CN110982776B

CN110982776B - 肝细胞的体外扩增培养方法及应用

Info

Publication number: CN110982776B
Application number: CN201811156216.1A
Authority: CN
Inventors: 惠利健; 张鲁狄; 张坤
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Priority date: 2018-09-30
Filing date: 2018-09-30
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2038-09-30
Also published as: US20210340494A1; JP7399955B2; EP3858981A1; WO2020063161A1; CN110982776A; JP2022517300A; CN117802031A; EP3858981A4

Abstract

本发明涉及肝细胞的体外扩增培养方法及应用。本发明建立了一种重编程人肝细胞为可增殖的处于成熟肝细胞和肝前体细胞之间的中间态细胞的培养体系，并在动物体内验证其肝脏再殖能力。本发明的方法不需要在肝细胞内导入外源基因，常规培养即可实现肝细胞的扩增，所获得的肝细胞可传代；还可继续成熟培养，以获得功能性人肝成熟细胞。

Description

肝细胞的体外扩增培养方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种体外扩增培养肝细胞的方法以及利用扩增后肝细胞进行代谢分析及细胞移植的应用。

背景技术

肝脏是体内功能最多且最复杂的实质脏器之一，主要功能包括调控糖类和脂质的平衡、参与外源性物质代谢与生物转化、胆汁的生成和排泄、维生素的储存、分泌性蛋白质的合成、凝血物质的生成与消除，并在特异性和非特异性免疫中具有重要作用。肝脏作为人体物质代谢的中心，在多种生理和病理过程中都发挥了重要的作用，很多疾病也会累及肝脏。目前对于晚期肝脏疾病最有效的治疗手段是肝脏移植，但是由于供体肝源的短缺和昂贵的治疗费用，使其临床应用受到很大的限制。近些年研究者们尝试利用肝细胞移植替代整肝移植，并已经在临床和动物模型中验证了其有效性。但是肝细胞移植治疗方法仍受限于具有肝脏整合能力的人肝细胞来源匮乏的问题。此外，由于人嗜肝性病原体具有宿主特异性和物种间肝脏代谢酶存在巨大差异，人肝细胞移植免疫缺陷动物获得的肝脏人源化动物被广泛应用于肝脏感染疾病研究和药物研发领域。因此，具有高效肝脏再生(再殖)能力的人肝细胞在肝病治疗和肝脏人源化动物构建中都具有巨大的需求及应用价值。

细胞永生化是指体外培养的细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离，从而具有无限增殖能力的过程。肝细胞自发永生化的几率很小,通常肝细胞永生化是借助基因转染等技术实现。但是，一些永生化肝细胞系体外肝功能远低于原代肝细胞，而且没有实验证实其能在肝脏中大量再生(再殖)。此外，有些永生化细胞还存在体内致瘤的风险。

本领域人员也采取了共培养结合小分子化合物促进人肝细胞少量增殖的技术，此类培养技术优势在于肝细胞功能的维持，但增殖倍数不多且并缺乏移植实验证明扩增的人肝细胞具有肝脏整合能力，限制该技术在细胞移植治疗中应用。

本领域人员也采取了类器官体方式培养人肝脏胆管来源前体细胞，但是此类培养获得的培养出来了可持续增殖的肝类器官体，肝功能即使在诱导后也远不如人原代肝细胞，而且体内移植整合效率非常低。

本领域人员也进行了鼠肝细胞体外退分化为肝前体细胞，此类培养技术的优势在于体外大规模扩增肝细胞，且移植后可以高效地实现肝脏再生。但该技术无法促使人肝细胞在体外扩增。

综上所述，尽管研究者在人肝细胞培养和肝脏再生新机制取得多项突破性进展。但目前尚无法实现人肝细胞在无基因编辑情况下，持续增殖并在体内具有高效的再殖能力。

发明内容

本发明的目的在于提供肝细胞的体外扩增培养方法及应用。

在本发明的第一方面，提供一种体外扩增肝细胞(包括：原代肝细胞)的方法，包括：以含有Wnt信号通路激活剂的细胞培养基培养肝细胞，使之体外扩增。

在一个优选例中，所述的细胞培养基中还含有选自下组的成分：N-乙酰-半胱氨酸，烟酰胺，FGF10，EGF，HGF，[Leu15]-gastrin I，A 83-01，Y-27632的细胞培养基。

在另一优选例中，所述的Wnt信号通路激活剂包括选自下组的激活剂：Wnt3a蛋白，Wnt3a条件培养基，CHIR，或其组合。

在另一优选例中，所述的细胞培养基中，还包括选自下组的细胞生长添加剂：N2添加物，B27添加物；或还包括血清。

在另一优选例中，所述的细胞培养基中，以选自下组的培养基作为基础培养基：DMEM、MEM、RPMI(如RPMI1640)、Neuronal basal或Fischers；较佳地，所述的DMEM 选自：Advanced DMEM/F12，DMEM/F12。

在另一优选例中，所述方法还包括：将扩增的肝细胞诱导为成熟肝细胞，包括：在所述的细胞培养基中添加Forskolin，地塞米松，制瘤素M。

在另一优选例中，所述组分在细胞培养基中的浓度为：

在另一优选例中，所述的Wnt3a蛋白、Wnt3a条件培养基、CHIR可以选择其一，或其组合。

在另一优选例中，所述的N2添加物用量为1X。

在另一优选例中，所述的B27添加物用量为1X。

在另一优选例中，所述方法还包括：将扩增的肝细胞进行传代培养；较佳地，在低氧条件下进行传代培养，所述的低氧为按照体积比氧气含量0～15％；较佳地，氧气含量低于10％，更佳地，氧气含量低于6％，如1％，2％，3％，4％；较佳地，所述的培养为三维条件下的培养。

在另一优选例中，所述的肝细胞为人肝细胞，包括人原代肝细胞。

在本发明的另一方面，提供由前面任一所述的方法获得的肝细胞培养物或从该肝细胞培养物中分离纯化的肝细胞。

在一个优选例中，所述的肝细胞为处于成熟肝细胞和肝前体细胞之间的中间态细胞。

在另一优选例中，所述的肝细胞为成熟肝细胞；较佳地，其具有成熟肝细胞所特有的典型多边形和双核，其肝前体基因如SOX9、CK19或CK7低表达，参与药物和尿素代谢的关键基因高表达，CYP2B6和尿素代谢能力增加。

在本发明的另一方面，提供所述的肝细胞培养物或分离纯化的肝细胞的用途，用于：制备促进肝脏再生的药物；用于制备预防、缓解或治疗肝脏疾病(包括肝损伤，肝癌，肝硬化等)的药物组合物或药盒；用于作为体外模型，进行肝脏相关疾病或药物的研究；用于制备体内细胞移植的组合物；或用于产生Albumin蛋白。

在一个优选例中，所述的肝脏相关疾病或药物的研究包括：研究药物运输、药物代谢、肝形成、肝再生；或肝毒性测试、筛选肝细胞毒性物质、筛选调节肝细胞功能的物质。

在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其中含有所述的肝细胞培养物或分离纯化的肝细胞；以及药学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种药盒，其中含有所述的肝细胞培养物或分离纯化的肝细胞；或含有所述的药物组合物。

在本发明的另一方面，提供用于体外扩增肝细胞的培养基，其包括：Wnt信号通路激活剂，N-乙酰-半胱氨酸，烟酰胺，FGF10，EGF，HGF，[Leu15]-gastrin I，A 83-01，Y-27632的细胞培养基；其中，所述的Wnt信号通路激活剂选自：Wnt3a蛋白，Wnt3a条件培养基，CHIR，或其组合。

在一个优选例中，所述的培养基还包括选自下组的组分：N2添加物，B27添加物，血清。

在本发明的另一方面，提供用于体外扩增肝细胞及诱导肝细胞成熟的培养基，其包括所述的体外扩增肝细胞的培养基，以及Forskolin，地塞米松，制瘤素M。

在一个优选例中，所述的Wnt信号通路激活剂，N-乙酰-半胱氨酸，烟酰胺，FGF10，EGF，HGF，[Leu15]-gastrin I，A 83-01，Y-27632的细胞培养基。

在另一优选例中，所述的Wnt信号通路激活剂选自：Wnt3a蛋白，Wnt3a条件培养基，CHIR，或其组合。

在另一优选例中，所述的培养基中，还包括N2添加物，B27添加物，血清，Forskolin，地塞米松，制瘤素M。

在另一优选例中，各个组分为有效量的。

在另一优选例中，所述的细胞培养基中，所述组分存在于基础培养基中，所述基础培养基选自：DMEM、MEM、RPMI(如RPMI1640)、Neuronal basal或Fischers；较佳地，所述的DMEM选自：Advanced DMEM/F12，DMEM/F12。

在本发明的另一方面，提供前面任一所述的培养基的用途，用于体外扩增肝细胞及诱导肝细胞成熟。

在本发明的另一方面，提供用于体外扩增肝细胞及诱导肝细胞成熟的试剂盒，其中含有前面任一所述的培养基。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、HM培养基结合低氧培养可以促进人肝细胞体外长期扩增。

A、人肝细胞体外用HM培养基培养5天的定时拍照记录。比例尺，200um。

B、人肝细胞体外用HM培养基培养5天，采用IncuCyte FLR进行定时细胞融合度分析。

C、人肝细胞体外培养第3天用Brdu及Ki67细胞免疫荧光染色分析细胞增殖。小鼠肝细胞培养基YAC作为阴性对照。比例尺，100um。

D、人肝细胞体外常氧培养第2和5代及低氧(第1代起低氧)培养第6代时用 SA-β-gal染色分析细胞衰老情况。

E、低氧(第1代起就低氧)和常氧情况下不同代数肝细胞体外扩增细胞数目统计。

F、低氧(第1代起低氧)培养条件下，不同供体(供体代号：JFC、TVR、DVA、 EYP、QIE、XJL、TLY)来源肝细胞体外扩增细胞数目统计。

图2、Wnt3a是HM培养基成分中促进肝细胞增殖所必需的。

A、含有Wnt3a条件培养基的HM培养基、去除Wnt3a条件培养基的HM培养基、利用Wnt3a纯化蛋白替代Wnt3a条件培养基配置的HM培养基和利用CHIR替代Wnt3a条件培养基配置的HM培养基培养人肝细胞6天后的细胞状态照片。

B、人肝细胞在含有Wnt3a条件培养基的HM培养基、去除Wnt3a条件培养基的HM培养基、利用Wnt3a纯化蛋白替代Wnt3a条件培养基配置的HM培养基和利用CHIR替代Wnt3a条件培养基配置的HM培养基培养6天后扩增倍数。

图3、增殖的人肝细胞维持了部分成熟肝细胞功能。

A、不同代数增殖的人肝细胞(ProliHH)的肝细胞基因表达。数据以原代人肝细胞(PHH)的表达量为1进行归一化处理。P1～P4表示第1至第4代。

B、对ProliHH进行ALB和AAT免疫荧光共定位染色。比例尺，100um。

C、针对ProliHH、PHH、hiHep和hiPSC-Hep的全基因组基因表达谱进行主成分及聚类分析。

D、利用基因集富集分析(GSEA)鉴定ProliHH相对于PHH富集的基因通路。

E、ELISA方法分析不同代数ProliHH的人白蛋白分泌量。

F、分别用过碘酸-希夫染色和油红染色鉴定第4代的ProliHH的糖原贮存能力和脂滴积累能力。

图4、增殖的人肝细胞处于成熟肝细胞和肝前体细胞两者间的中间状态。

A、基于RNA测序结果分析肝前体细胞特征基因在ProliHH及PHH中的表达。

B、对ProliHH进行ALB、CK19、CK7和SOX9的免疫荧光共定位染色。比例尺，100um。

C、韦恩图分析ProliHH和LPC相对于PHH表达上调(上调倍数>＝3)的基因数目和交集。

D、聚类分析LPC富集的基因在PHH、ProliHH和LPC的表达。

E、利用基因集富集分析(GSEA)鉴定LPC富集基因集I和II中富集的信号通路。

F、针对ProliHH、PHH、hiHep和hiPSC-Hep的全基因组基因表达谱进行主成分及聚类分析。

图5、增殖的人肝细胞可以体外诱导为成熟肝细胞。

A、ProliHH进行体外诱导成熟的流程图。ProliHH先用HM进行扩增培养，然后用HIM结合3D培养条件进行体外诱导肝向成熟。

B、未经过体外诱导成熟的ProliHH和体外3D诱导成熟后的ProliHH肝脏类器官体的代表性图片。黑色箭头标示双核细胞。比例尺，100um。

C、体外肝向诱导成熟10天后ProliHH的肝细胞基因表达。数据以原代人肝细胞(PHH)的表达量为1进行归一化处理。

D、体外肝向诱导成熟10天后ProliHH的肝前体细胞基因表达。数据以HM培养的ProliHH的表达量为1进行归一化处理。

E、经体外诱导成熟后ProliHH的CYP2B6代谢活性用液相色谱一串联质谱法分析羟基安非他酮(hydroxybupropion)代谢产物进行检测。PHH作为阳性对照。

F、经体外诱导成熟后ProliHH的尿素代谢能力检测。

图6、HIM促进肝细胞成熟的关键因子鉴定。将扩增后的肝细胞ProliHH置于 3D培养条件中形成肝脏类器官体，分别用HM和HIM进行培养。通过定量PCR检测肝细胞关键代谢基因CYP3A4及肝前体基因SOX9、EPCAM、CD133、CK19、CK7 表达。

图7、增殖的人肝细胞可以体外诱导为成熟肝细胞。

A、未移植细胞和移植ProliHH和PHH的FRG小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。

B、移植ProliHH(n＝4)和PHH(n＝6)后FRG小鼠的体重变化曲线。

C、未移植细胞而濒死(n＝3)、移植ProliHH(n＝3)及PHH(n＝4)而存活的FRG小鼠血清中ALT、AST和TBIL水平。

D、ELISA检测移植ProliHH(n＝4)及PHH(n＝5)后FRG血清中人白蛋白分泌量的动态变化。

E、移植ProliHH(n＝4)及PHH(n＝5)而存活4个月小鼠血清中人白蛋白分泌量。

F、移植ProliHH及PHH而存活4个月小鼠肝脏Fah免疫组化染色。

G、以Fah免疫组化染色对ProliHH及PHH在FRG肝脏中的再殖效率进行定量分析。

图8、增殖的人肝细胞移植后在体内肝功能完全成熟。

A、体内再殖的ProliHH进行Fah、ALB、HNF4a、CK19和CK7免疫荧光共定位染色。

B、Fah、CYP3A4和GS免疫荧光共定位染色分析肝脏代谢基因区域化表达。

C、成熟肝细胞功能基因如I、II相代谢酶和转运体在体外的PHH、ProliHH和体内再殖的PHH、ProliHH中的表达比较。

D、体外的PHH、ProliHH和体内再殖的PHH、ProliHH的全基因组表达谱相似性分析。

E、移植ProliHH的FRG小鼠进行人特异CYP2D6药物代谢能力分析。对照FRG 小鼠(n＝3)和移植ProliHH(n＝3)FRG小鼠在注射2mg/kg DEB 0-2小时后进行血清中 DEB和4-OHDEB浓度检测。

图9、增殖的人肝细胞体内无成瘤风险。2x10⁶的ProliHH(n＝8)和肝癌细胞系Snu-398(n＝6)注射到严重免疫缺陷的NOD-SCID小鼠腹股沟皮下，两个月后观察肿瘤形成情况。

具体实施方式

本发明人以人肝细胞在再生中的可塑性为理论基础，建立一种重编程人肝细胞为可增殖的处于成熟肝细胞和肝前体细胞之间的中间态细胞的培养体系，并在动物体内验证其肝脏再殖能力，从而解决具有肝脏再殖能力人肝细胞来源匮乏的问题。本发明的方法不需要在肝细胞内导入外源基因，常规培养即可实现肝细胞的扩增，所获得的肝细胞可传代；还可继续成熟培养，以获得功能性人肝成熟细胞。并且，所述方法培养条件简单，成本低廉且安全稳定。

如本发明所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成 (制成)”、“基本上由……构成”和“由……构成”。

除非另外说明，本发明中培养对象为肝细胞，特别是原代肝细胞，更特别是人肝细胞、人原代肝细胞。

培养方法

本发明公开了体外扩增肝细胞的方法：将肝细胞在本发明的“肝细胞培养基(体外扩增培养基)”中培养，从而获得大量处于成熟肝细胞和肝前体细胞之间的中间态细胞。在本发明的一些实施例方式中，观察到其表达表达肝前体细胞相关标志蛋白 SOX9、CK19和CK7，其ALB、HNF4A、TTR或CYP3A4表达水平低于原代肝细胞，其CYP1A2、CAR、C3或UGT1A1表达水平接近或高于原代肝细胞。这些细胞可进一步诱导为肝成熟细胞。

所述体外扩增肝细胞的方法，包括：以含有Wnt信号通路激活剂的细胞培养基培养肝细胞，使之体外扩增。所述的Wnt信号通路激活剂包括选自下组的激活剂： Wnt3a蛋白，Wnt3a条件培养基，CHIR，或其组合。所述的Wnt信号通路激活剂是本发明的方法的较为关键的因子。本发明人的实验结果显示，若是培养基中不含有Wnt信号通路激活剂，则无法发获得良好的扩增。

作为本发明的优选方式，所述的细胞培养基中还含有选自下组的成分：N-乙酰 -半胱氨酸，烟酰胺，FGF10，EGF，HGF，[Leu15]-gastrin I，A 83-01，Y-27632的细胞培养基，N2添加物，B27添加物，血清。在最为优选的方式中，所述细胞培养基中含有所有的上述成分。

作为本发明的优选方式，所述方法还包括：将扩增的肝细胞诱导为成熟肝细胞，包括在本发明的“肝细胞诱导培养基(肝向成熟培养基)”中培养，与所述的体外扩增培养基相比，该肝向成熟培养基中还添加了Forskolin，地塞米松，制瘤素M。在本发明的一些实施例方式中，观察到这些细胞具有成熟肝细胞所特有的典型多边形和双核，其肝前体基因如SOX9、CK19或CK7低表达，参与药物和尿素代谢的关键基因高表达，CYP2B6和尿素代谢能力增加。

本发明人在研究中意外地发现，低氧处理有利于增加本发明培养的肝细胞传代此处。因此，在本发明的优选方式中，在低氧条件下进行传代培养，所述的低氧为按照体积比氧气含量0～15％；较佳地，氧气含量低于10％，更佳地，氧气含量低于6％。

运用本发明的培养方法以及培养基，可以通过二维或三维培养体系培养。作为本发明的优选方式，所述的培养为三维条件下的培养。

本发明的方法所获得的肝成熟细胞可冻存、复苏、传代、长时间维持培养。此外，还应理解，本发明中作为出发菌株的肝细胞(原代肝细胞)，可以为建系的原代肝细胞，或者可以为生物体分离的。

培养基

本发明人提供了用于体外扩增肝细胞的培养基。所述的培养基包括“体外扩增培养基”和“肝向成熟培养基”。

所述的体外扩增培养基包括：Wnt信号通路激活剂，还包括还含有选自下组的成分：N-乙酰-半胱氨酸，烟酰胺，FGF10，EGF，HGF，[Leu15]-gastrin I，A 83-01， Y-27632，N2添加物，B27添加物，血清。可以使得肝细胞良好地增殖。

所述的肝向成熟培养基为在所述的体外扩增培养基的基础上，添加Forskolin，地塞米松，制瘤素M。

应理解，除了本发明实施例中所列举的具体Wnt信号通路激活剂以外的其它可激活Wnt信号通路的激活剂也可实现同样的技术效果，也应被包含在本发明中。优选地，所述的Wnt信号通路激活剂包括选自下组的激活剂：Wnt3a蛋白，Wnt3a条件培养基，CHIR，或其组合。

同样，上述具体列举的成分的类似物、同功能蛋白(如生长因子的同功能蛋白) 或化合物、诱导相同靶点的等效化合物、类似物、衍生物和/或它们的盐、水合物或前体，也可用于替换上述具体列举的成分，以实现同样的技术效果。这些类似物、同功能蛋白或化合物也应被包含在本发明中。化合物的类似物包括但不限于：化合物的异构体、外消旋体。化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。所述的“盐”包括但不限于：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸等。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐等。所述的“化合物的前体”指当用适当的方法施用或处理后，该化合物的前体在培养基中可转变成上述任一化合物的一种化合物，或上述任一化合物的一种化合物所组成的盐或溶液。

作为本发明的优选方式，所述的培养基中还加入用于预防细胞培养的细菌污染，特别是革兰氏阳性和阴性细菌污染的成分。较佳地，加入青链霉素(如1％；其中百分含量还可上下浮动50％；较佳地上下浮动30％；更佳地上下浮动20％，如10％， 5％)。

所述的基础细胞培养基可以是但不限于：DMEM/F12、MEM、DMEM、RPMI1640、Neuronal basal或Fischers等。应理解，本领域技术人员熟悉所述的基础细胞培养基的配制或购买途径，因此，基础细胞培养基并不限于本发明中所举例的这些。

本发明还提供了一种试剂盒，其中含有本发明所述的“体外扩增培养基”或“肝向成熟培养基”。较佳地，所述试剂盒中还包含使用说明书，从而便于本领域人员在研究中或在临床上应用。

培养的肝细胞及组合物

基于本发明的新发现，提供了一种由本发明所述的方法获得的肝细胞培养物或从该肝细胞培养物中分离纯化的肝细胞，包括处于成熟肝细胞和肝前体细胞之间的中间态细胞，或进一步诱导获得的成熟肝细胞。

从细胞培养物中富集或分离纯化细胞的方法也是本领域人员熟知的，例如可基于肝细胞的上皮样形态特征来进行富集；或基于肝细胞所表达的特殊蛋白(如Albumin等)或分子标记来选择收集(例如采用特异性抗体或配体)。另外，通过去除 (如消化、裂解)非上皮样形态的其它细胞来富集肝细胞也是一种可行的方法。作为一种可选的实施方式，可利用流式细胞分选技术，通过肝细胞表面的分子标记，将细胞分离纯化出来。

本发明培养的肝细胞有着多方面的用途。包括但不限于：用于制备促进肝脏再生的组合物(药物组合物)；用于制备治疗肝损伤(包括但不限于：终末期肝病、肝硬化、酒精肝、糖尿病、肥胖、急性肝衰竭、肝炎、肝纤维化、肝癌、肝脏代谢疾病或肝功能衰竭导致的肝损伤)的组合物(药物组合物)；用于作为体外模型，进行肝脏相关疾病或药物疗效的研究，例如用于研究药物运输、药物代谢、肝形成，肝再生，用于肝毒性测试、筛选肝细胞毒性化合物、筛选调节肝细胞功能化合物，用于产生 Albumin蛋白等。

本发明培养的肝细胞可用于肝毒理研究，也可应用于细胞移植治疗肝病、生物人工肝脏构建、新药肝毒检测、药效评估、药靶鉴定；可为生物、医学、药学的基础研究和临床应用提供充足的肝细胞来源或肝细胞模型；其诱导分化过程也可为人类肝脏细胞发育分化过程提供最佳研究平台，应用前景十分广阔。

在需要的情况下，本发明培养的肝细胞还可进一步被应用于基因工程重组，形成重组的细胞，例如为了赋予细胞进一步的功能或特征，在细胞中转入外源的基因表达盒，或对细胞的基因组进行基因敲除或基因编辑等。

本发明还提供了一种组合物(药物)，所述组合物含有：有效量的所述的肝细胞(如1×10⁴-1×10¹²个；较佳的1×10⁵-1×10¹⁰个)；以及药学上可接受的载体。其含有有效量的所述的肝细胞以及药学上可接受的载体。所述的组合物对于动物没有可见的毒性和副作用。

所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。

本发明还提供了一种促进肝脏再生的方法，所述方法包括：给予需要治疗的对象有效量的本发明培养的肝细胞。

所述组合物在用于给药时，通常1×10²-1×10¹⁰个细胞/kg体重，较佳的 1×10³-1×10⁸个细胞/kg体重是适合的，这还取决于临床医师的诊断以及患者的症状轻重。

本发明还提供了一种药盒，其中含有本发明培养的肝细胞或含有该肝细胞的组合物。较佳地，所述药盒中还包含使用说明书，从而便于本领域人员在研究中或在临床上应用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社， 2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

1、实验材料

1.1肝细胞培养基

肝细胞培养基(体外扩增培养基，HM)的配方及来源见表1。其中，各配方的工作浓度即为它们在培养基中的终浓度。

表1

*此成分可以用30％Wnt3a条件培养基或者0.1uM CHIR进行替代。其中Wnt3a 条件培养基取自L-Wnt3a细胞系(获自Hubrecht Institute的Hans Clevers实验室)培养两天产生的细胞上清。

1.2肝细胞诱导培养基

肝细胞诱导培养基(肝向成熟培养基，HIM)的配方及来源见表2。其中，各配方的工作浓度即为它们在培养基中的终浓度。

表2

*此成分可以用30％Wnt3a条件培养基或者0.1uM CHIR(CHIR99021)进行替代。其中Wnt3a条件培养基取自L-Wnt3a细胞系(获自Hans Clevers实验室)培养两天产生的细胞上清。

1.3对照培养基：培养基YAC

作为对照的YAC的配方：

1.4细胞

不同批号人肝细胞购于美国Celsis In Vitro Technologies(Blatimore，MD)公司。 L-Wnt3a细胞系获自Hans Clevers实验室。Snu-398细胞系购于美国ATCC细胞库。

1.5动物

Fah^-/-Rag2^-/-IL2rg^-/-(FRG)小鼠：延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)基因剔除小鼠(简称Fah^-/-小鼠)于1993年建立。Fah^-/-小鼠因不能进行完全的酪氨酸代谢而在肝脏中积累丁二酰，从而造成肝实质细胞的死亡。在饮用水中添加NTBC饲养的Fah^-/-小鼠与野生型小鼠表型无明显区别、肝功能正常并可正常发育和繁殖，但在停止喂食NTBC后将在4～6周内因肝功能衰竭而死亡。Fah^-/-小鼠存在广泛而持续的肝损伤，其肝脏微环境特别适合于移植细胞的增殖，野生性肝细胞(FAH基因表达正常) 经脾脏移植后几乎可以完全重建Fah^-/-小鼠的肝脏(90％以上)，受体小鼠恢复正常的肝功能。将Fah^-/-小鼠和Rag2^-/-IL2rg^-/-免疫缺陷小鼠杂交后，获得三基因敲除的 Fah^-/-Rag2^-/-IL2rg^-/-小鼠(FRG小鼠)。FRG小鼠缺少成熟的T、B细胞及NK细胞，当移植人肝细胞后，可以获得很高程度(>90％)的人肝细胞再殖。

2实验方法

2.1人肝细胞培养

从美国Celsis In Vitro Technologies(Blatimore，MD)公司购买冻存的人肝细胞。冻存的人肝细胞使用含有10％血清的DMEM培养基复苏，按照2×10⁴细胞/cm²的密度种植于包被I型胶原的培养板中，培养板放入37℃，5％CO₂，5％O₂培养箱中培养，在培养1天后培养换成肝细胞培养基培养，每隔3天更换细胞培养基。在细胞培养6天后，长满的细胞使用胰酶消化，再次按照3×10⁴细胞/cm²的密度种植于包被 I型胶原的培养板中，培养板放入37℃，5％CO₂，5％O₂培养箱中培养。

2.2增殖肝细胞的肝向诱导实验

增殖的人肝细胞培养长满后，细胞使用胰酶消化，使用肝细胞培养基重悬细胞，按照5×10⁵细胞/孔的密度种植于日本Elplasia公司的非贴附24孔板中，1天后细胞培养基换成肝细胞肝向诱导培养基，细胞会慢慢聚合成细胞球。培养基每隔2天换液，细胞诱导10天后收集诱导后的细胞。

2.3细胞培养、拍照

冻存的人肝细胞使用含有10％血清的DMEM培养基复苏，按照2×10⁴细胞/cm2 的密度种植于包被一型胶原的六孔板中。在细胞贴壁后，培养基换成肝细胞培养，细胞板放入incuCyte FLR仪器的37℃，5％CO2培养箱中培养，细胞连续培养3天，同一视野下细胞每隔30分钟拍照一组。细胞培养增殖的视频由软件生成。

2.4基因表达检测

1)利用Trizol(Invitrogen)或者RNeasy FFPE Kit(Qiagen)试剂抽提细胞RNA。

2)Trizol提取的RNA取1ug，RNeasy FFPE Kit提取RNA根据具体数值取1ug或全部，用M-MLV反转录酶(Promega)试剂盒获得cDNA。

3)采取SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)试剂盒进行实时定量PCR，利用ABIStepOnePlus real-time PCR system(Applied Biosystems)检测基因表达。所有的Q-PCR数据至少有两次重复，引物序列被提供在表3。

表3

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2.5人白蛋白ELISA检测

采用ALB ELISA试剂盒(Bethyl Laboratories)进行检测。

2.6尿素检测实验

为了检测培养细胞的尿素分泌能力，细胞24小时的细胞培养上清被收集，使用Abnova公司生产的尿素检测试剂盒，根据其实验操作过程进行实验。

2.7 PAS染色与油红染色

细胞的PAS(Periodic Acid-Schiff stain)染色是按照Sigma公司的实验试剂盒使用。细胞油红染色，将细细胞吸去细胞培养基，PBS洗一遍。加入4％多聚甲醛固定细胞30min，吸去多聚甲醛，PBS洗3遍。按照Oil Red O(Sigma-Aldrich)染色10分钟，使用70％乙醇溶液清洗两次，显微镜下观察拍照。

2.8衰老相关的β-半乳糖苷酶染色

细胞衰老相关的β-半乳糖苷酶染色，将细胞板中细胞吸去细胞培养基，PBS洗一遍。加入4％多聚甲醛固定细胞，5分钟，吸去多聚甲醛，PBS洗3遍。按照β-半乳糖苷酶染色试剂盒(Beyotime)的使用说明操作，显微镜下观察拍照。

2.9 CYP2B6代谢实验

为了检测增殖的人肝细胞的CYP2B6代谢能力，细胞在经过肝向诱导10天后，将其与新鲜复苏的人肝细胞分别用含有100um安非他酮的培养基孵育，分别取孵育不同时间点的培养上清。将细胞上清交与瑞德肝脏公司使用质谱检测CYP2B6代谢产物的生成量。产物以商业化的标准品绘制标准曲线。

2.10 RNA测序过程

根据实验流程利用Trizol(Invitrogen)试剂抽提细胞RNA。用Illumina TraseqRNA 样品预处理试剂盒从1微克总RNA中制备测序文库。在Illumina HISEQ 2000测序仪上进行单端100bp的读长度测序。使用Tophat将reads数影射到人类参考基因组 (HG19)。使用Cufflinks在默认参数情况下计算UCSC基因的FPKM(每个千百万个片段的百万分之一的外显子片段映射)。FPKM被转化Log2为下游基因分析。对于基因表达，进行单因素方差分析，以识别差异表达基因(DEGS)。每个分析需要计算P值和变化倍数。使用基于PartekGenomics Suite 6.6.的选择的探针集的平均连锁聚类的 Euclidean距离进行分类或整体基因的无差别聚类和热图生成。

2.11信号通路富集分析

基因集富集分析(GSEA)用于DEGs途径富集。对于DEGs列表，使用了在线 MSIGDB工具(http://Studio.Org/gSe/MSigDb/index.jsp)。GSEA V2桌面软件也被用来识别从RNASEQ结果显著富集的途径。

2.12细胞移植Fah^-/-Rag2^-/-IL2rg^-/-小鼠

1)移植细胞前6天，通过撤去饮水中NTBC浓度造成小鼠肝脏损伤。

2)小鼠脾脏侧朝上，在肋骨以下1-2cm处剪开表皮和肌肉层。找到附着在脾脏上的褐色脂肪，将其拉出即可牵引出脾脏。将脾脏前端用线轻轻结扎。

3)用胰岛素针取5×10⁵proliHHs或人原代肝细胞(100ul左右)，针头插入脾脏，超过结扎位置。注射完成后，停顿30-60秒，然后拔出针头，将线扎紧，防止液体回流。

4)将脾脏放入腹腔，缝合肌肉及表皮，用酒精棉消毒伤口后，放入笼中。移植后每周记录体重及死亡状况。未移植细胞，体重下降30％的小鼠作为阴性对照。

5)存活至12周的小鼠处理并收集肝脏、血液样本用于后续分析。

2.13皮下成瘤实验

1)将ProliHH和肝癌细胞系Snu398消化，取2×10⁶细胞直接注射到免疫缺陷 NOD-SCID小鼠的腹股沟处。

2)2个月后，观察小鼠成瘤情况并拍照记录

2.14统计学分析

利用GraphPad Prism 5软件进行全文统计学分析。计算大鼠原代肝细胞移植后动物生存曲线时采用双尾的Log-rank test。样品血清学数据统计采用非成对Student’s T-test。图中数据展示方式为平均值±标准误。*表示P<0.05，为显著性差异。

实施例1、HM培养基结合低氧培养可以促进人肝细胞体外长期扩增

通过培养基配方的筛选及优化，本发明人获得了一种可以促进人肝细胞体外扩增的培养基，并命名为HM培养基。将人肝细胞按照1×10⁵细胞/孔，铺于6孔板，加入HM培养基进行培养。在活细胞工作站中实时观察，可以发现人肝细胞在第2 天细胞形态上发生了上皮细胞-间充质转化，紧接着在第2天至第3天细胞发生大量增殖(图1A和B)。在第3天时进行ki67染色可以发现80％的细胞处于增殖状态，3 小时的Brdu孵育进一步显示20％的肝细胞存在细胞复制(图1C)。而之前报道能诱导小鼠肝细胞增殖的培养基YAC中，人肝细胞极少增殖和复制(图1C)。

将扩增后的人肝细胞进行连续传代发现，在常氧(20％)的培养条件下肝细胞在第5代时停止增殖而且有72％的细胞呈现SA-β-gal阳性，说明人肝细胞因细胞衰老而停止增殖(图1D和E)。本发明人意外地发现，通过将肝细胞置于低氧(5％(v/v))中显著抑制了肝细胞的衰老并且延长传代次数(图1D和E)。此外，7个不同供体肝细胞在 HM培养基结合低氧下可以持续扩增，进一步证实了该培养方法的普适性(图1F)。

以上结果证明，HM培养基可以促使人肝细胞在体外持续增殖；进一步地结合低氧处理可以促进这种体外持续增殖。

实施例2、Wnt3a是HM培养基成分中促进肝细胞增殖所必需的

HM培养基含有多种生长因子和小分子化合物，本发明人发现，当去除Wnt3a 条件培养基后，人肝细胞无法扩增(图2A和B)。

当采用50ng/ml的Wnt3a纯化蛋白或者Wnt信号通路激活剂CHIR(0.1uM)替代Wnt3a条件培养基后，人肝细胞也可以扩增，并且在细胞形态和扩增倍数上两者相似 (图2A和B)。

上述结果证明，HM培养基中Wnt信号通路激活剂是肝细胞增殖所必需的，该 Wnt信号通路激活剂可以是Wnt3a条件培养基，Wnt信号通路的激活蛋白或者小分子。

实施例3、增殖的人肝细胞维持了部分成熟肝细胞功能

人肝细胞经HM培养基培养后维持了成熟肝细胞基因的表达，在表达水平上与原代人肝细胞(PHH；新鲜复苏未培养的人原代肝细胞)有所差异，如ALB、HNF4A、 TTR和CYP3A4表达水平低于PHH，而CYP1A2、CAR、C3和UGT1A1表达水平接近或高于PHH(图3A)。免疫荧光染色进一步显示超过97％的增殖人肝细胞(ProliHH) 表达成熟肝细胞标志蛋白ALB和AAT(图3B)。为分析ProliHH的肝细胞基因维持的水平，本发明人比较了PHH、ProliHH和胚胎干细胞分化来源和纤维细胞转分化来源的类肝细胞(HLC；胚胎干细胞分化和纤维细胞转分化得到的类肝细胞)在转录组水平的差异。通过主成分分析和聚类分析显示ProliHH与PHH更加接近，而远离HLC(图 3C)。这就说明ProliHH比HLC在肝细胞基因表达上更加成熟。基因集富集分析(GSEA) 显示，ProliHH比HLC在药物、胆酸盐、脂肪酸和尿素代谢信号通路基因表达上更加富集(图3D)。和肝基因表达一致的是，ProliHH维持着高水平的ALB蛋白分泌、糖原积累和脂滴合成(图3E和F)。

上述结果证明，增殖人肝细胞维持了部分成熟肝细胞的功能。

实施例4、增殖的人肝细胞处于成熟肝细胞和肝前体细胞两者间的中间状态

人肝细胞经HM培养基培养后获得了肝前体细胞相关基因的表达，如SOX9、 EPCAM、CD44、CD133、CK19和CK7(图4A)。免疫荧光染色进一步显示超过97％的ProliHH表达肝前体细胞相关标志蛋白SOX9、CK19和CK7(图4B)。为分析ProliHH 和肝前体细胞(LPC；人胚胎干细胞体外分化获得的肝前体细胞)的相似性，本发明人比较了PHH、ProliHH和胚胎干细胞分化来源的LPC在转录组水平的差异。相对于 PHH，3482个基因在LPC中高表达(图4C)。而这其中的1652个(47.4％)基因同样在 ProliHH中上调表达(图4C)。这就暗示ProliHH在培养过程中整个转录组水平获得了大量肝前体细胞富集基因的表达。将PHH、ProliHH和LPC的差异基因表达谱进行分析发现，LPC富集的基因可以分成3个集合(图4D)。集合1和2的基因为PHH低表达、LPC高表达而ProliHH随着培养过程逐步上调表达。基因集富集分析显示集合1和2的基因主要富集在干细胞和细胞周期相关通路(图4E)。集合3的基因为PHH 低表达、LPC高表达而ProliHH随着培养过程并未显著上调的基因，如DLK1、KIT 和FOXJ1等之前报道的肝前体基因(图4D)。但从整个转录组分析可以发现，ProliHH表达谱更接近与PHH，而区分于LPC(图4F)。这些结果说明，ProliHH在培养过程中获得了大量肝前体细胞相关基因，但并未完全建立肝前体细胞整个表达谱。

因此，ProliHH处于一种成熟肝细胞和肝前体细胞之间的双表型(bi-phenotypic)的中间状态。

实施例5、增殖的人肝细胞可以体外诱导为成熟肝细胞

增殖的人肝细胞在体外扩增中下调了部分成熟肝基因的表达，而上调了肝前体相关基因的表达。为检测其能否体外诱导为成熟肝细胞，本发明人将ProliHH置于三维培养系统中并加入肝向成熟培养基(HIM)培养10天(图5A)(常氧)。在诱导成熟后，ProliHH具有成熟肝细胞所特有的典型多边形和双核(图5B)。除细胞形态上变化，肝细胞基因如ALB、TTR、HNF4A和AAT也显著上调，而肝前体基因如SOX9、CK19 和CK7显著下调(图5C)。更重要的是，参与药物和尿素代谢的关键基因也在诱导成熟后显著上调，相应地CYP2B6和尿素代谢能力也明显增加(图5D-F)。

以上结果说明，增殖的人肝细胞在体外肝向诱导成熟体系中可以被诱导为成熟肝细胞。

实施例6、促进代谢成熟和抑制前体基因表达的关键因子

将扩增后的肝细胞置于3D培养条件中形成肝脏类器官体，分别用HM和HIM 进行培养。通过定量PCR检测肝细胞关键代谢基因CYP3A4及肝前体基因SOX9、 EPCAM、CD133、CK19、CK7表达。

肝向成熟培养基(HIM)是由HM培养基加入Forskolin、DEX和OSM组成。将扩增后的肝细胞3D成球培养后，用HM和HIM进行培养。通过基因表达分析可以发现，HIM培养的肝脏类器官体中CYP3A4显著高于HM培养的肝脏类器官体，而肝前体基因如CD133，CK19等在HIM培养的肝脏类器官体中表达更低，如图6。

以上结果证明，Forskolin、DEX和OSM是肝向成熟培养基中促进肝细胞代谢成熟和抑制前体基因表达的关键因子。

实施例7、增殖的人肝细胞可以用于细胞移植治疗肝脏疾病

为证明增殖的人肝细胞可以用于细胞移植治疗肝脏疾病，本发明人将其移植到Fah^-/-Rag2^-/-IL2rg^-/-(FRG)小鼠。FRG小鼠是模拟人类I型酪氨酸血症的免疫缺陷小鼠模型。FRG小鼠需要在饮水中添加2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲醇)-1,3-环己二酮(NTBC)维持生存。当撤去NTBC小鼠会在4-6周内因肝脏衰竭死亡，而人类原代肝细胞可以在FRG肝脏中高效地再殖并拯救FRG小鼠免于肝衰竭。因此FRG小鼠是很好的验证人肝细胞体内功能的模型。

移植ProliHH的方法：移植细胞前6天，通过撤去饮水中NTBC浓度造成FRG 小鼠肝脏损伤。将5x10⁵人原代肝细胞PHH和扩增后的肝细胞ProliHH经脾移植到 FRG小鼠中。

未移植细胞的6只FRG小鼠中有5只在撤去NTBC水7周后死亡，而移植原代人肝细胞的7只小鼠中有5只能存活，显著提升了小鼠的存活率(图7A)。更重要的是，移植ProliHH的14只小鼠中有11只能存活超过4个月。移植ProliHH的小鼠在移植后前4周体重下降，但后续体重上升并维持稳定(图7B)。这说明移植ProliHH可以恢复FRG小鼠受损肝脏的肝功能。血清学检测进一步证实肝功能的恢复。相对于未移植而濒死的FRG小鼠，移植ProliHH后小鼠肝功能指标如ALT、AST和TBIL等显著下调，恢复到和移植PHH小鼠相当的水平(图7C)。小鼠血清中的人白蛋白分泌量在ProliHH移植后也逐步提高，并在移植后4个月达到5.8±4.5mg/ml(图7D和E)。该人白蛋白分泌水平达到了人原代肝细胞移植FRG小鼠后的水平(7.3±6.1mg/ml)(图 7D和E)。存活4个月的小鼠肝脏进行切片Fah免疫组化染色显示ProliHH在肝脏中的整合比例达到了64±21.8％(图7F和G)。同期移植PHH的整合比例为70.4±21.5％，说明ProliHH在体内的移植整合能力和PHH相当(图7F和G)。

以上结果说明，ProliHH可以高效再殖FRG小鼠肝脏，并对肝脏损伤具有治疗作用。

实施例8、增殖的人肝细胞移植后在体内肝功能完全成熟

增殖的人肝细胞ProliHH在体外扩增中上调了肝前体相关基因的表达。为检测其能否体内诱导为成熟肝细胞，本发明人对整合到FRG小鼠肝脏中的ProliHH进行分析鉴定。免疫荧光染色显示，体内的ProliHH表达成熟肝细胞标志蛋白ALB、FAH、 HNF4A和CYP3A4，而不表达肝前体细胞相关基因CK19和CK7(图8A和B)。利用人特异的肝基因引物进行qPCR检测显示，成熟肝细胞基因如I、II相代谢酶和转运体蛋白在体内ProliHH表达显著高于体外培养的ProliHH(图8C)。总体转录组分析显示体内的ProliHH与PHH具有极高的相似度(r²＝0.94)，从而说明ProliHH在体内肝细胞基因表达接近PHH的表达(图8D)。

为证明移植到体内的ProliHH具有成熟肝细胞代谢功能，本发明人在移植小鼠中检测了人类CYP2D6特异的药物代谢。异喹胍(DEB)作为人CYP2D6的代谢底物，不能被小鼠肝细胞代谢，只能被人肝细胞代谢为4-羟基异喹胍(4-OH-DEB)。移植 ProliHH的FRG小鼠灌胃DEB药物后，在其血清中可以检测到代谢产物4-OH-DEB 升高(图8E)。而对照组未经移植的FRG小鼠的4-OH-DEB一直处于本底水平(图8E)。这说明ProliHH在体内完全成熟具有人特异药物代谢能力。

以上结果显示，增殖的人肝细胞在肝脏体内大量再殖后可被诱导为成熟肝细胞。

实施例8、增殖的人肝细胞体内无成瘤风险

增殖的人肝细胞在体外培养后具有持续扩增的能力。为检测扩增后的ProliHH是否具有体内成瘤的风险，本发明人将2x10⁶的ProliHH和肝癌细胞系Snu-398注射到严重免疫缺陷的NOD-SCID小鼠皮下。两个月后，注射Snu-398的6只小鼠全部成瘤而注射ProliHH的8只小鼠都未能形成肿瘤(图9)。

以上结果说明，增殖的人肝细胞在体内无成瘤风险。

实施例9、以HM2～3和HIM2～3的体外扩增

为了验证HM培养基的作用，本发明人配制了体外扩增培养基HM2～3和肝向成熟培养基HIM2～3，具体如表4和表5。

表4

表5

以人原代肝细胞作为出发细胞，进行如实施例1的常氧培养，不同之处仅在于将实施例1中的HM培养基替换为HM2。结果发现，在常氧条件下，人肝细胞在第2 天细胞形态上发生了上皮细胞-间充质转化，紧接着在第2天至第3天细胞发生大量增殖；且增殖的人肝细胞处于成熟肝细胞和肝前体细胞两者间的中间状态。

以人原代肝细胞作为出发细胞，进行如实施例1的常氧培养，不同之处仅在于将实施例1中的HM培养基替换为HM3，以及将低氧条件替换为7％。结果发现，在低氧条件下，人肝细胞发生大量增殖；且增殖的人肝细胞处于成熟肝细胞和肝前体细胞两者间的中间状态，传代次数可多于6次。

以ProliHH作为出发细胞，进行如实施例5的培养，不同之处仅在于将实施例5 中的HIM培养基替换为HIM2。结果发现，在诱导成熟后，ProliHH具有成熟肝细胞所特有的典型多边形和双核；肝细胞基因如ALB、TTR、HNF4A和AAT也显著上调，而肝前体基因如SOX9、CK19和CK7显著下调。

以ProliHH作为出发细胞，进行如实施例5的培养，不同之处仅在于将实施例5 中的HIM培养基替换为HIM3。结果发现，在诱导成熟后，ProliHH具有成熟肝细胞所特有的典型多边形和双核；肝细胞基因如ALB、TTR、HNF4A和AAT也显著上调，而肝前体基因如SOX9、CK19和CK7显著下调。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 肝细胞的体外扩增培养方法及应用

<130> 188100

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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gcctttgctc agtatctt 18

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<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 42

gtctgcggga tggaaggga 19

<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 43

catgctggga agatactgtt gat 23

<210> 44

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 44

gcccgagact aacaaaagac tct 23

<210> 45

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 45

ctgcccgtat gtccacctg 19

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 46

agctcctcga cgtagtagag a 21

<210> 47

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 47

gaagcacgcc accaagac 18

<210> 48

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 48

cagggtccaa atcccagaa 19

<210> 49

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 49

aaggtgctgg tgtgggcag 19

<210> 50

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 50

agcggatgag ttgttggga 19

<210> 51

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 51

atgtctgccc tcggagtca 19

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 52

cgatgatggg aagcgggaaa 20

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 53

accatggaca agttttggtg 20

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 54

gaaagccttg cagaggtcag 20

<210> 55

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 55

gaagcatggg gacgacct 18

<210> 56

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 56

cacgagcatc cttgagcg 18

<210> 57

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 57

aatctggcct gtggcgttaa t 21

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 58

gtagttgcga gtgcagtgga 20

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 59

aaccagacag agccgtacta 20

<210> 60

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 60

gcatagcgga ggatgacata aa 22

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 61

taaccctgct cggtcctttg 20

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 62

ccaccctgga gttgatgtcg 20

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 63

ctggactggg cactcttgtc 20

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 64

ctcctaccat ccccttcctc 20

<210> 65

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 65

ccgcagtcag atcctagcg 19

<210> 66

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 66

aatcatccat tgcttgggac g 21

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 67

tactgaggag ccagcgtcta 20

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 68

tgcacgggtc gggtgagagt 20

<210> 69

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 69

agtggcactg ctgctcct 18

<210> 70

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 70

ggatttgtca ctgttcagc 19

Claims

1.一种体外扩增肝细胞的方法，包括：以含有Wnt信号通路激活剂的细胞培养基培养肝细胞，在氧气含量1～15%低氧条件下培养，使之体外扩增；所述的细胞培养基由基础培养基及Wnt信号通路激活剂、N-乙酰-半胱氨酸、烟酰胺、FGF10、EGF、HGF、[Leu¹⁵]-gastrin I、A83-01、Y-27632、血清、N2添加物和B27添加物组成，所述Wnt信号通路激活剂选自Wnt3a蛋白或CHIR；组分浓度如下：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞培养基中，以选自下组的培养基作为基础培养基：DMEM、MEM、RPMI、Neuronal basal、Fischers、Advanced DMEM/F12或DMEM/F12。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将扩增的肝细胞诱导为成熟肝细胞，包括：在所述的细胞培养基中添加Forskolin，地塞米松和制瘤素M：

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的细胞培养基中：

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组分的浓度为：

6.如权利要求1～5任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将扩增的肝细胞进行传代培养。

7.如权利要求1～5任一所述的方法，其特征在于，按照体积比氧气含量1～10%。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，按照体积比氧气含量1～6%。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养为三维条件下的培养。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肝细胞为人肝细胞。

11.权利要求1～10任一所述的方法的用途，用于体外制备肝细胞培养物或分离纯化的肝细胞，所述肝细胞培养物或分离纯化的肝细胞用于：

制备促进肝脏再生的药物；或

用于制备预防、缓解或治疗肝脏疾病的药物组合物或药盒；或

用于作为体外模型，进行肝脏相关疾病或药物的研究；或

用于制备体内细胞移植的组合物；或

用于产生Albumin蛋白。

12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的肝脏相关疾病或药物的研究包括：研究药物运输、药物代谢、肝形成、肝再生；或肝毒性测试、筛选肝细胞毒性物质、筛选调节肝细胞功能的物质。

13.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的肝细胞培养物或分离纯化的肝细胞存在于药学上可接受的载体中。

14.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的肝细胞培养物或分离纯化的肝细胞置于药盒中。

15.培养基的用途，用于体外扩增肝细胞；所述培养基由基础培养基及Wnt信号通路激活剂，N-乙酰-半胱氨酸，烟酰胺，FGF10，EGF，HGF，[Leu15]-gastrin I，A 83-01，Y-27632，血清，N2添加物和B27添加物组成；其中，所述的Wnt信号通路激活剂选自Wnt3a 蛋白或CHIR；组分浓度如下：

16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述基础培养基选自：DMEM、MEM、RPMI、Neuronal basal、Fischers、Advanced DMEM/F12或DMEM/F12。

17.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述组分在细胞培养基中的浓度为：

18.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述培养基被置于试剂盒中，所述试剂盒用于体外扩增肝细胞。