파-1-태아단백질", "알파-태아글로불린" 또는 "알파 태아 단백질"은 호환적으로 사용되고, 문맥에 따라, 이의 유전자 또는 단백질 산물을 지칭한다. 숙련된 사람에게 공지된 바와 같이, Afp는 발달 동안 태아 간에서 높은 정도로 전형적으로 발현된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "간 마커"는 Alb, Hnf4a, Hpx, Hp, Fgg Afp, Ahsg 및 Gc를 포함하지만 반드시 상기에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "부분적 간절제술" 및 "PHx"는 호환적으로 사용되고 간의 일부의 제거를 지칭한다.
일반
본 발명의 실시는, 달리 명시되지 않는 한, 업계의 기술 내에서, 화학, 생화학, 분자 생물학, 면역학 및 약리학의 통상적 방법을 이용할 것이다.
용어 "포함하는"은 "포괄하는" 뿐만 아니라 "이루어지는"을 포용하고 예를 들면 X를 "포함하는" 조성물은 배타적으로 X로 이루어질 수 있거나 추가의 것 예를 들면 X + Y를 포함할 수 있다.
용어 "약"은 숫자 값 x와 관련하여 임의적이고, 예를 들어, x +10%를 의미한다.
단어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않고 예를 들면 Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의로부터 생략될 수 있다.
구체적으로 언급하지 않는 한, 수많은 단계를 포함하는 공정 또는 방법은 본 방법의 시작 또는 끝에 추가의 단계를 포함할 수 있거나, 추가의 개입 단계를 포함할 수 있다. 또한, 단계는, 적절한 경우, 조합될 수 있거나, 생략될 수 있거나 대체 순서로 수행될 수 있다.
본 발명의 다양한 구현예는 본원에서 기재된다. 각 구현예에서 특정된 특성이 기타 특정된 특성과 조합되어, 추가 구현예를 제공할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 특히, 적당한, 전형적인 또는 바람직한 것으로서 본원에서 강조된 구현예는 (이들이 상호 배타적인 경우를 제외하고) 서로 조합될 수 있다.
실시예
실시예 1 - 방법
하기 방법은 본원에서 제공된 실시예 전체에서 사용된다.
마우스
모든 동물 실험은 AVD8010020151의 사업 면허 및 연구 프로토콜 HI16.10.05 및 HI16.1002가 있는 Animal Ethics Committee of the Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW)에 의해 기관 검토 후 수행되었다. 알부민- CreERT2 및 Axin2-CreERT2 마우스는 전에 기재되었다 (Schuler 등, 2004; van Amerongen 등, 2012). Rosa26-LSL-tdTomato 마우스는 알부민-CreERT2 또는 Axin2-CreERT2 마우스와 교배되었고 그들의 자손은 혈통 추적에 사용되었다. 생성 및 유전형분석 방법은 사전에 기재되었다 (Schuler 등, 2004; van Amerongen 등, 2012). 8-24 주령의 Cre 및 Rosa 대립유전자를 갖는 마우스는 25 g의 체중당 0.2mg 타목시펜 (Sigma, T548)의 단일 복강내 주사를 받았다. 마우스는 유도 후 5-7 일 후 수집되었다. 양쪽 숫컷 및 암컷 마우스는 사용되었다. PHx의 경우, 수술은 기재된 바와 같이 수행되었다 (Greene 및 Puder, 2003). 마우스는 PHx 2.5-3 일 후에 희생되었다 (Greene 및 Puder, 2003; Yokoyama 등, 1953). 인간 세포 이식의 경우, Fah-/- NOD Rag1-/- Il2rgnull (FNRG) 암컷 마우스는 록펠러 대학교에서 IACUC 프로토콜 15814에 따라 사용되었다.
세포주
293t-HA-Rspon1-Fc 세포는 사전에 기재된 바와 같이 사용되어 R-스폰딘1의 조건적 배지를 생성하였다. 세포는 가습된 5% CO2 대기에서 배양되었다. 상업적 인간 일차 간세포는 Thermo Scientific (HMCS10)으로부터 수득되었다.
환자 및 임상 표본
인간 태아 간은 Leiden University Medical Center의 Susana M. Chuva de Sousa Lopes로부터 수득되었다. 인간 간 생검은 University Medical Centre Utrecht Hospital 및 Rotterdam 및 University Medical Center에서 수술을 받는 환자로부터 수득되었다. 인간 저온보존된 태아 및 일차 인간 간세포는 Rockefeller University 및 Lonza Company 출신이었다. 연구를 위한 샘플의 사용은 윤리 위원회에 의해 승인되었고 정보제공된 동의는 적절한 경우 기증자로부터 수득되었다.
일차 마우스 간세포의 단리
간세포는 2단계 콜라게나제 관류에 의해 마우스로부터 단리되었다 (Li 등, 2010b). 간단히, 카테터를 문맥에 배치시킨 후, 하대 정맥은 절단되었고 간은 10 분 동안 사전-가온된 관류 배지로 5-7ml/분으로 관류되었다. 그 다음, 관류는 3-5 분 동안 5 ml/분으로 제 IV 형 콜라게나제 및 Ca2+를 포함하는 사전-가온된 소화 배지로 수행되었다. 해리 후, 세포는 70μm 필터를 통해서 여과되었다. 간세포는 추가로 분리되었고, 저속 (50g, 1-3분)으로 원심분리에 의해 정제되었고 퍼콜(Percoll) 기울기 원심분리는 전에 기재된 바와 같이 임의로 수행되었다 (Broutier 등, 2016; Huch 등, 2013).
간세포의 오르가노이드 배양
단리된 간세포는 70μm 필터에 의해 여과되었고, 차가운 AdDMEM/F12로 2회 세정되었고, 계수되었고 현탁 플레이트 (Greiner)에서 MatrigelR과 혼합되었다. 20,000-50,000 세포는 24 웰 플레이트의 웰당 사용되었다. MatrigelR이 고형화된 후, Hep-배지는 첨가되었다. Hep- 배지는 AdDMEM/F12 (Thermo Scientific, 헤페스, 글루타멕스 및 페니실린- 스트렙토마이신 있음 ) 더하기 15% RSPO1 조건화된 배지 (수제), B27 (비타민 A 제외), 50ng/ml EGF (Peprotech), 1.25mM N-아세틸시스테인 (Sigma), 10 nM 가스트린 (Sigma), 3μM CHIR99021 (Sigma), 25ng/ml HGF (Peprotech), 50ng/ml FGF7 (Peprotech), 50ng/ml FGF10 (Peprotech), 1μM A83-01 (Tocris), 10 mM 니코틴아미드 (Sigma), 및 10μM Rho 억제제 Y-27632 (Calbiochem)로 이루어진다. 씨딩 14 일 후, 오르가노이드는 기계적으로 단편화되었고 새로운 MatrigelR에 재- 씨딩되었다. 배양하는 동안, 배지는 많아야 3 일마다 새로 공급되었다. 오르가노이드는 7-10 일마다 1:3의 분할 비로 일반적으로 계대된다.
인간 Hep-Org 배양
태아 간세포는 2단계 콜라게나제 관류 방법에 의해 인간 태아 조직으로부터 단리되었고 100g에 5분 원심분리에 의해 단리되었다. 적혈구는 제거되었다. 간세포는 콜라게나제 소화의 2 단계에 의해 인간 성인 간으로부터 단리되었고 세포는 70μm 필터를 통해서 여과되었고 100g에 5분 원심분리에 의해 수집되었다. 상이한 분획은 고급 DMEM/F12로 세정되었다. 10,000개 저온보존된 태아 (11-20 주), 소아 (나이=0.6 세) 및 성인 간세포 또는 신선하게 단리된 세포는 인간 Hep-배지 및 MatrigelR과 (1:3의 비로) 혼합되었고 24 웰당 씨딩되었다. 고형화 후, 배지는 첨가되었다. 인간 Hep-배지: AdDMEM/F12 (Thermo Scientific, 헤페스, 글루타멕스 및 페니실린-스트렙토마이신 있음) 더하기 15% RSPO1 조건화된 배지 (수제), B27 (비타민 A 제외), 50ng/ml EGF (Peprotech), 1.25mM N-아세틸시스테인 (Sigma), 10 nM 가스트린 (Sigma), 3μM CHIR99021 (Sigma), 50ng/ml HGF (Peprotech), 100ng/ml FGF7 (Peprotech), 100ng/ml FGF10 (Peprotech), 2 μM A83-01 (Tocris), 10 mM 니코틴아미드 (Sigma), 10μM Rho 억제제 Y-27632 (Calbiochem) 및 20ng/ml TGFa. 태아-Org 분화의 경우, 인간 Hep-배지는 10ng/ml 온코스타틴 M 및 1μM 덱사메타손 (분화 배지, DM)으로 보충되었다. 배양하는 동안, 배지는 2-3 일마다 새로 공급되었다. 오르가노이드는 P10-15까지 7-8 일마다 1:3 그리고 P15부터 14 일마다 1:3의 분할 비로 일반적으로 계대된다. Chol-Orgs는 배양되었고 사전에 기재된 바와 같이 계대되었다 (Broutier 등, 2016). 오르가노이드 성장의 세포 수는 일차 간세포의 공지된 수로부터 만들어진 표준 곡선을 가진 CellTiter- Glo® 3D Cell Viability Assay에 의해 계산되었다.
RNA 단리 및 qRT-PCR
오르가노이드, 조직, 및 일차 세포의 RNA 단리는 제조자의 지시에 따라 RNeasy Mini Kit (Qiagen)로 수행되었다. 적은 양의 RNA를 가진 샘플은 TRIzol (Invitrogen)에서 용해되었다. RNA는 M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus (Promega)로 역전사되었다. qPCR 분석은 96 또는 384 q-PCR 기구 (Bio-rad Laboratories)에서 SYBR Green Mixture (Bio-rad Laboratories)로 수행되었다. qPCR을 위한 프라이머는 NCBI 프라이머-BLAST를 사용하여 설계되었다.
mRNA 시컨싱 및 분석
RNA-시컨싱 라이브러리는 DESeq2 방법 (Hashimshony 등, 2016; Love 등, 2014)에 기반하여 제조되었다. 간단히, 총 mRNA는 TRIzol 또는 RNeasy Mini Kit (Qiagen)에 의해 단리되었고 Ambion 키트로 역전사되었다. 시험관내 전사는 템플레이트로서 1-5 ng cDNA를 사용하여 수행되었고 RNA는 시컨싱 라이브러리에 역전사되었다. 샘플은 Illumina HiSeq 2000 계기에서 시컨싱되었다. 시컨싱 데이터 분석은 R 환경에서 DESeq2 패키지 (CIT)를 사용하여 수행되었다. 쌍으로 된 판독값은 그 다음 정량화되었고 정상화되었다. 샘플 가변성은 주성분 분석 (PCA)에 의해 가시화되었다. 차등적 유전자 발현 분석은 DeSeq2 패키지에 의해 수행되었고 히트맵에 의해 가시화되었다. 상관 분석 및 가시화는 코르플롯(Corrplot) 패키지로 수행되었다. 모든 데이터 분석 및 가시화는 R 스튜디오를 고소하여 수행되었다.
단일 세포 시컨싱 및 분석
오르가노이드는 트립신화되었고 조직은 단일 세포에 콜라게나제로 관주되었다. DAPI는 살아있는/죽은 세포 구분에 사용되었다. 단일, 살아있는 세포는 Aria II 세포 분류기 (BD bioscience)를 사용하여 384-웰 플레이트에서 분류되었다. 시컨싱 라이브러리는 CEL- seq2 방법 (Hashimshony 등, 2016)에 따라 제조되었다. 간단히, 384개 플레이트에 분류 후, 세포는 65℃에 5 분 동안 용해되었고 그 다음 RNA는 역전사되었고 시험관내 전사 전에 풀링되었다. Illumina 시컨싱 라이브러리는 TruSeq 작은 RNA 프라이머 (Illumina)를 사용하여 제조되었고 Illumina NextSeq500에서 75 bp 판독 길이로 쌍으로 된-말단 시컨싱되었다. 모든 데이터 분석은 RaceID2 알고리즘을 사용하여 수행되었다. 모든 RNA 시컨싱 데이터는 NCBI Gene Expression Omnibus에서 GEO 시리즈 번호 GSE111301을 통해서 접근가능하다.
면역조직화학, 면역형광, 전체 마운트 염색 및 현미경검사
섹션 면역형광의 경우, 오르가노이드는 MatrigelR로부터 단리되었고, 밤새 4℃에 2% 파라포름알데히드에서 고정되었고, 세정되었고, 파라핀 블록에 내장되었다. 섹션은 절단되었고 염색 전에 수화되었다. 섹션은 시트레이트 (pH=6.0)로 비등되었고, 0.2% 트리톤 X-100 (PBST)으로 보충된 PBS에서 삼투되었고 실온에서 1 시간 동안 2% 정상 당나귀 혈청 (Jackson ImmunoResearch) 또는 Power Block™ Universal Blocking Reagent (BioGenex)로 차단되었다. 일차 항체는 그 다음 4℃에 밤새 인큐베이션되었다. 후속적으로, PBS로 세정 후, 섹션은 이차 항체로 인큐베이션되었고, DAPI로 염색되었고 그 다음 Vertashield (Vector labs)를 사용하여 내장되었다. 이미지는 Sp8 공초점 현미경 (Leica)에서 포착되었고 Photoshop CS4 또는 Image J 소프트웨어를 사용하여 처리되었다. 간 오르가노이드의 세포 크기는 Image J 소프트웨어에 의해 DAPI 및 구성원-라벨링으로 공-염색된 오르가노이드 섹션에서 측정되었다.
면역조직화학의 경우, 섹션이 만들어지고 수화된 후, 이들은 15 분 동안 H2O2가 있는 차단 완충액으로 인큐베이션되었고 시트레이트 (pH=6.0)로 비등되었다. 냉각 후, 섹션은 사전-차단 완충액으로 처리되었고 밤새 4℃에 일차 항체로 인큐베이션되었다. 섹션은 이차 항체로 인큐베이션되었고 DAB 염색되었다. 섹션은 Pertex로 둘러싸였고 이미지는 DM4000 현미경 (Leica)에서 촬영되었다.
전체 마운트 염색의 경우, 오르가노이드는 세포 회수 용액 (Corning)을 사용하여 수확되었고 30 분 동안 4℃에 4% 파라포름알데히드에서 고정되었다. 오르가노이드는 그 다음 PBT (PBS, 0.1% Tween)로 세정되었고, 0.5% PBST에서 삼투되었고, 실온에서 1 시간 동안 PBS내 2% 정상 당나귀 혈청 또는 Power Block™ Universal Blocking Reagent (BioGenex)로 차단되었고 밤새 일차 항체로 인큐베이션되었다. 다음 날, 오르가노이드는 PBT로 세정되었고 밤새 4 ℃에 이차 항체, Alexa-fluor-647 Phalloidin (둘 모두 Thermo Fischer Scientific제) 및 DAPI (Invitrogen)로 인큐베이션되었다. 오르가노이드는 이미지화에 앞서 10 분 동안 글리세롤- 기반된 청소 용액에서 임의로 청소되었다. 오르가노이드 이미지화는 25x 오일 침지 대물렌즈를 사용하여 Zeiss LSM 880 또는 Sp8 공초점 현미경 (Leica) 상에서 수행되었다. 이미지는 Photoshop CS4 또는 Image J 소프트웨어를 사용하여 처리되었고 Imaris 이미지화 소프트웨어는 이미지의 3D 렌더링에 사용되었다.
마이크로어레이
총 RNA는 손상되지 않은 간으로부터 그리고 2/3 PHx 3 일 후 간으로부터 단리되었다. RNA는 증폭되었고, 라벨링되었고 홍콩 대학교 시설에서 마이크로어레이 분석을 위하여 풀링되었다. 범용 마우스 참조 RNA (Agilent)는 차등적으로 라벨링되었고 조직으로 하이브리드화되었다. 마이크로어레이 분석을 위한 데이터는 수탁 번호 GSE110292로 Gene Expression Omnibus에 기탁된다.
유세포 분석 (FACS)
알부민+ 간세포 또는 Axin2+ 간세포 분류의 경우, 간세포는 2 단계 콜라게나제 관류 방법에 의해 단리되었고 DAPI로 염색되었다. 단일 살아있는 Tomato+ 세포는 분류되었고 배양, mRNA 또는 단일 세포 시컨싱을 위하여 15ml 튜브 또는 384개 웰 플레이트에 수집되었다. 간세포의 배수성 분류의 경우, 세포는 15 분 동안 37℃에 Hoechst 34580 (Invitrogen)으로 염색되었고 2n, 4n, 또는 8n 세포는 전에 기재된 바와 같이 별도로 수집되었다 (Duncan 등, 2010).
투과 EM
투과 EM의 경우, 오르가노이드는 고압 냉동을 위한 3 mm 직경 및 200 미크롬 깊이 표준 평탄 캐리어 상의 MatrigelR에서 성장되었고 (HPM10에 맞먹는) Leica EM 고압 냉동고를 사용하여 즉시 저온고정화되었고, 추가 사용까지 액체 질소에서 저장되었다. 이들은 72 시간 동안 -90 ℃에 0.1% 아세트산 우라닐 및 2% 사산화 오스뮴을 함유하는 무수 아세톤에서 -90 ℃에 3 일 동안 냉동-치환되었고 실온까지, 시간당 5°(EM AFS-2, Leica, Vienna, Austria)로 가온되었다. 샘플은 4℃에서 2시간 동안 그리고 실온에서 2시간 더 유지되었다. 수회 아세톤 린스 (4 x 15 분) 후, 샘플은 2 일 (3:1-3시간; 2:2-3시간; 3:1-밤새; 순수한 수지- 6시간 +밤새+6시간+밤새+3시간) 동안 Epon 수지로 침윤되었다. 대안적으로, 1.6% 글루타르알데히드를 이용한 화학적 고정은 수행되었다. 고정에 이어서 아세톤내 탈수되었고 그 다음 설명된 바와 같이 Epon 수지에 내장되었다. 초박형 섹션은 Eagle CCD 카메라가 장착된 Tecnai Spirit T12 Electron Microscope (Thermo Fisher Scientific, The Netherlands)에서 관찰되었다.
Hep-Orgs 및 Chol-Orgs의 기능적 분석
후기 계대의 Hep-orgs는 기능적 분석에 사용되었다. 글리코겐 저장을 이용하기 위해, 우리는 과요오드산-시프 (PAS, Sigma) 염색을 사용하였다. LDL 흡수는 DiI-Ac-LDL (Biomedical Technologies)로 검출되었다. 로다민 123의 MDR1-매개된 수송은 10-15 분 인큐베이션 동안 검출되었다. 마우스 및 인간 알부민 분비는 Bethyl Elisa Kit로 검출되었고 P450 활성도는 Promega Kit로 테스트되었다. 인간 α1-안티트립신 및 인간 알파-태아단백질 (AFP)은 Assaypro and R&D로부터 Elisa 키트에 의해 검출되었다. 모든 실험은 제조자의 지시에 따랐다.
이식
인간 태아-Orgs는 2D 콜라겐 코팅된 플레이트 상에서 5-7 일 동안 DM내 분화 후 사용되었다. 이식 전, 오르가노이드는 수확되었고 트립신 소화로 소화되어 단일 세포를 생산하였고, 70 μm 세포 스트레이너 (BD Bioscience)에서 여과되었고, 세정되었고 생존가능한 세포 수는 트립판 블루 배제에 의해 계산되었다. 소화 후 Hep-Orgs (태아-Orgs 및 PHH-Orgs) 세포는 이식까지 차가운 Hep-배지에서 4℃에 유지되었다. 마우스당 100,000 내지 300,000개는 1개 70mg/kg 용량의 레트로르신, OSM, 및 인간 HGF (Agilent)를 발현시키는 아데노바이러스성 벡터의 1x109 게놈성 등가물로 사전조건화된 암컷 FNRG 마우스에 비장내로 주사되었다. ALB 및 AFP 수준은 이식 후 1-2 주마다 수득된 혈청에서 ELISA에 의해 정량화되었다. 마우스는 이식 후 다양한 시간 (대략 30 일 및 90 일)에 희생되었고 간 섹션은 인간 마커 (hALB 및 NuMA)에 대하여 염색되었다.
통계적 분석
데이터는 쌍으로 되지 않은, 양미 스튜던트 t-테스트를 사용하여 샘플의 2 그룹 사이에서 비교되었다. 평균+/- 표준 편차 또는 SEM 및 p 값으로서 제시된 오차 봉이 계산되었다.
GSEA 분석
유전자 셋트 농축 분석 (GSEA, Broad Institute)은 상이한 유전자 셋트를 선별하는데 사용되었다. 유전자는 부분적 간절제술 후 (적어도 5 배 상향-조절된 또는 하향-조절된) 발현 수준에 따라 순위되었다. 그 다음 Hep-Orgs 및 일차-Heps의 벌크 mRNA 시컨싱 데이터는 사전-순위된 모드로 GSEA 목록에 제출되었다.
실시예 2 - 단일 성숙한 간세포로부터 생성된 쥣과 간세포 오르가노이드 (Hep-Orgs)
일차 간세포는 2단계 콜라게나제 관류에 의해 야생형 성체 C57BL/6 마우스 간으로부터 단리되었고 세포는 MatrigelR에서 현탁되었다 (도 1a). Wnt 작용제 예컨대 R-스폰딘1 및 CHIR99021, EGF, FGF7 및 FGF10, HGF 및 TGF-β 억제제 A83-01을 포함하는, 다양한 소분자 및 생물제는 성장을 지원하는 능력에 대하여 테스트되었다 (도 8a). 배양의 첫 주 동안, 작은 오르가노이드는 배양 조건의 일부에서 Matrigel-내장된 간세포로부터 출현하였다. 이것은 조건 개선을 허용하여, 결과적으로 최적화된 Hep-배지 (표 2)에서 강건한 오르가노이드 성장 (도 8a 및 8b)을 초래하였다. Chol-Orgs와 달리, Hep-Orgs는 전형적 포도 송이 외관으로 조밀하였다 (도 1d와 비교하여 도 1b: 표 1은 모든 비교의 개관을 제공한다). 평판배양 효율은 성숙한 간세포의 약 0.5%-1.0%이었다 (도 1c). 이것은 담도 상피 세포의 높은 평판배양 효율 (정제된 담관세포의 최고 30%)와 대비하였지만 (Huch 등, 2015; Li 등, 2017), 위, 결장, 또는 전립선에서 유래된 오르가노이드의 것과 유사하였다 (Bartfeld 등, 2015; Drost 등, 2016; Sato 등, 2011). 오르가노이드는 15-20 일 내에 ~400μm의 직경까지 확장하였고 7-10 일마다 1:3의 비로 기계적 파괴에 의해 계대될 수 있었다. 성장 스피드는 2-3 개월 후 둔화되는 경향이었다 (도 8c). 오르가노이드는 BALB/c 및 C57BL/6 x BALB/c 마우스로부터 또한 수득될 수 있었다 (도 8d).
도 1e는, 쥣과 Chol-Orgs에서 보여진 큰 내강의 부재를 드러내는, 부착 연접 마커 β-카테닌 (황색) 및 증식 마커 mKi67 (적색)에 대하여 염색된 공초점 이미지 섹션을 제공한다 (Huch 등, 2013 및 도 2b). 전형적 간세포 형태학은 투과 EM에 의해 드러났다 (도 1f).
기원 세포를 연구하기 위해, 우리는 알부민-CreERT2; Rosa26-LSL- tdTomato 마우스로부터 간세포를 단리시켰다. 타목시펜 유도 후, ~99%의 알부민-분비 간세포는 라벨링되었고, 반면에 담도 상피의 세포는 재조합을 보여주지 못했다 (도 8e). 단일, 분류된 토마토-라벨링된 간세포는 충분히 라벨링된 오르가노이드를 생성하여, Hep- Orgs가 단일 성숙한, 알부민-발현 간세포에서 일어난다는 것을 암시하였다 (도 1g).
간 소엽에서 간세포는 중심주위 (PC)-대-문맥주위 (PP) 축을 따라 구역화 마커를 차등적으로 발현시킨다 (Bahar Halpern 등, 2017; Burke 등, 2009; Grun 등, 2015). 항상성 동안, Wnt 표적 유전자 Axin2의 발현은 항상적 자기-갱신의 주요 공급원인 PC에 인접한 간세포를 마크한다 (Wang 등, 2015). Hep-Orgs의 구역적 기원을 연구하기 위해, 우리는 FACS에 의한 타목시펜 유도 1 주 후 Axin2-CreERT2 및 Rosa26-LSL-tdTomato 대립유전자를 갖는 마우스로부터 성숙한 간세포를 단리시켰다. Axin2+ 간세포는 Axin2- 간세포보다 훨씬 더 높은 평판배양 효율을 표시하였다 (도 8f). 대조군 Epcam+ 담관세포는 Hep- 배지에서 Hep-Orgs를 본질적으로 생성하지 못했다 (도 8g). 추가적으로, 우리는 기재된 바와 같이 상이한 배수성 상태 (2n, 4n 및 8n)의 간세포를 분류하였다 (Duncan 등, 2010). 성체 마우스 간에서 공통인, 4배체 간세포는 2배체 세포에 비교가능한 평판배양 효율을 놀랍게도 산출하였고, 반면에 8배체 세포는 성장하지 못했다 (도 8h).
실시예 3 - 간세포 오르가노이드 (Hep-Orgs)는 간세포의 핵심 기능 및 유전자 발현 프로파일을 보유한다
실시예 2에서 생성된 바와 같이 Hep-Orgs는 그 다음 면역형광 및 면역-조직화학 염색에 의해 분석되었다. Hep-Orgs는 강한 알부민 발현을 보여주었지만, 담관 마커 Krt19 또는 Krt7에 대하여 음성이었다 (도 2a 및 2b, 도 9a 및 9c). 파라핀 섹션의 H&E, E-카드헤린 및 β-카테닌 염색은 Hep-Orgs의 특징적 조직화를 드러냈다 (도 2a 및 도 9b). Hep-Org 세포는 크기가 더 컸다 (도 2a 및 9b). 정량적 PCR (qPCR)은 간세포 마커 Alb, Hnf4a, Cyp1a2, 및 Cyp3a11, 태아 간세포 마커 Afp, 담관세포/전구 마커 Krt19, 및 전구 마커 Tbx3 및 Sox9에 대하여 수행되었다 (도 2c 및 도 2d). Hep-Orgs에서 이들 마커의 발현은 일차 마우스 간세포 (일차-Hep)의 것을 밀접하게 닮았다. 그러나, 전자는, 반-간절제의 특성인, 태아 간세포 유전자 Afp를 재-발현시켰다 (Engelhardt 등, 1976; Sell 등, 1974).
Hep-Orgs는 글리코겐 축적을 나타내는 강한 과요오드산-시프 (PAS) 염색을 보여주었다 (도 2e). 저밀도 리포단백질 흡수 (LDL)는 형광성 탐침에 의해 용이하게 가시화되었다 (도 2f). Hep-Orgs (계대 1 (P1) 및 P3)의 알부민 분비는 일차 간세포와 비교하여 겨우 2-4 배 더 적었다. 특히, 확장하는 Chol-Orgs는 적어도 1000 배 더 적은 알부민을 분비하고, 분화된 Chol-Orgs는 적어도 10 배 더 적게 분비한다 (Huch 등, 2013) (도 2g). 시토크롬 활성도 (Cyp1a2)는 일차 간세포와 비교하여 또한 겨우 2-3 배 더 적었다 (도 2h).
벌크 mRNA 시컨싱은 3개 상이한 마우스의 단리물로부터 Hep-Orgs 및 Chol-Orgs에 대하여 수행되었고 일차 간세포 RNA에 비교되었다. 도 2i는 ~40개 간세포 유전자, 10개 담관세포/전구 유전자 및 다수의 증식 마커 (도 9k에서 제공된 전체 유전자 목록)에 대하여 발현의 히트-맵을 나타낸다. 좌간절제 반응의 마커 (Afp, 세포 주기 유전자)는 일차 간세포가 아닌, Hep-Orgs에서 높았다. 명백히, 간세포 기능 예컨대 시토크롬 P450 활성도, 글리코겐 대사, 지질 대사, 스테로이드 대사, 요소 회로 및 완전 활성화에 관여된 유전자는 모두 Hep-Orgs와 일차 간세포 사이 유사한 발현 프로파일을 표시하였다 (도 9d- 9j). Hep-Orgs는 PP 마커보다 더 높은 정도로 PC 마커를 발현시켰다 (도 9l 및 9m).
이들 데이터는 Hep-Orgs가 일차 간세포의 결정적인 기능적 양태를 표시한다는 것을 입증한다. 본 발명의 간세포 오르가노이드는 전환분화된 담관세포와 비교하여 뚜렷한 유전자 발현 프로파일을 갖는다.
실시예 4 - 간세포 오르가노이드 (Hep-Orgs)는 부분적 간절제 (PHx)시 간세포 증식을 반복한다
경시적으로 유전자 발현 패턴은 2개 쥣과 Hep-Org 배양물 (M1 및 M2)에 대하여 mRNA 시컨싱에 의해 사정되었다. 이들은 PCA 플롯에 의해 가시화되고 P1, P3 및 P7에 사정된 바와 같이 경시적으로 현저히 유사하게 남아 있었다 (도 3a). 주요 간 마커 예컨대 Alb, Hnf4a, Hpx의 히트-맵은 Hep-Orgs 계대화 동안 그들의 안정한 발현을 나타냈지만, Krt7 및 Epcam은 재-발현되지 않았다 (도 3b).
Hep-Orgs가 일차 간세포의 결정적인 기능적 양태를 표시하여도, 이들은 주기적임 그리고 태아 마커 예컨대 Afp 및 Alb를 발현시킴에 의해 이들 간세포와 분명히 상이하다 (도 3b). PHx는 간세포를 증식시켜, 손상 후 3 일에 정점이 된다 (Michalopoulos, 2010). 증식하는 간세포의 생체내 전사적 상태와 Hep-Orgs의 유전자 발현 프로파일을 비교하기 위해, 우리는 PHx 후 3 일차에 콜라게나제 소화에 의한 간세포 뿐만 아니라 대조군 손상되지 않은 간세포를 단리시켰고 mRNA 시컨싱을 수행하였다. Hep-Orgs는 손상되지 않은 간세포 또는 Chol-Orgs보다 PHx 간세포와 더욱 밀접하게 클러스터링하였다 (도 3c). PHx 샘플과 대조군 손상되지 않은 간세포 사이 차등적으로 발현된 최상부-100개 유전자의 유전자 셋트는 유전자 셋트 농축 분석 (GSEA)에 의해 Hep-Orgs와 비교되었다. 여러 유전자는 Hep-Orgs에서 또한 활성화되었던 부분적-간절제 후 증식하는 간세포에서 상향-조절되었고; 유전자 농축은 P1, P3 및 P7의 Hep-Orgs에서 발견되었다 (도 3d). 이 밖에도, 우리는 마이크로어레이 분석에 의해 PHx와 대조군 손상되지 않은 간 사이 차등적 유전자 발현을 독립적으로 결정하였고 이 분석으로부터 우리는 적어도 5-배 변화하였던 유전자를 포함하는 유전자 셋트 목록을 생성하였다. 상당한 농축은 GSEA에 의해 재차 관찰되었다. 증식하는 PHx 후 간세포에서 하향-조절된 유전자는 마우스 Hep-Orgs에서 진압되었다. 반대로, PHx 샘플에서 상향조절된 유전자는 Hep-Orgs에서 농축되었다 (도 3d).
이들 데이터는 Hep-Orgs가 증식하는 간세포와 유사한 유전자 발현 프로파일을 갖는다는 것을 나타낸다.
실시예 5 - 간세포 오르가노이드 (Hep-Orgs)는 담관세포에 전환분화될 수 있다
Krt8/18 및 Spp1 같은 일부 전구 마커가 PHx 후 간 재생 동안 상향조절된다는 것이 관찰되었다. 생체내 연구는 상해 후 간세포-대-담도 상피 세포 전환을 기재하였다 (Yanger 등, 2013). 유사하게, 쓸개관암종은 Notch 및 AKT 활성화시 간세포에서 유래될 수 있다 (Fan 등, 2012; Sekiya 및 Suzuki, 2014). 일차 간세포를 알부민-CreERT2; Rosa26-LSL-tdTomato 마우스로부터 배양하는 경우, 낭성 오르가노이드는 CHIR이 제거된 때 가끔 형성하였다. 실제로, Tomato-양성 오르가노이드가 10 일 초과 동안 Chol-배지에서 배양된 경우, Krt7/19는 강하게 유도되었고 반면 Alb 및 Hnf4a 발현은 점차적으로 감소되었다 (도 10a 및 10c). 거꾸로, Chol-Orgs의 Hep-배지로의 이동은 Krt7/19 발현을 감소시켰지만 간세포-혈통 마커의 발현을 유도하지 않았다. (도 10b 및 10c).
실시예 6 - 간세포 오르가노이드의 단일 세포 mRNA 분석
단일 세포 mRNA 시컨싱은 Hep-Orgs 및 Chol-Orgs에서 수행되었다 (도 4a). 384개 세포는 각각으로부터 시컨싱되었고 결과는 RaceID2에 의해 분석되었다 (Grun 등, 2015). > 4000개 전사물을 가진 세포에 대하여 여과 후, Hep-Orgs로부터 186개 세포 및 Chol-Orgs로부터 253개 세포의 총계는 분석을 위하여 보유되었다. Hep-Orgs 및 Chol-Orgs로부터 조합된 데이터셋트의 분석은 수행되었고 유전자 발현은 t-SNE에 의해 가시화되었다 (도 4b). 일관되게, Alb, Ahsg, Afp, Fgg 및 Gc는 Hep-Orgs 모집단에서 단지 고도로 발현되었고 반면 Epcam 및 Krt7은 Chol-Orgs에서 고도로 발현되었다 (도 4c-4d, 및 도 11a 및 11b). 양쪽 오르가노이드 유형은 증식하는 세포를 함유하였다 (도 11c).
그 다음에 클러스터링 분석은 Hep-Orgs에서만 유래된 세포에서 수행되어, 그들의 세포성 조성물을 설명하였다 (도 4e). 5개 상이한 클러스터는 식별되었다. 클러스터 1은 비-순환 성숙한 간세포를 나타냈다 (도 4f 및 11d는 높은 알부민 및 간 마커 발현을 보여준다). 클러스터 2 및 3은 낮은 수준의 알부민, 높은 수준의 간세포 전구 마커 예컨대 Spp1 (Liu 등, 2015)을 발현시켰고 순환 간세포 전구 세포를 나타냈다 (도 4g 및 도 11e). 클러스터 4는 높은 수준의 순환 마커를 발현시켰고 성숙한 마커를 결핍시켜, 그것을 더더욱 원시적인 순환 세포 모집단으로서 식별하였다. 클러스터 5의 일부 세포에서, 우리는 전환-분화 이벤트를 시사하는 담관세포-혈통 마커 예컨대 Krt7의 발현을 주목하였다 (도 4h).
단일 세포 시컨싱에 의해 291개 손상되지 않은 간세포 및 197개 PHx 후 간세포는 또한 세포당 >3000개 전사물에 대하여 여과 후 분석을 위하여 보유되었다. 이들 사이 최상부 100개 차등적으로 발현된 유전자는 유전자 셋트에서 그룹화되었고 그 다음 Hep-Orgs의 GSEA에 사용되었다 (도 11f). Hep-Orgs는 대조군 간세포보다 증식하는, PHx 후 간세포와 더욱 비교가능하였다 (도 4i). 우리는 바이올린 플롯을 사용하여 손상되지 않은 간세포에서, PHx 간세포에서 그리고 Hep-Orgs로부터의 세포에서 유전자 발현을 가시화하였다. 예상된 대로, 세포 주기-관련된 및 리보솜 합성 유전자는 양쪽 Hep-Org 세포에서 그리고 PHx 후 간세포에서 상당히 증가되었다 (도 4j). 부분적-간절제 후 상향-조절된 전형적 비-세포-주기-관련된 유전자는 Hep-Orgs에서 합치한 발현을 보여주었다. 이들은 Afp, Lcn2, Actg1, Fabp5, Clu, Ly6d, Mt2, S100a11, Stmn1, Tubb6, Cdkn1a, 및 Dynll1을 포함하였다 (도 4j).
실시예 7 - 인간 간세포로부터 간세포 오르가노이드 (Hep-Orgs)의 확립 및 특성규명
Hep-Org 배지는 인간 간세포 (Hep-배지)의 클론형성성 및 확장에 대하여 최적화되었다 (도 12a 및 12b). 우리는 임신 11-20 주의 기증자 배아로부터 인간 태아 간 세포를 단리시켰다. 인간 태아 Hep-Orgs (태아-Orgs)는, 전형적 포도-유사 구조를 각각 표시하는, 8개 태아 기증자 조직 중 7개로부터 확립될 수 있었다 (도 5a). 이들 중 5개는 >16 계대 동안 확장될 수 있었고 원고 재재출시에 7-10 일마다 1:3의 분할 비로 기하급수적으로 여전히 증가중이었다. 가장 긴 배양은 현재 계대 28 (태아 기원: 임신 후 18 주, 11 개월의 배양)에 있다. 우리는 또한 저온보존된 소아 및 성인 일차 인간 간세포 (PHHs)로부터 Hep-Orgs (PHH-Orgs)를 확립하였다. 이들은 그들의 확장 시간 (2-2.5 개월)에서 더욱 제한된 것처럼 보였지만 대략 1%의 평판배양 효율을 가진 태아 배양물과 비교된 경우 매우 유사한 조성의 오르가노이드를 여전히 산출하였다 (도 5a 및 5b). Chol-Orgs와 달리, 인간 Hep-Orgs는 작은 내강을 함유하였고 간세포 형태학의 큰 세포로 이루어졌다 (도 5c, 도 12c-12e 및 표 1). 인간 Hep-Orgs는 Chol-Orgs보다 더 큰 세포 직경, 그리고 더 작은 핵/세포질 비 (세포 직경/핵 직경: 태아-Orgs에 대하여 30.08±8.17μm/14.07±1.59 μm, PHH-Orgs에 대하여 27.54±6.50 μm/11.69±1.64μm 그리고 Chol-Orgs에 대하여 10.42 ±2.78/7.22 ±1.55 μm)를 갖는다. 투과 EM은 세포질에서 풍부한 글리코겐 입자를 드러냈다. 전형적 간 간세포 특성은 원섬유 중심과 탈-응축된 염색질이 있는 두드러진 핵소체를 가진 핵, 크리스타가 적고 짧은 다수의 미토콘드리아, 그리고 그 주변에 조직화된 RER의 개별 대조를 포함하였다. 또한, 골지체 소낭 스택, 담 세관, 밀착 연접, 퍼옥시좀, 리소좀, 다포체 및 자가포식 공포는, 간세포의 것들을 밀접하게 닮은, 인간 Hep-Orgs에서 존재하였다 (도 5d 및 5e).
태아-Orgs는 ALB 및 HNF4A를 풍부하게 발현시켰고, 반면 세포의 상당한 부분은 CYP2E1을 발현시켰다 (도 5f 및 도 12f). 담 세관의 놀라운 네트워크는 MRP2 염색에 의해 드러났다 (도 5g). 태아-Orgs에서 강한 과요오드산-시프 (PAS) 염색 및 DiI-Ac-LDL은 기능적 LDL 흡스를 나타냈고 글리코겐 축적을 확인하였다 (도 5h 및 5i). Hep-Orgs는 담관세포 기능을 입증하지 못했다: 담관세포 표면 당단백질 다제 내성 단백질-1 (MDR1)에 대하여 형광성 기질인, 로다민123은 Hep-Orgs가 아닌 Chol-Orgs의 내강에 적극적으로 수송되었다 (도 S5g). 명백히, Hep-Orgs (6명 태아 기증자, 1명 PHH 기증자)에 의한 알부민 분비는 PHHs의 것과 비교가능하였다 (도 5j). Hep-Orgs에 의한 A1AT 분비는 PHHs에 의해 생산된 수준의 25%-50%이었다 (도 12h). ALB가 증가하는 태아- Org 계대 수 (도 5j에서 태아-Orgs 2 및 3을 태아-Orgs 2 후기 및 3 후기와 비교함)로 약간 증가하였던 반면, AFP 분비는 경시적으로 감소하였다 (도 12i). PHHs에서 유래된 Hep-Orgs에서의 CYP3A4 활성도는 PHHs의 것보다 더 높았고, 반면 태아-Orgs에서의 활성도는 PHHs의 것보다 2-8 배 더 낮았다 (도 5k).
벌크 mRNA 시컨싱은 수행되어 상이한 계대의 태아-Orgs 및 PHH-Orgs를 태아-Heps 및 PHHs와 비교하였다. 히트맵은 여러 계대 동안 PHHs와 비교가능하게 남아있었던 태아-Orgs 및 PHH-Orgs에서 간세포 유전자 예컨대 ALB, APOA2 및 SERPINA1의 광범위한 어레이를 나타낸다 (도 6a). 기능적 간세포 유전자의 발현 수준 (시토크롬 P450 활성도, 글리코겐/지질 대사 및 요소 회로) 모두는 후기 계대 태아-Orgs와 태아-Heps/PHHs가 있는 PHH-Orgs 사이 비교가능한 발현 수준을 표시하였다 (도 13a). 이들 수준은 분화 후 Chol-Orgs에서 간세포-유사 세포의 것들보다 훨씬 더 높았다. 대조적으로, EPCAM, SOX9, KRT8/18 및 KRT7/19 같은 전구/담관세포 마커는, Hep-Orgs와 비교된 경우, 분화 배지 (DM)내 Chol-Orgs에서 더 높게 남아있었다 (도 13b). PCA 플롯은 DM내 Chol-Orgs와 Hep-Orgs 사이 차이를 강조하였다. PHH-Orgs가 PCA 플롯에서 PHHs보다 태아-Heps에 PHH-Orgs를 더 밀접시키는 AFP (도 6a)를 재-발현시킨다는 것이 주목된다 (도 13a 및 도 13c).
그 다음에 우리는 태아-Orgs에서 유래된 384개 세포 그리고 인간 Chol-Orgs로부터 384개 세포에서 단일-세포 mRNA 시컨싱을 수행하였다. 최소 4000개 검출된 전사물/세포의 여과하는 기준을 적용한 후, 161개 및 197개 세포는 분석에, 각각 보유되었다. 조합된 태아-Orgs 및 Chol-Orgs 데이터셋트에서 RaceID2에 의한 클러스터링 분석은, t-SNE 맵에서 가시화된 바와 같이, 6개 주요 클러스터를 드러냈다 (도 6b 및 6c). 클러스터 i-iv 세포는 태아-Orgs로부터 거의 배타적으로 유래하였다. 마커 발현 분석은 클러스터 i이, 예를 들어 고 알부민, SERPINA1 및 ASGR에 의해 마크된, 간세포를 나타내는 것을 드러냈다 (도 6d-6e 및 도 13d). 클러스터 ii는 중간엽 마커 예컨대 COL1A2 및 FSTL1에 의해 정의되었다 (도 13e). 클러스터 iii 및 iv는 간 전구 마커 예컨대 CD24 및 IL32를 발현시켰고, 반면 일부 세포는 간 재생 동안 또한 고도로 발현되는 미토콘드리아성 유전자 mRNA가 풍부하였다. 큰 클러스터 v 및 vi은 (초기) 담관세포 마커 예컨대 KRT19 및 EPCAM을 발현시켰다 (도 6f). 실제로, 이들 2개 클러스터에서 거의 모든 세포는 Chol-Orgs에서 유래되었다. 양쪽 태아-Orgs 및 Chol-Orgs 세포는 증식의 마커를 발현시켰다 (도 6g 및 도 13f).
실시예 8 -인간 간세포로부터 간세포 오르가노이드 (Hep-Orgs)는 손상된 간에 생착하여 재증식시킬 수 있다
우리는 인간 Hep-Orgs가 손상된 간 조직을 생착 및 재증식할 수 있는지를 설명하였다. 이식가능성이 일반적으로 간세포 성숙도와 상관관계가 있으므로, 우리는 분화 배지 (DM, 덱사메타손 및 온코스타틴 M 함유)를 정의하여 태아-Orgs의 성숙화를 증가시켰다 (Kamiya 등, 2001) (도 14a). 태아-Org 주 2 (계대 16) 세포는 DM (7-10 일)에서 5-7 일 동안 콜라겐-코팅된 플레이트에 씨딩되었다. 후속적으로, 오르가노이드는 단일 세포로서 면역결핍성 Fah-/- NOD Rag1-/- Il2rg-/- (FNRG) 마우스 (Aini 등, 2014; Billerbeck 등, 2016; Grompe, 2017)에 비장 주사로 이식되었다.
이식 후 첫 30 일 동안, 마우스 순환화에서 인간 ALB은 안정하게 남아있었고 태아-Orgs를 받았던 모든 마우스에서 분명히 검출가능하였다 (도 7d). 1-2개 세포의 작은 클러스터의 초기 생착화는 인간 ALB 및 NuMa 염색에 의해 확인되었다 (Billerbeck 등, 2016) (도 7a). 양성 대조군으로서 나란히 이식된 동일한 기증자의 태아-Heps는 동일한 시기에서 hAlb의 연속 증가를 보여주었고 이식 후 30 일차에 더 큰 클러스터를 형성하였다 (도7d 및 14d). 30 일차 후, 하지만, 오르가노이드 이식편은 더욱 신속하게 증식하기 시작하였고 일차 세포와 동일한 속도로 확장하였다. 이식 90 일 후, 태아-Orgs의 혈청 hALB는 평균적으로 200 ug/ml 초과까지 200-배 상승하였다. 클러스터는 상당히 증가하였고 Ki67 염색 및 정량적 조직학에 의해 확인된 바와 같이 진행중 증식을 입증하였다 (도 7b 및 14b). 재증식하는 이식편 ('결절')은 ALB, MRP2 및 CYP2E1에 대하여 양성 염색하였고, 이는 그들의 기능적 성숙도를 나타냈다 (도 7c) 이식된 세포의 거의 9개는 AFP (태아 간세포 마커)의 발현을 보유하였고 KRT19 (담관세포 마커)는 이식편 내에서 검출될 수 없었다 (도 7c 및 도 14c). 동일한 실험은 1명 소아 PHH 기증자로부터 성장된 오르가노이드 배양물로 수행되었다. 우리가 동일한 기증자로부터 간세포 및 Hep-Orgs에 접근하였으므로, 우리는 재차 나란히 생착화를 비교할 수 있었다. 태아-Orgs와 유사하게, 성숙한 오르가노이드 이식편은 일차 간세포 대조군과 동일한 속도로 증식하기 전에 초기 지체 기를 보여주었다 (도 7d 및 14d). 성숙한 일차 세포 및 오르가노이드는 생착화 수준 및 이식편 증식에서 그들의 태아 상대방을 분명히 능가하였고, 이는 오르가노이드 배양에서 기본 조직 특성 (예를 들면 이식가능성)의 충실한 보존 및 Hep-Orgs의 재생적 잠재력을 입증한다. 요약하면, 우리의 데이터는 Hep-Orgs가 손상된 간을 성공적으로 재증식할 수 있고 이식후 상당한 이식편 확장을 입증할 수 있다는 것을 보여준다.
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Claims (56)

  1. 시험관내 간세포의 확장 방법으로서, 상기 방법이 간세포 배양 배지에서 간세포를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 간세포 배양 배지가
    i. FGF7, FGF10 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 임의로 선택된, 50 내지 500 ng/ml의 섬유아세포 성장 인자 (FGF);
    ii. R-스폰딘 및 적어도 하나의 글리코겐 신타제 키나제 3 (GSK3) 억제제를 포함하는 Wnt 작용제;
    iii. 5 내지 100 ng/ml의 표피 성장 인자 (EGF);
    iv. 5 내지 100 ng/ml의 간세포 성장 인자 (HGF); 및
    v. 액티빈 수용체-유사 키나제 ALK4, ALK5 및/또는 ALK7 신호전달 경로의 억제제를 포함하는, 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 억제제
    를 포함하는, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 R-스폰딘이 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3, R-스폰딘 4, 이들의 활성 단편 또는 변이체, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 R-스폰딘이 조건화된 배지로서 제공되고 상기 간세포 배양 배지 내에서 5%-50%, 5%-40%, 5%-35%, 10%-30%, 10%-20%, 12%-17%의 농도, 또는 바람직하게는 약 15% (vol/vol)의 농도인, 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 R-스폰딘 조건화된 배지에서의 상기 R-스폰딘이 R-스폰딘 1이고, 임의로 약 15%의 농도인, 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GSK3 억제제가 1 내지 10 μM, 0.5 내지 5 μM, 1 내지 5 μM, 2 내지 4 μM의 농도, 또는 바람직하게는 약 3 μM의 농도인, 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 GSK3 억제제가 CHIR99021, SB216763, TWS119, 5-브로모인돌, SB415286, BIO, AZD2858, AZD1080, AR-A014418, TDZD-8, LY2090314, BIO-아세톡심, 1-아자켄파울론 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 GSK3 억제제가 CHIR99021이고, 임의로 약 3 μM의 농도인, 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간세포 배양 배지가 50 내지 400 ng/ml, 50 내지 300 ng/ml, 75 내지 200 ng/ml, 80 내지 150 ng/ml 또는 바람직하게는 약 100 ng/ml의 농도로 FGF7을 포함하는, 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 간세포 배양 배지가 50 내지 400 ng/ml, 50 내지 300 ng/ml, 75 내지 200 ng/ml, 80 내지 150 ng/ml 또는 바람직하게는 약 100 ng/ml의 농도로 FGF10을 포함하는, 방법.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 상기 배양 배지가 FGF10 및 FGF7을 포함하는, 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EGF가 10 ng/ml 내지 100 ng/ml, 20 ng/ml 내지 100 ng/ml, 20 ng/ml 내지 80 ng/ml, 40 ng/ml 내지 80 ng/ml, 또는 바람직하게는 약 50 ng/ml의 농도인, 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HGF가 10 ng/ml 내지 100 ng/ml, 20 ng/ml 내지 100 ng/ml, 20 ng/ml 내지 80 ng/ml, 40 ng/ml 내지 80 ng/ml, 또는 바람직하게는 약 50 ng/ml의 농도인, 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TGF-β 억제제가 1 내지 10 μM, 0.5 내지 5 μM, 1 내지 4 μM, 1 내지 3 μM, 또는 바람직하게는 약 2 μM의 농도인, 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 TGF-β 억제제가 A83-01, SB-431542, SB-505124, EW-7197, LY-2157299, GW6604 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 액티빈 수용체-유사 키나제 ALK4, ALK5 및/또는 ALK7의 억제제인, 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 액티빈 수용체-유사 키나제 ALK4, ALK5 및/또는 ALK7의 상기 억제제가 A83-01이고 임의로 약 2 μM의 농도인, 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간세포 배양 배지가 추가로 니코틴아미드를 포함하고 임의로 1 내지 100 mM의 농도인, 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 니코틴아미드가 1 내지 50 mM, 1 내지 30 mM, 1 내지 20 mM, 5 내지 20 mM, 5 내지 15 mM, 또는 바람직하게는 약 10 mM의 농도인, 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간세포 배양 배지가 임의로 1 내지 100 nM의 농도로, 가스트린을 추가로 포함하는, 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 가스트린이 1 내지 50 nM, 1 내지 30 nM, 1 내지 20 nM, 5 내지 20 nM, 5 내지 15 nM, 또는 바람직하게는 약 10 nM의 농도인, 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간세포 배양 배지가 형질전환 성장 인자 알파 (TGF-α)를 추가로 포함하는, 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 TGF-α가 1 내지 50 ng/ml, 5 내지 35 ng/ml, 10 내지 30 ng/ml, 15 내지 25 ng/ml, 또는 바람직하게는 약 20 ng/ml의 농도인, 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간세포 배양 배지가 Rho-연관된 단백질 키나제 (ROCK) 억제제를 추가로 포함하고; 임의로 상기 ROCK 억제제가 Y-27632, GSK429286A, 파수딜, 티아조비빈, Rho 키나제 억제제 IV 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 임의로 상기 ROCK 억제제가 Y-27632인, 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 ROCK 억제제가 1 내지 50 μM, 1 내지 30 μM, 1 내지 20 μM, 5 내지 20 μM, 5 내지 15 μM, 또는 바람직하게는 약 10 μM의 농도인, 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간세포 배양 배지가 추가로 N-아세틸시스테인을 포함하는, 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 N-아세틸시스테인이 0.5 내지 5 mM, 0.5 내지 4 mM, 1 내지 4 mM, 1 내지 2 mM, 1 내지 1.5 mM, 또는 바람직하게는 약 1.25mM의 농도인, 방법.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간세포 배양 배지가 추가로 B27을 포함하고, 임의로 상기 B27이 비타민 A를 포함하지 않는, 방법.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간세포 배양 배지가 세포 성장 배지를 추가로 포함하고, 임의로 상기 세포 성장 배지가 항생제, 임의로 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하고; 상기 세포 성장 배지가, 임의로 헤페스 및/또는 글루타멕스를 포함하여, 임의로 AdDMEM/F12를 포함하는, 방법.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간세포 배양 배지가 cAMP 경로 활성화제를 포함하지 않는, 방법.
  29. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간세포가 일차 간세포, 바람직하게는 간 조직으로부터 단리된 세포인, 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 방법이 간 조직으로부터 상기 일차 간세포를 단리시키는 단계를 추가로 포함하고, 임의로 상기 간 조직이 확장된 간세포와 투여될 대상체로부터 외식편 또는 간 샘플이고/거나 단리시키는 단계가 콜라게나제 소화를 포함하는, 방법.
  31. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간세포가 상기 간세포 배양 배지의 존재 하에서 3차원 세포외 기질 (ECM)과 접촉하여 배양되는, 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 3차원 세포외 기질이, 임의로 1:1, 1:2, 또는 바람직하게는 1:3의 배지:기질 비로, 상기 간세포 배양 배지를 포함하는, 방법.
  33. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서, 상기 3차원 세포외 기질이 합성 ECM, 천연 ECM 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 임의로 상기 3차원 ECM이 MatrigelTM을 포함하는, 방법.
  34. 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간세포가 태아 간세포, 성인 간세포 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 세포를 포함하는, 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 간세포가 알부민-발현 간세포이고, 임의로 상기 배양된 간세포가 2배체 또는 4배체인, 방법.
  36. 제 1 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 확장된 세포의 적어도 일부가 하나 이상의 간세포 오르가노이드를 형성하는, 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 간세포 오르가노이드가 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 계대 동안 배양중 추가로 확장될 수 있는, 방법.
  38. 제 36 항에 있어서, 상기 간세포 오르가노이드가 적어도 3, 4, 5, 6, 10, 12, 15, 18, 20 또는 24 개월 동안 배양중 추가로 확장될 수 있는, 방법.
  39. 제 36 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간세포 오르가노이드가 내강을 포함하는, 방법.
  40. 제 36 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간세포 오르가노이드가 글리코겐 축적, 저밀도 리포단백질 (LDL)의 기능적 흡수, 섬유 중심과 탈-응축된 염색질을 갖는 두드러진 핵소체를 포함하는 핵, 크리스타가 적고 짧은 다수의 미토콘드리아, 담 세관, 단단한 연접, 퍼옥시좀, 리소좀, 다포체, 자가포식 공포 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 전체 간 및 일차 간세포의 특징을 포함하는, 방법.
  41. 제 36 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간세포 오르가노이드가 알부민, 알파-1 안티트립신 (A1AT), 알파-태아글로불린 (Afp) 및 이들의 조합 중 적어도 하나를 분비하는, 방법.
  42. 제 36 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 간세포 오르가노이드가 알부민, 아포리포단백질 A2 (APOA2), 세르핀 패밀리 구성원 1 (SERPINA1) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자에 대하여 일차 간세포의 것과 비교가능한 유전자 발현을 입증하는, 방법.
  43. 제 36 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간세포 오르가노이드가 기하급수적으로 확장하고, 임의로 상기 확장이 7-10 일마다 약 1:3의 비율인, 방법.
  44. 제 36 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간세포 오르가노이드가 적어도 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%의 평판배양 효율을 갖는, 방법.
  45. 제 36 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간세포 오르가노이드가 담관세포에서 전형적으로 발현된 마커 유전자를 발현시키지 않고/거나 상기 간세포 오르가노이드가 담관세포에서 전형적으로 발현되지 않는 유전자를 발현시키는, 방법.
  46. 제 36 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 의해 수득가능한 또는 수득된 간세포 오르가노이드 및/또는, 그것에서 유래된 세포, 임의로 단일 세포.
  47. 제 46 항에 있어서, 의학 또는 진단법에서 사용을 위한 간세포 오르가노이드 및/또는 그것에서 유래된 세포.
  48. 제 46 항에 있어서, 생체내 간세포에 관해서 서브스턴스의 잠재적 효과의 스크리닝에서 사용하기 위한, 임의로 치료적 또는 독성 효과에 대한 스크리닝에서 사용을 위한 간세포 오르가노이드 및/또는 그것에서 유래된 세포.
  49. 제 46 항에 있어서, 대상체의 간에서 손상된 간세포에 의해 야기되고/거나 이와 연관되는 질환 또는 병태 치료에서 사용을 위한 간세포 오르가노이드 및/또는 그것에서 유래된 세포.
  50. 제 49 항에 있어서, 상기 질환 또는 병태가 간세포 암종, 알라길 증후군, 알파- 1- 안티트립신 결핍증, 자가면역 간염, 담도 폐쇄증, 만성 간염, 간암, 간경변, 간 낭종, 지방간 질환, 갈락토스혈증 길버트 증후군, 원발성 담즙성 경화증, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 원발성 경화성 담관염, 라이 증후군, 유육종증, 티로신혈증, I형 글리코겐 축적병, 윌슨병, 신생아 간염, 비-알코올성 지방간염, 포르피린증, 혈색소증, 진행성 가족성 간내 담즙정체증, 글리코겐 축적병 III형, 티로신혈증, 데옥시구아노신 키나제 결핍증, 피루베이트 카복실라아제 결핍증, 선천성 적혈구형성이상 빈혈, 다낭성 간 질환 다낭성 신장 질환, 알파-1 안티트립신 결핍증, 요로 주기 결함, 유기 산혈증, 리소좀 축적병, 지방산 산화 장애, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 간세포 오르가노이드 및/또는 그것에서 유래된 세포.
  51. 제 46 항에 있어서, 손상을 입고/거나 적어도 부분적 간절제 (HPx)를 받은 간의 복구 방법으로, 상기 간세포 오르가노이드 및/또는 그것에서 유래된 상기 단일 세포를 상기 간에 이식하는 단계를 포함하는 방법에서 사용을 위한 간세포 오르가노이드 및/또는 그것에서 유래된 세포.
  52. 제 51 항에 있어서, 상기 간세포 오르가노이드가 태아 간세포로부터 확장되었고 간의 복구 방법이 추가로 상기 간세포 오르가노이드를 분화시키는 단계를 포함하고, 임의로 상기 간세포 오르가노이드를 분화시키는 단계가 간세포 오르가노이드 및/또는 그것에서 유래된 세포를 이식하는 단계에 앞서는, 간세포 오르가노이드 및/또는 그것에서 유래된 세포.
  53. 제 52 항에 있어서, 태아 간세포로부터 확장된 상기 간세포 오르가노이드를 분화시키는 단계가 분화 배지에서 상기 간세포 오르가노이드를 배양시키는 단계를 포함하고, 임의로 상기 분화 배지가 덱사메타손 및 온코스타틴 M을 포함하는, 간세포 오르가노이드 및/또는 그것에서 유래된 세포.
  54. 제 53 항에 있어서, 상기 분화 배지가 덱사메타손 및 온코스타틴 M에 의해 보충된 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항의 간세포 배양 배지를 포함하고, 임의로 상기 덱사메타손이 약 1 μM의 의 농도이고/거나 상기 온코스타틴 M이 약 10 ng/ml의 농도인, 간세포 오르가노이드 및/또는 그것에서 유래된 세포.
  55. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른, 간세포 배양 배지.
  56. 제 1 항 내지 제 28 항 및 제 55 항 중 어느 한 항에 따른 간세포 배양 배지로,
    약 100ng/ml FGF7;
    약 100ng/ml FGF10;
    약 20ng/ml TGFa;
    약 50ng/ml EGF;
    약 50ng/ml HGF;
    B27 (비타민 A를 포함하지 않음);
    약 2 μM A83-01;
    약 10μM Y-27632;
    약 3μm CHIR99021;
    약 10 mM 니코틴아미드;
    약 10 nM 가스트린;
    약 1.25mM N-아세틸시스테인; 및
    약 15% R-스폰딘 조건화된 배지
    를 포함하는 간세포 배양 배지.
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