WO2019022521A2 - 혈관 내 생리활성물질 전달용 조성물 - Google Patents

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WO2019022521A2
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    • A61L24/02—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices containing inorganic materials

Definitions

  • the present invention relates to a composition for delivering an intravascular bioactive substance.
  • a drug delivery system means a pharmaceutical technology that minimizes adverse effects of existing drugs and maximizes efficacy and efficacy so as to efficiently deliver necessary amounts of drugs such as proteins, nucleic acids, or other small molecules.
  • This technology which reduces the cost and time required for the development of new drugs, has recently become a field of advanced technology that creates new added value in medicine by combining with nanotechnology. The company has focused on the development of new drugs and the development of drug delivery systems.
  • An object of the present invention is to provide a composition for embolization comprising porous silica particles having biodegradability and sustained release properties.
  • a porous silica particle comprising a porous silica particle having a zeta potential of +3 mV or higher or -18 mV or lower,
  • the particles are chemically modified on the surface or inside of the pores.
  • the particles may be formed such that at least a part of the silanol groups in the surface or the pores are bonded to at least one of aldehyde group, keto group, carbamate group, sulfate group, sulfonate group, amino group, amine group, aminoalkyl group, silyl group, carboxyl group, , An ammonium group, a sulfhydryl group, a phosphate group, an ester group, an imide group, a thioimide group, a keto group, an ether group, an indene group, a sulfonyl group, a methylphosphonate group, a polyethylene glycol group, At least one member selected from the group consisting of an alkyl group of 1 to 30 carbon atoms, a substituted or unsubstituted C 3 to C 30 cycloalkyl group, a substituted or unsubstituted C 6 to C 30 aryl group, and a C 1 to C 30 este
  • the particles may be at least partially selected from the group consisting of an amino group, an amine group, a PEG group, a propyl group, an octyl group, a carboxyl group, a thiol group, a sulfonic acid group, a methylphosphonate group and an aldehyde group Lt; / RTI > is substituted with one functional group.
  • the particles are 100-1000 nm in diameter.
  • the particle has a zeta potential of +3 mV to +100 mV or -100 mV to -18 mV.
  • the particles have a volume per gram of 0.7 to 2.2 ml.
  • said particles have a t value of 20 or more, wherein the ratio of absorbance of the following formula (1) is 1/2:
  • a 0 is the absorbance of the porous silica particles measured by placing 5 ml of the suspension of the porous silica particles at 1 mg / ml in a cylindrical permeable membrane having a pore diameter of 50 kDa,
  • a t is the absorbance of the porous silica particles measured after passage of time t from the measurement of A 0 ).
  • the particles have a maximum release amount of the supported physiologically active substance of 99 wt% or more.
  • physiologically active substance is at least one selected from the group consisting of nucleic acids, nucleotides, proteins, peptides, amino acids, sugars, lipids, compounds, antibodies, antigens, cytokines, growth factors and elements constituting them.
  • the physiologically active substance may be at least one selected from the group consisting of doxorubicin, irinotecan, sorafenib, adriamycin, daunomycin, mitomycin, cisplatin, epirubicin, methotrexate, 5-fluorouracil, aclucinomycin, nitrogerm mustard, cyclophosphamide , Dexamethasone, dexamethasone, dexamethasone, dexamethasone, dexamethasone, dexamethasone, dexamethasone, dexamethasone, dexamethasone, dexamethasone, dexamethasone, dexamethasone, dexamethasone, but are not limited to, albumin, abeluxe, bevacizumab, carboplatin, legolapenib, docetaxel, dixyl, zetitib, imatinib mesylate, herceptin,
  • composition is released into the target tissue via a catheter.
  • composition for embolization comprising any one of compositions 1 to 11 above.
  • composition further comprises at least one of a contrast agent and an embolic material.
  • the composition may further comprise one or more additives selected from the group consisting of lipiodol, dextran, polyvinyl alcohol, lipiodol, N-butylcyanoacrylate, gel foam, gelatin, ethanol, dextran, silica, Polysodium acrylate vinyl alcohol copolymer, glass particles, poly-L-guluronic alginate, polyglycolic-polyactic acid, polydioxanone, polyglycolic acid-co At least one embolic material selected from the group consisting of polyglycolic acid-co-caprolactone, polypropylene, and porous silica particles having a diameter of at least 10 mu m.
  • additives selected from the group consisting of lipiodol, dextran, polyvinyl alcohol, lipiodol, N-butylcyanoacrylate, gel foam, gelatin, ethanol, dextran, silica, Polysodium acrylate vinyl alcohol copolymer, glass particles
  • composition of 12 above wherein said composition is released via a catheter to blood vessels directly connected to the tumor.
  • composition containing the porous silica particles of the present invention is capable of effectively transferring a physiologically active substance to a target tissue or cells into the bloodstream by modifying the surface thereof to inhibit coagulation and precipitation in the blood.
  • composition for embolization comprising the porous silica particles of the present invention has the above-mentioned advantages, besides it has the properties of biodegradability and sustained release, so that it can obtain excellent embolization effect and is excellent in targeting property to target tumor tissues or cells, There is a merit that it is less.
  • FIG. 1 is a photomicrograph of a porous silica particle according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a photomicrograph of a porous silica particle according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a microphotograph of a small pore particle during a process for producing porous silica particles according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a micrograph of a small pore particle according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a micrograph of the pore diameter of the porous silica particles according to an embodiment of the present invention.
  • the DDV (Degradable Delivery Vehicle) is a particle in the examples. Numbers in parentheses denote particle diameters, and subscripts indicate pore diameters.
  • DDV (200) 10 means a particle of an embodiment having a particle diameter of 200 nm and a pore diameter of 10 nm.
  • FIG. 6 is a photomicrograph showing the biodegradability of the porous silica particles according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7 is a tube with a cylindrical permeable membrane according to one example.
  • FIG. 8 shows the results of absorbance reduction with time of the porous silica particles according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a graph showing a result of absorbance reduction of particle size of porous silica particles according to an embodiment of the present invention with time.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of absorbance reduction of pore diameters of porous silica particles according to an embodiment of the present invention over time.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of absorbance reduction of pH of the environment of the porous silica particles according to an embodiment of the present invention over time.
  • Fig. 13 shows the amount of doxorubicin released under the two conditions of the porous silica particle carrying doxorubicin.
  • Fig. 15 is a view showing the sorapenib emission amount of porous silica particles carrying sorapenib.
  • 16 is a graph showing the amount of retinoic acid released from the porous silica particle carrying retinoic acid.
  • 17 is a graph showing the amount of p53 protein released from the porous silica particle carrying p53 protein.
  • Fig. 19 is a graph showing the amount of siRNA released from the porous silica particle carrying the siRNA.
  • 20 and 21 are graphs showing pDNA emission amounts of porous silica particles carrying pDNA.
  • 22 is a graph showing the linear DNA release of porous silica particles carrying linear DNA.
  • FIG. 24 is a chart showing IgG, antibody 1, and antibody 2 released amounts of porous silica particles carrying IgG (A), antibody 1 (B), and antibody 2 (C)
  • 25 is a graph showing the amount of RNase released from the porous silica particles carrying RNase.
  • 26 is a photograph showing that Cas9 protein is carried on porous silica particles and transferred into cells.
  • FIG. 27 is a graph showing the effect of the present invention (B) on the delivery of the siRNA into the porous silica particles and the release of siRNA (A), doxorubicin, siRNA, RNase A and peptide, (C) of the composition of the present invention.
  • 29 is a diagram showing the degree of precipitation of the porous silica particles in the blood simulating solution.
  • FIG. 30 is a graph showing the erythrocyte hemolysis degree of the modified porous silica particles.
  • 31 is a graph showing the erythrocyte hemolysis degree of the unmodified porous silica particles.
  • 34 is a diagram showing the particle stability when the porous silica particles and the lipiodol are mixed and emulsified.
  • Fig. 35 is a photograph of a naked eye of a rabbit liver removed after embolization using the composition for embolization containing porous silica particles.
  • FIG. 36 is a graph showing the index (A) of the composition for embolization comprising the porous silica particles, the index to target cells (B), the slight toxicity to peripheral normal cells (C) (D).
  • FIG. 37 is a graph showing the low survival rate (A, B) and the AST and ALT concentrations of hepatocellular carcinoma cells in the rabbit during embolization using embolization compositions comprising porous silica particles, showing no liver toxicity.
  • the porous silica particles are silica nanostructures having fine pores of several nanometers to several nanometers in size.
  • the regularity of the pore arrangement is well defined and the material properties (pore size, specific surface area, surface characteristics) And is also referred to as Mesoporous Slica Particle.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition containing porous silica particles having a zeta potential of not less than +3 mV or not more than -18 mV and carrying a physiologically active substance on the surface or inside of the pores, ≪ / RTI >
  • the physiologically active substance is a physiologically active substance / biological function-controlling substance which is carried on the porous silica particles and can transmit activity to the individual to exhibit activity.
  • the substance may be a low molecular weight drug, a gene drug, a protein drug, (Natural compounds and / or synthetic compounds), and elements constituting them, which are selected from the group consisting of nucleotides, proteins, peptides, antibodies, antigens, RNA, DNA, PNAs, plasmids, chemicals, enzymes, amino acids, sugars, lipids, At least one of which may be selected from the group consisting of doxorubicin, irinotecan, sorafenib, adriamycin, daunomycin, mitomycin, cisplatin, epirubicin, methotrexate, 5-fluorouracil, acclinomycin, Cyclophosphamide, bleomycin, daunorubicin, vincri
  • the bioactive material can be a therapeutic active agent that can provide a direct or indirect, therapeutic, physiological and / or pharmacological effect to a human or animal organism.
  • the therapeutically active agent can be, for example, a general medicament, a drug, a prodrug or a target group, or a drug or prodrug comprising a targeting group.
  • Such therapeutic active agents include, for example, cardiovascular drugs, especially antihypertensive agents (e.g., calcium channel blockers, or calcium antagonists) and antiarrhythmics; Congestive heart failure drugs; Muscle filling; Vasodilators; ACE inhibitors; diuretic; Deacidylase inhibitors; Heart glycoside; Phosphodiesterase inhibitors; Blockers; beta blockers; Sodium channel blockers; Potassium channel blockers; ?
  • -adrenergic agonists Platelet inhibitors; Angiotensin II antagonist; Anticoagulants; Thrombolytic agents; Hemorrhagic agent; Anemia treatment agent; Thrombin inhibitors; Antiparasitic agents; Antimicrobial agents; Anti-inflammatory agents, especially non-steroidal anti-inflammatory agents (NSAIDs), more particularly COX-2 inhibitors; Steroidal anti-inflammatory agents; Prophylactic anti-inflammatory agents; Anti-glaucoma agents; Mast cell stabilizers; Shandong; Drugs that affect the respiratory system; Allergic rhinitis; Alpha-adrenergic antagonists; Corticosteroids; Chronic obstructive lung disease; Acid-oxidase inhibitors; Anti-arthritic agents; Gout remedy; Anxiety drugs and antagonistic drug antagonists; Antimicrobial agent; Antifungal agents; Antigen challenge; helminthic; Antiviral agents, especially respiratory antiviral agents, herpes, cytomegalovirus, human immunodeficiency virus and hepati
  • the therapeutically active agent is, for example, erythropoietin (EPO).
  • EPO erythropoietin
  • Insulin insulin-like growth factors (including IGF-1 and IGF-2), epidermal growth factors (including IGF-1 and IGF-2), cytokines such as thrombopoietin, interleukins (including IL- factor (EGF)), transforming growth factor (including TGF-alpha and TGF-beta), human growth hormone, transferrin, low density lipoprotein, high density lipoprotein lipoprotein), leptin, VEGF, PDGF, ciliary neurotrophic factor, prolactine, adrenocorticotropic hormone (ACTH), calcitonin, human chorionic gonadotropin estrogen, follicle stimulating hormone (FSH), thyroid-stimulating hormone (TSH), luteinizing hormone (LH) hormone, ), Progesterone one, testosterone, toxin including ricine, and the like.
  • the therapeutically active agent may be selected from the group of drugs for the treatment of oncological disease and cellular or tissue modification.
  • Suitable therapeutic agents include, but are not limited to, alkyl sulphonates such as busulfan, improsulfan, piposulfane, benzodepa, carboquone, meturedepa Alkylating agents such as arizidine, such as uredepa; Ethyleneimine such as altretamine, triethylene melamine, triethylene phosphoramide, triethylene thiophosphoramide, and trimethylolmelamine, and the like, Methylmelamine; But are not limited to, chlorambucil, chlornaphazine, cyclophosphamide, estramustine, ifosfamide, mechlorethamine, mechlorethamine oxide hydro Called nitrogen mustards such as mechlorethaminoxide hydrochloride, melphalan, novembichin, phenesterine, prednimus
  • the therapeutically active agent may be selected from the group consisting of aclacinomycin, actinomycin, anthramycin, azaserin, bleomycin, cuctinomycin, carubicin, Carzinophilin, chromomycin, ductinomycin, daunorbicin, 6-diazo-5-oxn (5-oxo) -1-norieucin, doxorubicin, epirubicin, mitomycin, mycophenolsaure, mogalumycin, olivomycin, peplomycin, Plicamycin, porfiromycin, puromycin, streptonigrin, streptozocin, tubercidine, ubenimex, zino (for example, Statins such as zinostatin, zorubicin, aminoglycoside, It may be selected from anti-viral agents and anti-bacterial agents such as the group including the polyene (polyene) or macrolide antibiotics (macrolid-antibiotics), and any combinations thereof
  • the therapeutically active agent may be selected from the group consisting of endostatin, angiostatin, interferon, platelet factor 4 (PF4), thrombospondin, transforming growth factor beta, Metalloproteinase -1. -2 and -3 (TIMP-1, -2 and -3), TNP-470, marimastat, neovastatin (TIMP- neovastat, BMS-275291, COL-3, AG3340, thalidomide, squalamine, combrestastatin, SU5416, SU6668, IFN- [alpha], EMD121974, And radio-sensitizer drugs such as IM-862, steroidal or non-steroidal anti-inflammatory drugs, or agents for angiogenesis, and combinations and / or derivatives thereof. have.
  • the therapeutically active agent may be selected from the group comprising nucleic acids, wherein the term nucleic acid refers to a nucleic acid molecule, for example, that is capable of at least two nucleotides covalently linked to each other to provide a gene therapy or antisense effect Lt; / RTI > oligonucleotides.
  • the nucleic acid preferably comprises a phosphodiester linkage and also includes an analogue with a different backbone. Analogs include, for example, phosphoramide phosphorothioate, phosphorodithioate, O-methylphosphoroamidite-compound, and peptide-nucleic acid backbone peptide-nukleic acid-backbone and compounds thereof.
  • nucleic acid having one or more carbocyclic sugars may be suitable as the nucleic acid used in the present invention.
  • any combination of naturally occurring nucleic acids and nucleic acid analogs or mixtures of nucleic acids and analogs may be used.
  • Such therapeutically active agents include, for example, everolimus, tacrolimus, sirolimus, mycofenolate-mofetil, rapamycin, paclitaxel, paclitaxel, actinomycin D, angiopeptin, batimastate, estradiol, VEGF, statine, and derivatives and analogs thereof. anti-migratory, anti-proliferative or immunune-suppresive, anti-inflammatory or re-endotheliating agent.
  • the therapeutically active agent may be selected from the group consisting of opioid receptor agonists and antagonists, compounds exhibiting action / antagonistic activity and compounds exhibiting partial agonistic activity such as morphine, deformomorphin, etorphine, diacetylmorphine, hydromorphin, oxymorphone, But are not limited to, lepanol, methadone, levomethally, meperidine, fentanyl, cotentanil, alfentanil, codeine, hydrocodone, oxycodone, tebine, desomorphine, nicomorphine, dipropanyl morphine, benzylmorphine, Dean, Methadone, Tramadol, Dextrofoxyphen; Oxon and naltrexone; Buprenorphine, nalbuphine, butorphanol, penta-axine, and ethylketocycline.
  • opioid receptor agonists and antagonists compounds exhibiting action / antagonistic activity and compounds exhibiting
  • the therapeutically active agents and combinations thereof may be selected from the group consisting of heparin, synthetic heparin analogs (e.g., fondaparinux), hirudin, antithrombin III, drotrecogin alpha;
  • the compounds of the present invention may be used in combination with other drugs such as alteplase, plasmin, lysokinase, factor VIIa, prourokinase, urokinase, anistreplase, fibrinolytics such as streptokinase; Platelet aggregation inhibitors such as acetylsalicylic acid [aspirin], ticlopidine, clopidogrel, abciximab, dextran and the like; (Eg, alclometasone, amcinonide, augmented betamethasone, beclomethasone, betamethasone, budesonide, cortisone, clobetasol, clobetasol, clocor
  • NSAIDs -inflammatory drugs
  • Cytostatics such as alkaloids such as vinblastine and vincristine, and podophyllum toxin
  • Cytotoxic antibiotics such as daunorbicin, doxorubicin and other anthracycline and related substances, bleomycin, mitomycin and the like
  • Antimetabolites such as folic acid analogs, purine analogs or pyrimidine analogs
  • Platinum compounds such as carboplatin, cisplatin or oxaliplatin; But are not limited to, amsacrin, irinitecan, imatinib, topotecan, interferon-alpha 2a, interferon-alpha 2b, hydroxycarbide, , Miltefosine, pentostatin, porfimer, aldesleukin, bexaroten, tretinoin; Antiandrogen and antiestrogen; A quinidine type
  • Such therapeutically active agents include, for example, but are not limited to, for example, alprazolam, amoxapine, bentazepam, bromajeffam, clorazepin, clobazam, clotiazepam, diazepam, lorazepam, flunitrazem, fluazepam, Wherein the medicament is selected from the group consisting of medicament, medicament, medicament, medicament, medicament, medicament, medicament, medicament, medicament, medicament, medicament, medicament, medicament, but are not limited to, chlorpromazine, chlorpromazine, haloperidol, triazolam, clozapine, fluoropropazine, fluphenazine decanoate, fluianzone, perphenazine, phimozide, prochlorperazine, sulpiride, thioridazine, , Citalopram, bupuropion, phenelzine, olanzapine, divalphrox sodium and venla
  • Such therapeutically active agents include, for example, opioid receptor agonists and antagonists, compounds exhibiting action / antagonistic mixing activity and compounds exhibiting partial agonistic activity, such as morphine, deformomorphin, etorphine, diacetylmorphine, But are not limited to, thiophenes, thiophenes, phosgene, levorphanol, methadone, levomethally, meperidine, fentanyl, cotentanil, alfentanil, codeine, hydrocodone, oxycodone, Morphine, petidine, methadone, tramadol, dextrorphoxifene; Oxon and naltrexone; Buprenorphine, nalbuphine, butorphanol, penta-axine, and ethylketocycline.
  • opioid receptor agonists and antagonists compounds exhibiting action / antagonistic mixing activity and compounds exhibiting partial agonistic activity, such as morph
  • the therapeutically active agent may be, for example, a tricyclic compound including azothiopine, amitriptyline, famotidine, promethazine, paroxatin, oxcarbazepine, and mirtazapine.
  • Such therapeutically active agents include, for example, but not limited to, acetophenone derivatives such as acetohexamide, chlorpropamide, glibencluride, gliclazide, glipizide, metformin, tolazamide, gliburide, glimepiride and tolbutamide It can be antidiabetic.
  • acetophenone derivatives such as acetohexamide, chlorpropamide, glibencluride, gliclazide, glipizide, metformin, tolazamide, gliburide, glimepiride and tolbutamide It can be antidiabetic.
  • Such therapeutically active agents include, for example, solvemdemtartrate, amilobarbitone, barbitone, butobarbital, pentobarbitone, bromothiazol, carborum, chlordiazepoxide, chlormethiazole, etinamate Hypnotics / sedatives and / or muscle relaxants, including, for example, atopic dermatitis, atopic dermatitis, atopic dermatitis, atopic dermatitis, atopic dermatitis, atopic dermatitis, atopic dermatitis, atopic dermatitis, It can be the best.
  • Such therapeutically active agents include, for example, amphotericin, butotonazole nitrate, clotrimazole, econazole, nitrosamines, , Sulconazonitrate, terconazole, thioconazole and undecanoic acid; Benzodiazoles, clioquinol, decouquinate, diiodohydroxyquinoline, diloxanide furoate, dinitol mid, furzolydone, metronidazole, nimorazole, nitroprazone, ornidazole, terbinapine, Antifungal or antiparasitic agents, including but not limited to mazole, chloroquine, mefloquine, itraconazole, pyrimethamine, praziquantel, quinacrine, mebendazole and tidinazole.
  • Such therapeutically active agents include, for example, candesartan, hydralazine, clonidine, triamterine, felodipine, psifibrozil, fenofibrate, nephedilac, flazocin, mexamilamine, doxazosin, dobutamine and cilexetil It may be antihypertensive or cardiac therapy.
  • the therapeutically active agent may be, for example, an anti-migraine agent including dihydroergotamine mesylate, ergotamine tartrate, methisidized maleate, fizotifen maleate and sumatriptan succinate.
  • the therapeutically active agent can be, for example, an antimuscarinic agent comprising atropine, benzhexol, biperidene, ethoprodjin, hosiamine, mefenzolate bromide, oxybutynin, oxypentylimine and tropicamide .
  • Such therapeutically active agents include, for example, aminoglutethimide, amsacrine, azathioprine, pilaster, chlorambucil, cyclosporin, dacarbazine, estramermin, etoposide, romestin, melphalan, (Or immunosuppressive agents), including but not limited to furans, methocrecite, mitomycin, mitotan, mitoxantrone, procarbazine, tamoxifen citrate, testolactone, tacrolimus, mercaptopurine and sirolimus, Lt; / RTI >
  • Such therapeutically active agents include, for example, but are not limited to, bromocriptine mesylate, levodopa, tolcapone, rofinitrol, bromocriptine, hypoglycemic agents such as sulfonylurea beguuanid, alpha-glucosidase inhibitors , Thiazolidinedione, carbargolin, carbidopa, and lysylide maleate.
  • the therapeutically active agent can be, for example, an antithyroid agent including carbamazole and propithiouracil.
  • the therapeutically active agent can be, for example, a cardiac muscle contraction agent, including, for example, amrinone, millinone, digoxin, enoximone, ranatoside C and medigokine.
  • a cardiac muscle contraction agent including, for example, amrinone, millinone, digoxin, enoximone, ranatoside C and medigokine.
  • the therapeutically active agent may be, for example, a hypolipidemic or hyperlipidemic agent, including, for example, phenobibrate, clofibrate, probucol, erythimib and tosecaepib.
  • the therapeutically active agent can be, for example, an anti-inflammatory agent, including mexylocam, triamcinolone, cromolyn, nedocromil, hydroxychloroquine, montelukast, gylotron, jaffirucast and meloxicam.
  • an anti-inflammatory agent including mexylocam, triamcinolone, cromolyn, nedocromil, hydroxychloroquine, montelukast, gylotron, jaffirucast and meloxicam.
  • the therapeutically active agent can be, for example, selected from the group consisting of pesophenadine, chloral hydrate, hydroxyzine, promethazine, cetirazine, cimetidine, cliniczine, mechloridine, dimenhydrinate, loratavine, And antihistamines including prometagins.
  • the therapeutically active agent can be, for example, an anti-ulcer agent including omeprazole, lansoprazole, pantoprazole and ranitidine.
  • the therapeutically active agent can be, for example, a diuretic including hydrochlorothiazide, amiloride, acetazolamide, furosemide and torsemide.
  • Such therapeutically active agents include, for example, first generation retinoids such as retinol, retinal, tretanoin (retinoic acid, retin-A), isotretinoin and alitretinoin, agents such as acetylenes, 2 occurring retinoids; And retinoids containing third generation retinoids such as tyrosine, bexarotene, and adalparen.
  • first generation retinoids such as retinol, retinal, tretanoin (retinoic acid, retin-A), isotretinoin and alitretinoin
  • agents such as acetylenes, 2 occurring retinoids
  • retinoids containing third generation retinoids such as tyrosine, bexarotene, and adalparen.
  • Such therapeutically active agents may be, for example, statins and / or derivatives thereof, including atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, nystatin, rosuvastatin, pravastatin, orlistat and simvastatin.
  • the therapeutically active agent can be, for example, a stimulant comprising amphetamine, pentamine, tilamine, epheldrin, meta-laminol, phenyl ephrine, dexamphetamine, dexfenflamine, fenfluramine, nicotine, caffeine and marginal stones.
  • the therapeutically active agent can be, for example, a vasodilator including carvedilol, terazosin, phentolamine and menthol.
  • the therapeutically active agent can be, for example, an anti-Alzheimer agent including levetiracetam, levitiracetam and donepezil.
  • the therapeutically active agent can be, for example, an ACE inhibitor, including, for example, benzazuril, enalapril, ramipril, posinopril sodium, ricinopril, minoxidil, isosorbide, rhamril and quinapril.
  • an ACE inhibitor including, for example, benzazuril, enalapril, ramipril, posinopril sodium, ricinopril, minoxidil, isosorbide, rhamril and quinapril.
  • the therapeutically active agent can be, for example, a beta adrenergic receptor antagonist including atenolol, thymolol, finolol, proanolol hydrochloride, bisophorolol, esolol, methoprolol succinate, methoprolol and methoprolol tartrate .
  • a beta adrenergic receptor antagonist including atenolol, thymolol, finolol, proanolol hydrochloride, bisophorolol, esolol, methoprolol succinate, methoprolol and methoprolol tartrate .
  • the therapeutically active agent may be, for example, an angiotensin II antagonist comprising losartan.
  • the therapeutically active agent can be, for example, a platelet inhibitor, including abciximab, clopidogel, tirofiban, and aspirin.
  • Such therapeutic active agents include, for example, tramadol, tramadol hydrochloride, allopurinol, calcitriol, cilostazol, sortalol, urachodiol bromfuridol, droperidol, flufenthisol decanoate, albuterol, And may be an alcohol or phenol including, for example, benzoyl peroxide, sorbitan monolaurate, sorbitan monolaurate, sorbitan monolaurate, sorbitan monolaurate, sorbitan monolaurate, sorbitan monolaurate, sorbitan monolaurate, sorbitan monolaurate, sorbitan monolaurate,
  • the therapeutically active agents may be, for example, ketones or esters, including amiodarone, fluticasone, spironolactone, prednisone, triazodone, dexamethasone, methylprednison, benzonatate nabumetone and buspirone have.
  • the therapeutically active agent can be, for example, an anti-vomiting agent, including methoclopramide.
  • the therapeutically active agent can be, for example, an eye treatment agent comprising a dorzolamide, brimonidine, olopatadine, cyclopentolate, pilocarpine and echothiophate.
  • the therapeutically active agent may be, for example, an anticoagulant or an antithrombotic agent including warfarin, enoxaparin and repirudin.
  • the therapeutically active agent may be, for example, a gout therapeutic agent comprising probenecin and sulfinpyrazone.
  • the therapeutically active agent can be, for example, a COPD or asthma treatment comprising ipratropium.
  • the therapeutically active agent can be, for example, an osteoporosis treating agent including raloxifene, pamidronate and risedronate.
  • the therapeutic active may be, for example, a cosmetic peptide comprising acetyl hexapeptide-3, acetyl hexapeptide-8, acetyl octapeptide and 1-carnosine.
  • the therapeutically active agent can be, for example, a vaccine comprising a toxoid (a non-activated toxic compound); Proteins, protein subunits and polypeptides; Polynucleotides such as DNA and RNA; Junction; Saponin, virosomes, ignorance, and organic azants, such as, for example, Jostakovsky.
  • a toxoid a non-activated toxic compound
  • Proteins, protein subunits and polypeptides Proteins, protein subunits and polypeptides
  • Polynucleotides such as DNA and RNA
  • Junction Saponin, virosomes, ignorance, and organic azants, such as, for example, Jostakovsky.
  • Such therapeutically active agents include, for example, coenzyme Q10 (or ubiquinone), ubiquinol or resveratrol; carotenoids such as alpha, beta or gamma -carotene, lycopene, lutein, zeaxanthin and astaxanthin; Plant nutrients such as lycopene, lutein and siaxanthin; Omega-3 fatty acids including linoleic acid, conjugated linoleic acid, docosahexanoic acid (DHA) and ericosapentaenoic acid (EPA) and their glycerol-esters; Vitamin D (D2, D3 and derivatives thereof), vitamin E (alpha, beta, gamma, delta-tocopherol or alpha, beta, gamma, delta-tocotrienol), vitamin A (retinol, retinal, retinoic acid and derivatives) , Capric / caprylic triglycerides, folic
  • the mesoporous silica particles may be modified on the surface and / or inside of the pores.
  • This modification means that the -OH functional group of the silanol group (Si-OH) of the silica particle is replaced with another functional group.
  • the type of physiologically active substance suitable for carrying can be varied depending on the kind of the functional group to be modified and the degree of modification, and the zeta potential is changed to produce a difference in the size.
  • a chemical or biological modification method can be adopted, but the method can be carried out by a well-known method in the art.
  • Chemical modification method can be adopted.
  • the surface of the particles and the interior of the pores may be modified in the same manner or may be modified differently.
  • the modification may be carried out by reacting a compound having a hydrophilic, hydrophobic, cationic, or anionic substituent to be introduced with the particle, but not limited thereto, and it is possible to carry out the modification by transferring a physiologically active substance, transferring a physiologically active substance to a target cell, Or a compound having a substituent for the purpose of supporting a substance for other purposes or for binding of other additional substituents to the particle, and the substituent may be a form including an antibody, a ligand, a cell permeable peptide, Lt; / RTI >
  • the compound may be, for example, an alkoxysilane having a C1 to C10 alkoxy group, but is not limited thereto.
  • the alkoxysilane is one having at least one of the above-mentioned alkoxy groups and may have, for example, 1 to 3 substituents, and may have a substituent to be introduced or a substituted substituent at a site where an alkoxy group is not bonded.
  • an alkoxysilane When the alkoxysilane is reacted with the porous silica particles, an alkoxysilane can be bonded to the surface and / or pores of the porous silicon particles by forming a covalent bond between the silicon atom and the oxygen atom, and the alkoxysilane has a substituent to be introduced The substituent may be introduced into the surface and / or pores of the porous silicon particles.
  • the reaction may be carried out by reacting the porous silica particles dispersed in a solvent with alkoxysilane.
  • the solvent may be water and / or an organic solvent, and the organic solvent may be an ether such as 1,4-dioxane (Especially cyclic ethers); Halogenated hydrocarbons such as chloroform, methylene chloride, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, dichloroethylene, trichlorethylene, perchlorethylene, dichloropropane, amyl chloride and 1,2-dibromoethane; Acetone, methyl isobutyl ketone,?
  • the reaction of the particles with the alkoxysilane can be carried out, for example, under heating, and the heating can be carried out at a temperature of, for example, 80 to 180 DEG C, for example 80 to 160 DEG C, 80 to 150 DEG C, 100 ° C to 160 ° C, 100 ° C to 150 ° C, 110 ° C to 150 ° C, and the like.
  • reaction of the particles with the alkoxysilane can be carried out, for example, for 4 to 20 hours, for example 4 to 18 hours, 4 to 16 hours, 6 to 18 hours, 6 to 16 hours , 8 hours to 18 hours, 8 hours to 16 hours, 8 hours to 14 hours, 10 hours to 14 hours, and the like.
  • the modification to the cationic substituent may be for positively charging the particles or for supporting the negatively chargeable physiologically active substance, for example, an alkoxysilane having a basic group such as an amino group, And the reaction can be carried out.
  • Specific examples thereof include N- [3- (Trimethoxysilyl) propyl] ethylenediamine, N1- (3-Trimethoxysilylpropyl) diethylenetriamine, (3-Aminopropyl) trimethoxysilane, N- [3- propyl] silane, 3- (2-Aminoethylamino) propyldimethoxymethylsilane, and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • the modification to the anionic substituent may be for negatively charging the particles or for supporting the positively charged physiologically active substance, and reacting with an alkoxysilane having an acidic group such as a carboxyl group, a sulfonic acid group or a thiol group .
  • an alkoxysilane having an acidic group such as a carboxyl group, a sulfonic acid group or a thiol group .
  • 3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane can be used, but is not limited thereto.
  • the modification with a hydrophilic substituent has advantages in terms of ease of use and formulation of the composition of the present invention.
  • examples thereof include a carboxyl group, an amino group, a carbonyl group, a sulfhydryl group, a phosphate group, a thiol group, , An ester group, an imide group, a thioimide group, a keto group, an ether group, an indene group, a sulfonyl group, a polyethylene glycol group, or the like.
  • the modification to the hydrophobic substituent has an advantage that the bonding strength with the physically active substance is poor (hydrophobic).
  • trimethoxy (octadecyl) silane trimethoxy n-octylsilane, trimethoxy propyl silane
  • isobutyl trimethoxy silane trimethoxy (7-octen- silane, trimethoxy (2-phenylethyl) silane, vinyltrimethoxysilane, cyanomethyl, 3- (trimethoxysilyl) propyl] trithiocarbonate and (3-Bromopropyl) trimethoxysilane.
  • the modification may be carried out in combination, for example, two or more surface modification may be performed on the outer surface or inside the pores.
  • a compound containing a carboxyl group may be bonded to an amide group-introduced silica particle with an amide bond to change positively charged particles to have different surface characteristics, but the present invention is not limited thereto.
  • the reaction temperature, time, and the amount of the compound used in the modification may be selected depending on the desired degree of modification, and the reaction conditions may vary depending on the hydrophilicity, hydrophobicity, By adjusting the hydrophilicity, hydrophobicity and electric charge of the silica particles, the release rate of the physiologically active substance can be controlled. For example, when a physiologically active substance has a strong negative charge at a neutral pH, the reaction temperature can be increased or the reaction time can be lengthened and the compound throughput can be increased in order to allow the porous silica particles to have a strong positive charge , But is not limited thereto.
  • the above-mentioned porous silica particles are biodegradable particles, and when physiologically active substances are carried on the body, they can be biodegraded in the body to release physiologically active substances, May be slowly decomposed in the body so that the supported physiologically active substance has sustained release properties.
  • t at which the ratio of the absorbance of the following formula (1) is 1/2 is 20 or more.
  • a 0 is the absorbance of the porous silica particles measured by placing 5 ml of the 1 mg / ml suspension of the porous silica particles in a cylindrical permeable membrane having pores having a diameter of 50 kDa,
  • the pH of the suspension was 7.4,
  • a t is the absorbance of the porous silica particles measured after passage of time t from the measurement of A 0 ).
  • the above equation (1) means that the porous silica particles are decomposed at a certain rate in an environment similar to the body, and the absorbances A 0 and A t are obtained by, for example, putting the porous silica particles and suspension into a cylindrical permeable membrane, The same suspension may also be placed on the outside of the membrane.
  • the suspension may be a buffer solution, and may be at least one selected from the group consisting of, for example, PBS (phosphate buffered saline) and SBF (simulated body fluid), and more specifically, PBS.
  • PBS phosphate buffered saline
  • SBF simulated body fluid
  • the particles are biodegradable and can be slowly degraded in the suspension.
  • the diameter of 50 kDa corresponds to about 5 nm.
  • the biodegradable particles can pass through a permeation membrane having a diameter of 50 kDa and the cylindrical permeation membrane is under a horizontal stirring of 60 rpm. And the disintegrated particles can come out of the permeable membrane.
  • the absorbance in Equation (1) may be measured under an environment in which, for example, the suspension outside the permeable membrane is replaced with a new suspension.
  • the suspension may be constantly being replaced, replaced at regular intervals, and the period may be a periodic or irregular period. For example, in the range of 1 hour to 1 week, an interval of 1 hour, 2 hours, 3 hours, 6 hours, 12 hours, 24 hours, 2 days, 3 days, 4 days, 7 Day interval, etc., but is not limited thereto
  • the absorbance becomes half of the initial absorbance after t time, meaning that about half of the porous silica particles are decomposed.
  • T may be 20 or more, or 24 or more, for example, t is 20 to 120, for example, in which the ratio of the absorbance of the formula (1) is 1/2, and for example, 20 to 96, 20 to 72, 30 to 70, 40 to 70, 50 to 65, and the like.
  • the particle may have a ratio t of 1/5 of the absorbance of the formula (1), for example, 70 to 140, and for example, 80 to 140, 80 to 120, 80 to 110, 70 to 140 , 70 to 120, 70 to 110, and the like.
  • the particle may have a ratio of the absorbance of the formula 1 to 1/20, for example, 130 to 220, and may be within the range of, for example, 130 to 200, 140 to 200, 140 to 180, 150 to 180 And the like, but is not limited thereto.
  • the particle may have a t of, for example, not less than 250, such as not less than 300, not less than 350, not less than 400, not less than 500, not less than 1000, and the like, where the absorbance to be measured is 0.01 or less, But is not limited to.
  • the particle may have a Pearson correlation coefficient of 0.8 or more, for example, 0.9 or more, and 0.95 or more, for example, where the ratio of the absorbance of Equation 1 and t have a high positive correlation.
  • T represents the degree of decomposition of the porous silica particles at a certain rate in an environment similar to that of the body. This means that the surface area, the particle size, the pore diameter, the surface of the porous silica particles, and / The substituent, the degree of compactness of the surface, and the like.
  • the surface area of the particles can be increased to decrease t, or the surface area can be decreased to increase t.
  • the surface area can be controlled by controlling the diameter of the particles and the diameter of the pores. It is also possible to increase the t by placing substituents in the surface and / or pores to reduce the direct exposure of the porous silica particles to the environment (solvent, etc.). Also, it is possible to increase the affinity between the physiologically active substance and the porous silica particles by supporting the physiologically active substance on the porous silica particles, and to reduce the direct exposure of the porous silica silica particles to the environment, thereby increasing t. It is also possible to increase the t by fabricating the surface more densely during the production of the particles. While various examples have been described above for adjusting t in Equation 1, the present invention is not limited thereto.
  • the mesoporous silica particles are particles of silica (SiO 2 ) and have a diameter of several nanometers to several micrometers in size.
  • the average diameter of the particles may be, for example, 100 nm to 1000 nm, and may be, for example, 100 nm to 800 nm, 100 nm to 500 nm, 100 nm to 400 nm, 100 nm to 300 nm, 100 nm to 200 nm, But is not limited to.
  • the above-mentioned mesoporous silica particles are porous particles having nano-sized pores so that the above-mentioned physiologically active substance can be supported in pores or on the surface of the particles.
  • the average pore diameter of the particles may be, for example, from 1 nm to 100 nm. For example, within the above range, for example, 5 nm to 100 nm, 7 nm to 100 nm, 7 nm to 50 nm, 10 nm to 50 nm, 10 nm to 30 nm, But the present invention is not limited thereto and can be suitably selected and controlled in consideration of the amount and size of the physiologically active substance to be carried.
  • the shape of the mesoporous silica particles is not particularly limited to a specific form, but may be selected from the group consisting of the original activity of the flow in the blood flow, the original activity of interaction with blood cells in the bloodstream, Considering the prevention of hemolysis of red blood cells, it is preferable to be spherical.
  • the BET surface area of the porous silica particles may be, for example, 200 m 2 / g to 700 m 2 / g.
  • the BET surface area of the porous silica particles may be, for example, 200 m 2 / g to 700 m 2 / g.
  • 200m 2 / g to 700m 2 / g 200m 2 / g to 650m 2 / g, 250m 2 / g to 650m 2 / g, 300m 2 / g to 700m 2 / g, 300m 2 / g to 650 m 2 / g, 300 m 2 / g to 600 m 2 / g, 300 m 2 / g to 550 m 2 / g, 300 m 2 / g to 500 m 2 / g, 300 m 2 / g to 450 m 2 / But is not limited thereto.
  • the volume of the porous silica particles may be, for example, 0.7 ml to 2.2 ml per gram.
  • it may be within the range of 0.7 ml to 2.0 ml, 0.8 ml to 2.2 ml, 0.8 ml to 2.0 ml, 0.9 ml to 2.0 ml, 1.0 ml to 2.0 ml, and the like. If the volume per gram is too small, the rate of decomposition may become too high, and excessively large particles may be difficult to manufacture or may not have a perfect shape.
  • the above-mentioned mesoporous silica particles are those having a surface charge, that is, particles having a zeta potential of not 0 mV. This is because, as described above, by suppressing aggregation or precipitation of particles in the blood due to the repulsive force between particles modified by the same method, the flow in the blood is smooth and the physiologically active substance effectively carried on the target tissue or cells is transferred I will.
  • the value of the surface charge of the particle that is, the value of the zeta potential may be, for example, +1 to +150 mV or +2 to 130 mV when positively charged, and may be +3 to +100 mV But may be -150 to -1 mV or -130 to -10 mV when negatively charged, and may be -100 to -18 mV, but the value of the zeta potential is not limited to the particle The amount and the release rate of the physiologically active substance to be carried on the drug, and the like.
  • the value of the zeta potential is more than -18 mV and less than +3 mV
  • the repulsive force between the porous silica particles is lowered so that the particles can flocculate, the charge of the physiologically active substance bearing the charge can hardly be supported, Or less than -100 mV, the binding force with the charged physiologically active substance becomes excessively high and effective release may be difficult.
  • the above-mentioned physiologically active substance may be supported on the surface and / or pores of the above-mentioned porous silica particles (Mesoporous Silica Particles, MSP).
  • MSP Porous Silica Particles
  • the support of the physiologically active substance on the particles can be carried out, for example, by mixing the porous silica particles in the solvent and the physiologically active substance, and the solvent can be water and / or an organic solvent, Ethers such as 1,4-dioxane (particularly, cyclic ethers); Halogenated hydrocarbons such as chloroform, methylene chloride, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, dichloroethylene, trichlorethylene, perchlorethylene, dichloropropane, amyl chloride and 1,2-dibromoethane; Ketones such as acetone, methyl isobutyl ketone, and cyclohexanone; Carbon-based aromatic compounds such as benzene, toluene and xylene; Alkyl amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dibutylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidone
  • PBS phosphate buffered saline solution
  • SBF Simulated Body Fluid
  • borate-buffered saline borate-buffered saline
  • Tris-buffered saline Tris-buffered saline, etc. may be used as the solvent.
  • the ratio of the porous silica particles to the physiologically active substance is not particularly limited and may be, for example, 1: 0.05 to 0.8, for example, 1: 0.05 to 0.7, 1: 0.05 to 0.6, 1: 0.1 To 0.8, 1: 0.1 to 0.6, 1: 0.2 to 0.8, 1: 0.2 to 0.6, and the like.
  • the mesoporous silica particles can gradually release the supported physiologically active substance over a long period of time.
  • the physiologically active substance supported on the particles may be released while the particles are biodegraded.
  • the particles may be slowly decomposed to release the physiologically active substance to be released slowly. This can be controlled, for example, by controlling the surface area, particle size, pore diameter, surface area and / or porosity of the porous silica particles, the degree of compactness of the surface, and the like.
  • the physiologically active substance supported on the particles may be released while diffusing from the porous silica particles, which is affected by the relationship between the porous silica particles, the physiologically active substance, and the environment for releasing the physiologically active substance.
  • the release of bioactive material can be controlled. For example, by strengthening or weakening the binding force of the porous silica particles with the physiologically active substance by surface modification.
  • the binding force between the particle and the physiologically active substance may be increased due to the presence of a hydrophobic substituent on the surface and / or pores of the particle, Whereby the physiologically active substance can be released in a sustained manner.
  • the particle is surface-modified with an alkoxysilane having a hydrophobic substituent.
  • “poorly soluble” is a meant to include (for water) in that the insoluble (insoluble), substantially insoluble (practically insoluble) or very slightly soluble (only slightly soluble) This "Pharmaceutical Science,” 18 th Edition ( USP, Remington, published by Mack Publishing Company).
  • the water-insoluble physiologically active substance may have a water solubility of less than 10 g / L, specifically less than 5 g / L, more specifically less than 1 g / L at 25 ° C under 1 atm, but is not limited thereto.
  • the surface and / or the pores of the particles may have a hydrophilic substituent and the binding strength between the porous silica particles and the physiologically active substance may be increased, It can be released slowly.
  • the porous silica particles may be surface-modified with an alkoxysilane having a hydrophilic substituent.
  • the water-soluble physiologically active substance may have a water solubility of 10 g / L or more at 25 ° C and 1 atm, but is not limited thereto.
  • the surface and / or pore of the particle may be charged with opposite charge to increase the binding force between the porous silica particle and the physiologically active substance, Material may be released slowly.
  • the porous silica particles may be surface-modified with an alkoxysilane having an acidic group or a basic group.
  • the surface and / or pore of the particle may be negatively charged at a neutral pH, whereby the binding force between the porous silica particle and the physiologically active substance So that the physiologically active substance can be released slowly.
  • the porous silica particles may be surface-modified with an alkoxysilane having an acidic group such as a carboxyl group (-COOH) or a sulfonic acid group (-SO 3 H).
  • the surface and / or pore of the particle may be positively charged, thereby increasing the binding force between the porous silica particle and the physiologically active substance, Can be released slowly.
  • the porous silica particles may be surface-modified with an alkoxysilane having a basic group such as an amino group or other nitrogen-containing groups.
  • the supported physiologically active substance may be released for a period of, for example, 7 days to 1 year or more depending on the type of treatment required, the release environment, and the porous silica particles used.
  • the mesoporous silica particles (MSP) can be decomposed 100% as biodegradable, the supported physiologically active substance can be 100% released.
  • the 100% biodegradability of the particles can be appropriately set in accordance with the object of the amount of the physiologically active substance carried in the intravascular drug delivery, thereby avoiding problems such as side effects due to overuse of the physiologically active substance And it is possible to free the particles from serious situations such as blocking the blood vessels without completely decomposing them, and it is a great advantage to overcome the impossibility of performing the same procedure, which is a big problem of the existing embolization procedure, .
  • the mesoporous silica particles may be prepared by, for example, preparing pore-forming particles and pore-expanding processes, and if necessary, A reforming process, and the like.
  • the surface modification may be performed after the calcination.
  • the small pore particles may be, for example, particles having an average pore diameter of 1 nm to 5 nm, which can be obtained by adding a surfactant and a silica precursor to a solvent and stirring and homogenizing.
  • the solvent may be water and / or an organic solvent.
  • organic solvent include ethers (especially, cyclic ethers) such as 1,4-dioxane; Halogenated hydrocarbons such as chloroform, methylene chloride, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, dichloroethylene, trichlorethylene, perchlorethylene, dichloropropane, amyl chloride and 1,2-dibromoethane; Acetone, methyl isobutyl ketone,?
  • water and an organic solvent may be used in a volume ratio of 1: 0.7 to 1.5, for example, in a volume ratio of 1: 0.8 to 1.3, no.
  • the surfactant may be, for example, CTAB (cetyltrimethylammonium bromide), hexadecyltrimethylammonium bromide (TMABr), hexadecyltrimethylpyridinium chloride (TMPrCl), tetramethylammonium chloride (TMACl), and the like.
  • CTAB cetyltrimethylammonium bromide
  • TMABr hexadecyltrimethylammonium bromide
  • TMPrCl hexadecyltrimethylpyridinium chloride
  • TMACl tetramethylammonium chloride
  • the surfactant may be added in an amount of, for example, 1 g to 10 g per liter of solvent, for example, in the range of 1 g to 8 g, 2 g to 8 g, 3 g to 8 g, and the like.
  • the silica precursor may be added after stirring and adding a surfactant to the solvent.
  • the silica precursor may be, for example, TMOS (Tetramethyl orthosilicate), but is not limited thereto.
  • the stirring may be carried out, for example, for 10 minutes to 30 minutes, but is not limited thereto.
  • the silica precursor may be added, for example, in an amount of 0.5 ml to 5 ml per liter of solvent, for example, 0.5 ml to 4 ml, 0.5 ml to 3 ml, 0.5 ml to 2 ml, 1 ml to 2 ml, But may be further added with sodium hydroxide as a catalyst as needed, which may be added with stirring before addition of the surfactant to the solvent, followed by addition of the silica precursor.
  • the sodium hydroxide may be, for example, 0.5 ml to 8 ml per liter of solvent, for example 1 ml of sodium hydroxide solution, 0.5 ml to 5 ml, 0.5 ml to 4 ml, 1 ml to 4 ml, 1 ml to 3 ml, But is not limited thereto.
  • the solution can be reacted with stirring.
  • the stirring may be carried out for example for 2 hours to 15 hours, for example, within the above range for 3 hours to 15 hours, 4 hours to 15 hours, 4 hours to 13 hours, 5 hours to 12 hours, 6 hours to 12 hours , 6 hours to 10 hours, and the like, but is not limited thereto. If the stirring time (reaction time) is too short, nucleation may be insufficient.
  • the solution may be aged.
  • the aging can be carried out, for example, for 8 hours to 24 hours, for example within the above range, 8 to 20 hours, 8 to 18 hours, 8 to 16 hours, 8 to 14 hours, 10 to 16 hours , 10 hours to 14 hours, and the like, but is not limited thereto.
  • reaction product may be washed and dried to obtain porous silica particles, and if necessary, separation of the unreacted material may be preceded by washing, for example, by separating the supernatant liquid by centrifugation.
  • the centrifugation can be performed at, for example, 6,000 to 10,000 rpm, for example, for 3 minutes to 60 minutes, for example, 3 minutes to 30 minutes, 3 minutes to 30 minutes, 5 minutes To 30 minutes, and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • the washing may be performed using water and / or an organic solvent. Specifically, since the materials soluble in each solvent are different, water and an organic solvent may be used once or several times alternately. Alternatively, water or an organic solvent may be used once or several times It can be washed several times. The number of times may be, for example, 2 or more, 10 or less, for example, 3 or more and 10 or less, 4 or more or 8 or less, 4 or more or 6 or less, and the like.
  • the organic solvent includes, for example, ethers such as 1,4-dioxane (particularly, cyclic ethers); Halogenated hydrocarbons such as chloroform, methylene chloride, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, dichloroethylene, trichlorethylene, perchlorethylene, dichloropropane, amyl chloride and 1,2-dibromoethane; Acetone, methyl isobutyl ketone,?
  • ethers such as 1,4-dioxane (particularly, cyclic ethers)
  • Halogenated hydrocarbons such as chloroform, methylene chloride, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, dichloroethylene, trichlorethylene, perchlorethylene, dichloropropane, amyl chloride and 1,2-dibromoethane
  • Acetone methyl isobutyl ketone
  • the washing may be carried out under centrifugation, for example, at a speed of 6,000 to 10,000 rpm, for example, for 3 minutes to 60 minutes, for example 3 minutes to 30 minutes, Min to 30 min, 5 min to 30 min, and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • the washing may be performed by filtering the particles with a filter without centrifugation.
  • the filter may have pores smaller than the diameter of the porous silica particles.
  • the water and the organic solvent may be used once or several times at the time of the washing, and the water or the organic solvent may be washed once or several times.
  • the number of times may be, for example, 2 or more, 10 or less, for example, 3 or more and 10 or less, 4 or more or 8 or less, 4 or more or 6 or less, and the like.
  • the drying may be performed at, for example, 20 ° C to 100 ° C, but is not limited thereto, and may be performed in a vacuum state.
  • the pores of the obtained porous silica particles are expanded, which can be carried out using a pore-expanding agent.
  • pore-expanding agent for example, trimethylbenzene, triethylbenzene, tripropylbenzene, tributylbenzene, tripentylbenzene, trihexylbenzene, toluene, benzene and the like can be used. Specifically, trimethylbenzene can be used. But is not limited to.
  • the pore-expanding agent may be, for example, N, N-dimethylhexadecylamine (DMHA), but is not limited thereto.
  • DMHA N, N-dimethylhexadecylamine
  • the pore expansion can be performed, for example, by mixing porous silica particles in a solvent with a pore-expanding agent, and heating and reacting, for example, water and / or an organic solvent, Ethers such as 1,4-dioxane (particularly, cyclic ethers); Halogenated hydrocarbons such as chloroform, methylene chloride, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, dichloroethylene, trichlorethylene, perchlorethylene, dichloropropane, amyl chloride and 1,2-dibromoethane; Ketones such as acetone, methyl isobutyl ketone, and cyclohexanone; Carbon-based aromatic compounds such as benzene, toluene and xylene; Alkyl amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dibutylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidon
  • the porous silica particles may be present in an amount of from 10 g to 200 g per liter of solvent, for example from 10 g to 150 g, 10 g to 100 g, 30 g to 100 g, 40 g to 100 g, 50 g to 100 g, 50 g to 80 g, But the present invention is not limited thereto.
  • the porous silica particles may be uniformly dispersed in a solvent, for example, the porous silica particles may be added to a solvent and ultrasonically dispersed.
  • the second solvent may be added after dispersing the porous silica particles in the first solvent.
  • the pore-expanding agent may be, for example, 10 to 200 parts of skin to 100 parts of skin, 10 to 150 parts of skin, 10 to 100 parts of skin, 10 to 80 parts of skin, 30 to 80 parts of skin, 70 parts skin, and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • the reaction can be carried out, for example, at 120 ° C to 180 ° C.
  • 120 ° C to 180 ° C For example, within the above-mentioned range, it is possible to use a temperature of 120 to 170 ° C, 120 to 160 ° C, 120 to 150 ° C, 130 to 180 ° C, 130 to 170 ° C, 130 to 160 ° C, 130 to 150 ° C, But is not limited thereto.
  • the reaction can be carried out, for example, for 24 hours to 96 hours.
  • 24 hours to 96 hours For example, within the above range from 30 hours to 96 hours, 30 hours to 96 hours, 30 hours to 80 hours, 30 hours to 72 hours, 24 hours to 80 hours, 24 hours to 72 hours, 36 hours to 96 hours, 36 48 hours to 48 hours, 48 hours to 80 hours, 48 hours to 72 hours, and the like, for example, from 1 hour to 80 hours, 36 hours to 72 hours, 36 hours to 66 hours, 36 hours to 60 hours, But is not limited thereto.
  • the reaction time may be increased when the reaction temperature is lowered, or the reaction time may be shortened when the reaction temperature is lowered. If the reaction is insufficient, the expansion of the pores may not be sufficient, and if the reaction proceeds excessively, the particles may collapse due to over-expansion of the pores.
  • the reaction can be carried out, for example, by raising the temperature stepwise. Specifically, it can be performed by raising the temperature from room temperature to the temperature stepwise at a rate of 0.5 ° C / min to 15 ° C / min, for example, within a range of 1 ° C / min to 15 ° C / Min to 15 ° C / min, 3 ° C / min to 12 ° C / min, 3 ° C / min to 10 ° C / min, and the like.
  • the reaction solution may be gradually cooled, for example, it may be cooled stepwise. Specifically, it may be performed by gradually warming the temperature to room temperature at a rate of 0.5 ° C / minute to 20 ° C / minute.
  • the temperature may be 1 ° C / minute to 20 ° C / 20 ° C / min, 3 ° C / min to 12 ° C / min, 3 ° C / min to 10 ° C / min, and the like.
  • reaction product is washed and dried to obtain pore-expanded porous silica particles.
  • the separation of the unreacted material may be preceded by washing before washing, for example, by separating the supernatant by centrifugation.
  • the centrifugation can be performed at, for example, 6,000 to 10,000 rpm, for example, for 3 minutes to 60 minutes, for example, 3 minutes to 30 minutes, 3 minutes to 30 minutes, 5 minutes To 30 minutes, and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • the washing may be performed using water and / or an organic solvent.
  • water and an organic solvent may be used once or several times alternately.
  • water or an organic solvent may be used once or several times It can be washed several times.
  • the number of times may be, for example, two times or more and ten times or less, for example, three times, four times, five times, six times, seven times, eight times, and the like.
  • the organic solvent includes, for example, ethers such as 1,4-dioxane (particularly, cyclic ethers); Halogenated hydrocarbons such as chloroform, methylene chloride, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, dichloroethylene, trichlorethylene, perchlorethylene, dichloropropane, amyl chloride and 1,2-dibromoethane; Ketones such as acetone, methyl isobutyl ketone, and cyclohexanone; Carbon-based aromatic compounds such as benzene, toluene and xylene; Alkyl amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dibutylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidone; Alcohols such as methanol, ethanol, propanol and butanol; Etc., and specifically ethanol, more specifically ethanol, may be used, but the present invention
  • the washing may be carried out under centrifugation, for example, at a speed of 6,000 to 10,000 rpm, for example, for 3 minutes to 60 minutes, for example 3 minutes to 30 minutes, Min to 30 min, 5 min to 30 min, and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • the washing may be performed by filtering the particles with a filter without centrifugation.
  • the filter may have pores smaller than the diameter of the porous silica particles.
  • the water and the organic solvent may be used once or several times at the time of the washing, and the water or the organic solvent may be washed once or several times.
  • the number of times may be, for example, 2 or more, 10 or less, for example, 3 or more and 10 or less, 4 or more or 8 or less, 4 or more or 6 or less, and the like.
  • the drying may be performed at, for example, 20 ° C to 100 ° C, but is not limited thereto, and may be performed in a vacuum state.
  • the obtained particles can be calcined.
  • the calcination is a process for heating the particles to have a more dense structure on the surface and inside thereof, and removing organic substances that fill the pores.
  • calcination is performed at 400 to 700 ° C for 3 hours To 8 hours, more specifically, from 500 ° C to 600 ° C for 4 hours to 5 hours, but the present invention is not limited thereto.
  • porous silica particles can be modified in the surface and / or inside of the pores in the manner described above.
  • the mesoporous silica particles may also be prepared by, for example, preparing particles of small pores, expanding pores, modifying the surface, or modifying pores inside.
  • the particle preparation and the pore expansion of the small pores may be performed by the processes described above, and then the cleaning and drying processes may be performed.
  • the separation of the unreacted material may be preceded by washing before washing, for example, by separating the supernatant by centrifugation.
  • the centrifugation may be performed at, for example, 6,000 to 10,000 rpm, for example, 3 minutes to 60 minutes, specifically 3 minutes to 30 minutes, 3 minutes to 30 minutes, 5 minutes To 30 minutes, and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • the cleaning after the particle preparation of the small pores may be carried out by any method / condition within the range exemplified above, but is not limited thereto.
  • the purging after the pore expansion can be performed under more relaxed conditions than in the previous examples. For example, washing may be performed within 3 times, but is not limited thereto.
  • the surface and / or pore interior modification of the particles can be performed by the method described above, and the process can be performed in the order of surface modification and pore interior modification, and a cleaning process of the particles is further performed between the two processes .
  • the inside of the pores are filled with the reaction liquid such as the particles used for the preparation of the particles and the pore expansion, Only the surface can be modified. The particles may then be washed to remove the reaction liquid inside the pores.
  • the washing of the particles between the surface modification and the pore interior modification process may be performed using water and / or an organic solvent. Specifically, since the materials soluble in each solvent are different, water and an organic solvent may be used once or several times, Water or an organic solvent can be washed once or several times. The number of times may be, for example, 2 or more, 10 or less, specifically 3 or more and 10 or less, 4 or more or 8 or less, 4 or more, 6 or less, and the like.
  • the washing may be carried out under centrifugation, for example, at 6,000 to 10,000 rpm, for example, for 3 to 60 minutes, specifically for 3 to 30 minutes, Min to 30 min, 5 min to 30 min, and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • the washing may be performed by filtering the particles with a filter without centrifugation.
  • the filter may have pores smaller than the diameter of the porous silica particles.
  • the water and the organic solvent may be used once or several times at the time of the washing, and the water or the organic solvent may be washed once or several times.
  • the number of times may be, for example, 2 or more, 10 or less, specifically 3 or more and 10 or less, 4 or more or 8 or less, 4 or more, 6 or less, and the like.
  • the drying may be performed at, for example, 20 ° C to 100 ° C, but is not limited thereto, and may be performed in a vacuum state.
  • composition for delivering an intravascular bioactive substance according to the present invention may further contain substances known in the art depending on the efficiency of delivery of the physiologically active substance carried on the porous silica particles or the purpose of using the composition.
  • substance that can further include, but are not limited to, a fluorescent labeling substance, a blood coagulation preventing agent, a red blood cell hemolytic agent or contrast agent, and the like.
  • the blood coagulation inhibitor may be 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- (phospho-lact- (1-glycerol)) (1,2-DISTEAROYL-SN- GLYCERO- 3- (PHOSPHO- - (1-GLYCEROL)), 1,2-distearoyl-SN-GLYCERO-3-PHOSPHOCHOLINE, CETOMACROGOL 1000), cetostearyl alcohol (cETOSTEARYL aLCOHOL), cetyl alcohol (cETYL aLCOHOL), cetylpyridinium chloride (cETYLPYRIDINIUM cHLORIDE), cholesterol (cHOLESTEROL), di-palmitoyl phosphatidylglycerol (DIPALMITOYLPHOSPHATIDYLGLYCEROL), one phosphatidylcholine (DISTEAROYLPHOSPHATIDYLCHOLINE) to distearate , ALKYL POLYGLYCOSIDE
  • the contrast agent is selected from the group consisting of metrizamide, iopamidol, iodixanol, iohexol, iopromide, ioptilide, iomeprol, iopentol, iopaminol, ioxilane, iotrollan, gadodiamide, But are not limited to, at least one selected from the group consisting of lauric acid, lauric acid, lauric acid, lauric acid, lauric acid, lauric acid, lauric acid, gadodiamide, But are not limited to, at least one selected from the group consisting of lauric acid, lauric acid, lauric acid, lauric acid, lauric acid, lauric acid, lauric acid, but are not limited to, at least one selected from the group consisting of lauric acid, lauric acid, lauric acid, lauric acid, lauric acid, lauric acid, but are not limited to, at
  • the composition for delivering an intravascular bioactive substance of the present invention specifically relates to intravascular administration of the composition of the present invention.
  • intravascular is understood to refer to the transfer into the vascular system of a patient, which means within the patient's 'vessel (s)', 'into the vessel (s)' or 'in the vessel (s)'.
  • the administration is intravenous (intravenous) administration which is deemed to be intravenous, while in other embodiments administration is administration into the vessel, which is considered to be arterial.
  • the veins are divided into internal jugular vein, peripheral vein, coronary vein, hepatic vein, arteriovenous fistula, great saphenous vein, pulmonary vein, superior vein, inferior vein, stomach vein, mesenteric vein, superior mesenteric vein, head vein and / or femoral vein.
  • Arteries include the coronary arteries, the pulmonary arteries, the brachial artery, the internal carotid artery, the aortic arch, the femoral artery, the peripheral artery, and / or the ciliary artery. It is not. It is contemplated that they can be delivered through the arterioles or capillaries, or into the arterioles or capillaries.
  • the intravascular administration of the composition for delivering intravascular bioactive substance of the present invention is carried out by inserting a catheter into the blood vessel of a target tissue or a cell in order to effectively deliver the physiologically active substance carried on the porous silica particles, .
  • the physiologically active substance carried on the surface of the porous silica particles may be washed away by the flow of the blood stream, or the diffusion of the physiologically active substance carried on the surface of the porous silica particles or inside the pores may be reduced by diffusion And it has an advantage that it is possible to increase the target of transferring the supported physiologically active substance.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating a specific disease comprising the composition for delivering an intravascular bioactive substance.
  • beneficial or desired clinical results include, but are not limited to, alleviation of symptoms, reduction in the extent of disease, stabilization (i.e., not worsening) of the disease state, (Either partially or totally), detectable or undetected, whether or not an improvement or temporary relief or reduction
  • treatment may mean increasing the survival rate compared to the expected survival rate when not receiving treatment. Treatment refers to both therapeutic treatment and prophylactic or preventative measures. Such treatments include treatments required for disorders that have already occurred as well as disorders to be prevented.
  • prevention means any action that inhibits or delays the onset of a related disease. It will be apparent to those skilled in the art that the compositions herein may prevent early onset symptoms, or related disorders when administered prior to appearance.
  • the specific disease is selected from the group consisting of hepatocellular carcinoma, metastatic liver cancer, colon cancer, metastatic colorectal cancer, lung cancer, metastatic lung cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, metastatic pancreatic cancer, skin cancer, melanoma, metastatic melanoma, osteosarcoma, fibrosarcoma, lipoma, Neoplasms, cancer of the bladder, cancer of the cervix, cancer of the uterine cervix, ovarian cancer, breast cancer, head and neck cancer, thyroid cancer and kidney cancer, brain cancer, glioblastoma, tumor of the endometrium, metastasis of the lymph node metastasis, blood cancer, leukemia, Hodgkin's lymphoma, Lymphoma, malignant lymphoma, myelodysplastic syndrome, acute lymphoblastic leukemia, acute myelogenous leukemia, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, isolated myel
  • the present invention relates to the use of a compound of formula (I) in the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of a disease or condition selected from the group consisting of infectious diseases, viral infections, bacterial infections, rheumatoid arthritis, diabetic complications, foot ulcers, neuropathies, Selected from the group consisting of skin disease, pressure ulcer, vascular disease, arterial disease, venous disease, lymphatic disease, cardiovascular disease, ischemic heart disease, cerebrovascular disease, hypertension, dyslipidemia, atherosclerosis, peripheral vascular disease, But is not limited thereto.
  • a disease or condition selected from the group consisting of infectious diseases, viral infections, bacterial infections, rheumatoid arthritis, diabetic complications, foot ulcers, neuropathies, Selected from the group consisting of skin disease, pressure ulcer, vascular disease, arterial disease, venous disease, lymphatic disease, cardiovascular disease, ischemic heart disease, cerebrovascular disease, hypertension, dyslipidemia, atherosclerosis, peripheral vascular disease, But is not limited there
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating the above-mentioned diseases comprising the porous silica particles carrying the physiologically active substance of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier and may be formulated together with the carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier refers to a carrier or diluent that does not irritate the organism and does not interfere with the biological activity and properties of the administered compound.
  • the pharmaceutical carrier which is acceptable for the composition to be formulated into a liquid solution include sterilized and sterile water, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, One or more of these components may be mixed and used.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to formulate into injectable solutions, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • composition of the present invention can be applied to any formulation containing the porous silica particles carrying the physiologically active substance of the present invention as an active ingredient and can be manufactured into oral or parenteral formulations.
  • the pharmaceutical formulations of the present invention may be administered orally, rectally, nasal, topical (including under the ball and tongue), subcutaneous, vaginal or parenteral (intramuscular, subcutaneous And intravenous), or forms suitable for administration by inhalation or insufflation.
  • composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. Effective dose levels will depend on factors well known in the art and other medical disciplines including the type of disease, severity of the patient, activity of the drug, sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, Can be determined.
  • the composition of the present invention can be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and can be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and can be administered singly or in multiple doses. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the dosage of the composition of the present invention varies depending on the patient's body weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, administration method, excretion rate, severity of disease and the like.
  • the amount of the drug accumulated in the body and / or the specific activity of the porous silica particle carrying the physiologically active substance used. May be calculated on the basis of the EC50 generally measured as effective in the in vivo animal model and in vitro, for example from 0.01 [mu] g to 1 g per kg of body weight and may be divided into daily, weekly, monthly, May be administered once or several times per unit period, or may be continuously administered for a long period using an infusion pump.
  • the number of repeated administrations is determined in consideration of the duration of the drug in the body, the drug concentration in the body, and the like.
  • the composition may be administered for recurrence, even after treatment according to the course of the disease treatment.
  • composition of the present invention may further contain one or more active ingredients which exhibit the same or similar functions with respect to the treatment of the above-mentioned diseases, or a compound which maintains / increases the solubility and / or absorbency of the active ingredient. Also optionally, it may further comprise a chemotherapeutic agent, an anti-inflammatory agent, an antiviral agent and / or an immunomodulator.
  • compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art so as to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to the mammal.
  • the formulations may be in the form of powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatine capsules, sterile injectable solutions, sterile powders.
  • the present invention provides a composition for embolization comprising the composition for delivering an intravascular bioactive substance.
  • the physical properties of the porous silica particles used in the embolization composition are not largely different from those of the above-mentioned particles, but the particles can be adjusted to an appropriate size according to the purpose of embolization.
  • nanometer-sized particles are used to enter the microvessel inside the tumor tissue to prevent blood flow to the tumor tissue and prevent the flow of oxygen and nutrients to the tumor tissue while accumulating in blood vessels and tumor vessels to the tumor tissue While micrometric sized particles can be used to block the arteries connected to the tumor tissue, allowing embolization of a wider range of tumor tissues.
  • the average diameter of the particles may be, for example, 100 nm to 1000 nm, and may be, for example, 100 nm to 800 nm, 100 nm to 500 nm, 100 nm to 400 nm, 300 nm, and 100 nm to 200 nm, but is not limited thereto.
  • the average diameter of the particles may be, for example, 0.1 to 500 ⁇ m, 0.1 to 300 ⁇ m, 100 to 300 ⁇ m, 300 ⁇ m to 500 ⁇ m, 0.1 ⁇ m to 100 ⁇ m, 0.1 Mu m to 1 mu m, and 0.2 mu m to 0.8 mu m, but is not limited thereto.
  • the porous silica particles are biodegradable particles as described above, and can be decomposed by body fluids or microorganisms in vivo, so that the anticancer agent can be released in a sustained manner over a period of several hours to several hundreds of hours after the injection, It is possible to re-inject into the same pathway (blood vessel) during the second procedure when the tumor is not completely necrotized / killed after the chemoembolization procedure because it is not permanently blocked.
  • composition is selected from the group consisting of polyvinyl alcohol, contrast agent, iodized oil, oil contrast agent, oil contrast agent, barium contrast agent, lipiodol, N-butylcyanoacrylate, coil, gel foam, Silica, fumed silica, polymers, copolymers, polysodium acrylate vinylalcohol copolymers, radiation materials, glass, poly-L-guluronic alginate, Polyglycolic-polyactic acid, polydioxanone, polyglycolic acid-co-caprolactone, polypropylene and polypropylene having a diameter of 10 ⁇ m or more And porous silica particles.
  • emulsion of the present invention can be mixed with the porous silica particles of the present invention to form a stable emulsion in consideration of common sense in the art to perform embolization as an emulsion- Contrast agent or lipiodol can be selected.
  • Administration of the composition may be through a catheter having the advantages described above and may be administered to a vessel directly connected to the tumor via a catheter to inhibit damage to normal tissue and to increase the target uptake Effect can be obtained.
  • Diseases that can be used for embolization using the above composition include hepatocellular carcinoma, metastatic liver cancer, colon cancer, metastatic colorectal cancer, lung cancer, metastatic lung cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, metastatic pancreatic cancer, skin cancer, melanoma, metastatic melanoma, osteosarcoma, , Lipoma, gallbladder cancer, intrahepatic cholangiocarcinoma, bladder cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, breast cancer, head and neck cancer, thyroid cancer and kidney cancer, brain cancer, glioblastoma, tumor of the endometrium, metastatic lymph node metastasis, blood cancer, leukemia, Lymphoma, multiple myeloma, lymphoma, malignant lymphoma, myelodysplastic syndrome, acute lymphoblastic leukemia, acute myelogenous leukemia, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, isolated myelo
  • porous silica particles of the present invention may be referred to as Degrada Ball (trademark registration number 40-1292208).
  • reaction solution was centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes at 25 DEG C to remove the supernatant, centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes at 25 DEG C, and washed five times with ethanol and distilled water alternately.
  • microporous porous silica particles 1.5 g were added to 10 ml of ethanol and ultrasonically dispersed. 10 ml of water and 10 ml of trimethyl benzene (TMB) were added and ultrasonically dispersed.
  • TMB trimethyl benzene
  • the reaction was carried out by starting at 25 ° C and heating at a rate of 10 ° C / min and then slowly cooling down at a rate of 1 to 10 ° C / min in an autoclave.
  • the cooled reaction solution was centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes at 25 DEG C to remove supernatant, centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes at 25 DEG C, and washed five times with ethanol and distilled water alternately.
  • the porous silica particles prepared in 2) were placed in a glass vial and heated at 550 ° C for 5 hours. After completion of the reaction, the particles were gradually cooled to room temperature to prepare particles.
  • Porous silica particles were prepared in the same manner as in Example 1- (1), except that the reaction conditions at the time of pore expansion were changed to 140 ⁇ and 72 hours.
  • porous silica particles were prepared in the same manner as in item (1) of Example 1-9, except that a 5-fold vessel was used and all the materials were used in a 5-fold volume.
  • Porous silica particles were prepared in the same manner as in Example 1- (1), except that 920 ml of distilled water and 850 ml of methanol were used in the preparation of the small pore particles.
  • Porous silica particles were prepared in the same manner as in Example 1- (1), except that 800 ml of distilled water, 1010 ml of methanol and 10.6 g of CTAB were used in the preparation of small pore particles.
  • Porous silica particles were prepared in the same manner as in Example 1- (1), except that 620 ml of distilled water, 1380 ml of methanol and 7.88 g of CTAB were used in the preparation of the small pore particles.
  • Porous silica particles were prepared in the same manner as in Example 1- (1) except that 2.5 mL of TMB was used at the time of pore expansion.
  • Porous silica particles were prepared in the same manner as in Example 1- (1) except that 4.5 mL of TMB was used at the time of pore expansion.
  • Porous silica particles were prepared in the same manner as in Example 1- (1) except that 11 mL of TMB was used at the time of pore expansion.
  • Porous silica particles were prepared in the same manner as in item (1) of Example 1-9 except that TMB was used at 12.5 mL at the time of pore expansion.
  • Example 1- (1) -2 The small pore particles were reacted with TMB in the same manner as in Example 1- (1) -2), cooled, and centrifuged to remove the supernatant. Thereafter, the mixture was centrifuged under the same conditions as in Example 1- (1) -2), washed three times with ethanol and distilled water alternately, and then dried under the same conditions as in Example 1- (1) -2) Silica particles (pore diameter 10 to 15 nm, particle diameter 200 nm) were obtained.
  • the reaction solution in the previous step remains in the pores, and the inside of the pores are not modified.
  • the cooled reaction solution was centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes to remove the supernatant, centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes at 25 DEG C, and washed five times with ethanol and distilled water alternately.
  • Example 1- (4) The porous silica particles of Example 1- (4) were reacted with (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) to positively charge.
  • APTES (3-Aminopropyl) triethoxysilane
  • porous silica particles were dispersed in 10 mL of toluene in a 100 mL round bottom flask with a bath sonicator. Then, 1 mL of APTES was added, and the mixture was stirred at 400 rpm and stirred at 130 DEG C for 12 hours.
  • the mixture was slowly cooled to room temperature, centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes to remove the supernatant, centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes at 25 ° C, and washed 5 times with ethanol and distilled water.
  • Example 1- (1) The porous silica particles of Example 1- (1) were reacted with (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) and charged positively. 0.4 ml of APTES was added and the reaction time was changed to 3 hours Was modified in the same manner as in Example 2- (1) -1).
  • APTES (3-aminopropyl) triethoxysilane
  • Example 2- The porous silica particles of Example 1- (9) were reacted with (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) and positively charged.
  • APTES (3-Aminopropyl) triethoxysilane
  • Example 3- (10) were reacted with (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) and charged positively, and modified in the same manner as in Example 2- (1) -1.
  • APTES (3-Aminopropyl) triethoxysilane
  • Example 1- (1) -1) Porous silica particles subjected to the procedure of Example 1- (1) -1) and then subjected to the procedure of Example 1- (1) -3) were reacted with (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) The method was modified in the same manner as in Example 2- (1) -1).
  • APTES (3-Aminopropyl) triethoxysilane
  • the porous silica particles of Example 2- (1) -3) -2 were charged and positively charged by reacting with glutaraldehyde (GA).
  • porous silica particles were dispersed in 10 mL of distilled water in a 100 mL round bottom flask with a bath sonicator. Then, 10 mL of GA was added, and the mixture was stirred at 400 rpm at room temperature for 24 hours.
  • the supernatant was removed by centrifugation at 8000 rpm for 10 minutes, centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes at 25 ° C, and washed 5 times with distilled water.
  • Example 1- (1) The porous silica particles of Example 1- (1) were reacted with trimethoxy (propyl) silane to introduce a propyl group into the surface and pores, except that 0.35 ml of trimethoxy (propyl) silane was added instead of APTES and reacted for 12 hours , The modification was carried out in the same manner as in Example 2- (1).
  • Example 1- (1) The porous silica particles of Example 1- (1) were reacted with trimethoxy-n-octylsilane to introduce a propyl group into the surface and pores, except that 0.5 ml of trimethoxy-n-octylsilane was added instead of APTES and the reaction was carried out for 12 hours , The modification was carried out in the same manner as in Example 2- (1).
  • Example 1- (1) The porous silica particles of Example 1- (1) were reacted with succinic anhydride to negatively charge.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • 80 mg of succinic anhydride was added instead of APTES, (1) -1), except that DMSO was used instead of distilled water at the time of washing.
  • Example 2- (3) -2 100 mg of the porous silica particles of Example 2- (3) -2) was dispersed in 1 mL of 1 M aqueous sulfuric acid solution and 20 mL of 30% aqueous hydrogen peroxide, stirred at room temperature to induce oxidation reaction, and the thiol group was oxidized with a sulfonic acid group. Thereafter, it was washed and dried in the same manner as in Example 2- (1) -1).
  • porous silica particles were dispersed in 10 mL of distilled water in a 100 mL round bottom flask with a bath sonicator. Then, 3 mL of THMP and 1.5 mL of 1 M HCl aqueous solution were added and stirred at 400 rpm at 130 ° C for 24 hours.
  • the mixture was slowly cooled to room temperature, centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes to remove the supernatant, centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes at 25 ° C, and washed 5 times with distilled water.
  • Example 1- (1) 100 mg of the porous silica particles of Example 1- (1) were dispersed in 20 ml of N, N'-disuccinimidyl carbonate (DSC) solution having a concentration of 50 ⁇ g / ml and stirred at room temperature to bind the surface of the porous silica particles with DSC.
  • the particles were washed three times with 10 ml of distilled water, and 10 mg of PEG (HO-PEG-NH 2 ) having a molecular weight of 4 kDa and an amino group at the end were dispersed in 10 ml of the above solution.
  • the mixture was stirred at room temperature to obtain a porous silica particle surface So that the PEG can be connected. Thereafter, it was washed and dried in the same manner as in Example 2- (1) -1).
  • Doxorubicin was loaded onto the porous silica particles of Example 2- (3) -4) having a negative charge.
  • porous silica particle powder 5 mg was mixed under distilled water, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • Sorapanib was loaded onto the porous silica particles of Example 1- (11) -5) -1.
  • porous silica particle powder and 2 mg of sorafenib were mixed with 1 ml of deionized water / ethanol (5: 5 mixing ratio (volume ratio)), followed by incubation at room temperature for 1 hour. Then washed three times with 1 ml deionized water.
  • porous silica particles particles of Example 1- (11) -5) -2 were used.
  • the mimic sequence is related to the sequence of the hydrophobic secondary helical structure part where the p53 protein binds to the hMDM2 protein.
  • the p53 peptide acts as an antagonist of the hMDM2 protein.
  • amino acid sequence of the p53 peptide (Cal. m.w. 2596.78, found by MALDI-TOF 2597.92) is the same as in the following formula (1) (N-terminal to C-terminal).
  • X is an unnatural amino acid introduced with an azide functional group, 2-amino-5-azido-pentanoic acid, Y is an unnatural amino acid introduced with an alkyne functional group, and the side chain of D-Lys ) With 4-pentynoic acid;
  • X and Y are connected to form a triazole by an azide-alkyne cycloaddition reaction or a click reaction;
  • p53 peptide 1.3 mg (500 nmole) of p53 peptide was dissolved in 100 ⁇ l of DMSO, and 5 ml of an aqueous solution obtained by dissolving 5 mg of the porous silica particle powder in 15 ml of conical tube was mixed and then incubated at room temperature for 12 hours.
  • porous silica particles loaded with the p53 peptide were purified by centrifugation (9289 rcf, 8500 rpm, 20 min, 15 mL conical tube) and washing with water three times.
  • 5 '-GGCUACGUCCAGGAGCGCACC-3' (SEQ ID NO: 1), antisense; 5 '-GGCUACGACCAGGAGCGCACC-3' (SEQ ID NO: 1) was purchased from Bioneer, Inc. for synthesis of 21 base pair duplex siRNA targeting green fluorescent protein (GFP) - UGCGCUCCUGGACGUAGCCUU-3 '(SEQ ID NO: 2)).
  • GFP green fluorescent protein
  • Plasmid DNA (SEQ ID NO: 5) of 6.7k base pair designed to express GFP with pcDNA3.3 backbone was produced in bacteria and used after purification.
  • Example 2- (3) -4) -2 100 ⁇ g of the porous silica particle powder of Example 2- (3) -4) -2 was mixed with 50 ⁇ g of anti-PD-1 (BioXCell, BP0146) in 100 ⁇ l of distilled water, followed by incubation at room temperature for 5 minutes.
  • anti-PD-1 BioXCell, BP0146
  • FIG. 1 is a photograph of the porous silica particles of Example 1- (1)
  • FIG. 2 is a photograph of the porous silica particles of Example 1- (2) to confirm that spherical porous silica particles sufficiently expanded in pore size Can,
  • Fig. 3 is a photograph of small pore particles of Example 1- (1)
  • Fig. 4 is a photograph of small pore particles of Example 1- (1) and Example 1- (3) Is generated evenly.
  • the surface area and the pore volume of the small pore particles of Example 1- (1) and the porous silica particles of Examples 1- (1), (7), (8) and (10) were calculated.
  • the surface area was calculated by the Brunauer-Emmett-Teller (BET) method and the pore size distribution was calculated by the Barrett-Joyner-Halenda (BJH) method.
  • porous silica particles are almost completely decomposed after 360 hours of biodegradation.
  • a 0 is the absorbance of the porous silica particles measured by placing 5 ml of the 1 mg / ml suspension of the porous silica particles in a cylindrical permeable membrane having pores having a diameter of 50 kDa,
  • a t is the absorbance of the porous silica particles measured after passage of time t from the measurement of A 0 ).
  • porous silica particle powder 5 mg was dissolved in 5 ml of SBF (pH 7.4). Thereafter, 5 ml of the porous silica particle solution was placed in the permeable membrane having pores of 50 kDa in diameter shown in Fig. 15 ml of SBF was added to the outer membrane, and SBF of the outer membrane was replaced every 12 hours.
  • porous silica particles of the examples have significantly larger t than the control.
  • the positively charged particles had a t value of 20 or more, in which the ratio of the absorbance was 1/2.
  • porous silica particles loaded with doxorubicin 1 mg are dispersed in SBF (pH 7.4) (total volume 1 ml) and the solution is placed in a 1.5 ml tube and maintained in dynamic conditions with horizontal stirring at 37 ° C and 20 rpm .
  • doxorubicin is loaded relatively weakly with the surface of the particles and relatively fast release due to its high solubility in the SBF of doxorubicin, about 1.5 hours to 50% It can be seen that the physiologically active substance is continuously released over a period of time.
  • doxorubicin is loaded with a relatively weak binding force to the particle surface, and since it is highly soluble in doxorubicin SBF, about 6 days have elapsed to reach 50% It can be seen that the physiologically active substance is continuously released.
  • sorafenib which is an insoluble physiologically active substance, is released very slowly due to interaction with porous silica particles having a hydrophobic substituent.
  • retinoic acid-loaded particles were added to a solution of 5% ethanol in PBS (pH 7.4), and the temperature was maintained at 37 ⁇ with constant stirring. The solution containing the particles was centrifuged every 24 hours, and the absorbance of the supernatant was measured at a wavelength of 350 nm to measure the amount of retinoic acid released. The results are shown in FIG.
  • retinoic acid having a negative charge is released very slowly by interaction with positively charged porous silica particles, and is released to almost 100% at about 10 days.
  • the p53 peptide is loaded in the porous silica particles as a binding force through the hydrophobic effect and is not released in the PBS solution.
  • a protein such as FBS (fetal bovine serum)
  • FBS fetal bovine serum
  • the p53 peptide binds to the hydrophobic segment of the FBS protein and can be dissolved in the solution, and is released outside the porous silica particle have.
  • the p53 peptide loaded inside the particle may be released outside the particle, and the FBS protein may be introduced into the particle.
  • the 50% release time of the siRNA is about 6 hours.
  • porous silica particles linear DNA 3 ⁇ g, porous silica particles 100 ⁇ g loaded with Linear DNA were resuspended in PBS (pH 7.4, 37 ⁇ ) and a permeation membrane (the same tube as the tube in Fig. 18) , And the permeate tube was immersed in 1.5 ml of PBS. Release of plasmid DNA was performed at 37 ° C with 60 rpm horizontal stirring.
  • Release solvents were withdrawn at time intervals of 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 12, and 24 hours prior to 24 hours, followed by 24 hour intervals of 0.5 ml of release solvent for Hoechst-binding assay And an equal volume of PBS was added.
  • the 50% release time of the linear DNA is about 24 hours.
  • IgG is released slowly in both SBF and PBS, and is released to almost 100% over 250 hours.
  • release rate is higher in PBS in the initial stage and higher in release rate in SBF (100 hours to the divergence point), and the antibody was continuously released for more than 250 hours.
  • porous silica particles loaded with the Cas9 protein / guide RNA complex were suspended in PBS (pH 7.4), and the porous silica particles were immersed in a slide glass on which 50,000 NIH 3T3 cells, known as mouse fibroblasts, Treated with serum free media and incubated at 5% CO 2 and 37 ° C.
  • the medium was removed at 1 hour, 3 hours, 6 hours, 24 hours, washed with 1x PBS solution, and fixed with 4% paraformaldehyde for 15 minutes.
  • the cells were incubated in blocking buffer (1x PBS, 5% normal goat serum, 0.3% triton X-100) for 1 hour.
  • the His tag antibody (Santa Cruz, sc-8036) was incubated for 16 hours.
  • anti-mouse secondary antibody (Abcam, ab150113) with Alexa Fluor 488 was incubated for 2 hours.
  • DAPI is a nuclei staining reagent, which is blue in the fluorescence microscope image and shows the position of the cell nucleus.
  • Alexa Fluor 488 is a fluorescent dye labeled with Cas9 protein, which appears green in the fluorescence microscopic image and shows the location of the Cas9 protein in the cell.
  • Cells loaded with Cas 9 protein labeled with Alexa Fluor488 were treated with DAPI stain and the presence of Cas9 protein in the cells and the position of the nucleus can be confirmed by fluorescence microscopy images.
  • Cas9 protein introduced into the cell was observed mainly in the cytoplasmic part at 3 hours after the introduction and observed in the nucleus at 24 hours after the introduction. It is almost impossible for the used silica particles themselves to enter into the nucleus, and therefore it can be seen that Cas9 protein is released from the silica particles at 24 hours in the cell, and is introduced into the nucleus known as an intracellular organelle in which Cas9 protein is originally accumulated .
  • Balb / c nude male (5 weeks old) was purchased from Orient Bio Inc., and 3 million HeLa cells (cervical cancer cells) were dispersed in sterilized 1x PBS.
  • Xenograft tumors were subcutaneously injected into mice to grow 70 mm when the solidification of the 3 tumor size is confirmed, PBS, FITC- porous silica particles (example 2 (1) -2) the porous silica particles), porous silica particles FITC- loaded the Cy5-siRNA of -2 (prepared (Porous silica particles of Example 2- (1) -2) -2) were injected into mouse tumors, respectively.
  • fluorescence intensity and distribution were measured by FOBI fluorescence in vivo imaging system , Korea).
  • the FITC label was prepared by dispersing 50 mg of silica particles in 1 mL of DMSO and adding 25 ⁇ g (10 ⁇ l) of a solution of FITC-NHS (2.5 mg / mL) into the flask and blocking the light with aluminum foil. The reaction mixture was centrifuged at 8500 rpm for 10 minutes. The supernatant was discarded and the precipitated particles were dispersed evenly in ethanol. This was repeated 3-4 times with ethanol-distilled water and FITC color was added to the supernatant. And purification was carried out until it was not seen. The results are shown in Fig. 27 (A).
  • FIG. 27 (A) control was performed with PBS alone, cy5-siRNA alone with cy5-siRNA, FITC-DDV with porous silica particles singly labeled with FITC, complex with cy5-siRNA loaded and FITC-labeled porous silica particles , It can be confirmed that the siRNA transferred into the body on the particle has a longer period of maintaining the activity and stays longer in the injected region and shows strong fluorescence even after 48 hours .
  • Xeno was prepared in a Balb / C nude mouse using HepG2 cells, a human liver cancer cell line, and when the size (50-100 mm 3 ) suitable for the experiment was reached, doxorubicin was added to the particles of Example 2- (3) -4) -1 After being carried, it is dispersed in 100 ⁇ l of PBS solution, and then injected through the mouse vein.
  • the dose of doxorubicin is 4 mg / kg (mouse body weight), 80 ⁇ g of doxorubicin and 160 ⁇ g of particles are used based on 20 g of average weight of Balb / C nude mice aged 5 to 8 weeks old.
  • Xeno was prepared in a Balb / C nude mouse using MDA-MB-231 cells, a human breast cancer cell line, and when the size was appropriately set (50-100 mm 3 )
  • the particles were loaded with VEGF inhibitory siRNA (SEQ ID NO: 7 sense; 5'-GGAGUACCCUGAUGAGAUCdTd-3 ', SEQ ID NO: 8 antisense; 5'-GAUCUCAUCAGGGUACUCCdTdT-3') and dispersed in 100 ⁇ l of PBS solution. do.
  • the amount of VEGF inhibition siRNA injected is 1 mg / kg (mouse body weight) and 20 ⁇ g of siRNA and 400 ⁇ g of particles are used based on the average weight of 5 to 8 weeks old Balb / C nude mice.
  • Xeno was prepared in a Balb / C nude mouse using HeLa cells as a human cervical cancer cell line, and when the size (50-100 mm 3 ) suitable for the experiment was reached, RNase A was carried on the particle of Example 1- (9) PBS solution (100 ⁇ l) and then injected through the mouse vein.
  • the amount of Rnase A injected is 2 mg / kg (mouse body weight) and 40 ⁇ g of Rnase A and 400 ⁇ g of particles are used based on 20 g of average weight of Balb / C nude mice aged 5 to 8 weeks old.
  • Xeno was prepared in Balb / C nude mice using HeLa cells, a human cervical cancer cell line. When the size of the Xeno was 50-100 mm 3 , After the peptide is loaded, it is dispersed in 100 ⁇ l of PBS solution, and then injected through the mouse tail vein. The amount of p53 peptide injected is 2.5 mg / kg (mouse body weight), and 50 ⁇ g of p53 peptide and 200 ⁇ g of particles are used based on 20 g of average weight of Balb / C nude mice aged 5 to 8 weeks.
  • doxorubicin, VEGF inhibitory siRNA, Rnase A, or p53 were loaded on the porous silica particles of the present invention, doxorubicin, VEGF inhibiting siRNA, Rnase A or p53 alone
  • the inhibition of tumor growth and the suppression of VEGF expression are superior to those in the case of injection. This is considered to be due to the intrinsic properties of the particles of the present invention, such as excellent transduction and biodegradability in the blood vessel.
  • the composition containing the porous silica particles mixed with the contrast agent of the present invention which is mixed with the contrast agent, can be accurately detected without blocking the catheter and the blood vessel without precipitation or aggregation, Can be confirmed.
  • porous silica particles 100 ⁇ g of the porous silica particles are dispersed in 1 ml of PBS (pH 7.4), transferred to a disposable folded capillary cell (DTS1070), and mounted on a zeta potential measuring device to measure the zeta potential.
  • PBS pH 7.4
  • DTS1070 disposable folded capillary cell
  • P O vibration peak, P-CH 3 rocking peak and P-CH 3 wagging peak appear in the FT-IR spectrum, indicating that anionic functional groups are introduced on the surface of the particles, Able to know.
  • the porous silica particles can have various ranges of zeta potential depending on which functional group is modified, and that the types of supported physiologically active substances to be desired are diversified. Specifically, it can be seen that the porous silica particles of the present invention exhibit a zeta potential of + 3 mV or more and -18 mV or less, and a biomodified active material to be supported by double modification (for example, PEG) As shown in FIG.
  • Example 1- Si-OH (unmodified) Negative charge (about -18mV)
  • Example 2- (3) -5) CHO Positive charge (approximately + 8mV) Molecules that can form schiff base (imine) linkage
  • Example 1- (11) -5) (2)
  • Example 1 1- particles and 10 mg of 2- (3) -4) - (1) were dispersed in 1 ml of PBS solution and 25% plasma solution, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour. To compare the amount of particles that can not be dispersed. The absorbance of the supernatant was compared to compare the amount of particles stably dispersed in the PBS solution and the 25% plasma solution.
  • Example 1- (1) and 2- (3) -4) -1 are sequentially prepared at a concentration as low as 20 mg, which is the highest concentration, and dispersed in 0.8 ml of PBS solution.
  • 0.2 ml of the erythrocyte solution dispersed in the PBS solution is added, shaded at room temperature, and placed in a rotary stirrer at 80 rpm for 4 hours. After 4 hours, centrifuge at 10,000 rpm, 3 minutes, and 4 ° C to completely absorb the particles, and measure absorbance at 577 nm in the supernatant to compare the hemolysis of erythrocytes.
  • 0.8 ml of distilled water is used instead of the particle-dispersed solution.
  • 0.8 ml of PBS solution is used instead of the particle-dispersed solution.
  • the degree of precipitation or aggregation of the porous silica particles of the present invention is remarkably low in both the PBS aqueous solution condition and the 25% plasma solution condition. More specifically, in the PBS aqueous solution and the 25% plasma solution, The sedimentation rate of the particles of the present invention was only 80% and 70%, while that of the present invention was only 4% and 5%, respectively. This is because the surface treatment of the porous silica particles of the present invention produced a surface charge (zeta potential (mV)) and induced a repulsive force between the particles to maintain a stable solution.
  • zeta potential (mV) zeta potential
  • FIG. 30 it can be confirmed that hemolysis with erythrocytes does not occur even when the particles of the present invention are treated at a high concentration.
  • FIG. 31 it can be confirmed that the degree of hemolysis of red blood cells is increased in the case of the porous silica particles (Silanol-MSN) whose surface is not modified by other functional groups, depending on the concentration of the particles.
  • silica particles of the present invention are mostly modified with other functional groups including a sulfonate group, an aldehyde group, a polyethylene glycol group, a methylphosphonate group and an amine functional group instead of a silanol group on the surface, It is believed that the interaction is not strong and the interaction is low due to the small surface area that can contact the red blood cells due to the porous structure having numerous pores and the hemolysis of erythrocytes is significantly lower than that of the conventional silica particles due to the diameter of 100 nm or more .
  • Example 2- (3) -4) -1 which is negatively charged
  • the absorbance of the supernatant is measured to determine the amount of doxorubicin carried, and the loading ratio is calculated.
  • Example 2- (1) -2) to the porous silica particles to the retinoic acid solution of 100 ⁇ g -1 (50mM ethanol) was added to 1ml and the loading for 4 hours at room temperature, except that the measurement of absorbance at ⁇ 350nm ab was carried out in the same manner as in Experimental Example 9- (1) -1).
  • Example 2- (1) -3) -2 with positively charged siRNA is loaded into the supernatant, and the siRNA remaining in the supernatant is measured to determine the amount of siRNA to be carried, and the supporting ratio is calculated.
  • 20 ⁇ g of porous silica particles were dispersed in 10 ⁇ l of PBS aqueous solution, and 1 ⁇ g of siRNA was mixed and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Then, the solution was centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes, and the amount of siRNA remaining in the supernatant was measured by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and the amount of siRNA carried on the particle was calculated.
  • PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
  • Example 2- (1) -3) -2 with positively charged mRNA having a sequence of the following formula 2 was loaded on the particle, and the mRNA remaining in the supernatant was measured to determine the amount of the mRNA to be carried, do.
  • 20 ⁇ g of porous silica particles were dispersed in 10 ⁇ l of PBS aqueous solution, 1 ⁇ g of mRNA was mixed, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Then, the solution was centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes, and the amount of mRNA remaining in the supernatant was measured using agarose gel, and the amount of mRNA supported on the particle was calculated.
  • Example 2- (1) -3) -3) Positively charged pDNA is loaded on the particles, and the amount of pDNA retained in the supernatant is measured to calculate the amount of pDNA to be carried.
  • 20 ⁇ g of porous silica particles were dispersed in 10 ⁇ l of PBS aqueous solution, 1 ⁇ g of pDNA was mixed, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Then, the solution was centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes, and the amount of pDNA remaining in the supernatant was measured using agarose gel, and the amount of pDNA supported on the particle was calculated.
  • Example 2- (1) -3) -3) with positive charge After loading linear DNA into the particles, measure the remaining pDNA in the supernatant, calculate the amount of linear DNA supported, and calculate the loading ratio. Specifically, 20 ⁇ g of porous silica particles were dispersed in 10 ⁇ l of PBS aqueous solution, 1 ⁇ g of linear DNA was mixed, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Then, the solution was centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes, and the amount of linear DNA remaining in the supernatant was measured using an agarose gel, and the amount of lnear DNA carried on the particle was calculated.
  • Example 9- (1) -9) -1 100 ⁇ g of the porous silica particle powder of Example 2- (1) -2) -2) and 10 ⁇ g of anti-twist IgG (Santacruz, sc-81417) were mixed in 200 ⁇ l of 1 ⁇ PBS, and the mixture was incubated at room temperature for 1 hour to be loaded.
  • the procedure of Example 9- (1) -9) -1 was carried out in the same manner as described above.
  • Bioactive substances Loading capacity (w / w%) Small molecules : irinotecan, sorafenib, regorafenib, tamoxifen, gefitinib, erlotinib, afatinib, bleomycin, dactinomycin, daunorubicin, idarubicin, plicamycin, mitoxantrone, epirubicin, carboplatin, oxaliplatin, 5-fluorouracil, gemcitabine, temozolomide, alkylating agents (cisplatin, chlorambucil, antimetabolites, cytotoxic agents (bleomycin, mitomycin, etc.), topoisomerase inhibitors (etoposide, doxorubicin, etc.), anti-microtubule agents (vinblastine, paclitaxel, , metformine, etc 10-30 Antibodies: specific target antibodies for PD- 1, PD-L1, CTLA4, LAG3, OX40
  • HepG2 cells were plated on a 96-well plate at a rate of 10,000 cells / well. After 24 hours, the cells of Example 2- (3) -4) were sequentially dispersed from low concentration to 1 mg at the highest concentration for 24 hours. (CCK) was used to confirm the survival rate of HepG2 cells. The results are shown in Fig.
  • the composition containing the porous silica particles of the present invention had no effect on the survival rate of the HepG2 cell line regardless of the concentration, and thus it can be confirmed that there is no cytotoxicity.
  • An emulsion was formed by mixing 1.6 ml of lipiodol widely used as an embolization substance and 0.4 ml of porous silica particle carrying doxorubicin, and the emulsion was dropped on a transparent plastic plate in a droplet form, and then photographed with a fluorescence microscope. .
  • the emulsion type (B) in which the porous silica particles are mixed with respect to the lipiodol single emulsion (A) maintains the emulsion having a uniform size for a long time.
  • the kidneys were examined by taking a photograph of the liver and the infarction area of the liver was visually confirmed and the normal liver tissue was damaged.
  • porous silica particles with fluorescence on the surface of the particles For the porous silica particles with fluorescence on the surface of the particles, graft the tumor, liver, spleen and kidney of the rabbits collected after TACE, and add 2 ml of 1.5% hydrochloric acid-ethanol solution per 1 g of each tissue. After mixing, the mixture is kept at 4 ° C for 24 hours in a shaded state so that the particles in the tissue can be eluted. This solution is centrifuged at 5000 rpm at 4 ° C for 10 minutes using a centrifuge, and the fluorescence of the supernatant is measured to confirm the amount of particles remaining in each tissue.
  • the tumor, liver, spleen, and kidneys collected after TACE were finely minced, and then 10 ml of 0.25% trypsin per 200 mg of each tissue was placed and incubated at room temperature for 30 minutes. . After 30 minutes, collect the supernatant and compare the amount of particles contained in the extracted cells using flow cytometry.
  • TACE Procedure The rabbit blood is collected at 0, 1, 5, 10, 30, and 60 min intervals to separate plasma and the amount of doxorubicin present in the plasma is analyzed by HPLC.
  • the concentration of AST and ALT a protein that can detect liver-specific toxicity in blood plasma, was determined by colorimetric assay after collecting 1 ml of rabbit blood on the day of TACE treatment, day 1, day 4, day 7, do.
  • the liver cancer tissue portion of the rabbit was stained with a brown portion (A), and the survival rate of the liver cancer cells in the stained liver cancer tissues contained the porous silica particles carrying doxorubicin according to the present invention and lipiodol (B) shows that the survival rate of cancer cells is significantly decreased in the embolization procedure using embolization therapy composition (B), which shows excellent drug delivery through embolization of the composition of the present invention And the effect of treatment is shown through.

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Abstract

본 발명의 다공성 실리카 입자를 포함하는 조성물은 표면이 개질되어 혈액 내 응집과 침전을 억제함으로써 혈류 내로 표적 조직 또는 세포에 생리활성물질을 효과적으로 전달할 수 있고, 또한, 본 발명의 다공성 실리카 입자를 포함하는 색전 시술용 조성물은 상기의 장점 외, 생분해성과 서방성의 물성을 가져 우수한 색전 시술 효과를 얻을 수 있고, 표적 종양 조직 또는 세포에의 표적성이 우수하여 부작용이 적다는 장점이 있다.

Description

혈관 내 생리활성물질 전달용 조성물
본 발명은 혈관 내 생리활성물질 전달용 조성물에 관한 것이다.
약물전달 시스템은 기존 의약품의 부작용을 최소화하고 효능 및 효과를 극대화시켜 필요한 양의 약물, 예를 들어, 단백질, 핵산, 또는 기타 저분자 등을 효율적으로 전달할 수 있도록 하는 의약 기술을 의미한다. 신약 개발에 필요한 비용과 시간을 절감해 주는 상기 기술은 최근 나노기술과 결합하면서 의약계에서 새로운 부가가치를 창출하는 첨단기술의 한 분야로 자리 잡고 있으며, 미국과 일본 등 기술선진국들은 지난 80년대 후반부터 제약회사 등 기업을 중심으로 신약 개발과 함께 약물전달시스템의 개발에 전력을 쏟아 왔다.
지금까지는, 바이러스 유전자, 재조합 단백질, 리포좀(liposome), 양이온성 고분자, 그리고 다양한 형태의 나노입자와 나노물질들이 동물 세포 내로의 약물전달을 위해 이용되었다. 그러나 많은 양이온성 리포좀들과 양이온성 고분자들은 임상에 적용하기에는 세포에 독성이 강하여 부적합한 것으로 밝혀졌다. 또한, 안정적인 핵산의 세포막 투과를 위하여 핵산의 주 사슬을 화학적으로 변형시키는 방법도 시도되었다. 그러나, 이러한 방법은 비용이 비싸고 오랜 시간이 걸리며 노동 집약적인 공정이 요구되므로 임상 적용에는 적합하지 않다. 의미 있는 시도로서, 양자점, 자성 입자, 또는 금 나노입자를 포함한 다양한 형태의 나노입자를 이용한 약물전달 시스템(drug delivery system, DDS)이 개발된 바 있다. 그러나, 이러한 입자들은 세포에 독성을 가지며 핵산 등의 생체 고분자의 도입에 용이하지 않은 구조를 가지며, 세포 내로의 도입 효율도 낮다는 단점이 있었다.
세포 내에서의 생리활성물질의 기능의 연구 또는 세포내 전달을 위해서는 효율적인 전달 시스템이 필요하다. 그러나, 광범위한 생리활성물질을 전달할 수 있는 범용적인 전달 시스템, 다량의 약물을 수용 및 전달할 수 있는 시스템, 약물을 서방적으로 방출하는 시스템에 대한 개발은 아직 미진한 상황이다.
본 발명은 혈액 내 안정성을 갖는 다공성 실리카 입자를 포함하는 혈관 내 생리활성물질 전달용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 생분해성과 서방성을 갖는 다공성 실리카 입자를 포함하는 색전 시술용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 표면 또는 기공 내부에 생리활성물질을 담지하고, 제타 포텐셜 +3 mV 이상 또는 -18 mV 이하인 다공성 실리카 입자를 포함하고,
상기 입자는 표면 또는 기공 내부가 화학적 개질된 것인 혈관 내 생리활성물질 전달용 조성물.
2. 위 1에 있어서,
상기 입자는 상기 표면 또는 기공 내부의 실라놀기의 적어도 일부가 알데하이드기, 케토기, 카바메이트기, 설페이트기, 설포네이트기, 아미노기, 아민기, 아미노알킬기, 실릴기, 카르복실기, 술폰산기, 티올기, 암모늄기, 설프히드릴기, 포스페이트기, 에스터기, 이미드기, 싸이오이미드기, 케토기, 에터기, 인덴기, 설포닐기, 메틸포스포네이트기, 폴리에틸렌글리콜기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3 내지 C30의 사이클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 C30의 아릴기 및 C1 내지 C30의 에스테르기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 작용기로 치환된 것인 조성물.
3. 위 1에 있어서,
상기 입자는 상기 표면 또는 기공 내부의 실라놀기의 적어도 일부가 아미노기, 아민기, PEG기, 프로필기, 옥틸기, 카르복실기, 티올기, 술폰산기, 메틸포스포네이트기 및 알데하이드기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 작용기로 치환된 것인 조성물.
4. 위 1에 있어서,
상기 입자는 직경이 100 내지 1000nm인 것인 조성물.
5. 위 1에 있어서,
상기 입자는 제타 포텐셜 +3 mV 내지 +100 mV 또는 -100 mV 내지 -18 mV 인 것인 조성물.
6. 위 1에 있어서,
상기 입자는 g당 부피가 0.7 내지 2.2 ml인 것인 조성물.
7. 위 1에 있어서,
상기 입자는 하기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 20 이상인 조성물:
[수학식 1]
At/A0
(식 중, A0는 상기 다공성 실리카 입자 1 mg/ml 현탁액 5 ml를 직경 50 kDa의 기공을 갖는 원통형 투과막에 넣고 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도이고,
상기 투과막 외부에는 상기 투과막과 접하며, 상기 현탁액과 동일한 용매 15 ml가 위치하고, 상기 투과막 내외부는 37℃에서 60 rpm 수평 교반되며,
At는 상기 A0의 측정시로부터 t 시간 경과 후에 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도임).
8. 위 1에 있어서,
상기 입자는 담지한 생리활성물질의 최대 방출량이 99중량% 이상인 것인 조성물.
9. 위 1에 있어서,
상기 생리활성물질은 핵산, 뉴클레오티드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질, 화합물, 항체, 항원, 사이토카인, 성장인자 및 이들을 구성하는 요소로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인 것인 조성물.
10. 위 1에 있어서,
상기 생리활성물질은 독소루비신, 이리노테칸, 소라페닙, 아드리아마이신, 다우노마이신, 마이토마이신, 시스플라틴, 에피루비신, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 아클라시노마이신, 나이트로젠 머스터드, 사이클로포스파미드, 블레오마이신, 다우노루비신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 타목시펜, 발루비신, 피라루비신, 미토산트론, 젬시타빈, 이다루비신, 테모졸로마이드, 파클리탁셀, 덱사메타손, 알데스루킨, 아벨루맙, 베바시주맙, 카보플라틴, 레고라페닙, 도세탁셀, 독실, 제피티닙, 이마티닙 메실레이트, 허셉틴, 이마티닙, 알데스루킨, 키트루다, 옵디보, 마이토마이신 C, 니볼루맙, 올라파립, 펨브로리주맙, 리투시맙, 수니티닙, 아테졸리주맙, 라파티닙 및 이필리무맙으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인 조성물.
11. 위 1에 있어서,
상기 조성물은 카테터를 통해 표적 조직으로 방출되는 것인 조성물.
12. 위 1 내지 11 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 색전 시술용 조성물.
13. 위 12에 있어서,
상기 조성물은 조영제 및 색전물질 중 적어도 하나를 더 포함하는 조성물.
14. 위 12에 있어서,
상기 조성물은 리피오돌, 덱스트란, 폴리비닐알코올, 리피오돌, N-부틸 시아노아크릴레이트(N-butylcyanoacrylate), 젤폼, 젤라틴, 에탄올, 덱스트란, 실리카, 폴리소디움 아크릴레이트 비닐알코올 코폴리머(Polysodium acrylate vinylalcohol copolymer), 글라스 입자, 폴리-L-굴루로닉 알지네이트(poly-L-guluronic alginate), 폴리글리콜릭-폴리액틱산(Polyglycolic-Polyactic acid), 폴리디옥사논(Polydioxanone), 폴리글리콜산-co-카프로락톤(Polyglycolic acid-co-caprolactone), 폴리프로필렌(Polypropylene) 및 직경 10㎛ 이상의 다공성 실리카 입자로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 색전물질을 더 포함하는 조성물.
15. 위 12에 있어서, 상기 조성물은 카테터를 통해 종양에 직접 연결된 혈관에 방출되는 조성물.
본 발명의 다공성 실리카 입자를 포함하는 조성물은 표면이 개질되어 혈액 내 응집과 침전을 억제함으로써 혈류 내로 표적 조직 또는 세포에 생리활성물질을 효과적으로 전달할 수 있다.
또한, 본 발명의 다공성 실리카 입자를 포함하는 색전 시술용 조성물은 상기의 장점 외, 생분해성과 서방성의 물성을 가져 우수한 색전 시술 효과를 얻을 수 있고, 표적 종양 조직 또는 세포에의 표적성이 우수하여 부작용이 적다는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 현미경 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 현미경 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 제조 공정 중의 소기공 입자의 현미경 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 소기공 입자의 현미경 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 기공 직경별 현미경 사진이다.
DDV(Degradable Delivery Vehicle)는 실시예의 입자로서 괄호안의 숫자는 입자의 직경, 아래첨자의 숫자는 기공 직경을 의미한다. 예를 들어, DDV(200)10은 입자 직경은 200 nm, 기공 직경은 10 nm인 실시예의 입자를 의미한다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 생분해성을 확인할 수 있는 현미경 사진이다.
도 7은 일 예시에 따른 원통형 투과막을 구비한 튜브이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 흡광도 감소 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 입경별 흡광도 감소 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 기공 직경별 흡광도 감소 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 환경의 pH별 흡광도 감소 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 흡광도 감소 결과이다.
도 13은 독소루비신을 담지한 다공성 실리카 입자의 2가지 조건에서의 독소루비신 방출량을 나타낸 도이다.
도 14는 이노테칸을 담지한 다공성 실리카 입자의 이노테칸 방출량을 나타낸 도이다.
도 15는 소라페닙을 담지한 다공성 실리카 입자의 소라페닙 방출량을 나타낸 도이다.
도 16은 레티노산을 담지한 다공성 실리카 입자의 레티노산 방출량을 나타낸 도이다.
도 17은 p53 단백질을 담지한 다공성 실리카 입자의 p53 단백질 방출량을 나타낸 도이다.
도 18은 담지한 생리활성물질의 방출을 확인하는 튜브이다.
도 19는 siRNA를 담지한 다공성 실리카 입자의 siRNA 방출량을 나타낸 도이다.
도 20, 21은 pDNA를 담지한 다공성 실리카 입자의 pDNA 방출량을 나타낸 도이다.
도 22는 linear DNA를 담지한 다공성 실리카 입자의 linear DNA 방출량을 나타낸 도이다.
도 23은 BSA를 담지한 다공성 실리카 입자의 BSA 방출량을 나타낸 도이다.
도 24는 IgG(A), 항체 1(B), 항체 2(C)를 담지한 다공성 실리카 입자의 IgG, 항체 1, 항체 2 방출량을 나타낸 도이다.
도 25는 RNase를 담지한 다공성 실리카 입자의 RNase 방출량을 나타낸 도이다.
도 26은 다공성 실리카 입자에 Cas9 단백질을 담지하여 세포 내로 전달한 사진이다.
도 27은 다공성 실리카 입자에 siRNA를 담지하여 생쥐 내에서 siRNA의 방출(A), 독소루비신, siRNA, RNase A 및 peptide를 담지한 다공성 실리카 입자를 포함하는 조성물의 전달성 및 치료효과(B), 카테터를 통한 본 발명 조성물의 전달(C)을 나타낸 도이다.
도 28은 음이온성 작용기로 개질된 다공성 실리카 입자의 FT-IR spectrum을 나타낸 도이다.
도 29는 혈액 모사 용액 내 다공성 실리카 입자의 침전 정도를 나타낸 도이다.
도 30은 개질된 다공성 실리카 입자의 적혈구 용혈 정도를 나타낸 도이다.
도 31은 개질되지 않은 다공성 실리카 입자의 적혈구 용혈 정도를 나타낸 도이다.
도 32는 다공성 실리카 입자의 독소루비신 담지 정도를 나타낸 도이다.
도 33은 다공성 실리카 입자의 세포독성을 테스트한 결과이다.
도 34는 다공성 실리카 입자와 리피오돌을 혼합하여 에멀젼화 시켰을 때의 입자 안정성을 나타낸 도이다.
도 35는 다공성 실리카 입자를 포함하는 색전 시술용 조성물을 이용하여 색전 시술을 행한 후, 떼어낸 토끼의 간을 육안으로 관찰한 사진이다.
도 36은 다공성 실리카 입자를 포함하는 색전 시술용 조성물의 표적 조직에의 표적성(A), 표적 세포에의 표적성(B), 주변 정상 세포에의 미미한 독성(C), 표적 종양에의 표적성(D)을 나타낸 도이다.
도 37은 다공성 실리카 입자를 포함하는 색전 시술용 조성물을 이용한 색전 시술시 토끼의 간암 세포의 낮은 생존률(A,B)과 AST 및 ALT 농도 측정 결과로서 간 독성이 없음을 나타낸 도이다.
다공성 실리카 입자란 수 나노에서 수 마이크로 크기의 세공(finepore)를 가지는　실리카　나노구조체로서, 기공배열의 규칙성이 잘　정의되어 있으며 사용환경에 맞도록 물질 특성(기공크기, 비표면적, 표면특성)을 조절할 수 있는 것을 특징으로 하며, 메조포러스　실리카 입자(Mesoporous Slica Particle)라고도 한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 표면 또는 기공 내부에 생리활성물질을 담지하고, 제타 포텐셜 +3 mV 이상 또는 -18 mV 이하인 다공성 실리카 입자를 포함하고, 상기 입자는 표면 또는 기공 내부가 화학적 개질된 것인 혈관 내 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 생리활성물질은 다공성 실리카 입자에 담지되어 개체에 전달되어 활성을 나타낼 수 있는 생리활성물질/생체기능조절물질로서, 저분자량 약물, 유전자 약물, 단백질 약물, 추출물, 핵산, 뉴클레오티드, 단백질, 펩타이드, 항체, 항원, RNA, DNA, PNA, 압타머, 화학약품, 효소, 아미노산, 당, 지질, 화합물(천연화합물 및/또는 합성화합물) 및 이들을 구성하는 요소로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있고, 예를 들어 독소루비신, 이리노테칸, 소라페닙, 아드리아마이신, 다우노마이신, 마이토마이신, 시스플라틴, 에피루비신, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 아클라시노마이신, 나이트로젠 머스터드, 사이클로포스파미드, 블레오마이신, 다우노루비신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 타목시펜, 발루비신, 피라루비신, 미토산트론, 젬시타빈, 이다루비신, 테모졸로마이드, 파클리탁셀, 덱사메타손, 알데스루킨, 아벨루맙, 베바시주맙, 카보플라틴, 레고라페닙, 도세탁셀, 독실, 제피티닙, 이마티닙 메실레이트, 허셉틴, 이마티닙, 알데스루킨, 키트루다, 옵디보, 마이토마이신 C, 니볼루맙, 올라파립, 펨브로리주맙, 리투시맙, 수니티닙, 아테졸리주맙, 라파티닙 및 이필리무맙 으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다. 이들은 후술하는 구체적인 예시들을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 생리활성물질은 인간 또는 동물 유기체에 직접적 또는 간접적, 치료학적, 생리학적 및/또는 약리학적 효과를 제공할 수 있는 치료학적 활성제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들면 일반적인 의약, 약물, 전구약물 또는 목표기, 또는 목표기를 포함하는 약물 또는 전구약물일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 심혈관약, 특히 항고혈압제(예, 칼슘 채널 차단제, 또는 칼슘 길항제) 및 항부정맥제; 울혈성 심부전약; 근육수축제; 혈관확장제; ACE 억제제; 이뇨제; 탈산탈수효소 억제제; 심장 글리코시드; 포스포디에스테라제 억제제; 차단제; β 차단제; 나트륨 채널 차단제; 칼륨 채널 차단제; β-아드레날린 작용제; 혈소판 억제제; 안지오텐신 II 길항제; 항응고제; 혈전용해제; 출혈 치료제; 빈혈 치료제; 트롬빈 억제제; 항기생충제; 항균제; 항염증제, 특히 비스테로이드성 항염증제(NSAIDs), 더욱 특히 COX-2 억제제; 스테로이드성 항염증제; 예방적 항염증제; 항녹내장제; 비만 세포 안정화제; 산동제; 호흡기계에 영향을 주는 약물; 알레르기성 비염약; 알파-아드레날린 길항제; 코르티코스테로이드; 만성 폐쇄성 폐질환약; 산틴-옥시다제 억제제; 항관절염제; 통풍 치료제; 자능성 약물 및 자능성 약물 길항제; 항결핵균제; 항진균제; 항원충제; 구충제; 항바이러스제, 특히 호흡기 항바이러스제, 헤르페스, 거대세포 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 및 간염 감염증에 대한 항바이러스제; 백혈병 및 카포시 육종 치료제; 통증 관리제, 특히 마취제 및 진통제, 오피오이드 수용체 작용제, 오피오이드 수용체 부분 작용제, 오피오이드 길항제, 오피오이드 수용체 혼합 작용제-길항제를 비롯한 오피오이드류; 신경이완제; 교감신경흥분제; 아드레날린 길항제; 신경전달 물질 흡수 및 방출에 영향을 주는 약물; 항콜린자극제; 항치질 치료제; 방사선 또는 화학요법 효과의 예방 또는 치료제; 지방생성제; 지방 감소제; 리파제 억제제와 같은 항비만제; 교감신경 흥분제; 양자 펌프 억제제와 같은 위궤양 및 염증 치료제; 프로스타글란딘; VEGF 억제제; 항과지질혈증제, 특히 스타틴; 중추신경계(CNS)에 영향을 미치는 약물, 예를 들어 항정신, 항간질 및 항발작제(항경련제), 정신활성제, 자극제, 항불안 및 최면제; 항우울제; 항파킨슨제; 성적 호르몬과 같은 호르몬 및 이의 단편; 성장 호르몬 길항제; 고나도트로핀 방출 호르몬 및 이의 유사체; 스테로이드 호르몬 및 이의 길항제; 선택적 에스테로겐 조절제; 성장 인자; 인슐린, 인슐린 단편, 인슐린 유사체, 글루카곤 유사 펩티드 및 저혈당제와 같은 항당뇨제; H1 , H2, H3 및 H4 항히스타민; 펩티드, 단백질, 폴리펩티드, 핵산 및 올리고뉴클레오티드 약물; 천연 단백질, 폴리펩티드, 올리고뉴클레오티드 및 핵산 등의 유사체, 단편 및 변이체; 편두통을 치료하기 위해 사용되는 약물; 천식약; 콜린성 길항제; 글루코코르티코이드; 안드로겐; 항안드로겐; 아드레노코르티코이드 생합성의 억제제; 비포스포네이트와 같은 골다공증 치료제; 항갑상선제; 자외선 차단제, 자외선 예방 보호제 및 필터; 시토킨 길항제; 항종양제; 항알츠하이머제; HMGCoA 리덕타제 억제제; 피브레이트; 콜레스테롤 흡수 억제제; HDL 콜레스테롤 상승제; 트리글리세리드 감소제; 항노화 또는 항주름제; 호르몬의 발생을 위한 전구체 분자; 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 단백질, 항균제; 항여드름제; 항산화제; 모발 치료제 및 피부 미백제; 자외선 차단제, 자외선 예방 보호제 및 필터; 인간 아포지질 단백질의 변이체; 호르몬의 발생을 위한 전구체 분자; 이의 단백질 및 펩티드; 아미노산; 포도씨 추출물과 같은 식물 추출물; DHEA; 이소플라본; 비타민, 피토스테롤 및 이리도이드 글리코시드를 비롯한 영양제, 세스퀴테르펜 락톤, 테르펜, 페놀 글리코시드, 트리테르펜, 히드퀴논 유도체, 페닐알카논; 레티놀 및 기타 레틴산 및 코엔자임 Q10을 비롯한 레티노이드와 같은 항산화제; 오메가-3-지방산; 글루코사민; 핵산, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 의약; 효소; 코엔자임; 시토킨 유사체; 시토킨 작용제; 시토킨 길항제; 면역글로불린; 항체; 항체 의약; 유전자 요법제; 지단백질; 에리트로포이에틴; 백신; 알레르기/천식, 관절염, 암, 당뇨병, 성장 장애, 심혈관질환, 염증, 면역장애, 대머리, 통증, 안과질환, 간질, 부인과 장애, CNS 질환, 바이러스 감염, 세균 감염, 기생충 감염, Gl 질환, 비만 및 혈액 질환과 같은 인간 및 동물 질환의 치료 또는 예방을 위한 소분자 치료제 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 에리스로포이에틴(erythropoietine(EPO)). 트롬보포이에틴(thrombopoietine), 인터류킨(interleukine(IL-1 내지 IL-17 포함))과 같은 사이토카인, 인슐린, 인슐린 유사 성장인자(IGF-1 및 IGF-2 포함), 상피 성장인자(epidermal growth factor(EGF)), 변환 성장인자(transforming growth factor)(TGF-알파 및 TGF-베타 포함), 인간 성장 호르몬, 트렌스페린(transferrine), 저밀도 리포단백질(low density lipoprotein), 고밀도 리포단백질(high density lipoprotein), 렙틴(leptine), VEGF, PDGF, 섬모 향신경성 인자(ciliary neurotrophic factor), 프로락틴(prolactine), 부신피질자극호르몬(adrenocorticotropic hormone(ACTH)), 칼시토닌(calcitonine), 인간 융모성생식선자극호르몬(chrorionic gonadotropin), 코르티졸(cortisol), 에스트라디올(estradiol), 여포자극호르몬(follicle stimulating hormone(FSH)), 갑상선자극호르몬(thyroid-stimulating hormone(TSH)), 황체형성호르몬(luteinizing hormone(LH)), 프로게스테론(progesterone), 테스토스테론(testosterone), 리신(ricine)을 포함하는 독소 등을 포함하는 추가적인 활성제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 종양 질병(oncological disease) 및 세포 또는 조직 변형의 치료를 위한 약물의 군으로부터 선택될 수 있다. 적합한 치료학적 제제는 알킬 설포네이트, 예를 들어, 부설판(busulfan), 임프로설판(improsulfan), 피포설페인(piposulfane), 벤조데파(benzodepa), 카르보퀀(carboquone), 메트레데파(meturedepa), 우레데파(uredepa)와 같은 아리지딘(arizidine)과 같은 알킬화제; 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌 멜라민(triethylene melamine), 트리에틸렌 포스포라미드(triethylene phosphoramide), 트리에틸렌 티오포스포라미드(triethylene thiophosphoramide), 트리메틸올멜라민(tromethylolmelamine)과 같은 에틸렌이민(ethyleneimine) 및 메틸멜라민(methylmelamine); 클로람부실(chlorambucil), 클로르나파진(chlornaphazine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 에스트라무스틴(estramustine), 이포스파미드(ifosfamide), 메클로레타민(mechlorethamine), 메클로레타민옥사이드 하이드로클로라이드(mechlorethaminoxide hydrochloride), 멜팔란(melphalan), 노벰비킨(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실 머스타드(uracil mustard)와 같은 소위 질소 머스타드(nitrogen mustard); 카르무스틴(carmustine), 클로로조토신(chlorozotocin), 포텐무스틴(fotenmustine), 로무스틴(lomustine), 니무스틴(nimustine), 라니무스틴(ranimustine)과 같은 니트로소 우레아-화합물(nitroso urea-compound); 다카르바진(dacarbazine), 만노무스틴(mannomustine), 미토브라니톨(mitobranitol), 미토락톨(mitolactol); 피포브로만(pipobroman); 소라페닙(sorafenib); 독소루비신(doxorubicin) 및 시스-플래티넘(cis-platimum) 및 그 유도체 등 및 전술한 것들의 임의의 조합 및/또는 유도체를 포함하는 항종양제(antineoplastic agent)일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 아크락시노마이신(aclacinomycin), 악티노마이신(actinomycin), 안트라마이신(anthramycin), 아자세린(azaserin), 블레오마이신(bleomycin), 컥티노마이신(cuctinomycin), 카루비신(carubicin), 카르지노필린(carzinophilin), 크로모마이신(chromomycin), 덕티노마이신(ductinomycin), 다우노르비신(daunorbicin), 6-디아조-5-옥슨-1-노리유신(6-diazo-5-oxn-1-norieucin), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 미토마이신(mitomycin), 미코페놀소레(mycophenolsaure), 모갈루마이신(mogalumycin), 올리보마이신(olivomycin), 페플로마이신(peplomycin), 플리카마이신(plicamycin), 포르피로마이신(porfiromycin), 푸로마이신(puromycin), 스트렙토니그린(streptonigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 투베르시딘(tubercidine), 우베니멕스(ubenimex), 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin), 아미노글리코사이드(aminoglycoside) 또는 폴리엔(polyene) 또는 마크롤리드 항생물질(macrolid-antibiotics), 및 이들의 임의의 조합 및/또는 유도체와 같은 항바이러스제 및 항박테리아제를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 엔도스타틴(endostatin), 안지오스타틴(angiostatin), 인터페론(interferone), 혈소판 인자 4(platelet factor 4(PF4)), 트롬보스폰딘(thrombospondin), 변환성장인자 베타(transforming growth factor beta), 메탈로프로테이나제-1. -2 및 -3의 조직 억제제(tissue inhibitor of the metalloproteinase -1, -2, and -3)(TIMP-1, -2 and -3), TNP-470, 마리마스타트(marimastat), 네오바스타트(neovastat), BMS-275291, COL-3, AG3340, 탈리도마이드(thalidomide), 스쿠알라민(squalamine), 콤브레스타스타틴(combrestastatin), SU5416, SU6668, IFN-[alpha], EMD121974, CAI, IL-12 및 IM-862 등의 방사선 감작제 약물(radio-sensitizer drug), 스테로이드성 또는 비스테로이드성 항염증 약물, 또는 신생혈관형성(angiogenesis)에 관한 제제, 및 이들의 조합 및/또는 유도체로부터 선택될 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 핵산을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있으며, 여기에서, 핵산이라는 용어는 예를 들어 유전자 치료학적 또는 역배열(antisense) 효과를 제공하기 위하여, 적어도 2개의 뉴클레오티드가 서로 공유적으로 연결되어 있는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 핵산은 바람직하게는 포스포다이에스테르(phosphodiester) 결합을 포함하며, 또한 상이한 골격을 갖는 유사체(analoque)를 포함한다. 유사체는 예를 들어 포스포라미드(phosphoramide) 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포로다이티오에이트(phosphorodithioate), O-메틸포스포로아미디트-화합물(O-methylphosphoroamidit-compound), 및 펩티드-핵산 골격(peptide-nukleic acid-backbone) 및 그의 화합물 등의 골격을 함유할 수 있다. 다른 유사체는 이온성 골격을 가지는 것, 비이온성 골격을 가지는 것, 비-리보오스-골격(non-ribose-backbone)을 가지는 것이다. 일 이상의 카보사이클릭 당(carbocyclic sugar)을 가지는 핵산은 본 발명에 이용되는 핵산으로서 적합할 수 있다. 종래기술에서 알려진 핵산 및 핵산 유사체의 선택 외에도, 자연적으로 발생하는 핵산 및 핵산 유사체 또는 핵산과 유사체의 혼합물의 임의의 조합도 이용될 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 에베롤리무스(everolimus), 타크롤리무스(tacrolimus), 시롤리무스(sirolimus), 마이코페놀레이트-모페틸(mycofenolate-mofetil), 라파마이신(rapamycin), 파클리탁셀(paclitaxel), 악티노마이신 D(actinomycine D), 안지오펩틴(angiopeptin), 바티마스테이트(batimastate), 에스타라디올(estradiol), VEGF, 스타틴(statine) 등과 그들의 유도체 및 유사체와 같은 항-이동성(anti-migratory), 항-증식성(anti-proliferative) 또는 면역억제성(immune-suppresive), 항-염증성(anti-inflammatory) 또는 리엔도테리에이팅 제제(re-endotheliating agent)일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 오피오이드 수용체 작용제 및 길항제, 작용/길항 혼합 활성을 나타내는 화합물 및 부분적 작용 활성을 나타내는 화합물, 예를 들어 모르핀, 데포모르핀, 에트로핀, 디아세틸 모르핀, 히드로모르핀, 옥시모르폰, 레보르파놀, 메타돈, 레보메타딜, 메페리딘, 펜타닐, 서펜타닐, 알펜타닐, 코데인, 히드로코돈, 옥시코돈, 테바인, 데소모르핀, 니코모르핀, 디프로파노일모르핀, 벤질모르핀, 에틸모르핀, 페티딘, 메타돈, 트라마돌, 덱스트로프로폭시펜; 날옥손 및 날트렉손; 부프레노르핀, 날부핀, 부토르파놀, 펜타족신 및 에틸케토시클라족신일 수 있다.
상기 치료학적 활성제 및 그 조합은 헤파린(heparin), 합성 헤파린 유사체(예, 폰다파리눅스(fondaparinux)), 히루딘(hirudin), 안티트롬빈 Ⅲ(antithrombin Ⅲ), 드로트레코긴 알파(drotrecogin alpha); 알테플라제(alteplase), 플라스민(plasmin), 라이소키나제(lysokinase), 인자 VIIa(factor VIIa), 프로우로키나제(prourokinase), 우로키나제(urokinase), 아니스트레플라제(anistreplase), 스트렙토키나제(streptokinase) 등의 섬유소분해제(fibrinolytics); 아세틸살리실산(acetylsalicylic acid)[아스피린(aspirine)], 티클로피딘(ticlopidine), 클로피도그렐(clopidogrel), 압식시맙(abciximab), 덱스트란(dextran) 등의 혈소판 응집 억제제(platelet aggregation inhibitor); 알클로메타손(alclometasone), 암시노니드(amcinonide), 증대된 베타메타손(augmented betamethasone), 베클로메타손(beclomethasone), 베타메타손(betamethasone), 부데소니드(budesonide), 코르티손(cortisone), 클로베타솔(clobetasol), 클로코르톨론(clocortolone), 데소니드(desonide), 데속시메타손(desoximetasone), 덱사메타손(sexamethasone), 플루오시놀론(fluocinolone), 플루오시노니드(fluocinonide), 플루란드레놀리드(flurandrenolide), 플루니솔리드(flunisolide), 플루티카손(fluticasone), 할시노니드(halcinonide), 할로베타솔(halobetasol), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 모메타손(momethasone), 프레드리카르베이트(prednicarbate), 프레드니손(prednisone), 프레드니솔론(prednisolone), 트리암시놀론(triamcinolone) 등의 코르티코스테로이드(corticosteroid); 디클로페낙(diclofenac), 디플루니살(diflunisal), 에토돌락(etodolac), 페노프로펜(fenoprofen), 플루르비프로펜(flurbiprofen), 이부프로펜(ibuprofen), 인도페타신(indomethacin), 케토프로펜(ketoprofen), 케토롤락(ketorolac), 메클로페나메이트(meclofenamate), 메페남산(mefenamic acid), 멜록시캄(meloxicam), 나부메톤(nabumetone), 나프록센(naproxen), 옥사프로진(oxaprozin), 피로시캄(piroxicam), 살살레이트(salsalate), 설린닥(sulindac), 톨메틴(tolmetin), 셀레콕십(celecoxib), 로페콕십(rofecoxib) 등의 소위 비스테로이드성 항염증 약물(non-steroidal anti-inflammatory drugs)(NSAIDs); 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine) 등의 알칼로이드(alkaloide) 및 포도필룸 독소(podophyllum toxin) 등의 세포증식억제제(cytostatics); 다우노르비신(daunorbicin), 독소루비신(doxorubicin) 및 이외의 안트라사이클린(anthracycline) 및 관련 물질, 블레오마이신(bleomycin), 미토마이신(mitomycin) 등의 세포독성 항생제(cytotoxic antibiotics); 폴산 유사체(folic acid analog), 퓨린 유사체(purine analog) 또는 피리미딘 유사체(pyrimidine analog) 등의 대사길항물질(antimetabolite); 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 시롤리무스(sirolumus); 카르보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin) 또는 옥살리플라틴(oxaliplatin) 등의 백금(platinum) 화합물; 암사크린(amsacrin), 이리노테칸(irinitecan), 이마티닙(imatinib), 토포테칸(topotecan), 인터페론-알파 2a(interferone-alpha 2a), 인터페론-알파 2b(interferone-alpha 2b), 하이드록시카바이드(hydroxycarbide), 밀테포신(miltefosine), 펜토스타틴(pentostatin), 포르피머(porfimer), 알데스류킨(aldesleukin), 벡사로텐(bexaroten), 트레티노인(tretinoin); 항안드로겐제(antiandrogen) 및 항에스트로겐제(antiestrogen); 퀴니딘(quinidine)형의 항부정맥제(antiarrhythmic), 퀴니딘, 다이소피라미드, 아즈말린(ajmaline), 프라즈말리움 바이타르트레이트(prajmalium bitartrate), 데타즈미엄 바이타르트레이트(detajmium bitartrate) 등의 특히 Ⅰ형 항부정맥제인 항부정맥제; 예를 들어, 리도카인(lidocaine), 멕실레틴(mexiletin), 페니토인(phenytoin), 토카이니드(tocainid) 등의 리도카인 형태의 항부정맥제; 예를 들어, 프로파페논(propafenon), 플레카이니드(flecainid)(아세테이트) 등의 Ⅰc형 항부정맥제; 메토프롤롤(metoprolol), 에스모롤(esmolol), 프로프라놀롤(propranolol), 아테놀롤(atenolol), 옥스프레놀롤(oxprenolol) 등의 Ⅱ형 항부정맥 베타-수용체 차단제(class Ⅱ antiarrhythmics beta-receptor blocker); 아미오다론(amiodarone), 소탈롤(sotalol) 등의 Ⅲ형 항부정맥제; 딜티아젬(diltiazem), 베라파밀(verapami), 갈로파밀(gallopamil) 등의 Ⅳ형 항부정맥제; 아데노신(adenosine), 오르시프레날린(orciprenaline), 이프라트로피엄 브로마이드(ipratropium bromide) 등의 이외의 항부정맥제; 혈관 내피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 기본 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF), 비바이러스성 DNA, 바이러스성 DNA, 내피성장인자 등의 심근에서 신생혈관생성을 자극하는 제제; FGF-1, FGF-2, VEGF, TGF; 항생제, 단일클론 항체(monoclonal antibidy), 안티칼린(anticalin); 줄기세포(stem cell), 내피 전구 세포(endothelial progenitor cell, EPC); 아세틸 디곡신/메틸디곡신(acetyl digoxin/metildigoxin), 디지톡신(digitoxin), 디곡신(digoxin) 등의 디지탈리스 글리코시드(digitalis glycoside); 우아베인(ouabain), 프로실라리딘(proscillaridin) 등의 강심제 글리코시드(cardiac glycoside); 예를 들어, 메틸도파(methyldopa), 이미다졸린 수용체 작용제(imidazoline receptor agonist)인 CNS 활성 항아드레날린성 물질(CNS active antiadrenergic substances) 등의 항고혈압제(antihypertensive); 니페디핀(nifedipine), 니프렌디핀(nitrendipine) 등의 다이하이드로피리딘형의 칼슘 채널 차단제(calcium channel blocker); ACE 억제제; 퀴나프릴레이트(quinaprilate), 실라자프릴(cilazapril), 모엑시프릴(moexipril), 트란도라프릴(trandolapril), 스피라프릴(spirapril), 이미다프릴(imidapril); 엔지오텐신 Ⅱ 길항제(angiotensin Ⅱ antagonist); 칸데사르탄실렉세틸(candesartancilexetil), 발사르탄(valsartan), 텔미사르탄(telmisartan), 올메사르탄메독소밀(olmesartanmedoxomil), 에프로사르탄(eprosartan); 프라조신(prozosin), 우라피딜(urapidil), 독사조신(doxazosin), 부나조신(bunazosin), 테라조신(terazosin), 인도라민(indoramin) 등의 말초적 활성 알파-수용체 차단제(peripherally active alpha-receptor blocker); 다이하이드랄라진(dihydralazine), 다이이소프로필아민 다이클로르아세테이트(diisopropylamine dichloraetate), 미녹시딜(minoxidil), 니트로프루시드 소듐(nitroprusside sodium) 등의 혈관확장제(vasodilatator); 인다파미드(indapamide), 코-데르고크린 메실레이트(co-dergocrine mesylate), 다이하이드로에르고톡신 메탄설포네이트(dihydroergotoxin methanesulfonate), 시클레탄닌(cicletanin), 보센탄(bosetan), 플루드로코르티손(fludrocortisone) 등의 이외의 항고혈압제; 밀리논(milrinon), 에녹시몬(enoximon) 등의 포스포다이에스테라제 억제제(phosphodiesterase inhibitor), 및 특히 도부타민(dobutamine), 에피네프린(ephinephrine), 에틸레프린(etilefrine), 노르페네프린(norfenefrine), 노레피네프린(norepinephrine), 옥실로프린(oxilofrine), 도파민(dopamine), 미도프린(midodrine), 포레드린(pholedrine), 아메지니움메틸(ameziniummetil) 등의 아드레날린성 및 도파민성 물질(adrenergic and dopaminergic substance) 등의 항고혈압제; 다이하이드로에르고타민(dihydroergotamine) 등의 부분적 아드레노셉터 작용제(partial adrenoceptor agonist); 피브로넥틴(fibronectin), 폴리라이신(polylysine), 에틸렌 비닐 아세테이트(ethylene vinyl acetate), TGFβ, PDGF, VEGF, bFGF, TNFα, NGF, GM-CSF, IGF-a, IL-1, IL-8, IL-6, 성장 호르몬 등의 염증성 사이토카인(inflammatory cytokine); 또한, 시아노아크릴레이트, 베릴륨, 실리카 등의 접착성 물질(adhesive substance); 및 에리스로포에틴(erythropoetin) 등의 성장 인자, 코르티코트로핀(corticotropin), 고나도트로핀(gonadotropin), 소마트로핀(somatropin), 티로트로핀(thyrotrophin), 데스모프레신(desmopressin), 테르리프레신(terlipressin), 사이토신(pxytocin), 세트로렐릭스(cetrorelix), 코르티코렐린(corticorelin), 류프로렐린(leuprorelin), 트립토렐린(triptorelin), 고나도렐린(gonadorelin), 가니렐릭스(ganirelix), 부세렐린(buserelin), 나파렐린(nafarelin), 고세렐린(goserelin) 등의 호르몬, 또한 소마토스타틴(somatostatin), 옥트레오티드(octreotid) 등의 조절 펩티드(regulatory peptide); 뼈 및 연골 자극 펩티드(bone and cartilage stimulating peptide), 재조합 인간 BMP-2(rhBMP-2), 비스포스포네이트(bisphophonate)(예, 리세드로네이트(riseddronate), 파미드로네이트(pamidronate), 이반드로네이트(ibandronate), 졸레드론산(zoledronic acid), 클로드론산(clodronic acid), 에티드론산(etidronic acid), 알렌드론산(alendronic acid), 틸루드론산(tiludronic acid))과 같은 재조합 BMPs, 디소듐 플루오로포스페니트, 소듐 플루오라이드와 같은 플루오라이드인 골 형성 단백질(bone morphogenetic proteins(BMPs)); 칼시토닌(calcitonin), 다이하이드로타키스티롤(dihydrotachystyrol); 상피 성장 인자(epidermal growth factor(EGF)), 혈소판-유래 성장 인자(platelet-derived growth factor(PDGF)), 섬유아세포 성장 인자(fibrobast growth factor(FGFs)), 변환 성장 인자-b(transforming growth factors-b(TGFs-b)), 변환 성장 인자-a(transforming growth factors-a(TGFs-a)), 에리스로포이에틴(erythropoietin(EPO)), 인슐린 유사 성장 인자-Ⅰ(insuline-like growth factor-Ⅰ(IGF-Ⅰ)), 인슐린 유사 성장 인자-Ⅱ(insuline-like growth factor-Ⅱ(IGF-Ⅱ)), 인터류킨-1(interleukin-1(IL-1)), 인터류킨-2(interleukin-2(IL-2)), 인터류킨-6(interleukin-6(IL-6)), 인터류킨-8(interleukin-8(IL-8)), 종양 괴사 인자-a(tumor necrosis factor-a(TNF-a)), 종양 괴사 인자-b(tumor necrosis factor-b(TNF-b)), 인터페론-g(interferon-g(INF-g)), 콜로니 자극 인자(colony stimulating factors(CSFs)); 단구 주화성 단백질(monocyte chemotactic protein), 섬유아세포 자극 인자 1, 히스타민(histamine), 피브린 또는 피브리노겐(fibrin or fibrinogen), 엔도텔린-1(endothelin-1), 안지오텐신 Ⅱ(angiotensin Ⅱ), 콜라겐, 브로모크립틴(bromocriptine), 메티서지드(methysergide), 메토트렉세이트(methotrexate), 사염화탄소(carbon tetrachloride), 티오아세트아미드(thioacetamide) 및 에탄올; 또한, 은(이온), 티타늄 다이옥사이드, 특히 예를 들어 벤질 페니실린(페니실린 G), 페녹시메틸페니실린(페니실린 V) 등의 β-락탐아제-민감성 페니실린(β-lactamase-sensitive penicillin); 예를 들어 아목시실린(amoxicillin), 암피실린(ampicillin), 바캄피실린(bacampicillin) 등의 β-락탐아제-저항성 페니실린(β-lactamase-resistent penicillin); 메즈로실린(mezlocillin), 피페라실린(piperacillin) 등의 아실아미노페니실린; 세파놀린(cefazoline), 세푸록심(cefuroxim), 세폭시틴(cefoxitin), 세포티암(cefotiam), 세팍클로(cefaclor), 세파드록실(cefadroxil), 세파렉신(cefalexin), 로라카르베프(loracarbef), 세픽심(cefixim), 세푸록시마세틸(cefuroximaxetil), 세프티부텐(ceftibuten), 세프포독심프로세틸(cefpodoximproxetil) 등의 카르복시 페니실린; 아즈트레오남(aztreonam), 에르타페넴(ertapenem), 메로페넴(meropenem); 설박탐(sulbactam), 설타미실린토실레이트(sultamicillintosylate) 등의 β-락탐아제 억제제; 독시사이클린(doxycycline), 미노사이클린(minocycline), 테트라사이클린(tetracycline), 클로로테트라사이클린(chlorotetracycline), 옥시테트라사이클린(oxytetracycline) 등의 테트라사이클린(tetracycline); 겐타마이신(gentamicin), 네오마이신(neomycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 토브라마이신(tonramycin), 아미카신(amikacin), 네틸마이신(netilmicin), 파로모마이신(paromomycin), 프라마세틴(framyceetin), 스펙티노마이신(spectinomycin) 등의 아미노글리코시드; 아지스로마이신(azithromycin), 클라리스로마이신(clarithromycin), 에리스로마이신(erythromycin), 록시스로마이신(roxithromycin), 스피라마이신(spiramycin), 조사마이신(josamycin) 등의 마크롤리드 항체물질(macrolide antibiotics); 클린다마이신(clindamycin), 린코마이신(lincomycin) 등의 린코스아미드(limcosamide); 예를 들어 시프로플록사신(ciprofloxacin), 오플록사신(ofloxacin), 목시플록사신(moxifloxacin), 노르플록사신(norfloxacin), 가티플록사신(gatifloxacin), 에녹사신(enoxacin), 플레록사신(fleroxacin), 레보플록사신(levofloxacin)인 플루오로퀴놀론(fluoroquinolone) 등의 자이라제 억제제(gyrase inhibitor); 피페미드산(pipemidic acid) 등의 퀴놀론(quinolone); 설폰아미드(sulfonamide), 트리메토프림(trimethoprim), 설파디아진(sulfadiazine), 설팔렌(sulfalene); 반코마이신(vancomycin), 테이코플라닌(teicoplanin) 등의 글리코펩티드 항생물질(glycopeptide antibiotics); 예를 들어 콜리스틴(colistin), 폴리마이신-b(polymyxin-b)인 폴리마이신, 예를 들어 메트로니다졸(metronidazole), 티니다졸(tinidazole)인 니트로이미다졸(nitroimidazole) 유도체 등의 폴리펩티드 항생물질; 클로로퀸(cloroquin), 메플로퀸(mefloquin), 하이드록시클로로퀸(hydroxychloroquin) 등의 아미노퀴놀론(aminoquinolone); 프로구아닐(proguanil) 등의 바이구아니드(biguanid); 피리메타민(pyrimethamine) 등의 퀴닌 알칼로이드(quinine alkaloid) 및 다이아미노피리미딘(diaminopyrimidine); 클로람페니콜(chloramphenicol) 등의 암페니콜(amphenicol); 리파부틴(rifabutin), 답손(dapson), 푸시드산(fusidic acid), 포스포마이신(fosfomycin), 니푸라텔(nifuratel), 텔리스로마이신(telithromycin), 푸사펀진(fusafungin), 펜타미딘 다이이세티오네이트(pentamidine diisethionate), 리팜피신(rifampicin), 타우롤리딘(taurolidin), 아토바퀀(atovaquon), 리네졸리드(linezolid); 아시클로비어(aciclovir), 간시클로비어(ganciclovir), 팜시클로비어(famciclovir), 포스카르네트(foscarnet), 이노신-(다이메프라놀-4-아세트아미도벤조에이트)(ionsine-(dimepranol-4-acetanidobenzoate)), 발간시클로비어(valganciclovir), 발라시클로비어(valaciclovir), 시도포비어(cidofovir), 브리부딘(brivudin) 등의 바이러스 발육저지제(virus static); 라미부딘(lamivudine), 잘시타빈(zalcitabine), 디다노신(didanosine), 지도부딘(zidovudin), 테노포비어(tenofovir), 스타부딘(stavudin), 아바카비어(avacavir) 등의 항레트로바이어스성 활성 물질(antiretroviral active ingredient)(뉴클레오시드 유사체 역전사효소 억제제 및 유도체(nucleoside analog reverse-transcriptase inhibitors and derivatives)); 비뉴클레오시드 유사체 역전사효소 억제제(non-nucleoside analog reverse-transcriptase inhibitor); 암프레나비어(amprenavir), 인디나비어(indinavir), 사퀴나비어(saquinavir), 로피나비어(lopinavir), 리토나비어(ritonavir), 넬피나비어(nelfinavir); 아만타딘(amantadine), 리바비린(ribavirine), 자나미비어(zanamivir), 오셀타미비어(oseltamivir) 또는 라미부딘(lamivudine), 및 그의 임의의 조합 및 혼합물로부터 선택될 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 알프라졸람, 아목사핀, 벤타제팜, 브로마제팜, 클로라제핀, 클로바잠, 클로티아제팜, 디아제팜, 로라제팜, 플루니트라제팜, 플루라제팜, 로메타제팜, 메다제팜, 니트라제팜, 옥사제팜, 테마제팜, 마프로틸린, 미안세린, 노트리프틸린, 리스페리돈, 세르트랄린, 트라조돈, 발로페리돌, 트리미프라민 말레이트 플루옥세틴, 온단세트론, 미다졸람, 클로르프로마진, 하로페리돌, 트리아졸람, 클로자핀, 플루오프로마진, 플루페나진 데카노에이트, 플루아니손, 퍼페나진, 피모지드, 프로클로르페라진, 설피리드, 티오리다진, 파록시틴, 시타로프람, 부푸로피온, 페넬진, 올란자핀, 디발프록스 나트륨 및 벤라팍신을 포함하는 항우울제, 항정신제 또는 항불안제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어 오피오이드 수용체 작용제 및 길항제, 작용/길항 혼합 활성을 나타내는 화합물 및 부분적 작용 활성을 나타내는 화합물, 예를 들어 모르핀, 데포모르핀, 에트로핀, 디아세틸 모르핀, 히드로모르핀, 옥시모르폰, 레보르파놀, 메타돈, 레보메타딜, 메페리딘, 펜타닐, 서펜타닐, 알펜타닐, 코데인, 히드로코돈, 옥시코돈, 테바인, 데소모르핀, 니코모르핀, 디프로파노일모르핀, 벤질모르핀, 에틸모르핀, 페티딘, 메타돈, 트라마돌, 덱스트로프로폭시펜; 날옥손 및 날트렉손; 부프레노르핀, 날부핀, 부토르파놀, 펜타족신 및 에틸케토시클라족신일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 아조티오핀, 아미트리프틸린, 파모티딘, 프로메타진, 파록사틴, 옥스카바자핀 및 머타자핀을 포함하는 트리시클릭 화합물일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 아세토헥사미드, 클로르프로파미드, 글리벤클라라이드, 글리클아지드, 글리피지드, 메트포르민, 톨라자미드, 글리버리드, 글리메피리드 및 톨부타미드를 포함하는 항당뇨제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 베클라미드, 카바마제핀, 가파펜틴, 티아가빈, 비가바트린, 토피라메이트, 클로나제팜, 에토토인, 메토인, 메츄시미드, 메틸페노바비톤, 옥스카바제핀, 파라메타디온, 페나세미드, 페노바비톤, 페닐로인, 펜석시미드, 프리미돈, 설티아민, 페니토인 소듐, 니트로프란토인 모노히드레이트, 가바펜틴, 라모트리진, 조니사미드, 에토석시미드 및 발프로산을 포함하는 항간질제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 졸피뎀 타르트레이트, 아밀로바비톤, 바비톤, 부토바비톤, 펜토바비톤, 브로티졸람, 카브로말, 클로르디아제폭사이드, 클로르메티아졸, 에티나메이트, 메프로바메이트, 메타쿠알롬, 시클로벤자프렌, 시클로벤자프린, 티자니딘, 바클리펜, 부탈비탈, 조피클론, 아트라쿠륨, 투보쿠라린 및 페노바비탈을 포함하는 최면제/진정제 및/또는 근육 이완제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 암포테리신, 부토코나졸 니트레이트, 클로트리마졸, 에코나졸 니트레이트, 플루코나졸, 플루시토신, 그리세오플루빈, 이트라코나졸, 케토코나졸, 미코나졸, 나타마이신, 니스타틴, 설코나졸 니트레이트, 테르코나졸, 티오코나졸 및 운데센산; 벤즈니다졸, 클리오퀴놀, 데코퀴네이트, 디아이오도히드록시퀴놀린, 딜록사니드 푸로에이트, 디니톨미드, 푸르졸리돈, 메트로니다졸, 니모라졸, 니트로푸라존, 오르니다졸, 테르비나핀, 클로트리마졸, 클로로퀸, 메플로퀸, 이트라코나졸, 피리메타민, 프라지쿠안텔, 퀴나크린, 메벤다졸 및 티니다졸을 포함하는 항진균, 항원충 또는 항기생충제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 칸데사탄, 히드랄라진, 클로니딘, 트리암테린, 펠로디핀, 젭피브로질, 페노피브레이트, 니페디칼, 프라조신, 메카밀라민, 독사조신, 도부타민 및 실렉세틸하는 항고혈압 또는 심장 치료제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 디히드로에르고타민 메실레이트, 에르고타민 타르트레이트, 메티서지드 말레이트, 피조티펜 말레이트 및 수마트립판 숙시네이트를 포함하는 항편두통제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 아트로핀, 벤즈헥솔, 비페리덴, 에토프로파진, 히오시아민, 메펜졸레이트 브로마이드, 옥시부티닌, 옥시펜시클이민 및 트로피카미드를 포함하는 항무스카린제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 아미노글루테티미드, 암사크린, 아자티오프린, 부설판, 클로람부실, 시클로스포린, 다카바진, 에스트라머스틴, 에토포시드, 로머스틴, 멜팔란, 머캅토푸린, 메토클렉세이트, 미토마이신, 미토탄, 미토잔트론, 프로카바진, 타목시펜 시트레이트, 테스톨락톤, 타크롤리머스, 머캅토푸린 및 시롤리머스를 포함하는 항신생물제 (또는 면역억제제)일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 브로모크립틴 메실레이트, 레보도파, 톨카폰, 로피니트롤, 브로모크립틴, 저혈당제, 예를 들어, 설포닐우레아 비구아니드, 알파-글루코시다제 억제제, 티아졸리딘디온, 카베르골린, 카비도파 및 리수리드 말레이트를 포함하는 항파킨슨제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 카비마졸 및 프로피티오우라실을 포함하는 항갑상선제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 암리논, 밀리논, 디지톡신, 에녹시몬, 라나토시드 C 및 메디곡신을 포함하는 심장근육 수축제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 페노피브레이트, 클로피브레이트, 프로부콜, 이제티미브 및 토세트라피브를 포함하는 저지질혈증 또는 고지질혈증제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 메옥시캄, 트리암시놀론, 크로몰린, 네도크로밀, 히드록시클로로퀸, 몬텔루카스트, 질루톤, 자피루카스트 및 멜록시캄을 포함하는 항염증제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 페소페나딘, 클로랄 히드레이트, 히드록시진, 프로메타진, 세티라진, 시메티딘, 클리클리진, 메클리진, 디멘히드리네이트, 로라타빈, 니자타빈 및 프로메타진을 포함하는 항히스타민제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 오메프라졸, 란소프라졸, 판토프라졸 및 라니티딘을 포함하는 항궤양제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 히드로클로로티아지드, 아밀로리드, 아세타졸라미드, 푸로세미드 및 토르세미드를 포함하는 이뇨제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 레티놀, 레티날, 트레타노인(레티노산, 레틴-A), 이소트레티노인 및 알리트레티노인과 같은 제1 발생 레티노이트, 에트레티네이트 및 이의 대사산물인 아시트레틴과 같은 제2 발생 레티노이드; 타자로텐, 벡사로텐 및 아다팔렌과 같은 제3 발생 레티노이드를 포함하는 레티노이드일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 아토바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 니스타틴, 로슈바스타틴, 프라바스타틴, 올리스타트 및 심바스타틴을 포함하는 스타틴 및/또는 그 유도체일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 암페타민, 펜터민, 티라민, 에펠드린, 메타라미놀, 페닐에프린, 덱스암페타민, 덱스펜플루라민, 펜플루라민, 니코틴, 카페인 및 마진돌을 포함하는 자극제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 카베딜롤, 테라조신, 펜톨라민 및 멘톨을 포함하는 혈관확장제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 레베티라세탐, 레비티라세탐 및 도네페질을 포함하는 항알츠하이머제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 벤자프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 포시노프릴 소듐, 리시노프릴, 미녹시딜, 이소소르비드, 람프릴 및 퀴나프릴을 포함하는 ACE 억제제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 아테놀롤, 티몰롤, 핀돌롤, 프로나놀롤 히드로클로라이드, 비스오프롤롤, 에스몰롤, 메토프롤롤 숙신에이트, 메토프롤롤 및 메토프롤롤 타르트레이트를 포함하는 베타 아드레날린 수용체 길항제 일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 로자탄을 포함하는 안지오텐신 II 길항제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 아브식시마브, 클로피드로겔, 티로피반 및 아스피린을 포함하는 혈소판 억제제 일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 트라마돌, 트라마돌 히드로클로라이드, 알로푸리놀, 칼시트리올, 실로스타졸, 솔탈롤, 우라소디올 브롬페리돌, 드로페리돌, 플루펜틱솔 데카노에이트, 알부테롤, 알부테롤 설페이트, 카리소프로돌, 클로베타솔, 로피니롤, 라베탈롤 및 메토카바몰을 포함하는 알콜 또는 페놀일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 아미오데론, 플루티카손, 스피로놀락톤, 프레드니손, 트리아조돈, 데속시메타손, 메틸 프레드니손, 벤조나테이트 나부메톤 및 부스피론을 포함하는 케톤 또는 에스테르일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 메토클로프라미드를 포함하는 구토방지제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 도르졸라미드, 브리모니딘, 올로파타딘, 시클로펜톨레이트, 필로카핀 및 에코티오페이트를 포함하는 눈 치료제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 와파린, 에녹사파린 및 레피루딘을 포함하는 항응고 또는 항혈전제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 프로베네신 및 설핀피라존을 포함하는 통풍 치료제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 이프라트로퓸을 포함하는 COPD 또는 천식 치료제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 랄록시펜, 파미드로네이트 및 리세드로네이트를 포함하는 골다공증 치료제일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 아세틸 헥사펩티드-3, 아세틸 헥사펩티드-8, 아세틸 옥타펩티드 및 l-카르노신을 포함하는 화장품용 펩티드일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 톡소이드(불활성화 독성 화합물)를 포함하는 백신; 단백질, 단백질 부단위 및 폴리펩티드; DNA 및 RNA와 같은 폴리뉴클레오티드; 접합체; 사포닌, 비로좀, 무시 및 유기 아주반트, 예를 들어 조스타백스를 포함하는 백신일 수 있다.
상기 치료학적 활성제는 예를 들어, 코엔자임 Q10(또는 유비퀴논), 유비퀴놀 또는 레즈베라트롤; α, β 또는 γ-카로텐, 리코펜, 루테인, 제아크산틴 및 아스타크산틴과 같은 카로테노이드; 라이코펜, 루테인 및 시아크산틴과 같은 식물영양소; 리놀레산, 공액 리놀레산, 도코사헥사에노산(DHA) 및 에리코사펜타에노산(EPA) 및 이들의 글리세롤-에스테르 들을 비롯한 오메가-3 지방산; 비타민 D(D2, D3 및 이들의 유도체), 비타민 E(α, β, γ, δ-토코페롤, 또는 α, β, γ, δ-토코트리에놀), 비타민 A(레티놀, 레티날, 레티노산 및 유도체), 비타민K(K1, K2, K3및 이들의 유도체)를 비롯한 지용성 비타민, 카프릭/카프릴릭 트리글리세리드, 엽산, 철, 니아신, 글리세릴 리놀레이트, 오메가 6 지방산, 비타민 F, 셀레늄, 시아노코발라민, 알로에 베라, 베타 글루칸, 비사볼올, 카멜리아 테아(녹차) 추출물, 카프릭/카프릴릭 트리글리세리드, 병풀(gotu cola) 추출물, 세테아릴 올리베이트, 엽록소, 오랜지 오일, 코코일 프롤린, 디카프릴 에테르, 디소듐 라우리미노디프로피오네이트 토코페릴 포스페이트(비타민 E 포스페이트), 글리세린, 글리세릴 올레이트, 감초 추출물, 조롱나무(witch hazel) 추출물, 락트산, 레시틴, 루테인, 마카데미아 씨 오일, 캐모마일(chamomile) 추출물, 달맞이꽃 오일, 올리브 잎 추출물, 미강유, 아보카도 오일, 하수오 추출물, 석류 스테롤, 레스베라트롤, 장미 오일, 백단 기름, 이산화티타늄, 엽산, 글리세린, 글리세릴 리놀레이이트(오메가 6(지방산 비타민 F), 비타민 A 팔미테이트, 포도씨 기름, 할로베타졸, 아데노신, 아데노신 트리포스페이트, 알파 히드록산, 알란토인, 히알루론산 및 유도체, 이소루트롤, 트라넥사민산, 글리콜산, 아르기닌, 아스코르빌 글루코사민, 아스코르빌 팔미테이트, 살리실산, 카르노스산, 알파 리포산, 감마 리놀렌산(GLA), 판테놀, 레티닐 프로피오네이트, 레티닐 팔미테이트, 푸르푸릴아데닌, 레틴알테히드, 그리 펩티드, 이데베논, 디메틸아미노에탄올(DMAE), 니아신아미드, 베타-글루칸, 팔미토일 펜타펩티드-4, 팔미토일 올리고펩티드/테트라펩티드-7, 에토신, 세라미드, 페닐알리닌, 글루쿠로놀락톤, L-카르니틴, 히드록시아파타이트, 팔미토일 트리펩티드-3, 포스콜린, 산화아연, α-비사볼올, 유게놀, 실리빈, 콩 이소플라본, 카탈폴, Arnica chamissonis 유래의 슈도구아놀리드(pseudoguaianolide), 로즈마린산, 로즈마놀, 실라실레이트, 예를 들어, 살리신, 살리게닌 및 살리실산, 타락사스테롤, α-락투세롤, 이소락투세롤, 타락사코시드, 세레미드, 알부틴, 진게롤, 쇼가올, 히페리신, 엘라스틴, 콜라겐 및 이들의 펩티드를 포함하는 영양의학적 또는 화장의학적 활성물질일 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자(Mesoporous Silica Particle, MSP)는 표면 및/또는 기공 내부가 개질된 것일 수 있다.
상기 개질은 실리카 입자가 갖는 실라놀기(Si-OH)의 -OH 작용기를 타 작용기로 치환하는 것을 의미하는 것일 수 있는데, 이는 본 발명 조성물의 혈관 내 주입을 통해 실라놀기와 적혈구 표면의 4차 암모늄기 간 상호작용으로 인한 용혈과 같은 부작용을 감소시키는 역할을 할 수 있다. 또한, 개질되는 작용기의 종류 및 개질되는 정도에 따라 담지에 적합한 전술한 생리활성물질의 종류가 달라질 수 있고, 제타 포텐셜을 변화시키고 그 크기에 차이를 낳아 입자 간 전하 반발력을 통해 혈류 내 입자 간 침전 또는 응집을 방지하여 혈류 내 흐름의 원활성을 확보할 수 있으며, 생리활성물질 방출 환경에 대한 다공성 실리카 입자의 상호 작용이 조절되어 입자 자체의 분해 속도가 조절되어 생리활성물질 방출 속도가 조절될 수 있고, 생리활성물질의 나노입자에 대한 결합력이 조절되어 입자로부터의 확산에 의한 생리활성물질의 방출이 조절될 수 있다.
상기 개질의 방법에 있어 화학적 또는 생물학적 개질방법을 택할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니고 당업계의 주지된 방법에 의해 수행될 수 있으나, 실리카 입자와의 공유결합을 통한 작용기의 치환을 고려할 때 바람직하게는 화학적 개질방법을 택할 수 있다. 또한, 상기 입자의 표면과 기공의 내부는 동일하게 개질될 수 있고, 서로 다르게 개질될 수도 있다.
상기 개질은 도입하고자 하는 친수성, 소수성, 양이온성, 음이온성 치환기를 갖는 화합물을 입자와 반응시켜 수행할 수 있으나 이에 제한되지 아니하고, 생리활성물질의 담지, 생리활성물질의 표적 세포로의 이동, 그외 기타 목적을 위한 물질의 담지 또는 그 외 추가 치환기의 결합 등을 위한 치환기를 갖는 화합물을 입자와 반응시켜 수행할 수 있으며, 상기 치환기는 항체, 리간드, 세포투과성 펩타이드 또는 압타머 등을 더 포함하는 형태일 수 있다.
상기 화합물은 예를 들면 C1 내지 C10 알콕시기를 갖는 알콕시실란일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 알콕시실란은 상기 알콕시기를 1개 이상 갖는 것으로서, 예를 들면 1 내지 3개 가질 수 있고, 알콕시기가 결합되지 않은 부위에 도입하고자 하는 치환기가 있거나 이로 치환된 치환기가 있을 수 있다.
상기 알콕시실란을 다공성 실리카 입자와 반응시키면 실리콘 원자와 산소 원자간 공유 결합이 형성되어 알콕시실란이 다공성 실리콘 입자의 표면 및/또는 기공 내부와 결합될 수 있고, 상기 알콕시실란은 도입하고자 하는 치환기를 가지고 있는 바, 해당 치환기가 다공성 실리콘 입자의 표면 및/또는 기공 내부에 도입될 수 있다.
상기 반응은 용매에 분산시킨 다공성 실리카 입자를 알콕시실란과 반응시켜 수행할 수 있으며, 상기 용매는 물 및/또는 유기용매를 사용할 수 있고, 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, γ-부티로락톤, 1,3-디메틸-이미다졸리디논, 메틸에틸케톤, 시클로헥사논, 시클로펜타논, 4-하이드록시-4-메틸-2-펜타논 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 테트라메틸벤젠 등의 탄소계 방향족류 ; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 에틸렌글리콜모노에틸에테르, 에틸렌글리콜모노메틸에테르, 에틸렌글리콜모노부틸에테르, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르, 디에틸렌글리콜모노메틸에테르, 디에틸렌글리콜모노부틸에테르, 프로필렌글리콜모노메틸에테르, 프로필렌글리콜모노에틸에테르, 디프로필렌글리콜디에틸에테르, 트리에틸렌글리콜모노에틸에테르 등의 글리콜에테르류(셀로솔브); 그외 디메틸아세트아미드(DMAc), N,N-디에틸아세트아미드, 디메틸포름아미드(DMF), 디에틸포름아미드(DEF), N,N-디메틸아세트아미드(DMAc), N-메틸피롤리돈(NMP), N-에틸피롤리돈(NEP), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논, N,N-디메틸메톡시아세트아미드, 디메틸술폭사이드, 피리딘, 디메틸술폰, 헥사메틸포스포아미드, 테트라메틸우레아, N-메틸카르로락탐, 테트라히드로퓨란, m-디옥산, P-디옥산, 1,2-디메톡시에탄 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 톨루엔을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 입자의 알콕시실란과의 반응은 예를 들면 가열 하에 수행될 수 있고, 상기 가열은 예를 들면 80℃ 내지 180℃, 예를 들어 상기 범위 내에서 80℃ 내지 160℃, 80℃ 내지 150℃, 100℃ 내지 160℃, 100℃ 내지 150℃, 110℃ 내지 150℃ 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 입자의 알콕시실란과의 반응은 예를 들면 4시간 내지 20시간, 예를 들어 상기 범위 내에서 4시간 내지 18시간, 4시간 내지 16시간, 6시간 내지 18시간, 6시간 내지 16시간, 8시간 내지 18시간, 8시간 내지 16시간, 8시간 내지 14시간, 10시간 내지 14시간 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개질에 있어, 양이온성 치환기로의 개질은 입자를 양전하로 대전시키거나 음전하성 생리활성물질 담지를 위한 것일 수 있고, 예를 들면 아미노기, 아미노알킬기 등 질소함유기 등의 염기성기를 갖는 알콕시실란과 반응시켜 수행할 수 있다. 구체적으로는 N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine, N1-(3-Trimethoxysilylpropyl)diethylenetriamine, (3-Aminopropyl)trimethoxysilane, N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]aniline, Trimethoxy[3-(methylamino)propyl]silane, 3-(2-Aminoethylamino)propyldimethoxymethylsilane 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개질에 있어, 음이온성 치환기로의 개질은 입자를 음전하고 대전시키거나 양전하성 생리활성물질 담지를 위한 것일 수 있고, 예를 들면 카르복시기, 술폰산기, 티올기 등의 산성기를 갖는 알콕시실란과 반응시켜 수행할 수 있다. 구체적으로는 (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개질에 있어, 친수성 치환기로의 개질은 본 발명 조성물의 사용 및 제형화의 용이성 등의 측면의 유리함을 갖는데, 예를 들면 카르복시기, 아미노기, 카르보닐기, 설프히드릴기, 포스페이트기, 티올기, 암모늄기, 에스터기, 이미드기, 티오이미드기, 케토기, 에터기, 인덴기, 설포닐기, 폴리에틸렌글리콜기 등을 갖는 알콕시실란과 반응시켜 갖도록 할 수 있다. 구체적으로는, N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine, N1-(3-Trimethoxysilylpropyl)diethylenetriamine, (3-Aminopropyl)trimethoxysilane, (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane, Trimethoxy[3-(methylamino)propyl]silane, 3-(2-Aminoethylamino)propyldimethoxymethylsilane 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개질에 있어, 소수성 치환기로의 개질은 난용성(소수성) 생리활성물질과의 결합력이 증진되는 장점을 갖는데, 예를 들면 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3 내지 C30의 사이클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 C30의 아릴기, 치환 또는 비치환된 C2 내지 C30의 헤테로아릴기, 할로겐기, C1 내지 C30의 에스테르기, 할로겐 함유기 등을 갖는 알콕시실란과 반응시켜 갖도록 할 수 있다. 구체적으로는, Trimethoxy(octadecyl)silane, Trimethoxy-n-octylsilane, Trimethoxy(propyl)silane, Isobutyl(trimethoxy)silane, Trimethoxy(7-octen-1-yl)silane, Trimethoxy(3,3,3-trifluoropropyl)silane, Trimethoxy(2-phenylethyl)silane, Vinyltrimethoxysilane, Cyanomethyl, 3-(trimethoxysilyl)propyl] trithiocarbonate, (3-Bromopropyl)trimethoxysilane 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개질은 복합적으로 수행될 수도 있는데, 예를 들어, 외부 표면 또는 기공 내부에 2회 이상의 표면 개질이 수행될 수도 있다. 보다 구체적인 예로써, 아미노기가 도입된 실리카 입자에 카르복실기를 포함하는 화합물을 아미드 결합으로 결합시켜 양전하로 대전된 입자를 다른 표면특성을 가지게 변화시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개질에 있어서, 반응 온도, 시간, 그리고 개질에 사용되는 화합물의 양 등은 개질하고자 하는 정도에 따라 선택될 수 있는 것으로서, 생리활성물질의 친수성, 소수성, 전하 정도에 따라 반응 조건을 달리하여 다공성 실리카 입자의 친수성, 소수성, 전하 정도를 조절함으로써, 생리활성물질 방출 속도를 조절할 수 있다. 예를 들면, 생리활성물질이 중성의 pH에서 강한 음전하를 띠는 경우에는 다공성 실리카 입자가 강한 양전하를 띠도록 하기 위해, 반응 온도를 높이거나 반응 시간을 길게 할 수 있으며, 화합물 처리량을 늘릴 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자(Mesoporous Silica Particle, MSP)는 생분해성 입자로서, 생리활성물질을 담지하여 체내에 투여되었을 때 체내에서 생분해되면서 생리활성물질을 방출할 수 있어, 상기 입자는 체내에서 서서히 분해되어 담지된 생리활성물질이 서방성을 갖도록 할 수 있다. 예를 들면, 하기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 20 이상이다.
[수학식 1]
At/A0
(식 중, A0는 상기 다공성 실리카 입자 1mg/ml 현탁액 5ml를 직경 50kDa의 기공을 갖는 원통형 투과막에 넣고 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도이고,
상기 투과막 외부에는 상기 투과막과 접하며, 상기 현탁액과 동일한 용매 15ml가 위치하고, 상기 투과막 내외부는 37℃에서 60rpm 수평 교반되며,
상기 현탁액의 pH는 7.4이고,
At는 상기 A0의 측정시로부터 t시간 경과 후에 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도임).
상기 수학식 1은 다공성 실리카 입자가 체내와 유사한 환경에서 어느 정도의 속도로 분해되는지를 의미하는 것으로서, 상기 흡광도 A0, At는 예를 들면 원통형 투과막에 다공성 실리카 입자 및 현탁액을 넣고, 투과막 외부에도 동일한 현탁액을 넣고 측정된 것일 수 있다.
상기 현탁액은 완충용액일 수 있고, 구체적인 예를 들면, PBS(phosphate buffered saline) 및 SBF(simulated body fluid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 보다 구체적으로는 PBS일 수 있다.
상기 입자는 생분해성으로서, 현탁액 내에서 서서히 분해될 수 있고, 직경 50kDa는 약 5nm에 해당하는 것으로서 생분해된 입자는 직경 50kDa의 투과막을 통과할 수 있고, 원통형 투과막은 60rpm 수평 교반 하에 있으므로 현탁액이 고루 섞일 수 있으며 분해된 입자는 투과막 외부로 나올 수 있다.
상기 수학식 1에서의 흡광도는 예를 들어 투과막 외부의 현탁액이 새로운 현탁액으로 교체되는 환경 하에 측정된 것일 수 있다. 현탁액은 지속적으로 교체되는 것일 수 있고, 일정 기간마다 교체되는 것일 수 있으며, 상기 일정 기간은 정기 또는 비정기적인 기간일 수 있다. 예를 들어 1시간 내지 1주일의 범위 내에서, 1시간 간격, 2시간 간격, 3시간 간격, 6시간 간격, 12시간 간격, 24시간 간격, 2일 간격, 3일 간격, 4일 간격, 7일 간격 등으로 교체될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다
상기 흡광도의 비가 1/2가 된다는 것은 t시간 후에 흡광도가 초기 흡광도의 절반이 된다는 것인 바, 이는 다공성 실리카 입자의 대략 절반이 분해되었다는 의미이다.
상기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 20 이상, 또는 24 이상으로, 예를 들면 t는 20 내지 120일 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 20 내지 96, 20 내지 72, 30 내지 70, 40 내지 70, 50 내지 65 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 입자는 상기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/5가 되는 t가 예를 들면 70 내지 140일 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 80 내지 140, 80 내지 120, 80 내지 110, 70 내지 140, 70 내지 120, 70 내지 110 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 입자는 상기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/20가 되는 t가 예를 들면 130 내지 220일 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 130 내지 200, 140 내지 200, 140 내지 180, 150 내지 180 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 입자는 측정되는 흡광도가 0.01 이하가 되는 t가 예를 들면 250 이상, 예를 들어, 300 이상, 350 이상, 400 이상, 500 이상, 1000 이상 등일 수 있으며, 그 상한은 2000일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 입자는 상기 수학식 1의 흡광도의 비와 t는 높은 양의 상관 관계를 갖는 것으로서, 예를 들면 피어슨 상관 계수가 0.8 이상일 수 있고, 예를 들어, 0.9 이상, 0.95 이상일 수 있다.
상기 수학식 1의 t는 다공성 실리카 입자가 체내와 유사한 환경에서 어느 정도의 속도로 분해되는지를 의미하는 것으로서, 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자의 표면적, 입경, 기공 직경, 표면 및/또는 기공 내부의 치환기, 표면의 치밀함 정도 등을 조절함으로써 조절될 수 있다.
보다 구체적으로, 입자의 표면적을 증가시켜 t를 감소시키거나, 표면적을 감소시켜 t를 증가시킬 수 있다. 표면적은 입자의 직경, 기공의 직경을 조절함으로써 조절될 수 있다. 또한, 표면 및/또는 기공 내부에 치환기를 위치시켜 다공성 실리카 입자가 환경(용매 등)에 직접 노출되는 것을 줄여 t를 증가시킬 수 있다. 또한, 다공성 실리카 입자에 생리활성물질을 담지시키고 생리활성물질과 다공성 실리카 입자 간의 친화도를 증가시켜, 다공성 실리카 실리카 입자가 환경에 직접 노출되는 것을 줄여 t를 증가시킬 수 있다. 또한, 입자의 제조시에 표면을 보다 치밀하게 제조하여 t를 증가시킬 수도 있다. 상기에는 수학식 1의 t를 조절할 수 있는 다양한 예시를 서술하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자(Mesoporous Silica Particle, MSP)는 실리카(SiO2) 소재의 입자이며, 수 나노미터에서 수 마이크로미터 사이즈의 직경을 갖는다.
상기 입자의 평균 직경은 예를 들면 100nm 내지 1000nm일 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 예를 들면 100nm 내지 800nm, 100nm 내지 500nm, 100nm 내지 400nm, 100nm 내지 300nm, 100nm 내지 200nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자(Mesoporous Silica Particle, MSP)는 다공성의 입자로서, 나노사이즈의 기공을 가져 기공 내부 또는 입자 표면에 전술한 생리활성물질을 담지할 수 있다.
상기 입자의 평균 기공 직경은 예를 들면 1nm 내지 100nm일 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 예를 들면 5nm 내지 100nm, 7nm 내지 100nm, 7nm 내지 50nm, 10nm 내지 50nm, 10nm 내지 30nm, 7nm 내지 30nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 담지하고자 하는 생리활성물질의 양과 크기를 고려하여 바람직하게 선택될 수 있고, 조절될 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자(Mesoporous Silica Particle, MSP)의 형태는 특정 형태로 특별히 제한되는 것은 아니나, 혈류 내 흐름의 원활성, 혈류 내 혈구 세포들과의 상호작용의 원활성 및 적혈구의 용혈방지 측면을 고려할 때, 구형임이 바람직하다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자(Mesoporous Silica Particle, MSP)는 BET 표면적이 예를 들면 200m2/g 내지 700m2/g일 수 있다. 예를 들어 상기 범위 내에서 200m2/g 내지 700m2/g, 200m2/g 내지 650m2/g, 250m2/g 내지 650m2/g, 300m2/g 내지 700m2/g, 300m2/g 내지 650m2/g, 300m2/g 내지 600m2/g, 300m2/g 내지 550m2/g, 300m2/g 내지 500m2/g, 300m2/g 내지 450m2/g 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자(Mesoporous Silica Particle, MSP)는 g당 부피가 예를 들면 0.7ml 내지 2.2ml일 수 있다. 예를 들어 상기 범위 내에서 0.7ml 내지 2.0ml, 0.8ml 내지 2.2ml, 0,8 ml 내지 2.0ml, 0.9 ml 내지 2.0ml, 1.0 ml 내지 2.0ml 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. g당 부피가 과도하게 작아지면 분해 속도가 너무 빨라질 수 있고, 과도하게 큰 입자는 제조가 어렵거나, 온전한 형상을 가질 수 없을 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자(Mesoporous Silica Particle, MSP)는 표면전하를 갖는 것으로서, 즉, 제타 포텐셜이 0mV가 아닌 입자이다. 이는 전술한 바대로, 동일한 방법으로 개질된 입자 간 전자적 반발력으로 인해 혈액 내 입자가 응집하거나 침전하는 현상을 억제함으로써 혈액 내 흐름을 원활하게 하고, 표적 조직 또는 세포에 효과적으로 담지한 생리활성물질을 전달할 수 있게 한다.
상기 입자의 표면전하의 값, 즉, 제타 포텐셜의 값은, 예를 들어, 양전하로 대전된 경우, +1 내지 +150 mV 또는 +2 내지 130 mV 일 수 있고, +3 내지 +100 mV 일 수 있으나 이에 제한되지 아니하고, 음전하로 대전된 경우, -150 내지 -1 mV 또는 -130 내지 -10 mV 일 수 있고, -100 내지 -18 mV 일 수 있으나 이에 제한되지 아니하며, 제타 포텐셜의 값은 상기 입자에 담지하고자 하는 생리활성물질의 종류와 양 또는 방출 속도의 제어 등의 측면을 고려하여 목적에 맞게 조절할 수 있다. 다만, 상기 제타 포텐셜의 값이 -18 mV 초과 +3 mV 미만인 경우 다공성 실리카 입자 간의 반발력이 낮아져 입자끼리 응집할 수 있고, 전하를 띠는 생리활성물질의 담지가 어려워질 수 있으며, +100 mV 초과 또는 -100 mV 미만인 경우 전하를 띠는 생리활성물질과의 결합력이 과도하게 높아져 효과적 방출이 어려울 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자(Mesoporous Silica Particle, MSP)는 표면 및/또는 기공 내부에 전술한 생리활성물질을 담지할 수 있다.
상기 입자에의 생리활성물질의 담지는 예를 들면 용매 중의 다공성 실리카 입자와 생리활성물질을 혼합하여 수행될 수 있고, 상기 용매로는 물 및/또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, 시클로헥산온 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 탄소계 방향족류; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 용매로 PBS(phosphate buffered saline solution), SBF(Simulated Body Fluid), Borate-buffered saline, Tris-buffered saline 등을 사용할 수도 있다.
상기 다공성 실리카 입자와 상기 생리활성물질의 비율은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 중량비가 1: 0.05 내지 0.8, 예를 들어 상기 범위 내에서 1: 0.05 내지 0.7, 1:0.05 내지 0.6, 1: 0.1 내지 0.8, 1: 0.1 내지 0.6, 1: 0.2 내지 0.8, 1: 0.2 내지 0.6 등일 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자(Mesoporous Silica Particle, MSP)는 담지한 생리활성물질을 긴 시간에 걸쳐 점진적으로 방출할 수 있다.
상기 입자에 담지된 생리활성물질은 입자가 생분해되면서 방출될 수 있는데, 상기 입자는 서서히 분해되어 담지된 생리활성물질이 서방적으로 방출되도록 할 수 있다. 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자의 표면적, 입경, 기공 직경, 표면 및/또는 기공 내부의 치환기, 표면의 치밀함 정도 등을 조절함으로써 조절될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 입자에 담지된 생리활성물질은 다공성 실리카 입자로부터 이탈되어 확산되면서도 방출될 수 있고, 이는 다공성 실리카 입자와 생리활성물질, 생리활성물질 방출 환경과의 관계에 영향을 받는 것인 바, 이를 조절하여 생리활성물질 방출을 조절할 수 있다. 예를 들면 표면개질에 의해 다공성 실리카 입자의 생리활성물질과의 결합력을 강화 또는 약화시킴으로써 조절할 수 있다.
보다 구체적인 예를 들자면, 상기 담지된 생리활성물질이 난용성(소수성)인 경우에는 입자의 표면 및/또는 기공 내부가 소수성 치환기를 가져 상기 입자와 생리활성물질과의 결합력이 증가된 것일 수 있고, 이에 의해 생리활성물질이 서방적으로 방출될 수 있다. 이는 예를 들면 상기 입자가 소수성 치환기를 갖는 알콕시실란으로 표면개질된 것일 수 있다.
본 명세서에서 "난용성"은 (물에 대해) 불용성(insoluble), 실질적으로 불용성(practically insoluble) 또는 극히 약간의 가용성(only slightly soluble)인 것을 포함하는 의미로서 이는 "Pharmaceutical Science" 18th Edition(U.S.P., Remington, Mack Publishing Company 발행)에 정의되어 있는 용어이다.
상기 난용성 생리활성물질은 예를 들면 1기압, 25℃에서 수용해도가 10g/L 미만, 구체적으로 5g/L 미만, 보다 구체적으로 1g/L 미만일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 담지된 생리활성물질이 수용성(친수성)인 경우에는 입자의 표면 및/또는 기공 내부가 친수성 치환기를 가져 다공성 실리카 입자와 생리활성물질과의 결합력이 증가된 것일 수 있고, 이에 의해 생리활성물질이 서방적으로 방출될 수 있다. 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자가 친수성 치환기를 갖는 알콕시실란으로 표면개질된 것일 수 있다.
상기 수용성 생리활성물질은 예를 들면 1기압, 25℃에서 수용해도가 10g/L 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 담지된 생리활성물질이 전하를 띠는 경우에는 입자의 표면 및/또는 기공 내부가 그와 반대 전하로 대전되어 다공성 실리카 입자와 생리활성물질과의 결합력이 증가된 것일 수 있고, 이에 의해 생리활성물질이 서방적으로 방출될 수 있다. 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자가 산성기 또는 염기성기를 갖는 알콕시실란으로 표면개질된 것일 수 있다.
구체적으로, 생리활성물질이 중성의 pH에서 양전하를 띠는 것이라면 입자의 표면 및/또는 기공 내부가 중성의 pH에서 음전하로 대전되는 것일 수 있고, 이에 의해 다공성 실리카 입자와 생리활성물질과의 결합력이 증가되어 생리활성물질이 서방적으로 방출될 수 있다. 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자가 카르복시기(-COOH), 술폰산기(-SO3H) 등의 산성기를 갖는 알콕시실란으로 표면개질된 것일 수 있다.
또한, 생리활성물질이 중성의 pH에서 음전하를 띠는 것이라면 입자의 표면 및/또는 기공 내부가 양전하로 대전되는 것일 수 있고, 이에 의해 다공성 실리카 입자와 생리활성물질과의 결합력이 증가되어 생리활성물질이 서방적으로 방출될 수 있다. 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자가 아미노기, 그 외 질소함유기 등의 염기성기를 갖는 알콕시실란으로 표면개질된 것일 수 있다.
상기 담지된 생리활성물질은 필요한 치료 유형, 방출 환경, 사용되는 다공성 실리카 입자에 의존하여 예를 들면 7일 내지 1년 또는 그 이상의 기간 동안 방출될 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자(Mesoporous Silica Particle, MSP)는 생분해성으로서 100% 분해될 수 있으므로, 이에 담지된 생리활성물질은 100% 방출될 수 있다.
상기 입자의 100% 생분해성은 혈관 내 약물 전달에 있어, 담지하는 생리활성물질의 양을 해당하는 목적에 맞추어 적절한 양을 설정하여 사용할 수 있어 생리활성물질의 과다사용으로 인한 부작용 등의 문제를 회피할 수 있게 하고, 입자가 완전히 분해되지 않고 혈관을 막는 등의 심각한 상황으로부터 자유로울 수 있게끔 하며, 후술할 색전 시술에 있어서 기존 색전 시술의 큰 문제점인 동일 경로로의 시술 불가능을 극복할 수 있게끔 하는 큰 장점을 지닌다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자(Mesoporous Silica Particle, MSP)는 예를 들면, 소기공의 입자 제조 및 기공 확장 공정을 거쳐 제조된 것일 수 있고, 필요에 따라 하소(calcination) 공정, 표면 개질 공정 등을 더 거쳐 제조된 것일 수 있다. 하소 및 표면 개질 공정을 모두 거친 경우는 하소 이후에 표면 개질 된 것일 수 있다.
상기 소기공의 입자는 예를 들면 평균 기공 직경이 1nm 내지 5nm인 입자일 수 있고, 이는 용매에 계면활성제와 실리카 전구물질을 넣고 교반 및 균질화시켜 얻어질 수 있다.
상기 용매는 물 및/또는 유기용매를 사용할 수 있고, 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, γ-부티로락톤, 1,3-디메틸-이미다졸리디논, 메틸에틸케톤, 시클로헥사논, 시클로펜타논, 4-하이드록시-4-메틸-2-펜타논 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 테트라메틸벤젠 등의 탄소계 방향족류 ; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 에틸렌글리콜모노에틸에테르, 에틸렌글리콜모노메틸에테르, 에틸렌글리콜모노부틸에테르, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르, 디에틸렌글리콜모노메틸에테르, 디에틸렌글리콜모노부틸에테르, 프로필렌글리콜모노메틸에테르, 프로필렌글리콜모노에틸에테르, 디프로필렌글리콜디에틸에테르, 트리에틸렌글리콜모노에틸에테르 등의 글리콜에테르류(셀로솔브); 그외 디메틸아세트아미드(DMAc), N,N-디에틸아세트아미드, 디메틸포름아미드(DMF), 디에틸포름아미드(DEF), N,N-디메틸아세트아미드(DMAc), N-메틸피롤리돈(NMP), N-에틸피롤리돈(NEP), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논, N,N-디메틸메톡시아세트아미드, 디메틸술폭사이드, 피리딘, 디메틸술폰, 헥사메틸포스포아미드, 테트라메틸우레아, N-메틸카르로락탐, 테트라히드로퓨란, m-디옥산, P-디옥산, 1,2-디메톡시에탄 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 알코올, 보다 구체적으로 메탄올을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용매로서 물과 유기 용매의 혼합 용매 사용시 그 비율은 예를 들면 물과 유기용매를 1: 0.7 내지 1.5의 부피비, 예를 들어, 1: 0.8 내지 1.3의 부피비로 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 계면활성제는 예를 들면 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide), TMABr(hexadecyltrimethylammonium bromide), TMPrCl(hexadecyltrimethylpyridinium chloride), TMACl(tetramethylammonium chloride) 등일 수 있고, 구체적으로는 CTAB를 사용할 수 있다.
상기 계면활성제는 예를 들면 용매 1리터당 1g 내지 10g, 예를 들어 상기 범위 내에서 1g 내지 8g, 2g 내지 8g, 3g 내지 8g 등의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 실리카 전구 물질은 용매에 계면활성제를 첨가하여 교반한 후에 첨가될 수 있다. 실리카 전구물질은 예를 들면 TMOS(Tetramethyl orthosilicate)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 교반은 예를 들면 10분 내지 30분간 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 실리카 전구물질은 예를 들면 용매 1리터당 0.5ml 내지 5ml, 예를 들어 상기 범위 내에서 0.5ml 내지 4ml, 0.5ml 내지 3ml, 0.5ml 내지 2ml, 1ml 내지 2ml 등으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 필요에 따라 촉매로서 수산화나트륨을 더 사용할 수 있으며, 이는 용매에 계면활성제를 첨가한 후 실리카 전구물질의 첨가 전에 교반하면서 첨가될 수 있다.
상기 수산화나트륨은 예를 들면 1M 수산화나트륨 수용액 기준으로 용매 1리터당 0.5ml 내지 8ml, 예를 들어 상기 범위 내에서 0.5ml 내지 5ml, 0.5ml 내지 4ml, 1ml 내지 4ml, 1ml 내지 3ml 2ml 내지 3ml 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 실리카 전구 물질의 첨가 후에 용액을 교반하며 반응시킬 수 있다. 교반은 예를 들면 2시간 내지 15시간 할 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 3시간 내지 15시간, 4시간 내지 15시간, 4시간 내지 13시간, 5시간 내지 12시간, 6 시간 내지 12시간, 6시간 내지 10시간 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 교반 시간(반응 시간)이 너무 짧은 경우에는 결정핵 생성(nucleation)이 부족할 수 있다.
상기 교반 이후에는 용액을 숙성(aging)시킬 수 있다. 숙성은 예를 들면 8시간 내지 24시간 할 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 8시간 내지 20시간, 8시간 내지 18시간, 8시간 내지 16시간, 8시간 내지 14시간, 10시간 내지 16시간, 10시간 내지 14시간 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이후, 반응산물을 세척 및 건조시켜 다공성 실리카 입자를 얻을 수 있고, 필요에 따라 세척 전에 미반응 물질의 분리가 선행될 수 있으며, 이는 예를 들면 원심분리로 상등액을 분리하여 수행될 수 있다.
상기 원심분리는 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 예를 들어 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 물 및/또는 유기용매로 할 수 있고, 구체적으로는 용매별로 녹일 수 있는 물질이 상이하므로 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 예를 들어, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
상기 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, γ-부티로락톤, 1,3-디메틸-이미다졸리디논, 메틸에틸케톤, 시클로헥사논, 시클로펜타논, 4-하이드록시-4-메틸-2-펜타논 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 테트라메틸벤젠 등의 탄소계 방향족류 ; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 에틸렌글리콜모노에틸에테르, 에틸렌글리콜모노메틸에테르, 에틸렌글리콜모노부틸에테르, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르, 디에틸렌글리콜모노메틸에테르, 디에틸렌글리콜모노부틸에테르, 프로필렌글리콜모노메틸에테르, 프로필렌글리콜모노에틸에테르, 디프로필렌글리콜디에틸에테르, 트리에틸렌글리콜모노에틸에테르 등의 글리콜에테르류(셀로솔브); 그외 디메틸아세트아미드(DMAc), N,N-디에틸아세트아미드, 디메틸포름아미드(DMF), 디에틸포름아미드(DEF), N,N-디메틸아세트아미드(DMAc), N-메틸피롤리돈(NMP), N-에틸피롤리돈(NEP), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논, N,N-디메틸메톡시아세트아미드, 디메틸술폭사이드, 피리딘, 디메틸술폰, 헥사메틸포스포아미드, 테트라메틸우레아, N-메틸카르로락탐, 테트라히드로퓨란, m-디옥산, P-디옥산, 1,2-디메톡시에탄 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 알코올, 보다 구체적으로 에탄올을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 원심분리 하에 수행될 수 있으며, 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 예를 들어 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 원심분리를 하지 않고, 필터로 입자를 걸러내어 수행될 수도 있다. 필터는 다공성 실리카 입자의 직경 이하의 기공을 가지는 것일 수 있다. 반응액을 그러한 필터로 걸러내면 입자만이 필터 위에 남고, 그 필터 위에 물 및/또는 유기용매를 부어 세척할 수 있다.
상기 세척 시에 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 예를 들어, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
상기 건조는 예를 들면 20℃ 내지 100℃로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 진공 상태에서 수행될 수도 있다.
이후 상기 얻어진 다공성 실리카 입자의 기공을 확장하고, 이는 기공 팽창제를 사용하여 수행될 수 있다.
상기 기공 팽창제는 예를 들면 트리메틸벤젠, 트리에틸벤젠, 트리프로필벤젠, 트리부틸벤젠, 트리펜틸벤젠, 트리헥실벤젠, 톨루엔, 벤젠 등을 사용할 수 있고, 구체적으로, 트리메틸벤젠을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 기공 팽창제는 예를 들면 N,N-디메틸헥사데실아민(N,N-dimethylhexadecylamine,DMHA)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 기공 확장은 예를 들면 용매 중의 다공성 실리카 입자를 기공 팽창제와 혼합하고, 가열하여 반응시켜 수행될 수 있는데, 상기 용매는 예를 들면 물 및/또는 유기용매를 사용할 수 있고, 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, 시클로헥산온 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 탄소계 방향족류 ; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 알코올, 보다 구체적으로 에탄올을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 다공성 실리카 입자는 예를 들면 용매 1리터당 10g 내지 200g, 예를 들어 상기 범위 내에서 10g 내지 150g, 10g 내지 100g, 30g 내지 100g, 40g 내지 100g, 50g 내지 100g, 50g 내지 80g, 60g 내지 80g 등의 비율로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 다공성 실리카 입자는 용매 중에 고르게 분산되어 있는 것일 수 있고, 예를 들면 용매에 다공성 실리카 입자를 첨가하고 초음파 분산시킨 것일 수 있다. 혼합용매를 사용하는 경우에는 제1 용매에 다공성 실리카 입자를 분산시킨 후에 제2 용매를 첨가한 것일 수 있다.
상기 기공 팽창제는 예를 들면 용매 100부피부에 대하여 10 내지 200부피부, 상기 범위 내에서, 10 내지 150부피부, 10 내지 100부피부, 10 내지 80부피부, 30 내지 80부피부, 30 내지 70부피부 등의 비율로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반응은 예를 들면 120℃ 내지 180℃로 수행될 수 있다. 예를 들어 상기 범위 내에서 120℃ 내지 170℃, 120℃ 내지 160℃, 120℃ 내지 150℃, 130℃ 내지 180℃, 130℃ 내지 170℃, 130℃ 내지 160℃, 130℃ 내지 150℃ 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반응은 예를 들면 24시간 내지 96시간 수행 수행될 수 있다. 예를 들어 상기 범위 내에서 30시간 내지 96시간, 30시간 내지 96시간, 30시간 내지 80시간, 30시간 내지 72시간, 24시간 내지 80시간, 24시간 내지 72시간, 36시간 내지 96시간, 36시간 내지 80시간, 36시간 내지 72시간, 36시간 내지 66시간, 36시간 내지 60시간, 48시간 내지 96시간, 48시간 내지 88시간, 48시간 내지 80시간, 48시간 내지 72시간 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 예시한 범위 내에서 시간 및 온도를 조절하여 반응이 과다하지 않으면서 충분히 수행될 수 있도록 할 수 있다. 예를 들면 반응 온도가 낮아지면 반응 시간을 늘리거나, 반응 온도가 낮아지면 반응 시간을 짧게하는 등에 의할 수 있다. 반응이 충분하지 않으면 기공의 확장이 충분하지 못할 수 있고, 반응이 과다하게 진행되면 기공의 과다 확장에 의해 입자가 붕괴될 수 있다.
상기 반응은 예를 들면 단계적으로 승온시켜 수행될 수 있다. 구체적으로, 상온에서 상기 온도까지 0.5℃/분 내지 15℃/분의 속도로 단계적으로 승온시켜 수행될 수 있으며, 예를 들어 상기 범위 내에서 1℃/분 내지 15℃/분, 3℃/분 내지 15℃/분, 3℃/분 내지 12℃/분, 3℃/분 내지 10℃/분 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반응 이후에는 반응액을 서서히 냉각시킬 수 있으며, 예를 들면 단계적으로 감온하여 냉각시킬 수 있다. 구체적으로 상기 온도에서 상온까지 0.5℃/분 내지 20℃/분의 속도로 단계적으로 감온시켜 수행될 수 있으며, 예를 들어 상기 범위 내에서 1℃/분 내지 20℃/분, 3℃/분 내지 20℃/분, 3℃/분 내지 12℃/분, 3℃/분 내지 10℃/분 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 냉각 이후에 반응 산물을 세척 및 건조시켜 기공이 확장된 다공성 실리카 입자를 얻을 수 있다.
필요에 따라 세척 전에 미반응 물질의 분리가 선행될 수 있고, 이는 예를 들면 원심분리로 상등액을 분리하여 수행될 수 있다.
상기 원심분리는 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 예를 들어 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 물 및/또는 유기용매로 할 수 있고, 구체적으로는 용매별로 녹일 수 있는 물질이 상이하므로 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 예를 들어, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회 등일 수 있다.
상기 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, 시클로헥산온 등의 케톤류 ; 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 탄소계 방향족류 ; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 알코올, 보다 구체적으로 에탄올을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 원심분리 하에 수행될 수 있으며, 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 예를 들어 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 원심분리를 하지 않고, 필터로 입자를 걸러내어 수행될 수도 있다. 필터는 다공성 실리카 입자의 직경 이하의 기공을 가지는 것일 수 있다. 반응액을 그러한 필터로 걸러내면 입자만이 필터 위에 남고, 그 필터 위에 물 및/또는 유기용매를 부어 세척할 수 있다.
상기 세척 시에 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 예를 들어, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
상기 건조는 예를 들면 20℃ 내지 100℃로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 진공 상태에서 수행될 수도 있다.
이후, 얻어진 입자는 하소될 수 있는데, 하소는 입자를 가열하여 그 표면 및 내부를 좀 더 치밀한 구조를 갖게 하고, 기공을 채우는 유기물들을 제거하는 공정으로, 예를 들면 400℃ 내지 700℃에서 3시간 내지 8시간, 구체적으로 500℃ 내지 600℃에서 4시간 내지 5시간 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이후, 얻어진 다공성 실리카 입자는 전술한 방법대로 표면 및/또는 기공 내부가 개질될 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자(Mesoporous Silica Particle, MSP)는 또한 예를 들면, 소기공의 입자 제조, 기공 확장, 표면 개질, 기공 내부 개질 공정을 거쳐 제조된 것일 수도 있다.
상기 소기공의 입자 제조 및 기공 확장 공정은 전술한 바의 공정에 의할 수 있으며, 이 후 세척 및 건조 공정을 수행할 수 있다.
필요에 따라 세척 전에 미반응 물질의 분리가 선행될 수 있고, 이는 예를 들면 원심분리로 상등액을 분리하여 수행될 수 있다.
상기 원심분리는 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 구체적으로, 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 소기공의 입자 제조 이후의 세척은 앞서 예시한 범위 내의 방법/조건으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 기공 확장 이후의 세척은 앞서 예시보다는 보다 완화된 조건으로 수행할 수 있다. 예를 들면, 세척을 3회 이내 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 입자의 표면 및/또는 기공 내부 개질은 전술한 방법에 의할 수 있으며, 표면 개질과 기공 내부 개질의 순서로 공정이 수행될 수 있고, 상기 두 공정 사이에 입자의 세척 공정이 추가로 수행될 수 있다.
상기 소기공의 입자 제조 및 기공 확장 이후에 세척을 보다 완화된 조건으로 수행하는 경우 기공 내부에 입자 제조, 기공 확장에 사용된 계면활성제 등의 반응액이 채워져 있어 표면 개질시에 기공 내부는 개질되지 않고 표면만 개질될 수 있다. 그러고 나서 입자를 세척하면 기공 내부의 반응액이 제거될 수 있다.
상기 표면 개질과 기공 내부 개질 공정 사이의 입자 세척은 물 및/또는 유기용매로 할 수 있고, 구체적으로는 용매별로 녹일 수 있는 물질이 상이하므로 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 구체적으로, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
상기 세척은 원심분리 하에 수행될 수 있으며, 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 구체적으로, 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 원심분리를 하지 않고, 필터로 입자를 걸러내어 수행될 수도 있다. 필터는 다공성 실리카 입자의 직경 이하의 기공을 가지는 것일 수 있다. 반응액을 그러한 필터로 걸러내면 입자만이 필터 위에 남고, 그 필터 위에 물 및/또는 유기용매를 부어 세척할 수 있다.
상기 세척 시에 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 구체적으로, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
상기 건조는 예를 들면 20℃ 내지 100℃로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 진공 상태에서 수행될 수도 있다.
본 발명의 혈관 내 생리활성물질 전달용 조성물은 다공성 실리카 입자에 담지된 생리활성물질의 전달의 효율성 또는 상기 조성물의 사용 목적에 따라 당업계에 주지된 물질을 더 포함하여 사용할 수 있다. 더 포함할 수 있는 물질로는 형광 표지 물질, 혈액 응집 방지제, 적혈구 용혈 방지제 또는 조영제 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 혈액 응집 방지제는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-(포스포-락-(1-글리세롤))(1,2-DISTEAROYL-SN-GLYCERO-3-(PHOSPHO-RAC-(1-GLYCEROL))), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-DISTEAROYL-SN-GLYCERO-3-PHOSPHOCHOLINE), 세토매크로졸 1000(CETOMACROGOL 1000), 세토스테아릴 알코올(CETOSTEARYL ALCOHOL), 세틸 알코올(CETYL ALCOHOL), 세틸피리디늄 클로라이드(CETYLPYRIDINIUM CHLORIDE), 콜레스테롤(CHOLESTEROL), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DIPALMITOYLPHOSPHATIDYLGLYCEROL), 디스테아로일포스파티딜콜린(DISTEAROYLPHOSPHATIDYLCHOLINE), 알킬 폴리글리코사이드(ALKYL POLYGLYCOSIDE), 에그 포스포리피드(EGG PHOSPHOLIPIDS), 지방산 에스터(FATTY ACID ESTERS), 글리세릴 라우린산염(GLYCERYL LAURATE), 글리세릴 올레산염(GLYCERYL OLEATE), 하이드록시에틸피페라진 에탄 설폰산(HYDROXYETHYLPIPERAZINE ETHANE SULFONIC ACID), 락토오스 모노하이드레이트(LACTOSE MONOHYDRATE), 라놀린(LANOLIN), 라우릴 락테이트(LAURYL LACTATE),
레시틴(LECITHIN), 마그네슘 스테아레이트(MAGNESIUM STEARATE), 모노싸이오글리세롤(MONOTHIOGLYCEROL), 올레산(OLEIC ACID), 올레일 알코올(OLEYL ALCOHOL), 팔미틱산(PALMITIC ACID), PEG/PPG-18/18 디메티콘(PEG/PPG-18/18 DIMETHICONE), 폴리에틸렌글리콜(PEG), PEG-20 소르비탄 이소스테아레이트(PEG-20 SORBITAN ISOSTEARATE), PEG-40 카스토르 오일(PEG-40 CASTOR OIL), PEG-60 수소화 카스토르 오일(PEG-60 HYDROGENATED CASTOR OIL), 펜타소듐 펜테테이트(PENTASODIUM PENTETATE), 인지질(PHOSPHOLIPID), 폴록사머(POLOXAMER), 폴록사머 188(POLOXAMER 188), 폴록사머 407(POLOXAMER 407), 폴리옥시에틸렌 지방산 에스터(POLYOXYETHYLENE FATTY ACID ESTERS), 폴리옥실 30 카스토르 오일(POLYOXYL 30 CASTOR OIL), 폴리옥실 31 카스토르 오일(POLYOXYL 31 CASTOR OIL), 폴리옥실 32 카스토르 오일(POLYOXYL 32 CASTOR OIL), 폴리옥실 33 카스토르 오일(POLYOXYL 33 CASTOR OIL), 폴리옥실 34 카스토르 오일(POLYOXYL 34 CASTOR OIL), 폴리옥실 35 카스토르 오일(POLYOXYL 35 CASTOR OIL), 폴리옥실 36 카스토르 오일(POLYOXYL 36 CASTOR OIL), 폴리옥실 37 카스토르 오일(POLYOXYL 37 CASTOR OIL), 폴리옥실 38 카스토르 오일(POLYOXYL 38 CASTOR OIL), 폴리옥실 39 카스토르 오일(POLYOXYL 39 CASTOR OIL), 폴리옥실 40 카스토르 오일(POLYOXYL 40 CASTOR OIL), 폴리프로필렌 글리콜(POLYPROPYLENE GLYCOL), 폴리소르베이트(POLYSORBATE), 폴리소르베이트 20(POLYSORBATE 20), 폴리소르베이트 40(POLYSORBATE 40), 폴리소르베이트 80(POLYSORBATE 80), 포비돈 K12(POVIDONE K12), 포비돈 K17(POVIDONE K17), 포비돈 K30(POVIDONE K30), 포비돈(POVIDONE), 프로필렌 글라이콜(PROPYLENE GLYCOL), 프로필렌 글라이콜 모노라우린산염(PROPYLENE GLYCOL MONOLAURATE), 프로타민 설페이트(PROTAMINE SULFATE), 소듐 콜레스테릴 설페이트(SODIUM CHOLESTERYL SULFATE), 소듐 올레산염(SODIUM OLEATE), 소르비탄(SORBITAN), 소르비탄 모노스테아레이트(SORBITAN MONOSTEARATE), 소르비탄 트리스테아레이트(SORBITAN TRISTEARATE), 소르비탄 모노라우린산염(SORBITAN MONOLAURATE), 소르비탄 모노올레산염(SORBITAN MONOOLEATE), 소르비탄 모노팔미테이트(SORBITAN MONOPALMITATE), 스테아릴 알코올(STEARYL ALCOHOL), 스테아릭산(STEARIC ACID), 설팩틴(SULFACTIN), 아연 스테아릭산염(ZINC STEARATE), 코카마이드 DEA(COCAMIDE DEA), 코카마이드 MEA(COCAMIDE MEA), 데실 글루코사이드(DECYL GLUCOSIDE), 데실 폴리클루코오스(DECYL POLYGLUCOSE), 글리세롤 모노스테아레이트(GLYCEROL MONOSTEARATE), IGEPAL CA-630, 이소세테스-20(ISOCETETH-20), 라우릴 글루코시뎀 말토사이드(LAURYL GLUCOSIDEM MALTOSIDE), 모노라우린(MONOLAURIN), 마이코서브틸린(MYCOSUBTILIN), 에톡실레이트(ETHOXYLATE), 노니데트 P-40(NODIDET P-40), 노녹시놀(NONOXYNOL), 옥타에틸렌글리콜 모노도데실 에터(OCTAETHYLENE GLYCOL MONODODECYL ETHER), N-옥틸베타-D-티오글루코피라노사이드(N-OCTYLBETA-D-THIOGLUCOPYRANOSIDE), 옥틸 글루코사이드(OCTYL GLUCOSIDE), 올레일알코올(OLEYL ALCOHOL), PEG-10 선플라워 글리세라이드(PEG-10 SUNFLOWER GLYCERIDES), 펜타에틸렌글리콜 모노도데실 에터(PENTAEHYLENE GLYCOL MONODODEVYL ETHER), 폴리에톡실레이티드 탤로우 아민(POLYETHOXYLATED TALLOW AMINE), 폴리글리세롤 폴리리시놀레이트(POLYGLYCEROL POLYRICINOLEATE), 트리톤 X-100(TRITON X-100), 덱스트란(DEXTRAN), 폴리비닐피롤리돈(POLY VINYLPYRROLIDONE), 1,2-디오레오일-SN-글리세로-3-포스포콜린(1,2-DIOLEOYL-SN-GLYCERO-3-PHOSPHOCHOLINE), 엑소좀(EXOSOME), 마이셀(MICELLE), 리포좀(LIPOSOME), 폴리비닐알코올(POLYVINYL ALCOHOL), 실리콘(SILICON), 코폴리머(COPOLYMER), 핵산(NUCLEIC ACID), 펩타이드(PEPTIDE) 및 세포막(CELL MEMBRANE)으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조영제는 메트리자미드, 이오파미돌, 이오딕사놀, 이오헥솔, 이오프로미드, 이오브티리돌, 이오메프롤, 이오펜톨, 이오파미론, 이옥실란, 이오트롤란, 가도디아미드, 가도테리돌, 이오트롤, 이오베르솔, 리피오돌, 아이오다이즈드오일, 오일 조영제, 유상 조영제, 바륨 조영제,또는 이의 배합물로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 혈관 내 생리활성물질 전달용 조성물은 구체적으로 본 발명의 조성물의　혈관 내　투여에 관한 것이다. "혈관 내"라는 용어는 환자의 '혈관(들) 속으로', '혈관(들) 내로' 또는 '혈관(들) 속에'를 의미하는, 환자의　혈관계 속으로의 전달을 말하는 것으로 이해된다. 특정 양태에서,　투여는 정맥인 것으로 간주되는　혈관　속으로의 (정맥내)　투여이지만, 다른 양태에서　투여는 동맥인 것으로 간주되는　혈관　속으로의　투여이다. 정맥에는 내경정맥(internal jugular vein), 말초 정맥, 관상정맥, 간 정맥, 문정맥, 대복재정맥(great saphenous vein), 폐 정맥, 상대정맥, 하대정맥, 위 정맥, 비장 정맥, 하장간막 정맥(inferior mesenteric vein), 상장간막 정맥(superior mesenteric vein), 두부 정맥 및/또는 대퇴 정맥이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 동맥에는 관상동맥, 폐 동맥, 상완동맥(brachial artery), 내경동맥(internal carotid artery), 대동맥궁(aortic arch), 대퇴 동맥, 말초 동맥 및/또는 모양체 동맥(ciliary artery)이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 소동맥 또는 모세혈관을 통해, 또는 소동맥 또는 모세혈관으로 전달할 수 있는 것이 고려된다.
본 발명의 혈관 내 생리활성물질 전달용 조성물의 혈관 내 투여는 상기 조성물의 목적인 다공성 실리카 입자에 담지된 생리활성물질의 전달을 효과적으로 달성하기 위하여, 표적 조직 또는 세포 인근의 혈관에 카테터를 삽입하여 이루어질 수 있다. 이러한 경우, 다공성 실리카 입자의 표면에 담지된 생리활성물질이 혈류의 흐름에 의해 씻겨 나가거나, 다공성 실리카 입자의 표면 또는 기공내부에 담지된 생리활성물질이 혈류 내에서 확산에 의해 방출되는 것을 감소시킬 수 있으며, 담지된 생리활성물질 전달의 표적성을 상승시킬수 있는 등의 장점을 갖는다.
본 발명은 상기 혈관 내 생리활성물질 전달용 조성물을 포함하는 특정 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 "치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. 치료는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다.
상기 "예방"은 관련 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본원의 조성물은 초기 증상, 또는 나타나기 전에 투여할 경우 관련 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
상기 특정 질환은 간세포암, 전이성 간암, 대장암, 전이성 대장암, 폐암, 전이성 폐암, 위암, 췌장암, 전이성 췌장암, 피부암, 흑색종, 전이성 흑색종, 골육종, 섬유육종, 지방종, 담낭암, 간내 담관암, 방광암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 두경부암, 갑상선암 및 신장암, 뇌암, 교모세포종, 종격막 종양, 종격막 림프절 전이암, 혈액암, 백혈병, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 림프종, 악성림프종, 골수이형성증후군, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 고립성 골수종, 재생불량성 빈혈, 척수근위축증, 유전성 질환, 유전성 골격 질환, 유전성 기형 증후군, 상염색체 열성 유전질환, 희귀질환, 감염질환, 허혈성 질환, 비용종, 부비동염, 비대흉터, 켈로이드, 면역질환, 자가면역질환, 감염성 면역질환, 바이러스 감염증, 박테리아 감염증, 류마티스 관절염, 당뇨병, 당뇨병성 합병증, 족부궤양, 신경병증, 대사증후군, 장질환, 아토피, 알레르기, 루프스, 치매, 파킨슨병, 창상질환, 열상질환, 피부질환, 욕창, 혈관질환, 동맥질환, 정맥질환, 림프질환, 심혈관질환, 허혈성 심장질환, 뇌혈관 질환, 고혈압, 이상지질혈증, 동맥경화증, 말초혈관질환, 및 하지동맥 폐색증으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 생리활성물질을 담지한 다공성 실리카 입자를 포함하는 상기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로오스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 생리활성물질을 담지한 다공성 실리카 입자를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하며, 적정한 투여량은 예를 들면 환자의 체내에 축적된 약물의 양 및/또는 사용되는 생리활성물질을 담지한 다공성 실리카 입자의 구체적 효능정도에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 인비보 동물모델 및 인비트로에서 효과적인 것으로 측정된 EC50을 기초로 계산될 수 있으며, 예를 들면 체중 1kg당 0.01 μg 내지 1 g 일 수 있으며, 일별, 주별, 월별 또는 연별의 단위 기간으로, 단위 기간 당 일회 내지 수회 나누어 투여될 수 있으며, 또는 인퓨전 펌프를 이용하여 장기간 연속적으로 투여될 수 있다. 반복투여 횟수는 약물이 체내 머무는 시간, 체내 약물 농도 등을 고려하여 결정된다. 질환 치료 경과에 따라 치료가 된 후라도, 재발을 위해 조성물이 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 질환의 치료와 관련하여 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 또한 선택적으로, 화학치료제, 항염증제, 항바이러스제 및/또는 면역조절제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명은 상기 혈관 내 생리활성물질 전달용 조성물을 포함하는 색전 시술용 조성물을 제공한다.
상기 색전 시술용 조성물에 사용되는 다공성 실리카 입자의 물성은 전술한 입자의 물성과 크게 다르지 않으나, 색전 시술이라는 목적에 따라 입경을 적절한 크기로 조절하여 사용할 수 있다.
보다 구체적으로, 나노미터 크기의 입자를 사용하여 종양 조직 내부의 미세혈관까지 진입함으로써 종양 조직으로 향하는 혈관 및 종양 조직 내 혈관에 쌓이면서 종양 조직으로 향하는 혈류를 막아, 종양 조직으로의 산소와 영양분 공급을 차단할 수 있는 반면, 마이크로미터 크기의 입자를 사용하여 종양 조직에 연결된 동맥을 막아 보다 넓은 범위의 종양 조직에의 색전 시술을 행할 수 있다.
상기 나노미터 크기의 입자를 사용하는 경우, 입자의 평균 직경은 예를 들면 100nm 내지 1000nm일 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 예를 들면 100nm 내지 800nm, 100nm 내지 500nm, 100nm 내지 400nm, 100nm 내지 300nm, 100nm 내지 200nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 마이크로미터 크기의 입자를 사용하는 경우, 입자의 평균 직경은 예를 들면 0.1 ㎛ 내지 500 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 300 ㎛, 100 내지 300 ㎛, 300 ㎛ 내지 500 ㎛, 0.1㎛ 이상 내지 100 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 1㎛, 0.2 ㎛ 내지 0.8 ㎛ 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 다공성 실리카 입자는, 전술한 바대로 생분해성을 가진 입자로서, 생체 내에서 체액 또는 미생물 등에 의해서 분해될 수 있어 주입 후 수시간 내지 수백시간에 걸쳐 항암제를 서방형으로 방출시킬 수 있으며, 혈관을 영구적으로 차단하지 않는바 화학색전 시술 이후에 종양이 완전히 괴사/사멸하지 않은 경우의 2차 시술시 동일 경로(혈관)로 재투여가 가능하다.
상기 조성물은 폴리비닐알코올, 조영제, 아이오다이즈드오일, 오일 조영제, 유상 조영제, 바륨 조영제, 리피오돌, N-부틸 시아노아크릴레이트(N-butylcyanoacrylate), 코일, 젤폼, 젤라틴, 에탄올, 덱스트란, 실리카, 흄드 실리카(Fumed Silica), 폴리머, 코폴리머, 폴리소디움 아크릴레이트 비닐알코올 코폴리머(Polysodium acrylate vinylalcohol copolymer), 방사선 물질, 글라스, 폴리-L-굴루로닉 알지네이트(poly-L-guluronic alginate), 폴리글리콜릭-폴리액틱산(Polyglycolic-Polyactic acid), 폴리디옥사논(Polydioxanone), 폴리글리콜산-co-카프로락톤(Polyglycolic acid-co-caprolactone), 폴리프로필렌(Polypropylene) 및 직경 10㎛ 이상의 다공성 실리카 입자로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 색전물질을 더 포함할 수 있으나, 당업계의 주지된 색전 시술용 조성물로서 본 발명 조성물의 다공성 실리카 입자와 적절히 혼합될 수 있는 것이라면 제한없이 선택할 수 있으며, 보다 바람직하게는 에멀젼 형태의 주사제로서 색전 시술을 행하는 당업계의 상식을 고려할 때, 본 발명 조성물의 다공성 실리카 입자와 혼합되어 안정한 형태의 에멀젼을 구성하는 조영제 또는 리피오돌을 선택할 수 있다.
상기 조성물의 투여는 전술한 바의 장점을 갖는 카테터를 통한 투여일 수 있고, 카테터를 통해 종양에 직접 연결된 혈관으로 상기 조성물을 투여하여 정상 조직의 손상을 억제하며 표적 종양 조직만을 타겟팅하는 표적성 상승효과를 얻을 수 있다.
상기 조성물을 이용하여 색전 시술이 가능한 질환으로는 간세포암, 전이성 간암, 대장암, 전이성 대장암, 폐암, 전이성 폐암, 위암, 췌장암, 전이성 췌장암, 피부암, 흑색종, 전이성 흑색종, 골육종, 섬유육종, 지방종, 담낭암, 간내 담관암, 방광암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 두경부암, 갑상선암 및 신장암, 뇌암, 교모세포종, 종격막 종양, 종격막 림프절 전이암, 혈액암, 백혈병, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 림프종, 악성림프종, 골수이형성증후군, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 고립성 골수종, 재생불량성 빈혈, 척수근위축증, 유전성 질환, 유전성 골격 질환, 유전성 기형 증후군, 상염색체 열성 유전질환, 희귀질환, 감염질환, 허혈성 질환, 비용종, 부비동염, 비대흉터, 켈로이드, 면역질환, 자가면역질환, 감염성 면역질환, 바이러스 감염증, 박테리아 감염증, 류마티스 관절염, 당뇨병, 당뇨병성 합병증, 족부궤양, 신경병증, 대사증후군, 장질환, 아토피, 알레르기, 루프스, 치매, 파킨슨병, 창상질환, 열상질환, 피부질환, 욕창, 혈관질환, 동맥질환, 정맥질환, 림프질환, 심혈관질환, 허혈성 심장질환, 뇌혈관 질환, 고혈압, 이상지질혈증, 동맥경화증, 말초혈관질환, 및 하지동맥 폐색증으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
이하 실시예에서 본 발명의 다공성 실리카 입자는 DegradaBALL(상표등록번호 40-1292208)로 언급될 수 있다.
실시예 1. 다공성 실리카 입자의 제조
(1) 입자 1의 제조
1) 소기공 입자의 제조
2 L 둥근바닥플라스크에 증류수 (DW) 960 mL 과 MeOH 810 mL을 넣었다. 상기 플라스크에 CTAB 7.88 g을 넣은 후 교반하면서 1M NaOH 4.52 mL를 빠르게 넣었다. 10분 동안 교반시켜 균일한 혼합액을 넣은 후 TMOS 2.6 mL를 넣었다. 6시간 동안 교반하여 균일하게 혼합한 후, 24시간 동안 숙성시켰다.
이후 상기 반응액을 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 5회 세척하였다.
이후 70℃ 오븐에서 건조시켜 1.5g의 분말형의 소기공 다공성 실리카 입자(기공 평균 직경 2nm, 입경 200nm)를 얻었다.
2) 기공 확장
1.5g의 소기공 다공성 실리카 입자 분말을 에탄올 10ml에 첨가하여 초음파 분산시키고, 물 10ml, TMB (trimethyl benzene) 10ml를 첨가하여 초음파 분산시켰다.
이후 상기 분산액을 오토클레이브에 넣고 160℃, 48시간 반응시켰다.
반응은 25℃에서 시작하여 10℃/분의 속도로 승온시켜 수행하였고, 이후 오토클레이브 내에서 1~10℃/분의 속도로 서서히 냉각시켰다.
냉각된 반응액을 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 5회 세척하였다.
이후 70℃ 오븐에서 건조시켜 분말형의 다공성 실리카 입자(기공 직경 10~15nm, 입경 200nm)를 얻었다.
3) 하소
상기 2)에서 제조된 다공성 실리카 입자를 유리 vial에 담아 550℃에서 5시간 동안 가열하고, 반응 종료 후 상온으로 서서히 식혀 입자를 제조하였다.
(2) 입자 2의 제조
기공 확장시의 반응 조건을 140℃, 72시간으로 변경한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(3) 입자 3의 제조 (10L 스케일)
5배 큰 용기를 사용하고, 각 물질을 모두 5배 용량으로 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(4) 입자 4의 제조 (입경 300nm)
소기공 입자의 제조시에 증류수 920ml, 메탄올 850ml를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(5) 입자 5의 제조 (입경 500nm)
소기공 입자의 제조시에 증류수 800ml, 메탄올 1010ml, CTAB 10.6g을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(6) 입자 6의 제조 (입경 1000nm)
소기공 입자의 제조시에 증류수 620ml, 메탄올 1380ml, CTAB 7.88g을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(7) 입자 7의 제조 (기공 직경 4nm)
기공 확장시에 TMB를 2.5mL를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(8) 입자 8의 제조 (기공 직경 7nm)
기공 확장시에 TMB를 4.5mL를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(9) 입자 9의 제조 (기공 직경 17nm)
기공 확장시에 TMB를 11mL를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(10) 입자 10의 제조 (기공 직경 23nm)
기공 확장시에 TMB를 12.5mL를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(11) 입자 11의 제조 (이중개질)
1) 소기공 입자의 제조
실시예 1-(1)-1)과 동일한 방법으로 소기공 입자를 제조하였다.
2) 기공 확장
실시예 1-(1)-2)와 동일한 방법으로 소기공 입자를 TMB와 반응시키고 냉각시키고 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 이후 실시예 1-(1)-2)와 동일 조건으로 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 3회 세척하고, 이후 실시예 1-(1)-2)와 동일 조건으로 건조하여 분말형의 다공성 실리카 입자(기공 직경 10~15nm, 입경 200nm)를 얻었다.
3) 표면 개질
기공이 확장된 다공성 실리카 입자 0.8g 내지 1g을 50mL의 톨루엔에 분산시킨 후, (3-aminopropyl)triethoxysilane를 5mL 넣어주어 120 ℃로 환류한 채로 12시간 가열하였다. 해당 과정은 상기 서술된 세척과정 및 건조 과정을 거친 뒤 1mL의 트레에틸렌글리콜(PEG3, 2-[2-(2-methoxyethoxy)ethoxy]acetic acid)와 100mg의 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 및 200mg의 N-Hydroxysuccinimide (NHS)를 30mL의 PBS에 분산시켜서 상온에서 교반한 채로 12시간 동안 반응을 보낸다. 이후 생성물은 상기의 세척 및 건조과정을 거친다.
기공 내부에 이전 단계의 반응액이 남아 있어, 기공 내부는 개질 되지 않는다.
4) 기공 내부 세척
표면개질된 입자 분말 800mg을 2M HCl/에탄올 40ml에 녹이고, 12시간 강하게 교반 하에 환류시켰다.
이후 냉각된 반응액을 10분간 8000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 5회 세척하였다.
이후 70℃ 오븐에서 건조시켜 분말형의 다공성 실리카 입자를 얻었다.
5) 기공 내부 개질
① 후술하는 실시예 2-(2)-1)의 방법과 동일한 방법으로 기공 내부에 프로필기를 도입하였다.
② 후술하는 실시예 2-(2)-2)의 방법과 동일한 방법으로 기공 내부에 옥틸기를 도입하였다.
실시예 2. 다공성 실리카 입자의 표면 개질
(1) 양전하로의 대전
1) 아미노기 - 입경 300nm의 입자
실시예 1-(4)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰다.
구체적으로, 100 mL 둥근바닥플라스크에 100 mg의 다공성 실리카 입자를 10 mL의 톨루엔에 bath sonicator로 분산시켰다. 이후 1 mL의 APTES를 첨가하고 400 rpm으로 교반하며 130℃에서 교반하며 12시간 동안 반응시켰다.
반응 후에 상온까지 서서히 식히고, 10분간 8000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 5회 세척하였다.
이후 70℃ 오븐에서 건조시켜 표면 및 기공 내부에 아미노기를 갖는 분말형의 다공성 실리카 입자를 얻었다.
2) 아미노기 - 입경 200nm의 입자
① 실시예 1-(1)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, APTES를 0.4ml 첨가하고, 반응 시간을 3시간으로 한 것을 제외하고는 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
② 실시예 1-(9)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, 그 외 방법은 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
③ 실시예 1-(10)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
3) 아미노기 - 입자간 표면개질 정도의 차이
① 실시예 1-(1)-1) 이후 실시예 1-(1)-3) 의 과정을 거친 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, 그 외 방법은 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
② 실시예 1-(9)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, 반응 시간을 24시간으로 한 것을 제외하고는 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
4) 알데하이드기
실시예 2-(1)-3)-②의 다공성 실리카 입자를 glutaraldehyde (GA)와 반응 시켜 양전하로 대전시켰다.
구체적으로, 100 mL 둥근바닥플라스크에 100 mg의 다공성 실리카 입자를 10 mL의 증류수에 bath sonicator로 분산시켰다. 이후 10 mL의 GA를 첨가하고 상온에서 400 rpm으로 교반하여 24시간 동안 반응시켰다.
반응 후에 10분간 8000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하며 증류수로 5회 세척하였다.
(2) 소수성기의 도입
1) 프로필기
실시예 1-(1)의 다공성 실리카 입자를 Trimethoxy(propyl)silane와 반응시켜 표면 및 기공 내부에 프로필기를 도입하였으며, APTES 대신에 Trimethoxy(propyl)silane를 0.35ml 첨가하고, 12시간 반응시킨 것을 제외하고는 실시예 2-(1)과 동일한 방법으로 개질을 수행하였다.
2) 옥틸기
실시예 1-(1)의 다공성 실리카 입자를 Trimethoxy-n-octylsilane와 반응시켜 표면 및 기공 내부에 프로필기를 도입하였으며, APTES 대신에 Trimethoxy-n-octylsilane를 0.5ml 첨가하고, 12시간 반응시킨 것을 제외하고는 실시예 2-(1)과 동일한 방법으로 개질을 수행하였다.
(3) 음전하로의 대전
1) 카르복실기
실시예 1-(1)의 다공성 실리카 입자를 succinic anhydride와 반응시켜 음전하로 대전시켰으며, 톨루엔 대신에 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 사용하고, APTES 대신에 80 mg의 succinic anhydride를 첨가하여 24시간 동안 상온에서 교반하며 반응시키고, 세척 시에 증류수 대신에 DMSO를 사용한 것을 제외하고는 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
2) 티올기
APTES 대신에 MPTES 1.1 mL를 사용한 것을 제외하고는 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
3) 술폰산기
실시예 2-(3)-2)의 다공성 실리카 입자 100mg를 1M 황산수용액을 1mL와 30% 과산화수소수 20mL에 분산하여 상온에서 교반하여 산화반응을 유도하여 티올기를 술폰산기로 산화시켰다. 이후 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 세척 및 건조시켰다.
4) 메틸포스포네이트기
① 실시예 1-(1)-1) 이후 실시예 1-(1)-3) 의 과정을 거친 다공성 실리카 입자를 3-(Trihydroxysilyl)propyl methylphosphonate (THMP)와 반응시켜 전하로 대전시켰다.
구체적으로, 100 mL 둥근바닥플라스크에 100 mg의 다공성 실리카 입자를 10 mL의 증류수에 bath sonicator로 분산시켰다. 이후 3 mL의 THMP와 1.5 mL의 1M HCl 수용액을 첨가하고 130℃에서 400 rpm으로 교반하여 24시간 동안 반응시켰다.
반응 후에 상온까지 서서히 식히고, 10분간 8000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하며 증류수로 5회 세척하였다.
② 실시예 1-(9)의 다공성 실리카 입자를 3-(Trihydroxysilyl)propyl methylphosphonate (THMP)와 반응시켜 음전하로 대전시켰으며, 그 외 방법은 상기 ①의 방법과 동일하게 개질하였다.
③ 실시예 1-(10)의 다공성 실리카 입자를 3-(Trihydroxysilyl)propyl methylphosphonate (THMP)와 반응시켜 음전하로 대전시켰으며, 그 외 방법은 상기 ①의 방법과 동일하게 개질하였다.
(4) 친수성기의 도입 - PEG
실시예 1-(1)의 다공성 실리카 입자 100 mg을 50μg/ml 농도의 N,N'-Disuccinimidyl carbonate (DSC) 용액 20 ml에 분산하여 상온에서 교반하여 다공성 실리카 입자 표면에 DSC를 결합시킨다. 이 입자를 증류수 10 ml를 이용하여 3회 세척하고 끝이 아미노기로 되어있는 분자량 4kDa, PEG (HO-PEG-NH2) 10 mg을 위의 용액 10 ml에 분산하여 상온에서 교반하여 다공성 실리카 입자 표면에 PEG가 연결될 수 있도록 한다. 이후 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 세척 및 건조시켰다.
실시예 3. 생리활성물질 로딩
(1) 독소루비신(Doxorubicin)
음전하를 띠는 실시예 2-(3)-4)의 다공성 실리카 입자에 독소루비신을 로딩하였다.
구체적으로, 증류수 하에서 다공성 실리카 입자 분말 5mg과 독소루비신 2mg을 혼합한 후, 실온에서 1시간 정치하였다.
(2) 이리노테칸(Irinotecan)
음전하를 띠는 실시예 2-(3)-4)의 다공성 실리카 입자 분말 5mg을 1 mL 의 1xPBS에 분산시킨 뒤 2 mg의 이리노테칸을 첨가하고 15분간 분산시킨 후, 1시간 동안 실온에 정치하였다.
(3) 소라페닙(sorafenib)
실시예 1-(11)-5)-①의 다공성 실리카 입자에 소라페닙을 로딩하였다.
구체적으로, 5:5 혼합비(부피비)의 탈이온수/에탄올 1ml에 다공성 실리카 입자 분말 5mg과 소라페닙 2mg을 혼합한 후, 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 이후 탈이온수 1ml로 3회 세척하였다.
(4) 레티노산(Retinoic acid)
실시예 2-(1)-2)-①의 다공성 실리카 입자 분말 100μg에 레티노산 용액(50mM 에탄올) 1ml를 첨가하여 실온에서 4시간 정치한 후, 에탄올 1ml로 3회 세척하였다.
(5) p53 펩타이드
다공성 실리카 입자로는 실시예 1-(11)-5)-②의 입자를 사용하였다.
사용한 p53 펩타이드는 세포사멸기작에 관여하는 p53 단백질 서열의 일부분을 모방하였다. 모방한 서열은 p53 단백질이 hMDM2 단백질과 결합하는 소수성의 2차 나선구조 부분의 서열에 관한 것이다. 따라서, p53 펩타이드는 hMDM2 단백질의 대항제(antagonist)로 작용한다.
p53 펩타이드(Cal. m.w. 2596.78, found by MALDI-TOF 2597.92)의 아미노산 서열은 하기 화학식 1(N 말단 -> C 말단)과 같다.
[화학식 1]
Z-Gly-Gly-Qln-Ser-Qln-Qln-Thr-Phe-Y-Asn-Leu-Trp-Arg-Leu-Leu-X-Qln-Asn-NH2
(X는 아지드(azide) 작용기가 도입된 비천연 아미노산으로 2-amino-5-azido-pentanoic acid이고; Y는 알킨(alkyne) 작용기가 도입된 비천연 아미노산으로 D-Lys의 측쇄(side chain)에 4-pentynoic acid를 도입한 것이며;
X와 Y는 아지드-알킨 고리첨가반응 (azide-alkyne cycloaddition, 또는 클릭 반응, click reaction)을 통해 트리아졸 작용기를 (triazole) 이루면서 연결되고;
Z는 5(6)-carboxyfluorescein (FAM)임).
DMSO 100 ㎕에 p53 펩타이드 1.3 mg (500 nmole)을 녹이고, 이를 15 mL의 conical tube에서 다공성 실리카 입자 분말 5 mg를 녹인 수용액 5 mL를 혼합한 후, 실온에서 12시간 인큐베이션하였다.
p53 펩타이드가 적제된 다공성 실리카 입자는 원심분리 (9289 rcf, 8500 rpm, 20분, 15 mL conical tube)와 물을 이용한 세척을 3번 반복하여 정제하였다.
(6) siRNA
녹색형광단백질 (Green Fluorescence Protein, GFP)을 표적으로 하는 21 base pair duplex siRNA를 ㈜바이오니아에 합성의뢰하여 구입하였다(서열: sense; 5'-GGCUACGUCCAGGAGCGCACC-3'(서열번호 1), antisense; 5'- UGCGCUCCUGGACGUAGCCUU-3'(서열번호 2)).
실시예 2-(1)-2)-②의 다공성 실리카 입자 10-μg와 50pmol의 siRNA을 1xPBS 조건에서 섞은 후 상온에서 30분간 두고 적재가 되도록 하였다.
(7) Plasmid DNA
pcDNA3.3 backbone으로 GFP를 발현하도록 제작된 6.7k base pair의 plasmid DNA(서열번호 5)를 박테리아에서 생산하여 정제 후 사용하였다.
실시예 2-(1)-2)-③의 다공성 실리카 입자 10μg와 0.25μg의 plasmid DNA를 1x PBS 조건에서 섞은 후 상온에서 30분간 두고 적재하였다.
(8) linear DNA
Forward primer - CMV promotor - eGFP cDNA - Reverse primer 순서로 제작되어 PCR로 증폭하여 얻은 1.9k base pair의 linear DNA(서열번호 6)를 사용하였다.
실시예 2-(1)-2)-③의 다공성 실리카 입자 12.5μg과 0.25μg의 linear DNA를 1x PBS 조건에서 섞은 후 상온에서 30분간 두고 적재시켰다.
(9) 단백질
1) BSA
1 x PBS 200 ㎕ 내에 실시예 2-(1)-2)-②의 다공성 실리카 입자 분말 100μg과 BSA(sigma Aldrich, A6003) 10μg을 혼합한 후, 실온에서 1시간 인큐베이션하였다.
2) IgG
1 x PBS 200 ㎕ 내에 실시예 2-(1)-2)-②의 다공성 실리카 입자 분말 100μg과 anti-twist IgG(Santacruz, sc-81417) 10μg을 혼합한 후, 실온에서 1시간 인큐베이션하였다.
3) RNase A
1 x PBS 200μl 내에 실시예 1-(9)의 다공성 실리카 입자 분말 100μg과 RNase A(Sigma-aldrich, R6513) 10μg을 혼합한 후, 실온에서 1시간 인큐베이션하였다.
4) Cas9
1 x PBS 10 ㎕ 내에 실시예 2-(1)-2)-①의 다공성 실리카 입자 분말 40μg과 Cas9 단백질(서열번호 3) 4μg과 가이드 RNA(서열번호 4) 2.25μg을 혼합한 후, 실온에서 1시간 인큐베이션하였다.
5) Anti-PD-1 antibody
증류수 100μl 내에 실시예 2-(3)-4)-②의 다공성 실리카 입자 분말 100 μg과 anti-PD-1 (BioXCell, BP0146) 50 μg을 혼합 후, 실온에서 5분간 인큐베이션 하였다.
6) Anti-PD-L1 antibody
증류수 100 μl 내에 실시예 2-(3)-4)-②의 다공성 실리카 입자 분말 100 μg과 anti-PD-L1 (BioXCell, BP0101) 50 μg을 혼합 후, 실온에서 5분간 인큐베이션 하였다.
실험예 1. 다공성 실리카 입자 형성 확인 및 기공 확장 확인
실시예 1-(1) 내지 (3)의 입자의 소기공 입자, 제조된 다공성 실리카 입자를 현미경으로 관찰하여, 소기공 입자가 균일하게 생성되었는지, 기공이 충분히 확장되어 다공성 실리카 입자가 균일하게 형성되었는지를 확인하였다(도 1 내지 4).
도 1은 실시예 1-(1)의 다공성 실리카 입자의 사진, 도 2는 실시예 1-(2)의 다공성 실리카 입자의 사진으로 기공이 충분히 확장된 구형의 다공성 실리카 입자가 고르게 생성된 것을 확인할 수 있고,
도 3은 실시예 1-(1)의 소기공 입자의 사진이고, 도 4는 실시예 1-(1)과 실시예 1-(3)의 소기공 입자의 비교 사진으로, 구형의 소기공 입자가 고르게 생성된 것을 확인할 수 있다.
실험예 2. BET 표면적 및 기공 부피 계산
실시예 1-(1)의 소기공 입자, 실시예 1-(1),(7),(8),(10)의 다공성 실리카 입자의 표면적과 기공 부피를 계산하였다. 표면적은 Brunauer-Emmett-Teller(BET) 방법에 의해 계산되었으며, 기공 크기의 분포는 Barrett-Joyner-Halenda(BJH) 방법에 의하여 계산되었다.
상기 각 입자들의 현미경 사진은 도 5에 나타내었고, 계산 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
Figure PCTKR2018008445-appb-T000001
실험예 3. 다공성 실리카 입자의 생분해성 확인
실시예 1-(1)의 다공성 실리카 입자의 생분해성 확인을 위해 37℃, SBF(pH 7.4)에서의 생분해 정도를 0시간, 120시간, 360시간에 현미경으로 관찰하였고, 이는 도 6에 나타내었다.
이를 참조하면 다공성 실리카 입자가 생분해되어 360시간 경과 후에는 거의 다 분해된 것을 확인할 수 있다.
실험예 4. 다공성 실리카 입자의 흡광도비 측정
시간별 하기 수학식 1에 따른 흡광도비를 측정하였다.
[수학식 1]
At/A0
(식 중, A0는 상기 다공성 실리카 입자 1mg/ml 현탁액 5ml를 직경 50kDa의 기공을 갖는 원통형 투과막에 넣고 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도이고,
상기 투과막 외부에는 상기 투과막과 접하며, 상기 현탁액과 동일한 용매 15ml가 위치하고, 상기 투과막 내외부는 37℃에서 60rpm 수평 교반되며,
At는 상기 A0의 측정시로부터 t시간 경과 후에 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도임).
구체적으로, 다공성 실리카 입자 분말 5mg을 SBF (pH 7.4) 5ml에 녹였다. 이후 5ml의 다공성 실리카 입자 용액을 도 7에 도시된 직경 50 kDa의 기공을 갖는 투과막에 넣었다. 외부막에 15ml의 SBF를 첨가하고, 외부막의 SBF는 12시간마다 교체하였다. 다공성 실리카 입자의 분해는 37℃에서 60rpm 수평 교반하며 수행되었다. 이 후 UV-vis spectroscopy에 의해 흡광도를 측정하였고, λ = 640 nm에서 분석되었다.
(1) 흡광도 비 측정
실시예 1-(1)의 다공성 실리카 입자의 흡광도 비를 상기 방법에 따라 측정하였고, 그 결과는 도 8에 나타내었다.
이를 참조하면 흡광도 비가 1/2가 되는 t가 약 58시간으로 굉장히 천천히 분해되는 것을 확인할 수 있다.
(2) 입경별 측정
실시예 1-(1),(5),(6)의 다공성 실리카 입자의 흡광도를 상기 수학식 1에 따라 측정하였고, 그 결과는 도 9에 나타내었다(현탁액과 용매로는 SBF를 사용).
이를 참조하면, 입경의 증가에 따라 t가 감소함을 알 수 있다.
(2) 기공 평균 직경별 측정
실시예 1-(1),(9)의 다공성 실리카 입자, 그리고 컨트롤로서 실시예 1-(1)의 소기공 다공성 실리카 입자의 흡광도를 상기 수학식 1에 따라 측정하였고, 그 결과는 도 10에 나타내었다(현탁액과 용매로는 SBF를 사용).
이를 참조하면, 실시예의 다공성 실리카 입자는 컨트롤에 비해 t가 상당히 큰 것을 확인할 수 있다.
(3) pH별 측정
실시예 1-(4)의 다공성 실리카 입자의 pH별 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 SBF에서, 그리고 pH 2, 5, 및 7.4의 Tris에서 측정하였고, 그 결과는 도 11에 나타내었다.
이를 참조하면, pH 별 t의 차이는 있으나, 모두 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 20 이상이었다.
(4) 대전된 경우의 측정
실시예 2-(1)-1)의 다공성 실리카 입자의 흡광도를 측정하였고, 그 결과는 도 12에 나타내었다(현탁액과 용매로는 Tris(pH 7.4)를 사용).
이를 참조하면, 양전하로 대전된 입자도 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 20 이상이었다.
실험예 5. 생리활성물질의 방출
(1) 독소루비신
1) Dynamic condition
이는 혈류의 유속이 매우 빠른 환경이나 외부 충격이 많은 환경을 모사한 경우이다.
독소루비신(1mg)이 적재된 5mg의 다공성 실리카 입자를 SBF(pH 7.4)에 분산시킨 후(총 부피 1ml), 이 용액을 1.5ml 튜브에 넣고 37 ℃에서 20rpm으로 수평교반하는 동적인 조건을 유지한다. 각 시점마다 독소루비신이 적재된 다공성 실리카 용액을 원심분리기를 이용하여 가라앉히고 상층액의 흡광도(λab = 480nm)를 측정하여 방출된 독소루비신의 양을 측정하였고, 결과는 도 13(A)에 나타내었다.
이를 참조하면, 독소루비신은 입자 표면과 비교적 약한 결합력으로 적재되어 있고, 독소루비신의 SBF에서 용해도가 높기 때문에 상대적으로 빠르게 방출된 것을 확인할 수 있으며, 50%의 방출량에 이르기까지 약 1.5시간이 경과하였고, 12시간 이상까지 생리활성물질이 지속적으로 방출된 것을 알 수 있다.
2) Static condition
이는 종양조직, 근육조직 또는 종양주변 등 혈류의 유속이 느린 환경을 모사한 경우이다.
독소루비신(2mg)이 적재된 10mg의 다공성 실리카 입자를 투석막 내부의 SBF(pH 7.4)에 분산시킨 후(총 부피 0.5ml), 이 투석막을 1.5ml SBF(pH 7.4) 튜브에 넣고 37 ℃에서 정적인 조건을 유지한다. 각 시점마다 독소루비신이 적재된 다공성 실리카 용액을 원심분리기를 이용하여 가라앉히고 상층액의 흡광도(λab = 480nm)를 측정하여 방출된 독소루비신의 양을 측정하였고, 결과는 도 13(B)에 나타내었다.
이를 참조하면, 독소루비신은 입자 표면과 비교적 약한 결합력으로 적재되어 있고, 독소루비신의 SBF에서 용해도가 높기 때문에 상대적으로 빠르게 방출됨에도 불구하고 50%의 방출량에 이르기까지 약 6일이 경과하였고, 20일 이상까지 생리활성물질이 지속적으로 방출된 것을 알 수 있다.
(2) 이리노테칸
이리노테칸(0.2mg)이 적재된 1mg의 다공성 실리카 입자를 human plasma 1mL에 분산시켰다. 이 용액을 37 ℃에서 200rpm으로 수평교반하는 동적인 조건을 유지한다. 각 시점마다 이리노테칸이 적재된 다공성 실리카 용액을 원심분리기를 이용하여 가라앉히고 상층액의 흡광도(λab = 255 or 278 nm) 를 측정하여 방출된 이리노테칸의 양을 측정하였고, 결과는 도 14에 나타내었다.
이를 참조하면, 이리노테칸이 약 50%가 5.5시간 경과 후에 방출된 것을 확인할 수 있고, 120시간 이상까지 생리활성물질이 지속적으로 방출된 것을 확인할 수 있다.
(3) 소라페닙
소라페닙(0.1mg)이 적재된 1mg의 다공성 실리카 입자를 각각 1x PBS 10 mL에 분산시켰다. 용액을 37 ℃에서 200rpm으로 수평교반하는 동적인 조건을 유지하였다. 각 시점마다 소라페닙이 적재된 다공성 실리카 용액을 원심분리기를 이용하여 가라앉히고 상층액의 흡광도(λab = 270nm) 를 측정하여 방출된 소라페닙의 양을 측정하였고, 결과는 도 15에 나타내었다.
이를 참조하면, 난용성 생리활성물질인 소라페닙이 소수성 치환기를 갖는 다공성 실리카 입자와의 상호 작용에 의해 굉장히 느리게 방출되는 것을 확인할 수 있다.
(4) 레티노산
레티노산이 적재된 입자 0.1 mg을 5% 에탄올이 포함된 PBS (pH 7.4) 용액에 넣고 수평교반하면서 37 ℃로 온도를 유지시켰다. 매 24시간마다 입자가 포함된 용액을 원심분리하여 상층액의 흡광도를 350nm 파장에서 측정하여 방출된 레티노산의 양을 측정하였고, 결과는 도 16에 나타내었다.
이를 참조하면, 음전하를 갖는 레티노산이 양전하로 대전된 다공성 실리카 입자와의 상호 작용에 의해 굉장히 느리게 방출되며, 10일에 가까이 거의 100%까지 방출되는 것을 확인할 수 있다.
(5) p53 펩타이드
p53 peptide가 적재된 입자 5 mg 을 10% FBS 가 포함된 1x PBS 5 mL, 또는 1x PBS 5 mL에 넣어주고 37 ℃에서 20 rpm으로 회전시키며 동적 환경을 유지시켰다. 매 시점마다 8500 rpm으로 원심분리하여 상층액으로부터 p53 펩타이드에 결합시켜둔 형광표지인 5(6)-carboxyfluorescein (FAM)의 형광세기를 측정하였고(Absorbance : 480 nm, Emmision : 520 nm), 그 결과는 도 17에 나타내었다.
이를 참조하면, p53 펩타이드는 다공성 실리카 입자의 내부에 소수성결합(hydrophobic effect)을 통한 결합력으로 적재되어 있어 PBS 용액 내에서는 방출이 되지 않음을 볼 수 있다. 그러나 FBS(fetal bovine serum)와 같은 단백질이 용액상에 존재할 시에는 p53 펩타이드가 FBS 단백질의 소수성 부분 (hydrophobic segment)과 결합하면서 용액상에 녹을 수 있게 되면서, 다공성 실리카 입자 바깥으로 방출되는 것을 확인할 수 있다. 혹은, 입자 내부에 적재되어있던 p53 펩타이드가 입자 바깥으로 방출되면서, FBS 단백질이 입자 내부로 유입되는 현상도 생길 것이다.
(6) siRNA
1) Condition 1
Cy5-siRNA를 로딩한 다공성 실리카 입자 10μl를 SBF(pH 7.4, 37℃)에 재부유(총 부피 0.5 ml)시키고, 1.5ml 튜브에 담갔다. siRNA의 방출은 37℃에서 60rpm 수평 교반하며 수행되었다. 각 시점마다 siRNA가 적재된 다공성 실리카 용액을 원심분리기를 이용하여 가라앉히고 상층액의 형광강도를 측정하였다.
Cy5-siRNA의 형광 강도는 670 nm 파장(λex=647 nm)에서 측정하여 siRNA의 방출 정도를 측정하였고, 그 결과는 도 19(A)에 나타내었다.
이를 참조하면 siRNA가 50% 방출된 시간이 약 6시간인 것을 확인할 수 있다.
2) Condition 2
상기 1)의 siRNA(1μg)가 적재된 20μg의 다공성 실리카 입자를 투석막 내부의 SBF(pH 7.4)에 분산시킨 후(총 부피 0.5ml), 이 투석막을 1.5ml SBF(pH 7.4) 튜브에 넣고 37 ℃에서 정적인 조건을 유지한다. 각 시점마다 siRNA가 적재된 다공성 실리카 용액을 원심분리기를 이용하여 가라앉히고 상층액의 흡광도(λab = 480nm)를 측정하여 방출된 siRNA의 양을 측정하였고, 결과는 도 19(B)에 나타내었다.
이를 참조하면, siRNA가 50%의 방출량에 이르기까지 약 48시간이 경과하였고, 100시간 이상까지 생리활성물질이 지속적으로 방출된 것을 알 수 있다.
(7) Plasmid DNA
pDNA(1μg)가 적재된 20μg의 다공성 실리카 입자를 투석막 내부의 SBF(pH 7.4)에 분산시킨 후(총 부피 0.5ml), 이 투석막을 1.5ml SBF(pH 7.4) 튜브에 넣고 37 ℃에서 60rpm으로 shaking 하였다. 각 시점마다 pDNA가 적재된 다공성 실리카 용액을 원심분리기를 이용하여 가라앉히고 상층액의 흡광도(λab = 480nm)를 측정하여 방출된 pDNA의 양을 측정하였고, 결과는 도 20, 21에 나타내었다.
이를 참조하면, pDNA가 50%의 방출량에 이르기까지 약 24시간이 경과하였고, 100시간 이상까지 생리활성물질이 지속적으로 방출된 것을 알 수 있다.
(8) linear DNA
Linear DNA를 로딩한 다공성 실리카 입자(linear DNA 3㎍, 다공성 실리카 입자 100㎍)를 PBS(pH 7.4, 37℃)에 재부유시키고, 기공 직경 20 kDa의 투과막(도 18의 튜브와 동일한 튜브)에 넣은 후, 투과 튜브를 1.5ml의 PBS에 담갔다. Plasmid DNA의 방출은 37℃에서 60rpm 수평 교반하며 수행되었다.
24시간 이전에는 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 12, 24시간 경과한 시간에 방출 용매를 회수하고, 그 이후는 24시간 간격으로, 0.5ml의 방출 용매를 Hoechst-binding assay를 위해 회수하고 등량의 PBS를 첨가하였다.
Hoechst 33342의 형광 강도는 460 nm 파장(λex=360 nm)에서 측정하여 plasmid DNA의 방출 정도를 측정하였고, 그 결과는 도 22에 나타내었다.
이를 참조하면 linear DNA가 50% 방출된 시간이 약 24시간인 것을 확인할 수 있다.
(9) 단백질
1) BSA
Fluorescein 형광이 표지된 BSA를 로딩한 다공성 실리카 입자 100μg 을 SBF(pH 7.4) 또는 PBS(pH 7.4) 200μl에 재부유시켰다. BSA의 방출은 37℃에서 60rpm 수평 교반하며 수행되었다.
6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 96 시간, 144 시간, 240 시간 지점에서 200μl의 방출 용매를 형광 측정을 위해 회수하고 등량의 SBF 또는 PBS를 첨가하였다.
Fluorescein 형광이 표지된 BSA의 형광 강도는 517 nm 파장(λex=492 nm)에서 측정하여 BSA의 방출 정도를 측정하였고, 그 결과는 도 23에 나타내었다.
이를 참조하면, BSA는 SBF와 PBS에서 모두 서방적으로 방출되되 각 시간대 모두 PBS에서 미미하게 방출량이 높은 것을 확인할 수 있고, 250시간 이상에 걸쳐 거의 100%까지 방출되는 것을 확인할 수 있다.
2)IgG
Fluorescein 형광이 표지된 IgG를 로딩한 다공성 실리카 입자 100μg을 SBF(pH 7.4) 또는 PBS(pH 7.4) 200μl에 재부유시켰다. IgG의 방출은 37℃에서 60rpm 수평 교반하며 수행되었다.
6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 96 시간, 144 시간, 240 시간 지점에서 200 ㎕의 방출 용매를 형광 측정을 위해 회수하고 등량의 SBF 또는 PBS를 첨가하였다.
Fluorescein 형광이 표지된 IgG의 형광 강도는 517 nm 파장(λex=492 nm)에서 측정하여 BSA의 방출 정도를 측정하였고, 그 결과는 도 24(A)에 나타내었다.
이를 참조하면, IgG는 SBF와 PBS에서 모두 서방적으로 방출되며, 250시간 이상에 걸쳐 거의 100%까지 방출되는 것을 확인할 수 있다.
3) 기타 항체
항체 1(anti-PD-1) 또는 항체 2((anti-PD-L1) (10μg)이 적재된 20μg의 다공성 실리카 입자를 SBF(pH 7.4)에 분산시킨 후(총 부피 1ml), 이 용액을 1.5ml 튜브에 넣고 37 ℃에서 20rpm으로 수평교반하는 동적인 조건을 유지한다. 각 시점마다 항체가 적재된 다공성 실리카 용액을 원심분리기를 이용하여 가라앉히고 상층액의 흡광도(λab = 480nm)를 측정하여 방출된 항체의 양을 측정하였고, 결과는 도 24(B),(C)에 나타내었다.
이를 참조하면, 50%의 방출량에 이르기까지 항체 1의 경우 약 45시간, 항체 2의 경우 약 20시간이 경과하였고, 초기에는 PBS에서 방출속도가 더 높다 시간이 흐를수록 SBF에서 방출속도가 높은 것을 확인할 수 있고(100시간을 분기점으로), 250시간 이상까지 항체가 지속적으로 방출된 것을 알 수 있다.
4) RNase A
Fluorescein 형광이 표지된 RNase A를 로딩한 다공성 실리카 입자 100 ㎍을 SBF(pH 7.4) 또는 PBS(pH 7.4) 200 ㎕에 재부유시켰다. RNase A의 방출은 37℃에서 60rpm 수평 교반하며 수행되었다.
6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 96 시간, 144 시간, 240 시간 지점에서 200 ㎕의 방출 용매를 형광 측정을 위해 회수하고 등량의 SBF 또는 PBS를 첨가하였다.
Fluorescein 형광이 표지된 RNase A의 형광 강도는 517 nm 파장(λex=492 nm)에서 측정하여 BSA의 방출 정도를 측정하였고, 그 결과는 도 25에 나타내었다.
이를 참조하면, RNaseA는 SBF와 PBS에서 모두 서방적으로 방출되되 각 시간대 모두 PBS에서 미미하게 방출량이 높은 것을 확인할 수 있고, 250시간 이상에 걸쳐 거의 100%까지 방출되는 것을 확인할 수 있다.
5) Cas9
Cas9 단백질/가이드 RNA 복합체를 적재한 다공성 실리카 입자 40 μg을 PBS(pH 7.4)에 부유시킨 후, 마우스 섬유아세포(fibroblast)로 알려진 NIH 3T3 세포 50,000 개가 깔려있는 슬라이드 글라스에 다공성 실리카 입자를 혈청이 없는 배지(serum free media)하에서 처리하고 CO2 5 %, 37℃ 조건에서 인큐베이션하였다.
1 시간, 3 시간, 6 시간, 24 시간 지점에서 배지를 제거하고 1x PBS 용액으로 세척한 후 4% paraformaldehyde를 15분간 인큐베이션하여 세포를 고정하였다.
이후 PBS로 세척한 후 blocking 버퍼(1x PBS, 5% normal goat serum, 0.3% triton X-100)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
PBS로 세척한 후 His tag 항체(Santa Cruz, sc-8036)를 16시간 동안 인큐베이션하였다.
다시 PBS로 세척한 후 Alexa Fluor 488이 연결된 항마우스 2차 항체(Abcam, ab150113)를 2시간 동안 인큐베이션하였다.
PBS로 세척한 후 슬라이드 글라스에 DAPI를 처리하여 세포의 핵을 염색하였다. 이후 형광현미경을 이용하여 세포 내 단백질의 분포를 확인하였고, 결과는 도 26에 나타내었다.
도 26에서 DAPI는 핵을 염색하는 시약으로 형광현미경 이미지에서 파란색으로 보이며, 세포 핵의 위치를 보여준다. Alexa Fluor 488은 Cas9 단백질에 표지한 형광염료로서, 형광현미경 이미지에서 초록색으로 보이며, 세포내 Cas9 단백질의 위치를 보여준다. Alexa Fluor488이 표지된 Cas 9 단백질이 적재된 실리카 입자를 세포에 처리하고, DAPI염색을 해 주면, 실리카 입자에 의해 Cas9 단백질이 세포 내로 들어갔는지 여부와 세포핵의 위치를 형광현미경 이미지에서 확인할 수 있다.
이를 참조하면, 세포 내로 도입된 Cas9 단백질은 도입후 3시간 경과시에는 주로 세포질 부분에서 관찰되고, 24시간 경과시에는 핵 안에서 관찰되는 것을 확인할 수 있다. 사용한 실리카 입자 자체가 세포핵 내로 들어가기는 것은 거의 불가능하므로, 세포 내에서 Cas9 단백질이 24시간 경과시에는 실리카 입자로부터 방출되어 원래 Cas9 단백질이 축적되는 세포 내 소기관으로 알려져 있는 핵 내로 유입된다는 것을 알 수 있다.
실험예 6. 생리활성물질의 전달 및 질환의 치료
(1) 종양 내 직접 전달
동물수준에서의 siRNA 전달 연구에 적합한 수준의 전달체 역할이 가능함을 검증하고자, 마우스(쥐)를 대상으로 생리활성물질 방출에 따른 종양 억제 정도를 확인하였다.
Balb/c nude 수컷 (5주령)을 ㈜오리엔트바이오에서 구입하여 멸균된 1x PBS에 300만개의 HeLa 세포(자궁경부암세포)를 분산시켜 마우스에 피하주사 이종이식(Xenograft) 종양을 성장시키고, 70 mm3 크기의 고형화된 종양이 확인되었을 때, PBS, FITC-다공성 실리카 입자(실시예 2-(1)-2)-②의 다공성 실리카 입자), Cy5-siRNA를 적재한 FITC-다공성 실리카 입자(실시예 2-(1)-2)-②의 다공성 실리카 입자)를 각각 마우스 종양 내 주사 투여하고 투여 직전, 투여 직후, 그리고 48시간 이후에 대해 형광 세기 및 분포를 FOBI Fluorescence in vivo imaging system (Neo science, Korea) 기기를 통해 관찰하였다.
상기 FITC 표지는 실리카 입자 50mg을 1mL DMSO (dimethyl sulfoxide)에 분산시키고 FITC-NHS(N-hydroxycuccinimide) 용액 (2.5 mg/mL) 25μg (10μl)을 넣고 알루미늄 호일로 빛을 차단한 상태로 상온에서 18시간 반응시키고, 반응물을 원심분리(8500rpm, 10분)로 정제하여 상층액은 버리고 가라앉은 입자를 모아 에탄올에 고르게 분산시키고 이를 에탄올-증류수로 교차하여 3-4번 반복하여 상층액에 FITC 색이 보이지 않을때까지 정제하여 수행하였다. 결과는 도 27(A)에 나타내었다.
도 27(A)에서 control은 PBS 단독 투여, cy5-siRNA는 cy5-siRNA 단독 투여, FITC-DDV가 FITC로 표기한 다공성 실리카 입자 단독 투여, complex가 cy5-siRNA가 로딩되고 FITC 표지된 다공성 실리카 입자의 투여를 나타내는 것으로서, 이를 참조하면, 입자에 적재하여 체내로 전달된 siRNA는 활성을 유지하는 기간이 더 길고, 주입된 부위에서 더 오래 머물어서, 48시간이 지나도 강한 형광을 나타내는 것을 확인할 수 있다.
(2) 정맥혈관에의 주사를 통한 전달
1) 실험방법
① 독소루비신
인간 간암 세포주인 HepG2 세포를 이용하여 Balb/C nude 마우스에 Xeno를 만들고, 실험을 진행하기 적당한 크기(50~100 mm3)가 되면 실시예 2-(3)-4)-① 입자에 독소루비신을 담지 한 후 PBS 수용액 100μㅣ에 분산한 다음 마우스 미정맥을 통해 주입한다. 독소루비신 주입량은 4 mg/kg(마우스 몸무게)이고 5~8주령 Balb/C nude 마우스의 평균적인 몸무게 20g을 기준으로 독소루비신 80μg, 입자 160μg을 사용한다.
② VEGF 억제 siRNA
인간 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포를 이용하여 Balb/C nude 마우스에 Xeno를 만들고, 실험을 진행하기 적당한 크기(50~100 mm3)가 되면 실시예 2-(1)-2)-② 입자에 VEGF 억제 siRNA(서열번호 7 sense; 5′-GGAGUACCCUGAUGAGAUCdTdT-3′, 서열번호 8 antisense; 5′- GAUCUCAUCAGGGUACUCCdTdT-3′)을 담지 한 후 PBS 수용액 100μㅣ에 분산한 다음 마우스 미정맥을 통해 주입한다. VEGF 억제 siRNA 주입 량은 1 mg/kg(마우스 몸무게)이고 5~8주령 Balb/C nude 마우스의 평균적인 몸무게 20g을 기준으로 siRNA 20μg, 입자 400μg을 사용한다.
③ Rnase A
인간 자궁 경부암 세포주인 HeLa 세포를 이용하여 Balb/C nude 마우스에 Xeno를 만들고, 실험을 진행하기 적당한 크기(50~100 mm3)가 되면 실시예 1-(9)입자에 Rnase A를 담지 한 후 PBS 수용액 100μㅣ에 분산한 다음 마우스 미정맥을 통해 주입한다. Rnase A 주입 량은 2 mg/kg(마우스 몸무게)이고 5~8주령 Balb/C nude 마우스의 평균적인 몸무게 20g을 기준으로 Rnase A 40μg, 입자 400μg을 사용한다.
④ p53
인간 자궁 경부암 세포주인 HeLa 세포를 이용하여 Balb/C nude 마우스에 Xeno를 만들고, 실험을 진행하기 적당한 크기(50~100 mm3)가 되면 실시예 1-(11)-5)-②입자에 p53 펩타이드를 담지 한 후 PBS 수용액 100μㅣ에 분산한 다음 마우스 미정맥을 통해 주입한다. p53 펩타이드 주입 량은 2.5 mg/kg(마우스 몸무게)이고 5~8주령 Balb/C nude 마우스의 평균적인 몸무게 20g을 기준으로 p53 펩타이드는 50μg, 입자 200μg을 사용한다.
2) 실험결과
도 27(B)를 참조하면, 본 발명의 다공성 실리카 입자에 독소루비신, VEGF 억제 siRNA, Rnase A 또는 p53 각각을 담지하여 주사한 모든 경우에서, 독소루비신, VEGF 억제 siRNA, Rnase A 또는 p53 각각을 단독으로 주사한 경우에 비하여 종양의 성장 억제 및 VEGF의 발현 억제의 우수성을 나타내고 있다. 이는 본 발명 입자의 혈관 내 우수한 전달성 및 생분해성과 같은 고유 특성에 의한 효과로 판단된다.
(3) 종양 인근 혈관에 카테터를 통한 전달
종양에의 생리활성물질의 효과적인 전달을 위해 동맥으로 카테터를 삽입하여 종양과 연결된 혈관까지 접근 후, 항암제를 담지한 본 발명 다공성 실리카 입자를 혈관을 통해 표적 전달 하였다(도 27(C)). 도 27(C)를 참조하면, 조영제와 혼합되어 전달된 본 발명 다공성 실리카 입자를 포함하는 조성물은 도 27(C)에서 검은 방울로 보이는 바와 같이 침전이나 뭉침 현상 없이 카테터와 혈관을 막지 않고 정확하게 표적 전달됨을 확인할 수 있다.
실험예 7. 다공성 실리카 입자의 제타 포텐셜 측정
(1) 실험방법
100 μg 의 다공성 실리카 입자를 1 ml의 PBS (pH 7.4)에 분산시킨 후, disposable folded capillary cell (DTS1070)에 옮겨 담아 제타전위 측정 장치에 장착 후 제타 포텐셜을 측정한다.
(2) 실험결과
도 28을 참조하면, P=O vibration peak, P-CH3 rocking peak 및 P-CH3 wagging peak가 FT-IR spectrum에서 나타나는 것으로 보아 음이온성 작용기가 상기 입자의 표면에 도입되어 음전하를 띠고 있음을 알 수 있다.
하기 표 2를 참조하면, 다공성 실리카 입자는 어떠한 작용기로 개질되는가에 따라 다양한 범위의 제타 포텐셜을 가질 수 있고, 목적하고자 하는 담지 생리활성물질의 종류가 다양화됨을 확인할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 다공성 실리카 입자는 +3mV 이상 -18mV 이하의 제타 포텐셜을 보이고 있음을 확인할 수 있고, 소수성 작용기에 이중개질(예를 들어, PEG)을 하여 담지하고자 하는 생리활성물질을 보다 효율적으로 담지할 수 있음을 알 수 있다.
입자 작용기 Zeta Potential 적합 생리활성물질
실시예 1-(1) Si-OH(미개질) 음전하(약 -18mV)
실시예 2-(3)-4) OPMeO2H 음전하(약 -30mV) 양전하성 저분자 화합물
실시예 2-(1)-3)-① NH2 양전하(약 +15mV) 음전하성 저분자 화합물
실시예 2-(1)-3)-② NH2 양전하(약 +20mV) RNA, DNA
실시예 2-(3)-1) COOH 음전하(약 -26mV) 양전하성 저분자 화합물
실시예 2-(3)-3) SO3H 음전하(약 -27mV) 양전하성 저분자 화합물
실시예 2-(3)-5) CHO 양전하(약 +8mV) Molecules that can form schiff base (imine) linkage
실시예 1-(11)-5)-① C3, PEG 양전하(약 +3.5mV) Hydrophobic molecule
실시예 1-(11)-5)② C8, PEG 양전하(약 +3.6mV) Hydrophobic molecule
실험예 8. 다공성 실리카 입자의 혈액 내 안정성 분석
(1) 실험방법
실시예 1-(1) 입자와 2-(3)-4)-① 입자 10 mg을 PBS 수용액, 25% 혈장용액 1ml에 분산시킨 후 상온에서 1시간 동안 둔 다음 용액희 상층액을 제거하여 안정적으로 분산되지 못하고 가라앉는 입자의 량을 비교한다. 또한 제거한 상층액의 흡광을 비교하여 PBS 수용액과 25% 혈장용액에서 안정적으로 분산되어 있는 입자의 량을 비교한다.
사람 혈액 4ml를 PBS용액 15ml에 분산시킨 후 원심분리기를 이용하여 10,000rpm으로 5분간 원심분리하고 상층액을 15ml를 버린다. 이 과정을 5회 반복하면서 혈액에 남아있는 적혈구를 제외한 단백질 등을 제거한다. 분리가 끝난 적혈구는 PBS용액 40ml에 분산 시켜둔다. 실시예 1-(1), 2-(3)-4)-① 입자를 가장 고농도인 20 mg부터 순차적으로 낮은 농도로 준비하여 PBS 용액 0.8ml에 분산 시킨다. 여기에 분리하여 PBS용액에 분산시켜 둔 적혈구 용액 0.2ml를 넣고 상온에서 차광을 한 후 회전 교반기에 80rpm으로 4시간 동안 둔다. 4시간 후 원심분리기를 이용하여 10,000rpm, 3분, 4℃ 조건에서 입자를 모두 가라앉히고 상층액의 577 nm에서 흡광측정하여 적혈구의 용혈된 정도를 비교한다. 100% 용혈된 경우는 입자가 분산된 용액 대신에 증류수 0.8ml를 사용한 경우로 하고 0% 용혈된 경우는 입자가 분산된 용액 대신에 PBS용액 0.8ml를 사용한 경우로 한다.
(2) 실험결과
도 29를 참조하면, PBS 수용액 조건 및 25% 혈장용액 조건 모두에서 본 발명 다공성 실리카 입자의 침전이나 응집의 정도가 현저히 낮음을 확인할 수 있는데, 보다 구체적으로, PBS 수용액, 25% 혈장용액에서 각각 대조군 입자의 경우 80%, 70%의 침전율을 보인 반면, 본 발명 입자의 경우 각각 불과 4%, 5%의 침전율만을 보였다. 이는 본 발명 다공성 실리카 입자의 표면처리를 통해 표면전하(zeta potential(mV))를 생성하였고, 입자들 간 반발력을 유도하여 안정한 용액을 유지하도록 하기 때문이다.
도 30을 참조하면, 고농도의 본 발명 입자를 처리하여도 적혈구와의 용혈이 일어나지 않음을 확인할 수 있다. 반면, 도 31을 참조하면, 표면이 타 작용기로 개질되지 아니한 다공성 실리카 입자(Silanol-MSN)의 경우, 입자의 농도에 의존적으로 적혈구의 용혈 정도가 높아짐을 확인할 수 있다. 이는 본 발명의 실리카 입자들은 표면이 실라놀기 대신 술포네이트기, 알데하이드기, 폴리에틸렌글리콜기, 메틸포스포네이트기 및 아민 작용기를 포함하는 타 작용기들로 대부분 개질되어 있어 적혈구 표면의 4차 암모늄기와의 상호작용이 강하지 않고, 수많은 기공이 존재하는 다공성의 구조를 가져 적혈구와 접할 수 있는 표면적이 작아 상호작용이 낮으며, 100nm 이상의 직경을 가져 적혈구 용혈성이 기존의 실리카 입자들에 비해 현저히 낮은 것으로 판단된다.
실험예 9. 다공성 실리카 입자의 생리활성물질 담지율
(1) 실험방법
1) 독소루비신(Doxorubicin)
음전하를 띠는 실시예 2-(3)-4)-①의 다공성 실리카 입자에 독소루비신을 로딩한 뒤 상층액의 흡광도를 측정하여 담지된 독소루비신의 양을 구하고 담지율을 계산한다.
구체적으로, 증류수 1ml 하에서 다공성 실리카 입자 분말 5mg과 독소루비신 2mg을 혼합한 후, 실온에서 1시간 정치하였다. 이후 해당 용액을 10분간 8000 rpm으로 원심분리하여 가라앉히고 상층액 상층액의 흡광도(λab = 480nm)를 측정하여 적재되지 않고 상층액에 남아있는 저분자 화합물의 양을 측정하였고, 담지된 저분자 화합물의 양을 계산(담지된 저분자 화합물의 양 = 처음 넣어준 저분자 화합물의 양 - 상층액에 남아있는 저분자 화합물의 양)하여 담지율을 확인한다.(담지율 = 생리활설물질/다공성실리카입자, w/w%)
2) 이리노테칸(Irinotecan)
음전하를 띠는 실시예 2-(3)-4)-①의 다공성 실리카 입자에 이리노테칸을 로딩한 뒤 상층액의 흡광도를 측정하여 담지된 이리노테칸의 양을 구하고 담지율을 계산하였으며 λab = 255nm 에서 흡광도를 측정한 것을 제외하고는 실험예 9-(1)-1)과 동일하게 진행하였다.
3) 소라페닙(sorafenib)
실시예 1-(11)-5)-①의 다공성 실리카 입자 5mg과 소라페닙 2mg을 5:5 혼합비(부피비)의 탈이온수/에탄올 1ml에 혼합한 후, 실온에서 1시간 두어 로딩하고, λab = 270nm 에서 흡광도를 측정한 것을 제외하고는 실험예 9-(1)-1)과 동일하게 진행하였다.
4) 레티노산(Retinoic acid)
실시예 2-(1)-2)-①의 다공성 실리카 입자 100μg에 레티노산 용액(50mM 에탄올) 1ml를 첨가하여 실온에서 4시간 정치하여 로딩하고, λab = 350nm 에서 흡광도를 측정한 것을 제외하고는 실험예 9-(1)-1)과 동일하게 진행하였다.
5) p53 펩타이드
실시예 1-(11)-5)-②의 다공성 실리카 입자 5mg를 형광(FAM)이 표지된 p53 펩타이드 용액(13mg/ml, DMSO) 100㎕에 분산시키고, 이를 15ml conical tube에 둔 후 실온에서 12시간 인큐베이션 하였다. 그 후 p53 펩타이드가 적제된 다공성 실리카 입자를 원심분리 (9289 rcf, 8500 rpm, 20분, 15 mL conical tube)한 다음 상층액의 형광을 측정하여 입자에 담지 된 펩타이드의 량을 계산하였다.
5) siRNA
양전하를 띠는 실시예 2-(1)-3)-② 입자에 siRNA를 로딩한 뒤 상층액에 남아있는 siRNA를 측정하여 담지된 siRNA의 량을 구하여 담지율을 계산한다. 구체적으로, PBS 수용액 10μl에 다공성 실리카 입자 20 μg을 분산시킨 후 siRNA 1μg을 혼합하여 상온에서 30분간 정치하였다. 이후 해당 용액을 10분간 8000rpm으로 원심분리하고 상층액에 남아있는 siRNA의 량을 Polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE) 를 이용하여 측정하였고, 입자에 담지된 siRNA의 량을 계산하였다.
6) mRNA
양전하를 띠는 실시예 2-(1)-3)-② 입자에 하기 화학식 2의 서열을 갖는 mRNA를 로딩한 뒤 상층액에 남아있는 mRNA를 측정하여 담지된 mRNA의 량을 구하여 담지율을 계산한다. 구체적으로, PBS 수용액 10μl에 다공성 실리카 입자 20 μg을 분산시킨 후 mRNA 1μg을 혼합하여 상온에서 30분간 정치하였다. 이후 해당 용액을 10분간 8000rpm으로 원심분리하고 상층액에 남아있는 mRNA의 량을 아가로스 겔을 이용하여 측정하였고, 입자에 담지된 mRNA의 량을 계산하였다.
[화학식 2]
TTTGTTCATAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATACCCCACCGAGACCCCATTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCACCCCCCAAGTTCGGGTGAAGGCCCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGCGGCAGGCCCTGCCATAGCAGATCTGCGCAGCTGGG(A)≥100
7) pDNA
양전하를 띠는 실시예 2-(1)-3)-③ 입자에 pDNA를 로딩한 뒤 상층액에 남아있는 pDNA를 측정하여 담지된 pDNA의 량을 구하여 담지율을 계산한다. 구체적으로, PBS 수용액 10μl에 다공성 실리카 입자 20 μg을 분산시킨 후 pDNA 1μg을 혼합하여 상온에서 30분간 정치하였다. 이후 해당 용액을 10분간 8000rpm으로 원심분리하고 상층액에 남아있는 pDNA의 량을 아가로스 겔을 이용하여 측정하였고, 입자에 담지된 pDNA의 량을 계산하였다.
8) Linear DNA
양전하를 띠는 실시예 2-(1)-3)-③ 입자에 linear DNA를 로딩한 뒤 상층액에 남아있는 pDNA를 측정하여 담지된 linear DNA의 량을 구하여 담지율을 계산한다. 구체적으로, PBS 수용액 10μl에 다공성 실리카 입자 20 μg을 분산시킨 후 linear DNA 1μg을 혼합하여 상온에서 30분간 정치하였다. 이후 해당 용액을 10분간 8000rpm으로 원심분리하고 상층액에 남아있는 linear DNA의 량을 아가로스 겔을 이용하여 측정하였고, 입자에 담지된 lnear DNA의 량을 계산하였다.
9) 단백질
① BSA
양전하를 띠는 다공성 실리카 입자에 BSA를 로딩한 뒤, 상층액에 남아있는 BSA를 측정하여 담지된 BSA의 양을 구하고 담지율을 계산한다.
구체적으로, 1 x PBS 200 ㎕ 내에 실시예 2-(1)-2)-②의 다공성 실리카 입자 분말 100μg과 BSA(sigma Aldrich, A6003) 10μg을 혼합한 후, 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 이후 해당 용액을 10분간 8000 rpm으로 원심분리하여 가라앉히고 상층액을 10 μl 채취하여 5배 묽힌 Bradford reagent 200 μl와 잘 섞어준 뒤, λab = 595nm에서 흡광도를 측정하여 적재되지 않고 상층액에 남아있는 BSA의 양을 측정한다. 이때 BSA 용액의 농도를 묽혀가며 Bradford reagent와 섞은 뒤 흡광도를 측정해 얻은 BSA의 standard curve와 비교하여 정확한 담지율을 계산한다.
② IgG
1 x PBS 200 ㎕ 내에 실시예 2-(1)-2)-②의 다공성 실리카 입자 분말 100μg과 anti-twist IgG(Santacruz, sc-81417) 10μg을 혼합한 후, 실온에서 1시간 인큐베이션하여 로딩한 것을 제외하고는 실험예 9-(1)-9)-①에서 진행한 방법과 동일하게 진행하였다.
③ RNase A
1 x PBS 200μl 내에 실시예 1-(9)의 다공성 실리카 입자 분말 100μg과 RNase A(Sigma-aldrich, R6513) 10μg을 혼합한 후, 실온에서 1시간 인큐베이션하여 로딩한 것을 제외하고는 실험예 9-(1)-9)①에서 진행한 방법과 동일하게 진행하였다.
④ Cas9
1 x PBS 10 ㎕ 내에 실시예 2-(1)-2)-①의 다공성 실리카 입자 분말 40μg과 Cas9 단백질(서열번호 3) 4μg과 가이드 RNA(서열번호 4) 2.25μg을 혼합한 후, 실온에서 1시간 인큐베이션하여 로딩한 것을 제외하고는 실험예 9-(1)-9)-①에서 진행한 방법과 동일하게 진행하였다.
⑤ Anti-PD-1 antibody
증류수 100 μl 내에 실시예 2-(3)-4)-②의 다공성 실리카 입자 분말 100 μg과 anti-PD-1 (BioXCell, BP0146) 50 μg을 혼합 후, 실온에서 5분간 인큐베이션하여 로딩한 것을 제외하고는 실험예 9-(1)-9)-①에서 진행한 방법과 동일하게 진행하였다.
⑥ Anti-PD-L1 antibody
증류수 100 μl 내에 실시예 2-(3)-4)-②의 다공성 실리카 입자 분말 100 μg과 anti-PD-L1 (BioXCell, BP0101) 50 μg을 혼합 후, 실온에서 5분간 인큐베이션하여 로딩한 것을 제외하고는 실험예 9-(1)-9)-①에서 진행한 방법과 동일하게 진행하였다.
(2) 실험결과
도 32를 참조하면, 독소루비신이 담지된 다공성 실리카 입자를 원심분리하여 침전시킨 결과, 대부분의 독소루비신이 입자에 담지되어 대조군에 비해 용액이 현저한 투명색을 띠고 있음을 확인할 수 있다.
하기 표 3을 참조하면, 상기 실험방법에 따른 다양한 생리활성물질들의 다공성 실리카 입자에의 담지율(생리활성물질/다공성 실리카 입자), w/w%)을 확인할 수 있다.
Bioactive substances Loading capacity (w/w %)
Small molecules : irinotecan, sorafenib, regorafenib, tamoxifen, gefitinib, erlotinib, afatinib, bleomycin, dactinomycin, daunorubicin, idarubicin, plicamycin, mitoxantrone, epirubicin, carboplatin, oxaliplatin, 5-fluorouracil, gemcitabine, temozolomide, alkylating agents (cisplatin, chlorambucil, procarbazine, carmustine, etc.), antimetabolites (methotreaxate, cytarabine, gemcitabine, etc), anti-microtublue agents (vinblastine, paclitaxel, etc), topoisomerase inhibitors (etoposide, doxorubicin, etc), cytotoxic agents (bleomycin, mitomycin, etc), metformine, etc 10-30
Antibodies : specific target antibodies for PD-1, PD-L1, CTLA4, LAG3, OX40, KIR, CD137, CD276, GITR, CD27, 4-1BB, VISTA, TIM-3, CDs (CD3, CD20, CD28, CD130, etc), Immune Checkpoint Inhibitors, VEGFRs, VEGFs, PDGFRs, EGFRs, HER2/neu, estrogen receptors, etc 10-60
Cytokine, Chemokine, Growth Factor, etc : anti-tumor cytokines, chemokines, growth factors (VEGF, EGF, LTF, HGF, etc), interleukins (IL-2, IL-7, IL-12, IL-23, IL-1α, IL-1Receptor alpha, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12 p70, IL-18, etc), FGFs, G-CSF, interferons (IFN-alpha 2 beta, IFN-gammar, etc), PDGF-BB, TNF-alpha, OX40L, 4-1BB, etc 5-50
Peptides, Aptamers: p53, LTF, EGF, VEGF, HGF, growth factors, cytokines, chemokines, vaccines, antibodies, etc 5-50
Proteins: enzymes (caspases, ribonuclease (Rnase, Ribonuclease A, etc), proteasomes, kinase, phosphatase, alkaline phosphatase, phospholipase, etc), antibodies, toxins (botulinum toxin, etc), TGF-beta superfamily, interleukin superfamily, M-CSF, hemoglobin, beta-galactosidase, KRAS, OX40L, relaxin, blood factors (Factor VII, Factor VIII, and Factor Ⅸ, albumin, etc), cytokine, growth factors, hormone, interferons (IFN-alpha, IFN-beta, IFN-gamma, etc), lectin, glycosylated proteins, glycoproteins, SUMOylated proteins, phosphorylated proteins, transcription factors, reprogramming factors, erythropoietin, TNFs, cas9, CRISPR, etc 5-50
siRNA : siRNA specific for mammalian expressing genes (VEGF, CTGF, TSLP, beta-catenin, HIFs, STATs, Notch, etc), etc 10-30
mRNA: interleukins (IL-2, IL-7, IL-12, IL-23, IL-1α, IL-1Receptor alpha, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12 p70, IL-18, etc), FGFs, G-CSF, interferons (IFN-alpha 2 beta, IFN-gammar, etc), PDGF-BB, TNF-alpha, VEGF, EGF, LTF, OX40L, 4-1BB, etc 5-30
DNA (circular plasmid DNA and/or loop-shape contained DNA, etc): interleukins (IL-2, IL-7, IL-12, IL-23, IL-1α, IL-1Receptor alpha, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12 p70, IL-18, etc), FGFs, G-CSF, interferons (IFN-alpha 2 beta, IFN-gammar, etc), PDGF-BB, TNF-alpha, VEGF, EGF, LTF, OX40L, 4-1BB, etc 5-30
Linear DNA (single strand DNA, double strand DNA, etc): interleukins (IL-2, IL-7, IL-12, IL-23, IL-1α, IL-1Receptor alpha, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12 p70, IL-18, etc), FGFs, G-CSF, interferons (IFN-alpha 2 beta, IFN-gammar, etc), PDGF-BB, TNF-alpha, VEGF, EGF, LTF, OX40L, 4-1BB, DNAzyme, etc 5-30
Vaccines: anti-virus vaccines, anti-tumor vaccines, anti-bacteria vaccines, etc 5-30
Gene editing elements: CRISPRs, Cas9, zinc finger nucleases, TALEN, Hybrid Meganulcease, etc 5-40
Polymer: natural polymer, synthetic polymer, organic polymer, inorganic polymer, chitosan, alginate, dextran, pectin, hybrid polymer, collagen, hyaluronic acid, PLLA, PLGA, PMMA, hydrogel, etc 5-50
실험예 10. 다공성 실리카 입자의 세포독성 테스트
96웰 플레이트에 HepG2 세포를 각 웰 당 10,000개씩 깔아두고 24시간 후에 각 웰에 실시예 2-(3)-4) 입자를 저농도부터 가장 고농도인 1mg까지 순차적으로 분산시키고 24시간 둔 후 cell counting kit (CCK)를 이용하여 HepG2세포의 생존률을 확인하였고, 그 결과를 도 33에 나타내었다.
도 33을 확인하면, 본 발명 다공성 실리카 입자를 포함하는 조성물은 농도에 무관하게 HepG2 세포주의 생존율에 영향을 미치지 않은 것으로 보아, 세포독성이 없는 것을 확인할 수 있다.
실험예 11. 다공성 실리카 입자를 포함하는 색전 시술용 조성물의 안정성 및 표적성
(1) 색전물질과 혼합시의 안정성 확인
색전물질로 널리 사용되는 리피오돌 1.6ml와 독소루비신을 담지한 다공성 실리카 입자 0.4ml를 혼합하여 에멀젼을 형성하였고, 이를 방울 형태로 투명한 플라스틱 판 위에 떨어뜨린 후 형광 현미경으로 촬영한 이미지를 도 34에 나타내었다.
도 34를 참조하면, 리피오돌 단독 에멀젼(A)에 비해 상기 다공성 실리카 입자를 혼합한 에멀젼 형태(B)는 균일한 크기의 에멀젼을 오래 유지하는 것을 확인할 수 있는데, 이로써 본 발명 다공성 실리카 입자가 리피오돌과 같은 색전물질과 함께 혼합하여 사용하기 적합하고, 응집이나 침전현상을 줄여 우수한 색전 시술 효과 및 치료효과를 거둘 수 있음을 알 수 있다.
(2) 정상 간조직의 손상여부를 통한 표적성 확인
1) 실험방법
토끼 실험 종료 후 채취한 간의 사진 촬영을 통해 간 조직의 경색부위를 육안으로 확인하고 이를 통해 정상 간 조직의 손상여부를 확인한다.
2) 실험결과
하기 표 4과 도 35를 참조하면, 독소루비신이 담지된 다공성 실리카 입자를 리피오돌과 함께 혼합하여 에멀젼 형태로 간암 색전 시술을 행한 경우, 간암세포 이외의 이웃한 정상 간조직에는 염증 등의 간독성을 전혀 보이지 않았다. 이로써 본 발명의 다공성 실리카 입자와 리피오돌을 포함하는 색전 시술용 조성물의 높은 표적성을 통한 색전 시술의 효과와 담지환 생리활성물질에 해당하는 질환의 치료효과의 우수성을 확인할 수 있다.
cTACE DEB-TACE DegradaBALL-TACE
Composition Lipiodol PVA microbead Lipiodol+DegradaBALL
Doxorubicin loading conc. 1mg 1mg 1mg
Liver/Biliary injury Liver infarct None Observed None
Multiple portal vein narrowing None Observed None
Multiple portal vein thromboses None observed None
(3) 간암 조직 또는 세포 내 생리활성물질 방출량을 통한 표적성 확인
1) 실험방법
① TACE
간에 VX2 종양이 심어진 토끼의 귀에 있는 동맥을 이용하여 마이크로 카테터를 삽입하고 마이크로 카테터가 간 동맥까지 도달하면 VX2 종양으로 가는 혈관으로 독소루비신을 담지하고 있는 실시예 2-(3)-4)-① 입자 0.4ml를 리피오돌 1.6ml와 에멀전을 만든 후 이중 0.2ml 간 동맥으로 삽입한 마이크로 카테터를 통해 주입한다.
② 형광신호분석장비
입자 표면에 형광이 달린 다공성 실리카 입자에 대해서 TACE후 수거한 토끼의 종양, 간, 지라, 신장을 곱게 간 후 각 조직 1g당 1.5% 염산-에탄올 용액 2ml를 넣고 균질기를 이용하여 조직과 용액을 잘 혼합하여 준 후 차광한 상태로 4℃에 24시간 두면서 조직에 있는 입자가 용출될 수 있도록 한다. 이 용액을 원심분리기를 이용하여 5000 rpm, 4℃, 10분 동안 원심분리 한 후 상층액의 형광을 측정하여 각 조직에 남아있는 입자에 량을 확인한다.
③ Flow cytometry
입자 표면에 형광이 달린 다공성 실리카 입자에 대해서 TACE후 수거한 토끼의 종양, 간, 지라, 신장을 곱게 간 후 각 조직 200 mg 당 0.25% 트립신을 10ml씩 넣고 상온에서 30분간 두면서 조직에서 세포들이 떨어질 수 있도록 한다. 30분 후 상층액을 모아서 flow cytometry 를 이용해 추출된 세포들이 함유하고 있는 입자의 량을 비교한다.
④ Pharmacokinetics
TACE 시술 0, 1, 5, 10, 30, 60분 차에 토끼의 혈액을 채취하여 혈장을 분리하고 혈장에 존재하는 독소루비신의 량을 HPLC를 통해 분석한다.
⑤ 조직내 잔존 독소루비신 양
수거한 종양과 정상 간 조직을 곱게 간 후 각 조직 1g당 1.5% 염산-에탄올 용액 2ml를 넣고 균질기를 이용하여 조직과 용액을 잘 혼합하여 준 후 차광한 상태로 4℃에 24시간 두면서 조직에 있는 독소루비신이 용출될 수 있도록 한다. 이 용액을 원심분리기를 이용하여 5000 rpm, 4℃, 10분 동안 원심분리 한 후 상층액의 독소루비신 480 nm의 흡광을 측정하여 종양과 정상 간 조직에 남아있는 독소루비신의 양을 확인한다.
2) 실험결과
도 36(A),(B)을 참조하면, 본 발명 다공성 실리카 입자와 리피오돌을 포함하는 색전 시술용 조성물을 이용하여 색전 시술(DegradaBALL-TACE)을 행하였을 때, 주입한 대부분의 입자들이 간암 조직(A) 또는 간암 세포(B)에서 관찰되는 것으로 보아, 본 발명 색전 시술용 조성물의 표적 전달 우수성을 확인할 수 있다.
도 36(C)를 참조하면, 본 발명 독소루비신을 담지한 다공성 실리카 입자를 포함하는 색전 시술용 조성물을 이용하여 색전 시술(DegradaBALL-TACE without Lipiodol)을 행하였을 때, 종양 주변 세포에서의 독소루비신의 방출량이 리피오돌 단독 사용의 색전 시술(cTACE)보다 현저히 낮고, 리피오돌을 함께 사용한 색전 시술(DegradaBALL-TACE)의 경우 극히 미미함을 확인할 수 있다. 또한, 도 36(D)를 참조하면, 본 발명 독소루비신을 담지한 다공성 실리카 입자를 포함하는 색전 시술용 조성물을 이용하여 색전 시술(DegradaBALL-TACE without Lipiodol)을 행하였을 때, 정상 간 조직 대비 간암 조직 내 독소루비신의 잔류량이 리피오돌 단독 사용의 색전 시술(cTACE)보다 현저히 높고, 리피오돌을 함께 사용한 색전 시술(DegradaBALL-TACE)의 경우 더 높은 잔류량을 보임을 확인할 수 있다. 이는 본 발명 다공성 실리카 입자를 포함하는 색전 시술용 조성물의 높은 표적성을 나타내는 결과이고, 리피오돌과 함께 사용하였을 때 더 큰 시너지효과를 발휘하여 우수한 색전 시술 결과를 얻을 수 있음을 암시한다.
실험예 11. 다공성 실리카 입자를 포함하는 색전 시술용 조성물의 간암 치료 효과 확인
(1) 실험방법
1) Viability
수거한 종양의 조직 병리를 통해 종양 박편을 얻고 죽은 세포와 살아있는 세포를 구분할 수 있는 TUNEL assay 를 진행하여 종양내 살아있는 암세포와 죽어있는 암세포를 육안으로 구분할 수 있도록 한다. 이 살아있는 암세포와 죽어있는 암세포를 육안으로 확인 및 판단하여 전체 종양 크기 대비 살아있는 종양의 크기를 비교를 통해 viability를 측정한다.
2) AST and ALT
TACE 시술 당일, 1일차, 4일차, 7일차에 토끼의 혈액 1ml를 채취한 후 혈장을 분리하여 혈장에 존재하는 간 특이적 독성을 확인할 수 있는 단백질인 AST, ALT의 농도를 비색법을 이용하여 분석한다.
(2) 실험결과
도 37(A)(B)를 참조하면, 토끼의 간암 조직 부분이 갈색 부분으로 염색되었고(A), 염색된 간암 조직 내 간암 세포의 생존률이 본 발명 독소루비신을 담지한 다공성 실리카 입자와 리피오돌을 포함하는 색전 시술용 조성물을 이용하여 색전 시술시, 암 세포의 생존률이 담지된 독소루비신의 농도에 의존적으로 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있는데(B), 이는 본 발명의 조성물의 색전 시술을 통한 우수한 약물 전달을 통한 치료효과를 보여주는 것이다.
도 37(C)(D)를 참조하면, 상기 조성물을 통한 색전 시술시 AST(aspartate aminotransferase, (C)) 및 ALT(alanine aminotransferase, (D))의 농도를 측정한 결과로서, 그 농도가 낮은 수준을 유지하여 색전 시술시 간 독성을 나타내지 않음을 나타내는 것이다.

Claims (15)

  1. 표면 또는 기공 내부에 생리활성물질을 담지하고, 제타 포텐셜 +3 mV 이상 또는 -18 mV 이하인 다공성 실리카 입자를 포함하고,
    상기 입자는 표면 또는 기공 내부가 화학적 개질된 것인 혈관 내 생리활성물질 전달용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 입자는 상기 표면 또는 기공 내부의 실라놀기의 적어도 일부가 알데하이드기, 케토기, 카바메이트기, 설페이트기, 설포네이트기, 아미노기, 아민기, 아미노알킬기, 실릴기, 카르복실기, 술폰산기, 티올기, 암모늄기, 설프히드릴기, 포스페이트기, 에스터기, 이미드기, 싸이오이미드기, 케토기, 에터기, 인덴기, 설포닐기, 메틸포스포네이트기, 폴리에틸렌글리콜기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3 내지 C30의 사이클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 C30의 아릴기 및 C1 내지 C30의 에스테르기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 작용기로 치환된 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 입자는 상기 표면 또는 기공 내부의 실라놀기의 적어도 일부가 아미노기, 아민기, PEG기, 프로필기, 옥틸기, 카르복실기, 티올기, 술폰산기, 메틸포스포네이트기 및 알데하이드기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 작용기로 치환된 것인 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 입자는 직경이 100 내지 1000nm인 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 입자는 제타 포텐셜 +3 mV 내지 +100 mV 또는 -100 mV 내지 -18 mV 인 것인 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 입자는 g당 부피가 0.7 내지 2.2 ml인 것인 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 입자는 하기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 20 이상인 조성물:
    [수학식 1]
    At/A0
    (식 중, A0는 상기 다공성 실리카 입자 1 mg/ml 현탁액 5 ml를 직경 50 kDa의 기공을 갖는 원통형 투과막에 넣고 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도이고,
    상기 투과막 외부에는 상기 투과막과 접하며, 상기 현탁액과 동일한 용매 15 ml가 위치하고, 상기 투과막 내외부는 37℃에서 60 rpm 수평 교반되며,
    At는 상기 A0의 측정시로부터 t 시간 경과 후에 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도임).
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 입자는 담지한 생리활성물질의 최대 방출량이 99중량% 이상인 것인 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 생리활성물질은 핵산, 뉴클레오티드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질, 화합물, 항체, 항원, 사이토카인, 성장인자 및 이들을 구성하는 요소로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인 것인 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 생리활성물질은 독소루비신, 이리노테칸, 소라페닙, 아드리아마이신, 다우노마이신, 마이토마이신, 시스플라틴, 에피루비신, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 아클라시노마이신, 나이트로젠 머스터드, 사이클로포스파미드, 블레오마이신, 다우노루비신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 타목시펜, 발루비신, 피라루비신, 미토산트론, 젬시타빈, 이다루비신, 테모졸로마이드, 파클리탁셀, 덱사메타손, 알데스루킨, 아벨루맙, 베바시주맙, 카보플라틴, 레고라페닙, 도세탁셀, 독실, 제피티닙, 이마티닙 메실레이트, 허셉틴, 이마티닙, 알데스루킨, 키트루다, 옵디보, 마이토마이신 C, 니볼루맙, 올라파립, 펨브로리주맙, 리투시맙, 수니티닙, 아테졸리주맙, 라파티닙 및 이필리무맙으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인 조성물.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 카테터를 통해 표적 조직으로 방출되는 것인 조성물.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 색전 시술용 조성물.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 조성물은 조영제 및 색전물질 중 적어도 하나를 더 포함하는 조성물.
  14. 청구항 12에 있어서,
    상기 조성물은 리피오돌, 덱스트란, 폴리비닐알코올, 리피오돌, N-부틸 시아노아크릴레이트, 젤폼, 젤라틴, 에탄올, 덱스트란, 실리카, 폴리소디움 아크릴레이트 비닐알코올 코폴리머, 글라스 입자, 폴리-L-굴루로닉 알지네이트, 폴리글리콜릭-폴리액틱산, 폴리디옥사논, 폴리글리콜산-co-카프로락톤, 폴리프로필렌 및 직경 10㎛ 이상의 다공성 실리카 입자로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 색전물질을 더 포함하는 조성물.
  15. 청구항 12에 있어서,
    상기 조성물은 카테터를 통해 종양에 직접 연결된 혈관에 방출되는 조성물.
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